(57)【要約】  本発明の目的は、抗がん作用を有する新規核酸を提供することである。  配列番号１〜６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、がん細胞に対する増殖阻害作用があり、しかも正常細胞に対しては影響を与えないため、抗がん剤として有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列番号１〜６のいずれかに示す塩基配列からなる、オリゴヌクレオチド。
5'-GGTTAGGG-3’（配列番号１）
5'-GGTTAGGGT-3’（配列番号２）
5'-GGTTAGGGTT-3’（配列番号３）
5'-GGTTAGGGTTA-3’（配列番号４）
5'-GGTTAGGGTTAG-3’（配列番号５）
5'-GTTAGGGT-3’（配列番号６）
【請求項２】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを含む、抗がん剤。
【請求項３】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物。
【請求項４】
更に核酸送達用キャリアーを含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
がんの治療又はがん転移の予防に使用される、請求項３又は４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
がんが、膵癌、肺癌、骨肉腫、又は白血病である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの、抗がん剤の製造のための使用。
【請求項８】
前記抗がん剤が、がんの治療又はがん転移の予防に使用される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
がんが、膵癌、肺癌、骨肉腫、又は白血病である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの有効量を、がん患者、又はがん転移の予防が求められている者に投与する工程を含む、がんの治療又は転移予防方法。
【請求項１１】
がんが、膵癌、肺癌、骨肉腫、又は白血病である、請求項１０に記載のがんの治療又は転移予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗がん作用を有するオリゴヌクレオチドに関する。また、本発明は、当該オリゴヌクレオチドを利用した医薬及び抗がん剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、がんの治療薬や治療法の進歩によってがん患者の生存率が上昇しているが、依然として、日本では死因の１位であり、現在でも、年間３０万人以上の国民ががんで亡くなっている。【０００３】
従来、イマチニブ等の分子標的薬を使用した抗がん剤が開発され、がん治療において高い効果が認められている。しかしながら、このような分子標的薬では、一部の症例において、正常細胞への侵襲によって副作用が生じ、投与を継続できなくなったり、がん細胞が薬剤耐性を獲得することにより、効果が著しく減少したりすることがある。【０００４】
一方、核酸医薬は、配列特異性が高く、分子標的薬では標的にできなかったＤＮＡやＲＮＡをターゲッティングできるという利点であるため、高い有効性と安全性が期待され、様々な疾患分野で応用が検討されている。がん疾患の分野でも、がん細胞に存在する特有のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の生体内分子の機能を阻害できる核酸医薬は、次世代の抗がん剤として注目されている。【０００５】
従来、抗がん作用を有する核酸について精力的に検討されているが（例えば、特許文献１〜３等参照）、抗がん剤として臨床的実用化が有力視されている候補品は依然として少ないのが現状である。このような背景の下、抗がん作用を有する新規核酸の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１１２１４４号
【特許文献２】特開２０１４−２１７３１１号公報
【特許文献３】特開２０１０−３１０５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、抗がん作用を有する新規核酸、及び当該核酸を使用した医薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、配列番号１〜６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、がん細胞に対する増殖阻害作用があり、しかも正常細胞に対しては影響を与えないことを見出した。即ち、前記オリゴヌクレオチドは、優れたがん治療効果と安全性を備えており、抗がん剤として有効であることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。【０００９】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  以下の配列番号１〜６のいずれかに示す塩基配列からなる、オリゴヌクレオチド。
