(57)【要約】  本発明の課題は、酵母を宿主として用いてカビ由来トリプシン様プロテアーゼを製造する方法において、カビ由来トリプシン様プロテアーゼを高い生産性で製造できる方法を提供することである。本発明によれば、酵母内で機能する分泌シグナル配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのプロ配列に変異が導入され、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有するプロ配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列とをＮ末端側からＣ末端側にこの順に有する融合タンパク質をコードする遺伝子を酵母で発現させることを含む、酵母におけるプロテアーゼの製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母内で機能する分泌シグナル配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのプロ配列に変異が導入され、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有するプロ配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列とをＮ末端側からＣ末端側にこの順に有する融合タンパク質をコードする遺伝子を酵母で発現させることを含む、酵母におけるプロテアーゼの製造方法。
【請求項２】
酵母の培養上清中に、前記プロテアーゼと、前記プロ配列と前記プロテアーゼのアミノ酸配列とからなるプロテアーゼ前駆体とが１：１以上の活性比で分泌される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養上清中に発現したプロテアーゼにより、培養上清中に発現したプロテアーゼ前駆体がプロテアーゼに変換される、請求項１叉は２に記載の方法。
【請求項４】
フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼが、下記（ａ）〜（ｃ）の何れかである、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
（ａ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ；
（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ；又は
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ。
【請求項５】
酵母内で機能する分泌シグナル配列が、酵母ＭＦ配列である、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
プロ配列が、Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asnで示されるアミノ酸配列に対して１〜数個のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列であり、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有し、酵母においてそのＣ末端で切断されてプロテアーゼ前駆体からプロテアーゼが生成するアミノ酸配列である、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
プロ配列が、
Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Xdd-Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Pro-Xaa-Xbb、又は
Xaa-Xbb
（式中、Xaaは任意のアミノ酸残基を示し、XbbはArg又はLys残基を示し、Xccは任意のアミノ酸残基を示し、Xddは任意のアミノ酸残基を示す）
の何れかで示されるアミノ酸配列である、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列のＮ末端側に、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有するプロ配列が融合しているプロテアーゼ前駆体であって、
（ｉ）前記プロテアーゼ前駆体を酵母の培養上清中に発現させた場合、前記プロテアーゼと、前記プロ配列と前記プロテアーゼのアミノ酸配列とからなるプロテアーゼ前駆体とが１：１以上の活性比で分泌され、かつ
（ｉｉ）前記発現したプロテアーゼにより、前記発現したプロテアーゼ前駆体をプロテアーゼに変換することが可能である、
プロテアーゼ前駆体。
【請求項９】
フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼが、下記（ａ）〜（ｃ）の何れかである、請求項８に記載のプロテアーゼ前駆体：
（ａ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ；
（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ；又は
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ。
【請求項１０】
プロ配列が、Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asnで示されるアミノ酸配列に対して１〜数個のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列であり、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有し、酵母においてそのＣ末端で切断されてプロテアーゼ前駆体からプロテアーゼが生成するアミノ酸配列である、請求項８又は９に記載のプロテアーゼ前駆体。
【請求項１１】
プロ配列が、
Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Xdd-Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Pro-Xaa-Xbb、又は
Xaa-Xbb
（式中、Xaaは任意のアミノ酸残基を示し、XbbはArg又はLys残基を示し、Xccは任意のアミノ酸残基を示し、Xddは任意のアミノ酸残基を示す）
の何れかで示されるアミノ酸配列である、請求項８から１０の何れか一項に記載のプロテアーゼ前駆体。
【請求項１２】
酵母内で機能する分泌シグナル配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのプロ配列に変異が導入され、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有するプロ配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列とをＮ末端側からＣ末端側にこの順に有する融合タンパク質をコードするＤＮＡを有する組み換え発現ベクター。
【請求項１３】
フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼが、下記（ａ）〜（ｃ）の何れかである、請求項１２に記載の組み換え発現ベクター：
（ａ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ；
（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ；又は
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ。
【請求項１４】
酵母内で機能する分泌シグナル配列が、酵母ＭＦ配列である、請求項１２又は１３に記載の組み換え発現ベクター。
【請求項１５】
プロ配列が、Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asnで示されるアミノ酸配列に対して１〜数個のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列であって、酵母においてそのＣ末端で切断されてプロテアーゼ前駆体からプロテアーゼが生成するアミノ酸配列である、請求項１２から１４の何れか一項に記載の組み換え発現ベクター。
【請求項１６】
プロ配列が、
Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Xdd-Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Pro-Xaa-Xbb、又は
Xaa-Xbb
（式中、Xaaは任意のアミノ酸残基を示し、XbbはArg又はLys残基を示し、Xccは任意のアミノ酸残基を示し、Xddは任意のアミノ酸残基を示す）
の何れかで示されるアミノ酸配列である、請求項１２から１５の何れか一項に記載の組み換え発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１２から１６の何れか一項に記載の組み換え発現ベクターを有する形質転換酵母。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母におけるカビ由来トリプシン様プロテアーゼの製造方法、並びにカビ由来トリプシン様プロテアーゼ前駆体などに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術を用いてタンパク質を生産するためには、そのタンパク質の発現に適切な宿主が使用される。宿主としては、例えば、ＣＨＯ（Chinese Hamster Ovary）細胞等の動物細胞、カイコ等の昆虫及び昆虫細胞、ニワトリや牛などの動物、並びに大腸菌又は酵母などの微生物などが用いられる。上記の中でも酵母は、安価な培地で大規模な高密度培養が可能であり、タンパク質を低コストで生産することができる。また、分泌シグナルペプチド等を利用すれば培養液中への分泌生産も可能なため、タンパク質の精製も容易となる。【０００３】
