(57)【要約】  本発明は、テロメラーゼによるＤＮＡ伸張反応を阻害する方法を提供することを目的とする。  具体的に本発明は、テロメラーゼによるＤＮＡ伸張反応を阻害する方法であって、  テロメラーゼ、テロメラーゼ反応の基質となるＤＮＡ、およびｄＮＴＰを含有する溶液に、アニオン性フタロシアニンを添加する工程を有する、ことを特徴とする方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
テロメラーゼによるＤＮＡ伸張反応を阻害する方法であって、
テロメラーゼ、テロメラーゼ反応の基質となるＤＮＡ、およびｄＮＴＰを含有する溶液に、アニオン性フタロシアニンを添加する工程を有する、方法。
【請求項２】
前記溶液が緩衝液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アニオン性フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アニオン性フタロシアニンは、配位金属として銅、亜鉛、コバルト若しくはニッケルを有するアニオン性フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性フタロシアニンのいずれかである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はテロメラーゼによるＤＮＡ伸長反応を阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）は真核生物の染色体の両末端部分に位置するＤＮＡとさまざまなタンパク質からなる構造である。ヒトの場合、このテロメア部分におけるＤＮＡ（以下、単に「テロメアＤＮＡ」と呼ぶ）は５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’（配列番号：１）という６塩基の繰り返し配列でおよそ1万塩基対存在しており、３’末端では１００塩基ほど突出（オーバーハング）して一本鎖になっている。【０００３】
これまでの研究により、通常の体細胞におけるテロメアＤＮＡは、細胞分裂が行われるたびに短くなり、５０００塩基対程度になると分裂寿命の限界に達し、分裂できなくなった細胞は最終的にはアポトーシスへと至ることが知られている。【０００４】
しかしながらその一方で、癌細胞の７０〜８０％においては、短くなったテロメアＤＮＡを再び伸長させるテロメラーゼの活性が非常に高いため、その細胞が分裂寿命に至らず分裂をし続けてしまうことが明らかになってきている。したがって、近年このテロメラーゼによるテロメアＤＮＡの伸長反応（以下、単に「テロメラーゼ反応」と呼ぶ）は、癌治療における重要な標的であると考えられており、この反応の阻害剤や阻害方法が精力的に研究されている。【０００５】
テロメラーゼ反応の阻害方法は、種々提案されているが、その中にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造の安定化による阻害方法がある。Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造とはグアニン塩基に富んだＤＮＡ配列から形成される四重鎖ＤＮＡ構造のことであり、テロメアＤＮＡ配列（５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’、配列番号：１）の一本鎖部分もＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を形成できる配列である。【０００６】
テロメラーゼはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造には結合できないため、テロメアＤＮＡ中おいてＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を安定に存在させることができればテロメラーゼ反応は阻害できる。従って、これまで様々な化合物によりＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造安定化を介したテロメラーゼ反応阻害方法が提案されてきた。【０００７】
特許文献１ではピラゾロン誘導体によるテロメラーゼ反応阻害効果が報告されている。特許文献２では一般式：四級窒素原子を有する窒素含有芳香環−（ＮＲ３）ｐ−ＣＯ−分配剤−（ＣＯ）ｍ−（ＮＲ’３）ｑ−Ｘ−芳香環または非芳香環、からなる化合物によるテロメラーゼ反応阻害効果が報告されている。また特許文献３では下記（化１）の構造からなる化合物によるテロメラーゼ反応阻害効果が報告されている。【０００８】
【化１】
2010116423.tif 000003
【０００９】
非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３ではそれぞれ、テロメスタチン、Ｐｈｅｎ−ＤＣ３、３６０Ａによるテロメラーゼ反応阻害効果が報告されている。またさらに非特許文献４ではＴＭＰｙＰ４によるテロメラーゼ反応阻害効果が報告されている。これら以外にも例えばペリレン誘導体やキノリンおよびキノリン関連物質が同様の阻害効果があることが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００５−２８９８７４号公報
【特許文献２】特表２００６−５１８７２６号公報
【特許文献３】特表２００４−５０５０８２号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００２）１２４，２０９８−２０９９
【非特許文献２】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００７）１２９，１８５６−１８５７
【非特許文献３】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００５）２４，２９１７−２９２８
【非特許文献４】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０，３２６１−３２６２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述したテロメラーゼ反応阻害に関わる化合物において最も重要な点は、二重らせん構造ＤＮＡとは相互作用せず、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造に対して特異的に結合しなければいけない点である。【００１３】
何故ならゲノムＤＮＡの大半は二重らせん構造であり、これら化合物が非特異的にゲノムＤＮＡと相互作用することは細胞毒性へとつながるためである。より具体的には、これら化合物が二重らせん構造ＤＮＡに対しても非特異的に結合してしまうと、ＤＮＡの複製に必要なポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応までも阻害してしまう。【００１４】
これまでＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造安定によるテロメラーゼ反応阻害を目的として開発されてきた化合物はいずれも電気的に中性かカチオン性である。これはＤＮＡ自身がアニオン性であるため、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへ結合させるという観点から考えた場合、アニオン性の化合物は静電的な反発が起こり、結合反応において不利と考えられるためである。従って、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造安定によるテロメラーゼ反応阻害を目的とした場合、アニオン性の化合物を用いるという考え方はなかった。【００１５】
以上のような背景の下、本発明者は鋭意検討した結果、アニオン性のフタロシアニンがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造と特異的に相互作用し、かつ高いテロメラーゼ反応阻害効果を有していることを見出し、本発明を達成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題を解決する本発明は、
テロメラーゼによるＤＮＡ伸張反応を阻害する方法であって、アニオン性フタロシアニンをテロメラーゼ阻害剤としてテロメラーゼの基質となるＤＮＡと反応させることを特徴とするテロメラーゼ反応阻害方法に関する。【００１７】
具体的には、本発明に係るテロメラーゼ反応阻害方法は、テロメラーゼ、テロメラーゼ反応の基質となるＤＮＡ、およびｄＮＴＰを含有する溶液（多くの場合、緩衝液）に、アニオン性フタロシアニンを添加する。【００１８】
前記アニオン性フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有していることが望ましい。【００１９】
前記アニオン性フタロシアニンは、銅、亜鉛、コバルトおよびニッケルからなる群より得られる少なくとも一種の金属が配位したアニオン性フタロシアニンであるか、または金属が配位していないアニオン性フタロシアニンのいずれかであることが望ましい。【００２０】
本発明の上記目的、他の目的、特徴および利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、化合物による二重らせん構造ＤＮＡへの非特異的結合がなく、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造に対して特異的に相互作用しテロメラーゼ反応を阻害できる方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本発明の実施形態（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）を説明するための図である。
【図２】図２は、本発明の実施形態（ｉｎ  ｖｉｖｏ（ヒト細胞内））を説明するための図である。
【図３】図３は、本発明の実施形態で用いられるアニオン性フタロシアニンの例を示す図である。
【図４】図４は、比較例１における電気泳動結果を示すグラフである。
【図５】図５は、比較例１〜２および実施例１〜３の各電気泳動解析結果に基づき、ＰＣＲ  ｃｏｎｔｒｏｌのピークのＤＮＡ濃度と、ＴＭＰｙＰあるいは各アニオン性フタロシアニンの反応液中における濃度との関係を示したグラフである。
【図６】図６は、比較例１〜２および実施例１〜３の各電気泳動解析結果に基づき、ラダー状のピークに相当する反応産物中の合計ＤＮＡ濃度と、ＴＭＰｙＰあるいは各アニオン性フタロシアニンの反応液中における濃度との関係を示したグラフである。
【図７】図７は、アンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造が形成されていることを示すＣＤ測定結果を示すグラフである。
【図８】図８は、実施例４において、ＣｕＰＣとＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図９】図９は、実施例４において、ＣｕＰＣと一本鎖ＤＮＡ（Ａ）、あるいはＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ（Ｂ）を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１０】図１０は、実施例５において、ＮｉＰＣとＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１１】図１１は、実施例５において、ＮｉＰＣと一本鎖ＤＮＡ（Ａ）、あるいはＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ（Ｂ）を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１２】図１２は、実施例６において、ＰＣとＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１３】図１３は、実施例６において、ＰＣと一本鎖ＤＮＡ（Ａ）、あるいはＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ（Ｂ）を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１４】図１４は、実施例７において、ＣｏＰＣとＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１５】図１５は、実施例７において、ＣｏＰＣと一本鎖ＤＮＡ（Ａ）、あるいはＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ（Ｂ）を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１６】図１６は、比較例３における、λＤＮＡ非存在下でのＴＭＰｙＰによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。
【図１７】図１７は、比較例３における、λＤＮＡ存在下でのＴＭＰｙＰによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。
【図１８】図１８は、実施例４における、λＤＮＡ非存在下でのＣｕＰＣによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。
【図１９】図１９は、実施例４における、λＤＮＡ存在下でのＣｕＰＣによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。
【図２０】図２０は、実施例５における、λＤＮＡ非存在下でのＮｉＰＣによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。
【図２１】図２１は、実施例６における、λＤＮＡ存在下でのＮｉＰＣによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下本発明の実施の形態について、適宜図面を参酌しながら説明する。
【００２４】
まず、本発明の実施形態の一例として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアニオン性フタロシアニンによるテロメラーゼ反応阻害方法について、図１を用いて説明する。
【００２５】
まず、図１（ａ）に示すように、テロメラーゼ、テロメラーゼの基質となるＤＮＡ、およびｄＮＴＰを含有する溶液においては、テロメラーゼ反応が生じる。これにより、テロメラーゼの基質となるＤＮＡは、テロメアＤＮＡを繰り返しながら３’方向に伸長する。
【００２６】
一方、後述する実施例から裏付けられるように、図１（ｂ）に示すように、テロメラーゼ、テロメラーゼの基質となるＤＮＡ、およびｄＮＴＰを含有する溶液に、アニオン性フタロシアニンがさらに含有されている場合には、テロメラーゼ反応が抑制される。これが本発明の趣旨である。
【００２７】
ここで、「テロメラーゼの基質となるＤＮＡ」としては、例えば、ＴＳｐｒｉｍｅｒ、テロメアＤＮＡ（配列番号：１）を挙げることができる。
【００２８】
本明細書において用いられる用語「ｄＮＴＰ」とは、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）の混合物を意味する。ただし、テロメアＤＮＡ（配列番号：１）は、Ｃ（シトシン）を有しないので、「ｄＮＴＰ」にはｄＣＴＰが含まれなくても良い。なお、ｄＡＴＰとはデオキシアデノシントリホスフェート、ｄＣＴＰとはデオキシシチジントリホスフェート、ｄＧＴＰとはデオキシグアノシントリホスフェート、ｄＴＴＰとはデオキシチミジントリホスフェートである。
【００２９】
