(57)【要約】  ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター及びＦｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターを含む、体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター及びＦｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターを含む、体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
【請求項２】
Ｇａｔａファミリー遺伝子の発現ベクターを更に含む、請求項１に記載の体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
【請求項３】
前記Ｇａｔａファミリー遺伝子がＧａｔａ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ６（Ｇａｔａ６）遺伝子である、請求項２に記載の体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
【請求項４】
前記ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子がＮＫ２  Ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １（Ｎｋｘ２−１）遺伝子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
【請求項５】
前記Ｆｏｘファミリー遺伝子がＦｏｒｋｈｅａｄ  Ｂｏｘ  Ａ１（Ｆｏｘａ１）遺伝子又はＦｏｒｋｈｅａｄ  Ｂｏｘ  Ａ２（Ｆｏｘａ２）遺伝子である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
【請求項６】
体細胞にＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を強制発現させることと、
強制発現後の前記体細胞を培養することと、
を備える、肺胞上皮細胞の製造方法。
【請求項７】
前記ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を強制発現させることにおいて、Ｇａｔａファミリー遺伝子を更に強制発現させる、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記培養する工程を３次元培養により行う、請求項６又は７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記培養する工程を、デキサメタゾン及びＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）ファミリータンパク質の存在下で行う、請求項６〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか一項に記載の製造方法により製造された肺胞上皮細胞。
【請求項１１】
請求項１０の肺胞上皮細胞を有効成分として含有する細胞医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬及びその使用に関する。より具体的には、体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬、肺胞上皮細胞の製造方法、肺胞上皮細胞及び細胞医薬に関する。本願は、２０１７年４月２０日に、日本に出願された特願２０１７−０８３８１４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、特発性肺線維症は、有効な治療方法が知られていない難病の１つである。特発性肺線維症の患者の肺では、肺胞が線維化し、酸素や二酸化炭素が通過する間質が、厚く、硬くなり、ガス交換がうまくできなくなる。特発性肺線維症の治療方法として、肺胞上皮細胞の再生又は移植が期待されている。【０００３】
従来、肺細胞の再生医療には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の幹細胞を利用する検討が行われてきた。例えば、非特許文献１には、ＥＳ細胞を肺胞上皮細胞に分化させる方法が記載されている。また、非特許文献２には、ｉＰＳ細胞を肺胞上皮細胞に分化させる方法が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Roszell B. et al., Efficient derivation of alveolar type II cells from embryonic stem cells for in vivo application., Tissue Eng. Part A. 15 (11), 3351-3365, 2009.
【非特許文献２】Gotoh S. et al., Generation of Alveolar Epithelial Spheroids via Isolated Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells., Stem Cell Reports, 3 (3), 394-403, 2014.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、幹細胞から肺胞上皮細胞を得る方法では、発生過程を辿るように数段階の過程を経て幹細胞を分化させる必要がある。このため、肺胞上皮細胞の調製に時間や手間がかかり、臨床応用することが困難な場合がある。また、無限増殖能を持つ幹細胞を使用するため、肺胞上皮細胞を患者に移植した後に奇形腫等の腫瘍が形成される可能性がある。そこで、本発明は、幹細胞を使用せず、より簡便に肺胞上皮細胞を製造する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の態様を含む。
［１］ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター及びＦｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターを含む、体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
［２］ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター、Ｆｏｘファミリー遺伝子の発現ベクター及びＧａｔａファミリー遺伝子の発現ベクターを含む、［１］に記載の体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
