(57)【要約】  本発明の課題は、ノックアウト動物の作製期間を簡便化できるＤＮＡフラグメント及び医薬組成物等を提供することである。  ＤＮＡフラグメントは、薬剤耐性以外（好ましくは視覚的に検出可能な）の検出マーカをコードする検出配列と、少なくとも原核生物の１種以上の増殖を阻害する薬剤の耐性マーカをコードする耐性配列と、この耐性配列の上流に位置し原核生物で機能するプロモータ配列と、これら配列の最上流に位置し、１種以上の真核生物ゲノムの標的部位に挿入されたときにのみ下流に位置する配列の発現を誘導する調節配列と、を含む。検出配列及び耐性配列は作動可能に配置されている。
2011007859.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤耐性以外の検出マーカをコードする検出配列と、少なくとも原核生物の１種以上の増殖を阻害する薬剤の耐性マーカをコードする耐性配列と、この耐性配列の上流に位置し前記原核生物で機能する原核プロモータ配列と、これら配列の最上流に位置し、１種以上の真核生物ゲノムの標的部位に挿入されたときにのみ下流に位置する配列の発現を誘導する調節配列と、を含み、
前記検出配列及び前記耐性配列は、作動可能に配置されているＤＮＡフラグメント。
【請求項２】
前記調節配列は、配列内部リボソーム進入部位、及びスプライシングアクセプタからなる群より選ばれる１種以上を構成する配列である請求項１記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項３】
視覚的に検出可能な検出マーカをコードする検出配列と、少なくとも原核生物の１種以上の増殖を阻害する薬剤の耐性マーカをコードする耐性配列と、この耐性配列の上流に位置し前記原核生物で機能する原核プロモータ配列と、これら配列の最上流に位置し、１種以上の真核生物で構成的に機能する真核プロモータ配列と、を含み、
前記検出配列及び前記耐性配列は、作動可能に配置されているＤＮＡフラグメント。
【請求項４】
前記検出マーカは、視覚的に検出可能なものである請求項１から３いずれか記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項５】
前記耐性マーカは、真核生物の増殖を阻害する薬剤への耐性も付与する請求項１から４いずれか記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項６】
請求項１から５いずれか記載のＤＮＡフラグメントの配列を有するベクター。
【請求項７】
動物ゲノムの一部を構成する標的配列の相補配列を更に有する請求項６記載のベクター。
【請求項８】
請求項６又は７記載のベクターが導入された宿主細胞。
【請求項９】
遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞の作製方法であって、
請求項７記載のベクターを胚性幹細胞又は万能細胞に導入し、
導入後の胚性幹細胞又は万能細胞における前記検出配列の発現の有無を判定し、発現が存在すると判定された胚性幹細胞又は万能細胞を遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞として選択する手順を含む作製方法。
【請求項１０】
生殖系列キメラ動物の作製方法であって、
請求項１から５いずれか記載のＤＮＡフラグメントが導入された遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞を用いてキメラ動物を産生し、
前記キメラ動物の子孫における前記検出配列の発現の有無を判定し、発現が存在すると判定される場合、前記キメラ動物を生殖系列キメラ動物として選抜する手順を含む作製方法。
【請求項１１】
非ヒトノックアウト動物の作製方法であって、
請求項７記載のベクターを胚性幹細胞又は万能細胞に導入し、
導入後の胚性幹細胞又は万能細胞における前記検出配列の発現の有無を判定し、発現が存在すると判定された胚性幹細胞又は万能細胞を遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞として選択し、
前記遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞を用いて、生殖系列キメラ動物を作製し、
前記生殖系列キメラ動物を用いて、ホモ接合体を作製する手順を含む作製方法。
【請求項１２】
非ヒトノックアウト動物の作製方法であって、
請求項１から５いずれか記載のＤＮＡフラグメントが導入された遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞を用いてキメラ動物を産生し、
前記キメラ動物の子孫における前記検出配列の発現の有無を判定し、発現が存在すると判定される場合、前記キメラ動物を生殖系列キメラ動物として選抜し、
前記生殖系列キメラ動物を用いて、ホモ接合体を作製する手順を含む作製方法。
【請求項１３】
疾病の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
請求項７記載のベクターが導入され疾患原因遺伝子がノックアウトされた非ヒトノックアウト動物に被検物質を投与する投与手順と、
前記非ヒトノックアウト動物における前記疾患の改善を検出する検出手順と、を含むスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項１から５いずれか記載のＤＮＡフラグメントと、疾患の治療又は予防に発現抑制が効果的な遺伝子を構成する配列の相補配列とを含み、この相補配列が前記ＤＮＡフラグメントの両側に位置するベクターを有効量含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡフラグメント、ベクター、宿主細胞、非ヒトノックアウト動物の作製方法、治療薬の候補化合物のスクリーニング方法、及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ノックアウト動物の作製には、ターゲティングベクターが必要とされる。従来のターゲティングベクターは、一般に、ノックアウトすべき遺伝子を構成する塩基配列の一部が変異された配列、ネオマイシン耐性遺伝子及びチミジンキナーゼ遺伝子をそれぞれ構成する配列を有し、これら遺伝子は強力なプロモータ（ｐＧＫプロモータ等）によって強制発現させられる。【０００３】