次に、本発明の実施形態の一例として、ｉｎ  ｖｉｖｏ（ヒト細胞内）におけるアニオン性フタロシアニンによるテロメラーゼ反応阻害方法について、図２を用いて説明する。図２（ａ）に示すように、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、細胞に含まれる二重鎖ＤＮＡの末端が有するテロメア部分は、テロメアＤＮＡ：５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’（配列番号：１）の繰り返し配列からなる。そして、このようなテロメア部分、テロメラーゼおよびｄＮＴＰが存在すれば、テロメラーゼ反応が生じる。
【００３０】
しかし、図２（ｂ）に示すように、アニオン性フタロシアニンが存在すれば、細胞内テロメラーゼ反応は抑制される。
【００３１】
本発明の実施形態におけるアニオン性フタロシアニンは、図３に示すように、銅、亜鉛、コバルトおよびニッケルからなる群より得られる少なくとも一種の金属が配位したアニオン性フタロシアニンであるか、または金属が配位していないアニオン性フタロシアニンのいずれかであることが好ましい。また、本発明の実施形態におけるアニオン性フタロシアニンは、図３に示すように、官能基として、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種を有していることが好ましい。
【実施例】
【００３２】
以下の実施例で用いられるフタロシアニンのうち、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（以下、単にＣｕＰＣと呼ぶ）およびＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（以下、単にＮｉＰＣと呼ぶ）はシグマ・アルドリッチ（株）より購入した。Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（以下、単にＰＣと呼ぶ）およびＺｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（以下、単にＺｎＰＣと呼ぶ）は（株）フナコシより購入した。ＴＭＰｙＰは同仁化学研究所（株）より購入した。Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（以下、単にＣｏＰＣと呼ぶ）は発明者が合成した。合成方法は下記のとおりである。【００３３】
トリメリット酸６．４ｇ、尿素２０ｇ、塩化コバルト六水和物４．７５ｇおよびモリブデン酸アンモニウム四水和物０．８２ｇを１００ｍＬのニトロベンゼン中１７０〜１８０℃の油浴中で４．５時間加熱し、放冷後、デカンテーションでニトロベンゼン層を除いた。残留物をメタノールおよび水で洗浄後、真空乾燥して８．６６ｇの固形物を得た。この固形物１．０ｇを５０％水酸化カリウム水溶液３０ｇ中、７０〜７５℃で２時間攪拌後、９０ｍＬの水を添加、攪拌し、これをろ過した。ここで得られたろ液を３５〜３７％塩酸で強酸性にすることで沈殿物を析出させ、これをろ取した。この沈殿物を１００ｍＬの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶かして再度ろ過した。ここで得られたろ液を再び塩酸によって強酸性にし、析出した沈殿物をろ取した。これを大量の水で洗浄した後、真空乾燥することでＣｏＰＣを０．１ｇの粉末として得た。以下の実施例で用いられるＣｏＰＣはこの合成により得られた。【００３４】
−アニオン性フタロシアニンによるテロメラーゼ活性阻害効果の検討−
以下、比較例１、２および実施例１、２、３について説明する。ここでは、従来知られている代表的なテロメラーゼ阻害効果材料のカチオン性ポルフィリン（ＴＭＰｙＰ）と、アニオン性フタロシアニンによるテロメラーゼ阻害効果について、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のテロメラーゼ活性測定用キット（ＴＲＡＰＥＺＥ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｚｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｓ７７００）を用いて比較検討を行った。【００３５】
ＴＲＡＰＥＺＥ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｚｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｓ７７００（以下、単にＳ７７００キットと呼ぶ）は、１０×ＴＲＡＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、５０×ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ、ＴＳ  ｐｒｉｍｅｒ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ、ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃｅｌｌ  ｐｅｌｌｅｔを含むキットである。【００３６】
ここで、ＴＲＡＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒはＳ７７００キットを用いて反応を行うための緩衝液である。【００３７】
ｄＮＴＰ  ＭｉｘはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合液である。【００３８】
ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃｅｌｌ  ｐｅｌｌｅｔは、テロメラーゼを含む細胞のペレットであり、これよりテロメラーゼを含む溶液を調製することができる。【００３９】
ＴＳ  ｐｒｉｍｅｒは、５’ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ３’からなるオリゴＤＮＡで、ヒトのテロメアＤＮＡ配列と同様に、テロメラーゼによる結合を受け、テロメラーゼ反応の開始配列となる。【００４０】
本来であれば、このＴＳ  ｐｒｉｍｅｒから開始したテロメラーゼ反応の反応産物量を直接定量できればよい。しかし、この産物量は非常に少ないため、電気泳動などでは検出できず、得られたテロメラーゼ反応産物をＰＣＲで増幅する必要がある。【００４１】
そのためＳ７７００キットのＰｒｉｍｅｒ  ＭｉｘにはＲＰ  ｐｒｉｍｅｒが含まれている。このプライマーは、テロメラーゼ反応により伸長された配列に相補的な配列を有するオリゴＤＮＡであり、したがって、上記ＴＳ  ｐｒｉｍｅｒと、このＲＰ  ｐｒｉｍｅｒとでＰＣＲを行うことにより、電気泳動などで検出可能な量までテロメラーゼ反応産物を増幅させることができる。【００４２】
ＰＣＲには耐熱性のポリメラーゼが必要であるが、Ｓ７７００キットには含まれていないので、今回はＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いた。【００４３】
以上のように、Ｓ７７００キットを用いたテロメラーゼ活性測定では、テロメラーゼ反応とＰＣＲを順に行わせる。【００４４】
実際には、比較例１〜２および実施例１〜３で詳細に説明するように、必要な試薬は全て最初に混合し、この反応液の温度制御をすることで、テロメラーゼ反応とＰＣＲを順に行わせる。【００４５】
このとき、テロメラーゼ反応を阻害すると期待される材料（今回の場合は、ＴＭＰｙＰとアニオン性フタロシアニン）も最初に混合しておく。そして最後に行う電気泳動結果で、テロメラーゼ反応産物が検出されるか否かを確認すればよい。【００４６】
しかし、ここで気をつけなければいけないのは、電気泳動の結果、テロメラーゼ反応産物が検出されなかったとしても、テロメラーゼ反応を阻害すると期待される材料が、実際にテロメラーゼ反応を阻害したとは言えない点である。【００４７】
すなわち、テロメラーゼ反応は阻害していないが、その後のＰＣＲを阻害している可能性がある。【００４８】
例えば、二本鎖ＤＮＡに非特異的に結合する材料などはＰＣＲを阻害する可能性が高い。したがって、Ｓ７７００キットの反応のように、テロメラーゼ反応とＰＣＲを行う場合は、テロメラーゼ反応を阻害すると期待される材料が、通常のＰＣＲは阻害しないことを確認しておく必要がある。【００４９】
Ｓ７７００キットには、それを確認するための鋳型ＤＮＡとプライマーのセットがＰｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ中に含まれており、ＰＣＲを行うと、このセットから３６ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られる。【００５０】
従って、Ｓ７７００キットを用いてテロメラーゼ反応を阻害すると期待される材料の効果を検証する場合、最後の電気泳動結果において、テロメラーゼ反応産物が検出されないことと、この３６ｂｐのＰＣＲ産物が正常に増幅されていることを確認する必要がある。【００５１】
（比較例１）
比較例１では、上述のとおり、Ｓ７７００キットを用いて、キットに添付されたテロメラーゼの活性について測定した。測定手順は以下のとおりであった。【００５２】
まずキットのプロトコルに従い、添付されたｃｏｎｔｒｏｌ  ｃｅｌｌ  ｐｅｌｌｅｔよりテロメラーゼ溶液を調製した。次に、１０×ＴＲＡＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを２μＬ、５０×ｄＮＴＰ  Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＳ  ｐｒｉｍｅｒを０．４μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．４μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水（精製水）を１４．８μＬ、上記調製済みテロメラーゼ溶液を１．６μＬ混合し、全容量２０μＬの反応液を調製した。【００５３】
そしてこの反応液を３０℃条件下に３０分間置くことでテロメラーゼ反応を行った後、９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で１分間の温度サイクルを３３回繰り返すことでＰＣＲを行った。ＰＣＲ後の反応溶液については、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）による電気泳動解析を行った。【００５４】
電気泳動解析結果を図４に示す。【００５５】
ここで、図４において参照符号「１」で示されるＬｏｗｅｒ  Ｍａｒｋｅｒおよび参照符号「２」で示されるＵｐｐｅｒ  Ｍａｒｋｅｒと示されたピークは、電気泳動されたサンプルＤＮＡの長さや濃度を解析するための電気泳動解析用内部コントロールである。したがって上記のテロメラーゼ反応およびＰＣＲ反応結果とは関係ない。【００５６】
一方、ＰＣＲ  ｃｏｎｔｒｏｌと示されたピークは、上述のＰｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘに含まれる鋳型ＤＮＡとプライマーのセットから得られる３６ｂｐのＰＣＲ増幅産物である。【００５７】
したがって、上記テロメラーゼ反応の有無に関係なく得られるものであり、ＰＣＲ反応が良好に行われたか否かを示すピークである。そして残りのラダー状のピークは、テロメラーゼ反応によって得られた様々な長さのＤＮＡ断片がその後のＰＣＲ反応によって増幅されたものである。したがって、本比較例１ではテロメラーゼ反応およびＰＣＲ反応の両方が行われたことが分かる。【００５８】
Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００による解析の結果、ＰＣＲ  ｃｏｎｔｒｏｌのピークに相当する反応産物中のＤＮＡ濃度は１．２３ｎｇ／μＬであり、またラダー状のピークに相当する反応産物中の合計ＤＮＡ濃度は２．９５ｎｇ／μＬであった。【００５９】
（比較例２）
比較例２では、比較例１と同様に、Ｓ７７００キットを用いて、キットに添付されたテロメラーゼの活性について測定した。ただしその際、反応液中にＴＭＰｙＰを添加した。具体的には以下のとおりであった。【００６０】
１０×ＴＲＡＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを２μＬ、５０×ｄＮＴＰ  Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＳ  ｐｒｉｍｅｒを０．４μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．４μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水を１２．８μＬ、比較例１での調製済みテロメラーゼ溶液を１．６μＬ、ＴＭＰｙＰ水溶液２μＬを混合し、全容量２０μＬの反応液を調製した（ＴＭＰｙＰの終濃度が０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭのものをそれぞれ調製した）。【００６１】
その後、比較例１と同様にこの反応液を３０℃条件下に３０分間置き、さらにその後、９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で１分間の温度サイクルを３３回繰り返した。ＰＣＲ後の反応溶液については、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００による電気泳動解析を行った。【００６２】
（実施例１）
実施例１では、比較例１と同様に、Ｓ７７００キットを用いて、キットに添付されたテロメラーゼの活性について測定した。ただしその際、反応液中にＣｕＰＣを添加した。具体的には以下のとおりであった。【００６３】
１０×ＴＲＡＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを２μＬ、５０×ｄＮＴＰ  Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＳ  ｐｒｉｍｅｒを０．４μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．４μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水を１２．８μＬ、比較例１での調製済みテロメラーゼ溶液を１．６μＬ、ＣｕＰＣ水溶液２μＬを混合し、全容量２０μＬの反応液を調製（ＣｕＰＣの終濃度が０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭのものをそれぞれ調製した）。【００６４】
その後、比較例１と同様にこの反応液を３０℃条件下に３０分間置き、さらにその後、９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で１分間の温度サイクルを３３回繰り返した。ＰＣＲ後の反応溶液については、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００による電気泳動解析を行った。【００６５】
（実施例２）
実施例２では、比較例１と同様に、Ｓ７７００キットを用いて、キットに添付されたテロメラーゼの活性について測定した。ただしその際、反応液中にＮｉＰＣを添加した。具体的には以下のとおりであった。【００６６】
１０×ＴＲＡＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを２μＬ、５０×ｄＮＴＰ  Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＳ  ｐｒｉｍｅｒを０．４μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．４μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水を１２．８μＬ、比較例１での調製済みテロメラーゼ溶液を１．６μＬ、ＮｉＰＣ水溶液２μＬを混合し、全容量２０μＬの反応液を調製（ＮｉＰＣの終濃度が０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭのものをそれぞれ調製した）。【００６７】