［３］前記Ｇａｔａファミリー遺伝子がＧａｔａ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ６（Ｇａｔａ６）遺伝子である、［２］に記載の体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
［４］前記ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子がＮＫ２  Ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １（Ｎｋｘ２−１）遺伝子である、［１］〜［３］のいずれかに記載の体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
［５］前記Ｆｏｘファミリー遺伝子がＦｏｒｋｈｅａｄ  Ｂｏｘ  Ａ１（Ｆｏｘａ１）遺伝子又はＦｏｒｋｈｅａｄ  Ｂｏｘ  Ａ２（Ｆｏｘａ２）遺伝子である、［１］〜［４］のいずれかに記載の体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬。
［６］体細胞にＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を強制発現させる工程と、強制発現後の前記体細胞を培養する工程と、を備える、肺胞上皮細胞の製造方法。
［７］ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を強制発現させる前記工程において、Ｇａｔａファミリー遺伝子を更に強制発現させる、［６］に記載の製造方法。
［８］前記培養する工程を３次元培養により行う、［６］又は［７］に記載の製造方法。
［９］前記培養する工程を、デキサメタゾン及びＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）ファミリータンパク質の存在下で行う、［６］〜［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］［６］〜［９］のいずれかに記載の製造方法により製造された肺胞上皮細胞。
［１１］［１０］の肺胞上皮細胞を有効成分として含有する細胞医薬。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、幹細胞を使用せず、より簡便に肺胞上皮細胞を製造する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】（ａ）は、実験例１において、遺伝子を導入した線維芽細胞のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ（Ｓｆｔｐｃ）遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１において、遺伝子を導入した線維芽細胞のＳｅｃｒｅｔｏｇｌｏｂｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  １Ａ  Ｍｅｍｂｅｒ  １（Ｓｃｇｂ１ａ１）遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図２】実験例２において、各遺伝子の組み合わせを導入した線維芽細胞のＳｆｔｐｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図３】（ａ）は、実験例３において、遺伝子を導入した線維芽細胞のＳｆｔｐｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例３において、遺伝子を導入した線維芽細胞のＳｃｇｂ１ａ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図４】（ａ）は、実験例４において、遺伝子を導入した線維芽細胞のＳｆｔｐｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例４において、遺伝子を導入した線維芽細胞のＳｃｇｂ１ａ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図５】（ａ）〜（ｃ）は、実験例６における、遺伝子導入から２６日後の細胞の顕微鏡写真である。（ａ）は明視野観察画像であり、（ｂ）はＧＦＰの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真であり、（ｃ）は（ａ）及び（ｂ）の画像をマージした画像である。
【図６】（ａ）は、実験例６において、ＧＦＰ蛍光陽性の細胞を観察した代表的な電子顕微鏡写真である。（ｂ）は、（ａ）の四角で囲んだ領域を拡大した写真である。
【図７】（ａ）は、実験例７において、Ｎｋｘ２−１遺伝子、Ｆｏｘａ１遺伝子及びＧａｔａ６遺伝子の合計３種類の遺伝子の組み合わせを線維芽細胞に導入し、遺伝子導入から１２日後に顕微鏡観察し、明視野観察画像及びＧＦＰの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真をマージした画像である。（ｂ）は、実験例７において、蛍光免疫染色によりＳＦＴＰＣタンパク質を染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ｃ）は、実験例７において、蛍光免疫染色によりＡｑｕａｐｏｒｉｎ  ５（Ａｑｐ５）タンパク質を染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図８】（ａ）は、実験例８における、マウスの体重の推移を示すグラフである。（ｂ）は、実験例８における、マウスの生存率の推移を示すグラフである。
【図９】（ａ）及び（ｂ）は、実験例８における、マウスの肺の組織切片のヘマトキシリン・エオジン染色の光学顕微鏡写真である。
【図１０】（ａ）及び（ｂ）は、実験例８における、マウスの肺の組織切片の蛍光免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１１】実験例９において、ヒトＮＫＸ２−１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ２遺伝子、ヒトＧＡＴＡ６遺伝子を様々な組み合わせで導入したヒト成人皮膚由来線維芽細胞株（ＨＤＦａ細胞）におけるＳＦＴＰＣ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬］
１実施形態において、本発明は、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター及びＦｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターを含む、体細胞から肺胞上皮細胞への分化用試薬を提供する。本実施形態の分化用試薬は、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター及びＦｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターを含む組成物であるということもできる。あるいは、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター及びＦｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターを含むキットであるということもできる。
