(57)【要約】新規ペプチドを提供すること  配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、且つ、活性型プロテアーゼに結合するが、前駆型プロテアーゼには結合しないペプチド。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１８（図３２）で示されるアミノ酸配列を含み、且つ、活性型ヒトＭＭＰ−９に結合するが、前駆型ヒトＭＭＰ−９には結合しないＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド。        
【請求項２】
活性型ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインに結合する、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
ヒトＭＭＰ−９の有するプロテアーゼ活性を阻害する、請求項１又は２記載のペプチド。
【請求項４】
該阻害がＭＭＰ−９特異的である、請求項１乃至３のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項５】
Ｘ１はＡｓｐ又はＧｌｙである、請求項１乃至４のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項６】
Ｘ７はＰｒｏ、Ｘ９はＧｌｎ、並びに、Ｘ１０はＭｅｔである、請求項１乃至５のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項７】
Ｘ２はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ、Ｘ３はＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌ、Ｘ４はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ又はＶａｌ、Ｘ５はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ又はＬｙｓ、Ｘ６はＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ又はＳｅｒ、Ｘ８はＡｌａ、Ｌｅｕ又はＳｅｒ、Ｘ１１はＡｌａ、Ｇｌｙ又はＳｅｒ、Ｘ１２はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ又はＴｙｒ、並びに、Ｘ１３はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ又はＬｙｓである、請求項６記載のペプチド。
【請求項８】
Ｘ２はＡｒｇ又はＧｌｎ、Ｘ３はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ又はＶａｌ、Ｘ４はＡｒｇ、Ｇｌｙ又はＶａｌ、Ｘ５はＡｒｇ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ又はＬｙｓ、Ｘ６はＧｌｕ又はＧｌｙ、Ｘ８はＡｌａ又はＳｅｒ、Ｘ１１はＡｌａ、Ｇｌｙ又はＳｅｒ、Ｘ１２はＰｈｅ又はＴｙｒ、並びに、Ｘ１３はＡｓｎ、Ｇｌｎ又はＬｙｓである、請求項７記載のペプチド。
【請求項９】
配列番号２乃至６及び８（図１６乃至２０及び２２）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、請求項８記載のペプチド。
【請求項１０】
Ｘ６はＴｙｒ、Ｘ８はＧｌｎ、並びに、Ｘ９はＳｅｒである、請求項１乃至５のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項１１】
Ｘ２はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ又はＶａｌ、Ｘ３はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＭｅｔ、Ｘ４はＰｈｅ又はＴｙｒ、Ｘ５はＧｌｎ、Ｇｌｕ又はＬｙｓ、Ｘ７はＡｌａ又はＧｌｙ、Ｘ１０はＡｓｎ又はＨｉｓ、Ｘ１１はＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ又はＶａｌ、Ｘ１２はＰｈｅ、Ｓｅｒ又はＴｙｒ、並びに、Ｘ１３はＡｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ又はＬｙｓはＧｌｎ又はＬｙｓである、請求項１０記載のペプチド。
【請求項１２】
Ｘ２はＭｅｔ又はＶａｌ、Ｘ３はＭｅｔ、Ｘ４はＴｙｒ、Ｘ５はＬｙｓ、Ｘ７はＡｌａ、Ｘ１０はＨｉｓ、Ｘ１１はＬｙｓ、Ｘ１２はＳｅｒ又はＴｙｒ、並びに、Ｘ１３はＧｌｎ又はＬｙｓである、請求項１１記載のペプチド。
【請求項１３】
配列番号７（図２１）又は配列番号９（図２３）で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１２記載のペプチド。
【請求項１４】
配列番号１８（図３２）で示されるアミノ酸配列のアミノ末端側に、１乃至３個のアミノ酸残基が付加してなるアミノ酸配列、又は、配列番号１９（図３３）もしくは配列番号２０（図３４）で示されるアミノ酸配列が付加してなるアミノ酸配列を含む、請求項１乃至１３のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項１５】
配列番号１８（図３２）で示されるアミノ酸配列のカルボキシル末端側に、１乃至６個のアミノ酸からなるアミノ酸配列が付加してなるアミノ酸配列を含む、請求項１乃至１４のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項１６】
配列番号２乃至１７（図１６乃至３１）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１乃至１５のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項１７】
３つのジスルフィド結合を有し、ループ構造、αへリックス及びβシートを含むことで特徴付けられる立体構造を有する、請求項１乃至１６のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項１８】
請求項１乃至１７のいずれか一つに記載のペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１８記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２０】
請求項１８記載のポリヌクレオチド若しくは請求項１９記載のベクターを含むか又は請求項１乃至１７のいずれか一つに記載のペプチドを産生する細胞。
【請求項２１】
下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドの製造方法：
（ｉ）請求項２０記載の細胞を培養する工程；
（ｉｉ）該培養物からＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドを回収する工程。
【請求項２２】
請求項１乃至１７のいずれか一つに記載のペプチドを化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該ペプチドの製造方法。
【請求項２３】
請求項２１又は２２記載の方法により得られるＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド。
【請求項２４】
請求項１乃至１７及び２３のいずれか一つに記載のペプチドに他の部分が結合してなるコンジュゲート。
【請求項２５】
ペプチドである、請求項２４記載のコンジュゲート。
【請求項２６】
免疫グロブリンのＦｃ領域又はその機能断片を含む、請求項２４又は２５記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、請求項２４乃至２６のいずれか一つに記載のＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲートの製造方法：
（ｉ）該コンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドが挿入されたベクターを含む細胞を培養する工程：
（ｉｉ）該培養物からＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を回収する工程。
【請求項２８】
請求項２４乃至２６のいずれか一つに記載のＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該コンジュゲートの製造方法。
【請求項２９】
請求項２７又は２８記載の方法により得られるＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲート。
【請求項３０】
請求項１乃至１７及び２３のいずれか一つに記載のペプチドに結合する抗体又はその機能断片。
【請求項３１】
請求項１乃至１７及び２３のいずれか一つに記載のペプチド、請求項１８記載のポリヌクレオチド、請求項１９記載のベクター、請求項２０記載の細胞、請求項２４乃至２６及び２９のいずれか一つに記載のコンジュゲート、及び／又は、請求項３０記載の抗体もしくはその機能断片を含む組成物。
【請求項３２】
請求項１乃至１７及び２３のいずれか一つに記載のペプチド及び／又は請求項２４乃至２６及び２９のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む、検査用又は診断用組成物。
【請求項３３】
下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、活性型ＭＭＰ−９の検出方法：
（ｉ）請求項１乃至１７及び２３のいずれか一つに記載のペプチド及び／又は請求項２４乃至２６及び２９のいずれか一つに記載のコンジュゲートを被検試料と接触させる工程；及び
（ｉｉ）該被検試料の成分に結合した該ペプチド及び／又はコンジュゲートを測定する工程。
【請求項３４】
工程（ｉｉ）が該被検試料と接触させた該ペプチド及び／又はコンジュゲートを回収し、該ペプチド及び／又はコンジュゲートに結合した活性型ＭＭＰ−９の量又は活性を測定する工程である、請求項３３記載の検出方法
【請求項３５】
請求項１乃至１７及び２３のいずれか一つに記載のペプチド、請求項１８記載のポリヌクレオチド、請求項１９記載のベクター、請求項２０記載の細胞、並びに／又は、請求項２４乃至２６及び２９のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物。
【請求項３６】
ＭＭＰ−９関連疾患の治療又は予防のための、請求項３５記載の医薬組成物。
【請求項３７】
ＭＭＰ−９関連疾患が炎症性・自己免疫性疾患、神経変性疾患、精神疾患、血管系疾患、又は悪性腫瘍である、請求項３６記載の医薬組成物。
【請求項３８】
炎症性・自己免疫性疾患が関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、気管支喘息、間質性肺炎、慢性閉塞性肺疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、肝炎、湿疹（皮膚炎）、乾癬、扁平苔癬、紅斑・紅皮症、蕁麻疹、脱毛症、天疱瘡、尋常性ざ瘡、褥瘡・創傷、結膜炎、角膜炎、鼻炎、口内炎、舌炎、ベーチェット病、多発性硬化症、脳炎、頭痛、末梢神経炎、糖尿病合併症（糖尿病網膜症、糖尿病腎症、糖尿病神経障害）、アテローム性動脈硬化症、膵炎、慢性心不全、又は、腎炎である、請求項３７記載の医薬組成物。
【請求項３９】
神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、脳損傷、脊髄損傷、低酸素症、痙攣、又は、外傷性脳障害である、請求項３７記載の医薬組成物。
【請求項４０】
精神疾患が大うつ病、双極性障害、不安、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ)、摂食障害、睡眠障害、統合失調症、依存症、自閉症、脆弱Ｘ症候群、注意欠陥多動性障害、又は、ダウン症侯群である、請求項３７記載の医薬組成物。
【請求項４１】
血管系疾患が脳血管障害、脳動脈瘤、脳アミロイド血管症、末梢血管障害、大動脈瘤、大動脈解離、動静脈瘻、動脈硬化症、高安動脈炎、川崎病、静脈瘤、又は、血管石灰化である、請求項３７記載の医薬組成物。
【請求項４２】
悪性腫瘍が肺癌、乳癌、膵臓癌、大腸癌、又は、神経膠腫である、請求項３７記載の医薬組成物。
【請求項４３】
請求項３０記載の抗体又はその機能断片を含む、検査用又は診断用組成物。
【請求項４４】
請求項３０記載の抗体又はその機能断片を用いたアフィニティー精製工程を含む、請求項２１、２２、２７又は２８に記載の製造方法。
【請求項４５】
下記工程（ｉ）乃至（ｉｉｉ）を含む、ヒトＭＭＰ−９阻害ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドの同定方法：
（ｉ）被験ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド存在下及び非存在下で、ヒトＭＭＰ−９プロテアーゼ及び基質を保温する工程；
（ｉｉ）被験ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド存在下及び非存在下におけるヒトＭＭＰ−９プロテアーゼ活性を測定する工程；及び
（ｉｉｉ）該ペプチド存在下でのヒトＭＭＰ−９プロテアーゼ活性が、該ペプチド非存在下でのヒトＭＭＰ−９プロテアーゼ活性と比較して小さい場合、該ペプチドを陽性と判定する工程。
【請求項４６】
下記工程（ｉ）乃至（ｉｉｉ）を含む、ヒトＭＭＰ−９特異的阻害化合物の同定方法：
（ｉ）配列番号２乃至１７（図１６乃至３１）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含むペプチドの存在下で、被験化合物をヒト活性型ＭＭＰ−９と結合させる工程；
（ｉｉ）該化合物が、ヒト活性型ＭＭＰ−９との結合において、該ペプチドと競合するか否かを決定する工程；及び、
（ｉｉｉ）該化合物がヒトＭＭＰ−９特異的結合活性を有するか否かを決定する工程。
【請求項４７】
該化合物がＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドである、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
該化合物が抗体又は抗原結合タンパク質である、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
該ペプチド、抗体又は抗原結合タンパク質を、化学合成、イン・ビトロ翻訳、又は組換えにより調製する工程をさらに含む、請求項４５、４７又は４８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、ペプチドの製造方法、かかる方法により得られるペプチド、ペプチドを含む組成物、ペプチドを含む医薬組成物、ペプチドを含む各種疾患の治療又は予防のための該医薬組成物、各種疾患の治療又は予防のためのペプチドの使用、ペプチドを投与する工程を含む各種疾患の治療方法、ペプチドを含む各種疾患の診断又は検査のための組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９（ＭＭＰ−９）はメタロプロテアーゼ（Ｃｌａｎ  ＭＡ，  ｆａｍｉｌｙ  Ｍ１０）であり、Ｎ末のプロペプチド、亜鉛イオンを配位した酵素活性ドメイン、基質との結合に関与するフィブロネクチンＩＩ型ドメイン、Ｃ末のＨＰＸドメインから構成される（非特許文献１）。ＭＭＰ−９は非活性型の前駆型ＭＭＰ−９（ｐｒｏ−ＭＭＰ−９）として分泌され、ＭＭＰ−３やプラスミン等のプロテアーゼによるプロペプチドの切断によって、活性型ＭＭＰ−９（ａｃｔｉｖｅ  ＭＭＰ−９）へと変換される（非特許文献２、３）。活性型ＭＭＰ−９はＩＶ型コラーゲンやエラスチン等多くの細胞外マトリックス蛋白質や、ＩＬ−１βやＩＬ−８等のサイトカインを基質として切断し、細胞増殖や分化、遊走、アポトーシス等多くの生理作用に関与する（非特許文献４）。【０００３】
ＭＭＰ−９の過剰な亢進は組織構築の破壊並びに細胞機能の制御不全を起因とする様々な疾患の発症や増悪に繋がると考えられている。特に、大腸炎をはじめとする多くの炎症性疾患では上皮構造及びバリア機能の破綻並びに炎症反応の持続的な増幅、脳血管障害や大動脈疾患を代表とする血管系疾患では血液脳関門や基底膜の破綻、弾性線維の破壊等、その病態生理に深く関与することが示唆されている。過剰に亢進したＭＭＰ−９活性を抑えるＭＭＰ−９阻害剤は、ＭＭＰ−９関連疾患の治療薬になり得ると期待され、これまでに多くのＭＭＰ−９阻害剤が取得された。ＭＭＰファミリー分子の活性中心のアミノ酸配列は相同性が非常に高いため、ＭＭＰ−９の酵素活性中心に配位する亜鉛イオンをキレートする低分子化合物は強力なＭＭＰ−９阻害活性を示す一方、他のＭＭＰの活性も強く阻害する（非特許文献５）。このような非選択的ＭＭＰ−９阻害剤を投与した臨床試験では、筋骨格系に重篤な副作用が認められ、開発は中止に至っている（非特許文献６、７）。酵素活性中心を標的とする場合、低分子阻害剤を用いてＭＭＰ−９特異的阻害剤を取得することは困難である。【０００４】
抗体医薬創製技術の進歩に伴い、抗体分子を用いたＭＭＰ阻害抗体の取得が試みられており、ＭＭＰ−９阻害抗体についても報告されている。酵素活性中心に結合する抗体は強力なＭＭＰ−９阻害活性を示す一方、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−１４阻害活性も示し、ＭＭＰ−９を特異的に阻害することはできない（特許文献１、２、３、非特許文献８）。また、ＭＭＰファミリー分子間のアミノ酸配列相同性が低い領域に結合する抗体は、強力かつＭＭＰ−９特異的な阻害活性を示す一方、活性型ＭＭＰ−９のみならず非活性型の前駆型ＭＭＰ−９にも結合するため、活性型ＭＭＰ−９特異的に結合することはできない（特許文献４、５、６、非特許文献９、１０）。前駆型ＭＭＰ−９には結合せず、活性型ＭＭＰ−９特異的に結合してＭＭＰ−９活性を特異的に阻害する抗体も報告されている（特許文献７、８、非特許文献１１）が、抗体又はその断片以外の分子量の小さい蛋白質（例えば、免疫グロブリン可変領域を含まない蛋白質又はペプチド）であって、前駆型ＭＭＰ−９には結合せず、活性型ＭＭＰ−９特異的に結合してＭＭＰ−９活性を阻害するものは知られていない。【０００５】
ＳＰＩＮＫ２（Ｓｅｒｉｎｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｋａｚａｌ−ｔｙｐｅ  ２）は、３つのジスルフィド結合を有するＫａｚａｌ様ドメインであり、ｔｒｙｐｓｉｎ／ａｃｒｏｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとして機能する（非特許文献１２）が、活性型ＭＭＰ−９結合活性との関係は明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０８７０４２
【特許文献２】ＷＯ２００８／１０２３５９
【特許文献３】ＷＯ２０１１／０９２７００
【特許文献４】ＷＯ２０１２／０２７７２１
【特許文献５】ＷＯ２０１３／１３００７８
【特許文献６】ＷＯ２０１３／１３０９０５
【特許文献７】ＷＯ２０１６／０２３９７２
【特許文献８】ＷＯ２０１６／０２３９７９
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ナガセ  エイチ他（Ｎａｇａｓｅ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．）（１９９９年刊）  ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．）２７４巻（３１号）：２１４９１−４頁
【非特許文献２】オガタ  ワイ他（Ｏｇａｔａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．）（１９９２年刊）  ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．）２６７巻（６号）：３５８１−４頁
【非特許文献３】レイネン  エイチ・アール他（Ｌｉｊｎｅｎ  ＨＲ，ｅｔ  ａｌ．）（１９９８年刊）  ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）９１巻（６号）：２０４５−５３頁
【非特許文献４】バンドーレン  ジェイ他（Ｖａｎｄｏｏｒｅｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．）（２０１３年刊）  クリティカル・レビューズ・イン・バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．）４８巻（３号）：２２２−７２頁
【非特許文献５】チェン  エム他（Ｃｈｅｎｇ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．）（２０００年刊）  ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．）４３巻（３号）：３６９−８０頁
【非特許文献６】クーセン  エル・エム他（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ  ＬＭ，ｅｔ  ａｌ．）（２００２年刊）  サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ．）２９５巻（５５６４号）：２３８７−９２頁
【非特許文献７】ビセット  ディー他（Ｂｉｓｓｅｔｔ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．）（２００５年刊）  ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．）２３巻（４号）：８４２−９頁
【非特許文献８】セラ・パスウェル  エヌ他（Ｓｅｌａ−Ｐａｓｓｗｅｌｌ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．）（２０１１年刊）  ネイチャー・メディシン（Ｎａｔ  Ｍｅｄ．）１８巻（１号）：１４３−７頁
【非特許文献９】マーシャル  ディー・シー他（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＤＣ，ｅｔ  ａｌ．）（２０１５年刊）  プロス・ワン（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．）１０巻（５号）：ｅ０１２７０６３頁
【非特許文献１０】アップルビー  ティー・シー他（Ａｐｐｌｅｂｙ  ＴＣ，ｅｔ  ａｌ．）（２０１７年刊）  ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．）２９２巻（１６号）：６８１０−２０頁
【非特許文献１１】ゴフィン  エル他（Ｇｏｆｆｉｎ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．）（２０１６年刊）  インフラマトリー・バウエル・ディジーズ（Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．）２２巻（９号）：２０４１−５７頁
【非特許文献１２】チェン  ティー他（Ｃｈｅｎ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．）（２００９年刊）プロテインズ（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）７７巻（１号）：２０９−１９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
新規な活性型Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９（ＭＭＰ−９）結合ペプチドを提供すること。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は
（１）
配列番号１８（図３２）で示されるアミノ酸配列を含み、且つ、活性型ヒトＭＭＰ−９に結合するが、前駆型ヒトＭＭＰ−９には結合しないＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド、
（２）
活性型ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインに結合する、（１）記載のペプチド、
（３）
ヒトＭＭＰ−９の有するプロテアーゼ活性を阻害する、（１）又は（２）記載のペプチド、
（４）
該阻害がＭＭＰ−９特異的である、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載のペプチド、
（５）
Ｘ１はＡｓｐ又はＧｌｙである、（１）乃至（４）のいずれか一つに記載のペプチド、【００１０】
（６）
Ｘ７はＰｒｏ、Ｘ９はＧｌｎ、並びに、Ｘ１０はＭｅｔである、（１）乃至（５）のいずれか一つに記載のペプチド、
（７）
Ｘ２はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ、Ｘ３はＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌ、Ｘ４はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ又はＶａｌ、Ｘ５はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ又はＬｙｓ、Ｘ６はＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ又はＳｅｒ、Ｘ８はＡｌａ、Ｌｅｕ又はＳｅｒ、Ｘ１１はＡｌａ、Ｇｌｙ又はＳｅｒ、Ｘ１２はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ又はＴｙｒ、並びに、Ｘ１３はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ又はＬｙｓである、（６）記載のペプチド、
（８）
Ｘ２はＡｒｇ又はＧｌｎ、Ｘ３はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ又はＶａｌ、Ｘ４はＡｒｇ、Ｇｌｙ又はＶａｌ、Ｘ５はＡｒｇ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ又はＬｙｓ、Ｘ６はＧｌｕ又はＧｌｙ、Ｘ８はＡｌａ又はＳｅｒ、Ｘ１１はＡｌａ、Ｇｌｙ又はＳｅｒ、Ｘ１２はＰｈｅ又はＴｙｒ、並びに、Ｘ１３はＡｓｎ、Ｇｌｎ又はＬｙｓである、（７）記載のペプチド、
（９）
配列番号２乃至６及び８（図１６乃至２０及び２２）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、（８）記載のペプチド、
（１０）
Ｘ６はＴｙｒ、Ｘ８はＧｌｎ、並びに、Ｘ９はＳｅｒである、（１）乃至（５）のいずれか一つに記載のペプチド、【００１１】
（１１）
Ｘ２はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ又はＶａｌ、Ｘ３はＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＭｅｔ、Ｘ４はＰｈｅ又はＴｙｒ、Ｘ５はＧｌｎ、Ｇｌｕ又はＬｙｓ、Ｘ７はＡｌａ又はＧｌｙ、Ｘ１０はＡｓｎ又はＨｉｓ、Ｘ１１はＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ又はＶａｌ、Ｘ１２はＰｈｅ、Ｓｅｒ又はＴｙｒ、並びに、Ｘ１３はＡｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ又はＬｙｓはＧｌｎ又はＬｙｓである、（１０）記載のペプチド、
（１２）
Ｘ２はＭｅｔ又はＶａｌ、Ｘ３はＭｅｔ、Ｘ４はＴｙｒ、Ｘ５はＬｙｓ、Ｘ７はＡｌａ、Ｘ１０はＨｉｓ、Ｘ１１はＬｙｓ、Ｘ１２はＳｅｒ又はＴｙｒ、並びに、Ｘ１３はＧｌｎ又はＬｙｓである、（１１）記載のペプチド、
（１３）
配列番号７（図２１）又は配列番号９（図２３）で示されるアミノ酸配列を含む、（１２）記載のペプチド、
（１４）
配列番号１８（図３２）で示されるアミノ酸配列のアミノ末端側に、１乃至３個のアミノ酸残基が付加してなるアミノ酸配列、又は、配列番号１９（図３３）もしくは配列番号２０（図３４）で示されるアミノ酸配列が付加してなるアミノ酸配列を含む、（１）乃至（１３）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１５）
配列番号１８（図３２）で示されるアミノ酸配列のカルボキシル末端側に、１乃至６個のアミノ酸からなるアミノ酸配列が付加してなるアミノ酸配列を含む、（１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のペプチド、【００１２】
（１６）
配列番号２乃至１７（図１６乃至３１）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、（１）乃至（１５）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１７）
３つのジスルフィド結合を有し、ループ構造、αへリックス及びβシートを含むことで特徴付けられる立体構造を有する、（１）乃至（１６）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１８）
（１）乃至（１７）のいずれか一つに記載のペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（１９）
（１８）記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
（２０）
（１８）記載のポリヌクレオチド若しくは（１９）記載のベクターを含むか又は（１）乃至（１７）のいずれか一つに記載のペプチドを産生する細胞、【００１３】
（２１）
下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドの製造方法：
（ｉ）（２０）記載の細胞を培養する工程；
（ｉｉ）該培養物からＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドを回収する工程、
（２２）
（１）乃至（１７）のいずれか一つに記載のペプチドを化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該ペプチドの製造方法、
（２３）
（２１）又は（２２）記載の方法により得られるＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド、
（２４）
（１）乃至（１７）及び（２３）のいずれか一つに記載のペプチドに他の部分が結合してなるコンジュゲート、
（２５）
ペプチドである、（２４）記載のコンジュゲート、【００１４】
（２６）
免疫グロブリンのＦｃ領域又はその機能断片を含む、（２４）又は（２５）記載のコンジュゲート、
（２７）
下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、（２４）乃至（２６）のいずれか一つに記載のＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲートの製造方法：
（ｉ）該コンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドが挿入されたベクターを含む細胞を培養する工程：
（ｉｉ）該培養物からＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を回収する工程、
（２８）
（２４）乃至（２６）のいずれか一つに記載のＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該コンジュゲートの製造方法、
（２９）
（２７）又は（２８）記載の方法により得られるＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲート、
（３０）
（１）乃至（１７）及び（２３）のいずれか一つに記載のペプチドに結合する抗体又はその機能断片、【００１５】
（３１）
（１）乃至（１７）及び（２３）のいずれか一つに記載のペプチド、（１８）記載のポリヌクレオチド、（１９）記載のベクター、（２０）記載の細胞、（２４）乃至（２６）及び（２９）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、及び／又は、（３０）記載の抗体もしくはその機能断片を含む組成物、
（３２）
（１）乃至（１７）及び（２３）のいずれか一つに記載のペプチド及び／又は（２４）乃至（２６）及び（２９）のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む、検査用又は診断用組成物、
（３３）
下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、活性型ＭＭＰ−９の検出方法：
（ｉ）（１）乃至（１７）及び（２３）のいずれか一つに記載のペプチド及び／又は（２４）乃至（２６）及び（２９）のいずれか一つに記載のコンジュゲートを被験試料と接触させる工程；及び
（ｉｉ）該被験試料の成分に結合した該ペプチド及び／又はコンジュゲートを測定する工程、
（３４）
工程（ｉｉ）が該被験試料と接触させた該ペプチド及び／又はコンジュゲートを回収し、該ペプチド及び／又はコンジュゲートに結合した活性型ＭＭＰ−９の量又は活性を測定する工程である、（３３）記載の検出方法、
（３５）
（１）乃至（１７）及び（２３）のいずれか一つに記載のペプチド、（１８）記載のポリヌクレオチド、（１９）記載のベクター、（２０）記載の細胞、並びに／又は、（２４）乃至（２６）及び（２９）のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物、【００１６】
（３６）
ＭＭＰ−９関連疾患の治療又は予防のための、（３５）記載の医薬組成物、
（３７）
ＭＭＰ−９関連疾患が炎症性・自己免疫性疾患、神経変性疾患、精神疾患、血管系疾患、又は悪性腫瘍である、（３６）記載の医薬組成物、
（３８）
炎症性・自己免疫性疾患が関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、気管支喘息、間質性肺炎、慢性閉塞性肺疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、肝炎、湿疹（皮膚炎）、乾癬、扁平苔癬、紅斑・紅皮症、蕁麻疹、脱毛症、天疱瘡、尋常性ざ瘡、褥瘡・創傷、結膜炎、角膜炎、鼻炎、口内炎、舌炎、ベーチェット病、多発性硬化症、脳炎、頭痛、末梢神経炎、糖尿病合併症（糖尿病網膜症、糖尿病腎症、糖尿病神経障害）、アテローム性動脈硬化症、膵炎、慢性心不全、又は、腎炎である、（３７）記載の医薬組成物、
（３９）
神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、脳損傷、脊髄損傷、低酸素症、痙攣、又は、外傷性脳障害である、（３７）記載の医薬組成物、
（４０）
精神疾患が大うつ病、双極性障害、不安、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ)、摂食障害、睡眠障害、統合失調症、依存症、自閉症、脆弱Ｘ症候群、注意欠陥多動性障害、又は、ダウン症侯群である、（３７）記載の医薬組成物、【００１７】
（４１）
血管系疾患が脳血管障害、脳動脈瘤、脳アミロイド血管症、末梢血管障害、大動脈瘤、大動脈解離、動静脈瘻、動脈硬化症、高安動脈炎、川崎病、静脈瘤、又は、血管石灰化である、（３７）記載の医薬組成物、
（４２）
悪性腫瘍が肺癌、乳癌、膵臓癌、大腸癌、又は、神経膠腫である、（３７）記載の医薬組成物、
