(57)【要約】  医薬組成物は、糖誘導体を含有する生体適合性粒子を含み、生体適合性粒子は、乳酸・グリコール酸共重合体を含む。当該医薬組成物は、抗癌剤と併用される、こととしてもよい。
2019004338.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖誘導体を含有する生体適合性粒子を含み、
前記生体適合性粒子は、
乳酸・グリコール酸共重合体を含む、
医薬組成物。
【請求項２】
抗癌剤と併用される、
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
抗癌剤を含み、
請求項１に記載の医薬組成物と併用される、
医薬組成物。
【請求項４】
糖誘導体を含有する生体適合性粒子と、
抗癌剤と、
を含み、
前記生体適合性粒子は、
乳酸・グリコール酸共重合体を含む、
医薬組成物。
【請求項５】
前記抗癌剤は、
ソラフェニブ、ドキソルビシン又はシスプラチンである、
請求項２から４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記糖誘導体は、
２−デオキシ−Ｄ−グルコースである、
請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記生体適合性粒子の平均粒径は、
５０〜１７０ｎｍである、
請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
肝細胞癌、腎臓癌、大腸癌又は膵臓癌の治療に使用される、
請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
糖誘導体を含有する生体適合性粒子を含み、
前記生体適合性粒子は、
乳酸・グリコール酸共重合体を含む、
腫瘍免疫活性促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物及び腫瘍免疫活性促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコースの誘導体である２−デオキシ−Ｄ−グルコース（以下、単に「２ＤＧ」とする）は、グルコースと同様にグルコーストランスポーターによって細胞内に取り込まれる。がん細胞内に取り込まれ蓄積した２ＤＧは、解糖系の阻害に伴うＡＴＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の産生抑制を介した抗癌作用を有する。【０００３】
癌に対する２ＤＧの使用に関して、２ＤＧとは異なる作用機序の抗癌剤との併用が検討されている。例えば、特許文献１には、ヒト非小細胞肺癌株を移植したマウスに対して２ＤＧ及びパクリタキセルを投与すると、パクリタキセルのみを投与した場合よりも抗腫瘍効果が増大することが示されている。【０００４】
また、非特許文献１には、第１相の臨床試験として、ドセタキセルと併用した経口投与の２ＤＧの用量漸増試験の結果が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００６−５１５８８３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌｕｉｓ  Ｅ．  Ｒａｅｚ、外１４名、「Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｌｏｎｅ  ｏｒ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｏｃｅｔａｘｅｌ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２０１３年、７１、ｐ．５２３−５３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１によれば、２ＤＧは、６３ｍｇ／ｋｇまでの投与量では忍容性が認められたが、６３〜８８ｍｇ／ｋｇの投与量では消化管出血、ＱＴ延長症候群及び高血糖といった重篤な副作用が見られた。２ＤＧを臨床応用するためには、副作用の抑制及び抗腫瘍効果の向上等の改善が必要とされている。【０００８】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、少ない副作用で高い抗腫瘍効果が得られる医薬組成物及び腫瘍免疫活性促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の観点に係る医薬組成物は、
糖誘導体を含有する生体適合性粒子を含み、
前記生体適合性粒子は、
乳酸・グリコール酸共重合体を含む。【００１０】
この場合、上記本発明の第１の観点に係る医薬組成物は、
抗癌剤と併用される、
こととしてもよい。【００１１】
本発明の第２の観点に係る医薬組成物は、
抗癌剤を含み、
上記本発明の第１の観点に係る医薬組成物と併用される。【００１２】
本発明の第３の観点に係る医薬組成物は、
糖誘導体を含有する生体適合性粒子と、
抗癌剤と、
を含み、
前記生体適合性粒子は、
乳酸・グリコール酸共重合体を含む。【００１３】
また、前記抗癌剤は、
ソラフェニブ、ドキソルビシン又はシスプラチンである、
こととしてもよい。【００１４】
また、前記糖誘導体は、
２−デオキシ−Ｄ−グルコースである、
こととしてもよい。【００１５】
また、前記生体適合性粒子の平均粒径は、
５０〜１７０ｎｍである、
こととしてもよい。【００１６】
また、上記本発明の第１、第２及び第３の観点に係る医薬組成物は、
肝細胞癌、腎臓癌、大腸癌又は膵臓癌の治療に使用される、
こととしてもよい。【００１７】
本発明の第４の観点に係る腫瘍免疫活性促進剤は、
糖誘導体を含有する生体適合性粒子を含み、
前記生体適合性粒子は、
乳酸・グリコール酸共重合体を含む。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、少ない副作用で高い抗腫瘍効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１に係る肝癌細胞株皮下移植ヌードマウス及び腫瘍の外観を示す図である。
【図２】実施例１に係る肝癌細胞株皮下移植ヌードマウスにおける腫瘍体積の経時変化を示す図である。
【図３】実施例１に係る肝癌細胞株皮下移植ヌードマウスの体重の経時変化を示す図である。
【図４】実施例１に係る肝癌細胞株皮下移植ヌードマウスの食事量の経時変化を示す図である。
【図５】実施例１に係る２ＤＧ高用量群における２ＤＧ溶液投与後の血糖値の経時変化を示す図である。
【図６】実施例２に係る２ＤＧナノ粒子の粒度分布を示す図である。
