(57)【要約】  本発明は、ホルミル基を有する多孔質粒子にスペーサーを導入した後、前記スペーサー部分を過ヨウ素酸および／または過ヨウ素酸塩にて酸化してホルミル基に変換するホルミル基含有多孔質担体の製造方法において、スペーサー導入後の多孔質粒子のホルミル基含量が多孔質粒子１ｍＬあたり３μｍｏｌ以下であることを特徴とする、ホルミル基含有多孔質担体の製造方法に関する。また、当該ホルミル基含有多孔質担体にアミノ基含有リガンドを固定化する吸着体の製造方法に関する。本発明によれば、吸着量が大きく、高強度で、リガンドの溶出が少ないホルミル基含有多孔質担体、およびそれを用いた吸着体が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルミル基を有する多孔質粒子にスペーサーを導入した後、前記スペーサー部分を過ヨウ素酸および／または過ヨウ素酸塩にて酸化してホルミル基に変換するホルミル基含有多孔質担体の製造方法において、スペーサー導入後の多孔質粒子のホルミル基含量が多孔質粒子１ｍＬあたり３μｍｏｌ以下であることを特徴とする、ホルミル基含有多孔質担体の製造方法。
【請求項２】
導入されるスペーサーが糖または糖類似物である、請求項１に記載のホルミル基含有多孔質担体の製造方法。
【請求項３】
導入されるスペーサーが、エカトリアル位に水酸基を有する炭素原子が連続して存在している部分を有し、エカトリアル位に水酸基を有する炭素原子の連続している数が２または３であることを特徴とする、請求項１または２のいずれか一項に記載のホルミル基含有多孔質担体の製造方法。
【請求項４】
導入されるスペーサーが、アミノ基を含有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のホルミル基含有多孔質担体の製造方法。
【請求項５】
ホルミル基を有する多孔質粒子に、スペーサーとして１，２−グリコール構造を有する１級、あるいは２級アミンを、ｐＨ７〜１１の範囲で縮合させ、及び／又は、形成した結合を還元反応によって安定化することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のホルミル基含有多孔質担体の製造方法。
【請求項６】
ｐＨの範囲が８〜１０である、請求項５に記載の多孔質担体の製造方法。
【請求項７】
導入されるスペーサーが、グルコサミンであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のホルミル基含有多孔質担体の製造方法。
【請求項８】
前記グルコサミンが塩酸塩の状態で用いられることを特徴とする、請求項７に記載の多孔質担体の製造方法。
【請求項９】
スペーサーの導入量が担体１ｍＬ当り、１μｍｏｌ以上であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載のホルミル基含有多孔質担体の製造方法。
【請求項１０】
ホルミル基を有する多孔質粒子にスペーサーを導入した後、反応に使われなかった多孔孔質粒子のホルミル基を処理することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載のホルミル基含有多孔質担体の製造方法。
【請求項１１】
前記ホルミル基含有多孔質担体が、過ヨウ素酸塩を作用させて得られたものであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のホルミル基含有多孔質担体の製造方法。
【請求項１２】
ホルミル基の導入量が担体１ｍＬ当り、０．５μｍｏｌ以上１００μｍｏｌ以下であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のホルミル基含有多孔質担体の製造方法。
【請求項１３】
多孔質担体またはスペーサーが導入された多孔質担体に、酸を加えてｐＨを１〜６の範囲に調整された液中で、過ヨウ素酸、またはその塩を作用させることを特徴とする、ホルミル基含有多孔質担体の製造方法。
【請求項１４】
酸が有機酸である、請求項１３に記載のホルミル基含有多孔質担体の製造方法。
【請求項１５】
過ヨウ素酸、またはその塩を作用させるｐＨの範囲が２〜５であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のホルミル基含有多孔質担体の製造方法。
【請求項１６】
過ヨウ素酸、またはその塩の濃度が、５ｍＭ以上３００ｍＭ以下であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のホルミル基含有多孔質担体の製造方法。
【請求項１７】
多孔質担体またはスペーサーが導入された多孔質担体に、過ヨウ素酸および／または過ヨウ素酸塩を０℃以上１０℃以下の温度で作用させることを特徴とする、ホルミル基含有多孔質担体の製造方法。
【請求項１８】
過ヨウ素酸および／または過ヨウ素酸塩を０℃以上８℃以下の温度で作用させて得られることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のホルミル基含有多孔質担体の製造方法。
【請求項１９】
多孔質粒子が多糖を含有することを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のホルミル基含有多孔質担体の製造方法。
【請求項２０】
多糖がセルロースおよび／またはセルロース誘導体であることを特徴とする、請求項１９に記載のホルミル基含有多孔質担体の製造方法。
【請求項２１】
多孔質粒子が架橋されたことを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のホルミル基含有多孔質担体の製造方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載のホルミル基含有多孔質担体の製造方法によって得られたホルミル基含有多孔質担体。
【請求項２３】
請求項２２に記載のホルミル基含有多孔質担体にアミノ基含有リガンドを固定化することを特徴とする吸着体の製造方法。
【請求項２４】
カルボン酸塩、金属ハロゲン化物、及び硫酸塩からなる群より、カルボン酸塩を必須成分として選ばれた１種以上の化合物で構成された水溶液を含有する反応液中で、ホルミル基含有多孔質担体にアミノ基含有リガンドを固定化することを特徴とする請求項２３に記載の吸着体の製造方法。
【請求項２５】
クエン酸塩及び／または硫酸塩を含有する反応液中で、ホルミル基含有多孔質担体にアミノ基含有リガンドを固定化することを特徴とする、請求項２３または２４に記載の、吸着体の製造方法。
【請求項２６】
前記反応液中におけるクエン酸及び／または硫酸塩の濃度が０．０１Ｍ〜２Ｍであることを特徴とする、請求項２５に記載の吸着体の製造方法。
【請求項２７】
前記反応液のｐＨが７〜１３であることを特徴とする、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の、吸着体の製造方法。
【請求項２８】
前記反応液のｐＨが１１．５以上、１３．０未満であることを特徴とする、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の、吸着体の製造方法。
【請求項２９】
前記反応液のｐＨが１１．５以上、１２．６未満であることを特徴とする、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の吸着体の製造方法。
【請求項３０】
ホルミル基含有多孔質担体へのアミノ基含有リガンドの固定化をイミノ化、及びその還元反応の２段階反応で行い、イミノ化反応後に安定化操作を実施することを特徴とする吸着体の製造方法。
【請求項３１】
イミノ化反応後の安定化操作が、１時間以上である、請求項３０に記載の吸着体の製造方法。
【請求項３２】
イミノ化反応後の安定化操作を、ｐＨ２〜１０で実施することを特徴とする、請求項３０または３１に記載の吸着体の製造方法。
【請求項３３】
イミノ化反応後の安定化操作を緩衝液中で実施することを特徴とする、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の吸着体の製造方法。
【請求項３４】
緩衝液が、二価以上のアニオンを擁しうる塩を少なくとも１種類以上含有することを特徴とする、請求項３３に記載の吸着体の製造方法。
【請求項３５】
緩衝液が、ポリカルボン酸塩、及び／又は中性塩を含有する、請求項３３または３４に記載の吸着体の製造方法。
【請求項３６】
緩衝液が、クエン酸塩を含有する、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の吸着体の製造方法。
【請求項３７】
緩衝液が、金属ハロゲン化物と硫酸塩のうち、少なくとも一種以上を含有することを特徴とする、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の吸着体の製造方法。
【請求項３８】
ホルミル基含有多孔質担体に、アミノ基含有リガンドを固定化する際、有機ボラン錯体により、リガンドの固定化結合を安定化させると同時に、余剰ホルミル基を不活化させることを特徴とする、請求項２３〜３７のいずれか一項に記載の吸着体の製造方法。
【請求項３９】
緩衝液を含有する溶媒中で実施することを特徴とする、請求項３８に記載の吸着体の製造方法。
【請求項４０】
前記有機ボラン錯体により、リガンドの固定化結合を安定化させると同時に、余剰ホルミル基を不活化させる操作が、１時間以上４８時間以内であることを特徴とする、請求項３８または３９に記載の吸着体の製造方法。
【請求項４１】
有機ボラン錯体がアミンボラン錯体である、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の吸着体の製造方法。
【請求項４２】
操作温度が−１０〜４０℃である、請求項２３〜４１のいずれか一項に記載の吸着体の製造方法。
【請求項４３】
請求項２３〜４２のいずれか一項に記載の製造方法によって得られた吸着体。
【請求項４４】
アミノ基含有リガンドの導入量が多孔質担体１ｍＬ当たり、１ｍｇ以上５００ｍｇ以下であることを特徴とする、請求項４３に記載の吸着体。
【請求項４５】
アミノ基含有リガンドの導入量が多孔質担体１ｍＬ当たり、０．０１μｍｏｌ以上１５μｍｏｌ以下であることを特徴とする、請求項４３または４４に記載の吸着体。
【請求項４６】
前記アミノ基含有リガンドがプロテインＡである、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の吸着体。
【請求項４７】
吸着体から目的物中に溶出したリガンドの濃度の、精製１回目〜３回目の平均値が５０ｐｐｍ以下であることを特徴とする、請求項４３〜４６に記載の吸着体。
【請求項４８】
精製目的物の吸着量が吸着体１ｍＬあたり１ｍｇ以上１００ｍｇ以下であることを特徴とする、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の吸着体。
【請求項４９】
５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０３ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上５ＭＰａ以下であることを特徴とする、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載の吸着体。
【請求項５０】
５％圧縮時の圧縮応力が０．０２ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０９ＭＰａ以上５ＭＰａ以下であることを特徴とする、請求項４３〜４９のいずれか一項に記載の吸着体。
【請求項５１】
樹脂含量が２％以上５０％以下であることを特徴とする、請求項４３〜５０のいずれか一項に記載の吸着体。
【請求項５２】
体積平均粒径が２０μｍ以上１０００μｍ以下であることを特徴とする、請求項４３〜５１のいずれか一項に記載の吸着体。
【請求項５３】
請求項４３〜５１のいずれか一項に記載の吸着体を用いた精製方法。
【請求項５４】
直径０．５ｃｍ以上及び高さ３ｃｍ以上のカラムを用いることを特徴とする、請求項５３に記載の精製方法。
【請求項５５】
線速１００ｃｍ／ｈ以上１０００ｃｍ／ｈ以下で通液する工程を有することを特徴とする、請求項５３または５４に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は各種吸着体、特に治療用（医療用）吸着体や抗体医薬品精製用吸着体に関する。
【背景技術】
【０００２】
多孔質担体は各種吸着体として、例えば各種クロマトグラフィー用吸着体やアフィニティー吸着体として広く用いられている。なかでも、アフィニティー吸着体は、効率よく目的物を精製、または不要物の濃度を低減できることから、医療用吸着体や抗体医薬品精製用吸着体として利用されてきている。特に、リウマチ、血友病、拡張型心筋症の治療用（医療用）吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体が注目されている（例えば非特許文献１、非特許文献２）。【０００３】
一方、免疫グロブリン（ＩｇＧ）を特異的に吸着、溶出できる吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体（抗体医薬品精製用吸着体）が注目されている。プロテインＡをはじめとする、種々のアフィニティーリガンドを多孔質担体に固定化する方法としては、例えば非特許文献３の表８・１や図８・１５に示される臭化シアン法、トリクロロトリアジン法、エポキシ法、トレシルクロリド法等の、様々な固定化法の中から選択することができる。中でも、安全性の観点や、固定化反応の容易さ、比較的容易な方法で産生されたタンパク質やペプチドが使用できる等の理由から、多孔質担体のホルミル基と、アフィニティーリガンドのアミノ基との反応を固定化に用いることが、産業上好ましい。【０００４】
ホルミル基を多孔質担体に導入する方法としては、ビシナルの水酸基を持つ多糖ゲルを過ヨウ素酸酸化法によって酸化し、糖鎖上にホルミル基を生成させる方法（以下糖鎖開裂型と略す）が挙げられる（例えば非特許文献４）。この方法を介して得られた吸着体は、リガンドの溶出が少ないという利点がある。【０００５】
また、非特許文献３の図８・１５、または非特許文献５に示されるような、グルタルアルデヒドを作用させる方法、エポキシ基の開環により得られるグリセリル基に過ヨウ素酸塩を作用させる方法等により得られる、各種スペーサーを介してホルミル基を導入する方法（以下、スペーサー型と略す）が挙げられる。このスペーサー型ホルミル基含有多孔質担体を用いた吸着体は、比較的、目的物の吸着量が大きい傾向にある。また、特許文献１には、多孔質粒子のエポキシ基にアミノ糖を導入し、このアミノ糖の部分を酸化開裂することにより生じたホルミル基に、アミノ基含有リガンドを固定化する製造方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭６２−１５３００
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Annals of the New York Academy of Sciences, 2005, Vol.1051, P635-646
【非特許文献２】American Heart Journal, Vol.152(4), 2006
【非特許文献３】アフィニティークロマトグラフィー、笠井献一ら著、東京化学同人、１９９１年
【非特許文献４】Immunology, Vol.20, p1061, 1971
【非特許文献５】Immobilized Affinity Ligand Techniques, Greg T. Hermanson et al., Academic Press, 1992
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、糖鎖開裂型ホルミル基含有多孔質担体では、強い酸化反応により糖鎖が開裂し、多孔質担体の強度が弱くなり、高線速下での使用が困難な場合がある。しかも抗体医薬品精製用吸着体の場合、目的物である抗体の吸着量が比較的小さい傾向があり、抗体精製を高速で行うことが容易ではない。一方、スペーサー型ホルミル基含有多孔質担体は、ホルミル基導入量が少ないと、治療中や、目的物の精製中に、アフィニティーリガンドが溶出して、患者の血液や精製品に混入してしまう場合があり、安全性や純度の観点から好ましくない。【０００９】
また、一般的なアフィニティークロマト分野の文献（例えば非特許文献３や非特許文献５）や活性化担体の製品カタログには明記されていないが、特許文献１に記載の方法では、多孔質粒子をエポキシ化する際、どうしてもエポキシ基が自然に開環してグリセリル基が副生してしまう。よって、アミノ糖を酸化開裂してホルミル基を導入する際、このエポキシ基が開環したグリセリル基も同時に酸化され、前記スペーサー型と同様のホルミル基が導入されてしまい、アフィニティーリガンドが溶出しやすくなる場合があることを本発明者らは確認している。【００１０】
本発明は従来の技術が有する上記課題に鑑みてなされたものであり、治療や精製の安全性を高め、高速化を実現でき、さらには精製品の純度を高くしうる、ホルミル基含有多孔質担体、およびそれを用いた吸着体、およびそれらの製造方法、およびそれらを用いた精製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究の結果、本発明を完成させるに至った。
即ち本発明は、ホルミル基を有する多孔質粒子にスペーサーを導入した後、前記スペーサー部分を過ヨウ素酸および／または過ヨウ素酸塩にて酸化してホルミル基に変換するホルミル基含有多孔質担体の製造方法において、スペーサー導入後の多孔質粒子のホルミル基含量が多孔質粒子１ｍＬあたり３μｍｏｌ以下であることを特徴とする、ホルミル基含有多孔質担体の製造方法に関する。【００１２】
また本発明は、多孔質担体またはスペーサーが導入された多孔質担体に、酸を加えてｐＨを１〜６の範囲に調整された液中で、過ヨウ素酸、またはその塩を作用させることを特徴とするホルミル基含有多孔質担体の製造方法に関する。【００１３】