（４３）
（３０）記載の抗体又はその機能断片を含む、検査用又は診断用組成物、
（４４）
（３０）記載の抗体又はその機能断片を用いたアフィニティー精製工程を含む、（２１）、（２２）、（２７）又は（２８）記載の製造方法、
（４５）
下記工程（ｉ）乃至（ｉｉｉ）を含む、ヒトＭＭＰ−９阻害ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドの同定方法：
（ｉ）被験ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド存在下及び非存在下で、ヒトＭＭＰ−９プロテアーゼ及び基質を保温する工程；
（ｉｉ）被験ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド存在下及び非存在下におけるヒトＭＭＰ−９プロテアーゼ活性を測定する工程；及び
（ｉｉｉ）該ペプチド存在下でのヒトＭＭＰ−９プロテアーゼ活性が、該ペプチド非存在下でのヒトＭＭＰ−９プロテアーゼ活性と比較して小さい場合、該ペプチドを陽性と判定する工程、【００１８】
（４６）
下記工程（ｉ）乃至（ｉｉｉ）を含む、ヒトＭＭＰ−９特異的阻害化合物の同定方法：
（ｉ）配列番号２乃至１７（図１６乃至３１）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含むペプチドの存在下で、被験化合物をヒト活性型ＭＭＰ−９と結合させる工程；
（ｉｉ）該化合物が、ヒト活性型ＭＭＰ−９との結合において、該ペプチドと競合するか否かを決定する工程；及び、
（ｉｉｉ）該化合物がヒトＭＭＰ−９特異的結合活性を有するか否かを決定するする（任意の）工程、
（４７）
該化合物がＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドである、（４６）記載の方法、
（４８）
該化合物が抗体又は抗原結合タンパク質である、（４６）記載の方法、及び、
（４９）
該ペプチド、抗体又は抗原結合タンパク質を、化学合成、イン・ビトロ翻訳、又は組換えにより調製する工程をさらに含む、（４５）、（４７）又は（４８）記載の方法、
等に関する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の提供するペプチド又はそれを含む医薬組成物は、活性型ＭＭＰ−９結合活性を有し、ＭＭＰ−９関連疾患の治療又は予防、活性型ＭＭＰ−９の検出等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１（Ａ）】ヒト／サル／ラット／マウスＭＭＰ−９の配列類似性を比較した図。破線はプロペプチド（ヒトＭＭＰ−９：Ａｌａ２０〜Ａｒｇ１０６）を、実線はフィブロネクチンＩＩ型ドメイン（ヒトＭＭＰ−９：Ａｌａ２２５〜Ｓｅｒ２７３、Ａｌａ２８３〜Ｔｈｒ３３１、Ｓｅｒ３４２〜Ａｓｐ３９０）を含む酵素活性ドメイン（ヒトＭＭＰ−９：Ｐｈｅ１０７〜Ｐｒｏ４４９）を示す。
【図１（Ｂ）】ヒト／サル／ラット／マウスＭＭＰ−９の配列類似性を比較した図（続き）。
【図１（Ｃ）】ヒト／サル／ラット／マウスＭＭＰ−９の配列類似性を比較した図（続き）。
【図２（Ａ）】活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのアミノ末端に付加したタグの検出強度を指標として、各結合ペプチド又は野生型ＳＰＩＮＫ２の活性型ヒトＭＭＰ−９結合活性（ｎ＝２）を評価した図。
【図２（Ｂ）】活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのアミノ末端に付加したタグの検出強度を指標として、各結合ペプチド又は野生型ＳＰＩＮＫ２の前駆型ヒトＭＭＰ−９結合活性（ｎ＝２）を評価した図。
【図３】活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの活性型ヒトＭＭＰ−９結合活性ＥＣ５０（ｎ＝２）を示した表。
【図４（Ａ）】基質ペプチドの分解速度を指標として、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのヒトＭＭＰ−９阻害活性（ｎ＝３，Ｍｅａｎ±ＳＤ）を評価した図。
【図４（Ｂ）】基質ペプチドの分解速度を指標として、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのヒトＭＭＰ−９阻害活性（ｎ＝３，Ｍｅａｎ±ＳＤ）を評価した図（続き）。
【図５】基質ペプチドを用いた場合の、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのヒトＭＭＰ−９阻害定数Ｋｉ（ｎ＝３，Ｍｅａｎ±ＳＤ）を示した表。
【図６】基質ゼラチンの分解速度を指標として、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのヒトＭＭＰ−９阻害活性（ｎ＝３，Ｍｅａｎ±ＳＤ）を評価した図。
【図７】基質ゼラチンを用いた場合の、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのヒトＭＭＰ−９阻害活性ＩＣ５０（ｎ＝３，Ｍｅａｎ±ＳＤ）を示した表。
【図８】基質ペプチドの分解速度を指標として、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのマウスＭＭＰ−９阻害活性（ｎ＝３，Ｍｅａｎ±ＳＤ）を評価した図。
【図９】基質ペプチドを用いた場合の、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのマウスＭＭＰ−９阻害活性ＩＣ５０（ｎ＝３，Ｍｅａｎ±ＳＤ）を示した表。
【図１０】基質ペプチドの分解速度を指標として、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの各ＭＭＰ又はＡＤＡＭ１７阻害活性ＩＣ５０（ｎ＝３，Ｍｅａｎ±ＳＤ）を示した表。
【図１１（Ａ）】基質ペプチドの分解速度を指標として、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００２、そのＣ末誘導体Ｍ９１００２＿Ｇ３、Ｍ９１００２＿Ｇ２及びＭ９１００２＿Ｇ０のヒトＭＭＰ−９阻害活性（ｎ＝３，Ｍｅａｎ±ＳＤ）を評価した図。
【図１１（Ｂ）】基質ペプチドを用いた場合の、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００２、そのＣ末誘導体Ｍ９１００２＿Ｇ３、Ｍ９１００２＿Ｇ２及びＭ９１００２＿Ｇ０のヒトＭＭＰ−９阻害活性ＩＣ５０（ｎ＝３，Ｍｅａｎ±ＳＤ）を示した表。
【図１２（Ａ）】基質ペプチドの分解速度を指標として、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００５及びそのＣ末コンジュゲートＭ９１００５−Ｆｃ−０１のヒトＭＭＰ−９阻害活性（ｎ＝１）を評価した図。
【図１２（Ｂ）】基質ペプチドを用いた場合の、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００５及びそのＣ末コンジュゲートＭ９１００５−Ｆｃ−０１のヒトＭＭＰ−９阻害活性ＩＣ５０（ｎ＝１）を示した表。
【図１３（Ａ）】基質ペプチドの分解速度を指標として、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのＣ末コンジュゲートＭ９１００５−Ｆｃ−０１及びそのＮ末誘導体Ｍ９１００５＿Ｄ１Ｇ−Ｆｃ−０１のヒトＭＭＰ−９阻害活性（ｎ＝１）を評価した図。
【図１３（Ｂ）】基質ペプチドを用いた場合の、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのＣ末コンジュゲートＭ９１００５−Ｆｃ−０１及びそのＮ末誘導体Ｍ９１００５＿Ｄ１Ｇ−Ｆｃ−０１のヒトＭＭＰ−９阻害活性ＩＣ５０（ｎ＝１）を示した表。
【図１４（Ａ）】活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドが前駆型ヒトＭＭＰ−９に結合せず、活性型ヒトＭＭＰ−９に結合することを免疫沈降法により評価した図。添加したヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインはＩｎｐｕｔ（Ｉｎｐ）、ビーズと結合しなかった上清画分はＦｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ（ＦＴ）、ビーズに結合した沈殿画分はＥｌｕａｔｅ（Ｅｌｕ）と表す。前駆型ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインを添加したとき、ＩｎｐとＦＴのレーンに約５０ｋＤａのバンドが検出され、Ｅｌｕのレーンにはバンドが検出されなかった。活性型ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインを添加したとき、ＩｎｐとＥｌｕのレーンに約４０ｋＤａのバンドが検出され、ＦＴのレーンにはバンドが検出されなかった。活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのＣ末コンジュゲートＭ９１００５−Ｆｃ−０１を添加せずに免疫沈降した場合、Ｅｌｕのレーンにはバンドが検出されなかった。
【図１４（Ｂ）】活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドが前駆型マウスＭＭＰ−９に結合せず、活性型マウスＭＭＰ−９に結合することを免疫沈降法により評価した図。添加したマウスＭＭＰ−９酵素活性ドメインはＩｎｐｕｔ（Ｉｎｐ）、ビーズと結合しなかった上清画分はＦｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ（ＦＴ）、ビーズに結合した沈殿画分はＥｌｕａｔｅ（Ｅｌｕ）と表す。前駆型マウスＭＭＰ−９酵素活性ドメインを添加したとき、ＩｎｐとＦＴのレーンに約６０ｋＤａのバンドが検出され、Ｅｌｕのレーンにはバンドが検出されなかった。活性型マウスＭＭＰ−９酵素活性ドメインを添加したとき、ＩｎｐとＥｌｕのレーンに約４０ｋＤａのバンドが検出され、ＦＴのレーンにはバンドが検出されなかった。活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのＣ末コンジュゲートＭ９１００５−Ｆｃ−０１を添加せずに免疫沈降した場合、Ｅｌｕのレーンにはバンドが検出されなかった。
【図１５】ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列（配列番号１）
【図１６】ペプチドＭ９１００１のアミノ酸配列（配列番号２）
【図１７】ペプチドＭ９１００２のアミノ酸配列（配列番号３）
【図１８】ペプチドＭ９１００４のアミノ酸配列（配列番号４）
【図１９】ペプチドＭ９１００５のアミノ酸配列（配列番号５）
【図２０】ペプチドＭ９１０１０のアミノ酸配列（配列番号６）
【図２１】ペプチドＭ９１０１１のアミノ酸配列（配列番号７）
【図２２】ペプチドＭ９１０１２のアミノ酸配列（配列番号８）
【図２３】ペプチドＭ９１０１４のアミノ酸配列（配列番号９）
【図２４】ペプチド誘導体Ｍ９１００１＿Ｄ１Ｇのアミノ酸配列（配列番号１０）
【図２５】ペプチド誘導体Ｍ９１００２＿Ｄ１Ｇのアミノ酸配列（配列番号１１）
【図２６】ペプチド誘導体Ｍ９１００４＿Ｄ１Ｇのアミノ酸配列（配列番号１２）
【図２７】ペプチド誘導体Ｍ９１００５＿Ｄ１Ｇのアミノ酸配列（配列番号１３）
【図２８】ペプチド誘導体Ｍ９１０１０＿Ｄ１Ｇのアミノ酸配列（配列番号１４）
【図２９】ペプチド誘導体Ｍ９１０１１＿Ｄ１Ｇのアミノ酸配列（配列番号１５）
【図３０】ペプチド誘導体Ｍ９１０１２＿Ｄ１Ｇのアミノ酸配列（配列番号１６）
【図３１】ペプチド誘導体Ｍ９１０１４＿Ｄ１Ｇのアミノ酸配列（配列番号１７）
【図３２】活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの一般式（配列番号１８）。Ｘ１乃至Ｘ１３は任意のアミノ酸を示す。
【図３３】Ｓｔａｇ＋リンカー１からなるアミノ酸配列（配列番号１９）
【図３４】Ｓｔａｇ＋リンカー２からなるアミノ酸配列（配列番号２０）
【図３５】Ｃ末６マーのアミノ酸配列（配列番号２１）
【図３６】Ｃ末３マーのアミノ酸配列、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを示す。
【図３７】Ｃ末２マーのアミノ酸配列、Ｇｌｙ−Ｇｌｙを示す。
【図３８】Ｇ４Ｓリンカーのアミノ酸配列（配列番号２２）
【図３９】ヒト免疫グロブリンＧ１  Ｆｃ領域のアミノ酸配列（配列番号２３）
【図４０】プライマー１のヌクレオチド配列（配列番号２４）
【図４１】プライマー２のヌクレオチド配列（配列番号２５）
【図４２】プライマー３のヌクレオチド配列（配列番号２６）
【図４３】プライマー４のヌクレオチド配列（配列番号２７）
【図４４】ヒトＭＭＰ−９のアミノ酸配列（配列番号２８）
【図４５】マウスＭＭＰ−９のアミノ酸配列（配列番号２９）
【図４６】ＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２のアミノ酸配列（配列番号３０）。Ｎ末端の「ＭＯＣＡｃ−Ｋ」は（７−Ｍｅｔｈｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ−４−ｙｌ）ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅを、「Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−Ａ」は［Ｎβ−（２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−Ｌ−２，３−ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｙｌ］−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅを、Ｃ末端の「Ｒ−ＮＨ２」はＬ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ａｍｉｄｅを、それぞれ意味する。
【図４７】ＭＯＣＡｃ−ＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２のアミノ酸配列（配列番号３１）。Ｎ末端の「ＭＯＣＡｃ−Ｐ」は（７−Ｍｅｔｈｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ−４−ｙｌ）ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅを、「Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−Ａ」は［Ｎβ−（２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−Ｌ−２，３−ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｙｌ］−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅを、Ｃ末端の「Ｒ−ＮＨ２」はＬ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ａｍｉｄｅを、それぞれ意味する。
【図４８】ＤＮＰ−ＰＬＧＭＷＳＲのアミノ酸配列（配列番号３２）。Ｎ末端の「ＤＮＰ−Ｐ」はＮ−（２，４−Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅを意味する。
【図４９】ＭＯＣＡｃ−ＲＰＫＰＶＥ−Ｎｖａ−ＷＲ−Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）−ＮＨ２のアミノ酸配列（配列番号３３）。Ｎ末端の「ＭＯＣＡｃ−Ｒ」は（７−Ｍｅｔｈｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ−４−ｙｌ）ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅを、「Ｎｖａ」はＬ−ｎｏｒｖａｌｉｎｅを、「Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）−ＮＨ２」は［Ｎε−（２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）］−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ  ａｍｉｄｅを、それぞれ意味する。
【図５０】ＦＬＡＧタグのアミノ酸配列（配列番号３４）。
【図５１】Ａｖｉタグのアミノ酸配列（配列番号３５）。
【図５２】基質ペプチドの分解速度を指標として、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの各セリンプロテアーゼ阻害活性ＩＣ５０（ｎ＝１）を示した表。
【図５３（Ａ）】活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドが活性型ヒトＭＭＰ−９に結合することをサイズ排除クロマトグラフィーにより評価した図。阻害剤非存在下では、活性型ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインのピークは保持時間７．０分に検出された（点線）。ＴＩＭＰ−１又は活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００５、Ｍ９１０１１存在下では、活性型ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインのピークの保持時間は高分子量側にシフトした。
【図５３（Ｂ）】活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドがヒトＭＭＰ−９  Ｅ４０２Ｑ変異体に結合しないことをサイズ排除クロマトグラフィーにより評価した図。阻害剤非存在下では、ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインＥ４０２Ｑ変異体のピークは保持時間７．１分に検出された（点線）。ＴＩＭＰ−１存在下ではヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインＥ４０２Ｑ変異体のピークの保持時間は高分子量側にシフトした。対照的に、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００５又はＭ９１０１１存在下では、ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインＥ４０２Ｑ変異体のピークの保持時間は変化しなかった。
【図５３（Ｃ）】ＴＩＭＰ−１又は活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００５、Ｍ９１０１１をサイズ排除クロマトグラフィーにより評価した図。
【図５４（Ａ）】基質ペプチドを用いた場合の、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのヒトＭＭＰ−９変異体阻害活性ＩＣ５０（ｎ＝３，Ｍｅａｎ±ＳＤ）及び野生型ヒトＭＭＰ−９に対するＩＣ５０を１とした時のＩＣ５０の相対値を示した表。
【図５４（Ｂ）】基質ペプチドを用いた場合の、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのヒトＭＭＰ−９変異体阻害活性ＩＣ５０（ｎ＝３，Ｍｅａｎ±ＳＤ）及び野生型ヒトＭＭＰ−９に対するＩＣ５０を１とした時のＩＣ５０の相対値を示した表（続き）。
【図５５】Ｂｏｃ−ＦＳＲ−ＭＣＡのアミノ酸配列。Ｎ末端の「Ｂｏｃ」はｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを、Ｃ末端の「ＭＣＡ」は４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｙｌ−７−ａｍｉｄｅを、それぞれ意味する。
【図５６】Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡのアミノ酸配列（配列番号３６）。Ｎ末端の「Ｓｕｃ」はＳｕｃｃｉｎｙｌを、Ｃ末端の「ＭＣＡ」は４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｙｌ−７−ａｍｉｄｅを、それぞれ意味する。
【図５７】Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ＭＣＡのアミノ酸配列（配列番号３７）。Ｎ末端の「Ｓｕｃ」はＳｕｃｃｉｎｙｌを、Ｃ末端の「ＭＣＡ」は４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｙｌ−７−ａｍｉｄｅを、それぞれ意味する。
【図５８】Ｂｏｃ−ＶＬＫ−ＭＣＡのアミノ酸配列。Ｎ末端の「Ｂｏｃ」はｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを、Ｃ末端の「ＭＣＡ」は４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｙｌ−７−ａｍｉｄｅを、それぞれ意味する。
【図５９】Ｂｏｃ−ＶＰＲ−ＡＭＣのアミノ酸配列。Ｎ末端の「Ｂｏｃ」はｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを、Ｃ末端の「ＡＭＣ」は７−Ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎを、それぞれ意味する。
【図６０】Ｓｕｃ（ＯＭｅ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＭＣＡのアミノ酸配列（配列番号３８）。Ｎ末端の「Ｓｕｃ（ＯＭｅ）」はＮ−Ｍｅｔｈｏｘｙｓｕｃｃｉｎｙｌを、Ｃ末端の「ＭＣＡ」は４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｙｌ−７−ａｍｉｄｅを、それぞれ意味する。
【図６１】Ｂｏｃ−ＱＡＲ−ＡＭＣのアミノ酸配列。Ｎ末端の「Ｂｏｃ」はｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを、Ｃ末端の「ＡＭＣ」は７−Ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎを、それぞれ意味する。
【図６２】Ｂｏｃ−ＬＳＴＲ−ＭＣＡのアミノ酸配列（配列番号３９）。Ｎ末端の「Ｂｏｃ」はｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを、Ｃ末端の「ＭＣＡ」は４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｙｌ−７−ａｍｉｄｅを、それぞれ意味する。
【図６３】Ｐｙｒ−ＧＲ−ＭＣＡのアミノ酸配列。Ｎ末端の「Ｐｙｒ」はＬ−Ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｙｌを、Ｃ末端の「ＭＣＡ」は４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｙｌ−７−ａｍｉｄｅを、それぞれ意味する。
【図６４】Ｚ−ＦＲ−ＭＣＡのアミノ酸配列。Ｎ末端の「Ｚ」はＢｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを、Ｃ末端の「ＭＣＡ」は４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｙｌ−７−ａｍｉｄｅを、それぞれ意味する。
【図６５】エンテロキナーゼ認識配列のアミノ酸配列（配列番号４０）。
【００２１】
なお、本発明において「配列番号Ｘ（図Ｙ）」又は「図Ｙ（配列番号Ｘ）」のように、配列番号Ｘと図Ｙとが併記される場合、当該配列は配列番号Ｘにより示されるか又は図Ｙにより示されることを意味する。【００２２】
また、アミノ酸（Ｘ）、数字（１乃至数桁）及び他のアミノ酸（Ｙ）が、ＸｎＹ、ＸｎｎＹ、ＸｎｎｎＹ等のように表記される場合、ｎ番目、ｎｎ番目、ｎｎｎ番目（それぞれ１桁の数、２桁の数、３桁の数の番目）のアミノ酸Ｘが他のアミノ酸Ｙに置換されることを意味する。例えば、Ａｒｇ３４４Ｌｙｓは、３４４番目のアミノ酸がＡｒｇからＬｙｓに置換されることを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
１．定義
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子又はその相補鎖を意味し、一本鎖、二本鎖又は三本鎖以上からなり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本の鎖上にリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドが混在するもの及びそのよう鎖を含む二本鎖又は三本鎖以上の核酸分子も「遺伝子」の意味に含まれる。
【００２４】
本発明において、「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」は同義であり、それらの構成単位であるリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド等の個数によっては何ら限定されず、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、プライマー等もその範囲に含まれる。「核酸分子」は略して「核酸」と呼ばれる場合がある。
【００２５】
本発明において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「蛋白質」は同義である。
【００２６】
本発明において、標的分子Ｘを認識する、又は標的分子Ｘに結合する（以下、その認識又は結合作用をまとめて「Ｘ結合活性」という。）ペプチドを、「Ｘ結合ペプチド」と呼ぶことができる。さらに、標的分子Ｘを認識し、又は標的分子Ｘに結合し、かつ標的分子Ｘの有する１つ又は２つ以上の活性又は機能を阻害又は抑制する（以下、それらの阻害又は抑制作用をまとめて「Ｘ阻害活性」という。）ペプチドを、「Ｘ阻害ペプチド」と呼ぶことができる。
【００２７】
本発明において、「ＳＰＩＮＫ２」は、Ｓｅｒｉｎｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｋａｚａｌ−ｔｙｐｅ  ２を意味し、３つのジスルフィド結合を有するＫａｚａｌ様ドメインから成る７ｋＤａの蛋白質である。好適なＳＰＩＮＫ２はヒト由来である。本発明においては、別段記載された場合を除き、ヒトＳＰＩＮＫ２を単に「ＳＰＩＮＫ２」という。
【００２８】
本発明において、「ＭＭＰ−９」は、ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９を意味し、分泌シグナルペプチド、プロペプチド、亜鉛イオンを配位した酵素活性ドメイン、基質との結合に関与するフィブロネクチンＩＩ型ドメイン並びにＣ末のＨＰＸドメインから構成される、ＭＭＰファミリーに属する蛋白質である。好適なＭＭＰ−９はヒト由来である。本発明においては、別段記載された場合を除き、ヒトＭＭＰ−９を単に「ＭＭＰ−９」ということがある。
【００２９】
本発明において、「前駆型ＭＭＰ−９」は、ｐｒｏ−ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９を意味し、プロペプチド、亜鉛イオンを配位した酵素活性ドメイン、基質との結合に関与するフィブロネクチンＩＩ型ドメイン並びにＣ末のＨＰＸドメインから構成される。好適な前駆型ＭＭＰ−９はヒト由来である。本発明においては、別段記載された場合を除き、ヒト前駆型ＭＭＰ−９を単に「前駆型ＭＭＰ−９」というが、「全長成熟ＭＭＰ−９」もしくは「ｈＭＭＰ−９（ｆｕｌｌ）」ともいうことがある。
【００３０】
本発明において、「活性型ＭＭＰ−９」は、ａｃｔｉｖｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９を意味し、亜鉛イオンを配位した酵素活性ドメイン、基質との結合に関与するフィブロネクチンＩＩ型ドメイン並びにＣ末のＨＰＸドメインから構成される。好適な活性型ＭＭＰ−９はヒト由来である。本発明においては、別段記載された場合を除き、ヒト活性型ＭＭＰ−９を単に「活性型ＭＭＰ−９」というが、「活性型ＭＭＰ−９（ｆｕｌｌ）」ともいうことがある。
【００３１】
本発明において、「前駆型ＭＭＰ−９酵素活性ドメイン」は、ｐｒｏ−ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎを意味し、プロペプチド及び亜鉛イオンを配位した酵素活性ドメインを必須の構成要素として含み、任意に基質との結合に関与するフィブロネクチンＩＩ型ドメインをも含み得る。好適な前駆型ＭＭＰ−９酵素活性ドメインはヒト由来である。本発明においては、別段記載された場合を除き、前駆型ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインを単に「前駆型ＭＭＰ−９酵素活性ドメイン」というが、「前駆型ＭＭＰ−９（ｃａｔ）」ともいうことがある。
【００３２】
本発明において、「活性型ＭＭＰ−９酵素活性ドメイン」は、ａｃｔｉｖｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎを意味し、亜鉛イオンを配位した酵素活性ドメインを必須の構成要素として含み、任意に基質との結合に関与するフィブロネクチンＩＩ型ドメインをも含み得る。好適な活性型ＭＭＰ−９酵素活性ドメインはヒト由来である。本発明においては、別段記載された場合を除き、活性型ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインを略して「活性型ＭＭＰ−９酵素活性ドメイン」といい、活性型ＭＭＰ−９酵素活性ドメインを「活性型ＭＭＰ−９（ｃａｔ）」ということがある。
【００３３】
本発明において、「ＭＭＰ−９結合ペプチド」は、ＭＭＰ−９の部分ペプチド又は部分高次構造等を認識する、又はそれらに結合するペプチドを意味する。「ＭＭＰ−９結合ペプチド」の範囲には、当該ペプチドの断片、他の部分（ｍｏｉｅｔｙ）の付加体、又は、コンジュゲートのうち、ＭＭＰ−９結合活性を維持しているものが含まれる。すなわち、ＭＭＰ−９結合活性を維持する当該ペプチドの断片、付加体及び修飾体も「ＭＭＰ−９結合ペプチド」に含まれる。
【００３４】
本発明において、「活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド」は、活性型ＭＭＰ−９の部分ペプチド又は部分高次構造等を認識する、又はそれらに結合するペプチドを意味する。「活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド」の範囲には、当該ペプチドの断片、他の部分（ｍｏｉｅｔｙ）の付加体、又は、コンジュゲートのうち、活性型ＭＭＰ−９結合活性を維持しているものが含まれる。すなわち、活性型ＭＭＰ−９結合活性を維持する当該ペプチドの断片、付加体及び修飾体も「活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド」に含まれる。
【００３５】
本発明において、「ＭＭＰ−９阻害ペプチド」は、ＭＭＰ−９の有する１つ又は２つ以上の活性又は機能を阻害又は抑制するペプチドを意味する。「ＭＭＰ−９阻害ペプチド」の範囲には、当該ペプチドの断片、他の部分（ｍｏｉｅｔｙ）の付加体、又は、コンジュゲートのうち、ＭＭＰ−９阻害活性を維持しているものが含まれる。すなわち、ＭＭＰ−９阻害活性を維持する当該ペプチドの断片、付加体及び修飾体も「ＭＭＰ−９阻害ペプチド」に含まれる。
【００３６】
本発明において、「細胞」には、動物個体に由来する各種細胞、継代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、組換え細胞、酵母、微生物等も含まれる。
【００３７】
本発明において、ペプチドが結合する「部位」、すなわちペプチドが認識する「部位」とは、ペプチドが結合又は認識する標的分子上の連続的もしくは断続的な部分アミノ酸配列又は部分高次構造を意味する。本発明においては、かかる部位のことを標的分子上のエピトープ又は結合部位と呼ぶことができる。
【００３８】
本発明において、「ＳＰＩＮＫ２変異体」とは、野生型ＳＰＩＮＫ２の有するアミノ酸配列において、１個又は２個以上のアミノ酸が野生型とは異なるアミノ酸で置換され、１個又は２個以上の野生型のアミノ酸が欠失し、１個又は２個以上の野生型には無いアミノ酸が挿入され、及び／又は、野生型には無いアミノ酸が野生型のアミノ末端（Ｎ末）及び／又はカルボキシル末端（Ｃ末）に付加されて（以下、「変異」と総称する）なるアミノ酸配列を含むペプチドを意味する。「ＳＰＩＮＫ２変異体」のうち、活性型ＭＭＰ−９結合活性を有するものは、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドに包含される。なお、本発明においては「挿入」も「付加」の範囲に含まれ得る。
【００３９】
本発明において、「１乃至数個」における「数個」とは、３乃至１０個を指す。
【００４０】
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、５×ＳＳＣを含む溶液中で６５℃にてハイブリダイゼーションを行い、ついで２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、０．５×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、並びに、０．２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、それぞれ洗浄する条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることを意味する。ＳＳＣとは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−１５ｍＭクエン酸ナトリウムの水溶液であり、ｎ×ＳＳＣはｎ倍濃度のＳＳＣを意味する。
【００４１】
２．ペプチド
２−１．アミノ酸
「アミノ酸」は、アミノ基及びカルボキシル基を含む有機化合物であり、好適には蛋白質に、より好適には天然の蛋白質に、構成単位として含まれるα−アミノ酸を意味する。本発明において、より好適なアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌであり、特に明記しない限り「アミノ酸」はこれらの計２０アミノ酸を意味する。それらの計２０アミノ酸を「天然アミノ酸」と呼ぶことができる。本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、好適には天然アミノ酸を含有する。
【００４２】
本発明においては「アミノ酸残基」は「アミノ酸」と略記される場合がある。
【００４３】
また、本発明において、アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、又はその混合物（ＤＬ−アミノ酸）であるが、特に明記しない限りＬ−アミノ酸を意味する。
【００４４】
天然アミノ酸は、その共通する側鎖の性質に基づいて、例えば、次のグループに分けることができる。
（１）疎水性アミノ酸グループ：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性アミノ酸グループ：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性アミノ酸グループ：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性アミノ酸グループ：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグループ：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族アミノ酸グループ：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