【図７】実施例３に係る肝癌細胞株皮下移植ヌードマウス及び腫瘍の外観を示す図である。
【図８】実施例３に係る肝癌細胞株皮下移植ヌードマウスにおける腫瘍体積の経時変化を示す図である。
【図９】実施例３に係る肝癌細胞株皮下移植ヌードマウスの体重の経時変化を示す図である。
【図１０】実施例３に係る肝癌細胞株皮下移植ヌードマウスの食事量の経時変化を示す図である。
【図１１】実施例３に係る２ＤＧナノ粒子投与後のマウスの血糖値の経時変化を示す図である。
【図１２】実施例４に係る肝癌細胞株皮下移植ヌードマウスにおける腫瘍体積の経時変化を示す図（その１）である。
【図１３】実施例４に係る肝癌細胞株皮下移植ヌードマウス及び腫瘍の外観を示す図（その１）である。
【図１４】実施例４に係る肝癌細胞株皮下移植ヌードマウスにおける腫瘍体積の経時変化を示す図（その２）である。
【図１５】実施例４に係る肝癌細胞株皮下移植ヌードマウス及び腫瘍の外観を示す図（その２）である。
【図１６】実施例５に係る腎癌細胞株皮下移植ヌードマウスにおける腫瘍体積の経時変化を示す図である。
【図１７】実施例５に係る腎癌細胞株皮下移植ヌードマウス及び腫瘍の外観を示す図である。
【図１８】実施例６に係る大腸癌細胞株皮下移植ヌードマウスにおける腫瘍体積の経時変化を示す図である。
【図１９】実施例６に係る大腸癌細胞株皮下移植ヌードマウス及び腫瘍の外観を示す図である。
【図２０】実施例７に係る膵癌細胞株皮下移植ヌードマウスにおける腫瘍体積の経時変化を示す図である。
【図２１】実施例７に係る膵癌細胞株皮下移植ヌードマウス及び腫瘍の外観を示す図である。
【図２２】色素含有ナノ粒子投与後の実施例８に係る肝癌細胞株皮下移植ヌードマウスにおける色素の腫瘍及び生体分布の経時的推移を示す図である。
【図２３】色素含有ナノ粒子投与から７日後の図２２に示す肝癌細胞株皮下移植ヌードマウスの腫瘍組織及び各臓器における色素の分布を示す図である。
【図２４】実施例９に係る肝癌細胞株皮下移植ヌードマウスにおける腫瘍体積の経時変化を示す図である。
【図２５】実施例９に係る肝癌細胞株皮下移植ヌードマウス及び腫瘍の外観を示す図である。
【図２６】実施例１０に係る肝発癌マウスの外観を示す図である。
【図２７】実施例１０に係る肝発癌マウスにおける最大腫瘍径を示す図である。
【図２８】実施例１０に係る肝発癌マウスにおける総腫瘍体積を示す図である。
【図２９】実施例１０に係る肝発癌マウスの肝腫瘍組織の免疫染色の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（実施の形態）
本発明に係る実施の形態について説明する。本実施の形態に係る医薬組成物は、糖誘導体を含有する生体適合性粒子を含む。例えば、糖誘導体は、Ｄ−グルコースの誘導体であって、解糖系を阻害するものである。
【００２１】
好ましくは、糖誘導体は、グルコース環の２位においてヒドロキシル基を有さないグルコース誘導体である。グルコース誘導体としては、マンノース、ガラクトース及び５−チオ−グルコースが挙げられる。グルコース誘導体は、グルコース環上の任意の位置における水素の代わりにフッ素を有してもよい。フッ素を有するグルコース誘導体としては、例えば、２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース及び２−ジフルオロ−２−Ｄ−デオキシ−グルコース等が挙げられる。グルコース誘導体は、グルコース環上の６位以外の任意の位置において水酸基の代わりにアミノ基を有してもよい。アミノ基を有するグルコース誘導体としては、例えば、２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース及び２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトース等が挙げられる。上記の他にグルコース誘導体として、２−Ｆ−マンノース、２−マンノサミン、２−デオキシガラクトース、２−Ｆ−デオキシガラクトース等が例示される。好適には、糖誘導体は、２ＤＧである。
【００２２】
本実施の形態に係る医薬組成物においては、生体適合性粒子が上記糖誘導体を含有する。生体適合性粒子は、生体への刺激又は毒性が低く、かつ投与後分解して代謝される性質を備える粒子である。ここでの「含有」とは、糖誘導体が生体適合性粒子に内包又は封入されてもよく、糖誘導体が生体適合性粒子に内包又は封入され、かつ糖誘導体の一部が生体適合性粒子の表面に露出していてもよい。
【００２３】
生体適合性粒子は、乳酸・グリコール酸共重合体（ポリラクチドグリコライド共重合体ともいう。以下、単に「ＰＬＧＡ」という。）を含む。ＰＬＧＡは、例えば１：９９〜９９：１、好ましくは７５：２５、より好ましくは３：１の割合で、乳酸又はラクチドと、グリコール酸又はグリコライドと、からなるコポリマーである。ＰＬＧＡは、任意のモノマーから公知の方法で合成してもよいし、市販のＰＬＧＡを使用してもよい。市販のＰＬＧＡとしては、例えばＰＬＧＡ７５２０（乳酸：グリコール酸＝７５：２５、平均重量分子量２０，０００、和光純薬社製）が挙げられる。乳酸及びグリコール酸の含有量が２５重量％〜６５重量％であるＰＬＧＡは非晶質であり、アセトン等の有機溶媒に可溶である点で好ましい。
【００２４】
生体適合性粒子の粒径は、１０００ｎｍ未満で、例えば２．５〜９００ｎｍ、好ましくは５〜５００ｎｍ又は１０〜３００ｎｍ、より好ましくは３０〜２５０ｎｍ、さらに好ましくは４０〜１８０ｎｍ、特に好ましくは５０〜１００ｎｍである。例えば、生体適合性粒子の粒径は、５０〜１７０ｎｍである。生体適合性粒子の粒径は、ふるい分け法、沈降法、顕微鏡法、光散乱法、レーザー回折・散乱法、電気的抵抗試験、透過型電子顕微鏡による観察、及び走査型電子顕微鏡による観察等で測定できる。粒径は粒度分布計で測定してもよい。粒径は、測定方法に応じて、ストーク相当径、円相当径及び球相当径で表すことができる。また、粒径は、複数の粒子を測定対象として、平均で表した平均粒径、体積平均粒径及び面積平均粒径等であってもよい。また、粒径は、レーザー回折・散乱法等の測定に基づく個数分布等から算出される平均粒径であってもよい。
【００２５】
具体的には、粒子の集団の全体積を１００％として累積カーブを求めたとき、その累積カーブが５０％となる点の粒径である５０％径（Ｄ５０）を粒径としてもよい。累積カーブ及びＤ５０は、市販の粒度分布計を用いて求めることができる。粒度分布計としては、例えば、ＮＩＫＫＩＳＯ  Ｎａｎｏｔｒａｃ  Ｗａｖｅ−ＥＸ１５０（日機装社製）が挙げられる。
【００２６】
