(57)【要約】【課題】本発明は、微粒子で被検物質溶液を攪拌する際に、移動する微粒子により担体上の選択結合性物質が固定化されている部分に損傷を与えることなく、サイズの大きな微粒子を用いることにより被検物質溶液の攪拌効率を上げて選択結合性物質との反応効率を向上させることが可能な分析チップを提供する。【解決手段】表面に選択結合性物質が固定化された担体と、選択結合性物質と反応する被検物質を含む溶液を保持する容器と、該担体と該容器とによって形成される空隙内に封入された溶液を攪拌するための微粒子と、を含む分析チップであって、被検物質を含む溶液を通過させかつ微粒子を通過させない隔壁が、選択結合性物質が固定化された担体上の面と微粒子とを隔てて空隙内に設置されていることを特徴とする分析チップ、当該分析チップを用いる分析方法、及び溶液の攪拌方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に選択結合性物質が固定化された担体と、選択結合性物質と反応する被検物質を含む溶液を保持する容器と、該担体と該容器とによって形成される空隙内に封入された、溶液を攪拌するための微粒子と、を含む分析チップであって、
被検物質を含む溶液を通過させかつ微粒子を通過させない隔壁が、選択結合性物質が固定化された担体上の面と微粒子とを隔てて空隙内に設置されていることを特徴とする分析チップ。
【請求項２】
前記隔壁が開口を有するシート状又は板状の構造物である、請求項１に記載の分析チップ。
【請求項３】
前記隔壁が格子状の構造物である、請求項１に記載の分析チップ。
【請求項４】
前記隔壁がメッシュである、請求項１に記載の分析チップ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の分析チップに被検物質を接触させ、微粒子を移動させて被検物質を担体上の選択結合性物質に選択的に結合させる工程、及び担体上に選択結合性物質を介して結合した被検物質量を測定する工程を含むことを特徴とする、被検物質の分析方法。
【請求項６】
担体表面に固定化された選択結合性物質に、該選択結合性物質と反応する被検物質を含む溶液を接触させ、微粒子を用いて該溶液を攪拌する方法であって、被検物質を含む溶液を通過させかつ微粒子を通過させない隔壁により該選択結合性物質が固定化された担体表面と隔てられた微粒子を移動させる、溶液の攪拌方法。
【請求項７】
前記隔壁が開口を有するシート状又は板状の構造体である、請求項６に記載の溶液の攪拌方法。
【請求項８】
前記隔壁が格子状の構造物である、請求項６に記載の溶液の撹拌方法。
【請求項９】
前記隔壁がメッシュである、請求項６に記載の溶液の攪拌方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質と選択的に結合する物質（本明細書において「選択結合性物質」という。）を固定化した担体を備え、被検物質が含まれる溶液と選択結合性物質とを選択的に結合させて、担体上に前記選択結合性物質を介して結合した被検物質量を分析するための分析チップ、該分析チップを用いる分析方法及び該溶液の攪拌方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種生物の遺伝情報解析の研究が始められている。ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質及びこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能は、各種の方法で調べることができる。主なものとして、核酸は、ノーザンブロッティング、あるいはサザンブロッティングのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用して、各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。蛋白質は、ウエスタンブロッティングに代表される蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能及び発現について調べることができる。【０００３】
近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法として、ＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法が開発され、注目を集めている。この方法は、核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法である点で原理的には上記の従来の方法と同じである。このＤＮＡチップ法は、蛋白質／蛋白質間あるいは糖鎖／糖鎖間や糖鎖／蛋白質間の特異的な反応に基づく蛋白質や糖鎖検出・定量に応用が可能である。この技術は、マイクロアレイ又はＤＮＡチップと呼ばれるガラスの平面基板片上に、多数のＤＮＡ断片や蛋白質、糖鎖が高密度に整列固定化されたものが用いられている点に大きな特徴がある。ＤＮＡチップ法の具体的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を高解像度検出装置（スキャナー）で高速に読みとる方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法が挙げられる。このようして、サンプル中のそれぞれの遺伝子量を迅速に推定できる。また、ＤＮＡチップの応用分野は、発現遺伝子の量を推定する遺伝子発現解析のみならず、遺伝子の一塩基置換（ＳＮＰ）を検出する手段としても大きく期待されている。【０００４】
現在、ＤＮＡチップは、チップ上に数万から数千種類の多数の遺伝子を載せ、一度に多種類の遺伝子の発現を調べる研究用として用いられていることが多い。今後、診断用途で、ＤＮＡチップが使用されることが期待されている。ＤＮＡチップを診断で使用する場合、採取できる被検物質の量が非常に少ないことがあり、その場合には現行のＤＮＡチップは感度が十分ではなく、被検物質の測定が困難である可能性がある。また、現状のＤＮＡチップでは、発現量の低い遺伝子はハイブリダイゼーション後の蛍光強度が非常に微弱であるため、このような遺伝子は実質上解析できないこともある。以上のように、現行のＤＮＡチップでは、被検物質の量が少ない場合や発現量の少ない遺伝子の場合のハイブリダイゼーション後の蛍光の強度をいかに大きくするかということが課題である。この課題を解決するためには被検物質であるＤＮＡとプローブＤＮＡとをいかに効率よく反応させるかが１つのポイントとなる。効率よく被検物質であるＤＮＡとプローブを反応させる方法としては、被検物質の自然拡散では不十分であるので、溶液を攪拌し、効率よくプローブと被検物質との反応を促進することが考えられている。【０００５】
被検物質溶液を攪拌する例としては、特許文献１には、微粒子又は気泡を混合した被検物質溶液を、被検物質と反応する選択結合性物質を固定化させた担体に接触させ、微粒子又は気泡を移動させることにより被検物質の溶液を攪拌して、被検物質との反応効率を上げ、ハイブリダイゼーション後のシグナル強度を大きくする方法が開示されている。【０００６】
また、特許文献２には、選択結合性物質が固定化された凸部をマトリクス状に形成させた複数のサブブロック領域を構成させ、サブブロック領域内の凹部とサブブロック領域間の凹部を微粒子又はマイクロロッドが移動することにより被検物質の溶液を攪拌して、被検物質との反応効率を上げる方法が開示されている。このサブブロック領域間の凹部の幅は、サブブロック領域内の凹部の幅よりも広く、また、微粒子又はマイクロロッドは予め格納された状態にある。【０００７】
さらに、特許文献３、特許文献４には、磁気ビーズを磁力により被検物質の溶液中で動かすことで、被検物質の溶液を撹拌し、被検物質との反応効率を上げる方法が開示してある。また、特許文献４には、ビーズを混合した被検物質溶液をＤＮＡチップに接触させ、溶液をカバーガラスなどを用いてシーリングし、チップを回転させることにより、ビーズを重力方向に落下させることで被検物質の溶液を撹拌して、ハイブリダイゼーション後のシグナルを大きくする方法が開示してある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００５／０９０９９７号パンフレット
【特許文献２】特開２００７−２１２４４６号公報
【特許文献３】特開２００３−２４８００８号公報
【特許文献４】特開２００３−３３９３７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記特許文献１で開示されている分析チップでは、選択結合性物質が固定化されている部分に微粒子が接触しないように担体又は容器に設けられた構造の都合により、使用できる微粒子の大きさに制限がある。よって比較的大きな攪拌力を得るために大きいサイズの微粒子を用いることは容易ではない。また、図２に示された分析チップの場合は、担体と容器を接着して分析チップを製造する場合の位置合わせに精度が要求されるため、この製造工程が非常に困難になる可能性がある。【００１０】
特許文献２で開示されている分析チップは、担体上に、微粒子又はマイクロロッドが移動するための領域が、サブブロック領域内での凹部の他に、サブブロック領域間により広い凹部が設けられた構造を有しているため、担体上に構築できる凸部の数に制限が生じる。また、微粒子又はマイクロロッドは、サブブロック領域内の凹部よりも、サブブロック領域間にあるより広い凹部を優先的に移動するため、攪拌が不均一となる可能性がある。【００１１】
特許文献３及び特許文献４で開示されている分析チップでは、攪拌用の複数の磁気ビーズが磁気により凝集して大きな塊となり、これが基板（担体）表面に固定化された選択結合性物質を傷付けてしまったり、攪拌効率が低下したりするおそれがある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するため、本発明は、以下の構成からなる。
［１］表面に選択結合性物質が固定化された担体と、選択結合性物質と反応する被検物質を含む溶液を保持する容器と、該担体と該容器とによって形成される空隙内に封入された、溶液を攪拌するための微粒子と、を含む分析チップであって、
被検物質を含む溶液を通過させかつ微粒子を通過させない隔壁が、選択結合性物質が固定化された担体上の面と微粒子とを隔てて空隙内に設置されていることを特徴とする分析チップ。
［２］前記隔壁が開口を有するシート状又は板状の構造物である、［１］に記載の分析チップ。
［３］前記隔壁が格子状の構造物である、［１］に記載の分析チップ。
［４］前記隔壁がメッシュである、［１］に記載の分析チップ。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の分析チップに被検物質を接触させ、微粒子を移動させて被検物質を担体上の選択結合性物質に選択的に結合させる工程、及び担体上に選択結合性物質を介して結合した被検物質量を測定する工程を含むことを特徴とする、被検物質の分析方法。
［６］担体表面に固定化された選択結合性物質に、該選択結合性物質と反応する被検物質を含む溶液を接触させ、微粒子を用いて該溶液を攪拌する方法であって、被検物質を含む溶液を通過させかつ微粒子を通過させない隔壁により該選択結合性物質が固定化された担体表面と隔てられた微粒子を移動させる、溶液の攪拌方法。
［７］前記隔壁が開口を有するシート状又は板状の構造体である、［６］に記載の溶液の攪拌方法。
［８］前記隔壁が格子状の構造物である、［６］に記載の溶液の撹拌方法。
［９］前記隔壁がメッシュである、［６］に記載の溶液の攪拌方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、微粒子を用いて被検物質の溶液を攪拌して被検物質と固定化された選択結合性物質とを反応させるときに、微粒子が選択結合性物質固定化面に接触することによる選択結合性物質の損傷を防ぐことができる。【００１４】