また本発明は、多孔質担体またはスペーサーが導入された多孔質担体に、過ヨウ素酸および／または過ヨウ素酸塩を０℃以上１０℃以下の温度で作用させることを特徴とするホルミル基含有多孔質担体の製造方法に関する。【００１４】
また本発明は、前記のいずれかのホルミル基含有多孔質担体の製造方法によって得られたホルミル基含有多孔質担体に関する。【００１５】
また本発明は、上記ホルミル基含有多孔質担体にアミノ基含有リガンドを固定化することを特徴とする吸着体の製造方法に関する。【００１６】
また本発明は、カルボン酸塩、金属ハロゲン化物、及び硫酸塩からなる群より、カルボン酸塩を必須成分として選ばれた１種以上の化合物で構成された水溶液中で、ホルミル基含有多孔質担体にアミノ基含有リガンドを固定化することを特徴とする吸着体の製造方法に関する。【００１７】
また本発明は、クエン酸塩及び／または硫酸塩を含有する反応液中で、ホルミル基含有多孔質担体にアミノ基含有リガンドを固定化することを特徴とする吸着体の製造方法に関する。【００１８】
また本発明は、ホルミル基含有多孔質担体へのアミノ基含有リガンドの固定化をイミノ化、及びその還元反応の２段階反応で行い、イミノ化反応後に安定化操作を実施することを特徴とする吸着体の製造方法に関する。【００１９】
また本発明は、ホルミル基含有多孔質担体に、アミノ基含有リガンドを固定化する際、有機ボラン錯体により、リガンドの固定化結合を安定化させると同時に、余剰ホルミル基を不活化させることを特徴とする吸着体の製造方法に関する。【００２０】
また本発明は、前記アミノ基含有リガンドの導入量が多孔質担体１ｍＬ当たり、１ｍｇ以上５００ｍｇ以下であることを特徴とする、吸着体に関する。【００２１】
また本発明は、前記アミノ基含有リガンドの導入量が多孔質担体１ｍＬ当たり、０．０１μｍｏｌ以上１５μｍｏｌ以下であることを特徴とする、吸着体に関する。【００２２】
また本発明は、前記アミノ基含有リガンドがプロテインＡである、吸着体の製造方法に関する。【００２３】
また本発明は、吸着体から目的物中に溶出したリガンドの濃度の、精製１回目〜３回目の平均値が５０ｐｐｍ以下であることを特徴とする、吸着体に関する。【００２４】
また本発明は、５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０３ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上５ＭＰａ以下であることを特徴とする、吸着体に関する。【００２５】
また本発明は、吸着体の製造方法、前記製造方法によって得られた吸着体、および前記吸着体を用いた精製方法に関する。【００２６】
また本発明は、直径０．５ｃｍ以上及び高さ３ｃｍ以上のカラムを用いることを特徴とする、精製方法に関する。【００２７】
また本発明は、線速１００ｃｍ／ｈ以上１０００ｃｍ／ｈ以下で通液する工程を有することを特徴とする、精製方法に関する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、高強度のホルミル基含有多孔質担体が提供される。本発明のホルミル基含有多孔質担体は、吸着体に好適に用いることができ、目的物の吸着量が大きく、リガンドの漏れが少ない吸着体が得られる。また、本発明の吸着体によれば、治療や精製の安全性を高めることができ、治療や精製の高速化、高純度化をも提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、ホルミル基を有する多孔質粒子にスペーサーを導入した後、前記スペーサー部分を過ヨウ素酸および／または過ヨウ素酸塩にて酸化してホルミル基に変換するホルミル基含有多孔質担体の製造方法において、スペーサー導入後の多孔質粒子のホルミル基含量が多孔質粒子１ｍＬあたり３μｍｏｌ以下であることを特徴とする。これにより、アフィニティーリガンド導入後の吸着体において、リガンドの溶出量が少なく、且つロット間のばらつきを抑制することができ、また目的物の吸着量が大きな吸着体を得ることが出来る。
【００３０】
リガンドのリークを抑制するために、リガンド固定化後の還元反応の検討が一般に考えがちであるが、その検討だけでなく、本発明者らは、リガンドを導入するためのホルミル基含有多孔質担体の前駆体の段階、すなわちホルミル基を有する多孔質粒子にスペーサーを導入した後、反応に使われなかった多孔孔質粒子のホルミル基の処理に着眼点をおいた。すなわち、処理できずに残った多孔孔質粒子のホルミル基が溶出の原因となっているのではないかと考えた。
【００３１】
ホルミル基を有する多孔質粒子にスペーサーを導入した後、スペーサー導入反応に使われなかった多孔孔質粒子のホルミル基を処理する方法を検討した結果、スペーサー導入後の担体において、ホルミル基が存在しない又はホルミル基含量が担体１ｍＬあたり３μｍｏｌ以下の含有量である多孔質担体が得られた。このようなスペーサー導入後の多孔質担体を用いてホルミル基含有多孔質担体を製造した結果、驚くべきことに、アフィニティーリガンド導入後の吸着体において、リガンドの溶出量が少なく、且つロット間のばらつきを抑制することができた。これにより、精製の後工程の煩雑さが軽減され、また抗体医薬精製に用いた場合においては、抗体医薬品の安全性を高めることができる。
【００３２】
スペーサー導入後の担体における、好ましいホルミル基含有量は、担体１ｍＬあたり０μｍｏｌ以上３μｍｏｌ以下、より好ましくは０μｍｏｌ以上２μｍｏｌ以下、さらに好ましくは０μｍｏｌ以上１μｍｏｌ以下、特に好ましくは０μｍｏｌ以上０．５μｍｏｌ以下、最も好ましくは０μｍｏｌ以上０．３μｍｏｌ以下である。
【００３３】
本発明の多孔質担体、及び吸着体にスペーサーとして導入される化合物は、特に限定なく用いることができるが、リガンドの溶出量がより少なくなることから、環構造を有していることが好ましい。環構造を有する化合物としては特に限定は無いが、例えば、シクロペンタンやシクロヘキサン等に代表される炭素のみで構成される５員環乃至６員環や、フラノースあるいはピラノース等に代表される、糖または糖類似物が挙げられる。なかでも、入手が容易である等の理由から、糖または糖類似物であることが好ましい。また、多孔質担体とアフィニティーリガンドの結合がより強固になる、および／またはアフィニティーリガンドが解離し難くなるという観点から、糖が還元糖であることがより好ましい。
【００３４】
本発明の多孔質担体において、スペーサーとして導入される化合物は、特に限定なく用いることができるが、ホルミル基の導入方法として過ヨウ素酸酸化法等を用いる場合において、エカトリアル位に水酸基を有する炭素原子が連続して存在している部分を有し、エカトリアル位に水酸基を有する炭素原子の連続している数が２または３であることが好ましい。
【００３５】
本発明の多孔質担体において、スペーサーを導入する方法として、ホルミル基含有多孔質粒子と、スペーサーとして導入される化合物が有している官能基間の反応を利用することが好ましい。ホルミル基含有多孔質粒子の官能基、スペーサーとして導入される化合物の官能基については、それぞれ特に限定は無く、互いに反応しあう組み合わせを用いることが好ましく、間に他の化合物を介していることも好ましい。ホルミル基含有多孔質粒子のホルミル基を利用する場合は、スペーサーとして導入される化合物はホルミル基と反応しうる官能基を有していることが好ましい。ホルミル基と反応する官能基としては、ホルミル基と反応するものであれば特に限定は無いが、一般的にはアミノ基が挙げられ、好適である。すなわち、本発明の多孔質担体にスペーサーとして導入される化合物は、アミノ基を含有することが、より好ましく、スペーサーとして導入される化合物が糖である場合は、アミノ糖であることが好ましい。
【００３６】
また、ホルミル基を含有する多孔質粒子に、１，２−グリコール構造を有する１級、あるいは２級アミンを、ｐＨ７〜１１の範囲で縮合させ、及び／又は、形成した結合を還元反応によって安定化すると、驚くべき事に、１，２−グリコール構造を、効率良く担体に導入できることを本発明者らは見出した。前記ｐＨの範囲は８〜１０であることがより好ましく、ｐＨが８．５〜９．５であることが特に好ましい。
【００３７】
本発明の多孔質粒子にスペーサーとして導入できるアミノ基含有糖（アミノ糖）としては、特に限定は無いが、グルコサミン、ガラクトサミン、アンノサミン、ラクトサミン、フコサミン、マンノサミン、メグルミン、アロサミン、アルトロサミン、リボサミン、アラビノサミン、グロサミン、イドサミン、タロサミン、キシロサミン、リキソサミン、ソルボサミン、タガトサミン、サイコサミン、フルクトサミン、イミノシクリトール、ムコ多糖類、糖タンパク類、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン、コンドロイチン４−硫酸、デルマタン硫酸、およびこれらのＤ体、Ｌ体、ラセミ体、これらを構成成分として含む多糖，ポリマー、糖脂質等のから選択される一種以上のもの、あるいはこれらの塩酸塩等の塩、等を挙げることができる。なかでも、本発明の多孔質担体にスペーサーとして導入される糖が、グルコサミン及びその誘導体であることが、より好ましい。
【００３８】
本発明の多孔質担体にスペーサーとして導入できるグルコサミンとしては、特に限定は無いが、Ｄ体であることがより好ましい。また本発明に使用できるグルコサミンの製造方法は、特に限定は無いが、グルコース等を化学修飾することにより得られるもの、甲殻類等の甲羅、キチン、キトサン等の由来物も使用できるが、抗体医薬品精製用として用いる場合は、植物性化合物等から得られうるグルコサミン、例えば、協和発酵社製のいわゆる発酵グルコサミンとして知られているもの等であることが好ましい。また本発明に使用できるグルコサミンは塩酸塩等の塩であることも、溶解性の観点から好ましい。
【００３９】
また、本発明の多孔質担体にスペーサーとして導入される糖または糖類似物の導入量は、多孔質担体１ｍＬあたり、１μｍｏｌ以上５００μｍｏｌ以下であることが好ましい。糖または糖類似物の導入量が多孔質担体１ｍＬあたり、１μｍｏｌ以上であれば、吸着体として使用した場合に、目的物の吸着量が大きくなるため好ましく、５００μｍｏｌ以下であれば、本発明の多孔質担体の製造コストを抑制できるため好ましい。糖または糖類似物のより好ましい導入量は多孔質担体１ｍＬあたり、２μｍｏｌ以上２５０μｍｏｌ以下、さらに好ましくは４μｍｏｌ以上１２５μｍｏｌ以下、特に好ましくは６μｍｏｌ以上５０μｍｏｌ以下、最も好ましくは８μｍｏｌ以上２５μｍｏｌ以下である。糖または糖類似物の導入量は、導入反応終了後の反応溶液中の糖または糖類似物の減少量を測定する方法、反応後の多孔質担体への滴定法（非水滴定等）や、元素分析法等によって、求めることができる。
【００４０】
また、ホルミル基含有多孔質粒子に、スペーサーとして導入される化合物を導入する際、スペーサーとして導入される化合物の使用量に特に限定は無いが、より適切な導入量を得るため、多孔質担体の当該官能基含量の０．０１倍モル以上であることが好ましく、および／または廃液処理や効率の観点から、１００倍モル以下であることが好ましく、より好ましくは０．１倍モル以上５０倍モル以下、さらに好ましくは０．５倍モル以上２０倍モル以下、特に好ましくは１倍モル以上１０倍モル以下である。
【００４１】
スペーサーとして導入される化合物を多孔質粒子に導入する際の溶媒については特に限定は無いが、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキソラン等の汎用有機溶媒や、エタノール、メタノール、プロパノール等のアルコールや、これらの２種以上の混合溶媒を用いることができる。
【００４２】
また、反応液のｐＨについては特に限定は無いが、反応効率の観点から、ｐＨ３以上で反応させることが好ましく、官能基の失活や多孔質担体へのダメージが少ないという理由からｐＨ１３以下であることが好ましく、より好ましくはｐＨ４以上１２以下、特に好ましくはｐＨ６以上１１以下、最も好ましくはｐＨ７以上１１以下である。
【００４３】
また、スペーサーとして導入される化合物を導入する際の温度については特に限定は無いが、反応速度的に有利であるという理由から０℃以上であることが好ましく、安全性や担体へのダメージの観点から１００℃以下であることが好ましく、官能基が失活し難いという理由から７０℃以下であることがより好ましく、より好ましくは４℃以上５０℃以下、さらに好ましくは４℃以上３０℃以下、特に好ましくは１０℃以上２５℃以下、最も好ましくは１２℃以上１８℃以下である。
【００４４】
また導入反応は攪拌または振とうしながら行うことが好ましく、その１分間当りの回転数または回数は、特に限定は無いが、均一攪拌が可能で、且つ担体に物理的なダメージが加わらないという理由から、１回以上１０００回以下であることが好ましく、より好ましくは１０回以上５００回以下、さらに好ましくは３０回以上３００回以下、特に好ましくは５０回以上２００回以下、最も好ましくは７５回以上１５０回以下であるが、各原料の比重の差や担体の強度に合わせて調整することが特に好ましい。
【００４５】
スペーサーとして導入される化合物を多孔質担体に導入する反応時間については、特に限定は無いが、反応性や担体へのダメージが少ないという理由から、０．２時間以上１００時間以下、より好ましくは０．５時間以上５０時間以下、さらに好ましくは１時間以上２４時間以下、特に好ましくは２時間以上１５時間以下、最も好ましくは３時間以上１０時間以下であるが、反応性や、ｐＨや、反応温度に合わせて調整することが好ましい。
【００４６】
また、本発明の多孔質担体は、ホルミル基を有する多孔質粒子にスペーサーを導入した後、反応に使われなかった多孔孔質粒子のホルミル基を処理することによって得られる。
【００４７】
ホルミル基を有する多孔質粒子にスペーサーを導入した後、反応に使われなかった多孔孔質粒子のホルミル基を処理する方法としては、特に限定は無いが、還元剤で処理する方法、熱処理する方法、アルカリで処理する方法、ブロッキング剤で処理する方法などが挙げられる。
【００４８】
還元剤で処理する方法としては、特に限定は無いが、テトラヒドロホウ酸ナトリウム等のテトラヒドロホウ酸塩を作用させて処理する方法が好ましい。還元処理する際の溶媒としては、特に限定はないが、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキソラン等の汎用有機溶媒や、エタノール、メタノール、プロパノール等のアルコールや、これらの２種以上の混合溶媒を用いることができる。
【００４９】
還元処理する際のｐＨについては特に限定は無いが、安全性の問題から、ｐＨ７以上であることが好ましい。また、担体およびスペーサーへのダメージを軽減できるため、ｐＨ１２以下が好ましく、より好ましくは、ｐＨ９以上１２以下、さらに好ましくは、ｐＨ１１以上１２以下である。
【００５０】
また、還元処理温度については、特に限定がないが、反応速度的に有利であるという点から０℃以上が好ましく、安全性や担体およびスペーサーへのダメージの観点から１００℃以下であることが好ましい。さらに好ましくは、４℃以上７０℃以下、特に好ましくは１０℃以上５０℃以下、最も好ましくは１０℃以上４０℃以下である。
【００５１】
還元処理する時間については、特に限定は無いが、官能基の失活や担体へのダメージが少ないという理由から、０．０１時間以上５０時間以下、より好ましくは０．１時間以上２５時間以下、さらに好ましくは０．２５時間以上１０時間以下、特に好ましくは０．２５時間以上５時間以下、最も好ましくは０．５時間以上２時間以下であるが、反応性や、ｐＨや、反応温度に合わせて調整することが好ましい。
【００５２】
還元回数は、特に限定はないが、ホルミル基を有する多孔質粒子にスペーサーを導入した後、反応に使われなかった多孔孔質粒子のホルミル基を完全に処理するという観点から、１回以上が好ましい。また、２０回以下であれば担体およびスペーサーへのダメージが軽減できる。より好ましくは２回以上１５回以下、さらに好ましくは２回以上１０回以下、最も好ましくは３回以上７回以下である。
【００５３】
還元剤の濃度については特に限定はないが、ホルミル基を処理する効率の観点から、０．０００１Ｍ以上が好ましく、安全性の問題から２Ｍ以下であることが好ましく、より好ましくは、０．００１Ｍ以上１Ｍ以下、さらに好ましくは０．０１以上０．５Ｍ以下、特に好ましくは、０．０２Ｍ以上０．２５Ｍ以下、最も好ましくは０．０５Ｍ以上０.１Ｍ以下である。
【００５４】
ホルミル基を有する多孔質粒子にスペーサーを導入した後、反応に使われなかった多孔孔質粒子のホルミル基を熱処理する方法としては、特に限定はないが、反応速度的に有利であるという点から５０℃以上が好ましく、担体およびスペーサーへのダメージの観点から１５０℃以下であることが好ましく、より好ましくは５０℃以上１３０℃以下、さらに好ましくは８０℃以上１３０℃以下である。
【００５５】
ホルミル基を有する多孔質粒子にスペーサーを導入した後、反応に使われなかった多孔孔質粒子のホルミル基をアルカリで処理する方法としては、ｐＨについては特に限定は無いが、ｐＨ１０以上であると、効率良く処理できるため好ましい。ｐＨ１３以下であると、担体およびスペーサーへのダメージを軽減できるため好ましい。さらに好ましくは、ｐＨ１０以上ｐＨ１２以下、特に好ましくは、ｐＨ１１以上ｐＨ１２以下である。
【００５６】
ホルミル基を有する多孔質粒子にスペーサーを導入した後、反応に使われなかった多孔孔質粒子のホルミル基を封止剤で処理する方法としては特に限定は無いが、封止剤が多孔質担体上の活性基と反応する官能基を含有する低分子化合物であることが好ましい。低分子化合物であるほど、立体障害が少ないため、効率よく封止反応が進行する。なかでも、アミノ基を含有する低分子化合物を用いることが好ましく、これの一例として、リジン、グリシンやモノエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等を挙げることができる。
【００５７】
本発明の多孔質粒子に、スペーサーを導入した後、このスペーサー上にホルミル基を導入する方法として、過ヨウ素酸酸化法を挙げることができる。
【００５８】
本発明で使用できる過ヨウ素酸および／または過ヨウ素酸塩等に特に限定は無いが、過ヨウ素酸ナトリウムや過ヨウ素酸カリウム等の過ヨウ素酸塩を作用させて、ホルミル基を導入することが好ましい。