トリプシンは哺乳動物の膵臓で生産されるセリンプロテアーゼであり、アルギニン残基またはリジン残基のＣ末端側を切断するプロテアーゼ活性を有しており、インスリン等のタンパク質性医薬品の製造又は細胞分散などに用いられている。哺乳動物由来（ウシ、ブタ、ヒト）のトリプシン以外にも、カビや魚由来のトリプシン様プロテアーゼも知られている。【０００４】
例えば、特許文献１には、フザリウム属カビ（Fusarium oxysporum）からのトリプシン様プロテアーゼの精製及び当該トリプシン様プロテアーゼ遺伝子のクローニングが記載されている。非特許文献１には、フザリウム属カビ（Fusarium oxysporum）におけるトリプシン様プロテアーゼの生産が記載されている。【０００５】
また、非特許文献２には、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces  griseus）由来トリプシンを酵母（Pichia pastosis）により発現させることが記載されている。さらに、非特許文献３には、ブタトリプシンを酵母（Pichia pastosis）において発現させることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ１９９４／０２５５８３号公報
【非特許文献１】Natalie E.Farnworth et al., Enzyme and Microbial Technology 33 (2003) 85-91
【非特許文献２】Zhenmin Ling et al., J Ind Microbiol Biotechnol (2012) 39:1651-1662
【非特許文献３】Min Shu et al., Protein Expression and Purification 114 (2015) 149-155
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、酵母を宿主として用いてカビ由来トリプシン様プロテアーゼを製造する方法において、カビ由来トリプシン様プロテアーゼを高い生産性で製造できる方法を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、酵母内で機能する分泌シグナル配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼが有するプロ配列に変異を導入したプロ配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列とをＮ末端側からＣ末端側にこの順に有する融合タンパク質をコードする遺伝子を酵母で発現させることによって、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼを高い生産性で製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すわなち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  酵母内で機能する分泌シグナル配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのプロ配列に変異が導入され、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有するプロ配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列とをＮ末端側からＣ末端側にこの順に有する融合タンパク質をコードする遺伝子を酵母で発現させることを含む、酵母におけるプロテアーゼの製造方法。
（２）  酵母の培養上清中に、前記プロテアーゼと、前記プロ配列と前記プロテアーゼのアミノ酸配列とからなるプロテアーゼ前駆体とが１：１以上の活性比で分泌される、（１）に記載の方法。
（３）  培養上清中に発現したプロテアーゼにより、培養上清中に発現したプロテアーゼ前駆体がプロテアーゼに変換される、（１）叉は（２）に記載の方法。
（４）  フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼが、下記（ａ）〜（ｃ）の何れかである、（１）から（３）の何れか一に記載の方法。
（ａ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ；
（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ；又は
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ。
（５）  酵母内で機能する分泌シグナル配列が、酵母ＭＦ配列である、（１）から（４）の何れか一に記載の方法。
（６）  プロ配列が、Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asnで示されるアミノ酸配列に対して１〜数個のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列であり、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有し、酵母においてそのＣ末端で切断されてプロテアーゼ前駆体からプロテアーゼが生成するアミノ酸配列である、（１）から（５）の何れか一に記載の方法。
（７）  プロ配列が、
Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Xdd-Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Pro-Xaa-Xbb、又は
Xaa-Xbb
（式中、Xaaは任意のアミノ酸残基を示し、XbbはArg又はLys残基を示し、Xccは任意のアミノ酸残基を示し、Xddは任意のアミノ酸残基を示す）
の何れかで示されるアミノ酸配列である、（１）から（６）の何れか一に記載の方法。
（８）  フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列のＮ末端側に、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有するプロ配列が融合しているプロテアーゼ前駆体であって、
（ｉ）前記プロテアーゼ前駆体を酵母の培養上清中に発現させた場合、前記プロテアーゼと、前記プロ配列と前記プロテアーゼのアミノ酸配列とからなるプロテアーゼ前駆体とが１：１以上の活性比で分泌され、かつ
（ｉｉ）前記発現したプロテアーゼにより、前記発現したプロテアーゼ前駆体をプロテアーゼに変換することが可能である、
プロテアーゼ前駆体。
（９）  フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼが、下記（ａ）〜（ｃ）の何れかである、（８）に記載のプロテアーゼ前駆体：
（ａ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ；
（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ；又は
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ。
（１０）  プロ配列が、Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asnで示されるアミノ酸配列に対して１〜数個のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列であり、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有し、酵母においてそのＣ末端で切断されてプロテアーゼ前駆体からプロテアーゼが生成するアミノ酸配列である、（８）又は（９）に記載のプロテアーゼ前駆体。
（１１）  プロ配列が、
Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Xdd-Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Pro-Xaa-Xbb、又は
Xaa-Xbb
（式中、Xaaは任意のアミノ酸残基を示し、XbbはArg又はLys残基を示し、Xccは任意のアミノ酸残基を示し、Xddは任意のアミノ酸残基を示す）
の何れかで示されるアミノ酸配列である、（８）から（１０）の何れか一に記載のプロテアーゼ前駆体。
（１２）  酵母内で機能する分泌シグナル配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのプロ配列に変異が導入され、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有するプロ配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列とをＮ末端側からＣ末端側にこの順に有する融合タンパク質をコードするＤＮＡを有する組み換え発現ベクター。
（１３）  フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼが、下記（ａ）〜（ｃ）の何れかである、（１２）に記載の組み換え発現ベクター：