かかるターゲティングベクターが所望の動物由来の胚性幹細胞内に導入され、ベクター由来のＤＮＡが胚性幹細胞ゲノムに挿入されると、プロモータに誘導されて薬剤マーカが発現される。これにより、ベクター由来ＤＮＡがゲノムに挿入された改変胚性幹細胞は、薬剤存在下で生存し、選別できる。次に、選別された細胞群にガンシクローバーを与えることで、ＤＮＡがランダムに挿入された細胞株を排除する（例えば、非特許文献１参照）。【０００４】
選別された改変胚性幹細胞は動物胚に注入され、仮親の子宮に移植され、これによりキメラ動物を得る。得られた各キメラ動物は野生型動物と交配され、子孫が改変胚性幹細胞由来の表現型（例えば、毛色）を呈するか否かに基づいて、生殖系列のキメラ動物を選抜する。かかる生殖系列のキメラ動物同士を交配することで、ホモノックアウト動物が得られる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４：１９６４−７１，２００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、前述のターゲティングベクターでは、改変胚性幹細胞を選択する際、ＤＮＡがランダムに挿入された細胞株が排除された後にも、所望の箇所に挿入された細胞株以外の細胞が９０％程度混在する。このため、サザン分析等の手段を用いて所望の箇所に挿入された細胞株を選別する作業を更に行う必要がある。【０００７】
また、生殖系列のキメラ動物を選抜する際、子孫の生後、改変胚性幹細胞由来の表現型を呈するか否かの判断が可能となるまでに、少なからぬ期間、子孫を飼育して待機する必要がある。例えば、動物としてマウスを使用した場合、子孫の毛色に基づいて生殖系列のキメラ動物を選抜することが多いが、色を判定するのに必要な程度に毛が生えるには生後約１週間を要する。【０００８】
このように、従来、ノックアウト動物の作製は多段階を要するところ、その種々の段階で長時間が費やされる。その結果、ノックアウト動物の作製費用が莫大なものになっている。【０００９】
本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、ノックアウト動物の作製を簡便化できるＤＮＡフラグメント、ベクター、宿主細胞、遺伝子改変胚性幹細胞又は万能細胞の作製方法、生殖系列キメラ動物の作製方法、及び非ヒトノックアウト動物の作製方法を提供することを目的とする。【００１０】
また、本発明は、かかる非ヒトノックアウト動物を用いた疾患治療薬の候補化合物のスクリーニング方法、及び上記ＤＮＡフラグメントを含有する医薬組成物を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、薬剤耐性以外の検出マーカをコードする検出配列を備えるベクターを併用することで、ノックアウト動物の作製を飛躍的に簡便化できることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。【００１２】
（１）  薬剤耐性以外の検出マーカをコードする検出配列と、少なくとも原核生物の１種以上の増殖を阻害する薬剤の耐性マーカをコードする耐性配列と、この耐性配列の上流に位置し前記原核生物で機能する原核プロモータ配列と、これら配列の最上流に位置し、１種以上の真核生物ゲノムの標的部位に挿入されたときにのみ下流に位置する配列の発現を誘導する調節配列と、を含み、
前記検出配列及び前記耐性配列は、作動可能に配置されているＤＮＡフラグメント。【００１３】
（２）  前記調節配列は、配列内部リボソーム進入部位、及びスプライシングアクセプタからなる群より選ばれる１種以上を構成する配列である（１）記載のＤＮＡフラグメント。【００１４】
（３）  視覚的に検出可能な検出マーカをコードする検出配列と、少なくとも原核生物の１種以上の増殖を阻害する薬剤の耐性マーカをコードする耐性配列と、この耐性配列の上流に位置し前記原核生物で機能する原核プロモータ配列と、これら配列の最上流に位置し、１種以上の真核生物で構成的に機能する真核プロモータ配列と、を含み、
前記検出配列及び前記耐性配列は、作動可能に配置されているＤＮＡフラグメント。【００１５】
（４）  前記検出マーカは、視覚的に検出可能なものである（１）から（３）いずれか記載のＤＮＡフラグメント。【００１６】
（５）  前記耐性マーカは、真核生物の増殖を阻害する薬剤への耐性も付与する（１）から（４）いずれか記載のＤＮＡフラグメント。【００１７】
（６）  （１）から（５）いずれか記載のＤＮＡフラグメントの配列を有するベクター。【００１８】
（７）  動物ゲノムの一部を構成する標的配列の相補配列を更に有する（６）記載のベクター。【００１９】
（８）  （６）又は（７）記載のベクターが導入された宿主細胞。【００２０】
（９）  遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞の作製方法であって、
（７）記載のベクターを胚性幹細胞又は万能細胞に導入し、
導入後の胚性幹細胞又は万能細胞における前記検出配列の発現の有無を判定し、発現が存在すると判定された胚性幹細胞又は万能細胞を遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞として選択する手順を含む作製方法。【００２１】
（１０）  生殖系列キメラ動物の作製方法であって、
（１）から（５）いずれか記載のＤＮＡフラグメントが導入された遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞を用いてキメラ動物を産生し、
前記キメラ動物の子孫における前記検出配列の発現の有無を判定し、発現が存在すると判定される場合、前記キメラ動物を生殖系列キメラ動物として選抜する手順を含む作製方法。【００２２】
（１１）  非ヒトノックアウト動物の作製方法であって、
（７）記載のベクターを胚性幹細胞又は万能細胞に導入し、
導入後の胚性幹細胞又は万能細胞における前記検出配列の発現の有無を判定し、発現が存在すると判定された胚性幹細胞又は万能細胞を遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞として選択し、
