(57)【要約】    【課題】本発明は、リガンドとの結合能が高く、医薬品レベルの品質を有する合成ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン、及びその合成方法を提供することを目的とする。    【解決手段】本発明は、  ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインにおいて、配列番号：７に記載のヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列の６９位に相当する位置に糖鎖が結合し、かつ、３位及び９０位に相当する位置に糖鎖が付加されていない、糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインにおいて、配列番号：７に記載のヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列の６９位に相当する位置に糖鎖が結合し、かつ、３位及び９０位に相当する位置に糖鎖が付加されていない、糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン。
【請求項２】
ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインにおいて、配列番号：７に記載のヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列の６９位に相当する位置にのみ糖鎖が結合している、糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン。
【請求項３】
前記糖鎖が、
【化１】
2011007747.tif 000018
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
【化２】
2011007747.tif 000019
を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］
で表される糖鎖である、請求項１又は２に記載の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン。
【請求項４】
配列番号：７に記載のアミノ酸配列からなるＡＩＬＩＭ細胞外ドメインにおいて、配列番号：７の６９位のＡｓｎにのみ以下に示す９糖アシアロ糖鎖が結合している、糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン。
【化３】
2011007747.tif 000020
【請求項５】
前記糖鎖が実質的に均一である、請求項１から４のいずれか１項に記載の、糖鎖付加細胞外ドメイン。
【請求項６】
糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの製造方法であって、
前記糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインを、配列番号：７に記載のヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列の１位〜４２位の領域に相当するフラグメントＡ、４３位〜６２位の領域に相当するフラグメントＢ、６３位〜８８位の領域に相当し、６９位に相当する位置に糖鎖が付加されたフラグメントＣ、８９位〜Ｃ末端の領域に相当するフラグメントＤに分け、
フラグメントＡ〜Ｄを調製する工程であって、フラグメントＡは２２位に相当するＣｙｓのチオール基に保護基を導入すること；フラグメントＣの６９位に相当するＡｓｎに糖鎖を付加すること；及び、フラグメントＤの１１６位と１１７位のＣｙｓのチオール基に保護基を導入すること、を特徴とする工程と、
前記フラグメントＡ〜ＣのＣ末端をチオエステル化する工程と、
前記フラグメントＡ及びＢをＫＣＬ法により連結する工程と、
前記フラグメントＣ及びＤをＮＣＬ法により連結する工程と、
連結された前記フラグメントＡ及びＢと、連結された前記フラグメントＣ及びＤと、をＮＣＬ法により連結する工程と、を含む方法。
【請求項７】
前記フラグメントＡの調製を固相合成法によって行い、該固相合成法において、配列番号：７に記載のヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列の２２位に相当するＣｙｓとして、チオール基に保護基を導入したＣｙｓを用いる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記フラグメントＣの調製を固相合成法によって行い、該固相合成法において、配列番号：７に記載のヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列の６９位に相当するＡｓｎとして、糖鎖付加アスパラギンを用いる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記フラグメントＤの調製を固相合成法によって行い、該固相合成法において、配列番号：７に記載のヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列の１１６位と１１７位のＣｙｓとしてチオール基に保護基を導入したＣｙｓを用いる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記固相合成法が、Ｆｍｏｃ固相合成法である、請求項７から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｆｍｏｃ固相合成法において、アミノ酸の縮合反応及び／又はＦｍｏｃ基の脱離反応の際、マイクロウェーブを照射する、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記糖鎖が、
【化４】
2011007747.tif 000021
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
【化５】
2011007747.tif 000022
を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］
で表される糖鎖である、請求項６から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記糖鎖が、以下に示す９糖アシアロ糖鎖である、請求項１２に記載の方法。
【化６】
2011007747.tif 000023
【請求項１４】
請求項６から１３のいずれか１項に記載の方法で製造された糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインであって、前記糖鎖が実質的に均一である、糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン。
【請求項１５】
請求項１から５及び請求項１４のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインを有効成分として含む医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の医薬組成物であって、ＡＩＬＩＭに関連する疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１５に記載の医薬組成物であって、免疫抑制剤である、医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１から５のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン又は請求項１５から１７のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、免疫抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＩＬＩＭ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）は、Ｔ細胞表層に発現し、Ｔ細胞を活性化させる働きを有する共刺激受容体の一つであり、ＩＣＯＳ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ−ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）あるいはＡＩＬＩＭ／ＩＣＯＳ等の名称でも知られている（例えば、特許文献１及び非特許文献１を参照）。【０００３】
抗原特異的なＴ細胞の活性化には、抗原提示細胞上の主要組織適合抗原（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）に結合した抗原ペプチドと、Ｔ細胞表面上のＴ細胞抗原受容体／ＣＤ３との複合体を介した第１シグナルに加えて、共刺激分子を介した第２シグナルが必須である。抗原提示細胞上の共刺激分子と結合するＴ細胞上の受容体が、共刺激受容体である。これまでに、共刺激受容体として、インテグリンファミリー、免疫グロブリンスーパーファミリー、ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体ファミリーが報告されているが、ＡＩＬＩＭは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＣＤ２８／ＣＴＬＡ４ファミリーにおけるＣＤ２８、ＣＴＬＡ４に次ぐ第３の分子であることが明らかとなっている。【０００４】
ＣＤ２８のリガンド及びＣＴＬＡ４のリガンド（共刺激分子）は、それぞれＣＤ８０（Ｂ７−１）及びＣＤ８６（Ｂ７−２）であり、ＡＩＬＩＭのリガンド（共刺激分子）としてはこれまでにＢ７ｈ、Ｂ７ＲＰ−１、ＧＬ５０が報告されている（例えば、非特許文献２乃至４を参照）。【０００５】
近年、共刺激分子と共刺激受容体との相互作用を調節して、生体内の免疫応答を調節しようとする種々の試みがなされている。
ＣＤ２８は抗原特異的免疫応答に不可欠なＴ細胞の機能を強く促進する分子である一方、ＣＴＬＡ４はＴ細胞の活性化を抑制する分子であるが、ＡＩＬＩＭは、ＣＤ２８と同様にＴ細胞の活性化に促進的なシグナルを入れる調節分子であることが判明している（例えば、非特許文献５を参照）。
ＣＤ２８はＴ細胞において恒常的に発現しているのに対して、ＡＩＬＩＭは休止Ｔ細胞における発現は低く、ＣＴＬＡ４と同様に細胞の活性化に伴ってその発現が誘導される。このことから、免疫応答の初期段階は主としてＣＤ２８やＣＤ４０リガンドの経路が調節しているのに対して、ＡＩＬＩＭは免疫反応の２次的な反応の制御に深く関与していることがわかる。また、ＡＩＬＩＭはインターロイキン２の生産を増加させないが、Ｂ細胞分化誘導因子であるインターロイキン１０の合成を誘導する。さらに、炎症や病態に反応して発現誘導が起こるとともに、ＡＩＬＩＭの発現細胞が炎症局所に局在するという現象も見られる。
これらのことから、ＡＩＬＩＭとリガンドとの相互作用を調節すれば、Ｔ細胞機能全般の制御より、ＡＩＬＩＭ関与の高い炎症や疾患を特異的に制御できる可能性を有しているということができる。【０００６】
骨髄移植などの移植抗原の異なるドナーからの細胞の移入では、アロ抗原の認識と共刺激受容体からのシグナルによってドナーＴ細胞の活性化がおこり、結果としてＧｖＨＤ（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）が誘発される。そのため、共刺激分子からのシグナルのみを遮断して免疫不応答（ａｎｅｒｇｙ）を誘導し、ＧｖＨＤを抑制する方法が提案されている。この方法は、ドナーのＴ細胞と移植抗原の異なるドナー由来の抗原提示細胞を共培養するｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によって実験的に解析することが可能である。例えば、可溶型ＣＴＬＡ４を投与すると、ＣＤ２８を介するシグナル伝達が阻害されることによってＭＬＲが抑制され、ａｎｅｒｇｙが誘導される（例えば、非特許文献６及び７を参照）。
さらに、ＣＤ３刺激で活性化したＴ細胞を用いたＭＬＲにおいて、可溶型ＡＩＬＩＭが可溶型ＣＴＬＡ４と同等の反応抑制効果を有することが確認されており、ＡＩＬＩＭの移植医療への応用の可能性が期待されている（例えば、非特許文献８参照）。当該文献で用いられた可溶型ＡＩＬＩＭは、ＡＩＬＩＭタンパク質の１残基目（Ｍｅｔ）〜１３５残基目（Ｌｅｕ）とヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインとの融合タンパク質として発現させたものである。【０００７】
ＡＩＬＩＭは、Ｎ末端側より、シグナル配列（２０アミノ酸残基）、細胞外ドメイン（ヒトでは１２１アミノ酸残基、ラット、マウスでは１２２アミノ酸残基）、膜貫通ドメイン（２１アミノ酸残基）、細胞内ドメイン（３２アミノ酸残基）からなるＩ型膜タンパク質である。
天然型ヒトＡＩＬＩＭには、細胞外ドメインの２３、８９、１１０残基目のアスパラギンに糖鎖が結合している。このうち８９残基目の糖鎖を失うと、抗原提示細胞上のリガンドＢ７ｈとの結合能が著しく低下することが報告されている。
従って、ＡＩＬＩＭを医薬品として利用するためには、少なくとも８９残基目に糖鎖を有し、かつ、製造ロットによって糖鎖構造にばらつきのない高品質の可溶性ＡＩＬＩＭを得る必要があり、これまで、遺伝子組み換え法や化学合成法による可溶性ＡＩＬＩＭの製造が試みられている。【０００８】
特許文献１には、発現系により、ラットＡＩＬＩＭの細胞外ドメインとＩｇＧＦｃとの融合タンパク質を発現させたことが記載されている。また、特許文献３には、マウスＡＩＬＩＭの細胞外ドメインとＩｇＧＦｃとの融合タンパク質が心移植時に免疫抑制効果を示すことが記載されている（例えば、特許文献３参照）。特許文献１及び３には、当該融合タンパク質に結合した糖鎖については特に記載されていないが、発現系で発現させている以上、翻訳後修飾により、Ｎ型糖鎖修飾のコンセンサス配列（Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ又はＴｈｒ）に複数種類の糖鎖が不均一に結合していたものと考えられる。このように糖鎖にばらつきがある場合、医薬品としての使用には適さない。【０００９】
また、８９残基目のみに糖鎖を有する１残基目〜１４１残基目のＡＩＬＩＭと、ＩｇＧＦｃとの融合タンパク質を発現系により発現させた報告もなされている。しかしながら、この方法では、２３残基目及び１１０残基目に糖鎖が付加しないように、Ａｓｎを他のアミノ酸に置換しなければならないので、ペプチド骨格を天然と同じアミノ酸配列とすることができない。また、発現系で発現させているので不均一な糖鎖が付加されており、医薬品として利用できるような品質を得ることが困難である。【００１０】
なお、これらの例において、ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインをＩｇＧＦｃとの融合タンパク質として発現させているのは、発現させたタンパク質を抗体と同様の方法で精製できること、ＩｇＧＦｃのヒト型配列を用いれば抗原性を生じにくいと考えられること、抗体ヒンジ領域の−Ｓ−Ｓ−結合を介して２量化できるので活性向上が期待されること、等によるものと考えられる。
しかしながら、分子が大きくなることによって立体的な障害も大きくなり、リガンドへの親和性が低くなる可能性があった。【００１１】
一方、糖タンパク質の合成方法として、従来、天然型化学的ライゲーション法（Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ；ＮＣＬ法）が知られている（例えば、特許文献２を参照）。この方法は、Ｎ末端アミノ酸がＣｙｓであるペプチドフラグメントと、Ｃ末端にチオエステルをもつペプチドフラグメントを連結して、より大きなペプチド鎖を得る方法である。このとき、糖鎖を付加したペプチドフラグメントを用いれば、糖タンパク質を合成することができる。各フラグメントは、例えば、１アミノ酸ずつ伸長する固相合成法で合成することができ、合成の途中で、アミノ酸に代えて均一な糖鎖を有する糖鎖付加アスパラギンを結合させることにより、アミノ酸配列及び糖鎖構造が均一な糖鎖付加フラグメントが得られる。かかる糖鎖付加フラグメントを用いてＮＣＬ法を行えば、製造ロット等によるばらつきがなく、医薬品としても利用可能な均一な糖タンパク質を得ることができる。【００１２】
ＮＣＬ法によって、目的タンパク質を合成する場合、まず、１以上のＣｙｓ残基のＮ末端側で目的タンパク質を分割するようにフラグメントを設計する。そして各フラグメントを合成し、Ｎ末端側に連結するフラグメントのＣ末端をチオエステル化した後、当該チオエステルと、Ｃ末端側に連結するフラグメントのＮ末端のＣｙｓ残基とを反応させ、各フラグメントを連結していく。
例えば、目的タンパク質をＮ末端からフラグメントＷ、Ｘ、Ｙ、Ｚに分けて合成する場合を例に挙げて説明する。以下、フラグメントＸとＹを連結したものをフラグメントＸ＋Ｙと示す。
フラグメントＸ、Ｙ、Ｚは、それぞれＮ末端がＣｙｓ残基となるように設計する。
フラグメントＺはＣ末端をカルボキシル基として合成し、フラグメントＷ〜Ｙは合成後にＣ末端をチオエステル化しておく。こうして、まずフラグメントＺとフラグメントＹをＮＣＬ法によって連結し、続いて、フラグメントＸとフラグメントＹ＋Ｚ、さらにフラグメントＷとフラグメントＸ＋Ｙ＋Ｚを連結すれば、連結するフラグメントの一方は必ずＣ末端にカルボキシル基を有し、一方はＣ末端にチオエステルを有することになるので、連結する順序が逆になることなく、効率よく目的タンパク質を合成することができる。【００１３】