5'-GGTTAGGG-3’（配列番号１）
5'-GGTTAGGGT-3’（配列番号２）
5'-GGTTAGGGTT-3’（配列番号３）
5'-GGTTAGGGTTA-3’（配列番号４）
5'-GGTTAGGGTTAG-3’（配列番号５）
5'-GTTAGGGT-3’（配列番号６）
項２．  項１に記載のオリゴヌクレオチドを含む、抗がん剤。
項３．  項１に記載のオリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物。
項４．  更に核酸送達用キャリアーを含む、項３に記載の医薬組成物。
項５．  がんの治療又はがん転移の予防に使用される、項３又は４に記載の医薬組成物。
項６．  がんが、膵癌、肺癌、骨肉腫、又は白血病である、項３〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
項７．  項１に記載のオリゴヌクレオチドの、抗がん剤の製造のための使用。
項８．  前記抗がん剤が、がんの治療又はがん転移の予防に使用される、項７に記載の使用。
項９．  がんが、膵癌、肺癌、骨肉腫、又は白血病である、項８に記載の使用。
項１０．  項１に記載のオリゴヌクレオチドの有効量を、がん患者、又はがん転移の予防が求められている者に投与する工程を含む、がんの治療又は転移予防方法。
項１１．  がんが、膵癌、肺癌、骨肉腫、又は白血病である、項１０に記載のがんの治療又は転移予防方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、正常細胞の増殖を阻害することなく、がん細胞の増殖を効果的に阻害できるので、優れたがん治療効果と安全性を有する核酸医薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】試験例１において、各オリゴヌクレオチドについて、ヒト膵臓癌細胞に対する増殖阻害作用を評価した結果を示す図である。
【図２】試験例２において、各オリゴヌクレオチドについて、ヒト骨肉腫細胞に対する増殖阻害作用を評価した結果を示す図である。
【図３】試験例３において、各オリゴヌクレオチドについて、ヒト非小細胞肺癌細胞に対する増殖阻害作用を評価した結果を示す図である。
【図４】試験例４において、各オリゴヌクレオチドについて、ヒト慢性骨髄性白血病細胞に対する増殖阻害作用を評価した結果を示す図である。
【図５】試験例５において、各オリゴヌクレオチドについて、ヒト皮膚線維芽細胞に対する増殖阻害作用を評価した結果を示す図である。
【図６】試験例６において、各オリゴヌクレオチドについて、ヒト膵臓癌細胞に対する増殖阻害作用を評価した結果を示す図である。
【図７】試験例７において、各オリゴヌクレオチドについて、ヒト膵臓癌細胞に対する増殖阻害作用を評価した結果を示す図である。
【図８】試験例８において、各オリゴヌクレオチドについて、ヒト皮膚線維芽細胞に対する増殖阻害作用を評価した結果を示す図である。
【図９】試験例９において、各オリゴヌクレオチドについて、ヒト膵臓癌細胞内のタンパク質発現差を解析した結果を示す図である。
【図１０】試験例１０において、各オリゴヌクレオチドについて、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるヒト膵臓癌細胞に対する抗腫瘍効果を評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．オリゴヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の配列番号１〜６のいずれかに示す塩基配列からなることを特徴とする。
5'-GGTTAGGG-3’（配列番号１）
5'-GGTTAGGGT-3’（配列番号２）
5'-GGTTAGGGTT-3’（配列番号３）
5'-GGTTAGGGTTA-3’（配列番号４）
5'-GGTTAGGGTTAG-3’（配列番号５）
5'-GTTAGGGT-3’（配列番号６）
【００１３】
配列番号２〜５に示す塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列において、３’末端側にＴ、ＴＴ、ＴＴＡ、及びＴＴＡＧが付加されてなるものである。また、配列番号６に示す塩基配列は、配列番号２に示す塩基配列における５’末端のグアニン（Ｇ）が欠失されてなるものである。
【００１４】
配列番号１に示す塩基配列において、ヌクレオチドの付加、置換、及び／又は欠失によって、配列番号２〜６のいずれかに示す塩基配列に該当しないものに改変された場合には、がん細胞に対する増殖阻害作用が低減したり、正常細胞に対する増殖阻害作用細胞毒が現れたりする傾向が認められる。即ち、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜６に示す特定の塩基配列を有することに基づいて、正常細胞の増殖を阻害することがなく、がん細胞の増殖を特異的に阻害することが可能になっている。
【００１５】
