(57)【要約】本発明は、投与対象において骨成長障害を生じない、小児骨粗鬆症を治療及び／又は予防するための医薬を提供することを目的とする。  Ｓｉｇｌｅｃ−１５に結合し、かつ破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する活性を有する抗体又はその機能性断片を含む、小児骨粗鬆症を治療及び／又は予防するための医薬組成物。
2019004487.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｉｇｌｅｃ−１５に結合し、かつ破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する活性を有する抗体又はその機能性断片を含む、小児骨粗鬆症を治療及び／又は予防するための医薬組成物。
【請求項２】
成長障害、骨構造異常及び／又は骨質異常を生じない、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
小児骨粗鬆症が、薬剤投与により発症する小児骨粗鬆症である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
小児骨粗鬆症が、小児ステロイド性骨粗鬆症である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗体が、配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列表の配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列表の配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列表の配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記抗体の機能性断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、又はｓｃＦｖである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小児骨粗鬆症を治療及び／又は予防するための抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症は骨量減少や骨質異常によって骨の強度が低下し、易骨折性を示す疾患であり、主に閉経後女性や高齢者に発生する。しかし、薬剤や疾患により成長期の小児にも骨粗鬆症が発生することがある。【０００３】
小児骨粗鬆症の発症例として最も頻度が高いのは、ステロイド薬や免疫抑制剤等の薬剤投与によるものである。ネフローゼ症候群をはじめとする炎症性疾患の治療において、これらの薬剤を投与された小児患者にて多数の発症例が報告されている。特に、ステロイド大量投与療法を受けた小児患者においては、著しい骨脆弱性が生じ、骨痛や脊椎多発骨折をきたすことがある。ステロイド薬の投与により起こる骨粗鬆症をステロイド性骨粗鬆症（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ：ＧＩＯ）という。【０００４】
この他、小児骨粗鬆症の原因としては、骨形成不全症（指定難病であり、発生頻度は２〜３万人に１人）等の先天性疾患によるものが挙げられる。この場合、繰り返す骨折や骨変形による運動発達遅延をきたすことがある。【０００５】
小児骨粗鬆症により、脊椎の圧迫骨折や四肢骨の骨折が多発すれば、骨格が変形し、その後、一生涯にわたり運動や体幹支持機能の障害が遺残する場合がある。また、徴小骨折を繰り返すことにより、慢性的な骨痛に悩まされることもある。【０００６】
現在、骨粗鬆症患者に対しては、骨吸収抑制剤を含む治療薬の投与が施されている。また、骨形成不全症患者に対してビスフォスフォネート製剤（骨吸収抑制剤）を投与することにより骨密度や骨痛等の改善が確認されており、小児ではビスフォスフォネート製剤としてパミドロネートの周期的静脈内投与が行われ、２０１４年から日本において保険適用となっている。【０００７】
しかしながら、ビスフォスフォネート製剤をはじめとする強力な骨吸収抑制剤を用いた治療には、成長障害や腎障害、長期内服に伴う骨質異常や尿管結石等の発症リスクがある。したがって、このような製剤を成長期の小児に使用することについては、成長障害や骨構造・骨質異常等の発生が危惧される。現時点において、小児骨粗鬆症患者に対して、安全に使用できる骨吸収抑制剤は存在しないといえる。【０００８】
シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉａｌｉｃ−ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｌｅｃｔｉｎ、以下、「Ｓｉｇｌｅｃ」という。）は、シアル酸含有糖鎖を認識して結合するＩ型膜タンパク質ファミリーである。当該ファミリーに属するＳｉｇｌｅｃ−１５は、魚類からヒトまで進化的な保存度が高く、ヒト脾臓及びリンパ節において、樹状細胞／マクロファージ系の細胞に強く発現することが確認されている。また、Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、破骨細胞の分化、成熟に伴って発現が亢進し、ＲＮＡ干渉を用いて発現を低下させると破骨細胞の分化が抑制されることが確認されている（特許文献１）。さらに、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が破骨細胞の形成や破骨細胞による骨吸収を抑制することができ、骨代謝異常疾患の治療剤及び／又は予防剤として利用し得ることが報告されている（特許文献２）。【０００９】
しかしながら、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の小児骨粗鬆症におよぼす作用・効果については、これまで明らかにされていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０９３０４２
【特許文献２】ＷＯ２００９／０４８０７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、小児骨粗鬆患者に投与したとしても、投与対象において成長障害を生じることなく、小児骨粗鬆症を治療及び／又は予防することができる医薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に結合する抗体の投与により、投与対象において骨成長の障害を生じることなく、骨量や骨密度の改善をもたらすことから、骨成長の著しい成長期の小児における骨粗鬆症の治療薬及び予防薬としてＳｉｇｌｅｃ−１５に結合する抗体が有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
［１］  Ｓｉｇｌｅｃ−１５に結合し、かつ破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する活性を有する抗体又はその機能性断片を含む、小児骨粗鬆症を治療及び／又は予防するための医薬組成物。
［２］  前記抗体が、モノクローナル抗体である、［１］の医薬組成物。
［３］  前記抗体が、配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列表の配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列表の配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列表の配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖からなる、［１］の医薬組成物。
［４］  前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である、［１］〜［３］のいずれかの医薬組成物。
［５］  前記抗体の機能性断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、又はｓｃＦｖである、［１］〜［４］のいずれかの医薬組成物。
［６］  ［１］〜［５］のいずれかの医薬組成物を投与することを含む、小児骨粗鬆症の治療及び／又は予防方法。
また、本発明は、以下の発明をも包含する。
［１］  Ｓｉｇｌｅｃ−１５に結合し、かつ破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する活性を有する抗体又はその機能性断片を含む、小児骨粗鬆症を治療及び／又は予防するための医薬組成物。
［２］  成長障害、骨構造異常及び／又は骨質異常を生じない、［１］の医薬組成物。
［３］  小児骨粗鬆症が、薬剤投与により発症する小児骨粗鬆症である、［１］又は［２］の医薬組成物。
［４］  小児骨粗鬆症が、小児ステロイド性骨粗鬆症である、［１］又は［２］の医薬組成物。
［５］  前記抗体が、モノクローナル抗体である、［１］〜［４］のいずれかの医薬組成物。
［６］  前記抗体が、配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列表の配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列表の配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列表の配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列表の配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖からなる、［１］〜［４］のいずれかの医薬組成物。
［７］  前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である、［１］〜［６］のいずれかの医薬組成物。
［８］  前記抗体の機能性断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、又はｓｃＦｖである、［１］〜［７］のいずれかの医薬組成物。
［９］  ［１］〜［８］のいずれかの医薬組成物を投与することを含む、小児骨粗鬆症の治療及び／又は予防方法。
［１０］  小児骨粗鬆症を治療及び／又は予防するための医薬組成物の製造における、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に結合し、かつ破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する活性を有する抗体又はその機能性断片の使用。
［１１］  小児骨粗鬆症の治療及び／又は予防方法において使用される、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に結合し、かつ破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する活性を有する抗体又はその機能性断片。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１７−１２９１２９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、小児骨粗鬆患者に投与したとしても、投与対象において成長障害を生じることなく、小児骨粗鬆症を治療及び／又は予防することができる医薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、実験における各種操作の実施スケジュールを示す。
【図２】図２は、コントロール群（Ｃｔｌ）、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体投与群（Ｓｉｇ−１５  Ａｂ）、ビスフォスフォネート投与群（ＡＬＮ）について、投与観察期間にわたって縦断的に頭胴長、大腿骨長を計測した結果を示すグラフ図である。（Ａ）投与観察期間の終了時における各動物の頭胴長及び大腿骨長の測定結果を示す。（Ｂ）投与観察期間（６〜１２週齢）にわたる各動物の頭胴長及び大腿骨長の変化量を示す。＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ．Ｃｔｌ）。
【図３】図３は、コントロール群（Ｃｔｌ）、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体投与群（Ｓｉｇ−１５  Ａｂ）、ビスフォスフォネート投与群（ＡＬＮ）について、投与の開始前と投与６週間後（１２週齢の時点）に採血された血液サンプル中の骨形成マーカー（血清オステオカルシン）と骨吸収マーカー（血清ＴＲＡＣＰ−５ｂ）の測定結果を示すグラフ図である。（Ａ）投与観察期間の終了時（１２週齢の時点）における各動物の血清オステオカルシン量及び血清ＴＲＡＣＰ−５ｂ量の測定結果を示す。（Ｂ）投与観察期間（６〜１２週齢）にわたる各動物の血清オステオカルシン量及び血清ＴＲＡＣＰ−５ｂ量の変化量を示す。＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ．Ｃｔｌ）。
【図４−１】図４−１は、コントロール群（Ｃｔｌ）、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体投与群（Ｓｉｇ−１５  Ａｂ）、ビスフォスフォネート投与群（ＡＬＮ）について、薬剤による成長への影響を組織学的に分析した結果を示す。（Ａ）１２週齢の時点の脛骨近位部の３Ｄ−ＣＴ画像の冠状断面写真を示す。（Ｂ）安楽死７日前及び３日前にカルセインでラベリングして得られた脛骨近位部組織より作製された非脱灰組織標本におけるＶｉｌｌａｎｕｅｖａ染色の結果を示す。矢印（上側）が当該３日前にラベリングされた領域であり、矢印（下側）が当該７日前にラベリングされた領域をそれぞれ示す。（Ｃ）１２週齢の時点の成長軟骨及び成長軟骨直下の一次海綿骨領域の組織標本におけるサフラニンＯ染色（酸性ムコ多糖類を染色）の結果を示す。
【図４−２】図４−２は、コントロール群（Ｃｔｌ）、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体投与群（Ｓｉｇ−１５  Ａｂ）、ビスフォスフォネート投与群（ＡＬＮ）について、薬剤による成長への影響を組織学的に分析した結果を示す。（Ｄ）１２週齢の時点の脛骨近位部一次海綿骨領域の組織標本におけるＴＲＡＣＰ染色及びメチルグリーン染色の結果を示す。（Ｅ）非脱灰組織標本を用いて計測された骨成長速度及び成長軟骨幅、ならびに（Ｆ）一次海綿骨領域の骨表面に対する破骨細胞面（Ｏｃ．Ｐｍ／Ｂ．Ｐｍ（％））の測定結果を示す。＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ．Ｃｔｌ）。
【図５−１】図５−１は、コントロール群（Ｃｔｌ）、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体投与群（Ｓｉｇ−１５  Ａｂ）、ビスフォスフォネート投与群（ＡＬＮ）について、薬剤による骨量及び力学的強度への影響を、腰椎を用いて分析した結果を示す。（Ａ）１２週齢の時点の第５腰椎の３Ｄ−ＣＴ画像の冠状断面写真を示す。（Ｂ）１２週齢の時点の第５腰椎の一次及び二次海綿骨領域、椎体腹側の組織標本におけるＴＲＡＣＰ染色及びメチルグリーン染色の結果を示す。
【図５−２】図５−２は、コントロール群（Ｃｔｌ）、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体投与群（Ｓｉｇ−１５  Ａｂ）、ビスフォスフォネート投与群（ＡＬＮ）について、薬剤による骨量及び力学的強度への影響を、腰椎を用いて分析した結果を示す。（Ｃ）１２週齢の時点の第１〜第３腰椎のＤＸＡ法を用いた骨密度の測定結果を示す。（Ｄ）１２週齢の時点の第５腰椎の一次海綿骨領域及び二次海綿骨領域における骨表面に対する破骨細胞面（Ｏｃ．Ｐｍ／Ｂ．Ｐｍ（％））の測定結果を示す。（Ｅ）１２週齢の時点の腰椎椎体の圧縮力学試験の結果（最大破断強度、剛性、靱性）を示す（第２，３，４，６椎体の平均値）。＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ．Ｃｔｌ）。
【図６−１】図６−１は、コントロール群（Ｃｔｌ）、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体投与群（Ｓｉｇ−１５  Ａｂ）、ビスフォスフォネート投与群（ＡＬＮ）について、薬剤による骨量及び力学的強度への影響を、長管骨を用いて分析した結果を示す。（Ａ−１）１２週齢の時点の大腿骨遠位部の３Ｄ−ＣＴ画像の冠状断面写真を示す。（Ａ−２）１２週齢の時点の同部位のＤＸＡ法を用いた骨密度の測定結果を示す。（Ｂ−１）１２週齢の時点の脛骨近位部の二次海綿骨領域の組織標本におけるＴＲＡＣＰ染色及びメチルグリーン染色の結果を示す。（Ｂ−２）１２週齢の時点の同部位の骨表面に対する破骨細胞面（Ｏｃ．Ｐｍ／Ｂ．Ｐｍ（％））の測定結果を示す。
