(57)【要約】  本発明は、所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片を、二重非対称ＰＣＲ（ＤＡ−ＰＣＲ）により製造する方法に関する。該方法は、（１）それぞれが２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖の一部に相当する複数種のオリゴヌクレオチド（センスオリゴヌクレオチド）と、それぞれが２本鎖ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖の一部に相当する複数種のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）とを用意し、等濃度の各種オリゴヌクレオチドと、ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰとを混合し、反応混合液を調製する工程と、（２）工程（１）の反応混合液を用いて、ＰＣＲを行う工程と、（３）工程（２）の反応混合液に、２本鎖ＤＮＡ断片の完全長を増幅できるプライマーセットを添加する工程と、（４）工程（３）の反応混合液を用いて、ＰＣＲを行う工程を備える。
2019044820.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片を、二重非対称ＰＣＲ（ＤＡ−ＰＣＲ）により製造する方法であって、
（１）それぞれが前記２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖の一部に相当する複数種のオリゴヌクレオチド（センスオリゴヌクレオチド）と、それぞれが前記２本鎖ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖の一部に相当する複数種のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）とを用意し、等濃度の前記各種オリゴヌクレオチドと、ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰとを混合し、反応混合液を調製する工程と、
（２）工程（１）の反応混合液を用いて、ＰＣＲを行う工程と、
（３）工程（２）の反応混合液に、前記２本鎖ＤＮＡ断片の完全長を増幅できるプライマーセットを添加する工程と、
（４）工程（３）の反応混合液を用いて、ＰＣＲを行う工程を備え、
前記複数種のセンスオリゴヌクレオチド及び前記複数種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、前記２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖及びアンチセンス鎖に対応させて整列した場合、隣接する前記センスオリゴヌクレオチド同士又は隣接する前記アンチセンスオリゴヌクレオチド同士は互いに連続せず、交互に隣接する前記センスオリゴヌクレオチドと前記アンチセンスオリゴヌクレオチドとが隣接する末端部において相補的な塩基配列を有する領域（重複領域）を有し、交互に隣接する前記センスオリゴヌクレオチド及び前記アンチセンスオリゴヌクレオチドによって、前記２本鎖ＤＮＡ断片の全配列がカバーされる、
方法。
【請求項２】
工程（２）において、ＰＣＲが、９４〜９８℃で２０〜６０秒間及び７０〜７５℃で２０〜６０秒間のＰＣＲプロフィールを２〜２０サイクル繰り返す、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（２）において、ＰＣＲが、９４〜９８℃で２０〜６０秒間、５０〜６５℃で５〜６０秒間及び７０〜７５℃で２０〜６０秒間のＰＣＲプロフィールを２〜２０サイクル繰り返す、請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程（４）において、ＰＣＲが、９４〜９８℃で５〜１０秒間、５０〜６５℃で５〜１５秒間及び７０〜７５℃で５〜３０秒間のＰＣＲプロフィールを２〜３０サイクル繰り返す、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅからなる群より選ばれるＤＮＡポリメラーゼである、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
（５）ＯＥ−ＰＣＲを行う工程をさらに備える、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２本鎖ＤＮＡ断片を製造する方法に関し、特にＤＡ−ＰＣＲ法による２本鎖ＤＮＡ断片を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝情報の継承と発現等を担っているＤＮＡを選択的に増幅させる方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が知られている。ＰＣＲにおいては、目的とするＤＮＡがテンプレートとして必要であるが、目的とするＤＮＡが常に入手可能というわけではない。また、異なる生物において目的とするＤＮＡを効率的に発現させるために、制限酵素部位を組み入れたり、宿主細胞系のコドンの最適化を図ったりする必要がある。【０００３】
この代替法として、天然あるいは人工のＤＮＡ配列をアセンブルし、全遺伝子を合成する方法が用いられている。しかしながら、全遺伝子合成は、最良の結果を得るために、リン酸化し、ポリアクリルアミドゲルで精製したオリゴヌクレオチドを必要とするため、コストが高い。【０００４】
低コストの方法として、完全長分子の両方の鎖の完全な配列をカバーする、互いに２０ｎｔ重複する長さ４０ｎｔのオリゴヌクレオチドを使用し、Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ（オーバーラップ伸長ＰＣＲ：ＯＥ−ＰＣＲ）により完全長分子を作製し、２つの外側プライマーを用いたＰＣＲにより完全長分子を増幅する方法が知られている（非特許文献１）。また、この方法のＯＥ−ＰＣＲ工程の前に、ライゲーション工程を行う改良を加えた方法により、１４日間でφＸ１７４バクテリオファージの全長ＤＮＡを合成したことが報告されている（非特許文献２）。【０００５】
しかし、この方法はオリゴヌクレオチドに依拠するため、ＤＮＡ配列エラーの傾向が高く、φＸ１７４自体を効率的な突然変異スクリーニングツールとして利用できたために全長ＤＮＡを取得できたが、すべての遺伝子についてこの方法が適応できるわけではない。【０００６】
Ｄｕａｌ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ  ＰＣＲ（二重非対称ＰＣＲ：ＤＡ−ＰＣＲ）とＯＥ−ＰＣＲを組み合わせた、容易に自動化でき、単純で、再現性があり、誤差の少ない、低コストの遺伝子の合成方法が報告されている（非特許文献３）。この方法においては４つの連続して隣接するオリゴヌクレオチド毎に、外側の２つのオリゴヌクレオチドを内側のオリゴヌクレオチドの５倍モル過剰で一緒に混合し、ＤＡ−ＰＣＲを行うことを特徴としている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Stemmer WPら、Gene. 1995 Oct 16;164(1):49-53.
