(57)【要約】  本発明は、IL-17産生ヘルパーT細胞（Th17細胞）を特異的に検出することを可能にする少なくとも１つのポリヌクレオチドマーカーまたはタンパク質マーカー、及び少なくとも１つの前記マーカーの存在を検出することを含むことを特徴とするTh17細胞の検出方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Id2、Msc、Nfat5、Nfkbiz、Plekho1、Runx2、Tcf12、Vax2、Zc3h12a、Tnik、B3gnt8、Gcnt2、1190003J15Rik、Cybb、Rab32、Bcl2a1、Bcl7a、Cmah、Dab2、Fcer1a、Nlrp4c、Rbp1、Stab1、Tubb2c、Upp1、Rc3h2、Ddx6、Actr1a又はCyp1b1で表わされる細胞内タンパク質をコードする遺伝子；
March2、Abca1、Ccr2、Cd160、Cd1d2、Cd300a、Clec4n、Cnr2、Cr1l、Crtam、Csf2rb、Cxcr6、Cd163l1、Fcgr2b、H2-Ea、Il27ra、Itgae、Klrb1f、Klrc1、Klrc2、Klrd1、Pdpn、Slc2a6、Tmem176a、Tnfrsf14、Tnfrsf25、Umodl1、Vcam1、Ebi2、Tmem176b又はIl7rで表わされる細胞膜タンパク質をコードする遺伝子；
Acpp、Bmp1、Bpil2、Ccl3、Crispld2、Ctsc、Gzmc、Il2、Lum、Ly86、Lyz1、Mcpt1、Mmp10、Mmp13、Prg4、Rln1、S100a8、Tgfbi、Timp1又はApol7b若しくはApol7eで表わされる分泌タンパク質をコードする遺伝子；或いは
1200015M12Rik、1200016E24Rik、1300007F04Rik、2010002N04Rik、2900073C17Rik、4930480G23Rik、4933424M12Rik、5330403D14Rik、5430434G16Rik、5830444B04Rik、9630026M06Rik、A630023P12Rik、AI426953、AU015263、C030044O21Rik、C230085N15Rik、Car13、Hmga2-ps1、LOC552902、Rbm10、Rrad、Sbno2、Speer1-ps1、AK086919、BG071091、AK037075、AK048317、AK081530、AK143436、AW538350、AK138895、AI593283、BM219171、BB204715、AI447357、AK047185、AW491352、AK037546、BG072223、BB283635、BB800733、AK136422、BB309694、AI661001、AK080134、AA982044、AI447438、BB204715、AK041551、AI448729、BE951087、AK157595、AK085158、AK028862、BG076280、BM115076、AK037590、GENSCAN00000037577、AK037171、AK141370、AK031033、AW120969、AI605450、AK138320、AK149443、AK090273、BB043576又はAK036007により表される遺伝子
から選択される少なくとも１つの遺伝子に由来するポリヌクレオチドであるIL-17産生ヘルパーT細胞検出用ポリヌクレオチドマーカー。
【請求項２】
請求項１に記載の少なくとも１つの遺伝子によりコードされるタンパク質からなる、IL-17産生ヘルパーT細胞検出用タンパク質マーカー。
【請求項３】
細胞を含む試料中で、請求項１に記載の少なくとも１つのTh17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカー又は請求項２に記載の少なくとも１つのTh17細胞検出用タンパク質マーカーの存在を検出することを含むことを特徴とする、IL-17産生ヘルパーT細胞を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、IL-17産生ヘルパーT細胞（以下、「Th17細胞」ともいう）を検出するためのマーカー及びTh17細胞を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性関節リウマチ（以下、「RA」ともいう）は、関節炎を主な臨床症状とする全身性の炎症性自己免疫疾患である。RAは、関節の痛み及び腫脹の程度、骨X線による知見などに基づく視覚的な手法及び自覚症状によりその病勢が判断されているが、定量的な指標が確立されていない。さらに、現状では、RAに対する治療の効果を継続的にモニターする定量的方法も確立されていない。【０００３】
RAの発症原因の詳細は未だ明らかとなっていないが、細菌感染などが引き金となり、免疫細胞群およびサイトカイン群の複雑なネットワークを介して、関節組織の炎症が起こると考えられている。
免疫反応の中心を担うのは、ヘルパーT細胞群である。未熟なヘルパーT細胞であるナイーブT細胞は、抗原提示細胞から抗原を提示されるとヘルパーT細胞に分化するが、このときに特定のサイトカインの刺激を受けることにより、ナイーブT細胞は４種類の細胞種に分化誘導される。4種類の細胞種とは、インターフェロン（IFN）-γを産生するヘルパーT細胞（Th1細胞）、インターロイキン（IL）-4を産生するヘルパーT細胞（Th2細胞）、IL-17を産生するヘルパーT細胞（Th17細胞）及び免疫抑制効果を有する制御性T細胞（Treg細胞）である。【０００４】
これらのヘルパーT細胞のうち、Th17細胞がRAの発症に関与し得ることが明らかになっている。【０００５】
例えば、特開２０００−１８６０４６号公報（特許文献１）には、RA患者の関節滑液では、変形関節炎の患者の関節滑液よりも、Th17細胞によって産生されるIL-17の量が有意に高いことや、RA患者由来の滑液組織中のT細胞にIL-17陽性細胞が存在することから、IL-17がRAの病態形成、特に関節・骨破壊に深く関与することが示されている。さらに、特許文献１には、IL-17をRAの診断マーカーとして用い得ることも記載されている。【０００６】
また、特開２００７−５０６１００号公報（特許文献２）には、RA患者からの末梢血血清中のサイトカインを分析したところ、IFN-γ、IL-1β、TNF-α、G-CSF、GM-CSF、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13、IL-5及びIL-7のレベルがRA患者において有意に高い値であり、IL-2、CXCL8／IL-8、IL-12及びCCL2/MCP-1は高い値ではなかったことが記載されている。【０００７】
Th17細胞に関して、Ivanovら（Cell, 2006, 126, p.1121-1133：非特許文献１）、Stumhoferら（Nature Immunology, 2006, vol.7, p.937-945：非特許文献２）、Wilsonら（Nature Immunology, 2007, vol.8, p.950-957：非特許文献３）などの研究により、以下のことが明らかになっている。
- RORγtとよばれる核内受容体がTh17細胞の分化に重要な役割を果たす。
- IL-6、IL-23及びTGF-βにより、ナイーブT細胞からTh17細胞への分化が誘導される。
- Th17細胞は、IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-22、IL-26、TNF、IFN-γ及びCCL20を発現する。
- Th17細胞の表面には、IL-23受容体やIL-12受容体βが存在する。【０００８】
非特許文献１〜３では、IL-17に特異的な抗体を用いたELISA法（酵素結合免疫吸着法）により、IL-17の量を測定している。
しかし、IL-17の量を測定するだけでなく、Th17細胞自体を検出する方法を確立することにより、Th17細胞と免疫性疾患、例えばRAとの関連をより深く理解することができると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０００−１８６０４６号公報
【特許文献２】特開２００７−５０６１００号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ivanovら, "The Orphan Nuclear Receptor RORγt Directs the Differentiation Program of Proinflammatory IL-17+ T Helper Cells", Cell, 2006, 126, p.1121-1133
【非特許文献２】Stumhoferら, "Interleukin 27 negatively regulates the development of interleukin 17-producing T helper cells during chronic inflammation of the central nervous system" Nature Immunology, 2006, vol.7, p.937-945
【非特許文献３】Wilsonら, "Development, cytokine profile and function of human interleukin 17-producing helper T cells" Nature Immunology, 2007, vol.8, p.950-957