【図６−２】図６−２は、コントロール群（Ｃｔｌ）、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体投与群（Ｓｉｇ−１５  Ａｂ）、ビスフォスフォネート投与群（ＡＬＮ）について、薬剤による骨量及び力学的強度への影響を、長管骨を用いて分析した結果を示す。（Ｃ）１２週齢の時点の大腿骨遠位骨幹端部の圧縮力学試験の結果（最大破断強度、剛性、靱性）を示す（第２，３，４，６椎体の平均値）。＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ．Ｃｔｌ）。
【図７】図７は、実験における各種操作の実施スケジュールを示す。
【図８】図８は、Ｓｈａｍ群、ＧＣ群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、ＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５Ａｂ群（抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を低用量（ｌｏｗ）又は高用量（ｈｉｇｈ）にて投与）、ＧＣ＋ＡＬＮ群（ＡＬＮを低用量（ｌｏｗ）又は高用量（ｈｉｇｈ））にて投与）について、投与観察期間にわたって縦断的に体重、頭胴長、大腿骨長を計測した結果を示すグラフ図である。（Ａ）投与観察期間及び終了時における各動物の（ｉ）体重、（ｉｉ）頭胴長及び（ｉｉｉ）大腿骨長の測定結果を示す。（Ｂ）投与観察期間（６〜１２週齢）にわたる各動物の（ｉ）体重、（ｉｉ）頭胴長及び（ｉｉｉ）大腿骨長の変化量を示す。＃；ｐ＜０．０５（ｖｓ．ｓｈａｍ群）。
【図９】図９は、Ｓｈａｍ群、ＧＣ群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、ＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５Ａｂ群（抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を低用量（ｌｏｗ）又は高用量（ｈｉｇｈ）にて投与）、ＧＣ＋ＡＬＮ群（ＡＬＮを低用量（ｌｏｗ）又は高用量（ｈｉｇｈ））にて投与）について、投与の開始前と投与６週間後（１２週齢の時点）に採血された血液サンプル中の骨吸収マーカー（血清ＴＲＡＣＰ−５ｂ）と骨形成マーカー（血清オステオカルシン）の測定結果を示すグラフ図である。（Ａ）投与観察期間の終了時（１２週齢の時点）における各動物の血清ＴＲＡＣＰ−５ｂ量及び血清オステオカルシン量の測定結果を示す。（Ｂ）投与観察期間（６〜１２週齢）にわたる各動物の血清ＴＲＡＣＰ−５ｂ量及び血清オステオカルシン量の変化量を投与開始時（６週齢）からの変化率として示す。＃；ｐ＜０．０５（ｖｓ．Ｓｈａｍ群）、＊；ｐ＜０．０５（ｖｓ．ＧＣ群）。
【図１０−１】図１０−１はＳｈａｍ群、ＧＣ群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、ＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５Ａｂ群（抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を低用量（ｌｏｗ）又は高用量（ｈｉｇｈ）にて投与）、ＧＣ＋ＡＬＮ群（ＡＬＮを低用量（ｌｏｗ）又は高用量（ｈｉｇｈ））にて投与）について、薬剤による成長への影響を組織学的に分析した結果を示す。（Ａ）１２週齢の時点の脛骨近位部の３Ｄ−ＣＴ画像の冠状断面写真を示す。（Ｂ）安楽死５日前にテトラサイクリン及び２日前にカルセインでラベリングして得られた脛骨近位部組織より作製された非脱灰組織標本におけるＶｉｌｌａｎｕｅｖａ染色の結果を示す。矢印（上側）が当該２日前にラベリングされた領域であり、矢頭（下側）が当該５日前にラベリングされた領域をそれぞれ示す。（Ｃ）１２週齢の時点の成長軟骨及び成長軟骨直下の一次海綿骨領域の組織標本におけるサフラニンＯ色（酸性ムコ多糖類を染色）の結果を示す。
【図１０−２】図１０−２はＳｈａｍ群、ＧＣ群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、ＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５Ａｂ群（抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を低用量（ｌｏｗ）又は高用量（ｈｉｇｈ）にて投与）、ＧＣ＋ＡＬＮ群（ＡＬＮを低用量（ｌｏｗ）又は高用量（ｈｉｇｈ））にて投与）について、薬剤による成長への影響を組織学的に分析した結果を示す。（Ｄ）１２週齢の時点の脛骨近位部一次海綿骨領域の組織標本におけるＴＲＡＣＰ染色及びメチルグリーン染色の結果を示す。非脱灰組織標本を用いて計測された（Ｅ）成長軟骨幅、（Ｆ）骨成長速度、ならびに（Ｇ）一次海綿骨領域の骨表面に対する破骨細胞面（Ｏｃ．Ｐｍ／Ｂ．Ｐｍ（％））の測定結果を示す。＃；ｐ＜０．０５（ｖｓ．Ｓｈａｍ群）、＊；ｐ＜０．０５（ｖｓ．ＧＣ群）。
【図１１−１】図１１−１は、Ｓｈａｍ群、ＧＣ群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、ＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５Ａｂ群（抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を低用量（ｌｏｗ）又は高用量（ｈｉｇｈ）にて投与）、ＧＣ＋ＡＬＮ群（ＡＬＮを低用量（ｌｏｗ）又は高用量（ｈｉｇｈ））にて投与）について、薬剤による骨量及び力学的強度への影響を、長管骨を用いて分析した結果を示す。（Ａ）１２週齢の時点の大腿骨遠位部の３Ｄ−ＣＴ画像の冠状断面写真を示す。四角で囲った領域は、二次海綿骨領域を示す。（Ｂ）１２週齢の時点の前記二次海綿骨領域の骨量ＢＶ／ＴＶ（％）、骨梁幅Ｔｂ．Ｔｈ（μｍ）、及び骨梁数Ｔｂ．Ｎ（Ｎ／ｍｍ）の測定結果を示す。（Ｃ）ＤＸＡ法を用いた大腿骨遠位部の骨密度ＢＭＤの測定結果を示す。＃；ｐ＜０．０５（ｖｓ．Ｓｈａｍ群）、＊；ｐ＜０．０５（ｖｓ．ＧＣ群）。
【図１１−２】図１１−２は、Ｓｈａｍ群、ＧＣ群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、ＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５Ａｂ群（抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を低用量（ｌｏｗ）又は高用量（ｈｉｇｈ）にて投与）、ＧＣ＋ＡＬＮ群（ＡＬＮを低用量（ｌｏｗ）又は高用量（ｈｉｇｈ））にて投与）について、（Ｄ）１２週齢の時点の大腿骨遠位骨幹端部の圧縮力学試験の結果（最大破断強度、剛性、弾性率、靱性）を示す。＃；ｐ＜０．０５（ｖｓ．Ｓｈａｍ群）、＊；ｐ＜０．０５（ｖｓ．ＧＣ群）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書中において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡも含まれるものとする。
【００１６】
本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれている。
【００１７】
本明細中においては、「ポリペプチド」と「タンパク質」は区別せずに用いている。
【００１８】
本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。
【００１９】
本明細書中において、「Ｓｉｇｌｅｃ−１５」は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５タンパク質と同じ意味で用いている。
【００２０】
本明細書中において、「破骨細胞の形成」は、「破骨細胞の分化」又は「破骨細胞の成熟」と同じ意味で用いている。
【００２１】
本明細書中における「抗体の機能性断片」とは、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ等を含む。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の機能性断片に含まれる。但し、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。また、これらの機能性断片には、抗体タンパク質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生されたタンパク質も含まれる。
【００２２】
本明細書における、「エピトープ」とは、特定の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の結合するＳｉｇｌｅｃ−１５の部分ペプチドを意味する。前記のＳｉｇｌｅｃ−１５の部分ペプチドであるエピトープは、免疫アッセイ法等当業者によく知られている方法によって決定することができるが、例えば以下の方法によって行うことが出来る。Ｓｉｇｌｅｃ−１５の様々な部分構造を作製する。部分構造の作製にあたっては、公知のオリゴペプチド合成技術を用いることが出来る。例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−１５のＣ末端あるいはＮ末端から適当な長さで順次短くした一連のポリペプチドを当業者に周知の遺伝子組み換え技術を用いて作製した後、それらに対する抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定した後に、さらに短いペプチドを合成してそれらのペプチドとの反応性を検討することによって、エピトープを決定することが出来る。第一の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の結合する部分ペプチドに第二の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が結合すれば、第一の抗体と第二の抗体が共通のエピトープを有すると判定することができる。また、第一の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体のＳｉｇｌｅｃ−１５に対する結合に対して第二の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が競合する（すなわち、第二の抗体が第一の抗体とＳｉｇｌｅｃ−１５の結合を妨げる）ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列が決定されていなくても、第一の抗体と第二の抗体が共通のエピトープを有すると判定することができる。さらに、第一の抗体と第二抗体が共通のエピトープに結合し、かつ第一の抗体が抗原の中和活性等の特殊な効果を有する場合、第二の抗体も同様な活性を有することが期待できる。
【００２３】
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ．）中、６８℃でハイブリダイズすること、又は、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
【００２４】
１．Ｓｉｇｌｅｃ−１５
Ｓｉｇｌｅｃ−１５遺伝子は巨細胞腫（Ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒ；ＧＣＴ）において有意に発現量が増加していることが確認された遺伝子であり、また、単球由来細胞株が破骨細胞に分化する際に発現量が増加することが確認されている遺伝子である（ＷＯ２００９／０４８０７２）。
【００２５】
本発明で用いるＳｉｇｌｅｃ−１５は、ヒト、非ヒト哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）あるいはニワトリの単球細胞あるいは骨髄細胞から直接精製して使用するか、あるいは上記の細胞の細胞膜画分を調製して使用することができ、また、Ｓｉｇｌｅｃ−１５をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体的には、Ｓｉｇｌｅｃ−１５  ｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってＳｉｇｌｅｃ−１５を発現させることにより、該タンパク質を得ることができる。
【００２６】
ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＮＭ＿２１３６０２で登録され、配列表の配列番号１にも示されており、そのアミノ酸配列は配列表の配列番号２に示されている。マウスＳｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＸＭ＿８８４６３６で登録され、配列表の配列番号３にも示されており、そのアミノ酸配列は配列表の配列番号４に示されている。シグナル配列が除かれた成熟ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の２１番目から３２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する。また、シグナル配列が除かれたマウスＳｉｇｌｅｃ−１５は、配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１番目から３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する。なお、Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、ＣＤ３３  ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｉｋｅ  ３、ＣＤ３３  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｌｉｋｅ  ３、ＣＤ３３−ｌｉｋｅ  ３又はＣＤ３３Ｌ３と呼ばれることがあり、これらは全て同じ分子を示している。
【００２７】
Ｓｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡは例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡを発現しているｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｓｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８８）２３９，４８７−４９）を行なう、いわゆるＰＣＲ法により取得することができる。
【００２８】
なお、配列表の配列番号１及び３から選択される少なくともいずれか一つに示されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と同等の生物活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもＳｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡに含まれる。さらに、ヒト若しくはマウスＳｉｇｌｅｃ−１５遺伝子座から転写されるスプライシングバリアント又はこれにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と同等の生物活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもＳｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡに含まれる。
【００２９】
また、配列表の配列番号２及び４から選択される少なくともいずれか一つに示されるアミノ酸配列、又はこれらの配列からシグナル配列が除かれたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と同等の生物活性を有するタンパク質もＳｉｇｌｅｃ−１５に含まれる。さらに、ヒト若しくはＳｉｇｌｅｃ−１５遺伝子座から転写されるスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と同等の生物活性を有するタンパク質もＳｉｇｌｅｃ−１５に含まれる。
【００３０】
２．抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の製造
本発明のＳｉｇｌｅｃ−１５に対する抗体は、常法を用いて、Ｓｉｇｌｅｃ−１５又はＳｉｇｌｅｃ−１５のアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗原となるＳｉｇｌｅｃ−１５の生物種はヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来するＳｉｇｌｅｃ−１５を動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種Ｓｉｇｌｅｃ−１５に結合する抗体とヒトＳｉｇｌｅｃ−１５との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。