【００１０】
実施例において後述するように、発明者らは、線維芽細胞にＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を強制発現させることにより、幹細胞を使用することなく、線維芽細胞を直接肺胞上皮細胞に分化誘導することができることを明らかにした。したがって、本実施形態の分化用試薬によれば、幹細胞を使用せず、より簡便に肺胞上皮細胞を製造することができる。
【００１１】
本実施形態の分化用試薬において、体細胞としては、例えば、線維芽細胞、血球由来の細胞等が挙げられる。
【００１２】
本実施形態の分化用試薬は、体細胞中でＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を発現させることができる限りどのような形態であってもよい。例えば、１つの発現ベクターが、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を発現可能に含んでいてもよい。この場合、当該ベクターは、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクターでもあり、Ｆｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターでもあるということができる。あるいは、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクターと、Ｆｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターをそれぞれ別個のベクターとして含んでいてもよい。
【００１３】
本実施形態の分化用試薬において、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子としては、体細胞の種の遺伝子を使用するとよい。例えば、体細胞がヒトの細胞である場合にはヒトの遺伝子を使用すればよく、体細胞がマウスの細胞である場合にはマウスの遺伝子を使用すればよい。
【００１４】
ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子としては、例えば、Ｎｋｘ２−１遺伝子、Ｎｋｘ２−２遺伝子、Ｎｋｘ２−５遺伝子、Ｎｋｘ６−１遺伝子等が挙げられる。中でも、Ｎｋｘ２−１遺伝子が好ましい。マウスＮｋｘ２−１遺伝子のＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）は２１８６９であり、ＭＧＩ  ＩＤ（http://www.informatics.jax.org/）は１０８０６７である。また、ヒトＮＫＸ２−１遺伝子のＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）は７０８０である。ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子は１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００１５】
また、Ｆｏｘファミリー遺伝子としては、例えばＦｏｘａ１遺伝子、Ｆｏｘａ２遺伝子、Ｆｏｘａ３遺伝子、Ｆｏｘｂ１遺伝子、Ｆｏｘｂ２遺伝子、Ｆｏｘｃ１遺伝子、Ｆｏｘｃ２遺伝子、Ｆｏｘｄ１遺伝子、Ｆｏｘｄ２遺伝子、Ｆｏｘｄ３遺伝子、Ｆｏｘｄ４遺伝子、Ｆｏｘｄ５遺伝子、Ｆｏｘｄ６遺伝子、Ｆｏｘｄ７遺伝子、Ｆｏｘｄ８遺伝子、Ｆｏｘｅ１遺伝子、Ｆｏｘｅ２遺伝子、Ｆｏｘｅ３遺伝子、Ｆｏｘｆ１遺伝子、Ｆｏｘｆ２遺伝子、Ｆｏｘｇ１遺伝子、Ｆｏｘｈ１遺伝子、Ｆｏｘｉ１遺伝子、Ｆｏｘｊ１遺伝子、Ｆｏｘｊ２遺伝子、Ｆｏｘｊ３遺伝子、Ｆｏｘｋ１遺伝子、Ｆｏｘｍ１遺伝子、Ｆｏｘｎ１遺伝子、Ｆｏｘｎ２遺伝子、Ｆｏｘｎ３遺伝子、Ｆｏｘｎ４遺伝子、Ｆｏｘｎ５遺伝子、Ｆｏｘｎ６遺伝子、Ｆｏｘｏ１遺伝子、Ｆｏｘｏ３ａ遺伝子、Ｆｏｘｏ４遺伝子、Ｆｏｘｐ１遺伝子、Ｆｏｘｐ２遺伝子、Ｆｏｘｐ３遺伝子、Ｆｏｘｑ１遺伝子等が挙げられる。中でも、Ｆｏｘａ１遺伝子、Ｆｏｘａ２遺伝子が好ましい。マウスＦｏｘａ１遺伝子のＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤは１５３７５であり、ＭＧＩ  ＩＤは１３４７４７２である。また、ヒトＦＯＸＡ１遺伝子のＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤは３１６９である。また、マウスＦｏｘａ２遺伝子のＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤは１５３７６であり、ＭＧＩ  ＩＤは１３４７４７６である。また、ヒトＦＯＸＡ２遺伝子のＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤは３１７０である。Ｆｏｘファミリー遺伝子は１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００１６】
本実施形態の分化用試薬は、Ｇａｔａファミリー遺伝子の発現ベクターを更に含んでいてもよい。すなわち、本実施形態の分化用試薬は、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター、Ｆｏｘファミリー遺伝子の発現ベクター及びＧａｔａファミリー遺伝子の発現ベクターを含んでいてもよい。
【００１７】
実施例において後述するように、分化用試薬がＧａｔａファミリー遺伝子の発現ベクターを含むと、線維芽細胞を肺胞上皮細胞に分化誘導する効率が更に上昇する傾向にある。
【００１８】
本実施形態の分化用試薬において、１つの発現ベクターが、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子、Ｆｏｘファミリー遺伝子及びＧａｔａファミリー遺伝子を発現可能に含んでいてもよい。この場合、当該ベクターは、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクターでもあり、Ｆｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターでもあり、Ｇａｔａファミリー遺伝子の発現ベクターでもあるということができる。
【００１９】
あるいは、本実施形態の分化用試薬は、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子、Ｆｏｘファミリー遺伝子及びＧａｔａファミリー遺伝子の３種類の遺伝子のうちの任意の２種類の遺伝子を発現可能に含む１つの発現ベクターと、残りの１種類の遺伝子の発現ベクターとを含んでいてもよい。