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、Th17細胞を特異的に検出することを可能にする分子マーカーを同定することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らはまず、マウス脾臓から単離したナイーブT細胞を分化させて得られたTh17細胞において特異的に発現する遺伝子を同定した。次に、本発明者らは、このように同定した遺伝子から、Th17細胞が関連すると考えられている自己免疫疾患である関節炎、炎症性腸疾患及び脳脊髄炎の３種類の疾患モデルマウスにおいて高発現する遺伝子を同定し、本発明を完成した。【００１３】
よって、本発明は、
Id2（inhibitor of DNA binding 2）、Msc（musculin）、Nfat5（nuclear factor of activated T-cells 5）、Nfkbiz（nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, zeta）、Plekho1（pleckstrin homology domain containing, family O member 1）、Runx2（runt related transcription factor 2）、Tcf12（Transcription factor 12）、Vax2（ventral anterior homeobox containing gene 2）、Zc3h12a（zinc finger CCCH type containing 12A）、Tnik（TRAF2 and NCK interacting kinase）、B3gnt8 UDP-GlcNAc:betaGal（beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 8）、Gcnt2（glucosaminyl (N-acetyl) transferase 2, I-branching enzyme）、1190003J15Rik（RIKEN cDNA 1190003J15 gene）、Cybb（cytochrome b-245, beta polypeptide）、Rab32（RAB32, member RAS oncogene family）、Bcl2a1（B-cell leukemia/lymphoma 2 related protein A1）、Bcl7a（B-cell CLL/lymphoma 7A）、Cmah（cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase）、Dab2（disabled homolog 2）、Fcer1a（Fc receptor, IgE, high affinity I, alpha polypeptide）、Nlrp4c（NLR family, pyrin domain containing 4C）、Rbp1（retinol binding protein 1, cellular）、Stab1（stabilin 1）、Tubb2c（tubulin, beta 2c）、Upp1（uridine phosphorylase 1）、Rc3h2（ring finger and CCCH-type zinc finger domains 2）、Ddx6（DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 6）、Actr1a（ARP1 actin-related protein 1 homolog A）又はCyp1b1（cytochrome P450, family 1, subfamily b, polypeptide 1）で表わされる細胞内に存在するタンパク質（細胞内タンパク質）をコードする遺伝子；【００１４】
March2（membrane-associated ring finger (C3HC4) 2）、Abca1（ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 1）、Ccr2（chemokine (C-C motif) receptor 2）、Cd160（CD160 antigen）、Cd1d2（CD1d2 antigen）、Cd300a（CD300A antigen）、Clec4n（C-type lectin domain family 4, member n）、Cnr2（cannabinoid receptor 2 (macrophage)）、Cr1l（complement component (3b/4b) receptor 1-like）、Crtam（cytotoxic and regulatory T cell molecule）、Csf2rb（colony stimulating factor 2 receptor, beta, low-affinity (granulocyte-macrophage)）、Cxcr6（chemokine (C-X-C motif) receptor 6）、Cd163l1（CD163 molecule-like 1）、Fcgr2b（Fc receptor, IgG, low affinity IIb）、H2-Ea（histocompatibility 2, class II antigen E alpha）、Il27ra（interleukin 27 receptor, alpha）、Itgae（integrin, alpha E, epithelial-associated）、Klrb1f（killer cell lectin-like receptor subfamily B member 1F）、Klrc1（killer cell lectin-like receptor subfamily C, member 1）、Klrc2（killer cell lectin-like receptor subfamily C, member 2）、Klrd1（killer cell lectin-like receptor, subfamily D, member 1）、Pdpn（podoplanin）、Slc2a6（solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 6）、Tmem176a（transmembrane protein 176A）、Tnfrsf14（tumor necrosis factor receptor superfamily, member 14 (herpesvirus entry mediator)）、Tnfrsf25（tumor necrosis factor receptor superfamily, member 25）、Umodl1（uromodulin-like 1）、Vcam1（Vascular cell adhesion molecule 1）、Ebi2（Epstein-Barr virus induced gene 2）、Tmem176b（transmembrane protein 176B）又はIl7r（interleukin 7 receptor alpha chain）で表わされる細胞膜タンパク質をコードする遺伝子；【００１５】
Acpp（acid phosphatase, prostate）、Bmp1（bone morphogenetic protein 1）、Bpil2（bactericidal/permeability-increasing protein-like 2）、Ccl3（chemokine (C-C motif) ligand 3）、Crispld2（cysteine-rich secretory protein LCCL domain containing 2）、Ctsc（cathepsin C）、Gzmc（granzyme C）、Il2（interleukin 2）、Lum（lumican）、Ly86（lymphocyte antigen 86）、Lyz1（lysozyme 1）、Mcpt1（mast cell protease 1）、Mmp10（matrix metallopeptidase 10）、Mmp13（matrix metallopeptidase 13）、Prg4（proteoglycan 4 (megakaryocyte stimulating factor, articular superficial zone protein)）、Rln1（Relaxin 1）、S100a8（S100 calcium binding protein A8 (calgranulin A)）、Tgfbi（transforming growth factor, beta induced）、Timp1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1）又はApol7b若しくはApol7e（apolipoprotein L 7b若しくはapolipoprotein L 7e）で表わされる分泌タンパク質をコードする遺伝子；或いは【００１６】
