(57)【要約】  本発明は、多能性幹細胞をフィーダーフリー条件で培養する工程（１）、ＲＯＣＫ阻害剤およびレチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む、骨分化誘導培地と多能性幹細胞用培地の混合培地を用いて培養する工程（２）、およびレチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む骨分化誘導培地を用いて培養する工程（３）、を含むことを特徴とする骨分化誘導方法を提供する。本発明の骨分化誘導方法は、骨再生医療、骨代謝薬開発、骨疾患に対する新規治療法開発に適したシンプル、ワンステップ、短期間、高効率かつ再現性の高い骨分化誘導方法である。
2019124348.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞をフィーダーフリー条件で培養する工程（１）、
ＲＯＣＫ阻害剤およびレチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む、骨分化誘導培地と多能性幹細胞用培地の混合培地を用いて培養する工程（２）、および
レチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む骨分化誘導培地を用いて培養する工程（３）、を含むことを特徴とする骨分化誘導方法。
【請求項２】
工程（２）および工程（３）の合計培養期間が１２日間以内である請求項１に記載の骨分化誘導方法。
【請求項３】
工程（２）の培養期間が２日間である請求項１または２に記載の骨分化誘導方法。
【請求項４】
多能性幹細胞をフィーダーフリー条件で培養する工程（Ｉ）、
ＲＯＣＫ阻害剤およびレチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む、骨分化誘導培地と多能性幹細胞用培地の混合培地を用いて培養する工程（ＩＩ）、
レチノイン酸受容体αまたはβアゴニストおよび被験物質を含む骨分化誘導培地を用いて培養する工程（ＩＩＩ）、
石灰化結節形成量、カルシウム塩沈着量、Ｉ型コラーゲン産生または分泌量、および骨分化関連遺伝子発現量から選択される少なくとも１つを測定する工程（ＩＶ）、ならびに
被験物質を含まない骨分化誘導培地を用いて培養した細胞の測定値と比較し、骨分化能を亢進させる被験物質を選択する工程（Ｖ）、を含むことを特徴とする骨疾患治療薬のスクリーニング方法。
【請求項５】
工程（ＩＩ）および工程（ＩＩＩ）の合計培養期間が１２日間以内である請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
工程（ＩＩ）の培養期間が２日間である請求項４または５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
多能性幹細胞が骨疾患モデル多能性幹細胞である請求項４〜６のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
骨疾患モデル多能性幹細胞が骨疾患患者の細胞から作製したｉＰＳ細胞である請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
多能性幹細胞が健常ヒト由来の骨疾患に関連する異常を有しない多能性幹細胞である請求項４〜６のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞から骨細胞を分化誘導する新規な方法に関するものである。また、本発明は、当該骨分化誘導方法を利用して骨疾患治療薬をスクリーニングする方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
これまで報告されている多能性幹細胞から骨芽細胞そして骨細胞を誘導する方法は大きく２つの方法に分けられる。１つは胚様体を介する方法であり、胚様体を形成させることによって自発的な分化を開始させた後、培養皿に付着させ、間葉系細胞の特徴である遊走能を利用して、遊走してきた細胞を回収し、これまで骨髄由来の細胞に用いてきた骨分化誘導培地を用いて最終分化を誘導する方法である（非特許文献１）。もう１つは、より厳密に発生過程を、段階を経て模倣する多段階誘導法であり、これまで神経堤由来（非特許文献２）、中胚葉由来（非特許文献３）、あるいは体節由来（非特許文献４）の骨芽細胞の誘導が報告されている。前者は、比較的単純な方法ではあるが、胚様体形成というステップが必要であり、かつ一定した結果を得ることが困難である。後者は、発生過程の病態研究には適しているが、最終的な分化細胞の誘導効率は、各段階の効率に依存するため一定ではなく、かつ高価な生物製剤を含む複数の化合物を必要とするため、多種類の細胞を比較検討するような研究には適していない。また、いずれの方法も更に最終的な分化細胞である骨細胞の誘導に関しては不十分である。【０００３】
ヒト多能性幹細胞から骨組織を形成する能力のある細胞を分化誘導することは、骨組織の再生医療、骨代謝薬の開発、そして骨疾患に対する新規治療法の開発に大きく寄与する。しかしながら、現時点で、これらの用途に適したシンプル、ワンステップ、短期間、高効率かつ再現性の高い骨分化誘導方法は存在しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Nasu A, et al. Genetically matched human iPS cells reveal that propensity for cartilage and bone differentiation differs with clones, not cell type of origin. PLOS ONE. 2013; 8: e53771.