配列番号１〜６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの中でも、より一層優れた抗がん作用及び安全性を備えさせるという観点から、好ましくは配列番号２、３、４及び６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００１６】
本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、各塩基を結合している５炭糖は、Ｄ−リボース又はデオキシ−Ｄ−リボースのいずれであってもよく、これらが混在していてもよい。即ち、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、又はＤＮＡ／ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドのいずれであってもよい。好ましくはＤＮＡオリゴヌクレオチドが挙げられる。なお、本発明のオリゴヌクレオチドがＲＮＡオリゴヌクレオチドであれば、配列番号１〜６に示す塩基配列におけるＴ（チミン）はＵ（ウラシル）になる。また、本発明のオリゴヌクレオチドがＤＮＡ／ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドであれば、配列番号１〜６に示す塩基配列におけるＲＮＡ部分にＴ（チミン）がある場合、当該Ｔ（チミン）はＵ（ウラシル）になる。
【００１７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明の効果を妨げない限り、ヌクレアーゼ等に対する耐性を付与するために、必要に応じて、一般的に核酸に施される各種修飾がなされていてもよい。このような修飾としては、例えば、２’−Ｏメチル化等の糖鎖部分の修飾；塩基部分の修飾；アミノ化、低級アルキルアミノ化、アセチル化、ホスホロチオエート等のリン酸部分の修飾等が挙げられる。これのような核酸の修飾は、公知の手法に従って行うことができる。
【００１８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、公知の製造方法で得ることができる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、化学合成によって得ることができ、また、本発明のオリゴヌクレオチドの相補鎖を鋳型として用いて増幅させることにより得ることもできる。
【００１９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、正常細胞に対して増殖を阻害することなく、がん細胞の増殖を効果的に阻害できるので、抗がん剤として好適に使用できる。本発明のオリゴヌクレオチドを抗がん剤として使用する場合、製剤処方、適当対象となるがん種、投与方法、用量等については、後述する「２．医薬組成物」の欄に示す通りである。
【００２０】
２．医薬組成物
前記オリゴヌクレオチドを抗がん剤として使用する場合、前記オリゴヌクレオチドを医薬組成物として製剤化すればよい。即ち、本発明の医薬組成物は、前記オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする。
【００２１】
本発明の医薬組成物は、前記オリゴヌクレオチドをがん細胞内に効率的に送達させるために、更に核酸送達用キャリアーが含まれていることが望ましい。
【００２２】
核酸送達用キャリアーとしては、核酸デリバリーに使用可能であって薬学的に許容されるものであれば、特に制限されないが、例えば、リポフェクタミン、オリゴフェクタミン、リポフェクチン、アテロコラーゲン、リポソーム、ポリエチレンイミン、ポリアミン、ポリブレン、エクソソーム、ナノ粒子(ポリアミノ酸、金属、アパタイト等)、ペプチド、α−デキストリン、β−デキストリン、γ−デキストリン、ポリエチレングリコール、コレステロール、ビタミンＡ、ビタミンＥ、葉酸、キトサン、水溶性キトサン等が挙げられる。これらの核酸送達用キャリアーは、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２３】
これらの核酸送達用キャリアーの使用態様は、使用する核酸送達用キャリアーの種類に応じて適宜設定すればよく、例えば、核酸送達用キャリアーを前記オリゴヌクレオチドに水素結合や疎水結合等の非共有結合によって複合化して使用してもよく、また、核酸送達用キャリアーを前記オリゴヌクレオチドに共有結合によって連結して使用してもよい。なお、核酸送達用キャリアーを前記オリゴヌクレオチドに共有結合によって連結する場合、公知の二官能性リンカーを使用すればよい。
【００２４】
本発明の医薬組成物において、核酸送達用キャリアーの配合量は、使用する核酸送達用キャリアーの種類、剤型、投与方法等に応じて、前記オリゴヌクレオチドをがん細胞内に送達できる有効量に設定すればよい。
【００２５】
本発明の医薬組成物の剤型については、特に制限されず、投与方法等に応じて適宜設定すればよい。本発明の医薬組成物の剤型として、具体的には、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、坐剤、貼付剤等の固形製剤；液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、注射剤等の液状製剤等が挙げられる。これらの剤型の中でも、好ましくは液状製剤が挙げられる。