1200015M12Rik（RIKEN cDNA 1200015M12 gene）、1200016E24Rik（RIKEN cDNA 1200016E24 gene）、1300007F04Rik（RIKEN cDNA 1300007F04 gene）、2010002N04Rik（RIKEN cDNA 2010002N04 gene）、2900073C17Rik（RIKEN cDNA 2900073C17 gene）、4930480G23Rik（RIKEN cDNA 4930480G23 gene）、4933424M12Rik（RIKEN cDNA 4933424M12 gene）、5330403D14Rik（RIKEN cDNA 5330403D14 gene）、5430434G16Rik（RIKEN cDNA 5430434G16 gene）、5830444B04Rik（RIKEN cDNA 5830444B04 gene）、9630026M06Rik（RIKEN cDNA 9630026M06 gene）、A630023P12Rik（RIKEN cDNA A630023P12 gene）、AI426953（expressed sequence AI426953）、AU015263（expressed sequence AU015263）、C030044O21Rik（RIKEN cDNA C030044O21 gene）、C230085N15Rik（RIKEN cDNA C230085N15 gene）、Car13（carbonic anhydrase 13）、Hmga2-ps1（high mobility group AT-hook 2, pseudogene 1）、LOC552902（hypothetical LOC552902）、Rbm10（RNA binding motif protein 10）、Rrad（Ras-related associated with diabetes）、Sbno2（strawberry notch homolog 2）、Speer1-ps1（spermatogenesis associated glutamate (E)-rich protein 1, pseudogene 1）、AK086919（expressed sequence AK086919）、BG071091（expressed sequence BG071091）、AK037075（expressed sequence AK037075）、AK048317（expressed sequence AK048317）、AK081530（expressed sequence AK081530）、AK143436（expressed sequence AK143436）、AW538350（expressed sequence AW538350）、AK138895（expressed sequence AK138895）、AI593283（expressed sequence AI593283）、BM219171（expressed sequence BM219171）、BB204715（expressed sequence BB204715）、AI447357（expressed sequence AI447357）、AK047185（expressed sequence AK047185）、AW491352（expressed sequence AW491352）、AK037546（expressed sequence AK037546）、BG072223（expressed sequence BG072223）、BB283635（expressed sequence BB283635）、BB800733（expressed sequence BB800733）、AK136422（expressed sequence AK136422）、BB309694（expressed sequence BB309694）、AI661001（expressed sequence AI661001）、AK080134（expressed sequence AK080134）、AA982044（expressed sequence AA982044）、AI447438（expressed sequence AI447438）、BB204715（expressed sequence BB204715）、AK041551（expressed sequence AK041551）、AI448729（expressed sequence AI448729）、BE951087（expressed sequence BE951087）、AK157595（expressed sequence AK157595）、AK085158（expressed sequence AK085158）、AK028862（expressed sequence AK028862）、BG076280（expressed sequence BG076280）、BM115076（expressed sequence BM115076）、AK037590（expressed sequence AK037590）、GENSCAN00000037577（expressed sequence GENSCAN00000037577）、AK037171（expressed sequence AK037171）、AK141370（expressed sequence AK141370）、AK031033（expressed sequence AK031033）、AW120969（expressed sequence AW120969）、AI605450（expressed sequence AI605450）、AK138320（expressed sequence AK138320）、AK149443（expressed sequence AK149443）、AK090273（expressed sequence AK090273）、BB043576（expressed sequence BB043576）又はAK036007（expressed sequence AK036007）により表される遺伝子
から選択される少なくとも１つの遺伝子に由来するポリヌクレオチドであるIL-17産生ヘルパーT細胞（Th17細胞）検出用ポリヌクレオチドマーカーである。【００１７】
また、本発明は、少なくとも１つの上記の遺伝子によりコードされるタンパク質からなるTh17細胞検出用タンパク質マーカーも提供する。
さらに、本発明は、細胞を含む試料中で、上記の少なくとも１つのTh17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカー又は少なくとも１つのTh17細胞検出用タンパク質マーカーの存在を検出することを含む、Th17細胞を検出する方法を提供する。
本発明のマーカーは、少なくとも１つのマーカーの存在を検出すれば、Th17細胞を検出できるが、複数のマーカーを検出することによって、より確実にTh17細胞を検出できると考えられる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドマーカー又はタンパク質マーカーを検出することにより、Th17細胞を特異的に検出できる。よって、本発明のマーカーを用いることにより、Th17細胞を単離できる。例えば、本発明のマーカーを用いることにより、患者から採取した組織などの細胞を含む試料におけるTh17細胞を特異的に検出することができるので、該患者がRA、炎症性腸疾患、多発性硬化症のようなTh17細胞が関与すると考えられている自己免疫疾患に罹患している可能性を見出し得る。【００１９】
また、本発明のポリヌクレオチドマーカー又はタンパク質マーカーの発現量は、上記の自己免疫疾患の初期、極期、回復期などの各段階で異なっていると考えられる。よって、本発明のマーカーの発現量を、ELISA法、フローサイトメトリ（FCM）、マイクロアレイなどを用いて測定することにより、病態をモニターできる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】C57/BL6マウス由来Th1、Th2、Treg及びTh17の各細胞における、Il7r遺伝子の発現量を示す図である。
【図２】BALB/cマウス由来ナイーブT細胞から分化培養したTh1、Th2、Treg及びTh17の各細胞の培養上清中の、TIMP-1タンパク質濃度を示す図である。
【図３】抗CD4抗体、抗TNFRSF14抗体、抗IL7R抗体、抗PDPN抗体、及び抗CCR6抗体を用いて、Th17細胞をフローサイトメータで解析して得られた二次元分布図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明のTh17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカーは、上記の遺伝子に由来するポリヌクレオチド、すなわち、上記の遺伝子そのもの（DNA）、mRNA、cDNA又はcRNAである。  また、上記のポリヌクレオチドマーカーは、上記の遺伝子に由来するポリヌクレオチド、その変異型及び断片から選択される。
【００２２】
上記のポリヌクレオチドマーカーは、Th1、Th2及びTreg細胞に比べて、Th17細胞に特異的に存在することが見出されたポリヌクレオチド、その変異型又は断片である。さらに、上記のポリヌクレオチドマーカーは、Th17細胞が関与する疾患のモデルマウスにも特異的に発現することが見出された。ゆえに、少なくとも１つの該ポリヌクレオチドマーカーを検出することにより、Th17細胞をTh1、Th2及びTreg細胞と区別して、特異的に検出することができる。
また、本発明には、上記の遺伝子に由来するポリヌクレオチド及び上記の遺伝子によりコードされるタンパク質を、Th17細胞を検出するためのマーカーとして使用することも含まれる。
【００２３】
本明細書において、「遺伝子」とは、当該技術において一般的に用いられるものと同等の意味を有し、mRNAに転写されてタンパク質に翻訳されるゲノム上の一部分である。
【００２４】
本明細書において、あるポリヌクレオチドがTh17細胞において「特異的に発現する」との表現は、Th17細胞以外の細胞における該ポリヌクレオチドの発現量よりも、Th17細胞における該ポリヌクレオチドの発現量の方が有意に高いことを意味する。具体的には、Th17細胞における該ポリヌクレオチドの発現量が、Th17細胞以外の細胞における該ポリヌクレオチドの発現量の約1.5倍以上、より好ましくは3倍以上であることを意味する。さらに好ましくは、Th17細胞における該ポリヌクレオチドの発現量が、Th1細胞、Th2細胞及びTreg細胞における該ポリヌクレオチドの発現量の約1.5倍以上、より好ましくは約3倍以上である。
【００２５】
