(57)【要約】  本発明は、疾患との関連が十分に検証されたSNP等を利用する冠状動脈疾患の検査方法、当該方法に用いられる試薬等を提供することを目的とする。  本発明は、被検者の冠状動脈疾患リスクの検査方法であって、被験者から採取した試料におけるＭＫＬ１遺伝子発現を亢進させる変異又はＭＫＬ１遺伝子発現の亢進を検出する工程を含む方法を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者の冠状動脈疾患リスクの検査方法であって、被検者から採取した試料におけるＭＫＬ１遺伝子発現を亢進させる変異又はＭＫＬ１遺伝子発現の亢進を検出する工程を含む方法。
【請求項２】
前記ＭＫＬ１遺伝子発現を亢進させる変異を検出する工程は、
ＭＫＬ１遺伝子における配列番号：１に記載の塩基配列の８１７位に対応する部位の多型を検出する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記８１７位に対応する塩基がチミン（Ｔ）である多型を検出したときに、前記被検者の冠動脈疾患リスクが通常より高いと判断する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＫＬ１遺伝子発現の亢進を検出する工程は、被検者から採取した活性化マクロファージ内におけるＭＫＬ１遺伝子発現の亢進を検出する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＭＫＬ１遺伝子の発現が亢進しているときに、前記被検者の冠動脈疾患リスクが通常より高いと判断する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
冠状動脈疾患リスクの検査薬であって、以下の（１）から（３）の少なくとも１つを含む、検査薬。
（１）配列番号：１に記載の塩基配列における８１７位を含む少なくとも１０塩基の領域からなる核酸又はこれに相補的な領域からなる核酸にハイブリダイズする核酸
（２）配列番号：１に記載の塩基配列における８１７位を含む少なくとも１０塩基の領域からなる核酸又はこれに相補的な領域からなる核酸を増幅可能なプライマー
（３）ＭＫＬ１タンパク質に対する抗体
【請求項７】
被検者の冠状動脈疾患リスクの診断方法であって、被検者から採取した試料におけるＭＫＬ１遺伝子発現を亢進させる変異又はＭＫＬ１遺伝子発現の亢進を検出する工程を含む方法。
【請求項８】
前記被検者から採取した試料におけるＭＫＬ１遺伝子発現を亢進させる変異を検出する工程は、
被検者から採取した試料から核酸試料を調製する工程と、
前記核酸試料において、ＭＫＬ１遺伝子における配列番号：１に記載の塩基配列の８１７位に対応する部位の多型を検出する工程と、を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記８１７位に対応する塩基がチミン（Ｔ）である多型を検出したときに、前記被検者の冠状動脈疾患リスクが通常より高いと診断する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記被検者から採取した試料におけるＭＫＬ１遺伝子発現の亢進を検出する工程は、
前記被検者から活性化マクロファージを含む試料を採取する工程と、
前記活性化マクロファージ内におけるＭＫＬ１遺伝子の発現の亢進を検出する工程と、を含む請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＭＫＬ１遺伝子の発現が亢進しているときに、前記被検者の冠状動脈疾患リスクが通常より高いと診断する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
冠状動脈疾患の予防又は治療薬のスクリーニング方法であって、
ＭＫＬ１遺伝子を発現可能な細胞と、前記予防又は治療薬候補とを接触させる工程と、
前記ＭＫＬ１遺伝子の発現若しくはＭＫＬ１タンパク質の機能を阻害又は抑制する候補を選択する工程と、を含む方法。
【請求項１３】
配列番号：１に記載の塩基配列において８１７位に対応する塩基がＴ（チミン）である塩基配列からなる、ＭＫＬ１タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
請求項１３に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検者の冠状動脈疾患リスクを検査する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
冠状動脈疾患は、その罹患率の上昇及び死亡率の高さから、先進国において重要な健康問題の一つとなっている。冠状動脈疾患は、コレステロールエステルを主とする脂質、ムコ多糖類、線維性組織等を含む冠状動脈内壁のアテロームを主病変とする。病変部には、細胞成分として、平滑筋細胞や、脂肪滴を多量に含んで泡沫化したマクロファージも含まれる。心臓を取り囲む冠状動脈内でアテロームが隆起すると内腔が狭められ、血流が部分的に遮断される。その結果、心筋へ供給される血液が不足し、心筋虚血を引き起こし、心臓は正常に収縮して血液を送り出すことができなくなる。アテロームが動脈を完全にふさぐと、心筋の壊死も生じうる。冠状動脈における可逆的な虚血は狭心症、非可逆的な虚血は心筋梗塞であり、突発性の胸痛を引き起こす。【０００３】
冠状動脈疾患の発症には、喫煙、高血圧、高コレステロール血症、糖尿病などの環境的要因が深く関与しているが（例えば、非特許文献１参照。）、遺伝的要因も重要な役割を果たしていることを示す証拠もある（例えば、非特許文献２参照）。従って、一般に、冠状動脈疾患の病因には、環境的要因と遺伝的要因の両方が関連していると認識されている。【０００４】
近年、冠状動脈疾患を含む様々なヒトの疾患について、マイクロアレイ技術を利用した一塩基多型（single nucleotide polymorphism; SNP）のゲノムワイド関連解析により、易罹患性に関与する遺伝子についての情報が収集されている。例えば、染色体9p21のrs1333049は冠状動脈疾患に関与し、当該関与は、いくつかの集団サンプルにおいてレプリケートされているとの報告もある（非特許文献３−８等参照）。【０００５】
しかしながら、冠状動脈疾患リスクを高めると報告されている遺伝的多型の多くは、複数のケースコントロール解析におけるレプリケーションスタディによる確認がなされておらず、疾患との関連が十分に検証されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Wang, Q. et al. Curr Opin Cardiol., 20, 2005, 182-188
【非特許文献２】Ciruzzi, M. et al. Am J Cardiol., 80, 1997, 122-127
【非特許文献３】Wellcome Trust Case Control Consortium, Nature, 447, 2007, 661-678
【非特許文献４】McPherson, R. et al. Science, 316, 2007, 1488-1491
【非特許文献５】Helgadottir, A. Science, 316, 2007, 1491-1493
【非特許文献６】Samani, N.J. et al. N Engl J Med, 357, 2007, 443-453
【非特許文献７】Hinohara, K. et al. J Hum Genet., 53, 2008, 357-359
【非特許文献８】Heribert, S. et al. Circulation, 117(13), 2008, 1675-84.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、疾患との関連が十分に検証されたSNP等を利用する冠状動脈疾患の検査方法、当該方法に用いられる試薬等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、巨核芽球性白血病因子-1（以下、「MKL1」という。）遺伝子のプロモーター領域における-184位のシトシン（C）がチミン（T）に置換されたSNPは、冠状動脈疾患の罹患率と極めて関連が高いこと；当該SNPが存在すると、MKL1遺伝子のプロモーター活性が亢進すること；当該SNPが存在すると、MKL1遺伝子のプロモーターに対する抑制因子と見られる核内因子の当該プロモーターに対するアフィニティが低下すること；アテローム性動脈硬化の病変部における泡沫化したマクロファージにおいてMKL1タンパクの発現が亢進していること；これらの事実に基づくとMKL1遺伝子が冠状動脈疾患の病因遺伝子の一つであることが強く示唆されること、を見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、
〔１〕被検者の冠状動脈疾患リスクの検査方法であって、被検者から採取した試料におけるＭＫＬ１遺伝子発現を亢進させる変異又はＭＫＬ１遺伝子発現の亢進を検出する工程を含む方法；
〔２〕前記ＭＫＬ１遺伝子発現を亢進させる変異を検出する工程は、ＭＫＬ１遺伝子における配列番号：１に記載の塩基配列の８１７位に対応する部位の多型を検出する工程を含む、上記〔１〕に記載の方法；
