(57)【要約】  抗ＨＳＶモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）に特異的に結合する、抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）に特異的に結合する、抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、
配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と
を含む、抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
を含む、請求項１に記載の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
前記ＨＳＶが、ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２である、請求項１又は２に記載の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドと、当該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
【請求項７】
請求項４に記載のポリヌクレオチド、請求項５に記載の発現ベクター、又は請求項６に記載の形質転換体を用いて、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を製造する方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む、ＨＳＶ感染症を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項９】
前記ＨＳＶ感染症が、ＨＳＶ−１感染症又はＨＳＶ−２感染症である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＨＳＶ感染症は、口唇ヘルペス、角膜ヘルペス、性器ヘルペス、全身性の新生児ヘルペス、並びに、ＨＳＶに起因する口内炎、皮膚疾患、脳炎、髄膜炎、及び脊髄炎からなる群より選択されるものである、請求項８又は９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
配列番号１０に記載の単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）の３８３−３８８アミノ酸残基からなる領域における少なくとも１つのアミノ酸残基、及び／又は、配列番号１１に記載の単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）の３８６−３９１アミノ酸残基からなる領域における少なくとも１つのアミノ酸残基に特異的に結合する、抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と
を含む、請求項１１に記載の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
を含む、請求項１２に記載の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のポリヌクレオチドと、当該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを含む発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ；ＨＳＶ）は、向神経性の病原体であり、粘膜上皮に初感染後は知覚神経に移行し、三叉神経節又は仙骨神経節にて終生潜伏感染する。潜伏しているＨＳＶはときに再活性化し、様々な病態を引き起こす（非特許文献１）。【０００３】
ＨＳＶには２つの血清型（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２）が知られており、ＨＳＶ−１は主に口唇・角膜ヘルペス、ＨＳＶ−２は主に性器ヘルペスの原因となる。しかし近年、性行動の多様化等から、しばしばＨＳＶ−１が性器ヘルペス、ＨＳＶ−２が口唇ヘルペスの原因となることもある。日本における抗体陽性者（既感染者）比率は、ＨＳＶ−１で６０〜８０％、ＨＳＶ−２は１０％であり、ＨＳＶ−２に限ったとしてもワクチンの潜在需要は１０００万人と推測される（非特許文献２）。また、米国における抗体陽性者（既感染者）比率は、ＨＳＶ−１が５７％、ＨＳＶ−２が２０％（そのうち約１０％が顕在性の性器ヘルペス）となっている（非特許文献３）。【０００４】
ＨＳＶの細胞への感染成立には、吸着と侵入の２段階で５つのエンベロープ糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）が関与していることが知られている。この５つのエンベロープ糖タンパク質はそれぞれ、エンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、エンベロープ糖タンパク質Ｃ（ｇＣ）、エンベロープ糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）、エンベロープ糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）、エンベロープ糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）と呼ばれている（非特許文献４）。【０００５】
まず、吸着過程は、ｇＢ及びｇＣが細胞表面のヘパラン硫酸に結合することがきっかけとなる（非特許文献５、６）。この過程はＨＳＶが細胞に侵入する際必須ではないが、より効率的な侵入に関与していると考えられている。次に、侵入過程では、ｇＢ及びｇＤがそれぞれの宿主細胞受容体と結合し、ウイルスエンベロープと宿主細胞膜が融合することによって開始される。【０００６】
宿主細胞受容体としてｇＢ受容体とｇＤ受容体が知られている。ｇＢ受容体として、ＮＭ−ＩＩＡ（非特許文献７、８）及びＭＡＧ（非特許文献９）が同定されている。ｇＤ受容体として、ネクチン１（非特許文献１０）、ＨＶＥＭ（非特許文献１１）、及び３−Ｏ−硫酸化ヘパラン硫酸（非特許文献１２）が同定されている。また、ｇＨ／ｇＬのヘテロダイマーは、ｇＢ及びｇＤと相互作用し膜融合において重要な役割を果たしていることが知られている（非特許文献１３）。【０００７】
２００６年にＨＳＶ−１  ｇＢの構造が解かれた結果、ｇＢは５つのドメインをもった３量体を形成していることが明らかになった（非特許文献１４）。また、ｇＢの構造は膜融合タンパク質として知られているＶＳＶ（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）のｇＧと似た構造をとっており、このことはｇＢがＨＳＶの膜融合タンパク質であることを裏付けている。また、ｇＢは他のヘルペスウイルスにおいても高度に保存されており、その機能はヘルペスウイルスに共通するものであると考えられている。【０００８】
これまでに、ＨＳＶ  ｇＢの機能性領域を特定するため、ｇＢの変異体やモノクローナル抗体を用いた解析が複数のグループで行われきた（非特許文献１５〜１８）。その結果、いくつかの機能性領域が見出されてきている。【０００９】
現在、ＨＳＶの治療としてはアシクロビル等の抗ウイルス薬が用いられているが、ウイルスを完全に除去することはできず、服用を中止するとウイルスが再活性化する。これは、ＨＳＶが神経節への潜伏感染という特殊な感染形態をとることに起因している。そのため、ＨＳＶの感染そのものを防御する予防用ワクチン、又は感染症状・再活性化症状を軽減・緩和する治療用ワクチンの開発が望まれるが、現在、有効なワクチンは存在せず、そのアンメットニーズは高い。【００１０】
また、アシクロビルやホスカルネット等の抗ウイルス薬の高頻度又は長期の使用によって、耐性ウイルス株の増加をもたらすことが懸念されている（非特許文献１９）。更に、それらの抗ウイルス薬は肝機能異常、造精能低下、消化管障害、腎機能異常などの様々な副作用を有しており、時に減薬や休薬を避けられないケースも発生し得る。【００１１】
ＨＳＶは従来型ワクチンや病原体感染歴では十分な防御免疫を獲得できない病原体の一つであるとして知られている。これはＨＳＶが様々な免疫逃避機構を有し、宿主の免疫反応を巧妙にくぐり抜けているからであると考えられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Roizman, B.ら、Herpes simplex viruses, p. 2501-2602. In D. M. Knipe and P. M. Howley (ed.), 「Fields Virology」, 5th ed. Lippincott Williams &Wilkins, Philadelphia, P.A. 2007
【非特許文献２】Hashido M1ら、An epidemiologic study of herpes simplex virus type 1 and 2 infection in Japan based on type-specific serological assays, Epidemiol Infect. 1998 Mar; 120(2):179-86
【非特許文献３】Decision Resources; Emerging Vaccines 2008
【非特許文献４】ウイルス 2010 第60巻第2号，pp.187-196