【００５９】
また、本発明の多孔質担体のホルミル基含量は、多孔質担体１ｍＬあたり０．５μｍｏｌ以上１００μｍｏｌ以下であることが好ましい。ホルミル基含量が多孔質担体１ｍＬあたり０．５μｍｏｌ以上であれば、アフィニティーリガンドを効率よく固定化でき、吸着体として用いた場合に、目的物の吸着量が大きくなるため好ましい。また、理由は定かではないが、驚くべきことに、ホルミル基含量が多孔質担体１ｍＬあたり１００μｍｏｌ以下であれば、目的物の吸着量が大きくなりやすいため、好ましい。また、過ヨウ素酸および／または過ヨウ素酸塩を作用させてホルミル基を導入する方法を用いる場合、多孔質担体１ｍＬあたりのホルミル基含量が１００μｍｏｌ以下であれば、多孔質担体の強度が大きくなりやすいため好ましい。
【００６０】
ホルミル基含量のより好ましい範囲は多孔質担体１ｍＬあたり１μｍｏｌ以上５０μｍｏｌ以下であり、さらに好ましくは１μｍｏｌ以上２５μｍｏｌ以下であり、特に好ましくは１μｍｏｌ以上１０μｍｏｌ以下であり、最も好ましくは、２μｍｏｌ以上７μｍｏｌ以下である。ホルミル基含量は、特に限定は無いが、例えば、ホルミル基導入反応の、時間、温度、過ヨウ素酸および／または過ヨウ素酸塩等のホルミル化剤の濃度などによって、ホルミル基含量を調整することができる。
【００６１】
ホルミル基含量の測定は、ホルミル基含有多孔質担体に、フェニルヒドラジン溶液を加え、４０℃で１時間撹拌し、反応後の上澄みの吸収スペクトルをＵＶで測定し、フェニルヒドラジンの検量線からフェニルヒドラジン減少量を測定ことによって、ホルミル基含量を求めることが出来る。
【００６２】
本発明者らは鋭意研究の結果、理由は定かではないが、酸を加えてｐＨを１〜６の範囲に調整された液中で、過ヨウ素酸、またはその塩を作用させて得られたホルミル基含有多孔質担体に、アミノ基含有リガンドを固定化し、吸着体とすると、驚くべき事に、目的物の吸着量が大きくなり、またアミノ基含有リガンドのリーク量が小さくなることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００６３】
即ち本発明は、酸を加えてｐＨを１〜６の範囲に調整された液中で、過ヨウ素酸、またはその塩を作用させて得られたホルミル基含有多孔質担体に、アミノ基含有リガンドを固定化することを特徴とする吸着体の製造方法を提供する。
【００６４】
前記過ヨウ素酸の塩としては特に限定は無く、過ヨウ素酸ナトリウムや過ヨウ素酸カリウム等を好適に用いることができる。
【００６５】
また、本発明に使用できる前記酸については特に限定は無いが、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸、またはその塩等を用いることができる。また、クエン酸、酢酸、酒石酸、フタル酸、フマル酸、オレイン酸、乳酸、ラウリン酸等の有機酸、またはその塩を用いると、反応液のｐＨの緩衝効果が得られるため、より好ましい。
【００６６】
前記過ヨウ素酸、またはその塩を作用させるｐＨの範囲は２〜５であることが好ましい。より好ましくは、ｐＨ２〜４．５、特に好ましくはｐＨ２〜４である。
【００６７】
前記過ヨウ素酸、またはその塩の濃度は、５ｍＭ以上３００ｍＭ以下であることが好ましい。５ｍＭ以上であれば、ホルミル基を担体に導入しやすくなり、また３００ｍＭ以下であれば、多孔質担体の強度が小さくなり難くいため好ましい。より好ましい前記過ヨウ素酸、またはその塩の濃度は、５ｍＭ以上２５０ｍＭ以下、さらに好ましくは５ｍＭ以上１５０ｍＭ以下である。
【００６８】
本発明者らは、鋭意検討の結果、理由は定かではないが、驚くべきことに、過ヨウ素酸および／または過ヨウ素酸塩を０℃以上１０℃以下の温度で作用させて得られたホルミル基含有多孔質担体に、アミノ基含有リガンドを固定化することを特徴とする吸着体の製造方法により、吸着体の目的物の吸着量が大きくなることを見出した。前記温度は、０℃以上８℃以下であることがより好ましい。
【００６９】
本発明の多孔質担体の材質に特に限定は無いが、例えば、多糖類、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリビニルアルコール、およびこれらの誘導体等を挙げることができる。これらは、ヒドロキシエチルメタクリレート等のヒドロキシ基を有する高分子材料やポリエチレンオキサイド鎖を有する単量体と他の重合性単量体との共重合体のようなグラフト共重合体等のコーティング層を有していてもよい。これらの中で多糖類や、ポリビニルアルコール等が、担体表面に活性基を導入しやすいため、好ましく用いることができる。
【００７０】
なかでも、本発明の多孔質担体は多糖類を含有することがより好ましい。多糖類は産業的に容易に得ることが可能であり、また生体に対する安全性が高いため好ましい。本発明の多孔質担体に用いることができる多糖類に特に限定は無いが、例えば、アガロース、セルロース、デキストリン、キトサン、キチン、及びこれらの誘導体等を挙げることができる。
【００７１】
また、本発明の多孔質担体は、セルロースおよび／またはセルロース誘導体を含有することがより好ましい。セルロースまたはセルロース誘導体を含有する多孔質担体は、機械的強度が比較的高く、強靱であるため破壊されたり微粒子を生じたりすることが少なく、カラムに充填した場合に液を高線速で流しても比較的圧密化し難いため好ましい。また、強度やコストの観点から本発明の多孔質担体の材質に最も好ましいのはセルロースである。
【００７２】
多孔質担体は治療用（医療用）吸着体をはじめとする各種クロマトグラフィー用吸着体やアフィニティー吸着体として広く用いられているが、特に抗体医薬品精製の分野においては、抗体医薬品市場の大きな伸びに伴って、精製の大スケール化及び高線速化が積極的に行われている。精製の大スケール化及び高線速化に伴って、精製に用いられる吸着体、つまりは多孔質担体（または多孔質粒子）の強度を大きくする必要が生じる場合がある。多孔質担体（または多孔質粒子）の強度を大きくする方法としては、特に限定は無く、多孔質担体（または多孔質粒子）のマトリックス含量（例えば樹脂含量）を大きくする方法等が好ましいが、多孔質担体（または多孔質粒子）の細孔径が小さくなり難いという利点から、架橋剤を作用させて多孔質担体（または多孔質粒子）の強度を大きくすることがより好ましい。つまり、本発明の多孔質担体（または多孔質粒子）は、架橋されていることが好ましい。
【００７３】
架橋剤や架橋反応条件に特に限定は無く、公知の技術を用いて行うことができる。例えば、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリン等のハロヒドリンや、レソルシノールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ヒドロゲナートビスフェノールＡジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンジグリシジルエーテル、ジグリシジルテレフタレート、ジグリシジルオルトフタレート、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル等の２官能以上のエポキシ化合物を作用させることによって、架橋を行うことができる。
【００７４】
これら架橋剤を用いて、多孔質担体（または多孔質粒子）の強度を大きくする方法は特に限定は無いが、反応効率の観点から、これら架橋剤をアルカリ条件下で担体に作用させることが好ましい。架橋剤の投入方法には特に限定は無く、全使用量を反応初期から投入しても良いし、複数回に分けて反応を繰り返しても良く、また滴下ロート等を用いて、少量ずつ架橋剤を投入しても良く、また架橋剤が投入された反応容器に多孔質担体を投入しても良い。
【００７５】
架橋反応の溶媒については特に限定は無いが、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキソラン等の汎用有機溶媒や、エタノール、メタノール、プロパノール等のアルコールや、これらの２種以上の混合溶媒を用いることができる。また、反応効率を高めるため、ソディウムボロヒドリド等の還元剤を共存させることがより好ましい。
【００７６】
架橋反応時の温度については特に限定は無いが、反応速度的に有利であるという理由から０℃以上であることが好ましく、および／または安全性や多孔質担体（または多孔質粒子）へのダメージの観点から１００℃以下であることが好ましく、官能基が失活し難いという理由から７０℃以下であることがより好ましい。
【００７７】
架橋反応は攪拌または振とうしながら行うことが好ましく、その１分間当りの回転数または回数は、特に限定は無いが、均一攪拌が可能で、且つ多孔質担体（または多孔質粒子）に物理的なダメージが加わらないという理由から１分間あたり１回以上１０００回以下であることが好ましく、より好ましくは１０回以上５００回以下、さらに好ましくは３０回以上３００回以下、特に好ましくは５０回以上２００回以下、最も好ましくは７５回以上１５０回以下であるが、各原料の比重の差や多孔質担体（または多孔質粒子）の強度に合わせて調整することが、好ましい。
【００７８】
架橋反応時間については、特に限定は無いが、官能基の失活や担体へのダメージが少ないという理由から、ハロヒドリンを用いる場合は、１時間以上８時間以下、２官能以上のエポキシ化合物を用いる場合は、１時間以上、１５時間未満であることが好ましく、架橋剤の反応性や、ｐＨや、反応温度に合わせて調整することが、より好ましい。
【００７９】
また本発明は、カルボン酸塩、金属ハロゲン化物、及び硫酸塩からなる群より、カルボン酸塩を必須成分として選ばれた１種以上の化合物で構成された水溶液中で、ホルミル基含有多孔質担体にアミノ基含有リガンドを固定化することが好ましい。
【００８０】
前記カルボン酸塩としては特に限定は無いが、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、乳酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、酒石酸水素カリウム、オレイン酸カリウム、ラウリン酸ナトリウム、フタル酸ナトリウム、フタル酸カリウム、フマル酸ナトリウム、フマル酸カリウム、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウム等を用いることができ、特に好ましくはクエン酸ナトリウムである。
【００８１】
前記カルボン酸塩の水溶液中の濃度には特に限定は無いが、０．０１Ｍ以上５Ｍ以下であることが好ましい。０．０１Ｍ以上であれば、リガンドの固定化量が大きくなりやすいため好ましく、５M以下であれば製造コストの観点から好ましい。より好ましい前記カルボン酸塩の水溶液中の濃度は０．０５Ｍ以上３Ｍ以下、さらに好ましくは０．１Ｍ以上１．５Ｍ以下、特に好ましくは０．２５Ｍ以上１Ｍ以下、最も好ましくは０．４Ｍ以上０．８Ｍ以下である。
【００８２】
前記金属ハロゲン化物に特に限定は無いが、例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等を好適に用いることができる。また、前記金属ハロゲン化物の水溶液中の濃度には特に限定は無いが、０．００１Ｍ以上１Ｍ以下であることが好ましい。０．００５Ｍ以上であれば、目的物の吸着量が大きくなるため好ましく、１Ｍ以下であればコストの観点から好ましい。より好ましい前記金属ハロゲン化物の水溶液中の濃度は０．０１Ｍ以上０．７５Ｍ以下、さらに好ましくは０．０５Ｍ以上０．５Ｍ以下、特に好ましくは０．０７５Ｍ以上０．５Ｍ以下である。
【００８３】
また、本発明者らはさらに好ましい態様として、クエン酸塩及び／または硫酸塩を含有する反応液中で、ホルミル基含有多孔質担体にアミノ基含有リガンドを固定化すると、クエン酸塩及び／または硫酸塩を含有しない反応液を用いた場合に比べて、アミノ基含有リガンドの固定化量及び／または固定化率が大きくなることを見出した。このことは本発明に好適に用いることができる。
【００８４】
本発明で用いることができるクエン酸塩または硫酸塩には特に限定は無いが、クエン酸塩としては、例えばクエン酸一ナトリウム、クエン酸一カリウムなどのクエン酸一アルカリ金属塩、クエン酸ニナトリウム、クエン酸ニカリウムなどのクエン酸ニアルカリ金属塩、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三カリウムなどのクエン酸三アルカリ金属塩、クエン酸一鉄ナトリウム、クエン酸鉄、クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸カルシウム、イソクエン酸又はその塩等が挙げられ、これらの１種又は２種以上を用いることができ、更に水和物、無水物を問わず用いることができる。
【００８５】
硫酸塩としては、例えば硫酸リチウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム等のアルカリ金属硫酸塩を用いることができ、更に水和物、無水物を問わず用いることができる。
【００８６】
また、これらクエン酸塩及び／または硫酸塩を含有する反応液中には、その他の物質を含んでいても良く、その他物質としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸塩、リン酸塩、酢酸、酢酸ナトリウム等の酢酸塩、トリエチルアミン等のアミン類等を挙げることができる。
【００８７】
また、本発明の製造方法において、前記反応液中におけるクエン酸及び／または硫酸塩の濃度については特に限定は無いが、０．０１〜２Ｍであることが好ましい。クエン酸及び／または硫酸塩の濃度が０．０１Ｍ以上であると、リガンドの固定化量及び／または固定化率が大きくなるため好ましい。また、クエン酸及び／または硫酸塩の濃度が２Ｍ以下であると、コストが小さくなり、また反応液の粘度が低くなるため好ましい。より好ましいクエン酸及び／または硫酸塩の濃度は０．０５〜１．９Ｍ、さらに好ましくは０．１〜１．７Ｍ、特に好ましくは０．２５〜１．５Ｍ、最も好ましくは０．４〜１Ｍである。
【００８８】
また、これらクエン酸塩及び／または硫酸塩を含有する反応液中に含めることができる、前記その他の物質の濃度についても特に限定は無いが、０．００１〜１Ｍであることが好ましい。前記その他の物質の濃度が０．００１Ｍ以上であると、吸着体の諸性能が向上するため好ましい。また、前記その他の物質の濃度が１Ｍ以下であると、コストが小さくなり、また反応液の粘度が低くなり、更にはクエン酸及び／または硫酸塩による効果が発現しやすいため好ましい。より好ましい前記その他の物質の濃度は０．００５〜０．７Ｍ、さらに好ましくは０．０１〜０．５Ｍ、特に好ましくは０．０５〜０．５Ｍ、最も好ましくは０．１〜０．２５Ｍである。
【００８９】
また、本発明の製造方法において、前記反応液のｐＨは特に限定は無いが、７〜１３であることが好ましい。前記反応液のｐＨが７以上であれば、リガンドの固定化量及び／または固定化率が大きくなるため好ましい。また、前記反応液のｐＨが１３以下であれば、吸着体の基材やリガンドへのダメージが少ないため好ましい。
【００９０】
また、ｐＨが１１．５以上、１３．０未満の反応液中で、ホルミル基含有多孔質担体にアミノ基含有リガンドを固定化すると、アミノ基含有リガンドの固定化量及び／または固定化率がより大きくなるため、より好ましい。ｐＨは１１．５以上、１２．６未満であることがさらに好ましく、特に好ましくは１１．５以上１２．３未満であり、最も好ましくは１１．６以上１２．１未満である。ｐＨの測定は、ｐＨが３〜５、６〜７、９〜１０の標準液を用いて３点校正を行ったｐＨ計にて測定することができる。
【００９１】
また、本発明者らは鋭意研究の結果、イミノ化、及びその還元反応の２段階反応からなる、ホルミル基含有多孔質担体へのアミノ基含有リガンドの固定化において、イミノ化反応後に安定化操作を実施すると、驚くべき事に安定化操作を実施しない場合に比べて、吸着体として使用した時の目的物の吸着量が大きくなることをも見出した。
【００９２】
すなわち、本発明はイミノ化、及びその還元反応の２段階反応からなる、ホルミル基含有多孔質担体へのアミノ基含有リガンドの固定化において、イミノ化反応後に安定化操作を実施することを特徴とする、吸着体の製造方法をも提供する。
【００９３】
本発明におけるイミノ化反応後の安定化操作とは、イミノ化反応後に、反応液のｐＨを、還元反応のｐＨの±１以内に調整し、還元剤を投入せずに攪拌、振とう、又は放置することを指す。
【００９４】
また、前記安定化操作の時間については特に限定は無いが、１時間以上４８時間以内であることが好ましい。安定化時間が１時間以上であれば、吸着体の目的物の吸着量がより大きくなるため好ましく、４８時間以内であれば製造コストの観点からより好ましい。より好ましい安定化時間は１時間以上２４時間以内、更に好ましくは１時間以上１５時間以内、特に好ましくは２時間以上１５時間以内である。
【００９５】
また、前記イミノ化反応後の安定化操作は、ｐＨ２〜１０で実施することが好ましい。安定化操作のｐＨが２以上であれば、製造装置の耐久性や安全性の観点から好ましく、ｐＨが１０以下であれば、吸着体の目的物の吸着量がより大きくなるため好ましい。安定化操作のより好ましいｐＨは２〜９、さらに好ましくは２〜８である。
【００９６】
また、本発明のイミノ化反応、安定化操作、還元反応は、緩衝液中で行われることが、ｐＨの安定性の観点から好ましい。本発明で用いることができる緩衝液については特に限定はなく、従来公知の緩衝液を好適に用いることができる。
【００９７】
また、前記緩衝液が、二価以上のアニオンを擁しうる塩を少なくとも１種類以上含有することが好ましい。理由は定かではないが、驚くべきことに、本発明のイミノ化反応、安定化操作、還元反応を、二価以上のアニオンを擁しうる塩を少なくとも１種類以上含有する緩衝液中で行うと、アミノ基含有リガンドの固定化量がより大きくなるため好ましい。二価以上のアニオンを擁しうる塩としては特に限定は無いが、例えば、クエン酸塩、シュウ酸塩、フタル酸塩、琥珀酸塩、リンゴ酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩等のポリカルボン酸塩、燐酸塩、硫酸塩、炭酸塩等を用いることができる。
【００９８】