上記生体適合性粒子に含まれる糖誘導体の生物学的利用率を高めるために、生体適合性粒子の粒度分布は、好ましくはシングルピークである。上記生体適合性粒子の粒径の均一さの指標となるスパン値は、（Ｄ９０−Ｄ１０）／Ｄ５０で求められる。ここで、Ｄ９０は上記累積カーブが９０％となる点の粒径である９０％径である。Ｄ１０は上記累積カーブが１０％となる点の粒径である１０％径である。Ｄ９０及びＤ１０は、市販の粒度分布計を用いて求めることができる。スパン値は、生体適合性粒子の作用効果が得られるのであれば限定されないが、例えば２．５以下であり、好ましくは２．３以下、より好ましくは２．０以下又は１．８以下、特に好ましくは１．６以下である。
【００２７】
上記生体適合性粒子は、表面をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾してもよい。例えば、上記生体適合性粒子の製造に、ＰＬＧＡのＰＥＧ修飾体を用いることで、表面がＰＥＧで修飾された生体適合性粒子が得られる。表面がＰＥＧで修飾されることで、生体適合性粒子の血中安定性が向上する。
【００２８】
糖誘導体を含有する生体適合性粒子の製造方法としては、公知の任意の製造方法を採用できる。例えば、生体適合性粒子は、水中エマルジョン法で製造できる。水中エマルジョン法では、ＰＬＧＡが溶解する良溶媒と、ＰＬＧＡが溶解しない貧溶媒の２種類の溶媒を用いる。良溶媒には、ＰＬＧＡが溶解し、かつ貧溶媒へ混和する有機溶媒を用いる。良溶媒及び貧溶媒の種類は、特に限定されない。
【００２９】
貧溶媒としては、水が挙げられる。貧溶媒として水を用いる場合、水に界面活性剤を添加してもよい。例えば、界面活性剤としては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が好ましい。ＰＶＡ以外の界面活性剤としては、レシチン、ヒドロキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
【００３０】
良溶媒としては、低沸点かつ難水溶性の有機溶媒であるハロゲン化アルカン類、アセトン、メタノール、エタノール、エチルアセテート、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、ベンゼン及びトルエン等が挙げられる。好ましくは、例えば環境や人体に対する悪影響が少ないアセトンのみ又はアセトンとエタノールとの混合液が用いられる。
【００３１】
水中エマルジョン法では、まず、良溶媒中にＰＬＧＡを溶解後、ＰＬＧＡが析出しないように糖誘導体溶液を良溶媒中へ添加し混合する。ＰＬＧＡと糖誘導体とを含む混合液を、撹拌下で貧溶媒中に滴下すると、混合液中の良溶媒が貧溶媒中へ急速に拡散移行する。その結果、貧溶媒中で良溶媒の乳化が起き、良溶媒のエマルジョン滴が形成される。
【００３２】
さらに良溶媒と貧溶媒の相互拡散により、エマルジョン内から有機溶媒が貧溶媒へと継続的に拡散するため、エマルジョン滴内のＰＬＧＡ及び糖誘導体の溶解度が低下する。最終的には、糖誘導体を含有する球形結晶粒子の生体適合性粒子が生成する。その後、良溶媒である有機溶媒を遠心分離又は減圧留去し、生体適合性粒子粉末を得る。得られた粉末は、そのまま、又は必要に応じて凍結乾燥等により再分散可能な凝集粒子に複合化される。得られた生体適合性粒子における糖誘導体の含有率は、例えば０．０１〜９９重量％、０．１〜３０重量％、０．５〜２０重量％、１〜１５重量％、３〜１０重量％又は５〜１０重量％である。なお、ここでの糖誘導体の含有率は、生体適合性粒子の重量に対する糖誘導体の重量の割合である。含有率は、所定重量のナノ粒子から抽出された糖誘導体の重量を定量し、生体適合性粒子の重量に対する糖誘導体の重量の割合を算出することで求められる。
【００３３】
なお、生体適合性粒子における糖誘導体の含有率を高めるため、貧溶媒にカチオン性高分子を添加してもよい。カチオン性高分子としては、キトサン並びにキトサン誘導体、セルロースに複数のカチオン基を結合させたカチオン化セルロース及びポリエチレンイミン、ポリビニルアミン並びにポリアリルアミン等のポリアミノ化合物等が挙げられる。
【００３４】
好適には、糖誘導体を含有する生体適合性粒子は、強制薄膜式マイクロリアクターを用いて製造される。強制薄膜式マイクロリアクターを用いる場合、まず、互いに対向して配設され、少なくとも一方が他方に対して相対的に回転する処理用面間に、上述の良溶媒と貧溶媒とを導入する。これにより形成される薄膜流体中で、良溶媒と貧溶媒とを混合し、糖誘導体を含有する生体適合性粒子を、薄膜流体中に析出させる。強制薄膜式マイクロリアクターとしては、好ましくはＵＬＲＥＡ  ＳＳ−１１（エム・テクニック社製）が用いられる。
【００３５】
本実施の形態に係る医薬組成物の医薬用途は、特に限定されない。好ましくは、当該医薬組成物は、抗癌剤として癌、特には固形癌の治療に用いられる。具体的には、固形癌としては、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、乳癌、肝臓癌（肝癌）、腎臓癌（腎癌）、舌癌、甲状腺癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫及び平滑筋腫等が挙げられる。好適には、当該医薬組成物は、多血性腫瘍が形成される癌の治療に用いられる。多血性腫瘍とは、造影コンピューター断層撮影法等の造影検査において、造影にて増強される動脈血流の豊富な腫瘍である。多血性腫瘍が形成される癌種は、例えば、肝細胞癌及び腎細胞癌である。
【００３６】
上記医薬組成物は、抗肝細胞癌剤、抗腎臓癌剤、抗大腸癌剤、又は抗膵臓癌剤として有用である。また、別の実施の形態では、上記医薬組成物は抗腫瘍剤として使用される。
【００３７】
上記医薬組成物は、下記実施例１０に示されるように、腫瘍内部へのＴ細胞浸潤を増加させる。よって、さらに別の実施の形態では、上記医薬組成物は腫瘍免疫活性促進剤として使用される。
【００３８】
本実施の形態に係る医薬組成物のヒトへの投与経路は特に限定されない。上記医薬組成物は、注射剤及び経口投与剤として用いられるのが好ましい。このとき、医薬組成物は、例えば、薬理的に許容される担体と配合された合剤であってもよい。薬理的に許容される担体は、製剤素材として用いられる各種の有機担体物質又は無機担体物質である。薬理的に許容される担体は、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、又は液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等として医薬組成物に配合される。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤及び甘味剤等の添加物を用いることもできる。