その後、比較例１と同様にこの反応液を３０℃条件下に３０分間置き、さらにその後、９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で１分間の温度サイクルを３３回繰り返した。ＰＣＲ後の反応溶液については、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００による電気泳動解析を行った。【００６８】
（実施例３）
実施例３では、比較例１と同様に、Ｓ７７００キットを用いて、キットに添付されたテロメラーゼの活性について測定した。ただしその際、反応液中にＰＣを添加した。具体的には以下のとおりであった。【００６９】
１０×ＴＲＡＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを２μＬ、５０×ｄＮＴＰ  Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＳ  ｐｒｉｍｅｒを０．４μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．４μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水を１２．８μＬ、比較例１での調製済みテロメラーゼ溶液を１．６μＬ、ＰＣ水溶液２μＬを混合し、全容量２０μＬの反応液を調製（ＰＣの終濃度が０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭのものをそれぞれ調製した）。【００７０】
その後、比較例１と同様にこの反応液を３０℃条件下に３０分間置き、さらにその後、９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で１分間の温度サイクルを３３回繰り返した。ＰＣＲ後の反応溶液については、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００による電気泳動解析を行った。【００７１】
以上、比較例１〜２および実施例１〜３の各電気泳動解析結果に基づき、ＰＣＲ  ｃｏｎｔｒｏｌのピークのＤＮＡ濃度と、ＴＭＰｙＰあるいは各アニオン性フタロシアニンの反応液中における濃度の関係を、図５に示した。すなわち、ＰＣＲ  ｃｏｎｔｒｏｌのピークのＤＮＡ濃度を縦軸にとり、ＴＭＰｙＰあるいは各アニオン性フタロシアニンの反応液中における濃度を横軸にとり、これらの関係についてプロットした（横軸で０は、各アニオン性フタロシアニンあるいはＴＭＰｙＰの何れも含まれていない比較例１の結果である）。【００７２】
図５から、ＴＭＰｙＰの濃度に依存して顕著にＤＮＡ濃度が減少しており、ＴＭＰｙＰ濃度が３μＭ以上におけるＤＮＡ濃度はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００の検出限界以下となったことが分かる。【００７３】
すなわちこの結果は、ＴＭＰｙＰが通常のＰＣＲ反応を阻害しているためであり、これはＴＭＰｙＰが鋳型である二本鎖ＤＮＡに非特異的に結合しているためと考えられる。【００７４】
一方、各アニオン性フタロシアニンの場合、ＤＮＡ濃度の減少はＴＭＰｙＰと比較して穏やかであり、これらアニオン性フタロシアニンの濃度が３μＭである場合でも１．１ｎｇ／μＬ以上のＤＮＡが検出された。すなわち、これらアニオン性フタロシアニンによる二本鎖ＤＮＡへの非特異的結合がＴＭＰｙＰと比べ非常に少ないことが分かる。【００７５】
次に、図６において、ラダー状のピークに相当する反応産物中の合計ＤＮＡ濃度を縦軸にとり、ＴＭＰｙＰあるいは各アニオン性フタロシアニンの反応液中における濃度を横軸にとり、これらの関係についてプロットした（横軸で０は、ＴＭＰｙＰあるいは各アニオン性フタロシアニンの何れも含まれていない比較例１の結果である）。【００７６】
図６に示すように、各アニオン性フタロシアニンの場合、その濃度に依存してＤＮＡ濃度が減少しており、各アニオン性フタロシアニンが０．１μＭ以上の場合、１．０ｎｇ／μＬ以下となった。一方、ＴＭＰｙＰの場合、１．１μＭ添加された場合であっても、ラダー状のピークに相当する反応産物中の合計ＤＮＡ濃度は２．７ｎｇ／μＬであった。【００７７】
すなわち、これらの結果より、テロメラーゼ反応への阻害効果は、従来阻害物質候補として知られていたカチオン性物質のＴＭＰｙＰよりも、今回用いたアニオン性フタロシアニンのほうが明らかに大きいことが示された。【００７８】
以上まとめると、比較例１〜２および実施例１〜３の結果から、アニオン性フタロシアニンは、従来のテロメラーゼ反応阻害物質候補として知られているカチオン性物質のＴＭＰｙＰと比べ、顕著にテロメラーゼ反応阻害効果が大きく、またポリメラーゼ反応への阻害が小さいことがわかった。【００７９】
さらに、以下比較例３および実施例４〜５を用いてＴＭＰｙＰとアニオン性フタロシアニンによるテロメラーゼ阻害効果について比較する。これらの実験では、上記比較例１〜２および実施例１〜３と同じくＳ７７００キットが用いられている。しかし、上記比較例１〜２および実施例１〜３では、テロメラーゼ反応とＰＣＲに必要な試薬は全て最初に混合し、反応温度を制御することでテロメラーゼ反応とＰＣＲを順に行わせたのに対し、以下の比較例３および実施例４〜５では、まずテロメラーゼ反応に必要な試薬のみを混合してテロメラーゼ反応を行わせた後、その反応液の一部とＰＣＲに必要な試薬を混合し、ＰＣＲを行わせた。【００８０】
また、以下比較例３および実施例４〜５のそれぞれにおいて、テロメラーゼ反応時に、λＤＮＡを添加した場合としていない場合の実験を行っている。λＤＮＡの添加の意図は、λＤＮＡを添加することで、細胞のゲノムＤＮＡのように大量の二本鎖ＤＮＡが存在する条件を擬似的に再現し、このよりｉｎ  ｖｉｖｏに近い条件でもＴＭＰｙＰやアニオン性フタロシアニンがテロメラーゼ阻害効果を発揮し得るか否かを検討するものである。【００８１】
（比較例３）
比較例３では、Ｓ７７００キットを用いて、ＴＭＰｙＰによるテロメラーゼ活性阻害効果について検討した。具体的には以下のとおりであった。【００８２】
１０×ＴＲＡＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを１μＬ、５０×ｄＮＴＰ  Ｍｉｘを０．２μＬ、ＴＳ  ｐｒｉｍｅｒを０．２μＬ、比較例１での調製済みテロメラーゼ溶液を４μＬ、ＴＭＰｙＰ水溶液を２μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水を２．６μＬ混合し、全容量１０μＬのテロメラーゼ反応液を調製した（ＴＭＰｙＰの終濃度が０Ｍ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭのものをそれぞれ調製した）。そして、この反応液を３０℃条件下に６０分間置くことでテロメラーゼ反応を行った。【００８３】
次に、このテロメラーゼ反応後の溶液をｍｉｌｌｉＱ水で２０倍に希釈したものを４μＬ、５０×ｄＮＴＰ  Ｍｉｘを０．２μＬ、ＴＳ  ｐｒｉｍｅｒを０．２μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを０．２μＬ、ＴａＫａＬａ  ＬＡ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ株式会社製）を０．１μＬ、１０×ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（Ｍｇ２＋  ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＬａ  ＬＡ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎの付属緩衝液）を１μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水を４．３μＬ混合し、全容量１０μＬのＰＣＲ溶液を調製した。そしてこのＰＣＲ溶液を、９５℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の温度サイクルを３０回繰り返す温度条件下に置き、ＰＣＲを行った。【００８４】
最後に、ＰＣＲ後の溶液を１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＧｅｌＳｔａｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔａｉｎ（タカラバイオ株式会社製）により染色した。以上より得られたゲルの結果を図１６に示す。一番左のレーンより順に、ＴＭＰｙＰの終濃度が０Ｍ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭの結果である。これよりＴＭＰｙＰの終濃度が大きくなるにつれ、テロメラーゼ反応産物を示すバンドが薄くなっており、ＴＭＰｙＰがテロメラーゼ反応を阻害していることが分かる。ただし、１０μＭのＴＭＰｙＰの条件ではＰＣＲ  ｃｏｎｔｒｏｌを示すバンドも薄くなっており、ポリメラーゼ反応も阻害していることが分かる。【００８５】
一方で、テロメラーゼ反応液にλＤＮＡを添加した実験も行った。すなわち、上記テロメラーゼ反応液調製の際に、ｍｉｌｌｉＱ水を２．６μＬ混合する代わりに、λＤＮＡ溶液（タカラバイオ株式会社製）を２．６μＬ混合した。その他のテロメラーゼ反応温度／時間条件、ＰＣＲ溶液調製条件、ＰＣＲ温度／時間条件、電気泳動条件は全く同じである。この結果を図１７に示す。【００８６】
これより、図１６と大きく異なり、λＤＮＡ存在下では、ＴＭＰｙＰの濃度が大きくなっても全くテロメラーゼ反応が阻害されていないことが分かる。すなわちゲノムＤＮＡのように大量に二本鎖ＤＮＡが存在する条件下では、ＴＭＰｙＰによるテロメラーゼ阻害効果は著しく小さくなることが分かる。【００８７】
（実施例４）
実施例４では、比較例３と同じ実験を、ＴＭＰｙＰの代わりにＣｕＰＣを用いて行った。実験結果を図１８および図１９に示す。まず、図１８はλＤＮＡを添加していない条件下での結果であり、一番左のレーンより順に、ＣｕＰＣの終濃度が０Ｍ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭの結果である。これより、この条件下でＣｕＰＣの濃度が大きくなるに従いテロメラーゼ反応が阻害されていることが分かる。またＴＭＰｙＰの場合（図１６）と異なり、１０μＭＣｕＰＣの場合であっても、ＰＣＲ  ｃｏｎｔｒｏｌの増幅は阻害されていない。【００８８】
一方、図１９はλＤＮＡ存在下での結果を示すものである。これより、ＴＭＰｙＰの場合と異なりλＤＮＡ存在下であってもＣｕＰＣはテロメラーゼ反応を効率よく阻害できることが分かる。すなわち、ゲノムＤＮＡのように大量に二本鎖ＤＮＡが存在する条件下であってもＣｕＰＣはそのテロメラーゼ阻害効果を発揮できることが分かる。【００８９】
（実施例５）
実施例５では、比較例３と同じ実験を、ＴＭＰｙＰの代わりにＮｉＰＣを用いて行った。実験結果を図２０および図２１に示す。まず図２０はλＤＮＡを添加していない条件下での結果であり、一番左のレーンより順に、ＮｉＰＣの終濃度が０Ｍ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭの結果である。これより、この条件下でＮｉＰＣの濃度が大きくなるに従いテロメラーゼ反応が阻害されていることが分かる。またＴＭＰｙＰの場合（図１６）と異なり、１０μＭＮｉＰＣの場合であっても、ＰＣＲ  ｃｏｎｔｒｏｌの増幅は阻害されていない。【００９０】
一方、図２１はλＤＮＡ存在下での結果を示すものである。これより、ＴＭＰｙＰの場合と異なりλＤＮＡ存在下であってもＮｉＰＣはテロメラーゼ反応を効率よく阻害できることが分かる。すなわち、ゲノムＤＮＡのように大量に二本鎖ＤＮＡが存在する条件下であってもＮｉＰＣはそのテロメラーゼ反応阻害効果を発揮できることが分かる。【００９１】
以上、比較例３および実施例４〜５の結果から、アニオン性フタロシアニンであるＣｕＰＣおよびＮｉＰＣは、従来のテロメラーゼ反応阻害物質候補として知られているカチオン性物質のＴＭＰｙＰと異なり、ゲノムＤＮＡのように大量に二本鎖ＤＮＡが存在している条件下であっても、効率よくテロメラーゼ反応を阻害できることが分かった。【００９２】
−アニオン性フタロシアニンと各種ＤＮＡ間の相互作用についての検討−
以下、実施例６、７、８、９において、アニオン性フタロシアニンと各種ＤＮＡ間の相互作用について検討した。そのためまず、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を含む溶液、一本鎖ＤＮＡを含む溶液、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を以下の手順で調製した。【００９３】
＜Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液の調製＞
５’−ｇｇｇｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇ−３’の配列（配列番号：２）からなる一本鎖ＤＮＡ（この配列はヒトのテロメア部分の配列と同様のものであり、そのため以降このＤＮＡをヒトテロメアオリゴＤＮＡと呼ぶ）を含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μＬ）を９０℃で５分間インキュベートした後、２℃／分の降温速度で０℃まで冷やし、最後に０℃で２時間インキュベートした。【００９４】
溶液中に含まれるヒトテロメアオリゴＤＮＡの濃度は、０、０．５、２、５、１０、２５、５０、１００μＭであった。調製後の各溶液についてＣＤ解析を行った結果、図７に示すように、ヒトテロメアオリゴＤＮＡが０μＭであった溶液を除き、いずれの場合も２９５ｎｍ付近に正のピーク、２６５ｎｍ付近に負のピークが認められた。これはアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが形成されていることを示すものである。【００９５】
ヒトテロメアオリゴＤＮＡ濃度が１００μＭであった溶液における上記正および負のピークの絶対値は最も大きく、その他については５０、２５、１０、５、２、０．５μＭの順で小さくなっている。このことは最初に含まれていたヒトテロメアオリゴＤＮＡ濃度が大きければ、得られるアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ濃度も大きいということを示している。以降、ヒトテロメアオリゴＤＮＡ濃度が１００、５０、２５、１０、５、２、０．５μＭであった溶液から調製されたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液を、それぞれＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇと呼ぶ。一方、ヒトテロメアオリゴＤＮＡが含まれていなかった溶液についてはＮＣ溶液と呼ぶ。【００９６】
＜一本鎖ＤＮＡ溶液の調製＞
５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−３’の配列（配列番号：３）からなる一本鎖ＤＮＡが５０μＭの濃度で含まれる５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μＬ）を調製し、これを９０℃で５分間インキュベートした後、２℃／分の降温速度で０℃まで冷やし、最後に０℃で２時間インキュベートした。この結果得られる溶液中のＤＮＡはインキュベート後も一本鎖ＤＮＡである（以降、この溶液を一本鎖ＤＮＡ溶液と呼ぶ）。【００９７】
＜二本鎖ＤＮＡ溶液の調製＞