緩衝液中の二価以上のアニオンを擁しうる塩の濃度には特に限定は無いが、０．０１Ｍ以上５Ｍ以下であることが好ましい。０．０１Ｍ以上であれば、リガンドの固定化量が大きくなりやすいため好ましく、５Ｍ以下であれば製造コストの観点から好ましい。より好ましい前記カルボン酸塩の水溶液中の濃度は０．０５Ｍ以上３Ｍ以下、さらに好ましくは０．１Ｍ以上１．５Ｍ以下、特に好ましくは０．２５Ｍ以上１Ｍ以下、最も好ましくは０．４Ｍ以上０．８Ｍ以下である。
【００９９】
また、前記緩衝液がポリカルボン酸塩、及び／又は中性塩を含有することがより好ましい。中性塩としては特に限定は無いが、例えば、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等が挙げられる。
【０１００】
また、前記緩衝液がクエン酸塩を含有することが、更に好ましい。クエン酸塩としては特に限定は無いが、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸リチウム等を挙げることができる。
【０１０１】
また、前記クエン酸塩を含有する緩衝液は、金属ハロゲン化物と硫酸塩のうち、少なくとも一種以上を含有することが好ましい。前記金属ハロゲン化物に特に限定は無いが、例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等を好適に用いることができる。また、前記金属ハロゲン化物及び／または硫酸塩の緩衝液中の濃度には特に限定は無いが、０．００１Ｍ以上１Ｍ以下であることが好ましい。０．００５Ｍ以上であれば、目的物の吸着量が大きくなるため好ましく、１Ｍ以下であればコストの観点から好ましい。より好ましくは０．０１Ｍ以上０．５Ｍ以下、さらに好ましくは０．０５Ｍ以上０．７５Ｍ以下、特に好ましくは０．０７５Ｍ以上０．５Ｍ以下、最も好ましくは０．１Ｍ以上０．３Ｍ以下である。
【０１０２】
また、本発明者らはホルミル基含有多孔質担体に、アミノ基含有リガンドを固定化する際、有機ボラン錯体により、リガンドの固定化結合を安定化させると同時に、余剰ホルミル基を不活化させると、驚くべき事に、吸着体の目的物の吸着量が大きくなることをも見出した。
【０１０３】
即ち本発明は、ホルミル基含有多孔質担体に、アミノ基含有リガンドを固定化する際、有機ボラン錯体により、リガンドの固定化結合を安定化させると同時に、余剰ホルミル基を不活化させることを特徴とする吸着体の製造方法にも関する。ここで、余剰ホルミル基とは、多孔質担体上のホルミル基のうち、アミノ基含有リガンドの固定化に使用されず、残存したものを指す。この余剰ホルミル基が不活化されていないと、吸着体として使用した場合に、非特異吸着が起こる場合がある。
【０１０４】
本発明は、一般的には比較的弱い還元剤として使用される有機ボラン錯体を用いているにも関わらず、弱い還元剤を用いる際に通常不活化剤として使用される、アミノ基含有低分子量化合物（例えば、モノエタノールアミン、グリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等）、いわゆるブロッキング剤を用いずとも、余剰ホルミル基を不活化できることを特徴とする。
【０１０５】
また、前記有機ボラン錯体により、リガンドの固定化結合を安定化させると同時に、余剰ホルミル基を不活化させる操作は、カルボン酸塩を含有する反応液中で実施すると、リガンドの固定化結合の安定化、及び余剰ホルミル基の不活化がより促進されるため好ましい。
【０１０６】
本発明で使用できるカルボン酸塩には特に限定は無いが、例えば酢酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、フタル酸塩、琥珀酸塩、リンゴ酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩等を挙げることができ、これらのカチオン種としては特に限定は無いが、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等を用いることができる。なかでも、クエン酸塩、特にクエン酸のアルカリ金属塩が、コストの観点からも好適に用いることができる。また、カルボン酸塩の反応液中での濃度については特に限定は無いが、０．０１Ｍ以上であると、リガンドの固定化結合の安定化と、余剰ホルミル基の不活化がより促進されるため好ましい。また、カルボン酸塩の濃度が２Ｍ以下であると、コストが削減できると共に、反応液の粘度が低くなり、操作性の面からもより好ましい。より好ましいカルボン酸塩の濃度は０．０５〜１．９Ｍ、さらに好ましくは０．１〜１．７Ｍ、特に好ましくは０．２５〜１．５Ｍ、最も好ましくは０．４〜１Ｍである。
【０１０７】
また、前記反応液中にはカルボン酸塩以外の物質が含有されていてもよく、例えば金属ハロゲン化物と硫酸塩のうち、少なくとも一種以上を含有することが好ましい。前記金属ハロゲン化物に特に限定は無いが、例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等を好適に用いることができる。また、前記金属ハロゲン化物及び／または硫酸塩の緩衝液中の濃度には特に限定は無いが、０．００１Ｍ以上１Ｍ以下であることが好ましい。０．００５Ｍ以上であれば、目的物の吸着量が大きくなるため好ましく、１Ｍ以下であればコストの観点から好ましい。より好ましくは０．０１Ｍ以上０．５Ｍ以下、さらに好ましくは０．０５Ｍ以上０．７５Ｍ以下、特に好ましくは０．０７５Ｍ以上０．５M以下、最も好ましくは０．１Ｍ以上、０．３Ｍ以下である。
【０１０８】
また、前記有機ボラン錯体により、リガンドの固定化結合を安定化させると同時に、余剰ホルミル基を不活化させる操作が、１時間以上４８時間以内であることが好ましい。前記操作が１時間以上であれば、リガンドの固定化結合の安定化と、余剰ホルミル基の不活化がより促進されるため好ましく、４８時間以内であれば製造コストの観点から好ましい。より好ましい前記操作時間は、２時間以上２４時間以下、さらに好ましくは３時間以上２０時間以下、特に好ましくは４時間以上１５時間以下、最も好ましくは５時間以上１０時間以下である。
【０１０９】
また、本発明に使用できる前記有機ボラン錯体としては特に限定は無く使用することができるが、理由は定かではないが、驚くべきことに、前記有機ボラン錯体がアミンボラン錯体（アミノボランを含む）であれば、余剰ホルミル基の不活化がより促進しやすいため好ましい。本発明で使用できるアミンボラン錯体としては特に限定は無いが、例えば、４−(ジメチルアミノ)ピリジンボラン、Ｎ−エチルジイソプロピルアミンボラン、Ｎ−エチルモルホリンボラン、Ｎ−メチルモルホリンボラン、Ｎ−フェニルモルホリンボラン、ルチジンボラン、トリエチルアミンボラン、またはトリメチルアミンボラン、４−(ジメチルアミン)ピリジンボラン、Ｎ−エチルジイソプロピルアミンボラン、Ｎ−エチルモルホリンボラン、Ｎ−メチルモルホリンボラン、Ｎ−フェニルモルホリンボラン、ルチジンボラン、アンモニアボラン、ジメチルアミンボラン、ピリジンボラン、４−メチルピリジンボラン、Ｎ’Ｎ−ジエチルアニリンボラン、Ｎ’Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンボラン、２，６−ルチジンボラン、ボランアミン、トリスジメチルアミノボラン、トリスメチルアミノボラン、ボラジン、１，３，５−トリメチルボラジン、２，４，６−トリメチルボラジン、ヘキサメチルボラジン等を挙げることができる。
【０１１０】
中でも、反応液中での溶解性や安全性の観点から、ジメチルアミンボランであることが特に好ましい。
【０１１１】
また、本発明のイミノ化反応、安定化操作、還元反応の操作温度は−１０〜４０℃であることが好ましい。−１０℃以上であれば、反応液の流動性の観点からより好ましく、４０℃以下であれば、アフィニティーリガンドや多孔質担体のホルミル基が失活し難いためより好ましい。より好ましい操作温度は−５〜３５℃、さらに好ましくは０〜３０℃である。
【０１１２】
また、本発明の吸着体のアフィニティーリガンドの導入量は、多孔質担体１ｍＬ当り、１ｍｇ以上５００ｍｇ以下であることが好ましい。アフィニティーリガンドの導入量が多孔質担体１ｍＬ当り１ｍｇ以上であれば、目的物に対する吸着量が大きくなるため好ましく、５００ｍｇ以下であれば、製造コストを抑制できるため好ましい。より好ましいアフィニティーリガンドの導入量は、多孔質担体１ｍＬ当り２ｍｇ以上１２０ｍｇ以下であり、さらに好ましくは３ｍｇ以上６０ｍｇ以下であり、特に好ましくは４ｍｇ以上３０ｍｇ以下であり、最も好ましくは４ｍｇ以上１５ｍｇ以下である。
【０１１３】
また、本発明の吸着体のアフィニティーリガンドの導入量は、多孔質担体１ｍＬ当り、０．０１μｍｏｌ以上１５μｍｏｌ以下であることが好ましい。アフィニティーリガンドの導入量が多孔質担体１ｍＬ当り０．０１μｍｏｌ以上であれば、精製目的物に対する吸着量が大きくなるため好ましく、１５μｍｏｌ以下であれば、製造コストを抑制できるため好ましい。より好ましいアフィニティーリガンドの導入量は、多孔質担体１ｍＬ当り０．０３μｍｏｌ以上５μｍｏｌ以下であり、さらに好ましくは０．０５μｍｏｌ以上２μｍｏｌ以下であり、特に好ましくは０．１μｍｏｌ以上０．７５μｍｏｌ以下であり、最も好ましくは０．１μｍｏｌ以上０．５μｍｏｌ以下である。
【０１１４】
アフィニティーリガンドの導入量は、固定化反応後の反応液上清中のアフィニティーリガンド由来の吸光度を測定することによって求めることができる。また、元素分析法を用いて、アフィニティーリガンドの導入量を求めることができる。例えば、アミノ基含有アフィニティーリガンドであれば、吸着体のＮ含量分析を行うことにより、アフィニティーリガンドの導入量を測定することができる。
【０１１５】
治療用（医療用）吸着体や抗体医薬品精製用吸着体などに用いられる場合のアフィニティーリガンドとしては、特に限定は無いが、例えば、抗体に特異性の高い抗原やタンパク質や、プロテインＧ、Ｌやその変異体、抗体結合活性を有するペプチド等を挙げることができる。特に、免疫グロブリン（ＩｇＧ）等を特異的に吸着、溶出できる吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして担体に固定化した吸着体が注目されている。プロテインＡを固定化した吸着体は、リウマチ、血友病、拡張型心筋症の治療用吸着体として注目されている。また、抗体医薬精製の分野においては、ＩｇＧ等の抗体の精製を大スケール、高速、及び低コストで行える吸着体が望まれている。このような観点から、本発明の吸着体は、アフィニティーリガンドとしてプロテインＡが導入された吸着体であることが好ましい。
【０１１６】
本発明に用いることができるプロテインＡには特に限定は無なく、天然物、遺伝子組み換え物等を制限なく使用することができる。また、抗体結合ドメイン及びその変異体を含むもの、融合蛋白質等であってもよい。また、菌体抽出物もしくは培養上清より、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー及び膜分離技術を用いた分子量分画、分画沈殿法等の手法から選択される精製法を組合せ、および／または繰り返すことにより製造された、プロテインＡを用いることもできる。特に、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７や米国特許公報ＵＳ５１５１３５０に記載されている方法で得られたプロテインＡであることが好ましい。
【０１１７】
また、本発明の吸着体は、これを用いて精製を行った場合、吸着体から目的物中に溶出したリガンドの濃度が、精製１回目〜３回目の平均値が５０ｐｐｍ以下であることが好ましい。目的物中に溶出したリガンドの濃度が、精製１回目〜３回目の平均値が５０ｐｐｍ以下であれば、治療や精製の安全性を高めることができ、さらに目的物の純度を高めることができ、精製においては後工程の煩雑さが軽減されるため好ましい。より好ましい目的物中に溶出したリガンドの濃度は、０ｐｐｍ以上４０ｐｐｍ以下、さらに好ましくは０ｐｐｍ以上３０ｐｐｍ以下、特に好ましくは０ｐｐｍ以上２５ｐｐｍ以下、最も好ましくは０ｐｐｍ以上２０ｐｐｍ以下である。目的物中に溶出したリガンドの濃度は、Steindl F. et al., Journal of Immunological Methods,  Vol.235 (2000), 61-69、に記載の方法で求めることができる。
【０１１８】
本発明の吸着体のアミノ基含有リガンドのリーク量をさらに低減するために、吸着体を洗浄することが好ましい。洗浄剤や洗浄方法に特に限定は無いが、水、酢酸、アルコール、各種有機溶剤、ｐＨ２〜５の液体、ｐＨ８〜１３の液体、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸２水素ナトリウム、緩衝剤、界面活性剤、尿素、グアニジン、グアニジン塩酸塩、その他の再生剤等の、少なくとも１種を含有する溶液等を通液、または投入して攪拌することが好ましい。また、同一または異なる溶液を用いて洗浄を複数回行うと、リガンドのリーク量がさらに減少するため好ましい。
【０１１９】
また、本発明の吸着体の、目的物の吸着量は、吸着体１ｍＬあたり１ｍｇ以上であることが好ましい。目的物の吸着量が、吸着体１ｍＬあたり１ｍｇ以上であれば、効率よく精製が行えるため好ましい。また目的物の吸着量が、吸着体１ｍＬあたり１００ｍｇ以下であれば、吸着した目的物を吸着体から溶出しやすいため好ましい。より好ましい吸着体の、目的物の吸着量は、吸着体１ｍＬあたり５ｍｇ以上９０ｍｇ以下であり、さらに好ましくは１０ｍｇ以上８０ｍｇ以下であり、特に好ましくは２０ｍｇ以上７０ｍｇ以下であり、最も好ましくは３０ｍｇ以上６０ｍｇ以下である。
【０１２０】
目的物の吸着量は、以下のようにして求めることができる。目的物の吸着量の求め方としては、特に限定は無いが、静的吸着量や動的吸着量によって求めることができる。例えば、静的吸着量を測定する場合は、ｐＨ７．４のリン酸バッファー（シグマ社製）で置換した吸着体０．５ｍＬに対し、７０ｍｇの目的物を３５ｍＬのｐＨ７．４のリン酸バッファー（シグマ社製）に溶解させた溶液を接触させ、２５℃で２時間攪拌した後、上清中の目的物の減少量を測定することにより求めることができる。
【０１２１】
本発明の吸着体は、５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０３ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、及び１５％圧縮時の応力が０．０６ＭＰａ以上５ＭＰａ以下であることが好ましい。
【０１２２】
吸着体の５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０３ＭＰａ以上、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上であれば、高線速で通液しても圧密化を生じない吸着体が得られやすいため好ましい。また、吸着体の５％圧縮時の圧縮応力が１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が５ＭＰａ以下であれば、脆性が向上し、微粒子発生が抑制できるため好ましい。
【０１２３】
また、より好ましい圧縮応力は、５％圧縮時の圧縮応力が０．０２ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、及び１５％圧縮時の応力が０．０９ＭＰａ以上５ＭＰａ以下である。最も好ましくは、５％圧縮時の圧縮応力が０．０４ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０８ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．１１ＭＰａ以上５ＭＰａ以下である。
【０１２４】
ここで、５％圧縮時の圧縮応力とは、吸着体が圧縮されて、初期体積より体積が５％減少した時の応力、１０％圧縮時の圧縮応力とは、吸着体が圧縮されて、初期体積より体積が１０％減少した時の応力、１５％圧縮時の圧縮応力とは、吸着体が圧縮されて、初期体積より体積が１５％減少した時の応力である。初期体積とは、吸着体を含むスラリーに振動を与えながら、吸着体の体積が減少しなくなるまで沈降させて充填した状態の体積である。
【０１２５】
また、本発明の吸着体の充填体積あたりの樹脂含量に特に限定は無いが、２％以上５０％以下であることが好ましい。充填体積あたりの樹脂含量が２％以上であれば、大スケール、高線速で精製を行っても圧密化を生じない吸着体が得られるため好ましい。また、充填体積あたりの樹脂含量が５０％以下であると、精製目的物を通すことができる十分な孔を確保することができるため好ましい。また、充填体積あたりの樹脂含量のより好ましい範囲は３％以上２５％以下、さらに好ましくは４％以上１５％以下である。
【０１２６】
充填体積あたりの樹脂含量は、多孔質担体体積が減少しなくなるまで沈降させて充填し、多孔質担体体積が１ｍＬとなるよう多孔質担体量を調整する。この担体を１０５℃で１２時間乾燥させ、ゲル１ｍＬの乾燥重量（ｇ）から、ゲル１ｍＬあたりの乾燥重量パーセント、つまり樹脂含量を求めることができる。
【０１２７】
また、本発明の吸着体は、体積平均粒径が２０μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましい。多孔質担体の体積平均粒径が２０μｍ以上であれば、圧密化が起こり難いため好ましく、１０００μｍ以下であれば吸着体に用いた場合の目的物の吸着量が大きくなるため好ましい。多孔質担体の体積平均粒径のより好ましい範囲は、３０μｍ以上２５０μｍ以下であり、さらに好ましくは４０μｍ以上１２５μｍ以下であり、特に好ましくは５０μｍ以上１００μｍ以下であり、最も好ましくは６０μｍ以上８５μｍ以下である。体積平均粒径は、ランダムに選んだ１００個の多孔質担体の粒径を測定して求めることができる。個々の多孔質担体の粒径は、個々の多孔質担体の顕微鏡写真を撮影して電子データーとして保存し、粒径測定ソフトウェア（メディアサイバーネティックス社製イメージプロプラス）を用いて、測定することができる。
【０１２８】