【００３１】
また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  （１９７５）２５６，ｐ．４９５−４９７、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｐ．３６５−３６７，Ｐｒｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
【００３２】
抗原となるＳｉｇｌｅｃ−１５はＳｉｇｌｅｃ−１５遺伝子を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。
【００３３】
具体的には、Ｓｉｇｌｅｃ−１５遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現したＳｉｇｌｅｃ−１５を精製すればよい。以下、具体的にＳｉｇｌｅｃ−１５に対する抗体の取得方法を説明する。なお、以下において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）第４版」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓより２０１２年に発刊）に記載の方法に準拠して行うことができる。
【００３４】
（１）  抗原の調製
抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を作製するための抗原としては、Ｓｉｇｌｅｃ−１５又はその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。このような抗原としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｉ）に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択することができる；
（ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の２１番目から３２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１番目から２６０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｄ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の２１番目から２６０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｅ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列；
（ｆ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１番目から３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｇ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列の１番目から２５８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｈ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１番目から２５８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）に記載のアミノ酸配列に１〜数アミノ酸残基の置換、欠失又は付加を伴うアミノ酸配列。
【００３５】
また、抗原として、以下の（ｊ）〜（ｎ）に示すヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドを利用することができる；
（ｊ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列；
（ｋ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列；
（ｌ）配列番号５に示されるヌクレオチド配列；
（ｍ）配列番号６に示されるヌクレオチド配列；
（ｎ）（ｊ）〜（ｍ）に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列。
【００３６】
なお、配列表の配列番号２に記載アミノ酸配列の１番目から２０番目のアミノ酸残基からなるポリペプチドはヒトＳｉｇｌｅｃ−１５のシグナルペプチドに相当し、２１番目から２６０番目のアミノ酸残基からなるポリペプチドはヒトＳｉｇｌｅｃ−１５の成熟タンパク質の細胞外領域に相当する。また、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列の１番目から２０番目のアミノ酸残基からなるポリペプチドはマウスＳｉｇｌｅｃ−１５のシグナルペプチドに相当し、２１番目から２５８番目のアミノ酸残基からなるポリペプチドはマウスＳｉｇｌｅｃ−１５の成熟タンパク質の細胞外領域に相当する。さらに、配列番号６に示されるヌクレオチド配列は配列番号１に示されるヌクレオチド配列にコードされるヒトＳｉｇｌｅｃ−１５の細胞外領域をコードしており、配列番号５に示されるヌクレオチド配列は配列番号３に示されるヌクレオチド配列にコードされるマウスＳｉｇｌｅｃ−１５の細胞外領域をコードしている。
【００３７】
Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、ヒトの腫瘍組織あるいは腫瘍細胞から直接精製して使用することができ、また、Ｓｉｇｌｅｃ−１５をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。
【００３８】
遺伝子操作では、具体的には、Ｓｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってＳｉｇｌｅｃ−１５を発現させることにより、抗原を得ることが出来る。
【００３９】
また、膜タンパク質であるＳｉｇｌｅｃ−１５の細胞外領域と抗体の定常領域とを連結した融合タンパク質を適切な宿主・ベクター系において発現させることによって、分泌タンパク質として抗原を得ることも可能である。
【００４０】
Ｓｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡは例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡを発現しているｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｓｉｇｌｅｃ−１５  ｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，ｐ．４８７−４８９）を行なう、いわゆるＰＣＲ法により取得することができる。
【００４１】
ポリペプチドのイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）合成としては、例えばロシュ・ダイアグノスティックス社製のラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）を挙げることができるが、これに限定されない。
【００４２】
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などを挙げることができる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
【００４３】
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５−１８２、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，ｐ．４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【００４４】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、又は細胞外に目的のポリペプチドが産生される。
【００４５】
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、大腸菌であれば、例えば、ＬＢ培地に必要に応じて、アンピシリン等の抗生物質やＩＰＭＧを添加して用いることができる。
【００４６】
上記培養により、形質転換体の細胞内又は細胞外に産生される組換えタンパク質は、該タンパク質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。
【００４７】
該方法としては、具体的には例えば、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。
【００４８】
また、発現させる組換えタンパク質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。あるいは、発現させる組換えタンパク質にＩｇＧのＦｃ領域を繋げることにより、プロテインＡカラムで効率的に精製することができる。上記方法を組合せることにより容易に高収率、高純度で目的とするポリペプチドを大量に製造できる。
【００４９】
（２）  抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体の製造
Ｓｉｇｌｅｃ−１５と特異的に結合する抗体の例として、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と特異的に結合するモノクローナル抗体を挙げることができるが、その取得方法は、以下に記載する通りである。
【００５０】
モノクローナル抗体の製造にあたっては、一般に下記のような作業工程が必要である。すなわち、
（ａ）抗原として使用する生体高分子の精製、
（ｂ）抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、
（ｃ）骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）の調製、
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、
（ｇ）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育、
（ｈ）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、及びその結合特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定、等である。
【００５１】
以下、モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞及びミエローマを使用することもできる。
【００５２】
（ａ）抗原の精製
抗原としては、前記したような方法で調製したＳｉｇｌｅｃ−１５又はその一部を使用することができる。
【００５３】
また、Ｓｉｇｌｅｃ−１５発現組換え体細胞より調製した膜画分、又はＳｉｇｌｅｃ−１５発現組換え体細胞自身、さらに、当業者に周知の方法を用いて、化学合成した本発明のタンパク質の部分ペプチドを抗原として使用することもできる。
【００５４】
（ｂ）抗体産生細胞の調製
工程（ａ）で得られた抗原と、フロインドの完全又は不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物は公知のハイブリドーマ作製法に用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウス又はラットを被免疫動物とするのが好ましい。
【００５５】
また、実際に使用するマウス及びラットの系統は特に制限はなく、マウスの場合には、たとえば各系統Ａ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＤＰ、ＢＡ、ＣＥ、Ｃ３Ｈ、５７ＢＬ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７Ｌ、ＤＢＡ、ＦＬ、ＨＴＨ、ＨＴ１、ＬＰ、ＮＺＢ、ＮＺＷ、ＲＦ、Ｒ  ＩＩＩ、ＳＪＬ、ＳＷＲ、ＷＢ、１２９等が、またラットの場合には、たとえば、Ｗｉｓｔａｒ、Ｌｏｗ、Ｌｅｗｉｓ、Ｓｐｒａｑｕｅ、Ｄａｗｅｌｅｙ、ＡＣＩ、ＢＮ、Ｆｉｓｃｈｅｒ等を用いることができる。
【００５６】
これらのマウス及びラットは例えば日本クレア、日本チャ−ルスリバー等の実験動物飼育販売業者より入手することができる。
【００５７】
このうち、後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスではＢＡＬＢ／ｃ系統が、ラットではＷｉｓｔａｒ及びＬｏｗ系統が被免疫動物として特に好ましい。
【００５８】
また、抗原のヒトとマウスでの相同性を考慮し、自己抗体を除去する生体機構を低下させたマウス、すなわち自己免疫疾患マウスを用いることも好ましい。
【００５９】
なお、これらマウス又はラットの免疫時の週齢は、好ましくは５〜１２週齢、さらに好ましくは６〜８週齢である。
【００６０】
Ｓｉｇｌｅｃ−１５又はこの組換え体によって動物を免疫するには、例えば、Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．Ｉ．ＩＩ．ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．  ａｎｄ  Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｃ  Ｔｈｏｍａｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ  Ｓｐｉｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４）等に詳しく記載されている公知の方法を用いることができる。
【００６１】
これらの免疫法のうち、本発明において好適な方法を具体的に示せば、たとえば以下のとおりである。
【００６２】
すなわち、まず、抗原である膜タンパク質画分、もしくは抗原を発現させた細胞を動物の皮内又は腹腔内に投与する。
【００６３】
ただし、免疫効率を高めるためには両者の併用が好ましく、前半は皮内投与を行い、後半又は最終回のみ腹腔内投与を行うと、特に免疫効率を高めることができる。
【００６４】
抗原の投与スケジュールは、被免疫動物の種類、個体差等により異なるが、一般には、抗原投与回数３〜６回、投与間隔２〜６週間が好ましく、投与回数３〜４回、投与間隔２〜４週間がさらに好ましい。
【００６５】
また、抗原の投与量は、動物の種類、個体差等により異なるが、一般には０．０５〜５ｍｇ、好ましくは０．１〜０．５ｍｇ程度とする。
【００６６】
追加免疫は、以上の通りの抗原投与の１〜６週間後、好ましくは２〜４週間後、さらに好ましくは２〜３週間後に行う。
【００６７】
なお、追加免疫を行う際の抗原投与量は、動物の種類、大きさ等により異なるが、一般に、例えばマウスの場合には０．０５〜５ｍｇ、好ましくは０．１〜０．５ｍｇ、さらに好ましくは０．１〜０．２ｍｇ程度とする。
【００６８】
上記追加免疫から１〜１０日後、好ましくは２〜５日後、さらに好ましくは２〜３日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞又はリンパ球を無菌的に取り出す。
【００６９】
なお、その際に抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給源として用いれば、以後の操作の効率を高めることができる。
【００７０】
ここで用いられる抗体価の測定法としては、例えば、ＲＩＡ法又はＥＬＩＳＡ法を挙げることができるがこれらの方法に制限されない。
【００７１】
本発明における抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下に記載するような手順により行うことができる。
【００７２】
まず、精製又は部分精製した抗原をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係なタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料（例えばマウス血清）に接触させ、上記抗原に試料中の抗体を結合させる。
【００７３】
さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。
【００７４】
これらの脾臓細胞又はリンパ球からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５；Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７７）６，ｐ．５１１；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７），２６６，ｐ．５５０；Ｗａｌｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）２６６，ｐ．４９５）に従って行うことができる。