前記遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞を用いて、生殖系列キメラ動物を作製し、
前記生殖系列キメラ動物を用いて、ホモ接合体を作製する手順を含む作製方法。【００２３】
（１２）  非ヒトノックアウト動物の作製方法であって、
（１）から（５）いずれか記載のＤＮＡフラグメントが導入された遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞を用いてキメラ動物を産生し、
前記キメラ動物の子孫における前記検出配列の発現の有無を判定し、発現が存在すると判定される場合、前記キメラ動物を生殖系列キメラ動物として選抜し、
前記生殖系列キメラ動物を用いて、ホモ接合体を作製する手順を含む作製方法。【００２４】
（１３）  疾病の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法であって、
（７）記載のベクターが導入され疾患原因遺伝子がノックアウトされた非ヒトノックアウト動物に被検物質を投与する投与手順と、
前記非ヒトノックアウト動物における前記疾患の改善を検出する検出手順と、を含むスクリーニング方法。【００２５】
（１４）  （１）から（５）いずれか記載のＤＮＡフラグメントと、疾患の治療又は予防に発現抑制が効果的な遺伝子を構成する配列の相補配列とを含み、この相補配列が前記ＤＮＡフラグメントの両側に位置するベクターを有効量含有する医薬組成物。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の第１及び第２の態様によれば、遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞の選択を、細胞の生死で判別できる耐性配列の発現の有無、及び他の基準、例えば視覚的に判別できる検出配列の発現に基づいて行うことができ、いずれも簡便である。また、キメラ動物から生殖系列キメラ動物を選抜する際、検出配列の発現の有無を子孫の生後速やかに判定し、表現型が存在すると判定されれば、この子孫の親であるキメラ動物は生殖系列キメラ動物として選抜できる。これにより、ノックアウト動物の作製期間を短縮でき、作製コストを低減できる。【００２７】
また、耐性配列の上流に原核生物の１種以上で機能する原核プロモータ配列を配置したので、ＤＮＡフラグメントを複製するべく、複製速度の大きい原核生物にＤＮＡフラグメントを導入した際には、耐性配列が発現される。よって、ＤＮＡフラグメントが導入された原核生物の細胞株を薬剤で選抜でき、容易にＤＮＡフラグメントを複製できる。【００２８】
更に、本発明の第１の態様によれば、検出配列及び耐性配列の最上流に調節配列を配置したので、遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞を選択する際、検出配列及び耐性配列はＤＮＡフラグメントが標的部位に挿入されたときにのみ発現する。このため、ＤＮＡがランダムに挿入された細胞株の混入が大幅に抑制されるので、サザン分析のような煩雑な分析を行う回数を大幅に低減できる。そして、検出配列の発現は視覚的に検出され、耐性配列の発現は細胞の生死で判別され、いずれも簡便に確認できる。よって、ノックアウト動物の作製期間を短縮でき、作製コストを低減できる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の一実施形態に係るＤＮＡフラグメントの概略図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る宿主細胞の選別の手順を示すフローチャートである。
【図３】本発明の一実施例に係るベクターの概略図である。
【図４】本発明の一実施例に係る調節配列の配列を示す図である。
【図５】本発明の別の実施例に係るベクターの概略図である。
【図６】図５のベクターの作製方法を示す図である。
【図７】図５のベクターが備える検出配列の発現を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明の一実施形態について図面を参照しながら説明する。
【００３１】
＜ＤＮＡフラグメント＞
図１は、本発明の一実施形態に係るＤＮＡフラグメントの概略図である。本発明のＤＮＡフラグメントは、検出配列及び耐性配列を含み、この耐性配列の上流には原核プロモータ配列が位置する。また、これら配列の最上流には調節配列又は真核プロモータ配列が位置する。以下、各配列を詳細に説明する。
【００３２】
（検出配列）
検出配列は、薬剤耐性以外、例えば視覚的に検出可能な検出マーカをコードする配列である。これにより、ＤＮＡフラグメントが非ヒト動物に導入されると、導入された細胞では、検出配列が発現され、この発現が薬剤耐性とは異なる基準に基づいて、例えば視覚的に検出される。よって、ＤＮＡフラグメントが導入された細胞を容易に選別できる。
【００３３】
視覚的に検出可能な検出マーカは、特に限定されないが、一般に蛍光、発光、又は呈色するタンパク質である。蛍光タンパク質としては、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、ＣＦＰ、ＹＣＦＰ、ＤｓＲＥＤ等が挙げられる。また、発光タンパク質としてはルシフェラーゼ等が挙げられ、呈色タンパク質としてはα−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。
【００３４】
なお、耐性配列が検出配列の下流に位置する場合において、検出配列の塩基長が長いと、耐性配列の発現が不完全になるおそれがある。そこで、検出配列は、本実施形態のように後述の原核プロモータ配列の下流に検出配列が配置されていてもよいが、原核プロモータ配列の上流に位置してもよい。ただし、本実施形態の配置は、原核生物でのＤＮＡフラグメントの複製の際、耐性配列のみならず検出配列も選別に活用できる点で好ましい。
【００３５】
（耐性配列）
耐性配列は、少なくとも原核生物の１種以上の増殖を阻害する薬剤の耐性マーカをコードする。後述のようにＤＮＡフラグメントが原核生物に導入されると、耐性配列が発現されるため、導入された原核生物の細胞株を薬剤で容易に選別できる。
