(57)【要約】抗ウイルス剤または抗癌剤、及びその製造方法を提供する。ウイルス核酸または癌標的遺伝子のｍＲＮＡを切断可能なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子をＨＢｓ抗原粒子とリポソームの融合体に内包してなる抗ウイルス剤または抗癌剤。
2010137570.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス核酸または癌標的遺伝子のｍＲＮＡを切断可能なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子をＨＢｓ抗原粒子とリポソームの融合体に内包してなる抗ウイルス剤または抗癌剤。
【請求項２】
ＨＢｓ抗原が、細胞、臓器もしくは組織の標的化部分を含む請求項１に記載の抗ウイルス剤または抗癌剤。
【請求項３】
ＨＢｓ抗原が、ＨＢｓ抗原（Ｑ１２９Ｒ，Ｇ１４５Ｒ）である、請求項１または２に記載の抗ウイルス剤または抗癌剤。
【請求項４】
ウイルス核酸または肝細胞癌標的遺伝子のｍＲＮＡを切断可能なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子が、siRNA、miRNAまたはshRNAである、請求項１〜３のいずれかに記載の抗ウイルス剤または抗癌剤。
【請求項５】
標的遺伝子が肝細胞内で発現する標的遺伝子である、請求項１〜４のいずれかに記載の抗ウイルス剤または抗癌剤。
【請求項６】
リポソームとＨＢｓ抗原粒子を界面活性剤の存在下または非存在下に融合し、その融合物にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子を加えることを特徴とする抗ウイルス剤または抗癌剤の製造方法。
【請求項７】
界面活性剤がMEGA-8、Triton X-100、Tween 20、Tween 80、N-ラウロイルサルコシン-ナトリウム塩、ドデシル硫酸リチウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、SDS、塩化セチルピリジニウム、CTAB、CHAPS、CHAPSO、スルホベタインSB10及びスルホベタインSB16からなる群から選ばれる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ウイルス核酸または癌標的遺伝子のｍＲＮＡを切断可能なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子をＨＢｓ抗原粒子とリポソームの融合体に内包してなる粒子の、抗ウイルス剤または抗がん剤としての使用。
【請求項９】
ウイルス核酸または癌標的遺伝子のｍＲＮＡを切断可能なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子をＨＢｓ抗原粒子とリポソームの融合体に内包してなる粒子の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする、ウイルス感染症又は癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス剤または抗癌剤、あるいはそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
RNAi（RNA interference：RNA干渉）は、標的遺伝子と相同な二本鎖RNA（dsRNA）を細胞内に導入すると、標的遺伝子の転写産物であるmRNAの相同部分が特異的に分解され、これにより遺伝子発現が抑制されるという現象である。1998年に線虫でRNAiが発見(Fire et al., Nature, 391, 806-811, 1998）されて以来、さまざまな生物種でRNAi現象が観察されており、2001年にヒトを含む哺乳動物でも21〜23塩基程度のdsRNAであるsiRNA（small interference RNA）によりRNAi現象を起こすことが可能であることが報告された（Elbashirst al., Nature, 411, 494-498, 2001）。【０００３】
現在、RNAi技術を医薬品へ応用することに大きな期待が寄せられている。ほとんどの疾患は何らかのタンパク質の機能異常に起因すると考えられており、その異常タンパク質の発現を抑制することが可能なsiRNAは極めて多くの疾患に適応される可能性がある。また、siRNAによる遺伝子発現抑制効果は配列特異性が高いことから、標的とする原因因子のみに効果が現れ、副作用がほとんど生じないと想定されるためである。なお、現状ではsiRNAを活用した医薬品（siRNA医薬）は従来の薬剤とは異なる作用機序に基づくものであり、ヒトにおける安全性が完全に確立されていないため、有効な既存薬が少ない難病や、ガンや感染症といった疾患の治療薬として開発が先行している。【０００４】
siRNA医薬のもう1つの利点は、疾患と遺伝子の関係が明らかとなれば有効成分としてのsiRNAの設計が可能となり、容易に有効成分を合成できる点である。従来型の低分子医薬品はその有効成分の探索に極めて多くの時間と労力を割いてきたが、siRNA医薬ではそのような努力を最小限にすることが可能である。【０００５】
一方、siRNAは生体内での安定性が非常に悪く、生体膜透過性に乏しいことが大きな問題点としてある。更にもう1つの大きな問題として、標的とする細胞のみへ必要量のsiRNAを長時間持続して送達することが挙げられる。【０００６】
siRNAのDDS技術に関しては多くの研究が行われている。siRNAを細胞へ導入しその機能を発揮させるには次のように幾つかのステップをクリアーする必要がある。
１．細胞へのsiRNA複合体の到達
siRNAは容易にエキソヌクレアーゼなどの血中の分解酵素によって分解されるため、目的とする部位に到達する前に分解されてしまう。このため分解酵素から保護する必要がある。【０００７】
２．細胞へのsiRNAの取り込み
siRNA自体は細胞膜を透過できないため、細胞質へ取り込まれない。このためエンドサイトーシスなどの細胞への取り込み機構を介して取り込ませることが行われている。膜透過性ペプチドやカチオニック脂質などは直接細胞膜に作用し、細胞内へのsiRNAの導入を行うと考えられていたが、少なくとも膜透過性ペプチドはエンドサイトーシスを介した経路でsiRNAを細胞内へ入れることが分かっており、カチオニック脂質についても高濃度で用いる以外の場合にはエンドサイトーシスが関与していると考えられている。【０００８】
３．取り込み機構から細胞質への脱出
取り込み機構を介して取り込まれたsiRNAは細胞内ではエンドゾームを主とした細胞内小胞に入る。このままではsiRNAは作用しないので、そこからの脱出が必要である。エンドソームからの脱出にはpH感受性の脂質を用いたもの、一部の膜透過性ペプチド、カチオニック脂質、などが利用されている。【０００９】
以上のステップを総てクリアーした場合に、siRNAによるノックダウン効果が見られることになる。【００１０】
一方、特許文献１〜２は、ＨＢｓ（Ｂ型肝炎ウイルス表面）抗原タンパク質を構成要素とするＨＢｓ抗原粒子(ＨＢｓ抗原粒子)を用いたsiRNAの送達について記載しているが、特定の疾患の治療に使用できることは記載していない。【００１１】
