(57)【要約】【課題】  がん細胞等で高発現しているペプチダーゼ活性をより長波長の赤色蛍光の応答として検出することができ、組織透過性に優れた新規蛍光プローブを提供することを課題とする。【解決手段】  以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩：【化１】2018151260.tif 000020〔式中、Ａは、チオフェン環、シクロペンテン環、シクロペンタジエン環、及びフラン環よりなる群から選択される環構造を表し；Ｘは、Ｃ０-Ｃ３アルキレン基を表し；Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、又はＮＨを表し、Ｚは、Ｏ、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｓｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｓｅ、Ｐ（Ｒｃ）、又はＰ（Ｒｃ）（＝Ｏ）を表し（ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表し、Ｒｃは、水素原子、アルキル基、又はアリール基を表す）；Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、スルホ基、カルボキシル基、エステル基、アミド基及びアジド基よりなる群から選択される１〜３個の同一又は異なる置換基を表し；Ｒ３は、アミノ酸由来のアシル残基を表し（ここで、該アシル残基は、アミノ酸のカルボキシル基からＯＨ基を除去した残基である）；Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に水素原子もしくはアルキル基を表す（ここで、Ｒ４又はＲ５がアルキル基である場合、Ｒ２と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい）。〕
2018151260.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩：
【化１】
2018151260.tif 000018
〔式中、Ａは、チオフェン環、シクロペンテン環、シクロペンタジエン環、及びフラン環よりなる群から選択される環構造を表し；
Ｘは、Ｃ０-Ｃ３アルキレン基を表し；
Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、又はＮＨを表し、
Ｚは、Ｏ、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｓｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｓｅ、Ｐ（Ｒｃ）、又はＰ（Ｒｃ）（＝Ｏ）を表し（ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表し、Ｒｃは、水素原子、アルキル基、又はアリール基を表す）；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、スルホ基、カルボキシル基、エステル基、アミド基及びアジド基よりなる群から選択される１〜３個の同一又は異なる置換基を表し；
Ｒ３は、アミノ酸由来のアシル残基を表し（ここで、該アシル残基は、アミノ酸のカルボキシル基からＯＨ基を除去した残基である）；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に水素原子もしくはアルキル基を表す（ここで、Ｒ４又はＲ５がアルキル基である場合、Ｒ２と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい）。〕
【請求項２】
Ａがチオフェン環である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
Ｙが、Ｏである、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
Ｚが、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＣ（Ｒａ）（Ｒｂ）である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
Ｒ３が、グルタミン酸残基である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項６】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４及びＲ５が、いずれも水素原子である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項７】
式（Ｉ）で表される化合物が以下に示す群から選択される化合物である、請求項１に記載の化合物又はその塩；
【化２】
2018151260.tif 000019
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の化合物又はその塩を含む、ペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブ。
【請求項９】
請求項８に記載のペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブを含む、特定のペプチダーゼが発現している標的細胞を検出するための又は可視化するためのキット。
【請求項１０】
前記ペプチダーゼが、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）、又はカルパインである、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記標的細胞が、癌細胞である、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれかに記載の化合物又はその塩を用いて、特定のペプチダーゼが発現している標的細胞を検出又は可視化する方法。
【請求項１３】
前記化合物又はその塩と前記標的細胞とを生体外において接触させる工程；及び、前記標的細胞において特異的に発現するペプチダーゼと前記化合物又はその塩との反応による蛍光応答を観測する工程を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
蛍光イメージング手段を用いて前記蛍光応答を観測することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチダーゼが、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）、又はカルパインである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的細胞が、癌細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
特定のペプチダーゼが発現している標的細胞を検出するための又は可視化するための、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物又はその塩の使用。
【請求項１８】
標的細胞において特異的に発現するペプチダーゼと請求項１〜７のいずれかに記載の化合物又はその塩との反応による蛍光応答を観測するための蛍光イメージング手段を備える、装置。
【請求項１９】
前記装置が内視鏡又はｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージング装置である、請求項１８に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチダーゼ活性検出用の蛍光プローブに関する。より詳細には、アミノペプチダーゼ等のペプチダーゼ活性を赤色領域の蛍光により検出することが可能な新規蛍光プローブ、当該蛍光プローブを用いた検出方法・装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの罹患者や死亡者が年々増加している現在、その治療方法の開発が期待され続けている。現時点で、最も確実と考えられているがん治療法の一つは、がんの早期発見とその確実な外科的摘出であるが、目視が完全には難しいがん組織を完全に除去することは難しく再発の原因となっている。【０００３】
一方、がん細胞では、ペプチダーゼ（プロテアーゼ）であるγ-グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）の発現亢進が認められ、この発現亢進が薬剤耐性に関連するとの報告がなされている。したがって、γ-グルタミルトランスフェラーゼを検出することによりがん細胞やがん組織を高精度に特定する診断方法の開発に繋がることが期待できる。【０００４】
本発明者らは、これまでに、分子内スピロ環化平衡を示す蛍光色素を基に、γ-グルタミルトランスフェラーゼの活性を検出可能な蛍光プローブ群を開発している（非特許文献１等）。【０００５】
しかしながら、かかる従来の蛍光プローブの吸収・発光波長は、蛍光波長は５５０nm以下（緑色蛍光）であり、組織表面に存在するがん細胞等に対しては高感度で検出可能であるものの、リンパ節転移などの生体組織下や臓器内部に存在するがん細胞には適用できないという制約があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｙ．Ｕｒａｎｏら、Ｓｃｉ. Ｔｒａｎｓｌ. Ｍｅｄ., ２０１１年、ｖｏｌ．３, ｐｐ．１１０ｒａ１１９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、がん細胞等で高発現しているペプチダーゼ活性をより長波長の赤色蛍光の応答として検出することができ、組織透過性に優れた新規蛍光プローブを提供することを課題とするものである。また、かかる赤色蛍光プローブを従来の緑色蛍光プローブと併用することによって、マルチカラーイメージングを可能とし、精密かつ高感度にがん細胞を可視化及び検出し得るシステムを提供することも課題とする。【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、チオフェン環等を連結させたローダミン骨格に、ペプチダーゼによって切断される基を導入した構造する化合物を用い、分子内スピロ環化特性を最適化することにより、標的ペプチダーゼとの接触前は無色・無蛍光だが、当該ペプチダーゼとの反応により６００ｎｍ付近の赤色蛍光の応答を示す蛍光プローブが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、一態様において、
＜１＞以下の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩：
【化１】
2018151260.tif 000003
〔式中、Ａは、チオフェン環、シクロペンテン環、シクロペンタジエン環、及びフラン環よりなる群から選択される環構造を表し；
Ｘは、Ｃ０-Ｃ３アルキレン基を表し；
Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、又はＮＨを表し、