【非特許文献５】Herold, B. C.ら、Glycoprotein C-independent binding of herpes simplex virus to cells requires cell surface heparan sulphate and glycoprotein B. J Gen Virol 1994 75 (Pt 6):1211-22
【非特許文献６】Herold, B. C.ら、Glycoprotein C of herpes simplex virus type 1 plays a principal role in the adsorption of virus to cells and in infectivity. J Virol 1991 65:1090-8
【非特許文献７】Arii, J.ら、Non-muscle myosin IIA is a functional entry receptor for herpes simplex virus-1. Nature 2010 467:859-62
【非特許文献８】Satoh, T.ら、PILRalpha is a herpes simplex virus-1 entry coreceptor that associates with glycoprotein B. Cell 2008 132:935-44
【非特許文献９】Suenaga, T.ら、Myelin-associated glycoprotein mediates membrane fusion and entry of neurotropic herpesviruses. Proc Natl Acad Sci U S A 2010 107:866-71
【非特許文献１０】Geraghty, R. J.ら、Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor-related protein 1 and poliovirus receptor. Science 1998 280:1618-20
【非特許文献１１】Montgomery, R. I.ら、Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell (1996)87:427-36
【非特許文献１２】Shukla, D.,ら、A novel role for 3-O-sulfated heparan sulfate in herpes simplex virus 1 entry. Cell 1999 99:13-22
【非特許文献１３】Eisenberg RJら、Herpes virus fusion and entry: a story with many characters. Viruses 2012 4:800-832 10.3390/v4050800
【非特許文献１４】SCIENCE 2006 313, 14, 217-220
【非特許文献１５】Virology 1989 172(1),11-24
【非特許文献１６】Virology 1991 180(1),135-152
【非特許文献１７】Virology 1992 186(1),99-112
【非特許文献１８】Bender FCら、Antigenic and mutational analyses of herpes simplex virus glycoprotein B reveal four functional regions. J Virol. 2007 Apr;81(8):3827-41. Epub 2007 Jan 31
【非特許文献１９】Pottage JC Jrら、Herpes simplex virus resistance to acyclovir: clinical relevance. Infect Agents Dis. 1995 Sep;4(3):115-24
【非特許文献２０】Krawczyk Aら、Impact of valency of a glycoprotein B-specific monoclonal antibody on neutralization of herpes simplex virus. J Virol. 2011 Feb;85(4):1793-803. doi: 10.1128/JVI.01924-10. Epub 2010 Dec 1
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、ＨＳＶに対して中和効果を示し、ＨＳＶの細胞間伝播を抑制し、ＨＳＶ感染症の予防及び／又は治療に利用し得る新規な抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、ヒト抗体ライブラリーを用いて実施した抗ＨＳＶ  ｇＢ抗体の網羅的探索によって、４４種類の抗ｇＢ抗体を取得した。それらの抗体をウイルス中和試験に供した結果、モノクローナル抗体Ｄ４８と命名された株は、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に対する強力なウイルス中和活性（プラーク数減少活性）及び細胞間伝播（Ｃｅｌｌ  ｔｏ  ｃｅｌｌ感染拡大）の抑制活性を示し、その活性強度は他の抗体を圧倒していたことを見出した。本発明者らは、モノクローナル抗体Ｄ４８に対してさらに詳細な解析を行い、本発明の完成に至った。【００１５】
すなわち、本発明は、以下の各発明に関する。
（１）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）に特異的に結合する、抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、
配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と
を含む、抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、上記（１）の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
（３）ＨＳＶが、ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２である、上記（１）又は（２）の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかの抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
（５）上記（４）のポリヌクレオチドと、当該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを含む発現ベクター。
（６）上記（５）の発現ベクターが導入された形質転換体。
（７）上記（４）のポリヌクレオチド、上記（５）の発現ベクター、上記（６）に記載の形質転換体を用いて、上記（１）〜（３）のいずれかの抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を製造する方法。
（８）上記（１）又は（２）の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む、ＨＳＶ感染症を予防又は治療するための医薬組成物。
（９）ＨＳＶ感染症が、ＨＳＶ−１感染症又はＨＳＶ−２感染症である、上記（８）の医薬組成物。
（１０）ＨＳＶ感染症は、口唇ヘルペス、角膜ヘルペス、性器ヘルペス、全身性の新生児ヘルペス、並びに、ＨＳＶに起因する口内炎、皮膚疾患、脳炎、髄膜炎、及び脊髄炎からなる群より選択されるものである、上記（８）又は（９）の医薬組成物。
（１１）配列番号１０に記載の単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）の３８３−３８８番目のアミノ酸残基からなる領域における少なくとも１つのアミノ酸残基、及び／又は、配列番号１１に記載の単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）の３８６−３９１番目のアミノ酸残基からなる領域における少なくとも１つのアミノ酸残基に特異的に結合する、抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
（１２）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と
を含む、上記（１１）の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
（１３）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、
を含む、上記（１２）の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
（１４）上記（１１）〜（１３）のいずれかの抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド。