【００３６】
かかる薬剤としては従来周知の薬剤が挙げられ、具体的にはカナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ピューロマイシン等が挙げられる。ただし、耐性マーカは、ＤＮＡフラグメントを非ヒト動物に導入する際にも導入された細胞株の選別に資する点で、真核生物の増殖を阻害する薬剤（例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン）への耐性も付与するものであることが好ましい。
【００３７】
（原核プロモータ配列）
原核プロモータ配列は、上記の耐性配列が増殖を阻害する原核生物において機能する。このため、原核生物にＤＮＡフラグメントを導入した際には、下流に位置する耐性配列が発現される。よって、ＤＮＡフラグメントが導入された原核生物の細胞株を薬剤で選抜でき、容易にＤＮＡフラグメントを複製できる。また、原核生物で機能するプロモータは、一般に真核生物では機能しない。このため、ＤＮＡフラグメントが標的部位に挿入された真核生物細胞株の選別の障害にはならない。
【００３８】
かかる原核プロモータ配列としては、特に限定されず原核生物ゲノム由来のプロモータが広く使用でき、具体的にはＥＭ７プロモータ等が挙げられる。なお、後述のように真核生物で発現されることを考慮し、配列中に終始コドンが存在する場合には、終始コドンを変異するべきである。
【００３９】
（調節配列）
調節配列は、真核生物ゲノムの標的部位に挿入されたときにのみ、下流に位置する配列の発現を誘導する。つまり、標的部位以外の箇所に挿入された場合には、検出配列及び耐性配列の転写が誘導されないので、ＤＮＡフラグメントが標的部位に挿入された真核生物細胞株のみを、薬剤及び薬剤以外（例えば視覚的検出）で選別できることになる。
【００４０】
調節配列は、例えば、標的遺伝子の翻訳機構に依存して、下流に位置する配列の発現を誘導する配列であってよく、具体的には、配列内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、スプライシングアクセプタ（ＳＡ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来の２Ａセグメント（ＦＭＤＶ−２Ａ  Ｓｅｇｍｅｎｔ）等が挙げられる。ＩＲＥＳは内部の開始部位からｃａｐ非依存的な翻訳を開始させる配列であり、ＳＡは遺伝子の転写後制御のスプライシングに必要なイントロンの下流側のシグナル配列である。
【００４１】
真核生物ゲノムの標的遺伝子をドライブするプロモータとエクソンの間にＤＮＡフラグメントを挿入する場合には、ＩＲＥＳが必須である。一方、真核生物ゲノムの標的遺伝子のエクソン同士の間にＤＮＡフラグメントを挿入する場合には、ＳＡが必須であり、ＩＲＥＳも併存することが好ましい。よって、調節配列は、挿入箇所の多様性に対応できる点で、ＩＲＥＳ及びＳＡの双方を有することが好ましい。
【００４２】
ＤＮＡフラグメントを遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞の作製に利用する場合、胚性幹細胞又は万能細胞において充分に発現する遺伝子が標的であれば、調節配列を含むＤＮＡフラグメントを用いることが好ましい。これにより、標的遺伝子の配列内にＤＮＡフラグメントが挿入されると、胚性幹細胞又は万能細胞へのベクターの導入後、標的遺伝子の発現を利用して検出配列及び耐性配列が発現されるので、遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞を容易に選択できる。
【００４３】
［真核プロモータ配列］
真核プロモータ配列は、真核生物の１種以上で構成的に機能し、下流に位置する配列の発現を構成的に誘導する。つまり、挿入箇所が標的部位か否かにかかわらず、検出配列及び耐性配列が発現されることになる。真核プロモータ配列は、ＣＡＧ、Ｕ６、ＥＦ１−α、ｐＧＫプロモータ等の従来周知の配列が使用できる。
【００４４】
ＤＮＡフラグメントを遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞の作製に利用する場合、胚性幹細胞又は万能細胞において充分に発現しない遺伝子が標的であれば、調節配列ではなく真核プロモータ配列を含むＤＮＡフラグメントを用いることが好ましい。これにより、ＤＮＡフラグメントが胚性幹細胞又は万能細胞のゲノムに挿入されたか否かを容易に判別できる。なお、この場合には、挿入箇所が標的遺伝子の配列内であるか否かをサザンブロット等で確認する必要がある。
【００４５】
以上のＤＮＡフラグメントにおいて、検出配列及び耐性配列は作動可能に配置されている。ここで「作動可能に配置」とは、合成されたタンパク質が所期の機能を奏する読み枠での配置を意味する。
【００４６】
ＤＮＡフラグメントは単独で存在してもよいし、適宜のベクターに挿入されていてもよい。また、ＤＮＡフラグメントは、ＰＣＲを用いて増幅してもよく、ベクターに挿入されている場合には宿主細胞に導入し宿主細胞を培養することで複製してもよい。
【００４７】
＜ベクター＞
本発明のベクターは上記ＤＮＡフラグメントの配列を有し、細胞培養を通じたＤＮＡフラグメントの複製や、非ヒトノックアウト動物の作製に使用できる。複製用ベクターは、宿主細胞で機能する複製開始点を有するものであり、高コピー性又は低コピー性のいずれであってもよい。
【００４８】
相補配列を容易に挿入できるよう、ＤＮＡフラグメントの両側には、制限酵素の認識配列が配置されていることが好ましく、具体的にはマルチクローニングサイトが位置することが好ましい。また、ＤＮＡフラグメントの下流には、検出配列又は耐性配列から転写されるｍＲＮＡがポリＡテールを有するよう、ポリＴ配列が位置することが好ましい。
【００４９】
非ヒトノックアウト動物の作製に使用されるターゲティングベクターは、動物ゲノムの一部を構成する標的配列の相補配列を有しており、この相補配列は、調節配列又は真核プロモータ配列の上流、及び前述の配列の最下流の各々に配置されている。
【００５０】
また、ターゲティングベクターは、リコンビナーゼに認識される配列も通常有する。かかるターゲティングベクターを胚性幹細胞又は万能細胞等に導入すると、相同組換えによって、前述の配列が標的遺伝子ＤＮＡと組み換わり、標的遺伝子がノックアウトされる。
