(57)【要約】  本発明は、ＷＴ１タンパク質由来の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＷＴ１ペプチドであって、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合してＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞を誘導するペプチド、ならびにこれらを含む医薬組成物などに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＷＴ１タンパク質由来の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドであって、前記アミノ酸配列が、
（ａ）配列番号：３に示すアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：４に示すアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号：５に示すアミノ酸配列；および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）に示すアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、または欠失もしくは付加されたアミノ酸配列
からなる群から選択されるペプチドであって、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合してＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞を誘導するペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列が配列番号：３に示すアミノ酸配列である、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
ＭＨＣクラスＩＩ分子が、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊０８０２、ＤＲＢ１＊０８０３、ＤＲＢ１＊０９０１、ＤＲＢ１＊１２０１、ＤＲＢ１＊１４０３、ＤＲＢ１＊１５０１、ＤＲＢ１＊１５０２、ＤＰＢ１＊０２０１、ＤＰＢ１＊０２０２、ＤＰＢ１＊０４０２、ＤＰＢ１＊０５０１、ＤＰＢ１＊０９０１、ＤＱＢ１＊０３０１、ＤＱＢ１＊０３０２、ＤＱＢ１＊０４０１、ＤＱＢ１＊０５０１、ＤＱＢ１＊０６０１、ＤＱＢ１＊０６０２、およびＤＲＢ５＊０１０２からなる群から選択されるものである、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
ＭＨＣクラスＩＩ分子が、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊１５０２、ＤＰＢ１＊０２０１、ＤＰＢ１＊０２０２、およびＤＱＢ１＊０６０１からなる群から選択されるものである、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド、または請求項５記載のポリヌクレオチドに対する抗体。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド、請求項５記載のポリヌクレオチド、または請求項６記載のベクターを含む、癌を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド、請求項５記載のポリヌクレオチド、または請求項６記載のベクターの有効量を、請求項３または４記載のＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法。
【請求項１０】
癌を治療または予防するための、請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド、請求項５記載のポリヌクレオチド、または請求項６記載のベクターの使用。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチドを請求項３または４記載のＭＨＣクラスＩＩ分子を介して提示する、抗原提示細胞。
【請求項１２】
未熟抗原提示細胞を請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチドの存在下で培養し、該未熟抗原提示細胞から前記ペプチドを請求項３または４記載のＭＨＣクラスＩＩ分子を介して提示する抗原提示細胞を誘導することを特徴とする、抗原提示細胞の誘導方法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチドにより誘導される、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞。
【請求項１４】
末梢血単核球を請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチドの存在下で培養し、該末梢血単核球からＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞を誘導することを特徴とする、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の誘導方法。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチドを必須構成成分として含む、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞を誘導するためのキット。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド、請求項５記載のポリヌクレオチド、または請求項６記載のベクターを必須構成成分として含む、癌を予防または治療するためのキット。
【請求項１７】
請求項３または４記載のＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象におけるＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を決定する方法であって、
（ａ）請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチドを該対象由来試料と反応させ；次いで、
（ｂ）該試料に含まれるサイトカインの存在または量を調べる、
工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＷＴ１ヘルパーペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ペプチドにより誘導されるＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞、およびこれらを含む癌治療／予防用医薬組成物などに関する。なお、本願は、２００９年４月２３日出願の日本国特許出願第２００９−１０５２８６に対して優先権を主張するものであり、日本国特許出願第２００９−１０５２８６の全内容を本願に組み込むものである。
【背景技術】
【０００２】
ＷＴ１遺伝子（Ｗｉｌｍｓ’  ｔｕｍｏｒ  １  ｇｅｎｅ）は、小児の腎癌であるウイルムス腫瘍の責任遺伝子として同定された遺伝子であり（非特許文献１および２）、ジンクフィンガー構造を有する転写因子である。当初、ＷＴ１遺伝子は癌抑制遺伝子であるとされたが、その後の研究（非特許文献３〜６）により、造血器腫瘍や固形癌においてはむしろ癌遺伝子として働くことが示された。【０００３】
ＷＴ１遺伝子が多くの悪性腫瘍において高発現していることから、変異のない自己タンパク質であるＷＴ１遺伝子産物の生体内における免疫原性の有無が検証されてきた。その結果、腫瘍細胞で高発現しているＷＴ１遺伝子由来のタンパク質は細胞内プロセッシングにより断片化され、生じたペプチドがＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して細胞表面に提示されること、およびかかる複合体を認識する細胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬともいう）がＷＴ１ペプチドワクチネーションにより誘導され得ることが明らかとなった（非特許文献７〜９）。さらに、ＷＴ１ペプチドまたはＷＴ１  ｃＤＮＡで免疫されたマウスは、移植されたＷＴ１遺伝子発現腫瘍細胞を高い確率で拒絶するが（非特許文献７および１０）、ＷＴ１遺伝子を内在的に発現している正常組織は誘導されたＣＴＬによって傷害されないことも示された（非特許文献７）。これまでに、マウスだけでなくヒトにおいてもＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導が可能であり、かかるＣＴＬがＷＴ１遺伝子を高発現する腫瘍細胞に対しては傷害活性を有するが、ＷＴ１遺伝子を内在的に発現する正常細胞には傷害活性を有さない可能性が強く示唆された（非特許文献７、１０〜１４）。【０００４】
一方で、ＣＴＬが効率的に誘導されるためには、癌抗原に特異的なヘルパーＴ細胞の存在が重要であることが報告されている（非特許文献１５）。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４陽性Ｔ細胞）は、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子と抗原ペプチドとの複合体を認識して誘導、増殖、および活性化される。活性化されたヘルパーＴ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、またはインターフェロン（ＩＦＮ）のごときサイトカインを産生し、Ｂ細胞およびその他のＴ細胞のサブセットの増殖、分化、および成熟を促進する。このことから、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する抗原ペプチドは、ヘルパーＴ細胞の誘導を介することによりＣＴＬなどを効率的に活性化して免疫機能を増進すると考えられる（非特許文献１６）。これまで、ＷＴ１に関しては、ＭＨＣクラスＩＩ分子のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５に結合する抗原ペプチド（非特許文献１７および特許文献１)のみが報告されており、その他のサブタイプに対する抗原ペプチドを見出す必要があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開２００５／０４５０２７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Daniel A. Haber et al., Cell. 1990 Jun 29;61(7):1257-69.
【非特許文献２】Call KM et al., Cell. 1990 Feb 9;60(3):509-20.
【非特許文献３】Menke AL et al., Int Rev Cytol. 1998;181:151-212. Review.
【非特許文献４】Yamagami T et al., Blood. 1996 Apr 1;87(7):2878-84.
【非特許文献５】Inoue K et al., Blood. 1998 Apr 15;91(8):2969-76.
【非特許文献６】Tsuboi A et al., Leuk Res. 1999 May;23(5):499-505.
【非特許文献７】Oka Y et al., J Immunol. 2000 Feb 15;164(4):1873-80.
【非特許文献８】Melief CJ et al., Immunol Rev. 1995 Jun;145:167-77.
【非特許文献９】Ritz J, J Clin Oncol. 1994 Feb;12(2):237-8.
【非特許文献１０】Tsuboi A et al., J Clin Immunol. 2000 May;20(3):195-202.
【非特許文献１１】Oka Y et al., Immunogenetics. 2000 Feb;51(2):99-107.
【非特許文献１２】Ohminami H et al., Blood. 2000 Jan 1;95(1):286-93.
【非特許文献１３】Gao L et al., Blood. 2000 Apr 1;95(7):2198-203.
【非特許文献１４】Ohminami H et al., Blood. 2000 Jan 1;95(1):286-93.
