(57)【要約】  血中の分泌型ＩｇＭ存在下であっても、Ｂ細胞表面の膜結合型ＩｇＭとの結合活性が高く、Ｂ細胞に対し増殖阻害効果を発揮する抗体の提供。  ＩｇＭ及びＢ細胞表面抗原に結合する二重特異性抗体。
2018174274.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＭ及びＢ細胞表面抗原に結合する二重特異性抗体。
【請求項２】
前記ＩｇＭに結合する第一の抗原結合部位と、前記Ｂ細胞表面抗原に結合する第二の抗原結合部位とを含むものである、請求項１記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
前記Ｂ細胞表面抗原がＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ８１、ＢＡＦＦ受容体、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩからなる群より選択されるものである、請求項１又は２記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項１〜３のいずれか１項記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
抗体の可変領域が下記（ａ）〜（ｆ）の重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３並びに下記（ｇ）〜（ｌ）の重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３を含むものである、請求項１〜４のいずれか１項記載の二重特異性抗体。
（ａ）配列番号１、４８、６０、６６、７２及び７８からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号１、４８、６０、６６、７２及び７８からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１、４８、６０、６６、７２及び７８からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１
（ｂ）配列番号２、４９、６１、６７、７３及び７９からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号２、４９、６１、６７、７３及び７９からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号２、４９、６１、６７、７３及び７９からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２
（ｃ）配列番号３、５０、６２、６８、７４及び８０からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号３、５０、６２、６８、７４及び８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号３、５０、６２、６８、７４及び８０からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
（ｄ）配列番号４、５１、６３、６９、７５及び８１からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号４、５１、６３、６９、７５及び８１からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号４、５１、６３、６９、７５及び８１からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１
（ｅ）配列番号５、５２、６４、７０、７６及び８２からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号５、５２、６４、７０、７６及び８２からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号５、５２、６４、７０、７６及び８２からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２
（ｆ）配列番号６、５３、６５、７１、７７及び８３からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号６、５３、６５、７１、７７及び８３からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号６、５３、６５、７１、７７及び８３からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
（ｇ）配列番号７、１３、１９、２５、３０、３６、４２、８４、９０及び９６からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号７、１３、１９、２５、３０、３６、４２、８４、９０及び９６からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号７、１３、１９、２５、３０、３６、４２、８４、９０及び９６からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１
（ｈ）配列番号８、１４、２０、２６、３１、３７、４３、８５、９１及び９７からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号８、１４、２０、２６、３１、３７、４３、８５、９１及び９７からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号８、１４、２０、２６、３１、３７、４３、８５、９１及び９７からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２
（ｉ）配列番号９、１５、２１、ＦＤＹ、３２、３８、４４、８６、９２及び９８からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号９、１５、２１、ＦＤＹ、３２、３８、４４、８６、９２及び９８からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号９、１５、２１、ＦＤＹ、３２、３８、４４、８６、９２及び９８からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
（ｊ）配列番号１０、１６、２２、２７、３３、３９、４５、８７、９３及び９９からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号１０、１６、２２、２７、３３、３９、４５、８７、９３及び９９からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１０、１６、２２、２７、３３、３９、４５、８７、９３及び９９からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１
（ｋ）配列番号１１、１７、２３、２８、３４、４０、４６、８８、９４及び１００からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号１１、１７、２３、２８、３４、４０、４６、８８、９４及び１００からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１１、１７、２３、２８、３４、４０、４６、８８、９４及び１００からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２
（ｌ）配列番号１２、１８、２４、２９、３５、４１、４７、８９、９５及び１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号１２、１８、２４、２９、３５、４１、４７、８９、９５及び１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１２、１８、２４、２９、３５、４１、４７、８９、９５及び１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
【請求項６】
Ｂ細胞の増殖を阻害するものである、請求項１〜５のいずれか１項記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の二重特異性抗体を含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項記載の二重特異性抗体を有効成分として含有することを特徴とするＢ細胞関連疾患治療剤。
【請求項９】
前記Ｂ細胞関連疾患がＢ細胞性腫瘍である、請求項８記載のＢ細胞関連疾患治療剤。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項記載の二重特異性抗体の、Ｂ細胞関連疾患治療剤製造のための使用。
【請求項１１】
前記Ｂ細胞関連疾患がＢ細胞性腫瘍である、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
Ｂ細胞関連疾患の治療に用いるための、請求項１〜６のいずれか１項記載の二重特異性抗体。
【請求項１３】
前記Ｂ細胞関連疾患がＢ細胞性腫瘍である、請求項１２記載の二重特異性抗体。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項記載の二重特異性抗体の有効量を投与することを特徴とする、Ｂ細胞関連疾患の治療方法。
【請求項１５】
前記Ｂ細胞関連疾患がＢ細胞性腫瘍である、請求項１４記載のＢ細胞関連疾患治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩｇＭ及びＢ細胞表面抗原に結合する抗ＩｇＭ／Ｂ細胞表面抗原二重特異性抗体及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）は、抗体及びこれと構造や機能上の関連をもつタンパク質である免疫グロブリンのクラスの１種で、膜結合型と分泌型が存在する。膜結合型ＩｇＭは、Ｂ細胞受容体として適応免疫に関与する主なリンパ球であるＢ細胞に特異的に発現し、Ｂ細胞の生死に関与している。抗原がＢ細胞受容体に結合すると、Ｂ細胞は増殖し、その一部は形質細胞に分化し、形質細胞は大量の分泌型ＩｇＭを分泌する。分泌型ＩｇＭは、５又は６量体を形成し、血中に大量に存在（０．４〜２．８ｍｇ／ｍｌ）し、免疫の初期応答に寄与している。【０００３】
ＩｇＭに対する抗ＩｇＭモノクローナル抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、Ｂ細胞性腫瘍細胞株の細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することが知られている（非特許文献１、２及び３）。【０００４】
抗体を用いたがん治療は、２１世紀にはいって遺伝子工学によるヒト化や改変抗体などの技術の進歩とあいまって、有効な治療法として受け入れられるようになってきている。近年、多くの抗体医薬が上市され、新たな抗体医薬の開発も進められている。このうち、がんを直接標的とした抗体医薬は、多種多様な抗原を標的抗原とし、抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害活性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）、増殖シグナル伝達阻害、抗体薬物複合体の薬物による細胞傷害活性といった作用機序により抗腫瘍効果を示す分子標的薬として有用である。【０００５】
一方、膜結合型ＩｇＭを発現するＢ細胞性腫瘍は予後不良であるという報告があり（非特許文献４及び５）、膜結合型ＩｇＭが治療のターゲットになり得ると推測される。しかしながら、これまでのところ、抗ＩｇＭモノクローナル抗体はＢ細胞性腫瘍の治療薬として実用化されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃａｒｅｙ，Ｇ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，１７（１１）：９４２−９５５，２００７．
【非特許文献２】Ｂｅｓｎａｕｌｔ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７（２）：７３３−７４０，２００１．
【非特許文献３】Ｍｏｎｇｉｎｉ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９２（１０）：３７５６−３７７１，１９９８．
【非特許文献４】Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１４２（４）：５６２−５７０，２００８．
【非特許文献５】Ｃｕｔｒｏｎａ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，ＡＢＳＳＵＢ-４４６５，１９ｔｈ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２０１４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の抗ＩｇＭモノクローナル抗体は、生体に投与された場合、血中に大量に存在する分泌型ＩｇＭと結合して中和されてしまい、膜結合型ＩｇＭを発現するＢ細胞との結合性が十分とは言えなかった。そのため、分泌型ＩｇＭ存在下で膜結合型ＩｇＭを発現するＢ細胞に結合して増殖阻害効果を発揮するには、抗ＩｇＭモノクローナル抗体を大量に投与しなければならなかった。
従って、本発明の課題は、血中の分泌型ＩｇＭ存在下であっても、Ｂ細胞表面の膜結合型ＩｇＭに結合し、当該Ｂ細胞との結合活性が高く、さらに当該Ｂ細胞に対し増殖阻害効果を発揮する抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者らは、Ｂ細胞表面の膜結合型ＩｇＭとの結合活性が高い抗体を作製すべく種々検討したところ、ＩｇＭ及びＢ細胞表面抗原に対する二重特異性抗体が、大量の分泌型ＩｇＭの存在下であっても、Ｂ細胞表面の膜結合型ＩｇＭに結合し、当該Ｂ細胞との結合活性が高く、さらに当該Ｂ細胞に対し優れた細胞増殖阻害効果を示すことを見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔１５〕を提供するものである。
〔１〕ＩｇＭ及びＢ細胞表面抗原に結合する二重特異性抗体。
〔２〕前記ＩｇＭに結合する第一の抗原結合部位と、前記Ｂ細胞表面抗原に結合する第二の抗原結合部位とを含むものである、〔１〕記載の二重特異性抗体。
〔３〕前記Ｂ細胞表面抗原がＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ８１、ＢＡＦＦ受容体、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩからなる群より選択されるものである、〔１〕又は〔２〕に記載の二重特異性抗体。
〔４〕キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の二重特異性抗体。
〔５〕抗体の可変領域が下記（ａ）〜（ｆ）の重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３並びに下記（ｇ）〜（ｌ）の重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３を含むものである、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の二重特異性抗体。
（ａ）配列番号１、４８、６０、６６、７２及び７８からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号１、４８、６０、６６、７２及び７８からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１、４８、６０、６６、７２及び７８からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１
（ｂ）配列番号２、４９、６１、６７、７３及び７９からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号２、４９、６１、６７、７３及び７９からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号２、４９、６１、６７、７３及び７９からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２
（ｃ）配列番号３、５０、６２、６８、７４及び８０からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号３、５０、６２、６８、７４及び８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号３、５０、６２、６８、７４及び８０からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
（ｄ）配列番号４、５１、６３、６９、７５及び８１からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号４、５１、６３、６９、７５及び８１からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号４、５１、６３、６９、７５及び８１からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１
（ｅ）配列番号５、５２、６４、７０、７６及び８２からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号５、５２、６４、７０、７６及び８２からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号５、５２、６４、７０、７６及び８２からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２
（ｆ）配列番号６、５３、６５、７１、７７及び８３からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号６、５３、６５、７１、７７及び８３からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号６、５３、６５、７１、７７及び８３からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
（ｇ）配列番号７、１３、１９、２５、３０、３６、４２、８４、９０及び９６からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号７、１３、１９、２５、３０、３６、４２、８４、９０及び９６からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号７、１３、１９、２５、３０、３６、４２、８４、９０及び９６からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１
（ｈ）配列番号８、１４、２０、２６、３１、３７、４３、８５、９１及び９７からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号８、１４、２０、２６、３１、３７、４３、８５、９１及び９７からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号８、１４、２０、２６、３１、３７、４３、８５、９１及び９７からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２
（ｉ）配列番号９、１５、２１、ＦＤＹ、３２、３８、４４、８６、９２及び９８からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号９、１５、２１、ＦＤＹ、３２、３８、４４、８６、９２及び９８からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号９、１５、２１、ＦＤＹ、３２、３８、４４、８６、９２及び９８からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
（ｊ）配列番号１０、１６、２２、２７、３３、３９、４５、８７、９３及び９９からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号１０、１６、２２、２７、３３、３９、４５、８７、９３及び９９からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１０、１６、２２、２７、３３、３９、４５、８７、９３及び９９からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１
（ｋ）配列番号１１、１７、２３、２８、３４、４０、４６、８８、９４及び１００からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号１１、１７、２３、２８、３４、４０、４６、８８、９４及び１００からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１１、１７、２３、２８、３４、４０、４６、８８、９４及び１００からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２
（ｌ）配列番号１２、１８、２４、２９、３５、４１、４７、８９、９５及び１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号１２、１８、２４、２９、３５、４１、４７、８９、９５及び１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１２、１８、２４、２９、３５、４１、４７、８９、９５及び１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
〔６〕Ｂ細胞の増殖を阻害するものである、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の二重特異性抗体。
〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の二重特異性抗体を含有することを特徴とする医薬組成物。
〔８〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の二重特異性抗体を有効成分として含有することを特徴とするＢ細胞関連疾患治療剤。
〔９〕前記Ｂ細胞関連疾患がＢ細胞性腫瘍である、〔８〕記載のＢ細胞関連疾患治療剤。
〔１０〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の二重特異性抗体の、Ｂ細胞関連疾患治療剤製造のための使用。
〔１１〕前記Ｂ細胞関連疾患がＢ細胞性腫瘍である、〔１０〕記載の使用。
〔１２〕Ｂ細胞関連疾患の治療に用いるための、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の二重特異性抗体。