そこで、本発明者らは、常法に従って、ＡＩＬＩＭの細胞外ドメイン（２１残基目〜１４０残基目）をＣｙｓ残基のＮ末端側を境界にして５つのフラグメントに分けてそれぞれ合成し、ＮＣＬ法による連結を試みた。具体的には、２１残基目〜４１残基目のフラグメント１、４２残基目〜６２残基目のフラグメント２、６３残基目〜８２残基目のフラグメント３、８３残基目〜１０８残基目のフラグメント４、及び１０９残基目〜１４０残基目のフラグメント５に分け、それぞれを固相合成法によって合成した後、ＮＣＬ法によりフラグメント５と４から順に連結した。合成スキームを図５に示す（ルートＡ）。
しかしながら、この方法は、糖鎖付加したフラグメント４を最初の段階で連結することから、以降のすべての工程でのフラグメントのロスが高価な糖鎖の消費につながり、量産には適さなかった。【００１４】
次に、本発明者らは、糖鎖付加フラグメントの消費を抑える目的で、別のルート（ルートＢ）でＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの全合成を行った。合成スキームを図６に示す。この方法では、フラグメント２と３の連結の際、及び、フラグメント２＋３とフラグメント１の連結の際、両フラグメントのＣ末端がチオエステル化されていることになる。そのため、ＮＣＬ法ではなく、脱離能の異なるチオエステルを利用するＫＣＬ法（Ｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ；例えば、非特許文献９を参照）を用いた。具体的には、フラグメント１と２のＣ末端は脱離能の高いチオエステルであるチオフェニルエステルとし、フラグメント３はプロパンチオエステルとした。
ＫＣＬ法によれば、連結する両フラグメントがＣ末端にチオエステルを有していても、反応速度の違いにより目的とする化合物を比較的多く得ることができる。しかしながら、条件の検討も困難で副生成物の形成も多い。特に、フラグメント２と３を連結するときに、フラグメント２＋３のＣｙｓ側鎖であるチオール基が同一分子内のＣ末端チオエステルへ求核攻撃した結果生成する環状の副生成物と、フラグメント２のチオエステルへ求核攻撃した結果生成する副生成物とが確認された。実際、ＫＣＬ法を２回行った結果、目的とするフラグメント１＋２＋３は、合成を先に進めるほど十分な量が得られなかった。【００１５】
続いて、本発明者らは、ＫＣＬ法の回数を減らすため、別のルート（ルートＣ）でＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの全合成を行った。合成スキームを図７に示す。しかしながら、この方法においても、フラグメント２＋３と、フラグメント４＋５を連結する工程で、目的とするフラグメント２＋３＋４＋５を十分に得られず、フラグメント１を連結するに至らなかった。
この方法でも、フラグメント２＋３の環化が見られ、これが以降の反応において障害となったものと考えられる。そこで、チオール触媒を変えて検討を重ねたが、副反応を防ぎ、且つＮＣＬ法を効率的に進行させるチオール触媒を見出すことはできなかった。さらに、フラグメント２＋３の連結部のＣｙｓ残基（６３残基目）のチオール基を保護して副反応を防ぐ方法を検討した。しかしながら、ＮＣＬ法による連結後に、Ｃｙｓを選択的に保護するのは困難であり、ルートＣも全合成には適さないとの結論に至った。【００１６】
さらに、本発明者らは、フラグメント２＋３の合成における副反応（特に環化）を防ぐために、新たなルート（ルートＤ）を検討した。合成スキームを図８に示す。ルートＤでは、まず、フラグメント２＋３の４１残基をＢｏｃ固相合成法により連続合成した。合成の際に保護基で保護したＣｙｓを用いることにより、６３残基目のＣｙｓ残基が保護されたフラグメント２＋３を得た。続いて、フラグメント２＋３にフラグメント４＋５をＮＣＬ法により連結し、最後にフラグメント１をＮＣＬ法により連結することとした。
この方法では、フラグメント２＋３におけるＣｙｓ残基のチオール基による環化はかなり抑えることができたが、Ｂｏｃ法による合成では、フラグメント２＋３の生成量が不十分であり、また、フラグメント２＋３以外の副反応も多く存在したため、フラグメント２＋３＋４＋５も十分量得られず、実際にはフラグメント１を連結するに至らなかった。【００１７】
このように、複数回のライゲーション法で糖鎖付加ポリペプチドを合成するためには、フラグメントの設計と合成、ライゲーションの順序、試薬の選択、保護基の付与等、多くの条件を最適化する必要がある。上述のとおり、本発明者らはこれまで糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの合成を様々なルートや条件で検討してきたが、全合成することはできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】国際公開第９８／３８２１６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９６／３４８７８号パンフレット
【特許文献３】特開２００３−２７７２９３号公報
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｈｕｔｌｏｆｆ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ（１９９９）３９７：２６３−２６６
【非特許文献２】Ｙｏｓｈｉｎａｇａ  ＳＫ，ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ（１９９９）４０２：８２７−８３２
【非特許文献３】Ｓｗａｌｌｏｗ  ＭＭ，ｅｔ  ａｌ．：Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９９）１１：４２３−４３２
【非特許文献４】Ｌｉｎｇ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０００）１６４：１６５３−１６５７
【非特許文献５】Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．：ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ  ＡＮＤ  ＨＹＢＲＩＤＯＭＩＣＳ（２００１）２０：２９３−３０３
【非特許文献６】Ｔａｎ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（１９９３）１７７：１６５−１７３
【非特許文献７】Ｇｒｉｂｂｅｎ  ＪＧ，ｅｔ  ａｌ．：Ｂｌｏｏｄ（１９９６）８７：４８８７−４８９３
【非特許文献８】Ａｉｃｈｅｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０００）１６４：４６８９−４６９６
【非特許文献９】Ｂａｎｇ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．：Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００６）４５：３９８５−３９８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインは、ＡＩＬＩＭ関与の高い炎症や疾患を特異的に制御し、移植医療における免疫抑制剤等としての応用可能性が期待されている。
そこで、本発明は、リガンドとの結合能が高く、医薬品として使用可能な品質を有するＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン、及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、上記課題に鑑みて研究を重ねた結果、（ｉ）これまで個別に合成してライゲーション法で連結していたフラグメント１と２を固相合成法によって連続的に合成し、（ｉｉ）フラグメント１＋２及びフラグメント５に含まれる、ライゲーションに不要なＣｙｓ残基に保護基を導入し、（ｉｉｉ）フラグメント１＋２とフラグメント３とをＫＣＬ法で連結し、（ｉｖ）フラグメント４と５とをＮＣＬ法で連結すると、フラグメント１＋２＋３、フラグメント４＋５をそれぞれ十分な量得ることができ、（ｖ）最後に両者をＮＣＬ法によって連結して、全合成できることを見出した。さらに、こうして得られる８９残基目のＡｓｎに糖鎖が付加された全長ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインは、従来知られる可溶性ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインである、ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインとＩｇＧＦｃとの融合タンパク質と比較して、リガンドとの結合能が約１０倍も高いことを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、
〔１〕ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインにおいて、配列番号：７に記載のヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列の６９位に相当する位置に糖鎖が結合し、かつ、３位及び９０位に相当する位置に糖鎖が付加されていない、糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン；
〔２〕ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインにおいて、配列番号：７に記載のヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列の６９位に相当する位置にのみ糖鎖が結合している、糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン；
〔３〕前記糖鎖が、
【化１】
2011007747.tif 000002
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
【化２】
2011007747.tif 000003
を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］
で表される糖鎖である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン；
〔４〕配列番号：７に記載のアミノ酸配列からなるＡＩＬＩＭ細胞外ドメインにおいて、配列番号：７の６９位のＡｓｎにのみ以下に示す９糖アシアロ糖鎖が結合している、糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン；
【化３】
2011007747.tif 000004
〔５〕前記糖鎖が実質的に均一である、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の、糖鎖付加細胞外ドメイン；
〔６〕糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの製造方法であって、
前記糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインを、配列番号：７に記載のヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列の１位〜４２位の領域に相当するフラグメントＡ、４３位〜６２位の領域に相当するフラグメントＢ、６３位〜８８位の領域に相当し、６９位に相当する位置に糖鎖が付加されたフラグメントＣ、８９位〜Ｃ末端の領域に相当するフラグメントＤに分け、
フラグメントＡ〜Ｄを調製する工程であって、フラグメントＡは２２位に相当するＣｙｓのチオール基に保護基を導入すること；フラグメントＣの６９位に相当するＡｓｎに糖鎖を付加すること；及び、フラグメントＤの１１６位と１１７位のＣｙｓのチオール基に保護基を導入すること、を特徴とする工程と、
前記フラグメントＡ〜ＣのＣ末端をチオエステル化する工程と、
前記フラグメントＡ及びＢをＫＣＬ法により連結する工程と、
前記フラグメントＣ及びＤをＮＣＬ法により連結する工程と、
連結された前記フラグメントＡ及びＢと、連結された前記フラグメントＣ及びＤと、をＮＣＬ法により連結する工程と、を含む方法；
〔７〕前記フラグメントＡの調製を固相合成法によって行い、該固相合成法において、配列番号：７に記載のヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列の２２位に相当するＣｙｓとして、チオール基に保護基を導入したＣｙｓを用いる、上記〔６〕に記載の方法；
〔８〕前記フラグメントＣの調製を固相合成法によって行い、該固相合成法において、配列番号：７に記載のヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列の６９位に相当するＡｓｎとして、糖鎖付加アスパラギンを用いる、上記〔６〕に記載の方法；
〔９〕前記フラグメントＤの調製を固相合成法によって行い、該固相合成法において、配列番号：７に記載のヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列の１１６位と１１７位のＣｙｓとしてチオール基に保護基を導入したＣｙｓを用いる、上記〔６〕に記載の方法；
〔１０〕前記固相合成法が、Ｆｍｏｃ固相合成法である、上記〔７〕から〔９〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１１〕前記Ｆｍｏｃ固相合成法において、アミノ酸の縮合反応及び／又はＦｍｏｃ基の脱離反応の際、マイクロウェーブを照射する、上記〔７〕に記載の方法；
〔１２〕前記糖鎖が、
【化４】
2011007747.tif 000005
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
【化５】
2011007747.tif 000006
を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］
で表される糖鎖である、上記〔６〕から〔１１〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１３〕前記糖鎖が、以下に示す９糖アシアロ糖鎖である、上記〔１２〕に記載の方法；
【化６】
2011007747.tif 000007
〔１４〕上記〔６〕から〔１３〕のいずれか１項に記載の方法で製造された糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインであって、前記糖鎖が実質的に均一である、糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン；
〔１５〕上記〔１〕から〔５〕及び〔１４〕のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインを有効成分として含む医薬組成物；
〔１６〕上記〔１５〕に記載の医薬組成物であって、ＡＩＬＩＭに関連する疾患の治療又は予防のための医薬組成物；
〔１７〕上記〔１５〕に記載の医薬組成物であって、免疫抑制剤である、医薬組成物；及び
〔１８〕上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン又は上記〔１５〕から〔１７〕のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、免疫抑制方法、に関する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に係る糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインは、細胞外ドメインにおいて８９残基目のＡｓｎに糖鎖が付加された新規な化合物であり、従来品に比較して約１０倍高いリガンドとの結合能を有する。当該ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインは可溶性であり、医薬品としての有用性が期待される。
また、本発明に係る製造方法によれば、副生成物の生成を抑制し、且つ、ライゲーション法を効率よく行うことができるので、医薬品として用いられ得る高品質な糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインを大量合成することが可能となる。特に、ライゲーションに用いる糖鎖付加フラグメントとして均一な糖鎖が付加されたフラグメントを用いることにより、糖鎖構造及び糖鎖付加位置が均一な糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインを大量合成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ＡＩＬＩＭ（ヒト、マウス、ラット）、ヒトＣＤ２８及びヒトＣＴＬＡ４のアミノ酸配列の比較を示す。
【図２】図２は、本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの製造方法による合成スキームを示す。
【図３】図３は、本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインとリガンド（Ｂ７ｈ）との結合反応性解析の結果を示す。