【非特許文献２】Hamilton O. Smithら、Proc.Natl Acad. Sci. ΜSA, December 23, 2003, Vol.100, 15440-15445
【非特許文献３】Lei Youngら、Nucleic Acids Research,2004,Vol.32,No.7 e59
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は特に、所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片を増幅する方法において、従来のＤＡ−ＰＣＲにおいては、一度に４つの連続して隣接するオリゴヌクレオチドしか用いることができないという問題点を鑑み、ＤＡ−ＰＣＲにおいて、より多くの隣接したオリゴヌクレオチドを用いて所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片を増幅できる、低コストで、正確かつ効率的に２本鎖ＤＮＡ断片を合成できる改良ＤＡ−ＰＣＲ法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片に対応した、等濃度の６つ以上の交互に隣接したオリゴヌクレオチドを混合し、アニーリングを行う条件を高めに、もしくは省略する条件でＰＣＲを行うステップ（ステップ１）を行った後で、２本鎖ＤＮＡ断片の完全長を増幅できるプライマーセットを添加し、さらにＰＣＲを行うステップ（ステップ２）を行うという２段階二重非対称ＰＣＲによって、正確かつ効率的にＤＮＡを合成することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の各発明に関する。
［１］所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片を、二重非対称ＰＣＲ（ＤＡ−ＰＣＲ）により製造する方法であって、
（１）それぞれが上記２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖の一部に相当する複数種のオリゴヌクレオチド（センスオリゴヌクレオチド）と、それぞれが上記２本鎖ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖の一部に相当する複数種のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）とを用意し、等濃度の上記各種オリゴヌクレオチドと、ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰとを混合し、反応混合液を調製する工程と、
（２）工程（１）の反応混合液を用いて、ＰＣＲを行う工程と、
（３）工程（２）の反応混合液に、上記２本鎖ＤＮＡ断片の完全長を増幅できるプライマーセットを添加する工程と、
（４）工程（３）の反応混合液を用いて、ＰＣＲを行う工程を備え、
上記複数種のセンスオリゴヌクレオチド及び上記複数種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、上記２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖及びアンチセンス鎖に対応させて整列した場合、隣接する上記センスオリゴヌクレオチド同士又は隣接する上記アンチセンスオリゴヌクレオチド同士は互いに連続せず、交互に隣接する上記センスオリゴヌクレオチドと上記アンチセンスオリゴヌクレオチドとが隣接する末端部において相補的な塩基配列を有する領域（重複領域）を有し、交互に隣接する上記センスオリゴヌクレオチド及び上記アンチセンスオリゴヌクレオチドによって、上記２本鎖ＤＮＡ断片の全配列がカバーされる、
方法。
［２］工程（２）において、ＰＣＲが、９４〜９８℃で２０〜６０秒間及び７０〜７５℃で２０〜６０秒間のＰＣＲプロフィールを２〜２０サイクル繰り返す、［１］の方法。
［３］工程（２）において、ＰＣＲが、９４〜９８℃で２０〜６０秒間、５０〜６５℃で５〜６０秒間及び７０〜７５℃で２０〜６０秒間のＰＣＲプロフィールを２〜２０サイクル繰り返す、［１］の方法。
［４］工程（４）において、ＰＣＲが、９４〜９８℃で５〜１０秒間、５０〜６５℃で５〜１５秒間及び７０〜７５℃で５〜３０秒間のＰＣＲプロフィールを２〜３０サイクル繰り返す、［１］から［３］のいずれかの方法。
［５］ＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｆｕポリメラーゼ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅからなる群より選ばれるＤＮＡポリメラーゼである、［１］から［４］のいずれかの方法。
［６］工程（５）ＯＥ−ＰＣＲを行う工程をさらに備える、［１］又は［２］の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、一度に多数の隣接したオリゴヌクレオチドを正確にＤＡ−ＰＣＲで連結し、所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片を増幅できる方法を提供する。さらにＯＥ−ＰＣＲ法と組み合わせることにより、正確かつ効率的に所望の塩基配列を有する目的ＤＮＡを合成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の２段階二重非対称ＰＣＲ（ＤＡ−ＰＣＲ）法を図示したものである。
【図２】配列番号１に記載の塩基配列を有する所望の２本鎖ＤＮＡ断片を製造するためのオリゴヌクレオチドの設計を示す図である。所望の２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖の全配列を示し、下線部はセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示し、陰影部はアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な配列を示す。
【図３】配列番号５４に記載の塩基配列を有するｐＵＣ１１８プラスミドＤＮＡの構造を示す図である。
【図４】配列番号５４に記載の塩基配列を有する所望の２本鎖ＤＮＡ断片を製造するためのオリゴヌクレオチドの設計を示す図である。所望の２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖の全配列を示し、下線部はセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示し、陰影部はアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な配列を示す。
【図５】実施例１及び比較例１における、配列番号２〜１７の塩基配列を有する１６種類のオリゴヌクレオチドを用いたＤＡ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図６】実施例２のＤＡ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図７】実施例２のＯＥ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の一実施形態の所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片を、二重非対称ＰＣＲ（ＤＡ−ＰＣＲ）により製造する方法は、
（１）それぞれが上記２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖の一部に相当する複数種のオリゴヌクレオチド（センスオリゴヌクレオチド）と、それぞれが上記２本鎖ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖の一部に相当する複数種のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）とを用意し、等濃度の上記各種オリゴヌクレオチドと、ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰとを混合し、反応混合液を調製する工程と、
（２）工程（１）の反応混合液を用いて、ＰＣＲを行う工程と、
（３）工程（２）の反応混合液に、上記２本鎖ＤＮＡ断片の完全長を増幅できるプライマーセットを添加する工程と、
（４）工程（３）の反応混合液を用いて、ＰＣＲを行う工程を備える。
【００１４】
ここで、２本鎖ＤＮＡ断片とは、対象とするＤＮＡの断片であって、例えば、対象とするＤＮＡがタンパク質をコードする２本鎖ＤＮＡであった場合、そのＤＮＡの一部分に相当する２本鎖ＤＮＡ断片をいい、対象とするＤＮＡがプラスミドのような２本鎖環状ＤＮＡであった場合、そのＤＮＡの一部分に相当する２本鎖ＤＮＡ断片をいう。対象とするＤＮＡが、本発明の改良ＤＡ−ＰＣＲ法で合成できる程度の短い配列であった場合、当該ＤＮＡ自体が２本鎖ＤＮＡ断片に含まれる。
【００１５】
工程（１）