【非特許文献１５】Cancer. Res. 62:6438, 2002
【非特許文献１６】J.Immunol. Immunother., 24:195, 2001
【非特許文献１７】Cancer. Immunol. Immunother. 51:271, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の解決課題は、広範なＭＨＣクラスＩＩ分子に結合してＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞を誘導するペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ペプチドにより誘導されるＷＴ１ヘルパーＴ細胞、およびこれらを含む癌治療／予防用医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、本発明者らは、ＷＴ１タンパク質をコードする連続するアミノ酸配列の一部を有するペプチドが、癌抗原ヘルパーペプチドとして機能すること、すなわち、抗原提示細胞上でＭＨＣクラスＩＩ分子に結合して提示され、ＷＴ１特異的なヘルパーＴ細胞を誘導することを知見し、これらを癌の治療／予防用医薬組成物として用いることが可能なことを示した。【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）ＷＴ１タンパク質由来の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドであって、前記アミノ酸配列が、
（ａ）配列番号：３に示すアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号：４に示すアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号：５に示すアミノ酸配列；および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）に示すアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、または欠失もしくは付加されたアミノ酸配列
からなる群から選択されるペプチドであって、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合してＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞を誘導するペプチド、
（２）アミノ酸配列が配列番号：３に示すアミノ酸配列である、（１）記載のペプチド、
（３）ＭＨＣクラスＩＩ分子が、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊０８０２、ＤＲＢ１＊０８０３、ＤＲＢ１＊０９０１、ＤＲＢ１＊１２０１、ＤＲＢ１＊１４０３、ＤＲＢ１＊１５０１、ＤＲＢ１＊１５０２、ＤＰＢ１＊０２０１、ＤＰＢ１＊０２０２、ＤＰＢ１＊０４０２、ＤＰＢ１＊０５０１、ＤＰＢ１＊０９０１、ＤＱＢ１＊０３０１、ＤＱＢ１＊０３０２、ＤＱＢ１＊０４０１、ＤＱＢ１＊０５０１、ＤＱＢ１＊０６０１、ＤＱＢ１＊０６０２、およびＤＲＢ５＊０１０２からなる群から選択されるものである、（１）または（２）に記載のペプチド、
（４）ＭＨＣクラスＩＩ分子が、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊１５０２、ＤＰＢ１＊０２０１、ＤＰＢ１＊０２０２、およびＤＱＢ１＊０６０１からなる群から選択されるものである、（１）または（２）に記載のペプチド、
（５）（１）〜（４）のいずれか１つに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（６）（５）記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、
（７）（１）〜（４）のいずれか１つに記載のペプチド、または（５）記載のポリヌクレオチドに対する抗体、
（８）（１）〜（４）のいずれか１つに記載のペプチド、（５）記載のポリヌクレオチド、または（６）記載のベクターを含む、癌を治療または予防するための医薬組成物、
（９）（１）〜（４）のいずれか１つに記載のペプチド、（５）記載のポリヌクレオチド、または（６）記載のベクターの有効量を、（３）または（４）記載のＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法、
（１０）癌を治療または予防するための、（１）〜（４）のいずれか１つに記載のペプチド、（５）記載のポリヌクレオチド、または（６）記載のベクターの使用、
（１１）（１）〜（４）のいずれか１つに記載のペプチドを（３）または（４）記載のＭＨＣクラスＩＩ分子を介して提示する、抗原提示細胞、
（１２）未熟抗原提示細胞を（１）〜（４）のいずれか１つに記載のペプチドの存在下で培養し、該未熟抗原提示細胞から前記ペプチドを（３）または（４）記載のＭＨＣクラスＩＩ分子を介して提示する抗原提示細胞を誘導することを特徴とする、抗原提示細胞の誘導方法、
（１３）（１）〜（４）のいずれか１つに記載のペプチドにより誘導される、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞、
（１４）末梢血単核球を（１）〜（４）のいずれか１つに記載のペプチドの存在下で培養し、該末梢血単核球からＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞を誘導することを特徴とする、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の誘導方法、
（１５）（１）〜（４）のいずれか１つに記載のペプチドを必須構成成分として含む、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞を誘導するためのキット、
（１６）（１）〜（４）のいずれか１つに記載のペプチド、（５）記載のポリヌクレオチド、または（６）記載のベクターを必須構成成分として含む、癌を予防または治療するためのキット、
（１７）（３）または（４）記載のＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象におけるＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を決定する方法であって、
（ａ）（１）〜（４）のいずれか１つに記載のペプチドを該対象由来試料と反応させ；次いで、
（ｂ）該試料に含まれるサイトカインの存在または量を調べる、
工程を含む方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊０８０２、ＤＲＢ１＊０８０３、ＤＲＢ１＊０９０１、ＤＲＢ１＊１２０１、ＤＲＢ１＊１４０３、ＤＲＢ１＊１５０１、ＤＲＢ１＊１５０２、ＤＰＢ１＊０２０１、ＤＰＢ１＊０２０２、ＤＰＢ１＊０４０２、ＤＰＢ１＊０５０１、ＤＰＢ１＊０９０１、ＤＱＢ１＊０３０１、ＤＱＢ１＊０３０２、ＤＱＢ１＊０４０１、ＤＱＢ１＊０５０１、ＤＱＢ１＊０６０１、ＤＱＢ１＊０６０２、およびＤＲＢ５＊０１０２のごとき多種類のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するＷＴ１ヘルパーペプチド、およびこれらを含む癌の治療／予防用医薬組成物などが得られるので、非常に広範囲の対象（特に、日本人の大部分が上記分子を有する）におけるインビボおよびインビトロでのＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の誘導が可能となる。さらに、本発明により、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞が誘導されることから、ＷＴ１を高度に発現する癌においてＴ細胞やＢ細胞を効果的に活性化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、３種ペプチド（ｍＷＴ１３５、ｍＷＴ１８６、およびｍＷＴ１２９４）をパルスして作成した各ペプチド特異的Ｔ細胞株を各ペプチドで刺激した後に細胞増殖を測定した結果を示す。図中、−はペプチド刺激なしを表す。
【図２】図２は、３種ペプチド（ｍＷＴ１３５、ｍＷＴ１８６、およびｍＷＴ１２９４）をパルスして作成した各ペプチド特異的Ｔ細胞株を抗ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ抗体の存在下で各々の対応するペプチドで刺激した後に細胞増殖を測定した結果を示す。図中、−はペプチド刺激なしを表す。縦軸のｃｐｍは、１分あたりのカウントを表す。
【図３】図３は、Ｃ１４９８細胞、３種ペプチド（ｍＷＴ１３５、ｍＷＴ１８６、およびｍＷＴ１２９４）をパルスしたＣ１４９８細胞、ならびにＷＴ１タンパク質を強制発現させたＣ１４９８細胞による、各々の対応するＷＴ１ペプチド特異的Ｔ細胞株の細胞増殖を測定した結果を示す。縦軸のｃｐｍは、１分あたりのカウントを表す。
【図４】図４は、３種ペプチド（ｍＷＴ１３５、ｍＷＴ１８６、およびｍＷＴ１２９４）をパルスして作成した各ペプチド特異的Ｔ細胞株におけるＩＦＮ−γ産生能を測定した結果を示す。
【図５】図５は、３種ペプチド（ｍＷＴ１３５、ｍＷＴ１８６、およびｍＷＴ１２９４）のＣＴＬ細胞傷害活性を測定した結果を示す。黒丸は、ＷＴ１１２６ペプチド（ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチド）をパルスしたＲＭＡＳ細胞を用いて行った実験の結果を示す。白丸は、コントロールＲＭＡＳ細胞を用いて行った実験の結果を示す。
【図６】図６は、腫瘍移植実験において、腫瘍移植と免疫を行った時系列的な略図を示す。マウスへのＷＴ１発現白血病細胞の皮下移植後７、１４、２１日目にｍＷＴ１３５ヘルパーペプチドによる免疫を施し、２９日目に解剖を行った。下向きの白抜き矢印は、コントロール（ＰＢＳ）を皮内投与（ＩＦＡ／３０μｌ）した時期を示す。下向きの黒色矢印は、ｍＷＴ１３５ヘルパーペプチドを皮内投与（５０μＭ／ＩＦＡ／３０μｌ）した時期を示す。
【図７】図７は、ｍＷＴ１３５ヘルパーペプチドで免疫されたマウスにおける腫瘍の大きさおよび無病であったマウスの個体数の割合を示す。ｍＷＴ１３５ヘルパーペプチドで免疫されたマウスでは、１０匹中４匹が無病であった。一方、コントロールで免疫されたマウスでは、無病であったマウスが９匹中存在しなかった。
【図８】図８は、ｍＷＴ１３５ヘルパーペプチドで免疫されたマウスにおける無病生存率を示す。
【図９】図９は、ｍＷＴ１３５ヘルパーペプチドで免疫されたマウスにおけるＣＴＬの細胞傷害活性を示す。黒丸は、ｍＷＴ１１２６ペプチド（ＭＨＣＩペプチド）をパルスしたＲＭＡＳ細胞を用いて行った実験の結果である。白丸は、コントロールＲＭＡＳ細胞を用いて行った実験の結果を示す。（）内の数字は腫瘍径ｍｍを示す。
【図１０】図１０は、コントロールマウスにおけるｍＷＴ１特異的ＣＴＬの細胞傷害活性を示す。黒丸は、ｍＷＴ１１２６ペプチド（ＭＨＣＩペプチド）をパルスしたＲＭＡＳ細胞を用いて行った実験の結果である。白丸は、コントロールＲＭＡＳ細胞を用いて行った実験の結果を示す。（）内の数字は腫瘍径ｍｍを示す。