Ｚは、Ｏ、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｓｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｓｅ、Ｐ（Ｒｃ）、又はＰ（Ｒｃ）（＝Ｏ）を表し（ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表し、Ｒｃは、水素原子、アルキル基、又はアリール基を表す）；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、スルホ基、カルボキシル基、エステル基、アミド基及びアジド基よりなる群から選択される１〜３個の同一又は異なる置換基を表し；
Ｒ３は、アミノ酸由来のアシル残基を表し（ここで、該アシル残基は、アミノ酸のカルボキシル基からＯＨ基を除去した残基である）；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に水素原子もしくはアルキル基を表す（ここで、Ｒ４又はＲ５がアルキル基である場合、Ｒ２と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい）。〕；
＜２＞Ａがチオフェン環である、上記＜１＞に記載の化合物又はその塩；
＜３＞Ｙが、Ｏである、上記＜１＞に記載の化合物又はその塩；
＜４＞Ｚが、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＣ（Ｒａ）（Ｒｂ）である、上記＜１＞に記載の化合物又はその塩；
＜５＞Ｒ３が、グルタミン酸残基である、上記＜１＞に記載の化合物又はその塩；
＜６＞Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４及びＲ５が、いずれも水素原子である、上記＜１＞に記載の化合物又はその塩；及び
＜７＞式（Ｉ）で表される化合物が以下に示す群から選択される化合物である、上記＜１＞に記載の化合物又はその塩；
【化２】
2018151260.tif 000004
を提供するものである。【００１０】
また、別の態様において、本発明は、
＜８＞上記＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の化合物又はその塩を含む、ペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブ；
＜９＞
上記＜８＞に記載のペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブを含む、特定のペプチダーゼが発現している標的細胞を検出するための又は可視化するためのキット；
＜１０＞前記ペプチダーゼが、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）、又はカルパインである、上記＜９＞に記載のキット；及び
＜１１＞前記標的細胞が、癌細胞である、上記＜９＞に記載のキット
を提供するものである。【００１１】
更なる態様において、本発明は、特定のペプチダーゼが発現している標的細胞を検出又は可視化する方法にも関し、具体的には、
＜１２＞上記＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の化合物又はその塩を用いて、特定のペプチダーゼが発現している標的細胞を検出又は可視化する方法；
＜１３＞前記化合物又はその塩と前記標的細胞とを生体外において接触させる工程；及び、前記標的細胞において特異的に発現するペプチダーゼと前記化合物又はその塩との反応による蛍光応答を観測する工程を含むことを特徴とする、上記＜１２＞に記載の方法；
＜１４＞蛍光イメージング手段を用いて前記蛍光応答を観測することを含む、上記＜１３＞に記載の方法；
＜１５＞前記ペプチダーゼが、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）、又はカルパインである、上記＜１２＞に記載の方法；
＜１６＞前記標的細胞が、癌細胞である、上記＜１２＞に記載の方法；及び
＜１７＞特定のペプチダーゼが発現している標的細胞を検出するための又は可視化するための、上記＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の化合物又はその塩の使用；【００１２】
更なる態様において、本発明は、上記ペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブによる蛍光応答を観測する手段を備える装置にも関し、具体的には、
＜１８＞標的細胞において特異的に発現するペプチダーゼと上記＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の化合物又はその塩との反応による蛍光応答を観測するための蛍光イメージング手段を備える、装置；及び
＜１９＞前記装置が内視鏡又はｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージング装置である、上記＜１８＞に記載の装置
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の蛍光プローブは、標的ペプチダーゼとの接触前は無色・無蛍光だが、当該ペプチダーゼとの反応により赤色領域の蛍光応答を特異的にかつｏｎ／ｏｆｆで検出することができる。。【００１４】
また、本発明の赤色蛍光プローブと、従来の緑色蛍光プローブと併用することによって、複数の蛍光応答領域を用いるマルチカラーイメージングを可能とし、精密かつ高感度にがん細胞等を可視化及び検出することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ローダミン骨格を有する化合物の分子内平衡・速度論モデルである。
【図２】図２は、本発明の蛍光プローブ１（ｇＧｌｕ−ＭＨＭ４ＴｈＰＣＲ５５０）及び比較としてｇＧｌｕ基を有しないＭＨＭ４ＴｈＰＣＲ５５０の吸収スペクトル変化を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の蛍光プローブ１（ｇＧｌｕ−ＭＨＭ４ＴｈＰＣＲ５５０）及び比較としてｇＧｌｕ基を有しないＭＨＭ４ＴｈＰＣＲ５５０の蛍光スペクトル変化を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の蛍光プローブ２（ｇＧｌｕ−ＨＭ３ＴｈＰＳｉＲ６００）の吸収スペクトル変化を示すグラフである。また、比較としてｇＧｌｕ基を有しないＨＭ３ＴｈＰＳｉＲ６００及びｇＧｌｕ基の代わりにＡｃ基を有するＨＭ３ＴｈＰＡｃＳｉＲ６００の吸収スペクトルを併せて示している。
【図５】図５は、本発明の蛍光プローブ１（ｇＧｌｕ−ＭＨＭ４ＴｈＰＣＲ５５０）にγ-グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）を添加した際の蛍光強度の時間変化を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の蛍光プローブ２（ｇＧｌｕ−ＨＭ３ＴｈＰＳｉＲ６００）にγ-グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）を添加した際の蛍光強度の時間変化を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の蛍光プローブ１（ｇＧｌｕ−ＭＨＭ４ＴｈＰＣＲ５５０）を用いた、がん腹膜播種モデルマウスのｉｎ  ｖｉｖｏイメージング画像である。
【図８】図８は、本発明の蛍光プローブ２（ｇＧｌｕ−ＨＭ３ＴｈＰＳｉＲ６００）を用いた、がん腹膜播種モデルマウスのｉｎ  ｖｉｖｏイメージング画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００１７】
１．定義
【００１８】
本明細書中において、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を意味する。
【００１９】
本明細書中において、「アルキル」は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなる脂肪族炭化水素基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば、炭素数１〜２０個（Ｃ１〜２０）、炭素数１〜１５個（Ｃ１〜１５）、炭素数１〜１０個（Ｃ１〜１０）である。炭素数を指定した場合は、その数の範囲の炭素数を有する「アルキル」を意味する。例えば、Ｃ１〜８アルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎｅｏ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル等が含まれる。本明細書において、アルキル基は任意の置換基を1個以上有していてもよい。そのような置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルコシ基、アリールアルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
【００２０】
本明細書において、ある官能基について「置換されていてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。このような例として、例えば、ハロゲン化アルキル基、ジアルキルアミノ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００２１】
本明細書中において、「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有している直鎖又は分枝鎖の炭化水素基をいう。例えば、その非限定的な例として、ビニル、アリル、１−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタンジエニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１，３−ペンタンジエニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニル及び１，４−ヘキサンジエニル）を含む。二重結合についてシス配座またはトランス配座のいずれであってもよい。
【００２２】
本明細書中において、「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有している直鎖又は分枝鎖の炭化水素基をいう。例えば、その非限定的な例として、エチニル、プロピニル、２−ブチニルおよび３−メチルブチニルなどを含む。
【００２３】
本明細書中において、「シクロアルキル」は、上記のアルキルよりなる単環または多環式の非芳香環系をいう。当該シクロアルキルは、置換されていないか同一もしくは異なっても良い１以上の置換基によって置換されていることができ、単環式シクロアルキルの非限定的な例には、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロヘプチルなどがあり、多環式のシクロアルキルの非限定的な例には、１−デカリニル、２−デカリニル、ノルボルニル、アダマンチルなどが挙げられる。また、当該シクロアルキルは、環構成原子としてヘテロ原子（例えば、酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子など）を１個以上含むヘテロシクロアルキルであってもよい。ヘテロシクロアルキル環中の任意の−ＮＨは、例えば−Ｎ（Ｂｏｃ）基、−Ｎ（ＣＢｚ）基および−Ｎ（Ｔｏｓ）基としてのように保護されていてもよく、環中の窒素原子または硫黄原子が対応するＮ−オキシド、Ｓ−オキシドまたはＳ，Ｓ−ジオキシドへ酸化されたものであってもよい。例えば、単環式ヘテロシクロアルキルの非限定的な例には、ジアザパニル、ピペリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリジニル、１，４−ジオキサニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオフェニル、ラクタムおよびラクトン等が挙げられる。