工程（１）において、まず所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片に対応したオリゴヌクレオチドを用意する。オリゴヌクレオチドは、それぞれが２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖の一部に相当する複数種のセンスオリゴヌクレオチド、及び、それぞれが２本鎖ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖の一部に相当する複数種のアンチセンスオリゴヌクレオチドからなり、センスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを、２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖及びアンチセンス鎖に対応させて整列した場合、隣接するセンスオリゴヌクレオチド同士又は隣接するアンチセンスオリゴヌクレオチド同士は互いに連続せず、交互に隣接するセンスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドとが隣接する末端部において相補的な塩基配列を有する領域（重複領域）を有する（図１）。センスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端に相当するオリゴヌクレオチドだけは、片方の末端に重複領域を有し、２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端に相当するオリゴヌクレオチド以外のオリゴヌクレオチドは両末端に重複領域を有する。また、オリゴヌクレオチドは、重複領域以外の部分（以下、「ギャップ」と呼ぶ）も有する。
【００１６】
オリゴヌクレオチドの設計に際し、所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片を、重複領域及びギャップを有する、２５〜９０ｂｐ、好ましくは５０〜６５ｂｐの長さに分断することによって、それぞれの分断した断片に相当するセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する。オリゴヌクレオチドの数は目的とする２本鎖ＤＮＡ断片の長さとその配列の特性によって変動し得るが、６〜５０個であってよく、６〜４０個であってよく、６〜３２個であってよく、６〜３０個であってよい。
【００１７】
センスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが２５〜９０ｎｔ、又は５０〜６５ｎｔの長さを有してよく、一の末端の重複領域が５〜２２ｎｔ、１０〜２２ｎｔ、１５〜２２ｎｔ、又は１８〜２２ｎｔの長さがあればよい。ギャップは１０〜５０ｎｔ、２０〜５０ｎｔ、３０〜５０ｎｔ、又は２８〜４７ｎｔの長さを有してよい。
【００１８】
交互に隣接するセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドによって、２本鎖ＤＮＡ断片の全配列がカバーされる（図１）。ここで、「全配列がカバーされる」とは、センス鎖単独又はアンチセンス鎖単独で見た場合、すべての塩基配列に相当するオリゴヌクレオチドがないものの、センス鎖に相当するセンスオリゴヌクレオチドがない領域は、アンチセンス鎖に相当するアンチセンスオリゴヌクレオチドがあり、その逆も成立することによって、全配列に鋳型となるオリゴヌクレオチドが含まれることをいう。
【００１９】
上記で設計したオリゴヌクレオチドは通常の公知の方法で合成し、調製することができる。また、合成受託業者に委託して調製してもよい。
【００２０】
工程（１）において、等濃度の複数種のオリゴヌクレオチドと、ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰとを混合し、反応混合液を調製する。等濃度とは、それぞれのオリゴヌクレオチドがおよそ同じモル濃度で添加されることをいい、全く同じモル濃度であってもよく、例えば、基準モル濃度に対して０．８〜１．２倍の濃度範囲において異なる濃度であってもよく、０．９〜１．１倍の濃度範囲において異なる濃度であってもよい。各オリゴヌクレオチドの基準モル濃度は例えば、１〜５００ｐｍｏｌ／μｌ、１０〜２５０ｐｍｏｌ／μｌ、又は、５０〜２００ｐｍｏｌ／μｌであってよい。
【００２１】
ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＰＣＲに用いることのできるＤＮＡポリメラーゼであれば特に限定されないが、Ｐｆｕポリメラーゼ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅからなる群より選ばれるＤＮＡポリメラーゼであってよい。
【００２２】
反応混合液としては、オリゴヌクレオチド以外に、例えば、非特許文献３に記載のＰｆｕポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）及びｄＮＴＰをｐｆｕ緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％トリトンＸ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）を含むものを用いてもよく、オリゴヌクレオチドを市販の反応液、例えば、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ株式会社）に添加して用いてもよい。また、例えば非特許文献３に記載の、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘに、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２ｍＭ  Ｍｇ２＋、各０．４ｍＭ  ｄＮＴＰが含有する反応液に、オリゴヌクレオチドを添加したものを用いてもよい。
【００２３】
具体的な反応混合液としては、例えば、反応液ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ  ２５μｌに、上記混合オリゴヌクレオチドを１μｌ、超純水２４μｌを添加（全量５０μｌ）した反応混合液をあげることができる。
【００２４】
工程（２）
本発明において、工程（２）のＰＣＲと工程（４）のＰＣＲを合わせて２段階の二重非対称ＰＣＲ（ＤＡ−ＰＣＲ）という場合があり、また、この場合は、前者をステップ１、後者をステップ２という場合がある。工程（２）、すなわち、ステップ１において、（１）の反応混合液を用いて、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ポリメラーゼ連鎖反応：ＰＣＲ）を行う。ステップ１のＰＣＲは、以下の条件により行われる。本明細書に記載のない条件については、非特許文献３に記載の方法に準じて行えばよい。
【００２５】
反応条件は、通常のＰＣＲ条件を用いることができるが、アニーリングを行う条件を高めに設定もしくは省略する条件をあげることができる。
【００２６】
アニーリングを省略した条件としては、９４〜９８℃で２０〜６０秒間、７０〜７５℃で２０〜６０秒間のＰＣＲプロフィールを繰り返す条件をあげることができる。上記ＰＣＲプロフィールを、２〜２０サイクル、５〜２０サイクル、１０〜２０、又は１５〜２０サイクル繰り返してよい。
【００２７】
アニーリングを省略しない条件としては、９４〜９８℃で２０〜６０秒間、５０〜６５℃で５〜６０秒間、７０〜７５℃で２０〜６０秒間のＰＣＲプロフィールを繰り返す条件をあげることができる。上記ＰＣＲプロフィールを、２〜２０サイクル、５〜２０サイクル、１０〜２０サイクル、又は１５〜２０サイクル繰り返してよい。
【００２８】
ステップ１の反応を行った後に、このステップ１反応混合液を精製することなくそのまま使用して、工程（３）を経て、ステップ２のＰＣＲを行う。
【００２９】
工程（３）
工程（３）は、上記（２）の反応混合液に、上記２本鎖ＤＮＡ断片の完全長を増幅できるプライマーセットを添加することを含む。
【００３０】
上記（２）の反応混合液に上記のように、工程（２）で得られた増加した長さを有する連結したオリゴヌクレオチドの混合体を含む。この反応混合液に、上記連結したオリゴヌクレオチドの混合体が、所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片の完全長まで連結した場合に想定される両末端の塩基配列に相当し、ＰＣＲにより上記連結したオリゴヌクレオチドの混合体から所望の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片を増幅することのできるプライマーセット、すなわち、フォーワードプライマー（プライマーＦ）とリバースプライマー（プライマーＲ）とのプライマーセットを添加し、工程（３）の反応混合液とする。
【００３１】
具体的な反応混合液としては、例えば、工程（１）の反応混合液としてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘを使用する場合には、ステップ１の反応混合液１０μｌに、１０ｐｍｏｌ／μｌのプライマーＦとプライマーＲをそれぞれ１μｌ、さらに、必要に応じてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘを２５μｌ、蒸留水１３μｌを添加（全量５０μｌ）した反応混合液をあげることができる。
【００３２】
工程（４）