【００３９】
本実施の形態に係る医薬組成物は、既知の方法で製造され、有効成分として０．０００００１〜９９．９重量％、０．００００１〜９９．８重量％、０．０００１〜９９．７重量％、０．００１〜９９．６重量％、０．０１〜９９．５重量％、０．１〜９９重量％、０．５〜６０重量％、１〜５０重量％又は１〜２０重量％の生体適合性粒子を含む。
【００４０】
本実施の形態に係る医薬組成物の投与量は、患者の性別、年齢、体重及び症状等によって適宜決定される。当該医薬組成物は、糖誘導体が有効量となるように投与される。有効量とは、所望の結果を得るために必要な糖誘導体の量であり、治療又は処置する状態の進行の遅延、阻害、予防、逆転又は治癒をもたらすのに必要な量である。
【００４１】
当該医薬組成物の投与量は、典型的には、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであり、１日に１回、又はそれ以上に分割して投与することができる。医薬組成物を分割して投与する場合、該医薬組成物は、好ましくは１日に１〜４回投与される。また、医薬組成物は、毎日、隔日、１週間に１回、隔週、１ヶ月に１回等の様々な投与頻度で投与してもよい。好ましくは、投与頻度は、医師等により容易に決定される。なお、必要に応じて、上記の範囲外の量を用いることもできる。
【００４２】
本実施の形態に係る医薬組成物は、抗癌剤と併用されてもよい。併用とは、所定の期間に同一患者に医薬組成物と抗癌剤とを投与することをいう。併用では、医薬組成物を抗癌剤と時間的に同時に投与することが好ましいが、一方の効果が残っている間に、他方を投与する等して、時間的に前後してそれぞれ単独で投与してもよい。併用においては、医薬組成物及び抗癌剤の投与経路は同一であってもよいし、異なってもよい。例えば併用では、医薬組成物及び抗癌剤それぞれの用量及び用法が規定された１つのレジメンに従って、所定の期間に渡って、医薬組成物及び抗癌剤が投与される。
【００４３】
併用における抗癌剤は、特に限定されず、癌に有効、例えば抗腫瘍効果を有する抗癌剤を用いればよい。抗癌剤としては、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物アルカロイド、プラチナ製剤（白金化合物製剤）、生物学的治療薬、ホルモン剤及び分子標的薬等が挙げられる。抗癌剤として、具体的には、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、メトレキサート、フルオロウラシル、ドキソルビシン、イリノテカン、塩酸ゲムシタビン、テガフール・ウラシル及びドセタキセル等が挙げられる。好適には、上記医薬組成物は、肝細胞癌の治療のために、抗癌剤として分子標的薬であるソラフェニブと併用される。また、上記医薬組成物は、ドキソルビシン又はシスプラチンと併用されてもよい。
【００４４】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る医薬組成物は、糖誘導体がＰＬＧＡを含む生体適合性粒子に含有されているため、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果により、標的癌組織に選択的に効率よく糖誘導体を集積させることができる。このため、正常な組織への影響を極力抑制できるので副作用を抑えることができる。また、糖誘導体を標的癌組織に高効率で移行させることで、高い抗腫瘍効果が得られる。
【００４５】
また、本実施の形態では、医薬組成物が抗癌剤と併用されてもよいこととした。医薬組成物に含まれる糖誘導体は、癌細胞に取り込まれ解糖系を阻害するため、グルコースの代謝によるエネルギー産生と物質合成とを阻害することで抗腫瘍効果を示す。糖誘導体に加え、別の作用機序を有する抗癌剤、例えばキナーゼ阻害剤であるソラフェニブ等を併用することで、さらなる抗腫瘍効果が得られる。
【００４６】
別の実施の形態では、上記抗癌剤を含む医薬組成物が提供される。該医薬組成物は、上述の糖誘導体を含有する生体適合性粒子を含む医薬組成物と併用される。なお、当該医薬組成物における有効成分としての抗癌剤の含量は、上述の医薬組成物における生体適合性粒子の含量と同様である。また、当該医薬組成物の投与量及び投与方法も上述の生体適合性粒子を含む医薬組成物と同様である。
【００４７】
他の実施の形態に係る医薬組成物は、糖誘導体を含有する生体適合性粒子と、抗癌剤と、を含む。すなわち、当該医薬組成物は、糖誘導体を含有する生体適合性粒子及び抗癌剤の両成分を単一の製剤に含む。これにより、糖誘導体と抗癌剤とを同一投与経路において同時に投与することができる。当該医薬組成物における生体適合性粒子と抗癌剤との重量比は特に限定されず、抗腫瘍効果等に応じて適宜調整される。好ましくは、当該医薬組成物における生体適合性粒子と抗癌剤との重量比は、生体適合性粒子に含まれる糖誘導体と抗癌剤との重量比に応じて調整される。
【００４８】
別の実施の形態では、糖誘導体を含有する上記生体適合性粒子を患者に投与することにより、該患者の癌を治療又は予防する方法が提供される。この場合、抗癌剤をさらに該患者に投与してもよい。
【実施例】
【００４９】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。【００５０】
（実施例１：肝癌細胞株皮下移植ヌードマウスを用いた２ＤＧによる抗腫瘍効果の検討）  マウスに移植した肝癌細胞株Ｈｕｈ−７（国立大学法人東北大学  加齢医学研究所  医用細胞資源センター・細胞バンク）は、５％ＣＯ２インキュベーターを用いて３７℃で培養した。Ｈｕｈ−７の培地には、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）を用いた。【００５１】
６週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢｃ−ｎｕ／ｎｕ、雄）に１×１０７個のＨｕｈ−７を皮下移植した。移植した細胞の生着及び増殖を確認するために、腫瘍サイズをノギスで計測し、腫瘍の体積が１００〜１５０ｍｍ３となった時点で以下の６群にマウスを群分けした。
（ａ）対照群：ＰＢＳを腹腔内に２００μＬ連日投与した。
（ｂ）２ＤＧ低用量群：２ＤＧをＰＢＳに溶解した１００ｍｇ／ｍＬの２ＤＧ溶液を１００ｍｇ／ｋｇ／日で腹腔内に連日投与した。
（ｃ）２ＤＧ高用量群：１００ｍｇ／ｍＬの２ＤＧ溶液を１０００ｍｇ／ｋｇ／日で腹腔内に連日投与した。
