(57)【要約】  緑茶由来の新たな物及び新たな用途を提供すること。  緑茶抽出物を麹で発酵させることを特徴とする、緑茶抽出物由来の発酵物の製造方法；  緑茶抽出物由来の麹発酵物；  緑茶抽出物由来の麹発酵物を有効成分として含む組成物；そして、好ましくは、前記組成物が、医薬組成物、飲食品組成物である。  また、好ましくは、前記組成物が、アディポネクチン産生促進用組成物、又は肥満の予防、改善若しくは治療用組成物、又は、美肌用組成物、又は動脈硬化の予防、改善若しくは治療用の組成物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑茶抽出物を麹で発酵させることを特徴とする、緑茶抽出物由来の発酵物の製造方法。
【請求項２】
緑茶抽出物由来の麹発酵物。
【請求項３】
緑茶抽出物由来の麹発酵物を有効成分として含む組成物。
【請求項４】
前記組成物が、アディポネクチン産生促進用組成物、又は肥満の予防、改善若しくは治療用組成物、又は、美肌用組成物、又は動脈硬化の予防、改善若しくは治療用の組成物である請求項３記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緑茶抽出物由来の発酵物の製造方法、新規な緑茶抽出物由来の麹発酵物、及び当該麹発酵物を有効成分とするアディポネクチン産生促進用組成物、肥満の予防、改善又は治療用の組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑茶は古くから飲食品として使用され安全性も高く、緑茶には緑茶カテキンが含まれており、この緑茶カテキンには抗菌作用があることが知られている。抗菌作用を産業利用するために緑茶カテキンを高濃度に含む緑茶抽出物が開発され、これを原料とし抗菌作用を高めた虫歯予防や口腔洗浄等の口腔衛生製品や抗菌マスク等に用いられている。
そして、近年では、緑茶抽出物に関する様々な生理機能性がさらに探求され、この生理機能性を活用した新たな用途の研究・開発がなされている。
例えば、特許文献１には、プロトンポンプインヒビター（ＰＰＩ）と併用することを特徴とする、茶ポリフェノール又は茶抽出物を有効成分とするヘリコバクター・ピロリ菌除去剤、飲食物乃至食品添加物を提供することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００２−０６８９９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、緑茶由来の新たな物及び新たな用途を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、緑茶を起点とした新たな物及び新たな用途を提供しようと、試行錯誤した。その際に、本発明者らは、緑茶抽出物に抗菌作用があるにも関わらず、その常識にとらわれず、種麹を添加して発酵を試みた。そして、本発明者らは、麹発酵後の発酵物について、ＨＰＬＣ分析を行ったところ、発酵前と発酵後とで両者のピークパターンが異なっており、麹発酵が良好に進行していたことが確認できた。このように、抗菌作用を有するカテキン類が高濃度に含まれる緑茶抽出物で、麹発酵が良好に進行したことは全くの意外であった。【０００６】
しかも、本発明者らが得られた緑茶抽出物由来の麹発酵物のＨＰＬＣ分析のピークパターンを検討したところ、抗肥満作用で知られているカテキン類のピークが殆ど消失していた。そして、意外にも、この緑茶抽出物由来の麹発酵物は、発酵前の緑茶抽出物と比べて、低濃度でアディポネクチン産生促進用を有していた。そして、本発明者らは、種々の生理活性試験を行った結果、得られた緑茶抽出物由来の麹発酵物は、肥満の予防、改善又は治療；美肌；動脈硬化の予防、改善又は治療等に使用できることを見出した。【０００７】
本発明者らは、抗肥満作用で知られているカテキン類及びテアデノールのピークが未検出となり認められなかったので、得られた緑茶抽出物由来の麹発酵物中の何らかの成分が効能を発揮していると考える。このことから、本発明者らは、緑茶抽出物から、麹を用いることで、従来にない新規な緑茶発酵物が得られることを見出した。
このようなことから、本発明者らは、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。【０００８】
〔１〕  緑茶抽出物を麹で発酵させることを特徴とする、緑茶抽出物由来の発酵物の製造方法。
〔２〕  緑茶抽出物由来の麹発酵物。
〔３〕  緑茶抽出物由来の麹発酵物を有効成分として含む組成物。
〔４〕  前記組成物が、アディポネクチン産生促進用組成物、又は肥満の予防、改善若しくは治療用組成物、又は、美肌用組成物、又は動脈硬化の予防、改善若しくは治療用の組成物である前記〔３〕記載の組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、緑茶由来の新たな物及び新たな用途を提供することができる。
本発明によれば、新たな緑茶抽出物由来の麹発酵物を提供することができる。本発明によれば、新たな緑茶抽出物由来の麹発酵物を有効成分とするアディポネクチン産生促進用組成物；肥満の予防、改善又は治療用の組成物；美肌用組成物；動脈硬化の予防、改善又は治療用の組成物を提供することができる。
なお、ここに記載された効果は必ずしも限定されるものではなく、本明細書中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａは標準品カテキン類（左からEGC,EC,EGCG,GCG）、図１Ｂは緑茶抽出物（発酵前）、図１Ｃは標準品テアデノール  Ａ、図１Ｄは麹発酵物（製造例３：白もやし（米麹・麦麹系））、図１Ｅは麹発酵物（製造例５：長白菌（米麹・麦麹系））の各ＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図２】緑茶抽出物を麹発酵した麹発酵産物（製造例３：白もやし（米麹・麦麹系））及びその発酵前の緑茶抽出物が、成熟脂肪細胞のアディポネクチンの発現に与える影響を示す図である。上段はアディポネクチンのWestern blot解析の結果であり、下段はその発現量を定量化した結果である。なお、Contは、コントロールである。
【図３】麹発酵産物をマウスに投与した投与群（右側）、非投与群（左側：Cont）における、アディポネクチン（上段：Fig.3A）及び脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）（下段：Fig.3B）の結果を示す。なお、Fig.3A及びFig.3Bの上段はアディポネクチンのWestern blot解析の結果であり、下段はその発現量を定量化した結果である。なお、Contは、コントロールである。* P < 0.05 vs cont
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に本発明の好ましい実施形態について説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００１２】
１．緑茶抽出物由来の発酵物の製造方法
本実施形態は、緑茶抽出物を出発原料とする発酵物の製造方法であり、緑茶抽出物を麹で発酵させることを特徴とする、緑茶抽出物由来の発酵物の製造方法である。これにより、緑茶抽出物由来の麹発酵物を得ることができる。