（１５）上記（１４）のポリヌクレオチドと、当該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを含む発現ベクター。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に対する強力なウイルス中和活性（プラーク数減少活性）を有すると共に、強力なＣｅｌｌ  ｔｏ  ｃｅｌｌ感染拡大（細胞間伝播）抑制活性を有しており、また、ｉｎ  ｖｉｖｏでも予防的投与のみならず、生体において既にＨＳＶ感染が成立している状況下での治療的投与においても有意な感染防御効果を示す。それによって、ＨＳＶ感染を予防及び／又は治療・再活性化防止に適用でき、特にＨＳＶ感染リスクの高い免疫不全患者、又は免疫抑制剤を投与している骨髄移植、血液幹細胞移植、又は臓器移植患者に対する予防薬として、或いはＨＳＶの再活性化を繰り返す患者に対する治療薬として既存抗ウイルス薬の代替薬又は併用薬として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例２のＥＬＩＳＡによる抗ＨＳＶ  ｇＢ抗体（Ｆａｂ）の反応性解析の結果を示す図である。
【図２】実施例２のＥＬＩＳＡによる抗ＨＳＶ  ｇＢ抗体（ヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａ）の反応性解析の結果を示す図である。
【図３】実施例３のイムノブロットによる抗ＨＳＶ  ｇＢ抗体の反応性解析の結果を示す図である。
【図４】実施例６の水素−重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）によるエピトープ解析の結果を示す図である。
【図５】実施例８の抗体Ｄ４８、Ｆ６７及びＥ３１によるマウス感染防御試験の生存率の比較結果を示す図である。
【図６】実施例８の抗体Ｄ４８によるマウスへの予防的投与の生存率の結果を示す図である。
【図７】実施例８の抗体Ｄ４８によるマウスへの予防的投与の症状スコアの結果を示す図である。
【図８】実施例８の抗体Ｄ４８によるマウスへの治療的投与の生存率の結果を示す図である。
【図９】実施例８の抗体Ｄ４８によるマウスへの治療的投与の症状スコアの結果を示す図である。
【図１０】実施例９の抗体Ｄ４８によるモルモットへの予防的投与の症状スコアの結果を示す図である。
【図１１】実施例９の抗体Ｄ４８によるモルモットへの治療的投与の症状スコアの結果を示す図である。
【図１２】実施例９の抗体Ｄ４８によるモルモットへの治療的投与の膣拭い液中のＨＳＶ放出量の結果を示す図である。
【図１３】ＨＳＶ−１由来ｇＢのアミノ酸配列（配列番号１０）及びＨＳＶ−２由来ｇＢのアミノ酸配列（配列番号１１）を多重整列した比較結果を示した図であり、斜体部はリーダー配列を示し、下線部はＨＳＶ−１由来ｇＢのドメインＩＩの３８３−３８８番目のアミノ酸残基（Ｉ３８３−Ｒ３８８）、及び、ＨＳＶ−２由来ｇＢのドメインＩＩの３８６−３９１番目のアミノ酸残基（Ｉ３８６−Ｒ３９１）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１９】
本発明の一実施形態の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）に特異的に結合する。本発明の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む。
【００２０】
本発明者らは、ヒト抗体ライブラリーを用いて実施した抗ＨＳＶ―２  ｇＢ抗体の網羅的探索によって、４４種類の抗ｇＢ抗体を取得した。それらの抗体をウイルス中和試験に供した結果、モノクローナル抗体Ｄ４８は強力なプラーク数減少活性及びＣｅｌｌ  ｔｏ  ｃｅｌｌ感染拡大抑制活性を示した。
【００２１】
抗体Ｄ４８は、表１に示す配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を有し、また、配列番号３〜５のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号６〜７のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを有する。
【表１】
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【００２２】
本発明の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体Ｄ４８のＣＤＲ配列を含むものであるため、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に対する強力なウイルス中和活性（プラーク数減少活性）を有すると共に、強力なＣｅｌｌ  ｔｏ  ｃｅｌｌ感染拡大（細胞間伝播）抑制活性を有する。
【００２３】
抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含むものであってもよい。
【００２４】
抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体は、少なくとも重鎖の可変ドメイン及び軽鎖の可変ドメインを含む抗体であり、完全抗体であってよい。完全抗体は、２つの全長の軽鎖と２つの全長の重鎖とを有し、それぞれの軽鎖と重鎖とはジスルフィド結合によって連結されている。完全抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＧを含み、ＩｇＧは、サブタイプとして、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。
【００２５】
抗原結合断片は、抗体断片ともいい、抗原に結合する機能を持つ断片（抗原結合フラグメント）を意味する。抗原結合断片は、例えば、１本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖＦｃ及びＦｖを含む。Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の最初の不変領域(ＣＨ１ドメイン)を持つ構造として１つの抗原結合部位を持つ。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に少なくてもシステイン残基を含むヒンジ領域を持つという点でＦａｂと異なる。Ｆ(ａｂ’)２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基間のジスルフィド結合によって生成される。Ｆｖ(可変断片)は、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位のみを持つ最小の抗原結合断片を意味する。二本鎖Ｆｖ（ｄｓＦｖ）は、重鎖可変部位とジスルフィド結合によって軽鎖可変部位と連結されており、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、一般的にペプチドリンカーを通じて重鎖可変領域が軽鎖可変領域と共有結合で連結されている。ｓｃＡｂは、ｓｃＦｖにＬ鎖又はＨ鎖の定常領域の一部のドメイン（Ｃドメイン）が結合したものである。ｓｃＦｖＦｃは、ｓｃＦｖにＨ鎖のＣＨ１及びＣＨ２が結合したものである。
【００２６】
抗原結合断片は、例えば、完全抗体からタンパク質加水分解酵素を用いて得ることができる。例えば、完全抗体をパパインで切断することで、Ｆａｂ断片を得ることができ、ペプシンで切断することで、Ｆ(ａｂ’)２断片を得ることができる。また、抗原結合断片は、遺伝子組み換え技術を用いて作製することもできる。軽鎖及び重鎖の可変領域は、相補性決定領域（以下「ＣＤＲ」という）と呼ばれる３つの多変可能な領域を含む。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープに結合する役割をする。３つのＣＤＲは、Ｎ−末端から順にそれぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれる。
【００２７】
抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体は、ヒト抗体（完全ヒト抗体）、ヒト化抗体、又はキメラ抗体であってもよく、特にヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００２８】
本実施形態の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）に特異的に結合する。ＨＳＶ  ｇＢは、ＨＳＶ−１由来ｇＢ及びＨＳＶ−２由来ｇＢを含むが、図１３は、ＨＳＶ−１由来ｇＢのアミノ酸配列（配列番号１０）及びＨＳＶ−２由来ｇＢのアミノ酸配列（配列番号１１）を多重整列した比較結果を示す。図１３によれば、両者の配列同一性が８７％である本実施形態の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ＨＳＶ−１由来ｇＢ及びＨＳＶ−２由来ｇＢのいずれに特異的に結合し、特にｇＢのドメインＩＩ、さらに特にＨＳＶ−１由来ｇＢのドメインＩＩのＩ３８３−Ｒ３８８、又は、ＨＳＶ−２由来ｇＢのドメインＩＩのＩ３８６−Ｒ３９１に対応する領域における少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、さらに少なくとも３つのアミノ酸残基に特異的に結合する。
【００２９】
本実施形態の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、既存抗ウイルス薬に対するメリットとして、（１）副作用が少ない、（２）耐性ウイルス株出現のリスクが低い、の２点が考えられる。特に後者に関しては、本実施形態の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、ウイルス複製サイクルに不可欠なＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２外被の表面糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）上のエピトープ配列に特異的に結合する抗体であり、それゆえ、ｇＢタンパク質中の当該エピトープ配列の変異に起因するであろうＨＳＶ耐性の出現は、その変異自体がウイルス感染価の喪失をもたらすものと考えられるため、可能性は低いものと考えられる。