【図４】図４は、本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインと抗ＩＣＯＳモノクローナル抗体との反応性解析の結果を示す。
【図５】図５は、これまでに検討されたライゲーション法を用いたＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの合成スキーム（従来技術）の一例を示す。なお、図５〜８において、かっこ内の数値は、ＡＩＬＩＭタンパク質におけるアミノ酸の慣用的な数え方（Ｎ末端Ｍｅｔを１残基目とする数え方）に基づくものである。
【図６】図６は、これまでに検討されたライゲーション法を用いたＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの合成スキーム（従来技術）の一例を示す。
【図７】図７は、これまでに検討されたライゲーション法を用いたＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの合成スキーム（従来技術）の一例を示す。
【図８】図８は、これまでに検討されたライゲーション法を用いたＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの合成スキーム（従来技術）の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
<糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン>
本発明においてＡＩＬＩＭとは、ＡＩＬＩＭ／ＩＣＯＳとも呼ばれる共刺激受容体の一つをいう。本発明におけるＡＩＬＩＭは、ヒト、サル、マウス、イヌ、ウシ、ウマなどの任意の哺乳動物に由来するものを含むが、医薬品として用いる場合、ヒトに由来するものが好ましい。アミノ酸配列上の相同性は、ヒト−マウス間で６８％、マウス−ラット間では８４％と、種間で互いによく保存されていることが知られている。配列番号：１に、ヒトＡＩＬＩＭのアミノ酸配列を示し、また図１に、ラット、マウス、ヒトの各ＡＩＬＩＭのアミノ酸配列の比較を示す。
【００２５】
なお、本明細書において「Ｘ残基目」と表記した場合、特に断りがない限り、図１に示される慣用的な数え方、即ち、ＡＩＬＩＭのＮ末端Ｍｅｔを１残基目とする数え方に従った残基の位置を示す。この場合、ヒトＡＩＬＩＭの細胞外ドメインは、２１残基目から１４１残基目となる。
【００２６】
本発明においてＡＩＬＩＭ細胞外ドメインとは、Ｉ型膜タンパク質であるＡＩＬＩＭが発現したときに細胞表面に露出する部分のうち、シグナル配列を除いた部分をいう。ＡＩＬＩＭは、Ｎ末端にシグナル配列（２０アミノ酸残基）を有するが、これに続くヒトでは通常１２１アミノ酸残基、ラット、マウスでは１２２アミノ酸残基の領域が細胞外ドメインである。ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの一例として、配列番号：７にヒトのＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列を示す。
また、本発明におけるＡＩＬＩＭ細胞外ドメインは、通常細胞外ドメインと呼ばれる部分からなるペプチドに加え、本発明の効果を奏する限り、ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド、ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインにおいて１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド、又は、ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン改変体も含む。従って、本発明におけるＡＩＬＩＭ細胞外ドメインは、例えば、配列番号：７に記載のアミノ酸配列のうち１２１位のＰｈｅがない１２０アミノ酸（配列番号：８）からなるペプチドを含む。
【００２７】
本明細書において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えば、天然タンパク原性Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク原性アミノ酸；及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。非天然アミノ酸の例として、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニンなど）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン及びα−メチル−ヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。好ましい態様において、本発明の化合物に含まれるアミノ酸は、天然アミノ酸のみからなる。
【００２８】
本明細書において、「アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された」という場合、置換等されるアミノ酸の個数は、糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインが、ＡＩＬＩＭのリガンドに結合能を有する限り特に限定されないが、１〜９個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個程度であるかあるいは全体の長さの１０％以内、好ましくは５％以内である。置換又は付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸又はアミノ酸アナログであり得、好ましくは天然のアミノ酸である。これらの条件を満たす限り、欠失、置換及び付加はアミノ酸配列のどの部分であってもよい。
ここで、ＡＩＬＩＭのリガンドとは、抗原提示細胞上に発現し、ＡＩＬＩＭと結合する分子をいい、Ｂ７ｈ（例えば、非特許文献７を参照）、Ｂ７ＲＰ−１（例えば、非特許文献６を参照）、ＧＬ５０（例えば、非特許文献８を参照）が挙げられる。
【００２９】
本明細書において、「アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換された」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数及び／又は疎水性指数が類似している置換であって、そのような置換の前後で、糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのリガンド結合能の明らかな低下又は消失を生じない置換をいう。
【００３０】
本明細書において、「ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン改変体」とは、ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインを天然又は人工的に改変した化合物であり、そのような改変としては、例えば、ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの１又は複数のアミノ酸残基の、アルキル化、アシル化（例えばアセチル化）、アミド化、カルボキシル化、エステル形成、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、水酸化、標識成分の結合等が挙げられる。
【００３１】
本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインは、上述したＡＩＬＩＭ細胞外ドメインに糖鎖が付加されたものである。より具体的には、配列番号：７に記載されたヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列における、６９位に相当する位置に糖鎖が結合している。
ここで、「６９位に相当する位置」とは、本発明のＡＩＬＩＭ細胞外ドメインは、上述のとおり「ヒト以外の種に由来するＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン」「ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド」「ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインにおいて１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド」「ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン改変体」等を含むところ、これらのペプチドや改変体において、配列番号：７に記載されたヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列における６９位に相当する位置を意味し、かかる位置は、当業者がそれぞれの周辺のアミノ酸配列等に基づいて容易に決定することができる。
例えば、ラット及びマウスのＡＩＬＩＭ細胞外ドメインにおける、ヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの６９位に相当する位置は、図１に示された表からも理解されるとおり、ラットＡＩＬＩＭ−１においては配列番号：２に記載されたアミノ酸配列の８９位、ラットＡＩＬＩＭ−２においては配列番号：３に記載されたアミノ酸配列の８９位、マウスＡＩＬＩＭにおいては配列番号：４に記載されたアミノ酸配列の８９位である。
本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインとしては、例えば、配列番号：７に記載のアミノ酸配列において１２１位にＰｈｅを有しない１２０アミノ酸からなるペプチド（配列番号：８）の６９位にのみ糖鎖が結合しているものも挙げられる（配列番号：９）。
【００３２】
なお、配列番号：７の６９位に相当する位置である限り、６９位に相当する位置のアミノ酸は必ずしもＡｓｎでなくてもよい。糖鎖付加の方法等に応じて、６９位に相当する位置のアミノ酸をＡｓｎ以外のアミノ酸に置換したものも本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインに含まれる。
本明細書において、以降、「配列番号：ＸのＹ位に相当する位置」との表現は、上述した「配列番号：７の６９位に相当する位置」の説明に従って解釈される。
【００３３】
また、本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインは、配列番号：７に記載のヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列の３位及び９０位に相当する位置に糖鎖が付加されていないことを特徴とする。
【００３４】
また、本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインは、本発明の効果を奏する限り、配列番号：７の６９位に相当する位置以外（但し、配列番号：７に記載のヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列の３位及び９０位に相当する位置を除く）に１以上の糖鎖が付加されていてもよい。
【００３５】
本明細書において、「糖鎖」とは、単位糖（単糖及び／又はその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類及び多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸並びにそれらの複合体及び誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解又は誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。糖鎖は直鎖型であっても分岐鎖型であってもよい。
【００３６】
また、本明細書において、「糖鎖」には糖鎖の誘導体も含まれ、糖鎖の誘導体としては、例えば、糖鎖を構成する糖が、カルボキシル基を有する糖（例えば、Ｃ−１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルクロン酸））、アミノ基又はアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなど）、アミノ基及びカルボキシル基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ−アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２−デオキシ−Ｄ−リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などである糖鎖が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３７】
本発明において、好ましい糖鎖は、例えば、ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインに付加した場合に、リガンドに対する結合能を上昇させる糖鎖である。
【００３８】
本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインは生体に投与されるという観点から、本発明の糖鎖付加糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインにおける糖鎖は、生体内で複合糖質（糖ペプチド（又は糖タンパク質）、プロテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であり、好ましくは、生体内で糖ペプチド（又は糖タンパク質）としてペプチド（又はタンパク質）に結合している糖鎖であるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖等である。
【００３９】
中でもＮ結合型糖鎖が好ましい。Ｎ結合型糖鎖としては、例えば、高マンノース（ハイマンノース）型、複合（コンプレックス）型、混成（ハイブリッド）型を挙げることができ、特に好ましくは、複合型が良い。
【００４０】
本発明の一態様において、本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインにおける糖鎖は、４個以上、例えば５個以上、７個以上、特に９個以上の糖からなる糖鎖であることが好ましい。
【００４１】
本発明の好ましい一態様において、糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインにおける糖鎖は、５〜１１個、９〜１１個又は９個の糖からなる糖鎖である。
【００４２】
本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインにおける糖鎖は、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖及びジマンノース糖鎖からなる群より選択される糖鎖であり、より好ましくは、アシアロ糖鎖である。
【００４３】
本発明で使用する好ましい糖鎖としては、例えば、下記一般式
【００４４】
【化７】
2011007747.tif 000008
【００４５】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
【００４６】
【化８】
2011007747.tif 000009
を示す。Ａｃはアセチル基を示す。］
で表される糖鎖等が挙げられる。
【００４７】
本発明のＡＩＬＩＭ細胞外ドメインに付加する糖鎖としては以下に示す、９糖アシアロ糖鎖が好ましい。特に、本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインとしては、配列番号：７に記載の１２１アミノ酸からなるＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン又は配列番号：８に記載の１２０アミノ酸からなるＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの６９位に、以下に示す９糖アシアロ糖鎖が付加されたものが好ましい。
【００４８】
【化９】
2011007747.tif 000010
【００４９】
本発明において、その他の好ましい糖鎖としては、例えば、ヒト体内において、タンパク質と結合した糖タンパク質として存在する糖鎖（例えば、「ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴＥＲＳ  Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．３，Ｆｅｂ．１９７５」に記載の糖鎖）と、同一の構造を有する糖鎖（構成糖の種類及びそれらの結合様式が同一の糖鎖）又はこれの非還元末端から１又は複数の糖を失った糖鎖である、下記表１〜４に記載の糖鎖を挙げることができる。
【００５０】
【表１】
2011007747.tif 000011
【００５１】
【表２】
2011007747.tif 000012
【００５２】
【表３】
2011007747.tif 000013
【００５３】
【表４】
2011007747.tif 000014