また、担体の形状に関わりなく、従来よりサイズの大きい攪拌用微粒子を用いることができる。そのため、被検物質溶液の攪拌効率を高めることが可能となり、被検物質と選択結合性物質との反応効率を向上させ、微量のサンプルでも検出できる高感度な分析チップを提供することができる。【００１５】
また、本発明により、分析チップ中の選択結合性物質固定化面の全体をむらなく均質に攪拌することが容易になるので、複数の固定化面（スポット）間の測定データのばらつきを低減することができる。【００１６】
また、本発明の分析チップは、比較的単純な構造を用いることにより上記目的を達成することができるため、上記目的のために製造工程における特別の工夫等も必要とせずに製造することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の分析チップの一例を概略的に示す斜視図である。
【図２】図２は、図１に示される本発明の分析チップの一例を矢印Ａ１に沿った面で切断した断面図である。
【図３】図３は、図１に示される本発明の分析チップの一例を矢印Ａ１に沿った面で切断した断面図である。
【図４】図４は、本発明の分析チップの一例を概略的に示す斜視図である。
【図５】図５は、図４に示される本発明の分析チップの一例を矢印Ａ２に沿った面で切断した断面図である。
【図６】図６は、図４に示される本発明の分析チップの一例を矢印Ａ２に沿った面で切断した断面図である。
【図７】図７は、図４に示される本発明の分析チップの一例を矢印Ａ２に沿った面で切断した断面図である。
【図８】図８は、図４に示される本発明の分析チップの一例を矢印Ａ２に沿った面で切断した断面図である。
【図９】図９は、図４に示される本発明の分析チップの一例を矢印Ａ２に沿った面で切断した断面図である。
【図１０】図１０は、本発明の分析チップの一例を概略的に示す斜視図である。
【図１１】図１１は、図１０に示される本発明の分析チップの一例を矢印Ａ３に沿った面で切断した断面図である。
【図１２】図１２は、図１０に示される本発明の分析チップの一例を矢印Ａ３に沿った面で切断した断面図である。
【図１３】図１３（ｃ）〜（ｇ）は、本発明の分析チップの一例を構成する隔壁の斜視図である。図１３（ａ）及び（ｂ）は、図１３（ｃ）又は（ｄ）の隔壁を構成する外枠及び部材である。
【図１４】図１４は、本発明の分析チップの一例を構成する担体を概略的に示す斜視図である。
【図１５】図１５は、図１４に例示される担体の縦断面図である。
【図１６】図１６は、本発明の分析チップの一例を示す断面図である。
【図１７】図１７は、本発明の分析チップを用いた反応の結果を読み取る治具及びスキャナーの一例を概念的に示す縦断面図である。
【図１８】図１８は、本発明の分析チップを用いた反応の結果を読み取る治具及びスキャナーの一例を概念的に示す縦断面図である。
【図１９】図１９は、本発明の分析チップを用いた反応の結果を読み取る治具及びスキャナーの一例を概念的に示す縦断面図である。
【図２０】図２０は、本発明の実施例及び比較例における、プローブＤＮＡの固定化工程を示す概略図である。
【図２１】図２１（ａ）〜（ｆ）は、本発明の実施例及び比較例で用いた分析チップの部分断面図である。
【図２２】図２２（ａ）〜（ｅ）は、本発明の実施例及び比較例で用いた分析チップの部分断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の分析チップは、表面に選択結合性物質が固定化された担体と、選択結合性物質と反応する被検物質を含む溶液を保持する容器と、該担体と該容器とによって形成される空隙内に封入された溶液を攪拌するための微粒子とを含み、該空隙内に、選択結合性物質が固定化された担体上の面と微粒子とを隔てて設置される隔壁を備える。空隙内に設置された隔壁は、被検物質を含む溶液を通過させるが、攪拌用の微粒子を通過させないものである。
【００１９】
ここで、担体は、選択結合性物質が固定化された表面を有する基材である。また、容器は、担体の選択結合性物質が固定化された表面を覆う基材であって、被検物質溶液を保持する空隙を形成する様に担体と接着されて使用される。
【００２０】
本発明の分析チップには、重力方向に垂直な方向（水平方向）に向けて使用する場合、担体上の選択結合性物質が固定化された表面を、上方（反重力方向）、下方（重力方向）のいずれの方向に向けて使用できるもの、あるいは重力方向に平行な方向（垂直方向）に向けて使用できるものも含まれる。例えば、後記する図１〜１２は全て重力方向に垂直な方向（水平方向）に向けて使用する場合を示している。図１〜３、図１０〜１２に例示する分析チップにおいては、選択結合性物質が固定化された表面は上方を向いており、この場合、容器は担体上部から覆設される。また、図４〜９に例示する分析チップにおいては、選択結合性物質が固定化された表面は下方を向いており、この場合、容器は担体下部から覆設される。
【００２１】
本発明の分析チップは、被検物質を含む溶液を当該チップにアプライし、被検物質の存在の有無や、被検物質の量や、被検物質の性状等を測定するために用いるチップである。具体的には、担体表面に固定化された選択結合性物質と被検物質との反応により、被検物質の量や、被検物質の有無を測定するバイオチップが挙げられる。具体的なバイオチップとしては、核酸を担体表面に固定化したＤＮＡチップ、抗体に代表されるタンパク質を担体表面に固定化したタンパク質チップ、糖鎖を担体表面に固定化した糖鎖チップ、及び担体表面に細胞を固定化した細胞チップ等が挙げられる。
【００２２】
まず、本発明の分析チップの具体的な態様について、図面を用いて例示する。
【００２３】
図１に示す分析チップの例は、担体２の上部から容器１が覆設されている。図２及び図３は、図１で示される分析チップの異なる態様であって、それぞれ図１の矢印Ａ１方向に沿った面での断面図を示す。
【００２４】
図２及び図３の分析チップの例では、担体２と容器１とで、選択結合性物質が固定化された固定化領域Ｒ１を含む空隙６を形成しており、空隙６は、必要に応じて設けることのできる貫通孔３を介して外部と連通する他は、外部と連通しない閉じた空間となっている。図２の固定化領域Ｒ１は平面状であり、図３のＲ１は凹凸構造を有している。
【００２５】
図２及び図３の分析チップの固定化領域Ｒ１は、隔壁４で覆われている。攪拌用の微粒子５は、隔壁４により、空隙内で選択結合性物質の固定化面と隔てられた領域に封入されており、隔壁４の上方空間を移動する。
【００２６】
図２及び図３に示す分析チップの例では、隔壁４を、微粒子５は通過できないが、被検物質を含む溶液は通過できる。従って、被検物質を含む溶液を空隙内にアプライした後に分析チップを後記するように振動、回転等させて空隙内に設置された隔壁上で微粒子を移動させることで、選択結合性物質が固定化されている担体表面に移動する微粒子５が接触することなく、溶液の十分な攪拌を達成し、これにより生じる溶液の流動は隔壁を通過して起こり、空隙内全体の溶液を均一に攪拌することができる。従来の分析チップでは、選択結合性物質が固定化されている部分に微粒子が接触しないようにするために担体や容器に構造上の工夫を施していたために、使用可能な微粒子の大きさに制約があったが、このような隔壁を設けることにより、基本的に微粒子の大きさに制約がなくなる。
【００２７】
図４に示す分析チップの例は、担体２の下部から容器１が覆設されている。図５〜図９は、図４で示される分析チップのそれぞれ異なる態様であって、それぞれ図４の矢印Ａ２方向に沿った面での断面図を示す。
【００２８】
図５〜図９の分析チップの例では、担体２と容器１とで、選択結合性物質が固定化された固定化領域Ｒ１を含む空隙６を形成しており、空隙６は、必要に応じて設けることのできる貫通孔３を介して外部と連通する他は、外部と連通しない閉じた空間となっている。図５、図６及び図９の担体２の表面は凹凸構造を有しており、図７及び図８の担体２の表面は平面状である。また、図５の容器１の表面は平面状であり、図６、図７、図８及び図９の容器１の表面は凹凸構造を有している。図８の容器１の凹凸構造は、図７の容器１の構造と比較して、凸部の幅が広くなっている。図９の容器１の凹凸構造は、凸部が逆テーパー構造（逆台形錐構造）を有している。
【００２９】
図５、図６、図７及び図８の容器１の表面は、隔壁４で覆われている。図９の容器１の表面は、逆テーパー構造により微粒子５が凹部空間に保持されるように凹部開口部のサイズが微粒子５のサイズより小さくなるように設計されており、この逆テーパー構造そのものが隔壁４としての役割を果たしている。
【００３０】
図５〜図９に示す分析チップの固定化領域Ｒ１は、隔壁４で覆われている。微粒子５は、隔壁４により、空隙内で選択結合性物質の固定化面と隔てた領域に封入されており、隔壁４の下方空間を移動する。
【００３１】
図５〜図９の分析チップの例では、隔壁４を、微粒子５は通過できないが、被検物質を含む溶液は通過できる。従って、被検物質を含む溶液を前記空隙内にアプライした後に分析チップを振動、回転等させることにより、選択結合性物質が固定化されている担体表面に移動する微粒子５が飛び跳ねて接触することなく、微粒子５の移動により生じる溶液の流動は隔壁を通過して空隙内全体の溶液を均一に攪拌することができる。
【００３２】
従来の分析チップでは、選択結合性物質が固定化されている部分に微粒子が接触しないようにするために、容器の凹凸構造の位置合わせに高い精度が要求されていたが、図６〜図９に示す分析チップにおいては、本発明の隔壁を用いることで、容器と担体との厳密な位置合わせは必要なくなるので、その製造を容易に行うことが可能となる。
【００３３】
図１０〜図１２に示す分析チップの例は、ウェル構造６Ａを有する容器１が担体２の側面に結合しているか、又はウェル構造６Ａを有する容器１の底部が担体２の表面に結合している。選択結合性物質が固定化された固定化領域Ｒ１を含む空隙６は、担体２及び容器１のウェル構造の内壁によって複数形成されている。図１０の担体２の表面は平面状である。
【００３４】
図１０〜図１２に示す分析チップの固定化領域Ｒ１は、隔壁４で覆われている。微粒子５は、隔壁４により、空隙内で選択結合性物質の固定化面と隔てた領域に封入されており、隔壁４の上方空間を移動する。空隙６は、上部が開放された状態であってもよい（図示せず）。その場合は、溶液をアプライした後、微粒子５や反応溶液の流出を防ぐため、接着テープ等の封止部材１０により封をすることができる。
【００３５】
図１０〜図１２に示す分析チップの例では、隔壁４を、微粒子５は通過できないが、被検物質を含む溶液は通過できる。従って、被検物質を含む溶液を前記空隙内にアプライした後に分析チップを振動、回転等させることで、微粒子５の移動により生じる溶液の流動は隔壁を通過して空隙内全体の溶液を均一に攪拌することができる。
【００３６】
本発明の分析チップの隔壁は、被験物質を含む溶液は通過できるが、撹拌用の微粒子は通過しないものを用いることができる。例えば、シート状又は板状の構造物であって、撹拌子が通過できないサイズの開口を有するものを用いることができる。この場合の開口の形状は特に限定されず、正方形や長方形等の矩形、円形、楕円形等を用いることができる。
【００３７】
例えば、本発明の分析チップの隔壁としては、図１３（ｃ）〜（ｇ）に示すような矩形の開口を有する格子状の構造物や任意の形状の開口を有するパンチングシート状の構造物を使用することができる。格子状の構造物の場合には、格子窓の形状も様々な形態をとることができ、正方形や長方形等の矩形のものが、容易に入手して用いることができる。図１３（ｃ）に示す隔壁４は、矩形の開口を有する格子状構造物である格子状メッシュであり、図１３（ａ）の隔壁外枠１１に隔壁部材１２として格子状部材（メッシュ）を固定したものである。また、図１３（ｄ）は、隔壁部材１２として縞目状部材又は複数の紐状部材を図１３（ａ）の隔壁外枠１１に固定した隔壁４である。また、図（ｅ）〜（ｇ）に示すような矩形又は円形の開口を有する格子状構造物又はパンチングシート状構造物を使用することができる。