【００２６】
また、本発明の医薬組成物は、その剤型に応じて、薬学的に許容される担体や添加剤を加えて製剤化される。例えば、固形製剤の場合であれば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解補助剤、酸化防止剤、等張化剤等を用いて製剤化することができる。また、液状製剤の場合であれば、生理食塩水、緩衝液等を用いて製剤化することができる。
【００２７】
前記オリゴヌクレオチドは、がん細胞の増殖を阻害することにより、抗がん作用を発揮できるので、本発明の医薬組成物は、がんの治療、又はがん転移の予防用途に使用される。
【００２８】
治療対象又は転移予防の対処となるがん種については、化学療法の対象となるがんであることを限度として特に制限されないが、具体的には、膵癌、肺癌、骨肉腫、大腸癌、結腸癌、胃癌、直腸癌、肝癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頚癌、頭頚部癌、胆管癌、胆嚢癌、口腔癌、メラノーマ、脳腫瘍等の固形癌；白血病、悪性リンパ腫等の血液がんが挙げられる。これらのがん種の中でも、好ましくは膵癌、肺癌、骨肉腫、白血病が挙げられる。
【００２９】
本発明の医薬組成物の投与方法については、特に制限されず、全身投与又は局所投与のいずれであってもよく、適用対象となるがん種に応じて適宜設定すればよい。全身投与としては、具体的には、血管内（動脈内又は静脈内）投与、皮下投与、筋肉投与、腹膜内投与、吸入投与等が挙げられる。血管内投与には、血管内注射のみならず、持続点滴も含まれる。
【００３０】
本発明の医薬組成物の用量については、適用対象となるがん種、症状の程度、患者の性別、年齢等に応じて、抗がん作用を発揮できる有効な範囲に適宜設定すればよいが、例えば、１回当たりの前記オリゴヌクレオチドの投与量が１ｎｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ（体重）程度となるように設定して、１〜２１回／週程度の頻度で投与すればよい。
【００３１】
また、本発明の医薬組成物は、抗がん作用をより効果的に発揮させるために、必要に応じて、他の抗がん剤を含んでいてもよく、また他の抗がん剤と併用投与してもよい。
【００３２】
本発明の医薬組成物に含有又は併用される他の抗がん剤の種類については、特に制限されず、適用対象となるがん種等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、代謝拮抗剤、アルキル化薬、微小管作用薬、抗癌性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、白金製剤等が挙げられる。具体的には、５−フルオロウラシル、メソトレキセート、ドキシフルリジン、テガフール、６−メルカプトプリン、シタラビン、ゲムシタビン等の代謝拮抗剤；クロホスファミド、イホスファミド、チオテパ、カルボコン、塩酸ニムスチン等のアルキル化薬；ドセタキセル、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン等の微小管作用薬；塩酸ドキソルビシン、マイトマイシン、塩酸アムルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸エピルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン等の抗癌性抗生物質；イリノテカン、塩酸ノギテカン等のトポイソメラーゼ阻害剤；シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン等の白金製剤等が挙げられる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例を挙げて本発明を説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されて解釈されるものではない。【００３４】
製造例：オリゴヌクレオチドの合成
ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機ＮＴＳ  Ｍ−ＭＸ−Ａ２０（日本テクノサービス社製）を用いて、表１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ分子）を合成した。【００３５】
【表１】
2018221735.tif 000002
【００３６】
試験例１：ヒト膵臓癌細胞に対する増殖阻害作用の評価