【００２０】
あるいは、本実施形態の分化用試薬は、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクターと、Ｆｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターと、Ｇａｔａファミリー遺伝子の発現ベクターを、それぞれ別個のベクターとして含んでいてもよい。
【００２１】
本実施形態の分化用試薬において、Ｇａｔａファミリー遺伝子としては、体細胞の種の遺伝子を使用するとよい。例えば、体細胞がヒトの細胞である場合にはヒトの遺伝子を使用すればよく、体細胞がマウスの細胞である場合にはマウスの遺伝子を使用すればよい。
【００２２】
Ｇａｔａファミリー遺伝子としては、例えば、Ｇａｔａ６遺伝子、Ｇａｔａ１遺伝子、Ｇａｔａ４遺伝子等が挙げられる。中でも、Ｇａｔａ６遺伝子が好ましい。マウスＧａｔａ６遺伝子のＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤは１４４６５であり、ＭＧＩ  ＩＤは１０７５１６である。また、ヒトＧＡＴＡ６遺伝子のＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤは２６２７である。Ｇａｔａファミリー遺伝子は１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００２３】
本実施形態の分化用試薬において、発現ベクターはウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターは遺伝子の導入効率が高く使いやすい。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター等が挙げられる。
【００２４】
［肺胞上皮細胞の製造方法］
１実施形態において、本発明は、体細胞にＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を強制発現させる工程と、強制発現後の前記体細胞を培養する工程と、を備える、肺胞上皮細胞の製造方法を提供する。
【００２５】
実施例において後述するように、発明者らは、線維芽細胞にＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を強制発現させることにより、幹細胞を使用することなく、線維芽細胞を直接肺胞上皮細胞に分化誘導することができることを明らかにした。したがって、本実施形態の製造方法によれば、幹細胞を使用せず、より簡便に肺胞上皮細胞を製造することができる。
【００２６】
本実施形態の方法において、体細胞としては上述したものと同様である。また、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を強制発現させる方法は、特に制限されない。例えば、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現ベクター及びＦｏｘファミリー遺伝子の発現ベクターを体細胞に導入する方法であってもよい。あるいは、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子の発現を誘導する化合物等、及びＦｏｘファミリー遺伝子の発現を誘導する化合物等を体細胞の培地に添加する方法であってもよい。
【００２７】
ここで、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子、Ｆｏｘファミリー遺伝子、発現ベクターについては上述したものと同様である。
【００２８】
また、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子を強制発現させる前記工程において、Ｇａｔａファミリー遺伝子を更に強制発現させてもよい。実施例において後述するように、体細胞中で、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子、Ｆｏｘファミリー遺伝子に加えてＧａｔａファミリー遺伝子を強制発現させると、体細胞を肺胞上皮細胞に分化誘導する効率が更に上昇する傾向にある。
【００２９】
Ｇａｔａファミリー遺伝子を強制発現させる方法は特に制限されず、例えば、Ｇａｔａファミリー遺伝子の発現ベクターを体細胞に導入する方法であってもよいし、Ｇａｔａファミリー遺伝子の発現を誘導する化合物等を体細胞の培地に添加する方法であってもよい。ここで、Ｇａｔａファミリー遺伝子、発現ベクターについては上述したものと同様である。
【００３０】
本実施形態の製造方法において、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子及びＦｏｘファミリー遺伝子、並びに任意選択でＧａｔａファミリー遺伝子を強制発現後の体細胞を培養する工程を、３次元培養により行うことが好ましい。３次元培養の方法としては特に限定されず、例えば、マトリゲルを用いる方法、コラーゲンを用いる方法、ラミニンを用いる方法等が挙げられる。
【００３１】
実施例において後述するように、遺伝子導入後の体細胞を培養する工程を３次元培養により行うことにより、体細胞を肺胞上皮細胞に分化誘導する効率が更に上昇する傾向にある。
【００３２】
また、遺伝子導入後の体細胞を培養する工程を、デキサメタゾン及びＦＧＦファミリータンパク質の存在下で行うことが好ましい。実施例において後述するように、遺伝子導入後の体細胞を培養する工程をデキサメタゾン及びＦＧＦファミリータンパク質の存在下で行うことにより、体細胞を肺胞上皮細胞に分化誘導する効率が更に上昇する傾向にある。
【００３３】
ＦＧＦファミリータンパク質としては、例えば、ＦＧＦ７、ＦＧＦ２、ＦＧＦ１０等が挙げられる。中でも、ＦＧＦ７が好ましい。マウスＦＧＦ７タンパク質のＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＳｅｑｕｅｎｃｅはＮＰ＿０３２０３４であり、ヒトＦＧＦ７タンパク質のＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＳｅｑｕｅｎｃｅはＮＰ＿００２０００である。また、マウスＦＧＦ２タンパク質のＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＳｅｑｕｅｎｃｅはＮＰ＿０３２０３２．１であり、ヒトＦＧＦ２タンパク質のＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＳｅｑｕｅｎｃｅはＮＰ＿００１９９７である。また、マウスＦＧＦ１０タンパク質のＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＳｅｑｕｅｎｃｅはＮＰ＿０３２０２８．１であり、ヒトＦＧＦ１０タンパク質のＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＳｅｑｕｅｎｃｅはＮＰ＿００４４５６．１である。