〔３〕前記８１７位に対応する塩基がチミン（Ｔ）である多型を検出したときに、前記被検者の冠動脈疾患リスクが通常より高いと判断する、上記〔２〕に記載の方法；
〔４〕前記ＭＫＬ１遺伝子発現の亢進を検出する工程は、被検者から採取した活性化マクロファージ内におけるＭＫＬ１遺伝子発現の亢進を検出する工程を含む、上記〔１〕に記載の方法；
〔５〕前記ＭＫＬ１遺伝子の発現が亢進しているときに、前記被検者の冠動脈疾患リスクが通常より高いと判断する、上記〔４〕に記載の方法；
〔６〕冠状動脈疾患リスクの検査薬であって、以下の（１）から（３）の少なくとも１つを含む、検査薬、
（１）配列番号：１に記載の塩基配列における８１７位を含む少なくとも１０塩基の領域からなる核酸又はこれに相補的な領域からなる核酸にハイブリダイズする核酸
（２）配列番号：１に記載の塩基配列における８１７位を含む少なくとも１０塩基の領域からなる核酸又はこれに相補的な領域からなる核酸を増幅可能なプライマー
（３）ＭＫＬ１タンパク質に対する抗体；
〔７〕被検者の冠状動脈疾患リスクの診断方法であって、被検者から採取した試料におけるＭＫＬ１遺伝子発現を亢進させる変異又はＭＫＬ１遺伝子発現の亢進を検出する工程を含む方法；
〔８〕前記被検者から採取した試料におけるＭＫＬ１遺伝子発現を亢進させる変異を検出する工程は、被検者から採取した試料から核酸試料を調製する工程と、前記核酸試料において、ＭＫＬ１遺伝子における配列番号：１に記載の塩基配列の８１７位に対応する部位の多型を検出する工程と、を含む上記〔７〕に記載の方法；
〔９〕前記８１７位に対応する塩基がチミン（Ｔ）である多型を検出したときに、前記被検者の冠状動脈疾患リスクが通常より高いと診断する、上記〔８〕に記載の方法；
〔１０〕前記被検者から採取した試料におけるＭＫＬ１遺伝子発現の亢進を検出する工程は、前記被検者から活性化マクロファージを含む試料を採取する工程と、前記活性化マクロファージ内におけるＭＫＬ１遺伝子の発現の亢進を検出する工程と、を含む上記〔７〕に記載の方法；
〔１１〕前記ＭＫＬ１遺伝子の発現が亢進しているときに、前記被検者の冠状動脈疾患リスクが通常より高いと診断する、上記〔１０〕に記載の方法；
〔１２〕冠状動脈疾患の予防又は治療薬のスクリーニング方法であって、ＭＫＬ１遺伝子を発現可能な細胞と、前記予防又は治療薬候補とを接触させる工程と、前記ＭＫＬ１遺伝子の発現若しくはＭＫＬ１タンパク質の機能を阻害又は抑制する候補を選択する工程と、を含む方法；
〔１３〕配列番号：１に記載の塩基配列において８１７位に対応する塩基がＴである塩基配列からなる、ＭＫＬ１タンパク質をコードするＤＮＡ；
〔１４〕上記〔１３〕に記載のＤＮＡを含む組換えベクター；
〔１５〕上記〔１４〕に記載の組換えベクターを含む形質転換体、に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る検査方法又は診断方法によれば、被検者について、MKL1遺伝子発現を亢進させる変異の有無又はMKL1遺伝子発現の亢進の有無を検出することにより、被検者における冠状動脈疾患罹患の有無や、冠状動脈疾患の罹患リスクを判定することができる。MKL1遺伝子発現を亢進させる変異の中でも、特に、MKL1遺伝子における配列番号：１に記載の塩基配列の８１７位に対応する部位のSNPは、レプリケーションスタディによっても確認され、疾患との関連性が十分に検証されたものである。【００１１】
また、本発明に係る冠状動脈疾患リスクの検査薬によれば、被検者の冠状動脈疾患リスクを簡便に判定することができる。【００１２】
冠状動脈疾患の発症は、遺伝的要因に加え環境的要因にも依存する。したがって、本発明に係る方法により、遺伝的要因による冠状動脈疾患リスクが高いと判断される場合には、環境的要因を抑えることによって発症を抑制することも可能となる。【００１３】
さらに、本発明に係るスクリーニング方法によれば、冠状動脈疾患の予防又は治療薬を同定することができる。当該予防又は治療薬を投与することによって、冠状動脈疾患の原因の一つと考えられるMKL1遺伝子の発現量を減少させ、あるいはMKL1タンパク質の機能を抑制することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ゲノムワイドスクリーニングの手順の概略を示す。
【図２】図２は、ゲノムワイドスクリーニングの結果を示す。
【図３】図３は、MSマーカーCAD1-MSの染色体22q13上での位置を示す。
【図４】図４は、発現解析の結果を示す。図４Ａ及び図４Ｂは、それぞれK562細胞とHeLa細胞を用いたレポーターアッセイの結果である。いずれの細胞においても、感受性アレルTに駆動されたルシフェラーゼ活性は、アレルCに駆動されたルシフェラーゼ活性より高いことが確認された。図４Ｃは、Tアレルのホモ接合体を有するB細胞株と、Cアレルのホモ接合体を有するB細胞株におけるMKL1遺伝子の発現量を定量的リアルタイムPCRで比較した結果を示す。
【図５】図５は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。図５Ａは、DNA-タンパク質複合体が-184Tより-184Cに高いアフィニティを示すことを表す。図５Ｂは、-184Tプローブを含む場合より、-184Cプローブを含む場合に、非標識DNAによる競合の効率が高いことを示す。
【図６】図６は、免疫組織化学染色の結果を示す。図６Ａは、MKL1タンパク質がアテローム斑のコアで発現していることを示す。図６Ｂは、隣接する領域を抗CD68抗体で染色した結果を示す。MKL1-陽性細胞が泡沫化したマクロファージであることが確認された。図６Ｃは、抗ヒト平滑筋αアクチンモノクローナル抗体で染色した結果を示す。MKL1タンパク質が新生内膜中の平滑筋αアクチン陽性細胞でも発現していることが確認された。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に係る冠状動脈疾患リスクの検査方法は、被検者から採取した試料におけるMKL1遺伝子発現を亢進させる変異又はMKL1遺伝子発現の亢進を検出する工程を含む。
【００１６】
本発明において、冠状動脈疾患リスクの検査方法とは、被検者に関し、冠状動脈疾患を罹患する可能性の高さを判定する方法をいう。本発明に係る検査方法は、例えば検査会社等で実施されうる。
【００１７】
本発明に係る冠状動脈疾患リスクの検査方法の第一の態様は、被検者から採取した試料におけるMKL1遺伝子発現を亢進させる変異を検出する工程を含む。MKL1遺伝子発現を亢進させる変異はいかなる変異であってもよく、DNAレベル、転写レベル、翻訳レベルの変異が含まれるが、特に配列番号：１に記載の塩基配列の８１７位に対応する部位、すなわちMKL1遺伝子-184位の多型を検出することが好ましい。以下、この方法について具体的に説明する。
【００１８】
（冠状動脈疾患リスクの検査方法：-184位の多型の検出による方法）
本発明者らは、ゲノムワイド関連解析により、MKL1遺伝子のプロモーター領域における-184位（配列番号１に記載の塩基配列の８１７位）のシトシンがチミンに置換されたSNP（以下、「-184C>T」ともいう。）が、冠状動脈疾患の罹患率と極めて高い関連性を有することを見出した。この結果は、2つの異なる日本人集団によるレプリケーションスタディによって検証された。従って、-184C>Tを有する被検者は、冠状動脈疾患リスクが通常よりも高いと判断される。
【００１９】
なお、本発明に係る検査方法は、現在冠状動脈疾患を罹患していない被検者が将来罹患するリスクを検査・診断するのみでなく、現在冠状動脈疾患を罹患しているか否かの検査・診断に利用することもできる。
【００２０】
本明細書において、「被検者から採取した試料」は、MKL1遺伝子の多型を検出できる限りどのような試料であってもよいが、例えば、血液その他の体液、皮膚、組織、細胞等が挙げられる。
被検者について、MKL1遺伝子の多型を検出するためには、これらの試料からDNAを単離して多型を検出してもよいし、RNAを単離して検出することも可能であり、またRNAから調製したcDNAを利用して検出することもできる。試料
からDNA又はRNAを単離する方法は特に限定されず、当業者に公知の方法で染色体DNA又はRNAを抽出、単離することができる。
【００２１】
多型を検出する方法は特に限定されず、当業者に公知の種々の方法を採用することができ、例えば、以下のような方法を用いることができる。
【００２２】
(i) PCR-RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）
特定の多型を有する遺伝子は制限酵素による切断によって生じる断片の長さが異なることを利用して、多型を検出する方法であり、例えば以下の手順により行うことができる。被検者から得た染色体DNAについて、検出しようとする多型を含む領域をPCR法により増幅する。増幅産物に多型部位を認識する制限酵素を作用させ、断片を電気泳動法等により分離、同定する。生じた断片の長さから制限酵素による切断の有無、ひいては多型の有無を確認することができる。
本方法は、被検者から得たRNAを使用して、逆転写酵素によりcDNAを得て、これを染色体DNAの代わりに用いることもできる。
【００２３】
(ii) 対立遺伝子特異的PCR
