(57)【要約】  検出対象である（本願における微粒子の定義に含まれる）微生物と共に血液や唾液が混在した試料液における微粒子測定において、高溶液導電率での誘電泳動トラップと、高感度及び高精度なインピーダンス計測を両立させることができる微粒子測定装置及び微粒子測定方法を提供する。微粒子測定装置は、微粒子含有の液体を導入するセル１と、セル１内部に浸漬する少なくとも一対の電極１１ａ，１１ｂと、一対の電極１１ａ，１１ｂ間に１ＭＨｚ付近の高周波数の交流電圧を印加し、微粒子に誘電泳動力を作用させる泳動電源部４と、一対の電極１１ａ，１１ｂ間に１０ｋＨｚ付近の低周波数の交流電圧を印加し、一対の電極１１ａ，１１ｂ間のインピーダンスを測定する測定部５と、一対の電極１１ａ，１１ｂ間のインピーダンスの時間変化を演算し、セル１内の微粒子数を算出する制御演算部６とを備える。
2010092773.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液及び唾液のうち少なくともいずれか一方に含まれる微粒子を含有する液体を導入するセルと、
前記セル内部に浸漬する少なくとも一対の電極と、
前記一対の電極間に交流電圧を印加する泳動電源部と、
前記一対の電極間のインピーダンスを測定する測定部と、
前記一対の電極間のインピーダンスの時間変化を演算し、前記セル内の前記微粒子の数を算出する制御演算部と、を備え、
前記制御演算部は、前記微粒子に誘電泳動を誘起するための第１の周波数の交流電圧、及び前記一対の電極間のインピーダンスを測定するための、ワールブルグインピーダンスの影響を生じる周波数よりも高い周波数である第２の周波数の交流電圧、を前記一対の電極間に印加するよう、前記泳動電源部に指示する微粒子測定装置。
【請求項２】
請求項１記載の微粒子測定装置であって、
前記第１の周波数の交流電圧は、第１の振幅を有し、
前記第２の周波数の交流電圧は、第２の振幅を有する微粒子測定装置。
【請求項３】
請求項２記載の微粒子測定装置であって、
前記第２の振幅は、前記第１の振幅より小さいものである微粒子測定装置。
【請求項４】
請求項１記載の微粒子測定装置であって、
前記制御演算部は、溶液導電率に基づいて、前記第１の周波数、及び前記第２の周波数の少なくともいずれかを調整する微粒子測定装置。
【請求項５】
請求項１記載の微粒子測定装置であって、
前記第１の周波数と前記第２の周波数を逐次切り替える微粒子測定装置。
【請求項６】
請求項５記載の微粒子測定装置であって、
前記第２の周波数の交流電圧を印加する時間が、第１の周波数の交流電圧を印加する時間より短い微粒子測定装置。
【請求項７】
請求項１記載の微粒子測定装置であって、
前記第２の周波数が、８００ｋＨｚより高く、前記第１の周波数よりも低い、微粒子測定装置。
【請求項８】
請求項１記載の微粒子測定装置であって、
前記泳動電源部は、前記一対の電極間に、前記第１の周波数の交流電圧及び前記第２の周波数の交流電圧を重畳して印加し、
前記一対の電極間に印加されている重畳された交流電圧のうち前記第２の周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離するフィルタ手段を備え、
前記測定部は、フィルタ分離された前記第２の周波数の交流電圧の周波数成分に対応する前記一対の電極間のインピーダンスを測定する微粒子測定装置。
【請求項９】
血液及び唾液のうち少なくともいずれか一方に含まれる微粒子を含有する試料液に浸漬した一対の電極間に交流電界を印加し、誘電泳動力により前記微粒子を所定位置に配置し、前記試料液中における前記微粒子の数を測定する微粒子測定方法であって、
前記一対の電極間に第１の周波数の交流電圧を印加し、前記微粒子に誘電泳動力を作用させるステップと、
前記一対の電極間に、前記一対の電極間のインピーダンスを測定するための、ワールブルグインピーダンスの影響が生じる周波数よりも高い周波数である第２の周波数の交流電圧を前記一対の電極間に印加し、前記一対の電極間のインピーダンスを測定するステップと、
前記一対の電極間のインピーダンスの時間変化を演算し、前記セル内の前記微粒子の数を算出するステップと、を有する微粒子測定方法。
【請求項１０】
請求項９記載の微粒子測定方法であって、
溶液導電率に基づいて、前記第１の周波数、及び前記第２の周波数を選択するステップを有する微粒子測定方法。
【請求項１１】
請求項９記載の微粒子測定装置であって、
前記一対の電極間に、前記第１の周波数の交流電圧、及び前記第２の周波数の交流電圧を重畳して印加するステップと、
前記一対の電極間に印加されている重畳された交流電圧のうち、前記第２の周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離し、前記一対の電極間のインピーダンスを測定するステップと、を有する微粒子測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、誘電泳動を用いて試料液中の微粒子数を測定するための微粒子測定装置及び微粒子測定方法に関する。更に詳しくは、溶液導電率の影響を前処理なしに回避し、高感度、高精度に測定する微粒子測定装置及び微粒子測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今、食中毒や感染症などの原因となり、人体に何らかの害を及ぼす可能性がある微生物を、迅速、簡便、高感度に定量測定するニーズは特に高い。食品の製造工程や微生物検査施設を備えない診療所などにおいて、その場で微生物検査を実施することで、食中毒や感染症などの防止、予防が可能になるためである。【０００３】
また、いわゆるバイオセンサにおいて、抗体など、測定対象に特異的に結合する物質を標識したポリスチレンなどの人工微粒子を用いて、検体中の生化学的物質を定量測定する際に、検体中の微粒子数あるいはその結合状態を定量測定する必要がある。このように、昨今、液体中に含まれる微粒子を迅速、簡便、定量的に測定する要求は高い。【０００４】
ここで、本願における微粒子の定義について説明する。本願で言う微粒子とは、ポリスチレンやそれらに何らかのコーティングを施した粒子、カーボンナノチューブ、金コロイドなどの金属粒子、細菌、真菌、放線菌、リケッチア、マイコプラズマ、ウイルス、として分類されているいわゆる微生物、原生動物や原虫のうちの小型のもの、生物体の幼生、動植物細胞、精子、血球、核酸、蛋白質等も含む広い意味での生体又は生体由来の微粒子である。この他にも、本願で言う微粒子とは、誘電泳動可能な大きさのあらゆる粒子を意味する。本願では特に、微生物の測定を想定している。【０００５】
特に本願の検出対象は、ヒト又は動物の、血液及び唾液中に含まれる微生物、若しくは、ヒト又は動物の、血液や唾液が付着した粘膜等の表面から採取された微生物を想定する。ヒト又は動物の、血液や唾液中には、イオンが高濃度で含まれるため、測定溶液の導電率の上昇や変動を招き、誘電泳動を利用した検出方法の変動要因となる。【０００６】
従来、微生物の検査法として最も一般的に用いられるのは培養法である。培養法は、培地上に微生物検体を塗抹し、微生物が生育条件下で培養を行い、形成される培地上のコロニー数を計数することで微生物数を定量する方法である。【０００７】
しかし、コロニー形成までに通常１〜２日、微生物種によっては数週間を要するため、迅速な検査を実施できない問題があった。また、濃縮や希釈、培地への塗抹などが必要なため、専門家による操作が必要であり、簡便な検査が実施できない、あるいは操作上のバラツキによる精度低下の問題があった。【０００８】
これら従来の問題を解決するため、本発明者は他の発明者らと共に、迅速、簡便、高感度な微生物数測定法として、誘電泳動とインピーダンス計測を組み合わせたＤＥＰＩＭ（Dielectrophoretic Impedance Measurement Method）法を提案した（例えば、特許文献１を参照）。【０００９】
ＤＥＰＩＭ法は、微生物を誘電泳動力によってマイクロ電極に捕集し、同時にマイクロ電極のインピーダンス変化を測定することによって試料液中の微生物数を定量測定する方法である。以下、その測定原理について概説する。【００１０】
微生物は一般に、イオンリッチで誘電率及び導電率の高い、細胞質及び細胞壁が、比較的誘電率及び導電率の低い、細胞膜に囲まれた構造を有し、誘電体粒子とみなすことができる。ＤＥＰＩＭ法では、電界中で分極した誘電体粒子に一定方向に働く力である誘電泳動力を利用し、誘電体粒子である微生物をマイクロ電極のギャップ間に捕集する。【００１１】
誘電体粒子に働く誘電泳動力ＦＤＥＰは、以下の（数１）で与えられることが公知である（例えば、非特許文献１を参照）。以下、誘電体粒子が、微生物である場合を例として説明する。【００１２】
【数１】
2010092773.tif 000003
【００１３】
ここで、a：球形近似したときの微生物の半径、ε０：真空の誘電率、εｍ：試料液の比誘電率、Ｅ：電界強度であり、▽は演算子で勾配（gradient）を表す。この場合、▽Ｅ２は、電界Ｅ２の勾配なので、その位置でどれだけＥ２が傾斜を持っているか、つまり電界Ｅが空間的にどれだけ急に変化をするかを意味する。また、Ｋはクラウジウス・モソッティ数と呼ばれ、（数２）で表され、Ｒｅ［Ｋ］＞０は正の誘電泳動を表し、微生物は電界勾配と同方向、つまり、電界集中部に向かって泳動される。Ｒｅ［Ｋ］＜０は負の誘電泳動を表し、電解集中部から遠ざかる方向、すなわち弱電界部に向かって泳動される。【００１４】
【数２】
2010092773.tif 000004
【００１５】
ここで、εｂ＊及びεｍ＊はそれぞれ、微生物及び溶液の複素比誘電率を表し、一般に複素比誘電率εｒ＊は（数３）で表される。【００１６】
【数３】
2010092773.tif 000005
【００１７】
ここで、εｒ：微生物あるいは試料液の比誘電率、σ：微生物あるいは試料液の導電率、ω：印加電界の角周波数を表す。【００１８】
（数１）（数２）（数３）から、誘電泳動力は、微生物の半径、クラウジウス・モソッティ数の実部（以下、Ｒｅ［Ｋ］と表す）及び電界強度に依存することが分かる。また、Ｒｅ［Ｋ］は、試料液及び微生物の複素誘電率、電界周波数に依存して変化することが分かる。【００１９】
そのため、ＤＥＰＩＭ法では、これらのパラメータを適切に選択し、微生物に働く誘電泳動力を十分大きくし、微生物を電極ギャップに確実に捕集する必要がある。また、ＤＥＰＩＭ法では、上記誘電泳動による電極への微生物捕集と同時に、電気的計測を行い、試料液中の微生物数を定量測定することを特徴としている。【００２０】
微生物は、前述した構造を有するため、電気的には固有のインピーダンスを持った微粒子と考えることができる。そのため、誘電泳動によりマイクロ電極のギャップ間に捕集される微生物数が増加すると、その捕集数に応じて電極間のインピーダンスが変化する。【００２１】
従って、電極間インピーダンス時間変化の傾きは、単位時間当たりに電極ギャップ間に捕集される微生物数に応じた値となり、傾きの大きさは試料液中の微生物濃度に対応する。よって、電極間インピーダンス時間変化の傾きを測定することで、試料液中の微生物濃度、言い換えれば微生物数を測定することが可能となる。【００２２】
更に、ＤＥＰＩＭ法では、誘電泳動を開始直後のインピーダンス時間変化の傾きから微生物数を定量することで、短時間での微生物測定を実現している。以上、ＤＥＰＩＭ法の測定原理について概説したが、詳しくは非特許文献２を参照されたい。【００２３】
ところで、本願で測定に用いる試料液は、血液や唾液など、何らかの方法によって採取した微生物を、水を主成分とする低導電率の液体で懸濁したものを想定しているが、微生物を採取する際、微生物だけでなく周辺に含まれるイオンも同時に採取されると考えられる。この場合、試料液の誘電率は水とほぼ同じ値になり、結局、微生物に働く誘電泳動力は試料液のイオン濃度、言い換えれば、導電率に依存することになる。【００２４】
一般に、試料液導電率が高くなるほど誘電泳動力は小さくなる。そのため、従来のＤＥＰＩＭ法で上記のような試料液の測定を想定した場合、試料液導電率の高い試料では、微生物に働く誘電泳動力が低下しマイクロ電極に捕集される微生物数が少なくなる結果、測定感度が低下するという問題があった。更に、試料液導電率によって微生物に働く誘電泳動力が異なるため、異なる導電率の試料液を測定したときの測定結果バラツキが大きいという問題があった。【００２５】
誘電泳動を利用した微生物等の測定に際し、上記問題を解決するための手段として、測定前にイオン交換等により試料液導電率を低減する技術が公知である。この技術は、分析前に試料液をイオン交換カラムで処理を行い、試料液導電率を低減した後、誘電泳動により試料液中の微生物を分析する方法である（例えば、特許文献２を参照）。【００２６】
また、微生物の活性を測定する場合に、ほぼリアルタイムの迅速測定を行い、微生物活性を簡便且つ定量的に検出する微生物活性測定装置及びそのとき使用する微生物活性の測定方法が知られている。この方法は、微生物種類と試料液の導電率を入力し、活性を測定する最適な電圧（振幅と周波数）を表１のテーブルから選択するものである（例えば、特許文献３参照）。【００２７】
また、誘電泳動とインピーダンス計測を同時に行う際に、誘電泳動を誘起するための電圧とインピーダンス計測を行うための電圧及び周波数をそれぞれ独立して設定する測定方法が知られている。典型的には誘電泳動を行うための電圧は１２Vrms以上・１ｋＨｚ〜５０MHｚ、インピーダンス計測を行うための電圧は０．８Vｒｍｓ・８００Hzとされている（非特許文献３参照）。【００２８】
【表１】
2010092773.tif 000006
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２９】
【特許文献１】日本国特開２０００−１２５８４６号公報
【特許文献２】日本国特表平１１−５０１２１０号公報
【特許文献３】日本国特開２００３−０００２２４号公報
【非特許文献】
【００３０】
【非特許文献１】Hywel Morgan、他:「AC Electrokinetics:colloids and nanoparticles」、RESERCH STUDIES PRESS LTD.2003年出版、pp.15~63
【非特許文献２】J.Suehiro, R.Yatsunami, R.Hamada, M,Hara，J.Phys. D: Appl. Phys. 32(1999)2814-2820
【非特許文献３】DWE Allsopp et al,J.phys.D:Appl.Phys.32(1999)PP.1066-1074
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
誘電泳動を利用した微生物の操作は一般に、試料液の導電率が上昇したときに正の誘電泳動力が小さくなり、微生物を電極ギャップにトラップすることが困難になるという課題を有している。この課題を解決するためには、試料液導電率の上昇に対して誘電泳動力の変化（低下）が小さい、１ＭＨｚ以上の比較的高い周波数で誘電泳動を行う必要がある。また、インピーダンス変化測定のために十分な大きさの誘電泳動力を誘起する必要があるため、印加電圧は大きくする必要があり、結果として電極に流れる電流が大きくなる。このように、周波数が高く、且つ、測定する電圧（電流）の振幅が大きい場合、スルーレートが高くなるため、アンプ回路など素子の性能の制限から、一般にインピーダンス測定は困難になり、測定精度が低下してしまう。このため、インピーダンス測定回路にとっては、インピーダンスを測定するための電圧の条件は、振幅が小さく、周波数が低い方が有利となる。すなわち、誘電泳動による微生物の電極へのトラップと、高精度なインピーダンス計測を両立するための手段が必要である。【００３２】
しかしながら、特許文献１には、平板電極間に周波数１ＭＨｚでピーク電圧１００Ｖの正弦波交流電圧を印加する例が記載され、この時印加する交流の周波数は誘電泳動が生じる周波数範囲であれば任意に選ぶことが可能とされているが、周波数選択により溶液導電率の影響を回避すること、及び高精度なインピーダンス測定を両立するための手段に関する示唆はない。【００３３】
また、特許文献２に記載の技術によれば、誘電泳動による分析を行う前にイオン交換という前処理が必要であるため、微生物測定の簡便性が損なわれるし、測定全体にかかる時間も長くなるという問題があった。さらに、イオン交換処理後の試料液導電率は、イオン交換処理前の試料液導電率に依存するため、試料毎の導電率バラツキによって、ＤＥＰＩＭ法など、誘電泳動を用いた微生物測定の結果にバラツキを生じるという問題を解決できない。【００３４】
また、特許文献３の微生物活性測定装置は、微生物種類と試料液の導電率を入力し、活性を測定する最適な電圧（振幅と周波数）をテーブルから選択するものであり、活性状態によって誘電泳動力に差が生じる周波数を選択するものである。【００３５】
また、非特許文献３に記載の技術によれば、誘電泳動とインピーダンス計測それぞれを行うための電圧条件を個別に選択することができるため、試料液の導電率上昇に対して誘電泳動力の変化が小さい１ＭＨｚ以上の高周波で誘電泳動を行うことができるが、インピーダンス計測を行う低周波においてワールブルグインピーダンスの影響が顕著になり、正しいインピーダンス計測ができず、測定結果の正確さを著しく損なう場合があるという課題を有していた。【００３６】
上述したワールブルグインピーダンスの影響を具体的に示す例として、非特許文献３に記載の技術において、一方のセルに含まれるサンプルの導電率、及び他方のセルに含まれる測定対象の導電率を精度よく一致させた上でインピーダンス計測をしないと、電極の分極（electrode polarization）の寄与度が大きくなり、正しいインピーダンス測定が測定結果の正確さを著しく損なう場合がある。【００３７】