本発明の吸着体及び／または本発明の製造方法により製造された吸着体は、アフィニティークロマトグラフィーを用いた各種目的物の精製や、非特許文献３に示されるような各種精製方法や、治療用（医療用）吸着体に利用することができる。精製方法や治療方法には特に限定は無く、非特許文献１、２、３や、その他公知の方法を好適に用いる事ができる。
【０１２９】
さらに、本発明の吸着体は、目的物の精製を大スケール、高速且つ低コストで行うことを可能とする。よって、本発明の吸着体を用いた精製や治療は、直径０．５ｃｍ以上及び高さ３ｃｍ以上のカラムを用いることが好ましい。直径が０．５ｃｍ以上及び高さ３ｃｍ以上であれば、精製や治療を効率よく行うことができる。また、精製や治療の精度や効率の観点から、カラムの大きさは直径２０００ｃｍ以下及び高さ５０００ｃｍ以下であることが好ましい。
【０１３０】
より好ましいカラムの大きさは直径２ｃｍ以上２００ｃｍ以下、高さ５ｃｍ以上３００ｃｍ以下であり、さらに好ましくは直径５ｃｍ以上１００ｃｍ以下及び高さ８ｃｍ以上１５０ｃｍ以下であり、特に好ましくは直径１０ｃｍ以上８５ｃｍ以下及び高さ１２ｃｍ以上８５ｃｍ以下であり、最も好ましくは直径２０ｃｍ以上８５ｃｍ以下及び高さ１４ｃｍ以上３５ｃｍ以下である。
【０１３１】
また、本発明の吸着体を用いた治療や精製は、線速１００ｃｍ／ｈ以上で通液する工程を有することが好ましい。線速１００ｃｍ／ｈ以上で通液する工程を有していれば、治療や精製を効率よく行うことができるため好ましい。また治療や精製の精度や装置の耐久性の観点から、本発明の吸着体を用いた治療や精製は、線速１０００ｃｍ／ｈ以下で行うことが好ましい。より好ましい精製の線速は１５０ｃｍ／ｈ以上８００ｃｍ／ｈ以下、さらに好ましくは２５０ｃｍ／ｈ以上７５０ｃｍ／ｈ以下、特に好ましくは３００ｃｍ／ｈ以上７００ｃｍ／ｈ以下、最も好ましくは３５０ｃｍ／ｈ以上７００ｃｍ／ｈ以下である。
【０１３２】
本発明の多孔質担体、およびそれを用いた吸着体、およびそれらの製造方法は、およびそれらを用いた精製方法は、本発明を用いない場合に比べて、精製を高速で行うことができ、純度が高く、また安全性の高い精製品を提供することができる。
【実施例】
【０１３３】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、反応仕込み時の多孔質粒子、および多孔質担体の体積は、特に記載が無い限り、自然沈降体積である。自然沈降体積は、多孔質担体とＲＯ水のスラリーを、計量容器に投入し、振動の無い状態で２時間以上静置して、これ以上体積が減少しなくなった状態の体積である。また、官能基含量、における多孔質担体の体積は、特に記載が無い限り、多孔質担体とＲＯ水のスラリーを、計量容器に投入し、振動を与えながら、それ以上体積が減少しなくなるまで沈降させた状態の体積である。【０１３４】
（ホルミル含量測定）
ホルミル基含量は、ｐＨ８の０．１Ｍリン酸バッファーで置換した多孔質担体（または多孔質粒子）２ｍＬと、フェニルヒドラジンを溶解したｐＨ８の０．１Ｍリン酸バッファー溶液２ｍＬとを接触させ、４０℃で１時間攪拌し、ＵＶ測定により反応液の上清の２７８ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定し、これにより得られたフェニルヒドラジンの多孔質担体（または多孔質粒子）への吸着量として、見積もることができる。この時、フェニルヒドラジンの投入量は予想ホルミル基含量の３倍モルとし、フェニルヒドラジンの投入量に対して、多孔質担体（または多孔質粒子）への吸着量が１５％以下、または４５％以上であった場合は、フェニルヒドラジンの投入量を見直し、再度測定を行うものとしている。【０１３５】
（圧縮応力測定）
内径１５ｍｍのガラス製メスシリンダーに多孔質粒子または吸着体の５０ｖｏｌ％のスラリーを投入した。ガラス製メスシリンダーに振動を与えながら、多孔質粒子または吸着体の体積が減少しなくなるまで沈降させて充填し、多孔質粒子または吸着体の体積が４ｍＬとなるよう多孔質粒子または吸着体量を調整する。この時の体積を初期体積とした。金属製ピストン（メスシリンダーの内壁と摩擦を生じず、且つ多孔質粒子または吸着体が溶出ないように加工したもの）を、２０Ｎ用ロードセルを装着したオートグラフ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ製ＥＺ−ＴＥＳＴ）に取り付けた。多孔質粒子または吸着体の１２０ｖｏｌ％に相当する位置にピストンの底面を合わせた。気泡が入らないように、試験速度５ｍｍ／ｍｉｎでピストンを下降させ、多孔質粒子または吸着体を圧縮して体積を減少させ、任意の点の圧縮応力を測定する。【０１３６】
（グルコサミン固定化量の定量）
多孔質担体１ｍＬをグラスフィルター（ＴＯＰ社製３Ｇ−２）に移し、ゲルの３倍量の０．０１Ｎ水酸化ナトリウム溶液で３回置換し、ＲＯ水で、ゲルの３倍量で６回洗浄した。次に、５分間吸引ろ過（サクションドライ）し、酢酸（和光純薬工業製）で置換した。置換後のゲルを非水滴定用酢酸（和光純薬工業製）で５０ｍＬビーカーに移し、３０ｍＬまでメスアップした。これを、電位差自動滴定装置（ＫＥＭ社製ＡＴ−６１０）を用いて、０．００４Ｎ過塩素酸／酢酸（０．１Ｍ過塩素酸／酢酸溶媒を非水滴定用酢酸で希釈：和光純薬工業製）で滴定し、グルコサミン固定化量を求めた。【０１３７】
（動的吸着量、及び目的物中にリークしたリガンド濃度測定）
（１）溶液作製
Ａ液としてｐＨ７．４リン酸バッファー（シグマ社製）、Ｂ液としてｐＨ３．５の３５ｍＭ酢酸ナトリウム（和光純薬工業社製の酢酸、酢酸ナトリウム、ＲＯ水で調整）、Ｃ液として１Ｍ酢酸（和光純薬工業社製酢酸とＲＯ水で調整）、Ｄ液として１ｍｇ／ｍＬのヒトポリクローナルＩｇＧ溶液（バクスター社製ガンマガードとＡ液で調整）、Ｅ液として６Ｍ尿素、Ｆ液としてＡ液に対して０．２ｖｏｌ％の界面活性剤（和光純薬工業社製ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）を添加した液、中和液として２Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（シグマ社製トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとＲＯ水で調整）を作製し、各溶液を使用前に脱泡した。【０１３８】
（２）充填、準備
カラムクロマトグラフィー用装置として、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、直径０．５ｃｍ、高さ１５ｃｍのカラムに２２μｍのメッシュを取り付け、本発明の吸着体をそれぞれ３ｍＬ入れ、線速４５０ｃｍ／ｈで２０％エタノール水溶液（和光純薬工業社製エタノールとＲＯ水で調整）を１時間通液して充填した。フラクションコレクターに１５ｍＬの採取用チューブをセットし、溶出液の採取用チューブについては、あらかじめ中和液を入れておいた。【０１３９】
（３）ＩｇＧ精製
Ａ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ通液し、次いでＤ液を、ＵＶをモニターしながら、ＩｇＧが１０％破過するまで線速３００ｃｍ／ｈで通液した。次いで、Ａ液を線速３００ｃｍ／ｈで３０ｍＬ通液し、Ｂ液を線速３００ｃｍ／ｈで３０ｍＬ通液してＩｇＧを溶出させた。次にＣ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ，Ｅ液を線速３００ｃｍ／ｈで９ｍＬ通液した。吸着体の充填終了後からの操作をさらに２回繰り返すことにより、溶出液中のＩｇＧ量と、ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度を求めた。【０１４０】
（作製例１）
体積平均粒径が９２μｍ、樹脂含量が６％、排除限界分子量が５０００万の多孔質セルロース粒子（チッソ社製ＣＫ−Ａ）を９０μｍのメッシュ（ＮＯＮＡＫＡ  ＲＩＫＡＫＩ製、ワイヤ径６３μｍ）と分級機（筒井理化学器械社製３００−ＭＭ）を用いて、２時間、湿式分級を行い、体積平均粒径８３μｍの多孔質粒子Ａを得た。【０１４１】
２．３Ｌの多孔質粒子ＡにＲＯ水を加えて２．７８Ｌとし、これをセパラブルフラスコに移した。ここに４ＮＮａＯＨ（和光純薬工業社製とＲＯ水で調整）を０．２４６Ｌ加えた。また、水素化ホウ素ナトリウムを３．３ｇ加え、水槽中で４０℃に昇温させた。ここに架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテルを含有するデナコールＥＸ３１４（ナガセケムテックス社製）を１．６４Ｌ投入し４０℃で５時間攪拌した。反応終了後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で吸引ろ過しながら、多孔質粒子の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、架橋多孔質粒子を得た。この架橋多孔質粒子の５％圧縮時の圧縮応力は０．０２０ＭＰａ、１０％圧縮時の圧縮応力は０．０４９ＭＰａ、１５％圧縮時の圧縮応力は０．０８０ＭＰａであった。【０１４２】
得られた架橋多孔質粒子にＲＯ水を加えて、全量を架橋多孔質粒子の２倍体積量とし、ガラス製ビーカー（１Ｌ）に入れ、アルミ箔２枚で封をして、オートクレーブ（サクラ社製  高圧滅菌器ネオクレーブ）を用いて１２０℃で４０分間加温した。室温まで放冷した後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で多孔質粒子の５倍体積量のＲＯ水で洗浄し、エポキシ基がグリセリル基に変化した架橋多孔質粒子を得た。【０１４３】
ついで、このオートクレーブ済の多孔質粒子２．３ＬにＲＯ水を加えて２．７８Ｌとし、これをセパラブルフラスコに移した。ここに４Ｎ−ＮａＯＨ（和光純薬工業社製とＲＯ水で調整）を０．２４６Ｌ加えた。また、水素化ホウ素ナトリウムを３．３ｇ加え、水槽中で４０℃に昇温させた。ここにデナコールＥＸ３１４（ナガセケムテックス社製）を１．６４Ｌ投入し４０℃で５時間攪拌した。反応終了後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で吸引ろ過しながら、多孔質粒子の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、架橋多孔質粒子を得た。この架橋多孔質粒子の５％圧縮時の圧縮応力は０．０２０ＭＰａ、１０％圧縮時の圧縮応力は０．０４９ＭＰａ、１５％圧縮時の圧縮応力は０．０８０ＭＰａであった。【０１４４】
得られた架橋多孔質粒子にＲＯ水を加えて、全量を架橋多孔質粒子の２倍体積量とし、ガラス製ビーカー（１Ｌ）に入れ、アルミ箔２枚で封をして、オートクレーブ（サクラ社製  高圧滅菌器ネオクレーブ）を用いて１２０℃で４０分間加温した。室温まで放冷した後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で多孔質粒子の５倍体積量のＲＯ水で洗浄し、多孔質粒子Ｂを得た。【０１４５】
（実施例１）
作成例１の多孔質粒子Ｂ、５２３ｍＬに、ＲＯ水を加えて全量を７８４．５ｍＬとして、２Ｌのセパラブルフラスコに入れ、これを２５℃の恒温槽（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２Ｓ）に取り付けた。次に、過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業製）をＲＯ水に溶解させた、１１．５ｍｇ／ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を５２３ｍＬ作成し、セパラブルフラスコに加え、２５℃で１時間、回転数１２０ｒｐｍで攪拌した。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、濾液の伝導率が５μＳ／ｃｍ以下となるまでＲＯ水で洗浄した。ついで、得られた多孔質粒子に、ＲＯ水を加えて全量を７８４．５ｍＬとして、セパラブルフラスコに入れ、これを２５℃の恒温槽（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２Ｓ）に取り付けた。次に、過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業製）をＲＯ水に溶解させ、１１．５ｍｇ／ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム溶液を作製し、５２３ｍＬをセパラブルフラスコに加え、２５℃で１時間、回転数１２０ｒｐｍで攪拌した（マゼラ  Ｚ）。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、洗浄ろ液の電気伝導度が５μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、多孔質粒子Ｃを得た。洗浄ろ液の電気伝導度は、導電率計（ＥＵＴＥＣＨ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ製  ＥＣＴｅｓｔｒ１０  ｐｕｒｅ＋）で測定した。得られた多孔質粒子Ｃのホルミル基含量を前述の方法で測定した結果、ホルミル基含量は多孔質粒子Ｃ１ｍＬあたり６８μｍｏｌであった。【０１４６】
次いで、セパラブルフラスコに、１０４２ｍＬの所に印をつけ、得られた多孔質粒子Ｃ５２１ｍＬを、ＲＯ水を用いて移した。これを１５℃の恒温槽（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２Ｓ、投込冷却装置  ＡＤＶＡＮＴＥＣ  ＴＢＣ１２０ＤＡ）に取り付け、反応溶液が１５℃になるまで放置した。反応液が１５℃になったことを確認後、これに多孔質粒子Ｃのホルミル基含有量の１０倍モルの発酵グルコサミンＫ(協和発酵社製)を加え、水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを１１に合わせた。さらに、４Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨを１１に微調整しながら、反応液全体の体積が１０４２ｍＬになるよう、ＲＯ水を加え、１５℃で５時間、回転数１２０ｒｐｍで攪拌した。【０１４７】
次いで、２．９６ｇの水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業社製）を加えて、１時間撹拌しながら反応させた。  反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で多孔質粒子の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。洗浄後のゲルをセパラブルフラスコに入れ、セパラブルフラスコの１０４２ｍＬの印までＲＯ水を足し、２．９６ｇの水素化ホウ素ナトリウムを加え２５℃で１時間撹拌した。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上でゲルの２０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。さらに２回２５℃で１時間水素化ホウ素ナトリウムの反応を繰り返し、最後の洗浄はグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で濾液の電気伝導度が５μＳ／ｃｍ以下となるまでＲＯ水で洗浄し、グルコサミン化多孔質担体を得た。【０１４８】
この多孔質担体のグルコサミン導入量は、多孔質担体１ｍＬあたり１７μｍｏｌであった。また、還元剤で処理しきれなかったグルコサミン固定化後のホルミル基量は、多孔質担体１ｍLあたり０μｍｏｌであった。【０１４９】
得られたグルコサミン化多孔質担体１０９ｍＬにＲＯ水を加えて１６３．５ｍＬとし、５００ｍＬのセパラブルフラスコに移した。次に、１１．５ｍｇ／ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を作製し、これをセパラブルフラスコに１０９ｍＬ加え、２５℃で１時間、回転数１２０ｒｐｍで攪拌した。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、濾液の電気伝導度が５μＳ／ｃｍ以下となるまでＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有多孔質担体Ｄを得た。得られたホルミル基含有多孔質担体Ｄの５％圧縮時の圧縮応力は０．０２８ＭＰａ、１０％圧縮時の圧縮応力は０．０６７ＭＰａ、１５％圧縮時の圧縮応力は０．１０９ＭＰａであった。ホルミル基含有量は多孔質担体Ｄ１ｍＬあたり、６．２μｍｏｌであった。【０１５０】
（実施例２）
作成例１の多孔質粒子Ｂ４３５ｍＬに、ＲＯ水を加えて全量を６５２ｍＬとして、２Ｌのセパラブルフラスコに入れ、これを２５℃の恒温槽（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２Ｓ）に取り付けた。次に、過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業製）をＲＯ水に溶解させ、４６．０ｍｇ／ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業製）を作製し、２１７．５ｍＬをセパラブルフラスコに入れ、２５℃で１５分、回転数１２０ｒｐｍで攪拌した。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、濾液の伝導率が５μＳ／ｃｍ以下となるまでＲＯ水で洗浄し、多孔質粒子Ｄを得た。得られた多孔質粒子Ｄのホルミル基含量を測定した結果、ホルミル基含量は多孔質粒子Ｅ１ｍＬあたり４５．６μｍｏｌであった。【０１５１】
次いで、セパラブルフラスコに、８２０ｍＬの所に印をつけ、得られた多孔質粒子Ｅ４１０ｍＬを、ＲＯを用いて移した。これを１５℃の恒温槽（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２Ｓ、投込冷却装置  ＡＤＶＡＮＴＥＣ  ＴＢＣ１２０ＤＡ）に取り付け、反応溶液が１５℃になるまで放置した。反応液が１５℃になったことを確認したら、ここに多孔質粒子Ｄのホルミル基含有量の１０倍モルの発酵グルコサミンＫ(協和発酵社製)を加え、４Ｎ水酸化ナトリウム溶液（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）を加えてｐＨを１１に合わせた。さらに、４Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨを１１に微調整しながら、反応液全体の体積が１０４２ｍＬになるよう、ＲＯ水を加え、１５℃で５時間、回転数１２０ｒｐｍで攪拌した。【０１５２】