（ａ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ；
（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ；又は
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ。
（１４）  酵母内で機能する分泌シグナル配列が、酵母ＭＦ配列である、（１２）又は（１３）に記載の組み換え発現ベクター。
（１５）  プロ配列が、Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asnで示されるアミノ酸配列に対して１〜数個のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列であって、酵母においてそのＣ末端で切断されてプロテアーゼ前駆体からプロテアーゼが生成するアミノ酸配列である、（１２）から（１４）の何れか一に記載の組み換え発現ベクター。
（１６）  プロ配列が、
Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Xdd-Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Pro-Xaa-Xbb、又は
Xaa-Xbb
（式中、Xaaは任意のアミノ酸残基を示し、XbbはArg又はLys残基を示し、Xccは任意のアミノ酸残基を示し、Xddは任意のアミノ酸残基を示す）
の何れかで示されるアミノ酸配列である、（１２）から（１５）の何れか一に記載の組み換え発現ベクター。
（１７）  （１２）から（１６）の何れか一に記載の組み換え発現ベクターを有する形質転換酵母。
さらに本発明によれば、以下の発明が提供される。
（Ａ）  酵母で発現したフザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼを含む、酵母培養物由来プロテアーゼ組成物。
（Ｂ）  フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼが、下記（ａ）〜（ｃ）の何れかである、（Ａ）に記載の酵母培養物由来プロテアーゼ組成物；
（ａ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ；
（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ；又は
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、酵母においてカビ由来トリプシン様プロテアーゼを高い生産性で製造することができる。本発明によるカビ由来トリプシン様プロテアーゼの製造方法においては、高密度培養が可能な酵母を宿主として用いることが可能であることからカビ由来トリプシン様プロテアーゼの製造コストを削減できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、比較例３で得られた培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す。レーン１は MF-プロ配列-プロテアーゼ、レーン２は MF-プロテアーゼを示す。
【図２】図２は、実施例６で得られた培養上清について自己消化処理の前後のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す。Ｍはマーカー、レーン１は変換反応前の培養上清(MF-APQEIPNK-トリプシン)、レーン２は 自己消化反応後の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態についてさらに詳細に説明する。
［酵母におけるプロテアーゼの製造］
本発明においては、酵母内で機能する分泌シグナル配列と、プロ配列（より詳細には、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのプロ配列に変異を導入し、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有するプロ配列）と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列とを、Ｎ末端側からＣ末端側にこの順に有する融合タンパク質をコードする遺伝子を酵母で発現させることによって、酵母においてプロテアーゼを製造する。
【００１３】
本発明においては、酵母内で機能する分泌シグナル配列と、上記プロ配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列とをコードするＤＮＡを有する組み換え発現ベクターを使用して酵母において上記の融合タンパク質を発現させることにより、酵母の培養上清中に、プロ配列とプロテアーゼのアミノ酸配列とからなるプロテアーゼ前駆体と、プロテアーゼとが先ず発現する。さらに、培養上清中に発現したプロテアーゼにより、培養上清中に発現したプロテアーゼ前駆体がプロテアーゼに変換されることを見出した。上記メカニズムにより、本発明においては、所望のプロテアーゼ活性を有するフザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼを酵母において効率よく生産（製造）することが可能になった。
【００１４】
酵母の培養上清中におけるプロテアーゼとプロテアーゼ前駆体との発現比率（自己消化反応前の発現比率）は特に限定されないが、好ましくは、１：１以上の活性比で分泌され、より好ましくは１：１０以上の活性比で分泌され、さらに好ましくは１：１００以上の活性比で分泌される。
ここでいう活性比とは、培養上清中のプロテアーゼ活性量（培養後に自己消化によるプロテアーゼ前駆体からプロテアーゼへの変換を行う前の培養上清中のプロテアーゼ活性量）をプロテアーゼの発現量とし、自己消化後のプロテアーゼ活性量から培養上清中のプロテアーゼ活性量を引いた活性量をプロテアーゼ前駆体の発現量とした場合の発現量比のことを示す。
【００１５】
［フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼ］
本発明で言うフザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼとは、フザリウム・オキシスポラムが発現するトリプシン様プロテアーゼ又はその改変体を意味する。ザリウム・オキシスポラムが発現するトリプシン様プロテアーゼは、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼである。
【００１６】
本発明では、フザリウム・オキシスポラムが発現するトリプシン様プロテアーゼの改変体として、
（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ；又は
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ。
を発現させてもよい。例としては、実施例９および１０に記載した配列番号６７のＲ１０４残基（１０４番目のアミノ酸残基であるArg残基）を他のアミノ酸に置換した変異体が挙げられる。
【００１７】
アミノ酸配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０，  ５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １８３，  ６３  （１９９０）］を用いて決定することができる。
【００１８】
また、アミノ酸の置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする：
（第１群：中性非極性アミノ酸）Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｍｅｔ，Ｃｙｓ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ；
（第２群：中性極性アミノ酸）Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ；
（第３群：酸性アミノ酸）Ｇｌｕ，Ａｓｐ；
（第４群：塩基性アミノ酸）Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ：
【００１９】
上記したトリプシン様プロテアーゼの改変体をコードするＤＮＡは、部位特異的突然変異誘発法などの当業者に公知の常法により取得することができ、例えば、市販の変異導入用キット（例えば、Ｍｕｔａｎｔ−Ｋ、Ｍｕｔａｎｔ−Ｇ、ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  シリーズキット（ＴＡＫＡＲＡ社製））を用いて取得することもできる。
【００２０】
［酵母内で機能する分泌シグナル配列］
本発明で使用する酵母内で機能する分泌シグナル配列は、細胞質内で生合成されたタンパク質の小胞体への輸送及び局在化を指示する配列であり、タンパク質のＮ末端に存在することにより、発現したタンパク質を宿主細胞である酵母外に分泌させる機能を有するペプチドである。分泌シグナル配列は、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際にシグナルペプチダーゼにより分解されることにより除去される。
【００２１】
本発明で使用する酵母内で機能する分泌シグナル配列としては、酵母内で機能する配列であればよく、酵母由来の分泌シグナル配列、又は酵母以外の生物に由来する分泌シグナル配列のいずれでもよいが、好ましくは酵母由来の分泌シグナル配列である。
【００２２】