【００１３】
本実施形態の緑茶抽出物由来の発酵物の製造方法は、緑茶抽出物を麹で発酵させる工程を含むものである。
本実施形態の発酵物の製造方法は、麹発酵工程の他、適宜、発酵前及び発酵後に行う工程を含んでもよい。発酵前工程として、例えば、緑茶を抽出する工程、種麹調製工程、麹発酵用培地の調製工程；発酵後工程として、例えば、麹を処理する工程（例えば、除去工程）、麹発酵物の調製工程（例えば、発酵成分の分離精製工程）等が挙げられる。
また、前記発酵物製造方法の工程を、組成物の製造方法（例えば、飲食品製造方法等）の工程に組み込んでもよい。
【００１４】
＜緑茶抽出物＞
前記緑茶抽出物は、茶葉から抽出することによって得られるものであり、公知の製法にて得ることができ、茶葉として、例えば、製茶茶葉、生茶葉等が挙げられる。製法の一例として、例えば、製茶茶葉及び／又は生茶葉から熱水（０〜１００℃）又は水溶性有機溶媒により抽出することによって得ることができる。前記水溶性有機溶媒として、例えば、炭素数１〜４の低級アルコール類（エタノール、１，３−ブチレングリコール等）等が挙げられ、これらから１種又は２種以上組み合わせることができ、さらに水と混合し水混合溶媒としてもよい。また、超臨界抽出手段を用いてもよい。また抽出助剤（例えば、アスコルビン酸ナトリウム等の有機酸又はこれら有機酸塩類）を添加して抽出することも可能である。
前記製茶茶葉は、Camellia属（例えば、C. sinensis、C. assamica）又はそれらの雑種から得られる茶葉より製茶された茶葉である。本実施形態で使用する茶葉は、例えば、緑茶類（例えば、煎茶、番茶、玉露、てん茶、釜煎り茶等）を製茶した、不発酵の緑茶類の茶葉が、目的発酵物を効率よく得る点で、好ましい。
また、市販品の緑茶抽出物として、例えば、緑茶エキスＢＬ（（株）アクセスワン）、ポリフェノン（三井農林（株））、テアフラン（伊藤園（株））、サンフェノン（太陽化学（株））等が挙げられる。
【００１５】
前記緑茶抽出物には、茶カテキンが含まれていることが、良好な麹発酵できる点及び目的発酵物を得る点で、好ましい。
茶カテキンの主要成分は、エピカテキン（epicatechin、ＥＣ）とそのヒドロキシ体のエピガロカテキン(epigallocatechin、ＥＧＣ）、及びそれらの没食子酸エステルであるエピカテキンガラート(epicatechin gallate、没食子酸エピカテキン、ＥＣＧ）とエピガロカテキンガラート（epigallocatechin gallate、没食子酸エピガロカテキン、ＥＧＣＧ）の４つがあり、ＥＧＣＧ＞ＥＧＣ＞ＥＣＧ＞ＥＣの順の含有量であることが知られている。
【００１６】
本実施形態における緑茶抽出物中の茶ポリフェノール量は、特に限定されないが、乾燥物換算で、その下限値は好ましくは３０質量％以上、より好ましくは４０質量％以上であり、その上限値は好ましくは６０質量％以下であり、さらに好ましくは５０質量％以下である。
本実施形態における緑茶抽出物中の茶カフェイン量は、特に限定されないが、乾燥物換算で、その上限値は好ましくは１０質量％以下、より好ましくは８質量％以下であり、さらに好ましくは６質量％以下であり、また、その下限値は好ましくは１質量％以上、より好ましくは３質量％以上である。
【００１７】
本実施形態における緑茶抽出物中の総カテキン量は、特に限定されないが、乾燥物換算で、その下限値は好ましくは２０質量％以上、より好ましくは３０質量％以上であり、その上限値は好ましくは６０質量％以下である。また、当該緑茶抽出物中の総カテキン量は、特に限定されないが、乾燥物換算で、好ましくは２０〜６０質量％、より好ましくは３０〜５０質量％であり、当該範囲は良好な麹発酵できる点及び目的発酵物を効率よく得る点で好適である。
また、前記緑茶抽出物中の「ＥＧＣＧ」量は、特に限定されないが、乾燥物換算で、その下限値は好ましくは５質量％以上、より好ましくは１０質量％以上であり、またその上限値は好ましくは３０質量％以下、より好ましくは２０質量％以下である。また、前記緑茶抽出物中の「ＥＧＣＧ」量は、好ましくは１０〜３０質量％、より好ましくは１０〜２０質量％であり、当該範囲は良好な麹発酵できる点及び目的発酵物を効率よく得る点で好適である。
また、ＥＧＣＧの総カテキン量に占める比率は、好ましくは２０〜６０質量％であり、一般的に３０〜６０質量％程度といわれている。
本実施形態に使用する緑茶抽出物の形態は、特に限定されず、固体（粉末状や顆粒状等）、半固体、液体の何れでもよい。
【００１８】
＜麹＞
本実施形態に用いる麹は特に限定されないが、コウジ菌（例えば、米麹系、豆麹系、麦麹系等）を含む麹が、目的発酵物を効率よく得る点で、好ましい。
前記麹は、米、大豆、小麦等の穀物を原料として食品発酵させて、日本酒、味噌、醤油、焼酎等の製品を製造する際に種麹として使用できるものである。一般的に、種麹に使用するコウジ菌は、穀物に含まれるデンプンやタンパク質を分解し、生成するグルコースやアミノ酸を栄養源として増殖するものである。
前記麹は、米麹及び／又は麦麹として使用可能なコウジ菌（米麹系コウジ菌及び／又は麦麹系コウジ菌）を含むものが、目的発酵物が種々の作用効果を発揮し易い点で、好ましい。
前記麹として、市販品の種麹を使用することができる。市販品の種麹として、例えば、白麹雪こまち（8043）（秋田今野商店）、黄色小粒状（8143）（秋田今野商店）、糀の種（白もやし）（（株）樋口松之助商店）、糀の種（黄もやし）（（株）樋口松之助商店）、長白菌（（株）菱六製）、改良長白菌（（株）菱六製）、醤油用種麹（（株）ビオック）等が挙げられ、これらから１種又は２種以上選択することができる。
【００１９】
前記麹には、アスペルギルス属（Aspergillus）に属する微生物（所謂、コウジ菌）が含まれ、当該コウジ菌として、例えば、Aspergillus awamori、Aspergillus awamori ver. fumeus、Aspergillus Kawachii、Aspergillus oryzae、Aspergillus oryzae ver oryzae、Aspergillus sojae、Aspergillus luchuensis、Aspergillus saitoi、及びAspergillus usami等が挙げられ、これらから１種又は２種以上選択することができる。
このうち、好ましくは、目的発酵物を効率よく得る点で、種麹として使用可能なコウジ菌であり、当該種麹に使用するコウジ菌として、例えば、カワチ菌(Aspergillus kawachii)、オリゼ菌(Aspergillus oryzae)、ソーヤ菌(Aspergillus sojae)、及びアワモリ菌(Aspergillus awamori)等が挙げられ、これらから１種又は２種以上選択することができる。
麹は、日本の伝統的な製造産業において古くから用いられているが、麹には液体麹と固体麹とがあり、穀物を処理するときに固体麹を用いることが一般的である。本実施形態において、後記〔実施例〕に示すように、市販品のような固体麹の種麹を、液体培養に使用することができ、しかもこの液体培養によって本実施形態の麹発酵物を得ることができたことは全くの意外であった。これにより、種麹を用いた液体培養によって本実施形態の麹発酵物の大量生産もより容易となる。