特に、上述のように、本願における微粒子の定義に含まれ、且つ検出対象である微生物と共に、血液や唾液が混在した試料液では、検体を採取するヒト又は動物、若しくはその検体を採取する時間が異なると、導電率が大きく変化してしまう。そのため、非特許文献３に記載の技術において、検出対象である微生物と共に、血液や唾液が混在した試料液を測定する場合、一方のセルに含まれるサンプルの導電率と、他方のセルに含まれる測定対象の導電率を精度よく一致させる必要があるが、これは困難である。したがって、正しいインピーダンス測定ができず、測定結果の正確さを著しく損なう。【００３８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ヒト又は動物の、血液又は唾液中に含まれる微生物、若しくは、血液又は唾液が付着した粘膜などの表面から採取された微生物を検出対象とし、測定する試料液の溶液導電率が高く、且つ検体毎に変動する場合、高溶液導電率での誘電泳動トラップと、高感度及び高精度なインピーダンス計測を両立させることができる微粒子測定装置及び微粒子測定方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００３９】
本発明者らは、微粒子のなかでも特に、細菌を誘電泳動する際に、溶液導電率の影響を回避可能な周波数領域があり、それとは別に、高精度なインピーダンス計測に適した周波数領域及び振幅があることを見出した。本発明は、かかる知見に基づき達成されたものである。【００４０】
本発明に係る微粒子測定装置は、血液及び唾液のうち少なくともいずれか一方に含まれる微粒子を含有する液体を導入するセルと、前記セル内部に浸漬する少なくとも一対の電極と、前記一対の電極間に交流電圧を印加する泳動電源部と、前記一対の電極間のインピーダンスを測定する測定部と、前記一対の電極間のインピーダンスの時間変化を演算し、前記セル内の前記微粒子の数を算出する制御演算部と、を備え、前記制御演算部は、前記微粒子に誘電泳動を誘起するための第１の周波数の交流電圧、及び前記一対の電極間のインピーダンスを測定するための、ワールブルグインピーダンスの影響を生じる周波数よりも高い周波数である第２の周波数の交流電圧、を前記一対の電極間に印加するよう、前記泳動電源部に指示する。【００４１】
この構成によれば、第１の周波数の交流電圧を印加して微粒子に誘電泳動力を作用させ、境界周波数以上の周波数である第２の周波数の交流電圧を印加してインピーダンスを測定するので、高溶液導電率での誘電泳動トラップと、高感度及び高精度なインピーダンス計測を両立させることができる。【００４２】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記第１の周波数の交流電圧が、第１の振幅を有し、前記第２の周波数の交流電圧が、第２の振幅を有するものである。【００４３】
この構成によれば、第１の周波数の交流電圧は第１の振幅を有し、第２の周波数の交流電圧は第２の振幅を有するので、誘電泳動とインピーダンス計測のそれぞれに適切な電圧を印加することができる。【００４４】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記第２の振幅が、前記第１の振幅より小さいものである。【００４５】
この構成によれば、インピーダンスを測定するための第２の周波数の交流電圧が、誘導泳動に影響を及ぼすことを防ぐ効果がある。【００４６】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記制御演算部が、溶液導電率に基づいて、前記第１の周波数、及び前記第２の周波数の少なくともいずれかを調整するものである。【００４７】
この構成によれば、溶液導電率に基づいて第１の周波数及び第２の周波数を調整するので、溶液導電率が変動した場合でも、適切な周波数で誘電泳動及びインピーダンス計測を行うことができる。【００４８】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記第１の周波数と前記第２の周波数を逐次切り替えるものである。【００４９】
この構成によれば、第１の周波数と第２の周波数を逐次切り替えるので、誘電泳動及びインピーダンス計測を迅速に行うことができ、それぞれに最適な条件を選択することができる。【００５０】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記第２の周波数の交流電圧を印加する時間が、第１の周波数の交流電圧を印加する時間より短いものである。【００５１】
この構成によれば、インピーダンス測定を行う第２の周波数の電圧を印加中に、誘電泳動力が喪失することによって電極から微粒子が飛散することなく、確実に微粒子を電極にトラップすることができるため、高感度な測定を実現できる。【００５２】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記第２の周波数が、８００ｋＨｚより高く、前記第１の周波数よりも低いものである。【００５３】
この構成によれば、高周波で微粒子をトラップし低周波でインピーダンスを計測するので、高溶液導電率での誘電泳動トラップと、低周波数でインピーダンス計測を行うことによる高感度及び高精度なインピーダンス計測とを両立させることができる。【００５４】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記泳動電源部が、前記一対の電極間に、前記第１の周波数の交流電圧及び前記第２の周波数の交流電圧を重畳して印加し、前記一対の電極間に印加されている重畳された交流電圧のうち前記第２の周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離するフィルタ分離手段を備え、前記測定部が、フィルタ分離された前記第２の周波数の交流電圧の周波数成分に対応する前記一対の電極間のインピーダンスを測定するものである。【００５５】
この構成によれば、第１の周波数及び第２の周波数の交流電圧を重畳して印加し、第２の周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離し、一対の電極間のインピーダンスを測定するので、計測回路の設計を簡素化して低コスト化することができるとともに、第１の周波数及び第２の周波数の交流電圧を重畳して印加することにより、微粒子のトラップとインピーダンス測定を同時に行うことができるため、第１の周波数から第２の周波数に切替を行った際に微粒子に働く誘電泳動力が低下して電極ギャップから微粒子が離れることを防ぐことができ、高精度・高感度の測定を行うことが出来る。【００５６】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、血液及び唾液のうち少なくともいずれか一方に含まれる微粒子を含有する試料液に浸漬した一対の電極間に交流電界を印加し、誘電泳動力により前記微粒子を所定位置に配置し、前記試料液中における前記微粒子の数を測定する微粒子測定方法であって、前記一対の電極間に第１の周波数の交流電圧を印加し、前記微粒子に誘電泳動力を作用させるステップと、前記一対の電極間に、前記一対の電極間のインピーダンスを測定するための、ワールブルグインピーダンスの影響が生じる周波数よりも高い周波数である第２の周波数の交流電圧を前記一対の電極間に印加し、前記一対の電極間のインピーダンスを測定するステップと、前記一対の電極間のインピーダンスの時間変化を演算し、前記セル内の前記微粒子の数を算出するステップと、を有する。【００５７】
この構成によれば、第１の周波数の交流電圧を印加して微粒子に誘電泳動力を作用させ、境界周波数以上の周波数である第２の周波数の交流電圧を印加してインピーダンスを測定するので、高溶液導電率での誘電泳動トラップと、高感度及び高精度なインピーダンス計測を両立させることができる。【００５８】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、溶液導電率に基づいて、前記第１の周波数、及び前記第２の周波数を選択するステップを有する。【００５９】
この構成によれば、溶液導電率に基づいて第１の周波数及び第２の周波数を選択するので、溶液導電率が変動した場合でも、適切な周波数で誘電泳動及びインピーダンス計測を行うことができる。【００６０】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、前記一対の電極間に、前記第１の周波数の交流電圧、及び前記第２の周波数の交流電圧を重畳して印加するステップと、前記一対の電極間に印加されている重畳された交流電圧のうち、前記第２の周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離し、前記一対の電極間のインピーダンスを測定するステップと、を有する。【００６１】
この構成によれば、第１の周波数及び第２の周波数の交流電圧を重畳して印加し、第２の周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離し、一対の電極間のインピーダンスを測定するので、計測回路の設計を簡素化して低コスト化することができるとともに、第１の周波数及び第２の周波数の交流電圧を重畳して印加することにより、微粒子のトラップとインピーダンス測定を同時に行うことができる。
【発明の効果】
【００６２】
本発明によれば、血液や唾液など、本願における微粒子の定義に含まれる微生物を測定対象とした微粒子測定において、第１の周波数の交流電圧を印加して微粒子に誘電泳動力を作用させ、境界周波数以上の周波数である第２の周波数の交流電圧を印加してインピーダンスを測定するので、高溶液導電率での誘電泳動トラップと、高感度及び高精度なインピーダンス計測を両立させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明の第１の実施形態にかかる微粒子測定装置を説明するための概略構成図（１）
【図２】本発明の実施形態にかかる微粒子測定装置の電極チップを説明するための概略図
【図３】本発明の実施形態において測定電極１１ａ，１１ｂ間に印加される電圧によって生じる電気力線１５を示す図
【図４】図４（ａ）、（ｂ）は電極１１ａ、１１ｂの対向するエッジ部に微粒子１４が電気力線に沿ってトラップされる説明図
【図５】本発明の第１の実施形態にかかる微粒子測定装置を説明するための概略構成図（２）
【図６】本発明の第１の実施形態にかかる微粒子測定装置を説明するための概略構成図（３）
【図７】図７（ａ）、（ｂ）は誘電泳動用交流電圧の周波数をパラメータとした場合に、溶液導電率（μＳ／ｃｍ）とＲｅ［Ｋ］の関係を示すグラフ
【図８】誘電泳動用交流電圧の周波数（Ｈｚ）とクラウジウス・モソッティ数の実部（Ｒｅ［Ｋ］）の関係を示すグラフ
【図９】本発明の第１の実施形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャート
【図１０】誘電泳動用交流電圧の周波数をパラメータとした場合における、溶液導電率（μＳ／ｃｍ）とクラウジウス・モソッティ数の実部（Ｒｅ［Ｋ］）の関係を示すグラフ
【図１１】溶液内の微粒子数をパラメータにした場合における、インピーダンス測定用交流電圧の周波数と溶液のインピーダンスの関係を示すグラフ
【図１２】溶液導電率（μＳ／ｃｍ）をパラメータとした場合における、泳動電圧の周波数（Ｈｚ）とＲｅ［Ｋ］の関係を示すグラフ
【図１３】本発明の実施例における、周波数を掃引して測定した場合の電極インピーダンスの実部（横軸）と虚部（縦軸）の関係を示す図
【図１４】本発明の第２の実施形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャート
【図１５】本発明の実施例における電極を示す図
【図１６】本発明の実施例における、泳動電圧の周波数を、（ａ）は１００ｋＨｚ、（ｂ）は８００ｋＨｚ、（ｃ）は３ＭＨｚとしたときの、電圧印加４０秒後の電極ギャップの様子を示す図
【図１７】本発明の実施例における、試料液導電率を３００μＳ／ｃｍとし、泳動電圧の周波数を（ａ）は８００ｋＨｚ、（ｂ）は３ＭＨｚとしたときの電極ギャップの様子を示す図
【図１８】図１８（ａ）、（ｂ）は本発明の実施例における、泳動電圧の周波数として３ＭＨｚ、１０Ｖｐ−ｐを印加し、測定電圧の周波数として１００ｋＨｚを重畳して印加した場合の、電極ギャップの様子を示す図
【図１９】図１９（ａ）、（ｂ）は本発明の実施例における、大腸菌濃度とＤＥＰＩＭ測定の応答値（キャパシタンスの傾き）を対数表示したグラフを示す図
【図２０】本発明の実施例における、溶液の導電率が２４０μＳ／ｃｍのときの電極インピーダンスのコールコールプロット
【図２１】本発明の実施例における、測定電圧の周波数として（ａ）は１００ｋＨｚ、（ｂ）は８００ｋＨｚを重畳して印加した場合の、電極ギャップの様子を示す図
【発明を実施するための形態】
【００６４】
（第１の実施形態）
以下、本発明の実施の形態の微生物測定装置について、図面を用いて説明する。図１は、本実施形態の微生物測定装置の構成図、図２は、本実施形態の微生物測定装置の電極チップを表す概略図である。
【００６５】
図１において、１は測定対象の微生物が含まれる試料液２を保持するセル、３は誘電泳動で微生物を捕集する電極対を含む電極チップ、４は泳動電源部、５は誘電泳動によってトラップされた微生物によって生じた光学的あるいは電気的な変化を測定する測定部、６は微生物測定装置全体の制御や測定結果の解析演算や入出力処理などを行う制御演算部、７は試料液２の導電率を入力するための導電率入力手段である。
【００６６】
図２において、１０は基板、１１ａ、１１ｂは基板１０上に形成され一対の極をなす電極、１３は電極１１ａと１１ｂとの電極間ギャップである。基板１０には、金属などの導電性材料によって電極１１ａ、１１ｂのパターンが形成される。好ましい材料の一例としては、金、銀、銅、アルミニウム、白金など、十分な導電性を有することが望ましく、本実施の形態では銀を使用している。
【００６７】
図３は、測定電極１１ａ，１１ｂ間に印加される電圧によって生じる電気力線１５を示す。本実施の形態では測定電極１１ａ，１１ｂ間のギャップ１３付近の構成が電界集中部にあたり、中でも最も電界が集中するのはギャップ１３である。従ってギャップ１３部分にもっとも強く微生物が泳動される。
【００６８】
電極１１ａ、１１ｂはその幅に対して十分に薄い薄膜であることが望ましく、例えば１００μmの幅に対して厚さ１０００Å程度である。これにより、厚さ方向で見たエッジ部分に不平等電界が形成され、微生物を効率的に誘電泳動することが可能となる。
【００６９】
電極１１ａ、１１ｂのパターニングを行う方法は、選択した材料で所望のパターンを形成できれば良い。例えば、金属薄膜をスパッタあるいは蒸着、めっきなどにより形成し、フォトリソグラフィー、レーザー加工などによってパターンを形成する方法、印刷などの、直接パターンを形成する方法など、電極を形成するために用いられる一般的なプロセスが選択可能である。生産性やコストなどを勘案して最も適切なプロセスを選択すればよい。本実施の形態では、スパッタによって銀の薄膜を形成し、フォトリソグラフィーによってパターンを形成している。
【００７０】
電極１１ａ、１１ｂはそれぞれ泳動電源部４に接続されており、泳動電源部４は電極１１ａ、１１ｂ間に特定周波数の交流電圧を印加する。なお、ここで交流電圧というのは、正弦波のほか、ほぼ一定の周期で流れの向きを変える電圧のことであり、且つ両方向の電流の平均値が等しいものである。後述するが、泳動電源部４が印加する周波数は、制御演算部６によって適切に決定される。
【００７１】
電極チップ３が試料液２中に浸漬され、電極１１ａ、１１ｂが試料液２に接した状態で、電極１１ａ、１１ｂ間に交流電圧が印加されると、試料液２中に含まれる微生物が、電極１１ａと１１ｂに挟まれたギャップ１３に、誘電泳動力によって捕捉される。
【００７２】
微粒子１４に正の誘電泳動力が働く場合は図４（ａ）のように電界集中部であるギャップ１３の領域中、電極１１ａ、１１ｂの対向するエッジ部に、微粒子１４が電気力線に沿ってパールチェーンと呼ばれる数珠状にトラップされる。
【００７３】
一方、微粒子１４に負の誘電泳動が働く場合は、図４（ｂ）のように、電界集中部から遠ざかる方向、すなわち弱電界部であるギャップ１３の領域中、電極１１ａ、１１ｂの対向する中心部分にかけてトラップされる。
【００７４】
測定部５は、このようにしてギャップ１３にトラップされた微生物によるインピーダンス変化を測定する。具体的には、図５に示すように、泳動電源部４と電極チップ３の間に、測定部５を電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスを測定する回路を構成する。
【００７５】
この場合、測定部５は電極１１ａ、１１ｂ間に流れる電流値と、泳動電源部４が印加した電圧と電流の位相差を測定するための回路等から構成される。測定部５は、誘電泳動によって微生物が移動し電界集中部近傍に濃縮されることに起因する電極１１ａ、１１ｂ間の電流及び位相差の変化を測定する。尚、ここで行う電流値の測定は、電極に直列に検出抵抗を配置し、その電圧降下から電流値に変換したり、一般的なオペアンプを用いた電流―電圧変換回路など、公知の方法が利用可能である。
【００７６】
測定部５で測定した電流値と位相差は、制御演算部６に渡される。制御演算部６は、これら電流、位相差、及び、泳動電源部４が印加している電圧及び周波数の情報から、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンス値を計算する。
【００７７】
電圧印加前、電極１１ａ、１１ｂ間の試料液２のみで満たされた領域が、誘電泳動によるトラップによって誘電率の異なる微生物で置き換えられることで、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスはトラップされた微生物数に応じて変化する。