【００３０】
本発明の別の実施形態の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１０に記載の単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）の３８３−３８８番目のアミノ酸残基からなる領域における少なくとも１つのアミノ酸残基、及び／又は、配列番号１１に記載の単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）の３８６−３９１番目のアミノ酸残基からなる領域における少なくとも１つのアミノ酸残基に特異的に結合する。該抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片としては、例えば、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含むものが挙げられる。
【００３１】
別の実施形態として、上記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオヂド、上記ポリヌクレオチドと、当該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを含む発現ベクター、及び上記発現ベクターを含む形質転換体が提供される。
【００３２】
ポリヌクレオチドは、完全抗体をコードするポリヌクレオチド、並びに、配列番号１〜８に記載のアミノ酸配列を含む抗原結合断片をそれぞれコードするポリヌクレオチドであり得、複数のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを一つのポリヌクレオチドに組み込んでもよい。このようなポリヌクレオチドは、例えば、化学合成より得ることができる。
【００３３】
本実施形態の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオヂドと、当該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを含む発現ベクターとしては、特に限定されないが、宿主細胞において、ポリヌクレオチドを複製及び/又は発現可能なベクターであり得る。たとえば、ｐＣＡＧ、ｐＥＴなどが挙げられる。調節配列は、宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現を制御する配列（例えば、プロモータ、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。当該発現ベクターは、宿主細胞でポリヌクレオチドが発現できるように、適切なプロモータと作動可能に連結されており、また、選別用マーカーを含むベクターであってもよい。また、配列番号１〜８に記載のアミノ酸配列を含む抗原結合断片をそれぞれコードするポリヌクレオチド、たとえば、重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドと、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドとを別々のベクターで発現させてもよい。
【００３４】
宿主細胞としては、抗体を発現できるものであれば、特に限定されないが、例えば、ヒト、チャイニーズハムスター、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サル、ヤギ、ウマなどの哺乳類動物細胞、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又はバクテリア細胞等が挙げられる。
【００３５】
宿主細胞の形質転換の方法としては、特に限定されないが、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００３６】
モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、例えば、既知の遺伝子工学の方法により作製することができる。モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、例えば、上述の抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞において発現することによって作製することができる。ポリヌクレオチドの設計は、ヒト抗体か、ヒト化抗体か、又はキメラ抗体によって、当業者が適宜に行える。たとえば、ヒト抗体又はその抗原結合断片の場合、配列番号１及び２に記載の重鎖及び軽鎖の可変領域、或いは、配列番号３〜８に記載の重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３をコードするポリヌクレオチドに加えて、ヒト抗体のこれらの部分以外の部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの少なくとも一部をさらに含み得る。完全抗体の場合、上記可変領域又はＣＤＲ１〜３をコードするポリヌクレオチドと、それ以外の部分をコードするポリヌクレオチドとが正しい順番で機能的に連結することによって得ることができる。重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドを一つのポリヌクレオチドに組み込んでもよく、別々のポリヌクレオチドに組み込んでもよい。また、発現させるためのプロモータや、発現の確認に必要なタグをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。キメラ抗体又はその抗原結合断片の場合は、配列番号１及び２に記載の重鎖及び軽鎖の可変領域、或いは、配列番号３〜８に記載の重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３をコードするポリヌクレオチド以外の部分は、マウス又はモルモットなどの動物由来のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含み得る。
【００３７】
さらなる実施形態は、抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む、ＨＳＶ感染症を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。ＨＳＶ感染症は、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２による感染症を含み、例えば、口唇ヘルペス、角膜ヘルペス、性器ヘルペス、全身性の新生児ヘルペス、並びに、ＨＳＶに起因する口内炎、皮膚疾患、脳炎、髄膜炎、及び脊髄炎などが挙げられる。
【００３８】
予防とは、ＨＳＶ感染リスクのある対象、特にＨＳＶ感染リスクの高い免疫不全患者、又は免疫抑制剤を投与している骨髄移植・血液幹細胞移植・臓器移植患者に投与することによる感染の発症を抑制又は遅らせる或いは症状を緩和することを意味する。治療とは、生体において既にＨＳＶ感染が成立している対象に投与することによる症状の緩和、好転又は完治を意味し、ＨＳＶ再発を繰り返す対象に投与することによる再発防止をも含む。ＨＳＶ感染症を治療するための医薬組成物は、既存抗ウイルス薬の代替薬又は併用薬として使用することができる。
【００３９】
医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでもよい。薬学的に許容可能な担体としては、特に限定されないが、水、塩類溶液、リン酸緩衝化整理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどが挙げられる。これらの担体は、１種単独で用いてもよく、また２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４０】
医薬組成物は、錠剤、顆粒、カプセル、注射剤、点眼剤、吸入剤、湿布剤とすることができる。そのための製剤化剤として、例えばさらに、潤滑剤、乳化剤、防腐剤、緩衝材、安定化剤など、抗体または抗体部分の保存性又は有効性を増大させる少量の補助物質を含んでもよい。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４２】
実施例１  抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体Ｄ４８の作製
ヒト抗体ライブラリーを用いて実施した抗ＨＳＶ−２  ｇＢ（ＨＳＶ  ｇＢ２）抗体の網羅的探索によって、取得した抗体Ｄ４８について、ｓｃＦｖ−ｈＦｃ型、Ｆａｂ型、ヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａ型及びヒト−モルモットキメラＩｇＧ２κ型の４種類の分子形態の抗体Ｄ４８を作製し、さらに解析を行った。【００４３】
＜ｓｃＦｖ−ｈＦｃ＞