【００２４】
本明細書中において、「シクロアルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、単環または多環式の非芳香環系をいう。当該シクロアルケニルは、置換されていないか同一もしくは異なっても良い１以上の置換基によって置換されていることができ、単環式のシクロアルケニルの非限定的な例には、シクロペンテニル、シクロヘキセニルおよびシクロヘプタ−１，３−ジエニルなどがあり、多環式のシクロアルケニルの非限定的な例には、ノルボルニレニル等が挙げられる。また、当該シクロアルキルは、環構成原子としてヘテロ原子（例えば、酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子など）を１個以上含むヘテロシクロアルケニルであってもよいヘテロシクロアルケニル環中の窒素原子または硫黄原子を、対応するＮ−オキシド、Ｓ−オキシドまたはＳ，Ｓ−ジオキシドへ酸化してもよい。
【００２５】
本明細書中において、「アルキレン」とは、直鎖状または分枝状の飽和炭化水素からなる二価の基であり、例えば、メチレン、１−メチルメチレン、１，１−ジメチルメチレン、エチレン、１−メチルエチレン、１−エチルエチレン、１，１−ジメチルエチレン、１，２−ジメチルエチレン、１，１−ジエチルエチレン、１，２−ジエチルエチレン、１−エチル−２−メチルエチレン、トリメチレン、１−メチルトリメチレン、２−メチルトリメチレン、１，１−ジメチルトリメチレン、１，２−ジメチルトリメチレン、２，２−ジメチルトリメチレン、１−エチルトリメチレン、２−エチルトリメチレン、１，１−ジエチルトリメチレン、１，２−ジエチルトリメチレン、２，２−ジエチルトリメチレン、２−エチル−２−メチルトリメチレン、テトラメチレン、１−メチルテトラメチレン、２−メチルテトラメチレン、１，１−ジメチルテトラメチレン、１，２−ジメチルテトラメチレン、２，２−ジメチルテトラメチレン、２，２−ジ−ｎ−プロピルトリメチレン等が挙げられる。
【００２６】
本明細書中において、「アリール」は単環式又は縮合多環式の芳香族炭化水素基のいずれであってもよく、環構成原子としてヘテロ原子（例えば、酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子など）を１個以上含む芳香族複素環であってもよい。この場合、これを「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」と呼ぶ場合もある。アリールが単環および縮合環のいずれである場合も、すべての可能な位置で結合しうる。単環式のアリールの非限定的な例としては、フェニル基（Ｐｈ）、チエニル基（２−又は３−チエニル基）、ピリジル基、フリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、ピラゾリル基、２−ピラジニル基、ピリミジニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピリダジニル基、３−イソチアゾリル基、３−イソオキサゾリル基、１，２，４−オキサジアゾール−５−イル基又は１，２，４−オキサジアゾール−３−イル基等が挙げられる。縮合多環式のアリールの非限定的な例としては、１−ナフチル基、２−ナフチル基、１−インデニル基、２−インデニル基、２，３−ジヒドロインデン−１−イル基、２，３−ジヒドロインデン−２−イル基、２−アンスリル基、インダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、１，２−ジヒドロイソキノリル基、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリル基、インドリル基、イソインドリル基、フタラジニル基、キノキサリニル基、ベンゾフラニル基、２，３−ジヒドロベンゾフラン−１−イル基、２，３−ジヒドロベンゾフラン−２−イル基、２，３−ジヒドロベンゾチオフェン−１−イル基、２，３−ジヒドロベンゾチオフェン−２−イル基、ベンゾチアゾリル基、ベンズイミダゾリル基、フルオレニル基又はチオキサンテニル基等が挙げられる。本明細書において、アリール基はその環上に任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アリール基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アリール部分を含む他の置換基（例えばアリールオキシ基やアリールアルキル基など）のアリール部分についても同様である。
【００２７】
本明細書中において、「アルコキシ基」とは、前記アルキル基が酸素原子に結合した構造であり、例えば直鎖状、分枝状、環状又はそれらの組み合わせである飽和アルコキシ基が挙げられる。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、シクロプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、シクロブトキシ基、シクロプロピルメトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロプロピルエチルオキシ基、シクロブチルメチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロプロピルプロピルオキシ基、シクロブチルエチルオキシ基又はシクロペンチルメチルオキシ基等が好適な例として挙げられる。
【００２８】
本明細書中において用いられる「アミド」とは、ＲＮＲ’ＣＯ−（Ｒ＝アルキルの場合、アルカミノカルボニル−）およびＲＣＯＮＲ’−（Ｒ＝アルキルの場合、アルキルカルボニルアミノ−）の両方を含む。
【００２９】
本明細書中において用いられる「エステル」とは、ＲＯＣＯ−（Ｒ＝アルキルの場合、アルコキシカルボニル−）およびＲＣＯＯ−（Ｒ＝アルキルの場合、アルキルカルボニルオキシ−）の両方を含む。
【００３０】
本明細書中において、「環構造」という用語は、二つの置換基の組み合わせによって形成される場合、複素環または炭素環を意味し、そのような環は飽和、不飽和、または芳香族であることができる。従って、上記において定義した、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、及びヘテロアリールを含むものである。
【００３１】
本明細書中において、「ヘテロ環構造」という用語は、複素環と同義であり、Ｏ、Ｓ及びＮから任意に選択されるヘテロ原子を環内に１以上有する単環のへテロ環を意味し、そのような環は飽和、不飽和、または芳香族であることができる。また、これらの単環のへテロ環にさらに例えば３〜８員の環が１又は２個縮合した環（多環のへテロ環）を含むことができる。非芳香族のへテロ環として、例えば、ピペリジン環、ピペラジン環、モルホリン環等が挙げられる。また、芳香族のへテロ環として、例えば、ピリジン環、ピリミジン環、ピロール環、イミダゾール環等が挙げられる。その他、ジュロリジン、インドリン等も挙げられる。
【００３２】
本明細書中において、特定の置換基は、別の置換基と環構造を形成することができ、そのような置換基同士が結合する場合、当業者であれば、特定の置換、例えば水素への結合が形成されることを理解できる。従って、特定の置換基が共に環構造を形成すると記載されている場合、当業者であれば、当該環構造は通常の化学反応によって形成することができ、また容易に生成することを理解できる。かかる環構造およびそれらの形成過程はいずれも、当業者の認識範囲内である。また、当該ヘテロ環構造は、環上に任意の置換基を有していてもよい。
【００３３】
２．本発明のペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブ
本発明のペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブは、一態様において、以下の式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を含むものである。
【化３】
2018151260.tif 000005
【００３４】
上記式（Ｉ）において、Ａは、チオフェン環、シクロペンテン環、シクロペンタジエン環、及びフラン環よりなる群から選択される環構造を表す。当該Ａとして適切な環構造を選択することによって、後述する蛍光応答時のスピロ環化の可逆性（スピロ環化平衡定数：ｐＫｃｙｃｌ）を最適化することができる。好ましくは、Ａは、チオフェン環である。
【００３５】
環状構造Ａは、１以上の任意の置換基によって置換されていてもよい。かかる置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基は、１以上の置換基によってさらに置換されていてもよく、そのような置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基などを１個又は２個以上有していてもよい。Ａの環上に２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。
【００３６】
Ｘは、Ｃ０-Ｃ３アルキレン基を表す。当該アルキレン基はハロゲン原子又はハロアルキルで置換されていてもよい。Ｃ０アルキレン基の場合、Ｙは直接結合を意味する。アルキレン基は直鎖状アルキレン基又は分枝鎖状アルキレン基のいずれであってもよい。例えば、メチレン基（−ＣＨ２−）、エチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、プロピレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）のほか、分枝鎖状アルキレン基として−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−なども使用することができる。これらのうち、メチレン基、−ＣＨ（ＣＨ３）−、又はエチレン基が好ましく、メチレン基又は−ＣＨ（ＣＨ３）−がさらに好ましい。
【００３７】
Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、又はＮＨを表す。好ましくは、Ｙは、Ｏである。このＹは、スピロ環状の開環反応のしやすさの点でスピロ環化平衡定数（ｐＫｃｙｃｌ）に関与する部位であるため、上記Ａなどの構造との組み合わせによって、最適なＹを選択することによってスピロ環化平衡定数を調整することができる。
【００３８】
Ｚは、Ｏ、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｇｅ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｓｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）、Ｓｅ、Ｐ（Ｒｃ）、又はＰ（Ｒｃ）（＝Ｏ）を表す。好ましくは、Ｚは、Ｓｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＣ（Ｒａ）（Ｒｂ）である。ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表し、Ｒｃは、水素原子、アルキル基、又はアリール基を表す。Ｒａ及びＲｂが、アルキル基である場合、それらは１以上の置換基を有することができ、そのような置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基などを１個又は２個以上有していてもよい。Ｒａ及びＲｂは、好ましくは、いずれもＣ１-Ｃ４アルキル基であり、より好ましくは、いずれもメチル基である（その場合、Ｘは、Ｓｉ（ＣＨ３）２となる）。また、場合によっては、Ｒａ及びＲｂは互いに結合して環構造を形成していてもよい。例えば、Ｒａ及びＲｂがともにアルキル基である場合に、Ｒａ及びＲｂが互いに結合してスピロ炭素環を形成することができる。形成される環は、例えば５ないし８員環程度であることが好ましい。