【００３４】
遺伝子導入後の体細胞を培養する工程において、培地は、デキサメタゾン及びＦＧＦファミリータンパク質の他にも、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ等のプロテインキナーゼＡ活性化剤；ＩＢＭＸ等のｃＡＭＰホスホジエステラーゼ又はｃＧＭＰホスホジエステラーゼの阻害剤；ＣＨＩＲ−９９０２１等のＧｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３（ＧＳＫ３）の阻害剤等を含有していてもよい。
【００３５】
［肺胞上皮細胞］
１実施形態において、本発明は、上述した製造方法により製造した肺胞上皮細胞を提供する。本実施形態の肺胞上皮細胞は、例えば、特発性間質性肺炎、インフルエンザや細菌による肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等の肺胞上皮細胞の移植が有効な疾患の治療等に用いることができる。
【００３６】
なお、本実施形態の肺胞上皮細胞は、通常の発生によって分化したものではなく、体細胞に特定遺伝子を強制発現させることにより製造されたものである。このため、通常の肺胞上皮細胞と比較すると遺伝子の発現プロファイル等が異なっていることが予測される。しかしながら、本実施形態の肺胞上皮細胞と通常の肺胞上皮細胞とを識別可能な遺伝子の発現プロファイルの相違点を特定することは困難である。
【００３７】
［細胞医薬］
１実施形態において、本発明は、上述した製造方法により製造された肺胞上皮細胞を有効成分として含有する細胞医薬を提供する。本実施形態の細胞医薬は、例えば、特発性間質性肺炎、インフルエンザや細菌による肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等の肺胞上皮細胞の移植が有効な疾患の治療等に用いることができる。本実施形態の細胞医薬において、肺胞上皮細胞は、患者自身の体細胞から製造されたものであってもよいし、主要組織適合遺伝子複合体が適合する第３者の体細胞から製造されたものであってもよい。
【００３８】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、上述した製造方法により製造された肺胞上皮細胞の有効量を、治療を必要とする患者に移植することを含む肺疾患の治療方法を提供する。肺疾患としては、例えば、特発性間質性肺炎、インフルエンザや細菌による肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等が挙げられる。
【００３９】
１実施形態において、本発明は、肺疾患の治療のための、上述した製造方法により製造された肺胞上皮細胞の使用を提供する。肺疾患としては、例えば、特発性間質性肺炎、インフルエンザや細菌による肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等が挙げられる。
【００４０】
１実施形態において、本発明は、肺疾患の治療薬を製造するための、上述した製造方法により製造された肺胞上皮細胞の使用を提供する。肺疾患としては、例えば、特発性間質性肺炎、インフルエンザや細菌による肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等が挙げられる。
【実施例】
【００４１】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。【００４２】
［実験例１］
（体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子の検討１）
体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子を検討した。体細胞として、マウス胎仔由来の線維芽細胞を使用した。まず、マウス線維芽細胞に、レトロウイルス発現ベクターを用いて、下記表１に示す１４種類のマウス遺伝子を同時に導入して過剰発現させた。表１には、各遺伝子のＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ及びＭＧＩ  ＩＤも記載した。【００４３】
【表１】
2018194124.tif 000003
【００４４】
続いて、遺伝子導入から７日後に、肺胞上皮細胞のマーカーであるＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ（Ｓｆｔｐｃ）遺伝子及びＳｅｃｒｅｔｏｇｌｏｂｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  １Ａ  Ｍｅｍｂｅｒ  １（Ｓｃｇｂ１ａ１）遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。また、対照として、表１に示す遺伝子の代わりに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のレトロウイルス発現ベクターを導入した線維芽細胞を用いた。なお、マウスＳｆｔｐｃ遺伝子のＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤは２０３８９であり、ＭＧＩ  ＩＤは１０９５１７である。また、マウスＳｃｇｂ１ａ１遺伝子のＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤは２２２８７であり、ＭＧＩ  ＩＤは９８９１９である。【００４５】
図１（ａ）はＳｆｔｐｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。また、図１（ｂ）はＳｃｇｂ１ａ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。図１（ａ）及び（ｂ）中、「ＧＦＰ」は対照細胞の結果を示し、「１４Ｆａｃｔｏｒｓ」は表１に示す１４種類の遺伝子を導入した結果を示す。【００４６】
その結果、表１に示す１４種類の遺伝子を導入した線維芽細胞では、対照と比較して、Ｓｆｔｐｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量が２０００倍以上に増加し、Ｓｃｇｂ１ａ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量が３００倍以上に増加したことが明らかとなった。【００４７】
［実験例２］
（体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子の検討２）
体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子のより詳細な検討を行った。具体的には、まず、表１に示す１４種類の遺伝子から１種類ずつ遺伝子を除いた１３種類の遺伝子をマウス線維維芽細胞に導入した以外は実験例１と同様にして、肺胞上皮細胞のマーカーであるＳｆｔｐｃ遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。また、対照として、表１に示す遺伝子の代わりにＧＦＰのレトロウイルス発現ベクターを導入した線維芽細胞を用いた。【００４８】