【００２０】
〔麹発酵工程〕
本実施形態の麹発酵工程は、緑茶抽出物を含む培地で、麹を培養することにより行うことが、良好な麹発酵できる点及び目的発酵物を効率よく得る点で、好ましい。
本実施形態に使用する緑茶抽出物を含む培地は、前記基本培地組成と緑茶抽出物とを混合することで調製することができる。
また、本実施形態の緑茶抽出物を含む培地は、好ましくは液体培地であり、良好な麹発酵できる点及び目的発酵物を効率よく生産できる点で、また発酵物を容易に回収できる点で好ましい。
【００２１】
前記基本培地組成は、麹が発酵可能な培地組成であれば、特に限定されず、一般的麹の栄養源として用いられる無機塩類、炭素源（好適には糖類）、窒素源等を使用すればよい。
前記糖類として、例えば、スクロール、ブドウ糖、ラクトース、マンノース、マンニトール、ソルビトール等が挙げられ、これらから１種又は２種以上選択することができる。糖類としては、本実施形態の培地中の糖類の含有量は、特に限定されないが、良好な麹発酵できる点及び目的発酵物を得る点で、好ましくは０．１〜２質量％である。
前記無機塩としては、例えば、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられ、これらから１種又は２種以上選択することができる。
【００２２】
本実施形態に使用する培地中の緑茶抽出物の含有量は特に限定されないが、その下限値は好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．５質量％以上であり、その上限値は好ましくは４０質量％以下、より好ましくは３０質量％以下である。
本実施形態の培地中の緑茶抽出物の含有量は、好ましくは１〜２０質量％、より好ましくは１〜１０質量％であり、当該範囲は良好な麹発酵できる点及び目的発酵物を得る点で、好ましい。
【００２３】
本実施形態の培地中の緑茶カテキン総量及びＥＧＣＧ含有量は、特に限定されず、培地に使用する緑茶抽出物とその使用量で調整することが可能である。
本実施形態の培地中の緑茶カテキン総量は、好ましくは０．１〜５質量％であり、当該範囲は良好な麹発酵できる点及び目的発酵物を得る点で、好ましい。
本実施形態の培地中のＥＧＣＧ含有量は、好ましくは０．０５〜２．５質量％であり、当該範囲は良好な麹発酵できる点及び目的発酵物を得る点で、好ましい。
【００２４】
前記緑茶抽出物を含む培地に麹を添加し、麹発酵させるが、このときに添加する麹の使用量は、特に限定されないが、この下限値は好ましくは０．００１質量％以上、この上限値は好ましくは１質量％以下になるように培地に添加する。より好ましくは０．００５〜０．５質量％、さらに好ましくは０．０１〜０．１質量％になるように、培地に麹を添加することが好適である。
【００２５】
本実施形態における発酵条件として、好気培養条件が、良好な麹発酵できる点及び目的発酵物を得る点で、好ましい。振盪、通気、撹拌等の手段を単独で又は組み合わせて用いて好気培養を行うことが好ましい。
さらに、本実施形態における培養温度は、特に限定されず、好ましくは１０〜４０℃であり、より好ましくは２０〜３０℃である。
本実施形態における培養する際の培地のｐＨは、好ましくは４.０〜８.０であり、より好ましくは５.０〜７.０であり、さらに好ましくは５.５〜６.５である。
本実施形態における培養期間は、特に限定されず、好ましくは５日以上であり、より好ましくは１０〜３０日間であり、さらに好ましくは１０〜２０日期間である。
【００２６】
本実施形態における培養形態は、特に限定されず、連続培養（灌流培養等）であってもよいし、バッチ培養であってもよい。本実施形態における培養中の麹発酵物の生産状況は、後記〔実施例〕に示すようなＨＰＬＣ分析で確認することが可能であり、これにより培養期間や培地成分の追加、発酵物の回収のタイミング等を設定したりしてもよい。
【００２７】
上述のようにして、培養培地中に本実施形態の緑茶抽出物由来の麹発酵物が生産される。
なお、麹発酵して得られた麹発酵物の麹の処理方法は、公知の真菌類等の微生物の処理方法に従って行うことができる。例えば、加熱及び／又は濾過等により麹を殺菌又は除菌すること等が挙げられる。種麹等を使用している場合、この種麹は安全性が高いので、そのまま麹を含んでいてもよいが、風味等の変化の点で、殺菌又は除菌することが望ましい。除菌として、一般的な真菌類を除去するようなろ過処理を行えばよく、例えば、濾過助剤（活性白土、珪藻土等）や膜等による処理が挙げられる。
また、得られた麹発酵物中の発酵成分の調製方法は、公知の分離精製方法に従って行うことができる。
【００２８】
２．緑茶抽出物由来の麹発酵物
本実施形態の製造方法により、本実施形態の緑茶抽出物由来の麹発酵物を得ることができる。
本実施形態の緑茶抽出物由来の麹発酵物は、後記〔実施例〕のように、カテキン類及びテアデノールが未検出となっており、従来の緑茶由来にはない、新規な麹発酵物である。
本実施形態の緑茶抽出物由来の麹発酵物に含まれる成分は現在解析中であるが、カテキン類及びテアデノールが未検出になっているにも関わらず、後述のように、当該麹発酵物には、種々の効能が発現していることから、麹発酵により新規な成分が生じ含まれていると考えている。
【００２９】
本実施形態の製造方法にて製造される麹発酵物は、後記〔実施例〕で測定する逆相カラムクロマトのＨＰＬＣ分析において、相対保持時間１３〜１４分の間にある１本のピークを有することが好適であり、このピークが最も高いピークであることが、より好適である。このピークを指標とすることにより、麹発酵物の製造状況を判断することができ、目的とするピーク成分の回収効率を高めることができる。
【００３０】
さらに、本実施形態の緑茶抽出物由来の麹発酵物中に含まれるカテキン類の含有量は、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０５質量％以下であることが、カテキン類に起因しない効能を発揮できる点で、好ましい。
さらに、本実施形態の緑茶抽出物由来の麹発酵物中のテアデノールＡ及び／又はＢの含有量は、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０５質量％以下、さらに好ましくは０．００１質量％以下であることが、テアデノールに起因しない効能を発揮できる点で、好ましい。
【００３１】
なお、本実施形態の緑茶抽出物由来の麹発酵物は、既知効能成分（例えば、カテキン類及び／又はテアデノール等）や将来見出される効能成分との併用により、さらに種々の効能を高めることが期待できる。
【００３２】
そして、後記〔実施例〕に示すように、本実施形態の緑茶抽出物由来の麹発酵物は、アディポネクチン産生増加作用；アディポネクチン発現促進作用；脂肪細胞分解酵素ＡＴＧＬ発現促進作用；脂肪蓄積の少ない脂肪細胞への分化誘導作用；転写因子Ｃ／ＥＢＰα及びＰＰＡＲγの発現低下作用；脂肪細胞肥大化による脂肪蓄積増加の抑制作用；血管内皮創傷治癒作用；脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現抑制作用を有する。
【００３３】