siRNAは、細胞に導入されるまで、あるいは細胞に導入されてからも速やかに分解されるため、長時間継続して細胞にsiRNAを導入する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開2008-162981
【特許文献２】特開2008-029249
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、長時間継続して標的細胞、組織ないし臓器にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子を導入することができ、毒性が低く、十分に標的遺伝子の発現を抑制できる量を送達可能な抗ウイルス剤または抗癌剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、以下の抗ウイルス剤または抗癌剤、それらの製造方法を提供するものである。
項１．  ウイルス核酸または癌標的遺伝子のｍＲＮＡを切断可能なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子をＨＢｓ抗原粒子とリポソームの融合体に内包してなる抗ウイルス剤または抗癌剤。
項２．  ＨＢｓ抗原が、細胞、臓器もしくは組織の標的化部分を含む項１に記載の抗ウイルス剤または抗癌剤。
項３．  ＨＢｓ抗原が、ＨＢｓ抗原（Ｑ１２９Ｒ，Ｇ１４５Ｒ）である、項１または２に記載の抗ウイルス剤または抗癌剤。
項４．  ウイルス核酸または肝細胞癌標的遺伝子のｍＲＮＡを切断可能なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子が、siRNA、miRNAまたはshRNAである、項１〜３のいずれかに記載の抗ウイルス剤または抗癌剤。
項５．  標的遺伝子が肝細胞内で発現する標的遺伝子である、項１〜４のいずれかに記載の抗ウイルス剤または抗癌剤。
項６．  リポソームとＨＢｓ抗原粒子を界面活性剤の存在下または非存在下に融合し、その融合物にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子を加えることを特徴とする抗ウイルス剤または抗癌剤の製造方法。
項７．  界面活性剤がMEGA-8、Triton X-100、Tween 20、Tween 80、N-ラウロイルサルコシン-ナトリウム塩、ドデシル硫酸リチウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、SDS、塩化セチルピリジニウム、CTAB、CHAPS、CHAPSO、スルホベタインSB10及びスルホベタインSB16からなる群から選ばれる項６に記載の方法。
項８．  ウイルス核酸または癌標的遺伝子のｍＲＮＡを切断可能なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子をＨＢｓ抗原粒子とリポソームの融合体に内包してなる粒子の、抗ウイルス剤または抗がん剤としての使用。
項９．  ウイルス核酸または癌標的遺伝子のｍＲＮＡを切断可能なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子をＨＢｓ抗原粒子とリポソームの融合体に内包してなる粒子の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする、ウイルス感染症又は癌の治療方法。【００１５】
本発明の抗ウイルス剤または抗癌剤は、ウイルス核酸のｍＲＮＡを切断可能なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子をＨＢｓ抗原粒子とリポソームの融合体に内包してなる抗ウイルス剤と、癌標的遺伝子のｍＲＮＡを切断可能なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子をＨＢｓ抗原粒子とリポソームの融合体に内包してなる抗癌剤の両方を包含する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の抗ウイルス剤または抗癌剤は、siRNA、shRNA、miRNAなどのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子が細胞内で実際に作用してウイルス感染症および癌を治療できることが実証されており、ウイルス感染症および癌に対する高い効果が期待でき、かつ、副作用が実質的にない理想的な治療薬である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】HepG2, TE10についてのmRNAの測定結果を示す。
【図２】HepG2,についての細胞増殖能の測定結果を示す。
【図３】L粒子を用いた４８時間後のルシフェラーゼアッセイ。
【図４】DharmaFECT（登録商標）トランスフェクション試薬を用いた４８時間後のルシフェラーゼアッセイの結果を示す。
【図５】実施例２の遺伝子構築物の構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のＨＢｓ抗原粒子は、Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｓ抗原タンパク質またはその改変体を構成要素とするナノ粒子である。
【００１９】
本発明の融合体は、ＨＢｓ抗原粒子とリポソームが融合して得られるものである。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子としては、siRNA（短干渉RNA）、shRNA（短ヘアピンRNA）、miRNA（マイクロRNA）、siNA（短干渉核酸）、dsRNA (二本鎖RNA）、アンチセンスRNAが挙げられ、好ましくはsiRNA、shRNAが挙げられる。
【００２０】
本発明の抗ウイルス剤または抗癌剤の有効成分は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子をＨＢｓ抗原粒子とリポソームの融合体に内包したものである。ここで、「内包」とは、小核酸分子が標的細胞等に導入される前に血液中などの生体内で実質的に分解されない状態で融合体と複合化することを意味し、ＨＢｓ抗原粒子内または融合体内に封入される場合と、ＨＢｓ抗原粒子の外側であるが、リポソームの一部と相互作用して、RNaseなどの酵素による分解を受けない状態で複合化している場合の両方を含む。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子は、ＨＢｓ抗原粒子とリポソームを先に界面活性剤の存在下または非存在下に融合し、その後にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子を作用させた場合、あるいは、ＨＢｓ抗原粒子とリポソームとＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子を同時に混合し反応させた場合には、小核酸分子はＨＢｓ抗原粒子の外側に存在するが、リポソームの一部と相互作用して、RNaseなどの酵素による分解を受けない状態で複合化すると考えられる。一方、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子を封入したリポソームとＨＢｓ抗原粒子を必要に応じて界面活性剤の存在下に混合し反応させた場合には、前記小核酸分子がＨＢｓ抗原粒子内に封入される場合とＨＢｓ抗原粒子の外側であるが、リポソームの一部と相互作用して、RNaseなどの酵素による分解を受けない状態で融合ないし複合化する場合の両方があり得、これらは単独又は混合物として存在し得る。