【００５４】
本明細書において「糖鎖付加アミノ酸」とは、糖鎖が結合したアミノ酸をいう。糖鎖とアミノ酸はリンカーを介して結合していてもよい。糖鎖とアミノ酸との結合部位に特に制限はないが、糖鎖の還元末端にアミノ酸が結合していることが好ましい。
糖鎖が結合するアミノ酸の種類は特に限定されないが、上述したＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのいずれかのアミノ酸であり、好ましくはＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ等が挙げられ、より好ましくはＡｓｎである。
【００５５】
糖鎖とアミノ酸がリンカーを介して結合する場合、リンカーの種類は特に限定されないが、例えば、−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ａ−ＣＨ２−（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）、Ｃ１−１０ポリメチレン、−ＣＨ２−Ｒ−（式中、Ｒは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基及び置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が１つ脱離して生ずる基である）等を挙げることができる。
【００５６】
なお、本発明に係る糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインは、どのような製造方法によって製造されたものであってもよく、例えば、糖鎖付加アミノ酸を原料として用いた固相合成法によって製造したものであってもよいし、アミノ酸の結合していない糖鎖を、ペプチド上のアミノ酸に直接又はリンカーを介して結合させることにより製造したものであってもよい。糖鎖の結合していないペプチドは固相合成、液相合成、発現系による発現等によって調製することができる。
また、後述する本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの製造方法のように、ペプチドをフラグメントに分けてそれぞれ合成し、ライゲーション法によって連結してもよい。
また、糖鎖を付加したＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの糖鎖に、さらに糖又は糖鎖を付加することにより糖鎖を伸長させて製造したもの等、最終的な構造が一致している限り、本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインに含まれる。
【００５７】
本発明の好ましい一態様において、ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインに付加される糖鎖の構造は、実質的に均一である。本明細書において、糖鎖の構造が実質的に均一であるとは、糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン間で比較した場合に、糖鎖付加部位、糖鎖を構成する各糖の種類、結合順序、及び糖間の結合様式が同一であることをいい、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の糖鎖の構造が均一であることを言う。糖鎖が均一である糖ペプチドは、品質が一定であり、特に医薬品の製造や、アッセイなどの分野において好ましい。均一な糖鎖の割合は、例えば、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、ＮＭＲ、質量分析等を用いた方法によって測定することが可能である。糖鎖構造が均一な糖鎖の製造に関しては、国際公開番号第０３／００８４３１号パンフレット（ＵＳ２００４１８１０５４（Ａ１））、国際公開第２００４／０５８９８４号パンフレット（ＵＳ２００６２２８７８４（Ａ１））、国際公開第２００４／０５８８２４号パンフレット（ＵＳ２００６００９４２１（Ａ１））、国際公開第２００４／０７００４６号パンフレット（ＵＳ２００６２０５０３９（Ａ１））、国際公開第２００７／０１１０５５号パンフレットに記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
【００５８】
本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインは、従来知られる可溶性ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン、即ちＡＩＬＩＭ細胞外ドメインとＩｇＧＦｃとの融合タンパク質に比較して、約１０倍以上のリガンド結合能を有するものである。後述するとおり、本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインは、抗ＩＣＯＳモノクローナル抗体と反応せず、当該モノクローナル抗体が認識するエピトープは形成されていないものと考えられる。このように天然型ＡＩＬＩＭとは糖鎖の数も高次構造も異なる可溶性ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインが、リガンドに対して極めて高い結合能を有することはまったく予想されていなかった。従来、ＡＩＬＩＭ−ＩｇＧＦｃ融合タンパク質が心移植時に免疫抑制効果を示すことが確認されていることから（例えば、特開２００３−２７７２９３号公報、試験２参照）、本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインも免疫抑制剤あるいはＡＩＬＩＭ関連疾患との予防又は治療剤として有用性が高いものと理解される。
【００５９】
<糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの製造方法>
次に、本発明に係る、糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの製造方法について説明する。
本発明に係る糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの製造方法は、糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインを４つのフラグメントＡ〜Ｄに分け、それぞれを調製する工程と、各フラグメントをＫＣＬ法又はＮＣＬ法により順に連結する工程と、を含む。
４つのフラグメントは、配列番号：７に記載のヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列の１位〜４２位の領域に相当するフラグメントＡ、４３位〜６２位に相当するフラグメントＢ、６３位〜８８位に相当するフラグメントＣ、及び８９位〜Ｃ末端に相当するフラグメントＤである。
各フラグメントの調製方法は特に限定されないが、固相合成法、液相合成法、発現系による発現等、公知のペプチド合成方法またはそれに準ずる方法で調製することができる。固相合成法によれば、アミノ酸配列を正確に伸長させることができて好ましく、糖鎖付加アミノ酸を用いて固相合成を行えば、糖鎖付加位置を正確に制御することも可能である。また、副反応が生じやすいアミノ酸残基に、選択的に保護基を導入することもできる。一方、長いフラグメントは発現系によって効率よく製造することも好ましい。当業者は、製造するフラグメントのアミノ酸配列や長さ、糖鎖の有無等によって、適宜合成方法を選択することができる。以下、固相合成法によるフラグメントの調製についてより詳細に説明する。
【００６０】
（フラグメントの固相合成）
フラグメントの固相合成は、公知の方法またはそれに準ずる方法に従って行うことができる。
例えば、糖鎖付加されていないフラグメントは、以下の（１）〜（４）の工程によって任意のアミノ酸配列に合成することができる。
（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基をエステル化反応させる。この場合アミノ酸のアミノ基窒素を脂溶性保護基で保護しているので、アミノ酸同士の自己縮合は防止され、レジンの水酸基とアミノ酸のカルボキシル基が反応してエステル化が起こる。
（２）上記で得られたエステルの脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（３）以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を１回以上行う。これにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結し、Ｃ末端にレジンが結合し、Ｎ末端に遊離アミノ基を有するペプチドが得られる。
（ｉ）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させる。
（ｉｉ）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（４）酸でレジンを切断する。
【００６１】
また、糖鎖が付加されたフラグメントの場合は、例えば、国際公開第２００４／００５３３０号パンフレット（ＵＳ２００５２２２３８２（Ａ１））に記載された方法を用いることができ、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
具体的には、上記（１）〜（３）の工程により、Ｃ末端側から糖鎖付加されるアミノ酸の手前まで合成した後、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基と（３）の遊離アミノ基をアミド化反応させ、次に、糖鎖付加アスパラギンの脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
その後、上記（３）を必要な回数繰り返し、最後に酸で樹脂を切断することにより、任意の位置に糖鎖が付加された任意のアミノ酸配列を有する糖鎖付加ペプチドフラグメントを得ることができる。
【００６２】
なお、上記（１）において、水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加アミノ酸のカルボキシル基をエステル化反応させれば、Ｃ末端アミノ酸に糖鎖が付加された糖鎖付加ペプチドフラグメントを得ることができる。
また、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加アミノ酸を結合した直後に合成を終了し、酸で樹脂を切断すれば、Ｎ末端アミノ酸に糖鎖が付加された糖鎖付加ペプチドフラグメントを得ることができる。
【００６３】
水酸基を有する樹脂（レジン）としては、通常、固相合成で使用する水酸基を有する樹脂（レジン）であればよく、例えば、Ａｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）Ｗａｎｇレジン（メルク社製）、ＨＭＰＡ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）等を用いることができる。固相合成の後にチオエステル化するという観点からは、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡレジンが好ましい。
【００６４】
アミノ酸としては全てのアミノ酸を用いることができ、例えば、天然アミノ酸である、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）を挙げることができる。
【００６５】
脂溶性保護基としては、例えば９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基等の、カーボネート系又はアミド系の保護基等を挙げることができる。脂溶性保護基を導入するには、例えばＦｍｏｃ基を導入する場合には９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１〜５時間程度行うのが良い。脂溶性保護基としてＦｍｏｃ基を用いる固相合成法を、Ｆｍｏｃ固相合成法と呼ぶ。
【００６６】
脂溶性保護基で保護したアミノ酸としては、上記のアミノ酸を上記の方法で製造することができる。また、市販のものも使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−ＡＩａ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏを挙げることができる。
【００６７】
エステル化触媒として、例えば１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。アミノ酸と脱水縮合剤との使用割合は、前者１重量部に対して、後者が、通常１〜１０重量部、好ましくは２〜５重量部である。
【００６８】
エステル化反応は、例えば、固相カラムにレジンを入れ、このレジンを溶剤で洗浄し、その後アミノ酸の溶液を加えることにより行うのが好ましい。洗浄用溶剤としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２−プロパノール、塩化メチレン等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。エステル化反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０分〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。
【００６９】
この時固相上の未反応の水酸基を無水酢酸等を用いてアセチル化してキャッピングすることも好ましい。
【００７０】
脂溶性保護基の脱離は、例えば塩基で処理することにより行うことができる。塩基としては、例えばピペリジン、モルホリン等を挙げることができる。その際、溶媒の存在下行うのが好ましい。溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール等を挙げることができる。
【００７１】
遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とのアミド化反応は、活性化剤及び溶媒の存在下行うのが好ましい。
【００７２】
活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ／ＨＣｌ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ヒドロキシフタルイミド（ＨＯＰｈｔ）、ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ−ＯＨ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム  テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロジ−４−オキサ−１，２，３−ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ）等を挙げることができる。
【００７３】
活性化剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、１〜２０当量、好ましくは１〜１０当量、さらに好ましくは、１〜５当量とするのが好ましい。
【００７４】
溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。脂溶性保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。
【００７５】
樹脂（レジン）からペプチド鎖を切断するには酸で処理するのが好ましい。酸としては、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、弗化水素（ＨＦ）等を挙げることができる。
【００７６】
また、本発明においては、固相合成法にマイクロウェーブ法を用いることが好ましい場合もある。マイクロウェーブ法とは、例えば、Ｂａｃｓａ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（２００８）７３：７５３２−７５４２に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
マイクロウェーブ法は、アミノ酸縮合工程や脱保護工程の際にマイクロウェーブを照射して、分子内の凝集や二次構造の形成、保護基による立体的障害等に基づく問題を解消する方法であり、通常の方法では合成しにくいペプチド、特に長鎖ペプチドを合成する際に有用である。マイクロウェーブ照射の条件は、反応時に熱やエネルギーがかかることにより副反応が生じるのを防ぐよう、アミノ酸配列に依存して当業者が適宜決定することができる。
【００７７】
本発明に係る糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの製造方法においては、フラグメントＡ、Ｃ及びＤを固相合成法によって調製することが好ましい。一方、フラグメントＢの調製は、固相合成、液相合成、発現系による発現等、いずれの方法で行ってもよい。
以下、フラグメントＡ、Ｃ及びＤの好ましい調製方法について説明する。
【００７８】