さらに、アディポネクチンの産生が増加することによって、（１）インスリン受容体を介さない糖取り込み促進作用；（２）細胞内の脂肪酸を減少してインスリン受容体の感受性を上げる作用；（３）肝臓のＡＭＰキナーゼを活性化させることによるインスリン感受性の亢進作用；（４）脂肪酸の燃焼作用；（５）動脈硬化抑制作用；（６）抗炎症作用；（７）真皮におけるヒアルロン酸合成促進作用が認められることが一般的に知られている。
従って、本実施形態の緑茶抽出物由来の発酵物は、アディポネクチン産生増加作用を有するので、血糖値抑制作用、抗糖尿病作用、脂肪減少作用、抗肥満作用、痩身作用、抗高脂血症作用、抗炎症作用、美肌作用を発揮することができる。
【００３４】
また、本実施形態の緑茶抽出物由来の発酵物は、脂肪細胞分解酵素ＡＴＧＬ発現促進作用及び脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現抑制作用を有するので、脂肪分解促進作用、脂肪減少作用、抗肥満作用（特に体についた脂肪の分解作用）を発揮することができる。
本実施形態の緑茶抽出物由来の発酵物は、脂肪蓄積の少ない脂肪細胞への分化誘導作用；転写因子Ｃ／ＥＢＰα及びＰＰＡＲγの発現低下作用；脂肪細胞肥大化による脂肪蓄積増加の抑制作用を有するので、脂肪蓄積低下作用、脂肪減少作用、抗肥満作用（特に体につく脂肪蓄積の抑制作用）を発揮することができる。
【００３５】
また、本実施形態の緑茶抽出物由来の発酵物は、血管内皮創傷治癒作用を有するので、抗動脈硬化症を発揮することができる。
また、本実施形態の緑茶抽出物由来の発酵物は、抗酸化酵素であるCatalaseと抗酸化酵素であるHemeoxygenase-1（HO-1）の発現量低下抑制作用、また、活性酸素産生に関わる酵素NOX4と炎症因子TNFαの発現量抑制作用を有する。このことは、体内で悪い酸化ストレスの軽減作用を発揮することができる。
【００３６】
斯様に、本実施形態の緑茶抽出物由来の麹発酵物は、上述のような種々の作用（以下、「アディポネクチン産生増加作用等」又は「麹発酵物の作用」ともいう）を有するので、肥満、糖尿病、動脈硬化症、高脂血症（脂質異常症）、高血圧における予防・改善・又は治療に用いることができ、また、美肌のための肌質改善又は維持のスキンケア、酸化ストレスの改善又は低減に用いることができる。さらに、これら疾患又は症状を有する患者又はその予備軍に対して、本実施形態の緑茶抽出物由来の麹発酵物は有効である。
また、後記実施例に示すように、本実施形態の緑茶抽出物由来の麹発酵物は、経口摂取や経口投与といった簡単な投与形態でも優れた効果を得ることができるという利点がある。さらに、本実施形態の緑茶抽出物由来の麹発酵物は、粉末状や液体状等の状態を適宜選択できるので、飲食品、医薬品、飼料等においても摂取用又は経口投与用として簡便に使用することができ、また本実施形態の緑茶抽出物由来の麹発酵物を含む飲食品等を液体、固形、タブレットやゼリー状等にして提供することも容易である。本実施形態の緑茶抽出物由来の麹発酵物は、成人又は成熟動物に対して作用を発揮しやすい利点がある。
【００３７】
また、本実施形態は、治療目的使用であっても、非治療目的使用であってもよい。
「非治療目的」とは、医療行為、すなわち、治療による人体への処置行為を含まない概念である。例えば、健康増進、美容行為等が挙げられる。
「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転；疾患、症状又は状態の悪化防止、遅延；疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
「予防」とは、適用対象における疾患若しくは症状の発症の防止や遅延、又は適用対象の疾患若しくは症状の危険性の低下をいう。
【００３８】
従って、本実施形態の緑茶抽出物由来の麹発酵物は、アディポネクチン産生増加剤又はアディポネクチン産生増加用組成物等の上述した作用を使用目的とする製剤又は組成物（以下、「本実施形態の製剤又は組成物」ともいう）として、使用することができ、さらにこれら製剤又は組成物を製造するために使用することができる。
前記本実施形態の製剤又は組成物は、それ自体、人を含む動物（例えばペット等）に摂取又は投与した場合に、上述したアディポネクチン産生増加作用等の各種効果を発揮する。また、前記製剤又は組成物は、ヒト又はヒト以外の動物のための、医薬品用、医薬部外品用、飲食品用又は飼料用であってもよく、或いは、当該医薬品、医薬部外品、飲食品又は飼料に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。
【００３９】
また、当該飲食品には、上述の抗肥満等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した飲食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品が包含される。これらの飲食品は機能表示により、一般の飲食品と区別することができる。
さらに本実施形態の緑茶抽出物由来の麹発酵物を、従来の飲食品にさらに配合することにより、従来飲食品と区別することも可能であり、例えば、本実施形態の緑茶抽出物由来の麹発酵物を添加した茶系製品（例えば、茶葉、ティーバッグ、インスタントティー、茶飲料、茶抽出物入り製品（菓子、麺類等）等が挙げられる。
【００４０】
また、本実施形態の緑茶抽出物由来の麹発酵物を含有する上記医薬品（医薬部外品も含む）の剤型は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、静脈内注射剤、筋肉注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤、湿布剤、バップ剤、軟膏、ローション、クリーム、口腔用製剤（歯磨剤、液状歯磨剤、洗口液、歯肉マッサージクリーム、口腔用軟膏、うがい用錠剤、トローチ、のど飴等）等のいずれでもよい。投与形態も経口投与（内用）、非経口投与（外用、注射）のいずれであってもよい。
【００４１】
また、このような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、本実施形態の緑茶抽出物由来の麹発酵物を、各々単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤、本発明以外の薬効成分等を適宜組み合わせて調製することができる。また、これらの投与形態のうち、好ましい形態は経口投与であり、経口用液体製剤は、嬌味剤、緩衝剤、安定化剤等を加えて常法により調製することができる。
【００４２】
経口投与用製剤中の、本実施形態の緑茶抽出物由来の麹発酵物の含有量は、一般的に固形分濃度として、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、また好ましくは２０質量％以下、より好ましくは１０質量％以下である。また、好ましくは０．１〜１０質量％、より好ましくは０．５〜５質量％である。
【００４３】
本実施形態の緑茶抽出物由来の発酵物を含有する上記食品の形態としては、清涼飲料水、茶系飲料、茶葉製品、インスタントティー、コーヒー飲料、果汁飲料、炭酸飲料、ジュース、ゼリー、ウエハース、ビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品や栄養食等の各種食品の他、更には、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）の栄養補給用組成物が挙げられる。