酵母内で機能する分泌シグナル配列としては、酵母（サッカロマイセス・セレビシエ等）のＭａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ α（ＭＦα）プレプロシグナル配列（ＭＦ配列）の他、オガタエア・ポリモルファやコマガタエラ・パストリスの酸ホスファターゼ（ＰＨＯ１）、サッカロマイセス・セレビシアエのインベルターゼ（ＳＵＣ２）又はサッカロマイセス・セレビシアエのＰＬＢ１のシグナル配列等を挙げることができるが、特に限定されない。
【００２３】
［プロ配列］
本発明で使用するプロ配列は、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのプロ配列に変異を導入することにより得られるものであり、かつそのＣ末端にアルギニン又はリジン残基を有していることが好ましい。
【００２４】
フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのプロ配列のアミノ酸配列としては、Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asnを挙げることができる。従って、本発明で使用するプロ配列としては、Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asnで示されるアミノ酸配列に対して１〜数個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜６個、例えば、１個、２個、３個、４個、５個又は６個）のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列であり、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有している配列を挙げることができる。
本発明で使用するプロ配列は、酵母においてそのＣ末端で切断されてプロテアーゼ前駆体からプロテアーゼが生成するアミノ酸配列である。アミノ酸の置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。同族アミノ酸については、本明細書中上記した通りである。
【００２５】
プロ配列の具体例としては、
Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Xdd-Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Pro-Xaa-Xbb、又は
Xaa-Xbb
（式中、Xaaは任意のアミノ酸残基を示し、XbbはArg又はLys残基を示し、Xccは任意のアミノ酸残基を示し、Xddは任意のアミノ酸残基を示す）
の何れかで示されるアミノ酸配列を挙げることができる。
【００２６】
プロ配列の別の具体例としては、Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asn-Argで示されるアミノ酸配列に対して１〜数個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜６個、例えば、１個、２個、３個、４個、５個又は６個）のアミノ酸が置換したアミノ酸配列、又はAla- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asn-Lysで示されるアミノ酸配列に対して１〜数個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜６個、例えば、１個、２個、３個、４個、５個又は６個）のアミノ酸が置換したアミノ酸配列を挙げることができる。
【００２７】
Xaa、Xbb及びXccはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示し、具体的には、Asp、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Cys、Met、Ser、Thr、Tyr、Phe、Trp、Pro、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg、又はHisの何れかを表す。なお、Asp、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Cys、Met、Ser、Thr、Tyr、Phe、Trp、Pro、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg、およびHisはそれぞれ、アスパラギン酸残基、グリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロシシン残基、システイン残基、メチオニン残基、セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、プロリン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、リジン残基、アルギニン残基、およびヒスチジン残基を指す。
【００２８】
Xaaは、好ましくは、Asn、Gly、Asp、Ser、Arg、Thr 、Glu、Val、His、Ala、Tyr、Ile、Gln、又はMetである。
Xcc及びXddは、好ましくは中性アミノ酸残基（Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Cys、Met、Ser、Thr、Tyr、Phe、Trp、Pro、Asn、Gln）であり、より好ましくは脂肪族アミノ酸残基（Gly、Ala、Val、Leu、Ile）であり、さらに好ましくはAlaである。
【００２９】
［組み換え発現ベクター］
本発明では、酵母内で機能する分泌シグナル配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのプロ配列に変異が導入され、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有するプロ配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列とをＮ末端側からＣ末端側にこの順に有する融合タンパク質をコードするＤＮＡを有する組み換え発現ベクターを用いて、酵母においてフザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼを発現及び分泌させる。
【００３０】
本発明における組換え発現ベクターとは、形質転換後の宿主細胞において、組換え発現ベクターに組み込まれた発現カセット中の遺伝子が発現する機能を有する核酸分子のことを意味する。組み換え発現ベクターは、発現カセットに加えて、組み込み相同領域、栄養要求性相補遺伝子または薬剤耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子、自律複製配列などを有していてもよい。
【００３１】
本発明において宿主に形質転換された後のベクターは、形質転換体の染色体に組み込まれている状態でも良く、自律複製型として存在している状態でも良い。
【００３２】
発現ベクターは、プラスミドベクターでも人工染色体であってもよい。ベクターの調製が容易であり、また酵母細胞の形質転換が容易である点で、プラスミドベクターが好ましい。プラスミドとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３などのＹＥｐ系、ＹＣｐ５０などのＹＣｐ系等）などが挙げられるが、特に限定されない。
【００３３】
本発明における「発現カセット」とは、プロモーターおよび発現する目的タンパク質遺伝子より構成され、ターミネーターを含んでも良く、例えば、ｐＵＣ等のプラスミド上に構築することもできるし、ＰＣＲ法によっても作製することもできる。
【００３４】
プロモーターとしては、ＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＣＡＴプロモーター、ＤＨＡＳプロモーター、ＦＤＨプロモーター、ＦＭＤプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＭＯＸプロモーター、ＴＥＦプロモーター、ＬＥＵ２プロモーター、ＵＲＡ３プロモーター、ＡＤＥプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター等を使用することができるが、特に限定されない。
【００３５】
ターミネーターとしては、ＡＯＸ１ターミネーター、ＧＡＰターミネーター、ＡＤＨ１ターミネーター等を使用することができるが、特に限定されない。
【００３６】
本発明における組み込み相同領域とは、本発明の組換えベクターが形質転換後の宿主細胞の染色体上に相同組換えで組み込まれるための領域を指す。本領域は、宿主細胞の染色体の一部を任意で利用できるが、栄養要求性相補遺伝子や、発現カセット内のプロモーターやターミネーターなどを利用することもできる。
【００３７】
本発明における栄養要求性相補遺伝子は、宿主細胞のアミノ酸や核酸などの栄養要求性を相補する遺伝子であれば特に限定されない。具体的な例としては、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子などが挙げられ、それぞれウラシル、ロイシン、アデニン、ヒスチジンの栄養要求性株において原栄養株表現型の回復により選択することができる。
【００３８】