【００５１】
なお、相補配列は、ゲノム解析が終了した動物については、公知のゲノムＤＮＡライブラリーから得ることができ、ゲノム解析が終了していない動物については、ＰＣＲ等の技術を用いてゲノムから単離できる。
【００５２】
このように本発明のベクターは、用途に応じ、従来公知のものを選択し、種々改変して利用できる。例えば、リコンビナーゼＦＬＰが認識するＦＲＰサイトや、リコンビナーゼＣｒｅが認識するｌｏｘＰサイトも有するベクターは、相同組換えの操作を簡便化できる点で好ましい。
【００５３】
＜宿主細胞＞
本発明の宿主細胞は、導入された前述のベクターを有する。かかる宿主細胞は、ＤＮＡフラグメントの複製に使用できる複製能力の高い原核生物や、ノックアウト動物の作製に使用できる非ヒト動物に由来する細胞である。
【００５４】
原核生物としては、特に限定されないが、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等が挙げられる。これら原核生物の細胞群にベクターを導入し、細胞群を薬剤環境下におく。ベクターが導入された細胞は、耐性マーカを発現して薬剤環境下でも生存するため、容易に選別し、株化できる。この細胞株を培養し、増殖後の細胞からベクターを精製することで、多量のベクターが得られる。なお、ベクターの導入、宿主細胞株の単離、ベクターの取得等の具体的手順は、常法に従えばよい。
【００５５】
非ヒト動物としては、特に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウシ等が挙げられる。
【００５６】
［遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞の作製方法］
これら非ヒト動物の宿主細胞の一例である遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞の作製方法は、前述のベクターを胚性幹細胞又は万能細胞に導入し、導入後の胚性幹細胞又は万能細胞における検出配列の発現の有無を判定し、発現が存在すると判定された胚性幹細胞又は万能細胞を遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞として選択する手順を含む。なお、万能細胞とは分化万能性を有する細胞であり、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を包含する。
【００５７】
かかる手順を図２に基づいて説明する。図２に示される方法は、図１に示すような調節配列を含むＤＮＡフラグメントの配列を有するベクターを用いて、胚性幹細胞で充分に発現する遺伝子を標的とする場合に妥当する。
【００５８】
まず、胚性幹細胞にベクターを導入し（ＳＴ１０）、遺伝子改変胚性幹細胞を選択し、単離する（ＳＴ４０）。ここで、ＤＮＡフラグメントが標的部位に挿入されたときにのみ、検出マーカ及び耐性マーカが発現されるため、遺伝子改変胚性幹細胞の選択は、薬剤耐性（ＳＴ２０）及び例えば視覚的検出（ＳＴ３０）に基づいて行うことができる。ただし、選別された胚性幹細胞からＤＮＡを抽出し、サザン分析で選別精度を確認することが好ましい。
【００５９】
真核プロモータ配列を含むＤＮＡフラグメントの配列を有するベクターを用いて、胚性幹細胞で充分に発現しない遺伝子を標的とする場合には、上記のＳＴ４０において、次のように遺伝子改変胚性幹細胞を選択する。即ち、ＤＮＡフラグメントが胚性幹細胞のゲノムに挿入されたときのみ、検出マーカ及び耐性マーカが発現されるため、薬剤耐性（ＳＴ２０）及び視覚的検出（ＳＴ３０）に基づいて、ゲノムにＤＮＡフラグメントが挿入された胚性幹細胞が選別できる。次に、選別した胚性幹細胞から、サザンブロット等の周知の方法で、標的遺伝子の配列にＤＮＡフラグメントが挿入された遺伝子改変胚性幹細胞を選択する。以上の手順は、遺伝子改変万能細胞の作製にも妥当する。
【００６０】
＜非ヒトノックアウト動物＞
非ヒトノックアウト動物は、ゲノムに挿入された前述のＤＮＡフラグメントを有する。本発明におけるノックアウト動物は、ヒトを除く動物であり、通常、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウシ等の哺乳動物である。これらのノックアウト動物は、ノックアウトされた遺伝子の機能のインビボ解析や、後述の治療薬の候補化合物のスクリーニングについて非常に有益である。
【００６１】
［生殖系列キメラ動物の作製方法］
これらノックアウト動物を作製するにあたり、生殖系列キメラ動物が必要となる。かかる生殖系列キメラ動物の作製方法は、前述のＤＮＡフラグメントが導入された遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞を用いてキメラ動物を産生し、このキメラ動物の子孫における検出配列の発現の有無を判定し、発現が存在すると判定される場合、前記キメラ動物を生殖系列キメラ動物として選抜する手順を含む。
【００６２】
標的遺伝子の発現態様に依存するが、検出配列は、誕生時に既に発現されている場合が多い。このため、かかる検出配列の発現に伴う表現型を生後速やかに確認し、表現型が存在すれば、この子孫の親であるキメラマウスは生殖系列であることが分かる。
【００６３】
［非ヒトノックアウト動物の作製方法］
また、ノックアウト動物を作製方法は、前述のＤＮＡフラグメントが導入された遺伝子改変胚性幹細胞又は遺伝子改変万能細胞を用いてキメラ動物を産生し、このキメラ動物の子孫における検出配列の発現の有無を判定し、発現が存在すると判定される場合、キメラ動物を生殖系列キメラ動物として選抜し、この生殖系列キメラ動物を用いて、ホモ接合体を作製する手順を含む。
【００６４】
即ち、非ヒトノックアウト動物は、例えば、上記の生殖系列キメラ動物を野生型マウスと交配して得られるヘテロ接合体マウス同士を交配することで、ホモ接合体ノックアウトマウスが得られる。
【００６５】
なお、かかるノックアウト動物は、標的遺伝子の配列に検出配列が挿入されていることから、標的遺伝子の発現動向をｉｎ  ｖｉｖｏで把握できるという点でも有利である。
【００６６】