【００４４】
種々の形態の食品は、上記植物又はその抽出物を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤、本発明以外の有効成分等を適宜組み合わせて調製することができる。
【００４５】
当該飲食品又は飼料中の、本実施形態の緑茶抽出物由来の発酵物の含有量は、一般的に固形分濃度として好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、また好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下である。また、好ましくは０．０１〜１０質量％、より好ましくは０．５〜５質量％である。
【００４６】
また、飼料としては、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、犬、猫等に用いるペットフード等の飼料等が挙げられ、上記食品と同様の形態に調製できる。
【００４７】
本実施形態の緑茶抽出物由来の発酵物の摂取量は、対象の種、体重、性別、年齢、状態又はその他の要因に従って変動し得る。投与の用量、経路、間隔、及び摂取の量や間隔は、当業者によって適宜決定され得るが、成人に対して１日あたり、乾燥物換算として、一般的に好ましくは１ｍｇ／６０ｋｇ体重以上、より好ましくは２ｍｇ／６０ｋｇ体重以上、また好ましくは１０００ｍｇ／６０ｋｇ体重以下、より好ましくは５００ｍｇ／６０ｋｇ体重以下、更に好ましくは２００ｍｇ／６０ｋｇ体重以下である。また、好ましくは１〜２０００ｍｇ／６０ｋｇ体重、より好ましくは２〜１０００ｍｇ／６０ｋｇ体重、更に好ましくは２〜５０００ｍｇ／６０ｋｇ体重である。
【００４８】
本実施形態は、投与又は摂取対象者としては、病者又は健常者に関わらず、それを必要若しくは希望する人であれば特に限定されないが、例えば、運動不足者、肥満や糖尿病等が気になる中高年、肌質が気になる老若男女等が好ましい。
また、本実施形態は、肥満患者だけでなく、太りやすい体質の者、又は適切な体重維持を望む者等に適用することができる。
また本実施形態は、糖尿病やインスリン抵抗性の患者だけでなく、糖尿病やインスリン抵抗性に罹患していない対象者、例えば、食後高血糖は高いが空腹時血糖に異常のない対象者、空腹時血糖は下げなくともよいが食後高血糖は低下させることが所望される対象者等に適用することができる。
また、本実施形態は、高血圧患者、あるいは高血圧の予防又は当該発症のリスク低減を望む対象者等に適用することができる。
更に、血管保護強化が必要な対象者、あるいは血管保護強化を望む対象者に適用することができる。
【００４９】
本実施形態は、以下の態様も採用することができる。
〔１〕  緑茶抽出物を麹で発酵させることを特徴とする、緑茶抽出物由来の発酵物の製造方法。
好適には、前記麹には、アスペルギルス属（Aspergillus）に属する微生物を含むものであり、さらに好適には、米麹系コウジ菌及び／又は麦麹系コウジ菌である。
好適には、前記緑茶抽出物が、液体培地中、１〜３０質量％である。さらに好適には、液体培地中、緑茶カテキン総量が０．１〜５質量％及び／又はＥＧＣＧ含有量が０．０５〜２．５質量％である。
〔２〕  緑茶抽出物由来の麹発酵物。好適には、当該麹発酵物が、前記〔１〕記載の製造方法により得られた緑茶抽出物由来の発酵物である。当該麹発酵物の対象者が、健常者又は健常動物、成人又は成熟動物であることが好適である。
〔３〕  前記〔２〕記載の麹発酵物を有効成分として含む組成物又は製剤。好適には、医薬品組成物、飲食品組成物、飼料組成物、又は製剤である。
〔４〕  前記組成物が、アディポネクチン産生促進用組成物、又は肥満の予防、改善若しくは治療用組成物、又は、美肌用組成物、又は動脈硬化の予防、改善若しくは治療用の組成物；又は、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現抑制作用組成物である前記〔３〕記載の組成物又は製剤。
〔５〕  前記組成物が、アディポネクチン産生増加用；アディポネクチン発現促進用；脂肪細胞分解酵素ＡＴＧＬ発現促進用；脂肪蓄積の少ない脂肪細胞への分化誘導用；転写因子Ｃ／ＥＢＰα及びＰＰＡＲγの発現低下用；脂肪細胞肥大化による脂肪蓄積増加の抑制用；血管内皮創傷治癒用；又は、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現抑制作用の組成物である前記〔４〕記載の組成物又は製剤。
【００５０】
〔６〕  アディポネクチン産生促進用；肥満の予防、改善若しくは治療用；美肌用；又は、動脈硬化の予防、改善若しくは治療用；又は、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現抑制作用の、緑茶抽出物由来の麹発酵物。好適には、前記〔１〕記載の製造方法により得られた緑茶抽出物由来の麹発酵物である。
〔７〕  アディポネクチン産生増加用；アディポネクチン発現促進用；脂肪細胞分解酵素ＡＴＧＬ発現促進用；脂肪蓄積の少ない脂肪細胞への分化誘導用；転写因子Ｃ／ＥＢＰα及びＰＰＡＲγの発現低下用；脂肪細胞肥大化による脂肪蓄積増加の抑制用；又は血管内皮創傷治癒用；又は、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現抑制作用の、緑茶抽出物由来の麹発酵物。
【００５１】
〔８〕  前記〔２〕記載の緑茶抽出物由来の麹発酵物の、以下の何れかの用途への医療目的使用又は非医療目的使用。
アディポネクチン産生促進；肥満の予防、改善若しくは治療；美肌；又は、動脈硬化の予防、改善若しくは治療；アディポネクチン発現促進；脂肪細胞分解酵素ＡＴＧＬ発現促進；脂肪蓄積の少ない脂肪細胞への分化誘導；転写因子Ｃ／ＥＢＰα及びＰＰＡＲγの発現低下；脂肪細胞肥大化による脂肪蓄積増加の抑制；血管内皮創傷治癒；又は、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）発現抑制。
好適には、前記〔１〕記載の製造方法により得られた緑茶抽出物由来の麹発酵物である。
〔９〕  前記〔３〕又は〔４〕の組成物又は製剤の製造のための緑茶抽出物由来の麹発酵物の使用。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本発明の代表的な実施例の一例を示したものであり、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００５３】
＜緑茶抽出物由来の麹発酵物の製造方法＞
１．緑茶エキス
緑茶エキスとして、緑茶エキスＢＬ（商品名：株式会社アクセスワン）（緑茶ポリフェノール４６．５質量％、緑茶カテキン総量  ４０．１１質量％、ＥＧＣＧ含量  １３．６質量％、緑茶カフェイン５．２質量％）のものを用いた。
また、緑茶エキスＢＬの規格では、水分含有量はカールフィッシャー法にて５％以下となっている。また、茶ポリフェノールは酒石酸鉄比色定量法にて測定することができ、また緑茶カテキン総量、ＥＧＣＧ含有量及び緑茶カフェインはＨＰＬＣ法にて測定することができる。【００５４】
２．培養方法