〔１３〕前記Ｂ細胞関連疾患がＢ細胞性腫瘍である、〔１２〕記載の二重特異性抗体。
〔１４〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の二重特異性抗体の有効量を投与することを特徴とする、Ｂ細胞関連疾患の治療方法。
〔１５〕前記Ｂ細胞関連疾患がＢ細胞性腫瘍である、〔１４〕記載のＢ細胞関連疾患治療方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の抗ＩｇＭ／Ｂ細胞表面抗原二重特異性抗体は、大量の分泌型ＩｇＭ存在下であっても、Ｂ細胞表面の膜結合型ＩｇＭに結合し、当該Ｂ細胞との結合活性が高いという特徴を有する。また、副作用が少ない。従って、本発明の二重特異性抗体をＢ細胞関連疾患、特にＢ細胞性腫瘍患者に投与した場合、血中の分泌型ＩｇＭで中和されることなく、標的のＢ細胞表面の膜結合型ＩｇＭに結合し、当該Ｂ細胞に対し細胞増殖阻害活性を発揮することが可能となる。すなわち、Ｂ細胞性腫瘍増殖阻害活性を発揮することが可能となる。よって、抗体の大量投与に伴う患者の負担、医療費の増大等の問題も回避することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＨＨ細胞膜表面上のＩｇＭ分子数及びＨＬＡ−ＤＲ分子数を示すグラフである。
【図２】抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）及び抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体のＩｇＭ及びＨＬＡ−ＤＲに対する結合性を示すグラフである。縦軸は平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、横軸は抗体濃度を示す。
【図３】抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害活性を示すグラフである。縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
【図４】抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ抗体（１）と抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）の併用、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害活性を示すグラフである。縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
【図５】抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＢ１０４細胞に対する増殖阻害活性を示すグラフである。縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
【図６】ヒト血清非存在下（左グラフ）又は存在下（右グラフ）での抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害活性を示すグラフである。縦軸は細胞生存率を示す。
【図７】抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＣＤ２０抗体（１）、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ２０（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害活性を示すグラフである。縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
【図８】抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＣＤ２０抗体（２）、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ２０（２）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害活性を示すグラフである。縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
【図９】抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＣＤ２０抗体（１）、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ２０（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＢ１０４細胞に対する増殖阻害活性を示すグラフである。縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
【図１０】ヒト血清非存在下（左グラフ）又は存在下（右グラフ）での抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＣＤ２０抗体（１）、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ２０（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害活性を示すグラフである。縦軸は細胞生存率を示す。
【図１１】抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＣＤ５２抗体、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ５２二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＢ１０４細胞に対する増殖阻害活性を示すグラフである。縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
【図１２】分泌型ＩｇＭ非存在下（各左のチャート）又は存在下（各右のチャート）で抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体及び陰性対照がＪｅＫｏ−１細胞の細胞周期に与える影響を示す図である。
【図１３】ヒト血清非存在下（各左のチャート）又は存在下（各右のチャート）で抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体及び陰性対照がＪｅＫｏ−１細胞の細胞周期に与える影響を示す図である。
【図１４】抗ＩｇＭ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）及び抗ＩｇＭ／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体がラットＢ細胞数に与える影響を示す図である。
【図１５】抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体がサル血中Ｂ細胞数に与える影響を示す図である。
【図１６】抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体がサル血中Ｔ細胞数に与える影響を示す図である。
【図１７】抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体がサル血中赤血球数に与える影響を示す図である。
【図１８】抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体がサル血中血小板数に与える影響を示す図である。
【図１９】抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体がサル体温に与える影響を示す図である。
【図２０】抗ＩｇＭ抗体（２）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ（２）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＢ１０４細胞に対する増殖阻害活性を示すグラフである。縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
【図２１】抗ＩｇＭ抗体（３）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ（３）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害活性を示すグラフである。縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
【図２２】抗ＩｇＭ抗体（４）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ（４）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＢ１０４細胞に対する増殖阻害活性を示すグラフである。縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
【図２３】抗ＩｇＭ抗体（５）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ（５）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＢ１０４細胞に対する増殖阻害活性を示すグラフである。縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
【図２４】抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（２）、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（２）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＢ１０４細胞に対する増殖阻害活性を示すグラフである。縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
【図２５】抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＣＤ３８抗体、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ３８二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＢ１０４細胞に対する増殖阻害活性を示すグラフである。縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
【図２６】抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＣＤ８１抗体、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ８１二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害活性を示すグラフである。縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
【図２７】抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＲａｍｏｓ細胞に対するアポトーシス誘導作用を示すグラフである。縦軸はアポトーシス誘導率を示す。
【図２８】抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＣＤ２０抗体（２）、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ２０（２）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＲａｍｏｓ細胞に対するアポトーシス誘導作用を示すグラフである。縦軸はアポトーシス誘導率を示す。
【図２９】抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＣＤ３８抗体、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ３８二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＲａｍｏｓ細胞に対するアポトーシス誘導作用を示すグラフである。縦軸はアポトーシス誘導率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において、「二重特異性抗体」とは、異なる抗原に結合可能な少なくとも２つの抗原結合部位を有するモノクローナル抗体のことを指す。具体的には、「二重特異性抗体」とは、例えば、第一の抗体の重鎖の可変領域と第一の抗体の軽鎖の可変領域から形成される第一の抗原結合部位と、第二の抗体の重鎖の可変領域と第二の抗体の軽鎖の可変領域から形成される第二の抗原結合部位とを少なくとも１つずつ含み、異なる二種の抗原認識能を有するタンパク質を意味する。
【００１３】
二重特異性抗体の形態としては、特に限定されず、当該技術分野で公知の形態のいずれであってもよいし、二種の抗原に対する特異性を保持している限り、それ以外の形態であってもよい。二重特異性抗体の形態は、ＩｇＧ様型と低分子型に大別される。ＩｇＧ様型とは、Ｆｃ領域を保持した形態である。ＩｇＧ様型抗体の形態としては、これらに限定されるものではないが、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＤＡＦ（ｔｗｏ−ｉｎ−ｏｎｅ）、ＤＡＦ（ｆｏｕｒ−ｉｎ−ｏｎｅ）、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ−ＩｇＧ、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ  ｃｏｍｍｏｎ  ＬＣ、ＳＥＥＤｂｏｄｙ、Ｔｒｉｏｍａｂ、κλ−ｂｏｄｙ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ、ＤｕｏＢｏｄｙ等が挙げられる。ＩｇＧ様型抗体では、Ｆｃ領域を保持しているため、ＡＤＣＣやＣＤＣといったエフェクター機能の発揮、精製の容易化、安定性の改善、血中半減期の延長が期待される。一方、低分子型とは、通常、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とからなるＦｖ領域を基本の構成要素とした形態である。低分子型抗体の形態としては、これらに限定されるものではないが、Ｄｉａｂｏｄｙ（Ｄｂ）、ＢｉＴＥ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃＤｂ、ｔｒｉｐｌｅ  ｂｏｄｙ、ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ、ｓｃＦｖ、ｔａｎｄｅｍ  ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、ロイシンジッパー等が挙げられる。低分子型では、その大きさから、組織透過性の向上や生産性の高さが期待される。その他、抗原との結合能を保持したままアミノ酸配列を欠失、置換若しくは付加させたもの、糖鎖の一部又は全部を欠失又は付加させたもの、リンカー等が付加したもの、他のタンパク質と融合させたもの、抗体と低分子医薬とをリンカーを介して結合した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）等の改変抗体も包含される。本発明の抗ＩｇＭ／Ｂ細胞表面抗原二重特異性抗体（以下、単に本発明の二重特異性抗体とも称す）の形態は、使用目的、製造の容易性等を考慮して適宜選択すればよいが、Ｂ細胞に対する細胞傷害活性の点から、Ｆｃ領域を保持していることが好ましい。
【００１４】
本発明の二重特異性抗体は、ＩｇＭに結合する第一の抗原結合部位と、Ｂ細胞表面抗原に結合する第二の抗原結合部位とを含むことを特徴とする。
ここで、ＩｇＭとは免疫グロブリンＭを指す。ＩｇＭが由来する動物種は特に限定されないが、例えば、ヒトや、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等といった非ヒト動物が挙げられ、このうちヒトが好ましい。ＩｇＭに対する第一の特異性は、好ましくは、ＩｇＭに対する抗体に由来する部位により発現され、より好ましくは、ＩｇＭに対する抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域に由来する部位により発現され、さらに好ましくは、ＩｇＭに対する抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域により形成される抗原結合部位により発現されるものである。
一方、Ｂ細胞表面抗原とは、膜結合型ＩｇＭ以外のＢ細胞表面に発現する抗原であればよく、特に限定されないが、好ましくはＢ細胞関連疾患に罹患した生体のＢ細胞で発現している抗原であり、さらに好ましくはＢ細胞性腫瘍に罹患した生体のＢ細胞で発現している抗原である。Ｂ細胞表面抗原が由来する動物種は特に限定されないが、例えば、ヒトや、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等といった非ヒト動物が挙げられ、このうちヒトが好ましい。Ｂ細胞表面抗原としては、具体的には、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ１３８、ＣＤ２７２、ＢＡＦＦ受容体、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、ＰＤ−１等が挙げられ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＣＤ８１、ＢＡＦＦ受容体、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩが好ましく、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５２及びＣＤ８１がより好ましく、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ５２及びＣＤ８１がさらに好ましい。Ｂ細胞表面抗原に対する第二の特異性は、好ましくは、Ｂ細胞表面抗原に対する抗体に由来する部位により発現され、より好ましくは、Ｂ細胞表面抗原に対する抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域に由来する部位により発現され、さらに好ましくは、Ｂ細胞表面抗原に対する抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域により形成される抗原結合部位により発現されるものである。
【００１５】
具体的には、本発明の二重特異性抗体は、第一の特異性を有する抗ＩｇＭ抗体の重鎖の可変領域を含むポリペプチド、当該抗ＩｇＭ抗体の軽鎖の可変領域を含むポリペプチド、第二の特異性を有する抗Ｂ細胞表面抗原抗体の重鎖の可変領域を含むポリペプチド及び当該抗Ｂ細胞表面抗原抗体の軽鎖の可変領域を含むポリペプチドを含む。より具体的には、第一の特異性を有する抗ＩｇＭ抗体の重鎖の可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むポリペプチド、当該抗ＩｇＭ抗体の軽鎖の可変領域のＣＤＲを含むポリペプチド、第二の特異性を有する抗Ｂ細胞表面抗原抗体の重鎖の可変領域のＣＤＲを含むポリペプチド及び当該抗Ｂ細胞表面抗原抗体の軽鎖の可変領域のＣＤＲを含むポリペプチドを含む。
ＣＤＲとは、抗体間で配列が大きく異なる可変領域内の配列で、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域にそれぞれ３つのＣＤＲがあり、これらが組み合わさって抗原結合部位を形成し、抗原特異性を決定する。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．，１９９１．を参照のこと）の配列比較により定義される。Ｋａｂａｔにより定義されているように、重鎖ＣＤＲ１は重鎖可変領域の３１〜３５残基付近に、重鎖ＣＤＲ２は５０〜６５残基付近に、重鎖ＣＤＲ３は９５〜１０２残基付近に位置し、軽鎖ＣＤＲ１は軽鎖可変領域の２４〜３４残基付近に、軽鎖ＣＤＲ２は５０〜５６残基付近に、軽鎖ＣＤＲ３は８９〜９７残基付近に位置する。
【００１６】
本発明の二重特異性抗体において、ＩｇＭに対する第一の特異性に寄与するＣＤＲとしては、例えば、下記（ａ）〜（ｆ）に示す重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３が挙げられる。
（ａ）配列番号１、４８、６０、６６、７２及び７８からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号１、４８、６０、６６、７２及び７８からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１、４８、６０、６６、７２及び７８からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２、４９、６１、６７、７３及び７９からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号２、４９、６１、６７、７３及び７９からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号２、４９、６１、６７、７３及び７９からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３、５０、６２、６８、７４及び８０からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号３、５０、６２、６８、７４及び８０からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号３、５０、６２、６８、７４及び８０からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４、５１、６３、６９、７５及び８１からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号４、５１、６３、６９、７５及び８１からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号４、５１、６３、６９、７５及び８１からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５、５２、６４、７０、７６及び８２からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号５、５２、６４、７０、７６及び８２からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号５、５２、６４、７０、７６及び８２からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号６、５３、６５、７１、７７及び８３からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号６、５３、６５、７１、７７及び８３からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号６、５３、６５、７１、７７及び８３からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３。