ヒト膵臓癌細胞株（ＭＩＡ  ＰａＣａ−２）（医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンクより購入）を１００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、及び１０％牛胎児血清を含むＥａｇｌｅ‘ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（Ｅ−ＭＥＭ）培地に３．０×１０4個／ｍｌとなるように懸濁させた細胞液を準備した。９６ウェルプレートに細胞液を１００μｌ／ウェルとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で一晩培養した。その後、前記細胞に前記実施例１、６、比較例１及び２のオリゴヌクレオチドをトランスフェクション試薬Ｘ−ｔｒｅｍｅ  ＧＥＮＥ  ＨＰ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  （ロシュ社製）を用いて添付プロトコールに従って導入した。具体的には、前記オリゴヌクレオチドとトランスフェクション試薬との混合液１０μｌを各ウェルに添加して全量１１０μｌとした。ウェル中での前記オリゴヌクレオチドの最終濃度は５．５ｎｇ／μｌであった。トランスフェクション後、３７℃で４８時間培養した。その後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８  （Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）１０μｌを添加して３７℃で１時間培養した後に、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社製）を用いて、４５０ｎｍと６５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。また、コントロールとして、前記オリゴヌクレオチドを添加しないこと以外は、前記と同条件で試験を行った（未処理）。トランスフェクション試薬のみで処理した細胞（未処理の細胞）の生存率を１００％として、各オリゴヌクレオチドで処理した際の細胞生存率を下記式に基づいて算出した。【００３７】
【数１】
2018221735.tif 000003
【００３８】
得られた結果を図１に示す。比較例１のオリゴヌクレオチドではヒト膵臓癌細胞に対する増殖阻害作用は認められず、また、比較例２のオリゴヌクレオチドではヒト膵臓癌細胞に対する増殖阻害作用が認められた。これに対して、実施例１及び６のオリゴヌクレオチドでは、ヒト膵臓癌細胞に対する増殖阻害作用が比較例２よりも格段に高く、優れた抗がん作用を有していることが確認された。【００３９】
試験例２：ヒト骨肉腫細胞に対する増殖阻害作用の評価
（１）ヒト骨肉腫細胞株（Ｓａｏｓ−２）（理化学研究所バイオリソースセンターより購入）を使用したこと、（２）５．０×１０4個／ｍｌとなるように懸濁させた細胞液を９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルとなるように添加したこと、（３）培地に１００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０を用いたこと、並びに（４）実施例１、６及び比較例１の各オリゴヌクレオチドを使用して、トランスフェクション時のウェル中のオリゴヌクレオチド最終濃度を９．１ｎｇ／μｌにしたこと以外は、前記試験例１と同条件で試験を行い、各オリゴヌクレオチドで処理した際の細胞生存率を求めた。【００４０】
得られた結果を図２に示す。この結果、実施例１及び６のオリゴヌクレオチドは、ヒト骨肉腫細胞に対して、優れた増殖阻害作用を有することが確認された。【００４１】
試験例３：ヒト非小細胞肺癌細胞に対する増殖阻害作用の評価
（１）ヒト非小細胞肺癌細胞株（Ａ５４９）（医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンクより購入）を使用したこと、（２）５．０×１０4個／ｍｌとなるように懸濁させた細胞液を９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルとなるように添加したこと、及び（３）実施例１及び比較例１の各オリゴヌクレオチドを使用して、トランスフェクション時のウェル中のオリゴヌクレオチド最終濃度を９．１ｎｇ／μｌにしたこと以外は、前記試験例１と同条件で試験を行い、各オリゴヌクレオチドで処理した際の細胞生存率を求めた。【００４２】
得られた結果を図３に示す。この結果、比較例１のオリゴヌクレオチドでは、ヒト非小細胞肺癌細胞に対する増殖阻害作用は認められなかったが、実施例１のオリゴヌクレオチドでは、ヒト非小細胞肺癌細胞に対する増殖阻害作用が認められることが明らかとなった。【００４３】
試験例４：ヒト慢性骨髄性白血病細胞に対する増殖阻害作用の評価
（１）ヒト慢性骨髄性白血病細胞株（Ｋ５６２）（理化学研究所バイオリソースセンターより購入）を使用したこと、（２）５．０×１０4個／ｍｌとなるように懸濁させた細胞液を９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルとなるように添加したこと、（３）培地に１００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０を用いたこと、並びに（４）実施例１及び比較例１の各オリゴヌクレオチドを使用して、トランスフェクション時のウェル中のオリゴヌクレオチド最終濃度を９．１ｎｇ／μｌにしたこと以外は、前記試験例１と同条件で試験を行い、各オリゴヌクレオチドで処理した際の細胞生存率を求めた。【００４４】