本明細書において、あるポリヌクレオチドが疾患モデルマウスにおいて「特異的に発現する」との表現は、健常マウスの組織における該ポリヌクレオチドの発現量よりも、疾患モデルマウスの組織における該ポリヌクレオチドの発現量の方が有意に高いことを意味する。具体的には、疾患モデルマウスの組織における該ポリヌクレオチドの発現量が、健常マウスの組織における該ポリヌクレオチドの発現量の約2倍以上、より好ましくは3倍以上であることを意味する。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドマーカーの塩基配列は、すでに公知である。これらは、例えばUnigene 又はNucleotide（いずれも米国国立医学図書館の国立生物情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）により提供されるデータベース）などから知ることができる。本発明のポリヌクレオチドマーカーの塩基配列の情報は、例えば、以下の表４の「Annotation Mapped Transcripts」に記載のコード番号を用いて、上記のデータベースから得ることができる。
【００２７】
本明細書において、ポリヌクレオチドの「変異型」とは、上記の遺伝子がコードするタンパク質の性質を変化させないような変異が導入されたポリヌクレオチドを意味する。このような変異は、上記の遺伝子の公知の塩基配列からの１若しくは複数のヌクレオチドの欠失又は置換、或いは１若しくは複数のヌクレオチドの付加を含む。
【００２８】
上記の変異型は、上記の各遺伝子の公知の塩基配列と、通常は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、特に好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する。
本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の「相同性」とは、BLASTN、BLASTP、BLASTX又はTBLASTN（例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.govから利用可能）を標準設定で用いて算出される値を意味する。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドマーカーとしての遺伝子によりコードされるタンパク質を検出することにより、Th17細胞を検出することもできる。よって、少なくとも１つの上記の遺伝子によりコードされるタンパク質からなるTh17細胞検出用タンパク質マーカーも、本発明の一つである。
【００３０】
このようなタンパク質マーカーのアミノ酸配列の情報は、上記のUnigeneなどから得られたポリヌクレオチドマーカーの塩基配列に基づいて得ることができる。また、上記のNCBIにより提供されるデータベースから入手することもできる。
【００３１】
上記のTh17細胞検出用タンパク質マーカーは、少なくとも１つの上記の遺伝子によりコードされるタンパク質、その機能的に同等な変異型及びそれらの断片から選択されるものであってよい。
上記のタンパク質の「機能的に同等な変異型」とは、上記のタンパク質の機能を変化させないような変異が導入されたタンパク質を意味する。このような変異は、上記の公知のタンパク質のアミノ酸配列からの１若しくは複数のアミノ酸の欠失又は置換、或いは１若しくは複数のアミノ酸の付加を含む。
上記のタンパク質の機能的に同等な変異型は、上記の各タンパク質の公知のアミノ酸配列と、通常は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、特に好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する。
【００３２】
上記のポリヌクレオチドマーカーに特異的にハイブリダイズできる分子は、上記のマーカーを検出するために用いることができるので、Th17細胞検出用プローブとして有用である。該プローブは、上記のポリヌクレオチドマーカーに特異的にハイブリダイズできるDNA、RNAなどの核酸プローブ、又はペプチドプローブのいずれであってもよい。Th17細胞検出用プローブとしては、ポリヌクレオチドマーカーを検出するための核酸プローブ、特にDNAプローブが好ましい。
【００３３】
本明細書において、ポリヌクレオチドマーカーに「特異的にハイブリダイズできる分子」とは、ストリンジェントな条件下で該ポリヌクレオチドマーカーと二重鎖を形成できる分子を意味する。
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、Th17細胞検出用プローブが標的ポリヌクレオチドマーカーに、該標的ポリヌクレオチドマーカー以外のポリヌクレオチドよりも十分に検出可能な程度（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍を超える）でハイブリダイズできる条件である。なお、ストリンジェントな条件は、通常、配列依存性であり、そして種々の環境において異なる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱的融点（thermal melting point：Tm）よりも、約５℃低くなるように選択される。このTmは、規定されたイオン強度、pHおよび核酸組成の下で、上記の標的ポリヌクレオチドの配列に相補的なプローブの50%が平衡してハイブリダイズする温度である。
【００３４】
このような条件は、従来公知のポリヌクレオチド同士のハイブリダイゼーション法、例えばＰＣＲ法、マイクロアレイ法、サザンブロット法などにおいてポリヌクレオチド同士のハイブリダイゼーションに用いられる条件であってよい。具体的には、pH 7.0〜9.0、塩濃度が約1.5 M Naイオンより低い、より具体的には約0.01〜1.0 M Naイオン濃度（又は他の塩）であり、少なくとも約30℃の条件が挙げられる。より具体的には、例えば、マイクロアレイ法におけるストリンジェントな条件は、37℃で50%ホルムアミド、1 M NaCl、1% SDS中でのハイブリダイゼーション、及び60〜65℃での0.1×SSC中での洗浄を含む。また、ＰＣＲ法におけるストリンジェントな条件は、pH7〜9、0.01〜0.1 MのTris HCl、0.05〜0.15 M Kイオン濃度（又は他の塩）、少なくとも約55℃の条件が挙げられる。
【００３５】
上記のTh17細胞検出用核酸プローブの配列は、当該技術常識及び上記のポリヌクレオチドマーカーの配列に基づいて、上記のポリヌクレオチドマーカーに特異的にハイブリダイズできるように、当業者が適宜決定できる。
上記のTh17細胞検出用核酸プローブは、例えば、一般に利用可能なプライマー設計ソフトウェア（例えば、Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgiから利用可能)やDNASIS Pro (日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社)）を用いて設計できる。
【００３６】
上記のTh17細胞検出用核酸プローブは、当該技術において公知のポリヌクレオチドの合成方法により作製できる。
【００３７】
上記のTh17細胞検出用核酸プローブは、当該技術において通常用いられる標識物質により標識されていてもよい。標識されたTh17細胞検出用核酸プローブを用いることにより、Th17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカーの検出、すなわちTh17細胞の検出を簡便に行うことができる。
上記の標識物質は、32Ｐのような放射性同位体、フルオレセインのような蛍光物質、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼのような酵素、ビオチンなどの当該技術において通常用いられる標識物質であり得る。
【００３８】
上記のTh17細胞検出用核酸プローブは、１種のみを用いるか、又は複数種を組み合わせて用いることにより、Th17細胞を特異的に検出できる。
上記のTh17細胞検出用核酸プローブは、例えば、ＰＣＲ法により上記のポリヌクレオチドマーカーを増幅するための２種以上のプライマーのセットであり得る。
【００３９】
上記の核酸プローブを、核酸と結合可能な固相に固定化したTh17細胞検出用マイクロアレイも、本発明の一つである。
このようなマイクロアレイの作製方法は、当該技術において公知である。すなわち、核酸と結合可能である固相（例えば、ポリスチレンなど）又は核酸と結合可能になるように表面処理した固相、好ましくは陽イオンを有する官能基（例えば、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基など）を有するように表面処理した固相に所望の核酸プローブをスポットし、乾燥させる方法、上記の固相上で所望の配列の核酸プローブを合成する方法などが挙げられる。また、活性化エステル化したカルボキシル基を固相表面に導入し、そこに末端にアミノ基を導入した核酸を反応させる方法も挙げられる。
【００４０】
上記のマイクロアレイに結合させる核酸プローブは、試料中の標的遺伝子とのハイブリッド形成を電気的又は光学的に検出することを可能にする標識物質で標識されていてよい。このような標識は、当該技術において公知である。
【００４１】
上記のタンパク質マーカーに特異的に結合できる分子は、上記のマーカーを検出するために用いることができるので、Th17細胞を検出するために有用である。このような分子は、タンパク質マーカーに特異的に結合できるDNA、RNAなどの核酸アプタマー、抗体などのいずれであってもよいが、より好ましくは抗体である。また、Th17細胞特異的マーカーが酵素の場合、該酵素に基質を作用させて発色、発光、蛍光などを生じさせることにより、検出することができる。
【００４２】