【００３８】
隔壁の材質は特に限定されないが、金属（例えば金、白金、ステンレス）、プラスチック（例えば、ナイロン、ポリスチレン、ポリエステルやポリプロピレン）、カーボン等を用いることができる。隔壁の材質がプラスチックの場合、担体や容器と同じ材質のプラスチック及び異なる材質のプラスチックのいずれも使用することができる。また、図１３（ａ）の隔壁外枠１１としては、隔壁部材１２（格子状部材（メッシュ）や縞目状部材又は紐状部材）と同様の材質を用いることができる。
【００３９】
これらの中でも、隔壁としては、比較的容易に準備できるものとして、図１３（ｃ）に示す格子状メッシュを好ましく用いることができる。特に、隔壁部材１２としてプラスチック製メッシュを用いた隔壁を好ましく用いることができる。プラスチック製メッシュの素材としては、ナイロン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、フッ素繊維等のプラスチックを用いることができ、これらのなかでもポリエステル、ポリプロピレンが好ましい。メッシュの線径と目開きのサイズは、用いる微粒子のサイズによって、溶液の流れ易さと、微粒子の移動し易さを考慮し、最適なサイズを選んで使用できる。
【００４０】
ここで、格子状の隔壁と球状の微粒子を用いる場合のそれぞれ好ましいサイズについて述べる。
【００４１】
微粒子のサイズは、撹拌する被検物質を含む溶液の体積に応じて選択することができる。被検物質の溶液の体積は、ＤＮＡチップの場合、被検物質を含む溶液を調製する際に用いる容器のサイズと、扱いやすい液量を考慮すると、通常は最大１ｍＬ程度である。例えば、後記する図１６に示すＤＮＡチップの場合、選択結合性物質は１ｃｍ角程度のエリアに固定化され、１ｍＬの被検物質溶液を接触させるためには、溶液を保持する容器の凹部の深さＨ２は１．８ｍｍとすることができる。十分な撹拌を行うためには、一般的には微粒子は大きい方が好ましいと考えられるが、溶液を保持する容器のサイズを考慮すると、上記ＤＮＡチップの例では、球状の微粒子の場合、上限としては平均粒径が１．４ｍｍ以下であることが好ましい。これより大きくなると、隔壁、容器との摩擦が大きくなり、微粒子がスムーズに動かなくなる可能性がある。また、微粒子の平均粒径が０．１ｍｍ以下の場合は、この微粒子が通過しないメッシュサイズの隔壁を用いると、溶液の通過も妨げる可能性がある。従って、球状の微粒子の場合、特に、平均粒径が０．５〜１．１ｍｍの範囲の微粒子をそれぞれ隔壁の形状に合わせて用いることが好ましい。
【００４２】
格子状の隔壁（隔壁部材）としてプラスチック製メッシュを用いる場合、メッシュの目開きのサイズと、球状の微粒子の平均粒径との組合せとしては、メッシュの目開きが０．０５ｍｍ〜０．０９ｍｍの場合は平均粒径が０．１５ｍｍ〜０．２５ｍｍの微粒子、メッシュの目開きが０．１ｍｍ〜０．２５ｍｍの場合は平均粒径が０．３ｍｍ〜０．５ｍｍの微粒子、メッシュの目開きが０．２５ｍｍ〜０．３５ｍｍの場合は平均粒径が０．５ｍｍ〜０．７ｍｍの微粒子、目開きが０．３５ｍｍ〜０．４５ｍｍのメッシュの場合は平均粒径が０．７ｍｍ〜０．９ｍｍの微粒子、目開きが０．４５ｍｍ〜０．５５ｍｍのメッシュの場合は平均粒径が０．９ｍｍ〜１．１ｍｍの微粒子を用いることがそれぞれ好ましい。以上のように使い分けることで、メッシュの目開きに微粒子が挟まって動かなくなることを防ぐことができる。
【００４３】
メッシュの線径は、溶液の流れをできるだけ妨げないように細いものを用いることが好ましく、０．０６ｍｍ〜０．１６ｍｍのメッシュを特に好ましく用いることができる。
【００４４】
格子状の隔壁（隔壁部材）を用いる場合、格子の形状が長方形であるほうが、正方形の場合に比べて開口率が大きく、溶液の流れをより妨げにくい形状である。長方形の格子の場合、隔壁の格子窓に、微粒子が挟まることなく動けるように最適な格子窓の短辺の長さを選ぶことが好ましい。球状の微粒子の場合、微粒子の平均粒径が０．１５ｍｍ〜０．２５ｍｍの場合は短辺長さ０．０５ｍｍ〜０．０９ｍｍ、平均粒径が０．３ｍｍ〜０．５ｍｍの場合は短辺長さ０．１ｍｍ〜０．２５ｍｍ、平均粒径が０．５ｍｍ〜０．７ｍｍの場合は短辺長さ０．２５ｍｍ〜０．３５ｍｍ、平均粒径が０．７ｍｍ〜０．９ｍｍの微粒子の場合は短辺長さ０．３５ｍｍ〜０．４５ｍｍ、平均粒径が０．９ｍｍ〜１．１ｍｍの微粒子の場合は短辺長さ０．４５ｍｍ〜０．５５ｍｍ、の格子の隔壁をそれぞれ好ましく用いることができる。平均粒径が０．１ｍｍの微粒子では、短辺の長さが短くなり過ぎて開口率が小さくなり、その結果、溶液の流れが悪くなる。以上の場合、長方形の格子の長辺の長さは、特に限定されない。
【００４５】
隔壁には、隔壁自体の腐食防止、被検物質の吸着を防止のために物理的コーティングや、化学修飾による表面改質を施すことができる。
【００４６】
本発明の分析チップにおける隔壁は、担体に脱離可能に接着されていても、担体に脱離不可能に接着されていてもよい。通常、被検物質とのハイブリダイゼーション反応を行った後、選択結合性物質又は被験物質に結合させた蛍光物質から発せられる蛍光の強度をスキャナー装置により測定するが、隔壁が担体に脱離可能に接着されている場合は、被検物質とのハイブリダイゼーション反応を行った後、分析チップを解体して隔壁を脱離させ、また容器や微粒子も除いて、担体のみをスキャナー装置にセットして蛍光等のシグナル強度を測定することができる。
【００４７】
一方、隔壁が担体に脱離不可能に接着されている分析チップを解体することなくそのままスキャナー装置で測定することも可能であるが、この場合は、隔壁から自家蛍光が生じると、その発光がノイズとなり検出精度の低下に繋がることがあるので、光照射による自家蛍光が生じない又は低減された隔壁を用いることが重要である。隔壁自体からの自家蛍光を低減させるためには、後記する一般式（１）又は一般式（２）の構造単位を有するポリマー、あるいは光照射により発光を生じずかつ／又はポリマーから生じた発光を吸収する物質を含有させたポリマー、例えば、カーボンブラックやカーボンナノチューブ、フラーレン等を含有させた黒色ポリマーで隔壁を作製することにより、さらには、これらポリマーを隔壁表面にコーティング等施して被覆処理することにより、隔壁の表面を光照射による発光を生じない表面とすることが好ましい。このような光照射により発光を生じない隔壁、例えば黒色の隔壁を用いることにより、検出の際の隔壁からの自家蛍光を低減でき、結果的にＳ／Ｎ比が良好な結果を得ることができる。
【００４８】
ここで、隔壁が光照射によって発光を生じないとは、可視光（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）範囲において、隔壁の分光反射率が特定のスペクトルパターン（特定のピークなど）を持たず、一様に低い値であり、かつ、隔壁の分光透過率も、特定のスペクトルパターンを持たず、一様に低い値であることをいう。
【００４９】
本発明の分析チップにおいて、隔壁は、可視光（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）の範囲の分光反射率が７％以下であり、同波長範囲での分光透過率が２％以下であることが好ましい。ここでいう分光反射率は、ＪＩＳ Ｚ ８７２２ 条件Ｃに適合した、照明・受光光学系で、担体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率をいう。
【００５０】
本発明において、隔壁を光照射によって発光が生じないようにするためにポリマーに含有させて用いる物質の好ましいものを挙げると、カーボンブラック、カーボンナノチューブ、フラーレン、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラック、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ及びＣｕの酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、Ｚｒ及びＣｒの炭化物などの黒色物質が使用できる。これらの黒色物質の中でも、カーボンブラック、カーボンナノチューブ、フラーレン、グラファイト、チタンブラックを好ましく含有させることができ、特にカーボンブラックを好ましく用いることができる。これらの黒色物質は単独で含有させる他、２種類以上を混合して含有させることもできる。
【００５１】
本発明の分析チップにおける微粒子の好ましい態様について述べる。
【００５２】
微粒子のサイズは、前記のとおり、撹拌する被検物質を含む溶液の体積、隔壁の形状に応じて、攪拌の効果が得られるように適切なサイズを選択することができる。特に、隔壁の形状に合わせて、平均粒径が０．５〜１．１ｍｍの範囲の微粒子を用いることが好ましい。
【００５３】
本発明の分析チップでは、溶液を攪拌することができれば、どのような形の微粒子も用いることができる。微粒子の形状としては、微粒子を移動させて被検物質の溶液を攪拌することができるものであれば、どのような形の微粒子も用いることができる。具体的には、球状、多角形、円筒形などの任意の形状をとることができる。これらの中でも、球状の微粒子、すなわちビーズが特に好ましい。微粒子が球状であると、反応液中で滞ることなくスムーズに移動させることができ、検体溶液の攪拌を良好に行うことができる。
【００５４】
本発明の分析チップでは、微粒子の材質は特に限定されず、金属、ガラス、セラミック、ポリマー（ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロンなど）を用いることができる。この中でも、比重が水よりも大きい材質、例えば、ガラス、石英、ジルコニアセラミックの微粒子は、重力、振動・浸透、旋回による加速度などにより容易に溶液中を移動することが可能となり、また被検物質溶液中に微粒子成分が溶出することが少ないので好ましい。また、微粒子として、磁気ビーズを使用することも可能である。これらのうち、特に、ジルコニアセラミックからなる微粒子は、比重が大きいことから、重力、振動・振盪、旋回による加速度などを加えることにより、移動が容易に行えることから最も好ましく用いることができる。また、ガラス、石英、ジルコニアセラミックは、検体溶液中に微粒子の成分が溶出することが少ないので好ましい。
【００５５】
ジルコニアセラミック（イットリア安定化ジルコニア）からなる微粒子は、密度が６ｇ／ｃｍ３であり、石英ガラスの２．２ｇ／ｃｍ３などに比べて大きいので、攪拌効果がより発揮でき、容器でシーリングする際の溶液の動きに対してもビーズが舞い上がって動いてしまうことが少ないので、セッティングがより容易に行え、特に好ましい。
【００５６】
本発明の分析チップでは、微粒子を移動させることにより溶液を攪拌する。好ましくは、重力や磁力（磁気ビーズの場合）を利用して微粒子を移動させること、また分析チップに振動・振盪や旋回による加速度を加えること、又はこれらの組合せにより、微粒子を移動させる。これらの中でも、分析チップを重力方向に平行な面に沿って回転させて重力により微粒子を移動する方法、分析チップを重力方向に垂直な面に沿って旋回したり、上下や左右に振盪（素早く移動）したりすることにより、溶液中の微粒子を移動させる方法は、簡便に実施でき、十分な効果が得られることから好ましい。
【００５７】