次いで、２．３３ｇの水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業社製）を加えて、１時間撹拌しながら反応させた。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上でゲルの２０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。洗浄後のゲルをセパラブルフラスコに入れ、セパラブルフラスコの１０４２ｍＬの印までＲＯ水を足し、２．３３ｇの水素化ホウ素ナトリウムを加え２５℃で１時間撹拌した。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上でゲルの２０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。さらに５回２５℃で１時間水素化ホウ素ナトリウムの反応を繰り返し、最終の洗浄はグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で濾液の電気伝導度が５μＳ／ｃｍ以下となるまでＲＯ水で洗浄し、グルコサミン化多孔質担体を得た。【０１５３】
この多孔質担体１ｍＬあたりのグルコサミン導入量は、１１．０μｍｏｌ／ｍＬであった。また、還元剤で処理しきれなかったグルコサミン固定化後のホルミル基量は、多孔質担体１ｍLあたり０．４μｍｏｌであった。【０１５４】
得られたグルコサミン化多孔質担体８０ｍＬのＲＯ水を加えて１２０ｍＬとし、セパラブルフラスコに移した。次に、１１．５ｍｇ／ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム溶液を作製し、４０ｍＬ加え、２５℃で３０分間、回転数１５０ｒｐｍで攪拌した（マゼラ  Ｚ）。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、濾液の伝導率が５μＳ／ｃｍ以下となるまでＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有多孔質担体を得た。ホルミル基含有量は多孔質担体１ｍＬあたり、３．４μｍｏｌであった。【０１５５】
（実施例３）
グルコサミン固定化後の還元反応において、１５℃１時間を１回、２５℃１時間を６回行う代わりに、１５℃１時間を1回、３７℃１時間を２回とした以外は、実施例２と同様の方法にて、グルコサミン化多孔質担体、次いでホルミル基含有多孔質担体を得た。なお、グルコサミン化多孔質担体１ｍＬあたりのグルコサミン導入量は、９．６μｍｏｌ／ｍＬであった。また、還元剤で処理しきれなかったグルコサミン固定化後のホルミル基量は、多孔質担体１ｍLあたり０．３μｍｏｌであった。また、ホルミル基含有多孔質担体のホルミル基含有量は多孔質担体１ｍＬあたり、４．３μｍｏｌであった。【０１５６】
（実施例４）
グルコサミン固定化後の還元反応において、１５℃１時間を１回、２５℃１時間を６回行う代わりに、１５℃１時間を1回、５０℃１時間を１回とした以外は、実施例２と同様の方法にて、グルコサミン化多孔質担体とホルミル基含有多孔質担体を得た。なお、グルコサミン化多孔質担体１ｍＬあたりのグルコサミン導入量は、８．７μｍｏｌ／ｍＬであった。また、還元剤で処理しきれなかったグルコサミン固定化後のホルミル基量は、多孔質担体１ｍLあたり０．４μｍｏｌであった。また、ホルミル基含有多孔質担体のホルミル基含有量は多孔質担体１ｍＬあたり、４．３μｍｏｌであった。【０１５７】
（実施例５）
実施例１で得られたホルミル基多孔質担体１０９ｍＬをグラスフィルター（ＴＯＰ社製２５Ｇ−２）上でｐＨ１１の０．５Ｍクエン酸ナトリウム（和光純薬工業製）＋０．１５Ｍ食塩（和光純薬工業製）バッファー３２７ｍＬで置換した。ｐＨ１１の０．５Ｍクエン酸ナトリウム＋０．１５Ｍ食塩バッファーを用い、置換後のホルミル基含有多孔質担体を、１９７．６ｍＬの所に印をつけたセパラブルフラスコに入れた。ここに、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７に記載の方法で作製されたプロテインＡの濃度が、５２．８５ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ含有溶液（カネカ社製ＰＮＸＬ３０）を１６．５ｍＬ加え、４ＮＮａＯＨ（和光純薬工業社製とＲＯ水で調整）を用いてｐＨを１１に調整し、反応液面を１９７．６ｍＬに合わせ、恒温槽中で（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２Ｓ、投込冷却装置  ＡＤＶＡＮＴＥＣ  ＴＢＣ１２０ＤＡ）、４℃で１２時間、回転数１５０ｒｐｍで攪拌ながら反応させた（マゼラ  Ｚ）。【０１５８】
反応後、反応液のｐＨが６．８になるように４Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）を用いて調整した後、水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業製）を０．３０９ｇ加えて、４℃で１時間、ゆるやかに攪拌しながら反応させた。反応後、反応液の２７７ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定した結果、アフィニティーリガンドであるプロテインＡの導入量が、多孔質担体１ｍＬ当り、７．２ｍｇであることがわかった。【０１５９】
反応後の多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、洗浄後の担体をセパラブルフラスコに入れ、１９７．６ｍＬの印の所までＲＯ水を入れ、０．３０９ｇの水素化ホウ素ナトリウムを加えて２５℃で１時間攪拌した。反応後、２０倍量のＲＯ水で洗浄した。次いで、３倍体積量の０．０１Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）で置換し、置換した多孔質担体に０．０１Ｍ塩酸を加えて全量を２２０ｍＬとし、セパラブルフラスコに入れ、室温で３０分間、攪拌しながら、酸洗浄を行った。【０１６０】
酸洗浄後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ―２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、次いで、３倍体積量の０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム、ＲＯ水で調整）で置換した。次に、置換した多孔質担体に０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を加えて全量を２２０ｍＬとし、セパラブルフラスコに入れ、室温で２０分間、攪拌しながら、アルカリ洗浄を行った。【０１６１】
アルカリ洗浄後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。次に、多孔質担体の３倍量のｐＨ７．４のＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ社製）で置換し後、ＲＯ水を用いて、洗浄濾液の電導度が５μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、目的とするプロテインＡを固定化した吸着体を得た。洗浄濾液の電導度は、導電率計（ＥＵＴＥＣＨ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ製  ＥＣＴｅｓｔｒ１０  ｐｕｒｅ＋）で測定した。【０１６２】
得られた吸着体の目的物としてヒトポリクローナルＩｇＧ（バクスター社製ガンマガード）を選択し、動的吸着量と目的物中に溶出したリガンド量を求めた結果、ＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、１回目３７ｍｇ、２回目３７ｍｇ、３回目３８ｍｇであった。また、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンドのＩｇＧに対する濃度は、１回目３８ｐｐｍ、２回目２０ｐｐｍ、３回目１９ｐｐｍであった。【０１６３】
（実施例６）
実施例２で得られたホルミル基多孔質担体を用いて、実施例５と同様の方法にて、プロテインＡを固定化した吸着体を得た。得られた吸着体の動的吸着量と目的物中に溶出したリガンド量を求めた結果、ＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、１回目３７ｍｇ、２回目３８ｍｇ、３回目３９ｍｇであった。また、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンドのＩｇＧに対する濃度は、１回目２３ｐｐｍ、２回目１９ｐｐｍ、３回目１９ｐｐｍであった。【０１６４】
（実施例７）
実施例３で得られたホルミル基多孔質担体を用いて、実施例５と同様の方法にて、プロテインＡを固定化した吸着体を得た。得られた吸着体の動的吸着量と目的物中に溶出したリガンド量を求めた結果、ＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、１回目３４ｍｇ、２回目３５ｍｇ、３回目３６ｍｇであった。また、精製ＩｇＧ中にリークしたＩｇＧに対するリガンド濃度は、１回目２７ｐｐｍ、２回目２４ｐｐｍ、３回目１６ｐｐｍであった。【０１６５】
（実施例８）
実施例４で得られたホルミル基多孔質担体を用いて、実施例５と同様の方法にて、プロテインＡを固定化した吸着体を得た。得られた吸着体の動的吸着量と目的物中に溶出したリガンド量を求めた結果、ＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、１回目３１ｍｇ、２回目３２ｍｇ、３回目３２ｍｇであった。また、精製ＩｇＧ中にリークしたＩｇＧに対するリガンド濃度は、１回目１６ｐｐｍ、２回目１６ｐｐｍ、３回目８ｐｐｍであった。【０１６６】
（実施例９）
プロテインＡ固定化温度を４℃から２１℃に変更する以外は、実施例７と同様の方法にて、吸着体を得た。得られた吸着体の動的吸着量と目的物中に溶出したリガンド量を求めた結果、ＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、３４ｍｇであった。【０１６７】
（実施例１０）
プロテインＡ固定化後に、水素化ホウ素ナトリウムを加える時に、粉末で加える代わりに、同量の水素化ホウ素ナトリウムをＲＯ水に溶解させ、１７ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液を１２．４ｍＬ作製し、２５回に分けて１時間かけて全量を加えたこと以外は、実施例７と同様の方法にて、吸着体を得た。得られた吸着体の動的吸着量を求めた結果、ＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、１回目３９ｍｇ、２回目３８ｍｇ、３回目３９ｍｇであった。【０１６８】
（実施例１１）
プロテインＡ固定化後に、水素化ホウ素ナトリウムを加える時に、粉末で加える代わりに、１７ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液を０．５ｍＬ加えたこと以外は、実施例７と同様の方法にて、吸着体を得た。得られた吸着体の動的吸着量と目的物中に溶出したリガンド量を求めた結果、ＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、２回目３９ｍｇ、３回目３９ｍｇであった。  【０１６９】
（実施例１２）
プロテインＡ固定化後に、一回目に水素化ホウ素ナトリウムを加える代わりに、ジメチルアミンボラン（和光純薬工業製）を水素化ホウ素ナトリウムと当モル量粉末で加えたこと以外は、実施例７と同様の方法にて、吸着体を得た。得られた吸着体の動的吸着量を求めた結果、ＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、１回目３６ｍｇ、３回目３８ｍｇであった。【０１７０】
（比較例１）
グルコサミン固定化後に還元反応を行わない以外は、実施例１と同様にして、グルコサミン化多孔質担体とホルミル基含有多孔質担体Ｆを得た。この多孔質担体のグルコサミン導入量は、多孔質担体１ｍＬあたり２０．２μｍｏｌであった。また、還元剤で処理しきれなかったグルコサミン固定化後のホルミル基量は、７μｍｏｌであった。また、ホルミル基含有多孔質担体のホルミル基含有量は多孔質担体Ｆ１ｍＬあたり、１４．５μｍｏｌであった。得られたホルミル基多孔質担体を用いて、実施例５と同様の方法にて、プロテインＡを固定化した吸着体を得た。得られた吸着体の動的吸着量と目的物中に溶出したリガンド量を求めた結果、ＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、１回目３７ｍｇ、２回目３８ｍｇ、３回目３８ｍｇであった。また、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンドのＩｇＧに対する濃度は、１回目８７ｐｐｍ、２回目４７ｐｐｍ、３回目５６ｐｐｍであった。【０１７１】
（比較例２）
作成例１の多孔質粒子Ｂ、６４ｍＬに、ＲＯ水を加えて全量を９６ｍＬとして、セパラブルフラスコに入れ、これを２５℃の恒温槽（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２Ｓ）に取り付けた。次に、過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業製）をＲＯ水に溶解させ、１．４４ｍｇ／ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム溶液を作製し、６４ｍＬをセパラブルフラスコに加え、２５℃で１時間、回転数１２０ｒｐｍで攪拌した（マゼラ  Ｚ）。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、濾液の電気伝導度が５μＳ／ｃｍ以下となるまでＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有多孔質担体Ｇを得た。得られたホルミル基含有多孔質担体Ｇのホルミル基含量を測定した結果、ホルミル基含量は多孔質担体１ｍＬあたり５．９μｍｏｌであった。【０１７２】
このホルミル基多孔質担体５４．５ｍＬをグラスフィルター（ＴＯＰ社製２５Ｇ−２）上でｐＨ１１の０．５Ｍリン酸（和光純薬工業製）＋０．１５Ｍ食塩（和光純薬工業製）バッファー１６５ｍＬで置換した。置換後のホルミル基含有多孔質担体にｐＨ１１の０．５Ｍリン酸（和光純薬工業製）＋０．１５Ｍ食塩（和光純薬工業製）バッファーを加えて全量を９０．５ｍＬとして、セパラブルフラスコに入れ、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７に記載の方法で作製されたプロテインＡの濃度が、５２．８５ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ含有溶液（カネカ社製ＰＮＸＬ３０）を８．２５ｍＬ加え、恒温槽中で（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２Ｓ、投込冷却装置  ＡＤＶＡＮＴＥＣ  ＴＢＣ１２０ＤＡ）、４℃で１２時間、回転数１５０ｒｐｍで攪拌ながら反応させた（マゼラ  Ｚ）。【０１７３】
反応後、反応液のｐＨが８になるように４Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）を用いて調整した後、水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業製）を０．１５５ｇ加えて、４℃で１時間、ゆるやかに攪拌しながら反応させた。反応後、反応液の２７６ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定した結果、アフィニティーリガンドであるプロテインＡの導入量が、多孔質担体１ｍＬ当り、６．７ｍｇであることがわかった。【０１７４】
反応後の多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、洗浄後の担体にＲＯ水を加え１０９ｍＬとし、セパラブルフラスコに移し、０．１５５ｇの水素化ホウ素ナトリウムを加えて２５℃で１時間攪拌した。反応後、２０倍量のＲＯ水で洗浄した。次いで、３倍体積量の０．０１Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）で置換し、置換した多孔質担体に０．０１Ｍ塩酸を加えて全量を１０９ｍＬとし、セパラブルフラスコに入れ、室温で３０分間、攪拌しながら、酸洗浄を行った。【０１７５】
酸洗浄後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ―２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、次いで、３倍体積量の０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム、ＲＯ水で調整）で置換した。次に、置換した多孔質担体に０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を加えて全量を１０９ｍＬとし、セパラブルフラスコに入れ、室温で２０分間、攪拌しながら、アルカリ洗浄を行った。【０１７６】