【００３９】
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、スルホ基、カルボキシル基、エステル基、アミド基及びアジド基よりなる群から選択される１〜３個の同一又は異なる置換基を表す。好ましくは、Ｒ１及びＲ２が、いずれも水素原子である。
【００４０】
Ｒ３は、アミノ酸由来のアシル残基を表す。ここで、当該アシル残基は、アミノ酸のカルボキシル基からＯＨ基を除去した残りの部分構造である残基を意味する。すなわち、アミノ酸由来のアシル残基のカルボニル部分と式（Ｉ）のＲ３に隣接するＮＨとがアミド結合を形成し、これによりローダミン骨格と連結している。
【００４１】
本明細書において、「アミノ酸」は、アミノ基とカルボキシル基の両方を有する化合物であれば任意の化合物を用いることができ、天然及非天然のものを含む。中性アミノ酸、塩基性アミノ酸、又は酸性アミノ酸のいずれであってもよく、それ自体が神経伝達物質などの伝達物質として機能するアミノ酸のほか、生理活性ペプチド（ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドのほか、オリゴペプチドを含む）やタンパク質などのポリペプチド化合物の構成成分であるアミノ酸を用いることができ、例えばαアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸などであってもよい。アミノ酸としては、光学活性アミノ酸を用いることが好ましい。例えば、αアミノ酸についてはＤ−又はＬ−アミノ酸のいずれを用いてもよいが、生体において機能する光学活性アミノ酸を選択することが好ましい場合がある。
【００４２】
後述のようにＲ３は、標的とするペプチダーゼとの反応によって切断される部位である。前記標的ペプチダーゼが、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）、又はカルパインであることができる。それゆえ、標的ペプチダーゼがγ-グルタミルトランスペプチダーゼである場合、Ｒ３は、γ-グルタミル基であることが好ましい。また、標的ペプチダーゼがジペプチジルペプチダーゼＩＶである場合、Ｒ３は、プロリン残基を含むアシル基であることが好ましい。標的ペプチダーゼがカルパインである場合、Ｒ３は、例えば、システイン残基を含むアシル基であることができ、或いは、カルパイン基質として当該技術分野において公知のＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ）やＡｃＬＭを用いることもできる。
【００４３】
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に水素原子もしくはアルキル基を表す。Ｒ４及びＲ５がともにアルキル基を示す場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。例えば、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に、メチル基又はエチル基であることができる。好ましくは、Ｒ４及びＲ５が、いずれも水素原子である。
【００４４】
ここで、Ｒ４及びＲ５が、いずれもアルキル基の場合、Ｒ４とＲ５が一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む５〜８員のヘテロ環構造を形成してもよい。また、Ｒ４（又はＲ５）がアルキル基の場合、Ｒ２と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む５〜８員のヘテロ環構造を形成してもよい。好ましくは、当該ヘテロ環構造は６員環である。また、当該ヘテロ環構造は、Ｒ４及びＲ５が結合している窒素原子以外のヘテロ原子をさらに含むことができる。
【００４５】
本発明のペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブとして代表的な式（Ｉ）の化合物の具体例としては、以下の式（Ｉａ）及び式（Ｉｂ）の化合物が挙げられる。ただし、これに限定されるものではない。
【化４】
2018151260.tif 000006
【００４６】
上記式（Ｉ）で表される化合物は、塩として存在する場合がある。そのような塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、カルボン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、これらの塩に限定されることはない。
【００４７】
式（Ｉ）で表される化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。
【００４８】
式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
【００４９】
上記の蛍光プローブは、必要に応じて試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され得る。
【００５０】
また、本発明の蛍光プローブを用いてペプチダーゼ活性を検出する場合或いは後述のようにがん診断用に用いる場合、当該蛍光プローブを含むキットの形態として用いることもできる。当該キットにおいて、通常、本発明の蛍光プローブは溶液として調製されているが、例えば、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用することもできる。当該キットは、必要に応じて、上述の添加剤を配合してもよい。
【００５１】
本明細書の実施例には、式（Ｉ）で表される本発明の化合物に包含される代表的化合物についての製造方法が具体的に示されているので、当業者は本明細書の開示を参照することにより、及び必要に応じて出発原料や試薬、反応条件などを適宜選択することにより、式（Ｉ）に包含される任意の化合物を容易に製造することができる。
【００５２】
３．本発明の蛍光プローブの蛍光発光機構
以下、本発明のペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブにおける蛍光発光機構について説明する。
【００５３】
式（Ｉ）で示される化合物として上記式（Ｉａ）を用いる場合を例示する。以下のスキームの左に示すように、上記式（Ｉａ）で示される化合物は、ローダミンの中心原子をＯからＳｉに置換した構造を有するシリコンローダミン骨格の上部が閉環してスピロ環を形成した状態では、生理的ｐＨ（ｐＨ７．４付近）において当該蛍光プローブ自体は実質的に無吸収・無蛍光（蛍光応答がＯｆｆの状態）である。これに対し、Ｒ３のアミノ酸由来のアシル残基（式（Ｉａ）ではグルタミン酸残基）がペプチダーゼにより加水分解されシリコンローダミン骨格から切断されると、スピロ環部分か開環したスキーム右の化合物が生じる。当該開環化合物は強蛍光性を示す。
【００５４】
【化５】
2018151260.tif 000007
【００５５】
すなわち、上記式（Ｉａ）を含む式（Ｉ）で表される化合物は、生体内のｐＨ環境下において例えば５００〜６５０ｎｍ程度の励起光を照射した場合には、ほとんど蛍光を発しないが、ペプチダーゼとの反応によって生じた開環化合物は、同じ条件下において極めて強い蛍光を発する性質を有している。したがって、式（Ｉ）で表される蛍光プローブを取り込んだ細胞が、Ｒ３を加水分解して切断可能なペプチダーゼを発現していない場合には、開環化合物は生成せず、蛍光物質が当該細胞内で生成することはないが、そのようなペプチダーゼが存在する場合には、開環化合物が生じて強い蛍光発光が得られる。したがって、標的とするペプチダーゼの存在を蛍光強度のｏｎ／ｏｆｆ変化により観測し、それにより、当該ペプチダーゼを発現するがん細胞等の存在を検出することが可能となる。
【００５６】
また、式（Ｉ）で表される化合物では、キサンテン環の１０位元素であるＺ
の種類及び当該キサンテン骨格に連結する環状構造Ａの種類を調整することで、スピロ環の開環による蛍光発光を、蛍光ピーク波長が６００ｎｍ近傍の赤色領域の蛍光とすることができるという特徴を有するものである。これにより、従来は困難であったリンパ節転移などの生体深部に存在するがん細胞等の可視化が可能となる。
【００５７】
本発明の蛍光プローブを生体細胞内に適用した場合の特性としては、式（Ｉ）の化合物がペプチダーゼによって加水分解された開環化合物は、細胞のリソソーム内に集積することになり、リソソーム内の低ｐＨによってスピロ環化平衡が移動し閉環構造から開環構造へと変化し、蛍光応答が得られる。細胞から漏出したプローブから発せられるバックグラウンドシグナルは抑制され、高感度の検出が可能である。
【００５８】
４．本発明の蛍光プローブを用いたペプチダーゼ活性検出方法
かかる発光機構に従い、本発明の蛍光プローブを用いて特定のペプチダーゼが発現している標的細胞を特異的に検出又は可視化することができる。具体的には、
Ａ）蛍光プローブと標的細胞とを生体内又は生体外において接触させる工程；及び、
Ｂ）前記標的細胞において特異的に発現するペプチダーゼと前記蛍光プローブとの反応による蛍光応答を観測する工程
を含むことによって、特定のペプチダーゼを発現している標的細胞のみを特異的に近赤外の蛍光シグナルとして検出又は可視化することができる。なお、本明細書において「検出」という用語は、定量、定性など種々の目的の測定を含めて最も広義に解釈されるべきである。
【００５９】
上述のように、特定のペプチダーゼは、好ましくは、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）、又はカルパインであることができる。ただし、これらに限定されるものではない。上記標的細胞は、好ましくは癌細胞である。
【００６０】
また、本発明の方法は、さらに蛍光イメージング手段を用いて前記蛍光応答を観測することを含むことができる。上記の蛍光応答を観測する手段は、広い測定波長を有する蛍光光度計を用いることができるが、前記蛍光応答を２次元画像として表示可能な蛍光イメージング手段を用いて可視化することもできる。蛍光イメージングの手段を用いることによって、蛍光応答を二次元で可視化できるため、ペプチダーゼを発現する標的細胞に瞬時に視認することが可能となる。蛍光イメージング装置としては、当該技術分野において公知の装置を用いることができる。なお、場合によって、紫外可視吸光スペクトルの変化（例えば、特定の吸収波長における吸光度の変化）によって上記ペプチダーゼと蛍光プローブの反応を検出することも可能である。
【００６１】
上工程Ａ）において、本発明の蛍光プローブと、標的細胞において特異的に発現するペプチダーゼとを接触させる手段としては、代表的には、蛍光プローブを含む溶液を試料添加、塗布、或いは噴霧することが挙げられるが、その用途に応じて適宜選択することが可能である。また、本発明の蛍光プローブを、動物個体における診断又は診断の補助、若しくは特定の細胞又は組織の検出に適用する際に、当該蛍光プローブと、標的細胞又は組織において発現するペプチダーゼとを接触させる手段としては、特に限定されることなく、例えば、静脈内投与等、当該分野において一般的な投与手段を用いることができる。