分析チップを重力方向に平行又は略平行な面（垂直又は略垂直な面）に沿って回転させ、重力により微粒子を移動する方法において、分析チップの回転速度としては、０．１ｒｐｍ〜３０ｒｐｍが好ましい。回転速度が３０ｒｐｍを越えると、微粒子が一方向に移動しきれないうちに、微粒子に反対側の重力がかかることになる。すなわち、微粒子が被検物質溶液中で往復運動する距離が小さくなってしまい、攪拌の効果が十分に発揮できない場合がある。また、０．１ｒｐｍより回転速度が遅いと、液中の微粒子が移動しているトータルの時間が短くなってしまい、結果的に被検物質溶液を攪拌している時間が短くなるので十分な効果が得られないことがある。以上の点を鑑みると、回転速度のより好ましい範囲としては０．５ｒｐｍ〜５ｒｐｍである。
【００５８】
また、分析チップを重力方向に垂直又は略垂直な面（水平又は略水平な面）に沿って公転させて微粒子を移動する方法も、市販の振盪器等を利用できることから好ましい。略水平な面とは、担体を回転させた場合に微粒子が分析チップの片側に寄らない程度の傾きを持たせた面を意味し、例えば水平面を基準として０度から３度の間が好ましい。また、公転とは、分析チップが任意の回転軸を基準としてその周囲を回転することを意味する。この場合、任意の回転軸の周囲を分析チップが円軌道を描くように回転することが好ましい。分析チップ自体は回転（自転）してもしなくてもよいが、回転しない方が、装置が簡便であり、微粒子に大きな加速度や遠心力がかかることから撹拌効率が向上するので好ましい。
【００５９】
公転の回転方向は特に限定されず、連続して一方向に連続して公転するものでも良いし、１回又は２回以上の等周期あるいはランダムな周期で正方向と逆方向に切り替えるようなパターンを繰り返して公転するものでもよい。分析チップを公転させる際の回転数としては、１００ｒｐｍから５００ｒｐｍが好ましい。１００ｒｐｍ未満であると十分な攪拌が行われない場合があるし、５００ｒｐｍを超えると、分析チップから容器が遠心力によって剥がれてしまう可能性がある。特に好ましくは、２００ｒｐｍから３００ｒｐｍである。また、公転の回転数は、撹拌処理時間を通じて一定であっても良いし、周期的又はランダムに変化させても良い。公転の際、分析チップが描く円軌道の半径としては、分析チップの中心部が描く円軌道として、半径２ｃｍから５ｃｍであることが好ましい。半径が２ｃｍ未満であると、十分な撹拌が行われない場合があるし、５ｃｍを超えると、分析チップから容器が遠心力によって剥がれてしまう場合がある。尚、この円軌道は正円に限定されず、多少ゆがみが含まれていてもよく、例えば楕円であっても良い。
【００６０】
また、分析チップを重力方向に垂直又は略垂直な面（水平又は略水平な面）に沿って８の字状に旋回させて微粒子を移動させる方法も好ましく用いることができる。この場合、分析チップが任意の８の字旋回軸に対して左右対称に８の字を描くように旋回することが好ましい。８の字旋回の旋回方向は特に限定されず、連続して一方向に８の字旋回するものでも良いし、１回又は２回以上の等の周期あるいはランダムな周期で正方向と逆方向に切り替えるようなパターンを繰り返して８の字旋回するものでもよい。分析チップを８の字旋回させる際の回転数としては、１００ｒｐｍから５００ｒｐｍが好ましい。１００ｒｐｍ未満であると十分な攪拌が行われない場合があるし、５００ｒｐｍを超えると、分析チップから容器が遠心力によって剥がれてしまう可能性がある。特に好ましくは、２００ｒｐｍから３００ｒｐｍである。また、８の字旋回の回転数は、撹拌処理時間を通じて一定であっても良いし、周期的又はランダムに変化させても良い。８の字旋回の際、分析チップが描く８の字軌道の半径としては、分析チップの中心部が描く円軌道として、半径２ｃｍから５ｃｍであることが好ましい。半径が２ｃｍ未満であると、十分な撹拌が行われない場合があるし、５ｃｍを超えると、分析チップから容器が遠心力によって剥がれてしまう場合がある。
【００６１】
さらに、分析チップを上下や左右に振動・振盪して、加速度を加えることにより、溶液中の微粒子を動かすことも好ましく用いることのできる方法である。この場合、分析チップが任意の軸に対して上下対称や左右対称に振盪することが好ましい。分析チップを上下や左右に振盪させる際の振盪速度としては、１００回／ｍｉｎから５００回／ｍｉｎが好ましい。１００回／ｍｉｎ未満であると十分な攪拌が行われない場合があるし、５００回／ｍｉｎを超えると、分析チップから容器が剥がれてしまう可能性がある。特に好ましくは、２００回／ｍｉｎから３００回／ｍｉｎである。また、振盪速度は、撹拌処理時間を通じて一定であっても良いし、周期的又はランダムに変化させても良い。振盪の際、分析チップの振幅としては、２ｃｍから５ｃｍであることが好ましい。振幅が２ｃｍ未満であると、十分な撹拌が行われない場合があるし、５ｃｍを超えると、分析チップから容器が剥がれてしまう場合がある。
【００６２】
また、被検物質とのハイブリダイゼーション反応を行った後、分析チップを解体して容器や隔壁を脱離させることなくそのままスキャナー装置で蛍光強度を測定する場合は、微粒子から自家蛍光が生じると、その発光がノイズとなり検出精度の低下に繋がることがあるので、光照射による自家蛍光が生じない又は低減された隔壁を用いることが重要である。微粒子自体からの自家蛍光を低減させるためには、前記隔壁の場合と同様、後記する一般式（１）又は一般式（２）の構造単位を有するポリマー、又は光照射により発光を生じない物質を含有させたポリマー（例えば、前記の黒色ポリマー）で、微粒子表面にコーティング等を施して被覆処理することにより表面を形成することが好ましい。このような微粒子を用いることにより、検出の際、微粒子からの自家蛍光を低減できる。
【００６３】
選択結合性物質が固定化される担体の好ましい形状について述べる。
【００６４】
本発明の分析チップに用いる選択結合性物質が固定化された担体には、その表面形状が平面状のものや凹凸構造を有するものを利用できる。表面が凹凸構造である担体を用いた場合、凹凸構造の凸部上面に選択性適合物質が固定化されていることが好ましい。このような構造を取ることにより、検出の際、非特異的に吸着した被検物質の検出を抑制できるので、ノイズが小さく、結果的によりＳ／Ｎが良好な結果を得ることができる。ノイズが小さくなる具体的な理由は、以下の通りである。すなわち、凸部上面に選択結合性物質を固定化した担体をスキャナーと呼ばれる装置を用いてスキャンすると、担体の表面（選択結合性物質が固定化された面）から検出する場合であっても、裏面から検出する場合であっても、凹凸部の凸部上面にレーザー光の焦点が合っているため、凹部では、レーザー光がぼやけ、凹部に非特異的に吸着した被検物質の望まざる蛍光（ノイズ）を検出しがたいという効果があるためである。
【００６５】
凹凸部の凸部は、それぞれの凸部の上面の高さが略同一であることが好ましい。ここで、高さが略同一とは、多少高さの違う凸部の表面に選択結合性物質を固定化し、これと蛍光標識した被検物質とを反応させ、そして、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの強度差が問題とならない高さをいう。具体的に高さが略同一とは、高さの差が５０μｍより小さいことをいう。高さの差は３０μｍ以下であることがより好ましく、高さが同一であればなお好ましい。
【００６６】
また、凸部分の上面は、実質的に平坦であることが好ましい。ここで凸部上面が実質的に平坦とは、２０μｍ以上の凹凸がないことを意味する。
【００６７】
さらに、担体が凹凸構造を有する分析チップのうち、選択結合性物質が固定化された凹凸のある面から検出する分析チップには、その周囲に平坦部が設けられていることが好ましい。そして、凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部分の高さが略同一であることが好ましい。すなわち、平坦部の高さと凸部上面の高さの差は、５０μｍ以下であることが好ましい。より好ましくは、３０μｍ以下であり、最も好ましくは、平坦部の高さと凸部の高さは同一である。
【００６８】
本発明の分析チップの凹凸構造を有する担体の一例を図１４、図１５及び図１６に例示する。凹凸部の周りに平坦部１４があり、かつ、凹凸部の凸部上面１３に選択結合性物質（例えば核酸）が固定化されている。このような担体において凹凸面側から検出する場合、この平坦部を使って、容易にスキャナーの励起光の焦点を凸部の上面に合わせることが可能となる。すなわち、スキャナーが担体の表面に励起光の焦点を合わせる際には、図１７に示すように、治具１６に担体１５を突き当て、この治具１６の突き当て面の高さにレーザー光１９の焦点を予め調整しておくことが多い。本発明の分析チップに用いる担体の平坦部を治具の面に突き当てることにより、容易に担体の凸部上面にスキャナーのレーザー光の焦点を合わせることが可能となる。
【００６９】
図１８に示すように、選択結合物質が固定化された担体の表面形状が平面状の場合で、分析チップを分解して容器や隔壁を脱離させることなく、選択結合物質が固定されている面の裏側からスキャナーで読み取る場合は、例えば、選択結合物質が固定されている面にレーザー光の焦点を合わせるために、反射等でこの面を検出できるマーカー領域を担体上に設けることが好ましい。また、図９に例示する分析チップを容器を脱離させることなくスキャナーで読み取る場合には、図１９に示すように、選択結合物質が固定されている面と略同一の高さの面に、レーザー光の焦点を合わせるために、反射等でこの面を検出できるマーカー領域を担体上に設け、容器側からスキャナーで読み取ることが好ましい。
【００７０】
本発明の分析チップでは、選択結合性物質が固定化される担体の選択結合性物質が固定化された固定化面とは、データとして必要な選択結合性物質（例えば核酸）が固定化された部分をいい、ただ単にダミーの選択結合性物質を固定化した部分は除く。
【００７１】
本発明の分析チップでは、選択結合性物質が固定化される担体は、選択結合性物質が固定化される領域の表面形状が平面状の場合であっても、凹凸構造の場合であっても、それぞれの選択結合性物質が固定化される表面の面積は略同一であることが好ましい。ここで、固定化面の面積が略同一とは、最も大きい固定化面面積を、最も小さい固定化面面積で割った値が１．２以下であることを言う。
【００７２】
凹凸構造を有する担体において、選択結合性物質が固定化される凸部の上面の面積は、特に限定されないが、選択結合性物質の量を少なくすることができる点とハンドリングの容易さの点から、１ｍｍ２以下、１０μｍ２以上が好ましい。
【００７３】
凹凸構造を有する担体の凹凸部における凸部の高さは、１０μｍ以上、５００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以上、３００μｍ以下が特に好ましい。凸部の高さがこれより低いと、スポット（凸部表面）以外の部分の非特異的に吸着した被検物質を検出してしまうことがあり、結果的にＳ／Ｎが悪くなることがある。また、凸部の高さが５００μｍ以上であると、凸部が折れて破損しやすいなどの問題が生じる場合がある。
【００７４】
本発明の分析チップで用いられる担体の材質は、特に限定されない。好ましく用いられる担体の材質は、ガラス又は各種のポリマーである。ポリマーとしては、例えばポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリオレフィンが挙げられる。ここで、本発明において、ポリマーとは、数平均重合度が５０以上の高分子化合物を言う。このポリマーの数平均重合度の好ましい範囲は、１００から１万である。特に好ましくは、２００以上、５０００以下である。数平均重合度はＧＰＣ（ゲルパーメイションクロマトグラフ）を用い定法にてポリマーの分子量を測定することにより、容易に測定できる。
【００７５】
担体の材質がガラスの場合、選択結合性物質の固定化は、例えばシランカップリング処理を行うことで官能基を表面に生成でき、これを足がかりにＤＮＡなどの選択結合性物質を担体に固定化することが可能である。例えば、アミノアルキルシランなどを用いて、ガラスの表面にアミノ基を生成でき、ＤＮＡの場合だと、このアミノ基のプラスチャージとＤＮＡのマイナスチャージにより静電的な力により固定化することが可能となる。