＜スクリーニング方法＞
疾病の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法は、投与手順及び検出手順を含む。各手順について説明する。
【００６７】
（投与手順）
投与手順では、疾患原因遺伝子がノックアウトされた動物に、被検物質を投与する。投与経路は経口又は非経口のいずれであってもよく、投与箇所は全身又は局所のいずれであってもよく、治療薬の予定される投与形式を考慮して適宜設定されてよい。経口投与には舌下投与も包含され、非経口の経路としては、注射（例えば静脈注射、皮下注射、筋肉注射、点滴等）、経皮吸収等が挙げられる。
【００６８】
（検出手順）
検出手順では、投与手順の後、ノックアウト動物における疾患の改善を検出する。改善が検出された場合には、用いた被検物質が、疾患原因遺伝子の機能を補完又は代替できることが示唆されるため、疾患治療薬の候補化合物であると判断できる。検出の基準は、確認したい改善の態様に応じて適宜設定されてよく、細胞レベル、組織レベル、個体レベルのいずれであってもよい。
【００６９】
＜医薬組成物＞
本発明の医薬組成物は、ＤＮＡフラグメントと、疾患の治療又は予防に発現抑制が効果的な遺伝子の部分配列の相補配列とを含むベクターを有効量含有する。このベクターにおいて、相補配列はＤＮＡフラグメントの両側に位置する。かかる医薬組成物によれば、投与された被験者の体内で、ＤＮＡフラグメントが相補配列に挟まれているので、標的遺伝子ＤＮＡとＤＮＡフラグメントとの相同組換えが起こる。これにより、標的遺伝子がノックアウトされてその発現が抑制されるため、疾患を効果的に治療又は予防できる。
【００７０】
本明細書における「有効量」は、所望の治療又は予防効果を得るために必要な量を指し、効果の程度に応じて適宜設定される。また、医薬組成物の投与経路は、経口又は非経口のいずれであってもよく、治療又は予防すべき疾患等に応じて適宜設定される。
【００７１】
経口投与の場合、医薬組成物は、一般に使用される結合剤、包含剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤のような添加剤を含有してよく、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤等の種々の形状に製剤化される。また、医薬組成物は、内用水剤、懸濁剤、乳剤シロップ剤等の液体状態であってもよく、使用時に再溶解される乾燥状態であってもよい。
【００７２】
非経口投与の場合、医薬組成物は、安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤も含有してよく、通常、単位投与量アンプル若しくは多投与量容器またはチューブ内に収容された状態で流通される。また、医薬組成物は、使用時に、適当な担体（滅菌水等）で再溶解可能な粉体に製剤化されてもよい。
【実施例】
【００７３】
＜実施例１＞
本実施例では、調節配列としてＥｎ２ＳＡ及びＩＲＥＳ配列を、耐性配列としてネオマイシン耐性遺伝子配列を、検出配列としてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子配列を、プロモータ配列としてＥＭ７プロモータを改変したＥＭ７ｍ配列を用いた。このＥＭ７ｍを検出配列の下流に配置した（図３及び図５参照）。プラスミドのバックボーンは、「ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ」（登録商標、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）（以下、「ｐＢＳＫ」と称する）を用いた。図３に示されるベクターのクローニングサイト、ＰｍｅＩ／ＡｓｃＩ／ＰａｃＩ／ＳｐｅＩをアダプター配列としてＤＮＡ合成をし、この合成ＤＮＡをｐＢＳＫのＳａｃＩ／ＢａｍＨＩサイトに常法により挿入した。同様に、ＢａｍＨＩ−ｌｏｘＰ／ＦＲＴ−ＳａｌＩ配列もＤＮＡ合成により作製し、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩサイトに挿入した。これにより得たベクターをｐＢＳＫ−ＭＣＳ−ＬＦと称する。【００７４】
Ｅｎ２ＳＡ、ＩＲＥＳ配列、β−ガラクトシダーゼ遺伝子配列、及びネオマイシン耐性遺伝子配列としては、既存のベクター「ｐＧＴ１．８Ｉｒｅｓβｇｅｏ」（Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，９１，  ４３０３−４３０７，  １９９４）に挿入された配列を用いた。【００７５】
大腸菌内で機能するプロモータ配列ＥＭ７は、「ｐｃＤＮＡ６／ＴＲ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）からＰＣＲクローニングで単離した。この産物をｐＢＳＫに挿入し、クローニングした（これにより得たベクターを「ｐＢＳＫ−ＥＭ７」と称する）。ＥＭ７は、「ｐＧＴ１．８Ｉｒｅｓβｇｅｏ」のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子配列及びネオマイシン耐性遺伝子配列の継ぎ目に、インフレームで挿入されると、配列中に存在する停止コドンにより、β−ガラクトシダーゼおよびネオマイシン耐性タンパク質が発現しない。そこで、「ｐＢＳＫ−ＥＭ７」を用い、ＰＣＲ−突然変異生成でＥＭ７に変異を入れて変異型ＥＭ７のＰＣＲ  産物を得て、このＰＣＲ産物の配列を確認した。【００７６】
この配列に基づいて、β−ガラクトシダーゼ及びネオマイシン耐性遺伝子配列の継ぎ目に、停止コドンがなくインフレームで挿入できる変異型ＥＭ７を選別し、それら変異型ＥＭ７の各々を、ｐＢＳＫのネオマイシン耐性遺伝子配列の上流に挿入した。これにより得たベクターを大腸菌に導入し、ネオマイシン耐性遺伝子が発現されるか否かに基づいてプロモータ活性を検査した。この結果、プロモータ活性に優れることが判別した変異型ＥＭ７を、修飾型ＥＭ７、即ち「ＥＭ７ｍ」と称する（図４参照）。ＥＭ７及びＥＭ７ｍの塩基配列を、配列表の配列番号１、２に示す。【００７７】