５’−ＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡ−３’の配列（配列番号：４）からなる一本鎖ＤＮＡと５’−ＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴ−３’の配列（配列番号：５）からなる一本鎖ＤＮＡがそれぞれ５０μＭの濃度で含まれる５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μＬ）を調製し、これを９０℃で５分間インキュベートした後、２℃／分の降温速度で０℃まで冷やし、最後に０℃で２時間インキュベートした。上記二種類のＤＮＡは相補的な関係にあるため、このインキュベートの結果、溶液中において両ＤＮＡは二本鎖ＤＮＡを形成している（以降、この溶液を二本鎖ＤＮＡ溶液と呼ぶ）。【００９８】
（実施例６）
本実施例６ではＣｕＰＣと各種ＤＮＡ間の相互作用について検討した。【００９９】
まず、１５μＭのＣｕＰＣを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μＬ）を調製した。そして、このＣｕＰＣ溶液とＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。【０１００】
測定結果を図８に示す。図８より、ＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｃ＞Ｄ＞Ｅ＞Ｆの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、ＣｕＰＣとＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造間で相互作用があることが分かる。【０１０１】
次に、同様に上記ＣｕＰＣ溶液と一本鎖ＤＮＡ溶液、および上記ＣｕＰＣ溶液と二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図９（Ａ）及び図９（Ｂ）に示す。【０１０２】
それぞれの図において、ＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。図９（Ａ）および図９（Ｂ）より、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがってＣｕＰＣと一本鎖ＤＮＡ間、およびＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ間に相互作用はないことが分かる。【０１０３】
（実施例７）
本実施例７ではＮｉＰＣと各種ＤＮＡ間の相互作用について検討した。【０１０４】
まず、１５μＭのＮｉＰＣを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μＬ）を調製した。そして、このＮｉＰＣ溶液とＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。【０１０５】
測定結果を図１０に示す。図１０より、ＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ＞Ｅ＞Ｆ＞Ｇの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、ＮｉＰＣとＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造間で相互作用があることが分かる。【０１０６】
次に、同様に上記ＮｉＰＣ溶液と一本鎖ＤＮＡ溶液、および上記ＮｉＰＣ溶液と二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）に示す。それぞれの図において、ＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）より、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがってＮｉＰＣと一本鎖ＤＮＡ間、およびＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ間に相互作用はないことが分かる。【０１０７】
（実施例８）
本実施例８ではＰＣと各種ＤＮＡ間の相互作用について検討した。【０１０８】
まず、１５μＭのＰＣを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μＬ）を調製した。そして、このＰＣ溶液とＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。【０１０９】
測定結果を図１２に示す。図１２より、ＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、６６０〜７４０ｎｍの範囲で二つのピークが現れ、またこのピークはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ＞Ｅ＞Ｆ＞Ｇの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、ＰＣとＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造間で相互作用があることが分かる。【０１１０】
次に、同様に上記ＰＣ溶液と一本鎖ＤＮＡ溶液、および上記ＰＣ溶液と二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図１３（Ａ）および図１３（Ｂ）に示す。それぞれの図において、ＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。図１３（Ａ）および図１３（Ｂ）より、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがってＰＣと一本鎖ＤＮＡ間、およびＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ間に相互作用はないことが分かる。【０１１１】
（実施例９）
本実施例９ではＣｏＰＣと各種ＤＮＡ間の相互作用について検討した。【０１１２】
まず、１５μＭのＣｏＰＣを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μＬ）を調製した。そして、このＣｏＰＣ溶液とＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。【０１１３】
測定結果を図１４に示す。図１４より、ＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、６６０〜７４０ｎｍの範囲で二つのピークが現れ、またこのピークはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｇの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、ＣｏＰＣとＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造間で相互作用があることが分かる。【０１１４】
ところでＣｏＰＣを用いた場合に見られた６４０〜７２０ｎｍの範囲のピーク上昇は、ＣｕＰＣやＮｉＰＣやＰＣを用いた場合の結果より小さい。これは合成したＣｏＰＣが十分に精製されていなかったためと考えられる。【０１１５】
次に、同様に上記ＣｏＰＣ溶液と一本鎖ＤＮＡ溶液、および上記ＣｏＰＣ溶液と二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図１５（Ａ）および図１５（Ｂ）に示す。それぞれの図において、ＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。図１５（Ａ）および図１５（Ｂ）より、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがってＣｏＰＣと一本鎖ＤＮＡ間、およびＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ間に相互作用はないことが分かる。【０１１６】
以上のアニオン性フタロシアニンの他、ＺｎＰＣを用いて、同様の実験を行った結果、ＺｎＰＣについてもＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造と特異的に相互作用することが示された。【０１１７】
以上、実施例６〜９についてまとめると、いずれのアニオン性フタロシアニンもＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造とは相互作用を起こすものの極めて特異的であり、一本鎖ＤＮＡや二本鎖ＤＮＡとは相互作用を起こさないことが分かった。したがって、アニオン性フタロシアニンはテロメラーゼ阻害物質として非常に適しており、本発明におけるテロメラーゼ阻害方法は従来の方法と比べ効果的であると言える。【０１１８】
上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施の形態が明らかである。したがって、上記説明は例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造および／または機能の詳細を実質的に変更できる。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明により、テロメラーゼ阻害方法が提供される。テロメラーゼ反応は癌化の原因であることが知られていることから、本発明の方法は癌治療に用いることができる。
【符号の説明】
【０１２０】
１  Ｌｏｗｅｒ  Ｍａｒｋｅｒ
２  Ｕｐｐｅｒ  Ｍａｒｋｅｒ 
３  ＰＣＲ  ｃｏｎｔｒｏｌのピーク
４  ラダー状ピーク
【図１】
2010116423.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2010116423.tif 000022
【図２０】
2010116423.tif 000023
【図２１】
2010116423.tif 000024
【配列表】
2010116423000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年10月30日(2009.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はテロメラーゼによるＤＮＡ伸長反応を阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）は真核生物の染色体の両末端部分に位置するＤＮＡとさまざまなタンパク質からなる構造である。ヒトの場合、このテロメア部分におけるＤＮＡ（以下、単に「テロメアＤＮＡ」と呼ぶ）は５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’（配列番号：１）という６塩基の繰り返し配列でおよそ1万塩基対存在しており、３’末端では１００塩基ほど突出（オーバーハング）して一本鎖になっている。
【０００３】
これまでの研究により、通常の体細胞におけるテロメアＤＮＡは、細胞分裂が行われるたびに短くなり、５０００塩基対程度になると分裂寿命の限界に達し、分裂できなくなった細胞は最終的にはアポトーシスへと至ることが知られている。
【０００４】
しかしながらその一方で、癌細胞の７０〜８０％においては、短くなったテロメアＤＮＡを再び伸長させるテロメラーゼの活性が非常に高いため、その細胞が分裂寿命に至らず分裂をし続けてしまうことが明らかになってきている。したがって、近年このテロメラーゼによるテロメアＤＮＡの伸長反応（以下、単に「テロメラーゼ反応」と呼ぶ）は、癌治療における重要な標的であると考えられており、この反応の阻害剤や阻害方法が精力的に研究されている。
【０００５】
テロメラーゼ反応の阻害方法は、種々提案されているが、その中にＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造の安定化による阻害方法がある。Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造とはグアニン塩基に富んだＤＮＡ配列から形成される四重鎖ＤＮＡ構造のことであり、テロメアＤＮＡ配列（５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’、配列番号：１）の一本鎖部分もＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を形成できる配列である。
【０００６】
テロメラーゼはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造には結合できないため、テロメアＤＮＡ中おいてＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を安定に存在させることができればテロメラーゼ反応は阻害できる。従って、これまで様々な化合物によりＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造安定化を介したテロメラーゼ反応阻害方法が提案されてきた。
【０００７】
特許文献１ではピラゾロン誘導体によるテロメラーゼ反応阻害効果が報告されている。特許文献２では一般式：四級窒素原子を有する窒素含有芳香環−（ＮＲ３）ｐ−ＣＯ−分配剤−（ＣＯ）ｍ−（ＮＲ’３）ｑ−Ｘ−芳香環または非芳香環、からなる化合物によるテロメラーゼ反応阻害効果が報告されている。また特許文献３では下記（化１）の構造からなる化合物によるテロメラーゼ反応阻害効果が報告されている。
【０００８】
【化１】
2010116423.tif 000025
【０００９】
非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３ではそれぞれ、テロメスタチン、Ｐｈｅｎ−ＤＣ３、３６０Ａによるテロメラーゼ反応阻害効果が報告されている。またさらに非特許文献４ではＴＭＰｙＰ４によるテロメラーゼ反応阻害効果が報告されている。これら以外にも例えばペリレン誘導体やキノリンおよびキノリン関連物質が同様の阻害効果があることが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００５−２８９８７４号公報
【特許文献２】特表２００６−５１８７２６号公報
【特許文献３】特表２００４−５０５０８２号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００２）１２４，２０９８−２０９９
【非特許文献２】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００７）１２９，１８５６−１８５７
【非特許文献３】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００５）２４，２９１７−２９２８
【非特許文献４】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０，３２６１−３２６２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述したテロメラーゼ反応阻害に関わる化合物において最も重要な点は、二重らせん構造ＤＮＡとは相互作用せず、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造に対して特異的に結合しなければいけない点である。
【００１３】
何故ならゲノムＤＮＡの大半は二重らせん構造であり、これら化合物が非特異的にゲノムＤＮＡと相互作用することは細胞毒性へとつながるためである。より具体的には、これら化合物が二重らせん構造ＤＮＡに対しても非特異的に結合してしまうと、ＤＮＡの複製に必要なポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応までも阻害してしまう。