【００７６】
本発明において、選択結合性物質を固定化するための担体表面が、下記一般式（１）で表す構造単位を有するポリマーを含有する固体であると、光照射による担体の自家蛍光を低減することができるので好ましい。
【００７７】
【化１】
2010106989.tif 000003
【００７８】
（一般式（１）のＲ１、Ｒ２、Ｒ３は、アルキル基、アリール基又は水素原子を表す。）
一般式（１）で表す構造単位を含有するポリマーとしては、単独重合体あるいは共重合体が用いられる。共重合体の場合、一般式（１）で表される構造単位を全モノマー単位の１０％以上含有していることが好ましい。
【００７９】
一般式（１）において、Ｒ１及びＲ２はアルキル基、アリール基又は水素原子を表し、それぞれ同一でも異なっても良い。アルキル基は直鎖状でも枝別れしても良く、好ましくは１から２０の炭素数を有する。アリール基は、好ましくは６から１８、さらに好ましくは６から１２の炭素数を有する。官能基Ｘは、Ｏ、ＮＲ３又はＣＨ２の中から任意に選ばれる。Ｒ３は、Ｒ１及びＲ２と同様に定義される官能基である。
【００８０】
担体表面のポリマーとしては、酸無水物単位を有する熱可塑性ポリマー共重合体を用いることもできる。この熱可塑性ポリマー共重合体は、酸無水物単位を有することが好ましい。ここでいう酸無水物単位は、熱可塑性ポリマー共重合体の主鎖や側鎖の骨格中や末端に存在する単位である。酸無水物単位の構造としては、（メタ）アクリル酸無水物単位、グルタル酸無水物単位、マレイン酸無水物単位、イタコン酸無水物単位、シトラコン酸無水物単位、アコニット酸無水物単位等が挙げられ、なかでもマレイン酸無水物単位、グルタル酸無水物単位が好ましく、下記一般式（２）
【００８１】
【化２】
2010106989.tif 000004
【００８２】
（上記式中、Ｒ４、Ｒ５は、同一又は相異なる水素原子又は炭素数１〜５のアルキル基を表す。）
で表されるグルタル酸無水物単位がより好ましい。
【００８３】
熱可塑性ポリマー共重合体は、酸無水物単位を含有していれば特に制限はないが、下記一般式（３）
【００８４】
【化３】
2010106989.tif 000005
【００８５】
（Ｒ６は水素又は炭素数１〜５のアルキル基を表す。）
で表される不飽和カルボン酸単位を有していることが好ましい。ここでいう不飽和カルボン酸単位とは、不飽和カルボン酸単量体を、共重合することにより得られる単位であり、この際に用いられる不飽和カルボン酸単量体としては特に制限はなく、他のビニル化合物と共重合させることが可能ないずれの不飽和カルボン酸単量体も使用可能である。好ましい不飽和カルボン酸単量体として、下記一般式（４）
【００８６】
【化４】
2010106989.tif 000006
【００８７】
（Ｒ６は水素又は炭素数１〜５のアルキル基を表す。）
で表される化合物、マレイン酸、及び無水マレイン酸の加水分解物などが挙げられるが、特に熱安定性が優れる点でアクリル酸、メタクリル酸が好ましく、より好ましくはメタクリル酸である。これらはその１種又は２種以上用いることができる。
【００８８】
また、熱可塑性ポリマー共重合体は、下記一般式（５）
【００８９】
【化５】
2010106989.tif 000007
【００９０】
（Ｒ７は水素又は炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ｒ８は炭素数１〜６の脂肪族若しくは脂環式炭化水素基、又はハロゲンで置換された炭素数１〜６の脂肪族若しくは脂環式炭化水素基を示す。）
で表される不飽和カルボン酸アルキルエステル単位を有していることが好ましい。ここでいう不飽和カルボン酸アルキルエステル単位とは、不飽和カルボン酸アルキルエステル単量体を、共重合することにより得られる単位である。ここで、不飽和カルボン酸アルキルエステル単量体としては特に制限はないが、好ましい例として、下記一般式（６）で表されるものを挙げることができる。（Ｒ７、Ｒ８は上記定義に同じ。）
【００９１】
【化６】
2010106989.tif 000008
【００９２】
本発明の分析チップにおいて、選択結合性物質を固定化するための担体表面は、官能基を含むポリマーであることが好ましい。ポリマー製担体の表面に、官能基としてカルボキシル基や酸無水物があれば、アミノ基や水酸基を有する選択結合性物質を担体表面に共有結合で固定化することが可能となる。担体表面にカルボキシル基がある場合には、選択結合性物質の固定化反応を促進するため、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホナート、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などの様々な縮合剤を用いることができる。このような縮合剤を用い、担体表面のカルボキシル基と選択結合性物質のアミノ基とを反応させた場合は、アミド結合により担体表面と選択結合性物質が固定化されることになり、担体表面のカルボキシル基と選択結合性物質の水酸基とを反応させた場合は、エステル結合により担体表面と選択結合性物質とが固定化されることになる。また、酸無水物が表面に存在するポリマーの場合では、上記のような縮合剤を加えても良いし、加えなくとも、例えば選択結合性物質のアミノ基との間で共有結合を行うことが可能である。
【００９３】
表面がポリマーである担体に選択結合性物質を固定化することにより、非特異的な被検物質の吸着を抑え、さらに、共有結合で強固に、かつ、高密度に選択結合性物質を固定化できるので好ましい。また、ガラスに比べ、担体表面がポリマーである場合は、固定化された選択結合性物質の空間的な自由度が高いという推定理由のために、被検物質とのハイブリダイゼーション効率が高い担体を得ることができる。
【００９４】
官能基を含むポリマーで好ましいものとしては、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチルメタクリレート（ＰＥＭＡ）又はポリプロピルメタクリレートのポリメタクリル酸アルキル（ＰＡＭＡ）等がある。これらの中で特に好ましいものは、ポリメチルメタクリレートである。さらに、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリル酸シクロヘキシル又はポリメタクリル酸フェニル等も用いることができる。また、これらのポリマーの構成単位を組み合わせた共重合体、又はこれらのポリマーの構成単位に他の一種又は複数種のポリマーの構成単位を加えた構造の共重合体も用いることができる。ここで、他のポリマーとしては、ポリスチレンがある。ポリマーが共重合体の場合、各構成単位の比の範囲は、カルボニル基を含むモノマー、例えばメタクリル酸アルキルの割合は、１０モル％以上が好ましい。
【００９５】
一般式（１）で表される構造単位を少なくとも１つ有するポリマーを表面に有する担体に選択結合性物質を固定化するためには、前処理を施して担体表面にカルボキシル基を形成させることが好ましい。担体表面にカルボキシル基を生成する手段としては、アルカリ、酸の液体又は溶液などで処理するほか、温水中での超音波処理、酸素プラズマ、アルゴンプラズマ、放射線に担体を晒す方法などが挙げられるが、担体の損傷が少なく、また、容易に実施できるという点から、アルカリ又は酸の液体又は溶液に担体を漬け込んで表面にカルボキシル基を生成させることが好ましい。具体的な例としては、水酸化ナトリウムや硫酸の水溶液（好ましい濃度は、１Ｎ〜２０Ｎ）に担体を漬け込み、好ましくは３０℃から８０℃の温度にして、１時間から１００時間の間保持すればよい。
【００９６】
選択結合性物質が固定化される表面を含む形状が凹凸構造である担体は、一般式（１）や一般式（２）で示される構造単位を含むポリマーを用いると、射出成形方法やホットエンボス法などを適用して作製することができるので、微細な凹凸形状を設けた担体をより簡単に大量生産することが可能である。特に、射出成型法は大量生産が容易であることから好ましく用いることができる。
【００９７】
本発明の分析チップを用いる被検物質の測定においては、通常、蛍光標識化された被検物質と担体に固定化された選択結合性物質とをハイブリダイゼーション反応させた後、スキャナー装置で蛍光強度を測定する。ここで、スキャナーは励起光であるレーザー光を対物レンズで絞り込み、レーザー光を集光する。しかし、担体表面から自家蛍光が生じると、その発光がノイズとなり検出精度の低下に繋がることがあるので、光照射による自家蛍光が生じない又は低減された担体を用いることが重要である。担体自体からの自家蛍光を低減させるためには、前記した隔壁の場合と同様に、一般式（１）又は一般式（２）の構造単位を有するポリマー、光照射により発光を生じない物質を含有させたポリマー、又はポリマーから生じた発光を吸収する物質を含有させたポリマー（例えば、前記の黒色ポリマー）で担体を作製することにより、又はこれらポリマーを担体の表面にコーティング等施して被覆処理することにより、担体の表面を光照射により発光を生じない表面にすることが好ましい。このような光照射により発光を生じない、例えば黒色の担体を用いることにより、検出の際の担体からの自家蛍光を低減でき、結果的にＳ／Ｎ比が良好な担体となる。ここで、担体が黒色であることの定義、担体を黒色にする方法は、前記した隔壁の場合と同様である。
【００９８】
本発明の分析チップにおける容器としては、前記担体の表面の選択結合性物質が固定化された固定化表面を覆い、担体と容器との間に空隙を有するように接着されうる形状を選択することができる。
【００９９】
本発明の分析チップは、担体と容器とにより形成された空隙を有するが、当該空隙は、一つの空間でもよく、複数の仕切られた空間であってもよい。複数の区切られた空間は、例えば図１１に示す分析チップのような仕切り構造により設けることができる。この例においては、空隙６は、互いに連通しない。このように、複数の仕切られた空間を設けることによって、１枚の分析チップに複数種の被検物質溶液をアプライすることが可能となり、複数種の被検物質を同時に１枚のチップで測定することができる。
【０１００】
また、本発明の分析チップにおける容器には、例えば図６、図７、図８に示す分析チップのように、凹凸構造を設けることができる。この凹凸構造を有する容器は、単純な切削加工や、一般的な射出成形法によって作製することが出来る。また、図９に示す分析チップのような逆テーパー構造は、２色成形などの公知の方法によって作ることが出来る。
【０１０１】
本発明の分析チップにおける容器は、担体に脱離可能に接着されていても、担体に脱離不可能に接着されていてもよい。容器が担体に脱離可能に接着されている場合は、被検物質とのハイブリダイゼーション反応を行った後、分析チップを解体して容器を脱離させ、担体のみをスキャナーにセットして蛍光等のシグナル強度を測定することができる。
【０１０２】
本発明の分析チップを構成する容器の材料としては、特に限定されるものではないが、好ましく用いられる容器の材質として、ガラス又はプラスチック、あるいはこれらを組み合わせたもの等が挙げられる。特に、貫通孔や液面駐止チャンバー等の構造を容易に作製可能という点から、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート等のポリマーを好ましく用いることができる。
【０１０３】
容器は、被検物質溶液をアプライした際に、溶液の様子を観察可能とするために、透明な材料が好ましい。分析チップから容器を脱離させることなくスキャナーで読み取る分析チップにおいては、容器を透過して光を照射して検出する場合、容器の光が透過する部分は十分透明な材料でなければならない。また、容器から自家蛍光を生じると、その自家蛍光がノイズとなり検出精度の低下に繋がることがある。
【０１０４】