【００７５】
例えば、脾臓細胞の場合には、脾臓を細切して細胞をステンレスメッシュで濾過した後、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）に浮遊させて抗体産生細胞を分離する一般的方法を採用することができる。
【００７６】
（ｃ）骨髄腫細胞（以下、「ミエローマ」という）の調製
細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｉｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いるのが好ましい。
【００７７】
すなわち、マウス由来のＸ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、ＮＳ１−ＡＮＳ／１（ＮＳ１）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕｌ（Ｐ３Ｕｌ）、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０）、ＭＰＣ１１−４５．６ＴＧ１．７（４５．６ＴＧ）、ＦＯ、Ｓ１４９／５ＸＸＯ、ＢＵ．１等、ラット由来の２１０．ＲＳＹ３．Ａｇ．１．２．３（Ｙ３）等、ヒト由来のＵ２６６ＡＲ（ＳＫＯ−００７）、ＧＭ１５００・ＧＴＧ−Ａ１２（ＧＭ１５００）、ＵＣ７２９−６、ＬＩＣＲ−ＬＯＷ−ＨＭｙ２（ＨＭｙ２）、８２２６ＡＲ／ＮＩＰ４−１（ＮＰ４１）等である。
【００７８】
これらのＨＧＰＲＴ欠損株は例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）等から入手することができる。
【００７９】
これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、及びウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という）を加えた培地に８−アザグアニンを加えた培地］、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＩＭＤＭ」という）、又はダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地［例えば、１０％ＦＣＳを含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社製）］で継代培養し、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
【００８０】
（ｄ）細胞融合
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法（Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．Ｉ．ＩＩ．ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．  ａｎｄ  Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｃ  Ｔｈｏｍａｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ  Ｓｐｉｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４）等）に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。
【００８１】
そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。
【００８２】
このうち、上記化学的方法の具体例を示せば以下のとおりである。すなわち、高濃度ポリマー溶液としてポリエチレングリコールを用いる場合には、分子量１５００〜６０００、好ましくは２０００〜４０００のポリエチレングリコール溶液中で、３０〜４０℃、好ましくは３５〜３８℃の温度で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを１〜１０分間、好ましくは５〜８分間混合する。
【００８３】
（ｅ）ハイブリドーマ群の選択
上記細胞融合により得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノブテリン・チミジン）選択法（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔｖａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）２６６，ｐ．５５０）が用いられる。
【００８４】
この方法は、アミノブテリンで生存し得ないＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用いてハイブリドーマを得る場合に有効である。
【００８５】
すなわち、未融合細胞及びハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養することにより、アミノブテリンに対する耐性を持ち合わせたハイブリドーマのみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。
【００８６】
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）
ハイブリドーマのクローニング法としては、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができる（例えば、Ｂａｒｂａｒａ，Ｂ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｍ．Ｓ．：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８０））。これらの方法のうち、特に限界希釈法が好適である。
【００８７】
この方法では、マイクロプレートにラット胎児由来線維芽細胞株、あるいは正常マウス脾臓細胞、胸腺細胞、腹水細胞などのフィーダー（ｆｅｅｄｅｒ）を接種しておく。
【００８８】
一方、あらかじめハイブリドーマを０．２〜０．５個／０．２ｍｌになるように培地中で希釈し、この希釈したハイブリドーマの浮遊液を各ウェルに０．１ｍｌずつ入れ、一定期間毎（例えば３日毎）に約１／３の培地を新しいものに交換しながら２週間程度培養を続けることによってハイブリドーマのクローンを増殖させることができる。
【００８９】
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを２〜４回繰返し、安定して抗体価の認められたものを抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【００９０】
このようにしてクローニングされたハイブリドーマ株の例としては、ハイブリドーマ＃３２Ａ１及びハイブリドーマ＃４１Ｂ１を挙げることができる。ハイブリドーマ＃３２Ａ１及びハイブリドーマ＃４１Ｂ１は、２００８年８月２８日付けで日本国独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現：日本国独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター  特許微生物寄託センター）に寄託され、ハイブリドーマ＃３２Ａ１はａｎｔｉ−Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＃３２Ａ１の名称で寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９９９が付与され、ハイブリドーマ＃４１Ｂ１はａｎｔｉ−Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＃４１Ｂ１の名称で寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０００が付与されている。
【００９１】
（ｇ）ハイブリドーマの培養によるモノクローナル抗体の調製
このようにして選択されたハイブリドーマは、これを培養することにより、モノクローナル抗体を効率よく得ることができるが、培養に先立ち、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることが望ましい。
【００９２】
このスクリーニングにはそれ自体既知の方法が採用できる。
【００９３】
本発明における抗体価の測定は、例えば上記（ｂ）の項目で説明したＥＬＩＳＡ法により行うことができる。
【００９４】
以上の通りの方法によって得たハイブリドーマは、液体窒素中又は−８０℃以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。
【００９５】
クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をＨＴ培地から正常培地に換えて培養される。
【００９６】
大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行われる。この大量培養における上清から、ゲル濾過等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、本発明の蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。
【００９７】
また、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃ）、あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内にハイブリドーマを注射し、該ハイブリド−マを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。
【００９８】
腹腔内に投与する場合には、事前（３〜７日前）に２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（２，６，１０，１４−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）（プリスタン）等の鉱物油を投与すると、より多量の腹水が得られる。
【００９９】
たとえば，ハイブリドーマと同系統のマウスの腹腔内に予め免疫抑制剤を注射し、Ｔ細胞を不活性化した後、２０日後に１０６〜１０７個のハイブリドーマ・クローン細胞を、血清を含まない培地中に浮遊（０．５ｍｌ）させて腹腔内に投与し、通常腹部が膨満し、腹水がたまったところでマウスより腹水を採取する。
【０１００】
この方法により、培養液中に比べて約１００倍以上の濃度のモノクローナル抗体が得られる。
【０１０１】
上記方法により得たモノクローナル抗体は、例えばＷｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９７８）に記載されている方法で精製することができる。
【０１０２】
すなわち、硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等である。
【０１０３】
精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット等を利用することもできる。
【０１０４】
かくして得られるモノクローナル抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に対して高い抗原特異性を有する。
【０１０５】
（ｈ）モノクローナル抗体の検定
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。
【０１０６】
まず、同定法としてはオクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、又はＲＩＡ法を挙げることができる。
【０１０７】
オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。
【０１０８】
一方、ＥＬＩＳＡ法又はＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。
【０１０９】
また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット（例えば、マウスタイパーキット；バイオラッド社製）等を利用することもできる。
【０１１０】
さらに、タンパク質の定量は、フォーリンロウリー法、及び２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍｌ］より算出する方法により行うことができる。
【０１１１】
（３）その他の抗体
本発明の抗体には、上記Ｓｉｇｌｅｃ−１５に対するモノクローナル抗体に加え、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト抗体等も含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
【０１１２】
キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１−６８５５（１９８４））。
【０１１３】
ヒト化抗体としては、相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２−５２５）、ＣＤＲ移植法によって、ＣＤＲ  の配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（ＷＯ９０／０７８６１）を挙げることができる。
【０１１４】
さらに、ヒト抗体を挙げることができる。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を意味する。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５ヒト抗体は、ヒト抗体のＨ鎖とＬ鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１６，ｐ．１３３−１４３；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９８）２６，ｐ．３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｖｏｌ．１０，ｐ．６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，Ｔ．  ａｎｄ  Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７，ｐ．７２２−７２７）によって取得することができる。
【０１１５】
このようなトランスジェニック動物は、具体的には、非ヒト哺乳動物の内在性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が破壊され、代わりにヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が導入された遺伝子組み換え動物を、ノックアウト動物及びトランスジェニック動物の作製、及びこれらの動物同士を掛け合わせることにより作り出すことができる。
【０１１６】
また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターにより真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することにより、この抗体を培養上清中から得ることもできる。
【０１１７】
ここで、宿主としては例えば真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞を用いることができる。
【０１１８】
また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２００２）４３（７），ｐ．２３０１−２３０８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００２），１（２），ｐ．１８９−２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（２００２）１０９（３），ｐ．４２７−４３１）も知られている。
【０１１９】
例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，（９），ｐ．１１０５−１１１６）を用いることができる。
【０１２０】
抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。
【０１２１】
抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，ｐ．４３３−４５５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３（９），ｐ．１１０５−１１１６）。