ステップ２でのＰＣＲの反応条件は９４〜９８℃で５〜１０秒間、５０〜６５℃で５〜１５秒間、７０〜７５℃で５〜３０秒間のＰＣＲプロフィールを、２〜３０サイクル、５〜３０サイクル、１０〜３０サイクル、又は１５〜３０サイクル繰り返してよい。
【００３３】
このＰＣＲプロフィールの繰り返しサイクルを始める前に、９４〜９８℃で３０〜６０秒間処理してもよい。また、ＰＣＲプロフィールの繰り返しサイクル後に７０〜７５℃で６０〜１２０秒間処理を行ってもよい。さらに、このＰＣＲプロフィールの繰り返しサイクルを始める前に、９４〜９８℃で３０〜６０秒間処理し、ＰＣＲプロフィールの繰り返しサイクル後に７０〜７５℃で６０〜１２０秒間処理を行ってもよい。
【００３４】
所望のＤＮＡ断片の有する塩基配列が、対象とするＤＮＡの有する塩基配列を、連結したオリゴヌクレオチドの混合体で網羅している場合には、対象とする２本鎖ＤＮＡを取得することができる。
【００３５】
任意工程
（５）Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ（オーバーラップ伸長ＰＣＲ：ＯＥ−ＰＣＲ）
工程（４）のＰＣＲで得られた反応生成物が、所望の２本鎖ＤＮＡ断片以外に、所望の２本鎖ＤＮＡ断片の部分断片も含み得る。これらのＤＮＡの部分断片を精製し、ＯＥ−ＰＣＲを行うことにより、対象とする２本鎖ＤＮＡを取得することができる。また、ＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、得られた所望の２本鎖ＤＮＡ断片をさらに別の所望の２本鎖ＤＮＡ断片と連結することもできる。
【００３６】
反応生成物の精製は、上記工程（４）で得られた反応生成物毎に行ってもよく、また、等量の反応生成物を混合した後に精製を行ってもよい。精製は、反応生成物と等容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、３倍量のエタノールで沈殿させることにより行うことができる。
【００３７】
また、市販の精製システムを利用してもよい。このような精製システムとして、例えば、Ｗｉｚａｒｄ（商標登録）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）をあげることができる。
【００３８】
精製したＤＮＡの部分断片を用いて、非特許文献３に記載の方法に準じてＯＥ−ＰＣＲを行うことができる。ＯＥ−ＰＣＲを行うための反応液としては非特許文献３記載の、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）及びｄＮＴＰをｐｆｕ緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％トリトンＸ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中に含む反応液を用いることができる。また、市販の反応液、例えば、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ株式会社）を用いてもよい。
【００３９】
具体的な反応混合液としては、Ｗｉｚａｒｄ（商標登録）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で別々に精製したＤＮＡの部分断片を鋳型ＤＮＡとして使用する場合には、精製したＤＮＡの部分断片を１μｌずつ、これらＤＮＡの部分断片が連結した場合に想定される両末端の塩基配列に相当し、ＰＣＲにより上記所望の塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅することのできるプライマーセットである、プライマーＦ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）とプライマーＲ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）をそれぞれ１μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘを２５μｌ、超純水を最終容量５０μｌとなるように添加したものをあげることができる。
【００４０】
ＯＥ−ＰＣＲの条件は９４〜９８℃で２０〜６０秒間、５５〜６５℃で５〜６０秒間、７０〜７５℃で３０〜１２０秒間のＰＣＲプロフィールを、２〜３０サイクル、５〜３０サイクル、１０〜３０サイクル、又は１５〜３０サイクル繰り返してよい。
【００４１】
（６）完全長ＤＮＡの増幅
上記（４）又は（５）のＰＣＲで得られた対象とする２本鎖ＤＮＡは、下記通常のＰＣＲにより増幅することができる。
【００４２】
すなわち、ＰＣＲの反応生成物（１μｌ）、２００μＭ  ｄＮＴＰ、５Μ  ｐｆｕポリメラーゼ及び対象とする２本鎖ＤＮＡ断片を増幅できる、最も外側のプライマーセットを含む５０μｌの１×ｐｆｕ緩衝液中で、下記条件のＰＣＲを行うことにより増幅することができる。
【００４３】
ＰＣＲの条件は９４〜９８℃で２０〜６０秒間、５５〜６５℃で２０〜６０秒間、７０〜７５℃で６０〜１２０秒間のＰＣＲプロフィールを、２〜３０サイクル、５〜３０サイクル、１０〜３０サイクル、又は１５〜３０サイクル繰り返してよい。
【００４４】
最終ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動（１％）によって確認することができる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４６】
（１）オリゴヌクレオチドの設計及び調製その１
天然由来のフィブロインであるＡｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ  のｆｉｂｒｏｉｎ−３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Μ４７８５５．１  ＧＩ：１２６３２８６）の塩基配列を基に改変した配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡの合成のためのオリゴヌクレオチドの設計及び調製を行った。
配列番号１の５’末端の１〜６２番目の塩基配列に相当する配列番号２（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から４１〜１０２番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号３（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から８１〜１４２番目の塩基配列に相当する配列番号４（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から１２１〜１８２番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号５（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から１６１〜２２２番目の塩基配列に相当する配列番号６（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から２０４〜２６５番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号７（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から２４７〜３０８番目の塩基配列に相当する配列番号８（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から２８７〜３４８番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号９（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から３２７〜３８８番目の塩基配列に相当する配列番号１０（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から３６７〜４２３番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１１（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から４０２〜４４８番目の塩基配列に相当する配列番号１２（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から４２７〜４７８番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１３（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から４５９〜５２０番目の塩基配列に相当する配列番号１４（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から４９９〜５６０番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１５（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から５３９〜６００番目の塩基配列に相当する配列番号１６（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