分析チップから容器を脱離させることなく、容器に光を透過させることなく検出する場合は、容器自体からの自家蛍光を低減させるために、前記隔壁や担体の場合と同様、一般式（１）もしくは一般式（２）の構造単位を有するポリマー、光照射によって発光を生じない物質を含有させたポリマー（例えば、前記の黒色ポリマー）又はポリマーから生じた発光を吸収する物質を含有させたポリマーで容器を作製することにより、又はこれらポリマーを担体の表面にコーティング等施して被覆処理することにより、担体の表面を光照射により発光を生じない表面にすることが好ましい。このような光照射により発光を生じない、例えば黒色の容器を用いることにより、検出の際の容器からの自家蛍光を低減できる。ここで、容器が黒色であることの定義、容器を黒色にする方法は、前記した隔壁又は担体の場合と同様である。
【０１０５】
一方、容器を透過して光を照射して検出する場合は、自家蛍光を生じず、かつ透明な、一般式（１）もしくは一般式（２）の構造単位を有するポリマーや無蛍光ガラスを用いるか、光が透過する部分のみこれらの材料を用いて、他の部分は、光が照射しても自家蛍光が生じない材料を用いて組み合わせて容器を作製することが好ましい。
【０１０６】
容器の作製方法は特に限定されるものではなく、ポリマーで構成する部分は、切削加工や射出成型法によって作製することができる。大量生産が可能であるという観点から、射出成型法を好ましく用いることができる。
【０１０７】
本発明において、選択結合性物質とは、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る物質を意味する。選択結合性物質の代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物等を挙げることができる。
【０１０８】
選択結合性物質として、特に好ましいものは、核酸である。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡのいずれでもよい。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう選択結合性物質に該当する。また、タンパク質としては、抗体及びFabフラグメントやF(ab')2フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、選択結合性物質に該当する。糖類としては、多糖類が好ましく、種々の抗原を挙げることができる。また、タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質を選択結合性物質として固定化することもできる。
【０１０９】
本発明に用いる選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。
【０１１０】
本発明に用いる選択結合性物質は、核酸が好ましく、核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが１０塩基から１００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能であり、また、核酸末端のアミノ基修飾が容易であるため、担体表面への固定化が容易となることから好ましい。さらに、２０塩基未満ではハイブリダイゼーションの安定性が低いという観点から２０〜１００塩基がより好ましい。ハイブリダイゼーションの安定性を保持するため、特に好ましくは４０〜１００塩基の範囲である。
【０１１１】
本発明の被検物質の分析方法は、上記の本発明の分析チップを用いて、これに被検物質を接触させ、微粒子を移動させて被検物質を担体上の選択結合性物質に選択的に結合させる工程、及び担体上に選択結合性物質を介して結合した被検物質量を測定する工程とを含む方法である。
【０１１２】
被検物質を含む溶液は、例えば図１〜図９に例示する分析チップの場合、貫通孔３から空隙内にアプライすることができる。分析チップに複数の貫通孔を設けることで、被検物質を含む溶液をアプライする際、気泡の流入を抑制することができ、操作性が向上する。
【０１１３】
本発明の分析方法において、微粒子を移動させて被検物質を含む溶液を攪拌する工程は、前記のように、重力や磁力（磁気ビーズの場合）を利用して微粒子を移動させること、振動・振盪や旋回による加速度を加えること、又はこれらの組合せにより、微粒子を移動させることによって好ましく行うことができる。これらのうち、分析チップを重力方向に平行又は略平行な面（垂直又は略垂直な面）に沿って回転させ、重力により微粒子を移動する方法が、簡便に実施でき、十分な効果が得られることから好ましい。この場合の回転速度等の回転の条件は、前記のとおりである。また、前記のように、分析チップを重力方向に垂直又は略垂直な面に沿って８の字状に旋回させて微粒子を移動させる方法も好ましく用いることができる。
【０１１４】
本発明の溶液の攪拌方法は、担体表面に固定化された選択結合性物質に、該選択結合性物質と反応する被検物質を含む溶液を接触させ、微粒子を用いて該溶液を攪拌する方法であって、隔壁により該選択結合性物質が固定化された担体表面と微粒子とを隔てられた微粒子を移動させる方法である。ここで用いる隔壁は、被検物質を含む溶液を通過させるが、微粒子は通過させない。本発明の溶液の攪拌方法は、上記の本発明の分析チップを用いて被験物質の測定を行う際に効果的に用いることができる。
【０１１５】
本発明の溶液の攪拌方法において、例えば、図２、３、１１、１２に示す分析チップでは、微粒子５は隔壁４の上部を移動し、選択結合性物質が固定化された担体表面と隔壁４により隔てられている。また、図５〜９に示す分析チップでは、微粒子５は隔壁４の下部の容器１の表面上を移動し、選択結合性物質が固定化された担体表面と隔壁４により隔てられている。
【０１１６】
本発明の溶液の攪拌方法において、選択結合性物質が固定化された担体表面と微粒子とを隔てる隔壁は、本発明の分析チップの態様として前記した、撹拌子が通過できないサイズの開口を有するシート状又は板状の構造物を用いることができる。好ましくは、矩形の開口を有する開口を有する格子状の構造物を用いることができ、格子状のメッシュがより好ましく、プラスチック製メッシュが特に好ましい。
【０１１７】
本発明の溶液の攪拌方法において、微粒子の移動は、前記のように、重力や磁力（磁気ビーズの場合）を利用することにより、振動・振盪や旋回による加速度を加えることにより、又はこれらの組合せにより好ましく行うことができる。これらのうち、前記のように、分析チップを重力方向に平行又は略平行な面（垂直又は略垂直な面）に沿って回転させて重力により微粒子を移動する方法や、分析チップを重力方向に垂直又は略垂直な面に沿って８の字状に旋回させて微粒子を移動させる方法を好ましく用いることができる。これら微粒子を移動させる条件は、前記のとおりである。
【０１１８】
本発明では、被検物質として、測定すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１１９】
本発明では、これらの被検物質を含む溶液としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物、並びにこれらの希釈液等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【０１２０】
被検物質となる核酸は、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものの場合には、測定感度を大幅に向上させることが可能である。核酸増幅産物を被検物質とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオチド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。また、被検物質が抗原又は抗体の場合には、被検物質である抗原や抗体を常法により直接標識してもよい。被検物質である抗原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、担体を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、担体に結合した標識を測定することもできる。
【０１２１】
担体上の選択結合性物質に被検物質とを接触させて相互作用させ、被検物質と選択結合性物質とを選択的に結合させる（ハイブリダイゼーション反応）させる工程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、３５℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜４０℃程度で１分間〜数時間程度である。
【０１２２】
担体上に選択結合性物質を介して結合した被検物質量の測定は、従来の方法に従って行うことができる。例えば、被検物質と選択結合性物質とを選択的に結合させた後の分析チップ又は容器を脱離させた担体を、既存のスキャナー等の装置にセットし、蛍光等のシグナル強度を測定することによって行うことができる。
【実施例】
【０１２３】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【０１２４】
実施例１
（ＤＮＡ固定化担体の作製）
公知の方法であるＬＩＧＡ（Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｅ  Ｇａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｎｇ  Ａｂｆｏｒｍｕｎｇ）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により、図１６に示す担体２として、後記する形状を有するポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製の担体を得た。なお、この実施例で用いたＰＭＭＡの平均分子量は５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合でカーボンブラック（三菱化学製  ＃３０５０Ｂ）を含有させており、担体は黒色である。この黒色担体の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、担体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。【０１２５】
担体の形状は、大きさが縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、担体の中央部分を除き表面は平坦であった。担体の中央に、縦・横１３ｍｍ、深さ０．１５ｍｍの凹んだ部分が設けてあり、この凹みの中に、直径０．１５ｍｍ、高さ０．１５ｍｍの選択結合性物質をその表面に結合させる凸部７を２５６（１６×１６）箇所設けた。凹凸部分の凸部上面の高さ（２５６箇所の凸部の高さの平均値）と平坦部分との高さの差を測定したところ、３μｍ以下であった。また、２５６個の凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）、さらには、凸部上面の高さの平均値と平坦部上面の高さの差を測定したところそれぞれ３μｍ以下であった。【０１２６】
（プローブＤＮＡの固定化）
次に上記のＰＭＭＡ担体を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、担体表面にカルボキシル基を生成した。【０１２７】
配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ（６０塩基、５’末端アミノ化）を合成した。なお、このＤＮＡは５’末端がアミノ化されている。【０１２８】