フラグメントＡは、従来、発明者らがフラグメント１（２１残基目〜４１残基目）とフラグメント２（４２残基目〜６２残基目）をそれぞれ合成し、ＫＣＬ法で連結して得ていたものであるが、本発明に係る方法では、これを連続的に固相合成法で合成することが好ましい。フラグメントＡの固相合成の際には、配列番号：７の２２位に相当するＣｙｓを結合させるときに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護され、且つ、チオール基に保護基を導入したＣｙｓを用いる。このようにフラグメントＡを連続的に固相合成法により合成することで、Ｃｙｓに選択的に保護することができ、後で行われるＮＣＬ法やＫＣＬ法によるライゲーションの際、Ｃｙｓ残基のチオール基がチオエステルと反応して副生成物が生じるのを防ぐことができる。
チオール基に導入する保護基としては、ジスルフィド基、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）基、ニトロベンジル基、トリチル基等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
フラグメントＡは比較的長いので、上述したマイクロウェーブ法を用いることが好ましい。
好ましい照射条件は、固相合成によるアミノ酸縮合時には、例えば約３０℃〜５０℃、好ましくは約３５℃〜４０℃で、約１０分〜２０分、好ましくは約１５分、約１０Ｗ〜３０Ｗ、好ましくは約２０Ｗである。
保護基を除去する際の好ましい照射条件は、例えば、約３０℃〜４５℃、好ましくは約３５℃〜３７℃、約１分〜１０分、好ましくは約３〜５分、約１０Ｗ〜３０Ｗ、好ましくは約２０Ｗである。
【００８０】
フラグメントＣは、上述した糖鎖付加ペプチドフラグメントの固相合成法に従って合成することができる。
糖鎖付加ペプチドフラグメントの固相合成に用いられる実質的に均一な糖鎖付加Ａｓｎは、上述のとおり、例えば、国際公開番号第０３／００８４３１号パンフレット（ＵＳ２００４１８１０５４（Ａ１））、国際公開第２００４／０５８９８４号パンフレット（ＵＳ２００６２２８７８４（Ａ１））、国際公開第２００４／０５８８２４号パンフレット（ＵＳ２００６００９４２１（Ａ１））、国際公開第２００４／０７００４６号パンフレット（ＵＳ２００６２０５０３９（Ａ１））、国際公開第２００７／０１１０５５号パンフレットに記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
【００８１】
フラグメントＤの固相合成の際には、配列番号：７の１１６位及び１１７位に相当するＣｙｓを結合させるときに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護され、且つ、チオール基に保護基を導入したＣｙｓを用いる。このような方法により、Ｃｙｓを選択的に保護することができるので、後で行われるＮＣＬ法やＫＣＬ法によるライゲーションの際、Ｃｙｓ残基の側鎖のチオール基がチオエステルと反応して副生成物が生じるのを防ぐことができる。チオール基に導入する保護基は、フラグメントＡと同様のものを用いることができる。
【００８２】
なお、当然のことながら、フラグメントＡ〜Ｄの合成は、順次行っても並行して行ってもよく、また順次行う場合の順序も問われない。
【００８３】
（Ｃ末端のチオエステル化工程）
本発明に係る糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの製造方法では、ライゲーションを行うために、フラグメントＡ〜ＣのＣ末端をチオエステル化、すなわちＣ末端にα−カルボキシチオエステル部分を形成する。Ｃ末端に−Ｃ（＝Ｏ）−ＳＲにより表されるα−カルボキシチオエステル部分を有するペプチドフラグメント（又は糖ペプチドフラグメント）の製造方法は、公知の方法又はそれに準ずる方法を用いることができる。かかる方法は、例えば、国際公開第９６／３４８７８号パンフレット（米国特許第６１８４３４４号明細書）に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
ここで、Ｒはチオール交換反応を阻害せず、カルボニル炭素への求核置換反応において脱離基となる基であれば特に限定されないが、好ましくはベンジルメルカプタン等のベンジル型、チオフェノール、４−（カルボキシメチル）−チオフェノール等のアリール型、２−メルカプトエタンスルホン酸塩、３−メルカプトプロピオン酸アミド等のアルキル型等から選択することができる。
【００８４】
Ｃ末端にα−カルボキシチオエステル部分を有するペプチドフラグメントを製造する方法として、具体的には、例えば固相からペプチドを切り出す際にチオエステル化を行う方法や、固相からペプチドを切り出した後にペプチドのＣ末端カルボキシル基をチオエステル化する方法等が挙げられる。固相からペプチドを切り出す際にチオエステル化する方法としては、例えば固相樹脂にＳａｆｅｔｙ  Ｃａｔｃｈ  Ｌｉｎｋｅｒを用いてペプチドを製造し、チオール化合物を作用させる方法が知られている（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，（１９９９）１２１：１１３６９−１１３７４、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，（２００５）４４：１６５０−１６５４）。また、固相からペプチドを切りだした後にペプチドのＣ末端カルボキシル基をチオエステル化する場合は、側鎖が保護されたペプチドをアルキルチオールやチオフェノールと反応させればよい。
例えば、後述の実施例に記載のように、固相合成法によって、アミノ酸側鎖とＮ末端のアミノ基が保護された保護ペプチド（又は糖ペプチド）を得て、このＣ末端側のカルボキシル基を、液相中において縮合剤にＰｙＢＯＰ（Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ−ｏｘｙ−ｔｒｉｓ−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）／ＤＩＰＥＡを用いてベンジルチオールと縮合させ、その後、９５％ＴＦＡ溶液を用いてアミノ酸の鎖を脱保護することで、Ｃ末端にα−カルボキシチオエステル部分を有するようにしたペプチド（又は糖ペプチド）を得ることができる。
【００８５】
なお、本発明に係る糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの製造方法においては、フラグメントＡ〜Ｄを調製する工程と、フラグメントＡ〜ＣのＣ末端をチオエステル化する工程が、同時に行われてもよい。
フラグメントＡ〜Ｄを調製する工程と、フラグメントＡ〜ＣのＣ末端をチオエステル化する工程を同時に行う方法としては、例えば各フラグメントのＣ末端側にインテインのアミノ酸配列を付加した融合タンパク質を調製し、インテイン反応によってインテインを切断するのと同時にフラグメントのＣ末端をチオエステル化することができる。かかる方法は、たとえば、Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒａｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００６）Ｖｏｌ．３  Ｎｏ．６  ４２９−４３８）記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【００８６】
フラグメントＡ及びＢはＫＣＬ法で連結するため、フラグメントＡのＣ末端のチオエステルを、フラグメントＢのＣ末端のチオエステルよりも脱離能が高いチオエステルとして用意する必要がある。こうすることで、反応速度の違いによってフラグメントＡのＣ末端側にフラグメントＢを結合させることができ、逆に連結した副産物等が生成するのを抑制することができる。
一般に、チオール基の反応性は、アリールチオール基>ベンジル型チオール基>アルキル型チオール基の順であるので、この順序に基づいて、フラグメントＡのＣ末端に、フラグメントＢのＣ末端より反応性の高いチオール基を用意する。
例えば、フラグメントＡのＣ末端をチオフェニルエステル、フラグメントＢのＣ末端をエチルチオエステルとする組み合わせ；フラグメントＡのＣ末端を４−メルカプトフェニルチオエステル（ＭＰＡＡ）、フラグメントＢのＣ末端をベンジルチオエステルとする組み合わせ；フラグメントＡのＣ末端をチオフェニルエステル、フラグメントＢのＣ末端をメルカプトエタンスルホニルエステルとする組み合わせ、等が好ましい。
【００８７】
また、フラグメントＢ〜ＤのＮ末端Ｃｙｓの−ＳＨ基は、所望により保護基により保護されていてもよい。例えば、−ＳＨ基をチアゾリジンとして保護してもよい。この保護基はライゲーション反応までの所望の時点で脱保護する。例えばジスルフィド基等、ライゲーションが起こる条件において自然に脱保護される保護基であれば、脱保護せずにそのまま以下のライゲーション反応に用いることもできる。ジスルフィド基は、その後のライゲーション法の反応条件下で容易に脱保護される。
【００８８】
（ライゲーション法による連結工程）
本発明に係る糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの製造方法では、固相合成したフラグメントＡとＢをＫＣＬ法により連結してフラグメントＡ＋Ｂとし、フラグメントＣとＤをＮＣＬ法により連結してフラグメントＣ＋Ｄとし、最後にフラグメントＡ＋ＢとフラグメントＣ＋ＤをＮＣＬ法により連結する。
なお、本明細書においては、フラグメントＸとフラグメントＹをライゲーション法によって連結したフラグメントをフラグメントＸ＋Ｙと表記する。
【００８９】
２つのペプチドフラグメントを、必要に応じ、４−メルカプトフェニル酢酸、ベンジルメルカプタン、チオフェノール等の触媒チオールの存在下、１００ｍＭリン酸緩衝溶液等の溶液中で混合する。好ましくは、第１のペプチドフラグメント１当量に対し第２のペプチドフラグメントを０．５〜２当量及び触媒チオールを５当量程度の割合で反応を行う。反応はｐＨ６．５〜７．５程度、２０〜４０℃程度の条件下、約１〜３０時間程度行うのが望ましい。反応の進行は、ＨＰＬＣ、ＭＳ等を組み合わせた公知の手法を用いて確認することができる。
【００９０】
これに、トリス２−カルボキシエチルホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）のような還元剤を加えて副反応を抑制し、所望により精製することで、第１のペプチドフラグメントと第２のペプチドフラグメントとを連結することができる。
【００９１】
また、ＫＣＬ法は、Ｋｅｎｔが報告したもので、反応速度論的制御をしたＮＣＬ法である（Ｋｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００６，４５，３９８５−３９８８）。ＮＣＬ法では、連結する２つのフラグメントのうち、一方のＣ末端をカルボキシル基とし、もう一方のＣ末端をチオエステル化し、チオエステル化したフラグメントのＣ末端側にもう一方のフラグメントが結合させる方法である。これに対し、ＫＣＬ法は、連結するフラグメントの両方がチオエステル化されている場合に用いることができ、より脱離能の高いチオエステルが連結反応に供される。
上述のとおり、チオール基の反応性は、概して、アリールチオール基>ベンジル型チオール基>アルキル型チオール基の順である。従って、Ｃ末端のチオエステル−Ｃ（＝Ｏ）−ＳＲにおいては、Ｒがアリール基であるものがもっとも脱離能が高く、Ｒがベンジル基であるもの、Ｒがアルキル基であるものがこれに次ぐ。これに基づいて各フラグメントのチオエステルを決定すれば、所望の順序で各フラグメントを連結することができる。例えば、一方をチオフェニルエステル、他方をエチルチオエステルとすれば、まずチオフェニルエステルが連結反応に供され、Ｃ末端にエチルチオエステルを有するペプチドが得られる。一方を４−メルカプトフェニルチオエステル（ＭＰＡＡ）、他方をベンジルチオエステルとすれば、ＭＰＡＡが先に反応してＣ末端にベンジルチオエステルを有するペプチドが得られ、一方をチオフェニルエステル、他方をメルカプトエタンスルホニルエステルとすれば、チオフェニルエステルが先に反応してＣ末端にメルカプトエタンスルホニルエステルを有するペプチドが得られる。
このように、ＫＣＬ法によって得られたペプチド鎖はＣ末端にチオエステルを有するので、当該ペプチド鎖を、そのまま別のフラグメントとのライゲーションに用いることができる。
【００９２】
（フォールディング工程）
本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの製造方法では、フラグメントＡ〜Ｄを連結した後、フォールディング工程を行って、適切な高次構造をとるように処理してもよい。
フォールディング工程は、種々の公知の方法を用いることができるが、たとえば、フォールディングバッファー中での透析によって行うことができる。フォールディングバッファーは、たとえば、グアニジン等のグアニジノ基を有する化合物又はその塩を含み、ｐＨは６．０〜９．０であってもよい。透析は、複数回行ってもよく、その場合各透析処理のバッファーの組成やｐＨは同一であっても異なっていてもよい。
ポリペプチドがフォールディングしたことは、ポリペプチドの立体構造を解析する任意の方法で確認することができ、例えば、ジスルフィドマッピング法、立体構造エピトープに特異的な抗体への結合性の評価、Ｘ線解析などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９３】
<医薬組成物>
本発明の医薬組成物は、本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインを有効成分として含む。本発明の可溶性糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインは、生体内に投与されると、リガンドに対する高い親和性により、Ｔ細胞表面に発現したＡＩＬＩＭとリガンドとの相互作用を拮抗的に阻害する。従って、本発明の医薬組成物は治療上免疫を抑制することが望ましい多くの疾患に有効であり、特にＡＩＬＩＭに関連する疾患の治療又は予防に有効であり、とりわけＡＩＬＩＭ経路を調節する免疫抑制剤として有効である。
本発明の医薬組成物の主な適応症としては、例えば、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、多発性硬化症、再生不良性貧血、乾癬、アレルギー、炎症性胆汁疾患、慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患が挙げられる。
また、本発明の医薬組成物の適応症としては、臓器又は組織（例えば、腎臓、心臓、肺、骨髄、皮膚、角膜など）の移植や骨髄移植の際の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）も挙げられる。ＧｖＨＤは、ドナー由来の細胞が移入されたときに、アロ抗原の認識と共刺激受容体からのシグナルによってドナーＴ細胞の活性化が起こる結果、レシピエントの臓器を攻撃することによって起こる症状の総称である。本発明の医薬組成物は、共刺激分子からのシグナルのみを遮断して免疫不応答（ａｎｅｒｇｙ）を誘導し、ＧｖＨＤを抑制するものと理解される。
ＧｖＨＤの抑制は、例えば、ドナーＴ細胞と移植抗原の異なるドナー由来の抗原提示細胞を共培養するｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によって実験的に解析することが可能である。これまでに、可溶型ＣＴＬＡ４がＣＤ２８を介するシグナル伝達を阻害することによってＭＬＲを抑制するとともにａｎｅｒｇｙを誘導することが確認されており（非特許文献３及び４参照）、ＣＤ３刺激で活性化したＴ細胞を用いたＭＬＲにおいて、可溶型ＡＩＬＩＭが可溶型ＣＴＬＡ４の場合と同等の反応抑制効果を有することが示されていることから（非特許文献５）、本発明の医薬組成物はそれ以上の効果を奏するものと理解される。
さらに、本発明の医薬組成物の適応症として喘息も挙げられる。
【００９４】
上記医薬組成物は、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を用いて、通常の医薬組成物の形態に製剤したものである。
このような医薬組成物としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤等が挙げられる。
【００９５】
医薬組成物中に含有される本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの量は、特に限定されず広い範囲内から適宜選択することができるが、通常、医薬組成物中に本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインを１〜７０重量％含有させるのが好ましい。
【００９６】
本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインを有効成分として含有する医薬組成物は、さらに他の有効成分を含有することもできるし、他の有効成分を含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。また、本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインを有効成分として含有する医薬組成物は、さらに異なる１以上の本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインを有効成分として含有することもできるし、異なる１以上の本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインを有効成分として含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。