【００１７】
また、本発明の二重特異性抗体において、Ｂ細胞表面抗原に対する第二の特異性に寄与するＣＤＲとしては、例えば、下記（ｇ）〜（ｌ）に示す重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３が挙げられる。
（ｇ）配列番号７、１３、１９、２５、３０、３６、４２、８４、９０及び９６からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号７、１３、１９、２５、３０、３６、４２、８４、９０及び９６からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号７、１３、１９、２５、３０、３６、４２、８４、９０及び９６からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
（ｈ）配列番号８、１４、２０、２６、３１、３７、４３、８５、９１及び９７からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号８、１４、２０、２６、３１、３７、４３、８５、９１及び９７からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号８、１４、２０、２６、３１、３７、４３、８５、９１及び９７からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、
（ｉ）配列番号９、１５、２１、ＦＤＹ、３２、３８、４４、８６、９２及び９８からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号９、１５、２１、ＦＤＹ、３２、３８、４４、８６、９２及び９８からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号９、１５、２１、ＦＤＹ、３２、３８、４４、８６、９２及び９８からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、
（ｊ）配列番号１０、１６、２２、２７、３３、３９、４５、８７、９３及び９９からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号１０、１６、２２、２７、３３、３９、４５、８７、９３及び９９からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１０、１６、２２、２７、３３、３９、４５、８７、９３及び９９からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
（ｋ）配列番号１１、１７、２３、２８、３４、４０、４６、８８、９４及び１００からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号１１、１７、２３、２８、３４、４０、４６、８８、９４及び１００からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１１、１７、２３、２８、３４、４０、４６、８８、９４及び１００からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、
（ｌ）配列番号１２、１８、２４、２９、３５、４１、４７、８９、９５及び１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号１２、１８、２４、２９、３５、４１、４７、８９、９５及び１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号１２、１８、２４、２９、３５、４１、４７、８９、９５及び１０１からなる群より選択されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３。
【００１８】
上記（ａ）〜（ｌ）のＣＤＲを有する二重特異性抗体の好適な具体例としては、後記実施例で示す、表１記載の配列番号のアミノ酸配列からなるＣＤＲを有する抗ＩｇＭ／ＨＬＡ−ＤＲ二重特異性抗体、抗ＩｇＭ／ＣＤ２０二重特異性抗体、抗ＩｇＭ／ＣＤ３２ｂ二重特異性抗体、抗ＩｇＭ／ＣＤ３７二重特異性抗体、抗ＩｇＭ／ＣＤ３８二重特異性抗体、抗ＩｇＭ／ＣＤ５２二重特異性抗体、抗ＩｇＭ／ＣＤ８１二重特異性抗体及び抗ＩｇＭ／ＢＣＭＡ二重特異性抗体や、抗ＩｇＭ／ＢＡＦＦ受容体二重特異性抗体及び抗ＩｇＭ／ＴＡＣＩ二重特異性抗体が例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
【表１】
2018174274.tif 000003
【００２０】
上記（ａ）〜（ｌ）において、アミノ酸配列の同一性は、８５％以上であるが、９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がさらに好ましい。また、上記のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加の数は、１〜１０個が好ましく、１〜５個がより好ましく、１〜３個がさらに好ましい。配列番号１〜５３及び６０〜１０１のいずれかに示すアミノ酸配列又はＦＤＹからなるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＣＤＲや、配列番号１〜５３及び６０〜１０１のいずれかに示すアミノ酸配列又はＦＤＹからなるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなるＣＤＲは、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、チェーンシャフリング法、ＣＤＲウォーキング法などの公知の方法を用いて作製され得る。
【００２１】
アミノ酸配列の同一性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときに両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。例えば、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス）を用いたＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７（４６９３）：１４３５−１４４１，１９８５．）によるホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用い、パラメーターＵｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅを２として算出できる。
【００２２】
「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えば、天然タンパク原性Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク原性アミノ酸；及びアミノ酸の特徴である当該技術分野で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられる。非天然アミノ酸の例として、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニンなど）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン及びα−メチル−ヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。
【００２３】
本発明の二重特異性抗体には、糖鎖付加等の修飾が加えられたものも含まれる。かかる抗体としては、例えば、Ｆｃ領域に１以上のＮ−結合型糖鎖が結合し、該Ｎ−結合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体が挙げられる。Ｎ−結合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにはフコースが結合し得るが、このフコースが結合していない場合、結合している場合に比較してＡＤＣＣが著しく上昇することが知られている。また、本発明の二重特異性抗体には、ＩｇＧ１のＣＨ２領域とＣＨ３領域をそれぞれＩｇＧ３のＣＨ２領域とＣＨ３領域と入れ替えたＩｇＧ１／ＩｇＧ３キメラ抗体といった改変抗体も含まれる。当該抗体の補体結合力は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３よりも強く、高いＣＤＣを有することが知られている。これら細胞傷害活性の向上により、抗体を医薬として用いる場合に投与量を少なくし、副作用を軽減させる効果と共に、治療費の低減が期待できる。
【００２４】
本発明の二重特異性抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹのいずれのイムノグロブリンクラスであってもよく、精製の容易性等を考慮すると好ましくはＩｇＧである。また、本発明の二重特異性抗体はいずれのアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）の抗体をも包含するものである。
【００２５】
本発明の二重特異性抗体は、非ヒト動物の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体のいずれであってもよい。非ヒト動物の抗体としては、例えば、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等の抗体を挙げることができ、好ましくはマウスの抗体である。
ここで、「キメラ抗体」とは、非ヒト動物由来であって抗原と特異的に結合する抗体の定常領域をヒトの抗体と同じ定常領域を有するように遺伝子工学的に改変した抗体のことであり、好ましくは、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域に連結させたキメラ抗体である。また、「ヒト化抗体」とは、非ヒト動物由来であって抗原と特異的に結合する抗体の重鎖と軽鎖のＣＤＲ以外の一次構造をヒトの抗体に対応する一次構造に遺伝子工学的に改変した抗体のことである。また、「ヒト抗体」とは、完全にヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体を意味する。
【００２６】
本発明の二重特異性抗体に第一の特異性を提供する抗体及び第二の特異性を提供する抗体は、公知の抗体であってもよいし、当該技術分野においてよく知られる任意の方法により作製することもできる。
【００２７】
ポリクローナル抗体であれば、マウス等の動物の体内に免疫原及び必要に応じてアジュバントを複数回、皮下及び腹腔内等の適当な経路で注射することによって、動物の体内に生成せしめ、免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単離し、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、又はラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングすることにより得ることができる。免疫原としては、ＩｇＭ、Ｂ細胞表面抗原タンパク質、これらの部分ペプチド、これらの安定発現細胞等を用いることができる。
【００２８】
一方、モノクローナル抗体であれば、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６（５５１７）：４９５−４９７，１９７５．により最初に記述されたハイブリドーマ法を使用して実質的に均質な抗体の母集団から得ることができる。具体的には、免疫した動物から脾臓細胞を採取し、ミエローマ細胞と融合させ、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製することにより得ることができる。ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、又はラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、目的とするタンパク質を認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する。所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし、適切な条件下で培養し、分泌された抗体を回収し、当該技術分野においてよく知られる方法、例えばイオン交換カラム、アフィニティークロマトグラフィー等を用いて精製することができる。あるいは、モノクローナル抗体を組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）によって作製することもできる。
【００２９】
抗体又はそれに含まれる可変領域等の各領域をコードする核酸は、当業者に公知の方法で取得し、その塩基配列を決定することができる。例えば、当該核酸は、文献記載の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブ、あるいはプライマーを使用し、ハイブリダイゼーションにより、あるいはポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）により単離され得る。上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、こうした方法におけるＤＮＡの供給源として使用することが出来る。なお、「核酸」とは、その化学構造及び取得経路に特に制限はなく、例えば、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ及びｍＲＮＡ等を含むものである。
単離したＤＮＡは、発現ベクター中に導入される。次いでこれを、適当な宿主細胞にトランスフェクションすることで、該組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体又はそれに含まれる領域を発現させることができる。
【００３０】
ここで、「発現ベクター」は、ＤＮＡ（通常は二本鎖である）の断片をいい、該ＤＮＡは、その中に外来のＤＮＡの断片を挿入せしめることができる。外来のＤＮＡは、異種ＤＮＡとして定義され、このものは、対象宿主細胞においては天然では見出されないＤＮＡである。ベクターは、外来ＤＮＡまたは異種ＤＮＡを適切な宿主細胞に導入するために使用される。一旦、宿主細胞中に入ると、ベクターは、宿主染色体ＤＮＡとは独立に複製することが可能であり、そしてベクター及びその挿入された外来ＤＮＡのいくつかのコピーが生成され得る。さらに、ベクターは外来ＤＮＡのポリペプチドへの翻訳を可能にするのに不可欠なエレメントを含む。従って、外来ＤＮＡによってコードされるポリペプチドの多くの分子を迅速に生合成することができる。
【００３１】
このようなベクターは、適切な宿主中でＤＮＡ配列がコードするタンパク質を発現するように、適切な制御配列とそれが機能するように（即ち、外来ＤＮＡがコードするタンパク質を発現できるように）連結せしめられたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物を意味している。そうした制御配列としては、転写させるためのプロモーター、そうした転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードしている配列、エンハンサー、ポリアデニル化配列、及び転写や翻訳の終了を制御する配列等が挙げられる。更にベクターは、当業者に公知の各種の配列、例えば、制限酵素切断部位、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子（選択遺伝子）、シグナル配列、リーダー配列等を必要に応じて適宜含むことができる。これらの各種配列又は要素は、外来ＤＮＡの種類、使用する宿主細胞、培養培地等の条件に応じて、当業者が適宜選択して使用することができる。
【００３２】
該ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、あるいは単純に宿主ゲノムへの挿入体等の任意の形態が可能である。一旦、適切な宿主の中に形質転換で導入されると、該ベクターは宿主のゲノムとは独立して複製及び機能するものであり得る。又は、該ベクターは宿主ゲノムの中に組み込まれるものであってもよい。
【００３３】
ＰＣＲ反応は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、例えばＳａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０（４７３２）：１３５０−１３５４，１９８５．；Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９（４８３９）：４８７−４９１，１９８８．；Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．，ｅｄ．，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ．，１９８９．；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄ．，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１，Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，１９９５．；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ．，１９９０．；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，ＰＣＲ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，１９９１．；ＦｒｏｈｍａｎＭ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５（２３），８９９８−９００２，１９８８．などに記載された方法あるいはそれを改変した方法に従って行うことができる。また、ＰＣＲ法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者が提供する指図書に従って実施することもできる。
【００３４】
ハイブリダイゼーションについては、Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ  Ｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ．，１９７４．などを参考にすることができる。ＤＮＡなど核酸の配列決定は、例えばＳａｎｇｅｒ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４（１２）：５４６３−５４６７，１９７７．などを参考にすることができる。また一般的な組換えＤＮＡ技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９．及びＧｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄ．，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．，Ｖｏｌ．１  ｔｏ  ４，Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，１９９５．などを参考にできる。
【００３５】
こうして取得された抗体又はそれに含まれる各領域をコードする核酸は、目的に応じて、当業者に公知の手段により適宜所望のペプチド又はアミノ酸をコードするように改変することができる。この様にＤＮＡを遺伝子的に改変又は修飾する技術は、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．，Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，１９９１．において総説が収載されており、例えば、位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法）、カセット変異誘発法及びＰＣＲ変異生成法を挙げることができる。
【００３６】
ここで、核酸の「改変」とは、得られたオリジナルの核酸において、アミノ酸残基をコードする少なくとも一つのコドンにおける、塩基の挿入、欠失または置換を意味する。例えば、オリジナルのアミノ酸残基をコードするコドンを、別のアミノ酸残基をコードするコドンにより置換することによりポリペプチドを構成するアミノ酸配列自体を改変する方法がある。または、アミノ酸自体は変更せずに、その宿主細胞にあったコドン（至適コドン）を使用するように、核酸を改変することも出来る。このように至適コドンに改変することによって、宿主細胞内におけるポリペプチドの発現効率等の向上を図ることができる。
【００３７】
宿主細胞としては当業者に公知の任意の細胞を使用することができるが、例えば、代表的な宿主細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の原核細胞、及び、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ヒト由来細胞などの哺乳動物細胞、酵母、昆虫細胞等の真核細胞を挙げることができる。
【００３８】
このような宿主細胞における発現等により得られた抗体分子は、一般に分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収されるが、それが分泌シグナルを持たずに産生された場合には宿主細胞溶解物から回収することができる。
【００３９】
抗体分子の精製操作は当業者に公知の任意の方法を適宜組み合わせて行うことができる。例えば、遠心分離、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロースクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン樹脂クロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム等）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及びアフィニティークロマトグラフィーによって好適に精製される。
【００４０】
本発明の二重特異性抗体に第一の特異性を提供する抗体及び第二の特異性を提供する抗体は、非ヒト動物、例えばマウスの抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなるキメラ抗体であっても良い。この様な抗体は、例えば、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
【００４１】