多型を含む領域にハイブリダイズするプライマー（allele-specific oligonuceoide: ASO）を用いてPCRを行い、多型を有する場合、当該プライマーと鋳型DNAとの間にミスマッチが生じるため、アニール温度が高い場合に伸長反応が起こらないことを利用する方法である。増幅産物を電気泳動法等により分離、同定し、増幅の有無を確認することによって、試料DNAの多型の有無を知ることができる。
【００２４】
(iii) 一本鎖DNA高次構造多型（SSCP）法
DNAをPCRで増幅した後、一本鎖に解離させると、一本鎖DNAは塩基対形成をはじめとする種々の分子内相互作用で塩基配列に依存した固有の高次構造をとる。安定な二重らせん構造をとる二本鎖DNAに比べ、一本鎖DNAの高次構造は、一塩基の違いが存在しても変化することがある。そのため一本鎖DNAをポリアクリルアミド中で電気泳動すると、高次構造の違いに応じて移動度も異なり、この移動度の違いを検出することによって多型の有無を判定することができる。
具体的には、例えば、被検者から得られた染色体DNAを、32Pやビオチンで標識したプライマーを用いてPCRにより増幅する。得られた標識DNA断片を加熱変性して一本鎖DNAとし、これをポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離して、オートラジオグラフィーによりバンドの位置変化を検出する。
【００２５】
(iv) 変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（denaturing gradient gel electrophoresis: DGGE）法
変性剤による変性は二本鎖DNAにミスマッチが存在すると起こりやすくなること、二本鎖DNAが部分的に融解した状態では電気泳動の移動度が著しく低下することを利用して、多型の有無を検出する方法である。
具体的には、尿素、ホルムアミド等の変性剤の濃度に勾配をつけたポリアクリルアミドゲル上で、必要に応じて制限酵素等で処理した被検者のDNAサンプルと、正常DNA断片と、これらに相補的なプローブ核酸との混合物の電気泳動を行ってサンプルを分離する。多型に起因するミスマッチが存在すると、より低い濃度の変性剤で一本鎖に解離するため、変性剤濃度が低いゲル領域で泳動速度が遅くなる。従って、正常DNAサンプルのバンドと比較することによって、ミスマッチの存在の有無を検出することが可能となり、結果として多型の有無を検出することができる。
変性剤の濃度勾配は、垂直につけてもよいし（垂直勾配法）と平行につけてもよい（平行勾配法）。また、DGGEと類似の原理を利用した温度勾配ゲル電気泳動法（temperature gradient gel electrophoresis: TGGE）も開発されている。
【００２６】
(v) マイクロアレイを用いる方法
マイクロアレイ上に固定されたプローブDNAと、DNA又はRNAサンプルとの特異的なハイブリダイゼーションを検出して、多型の有無を解析する方法である。ハイブリダイゼーションの有無を検出する方法や、プローブDNAの3'末端を多型の予想される部位にあわせてハイブリダイゼーションさせ、標識したジデオキシヌクレオチドとDNAポリメラーゼを添加して、伸長反応の有無を検出する方法等がある。標識は、蛍光色素、放射性物質、電気化学的に検出できる化合物等各種選択することができる。
なお、特異的なハイブリダイゼーションとは、通常のハイブリダイゼーション条件で、好ましくは高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下における特異的なハイブリダイゼーションを意味する。本明細書において高ストリンジェントな条件とは、例えば、少なくとも約6×SSC及び1％SDSの65℃溶液中でハイブリダイゼーションを行い、最初の洗浄を42℃の20%(v/v)ホルムアミド（0.1×SSC中）で10分、次の洗浄を65℃の0.2×SSC及び0.1%SDSで行う条件とすることができるが、これに限定されず、当業者は適宜条件を選択することができる。
【００２７】
(vi) Pyrosequencing法
シーケンス反応を化学発光で検出する方法である。被検者由来のDNAをPCRで増幅した後、一本鎖DNAを精製し、適当なプライマーをハイブリダイズさせてからデオキシヌクレオチドを一塩基ずつ添加する。伸長反応に伴って発生するピロリン酸がカスケード反応を開始させ、生じたATPによりルシフェリンを基質としてルシフェラーゼが発光する。この発光を検出することにより被検DNAの塩基配列を決定することができ、高精度に多型を検出できる（Alderborn, A. et al.: Genome Res. (2000) 28:1249-1258）
【００２８】
その他、-184位の多型を検出する方法としては、質量分析計（MALDI TOF-MS等）を用いて、質量の違いにより多型を検出する方法；クエンチャーと蛍光色素によって標識されたアレル特異的オリゴと、Taq DNAポリメラーゼを用いたPCR反応を行ってタイピングするTaqMan PCR法；いわゆるインベーダー法；ローリングサークル法；シーケンサーを使用して試料DNAの配列を解析する方法、denatured HPLC法、Melting Temperature解析、PCR-SSOP(sequence-specific oligonucleotide probe)法、PCR-PHFA(preferential homoduplex formation assay)法、PCR-RSCA(reference strand conformation assay)法等も挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
次に、本発明における冠状動脈疾患リスクの検査方法の第二の態様は、被験者から採取した試料におけるMKL1遺伝子発現の亢進を検出する工程を含む。MKL1遺伝子発現の亢進の検出方法は、特に限定されず、当業者に公知の遺伝子発現解析方法を用いることができる。例えば、転写レベルまたは翻訳レベルで検出することもできるし、プロモーターの機能等を測定して検出することもできるが、これらに限定されない。以下、この方法について具体的に説明する。
【００３０】
（冠状動脈疾患リスクの検査方法：MKL1遺伝子発現の検出による方法）
本発明者らは、冠状動脈の重度の狭窄を伴う患者から得たヒト冠状動脈のアテローム性動脈硬化部位病理標本サンプルにおいて、MKL1遺伝子の発現がタンパク質レベルで有意に亢進していることを見出した。免疫染色によって、MKLタンパク質は泡沫化したマクロファージにおいて強く発現し、αアクチン陽性の平滑筋細胞でもMKL1タンパク質の発現が確認された。また、本発明者らは、レポーター遺伝子を用いたアッセイにより、-184位の多型が転写レベルでMKL1遺伝子の発現に関与していることを突き止め、さらに、-184C>Tの多型を有する場合、ある種の転写抑制因子と考えられる核内因子と-184位付近のMKL1遺伝子とのアフィニティが低下することをゲルシフトアッセイによって確認し、-184C>TによるMKL1遺伝子発現の亢進の機序を明らかにした。
【００３１】
アテローム性動脈硬化は、動脈血管壁を侵食する病原性リポタンパク質に対するマクロファージ及びリンパ球の炎症反応と考えられている（Libby, P. et al., Circulation., 105, 2002, 1135-1143; Glass, C,K. et al., Cell., 104, 2001, 503-516）。MKL1遺伝子は、転写補助因子として知られており、アテローム形成において細胞内へのコレステロール取り込み制御やマクロファージ中のサイトカイン発現において重要な役割を果たしている可能性がある。
【００３２】
以上より、被検者に由来する活性化マクロファージ、ことに泡沫化マクロファージにおいて、MKL1タンパク質の発現が亢進している場合、被検者は、冠状動脈疾患リスクが高いと判断される。
【００３３】
活性化マクロファージは、被検者から採血、手術や内膜バイオプシーによって得られる。活性化ないし泡沫化マクロファージ内における、MKL1遺伝子の発現を測定する方法は特に限定されず、当業者に公知の方法、又はそれに準ずる方法を用いることができ、転写レベル、翻訳レベルのいずれで検出してもよい。
【００３４】
MKL1遺伝子発現の転写レベルでの検出は、当業者に公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができるが、例えば、以下の方法が挙げられる。
【００３５】
(i) ノーザンブロット法
被検者に由来する活性化したマクロファージから、常法に従ってmRNAを取り出し、これをグリオキサール、ホルムアミド、ホルマリン、メチル水銀などを含む溶液中で加熱し、分子内の水素結合をはずして、高次構造を壊して線上にする。その後、ホルマリンを含むアガロースゲルで電気泳動する。ゲルを15〜20×SSCの高塩溶液でナイロンメンブレンやニトロセルロースメンブレンにトランスファーする。ニトロセルロースメンブレンの場合は、80℃で約2時間真空オーブンで処理し、RNAを固定する。ナイロンメンブレンの場合は、たとえば紫外線を照射して架橋によりRNAを固定する。