（ｄ）ソラフェニブ群：ソラフェニブ（サンタクルーズバイオテクノロジー社製）溶液を５ｍｇ／ｋｇ／日でゾンデを用いて連日経口投与し、かつ２００μＬのＰＢＳを腹腔内に連日投与した。なお、ソラフェニブ溶液は、原末をＤＭＳＯ全量で溶解し、さらにその溶液をオリーブ油で１／２０に希釈したものである（最終的には５％ＤＭＳＯ溶液）。
（ｅ）ソラフェニブ＋２ＤＧ低用量群：ソラフェニブ溶液を５ｍｇ／ｋｇ／日でゾンデを用いて連日経口投与し、かつ２ＤＧ溶液を１００ｍｇ／ｋｇ／日で腹腔内に連日投与した。
（ｆ）ソラフェニブ＋２ＤＧ高用量群：ソラフェニブ溶液を５ｍｇ／ｋｇ／日でゾンデを用いて連日経口投与し、２ＤＧ溶液を１０００ｍｇ／ｋｇ／日で腹腔内に連日投与した。【００５２】
各群において投与開始から３日毎に腫瘍体積及び体重を計測した。また、投与開始７日後、１４日後、２１日後の時点において過去１週間分の食事量から１日平均食事量を算出した。投与開始１４日目の２ＤＧ高用量群のマウスから所定の時間に血液を採取し、グルコカード（商標）  マイダイア（アークレイ社製）を用いて血糖値を測定した。さらに、投与開始２１日後に腫瘍を観察し、常法に従ってマウスから血液を採取し、肝臓を摘出した。採取した血液について、スポットケム（商標）  ＥＺ  ＳＰ−４４３０  ｓｙｓｔｅｍ（アークレイ社製）を用いて血清学的プロファイルを測定した。摘出した肝臓の重量を計測した。【００５３】
（結果）
図１は、各群における投与開始２１日後のマウス及び摘出した腫瘍の外観を示す。２ＤＧは、移植された肝癌細胞の腫瘍サイズを減少させた。２ＤＧは、ソラフェニブとの併用によりさらに腫瘍サイズを減少させた。図２は、腫瘍体積の経時変化を示す。２ＤＧ低用量群及び２ＤＧ高用量投与群において投与量に依存した有意な腫瘍体積の減少が認められた。ソラフェニブ＋２ＤＧ低用量群及びソラフェニブ＋２ＤＧ高用量群では、２ＤＧとソラフェニブとの併用により投与量に依存した有意な腫瘍体積のさらなる減少が認められた。【００５４】
図３に示すように、実験期間中、ソラフェニブ＋２ＤＧ高用量群のマウスの体重が、対照群及びソラフェニブ群と比較して有意に減少した。投与開始７日後、１４日後及び２１日後の時点における１日平均食事量を図４に示す。１日平均食事量については、全群間で有意差を認めなかった。投与開始２１日後における血清学的プロファイル及び肝重量を表１に示す。ＡＬＴ値において、ソラフェニブ＋２ＤＧ高用量群が有意に高値を示した。中性脂肪に関しては、２ＤＧ高用量群及びソラフェニブ＋２ＤＧ高用量群が有意に低値を示した。【００５５】
【表１】
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【００５６】
また、図５には、投与開始１４日目の２ＤＧ溶液投与後の２ＤＧ高用量群における血糖値の経時変化を示す。２ＤＧ高用量群では、著明な血糖値上昇とともに意識障害が生じた。以上の結果から、高用量の２ＤＧの投与によって、体重減少、肝障害及び高血糖の副作用が起こり得ることが示された。【００５７】
（実施例２：２ＤＧナノ粒子の調製及び２ＤＧナノ粒子の分析）
ＵＬＲＥＡ  ＳＳ−１１（エム・テクニック社製）を使用して、以下のように２ＤＧナノ粒子（２ＤＧ−ＰＬＧＡ）を作製した。まず、Ａ液をＡ液タンクに充填し、タンクを０．３ＭＰａに加圧した。その後、設定値４３℃でＡ液を１６７ｍＬ／分で送液し、次いで設定値４１℃（実測値約２９℃）でＢ液を１００ｍＬ／分で送液した。Ａ液は０．５％ＰＶＡを含む水溶液である。また、Ｂ液は、ＰＬＧＡ：２ＤＧ：アセトン：エタノールが重量比で０．６５：０．２５：６６：３３の溶液である。回転数を１０００ｒｐｍとし、背圧を０．０２ＭＰａとした。吐出液４００．５ｍＬを回収し、吐出液からエバポレーターで８０分間、溶媒を留去した。なお、Ｂ液におけるＰＬＧＡとして、ＰＬＧＡ−７５２０（乳酸：グリコール酸＝７５：２５、平均重量分子量２０，０００、和光純薬社製）を用いた。得られた２ＤＧ−ＰＬＧＡ水性分散液２２４ｍＬを凍結乾燥し、２．１６ｇの２ＤＧ−ＰＬＧＡを得た。【００５８】
上記で調製した２ＤＧ−ＰＬＧＡ３．７ｍｇをチューブに量りとり、ミリＱ水３．７ｍＬを加えた。ボルテックスミキサーで３０秒間撹拌後、５分間超音波処理を行った。ミリＱ水を対照とし、２ＤＧ−ＰＬＧＡの粒度分布をＮＩＫＫＩＳＯ  Ｎａｎｏｔｒａｃ  Ｗａｖｅ−ＥＸ１５０（日機装社製）で測定した。【００５９】
２ＤＧ−ＰＬＧＡにおける２ＤＧの含有率は、以下のように評価した。まず、標準溶液を調製した。２００ｍｇの２ＤＧを１００ｍＬメスフラスコに量りとり、水５０ｍＬを加えて溶解した。次にアセトニトリルを用いて１００ｍＬにメスアップし、標準原液（２０００μｇ／ｍＬ）とした。標準原液を２５０、１２５、６２．５、３１．２５μｇ／ｍＬになるようにアセトニトリル：水（１：１）を用いて段階希釈し、標準溶液とした。【００６０】
試料溶液の調製では、試料として約２０ｍｇの２ＤＧ−ＰＬＧＡを量りとり、ミリＱ水１０ｍＬを加えた。ボルテックスミキサーで３０秒間撹拌後、３０分間超音波処理し試料原液とした。試料原液１．０ｍＬにアセトニトリルを加え２ｍＬとした。この液を２０℃、１０，０００×ｇで１５分間遠心分離した。遠心後の上澄み液を、０．２μｍメンブレンフィルターを用いてろ過し、得られたろ液を試料溶液とした。試料溶液についてはｎ＝３で試験を実施した。標準溶液及び試料溶液を下記条件にて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、標準溶液の検量線から試料溶液中の２ＤＧの濃度を計算により求めた。上記の２ＤＧ−ＰＬＧＡの重量及び２ＤＧの濃度に基づいて２ＤＧの含有率を算出した。【００６１】
ＨＰＬＣの条件
機器：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  １０Ａ  ｓｅｒｉｅｓ（島津製作所社製）
検出：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＥＬＳＤ−ＬＴ
ゲイン：８
ドリフト温度：４０℃
ガス圧力：３５０ｋＰａ（実測３５８ｋＰａ）
ネブライザーガス：Ｎ２
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０４Ｄ（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）
カラム温度：４０℃
移動相：Ａ：水、Ｂ：アセトニトリル
Ｂ．濃度  ７５％→６９％（８分）６９→７５％（８分→１６分）
流量：１．０ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
注入量：２０μＬ
測定時間：１６分【００６２】
（結果）