表１に示す培地組成の液体培地  100mLをあらかじめシリコ栓をして乾熱殺菌した500mL容の肩付きフラスコに分注し、常法に従いオートクレーブ滅菌を行った。室温まで放冷後、スパーテルで１杯の各種種麹（表２、２０〜６０ｍｇ）を直接植菌した。植菌後、２５℃、120 oscillation/minの振盪で１７日間培養した。
培養後、ろ紙（Advantec No. 2）で吸引濾過により菌体を除去し、培養上清として以後の生理活性試験の実験に用いた。【００５５】
【表１】
2019131274.tif 000002
【００５６】
【表２】
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【００５７】
３．ＨＰＬＣ分析条件
培養上清は、0.22 μmのディスクフィルターで濾過後、逆相カラムクロマトのＨＰＬＣ分析によって成分分析に供した。分析条件は以下のとおりである。
＜分析条件＞
カラム：逆相カラム：TSK gel ODS-80Ts (5 μm. 4.6×250 mm)
移動相：(A) 1.0 % acetic acid
(B) Acetonitrile
Gradient： A:B = 90:10 (0 min) →20:80 (45 min)
流速：0.6 ml / min
検出：UV 280 nm
注入量：20 μL
標準品１：カテキン標準品混合物 エピガロカテキン (EGC),   エピカテキン (EC), エピガロカテキンガレート(EGCG), エピカテキンガレート (ECG)  各0.025 mg/mL
標準品２：テアデノール  Ａ  0.025 mg/mL【００５８】
いずれの種麹を使用しても、培養初期に培地中に見られたカテキン類や他の緑茶成分が培養によってほとんど消失し、相対保持時間１３〜１４分にピークが見られる化合物のみが検出された。このピークは、単独の化合物か複数が存在しているかは不明であり、現在解析中である。いずれの種麹を使用しても、麹発酵後の培養液中にカテキン類及びテアデノールのピークは０．０１ｍｇ／ｍＬ以下で検出できず、この１３〜１４分のピークの高さを１．００としたときに、カテキン類及びテアデノールは、０．００５以下であった。
また、未植菌培地及び培養後の各上清のポリフェノール量を、没食子酸（gallic acid）を標準品として用い、フォリンーチオカルト（Folin-Ciocalteu）法によるポリフェノール量として測定を行った。培養後の各上清ではＨＰＬＣ分析の結果と同様に麹に資化されポリフェノール量が著しく低減し、未植菌培地のポリフェノール量を１００％としたときに少なくとも１３％以下になっていた。
なお、図１に、代表的な培養上清の製造例３（白もやし）（図１Ｄ）及び製造例５（長白菌）（図１Ｅ）の分析結果を示した（クロマトグラムの縦軸は同一スケール）。
製造例３（白もやし）及び製造例５（長白菌）は、米麹・麦麹系の種麹として使用されている。
また、図１Ａに標準品１のカテキン類、図１Ｂに緑茶抽出物（発酵前）、図１Ｃに標準品２のテアデノールＡの分析結果を示した。【００５９】
＜生理活性の実験方法＞
１．創傷治癒実験
ブタ由来血管内皮細胞を3.5 cm dishに3×105 cells/dishで播種し、7時間かけて接着させた。1%FBSを含む培地で17時間同調培養後、Hydroxytyrosolを終濃度50 μMおよび発酵産物を終濃度1/1000希釈で添加した。化合物添加後、200 μLチップの先端を用いてディッシュの底に擬似的な傷をつけ、顕微鏡下で観察、撮影した。24時間後に再び撮影を行い、最初に作成した傷の範囲内に存在する細胞数をカウントすることで傷の修復の程度を評価した。撮影は1ディッシュにつき3視野行った。【００６０】
２.3T3-L1細胞の培養と化合物の添加
3T3-L1細胞の培養には高グルコースDMEMを用い、37 ℃、5％ CO2環境下で培養した。10%仔牛血清を含むDMEMでコンフルエントに達するまで培養し、2日後に分化誘導培地（Insulin、DEX、IBMX、10% FBSを含むDMEM）に交換して2日間培養した。その後Insulin及び10%FBS存在下で、2日ごとに培地交換を繰り返しながら培養を続けた。分化誘導から12日目前後の細胞を成熟脂肪細胞、18日目前後の細胞を肥大化脂肪細胞のモデルとした。3T3-L1細胞から成熟脂肪細胞への分化に対する化合物の効果を評価する実験では、化合物は分化誘導培地に変換した２日後から、Insulinと共に添加した。成熟脂肪細胞に対する化合物の効果を観察する実験では、12日後の成熟脂肪細胞に化合物を添加し24時間培養した。更に、肥大化脂肪細胞への変化に対する効果を検討する実験では、12日後の細胞に化合物を添加し、化合物存在下で培地交換を繰り返しながら6日間培養した。以上の処理後、オイルレッドO染色およびWestern blot解析を行った。【００６１】
３．オイルレッドO染色
オイルレッドOは1 g/200 mL（99% イソプロパノール）の濃度で溶解して保存液とし、使用時には水で60%に希釈した。各刺激後の細胞をPBS（-）で3回洗浄し、10% ホルマリン液を加えて30分間固定した。水で3回洗浄してから60% イソプロパノールを加えて5分間静置後、オイルレッドO溶液を加えて脂質を染色した。20分後に再び水で3回洗浄し、DMSOを加えてオイルレッドO色素を抽出して1.5 mL tubeに回収した。10,000 rpmで10分間遠心分離後に上清を採取し、540 nmの吸光度を測定して定量化した。【００６２】
４．トータルライゼートの調製
各細胞培養後、PBS（-）で2回洗浄し、直ちに-80 ℃で保存した。その後細胞を氷上で融解し、Lysisバッファー（50 mM HEPES pH7.5、50 mM NaCl、1 mM EDTA、50% Glycerol、100 mM NaF、10 mM Sodium pyrophosphate、1% Triton X-100、1 mM NaVO4、1 mM PMSF、10 μg/mL Antipain、10 μg/mL Leupeptin、10 μg/mL Aprotinin）を150 μL加えて5分間静置し、スクレーパーで細胞を剥ぎ取って1.5 mL tubeに回収した。これらを氷上で15分間静置し、14,000 rpmで15分間遠心後、上清を回収した。【００６３】
５．電気泳動及び抗原抗体反応
回収したサンプルのタンパク質濃度をBCA Protein assay kit（Pierce）を用いて測定し、20 μg相当のタンパク質を7.5%、10%、12.5%、15%アクリルアミドゲルSDS-PAGEに供した。電気泳動後、PVDFメンブレン（Millipore）に転写し、5% BSA/TBS-T（10 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.1% Tween20）でブロッキングを行い、各種一次抗体を反応させた。TBS-Tで15分間メンブレンを洗浄した後、それぞれの一次抗体を認識する二次抗体を用いて抗原抗体反応をさせた。再びメンブレンをTBS-Tで15分間洗浄し、バンドの検出にChemi-lumi one（ナカライテスク）もしくはClarity Max Western ECL Substrate（BIO-RAD）を用いて、Horse radish peroxidase（HRP）による化学発光をC-DiGit Blot Scanner（LI-COR社）により検出した。抗体の希釈には5% BSA/TBS-Tを用いた。希釈倍率及び反応温度・時間は各抗体の付属プロトコールに準じた。【００６４】