ただし、天然アミノ酸の分類はこれらに限定されるものではない。
【００４５】
本発明においては、天然アミノ酸は保存的アミノ酸置換を受け得る。
【００４６】
「保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、機能的に等価又は類似のアミノ酸との置換を意味する。ペプチドにおける保存的アミノ酸置換は、該ペプチドのアミノ酸配列に静的変化をもたらす。例えば、同様の極性を有する一つ又は二つ以上のアミノ酸は機能的に等価に作用し、かかるペプチドのアミノ酸配列に静的変化をもたらす。一般に、あるグループ内の置換は構造及び機能について保存的であると考えることができる。しかしながら、当業者には自明であるように、特定のアミノ酸残基が果たす役割は当該アミノ酸を含む分子の三次元構造における意味合いにおいて決定され得る。例えば、システイン残基は、還元型の（チオール）フォームと比較してより極性の低い、酸化型の（ジスルフィド）フォームをとることができる。アルギニン側鎖の長い脂肪族の部分は構造的及び機能的に重要な特徴を構成し得る。また、芳香環を含む側鎖（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン）はイオン−芳香族相互作用又は陽イオン−パイ相互作用に寄与し得る。かかる場合において、これらの側鎖を有するアミノ酸を、酸性又は非極性グループに属するアミノ酸と置換しても、構造的及び機能的には保存的であり得る。プロリン、グリシン、システイン（ジスルフィド・フォーム）等の残基は主鎖の立体構造に直接的な効果を与える可能性があり、しばしば構造的ゆがみなしに置換することはできない。
【００４７】
保存的アミノ酸置換は、以下に示すとおり、側鎖の類似性に基づく特異的置換（レーニンジャ、生化学、改訂第２版、１９７５年刊行、７３乃至７５頁：Ｌ．  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｐｐ７３−７５，  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９７５））及び典型的置換を含む。
（１）非極性アミノ酸グループ：アラニン（以下、「Ａｌａ」又は単に「Ａ」と記す）、バリン（以下、「Ｖａｌ」又は単に「Ｖ」と記す）、ロイシン（以下、「Ｌｅｕ」又は単に「Ｌ」と記す）、イソロイシン（以下、「Ｉｌｅ」又は単に「Ｉ」と記す）、プロリン（以下、「Ｐｒｏ」又は単に「Ｐ」と記す）、フェニルアラニン（「Ｐｈｅ」又は単に「Ｆ」と記す）、トリプトファン（以下、「Ｔｒｐ」又は単に「Ｗ」と記す）、メチオニン（以下、「Ｍｅｔ」又は単に「Ｍ」と記す）
（２）非荷電極性アミノ酸グループ：グリシン（以下、「Ｇｌｙ」又は単に「Ｇ」と記す）、セリン（以下、「Ｓｅｒ」又は単に「Ｓ」と記す）、スレオニン（以下、「Ｔｈｒ」又は単に「Ｔ」と記す）、システイン（以下、「Ｃｙｓ」又は単に「Ｃ」と記す）、チロシン（以下、「Ｔｙｒ」又は単に「Ｙ」と記す）、アスパラギン（以下、「Ａｓｎ」又は単に「Ｎ」と記す）、グルタミン（以下、「Ｇｌｎ」又は単に「Ｑ」と記す）
（３）酸性アミノ酸グループ：アスパラギン酸（以下、「Ａｓｐ」又は単に「Ｄ」と記す）、グルタミン酸（以下、「Ｇｌｕ」又は単に「Ｅ」と記す）
（４）塩基性アミノ酸グループ：リジン（以下、「Ｌｙｓ」又は単に「Ｋ」と記す）、アルギニン（以下、「Ａｒｇ」又は単に「Ｒ」と記す）、ヒスチジン（以下、「Ｈｉｓ」又は単に「Ｈ」と記す）
本発明において、アミノ酸は、天然アミノ酸以外のアミノ酸であってもよい。例えば、天然のペプチドや蛋白質において見出されるセレノシステイン、Ｎ−ホルミルメチオニン、ピロリジン、ピログルタミン酸、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、チロキシン、Ｏ−ホスホセリン、デスモシン、β−アラニン、サルコシン、オルニチン、クレアチン、γアミノ酪酸、オパイン、テアニン、トリコロミン酸、カイニン酸、ドウモイ酸、アクロメリン酸等をあげることができ、ノルロイシン、Ａｃ−アミノ酸、Ｂｏｃ−アミノ酸、Ｆｍｏｃ−アミノ酸、Ｔｒｔ−アミノ酸、Ｚ−アミノ酸等のＮ末端保護アミノ酸、アミノ酸ｔ−ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、フルオレニルエステル等のＣ末端保護アミノ酸、ジアミン、ωアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸、アミノ酸のＴｉｃ誘導体、アミノフォスフォン酸を含むその他の天然界には見出されないアミノ酸等をあげることができるが、それらに限らず上記２０の「天然アミノ酸」以外のアミノ酸を、本発明では便宜的に「非天然アミノ酸」と総称する。
【００４８】
２−２．活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド
本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、ＳＰＩＮＫ２の有する骨格が少なくとも部分的に維持されたＳＰＩＮＫ２変異体（以下、「ＳＰＩＮＫ２変異体」と略記する）であり、活性型ＭＭＰ−９、その部分ペプチド又は部分高次構造等を認識する、又はそれらに結合する（以下、かかる認識又は結合作用をまとめて「活性型ＭＭＰ−９結合活性」という）。本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、好適には前駆型ＭＭＰ−９には結合しないことが好ましい。言い換えれば、本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、好適には、活性型ＭＭＰ−９特異的に結合する。
【００４９】
本発明におけるＳＰＩＮＫ２変異体とＭＭＰ−９の結合は、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：以下、「ＳＰＲ」という）解析法、バイオレイヤー干渉（ＢｉｏＬａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ:以下、「ＢＬＩ」という）法、等温滴定熱量測定（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ：以下、「ＩＴＣ」という）、フローサイトメトリー、免疫沈降法等により、当業者に公知の方法を用いて、測定又は判定することができる。
【００５０】
ＥＬＩＳＡ法としては、プレート上に固相化された活性型ＭＭＰ−９を認識して結合した活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドを検出する方法が挙げられる。活性型ＭＭＰ−９の固相化には、ビオチン−ストレプトアビジンの他、活性型ＭＭＰ−９又は活性型ＭＭＰ−９に融合したタグを認識する固相用抗体等を利用することができる。活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの検出には、標識されたストレプトアビジンの他、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド又は活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドに融合したタグを認識する標識された検出用抗体等を利用することができる。標識には、ビオチンの他、ＨＲＰ、アルカリフォスファターゼ、ＦＩＴＣ等生化学的解析に実施可能な方法を利用することができる。酵素標識を利用した検出にはＴＭＢ（３，３'，５，５'−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＢＣＩＰ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ρ−ＮＰＰ（ρ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＯＰＤ（ｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（３−Ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等の発色基質やＱｕａｎｔａＢｌｕ（商標）Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等の蛍光基質、及び化学発光基質を用いることができる。検出シグナルの測定には、吸光プレートリーダー、蛍光プレートリーダー、発光プレートリーダー、ＲＩ液体シンチレーションカウンター等を利用することができる。
【００５１】
ＳＰＲ解析に用いる機器としては、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＰｒｏｔｅＯｎ（商標）（ＢｉｏＲａｄ）、ＳＰＲ−Ｎａｖｉ（商標）（ＢｉｏＮａｖｉｓＯｙ）、Ｓｐｒｅｅｔａ（商標）（Ｔｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ＳＰＲｉ−ＰｌｅｘＩＩ（商標）（ホリバ）、Ａｕｔｏｌａｂ  ＳＰＲ（商標）（Ｍｅｔｒｏｈｍ）等を例示することができる。ＢＬＩ法に用いる機器としては、Ｏｃｔｅｔ（商標）（Ｐａｌｌ）を例示することができる。
【００５２】
免疫沈降法としては、ビーズ上に固相化された活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドによって認識され、結合した活性型ＭＭＰ−９を検出する方法が挙げられる。ビーズには磁気ビーズやアガロースビーズ等を利用することができる。活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの固相化には、ビオチン−ストレプトアビジンの他、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド又は活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドに融合したタグを認識する抗体、プロテインＡ又はプロテインＧ等を利用することができる。磁石や遠心分離等によってビーズを分離し、ビーズと共に沈殿した活性型ＭＭＰ−９をＳＤＳ−ＰＡＧＥやＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法で検出する。活性型ＭＭＰ−９の検出には、標識されたストレプトアビジンの他、活性型ＭＭＰ−９又は活性型ＭＭＰ−９に融合したタグを認識する標識された検出用抗体等を利用することができる。標識には、ビオチンの他、ＨＲＰ、アルカリフォスファターゼ、ＦＩＴＣ等生化学的解析に実施可能な方法を利用することができる。酵素標識を利用した検出にはＥＬＩＳＡ法と同様の基質を利用することができる。検出シグナルの測定にはＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）（ＢｉｏＲａｄ）やＬｕｍｉｎｏＧｒａｐｈ（ＡＴＴＯ）等を利用することができる。
【００５３】
本発明において「特異的な認識」、すなわち「特異的な結合」とは、非特異的な吸着ではない結合を意味する。結合が特異的であるか否かの判定基準としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法における結合活性ＥＣ５０をあげることができる。プレート上に固相化された活性型ＭＭＰ−９に過剰量の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドを添加し、検出されたシグナルの最大値を１００％とする時、５０％のシグナルが得られるペプチド濃度をＥＣ５０と呼ぶ。本発明の好適な活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの活性型ＭＭＰ−９に対するＥＣ５０値は１×１０−６Ｍ以下、５×１０−７Ｍ以下、２×１０−７Ｍ以下又は１×１０−７Ｍ以下、より好適には５×１０−８Ｍ以下、２×１０−８Ｍ以下又は１×１０−８Ｍ以下、より一層好適には５×１０−９Ｍ以下、２×１０−９Ｍ以下又は１×１０−９Ｍ以下である。本発明における好適な活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは活性型ＭＭＰ−９特異的結合ペプチドであり、前駆型ＭＭＰ−９を認識しない、すなわち前駆型ＭＭＰ−９に結合しない。そのような活性型ＭＭＰ−９特異的結合ペプチドの前駆型ＭＭＰ−９に対するＥＣ５０値は、１×１０−６Ｍ以上、好適には１×１０−５Ｍ以上であるか、又は１×１０−６Ｍのペプチド濃度条件とペプチド非添加条件のシグナル強度に差が見られない。他の判定基準としては、例えば、解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ：以下、「ＫＤ」という）をあげることができる。本発明における好適な活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの活性型ＭＭＰ−９に対するＫＤ値は１×１０−５Ｍ以下、５×１０−６Ｍ以下、２×１０−６Ｍ以下又は１×１０−６Ｍ以下、より好適には５×１０−７Ｍ以下、２×１０−７Ｍ以下又は１×１０−７Ｍ以下、より一層好適には５×１０−８Ｍ以下、２×１０−８Ｍ以下又は１×１０−８Ｍ以下、さらにより一層好適には５×１０−９Ｍ以下、２×１０−９Ｍ以下又は１×１０−９Ｍ以下である。本発明における好適な活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド、すなわち前駆型ＭＭＰ−９に結合しない、活性型ＭＭＰ−９特異的結合ペプチドの前駆型ＭＭＰ−９に対するＫＤ値は、１×１０−６Ｍ以上、好適には１×１０−５Ｍ以上である。他の判定基準としては、例えば、免疫沈降法での解析結果をあげることができる。本発明における好適な活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドをビーズに固相化し、活性型ＭＭＰ−９を添加した後にビーズを分離し、ビーズと共に沈殿した活性型ＭＭＰ−９を検出した場合、活性型ＭＭＰ−９のシグナルが検出される。本発明における好適な活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド、すなわち前駆型ＭＭＰ−９に結合しない、活性型ＭＭＰ−９特異的結合ペプチドをビーズに固相化し、前駆型ＭＭＰ−９を添加した後にビーズを分離し、ビーズと共に沈殿した前駆型ＭＭＰ−９を検出した場合、前駆型ＭＭＰ−９のシグナルは検出されない。言い換えると、同様の方法で任意のＭＭＰ−９結合ペプチドをビーズに固相化し、前駆型ＭＭＰ−９を添加した後にビーズを分離し、ビーズと共に沈殿した前駆型ＭＭＰ−９を検出したとき、前駆型ＭＭＰ−９のシグナルが検出される場合には、当該ＭＭＰ−９結合ペプチドは活性型ＭＭＰ−９特異的結合活性を有していないと判定できる。
【００５４】
また、ある態様における本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、好適には、ＭＭＰ−９阻害活性を有する。
【００５５】
本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの標的であるＭＭＰ−９は、好適には脊椎動物、より好適には哺乳類、より一層好適には霊長類、最適にはヒトに由来する。前駆型ヒトＭＭＰ−９、すなわち全長成熟ヒトＭＭＰ−９（以下、「ｈＭＭＰ−９（ｆｕｌｌ）」という）のアミノ酸配列は、配列番号２８（図４４）で示されるアミノ酸配列の２０番乃至７０７番からなり、１番乃至１９番からなるシグナル配列を含まない。前駆型ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメイン（以下、「ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）」という）のアミノ酸配列としては、配列番号２８（図４４）の２０番Ａｌａ〜４４９番Ｐｒｏからなるもの、２０番Ａｌａ〜２１５番Ｇｌｙ並びに３９１番Ｇｌｎ〜４４３番Ｔｙｒを含むもの（基質との結合に関与するフィブロネクチンＩＩ型ドメインを欠失させたもの）等を例示することができる。活性型ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメイン（以下、「ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）」という）のアミノ酸配列としては、該プロテアーゼ活性が保持されていれば特に限定されないが、配列番号２８（図４４）の１０７番Ｐｈｅ〜４４９番Ｐｒｏからなるもの、１０７番Ｐｈｅ〜２１５番Ｇｌｙ並びに３９１番Ｇｌｎ〜４４３番Ｔｙｒを含むもの（基質との結合に関与するフィブロネクチンＩＩ型ドメインを欠失させたもの）等を例示することができる。ＭＭＰ−９及びその機能断片は、ＭＭＰ−９プロテアーゼとも表記され、組織や細胞から精製するか、又は、遺伝子組換え、イン・ビトロ翻訳、ペプチド合成等の蛋白質の調製方法として当業者に公知の方法により、調製することができる。ＭＭＰ−９及びその機能断片には、シグナル配列、免疫グロブリンのＦｃ領域、タグ、標識等が連結されてもよい。
【００５６】
ＭＭＰ−９阻害活性は、ＭＭＰ−９の有するプロテアーゼ活性を指標として評価することができる。例えば、ＭＭＰ−９又はその機能断片、基質及び本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド又はその候補を共存させた場合に、対照の存在下又は該阻害剤又はその候補の非存在下と比較して、ＭＭＰ−９のプロテアーゼ活性が７０％以下、５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、１％以下又は０％である場合、ＭＭＰ−９阻害が生じており、その阻害活性はそれぞれ３０％以上、５０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上又は１００％である。ＭＭＰ−９阻害活性は、反応条件、基質の種類や濃度等により異なり得る。反応条件については、実施例に記載のものを例示することができるが、それに限定されない。一定濃度のＭＭＰ−９に基質ペプチド又は基質蛋白質を添加し、一定時間反応させた後、基質ペプチドの蛍光を検出する、又は基質蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥやＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法、液体クロマトグラフィー等により検出することで、酵素活性は評価できる。緩衝液としては、例えば、ホスフェート・バッファー・セイライン(ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ：以下「ＰＢＳ」という)、トリスバッファー（５０ｍＭ  トリス，ｐＨ７乃至８．５、例えばｐＨ７．５）等を用いることができ、ＮａＣｌ（０乃至２００ｍＭ、例えば２００ｍＭ）、ＣａＣｌ２（０乃至１０ｍＭ、例えば２ｍＭ）、ＺｎＣｌ２、Ｂｒｉｊ−３５等の塩を添加することもできるが、それらに限定されない。
【００５７】
ＭＭＰ−９の有するプロテアーゼの基質は、内在性の基質、外因性の基質、合成基質等、特に限定されるものではない。ヒトの内在性の基質としては、コラーゲン等を例示することができる。コラーゲンを熱変性して得られるゼラチンも基質として用いることができる。合成基質としては、特に限定されないが、ＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２（配列番号３０：図４６）やＭＯＣＡｃ−ＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２（配列番号３１：図４７）、ＤＮＰ−ＰＬＧＭＷＳＲ（配列番号３２：図４８）、ＭＯＣＡｃ−ＲＰＫＰＶＥ−Ｎｖａ−ＷＲ−Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）−ＮＨ２（配列番号３３：図４９）等を例示することができる。本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのＭＭＰ−９阻害活性（ＩＣ５０又はＫｉ）は、１μＭ以下、好適には１００ｎＭ以下、より好適には１０ｎＭ以下、より一層好適には１ｎＭ以下である。
【００５８】
また、本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、ＭＭＰ−９以外のプロテアーゼ活性を阻害若しくは抑制しないか、又はそれらに対する阻害若しくは抑制の程度が相対的に弱いことが好ましい。言い換えれば、本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのプロテアーゼ阻害活性は、好適には、ＭＭＰ−９特異性が高い。好適な本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１７、ＡＤＡＭ１７等のプロテアーゼ活性を阻害若しくは抑制しないか、又はそれらに対する阻害若しくは抑制の程度が相対的に弱い。より好適な本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、トリプシン、キモトリプシン、トリプターゼ、キマーゼ、プラスミン、トロンビン、エラスターゼ、マトリプターゼ、プロテインＣ、ｔＰＡ、ｕＰＡ、血漿カリクレイン等のプロテアーゼ活性を阻害若しくは抑制しないか、又はそれらに対する阻害若しくは抑制の程度が相対的に弱い。そのような本発明の好適なペプチドは、他のプロテアーゼ活性を阻害若しくは抑制することに起因する副作用を示さず、ＭＭＰ−９に関わる疾患（後述）の治療薬又は予防薬として好適に使用され得る。
【００５９】
ＭＭＰ−９に対する特異性が低く、ＭＭＰ−９に加えて、他のＭＭＰが有するプロテアーゼ活性も阻害する阻害剤、すなわち非選択的ＭＭＰ−９阻害剤は、ヒトに投与した場合に重篤な副作用を示す。亜鉛イオンをキレートする低分子阻害剤は非選択的ＭＭＰ−９阻害剤であり、この阻害剤を投与した臨床試験では、骨や関節の痛み、拘縮等、筋骨格系の重篤な副作用が認められた（非特許文献６、７）。一方、ＭＭＰ−９に対する特異性が高い阻害剤、すなわちＭＭＰ−９特異的阻害剤は、前述のような副作用を回避できる可能性が高い。ラットを用いた安全性試験において、非選択的ＭＭＰ−９阻害剤Ｍａｒｉｍａｓｔａｔを投与した群では、筋骨格症候群の症状が認められたが、ＭＭＰ−９特異的阻害抗体を投与した群では、そのような症状が全く見られなかったことが報告されており（特許文献６）、ＭＭＰ−９特異的にプロテアーゼ活性を阻害する本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、ＭＭＰ−９に関わる疾患の治療又は予防のために好適に使用することができる。
【００６０】
本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、ＭＭＰ−９へのプロテアーゼ基質の結合において、競合的であってもよい。
【００６１】
前述の通り、本発明のペプチドの標的であるＭＭＰ−９は、脊椎動物、好適には哺乳動物、より好適には霊長類、より一層好適にはヒトに由来するが、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス等のげっ歯類、カニクイザル、コモンマーモセット、アカゲザル等の霊長類に由来してもよい。非ヒト動物由来のＭＭＰ−９に対して活性型ＭＭＰ−９特異的結合活性を有するペプチドは、かかる非ヒト動物の活性型ＭＭＰ−９特異的な検出や測定に供することができる。また、非ヒト動物由来のＭＭＰ−９を標的とする本発明のペプチドは、かかる非ヒト動物由来のＭＭＰ−９が有するプロテアーゼ活性を阻害するペプチドであってもよい。そのような、非ヒト動物由来のＭＭＰ−９に対して活性型特異的結合活性及び／又はプロテアーゼ阻害活性を有するペプチドは、かかる非ヒト動物におけるＭＭＰ−９に関わる疾患の診断、検査、治療又は予防等に使用することができる。また、そのような非ヒト動物由来ＭＭＰ−９プロテアーゼ阻害活性を有するペプチドが、ヒトＭＭＰ−９の有するプロテアーゼ活性も阻害する場合、ヒトＭＭＰ−９に関わる疾患の治療薬又は予防薬としての該ペプチドの非臨床研究開発において、かかる非ヒト動物を動物病態モデルとして使用した薬効薬理試験や薬物動態試験、健常動物として使用した安全性試験や毒性試験等を行うことができる。
【００６２】
また、本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、医薬及び診断薬として当該分野で使用される抗体等の他の生体高分子と比較して分子量が小さく、その製造（後述）が比較的容易であり、保存安定性や熱安定性等の物性の面で優れており、医薬組成物（後述）として使用される場合の投与経路、投与方法、製剤等の選択の幅が広い等の長所を有する。また、生体高分子やポリマーの付加等、公知の方法を適用して本発明のペプチドの分子量を大きくすることにより、医薬組成物として使用された場合の血中半減期をより長く調節することもできる。そのような本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの分子量は１０，０００未満、好適には８，０００未満、より好適には約７，０００〜７，２００である。また、配列番号１８（図３２）の１５番Ｃｙｓ〜３１番Ｃｙｓからなる可変ループ部分又は１５番Ｃｙｓ〜６３番Ｃｙｓからなる部分（以下「６つのＣｙｓを含む部分」という）のうち、活性型ＭＭＰ−９結合活性を有するものも、本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドに包含され、可変ループ部分の分子量は２，５００未満、好適には約１，８００〜２，０００であり、６つのＣｙｓを含む部分の分子量は６，０００未満、好適には約５，３００〜５，５００である。
【００６３】
本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドとしてのＳＰＩＮＫ２変異体は、上記のような特異的結合活性、プロテアーゼ阻害活性、その他の性質、機能、特徴等を有し得る一方で、その全長アミノ酸配列はヒト野生型ＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列に対して高い配列同一性を有する。本発明のＳＰＩＮＫ２変異体は、ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列（配列番号１：図１５）と６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する。
【００６４】
「同一性」とは、２つの配列の間の、類似性又は関係の程度を示す性質を意味する。アミノ酸配列の同一性（％）は、同一であるアミノ酸もしくはアミノ酸残基の数をアミノ酸もしくはアミノ酸残基の総数で割って得られる数値に、１００を掛けることにより、算出される。
【００６５】
「ギャップ」とは、２つ以上の配列のうち少なくとも１つにおける欠失及び／又は付加の結果である、当該配列間のアライメントにおける隙間を意味する。
【００６６】
完全に同一なアミノ酸配列を有する２つのアミノ酸配列の間の同一性は１００％であるが、一方のアミノ酸配列を他方と比較して１つ又は２つ以上のアミノ酸又はアミノ酸残基の置換、欠失又は付加があれば、両者の同一性は１００％未満となる。ギャップをも考慮して２つの配列間の同一性を決定するためのアルゴリズムやプログラムとしては、標準的なパラメータを用いるＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻、３３８９−３４０２頁、１９９７年）、ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻、４０３−４１０頁、１９９０年）、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７巻、１９５−１９７頁、１９８１年）等の当業者に公知のものを例示することができる。
【００６７】
本発明において、「変異した」とは、天然に存在する核酸分子又はペプチドと比較のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列において、１つ又は２つ以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド残基又はアミノ酸もしくはアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入がなされていることを意味する。本発明のＳＰＩＮＫ２変異体のアミノ酸配列は、ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列と比較して、１つ又は２つ以上のアミノ酸又はアミノ酸残基が変異されている。
【００６８】
本発明のある態様において、ＳＰＩＮＫ２変異体のアミノ酸配列は、ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列（配列番号１：図１５）の：
１６番Ｓｅｒ〜２２番Ｇｌｙのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又は７つのアミノ酸が他のアミノ酸又はアミノ酸残基に置換されており；
２４番Ｐｒｏ〜２８番Ａｓｎのうち１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸が他のアミノ酸又はアミノ酸残基に置換されており；
１５番Ｃｙｓ、２３番Ｃｙｓ、３１番Ｃｙｓ、４２番Ｃｙｓ、４５番Ｃｙｓ及び６３番Ｃｙｓは、天然型のジスルフィド結合を維持するためには野生型と同じくＣｙｓであることが好ましく、天然型のジスルフィド結合を消失させたり、非天然型のジスルフィド結合を生じさせたりするためには、それらのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つを他のアミノ酸に置換してもよい。本発明のＳＰＩＮＫ２変異体うち一部の好適な活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドにおいては、天然型と同じ当該６箇所にＣｙｓが維持され、ジスルフィド結合が保持されている。かかる活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのうちより好適な一部の態様においては、１５番Ｃｙｓ−４５番Ｃｙｓ、２３番Ｃｙｓ−４２番Ｃｙｓ、及び、３１番Ｃｙｓ−６３番Ｃｙｓが、それぞれジスルフィド結合を形成している。
【００６９】
そのようなＳＰＩＮＫ２変異体の有するアミノ酸配列が活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドに含まれる場合、野生型ＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列に含まれる１６番Ｓｅｒ乃至３０番Ｖａｌからなるループ構造、３１番Ｃｙｓ及び３２番Ｇｌｙからなるβストランド（１）並びに５７番Ｉｌｅ乃至５９番Ａｒｇからなるβストランド（２）から構成されるβシート、４１番Ｇｌｕ乃至５１番Ｇｌｙからなるαへリックス、又は、それらに類似しているか若しくはそれら（の位置）に少なくとも部分的に対応するループ構造、βシート、αへリックス等から構成される立体構造が、活性型ＭＭＰ−９結合活性を発揮し得る程度に、維持されていることが好ましい。
【００７０】
本発明のＳＰＩＮＫ２変異体のうち、一部の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの有するアミノ酸配列について以下に述べる。上述の通り、本発明において「アミノ酸残基」は単に「アミノ酸」と表記されることがある。
【００７１】
配列番号１８（図３２）で示されるアミノ酸配列において、Ｘ１乃至Ｘ１３は、ＭＭＰ−９に結合し且つＭＭＰ−９活性を阻害する限りに置いてそれぞれ任意のアミノ酸であれば特に限定されない。以下、Ｘ１乃至Ｘ１３の好適なアミノ酸について記載するが、それらのアミノ酸の中には天然型、すなわち野生型ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列中と同一のアミノ酸が含まれている場合がある。
【００７２】
１番Ｘ１は、好適にはＡｓｐ又はＧｌｙ、より好適にはＧｌｙである。
【００７３】
２１番Ｘ７がＰｒｏ、２４番Ｘ９がＧｌｎ、且つ、２５番Ｘ１０がＭｅｔのとき、
１６番Ｘ２は、好適にはＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ、より好適にはＡｒｇ又はＧｌｎであり；
１７番Ｘ３は、好適にはＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌ、より好適にはＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ又はＶａｌであり；
１８番Ｘ４は、好適にはＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ又はＶａｌ、より好適にはＡｒｇ、Ｇｌｙ又はＶａｌであり；
１９番Ｘ５は、好適にはＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ又はＬｙｓ、より好適にはＡｒｇ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ又はＬｙｓであり；
２０番Ｘ６は、好適にはＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ又はＳｅｒ、より好適にはＧｌｕ又はＧｌｙであり；
２２番Ｘ８は、好適にはＡｌａ、Ｌｅｕ又はＳｅｒ、より好適にはＡｌａ又はＳｅｒであり；
２６番Ｘ１１は、好適にはＡｌａ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり；
２７番Ｘ１２は、好適にはＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ又はＴｙｒ、より好適にはＰｈｅ又はＴｙｒであり；
２８番Ｘ１３は、好適にはＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ又はＬｙｓ、より好適にはＡｓｎ、Ｇｌｎ又はＬｙｓである。
【００７４】
２０番Ｘ６がＴｙｒ、２２番Ｘ８がＧｌｎ、且つ２４番Ｘ９がＳｅｒのとき、
１６番Ｘ２は、好適にはＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ又はＶａｌ、より好適にはＭｅｔ又はＶａｌであり；
１７番Ｘ３は、好適にはＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＭｅｔ、より好適にはＭｅｔであり；
１８番Ｘ４は、好適にはＰｈｅ又はＴｙｒ、より好適にはＴｙｒであり；
１９番Ｘ５は、好適にはＧｌｎ、Ｇｌｕ又はＬｙｓ、より好適にはＬｙｓであり；
２１番Ｘ７は、好適にはＡｌａ又はＧｌｙ、より好適にはＡｌａであり；
２５番Ｘ１０は、好適にはＡｓｎ又はＨｉｓ、より好適にはＨｉｓであり；
２６番Ｘ１１は、好適にはＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ又はＶａｌ、より好適にはＬｙｓであり；
２７番Ｘ１２は、好適にはＰｈｅ、Ｓｅｒ又はＴｙｒ、より好適にはＳｅｒ又はＴｙｒであり；
２８番Ｘ１３は、好適にはＡｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ又はＬｙｓ、より好適にはＧｌｎ又はＬｙｓである。
【００７５】
なお、野生型のＸ１乃至Ｘ１３は、それぞれＡｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ及びＡｓｎである。