アルカリ洗浄後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。次に、ゲルの３倍体積量のｐＨ７．４のＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ社製）で置換し後、ＲＯ水を用いて、洗浄濾液の電導度が５μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、目的とするプロテインＡを固定化した吸着体を得た。洗浄濾液の電気伝導度は、導電率計（ＥＵＴＥＣＨ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ製  ＥＣＴｅｓｔｒ１０  ｐｕｒｅ＋）で測定した。【０１７７】
得られた吸着体の動的吸着量と目的物中に溶出したリガンド量を求めた結果、ＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、１回目３５ｍｇ、２回目３５ｍｇ、３回目３５ｍｇであった。また、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンドのＩｇＧに対する濃度は、１回目＞１００ｐｐｍ、２回目＞１００ｐｐｍ、３回目＞１００ｐｐｍであった。【０１７８】
（比較例３）
チッソ社製ＣＫ−Ａを分級しないこと以外は、作成例１と同様の方法で、架橋多孔質粒子を得た。次いで、この架橋多孔質粒子１１ｍＬにＲＯ水を加えて全量を１２．６ｍＬとして、遠沈管（岩城硝子社製５０ｍＬ）に入れ、さらに２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウムとＲＯ水で調整）３．７ｍＬをこれに加えて、４０℃で３０分加温した。液温が４０℃に加温された後、エピクロロヒドリン（和光純薬工業社製）を１．３ｍＬ加えて、恒温振とう機（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２５）を用いて、４０℃で２時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。【０１７９】
反応終了後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で、多孔質粒子の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、多孔質粒子１ｍＬあたりのエポキシ含量が５．７μmolであるエポキシ化多孔質粒子を得た。このエポキシ化多孔質粒子９．５ｍＬをグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で、ｐＨ１０の０．５Ｍ炭酸バッファー（和光純薬工業社製の炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムと、ＲＯ水で調整）３０ｍＬを用いて置換した。置換後のエポキシ化多孔質粒子にｐＨ１０の０．５Ｍ炭酸バッファーを加えて全量を１９ｍＬとして、遠沈管（岩城硝子社製５０ｍＬ）に入れ、さらにＤ（＋）−グルコサミン塩酸塩（和光純薬工業社製）を０．１８ｇ加え、恒温振とう機（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２５）を用いて、５０℃で一晩、１００回／分で振とうし、反応させた。【０１８０】
反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、グルコサミン含量が多孔質担体１ｍＬあたり１．４μmolであるグルコサミン化多孔質担体を得た。得られたグルコサミン化多孔質担体１０ｍＬにＲＯ水を加えて、全量を１５ｍＬとして、遠沈管（岩城硝子社製５０ｍＬ）に入れた。次に１１５ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）を１０ｍＬのＲＯ水に溶解させ、この過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を遠沈管に加えて、インキュベーター（イワキガラス社製インキュベーターＬＯＷ−ＴＥＭＰ  ＩＣＢ−１５１Ｌ）中で、ミックスローター（井内盛栄堂社製バリアブルミックスローターＶＭＲ−５）を用いて、２５℃で１時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。【０１８１】
反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有多孔質担体を得た。得られたホルミル基含有多孔質担体のホルミル基含量を前述の方法で測定した結果、ホルミル基含量は多孔質担体１ｍＬあたり５．９μｍｏｌであった。【０１８２】
このホルミル基含有多孔質担体７．１ｍＬをグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で、ｐＨ１０の０．５Ｍリン酸＋０．１５Ｍ食塩バッファー（和光純薬工業社製リン酸水素２ナトリウム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調整）３０ｍＬで置換した。置換後のホルミル基含有多孔質担体にｐＨ１０の０．５Ｍリン酸＋０．１５Ｍ食塩バッファーを加えて、全量を１１．８ｍＬとして、遠沈管（岩城硝子社製５０ｍＬ）に入れ、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７に記載の方法で作製されたプロテインＡの濃度が、５２．６ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ含有溶液（カネカ社製ＰＮＸＬ２８）を１．０８ｍＬ加え、インキュベーター（イワキガラス社製インキュベーターＬＯＷ−ＴＥＭＰ  ＩＣＢ−１５１Ｌ）中で、ミックスローター（井内盛栄堂社製バリアブルミックスローターＶＭＲ−５）を用いて、４℃で１２時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。【０１８３】
反応後の反応液のｐＨが８になるように４Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）を用いて調整した後、水素化ホウ素ナトリウムを０．０２ｇ加えて、４℃で１時間、ゆるやかに振とうしながら反応させた。反応後、反応液の２７７ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定した結果、アフィニティーリガンドであるプロテインＡの導入量が、多孔質担体１ｍＬ当り、４．７ｍｇであることがわかった。【０１８４】
反応後の多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で、ＲＯ水を用いて、洗浄濾液の電気伝導度が５μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、目的とするプロテインＡを固定化した吸着体を得た。【０１８５】
得られた吸着体の目的物としてヒトポリクローナルＩｇＧ（バクスター社製ガンマガード）を選択し、動的吸着量と目的物中にリークしたリガンド量を以下の方法で求めた結果、ＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、１回目２２ｍｇ、２回目２３ｍｇ、３回目２７ｍｇであった。また、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度は、１回目２９７ｐｐｍ、２回目２１４ｐｐｍ、３回目１９８ｐｐｍであった。【０１８６】
（作製例２）
作製例１と同様の方法で作製した多孔質粒子B１００ｍＬにＲＯ水を加えて、全量を１５０ｍＬとして、セパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製５００ｍＬ）に入れた。次に２．３０ｇの過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）を５０ｍＬのＲＯ水に溶解させ、この過ヨウ素酸ナトリウム水溶液をセパラブルフラスコに加えて、２５℃で１５分、１５０回／分で攪拌しながら反応させた。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質粒子の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、多孔質粒子Ｈを得た。得られたホルミル基含有多孔質粒子のホルミル基含量を前述の方法で測定した結果、ホルミル基含量は多孔質粒子１ｍＬあたり５７μｍｏｌであった。【０１８７】
（実施例１３）
作製例２と同様の方法で作製した９９ｍＬの多孔質粒子Ｈと９９ｍＬのＲＯ水との１：１スラリーを１５℃に調整した後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で１５分間吸引ろ過（サクションドライ）した。得られたサクションドライ済みの多孔質粒子Ｉをガラス製のセパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製５００ｍＬ）に全量投入した。その後、このセパラブルフラスコに３．３ｇのグルコサミン塩酸塩（協和発酵社製発酵グルコサミンＫ）を投入した。次いで、グルコサミン塩酸塩を溶解しながら１５℃のＲＯ水を加え、溶解後の反応液全量が１８０ｍＬとなるように調整した。反応液を１５℃に調整した後、４Ｎの水酸化ナトリウム水溶液とＲＯ水を用いて、ｐＨが１０で、反応液全量が１９８ｍＬとなるように調整した。次いで１５℃で５時間、１５０回／分で攪拌した。その後、水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業社製）を０．５６ｇ添加し、１５℃で６０分間、１５０回／分で攪拌した。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の４０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。【０１８８】
「次に、洗浄後の多孔質担体をガラス製のセパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製５００ｍＬ）に全量投入し、ＲＯ水を加えて、全量が１９８ｍＬとなるように調整した。その後、水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業社製）を０．５６ｇ添加し、１５℃で６０分間、１５０回／分で攪拌した。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の４０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。」この「」内の操作を計２回行い、目的とする多孔質担体を得た。非水滴定により、この多孔質担体中のグルコサミン固定化量を測定した結果、担体の１ｍＬあたり１０μmolであった。【０１８９】
（実施例１４）
グルコサミン塩酸塩添加後に実施するｐＨ調整にて、ｐＨを９とした以外は、実施例１３と同様の方法で目的の多孔質担体を作製した。このグルコサミン固定化量は、担体の１ｍＬあたり１０μmolであった。【０１９０】
（実施例１５）
グルコサミン塩酸塩添加後に実施するｐＨ調整にて、ｐＨを８とした以外は、実施例１３と同様の方法で目的の多孔質担体を作製した。このグルコサミン固定化量は、担体の１ｍＬあたり１０μmolであった。【０１９１】
（実施例１６）
実施例１３で作製した９４ｍＬの多孔質担体を、ｐＨ３の０．０１Ｍクエン酸バッファー（和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸一水和物、ＲＯ水を用いて調整）２８０ｍＬで置換し、該バッファーを加え、全量を１４１ｍＬとして、セパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製５００ｍＬ）に入れた。次に０．５４ｇの過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）を９４ｍＬのＲＯ水に溶解させ、この過ヨウ素酸ナトリウム水溶液をセパラブルフラスコに加えて、５℃で４０分、１５０回／分で攪拌しながら反応させた。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の４０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有多孔質担体を得た。得られた担体のホルミル基含量を前述の方法で測定した結果、ホルミル基含量は多孔質担体１ｍＬあたり４μｍｏｌであった。【０１９２】
９２．８ｍＬの上記ホルミル基含有多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、０．６Ｍクエン酸三ナトリウム＋０．２Ｍ食塩バッファー（和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調整）２８０ｍＬで置換した。置換後の該多孔質担体に０．６Ｍクエン酸三ナトリウム＋０．２Ｍ食塩バッファーを加えて全量を１３２ｍＬとし、セパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製５００ｍＬ）に入れ、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７に記載の方法で作製されたプロテインＡの濃度が、５２．８ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ含有溶液（カネカ社製ＰＮＸＬ３５）を１４．０６ｍＬ加え、０．０８Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製の水酸化ナトリウムとＲＯ水で調整）を加えて反応液のｐＨを１２に調整し、４℃で４時間、１５０回／分で攪拌しながら反応させた。【０１９３】
反応後の反応液のｐＨが７になるように０．１Ｍクエン酸（和光純薬工業社製クエン酸一水和物とＲＯ水で調整）を用いて調整した後、ジメチルアミンボランを４０８ｍｇ加えて、４℃で１時間、次いで２５℃で８時間、いずれも１５０回／分で撹拌しながら反応させた。反応後、反応液の２７７ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定した結果、アフィニティーリガンドであるプロテインＡの固定化量は、多孔質担体１ｍＬ当り、７．６ｍｇであることがわかった。【０１９４】
反応後の多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ―２）上で、多孔質担体の１０倍体積量のＲＯ水で洗浄した後、３倍体積量の０．１Ｍクエン酸（和光純薬工業社製クエン酸一水和物とＲＯ水で調整）で置換した。次に、置換した多孔質担体に０．１Ｍクエン酸を加えて全量を１８６ｍＬとし、セパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製５００ｍＬ）に入れ、２５℃で３０分間、１５０回／分で振とうしながら、酸洗浄を行った。【０１９５】
酸洗浄後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ―２）上で、３倍体積量の０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム、ＲＯ水で調整）で置換した。次に、置換した多孔質担体に０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を加えて全量を１８６ｍＬとし、全量をセパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製５００ｍＬ）に入れ、２５℃で２０分間、１５０回／分で振とうしながら、アルカリ洗浄を行った。【０１９６】
アルカリ洗浄後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ―２）上で、ｐＨ６の０．５Ｍクエン酸バッファー（和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸一水和物、ＲＯ水を用いて調整）２７８ｍＬで置換し、その後、ＲＯ水を用いて、洗浄ろ液の電導度が５μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄した。【０１９７】
続いて、２０％エタノール水溶液（日本薬局方のエタノールとＲＯ水で調整）で多孔質担体を置換し、さらに２０％エタノール水溶液を用いて、２５０ｍＬのポリ容器（サンプラテック社製）に入れ、目的とするプロテインＡを固定化した吸着体を得た。洗浄ろ液の電導度は、導電率計（ＥＵＴＥＣＨ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ製  ＥＣＴｅｓｔｒ１０  ｐｕｒｅ＋）で測定した。【０１９８】
得られた吸着体の目的物としてヒトポリクローナルＩｇＧ（バクスター社製ガンマガード）を選択し、動的吸着量と目的物中にリークしたリガンド量を以下の方法で求めた結果、ＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、担体１ｍＬあたり３７ｍｇであった。また、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度は２４ｐｐｍであった。得られた吸着体のホルミル基含量を前述の方法で測定した結果、多孔質担体１ｍＬあたり０．２μｍｏｌであった。【０１９９】
（実施例１７）
実施例１４で作製した多孔質担体を用いた以外は、実施例１６と同様の操作で目的とする吸着体を得た。このＩｇＧ動的吸着量は、担体１ｍＬあたり３７ｍｇであり、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度は２２ｐｐｍであった。【０２００】
（実施例１８）
実施例１５で作製した多孔質担体を用いた以外は、実施例１６と同様の操作で目的とする吸着体を得た。このＩｇＧ動的吸着量は、担体１ｍＬあたり３７ｍｇであり、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度は２６ｐｐｍであった。【０２０１】
（実施例１９）