【００７８】
従って、ある時間におけるインピーダンス値と、電圧印加直後の初期インピーダンス値との差分、言い換えれば変化分から、ギャップ１３にトラップされた微生物数を推定することが可能である。そして、トラップされた微生物数は試料液中に含まれる微生物濃度に依存するものであるから、試料液中の微生物数を測定することが可能になる。
【００７９】
測定部５はまた、図６に示すように、光学的測定手段によっても実現可能である。この場合、光源２１と受光部２２の光路内にギャップ１３が含まれるような位置関係にセル１を配置する。ギャップ１３にトラップされた微生物数によって、受光部２２に入射する光量が変化することを利用して、ギャップ１３にトラップされた微生物数を推定することができる。
【００８０】
あるいは、受光部２２の情報を制御演算部６に渡して画像化し、制御演算部６が粒子判定アルゴリズムなどを用いて直接粒子数を計数してもよいし、視野面積に対する微粒子面積を求めることで微粒子数に換算してもよい。このようにして得られたギャップ１３にトラップされた微生物数は試料液中に含まれる微生物濃度に依存するものであるから、試料液中の微生物数を測定することが可能になる。
【００８１】
以上のように微生物をギャップ１３にトラップするためには、微生物に働く粘性力や重力、ブラウン運動など、誘電泳動以外の全ての外力に対して十分大きな誘電泳動力を誘起する必要がある。これが不十分であれば、測定部５が測定できる微生物数が減少するため、測定感度及び精度が著しく低下し、測定部５が測定可能な信号の大きさを下回ると微生物の測定が出来なくなる。
【００８２】
従って、本実施の形態では、微生物をギャップ１３にトラップするために十分な誘電泳動力が働くような周波数を、制御演算部６が適切に決定し、決定した周波数の電圧を泳動電源部４が印加する。これにより、測定部５が十分に検出可能な信号を取り出すことが出来るため、微生物濃度の測定が高精度且つ高感度に行える。
【００８３】
制御演算部６は、図示しないＣＰＵや、一連の動作を規定するプログラムや各種データが格納されたメモリ６ａなどの回路から構成され、一連の測定動作を制御する。導電率入力手段７は、試料液の導電率を、測定前に入力できるようになっている。例えば、テンキーで数値入力する方法や、「０〜５０μＳ／ｃｍ」、「５０〜１００μＳ／ｃｍ」など複数の導電率範囲に対応したスイッチを押下するなどの方法で実現できる。
【００８４】
メモリ６ａは、導電率入力手段７から与えられた試料液の導電率の値から、泳動電源部４が印加する電圧の適切な周波数を選択するための周波数選択テーブルを有する。周波数選択テーブルには、試料液２の導電率毎に、微生物に十分な誘電泳動力が働く最適な周波数と印加電圧値がテーブル化されている。
【００８５】
ここで、メモリ６ａに格納されている周波数選択テーブルについて詳説する。表２に示すように、周波数選択テーブルは少なくとも、試料液の導電率、印加する交流電圧の振幅、最適周波数が互いに関連付けられて格納されている。試料液の導電率は特定の数値であってもよいし、ある範囲を設定してテーブルを作成してもよい。制御演算部６は、与えられた導電率に該当する交流電圧の振幅と最適周波数を選択する。尚、導電率３００μS／ｃｍ〜に対応する周波数の“Ｅ”は、エラーであることを示しており、あまりにも導電率が高い場合には測定が出来ないことを表している。尚、表２に挙げた数値はあくまでも一例であり、実際には測定対象や導電率、電極設計によって最適な値とする。
【００８６】
【表２】
2010092773.tif 000007
【００８７】
次に、最適周波数について説明する。（数１）において、誘電泳動力ＦＤＥＰは、クラウジウス・モソッティ数Ｋの実部、すなわちＲｅ［Ｋ］に比例する。そして、Ｒｅ［Ｋ］は、（数２）及び（数３）から明らかなように、試料液２の導電率に依存する。試料液２の導電率が変化した場合、Ｒｅ［Ｋ］すなわち誘電泳動力がどのように変化するかを示したものが図７である。
【００８８】
図７においては、誘電泳動に用いる電界、言い換えれば印加電圧の周波数をパラメータに、試料液２の導電率の関数として示している。Ｒｅ［Ｋ］は、誘電泳動力ＦＤＥＰに対応しており、その正負は誘電泳動力が引力として作用するか、あるいは斥力として作用するかにそれぞれ対応する。
【００８９】
図７（ａ）に示すように、たとえば、誘電泳動用交流電圧の周波数が（１）１０ｋＨｚの場合は、溶液導電率３μＳ／ｃｍ付近でＲｅ［Ｋ］が正から負に変わっており、微粒子に作用する誘電泳動力ＦＤＥＰが引力から斥力に変化する。
【００９０】
一方、誘電泳動用交流電圧の周波数が（２）１００ｋＨｚの場合は、溶液導電率３０μＳ／ｃｍ付近でＲｅ［Ｋ］が正から負に変わっており、微粒子に作用する誘電泳動力ＦＤＥＰが引力から斥力に変化する。
【００９１】
なお、図７（ｂ）は、誘電泳動用交流電圧の周波数が（２）１００ｋＨｚ及び（３）８００ｋＨｚの場合に、溶液導電率を１μＳ／ｃｍ〜１０００μＳ／ｃｍまで変化させた場合の誘電泳動力ＦＤＥＰの変化を示す。周波数が（２）１００ＫＨｚの場合、約２０μＳ／ｃｍ以上でＲｅ［Ｋ］＜０となるが、８００ＫＨｚでは導電率上昇に対する誘電泳動力の低下が抑えられ、約２５０μＳ／ｃｍまでＲｅ［Ｋ］＞０となり引力によりギャップ１３のエッジ部にトラップすることができる。
【００９２】
このことは、試料液の導電率上昇に対して最も誘電泳動力の低下が小さくなる最適な周波数が存在することを示している。この最適周波数を決定するには、次のような実験を行って決定するのがよい。すなわち、同じ微粒子濃度で、導電率を変えた複数の試料液を用意し、それぞれの試料液に対して印加電圧の周波数を変えながら測定を行う。その結果、測定応答が最も大きくなった周波数が、それぞれの試料液導電率に対する最適周波数となる。表２に示した最適周波数は、このようにして決定する。
【００９３】
しかしながら、あまりにも周波数が高いと測定回路の実現が困難となり、あまりにも周波数が低いとジュール熱による対流や、極端な場合、電気分解による気泡発生が測定に悪影響をもたらす。このため、最適周波数は、誘電泳動にとって最適とはいえないが、微粒子測定を行うのに十分な誘電泳動を働かせることの出来る、許容範囲の周波数が存在する。
【００９４】
図８は、溶液導電率（μＳ／ｃｍ）をパラメータとした場合における、誘電泳動用交流電圧の周波数（Ｈｚ）とクラウジウス・モソッティ数の実部（Ｒｅ［Ｋ］）の関係を示すグラフである。試料液の導電率１００μＳ／ｃｍにおいて、正の誘電泳動を利用して微粒子の測定を行う場合、測定応答を得られる十分な誘電泳動力がＲｅ［Ｋ］＞０．４であるため、最適周波数は約７００ｋＨｚ〜４ＭＨｚとなる。この場合、高周波による測定回路の複雑化を避けるために、下限の周波数である７００ｋＨｚを最適周波数として採用することも可能である。
【００９５】
また、測定する必要がある試料液導電率の範囲内で、ある特定の一つの周波数で十分に誘電泳動力が得られることがある。その場合は、表３に示すような周波数選択テーブルになる。
【００９６】
【表３】
2010092773.tif 000008
【００９７】
例えば、測定する必要のある試料液導電率の範囲が０〜１００μＳ／ｃｍであった場合、周波数８００ｋＨｚであれば、全ての導電率領域に対してＲｅ［Ｋ］＞０．４となり、単一の周波数で所望の試料液導電率の範囲で測定を行うことができるため、回路構成が簡易となり好都合である。この場合、試料液導電率が１００μＳ／ｃｍを超えた場合には、周波数選択テーブルに示されるよう、エラーに該当するデータが書き込まれている。
【００９８】
図９は、本実施形態にかかる微生物測定方法を説明するためのフローチャートである。以下、フローチャートを参照して、試料の導入からセル１内の微生物の濃縮、測定、結果提示にいたるまでの一連の流れを説明する。まず、初期状態では、セル１に測定対象の微生物が含有された試料液を投入する（ステップＳ１１）。
【００９９】
次に、導電率入力手段７によって、投入した試料液の導電率を入力する。入力された導電率は、制御演算部６に渡される（ステップＳ１２）。
【０１００】
試料液の導電率を渡された制御演算部６は、メモリ６ａに備わる最適周波数テーブルを参照し、電極に印加すべき電圧振幅値及び周波数を選択する（ステップＳ１３）。この時の電圧振幅値（以下、「誘電泳動のための電圧」と呼ぶ）は、微生物をギャップ１３にトラップするために十分な値を選択すればよく、本実施の形態では１０Ｖｐ−ｐとしている。
【０１０１】
また、表２及び表３では、誘電泳動のための電圧は導電率に対して一定の値としているが、それぞれの導電率で最適な値を選択することができる。例えば、導電率が高い場合は、あまりに電圧が高すぎるとジュール熱が発生し、誘電泳動による微生物トラップに影響が出るため、導電率が高くなるに従い、誘電泳動のための電圧を低くする、などとする。
【０１０２】
次いで、制御演算部６は、メモリ上に保存された、入力された導電率に対応する周波数がエラーコード（Ｅ）であるか判断する（ステップＳ１４）。エラーコード（Ｅ）であった場合には、ステップＳ１６に進み、制御演算部６は、入力された導電率が測定範囲外であることを表示手段９に表示するよう指示し、測定を終了する（ステップＳ２２）。
【０１０３】
ステップＳ１４において、選択した周波数がエラーコード（Ｅ）でなかった場合、制御演算部６は泳動電源部４に対し、最適周波数テーブルで選択した電圧振幅及び周波数にて、電極１１ａ、１１ｂ間に電圧を印加させる（ステップＳ１５）。
【０１０４】
電極１１ａ、１１ｂ間に所定の電圧が印加されると、測定部５は直ちに電圧印加直後の初期状態のデータとして、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスを測定し、測定結果は制御演算部６に渡され、メモリ６ａに初期のインピーダンス値として保存する（ステップＳ１７）。
【０１０５】
ここでは、インピーダンス測定を例として記載するが、測定部５が光学的な手段を用いてギャップ１３の状態を測定するのであれば、電圧を印加しなくても初期状態が測定できるので、ステップＳ１７はステップＳ１５の前に行うことも可能である。
【０１０６】
次に、制御演算部６は、図示しない時計手段によって所定の時間が経過するまで待つ。この時、泳動電源部４は電圧印加を保持したままである（ステップＳ１８）。
【０１０７】
所定の時間が経過すると、制御演算部６は所定の測定回数が満了したかを判断し（ステップＳ１９）、満了していなければステップＳ１７に戻る。ステップＳ１７に戻り、制御演算部６は測定部５に命じ、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスを測定し、その結果をメモリ６ａに所定時間経過後の結果として保存する。
【０１０８】
所定の測定回数が満了した場合、制御演算部６は泳動電源部４に電圧印加を止めるよう指示する（ステップＳ２０）。
【０１０９】
電圧印加を停止後、制御演算部６は、メモリ６ａに保存された、電極１１ａ、１１ｂ間インピーダンスの経時変化データから、試料液２中の微粒子濃度を算出し、表示手段９に結果を表示させ（ステップＳ２１）、一連の測定動作を終了する（ステップＳ２２）。
【０１１０】
微生物濃度の算出は、メモリ６ａに予め保存された、検量線から求めることができる。この検量線は、微生物濃度が明らかな校正用試料を、本実施の形態で説明した微生物測定装置の測定系を用いて予め測定し、その時の微生物数とインピーダンス変化の相関関係からばらつきを回帰分析して得られる曲線をあらわす関数を使用する。
【０１１１】
この変換式を制御演算部６のメモリ６ａに記憶させ、微生物濃度が未知の試料を測定する場合には、所定時間内におけるインピーダンス変化の値を代入することにより、セル１内の微生物濃度を算出できる。なお、換算テーブルを用いる場合は、変換式による演算結果を予めメモリさせている。
【０１１２】
以上、本実施の形態によれば、試料液の導電率に応じて、最適な印加電界周波数を選択することにより、測定を行うために十分な誘電泳動力を微生物に働かせることができるため、試料液の導電率が上昇しても、前処理無く、微生物の測定を行うことができる。
【０１１３】
（第２の実施形態）
次に、本発明の第２の実施形態にかかる微生物測定装置について図面を参照しながら説明する。本実施形態の微生物測定装置の基本構成は、第１の実施形態とほぼ同様であるため、図５及び図２を参照して説明する。
【０１１４】
本実施形態の微生物測定装置は、微生物含有の液体を導入するセル１と、セル１内部に浸漬する少なくとも一対の電極１１ａ，１１ｂと、一対の電極１１ａ，１１ｂ間に微粒子に誘電泳動を誘起するための交流電圧（以下、泳動電圧と呼ぶ）及び、一対の電極１１ａ，１１ｂ間のインピーダンスを測定するための交流電圧（以下、測定電圧と呼ぶ）の少なくともいずれかを印加する泳動電源部４と、一対の電極１１ａ，１１ｂ間のインピーダンスを測定する測定部５と、泳動電源部４に対し、印加する電圧の周波数及び振幅が、適切な値になるよう指示命令を行う機能と、一対の電極１１ａ，１１ｂ間のインピーダンスの時間変化を演算し、セル１内の微生物数を算出する機能を有する制御演算部６とを備える。後述するが、泳動電圧は数ＭＨｚ付近の比較的高周波を、測定電圧は数百ｋＨｚ付近の比較的低周波を用いるのが適当である。
【０１１５】
図１０は、泳動電圧の周波数をパラメータとした場合における、溶液導電率（μＳ／ｃｍ）とクラウジウス・モソッティ数の実部（Ｒｅ［Ｋ］）の関係を示すグラフである。Ｒｅ［Ｋ］は、誘電泳動力ＦＤＥＰに対応している。Ｒｅ［Ｋ］の正負は、誘電泳動力が引力として作用するか、あるいは斥力として作用するかにそれぞれ対応する。
【０１１６】
同図に示すように、たとえば、泳動電圧の周波数が（１）１０ｋＨｚの場合は、溶液導電率３μＳ／ｃｍ付近でＲｅ［Ｋ］が正から負に変わっており、微生物に作用する誘電泳動力ＦＤＥＰが引力から斥力に変化する。
【０１１７】
一方、泳動電圧の周波数が（２）１００ｋＨｚの場合は、溶液導電率３０μＳ／ｃｍ付近でＲｅ［Ｋ］が正から負に変わっており、微生物に作用する誘電泳動力ＦＤＥＰが引力から斥力に変化する。
【０１１８】
さらに泳動電圧の周波数を、（３）８００ｋＨｚ、（４）１ＭＨｚと高めると、溶液導電率が高くなっても微生物に作用する正の誘電泳動力ＦＤＥＰが維持される。このように、泳動電圧の周波数は高い方が溶液導電率の影響が軽微であり、微生物を効率良くトラップするために、泳動電圧の周波数を高くする方が有利であることが分かる。
【０１１９】
図１２は、溶液導電率（μＳ／ｃｍ）をパラメータとした場合における、泳動電圧の周波数（Ｈｚ）とＲｅ［Ｋ］の関係を示すグラフである。ここで、試料液の導電率は２０μS／ｃｍ以上である可能性が高い。試料液の導電率が２０μS／ｃｍの場合、泳動電圧の周波数は、約５０ｋHｚ以上で誘電泳動力ＦＤＥＰが斥力から引力に変化する。従って、泳動電圧の周波数は最低５０ｋＨｚ以上である必要がある。一方、泳動電圧の周波数が高すぎると、溶液導電率に関わらずＲｅ［Ｋ］は低下し、５０ＭＨｚで誘電泳動力ＦＤＥＰが引力から斥力に変化する。このため、泳動電圧の周波数は、５０ｋＨｚ〜５０ＭＨｚの間が望ましい。
【０１２０】
試料液の導電率は、場合によっては１００μS／ｃｍ以上のものが想定される。よって、この試料液も測定可能とするためには、７００ｋＨｚ〜１５ＭＨｚとするとＲｅ［Ｋ］が０．５以上となるため、微生物に十分な誘電泳動力を誘起することが出来るため、最も望ましい。
本実施の形態では、泳動電圧の周波数を３ＭＨｚ、振幅は、微生物をギャップ１３にトラップするために十分な値を選択すればよく、１０Vｐ−ｐとしている。
【０１２１】
一方、図１１は、溶液内の微生物数をパラメータとした場合に、測定電圧の周波数と溶液のインピーダンスの関係を示すグラフである。同図に示すように、微生物数が（１）３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜（５）３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに対して、インピーダンスの絶対値｜Ｚ｜の変化幅は、測定電圧の周波数が１０ｋＨｚ付近（矢印Ｃ）で最大（約２０ＫΩ〜１５０ＫΩ）となる。このため、１０ｋＨｚ前後が、インピーダンス測定にとって最も最適な周波数であると言える。
【０１２２】
一般的に、周波数が高くなるほどインピーダンス計測の精度を保つのは難しくなり、泳動電圧の周波数として最適な、１〜１０ＭＨｚ程度の比較的高周波の領域においてインピーダンス測定を行おうとすると、測定回路の複雑化を招き、高精度のインピーダンス測定回路の実現が困難である。このため、測定電圧の周波数を１０ｋＨｚ〜１ＭＨｚ程度の比較的低周波領域としてインピーダンス測定を行う。本実施の形態では、誘電泳動とインピーダンス計測に別の周波数を個別に選択できるため、誘電泳動とインピーダンス計測それぞれに最適な条件を、簡易な測定回路で、且つ高精度なインピーダンス計測を実現できるという効果がある。
【０１２３】
ところで、測定電圧として最も適した周波数１０ｋＨｚ付近は、溶液導電率が約３μS／ｃｍ以上となると負の誘電泳動の領域となり、泳動電圧による誘電泳動を阻害するため、電極１１ａ，１１ｂ間に微生物をトラップするためには望ましくない。このため、周波数はインピーダンス測定精度が許す範囲内で高くし、且つ、泳動電圧に比較して振幅を小さくすることが望ましく、測定電圧の周波数は、測定試料液の導電率において負の誘電泳動が生じない周波数であることが最も好ましい。
【０１２４】
更に、インピーダンス計測に最適な周波数を選択する際、電極と試料液界面における拡散の影響に起因する、ワールブルグインピーダンスの影響が生じる周波数領域でインピーダンス計測を行うと、正確なインピーダンスが計測できないという問題がある。図１３は、周波数を掃引して測定した、電極インピーダンスの実部（横軸）と虚部（縦軸）の関係を示す図（コールコールプロットと呼ぶ）である。
【０１２５】