【００２１】
本発明のＨＢｓ抗原粒子は、粒子形成能を有するＨＢｓ抗原タンパク質またはその改変体と脂質膜を構成要素とし、例えば粒子形成能を有するＨＢｓ抗原タンパク質またはその改変体が球状、楕円体状或いはこれらに類似する形状の脂質膜と複合化した構造を有するものである。
【００２２】
本明細書において、ＨＢｓ抗原タンパク質またはその改変体を構成要素とするＨＢｓ抗原粒子としては、ＨＢｓ抗原タンパク質（ＨＢｓＡｇ）またはその改変体と脂質膜を構成要素とする粒子などが例示される。
【００２３】
本明細書において、ＨＢｓ抗原粒子は、ＨＢｓ抗原タンパク質又はその改変体を主成分として包含し、該タンパク質は脂質膜に保持されている。また、該タンパク質には通常糖鎖が結合している。この糖鎖は、真核細胞でＨＢｓ抗原タンパク質又はその改変体を発現させたときに真核細胞内で結合されるものであるが、ＨＢｓ抗原粒子が得られた後に、共有結合などにより化学的に糖鎖を結合させてもよい。
【００２４】
ＨＢｓ抗原粒子としては、酵母、昆虫細胞あるいはCHO細胞などの哺乳動物細胞を含む真核細胞でＨＢｓ抗原タンパク質またはその改変体を発現させることにより得られるものが挙げられる。ＨＢｓ抗原粒子の製造法は、特開2001-316298に記載され、ＨＢｓ抗原の調製法は、Vaccine. 2001 Apr 30;19(23-24):3154-63.   Physicochemical and immunological characterization of hepatitis B virus envelope particles exclusively consisting of the entire L (pre-S1 + pre-S2 + S) protein. Yamada T, Iwabuki H, Kanno T, Tanaka H, Kawai T, Fukuda H, Kondo A, Seno M, Tanizawa K, Kuroda S.に記載されている。
【００２５】
真核細胞でＨＢｓ抗原タンパク質を発現させると、該タンパク質は、小胞体膜上に膜蛋白として発現、蓄積され、ナノ粒子として放出されるので、脂質膜を有する構造となる。真核細胞で発現させたＨＢｓ抗原粒子は、ＨＢＶゲノムを全く含まないので、人体への安全性が極めて高い。
【００２６】
１つの好ましい実施形態において、ＨＢｓ抗原粒子は、６５〜８０重量部のＨＢｓ抗原タンパク質またはその改変体、８〜２０重量部の脂質、５〜２０重量部の糖鎖から構成される。本願の実施例で使用されているＨＢｓ抗原粒子（L粒子）は、ＨＢｓ抗原タンパク質またはその改変体約７０重量部、糖鎖約１６重量部、脂質約１３重量部からなる。
【００２７】
本発明の小核酸分子、例えばsiRNA、shRNA(ショートヘアピンRNA)、miRNAは、ウイルス核酸または癌細胞の標的遺伝子のRNA(特にmRNA)を分解させるものであれば特に限定されず、標的となる遺伝子が決まれば、常法に従い設計することができる。siRNAの長さは、２１〜２３塩基であるものが好ましいが、標的のRNAを切断できるのであれば、例えば１５〜３０塩基のより長いあるいはより短い配列を有するものであってもよい。shRNAは、siRNAの2本のRNAを適当な長さ（長さの下限は0、1、2、3、4または5塩基であり、長さの上限は100,90,80,70,60,50,40,30,25,20,15又は10塩基）のRNAでつないだものが例示される。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態において、リポソームと融合した後の、小核酸分子を除いたリポソームＨＢｓ抗原粒子融合体は、１０〜６０重量部のＨＢｓ抗原タンパク質またはその改変体、４０〜９５重量部の脂質(リン脂質を含む)、１〜１０重量部の糖鎖から構成され得る。
【００２９】
ＨＢｓ抗原粒子を構成する脂質としては、酵母ないし動物細胞などの真核細胞由来の膜成分（例えばリン脂質、コレステロールなど）、リポソームを構成するリン脂質が挙げられる。糖鎖は、真核細胞においてＨＢｓ抗原タンパク質を発現される際にタンパク質に導入されるものであるが、標的となる細胞／組織／臓器を特異的に認識する部位として糖鎖を結合させることも可能である。標的認識部位として使用可能な糖鎖としては、例えばシアリルルイスXが挙げられる。シアリルルイスXは、炎症を起こしている細胞表面に存在するレクチンタンパク質と相互作用するため、生体内の炎症部位への標的化に使用することができる。シアリルルイスＸなどの標的認識分子としての糖鎖は、複合体の導入前と導入後のいずれの粒子に対して導入してもよい。あるいは、糖鎖をＮａＩＯ４などの酸化剤で酸化してアルデヒド基を導入し、これに特定の細胞、臓器、組織などを認識するリガンドを結合させることにより、ウイルス感染細胞あるいは癌細胞を標的化することが可能である。
【００３０】
ＨＢｓ抗原タンパク質は、Ｓタンパク質を必須の構成要素として含み、さらにPreS1およびPreS2の2つの領域を含み得る。Sタンパク質(226アミノ酸)は、粒子形成能を有している。S粒子に55アミノ酸からなるPre-S2を付加したのがMタンパク質（M粒子の構成蛋白）であり、M蛋白に108アミノ酸または119アミノ酸からなるPre-S1を付加したものがLタンパク質（L粒子の構成蛋白）である。Lタンパク質、Mタンパク質はSタンパク質と同様に粒子形成能を有している。従って、PreS1およびPreS2の2つの領域は任意に置換、付加、欠失、挿入を行ってもよい。例えばPre-S1領域の３から７７アミノ酸残基に含まれる肝細胞認識部位を欠失させた改変タンパク質を用いることで、肝細胞認識能を失った中空粒子を得ることができる。また、PreS2領域にはアルブミンを介して肝細胞を認識する部位が含まれているので、このアルブミン認識部位を欠失させることもできる。一方、S領域(226アミノ酸)は粒子形成能を担っているので、S領域の改変は、粒子形成能を損なわないように行う必要がある。例えばＳ領域において、129位のGlnをArgに置換し、及び／又は、145位のGlyをArgに置換したタンパク質は、ＨＢｓ抗原粒子の抗原性が低下し、粒子形成能とsiRNAの細胞への導入能は損なわれないため好ましく、特にLタンパク質のＳ領域において、129位のGlnをArgに置換し、かつ、145位のGlyをArgに置換したタンパク質であるＨＢｓ抗原（Ｑ１２９Ｒ，Ｇ１４５Ｒ）は、粒子形成能とsiRNAの細胞への導入能を有し、免疫原性が低いために好ましい。
【００３１】
なお、PreS1領域、特にPreS1領域の１位〜５０位のアミノ酸は、リポソームなどの脂質との融合に寄与することが本発明者らの研究により明らかになった。従って、本発明のＨＢｓ抗原タンパク質またはその改変体は、PreS1領域、特にPreS1領域の１位〜５０位を有するものが好ましく、この領域に置換、付加、欠失、挿入などの改変があるとしてもこの領域の脂質融合能を損なわないような変異であるのが好ましい。
【００３２】