から５７９〜６４０番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１７（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から６２１〜６８２番目の塩基配列に相当する配列番号１８（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から６６１〜７２２番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１９（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から７０１〜７５５番目の塩基配列に相当する配列番号２０（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から７３４〜７９０番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号２１（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から７６９〜８１５番目の塩基配列に相当する配列番号２２（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から７９４〜８４８番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号２３（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から８２７〜８８８番目の塩基配列に相当する配列番号２４（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から８６７〜９２８番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号２５（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から９１０〜９７１番目の塩基配列に相当する配列番号２６（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から９５３〜１０１４番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号２７（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から９９３〜１０５２番目の塩基配列に相当する配列番号２８（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から１０３４〜１０９０番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号２９（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から１０６９〜１１２９番目の塩基配列に相当する配列番号３０（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から１１０８〜１１５４番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号３１（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から１１３３〜１１８７番目の塩基配列に相当する配列番号３２（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から１１６８〜１２２９番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号３３（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から１２１０〜１２７１番目の塩基配列に相当する配列番号３４（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から１２５２〜１３１２番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号３５（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から１２９４〜１３５５番目の塩基配列に相当する配列番号３６（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から１３３６〜１３９７番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号３７（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から１３７７〜１４３８番目の塩基配列に相当する配列番号３８（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から１４１９〜１４６５番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号３９（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から１４４４〜１５０５番目の塩基配列に相当する配列番号４０（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から１４８４〜１５４１番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号４１（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から１５２２〜１５８１番目の塩基配列に相当する配列番号４２（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から１５６４〜１６１９番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号４３（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から１６００〜１６６１番目の塩基配列に相当する配列番号４４（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から１６４２〜１７０３番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号４５（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から１６８２〜１７３８番目の塩基配列に相当する配列番号４６（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から１７１７〜１７７１番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号４７（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から１７５２〜１８１３番目の塩基配列に相当する配列番号４８（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から１７９２〜１８４７番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号４９（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から１８２６〜１８８７番目の塩基配列に相当する配列番号５０（センス鎖）、
配列番号１の５’末端から１８６６〜１９２７番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号５１（アンチセンス鎖）、
配列番号１の５’末端から１９１０〜１９７１番目の塩基配列に相当する配列番号５２（センス鎖）、及び
配列番号１の５’末端から１９５３〜１９８３番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号５３（アンチセンス鎖）
に示したオリゴヌクレオチドを設計し、それぞれ合成した（株式会社ファスマックに委託）。【００４７】
上記配列番号２〜５３において、配列番号１に記載の塩基配列を有する所望のＤＮＡ断片のセンス鎖に相当する配列を有する４７〜６２ｎｔのセンスオリゴヌクレオチドと、交互に隣接するアンチセンス鎖に相当する配列を有する３１〜６２ｎｔのアンチセンスオリゴヌクレオチドとは、１８〜２２ｎｔの相補的な配列を有する重複領域を有し、当該領域においてハイブリダイズして隣接し、これらオリゴヌクレオチドが、交互に隣接することにより配列番号１のＤＮＡの全配列をカバーする（図２）。図２は、所望のＤＮＡ断片のセンス鎖の全配列を示し、下線部はセンスオリゴヌクレオチドを示し、陰影部はアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な配列を示す。【００４８】
（２）オリゴヌクレオチドの設計及び調製その２
上記同様配列番号５４に記載の塩基配列を有するｐＵＣ１１８プラスミドＤＮＡ（図３）を合成するためのオリゴヌクレオチドの設計及び調製を行った。