図２は、各遺伝子の組み合わせを導入した線維芽細胞におけるＳｆｔｐｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。図２中、「ＧＦＰ」は対照細胞の結果を示し、「１４Ｆａｃｔｏｒｓ」は表１に示す１４種類の遺伝子を全て導入した結果を示す。また、「１４Ｆ−＃１」は表１に示す１４種類の遺伝子から、表１の番号１の遺伝子を除いた１３種類の遺伝子を導入した結果を示し、以下同様である。また、「ＮＯ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔ」は遺伝子を導入しなかった線維芽細胞の結果を示す。【００４９】
その結果、表１に示す番号１の因子（Ｎｋｘ２−１遺伝子）の発現ベクターを除くと、Ｓｆｔｐｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量が低下することが明らかとなった。この結果は、線維芽細胞から肺胞上皮細胞への分化誘導にＮｋｘ２−１遺伝子の発現が必須であることを示す。【００５０】
［実験例３］
（体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子の検討３）
実験例２の結果から、体細胞から肺胞上皮細胞への分化にＮｋｘ２−１遺伝子の発現が必須であることが明らかとなった。そこで、Ｎｋｘ２−１遺伝子と、表１に示すＮｋｘ２−１遺伝子以外の１３種類の遺伝子から選択した１種類の遺伝子との組み合わせをマウス線維芽細胞に導入し、肺胞上皮細胞のマーカーであるＳｆｔｐｃ遺伝子及びＳｃｇｂ１ａ１遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。また、対照として、表１に示す遺伝子の代わりにＧＦＰのレトロウイルス発現ベクターを導入した線維芽細胞を用いた。【００５１】
図３（ａ）はＳｆｔｐｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。また、図３（ｂ）はＳｃｇｂ１ａ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。図３（ａ）及び（ｂ）中、「ＧＦＰ」は対照細胞の結果を示し、「＃１＋＃２」は表１の番号１の遺伝子及び番号２の遺伝子を組み合わせて導入した結果を示し、以下同様である。また、「ＮＯ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔ」は遺伝子を導入しなかった線維芽細胞の結果を示す。【００５２】
その結果、Ｎｋｘ２−１遺伝子と組み合わせて、番号２の因子（Ｆｏｘａ１遺伝子）、番号８の因子（Ｇａｔａ６遺伝子）等を導入した線維芽細胞では、Ｓｆｔｐｃ遺伝子及びＳｃｇｂ１ａ１遺伝子の発現量が増加することが明らかとなった。この結果は、線維芽細胞から肺胞上皮細胞への分化誘導にこれらの遺伝子の組み合わせの発現が重要であることを示す。【００５３】
［実験例４］
（体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子の検討４）
実験例２、３の結果に基づいて、体細胞から肺胞上皮細胞への分化に必要な因子の検討を更に行った。具体的には、表１に示す番号１の因子（Ｎｋｘ２−１遺伝子）、番号２の因子（Ｆｏｘａ１遺伝子）、番号３の因子（Ｆｏｘａ３遺伝子）及び番号８の因子（Ｇａｔａ６遺伝子）を様々な組み合わせでマウス線維芽細胞に導入し、肺胞上皮細胞のマーカーであるＳｆｔｐｃ遺伝子及びＳｃｇｂ１ａ１遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。また、対照として、表１に示す遺伝子の代わりにＧＦＰのレトロウイルス発現ベクターを導入した線維芽細胞を用いた。【００５４】
図４（ａ）はＳｆｔｐｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。また、図４（ｂ）はＳＣＧＢ１Ａ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。図４（ａ）及び（ｂ）中、「ＧＦＰ」は対照細胞の結果を示し、「＃１」は表１の番号１の遺伝子を導入した結果を示し、「＃１＋＃２＋＃３」は表１の番号１、２及び３の遺伝子を組み合わせて導入した結果を示し、以下同様である。また、「ＮＯ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔ」は遺伝子を導入しなかった線維芽細胞の結果を示す。【００５５】
その結果、これらの遺伝子を組み合わせて導入した線維芽細胞では、Ｓｆｔｐｃ遺伝子及びＳｃｇｂ１ａ１遺伝子の発現量が増加することが明らかとなった。この結果は、線維芽細胞から肺胞上皮細胞への分化誘導にこれらの遺伝子の組み合わせの発現が重要であることを示す。【００５６】
［実験例５］
（体細胞から肺胞上皮細胞への分化条件の検討１）
ＳＰＣ−ＧＦＰマウスは、ＳＰＣ（Ｓｆｔｐｃ）遺伝子のプロモーターの下流にＧＦＰ遺伝子が連結されたコンストラクトが導入されたトランスジェニックマウスである。ＳＰＣ−ＧＦＰマウスでは、Ｓｆｔｐｃ遺伝子を発現する細胞でＧＦＰの蛍光が観察される。そこで、体細胞として、ＳＰＣ−ＧＦＰマウスの胎仔由来の線維芽細胞を使用して肺胞上皮細胞への分化条件の検討を行った。【００５７】
まず、ＳＰＣ−ＧＦＰマウスの線維芽細胞に、表１に示す番号１の因子（Ｎｋｘ２−１遺伝子）、番号２の因子（Ｆｏｘａ１遺伝子）、番号３の因子（Ｆｏｘａ２遺伝子）及び番号８の因子（Ｇａｔａ６遺伝子）を様々な組み合わせで導入して２日間２次元培養し、ＧＦＰの蛍光を観察した。【００５８】
因子の組み合わせとしては、番号１、番号２、番号３及び番号８の因子の組み合わせ、番号１、番号２及び番号８の因子の組み合わせ、番号１、番号３及び番号８の因子の組み合わせを検討した。【００５９】
その結果、ＧＦＰの蛍光は明確には検出されなかった。一方、Ｓｆｔｐｃ遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した結果、Ｓｆｔｐｃ遺伝子のｍＲＮＡの発現量が増加したことが確認された。【００６０】
［実験例６］
（体細胞から肺胞上皮細胞への分化条件の検討２）
ＳＰＣ−ＧＦＰマウスの線維芽細胞に、表１に示す番号１の因子（Ｎｋｘ２−１遺伝子）、番号２の因子（Ｆｏｘａ１遺伝子）、番号３の因子（Ｆｏｘａ３遺伝子）及び番号８の因子（Ｇａｔａ６遺伝子）の合計４種類の遺伝子を導入して１〜２日間２次元培養した。【００６１】
その後、マトリゲルを用いた３次元培養を行った。３次元培養の培地には、各種液性因子を添加した。表２に、使用した液性因子及び終濃度を示す。【００６２】
【表２】
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【００６３】