あるいは、当該抗体は、非ヒト動物、例えばマウスの抗体の重鎖、軽鎖のＣＤＲをヒト抗体のＣＤＲへ移植したものである、ヒト化抗体であってもよい。このヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５７６）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のＦＲのアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３（４），８５１−８５６，１９９３．）。
【００４２】
あるいは、当該抗体は、ヒト抗体であってもよい。ヒト抗体は、例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体をスクリーニングして得ることができる（特公平１−５９８７８）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することもできる（ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を組み込んだ適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。さらには、チェイン・シャッフリング法（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）によって高親和性（ｎＭのオーダーの範囲）のヒト抗体を作出することができる（Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１０（７）：７７９−７８３，１９９２．）。極めて大きいファージライブラリーを構築するための手法として、組合せ感染（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）及びインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１（９）：２２６５−２２６６，１９９３．）なども知られている。
【００４３】
本発明の二重特異性抗体に第一の特異性を提供する抗体及び第二の特異性を提供する抗体の組み合わせは、非ヒト動物の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体のいずれの組み合わせであってもよい。
【００４４】
本発明の二重特異性抗体は、当該技術分野で公知の種々の方法に従い作製することができる。ＩｇＧ様型の二重特異性抗体の作製方法としては、例えば、モノクローナル抗体を産生する２種のハイブリドーマを融合させ、産生された抗体から目的の抗体を精製するクワドローマ法（Ｍｉｌｅｓｔｅｉｎ，Ｃ．  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ａ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５（５９３４）：５３７−５４０，１９８３．等）；２種の抗体のヒンジ領域のジスルフィド結合を還元後、同種での再会合を防ぐため化学的に処理をし、架橋剤により結合させることで目的の二重特異性抗体を得る化学合成による方法（Ｎｉｔｔａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３３５（８６８６）：３６８−３７１，１９９０．）；第一の特異性を有する抗体の重鎖の遺伝子、軽鎖の遺伝子、第二の特異性を有する抗体の重鎖の遺伝子、及び軽鎖の遺伝子を細胞に導入して共発現させて目的の抗体を得る遺伝子組換え技術を利用した方法等が挙げられる。遺伝子組換え技術を利用した方法では、１種の遺伝子のみを含むベクターを４種類まとめて、または重鎖の遺伝子と軽鎖の遺伝子を含むベクターを２種類まとめて適当な宿主細胞にトランスフェクションすることで、該組換え宿主細胞中で二重特異性抗体を発現させることができる。なお、二重特異性抗体の産生、精製等は、上記した抗体の産生、精製等に準じて行えばよい。
【００４５】
しかしながら、クワドローマ法や４種の遺伝子を共発現させる方法では、ＩｇＭに対する第一の特異性を有する抗体由来の重鎖と軽鎖が会合し、Ｂ細胞表面抗原に対する第二の特異性を有する抗体由来の重鎖と軽鎖が会合し、これらの重鎖同士が会合した目的の構造を有する抗体に加え、由来の異なる重鎖と軽鎖が会合した抗体、あるいは由来が同じ重鎖同士が会合した抗体など、合計１０種の抗体分子が産生されてしまう。この場合、目的の抗体を得るためには、複雑な精製操作が必要となり、抗体産生量も十分でない。
【００４６】
そこで、二重特異性抗体の製造方法において、精製を容易にする技術を適用することができる。かかる技術として、例えば、マウスとラット由来の重鎖と軽鎖が共存すると、異種間での会合は生じず、マウス由来のＩｇＧ２の重鎖がプロテインＡに結合する一方ラット由来のＩｇＧ２はプロテインＡにほとんど結合しないという特性を利用して、プロテインＡカラムを用いて目的の抗体を精製する方法が知られている（ＷＯ９８／０５０４３１）。あるいは、ＩｇＧ１とＩｇＧ３のプロテインＡ結合能の差異を利用して効率的に目的の抗体を精製する方法も利用できる。
【００４７】
また、由来の異なる重鎖間のヘテロな会合を促進する技術を適用することもできる。かかる技術として、例えば、一方の重鎖のＣＨ３領域のアミノ酸を大きなアミノ酸に置換（ｋｎｏｂ変異）し、もう一方の重鎖のＣＨ３領域の対応するアミノ酸を立体的に相補な小さなアミノ酸に置換（ｈｏｌｅ変異）することで、重鎖間のヘテロな会合を促進する方法が知られている（Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，９（７）：６１７−６２１，１９９６）。重鎖のＣＨ３領域の界面に電荷的な変異を導入し、重鎖間のヘテロな会合を促進する一方、ホモな会合は電荷の反発により阻害する方法も知られている（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８５（２５）：１９６３７−１９６４６，２０１０．）。あるいは、ＩｇＧとＩｇＡのＣＨ３領域のβ−ストランド部分を互いに組み合わせることで、重鎖間のヘテロな会合を促進する方法も知られている（Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．，２３（４）：１９５−２０２，２０１０．）。
【００４８】
また、由来の異なる重鎖と軽鎖間の会合を回避する技術を適用することもできる。かかる技術として、例えば、由来の異なる重鎖に対し共通に会合可能な軽鎖をファージディスプレイ法で選択する方法が知られている（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６（７）：６７７−６８１，１９９８）。重鎖ＣＨ１領域と由来の同じ軽鎖ＣＬ領域を交換し、由来が同じ重鎖と軽鎖の会合を促進する方法も知られている（Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０８（２７）：１１１８７−１１１９２，２０１１．）。１つの重鎖と１つの軽鎖からなる抗体の構成要素を２つの異なる宿主細胞で発現させ、これを精製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセンブルして二重特異性抗体を製造する方法も知られている（Ｊａｃｋｍａｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（７）：２０８５０−２０８５９，２０１０）。また、重鎖と軽鎖の間に非天然型ジスルフィド結合を導入して、重鎖と軽鎖の特定の組み合わせを有する抗体を効率よく製造する方法も知られている（ＷＯ２０１４／０６９６４７）。
【００４９】
これら公知の技術は、単独で用いることも、２つ以上の技術を組み合わせて用いることもできる。また、これら公知の技術は、２種の重鎖に別々に適用してもよい。
【００５０】
本発明の低分子型の二重特異性抗体の作製においては、基本構成単位として重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）をリンカーで結合した一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が用いられることが多い。当該ｓｃＦｖにおけるＶＬとＶＨの配置は、Ｎ−末端側がＶＬでそれにリンカー、続いてＶＨと配置されているもの（ＶＬ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＶＨ構築体）でも、Ｎ−末端側がＶＨでそれにリンカー、続いてＶＬと配置されているもの（ＶＨ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＶＬ構築体）のいずれであってもよい。２種のｓｃＦｖを共発現させることで、ダイアボディとして知られる二重特異性抗体を得ることができる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０（１４）：６４４４−６４４８，１９９３．）。ダイアボディ以外の形態の低分子型二重特異性抗体についても、それぞれ当該技術分野で公知の方法に従って作製することができる。
【００５１】
本発明の二重特異性抗体は、Ｂ細胞表面に存在する膜結合型ＩｇＭに結合し、当該Ｂ細胞との結合活性が高く、後記実施例に示す通り、大量の分泌型ＩｇＭ存在下であっても、表面にＩｇＭを発現するＢ細胞の細胞周期を停止させることにより、当該Ｂ細胞に対し優れた細胞増殖阻害活性を示す。また、本発明の二重特異性抗体は、後記実施例に示す通り、当該Ｂ細胞に対し優れたアポトーシス誘導作用を示す。抗ＩｇＭ抗体がＢ細胞性腫瘍細胞株に対しアポトーシスを誘導することは知られているが、本発明の二重特異性抗体のアポトーシス誘導作用は、予想外にも、二重特異性抗体に第一の特異性を提供する抗ＩｇＭ抗体及び第二の特異性を提供する抗Ｂ細胞表面抗原抗体のそれぞれのアポトーシス誘導作用よりも有意に強いものである。さらに、本発明の二重特異性抗体は、副作用が少ない。
本発明において、抗体と抗原の結合活性は、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法等の公知の方法で測定することができる。ＥＬＩＳＡを用いる場合、例えば、抗原をプレートに固定化し、プレートに本発明の二重特異性抗体を添加して反応させた後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素で標識した抗ＩｇＧ抗体等の二次抗体を反応させ、発色基質（例えばＴＭＢ発色基質）を加えて吸光度を測定すればよい。フローサイトメトリー法を用いる場合、例えば、本発明の二重特異性抗体を、未標識の評価対象（例えば、個体、臓器、組織、細胞又はこれらの断片等を含む生物試料を指してよい）と結合させた後、蛍光色素結合二次抗体と反応させ、又は、本発明の二重特異性抗体に蛍光色素（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７）を直接標識して、フローサイトメーターにて蛍光を検出すればよい。また、ＳＰＲ法を用いれば、抗体と抗原の結合活性をより詳細に測定することができる。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステムを用い、センサーチップに抗原を固定化し、本発明の二重特異性抗体を含む溶液をセンサーチップ表面に一定時間供給し、その後緩衝液を供給して、本発明の二重特異性抗体と抗原の結合と解離をモニターし、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び解離定数（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を算出することができる。ＫＤは親和性の指標であり、ＫＤが小さいほど抗原に対する抗体の親和性は強い。あるいは、結合定数（ＫＡ＝１／ＫＤ）によっても親和性を表すことができる。
本発明の二重特異性抗体は、例えば、１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９以下、１０−１０Ｍ以下、又は１０−１１Ｍ以下のＫＤでＢ細胞に結合することが好ましい。
本発明において、「細胞周期の停止」とは、細胞周期の進行がＧ１期で停止することを意味する。細胞周期は、定法に従って、例えばフローサイトメーターにより細胞のＤＮＡ量を測定することで解析できる。
また、本発明において、「細胞増殖阻害活性」とは、細胞表面にＩｇＭを発現するＢ細胞に対して本発明の二重特異性抗体を投与することにより、当該Ｂ細胞の増殖が阻害されることを意味する。より具体的には、細胞増殖阻害活性は、後述の実施例４の式（１）により求められる。
さらに、本発明において、「アポトーシス誘導作用」とは、細胞に対し細胞自らが積極的に引き起こす細胞の死を誘導する作用を意味する。アポトーシスが誘導されると、細胞は縮小し、核の凝集及びＤＮＡの断片化が生じ、最終的にアポトーシス小体となってマクロファージ等に貪食される。アポトーシス誘導作用は、定法に従って、例えば、細胞膜の構造変化、核の凝集及びＤＮＡの断片化、カスパーゼ活性等を検出することで評価できる。
【００５２】
上述の通り、本発明の二重特異性抗体は、Ｂ細胞表面に存在する膜結合型ＩｇＭに対する結合性が高く、当該Ｂ細胞に対し優れた細胞増殖阻害活性を示す。従って、本発明の二重特異性抗体は、Ｂ細胞関連疾患の予防治療剤として有用である。Ｂ細胞関連疾患としては、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー疾患、移植片対宿主病、Ｂ細胞性腫瘍等が挙げられる。自己免疫疾患としては、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、皮膚炎、全身性強皮症及び硬化症、炎症性腸疾患に関連した反応、クローン病、潰瘍性大腸炎、呼吸困難症候群、成人性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、皮膚炎、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、アレルギーによる病状、湿疹、喘息、Ｔ細胞の浸潤に関連した病状及び慢性炎症反応、アテローム性動脈硬化症、白血球付着欠損症、真性糖尿病、レイノー症候群、自己免疫甲状腺炎、アレルギー性脳脊髄炎、シェーグレン（Ｓｊｏｒｇｅｎ）症候群、若年発症糖尿病、Ｔリンパ球及びサイトカインにより媒介される急性及び遅延高血圧に関連した免疫反応、結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽種症、血管炎、悪性貧血（アジソン病）、白血球血管外遊出に関連した疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症疾病、多臓器傷害症候群、溶血性貧血、重症筋無力症、抗原−抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質症候群、アレルギー性神経炎、グレーヴス病、ランバート−イートン筋無力症症候群、類天疱瘡、天疱瘡、自己免疫多腺性内分泌障害、ライター病、ｓｔｉｆｆ−ｍａｎ症候群、ベーチェット症候群、巨細胞動脈炎、免疫複合体腎炎、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性神経障害、慢性疲労症候群、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）又は自己免疫血小板減少病等が挙げられる。炎症性疾患としては、２型糖尿病、歯周病等が挙げられる。アレルギー疾患としては、不適合輸血による溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血、薬剤性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、顆粒球減少症、Ｇｏｏｄｐａｓｕｔｕｒｅ症候群、血清病、過敏性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、多発性硬化症、関節リウマチ、糸球体腎炎等が挙げられる。Ｂ細胞性腫瘍としては、前駆Ｂ細胞腫瘍及び成熟Ｂ細胞性腫瘍が挙げられる。前駆Ｂ細胞腫瘍としては、Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫が挙げられる。成熟Ｂ細胞腫瘍としては、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫、単クローン性Ｂ細胞リンパ球増加症、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、脾辺縁帯リンパ腫、有毛細胞白血病、脾Ｂ細胞リンパ腫／白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、μ重鎖病、γ重鎖病、α重鎖病、ＩｇＭ型ＭＧＵＳ、ＩｇＧ／ＩｇＡ型ＭＧＵＳ、形質細胞腫、骨単発性形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、単クローン性免疫グロブリン沈着病、粘膜関連リンパ組織型節外性辺縁帯リンパ腫（ＭＡＬＴリンパ腫）、節性辺縁帯リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小児濾胞性リンパ腫、ＩＲＦ４転座を伴う大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、中枢神経原発ＤＬＢＣＬ、皮膚原発ＤＬＢＣＬ、ＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬ、ＥＢＶ陽性粘膜皮膚潰瘍、慢性炎症に伴うＤＬＢＣＬ、リンパ腫様肉芽腫症、縦隔（胸腺）発生大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、原発性浸出液リンパ腫、ＨＨＶ８陽性ＤＬＢＣＬ、バーキットリンパ腫、１１ｑ異常を伴うバーキット様リンパ腫、ＭＹＣ及びＢＣＬ２及び／又はＢＣＬ６再構成を伴う高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、ＤＬＢＣＬと古典的ホジキンリンパ腫の中間型を伴う分類不納型のＢ細胞リンパ腫等が挙げられる。これらＢ細胞関連疾患のうち、好ましくは成熟Ｂ細胞性腫瘍であり、さらに好ましくは慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫及びＤＬＢＣＬ、形質細胞腫であり、さらに好ましくは慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫及びＤＬＢＣＬである。
【００５３】
本発明の二重特異性抗体を含有する医薬組成物は、当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化することができる。
【００５４】
経口投与用には、本発明の二重特異性抗体を、水、生理食塩水のような希釈剤に有効量溶解させた液剤、有効量を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量を懸濁させた懸濁液剤、有効量を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等の剤型に製剤化することができる。
【００５５】
非経口投与用には、本発明の二重特異性抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、坐剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、本発明の二重特異性抗体を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、本発明の医薬組成物は、油性又は水性のビークル中で、懸濁液、溶液、又は乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、本発明の二重特異性抗体を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液又は懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、本発明の二重特異性抗体を粉末化し、ラクトース又はデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、本発明の二重特異性抗体をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の医薬組成物は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
【００５６】
これらの剤型のうち、好ましい態様は注射剤であり、非経口（例えば、静脈内、経皮、皮内、腹腔内、筋内）で投与することが好ましい。
【００５７】
有効成分である二重特異性抗体の投与量は、患者の症状、投与経路、体重、年令等に応じて適宜設定すればよいが、例えば成人１日あたり０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましく、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇを投与するのがさらに好ましい。
【００５８】
本発明の医薬組成物には、本発明の二重特異性抗体以外に、Ｂ細胞関連疾患、好ましくはＢ細胞性腫瘍の治療に有用な成分、例えば化学療法剤、他の抗体医薬等を配合することもできる。
【実施例】
【００５９】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【００６０】
実施例１  発現ベクターの構築
（１）ヒト化抗ＩｇＭ抗体（１）に関する発現ベクターの構築
ヒト化抗ＩｇＭ抗体（１）重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子は、既知マウス抗ＩｇＭ抗体（ＧｅｎＢａｎｋエントリー：Ｌ１７０３７．１）を参考に、定法によりマウスフレームワーク領域（ＦＲ）を対応するヒトＦＲをコードする塩基配列に置換することで得た。表２において、使用した重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を配列番号１〜３に、また、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号４〜６に示す。ＣＤＲはＫａｂａｔの定義に準拠した。【００６１】
【表２】
2018174274.tif 000004
【００６２】
得られた重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片の上流部に公知の細胞外分泌シグナル配列（Ｈａｉｓｍａ，Ｈ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９２（１）：１８４−１９０，１９９８．）を連結し、さらにクローニングを容易にするため、重鎖の分泌シグナル配列の上流部に制限酵素ＫｐｎＩ認識配列を、また可変領域３’末端部には可変領域と定常領域の接合部のアミノ酸を変異させないように制限酵素ＮｈｅＩ認識配列を連結した。同様に、軽鎖の分泌シグナル配列の上流部に制限酵素Ｈｉｎｄ  III認識配列を、また可変領域３’末端部には制限酵素ＢｓｉＷＩ認識配列を連結した。デザインした重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子をＰＣＲ法により合成し、ＰＣＲ産物をクローニングベクター（ｐ３Ｔなど）にクローニング後、塩基配列を確認し、デザインした遺伝子配列と同一の塩基配列をもつクローンを選抜した。