このＤＮＡを、純水に０．３ｎｍｏｌ／μＬの濃度となるよう溶解させて、ストックソリューションとした。担体に点着する際は、ＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２ｇ純水に溶かし１ＬにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５）で１０倍希釈して、プローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μＬとし、かつ、担体表面のカルボン酸とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍＬとした。そして、これらの混合溶液をアレイヤー（日本レーザー電子製；Ｇｅｎｅ  Ｓｔａｍｐ−ＩＩ）を用いて、カルボキシル基を生成させた上記担体の凸部上面の全てにスポットした。次いで、担体を密閉したプラスチック容器に入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートした。最後に純水で洗浄し、スピンドライヤーで遠心して乾燥した。この反応スキームを図２０に示す。【０１２９】
（隔壁）
隔壁外枠１１として厚さ０．２ｍｍのステンレス板を図１３（ａ）に示す形状に加工し、２０ｍｍ角にカットしたポリプロピレン製メッシュクロス（株式会社セミテック；目開き２５０μｍ、線径１０３μｍ）を隔壁部材１２として、ＰＤＭＳポリマー（東レダウコーニング）により隔壁外枠１１に固定し、図１３（ｃ）に示す隔壁４を用意した。この隔壁を上記ＰＤＭＳポリマーにより担体に接着した。接着条件は４２℃、２時間である。【０１３０】
（液体を保持する容器）
射出成形法により図１６に示す貫通孔３を４つ有する容器１を作製した。凹部の深さＨ２は１．８ｍｍであった。そして、これを洗浄剤（クリーンエース製（アズワンカタログ、品番：４−０７８−０１）２５倍希釈溶液）に浸漬して５分間超音波洗浄した後、逆浸透水（ＲＯ水）で十分にすすぎ、エアブローにより乾燥させた。【０１３１】
（チップの組み立て）
プローブＤＮＡを固定化した担体の中央の凹部を覆うように隔壁を置き、さらに洗浄済みの容器１を、隔壁を覆うように配置し、担体２と容器１とをＰＤＭＳポリマーで接着した（図１６）。接着条件は４２℃、２時間である。【０１３２】
（微粒子の調製と封入）
表面粗さが２０ｎｍ、平均粒径が５００μｍの市販ジルコニア製微粒子（東レ株式会社製）を、炭化珪素質研磨材（粒度＃２０）を用い遠心式バレル研磨機で１時間、水中にて研磨を行い、水洗して乾燥した。得られた微粒子の表面粗さは、Ｒａ＝１６５ｎｍであった。かかる微粒子の表面粗さの測定は、その表面をＡｕで真空蒸着した後、走査型電子顕微鏡（株式会社エリオニクス製、型式ＥＳＡ−２０００）で表面粗さＲａ（ｎｍ）を測定した。前記表面粗さは、観察倍率を１０，０００倍、カットオフ値を０とし、任意の１０個について測定し、その平均値を求めた。かかる微粒子の粒径は、実体顕微鏡で任意の１００個以上の微粒子の画像を５０〜１５０倍で撮影した後、画像処理解析ソフト（三谷商事社株式会社製、Ｗｉｎ  Ｒｏｏｆ）により円相当径を求めて平均値を算出し、それを平均粒径とした。その後エタノール溶液に浸漬し、超音波洗浄を５分間行った。さらに同様の洗浄を２回繰り返した。この微粒子を、容器１の貫通孔３から、隔壁上の空隙６に適切量封入した。適切量とは、隔壁４の上面が半分程度埋め尽くす量であり、十分であることが分かっている。【０１３３】
（被検物質ＤＮＡの調製）
被検物質ＤＮＡとして、上記ＤＮＡ固定化担体に固定化されたプローブＤＮＡとハイブリダイズ可能な配列番号４で表される塩基配列を持つＤＮＡ（９６８塩基）を用いた。調製方法を以下に示す。【０１３４】
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡと配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成した。これを純水に溶解して濃度を１００μＭとした。次いで、ｐＫＦ３  プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ（株））（配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡ：２２６４塩基）を用意して、これをテンプレートとし、配列番号２及び配列番号３で表される塩基配列のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅を行った。【０１３５】
ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、ＥｘＴａｑ  ２μＬ、１０×ＥｘＢｕｆｆｅｒ  ４０μＬ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ３２μＬ（タカラバイオ（株）製）、配列番号２で表される塩基配列のＤＮＡの溶液を２μＬ、配列番号３で表される塩基配列のＤＮＡの溶液を２μＬ、テンプレート（配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡ）を０．２μＬ加え、純水によりトータル４００μＬにメスアップした。これらの混合液を、４つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。これを、エタノール沈殿により精製し、４０μＬの純水に溶解した。ＰＣＲ反応後の溶液の一部をとり電気泳動で確認したところ、増幅したＤＮＡの塩基長は、およそ９６０塩基であり配列番号４で表される塩基配列のＤＮＡ（９６８塩基）が増幅されていることを確認した。【０１３６】
次いで、９塩基のランダムプライマー（タカラバイオ（株）製）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、上記のＰＣＲ反応後精製したＤＮＡ溶液に２μＬ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ（株）製）付属のバッファーを５μＬ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、ｄＣＴＰの濃度は４００μＭ）を２．５μＬ加えた。さらに、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を２μＬ加えた。この溶液に１０ＵのＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ３で標識された被検物質ＤＮＡを得た。なお、標識の際ランダムプライマーを用いたので、被検物質ＤＮＡの長さにはばらつきがある。最も長い被検物質ＤＮＡは配列番号４で表される塩基配列のＤＮＡ（９６８塩基）となる。なお、被検物質ＤＮＡの溶液を取り出して、電気泳動で確認したところ、９６０塩基に相当する付近にもっとも強いバンドが現れ、それより短い塩基長に対応する領域に薄くスメアがかかった状態であった。そして、これをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。【０１３７】
この標識化された被検物質ＤＮＡを、１重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとは、２０×ＳＳＣ（シグマ製）を純水にて４倍に希釈した液を指す。同様に、２０×ＳＳＣを純水で２倍に希釈した液を１０×ＳＳＣ、１００倍に希釈した液を０．２×ＳＳＣと表記する）、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡの溶液（各濃度はいずれも終濃度）、４００μＬに溶解し、ハイブリダイゼーション用のストック溶液とした。【０１３８】
以下の実施例、比較例において、ハイブリダイゼーション用の被検物質ＤＮＡ溶液は、特に断りのない限り、上記で調製したハイブリダイゼーション用ストック溶液を、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡ、０．１重量％ＳＤＳの溶液（各濃度はいずれも終濃度）で２００倍に希釈したものを用いた。なお、この溶液の被検物質ＤＮＡ濃度を測定したところ、３ｎｇ／μＬであった。【０１３９】
（ハイブリダイゼーション）
マイクロピペットを用いて、容器１の貫通孔３より、これと担体と囲まれた空隙（空間）６に上記で調製したハイブリダイゼーション用被検物質ＤＮＡ溶液を貫通孔３からあふれないように注入した。このとき、容易に溶液を注入でき、気泡が混入することはなかった。封止材としてシリコンテープ（アズワン）を用い、４つの貫通孔３を塞いだ。ハイブリダイゼーションチャンバー（Ｔａｋａｒａ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｃｈａｍｂｅｒ（タカラバイオ（株））をシート振盪台（東京理化器械（株）製  ＭＭＳ  ＦＩＴ−Ｓ）に密着させて固定し、分析チップをハイブリダイゼーションチャンバー内にセットした。このとき、分析チップをセットする位置の両端の凹みに、１５μＬずつ超純水を滴下した。ハイブリダイゼーションチャンバーのふたを閉めて６本の固定ネジを締めて固定後、４２℃に設定した恒温チャンバー（東京理化器械（株）製  ＦＭＳ−１０００）内に据え付けた振盪機（東京理化器械（株）製  ＭＭＳ−３１０）の上に載せて固定した。恒温チャンバーの前面をアルミホイルで遮光して、２５０回転／分で旋回振盪しながら、４２℃で１６時間インキュベートした。インキュベート後、ハイブリダイゼーションチャンバーから分析チップを取り出し、容器１を脱離して分析チップを解体し、ＰＤＭＳポリマー（接着剤）を剥がした後、微粒子５、隔壁４を取り除いて担体２のみとし、この担体２を洗浄、乾燥した。【０１４０】
（測定・評価）
ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製  ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ）に上記処理後の担体をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を４５０、データスキャン時の解像度（ピクセルサイズ）を１０μｍにした状態で蛍光強度の測定を行った。得られたスキャン画像から、以下に説明する蛍光強度（評価Ａ）、スポット内欠点の有無（評価Ｂ）、スポット間のばらつき（評価Ｃ）３項目について評価した。結果を表１に示した。また、本実施例１で用いた分析チップの概略を示す部分断面図を図２１（ａ）に示した。【０１４１】
＜評価Ａ：蛍光強度＞
担体上のプローブＤＮＡを固定化した２５６箇所のスポット（凸部表面）の蛍光強度を測定して、検体ＤＮＡとプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応を評価した。蛍光強度は全スポットの蛍光強度の平均値として求めた。ここで、各々のスポットの蛍光強度は、一つのスポット内の全ピクセル（ピクセルサイズは１０μｍ）の蛍光強度の中央値とした。本スキャナーにおける検出限界値（上限）は５００００である。蛍光強度が３５０００〜５００００の場合を蛍光強度が大きく十分である「＋」、３５０００〜１５０００の場合を蛍光強度が低い「−」、１５０００以下を蛍光強度が不十分な「−−」とそれぞれ評価した。【０１４２】
＜評価Ｂ：スポット内欠点の有無＞
得られたスキャン画像において、２５６個の各々のスポットについて、スポット内の欠点の有無及びその程度を目視で検査し、ハイブリダイゼーション溶液攪拌時に移動する微粒子によるプローブＤＮＡ固定化面への影響について評価を行った。設定したスキャン解像度において、２５６個全てのスポットにおいて欠点が検出されなかった場合を「＋」（欠点無し）と評価し、２５６個のスポットのうち一つでもスポット内に欠点が見られた場合で、個々のスポット内の欠点が占有する面積が各々のスポット面積の半分未満の場合を「−」と評価し、スポット内の半分以上を占有する場合を「−−」と評価した。一つのスポット内における欠点の占有面積が半分未満の場合はスポットの蛍光強度値に影響を及ぼさないが、半分以上の場合はスポットの蛍光強度値に影響が現れる。 【０１４３】