配列番号５４の５’末端の１〜６０番目の塩基配列に相当する配列番号５５（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から４１〜１００番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号５６（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の８３〜１４２番目の塩基配列に相当する配列番号５７（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から１２５〜１８４番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号５８（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の１６３〜２２２番目の塩基配列に相当する配列番号５９（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から２０１〜２６０番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号６０（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の２４３〜３０２番目の塩基配列に相当する配列番号６１（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から２８５〜３４４番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号６２（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の３２７〜３８５番目の塩基配列に相当する配列番号６３（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から３６８〜４２７番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号６４（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の４０７〜４６６番目の塩基配列に相当する配列番号６５（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から４４９〜５０８番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号６６（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の４９０〜５４６番目の塩基配列に相当する配列番号６７（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から５２９〜５８８番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号６８（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の５７１〜６３０番目の塩基配列に相当する配列番号６９（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から６１２〜６７１番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号７０（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の６５１〜７０８番目の塩基配列に相当する配列番号７１（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から６８７〜７４６番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号７２（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の７２５〜７８４番目の塩基配列に相当する配列番号７３（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から７６５〜８２２番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号７４（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の８０１〜８６０番目の塩基配列に相当する配列番号７５（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から８３９〜８９８番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号７６（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の８７７〜９３６番目の塩基配列に相当する配列番号７７（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から９１５〜９７４番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号７８（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の９５３〜１０１０番目の塩基配列に相当する配列番号７９（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から９８９〜１０４６番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号８０（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の１０２９〜１０８８番目の塩基配列に相当する配列番号８１（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から１０７１〜１１３０番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号８２（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の１１１３〜１１７１番目の塩基配列に相当する配列番号８３（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から１１５４〜１２１３番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号８４（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の１１９２〜１２５１番目の塩基配列に相当する配列番号８５（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から１２３４〜１２９３番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号８６（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の１２７２〜１３３１番目の塩基配列に相当する配列番号８７（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から１３１０〜１３６９番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号８８（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の１３４８〜１４０６番目の塩基配列に相当する配列番号８９（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から１３８７〜１４４６番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号９０（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の１４２９〜１４８８番目の塩基配列に相当する配列番号９１（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から１４７１〜１５３０番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号９２（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の１５１０〜１５６９番目の塩基配列に相当する配列番号９３（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から１５４８〜１６０７番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号９４（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の１５８６〜１６４５番目の塩基配列に相当する配列番号９５（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