【００１４】
これまでＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造安定によるテロメラーゼ反応阻害を目的として開発されてきた化合物はいずれも電気的に中性かカチオン性である。これはＤＮＡ自身がアニオン性であるため、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘへ結合させるという観点から考えた場合、アニオン性の化合物は静電的な反発が起こり、結合反応において不利と考えられるためである。従って、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造安定によるテロメラーゼ反応阻害を目的とした場合、アニオン性の化合物を用いるという考え方はなかった。
【００１５】
以上のような背景の下、本発明者は鋭意検討した結果、アニオン性のフタロシアニンがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造と特異的に相互作用し、かつ高いテロメラーゼ反応阻害効果を有していることを見出し、本発明を達成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題を解決する本発明は、
テロメラーゼによるＤＮＡ伸張反応を阻害する方法であって、アニオン性フタロシアニンをテロメラーゼ阻害剤としてテロメラーゼの基質となるＤＮＡと反応させることを特徴とするテロメラーゼ反応阻害方法に関する。
【００１７】
具体的には、本発明に係るテロメラーゼ反応阻害方法は、テロメラーゼ、テロメラーゼ反応の基質となるＤＮＡ、およびｄＮＴＰを含有する溶液（多くの場合、緩衝液）に、アニオン性フタロシアニンを添加する。
【００１８】
前記アニオン性フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有していることが望ましい。
【００１９】
前記アニオン性フタロシアニンは、銅、亜鉛、コバルトおよびニッケルからなる群より得られる少なくとも一種の金属が配位したアニオン性フタロシアニンであるか、または金属が配位していないアニオン性フタロシアニンのいずれかであることが望ましい。
【００２０】
本発明の上記目的、他の目的、特徴および利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、化合物による二重らせん構造ＤＮＡへの非特異的結合がなく、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造に対して特異的に相互作用しテロメラーゼ反応を阻害できる方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の実施形態（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）を説明するための図である。
【図２】本発明の実施形態（ｉｎ  ｖｉｖｏ（ヒト細胞内））を説明するための図である。
【図３】本発明の実施形態で用いられるアニオン性フタロシアニンの例を示す図である。
【図４】比較例１における電気泳動結果を示すグラフである。
【図５】比較例１〜２および実施例１〜３の各電気泳動解析結果に基づき、ＰＣＲ  ｃｏｎｔｒｏｌのピークのＤＮＡ濃度と、ＴＭＰｙＰあるいは各アニオン性フタロシアニンの反応液中における濃度との関係を示したグラフである。
【図６】比較例１〜２および実施例１〜３の各電気泳動解析結果に基づき、ラダー状のピークに相当する反応産物中の合計ＤＮＡ濃度と、ＴＭＰｙＰあるいは各アニオン性フタロシアニンの反応液中における濃度との関係を示したグラフである。
【図７】アンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造が形成されていることを示すＣＤ測定結果を示すグラフである。
【図８】実施例４において、ＣｕＰＣとＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図９】実施例４において、ＣｕＰＣと一本鎖ＤＮＡ（Ａ）、あるいはＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ（Ｂ）を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１０】実施例５において、ＮｉＰＣとＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１１】実施例５において、ＮｉＰＣと一本鎖ＤＮＡ（Ａ）、あるいはＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ（Ｂ）を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１２】実施例６において、ＰＣとＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１３】実施例６において、ＰＣと一本鎖ＤＮＡ（Ａ）、あるいはＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ（Ｂ）を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１４】実施例７において、ＣｏＰＣとＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１５】実施例７において、ＣｏＰＣと一本鎖ＤＮＡ（Ａ）、あるいはＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ（Ｂ）を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１６】比較例３における、λＤＮＡ非存在下でのＴＭＰｙＰによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。
【図１７】比較例３における、λＤＮＡ存在下でのＴＭＰｙＰによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。
【図１８】実施例４における、λＤＮＡ非存在下でのＣｕＰＣによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。
【図１９】実施例４における、λＤＮＡ存在下でのＣｕＰＣによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。
【図２０】実施例５における、λＤＮＡ非存在下でのＮｉＰＣによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。
【図２１】実施例６における、λＤＮＡ存在下でのＮｉＰＣによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下本発明の実施の形態について、適宜図面を参酌しながら説明する。
【００２４】
まず、本発明の実施形態の一例として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアニオン性フタロシアニンによるテロメラーゼ反応阻害方法について、図１を用いて説明する。
【００２５】
まず、図１（ａ）に示すように、テロメラーゼ、テロメラーゼの基質となるＤＮＡ、およびｄＮＴＰを含有する溶液においては、テロメラーゼ反応が生じる。これにより、テロメラーゼの基質となるＤＮＡは、テロメアＤＮＡを繰り返しながら３’方向に伸長する。
【００２６】
一方、後述する実施例から裏付けられるように、図１（ｂ）に示すように、テロメラーゼ、テロメラーゼの基質となるＤＮＡ、およびｄＮＴＰを含有する溶液に、アニオン性フタロシアニンがさらに含有されている場合には、テロメラーゼ反応が抑制される。これが本発明の趣旨である。
【００２７】
ここで、「テロメラーゼの基質となるＤＮＡ」としては、例えば、ＴＳｐｒｉｍｅｒ、テロメアＤＮＡ（配列番号：１）を挙げることができる。
【００２８】
本明細書において用いられる用語「ｄＮＴＰ」とは、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）の混合物を意味する。ただし、テロメアＤＮＡ（配列番号：１）は、Ｃ（シトシン）を有しないので、「ｄＮＴＰ」にはｄＣＴＰが含まれなくても良い。なお、ｄＡＴＰとはデオキシアデノシントリホスフェート、ｄＣＴＰとはデオキシシチジントリホスフェート、ｄＧＴＰとはデオキシグアノシントリホスフェート、ｄＴＴＰとはデオキシチミジントリホスフェートである。
【００２９】
次に、本発明の実施形態の一例として、ｉｎ  ｖｉｖｏ（ヒト細胞内）におけるアニオン性フタロシアニンによるテロメラーゼ反応阻害方法について、図２を用いて説明する。図２（ａ）に示すように、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、細胞に含まれる二重鎖ＤＮＡの末端が有するテロメア部分は、テロメアＤＮＡ：５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’（配列番号：１）の繰り返し配列からなる。そして、このようなテロメア部分、テロメラーゼおよびｄＮＴＰが存在すれば、テロメラーゼ反応が生じる。
【００３０】
しかし、図２（ｂ）に示すように、アニオン性フタロシアニンが存在すれば、細胞内テロメラーゼ反応は抑制される。
【００３１】
本発明の実施形態におけるアニオン性フタロシアニンは、図３に示すように、銅、亜鉛、コバルトおよびニッケルからなる群より得られる少なくとも一種の金属が配位したアニオン性フタロシアニンであるか、または金属が配位していないアニオン性フタロシアニンのいずれかであることが好ましい。また、本発明の実施形態におけるアニオン性フタロシアニンは、図３に示すように、官能基として、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種を有していることが好ましい。
【００３２】
［実施例］
以下の実施例で用いられるフタロシアニンのうち、Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ−３，４’，４’’，４’’’−ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（以下、単にＣｕＰＣと呼ぶ）およびＮｉｃｋｅｌ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（以下、単にＮｉＰＣと呼ぶ）はシグマ・アルドリッチ（株）より購入した。Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（以下、単にＰＣと呼ぶ）およびＺｉｎｃ（ＩＩ）  ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｔｅｔｒａｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（以下、単にＺｎＰＣと呼ぶ）は（株）フナコシより購入した。ＴＭＰｙＰは同仁化学研究所（株）より購入した。Ｃｏｂａｌｔ（ＩＩ）ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（以下、単にＣｏＰＣと呼ぶ）は発明者が合成した。合成方法は下記のとおりである。
【００３３】
トリメリット酸６．４ｇ、尿素２０ｇ、塩化コバルト六水和物４．７５ｇおよびモリブデン酸アンモニウム四水和物０．８２ｇを１００ｍＬのニトロベンゼン中１７０〜１８０℃の油浴中で４．５時間加熱し、放冷後、デカンテーションでニトロベンゼン層を除いた。残留物をメタノールおよび水で洗浄後、真空乾燥して８．６６ｇの固形物を得た。この固形物１．０ｇを５０％水酸化カリウム水溶液３０ｇ中、７０〜７５℃で２時間攪拌後、９０ｍＬの水を添加、攪拌し、これをろ過した。ここで得られたろ液を３５〜３７％塩酸で強酸性にすることで沈殿物を析出させ、これをろ取した。この沈殿物を１００ｍＬの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶かして再度ろ過した。ここで得られたろ液を再び塩酸によって強酸性にし、析出した沈殿物をろ取した。これを大量の水で洗浄した後、真空乾燥することでＣｏＰＣを０．１ｇの粉末として得た。以下の実施例で用いられるＣｏＰＣはこの合成により得られた。
【００３４】
−アニオン性フタロシアニンによるテロメラーゼ活性阻害効果の検討−
以下、比較例１、２および実施例１、２、３について説明する。ここでは、従来知られている代表的なテロメラーゼ阻害効果材料のカチオン性ポルフィリン（ＴＭＰｙＰ）と、アニオン性フタロシアニンによるテロメラーゼ阻害効果について、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のテロメラーゼ活性測定用キット（ＴＲＡＰＥＺＥ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｚｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｓ７７００）を用いて比較検討を行った。
【００３５】
ＴＲＡＰＥＺＥ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｚｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｓ７７００（以下、単にＳ７７００キットと呼ぶ）は、１０×ＴＲＡＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、５０×ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ、ＴＳ  ｐｒｉｍｅｒ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ、ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃｅｌｌ  ｐｅｌｌｅｔを含むキットである。
【００３６】
ここで、ＴＲＡＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒはＳ７７００キットを用いて反応を行うための緩衝液である。
【００３７】
ｄＮＴＰ  ＭｉｘはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合液である。
【００３８】
ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃｅｌｌ  ｐｅｌｌｅｔは、テロメラーゼを含む細胞のペレットであり、これよりテロメラーゼを含む溶液を調製することができる。
【００３９】
ＴＳ  ｐｒｉｍｅｒは、５’ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ３’からなるオリゴＤＮＡで、ヒトのテロメアＤＮＡ配列と同様に、テロメラーゼによる結合を受け、テロメラーゼ反応の開始配列となる。
【００４０】
本来であれば、このＴＳ  ｐｒｉｍｅｒから開始したテロメラーゼ反応の反応産物量を直接定量できればよい。しかし、この産物量は非常に少ないため、電気泳動などでは検出できず、得られたテロメラーゼ反応産物をＰＣＲで増幅する必要がある。
【００４１】
そのためＳ７７００キットのＰｒｉｍｅｒ  ＭｉｘにはＲＰ  ｐｒｉｍｅｒが含まれている。このプライマーは、テロメラーゼ反応により伸長された配列に相補的な配列を有するオリゴＤＮＡであり、したがって、上記ＴＳ  ｐｒｉｍｅｒと、このＲＰ  ｐｒｉｍｅｒとでＰＣＲを行うことにより、電気泳動などで検出可能な量までテロメラーゼ反応産物を増幅させることができる。
【００４２】
ＰＣＲには耐熱性のポリメラーゼが必要であるが、Ｓ７７００キットには含まれていないので、今回はＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いた。