【００９７】
本発明に係る医薬組成物の投与方法としては特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、疾患の状態、その他の条件に応じた方法で投与される。錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤の場合の投与方法としては、例えば、経口投与が挙げられる。また、注射剤の場合には、単独で、又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して、静脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内に投与することができる。坐剤の場合には、直腸内に投与される。
【００９８】
上記医薬組成物の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、通常、体重１ｋｇに対して本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインが０．１〜９００ｎｍｏｌ、好ましくは１〜９０ｎｍｏｌとなる投与量である。本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインは、従来の可溶型ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン（ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインとＩｇＧＦｃの融合タンパク質）に比較してリガンドへの結合能が極めて高いことから、従来の可溶型ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインに比較して投与量を少なくすることができるものと理解される。
【００９９】
上記医薬組成物の投与回数は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、例えば、３回／１日、２回／１日、１回／１日、さらにはその血中安定性に応じて、より頻度の少ない投与回数（例えば、１回／週、１回／月など）も選択しうる。好ましくは、上記医薬組成物の投与回数は、１回以下／１日である。本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインは従来の可溶型ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインに比べ、リガンドへの結合能が極めて高いことから、従来の可溶型ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインに比較して投与回数を減らすことができるものと理解される。
【０１００】
本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインに付加された糖鎖は、体内の代謝系で容易に分解される。また、本発明の一態様において、該糖鎖は生体内で糖ペプチド（又は糖タンパク質）として結合して存在する構造を有する。従って、本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン及び本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインを有効成分として含む医薬組成物は、生体内に投与しても副作用や抗原性を示す可能性が低く、アレルギー反応や、抗体産生により薬効が得られなくなる心配が少ないなどの利点を有する。
【０１０１】
さらに、本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインは安定して簡便に大量に供給することが可能であり、安定した高品質の医薬品の提供という観点からも非常に有用である。
本発明はまた、本発明の糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインの有効量を投与することを特徴とする、ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインに関連する疾患の治療又は予防方法も提供する。
【０１０２】
なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
【０１０３】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
【０１０４】
本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、  例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
【０１０５】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【０１０６】
図２に示すスキームに従って、配列番号：７の６９位に相当する位置に糖鎖が付加された１２０アミノ酸からなるＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン（配列番号：９）を４つのフラグメントに分けてそれぞれＦｍｏｃ固相合成法により合成し、ＮＣＬ法又はＫＣＬ法により順に連結した。各フラグメントをＮ末端から順にフラグメントＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄと呼ぶ。フラグメントＡは、配列番号：８の１位〜４２位、フラグメントＢは４３位〜６２位、フラグメントＣは６３位〜８８位、フラグメントＤは８９位〜１２０位に当たる。
図示されたとおり、フラグメントＤとＣを合成し、フラグメントＣのＣ末端カルボキシル基をチオエステル化して、両者をＮＣＬ法により連結し、フラグメントＣ＋Ｄを得た。このとき、フラグメントＣのＮ末端Ｃｙｓはチアゾリジンとして保護し、連結後にチアゾリジンをＣｙｓに変換した。フラグメントＤの固相合成の際、チオール基に保護基を導入したＣｙｓを用いた。また、フラグメントＣの固相合成の際、９糖アシアロ糖鎖付加Ａｓｎを用いて、配列番号：１１の７位に糖鎖を付加した。
また、フラグメントＡとＢも固相合成法により合成した。フラグメントＡとＢは、連結してフラグメントＡ＋Ｂとされた後、続いてフラグメントＣ＋ＤとのＮＣＬ法による連結に供される。そのため、フラグメントＡとＢの両者のＣ末端カルボキシル基をチオエステルとし、フラグメントＡ＋ＢにおいてもＣ末端がチオエステルとなるようにした。フラグメントＢはプロパンチオエステルとし、フラグメントＡはより脱離しやすいチオフェニルエステルとした。なお、フラグメントＡの固相合成の際、チオール基に保護基を導入したＣｙｓを用いた。
最後にフラグメントＡ＋ＢとフラグメントＣ＋ＤをＮＣＬ法により連結し、Ｃｙｓの保護基を脱保護し目的とする糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメインを得た。
各工程を以下に詳細に説明する。【０１０７】
<フラグメントＤの合成>
樹脂はＨＭＰＡ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（５０μｍｏｌ）を用いた。アミノ酸の縮合はＦｍｏｃ法を用いてこれまでと同様に行った。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１１７．１ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）をＭＳＮＴ（７４ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ（１５μｌ，０．１９ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（１ｍｌ）によって縮合させた。その後のアミノ酸はＨＯＢｔ（３３．８ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（３８μｌ，０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１ｍｌ）によって縮合させた。用いたアミノ酸は以下の通りである。
樹脂はＨＭＰＡ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（５０μｍｏｌ）を用いた。アミノ酸の縮合はＦｍｏｃ法を用いてこれまでと同様に行った。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１１７．１ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）をＭＳＮＴ（７４ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ（１５μｌ，０．１９ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（１ｍｌ）によって縮合させた。その後のアミノ酸はＨＯＢｔ（３３．８ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（３８μｌ，０．２５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１ｍｌ）によって縮合させた。用いたアミノ酸は以下の通りである。
Ｌｅｕ（８８．４ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｇｌｎ（９２．１ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｃｙｓ（ａｃｍ）（１０３．６ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）（９５．９ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）（１０６．４ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）（１１５ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｉｌｅ（８８．４ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｈｉｓ（ｔｒｔ）（１５４．９ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｇｌｙ（７４．３ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）（９９．４ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｖａｌ（８４．９ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｐｈｅ（９６．８ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ｐｒｏ（８４．４ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）（１０２．９ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、Ａｓｎ（ｔｒｔ）（１４９．２ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）【０１０８】
３２残基のアミノ酸を伸長した樹脂に９５％ＴＦＡ水溶液を加え室温で２時間攪拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を濃縮した。ＨＰＬＣで精製することで目的物ペプチド（配列番号：１０）を得た。
ＨＰＬＣ分析：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−１８（３ｍｍ，４．６×７５ｍｍ）  展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→２５：７５  １５分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ
ＨＰＬＣ精製：ＶｙｄａｃＣ−１８（５ｍｍ，１０×２５０ｍｍ）グラジエントＡ：Ｂ＝７０：３０→３０：７０  ２５分  流速４．０ｍｌ／ｍｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ：  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１７２Ｈ２６５Ｎ４１Ｏ４８Ｓ３：  ［Ｍ＋２Ｈ］  ２＋  １８８６．７，  ｆｏｕｎｄ  １８８６．８  【０１０９】
<フラグメントＣの合成>
アシアロ糖鎖付加アミノ酸としては以下に示す９糖アシアロ糖鎖付加Ａｓｎを用い、樹脂はＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（０．１ｍｍｏｌ）を用い、アミノ酸の縮合はＦｍｏｃ法を用いてこれまでと同様に行った。
【化１０】
2011007747.tif 000015
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（１９３．７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）をＭＳＮＴ（１４８．２ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ（２９．９ｍｌ，０．３７５ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（２ｍｌ）によって縮合させた。その後のアミノ酸はＨＯＢｔ（６７．６ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（７７ｍｌ，０．５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（２ｍｌ）によって縮合させた。用いたアミノ酸は以下の通りである。
Ｔｙｒ（ｔＢｕ）（２２９．８ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ａｓｎ（１７７．２ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ａｌａ（１５５．７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｈｉｓ（ｔｒｔ）（３０９．９ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）（１９１．７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）（２０５．８ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｌｅｕ（１７６．８ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｐｈｅ（１９３．７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｖａｌ（１６９．７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）【０１１０】
アミノ酸１９残基伸長した樹脂１０μｍｏｌ分をエッペンチューブに移し、アシアロ糖鎖Ａｓｎ（４０ｍｇ，２０μｍｏｌ）を縮合した。ＤＥＰＢＴ（８．９８ｍｇ，３０μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（３．４μｌ，４０μｍｏｌ）、ＤＭＦ：ＤＭＳＯ＝４：１の混合溶液（６６７μｌ）を用いてこれまでと同様の方法を用いた。このアシアロ糖鎖ペプチドにさらに順次アミノ酸を縮合した。アミノ酸とＨＯＢｔ（６．８ｇ，５０μｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（７．７μｌ，５０μｍｏｌ）、ＤＭＦ（１．２５ｍｌ）によって縮合させた。用いたアミノ酸は以下の通りである。
Ｓｅｒ（ｔＢｕ）（１９．２ｍｇ，５０μｍｏｌ）、Ｌｅｕ（１７．７ｍｇ，５０μｍｏｌ）、Ｇｌｎ（１８．４ｍｇ，５０μｍｏｌ）、Ｈｉｓ（ｔｒｔ）（３１ｍｇ，５０μｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｌ−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ（１１．７ｍｇ，５０μｍｏｌ）【０１１１】
２６残基アミノ酸を伸長したこの樹脂にＡｃＯＨ：ＴＦＥ＝１：１（３ｍｌ）を加え、室温で１８時間反応させた。樹脂をろ過して除き、反応溶液を濃縮した。切り出し操作は３回繰り返した。ＨＰＬＣで精製することで目的物である側鎖の保護されたアシアロ糖鎖ペプチドを得た。
続いて、アシアロ糖鎖を有するフラグメントＣのチオエステル体を合成した。