から１６２８〜１６８７番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号９６（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の１６６６〜１７２５番目の塩基配列に相当する配列番号９７（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から１７０４〜１７６３番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号９８（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の１７４６〜１８０５番目の塩基配列に相当する配列番号９９（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から１７８８〜１８４７番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１００（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の１８２７〜１８８５番目の塩基配列に相当する配列番号１０１（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から１８６７〜１９２６番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１０２（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の１９０９〜１９６５番目の塩基配列に相当する配列番号１０３（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から１９４４〜２００３番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１０４（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の１９８４〜２０４３番目の塩基配列に相当する配列番号１０５（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から２０２２〜２０８１番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１０６（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の２０６３〜２１２２番目の塩基配列に相当する配列番号１０７（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から２１０５〜２１６４番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１０８（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の２１４５〜２２０４番目の塩基配列に相当する配列番号１０９（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から２１８６〜２２４５番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１１０（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の２２２４〜２２８３番目の塩基配列に相当する配列番号１１１（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から２２６２〜２３２１番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１１２（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の２３０１〜２３６０番目の塩基配列に相当する配列番号１１３（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から２３４３〜２４０１番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１１４（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の２３８０〜２４３９番目の塩基配列に相当する配列番号１１５（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から２４２１〜２４８０番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１１６（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の２４６３〜２５２２番目の塩基配列に相当する配列番号１１７「（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から２５０５〜２５６２番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１１８（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の２５４１〜２６００番目の塩基配列に相当する配列番号１１９（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から２５７９〜２６３８番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１２０（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の２６２０〜２６７９番目の塩基配列に相当する配列番号１２１（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から２６６１〜２７２０番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１２２（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の２７００〜２７５９番目の塩基配列に相当する配列番号１２３（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から２７４１〜２８００番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１２４（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の２７８１〜２８４０番目の塩基配列に相当する配列番号１２５（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から２８２２〜２８８１番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１２６（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の２８６４〜２９２３番目の塩基配列に相当する配列番号１２７（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から２９０６〜２９６３番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１２８（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の２９４６〜３００５番目の塩基配列に相当する配列番号１２９（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から２９８８〜３０４７番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１３０（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の３０２７〜３０８６番目の塩基配列に相当する配列番号１３１（センス鎖）、
配列番号５４の５’末端から３０６５〜３１２２番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１３２（アンチセンス鎖）、
配列番号５４の５’末端の３１０１〜３１６０番目の塩基配列に相当する配列番号１３３（センス鎖）、及び
配列番号５４の５’末端から３１４３〜３１６３番目の塩基配列と相補的な配列を有する配列番号１３４（アンチセンス鎖）
を設計し、それぞれ合成した（株式会社ファスマックに委託）。【００４９】
配列番号５４に示す所望のＤＮＡのセンス鎖に相当する配列を有する５７〜６０ｎｔのセンスオリゴヌクレオチドと、交互に隣接するアンチセンス鎖に相当する配列を有する２１〜６０ｎｔのアンチセンスオリゴヌクレオチドとは、１８〜２２ｎｔの相補的な配列を有する重複領域を有し、当該領域においてハイブリダイズして隣接し、これらオリゴヌクレオチドが、交互に隣接することにより配列番号５４のＤＮＡの全配列をカバーする（図４）。図４は、所望のＤＮＡ断片のセンス鎖の全配列を示し、下線部はセンスオリゴヌクレオチドを示し、陰影部はアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な配列を示す。【００５０】