ヒト化抗ＩｇＭ抗体（１）発現ベクターは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域遺伝子断片が挿入された各クローニングベクターより、特異的な制限酵素によって得られる遺伝子断片をＷＯ２０１４／０６９６４７の実施例１に記載のヒトκ軽鎖定常領域遺伝子及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子を有する抗体発現ベクターに順次連結した。連結したベクターは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子またはハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒト化抗ヒトＩｇＭ抗体（１）遺伝子を発現する。【００６３】
（２）ヒト型抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）発現ベクターの構築
ヒト型抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子は、特開２００５−３２５１３３の実施例１２に記載の抗体可変領域塩基配列を元にＰＣＲプライマーを設計し、ＰＣＲ法により合成した。ＰＣＲ産物をクローニングベクター（ｐ３Ｔなど）にクローニング後、記載された遺伝子配列と同一の配列をもつクローンを選抜した。表３において、使用した抗体の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号７〜９に、また、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号１０〜１２に示す。【００６４】
【表３】
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【００６５】
得られた重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片の上流部に実施例１（１）と同一の細胞外分泌シグナル配列を連結し、さらに、分泌シグナル配列の上流部及び可変領域３’末端部に制限酵素認識配列を連結した。実施例１（１）と同様にして、目的とする遺伝子配列と同一の塩基配列をもつクローンを選抜した後、特異的な制限酵素によって重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片を切り出し、ＷＯ２０１４／０６９６４７の実施例１に記載のヒトκ軽鎖定常領域遺伝子及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子を有する抗体発現ベクターに順次連結した。連結したベクターは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子またはピューロマイシン耐性遺伝子、ヒト型抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）遺伝子を発現する。【００６６】
（３）キメラ抗ＣＤ２０抗体（１）発現ベクターの構築
キメラ抗ＣＤ２０抗体（１）の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子は、特表平８−５０３４６８の実施例IIに記載の抗体可変領域塩基配列を元にＰＣＲプライマーを設計し、ＰＣＲ法により合成した。ＰＣＲ産物をクローニングベクター（ｐ３Ｔなど）にクローニング後、記載された遺伝子配列と同一の配列をもつクローンを選抜した。表４において、重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号１３〜１５に、また、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号１６〜１８に示す。【００６７】
【表４】
2018174274.tif 000006
【００６８】
特表平８−５０３４６８の実施例IIＡに記載の分泌シグナル配列を含む重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片の５’末端部及び３’末端部に制限酵素認識配列を実施例１（１）に従って連結した。実施例１（１）と同様にして、目的とする遺伝子配列と同一の塩基配列をもつクローンを選抜した後、特異的な制限酵素によって重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片を切り出し、ＷＯ２０１４／０６９６４７の実施例１に記載のヒトκ軽鎖定常領域遺伝子及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子を有する抗体発現ベクターに順次連結した。連結したベクターは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、キメラ抗ＣＤ２０抗体（１）遺伝子を発現する。【００６９】
（４）キメラ抗ＣＤ２０抗体（２）発現ベクターの構築
定法に従って、Ｒａｍｏｓ細胞（ＣＲＬ−１５９６、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、マウス抗ＣＤ２０抗体産生ハイブリドーマを樹立した。Ｒａｍｏｓ細胞はヒトのバーキットリンパ腫由来の細胞株であり、細胞表面にＣＤ２０、ＩｇＭ、ＣＤ３７を発現する。Ｒａｍｏｓ細胞はＲａｍｏｓ細胞増殖培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。Ｒａｍｏｓ細胞増殖培地はＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（ペニシリン最終濃度：１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、ストレプトマイシン最終濃度：０．１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む。ハイブリドーマ全ＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、抗体可変領域遺伝子をクローニングした。表５において、取得した抗体の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号１９〜２１に、また、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号２２〜２４に示す。【００７０】
【表５】
2018174274.tif 000007
【００７１】
得られた重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片の上流部に実施例１（１）と同一の細胞外分泌シグナル配列を連結し、さらに、分泌シグナル配列の上流部及び可変領域３’末端部に制限酵素認識配列を連結した。実施例１（１）と同様にして、目的とする遺伝子配列と同一の塩基配列をもつクローンを選抜した後、特異的な制限酵素によって重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片を切り出し、ＷＯ２０１４／０６９６４７の実施例１に記載のヒトκ軽鎖定常領域遺伝子及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子を有する抗体発現ベクターに順次連結した。連結したベクターは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、キメラ抗ＣＤ２０抗体遺伝子（２）を発現する。【００７２】
（５）キメラ抗ＣＤ３２ｂ抗体発現ベクターの構築
キメラ抗ＣＤ３２ｂ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子は、ＵＳ２００６／００７３１４２  Ａ１のＥｘａｍｐｌｅ  １．０に記載の抗体可変領域の塩基配列を参考にして得た。表６において、重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号２５〜２６に、又軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号２７〜２９に示す。なお、重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列はＦＤＹである。【００７３】
【表６】
2018174274.tif 000008
【００７４】
得られた重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片の上流部に実施例１（１）と同一の細胞外分泌シグナル配列を連結し、さらに、分泌シグナル配列の上流部及び可変領域３’末端部に制限酵素認識配列を連結した。実施例１（１）と同様にして、目的とする遺伝子配列と同一の塩基配列をもつクローンを選抜した後、特異的な制限酵素によって重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片を切り出し、ＷＯ２０１４／０６９６４７の実施例１に記載のヒトκ軽鎖定常領域遺伝子及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子を有する抗体発現ベクターに順次連結した。連結したベクターは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、キメラ抗ＣＤ３２ｂ抗体遺伝子を発現する。【００７５】
（６）キメラ抗ＣＤ３７抗体発現ベクターの構築
定法に従って、Ｒａｍｏｓ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、マウス抗ＣＤ３７抗体産生ハイブリドーマを樹立した。ハイブリドーマ全ＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し抗体可変領域遺伝子をクローニングした。表７において、クローニングした抗体の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号３０〜３２に、又軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号３３〜３５に示す。【００７６】
【表７】
2018174274.tif 000009
【００７７】
得られた重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片の上流部に実施例１（１）と同一の細胞外分泌シグナル配列を連結し、さらに、分泌シグナル配列の上流部及び可変領域３’末端部に制限酵素認識配列を連結した。実施例１（１）と同様にして、目的とする遺伝子配列と同一の塩基配列をもつクローンを選抜した後、特異的な制限酵素によって重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片を切り出し、ＷＯ２０１４／０６９６４７の実施例１に記載のヒトκ軽鎖定常領域遺伝子及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子を有する抗体発現ベクターに順次連結した。連結したベクターは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、キメラ抗ＣＤ３７抗体遺伝子を発現する。【００７８】
（７）ヒト化抗ＣＤ５２抗体発現ベクターの構築
ヒト化抗ＣＤ５２抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子は、特表平２−５０３５１４の実施例１に記載の抗体可変領域の塩基配列を参考にして取得した。表８において、重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号３６〜３８に、又軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号３９〜４１に示す。【００７９】
【表８】
2018174274.tif 000010
【００８０】
得られた重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片の上流部に実施例１（１）と同一の細胞外分泌シグナル配列を連結し、さらに、分泌シグナル配列の上流部及び可変領域３’末端部に制限酵素認識配列を連結した。実施例１（１）と同様にして、目的とする遺伝子配列と同一の塩基配列をもつクローンを選抜した後、特異的な制限酵素によって重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片を切り出し、ＷＯ２０１４／０６９６４７の実施例１に記載のヒトκ軽鎖定常領域遺伝子及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子を有する抗体発現ベクターに順次連結した。連結したベクターは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、ヒト化抗ＣＤ５２抗体遺伝子を発現する。【００８１】
（８）ヒト化抗ＢＡＦＦ受容体抗体発現ベクターの構築
ヒト化抗ＢＡＦＦ受容体抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子を取得する。得られる重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片の上流部に実施例１（１）と同一の細胞外分泌シグナル配列を連結し、さらに、分泌シグナル配列の上流部及び可変領域３’末端部に制限酵素認識配列を連結する。実施例１（１）と同様にして、目的とする遺伝子配列と同一の塩基配列をもつクローンを選抜した後、特異的な制限酵素によって重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片を切り出し、ＷＯ２０１４／０６９６４７の実施例１に記載のヒトκ軽鎖定常領域遺伝子及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子を有する抗体発現ベクターに順次連結する。連結したベクターは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、ヒト化抗ＢＡＦＦ受容体抗体遺伝子を発現する。【００８２】
（９）キメラ抗ＢＣＭＡ抗体発現ベクターの構築
キメラ抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子は、特許第６０６１４６９号に記載のＣ１２Ａ３．２の可変領域のアミノ酸配列を参考にして取得した。表９において、重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号４２〜４４に、又、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号４５〜４７に示す。【００８３】
【表９】
2018174274.tif 000011
【００８４】
得られた重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片の上流部に実施例１（１）と同一の細胞外分泌シグナル配列を連結し、さらに、分泌シグナル配列の上流部及び可変領域３’末端部に制限酵素認識配列を連結する。実施例１（１）と同様にして、目的とする遺伝子配列と同一の塩基配列をもつクローンを選抜した後、特異的な制限酵素によって重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片を切り出し、ＷＯ２０１４／０６９６４７の実施例１に記載のヒトκ軽鎖定常領域遺伝子及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子を有する抗体発現ベクターに順次連結した。連結したベクターは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、キメラ抗ＢＣＭＡ抗体遺伝子を発現する。【００８５】
（１０）キメラ抗ＴＡＣＩ抗体発現ベクターの構築
キメラ抗ＴＡＣＩ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子を取得する。得られる重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片の上流部に実施例１（１）と同一の細胞外分泌シグナル配列を連結し、さらに、分泌シグナル配列の上流部及び可変領域３’末端部に制限酵素認識配列を連結する。実施例１（１）と同様にして、目的とする遺伝子配列と同一の塩基配列をもつクローンを選抜した後、特異的な制限酵素によって重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片を切り出し、ＷＯ２０１４／０６９６４７の実施例１に記載のヒトκ軽鎖定常領域遺伝子及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子を有する抗体発現ベクターに順次連結する。連結したベクターは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、キメラ抗ＴＡＣＩ抗体遺伝子を発現する。【００８６】
（１１）キメラ抗ＩｇＭ抗体発現ベクターの構築
定法に従って、ＷＫＡＨ／ＨｋｍラットＢ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、マウス抗ＩｇＭ抗体産生ハイブリドーマを樹立した。ハイブリドーマ全ＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、抗体可変領域遺伝子をクローニングした。表１０において、取得した抗体の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号４８〜５０に、又軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号５１〜５３に示す。【００８７】
【表１０】
2018174274.tif 000012
【００８８】
マウス抗ＩｇＭ抗体に由来する分泌シグナル配列を含む重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片の５’末端部及び３’末端部に実施例１（１）に従って制限酵素認識配列を連結した。目的とする遺伝子配列と同一の塩基配列をもつクローンを選抜した後、特異的な制限酵素によって重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片を切り出し、ＷＯ２０１４／０６９６４７の実施例１に記載のヒトκ軽鎖定常領域遺伝子及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子を有する抗体発現用ベクターに順次連結した。連結したベクターは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、キメラ抗ＩｇＭ抗体遺伝子を発現する。【００８９】
（１２）ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体（陰性対照）発現ベクターの構築
ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体（陰性対照）の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子は、ＵＳ５５５８８６４のＥＸＡＭＰＬＥ４に記載の抗体可変領域の塩基配列を参考にして得た。表１１において、重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号５４〜５６に、又軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号５７〜５９に示す。【００９０】
【表１１】
2018174274.tif 000013
【００９１】
得られた重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片の上流部に実施例１（１）と同一の細胞外分泌シグナル配列を連結し、さらに、分泌シグナル配列の上流部及び可変領域３’末端部に制限酵素認識配列を連結した。実施例１（１）と同様にして、目的とする遺伝子配列と同一の塩基配列をもつクローンを選抜した後、特異的な制限酵素によって重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片を切り出し、ＷＯ２０１４／０６９６４７の実施例１に記載のヒトκ軽鎖定常領域遺伝子及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子を有する抗体発現ベクターに順次連結した。連結したベクターは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体遺伝子を発現する。【００９２】
（１３）キメラ抗ＩｇＭ抗体に関する発現ベクターの構築
定法に従って、ヒトＩｇＭおよびサルＩｇＭをＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、マウス抗ＩｇＭ抗体産生ハイブリドーマを４株樹立した。ハイブリドーマ全ＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し抗体可変領域遺伝子をクローニングした。表１２において、クローニングした抗ＩｇＭ抗体（２）の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号６０〜６２に、また、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号６３〜６５に示す。表１３において、クローニングした抗ＩｇＭ抗体（３）の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号６６〜６８に、また、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号６９〜７１に示す。表１４において、クローニングした抗ＩｇＭ抗体（４）の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号７２〜７４に、また、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号７５〜７７に示す。表１５において、クローニングした抗ＩｇＭ抗体（５）の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号７８〜８０に、また、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号８１〜８３に示す。【００９３】
【表１２】
2018174274.tif 000014
【００９４】
【表１３】
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【００９５】
【表１４】
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【００９６】
【表１５】