その結果、遺伝子導入から１４日後にＧＦＰ蛍光陽性の細胞が認められるようになった。また、遺伝子導入から２８日後には、５〜７％の細胞がＧＦＰ蛍光陽性となった。【００６４】
図５（ａ）〜（ｃ）は、遺伝子導入から２６日後の細胞の顕微鏡写真である。図５（ａ）は明視野観察画像であり、図５（ｂ）はＧＦＰの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真であり、図５（ｃ）は図５（ａ）及び図５（ｂ）の画像をマージした画像である。【００６５】
続いて、得られたＧＦＰ蛍光陽性の細胞をセルソーターで回収し、電子顕微鏡で観察した。図６（ａ）及び（ｂ）は代表的な電子顕微鏡写真である。図６（ｂ）は図６（ａ）の四角で囲んだ領域を拡大した写真である。その結果、ＧＦＰ蛍光陽性の細胞にはラメラ体と呼ばれる構造体が存在することが明らかとなった。図６（ｂ）中、矢印はラメラ体を示す。ラメラ体は、ＩＩ型肺胞上皮細胞に特徴的な構造体であることが知られている。この結果から、体細胞から誘導した細胞が、形態的にも肺胞上皮細胞であることが明らかとなった。【００６６】
同様の実験を繰り返し行った結果、体細胞からＧＦＰ蛍光陽性の細胞を得るためには、液性因子の中でも、特にデキサメタゾン及びＦＧＦファミリータンパク質（ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０）の存在が重要であると考えられた。更に、ＦＧＦファミリータンパク質の中でも、特にＦＧＦ７の存在が重要であると考えられた。【００６７】
以上の結果から、遺伝子導入後の体細胞を３次元培養することや、デキサメタゾン及びＦＧＦファミリータンパク質の存在下で培養すること等により、体細胞から肺胞上皮細胞への分化誘導効率を顕著に上昇させることができることが明らかとなった。【００６８】
［実験例７］
（体細胞から肺胞上皮細胞への分化条件の検討３）
ＳＰＣ−ＧＦＰマウスの線維芽細胞に、表１に示す番号１の因子（Ｎｋｘ２−１遺伝子）、番号２の因子（Ｆｏｘａ１遺伝子）及び番号８の因子（Ｇａｔａ６遺伝子）の合計３種類の遺伝子、又は番号１の因子（Ｎｋｘ２−１遺伝子）、番号３の因子（Ｆｏｘａ２遺伝子）及び番号８の因子（Ｇａｔａ６遺伝子）の合計３種類の遺伝子をそれぞれ導入し、実験例６と同様に３次元培養した。【００６９】
図７（ａ）は、表１に示す番号１の因子（Ｎｋｘ２−１遺伝子）、番号２の因子（Ｆｏｘａ１遺伝子）及び番号８の因子（Ｇａｔａ６遺伝子）の合計３種類の遺伝子の組み合わせを線維芽細胞に導入し、遺伝子導入から１２日後に顕微鏡観察し、明視野観察画像及びＧＦＰの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真をマージした画像である。【００７０】
その結果、遺伝子導入から１２日後にＧＦＰ蛍光陽性の細胞がクラスターを形成したことが確認された。クラスターの形成は、増殖能を有する肺胞上皮細胞が得られたことを示す。【００７１】
また、表１に示す番号１の因子（Ｎｋｘ２−１遺伝子）、番号３の因子（Ｆｏｘａ２遺伝子）及び番号８の因子（Ｇａｔａ６遺伝子）の合計３種類の遺伝子の組み合わせを導入した線維芽細胞においても、遺伝子導入から１２日後にＧＦＰ蛍光陽性の細胞がクラスターを形成したことが確認された。【００７２】
以上の結果から、３種類の遺伝子の組み合わせの導入によっても、肺胞上皮細胞が得られることが明らかとなった。【００７３】
続いて、表１に示す番号１の因子（Ｎｋｘ２−１遺伝子）、番号２の因子（Ｆｏｘａ１遺伝子）及び番号８の因子（Ｇａｔａ６遺伝子）の合計３種類の遺伝子の組み合わせを線維芽細胞に導入して得られたＧＦＰ蛍光陽性の細胞を蛍光免疫染色し、ＳＰ−Ｃ（Ｓｆｔｐｃ）タンパク質及びＡｑｕａｐｏｒｉｎ  ５（ＡＱＰ５、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＳｅｑｕｅｎｃｅはＮＰ＿０３３８３１．１である。）タンパク質の発現を検討した。また、細胞の核を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。【００７４】
図７（ｂ）は、蛍光免疫染色によりＳＰ−Ｃタンパク質を染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、ＧＦＰ蛍光陽性の細胞が、ＳＰ−Ｃタンパク質を発現していることが確認された。ＳＰ−Ｃは主にＩＩ型肺胞上皮細胞に発現するため一般的にはＩＩ型肺胞上皮細胞マーカーとされる。【００７５】
また、図７（ｃ）は、蛍光免疫染色によりＡＱＰ５タンパク質を染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、ＧＦＰ蛍光陽性の細胞が、ＡＱＰ５タンパク質を発現していることが確認された。ＡＱＰ５は主としてＩ型肺胞上皮細胞に発現するため一般的にはＩ型肺胞上皮細胞のマーカーとされる。【００７６】
以上の結果から、体細胞から誘導した細胞が、Ｉ型肺胞上皮細胞及びＩＩ型肺胞上皮細胞の双方を含むことが示された。【００７７】
［実験例８］
（分化誘導した肺胞上皮細胞のインフルエンザマウスへの移植）
マウス馴化インフルエンザウイルス（Ａ／Ｈ１Ｎ１、ＰＲ８）を、２００ｐ．ｆ．ｕ．／マウスの投与量で点鼻感染させた。また、対照として、インフルエンザウイルスの代わりにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与したマウスを用意した。【００７８】
続いて、１時間後に、胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞を１×１０６個ずつ経気管支投与した。また、比較のために、分化誘導を行っていない胚性線維芽細胞を１×１０６個ずつ経気管支投与したマウス、及び、ＰＢＳを投与したマウスも用意した。【００７９】
《体重及び生存率の検討》
続いて、各群のマウスの体重及び生存率の推移を観察した。図８（ａ）は、各群のマウスの体重の推移を示すグラフであり、図８（ｂ）は、各群のマウスの生存率の推移を示すグラフである。図８（ａ）及び（ｂ）中、「Ｆｌｕ＋ｉＰＵＬ」は、マウスにインフルエンザウイルスを感染させ、胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞（ｉＰＵＬ）を投与した群の結果であることを示し、「Ｆｌｕ＋ＭＥＦ」は、マウスにインフルエンザウイルスを感染させ、分化誘導を行っていない胚性線維芽細胞を投与した群の結果であることを示し、「Ｆｌｕ＋ＰＢＳ」は、マウスにインフルエンザウイルスを感染させ、ＰＢＳを投与した群の結果であることを示し、「ＰＢＳ＋ｉＰＵＬ」は、マウスにＰＢＳを投与し、続いて胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞を投与した群の結果であることを示し、「ＰＢＳ＋ＭＥＦ」は、マウスにＰＢＳを投与し、続いて分化誘導を行っていない胚性線維芽細胞を投与した群の結果であることを示す。【００８０】