【００４３】
以上のように、Ｓ７７００キットを用いたテロメラーゼ活性測定では、テロメラーゼ反応とＰＣＲを順に行わせる。
【００４４】
実際には、比較例１〜２および実施例１〜３で詳細に説明するように、必要な試薬は全て最初に混合し、この反応液の温度制御をすることで、テロメラーゼ反応とＰＣＲを順に行わせる。
【００４５】
このとき、テロメラーゼ反応を阻害すると期待される材料（今回の場合は、ＴＭＰｙＰとアニオン性フタロシアニン）も最初に混合しておく。そして最後に行う電気泳動結果で、テロメラーゼ反応産物が検出されるか否かを確認すればよい。
【００４６】
しかし、ここで気をつけなければいけないのは、電気泳動の結果、テロメラーゼ反応産物が検出されなかったとしても、テロメラーゼ反応を阻害すると期待される材料が、実際にテロメラーゼ反応を阻害したとは言えない点である。
【００４７】
すなわち、テロメラーゼ反応は阻害していないが、その後のＰＣＲを阻害している可能性がある。
【００４８】
例えば、二本鎖ＤＮＡに非特異的に結合する材料などはＰＣＲを阻害する可能性が高い。したがって、Ｓ７７００キットの反応のように、テロメラーゼ反応とＰＣＲを行う場合は、テロメラーゼ反応を阻害すると期待される材料が、通常のＰＣＲは阻害しないことを確認しておく必要がある。
【００４９】
Ｓ７７００キットには、それを確認するための鋳型ＤＮＡとプライマーのセットがＰｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ中に含まれており、ＰＣＲを行うと、このセットから３６ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られる。
【００５０】
従って、Ｓ７７００キットを用いてテロメラーゼ反応を阻害すると期待される材料の効果を検証する場合、最後の電気泳動結果において、テロメラーゼ反応産物が検出されないことと、この３６ｂｐのＰＣＲ産物が正常に増幅されていることを確認する必要がある。
【００５１】
（比較例１）
比較例１では、上述のとおり、Ｓ７７００キットを用いて、キットに添付されたテロメラーゼの活性について測定した。測定手順は以下のとおりであった。
【００５２】
まずキットのプロトコルに従い、添付されたｃｏｎｔｒｏｌ  ｃｅｌｌ  ｐｅｌｌｅｔよりテロメラーゼ溶液を調製した。次に、１０×ＴＲＡＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを２μＬ、５０×ｄＮＴＰ  Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＳ  ｐｒｉｍｅｒを０．４μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．４μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水（精製水）を１４．８μＬ、上記調製済みテロメラーゼ溶液を１．６μＬ混合し、全容量２０μＬの反応液を調製した。
【００５３】
そしてこの反応液を３０℃条件下に３０分間置くことでテロメラーゼ反応を行った後、９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で１分間の温度サイクルを３３回繰り返すことでＰＣＲを行った。ＰＣＲ後の反応溶液については、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）による電気泳動解析を行った。
【００５４】
電気泳動解析結果を図４に示す。
【００５５】
ここで、図４において参照符号「１」で示されるＬｏｗｅｒ  Ｍａｒｋｅｒおよび参照符号「２」で示されるＵｐｐｅｒ  Ｍａｒｋｅｒと示されたピークは、電気泳動されたサンプルＤＮＡの長さや濃度を解析するための電気泳動解析用内部コントロールである。したがって上記のテロメラーゼ反応およびＰＣＲ反応結果とは関係ない。
【００５６】
一方、ＰＣＲ  ｃｏｎｔｒｏｌと示されたピークは、上述のＰｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘに含まれる鋳型ＤＮＡとプライマーのセットから得られる３６ｂｐのＰＣＲ増幅産物である。
【００５７】
したがって、上記テロメラーゼ反応の有無に関係なく得られるものであり、ＰＣＲ反応が良好に行われたか否かを示すピークである。そして残りのラダー状のピークは、テロメラーゼ反応によって得られた様々な長さのＤＮＡ断片がその後のＰＣＲ反応によって増幅されたものである。したがって、本比較例１ではテロメラーゼ反応およびＰＣＲ反応の両方が行われたことが分かる。
【００５８】
Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００による解析の結果、ＰＣＲ  ｃｏｎｔｒｏｌのピークに相当する反応産物中のＤＮＡ濃度は１．２３ｎｇ／μＬであり、またラダー状のピークに相当する反応産物中の合計ＤＮＡ濃度は２．９５ｎｇ／μＬであった。
【００５９】
（比較例２）
比較例２では、比較例１と同様に、Ｓ７７００キットを用いて、キットに添付されたテロメラーゼの活性について測定した。ただしその際、反応液中にＴＭＰｙＰを添加した。具体的には以下のとおりであった。
【００６０】
１０×ＴＲＡＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを２μＬ、５０×ｄＮＴＰ  Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＳ  ｐｒｉｍｅｒを０．４μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．４μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水を１２．８μＬ、比較例１での調製済みテロメラーゼ溶液を１．６μＬ、ＴＭＰｙＰ水溶液２μＬを混合し、全容量２０μＬの反応液を調製した（ＴＭＰｙＰの終濃度が０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭのものをそれぞれ調製した）。
【００６１】
その後、比較例１と同様にこの反応液を３０℃条件下に３０分間置き、さらにその後、９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で１分間の温度サイクルを３３回繰り返した。ＰＣＲ後の反応溶液については、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００による電気泳動解析を行った。
【００６２】
（実施例１）
実施例１では、比較例１と同様に、Ｓ７７００キットを用いて、キットに添付されたテロメラーゼの活性について測定した。ただしその際、反応液中にＣｕＰＣを添加した。具体的には以下のとおりであった。
【００６３】
１０×ＴＲＡＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを２μＬ、５０×ｄＮＴＰ  Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＳ  ｐｒｉｍｅｒを０．４μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．４μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水を１２．８μＬ、比較例１での調製済みテロメラーゼ溶液を１．６μＬ、ＣｕＰＣ水溶液２μＬを混合し、全容量２０μＬの反応液を調製（ＣｕＰＣの終濃度が０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭのものをそれぞれ調製した）。
【００６４】
その後、比較例１と同様にこの反応液を３０℃条件下に３０分間置き、さらにその後、９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で１分間の温度サイクルを３３回繰り返した。ＰＣＲ後の反応溶液については、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００による電気泳動解析を行った。
【００６５】
（実施例２）
実施例２では、比較例１と同様に、Ｓ７７００キットを用いて、キットに添付されたテロメラーゼの活性について測定した。ただしその際、反応液中にＮｉＰＣを添加した。具体的には以下のとおりであった。
【００６６】
１０×ＴＲＡＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを２μＬ、５０×ｄＮＴＰ  Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＳ  ｐｒｉｍｅｒを０．４μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．４μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水を１２．８μＬ、比較例１での調製済みテロメラーゼ溶液を１．６μＬ、ＮｉＰＣ水溶液２μＬを混合し、全容量２０μＬの反応液を調製（ＮｉＰＣの終濃度が０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭのものをそれぞれ調製した）。
【００６７】
その後、比較例１と同様にこの反応液を３０℃条件下に３０分間置き、さらにその後、９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で１分間の温度サイクルを３３回繰り返した。ＰＣＲ後の反応溶液については、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００による電気泳動解析を行った。
【００６８】
（実施例３）
実施例３では、比較例１と同様に、Ｓ７７００キットを用いて、キットに添付されたテロメラーゼの活性について測定した。ただしその際、反応液中にＰＣを添加した。具体的には以下のとおりであった。
【００６９】
１０×ＴＲＡＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを２μＬ、５０×ｄＮＴＰ  Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＳ  ｐｒｉｍｅｒを０．４μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを０．４μＬ、ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．４μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水を１２．８μＬ、比較例１での調製済みテロメラーゼ溶液を１．６μＬ、ＰＣ水溶液２μＬを混合し、全容量２０μＬの反応液を調製（ＰＣの終濃度が０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭのものをそれぞれ調製した）。
【００７０】
その後、比較例１と同様にこの反応液を３０℃条件下に３０分間置き、さらにその後、９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で１分間の温度サイクルを３３回繰り返した。ＰＣＲ後の反応溶液については、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００による電気泳動解析を行った。
【００７１】
以上、比較例１〜２および実施例１〜３の各電気泳動解析結果に基づき、ＰＣＲ  ｃｏｎｔｒｏｌのピークのＤＮＡ濃度と、ＴＭＰｙＰあるいは各アニオン性フタロシアニンの反応液中における濃度の関係を、図５に示した。すなわち、ＰＣＲ  ｃｏｎｔｒｏｌのピークのＤＮＡ濃度を縦軸にとり、ＴＭＰｙＰあるいは各アニオン性フタロシアニンの反応液中における濃度を横軸にとり、これらの関係についてプロットした（横軸で０は、各アニオン性フタロシアニンあるいはＴＭＰｙＰの何れも含まれていない比較例１の結果である）。
【００７２】
図５から、ＴＭＰｙＰの濃度に依存して顕著にＤＮＡ濃度が減少しており、ＴＭＰｙＰ濃度が３μＭ以上におけるＤＮＡ濃度はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００の検出限界以下となったことが分かる。
【００７３】
すなわちこの結果は、ＴＭＰｙＰが通常のＰＣＲ反応を阻害しているためであり、これはＴＭＰｙＰが鋳型である二本鎖ＤＮＡに非特異的に結合しているためと考えられる。
【００７４】
一方、各アニオン性フタロシアニンの場合、ＤＮＡ濃度の減少はＴＭＰｙＰと比較して穏やかであり、これらアニオン性フタロシアニンの濃度が３μＭである場合でも１．１ｎｇ／μＬ以上のＤＮＡが検出された。すなわち、これらアニオン性フタロシアニンによる二本鎖ＤＮＡへの非特異的結合がＴＭＰｙＰと比べ非常に少ないことが分かる。
【００７５】
次に、図６において、ラダー状のピークに相当する反応産物中の合計ＤＮＡ濃度を縦軸にとり、ＴＭＰｙＰあるいは各アニオン性フタロシアニンの反応液中における濃度を横軸にとり、これらの関係についてプロットした（横軸で０は、ＴＭＰｙＰあるいは各アニオン性フタロシアニンの何れも含まれていない比較例１の結果である）。
【００７６】
図６に示すように、各アニオン性フタロシアニンの場合、その濃度に依存してＤＮＡ濃度が減少しており、各アニオン性フタロシアニンが０．１μＭ以上の場合、１．０ｎｇ／μＬ以下となった。一方、ＴＭＰｙＰの場合、１．１μＭ添加された場合であっても、ラダー状のピークに相当する反応産物中の合計ＤＮＡ濃度は２．７ｎｇ／μＬであった。
【００７７】
すなわち、これらの結果より、テロメラーゼ反応への阻害効果は、従来阻害物質候補として知られていたカチオン性物質のＴＭＰｙＰよりも、今回用いたアニオン性フタロシアニンのほうが明らかに大きいことが示された。
【００７８】
以上まとめると、比較例１〜２および実施例１〜３の結果から、アニオン性フタロシアニンは、従来のテロメラーゼ反応阻害物質候補として知られているカチオン性物質のＴＭＰｙＰと比べ、顕著にテロメラーゼ反応阻害効果が大きく、またポリメラーゼ反応への阻害が小さいことがわかった。
さらに、以下比較例３および実施例４〜５を用いてＴＭＰｙＰとアニオン性フタロシアニンによるテロメラーゼ阻害効果について比較する。これらの実験では、上記比較例１〜２および実施例１〜３と同じくＳ７７００キットが用いられている。しかし、上記比較例１〜２および実施例１〜３では、テロメラーゼ反応とＰＣＲに必要な試薬は全て最初に混合し、反応温度を制御することでテロメラーゼ反応とＰＣＲを順に行わせたのに対し、以下の比較例３および実施例４〜５では、まずテロメラーゼ反応に必要な試薬のみを混合してテロメラーゼ反応を行わせた後、その反応液の一部とＰＣＲに必要な試薬を混合し、ＰＣＲを行わせた。
【００７９】
また、以下比較例３および実施例４〜５のそれぞれにおいて、テロメラーゼ反応時に、λＤＮＡを添加した場合としていない場合の実験を行っている。λＤＮＡの添加の意図は、λＤＮＡを添加することで、細胞のゲノムＤＮＡのように大量の二本鎖ＤＮＡが存在する条件を擬似的に再現し、このよりｉｎ  ｖｉｖｏに近い条件でもＴＭＰｙＰやアニオン性フタロシアニンがテロメラーゼ阻害効果を発揮し得るか否かを検討するものである。
【００８０】
（比較例３）
比較例３では、Ｓ７７００キットを用いて、ＴＭＰｙＰによるテロメラーゼ活性阻害効果について検討した。具体的には以下のとおりであった。
【００８１】