この情報に基づき、ＰｓｔＩサイトを５’側に有するＥＭ７ｍと、ネオマイシン耐性遺伝子配列ＯＲＦのＰｓｔＩ配列上流を３’側に有する配列とをＰＣＲで作製し、ｐＢＳＫにクローニングした。このｐＢＳＫからＰｓｔＩでこの配列を切り出した。一方、ｐＧＴ１．８ＩｒｅｓＢｇｅｏのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子配列及びネオマイシン耐性遺伝子配列の継ぎ目に位置するＰｓｔ１−ＰｓｔＩ領域配列を切り出し、上記のＥＭ７ｍ−ネオマイシン耐性遺伝子配列ＯＲＦのＰｓｔＩ配列の上流を代わりに挿入した。これにより得たベクターを「ｐＳＡＩＲＥＳβｇｅｏＥＭ７ｍ」と称する。【００７８】
ｐＳＡＩＲＥＳβｇｅｏＥＭ７ｍの挿入配列をＳａｌＩにより切り出した。一方、上記のｐＢＳＫ−ＭＣＳ−ＬＦをＳａｌＩで開き、このＳａｌＩサイトにＳＡＩＲＥＳβｇｅｏＥＭ７ｍを挿入した。これにより得たベクターをＸｈｏＩで開き、ＤＮＡ合成したＳａｌＩ−ＮｏｔＩ／ＮｒｕＩ／ＸｈｏＩ−ＦＲＴ−ＳａｌＩ配列を挿入した。この配列の方向性は、ＰＣＲ、制限酵素地図、及びシークエンスで確認した。このベクターを「ｐＬＦＳＡＩＲＥＳβｇｅｏＥＭ７ｍＦ」（図３）と称する。【００７９】
＜実施例２＞
本実施例では、調節配列としてＳＡ配列を、耐性配列としてネオマイシン耐性遺伝子配列を、検出配列としてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子配列を、プロモータ配列として実施例１で得たＥＭ７ｍを用いた（図５）。【００８０】
図５のベクター構築に使用した遺伝子配列の多くは、実施例１のｐＬＦＳＡＩＲＥＳβｇｅｏＥＭ７ｍＦ（図３）の断片であった。まず実施例１のｐＳＡＩＲＥＳβｇｅｏＥＭ７ｍから調節配列であるＥｎ２ＳＡ及びＩＲＥＳ配列をＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理にて取り除いた。【００８１】
ＳＡ配列は、既存のベクター「ｐＳＡｎｅｏｌｏｘ２βｇａｌ」（Ｃ．Ｓ．Ｒａｙｍｏｎｄ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｓｏｒｉａｎｏ，  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２（１），ｅ１６２，２００７）から、ＰＣＲクローニングで単離した。なお、ＰＣＲでは、フォワード側にＳａｌＩサイト、リバース側にＨｉｎｄＩＩＩサイトを付したプライマーを用いた。このＰＣＲ産物を、Ｅｎ２ＳＡ及びＩＲＥＳ配列を除いたｐＳＡＩＲＥＳβｇｅｏＥＭ７ｍに挿入し、配列の正確性をシークエンスで確認した。これにより得たベクターをｐＬＦＳＡβｇｅｏＥＭ７ｍＦ（図５）と称する。【００８２】
＜実施例３＞
本実施例では、ｐＳＡＩＲＥＳβｇｅｏＥＭ７ｍを用い、アドレノメデュリン受容体修飾因子「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ３（ＲＡＭＰ３）」のコンディショナルターゲティングベクターを構築した（図６参照）。【００８３】
このベクター構築にあたり、Ｐ  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  らの方法（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，  ４７６−４８４，２００３）を基本手技とした。使用した大腸菌ＳＷ１０２及びＳＷ１０６、ｌｏｘＰサイト挿入用ベクター「ｐＬ４５２」は、アメリカ国立ガン研究所のＮ．Ｇ．Ｃｏｐｅｌａｎｄ博士からの分与である。また、ゼオシン耐性遺伝子置換ベクター「ｐ２３ｌｏｘＺｅｏ」及び回収用ベクター「ｐＭＣＳ−ＤＴＡ」は、大阪大学の遊佐博士からの分与である。また、ＲＡＭＰ３配列を含むマウスＢＡＣ「ＲＰ２３−６９Ｐ８」はＢＡＣＰＡＣ社から購入した。ＲＡＭＰ３遺伝子の配列及び情報はＮＣＢＩから取得した。【００８４】
まず、ＲＰ２３−６９Ｐ８内に存在する内在性のｌｏｘＰサイトを除き、除去後のＲＰ２３−６９Ｐ８をＳＷ１０２にエレクトロポレーション法で導入した（これにより得たベクターを「ＳＷ１０２＋６９Ｐ８」と称する）。次に、ｐ２３ｌｏｘＺｅｏから、左右にＲＰ２３−６９Ｐ８内在性のｌｏｘＰサイト周辺の配列を有するゼオシン耐性遺伝子配列断片をＥｃｏＲＩ処理により切り出し、精製した。この精製断片をＳＷ１０２＋６９Ｐ８にエレクトロポレーション法により導入した。このＳＷ１０２＋６９Ｐ８を４２℃にて１５分間に亘り保持することで、ＳＷ１０２内のｅｘｏ，ｂｅｔ，ｇａｍ遺伝子を発現させ、内在性ｌｏｘＰ領域配列及びゼオシン耐性遺伝子配列の間で相同組換えを行った。形質転換菌は、ゼオシン及びクロラムフェニコール耐性によって選別し、更にＰＣＲ法で相同組換えの成功を確認した（これにより得たベクターを「ＳＷ１０２＋６９Ｐ８Ｚｅｏ」と称する）。【００８５】
ＲＡＭＰ３の第４エクソンの下流にｌｏｘＰ配列を導入した。ｌｏｘＰサイトを導入するＲＡＭＰ３遺伝子領域配列を中心として上流及び下流へ４００ｂｐに亘る範囲をＰＣＲクローニングで単離した。これら配列の正確性はシークエンスで確認した。ＰＣＲ産物の各々を、ｐＬ４５２のＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩサイトにクローニングし、このｐＬ４５２からＲＡＭＰ３遺伝子配列断片を左右に有するｌｏｘＰ−ＰＧＫプロモータＥＭ７Ｎｅｏ−ｌｏｘＰ断片をＮｏｔＩ／ＳａｌＩで切り出し、精製した。この精製断片をＳＷ１０２＋６９Ｐ８Ｚｅｏにエレクトロポレーション法により導入した。その後、このＳＷ１０２＋６９Ｐ８Ｚｅｏを４２℃にて１５分間に亘り処理することで、ＳＷ１０２菌内、導入断片及びＢＡＣの相同領域で相同組換えを行った。形質転換菌はカナマイシン耐性によって選別し、更にＰＣＲ法で相同組換えの成功を確認した（これにより得たベクターを「ＳＷ１０２＋６９Ｐ８ｌｏｘＰＮｅｏＺｅｏ」と称する）。【００８６】
次に、ＳＷ１０２＋６９Ｐ８ｌｏｘＰＮｅｏＺｅｏからＢＡＣ「６９Ｐ８ｌｏｘＰＮｅｏＺｅｏ」を単離し、ＳＷ１０６に再挿入した（これにより得たベクターを「ＳＷ１０６＋６９Ｐ８ｌｏｘＰＮｅｏＺｅｏ」と称する）。このＳＷ１０６＋６９Ｐ８ｌｏｘＰＮｅｏＺｅｏを０．１％アラビノース溶液中に３２℃にて１時間に亘り保持することで、ＳＷ１０６のＣｒｅ遺伝子を発現させ、ｌｏｘＰ配列間のＰＧＫプロモータＥＭ７Ｎｅｏを除去した。形質転換菌はクロラムフェニコール耐性及びカナマイシン感受性に基づいて選別し、更にＰＣＲ法でＰＧＫプロモータＥＭ７Ｎｅｏの欠損を確認した（これにより得たベクターを「ＳＷ１０６＋６９Ｐ８ｌｏｘＰＺｅｏ」と称する）。この形質転換菌からＢＡＣを精製し、ＳＷ１０２に再挿入した（これにより得たベクターを「ＳＷ１０２＋６９Ｐ８ｌｏｘＰＺｅｏ」と称する）。【００８７】