ＨＢｓ抗原タンパク質の改変体としては粒子を形成する能力を有する限り種々の改変体が広く包含され、ＨＢｓ抗原タンパク質を例に取ると、PreS1とPreS2領域に関しては任意の数の置換、欠失、付加、挿入が挙げられ、S領域に関しては、１又は数個もしくは複数個、例えば１〜１２０個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に１〜５個のアミノ酸が置換、付加、欠失又は挿入されていてもよい。置換、付加、欠失、挿入などの変異を導入する方法としては、該タンパク質をコードするＤＮＡにおいて、例えばサイトスペシフィック・ミュータジェネシス（Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同 100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)）などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段（例えばＤＮＡ合成機を使用する）（J. Am. Chem. Soc., 89, 4801(1967)；同 91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett.,22, 1859 (1981)）などが挙げられる。コドンの選択は、宿主のコドンユーセージを考慮して決定できる。
【００３３】
ＨＢｓ抗原タンパク質またはその改変体としてLタンパク質などの肝細胞を認識可能なタンパク質から構成されるＨＢｓ抗原粒子の場合には、細胞認識部位を導入する必要はない。一方、Pre-S1領域の３から７７アミノ酸残基に含まれる肝細胞認識部位を欠失させた改変タンパク質、或いはPreS1とPreS2の両方の領域を欠失させたタンパク質から構成されるＨＢｓ抗原粒子の場合、そのままでは細胞認識ができないので、細胞認識部位を導入して、肝細胞以外の任意の細胞を認識させ、前記ポリマー／核酸複合体を種々の標的細胞に導入することができる。このような特定の細胞を認識する細胞認識部位としては、例えば成長因子、サイトカイン等のポリペプチドからなる細胞機能調節分子、細胞表面抗原、組織特異的抗原、レセプターなどの細胞および組織を識別するためのポリペプチド分子、ウイルスおよび微生物に由来するポリペプチド分子、抗体、糖鎖などが好ましく用いられる。具体的には、癌細胞に過剰に発現されるＥＧＦ受容体やＩＬ−２受容体に対する抗体やＥＧＦ、またＨＢＶの提示するレセプターも含まれる。或いは、抗体Fcドメインを結合可能なタンパク質（例えば、ZZタグ）、ストレプトアビジンを介してビオチン標識した生体認識分子を提示するためにビオチン様活性を示すストレプトタグなどを使用することもできる。
【００３４】
細胞認識部位がポリペプチドである場合には、ＨＢｓ抗原タンパク質またはその改変体をコードするＤＮＡと細胞認識部位をコードするＤＮＡを必要に応じてスペーサーペプチドをコードするＤＮＡを介してインフレームに連結し、これをベクター等に組み込み、真核細胞で発現させることにより、任意の標的細胞を認識するＨＢｓ抗原粒子を得ることができる。
【００３５】
細胞認識部位が抗体である場合、ＨＢｓ抗原タンパク質またはその改変体をコードするＤＮＡとＺＺタグをコードするＤＮＡを必要に応じてスペーサーペプチドをコードするＤＮＡを介してインフレームに連結し、これをベクター等に組み込み、真核細胞で発現させ、得られたＨＢｓ抗原粒子と標的細胞を認識し得る抗体を混合することにより、目的とする、抗体が結合したＨＢｓ抗原粒子を得ることができる。
【００３６】
細胞認識部位が糖鎖の場合、糖転移酵素を使用して、細胞認識能を持たないＨＢｓ抗原粒子にシアリルルイスＸなどの細胞を認識可能な糖鎖を連結することにより、得ることができる。
【００３７】
ＨＢｓ抗原粒子とリポソームの融合は、必要に応じて界面活性剤の存在下に水又は水性媒体中で該リポソームとＨＢｓ抗原粒子を混合し、必要に応じて攪拌ないし振盪することにより容易に実施できる(直接融合法)。
【００３８】
あるいは、ＨＢｓ抗原粒子とリポソーム(小核酸分子を含まない)の融合は、水又は水性媒体中でリポソームとＨＢｓ抗原粒子を界面活性剤の存在下で混合・透析し、複合体を形成した後、小核酸分子を内包させてもよい。
【００３９】
有効成分となる、小核酸分子を含むＨＢｓ抗原粒子とリポソームの融合体(ＨＢｓ抗原融合粒子)の大きさは、５０〜１０００ｎｍ、好ましくは６０〜７００ｎｍ程度、より好ましくは７０〜５００ｎｍ程度、特に好ましくは７０〜３００ｎｍ程度、特に７０〜２００ｎｍ程度である。ＨＢｓ抗原融合粒子の粒子径は、生体内(特に血液中)での半減期、クリアランスなどに影響する。
【００４０】
本明細書において、ＨＢｓ抗原粒子の大きさは、動的散乱光法による測定装置、例えば、FPAR1000（大塚電子）により測定することができ、表面電荷はゼーターサイザーナノ-ZS（Malvern Instruments）により測定することができる。
【００４１】
本発明のＨＢｓ抗原融合粒子の大きさが上記の範囲内に入っている場合、生体内(特に血液中)での半減期が長く、小核酸分子を長期間標的細胞に導入できるので特に好ましい。
【００４２】
小核酸分子を内包したＨＢｓ抗原融合粒子の粒子径を調整するには、直接融合法においてはリポソームの粒子径を最小化する処理を行い、その後、粒子サイズを最小化したＨＢｓ抗原粒子と融合させる。また、界面活性剤法においても前もって例えば50nm〜100nmの小サイズに調節したリポソームと粒子サイズを最小化したＨＢｓ抗原粒子を準備し、これを界面活性剤存在下で融合させ、それの融合体を更に最小化処理を行うことで可能である。
【００４３】
リポソームの粒子径の最小化には、例えば、エクストルーダーを用いて孔径が小さいフィルター(例えば、100nm, 80nm，50nmなど)を通過させることによって粒子径を調節可能である。また、別の方法として、ロッド状の超音波発生機により数時間処理することによって粒子径を小さくすることも可能である。勿論、他の方法よるリポソーム粒子径の最小化処理法を利用しても問題ない。ＨＢｓ抗原粒子の粒子径を最小化する際には、例えば、ロッド状の超音波発生機により数時間処理することによって粒子径を小さくすることが可能であるが、他の方法よる最小化処理法を利用しても問題ない。なお、界面活性剤法による複合体を最小化する際には、例えば、エクストルーダーを用いて孔径が小さいフィルター(例えば、200nm, 150nm，100nmなど)を通過させることによって粒子径を調節可能である。
【００４４】
リポソームは、多重層リポソーム、一枚膜リポソームのいずれであってもよい。リポソームの大きさは４０〜３００ｎｍ程度、好ましくは５０〜２００ｎｍ程度、特に６０〜１５０ｎｍ程度である。リポソームをＨＢｓ抗原粒子と直接融合させる場合、リポソームの大きさは、ＨＢｓ抗原粒子の０．５〜２倍程度の大きさであるのが好ましい。界面活性剤を用いてリポソ−ムとＨＢｓ抗原粒子を複合体化する場合には、リポソームの大きさは任意であるが、上記の大きさのリポソームが好ましく例示される。
【００４５】
リポソームは超音波処理法、逆相蒸発法、凍結融解法、脂質溶解法、噴霧乾燥法などにより製造することができる。
【００４６】
リポソームはＨＢｓ抗原粒子に対し、適切な量と組成で作製され、使用される。具体的には、ＨＢｓ抗原粒子 100重量部に対し、リポソームを２０〜１０００重量部使用する。
【００４７】