【０１２２】
抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
【０１２３】
真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。
【０１２４】
動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５−１８２、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７，ｐ．４１２６−４２２０）を挙げることができる。
【０１２５】
原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。
【０１２６】
これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。
【０１２７】
本発明の抗体のアイソタイプとしての制限はなく、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等を挙げることができるが、好ましくはＩｇＧ又はＩｇＭを挙げることができ、より好ましくはＩｇＧ２を挙げることができる。
【０１２８】
また本発明の抗体は、抗体の抗原結合部を有する抗体の機能性断片又はその修飾物であってもよい。抗体をパパイン、ペプシン等のタンパク質分解酵素で処理するか、あるいは抗体遺伝子を遺伝子工学的手法によって改変し適当な培養細胞において発現させることによって、該抗体の断片を得ることができる。このような抗体断片のうちで、抗体全長分子の持つ機能の全て又は一部を保持している断片を抗体の機能性断片と呼ぶことができる。抗体の機能としては、一般的には抗原結合活性、抗原の活性を中和する活性、抗原の活性を増強する活性、抗体依存性細胞障害活性、補体依存性細胞傷害活性及び補体依存性細胞性細胞傷害活性を挙げることができる。本発明における抗体の機能性断片が保持する機能は、好ましくは破骨細胞の形成を抑制する活性であり、より好ましくは破骨細胞の細胞融合の過程を抑制する活性である。
【０１２９】
例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又は重鎖及び軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体などを挙げることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の断片に含まれる。
【０１３０】
さらに、本発明の抗体は少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する多特異性抗体であってもよい。
【０１３１】
通常このような分子は２個の抗原を結合するものであるが（即ち、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上（例えば、３種類）の抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。
【０１３２】
本発明の抗体は、多特異性抗体は全長からなる抗体、又はそのような抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二特異性抗体）でもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体の重鎖と軽鎖（ＨＬ対）を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することによっても、作製することができる（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０５，ｐ．５３７−５３９）。
【０１３３】
本発明の抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖとも記載する）でもよい。一本鎖抗体は、抗体の重鎖Ｖ領域と軽鎖Ｖ領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られる（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６９−３１５（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，ｐ．１１２６−１１３６）。また、２つのｓｃＦｖをポリペプチドリンカーで結合させて作製されるＢｉｓｃＦｖ断片を二重特異性抗体として使用することもできる。
【０１３４】
一本鎖抗体を作成する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。このｓｃＦｖにおいて、重鎖Ｖ領域と軽鎖Ｖ領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８），８５，ｐ．５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおける重鎖Ｖ領域及び軽鎖Ｖ領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。Ｖ領域を連結するポリペプチドリンカーとしては、例えば１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
【０１３５】
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体の重鎖又は重鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、及び軽鎖又は軽鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、及びその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。
【０１３６】
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
【０１３７】
これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。
【０１３８】
本発明の抗体は、多量化して抗原に対する親和性を高めたものであってもよい。多量化する抗体としては、１種類の抗体であっても、同一の抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であってもよい。抗体を多量化する方法としては、ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインと２つのｓｃＦｖとの結合、ストレプトアビシンとの結合、ヘリックスーターン−ヘリックスモチーフの導入等を挙げることができる。
【０１３９】
本発明の抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の混合物である、ポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の一例としては、ＣＤＲが異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体としては、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、該培養物から精製された抗体を用いることが出来る（ＷＯ２００４／０６１１０４号参照）。
【０１４０】
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。
【０１４１】
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。
【０１４２】
例えばクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））が、これらに限定されるものではない。
【０１４３】
クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を挙げることができる。
【０１４４】
これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
【０１４５】
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを挙げることができる。
【０１４６】
例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．等を挙げることができる。
【０１４７】
また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
【０１４８】
好ましくは、本発明における抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は、破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する活性を有する抗体である。
【０１４９】
抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が有する当該活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｓｉｇｌｅｃ−１５を過剰発現している細胞の破骨細胞への分化を抑制する活性を測定することによって評価することができる。例えば、マウス単球由来細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞又はＲＡＷ２６４細胞に種々の濃度で抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を添加し、ＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ）あるいはＴＮＦ−α刺激による、破骨細胞への分化の抑制活性を測定することができる。また、骨髄由来の初代培養細胞に種々の濃度で抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を添加し、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ−αあるいは活性型ビタミンＤ３刺激による、破骨細胞への分化の抑制活性を測定することができる。さらに、正常ヒト破骨前駆細胞に種々の濃度で抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を添加し、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦ刺激による、破骨細胞への分化の抑制活性を測定することができる。このような破骨細胞の分化抑制効果は、破骨細胞の酒石酸耐性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＣＰ）活性の抑制を指標として測定できる。また、ＴＲＡＣＰ陽性多核破骨細胞の形成の抑制、すなわち破骨細胞の細胞融合の抑制を指標としても、破骨細胞の分化抑制効果を測定することができる。例えば、上記の破骨細胞分化の試験系において、３０μｇ／ｍｌ以下の濃度で細胞融合の抑制効果を示す、あるいは３μｇ／ｍｌ以下、又は１μｇ／ｍｌ以下の濃度において抑制効果を示す抗体を選択することができる。また、より低濃度側での効果を試験した場合に、例えば、６３ｎｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌの範囲で破骨細胞の分化抑制効果を示す抗体を選択してもよい。さらに、大腿骨及び／又は脛骨由来の細胞を用いたピットアッセイ（Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ（１９９２）１７，３４７−３５９）実験において、大腿骨及び／又は脛骨由来の細胞に種々の濃度で抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を添加して象牙切片上のピットの形成を観察することによっても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける破骨細胞による骨吸収の抑制活性を測定することができる。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける破骨細胞による骨吸収の抑制活性を測定系としては、ユーロピウムが結合したヒトコラーゲンをコーティングしたプレートを使用することも可能である（ＷＯ２００９／０４８０７２の実施例３７）。例えば、上記の破骨細胞による骨吸収の試験系において、３μｇ／ｍｌ以下の濃度、すなわち０．３μｇ／ｍｌから３μｇ／ｍｌの範囲で骨吸収の抑制効果を示す抗体を選択することができる。一方、ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験動物を利用した場合には、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が有する当該活性は、二次海面骨領域における破骨細胞の変化を測定することで確認することができる。
【０１５０】
本発明において利用可能な抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の例としては、ＷＯ２００９／０４８０７２、ＷＯ２０１０／１１７０１１、ＷＯ２０１３／１４７２１２、ＷＯ２０１３／１４７２１３、ＷＯ２０１２／０４５４８１等に開示される抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を挙げることができる。例えば、本発明において利用可能な抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体として、上記ハイブリドーマ＃３２Ａ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９９９）の産生する抗体（以下「＃３２Ａ１抗体」という）が挙げられ、＃３２Ａ１抗体は配列番号２１の２０〜１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２２の２１〜１３２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを有する。また、本発明において利用可能な抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体としては、Ｓｉｇｌｅｃ−１５への結合において、＃３２Ａ１抗体と競合し又は共通のエピトープを有し、破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制するモノクローナル抗体であって、３μｇ／ｍｌ以下の濃度において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの破骨細胞による骨吸収を抑制することを特徴とする抗体等が挙げられる。＃３２Ａ１抗体のエピトープは、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５  Ｖ−ｓｅｔドメイン（（ＮＣＢＩのタンパク質データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＮＰ＿９９８７６７のアミノ酸配列又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の３９〜１６５番目のアミノ酸残基からなるドメイン）である。
【０１５１】
本発明において利用可能な抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体としては、好ましくは、＃３２Ａ１抗体のヒト化抗体、又はそのＣＤＲ改変体を挙げることができる。＃３２Ａ１抗体のヒト化抗体の実例としては、配列番号７の２０〜１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８の２１〜１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の組合せ、配列番号９の２０〜１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８の２１〜１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の組合せ、配列番号９の２０〜１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号１０の２１〜１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の組合せ、配列番号９の２０〜１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号１１の２１〜１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の組合せを挙げることができる。