本発明における薬剤耐性遺伝子などの選択マーマー遺伝子は、宿主細胞が保有していない薬剤耐性を付与する遺伝子であれば特に限定されない。具体的な例としては、G418耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などが挙げられ、それぞれＧ４１８、ゼオシン、ハイグロマイシンを含む培地上における耐性により選択することができる。なお、酵母宿主を作成するときに用いた栄養要求性選択マーカーは、該選択マーカーが破壊されていない場合は、用いることができない。この場合、該選択マーカーを回復させればよく、方法は当業者において公知の方法を用いることができる。
【００３９】
本発明における自律複製配列とは、宿主細胞において、本発明の組換えベクターの複製起点として作用し、自律的な複製を可能とする配列のことを指す。
【００４０】
［形質転換酵母］
本発明によれば、上記した本発明の組み換え発現ベクターを有する形質転換酵母が提供される。
酵母の種類は、特に限定されないが、メタノール資化性酵母がより好ましく、オガタエア属（Ｏｇａｔａｅａ）やコマガタエラ属(Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ)に属するメタノール資化性酵母がさらに好ましい。オガタエア属に属するメタノール資化性酵母の中でも、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、オガタエア・ミニュータ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）が好ましく、コマガタエラ属に属するメタノール資化性酵母では、コマガタエア・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が好ましい。
【００４１】
本発明の組み換え発現ベクターを酵母に導入する方法は、酵母にＤＮＡを導入することができる方法であれば特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、酢酸リチウム法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法などのトランスフェクション法やマイクロインジェクション法のような公知の方法を制限なく使用できる。また、ＹＩｐ系などのベクター又は染色体中の任意の領域と相同なＤＮＡ配列を用いた染色体への置換又は挿入型の酵母の形質転換法を使用することもできる。
【００４２】
本発明におけ形質転換酵母とは、本発明の組換えベクターが導入された酵母を意味する。本発明の形質転換酵母は、組換えベクターに含まれる栄養要求性相補遺伝子や薬剤耐性遺伝子により得られる表現型を指標にして、選択的に得ることができる。
【００４３】
本発明の組み換え発現ベクターが酵母に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション又はノーザンハイブリダイゼーション等により行うことができる。例えば、形質転換酵母からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行い、増幅産物について電気泳動（アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル又はキャピラリー）を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色して増幅産物を検出することにより、形質転換を確認することができる。あるいは、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。
【００４４】
形質転換酵母を培養するための培地は、酵母が資化する栄養源を含む培地であれば何でも使用でき、上記栄養源としては、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、メタノール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油脂類、またはこれらの混合物等の炭素源、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等の窒素源、更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源を適宜混合・配合した通常の培地を用いることができるが、特にグリセロールやメタノールを炭素源として用いることが好ましい。また、培養方法としてバッチ培養、連続培養またはドーム型培養のいずれでも培養可能である。
【００４５】
培養は通常一般の条件により行なうことができ、例えば、ｐＨ２．５〜１０．０、好ましくはｐＨ４．０〜８．０、温度１０℃〜４８℃、好ましくは２０℃〜４２℃、より好ましくは２５℃〜３７℃で、好気的に１０時間〜１０日間培養することにより行うことができる。
【００４６】
［プロテアーゼ前駆体］
本発明によれば、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列のＮ末端側に、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有するプロ配列が融合しているプロテアーゼ前駆体が提供される。
【００４７】
本発明のプロテアーゼ前駆体は、
（ｉ）前記プロテアーゼ前駆体を酵母の培養上清中に発現させた場合、前記プロテアーゼと、前記プロテアーゼ前駆体とが１：１以上の比率で分泌し、かつ
（ｉｉ）前記発現したプロテアーゼにより、前記発現したプロテアーゼ前駆体をプロテアーゼに変換することが可能である、
という特徴を有している。
【００４８】
フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼ、並びにプロ配列の詳細については本明細書中において上記した通りである。
【００４９】
本発明のプロテアーゼ前駆体は、上記した形質転換酵母を培養することにより、形質転換酵母に生産させることができる。従って、本発明のプロテアーゼ前駆体は、本発明の形質転換酵母を培養し、その培養上清中に本発明のプロテアーゼ前駆体を蓄積させる分泌生産により得ることができる。
本発明における分泌生産とは、形質転換酵母を液体培養して、菌体内部でなく培養上清にプロテアーゼ前駆体及びプロテアーゼを蓄積させることを指す。
【００５０】
［フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼを含む酵母培養物由来プロテアーゼ組成物］
本発明によれば、酵母で発現したフザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼを含む、酵母培養物由来プロテアーゼ組成物が提供される。本発明の組成物は、酵母培養物由来プロテアーゼ組成物であり、酵母培養物由来成分を含む場合がある。また、本発明におけるフザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼは、酵母で発現したものであり、酵母における翻訳語修飾を受けているものである場合がある。
【００５１】
フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼとしては、本明細書中上記した通り、下記（ａ）〜（ｃ）の何れかであることが好ましい。
（ａ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ；
（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ；又は
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ。
【００５２】
本発明の形質転換酵母を培養した後の培養上清又は培養物には、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼ、及びその前駆体（プロテアーゼ前駆体）が含まれている。本発明においては、上記の培養上清又は培養物において、自己消化を行うことにより、プロテアーゼ前駆体から、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼへの変換を行うことが好ましい。自己消化は、培養上清又は培養物を自己消化反応に適した条件下の反応液に調整し、得られた反応液をインキュベートすることにより行うことができる。自己消化反応は、好ましくはｐＨ６〜１０、より好ましくはｐＨ７〜９、Ｍｇ2+イオンの存在下、かつ温度０℃〜４０℃、より好ましくは温度４℃〜２０℃の条件下において行うことができる。
【００５３】
フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼの単離精製は、公知のタンパク質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、形質転換酵母を適当な培地で培養した後、培養液の遠心分離、あるいは、濾過処理により培養上清から菌体を除く。次いで、得られた培養上清を用いて、所望により、自己消化を行うことができる。自己消化後の反応液を用いて、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法で、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼを回収することができる。
上記の通り回収したフザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼは、そのまま使用することもできるが、各種の製剤化処理を施してから使用してもよい。
【００５４】
本発明のプロテアーゼ組成物は、タンパク質分解酵素として使用できる。酵素反応のｐＨ及び温度は、本発明のプロテアーゼ組成物中のトリプシン様プロテアーゼがトリプシン活性を発揮し得る範囲内であればよい。例えば、ｐＨ６〜１２、より好ましくはｐＨ７〜１０、温度４℃〜４０℃、より好ましくは温度２０℃〜３７℃の条件下において行うことができる。