図１３において、（１）における周波数（Fｌと呼ぶ）を境界に、高周波側は半円上の軌跡（（１）よりも左側）となり、電極系の等価回路が抵抗と容量の単純なモデルで記述される。一方、Fｌよりも低周波側（（１）よりも右側）はワールブルグインピーダンスの影響を生じ、コールコールプロットが半円から外れる領域となる。本発明においてはFｌの周波数を境界周波数と呼ぶ。プロットが半円から外れた領域のインピーダンスは、抵抗と容量の並列回路からなる単純な等価回路モデルとは異なり、電極と溶液間の電子授受に関わる物質の拡散係数など複雑となるため、電極に微生物がトラップされたことによるインピーダンス変化を正確に算出することができない。このため、ＤＥＰＩＭ法の測定を行うためには、ワールブルグインピーダンスの影響が生じないFｌ以上の周波数領域でインピーダンス測定を行う必要がある。測定電圧の周波数を決定するには、実際の電極系と想定している導電率の溶液（細菌は含まない）でコールコールプロットを測定すればよい。
【０１２６】
また、インピーダンス計測回路の観点から、不要な電流が流れることによる計測誤差を防ぐため、測定電圧の周波数におけるインピーダンスの大きさは可能な限り大きい方が望ましい。従って、測定電圧の周波数は、コールコールプロット半円の頂点（図１３における（２）の点、Ｆｈと呼ぶ）までの周波数を選択することが望ましい。
測定結果から求められたFｌ以上、Ｆｈ以下の周波数で、所望の測定精度が確保できる周波数を測定電圧の周波数と決めることができる。本実施の形態では、測定電圧の周波数を８００ｋHｚとしている。
【０１２７】
すなわち、本実施の形態において、測定対象物は、血液又は唾液中に含まれる微粒子、具体的には細菌を測定するものである。血液又は唾液は、測定対象のヒト又は動物によって、若しくは、その検体採取時間によって、導電率がばらつくものである。従って、電極に細菌がトラップされたことによるインピーダンス変化のみを検出するために、一方のセルに測定対象の細菌を含む溶液を、他方のセルに測定対象の溶液と同じ導電率をもち、且つ、測定対象の細菌を含まない溶液を導入し、細菌がトラップされたこと以外によるインピーダンス変化分をキャンセルすることは、工業的なものにおいては、２つのセルに投入する液体の導電率を合わせることが可能のため、有効と考えられる。しかし、ヒト又は動物の血液又は唾液を測定するものにおいては、この２セルタイプを活用できない。何故なら、前述のごとく、検体の導電率は被験者あるいは採取時間によって導電率が大きく変わってしまうため、同じ導電度の溶液を検体毎に準備するのは極めて困難であり、場合によっては不可能である。このようなことを考慮し、検体を採取するヒト又は動物、若しくは検体採取時間が異なっても、安定に測定できることを想定し、鋭意検討した結果、上述のごとくワールブルグインピーダンスの影響を生じる周波数よりも高い周波数で計測することで、安定な測定が可能となる。ワールブルグインピーダンスの影響を生じる周波数よりも高い周波数について、上述した例では、ワールブルグインピーダンスの影響を受ける周波数は１００ｋＨｚより低い値であったので、これより高い周波数の信号を加えればよいという発想になる。しかし、上述のごとくヒト又は動物は、それぞれのヒト又は動物、更には、検体採取時間によって大きくその導電率が変わるため、これらのことを考慮し、本実施形態では測定電圧の周波数を８００ｋＨｚから誘電泳動のための周波数よりも低い周波数範囲の電圧を加えることとした。その中でも、本実施形態では、８００ｋＨｚで十分その検出に安定性を持たせることが出来たので、８００ｋＨｚより少しでも高い周波数で測定が可能である。もちろん、より高い周波数で測定しても構わないが、本実施の形態における誘電泳動のための周波数である３ＭＨｚと分離できなくなるため、２ＭＨｚ程度までが現実的であった。
【０１２８】
図１４は、本実施形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャートである。以下、フローチャートを参照して、試料の導入からセル１内の微生物の濃縮、測定、結果提示にいたるまでの一連の流れを説明する。
【０１２９】
まず、初期状態では、セル１に測定対象の微生物が含有された試料液を投入する（ステップＳ１２１）。試料液が投入されたことを、ユーザの操作あるいは図示しない液検知手段によって感知した制御演算部６は、泳動電源部４に対し、予めメモリ６ａに記憶された測定電圧の周波数、及び振幅を印加するよう指示し、泳動電源部４は、指示された測定電圧を電極１１ａ，１１ｂ間に印加する（ステップＳ１２２）。
【０１３０】
測定電圧が印加されると、制御演算部６の指示により、即座に測定部５は電極１１ａ，１１ｂ間の電流測定を行う。測定結果は、制御演算部６に渡され、インピーダンス演算が行われ、メモリ６ａに記憶される（ステップＳ１２３）。
【０１３１】
インピーダンス測定を終えると、制御演算部６は、予めメモリ６ａに記憶された測定回数（あるいは測定時間）を満たしているか判断し（ステップＳ１２５）、満たしていない場合、制御演算部６は、泳動電源部４に対し、予めメモリ６ａに記憶された周波数、及び振幅の泳動電圧を印加するよう指示し、泳動電源部４は、指示された泳動電圧を電極１１ａ，１１ｂ間に印加する（ステップＳ１２４）。
【０１３２】
所定の時間が経過すると、制御演算部６は、泳動電源部４に対し、印加電圧を測定電圧に変更するよう指示し、泳動電源部４は電極１１ａ，１１ｂ間へ印加する電圧を泳動電圧から測定電圧に変更する（ステップＳ１２２）。このとき、電極１１ａ，１１ｂ間には、泳動電圧の印加によって微生物がトラップされているが、測定電圧に切り替えた後は泳動電圧は印加されていない。測定電圧は数百ｋＨｚ程度の比較的低周波が望ましいため、導電率が高い状態では正の誘電泳動を誘起しにくい条件と言える。このため、測定電圧を印加する時間が長ければ、泳動電圧によってトラップした微生物が試料液の粘性力や重力沈降などの外力によって電極１１ａ，１１ｂ間のギャップから分散してしまう可能性がある。よって、測定電圧は、測定部５が必要十分な精度で電流を測定できる時間内で、少なくとも泳動電圧の印加時間より短く、可能な限り短時間の印加とするほうが望ましく、１０ｍｓ〜１００ｍｓ程度が最も望ましい。これにより、測定電圧印加時に泳動電圧によってトラップされた微生物が、測定電圧印加時に電極から分散することなく保持され、高感度な測定を実現できるという効果がある。
【０１３３】
以下、同様のステップを繰り返し、ステップＳ１２５で所定の測定回数（あるいは測定時間）を満たしていれば、測定終了のためステップＳ１２６に進み、制御演算部６は電圧印加を停止するよう泳動電源部４に指示し、泳動電源部４は電圧印加を停止する。その後、制御演算部６は、ステップＳ１２７で微生物濃度の算出と、結果表示を行い、測定動作を完了する。詳細については前述の実施例と同様のため説明を省略する。
【０１３４】
このように本実施形態の微生物測定装置は、溶液導電率の影響が軽微で誘電泳動に有利な高周波数で微生物をトラップし、インピーダンスの絶対値｜Ｚ｜の変化幅が広く、言い換えればインピーダンス測定が容易で感度が高い低周波数でインピーダンス計測を行うので、高溶液導電率条件下での微生物の誘電泳動トラップと、高感度及び高精度なインピーダンス計測を両立させることができる。
【０１３５】
尚、本実施の形態においては、測定量がインピーダンスであるとして説明したが、測定量として、電極を流れる電流、電圧と電流との位相差、誘電率、導電率、あるいはこれらから算出される電気物理的な特性値を用いて良い。本実施の形態ではこの中でも特に、インピーダンス及びその抵抗成分（コンダクタンス）と容量成分（キャパシタンス）の測定によって微粒子の測定を行っている。
【０１３６】
また、本実施形態の微生物測定装置において、制御演算部６は、溶液導電率に基づいて泳動電圧の周波数及び測定電圧の周波数を選択することも可能である。前述の通り、誘電泳動力は溶液導電率によって変化するし、導電率によってインピーダンス計測に最適な周波数が異なることも考えられる。よって、溶液導電率によって泳動電圧及び測定電圧の周波数はそれぞれ最適な値を選ぶ必要がある。
ここで、溶液導電率は、電極１１ａ，１１ｂ間のインピーダンス計測結果から求めることが可能である。なぜなら、インピーダンスの抵抗成分の逆数であるコンダクタンスは、溶液導電率を反映した値になるからである。よって、測定に先立ち、試料液のインピーダンスを計測して導電率を求め、泳動電圧及び測定電圧の最適周波数を選択する。
これにより、導電率が変化する試料液でも、確実な誘電泳動による微生物のトラップと、高精度なインピーダンス計測を実現することが可能である。
【０１３７】
（第３の実施形態）
第２の実施形態では、泳動電源部４が、泳動電圧と測定電圧とを逐次印加する微生物測定装置について説明したが、本実施形態では、第２の実施形態で説明した微生物測定装置において、泳動電源部４が、泳動電圧と測定電圧とを同時に印加する場合について説明する。本実施形態の微生物測定装置（図示せず）は、図５に示す構成において、測定部５が、後述するフィルタ分離機能を有するものである。
【０１３８】
本実施形態において、泳動電源部４は、一対の電極１１ａ，１１ｂ間に、泳動電圧として１ＭＨｚ付近の高周波数の交流電圧及び、測定電圧として１０ｋＨｚ〜１ＭＨｚ付近の低周波数の交流電圧を重畳して印加する。これら条件設定の根拠は、第２の実施形態の通りである。また、測定部５は、１０ＫＨｚ〜１ＭＨｚ付近の低周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離し、一対の電極１１ａ，１１ｂ間のインピーダンスを測定することもできる。
【０１３９】
ここでいう重畳とは、少なくとも異なる２つの周波数の正弦波あるいは矩形波などの交流信号同士を加算して交流信号を生成することを指す。また、フィルタ分離機能とは、交流信号から特定の周波数成分のみを取り出す機能である。フィルタ分離機能は、例えば、ＲＣ回路などにより構成される、受動素子によるパッシブフィルタ、及び、オペアンプなどの能動素子により構成されるアクティブフィルタ、あるいは信号処理によるディジタルフィルタなど、公知の技術により実現可能である。本実施の形態では、高周波の泳動電圧が混合された信号から、低周波の測定電圧の信号を分離する必要があるため、フィルタはローパスフィルタの構成としている。
【０１４０】
また、振幅の大きい泳動電圧の信号から、振幅の小さい測定電圧の信号を分離する必要があるため、高ノイズ成分を含む信号から、特定周波数の低レベル信号を取り出すことが可能な、位相検波方式によって測定電圧の周波数成分のみを取り出し、高精度なインピーダンス測定を実現している。
【０１４１】
この構成によれば、１ＭＨｚ以上の高周波数及び１０ｋＨｚ付近の低周波数の交流電圧を重畳して印加し、１０ｋＨｚ付近の低周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離してインピーダンスを測定するので、微生物のトラップとインピーダンス測定を同時に行うことができ、測定電圧のみが印加される状態にならず、微生物を強固に電極間にトラップしたままインピーダンス測定ができるため、高精度且つ高感度の微生物検出を実現できる。すなわち、高周波でトラップし低周波で計測するので、導電率影響の回避と高感度測定の両立が可能になる。また、計測を低周波で行うので、設計上有利となり、低コストな簡易回路で構成することができる。さらに、高周波と低周波の重畳波を使うことで、測定とトラップが同時に可能となる。
【０１４２】
なお、本実施形態の微生物測定装置において、制御演算部６は、溶液導電率に基づいて印加する電圧の周波数、つまり、少なくとも泳動電圧の周波数及び測定電圧の周波数のいずれか一方を調整することも可能である。
【０１４３】
このように、泳動電圧及び測定電圧の周波数を、試料液の導電率に応じてそれぞれ適切な値に設定することで、微生物のトラップ及びインピーダンス測定をより確実に、高精度に行うことができるという効果を有する。
【０１４４】
以下に、実施の形態３についての実施例を示す。
【実施例】
【０１４５】
（１）泳動電圧の周波数及び測定電圧の振幅の設定
泳動電圧、測定電圧の周波数及び振幅の最適値を検討するための実験を行った。標準寒天培地（ＭＢ００１０、栄研器材（株））上で３７℃、１６時間の好気培養を行った大腸菌Ｋ−１２株（ＮＢＲＣ３３０１、製品評価技術基盤機構）をコンラージ棒で採取し、０．１Ｍ  Ｄ−マニトール溶液（導電率、約５μＳ／ｃｍ）に懸濁、適宜希釈したものを試料とした。試料に、ＮａＣｌ溶液を適宜追加し、試料液導電率を調製した。試料液導電率は、導電率計（Ｂ−１７３、堀場製作所（株））により測定した。微生物が誘電泳動される様子を観察するため、電極は図１５に示すような矩形が入れ子になった形状の電極を用いた。電極上を透明なチャンバで覆い、位相差顕微鏡（ＩＸ７０、オリンパス）にて観察を行った。【０１４６】
図１６は、泳動電圧の周波数を、（ａ）１００ｋＨｚ、（ｂ）８００ｋＨｚ、（ｃ）３ＭＨｚとしたときの、電圧印加４０秒後の電極ギャップの様子を示す。試料液の導電率は１００μＳ／ｃｍである。印加電圧は１０Ｖｐ−ｐ、交流電圧は正弦波である。周波数の高い（ｂ）、（ｃ）の場合、電極ギャップ間（電極のコーナー部、白丸枠内）の電界集中部に大腸菌がトラップされている様子が分かる。一方、周波数の低い（ａ）の場合、電極に殆ど大腸菌はトラップされておらず、試料液の導電率が１００μＳ／ｃｍの場合、１００ｋＨｚでは電極に微生物をトラップできないことが分かった。【０１４７】
図１７は、更に試料液導電率を３００μＳ／ｃｍとし、泳動電圧の周波数を（ａ）８００ｋＨｚ、（ｂ）３ＭＨｚとしたときの電極ギャップの様子である。周波数を３ＭＨｚでは８００ｋＨｚに比べ、大腸菌が多くトラップされており、導電率が上昇した場合、３ＭＨｚが最も適した条件であることを確認した。【０１４８】
図１８は、泳動電圧の周波数として３ＭＨｚ、１０Ｖｐ−ｐを印加し、測定電圧の周波数として１００ｋＨｚを重畳して印加した場合の、電極ギャップの様子である。試料液導電率は２００μＳ／ｃｍである。（ａ）は１００ｋＨｚ（測定電圧の周波数）の振幅を３Ｖｐ−ｐ、（ｂ）は１００ｋＨｚの振幅を１Ｖｐ−ｐとした場合である。周波数の低い測定電圧の振幅が高い３Ｖｐ−ｐの場合、１Ｖｐ−ｐに比べトラップされる大腸菌の量が少ないことが分かる。よって、測定電圧の振幅は１Ｖｐ−ｐ程度が最適であると確認した。【０１４９】
図２０は、溶液の導電率が２４０μＳ／ｃｍのときの電極インピーダンスのコールコールプロットである。同図より、Fｌ＝１００ｋＨｚであることが分かる。このため、測定電圧の周波数は１００ｋＨｚ以上である必要がある。図２１は、泳動電圧の周波数として３ＭＨｚ、１０Ｖｐ−ｐを印加し、測定電圧の周波数として（ａ）１００ｋＨｚ、（ｂ）８００ｋＨｚを重畳して印加した場合の、電極ギャップの様子である。試料液導電率は２００μＳ／ｃｍである。測定電圧の周波数が低い１００ｋＨｚに比べて、周波数が高い８００ｋＨｚのトラップされる大腸菌の量が多いことが分かる。よって、測定電圧の周波数は８００ｋＨｚ程度が最適であると確認した。【０１５０】
（２）微生物測定
前述した実験から、泳動電圧を３ＭＨｚ、１０Ｖｐ−ｐ、測定電圧を８００ｋＨｚ、１Ｖｐ−ｐと定め、図５の装置で大腸菌濃度及び導電率を適宜調整した試料液の測定を行った。比較のため、泳動電圧と測定電圧を同一の８００ｋＨｚ、１０Ｖｐ−ｐとして同様の測定を行った。図１９は、横軸に大腸菌濃度、縦軸にＤＥＰＩＭ測定の応答値（キャパシタンスの傾き）を対数表示したグラフを示す。（ａ）は泳動電圧及び測定電圧をいずれも８００ｋＨｚにした場合を、（ｂ）は泳動電圧を３ＭＨｚ、測定電圧を８００ｋＨｚにした場合を示す。（ａ）の場合、試料液導電率が１００μＳ／ｃｍまで上昇すると、微生物に働く誘電泳動力が低下する結果、ＤＥＰＩＭ測定の応答値にも低下が見られる。一方、（ｂ）に示すように、泳動電圧及び測定電圧をそれぞれ適切に設定した場合、試料液導電率が４００μＳ／ｃｍまで上昇しても応答低下が見られず、高精度な測定ができることが示された。【０１５１】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。【０１５２】
本出願は、２００９年２月１０日出願の日本特許出願（特願２００９−０２８９２７）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１５３】
本発明は、高溶液導電率での誘電泳動トラップと、高感度及び高精度なインピーダンス計測を両立させることができる微粒子測定装置及び微粒子測定方法として有用である。
【符号の説明】
【０１５４】
１  セル
２  試料液
３  電極チップ
４  泳動電源部
５  測定部
６  制御演算部
６ａ  メモリ
７  導電率入力手段
９  表示手段
１０  基板
１１ａ，１１ｂ  電極
１３  ギャップ
１４  微粒子
１５  電気力線
１７  攪拌手段
２１  光源
２２  受光部
【図１】
2010092773.tif 000009
【図２】
2010092773.tif 000010
【図３】
2010092773.tif 000011
【図４】
2010092773.tif 000012
【図５】
2010092773.tif 000013
【図６】
2010092773.tif 000014
【図７】
2010092773.tif 000015
【図８】
2010092773.tif 000016
【図９】
2010092773.tif 000017
【図１０】
2010092773.tif 000018
【図１１】
2010092773.tif 000019
【図１２】
2010092773.tif 000020
【図１３】
2010092773.tif 000021
【図１４】
2010092773.tif 000022
【図１５】
2010092773.tif 000023
【図１６】
2010092773.tif 000024
【図１７】