配列番号９に示すアミノ酸配列をコードする単離した抗体Ｄ４８  ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）遺伝子をヒトＩｇＧ１に由来するＦｃ遺伝子（ＣＨ２−ＣＨ３）と連結し、ｐＣＡＧベクターにクローニングし、ｓｃＦｖ−Ｆｃ発現プラスミドを構築した。発現には、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３又はＥｘｐｉ２９３発現システム（ライフテクノロジー社）を用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、４〜６日で培養上清を回収した。培養上清をＡｂ−Ｒａｐｉｄ  ＰｕＲｅ  １０（ＰｒｏｔｅＮｏｖａ）又はＡｂ−Ｒａｐｉｄ  ＰｕＲｅ  Ｅｘ（ＰｒｏｔｅＮｏｖａ）を用いて精製し、ｓｃＦｖ−ｈＦｃを得た。【００４４】
＜Ｆａｂ＞
単離した抗体Ｄ４８  ｓｃＦｖ遺伝子のＶＨ領域をマウスＩｇＧ２ａに由来するＣＨ１遺伝子と連結し、ｐＣＡＧベクターにクローニングし、Ｈ鎖発現プラスミドを構築した。また、抗体Ｄ４８  ｓｃＦｖ遺伝子のＶＬ領域をマウスＣＬ遺伝子と連結し、ｐＣＡＧベクターにクローニングし、Ｌ鎖発現プラスミドを構築した。精製を容易にするため、ＣＨ１遺伝子の後（Ｃ末端側）にＨｉｓ  ｔａｇ遺伝子を連結している。発現には、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３又はＥｘｐｉ２９３発現システムを用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、４〜６日で培養上清を回収した。培養上清をＮｉ  ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、Ｆａｂを得た。【００４５】
＜ヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａ＞
単離した抗体Ｄ４８  ｓｃＦｖ遺伝子のＶＨ領域をマウスＩｇＧ２ａに由来するＨ鎖定常領域遺伝子（ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）と連結し、ｐＣＡＧベクターにクローニングし、Ｈ鎖発現プラスミドを構築した。また、抗体Ｄ４８  ｓｃＦｖ遺伝子のＶＬ領域をマウスＣＬ遺伝子と連結し、ｐＣＡＧベクターにクローニングし、Ｌ鎖発現プラスミドを構築した。発現には、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３又はＥｘｐｉ２９３発現システムを用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、４〜６日で培養上清を回収した。培養上清をＨｉ  Ｔｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＰ  Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア）を用いて精製し、ヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａを得た。【００４６】
＜ヒト−モルモットキメラＩｇＧ２κ＞
単離した抗体Ｄ４８  ｓｃＦｖ遺伝子のＶＨ領域をモルモットＩｇＧ２に由来するＨ鎖定常領域遺伝子（ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）と連結し、ｐＣＡＧベクターにクローニングし、Ｈ鎖発現プラスミドを構築した。また、抗体Ｄ４８  ｓｃＦｖ遺伝子のＶＬ領域をマウスＣＬ遺伝子と連結し、ｐＣＡＧベクターにクローニングし、Ｌ鎖発現プラスミドを構築した。発現には、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３又はＥｘｐｉ２９３発現システムを用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、４〜６日で培養上清を回収した。培養上清をＨｉ  Ｔｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＰ  Ｃｏｌｕｍｎを用いて精製し、ヒト−モルモットキメラＩｇＧ２κを得た。【００４７】
実施例２  ＥＬＩＳＡによる抗ＨＳＶ  ｇＢ抗体の反応性解析
＜Ｆａｂの反応性解析＞
取得したＦａｂの結合活性はＥＬＩＳＡによって評価した。ＦａｂをＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ  ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）に１００μＬ入れ、２時間室温でインキュベートすることによってＦａｂを固相化した。固相化後、プレートをＰＢＳで洗浄し、１μｇ／ｍＬから３．１６倍ずつ０．３１６ｎｇ／ｍＬまで段階希釈して組換えＨＳＶ−１  ｇＢ（ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐ）プレートのウェルに１００μＬ加え、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体抗ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ／ＨＲＰ（フナコシ）をプレートのウェルに１００μＬ加え、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）をプレートのウェルに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、１Ｎ硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）で発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した。使用した組換えｇＢ（ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐ）は、配列番号１１に示すアミノ酸配列の１〜７０５アミノ酸残基からなるＨＳＶ−２の３３３株由来の野生型ｇＢのエクトドメインのＣ末端にＳｔｒｅｐ  ｔａｇＩＩを結合したものであり、このタグを用いて精製やＥＬＩＳＡでの検出を行った。【００４８】
その結果、図１に示すように組換えｇＢ（ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐ)は、抗体Ｄ４８  Ｆａｂに特異的な結合を示した。【００４９】
＜ヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａの反応性解析＞
取得したヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａの結合活性はＥＬＩＳＡによって評価した。組換えｇＢ（ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐ）をＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ  ｐｌａｔｅに１００μＬ入れ、１時間室温でインキュベートすることによって組換えｇＢ（ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐ）を固相化した。固相化後、プレートをＰＢＳで洗浄し、１μｇ／ｍＬから３．１６倍ずつ０．３１６ｎｇ／ｍＬまで段階希釈して、ヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａをプレートのウェルに１００μＬ加え、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体ウサギ抗マウスＩｇＧ／ＨＲＰ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプレートのウェルに１００μＬ加え、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢをプレートのウェルに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、１Ｎ硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した。【００５０】
その結果、図２に示すように、ヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａは、組換えｇＢ（ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐ）に特異的な結合を示した。【００５１】
実施例３  イムノブロットによる抗ＨＳＶ  ｇＢ抗体の反応性解析
ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐを８−１６重量％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルに２μｇ／レーン注入し電気泳動した。電気泳動後、ゲルをニトロセルロース膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）へ転写し、２％スキムミルク（Ｗａｋｏ）−ＰＢＳＴを用いてブロッキングした。ブロッキングしたニトロセルロース膜は、ＰＢＳＴによる洗浄後、２％スキムミルク−ＰＢＳＴ、並びに、１０μｇ／ｍＬのｓｃＦｖ−ｈＦｃ、Ｆａｂ、ヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａ、又はヒト−モルモットキメラＩｇＧ２κと室温で６０分間反応させた。再度の洗浄の後、ニトロセルロース膜は、２％スキムミルク−ＰＢＳＴ中でそれぞれ抗ｈＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）／ＨＲＰ（ＢＩＯＲＡＤ）、抗Ｈｉｓタグ／ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ）、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）／ＨＲＰ、又は抗モルモット（Ｈ＋Ｌ）／ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と反応させ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅｇｅｎｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で発色させた。未変性ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐ、変性ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐ、及び、還元・変性ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐを作成した。還元・変性ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐは１Ｍ  ＤＴＴを加え、９６℃で５分間煮沸させることで得た。変性ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐは、９６℃で５分間煮沸することで得た。未変性ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐはこれらの操作を行っていない。作成した未変性ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐ、変性ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐ、及び、還元・変性ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐを直接ゲルに注入した。【００５２】
結果を図３に示す。レーン１〜３は順に、未変性ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐ、変性ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐ、及び、還元・変性ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐであり、レーンＭ及びＭ´はそれぞれＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｌａｄｄｅｒ及びＭａｇｉｃ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｓｔａｎｄａｒｄであった。左の写真はＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、バンド染色にはＣＢＢ染色を行った。右側の４つの写真はウェスタンブロット（ＷＢ）の結果であった。図３から分かるように、原体であるｓｃＦｖ−ｈＦｃは、未変性ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐと比較して還元・変性ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐへと強く反応する興味深い特徴を有していたが、分子形態を変更したＦａｂ型、ヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａ型及びヒト−モルモットキメラＩｇＧ２κ型でもこの特徴は引き継がれていた。変性抗原へ強く反応する抗体は、リニアな配列のエピトープを認識している可能性が高いと考えられる。したがって、この結果から、抗体Ｄ４８はｇＢのリニアな配列を認識すると推測される。【００５３】
実施例４  表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による解析
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行われた。すべての実験においてＨＢＳ−ＥＰ＋ｂｕｆｆｅｒを使用し、温度は２５℃、流速は３０μＬ／分に設定した。センサーチップはＣＭ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、ｇＢ１−７０５−ｓｔｒｅｐを約１００レゾナンスユニット（ＲＵ）固相化した。測定はシングルサイクルカイネティクスモードで実施し、ｓｃＦｖ−ｈＦｃについては１２８ｎＭ、６４ｎＭ、３２ｎＭ、１６ｎＭ、８ｎＭ、Ｆａｂについては６４ｎＭ、３２ｎＭ、１６ｎＭ、８ｎＭ、４ｎＭ、ヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａ、ヒト−モルモットキメラＩｇＧ２κ、モノクローナル抗体Ｅ３１、モノクローナル抗体Ｆ６７については２５６倍、１２８倍、６４倍、３２倍、１６倍に希釈して使用した。すべてのサンプルは一回のみ測定した。モノクローナル抗体Ｅ３１とモノクローナル抗体Ｆ６７はともにｇＢのドメインＩＶを認識する抗体である。【００５４】
結果は、表２に示す。ＳＰＲを用いた速度論的解析からも親和性が維持されたままであることが示唆された。また同速度論的解析から、ヒト抗体ライブラリーを用いた抗ＨＳＶ  ＨＳＶ  ｇＢ２抗体の網羅的探索によって得られた別の抗体株であるＦ６７及びＥ３１は、抗体Ｄ４８よりも１オーダー低い親和性を有していることを判明した。
【表２】
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【００５５】
実施例５  アラニンスキャニングによるエピトープ解析
抗体Ｄ４８のエピトープを同定するためにｇＢ１−７０５に含まれる荷電アミノ酸をアラニンに置換した１８７クローンを作製し、抗体Ｄ４８のｓｃＦｖ−ｈＦｃとの反応性を確認した。【００５６】
ｇＢ１−７０５中の荷電アミノ酸残基（１８７箇所）をそれぞれアラニンに改変した遺伝子をＰＣＲによって構築し、ｐＣＡＧＧＳ１−ｄｈｆｒ−ｎｅｏにクローニングした。発現には、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３又はＥｘｐｉ２９３発現システムを用いた。取得したｇＢアラニン置換体の発現量と、アラニン置換体と抗体断片との結合活性をＥＬＩＳＡによって評価した。【００５７】
ｇＢアラニン置換体を含む培養上清をＭａｘｉＳｏｒｐ  ｐｌａｔｅに入れ、室温で１時間インキュベートすることによってｇＢアラニン置換体を固相化した。固相化後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ／ＨＲＰ（ＩＢＡ）をプレートのウェルに１００μＬ加え、室温でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢをプレートのウェルに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、１Ｎ硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定し、発現量を求めた。【００５８】
一方、ｇＢアラニン置換体を含む培養上清をＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ（ＩＢＡ）を固定化したＭａｘｉＳｏｒｐ  ｐｌａｔｅに入れ、室温で１時間インキュベートすることによってｇＢアラニン置換体を固相化した。固相化後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、抗体断片をプレートのウェルに１００μＬ加え、室温でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ／ＨＲＰ（コスモバイオ）をプレートのウェルに１００μＬ加え、室温でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢをプレートのウェルに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、１Ｎ硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定し、結合活性を求めた。アラニン置換していない野生型ｇＢ１−７０５と比較して発現量あたりの反応性が変化しているかどうかによってエピトープ候補を選出した。【００５９】
その結果、ｇＢのドメインＩＩ上のＲ３９１がエピトープとして重要なアミノ酸残基であることが示唆されている。【００６０】
実施例６  水素−重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）によるエピトープ解析
アラニンスキャングは親水性残基のみをターゲットとした解析であり、その他の非親水性残基がエピトープであるという可能性が十分に予想された。【００６１】