１０×ＴＲＡＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを１μＬ、５０×ｄＮＴＰ  Ｍｉｘを０．２μＬ、ＴＳ  ｐｒｉｍｅｒを０．２μＬ、比較例１での調製済みテロメラーゼ溶液を４μＬ、ＴＭＰｙＰ水溶液を２μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水を２．６μＬ混合し、全容量１０μＬのテロメラーゼ反応液を調製した（ＴＭＰｙＰの終濃度が０Ｍ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭのものをそれぞれ調製した）。そして、この反応液を３０℃条件下に６０分間置くことでテロメラーゼ反応を行った。
【００８２】
次に、このテロメラーゼ反応後の溶液をｍｉｌｌｉＱ水で２０倍に希釈したものを４μＬ、５０×ｄＮＴＰ  Ｍｉｘを０．２μＬ、ＴＳ  ｐｒｉｍｅｒを０．２μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘを０．２μＬ、ＴａＫａＬａ  ＬＡ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ株式会社製）を０．１μＬ、１０×ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（Ｍｇ２＋  ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＬａ  ＬＡ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎの付属緩衝液）を１μＬ、ｍｉｌｌｉＱ水を４．３μＬ混合し、全容量１０μＬのＰＣＲ溶液を調製した。そしてこのＰＣＲ溶液を、９５℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の温度サイクルを３０回繰り返す温度条件下に置き、ＰＣＲを行った。
【００８３】
最後に、ＰＣＲ後の溶液を１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＧｅｌＳｔａｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔａｉｎ（タカラバイオ株式会社製）により染色した。以上より得られたゲルの結果を図１６に示す。一番左のレーンより順に、ＴＭＰｙＰの終濃度が０Ｍ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭの結果である。これよりＴＭＰｙＰの終濃度が大きくなるにつれ、テロメラーゼ反応産物を示すバンドが薄くなっており、ＴＭＰｙＰがテロメラーゼ反応を阻害していることが分かる。ただし、１０μＭのＴＭＰｙＰの条件ではＰＣＲ  ｃｏｎｔｒｏｌを示すバンドも薄くなっており、ポリメラーゼ反応も阻害していることが分かる。
【００８４】
一方で、テロメラーゼ反応液にλＤＮＡを添加した実験も行った。すなわち、上記テロメラーゼ反応液調製の際に、ｍｉｌｌｉＱ水を２．６μＬ混合する代わりに、λＤＮＡ溶液（タカラバイオ株式会社製）を２．６μＬ混合した。その他のテロメラーゼ反応温度／時間条件、ＰＣＲ溶液調製条件、ＰＣＲ温度／時間条件、電気泳動条件は全く同じである。この結果を図１７に示す。
【００８５】
これより、図１６と大きく異なり、λＤＮＡ存在下では、ＴＭＰｙＰの濃度が大きくなっても全くテロメラーゼ反応が阻害されていないことが分かる。すなわちゲノムＤＮＡのように大量に二本鎖ＤＮＡが存在する条件下では、ＴＭＰｙＰによるテロメラーゼ阻害効果は著しく小さくなることが分かる。
【００８６】
（実施例４）
実施例４では、比較例３と同じ実験を、ＴＭＰｙＰの代わりにＣｕＰＣを用いて行った。実験結果を図１８および図１９に示す。まず、図１８はλＤＮＡを添加していない条件下での結果であり、一番左のレーンより順に、ＣｕＰＣの終濃度が０Ｍ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭの結果である。これより、この条件下でＣｕＰＣの濃度が大きくなるに従いテロメラーゼ反応が阻害されていることが分かる。またＴＭＰｙＰの場合（図１６）と異なり、１０μＭＣｕＰＣの場合であっても、ＰＣＲ  ｃｏｎｔｒｏｌの増幅は阻害されていない。
【００８７】
一方、図１９はλＤＮＡ存在下での結果を示すものである。これより、ＴＭＰｙＰの場合と異なりλＤＮＡ存在下であってもＣｕＰＣはテロメラーゼ反応を効率よく阻害できることが分かる。すなわち、ゲノムＤＮＡのように大量に二本鎖ＤＮＡが存在する条件下であってもＣｕＰＣはそのテロメラーゼ阻害効果を発揮できることが分かる。
【００８８】
（実施例５）
実施例５では、比較例３と同じ実験を、ＴＭＰｙＰの代わりにＮｉＰＣを用いて行った。実験結果を図２０および図２１に示す。まず図２０はλＤＮＡを添加していない条件下での結果であり、一番左のレーンより順に、ＮｉＰＣの終濃度が０Ｍ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭの結果である。これより、この条件下でＮｉＰＣの濃度が大きくなるに従いテロメラーゼ反応が阻害されていることが分かる。またＴＭＰｙＰの場合（図１６）と異なり、１０μＭＮｉＰＣの場合であっても、ＰＣＲ  ｃｏｎｔｒｏｌの増幅は阻害されていない。
【００８９】
一方、図２１はλＤＮＡ存在下での結果を示すものである。これより、ＴＭＰｙＰの場合と異なりλＤＮＡ存在下であってもＮｉＰＣはテロメラーゼ反応を効率よく阻害できることが分かる。すなわち、ゲノムＤＮＡのように大量に二本鎖ＤＮＡが存在する条件下であってもＮｉＰＣはそのテロメラーゼ反応阻害効果を発揮できることが分かる。
以上、比較例３および実施例４〜５の結果から、アニオン性フタロシアニンであるＣｕＰＣおよびＮｉＰＣは、従来のテロメラーゼ反応阻害物質候補として知られているカチオン性物質のＴＭＰｙＰと異なり、ゲノムＤＮＡのように大量に二本鎖ＤＮＡが存在している条件下であっても、効率よくテロメラーゼ反応を阻害できることが分かった。
【００９０】
−アニオン性フタロシアニンと各種ＤＮＡ間の相互作用についての検討−
以下、実施例６、７、８、９において、アニオン性フタロシアニンと各種ＤＮＡ間の相互作用について検討した。そのためまず、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を含む溶液、一本鎖ＤＮＡを含む溶液、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を以下の手順で調製した。
【００９１】
＜Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液の調製＞
５’−ｇｇｇｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇ−３’の配列（配列番号：２）からなる一本鎖ＤＮＡ（この配列はヒトのテロメア部分の配列と同様のものであり、そのため以降このＤＮＡをヒトテロメアオリゴＤＮＡと呼ぶ）を含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μＬ）を９０℃で５分間インキュベートした後、２℃／分の降温速度で０℃まで冷やし、最後に０℃で２時間インキュベートした。
【００９２】
溶液中に含まれるヒトテロメアオリゴＤＮＡの濃度は、０、０．５、２、５、１０、２５、５０、１００μＭであった。調製後の各溶液についてＣＤ解析を行った結果、図７に示すように、ヒトテロメアオリゴＤＮＡが０μＭであった溶液を除き、いずれの場合も２９５ｎｍ付近に正のピーク、２６５ｎｍ付近に負のピークが認められた。これはアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘが形成されていることを示すものである。
【００９３】
ヒトテロメアオリゴＤＮＡ濃度が１００μＭであった溶液における上記正および負のピークの絶対値は最も大きく、その他については５０、２５、１０、５、２、０．５μＭの順で小さくなっている。このことは最初に含まれていたヒトテロメアオリゴＤＮＡ濃度が大きければ、得られるアンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ形成ＤＮＡ濃度も大きいということを示している。以降、ヒトテロメアオリゴＤＮＡ濃度が１００、５０、２５、１０、５、２、０．５μＭであった溶液から調製されたＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液を、それぞれＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇと呼ぶ。一方、ヒトテロメアオリゴＤＮＡが含まれていなかった溶液についてはＮＣ溶液と呼ぶ。
【００９４】
＜一本鎖ＤＮＡ溶液の調製＞
５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−３’の配列（配列番号：３）からなる一本鎖ＤＮＡが５０μＭの濃度で含まれる５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μＬ）を調製し、これを９０℃で５分間インキュベートした後、２℃／分の降温速度で０℃まで冷やし、最後に０℃で２時間インキュベートした。この結果得られる溶液中のＤＮＡはインキュベート後も一本鎖ＤＮＡである（以降、この溶液を一本鎖ＤＮＡ溶液と呼ぶ）。
【００９５】
＜二本鎖ＤＮＡ溶液の調製＞
５’−ＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡ−３’の配列（配列番号：４）からなる一本鎖ＤＮＡと５’−ＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴ−３’の配列（配列番号：５）からなる一本鎖ＤＮＡがそれぞれ５０μＭの濃度で含まれる５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量１００μＬ）を調製し、これを９０℃で５分間インキュベートした後、２℃／分の降温速度で０℃まで冷やし、最後に０℃で２時間インキュベートした。上記二種類のＤＮＡは相補的な関係にあるため、このインキュベートの結果、溶液中において両ＤＮＡは二本鎖ＤＮＡを形成している（以降、この溶液を二本鎖ＤＮＡ溶液と呼ぶ）。
【００９６】
（実施例６）
本実施例６ではＣｕＰＣと各種ＤＮＡ間の相互作用について検討した。
【００９７】
まず、１５μＭのＣｕＰＣを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μＬ）を調製した。そして、このＣｕＰＣ溶液とＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【００９８】
測定結果を図８に示す。図８より、ＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｃ＞Ｄ＞Ｅ＞Ｆの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、ＣｕＰＣとＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造間で相互作用があることが分かる。
【００９９】
次に、同様に上記ＣｕＰＣ溶液と一本鎖ＤＮＡ溶液、および上記ＣｕＰＣ溶液と二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図９（Ａ）及び図９（Ｂ）に示す。
【０１００】
それぞれの図において、ＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。図９（Ａ）および図９（Ｂ）より、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがってＣｕＰＣと一本鎖ＤＮＡ間、およびＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ間に相互作用はないことが分かる。
【０１０１】
（実施例７）
本実施例７ではＮｉＰＣと各種ＤＮＡ間の相互作用について検討した。
【０１０２】
まず、１５μＭのＮｉＰＣを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μＬ）を調製した。そして、このＮｉＰＣ溶液とＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０３】
測定結果を図１０に示す。図１０より、ＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、おおよそ６４０〜７２０ｎｍの範囲でピークが現れ、またこのピークはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ＞Ｅ＞Ｆ＞Ｇの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、ＮｉＰＣとＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造間で相互作用があることが分かる。
【０１０４】
次に、同様に上記ＮｉＰＣ溶液と一本鎖ＤＮＡ溶液、および上記ＮｉＰＣ溶液と二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）に示す。それぞれの図において、ＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）より、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがってＮｉＰＣと一本鎖ＤＮＡ間、およびＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ間に相互作用はないことが分かる。
【０１０５】
（実施例８）
本実施例８ではＰＣと各種ＤＮＡ間の相互作用について検討した。
【０１０６】
まず、１５μＭのＰＣを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μＬ）を調製した。そして、このＰＣ溶液とＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０７】
測定結果を図１２に示す。図１２より、ＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、６６０〜７４０ｎｍの範囲で二つのピークが現れ、またこのピークはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｄ＞Ｅ＞Ｆ＞Ｇの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、ＰＣとＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造間で相互作用があることが分かる。
【０１０８】
次に、同様に上記ＰＣ溶液と一本鎖ＤＮＡ溶液、および上記ＰＣ溶液と二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図１３（Ａ）および図１３（Ｂ）に示す。それぞれの図において、ＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。図１３（Ａ）および図１３（Ｂ）より、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがってＰＣと一本鎖ＤＮＡ間、およびＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ間に相互作用はないことが分かる。
【０１０９】
（実施例９）
本実施例９ではＣｏＰＣと各種ＤＮＡ間の相互作用について検討した。
【０１１０】
まず、１５μＭのＣｏＰＣを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の溶液（全量２０μＬ）を調製した。そして、このＣｏＰＣ溶液とＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＮＣ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。