２ＤＧ−ＰＬＧＡにおける２ＤＧの含有率は、８.１±０.４％であった。図６に示すように、２ＤＧ−ＰＬＧＡの粒度分布はシングルピークで、Ｄ５０が１６６ｎｍ±５.４ｎｍ、スパン値は１.５２±０.１５であった。【００６３】
（実施例３：肝癌細胞株皮下移植ヌードマウスを用いた２ＤＧ−ＰＬＧＡによる抗腫瘍効果の検討）
実施例１と同様にＨｕｈ−７を皮下移植することで作製した皮下移植ヌードマウスを以下の６群に群分けした。
（ｇ）対照群：２００μＬのＰＢＳを週１回、頚静脈投与した。
（ｈ）ＰＬＧＡ群：ＰＬＧＡを週１回、頚静脈投与した。
（ｉ）２ＤＧ群：１００ｍｇ／ｍＬの２ＤＧ溶液を１００ｍｇ／ｋｇ／日で週１回、頚静脈投与した。
（ｊ）２ＤＧ−ＰＬＧＡ群：２ＤＧ−ＰＬＧＡを週１回、頚静脈投与した。
（ｋ）２ＤＧ腹腔内注射群：上記２ＤＧ溶液を１００ｍｇ／ｋｇ／日で腹腔内に連日投与した。
（ｌ）ソラフェニブ＋ＰＬＧＡ群：ソラフェニブ溶液を５ｍｇ／ｋｇ／日でゾンデを用いて連日経口投与し、かつＰＬＧＡを週１回、頚静脈投与した。
（ｍ）ソラフェニブ＋２ＤＧ−ＰＬＧＡ群：ソラフェニブ溶液を５ｍｇ／ｋｇ／日でゾンデを用いて連日経口投与し、かつ２ＤＧ−ＰＬＧＡを週１回、頚静脈投与した。【００６４】
なお、上記（ｉ）及び（ｋ）における２ＤＧの用量１００ｍｇ／ｋｇ／日は、マウス１匹あたり（平均体重２５ｇとして計算）の実質的な２ＤＧ単回投与量としては約２．５ｍｇに相当する。また、上記（ｈ）及び（ｌ）におけるＰＬＧＡ及び上記（ｊ）及び（ｍ）における２ＤＧ−ＰＬＧＡは、毎回投与前に１００ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ懸濁液とし、マウス１匹につき１回あたり２００μＬ投与した。２ＤＧ−ＰＬＧＡにおける２ＤＧの含有率が約８％であることを考慮すると、上記（ｊ）及び（ｍ）におけるマウス１匹あたりの実質的な２ＤＧ単回投与量は約１．６ｍｇに相当し、上記（ｉ）及び（ｋ）の約６０％程度である。【００６５】
各群について実施例１と同様に、腫瘍体積及び体重を計測し、１日平均食事量を算出した。投与開始１４日目の２ＤＧ−ＰＬＧＡ群のマウスを対象に実施例１と同様に血糖値を測定した。投与開始２１日後には実施例１と同様に、腫瘍を観察し、血清学的プロファイル及び肝重量を測定した。【００６６】
（結果）
投与開始２１日後の腫瘍の外観を図７に示す。２ＤＧ−ＰＬＧＡは、移植された肝癌細胞の腫瘍サイズを減少させた。さらに、２ＤＧ−ＰＬＧＡは、ソラフェニブとの併用によりさらに腫瘍サイズを減少させた。図８は、腫瘍体積の経時変化を示す。２ＤＧ−ＰＬＧＡ群では、対照群、ＰＬＧＡ群及び２ＤＧ静注群に対して有意な腫瘍体積の減少が認められた。ソラフェニブを併用したソラフェニブ＋２ＤＧ−ＰＬＧＡ群でも有意な腫瘍体積の減少が認められた。【００６７】
図８に示す投与開始後２１日目の腫瘍体積において、ソラフェニブ＋ＰＬＧＡ群は、対照群との間でｐ＜０．０１の有意差であったのに対し、ソラフェニブ＋２ＤＧ−ＰＬＧＡ群は、対照群との間でさらに有意性の高いｐ＜０．００１であった。これにより、２ＤＧ−ＰＬＧＡをソラフェニブに併用することで顕著な抗腫瘍効果が得られることが示された。【００６８】
図９に示すように、実験期間中、全群間でマウスの体重に有意差を認めなかった。投与開始７日後、１４日後及び２１日後の時点における１日平均食事量も、図１０に示すように全群間で有意差を認めなかった。投与開始２１日後における血清学的プロファイル及び肝重量を表２に示す。投与開始２１日後における血清学的プロファイル及び肝重量については、全群間で有意差を認めなかった。【００６９】
【表２】
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【００７０】
実施例１における２ＤＧ高用量群においては、投与開始１４日目の２ＤＧ投与後に著明な血糖値上昇とともに意識障害が生じたが、本実施例では、図１１に示すように２ＤＧ−ＰＬＧＡ群においては投与開始１４日目の２ＤＧ−ＰＬＧＡ投与後に血糖値上昇は認められず、意識障害は認められなかった。以上の結果から、２ＤＧ−ＰＬＧＡによって、体重減少、肝障害及び高血糖等の副作用を伴わずに、高い抗癌作用が得られることが示された。【００７１】
（実施例４：抗癌剤と併用した２ＤＧ−ＰＬＧＡによる抗腫瘍効果及び安全性の検討）
上記実施例１と同様にＨｕｈ−７を皮下移植したマウスを、以下の４群に群分けてソラフェニブと異なる抗癌剤との併用による抗腫瘍効果及び安全性を検討した。
ドキソルビシン＋ＰＬＧＡ群：ドキソルビシン（ＳＩＧＭＡ社製）溶液を４ｍｇ／ｋｇで腹腔内に１日おきに経口投与し、かつＰＬＧＡを週１回、頚静脈投与した。
ドキソルビシン＋２ＤＧ−ＰＬＧＡ群：ドキソルビシン溶液を４ｍｇ／ｋｇで腹腔内に１日おきに経口投与し、かつ２ＤＧ−ＰＬＧＡを週１回、頚静脈投与した。
シスプラチン＋ＰＬＧＡ群：シスプラチン（ＳＩＧＭＡ社製）溶液を３ｍｇ／ｋｇで週１回、腹腔内に投与し、かつＰＬＧＡを週１回、頚静脈投与した。
シスプラチン＋２ＤＧ−ＰＬＧＡ群：ドキソルビシン溶液を３ｍｇ／ｋｇで週１回、腹腔内に投与し、かつ２ＤＧ−ＰＬＧＡを週１回、頚静脈投与した。【００７２】
なお、本実施例でのＰＬＧＡ及び２ＤＧ−ＰＬＧＡの投与では、実施例３と同様に、毎回投与前にＰＬＧＡ又は２ＤＧ−ＰＬＧＡを１００ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ懸濁液とし、マウス１匹につき１回あたり２００μＬ投与した。【００７３】
上記実施例３と同様に腫瘍体積、体重、１日平均食事量、血糖値、血清学的プロファイル及び肝重量を評価し、腫瘍を観察した。抗腫瘍効果及び安全性について上記実際例３の対照群等と比較した。【００７４】
（結果）
図１２に示すように、２ＤＧ−ＰＬＧＡ群及びドキソルビシン＋２ＤＧ−ＰＬＧＡ群では、対照群に対して腫瘍体積の有意な減少が認められた。また、ドキソルビシン＋２ＤＧ−ＰＬＧＡ群では、ドキソルビシン＋ＰＬＧＡ群に対して腫瘍体積の有意な減少が認められた。図１３に示された投与開始２１日後のマウス及び腫瘍の外観から明らかなように、２ＤＧ−ＰＬＧＡの投与は、ドキソルビシンの抗腫瘍効果を増強する。【００７５】
図１４に示すように、２ＤＧ−ＰＬＧＡ群及びシスプラチン＋２ＤＧ−ＰＬＧＡ群では、対照群に対して腫瘍体積の有意な減少が認められた。また、シスプラチン＋２ＤＧ−ＰＬＧＡ群の腫瘍体積は、２ＤＧ−ＰＬＧＡ群の腫瘍体積と有意差があった。図１５に示された投与開始２１日後のマウス及び腫瘍の外観から明らかなように、２ＤＧ−ＰＬＧＡの投与は、シスプラチンの抗腫瘍効果を増強し、腫瘍をほとんど消失させた。【００７６】