【００６２】
本発明の蛍光プローブの適用濃度は特に限定されないが、例えば０．１〜１００μＭ程度の濃度の溶液を適用することができる。
【００６３】
また、標的細胞に行う光照射は、当該細胞に対して光を直接或いは導波管（光ファイバー等）を介して照射することができる。光源としては、酵素切断を受けた後の、本発明の蛍光プローブの吸収波長を含む光を照射できるものであれば、任意の光源を用いることができ、本発明の方法を実施する環境等に応じて適宜選択され得る。
【００６４】
本発明の蛍光プローブとしては、上記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、一般的には、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供されるが、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用することが可能である。
【００６５】
上記工程Ｂ）における標的細胞が、特定のペプチダーゼを発現しているがん細胞やがん組織である場合には、本発明の検出方法によって、がん細胞やがん組織を検出・可視化することができる。すなわち、本発明の蛍光プローブ、それを含むキット及び検出方法（以下、「本発明の検出方法」という。）は、がんの診断に用いることもできる。
【００６６】
本明細書において、「がん組織」の用語はがん細胞を含む任意の組織を意味している。「組織」の用語は臓器の一部又は全体を含めて最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。本発明のがん診断用組成物は、がん組織において特異的に強発現しているペプチダーゼ、典型的にはγ-グルタミルトランスフェラーゼを検出する作用を有していることから、がん組織としてはγ-グルタミルトランスフェラーゼを高発現している組織が好ましい。また、本明細書において「診断」の用語は任意の生体部位においてがん組織の存在を肉眼的又は顕微鏡下に確認することを含めて最も広義に解釈する必要がある。
【００６７】
本発明の検出方法は、例えば手術中又は検査中に使用することができる。本明細書において「手術」の用語は、例えば開創を伴う開頭手術、開胸手術、若しくは開腹手術、又は皮膚手術などのほか、胃内視鏡、大腸内視鏡、腹腔鏡、又は胸腔鏡などの鏡視下手術などを含めて、がんの治療のために適用される任意の手術を包含する。また、「検査」の用語は、胃内視鏡や大腸内視鏡などの内視鏡を用いた検査及び検査に伴う組織の切除や採取などの処置のほか、生体から分離・採取された組織に対して行う検査などを包含する。
【００６８】
本発明の検出方法により診断可能ながんは特に限定されず、肉腫を含め任意の悪性腫瘍を包含するが、好ましくは固形がんの診断に用いることが好ましい。好ましい態様の一つとして、例えば、肉眼下又は鏡視下における手術野の一部又は全体に本発明の蛍光プローブを噴霧、塗布、又は注入などの適宜の方法により適用し、数十秒から数分後に５００nm程度の波長の光を適用部位に照射することができる。その適用部位にがん組織が含まれる場合には、その組織が蛍光を発するようになるので、その組織をがん組織であると特定してそこを含めて周囲組織と共に切除する。例えば、胃癌、肺癌、乳癌、大腸癌、肝臓癌、胆のう癌、膵臓癌などの典型的な癌腫の外科治療に際して、肉眼的に確認できる癌種組織に対して確定診断を行うほか、リンパ節などのリンパ組織並びに周囲臓器及び組織への浸潤及び転移などを診断することができ、術中迅速診断を行って切除範囲を確定することが可能になる。
【００６９】
また、その他の好ましい態様として、例えば、胃内視鏡又は大腸内視鏡検査において検査部位に本発明の蛍光プローブを噴霧、塗布、又は注入などの適宜の方法により適用し、数十秒から数分後に５００nm程度の波長の光を適用部位に照射し、蛍光を発する組織が確認された場合にはそこをがん組織と特定することができる。内視鏡検査においてがん組織が確認できた場合には、その組織について検査切除や治療的な切除を行うこともできる。
【００７０】
本発明の蛍光プローブ及びキットには、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる上述の添加剤を配合してもよい。
【００７１】
６．本発明の蛍光プローブを用いる装置
別の態様において、本発明は、式（１）の化合物を含む蛍光プローブと、標的細胞において特異的に発現するペプチダーゼとの反応による蛍光応答を観測するための蛍光イメージング手段を備える、装置にも関する。
【００７２】
好ましくは、前記装置が内視鏡又はｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージング装置であることができる。かかる内視鏡や蛍光イメージング装置の構造については、当該技術分野において公知の装置の構造を参照することができる。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【００７４】
［試薬、装置等］
以下に示す反応に用いる有機溶媒は、すべて脱水グレードのものを用いた。市販の原料は試薬メーカー（Aldrich Chemical Co. Ltd.、東京化成工業株式会社、和光純薬株式会社、株式会社同仁化学研究所）より購入した。【００７５】
ＮＭＲ測定は、JEOL JNM-LA300 （300 MHz for 1H NMR, 75 MHz for 13C NMR）又はJEOL JNM-LA400（400 MHz for 1H NMR, 100 MHz for 13C NMR） を用いて行った。質量分析測定は、MicrOTOF (ESI-TOF, Bruker, Co. Ltd.)を用いて行った。High-resolution MS (HRMS)測定に際しては、外部標準物質としてギ酸ナトリウムを用いた。【００７６】
ＨＰＬＣ装置は、Inertsil ODS-3 (10.0 mm ×250 mm) 逆相カラムクロマトグラフィー (GL Science Inc.) を備える Jasco PU-1587Sである。分離精製に際しては、特に断りがない限り以下の溶媒Ａ及びＢを用い、これらを任意の組成で混合して精製を行った。 
Ａ: 精製水（0.1% トリフルオロ酢酸を含む） 
Ｂ: アセトニトリル（20%精製水を含む） 
【実施例１】
【００７７】
１．蛍光プローブの合成【００７８】
１−１  ｇＧｌｕ−ＭＨＭ４ＴｈＰＣＲ５５０の合成
本発明の式（Ｉ）の化合物である以下の構造を有する蛍光プローブ１（ｇＧｌｕ−ＭＨＭ４ＴｈＰＣＲ５５０）の合成を行った。
【化６】
2018151260.tif 000008
【００７９】
ｇＧｌｕ−ＭＨＭ４ＴｈＰＣＲ５５０（化合物１６）の合成を、以下に示すの合成スキームにより行った。
【化７】
2018151260.tif 000009
2018151260.tif 000010
【００８０】
［化合物４の合成]
化合物４は、文献（O'Sullivan, S., Doni, E., Tuttle, T. and Murphy, J. A., Angew. Chem., 2014, 53, 474-478）に従って合成した。【００８１】
［化合物５の合成]
ビルスマイヤー試薬（7.4g、57.7mmol）を無水DMF（40mL）に溶解し、混合物を0℃でAr雰囲気下で撹拌した。次に、化合物4（10.0g、10.9mL、57.7mmol）を加え、室温で20時間撹拌を続けた。飽和NaHCO3水溶液を添加し反応を終了させ、混合物をCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、n-ヘキサン/ AcOEt = 9/1から2/1）により精製し、無色液体の化合物5を得た（9.14g、79％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ3.99 (d, 4H, J = 5.6 Hz), 5.12-5.20 (m, 4H), 5.79-5.87 (m, 2H), 6.69 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.69 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 9.71 (s, 1H). 
13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ52.8, 111.5, 116.8, 125.7, 132.1, 132.3, 153.3, 190.3. 【００８２】
［化合物６の合成]
化合物5（8000mg、39.7mmol）を無水メタノール（50mL）に溶解し、0℃で撹拌した。 ナトリウムテトラヒドロボレート（1654mg、43.7mmol）を加え、室温で4時間撹拌を続けた。H2Oを添加し反応を終了させ、混合物をCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、n-ヘキサン/ AcOEt = 2/1から1/1）で精製し、無色液体の化合物6得た（7450mg、92％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ3.92 (d, 4H, J = 4.0 Hz), 4.53 (s, 2H), 5.14-5.19 (m, 4H), 5.80-5.89 (m, 2H), 6.67 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.19 (d, 2H, J = 9.2 Hz). 
13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ52.9, 65.4, 112.4, 116.1, 128.7, 128.8, 133.9, 148.5.
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 204.13884, Found, 204.13520 (-3.64 mmu).【００８３】
［化合物７の合成]
化合物2（2522mg、10.0mmol）および化合物6（2030mg、10.0mmol）を無水CH2Cl2（20mL）に溶解し、0℃で撹拌した。三フッ化ホウ素エチルエーテル錯体（2.5mL、20.0mmol）を加え、室温で22時間撹拌を続けた。反応を飽和NaHCO3水溶液で終了させ、混合物をCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、n-ヘキサン/ AcOEt = 10/0から8/2）により精製し、無色液体の化合物7を得た（3870mg、88％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ3.85-3.90 (m, 10H), 5.12-5.19 (m, 8H), 5.77-5.90 (m, 4H), 6.55 (dd, 1H, J = 8.4 Hz, 2.8 Hz), 6.63 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 6.87 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 6.93 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.02 (d, 2H, J = 8.4 Hz). 