【図１１】図１１は、ｍＷＴ１３５ペプチドの投与によるｍＷＴ１１２６ペプチド特異的ＣＴＬの細胞傷害活性（左図）およびＷＴ１１２６テトラマー陽性Ｔ細胞の割合（右図）を示す。
【図１２】図１２は、各ＭＨＣクラスＩＩ分子を有する健常人の末梢血単核球におけるＷＴ１３５ペプチド刺激による細胞増殖の測定結果を示す。
【図１３】図１３は、Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ（ＤＲＢ１＊０１０１／０４０５、ＤＰＢ１＊０２０１／０４０２、ＤＱＢ１＊０４０１／０５０１陽性の健常人（健常人Ａ）由来のＰＢＭＣ）を、Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ（ＤＲＢ１＊０４０５／０９０１、ＤＰＢ１＊０２０１／０５０１、ＤＱＢ１＊０３０３／０４０１陽性の健常人（健常人Ｂ）由来のＰＢＭＣ）で処理した場合における、細胞増殖の測定結果を示す。縦軸は、取り込まれた３Ｈ−チミジン量（ｃｐｍ）を示す。横軸は、添加した各種抗体の種類（添加なし、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体、および抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体）を表す。
【図１４】図１４は、Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ（ＤＲＢ１＊０１０１／０４０５、ＤＰＢ１＊０２０１／０４０２、ＤＱＢ１＊０４０１／０５０１陽性の健常人（健常人Ａ）由来のＰＢＭＣ）を、Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ（ＤＲＢ１＊０４０５／０８０３、ＤＰＢ１＊０２０２／０５０１、ＤＱＢ１＊０４０１／０６０１陽性の健常人（健常人Ｇ）由来のＰＢＭＣ）で処理した場合における、細胞増殖の測定結果を示す。縦軸は、取り込まれた３Ｈ−チミジン量（ｃｐｍ）を示す。横軸は、添加した各種抗体の種類（添加なし、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体、および抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体）を表す。
【図１５】図１５は、Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ（ＤＲＢ１＊０１０１／０４０５、ＤＰＢ１＊０２０１／０４０２、ＤＱＢ１＊０４０１／０５０１を有する健常人（健常人Ａ）由来のＰＢＭＣ）を、Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ（ＤＲＢ１＊０１０１／０８０３、ＤＰＢ１＊０５０１／−、ＤＱＢ１＊０５０１／０６０１陽性の健常人（健常人Ｈ）由来のＰＢＭＣ）で処理した場合における、細胞増殖の測定結果を示す。縦軸は、取り込まれた３Ｈ−チミジン量（ｃｐｍ）を示す。横軸は、添加した各種抗体の種類（添加なし、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体、および抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体）を表す。
【図１６】図１６は、Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ（ＤＲＢ１＊０４０５／０８０３、ＤＰＢ１＊０２０２／０５０１、ＤＱＢ１＊０４０１／０６０１陽性の健常人（健常人Ｇ）由来のＰＢＭＣ）を、Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ（ＤＱＢ１＊０６０１遺伝子を導入したＬ細胞）で処理した場合における、ＩＦＮ−γ産生能の測定結果を示す。縦軸は、Ｔ細胞中のＩＦＮ−γ量の割合を示す。横軸は、ＷＴ１３５ペプチドによるパルスの有無（＋または−）を表す。
【図１７】図１７は、Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ（ＤＲＢ１＊１５０２／１５０２、ＤＰＢ１＊０２０１／０９０１、ＤＱＢ１＊０６０１／０６０１陽性の健常人（健常人Ｄ）由来のＰＢＭＣ）を、Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ（Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒと同一の健常人由来のＰＢＭＣ）で処理した場合における、細胞増殖の測定結果を示す。縦軸は、取り込まれた３Ｈ−チミジン量（ｃｐｍ）を示す。横軸は、添加した各種抗体の種類（添加なし、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体、および抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体）を表す。
【図１８】図１８は、Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ（ＤＲＢ１＊０１０１／１５０１、ＤＰＢ１＊０２０１／０４０２、ＤＱＢ１＊０５０１／０６０２陽性の健常人（健常人Ｉ）由来のＰＢＭＣ）を、Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ（Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒと同一の健常人由来のＰＢＭＣ）で処理した場合における、ＩＦＮ−γ産生能の測定結果を示す。縦軸は、Ｔ細胞中のＩＦＮ−γ量の割合を示す。横軸は、ＷＴ１３５ペプチドによるパルスの有無（＋または−）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、１の態様において、マウスまたはヒトＷＴ１タンパク質由来のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドに関するものである。ＷＴ１遺伝子は、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌において高度に発現する。従って、本発明のペプチドは、ＷＴ１遺伝子を発現する癌の細胞に多く存在する。
【００１３】
本発明のペプチドは、配列番号：２に示すヒトＷＴ１タンパク質由来の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドであり、以下に示すＭＨＣクラスＩＩ分子との結合能を保持し、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の誘導能を有するペプチドである。本発明のペプチドは、上記特徴を有する限り、そのアミノ酸配列および長さは特に限定されないが、ペプチドが長すぎると蛋白分解酵素の作用を受けやすくなり、短すぎるとペプチド収容溝にうまく結合できない。本発明のペプチドの長さは、好ましくは１０〜２５アミノ酸、より好ましくは１５〜２１アミノ酸、さらに好ましくは１６〜２０アミノ酸、例えば１７アミノ酸、１８アミノ酸、あるいは１９アミノ酸である。本発明のペプチドの具体例は、配列番号：３に示すアミノ酸配列；配列番号：４に示すアミノ酸配列；配列番号：５に示すアミノ酸配列を有するものである。さらに本発明のペプチドは、上記ペプチドの変異体も包含する。変異体は、例えば上記のうちの１つのアミノ酸配列において、数個、例えば、１〜９個まで、好ましくは、１〜５個、１〜４個、１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が、置換、または欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドを含んでもよい。ペプチド中のアミノ酸の置換はいずれの位置でいずれの種類のアミノ酸との間で行われてもよい。保存的なアミノ酸置換が好ましい。例えば、Ｇｌｕ残基をＡｓｐ残基に、Ｐｈｅ残基をＴｙｒ残基に、Ｌｅｕ残基をＩｌｅ残基に、Ａｌａ残基をＳｅｒ残基に、Ｈｉｓ残基をＡｒｇ残基に置換してもよい。アミノ酸の付加もしくは欠失は、ペプチド中のＮ末端およびＣ末端で行うことが好ましいが、配列内部において行われてもよい。本発明のペプチドの好ましい具体例は配列番号：３を有する。但し、上記のいずれのペプチドであっても、ＭＨＣクラスＩＩ分子との結合能を保持し、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の誘導能を有することが条件となる。ここで、本発明のペプチドが結合するＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰのいずれのサブクラスに属するものであってもよい。好ましくは、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊０８０２、ＤＲＢ１＊０８０３、ＤＲＢ１＊０９０１、ＤＲＢ１＊１２０１、ＤＲＢ１＊１４０３、ＤＲＢ１＊１５０１、ＤＲＢ１＊１５０２、ＤＰＢ１＊０２０１、ＤＰＢ１＊０２０２、ＤＰＢ１＊０４０２、ＤＰＢ１＊０５０１、ＤＰＢ１＊０９０１、ＤＱＢ１＊０３０１、ＤＱＢ１＊０３０２、ＤＱＢ１＊０４０１、ＤＱＢ１＊０５０１、ＤＱＢ１＊０６０１、ＤＱＢ１＊０６０２、およびＤＲＢ５＊０１０２からなる群から選択される分子である。より好ましくは、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊１４０３、ＤＲＢ１＊１５０２、ＤＰＢ１＊０２０１、ＤＰＢ１＊０２０２、ＤＰＢ１＊０９０１、ＤＱＢ１＊０３０１、ＤＱＢ１＊０６０１またはＤＲＢ５＊０１０２であり、最も好ましくは、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊１５０２、ＤＰＢ１＊０２０１、ＤＰＢ１＊０２０２、またはＤＱＢ１＊０６０１である。本明細書では、ＭＨＣクラスＩＩ分子との結合能を保持し、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の誘導能を有するペプチドをＷＴ１ヘルパーペプチドという。また、下記の実施例では、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するペプチドをＷＴ１３５ペプチド、ＷＴ１３５ヘルパーペプチドまたはＷＴ１３５ペプチドともいう。
【００１４】
本発明のペプチドはまた、配列番号：１に示すマウスＷＴ１タンパク質由来の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号：４に示すアミノ酸配列の第９位のアミノ酸残基がロイシンに置換されたペプチド（配列番号：６）；あるいは配列番号：５に示すアミノ酸配列の第１１位のアミノ酸残基がセリンに置換されたペプチド（配列番号：７）であってもよい。さらに、本発明のペプチドは、配列番号：６または配列番号：７に示すアミノ酸配列において、数個、例えば、１〜９個まで、好ましくは、１〜５個、１〜４個、１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が、置換、または欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドを含んでもよい。下記の実施例では、配列番号：６に示すアミノ酸配列を有するペプチドを、ｍＷＴ１８６ペプチドまたはｍＷＴ１８６ヘルパーペプチドともいい、配列番号：７に示すアミノ酸配列を有するペプチドを、ｍＷＴ１２９４ペプチドまたはｍＷＴ１２９４ヘルパーペプチドともいう。