＜生理活性試験の結果＞
＜アディポネクチン発現量増加確認試験＞
上述のとおり、表２に示す各種麹で麹発酵させた、緑茶抽出物由来の各麹発酵物を使用して得られた結果を以下に示す。
成熟脂肪細胞に、製造例１〜６の麹発酵産物を、終濃度で1/1000希釈で添加し、24時間培養後、細胞ライゼートを調製し、Western blot法によりアディポネクチンのタンパク発現量を定量した。Contは化合物無添加のコントロールを示す。Western blot解析の内部標準としてα-Tubulinを用いた。
麹種で緑茶抽出物を麹発酵させた、緑茶抽出物由来の麹発酵物（製造例１〜６）は、全て成熟脂肪細胞におけるアディポネクチンの発現量を増加させた。【００６５】
【表３】
2019131274.tif 000004
【００６６】
＜血管内皮細胞の創傷治癒促進効果確認試験＞
ブタ由来血管内皮細胞に製造例５：長白菌(米麹・麦麹系)の麹発酵産物を終濃度1/1000希釈し、創傷治癒効果を添加24時間に評価した。Contは化合物を添加しないコントロールを示す。
麹発酵産物（製造例５：長白菌(米麹・麦麹系)）が、血管内皮細胞の創傷治癒促進効果を示した。【００６７】
【表４】
2019131274.tif 000005
【００６８】
＜アディポネクチン発現量増加確認試験：発酵前後＞
成熟脂肪細胞に発酵産物（製造例３：白もやし(米麹・麦麹系)）及びその発酵前のものを終濃度1/1000希釈で添加し、24時間培養後、細胞ライゼートを調製し、Western blot法によりアディポネクチンのタンパク発現量を定量した。Contは化合物を添加しないコントロールを示す。Western blot解析の内部標準としてα-Tubulinを用いた。図２にその結果を示す。
麹発酵産物（製造例３：白もやし(米麹・麦麹系)）がアディポネクチンの発現量を増加させたのに対し、発酵前の茶葉抽出物は同条件下（1/1000希釈）でアディポネクチンの発現量の増加効果を示さなかった。これは、微生物制御発酵によりカテキン類から新たに生成された化合物が、カテキン類より強いアディポネクチン産生作用を有することを意味する。【００６９】
【表５】
2019131274.tif 000006
【００７０】
＜酵素ＡＴＧＬ発現量増加確認試験＞
成熟脂肪細胞に、麹発酵産物（製造例３：白もやし（米麹・麦麹系）、製造例５：長白菌(米麹。麦麹系)）を終濃度1/1000希釈で添加し、24時間培養後、細胞ライゼートを調製し、Western blot法により脂肪分解に関わる酵素ATGLのタンパク発現量を定量した。Contは化合物を添加しないコントロールを示す。Western blot解析の内部標準としてα-Tubulinを用いた。
麹発酵産物（製造例３：白もやし（米麹・麦麹系）、製造例５：長白菌(米麹。麦麹系)）は、脂肪細胞の脂肪分解に関わる酵素ATGLの発現を増加させる傾向を示したのに対し、Teadenol A（0.3μM）はその作用を示さなかった。【００７１】
【表６】
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【００７２】
＜脂肪蓄積の少ない脂肪細胞への分化誘導作用確認試験＞
脂肪前駆細胞に分化誘導初期から８日間、麹発酵産物（製造例３：白もやし（米麹・麦麹系）、製造例５：長白菌(米麹・麦麹系)）を終濃度1/1000希釈、Teadenol Aを終濃度0.3 μM で添加し、細胞内に蓄積される脂肪をオイルレッドOを用いて染色し定量化した。Contは化合物を添加しないコントロールを示す。
麹発酵産物（製造例３：白もやし（米麹・麦麹系）、製造例５：長白菌(米麹・麦麹系)）は、3T3-L1細胞から成熟脂肪細胞へと分化する際の脂肪蓄積を抑制した。この結果は、体内で脂肪前駆細胞が脂肪細胞に分化する際に、当該発酵産物が脂肪蓄積の少ない脂肪細胞を作り出す可能性を意味する。【００７３】
【表７】
2019131274.tif 000008
【００７４】
＜転写因子C/EBPαとPPARγの発現増加確認試験＞
脂肪前駆細胞に、分化誘導開始２日後に、麹発酵産物（製造例３：白もやし（米麹・麦麹系）、製造例５：長白菌(米麹・麦麹系)）を終濃度1/1000希釈で添加し、８日間培養後に細胞ライゼートを調製し、Western blot法により脂肪分化に関わる転写因子C/EBPαとPPARγのタンパク発現量を定量した。Contは化合物を添加しないコントロールを示す。Western blot解析の内部標準としてα-Tubulinを用いた。
麹発酵産物（製造例３：白もやし（米麹・麦麹系）、製造例５：長白菌(米麹・麦麹系)）は、3T3-L1細胞から成熟脂肪細胞への分化に関わる転写因子C/EBPαとPPARγの発現を低下させる。この結果は、3T3-L1細胞から成熟脂肪細胞への分化過程での脂肪蓄積を発酵産物が部分的に抑制する結果を裏付けるものである。【００７５】
【表８】
2019131274.tif 000009
【００７６】
【表９】
2019131274.tif 000010
【００７７】
＜脂肪細胞肥大化による脂肪蓄積増加の抑制確認試験＞
分化開始１２日後の成熟脂肪細胞に、麹発酵産物（製造例３：白もやし（米麹・麦麹系）、製造例５：長白菌(米麹・麦麹系)）を終濃度1/1000希釈で添加し、６日間培養後に細胞内に蓄積された脂肪を、オイルレッドOを用いて染色し定量化した。Day 12とDay 18におけるぞれぞれのContは、化合物を添加しないコントロールを示す。
成熟脂肪細胞の培養を続けることで細胞内の脂肪量は大きく増加した。その増加は、麹発酵産物（製造例３：白もやし（米麹・麦麹系）、製造例５：長白菌(米麹・麦麹系)）により部分的に抑制された。この結果は、体内において発酵産物が脂肪細胞肥大化による脂肪蓄積の更なる増加を抑制する可能性を示す。【００７８】
【表１０】
2019131274.tif 000011
【００７９】
＜アディポネクチンと脂肪分解酵素ATGLの発現量確認試験＞
分化開始１２日後の成熟脂肪細胞に、麹発酵産物（製造例３：白もやし（米麹・麦麹系）、製造例５：長白菌(米麹・麦麹系)）を終濃度1/1000希釈で添加し、６日間培養後に細胞内に蓄積された脂肪をオイルレッドOを用いて染色し定量化した。Day 12とDay 18におけるぞれぞれのContは、化合物を添加しないコントロールを示す。
成熟脂肪細胞の培養を続けることで細胞内のアディポネクチンと脂肪分解酵素ATGLの発現量は大きく低下した。その低下は、麹発酵産物（製造例３：白もやし（米麹・麦麹系）、製造例５：長白菌(米麹・麦麹系)）により部分的に抑制された。この結果は、肥満と連動する脂肪細胞肥大化による超善玉ホルモンであるアディポネクチンの産生低下、またATGL産生低下による脂肪分解能力の低下を、麹発酵産物が改善する可能性を示す。【００８０】
【表１１】
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【００８１】
【表１２】
2019131274.tif 000013
【００８２】