【００７６】
本発明においては、１番アミノ酸のＮ末側に、さらに１つ乃至数個又はそれ以上のアミノ酸が付加していてもよく、そのような付加されるアミノ酸としては、例えば、Ｓｔａｇ＋リンカーからなるアミノ酸配列（配列番号１９及び２０：図３３及び３４）等をあげることができる。
【００７７】
さらに、Ｃ末に位置する６３番Ｃｙｓに１乃至数個のアミノ酸が付加していてもよく、例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙを加えＣ末が６５番Ｇｌｙであるアミノ酸配列等をあげることができる。そのような付加されるアミノ酸としては、例えば、Ｃ末６マー（配列番号２１：図３５）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（図３６）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（図３７）等をあげることができる。
【００７８】
本発明においては、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド又はＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドのＮ末及び／又はＣ末付加体（以下、「親ペプチド」と呼ぶ）において、１つ又は２つ以上のアミノ酸が置換、付加及び／又は欠失されてなるペプチドを「親ペプチドの誘導体」又は「親ペプチド誘導体」と呼ぶことがある。かかる「誘導体」も本発明の「ペプチド」の範囲に含まれる。
【００７９】
本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの範囲に含まれるＳＰＩＮＫ２変異体の有するアミノ酸配列においては、Ｘ１乃至Ｘ１３以外の部分、すなわち、野生型ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列（配列番号１：図１５）中の、２番Ｐｒｏ〜１５番Ｃｙｓ、２３番Ｃｙｓ及び２９番Ｐｒｏ〜６３番Ｃｙｓの位置において、天然型のアミノ酸もしくは変異したアミノ酸又はアミノ酸配列を含むことができる。例えば、ＳＰＩＮＫ２変異体は、活性型ＭＭＰ−９結合活性又はフォールディングを少なくとも部分的に妨げないか又は干渉をしない限りにおいて、１つ又は２つ以上の位置において変異してよい。そのような変異は、当業者に公知の標準的な方法を使用することによりなし得る。アミノ酸配列中の典型的な変異としては、１つ又は２つ以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加をあげることができ、置換としては、保存的置換を例示することができる。保存的置換により、あるアミノ酸残基は、嵩高さのみならず、極性の面についても化学的特徴が類似しているアミノ酸残基により置換される。保存的置換の例は、本明細書の他の部分に記載されている。一方で、Ｘ１乃至Ｘ１３以外の部分は、活性型ＭＭＰ−９結合活性又はフォールディングを少なくとも部分的に妨げないか又は干渉をしない限りにおいて、１つ又は２つ以上のアミノ酸の非保存的置換も許容し得る。
【００８０】
本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドとしてのＳＰＩＮＫ２変異体の有するアミノ酸配列は、Ｘ１乃至Ｘ１３が、好適には配列番号２乃至１７（図１６乃至３１）のいずれか一つにおけるＸ１乃至Ｘ１３の各アミノ酸であり、且つ、Ｘ１乃至Ｘ１３以外の部分が活性型ＭＭＰ−９結合活性又はフォールディングを少なくとも部分的に妨げないか又は干渉をしないアミノ酸又はアミノ酸配列を有することができる。
【００８１】
また、本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドとしてのＳＰＩＮＫ２変異体のアミノ酸配列の例として、次の（ａ）乃至（ｄ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列をあげることができる：
（ａ）配列番号２乃至１７（図１６乃至３１）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列；
（ｂ）（ａ）に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ活性型ＭＭＰ−９結合活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）に記載のアミノ酸配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つ活性型ＭＭＰ−９結合活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列；及び、
（ｄ）（ａ）に記載のアミノ酸配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つ活性型ＭＭＰ−９結合活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列。
【００８２】
上記（ａ）乃至（ｄ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列からなるか又は該アミノ酸配列を含むペプチドは、好適には、前駆型ＭＭＰ−９には結合せず、より好適にはＭＭＰ−９の有するプロテアーゼ活性を阻害し、より一層好適にはＭＭＰ−９の有するプロテアーゼ活性を特異的に阻害する（そのようなペプチドを、「ＭＭＰ−９特異的阻害ペプチド」又は「ＭＭＰ−９特異的阻害ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド」という）。
【００８３】
本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドに、そのフォールディング安定性、熱安定性、保存安定性、血中半減期、水溶性、生物活性、薬理活性、副次的作用等を改善する目的で、変異を導入することができる。例えば、ポリエチレングルコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ビオチン、ペプチド又は蛋白質等の他の物質にコンジュゲートさせるため、Ｃｙｓのような新たな反応性基を変異により導入することができる。
【００８４】
本発明において、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは他の部分に連結していてもよく、そのようなコンジュゲート体を「活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのコンジュゲート」と総称する。「コンジュゲート」又は「コンジュゲーション」には、ある部分が架橋剤等の化学物質を介して、ある部分をアミノ酸の側鎖に連結するのに適した作用物質等を介して、本発明のペプチドのＮ末及び／又はＣ末に遺伝子工学的手法により、本発明のペプチドに連結される形態が含まれる。そのような「部分」には、血中半減期を改善するものとして、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、パルミチン酸等の脂肪酸分子、免疫グロブリンのＦｃ領域、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン又はその断片、アルブミン結合ペプチド、連鎖球菌プロテインＧ等のアルブミン結合蛋白質、トランスフェリンを、例示することができる。その他の「部分」としては、かかる「部分」はペプチドリンカー等のリンカーを介して本発明のペプチドが連結され得る。
【００８５】
また、本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドには、薬理活性を発揮するか又は増強するために、他の薬物がコンジュゲートされていてもよい。抗体分野において抗体−薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ＡＤＣ）として当業者に公知の技術や態様は、抗体を本発明のペプチドに置き換えることにより、本発明の一部の態様となり得る。
【００８６】
本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、ＭＭＰ−９以外の標的分子に対する結合親和性、阻害活性、拮抗活性、作動活性等を発揮する１つ又は２つ以上の部分をさらに含むか、そのような部分にコンジュゲートされていてもよい。かかる「部分」としては、抗体又はその断片、ＳＰＩＮＫ２変異体のような抗体以外の骨格を有する蛋白質又はその断片を例示することができる。抗体分野において多重特異的抗体及び二重特異的抗体（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）として当業者に公知の技術や態様は、それらに含まれる２つ以上の「抗体」のうち少なくとも１つを本発明のペプチドに置き換えることにより、本発明のコンジュゲートの一部の態様となる。
【００８７】
本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド又はその前駆体は、シグナル配列を含み得る。あるポリペプチドもしくはその前駆体のＮ末に存在するか又は付加されたシグナル配列は、当該ポリペプチドを細胞の特定の区画、例えば、大腸菌であれば周辺質、真核細胞であれば小胞体に送達するために有用であり、多くのシグナル配列が当業者に公知であり、宿主細胞に応じて選択され得る。大腸菌の周辺質中に所望のペプチドを分泌させるためのシグナル配列としては、ＯｍｐＡを例示することができる、シグナル配列を含む形態も、本発明のコンジュゲートに、その一部の態様として含まれ得る。
【００８８】
また、本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドに予めタグを付加させることにより、アフィニティークロマトグラフィーによって該ペプチドを精製することができることができる。本発明のペプチドは、例えば、そのＣ末に、ビオチン、Ｓｔｒｅｐタグ（商標）、ＳｔｒｅｐタグＩＩ（商標）、Ｈｉｓ６等のオリゴヒスチジン、ポリヒスチジン、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合蛋白質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ジゴキシゲニンやジニトロフェノール等のハプテン、ＦＬＡＧ（商標）等のエピトープタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ等（以下まとめて「アフィ二ティー・タグ」と呼ぶ）を含むことができる。タグ付加体も、本発明のコンジュゲートに、その一部の態様として含まれ得る。
【００８９】
本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、標識のための部分を含むことができ、具体的には、酵素標識、放射性標識、着色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属複合体、金属、コロイド金等の標識部分がコンジュゲートされ得る。標識のための部分を含む態様も、本発明のコンジュゲートに、その一部の態様として含まれ得る。
【００９０】
本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、そのペプチド部分に天然アミノ酸及び非天然アミノ酸のいずれをも含むことができ、天然アミノ酸としてはＬ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸のいずれをも含むことができる。
【００９１】
本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのアミノ酸配列には、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸のいずれをも含むことができ、天然アミノ酸としてはＬ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸のいずれをも含むことができる。
【００９２】
本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、単量体、２量体、３量体以上のオリゴマー又は多量体として存在し得る。２量体、３量体以上のオリゴマー及び多量体は、単一の単量体から構成されるホモ、及び、２つ以上の異なる単量体から構成されるヘテロ、のいずれでもよい。単量体は、例えば、速やかに拡散し組織への浸透に優れている場合がある。２量体、オリゴマー及び多量体は、例えば、局所において標的分子に対して高い親和性もしくは結合活性を有するか、遅い解離速度を有するか、又は高い活性型ＭＭＰ−９結合活性を示す等の優れた側面を有し得る。自発的な２量体化、オリゴマー化及び多量体化に加え、意図した２量体化、オリゴマー化及び多量体化も、ｊｕｎ−ｆｏｓドメイン、ロイシンジッパー等を本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドに導入することにより、なし得る。
【００９３】
本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、単量体、２量体、３量体以上のオリゴマー又は多量体で、１つ又は２つ以上の標的分子に結合するか又は標的分子の活性を阻害することができる。
【００９４】
本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドがとり得る形態としては、単離された形態（凍結乾燥標品、溶液等）、上述のコンジュゲート体、他の分子に結合した形態（固相化された形態、異分子との会合体、標的分子と結合した形態等）等をあげることができるが、それらに限定されるものではなく、発現、精製、使用、保存等に適合した形態を任意に選択することができる。
【００９５】
ある態様において、本発明の好適な活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドである、ＭＭＰ−９阻害ペプチド、とりわけＭＭＰ−９特異的阻害ペプチドが認識する、活性型ヒトＭＭＰ−９分子上の結合部位は、次の（ｉ）又は（ｉｉ）であり得る：
（ｉ）活性型ＭＭＰ−９のアミノ酸配列（配列番号２８）中、
（ｉａ）第４０２番Ｇｌｕ、及び、
（ｉｂ）第１１０番Ｐｈｅ、第１７９番Ｔｙｒ、第１８７番Ｌｅｕ、第１９２番Ｐｈｅ、第１９９番Ｇｌｎ、第３９３番Ｔｙｒ、第３９７番Ｌｅｕ、第３９８番Ｖａｌ、第４２０番Ｔｙｒ、第４２２番Ｍｅｔ及び第４２３番Ｔｙｒからなる群より選択される１つ又は２つ以上のアミノ酸；又は
（ｉｉ）活性型ＭＭＰ−９のアミノ酸配列（配列番号２８）中、
（ｉｉａ）第４０２番Ｇｌｕ、及び、
（ｉｉｂ）第１７９番Ｔｙｒ、第１８５番Ａｓｐ、第１９２番Ｐｈｅ、第１９３番Ｐｈｅ、第３９３番Ｔｙｒ、第３９７番Ｌｅｕ、第３９８番Ｖａｌ、第４２２番Ｍｅｔ、第４２３番Ｔｙｒ及び第４２４番Ａｒｇからなる群より選択される１つ又は２つ以上のアミノ酸。
【００９６】
ここで、「２つ以上」とは、好適には３つ以上、４つ以上、５つ以上又は６つ以上、であり、より好適には７つ以上、８つ以上又は９つ以上であり、最適には１０、又は、１０若しくは１１、である。
【００９７】
活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドが認識する、活性型ＭＭＰ−９分子上の結合部位は、活性型ＭＭＰ−９の野生型及び変異体と該ペプチドを用いた阻害活性を測定することで特定することができる。例えば、野生型である活性型ＭＭＰ−９の基質ペプチド分解活性を１００％として測定される被験化合物の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）と比較して、ｎｎｎ番目のアミノ酸Ｘを置換した活性型ＭＭＰ−９変異体の基質ペプチド分解活性に対する被験化合物のＩＣ５０が増加する場合、基準は特に限定されないが、例えば、２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは４倍以上、より一層好ましくは５倍以上増加する場合、被験化合物はｎｎｎ番目のアミノ酸Ｘを認識して活性型ＭＭＰ−９に結合する、と判定する。
【００９８】
３．活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの同定
活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、ＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列又は本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの有するアミノ酸配列（例えば、配列番号２乃至１７からなる群、又は、図１６乃至３１からなる群から選択されるアミノ酸配列）、該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列を含む核酸分子等を出発材料として、当業者に周知の方法により、同定することができる。好適な一例として、ヒトＳＰＩＮＫ２変異体ライブラリーより、活性型ＭＭＰ−９結合活性を指標として同定することができ、前駆型ＭＭＰ−９結合活性又はＭＭＰ−９阻害活性も指標として組み合わせてもよい。
【００９９】
例えば、出発材料としての核酸分子は、変異誘発に供され、組換えＤＮＡ技術を用いて適切な細菌宿主又は真核性宿主中に導入され得る。ＳＰＩＮＫ２変異体ライブラリーは、標的分子のバインダーや阻害剤を同定するための技術として公知であり、例えば、ＷＯ２０１２／１０５６１６公報における開示も、その全体を参照することにより本発明の開示に含まれる。適切な宿主において変異誘発に供されたヌクレオチド配列を発現させた後、所望の性質、活性、機能等を有するＳＰＩＮＫ２変異体がその遺伝形質とリンクしてなるクローンを、前記のライブラリーから濃縮及び／又は選抜し、同定することができる。クローンの濃縮及び／又は選抜には、細菌ディスプレイ法（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０巻，１０４４４−１０４４８頁）、酵母ディスプレイ法（Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １５巻，５５３−５５７頁）、哺乳動物細胞ディスプレイ法（Ｈｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００９年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．５２５巻：３３７−５２頁）、ファージディスプレイ法（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２２８巻，１３１５−１３１７頁）、リボソームディスプレイ法（（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ  ＬＣ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４年）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９1巻１９号，９０２２−９０２９頁））、ｍＲＮＡディスプレイ等の核酸ディスプレイ法（Ｎｅｍｏｔｏ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４１４巻２号，４０５−４０８頁）、コロニースクリーニング法（Ｐｉｎｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００２年）Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．  ５巻，５０３−５１０頁）等、当業者に公知の方法を使用することにより、選抜され同定されたクローンに含まれるＳＰＩＮＫ２変異体のヌクレオチド配列を決定することにより、該ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を、当該クローンに含まれるＳＰＩＮＫ２変異体すなわち活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの有するアミノ酸配列として決定することができる。
【０１００】
本発明のＳＰＩＮＫ２変異体は、例えば、天然型のＳＰＩＮＫ２に変異を誘発することにより、得ることができる。「変異の誘発」とは、あるアミノ酸配列の各位置に存在する１つ又は２つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換するかもしくは欠失させるか、又は当該アミノ酸配列中には存在しないアミノ酸を付加もしくは挿入することができるようにすることを意味する。かかる欠失又は付加もしくは挿入により、配列長が変わり得る。本発明のＳＰＩＮＫ２変異体において、変異の誘発は、好適には、配列番号１８（図３２）で示されるアミノ酸配列中の、Ｘ１乃至Ｘ１３の１つ又は２つ以上の位置において生じ得る。
【０１０１】
但し、そのような好適な変異の誘発の後に、Ｘ１乃至Ｘ１３の１つ又は２つ以上の位置において、天然型のアミノ酸、すなわち天然型のアミノ酸配列中の特定の位置に存在するのと同じアミノ酸が維持されたものも、全体として少なくとも１つのアミノ酸が変異されていれば、変異体の範囲に含まれる。同様に、本発明のある態様において、Ｘ１乃至Ｘ１３以外の部分の１つ以上の位置に変異を誘発した後に、当該位置に天然型のアミノ酸、すなわち天然型のアミノ酸配列中の特定の位置に存在するのと同じアミノ酸が維持されたものも、全体として少なくとも１つのアミノ酸が変異されていれば、変異体の範囲に含まれる。
【０１０２】
「ランダム変異の誘発」とは、配列上の特定の位置について、１つ又は２つ以上の異なるアミノ酸が、変異の誘発により、当該位置に一定の確率で導入させることを意味するが、少なくとも２つの異なるアミノ酸の導入される確率が全て同じではなくてもよい。また、本発明においては、少なくとも２つの異なるアミノ酸に、天然型のアミノ酸（１種）が含まれることを妨げるものではなく、そのような場合も「ランダム変異の誘発」の範囲に含まれる。
【０１０３】
特定の位置にランダム変異を誘発する方法としては、当業者に公知の標準的方法を使用することができる。例えば、配列中の特定の位置に、縮重ヌクレオチド組成物を含む合成オリゴヌクレオチドの混合物を用いたＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により変異を誘発することができる。例えば、コドンＮＮＫ又はＮＮＳ（Ｎ＝アデニン、グアニン、シトシン又はチミン；Ｋ＝グアニン又はチミン；Ｓ＝アデニン又はシトシン）を使用すれば、天然アミノ酸２０種全てに加え、停止コドンが導入される変異の誘発されるのに対し、コドンＶＶＳ（Ｖ＝アデニン、グアニン又はシトシン）を使用すれば、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌが導入される可能性が無く、残る１２の天然アミノ酸の導入が変異誘発される。また、例えば、コドンＮＭＳ（Ｍ＝アデニン又はシトシン）を使用すれば、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ及びＶａｌが導入される可能性が無く、残る１１の天然アミノ酸の導入が変異誘発される。非天然アミノ酸の導入を変異誘発するために、特殊なコドン、人工的なコドン等を用いることができる。
【０１０４】
部位特異的な変異誘発は、高次構造を含む標的及び／又は該標的に対するペプチドもしくはペプチドが由来する野生型ペプチドの構造情報を利用しても行うことができる。本発明においては、標的であるＭＭＰ−９及び／又は標的に対するＳＰＩＮＫ２変異体もしくは野生型ＳＰＩＮＫ２の、又は両者の複合体の、高次情報を含む構造情報を利用して、部位特異的な変異を導入することができる。例えば、活性型ＭＭＰ−９結合活性を有するＳＰＩＮＫ２変異体を同定し、次いでＭＭＰ−９及び当該ＳＰＩＮＫ２変異体の複合体の結晶を取得してＸ線結晶構造解析を行い、その解析結果に基づいて該ＳＰＩＮＫ２変異体が結合するＭＭＰ−９分子上のエピトープ及び該エピトープに対応する該ＳＰＩＮＫ２変異体上のパラトープを特定すること等を通じて得られる構造情報と、活性型ＭＭＰ−９結合活性との相関を見出すことができる場合がある。そのような構造活性相関に基づいて、特定の位置において特定のアミノ酸への置換、特定の位置におけるアミノ酸の挿入又は欠失等をデザインし、実際に活性型ＭＭＰ−９結合活性を確認することができる。
また、例えば、イノシン等の塩基対の特異性が改変されたヌクレオチド構成単位を用いて、変異を誘発することができる。
【０１０５】
さらに、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ等の、校正機能を欠き、エラー率の高いＤＮＡポリメラーゼを用いたエラー・プローンＰＣＲ法、化学変異誘発等により、ランダムな位置への変異誘発が可能である。
【０１０６】
活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳細胞ディスプレイ、ファージディスプレイ、リボゾームディスプレイ、核酸ディスプレイ、コロニースクリーニング等を利用して、ファージライブラリー、コロニーライブラリー等それぞれのスクリーニング方法に適した当業者に公知のライブラリーより濃縮及び／又は選抜することができる。それらのライブラリーのうち、ファージライブラリーにはファージミド、コロニースクリーニングにはコスミド等、それぞれのライブラリーに適した当業者に公知のベクター及び方法により構築することができる。そのかかるベクターは、原核細胞又は真核細胞に感染するウイルス又はウイルス性ベクターであってもよい。それらの組換えベクターは、遺伝子操作等当業者に公知の方法により調製することができる。
【０１０７】
細菌ディスプレイは、例えば、大腸菌の外膜リポ蛋白質（Ｌｐｐ）の一部及び外膜蛋白質ＯｍｐＡと所望の蛋白質を融合させ、大腸菌表面上に所望の蛋白質を提示させる技術である。ある蛋白質の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にランダム変異を誘発して得られるＤＮＡ群を細菌ディスプレイに適したベクターに導入し、当該ベクターで細菌細胞を形質転換すれば、形質転換細菌細胞表面上に、ランダム変異誘発された蛋白質群を提示するライブラリーを得ることができる（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０巻，１０４４４−１０４４８頁）。
【０１０８】
酵母ディスプレイは、酵母の細胞表面の外殻にあるα−アグルチニン等の蛋白質に所望の蛋白質を融合させ、酵母表面上に提示させる技術である。α−アグルチニンには、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ)アンカー付着シグナルと推定されるＣ末疎水性領域、シグナル配列、活性ドメイン、細胞壁ドメイン等が含まれ、それらを操作することにより、酵母の細胞表面上に所望の蛋白質をディスプレイすることができる。ある蛋白質の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にランダム変異を誘発して得られるＤＮＡ群を酵母ディスプレイに適したベクターに導入し、当該ベクターで酵母細胞を形質転換すれば、形質転換酵母細胞表面上に、ランダム変異誘発された蛋白質群を提示するライブラリーを得ることができる（Ｕｅｄａ，Ｍ．＆  Ｔａｎａｋａ，Ａ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．、１８巻、１２１頁〜、２０００年刊：Ｕｅｄａ，Ｍ．＆  Ｔａｎａｋａ，Ａ．、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９０巻、１２５頁〜、２０００年刊等）。
【０１０９】
動物細胞ディスプレイは、例えば、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）に代表される膜蛋白質の膜貫通領域と所望の蛋白質を融合させ、ＨＥＫ２９３やチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞表面上に所望の蛋白質を提示させる技術である。ある蛋白質の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にランダム変異を誘発して得られるＤＮＡ群を動物細胞ディスプレイに適したベクターに導入し、当該ベクターで動物細胞を形質転換すれば、形質転換動物細胞表面上に、ランダム変異誘発された蛋白質群を提示するライブラリーを得ることができる（Ｈｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００９年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．５２５巻：３３７−５２頁）。
【０１１０】
酵母、細菌、動物細胞等の細胞上に提示された所望のライブラリーは、標的分子の存在下で保温するか、又は、標的分子と接触させることができる。例えば、ビオチン等で修飾されたＭＭＰ−９とライブラリーを含む細胞を一定時間保温した後、磁性ビーズ等の担体を添加し、細胞を担体から分離し、次いで担体を洗浄することにより非特異的な吸着物及び結合物を除去し、担体（に結合したＭＭＰ−９）に結合したペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物が提示された細胞群を回収することができる。同様に、磁性ビーズ添加後に磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）をする、又は、抗ＭＭＰ−９抗体を用いた細胞染色後にＦＡＣＳを実施することで、担体（に結合したＭＭＰ−９）又はＭＭＰ−９と結合したペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物が提示された細胞群を回収することができる。非特異的な吸着物部位及び／又は結合部位は、例えば、ブロッキング処理することも可能であり、ブロッキング工程も適切な方法であれば組み入れられ得る。そのようにして得られたペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物を発現しているベクターを回収し、ベクターに挿入されたポリヌクレオチドの有するヌクレオチド配列を決定し、該ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を決定することができる。また、ベクターを再度宿主細胞に導入し、上述の操作をサイクルとして１回乃至数回繰り返すことにより、標的分子に結合するペプチド集合物をより高度に濃縮することができる。
【０１１１】
ファージディスプレイの場合、例えば、ファージミドは、プラスミド複製起点の他に、一本鎖バクテリオファージから誘導された第二の複製起点を含む細菌プラスミドである。ファージミドを有する細胞は、Ｍ１３又はそれに類似のヘルパーバクテリオファージによる重感染において、一本鎖複製モードを介してファージミドを複製することができる。すなわち、バクテリオファージ被覆蛋白質により被覆された感染性粒子の中に、一本鎖ファージミドＤＮＡがパッケージされる。このようにして、ファージミドＤＮＡを、感染細菌中にクローン二本鎖ＤＮＡプラスミドとして、ファージミドを、重感染した細胞の培養上清からバクテリオファージ状の粒子として、それぞれ形成することができる。バクテリオファージ状の該粒子を、Ｆ性線毛を有する細菌にかかるＤＮＡを感染させるために該細菌中に注入することにより、粒子自体をプラスミドとして再形成することができる。
【０１１２】
被験ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド及びバクテリオファージ被覆蛋白質（ｃｏａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を含んで構成される融合遺伝子を該ファージミドに挿入して細菌に感染させ、該細胞を培養すれば、かかるペプチドを、該細菌上又はファージ様粒子上に発現もしくは提示（ディスプレイと同義）させるか、又は、該被覆蛋白質との融合蛋白質としてファージ粒子中もしくは該細菌の培養上清中に産生することができる。
【０１１３】
例えば、該ポリヌクレオチド及びバクテリオファージ被覆蛋白質遺伝子ｇｐＩＩＩを含んで構成される融合遺伝子をファージミドに挿入し、Ｍ１３又はそれに類似のヘルパーファージとともに大腸菌に重感染させれば、該ペプチド及び該被覆蛋白質を含んで構成される融合蛋白質として、該大腸菌の培養上清中に産生させることができる。
【０１１４】
ファージミドの代わりに、環状又は非環状の各種ベクター、例えば、ウイルスベクターを用いる場合、当業者に公知の方法に従って、該ベクターに挿入された該ポリヌクレオチドの有するヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を有するペプチドを、該ベクターが導入された細胞もしくはウイルス様粒子上に発現又は提示させるか、又は該細胞の培養上清中に産生することができる。
【０１１５】
そのようにして得られる、ペプチドを発現しているライブラリーを、標的分子の存在下で保温するか、又は、標的分子と接触させることができる。例えば、ＭＭＰ−９が固相化された担体を、ライブラリーを含む移動相と一定時間保温した後、移動相を担体から分離し、次いで担体を洗浄することにより非特異的な吸着物及び結合物を除去し、担体（に結合したＭＭＰ−９）に結合したペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物を、溶出により回収することができる。溶出は、相対的に高いイオン強度、低いｐＨ、中程度の変性条件、カオトロピック塩の存在下等で、非選択的に行うか、又は、ＭＭＰ−９等の可溶性の標的分子、標的分子に結合する抗体、天然のリガンド、基質等を添加して固相化された標的分子と競合させることにより選択的に行うことができる。非特異的な吸着物部位及び／又は結合部位は、例えば、ブロッキング処理することも可能であり、ブロッキング工程も適切な方法であれば組み入れられ得る。
【０１１６】
そのようにして得られたペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物を発現しているベクターを回収し、ベクターに挿入されたポリヌクレオチドの有するヌクレオチド配列を決定し、該ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を決定することができる。また、ベクターを再度宿主細胞に導入し、上述の操作をサイクルとして１回乃至数回繰り返すことにより、標的分子に結合するペプチド集合物をより高度に濃縮することができる。
【０１１７】
リボゾームディスプレイは、例えば、終始コドンを持たない所望の蛋白質をコードするｍＲＮＡと無細胞蛋白質合成系を用いることで、試験管内で所望の蛋白質とそれに対応するｍＲＮＡ、及びリボゾームが連結した分子を合成する技術である。ある蛋白質の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にランダム変異を誘発して得られるｍＲＮＡ群と無細胞蛋白質合成系を利用することで、ランダム変異誘発された蛋白質群がリボゾーム上に提示されたライブラリーを得ることができる（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ  ＬＣ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４年）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９1巻１９号，９０２２−９０２９頁）。
【０１１８】