【００１５】
本発明のペプチドは、ＷＴ１タンパク質由来であって、上記の連続するアミノ酸配列からなっていてもよく、これらを含むものであってもよい。従って、本発明のペプチドは、例えば、上記アミノ酸配列からなるペプチドそのものであってもよく、あるいは上記アミノ酸配列を含むＷＴ１タンパク質またはその一部であってもよい。本発明のペプチドはまた、上記アミノ酸配列の修飾体であってもよい。上記アミノ酸配列中のアミノ酸残基を公知の方法にて修飾することができる。そのような修飾体は、例えばペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖中の官能基にエステル化、アルキル化、ハロゲン化、リン酸化、スルホン化、アミド化などを施したものであってもよい。また、上記アミノ酸配列を含むペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に、種々の物質を結合させることができる。例えば、アミノ酸、ペプチド、それらのアナログ等を結合させてもよい。本発明のペプチドにこれらの物質が結合している場合、これらの物質が例えば、生体内酵素などにより、あるいは細胞内プロセッシングなどの過程により処理され、最終的に上記アミノ酸配列からなるペプチドを生じるものであってもよく、ＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体として細胞表面に提示されることにより、ヘルパーＴ細胞誘導効果を得ることができる。これらの物質は、本発明のペプチドの溶解性を調節するものであってもよく、耐プロテアーゼ作用等その安定性を向上させるものであってもよく、また例えば、所定の組織・器官に特異的に本発明のペプチドをデリバリーするようなものであってもよく、あるいはまた抗原提示細胞の取込み効率を増強させる作用などを有するものであってもよい。これらの物質はまた、ＣＴＬ誘導能を増大させるもの、例えば、本発明のペプチド以外のヘルパーペプチドであってもよい。
【００１６】
本発明のペプチドの修飾体は、そのＮ末端アミノ酸のアミノ基、またはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基が修飾されたものであってもよい。Ｎ末端アミノ酸のアミノ基の修飾基としては、例えば１〜３個の炭素数１から６のアルキル基、フェニル基、シクロアルキル基、アシル基が挙げられ、アシル基の具体例としては炭素数１から６のアルカノイル基、フェニル基で置換された炭素数１から６のアルカノイル基、炭素数５から７のシクロアルキル基で置換されたカルボニル基、炭素数１から６のアルキルスルホニル基、フェニルスルホニル基、炭素数２から６のアルコキシカルボニル基、フェニル基で置換されたアルコキシカルボニル基、炭素数５から７のシクロアルコキシで置換されたカルボニル基、フェノキシカルボニル基等が挙げられる。Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾したペプチドとしては、例えばエステル体およびアミド体が挙げられ、エステル体の具体例としては、炭素数１から６のアルキルエステル、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキルエステル、炭素数５から７のシクロアルキルエステル等が挙げられ、アミド体の具体例としては、アミド、炭素数１から６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、アミド基の窒素原子を含んで５から７員環のアザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。
【００１７】
さらに本発明のペプチドの修飾体は、炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、炭素−硫黄結合などのペプチド結合以外の結合によってアミノ酸残基が結合したものであってもよい。さらに本発明のペプチドは１またはそれ以上のＤ−体アミノ酸を含んでいてもよい。
【００１８】
本発明のペプチド、ならびに上で述べた本発明の変異体および修飾体は例示であり、当業者であれば容易にそのバリエーションを想定し、製造し、効果を調べ、用いることができる。
【００１９】
本発明のペプチドは、当該技術分野において通常用いられる方法またはそれらの変法を用いて合成することができる。かかる合成方法は、例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976；ペプチド合成、丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成、広川書店，1991などに記載されている。本発明のペプチドはまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列情報に基づき、遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。かかる遺伝子工学的手法は、当業者に周知のものである。これらの手法は、前述のように文献記載の方法(Molecular Cloning, T.Maniatis et al.,CSH Laboratory(1983)、DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS(1985))や後述の方法などに準じて行うことができる。
【００２０】
本発明のペプチドあるいはその候補ペプチドが上記ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合してヘルパーＴ細胞を誘導することは、例えばCancer Immunol. Immunother. 51:271(2002)に記載の方法などの公知の方法や、本明細書実施例に記載の方法などにより調べることができる。
【００２１】
本発明のペプチドはヘルパーＴ細胞（ＣＤ４陽性Ｔ細胞）を活性化するので、ＣＴＬの分化の誘導や維持およびマクロファージなどのエフェクター細胞の活性化作用を発揮するため、本発明のペプチドは効率的な癌の治療または予防に使用可能である。
【００２２】
本発明は、別の態様において、上記ＷＴ１ヘルパーペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、ＷＴ１ポリヌクレオチドともいう）に関するものである。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。本発明のポリヌクレオチドの塩基配列は、上記ＷＴ１ヘルパーペプチドのアミノ酸配列に基づき決定できる。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成方法、ＰＣＲ法などにより製造することができる。
【００２３】
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドには、当該ポリヌクレオチドの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって本発明のペプチドと同等の活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。ここに、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，  Ｆｒｉｓｃｈ  Ｅ．  Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１５Ｍ  クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％ホルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．  Ｙ．  （１９８９），  ６．３．１−６．３．６）等を挙げることができる。
【００２４】
本発明は、さらなる別の態様において、上記ポリヌクレオチドを含有する発現ベクター（以下、ＷＴ１発現ベクターともいう）に関するものである。発現ベクターの種類、上記ポリヌクレオチド配列以外に含まれる配列等は、当該発現ベクターを導入する宿主の種類、目的等に応じて適宜選択でき、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３等のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Ｈｉｓタグ、あるいはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ＣＭＶ、ＳＶ４０初期プロモーターなど）を有するＧＳＴ融合タンパクベクター（ｐＧＥＸ４Ｔなど）や、Ｍｙｃ、Ｈｉｓなどのタグ配列を有するベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓなど）、さらにはチオレドキシンおよびＨｉｓタグとの融合タンパク質を発現するベクター（ｐＥＴ３２ａ）などを用いることができる。
本発明の発現ベクターを対象に投与し、生体内においてＷＴ１ヘルパーペプチドを産生させ、それにより誘導されたＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞は各種サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、またはインターフェロン（ＩＦＮ）など）を産生し、Ｂ細胞およびその他のＴ細胞の増殖、分化、成熟を促進する。従って、本発明のＷＴ１発現ベクターを用いて、ＭＨＣクラスＩ分子を有し、かつＷＴ１高発現である腫瘍細胞を特異的に傷害することができる。
【００２５】
本発明は、別の態様において、上記ＷＴ１ヘルパーペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対する抗体（以下、ＷＴ１抗体ともいう）に関するものである。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよい。これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13、Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D.ら編, Cold Spring Harber Laboratory Press 出版 New York 1989）。
【００２６】