＜抗酸化酵素CatalaseとHemeoxygenase-1（HO-1）の発現量低下抑制確認試験＞
分化開始１２日後の成熟脂肪細胞に、麹発酵産物（製造例３：白もやし（米麹・麦麹系）、製造例５：長白菌(米麹・麦麹系)）を終濃度1/1000希釈で添加し、６日間培養後に細胞ライゼートを調製し、Western blot法により抗酸化酵素CatalaseとHemeoxygenase-1（HO-1）のタンパク発現量を定量した。Day 12とDay 18におけるぞれぞれのContは、化合物を添加しないコントロールを示す。Western blot解析の内部標準としてα-Tubulinを用いた。
成熟脂肪細胞の培養を続けることで細胞内の抗酸化酵素CatalaseとHemeoxygenase-1（HO-1）の発現量は大きく低下した。その低下は、麹発酵産物（製造例３：白もやし（米麹・麦麹系）、製造例５：長白菌(米麹・麦麹系)）により顕著に改善された。脂肪細胞の肥大化は炎症反応であり活性酸素種が発生する。肥大化による抗酸化酵素の発現低下は、発生する活性酸素種の更なる増加を意味する。麹発酵産物が抗酸化酵素の発現低下を改善できることは、体内でこの悪い酸化ストレスサイクルを軽減できることに繋がる。【００８３】
【表１３】
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【００８４】
【表１４】
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【００８５】
＜活性酸素産生に関わる酵素NOX4と炎症因子TNFαの発現量増加抑制確認試験＞
分化開始１２日後の成熟脂肪細胞に、麹発酵産物（製造例３：白もやし（米麹・麦麹系）、製造例５：長白菌(米麹・麦麹系)）を終濃度1/1000希釈で添加し、６日間培養後に細胞ライゼートを調製し、Western blot法により活性酸素産生酵素NOX4と炎症因子TNFαのタンパク発現量を定量した。Day 12とDay 18におけるぞれぞれのContは、化合物を添加しないコントロールを示す。Western blot解析の内部標準としてα-Tubulinを用いた。
成熟脂肪細胞の培養を続けることで細胞内の活性酸素産生に関わる酵素NOX4と炎症因子TNFαの発現量は大きく増加した。TNFαの増加は、麹発酵産物（製造例３：白もやし（米麹・麦麹系）、製造例５：長白菌(米麹・麦麹系)）により抑制された。また、NOX4の増加は製造例２：白もやし（米麹系）の発酵産物で抑制されたが、製造例５：長白菌(米麹・麦麹系)）の麹発酵物にはその効果は見出せなかった。肥大化によるTNFαとNOX4の発現増加は活性酸素種増加に直結し、その発現を抑えることは、肥満と連動する脂肪細胞の肥大化で生じる体内の酸化ストレスを軽減することを意味する。【００８６】
【表１５】
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【００８７】
【表１６】
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【００８８】
＜発酵産物のマウス投与：脂肪組織のAdiponectin発現促進作用及び脂肪酸合成酵素（FAS）発現抑制作用＞
動物実験：
成熟雌ICRマウス（日本エスエルシー株式会社）を発酵産物投与群（６匹）と非投与群（６匹）に分けた。投与群には、長白菌（菱六）を用いて調製した発酵培養上清の凍結乾燥品（製造例５）を１０mg/kg体重/日で１０日間投与した。投与は、通常食の粉末飼料MF粉末（日本エスエルシー株式会社）に上記乾燥品の粉末を混合し、自由摂取にて行った。１０日後に脂肪組織を摘出し、-80 ℃で保存した。【００８９】
・組織からのタンパク質調製：
-80 ℃で保存した脂肪組織を氷上で融解後、一部を切り出して組織用Lysisバッファー（50 mM HEPES pH7.5、50 mM NaCl、1 mM EDTA、50 mM NaF、1 mM NaVO4、25 mM β-glycerophosphate、200 μM dithiothreitol、0.02% Triton X-100）中でホモジナイズし、14,000 rpmで30分間遠心分離して上清を回収した。さらに14,000 rpmで15分間遠心分離し、回収した上清を最終的なサンプルとした。【００９０】
・電気泳動及び抗原抗体反応：  
回収したサンプルのタンパク質濃度をBCA Protein assay kit（Pierce）を用いて測定し、20 μg相当のタンパク質を10%アクリルアミドゲルSDS-PAGEに供した。電気泳動後、PVDFメンブレン（Millipore）に転写し、5% BSA/TBS-T（10 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.1% Tween20）でブロッキングを行い、各種一次抗体を反応させた。TBS-Tで15分間メンブレンを洗浄した後、それぞれの一次抗体を認識する二次抗体を用いて抗原抗体反応をさせた。再びメンブレンをTBS-Tで15分間洗浄し、バンドの検出にChemi-lumi one（ナカライテスク）もしくはClarity Max Western ECL Substrate（BIO-RAD）を用いて、Horse radish peroxidase（HRP）による化学発光をC-DiGit Blot Scanner（LI-COR社）により検出した。抗体の希釈には5% BSA/TBS-Tを用いた。希釈倍率及び反応温度・時間は各抗体の付属プロトコールに準じた。【００９１】
・結果：
ウェスタンブロットのアディポネクチンと脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）のバンド、およびそれらを定量化したものを図３に示す。定量化にはβ-アクチンを内部標準として用いた。バンドの強度から明らかなように、発酵産物投与群のアディポネクチンの発現は非投与群に比べて明らかな高値を示した。これに対し、ＦＡＳの発現は、発酵産物投与群で低値を示した。この結果から、発酵産物が培養脂肪細胞だけでなく、個体レベルでもアディポネクチンの発現を増加させる効果があることが明らかとなった。更に、発酵産物はＦＡＳの発現を低下させることで脂質合成を抑制する能力があると考えられる。【００９２】
これは、緑茶抽出物由来の麹発酵物は、マウス脂肪組織のアディポネクチンの発現を促進する作用、及び脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の発現を抑制する作用を有している。そして、緑茶抽出物由来の麹発酵物は、経口投与によってアディポネクチン発現促進作用及び脂肪酸合成酵素の発現抑制作用が得られ、飲料や飲食品等の摂取において又は医薬品等の経口投与においても、肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧等の各種の症状、疾患又は状態を予防、改善又は治療できる。また、緑茶抽出物由来の麹発酵物は、いわゆる成人病又はその予備軍が多い成人に対して非常に有効である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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