上記のTh17細胞検出用抗体は、例えば次のような従来公知の手順により作製できる。上記のポリヌクレオチドマーカーの遺伝子の塩基配列又はタンパク質マーカーのアミノ酸配列に基づいて、タンパク質マーカーのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA分子を適切な発現ベクターに導入する。得られた発現ベクターを適切な宿主細胞に導入し、得られた形質転換細胞を培養して、目的のタンパク質を得る。得られたタンパク質を精製して免疫原とし、免疫原と所望によりアジュバントとを用いて、適切な哺乳動物、例えばラット、マウスなどを免疫する。免疫された動物の脾臓細胞などから、目的の免疫原に対する抗体を産生する抗体産生細胞をスクリーニングにより選択する。得られた抗体産生細胞を、ミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを得て、これをスクリーニングすることにより、上記の遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的結合性を有する抗体を産生する抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。得られた抗体産生ハイブリドーマを培養することにより、目的の抗体を得ることができる。
【００４３】
上記のTh17細胞を検出するために用いることができる核酸アプタマーは、例えば次のような従来公知の手順により作製できる。ランダムな核酸の塩基配列を有する核酸ライブラリーを公知の手法により作成し、試験管内進化法（SELEX法）などにより標的のタンパク質（上記のタンパク質マーカー）に特異的に結合できるアプタマーを選択することができる。
【００４４】
上記のTh17細胞検出用タンパク質マーカーに特異的に結合できる分子は、当該技術において通常用いられる標識物質により標識されていてもよい。標識されたTh17細胞検出用抗体を用いることにより、Th17細胞検出用タンパク質マーカーの検出、すなわちTh17細胞の検出を簡便に行うことができる。
上記の標識物質は、32Ｐのような放射性同位体、フルオレセインのような蛍光物質、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼのような酵素、ビオチンなどの当該技術において通常用いられる標識物質であり得る。
【００４５】
細胞を含む試料中で、少なくとも１つの上記のTh17細胞検出用ポリヌクレオチドマーカー又はTh17細胞検出用タンパク質マーカーの存在を検出することによりTh17細胞を検出する方法も、本発明の一つである。
本発明の方法において、細胞を含む試料としては、ヒトを含む哺乳動物から採取した生体試料又は人工的に培養した細胞を含む試料が挙げられる。生体試料としては、血液、組織、関節液、脳脊髄液、胸水、腹水などが挙げられる。
【００４６】
上記のポリヌクレオチドマーカーの存在を検出する方法のある実施形態について説明する。
まず、細胞を含む試料から、フェノール抽出及びエタノール沈殿、市販のDNA抽出キットなどを用いる当該技術において公知の方法により核酸（DNA又はRNA）を抽出する。
次いで、得られた核酸試料中の上記のポリヌクレオチドマーカーの存在を検出する。この検出においては、上記のTh17細胞検出用核酸プローブを用いることが好ましい。
上記のポリヌクレオチドマーカーは、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法のような核酸増幅法、サザンハイブリダイゼーション、ノザンハイブリダイゼーション、ＦＩＳＨ（蛍光in situハイブリダイゼーション）のようなハイブリダイゼーション法、マイクロアレイ法などの当該技術において公知の方法により検出できる。これらの方法を、上記のストリンジェントな条件下で行い、上記のTh17細胞検出用核酸プローブがハイブリッドを形成したことを上記の標識物質を検出することなどにより検出して、ポリヌクレオチドマーカーの存在を検出できる。
【００４７】
また、上記のマイクロアレイを用いることにより、核酸試料中の上記のポリヌクレオチドマーカーの存在を検出することもできる。
【００４８】
次に、上記のTh17細胞検出用タンパク質マーカーの存在を検出する方法のある実施形態について説明する。例えば、検出対象であるタンパク質マーカーが細胞内部に存在するタンパク質である場合、当該技術において公知の方法を用いて、細胞からタンパク質を抽出する。細胞からのタンパク質の抽出は、超音波による細胞の破砕、細胞可溶化液を用いる可溶化などの公知の方法により行うことができる。そして、タンパク質マーカーに特異的に結合する分子を用いて、得られたタンパク質試料中の上記のタンパク質マーカーを検出することができる。具体的には、タンパク質マーカーは、酵素結合免疫吸着法（ELISA）、ウェスタンブロッティング法などの当該技術において公知の方法により検出できる。検出において、タンパク質マーカーに特異的に結合する分子は、上記のTh17細胞検出用抗体を用いることが好ましい。
【００４９】
例えば、検出対象であるタンパク質マーカーが分泌タンパク質である場合、タンパク質マーカーに特異的に結合する分子を用いて、上記細胞を含む試料中に分泌されたタンパク質マーカーを検出することができる。また、上記細胞を含む試料から細胞（リンパ球）を採取し、抗CD3抗体、抗CD28抗体、コンカナバリンA、PHA（フィトヘマグルチニン）、PMA（ホルボールミリステートアセテート）、イオノマイシンなどを用いて、採取した細胞を刺激する。そして、タンパク質マーカーに特異的に結合する分子を用いて、分泌されたタンパク質マーカーを検出することができる。具体的には、タンパク質マーカーは、ELISA、ウェスタンブロッティング法などの当該技術において公知の方法により検出できる。検出において、タンパク質マーカーに特異的に結合する分子は、上記のTh17細胞検出用抗体を用いることが好ましい。
【００５０】
例えば、検出対象であるタンパク質マーカーが細胞の表面に存在するタンパク質である場合、タンパク質マーカーに特異的に結合する分子を用いて、上記細胞を含む試料中の細胞の表面に存在するタンパク質マーカーを検出することができる。また、上記細胞を含む試料から細胞の膜画分を採取し、タンパク質マーカーに特異的に結合する分子を用いて、得られた膜画分中の上記のタンパク質マーカーを検出することができる。具体的には、酵素結合免疫吸着法（ELISA）、ウェスタンブロッティング法などの当該技術において公知の方法により検出できる。また、検出対象であるタンパク質マーカーが細胞の表面に存在するタンパク質である場合、フローサイトメトリ（FCM）に基づく方法により検出することもできる。検出において、タンパク質マーカーに特異的に結合する分子は、上記のTh17細胞検出用抗体を用いることが好ましい。
【００５１】
例えば、FCMによりタンパク質マーカーを検出する場合、次のような手順で検出を行うことができる。
まず、細胞を含む試料を、適切な標識物質で標識された上記のTh17細胞検出用抗体と接触させる。存在するのであればTh17細胞は、この標識された抗体と細胞表面で結合する。よって、標識物質と結合した細胞を含む試料をフローサイトメータに通すことにより、Th17細胞を検出できる。また、所望により標識物質と結合したTh17細胞を、セルソーターを用いて弁別および／または分取することもできる。
このようなFCMの方法は、それ自体当業者に公知であり、反応の条件は当業者により適宜決定される。
【実施例】
【００５２】
本発明を、実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１
本例では、まず、マイクロアレイ発現解析により、培養Th17細胞において特異的に発現する遺伝子を選択した。次に、選択された遺伝子の中から、リアルタイムPCRによる発現解析により、３種類の疾患モデルマウス（関節炎、炎症性腸疾患及び脳脊髄炎）において特異的に発現する遺伝子を特定した。【００５３】
（１）培養Th17細胞での発現解析
1-1．マウス脾臓からのナイーブT細胞の単離
BALB/cマウス脾臓を摘出し、脾臓細胞を含む試料を得た。塩化アンモニウムを用いて試料中の赤血球を溶血した後、磁気ビーズ（Polyscience社製）を用いて試料からCD8、B細胞、単球、マクロファージ、顆粒球及び赤芽球の細胞分画を除去して、CD4陽性（CD4+）T細胞を粗精製した。得られたCD4+T細胞から、フローサイトメータを用いたソーティングによりナイーブT細胞の画分（CD4+/CD25neg/CD44low/CD62high）を純化した。同様にして、C57/BL6マウスの脾臓細胞からナイーブT細胞を純化した。【００５４】
1-2．ナイーブT細胞からTh1、Th2、Treg及びTh17細胞への分化培養
上記の１．で得られたBALB/cマウス由来ナイーブT細胞を、抗CD3抗体をコーティングした24ウェルプレートに、0.5〜2.0×106細胞／2 ml／ウェルの細胞密度で播種した。表１に示す各サイトカイン及び抗体、並びに抗CD28抗体を添加したT細胞培地（PRMI1640、10%ウシ胎児血清（FBS）、10 mM HEPES、1 mMピルビン酸ナトリウム、2 mM L-グルタミン酸、50μM 2-メルカプトエタノール、100 U/mlペニシリン、100 mg/mlストレプトマイシン）中で、細胞を37℃、5% CO2のインキュベータ内で培養した。培養開始から３日後に、表１のサイトカイン及び抗体を培地に添加し、さらに２〜１１日間培養した。このようにして、BALB/cマウス由来ナイーブT細胞からTh1、Th2、Treg及びTh17細胞への分化を誘導した。
また、同様にして、上記の１．で得られたC57/BL6マウス由来ナイーブT細胞からTh1、Th2、Treg及びTh17細胞への分化を誘導した。【００５５】
【表１】
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【００５６】
1-3．フローサイトメータによる細胞分化の確認