本発明は、上記ＷＴ１ヘルパーペプチド、ＷＴ１ポリヌクレオチド、またはＷＴ１発現ベクターを含む、癌を治療または予防するための医薬組成物に関するものである。ＷＴ１遺伝子は、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌において高度に発現するため、本発明の医薬組成物を、ＷＴ１遺伝子を発現している癌の治療または予防のために用いることができる。本発明の医薬組成物がＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象に投与されると、該医薬組成物に含まれるＷＴ１ヘルパーペプチドにより誘導されたＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞は、各種サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、またはインターフェロン（ＩＦＮ）など）を産生し、Ｂ細胞およびその他のＴ細胞のサブセットの増殖、分化、成熟を促進する。従って、本発明のペプチドを用いて、ＭＨＣクラスＩ分子を有し、かつＷＴ１高発現である腫瘍細胞を特異的に傷害することができる。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、有効成分としての上記ＷＴ１ヘルパーペプチド、ＷＴ１ポリヌクレオチド、またはＷＴ１発現ベクター以外に、例えば、担体、賦形剤などを含んでいてもよい。本発明の医薬組成物に含まれるＷＴ１ヘルパーペプチドは、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞を誘導することから、その誘導効率を増強させるために、本発明の医薬組成物は適当なアジュバントを含むか、あるいは適当なアジュバントと共に投与されてもよい。好ましいアジュバントとしては、例えば、完全または不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどが挙げられるがこれらに限定されない。また、本発明の医薬組成物は、有効成分として上記ＷＴ１ヘルパーペプチド以外の公知な癌抗原ペプチド、例えば、ＷＴ１特異的ＣＴＬを誘導するＷＴ１１２６ペプチドなどを一緒に含んでもよい（Oka et al, Cancer immunotherapy targeting Wilms' tumor gene WT1 product. Journal of Immunology, 164:1873-1880, 2000およびOka et al. Human cytotoxic T-lymphocyte responses specific for peptides of the wild-type Wilms' tumor gene (WT1) product. Immunogenetics, 51: 99-107,2000）。
【００２８】
本発明の医薬組成物はまた、公知な癌抗原ペプチドと組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明の医薬組成物を投与する前または後に、公知な癌抗原ペプチド、例えば、ＷＴ１１２６ペプチドを投与することができる。本発明の医薬組成物は、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞を誘導することによりＢ細胞やその他のＴ細胞を活性化するという特徴を有することから、公知の癌抗原ペプチドを投与することにより誘導されたＣＴＬの活性をより増強し、治療効果を著しく上昇させることが可能である。
【００２９】
本発明の医薬組成物の投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。前記投与方法は、例えば、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限らない。さらに、前記投与方法は、リンパ球療法またはＤＣ（樹状細胞）療法であってもよい。本発明の医薬組成物に含まれるペプチドの量、医薬組成物の剤形、投与回数などは、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択できるが、１回あたりのペプチド投与量は、通常、０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１ｍｇ〜１００００ｍｇである。
【００３０】
本発明は、別の態様において、有効量の上記医薬組成物を、上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法に関するものである。治療または予防される癌は、ＷＴ１遺伝子を発現するものであればいずれのものであってもよく、例えば、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などの固形癌を含む。
【００３１】
本発明は、別の態様において、癌を治療または予防するための、上記ＷＴ１ヘルパーペプチド、ＷＴ１ポリヌクレオチド、またはＷＴ１発現ベクターの使用に関する。
【００３２】
本発明は、なお別の態様において、癌を治療または予防するための医薬組成物を製造するためのＷＴ１ヘルパーペプチドの使用に関する。
【００３３】
本発明は、さらなる別の態様において、上記ＷＴ１ポリヌクレオチドまたはＷＴ１発現ベクターを含む医薬組成物を製造するためのＷＴ１ポリヌクレオチドまたはＷＴ１発現ベクターの使用に関するものである。
【００３４】
本発明は、別の態様において、上記ＷＴ１ヘルパーペプチド、ＷＴ１ポリヌクレオチド、またはＷＴ１発現ベクターを含有する細胞に関するものである。本発明の細胞は、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などの宿主細胞を上記発現ベクターを用いて形質転換させることにより製造することができる。宿主細胞への発現ベクターの導入方法は、種々の方法を適宜選択して用いることができる。形質転換した細胞を培養し、産生されたＷＴ１ヘルパーペプチドを回収・精製することにより、本発明のペプチドを製造することもできる。
【００３５】
本発明は、なお別の態様において、上記ＷＴ１ヘルパーペプチドを上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を介して提示する抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、Ｂ−リンパ球、マクロファージなど）に関するものである。本発明の抗原提示細胞は、上記ＷＴ１ヘルパーペプチドにより誘導される。本発明の抗原提示細胞を用いることで、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞が効率よく誘導される。
【００３６】
本発明は、さらなる別の態様において、未熟抗原提示細胞をＷＴ１ヘルパーペプチドの存在下で培養し、該未熟抗原提示細胞からＷＴ１ヘルパーペプチドを上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を介して提示する抗原提示細胞を誘導することを特徴とする、ＷＴ１ヘルパーペプチドをＭＨＣクラスＩＩ分子を介して提示する抗原提示細胞の誘導方法に関するものである。本明細書における未熟抗原提示細胞は、成熟して抗原提示細胞、例えば、樹状細胞、Ｂ−リンパ球、マクロファージなどになり得る細胞をいう。未熟抗原提示細胞が由来する対象は、上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を有するものであればいずれのものであってもよい。未熟抗原提示細胞は、例えば、末梢血単核球などに含まれているため、かかる細胞を上記ＷＴ１ヘルパーペプチドの存在下で培養してもよい。
【００３７】
本発明は、別の態様において、ＷＴ１ヘルパーペプチドを上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を介して提示する抗原提示細胞を、前記ＭＨＣクラスＩＩ分子と同一の分子を有する対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法に関するものである。抗原提示細胞の投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該方法は、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限らない。
【００３８】
本発明は、なお別の態様において、ＷＴ１ヘルパーペプチドを上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を介して提示する抗原提示細胞を誘導することを特徴とする、癌を予防または治療するための方法であって、
（ａ）試料とＷＴ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）をコードするヌクレオチド配列もしくはその部分配列を有する核酸または上記ＷＴ１ヘルパーペプチドを反応させ、
（ｂ）該試料中に含まれるＷＴ１ヘルパーペプチドを上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を介して提示する抗原提示細胞を得、
（ｃ）前記抗原提示細胞を前記ＭＨＣクラスＩＩ分子と同一の分子を有する対象に投与する
工程を含む方法に関するものである。前記方法における試料は、リンパ球または樹状細胞が含まれている可能性があればいずれのものであってもよく、例えば、血液などの対象由来試料、細胞培養液などが挙げられる。上記方法における反応は、一般的な手法を用いて行われてよく、好ましくは、エレクトロポレーションを用いて行われる。抗原提示細胞の取得は、当業者に既知の方法を用いて行うことができる。各工程における試料中の細胞の培養条件は、当業者が適宜決定することができる。抗原提示細胞の投与方法は、上述の如くであってもよい。
【００３９】
本発明は、さらなる態様において、上記ＷＴ１ヘルパーペプチドにより誘導される、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞に関するものである。本発明のヘルパーＴ細胞は、ＷＴ１ヘルパーペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体を認識して誘導、増殖、および活性化される。活性化されたＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、またはインターフェロン（ＩＦＮ）のごときサイトカインを産生し、Ｂ細胞およびその他のＴ細胞のサブセットの増殖、分化、成熟を促進する。従って、本発明のヘルパーＴ細胞を用いて、ＭＨＣクラスＩ分子を有し、かつＷＴ１高発現である腫瘍細胞を特異的に傷害することができる。
【００４０】