（比較例１）
非特許文献３に記載の従来のＤＡ−ＰＣＲ法では、４つの連続したオリゴヌクレオチド毎に、外側の２つのオリゴヌクレオチドを内側のオリゴヌクレオチドの５倍モル過剰で一緒に混合し、９４℃２０秒、４５℃１５秒、７２℃３０秒の条件で、１段階でＤＡ−ＰＣＲを行っている。【００５１】
比較例１は、上記配列番号２〜１７の塩基配列を有する１６種類のオリゴヌクレオチドを用い、従来法に準じたＤＡ−ＰＣＲを実施した。【００５２】
すなわち、外側の２つのオリゴヌクレオチド（配列番号２及び配列番号１７）を内側のオリゴヌクレオチド（２ｐｍｏｌ）の５倍モル過剰（１０ｐｍｏｌ）とし、１６種類のオリゴヌクレオチドを一緒に混合した溶液７．６μｌに、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘを２５μｌ、超純水を最終容量５０μｌとなるように添加し、反応混合液を調製した。【００５３】
当該反応混合液を、従来法であれば、９４℃、４５℃、７２℃のＰＣＲプロフィールを繰り返すことになるが、この条件では連結がうまくいかないことは明白であるため、本発明に近い、９８℃、６５℃、７２℃と、変性温度及びアニーリングの温度を高めの条件で行った。すなわち、９８℃で５分、加温後、９８℃で１０秒間、６５℃で５秒間、７２℃で１０秒間のＰＣＲプロフィールを、２０サイクル繰り返し、さらに、７２℃で２分間反応させた。結果を図５のレーン１に示す。アニーリングの温度を高めても、当該従来法では１６断片を連結することはできなかった。【００５４】
（実施例１）
配列番号２〜１７の塩基配列を有する１６種類のオリゴヌクレオチドを等モルで混合した溶液（１００ｐｍｏｌ）１μｌに、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘを２５μｌ、超純水を最終容量５０μｌとなるように添加し、反応混合液を調製した。【００５５】
ステップ１として、９８℃で１０秒間、６５℃で５秒間、７２℃で５秒間のＰＣＲプロフィールを、１５サイクル繰り返した。【００５６】
上記ステップ１で得られた反応液１０μｌに、プライマーＦとして配列番号２のオリゴＤＮＡ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）を１μｌ、プライマーＲとして配列番号１７のオリゴＤＮＡ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）を１μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘを２５μｌ、超純水を最終容量５０μｌとなるように添加し、反応混合液を調製し、ステップ２として、９８℃で１分、加温後、９８℃で１０秒間、６５℃で５秒間、７２℃で１５秒間のＰＣＲプロフィールを、２０サイクル繰り返し、さらに、７２℃で２分間反応させた。【００５７】
結果を図５のレーン２に示す。目的とする位置にＤＮＡのバンドを検出することができた。ステップ１において、６５℃でのアニーリングを行わず、９８℃で６０秒間、７２℃で６０秒間のＰＣＲプロフィールを、１５サイクル繰り返しても同様に目的とする位置にバンドを検出することができた（図５のレーン３）。【００５８】
（実施例２）
配列番号５５〜７４（＃１−２０）の塩基配列を有する２０種類のオリゴヌクレオチドを等モル混合（１００ｐｍｏｌ）した溶液１μｌに、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘを２５μｌ、超純水を最終容量５０μｌとなるように添加し、反応混合液を調製した。同様に、配列番号７５〜９４（＃２１−４０）の塩基配列を有する２０種類のオリゴヌクレオチドを等モル混合（１００ｐｍｏｌ）した溶液、配列番号９５〜１１４（＃４１−６０）の塩基配列を有する２０種類のオリゴヌクレオチドを等モル混合（１００ｐｍｏｌ）した溶液、配列番号１１５〜１３４（＃６１−８０）の塩基配列を有する２０種類のオリゴヌクレオチドを等モル混合（１００ｐｍｏｌ）した溶液、配列番号５５〜９４（＃１−４０）の塩基配列を有する４０種類のオリゴヌクレオチドを等モル混合（１００ｐｍｏｌ）した溶液、及び配列番号９５〜１３４（＃４１−８０）の塩基配列を有する４０種類のオリゴヌクレオチドを等モル混合（１００ｐｍｏｌ）した溶液それぞれ１μｌに、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘを２５μｌ、超純水を最終容量５０μｌとなるように添加し、計６種類の反応混合液を調製した。【００５９】
これら調製した反応混合液を用いて、ステップ１として、９８℃で１０秒間、５０〜６５℃で５秒間、７２℃で１０秒間のＰＣＲプロフィールを、１５サイクル繰り返した。【００６０】
上記ステップ１で得られた反応液１０μｌに、上記ステップ１でオリゴヌクレオチドが連結した場合に想定される両末端の塩基配列に相当し、ＰＣＲにより上記連結したオリゴヌクレオチドの混合体を増幅することのできるプライマーセットである、プライマーＦ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）とプライマーＲ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）をそれぞれ１μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘを２５μｌ、超純水を最終容量５０μｌとなるように調製し、ステップ２として、９８℃で１分、加温後、９８℃で１０秒間、５０〜６５℃で５秒間、７２℃で３０秒間のＰＣＲプロフィールを、２０サイクル繰り返し、さらに、７２℃で２分間反応させた。結果をＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いたキャピラリー電気泳動によって確認した。【００６１】
ステップ２のＰＣＲにおいて、例えばステップ１のアニーリング温度が５０℃の時は、ステップ２のアニーリング温度も５０℃とし、アニーリング温度を合わせた。アニーリングを５０〜６５℃の範囲の異なる条件で行ったが、５０℃で行った時の結果を図６に示す。２０断片のオリゴヌクレオチド混合反応液においては明確に目的とする位置にバンドを検出することができた（レーン＃１−２０、＃２１−４０、＃４１−６０及び＃６１−８０）。また、４０断片においても薄かったものの、目的とする位置にバンドを検出することができた（レーン＃１−４０、＃４１−８０）。得られたＤＮＡ断片を下記方法により精製し、ＯＥ−ＰＣＲを行った。【００６２】
上記で得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片＃１−２０、＃２１−４０、＃４１−６０、＃６１−８０、＃１−４０及び＃４１−８０を、市販の精製システム、Ｗｉｚａｒｄ（商標登録）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Μｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製，製品番号Ａ９２８０）を用い、添付のカタログに従って処理し、精製した。【００６３】
精製したＤＮＡ断片＃１−２０及び＃２１−４０を同じ量混合し、鋳型ＤＮＡ１を調製した。同様に、ＤＮＡ断片＃４１−６０及び＃６１−８０で鋳型ＤＮＡ２を、ＤＮＡ断片＃１−４０及び＃４１−８０で鋳型ＤＮＡ３を調製した。【００６４】
ＤＮＡ断片＃１−２０及び＃２１−４０を連結するための鋳型ＤＮＡ１においては、プライマーＦとして配列番号５５のオリゴヌクレオチドを、プライマーＲとして配列番号９４のオリゴヌクレオチドを用いた。【００６５】
ＤＮＡ断片＃４１−６０及び＃６１−８０を連結するための鋳型ＤＮＡ２においては、プライマーＦとして配列番号９５のオリゴヌクレオチドを、プライマーＲとして配列番号１３４のオリゴヌクレオチドを用いた。【００６６】
ＤＮＡ断片＃１−４０及び＃４１−８０を連結するための鋳型ＤＮＡ３においては、プライマーＦとして配列番号５５のオリゴヌクレオチドを、プライマーＲとして配列番号１３４のオリゴヌクレオチドを用いた。【００６７】
鋳型ＤＮＡ１と鋳型ＤＮＡ２は２μｌ、鋳型ＤＮＡ３は４μｌ用い、１０ｐｍｏｌ／μｌに調整したそれぞれのプライマーＦ及びプライマーＲを１μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘを２５μｌ、超純水を最終容量５０μｌとなるように添加し、反応混合液を調製した。【００６８】
調製した反応混合液を、９８℃で６０秒間、加温後、９８℃で１０秒間、６５℃で５秒間、７２℃で３０秒間のＰＣＲプロフィールを、２０サイクル繰り返し、さらに、７２℃で２分間反応させた。結果をＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いたキャピラリー電気泳動によって確認したものを図７に示す。いずれの鋳型ＤＮＡにおいても、ＤＮＡ断片は目的通りに連結された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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