リポソームの構成成分としては、リン脂質、コレステロール類、脂肪酸などが挙げられ、具体的にはホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン等の天然リン脂質、あるいはこれらを常法によって水素添加したものの他、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、エレオステアロイルホスファチジルコリン、エレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン、エレオステアロイルホスファチジルセリン等の合成リン脂質が挙げられる。リン脂質は様々な飽和度を有する脂質を組み合わせて使用するのが望ましい。その他、コレステロール類としては、コレステロール、フィトステロールなどが挙げられ、脂肪酸としてはオレイン酸、パルミトオレイン酸、リノール酸、或いはこれら不飽和脂肪酸を含む脂肪酸混合物が挙げられる。側鎖の小さい不飽和脂肪酸を含むリポソームは曲率の関係から小さいリポソーム作製に有効である。
【００４８】
リポソームには、エンドソームからの小核酸分子の脱出のためにpH感受性の脂質(例えばCHEMS)、膜透過性ペプチド、カチオニック脂質の少なくとも１種を包含させるのが好ましい。カチオニック脂質としては、DC-6-14（O,O’-ditetradecanoyl-N-(α-trimethylammonioacetyl)diethanolamine chloride）、DODAC(dioctadecyldimethylammonium chloride）、DOTMA（N-(2,3-dioleyloxy)propyl-N,N,N-trimethylammonium）、DDAB（didodecylammonium bromide）、ＤＯＴＡＰ（1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonio propane）、DC-Chol（3β-N-(N',N',-dimethyl-aminoethane)-carbamol cholesterol）、DMRIE（1,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium）、DOSPA（2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminum trifluoroacetate）等が挙げられる。
【００４９】
好ましい1つの実施形態において、本発明のリポソームは、カチオニック脂質、リン脂質、コレステロールを含む。これらの比率としては、リポソーム全体を100重量部として
カチオニック脂質：10〜60重量部、好ましくは20〜50重量部、より好ましくは30〜40重量部、
リン脂質：10〜50重量部、好ましくは15〜45重量部、より好ましくは20〜40重量部、
コレステロール：10〜50重量部、好ましくは15〜45重量部、より好ましくは20〜40重量部。
【００５０】
リン脂質としては、DSPE-PG10G、DSPE-PEG350のようにPEGなどで修飾されたリン脂質を使用することもできる。
【００５１】
リポソームとＨＢｓ抗原粒子の融合体の製造法の例を具体的に説明すると、例えば前記したリン脂質、コレステロール等を適当な有機溶媒に溶解し、これを適当な容器に入れて減圧下に溶媒を留去して容器内面にリン脂質膜を形成し、これに水溶液、好ましくは緩衝液を加えて攪拌して、リポソームを得ることができる。該リポソームを直接、またはいったん凍結乾燥した後に、ＨＢｓ抗原粒子と混合することにより、リポソームとＨＢｓ抗原粒子の融合体を得ることができる（直接融合法）。別の方法として、例えば前記したリン脂質、コレステロール等を適当な有機溶媒に溶解し、これを適当な容器に入れて減圧下に溶媒を留去して容器内面にリン脂質膜を形成し、水又は水性媒体中で水和しリポソームを作製する。作製したリポソームを凍結融解し超音波処理によりサイズ調整を行い、界面活性剤を加える。これに界面活性剤が含有されているＨＢｓ抗原粒子溶液を混合し、透析処理を実施することによりリポソームとＨＢｓ抗原粒子の融合体を得ることも出来る（界面活性剤法）。界面活性剤としては、界面活性剤がMEGA-8、MEGA-9、 MEGA-10、n-オクチル-α‐D-グルコピラノシド、n-オクチル-α‐D-チオグルコシド、n-ヘプチル-β‐D-チオグルコシド、Triton X-100、Tween 20、Tween 80、N-ラウロイルサルコシン-ナトリウム塩、ドデシル硫酸リチウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、SDS、塩化セチルピリジニウム、CTAB、CHAPS、CHAPSO、スルホベタインSB10及びスルホベタインSB16、などが挙げられる。
【００５２】
界面活性剤法によるリポソームとＨＢｓ抗原粒子の融合の場合、界面活性剤の濃度は、0.1〜5％程度、好ましくは0.5〜2％程度である。この場合、水などの溶媒100重量部あたりＨＢｓ抗原粒子は0.01〜0.5重量部程度、好ましくは0.02〜0.1重量部程度使用され、リポソームは0.03〜10重量部程度、好ましくは0.06〜5重量部程度使用される。界面活性剤法を実施するときの温度は５〜７５℃程度、好ましくは１０〜６０℃程度の温度で、１０分から６時間、好ましくは２０分〜３時間程度で好ましく実施することができる。
【００５３】
直接融合法の場合、水などの溶媒100重量部あたりＨＢｓ抗原粒子は0.005〜0.5重量部程度、好ましくは0.02〜0.2重量部程度使用され、リポソームは0.01〜10重量部程度、好ましくは0.03〜5重量部程度使用される。直接融合法を実施するときの温度は０〜５０℃程度、好ましくは０〜４０℃程度の温度で、１分〜１２０分、好ましくは２分〜６０分程度で好ましく実施することができる。
【００５４】
本発明において、抗ウイルス剤の対象となるウイルスとしては、二本鎖RNAウイルス、一本鎖RNAウイルスなどのＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスが挙げられ、ＲＮＡウイルスの感染症が、好ましい治療対象として例示できる。本発明の「ウイルス核酸」は、これらＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルス由来の核酸を包含する。
【００５５】
ＲＮＡウイルスとしては、アレナウイルス科（ラッサウイルスなど）、オルトミクソウイルス科（インフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型など）、カリシウイルス科（ノロウイルス、サポウイルスなど）、コロナウイルス科（SARSウイルス、鳥インフルエンザウイルスなど）、トガウイルス科（風疹ウイルスなど）、ノダウイルス科（ウイルス性神経壊死症ウイルスなど）、パラミクソウイルス科（ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルスなど）、ピコルナウイルス科（ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルスなど）、フィロウイルス科（マールブルグウイルス、エボラウイルスなど）、ブニヤウイルス科（クリミア・コンゴ出血熱ウイルスなど）、フラビウイルス科（黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、C型肝炎ウイルス、G型肝炎ウイルス）、ラブドウイルス科（狂犬病ウイルス）、レオウイルス科、レトロウイルス科（ヒト免疫不全ウイルス、ヒトTリンパ好性ウイルス、サル免疫不全ウイルス、STLVなど）が挙げられる。