2010092773.tif 000025
【図１８】
2010092773.tif 000026
【図１９】
2010092773.tif 000027
【図２０】
2010092773.tif 000028
【図２１】
2010092773.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】平成23年6月6日(2011.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、誘電泳動を用いて試料液中の微粒子数を測定するための微粒子測定装置及び微粒子測定方法に関する。更に詳しくは、溶液導電率の影響を前処理なしに回避し、高感度、高精度に測定する微粒子測定装置及び微粒子測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今、食中毒や感染症などの原因となり、人体に何らかの害を及ぼす可能性がある微生物を、迅速、簡便、高感度に定量測定するニーズは特に高い。食品の製造工程や微生物検査施設を備えない診療所などにおいて、その場で微生物検査を実施することで、食中毒や感染症などの防止、予防が可能になるためである。
【０００３】
また、いわゆるバイオセンサにおいて、抗体など、測定対象に特異的に結合する物質を標識したポリスチレンなどの人工微粒子を用いて、検体中の生化学的物質を定量測定する際に、検体中の微粒子数あるいはその結合状態を定量測定する必要がある。このように、昨今、液体中に含まれる微粒子を迅速、簡便、定量的に測定する要求は高い。
【０００４】
ここで、本願における微粒子の定義について説明する。本願で言う微粒子とは、ポリスチレンやそれらに何らかのコーティングを施した粒子、カーボンナノチューブ、金コロイドなどの金属粒子、細菌、真菌、放線菌、リケッチア、マイコプラズマ、ウイルス、として分類されているいわゆる微生物、原生動物や原虫のうちの小型のもの、生物体の幼生、動植物細胞、精子、血球、核酸、蛋白質等も含む広い意味での生体又は生体由来の微粒子である。この他にも、本願で言う微粒子とは、誘電泳動可能な大きさのあらゆる粒子を意味する。本願では特に、微生物の測定を想定している。
【０００５】
特に本願の検出対象は、ヒト又は動物の、血液及び唾液中に含まれる微生物、若しくは、ヒト又は動物の、血液や唾液が付着した粘膜等の表面から採取された微生物を想定する。ヒト又は動物の、血液や唾液中には、イオンが高濃度で含まれるため、測定溶液の導電率の上昇や変動を招き、誘電泳動を利用した検出方法の変動要因となる。
【０００６】
従来、微生物の検査法として最も一般的に用いられるのは培養法である。培養法は、培地上に微生物検体を塗抹し、微生物が生育条件下で培養を行い、形成される培地上のコロニー数を計数することで微生物数を定量する方法である。
【０００７】
しかし、コロニー形成までに通常１〜２日、微生物種によっては数週間を要するため、迅速な検査を実施できない問題があった。また、濃縮や希釈、培地への塗抹などが必要なため、専門家による操作が必要であり、簡便な検査が実施できない、あるいは操作上のバラツキによる精度低下の問題があった。
【０００８】
これら従来の問題を解決するため、本発明者は他の発明者らと共に、迅速、簡便、高感度な微生物数測定法として、誘電泳動とインピーダンス計測を組み合わせたＤＥＰＩＭ（Dielectrophoretic Impedance Measurement Method）法を提案した（例えば、特許文献１を参照）。
【０００９】
ＤＥＰＩＭ法は、微生物を誘電泳動力によってマイクロ電極に捕集し、同時にマイクロ電極のインピーダンス変化を測定することによって試料液中の微生物数を定量測定する方法である。以下、その測定原理について概説する。
【００１０】
微生物は一般に、イオンリッチで誘電率及び導電率の高い、細胞質及び細胞壁が、比較的誘電率及び導電率の低い、細胞膜に囲まれた構造を有し、誘電体粒子とみなすことができる。ＤＥＰＩＭ法では、電界中で分極した誘電体粒子に一定方向に働く力である誘電泳動力を利用し、誘電体粒子である微生物をマイクロ電極のギャップ間に捕集する。
【００１１】
誘電体粒子に働く誘電泳動力ＦＤＥＰは、以下の（数１）で与えられることが公知である（例えば、非特許文献１を参照）。以下、誘電体粒子が、微生物である場合を例として説明する。
【００１２】
【数１】
2010092773.tif 000030
【００１３】
ここで、a：球形近似したときの微生物の半径、ε０：真空の誘電率、εｍ：試料液の比誘電率、Ｅ：電界強度であり、▽は演算子で勾配（gradient）を表す。この場合、▽Ｅ２は、電界Ｅ２の勾配なので、その位置でどれだけＥ２が傾斜を持っているか、つまり電界Ｅが空間的にどれだけ急に変化をするかを意味する。また、Ｋはクラウジウス・モソッティ数と呼ばれ、（数２）で表され、Ｒｅ［Ｋ］＞０は正の誘電泳動を表し、微生物は電界勾配と同方向、つまり、電界集中部に向かって泳動される。Ｒｅ［Ｋ］＜０は負の誘電泳動を表し、電解集中部から遠ざかる方向、すなわち弱電界部に向かって泳動される。
【００１４】
【数２】
2010092773.tif 000031
【００１５】
ここで、εｂ＊及びεｍ＊はそれぞれ、微生物及び溶液の複素比誘電率を表し、一般に複素比誘電率εｒ＊は（数３）で表される。
【００１６】
【数３】
2010092773.tif 000032
【００１７】
ここで、εｒ：微生物あるいは試料液の比誘電率、σ：微生物あるいは試料液の導電率、ω：印加電界の角周波数を表す。
【００１８】
（数１）（数２）（数３）から、誘電泳動力は、微生物の半径、クラウジウス・モソッティ数の実部（以下、Ｒｅ［Ｋ］と表す）及び電界強度に依存することが分かる。また、Ｒｅ［Ｋ］は、試料液及び微生物の複素誘電率、電界周波数に依存して変化することが分かる。
【００１９】
そのため、ＤＥＰＩＭ法では、これらのパラメータを適切に選択し、微生物に働く誘電泳動力を十分大きくし、微生物を電極ギャップに確実に捕集する必要がある。また、ＤＥＰＩＭ法では、上記誘電泳動による電極への微生物捕集と同時に、電気的計測を行い、試料液中の微生物数を定量測定することを特徴としている。
【００２０】
微生物は、前述した構造を有するため、電気的には固有のインピーダンスを持った微粒子と考えることができる。そのため、誘電泳動によりマイクロ電極のギャップ間に捕集される微生物数が増加すると、その捕集数に応じて電極間のインピーダンスが変化する。
【００２１】
従って、電極間インピーダンス時間変化の傾きは、単位時間当たりに電極ギャップ間に捕集される微生物数に応じた値となり、傾きの大きさは試料液中の微生物濃度に対応する。よって、電極間インピーダンス時間変化の傾きを測定することで、試料液中の微生物濃度、言い換えれば微生物数を測定することが可能となる。
【００２２】
更に、ＤＥＰＩＭ法では、誘電泳動を開始直後のインピーダンス時間変化の傾きから微生物数を定量することで、短時間での微生物測定を実現している。以上、ＤＥＰＩＭ法の測定原理について概説したが、詳しくは非特許文献２を参照されたい。
【００２３】
ところで、本願で測定に用いる試料液は、血液や唾液など、何らかの方法によって採取した微生物を、水を主成分とする低導電率の液体で懸濁したものを想定しているが、微生物を採取する際、微生物だけでなく周辺に含まれるイオンも同時に採取されると考えられる。この場合、試料液の誘電率は水とほぼ同じ値になり、結局、微生物に働く誘電泳動力は試料液のイオン濃度、言い換えれば、導電率に依存することになる。
【００２４】
一般に、試料液導電率が高くなるほど誘電泳動力は小さくなる。そのため、従来のＤＥＰＩＭ法で上記のような試料液の測定を想定した場合、試料液導電率の高い試料では、微生物に働く誘電泳動力が低下しマイクロ電極に捕集される微生物数が少なくなる結果、測定感度が低下するという問題があった。更に、試料液導電率によって微生物に働く誘電泳動力が異なるため、異なる導電率の試料液を測定したときの測定結果バラツキが大きいという問題があった。
【００２５】
誘電泳動を利用した微生物等の測定に際し、上記問題を解決するための手段として、測定前にイオン交換等により試料液導電率を低減する技術が公知である。この技術は、分析前に試料液をイオン交換カラムで処理を行い、試料液導電率を低減した後、誘電泳動により試料液中の微生物を分析する方法である（例えば、特許文献２を参照）。
【００２６】
また、微生物の活性を測定する場合に、ほぼリアルタイムの迅速測定を行い、微生物活性を簡便且つ定量的に検出する微生物活性測定装置及びそのとき使用する微生物活性の測定方法が知られている。この方法は、微生物種類と試料液の導電率を入力し、活性を測定する最適な電圧（振幅と周波数）を表１のテーブルから選択するものである（例えば、特許文献３参照）。
【００２７】
また、誘電泳動とインピーダンス計測を同時に行う際に、誘電泳動を誘起するための電圧とインピーダンス計測を行うための電圧及び周波数をそれぞれ独立して設定する測定方法が知られている。典型的には誘電泳動を行うための電圧は１２Vrms以上・１ｋＨｚ〜５０MHｚ、インピーダンス計測を行うための電圧は０．８Vｒｍｓ・８００Hzとされている（非特許文献３参照）。
【００２８】
【表１】
2010092773.tif 000033
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２９】
【特許文献１】日本国特開２０００−１２５８４６号公報
【特許文献２】日本国特表平１１−５０１２１０号公報
【特許文献３】日本国特開２００３−０００２２４号公報
【非特許文献】
【００３０】
【非特許文献１】Hywel Morgan、他:「AC Electrokinetics:colloids and nanoparticles」、RESERCH STUDIES PRESS LTD.2003年出版、pp.15~63
【非特許文献２】J.Suehiro, R.Yatsunami, R.Hamada, M,Hara，J.Phys. D: Appl. Phys. 32(1999)2814-2820
【非特許文献３】DWE Allsoppet al,J.phys.D:Appl.Phys.32(1999)PP.1066-1074
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
誘電泳動を利用した微粒子の操作は一般に、試料液の導電率が上昇したときに正の誘電泳動力が小さくなり、微粒子を電極ギャップにトラップすることが困難になるという課題を有している。この課題を解決するためには、試料液導電率の上昇に対して誘電泳動力の変化（低下）が小さい、１ＭＨｚ以上の比較的高い周波数で誘電泳動を行う必要がある。また、インピーダンス変化測定のために十分な大きさの誘電泳動力を誘起する必要があるため、印加電圧は大きくする必要があり、結果として電極に流れる電流が大きくなる。このように、周波数が高く、且つ、測定する電圧（電流）の振幅が大きい場合、スルーレートが高くなるため、アンプ回路など素子の性能の制限から、一般にインピーダンス測定は困難になり、測定精度が低下してしまう。このため、インピーダンス測定回路にとっては、インピーダンスを測定するための電圧の条件は、振幅が小さく、周波数が低い方が有利となる。すなわち、誘電泳動による微粒子の電極へのトラップと、高精度なインピーダンス計測を両立するための手段が必要である。
【００３２】
しかしながら、特許文献１には、平板電極間に周波数１ＭＨｚでピーク電圧１００Ｖの正弦波交流電圧を印加する例が記載され、この時印加する交流の周波数は誘電泳動が生じる周波数範囲であれば任意に選ぶことが可能とされているが、周波数選択により溶液導電率の影響を回避すること、及び高精度なインピーダンス測定を両立するための手段に関する示唆はない。
【００３３】
また、特許文献２に記載の技術によれば、誘電泳動による分析を行う前にイオン交換という前処理が必要であるため、微粒子測定の簡便性が損なわれるし、測定全体にかかる時間も長くなるという問題があった。さらに、イオン交換処理後の試料液導電率は、イオン交換処理前の試料液導電率に依存するため、試料毎の導電率バラツキによって、ＤＥＰＩＭ法など、誘電泳動を用いた微粒子測定の結果にバラツキを生じるという問題を解決できない。
【００３４】
また、特許文献３の微生物活性測定装置は、微生物種類と試料液の導電率を入力し、活性を測定する最適な電圧（振幅と周波数）をテーブルから選択するものであり、活性状態によって誘電泳動力に差が生じる周波数を選択するものである。
【００３５】
また、非特許文献３に記載の技術によれば、誘電泳動とインピーダンス計測それぞれを行うための電圧条件を個別に選択することができるため、試料液の導電率上昇に対して誘電泳動力の変化が小さい１ＭＨｚ以上の高周波で誘電泳動を行うことができるが、インピーダンス計測を行う低周波においてワールブルグインピーダンスの影響が顕著になり、正しいインピーダンス計測ができず、測定結果の正確さを著しく損なう場合があるという課題を有していた。
【００３６】
上述したワールブルグインピーダンスの影響を具体的に示す例として、非特許文献３に記載の技術において、一方のセルに含まれるサンプルの導電率、及び他方のセルに含まれる測定対象の導電率を精度よく一致させた上でインピーダンス計測をしないと、電極の分極（electrode polarization）の寄与度が大きくなり、正しいインピーダンス測定が測定結果の正確さを著しく損なう場合がある。
【００３７】
特に、上述のように、本願における微粒子の定義に含まれ、且つ検出対象である微生物と共に、血液や唾液が混在した試料液では、検体を採取するヒト又は動物、若しくはその検体を採取する時間が異なると、導電率が大きく変化してしまう。そのため、非特許文献３に記載の技術において、検出対象である微生物と共に、血液や唾液が混在した試料液を測定する場合、一方のセルに含まれるサンプルの導電率と、他方のセルに含まれる測定対象の導電率を精度よく一致させる必要があるが、これは困難である。したがって、正しいインピーダンス測定ができず、測定結果の正確さを著しく損なう。
【００３８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ヒト又は動物の、血液又は唾液中に含まれる微生物、若しくは、血液又は唾液が付着した粘膜などの表面から採取された微生物を検出対象とし、測定する試料液の溶液導電率が高く、且つ検体毎に変動する場合、高溶液導電率での誘電泳動トラップと、高感度及び高精度なインピーダンス計測を両立させることができる微粒子測定装置及び微粒子測定方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００３９】
本発明者らは、微粒子のなかでも特に、細菌を誘電泳動する際に、溶液導電率の影響を回避可能な周波数領域があり、それとは別に、高精度なインピーダンス計測に適した周波数領域及び振幅があることを見出した。本発明は、かかる知見に基づき達成されたものである。
【００４０】
本発明に係る微粒子測定装置は、血液及び唾液のうち少なくともいずれか一方に含まれる微粒子を含有する液体を導入するセルと、前記セル内部に浸漬する少なくとも一対の電極と、前記一対の電極間に交流電圧を印加する泳動電源部と、前記一対の電極間のインピーダンスを測定する測定部と、前記一対の電極間のインピーダンスの時間変化を演算し、前記セル内の前記微粒子の数を算出する制御演算部と、を備え、前記制御演算部は、前記微粒子に誘電泳動を誘起するための第１の周波数の交流電圧、及び前記一対の電極間のインピーダンスを測定するための、ワールブルグインピーダンスの影響を生じる周波数よりも高い周波数である第２の周波数の交流電圧、を前記一対の電極間に印加するよう、前記泳動電源部に指示する。
【００４１】
この構成によれば、第１の周波数の交流電圧を印加して微粒子に誘電泳動力を作用させ、境界周波数以上の周波数である第２の周波数の交流電圧を印加してインピーダンスを測定するので、高溶液導電率での誘電泳動トラップと、高感度及び高精度なインピーダンス計測を両立させることができる。
【００４２】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記第１の周波数の交流電圧が、第１の振幅を有し、前記第２の周波数の交流電圧が、第２の振幅を有するものである。
【００４３】
この構成によれば、第１の周波数の交流電圧は第１の振幅を有し、第２の周波数の交流電圧は第２の振幅を有するので、誘電泳動とインピーダンス計測のそれぞれに適切な電圧を印加することができる。
【００４４】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記第２の振幅が、前記第１の振幅より小さいものである。
【００４５】
この構成によれば、インピーダンスを測定するための第２の周波数の交流電圧が、誘導泳動に影響を及ぼすことを防ぐ効果がある。
【００４６】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記制御演算部が、溶液導電率に基づいて、前記第１の周波数、及び前記第２の周波数の少なくともいずれかを調整するものである。
【００４７】
この構成によれば、溶液導電率に基づいて第１の周波数及び第２の周波数を調整するので、溶液導電率が変動した場合でも、適切な周波数で誘電泳動及びインピーダンス計測を行うことができる。
【００４８】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記第１の周波数と前記第２の周波数を逐次切り替えるものである。
【００４９】
この構成によれば、第１の周波数と第２の周波数を逐次切り替えるので、誘電泳動及びインピーダンス計測を迅速に行うことができ、それぞれに最適な条件を選択することができる。