2018174274.tif 000017
【００９７】
得られた分泌シグナル配列、重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片の上流部及び可変領域３’末端部に制限酵素認識配列を連結した。実施例１（１）と同様にして、目的とする遺伝子配列と同一の塩基配列をもつクローンを選抜した後、特異的な制限酵素によって重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片を切り出し、ＷＯ２０１４／０６９６４７の実施例１に記載のヒトκ軽鎖定常領域遺伝子及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子を有する抗体発現ベクターに順次連結した。連結したベクターは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子と、キメラ抗ヒトＩｇＭ抗体（２）遺伝子、キメラ抗ヒトＩｇＭ抗体（３）遺伝子、キメラ抗ヒトＩｇＭ抗体（４）遺伝子又はキメラ抗ヒトＩｇＭ抗体（５）遺伝子を発現する。【００９８】
（１４）キメラ抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（２）発現ベクターの構築
キメラ抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（２）の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子は、ＵＳ７６１２１８０のＦｉｇ１及びＦｉｇ２記載の抗体可変領域の塩基配列を元にＰＣＲプライマーを設計し、ＰＣＲ法により合成した。ＰＣＲ産物をクローニングベクター（ｐ３Ｔなど）にクローニング後、記載された遺伝子配列と同一の配列をもつクローンを選抜した。表１６において、使用した抗体の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号８４〜８６に、また、軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号８７〜８９に示す。【００９９】
【表１６】
2018174274.tif 000018
【０１００】
得られた重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片の上流部に実施例１（１）と同一の細胞外分泌シグナル配列を連結し、さらに、分泌シグナル配列の上流部及び可変領域３’末端部に制限酵素認識配列を連結した。実施例１（１）と同様にして、目的とする遺伝子配列と同一の塩基配列をもつクローンを選抜した後、特異的な制限酵素によって重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片を切り出し、ＷＯ２０１４／０６９６４７の実施例１に記載のヒトκ軽鎖定常領域遺伝子及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子を有する抗体発現ベクターに順次連結した。連結したベクターは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子またはピューロマイシン耐性遺伝子、キメラ抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（２）遺伝子を発現する。【０１０１】
（１５）ヒト化抗ＣＤ３８抗体発現ベクターの構築
ヒト化抗ＣＤ３８抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子は、ＷＯ２０１２／０９２６１２に記載の抗体可変領域の塩基配列を参考にして取得した。表１７において、重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号９０〜９２に、又軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号９３〜９５に示す。【０１０２】
【表１７】
2018174274.tif 000019
【０１０３】
得られた重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片の上流部に実施例１（１）と同一の細胞外分泌シグナル配列を連結し、さらに、分泌シグナル配列の上流部及び可変領域３’末端部に制限酵素認識配列を連結した。実施例１（１）と同様にして、目的とする遺伝子配列と同一の塩基配列をもつクローンを選抜した後、特異的な制限酵素によって重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片を切り出し、ＷＯ２０１４／０６９６４７の実施例１に記載のヒトλ軽鎖定常領域遺伝子及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子を有する抗体発現ベクターに順次連結した。連結したベクターは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、ヒト化抗ＣＤ３８抗体遺伝子を発現する。【０１０４】
（１６）ヒト化抗ＣＤ８１抗体発現ベクターの構築
ヒト化抗ＣＤ８１抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子は、ＷＯ２０１２／０７７６４９に記載の抗体可変領域の塩基配列を参考にして取得した。表１８において、重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号９６〜９８に、又軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を配列番号９９〜１０１に示す。【０１０５】
【表１８】
2018174274.tif 000020
【０１０６】
得られた重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片の上流部に実施例１（１）と同一の細胞外分泌シグナル配列を連結し、さらに、分泌シグナル配列の上流部及び可変領域３’末端部に制限酵素認識配列を連結した。実施例１（１）と同様にして、目的とする遺伝子配列と同一の塩基配列をもつクローンを選抜した後、特異的な制限酵素によって重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片を切り出し、ＷＯ２０１４／０６９６４７の実施例１に記載のヒトλ軽鎖定常領域遺伝子及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子を有する抗体発現ベクターに順次連結した。連結したベクターは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、ヒト化抗ＣＤ８１抗体遺伝子を発現する。【０１０７】
実施例２  抗体の製造
（１）モノクローナル抗体の製造
上記実施例１で作製した抗体発現ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、又はＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて遺伝子導入した。メーカー指図書に従い、３２〜３７℃、５〜８％ＣＯ２条件下で１〜２週間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりモノクローナル抗体をＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥヘルスケア）を用いて精製した。モノクローナル抗体はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）に対して透析した後、試験使用時まで４℃に保存した。【０１０８】
（２）二重特異性抗体の製造
（２−１）Ｃｙｓ１ｍ型二重特異性抗体の製造
上記実施例１で作製した抗体発現ベクターを、ＷＯ２０１４／０６９６４７に従って改変した。具体的には、プロテインＡ結合能の差異を指標に効率的に二重特異性抗体を精製するため、抗ＩｇＭ抗体（１）の重鎖にＨ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆの変異を導入し、ヒトＩｇＧ１型からヒトＩｇＧ３型に置換した。また、二重特異性抗体を調製する際の抗ＩｇＭ抗体（１）の組み合わせ相手がキメラ抗ＣＤ２０抗体（１）の場合には、抗ＩｇＭ抗体（１）の軽鎖−重鎖間の天然型ジスルフィド結合を無効化するため、軽鎖にＣ２１４Ｓの変異を、重鎖にＣ２２０Ｓの変異を加え、非天然型ジスルフィド結合を導入するために、軽鎖にＳ１６２Ｃの変異を、重鎖にＦ１７０Ｃの変異を加えた。組み合わせ相手がキメラ抗ＣＤ２０抗体（１）以外の場合は、同じ変異を相手方に導入した。これらの変異により、所望の軽鎖と重鎖の組み合わせを有する抗体を効率よく製造することができる。得られた抗ＩｇＭ抗体（１）発現改変ベクター及び抗Ｂ細胞表面抗原抗体発現改変ベクターを共にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆ細胞又はＥｘｐｉＣＨＯ細胞に遺伝子導入した。メーカー指図書に従い、３２〜３７℃、５％〜８％ＣＯ２存在下で１〜２週間培養後、培養上清を回収した。培養上清をＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥヘルスケア）またはＰｒｏＳｅｐ−ｖＡ  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  カラム（メルクミリポア）を用いて精製後、二重特異性抗体をＣＥＸクロマトグラフィーにて分取した。分取には強陽イオン交換カラムＰＬ−ＳＣＸ（Ａｇｉｌｅｎｔ、粒子径：８μｍ、細孔径：１０００Å）を用いた。移動相に移動相Ａ液（１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０）及び移動相Ｂ液（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０）を用いた。初期移動相（９８％Ａ液、２％Ｂ液）を流速１ｍＬ／ｍｉｎにてカラムの５倍容量以上を送液して予めカラムを平衡化させておき、ここに精製した試料を注入し（０ｍｉｎ）、カラムに試料を電荷的に結合させた。初期移動相で５分間洗浄後、Ｂ液の最終混合率が４０％となるよう、１分間当たり０．８％増の直線勾配で４７．５分間漸増させた。その後、直ちにＢ液の混合率を１００％とし、カラムを洗浄した。この間、２８０ｎｍにおける吸収を記録し、二重特異性抗体の保持時間に相当するピークを分取した。取得した二重特異性抗体はＰＢＳ（ｐＨ７．０）に対して透析後、試験使用時まで４℃に保存した。【０１０９】
（２-２）Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅｓ（ＫＩＨ）型二重特異性抗体の製造
二重特異性抗体の別態様として、上記実施例１で作製した抗体発現ベクターを、ＵＳ５７３１１６８Ａ及びＭａｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６（７）：６７７−６８１，１９９８．に従って改変した。具体的には、抗ＩｇＭ抗体（１）の重鎖にＴ３６６Ｗの変異を加え、抗ＩｇＭ抗体（１）の組み合わせ相手となる抗Ｂ細胞表面抗原抗体の重鎖にＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの変異を導入した。これらの変異により、所望の重鎖と重鎖の組み合わせを有する抗体を効率よく製造することができる。さらに、プロテインＡ結合能の差異を指標に効率的に二重特異性抗体を精製するため、抗Ｂ細胞表面抗原抗体の重鎖にＨ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆの変異を導入し、ヒトＩｇＧ１型からヒトＩｇＧ３型に置換した。得られた抗ＩｇＭ抗体（１）発現改変ベクター及び抗Ｂ細胞表面抗原抗体発現改変ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆ細胞又はＥｘｐｉＣＨＯ細胞に遺伝子導入した。メーカー指図書に従い、３２〜３７℃、５％〜８％ＣＯ２存在下で１〜２週間培養後、培養上清を回収した。抗ＩｇＭ抗体（１）発現改変ベクターを導入した細胞の培養上清は、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥヘルスケア）を用いて精製後、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）に対して透析した。抗Ｂ細胞表面抗原抗体発現改変ベクターを導入した細胞の培養上清は、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（ＧＥヘルスケア）を用いて精製後、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）に対して透析した。得られた抗ＩｇＭ抗体（１）と抗Ｂ細胞表面抗原抗体を１：１で混合し、そこに終濃度２０ｍＭ  還元型グルタチオン（Ｗａｋｏ）及び２ｍＭ  酸化型グルタチオン（Ｗａｋｏ）を添加し、２５℃で１３〜１５時間反応させた。反応後、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムにて抗体を精製し、さらにサイズ排除クロマトグラフィー（東ソー、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ）にて二重特異性抗体を分取した。移動相には０．２Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４、０．２５Ｍ  ＫＣｌ（ｐＨ７．０）を用いた。取得した二重特異性抗体はＰＢＳ（ｐＨ７．０）に対して透析後、試験使用時まで４℃に保存した。【０１１０】
（２-３）Ｃｙｓ１ｍ型およびＫＩＨ型二重特異性抗体の製造 
上記実施例１で作製した抗体発現ベクターを、ＷＯ２０１４／０６９６４７に従って改変した。具体的には、プロテインＡ結合能の差異を指標に効率的に二重特異性抗体を精製するため、抗ＩｇＭ抗体（２）〜（５）と組み合わせる抗Ｂ細胞表面抗原抗体の重鎖にＨ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆの変異を導入し、ヒトＩｇＧ１型からヒトＩｇＧ３型に置換した。二重特異性抗体を調製する際の抗ＩｇＭ抗体（２）〜（５）の組み合わせ相手となる抗Ｂ細胞表面抗原抗体に軽鎖−重鎖間の天然型ジスルフィド結合を無効化するため、軽鎖にＣ２１４Ｓの変異を、重鎖にＣ２２０Ｓの変異を加え、非天然型ジスルフィド結合を導入するために、軽鎖にＳ１６２Ｃの変異を、重鎖にＦ１７０Ｃの変異を加えた（Ｃｙｓ１ｍ型）。また、上記実施例１で作製した抗体発現ベクターを、ＵＳ５７３１１６８Ａ及びＭａｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６（７）：６７７−６８１，１９９８．に従って改変を加えた。具体的には、抗ＩｇＭ抗体（２）〜（５）の重鎖にＴ３６６Ｗの変異を加え、抗ＩｇＭ抗体（２）〜（５）の組み合わせ相手となる抗Ｂ細胞表面抗原抗体の重鎖にＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの変異を導入した（ＫＩＨ型）。これらの変異により、所望の軽鎖と重鎖の組み合わせを有する抗体を効率よく製造することができる。得られた抗ＩｇＭ抗体（２）〜（５）発現改変ベクター及び抗Ｂ細胞表面抗原抗体発現改変ベクターを共にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆ細胞又はＥｘｐｉＣＨＯ細胞に遺伝子導入した。メーカー指図書に従い、３２〜３７℃、５％〜８％ＣＯ２存在下で１〜２週間培養後、培養上清を回収した。培養上清をＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥヘルスケア）を用いて精製後、二重特異性抗体をＣＥＸクロマトグラフィーにて分取した。分取には強陽イオン交換カラムＰＬ−ＳＣＸ（Ａｇｉｌｅｎｔ、粒子径：８μｍ、細孔径：１０００Å）を用いた。移動相に移動相Ａ液（１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０）及び移動相Ｂ液（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０）を用いた。初期移動相（９８％Ａ液、２％Ｂ液）を流速１ｍＬ／ｍｉｎにてカラムの５倍容量以上を送液して予めカラムを平衡化させておき、ここに精製した試料を注入し（０ｍｉｎ）、カラムに試料を電荷的に結合させた。初期移動相で５分間洗浄後、Ｂ液の最終混合率が４０％となるよう、１分間当たり０．８％増の直線勾配で４７．５分間漸増させた。その後、直ちにＢ液の混合率を１００％とし、カラムを洗浄した。この間、２８０ｎｍにおける吸収を記録し、二重特異性抗体の保持時間に相当するピークを分取した。取得した二重特異性抗体はＰＢＳ（ｐＨ７．０）に対して透析後、試験使用時まで４℃に保存した。【０１１１】
実施例３  二重特異性抗体の抗原結合能の解析
（１）ＨＨ細胞膜表面上のＩｇＭ分子数及びＨＬＡ−ＤＲ分子数の測定
作製した抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体がＨＬＡ−ＤＲ及びＩｇＭに対する結合性を有することを確認するため、ＨＨ細胞を用いた。まず、ＨＨ細胞膜表面上に存在するＨＬＡ-ＤＲ及びＩｇＭの分子数を調べた。ＨＨ細胞（ＣＲＬ-２１０５、ＡＴＣＣ）はヒトＴ細胞性リンパ腫由来の細胞株であることからＩｇＭは発現しないと考えられ、一方、細胞膜表面上にＨＬＡ−ＤＲを発現することは知られている。ＨＨ細胞は１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液を含むＲＰＭＩ１６４０を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
ＨＬＡ−ＤＲ及びＩｇＭの分子数についてはＱＩＦキット（Ｄａｋｏ）を用いて測定した。具体的には、予めＨＨ細胞を播種した９６ウェルプレート（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）にマウス抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体若しくはマウス抗ＩｇＭ抗体（２０μｇ／ｍＬ）を５０μＬ添加し、氷上で１時間反応させた。その後、２００μＬの５％のＦＢＳを含むＰＢＳ（５％ＦＢＳ／ＰＢＳ）で２回洗浄した。次に、キット付属のＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体を５％ＦＢＳ／ＰＢＳで５０倍希釈し、各ウェルに１００μＬずつ添加した。氷上で４５分間反応させた後、２００μＬの５％ＦＢＳ／ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで希釈した１％ホルムアルデヒド（関東化学）でＨＨ細胞を固定した。固定した細胞はフローサイトメーター（ＦＣ５００ＭＰＬ、ベックマン・コールター）及び解析ソフトＣｙｔｏｍｉｃｓ  ＭＸＰ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ベックマン・コールター）を用いてＨＨ細胞に由来する蛍光を測定した。またその際、添付の指図書に従い、キットに付属するセットアップビーズ及びキャリブレーションビーズを用いて検量線を作成し、ＨＨ細胞膜表面上のＨＬＡ−ＤＲ及びＩｇＭの分子数を算出した。結果を図１に示す。縦軸は細胞あたりの分子数を示す。
試験の結果、細胞膜表面上のＩｇＭの分子数は−０．１ｘ１０５ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｅｌｌと算出され、ＨＬＡ-ＤＲの分子数は４．４ｘ１０５ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｃｅｌｌと算出された。ヒトＴ細胞由来のＨＨ細胞を用いた本試験の結果から、ＨＨ細胞は細胞膜上にＨＬＡ−ＤＲを発現し、ＩｇＭを発現しないことを確認した。【０１１２】
（２）抗ＩｇＭ／ＨＬＡ−ＤＲ二重特異性抗体のＩｇＭ及びＨＬＡ−ＤＲに対する結合
抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体がＩｇＭとＨＬＡ−ＤＲに同時に結合することを分泌型ＩｇＭ及びＨＨ細胞を用いて確認した。ＨＨ細胞は実施例３（１）の実験の通り、細胞膜表面上にＨＬＡ−ＤＲを発現しているが、ＩｇＭは発現していない。
このため、蛍光標識した分泌型ＩｇＭと二重特異性抗体とをＨＨ細胞に反応させた際には、二重特異性抗体がヘテロ二量体であればＨＨ細胞が蛍光標識されることになる。そこで、この試験系を用いて製造した二重特異性抗体がＩｇＭとＨＬＡ−ＤＲに同時に結合することを調べた。
分泌型ＩｇＭ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）をＬＹＮＸ  ＲＡＰＩＤ  ＲＰＥ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＫＩＴ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて、添付の指図書に従いＰＥ標識した。２０μｇ/ｍＬより公比３にて抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）又は抗ＩｇＭ抗体（１）を希釈した後、各々に２μｇ／ｍＬのＰＥ標識分泌型ＩｇＭを体積比１：１となるように添加し、室温で３０分間静置した。反応後、当該混合液を予めＨＨ細胞を播種した９６ウェルプレート（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に加え、氷上で１時間反応させた。続いて、各ウェルを２００μＬの５％ＦＢＳ／ＰＢＳで３回洗浄後、ＰＢＳで希釈した１％ホルムアルデヒド液で細胞を固定した。固定した細胞に結合したＰＥ標識由来の蛍光をフローサイトメーターにて測定し、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＭＸＰ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて解析した。結果を図２に示す。図の縦軸は平均蛍光強度（ＭＦＩ）、横軸は抗体濃度を示す。
抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）はＨＨ細胞に結合するが分泌型ＩｇＭとは結合しないため、蛍光は検出されなかった。また、抗ＩｇＭ抗体（１）は分泌型ＩｇＭに結合するがＨＨ細胞とは結合しないため、ＨＨ細胞はＰＥ標識されず蛍光は検出されなかった。一方、製造した抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体が目的とするヘテロ体を形成しているのであれば、ＨＨ細胞に結合すると同時にＰＥ標識分泌型ＩｇＭに結合し、ＰＥ標識されたＨＨ細胞が検出されるはずである。そこで、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体とＰＥ標識した分泌型ＩｇＭとＨＨ細胞を順次反応させたところ、ＰＥ標識されたＨＨ細胞が検出された。さらに、Ｃｙｓ１ｍ型二重特異性抗体とＫＩＨ型二重特異性抗体の結合曲線が同等であり、製造法の違いによる結合の差異はないことが示された。なお、データには示さないが、ＨＨ細胞のみ、ＨＨ細胞に分泌型ＩｇＭのみを処理、ＨＨ細胞に抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体のみを処理した場合においても蛍光は検出されなかった。