アシアロ糖鎖を有する保護フラグメントＣ（６３ｍｇ，１０μｍｏｌ）とＭＳ４Ａ（１０ｍｇ）、ベンジルメルカプタン（３５．５μｌ，０．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒中（１．３５ｍｌ）アルゴン気流下−２０℃で１時間攪拌した後、ＰｙＢＯＰ（２６ｍｇ，５０μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（８．５μｌ，５０μｍｏｌ）を加え６時間攪拌した。その後、反応溶液にジエチルエーテルを加え化合物を沈殿させた。ろ過した後に沈殿物をＤＭＦで回収し、ろ液を減圧濃縮した。その後９５％ＴＦＡ水溶液を加えて室温で２時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、ＨＰＬＣで精製することで目的物であるアシアロ糖鎖を有するフラグメントＣのチオエステル体（配列番号：１１）を得た。
ＨＰＬＣ分析：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−１８（３ｍｍ，４．６×７５ｍｍ）  展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→２５：７５  １５分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ
ＨＰＬＣ精製：ＶｙｄａｃＣ−１８（５ｍｍ，１０×２５０ｍｍ）グラジエントＡ：Ｂ＝６５：３５→２５：７５  ２０分  流速３．０ｍｌ／ｍｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ：  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２１１Ｈ２９９Ｎ４１Ｏ８６Ｓ２：［Ｍ＋Ｈ］＋４８４８．０，  ｆｏｕｎｄ  ４８４７．９（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）【０１１２】
<フラグメントＣチオエステル体とフラグメントＤのＮＣＬ法による連結>
フラグメントＣチオエステル体（１ｍｇ，０．２１μｍｏｌ）とフラグメントＤ（１．５ｍｇ，０．３３μｍｏｌ）とをエッペンチューブに移し、ｐＨ７．２３に調節した８Ｍ  グアニジン塩酸塩・２０ｍＭ  ＴＣＥＰ・５０ｍＭ  ＭＰＡＡ・０．２Ｍ  リン酸緩衝溶液（１６５ｍｌ）を加え３７℃で反応させた。反応はＨＰＬＣで追跡し４時間後に目的化合物フラグメントＣ＋Ｄ（Ｎ末端はチアゾリジン；配列番号：１２）の生成、及び、原料であるフラグメントＣチオエステル体の消失を確認した。そこで、反応溶液に０．２Ｍメトキシアミン塩酸塩水溶液をｐＨ４．０になるまで加え、室温で反応させた。４時間後にＮ末端のチアゾリジンのシステインへの変換をＨＰＬＣ及び質量分析によって確認した。その後ＨＰＬＣにより精製することで目的化合物フラグメントＣ＋Ｄ（配列番号：１３）を得た。
ＨＰＬＣ分析：ＶｙｄａｃＣ−１８（５ｍｍ，４．６×７５ｍｍ）展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝７０：３０→２５：７５  ３０分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ
ＨＰＬＣ精製：ＶｙｄａｃＣ−１８（５ｍｍ，４．６×７５ｍｍ）グラジエントＡ：Ｂ＝６５：３５→２０：８０  ３０分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３７５Ｈ５５６Ｎ８２Ｏ１３４Ｓ４：［Ｍ＋５Ｈ］５＋１６９８．０，  ｆｏｕｎｄ  １６９８．２
<フラグメントＢの合成>
樹脂にはＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（０．１ｍｍｏｌ）を用いた。アミノ酸の縮合はＦｍｏｃ法を用いてこれまでと同様に行った。Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（１９３．７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）をＭＳＮＴ（１４８．２ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ（２９．９ｍｌ，０．３７５ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（２ｍｌ）によって縮合させた。その後のアミノ酸はＨＯＢｔ（６７．６ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（７７ｍｌ，０．５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（２ｍｌ）によって縮合させた。用いたアミノ酸は以下の通りである。
Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（２３４．３ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｌｅｕ（１７６．７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）（１９１．７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｉｌｅ（１７６．７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｖａｌ（１６９．７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）（１９８．８ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ａｓｎ（１７７．２ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｇｌｙ（１４８．７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）（２０５．８ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｌ−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（１１６．６ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）【０１１３】
２０残基アミノ酸を伸長した樹脂１５μｍｏｌ相当を取り出し、１％ＴＦＡ（ＤＣＭ中）（３ｍｌ）を加え、室温で２分間攪拌した。樹脂をろ過して除き、ろ液は１０％ピリジン（５ｍｌ）中へ滴下した。この操作を５回繰り返した。反応溶液を濃縮した後に、水を加えることで目的物を沈殿させた。ろ過した後に沈殿物をＤＭＦで回収し、ろ液を減圧濃縮した。側鎖の保護された２０残基のペプチドを得た。【０１１４】
この保護ペプチド（５４ｍｇ，２０μｍｏｌ）とＭＳ４Ａ、１−プロパンチオール（５４．４μｌ，０．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒中（２．７ｍｌ）アルゴン気流下−２０℃で１時間攪拌した後、ＰｙＢＯＰ（５２．３ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１７．０μｌ，０．１ｍｍｏｌ）を加え３時間攪拌した。その後、反応溶液にジエチルエーテルを加え化合物を沈殿させた。ろ過した後に沈殿物をＤＭＦで回収し、ろ液を減圧濃縮した。その後９５％ＴＦＡ水溶液を加えて室温で２時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮した後、混合物に対し、８Ｍグアニジン緩衝液（２００ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ＝６．５）に溶解させた。次いで、０．２Ｍメトキシアミン水溶液を加えて反応溶液をｐＨ＝４．０付近に調整する。６時間撹拌した後、ＨＰＬＣで精製することで目的物であるペプチドプロパンチオエステル（配列番号：１４）を得た。
ＨＰＬＣ分析：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−１８（３ｍｍ，４．６×７５ｍｍ）展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→２５：７５  １５分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ
ＨＰＬＣ精製：ＶｙｄａｃＣ−１８（５ｍｍ，１０×２５０ｍｍ）グラジエントＡ：Ｂ＝６５：３５→２５：７５  ２０分  流速３．０ｍｌ／ｍｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ：  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ９５Ｈ１６５Ｎ２５Ｏ２９Ｓ２：［Ｍ＋２Ｈ］２＋１０９３．８，ｆｏｕｎｄ  １０９３．７【０１１５】
<フラグメントＡの合成>
フラグメントＡの固相合成には、マイクロウェーブ法を用いた。
樹脂にはＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（０．１ｍｍｏｌ）を用いた。アミノ酸の縮合はＦｍｏｃ法を用いてこれまでと同様に行った。Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（１７６．７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）をＭＳＮＴ（１４８．２ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ（２９．９ｍｌ，０．３７５ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（２ｍｌ）によって縮合させた。その後のアミノ酸はＨＯＢｔ（６７．６ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＩ（７７ｍｌ，０．５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（２ｍｌ）によって縮合させた。用いたアミノ酸は以下の通りである。
Ｉｌｅ（１７６．７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｇｌｎ（１８４．２ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｇｌｙ（１４８．７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（２３４．３ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｌｅｕ（１７６．７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｍｅｔ（１８５．７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、Ｐｈｅ（１９３．７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｖａｌ（１６９．７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）（２０５．７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｐｒｏ（１６８．７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）（２２９．８ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｃｙｓ（ａｃｍ）（２０６．６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、Ａｓｎ（１７７．２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）（３０９．９ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ａｌａ（１５５．７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）（１９１．７ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）【０１１６】
４２残基アミノ酸を伸長した樹脂２０μｍｏｌ相当を取り出し、１％ＴＦＡ（ＤＣＭ：ＴＦＥ＝１：１中）を加え、Ｆｍｏｃ基をはずすために、マイクロウェーブ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  １（ＣＥＭ社製））を用いて３７℃、２０Ｗで３分間照射した。樹脂をろ過して除き、ろ液はヘキサン中へ滴下した。１％ＴＦＡを加える操作からヘキサン中への滴下までの操作を３回繰り返した。反応溶液を濃縮し、側鎖の保護された４２残基のペプチドを得た。
この保護ペプチド（１５３．２ｍｇ，２０μｍｏｌ）とＭＳ４Ａ、チオフェノール（６１．４μｌ，０．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ溶媒中（２．７ｍｌ）アルゴン気流下−２０℃で１時間攪拌した後、ＰｙＢＯＰ（５２．０ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１７．０μｌ，０．１ｍｍｏｌ）を加え３時間攪拌した。その後、反応溶液にジエチルエーテルを加え化合物を沈殿させた。ろ過した後に沈殿物をＤＭＦで回収し、ろ液を減圧濃縮した。その後９５％ＴＦＡ水溶液を加えて室温で２時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、ＨＰＬＣで精製することで目的物であるペプチドチオフェニルエステル（配列番号：１５）を得た。
ＨＰＬＣ分析：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−１８（３ｍｍ，４．６×７５ｍｍ）展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝８０：２０→２５：７５  １５分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ
ＨＰＬＣ精製：ＶｙｄａｃＣ−１８（５ｍｍ，１０×２５０ｍｍ）グラジエントＡ：Ｂ＝７０：３０→３０：７０  ２０分  流速３．０ｍｌ／ｍｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１１２Ｈ１６１Ｎ２７Ｏ３１Ｓ２：［Ｍ＋４Ｈ］４＋１２３８．４，ｆｏｕｎｄ  １２３８．３
<フラグメントＡとフラグメントＢのＫＣＬによる連結>
フラグメントＡのフェニルチオエステル体（１ｍｇ，０．２０μｍｏｌ）とフラグメントＢのエチルチオエステル体（２ｍｇ，０．９１μｍｏｌ）とをエッペンチューブに移し、ｐＨ６．８５に調節した８Ｍ  グアニジン塩酸塩・４０ｍＭ  ＴＣＥＰ・０．２Ｍ  リン酸緩衝溶液（５００μｌ）を加え室温で反応させた。反応はＨＰＬＣで追跡し２時間後に目的化合物の生成を確認した。その後ＨＰＬＣにより精製することで目的化合物フラグメントＡ＋Ｂ（配列番号：１６）を得た。
ＨＰＬＣ分析：ＶｙｄａｃＣ−１８（５ｍｍ，４．６×７５ｍｍ）展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝７０：３０→２５：７５  ３０分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ
ＨＰＬＣ精製：ＶｙｄａｃＣ−１８（５ｍｍ，４．６×７５ｍｍ）グラジエントＡ：Ｂ＝６５：３５→２０：８０  ３０分  流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ：  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３６９Ｈ５４６Ｎ８０Ｏ１３２Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３＋２３５３．８，ｆｏｕｎｄ  ２３５３．８  
<フラグメントＡ＋ＢとフラグメントＣ＋ＤのＮＣＬ法による連結>
フラグメントＡ＋Ｂのチオエステル体（配列番号：１７；１ｍｇ，０．２１μｍｏｌ）とフラグメントＣ＋Ｄ（配列番号：１３；１ｍｇ，０．１２μｍｏｌ）とをエッペンチューブに移し、ｐＨ６．８５に調節した８Ｍ  グアニジン塩酸塩・４０ｍＭ  ＴＣＥＰ・５０ｍＭ  ＭＰＡＡ・０．２Ｍ  リン酸緩衝溶液（２００μｌ）を加え３７℃で反応させた。反応はＨＰＬＣで追跡し１２時間後に目的化合物フラグメントＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ（配列番号：１７）の生成を確認した。その後ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製することで目的化合物を得た。