【００５０】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記第２の周波数の交流電圧を印加する時間が、第１の周波数の交流電圧を印加する時間より短いものである。
【００５１】
この構成によれば、インピーダンス測定を行う第２の周波数の電圧を印加中に、誘電泳動力が喪失することによって電極から微粒子が飛散することなく、確実に微粒子を電極にトラップすることができるため、高感度な測定を実現できる。
【００５２】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記第２の周波数が、８００ｋＨｚより高く、前記第１の周波数よりも低いものである。
【００５３】
この構成によれば、高周波で微粒子をトラップし低周波でインピーダンスを計測するので、高溶液導電率での誘電泳動トラップと、低周波数でインピーダンス計測を行うことによる高感度及び高精度なインピーダンス計測とを両立させることができる。
【００５４】
また、本発明に係る微粒子測定装置は、前記泳動電源部が、前記一対の電極間に、前記第１の周波数の交流電圧及び前記第２の周波数の交流電圧を重畳して印加し、前記一対の電極間に印加されている重畳された交流電圧のうち前記第２の周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離するフィルタ分離手段を備え、前記測定部が、フィルタ分離された前記第２の周波数の交流電圧の周波数成分に対応する前記一対の電極間のインピーダンスを測定するものである。
【００５５】
この構成によれば、第１の周波数及び第２の周波数の交流電圧を重畳して印加し、第２の周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離し、一対の電極間のインピーダンスを測定するので、計測回路の設計を簡素化して低コスト化することができるとともに、第１の周波数及び第２の周波数の交流電圧を重畳して印加することにより、微粒子のトラップとインピーダンス測定を同時に行うことができるため、第１の周波数から第２の周波数に切替を行った際に微粒子に働く誘電泳動力が低下して電極ギャップから微粒子が離れることを防ぐことができ、高精度・高感度の測定を行うことが出来る。
【００５６】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、血液及び唾液のうち少なくともいずれか一方に含まれる微粒子を含有する試料液に浸漬した一対の電極間に交流電界を印加し、誘電泳動力により前記微粒子を所定位置に配置し、前記試料液中における前記微粒子の数を測定する微粒子測定方法であって、前記一対の電極間に第１の周波数の交流電圧を印加し、前記微粒子に誘電泳動力を作用させるステップと、前記一対の電極間に、前記一対の電極間のインピーダンスを測定するための、ワールブルグインピーダンスの影響が生じる周波数よりも高い周波数である第２の周波数の交流電圧を前記一対の電極間に印加し、前記一対の電極間のインピーダンスを測定するステップと、前記一対の電極間のインピーダンスの時間変化を演算し、前記セル内の前記微粒子の数を算出するステップと、を有する。
【００５７】
この構成によれば、第１の周波数の交流電圧を印加して微粒子に誘電泳動力を作用させ、境界周波数以上の周波数である第２の周波数の交流電圧を印加してインピーダンスを測定するので、高溶液導電率での誘電泳動トラップと、高感度及び高精度なインピーダンス計測を両立させることができる。
【００５８】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、溶液導電率に基づいて、前記第１の周波数、及び前記第２の周波数を選択するステップを有する。
【００５９】
この構成によれば、溶液導電率に基づいて第１の周波数及び第２の周波数を選択するので、溶液導電率が変動した場合でも、適切な周波数で誘電泳動及びインピーダンス計測を行うことができる。
【００６０】
また、本発明に係る微粒子測定方法は、前記一対の電極間に、前記第１の周波数の交流電圧、及び前記第２の周波数の交流電圧を重畳して印加するステップと、前記一対の電極間に印加されている重畳された交流電圧のうち、前記第２の周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離し、前記一対の電極間のインピーダンスを測定するステップと、を有する。
【００６１】
この構成によれば、第１の周波数及び第２の周波数の交流電圧を重畳して印加し、第２の周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離し、一対の電極間のインピーダンスを測定するので、計測回路の設計を簡素化して低コスト化することができるとともに、第１の周波数及び第２の周波数の交流電圧を重畳して印加することにより、微粒子のトラップとインピーダンス測定を同時に行うことができる。
【発明の効果】
【００６２】
本発明によれば、血液や唾液など、本願における微粒子の定義に含まれる微生物を測定対象とした微粒子測定において、第１の周波数の交流電圧を印加して微粒子に誘電泳動力を作用させ、境界周波数以上の周波数である第２の周波数の交流電圧を印加してインピーダンスを測定するので、高溶液導電率での誘電泳動トラップと、高感度及び高精度なインピーダンス計測を両立させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明の第１の実施形態にかかる微粒子測定装置を説明するための概略構成図（１）
【図２】本発明の実施形態にかかる微粒子測定装置の電極チップを説明するための概略図
【図３】本発明の実施形態において測定電極１１ａ，１１ｂ間に印加される電圧によって生じる電気力線１５を示す図
【図４】図４（ａ）、（ｂ）は電極１１ａ、１１ｂの対向するエッジ部に微粒子１４が電気力線に沿ってトラップされる説明図
【図５】本発明の第１の実施形態にかかる微粒子測定装置を説明するための概略構成図（２）
【図６】本発明の第１の実施形態にかかる微粒子測定装置を説明するための概略構成図（３）
【図７】図７（ａ）、（ｂ）は誘電泳動用交流電圧の周波数をパラメータとした場合に、溶液導電率（μＳ／ｃｍ）とＲｅ［Ｋ］の関係を示すグラフ
【図８】誘電泳動用交流電圧の周波数（Ｈｚ）とクラウジウス・モソッティ数の実部（Ｒｅ［Ｋ］）の関係を示すグラフ
【図９】本発明の第１の実施形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャート
【図１０】誘電泳動用交流電圧の周波数をパラメータとした場合における、溶液導電率（μＳ／ｃｍ）とクラウジウス・モソッティ数の実部（Ｒｅ［Ｋ］）の関係を示すグラフ
【図１１】溶液内の微粒子数をパラメータにした場合における、インピーダンス測定用交流電圧の周波数と溶液のインピーダンスの関係を示すグラフ
【図１２】溶液導電率（μＳ／ｃｍ）をパラメータとした場合における、泳動電圧の周波数（Ｈｚ）とＲｅ［Ｋ］の関係を示すグラフ
【図１３】本発明の実施例における、周波数を掃引して測定した場合の電極インピーダンスの実部（横軸）と虚部（縦軸）の関係を示す図
【図１４】本発明の第２の実施形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャート
【図１５】本発明の実施例における電極を示す図
【図１６】本発明の実施例における、泳動電圧の周波数を、（ａ）は１００ｋＨｚ、（ｂ）は８００ｋＨｚ、（ｃ）は３ＭＨｚとしたときの、電圧印加４０秒後の電極ギャップの様子を示す図
【図１７】本発明の実施例における、試料液導電率を３００μＳ／ｃｍとし、泳動電圧の周波数を（ａ）は８００ｋＨｚ、（ｂ）は３ＭＨｚとしたときの電極ギャップの様子を示す図
【図１８】図１８（ａ）、（ｂ）は本発明の実施例における、泳動電圧の周波数として３ＭＨｚ、１０Ｖｐ−ｐを印加し、測定電圧の周波数として１００ｋＨｚを重畳して印加した場合の、電極ギャップの様子を示す図
【図１９】図１９（ａ）、（ｂ）は本発明の実施例における、大腸菌濃度とＤＥＰＩＭ測定の応答値（キャパシタンスの傾き）を対数表示したグラフを示す図
【図２０】本発明の実施例における、溶液の導電率が２４０μＳ／ｃｍのときの電極インピーダンスのコールコールプロット
【図２１】本発明の実施例における、測定電圧の周波数として（ａ）は１００ｋＨｚ、（ｂ）は８００ｋＨｚを重畳して印加した場合の、電極ギャップの様子を示す図
【発明を実施するための形態】
【００６４】
（第１の実施形態）
以下、本発明の実施の形態の微粒子測定装置について、図面を用いて説明する。図１は、本実施形態の微粒子測定装置の構成図、図２は、本実施形態の微粒子測定装置の電極チップを表す概略図である。
【００６５】
図１において、１は測定対象の微粒子が含まれる試料液２を保持するセル、３は誘電泳動で微粒子を捕集する電極対を含む電極チップ、４は泳動電源部、５は誘電泳動によってトラップされた微粒子によって生じた光学的あるいは電気的な変化を測定する測定部、６は微粒子測定装置全体の制御や測定結果の解析演算や入出力処理などを行う制御演算部、７は試料液２の導電率を入力するための導電率入力手段である。
【００６６】
図２において、１０は基板、１１ａ、１１ｂは基板１０上に形成され一対の極をなす電極、１３は電極１１ａと１１ｂとの電極間ギャップである。基板１０には、金属などの導電性材料によって電極１１ａ、１１ｂのパターンが形成される。好ましい材料の一例としては、金、銀、銅、アルミニウム、白金など、十分な導電性を有することが望ましく、本実施の形態では銀を使用している。
【００６７】
図３は、測定電極１１ａ，１１ｂ間に印加される電圧によって生じる電気力線１５を示す。本実施の形態では測定電極１１ａ，１１ｂ間のギャップ１３付近の構成が電界集中部にあたり、中でも最も電界が集中するのはギャップ１３である。従ってギャップ１３部分にもっとも強く微粒子が泳動される。
【００６８】
電極１１ａ、１１ｂはその幅に対して十分に薄い薄膜であることが望ましく、例えば１００μmの幅に対して厚さ１０００Å程度である。これにより、厚さ方向で見たエッジ部分に不平等電界が形成され、微粒子を効率的に誘電泳動することが可能となる。
【００６９】
電極１１ａ、１１ｂのパターニングを行う方法は、選択した材料で所望のパターンを形成できれば良い。例えば、金属薄膜をスパッタあるいは蒸着、めっきなどにより形成し、フォトリソグラフィー、レーザー加工などによってパターンを形成する方法、印刷などの、直接パターンを形成する方法など、電極を形成するために用いられる一般的なプロセスが選択可能である。生産性やコストなどを勘案して最も適切なプロセスを選択すればよい。本実施の形態では、スパッタによって銀の薄膜を形成し、フォトリソグラフィーによってパターンを形成している。
【００７０】
電極１１ａ、１１ｂはそれぞれ泳動電源部４に接続されており、泳動電源部４は電極１１ａ、１１ｂ間に特定周波数の交流電圧を印加する。なお、ここで交流電圧というのは、正弦波のほか、ほぼ一定の周期で流れの向きを変える電圧のことであり、且つ両方向の電流の平均値が等しいものである。後述するが、泳動電源部４が印加する周波数は、制御演算部６によって適切に決定される。
【００７１】
電極チップ３が試料液２中に浸漬され、電極１１ａ、１１ｂが試料液２に接した状態で、電極１１ａ、１１ｂ間に交流電圧が印加されると、試料液２中に含まれる微粒子が、電極１１ａと１１ｂに挟まれたギャップ１３に、誘電泳動力によって捕捉される。
【００７２】
微粒子１４に正の誘電泳動力が働く場合は図４（ａ）のように電界集中部であるギャップ１３の領域中、電極１１ａ、１１ｂの対向するエッジ部に、微粒子１４が電気力線に沿ってパールチェーンと呼ばれる数珠状にトラップされる。
【００７３】
一方、微粒子１４に負の誘電泳動が働く場合は、図４（ｂ）のように、電界集中部から遠ざかる方向、すなわち弱電界部であるギャップ１３の領域中、電極１１ａ、１１ｂの対向する中心部分にかけてトラップされる。
【００７４】
測定部５は、このようにしてギャップ１３にトラップされた微粒子によるインピーダンス変化を測定する。具体的には、図５に示すように、泳動電源部４と電極チップ３の間に、測定部５を電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスを測定する回路を構成する。
【００７５】
この場合、測定部５は電極１１ａ、１１ｂ間に流れる電流値と、泳動電源部４が印加した電圧と電流の位相差を測定するための回路等から構成される。測定部５は、誘電泳動によって微粒子が移動し電界集中部近傍に濃縮されることに起因する電極１１ａ、１１ｂ間の電流及び位相差の変化を測定する。尚、ここで行う電流値の測定は、電極に直列に検出抵抗を配置し、その電圧降下から電流値に変換したり、一般的なオペアンプを用いた電流―電圧変換回路など、公知の方法が利用可能である。
【００７６】
測定部５で測定した電流値と位相差は、制御演算部６に渡される。制御演算部６は、これら電流、位相差、及び、泳動電源部４が印加している電圧及び周波数の情報から、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンス値を計算する。
【００７７】
電圧印加前、電極１１ａ、１１ｂ間の試料液２のみで満たされた領域が、誘電泳動によるトラップによって誘電率の異なる微粒子で置き換えられることで、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスはトラップされた微粒子数に応じて変化する。
【００７８】
従って、ある時間におけるインピーダンス値と、電圧印加直後の初期インピーダンス値との差分、言い換えれば変化分から、ギャップ１３にトラップされた微粒子数を推定することが可能である。そして、トラップされた微粒子数は試料液中に含まれる微粒子濃度に依存するものであるから、試料液中の微粒子数を測定することが可能になる。
【００７９】
測定部５はまた、図６に示すように、光学的測定手段によっても実現可能である。この場合、光源２１と受光部２２の光路内にギャップ１３が含まれるような位置関係にセル１を配置する。ギャップ１３にトラップされた微粒子数によって、受光部２２に入射する光量が変化することを利用して、ギャップ１３にトラップされた微粒子数を推定することができる。
【００８０】
あるいは、受光部２２の情報を制御演算部６に渡して画像化し、制御演算部６が粒子判定アルゴリズムなどを用いて直接粒子数を計数してもよいし、視野面積に対する微粒子面積を求めることで微粒子数に換算してもよい。このようにして得られたギャップ１３にトラップされた微粒子数は試料液中に含まれる微粒子濃度に依存するものであるから、試料液中の微粒子数を測定することが可能になる。
【００８１】
以上のように微粒子をギャップ１３にトラップするためには、微粒子に働く粘性力や重力、ブラウン運動など、誘電泳動以外の全ての外力に対して十分大きな誘電泳動力を誘起する必要がある。これが不十分であれば、測定部５が測定できる微粒子数が減少するため、測定感度及び精度が著しく低下し、測定部５が測定可能な信号の大きさを下回ると微粒子の測定が出来なくなる。
【００８２】
従って、本実施の形態では、微粒子をギャップ１３にトラップするために十分な誘電泳動力が働くような周波数を、制御演算部６が適切に決定し、決定した周波数の電圧を泳動電源部４が印加する。これにより、測定部５が十分に検出可能な信号を取り出すことが出来るため、微粒子濃度の測定が高精度且つ高感度に行える。
【００８３】
制御演算部６は、図示しないＣＰＵや、一連の動作を規定するプログラムや各種データが格納されたメモリ６ａなどの回路から構成され、一連の測定動作を制御する。導電率入力手段７は、試料液の導電率を、測定前に入力できるようになっている。例えば、テンキーで数値入力する方法や、「０〜５０μＳ／ｃｍ」、「５０〜１００μＳ／ｃｍ」など複数の導電率範囲に対応したスイッチを押下するなどの方法で実現できる。
【００８４】
メモリ６ａは、導電率入力手段７から与えられた試料液の導電率の値から、泳動電源部４が印加する電圧の適切な周波数を選択するための周波数選択テーブルを有する。周波数選択テーブルには、試料液２の導電率毎に、微粒子に十分な誘電泳動力が働く最適な周波数と印加電圧値がテーブル化されている。
【００８５】
ここで、メモリ６ａに格納されている周波数選択テーブルについて詳説する。表２に示すように、周波数選択テーブルは少なくとも、試料液の導電率、印加する交流電圧の振幅、最適周波数が互いに関連付けられて格納されている。試料液の導電率は特定の数値であってもよいし、ある範囲を設定してテーブルを作成してもよい。制御演算部６は、与えられた導電率に該当する交流電圧の振幅と最適周波数を選択する。尚、導電率３００μS／ｃｍ〜に対応する周波数の“Ｅ”は、エラーであることを示しており、あまりにも導電率が高い場合には測定が出来ないことを表している。尚、表２に挙げた数値はあくまでも一例であり、実際には測定対象や導電率、電極設計によって最適な値とする。
【００８６】
【表２】
2010092773.tif 000034
【００８７】
次に、最適周波数について説明する。（数１）において、誘電泳動力ＦＤＥＰは、クラウジウス・モソッティ数Ｋの実部、すなわちＲｅ［Ｋ］に比例する。そして、Ｒｅ［Ｋ］は、（数２）及び（数３）から明らかなように、試料液２の導電率に依存する。試料液２の導電率が変化した場合、Ｒｅ［Ｋ］すなわち誘電泳動力がどのように変化するかを示したものが図７である。
【００８８】
図７においては、誘電泳動に用いる電界、言い換えれば印加電圧の周波数をパラメータに、試料液２の導電率の関数として示している。Ｒｅ［Ｋ］は、誘電泳動力ＦＤＥＰに対応しており、その正負は誘電泳動力が引力として作用するか、あるいは斥力として作用するかにそれぞれ対応する。
【００８９】
図７（ａ）に示すように、たとえば、誘電泳動用交流電圧の周波数が（１）１０ｋＨｚの場合は、溶液導電率３μＳ／ｃｍ付近でＲｅ［Ｋ］が正から負に変わっており、微粒子に作用する誘電泳動力ＦＤＥＰが引力から斥力に変化する。