体重及び１日平均食事量に関しては、上記実施例３の（ｇ）〜（ｍ）を含めた全群間で、有意な変化は認められなかった。投与開始２１日後における血清学的プロファイル及び肝重量を表３に示す。血清学的プロファイル及び肝重量については、全群間で有意差を認めなかった。【００７７】
【表３】
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【００７８】
（実施例５：腎癌細胞株皮下移植ヌードマウスを用いた２ＤＧ−ＰＬＧＡによる抗腫瘍効果の検討）
腎癌細胞株ＯＳ−ＲＣ−２（理化学研究所より取得）は、５％ＣＯ２インキュベーターを用いて３７℃で培養した。ＯＳ−ＲＣ−２の培地には、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩを用いた。【００７９】
６週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢｃ−ｎｕ／ｎｕ、雄）に５×１０６個のＯＳ−ＲＣ−２を皮下移植した。腫瘍サイズをノギスで計測し、腫瘍の体積が１００〜１５０ｍｍ３となった時点で以下の３群にマウスを群分けした。
対照群：２００μＬのＰＢＳを週１回、頚静脈投与した。
２ＤＧ群：１００ｍｇ／ｍＬの２ＤＧ溶液を１００ｍｇ／ｋｇ／日で腹腔内に連日投与した。
２ＤＧ−ＰＬＧＡ群：２ＤＧ−ＰＬＧＡを週１回、頚静脈投与した。【００８０】
２ＤＧ−ＰＬＧＡ群における２ＤＧ−ＰＬＧＡの投与方法は、実施例３と同様である。各群について実施例１と同様に、腫瘍体積及び体重を測定した。投与開始１４日後にマウスを安楽死させ、実施例１と同様に腫瘍を観察した。【００８１】
（結果）
図１６は、腫瘍体積の経時変化を示す。２ＤＧ−ＰＬＧＡ群では、対照群及び２ＤＧ群に対して腫瘍体積の有意な減少が認められた。投与開始１４日後のマウス及び腫瘍の外観を図１７に示す。２ＤＧ群と比較して、２ＤＧ−ＰＬＧＡ群の腫瘍サイズは明らかに小さかった。２ＤＧ−ＰＬＧＡは、腎癌細胞株ＯＳ−ＲＣ−２皮下移植ヌードマウスにおいても抗腫瘍効果を示した。【００８２】
（実施例６：大腸癌細胞株皮下移植ヌードマウスを用いた２ＤＧ−ＰＬＧＡによる抗腫瘍効果の検討）
大腸癌細胞株ＨＴ−２９は、５％ＣＯ２インキュベーターを用いて３７℃で培養した。ＨＴ−２９の培地には、１０％ウシ胎児血清を含むＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａを用いた。ＯＳ−ＲＣ−２の代わりにＨＴ−２９をマウスに移植する点及びマウスを投与開始１４日後ではなく２１日後に安楽死させる点を除いて、上記実施例５と同様に２ＤＧ−ＰＬＧＡによる抗腫瘍効果を評価した。【００８３】
（結果）
図１８は、腫瘍体積の経時変化を示す。２ＤＧ−ＰＬＧＡ群では、対照群及び２ＤＧ群に対して腫瘍体積の有意な減少が認められた。投与開始２１日後のマウス及び腫瘍の外観を図１９に示す。２ＤＧ群と比較して、２ＤＧ−ＰＬＧＡ群の腫瘍サイズは明らかに小さかった。２ＤＧ−ＰＬＧＡは、大腸癌細胞株ＨＴ−２９皮下移植ヌードマウスにおいても抗腫瘍効果を示した。【００８４】
（実施例７：膵癌細胞株皮下移植ヌードマウスを用いた２ＤＧ−ＰＬＧＡによる抗腫瘍効果の検討）
膵癌細胞株Ｂｘ−ＰＣ−３は、５％ＣＯ２インキュベーターを用いて３７℃で培養した。Ｂｘ−ＰＣ−３の培地には、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩを用いた。上記実施例６と同様に２ＤＧ−ＰＬＧＡによる抗腫瘍効果を評価した。【００８５】
（結果）
図２０は、腫瘍体積の経時変化を示す。２ＤＧ−ＰＬＧＡ群では、対照群及び２ＤＧ群に対して腫瘍体積の有意な減少が認められた。投与開始２１日後のマウス及び腫瘍の外観を図２１に示す。２ＤＧ群と比較して、２ＤＧ−ＰＬＧＡ群の腫瘍サイズは明らかに小さかった。２ＤＧ−ＰＬＧＡは、膵癌細胞株Ｂｘ−ＰＣ−３皮下移植ヌードマウスにおいても抗腫瘍効果を示した。【００８６】
（実施例８：肝癌細胞株皮下移植ヌードマウスを用いたＩＣＧ−ＰＬＧＡの腫瘍及び生体内分布解析）
ＵＬＲＥＡ  ＳＳ−１１（エム・テクニック社製）を使用して、インドシアニングリーン（以下「ＩＣＧ」とする、第一三共社製）を内包するＰＬＧＡ粒子を作製した。実施例２と同様の方法で調製した０．５％ＰＶＡを含む水溶液（Ａ液）と、ＰＬＧＡ：ＩＣＧ：アセトン：エタノールが重量比で０．６５：０．１：６６：３３の溶液（Ｂ液）と、から得られたＩＣＧ−ＰＬＧＡ水性分散液を凍結乾燥し、０．６１ｇのＩＣＧ−ＰＬＧＡを得た。【００８７】
ＩＣＧ−ＰＬＧＡを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、標準溶液の検量線から試料溶液中のＩＣＧ含有率（含量）を算出した。ＩＣＧ−ＰＬＧＡにおけるＩＣＧの含量は、６.２±０.３％であった。【００８８】
ＩＣＧ−ＰＬＧＡの粒度分布をＮＩＫＫＩＳＯ  Ｎａｎｏｔｒａｃ  Ｗａｖｅ−ＥＸ１５０（日機装社製）で測定した。ＩＣＧ−ＰＬＧＡの粒度分布はシングルピークで、Ｄ５０が１８７ｎｍであった。ＩＣＧ−ＰＬＧＡの粒径のスパン値は１．５ｎｍであった。【００８９】
８週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢｃ−ｎｕ／ｎｕ、雄）に１×１０７個のＨｕｈ−７を皮下移植した。腫瘍サイズをノギスで計測し、腫瘍の最大直径が１５ｍｍ程度になったのを確認後、ＩＣＧ−ＰＬＧＡをマウスの頸静脈に注射した（８００ｍｇ／ｋｇ）。注射１．５時間後、６時間後、２４時間後、２日後、３日後及び７日後にイソフルラン吸入麻酔下で、ＩＣＧ−ＰＬＧＡの腫瘍及び生体分布の経時的推移をｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ）にて解析した。ＩＶＩＳには、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ社製）を使用した。【００９０】
（結果）
図２２及び図２３はＩＶＩＳでの解析結果を示す。図２２に示すように、ＩＣＧ−ＰＬＧＡの投与直後より、ＩＶＩＳにて全身にＩＣＧの分布が確認されたが、ＩＣＧ−ＰＬＧＡは投与直後から腫瘍へ集積した。投与７日後も腫瘍部にＩＣＧが集積していたが、その他の生体組織へのＩＣＧの集積は認めなかった。なお、ＩＣＧ−ＰＬＧＡ投与７日後、腫瘍組織及び各臓器を採取し、ＩＶＩＳにて撮像したところ、図２３に示すように、腫瘍組織のみにＩＣＧの強い集積が認められ、それ以外の各臓器への明らかな集積は認められなかった。【００９１】
（実施例９：粒径の異なる２ＤＧ−ＰＬＧＡによる抗腫瘍効果の検討）