次に、メンブレン上の特定のmRNAを同定するために、クローン化したcDNAからプローブを作製して標識し、プローブとメンブレンを特定条件下で接触させた後、cDNAプローブが結合したmRNAのみを検出できる。ハイブリダイゼーションの条件は、塩濃度、温度、塩基の長さ、組成等によって、当業者が適宜選択することができる。
標的mRNAが微量の場合は、RT-PCR法を組み合わせることもできる。RNA試料に対して、逆転写酵素とオリゴ(dT)プライマーを用いて逆転写反応を行い、得られたcDNAをPCR法により増幅した後、標識した相補的核酸を使用してcDNAを検出する。
【００３６】
(ii) ドットブロット法
ノーザンブロット法の変法であり、被検者に由来する活性化したマクロファージから取り出したmRNAを水酸化メチル水銀法等で変成させた後、いろいろな濃度でニトロセルロース等のフィルターに点（ドット）としてスポッティングし、放射性標識等で標識したプローブとハイブリダイゼーションさせ、シグナルの強さを検出する。ノーザンブロット法よりも簡便であるが、プローブに相同性を有する別のmRNAや、目的mRNAとは長さの異なるものを検出する可能性がある。
【００３７】
(iii) RNase保護アッセイ
RNaseが標的RNAと完全に一致してハイブリダイズした二本鎖RNAは分解しないが、ミスマッチがあるとそこで切断するという性質を利用する方法である。まず、32P等で標識したmRNAをプローブとして試料RNAとハイブリダイズさせたのち、RNAseによって消化する。反応産物をアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル等で電気泳動し、サイズを測定する。転写産物がプローブRNAと完全に相補的であれば、大きな一つのバンドを示すが、ミスマッチが存在する場合、バンドのサイズが小さくなったり、2本以上のバンドが生じたりするので、目的とするRNAの有無を確認できる。
【００３８】
(iv) in situ ハイブリダイゼーション
被検者から得た活性化したマクロファージを含む組織をタンパク質分解酵素や塩酸などで前処理した後、プローブの非特異的な結合を抑えるためにサケ精子DNAやアルブミンなどでブロッキングする。その後、標識物質でラベルしたプローブRNAと組織標本とを約24時間かけてハイブリダイズさせ、その後組織標本を洗浄して、オートラジオグラフィーや免疫組織化学的方法により標的部位を検出する。また、標的mRNAが微量の場合には、in situ RT-PCR法が用いられる。逆転写酵素とオリゴ(dT)プライマーを用いて逆転写反応を行い、得られたcDNAをPCR法により増幅した後、標識した相補的核酸を使用してcDNAを検出する。
【００３９】
その他、MKL1遺伝子発現の転写レベルでの検出は、DNAマイクロアレイを用いた方法によっても行うことができる。
【００４０】
一方、MKL1遺伝子発現の翻訳レベルでの検出は、当業者に公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができるが、例えば、以下の方法が挙げられる。
【００４１】
(i) ウエスタンブロット法
被検者由来の活性化マクロファージから常法に従ってタンパク質試料を得て、SDSなどを含むバッファーでタンパク質の高次構造を破壊し変成させた後、SDS-PAGEによりタンパク質を分子量に従って分離する。泳動後、ゲルをメンブレン（ニトロセルロース、ナイロン、PVDF等）と重ねて転写装置にセットし、ゲル内に展開したタンパク質のバンドを電気的にメンブレン上に転写（ブロッティング）する。
タンパク質への非特異的吸着を防ぐためのブロッキングを行った後、抗MKL1タンパク質抗体と一次抗体反応させる。続いて、発色酵素等で標識した一次抗体分子を特異的に認識する二次抗体を一次抗体と反応させ、二次抗体の検出を介して、MKL1タンパク質を検出する。
【００４２】
(ii) 免疫染色
組織サンプル中でタンパク質を化学的に固定し、その局在を検出する方法であり、例えば、次の手順で行うことができる。被検者由来の活性化マクロファージを含む組織をPBS等洗浄した後、常法に従って5〜20μm程度の凍結切片を作製し、シランコートしておいたスライドグラス等に貼り付ける。
切片を風乾した後、パラホルムアルデヒド溶液中で10〜30分氷上に置き固定する。PBSで数回洗浄後、過酸化水素溶液中に浸して30分間室温で静置し、再度PBSで数回洗浄後、ブロッキング溶液（例えば1gのBSAを100mlのPBSに懸濁した溶液）を切片に添加する。続いて、一次抗体として抗MKL1タンパク質抗体を加え、室温で30〜60分反応させる。洗浄バッファーで洗浄後、二次抗体を添加し、室温で30分反応させる。二次抗体の検出を介して、MKL1タンパク質を検出する。
【００４３】
（検査薬）
本発明に係る冠状動脈疾患リスクの検査薬は、配列番号：１に記載の塩基配列における８１７位を含む少なくとも10塩基の領域からなる核酸にハイブリダイズする核酸、又は、配列番号：１に記載の塩基配列における８１７位を含む少なくとも10塩基の領域からなる核酸に相補的な領域からなる核酸にハイブリダイズする核酸を含む。
【００４４】
かかる核酸は、上述した-184位の多型の検出による方法や、転写レベルでMKL1遺伝子発現を検出する方法において、目的とするDNA又はRNA配列を検出するためのプローブとして使用することができる。当該核酸は、当業者に公知の方法で合成することが可能であり、合成の際、蛍光色素等で標識されたヌクレオチド誘導体を使用する方法や、合成された核酸を蛍光色素等で標識する方法によって、検出可能に修飾することもできる。プローブとして使用する場合、当該核酸は、好ましくは１０〜１００塩基長、より好ましくは１５〜５０塩基長、さらに好ましくは１５〜３０塩基長である。
【００４５】
本発明に係る冠状動脈疾患リスクの検査薬の第二の態様は、配列番号：１に記載の塩基配列における８１７位を含む少なくとも１０塩基の領域からなる核酸又はこれに相補的な領域からなる核酸を増幅可能なプライマーを含む。当該プライマーは、上述した-184位の多型の検出による方法や、転写レベルでMKL1遺伝子発現を検出する方法に用いられる。-184位を含む領域を増幅できるものである限り特に限定されず、増幅される領域の長さも任意である。当該プライマーは、増幅する領域の塩基配列に基づいて、当業者に公知の方法で適宜設計し合成することができる。当該プライマーは、好ましくは１０〜１００塩基長、より好ましくは１５〜５０塩基長、さらに好ましくは１５〜３０塩基長である。
【００４６】
本発明に係る冠状動脈疾患リスクの検査薬の第三の態様は、MKL1タンパク質に対する抗体を含む。かかる抗体は、例えば上述した翻訳レベルでMKL1遺伝子発現を検出する方法においてMKL1タンパク質を検出する際に用いられる。当該抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、MKL1タンパク質で免疫した動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマに産生させることができる。ポリクローナル抗体は、MKL1タンパク質で免疫した動物の血清等から得ることができる。本発明に係る検査薬に含まれる抗体は、蛍光物質、放射性物質等で標識しておくこともできる。また、当該検査薬は、抗MKL1タンパク質抗体を検出するための二次抗体を含んでいても良い。
【００４７】
上記本発明に係る検査薬は、第一から第三のいずれの態様においても、検査方法に応じて、各種酵素、酵素の基質、緩衝液等を含んでいてもよい。
【００４８】
（冠状動脈疾患リスクの診断方法）
本発明は、MKL1遺伝子発現を亢進させる変異の有無又はMKL1遺伝子発現の亢進の有無を検出する工程を含む冠状動脈疾患リスクの診断方法も包含する。MKL1遺伝子発現を亢進させる変異の有無又はMKL1遺伝子発現の亢進の有無を検出する工程については、本発明に係る検査方法と同様に行うことができるので、ここでは説明を省略する。
【００４９】
（冠状動脈疾患の予防又は治療方法）
本発明者らは、免疫組織染色により、アテローム性動脈硬化の病変部における脂質が蓄積された活性化マクロファージおよび新生内膜中の平滑筋細胞において、MKL1遺伝子の発現が亢進していることを確認した。このことは、MKL1遺伝子が冠状動脈疾患の原因の一つであることを強く示唆するものである。
【００５０】
そこで、本発明に係る冠状動脈疾患の予防又は治療方法は、MKL1遺伝子の発現又はMKL1タンパク質の機能を阻害又は抑制する工程を含む。遺伝子発現の阻害又は抑制は、当業者に公知の方法に従って行うことができるが、例えば、以下の方法が挙げられる。
【００５１】
(i) アンチセンス法
MKL1遺伝子の転写産物に相補的な配列のRNA（アンチセンスRNA）を細胞内に導入して当該転写産物の機能を抑制する方法である。アンチセンスRNAの配列は、標的とするMKL1遺伝子の塩基配列に基づいて設計することができる。ヌクレアーゼ等で分解されにくくするために、公知の方法に従って化学修飾してもよい。