【００５５】
本発明の酵母培養物由来プロテアーゼ組成物の用途は特に限定されないが、例えば、組織や細胞からＤＮＡ等の核酸を調製する際に、試料を前処理するための試薬（研究試薬など）として利用することができる。さらに、本発明の酵母培養物由来プロテアーゼ組成物は、例えば、洗剤（医療器具用洗剤、食器洗浄機用洗剤、洗濯用洗剤等）、飼料加工、食品加工（魚油加工、食肉加工等）、繊維加工、羊毛加工、皮革加工、コンタクトレンズ洗浄、配管洗浄、医薬等に利用することができ、入浴剤や脱毛剤に配合してもよい。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組換えDNA技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、Current Protocolsin Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）。【００５７】
また、以下の実施例において、酵母の形質転換に用いるプラスミドは、構築したベクターを大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入し、得られた形質転換体を培養して増幅することによって調製した。プラスミド保持株からのプラスミドの調製は、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。【００５８】
ベクターの構築において利用した、ＡＯＸ１プロモーター（配列番号２）、ＡＯＸ１ターミネーター（配列番号３）、ＨＩＳ４遺伝子（配列番号４）はコマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ７６２７３株の染色体ＤＮＡ（塩基配列はＥＭＢＬ  （Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．  ＦＲ８３９６２８〜ＦＲ８３９６３１に記載）混合物をテンプレートにしてＰＣＲで調製した。【００５９】
ベクターの構築において利用した、Ｍａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒαプレプロシグナル配列（ＭＦ配列）が付与された野生型プロテアーゼ前駆体遺伝子（配列番号５）は公開配列情報に基づいて合成ＤＮＡを調製した。
ＰＣＲにはＰｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）等を用い、反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。染色体ＤＮＡの調製は、コマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ７６２７３株からＧｅｎとるくんTM（タカラバイオ社製）等を用いて、これに記載の条件で実施した。【００６０】
比較例１:野生型プロテアーゼ前駆体の分泌発現ベクターの構築
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩのマルチクローニングサイトをもつ遺伝子断片（配列番号６）を全合成し、これをｐＵＣ１９（タカラバイオ社製、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．  ３２１９）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩサイト間に挿入して、ｐＵＣ−１を構築した。
また、ＡＯＸ１プロモーターの両側にＢａｍＨＩ認識配列を付加した核酸断片を、プライマー１（配列番号７）及び２（配列番号８）を用いたＰＣＲにより調製し、ＢａｍＨＩ処理後にｐＵＣ−１のＢａｍＨＩサイトに挿入して、ｐＵＣ−Ｐａｏｘを構築した。【００６１】
次に、ＡＯＸ１ターミネーターの両側にＸｂａＩ認識配列を付加した核酸断片を、プライマー３（配列番号９）及び４（配列番号１０）を用いたＰＣＲにより調製し、ＸｂａＩ処理後にｐＵＣ−ＰａｏｘのＸｂａＩサイトに挿入して、ｐＵＣ−ＰａｏｘＴａｏｘを構築した。
次に、ＨＩＳ４遺伝子の両側にＥｃｏＲＩ認識配列を付加した核酸断片を、プライマー５（配列番号１１）及び６（配列番号１２）を用いたＰＣＲにより調製し、ＥｃｏＲＩ処理後にｐＵＣ−ＰａｏｘＴａｏｘのＥｃｏＲＩサイトに挿入して、ｐＵＣ−ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４を構築した。【００６２】
次に、ＭＦ配列が付与されたプロテアーゼ前駆体遺伝子の両側にＢｇｌＩＩ認識配列を付加した核酸断片を、プライマー７（配列番号１３）及び８（配列番号１４）を用いたＰＣＲにより調製し、ＢｇｌＩＩ処理後にｐＵＣ−ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ｐＵＣ−ＰａｏｘＴＰＴａｏｘＨＩＳ４を構築した。このｐＵＣ−ＰａｏｘＴＰＴａｏｘＨＩＳ４は、野生型プロテアーゼ前駆体遺伝子がＡＯＸ１プロモーター制御下で分泌発現するように設計されている。【００６３】
比較例２: 形質転換酵母の取得
比較例１で構築した野生型プロテアーゼ前駆体発現ベクターを用いて、以下のようにコマガタエラ・パストリスを形質転換した。
コマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ７６２７３株由来ヒスチジン要求性株を３ｍｌのＹＰＤ培地（１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％  ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、２％  ｇｌｕｃｏｓｅ）に接種し、３０℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液５００μｌを５０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、ＯＤ６００が１〜１．５になるまで振盪培養後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、２５０μｌの１Ｍ  ＤＴＴ（終濃度２５ｍＭ）を含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー，ｐＨ７．５に再懸濁した。【００６４】
この懸濁液を３０℃で１５分インキュベート後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、予め氷冷した５０ｍｌのＳＴＭバッファー（２７０ｍＭスクロース、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄液を集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）し、２５  ｍｌのＳＴＭバッファーで再度洗浄したのち、集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）した。最終的に、２５０μｌの氷冷ＳＴＭバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。
比較例１で構築した野生型プロテアーゼ前駆体発現ベクターｐＵＣ−ＰａｏｘＴＰＴａｏｘＨＩＳ４を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を２ｍｌのアンピシリン含有２ＹＴ培地（１．６％  ｔｒｙｐｔｏｎｅ  ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％  塩化ナトリウム、０．０１％アンピシリンナトリウム（和光純薬工業社製））で培養し、得られた菌体からＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ｐＵＣ−ＰａｏｘＴＰＴａｏｘＨＩＳ４を取得した。本プラスミドをＳａｌＩ処理し、ＨＩＳ４遺伝子内のＳａｌＩ認識配列で切断された直鎖状ベクターを調製した。【００６５】
上述のコンピテントセル溶液６０μｌと直鎖状のｐＵＣ−ＰａｏｘＴＰＴａｏｘＨＩＳ４溶液１μｌを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極、電極間隔２ｍｍ（ビーエム機器社製））に移し入れ、７．５ｋＶ／ｃｍ、２５μＦ、２００Ωに供した後、菌体を１ｍｌのＹＰＤ培地で懸濁し、３０℃で１時間静置した。１時間静置後、集菌（３０００×ｇ、５分、２０℃）し、１ｍｌのＹＮＢ培地（０．６７％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製））に懸濁後、再度集菌（３０００×ｇ、５分、２０℃）した。菌体を適当量のＹＮＢ培地で再懸濁後、ＹＮＢ選択寒天プレート（０．６７％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１．５％アガロース、２％  ｇｌｕｃｏｓｅ）に塗布し、３０℃、３日間の静置培養で生育する株を選択し、野生型プロテアーゼ前駆体発現酵母を取得した。【００６６】
比較例３：  形質転換酵母の培養