【００９０】
一方、誘電泳動用交流電圧の周波数が（２）１００ｋＨｚの場合は、溶液導電率３０μＳ／ｃｍ付近でＲｅ［Ｋ］が正から負に変わっており、微粒子に作用する誘電泳動力ＦＤＥＰが引力から斥力に変化する。
【００９１】
なお、図７（ｂ）は、誘電泳動用交流電圧の周波数が（２）１００ｋＨｚ及び（３）８００ｋＨｚの場合に、溶液導電率を１μＳ／ｃｍ〜１０００μＳ／ｃｍまで変化させた場合の誘電泳動力ＦＤＥＰの変化を示す。周波数が（２）１００ＫＨｚの場合、約２０μＳ／ｃｍ以上でＲｅ［Ｋ］＜０となるが、８００ＫＨｚでは導電率上昇に対する誘電泳動力の低下が抑えられ、約２５０μＳ／ｃｍまでＲｅ［Ｋ］＞０となり引力によりギャップ１３のエッジ部にトラップすることができる。
【００９２】
このことは、試料液の導電率上昇に対して最も誘電泳動力の低下が小さくなる最適な周波数が存在することを示している。この最適周波数を決定するには、次のような実験を行って決定するのがよい。すなわち、同じ微粒子濃度で、導電率を変えた複数の試料液を用意し、それぞれの試料液に対して印加電圧の周波数を変えながら測定を行う。その結果、測定応答が最も大きくなった周波数が、それぞれの試料液導電率に対する最適周波数となる。表２に示した最適周波数は、このようにして決定する。
【００９３】
しかしながら、あまりにも周波数が高いと測定回路の実現が困難となり、あまりにも周波数が低いとジュール熱による対流や、極端な場合、電気分解による気泡発生が測定に悪影響をもたらす。このため、最適周波数は、誘電泳動にとって最適とはいえないが、微粒子測定を行うのに十分な誘電泳動を働かせることの出来る、許容範囲の周波数が存在する。
【００９４】
図８は、溶液導電率（μＳ／ｃｍ）をパラメータとした場合における、誘電泳動用交流電圧の周波数（Ｈｚ）とクラウジウス・モソッティ数の実部（Ｒｅ［Ｋ］）の関係を示すグラフである。試料液の導電率１００μＳ／ｃｍにおいて、正の誘電泳動を利用して微粒子の測定を行う場合、測定応答を得られる十分な誘電泳動力がＲｅ［Ｋ］＞０．４であるため、最適周波数は約７００ｋＨｚ〜４ＭＨｚとなる。この場合、高周波による測定回路の複雑化を避けるために、下限の周波数である７００ｋＨｚを最適周波数として採用することも可能である。
【００９５】
また、測定する必要がある試料液導電率の範囲内で、ある特定の一つの周波数で十分に誘電泳動力が得られることがある。その場合は、表３に示すような周波数選択テーブルになる。
【００９６】
【表３】
2010092773.tif 000035
【００９７】
例えば、測定する必要のある試料液導電率の範囲が０〜１００μＳ／ｃｍであった場合、周波数８００ｋＨｚであれば、全ての導電率領域に対してＲｅ［Ｋ］＞０．４となり、単一の周波数で所望の試料液導電率の範囲で測定を行うことができるため、回路構成が簡易となり好都合である。この場合、試料液導電率が１００μＳ／ｃｍを超えた場合には、周波数選択テーブルに示されるよう、エラーに該当するデータが書き込まれている。
【００９８】
図９は、本実施形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャートである。以下、フローチャートを参照して、試料の導入からセル１内の微粒子の濃縮、測定、結果提示にいたるまでの一連の流れを説明する。まず、初期状態では、セル１に測定対象の微粒子が含有された試料液を投入する（ステップＳ１１）。
【００９９】
次に、導電率入力手段７によって、投入した試料液の導電率を入力する。入力された導電率は、制御演算部６に渡される（ステップＳ１２）。
【０１００】
試料液の導電率を渡された制御演算部６は、メモリ６ａに備わる最適周波数テーブルを参照し、電極に印加すべき電圧振幅値及び周波数を選択する（ステップＳ１３）。この時の電圧振幅値（以下、「誘電泳動のための電圧」と呼ぶ）は、微粒子をギャップ１３にトラップするために十分な値を選択すればよく、本実施の形態では１０Ｖｐ−ｐとしている。
【０１０１】
また、表２及び表３では、誘電泳動のための電圧は導電率に対して一定の値としているが、それぞれの導電率で最適な値を選択することができる。例えば、導電率が高い場合は、あまりに電圧が高すぎるとジュール熱が発生し、誘電泳動による微粒子トラップに影響が出るため、導電率が高くなるに従い、誘電泳動のための電圧を低くする、などとする。
【０１０２】
次いで、制御演算部６は、メモリ上に保存された、入力された導電率に対応する周波数がエラーコード（Ｅ）であるか判断する（ステップＳ１４）。エラーコード（Ｅ）であった場合には、ステップＳ１６に進み、制御演算部６は、入力された導電率が測定範囲外であることを表示手段９に表示するよう指示し、測定を終了する（ステップＳ２２）。
【０１０３】
ステップＳ１４において、選択した周波数がエラーコード（Ｅ）でなかった場合、制御演算部６は泳動電源部４に対し、最適周波数テーブルで選択した電圧振幅及び周波数にて、電極１１ａ、１１ｂ間に電圧を印加させる（ステップＳ１５）。
【０１０４】
電極１１ａ、１１ｂ間に所定の電圧が印加されると、測定部５は直ちに電圧印加直後の初期状態のデータとして、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスを測定し、測定結果は制御演算部６に渡され、メモリ６ａに初期のインピーダンス値として保存する（ステップＳ１７）。
【０１０５】
ここでは、インピーダンス測定を例として記載するが、測定部５が光学的な手段を用いてギャップ１３の状態を測定するのであれば、電圧を印加しなくても初期状態が測定できるので、ステップＳ１７はステップＳ１５の前に行うことも可能である。
【０１０６】
次に、制御演算部６は、図示しない時計手段によって所定の時間が経過するまで待つ。この時、泳動電源部４は電圧印加を保持したままである（ステップＳ１８）。
【０１０７】
所定の時間が経過すると、制御演算部６は所定の測定回数が満了したかを判断し（ステップＳ１９）、満了していなければステップＳ１７に戻る。ステップＳ１７に戻り、制御演算部６は測定部５に命じ、電極１１ａ、１１ｂ間のインピーダンスを測定し、その結果をメモリ６ａに所定時間経過後の結果として保存する。
【０１０８】
所定の測定回数が満了した場合、制御演算部６は泳動電源部４に電圧印加を止めるよう指示する（ステップＳ２０）。
【０１０９】
電圧印加を停止後、制御演算部６は、メモリ６ａに保存された、電極１１ａ、１１ｂ間インピーダンスの経時変化データから、試料液２中の微粒子濃度を算出し、表示手段９に結果を表示させ（ステップＳ２１）、一連の測定動作を終了する（ステップＳ２２）。
【０１１０】
微粒子濃度の算出は、メモリ６ａに予め保存された、検量線から求めることができる。この検量線は、微粒子濃度が明らかな校正用試料を、本実施の形態で説明した微粒子測定装置の測定系を用いて予め測定し、その時の微粒子数とインピーダンス変化の相関関係からばらつきを回帰分析して得られる曲線をあらわす関数を使用する。
【０１１１】
この変換式を制御演算部６のメモリ６ａに記憶させ、微粒子濃度が未知の試料を測定する場合には、所定時間内におけるインピーダンス変化の値を代入することにより、セル１内の微粒子濃度を算出できる。なお、換算テーブルを用いる場合は、変換式による演算結果を予めメモリさせている。
【０１１２】
以上、本実施の形態によれば、試料液の導電率に応じて、最適な印加電界周波数を選択することにより、測定を行うために十分な誘電泳動力を微粒子に働かせることができるため、試料液の導電率が上昇しても、前処理無く、微粒子の測定を行うことができる。
【０１１３】
（第２の実施形態）
次に、本発明の第２の実施形態にかかる微粒子測定装置について図面を参照しながら説明する。本実施形態の微粒子測定装置の基本構成は、第１の実施形態とほぼ同様であるため、図５及び図２を参照して説明する。
【０１１４】
本実施形態の微粒子測定装置は、微粒子含有の液体を導入するセル１と、セル１内部に浸漬する少なくとも一対の電極１１ａ，１１ｂと、一対の電極１１ａ，１１ｂ間に微粒子に誘電泳動を誘起するための交流電圧（以下、泳動電圧と呼ぶ）及び、一対の電極１１ａ，１１ｂ間のインピーダンスを測定するための交流電圧（以下、測定電圧と呼ぶ）の少なくともいずれかを印加する泳動電源部４と、一対の電極１１ａ，１１ｂ間のインピーダンスを測定する測定部５と、泳動電源部４に対し、印加する電圧の周波数及び振幅が、適切な値になるよう指示命令を行う機能と、一対の電極１１ａ，１１ｂ間のインピーダンスの時間変化を演算し、セル１内の微粒子数を算出する機能を有する制御演算部６とを備える。後述するが、泳動電圧は数ＭＨｚ付近の比較的高周波を、測定電圧は数百ｋＨｚ付近の比較的低周波を用いるのが適当である。
【０１１５】
図１０は、泳動電圧の周波数をパラメータとした場合における、溶液導電率（μＳ／ｃｍ）とクラウジウス・モソッティ数の実部（Ｒｅ［Ｋ］）の関係を示すグラフである。Ｒｅ［Ｋ］は、誘電泳動力ＦＤＥＰに対応している。Ｒｅ［Ｋ］の正負は、誘電泳動力が引力として作用するか、あるいは斥力として作用するかにそれぞれ対応する。
【０１１６】
同図に示すように、たとえば、泳動電圧の周波数が（１）１０ｋＨｚの場合は、溶液導電率３μＳ／ｃｍ付近でＲｅ［Ｋ］が正から負に変わっており、微粒子に作用する誘電泳動力ＦＤＥＰが引力から斥力に変化する。
【０１１７】
一方、泳動電圧の周波数が（２）１００ｋＨｚの場合は、溶液導電率３０μＳ／ｃｍ付近でＲｅ［Ｋ］が正から負に変わっており、微粒子に作用する誘電泳動力ＦＤＥＰが引力から斥力に変化する。
【０１１８】
さらに泳動電圧の周波数を、（３）８００ｋＨｚ、（４）１ＭＨｚと高めると、溶液導電率が高くなっても微粒子に作用する正の誘電泳動力ＦＤＥＰが維持される。このように、泳動電圧の周波数は高い方が溶液導電率の影響が軽微であり、微粒子を効率良くトラップするために、泳動電圧の周波数を高くする方が有利であることが分かる。
【０１１９】
図１２は、溶液導電率（μＳ／ｃｍ）をパラメータとした場合における、泳動電圧の周波数（Ｈｚ）とＲｅ［Ｋ］の関係を示すグラフである。ここで、試料液の導電率は２０μS／ｃｍ以上である可能性が高い。試料液の導電率が２０μS／ｃｍの場合、泳動電圧の周波数は、約５０ｋHｚ以上で誘電泳動力ＦＤＥＰが斥力から引力に変化する。従って、泳動電圧の周波数は最低５０ｋＨｚ以上である必要がある。一方、泳動電圧の周波数が高すぎると、溶液導電率に関わらずＲｅ［Ｋ］は低下し、５０ＭＨｚで誘電泳動力ＦＤＥＰが引力から斥力に変化する。このため、泳動電圧の周波数は、５０ｋＨｚ〜５０ＭＨｚの間が望ましい。
【０１２０】
試料液の導電率は、場合によっては１００μS／ｃｍ以上のものが想定される。よって、この試料液も測定可能とするためには、７００ｋＨｚ〜１５ＭＨｚとするとＲｅ［Ｋ］が０．５以上となるため、微粒子に十分な誘電泳動力を誘起することが出来るため、最も望ましい。
本実施の形態では、泳動電圧の周波数を３ＭＨｚ、振幅は、微粒子をギャップ１３にトラップするために十分な値を選択すればよく、１０Vｐ−ｐとしている。
【０１２１】
一方、図１１は、溶液内の微粒子数をパラメータとした場合に、測定電圧の周波数と溶液のインピーダンスの関係を示すグラフである。同図に示すように、微粒子数が（１）３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜（５）３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに対して、インピーダンスの絶対値｜Ｚ｜の変化幅は、測定電圧の周波数が１０ｋＨｚ付近（矢印Ｃ）で最大（約２０ＫΩ〜１５０ＫΩ）となる。このため、１０ｋＨｚ前後が、インピーダンス測定にとって最も最適な周波数であると言える。
【０１２２】
一般的に、周波数が高くなるほどインピーダンス計測の精度を保つのは難しくなり、泳動電圧の周波数として最適な、１〜１０ＭＨｚ程度の比較的高周波の領域においてインピーダンス測定を行おうとすると、測定回路の複雑化を招き、高精度のインピーダンス測定回路の実現が困難である。このため、測定電圧の周波数を１０ｋＨｚ〜１ＭＨｚ程度の比較的低周波領域としてインピーダンス測定を行う。本実施の形態では、誘電泳動とインピーダンス計測に別の周波数を個別に選択できるため、誘電泳動とインピーダンス計測それぞれに最適な条件を、簡易な測定回路で、且つ高精度なインピーダンス計測を実現できるという効果がある。
【０１２３】
ところで、測定電圧として最も適した周波数１０ｋＨｚ付近は、溶液導電率が約３μS／ｃｍ以上となると負の誘電泳動の領域となり、泳動電圧による誘電泳動を阻害するため、電極１１ａ，１１ｂ間に微粒子をトラップするためには望ましくない。このため、周波数はインピーダンス測定精度が許す範囲内で高くし、且つ、泳動電圧に比較して振幅を小さくすることが望ましく、測定電圧の周波数は、測定試料液の導電率において負の誘電泳動が生じない周波数であることが最も好ましい。
【０１２４】
更に、インピーダンス計測に最適な周波数を選択する際、電極と試料液界面における拡散の影響に起因する、ワールブルグインピーダンスの影響が生じる周波数領域でインピーダンス計測を行うと、正確なインピーダンスが計測できないという問題がある。図１３は、周波数を掃引して測定した、電極インピーダンスの実部（横軸）と虚部（縦軸）の関係を示す図（コールコールプロットと呼ぶ）である。
【０１２５】
図１３において、（１）における周波数（Fｌと呼ぶ）を境界に、高周波側は半円上の軌跡（（１）よりも左側）となり、電極系の等価回路が抵抗と容量の単純なモデルで記述される。一方、Fｌよりも低周波側（（１）よりも右側）はワールブルグインピーダンスの影響を生じ、コールコールプロットが半円から外れる領域となる。本発明においてはFｌの周波数を境界周波数と呼ぶ。プロットが半円から外れた領域のインピーダンスは、抵抗と容量の並列回路からなる単純な等価回路モデルとは異なり、電極と溶液間の電子授受に関わる物質の拡散係数など複雑となるため、電極に微粒子がトラップされたことによるインピーダンス変化を正確に算出することができない。このため、ＤＥＰＩＭ法の測定を行うためには、ワールブルグインピーダンスの影響が生じないFｌ以上の周波数領域でインピーダンス測定を行う必要がある。測定電圧の周波数を決定するには、実際の電極系と想定している導電率の溶液（細菌は含まない）でコールコールプロットを測定すればよい。
【０１２６】
また、インピーダンス計測回路の観点から、不要な電流が流れることによる計測誤差を防ぐため、測定電圧の周波数におけるインピーダンスの大きさは可能な限り大きい方が望ましい。従って、測定電圧の周波数は、コールコールプロット半円の頂点（図１３における（２）の点、Ｆｈと呼ぶ）までの周波数を選択することが望ましい。
測定結果から求められたFｌ以上、Ｆｈ以下の周波数で、所望の測定精度が確保できる周波数を測定電圧の周波数と決めることができる。本実施の形態では、測定電圧の周波数を８００ｋHｚとしている。
【０１２７】
すなわち、本実施の形態において、測定対象物は、血液又は唾液中に含まれる微粒子、具体的には細菌を測定するものである。血液又は唾液は、測定対象のヒト又は動物によって、若しくは、その検体採取時間によって、導電率がばらつくものである。従って、電極に細菌がトラップされたことによるインピーダンス変化のみを検出するために、一方のセルに測定対象の細菌を含む溶液を、他方のセルに測定対象の溶液と同じ導電率をもち、且つ、測定対象の細菌を含まない溶液を導入し、細菌がトラップされたこと以外によるインピーダンス変化分をキャンセルすることは、工業的なものにおいては、２つのセルに投入する液体の導電率を合わせることが可能のため、有効と考えられる。しかし、ヒト又は動物の血液又は唾液を測定するものにおいては、この２セルタイプを活用できない。何故なら、前述のごとく、検体の導電率は被験者あるいは採取時間によって導電率が大きく変わってしまうため、同じ導電度の溶液を検体毎に準備するのは極めて困難であり、場合によっては不可能である。このようなことを考慮し、検体を採取するヒト又は動物、若しくは検体採取時間が異なっても、安定に測定できることを想定し、鋭意検討した結果、上述のごとくワールブルグインピーダンスの影響を生じる周波数よりも高い周波数で計測することで、安定な測定が可能となる。ワールブルグインピーダンスの影響を生じる周波数よりも高い周波数について、上述した例では、ワールブルグインピーダンスの影響を受ける周波数は１００ｋＨｚより低い値であったので、これより高い周波数の信号を加えればよいという発想になる。しかし、上述のごとくヒト又は動物は、それぞれのヒト又は動物、更には、検体採取時間によって大きくその導電率が変わるため、これらのことを考慮し、本実施形態では測定電圧の周波数を８００ｋＨｚから誘電泳動のための周波数よりも低い周波数範囲の電圧を加えることとした。その中でも、本実施形態では、８００ｋＨｚで十分その検出に安定性を持たせることが出来たので、８００ｋＨｚより少しでも高い周波数で測定が可能である。もちろん、より高い周波数で測定しても構わないが、本実施の形態における誘電泳動のための周波数である３ＭＨｚと分離できなくなるため、２ＭＨｚ程度までが現実的であった。
【０１２８】
図１４は、本実施形態にかかる微粒子測定方法を説明するためのフローチャートである。以下、フローチャートを参照して、試料の導入からセル１内の微粒子の濃縮、測定、結果提示にいたるまでの一連の流れを説明する。
【０１２９】
まず、初期状態では、セル１に測定対象の微粒子が含有された試料液を投入する（ステップＳ１２１）。試料液が投入されたことを、ユーザの操作あるいは図示しない液検知手段によって感知した制御演算部６は、泳動電源部４に対し、予めメモリ６ａに記憶された測定電圧の周波数、及び振幅を印加するよう指示し、泳動電源部４は、指示された測定電圧を電極１１ａ，１１ｂ間に印加する（ステップＳ１２２）。