核酸ディスプレイは、ｍＲＮＡディスプレイともよばれ、例えば、チロシルｔＲＮＡの３’末端に類似の構造をもつピューロマイシン等のリンカーを用いることで、所望の蛋白質、それをコードするｍＲＮＡ及びリボゾームが連結した分子を合成する技術である。当該技術は生細胞ではなく、無細胞蛋白質合成系を利用するため、試験管内で合成することが可能である。ある蛋白質の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にランダム変異を誘発して得られるｍＲＮＡ群とピューロマイシン等のリンカー、及び、無細胞蛋白質合成系を利用することで、ランダム変異誘発された蛋白質群がリボゾーム上に提示されたライブラリーを得ることができる（Ｎｅｍｏｔｏ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４１４巻２号，４０５−４０８頁）。
【０１１９】
リボゾームディスプレイや核酸ディスプレイ等の無細胞合成系を介して得られる、ペプチドを発現しているライブラリーは、標的分子の存在下で保温するか、又は、標的分子と接触させることができる。例えば、ＭＭＰ−９が固相化された担体を、ライブラリーを含む移動相と一定時間保温した後、移動相を担体から分離し、次いで担体を洗浄することにより非特異的な吸着物及び結合物を除去し、担体（に結合したＭＭＰ−９）に結合したペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物を、溶出により回収することができる。溶出は、相対的に高いイオン強度、低いｐＨ、中程度の変性条件、カオトロピック塩の存在下等で、非選択的に行うか、又は、ＭＭＰ−９等の可溶性の標的分子、標的分子に結合する抗体、天然のリガンド、基質等を添加して固相化された標的分子と競合させることにより選択的に行うことができる。非特異的な吸着物部位及び／又は結合部位は、例えば、ブロッキング処理することも可能であり、ブロッキング工程も適切な方法であれば組み入れられ得る。
【０１２０】
そのようにして得られたペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物を発現している核酸を回収し、ｍＲＮＡの場合はｃＤＮＡに逆転写反応後にヌクレオチド配列を決定し、該ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を決定することができる。また、回収した核酸からｍＲＮＡを転写し、上述の操作をサイクルとして１回乃至数回繰り返すことにより、標的分子に結合するペプチド集合物をより高度に濃縮することができる。
【０１２１】
ペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物に予めアフィ二ティー・タグをコンジュゲートさせておけば、効率的に当該ペプチド又はそれらの集合物を精製することができる。例えば、プロテアーゼの基質をタグとして予めペプチド集合物にコンジュゲートさせておけば、該プロテアーゼ活性により切断することにより、ペプチドを溶出することができる。
【０１２２】
得られた配列情報及びペプチドの機能等に基づき、得られたクローン又はライブラリーにさらなる変異を誘発させ、変異が導入されたライブラリーから、その機能（例えば、活性型ＭＭＰ−９結合活性）、物性（熱安定性、保存安定性等）、体内動態（分布、血中半減期）等が改善されたペプチドを取得することも可能である。
【０１２３】
得られたペプチドが、活性型ＭＭＰ−９結合活性を有しているか否かを決定することにより、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドを同定することができる。
【０１２４】
また、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、好適には、野生型ＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列に含まれる１６番Ｓｅｒ乃至３０番Ｖａｌからなるループ構造、３１番Ｃｙｓ及び３２番Ｇｌｙからなるβストランド（１）並びに５７番Ｉｌｅ乃至５９番Ａｒｇからなるβストランド（２）から構成されるβシート、並びに、４１Ｇｌｕ番アミノ酸乃至５１番Ｇｌｙからなるαへリックス、又は、それらに類似するか若しくはそれら（の位置）に少なくとも部分的に対応するループ構造、βシート、αへリックス等から構成される立体構造が、活性型ＭＭＰ−９結合活性を発揮し得る程度に、維持され得る。かかる立体構造（全体の構造又は部分構造）を指標の一部として、より好適な活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドを同定することも可能である。
【０１２５】
４．活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドをコードする核酸分子、それを含むベクター、それらを含む細胞、並びに、組換え活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの製造方法
本発明は、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（以下、「活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドをコードする核酸分子」という）、該遺伝子が挿入された組換えベクター、該遺伝子もしくはベクターが導入された細胞（以下、「活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドをコードする核酸分子含有細胞」という）、又は活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドを産生する細胞（以下、「活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド産生細胞」という）をも提供する。
【０１２６】
本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドをコードする核酸分子の一部の好適な例として、次の（ａ）乃至（ｄ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列（以下、「活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのヌクレオチド配列」という）を含んでなるか、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるか、又は活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるものをあげることができる：
（ａ）配列番号２乃至１７（図１６乃至３１）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）（ａ）に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ活性型ＭＭＰ−９結合活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）に記載のヌクレオチド配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つ活性型ＭＭＰ−９結合活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；及び、
（ｄ）（ａ）に記載のヌクレオチド配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つ活性型ＭＭＰ−９結合活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【０１２７】
上記（ａ）乃至（ｄ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなるか又は該アミノ酸配列を含むＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドは、好適には前駆型ＭＭＰ−９には結合せず、より好適にはＭＭＰ−９の有するプロテアーゼ活性を阻害し、より一層好適にはＭＭＰ−９の有するプロテアーゼ活性を特異的に阻害する。
【０１２８】
しかしながら、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドをコードする核酸分子は（ａ）乃至（ｄ）に限定されるものではなく、活性型ＭＭＰ−９結合活性を有するＳＰＩＮＫ２変異体に含まれるアミノ酸配列、好適には配列番号１８（図３２）で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子は遍く活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドをコードする核酸分子の範囲に包含される。
【０１２９】
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を設計するには、各アミノ酸に対応するコドンを１種又は２種以上使用することができる。そのため、あるペプチドが有する単一のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、複数のバリエーションを有し得る。かかるコドンの選択に際しては、該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入される、発現用の宿主細胞のコドン使用（ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）に応じて適宜コドンを選択したり、複数のコドンの使用の頻度もしくは割合を適宜調節したりすることができる。例えば、大腸菌を宿主細胞として用いる場合は、大腸菌において使用頻度が高いコドンを使用してヌクレオチド配列を設計してもよい。
【０１３０】
活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドをコードする核酸分子は、１つ又は２つ以上の調節配列に機能的に連結されていてもよい。「機能的に連結される」とは、連結された核酸分子を発現させることができる、又は、該分子に含まれるヌクレオチド配列の発現を可能にする、ことを意味する。調節配列は、転写調節及び／又は翻訳調節に関する情報を含む配列エレメントを含む。調節配列は、種により様々であるが、一般に、プロモーターを含み、原核生物の−３５／−１０ボックス及びシャイン・ダルガノ配列、真核生物のＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴ配列、及び５’キャッピング配列等で例示される、転写及び翻訳の開始に関与する５’非コード配列を含む。かかる配列は、エンハンサーエレメント及び／又はリプレッサーエレメント、並びに宿主細胞内外の特定の区画へと天然型又は成熟型のペプチドを送達するための、翻訳され得るシグナル配列、リーダー配列等を含んでもよい。さらに、調節配列は３’非コード配列を含んでよく、かかる配列には、転写終結又はポリアデニル化等に関与するエレメントを含み得る。ただし、転写終結に関する配列が、特定の宿主細胞において充分に機能しない場合は、当該細胞に適した配列で置換され得る。
【０１３１】
プロモーター配列としては、原核生物ではｔｅｔプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、Ｔ７プロモーター等を、真核細胞ではＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等を例示することができる。
【０１３２】
活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドをコードする核酸分子は、単離された形態、ベクターもしくは他のクローニングビヒクル（以下、単に「ベクター」という：プラスミド、ファージミド、ファージ、バキュロウイルス、コスミド等）中又は染色体中に含まれる形態であってよいが、それらの形態に限定されない。ベクターには、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのヌクレオチド配列及び上記調節配列に加え、発現に使用される宿主細胞に適した複製配列及び制御配列、並びに形質転換等により核酸分子が導入された細胞を選択可能な表現型を与える選択マーカーを含んでいてもよい。
【０１３３】
活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドをコードする核酸分子、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのヌクレオチド配列を含むベクターは、当該ペプチド又はヌクレオチド配列を発現可能な宿主細胞に形質転換等の当業者に公知の方法により導入することができる。該核酸分子又はベクターを導入された宿主細胞は、当該ペプチド又はヌクレオチド配列の発現に適した条件下で培養され得る。宿主細胞は、原核及び真核のいずれでもよく、原核では大腸菌、枯草菌等、真核ではサッカロミセス・セレヴィシエ、ピキア・パストリス等の酵母、ＳＦ９、Ｈｉｇｈ５等の昆虫細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳ０等の動物細胞を例示することができる。真核細胞等を宿主細胞として用いることにより、発現した本発明のペプチドに所望の翻訳後修飾を施すことができる。翻訳後修飾としては、糖鎖等の官能基付加、ペプチド又は蛋白質の付加、アミノ酸の化学的性質の変換等を例示することができる。また、本発明のペプチドへの所望の修飾を人工的に施すことも可能である。そのようなペプチドの修飾体も、本発明の「ペプチド」の範囲に包含される。
【０１３４】
本発明は活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの製造方法をも含む。当該方法には、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドをコードする核酸分子もしくは活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのヌクレオチド配列を含むベクターが導入された宿主細胞又は活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドを発現する細胞を培養する工程１、及び／又は、工程１で得られた培養物から活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドを回収する工程２が含まれる。工程２には、当業者に公知の分画、クロマトグラフィー、精製等の操作を適用することができ、例えば、後述する本発明の抗体を利用したアフィニティー・クロマトグラフィーによる精製が適用可能である。
【０１３５】
本発明の一部の態様において、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、分子内ジスルフィド結合を有する。分子内ジスルフィド結合を有するペプチドは、シグナル配列等を用いて、酸化性の酸化還元環境を有する細胞区間に送達させることが好ましい場合がある。酸化性環境は、大腸菌等のグラム陰性細菌の周辺質、グラム陽性細菌の細胞外環境、真核細胞の小胞体内腔等により提供することが可能であり、かかる環境下では、構造的なジスルフィド結合の形成が促進され得る。また、大腸菌等の宿主細胞の細胞質において分子内ジスルフィド結合を有するペプチドを作製することも可能であり、その場合ペプチドは、可溶性の折り畳まれた状態で直接的に獲得されるか、又は封入体の形態で回収され、次いでイン・ビトロで復元され得る。さらに、酸化性の細胞内環境を有する宿主細胞を選択し、その細胞質において分子内ジスルフィド結合を有するペプチドを作製することもできる。一方、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドが分子内ジスルフィド結合を有さない場合は、還元性の酸化還元環境を有する細胞区間、例えば、グラム陰性細菌の細胞質において作製され得る。
【０１３６】
本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、メリフィールド他のペプチド固相合成法、並びに、ｔ−ブトキシカルボニル（ｔ−Ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ：Ｂｏｃ）や９−フルオレニルメトキシカルボニル（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ：Ｆｍｏｃ）等を利用した有機合成化学的ペプチド合成法により例示される化学合成、イン・ビトロ翻訳等の、他の当業者に公知の方法によっても製造することができる。
【０１３７】
本発明は、その一部の態様として、活性型ＭＭＰ−９結合活性を有するＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに結合する抗体及びその機能断片を提供する。抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれでもよく、モノクローナル抗体としては、免疫グロブリン又はそれに由来するものであれば特に限定されない。抗体の機能断片は、抗原結合活性すなわち該ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドへの結合活性を有している範囲において限定はなく、重鎖及び軽鎖の両方もしくは一方又はその断片、定常領域やＦｃ領域を欠くもの、他の蛋白質や標識用物質とのコンジュゲート体等も含まれる。かかる抗体及びその機能断片は、当業者に公知の方法により調製することができ、該ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドのアフィニティー・クロマトグラフィーによる精製、該ペプチドを含む医薬組成物又はその使用に関連した臨床検査、診断等における該ペプチドの検出、イムノアッセイ等に有用である。本発明の抗体は、該抗体が結合する本発明のペプチドを用いたアフィニティー・クロマトグラフィーにより精製することができる。
【０１３８】
５．医薬組成物
本発明は活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド又はそのコンジュゲートを含む医薬組成物をも提供する。好適には、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド又はそのコンジュゲートは、ＭＭＰ−９阻害活性を持つＭＭＰ−９阻害ペプチド又はそのコンジュゲートである。
【０１３９】
本発明の医薬組成物は、ＭＭＰ−９により惹起されるか又は増悪化され、ＭＭＰ−９の発現又は機能を阻害又は抑制することにより、かかる惹起又は増悪化の抑制、治癒、症状の維持もしくは改善、二次性疾患の回避等し得る各種疾患（以下、「ＭＭＰ−９に関わる疾患」又は「ＭＭＰ−９関連疾患」という）の治療及び／又は予防に有用である。
【０１４０】
ＭＭＰ−９に関わる疾患としては、例えば、炎症性・自己免疫性疾患、神経変性疾患、精神疾患、血管系疾患、又は悪性腫瘍等をあげることができる。
【０１４１】
炎症性・自己免疫性疾患としては、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、気管支喘息、間質性肺炎、慢性閉塞性肺疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、肝炎、湿疹（皮膚炎）、乾癬、扁平苔癬、紅斑・紅皮症、蕁麻疹、脱毛症、天疱瘡、尋常性ざ瘡、褥瘡・創傷、結膜炎、角膜炎、鼻炎、口内炎、舌炎、ベーチェット病、多発性硬化症、脳炎、頭痛、末梢神経炎、糖尿病合併症（糖尿病網膜症、糖尿病腎症、糖尿病神経障害）、アテローム性動脈硬化症、膵炎、慢性心不全、又は腎炎をあげることができる。
【０１４２】
神経変性疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、脳損傷、脊髄損傷、低酸素症、痙攣、又は外傷性脳障害をあげることができる。
【０１４３】
精神疾患としては、例えば、大うつ病、双極性障害、不安、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ)、摂食障害、睡眠障害、統合失調症、依存症、自閉症、脆弱Ｘ症候群、注意欠陥多動性障害、又はダウン症侯群をあげることができる。
【０１４４】
血管系疾患としては、例えば、脳血管障害、脳動脈瘤、脳アミロイド血管症、抹消血管障害、大動脈瘤、大動脈解離、動静脈瘻、動脈硬化症、高安動脈炎、川崎病、静脈瘤、又は血管石灰化をあげることができる。
【０１４５】
悪性腫瘍としては、例えば、肺癌、乳癌、膵臓癌、大腸癌、又は神経膠腫をあげることができる。
【０１４６】
但し、ＭＭＰ−９に関わる疾患は、ここに例示された疾患に限定されるものではない。
【０１４７】
本発明の医薬組成物には、治療又は予防に有効な量の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドと薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含有せしめることができる。
【０１４８】
「治療又は予防に有効な量」とは、特定の疾患、投与形態及び投与経路につき治療又は予防効果を奏する量を意味し、「薬理学的に有効な量」と同義である。
【０１４９】
本発明の医薬組成物には、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、無菌性、該組成物又はそれに含まれるペプチド又はコンジュゲートの安定性、溶解性、徐放性、吸収性、浸透性、剤型、強度、性状、形状等を変化させたり、維持したり、保持したりするための物質（以下、「製剤用の物質」という）を含有せしめることができる。製剤用の物質としては、薬理学的に許容される物質であれば特に限定されるものではない。例えば、非毒性又は低毒性であることは、製剤用の物質が好適に具備する性質である。
【０１５０】
製剤用の物質として、例えば、以下のものをあげることができるが、これらに限定されるものではない；グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素ナトリウム、トリス−塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β−シクロデキストリンやヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノース又はデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類やグルコース、マンノースやデキストリン等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール等の溶媒、マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール、懸濁剤、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルビテート２０やポリソルビテート８０等のポリソルビテート、トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）、トロメタミン（ｔｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、レシチン又はコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトールやソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、希釈剤、賦形剤、及び／又は薬学上の補助剤。
【０１５１】
これらの製剤用の物質の添加量は、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの重量に対して０．００１乃至１０００倍、好適には０．０１乃至１００倍、より好適には０．１乃至１０倍である。
【０１５２】
活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドをリポソーム中に含有せしめたもの、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドとリポソームとが結合してなる修飾体を含有する医薬組成物も、本発明の医薬組成物に含まれる。
【０１５３】
賦形剤や担体は、通常液体又は固体であり、注射用の水、生理食塩水、人工脳脊髄液、その他の、経口投与又は非経口投与用の製剤に用いられる物質であれば特に限定されない。生理食塩水としては、中性のもの、血清アルブミンを含むもの等をあげることができる。
【０１５４】
緩衝剤としては、医薬組成物の最終ｐＨが７．０乃至８．５になるように調製されたＴｒｉｓバッファー、同じく４．０乃至５．５になるように調製された酢酸バッファー、同じく５．０乃至８．０になるように調製されたクエン酸バッファー、同じく５．０乃至８．０になるように調製されたヒスチジンバッファー等を例示することができる。
【０１５５】
本発明の医薬組成物は、固体、液体、懸濁液等である。本発明の別の医薬組成物の例として、凍結乾燥製剤をあげることができる。凍結乾燥製剤を成型するには、スクロース等の賦形剤を用いることができる。
【０１５６】
本発明の医薬組成物の投与経路としては、点眼、経腸投与、局所投与及び非経口投与のいずれでもよく、例えば、結膜上への点眼、硝子体内投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、経皮投与、骨内投与、関節内投与等をあげることができる。
【０１５７】
かかる医薬組成物の組成は、投与方法、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの活性型ＭＭＰ−９結合親和性又はＭＭＰ−９阻害活性等に応じて決定することができる。本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの活性型ＭＭＰ−９蛋白質に対する親和性が高いほど（ＫＤ値、ＩＣ５０値又はＫｉ値が低いほど）、少ない投与量でその薬効を発揮し得る。
【０１５８】
本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの投与量は、薬理学的に有効な量であれば限定されず、個体の種、疾患の種類、症状、性別、年齢、持病、該ペプチドのＭＭＰ−９蛋白質結合親和性又はその生物活性、その他の要素に応じて適宜決定することができるが、通常、０．０１乃至１０００ｍｇ／ｋｇ、好適には０．１乃至１００ｍｇ／ｋｇを、１乃至１８０日間に１回、又は１日２回若しくは３回以上投与することができる。
【０１５９】
医薬組成物の形態としては、注射剤（凍結乾燥製剤、点滴剤を含む）、坐剤、経鼻型吸収製剤、経皮型吸収製剤、舌下剤、カプセル、錠剤、軟膏剤、顆粒剤、エアーゾル剤、丸剤、散剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、生体埋め込み型製剤等を例示することができる。
【０１６０】
活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドを有効成分として含む医薬組成物は、他の医薬と同時に又は別個に投与することができる。例えば、他の医薬を投与した後に活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドを有効成分として含む医薬組成物を投与するか、かかる医薬組成物を投与した後に、他の医薬を投与するか、又は、当該医薬組成物と他の医薬とを同時に投与してもよい。同時に投与する場合、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドと他の医薬とは、単一の製剤、及び、別々の製剤（複数の製剤）、のいずれに含有されてもよい。
【０１６１】
それらの他の医薬は、１つの場合もあり、２つ、３つあるいはそれ以上を投与するか又は受けることもできる。それらをまとめて本発明の医薬組成物と「他の医薬との併用」又は「他の医薬との組み合わせ」と呼び、本発明のペプチド又はそのコンジュゲートに加えて他の医薬を含むか又は他の療法と組み合わせて使用される本発明の医薬組成物も「他の医薬との併用」又は「他の医薬との組み合わせ」の態様として本発明に含まれる。
【０１６２】
本発明は、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドを投与する工程を含む、ＭＭＰ−９に関わる疾患の治療方法又は予防方法、該疾患の治療用又は予防用医薬組成物を調製するための本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの使用、該疾患の治療又は予防のための活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの使用、をも提供する。本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドを含む治療用又は予防用キットも本発明に含まれる。
【０１６３】
さらに、本発明は、本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド又はそのコンジュゲートの有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、又は、該ポリヌクレオチドもしくは該ベクターを含むか又は本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド又はそのコンジュゲートを発現する細胞を含む医薬組成物をも提供する。例えば、かかるポリヌクレオチド及びベクターはＭＭＰ−９に関わる疾患の遺伝子治療に、かかる細胞はＭＭＰ−９に関わる疾患の細胞治療に、それぞれ公知の手法を用いて適用することができる。また、例えば、かかるポリヌクレオチド又はベクターを、自家細胞又は他家細胞（同種細胞）に導入することにより、細胞治療用の細胞を調製することができる。そのようなポリヌクレオチド及びベクターは、細胞治療薬調製用の組成物としても、本発明に包含される。しかしながら、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、細胞等を含む医薬組成物の態様は上記のものに限定されない。
【０１６４】
６．診断用組成物
本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド又はそのコンジュゲートを含む検査用又は診断用組成物（以下、まとめて「診断用組成物」という）を提供する。
【０１６５】
本発明の診断用組成物は、炎症性疾患や血管系疾患等ＭＭＰ−９に関わる疾患、ＭＭＰ−９発現の検査又は診断に有用である。本発明において検査又は診断には、例えば、罹患リスクの判定又は測定、罹患の有無の判定、進行や増悪化の程度の測定、ＭＭＰ−９阻害剤等の医薬組成物による薬物治療の効果の測定又は判定、薬物治療以外の治療の効果の測定又は判定、再発リスクの測定、再発の有無の判定等が含まれるが、検査又は診断であればそれらに限定されるものではない。
【０１６６】
本発明の診断用組成物は、本発明のペプチド又はそのコンジュゲート、それらを含む組成物、それらを含む医薬組成物を投与する個体の同定に有用である。
【０１６７】
かかる診断用組成物には、ｐＨ緩衝剤、浸透圧調節剤、塩類、安定化剤、防腐剤、顕色剤、増感剤、凝集防止剤等を含有せしめることができる。
【０１６８】
本発明は炎症性疾患や血管系疾患等ＭＭＰ−９に関わる疾患の検査方法又は診断方法、該疾患の診断用組成物を調製するための本発明のペプチドの使用、該疾患の検査又は診断のための本発明のペプチドの使用、をも提供する。本発明のペプチドを含む検査又は診断用キットも本発明に含まれる。
【０１６９】
本発明のペプチドを含む検査又は診断の方法としてはサンドウィッチＥＬＩＳＡが望ましいが、通常のＥＬＩＳＡ法やＲＩＡ法、ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ）法、ドットブロット法、オクタロニー法、ＣＩＥ（Ｃｏｕｎｔｅｒｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法、ＣＬＩＡ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）、ＦＣＭ（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）等の検出方法が利用可能である。検出には抗体や本発明のペプチドもしくはそのコンジュゲート等を標識したものが利用される。標識法としてはビオチンのほか、ＨＲＰ、アルカリフォスファターゼ、ＦＩＴＣ等の発蛍光団、放射性同位元素等のラベル等生化学的解析に実施可能な標識法が利用できる。酵素標識を利用した検出にはＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＢＣＩＰ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ρ−ＮＰＰ（ρ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＯＰＤ（ｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（３−Ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等の発色基質やＱｕａｎｔａＢｌｕ（商標）  Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）蛍光基質のほか、化学発光基質を用いることができる。本測定には、ヒト又は非ヒト動物由来の試料に加え、組換え蛋白質等の人工的な処理を加えた試料をも供することができる。生物個体由来の被験試料としては、例えば、血液、関節液、腹水、リンパ液、脳脊髄液、肺胞洗浄液、唾液、痰、組織ホモジネート上清、組織切片等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。
【０１７０】
本発明のペプチドを含む検査又は診断用のサンドウィッチＥＬＩＳＡキットには、活性型ＭＭＰ−９蛋白質標準液、発色試薬、希釈用緩衝液、固相用蛋白質、検出用蛋白質、並びに洗浄液等が含まれてよい。抗原に結合した蛋白質量を測定する方法としては、吸光法、蛍光法、発光法、ＲＩ（Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ）法等が好適に適用され、測定には、吸光プレートリーダー、蛍光プレートリーダー、発光プレートリーダー、ＲＩ液体シンチレーションカウンター等が好適に使用される。
【０１７１】
また、免疫沈降法を利用した方法でも検査又は診断が可能である。
【０１７２】
また、本発明は被験サンプル中の活性型ＭＭＰ−９を検出又は測定する方法を提供する。これらの検出又は測定方法には、本発明の診断用組成物を使用することができる。活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドもしくはそのコンジュゲートを被験試料と接触させ（工程１）、次いで該ペプチドに結合したＭＭＰ−９の量又は測定を測定する（工程２）ことにより、該試料中の活性型ＭＭＰ−９を検出することができる。工程１としては、例えば、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドに免疫グロブリンのＦｃ領域をコンジュゲートしたものをプロテインＧを介して磁気ビーズに固相化し、そこに被験試料を添加する等、工程２としては、例えば、磁気ビーズを分離し、ビーズと共に沈殿した可溶性蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥやＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法で解析し、活性型ＭＭＰ−９を検出する等をあげることができる。本測定には、ヒト又は非ヒト動物由来の試料に加え、組換え蛋白質等の人工的な処理を加えた試料をも供することができる。生物個体由来の被験試料としては、例えば、血液、関節液、腹水、リンパ液、脳脊髄液、肺胞洗浄液、唾液、痰、組織ホモジネート上清、組織切片等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。