ｐＨ３のクエン酸バッファーの代わりにｐＨ２のクエン酸バッファー（和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸一水和物、ＲＯ水を用いて調整）を用いた以外は、実施例１７と同様の操作で吸着体を作製した。このとき、ホルミル基含有多孔質担体のホルミル含量は多孔質担体１ｍＬあたり６μｍｏｌであり、アフィニティーリガンドであるプロテインＡの固定化量は、多孔質担体１ｍＬ当り、７．２ｍｇであった。また、ＩｇＧ動的吸着量は３５ｍｇであり、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度は３８ｐｐｍであった。【０２０２】
（実施例２０）
ｐＨ３のクエン酸バッファーの代わりにｐＨ５のクエン酸バッファー（和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸一水和物、ＲＯ水を用いて調整）を用いた以外は、実施例１７と同様の操作で吸着体を作製した。このとき、ホルミル基含有多孔質担体のホルミル含量は多孔質担体１ｍＬあたり４μｍｏｌであり、アフィニティーリガンドであるプロテインＡの固定化量は、多孔質担体１ｍＬ当り、６．５ｍｇであった。また、ＩｇＧ動的吸着量は３５ｍｇであり、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度は４２ｐｐｍであった。【０２０３】
（実施例２１）
実施例１と同様の方法で作製した９２．８ｍＬのホルミル基含有多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、０．５Ｍクエン酸三ナトリウム＋０．１５Ｍ食塩バッファー（和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調整）２７８ｍＬで置換した。置換後のホルミル基含有多孔質担体に０．５Ｍクエン酸三ナトリウム＋０．１５Ｍ食塩バッファーを加えて全量を１３０ｍＬとし、セパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製５００ｍＬ）に入れ、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７に記載の方法で作製されたプロテインＡの濃度が、５２．８５ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ含有溶液（カネカ社製ＰＮＸＬ３０）を１４．０４ｍＬ加え、４Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製の水酸化ナトリウムとＲＯ水で調整）を加えて反応液のｐＨを１１に調整した。さらに、ｐＨ１１の０．５Ｍクエン酸三ナトリウム＋０．１５Ｍ食塩バッファー（和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調整）を用いて、反応液全量を１６８ｍＬに調整した後、４℃で１２時間、１５０回／分で攪拌しながら反応させた。【０２０４】
反応後の反応液のｐＨが６．８になるように４Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）を用いて調整した後、水素化ホウ素ナトリウムを２６３ｍｇ加えて、４℃で１時間、１５０回／分で撹拌しながら反応させた。反応後、反応液の２７７ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定した結果、アフィニティーリガンドであるプロテインＡの固定化量は、多孔質担体１ｍＬ当り、７．２ｍｇであることがわかった。【０２０５】
反応後の多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ―２）上で、多孔質担体の１０倍体積量のＲＯ水で洗浄した後、全量をセパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製５００ｍＬ）に入れ、ＲＯ水を加えて、反応液全量が１６８ｍＬとなるよう調整した。次いで、水素化ホウ素ナトリウムを２６３ｍｇ加えて、２５℃で１時間、１５０回／分で撹拌しながら反応させた。反応後の多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ―２）上で、多孔質担体の１０倍体積量のＲＯ水で洗浄した後、３倍体積量の０．０１Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）で置換した。次に、置換した多孔質担体に０．０１Ｍ塩酸を加えて全量を１６８ｍＬとし、セパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製５００ｍＬ）に入れ、２５℃で３０分間、１５０回／分で振とうしながら、酸洗浄を行った。【０２０６】
酸洗浄後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ―２）上で、多孔質担体の１０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、次いで、３倍体積量の０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム、ＲＯ水で調整）で置換した。次に、置換した多孔質担体に０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を加えて全量を１６８ｍＬとし、全量をセパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製５００ｍＬ）に入れ、２５℃で２０分間、１５０回／分で振とうしながら、アルカリ洗浄を行った。【０２０７】
アルカリ洗浄後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ―２）上で、ｐＨ６の０．０１Ｍクエン酸バッファー（和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸一水和物、ＲＯ水を用いて調整）２７８ｍＬで置換し、その後、ＲＯ水を用いて、洗浄ろ液の電導度が５μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄した。続いて、２０％エタノール水溶液（日本薬局方のエタノールとＲＯ水で調整）で多孔質担体を置換し、さらに２０％エタノール水溶液を用いて、２５０ｍＬのポリ容器（サンプラテック社製）に入れ、目的とするプロテインＡを固定化した吸着体を得た。洗浄ろ液の電導度は、導電率計（ＥＵＴＥＣＨ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ製  ＥＣＴｅｓｔｒ１０  ｐｕｒｅ＋）で測定した。【０２０８】
得られた吸着体の目的物としてヒトポリクローナルＩｇＧ（バクスター社製ガンマガード）を選択し、動的吸着量と目的物中にリークしたリガンド量を以下の方法で求めた結果、ＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、１回目３６ｍｇ、２回目３６ｍｇ、３回目３７ｍｇであった。また、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度は、１回目６９ｐｐｍ、２回目４７ｐｐｍ、３回目３６ｐｐｍであった。【０２０９】
（実施例２２）
０．５Ｍクエン酸三ナトリウム＋０．１５Ｍ食塩バッファーの代わりに、０．０２５Ｍリン酸＋１．５Ｍ硫酸ナトリウムバッファー（和光純薬工業社製リン酸水素二ナトリウム１２水、硫酸ナトリウム、ＲＯ水を用いて調整）を用い、ｐＨ１１の０．５Ｍクエン酸三ナトリウム＋０．１５Ｍ食塩バッファーの代わりに、ｐＨ１１の０．０２５Ｍリン酸＋１．５Ｍ硫酸ナトリウムバッファー（和光純薬工業社製リン酸水素二ナトリウム１２水、硫酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調整）を用いた以外は、実施例２１と同様の方法で吸着体を作製した。アフィニティーリガンドであるプロテインＡの固定化量を実施例２と同様に求めた結果、多孔質担体１ｍＬ当り、７．４ｍｇであることがわかった。【０２１０】
（実施例２３）
実施例２１でｐＨを１１に調整した操作を、ｐＨ１２．５に変更した以外は、実施例２１と同様の方法で吸着体を作製した。プロテインＡの固定化量は、多孔質担体１ｍＬ当り、６．０ｍｇで、ＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、１回目３３ｍｇ、２回目３３ｍｇ、３回目３３ｍｇであった。また、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度は、１回目が３５ｐｐｍであった。【０２１１】
（実施例２４）
実施例２１でｐＨを１１に調整した操作を、ｐＨ１３に変更した以外は、実施例２１と同様の方法で吸着体を作製した。プロテインＡの固定化量は、多孔質担体１ｍＬ当り、４．０ｍｇで、ＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、１回目２８ｍｇ、２回目３３ｍｇ、３回目３３ｍｇであった。また、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度は、１回目が２３ｐｐｍであった。【０２１２】
（実施例２５）
実施例２１でｐＨを１１に調整した操作を、ｐＨ１０に変更した以外は、実施例２１と同様の方法で吸着体を作製した。プロテインＡの固定化量は、多孔質担体１ｍＬ当り、４．０ｍｇで、ＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、２９ｍｇであった。【０２１３】
（実施例２６）
実施例１と同様の方法で作製した９２．８ｍＬのホルミル基含有多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、０．６Ｍクエン酸三ナトリウム＋０．２Ｍ食塩バッファー（和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調整）２８０ｍＬで置換した。置換後の多孔質担体Ｆに０．６Ｍクエン酸三ナトリウム＋０．２Ｍ食塩バッファーを加えて全量を１３２ｍＬとし、セパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製５００ｍＬ）に入れ、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７に記載の方法で作製されたプロテインＡの濃度が、５２．８ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ含有溶液（カネカ社製ＰＮＸＬ３５）を１４．０６ｍＬ加え、０．０８Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製の水酸化ナトリウムとＲＯ水で調整）を加えて反応液のｐＨを１２に調整し、４℃で４時間、１５０回／分で攪拌しながら反応させた。反応後の反応液のｐＨが７になるように０．１Ｍクエン酸（和光純薬工業社製クエン酸一水和物とＲＯ水で調整）を用いて調整した。１時間、同温度にて撹拌を継続した後、ジメチルアミンボランを４０８ｍｇ加えて、４℃で１時間、次いで２５℃で５時間、いずれも１５０回／分で撹拌しながら反応させた。【０２１４】
反応後の多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ―２）上で、多孔質担体の１０倍体積量のＲＯ水で洗浄した後、３倍体積量の０．１Ｍクエン酸（和光純薬工業社製クエン酸一水和物とＲＯ水で調整）で置換した。次に、置換した多孔質担体に０．１Ｍクエン酸を加えて全量を１８６ｍＬとし、セパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製５００ｍＬ）に入れ、２５℃で３０分間、１５０回／分で振とうしながら、酸洗浄を行った。【０２１５】
酸洗浄後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ―２）上で、３倍体積量の０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム、ＲＯ水で調整）で置換した。次に、置換した多孔質担体に０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を加えて全量を１８６ｍＬとし、全量をセパラブルフラスコ（ＴＯＰ社製５００ｍＬ）に入れ、２５℃で２０分間、１５０回／分で振とうしながら、アルカリ洗浄を行った。【０２１６】
アルカリ洗浄後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ―２）上で、ｐＨ６の０．５Ｍクエン酸バッファー（和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸一水和物、ＲＯ水を用いて調整）２７８ｍＬで置換し、その後、ＲＯ水を用いて、洗浄ろ液の電導度が５μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄した。続いて、２０％エタノール水溶液（日本薬局方のエタノールとＲＯ水で調整）で多孔質担体を置換し、さらに２０％エタノール水溶液を用いて、２５０ｍＬのポリ容器（サンプラテック社製）に入れ、目的とするプロテインＡを固定化した吸着体を得た。ＲＯ水を用いて、洗浄ろ液の電導度が５μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄した。続いて、２０％エタノール水溶液（日本薬局方のエタノールとＲＯ水で調整）で多孔質担体を置換し、さらに２０％エタノール水溶液を用いて、２５０ｍＬのポリ容器（サンプラテック社製）に入れ、目的とするプロテインＡを固定化した吸着体を得た。洗浄ろ液の電導度は、導電率計（ＥＵＴＥＣＨ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ製  ＥＣＴｅｓｔｒ１０  ｐｕｒｅ＋）で測定した。【０２１７】
得られた吸着体の目的物としてヒトポリクローナルＩｇＧ（バクスター社製ガンマガード）を選択し、動的吸着量と目的物中にリークしたリガンド量を以下の方法で求めた結果、ＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、担体１ｍＬあたり３４ｍｇであった。また、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度は３０ｐｐｍであった。【０２１８】
（実施例２７）
０．１Ｍクエン酸にてｐＨ７に調整した後、同温度で行う撹拌継続時間を２時間とした以外は、実施例２６と同じ操作として吸着体を得た。取得した吸着体のＩｇＧ動的吸着量は、担体１ｍＬあたり３６ｍｇであった。【０２１９】
（実施例２８）
０．１Ｍクエン酸にてｐＨ７に調整した後、同温度で行う撹拌継続時間を４時間とした以外は、実施例２６と同じ操作として吸着体を得た。取得した吸着体のＩｇＧ動的吸着量は、担体１ｍＬあたり３７ｍｇであり、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度は２２ｐｐｍであった。【０２２０】
（実施例２９）
０．１Ｍクエン酸にてｐＨ７に調整した後、同温度で行う撹拌継続時間を６時間とした以外は、実施例２６と同じ操作として吸着体を得た。取得した吸着体のＩｇＧ動的吸着量は、担体１ｍＬあたり３６ｍｇであり、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度は４５ｐｐｍであった。【０２２１】
（実施例３０）
０．１Ｍクエン酸にてｐＨ７に調整した後、同温度で行う撹拌継続時間を１５時間とした以外は、実施例２６と同じ操作として吸着体を得た。取得した吸着体のＩｇＧ動的吸着量は、担体１ｍＬあたり３７ｍｇであった。【０２２２】
（実施例３１）
ｐＨ１２にてプロテインＡを反応させた後、１．６Ｍクエン酸にてｐＨ３に調整し、その後同温度で行う撹拌継続時間を４時間とした以外は、実施例２６と同じ操作とし、吸着体を得た。取得した吸着体のＩｇＧ動的吸着量は、担体１ｍＬあたり３６ｍｇ、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度は３０ｐｐｍであった。【０２２３】
（実施例３２）
０．１Ｍクエン酸にてｐＨ７に調整した直後に、ジメチルアミンボランを加えたこと以外は、実施例２６と同じ操作をして吸着体を得た。取得した吸着体のＩｇＧ動的吸着量は、担体１ｍＬあたり３１ｍｇ、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度は２２ｐｐｍであった。【０２２４】
（実施例３３）
作製例１で作製した多孔質粒子Ｂを、ｐＨ３のクエン酸バッファー（和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸一水和物、ＲＯ水を用いて調整）２８２ｍＬで置換し、該バッファーを用いて液量を調整し、また、過ヨウ素酸ナトリウムを０．１６ｇとした以外は、実施例３２と同様の操作で吸着体を作製した。このとき、多孔質担体Ｅのホルミル基含量は多孔質担体１ｍＬあたり７μｍｏｌであり、アフィニティーリガンドであるプロテインＡの固定化量は、多孔質担体１ｍＬ当り、５．０ｍｇであった。また、ＩｇＧ動的吸着量は３１ｍｇであり、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度は３６ｐｐｍであった。得られた吸着体のホルミル基含量は、多孔質担体１ｍＬあたり０．２μｍｏｌであった。【０２２５】
（比較例４）
ジメチルアミンボランを用いず、実施例１６と同様の操作で吸着体を得た。得られた吸着体のホルミル基含量は多孔質担体１ｍＬあたり２μｍｏｌであった。また、ＩｇＧ動的吸着量は、担体１ｍＬあたり２７ｍｇであり、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度は、６１５ｐｐｍであった。
【国際調査報告】
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