アンチセンスRNAは、アンチセンスRNAをコードするDNAを発現ベクターに挿入して細胞内に導入し細胞内で転写させる方法や、細胞外で合成したアンチセンスRNAを細胞内に導入する方法によって、細胞内に導入される。細胞内で転写により作製する場合は、シグナル配列を付与しておくことによって、細胞質内へ効率よく移行させることができる。また、細胞外で合成したRNA分子を投与する場合、リポソーム等で包埋するリポフェクション法を用いてもよい。リポソーム表面に抗体を付加することにより標的細胞に効率よく移行させることもできる。
【００５２】
(ii) リボザイム法
RNAの所定の位置を加水分解して切断するRNA分子（リボザイム）を利用する方法である。リボザイムは、切断部位を認識するための位置決め配列と、触媒活性を有する触媒配列からなる。位置決め配列を、MKL1遺伝子の転写産物の所定の位置に相補的な配列とすることにより、当該転写産物が切断され、MKL1遺伝子の発現が抑制される。リボザイムの塩基配列は、公知の方法に従って設計される。リボザイムは、アンチセンスRNAと同様に、リボザイムをコードするDNAを発現ベクターに挿入して細胞内に導入し細胞内で転写させる方法や、細胞外で合成したアンチセンスRNAを細胞内に導入する方法によって、細胞内に導入される。
アンチセンスRNAと同様に、化学修飾、シグナル配列の付与を行うことも好ましい。
【００５３】
(iii) RNAi法
二本鎖RNA（double stranded RNA; dsRNA）によって、標的遺伝子の機能を特異的に破壊する方法である。dsRNAは、MKL1遺伝子のcDNAを鋳型にして二本鎖RNAを合成して細胞に導入する方法や、ヘアピン型RNAを発現させ二本鎖RNAを細胞内で発現させる方法によって、細胞内に導入される。dsRNAの塩基配列は、MKL1遺伝子の塩基配列に基づいて設計される。
【００５４】
(iv) アプタマー法
標的物質に結合能を有するRNA又はDNA分子（アプタマー）を用いる方法である。例えば、アプタマーは、MKL1タンパク質に特異的に結合することによって、細胞内でのMKL1タンパク質の生理活性を抑制する。MKL1タンパク質やMKL1タンパク質をコードする核酸を標的とするアプタマーは、例えば、ランダムに合成されたDNAライブラリーから、公知のスクリーニング方法に従って選択することができる。
【００５５】
(v) デコイ法
標的遺伝子の転写因子結合部位の配列を含む短い核酸（デコイ）を用いる方法である。デコイは、転写因子に対するおとりとなって、転写因子が標的遺伝子の転写因子結合部位に結合するのを阻害する。デコイは、MKL1遺伝子の転写因子結合部位の塩基配列に基づいて設計することができる。
【００５６】
(vi) トランス・スプライシング法
正常な塩基配列を有する核酸を付加したリボザイム（トランス・スプライシング・リボザイム）によって、変異mRNAを修復する方法である。例えば、トランス・スプライシング・リボザイムは、MKL1のmRNAにおける-184位を含む領域を切り離すように設計することができ、トランス・スプライシング・リボザイムに-184位がシトシンである核酸を付加しておくことにより、当該核酸をMKL1のmRNAに連結することができる。
【００５７】
(vii) 抗体による方法
MKL1タンパク質を不活性化する抗体を投与して、MKL1タンパク質の機能を阻害してもよい。MKL1タンパク質に対する抗体は、上述の検査薬について説明した方法と同様の方法で作製することができ、スクリーニングを行って、MKL1タンパク質を不活性化するものを選択することができる。
【００５８】
（スクリーニング方法）
本発明に係る冠状動脈疾患の予防又は治療薬のスクリーニング方法は、MKL1遺伝子を発現可能な細胞と、予防又は治療薬候補とを接触させる工程と、MKL1遺伝子の発現を抑制する前記治療剤候補を選択する工程と、を含む。MKL1遺伝子を発現可能な細胞は、当業者が公知の方法に従って作製することができるが、例えば、プロモーター領域に-184C>Tの多型を有するMKL1遺伝子を含むベクターで各種の宿主細胞を形質転換して得ることができる。宿主細胞及びベクターは、当業者が適宜選択して使用することが可能である。
【００５９】
こうして得られたMKL1遺伝子を発現する細胞に、冠状動脈疾患の予防又は治療薬候補を投与し、発現が抑制されるかどうか検出する。予防又は治療薬候補は特に限定されないが、例えば低分子化合物、タンパク質、核酸を含む医薬が挙げられる。核酸としては、例えば、上述したアンチセンスRNA、リボザイム、dsRNA、アプタマー、デコイ等、タンパク質としては抗体が挙げられる。RNAやタンパク質は、そのまま投与することもできるし、細胞内で転写、翻訳される形態で投与してもよい。
【００６０】
MKL1遺伝子の発現は、上述の方法を用いて行うことができる。
【００６１】
（MKL1タンパク質をコードするDNA等）
本発明はまた、配列番号：１に記載の塩基配列において８１７位に対応する塩基がＴである塩基配列からなる、MKL1タンパク質をコードするDNAも包含する。かかるDNAは、プロモーター領域に-184C>Tという新規な一塩基多型を含む、MKL1タンパク質をコードする新規な遺伝子配列である。当該DNAは、上述のとおり、公知のMKL1タンパク質遺伝子に比較して、発現を抑制する核内因子とのアフィニティが低く、その結果、MKL1タンパク質を高発現させる。
【００６２】
さらに、本発明は、かかるDNAを含む組換えベクター及び該組換えベクターを含む形質転換体も包含する。当該組み換えベクター及び形質転換体は、当業者であれば最適なベクター及び宿主を選択して公知の方法に従って作製することができるものであり、MKL1タンパク質を高発現させるという顕著な効果を奏するものである。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。【００６４】
〔対象〕
合計で冠状動脈疾患患者1,738人とコントロール3,354人の2つの群を対象として研究を行った。
1つめの群（日本人群A）は、629人の症例と1,232人のコントロールである。症例は北里大学病院とその関連病院で集められ、コントロールは、ランダムに選択された健常者（n=632）、及び財団法人ヒューマンサイエンス振興財団から得た健常ドナー由来のEBウイルスで形質転換されたヒトB細胞株（n=600）からなる。ここから任意に選択された392の症例サンプルと、392のコントロールサンプルを用いてゲノムワイドにマイクロサテライトマーカーを用いた冠状動脈疾患関連遺伝子座位のスクリーニングを実施した。
もう1つの群（日本人群B）は、岐阜県立総合医療センター、岐阜県立多治見病院、弘前大学病院、黎明郷リハビリテーション病院、及び弘前脳卒中センターに様々な症状で外来を訪れた人、又は健康診断のために来た3,231人（うち心筋梗塞患者1,109人、コントロール2,122人）である。表１に各サンプルの性質を示す。【００６５】
【表１】
2010073544.tif 000002
【００６６】
表１において数値は平均値±標準偏差及び百分率で示されている。喫煙者は、現在または過去において1日10本以上喫煙する者；HTは高血圧を意味し、最高血圧140mmHg以上、最低血圧90mmHg以上、又は降圧剤を服用している者；HCは高脂血症を意味し、血清総コレステロールが5.72mmol/l (220mg/dl)、又は脂質低下薬を服用している者；DMは糖尿病を示し、空腹時血糖が6.93mmol/l (126mg/dl)、グリコシル化ヘモグロビンが6.5％以上、又は糖尿病治療薬を服用している者、である。【００６７】
冠状動脈のアテローム性動脈硬化は、深刻な狭窄（血管造影による内腔狭窄が50％を超える）を有する冠状動脈の数に従って、0、1、2又は3 vessel disease (VD)と分類した。【００６８】
コントロールは、冠状動脈性心臓病、末梢動脈閉塞性疾患又はその他のアテローム性動脈硬化症；虚血性若しくは出血性脳卒中又はその他の脳疾患；血栓性、塞栓性又は出血性障害の病歴がない人とした。各疾患の診断は通常の診断基準に従って行った。各参加者にはインフォームドコンセントがなされ、本研究は各医療機関の倫理委員会に承認された。【００６９】
〔ゲノムワイドスクリーニング〕
日本人群Aについて、冠状動脈疾患の候補ローカスを同定するために合計18,880のマイクロサテライト（MS）マーカーを使って3段階のゲノムワイドスクリーニングを実施した。【００７０】
タミヤらの方法（Tamiya, G. et al. Hum Mol Genet., 2005, 2305-2321）に従って、第一〜第三のDNAサンプルプールのセットをストックした。具体的には、第一のセットは3VDの心筋梗塞症例100例、コントロール100例、第二のセットは2VDの心筋梗塞症例100例、コントロール100例、第三のセットは、発症年齢が50歳未満の心筋梗塞症例192例（うち3VDが2例、2VDが46例、1VDが144例）、コントロール192例とした。DNAサンプルのストックの調製のため、コリンズらの方法（Collins, H.E. et al., Hum Genet. 106, 2000, 218-226）に従い、二本鎖DNA定量キット（Molecular Probes社製Pico Green）を使用して、ゲノムDNA濃度をトリプリケートで測定し、各ゲノムDNAを8ng/μlに調整した。【００７１】