ＨＰＬＣ精製：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ＴＭ  １０／３００ｍｍ  ＧＬ．上でのゲルろ過。カラム（１０×３００ｍｍ）は、以下のとおりに平衡化した。：１０％（ｖ／ｖ）  ギ酸、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ：  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ６８８Ｈ１０５５Ｎ１６３Ｏ２２３Ｓ８：［Ｍ＋７Ｈ］７＋２２０５．９，ｆｏｕｎｄ  ２２０６．３，［Ｍ＋８Ｈ］８＋１９３０．３，ｆｏｕｎｄ  １９３０．６，［Ｍ＋９Ｈ］９＋１７１５．９，ｆｏｕｎｄ  １７１６．３，［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋１５４４．４，ｆｏｕｎｄ  １５４４．７，［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋１４０４．１，ｆｏｕｎｄ  １４０４．６，［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋１２８７．２，ｆｏｕｎｄ  １２８７．４，［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋１１８８．２，ｆｏｕｎｄ  １１８８．６，［Ｍ＋１４Ｈ］１４＋１１０３．４，ｆｏｕｎｄ  １１０３．８，［Ｍ＋１５Ｈ］１５＋１０３０．０，ｆｏｕｎｄ  １０３０．２，［Ｍ＋１６Ｈ］１６＋９６５．６，ｆｏｕｎｄ  ９６６．０
<フラグメントＡ＋Ｂ＋Ｃ＋ＤのＣｙｓのＡｃｍ基脱保護>
フラグメントＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ（１ｍｇ，０．０７μｍｏｌ）に対して９０％  酢酸（１４０μｌ）、ＡｇＯＡｃ（１．４μｍｏｌ，０．３ｍｇ）を加え室温で反応させた。８時間後にＤＴＴ（２ｍｇ）を加え１時間反応させた後にゲル濾過クロマトグラフィーにより目的化合物である糖鎖付加ＡＩＬＩＭ細胞外ドメイン（以下、「合成ＡＩＬＩＭ」と呼ぶ；配列番号：９）の生成を確認した。その後Ｓｕｐｅｒｄｅｘにより精製することで目的化合物を得た。
ＨＰＬＣ精製：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ＴＭ１０／３００ｍｍ  ＧＬ．上でのゲルろ過。カラム（１０×３００ｍｍ）は、以下のとおりに平衡化した。：１０％（ｖ／ｖ）ギ酸、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ６７９Ｈ１０４０Ｎ１６０Ｏ２２０Ｓ８：［Ｍ＋７Ｈ］７＋２１７５．４，ｆｏｕｎｄ  ２１７５．４，［Ｍ＋８Ｈ］８＋１９０３．６，ｆｏｕｎｄ  １９０３．４，［Ｍ＋９Ｈ］９＋１６９２．２，ｆｏｕｎｄ  １６９２．０，［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋１５２３．１，ｆｏｕｎｄ  １５２３．１，［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋１３８４．７，ｆｏｕｎｄ  １３８４．７，［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋１２６９．４，ｆｏｕｎｄ  １２６９．２，［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋１１７１．８，ｆｏｕｎｄ  １１７１．７，［Ｍ＋１４Ｈ］  １４＋１０８８．２，ｆｏｕｎｄ  １０８８．０，［Ｍ＋１５Ｈ］１５＋１０１５．７，ｆｏｕｎｄ  １０１５．６，［Ｍ＋１６Ｈ］１６＋９５２．３，ｆｏｕｎｄ  ９５２．３  【０１１７】
<フォールディング工程>
凍結乾燥後のフラグメントＡ＋Ｂ＋Ｃ＋ＤをｐＨ＝８．５に調整したバッファー（６Ｍ  グアニジン塩酸塩、０．１Ｍ  ＴＲＩＺＭＡベース）２ｍｌに溶解し、透析チューブａ；スペクトラ／ポア  ７（ＦＵＮＡＫＯＳＨＩ、ＭＷＣＯ  ８０００  ７．５ｍｍ×１２ｍｍ×２ｃｍ）、ｂ；スペクトラ／ポア（ＦＵＮＡＫＯＳＨＩ、ＭＷＣＯ  ８０００  ３２ｍｍ×５０ｍｍ×６ｃｍ）に各１ｍｌずつ加え密閉した。透析チューブａ、ｂをそれぞれｐＨ＝８．５に調整したバッファー（３Ｍ  グアニジン塩酸塩、０．１Ｍ  ＴＲＩＺＭＡｂａｓｅ、２０μＭ  システイン、２．５μＭ  シスチン）５００ｍｌ中で一晩透析した。
一晩透析後、透析チューブａ、ｂをそれぞれｐＨ＝８．０に調整したバッファー（１Ｍグアニジン塩酸塩、０．１Ｍ  ＴＲＩＺＭＡベース）５００ｍｌに移して、再度透析を行った。８時間後、透析チューブａ、ｂをそれぞれｐＨ＝７．０に調整したバッファー（１０ｍＭ  ＰＢＳ）５００ｍｌに移して一晩透析を行った。一晩透析後、透析チューブ内液を回収し、Ａｍｉｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＷＣＯ  ５０００）で濃縮した。ａｍｉｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＷＣＯ  ５０００）で濃縮したサンプルの一部をａｍｉｃｏｎを用いて１％ギ酸水溶液に置換したものを評価サンプルとして使用した。【０１１８】
<合成ＡＩＬＩＭの評価>
（１）ＡＩＬＩＭ／ＩＣＯＳリガンド（Ｂ７ｈ）との結合反応性解析
活性化Ｔ細胞に発現誘導されるＡＩＬＩＭ分子は、ＡＩＬＩＭリガンド分子であるＢ７ｈ／Ｂ７Ｈ２／Ｂ７ＲＰ−１と結合することにより共刺激シグナルを細胞内に伝達する。合成ＡＩＬＩＭの生物学的機能評価を目的として、合成ＡＩＬＩＭのＢ７ｈ分子との結合反応性を解析した。
合成ＡＩＬＩＭの評価サンプル溶液の希釈系列をＥＬＩＳＡプレートに添加し、３７℃、２時間反応させることによりコートした。反応後、サンプル溶液を捨て、０．４％  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ  および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）（ブロッキング溶液）を１５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、１時間反応させることによりブロッキングした。ブロッキング後のプレートは０．１％  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）（洗浄バッファー）で３回洗浄した。ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＰＥＯ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてビオチン標識したＡＩＬＩＭリガンド、Ｂ７−Ｈ２／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を２００ｎｇ／５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し３７℃、１．５時間反応させた。未反応のリガンド分子は洗浄バッファーで３回洗浄することにより除去した。
次いで０．１％Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ含有Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いて１０００倍希釈されたストレプトアビジン標識Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し３７℃、１時間反応させた。反応後のプレートは洗浄バッファーで３回洗浄することにより未反応のストレプトアビジン標識Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  を除去した。ＡＢＴＳ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ）とＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ（Ｈ２Ｏ２）（ＫＰＬ）の等量混合液を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、遮光下、室温で３０分反応させた。１％ＳＤＳを１００μＬ／ｗｅｌｌ添加することにより反応を停止し、プレートリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｉｃｅｓ社）で４０５ｎｍのＯＤ値を測定した。
陽性対照物質としてＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＩＣＯＳ／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ；以下「ＩＣＯＳ／Ｆｃ」という。）を、陰性対照物質としてＣＴＬＡ−４／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）をＥＬＩＳＡプレートにコートし同様の操作を行った。なお、ＩＣＯＳ／Ｆｃは、ヒトＡＩＬＩＭの細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１とをポリペプチドリンカーを介して融合発現させたものであり、以下の構造を有する。ヒトＡＩＬＩＭ部分の糖鎖は、天然型と同一の３箇所に付加されている。
【化１１】
2011007747.tif 000016
図３Ａに結果を示す。陽性対照であるＩＣＯＳ／Ｆｃはコート量に依存したリガンドとの結合反応性を示した。合成ＡＩＬＩＭはｌｏｔ．ａ、ｌｏｔ．ｂともに陽性対照よりも低いコート量からリガンド結合活性を示した。
陽性対照と合成ＡＩＬＩＭの活性を比較するため、ＩＣＯＳ／Ｆｃの結果から濃度依存性曲線を作成し（図３Ｂ）、以下の近似式を得た。
ｙ＝０．０１２３ｅ１２．８４２ｘ
この式から、合成ＡＩＬＩＭ（ｌｏｔ．ａ）と同じ吸光度を得るために必要なＩＣＯＳ／Ｆｃの濃度を算出した。結果を表５に示す。
【表５】
2011007747.tif 000017
Ｂ／Ａの値からわかるとおり、合成ＡＩＬＩＭと同等のリガンド結合活性を得るためには、ＩＣＯＳ／Ｆｃは合成ＡＩＬＩＭの約１０倍の濃度が必要であった。
合成ＡＩＬＩＭが天然型に比較してこれほど高い結合能を示すことは予想外であったが、合成ＡＩＬＩＭは、ＩＣＯＳ／Ｆｃに比較して単純な構造であるため、結合領域が立体的な障害を受けることなくリガンドと結合できることに起因するものと考えられる。
（２）抗ＩＣＯＳモノクローナル抗体反応性解析
次に合成ＡＩＬＩＭの高次構造解析を目的として、合成ＡＩＬＩＭ分子中の抗ＩＣＯＳ抗体エピトープ形成の有無を抗体反応性解析により検討した。
合成ＡＩＬＩＭサンプル溶液の希釈系列をＥＬＩＳＡプレートに添加し、３７℃、２時間反応させることによりコートした。反応後、サンプル溶液を捨て、０．４％  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）（ブロッキング溶液）を１５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し３７℃、１時間反応させることによりブロッキングした。ブロッキング後のプレートは０．１％  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ  および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）（洗浄バッファー）で３回洗浄した。０．１％  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ含有Ｄ−ＰＢＳ（−）で１０μｇ／ｍＬに調製した抗ＡＩＬＩＭ抗体、Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−ＩＣＯＳ  （ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し３７℃、１．５時間反応させた。未反応の抗体は洗浄バッファーで３回洗浄することにより除去した。次いで０．１％Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ含有Ｄ−ＰＢＳ（−）を用いて１０００倍希釈された検出用抗体、Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗マウスＩｇ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＶＥＣＴＯＲ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し３７℃、１時間反応させた。反応後のプレートは洗浄バッファーで３回洗浄することにより未反応のＨｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗マウスＩｇ（Ｈ＋Ｌ）抗体を除去した。ＡＢＴＳ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ）とＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ（Ｈ２Ｏ２）（ＫＰＬ）の等量混合液を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、遮光下、室温で３０分反応させた。１％ＳＤＳを１００μＬ／ｗｅｌｌ添加することにより反応を停止し、プレートリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｉｃｅｓ社）で４０５ｎｍのＯＤ値を測定した。陽性対照物質としてＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＩＣＯＳ／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ）を、陰性対照物質としてＣＴＬＡ−４／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ）をＥＬＩＳＡプレートにコートし同様の操作を行った。
結果を図４に示す。陽性対照であるＲｅｃｏｍｂｉａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＩＣＯＳ／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａがコート量に依存した抗体反応性を示し、分子内に抗体エピトープが形成されていたのに対し、合成ＡＩＬＩＭは全く抗体反応性を示さず、抗体エピトープは形成されていないと考えられた。
【配列表フリーテキスト】
【０１１９】
配列番号：１は、ヒトＡＩＬＩＭタンパク質である。
配列番号：２は、ラットＡＩＬＩＭ１タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：３は、ラットＡＩＬＩＭ２タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：４は、マウスＡＩＬＩＭタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：５は、ヒトＣＤ２８タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：６は、ヒトＣＴＬＡ４タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号：７は、ヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号：８は、ヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列（１２０アミノ酸からなる場合）である。
配列番号：９は、配列番号：７の６９位に相当する位置に糖鎖が付加された、１２０アミノ酸からなるヒトＡＩＬＩＭ細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号：１０は、２８位及び２９位のＣｙｓの側鎖が保護されたフラグメントＤのアミノ酸配列である。
配列番号：１１は、Ｎ末端がチアゾリジンで保護され、Ｃ末端がチオエステル化された、糖鎖付加フラグメントＣのアミノ酸配列である。
配列番号：１２は、Ｎ末端がチアゾリジンで保護され、５４位及び５５位のＣｙｓの側鎖が保護された、糖鎖付加フラグメントＣ＋Ｄのアミノ酸配列である。
配列番号：１３は、Ｎ末端がＣｙｓに変換され、５４位及び５５位のＣｙｓの側鎖が保護された、糖鎖付加フラグメントＣ＋Ｄのアミノ酸配列である。
配列番号：１４は、Ｃ末端がチオエステル化された、フラグメントＢのアミノ酸配列である。
配列番号：１５は、２２位のＣｙｓの側鎖が保護され、Ｃ末端がチオエステル化された、フラグメントＡのアミノ酸配列である。
配列番号：１６は、２２位のＣｙｓの側鎖が保護され、Ｃ末端がチオエステル化された、フラグメントＡ＋Ｂのアミノ酸配列である。
配列番号：１７は、２２位、１１６位、１１７位のＣｙｓの側鎖が保護された、糖鎖付加フラグメントＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄのアミノ酸配列である。
【図１】
2011007747.tif 000024
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
2011007747.tif 000029
【図６】
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【図７】
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【図８】
2011007747.tif 000032
【配列表】
2011007747000001.app
【国際調査報告】
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