６週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢｃ−ｎｕ／ｎｕ、雄）に１×１０７個のＨｕｈ−７を皮下移植した。腫瘍サイズをノギスで計測し、腫瘍の体積が１００〜１５０ｍｍ３程度になった時点で、マウスを次の３群に群分けした。
対照群：２００μＬのＰＢＳを週１回、頚静脈投与した。
２ＤＧ−ＰＬＧＡ（Ｄ５０＝４９ｎｍ）群：Ｄ５０が４９ｎｍの２ＤＧ−ＰＬＧＡを週１回、頚静脈投与した（８００ｍｇ／ｋｇ）。なお、当該２ＤＧ−ＰＬＧＡにおける２ＤＧの含有率は、８．５±０．５％であって、スパン値は０．９５であった。
２ＤＧ−ＰＬＧＡ（Ｄ５０＝１５３ｎｍ）群：Ｄ５０が１５３ｎｍの２ＤＧ−ＰＬＧＡを週１回、頚静脈投与した（８００ｍｇ／ｋｇ）。なお、当該２ＤＧ−ＰＬＧＡにおける２ＤＧの含有率は、７．２±０．２％であって、スパン値は１．３であった。
２ＤＧ−ＰＬＧＡ（Ｄ５０＝３１３ｎｍ）群：Ｄ５０が３１３ｎｍの２ＤＧ−ＰＬＧＡを週１回、頚静脈投与した（８００ｍｇ／ｋｇ）。なお、当該２ＤＧ−ＰＬＧＡにおける２ＤＧの含有率は、６．６±０．２％であって、スパン値は１．６であった。【００９２】
本実施例での２ＤＧ−ＰＬＧＡの投与では、毎回投与前に２ＤＧ−ＰＬＧＡを１００ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ懸濁液とし、マウス１匹につき１回あたり８００ｍｇ／ｋｇとなるように投与した。上記の各群について、投与開始から３日毎に腫瘍体積を測定し、腫瘍体積経時的推移を評価した。投与開始２１日後にマウスを安楽死させ腫瘍を観察した。【００９３】
（結果）
図２４は、腫瘍体積の経時変化を示す。２ＤＧ−ＰＬＧＡ（Ｄ５０＝４９ｎｍ）群及び２ＤＧ−ＰＬＧＡ（Ｄ５０＝１５３ｎｍ）群では、対照群及び２ＤＧ−ＰＬＧＡ（Ｄ５０＝３１３ｎｍ）群に対して腫瘍体積の有意な減少が認められた。投与開始２１日後のマウス及び腫瘍の外観を図２５に示す。対照群と比べ２ＤＧ−ＰＬＧＡ（Ｄ５０＝４９ｎｍ）群及び２ＤＧ−ＰＬＧＡ（Ｄ５０＝１５３ｎｍ）群では、同等に移植された肝癌細胞の腫瘍体積を有意に減少させたが、２ＤＧ−ＰＬＧＡ（Ｄ５０＝３１３ｎｍ）群では、対照群に対して腫瘍体積を減少させたものの、２ＤＧ−ＰＬＧＡ（Ｄ５０＝５０ｎｍ）群及び２ＤＧ−ＰＬＧＡ（Ｄ５０＝１５３ｎｍ）群には及ばなかった。【００９４】
（実施例１０：免疫不全ではない肝発癌マウスを用いた２ＤＧ−ＰＬＧＡによる抗腫瘍効果の検討）
２ＤＧ−ＰＬＧＡによる抗腫瘍効果における抗腫瘍免疫活性を評価するために、免疫不全ではない肝発癌マウスを用いて実験を行った。【００９５】
肝発癌マウスとして、生後２日齢のＣ５７ＢＬ６／Ｎマウス雄にストレプトゾトシンを皮下注射し、出生から４週目に離乳を行い、餌を高脂肪食に切り替えることにより作製されたＳＴＡＭ（商標）マウス（ＳＭＣラボラトリーズ社製）を取得した。【００９６】
１２週齢の肝発癌マウス（雄）を次の４群に群分けした。
（１）対照群：２００μＬのＰＢＳを週１回、頚静脈投与した。
（２）２ＤＧ群：１００ｍｇ／ｍＬの２ＤＧ溶液を１００ｍｇ／ｋｇ／日で腹腔内に連日投与した。
（３）２ＤＧ−ＰＬＧＡ低用量群：２ＤＧ−ＰＬＧＡを週１回、頚静脈投与した。
（４）２ＤＧ−ＰＬＧＡ高用量群：（３）の１０倍用量の２ＤＧ−ＰＬＧＡを週１回、頚静脈投与した。【００９７】
上記（２）で投与された２ＤＧ濃度１００ｍｇ／ｋｇ／日は、マウス１匹あたり（平均体重２７ｇとして計算）の実質的な２ＤＧ単回投与量としては約２．７ｍｇに相当する。上記（３）における２ＤＧ−ＰＬＧＡは、毎回投与前にＰＢＳにて１０ｍｇ／ｍＬの懸濁液とし、１匹につき１回あたり２００μＬ投与した。上記（４）の２ＤＧ−ＰＬＧＡは、毎回投与前にＰＢＳにて１００ｍｇ／ｍＬの懸濁液とし、１匹につき１回あたり２００μＬ投与とした。【００９８】
２ＤＧ−ＰＬＧＡにおける２ＤＧ充填率が約８％であることを考慮すると、上記（３）におけるマウス１匹あたりの実質的な２ＤＧ単回投与量は約０．１６ｍｇに相当し、上記（２）の約６％程度となる。上記（４）におけるマウス１匹あたりの実質的な２ＤＧ単回投与量は約１．６ｍｇに相当し、上記（２）の約６０％程度となる。【００９９】
上記（１）〜（４）において、投与開始から２１日目に肝臓全体を観察し、肝臓内の腫瘍最大径、腫瘍個数及び総腫瘍体積を計測した（ｎ＝５）。また、肝腫瘍組織に対してウサギモノクローナルＣＤ３抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ社製）を用いて免疫染色を行った。【０１００】
（結果）
投与開始２１日後の腫瘍の外観を図２６に示す。２ＤＧ−ＰＬＧＡは、高用量群のみならず低用量群においても、腫瘍個数を抑制した。図２７に示すように、２ＤＧ−ＰＬＧＡは、高用量群及び低用量群において最大腫瘍径を減少させ、特に高用量群では、最大腫瘍径が対照群に対して有意に減少した。また、図２８に示すように、２ＤＧ−ＰＬＧＡは、高用量群のみならず低用量群においても、総腫瘍体積を対照群に対して有意に減少させた。【０１０１】
免疫染色の結果を図２９に示す。図２９においてＣＤ３染色陽性Ｔ細胞が矢印で示されている。２ＤＧ投与群及び２ＤＧ−ＰＬＧＡ高用量群において、腫瘍内部へのＴ細胞浸潤の増加が認められた。本実施例で用いた肝発癌モデルは、Ｔ細胞免疫も含めて免疫不全のないマウスである。本実施例において２ＤＧ−ＰＬＧＡは、実施例１で免疫不全の肝癌細胞株皮下移植ヌードマウスに投与された２ＤＧ−ＰＬＧＡの１／１０の低用量でも高用量と同等の抗腫瘍効果が認められた。その理由としては、図２９に示すように、免疫不全の肝癌細胞株皮下移植ヌードマウスでは認められなかったＴ細胞性腫瘍免疫活性促進効果が抗腫瘍効果の機序に加わったためであると考えられる。【０１０２】
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。【０１０３】
本出願は、２０１７年６月２８日に出願された日本国特許出願２０１７−１２５７７０号及び２０１７年１０月５日に出願された日本国特許出願２０１７−１９５１７８号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１７−１２５７７０号及び日本国特許出願２０１７−１９５１７８号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明は、医薬組成物、特には抗癌剤に好適である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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