上記の２．のようにして分化培養した各細胞（それぞれ2.5×105細胞）を含む細胞懸濁液に、ホルボールミリステートアセテート（PMA；50 ng/ml）及びイオノマイシン（1μM）を加えて細胞を刺激した。４時間後にブレフェルディンA（10μg/ml）を添加して、さらに２時間培養した。その後、各細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定した。固定後、サポニン緩衝液（0.5%サポニン、0.5%ウシ血清アルブミン（BSA）、1 mMアジ化ナトリウム（PBS中））で各細胞を処理して細胞膜の透過性を亢進させた。そして、細胞に抗IFN-γ抗体、抗IL-4抗体及び抗IL-17抗体を反応させた。反応後、各細胞をサポニン緩衝液、次いで0.5% BSA含有PBSで洗浄し、FACS Canto II（BDバイオサイエンス社）を用いて解析して、Th1、Th2、Treg及びTh17の各細胞への分化を確認した。【００５７】
1-4．トータルRNAの抽出
上記の２．で５日間培養したBALB/cマウス由来Th1、Th2、Treg及びTh17の各細胞をPBSで洗浄後、遠心してペレットにし、−80℃にて凍結保存した。RNeasy Plus Mini Kit（QIAGEN社）を用いてペレットからトータルRNAを抽出し、解析まで−80℃にて保管した。同様にして、上記の２．で５日間培養したC57/BL6マウス由来Th1、Th2、Treg及びTh17の各細胞から、トータルRNAを抽出した。
なお、このトータルRNA抽出は、上記キットの添付文書の記載に従って行った。【００５８】
1-5．マイクロアレイ発現解析
One-Cycle Target Labeling and Control Reagents（Affymetrix社）を用いて、上記の４．で抽出したトータルRNA（1〜5μg）をcDNAに逆転写し、さらにビオチン化cRNAへの転写反応を行った。15μgのビオチン化cRNAをGeneChip Mouse Genome 430 2.0 Array（Affymetrix社）に加え、GeneChip Hybridization Oven 640（Affymetrix社）中で45℃、60 rpmの条件下で16時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、GeneChip Fluidic Station 450（Affymetrix社）を用いて洗浄及び蛍光標識を行ったマイクロアレイ（DNAチップ）を、GeneChip Scanner 3000 7G（Affymetrix社）を用いてスキャンし、蛍光強度のデータを取得した。
なお、上記の各操作は、各試薬及び装置の添付文書の記載に従って行った。【００５９】
1-6．マウスTh17細胞に特異的に発現する遺伝子の選択
上記の５．で得られた蛍光強度のデータに基づいて、発現解析ソフトウェアArray Assist（株式会社メディビックグループ）を用いてデータを標準化した。そして、各遺伝子の蛍光強度を、ハウスキーピング遺伝子の1つであるグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（Gapdh）遺伝子の蛍光強度で除して相対蛍光強度を算出した。Th17細胞の各遺伝子の相対蛍光強度を、Th1、Th2及びTreg細胞のものと比較した。そして、BALB/cマウス及びC57/BL6マウスの少なくともいずれか一方において、Th17細胞における相対蛍光強度が、Th1、Th2又はTreg細胞のいずれからも３倍以上高い128個の遺伝子を選択した（結果は示さず）。【００６０】
（２）疾患モデルマウスの作製とトータルRNAの調製
2-1．SKG関節炎モデルマウスの作製
以下の方法により関節炎モデルマウスを作製した。
（ｉ）菌体成分の調製
ラミナリン（laminarin from Laminaria digitata、SIGMA社）を150 mg/mlとなるようにPBS(リン酸バッファー)中に溶解した。カードラン（curdlan from Alcaligenes faecalis、SIGMA社）を50 mg/mlとなるようにPBS(リン酸バッファー)に懸濁した。
（ii）菌体成分の投与
7〜8週齢のSKG関節炎自然発症マウス（雌性）に、（ｉ）で調製したラミナリン（30mg/200μl/mouse）又はカードラン(10mg/200μl/mouse）を腹腔内投与した。さらに、４週間後に（ｉ）で調製したカードラン（10mg/200μl/mouse）を腹腔内投与した。【００６１】
（iii）関節炎の重症度の判定
上記菌体成分投与後30日目以降に関節炎症状が出現する。重症度スコアを以下のように判定した。
スコア0：正常
スコア0.1：指関節部位が腫脹と紅斑
スコア1：足関節部位が軽度な腫脹と紅斑
スコア２：手足関節部位が重度な腫脹と紅斑
四肢のスコアを合計し、その値が9以上の個体を解析に使用した。
（iv）関節組織の摘出とトータルRNAの抽出
ハサミで関節部位の皮膚を除き、足趾を切離して足関節部組織を摘出した。採取した足関節部組織を液体窒素内で凍結保存した。凍結した足関節部組織からRNeasy Plus Mini kit（QIAGEN社）とQIAshredder（QIAGEN社）を用いてトータルRNAを抽出した。
なお、このトータルRNA抽出は、各キットの添付文書の記載に従って行った。【００６２】
2-2．SCID移植大腸炎モデルマウス（腸炎モデルマウス）の作製
以下の方法により大腸炎モデルマウスを作製した。
（ｉ）ナイーブCD4 T細胞の調製
8〜10週齢のBALB/cマウス脾臓を摘出し、脾臓細胞を含む試料を得た。塩化アンモニウムを用いて試料中の赤血球を溶血した後、磁気ビーズ（Polyscience社製）を用いて試料からCD8、B細胞、単球、マクロファージ、顆粒球及び赤芽球の細胞分画を除去して、CD4陽性（CD4+）T細胞を粗精製した（試料A）。得られたCD4+T細胞から、フローサイトメータを用いたソーティングによりナイーブT細胞の画分（CD4+/CD25neg/CD44low/CD62high又はCD4+/CD45RBhigh細胞）を純化した。
（ii）ナイーブCD4 T細胞の投与
8〜10週齢のC.B.17/Icr-Prkdc(scid) / CrlCrljマウス（SCIDマウス）に、分取したナイーブCD4 T細胞（5×105 cells/300μl/mouse）を腹腔内投与した。
（iii）発症の確認
ナイーブCD4 T細胞投与後、マウス体重変化を観察した。約4週間後以降に腸炎惹起に伴う体重減少が観察された。初期体重の80%以下まで体重が減少した個体を腸炎が重症化した個体と判定した。
（iv）腸管組織摘出とトータルRNAの抽出
重症個体から大腸を摘出し、大腸から上行結腸、横行結腸及び下行結腸部位に相当する3断片を分離し、液体窒素内で凍結保存した。凍結した腸管組織からRNeasy Plus Mini kit（QIAGEN社）とQIAshredder（QIAGEN社）を用いてトータル RNAを抽出した。
なお、このトータルRNA抽出は、各キットの添付文書の記載に従って行った。【００６３】
2-3．実験的脳脊髄炎（experimental allergic encephalomyelitis: EAE）（急性型）モデルマウス（脳炎モデルマウス）の作製
以下の方法により急性型EAEモデルマウスを作製した。
（ｉ）抗原エマルジョンの作成
不完全フロインド・アジュバント（Difco Laboratories）と結核菌体成分Mycobacterium Tuberculosis H37Ra（Difco Laboratories）を混合して、完全フロインド・アジュバント(CFA)（20 mg/ml）を作製した。PLP(139-151)ペプチド（Bio-systhesis, Inc.）(2 mg/ml、PBS(リン酸バッファー)に溶解)とCFAを等量混合し，ダブルハブニードル（ダブルハブニードルセット、テクノケミカル株式会社）を用いてシリンジを往復させて混和し、抗原エマルジョンを作製した。
（ii）抗原エマルジョンの投与
8〜10週齢のSJLマウス（メス）の背部の毛をバリカンを用いて剃り、正中線の左右2箇所の腰部皮下に抗原エマルジョンを1ml シリンジを用いて各部位に50μlずつ注入した（計100μl）。同日に、百日咳毒素Pertussis Toxin（List Biological Laboratories）（100ngを 200μl PBSに溶解）を腹腔内投与した。また、脳脊髄炎モデルマウスに対する健常マウスとしては、百日咳毒素Pertussis Toxinのみを投与したSJLマウスを用いた。
（iii）脳脊髄炎の重症度の判定
上記抗原エマルジョン投与後10〜21日目に脳脊髄炎症状が出現する。重症度スコアを以下のように判定した。
スコア1：尻尾の完全麻痺
スコア2：後肢の部分的麻痺
スコア3：後肢の完全麻痺
スコア4：前肢の麻痺
スコア5：全身麻痺による瀕死状態・死亡
解析にはスコア2以上の個体を使用した。
（iv）脳脊髄組織の抽出とトータルRNAの抽出
頭部より頭蓋骨を除去して脳を摘出した。また、頭部及び尾部を切り離した脊柱を取り出し、尾椎の椎孔から注射器を用いてPBSを入れ、圧力によって脊髄を摘出した。採取した脳及び脊髄を液体窒素内で凍結した。凍結した脳脊髄組組織をホモジナイザー（アズワン株式会社）により粉砕し、RNeasy Plus Mini kit（QIAGEN社）とQIAshredder（QIAGEN社）を用いてトータルRNAを抽出した。
なお、このトータルRNA抽出は、各キットの添付文書の記載に従って行った。【００６４】
（３）疾患モデルマウスにおける遺伝子のリアルタイムPCRによる発現解析