【００５６】
治療の対象となる癌としては、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、卵巣癌または血液腫瘍などが挙げられる。
【００５７】
本発明の抗ウイルス剤または抗癌剤は、特定の臓器、組織、細胞などを標的化して、小核酸分子を導入することができる。
【００５８】
癌の標的遺伝子としては、以下のものが挙げられる：
EGFR, ErbB2, ErbB3, IGF-1R, RET, K-ras, R-ras, CSF-1R, PDGFR-β, FLT-3, Met, EphA2, BRAF, ABL, c-Kit, c-Src, Met, β-catenin, c-Myc, N-Myc, Cycline-D1, PI3K, AKT, IKK-β, NF-κβ, EWS, HIF-1α, XBP-1, HIPV E7, E2F4, HIPV E6, Hdmx, Notch-1, Delta-like-1, Jagged-1, Cycline B1, Chk1, FLIP, BCL-2, BCL-XL, Survivin, XIAP, Telomerase, Id1, Cks-1, Skp-2, βTRCP1, cathepsin L, VEGF(A-D), PIGF, Angiogenin, Angiotropin, EGF, HGF, SF, FGF, PDGF, TNF-α, IGF-1, Cathepsin, MMP 2, 9, Stromelysin, uPA, c-myc, ras, c-src, v-raf, c-jun, VEGFR1, 2, 3, Thymidine, phospholyrase, RAS-farnesyl, transferase, Geranyl, IL-1, 6, 8, 10, αvβ3 integrin, Ang-1, Angiostatin II, Endothelin, Erythropoietin, iNOS, PAF, Cox-2, Thrombopoietin, CEACAM1, RhoA, CXCR4, IGFBP2, EphA2, EpCAM, TGF-β, IDO, MIC-A, MIC-B, ABCB1, 4, 5, ERCC1。
【００５９】
小核酸分子をＨＢｓ抗原粒子とリポソームの融合体に内包してなる粒子が投与される哺乳動物としては、ヒト、ウシ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、イヌ、ネコなどが挙げられ、ヒトが特に好ましい。
【００６０】
投与される小核酸分子の投与量は特に限定されないが、ヒト成人1日当たり例えば、約０．１ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約１ｎｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００６１】
小核酸分子をＨＢｓ抗原粒子とリポソームの融合体に内包してなる本発明の抗ウイルス剤又は抗がん剤の有効量は、上記の小核酸分子の投与量を実現できる量である。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。【００６３】
実施例１
DC-6-14 (O,O’-ditetradecanoyl-N-(α-trimethylammonioacetyl)diethanolamine chloride)
DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine)
１．siRNA封入BNC-Liposomeの作製方法
クロロホルム、 DC-6-14、 DOPE、 Cholesterol、を200mlナス型フラスコ内で溶解させ、脂質溶液を作製した。（モル比でDC-6-14：DOPE：Cholesterol：DSPE-PG10G＝４：３：３：１）調製したナス型フラスコをロータリーエバポレーターにセットし、窒素置換し、減圧してクロロホルムを留去し、脂質フィルムを作製した。作製した脂質フィルムに大塚蒸留水を加えて水和し、水和した溶液を液体窒素で凍結・融解を繰り返し、リポソームを作製した。作製したリポソームをNLI社LIPEX Extruderを用いてPCMB 25mm、 2 μm（Whatman 110602)、PCMB 25mm、1 μm（Whatman 110603)、PCMB 25mm、0.08 μm（Whatman 110604)、PCMB 25mm、0.05 μm（Whatman 110605)、PCMB 25mm、0.03 μm（Whatman 110606）それぞれ順に各3回かけ粒径を調製し、Filter滅菌した。リポソーム溶液 10μl を 大塚蒸留水240μlで希釈し、FPAR-1000AS(大塚電子)を用いて粒径測定した。リポソームの粒径は、68〜75nmであった。コレステロールE-テストによりコレステロール濃度を測定し、測定値からリポソーム総脂質濃度を算出した。リポソーム総脂質濃度は、7.55mg/mlであった。リポソームにPG-10Gを約10％添加した。リポソームにsiRNA及びBNC-ST（Ｌ粒子において、Lタンパク質のＳ領域において、129位のGlnをArgに置換し、かつ、145位のGlyをArgに置換したタンパク質であるＨＢｓ抗原（Q129R,G145R）を酵母で発現させて得られたステルス性のＬ粒子）を加え、速やかに混合しFilter滅菌した。混合比は重量比でリポソーム1に対し、BNCは０．５〜３の混合比を用いた。【００６４】
２．定量RT-PCRによるmRNAの定量
2×105個の細胞（HepG2、TE10）を6ウェルディッシュ（コーニング  3516）に撒いた。
24時間後にsiRNAとして終濃度250nMになるようにsiRNA封入BNC-Liposomeを加えた。さらに24時間後にメディウムチェンジを行った。メディウムは、HepG2には10% FBS（JRH  12303 500M）を加えたMEM（SIGMA  M4655）及びTE10にはDMEM（SIGMA  D5796）培地である。siRNA導入後3日目にQIAGEN  RNeasy Mini Kit（74104）にてRNA抽出した。プロトコールは添付のメーカー取り扱い説明書を参考とする。ABI社のHigh Capacity RNA-to-cDNA Kit（4387406）を用いて約2μgのRNAからcDNAを作成し、ABI 7300 Real Time PCR System（TaqMan Gene Expression Assay ABI 436916使用）にてPCRを施行、未処理の細胞を基準としてΔΔcT値求め比較した。【００６５】
結果を図1に示す。図１において、
Ep     EpCAMのsiRNA
Sc     スクランブルsiRNA
Mock   siRNAなし（BNC-Liposomeのみ）
NC     ネガティブコントロール（未処理）。【００６６】
下記にsiRNAの配列を以下に示す。
EpCAM siRNA 配列（Ambionより購入  ID:11452）
Sense         5’-GGCAGAAAUGAAUGGCUCA(TT)  （配列番号１）