本発明は、別の態様において、末梢血単核球をＷＴ１ヘルパーペプチドの存在下で培養し、該末梢血単核球からＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞を誘導することを特徴とする、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の誘導方法に関するものである。末梢血単核球が由来する対象は、上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を有していればいずれであってもよい。末梢血単核球をＷＴ１ヘルパーペプチドの存在下で培養することで、末梢血単核球中のヘルパーＴ細胞前駆細胞からＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞が誘導される。本発明により得られたＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞を上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象に投与することで、対象の造血器腫瘍、固形癌を治療または予防することができる。ここで、本明細書における末梢血単核球には、抗原提示細胞の前駆体である未熟抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、Ｂ−リンパ球、マクロファージなどの前駆体）が含まれるものとし、未熟抗原提示細胞は、例えば、末梢血単核球などに含まれているため、かかる細胞を上記ＷＴ１ヘルパーペプチドの存在下で培養してもよい。
【００４１】
本発明は、さらなる別の態様において、上記ＷＴ１ヘルパーペプチドを必須構成成分として含む、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞を誘導するためのキットに関するものである。好ましくは、該キットは上記ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の誘導方法に用いられる。本発明のキットは、上記ＷＴ１ヘルパーペプチドのほかに、例えば、末梢血単核球の取得手段、アジュバント、反応容器等を含んでいてもよい。一般的には、キットには取扱説明書を添付する。本発明のキットを用いて、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞を効率よく誘導できる。
【００４２】
本発明は、なお別の態様において、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞を、上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法に関するものである。ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。前記投与方法は、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限らない。
【００４３】
さらに、本発明は、上記ＷＴ１ヘルパーペプチド、ＷＴ１ポリヌクレオチド、またはＷＴ１発現ベクターを必須構成成分として含む、癌を予防または治療するためのキットに関するものである。該キットは、上記ＷＴ１ヘルパーペプチドを上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を介して提示する抗原提示細胞を誘導することを特徴とするキットである。また、本発明のキットは、上記必須構成成分のほかに、例えば、試料の取得手段、反応容器等を含んでいてもよい。一般的には、キットには取扱説明書を添付する。本発明のキットを用いて、ＷＴ１ヘルパーペプチドを上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を介して提示する抗原提示細胞を効率よく得ることができ、この抗原提示細胞を投与することにより癌の治療または予防に用いることができる。
【００４４】
本発明は、別の態様において、上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象におけるＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を決定する方法であって、
（ａ）上記ＷＴ１ヘルパーペプチドと上記ＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体を該対象由来試料と反応させ；次いで、
（ｂ）該試料に含まれる該複合体を認識するヘルパーＴ細胞の存在または量を調べる、
工程を含む方法に関するものである。対象由来試料は、リンパ球が含まれている可能性があればいずれのものであってもよく、例えば、血液、リンパ液などの体液、組織などが挙げられる。ＷＴ１ヘルパーＴ細胞とＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体は、例えば、ビオチンストレプトアビジン法などの当業者に既知の方法を用いて、例えば、テトラマー、ペンタマーなどの形態にされていてもよい。かかる複合体を認識するヘルパーＴ細胞の存在または量は、当業者に既知の方法により測定することができる。本発明のこの態様において、上記複合体は標識されたものであってもよい。標識としては、蛍光標識、放射性標識などの公知のものを使用することができる。標識することで、ヘルパーＴ細胞の存在または量の決定が容易かつ迅速になる。本発明のこの態様の方法を用いて、癌の診断、予後診断などが可能になる。
【００４５】
従って、本発明はまた、上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象におけるＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を決定するための、ＷＴ１ヘルパーペプチドと上記ＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体を含む組成物を提供する。
【００４６】
さらに、本発明は、ＷＴ１ヘルパーペプチドと上記ＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体を含む、上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象におけるＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を決定するためのキットを提供する。
【００４７】
本発明は、さらになお別の態様において、上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象におけるＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を決定する方法であって、
（ａ）上記ＷＴ１ヘルパーペプチドを該対象由来試料と反応させ；次いで、
（ｂ）該試料に含まれるサイトカインの存在または量を調べる、
工程を含む方法に関するものである。対象由来試料は、リンパ球が含まれている可能性があればいずれのものであってもよく、例えば、末梢血単核球、血液、体液、組織などが挙げられ、好ましくは末梢血単核球である。上記工程（ａ）における反応は、上記ＷＴ１ヘルパーペプチドを上記対象由来試料中で一般的な手法を用いて行うことができる。各工程における試料中の細胞の培養条件は、当業者が適宜決定することができる。試料に含まれるサイトカインの存在または量は、当業者に既知の方法により測定することができる。サイトカインは、インターフェロンγ、インターロイキン１０などのヘルパーＴ細胞により誘導されうるものであってもよい。本発明のこの態様において、上記サイトカインは標識されたものであってもよい。標識としては、蛍光標識、放射性標識などの公知のものを使用することができる。前記サイトカインの存在または量を指標とすることにより、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を容易かつ迅速に調べることが可能となる。
【００４８】
本発明は、さらなる態様において、ＷＴ１ヘルパーペプチドと上記ＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体を用いて、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞を得る方法であって、
（ａ）試料と複合体を反応させ、
（ｂ）該試料中に含まれる該複合体を認識するヘルパーＴ細胞を得る、
工程を含む方法に関するものである、ＷＴ１ヘルパーペプチドと上記ＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体については上述の通りである。試料は、リンパ球が含まれている可能性があればいずれのものであってもよく、例えば、血液などの対象由来試料、細胞培養液などが挙げられる。複合体を認識するヘルパーＴ細胞の取得は、例えば、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳなど当業者に既知の方法を用いて行うことができる。得られたＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞を培養し、種々の癌の治療または予防に用いることも可能になる。
【００４９】
従って、本発明はまた、ＷＴ１ヘルパーペプチドと上記ＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体を用いて、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞を得る方法により得ることのできる、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞に関するものである。
【００５０】
さらに、本発明は、ＷＴ１ヘルパーペプチドと上記ＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体を含む、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞を得るためのキットに関するものである。
【００５１】
本発明は、さらなる別の態様において、上記ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞、ＷＴ１ヘルパーペプチドを上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を介して提示する抗原提示細胞、または上記ＷＴ１抗体を用いることを特徴とする、癌の診断方法に関するものである。好ましくは、ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞が本発明の診断方法に用いられる。例えば、上記ヘルパーＴ細胞、抗原提示細胞または抗体を上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象由来の試料とインキュベーションする、あるいは上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象に投与し、次に該ヘルパーＴ細胞、抗原提示細胞または抗体の例えば、位置、部位、量等を決定することで、癌の診断が可能となる。上記ヘルパーＴ細胞、抗原提示細胞または抗体は、標識されたものであってもよい。かかる標識を付すことで、本発明の診断方法を効率よく実施することができる。
【００５２】