以上の結果から、製造したＣｙｓ１ｍ型及びＫＩＨ型の抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体は、目的とするヘテロ二量体であり、ＩｇＭとＨＬＡ−ＤＲに同時に結合する性質をもつことが示された。【０１１３】
実施例４  二重特異性抗体の細胞増殖阻害作用
（１）抗ＩｇＭ抗体と抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を組み合せた二重特異性抗体
（１−１）ＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害作用１
分泌型ＩｇＭ濃度上昇による抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体及び陰性対照としての抗ＥＧＦＲ抗体のＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害活性の変化を調べた。ＪｅＫｏ−１細胞（ＲＬ-３００６、ＡＴＣＣ）はヒトのマントル細胞リンパ腫由来の細胞株であり、細胞表面にＩｇＭ、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ２０を発現する。ＪｅＫｏ−１細胞はJｅＫｏ−１細胞増殖培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。JｅＫｏ−１細胞増殖培地は、ＲＰＭＩ１６４０に２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液を含む。増殖阻害活性は、４０μｇ／ｍＬより公比３にてJｅＫｏ−１細胞増殖培地で希釈した分泌型ＩｇＭと各抗体（１２００ｎｇ／ｍＬ）を体積比1：1で混合し、室温で３０分間静置した。予め培地に懸濁したＪｅＫｏ−１細胞を播種した９６ウェルプレート（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に、上記の当該混合液を体積比１：１となるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７２時間培養した。その際、抗体非添加群と１００％細胞死群（１％  Ｔｗｅｅｎ８０）を用意した。各ウェルにＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）を１０μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で３時間呈色反応を行った。その後、マイクロプレートリーダー（ｉＭａｒｋ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定し、次式（１）に従って、細胞増殖阻害活性（％）を算出した。【０１１４】
【数１】
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【０１１５】
結果を図３に示す。図の縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
抗ＩｇＭ抗体（１）の増殖阻害活性は、分泌型ＩｇＭ濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体は、分泌型ＩｇＭ濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。さらに、Ｃｙｓ１ｍ型二重特異性抗体とＫＩＨ型二重特異性抗体の増殖阻害活性は同等であり、製造法の違いによる活性の差異はないことが示された。【０１１６】
（１−２）ＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害作用２
実施例４（１−１）に準じて、分泌型ＩｇＭ濃度上昇による抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ抗体（１）と抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）の併用、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＪｅＫｏ−１細胞増殖阻害活性の変化を調べた。なお、抗体濃度は３００ｎｇ／ｍＬとし、抗体の併用では抗ＩｇＭ抗体（１）及び抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）をそれぞれ３００ｎｇ／ｍＬ（合計６００ｎｇ／ｍＬ）添加した。結果を図４に示す。図の縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
抗体を併用した場合の増殖阻害活性は、抗ＩｇＭ抗体（１）単独添加と同様に分泌型ＩｇＭ濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体は、分泌型ＩｇＭ濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。
以上のことから、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体は両親抗体を併用するよりも増殖阻害活性が優れていることが示された。【０１１７】
（１−３）Ｂ１０４細胞に対する増殖阻害作用
実施例４（１−１）に準じて、ＪｅＫｏ−１細胞の代わりにＢ１０４細胞を用いて、分泌型ＩｇＭ濃度上昇による抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体（１００ｎｇ／ｍＬ）のＢ１０４細胞に対する増殖阻害活性の変化を調べた。Ｂ１０４細胞（ＪＣＲＢ０１１７、ＪＣＲＢ細胞バンク）はヒトのＢ細胞性腫瘍由来の細胞株であり、細胞表面にＩｇＭ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３８及びＣＤ５２を発現する。Ｂ１０４細胞はＢ１０４細胞増殖培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。Ｂ１０４細胞増殖培地は、ＲＰＭＩ１６４０に２０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液を含む。また、分泌型ＩｇＭの希釈はＢ１０４細胞増殖培地を用いた。試験の結果を図５に示す。図の縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
抗ＩｇＭ抗体（１）の増殖阻害活性は、分泌型ＩｇＭ濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体は、分泌型ＩｇＭ濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。また、Ｃｙｓ１ｍ型二重特異性抗体とＫＩＨ型二重特異性抗体の増殖阻害活性は同等であり、製造法の違いによる活性の差異はないことが示された。
分泌型ＩｇＭ存在下における抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体の増殖阻害活性は、ＪｅＫｏ−１細胞、Ｂ１０４細胞の２種の細胞で同様の結果が得られたことから、ＩｇＭとＨＬＡ−ＤＲの両者を発現する細胞であれば、分泌型ＩｇＭが存在しても抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体の増殖阻害活性が発揮できるものと考えられた。【０１１８】
（１−４）Ｂ１０４細胞に対する増殖阻害作用
実施例４（１−１）に準じて、分泌型ＩｇＭ濃度上昇による抗ＩｇＭ抗体（２）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ（２）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＢ１０４細胞増殖阻害活性の変化を調べた。なお、抗体濃度は５００ｎｇ／ｍＬとした。結果を図２０に示す。図の縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
抗ＩｇＭ抗体（２）の増殖阻害活性は、分泌型ＩｇＭ濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗ＩｇＭ（２）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体は、分泌型ＩｇＭ濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。【０１１９】
（１−５）ＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害作用
実施例４（１−１）に準じて、分泌型ＩｇＭ濃度上昇による抗ＩｇＭ抗体（３）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ（３）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＪｅＫｏ−１細胞増殖阻害活性の変化を調べた。なお、抗体濃度は５００ｎｇ／ｍＬとした。結果を図２１に示す。図の縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
抗ＩｇＭ抗体（３）の増殖阻害活性は、分泌型ＩｇＭ濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗ＩｇＭ（３）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体は、分泌型ＩｇＭ濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。【０１２０】
（１−６）Ｂ１０４細胞に対する増殖阻害作用
実施例４（１−１）に準じて、分泌型ＩｇＭ濃度上昇による抗ＩｇＭ抗体（４）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ（４）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＢ１０４細胞増殖阻害活性の変化を調べた。なお、抗体濃度は５００ｎｇ／ｍＬとした。結果を図２２に示す。図の縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
抗ＩｇＭ抗体（４）の増殖阻害活性は、分泌型ＩｇＭ濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗ＩｇＭ（４）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体は、分泌型ＩｇＭ濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。【０１２１】
（１−７）Ｂ１０４細胞に対する増殖阻害作用
実施例４（１−１）に準じて、分泌型ＩｇＭ濃度上昇による抗ＩｇＭ抗体（５）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ（５）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＢ１０４細胞増殖阻害活性の変化を調べた。なお、抗体濃度は５００ｎｇ／ｍＬとした。結果を図２３に示す。図の縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
抗ＩｇＭ抗体（５）の増殖阻害活性は、分泌型ＩｇＭ濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗ＩｇＭ（５）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体は、分泌型ＩｇＭ濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。
抗Ｂ細胞表面抗原抗体と組み合わせる抗ＩｇＭ抗体はクローンに関係なく同様の結果が得られたことから、いずれの抗ＩｇＭ抗体クローンでも、抗ＩｇＭ／Ｂ細胞表面抗原二重特異性抗体は分泌型ＩｇＭ存在下において増殖阻害活性を有することが示された。【０１２２】
（１−８）Ｂ１０４細胞に対する増殖阻害作用
実施例４（１−１）に準じて、分泌型ＩｇＭ濃度上昇による抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＨＬＡ−ＤＲ（２）抗体、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（２）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＢ１０４細胞増殖阻害活性の変化を調べた。なお、抗体濃度は５００ｎｇ／ｍＬとした。結果を図２４に示す。図の縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
抗ＩｇＭ抗体（１）の増殖阻害活性は、分泌型ＩｇＭ濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（２）二重特異性抗体は、分泌型ＩｇＭ濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。
抗Ｂ細胞表面抗原抗体と組み合わせる抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体はクローンに関係なく同様の結果が得られたことから、いずれの抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体クローンでも、抗ＩｇＭ／ＨＬＡ−ＤＲ二重特異性抗体は分泌型ＩｇＭ存在下において増殖阻害活性を有することが示された。【０１２３】
（１−９）ヒト血清存在下でのＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害活性
ヒト血清存在下での抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害活性を調べた。具体的には、健常人ボランティアより採取した血清を５６℃、３０分間処理により非働化し、また抗体はＰＢＳにて最終濃度の１０倍濃度（１００μｇ／ｍＬ)となるよう調製した。生存率の測定にはＲｅａｌＴｉｍｅ−Ｇｌｏ  ＭＴ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。試験時は、９０％ヒト血清／１０％抗体液（抗体の最終濃度は１０μｇ／ｍＬ）となるよう、ヒト血清と抗体を混合し、ヒト血清非添加群では９０％ＪｅＫｏ−１細胞増殖培地／１０％抗体液とした。予め、ＪｅＫｏ−１細胞を播種した９６ウェルプレート（１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に当該混合液を添加し、さらに反応液１０μＬを指図書に従い添加した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で４８時間培養後、マイクロプレートリーダー（ＧｌｏＭａｘ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ、ＧＭ３０００、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて発光を測定し、次式（２）に従って、細胞生存率（％）を数値化した。【０１２４】
【数２】
2018174274.tif 000022
【０１２５】
また、有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いた。結果を図６に示す。図の縦軸は細胞生存率を示す。
「血清なし」の条件では、抗ＩｇＭ抗体（１）はＢ細胞性腫瘍細胞に対して増殖阻害活性を示したが、「血清あり」の条件では、抗ＩｇＭ抗体（１）の増殖阻害活性は消失した。一方、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体は血清の有無に関わらず増殖阻害活性を示した。さらに、Ｃｙｓ１ｍ型二重特異性抗体とＫＩＨ型二重特異性抗体の増殖阻害活性は同等であり、製造法の違いによる活性の差異はないことが示された。
以上のことから、抗ＩｇＭ抗体はヒト血清中で増殖阻害活性を失うが、抗ＩｇＭ／ＨＬＡ−ＤＲ二重特異性抗体にすると血清中でも活性を維持することが示された。
なお、本試験は２人のヒト血清で試験を実施したが、両ドナーの非働化血清で同等の結果が得られ、ドナーによる違いは認められなかった。【０１２６】
（２）抗ＩｇＭ抗体と抗ＣＤ２０抗体を組み合せた二重特異性抗体
（２−１）ＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害作用１
実施例４（１−１）に準じて、分泌型ＩｇＭ濃度上昇による抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＣＤ２０抗体（１）、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ２０（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体（３００ｎｇ／ｍＬ）のＪｅＫｏ−１細胞増殖阻害活性の変化を調べた。結果を図７に示す。図の縦軸は増殖阻害活性、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
抗ＩｇＭ抗体（１）の増殖阻害活性は、分泌型ＩｇＭ濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ２０（１）二重特異性抗体は、分泌型ＩｇＭ濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。さらに、Ｃｙｓ１ｍ型二重特異性抗体とＫＩＨ型二重特異性抗体の増殖阻害活性は同等であり、製造法の違いによる活性の差異はないことが示された。【０１２７】
（２−２）ＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害作用２
実施例４（２−１）で用いた抗ＣＤ２０抗体（１）とは異なるクローン由来の抗ＣＤ２０抗体（２）を組み合せた二重特異性抗体の検討を行った。実施例４（１−１）に準じて、分泌型ＩｇＭ濃度上昇による抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＣＤ２０抗体（２）、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ２０（２）二重特異性抗体及び陰性対照抗体（１，０００ｎｇ／ｍＬ）のＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害活性の変化を調べた。結果を図８に示す。図の縦軸は増殖阻害活性、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
抗ＩｇＭ抗体（１）の増殖阻害活性は、分泌型ＩｇＭ濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ２０（２）二重特異性抗体は、分泌型ＩｇＭ濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。
抗ＩｇＭ抗体と組み合わせる抗ＣＤ２０抗体は抗ＣＤ２０抗体（１）であっても抗ＣＤ２０抗体（２）であっても同様の結果が得られたことから、いずれの抗ＣＤ２０抗体クローンでも、抗ＩｇＭ／ＣＤ２０二重特異性抗体は分泌型ＩｇＭ存在下において増殖阻害活性を有することが示された。【０１２８】
（２−３）Ｂ１０４細胞に対する増殖阻害作用
実施例４（１−１）に準じて、分泌型ＩｇＭ濃度上昇による抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＣＤ２０抗体（１）、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ２０（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体（１，０００ｎｇ／ｍＬ）のＢ１０４細胞に対する増殖阻害活性の変化を調べた。尚、Ｂ１０４細胞の培養及び分泌型ＩｇＭの希釈にはＢ１０４細胞増殖培地を用いた。結果を図９に示す。図の縦軸は増殖阻害活性、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
抗ＩｇＭ抗体（１）の増殖阻害活性は、分泌型ＩｇＭ濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ２０（１）二重特異性抗体は、分泌型ＩｇＭ濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。また、Ｃｙｓ１ｍ型二重特異性抗体とＫＩＨ型二重特異性抗体の増殖阻害活性は同等であり、製造法の違いによる活性の差異はないことが示された。
分泌型ＩｇＭ存在下における抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ２０（１）二重特異性抗体の増殖阻害活性は、ＪｅＫｏ−１細胞、Ｂ１０４細胞の２種の細胞で同様の結果が得られたことから、ＩｇＭとＣＤ２０の両抗原を膜表面に発現する細胞であれば、分泌型ＩｇＭが存在しても抗ＩｇＭ／ＣＤ２０二重特異性抗体によって増殖阻害されることが示された。【０１２９】
（２−４）ヒト血清存在下でのＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害活性
実施例４（１−９）に準じて、ヒト血清存在下での抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＣＤ２０抗体（１）、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ２０（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体（１０μｇ／ｍＬ）のＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害活性を調べた。結果を図１０に示す。有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いた。図の縦軸は生存率を示す。
「血清なし」の条件では、抗ＩｇＭ抗体（１）はＢ細胞性腫瘍細胞に対して増殖阻害活性を示したが、「血清あり」の条件では、抗ＩｇＭ抗体（１）の増殖阻害活性は消失した。一方、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ２０（１）二重特異性抗体は血清の有無に関わらず増殖阻害活性を示した。また、Ｃｙｓ１ｍ型二重特異性抗体とＫＩＨ型二重特異性抗体の増殖阻害活性は同等であり、製造法の違いによる活性の差異はないことが示された。
以上のことから、抗ＩｇＭ抗体はヒト血清中で増殖阻害活性を失うが、抗ＩｇＭ／ＣＤ２０二重特異性抗体は血清中でもその活性を維持することが示された。