したがって、水素／重水素交換質量分析法（ＨＤＸ−ＭＳ）を用いて抗体Ｄ４８の詳細なエピトープ解析を実施した。この手法は、タンパク質がＤ２Ｏに暴露された場合、安定な水素結合を形成していない構造表面及び天然変性（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）領域のアミド水素が急速にＨからＤへと交換されるという現象を利用している。例えば抗体がＴｉｇｈｔな結合を形成した抗体−タンパク質界面では、揺らぎ運動（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ  ｍｏｔｉｏｎ）によってのみＤ２Ｏの侵入が可能となるため、ＨＤＸからは強く保護されることとなり、結果として低速のＨＤＸしか発生しない。一方、抗体−タンパク質界面以外ではＨＤＸからは保護されないため、結果として高速のＨＤＸが発生する。このＨＤＸ速度の差によって不均一にＨＤＸが起こった状態の抗体−タンパク質複合体の質量変化をＭＳベースペプチドマッピングによって解析することで、抗体の詳細なエピトープ解析が可能となる。ＨＤＸ−ＭＳは既に多方面での応用実績のある確立された手法となっており、特に抗体のエピトープ解析においては、溶液中で立体構造を保ったままコンフォメーショナルなエピトープを解析できる点で重要な技術となっている。【００６２】
実験方法は、以下のとおりであった。１２０μＭのｇＢ１−７０５と４００μＭの抗体Ｄ４８  Ｆａｂを等量で混合し、ｇＢ１−７０５／抗体Ｄ４８  Ｆａｂ複合体を調製した。この複合体はＰＢＳ（ｐＨ７．２）で調製し、ジュウテリウム緩衝剤としてＰＢＳ（ｐＤ７．２）を用い２０℃でＨ／Ｄ交換反応を行った。反応後の複合体にＱｕｅｎｃｈ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、４Ｍグアニジン塩酸塩、１５０ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ））を加え、ｐＨ２．４になるように調製した。ペプシンカラムを用いて、複合体をペプチド断片にし、ＬＣ−ＭＳで解析した。この際の切断、溶出条件はＩｎｊｅｃｔｅｄ  ｓａｍｐｌｅ：７５ｐｍｏｌ、ペプシン消化＋脱塩時間：６分、ＬＣのグラジエント条件：９分とした。この条件においてｇＢ１−７０５、ｇＢ１−７０５／抗体Ｄ４８  Ｆａｂ複合体の３回測定で共通するペプチドは１９２本であり、配列包括度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）は９９．２％であった。【００６３】
水素−重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）によるエピトープ解析の結果を図４に示す。ｇＢ１−７０５と抗体Ｄ４８  Ｆａｂを用いた解析を実施した結果、ヒットしたペプチドはＶ３８０−Ｄ３８９であった。また、Ｌ３７７−Ｃ３８５は重水素交換率に差がないペプチドであると判断されたため、Ｉ３８６−Ｄ３８９が抗体Ｄ４８のエピトープであると示唆された。これはこれまでの本発明者らの解析結果であるＲ３９１の非常に近傍である。【００６４】
また、今回の検討では消化酵素としてペプシンを使用しており、Ｒ３９１を含むペプチドを得ることはできなかったが、総合的に考えて配列番号１１に記載のＨＳＶ−２  ｇＢのＩ３８６−Ｒ３９１が抗体Ｄ４８のエピトープである可能性は非常に高いと考えられる。また、Ｄ３８９、Ｒ３８８、Ｇ３８７、Ｉ３８６のいずれかのみがエピトープである可能性があると考えられる。さらに、Ｒ３９１以降がエピトープの一部を構成している可能性もある。同様に、配列番号１１に記載のＨＳＶ−２  ｇＢのＩ３８６−Ｒ３９１に対応する、配列番号１０に記載のＨＳＶ−１  ｇＢのＩ３８３−Ｒ３８８からなる領域が抗体Ｄ４８のエピトープである可能性は非常に高いと考えられる。【００６５】
立体構造を見るとＩ３８６−Ｒ３９１はｇＢドメインＩＩの溶媒面に位置するαへリックスを形成しており、抗体がアクセスしやすい部位であると言える。また、ヒットのクライテリアを達成することはできなかったが、Ｌ４１６−Ｌ４２２についても重水素交換率に差が検出されていた。Ｌ４１６−Ｌ４２２はＩ３８６−Ｒ３９１より構造内部側に位置し、溶媒に露出しにくい部位に存在しているため、この重水素交換率差は構造変化による影響を受けたものであると考えられる。【００６６】
既報抗体の中でドメインＩＩ上にエピトープを有する抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体としてはＣ２２６、Ｈ１８３８及びＨ１７８１が知られており、大まかなエピトープ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの生物活性は報告されているが、ｉｎ  ｖｉｖｏの生物活性の詳細は報告されていない（非特許文献１８）。【００６７】
実施例７  ウイルス中和試験
＜細胞及びウイルスの培養＞
ウイルスの培養、感染価測定、中和抗体価測定にはＡＴＣＣから購入したＶｅｒｏ細胞（ＣＣＬ．８１）を使用した。Ｖｅｒｏ細胞は、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。拡張、維持、解析プレート作製時は、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地を使用し、感染価測定及び中和抗体価測定時は、２％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地を使用した。中和試験及び感染防御能解析に用いるウイルスバンクはＡＴＣＣから購入した、Ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ２（ＨＳＶ−２）ＭＳ株（ＶＲ−５４０）及びＨｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １（ＨＳＶ−１）ＫＯＳ株（ＶＲ−１４９３）をｍ．ｏ．ｉ＝０．０１〜１でフルシートのＶｅｒｏ細胞に接種し、２〜３日間２％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地で培養した。回収した感染細胞培養ボトルを３回凍結融解して細胞を破砕後、ＴＯＭＹ遠心器で室温にて３５００ｒｐｍ、１０分遠心し、上清をＨＳＶ−２ウイルスバンク及びＨＳＶ−１ウイルスバンクとした。【００６８】
＜中和試験＞
中和試験はプラーク数減少活性（プラークリダクション活性）測定とｃｅｌｌ  ｔｏ  ｃｅｌｌ感染拡大抑制活性測定の２種類の方法を用いて行った。対象とするウイルスはＨＳＶ−２  ＭＳ株とＨＳＶ−１  ＫＯＳ株の２種を用いた。【００６９】
プラークリダクション活性測定は、被験抗体を所定の濃度になるように調製し約１００ＰＦＵのＨＳＶ−２  ＭＳ株又はＨＳＶ−１  ＫＯＳ株と混合後、３７℃で１時間反応させた。４８ウェルプレートにフルシートになったＶｅｒｏ細胞に反応液を播種し、３０℃で１時間吸着後に１％メチルセルロース含有ＭＥＭ（２％ＦＢＳ）培地で２４時間培養後、５０％メタノール／５０％エタノール（−２０℃）で、−２０℃で３０分間不活化及び固定を行った。その後、抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体を３７℃で１時間反応させ、抗マウスＩｇＧ／ＨＲＰ（Ｄａｋｏ  Ｐ０４４７）とＴＭＢＨで免疫染色し、ＥＬＩＳＰＯＴアナライザー（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  Ｓ６  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＣＴＬ社）で各ウェルの画像を取り込み、解析ソフト（ＢｉｏＳｐｏｔ  ＣＴＬ社）でプラーク数をカウントした。【００７０】
Ｃｅｌｌ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ感染拡大抑制活性測定は、４８ウェルプレートにフルシートになったＶｅｒｏ細胞に約１００ＰＦＵのＨＳＶ−２  ＭＳ株又はＨＳＶ−１  ＫＯＳ株を接種し、３０℃で１時間吸着後、所定濃度の被験抗体を含有した１％メチルセルロース含有ＭＥＭ（２％ＦＢＳ）培地（抗体濃度は５、２５及び１２５μｇ／ｍＬ）を添加し、ＨＳＶ−２  ＭＳ株は約４０時間、ＨＳＶ−１  ＫＯＳ株は約４８時間培養後、５０％メタノール／５０％エタノール（−２０℃）で、−２０℃で３０分間不活化及び固定を行った。その後、自家調製した抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体を３７℃で１時間反応させ、抗マウスＩｇＧ／ＨＲＰとＴＭＢＨで免疫染色し、ＥＬＩＳＰＯＴアナライザーで各ウェルの画像を取り込み、解析ソフトでプラークサイズの平均値を解析した。【００７１】
結果を表３に示す。抗体Ｄ４８のｓｃＦｖ−ｈＦｃ、Ｆａｂ、ヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａ、及びヒト−モルモットキメラＩｇＧ２ｋは、何れもＫＯＳ（ＨＳＶ−１）、ＭＳ（ＨＳＶ−２）の両株に対して１ｎＭ以下又は数ｎＭの強力な５０％プラーク数減少活性を示した。また、抗体Ｄ４８のｓｃＦｖ−ｈＦｃ及びヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａはＭＳ（ＨＳＶ−２）株に対して、それぞれ４０ｎＭ及び４８ｎＭの強力な５０％Ｃｅｌｌ  ｔｏ  ｃｅｌｌ感染拡大抑制活性を示した。
【表３】
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【００７２】