本発明は、なお別の態様において、上記ＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞、ＷＴ１ヘルパーペプチドを上記ＭＨＣクラスＩＩ分子を介して提示する抗原提示細胞、あるいはＷＴ１ヘルパーペプチドに対する抗体または該ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対する抗体を必須構成成分として含む、癌の診断用キットに関するものである。
【００５３】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００５４】
ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する候補ＷＴ１ペプチドの選択
ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチド配列を探索するため、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅらにより示された方法を用いた（Rammensee et al, Immunogenetics 41:178-228,1995）。具体的には、表中の右端に記載のプログラムとＲａｍｍｅｎｓｅｅらの法則を併用することにより選択した。この方法により、ＷＴ１３５ペプチドに関しては、表１および２、ＷＴ１８６に関しては、表３および４、ＷＴ１２９４ペプチドに関しては、表５および６に示すペプチド配列まで絞り込んだ。表１〜６中、左端の列は、候補ペプチド配列としての「適性」を示し、○の数が多い程Ｒａｍｍｅｎｓｅｅらの法則に対して適性が高いことを表す。無印は、あまり適性がないことを示す。また、表１〜６の「ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する候補ペプチド配列」の列における［  ］内は、その中に列挙されたアミノ酸群から１つのアミノ酸を選択することができることを示す。例えば、［ＦＬＭ］と表記した場合には、アミノ酸Ｆ、Ｌ、Ｍのうちいずれか１つのアミノ酸であることを意味する。また、［ＶＹＩ（ＡＬ）］と表記した場合には、アミノ酸Ｖ、Ｙ、Ｉのうちいずれか１つのアミノ酸であるか、あるいはＡ、Ｌのうちいずれか１つのアミノ酸であるかのどちらかを意味する。ｘは、いかなるアミノ酸であってもよいことを示す。右端の列には、候補ペプチド配列を列挙するのに用いたプログラムの「プログラム名」を記載する。
【表１】
2010123065.tif 000002
【表２】
2010123065.tif 000003
【表３】
2010123065.tif 000004
【表４】
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【表５】
2010123065.tif 000006
【表６】
2010123065.tif 000007
【００５５】
次いで、表１〜６の中から候補となるＷＴ１ペプチドを目視にて選択し、以下の表７に示すペプチドをＭＨＣクラスＩＩ分子の好ましい候補ペプチドと同定し、下記のごとく、これらのペプチドについて実際の機能を解析した。
【表７】
2010123065.tif 000008
【００５６】
ＷＴ１ペプチド特異的細胞株の調製および細胞増殖能の測定
まず、上記ＷＴ１ペプチドを不完全フロイントアジュバント（モンタナイドISA51）でエマルジョン化し、１００μｇ／マウス相当量のＷＴ１ペプチドをマウスの皮内に接種した。この免疫を１週間毎に３回行い、最終免疫の１週間後に脾臓を取り出し、脾細胞を調製した。この脾細胞を、各マウスの免疫に用いたものと同一のＷＴ１ペプチドでパルスし、放射線照射した非免疫マウスの脾細胞をｓｔｉｍｕｌａｔｏｒとして用い、１０日間隔で３回刺激した後、４回目の刺激を表７に記載された各ペプチド（ＷＴ１３５、ＷＴ１８６またはＷＴ１２９４ペプチド）でパルスし、放射線照射した非免疫マウスの脾細胞をｓｔｉｍｕｌａｔｏｒとして用いて、３Ｈ取り込み実験により各ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒに対する増殖反応を測定した。コントロールペプチドとしてＷＴ１ペプチドとは無関係なＯＶＡ（卵白アルブミン）ペプチドを用いた。その結果、ＷＴ１３５ペプチド、ＷＴ１８６ペプチドまたはＷＴ１２９４ペプチドで免疫したマウスの脾細胞は各々、ＷＴ１３５ペプチド、ＷＴ１８６ペプチドまたはＷＴ１２９４ペプチドをパルスしたｓｔｉｍｕｌａｔｏｒに反応し、増殖した（図１Ａ〜Ｃ）。【００５７】
上述のごとく、各ＷＴ１ペプチドをパルスし、放射線照射した非免疫マウスの脾細胞を用いて、インビトロで１０日間隔で３回刺激した後、４回目の刺激を上述の各ペプチドをパルスし、放射線照射した非免疫マウスの脾細胞をｓｔｉｍｕｌａｔｏｒとして用いて増殖反応を測定する際に、培養液に、ＭＨＣクラスＩ抗体（Ｄｂ抗体）あるいはＭＨＣクラスＩＩ抗体（Ａｂ抗体）を添加し、３Ｈの取り込みを測定した。その結果、ＷＴ１３５ペプチド、ＷＴ１８６ペプチドおよびＷＴ１２９４ペプチドを各々パルスしたｓｔｉｍｕｌａｔｏｒに対する増殖反応が、ＭＨＣクラスＩＩ抗体の添加で抑制された（図２Ａ〜Ｃ）。【００５８】
上述のごとく、各ＷＴ１ペプチドをパルスし、放射線照射した非免疫マウスの脾細胞を用いて、インビトロで１０日間隔で３回刺激した後、放射線照射した、ＷＴ１タンパク質を発現しないＣ１４９８細胞、上述の各ＷＴ１ペプチドをパルスしたＣ１４９８細胞、あるいはＷＴ１遺伝子を導入してＷＴ１タンパク質を発現するようにしたＣ１４９８細胞をｓｔｉｍｕｌａｔｏｒとして用いて、増殖反応を３Ｈの取り込みにより測定した。その結果、インビボで免疫したＷＴ１ペプチドと同じＷＴ１ペプチドでパルスしたＣ１４９８細胞およびＷＴ１遺伝子を導入されＷＴ１タンパクを発現するようになったＣ１４９８細胞に対しては、増殖反応を起こした（図３）。このことは、ＷＴ１３５ペプチド、ＷＴ１８６ペプチドおよびＷＴ１２９４ペプチドが内在性のＷＴ１タンパク質の細胞内プロセスによって産生され、ＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示されることを明らかにした。以上より、これら３種のＷＴ１ペプチドはＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＷＴ１ペプチドであることが示された。【００５９】
ＩＦＮγ産生能の測定
上述のごとく、各ＷＴ１ペプチドをパルスし、放射線照射した非免疫マウスの脾細胞を用いてインビトロで１０日間隔で３回刺激した後、培養上清中のＩＦＮ−γとＩＬ−４の濃度をＥＬＩＳＡキット（BIOSOURCE Immunoassay Kit, Invitrogen）を用いて測定した。その結果、２匹の別々のマウスの脾細胞は、各ＷＴ１ペプチドをパルスし、放射線照射した非免疫マウスの脾細胞に反応し、インターフェロンγを産生したが、インターロイキン４をほとんど産生しなかった（図４）。このことは、これら３種類のＷＴ１ペプチドがＴｈ１タイプのＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞を誘導することを明らかにする。
【実施例２】
【００６０】
ＷＴ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の測定
ＷＴ１１２６ペプチド（ＭＨＣクラスＩ）単独、ＷＴ１１２６ペプチド（ＭＨＣクラスＩ）＋ＷＴ１３５ペプチド（ＭＨＣクラスＩＩ）、ＷＴ１１２６ペプチド（ＭＨＣクラスＩ）＋ＷＴ１８６ペプチド（ＭＨＣクラスＩＩ）、あるいはＷＴ１１２６ペプチド（ＭＨＣクラスＩ）＋ＷＴ１２９４ペプチド（ＭＨＣクラスＩＩ）で、マウスを３回免疫した後、マウスの脾細胞を調製した。次に、この脾細胞をＷＴ１１２６ペプチド（ＭＨＣクラスＩ）を用いてインビトロで１回刺激後６日目に、ＷＴ１１２６ペプチド（ＭＨＣクラスＩ）をパルスしたＲＭＡＳ細胞を標的細胞に用いて、細胞傷害活性を測定した。コントロールの標的細胞としては、ＷＴ１１２６ペプチド（ＭＨＣクラスＩ）をパルスしていないＲＭＡＳ細胞を用いた。その結果、ＷＴ１１２６ペプチド（ＭＨＣクラスＩ）＋ＷＴ１ヘルパーペプチド（ＭＨＣクラスＩＩ）で免疫したマウスの脾細胞は、ＷＴ１１２６ペプチド（ＭＨＣＩクラスＩ）単独で免疫したマウスの脾細胞に比し、より強くＷＴ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導した（図５）。このことは、３種類のＷＴ１ペプチド（ＭＨＣクラスＩＩ）がＷＴ１特異的ヘルパーペプチドであることを実証した。
【実施例３】
【００６１】
腫瘍移植実験
ＷＴ１発現Ｃ１４９８白血病細胞を、１匹のマウスあたり２．５×１０５個の割合でマウスの皮下に移植し、その１週間後から毎週１回、計３回、ＷＴ１３５ヘルパーペプチド  ５０μｇ/マウスをフロイント不完全アジュバントとともに皮内投与した（図６）。コントロールとしては、ＷＴ１３５ヘルパーペプチドの代わりに生理食塩水をフロイント不完全アジュバントとともに皮内投与した。継時的に皮下の腫瘍径を測定するとともに、皮下移植後２９日までの無病生存率を算定した。その結果、コントロール群では、全匹腫瘍が拡大したが、一方、ＷＴ１３５ヘルパーペプチド（ＭＨＣクラスＩＩ）の免疫群では、１０匹中４匹で腫瘍の増殖が完全に抑制された（図７）。ＷＴ１３５ヘルパーペプチド免疫群とコントロール群との間に有意差（ｐ＜０．０５）が認められた（図８）。このことは、ＷＴ１３５ヘルパーペプチド（ＭＨＣクラスＩＩ）がインビボで腫瘍免疫を誘導する能力を有するＷＴ１ペプチドであることを実証した。【００６２】
次に、上記の実験開始後２９日目のマウスを解剖し、脾臓を摘出し、脾細胞を用いてＷＴ１特異的免疫応答を解析した。簡単に説明すると、ＷＴ１３５ヘルパーペプチド（ＭＨＣクラスＩＩ）免疫群およびコントロール群のマウスの解剖時に、脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。この脾細胞を、ＷＴ１１２６ペプチド（ＭＨＣクラスＩ）で１回刺激し、その６日後にＷＴ１１２６ペプチド（ＭＨＣクラスＩ）をパルスしたＲＭＡＳ細胞を標的細胞にして、この脾細胞の細胞傷害活性を測定した。コントロールとしては、ＲＭＡＳ細胞を標的細胞にして、この脾細胞の細胞傷害活性を測定した。その結果、ＷＴ１３５ヘルパーペプチド（ＭＨＣクラスＩＩ）免疫群のマウスは、４匹ともにＷＴ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞が誘導されていた（図９）。一方、コントロール群のマウス３匹では、ＷＴ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞が極めて弱く誘導されていた（図１０）。１匹においては、ＷＴ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導は見られなかった。明らかに、ＷＴ１３５ヘルパーペプチド（ＭＨＣクラスＩＩ）免疫群に比し、ＷＴ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導が低かった（図９および１０）。このことは、ＷＴ１３５クラスＩＩヘルパーペプチドの投与によってＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞が誘導され、このＷＴ１特異的ヘルパーＴ細胞の働きにより、移植した腫瘍細胞が発現するＷＴ１タンパク質に免疫応答して誘導されたＷＴ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞がインビボで強く増幅したことを示しており、この結果は、ＷＴ１３５ヘルパーペプチドの有用性を実証した。【００６３】