【０１５２】
より好ましいヒト化抗体としては、配列番号７の２０〜４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８の２１〜２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の組合せ、配列番号９の２０〜４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号８の２１〜２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の組合せ、配列番号９の２０〜４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号１０の２１〜２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の組合せ、配列番号９の２０〜４６６目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号１１の２１〜２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の組合せを挙げることができる。
【０１５３】
但し、＃３２Ａ１抗体のヒト化抗体としては、＃３２Ａ１抗体の６種全てのＣＤＲ配列を保持し、破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する活性を持つ限り、上記のヒト化抗体に限定されない。なお、＃３２Ａ１抗体の重鎖可変領域は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＤＹＦＭＮ）、配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＱＩＲＮＫＩＹＴＹＡＴＦＹＡ）、及び配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＳＬＴＧＧＤＹＦＤＹ）を保有している。また、＃３２Ａ１抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＲＡＳＱＳＶＴＩＳＧＹＳＦＩＨ）、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＲＡＳＮＬＡＳ）、及び配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＳＲＫＳＰＷＴ）を保有している。
【０１５４】
＃３２Ａ１抗体のヒト化抗体のＣＤＲ改変体としては、＃３２Ａ１抗体のヒト化抗体において、配列番号１４のＣＤＲＨ３の３番目のスレオニン残基をグルタミン酸残基に置換した抗体を挙げることができる。Ｓｉｇｌｅｃ−１５は塩基性のタンパク質であり、アスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸残基の抗体配列への導入により、抗原−抗体間のイオン結合が形成されて結合能が向上することが期待される。抗体の認識部位で最も重要と考えられるＣＤＲＨ３ループの中央に位置し、Ｘ線結晶構造解析により抗原側に向いていると予想されるスレオニン残基に酸性アミノ酸で側鎖の長いグルタミン酸残基を導入する置換体を設計した。前記の置換を有するＣＤＲＨ３（ＳＬＥＧＧＤＹＦＤＹ）は、配列表の配列番号１８のアミノ酸配列に相当する。
【０１５５】
ＣＤＲ改変体の実例としては、配列番号１９の２０〜１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号２０の２１〜１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の組合せを挙げることができる。
【０１５６】
より好ましいＣＤＲ改変体としては、配列番号１９の２０〜４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２０の２１〜２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
【０１５７】
但し、＃３２Ａ１抗体のヒト化抗体のＣＤＲ改変体は、配列番号１８のＣＤＲＨ３配列を保有し、破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する活性を持つ限り、上記のＣＤＲ改変体に限定されない。
【０１５８】
なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリジン残基が欠失することが知られており（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，７０５：１２９−１３４（１９９５））、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リジンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５−８３（２００７））。しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞障害作用など）には影響を及ぼさない。従って、本発明には当該修飾を受けた抗体も含まれ、重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失した欠失体、及びアミド化された当該欠失体（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖）等を挙げることができる。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、本発明に係る抗体の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に係る抗体を構成する２本の重鎖は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であっても良いし、いずれか二種を組み合わせたものであっても良い。各欠失体の量比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に影響を受け得るが、本発明に係る抗体の主成分としては２本の重鎖の双方でカルボキシル末端の１つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。
【０１５９】
３．抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を含有する医薬
上述の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は、小児骨粗鬆症を治療及び／又は予防するための医薬の有効成分として用いることができる。
【０１６０】
小児骨粗鬆症とは、成長期にある小児（およそ１７歳くらいまで）において発症する骨粗鬆症を意味する。小児骨粗鬆症の原因は様々であり、骨形成不全又は特発性小児骨粗鬆症を原因とする小児骨粗鬆症（原発性骨粗鬆症に分類される）、ならびに神経疾患、内分泌・炎症性疾患、血液疾患、又は薬剤投与を原因とする小児骨粗鬆症（続発性骨粗鬆症に分類される）がある。好ましくは本発明において「小児骨粗鬆症」とは、薬剤投与により発症する小児骨粗鬆症である。小児骨粗鬆症の原因となる薬剤としては、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン等のステロイド薬、タクロリムス、シクロスポリン、メトトレキサート等の免疫抑制剤を挙げることができるがこれらに限定されない。より好ましくは本発明において「小児骨粗鬆症」とは、ステロイド薬の投与により発症する小児ステロイド性骨粗鬆症である。小児は骨形成・成長の著しい時期であることから、骨粗鬆症の治療を目的として投与されたビスフォスフォネート製剤をはじめとする既存の強力な骨吸収抑制剤の影響を受けやすい。そのため小児骨粗鬆症は、骨吸収抑制剤を用いて治療した場合に、深刻な成長障害、骨構造異常、骨質異常の発生が危惧される疾患である。
【０１６１】
本発明において上述の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は、薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤と共に、医薬組成物の形態で提供することができる。当該医薬組成物には、上述の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を治療及び／又は予防に有効な量を含めることができる。
【０１６２】
本発明の医薬組成物において許容される製剤に用いる物質としては好ましくは投与量や投与濃度において、医薬組成物を投与される者に対して非毒性のものが好ましい。
【０１６３】
本発明の医薬組成物は、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、無菌性、安定性、溶解率、徐放率、吸収率、浸透率を変えたり、保持したりするための製剤用の物質を含むことができる。製剤用の物質として以下のものを挙げることができるが、これらに制限されない：グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素ナトリウム、トリス−塩酸（Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ）溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β−シクロデキストリンやヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノース又はデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレン・グリコール又はポリエチレングリコール等の溶媒、マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール、懸濁剤、ソルビタンエステル、ポリソルビテート２０やポリソルビテート８０等ポリソルビテート、トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）、トロメタミン（ｔｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、レシチン又はコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウムやマンニトール・ソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、希釈剤、賦形剤、及び／又は薬学上の補助剤。これらの製剤用の物質の添加量は、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の重量に対して０．０１〜１００倍、特に０．１〜１０倍添加するのが好ましい。製剤中の好適な医薬組成物の組成は当業者によって、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜決定することができる。
【０１６４】
医薬組成物中の賦形剤や担体は液体でも固体でもよい。適当な賦形剤や担体は注射用の水や生理食塩水、人工脳脊髄液や非経口投与に通常用いられている他の物質でもよい。中性の生理食塩水や血清アルブミンを含む生理食塩水を担体に用いることもできる。医薬組成物にはｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓバッファーやｐＨ４．０〜５．５の酢酸バッファーやそれらにソルビトールや他の化合物を含むこともできる。本発明の医薬組成物は選択された組成と必要な純度を持つ薬剤として、凍結乾燥品あるいは液体として準備される。本発明の医薬組成物はスクロースのような適当な賦形剤を用いた凍結乾燥品として成型されることもできる。
【０１６５】
本発明の医薬組成物は非経口投与用に調製することもできるし、経口による消化管吸収用に調製することもできる。製剤の組成及び濃度は投与方法によって決定することができるし、本発明の医薬組成物に含まれる、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体のＳｉｇｌｅｃ−１５に対する親和性、即ち、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に対する解離定数（Ｋｄ値）に対し、親和性が高い（Ｋｄ値が低い）ほど、ヒトへの投与量を少なく薬効を発揮することができるので、この結果に基づいて本発明の医薬組成物の人に対する投与量を決定することもできる。投与量は、ヒト型抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体をヒトに対して投与する際には、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇを１〜１８０日間に１回投与すればよい。
【０１６６】
本発明の医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などを挙げることができる。
【０１６７】
本発明の医薬組成物には、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体と共に、骨疾患の治療及び／又は予防に有効な一又は複数の成分を含めることができる。このような成分としては、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン製剤、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）製剤、非ステロイド性抗炎症剤、可溶性ＴＮＦレセプター製剤、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の機能性断片、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の機能性断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ−６レセプター抗体又は該抗体の機能性断片等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【０１６８】
当該成分は、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体と同じ製剤の中に含めてもよいし、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体とは異なる製剤の中に含めて一緒に又は別々に供給されてもよい。あるいは、当該成分は抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体又はその機能的断片に結合させた形態で供給されてもよい。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体又はその機能的断片と当該成分との結合様式は、Ｍ．Ｃ．Ｇａｒｎｅｔ「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，（２００１）５３，１７１−２１６、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９６）、Ｐｕｔｎａｍ  ａｎｄ  Ｊ．Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）１２２，５５−１２３等に記載される種々の形態を利用することができる。
【実施例】
【０１６９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
Ａ．成長期健常ラットを用いた評価
Ｉ．実験方法【０１７０】
（１）使用動物
６週齢の成長期雄性Ｆ３４４  Ｒａｔを用いた。【０１７１】
（２）実験群（各ｎ＝１０）
（ｉ）コントロール群（以下、「Ｃｔｌ群」と記載）
（ｉｉ）抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体投与群（以下、「Ｓｉｇ−１５  Ａｂ投与群」と記載）：抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は、上記＃３２Ａ１抗体を用いた。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は０．２５、１、４ｍｇ／ｋｇの用量にて、３週間に一度、皮下投与した。
（ｉｉｉ）ビスフォスフォネート投与群（以下、「ＡＬＮ投与群」と記載）：Ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ（ＡＬＮ）（ＬＫＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を０．０２８、０．１４０ｍｇ／ｋｇの用量にて、１週間に２度皮下投与した。
各薬剤の投与量は、１週間に一度行った体重の測定結果に基づいて調整した。【０１７２】
（３）投与観察期間