第一のスクリーニングでは、第一の症例／コントロールのDNAサンプルプールのセットを使用したケースコントロールスタディにより、冠状動脈疾患に関連するMSマーカーを同定した。第二のスクリーニングでは、第一のスクリーニングで冠状動脈疾患に対して有意な関連性（2 by 2 analysis及び／又は2 by multiple analysisでp<0.05）を示したMSマーカーについて第二の症例／コントロールのDNAサンプルプールのセットを使って分析した。すなわち、各DNAサンプルプール中のアレル頻度は、ピークの高さで判断し、各アレル頻度は、それぞれのアレルのピークの高さをすべてのアレルのピークの高さの合計で除して求めた。2つのDNAサンプル間のアレル頻度の差異は、2×2及び2×m（mはアレルの数）分割表を使用してカイ二乗検定で評価した。6つのMSマーカーは、フィッシャーの正確確率検定により評価した。すべての実験において、P値が0.05以下の場合、有意と判断した。【００７２】
第一及び第二のスクリーニングの双方において統計学的に有意な結果を生じたMSマーカーについて、第一及び第二のDNAサンプルセットを構成する個々のサンプルについてタイピング（個別タイピング）を行い、疾患との関連性を検証した。冠状動脈疾患への有意な関連性が確認されたMSマーカーは、これらのMSマーカーが冠状動脈疾患に関連するとの仮説をテストするために、第三の症例とコントロールのDNAサンプルセットを用いて個別タイピングを行うことで第三のスクリーニングに供した。このように、複数DNAサンプルセットを使用して複数ステップのスクリーニングを行うことにより、疾患との関連について偽陽性が生じる可能性を低下できる。【００７３】
上述したゲノムワイドスクリーニングの概略を図１に、結果を図２に示す。
第一のスクリーニングでは、1,818のMSマーカーが冠状動脈疾患と有意な関連を示し、このうち190のMSマーカーが第二のスクリーニング後も残った。これらのMSマーカーについて、第一及び第二のセットから任意に抽出した症例96例、コントロール96例について個別タイピングを行ったところ、42のMSマーカーが有意な関連を示した。さらに、第一及び第二のセットから任意に抽出した別の症例96例、コントロール96例を使用したスクリーニングでも同様の結果が得られた。【００７４】
42のMSマーカーについて、第三のセットを用いた関連解析を行った結果、冠状動脈疾患に関連するMSマーカーとして6つが同定された。6つのマーカーを表２に示す。【００７５】
【表２】
2010073544.tif 000003
【００７６】
これらの6つのMSマーカー周辺領域の連鎖不均衡（linkage disequilibrium; LD）構造を、HapMap JPT+CHBデータに基づいて解析した。22q13染色体領域のLDの評価のために、HaploviewソフトウエアでD’及びr2を計算した。その結果、CAD3、CAD4及びCAD5は既知の遺伝子を含まないLDブロック内に位置し、CAD1、CAD2及びCAD6はそれぞれ既知の遺伝子MKL1、PCSK9及びK125001を含むLDブロック内に存在することがわかった。さらにPCSK9遺伝子のジェノタイピングを行い、CAD2-MSは高コレステロール血症に特異的な関連性を示すことが判明した。結果を表３に示す。【００７７】
【表３】
2010073544.tif 000004
【００７８】
表３中、A01アレルは（Leu）9を示し、A01/A01のジェノタイプ頻度は、最初のスクリーニング（OR=1.49、p=0.045）及び#2で（OR=1.66、p=0.02）、コントロール（n=278）において72.6％、症例（n=283）において79.9％であった。【００７９】
一方、MKL1遺伝子内に位置するCAD1-MSは、染色体22q13上に存在する（図３）。HapMapデータ（Phase II, release 21）から予測される組換えホットスポットは、MKL1の10kb上流と3’非翻訳領域であり、MKL1遺伝子のみがCAD1関連LDブロックに含まれていることがわかった。CAD1-MSについて、さらに症例とコントロールのジェノタイピングを行った。ジェノタイプ分布とSNPのアレル頻度は、カイ二乗検定で比較し、関連の強さはオッズ比（OR）で表した。結果を表４に示す。（ATAC）9アレル（表１のA05アレル）の頻度は、症例（n=374）で0.132、コントロール（n=339）で0.090であり、疾患感受性に有意な関連を示した（OR=1.54、P=0.012）。一方、（ATAC）13アレル（表１のA09アレル）の頻度は、症例で0.118、コントロールで0.173であり、CADに対する防御との関連が示唆された（OR=0.64、P=0.0040）。【００８０】
【表４】
2010073544.tif 000005
【００８１】
〔MKL1におけるSNP解析〕
さらに、冠状動脈疾患に関連するローカスについて、SNP解析を行った。特定のSNPと疾患との関連は、異なる群（日本人群B）を使用したレプリケーションスタディによって、さらに検証を行った。【００８２】
エクソン及び隣接するイントロン、並びにMKL1遺伝子上流のプロモーター領域（約1kb）における配列の変異を同定するために、32人の日本人DNAサンプル（CAD1-MS1アレルA05のホモ接合体6例、ヘテロ接合体6例；CAD1-MS1アレルA09のホモ接合体6例、ヘテロ接合体6例；及びCAD1-MS1アレルA05及びA09を有しない8例）を、自動DNAシーケンサー（Applied Biosystems社製ABI PRISM 3100 DNA sequencer）を用いたPCRダイレクトシーケンス法により分析した。【００８３】
その結果、表５に示すとおり、7個の新規SNPを含む12個のSNPsが同定された。2つのプロモーターSNP（-184C>T及び-173T/C(rs4140512)）及び2つのコーディングSNP（1848G>A及び1942A>G(rs878756)）は、マイナーアレル頻度が5％を超えていたので、日本人群Aの症例432例、コントロール432例で関連解析を行った。さらに、HapMapデータベースから選択されたMKL1遺伝子の7つのタグSNPについてもケースコントロール分析を行った。その結果、-184C>Tが冠状動脈疾患と有意に関連を示した。（アレル頻度が症例で0.104、コントロールで0.080。OR=1.44、p=0.033）  【００８４】
【表５】
2010073544.tif 000006
【００８５】
CAD1-MSとSNP解析の結果は、-184C>TがCAD1-MSのA05アレル（D’=0.88、r2=0.75）と強い連鎖不平衡（linkage disequilibrium, LD）であることを示し、CAD1ローカスの冠状動脈疾患への関連は-184C>Tによるものであることを示唆する。これらの知見をさらに補強するために、日本人群Aのすべての使用可能なサンプル（症例629例、コントロール1,232例。表１参照）についてジェノタイピングを行ったところ、データは有意な関連を示した（OR=1.30、95％信頼区間=1.04-1.64、P=0.024。表２参照）。【００８６】
〔異なる群での関連解析〕
関連分析のレプリケートスタディのために、日本人群B（症例1,109例、コントロール2,122例。表１）において、-184C>Tを解析した。表６に示されるとおり、日本人群Bにおいて-184C>Tと冠状動脈疾患との関連がレプリケートされた（OR=1.25、95%信頼区間=1.04-1.49、P=0.015）。【００８７】
【表６】
2010073544.tif 000007
【００８８】
日本人群A及びBのデータについてメタアナリシス（Mantel-Haenszel検定を使用）を行った結果、リスクアレル-184Tについて、冠状動脈疾患との関連は有意（P=9.5×10-4）であり、OR=1.27（95％信頼区間=1.10-1.46）であった。遺伝形式を解明するために、-184C>Tについてジェノタイプ特異的ORを分析した結果を表７に示す。CC、CT及びTTのORは、それぞれ0.79、1.24及び1.77であった。この結果は、リスクの遺伝が相加的モデルに従うことを示唆した。【００８９】
【表７】
2010073544.tif 000008
【００９０】
リスクアレルと冠状動脈疾患の臨床的背景との相関性を調べるため、-184C>Tとアテローム性動脈硬化の重篤度との関連を分析したところ、いずれの群においても-184C>Tと3VDとの間に強い関連が見られた（表６参照）。データを分析した結果、-184Tアレルは3VD群において特にリスクを高くすることがわかった（OR=1.44、P=4.2×10-4）（表２参照）。-184C>Tと、高血圧、高脂血症及び糖尿病を含む古典的な冠状動脈疾患リスクファクターとの層別解析によれば、特定の古典的リスクファクターへの関連傾向は見られなかった。表８に結果を示す。【００９１】
【表８】
2010073544.tif 000009
【００９２】
〔発現解析（レポーターアッセイ）〕
-184C>TがMKL1遺伝子のプロモーター領域と見られるローカスに位置したため、この多型が転写レベルに与える影響をレポーターアッセイで測定した。【００９３】
レポーターアッセイは、-184C>Tアレルを含むルシフェラーゼレポーター構築物を使って行われた。転写開始部位のデータベースからに基づいてMKL1遺伝子のプロモーター領域の249bpのフラグメントを決定し、以下のプライマーペアを用いてPCRで増幅した。