次いで、上記のＷＴ１３５ヘルパーペプチド（ＭＨＣクラスＩＩ）免疫群およびコントロール群のマウスにおける特異的溶解度について解析した。簡単に説明すると、上記実験によりＷＴ１１２６ペプチド（ＭＨＣクラスＩ）をパルスしたＲＭＡＳ細胞を標的細胞にした時の細胞溶解率（％）から、ＲＭＡＳ細胞を標的細胞にした時の細胞溶解率（％）を引いた細胞溶解度（％）を特異的溶解度（％）とした（図１１左図）。また、上記で調製した脾細胞と、蛍光標識したＷＴ１テトラマー（Ｈ−２Ｄｂ  ＷＴ１  Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＲＦＭＰＮＡＰＹＬ−ＰＥ）とを４℃で２０分間インキュベートし、洗浄した後、蛍光標識したＣＤ３抗体、ＣＤ８抗体で染色し、再洗浄し、ＦＡＣＳで解析した。ＣＤ３陽性、ＣＤ８陽性、ＷＴ１テトラマー陽性細胞を、ＷＴ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞とした（図１１右図）。その結果、ＷＴ１３５ヘルパーペプチド（ＭＨＣクラスＩＩ）免疫群のマウスの脾細胞では、コントロール群のマウスの脾細胞に比べて、有意に高く（ｐ＜０．０５）ＷＴ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞が誘導されていた（図１１）。
【実施例４】
【００６４】
ヒトにおけるＷＴ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の増殖能の測定
図１２に示されるＤＲＢ１、ＤＰＢ１、ＤＱＢ１またはＤＲＢ５サブクラス分子を有する健常人６人から末梢血単核球を調製した。この末梢血単核球にＷＴ１３５ヘルパーペプチドを添加し、１週間培養した後、これらの末梢血単核球をＷＴ１３５ヘルパーペプチドでパルスし、放射線照射した同一人の末梢血単核球をｓｔｉｍｕｌａｒとして１週間毎に計４回刺激し、６日目に３Ｈの取り込みを測定した。健常人６人全員において、末梢血単核球がＷＴ１３５ヘルパーペプチドに反応し、増殖した（図１２）。このことは、ＷＴ１３５ヘルパーペプチドが表記のＨＬＡクラスＩＩ分子に結合し、増殖反応を引き起こす機能を有することを示した。また、表８に示すように、マウスＷＴ１８６ペプチドおよびＷＴ１２９４ペプチドは、ヒトＷＴ１８６ペプチド（配列番号：４）およびＷＴ１２９４ペプチド（配列番号：５）と四角で囲ったペプチドの位置においてアミノ酸配列が１個異なる。
【表８】
2010123065.tif 000009
【実施例５】
【００６５】
ＷＴ１３５ペプチドのＨＬＡクラスＩＩ分子拘束性
さらに、ＷＴ１３５ペプチドのＨＬＡクラスＩＩ分子拘束性を調べるため、以下に簡潔に説明されるごとく当業者間で周知な方法により実験を行った。まず、健常人（ＤＲＢ１＊０１０１／０４０５、ＤＰＢ１＊０２０１／０４０２、ＤＱＢ１＊０４０１／０５０１陽性の健常人（以下、健常人Ａという））由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＷＴ１３５ペプチドで５回刺激してＲｅｓｐｏｎｄｅｒを調整した。次いで、ＨＬＡクラスＩＩタイプが異なる別の健常人（ＤＲＢ１＊０４０５／０９０１、ＤＰＢ１＊０２０１／０５０１、ＤＱＢ１＊０３０３／０４０１陽性の健常人（健常人Ｂという））由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）にＷＴ１３５ペプチドをパルスしてＳｔｉｍｕｌａｔｏｒとし、細胞の増殖（取り込まれた３Ｈ−チミジン量（ｃｐｍ））を測定した。この測定の際、抗体の添加なし、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の添加（＋ａ−ＤＲ）、抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体の添加（＋ａ−ＤＰ）、または抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体の添加（＋ａ−ＤＱ）の条件下で測定を行った。ＲｅｓｐｏｎｄｅｒとＳｔｉｍｕｌａｔｏｒの両方で陽性を示す共通のＨＬＡクラスＩＩタイプが、ＷＴ１３５ペプチドの拘束性を示す。実験の結果、図１３に示すように、抗ＤＲ抗体を添加した条件下において増殖が抑制され、健常人ＡとＢにおいてＤＲＢ１＊０４０５が共通であることから、ＷＴ１３５ペプチドがＤＲＢ１＊０４０５拘束性であることが示された。【００６６】
次いで、Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒとして、健常人Ａと異なる健常人（ＤＲＢ１＊０４０５／０８０３、ＤＰＢ１＊０２０２／０５０１、ＤＱＢ１＊０４０１／０６０１陽性の健常人（健常人Ｇという））由来のＰＢＭＣを用いることを除いて、上記実験と同じ条件下で実験を行った。その結果、図１４に示すように、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体または抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体を添加した条件下で増殖が抑制され、健常人Ａと健常人ＧにおいてＤＲＢ１＊０４０５、ＤＰＢ１＊０２０１およびＤＰＢ１＊０２０２が共通であることから（ＤＰＢ１＊０２０１とＤＰＢ１＊０２０２は類似性が高いため、クロスして反応することから、共通とみなした）、ＷＴ１３５ペプチドがＤＲＢ１＊０４０５、ＤＰＢ１＊０２０１およびＤＰＢ１＊０２０２拘束性であることが示された。【００６７】
次に、Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒとして健常人Ａと異なる健常人（ＤＲＢ１＊０１０１／０８０３、ＤＰＢ１＊０５０１／−、ＤＱＢ１＊０５０１／０６０１陽性（健常人Ｈという））由来のＰＢＭＣを用いることを除いて、上記実験と同じ条件下で実験を行った。その結果、図１５に示すように、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を添加した条件下で増殖が抑制され、健常人Ａと健常人ＨにおいてＤＲＢ１＊０１０１が共通であることから、ＷＴ１３５ペプチドがＤＲＢ１＊０１０１拘束性であることが示された。【００６８】
さらに、ＷＴ１３５ペプチドの拘束性を調べるため、ｒｅｓｐｏｎｄｅｒとして健常人Ｇ由来のＰＢＭＣを用い、ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒとしてＤＱＢ１＊０６０１遺伝子を導入したＬ細胞を使用した。Ｌ細胞のＷＴ１３５ペプチドを用いたパルスの有無によるＩＦＮ−γ量の相違を測定した。細胞内のＩＦＮ−γ産生の割合を、当業者に周知な手法であるＦＡＣＳを用いて測定した。その結果、図１６に示すように、ＷＴ１３５ペプチドのＬ細胞へのパルスにより、Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒが活性化されることから、ＷＴ１３５ペプチドがＤＱＢ１＊０６０１拘束性であることが示された。【００６９】
次に、ＲｅｓｐｏｎｄｅｒとＳｔｉｍｕｌａｔｏｒに同一健常人由来のＰＢＭＣを用いて、上記と同様に実験を行った。本実験で用いた健常人が有するＨＬＡクラスＩＩ分子の種類を以下の表９にまとめる。
（表９．本実験で用いた健常人が有するＨＬＡクラスＩＩ分子の種類）
【表９】
2010123065.tif 000010
【００７０】
その結果、健常人Ａ〜Ｅ由来のＰＢＭＣを用いて実験を行った場合、抗ＤＲ抗体または抗ＤＰ抗体を添加すると、取り込まれた３Ｈ−チミジン量（ｃｐｍ）が減少することから、増殖が抑制されることがわかった。また、健常人Ｆ由来のＰＢＭＣを用いた場合、抗ＤＲ抗体のみを添加すると増殖が抑制された。さらに、健常人Ｇ由来のＰＢＭＣを用いた場合、抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体のみを添加すると増殖が抑制された。健常人Ａを用いた実験により、ＷＴ１３５ペプチドは、ＤＲＢ１＊０１０１または０４０５に対して、およびＤＰＢ１＊０２０１または０４０２に対して拘束性であることが示された。健常人Ｂを用いた実験により、ＷＴ１３５ペプチドは、ＤＲＢ１＊０４０５または０９０１に対して、およびＤＰＢ１＊０２０１または０５０１に対して拘束性であることが示された。健常人Ｃを用いた実験により、ＷＴ１３５ペプチドは、ＤＲＢ１＊０８０２または１２０１に対して、およびＤＰＢ１＊０２０１または０５０１に対して拘束性であることが示された。健常人Ｄを用いた実験により、ＷＴ１３５ペプチドは、ＤＲＢ１＊１５０２がホモ接合体であることから、ＤＲＢ１＊１５０２に対して拘束性であることが示された（図１７）。加えて、ＷＴ１３５ペプチドがＤＰＢ１＊０２０１または０９０１に対して拘束性であることが示された。健常人Ｅを用いた実験により、ＷＴ１３５ペプチドは、ＤＲＢ１＊０４０５または０９０１に対して、およびＤＰＢ１＊０２０２または０５０１に対して拘束性であることが示された。健常人Ｆを用いた実験により、ＷＴ１３５ペプチドは、ＤＲＢ１＊１４０３または１５０２に対して拘束性であることが示された。健常人Ｇを用いた実験により、ＷＴ１３５ペプチドは、ＤＰＢ１＊０２０２または０５０１に対して拘束性であることが示された。【００７１】
また、ＲｅｓｐｏｎｄｅｒとＳｔｉｍｕｌａｔｏｒとして健常人Ｉ由来のＰＢＭＣを用いて、ＷＴ１３５ペプチドを用いたパルスの有無によるＩＦＮ−γ量の相違を測定した。細胞内のＩＦＮ−γ産生の割合を、当業者に周知な手法であるＦＡＣＳを用いて測定した。その結果、ＷＴ１３５ペプチドでパルスすることによりＩＦＮ−γ量の割合が著しく増加した（図１８）。このことは、ＷＴ１３５ペプチドがＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊１５０１、ＤＰＢ１＊０２０１、ＤＰＢ１＊０４０２、ＤＱＢ１＊０５０１、またはＤＱＢ１＊０６０２のいずれかに対して拘束性であることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明により、多種類のＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性のＷＴ１ペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびこれらを含む医薬組成物などが提供されるので、医薬品などの分野、例えば、ＷＴ１遺伝子を高度に発現している種々の造血器腫瘍、固定癌の予防薬、または治療薬の開発、製造分野において利用可能である。
【図１】
2010123065.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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