投与開始から６週間（６週齢から１２週齢）。当該期間の終了後（１２週齢）に安楽死させて評価を行った。
各実験群のラットは、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ−ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ  （ＳＰＦ）環境下で、通常飼料にて飼育した。餌、水へはアクセスフリーとした。
骨ラベリングのために、安楽死の７日前と３日前（４日間のインターバル）にカルセインを投与した。カルセインは、１．４％重曹溶液中に、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、１０ｍｇ／ｋｇの用量で各動物に皮下注射した。【０１７３】
（４）評価項目
＜縦断的評価＞
（ｉ）頭胴長及び体重
頭胴長の測定は投与０、３、６週間後に行った。体重測定は、１週間に一度行った。
（ｉｉ）大腿骨長
大腿骨長の測定は、麻酔下、マイクロＣＴ撮影により３週間毎に行った。
（ｉｉｉ）骨形成マーカーと骨吸収マーカー
投与開始前と投与６週間後、安楽死前に尾静脈から採血し、血中の骨形成マーカー（血清オステオカルシン）と骨吸収マーカー（血清ＴＲＡＣＰ−５ｂ）の値をＥＬＩＳＡ法により測定した。
各種操作は、図１に記載のスケジュールに従って実施した。【０１７４】
＜検体摘出後評価＞
安楽死させた後、解剖して大腿骨、脛骨、腰椎を採取して評価サンプルとした。
（ｉ）骨形態計測
大腿骨、脛骨、第５腰椎のマイクロＣＴ撮影を行い、右大腿骨長軸長を測定した。【０１７５】
（ｉｉ）組織学的検討
非脱灰硬組織標本：左脛骨近位１／２（長さ約１．５ｃｍ）の冠状断組織を利用した。７０％エタノールに浸漬固定した後、冷暗所に保存した。得られた非脱灰硬組織標本は、Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ染色、明視野観察及び蛍光観察、ならびに定量的骨形態計測に用いた。
脱灰組織標本：膝関節離断し、脛骨近位部の冠状断組織（右膝脛骨近位１／２）、ならびに第５腰椎冠状断組織の標本を作製した。
上記非脱灰硬組織標本および脱灰組織標本より、成長軟骨板幅の計測と長軸方向への成長速度計測を組織学的に行い、成長障害を評価した（「新しい骨形態計測」、２０１４年、ウイネット出版）。【０１７６】
破骨細胞は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（Ｔａｒｔｒａｔｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＴＲＡＣＰ）に対する化学染色（以下、「ＴＲＡＣＰ染色」と記載）とメチルグリーンによる対比染色により検出・評価した。
成長軟骨部は、サフラニンＯ染色（酸性ムコ多糖類を染色）により検出・評価した。【０１７７】
（ｉｉｉ）力学試験
第２、３、４、６腰椎椎体と左大腿骨遠位骨幹端部について、圧縮試験を行い、最大破断強度（破断するまでに耐えた最大の荷重）、剛性（変形しにくさ）、及び靱性（破断までに要したエネルギー）について評価した。【０１７８】
（ｉｖ）骨密度測定
骨密度測定装置（日立アロメディカル社製）を用いて、Ｄｕａｌ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−Ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ（ＤＸＡ）法により、腰椎（第１〜３腰椎）、左大腿骨遠位端のＢＭＤ測定を行った。【０１７９】
ＩＩ．実験結果
（１）薬剤による頭胴長及び体重への影響
投与観察期間の開始から縦断的に頭胴長及び大腿骨長を計測した結果を図２に示す。投与観察期間の終了時（１２週齢の時点）で、Ｓｉｇ−１５  Ａｂ投与群はＣｔｌ群と比較して、頭胴長及び大腿骨長に有意な差は認められなかった。一方、ＡＬＮ投与群はＣｔｌ群と比較して、頭胴長及び大腿骨長の低下が認められた（図２（Ａ）。同様の傾向が、投与観察期間にわたる頭胴長及び大腿骨長の変化量についても認められた（図２（Ｂ））。【０１８０】
この結果は、ビスフォスフォネートと異なり、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の投与により投与対象の成長障害が生じないことを示す。【０１８１】
（２）薬剤による骨代謝（骨形成マーカーと骨吸収マーカー）への影響
投与観察期間の開始前後に採血された血液サンプル中の骨形成マーカー（血清オステオカルシン）と骨吸収マーカー（血清ＴＲＡＣＰ−５ｂ）の測定結果を図３に示す。投与観察期間の終了時（１２週齢の時点）における血清ＴＲＡＣＰ−５ｂ量は、Ｓｉｇ−１５  Ａｂ投与群及びＡＬＮ投与群のいずれにおいても、投与した薬剤の用量依存的に低下することが認められた（図３（Ａ））。一方、血清オステオカルシン量については、いずれの投与群においてもＣｔｌ群と有意な差は認められなかった。同様の傾向が、投与観察期間にわたる変化量についても認められた（図３（Ｂ））。【０１８２】
この結果は、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の投与及びビスフォスフォネート投与のいずれにおいても、用量依存的に骨吸収が抑制されることを示す。【０１８３】
（３）薬剤による成長への影響の組織学的評価
投与観察期間の終了時（１２週齢の時点）の脛骨近位部について、薬剤による成長への影響を組織学的に評価した結果を図４−１、図４−２に示す。図４−１（Ａ）は、当該脛骨近位部をマイクロＣＴ撮影し、取得データを３次元再構築して得られた画像（３Ｄ−ＣＴ画像）の冠状断面写真を示す。Ｓｉｇ−１５  Ａｂ投与群はいずれも、Ｃｔｌ群と比較して大きな変化は認められなかった。一方、ＡＬＮ投与群においては、特に高用量投与群において、カップ状の形態（すなわち、近位部から遠位側にかけて骨の太さの変化量が少ない）を呈し（正常ではラッパ状の形態）、また成長軟骨板幅（矢頭）の減少が認められた。【０１８４】
図４−１（Ｃ）には、軟骨の評価に用いるサフラニンＯ染色（酸性ムコ多糖類を染色）標本を用いて、成長軟骨及び成長軟骨直下の一次海綿骨領域の観察を行った結果を示す。成長軟骨の幅は上記３Ｄ−ＣＴ画像と同様に、ＡＬＮ投与群で減少していることが認められた。また、一次海綿骨領域の骨内に認められるサフラニンＯ染色陽性（赤色）の領域について、Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体投与群ではＣｔｌ群との差は認められないが、ＡＬＮ投与群では当該領域が増大していることが認められた。さらに、サフラニンＯ染色陽性の成長軟骨領域を詳細に観察すると、Ｃｔｌ群及びＳｉｇｌｅｃ−１５抗体投与群では、当該領域が増殖層から肥大化軟骨細胞層、石灰化軟骨細胞層にかけて、長軸方向に沿って整然と配列されているのに対して、ＡＬＮ投与群では当該領域が不整然な配列を有する傾向を示した。【０１８５】
図４−１（Ｂ）には、安楽死７日前及び３日前にカルセインでラベリングして得られた脛骨近位部の非脱灰組織標本を作製しＶｉｌｌａｎｕｅｖａ染色を行った結果を示す。成長軟骨と平行にラベルされる部位が２箇所に見られ、近位にあるラベル部位（矢印（上））が当該３日前にラベリングされた領域であり、より遠位にある部位（矢印（下））が当該７日前にラベリングされた領域をそれぞれ示す。当該２箇所のラベルされた領域の間の距離に基づいて、骨成長速度を評価した。結果、Ｓｉｇ−１５  Ａｂ投与群における当該距離は、Ｃｔｌ投与群のそれと差はなく、両者の骨成長速度に違いが認められないことが確認された。一方、ＡＬＮ投与群（特に高用量投与群）における当該距離は、Ｃｔｌ投与群のそれと比べて減少しており、ＡＬＮ投与群においては骨成長速度が小さくなっていることが確認された。【０１８６】
図４−２（Ｄ）には、破骨細胞の評価に用いるＴＲＡＣＰ染色標本を用いて、脛骨近位部の一次海綿骨領域の観察を行った結果を示す。Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体投与群におけるＴＲＡＣＰ陽性細胞の数はＣｔｌ群におけるその数と差は認められないが、ＡＬＮ投与群におけるＴＲＡＣＰ陽性細胞の数は明らかに減少していることが認められた。【０１８７】
さらに、骨成長速度、成長軟骨幅、一次海綿骨領域の骨表面に対する破骨細胞面（Ｏｃ．Ｐｍ／Ｂ．Ｐｍ（％））について定量的評価を行った結果を図４−２（Ｅ）、（Ｆ）に示す。Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体投与群では、骨成長速度、成長軟骨幅、破骨細胞面のいずれも、Ｃｔｌ群と比較して有意差は認められなかった。一方、ＡＬＮ投与群（特に高用量投与群）では、骨成長速度、成長軟骨幅、一次海綿骨領域の破骨細胞面のいずれにおいても、Ｃｔｌ群と比較して有意に低下していることが認められた。【０１８８】
以上の結果より、成長軟骨直下の骨吸収は長管骨の成長に重要な役割を担っているが、ＡＬＮ投与によってその骨吸収が阻害されるために、骨の正常な発育、モデリング過程に障害を生じることが示唆される。一方、Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体投与は、当該領域の骨吸収を阻害しないことから、骨成長に影響を及ぼさないことが示唆された。【０１８９】
（４）薬剤による骨量及び力学的強度への影響
海綿骨の豊富な腰椎を用いて、薬剤投与による影響を評価検証した結果を図５−１、図５−２に示す。投与観察期間の終了時（１２週齢の時点）の腰椎についてマイクロＣＴ撮影を行い、作製された３Ｄ−ＣＴ画像より得られた腰椎の冠状断面写真を図５−１（Ａ）に示す。Ｃｔｌ群と比較して、Ｓｉｇ−１５  Ａｂ投与群及びＡＬＮ投与群のいずれにおいても、投与薬剤の用量依存的に海綿骨骨量の増加が認められた。ＡＬＮ投与群では、一次海綿骨での骨量増加がとくに顕著であった。【０１９０】
図５−２（Ｃ）には、ＤＸＡ法を用いた腰椎の骨密度の測定結果を示す。Ｃｔｌ群と比較して、Ｓｉｇ−１５  Ａｂ投与群及びＡＬＮ投与群のいずれにおいても、投与薬剤の用量依存的に腰椎のＢＭＤ値の増大が認められた。【０１９１】
図５−１（Ｂ）には、腰椎組織のＴＲＡＣＰ染色による一次及び二次海綿骨領域の破骨細胞の観察結果を示す。Ｃｔｌ群と比較して、Ｓｉｇ−１５  Ａｂ投与群及びＡＬＮ投与群のいずれにおいても、二次海綿骨領域のＴＲＡＣＰ陽性細胞の減少が認められ、骨表面に対する破骨細胞面（Ｏｃ．Ｐｍ／Ｂ．Ｐｍ（％））についても、Ｃｔｌ群と比較して、Ｓｉｇ−１５  Ａｂ投与群及びＡＬＮ投与群のいずれにおいても低下が認められた（図５−２（Ｄ））。この結果は、Ｓｉｇ−１５  Ａｂ投与及びＡＬＮ投与のいずれにおいても、二次海綿骨（リモデリング骨）の骨吸収が阻害されることを示唆する。【０１９２】
図５−２（Ｅ）には、腰椎の圧縮試験の測定結果を示す。最大破断強度、剛性、靱性に関し、Ｃｔｌ群と比較して、Ｓｉｇ−１５  Ａｂ投与群においてはいずれも有意差は認められなかった。一方、ＡＬＮ投与群（特に高用量投与群）においては、最大破断強度及び剛性について、Ｃｔｌ群と比較して有意な増加が認められた。これは海綿骨骨量の変化だけでなく、骨吸収の阻害に伴い一次海綿骨の骨量増加によって生じたものと示唆される。【０１９３】
（５）薬剤による長管骨への影響
海綿骨量の多い脛骨近位部、及び大腿骨遠位骨幹端部を用いて、薬剤投与による長管骨への影響を評価検証した結果を図６−１、図６−２に示す。投与観察期間の終了時（１２週齢の時点）の大腿骨遠位端部についてマイクロＣＴ撮影を行い、作製された３Ｄ−ＣＴ画像より得られた大腿骨の冠状断面写真を図６−１（Ａ−１）に示す。Ｃｔｌ群と比較して、Ｓｉｇ−１５  Ａｂ投与群及びＡＬＮ投与群のいずれにおいても、投与薬剤の用量依存的に海綿骨骨量の増加が認められた。図６−１（Ａ−２）には、ＤＸＡ法を用いた同部位の骨密度の測定結果を示す。Ｃｔｌ群と比較して、Ｓｉｇ−１５  Ａｂ投与群及びＡＬＮ投与群のいずれにおいても、投与薬剤の用量依存的にＢＭＤ値の増大が認められた。組織学的にも用量依存的に骨量の増加が認められ、ＡＬＮ投与群（特に高用量投与群）では骨梁幅の増加が認められた。【０１９４】
図６−１（Ｂ−１）には、１２週齢の脛骨近位部のＴＲＡＣＰ染色による二次海綿骨領域の破骨細胞の観察結果を示す。Ｃｔｌ群と比較して、Ｓｉｇ−１５  Ａｂ投与群及びＡＬＮ投与群のいずれにおいても、ＴＲＡＣＰ陽性細胞の減少が認められ、骨表面に対する破骨細胞面（Ｏｃ．Ｐｍ／Ｂ．Ｐｍ（％））はＣｔｌ群と比較して、Ｓｉｇ−１５  Ａｂ投与群及びＡＬＮ投与群のいずれにおいても低下していた（図６−１（Ｂ−２））。【０１９５】
図６−２（Ｃ）には、１２週齢の大腿骨遠位骨幹端部の圧縮試験の測定結果を示す。最大破断強度、剛性、靱性に関し、Ｃｔｌ群と比較して、Ｓｉｇ−１５  Ａｂ投与群及びＡＬＮ投与群のいずれにおいても用量依存的に増大することが認められた。【０１９６】
以上のとおり、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体及びビスフォスフォネートはいずれも、投与対象における海綿骨骨量、骨密度、力学的特性の増大を生じることから、骨粗鬆症の治療薬及び予防薬として有用であることを示すが、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の投与においては、ビスフォスフォネートの投与において認められた、成長軟骨直下（一次海綿骨領域）における骨吸収の阻害、その結果もたらされる骨の発育及びモデリングの障害が確認されなかった。この結果は、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が、特に、骨成長の著しい成長期の小児における骨粗鬆症の治療薬及び予防薬として有用であることを示す。【０１９７】
Ｂ．小児ステロイド性骨粗鬆症モデルラットを用いた評価
Ｉ．実験方法【０１９８】
（１）使用動物
６週齢の成長期雌性ＬＥＷ／ＣｒｌＣｒｌｊ  Ｒａｔを用いた。【０１９９】
（２）小児ステロイド性骨粗鬆症モデル動物
骨粗鬆症モデル動物として、げっ歯類ではマウスにＧｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓを投与するモデルが用いられることが多いが、Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ投与によって、ヒトと同じ様に骨量減少を示す系統はＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ及びＦＶＢ／Ｎの２つの系統に限られている（Ｔｈｉｅｌｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｏｎｅ  ＫＥｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ３：５５２（２０１４））。しかし、これらの系統でも２０週齢以前の骨成長が完了していない若いマウスでは骨量減少は起こらないとされており、小児骨粗鬆症モデルとして確立されたマウスは存在しない。また、薬剤の骨量や構造、骨成長に対する影響を観察するには、マウスは小さく適当でない場合がある。【０２００】
一方、ラットではステロイド性骨粗鬆症モデルは確立していない。そこで、本実施例では、ＬＥＷ／ＣｒｌＣｒｌｊ  Ｒａｔ雌６週齢にＰｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ  ２５ｍｇ／ｐｅｌｌｅｔ／６０ｄａｙｓを皮下に埋め込むモデルラットを、小児ステロイド性骨粗鬆症モデルとして採用した。このモデルではＰｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ埋め込み後、２，４，６週時に大腿骨ＢＭＤの低下が認められ、また、大腿骨と腰椎の最大破断強度も低下することが確認されている。
なお、Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ  ２５ｍｇ／ｐｅｌｌｅｔ／６０ｄａｙｓは１日当たり０．４２ｍｇの投与となる。この量は、６週齢のラット（体重１２０ｇ）では３．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとなり、体重３０ｋｇの小児に換算すると１０５ｍｇ／ｄａｙに相当する投与量である。【０２０１】
（３）実験群（各ｎ＝１０）
（ｉ）Ｓｈａｍ群：Ｓｈａｍ手術＋Ｖｅｈｉｃｌｅ（ＰＢＳ）（皮下投与）
（ｉｉ）ＧＣ群：Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ（ＰＳＬ）ペレット  ２５ｍｇ／ｐｅｌｌｅｔ／６０ｄａｙｓ皮下埋入手術（ＧＣ）＋Ｖｅｈｉｃｌｅ（ＰＢＳ）（皮下投与）
（ｉｉｉ）ＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５Ａｂ群：ＧＣ処理と共に、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を１ｍｇ／ｋｇの用量（低用量）又は１０ｍｇ／ｋｇの用量（高用量）にて、３週間に一度、皮下投与した。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は上記＃３２Ａ１抗体を用いた。