その結果、インフルエンザウイルスを感染させたマウスに、胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞を投与した群、分化誘導を行っていない胚性線維芽細胞を投与した群、ＰＢＳを投与した群の間で、インフルエンザウイルスの感染による体重減少には有意差は認められなかった。一方、インフルエンザウイルスを感染させたマウスに胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞を投与すると、インフルエンザウイルスの感染による死亡を有意に抑制したことが明らかとなった。「Ｆｌｕ＋ＭＥＦ」群の生存率に対する「Ｆｌｕ＋ｉＰＵＬ」群の生存率には、Ｐ＝０．００８で有意差が認められた。【００８１】
《肺組織切片の組織化学的解析》
マウスにインフルエンザウイルスを感染させ、胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞を投与した群（Ｆｌｕ＋ｉＰＵＬ群）、及び、マウスにインフルエンザウイルスを感染させ、分化誘導を行っていない胚性線維芽細胞を投与した群（Ｆｌｕ＋ＭＥＦ群）の各群のマウスについて、インフルエンザウイルスの感染から５日目にそれぞれ肺を摘出した。続いて、摘出した肺を４％パラホルムアルデヒドにて固定し、パラフィン包埋組織切片を作製した。続いて、各群の組織切片を、エタノール及び純水にて脱パラフィン処理を行い、ヘマトキシリン・エオジン染色し、光学顕微鏡で観察した。【００８２】
図９（ａ）は、Ｆｌｕ＋ｉＰＵＬ群の肺の組織切片の顕微鏡写真である。また、図９（ｂ）は、Ｆｌｕ＋ＭＥＦ群の肺の組織切片の顕微鏡写真である。その結果、Ｆｌｕ＋ｉＰＵＬ群では、インフルエンザウイルスの感染による肺損傷が抑制されたことが明らかとなった。一方、Ｆｌｕ＋ＭＥＦ群では、インフルエンザウイルスの感染による肺損傷を抑制することができなかったことが明らかとなった。【００８３】
《肺組織切片の蛍光免疫染色》
続いて、Ｆｌｕ＋ｉＰＵＬ群の肺の組織切片を免疫染色し、ＧＦＰタンパク質及びＳＰ−Ｃタンパク質の発現を検討した。【００８４】
図１０（ａ）及び（ｂ）は、免疫染色の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。
（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ視野及び倍率が異なっている。図１０（ａ）及び（ｂ）中、ＧＦＰタンパク質及びＳＰ−Ｃタンパク質の二重陽性細胞を矢印で示す。【００８５】
その結果、ＧＦＰタンパク質及びＳＰ−Ｃタンパク質の二重陽性細胞の存在が確認された。この結果から、Ｆｌｕ＋ｉＰＵＬ群の肺に、胚性線維芽細胞から分化誘導した肺胞上皮細胞が生着していることが確認された。【００８６】
［実験例９］
（ヒト線維芽細胞から肺胞上皮細胞への分化誘導）
ヒト成人皮膚由来線維芽細胞（細胞名「ＨＤＦａ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に、ヒトＮＫＸ２−１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ２遺伝子、ヒトＧＡＴＡ６遺伝子を組み合わせて導入し、マウスと同様に肺胞上皮細胞に分化誘導できるか否かを検討した。【００８７】
遺伝子の組み合わせとしては、ヒトＮＫＸ２−１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ１遺伝子及びヒトＧＡＴＡ６遺伝子の３遺伝子の組み合わせ、ヒトＮＫＸ２−１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ２遺伝子及びヒトＧＡＴＡ６遺伝子の３遺伝子の組み合わせ、ヒトＮＫＸ２−１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ２遺伝子及びヒトＧＡＴＡ６遺伝子の４遺伝子の組み合わせを検討した。【００８８】
各遺伝子の導入には、レトロウイルスシステム（型式「ｐＭＸ」、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を使用した。また、パッケージング細胞にはＰｌａｔ−ＧＰ細胞（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を使用した。【００８９】
各遺伝子を導入したＨＤＦａ細胞は、遺伝子導入から２日目にマトリゲルを用いた３次元培養を開始した。続いて、遺伝子の導入から１１日目及び１７日目に、各細胞におけるＳＦＴＰＣ遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。【００９０】
図１１は、定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。図１１中、ＳＦＴＰＣ遺伝子の発現量は、遺伝子を導入していないＨＤＦａ細胞におけるＳＦＴＰＣ遺伝子の発現量を１とした相対値で示す。【００９１】
その結果、ヒトＮＫＸ２−１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ１遺伝子及びヒトＧＡＴＡ６遺伝子の３遺伝子の組み合わせを導入したＨＤＦａ細胞では、遺伝子導入から１７日目に、ＳＦＴＰＣ遺伝子の発現量が、遺伝子を導入していないＨＤＦａ細胞の約６３０倍に達したことが明らかとなった。【００９２】
また、ヒトＮＫＸ２−１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ２遺伝子及びヒトＧＡＴＡ６遺伝子の３遺伝子の組み合わせを導入したＨＤＦａ細胞では、遺伝子導入から１７日目に、ＳＦＴＰＣ遺伝子の発現量が、遺伝子を導入していないＨＤＦａ細胞の約２９０倍に達したことが明らかとなった。【００９３】
また、ヒトＮＫＸ２−１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ１遺伝子、ヒトＦＯＸＡ２遺伝子及びヒトＧＡＴＡ６遺伝子の４遺伝子の組み合わせを導入したＨＤＦａ細胞では、遺伝子導入から１７日目に、ＳＦＴＰＣ遺伝子の発現量が、遺伝子を導入していないＨＤＦａ細胞の約５２０倍に達したことが明らかとなった。【００９４】
以上の結果から、ヒトにおいても、マウスと同様に、ＮＫ２ホメオボックスファミリー遺伝子、Ｆｏｘファミリー遺伝子、Ｇａｔａファミリー遺伝子の組み合わせを体細胞に発現させることにより、体細胞から肺胞上皮細胞への分化誘導を行うことができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明によれば、幹細胞を使用せず、より簡便に肺胞上皮細胞を製造する技術を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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