【０１１１】
測定結果を図１４に示す。図１４より、ＤＮＡを含まないＮＣ溶液の場合を除き、６６０〜７４０ｎｍの範囲で二つのピークが現れ、またこのピークはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ溶液Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｇの順番で大きいことが分かる。以上の結果より、ＣｏＰＣとＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造間で相互作用があることが分かる。
【０１１２】
ところでＣｏＰＣを用いた場合に見られた６４０〜７２０ｎｍの範囲のピーク上昇は、ＣｕＰＣやＮｉＰＣやＰＣを用いた場合の結果より小さい。これは合成したＣｏＰＣが十分に精製されていなかったためと考えられる。
【０１１３】
次に、同様に上記ＣｏＰＣ溶液と一本鎖ＤＮＡ溶液、および上記ＣｏＰＣ溶液と二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図１５（Ａ）および図１５（Ｂ）に示す。それぞれの図において、ＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。図１５（Ａ）および図１５（Ｂ）より、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがってＣｏＰＣと一本鎖ＤＮＡ間、およびＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ間に相互作用はないことが分かる。
【０１１４】
以上のアニオン性フタロシアニンの他、ＺｎＰＣを用いて、同様の実験を行った結果、ＺｎＰＣについてもＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造と特異的に相互作用することが示された。
【０１１５】
以上、実施例６〜９についてまとめると、いずれのアニオン性フタロシアニンもＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造とは相互作用を起こすものの極めて特異的であり、一本鎖ＤＮＡや二本鎖ＤＮＡとは相互作用を起こさないことが分かった。したがって、アニオン性フタロシアニンはテロメラーゼ阻害物質として非常に適しており、本発明におけるテロメラーゼ阻害方法は従来の方法と比べ効果的であると言える。
【０１１６】
上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施の形態が明らかである。したがって、上記説明は例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造および／または機能の詳細を実質的に変更できる。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明により、テロメラーゼ阻害方法が提供される。テロメラーゼ反応は癌化の原因であることが知られていることから、本発明の方法は癌治療に用いることができる。
【符号の説明】
【０１１８】
１  Ｌｏｗｅｒ  Ｍａｒｋｅｒ
２  Ｕｐｐｅｒ  Ｍａｒｋｅｒ 
３  ＰＣＲ  ｃｏｎｔｒｏｌのピーク
４  ラダー状ピーク
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テロメラーゼによるＤＮＡ伸張反応を阻害する方法であって、
テロメラーゼ、テロメラーゼ反応の基質となるＤＮＡ、およびｄＮＴＰを含有する溶液に、アニオン性フタロシアニンを添加する工程を有する、方法。
【請求項２】
前記溶液が緩衝液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アニオン性フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アニオン性フタロシアニンは、配位金属として銅、亜鉛、コバルト若しくはニッケルを有するアニオン性フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性フタロシアニンのいずれかである、請求項１に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2010116423.tif 000026
【図２】
2010116423.tif 000027
【図３】
2010116423.tif 000028
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2010116423.tif 000033
【図９】
2010116423.tif 000034
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2010116423.tif 000037
【図１３】
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【図１４】
2010116423.tif 000039
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2010116423.tif 000042
【図１８】
2010116423.tif 000043
【図１９】
2010116423.tif 000044
【図２０】
2010116423.tif 000045
【図２１】
2010116423.tif 000046
【手続補正書】
【提出日】平成22年1月14日(2010.1.14)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明はテロメラーゼによるＤＮＡ伸長反応を阻害する方法およびそれに用いられるテロメラーゼ反応阻害剤に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
上記課題を解決する本発明は、テロメラーゼによるＤＮＡ伸張反応を阻害する方法およびそれに用いられるテロメラーゼ反応阻害剤であって、アニオン性フタロシアニンをテロメラーゼ阻害剤としてテロメラーゼの基質となるＤＮＡと反応させることを特徴とする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
具体的には、本発明に係るテロメラーゼ反応阻害方法は、テロメラーゼ、テロメラーゼ反応の基質となるＤＮＡ、およびｄＮＴＰを含有する溶液（多くの場合、緩衝液）に、アニオン性フタロシアニンを添加する。本発明に係るテロメラーゼ反応阻害剤は、テロメラーゼによるＤＮＡ伸長反応を阻害するテロメラーゼ反応阻害剤であって、アニオン性フタロシアニンを含有する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
本発明により、テロメラーゼ阻害方法およびそれに用いられるテロメラーゼ反応阻害剤が提供される。テロメラーゼ反応は癌化の原因であることが知られていることから、本発明の方法は癌治療に用いることができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テロメラーゼによるＤＮＡ伸張反応をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて阻害する方法であって、
テロメラーゼ、テロメラーゼ反応の基質となるＤＮＡ、およびｄＮＴＰを含有する溶液に、アニオン性フタロシアニンを添加する工程を有する、方法。
【請求項２】
前記溶液が緩衝液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アニオン性フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、スルホ基およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アニオン性フタロシアニンは、配位金属として銅、亜鉛、コバルト若しくはニッケルを有するアニオン性フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性フタロシアニンのいずれかである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
テロメラーゼによるＤＮＡ伸長反応を阻害するテロメラーゼ反応阻害剤であって、
アニオン性フタロシアニンを含有する、テロメラーゼ反応阻害剤。
【請求項６】
前記アニオン性フタロシアニンは、カルボキシル基、カルボキシル基の金属塩、
スルホ基およびスルホ基の金属塩からなる群より得られる少なくとも一種の官能基を有している、請求項５に記載のテロメラーゼ反応阻害剤。
【請求項７】
前記アニオン性フタロシアニンは、配位金属として銅、亜鉛、コバルト若しくはニッケルを有するアニオン性フタロシアニンであるか、または配位金属を有しないアニオン性フタロシアニンのいずれかである、請求項５に記載のテロメラーゼ反応阻害剤。
【手続補正書】
【提出日】平成22年1月21日(2010.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
次に、同様に上記ＮｉＰＣ溶液と一本鎖ＤＮＡ溶液、および上記ＮｉＰＣ溶液と二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）に示す。それぞれの図において、ＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）より、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがってＮｉＰＣと一本鎖ＤＮＡ間、およびＮｉＰＣと二本鎖ＤＮＡ間に相互作用はないことが分かる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
次に、同様に上記ＰＣ溶液と一本鎖ＤＮＡ溶液、および上記ＰＣ溶液と二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図１３（Ａ）および図１３（Ｂ）に示す。それぞれの図において、ＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。図１３（Ａ）および図１３（Ｂ）より、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがってＰＣと一本鎖ＤＮＡ間、およびＰＣと二本鎖ＤＮＡ間に相互作用はないことが分かる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
次に、同様に上記ＣｏＰＣ溶液と一本鎖ＤＮＡ溶液、および上記ＣｏＰＣ溶液と二本鎖ＤＮＡ溶液それぞれとを混合し、この混合液について４８０〜８００ｎｍの吸光度を測定した。一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液の場合におけるそれぞれの測定結果を図１５（Ａ）および図１５（Ｂ）に示す。それぞれの図において、ＮＣ溶液を用いた結果も併せて示す。図１５（Ａ）および図１５（Ｂ）より、一本鎖ＤＮＡ溶液および二本鎖ＤＮＡ溶液いずれの場合も、５０μＭの高濃度のＤＮＡが含まれているにも関わらず、ＮＣ溶液の場合とほぼ同じ結果となることが分かる。したがってＣｏＰＣと一本鎖ＤＮＡ間、およびＣｏＰＣと二本鎖ＤＮＡ間に相互作用はないことが分かる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１４】
2010116423.tif 000047
【手続補正書】
【提出日】平成22年2月19日(2010.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
【図１】本発明の実施形態（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）を説明するための図である。
【図２】本発明の実施形態（ｉｎ  ｖｉｖｏ（ヒト細胞内））を説明するための図である。
【図３】本発明の実施形態で用いられるアニオン性フタロシアニンの例を示す図である。
【図４】比較例１における電気泳動結果を示すグラフである。
【図５】比較例１〜２および実施例１〜３の各電気泳動解析結果に基づき、ＰＣＲ  ｃｏｎｔｒｏｌのピークのＤＮＡ濃度と、ＴＭＰｙＰあるいは各アニオン性フタロシアニンの反応液中における濃度との関係を示したグラフである。
【図６】比較例１〜２および実施例１〜３の各電気泳動解析結果に基づき、ラダー状のピークに相当する反応産物中の合計ＤＮＡ濃度と、ＴＭＰｙＰあるいは各アニオン性フタロシアニンの反応液中における濃度との関係を示したグラフである。
【図７】アンチパラレル型Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造が形成されていることを示すＣＤ測定結果を示すグラフである。
【図８】実施例４において、ＣｕＰＣとＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図９】実施例４において、ＣｕＰＣと一本鎖ＤＮＡ（Ａ）、あるいはＣｕＰＣと二本鎖ＤＮＡ（Ｂ）を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１０】実施例５において、ＮｉＰＣとＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１１】実施例５において、ＮｉＰＣと一本鎖ＤＮＡ（Ａ）、あるいはＮｉＰＣと二本鎖ＤＮＡ（Ｂ）を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１２】実施例６において、ＰＣとＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１３】実施例６において、ＰＣと一本鎖ＤＮＡ（Ａ）、あるいはＰＣと二本鎖ＤＮＡ（Ｂ）を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１４】実施例７において、ＣｏＰＣとＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１５】実施例７において、ＣｏＰＣと一本鎖ＤＮＡ（Ａ）、あるいはＣｏＰＣと二本鎖ＤＮＡ（Ｂ）を混合した際の４８０ｎｍ〜８００ｎｍにおける吸光スペクトルを示すグラフである。
【図１６】比較例３における、λＤＮＡ非存在下でのＴＭＰｙＰによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。
【図１７】比較例３における、λＤＮＡ存在下でのＴＭＰｙＰによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。
【図１８】実施例４における、λＤＮＡ非存在下でのＣｕＰＣによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。
【図１９】実施例４における、λＤＮＡ存在下でのＣｕＰＣによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。
【図２０】実施例５における、λＤＮＡ非存在下でのＮｉＰＣによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。
【図２１】実施例６における、λＤＮＡ存在下でのＮｉＰＣによるテロメラーゼ阻害効果を示すゲル電気泳動結果である。
【国際調査報告】
2010116423.tif 000048
2010116423.tif 000049
2010116423.tif 000050
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