13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ39.7, 52.8, 52.9, 111.8, 112.5, 116.0, 116.1, 116.3, 125.5, 128.4, 128.6, 129.6, 131.1, 133.6, 134.4, 147.1, 148.1
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 437.15924, 439.15719, Found, 437.16055, 439.15909 (+1.32 mmu, +1.90 mmu)【００８４】
［化合物８の合成]
Arを充填した乾燥フラスコに、化合物7（1800mg、4.1mmol）および無水THF（15mL）を添加した。混合物を-78℃に冷却し、1M sec-BuLi（4.1mL、4.1mmol）を加え、さらにアセトン（0.6mL、8.2mmol）を添加した。混合物を室温で3時間撹拌した。H2Oを添加し反応を終了させ、混合物を飽和NaHCO3水溶液からCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、n-ヘキサン/ AcOEt = 10/0から8/2）で精製し、無色固体の化合物8を得た（1073mg、63％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ1.60 (s, 6H), 1.76 (s, 1H), 3.87-3.91 (m, 8H), 4.16 (s, 2H), 5.11-5.22 (m, 8H), 5.79-5.92 (m, 4H), 6.56 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 6.61 (d, 2H, J = 7.2 Hz), 6.82 (s, 1H), 6.93-6.97 (m, 3H). 
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ31.8, 38.0, 53.0, 53.2, 74.3, 110.2, 111.3, 112.6, 116.0, 116.2, 126.5, 129.4, 130.9, 134.0, 134.4, 134.6, 146.6, 146.9, 146.9.【００８５】
［化合物９の合成]
化合物8（8900mg、21.4mmol）を95％ H2SO4（10mL）に溶解し、0℃で10分間攪拌した。飽和NaHCO3水溶液を添加し反応を終了させ、混合物をCH2Cl2で抽出した。 有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。その後、残渣をアセトニトリル（120mL）に溶解し、0℃で攪拌した。 KMnO 4（10128mg、64.1mmol）を少しずつ加えた。 混合物を室温で2時間撹拌し、メタノールを添加し反応を終了させた。混合物をセライトで濾過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、CH2Cl2/メタノール= 100 / 0から97 / 3）で精製することにより、淡黄色固体の化合物9を得た（1420mg、16％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ1.63 (s, 6H), 4.02 (d, 8H, J = 2.8 Hz), 5.20-5.23 (m, 8H), 5.84-5.93 (m, 4H), 6.72 (dd, 2H, J = 2.0 Hz, 8.8 Hz), 6.76 (d, 2H, J = 2.0 Hz), 8.20 (d, 2H, J = 8.8 Hz).
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ33.6, 38.1, 53.0, 108.5, 111.1, 116.6, 120.3, 129.2, 133.3, 151.8, 152.3, 181.1.
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 413.25929, Found, 413.25696(-2.23mmu)【００８６】
［化合物１１の合成]
化合物１１は、文献（S. Gao, Z. Wu, F. Wu, A. Lin, H. Yao, Adv. Synth. Catal. 2016, 358, 4129）に従って合成した。【００８７】
［化合物１２の合成]
化合物11（1000mg、4.9mmol）を無水THF（20mL）に溶解し、0℃で撹拌した。ナトリウムテトラヒドロボレート（278mg、7.4mmol）を加え、室温で22時間撹拌した。反応を1N HCl水溶液で終了させた。混合物をCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、n-ヘキサン/ AcOEt = 9/1から7/3）により精製し、無色液体の化合物12を得た（714mg、71％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ1.49 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 2.43 (d, 1H, J = 4.4 Hz), 4.91-4.97 (m, 1H), 7.23 (d, 1H, J = 3.6 Hz), 7.27 (d, 1H, J = 3.6 Hz).
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ23.4, 66.0, 109.9, 121.3, 123.7, 145.2.【００８８】
［化合物１３の合成]
化合物12（1077mg、5.23mmol）、tert-ブチルジメチルクロロシラン（2366mg、15.7mmol）およびイミダゾール（2136mg、31.4mmol）を無水DMF（12mL）に溶解した。当該溶液をAr雰囲気下、室温で4時間撹拌した。混合物を塩水からn-ヘキサンで抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、n-ヘキサン/ AcOEt = 10/0から9/1）で精製して、無色液体の化合物13を得た（1384mg、82％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ0.01 (s, 3H), 0.06 (s, 3H), 0.90 (s, 9H), 1.41 (d, 3H, J = 6.0 Hz), 4.91 (q, 1 H, J = 6.0 Hz), 7.20 (d, 1H, J = 3.6 Hz), 7.26 (d, 1H, J = 3.6 Hz).
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ -4.86, -4.82, 18.3, 25.6, 25.9, 67.5, 108.9, 121.2, 123.1, 146.5.【００８９】
［化合物１４（ＭＨＭ４ＴｈＰＣＲ５５０Ａ）の合成]
rを充填した乾燥フラスコに、化合物13（546mg、1.7mmol）および無水THF（12mL）を添加した。混合物を-85℃に冷却し、1M sec-BuLi（1.6mL、1.7mmol）を加えた。そこに、化合物9（140mg、0.34mmol）の無水THF（4mL）溶液を加えた。混合物を室温で1時間撹拌した。2N HCl水溶液で反応を終了させた。混合物を飽和NaHCO3水溶液からCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣を以下の条件で分取HPLCにより精製した：
A / B = 80/20（0分）− 0/100（30分）、直線勾配（溶媒A：H2O、0.1％TFA;溶媒B：アセトニトリル/ H2O = 80/20,0.1％TFA）。暗紫色の固体の化合物14を得た（137mg、77％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ1.23 (d, 3H, J = 6.0 Hz), 1.69 (s, 3H), 1.74 (s, 3H), 4.28-4.32 (m, 8H), 4.46 (q, 1H, J = 6.0 Hz), 5.26 (d, 4H, J = 17.6 Hz), 5.28 (d, 4H, J = 10.4 Hz), 5.89-5.97 (m, 4H).
13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ23.3, 32.0, 33.7, 41.6, 53.5, 64.5, 111.7, 111.7, 113.4, 113.4, 116.6, 121.3, 121.4, 122.1, 126.8, 131.4, 134.2, 137.7, 138.0, 147.4, 156.4, 156.4, 157.2, 161.8.
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 523.27831, Found, 523.27729 (-1.02 mmu)【００９０】
［化合物１５（ＭＨＭ４ＴｈＰＣＲ５５０）の合成]
化合物14（125mg、0.24mmol）をメタノール（20mL）に溶解し、0℃で撹拌した。ナトリウムテトラヒドロボレート（18mg、0.48mmol）を加え、室温で15分間で撹拌を続けた。反応を飽和NaHCO 3水溶液で終了させた。混合物をCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣を脱水CH2Cl2（20mL）に溶解し、1,3-ジメチルバルビツール酸（186mg、1.19mmol）およびPd（PPh3）4（58mg、0.05mmol）を加えた。この溶液を35℃、Ar雰囲気下で14時間攪拌した。次にクロラニル（118mg、0.48mmol）を加え、室温で30分間撹拌を続けた。混合物を2N NaOH水溶液からCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣を以下の条件で分取HPLCにより精製した：A / B = 80/20（0分）から0/100（60分）、直線勾配（溶媒A：H2O、0.1％TFA;溶媒B：アセトニトリル/ H2O = 80/20, 0.1％TFA）で溶出した。紫色固体の化合物15を得た（51mg、58％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ1.23 (d, 3H, J = 6.4 Hz), 1.66 (s, 3H), 1.71 (s, 3H), 4.46 (q, 1H, J = 6.4 Hz), 6.62 (dd, 2H, J = 9.2 Hz, 3.2 Hz), 7.12 (d, 1H, J = 3.2 Hz), 7.13 (d, 1H, J = 3.2 Hz), 7.16 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 7.21 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 7.42 (d, 1H, J = 3.2 Hz), 7.63 (d, 1H, J = 3.2 Hz).
13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ23.4, 31.5, 33.4, 41.0, 64.6, 112.6, 112.7, 114.6, 114.6, 120.7, 120.9, 121.9, 126.5, 134.4, 138.5, 138.8, 147.4, 157.9, 159.3, 159.4, 161.4.