5’-CCACGCGTTCCTCAGAGATGAGGTCAT-3’（配列番号：１４）
5’-TGCTCGAGCCGGCTCCTCTCAGCCACGG-3’（配列番号：１５）【００９４】
ゲノムDNAを-184C>Tのホモ接合体の個人から得て、テンプレートとして用いた。PCR産物は、MluI及びXhoI制限酵素で消化し、pGL3-ベーシックベクター（Promega社製）のホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入した。ウシ胎児血清（FBS）10％、ペニシリン／ストレプトマイシン1％を添加したRPMI培地-1840又はDulbeccoの修正イーグル培地で、37℃、5％CO2の条件で、K562又はHeLa細胞を培養した。各構築物は、エレクトロポレーション法でK562細胞（各2μg）に、又はリポフェクション法でHeLa細胞（各1μg）に、内部コントロールとして0.05μgのpRL-tk（Promega社製）と共に導入した。【００９５】
細胞は、トランスフェクションの24時間後に回収し、シバタらの方法（Shibata, H. et al. Hum Immunol, 67, 2006, 363-373）に従って細胞溶解物を調製した。各細胞溶解物のルシフェラーゼ活性はDUAL Luciferase Reporter Assay System（Promega社製）を使用して決定し、ホタルルシフェラーゼレベルは、pRL-tkからのレニラルシフェラーゼレベルに対して標準化した。データは、4つの独立した実験（各quadruplicate）で採取した。【００９６】
図４に示すとおり、K562細胞（図４Ａ）及びHeLa細胞（図４Ｂ）のいずれにおいても、感受性アレルTに駆動されたルシフェラーゼ活性は、抵抗性対立遺伝子アレルCの転写活性よりも1.2倍高いことが確認された。【００９７】
〔発現解析（B細胞株におけるMKL1転写物の発現）〕
定常状態でのMKL1遺伝子の発現を、EBウイルスで形質転換したヒトB細胞株の-184Cのホモ接合体又は-184Tのホモ接合体におけるmRNAレベルで検出した。第10回国際組織適合性ワークショップBリンパ芽球様細胞株（http://www.ihwg.org/cellbank/cell_lines/blcl.html）にリストされたヒトB細胞株、又は財団法人ヒューマンサイエンス振興財団から入手したヒトB細胞株のプロモーターの-184位の多型をジェノタイピングし、-184C/C又は184T/Tの遺伝子型を有する5つのB細胞株を選択した。【００９８】
選択された細胞株は、10％FBS及び1％ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMI培地-1840で、5％CO2で培養し、成長段階で回収し、RNeasy mini kit（Qiagen社製）を用いて細胞約107個からトータルRNAを得た。トータルRNA（5μg）はSuperscript II逆転写酵素（Invitrogen社製）によりcDNA合成に供された。iCycler iQ Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad社製）及びSYBR Premix Ex Taq（Takara社製）を使用して定量的リアルタイムPCRを行い、mRNAの相対量を測定した。MKL1遺伝子の転写物の相対量は、GAPDHの相対量で除して標準化した。使用したプライマーペアは以下のとおりである。
MKL1用
5’-TAGCCGATGACCTCAATGAG-3’（配列番号：１６）
5’-ATCGAAGGAAGAGCTGTCTG-3’（配列番号：１７）
GAPDH用
5’-CTTCACCACCATGGAGAAGGC-3’（配列番号：１８）
5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’（配列番号：１９）【００９９】
実験は3回繰り返し、各実験においてサンプルはトリプリケートとした。
図４Ｃに示すとおり、Tアレルのホモ接合体を有するB細胞株は、Cアレルのホモ接合体に比較してMKL1遺伝子発現が約1.8倍（1.5倍から2.1倍）高かった。このことは、-184TアレルがMKL1遺伝子の発現亢進に関与することをさらに支持する。【０１００】
〔ゲルシフトアッセイ（Electrophoretic mobility shift assay; EMSA）〕
-184C>Tの変異がMKL1遺伝子の発現レベルに関与することがわかったので、MKL1遺伝子のプロモーター領域にある-184C>T付近に結合する核内因子をEMSAにより探索した。核抽出物は、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株K562から調製した。【０１０１】
プロモーター領域の多型-184C>Tの各アレルに特異的な21塩基長のジゴキシゲニン（DIG）標識二本鎖オリゴヌクレオチドを使用して、DIG Gel Shift Kit 2nd Generation（Roche Diagnostics社製）により、EMSAを行った。二本鎖プローブの塩基配列は以下のとおりである。
-184Cアレル用
5’-CACAGGAAGTCAGGCCGCCGT -3’（配列番号：２０）
5’- ACGGCGGCCTGACTTCCTGTG -3’（配列番号：２１）
-184Tアレル用
5’-CACAGGAAGTTAGGCCGCCGT -3’（配列番号：２２）
5’- ACGGCGGCCTAACTTCCTGTG -3’（配列番号：２３）【０１０２】
Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents（Thermo Fisher Scientific社（Rockford）製）を使用し、K562細胞から核抽出物を調製した。DIG標識プローブとK562核抽出物とを4℃で30分インキュベートした後、0.5×TBEランニングバッファーと共に、6％非変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動によって分離した。【０１０３】
DNA-タンパク質複合体は、プラスにチャージされたナイロンメンブレン上にエレクトロブロッティングされ、DIG Gel Shift Kit 2nd generationのマニュアルに従って可視化された。K562核抽出物は、競合アッセイに使用するために、様々な濃度の標識されていない競合物質と予めインキュベートした。【０１０４】
その結果、図５Ａに示されるとおり、DNA-タンパク質複合体は、-184Tより-184Cの場合に高いアフィニティを示した。また、このDNA-タンパク質相互作用は、-184Tプローブを含む場合より、-184Cプローブを含む場合に、非標識DNAによる競合の効率が高かった（図５Ｂ）。【０１０５】
TFSEARCH（http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCHJ.html）を使用して-184C>Tに特異的に結合する転写因子を探索したところ、-184C>T周辺の塩基配列は、Ets-1、Nrf2、Elk-1、P300及びMybの結合領域に類似することがわかった。しかしながら、これらの核内因子に対する抗体を加えても、EMSAバンドのスーパーシフト（電気泳動性の大きな遅延）は見られなかった。【０１０６】
〔免疫組織化学染色〕
冠状動脈の狭窄が深刻な患者の病理解剖でアテローム性動脈硬化の病変部を採取し、免疫組織化学染色を行った。【０１０７】
パラフィンに包埋した3μmの組織切片をキシレンで脱パラフィンし、エタノールから脱イオン水で水和した。組織切片は、DakoCytomation Protein Block（DAKO社製）で5分間ブロッキングし、1:100希釈で抗ヒトMKL1ポリクローナル抗体（Santa Cruz社製； sc-32909）と共に2時間、室温でインキュベートした。洗浄用バッファーとリン酸バッファー溶液で洗浄後、3％過酸化水素水溶液で5分間インキュベートして、内在性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。切片を洗浄用バッファーとリン酸バッファー溶液で洗浄後、二次抗体（DAKO ChemMate Envision/HRP）とインキュベートし、続いてDAB色原体とインキュベートし、Mayerのヘマトキシリンとの対比染色を行った。細胞型特異的抗体を用いた隣接する組織の免疫組織化学分析は、抗ヒトCD68モノクローナル抗体（DAKO社製）及び抗ヒト平滑筋αアクチンモノクローナル抗体（DAKO社製）を使用して実施した。【０１０８】
図６Ａに示されるとおり、MKL1タンパクはアテローム斑の脂質コアで発現している。隣接する領域を抗CD68抗体で染色したところ、MKL1-陽性細胞は、泡沫化したマクロファージであることがわかった（図６Ｂ参照）。また、MKL1タンパクは、新生内膜中の平滑筋αアクチン陽性細胞でも発現していた（図６Ｃ）。
【配列表フリーテキスト】
【０１０９】
配列番号：１は、上流配列1000Bp及び下流配列500bpを含むMKL1ゲノム遺伝子の塩基配列である。
配列番号：２は、MSマーカーCAD1-MSを増幅するフォワードプライマーである。