（ｉｖ）ＧＣ＋ＡＬＮ群：ＧＣ処理と共に、ＡＬＮを０．０１４ｍｇ／ｋｇの用量（低用量）又は０．１４０ｍｇ／ｋｇの用量（高用量）にて、１週間に２度皮下投与した。
ＰＳＬ皮下埋入手術と、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体又はＡＬＮの投与は同時に開始した。
各薬剤の投与量は、１週間に一度行った体重の測定結果に基づいて調整した。【０２０２】
（４）投与観察期間
投与開始から６週間（６週齢から１２週齢）。当該期間の終了後（１２週齢）に安楽死させて評価を行った。
各実験群のラットは、ＳＰＦ環境下で、通常飼料にて飼育した。餌、水へはアクセスフリーとした。
骨ラベリングのために、安楽死の５日前にテトラサイクリン、さらに２日前にカルセイン（３日間のインターバル）を投与した。カルセイン投与の３６時間後に屠殺した。テトラサイクリンは、ＰＢＳ中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、２５ｍｇ／ｋｇの用量で各動物に皮下注射した。また、カルセインは、１．４％重曹溶液中に、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、１０ｍｇ／ｋｇの用量で各動物に皮下注射した。【０２０３】
（５）評価項目
＜縦断的評価＞
（ｉ）頭胴長及び体重
頭胴長の測定は投与０、３、６週間後に行った。体重測定は、１週間に一度行った。
（ｉｉ）大腿骨長
大腿骨長の測定は、麻酔下、マイクロＣＴ撮影により３週間毎に行った。
（ｉｉｉ）骨形成マーカーと骨吸収マーカー
投与開始前と投与６週間後の安楽死前に尾静脈から採血し、血中の骨形成マーカー（血清オステオカルシン）と骨吸収マーカー（血清ＴＲＡＣＰ−５ｂ）の値をＥＬＩＳＡ法により測定した。
各種操作は、図７に記載のスケジュールに従って実施した。【０２０４】
＜検体摘出後評価＞
安楽死させた後、解剖して大腿骨、脛骨、第５腰椎を採取して評価サンプルとした。
（ｉ）骨形態計測
大腿骨、脛骨のマイクロＣＴ撮影を行い、右大腿骨長を測定した。【０２０５】
（ｉｉ）組織学的検討
非脱灰硬組織標本：左脛骨近位１／２（長さ約１．５ｃｍ）の冠状断組織を利用した。７０％エタノールに浸漬固定した後、冷暗所に保存した。得られた非脱灰硬組織標本は、Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ染色、明視野観察及び蛍光観察、ならびに定量的骨形態計測に用いた。
脱灰組織標本：膝関節離断し、脛骨近位部の冠状断組織（右膝脛骨近位１／２）、ならびに第５腰椎冠状断組織の標本を作製した。
成長障害に関しては、６週間の投与期間では大腿骨長に違いがでるほどの変化が生じない可能性があったため、成長軟骨板幅の計測と長軸方向への成長速度計測を上記非脱灰及び脱灰組織を用いて組織学的に行い、成長障害を評価した（「新しい骨形態計測」、２０１４年、ウイネット出版）。【０２０６】
（ｉｉｉ）力学試験
左大腿骨骨幹部について３点曲げ試験を行い、また第３腰椎と左大腿骨遠位端について、圧縮試験を行い、最大破断強度、剛性、弾性率及び靱性について評価した。【０２０７】
（ｉｖ）骨密度測定
骨密度測定装置（日立メディカル社製）を用いて、ＤＸＡ法により、腰椎、左大腿骨遠位端ＢＭＤ及びＢＭＣ測定を行った。【０２０８】
ＩＩ．実験結果
（１）薬剤による成長への影響
投与観察期間の開始から縦断的に体重、頭胴長、大腿骨長を計測した結果を図８に示す。８週齢時にＧＣ群、ＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ａｂ群、ＧＣ＋ＡＬＮ群では体重減少のピークがあり、その後徐々に体重は回復、増加した（図８Ａ（ｉ））。頭胴長、大腿骨長は９週齢から１２週齢にかけて体重と同様に増加する傾向にあった（図８Ａ（ｉｉ），（ｉｉｉ））。
６週齢から１２週齢までの体重、頭胴長、大腿骨長の変化量については、Ｓｈａｍ群と比較してＧＣ群では有意に低下したが、ＧＣ群とＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ａｂ群及びＧＣ＋ＡＬＮ群との間に有意な差は認められなかった（図８Ｂ）。【０２０９】
（２）薬剤による骨代謝（骨形成マーカーと骨吸収マーカー）への影響
投与観察期間の開始前及び６週間後に採血された血液サンプル中の骨形成マーカー（血清オステオカルシン）と骨吸収マーカー（血清ＴＲＡＣＰ−５ｂ）の測定結果を図９に示す。
ＧＣ群では骨吸収マーカーであるＴＲＡＣＰ−５ｂが６週間後（１２週齢）において、７５％増加した（図９Ａ、Ｂ）。
これに対し、ＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ａｂ群やＧＣ＋ＡＬＮ群では、血清ＴＲＡＣＰ−５ｂは有意に減少した（図９Ａ，Ｂ）。
一方、骨形成マーカーであるオステオカルシンはＳｈａｍ群においても６週齢から１２週齢にかけて２７％程度低下した（図９Ａ，Ｂ）。血清オステオカルシンはＧＣ群において若干の低下傾向を示したが、Ｓｈａｍ群やＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ａｂ群、ＧＣ＋ＡＬＮ群と比べて、有意な差は認められなかった（図９Ａ，Ｂ）。【０２１０】
（３）薬剤による一次海綿骨領域への影響
投与観察期間の終了時（１２週齢の時点）の脛骨近位部について、薬剤による成長への影響を組織学的に評価した結果を図１０−１、図１０−２に示す。図１０−１（Ａ）は、当該脛骨近位部をマイクロＣＴ撮影し、取得データを３次元再構築して得られた画像（３Ｄ−ＣＴ画像）の冠状断面写真を示す。３Ｄ−ＣＴ画像をみると、Ｓｈａｍ群と比較してＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ａｂ群では形態に大きな変化はなかったが、ＧＣ＋ＡＬＮ群（高用量）では、骨端部から骨幹端部にかけて丸みを帯びた盃状（カッピング）の形態を呈していた（正常ではラッパ状の形態）。【０２１１】
さらに詳細に各薬剤の一次海綿骨領域への効果を検討するために、組織学的検討を行った。
安楽死５日前にテトラサイクリン、続いて２日前にカルセインでラベリングした非脱灰組織標本を蛍光顕微鏡で観察し（図１０−１（Ｂ））、成長速度を評価した（図１０−２（Ｆ））。図１０−１（Ｂ）中、成長軟骨と平行に遠位にラベルされる部位が２日前に標識した領域（白下矢印）を示し、さらに遠位に平行にラベルされる部位が５日前に標識した領域（白上矢頭）を示す。当該２箇所のラベルされた領域の間の距離に基づいて、骨成長速度を評価した。
結果、Ｓｈａｍ群、ＧＣ群、ＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ａｂ群、ＧＣ＋ＡＬＮ群の間に有意な差は認められなかった（図１０−２（Ｆ））。【０２１２】
また、軟骨の評価に用いるサフラニンＯ染色（酸性ムコ多糖類を染色）標本を用いて、成長軟骨及び成長軟骨直下の一次海綿骨領域の観察を行った結果を図１０−１（Ｃ）に示す。一次海綿骨領域の骨内のサフラニンＯ染色陽性（赤色）の領域（軟骨基質）は、ＧＣ＋ＡＬＮ群において、Ｓｈａｍ群、ＧＣ群、ＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５Ａｂ群と比較して、サフラニンＯ染色陽性の領域が多くかつ遠位まで広く分布していることが認められた。成長軟骨幅はＧＣ＋ＡＬＮ群では若干低下する傾向を示すもののＳｈａｍ群、ＧＣ群、ＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ａｂ群と比較して統計学的有意差は認められなかった（図１０−２（Ｅ））。【０２１３】
さらに、一次海綿骨領域の骨吸収を評価する目的でＴＲＡＣＰ染色標本を観察した結果を図１０−２（Ｄ）に示す。ＧＣ群では、Ｓｈａｍ群と比較して一次海綿骨領域のＴＲＡＣＰ陽性細胞の増加が認められた。ＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ａｂ群におけるＴＲＡＣＰ陽性細胞は、ＧＣ群と同程度であった。一方、ＧＣ＋ＡＬＮ群におけるＴＲＡＣＰ陽性細胞は、Ｓｈａｍ群やＧＣ群と比べて、顕著な減少が認められた。さらに、一次海綿骨領域の骨表面に対する破骨細胞面（Ｏｃ．Ｐｍ／Ｂ．Ｐｍ（％））について定量的評価を行った結果、ＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ａｂ群とＧＣ群との間で有意な差はなかったが、ＧＣ群と比べてＡＬＮ投与群では有意な低下が認められた（図１０−２（Ｇ））。【０２１４】
（４）薬剤による二次海綿骨への影響
投与観察期間の終了時（１２週齢の時点）の大腿骨遠位骨幹端部について、薬剤による成長への影響を組織学的に評価した結果を図１１−１、図１１−２に示す。図１１−１（Ａ）は、当該大腿骨遠位骨幹端部をマイクロＣＴ撮影した画像（３Ｄ−ＣＴ画像）の冠状断面写真を示す。３Ｄ−ＣＴ画像をみると、Ｓｈａｍ群と比較してＧＣ群では成長帯直上領域では骨量の増加が認められたが、成長帯から近位側に離れた二次海綿骨領域（枠内）では骨量の低下が認められた（図１１−１（Ａ））。
ＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ａｂ群及びＧＣ＋ＡＬＮ群では、ともに成長帯直上から大腿骨の近位にむけた領域において用量依存的に骨量の増加が認められた。さらに、興味深いことに、ＧＣ＋ＡＬＮ群と比較してＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ａｂ群においては、より近位に近い領域まで骨量の増加が認められた。この結果は、長軸方向の成長がＡＬＮの投与によって障害されることを示唆している。【０２１５】
また、二次海綿骨領域（枠内）を関心領域として骨微細構造解析を行い、骨量の変化を定量的に評価した（図１１−１（Ｂ））。骨量（ＢＶ／ＴＶ（％））は、Ｓｈａｍ群と比較してＧＣ群で低下する傾向が認められ、ＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ａｂ群とＧＣ＋ＡＬＮ群（高用量）ではＧＣ群と比較して有意な増加が認められた。骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ（μｍ））は、Ｓｈａｍ群と比較してＧＣ群では有意差は認められなかったが、ＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ａｂ群の骨梁数（Ｔｂ．Ｎ（Ｎ／ｍｍ））はＧＣ群と比較して有意な増加が認められた。また、ＤＸＡ法を用いた同部位の骨密度測定において、大腿骨遠位部のＢＭＤはＳｈａｍ群と比較してＧＣ群において低下が認められ、ＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ａｂ群及びＧＣ＋ＡＬＮ群ではＧＣ群と比較して、用量依存的な増加が認められた（図１１−１（Ｃ））。【０２１６】
さらに、大腿骨遠位端部の圧縮試験を行い、大腿骨遠位部の力学的強度を評価した（図１１−２（Ｄ））。ＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ａｂ群では最大破断強度及び靱性のいずれにおいても用量依存的な増強が認められた。ＧＣ＋ＡＬＮ群においては、最大破断強度及び靱性のいずれにおいても増加傾向を示したがＧＣ群と比較して有意な差は認められなかった。大腿骨骨幹端部圧縮試験におけるＧＣ＋Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ａｂ群とＧＣ＋ＡＬＮ群の力学的強度の差は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５  Ａｂ群がより近位に近い領域まで広い範囲で骨量が増加したのに対し、ＧＣ＋ＡＬＮ群では骨量が増加した範囲が狭いことによるものと考えられる。【０２１７】
（５）結論
以上の結果より、二次海綿骨のリモデリングに働く破骨細胞は、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体、ビスフォスフォネートのいずれの薬剤によっても著明に減少し、これが骨量増加効果をもたらすことが確認された。特に興味深い点はビスフォスフォネートで治療された場合と比較して、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体で治療された場合には骨量増加の範囲が長軸方向に広い範囲で確認されたことである。成長期の小児では、成長帯直下で形成された一次海綿骨は次第に二次海綿骨にモデリングされるとともに押し出されるように骨幹部の方向に移動してゆく。ビスフォスフォネートで治療された場合はこの海綿骨の移動が遅くなるのに対し、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体ではそのような遅延が生じないことによって広い範囲で骨量増加が効率的に生じると考えられる。この結果は、小児骨粗鬆症において抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体がビスフォスフォネートと同等あるいはそれ以上の骨量増加効果を発揮する可能性を示唆するものであり、当該疾患の治療における有用性を示すものであるといえる。【０２１８】
骨の成長障害については、上記「Ａ．成長期健常ラットを用いた評価」の成長期健常ラットを用いた実験では、ビスフォスフォネートの投与により長管骨成長障害が生じた一方で、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の投与ではそのような障害は生じないことが確認された。また、組織学的には、ビスフォスフォネートの投与により成長帯軟骨の吸収や骨幹端部の一次海綿骨及び皮質骨のモデリングに働く破骨細胞が著明に減少した一方で、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の投与では減少しないことが確認された。この結果より、ビスフォスフォネートは成長帯近傍組織のモデリングに負の影響を及ぼす可能性があることが示唆された。なお、上記「Ｂ．小児ステロイド性骨粗鬆症モデルラットを用いた評価」の小児ステロイド性骨粗鬆症モデルラットを用いた実験では、ビスフォスフォネートの投与によって骨幹端付近の骨の形態異常が生じるものの、長軸方向の成長については有意な成長障害は観察されなかった。これは本骨粗鬆症モデルラットではステロイドによって重篤な成長障害が引き起こされ、その影響に比べてビスフォスフォネートによる影響が小さく目立たないものであることによると考えられる。実際に、ビスフォスフォネート高用量投与群では頭胴長や大腿骨長のいずれも低下する傾向が観察されている。【０２１９】
ビスフォスフォネート投与による骨幹端付近の骨の形態異常については、実際のヒト小児に対する使用例でも報告されており、長期使用による影響が懸念されている（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，２００３）。今日までに、小児ステロイド性骨粗鬆症に対するビスフォスフォネート製剤の長期使用に関する効果や安全性について、データはほとんど得られていないため、その使用については十分に注意が必要とされている（Ｃｏｃｈｒａｎｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｙｓｔ  Ｒｅｖ．２００７  Ｏｃｔ  １７；（４）：ＣＤ００５３２４．，Ｍａｒｉｎｉ  ＪＣ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００９  Ｍａｙ；５（５）：２４１−３．；米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｏｎｅｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｅａｌｔｈ−ｉｎｆｏ／ｂｏｎｅ／ｂｏｎｅ−ｈｅａｌｔｈ／ｊｕｖｅｎｉｌｅ／ｊｕｖｅｎｉｌｅ−ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ＃ａ））。【０２２０】
一方、上記の結果は、骨の成長帯近傍ではＳｉｇｌｅｃ−１５の代償機構が存在すること、また抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体による治療は二次海綿骨におけるリモデリング破骨細胞を抑制するが、骨の成長に関わるモデリング破骨細胞は抑制しないことを示すものである。故に、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体療法は小児骨粗鬆症患者にも比較的安全に使用することができ、成長障害、骨構造異常、骨質異常等が生じないきわめて合目的な治療法であるといえる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【国際調査報告】
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