得られた結果を図４に示す。この結果、ヒト慢性骨髄性白血病細胞の場合でも、実施例１のオリゴヌクレオチドでは、増殖阻害作用が認められることが確認された。【００４５】
試験例５：ヒト皮膚線維芽細胞（正常細胞）に対する増殖阻害作用の評価
（１）ヒト皮膚線維芽細胞株（ＮＨＤＦ）（タカラバイオ株式会社より購入）を使用したこと、（２）２．５×１０4個／ｍｌとなるように懸濁させた細胞液を９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルとなるように添加したこと、（３）培地に１００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０を用いたこと、並びに（４）実施例１及び比較例１の各オリゴヌクレオチドを使用して、トランスフェクション時のウェル中のオリゴヌクレオチド最終濃度を４．５ｎｇ／μｌにしたこと以外は、前記試験例１と同条件で試験を行い、各オリゴヌクレオチドで処理した際の細胞生存率を求めた。【００４６】
得られた結果を図５に示す。この結果、前記試験例１〜４においてがん細胞に対する増殖阻害作用が認められなかった比較例１のオリゴヌクレオチドでは、ヒト皮膚線維芽細胞（正常細胞）に対する増殖阻害作用も認められなかった。これに対して、実施例１のオリゴヌクレオチドにおいても、ヒト皮膚線維芽細胞に対する増殖阻害作用は認められず、正常細胞に対して悪影響を及ぼさないことが確認された。以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドは、正常細胞の増殖を阻害することがなく、がん細胞の増殖を
特異的に阻害することが可能であることが明らかとなった。【００４７】
試験例６：ヒト膵臓癌細胞に対する増殖阻害作用の評価
実施例３及び４の各オリゴヌクレオチドを使用したこと以外は、前記試験例１と同条件で試験を行い、各オリゴヌクレオチドで処理した際の細胞生存率を求めた。【００４８】
得られた結果を図６に示す。図６の結果を踏まえると、実施例１と実施例６と同様に実施例３及び４の各オリゴヌクレオチドもヒト膵臓癌細胞に対する増殖阻害作用が認められた。実施例は優れた抗がん作用を有していることが認められた。【００４９】
試験例７：ヒト膵臓癌細胞に対する増殖阻害作用の評価
実施例１及び比較例３〜６の各オリゴヌクレオチドを使用したこと以外は、前記試験例１と同条件で試験を行い、各オリゴヌクレオチドで処理した際の細胞生存率を求めた。【００５０】
得られた結果を図７に示す。図７の結果から、実施例１の相補鎖である比較例３のオリゴヌクレオチド及び実施例１を数塩基置換した比較例４〜６のオリゴヌクレオチドでは、ヒト膵臓癌細胞に対する増殖阻害能が減少していることが明らかとなった。
以上の試験例１〜７の結果から、配列番号１に示す塩基配列において、ヌクレオチドの付加、置換、及び／又は欠失によって、配列番号２〜６のいずれかに示す塩基配列に該当しないものに改変された場合には、がん細胞に対する増殖阻害作用が低減することが確認された。【００５１】
試験例８：ヒト皮膚線維芽細胞（正常細胞）に対する増殖阻害作用の評価
実施例３、４、及び６の各オリゴヌクレオチドを使用したこと以外は、前記試験例５と同条件で試験を行い、各オリゴヌクレオチドで処理した際の細胞生存率を求めた。【００５２】
得られた結果を図８に示す。図８の結果から、実施例１と同様に実施例３、４、及び６の各オリゴヌクレオチドでは、ヒト皮膚線維芽細胞（正常細胞）に対する増殖阻害作用も認められず、正常細胞に対して悪影響を及ぼさないことが確認された。【００５３】
試験例９：ヒト膵臓癌細胞内のタンパク質発現差解析
ヒト膵臓癌細胞株（ＭＩＡ  ＰａＣａ−２）（医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンクより購入）を１００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、及び１０％牛胎児血清を含むＥａｇｌｅ‘ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（Ｅ−ＭＥＭ）培地に５．７×１０5個／ｍｌとなるように懸濁させた細胞液を準備した。４８ウェルプレートに細胞液を２７０μｌ／ウェルとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で一晩培養した。その後、前記細胞に対して、実施例１及び比較例３のオリゴヌクレオチドをトランスフェクション試薬Ｘ−ｔｒｅｍｅ  ＧＥＮＥ  ＨＰ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  （ロシュ社製）を用いて添付プロトコールに従って導入した。具体的には、前記オリゴヌクレオチドとトランスフェクション試薬との混合液３０μｌを各ウェルに添加して全量３００μｌとし、ウェル中での前記オリゴヌクレオチドの最終濃度は３．３ｎｇ／μｌであった。トランスフェクション後、３７℃で２４時間培養した。また参照として、トランスフェクション試薬のみを使用して、前記と同様の操作を行った。