＜評価Ｃ：スポット間ばらつき＞
２５６箇所の各スポット間の蛍光強度のばらつきを検査することにより、ハイブリダイゼーション溶液の撹拌効果を評価した。評価Ｂで欠点の検出されなかったスポットにおいてスポット間での蛍光強度を比較し、蛍光強度の平均値に対する個々のスポットの蛍光強度差が１割未満である場合を「＋」（スポット間ばらつき無し）と評価し、蛍光強度差が１割以上となるスポットが１個以上存在した場合を、「−」（スポット間ばらつき有り）と評価した。【０１４４】
以上の評価Ａ〜Ｃの結果、評価Ａでは、得られた蛍光強度は「＋」であり、また評価Ｃでは、スポット間のばらつきは見られなかった（「＋」）ことから、十分な撹拌により十分なハイブリダイゼーション反応が行われたことが分かった。また、評価Ｂでは、２５６箇所全てのスポットにおいて、欠点は見られず（「＋」）、プローブＤＮＡの固定化面への微粒子による影響はなかったことが分かった。【０１４５】
比較例１
隔壁４を設置しなかったこと以外は、実施例１と同様の分析チップを用いて同様に実験を行い測定・評価を行った。結果を表１に示した。また、本比較例１で用いた分析チップの概略を示す部分断面図を図２１（ｂ）に示した。【０１４６】
評価Ａでは、蛍光強度は「−」であり、実施例１と比較して５０％程度であった。評価Ｂでは、欠点が一つのスポット内の半分以上を占めるスポットが多数存在した（「−−」）。これは、隔壁を設けなかったため、微粒子が担体のプローブＤＮＡ固定化面に接触し、プローブＤＮＡを損傷させてしまったからであると考えられる。評価Ｃで、欠点の検出されなかったスポットにおいて、スポット間ばらつきは見られなかった（「＋」）。【０１４７】
比較例２
隔壁４を設置しなかったこと、微粒子の平均粒径を５００μｍから１９７μｍに変更したこと、及び溶液を保持する容器１の凹部の深さ（図１６のＨ２）を１．８ｍｍから０．１３ｍｍに変更したこと以外は、実施例１と同様の分析チップを用いて同様の実験を行い測定・評価を行った。結果を表１に示した。また、本比較例２で用いた分析チップの概略を示す部分断面図を図２１（ｃ）に示した。【０１４８】
評価Ａでは、蛍光強度は「−」であり、実施例１と比較して７０％程度であった。これは、微粒子のサイズが実施例１より小さいために、撹拌力が不十分であったと考えられる。評価Ｃで、スポット間ばらつきは見られなかった（「＋」）。評価Ｂで、スポット内欠点は検出されなかった（「＋」）。【０１４９】
実施例２
凹凸部が設けられていない平坦なＰＭＭＡ担体の場合の実験を行った。すなわち、図１６の担体２において、選択結合性物質をその表面に固定化する凸部７を有さない平坦な担体の用いたこと以外は、実施例１と同様の分析チップを用いて同様に実験を行い測定・評価を行った。プローブの固定化位置は、実施例１の凹凸部があった場合と同じ担体の中央とし、隔壁及び容器の配置位置は、実施例１と同様に中央にした。結果を表１に示した。また、本実施例２で用いた分析チップの概略を示す部分断面図を図２１（ｄ）に示した。【０１５０】
評価Ａでは、蛍光強度は「＋」であり、実施例１と同等であった。評価Ｃで、スポット間ばらつきは見られず（「＋」）、十分な撹拌による十分なハイブリダイゼーション反応が行われたことが分かった。また評価Ｂで、２５６箇所全てのスポットにおいて欠点は検出されず（「＋」）、プローブＤＮＡの固定化面への微粒子による影響はなかったことが分かった。【０１５１】
実施例３
実施例２と同様の平坦な担体を用い、担体におけるプローブＤＮＡが固定化された面を下方に向け、かつ担体下部から溶液を保持する容器１（貫通孔は有さない）を覆設した分析チップを用い、該容器表面上で微粒子を移動させたこと、微粒子の平均粒径を５００μｍから１９７μｍに変更したこと、及び溶液を保持する容器１の凹部の深さ（図１６のＨ２）を１．８ｍｍから０．２３ｍｍに変更したこと以外は、実施例１と同様の分析チップを用いて同様の実験を行い測定・評価を行った。結果を表１に示した。また、本実施例３で用いた分析チップの概略を示す部分断面図を図２１（ｅ）に示した。【０１５２】
評価Ａでは、蛍光強度は「＋」であり、実施例１と同等であった。実施例１より微粒子サイズは小さいが、担体表面に凹凸構造がないため微粒子が自由に移動することができたため、撹拌効率が向上したと考えられる。評価Ｃでは、スポット間ばらつきは見られず（「＋」）、評価Ｂでスポット内の欠点も検出されなかった（「＋」）。【０１５３】
比較例３
隔壁を設置せず、実施例２と同様の平坦な担体を用いたこと以外は、実施例１と同様の分析チップを用いて同様の実験を行い測定・評価を行った。結果を表１に示した。また、本比較例３で用いた分析チップの概略を示す部分断面図を図２１（ｆ）に示した。【０１５４】
評価Ａでは、蛍光強度は「−」であり、実施例２と比較して５０％程度であった。評価Ｂでは、一つのスポット内で欠点の占有面積が半分以上であるスポットが多数検出された（「−−」）。これは、隔壁を設けなかったため、微粒子が担体上のプローブＤＮＡ固定化面に接触し、プローブＤＮＡを損傷させてしまったためと考えられる。評価Ｃでは、欠点の検出されなかったスポットにおいては、スポット間ばらつきは見られなかった（「＋」）。【０１５５】
比較例４
隔壁を設置せず、実施例２と同様の平坦な担体を用い、微粒子の平均粒径を５００μｍから１９７μｍに変更したこと、及び溶液を保持する容器１の凹部の深さ（図１６のＨ２）を１．８ｍｍから０．１３ｍｍに変更したこと以外は、実施例１と同様の分析チップを用いて同様の実験を行い測定・評価を行った。結果を表２に示した。また、本比較例４で用いた分析チップの概略を示す部分断面図を図２２（ａ）に示した。【０１５６】
評価Ａでは、蛍光強度は「−−」であった。評価Ｂでは、一つのスポット内で欠点の占有面積が半分以上であるスポットが多数検出された（「−−」）。これは、隔壁を設けなかったため、微粒子が担体上のプローブＤＮＡ固定化面に接触し、プローブＤＮＡを損傷させてしまったためと考えられる。評価Ｃでは、欠点の検出されなかったスポットにおいては、スポット間ばらつきは見られなかった（「＋」）。【０１５７】
比較例５
隔壁を設置せず、実施例２と同様の平坦な担体を用い、担体におけるプローブＤＮＡが固定化された面を下方に向け、かつ担体下部から溶液を保持する容器１（貫通孔は有さない）を覆設し、容器表面上で微粒子を移動させたこと、微粒子の平均粒径を５００μｍから１９７μｍに変更したこと、及び溶液を保持する容器１の凹部の深さ（図１６のＨ２）を１．８ｍｍから０．１３ｍｍに変更したこと以外は、実施例１と同様の分析チップを用いて同様の実験を行い測定・評価を行った。結果を表２に示した。また、本比較例５で用いた分析チップの概略を示す部分断面図を図２２（ｂ）に示した。【０１５８】
評価Ａでは、蛍光強度は「−」であった。評価Ｂでは、一つのスポット内における欠点の占有面積が半分未満であるスポットが数個見られた（「−」）。これは、微粒子がプローブＤＮＡ固定化面に接触し、プローブＤＮＡを損傷させてしまったためと考えられる。評価Ｃでは、欠点の検出されなかったスポットにおいては、スポット間ばらつきは見られなかった（「＋」）。【０１５９】
比較例６
隔壁を設置せず、実施例２と同様の平坦な担体を用い、担体におけるプローブＤＮＡが固定化された面を下方に向け、かつ担体下部から溶液を保持する容器１（貫通孔は有さない）を覆設し、容器表面上で微粒子を移動させたこと、微粒子の平均粒径を５００μｍから１９７μｍに変更したこと、及び溶液を保持する容器１の凹部の深さ（図１６のＨ２）を１．８ｍｍから０．４３ｍｍに変更したこと以外は、実施例１と同様の分析チップを用いて同様の実験を行い測定・評価を行った。結果を表２に示した。また、本比較例６で用いた分析チップの概略を示す部分断面図を図２２（ｃ）に示した。【０１６０】
評価Ａでは、蛍光強度は「−−」であった。評価Ｂではスポット内に欠点は検出されなかったが（「＋」）、評価Ｃではスポット間ばらつきが見られた（「−−」）。これは、プローブＤＮＡ固定化面に微粒子が接触しない程度に充分なクリアランスを設けたため、微粒子がプローブ固定化面に接触することなくプローブＤＮＡは損傷しなかったが、反応空間に対する微粒子サイズが相対的に小さかったため、溶液の攪拌が不十分になったためと考えられる。【０１６１】
比較例７
隔壁を設置せず、実施例２と同様の平坦な担体を用い、担体におけるプローブＤＮＡが固定化された面を下方に向け、かつ担体下部から溶液を保持する容器１（貫通孔は有さない）を覆設し、容器表面上で微粒子を移動させたこと以外は、実施例１と同様の分析チップを用いて同様の実験を行い測定・評価を行った。結果を表２に示した。また、本比較例７で用いた分析チップの概略を示す部分断面図を図２２（ｄ）に示した。【０１６２】
評価Ａでは、蛍光強度は「＋」であった。評価Ｂでは、欠点の占有面積が半分未満であるスポットが数個検出された（「−」）。これは、微粒子がプローブＤＮＡ固定化面に接触し、プローブＤＮＡを損傷させてしまったためと考えられる。評価Ｃでは、スポット間ばらつきは見られなかった（「＋」）。【０１６３】
比較例８
隔壁を設置せず、実施例２と同様の平坦な担体を用い、担体におけるプローブＤＮＡが固定化された面を下方に向け、かつ担体下部から溶液を保持する容器１（貫通孔は有さない）を覆設し、容器表面上で微粒子を移動させたこと、及び溶液を保持する容器１の凹部の深さ（図１６のＨ２）を１．８ｍｍから３．６ｍｍに変更したこと以外は、実施例１と同様の分析チップを用いて同様の実験を行い測定・評価を行った。結果を表２に示した。また、本比較例８で用いた分析チップの概略を示す部分断面図を図２２（ｅ）に示した。【０１６４】
評価Ａでは、蛍光強度は「−−」であった。評価Ｂでは、スポット内欠点は検出されなかったが（「＋」）、評価Ｃではスポット間ばらつきが見られた（「−」）。これは、プローブＤＮＡ固定化面に微粒子が接触しない程度に充分なクリアランスを設けたため、微粒子がプローブ固定化面に接触することなくプローブＤＮＡは損傷しなかったが、反応空間に対する微粒子サイズが相対的に小さかったため、溶液の攪拌が不十分になったためと考えられる。【０１６５】
【表１】
2010106989.tif 000009
【０１６６】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【０１６７】
本発明は、微粒子を用いて被検物質の溶液を攪拌して被検物質と担体に固定化された選択結合性物質とを反応させる分析チップにおいて、その反応効率を向上させ、高感度な分析を可能とするものであり、医薬・医療分野、食品分野、環境分野等において有用である。
【符号の説明】
【０１６８】
１  容器
２  担体
３  貫通孔
３Ａ  液面駐止用チャンバー
４  隔壁
５  微粒子
６  空隙（空間）
６Ａ  ウェル構造
７  選択結合性物質をその表面に固定化する凸部
８  選択結合性物質
９  容器表面の凸部
１０  封止部材
１１  隔壁外枠
１２  隔壁部材
１３  担体表面の凸部
１４  平坦部
１５  担体
１６  治具
１７  マイクロアレイを治具に突き当てるためのバネ
１８  対物レンズ  
１９  レーザー励起光
２０  ＤＮＡ
Ｒ１  選択結合性物質が固定化された固定化領域
Ｌ１  凸部ピッチ
Ｈ１  凸部高さ
Ｈ２  容器の凹部深さ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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