抗体Ｄ４８のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に対する５０％プラーク数減少活性は、既報の様々な抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体の中でも突出している。【００７３】
実施例８  マウス感染防御試験
＜試験方法＞
マウス性器ヘルペス感染モデルを用いて、抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体（ヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａ）の予防的投与及び治療的投与における感染防御試験を実施した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（５週齢、メス）を用いた。所定量の抗体を注射用生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）に溶解してマウスに抗体を投与する。予防的投与の場合にはウイルス接種２４時間前に２００μＬ／匹の容量にて腹腔内投与した。治療的投与の場合にはウイルス接種４８時間後に、２００μＬ／匹の容量にて腹腔内投与した。１群あたりＮ＝１０の例数を設定した。ウイルス接種時の感染効率を向上させるために、ウイルス接種６日前にＤｅｐｏ−Ｐｒｏｖｅｒａを２ｍｇ／匹で皮下接種した。麻酔下で５×１０５ＰＦＵ／２０μＬのＨＳＶ−２  ＭＳ株を経腟接種し、２１日間経過観察を行った。生存日数（生存率）及び症状スコアを指標に感染防御能を示した。症状スコアは、膣病変症状の有無及び程度によってスコアを定義し各群における平均値を示した。スコアの付け方として、０：変化なし、１：部分的な紅斑・腫脹、２：広範囲の腫脹・浮腫、３：潰瘍・出血、４：死亡、とした。回復の見込みのない重篤な全身症状（立毛、麻痺、震戦、痙攣など）が認められた場合、その日はスコアを３．５とし、犠牲死させ、次の日に死亡として扱ってスコアを４とした。【００７４】
＜抗体Ｄ４８、Ｆ６７及びＥ３１によるマウス感染防御試験＞
表４に示す３種類の抗ＨＳＶ  ｇＢ２抗体Ｄ４８、Ｆ６７及びＥ３１（何れもヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａ）に関して、それぞれのマウス感染防御能を評価し比較した。抗体Ｄ４８がＨＳＶ  ｇＢのドメインＩＩ領域にエピトープを有し強力なウイルス中和活性（５０％プラーク数減少活性）を有する抗体であるのに対し、Ｆ６７及びＥ３１は共にドメインＩＶ領域にエピトープを有し、前者がウイルス中和活性を有さず、後者は中程度のウイルス中和活性を有していた。
【表４】
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【００７５】
各群の動物例数をｎ＝７として予防的投与を行い、表５に感染後の生存日数及びその平均値を示し、図５に感染後の生存率（％）の平均値を示す。マウス感染防御能に関しては、抗体Ｄ４８が３０μｇ／匹／回及び３μｇ／匹／回で顕著な生存日数延長効果を示し、０．３μｇ／匹／回でも有意な生存日数延長効果を示したのに対し、Ｆ６７及びＥ３１は何れも限定された効果を示すにとどまっていた。この結果から、抗体Ｄ４８が他の抗ＨＳＶ  ｇＢ２抗体に比してｉｎ  ｖｉｔｒｏのみならずｉｎ  ｖｉｖｏにおいても顕著な感染防御活性を有し、その優秀性はエピトープ領域及び親和性の差異に基づく可能性が示唆された。
【表５】
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【００７６】
＜抗体Ｄ４８によるマウス感染防御試験結果＞
マウス性器ヘルペス感染モデル（ｎ＝１０）を用いて、抗体Ｄ４８（ヒト−マウスキメラＩｇＧ２ａ）の予防的投与及び治療的投与における感染防御試験結果を示す。予防的投与の結果は、表６（投与量別の生存日数）、図６（生存率）及び図７（症状スコア）に示す。治療的投与の結果は、表７（投与量別の生存日数）、図８（生存率）及び図９（症状スコア）に示す。【００７７】
予防的投与において、設定した全ての投与量（１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ）において、陰性対照群（ｓａｌｉｎｅ投与群）に比して有意な生存日数延長効果を示した。特に、高用量域である１０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇの２用量において、顕著な生存率及び症状スコアの改善効果を示した。
【表６】
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【００７８】
治療的投与において、ＨＳＶは感染局所から体内に侵入後４８時間以内に神経節に移行するという報告がある。しかし、感染後４８時間時点において抗体Ｄ４８を治療的投与した場合も、１０ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇの２用量において顕著な生存率及び症状スコアの改善効果を示した。これらの結果から、抗体Ｄ４８は予防的投与のみならず治療的投与においても強力な感染防御効果を示すことが確認された。
【表７】
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【００７９】
実施例９  モルモット感染防御試験
＜試験方法＞
モルモット性器ヘルペス感染モデルを用いて、抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体Ｄ４８（ヒト−モルモットキメラＩｇＧ２ｋ）の予防的投与及び治療的投与における感染防御試験を実施した。ＳＬＣ社から購入したＨａｒｔｌｅｙモルモット（３〜５週齢、メス）を用いた。所定量の抗体を注射用生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）に溶解し、予防的投与の場合にはウイルス接種２４時間前に、また治療的投与の場合にはウイルス接種４日間後に、何れも１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの容量にて腹腔内投与した。治療的投与の場合は、投与前に症状観察を行い、膣症状を呈している個体を選別し、各群の平均スコアに偏りが生じない様にランダマイズした。各群の動物例数を予防的投与ではＮ＝９に設定し、治療的投与ではＮ＝１５に設定した。ウイルス接種は麻酔下で５×１０５ＰＦＵ／５０μＬのＨＳＶ−２  ＭＳ株を経腟接種し、急性期症状を接種後２〜３週間観察した。症状スコアは、０：明確な病変なし、０．５−１：紅斑、１．５−２：限局的な水泡、２．５−３：限局的な潰瘍又は痂皮、３−５：広範に及ぶ水泡・潰瘍又は痂皮、３−７：失禁を伴う広範な潰瘍又は痂皮、７．５：重篤な症状による安楽殺、８：死亡、とした。また、ウイルス接種後７日目に、膣拭い液（膣ｓｗａｂ）を採取し、プラーク法によってウイルス放出量を測定した。膣Ｓｗａｂは、ＭＥＭ培地で湿潤させた綿棒を膣内に挿入後、膣内壁の粘膜を拭い取るようにして採取した。採取した膣Ｓｗａｂは、シリコナイズドチューブに１ｍＬずつ分注したＭＥＭ培地にて懸濁し、使用時まで凍結保存した。ウイルス放出量の測定時に膣ｓｗａｂを原液、１０倍、１００倍、１０００倍希釈し、１００μＬ／ウェルで９６ウェル又は４８ウェルにフルシートになったＶｅｒｏ細胞に接種した。膣Ｓｗａｂ接種後３７℃で１時間ウイルス吸着を行い、１％メチルセルロース含有２％ＦＢＳ  ＭＥＭ培地で２４〜７２時間培養した後に、所定の方法でプラーク数を計測した。【００８０】
＜結果＞
モルモット性器ヘルペス感染モデル（急性期）を用いて、抗体Ｄ４８（ヒト−モルモットキメラＩｇＧ２κ）の予防的投与の感染防御試験の症状スコアの結果を図１０に、治療的投与感染防御試験の症状スコアの結果を図１１に、治療的投与感染防御試験の膣拭い液中のＨＳＶ放出量を図１２に示す。【００８１】
図１０に示すように、予防的投与では設定した投与量（３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ）の全ての用量において、陰性対照群（ｓａｌｉｎｅ投与群）に比して有意な症状スコアの改善効果が認められた。【００８２】
図１１に示すように、感染後４日時点において既に膣症状を呈しているモルモットに対して抗体Ｄ４８を３０ｍｇ／ｋｇを投与した結果、陰性対照群（ｓａｌｉｎｅ投与群）に比して有意に症状スコアが軽減した。また、ウイルス接種後７日目において膣拭い液（膣ｓｗａｂ）を採取し、プラーク法によってウイルス放出量を測定した結果、図１２に示すように陰性対照群に比して有意にウイルス放出量が減少した。以上から、抗体Ｄ４８は予防的投与のみならず治療的投与においても有意な感染防御効果を示すことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明によれば、ＨＳＶに対して強力な中和効果を示し、ＨＳＶの細胞間伝播を抑制できる新規な抗ＨＳＶ  ｇＢモノクローナル抗体を提供できる。それによって、ＨＳＶ感染を予防及び／又は治療に適用でき、特にＨＳＶ感染リスクの高い免疫不全患者、又は免疫抑制剤を投与している骨髄移植・血液幹細胞移植・臓器移植患者に対する予防薬として、或いはＨＳＶ再発を繰り返す患者に対する治療薬として既存抗ウイルス薬の代替薬又は併用薬として使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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