【０１７３】
前記の活性型ＭＭＰ−９検出は、イン・ビトロのみならず、イン・ビボでも実施することができる。画像診断の場合は、薬学的に許容可能な放射性核種や発光体で標識された活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドもしくはそのコンジュゲートを利用することができる。工程１としては、例えば、被験者に、標識された該ペプチドもしくはそのコンジュゲートを投与する、工程２としては、例えば、ＰＥＴ／ＣＴ等の画像診断技術を使用して画像を取り、活性型ＭＭＰ−９の存在を判定又は検査する等をあげることができる。
【０１７４】
本発明の診断用組成物に含まれるペプチド又はそのコンジュゲートは活性型ＭＭＰ−９に結合し、好適には活性型ＭＭＰ−９特異的結合活性を有する、すなわち前駆型ＭＭＰ−９には結合しない。
【０１７５】
本発明の医薬組成物が投与される個体を同定する方法も本発明に包含される。かかる同定方法においては、該個体由来サンプル中の活性型ＭＭＰ−９を測定し、該サンプル中に、活性型ＭＭＰ−９が検出されたか、又は、健常個体由来サンプル中に検出された活性型ＭＭＰ−９の量と比較してより多くの活性型ＭＭＰ−９が検出された場合に、該個体を陽性と判定することができる。
当該方法には、本発明の診断用組成物を使用することができる。
【０１７６】
また、かかる同定方法の好適な一態様において、該個体はＭＭＰ−９関連疾患に罹患しているか又はそのリスクがある。
【０１７７】
さらに、本発明の医薬組成物は、その一態様において、かかる同定方法において陽性と判定された個体に投与され得る。
【０１７８】
７．活性型ＭＭＰ−９の分離法
本発明の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは、活性型ＭＭＰ−９特異的結合活性を有し、好適には、前駆型ＭＭＰ−９結合活性を有しない。したがって、本発明の好適な活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド又はそのコンジュゲートを用いて、前駆型ＭＭＰ−９と活性型ＭＭＰ−９が混在した試料中から、活性型ＭＭＰ−９を特異的に分離することができる。ペプチドからの活性型ＭＭＰ−９の遊離は、相対的に高いイオン強度、低いｐＨ、中程度の変性条件、カオトロピック塩の存在下等で、非選択的に行うことができるが、活性型ＭＭＰ−９のプロテアーゼ活性を減弱させない範囲で行うことが好ましい。
【０１７９】
８．ＭＭＰ−９関連疾患の治療薬又は予防薬の同定方法
本発明はそのある態様において、ＭＭＰ−９阻害活性を指標として、ＭＭＰ−９阻害化合物又はＭＭＰ−９関連疾患の治療薬もしくは予防薬、又はその候補を同定する方法を提供する。該方法には、ＭＭＰ−９プロテアーゼ及び基質を、被験化合物の存在下又は非存在下（若しくはヴィークル存在下）で保温する工程（ｉ）、被験化合物の存在下及び非存在下でのＭＭＰ−９プロテアーゼ活性を決定する工程（ｉｉ）、及び、被験化合物の存在下でのＭＭＰ−９プロテアーゼ活性が、被験化合物の非存在下でのＭＭＰ−９プロテアーゼ活性と比較して小さい場合、該被験化合物を陽性と判定する工程（ｉｉｉ）、を含み得る。また、別の態様において、本発明のＭＭＰ−９特異的阻害化合物の同定方法は、本発明のＭＭＰ−９特異的阻害ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド、好適には、配列番号２乃至１７（図１６乃至３１）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含むペプチドの存在下で、被験化合物をヒト活性型ＭＭＰ−９と結合させる工程（ｉ）、該化合物が、ヒト活性型ＭＭＰ−９との結合において、該ペプチドと競合するか否かを決定する工程（ｉｉ）、及び、該化合物がヒトＭＭＰ−９特異的結合活性を有するか否かを決定する任意の工程（ｉｉｉ）、を含み得る。これらの同定方法における被験化合物は、ペプチド性、非ペプチド性のいずれであってもよく、ペプチド性としては、ＳＰＩＮＫ２変異体に限定されず、抗体、抗体の抗原結合断片、抗原結合蛋白質、免疫グロブリンではない蛋白質の骨格を有するＳＰＩＮＫ２変異体以外のペプチド、ＭＭＰ−９基質アナローグ等を例示することができるが、好適なペプチド性のものはＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドである。非ペプチド性としては合成低分子化合物、核酸等を例示することができるが、それらに限定されない。かかる方法におけるＭＭＰ−９は、好適には、ヒトＭＭＰ−９である。
【実施例】
【０１８０】
以下の実施例において、本発明の一部の態様についてさらに詳述するが、本発明はそれらに限定されない。【０１８１】
なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８２年発刊又は１９８９年発刊）に記載の方法及びその他の当業者が使用する実験書に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従った。【０１８２】
実施例１．活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの調製
（１−１）活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド発現ベクターｐＥＴ  ３２ａ（改変）＿活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの構築
まず、ＳＰＩＮＫ２  ｓｃａｆｆｏｌｄを骨格とした活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの発現ベクターを構築した。各結合ペプチドのアミノ酸配列（配列番号２乃至９）をコードするヌクレオチド配列とＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列（配列番号１）をコードするヌクレオチド配列を鋳型として、下記プライマー及びＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃  １５秒、６０℃  ３０秒、６８℃  ３０秒）×３０サイクル）により結合ペプチド断片を増幅した。
プライマー１：５’−ＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＣＣＧＣＡＧＴＴＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＡＧ−３’
プライマー２：５’−ＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＧＧＡＣＣ−３’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡ断片及びｐＥＴ  ３２ａ（改変）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）及びＸｈｏＩ（ＮＥＢ）を用いて、３７℃で１時間以上処理し、アガロースゲル電気泳動後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により精製した。Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）を用いて、精製した断片を１６℃で一晩反応させることでｌｉｇａｔｉｏｎ反応を実施した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ溶液は、大腸菌ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ）に添加し、氷上で３０分間静置した後、４２℃で４５秒の熱処理、さらに氷上で５分間静置し、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ＹＴプレートに播種後、３７℃で一晩静置培養することで、大腸菌へ形質転換した。翌日、形質転換された大腸菌を、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に植菌し、３７℃で一晩培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  ９６  Ｔｕｒｂｏ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを回収し（以下、「ｍｉｎｉｐｒｅｐ処理」という）、配列解析を実施することで「ｐＥＴ  ３２ａ（改変）＿活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド」を構築した。【０１８３】
（１−２）活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの発現精製
（１−１）で構築したベクターｐＥＴ  ３２ａ（改変）＿活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドを大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ  Ｂ  （ＤＥ３）（Ｍｅｒｃｋ）へ形質転換し、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ＹＴ培地を用いて３７℃で培養後、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加し、１６℃で一晩培養した。翌日、遠心分離（３，０００ｇ、２０分、４℃）により集菌後、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ）を用いてｌｙｓａｔｅを調製し、ＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＨｉｓタグ融合目的蛋白質を精製した。次に、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｋ）を用いてｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ  ｔａｇと所望の蛋白質とを切断し、ＴＡＬＯＮを用いて精製した。さらに、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  １０／３００  ＧＬ）又は逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＭ）に供することで、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドを調製した。得られたペプチドのＮ末端にはＳｔａｇ＋リンカー１からなる部分（配列番号１９：図３３）が、Ｃ末端にはＣ末６マー（配列番号２１：図３５）が、それぞれコンジュゲートされている。【０１８４】
実施例２．活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド評価用ＭＭＰ−９の調製
ヒト／サル／ラット／マウスＭＭＰ−９の配列類似性を図１に示す。
（２−１）ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）の調製
（２−１−１）ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６の構築
プラスミドｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ／ＬａｃＺ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を制限酵素ＸｂａＩ（ＮＥＢ）及びＰｍｅＩ（ＮＥＢ）で消化して得られる約５．４ｋｂのフラグメントと、配列番号２８（図４４）に示すヒトＭＭＰ−９（Ｐ１４７８０）をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて結合して、ｐｃＤＮＡ３．３−ｈＭＭＰ−９を作製した。ｐｃＤＮＡ３．３−ｈＭＭＰ−９を鋳型として、下記プライマーを用いたＰＣＲを行い、得られた約５．５ｋｂのフラグメントをリン酸化後セルフライゲーションすることによりＣＭＶプロモーターの下流に配列番号２８（図４４）に示すヒトＭＭＰ−９をコードするヌクレオチド配列を持つ、ｐＣＭＡ−ｈＭＭＰ−９を構築した。
プライマー３：５’−ＴＡＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＣＴＡＧＣＴＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣ−３’
プライマー４：５’−ＧＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＧＴＴＧ−３’
ｐＣＭＡ−ｈＭＭＰ−９を鋳型としてＰＣＲを行い、ＣＭＶプロモーターの下流にヒトＭＭＰ−９（配列番号２８（図４４））の分泌シグナル（Ｍｅｔ１〜Ａｌａ１９）、プロペプチド（Ａｌａ２０〜Ａｒｇ１０６）、酵素活性ドメイン（Ｐｈｅ１０７〜Ｐｒｏ４４９）及びＨｉｓタグをコードするヌクレオチド配列を持つ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６を構築した。【０１８５】
（２−１−２）ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉの構築
ｐＣＭＡ−ｈＭＭＰ−９を鋳型としてＰＣＲを行い、ＣＭＶプロモーターの下流にヒトＭＭＰ−９（配列番号２８（図４４））の分泌シグナル（Ｍｅｔ１〜Ａｌａ１９）、Ｈｉｓタグ、プロペプチド（Ａｌａ２０〜Ａｒｇ１０６）、酵素活性ドメイン（Ｐｈｅ１０７〜Ｐｒｏ４４９）、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ：図５０：配列番号３４））及びＡｖｉタグ（ＧＧＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ：図５１：配列番号３５）をコードするヌクレオチド配列を持つ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉを構築した。【０１８６】
（２−１−３）ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６の調製
（２−１−１）で構築したｐＣＭＡ−ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６はＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ  Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし、６日後に培養上清を回収した。ＨｉｓＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりＨｉｓタグ融合蛋白質を回収し、緩衝液をＰＢＳに置換してｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６を精製した。【０１８７】
（２−１−４）ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９(ｃａｔ)＿Ｈｉｓ６の調製
（２−１−３）で取得したｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６と、ＡＰＭＡで活性化したｈＭＭＰ−３を混合し、３７℃で４時間反応させた。反応液を低温下でＰＢＳに置換し、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９(ｃａｔ)＿Ｈｉｓ６を精製した。【０１８８】
（２−１−５）ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉの調製
（２−１−３）と同様に、（２−１−２）で構築したｐＣＭＡ−ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉを用いてｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉを精製した。【０１８９】
（２−１−６）ビオチン標識ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉの調製
（２−１−５）で取得したｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０に置換し、ビオチンリガーゼＢｉｒＡ（Ａｖｉｄｉｔｙ）のプロトコルに従い、３０℃で１時間ビオチン標識した。反応液を低温下でＰＢＳに置換し、ビオチン標識ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉを精製した。【０１９０】
（２−１−７）ビオチン標識ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉの調製
（２−１−４）と同様に、（２−１−６）で取得したビオチン標識ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉを活性化し、ビオチン標識ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉを精製した。【０１９１】
（２−２）マウスＭＭＰ−９酵素活性ドメインｍＭＭＰ−９（ｃａｔ）の調製
（２−２−１）ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−ｍＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉの構築
プラスミドｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ／ＬａｃＺ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を制限酵素ＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して得られる約５．４ｋｂのフラグメントと、配列番号２９（図４５）に示すマウスＭＭＰ−９（Ｐ４１２４５）をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて結合して、ｐｃＤＮＡ３．３−ｍＭＭＰ−９を作製した。ｐｃＤＮＡ３．３−ｍＭＭＰ−９を鋳型として、下記プライマーを用いたＰＣＲを行い、得られた約５．６ｋｂのフラグメントをリン酸化後セルフライゲーションすることによりＣＭＶプロモーターの下流に配列番号２９（図４５）に示すマウスＭＭＰ−９をコードするヌクレオチド配列を持つ、ｐＣＭＡ−ｍＭＭＰ−９を構築した。
プライマー３：５’−ＴＡＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＣＴＡＧＣＴＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣ−３’
プライマー４：５’−ＧＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＧＴＴＧ−３’
ｐＣＭＡ−ｍＭＭＰ−９を鋳型としてＰＣＲを行い、ＣＭＶプロモーターの下流にマウスＭＭＰ−９（配列番号２９（図４５））の分泌シグナル（Ｍｅｔ１〜Ａｌａ１９）、Ｈｉｓタグ、プロペプチド（Ａｌａ２０〜Ａｒｇ１０７）、酵素活性ドメイン（Ｐｈｅ１０８〜Ｐｒｏ４４９）、ＦＬＡＧタグ（図５０：配列番号３４）及びＡｖｉタグ（図５１：配列番号３５）をコードするヌクレオチド配列を持つ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−ｍＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉを構築した。【０１９２】
（２−２−２）ｐｒｏ−ｍＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉの調製
（２−１−３）と同様に、（２−２−１）で構築したｐＣＭＡ−ｐｒｏ−ｍＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉを用いてｐｒｏ−ｍＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉを精製した。【０１９３】
（２−２−３）ａｃｔｉｖｅ  ｍＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉの調製
（２−１−４）と同様に、（２−２−２）で取得したｐｒｏ−ｍＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉを活性化し、ａｃｔｉｖｅ  ｍＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉを精製した。【０１９４】
実施例３．活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのＭＭＰ−９結合活性評価
ストレプトアビジンコート９６−ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に（２−１−６）で取得したビオチン標識ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉ又は（２−１−７）で取得したビオチン標識ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉを固相化した。３％ＢＳＡでブロッキングした後、１〜１，０００ｎＭの結合ペプチドを添加し、室温で１．５時間反応させた。洗浄後、Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｓ−Ｔａｇ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＢＥＴＨＹＬ）を添加して、室温で１時間反応させた。洗浄後、ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質Ａ．Ｂ．Ｔ．Ｓキット（ナカライテスク）の基質を添加して室温で反応させ、反応停止液を添加後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で吸光度４０５ｎｍを測定し、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのＭＭＰ−９結合活性を評価した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  （ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０；  ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて５０％効果濃度（ＥＣ５０）を算出した結果、いずれの活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドも低濃度で活性型ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインに結合する一方、１μＭにおいても前駆型ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインには結合しないことが明らかとなった（図２及び３）。対照的に、野生型ＳＰＩＮＫ２（ＷＴ）は活性型ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメイン及び前駆型ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインに結合しなかった（図２）。【０１９５】
実施例４．活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのＭＭＰ−９阻害活性評価
（４−１）基質ペプチドを用いた活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのヒトＭＭＰ−９阻害活性評価
基質ペプチドＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２（配列番号３０（図４６））（ペプチド研究所；３２２６−ｖ）を１ｍＭになるよう水で溶解し、Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，ｐＨ７．５）で希釈して終濃度２．５〜１０μＭで使用した。Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒで希釈したａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９(ｃａｔ)＿Ｈｉｓ６と活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドをそれぞれ５０μｌずつ混ぜ、３７℃で１時間反応させた後にＡｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒで希釈した基質を１００μｌ加えて、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光シグナル（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ３２８ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ３９３ｎｍ）を測定した。Ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９(ｃａｔ)＿Ｈｉｓ６は終濃度０．４ｎＭ、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは終濃度０．５〜２５ｎＭ、反応及び測定にはプロテオセーブ（商標）ＳＳ９６Ｆ黒プレート（住友ベークライト）を使用した。【０１９６】
各濃度の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドにおける基質ペプチド分解速度を算出し、阻害剤濃度０ｎＭの分解速度を１００％として、各結合ペプチドのヒトＭＭＰ−９阻害活性を評価した（図４）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  （ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０；  ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、Ｍｏｒｒｉｓｏｎの式に従い阻害定数Ｋｉを算出した結果、いずれの活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドも低濃度で強力にヒトＭＭＰ−９酵素活性を阻害することが明らかとなった（図５）。【０１９７】
（４−２）基質ゼラチンを用いた活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのヒトＭＭＰ−９阻害活性評価
基質ゼラチンＤＱ  ｇｅｌａｔｉｎ  Ｆｒｏｍ  Ｐｉｇ  Ｓｋｉｎ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１ｍｇ／ｍｌになるよう水で溶解し、Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，ｐＨ７．５）で希釈して終濃度１０μｇ／ｍｌで使用した。Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒで希釈したａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９(ｃａｔ)＿Ｈｉｓ６と活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドをそれぞれ５０μｌずつ混ぜ、３７℃で１時間反応させた後にＡｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒで希釈した基質を１００μｌ加えて、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光シグナル（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ４９５ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ５１５ｎｍ）を測定した。Ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９(ｃａｔ)＿Ｈｉｓ６は終濃度０．６ｎＭ、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは終濃度０．００２〜１００ｎＭ、反応及び測定にはプロテオセーブ（商標）ＳＳ９６Ｆ黒プレート（住友ベークライト）を使用した。【０１９８】
各濃度の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドにおける基質ゼラチン分解速度を算出し、阻害剤濃度０ｎＭの分解速度を１００％として、各結合ペプチドのヒトＭＭＰ−９阻害活性を評価した（図６）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  （ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０；  ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した結果、ゼラチンを基質とした場合にも、（４−１）と同様、いずれの活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドも低濃度で強力にヒトＭＭＰ−９酵素活性を阻害することが明らかとなった（図７）。【０１９９】
実施例５．基質ペプチドを用いた活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのマウスＭＭＰ−９阻害活性評価
基質ペプチドＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２（配列番号３０（図４６））（ペプチド研究所；３２２６−ｖ）を１ｍＭになるよう水で溶解し、Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，ｐＨ７．５）で希釈して終濃度１０μＭで使用した。Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒで希釈したａｃｔｉｖｅ  ｍＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉと活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドをそれぞれ５０μｌずつ混ぜ、３７℃で１時間反応させた後にＡｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒで希釈した基質を１００μｌ加えて、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光シグナル（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ３２８ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ３９３ｎｍ）を測定した。Ａｃｔｉｖｅ  ｍＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉは終濃度０．４ｎＭ、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは終濃度０．００２〜１００ｎＭ、反応及び測定にはプロテオセーブ（商標）ＳＳ９６Ｆ黒プレート（住友ベークライト）を使用した。【０２００】
各濃度の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドにおける基質ペプチド分解速度を算出し、阻害剤濃度０ｎＭの分解速度を１００％として、各結合ペプチドのマウスＭＭＰ−９阻害活性を評価した（図８）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  （ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０；  ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した結果、いずれの活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドも低濃度で強力にマウスＭＭＰ−９酵素活性を阻害することが明らかとなった（図９）。【０２０１】
実施例６．活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの特異性評価
基質ペプチドの切断を指標に、他のＭＭＰ又はＡＤＡＭ１７プロテアーゼに対する特異性を評価した。（３−１）に記載の方法と同様、Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒで希釈したプロテアーゼとサンプル（終濃度１μＭ）をそれぞれ５０μｌずつ混ぜ、ＭＭＰ−１３及びＭＭＰ−１７は３７℃で１０分、その他のプロテアーゼは３７℃で６０分反応させた後に、Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒで希釈した基質を１００μｌ加えて、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光シグナル（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ３２８ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ３９３ｎｍ）を測定した。なお、ＭＭＰ−１７活性評価にはＡｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＣａＣｌ２，ｐＨ７．５）、ＭＭＰ−１７以外のプロテアーゼ活性評価にはＡｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，ｐＨ７．５）を用い、反応及び測定にはプロテオセーブ（商標）ＳＳ９６Ｆ黒プレート（住友ベークライト）を使用した。特異性評価に用いたプロテアーゼ及び基質の組み合わせは以下の通り。【０２０２】
Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ−１阻害活性評価；終濃度５ｎＭ  ＡＰＭＡで活性化したヒトＭＭＰ−１酵素活性ドメイン（自社調製）、終濃度１０μＭ  基質ペプチドＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２（配列番号３０：図４６）（ペプチド研究所；３２２６−ｖ）【０２０３】
Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ−２阻害活性評価；終濃度１．４ｎＭ  ＭＭＰ−２，ａｃｔｉｖｅ，Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ＣＨＯ  Ｃｅｌｌｓ（Ｍｅｒｃｋ；ＰＦ０２３）、終濃度５０μＭ  基質ペプチドＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２（配列番号３０：図４６）（ペプチド研究所；３２２６−ｖ）【０２０４】
Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ−３阻害活性評価；終濃度２５ｎＭ  ＡＰＭＡで活性化したヒトＭＭＰ−３（自社調製）、終濃度１０μＭ  基質ペプチドＭＯＣＡｃ−ＲＰＫＰＶＥ−Ｎｖａ−ＷＲ−Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）−ＮＨ２（配列番号３３：図４９）（ペプチド研究所；３１６８−ｖ）【０２０５】
Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ−７阻害活性評価；終濃度１ｎＭ  ＭＭＰ−７（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）（ｈｕｍａｎ），（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＢＭＬ−ＳＥ１８１）、終濃度１０μＭ  基質ペプチドＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２（配列番号３０：図４６）（ペプチド研究所；３２２６−ｖ）【０２０６】
Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ−８阻害活性評価；終濃度０．６ｎＭ  ＡＰＭＡで活性化したヒトＭＭＰ−８酵素活性ドメイン（自社調製）、終濃度１０μＭ  基質ペプチドＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２（配列番号３０：図４６）（ペプチド研究所；３２２６−ｖ）【０２０７】
Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ−１０阻害活性評価；終濃度４ｎＭ  ＭＭＰ−１０（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）（ｈｕｍａｎ），（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＢＭＬ−ＳＥ３２９）、終濃度１０μＭ  基質ペプチドＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２（配列番号３０：図４６）（ペプチド研究所；３２２６−ｖ）【０２０８】
Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ−１２阻害活性評価；終濃度４ｎＭ  ＭＭＰ−１２（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）（ｈｕｍａｎ），（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＢＭＬ−ＳＥ１３８）、終濃度１０μＭ  基質ペプチドＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２（配列番号３０：図４６）（ペプチド研究所；３２２６−ｖ）【０２０９】
Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ−１３阻害活性評価；終濃度２ｎＭ  ＡＰＭＡで活性化したヒトＭＭＰ−１３酵素活性ドメイン（自社調製）、終濃度１０μＭ  基質ペプチドＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２（配列番号３０：図４６）（ペプチド研究所；３２２６−ｖ）【０２１０】
Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ−１４阻害活性評価；終濃度１ｎＭ  ＭＭＰ１４  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ＲＰ−７７５３１）、終濃度１０μＭ  基質ペプチドＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２（配列番号３０：図４６）（ペプチド研究所；３２２６−ｖ）【０２１１】
Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ−１５阻害活性評価；終濃度１ｎＭ  ＭＴ２−ＭＭＰ，Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｄｏｍａｉｎ，Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｍｅｒｃｋ；４７５９３８）、終濃度１０μＭ  基質ペプチドＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２（配列番号３０：図４６）（ペプチド研究所；３２２６−ｖ）【０２１２】
Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ−１６阻害活性評価；終濃度３ｎＭ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ−１６／ＭＴ３−ＭＭＰ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；１７８５−ＭＰ）、終濃度１０μＭ  基質ペプチドＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２（配列番号３０：図４６）（ペプチド研究所；３２２６−ｖ）【０２１３】
Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ−１７阻害活性評価；終濃度３ｎＭ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ−１７  Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；７７９６−ＭＰ）、終濃度１０μＭ  基質ペプチドＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２（配列番号３０：図４６）（ペプチド研究所；３２２６−ｖ）【０２１４】
Ｈｕｍａｎ  ＡＤＡＭ１７阻害活性評価；終濃度３ｎＭ  ＡＤＡＭ１７（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）（ｈｕｍａｎ），（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）（Ｈｉｓ−ｔａｇ）（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＢＭＬ−ＳＥ２６８）、終濃度１０μＭ  基質ペプチドＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２（配列番号３０：図４６）（ペプチド研究所；３２２６−ｖ）【０２１５】
（４−１）と同様、基質ペプチドの分解を指標に、他のＭＭＰ又はＡＤＡＭ１７プロテアーゼに対する特異性を評価した。阻害剤の終濃度１μＭにおいては、いずれのプロテアーゼに対しても各結合ペプチドはプロテアーゼ活性を阻害せず、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドはＭＭＰ−９特異的な阻害作用を有することが示された（図１０）。対照的に、非選択的阻害剤ｓｃ−３１１４３８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は終濃度１μＭにおいて全てのプロテアーゼを阻害した（図１０）。【０２１６】
実施例７．活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド誘導体の調製
（７−１）活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド誘導体発現ベクターの構築
（７−１−１）活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド誘導体（Ｃ末誘導体）発現ベクターの構築
（１−１）で構築したベクターｐＥＴ  ３２ａ（改変）＿活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドのうち、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００２が挿入されたベクターｐＥＴ  ３２ａ（改変）＿Ｍ９１００２を鋳型としてＰＣＲを行い、Ｔ７プロモーターの下流にＴｒｘタグ、Ｈｉｓタグ、Ｓｔａｇ＋リンカー２（配列番号２０：図３４）及びＭ９１００２（配列番号３：図１７）をコードするヌクレオチド配列を持つ、ｐＥＴ  ３２ａ（改変）＿Ｍ９１００２＿Ｇ０を構築した。次に、構築したｐＥＴ  ３２ａ（改変）＿Ｍ９１００２＿Ｇ０を鋳型としてＰＣＲを行い、Ｔ７プロモーターの下流にＴｒｘタグ、Ｈｉｓタグ、Ｓｔａｇ＋リンカー２（配列番号２０：図３４）、Ｍ９１００２（配列番号３：図１７）及びＣ末２マー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ：図３７）をコードするヌクレオチド配列を持つ、ｐＥＴ  ３２ａ（改変）＿Ｍ９１００２＿Ｇ２を構築した。次に、構築したｐＥＴ  ３２ａ（改変）＿Ｍ９１００２＿Ｇ０を鋳型としてＰＣＲを行い、Ｔ７プロモーターの下流にＴｒｘタグ、Ｈｉｓタグ、Ｓｔａｇ＋リンカー２（配列番号２０：図３４）、Ｍ９１００２（配列番号３：図１７）及びＣ末３マー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ：図３６）をコードするヌクレオチド配列を持つ、ｐＥＴ  ３２ａ（改変）＿Ｍ９１００２＿Ｇ３を構築した。【０２１７】
（７−１−２）活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド誘導体（Ｆｃコンジュゲート）発現ベクターの構築
（２−１−１）で構築したベクターｐＣＭＡ−ｈＭＭＰ−９を制限酵素ＸｂａＩ（ＮＥＢ）及びＰｍｅＩ（ＮＥＢ）で消化してヒトＭＭＰ−９をコードするヌクレオチド配列を取り除いたＤＮＡ断片と、ヒトＩｇＧ１重鎖シグナル配列、Ｓｔａｇ＋リンカー１（配列番号１９：図３３）、Ｍ９１００５（配列番号５：図１９）、Ｃ末６マー（配列番号２１：図３５）、Ｇ４Ｓリンカー（配列番号２２：図３８）及びｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号２３：図３９）をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて結合して、ｐＣＭＡ−Ｍ９１００５−Ｆｃ−０１を作製した。【０２１８】
（７−１−３）活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド誘導体（Ｎ末誘導体）発現ベクターの構築
（７−１−２）で構築したベクターｐＣＭＡ−Ｍ９１００５−Ｆｃ−０１を鋳型としてＰＣＲを行い、ＣＭＶプロモーターの下流にヒトＩｇＧ１重鎖シグナル配列、Ｓｔａｇ＋リンカー１（配列番号１９：図３３）、Ｍ９１００５＿Ｄ１Ｇ（配列番号１３：図２７）、Ｃ末６マー（配列番号２１：図３５）、Ｇ４Ｓリンカー（配列番号２２：図３８）及びｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号２３：図３９）をコードするヌクレオチド配列を持つ、ｐＣＭＡ−Ｍ９１００５＿Ｄ１Ｇ−Ｆｃ−０１を構築した。【０２１９】
（７−２）活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド誘導体の発現精製
（１−２）と同様に、（７−１−１）で構築したベクターｐＥＴ  ３２ａ（改変）＿Ｍ９１００２＿Ｇ０、ｐＥＴ  ３２ａ（改変）＿Ｍ９１００２＿Ｇ２又はｐＥＴ  ３２ａ（改変）＿Ｍ９１００２＿Ｇ３を用いて、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド誘導体（Ｃ末誘導体）を調製した。得られたペプチド誘導体のＮ末端にはＳｔａｇ＋リンカー２からなる部分（配列番号２０：図３４）がコンジュゲートされている。Ｍ９１００２＿Ｇ２のＣ末端にはＣ末２マー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ：図３７）が、Ｍ９１００２＿Ｇ３のＣ末端にはＣ末３マー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ：図３６）が、それぞれコンジュゲートされている。【０２２０】
（７−１−２）で構築したｐＣＭＡ−Ｍ９１００５−Ｆｃ−０１又は（７−１−３）で構築したｐＣＭＡ−Ｍ９１００５＿Ｄ１Ｇ−Ｆｃ−０１はＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ  Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし、６日後に培養上清を回収した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりＦｃコンジュゲート蛋白質を回収し、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬ）に供することで、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド誘導体（Ｆｃコンジュゲート）又は活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド誘導体（Ｎ末誘導体）を調製した。得られたペプチド誘導体のＮ末端にはＳｔａｇ＋リンカー１からなる部分（配列番号１９：図３３）が、Ｃ末端にはＣ末６マー（配列番号２１：図３５）、Ｇ４Ｓリンカー（配列番号２２：図３８）及びｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号２３：図３９）がコンジュゲートされている。【０２２１】
実施例８．活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド誘導体のＭＭＰ−９阻害活性評価
（４−１）記載の方法に準じて、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９(ｃａｔ)＿Ｈｉｓ６は終濃度０．６ｎＭ、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドは終濃度０．００１５〜１００ｎＭで、各結合ペプチドのヒトＭＭＰ−９阻害活性を評価した（図１１（Ａ）、１２（Ａ）及び１３（Ａ））。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  （ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０；  ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した結果、Ｍ９１００２＿Ｇ３、Ｍ９１００２＿Ｇ２及びＭ９１００２＿Ｇ０の阻害活性はＭ９１００２と同等であり（図１１（Ｂ））、結合ペプチドのＣ末端に１乃至６個のアミノ酸が付加したことによるＭＭＰ−９阻害活性への影響は無いことが示された。また、Ｍ９１００５−Ｆｃ−０１とＭ９１００５の阻害活性は同等であり（図１２（Ｂ））、ＦｃコンジュゲートによるＭＭＰ−９阻害活性への影響は無いことが示された。また、Ｍ９１００５−Ｆｃ−０１とＭ９１００５＿Ｄ１Ｇ−Ｆｃ−０１の阻害活性は同等であり（図１３（Ｂ））、結合ペプチドの１番ＡｓｐのＧｌｙへの置換によるＭＭＰ−９阻害活性への影響は無いことが示された。【０２２２】
実施例９．活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド誘導体（Ｆｃコンジュゲート）を用いた活性型ＭＭＰ−９の検出
（７−２）で調製したＭ９１００５−Ｆｃ−０１、（２−１）で調製したｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６及びａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６を用いて、免疫沈降法により結合性を評価した。３μｇの活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド誘導体と１．５ｍｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を混合して室温で３０分反応させた。洗浄後、０．３９μｇの前駆型ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメイン又は０．６３μｇの活性型ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインを添加して４℃で１時間反応させた。磁石でビーズを分離後、上清画分（ＦＴ）を回収した。ビーズを洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（還元）を添加して９９℃で５分反応させ、ビーズに結合したサンプルを沈殿画分（Ｅｌｕ）として回収した。添加したヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメイン（Ｉｎｐ）、ＦＴ及びＥｌｕをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ−９  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＢＡＦ９１１）及びＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ＲＰＮ２２８０）を用いて検出することで結合性を評価した。なお、反応のバッファーにはＡｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，ｐＨ７．５）を用いた。【０２２３】
Ｍ９１００５−Ｆｃ−０１を結合させたビーズを用いた場合、ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６はＥｌｕのレーンに検出されず、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６はＥｌｕのレーンに検出された。対照的に、Ｍ９１００５−Ｆｃ−０１を結合させていないビーズを用いた場合、ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６及びａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６はＥｌｕのレーンに検出されなかった（図１４（Ａ））。よって、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド誘導体（Ｆｃコンジュゲート）は前駆型ヒトＭＭＰ−９に結合せず、活性型ヒトＭＭＰ−９特異的に結合することが示された。【０２２４】
同様に、（７−２）で調製したＭ９１００５−Ｆｃ−０１、（２−２）で調製したｐｒｏ−ｍＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉ及びａｃｔｉｖｅ  ｍＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉを用いて、免疫沈降法により結合性を評価した。評価用サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、Ｍｏｕｓｅ  ＭＭＰ−９  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＡＦ９０９）及びＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ‘）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｄｏｎｋｅｙ  Ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；７０５−０３６−１４７）を用いて検出することで結合性を評価した。【０２２５】
Ｍ９１００５−Ｆｃ−０１を結合させたビーズを用いた場合、ｐｒｏ−ｍＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６＿ＦＬＡＧ＿ＡｖｉはＥｌｕのレーンに検出されず、ａｃｔｉｖｅ  ｍＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿ＦＬＡＧ＿ＡｖｉはＥｌｕのレーンに検出された。対照的に、Ｍ９１００５−Ｆｃ−０１を結合させていないビーズを用いた場合、ｐｒｏ−ｍＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６＿ＦＬＡＧ＿Ａｖｉ及びａｃｔｉｖｅ  ｍＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿ＦＬＡＧ＿ＡｖｉはＥｌｕのレーンに検出されなかった（図１４（Ｂ））。よって、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド誘導体（Ｆｃコンジュゲート）は前駆型マウスＭＭＰ−９に結合せず、活性型マウスＭＭＰ−９特異的に結合することが示された。【０２２６】
実施例１０．活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの特異性評価（セリンプロテアーゼ）
基質ペプチドの切断を指標に、１２種のセリンプロテアーゼに対する特異性を評価した。Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で希釈したプロテアーゼとサンプル（終濃度１μＭ）をそれぞれ２５μｌずつ混ぜ、３７℃で２０分反応させた後に、Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒで希釈した基質を５０μｌ加えて、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光シグナル（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ４６０ｎｍ）を測定した。反応及び測定にはプロテオセーブ（商標）ＳＳ９６Ｆ黒プレート（住友ベークライト）を使用した。特異性評価に用いたプロテアーゼ及び基質の組み合わせは以下の通り。【０２２７】
Ｈｕｍａｎ  Ｔｒｙｐｓｉｎ阻害活性評価；終濃度１ｎＭ  Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ６２６４）、終濃度１０μＭ  基質ペプチドＢｏｃ−ＦＳＲ−ＭＣＡ（図５５）（ペプチド研究所；３１０７−ｖ）【０２２８】
Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ阻害活性評価；終濃度１０ｎＭ  α−Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃ８９４６）、終濃度１０μＭ  基質ペプチドＳｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡ（配列番号３６：図５６）（ペプチド研究所；３１２０−ｖ）【０２２９】
Ｈｕｍａｎ  Ｔｒｙｐｔａｓｅ阻害活性評価；終濃度１ｎＭ  Ｔｒｙｐｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ７０６３）、終濃度１００μＭ  基質ペプチドＢｏｃ−ＦＳＲ−ＭＣＡ（図５５）（ペプチド研究所；３１０７−ｖ）【０２３０】
Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｙｍａｓｅ阻害活性評価；終濃度１００ｎＭ  Ｃｈｙｍａｓｅ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃ８１１８）、終濃度１００μＭ  基質ペプチドＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ＭＣＡ（配列番号３７：図５７）（ペプチド研究所；３１１４−ｖ）【０２３１】
Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｓｍｉｎ阻害活性評価；終濃度５０ｎＭ  Ｐｌａｓｍｉｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｐ１８６７）、終濃度１００μＭ  基質ペプチドＢｏｃ−ＶＬＫ−ＭＣＡ（図５８）（ペプチド研究所；３１０４−ｖ）【０２３２】
Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ阻害活性評価；終濃度１ｎＭ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ１０６３）、終濃度１００μＭ  基質ペプチドＢｏｃ−ＶＰＲ−ＡＭＣ（図５９）（ＲＤ−ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）【０２３３】
Ｈｕｍａｎ  Ｅｌａｓｔａｓｅ阻害活性評価；終濃度０．０１Ｕ／ｍｌ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｌａｓｔａｓｅ  （ｈｕｍａｎ）（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＢＭＬ−ＳＥ２８４）、終濃度１００μＭ  基質ペプチドＳｕｃ（ＯＭｅ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＭＣＡ（配列番号３８：図６０）（ペプチド研究所；３１５３−ｖ）【０２３４】
Ｈｕｍａｎ  Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ阻害活性評価；終濃度１ｎＭ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ／ＳＴ１４  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｄｏｍａｉｎ（ＲＤ−ｓｙｓｔｅｍｓ；３９４６−ＳＥ）、終濃度１００μＭ  基質ペプチドＢｏｃ−ＱＡＲ−ＡＭＣ（図６１）（ＲＤ−ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１４）【０２３５】
Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ阻害活性評価；終濃度１００ｎＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｐ２５６２）、終濃度１００μＭ  基質ペプチドＢｏｃ−ＬＳＴＲ−ＭＣＡ（配列番号３９：図６２）（ペプチド研究所；３１１２−ｖ）【０２３６】
Ｈｕｍａｎ  ｔＰＡ阻害活性評価；終濃度１０ｎＭ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｈｕｍａｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ０８３１）、終濃度１００μＭ  基質ペプチドＰｙｒ−ＧＲ−ＭＣＡ（図６３）（ペプチド研究所；３１４５−ｖ）【０２３７】
Ｈｕｍａｎ  ｕＰＡ阻害活性評価；終濃度２ｎＭ  Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｕｒｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｕ０６３３）、終濃度１００μＭ  基質ペプチドＰｙｒ−ＧＲ−ＭＣＡ（図６３）（ペプチド研究所；３１４５−ｖ）【０２３８】
Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ阻害活性評価；終濃度０．１２５μｇ／ｍｌ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ／ＫＬＫＢ１  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＤ−ｓｙｓｔｅｍｓ；２４９７−ＳＥ）、終濃度１００μＭ  基質ペプチドＺ−ＦＲ−ＭＣＡ（図６４）（ペプチド研究所；３０９５−ｖ）【０２３９】
（４−１）と同様、基質ペプチドの分解を指標に、セリンプロテアーゼに対する特異性を評価した。阻害剤の終濃度１μＭにおいては、いずれのプロテアーゼに対しても各結合ペプチドはプロテアーゼ活性を阻害せず、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドはＭＭＰ−９特異的な阻害作用を有することが示された（図５２）。対照的に、非選択的阻害剤Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；１１８３６１７０００１）は終濃度１μＭにおいて全てのプロテアーゼを阻害した（図５２）。【０２４０】
実施例１１．ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインＥ４０２Ｑ変異体の調製
（１１−１）ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｅ４０２Ｑ＿Ｈｉｓ６の構築
（２−１−１）で構築したｐＣＭＡ−ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６を鋳型としてＰＣＲを行い、ＣＭＶプロモーターの下流にヒトＭＭＰ−９（配列番号２８（図４４））の分泌シグナル（Ｍｅｔ１〜Ａｌａ１９）、プロペプチド（Ａｌａ２０〜Ａｒｇ１０６）、酵素活性ドメインＥ４０２Ｑ変異体（Ｐｈｅ１０７〜Ｐｒｏ４４９、Ｅ４０２Ｑ）及びＨｉｓタグをコードするヌクレオチド配列を持つ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｅ４０２Ｑ＿Ｈｉｓ６を構築した。
（１１−２）ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｅ４０２Ｑ＿Ｈｉｓ６の調製
（１１−１）で構築したｐＣＭＡ−ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｅ４０２Ｑ＿Ｈｉｓ６はＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ  Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし、６日後に培養上清を回収した。ＨｉｓＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりＨｉｓタグ融合蛋白質を回収し、緩衝液をＰＢＳに置換してｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｅ４０２Ｑ＿Ｈｉｓ６を精製した。
（１１−３）ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｅ４０２Ｑ＿Ｈｉｓ６の調製
（１１−２）で取得したｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｅ４０２Ｑ＿Ｈｉｓ６と、ＡＰＭＡで活性化したｈＭＭＰ−３を混合し、３７℃で４時間反応させた。反応液を低温下でＰＢＳに置換し、ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｅ４０２Ｑ＿Ｈｉｓ６を精製した。【０２４１】
実施例１２．活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドとヒトＭＭＰ−９活性中心Ｇｌｕ４０２残基との相互作用解析
（１−２）で調製したＭ９１００５及びＭ９１０１１、（２−１−４）で調製したａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９(ｃａｔ)＿Ｈｉｓ６、（１１−３）で調製したｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｅ４０２Ｑ＿Ｈｉｓ６を用いて、サイズ排除クロマトグラフィーにより結合性を評価した。２５μＭのａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９(ｃａｔ)＿Ｈｉｓ６又はｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｅ４０２Ｑ＿Ｈｉｓ６と、７５μＭの活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド又はｈＴＩＭＰ−１（自社調製）を混合して４℃で１時間反応させた。反応後、１０μｌの反応液をサイズ排除クロマトグラフィーで分析した。
クロマトグラフィー条件は以下の通り。【０２４２】
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ２００  ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ；１８６００５２２５）
移動相：ＰＢＳ
検出：吸光度（２８０ｎｍ）【０２４３】
Ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９(ｃａｔ)＿Ｈｉｓ６のみを分析した場合、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９(ｃａｔ)＿Ｈｉｓ６のピークは保持時間７．０分に検出された（図５３（Ａ））。Ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９(ｃａｔ)＿Ｈｉｓ６とｈＴＩＭＰ−１又は活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００５、Ｍ９１０１１を混合した反応液を分析した場合、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９(ｃａｔ)＿Ｈｉｓ６のピークの保持時間は高分子量側にシフトした（図５３（Ａ））。よって、ｈＴＩＭＰ−１及び活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００５、Ｍ９１０１１は活性型ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインに結合することが示された。Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｅ４０２Ｑ＿Ｈｉｓ６のみを分析した場合、ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｅ４０２Ｑ＿Ｈｉｓ６のピークは保持時間７．１分に検出された（図５３（Ｂ））。Ｈｕｍａｎ  ＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｅ４０２Ｑ＿Ｈｉｓ６とｈＴＩＭＰ−１を混合した反応液を分析した場合、ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｅ４０２Ｑ＿Ｈｉｓ６のピークの保持時間は高分子量側にシフトした（図５３（Ｂ））。よって、ｈＴＩＭＰ−１はヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインＥ４０２Ｑ変異体に結合することが示された。対照的に、ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｅ４０２Ｑ＿Ｈｉｓ６と活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００５又はＭ９１０１１を混合した反応液を分析した場合、ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｅ４０２Ｑ＿Ｈｉｓ６のピークの保持時間は変化しなかった（図５３（Ｂ））。なお、ｈＴＩＭＰ−１又は活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００５、Ｍ９１０１１のみを分析した場合、ｈＴＩＭＰ−１のピークは保持時間７．３分に検出され、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００５のピークは保持時間８．２分に検出され、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１０１１のピークは保持時間８．１分に検出された（図５３（Ｃ））。【０２４４】