ＲＡＭＰ３の第３エクソンの上流にＬＦＳＡＩＲＥＳβｇｅｏＥＭ７ｍＦ配列を導入した。この導入部位の配列を中心として上流及び下流へと４００ｂｐに亘る範囲をＰＣＲクローニングで単離した。ＰＣＲ産物の配列の正確性はシークエンスで確認した。このＰＣＲ産物の各々を、ｐＬＦＳＡＩＲＥＳβｇｅｏＥＭ７ｍＦのＡｓｃＩ／ＳｐｅＩ及びＸｈｏＩ／ＮｏｔＩサイトにクローニングした。その後、ｐＬＦＳＡＩＲＥＳβｇｅｏＥＭ７ｍＦから、ＲＡＭＰ３遺伝子配列断片を左右に有するＬＦＳＡＩＲＥＳβｇｅｏＥＭ７ｍＦ断片をＡｓｃＩ／ＮｏｔＩで切り出し、精製した。この精製断片をＳＷ１０２＋６９Ｐ８ｌｏｘＰＺｅｏにエレクトロポレーション法により導入した。【００８８】
ベクター導入された菌を４２℃にて１５分間に亘り処理することで、ＳＷ１０２内で相同組換えを起こし、ＬＦＳＡＩＲＥＳβｇｅｏＥＭ７ｍＦ配列を、所望のＲＡＭＰ３の第３エクソンの上流に挿入した。形質転換菌はカナマイシン及びクロラムフェニコール耐性によって選別し、更にＰＣＲ法で相同組換えの成功を確認した（これにより得たベクターを「ＳＷ１０２＋６９Ｐ８ＬＦＳＡＩＲＥＳβｇｅｏＥＭ７ｍＦＺｅｏ」と称する）。【００８９】
最後に、ＢＡＣ「６９Ｐ８ＬＦＳＡＩＲＥＳβｇｅｏＥＭ７ｍＦＺｅｏ」から、上記のように加工したＲＭＡＰ３遺伝子を切り出した。ＲＡＭＰ３遺伝子領域配列の第１エクソンから上流へ２ｋｂの範囲、及び第３エクソンから下流へ６ｋｂの範囲に存在する遺伝子配列４００ｂｐをＰＣＲクローニングで単離した。これら配列の正確性はシークエンスで確認した。ＰＣＲ産物の各々をｐＭＣＳ−ＤＴＡのＸｈｏＩ／ＸｂａＩ及びＸｂａＩ／ＫｐｎＩサイトにクローニングした。その後、このＲＭＡＰ３遺伝子配列を有するｐＭＣＳ−ＤＴＡを精製して、ＸｂａＩ処理で直鎖化した。このＤＮＡフラグメントを上記ＳＷ１０２＋６９Ｐ８ＬＦＳＡＩＲＥＳβｇｅｏＥＭ７ｍＦＺｅｏにエレクトロポレーション法により導入した。ベクター導入した細胞を４２℃にて１５分間処理することで、ＳＷ１０２内、ＢＡＣ及び導入ＤＮＡフラグメント間で相同組換えを起こした。ｐＭＣＳ−ＤＴＡが有するＲＡＭＰ３遺伝子配列間で相同組換えを起こし、コンディショナルノックアウト用に加工されたＲＡＭＰ３遺伝子配列全域が挿入されたｐＭＣＳ−ＤＴＡを保持するＳＷ１０２は、カナマイシン及びアンピシリン耐性によって選別した。更にＰＣＲ法及び制限酵素マップで相同組換えの成功を確認した。この形質転換菌からプラスミドを精製し、このプラスミドを、ＲＡＭＰ３コンディショナルジーンターゲティングベクター「ｐＲ３ＣＫＯ１」と称する。【００９０】
＜実施例４＞
本実施例では、ｐＲ３ＣＫＯ１を用いてＲＡＭＰ３遺伝子改変ＥＳ細胞を取得した。Ｔ  Ｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２１４，  ７０−７６，１９９３）に記載される手法を基本手技とした。上記のｐＲ３ＣＫＯ１を制限酵素ＰｍｅＩで直鎖化し、ＥＳ細胞導入用のコンディショナルジーンターゲティングベクターとした。ＥＳ細胞としては、「Ｅ１４．１」（  Ｒ．  Ｋｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５４，７０７−７１０，  １９９１）を用いた。【００９１】
ＥＳ細胞を培養して増殖させ、使用直前にＰＢＳに２．５×１０７細胞／ｍｌで懸濁した。この懸濁液を、Ｒ３ＣＫＯ１を導入するまでの間、氷上にて冷却した。Ｒ３ＣＫＯ１の導入は、「ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ」（ＢＩＯＲＡＤ社製）を用い、エレクトロポレーションによって行った。０．４ｃｍ幅の冷却キュベット（ＢＩＯＲＡＤ社製）内に０．７５ｍＬのＥＳ細胞液（１．１×１０７細胞）及び５０ｕＬの調製済みＲ３ＣＫＯ１  ＤＮＡ（５０ｕｇ）液を、１ｍＬチップで丁寧に加えた。条件を２３０Ｖ，５００ｕＦに設定し、電気パルスを一回与えた。室温で１０分間静置した後、キュベット内のＥＳ細胞を２４ｍＬのＥＳ細胞用培地（ＥＳＭ）に懸濁し、４．５ｍＬずつ４枚の１０ｃｍ径培養ディッシュに播いた。なお、これら培養ディッシュには、ネオマイシン耐性遺伝子配列を有する胎性１２．５〜１４．５日胚から単離した初代繊維芽細胞を、フィーダ細胞として予め播いておいた。２４時間後に培地交換を行い、３６時間後に、培養ディッシュ各２枚を、ジェネティシン（登録商標）１４０μｇ／ｍＬを添加したＥＳＭ培地に交換して薬剤選別を開始した。以後、毎日、ジェネティシン添加ＥＳＭ培地の交換を行った。【００９２】
薬剤選別の開始後、８日目にネオマイシン耐性ＥＳ細胞コロニー４９個を単離し、各々のコロニーを単細胞にばらした。単細胞の各々を２等分し、一方をゼラチンコートした２４穴培養ウェルに播き、他方をネオマイシン耐性フィーダ細胞が播かれた２４穴培養ウェルに播き、引き続き培養を行った。【００９３】
細胞が充分に増殖した時点で、前者から常法で高分子ＤＮＡを単離し、このＤＮＡを後のＰＣＲ又はサザンブロットのための予備試料とした。【００９４】
後者では、翌日に培地交換を行い、ＥＳ細胞コロニーが増えた時点で細胞凍結を行った。この際、一部のＥＳ細胞懸濁液をフィーダ細胞が播かれた２４穴又は９６穴培養ウェルに播いた。各ウェルでＥＳ細胞が増えた時点で、常法でβガラクトシダーゼ染色を行った。その結果、１１ウェルのＥＳ細胞が陽性であった（図７参照）。このβガラクトシダーゼ陽性ＥＳ細胞群に関して、ＲＡＭＰ３遺伝子配列の５’および３’側に特異的なプライマーによるＰＣＲで相同組換えを確認した結果、２個体のＥＳ細胞がＲＡＭＰ３遺伝子改変ＥＳ細胞であることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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