その後、ＰＢＳ ３００μｌで２回洗浄し、１０μｇ／ｍｌ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１０μｇ／ｍｌ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、及び１０μｇ／ｍｌ Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａを含むＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ ３００μｌで細胞を溶解させた。５分間１４０００×ｇで遠心分離を行って上清を取り、細胞抽出液とした。この細胞抽出液を使用して、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ａｒｒａｙ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社製）を用いて添付プロトコールに従ってメンブレンを準備し、ＧＥ  ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉ（ＧＥライフサイエンス社製）を用いて測定し、細胞内タンパク質の発現差解析を行った。【００５４】
得られた結果を図９に示す。この結果から、トランスフェクション試薬のみと比較例３の結果を比べると、Ｃａｔａｌａｓｅ以外はほとんど差がなかったが、実施例１に関しては、Ｃａｔａｌａｓｅ以外にＨｅｍｅ  Ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２（ＨＯ−２）の発現が亢進していた。この結果を踏まえると、比較例３のオリゴヌクレオチドを細胞に導入すると細胞内でストレスがかかり、活性酸素は産生されるが、Ｃａｔａｌａｓｅによって活性酸素が分解されて無毒化されたことで、細胞死が誘導されなかったものと考えられる。その一方で、実施例１のオリゴヌクレオチドを細胞に導入することで比較例３と同様にＣａｔａｌａｓｅによって活性酸素が分解されているが、ＨＯ−２でヘムの分解が起こり、これによって二価の鉄が遊離して活性酸素が産生された可能性が考えられる。従って、実施例１のオリゴヌクレオチドは、癌細胞内の活性酸素の増加を引き起こし、Ｃａｔａｌａｓｅの発現量と活性酸素量のバランスを保持できなくすることにより細胞死を誘導し、その結果、癌細胞の増殖を阻害することが示唆された。【００５５】
試験例１０：動物実験によるヒト膵臓癌細胞に対する抗腫瘍効果の評価
２．１×１０6個のヒト膵臓癌細胞株（ＭＩＡ  ＰａＣａ−２）をマウスの右足の皮下に投与し、腫瘍サイズが２００ｍｍ3に到達した後に、実施例１及び比較例１のオリゴヌクレオチドをトランスフェクション試薬ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｊｅｔＰＥＩ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社製）を用いて添付プロトコールに従って薬剤を調製し、腫瘍に直接投与した。具体的には、マウス１匹につき前記オリゴヌクレオチドとトランスフェクション試薬との混合液１００μｌを投与した。前記オリゴヌクレオチドの１回当たりの投与量は実施例1では０．５ｍｇ／ｋｇと２．０ｍｇ／ｋｇ、比較例１では２．０ｍｇ／ｋｇに設定した。また、薬剤投与は、１日おきに計３回の投薬、その後２日間の休薬を１サイクル（１週間）として、合計７サイクル（７週間）行った。試験期間中、１週間毎に経時的に腫瘍容積を測定した。腫瘍容積は、腫瘍の長径と短径をノギスにて測り、近似式 Ｖ＝（Ｗ2×Ｌ）×０．４（Ｖ：体積、Ｗ：短径、Ｌ：長径）で腫瘍容積（ｍｍ3）から算出することにより求めた。また、比較として、前記薬剤の代わりに、同量のＰＢＳのみを添加した群（ＰＢＳ群）、同量のトランスフェクション試薬のみを投与した群（Ｖｅｈｉｃｌｅ群）、及び既存の抗がん剤であるゲムシタビン塩酸塩を投与（1回当たり８０ｍｇ／ｋｇの投与量で週２回の投与(３〜４日に１回の投与)を１サイクル（１週間）として、前記と同じサイクル数）した群（陽性コントロール群）についても、同様に試験を行った。なお、試験は、各群４匹のマウスを使用し、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法を用いて多重比較検定を行った。【００５６】
得られた結果を図１０に示す。ＰＢＳ群、Ｖｅｈｉｃｌｅ群、及び比較例１は、試験日数の経過と共に腫瘍が増殖し続けていることが確認された。これに対して、実施例１では、腫瘍の増殖が抑えられており、特に投与量が少ない場合（０．５ｍｇ／ｋｇ）でも腫瘍の増殖が抑えられていることが確認された。更に、実施例１では、投与量が多い場合（２．０ｍｇ／ｋｇ）においてＶｅｈｉｃｌｅ群と有意差があるだけではなく、既存の抗がん剤であるゲムシタビン塩酸塩（陽性コントロール群）と同等の抗腫瘍効果があった。従って、実施例１は、優れた抗腫瘍作用を有していることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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