Antisense     5’-UGAGCCAUUCAUUUCUGCC(TT)   （配列番号２）
Scramble siRNA 配列（Osta et.al 2004 Cancer Research参照）
Sense         5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU(TT)   （配列番号３）
Antisense     5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA(TT)   （配列番号４）
図１に示されるように、肝細胞由来であるHepG2細胞では本発明のsiRNA導入法によりEpCAMの発現が40%まで抑制された。スクランブルsiRNAやmockではEpCAMの発現に変化は見られなかった。一方、食道癌細胞TE10ではEpCAMに対するsiRNAを用いても明らかなmRNAの減少は見られなかった。【００６７】
３．細胞増殖率測定
1×104個の細胞（HepG2）を96ウェルディッシュ（コーニング  3599）に撒いた。24時間後にsiRNAとして終濃度250nMになるようにsiRNA封入BNC-Liposomeを加えた。24時間後にメディウムチェンジを行った。メディウムは上述の10% FBSを加えたMEM培地である。siRNA導入後3日目にCell Proliferation ELISA, BrdU Kit (Roche  11 647 229 001)を用いて未処理の細胞（ネガティブコントロール：NC）を基準に細胞増殖率を比較した。そのプロトコールは添付の通りである。
結果を図2に示す。
図2に示されるように、本発明のsiRNAを導入したHepG2細胞は細胞増殖が抑制され、抗腫瘍作用を有することが確認された。【００６８】
実施例2
リポソームとＨＢｓ抗原粒子を界面活性剤の存在下または非存在下に融合し、その融合物にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子を加えることを特徴とする抗ウイルス剤によるウイルス増殖抑制
（１）細胞株とその継代培養HCV
レプリコン細胞株OR6（HuH-7細胞由来で  ポリクローナルなOR/C-5B/KEゲノム全長HCV RNAが複製している細胞）を１０％牛胎児血清（ＦBＳ：Biowest社製）、ペニシリンストレプトマイシン(invitrogen社製)、geneticin(300ug/ml invitrogen)を含むDMEM培地（invitrogen社製）を用いて、10ｃｍ２のコラーゲンコートされた組織培養シャーレ（BD Biocoat社製：354450）中でコンフルエント（confluent）にならないよう注意しつつ５％CO2，３７℃条件下で培養し、対数増殖期のうちにトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（シグマ社製）を用いて新しい組織培養フラスコに移して継代培養した。【００６９】
（２）L粒子、かつ市販のトランスフェクション試薬を用いたsiRNAによるOR6HCVレプリコン細胞の増殖抑制試験
(Ｉ)トランスフェクションプロトコール及びルシフェラーゼアッセイプロトコール
100nM siRNAについてトランスフェクション 試薬 (DharmaFECT1 ) （登録商標）を使用した。
1. コラーゲンコートされた組織培養24-ウェルプレート（Collagen coated I  24-Well Plate：BD Biocoat社製 354408）に2×104個の500μlの細胞をプレートに播種し、細胞を終夜抗生物質フリー完全培地10%FBS (Biowest社製）含有DMEM（invitrogen社製）培地にて培養した。
チューブ１の調製：87.5 μlの2μM siRNA溶液を87.5μlの血清フリー培地に加えた。総体積は175μlであった。
チューブ２の調製：3.5μlのDharmaFECT1（登録商標）を171.5μlの血清フリー培地に加えた。総体積は175μlであった。
2. チューブ１とチューブ２の内容物をピペットを用いて注意深く混合し、室温で２０分間インキュベートした。
3. 1400μlの抗生物質フリー完全培地を加えた。
4. 24 ウェルプレートの各ウェルから培養培地を除去し、500μlのトランスフェクション培地を加えた。
5. 細胞を48-72hr培養した(タンパク質分析用)
6. Renillaルシフェラーゼ (RL) アッセイのために、細胞を48-72時間培養した。処理細胞をRenilla 溶解 試薬 (Promega)で収穫し、製造業者のプロトコールに従いRLアッセイにかけた。各アッセイについて細胞を少なくとも３重でプレートに播種した。【００７０】
（II）siRNAトランスフェクション用のＬ粒子とルシフェラーゼアッセイプロトコール
1. コラーゲンコートされた組織培養24-ウェルプレート（Collagen coated I  24-Well Plate：BD Biocoat社製 354408）に2×104個の500μlの細胞をプレートに播種し、細胞を終夜抗生物質フリー完全培地10%FBS (Biowest社製）含有DMEM（invitrogen社製）培地で培養した。
2. siRNAを含むL粒子溶液を細胞に加えた。 
3. 1時間後、細胞の培地を抗生物質フリー完全培地で交換した。 
4. 細胞を48時間培養した。
5.  Renilla溶解試薬(Promega)で細胞を収穫し、製造業者の プロトコールに従いRL アッセイにかけた。【００７１】
細胞増殖を抑制しないネガティブコントロールとしてDharmacon社市販のｓｉＲＮＡ(ON-TARGETplus Non-targeting siRNA #1)、HCVを抑制するポジティブコントロールとしてレプリコン内に含まれているレニラルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いた。negative controlとして使用したsiRNAは：ON-TARGETplus Non-targeting siRNA #1
Cat #D-001810-01-05
ルシフェラーゼ用のｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列は以下の配列：
5’- GGCCUUUCACUACUCCUACUU -3’（配列番号５）からなる。
また、HCV用のsiRNAのヌクレオチド配列は：
5’- GUCUCGUAGACCGUGCAUCAUU -3’（配列番号６）からなる。
レプリコン細胞が発現しているルシフェラーゼ値、各種トランスフェクション試薬やSiRNA導入した場合のルシフェラーゼ発現値の変化率を求めた。【００７２】
L粒子を用いた４８時間後のルシフェラーゼアッセイ（図３）、DharmaFECT（登録商標）トランスフェクション試薬を用いた４８時間後（図４）及び７２時間後（図５）のルシフェラーゼアッセイの結果を示す。図３〜５において、
Mock: transfectin agentのみ添加したもの。DharmaFECT1（登録商標）またはL粒子のみでSiRNAは含まれていない。Nontarget : Dharmacon社 市販のnontarget siRNAが含まれている
posi(hluc): レニラレポーター遺伝子の配列をtarget にしたsiRNAが含まれている。レプリコン細胞にレニラレポーター遺伝子が入っているためpositive controlとして使用。