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 363.15311, Found, 363.15147 (-1.64 mmu)【００９１】
［化合物１６（ｇＧｌｕ−ＭＨＭ４ＴｈＰＣＲ５５０）の合成]
化合物15（31mg、0.085mmol）、boc-Glu-OtBu（13mg、0.043mmol）およびN、N-ジイソプロピルエチルアミン（110mg、0.85mmol）を無水DMF（2mL）に溶解し、室温で撹拌した。ＨＡＴＵ（16.2mg、0.043mmol）を加え、撹拌を2時間続けた。混合物を蒸発させ、残渣をCH2Cl2（5mL）およびトリフルオロ酢酸（5mL）に溶解し、40℃で1時間攪拌した。 その後、混合物を蒸発させた。 残渣を以下の条件で分取HPLCにより精製した：A / B = 80/20（0分）〜0 / 100（45分）、直線勾配（溶媒A：H2O、0.1％TFA;溶媒B：アセトニトリル/ H2O = 80/20, 0.1％TFA）で溶出した。橙色固体の化合物16を得た（11mg、52％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ1.24-1.30 (m, 3H), 1.71 (s, 3H), 1.77 (s, 3H), 2.20-2.32 (m, 2H), 2.75 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 4.05 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 4.42-4.50 (m, 1H), 6.83 (t, 1H, J = 8.4 Hz), 7.20-7.34 (m, 2H), 7.42-7.52 (m, 2H), 7.59 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.66 (t, 1H, J = 3.2Hz), 8.26 (s, 1H).
13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ22.9, 23.3, 25.4, 31.1, 31.1, 32.2, 33.1, 41.3, 52.4, 64.4, 64.6, 115.2, 115.3, 116.9, 117.0, 117.8, 118.0, 118.1, 122.4, 122.6, 124.5, 124.6, 125.8, 125.9, 127.3, 127.3, 133.7, 134.0, 134.4, 134.8, 141.8, 142.2, 145.4, 145.4, 147.1, 147.5, 152.6, 160.8, 161.1, 161.8, 163.4, 163.5, 170.6, 171.9.
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 492.19570, Found, 492.19380 (-1.90 mmu)【００９２】
１−２  ｇＧｌｕ−ＭＨＭ４ＴｈＰＣＲ５５０の合成
本発明の式（Ｉ）の化合物である以下の構造を有する蛍光プローブ２（ｇＧｌｕ−ＨＭ３ＴｈＰＳｉＲ６００）の合成を行った。
【化８】
2018151260.tif 000011
【００９３】
ｇＧｌｕ−ＭＨＭ４ＴｈＰＣＲ５５０（化合物４４）の合成を、以下に示すの合成スキームにより行った。
【化９】
2018151260.tif 000012
2018151260.tif 000013
【００９４】
［化合物３３の合成]
3-ブロモチオフェン-2-カルボキシアルデヒド（1910mg、10.0mmol）を無水THF（40mL）に溶解し、0℃で撹拌した。ナトリウムテトラヒドロボレート（757mg、20.0mmol）を加え、室温で3時間撹拌を続けた。反応を2N HCl水溶液で終了させた。混合物をCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、n-ヘキサン/ AcOEt = 9/1から7/3）で精製し、無色液体の化合物33を得た（2015mg、定量的）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ2.25 (t, 1H, J = 5.1 Hz), 4.79 (d, 2H, J = 5.1 Hz), 6.96 (d, 1H, J = 5.9 Hz), 7.27 (d, 1H, J = 5.9 Hz).【００９５】
［化合物３４の合成]
化合物33（2000mg、10.36mmol）、tert-ブチルジメチルクロロシラン（2342mg、15.54mmol）およびイミダゾール（2116mg、31.08mmol）を無水DMF（20mL）に溶解し、Ar雰囲気下、室温で3時間撹拌した。混合物を塩水からn-ヘキサンで抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。 残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、n-ヘキサン）で精製して、無色液体の化合物34を得た（2884mg、91％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ0.11 (s, 6H), 0.93 (s, 9H), 4.80 (s, 2H), 6.90 (d, 1H, J = 4.8 Hz), 7.20 (d, 1H, J = 4.8 Hz). 
13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ-5.2, 18.4, 25.9, 60.7, 106.1, 124.6, 129.8, 140.4【００９６】
［化合物３５〜３９の合成]
化合物３５〜３９の合成は、文献（Hirabayashi, K.; Hanaoka, K.; Takayanagi, T.; Toki, Y.; Egawa, T.; Kamiya, M.; Komatsu, T.; Ueno, T.; Terai, T.; Yoshida, K.; Uchiyama, M.; Nagano, T.; Urano, Y. Analytical chemistry 2015, 87, 9061）に従って行った。【００９７】
［化合物４０の合成]
化合物39（1600mg、5.92mmol）およびピリジン（1.9mL、23.7mmol）を無水CH 2 Cl 2（40mL）に溶解し、混合物を0℃で撹拌した。次いで、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（3.9mL、23.7mmol）を加え、4時間攪拌を続けた。 反応をH2Oで終了させ、混合物をCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。 残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、CH2Cl2）で精製して、無色固体の化合物40を得た（1660mg、52％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ0.55 (s, 6H), 7.48 (dd, 2H, J = 2.8 Hz, 8.8 Hz), 7.57 (d, 2H, J = 2.8 Hz), 8.49 (d, 2H, J = 8.8 Hz). 
13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ-2.4, 118.8(q, J = 320 Hz),123.2, 125.6, 132.9, 140.0, 142.2, 152.2, 184.8【００９８】
［化合物４１の合成]
化合物40（1500mg、2.8mmol）、ベンゾフェノンイミン（4060mg、22.4mmol）、Pd2(dba)3（513mg、0.56mmol）、キサントホス（324mg、0.56mmol）およびCs2CO3（9123mg、28.0 mmol) を脱気したジオキサン（50mL）に溶解し、溶液を100℃でAr雰囲気下で22時間撹拌した。混合物をCH2Cl2で抽出し、有機溶液をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。 残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、n-ヘキサン/ AcOEt = 10 / 0から7 / 3）により精製して、黄色固体の化合物41を得た（220mg、13％）。
1H NMR (400 MHz, CD2Cl2): δ0.13 (s, 6H), 6.82 (d, 2H, J = 2.4 Hz), 6.95 (dd, 2H, J = 8.4, 2.4 Hz), 7.11-7.15 (m, 3H), 7.22-7.32 (m, 6H), 7.42-7.53 (m, 7H), 7.78 (d, 4H, J = 8.0 Hz), 8.20 (d, 2H, J = 8.4 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD2Cl2) δ-1.64, 123.1, 125.2, 128.4, 128.6, 129.2, 129.6, 129.8, 130.3, 130.6, 131.5, 136.3, 139.3, 140.2, 154.6, 169.2, 186.1. HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 597.23621 ; found, 597.23370 (-2.51 mmu).【００９９】
［化合物４２（ＨＭ３ＴｈＰＳｉＲ６００）の合成]
Arを充填した乾燥フラスコに、化合物34（412mg、1.34mmol）および無水THF（10mL）を添加した。混合物を-78℃に冷却し、1M sec-BuLi（1.3mL、1.30mmol）を加えた。化合物41（80mg、0.13mmol）の無水THF（4mL）溶液を加えた。混合物を室温で1時間撹拌した。反応を2N HCl水溶液で終了させ、混合物を飽和NaHCO3水溶液からCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。 残渣を以下の条件で分取HPLCにより精製した：A / B = 80/20（0分）から0/100（30分）、直線勾配（溶媒A：H2O、0.1％TFA;溶媒B：アセトニトリル/ H2O = 80/20, 0.1％TFA）で溶出した。オレンジ色の固体の化合物42を得た（50mg、92％）。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ0.37 (s, 3H), 0.46 (s, 3H), 4.37 (s, 2H), 6.69 (dd, 2H, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz), 6.91 (d, 2H, J = 2.4 Hz), 7.01-7.10 (m, 4H). 13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ-0.9, 0.0, 60.5, 85.0, 118.8, 119.1, 122.0, 129.8, 132.5, 136.6, 138.7, 139.4, 147.1, 147.4. HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 365.11438, Found, 365.11429 (-0.09 mmu)【０１００】