本試験は、２人のヒト血清で試験を実施したが、両ドナーの非働化血清で同等の結果が得られ、ドナーによる違いは認められなかった。【０１３０】
（３）抗ＩｇＭ抗体と抗ＣＤ３２ｂ抗体を組み合せた二重特異性抗体
（３−１）ＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害作用
実施例４（１−１）に準じて、分泌型ＩｇＭ濃度上昇による抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＣＤ３２ｂ抗体、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ３２ｂ抗体及び陰性対照抗体（３００ｎｇ／ｍＬ）のＪｅＫｏ−１細胞増殖阻害活性の変化を調べた。
その結果、抗ＩｇＭ抗体（１）及び抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ３２ｂ抗体の増殖阻害活性は、実施例４（１−１）の結果と同様の傾向を示した。【０１３１】
（４）抗ＩｇＭ抗体と抗ＣＤ３７抗体を組み合せた二重特異性抗体
（４−１）Ｒａｍｏｓ細胞に対する増殖阻害作用
実施例４（１−１）に準じて、分泌型ＩｇＭ濃度上昇による抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＣＤ３７抗体、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ３７二重特異性抗体及び陰性対照抗体（１，０００ｎｇ／ｍＬ）のＲａｍｏｓ細胞増殖阻害活性の変化を調べた。Ｒａｍｏｓ細胞は細胞表面にＩｇＭ及びＣＤ３７を発現する。尚、Ｒａｍｏｓ細胞の培養及び分泌型ＩｇＭの希釈にはＲａｍｏｓ細胞増殖培地を用いた。
その結果、抗ＩｇＭ抗体（１）及び抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ３７抗体の増殖阻害活性は、実施例４（１−１）の結果と同様の傾向を示した。【０１３２】
（５）抗ＩｇＭ抗体と抗ＣＤ５２抗体を組み合せた二重特異性抗体
（５−１）Ｂ１０４細胞に対する増殖阻害作用
実施例４（１−１）に準じて、分泌型ＩｇＭ濃度上昇による抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＣＤ５２抗体、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ５２二重特異性抗体及び陰性対照抗体（１，０００ｎｇ／ｍＬ）のＢ１０４細胞増殖阻害活性の変化を調べた。尚、Ｂ１０４細胞の培養及び分泌型ＩｇＭの希釈にはＢ１０４細胞増殖培地を用いた。結果を図１１に示す。図の縦軸は増殖阻害活性、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
抗ＩｇＭ抗体（１）の増殖阻害活性は、分泌型ＩｇＭ濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ５２二重特異性抗体は、分泌型ＩｇＭ濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。
実施例４（１）〜（５）の結果より本発明の抗ＩｇＭ／Ｂ細胞表面抗原抗体は、Ｂ細胞表面抗原の種類に関わらず、分泌型ＩｇＭ存在下でＢ細胞に対し細胞増殖阻害効果を示すことが示唆された。【０１３３】
（６）抗ＩｇＭ抗体と抗ＢＡＦＦ受容体抗体を組み合せた二重特異性抗体
（６−１）Ｊｅｋｏ−１細胞又はＢ１０４細胞に対する増殖阻害作用
実施例４（１−１）に準じて、分泌型ＩｇＭ濃度上昇による抗ＩｇＭ抗体、抗ＢＡＦＦ受容体抗体、抗ＩｇＭ／ＢＡＦＦ受容体二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＪｅｋｏ−１細胞又はＢ１０４細胞増殖阻害活性の変化を調べる。尚、細胞の培養及び分泌型ＩｇＭの希釈には当該細胞の増殖培地を用いる。【０１３４】
（７）抗ＩｇＭ抗体と抗ＢＣＭＡ抗体を組み合せた二重特異性抗体
（７−１）  Ｒａｍｏｓ細胞又はＢ１０４細胞に対する増殖阻害作用
実施例４（１−１）に準じて、分泌型ＩｇＭ濃度上昇による抗ＩｇＭ抗体、抗ＢＣＭＡ抗体、抗ＩｇＭ／ＢＣＭＡ二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＲａｍｏｓ細胞又はＢ１０４細胞増殖阻害活性の変化を調べる。尚、細胞の培養及び分泌型ＩｇＭの希釈には当該細胞の増殖培地を用いる。【０１３５】
（８）抗ＩｇＭ抗体と抗ＴＡＣＩ抗体を組み合せた二重特異性抗体
（８−１）  Ｊｅｋｏ−１細胞又はＢ１０４細胞に対する増殖阻害作用
実施例４（１−１）に準じて、分泌型ＩｇＭ濃度上昇による抗ＩｇＭ抗体、抗ＴＡＣＩ抗体、抗ＩｇＭ／ＴＡＣＩ二重特異性抗体及び陰性対照抗体のＪｅｋｏ−１細胞又はＢ１０４細胞増殖阻害活性の変化を調べる。尚、細胞の培養及び分泌型ＩｇＭの希釈には当該細胞の増殖培地を用いる。【０１３６】
（９）抗ＩｇＭ抗体と抗ＣＤ３８抗体を組み合せた二重特異性抗体
（９−１）  Ｂ１０４細胞に対する増殖阻害作用
実施例４（１−１）に準じて、分泌型ＩｇＭ濃度上昇による抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＣＤ３８抗体、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ３８二重特異性抗体及び陰性対照抗体（５００ｎｇ／ｍＬ）のＢ１０４細胞増殖阻害活性の変化を調べた。尚、Ｂ１０４細胞の培養及び分泌型ＩｇＭの希釈にはＢ１０４細胞増殖培地を用いた。結果を図２５に示す。図の縦軸は増殖阻害活性、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
抗ＩｇＭ抗体（１）の増殖阻害活性は、分泌型ＩｇＭ濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ３８二重特異性抗体は、分泌型ＩｇＭ濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。【０１３７】
（１０）抗ＩｇＭ抗体と抗ＣＤ８１抗体を組み合せた二重特異性抗体
（１０−１）  ＪｅＫｏ−１細胞に対する増殖阻害作用
実施例４（１−１）に準じて、分泌型ＩｇＭ濃度上昇による抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＣＤ８１抗体、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ８１二重特異性抗体及び陰性対照抗体（５００ｎｇ／ｍＬ）のＪｅＫｏ−１細胞増殖阻害活性の変化を調べた。尚、ＪｅＫｏ−１細胞の培養及び分泌型ＩｇＭの希釈にはＪｅＫｏ−１細胞増殖培地を用いた。結果を図２６に示す。図の縦軸は増殖阻害活性、横軸は培地に添加した分泌型ＩｇＭ濃度を示す。
抗ＩｇＭ抗体（１）の増殖阻害活性は、分泌型ＩｇＭ濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗ＩｇＭ（１）／ＣＤ８１二重特異性抗体は、分泌型ＩｇＭ濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。
さらに実施例４（９）及び（１０）の結果より本発明の抗ＩｇＭ／Ｂ細胞表面抗原抗体は、Ｂ細胞表面抗原の種類に関わらず、分泌型ＩｇＭ存在下でＢ細胞に対し細胞増殖阻害効果を示すことが示唆された。【０１３８】
実施例５  二重特異性抗体のＲａｍｏｓ細胞に対するアポトーシス誘導作用
（１）抗ＩｇＭ抗体と抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を組み合せた二重特異性抗体のＲａｍｏｓ細胞に対するアポトーシス誘導作用
抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体及び陰性対照抗体（１，０００ｎｇ／ｍＬ）のＲａｍｏｓ細胞に対するアポトーシス誘導効果を調べた。予め培地に懸濁したＲａｍｏｓ細胞を６ウェルプレートに播種し（３．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３時間培養した。抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体又は陰性対照抗体をＰＢＳにて１ｍｇ／ｍｌに調製した溶液を、最終濃度１，０００ｎｇ／ｍｌとなるように各ウェルへ添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下でさらに２４時間培養した。遠心分離で回収した各細胞を１％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳに懸濁し、４℃条件下で１６時間インキュベートした。再度、遠心分離で各細胞を回収後、４０μＬのＰＢＳへ懸濁した。
１０μＬの細胞懸濁液と２μＬの１ｍＭ  Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所）を混合した後、蛍光顕微鏡下にて観察を行った。染色体構造が凝集・断片化した細胞をアポトーシス誘導細胞と判断し、無作為に選出した１０視野における全細胞数及びアポトーシス誘導細胞数を計測した。【０１３９】
結果を図２７に示す。有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いた。図の縦軸はアポトーシスが誘導された細胞の割合を示す。
抗ＩｇＭ抗体（１）及び抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）のアポトーシス誘導率はそれぞれ６．０％及び４．２％であり、ビークル及び陰性抗体のアポトーシス誘導率はそれぞれ３．８％及び４．３％であった。二重特異性抗体は１１．０％といずれの抗体と比較しても有意に高いアポトーシス誘導率を示した。【０１４０】
（２）抗ＩｇＭ抗体（１）と抗ＣＤ２０（２）抗体を組み合せた二重特異性抗体のＲａｍｏｓ細胞に対するアポトーシス誘導作用
実施例５（１）に準じて、抗ＩｇＭ抗体（１）と抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）を組み合せた二重特異性抗体の代わりに抗ＩｇＭ抗体（１）と抗ＣＤ２０抗体（２）を組み合せた二重特異性抗体を用いて、アポトーシス誘導率を調べた。【０１４１】
結果を図２８に示す。図の縦軸はアポトーシスが誘導された細胞の割合を示す。
抗ＩｇＭ抗体（１）及び抗ＣＤ２０抗体（２）のアポトーシス誘導率はそれぞれ８．７％及び７．９％であり、ビークル及び陰性抗体のアポトーシス誘導率はそれぞれ３．５％及び４．１％であった。一方、二重特異性抗体は２２．４％といずれの抗体と比較しても有意に高いアポトーシス誘導率を示した。【０１４２】
（３）抗ＩｇＭ抗体と抗ＣＤ３８抗体を組み合せた二重特異性抗体のＲａｍｏｓ細胞に対するアポトーシス誘導作用
実施例５（１）に準じて、抗ＩｇＭ抗体（１）と抗ＣＤ３８抗体を組み合せた二重特異性抗体の代わりに抗ＩｇＭ抗体（１）と抗ＣＤ３８抗体を組み合せた二重特異性抗体を用いて、アポトーシス誘導率を調べた。【０１４３】
結果を図２９に示す。図の縦軸は全細胞中のアポトーシスが誘導された細胞の割合を示す。
抗ＩｇＭ抗体（１）及び抗ＣＤ３８抗体のアポトーシス誘導率はそれぞれ４．３％及び１．４％であり、ビークル及び陰性抗体のアポトーシス誘導率はそれぞれ１．３％及び１．１％であった。一方、二重特異性抗体は１６．４％といずれの抗体と比較しても有意に高いアポトーシス誘導率を示した。【０１４４】
実施例６  抗ＩｇＭ抗体と抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体とを組み合せた二重特異性抗体の細胞周期停止作用
（１）分泌型ＩｇＭ存在下でのＪｅＫｏ−１細胞に対する細胞周期停止作用
分泌型ＩｇＭ存在下で抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）及び抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体がＪｅＫｏ−１細胞の細胞周期に与える影響を検討した。具体的には、ＪｅＫｏ−１細胞増殖培地で調製した各抗体（４００ｎｇ／ｍＬ）と分泌型ＩｇＭ（４０μｇ／ｍＬ）を体積比１:１で混合し、室温で３０分間静置した。その後、予め培地に懸濁したＪｅＫｏ−１細胞を６ウェルプレートに播種し（３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、各ウェルに各抗体濃度が１００ｎｇ／ｍＬ、及び、分泌型ＩｇＭ濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、２４時間培養した。陰性対照は抗体液の代わりにＰＢＳを添加した。培養後、細胞を７０％エタノール／ＰＢＳで固定し、ヨウ化プロピジウム（シグマ・アルドリッチ）でＤＮＡを染色した上でフローサイトメーター及び解析ソフトＣｙｔｏｍｉｃｓ  ＭＸＰ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて細胞周期解析を行った。結果を図１２に示す。各スライドの縦軸は細胞数、横軸は細胞あたりのＤＮＡ含有量を示す。
抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）は分泌型ＩｇＭの存在に関係なくＪｅＫｏ−１細胞の細胞周期に影響を与えなかった。抗ＩｇＭ抗体（１）は分泌型ＩｇＭの非存在下では細胞周期を停止させたが、分泌型ＩｇＭ添加により細胞周期停止作用は消失した。一方、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体は、分泌型ＩｇＭの存在に関係なく細胞周期をＧ１期で停止させた。また、Ｃｙｓ１ｍ型二重特異性抗体とＫＩＨ型二重特異性抗体の細胞周期停止作用は同等であり、製造法の違いによる活性の差異はないことが示された。
この結果から、抗ＩｇＭ抗体をＢ細胞表面抗原に対する抗体と二重特異性抗体とすることで分泌型ＩｇＭ存在下でも細胞周期を停止させることが明らかとなった。【０１４５】
（２）ヒト血清存在下でのＪｅＫｏ−１細胞に対する細胞周期停止作用
実施例６（１）に準じて、分泌型ＩｇＭに代えてヒト血清を用い、ヒト血清存在下で抗ＩｇＭ抗体（１）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）及び抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体（１μｇ／ｍＬ）がＪｅＫｏ−１細胞の細胞周期に与える影響を検討した。具体的には、９０％ヒト血清／１０％抗体液（抗体の最終濃度は１μｇ／ｍＬ）となるよう、ヒト血清と抗体を混合し、ＪｅＫｏ−１細胞に添加した。ヒト血清非添加群には９０％ＪｅＫｏ−１細胞増殖培地／１０％抗体液とした。また、陰性対照は抗体液の代わりにＰＢＳを添加した。結果を図１３に示す。各図の縦軸は細胞数、横軸は細胞あたりのＤＮＡ含有量を示す。
抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）はヒト血清の存在に関係なくＪｅＫｏ−１細胞の細胞周期に影響を与えなかった。抗ＩｇＭ抗体（１）は、ヒト血清非存在下では細胞周期を停止させたが、ヒト血清を添加することにより細胞周期停止作用は消失した。一方、抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体は、ヒト血清の存在に関係なく細胞周期をＧ１期で停止させた。また、Ｃｙｓ１ｍ型二重特異性抗体とＫＩＨ型二重特異性抗体の細胞周期停止作用は同等であり、製造法の違いによる活性の差異はないことが示された。
この結果から、抗ＩｇＭ抗体をＢ細胞表面抗原に対する抗体と二重特異性抗体とすることでヒト血清存在下でも細胞周期を停止させることが明らかとなった。
なお、本試験は、２人のヒト血清で試験を実施したが、両ドナーの非働化血清で同等の結果が得られ、ドナーによる違いは認められなかった。【０１４６】
実施例７  抗ＩｇＭ抗体と抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体とを組み合わせた二重特異性抗体のラット投与試験
（１）ラットへの抗体投与によるＢ細胞減少作用
抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）は、ＷＫＡＨ／ＨｋｍラットのＢ細胞に結合することが知られている。そこで、抗ＩｇＭ／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体のラットへの作用を調べた。
抗ＩｇＭ抗体（１、３、１０、３０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）（０．１、０．３、１ｍｇ／ｋｇ）及び抗ＩｇＭ／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体（０．１、０．３、１、３、１０、３０ｍｇ／ｋｇ）をＷＫＡＨ／Ｈｋｍラットの尾静脈から投与した。投与５時間後に、ラット尾静脈より採血した。ＰＥ標識抗ラットＣＤ４５ＲＡ抗体（ＢＤファーミンゲン）と反応させた後にＯｐｔｉＬｙｓｅ  Ｃ（ベックマン・コールター）を用いて溶血処理を行い、血中のＢ細胞数をフローサイトメーター及び解析ソフトＣｙｔｏｍｉｃｓ  ＭＸＰ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて計測した。抗体の代わりにＰＢＳを投与した個体の末梢血中Ｂ細胞数を１００％とし、各抗体投与後の末梢血Ｂ細胞数の変動を算出した。
抗ＩｇＭ／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体の投与がラット生体内のＢ細胞に与える影響を図１４に示す。抗ＩｇＭ抗体は１０ｍｇ／ｋｇ以上投与しないとＢ細胞数が減少しなかったのに対し、抗ＩｇＭ／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体では０．３ｍｇ／ｋｇ投与群でもＢ細胞数を減少させた。抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）は０．３ｍｇ／ｋｇ以上を投与した個体で鎮静、腹臥位などの行動異常が認められ、さらに１ｍｇ／ｋｇを投与した個体では、重篤な副作用のため採血不能となった。また、それ以下の投与量ではＢ細胞の十分な減少効果が認められなかった。以上の結果から、ラット生体内において抗ＩｇＭ抗体の活性が発揮できない低濃度でも、抗ＩｇＭ抗体を他のＢ細胞表面抗原に対する抗体と二重特異性抗体とすることで、Ｂ細胞数を減少させることが示された。また、ラット生体内において低濃度でも重篤な副作用が観察される抗Ｂ細胞抗原抗体でも、抗ＩｇＭ抗体と二重特異性抗体とすることにより副作用の発現が抑制され、Ｂ細胞数を減少させることが示された。【０１４７】
実施例８  抗ＩｇＭ抗体と抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体とを組み合わせた二重特異性抗体のサル投与試験
（１）カニクイザルへの抗体投与によるＢ細胞減少作用
抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体をカニクイザルへ投与し、その有効性を評価した。抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体をカニクイザル雌１匹の橈側皮静脈内へ投与した。投与は、それぞれ１、３、１０、２０ｍｇ／ｋｇに相当する抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体を低用量から順に、２日に１回実施し、合計４回投与した。初回投与の直前、及び、各投与から２４時間後に大腿静脈より採血した。ＡＰＣ標識抗ＣＤ２０抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識抗ＣＤ３抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を反応させ、Ｂ細胞数及びＴ細胞数をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び解析ソフトＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏ（Ｖｅｒｓｉｏｎ６．０、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて計測すると共に、赤血球及び血小板数を総合血液学検査装置（Ｓｉｅｍｅｎｓ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ）を用いて計測した。投与前の末梢血中の各血球数を１００％とし、各投与後の末梢血中の各血球数を算出した。また、投与期間を通じてサルの症状を観察すると共に試験終了後に剖検により異常所見の有無を観察した。
結果を図１５−１９に示す。抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体は１ｍｇ／ｋｇ投与により末梢血中のＢ細胞数が約５０％減少した。さらにその効果は濃度依存的に増強し、２０ｍｇ/ｋｇ投与では投与前の約２％まで末梢血中のＢ細胞を消失させた（図１５）。さらに抗体投与後に作製した腋窩リンパ節のヘマトキシリン・エオジン染色において、リンパ節内のリンパ球が占める割合が著しく低下し、リンパ濾胞の萎縮及び胚中心の消失が観察された。一方、Ｂ細胞と同様にＨＬＡ−ＤＲを細胞膜表面に発現するＴ細胞は抗体の投与依存的な減少は観察されなかった（図１６）。また、ＨＬＡ−ＤＲを細胞膜表面に発現しない赤血球及び血小板も抗体の投与依存的な減少は観察されなかった（図１７、図１８）。さらに体温は抗体の投与後も変化せず、ほぼ一定の値を示した（図１９）。抗体投与が原因と思われるサルの異常な症状は確認されておらず、剖検の結果からも異常な所見は確認されなかった。
以上の結果は、血中に分泌型ＩｇＭが存在するカニクイザル生体内においても抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体は末梢血Ｂ細胞の枯渇を引き起こすことを示し、該二重特異性抗体がＢ細胞性腫瘍だけでなく、正常Ｂ細胞に由来するＢ細胞関連疾患の治療にも有効であることを強く示唆するものである。
抗ＩｇＭ（１）／ＨＬＡ−ＤＲ（１）二重特異性抗体の親抗体の１つである抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（１）については、実施例６で示した通り、ラットに対する副作用は０．３ｍｇ／ｋｇから認められ、さらに１ｍｇ／ｋｇの投与で重篤な副作用が認められており、カニクイザルに対しても同様に重篤な副作用を示すことが予想される。しかしながら、以上の結果より、カニクイザル生体内において重篤な副作用が懸念される抗Ｂ細胞抗原抗体でも、抗ＩｇＭ抗体と二重特異性抗体とすることにより、より高い濃度で用いても、副作用の発現が抑制され、Ｂ細胞数を減少させることが示された。
実施例７及び８の結果より、抗ＩｇＭ／Ｂ細胞表面抗原二重特異性抗体は、Ｂ細胞に対する優れた増殖阻害活性を有するとともに、副作用の面からも顕著な効果を有することが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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