上記の（２）のようにして調製した各疾患モデルマウスの組織サンプルより抽出したトータルRNA（2.0〜5.0μg）を、poly dTプライマー（北海道システムサイエンス株式会社）、ランダムプライマー（北海道システムサイエンス株式会社）及びスーパースクリプトIII逆転写酵素（Invitrogen Corporation）を用いて逆転写して、cDNAを得た。また、上記（１）で選択した各遺伝子に対応するプライマーセットを作製した。そして、得られたcDNAをテンプレートとして、各プライマーセットを用い、Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems社）及び7300 Real Time PCR System（Applied Biosystems社）により、遺伝子の発現量（threshold cycle：Ct値）を測定した。さらに、各サンプル間の比較を行うために、Gapdh遺伝子を内部標準遺伝子としてデータ補正を行った。そして、次式から得られた値を各遺伝子の発現量を表す数値とした。
（各遺伝子の発現量）＝ 100000 × 2-x
（但し、ｘ＝ (各遺伝子Ct値)−(Gapdh遺伝子Ct値)）
なお、上記の各操作は、各試薬及び装置の添付文書の記載に従って行った。
また、上記のプライマーセットは、Primer3ソフトウェアを用いて設計した。【００６５】
また、疾患モデルマウスの代わりに、下記の健常マウスを用いて、同様の実験を行った。
関節炎モデルマウスに対する健常マウス：BALB/cマウス２個体。
大腸炎モデルマウスに対する健常マウス：ナイーブCD4 T細胞分離前のCD4 T細胞（試料A）を腹腔内投与したSCIDマウス2個体、培地を腹腔内投与したSCIDマウス2個体、及びBALB/cマウス2個体の計6個体。
脳脊髄炎モデルマウスに対する健常マウス：百日咳毒素Pertussis Toxinを腹腔内投与したSJLマウス３個体。【００６６】
さらに、参考として、従来Th17細胞において特異的に発現していることが知られている遺伝子（Il23r、Il17f及びIl19）についても、プライマーセットを設計し、上記と同様に実験を行った。【００６７】
（４）解析
上記の（３）のようにして発現量を解析した各遺伝子について、「疾患モデルマウスでの発現量の値（A）〜（C）」及び「健常マウスでの発現量に対する疾患モデルマウスでの発現量の比（A）〜（C）」を、下記のとおりに算出した。
4-1．関節炎モデル
解析個体数：健常マウス2個体、関節炎モデルマウス3個体
解析サンプル：後肢関節部組織(各個体につき左右1つずつ)
（ｉ）健常マウスでの発現量に対する関節炎モデルマウスでの発現量の比（A）の算出
健常マウスから得た4サンプル（2個体×左右の後肢関節部組織）の発現量の平均値を算出した。
健常マウスでの平均発現量に対する関節炎モデルマウスでの発現量の比「（関節炎モデルマウスの発現量）/（健常マウスの平均発現量）」を、6サンプル（3個体×左右の後肢関節部組織）それぞれについて算出した。
上記で算出した発現量の比について、6サンプルの平均値を計算し、これを最終的な健常マウスでの発現量に対する関節炎マウスの発現量の比（A）とした。
（ii）関節炎モデルマウスでの発現量（A）の算出
関節炎モデルマウスから得た6サンプル（3個体×左右の後肢関節部組織）の発現量（Ct値）の平均値を算出し、これを関節炎モデルマウスでの発現量（A）とした。【００６８】
4-2．大腸炎モデル
解析個体数：健常マウス6個体、大腸炎モデルマウス3個体
解析サンプル：上行結腸、横行結腸及び下行結腸に相当する大腸3部位
（ｉ）健常マウスでの発現量に対する大腸炎モデルマウスでの発現量の比（B）の算出
大腸3部位ごとに、健常マウス6個体の発現量の平均値、及び大腸炎モデルマウス3個体の発現量の平均値を算出した。
健常マウスでの平均発現量に対する大腸炎モデルマウスでの平均発現量の比「（大腸炎モデルマウスの平均発現量）/（健常マウスの平均発現量）」を、大腸3部位について算出した。  上記で算出した大腸3部位の発現量の比のうち最大のものを、最終的な健常マウスでの発現量に対する大腸炎モデルマウスの発現量の比（B）とした。
（ii）大腸炎モデルマウスでの発現量（B）の算出
上記（ｉ）で大腸炎モデルマウスの発現量の比（B）の値を示した部位における、大腸炎モデルマウス3個体の発現量の平均値を、最終的な大腸炎モデルマウスの発現量（B）とした。【００６９】
4-3．脳脊髄炎モデル
解析個体数：健常マウス3個体、脳脊髄炎モデルマウス3個体
解析サンプル：脳、脊髄頭部側半分、及び脊髄尾部側半分の計3部位
（ｉ）健常マウスでの発現量に対する脳脊髄炎モデルマウスでの発現量の比（C）の算出
各3部位において、健常マウス3個体の発現量の平均値、脳脊髄炎モデルマウス3個体の発現量の平均値を算出した。
健常マウスの平均発現量に対する脳脊髄炎モデルマウスの平均発現量の比「（脳脊髄炎モデルマウスの平均発現量）/（健常マウスの平均発現量）」を、各3部位について算出した。
上記で算出した3部位の発現量の比のうち最大のものを、最終的な健常マウスでの発現量に対する脳脊髄炎モデルマウスの発現量の比（C）とした。
（ii）脳脊髄炎モデルマウスでの発現量（C）の算出
上記（ｉ）で脳脊髄炎モデルマウスの発現量の比（C）の値を示した部位における、脳脊髄炎モデルマウス3個体の発現量の平均値を、最終的な脳脊髄炎モデルマウスの発現量（C）とした。【００７０】
（５）結果
Th17培養細胞において特異的に発現する遺伝子として選択した128個の遺伝子の中から、健常マウスでの発現量に対する疾患モデルマウスでの発現量の比が2倍以上の遺伝子（すなわち、上記（４）で得られた発現量の比（A）〜（C）のすべてが２以上の値を示す遺伝子）を、表２に示す。
これら27個の遺伝子は、Th17細胞が関与する疾患モデルマウスで特異的に発現している遺伝子として同定した。このようにして同定された27個の遺伝子について、上記（４）で算出された発現量の値（A）〜（C）と発現量の比（A）〜（C）とを、表２に示す。さらに、従来Th17細胞において特異的に発現していることが知られている遺伝子（Il23r、Il17f及びIl19）についての結果は、（比較）として表２に示す。また、同定された27個の遺伝子について、上記（３）で用いたプライマーセットを表３に示す。
表２の27個の遺伝子のうち、Ccl20、Il17a、Il22及びRORγt（表２中に斜体で示す）は、Th17細胞において特異的に発現していることが知られている遺伝子である。従って、これら4個の遺伝子を除く23個の遺伝子が、Th17細胞で特異的に発現し且つTh17細胞が関与する疾患モデルマウスでも特異的に発現している遺伝子として今回新たに同定された。
そして、今回同定された23個の遺伝子は、Th17細胞の検出に有用な新規マーカーであると考えられる。また、これらの遺伝子のうち、発現量の高い（好ましくは発現量が1000以上、より好ましくは10000以上）ものほど、マーカーとして有望であると考えられる。【００７１】
【表２】
2010024289.tif 000003
【００７２】
【表３】
2010024289.tif 000004
【００７３】
実施例２
本例では、まず、マイクロアレイ発現解析により、Th17培養細胞において特異的に発現する遺伝子を選択した。次に、選択された遺伝子の中から、マイクロアレイ発現解析により、３種類の疾患モデルマウス（関節炎、炎症性腸疾患及び脳脊髄炎）において特異的に発現する遺伝子を特定した。【００７４】
（１）培養Th17細胞での発現解析
実施例１（１）と同様にして培養Th17細胞での発現解析を行い、Th17細胞における発現が、Th1細胞、Th2細胞及びTreg細胞のいずれからも1.5倍以上高い遺伝子586個を選択した（結果は示さず）。【００７５】
（２）疾患モデルマウスにおける遺伝子のマイクロアレイによる発現解析
次に、マイクロアレイを用いて、上記（１）で選択した586遺伝子の疾患モデルマウスにおける発現解析を行った。
具体的には、実施例１（２）と同様にして、まず上記3つの疾患モデルマウス（関節炎、腸炎及び脳炎）から組織サンプルを採取し、採取した組織サンプルからトータルRNAを抽出した。
次に、One-Cycle Target Labeling and Control Reagents（Affymetrix社）、又はTwo-CycleTarget Labeling and Control Reagents (Affymetrix社)を用いて抽出したトータルRNA（One-cycleの場合1〜5μg、Two-Cycleの場合10〜100μg）を、取扱説明書に従いcDNAに逆転写し、さらにビオチン化cRNAへの転写反応を行った。15μgのビオチン化cRNAをGeneChip Mouse Genome 430 2.0 Array（Affymetrix社）に入れ、GeneChip Hybridization Oven 640（Affymetrix社）中で45℃、60 rpmの条件下で16時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、GeneChip Fluidic Station 450（Affymetrix社）を用いて洗浄及び蛍光標識を行ったマイクロアレイをGeneChip Scanner 3000 7G（Affymetrix社）を用いてスキャンし、蛍光強度データを取得した。
また、疾患モデルマウスの代わりに、実施例１に記載したような健常マウスを用いて、同様の実験を行った。【００７６】
（３）解析
得られた蛍光強度のデータに基づいて、発現解析ソフトウェアArray Assist（株式会社メディビックグループ）を用いてデータを標準化し、各遺伝子の蛍光強度を、Gapdh遺伝子の蛍光強度で除して相対蛍光強度（relative fluorescence units：RFU）を算出した。このようにして、関節炎モデルマウスについて算出した相対蛍光強度を関節炎モデルマウスでの発現量（D）とし、大腸炎モデルマウスについて算出した相対蛍光強度を大腸炎モデルマウスでの発現量（E）とし、脳脊髄炎モデルマウスについて算出した相対蛍光強度を脳脊髄炎モデルマウスでの発現量（F）とした。