siHCV: HCVRNAの配列をtargetにして作成したsiRNAを意味する。【００７３】
siRNAトランスフェクション用のＬ粒子を使用した場合
何も添加しないレプリコン細胞株OR6の48時間後のルシフェラーゼ活性値を100%とした場合、MOCKとしてトランスフェクション試薬(SiRNAが含まれていないL粒子のみ)のみ導入した場合のルシフェラーゼ活性値、ネガティブコントロールとしてNon-targeting siRNA #1 200nMを導入した場合、ポジティブコントロールとして用いたレニラレポーター遺伝子配列に対するsiRNA 200nM、HCVRNA の配列に対するsiRNA200nMを導入レプリコン細胞株OR6に導入したルシフェラーゼ活性値は、それぞれMOCK （80.1％±27％）、ネガティブコントロール（42．5％±7．2％）, ポジティブコントロール（12.1％±2.0％）, HCVRNA の配列に対するsiRNA （12.9％±2.3％） （平均±標準偏差(ＳＤ)）にウイルス複製率が低下した。【００７４】
トランスフェクション 試薬 (DharmaFECT1 ) （登録商標）を使用した場合
何も添加しないレプリコン細胞株OR6の48時間後のルシフェラーゼ活性値を100%とした場合、MOCKとしてトランスフェクション試薬(DharmaFECT) （登録商標）のみ導入した場合のルシフェラーゼ活性値の割合、ネガティブコントロールとしてNon-targeting siRNA #1 100nMを導入した場合、ポジティブコントロールとして用いたレニラレポーター遺伝子配列に対するsiRNA 100nM、HCVRNA の配列に対するsiRNA 100nMを導入レプリコン細胞株OR6に導入したルシフェラーゼ活性値は、それぞれMOCK （1.51％±0.84％）、ネガティブコントロール（1.47％±1.25％）, ポジティブコントロール（0.59％±0.11％）, HCVRNA の配列に対するsiRNA （0.89％±0.27％） （平均±標準偏差(ＳＤ)）にウイルス複製率が低下した。【００７５】
市販のトランスフェクション試薬ではそのもの自体の毒性が強く、siRNAの評価ができなかった。一方、L粒子を用いた場合、毒性は２０％程度にとどまり、市販のトランスフェクション試薬と比較し毒性を少なく抑えることが示唆された。【００７６】
OR6レプリコン細胞とはHCV ゲノムの複製に必要なHCVゲノムの断片を含むキメラRNAがヒト肝癌由来細胞株HuH7細胞内で持続的に複製維持している細胞モデルである。【００７７】
レプリコンRNAは本来HCVゲノム中で5‘UTRの下流にレニルシフェラーゼラレポーター遺伝子、細胞毒性を示す抗生物質ネオマイシン耐性遺伝子、かつその下流に脳心筋炎ウイルス(EMCV)遺伝子由来の内部リボゾーム挿入部位(IRES)が挿入されている。この配列によりRNAの内部から翻訳反応が開始され、その下流に位置し構造(s)蛋白質、非構造(NS)タンパク質が効率よく翻訳される。試験管内転写反応により合成したRNAを肝癌由来のHuH7細胞に導入した後、ネオマイシンにより選択を行う。導入したRNAが細胞内で効率よく自己複製し、ネオマイシンにてクローンが選択された場合、その細胞は生存可能となる。このようにして細胞内で自己複製が可能なHCVゲノム配列とその自己複製を可能にする細胞が選択されレプリコン複製細胞が得られるが、具体的にOR6細胞はgenotype 1でstrain O由来のレプリコン細胞である（図５）。
【図１】
2010137570.tif 000003
【図２】
2010137570.tif 000004
【図３】
2010137570.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【配列表】
2010137570000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年6月30日(2011.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス核酸の標的遺伝子のｍＲＮＡを切断可能なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子を、肝細胞を認識可能なタンパク質から構成されるＨＢｓ抗原粒子とリポソームの融合体に内包してなる抗Ｃ型肝炎ウイルス剤。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
ＨＢｓ抗原が、ＨＢｓ抗原（Ｑ１２９Ｒ，Ｇ１４５Ｒ）である、請求項１に記載の抗Ｃ型肝炎ウイルス剤。
【請求項４】
Ｃ型肝炎ウイルス核酸の標的遺伝子のｍＲＮＡを切断可能なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである、請求項１または３に記載の抗Ｃ型肝炎ウイルス剤。
【請求項５】
標的遺伝子が肝細胞内で発現する標的遺伝子である、請求項１、３または４のいずれかに記載の抗Ｃ型肝炎ウイルス剤。
【請求項６】
リポソームと、肝細胞を認識可能なタンパク質から構成されるＨＢｓ抗原粒子を界面活性剤の存在下または非存在下に融合し、その融合物にＣ型肝炎ウイルス核酸の標的遺伝子のｍＲＮＡを切断可能なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子を加えることを特徴とする抗Ｃ型肝炎ウイルス剤の製造方法。
【請求項７】
界面活性剤がＭＥＧＡ−８、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｎ−ラウロイルサルコシン−ナトリウム塩、ドデシル硫酸リチウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ＳＤＳ、塩化セチルピリジニウム、ＣＴＡＢ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、スルホベタインＳＢ１０及びスルホベタインＳＢ１６からなる群から選ばれる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｃ型肝炎ウイルス核酸の標的遺伝子のｍＲＮＡを切断可能なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子を、肝細胞を認識可能なタンパク質から構成されるＨＢｓ抗原粒子とリポソームの融合体に内包してなる粒子の、抗Ｃ型肝炎ウイルス剤としての使用。
【請求項９】
Ｃ型肝炎ウイルス核酸の標的遺伝子のｍＲＮＡを切断可能なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子を、肝細胞を認識可能なタンパク質から構成されるＨＢｓ抗原粒子とリポソームの融合体に内包してなる粒子の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする、Ｃ型肝炎ウイルス感染症の治療方法。
【国際調査報告】
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2010137570.tif 000010
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