［化合物４３（ＨＭ３ＴｈＰＡｃＳｉＲ６００）の合成]
化合物42（20mg、0.055mmol）を無水ピリジン（3mL）に溶解し、0℃でAr雰囲気下で撹拌した。無水ピリジン（1mL）中の無水酢酸（5.6mg、0.55mmol）を滴下し、24時間撹拌を続けた。反応をH2Oでクエンチさせ、混合物を蒸発させた。残渣を以下の条件で分取HPLCにより精製した：A / B = 80/20（0分）から0/100（30分）、直線勾配（溶媒A：H2O、0.1％TFA;溶媒B：アセトニトリル/ H2O = 80/20, 0.1％TFA）で溶出した。赤色固体の化合物43を得た（1.5mg、7％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ0.47 (s, 3H), 0.53 (s,3H), 2.12 (s,3H), 5.11 (s, 2H), 6.63-6.69 (m, 2H), 6.97-7.03 (m, 2H), 7.11-7.14 (m, 1H), 7.44-7.47 (m, 2H), 7.81-7.82 (m, 1H). HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 407.12495, Found, 407.12319 (-1.76 mmu)【０１０１】
［化合物４４（ｇＧｌｕ−ＨＭ３ＴｈＰＳｉＲ６００）の合成]
化合物42（30mg、0.082mmol）、boc-Glu-OtBu（12.4mg、0.041mmol）およびN、N-ジイソプロピルエチルアミン（106mg、0.82mmol）を無水DMF（2mL）に溶解し、室温で撹拌した。ＨＡＴＵ（15.6mg、0.041mmol）を加え、撹拌を1時間続けた。混合物を蒸発させ、残渣をCH2Cl2（5mL）およびトリフルオロ酢酸（5mL）に溶解し、40℃で1時間攪拌した。その後、混合物を蒸発させた。残渣を以下の条件で分取HPLCにより精製した：A / B = 80/20（0分）から0 / 100（45分）直線勾配（溶媒A：H2O、0.1％TFA;溶媒B：アセトニトリル/ H2O = 80/20, 0.1％TFA）で溶出した。赤色固体の化合物44を得た（16mg、80％）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ0.55 (s, 6H), 2.18-2.36 (m, 2H), 2.74-2.79 (m, 2H), 4.09 (t, 1H, J = 6.4 Hz), 4.42 (s, 2H), 6.85 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 6.97 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 7.21 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.41 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.46 (s, 1H), 7.62 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 7.72 (dd, 1H, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz), 8.15 (d, 1H, J = 2.4 Hz) HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 494.15698, Found, 494.15708 (+0.10mmu)
【実施例２】
【０１０２】
２．pKcycl計算に基づく赤色プローブ構造の検討
標的であるペプチダーゼによる式（Ｉ）のアシル残基の切断により発蛍光性を示し得る好適な蛍光プローブ化合物の構造について、pKcycl計算値に基づく検討を行った。【０１０３】
図１に示すように、ローダミン骨格を有する化合物の分子内平衡のモデルとして、アミノ基のプロトン化・ヒドロキシメチル基（ＨＭ）の脱プロトン化を考慮し、４つの分子種のみからなる平衡・速度論モデルを考案した。ＨＭ基、アミノ基における酸塩基平衡（モデル中の横方向）は十分速く成立していると仮定し、解析したcationicな反応での閉環型／開環型の自由エネルギー差からpKcyclを計算する式を導いた。この自由エネルギー差としてclose-1, open-1の計算結果を用いたところ、既存の誘導体のpKcyclを精度よく再現することが分かった。種々のモデル構造についての実測値と計算結果の比較を表１に示す。
【表１】
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【０１０４】
次に、このpKcycl計算モデルを用いて、適切なpKcyclを有する分子構造の検討を行った。例示として、シリコンローダミン骨格を用いる場合についてのpKcyc計算結果を表２に示す。ここで、アミノ基のモノアセチル化の有無（すなわち、ＳｉＲ６００とＡｃＳｉＲ６００の差）でpKcyclが7.4を跨いで変化する構造が好ましいという観点から、表２に示す構造においては、特にＡｒがチオフェン環の場合、特にＳ原子が蛍光団から見て３位にある場合が良好なpKcycl値となった。
【表２】
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【実施例３】
【０１０５】
３．本発明の蛍光プローブの吸収・蛍光スペクトル測定
実施例１で合成した蛍光プローブ１（ｇＧｌｕ−ＭＨＭ４ＴｈＰＣＲ５５０）及び蛍光プローブ２（ｇＧｌｕ−ＨＭ３ＴｈＰＳｉＲ６００）の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルをそれぞれ測定した。【０１０６】
図２及び図３に、蛍光プローブ１（ｇＧｌｕ−ＭＨＭ４ＴｈＰＣＲ５５０）及び比較としてｇＧｌｕ基を有しないＭＨＭ４ＴｈＰＣＲ５５０の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルをそれぞれ示す。図２の結果から算出したpKcycl値を以下の表３に示す。
【表３】
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【０１０７】
また、図３に示すように、閉環構造の蛍光プローブ１は６００ｎｍ付近にほとんど蛍光を示さないのに対し、ｐＨ６で開環構造をとるＭＨＭ４ＴｈＰＣＲ５５０は６００ｎｍ付近に大きな蛍光強度を示すことが分かった。【０１０８】
図４に、蛍光プローブ２（ｇＧｌｕ−ＨＭ３ＴｈＰＳｉＲ６００）の吸収スペクトルを示す。比較としてｇＧｌｕ基を有しないＨＭ３ＴｈＰＳｉＲ６００及びＨＭ３ＴｈＰＡｃＳｉＲ６００の吸収スペクトルを併せて示す。図４の結果から算出したpKcycl値を以下の表４に示す。
【表４】
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【実施例４】
【０１０９】
４．蛍光プローブの酵素アッセイ
本発明の蛍光プローブ１及び２にγ-グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）を添加して蛍光強度変化を測定した。結果をそれぞれ図５及び６に示す。図５中の矢印はＧＧＴの添加時間を示す。
実験条件：
共溶媒として０．０３%のDMSOを含む2.5 mlの１０ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．４）に蛍光プローブ１又は２を1μMになるよう溶解した。37 ℃に保った溶液をマグネチックスターラーで攪拌し、蛍光強度を測定した。ネガティブコントロール以外の実験では、測定開始から２分後に１．１ＵのGGTを添加した。蛍光プローブ１は５８５ｎｍでの蛍光強度を合計６０００秒、蛍光プローブ２は６１３ｎｍでの蛍光強度を合計２４００秒間測定し、経過時間の関数としてプロットした。 励起波長は蛍光プローブ１が５５０ｎｍ、蛍光プローブ２が５９３ｎｍで、スリット幅は、励起・蛍光ともに２．４ｎｍ5.0 nm、光電子増倍管電圧は700 Vであった。【０１１０】
その結果、蛍光プローブ１及び２のいずれに場合も、GGTの添加により蛍光強度が増加することが確認された。蛍光プローブ１の量子収率は、ｐＨ３．０において０．５８であった。蛍光プローブ２の量子収率は、ｐＨ３．０において０．２６であった。
【実施例５】
【０１１１】
５．がん腹膜播種モデルマウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏイメージング
ＳＨＩＮ３を腹腔内に注射したモデルマウスに１００μＭの蛍光プローブ１及び２を３００μＬ腹腔内に注射した。５分後にイソフルラン麻酔をかけ、腹部を切開しＭａｅｓｔｒｏイメージャーを用いてイメージングを行った。【０１１２】
具体的な実験条件は以下のとおりである。
蛍光スペクトルイメージングは、SHIN3細胞を腹腔内播種したマウスモデルを用いて行った。SHIN3播種モデルマウスは7週齢の雌のヌードマウスに300 μLのPBS(-) 中に懸濁した3×106個のSHIN3細胞を腹腔内注射することによって樹立した。実験は注射29-30日後に行った。PBS(-) に溶解したプローブ溶液（100 μM, 300 μL）を腹腔内注射し、5分間静置した。その後イソフルランの吸入によってマウスを麻酔し、腹部の皮膚を切開した。腸を切開部から引き出し、黒いゴム板に載せ、腸間膜を広げた。広げた腸間膜に滴下した。蛍光画像は、MaestroTM Ex In-Vivo Imaging System (CRi Inc.) を用いて撮影した。蛍光プローブ１（gGlu-MHM4ThPCR550）にはgreen-filter setting (excitation, 503 to 555 nm; emission, 580 nm long-pass)、蛍光プローブ２（gGlu-HM3ThPSiR600）にはyellow-filter setting (excitation, 575 to 605 nm; emission, 645 nm long-pass)を用いた。プローブ由来の蛍光の波長を切り出した画像、または自家蛍光とのスペクトルアンミックスを施した画像を掲示している。【０１１３】
蛍光プローブ１及び２について得られたイメージング画像を、それぞれ図７及び８に示す（図中の上段２００ msec、 下段３００msec）。いずれの場合も投与後５分で、腸間膜上の小さな腫瘍はバックグラウンドから十分なコントラストを持って観察でき、本発明の蛍光プローブによって腸間膜上の微小がんを蛍光描出できることが確認された（なお、バックグラウンドは主に腸内に残存する糞便からの自己蛍光である）。【０１１４】
これらの結果は、本発明の蛍光プローブ１及び２が赤色蛍光応答によってＧＧＴ及びがん細胞を検出し得るプローブとして機能し得ることを実証するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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