次に、健常マウスにおける各遺伝子の発現による相対蛍光強度を、疾患モデルマウスのものと比較し、健常マウスの相対蛍光強度に対する疾患モデルマウスの相対蛍光強度の比「（疾患モデルマウスの相対蛍光強度）／（健常マウスの相対蛍光強度）」を算出した。このようにして関節炎モデルマウスについて算出した相対蛍光強度の比を、健常マウスでの発現量に対する関節炎マウスの発現量の比（D）とした。大腸炎モデルマウスについて算出した相対蛍光強度の比を、健常マウスでの発現量に対する大腸炎マウスの発現量の比（E）とした。脳脊髄炎モデルマウスについて算出した相対蛍光強度の比を、健常マウスでの発現量に対する脳脊髄炎マウスの発現量の比（F）とした。【００７７】
（４）結果
Th17培養細胞において特異的に発現する遺伝子として選択した586個の遺伝子の中から、健常マウスでの発現量に対する疾患モデルマウスでの発現量の比が2倍以上の遺伝子（すなわち、上記（３）で得られた発現量の比（D）〜（F）のすべてが２以上の値を示す遺伝子）を、表４に示す。
これらの150個の遺伝子は、Th17細胞が関与する疾患モデルマウスで特異的に発現している遺伝子として同定された。このようにして同定された150個の遺伝子について、測定された発現量の値（D）〜（F）と算出された発現量の比（D）〜（F）とをあわせて、表４に示した。さらに、表４には、各遺伝子のUnigeneコード、各遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を示すNCBIコード、遺伝子シンボル及びAnnotation Mapped Transcriptsも示した。【００７８】
表４に示す150遺伝子のうち、Th17細胞において特異的に発現していることが現在までに知られている遺伝子は、Gpr15、Ccl20、Il17a、Il21及びIl22（表４中に斜体で示す）である。従って、これら５個の遺伝子を除く145個の遺伝子が、Th17培養細胞で特異的に発現し且つTh17細胞が関与する疾患モデルマウスで特異的に発現している遺伝子として今回新たに同定された。そして、今回同定された145個の遺伝子は、Th17細胞の検出に有用な新規マーカーであると考えられる。また、これらの遺伝子のうち、発現量の高い（好ましくは発現量が1000以上、より好ましくは10000以上）ものほど、マーカーとして有望であると考えられる。【００７９】
【表４−１】
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【００８０】
【表４−２】
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【００８１】
【表４−３】
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【００８２】
【表４−４】
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【００８３】
【表４−５】
2010024289.tif 000009
【００８４】
これらの結果から、表４に示す各遺伝子が、Th17細胞において特異的に発現していることが従来知られている表４に斜体で示す5個の遺伝子と同様に、Th17細胞及びTh17細胞が関与し得る疾患のモデルマウスにおいて特異的に発現していることが示された。【００８５】
以上のことから、表２及び表４に示す各遺伝子を、ＰＣＲ法などの当該技術において公知の方法を用いて検出することにより、また、これらの遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を、ELISA法、マイクロアレイを用いる方法、フローサイトメータを用いる方法などの当該技術において公知の方法を用いて検出することにより、Th17細胞を特異的に検出することができると考えられる。【００８６】
実施例３
本例では、培養Th細胞のIl7r遺伝子発現量を、リアルタイムPCR解析を用いて測定した。【００８７】
実施例１の1-4．で得られたトータルRNA（2.5μg）を、poly dTプライマー（北海道システムサイエンス株式会社）、ランダムプライマー（北海道システムサイエンス株式会社）及びスーパースクリプトIII逆転写酵素（Invitrogen Corporation）を用いて逆転写して、cDNAを得た。また、Il7r遺伝子に対応するプライマーセットを作製した。そして、得られたcDNAをテンプレートとして、このプライマーセットを用い、Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems社）及び7300 Real Time PCR System（Applied Biosystems社）により、Il7r遺伝子のCt値を測定した。
なお、上記の各操作は、各試薬及び装置の添付文書の記載に従って行った。また、上記のプライマーセットは、Primer3ソフトウェアを用いて設計した。表５に、Il7r遺伝子及びGapdh遺伝子のプライマーセットの配列を示す。【００８８】
【表５】
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【００８９】
各サンプル間の比較を行うために、Gapdh遺伝子を内部標準遺伝子として同様にCt値を求めた。そして、次式から得られた値をIl7r遺伝子の発現量を表す数値とした。
（Il7r遺伝子の発現量）＝ 100000 × 2-x
（但し、ｘ＝ (Il7r遺伝子Ct値)−(Gapdh遺伝子Ct値)）
図１に、C57/BL6マウス由来Th1、Th2、Treg及びTh17の各細胞における、Il7r遺伝子の発現量を示す。【００９０】
図１から明らかなように、Il7r遺伝子は、Th17細胞において強く発現していることが分かる。このことから、Il7r遺伝子をマーカーとして、Th17細胞を検出することができることが示された。【００９１】
実施例４
本例では、BALB/cマウス由来ナイーブT細胞から分化培養したTh1、Th2、Treg及びTh17細胞の培養上清中のTIMP-1タンパク質濃度をELISA法で測定した。【００９２】
測定には、mouse TIMP-1 DuoSet ELISA Development kit(R&D Systems社)を用いた。なお、ブロッキング液にカゼイン(SIGMA-Aldrich社)を終濃度が0.5%となるように添加し、発光基質としてFEMTOGLOW Plus(Michigan Diagnostics LLC社)を用いたペルオキシダーゼ化学発光系で検出を行ったこと以外は、前記キットの添付文書の記載に従って行った。【００９３】
Th1及びTh2細胞のそれぞれ32サンプル、並びにTreg及びTh17細胞のそれぞれ28サンプルの測定を行い、測定値の各細胞間における有意差（p値）をMann-Whitney検定により求めた。この結果を図２に示す。【００９４】
図２から明らかなように、TIMP-1タンパク質は、Th17細胞において多く分泌していることが分かる。このことから、TIMP-1タンパク質をマーカーとして、Th17細胞を検出することができることが示された。【００９５】
実施例５
本例では、抗TNFRSF14抗体、抗IL7R抗体及び抗PDPN抗体を用いたTh17細胞のフローサイトメータを用いた解析と、従来の抗CCR6抗体を用いたTh17細胞のフローサイトメータを用いた解析との比較を行った。【００９６】
実施例１の1-２．で分化培養したTh1、Th2、Treg及びTh17細胞（それぞれ107cells/ml）に、PE-Cy7標識抗CD4抗体（1.0μg／ml、BDバイオサイエンス社)、PE標識抗TNFRSF14抗体（2.0μg／ml、eBioscience社)、FITC標識抗IL7R抗体（1.0μg／ml、Biolegend社)、抗PDPN抗体（2.5μg／ml、R&D Systems社）及びAlexa647標識抗CCR6抗体（5.0μg／ml、Biolegend社）を添加して20分間反応させた。
なお、抗PDPN抗体は、蛍光標識されていないため、抗PDPN抗体に対する蛍光標識二次抗体として抗goat IgG-Alexa488抗体（1.0μg／ml、Molecular Probes社）を20分間、さらに反応させた。【００９７】
上記の反応後のTh1、Th2、Treg及びTh17細胞を0.5% BSA含有PBSで洗浄し、次いで、0.5μg／ml 7-アミノ-アクチノマイシンD（7-AAD）及び0.5% BSA含有PBSに懸濁した。そして、FACS CantoII（BDバイオサイエンス社）及びFACS DIVAソフトウェアを用いた解析によりTh1、Th2、Treg及びTh17細胞における各表面抗原の発現を確認し、全細胞数に対する陽性細胞数の比率（％）を求めた。図３に、抗CD4抗体、抗TNFRSF14抗体、抗IL7R抗体、抗PDPN抗体及び抗CCR6抗体を用いて、Th17細胞をフローサイトメータで解析した結果を二次元分布図で示す。また、表６に、Th17細胞について、全細胞数に対する陽性細胞数の比率（％）を示す。【００９８】
【表６】
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【００９９】
図３及び表６から明らかなように、従来の抗CCR6抗体を用いたTh17細胞のフローサイトメータによる解析よりも、抗TNFRSF14抗体、抗IL7R抗体及び抗PDPN抗体を用いたTh17細胞のフローサイトメータによる解析の方が、高感度にTh17細胞を検出できることが示された。【０１００】
本出願は、２００８年８月２７日に出願された日本国特許出願特願２００８−２１８１９６号に関し、この特許請求の範囲、明細書および要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2010024289.tif 000018
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