比較例２で得られた野生型プロテアーゼ前駆体発現酵母を２ｍｌのＢＭＧＹ培地（１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％  ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、０．３４％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１％  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ、０．４ｍｇ／ｌ  Ｂｉｏｔｉｎ、１００ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ６．０）、１％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１％  Ｍｅｔｈａｎｏｌ）に接種し、これを３０℃、４８時間振盪培養後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分、４℃）により培養上清を回収した。【００６７】
比較例４：培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
比較例３で得られた培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を実施した。
１２μｌの培養上清と３μｌの５×サンプルバッファー（０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、６．７％  ＳＤＳ、０．０１％  ＢＰＢ）を混合し、９５℃−８ｍｉｎ処理をした。本サンプルを分子量マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ’TM  Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、バイオラッド社製）と共に、  ｅ−ＰＡＧＥＬゲル（Ｅ−Ｒ１５Ｌ、ＡＴＴＯ社製）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供した。泳動後、ゲルを１５分間水洗し、染色液（Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ  ＣＢＢ  Ｇ−２５０ステイン；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により３０分染色したのち、水で脱色した。その結果、プロテアーゼ前駆体のアミノ酸配列から推定される分子量に相当する領域にバンドは認められた（図１、ｌａｎｅ１）。【００６８】
比較例５：自己消化によるプロテアーゼ前駆体の変換
培養上清中に存在するプロテアーゼ前駆体を自己消化により活性体への変換は以下のように実施した。
培養上清  ５００μｌを、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３Ｋ（メルクミリポア製）を用いて、活性測定用ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  （ｐＨ８．０），  １０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に置換した。その後、同ｂｕｆｆｅｒを用いて、液量を５００μｌに調整して、１５℃で２４〜４８時間インキュベートした。【００６９】
比較例６：プロテアーゼ活性の測定
各サンプル中に含まれるプロテアーゼ活性は以下の方法で測定した。
活性測定用ｂｕｆｆｅｒ    ９９０μｌに、２．５ｍＭ  Ｎ−Ｂｅｎｚｏｙｌ−ＤＬ−ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅＨＣｌ  （ｎａｃａｌａｉ社製）  のＤＭＳＯ溶液  １０μｌを加えた後に、サンプル  １〜１０μｌを添加後、初発の４１０ｎｍの吸光度を測定する。そして３７℃で１時間インキュベートし、反応後の４１０ｎｍの吸光度を測定した。反応前後の４１０ｎｍの吸光度変化から、遊離したｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ量を算出して、プロテアーゼ活性を計算した。なお、１ｍｉｎ間に１μｍｏｌのｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅを生成する酵素量を１ユニットと定義した。
上記方法で比較例３で得られた培養上清および比較例５で得られた自己消化後の溶液中のプロテアーゼ活性を測定したが、活性は検出できなかった（表１）。【００７０】
比較例７：プロテアーゼ発現ベクターの構築
ＭＦ配列が付与された野生型プロテアーゼ前駆体遺伝子の合成遺伝子をテンプレートにプロテアーゼ遺伝子をＰＣＲで調製した。プライマー７及びプライマー９（配列番号１５）、プライマー１０（配列番号１６）及びプライマー８を用いたＰＣＲを実施し、それぞれのＰＣＲの増幅断片を混合した後に、プライマー７及びプライマー８でＰＣＲを実施し、ＭＦ配列が付与されたプロテアーゼ遺伝子を調製した。
上記で調製したプロテアーゼ遺伝子をＢｇｌＩＩ処理し、比較例１で調製したｐＵＣ−ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与されたプロテアーゼ遺伝子発現ベクターを構築した。【００７１】
比較例８：プロテアーゼの分泌生産
比較例７で構築したベクターを用いて、比較例２〜６の処理を行い、ピキア酵母でのプロテアーゼの分泌生産を評価した。その結果、培養上清中に少量のプロテアーゼ活性を認めたものの、ＰＡＧＥ上でのプロテアーゼのバンドは認められなかった（図１  ｌａｎｅ  ２，  表１）。本結果は、プロテーゼをピキア酵母で高分泌させるのは困難であることを示している。【００７２】
比較例９：変異プロテアーゼ前駆体発現ベクターの構築
ＭＦ配列が付与された野生型プロテアーゼ前駆体遺伝子の合成遺伝子をテンプレートにブタトリプシン由来プロ配列をもつ変異プロテアーゼ前駆体遺伝子をＰＣＲで調製した。プライマー７及びプライマー１１（配列番号１７）、プライマー１２（配列番号１８）及びプライマー８を用いたＰＣＲを実施し、それぞれのＰＣＲの増幅断片を混合した後に、プライマー７及びプライマー８でＰＣＲを実施し、ＭＦ配列が付与された変異プロテアーゼ前駆体遺伝子を調製した。
上記で調製したプロテアーゼ遺伝子をＢｇｌＩＩ処理し、比較例１で調製したｐＵＣ−ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与された変異プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを構築した。【００７３】
比較例１０：変異プロテアーゼ前駆体の分泌生産
比較例９で構築したベクターを用いて、比較例２〜６の処理を行い、ピキア酵母での変異プロテアーゼ前駆体の分泌生産を評価した。その結果、培養上清中にプロテアーゼ活性は認められず（表１）、ＰＡＧＥ上ではアミノ酸配列から推測されるサイズとは異なるバンドが認められた。本結果は、自己消化による前駆体から活性型への変換例が報告されているブタ由来トリプシンのプロ配列を用いても、本プロテアーゼではうまく機能しないことを示している。【００７４】
【表１】
2018174231.tif 000002
【００７５】
実施例１：変異プロテアーゼ前駆体発現ベクターの構築１
ＭＦ配列が付与された野生型プロテアーゼ前駆体遺伝子の合成遺伝子をテンプレートにＮ７ＮＲ変異前駆体遺伝子をＰＣＲで調製した。プライマー７及びプライマー１３（配列番号１９）、プライマー１４（配列番号２０）及びプライマー８を用いたＰＣＲを実施し、それぞれのＰＣＲの増幅断片を混合した後に、プライマー７及びプライマー８でＰＣＲを実施し、ＭＦ配列が付与されたＮ７ＮＲ変異前駆体遺伝子を調製した。
上記で調製した変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子をＢｇｌＩＩ処理し、比較例１で調製したｐＵＣ−ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与された各種変異プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを構築した。
この変異前駆体は、野生型前駆体のＮ７とＩ８に相当する残基間にＲ残基が挿入された変異を有する。【００７６】
実施例２：  変異プロテアーゼ前駆体発現ベクターの構築２
ＭＦ配列が付与された野生型プロテアーゼ前駆体遺伝子の合成遺伝子をテンプレートにＮ７ＮＫ変異前駆体遺伝子をＰＣＲで調製した。プライマー７及びプライマー１５（配列番号２１）、プライマー１６（配列番号２２）及びプライマー８を用いたＰＣＲを実施し、それぞれのＰＣＲの増幅断片を混合した後に、プライマー７及びプライマー８でＰＣＲを実施し、ＭＦ配列が付与されたＮ２４ＮＫ変異前駆体遺伝子を調製した。
上記で調製した変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子をＢｇｌＩＩ処理し、比較例１で調製したｐＵＣ−ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与された各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを構築した。
この変異前駆体は、野生型前駆体のＮ７とＩ８に相当する残基間にＫ残基が挿入された変異を有する。【００７７】
実施例３：  変異プロテアーゼ前駆体発現ベクターの構築３
実施例１で構築したＮ７ＮＲ変異前駆体遺伝子の発現ベクターをテンプレートに、以下の表２に示した、各プライマーの組合せ（１ｓｔＰＣＲ−１、１ｓｔＰＣＲ−２）を用いてＰＣＲを行い、得られた各断片を混合したものをテンプレートに、プライマー７およびプライマー８でＰＣＲを行い、ＭＦ配列が付与された各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子を調製した。
上記で調製した変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子をＢｇｌＩＩ処理し、比較例１で調製したｐＵＣ−ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与された各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを構築した。