配列番号：３は、MSマーカーCAD1-MSを増幅するリバースプライマーである。
配列番号：４は、MSマーカーCAD2-MSを増幅するフォワードプライマーである。
配列番号：５は、MSマーカーCAD2-MSを増幅するリバースプライマーである。
配列番号：６は、MSマーカーCAD3-MSを増幅するフォワードプライマーである。
配列番号：７は、MSマーカーCAD3-MSを増幅するリバースプライマーである。
配列番号：８は、MSマーカーCAD4-MSを増幅するフォワードプライマーである。
配列番号：９は、MSマーカーCAD4-MSを増幅するリバースプライマーである。
配列番号：１０は、MSマーカーCAD5-MSを増幅するフォワードプライマーである。
配列番号：１１は、MSマーカーCAD5-MSを増幅するリバースプライマーである。
配列番号：１２は、MSマーカーCAD6-MSを増幅するフォワードプライマーである。
配列番号：１３は、MSマーカーCAD6-MSを増幅するリバースプライマーである。
配列番号：１４は、MKL1遺伝子のプロモーター領域のフラグメントを増幅するフォワードプライマーである。
配列番号：１５は、MKL1遺伝子のプロモーター領域のフラグメントを増幅するリバースプライマーである。
配列番号：１６は、B細胞株におけるMKL1転写物に対する定量的リアルタイムPCRに用いたフォワードプライマーである。
配列番号：１７は、B細胞株におけるMKL1転写物に対する定量的リアルタイムPCRに用いたリバースプライマーである。
配列番号：１８は、B細胞株におけるGAPDH転写物に対する定量的リアルタイムPCRに用いたフォワードプライマーである。
配列番号：１９は、B細胞株におけるGADPH転写物に対する定量的リアルタイムPCRに用いたリバースプライマーである。
配列番号：２０は、EMSAに用いた-184Cアレル用フォワードプライマーである。
配列番号：２１は、EMSAに用いた-184Cアレル用リバースプライマーである。
配列番号：２２は、EMSAに用いた-184Tアレル用フォワードプライマーである。
配列番号：２３は、EMSAに用いた-184Tアレル用リバースプライマーである。
【図１】
2010073544.tif 000010
【図４】
2010073544.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図５】
2010073544.tif 000014
【図６】
2010073544.tif 000015
【配列表】
2010073544000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年10月5日(2010.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者の冠状動脈疾患リスクの検査方法であって、被検者から採取した試料におけるＭＫＬ１遺伝子発現を亢進させる変異又はＭＫＬ１遺伝子発現の亢進を検出する工程を含む方法。
【請求項２】
前記ＭＫＬ１遺伝子発現を亢進させる変異を検出する工程は、
ＭＫＬ１遺伝子における配列番号：１に記載の塩基配列の８１７位に対応する部位の多型を検出する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記８１７位に対応する塩基がチミン（Ｔ）である多型を検出したときに、前記被検者の冠動脈疾患リスクが通常より高いと判断する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＫＬ１遺伝子発現の亢進を検出する工程は、被検者から採取した活性化マクロファージ内におけるＭＫＬ１遺伝子発現の亢進を検出する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＭＫＬ１遺伝子の発現が亢進しているときに、前記被検者の冠動脈疾患リスクが通常より高いと判断する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
冠状動脈疾患リスクの検査薬であって、以下の（１）から（３）の少なくとも１つを含む、検査薬。
（１）配列番号：１に記載の塩基配列における８１７位を含む少なくとも１０塩基の領域からなる核酸又はこれに相補的な領域からなる核酸にハイブリダイズする核酸
（２）配列番号：１に記載の塩基配列における８１７位を含む少なくとも１０塩基の領域からなる核酸又はこれに相補的な領域からなる核酸を増幅可能なプライマー
（３）ＭＫＬ１タンパク質に対する抗体
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
配列番号：１に記載の塩基配列において８１７位に対応する塩基がＴ（チミン）である塩基配列からなる、ＭＫＬ１タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
請求項１３に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
ーディングＳＮＰ（１８４８Ｇ＞Ａ及び１９４２Ａ＞Ｇ（ｒｓ８７８７５６））は、マイナーアレル頻度が５％を超えていたので、日本人群Ａの症例４３２例、コントロール４３２例で関連解析を行った。さらに、ＨａｐＭａｐデータベースから選択されたＭＫＬ１遺伝子の７つのタグＳＮＰについてもケースコントロール分析を行った。その結果、−１８４Ｃ＞Ｔが冠状動脈疾患と有意に関連を示した。（アレル頻度が症例で０．１０４、コントロールで０．０８０。ＯＲ＝１．４４、ｐ＝０．０３３）
［００８４］
［表５］
2010073544.tif 000016
［００８５］
ＣＡＤ１−ＭＳとＳＮＰ解析の結果は、−１８４Ｃ＞ＴがＣＡＤ１−ＭＳのＡ０５アレル（Ｄ’＝０．８８、ｒ２＝０．７５）と強い連鎖不平衡（ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ，ＬＤ）であることを示し、ＣＡＤ１ローカスの冠状動脈疾患への関連は−１８４Ｃ＞Ｔによるものであることを示唆する。これらの知見をさらに補強するために、日本人群Ａのすべての使用可能なサンプル（症例６２９例、コントロール１，２３２例。表１参照）についてジェノタイピングを行ったところ、データは有意な関連を示した（ＯＲ＝１．３０、９５％信頼区間＝１．０４−１．６４、Ｐ＝０．０２４。表６参照）。
［００８６］
〔異なる群での関連解析〕
関連分析のレプリケートスタディのために、日本人群Ｂ（症例１，１０９例、コントロール２，１２２例。表１）において、−１８４Ｃ＞Ｔを解析した。表６に示されるとおり、日本人群Ｂにおいて−１８４Ｃ＞Ｔと冠状動脈疾患との関連がレプリケート
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
わかった（ＯＲ＝１．４４、Ｐ＝４．２×１０−４）（表６参照）。−１８４Ｃ＞Ｔと、高血圧、高脂血症及び糖尿病を含む古典的な冠状動脈疾患リスクファクターとの層別解析によれば、特定の古典的リスクファクターへの関連傾向は見られなかった。表８に結果を示す。
［００９１］
［表８］
2010073544.tif 000017
［００９２］
〔発現解析（レポーターアッセイ）〕
−１８４Ｃ＞ＴがＭＫＬ１遺伝子のプロモーター領域と見られるローカスに位置したため、この多型が転写レベルに与える影響をレポーターアッセイで測定した。
［００９３］
レポーターアッセイは、−１８４Ｃ＞Ｔアレルを含むルシフェラーゼレポーター構築物を使って行われた。転写開始部位のデータベースからに基づいてＭＫＬ１遺伝子のプロモーター領域の２４９ｂｐのフラグメントを決定し、以下のプライマーペアを用いてＰＣＲで増幅した。
2010073544.tif 000018
［００９４］
ゲノムＤＮＡを−１８４Ｃ＞Ｔのホモ接合体の個人から得て、テンプレートとして用いた。ＰＣＲ産物は、ＭｌｕＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で消化し、ｐＧＬ３−ベーシックベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）１０％、ペニシリン／ストレプトマイシン１％を添加したＲＰＭＩ培地−１８４０又はＤｕｌｂｅｃｃｏの修正イーグル培地で、３７℃、５％ＣＯ２の条件で、Ｋ５６２又はＨｅＬａ細胞を培養した。各構築物は、エレクトロポレーション法でＫ５６２細胞（各２μｇ）に、又はリポフェクション法でＨｅＬａ細胞（各１μｇ）に、内部コントロールとして０．０５μｇのｐＲＬ−ｔｋ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）と共に導入した。
［００９５］
細胞は、トランスフェクションの２４時間後に回収し、シバタらの方法（Ｓｈｉ
【国際調査報告】
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2010073544.tif 000022
2010073544.tif 000023
2010073544.tif 000024
2010073544.tif 000025
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