よって、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００５及びＭ９１０１１はヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメインＥ４０２Ｑ変異体に結合しないことが示された。以上のことから、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００５及びＭ９１０１１はヒトＭＭＰ−９の活性中心であるＧｌｕ４０２残基を認識して結合することが示された。【０２４５】
実施例１３．活性型ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメイン変異体の調製【０２４６】
（１３−１）ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）の構築
（２−１−１）で構築したｐＣＭＡ−ｐｒｏ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｈｉｓ６を鋳型としてＰＣＲを行い、ＣＭＶプロモーターの下流にヒトＭＭＰ−９（配列番号２８（図４４））の分泌シグナル（Ｍｅｔ１〜Ａｌａ１９）、Ｈｉｓタグ、プロペプチド（Ａｌａ２０〜Ａｒｇ１０６）、エンテロキナーゼ認識配列（図６５：配列番号４０））、酵素活性ドメイン（Ｐｈｅ１０７〜Ｐｒｏ４４９）をコードするヌクレオチド配列を持つ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）を構築した。【０２４７】
（１３−２）ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿ＸｎｎｎＹの構築
（１３−１）で構築したｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）を鋳型としてＰＣＲを行い、ＣＭＶプロモーターの下流にヒトＭＭＰ−９（配列番号２８（図４４））の分泌シグナル（Ｍｅｔ１〜Ａｌａ１９）、Ｈｉｓタグ、プロペプチド（Ａｌａ２０〜Ａｒｇ１０６）、エンテロキナーゼ認識配列（図６５：配列番号４０））、酵素活性ドメイン（Ｐｈｅ１０７〜Ｐｒｏ４４９）の変異体（Ｑ１０８Ｎ、Ｔ１０９Ｆ、Ｆ１１０Ａ、Ｅ１１１Ｐ、Ｇ１１２Ｒ、Ｄ１１３Ｋ、Ｌ１１４Ｐ、Ｙ１７９Ａ、Ｐ１８０Ａ、Ｄ１８５Ａ、Ｇ１８６Ａ、Ｌ１８７Ａ、Ｆ１９２Ａ、Ｐ１９３Ａ、Ｐ１９６Ｔ、Ｉ１９８Ｖ、Ｑ１９９Ｇ、Ｙ３９３Ａ、Ｌ３９７Ａ、Ｖ３９８Ａ、Ｄ４１０Ｅ、Ｓ４１３Ｑ、Ｌ４１８Ａ、Ｙ４２０Ａ、Ｐ４２１Ａ、Ｍ４２２Ｉ、Ｙ４２３Ａ又はＲ４２４Ｔ）をコードするヌクレオチド配列を持つ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｑ１０８Ｎ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｔ１０９Ｆ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｆ１１０Ａ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｅ１１１Ｐ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｇ１１２Ｒ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｄ１１３Ｋ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｌ１１４Ｐ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｙ１７９Ａ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｐ１８０Ａ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｄ１８５Ａ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｇ１８６Ａ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｌ１８７Ａ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｆ１９２Ａ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｐ１９３Ａ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｐ１９６Ｔ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｉ１９８Ｖ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｑ１９９Ｇ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｙ３９３Ａ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｌ３９７Ａ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｖ３９８Ａ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｄ４１０Ｅ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｓ４１３Ｑ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｌ４１８Ａ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｙ４２０Ａ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｐ４２１Ａ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｍ４２２Ｉ、ｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｙ４２３Ａ及びｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｒ４２４Ｔを構築した。【０２４８】
（１３−３）ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）の調製
（１３−１）で構築したｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）はＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ  Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし、６日後に培養上清を回収した。ＨｉｓＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とｇｅｌａｔｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｒｅｓｉｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりＨｉｓタグ融合蛋白質を回収し、緩衝液をＰＢＳに置換してｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）を精製した。【０２４９】
（１３−４）Ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）の調製
（１３−３）で取得したｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）と、ＥＫＭａｘ  Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を混合し、４℃で２時間反応させた。ＥＫａｐｔｕｒｅ  Ａｇａｒｏｓｅ  （ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により反応液からエンテロキナーゼを除去した後、緩衝液を低温下でＰＢＳに置換してａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）を精製した。【０２５０】
（１３−５）ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿ＸｎｎｎＹの調製
（１３−２）で構築したｐＣＭＡ−ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿ＸｎｎｎＹはＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ  Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし、６日後に培養上清を回収した。ＨｉｓＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とｇｅｌａｔｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｒｅｓｉｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりＨｉｓタグ融合蛋白質を回収し、緩衝液をＰＢＳに置換してｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｑ１０８Ｎ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｔ１０９Ｆ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｆ１１０Ａ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｅ１１１Ｐ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｇ１１２Ｒ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｄ１１３Ｋ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｌ１１４Ｐ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｙ１７９Ａ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｐ１８０Ａ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｄ１８５Ａ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｇ１８６Ａ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｌ１８７Ａ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｆ１９２Ａ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｐ１９３Ａ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｐ１９６Ｔ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｉ１９８Ｖ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｑ１９９Ｇ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｙ３９３Ａ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｌ３９７Ａ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｖ３９８Ａ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｄ４１０Ｅ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｓ４１３Ｑ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｌ４１８Ａ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｙ４２０Ａ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｐ４２１Ａ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｍ４２２Ｉ、ｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｙ４２３Ａ及びｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｒ４２４Ｔを精製した。
（１３−６）Ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿ＸｎｎｎＹの調製
（１３−５）で取得したｐｒｏ−Ｈｉｓ６＿ＥＫ−ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿ＸｎｎｎＹと、ＥＫＭａｘ  Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を混合し、４℃で２時間反応させた。ＥＫａｐｔｕｒｅ  Ａｇａｒｏｓｅ  （ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により反応液からエンテロキナーゼを除去した後、緩衝液を低温下でＰＢＳに置換してａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｑ１０８Ｎ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｔ１０９Ｆ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｆ１１０Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｅ１１１Ｐ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｇ１１２Ｒ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｄ１１３Ｋ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｌ１１４Ｐ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｙ１７９Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｐ１８０Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｄ１８５Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｇ１８６Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｌ１８７Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｆ１９２Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｐ１９３Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｐ１９６Ｔ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｉ１９８Ｖ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｑ１９９Ｇ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｙ３９３Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｌ３９７Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｖ３９８Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｄ４１０Ｅ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｓ４１３Ｑ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｌ４１８Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｙ４２０Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｐ４２１Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｍ４２２Ｉ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｙ４２３Ａ及びａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｒ４２４Ｔを精製した。【０２５１】
実施例１４．活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドと活性型ヒトＭＭＰ−９酵素活性ドメイン変異体との相互作用解析【０２５２】
（１−２）で調製したＭ９１００５及びＭ９１０１１、（１３−４）で調製したａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）及び（１３−６）で調製したａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿ＸｎｎｎＹを用いて、ヒトＭＭＰ−９阻害活性を評価した。【０２５３】
基質ペプチドＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２（配列番号３０（図４６））（ペプチド研究所；３２２６−ｖ）を１ｍＭになるよう水で溶解し、Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，ｐＨ７．５）で希釈して終濃度１０μＭで使用した。Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒで希釈したａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）又はａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿ＸｎｎｎＹと活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド又はｓｃ−３１１４３８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をそれぞれ５０μｌずつ混ぜ、３７℃で１時間反応させた後にＡｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒで希釈した基質を１００μｌ加えて、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光シグナル（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ３２８ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ３９３ｎｍ）を測定した。Ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）及びａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿ＸｎｎｎＹは終濃度１ｎＭ、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチド及びｓｃ−３１１４３８は終濃度０．５〜３３０ｎＭ、反応及び測定にはプロテオセーブ（商標）ＳＳ９６Ｆ黒プレート（住友ベークライト）を使用した。【０２５４】
各濃度の活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドにおける基質ペプチド分解速度を算出し、阻害剤濃度０ｎＭの分解速度を１００％として、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  （ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０；  ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて各結合ペプチドの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した（図５４（Ａ）及び図５４（Ｂ））。野生型であるａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）を用いた場合、非選択的阻害剤ｓｃ−３１１４３８のＩＣ５０は２８±７ｎＭ、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００５のＩＣ５０は１７±７ｎＭ、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１０１１のＩＣ５０は１７±５ｎＭであった。Ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿ＸｎｎｎＹを用いた場合、非選択的阻害剤ｓｃ−３１１４３８のＩＣ５０は野生型を用いた場合に比べて２倍未満であり、顕著な違いは見られなかった。非選択的阻害剤ｓｃ−３１１４３８は活性中心の亜鉛イオンを認識して結合するため、活性中心以外の残基の置換による影響はほとんど無いと考えられる。対照的に、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００５のＩＣ５０は、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｆ１１０Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｙ１７９Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｌ１８７Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｆ１９２Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｑ１９９Ｇ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｙ３９３Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｌ３９７Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｖ３９８Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｙ４２０Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｍ４２２Ｉ及びａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｙ４２３Ａを用いた場合、野生型を用いた場合に比べて４．０倍、３．２倍、６．７倍、＞５７．８倍、２．３倍、２．７倍、２．２倍、２．２倍、３．１倍、２．６倍及び１３．２倍増加した。よって、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００５はヒトＭＭＰ−９のＰｈｅ１１０、Ｔｙｒ１７９、Ｌｅｕ１８７、Ｐｈｅ１９２、Ｇｌｎ１９９、Ｔｙｒ３９３、Ｌｅｕ３９７、Ｖａｌ３９８、Ｔｙｒ４２０、Ｍｅｔ４２２及びＴｙｒ４２３を認識して活性型ヒトＭＭＰ−９に結合することが示唆された。同様に、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１０１１のＩＣ５０は、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｙ１７９Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｄ１８５Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｆ１９２Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｐ１９３Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｙ３９３Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｌ３９７Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｖ３９８Ａ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｍ４２２Ｉ、ａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｙ４２３Ａ及びａｃｔｉｖｅ  ｈＭＭＰ−９（ｃａｔ）＿Ｒ４２４Ｔを用いた場合、野生型を用いた場合に比べて４．９倍、１９．０倍、５．０倍、６．５倍、＞５７．６倍、３．５倍、４．８倍、２．６倍、＞２０．０倍及び２．７倍増加した。よって、活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１０１１はヒトＭＭＰ−９のＴｙｒ１７９、Ａｓｐ１���５、Ｐｈｅ１９２、Ｐｈｅ１９３、Ｔｙｒ３９３、Ｌｅｕ３９７、Ｖａｌ３９８、Ｍｅｔ４２２、Ｔｙｒ４２３及びＡｒｇ４２４を認識して活性型ヒトＭＭＰ−９に結合することが示唆された。 
【産業上の利用可能性】
【０２５５】
本発明の提供するペプチド、並びに、それを含む医薬組成物及び診断用組成物は、ＭＭＰ−９に関わる疾患の治療、予防、検査又は診断等に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０２５６】
配列番号１：ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列（図１５）
配列番号２：活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００１のアミノ酸配列（図１６）
配列番号３：活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００２のアミノ酸配列（図１７）
配列番号４：活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００４のアミノ酸配列（図１８）
配列番号５：活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００５のアミノ酸配列（図１９）
配列番号６：活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１０１０のアミノ酸配列（図２０）
配列番号７：活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１０１１のアミノ酸配列（図２１）
配列番号８：活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１０１２のアミノ酸配列（図２２）
配列番号９：活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１０１４のアミノ酸配列（図２３）
配列番号１０：活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００１＿Ｄ１Ｇのアミノ酸配列（図２４）
配列番号１１：活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００２＿Ｄ１Ｇのアミノ酸配列（図２５）
配列番号１２：活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００４＿Ｄ１Ｇのアミノ酸配列（図２６）
配列番号１３：活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１００５＿Ｄ１Ｇのアミノ酸配列（図２７）
配列番号１４：活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１０１０＿Ｄ１Ｇのアミノ酸配列（図２８）
配列番号１５：活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１０１１＿Ｄ１Ｇのアミノ酸配列（図２９）
配列番号１６：活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１０１２＿Ｄ１Ｇのアミノ酸配列（図３０）
配列番号１７：活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドＭ９１０１４＿Ｄ１Ｇのアミノ酸配列（図３１）
配列番号１８：活性型ＭＭＰ−９結合ペプチドの一般式（図３２）
配列番号１９：Ｓｔａｇ＋リンカー１のアミノ酸配列（図３３）
配列番号２０：Ｓｔａｇ＋リンカー２のアミノ酸配列（図３４）
配列番号２１：Ｃ末６マーのアミノ酸配列（図３５）
配列番号２２：Ｇ４Ｓリンカーのアミノ酸配列（図３８）
配列番号２３：ヒトＩｇＧ１  Ｆｃのアミノ酸配列（図３９）
配列番号２４：プライマー１のヌクレオチド配列（図４０）
配列番号２５：プライマー２のヌクレオチド配列（図４１）
配列番号２６：プライマー３のヌクレオチド配列（図４２）
配列番号２７：プライマー４のヌクレオチド配列（図４３）
配列番号２８：ヒトＭＭＰ−９のアミノ酸配列（図４４）
配列番号２９：マウスＭＭＰ−９のアミノ酸配列（図４５）
配列番号３０：ＭＯＣＡｃ−ＫＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２のアミノ酸配列（図４６）
配列番号３１：ＭＯＣＡｃ−ＰＬＧＬ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−ＡＲ−ＮＨ２のアミノ酸配列（図４７）
配列番号３２：（図４８）ＤＮＰ−ＰＬＧＭＷＳＲのアミノ酸配列
配列番号３３：ＭＯＣＡｃ−ＲＰＫＰＶＥ−Ｎｖａ−ＷＲ−Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）−ＮＨ２のアミノ酸配列（図４９）
配列番号３４：ＦＬＡＧタグのアミノ酸配列（図５０）
配列番号３５：Ａｖｉタグのアミノ酸配列（図５１）
配列番号３６：Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡのアミノ酸配列（図５６）
配列番号３７：Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ＭＣＡのアミノ酸配列（図５７）
配列番号３８：Ｓｕｃ（ＯＭｅ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＭＣＡのアミノ酸配列（図６０）
配列番号３９：Ｂｏｃ−ＬＳＴＲ−ＭＣＡのアミノ酸配列（図６２）
配列番号４０：エンテロキナーゼ認識配列のアミノ酸配列（図６５）
【図１（Ａ）】
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【図１（Ｂ）】
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【図１（Ｃ）】
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【図２（Ａ）】
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【図２（Ｂ）】
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【図３】
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【図４（Ａ）】
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【図４（Ｂ）】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１（Ａ）】
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【図１１（Ｂ）】
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【図１２（Ａ）】
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【図１２（Ｂ）】
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【図１３（Ａ）】
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【図１３（Ｂ）】
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【図１４（Ａ）】
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【図１４（Ｂ）】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３（Ａ）】
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【図５３（Ｂ）】
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【図５３（Ｃ）】
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【図５４（Ａ）】
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【図５４（Ｂ）】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
2019017338.tif 000073
【図６１】
2019017338.tif 000074
【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
2019017338.tif 000078
【配列表】
2019017338000001.app
【国際調査報告】
2019017338.tif 000079
2019017338.tif 000080
2019017338.tif 000081
2019017338.tif 000082
2019017338.tif 000083
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