これらの変異前駆体は、野生型前駆体のＮ７とＩ８に相当する残基間にＲ残基が挿入され、かつＮ７に相当する残基が別のアミノ酸残基に置換された変異を有する。【００７８】
【表２】
2018174231.tif 000003
【００７９】
実施例４: 変異プロテアーゼ前駆体発現ベクターの構築４
実施例２で構築したＮ７ＮＫ変異前駆体遺伝子の発現ベクターをテンプレートに、以下の表３に示した、各プライマーの組合せ（1ｓｔＰＣＲ−１、１ｓｔＰＣＲ−２）を用いてＰＣＲを行い、得られた各断片を混合したものをテンプレートに、プライマー７およびプライマー８でＰＣＲを行い、ＭＦ配列が付与された各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子を調製した。
上記で調製した変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子をＢｇｌＩＩ処理し、比較例1で調製したｐＵＣ−ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与された各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを構築した。
これらの変異前駆体の一部は、野生型前駆体のＮ７とＩ８に相当する残基間にＫ残基が挿入され、かつＮ７に相当する残基が別のアミノ酸残基に置換された変異を有する。また、別のこれらの変異前駆体の一部は、野生型前駆体のＮ７とＩ８に相当する残基間にＫ残基が挿入され、プロ配列の長さが異なる変異を有する【００８０】
【表３】
2018174231.tif 000004
2018174231.tif 000005
【００８１】
実施例５: 変異型プロテアーゼ前駆体の分泌生産１
実施例１および３で得られた各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを用いて、比較例２〜６に記載の処理を行い、ピキア酵母での変異型プロテアーゼ前駆体の分泌生産を評価した。その結果、培養上清中にプロテアーゼ活性が認められ（表４）、PAGE上において前駆体バンドも検出された。さらに、自己消化処理を行うことにより、プロテアーゼ活性が大きく向上した（表４）。
これらの結果は、改変したプロ配列を有する変異型プロテアーゼ前駆体を用いることにより、効率的にプロテアーゼを分泌生産できることを示している。【００８２】
【表４】
2018174231.tif 000006
【００８３】
実施例６: 変異型プロテアーゼ前駆体の分泌生産２
実施例２および４で得られた各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを用いて、比較例２〜６に記載の処理を行い、ピキア酵母での変異型プロテアーゼ前駆体の分泌生産を評価した。その結果、培養上清中にプロテアーゼ活性が認められ（表５）、PAGE上において前駆体バンドも検出された。さらに、自己消化処理を行うことにより、プロテアーゼ活性が大きく向上した（表５）。自己消化処理の前後のサンプルのSDS-PAGE解析の結果、処理によりプロテアーゼ前駆体のバンドが消失し、プロテアーゼのバンドに変換されていた（図２）。
これらの結果は、改変したプロ配列を有する変異型プロテアーゼ前駆体を用いることにより、効率的にプロテアーゼを分泌生産できることを示している。【００８４】
【表５】
2018174231.tif 000007
【００８５】
実施例７: 変異プロテアーゼ前駆体発現ベクターの構築５
実施例２で構築したＮ７ＮＫ変異前駆体遺伝子の発現ベクターをテンプレートに、以下の表６に示した、各プライマーの組合せ（1ｓｔＰＣＲ−１、１ｓｔＰＣＲ−２）を用いてＰＣＲを行い、得られた各断片を混合したものをテンプレートに、プライマー７およびプライマー８でＰＣＲを行い、ＭＦ配列が付与された各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子を調製した。【００８６】
上記で調製した変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子をＢｇｌＩＩ処理し、比較例1で調製したｐＵＣ−ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与された各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを構築した。【００８７】
【表６】
2018174231.tif 000008
【００８８】
これらの変異前駆体の一部は、野生型前駆体のＮ７とＩ８に相当する残基間にＫ残基が挿入され、かつＧ１からＩ５の各アミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置換された変異を有する。【００８９】
実施例８: 変異型プロテアーゼ前駆体の分泌生産３
実施例７で得られた各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを用いて、比較例２〜６に記載の処理を行い、ピキア酵母での変異型プロテアーゼ前駆体の分泌生産を評価した。その結果、培養上清中にプロテアーゼ活性が認められ（表７）、PAGE上において前駆体バンドも検出された。さらに、自己消化処理を行うことにより、プロテアーゼ活性が大きく向上した（表７）。【００９０】
【表７】
2018174231.tif 000009
【００９１】
これらの結果は、改変したプロ配列を有する変異型プロテアーゼ前駆体を用いることにより、効率的にプロテアーゼを分泌生産できることを示している。【００９２】
実施例９: 変異プロテアーゼ前駆体発現ベクターの構築６
実施例４で構築したＮ７ＥＫ変異前駆体遺伝子の発現ベクターをテンプレートに、以下の表８に示した、各プライマーの組合せ（1ｓｔＰＣＲ−１、１ｓｔＰＣＲ−２）を用いてＰＣＲを行い、得られた各断片を混合したものをテンプレートに、プライマー７およびプライマー８でＰＣＲを行い、ＭＦ配列が付与された各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子を調製した。
上記で調製した変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子をＢｇｌＩＩ処理し、比較例1で調製したｐＵＣ−ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与された各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを構築した。【００９３】
【表８】
2018174231.tif 000010
【００９４】
これらの変異前駆体は、野生型前駆体のＮ７とＩ８に相当する残基間にＫ残基が挿入され、かつＮ７に相当する残基がＥ残基に置換された変異を有する。さらに、活性体の内部で自己分解を起こし得るサイトの一つであるＲ１１１が別のアミノ酸残基に置換された変異を有する。【００９５】
実施例１０: 変異型プロテアーゼ前駆体の分泌生産４
実施例９で得られた各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを用いて、比較例２〜６に記載の処理を行い、ピキア酵母での変異型プロテアーゼ前駆体の分泌生産を評価した。その結果、培養上清中にプロテアーゼ活性が認められ（表９）、PAGE上において前駆体バンドも検出された。さらに、自己消化処理を行うことにより、プロテアーゼ活性が大きく向上した（表９）。【００９６】
【表９】
2018174231.tif 000011
【００９７】
これらの結果は、Ｒ１１１残基を改変することにより、前駆体／活性体の比率を向上させ、より効率的にプロテアーゼを分泌生産できることを示している。
実施例１１: ＧＡＰプロモーター下での変異プロテアーゼ前駆体発現ベクターの構築
実施例９で構築したＮ７ＥＫ-Ｒ１１１Ａ変異前駆体遺伝子の発現ベクターをＢａｍＨＩ処理後に、アガロースゲル電気泳動し、ＡＯＸ１プロモーターを除く上記ベクター領域を精製した。次に、ＧＡＰプロモーター（配列番号８２）の両側にＢａｍＨＩ認識配列を付加した核酸断片を、プライマー７５（配列番号８３）及び７６（配列番号８４）を用いたＰＣＲにより調製し、ＢａｍＨＩ処理後に上記のベクター領域のＢａｍＨＩサイトに挿入して、ＧＡＰプロモーター下でのＮ７ＥＫ-Ｒ１１１Ａ変異前駆体遺伝子が発現する発現ベクターを構築した。【００９８】
実施例１２: 変異型プロテアーゼ前駆体の分泌生産４
実施例１１で得られたＧＡＰプロモーター下でのＮ７ＥＫ-Ｒ１１１Ａ変異前駆体遺伝子が発現する発現ベクターを用いて、比較例２〜６に記載の処理を行い、ピキア酵母での変異型プロテアーゼ前駆体の分泌生産を評価した。その結果、培養上清中にプロテアーゼ活性が認められ（表１０）、PAGE上において前駆体バンドも検出された。さらに、自己消化処理を行うことにより、プロテアーゼ活性が大きく向上した（表１０）。【００９９】
【表１０】
2018174231.tif 000012
【０１００】
この結果は、プロモーターを変更することにより、前駆体／活性体の比率を向上させ、より効率的にプロテアーゼを分泌生産できることを示している。
【図１】
2018174231.tif 000013
【図２】
2018174231.tif 000014
【配列表】
2018174231000001.app
【国際調査報告】
2018174231.tif 000015
2018174231.tif 000016
2018174231.tif 000017