【０１３０】
測定電圧が印加されると、制御演算部６の指示により、即座に測定部５は電極１１ａ，１１ｂ間の電流測定を行う。測定結果は、制御演算部６に渡され、インピーダンス演算が行われ、メモリ６ａに記憶される（ステップＳ１２３）。
【０１３１】
インピーダンス測定を終えると、制御演算部６は、予めメモリ６ａに記憶された測定回数（あるいは測定時間）を満たしているか判断し（ステップＳ１２５）、満たしていない場合、制御演算部６は、泳動電源部４に対し、予めメモリ６ａに記憶された周波数、及び振幅の泳動電圧を印加するよう指示し、泳動電源部４は、指示された泳動電圧を電極１１ａ，１１ｂ間に印加する（ステップＳ１２４）。
【０１３２】
所定の時間が経過すると、制御演算部６は、泳動電源部４に対し、印加電圧を測定電圧に変更するよう指示し、泳動電源部４は電極１１ａ，１１ｂ間へ印加する電圧を泳動電圧から測定電圧に変更する（ステップＳ１２２）。このとき、電極１１ａ，１１ｂ間には、泳動電圧の印加によって微粒子がトラップされているが、測定電圧に切り替えた後は泳動電圧は印加されていない。測定電圧は数百ｋＨｚ程度の比較的低周波が望ましいため、導電率が高い状態では正の誘電泳動を誘起しにくい条件と言える。このため、測定電圧を印加する時間が長ければ、泳動電圧によってトラップした微粒子が試料液の粘性力や重力沈降などの外力によって電極１１ａ，１１ｂ間のギャップから分散してしまう可能性がある。よって、測定電圧は、測定部５が必要十分な精度で電流を測定できる時間内で、少なくとも泳動電圧の印加時間より短く、可能な限り短時間の印加とするほうが望ましく、１０ｍｓ〜１００ｍｓ程度が最も望ましい。これにより、測定電圧印加時に泳動電圧によってトラップされた微粒子が、測定電圧印加時に電極から分散することなく保持され、高感度な測定を実現できるという効果がある。
【０１３３】
以下、同様のステップを繰り返し、ステップＳ１２５で所定の測定回数（あるいは測定時間）を満たしていれば、測定終了のためステップＳ１２６に進み、制御演算部６は電圧印加を停止するよう泳動電源部４に指示し、泳動電源部４は電圧印加を停止する。その後、制御演算部６は、ステップＳ１２７で微粒子濃度の算出と、結果表示を行い、測定動作を完了する。詳細については前述の実施例と同様のため説明を省略する。
【０１３４】
このように本実施形態の微粒子測定装置は、溶液導電率の影響が軽微で誘電泳動に有利な高周波数で微粒子をトラップし、インピーダンスの絶対値｜Ｚ｜の変化幅が広く、言い換えればインピーダンス測定が容易で感度が高い低周波数でインピーダンス計測を行うので、高溶液導電率条件下での微粒子の誘電泳動トラップと、高感度及び高精度なインピーダンス計測を両立させることができる。
【０１３５】
尚、本実施の形態においては、測定量がインピーダンスであるとして説明したが、測定量として、電極を流れる電流、電圧と電流との位相差、誘電率、導電率、あるいはこれらから算出される電気物理的な特性値を用いて良い。本実施の形態ではこの中でも特に、インピーダンス及びその抵抗成分（コンダクタンス）と容量成分（キャパシタンス）の測定によって微粒子の測定を行っている。
【０１３６】
また、本実施形態の微粒子測定装置において、制御演算部６は、溶液導電率に基づいて泳動電圧の周波数及び測定電圧の周波数を選択することも可能である。前述の通り、誘電泳動力は溶液導電率によって変化するし、導電率によってインピーダンス計測に最適な周波数が異なることも考えられる。よって、溶液導電率によって泳動電圧及び測定電圧の周波数はそれぞれ最適な値を選ぶ必要がある。
ここで、溶液導電率は、電極１１ａ，１１ｂ間のインピーダンス計測結果から求めることが可能である。なぜなら、インピーダンスの抵抗成分の逆数であるコンダクタンスは、溶液導電率を反映した値になるからである。よって、測定に先立ち、試料液のインピーダンスを計測して導電率を求め、泳動電圧及び測定電圧の最適周波数を選択する。
これにより、導電率が変化する試料液でも、確実な誘電泳動による微粒子のトラップと、高精度なインピーダンス計測を実現することが可能である。
【０１３７】
（第３の実施形態）
第２の実施形態では、泳動電源部４が、泳動電圧と測定電圧とを逐次印加する微粒子測定装置について説明したが、本実施形態では、第２の実施形態で説明した微粒子測定装置において、泳動電源部４が、泳動電圧と測定電圧とを同時に印加する場合について説明する。本実施形態の微粒子測定装置（図示せず）は、図５に示す構成において、測定部５が、後述するフィルタ分離機能を有するものである。
【０１３８】
本実施形態において、泳動電源部４は、一対の電極１１ａ，１１ｂ間に、泳動電圧として１ＭＨｚ付近の高周波数の交流電圧及び、測定電圧として１０ｋＨｚ〜１ＭＨｚ付近の低周波数の交流電圧を重畳して印加する。これら条件設定の根拠は、第２の実施形態の通りである。また、測定部５は、１０ＫＨｚ〜１ＭＨｚ付近の低周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離し、一対の電極１１ａ，１１ｂ間のインピーダンスを測定することもできる。
【０１３９】
ここでいう重畳とは、少なくとも異なる２つの周波数の正弦波あるいは矩形波などの交流信号同士を加算して交流信号を生成することを指す。また、フィルタ分離機能とは、交流信号から特定の周波数成分のみを取り出す機能である。フィルタ分離機能は、例えば、ＲＣ回路などにより構成される、受動素子によるパッシブフィルタ、及び、オペアンプなどの能動素子により構成されるアクティブフィルタ、あるいは信号処理によるディジタルフィルタなど、公知の技術により実現可能である。本実施の形態では、高周波の泳動電圧が混合された信号から、低周波の測定電圧の信号を分離する必要があるため、フィルタはローパスフィルタの構成としている。
【０１４０】
また、振幅の大きい泳動電圧の信号から、振幅の小さい測定電圧の信号を分離する必要があるため、高ノイズ成分を含む信号から、特定周波数の低レベル信号を取り出すことが可能な、位相検波方式によって測定電圧の周波数成分のみを取り出し、高精度なインピーダンス測定を実現している。
【０１４１】
この構成によれば、１ＭＨｚ以上の高周波数及び１０ｋＨｚ付近の低周波数の交流電圧を重畳して印加し、１０ｋＨｚ付近の低周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離してインピーダンスを測定するので、微粒子のトラップとインピーダンス測定を同時に行うことができ、測定電圧のみが印加される状態にならず、微粒子を強固に電極間にトラップしたままインピーダンス測定ができるため、高精度且つ高感度の微粒子検出を実現できる。すなわち、高周波でトラップし低周波で計測するので、導電率影響の回避と高感度測定の両立が可能になる。また、計測を低周波で行うので、設計上有利となり、低コストな簡易回路で構成することができる。さらに、高周波と低周波の重畳波を使うことで、測定とトラップが同時に可能となる。
【０１４２】
なお、本実施形態の微粒子測定装置において、制御演算部６は、溶液導電率に基づいて印加する電圧の周波数、つまり、少なくとも泳動電圧の周波数及び測定電圧の周波数のいずれか一方を調整することも可能である。
【０１４３】
このように、泳動電圧及び測定電圧の周波数を、試料液の導電率に応じてそれぞれ適切な値に設定することで、微粒子のトラップ及びインピーダンス測定をより確実に、高精度に行うことができるという効果を有する。
【０１４４】
以下に、実施の形態３についての実施例を示す。
【実施例】
【０１４５】
（１）泳動電圧の周波数及び測定電圧の振幅の設定
泳動電圧、測定電圧の周波数及び振幅の最適値を検討するための実験を行った。標準寒天培地（ＭＢ００１０、栄研器材（株））上で３７℃、１６時間の好気培養を行った大腸菌Ｋ−１２株（ＮＢＲＣ３３０１、製品評価技術基盤機構）をコンラージ棒で採取し、０．１Ｍ  Ｄ−マニトール溶液（導電率、約５μＳ／ｃｍ）に懸濁、適宜希釈したものを試料とした。試料に、ＮａＣｌ溶液を適宜追加し、試料液導電率を調製した。試料液導電率は、導電率計（Ｂ−１７３、堀場製作所（株））により測定した。微生物が誘電泳動される様子を観察するため、電極は図１５に示すような矩形が入れ子になった形状の電極を用いた。電極上を透明なチャンバで覆い、位相差顕微鏡（ＩＸ７０、オリンパス）にて観察を行った。
【０１４６】
図１６は、泳動電圧の周波数を、（ａ）１００ｋＨｚ、（ｂ）８００ｋＨｚ、（ｃ）３ＭＨｚとしたときの、電圧印加４０秒後の電極ギャップの様子を示す。試料液の導電率は１００μＳ／ｃｍである。印加電圧は１０Ｖｐ−ｐ、交流電圧は正弦波である。周波数の高い（ｂ）、（ｃ）の場合、電極ギャップ間（電極のコーナー部、白丸枠内）の電界集中部に大腸菌がトラップされている様子が分かる。一方、周波数の低い（ａ）の場合、電極に殆ど大腸菌はトラップされておらず、試料液の導電率が１００μＳ／ｃｍの場合、１００ｋＨｚでは電極に微生物をトラップできないことが分かった。
【０１４７】
図１７は、更に試料液導電率を３００μＳ／ｃｍとし、泳動電圧の周波数を（ａ）８００ｋＨｚ、（ｂ）３ＭＨｚとしたときの電極ギャップの様子である。周波数を３ＭＨｚでは８００ｋＨｚに比べ、大腸菌が多くトラップされており、導電率が上昇した場合、３ＭＨｚが最も適した条件であることを確認した。
【０１４８】
図１８は、泳動電圧の周波数として３ＭＨｚ、１０Ｖｐ−ｐを印加し、測定電圧の周波数として１００ｋＨｚを重畳して印加した場合の、電極ギャップの様子である。試料液導電率は２００μＳ／ｃｍである。（ａ）は１００ｋＨｚ（測定電圧の周波数）の振幅を３Ｖｐ−ｐ、（ｂ）は１００ｋＨｚの振幅を１Ｖｐ−ｐとした場合である。周波数の低い測定電圧の振幅が高い３Ｖｐ−ｐの場合、１Ｖｐ−ｐに比べトラップされる大腸菌の量が少ないことが分かる。よって、測定電圧の振幅は１Ｖｐ−ｐ程度が最適であると確認した。
【０１４９】
図２０は、溶液の導電率が２４０μＳ／ｃｍのときの電極インピーダンスのコールコールプロットである。同図より、Fｌ＝１００ｋＨｚであることが分かる。このため、測定電圧の周波数は１００ｋＨｚ以上である必要がある。図２１は、泳動電圧の周波数として３ＭＨｚ、１０Ｖｐ−ｐを印加し、測定電圧の周波数として（ａ）１００ｋＨｚ、（ｂ）８００ｋＨｚを重畳して印加した場合の、電極ギャップの様子である。試料液導電率は２００μＳ／ｃｍである。測定電圧の周波数が低い１００ｋＨｚに比べて、周波数が高い８００ｋＨｚのトラップされる大腸菌の量が多いことが分かる。よって、測定電圧の周波数は８００ｋＨｚ程度が最適であると確認した。
【０１５０】
（２）微生物測定
前述した実験から、泳動電圧を３ＭＨｚ、１０Ｖｐ−ｐ、測定電圧を８００ｋＨｚ、１Ｖｐ−ｐと定め、図５の装置で大腸菌濃度及び導電率を適宜調整した試料液の測定を行った。比較のため、泳動電圧と測定電圧を同一の８００ｋＨｚ、１０Ｖｐ−ｐとして同様の測定を行った。図１９は、横軸に大腸菌濃度、縦軸にＤＥＰＩＭ測定の応答値（キャパシタンスの傾き）を対数表示したグラフを示す。（ａ）は泳動電圧及び測定電圧をいずれも８００ｋＨｚにした場合を、（ｂ）は泳動電圧を３ＭＨｚ、測定電圧を８００ｋＨｚにした場合を示す。（ａ）の場合、試料液導電率が１００μＳ／ｃｍまで上昇すると、微生物に働く誘電泳動力が低下する結果、ＤＥＰＩＭ測定の応答値にも低下が見られる。一方、（ｂ）に示すように、泳動電圧及び測定電圧をそれぞれ適切に設定した場合、試料液導電率が４００μＳ／ｃｍまで上昇しても応答低下が見られず、高精度な測定ができることが示された。
【０１５１】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
【０１５２】
本出願は、２００９年２月１０日出願の日本特許出願（特願２００９−０２８９２７）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１５３】
本発明は、高溶液導電率での誘電泳動トラップと、高感度及び高精度なインピーダンス計測を両立させることができる微粒子測定装置及び微粒子測定方法として有用である。
【符号の説明】
【０１５４】
１  セル
２  試料液
３  電極チップ
４  泳動電源部
５  測定部
６  制御演算部
６ａ  メモリ
７  導電率入力手段
９  表示手段
１０  基板
１１ａ，１１ｂ  電極
１３  ギャップ
１４  微粒子
１５  電気力線
１７  攪拌手段
２１  光源
２２  受光部
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液及び唾液のうち少なくともいずれか一方に含まれる微粒子を含有する液体を導入するセルと、
前記セル内部に浸漬する少なくとも一対の電極と、
前記一対の電極間に交流電圧を印加する泳動電源部と、
前記一対の電極間のインピーダンスを測定する測定部と、
前記一対の電極間のインピーダンスの時間変化を演算し、前記セル内の前記微粒子の数を算出する制御演算部と、を備え、
前記制御演算部は、前記微粒子に誘電泳動を誘起するための第１の周波数の交流電圧、及び前記一対の電極間のインピーダンスを測定するための、ワールブルグインピーダンスの影響を生じる周波数よりも高い周波数である第２の周波数の交流電圧、を前記一対の電極間に印加するよう、前記泳動電源部に指示する微粒子測定装置。
【請求項２】
請求項１記載の微粒子測定装置であって、
前記第１の周波数の交流電圧は、第１の振幅を有し、
前記第２の周波数の交流電圧は、第２の振幅を有する微粒子測定装置。
【請求項３】
請求項２記載の微粒子測定装置であって、
前記第２の振幅は、前記第１の振幅より小さいものである微粒子測定装置。
【請求項４】
請求項１記載の微粒子測定装置であって、
前記制御演算部は、溶液導電率に基づいて、前記第１の周波数、及び前記第２の周波数の少なくともいずれかを調整する微粒子測定装置。
【請求項５】
請求項１記載の微粒子測定装置であって、
前記第１の周波数と前記第２の周波数を逐次切り替える微粒子測定装置。
【請求項６】
請求項５記載の微粒子測定装置であって、
前記第２の周波数の交流電圧を印加する時間が、第１の周波数の交流電圧を印加する時間より短い微粒子測定装置。
【請求項７】
請求項１記載の微粒子測定装置であって、
前記第２の周波数が、８００ｋＨｚより高く、前記第１の周波数よりも低い、微粒子測定装置。
【請求項８】
請求項１記載の微粒子測定装置であって、
前記泳動電源部は、前記一対の電極間に、前記第１の周波数の交流電圧及び前記第２の周波数の交流電圧を重畳して印加し、
前記一対の電極間に印加されている重畳された交流電圧のうち前記第２の周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離するフィルタ手段を備え、
前記測定部は、フィルタ分離された前記第２の周波数の交流電圧の周波数成分に対応する前記一対の電極間のインピーダンスを測定する微粒子測定装置。
【請求項９】
血液及び唾液のうち少なくともいずれか一方に含まれる微粒子を含有する試料液に浸漬した一対の電極間に交流電界を印加し、誘電泳動力により前記微粒子を所定位置に配置し、前記試料液中における前記微粒子の数を測定する微粒子測定方法であって、
前記一対の電極間に第１の周波数の交流電圧を印加し、前記微粒子に誘電泳動力を作用させるステップと、
前記一対の電極間に、前記一対の電極間のインピーダンスを測定するための、ワールブルグインピーダンスの影響が生じる周波数よりも高い周波数である第２の周波数の交流電圧を前記一対の電極間に印加し、前記一対の電極間のインピーダンスを測定するステップと、
前記一対の電極間のインピーダンスの時間変化を演算し、前記セル内の前記微粒子の数を算出するステップと、を有する微粒子測定方法。
【請求項１０】
請求項９記載の微粒子測定方法であって、
溶液導電率に基づいて、前記第１の周波数、及び前記第２の周波数を選択するステップを有する微粒子測定方法。
【請求項１１】
請求項９記載の微粒子測定装置であって、
前記一対の電極間に、前記第１の周波数の交流電圧、及び前記第２の周波数の交流電圧を重畳して印加するステップと、
前記一対の電極間に印加されている重畳された交流電圧のうち、前記第２の周波数の交流電圧の周波数成分をフィルタ分離し、前記一対の電極間のインピーダンスを測定するステップと、を有する微粒子測定方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2010092773.tif 000036
【図２】
2010092773.tif 000037
【図３】
2010092773.tif 000038
【図４】
2010092773.tif 000039
【図５】
2010092773.tif 000040
【図６】
2010092773.tif 000041
【図７】
2010092773.tif 000042
【図８】
2010092773.tif 000043
【図９】
2010092773.tif 000044
【図１０】
2010092773.tif 000045
【図１１】
2010092773.tif 000046
【図１２】
2010092773.tif 000047
【図１３】
2010092773.tif 000048
【図１４】
2010092773.tif 000049
【図１５】
2010092773.tif 000050
【図１６】
2010092773.tif 000051
【図１７】
2010092773.tif 000052
【図１８】
2010092773.tif 000053
【図１９】
2010092773.tif 000054
【図２０】
2010092773.tif 000055
【図２１】
2010092773.tif 000056
【国際調査報告】
2010092773.tif 000057
2010092773.tif 000058
2010092773.tif 000059
2010092773.tif 000060