【非特許文献２】Fukuta M, et al. Derivation of mesenchymal stromal cells from pluripotent stem cells through a neural crest lineage using small molecule compounds with defined media. PLOS ONE, 2014; 9: e112291.
【非特許文献３】Kanke K, et al. Stepwise Differentiation of Pluripotent Stem Cells into Osteoblasts Using Four Small Molecules under Serum-free and Feeder-free Conditions. Stem Cell Reports 2014; 2: 751-60.
【非特許文献４】Loh KM, et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 2016; 166: 451-67.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、骨再生医療、骨代謝薬開発、骨疾患に対する新規治療法開発に適したシンプル、ワンステップ、短期間、高効率かつ再現性の高い骨分化誘導方法を提供することを課題とする。また、当該骨分化誘導方法を利用した骨疾患治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の発明を包含する。
［１］多能性幹細胞をフィーダーフリー条件で培養する工程（１）、ＲＯＣＫ阻害剤およびレチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む、骨分化誘導培地と多能性幹細胞用培地の混合培地を用いて培養する工程（２）、およびレチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む骨分化誘導培地を用いて培養する工程（３）、を含むことを特徴とする骨分化誘導方法。
［２］工程（２）および工程（３）の合計培養期間が１２日間以内である前記［１］に記載の骨分化誘導方法。
［３］工程（２）の培養期間が２日間である前記［１］または［２］に記載の骨分化誘導方法。
［４］多能性幹細胞をフィーダーフリー条件で培養する工程（Ｉ）、ＲＯＣＫ阻害剤およびレチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む、骨分化誘導培地と多能性幹細胞用培地の混合培地を用いて培養する工程（ＩＩ）、レチノイン酸受容体αまたはβアゴニストおよび被験物質を含む骨分化誘導培地を用いて培養する工程（ＩＩＩ）、石灰化結節形成量、カルシウム塩沈着量、Ｉ型コラーゲン産生または分泌量、および骨分化関連遺伝子発現量から選択される少なくとも１つを測定する工程（ＩＶ）、ならびに被験物質を含まない骨分化誘導培地を用いて培養した細胞の測定値と比較し、骨分化能を亢進させる被験物質を選択する工程（Ｖ）、を含むことを特徴とする骨疾患治療薬のスクリーニング方法。
［５］工程（ＩＩ）および工程（ＩＩＩ）の合計培養期間が１２日間以内である前記［４］に記載のスクリーニング方法。
［６］工程（ＩＩ）の培養期間が２日間である前記［４］または［５］に記載のスクリーニング方法。
［７］多能性幹細胞が骨疾患モデル多能性幹細胞である前記［４］〜［６］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［８］骨疾患モデル多能性幹細胞が骨疾患患者の細胞から作製したｉＰＳ細胞である前記［７］に記載のスクリーニング方法。
［９］多能性幹細胞が健常ヒト由来の骨疾患に関連する異常を有しない多能性幹細胞である前記［４］〜［６］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、骨再生医療、骨代謝薬開発、骨疾患に対する新規治療法開発に適したシンプル、ワンステップ、短期間、高効率かつ再現性の高い骨分化誘導方法を提供することができる。さらに、当該骨分化誘導方法を利用した骨疾患治療薬のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明のワンステップ骨分化誘導方法の手順を示す図である。
【図２】本発明のワンステップ骨分化誘導方法で分化誘導した細胞の骨基質形成能を、アリザリンレッド染色で経時的に評価した結果を示す図である。
【図３】本発明のワンステップ骨分化誘導方法で分化誘導した細胞の骨基質形成能を、カルシウム塩沈着量を経時的に測定して評価した結果を示す図である。
【図４】本発明のワンステップ骨分化誘導方法で分化誘導した細胞の各分化段階における代表的な遺伝子の発現を、mRNAレベルで経時的に測定した結果を示す図である。
【図５】本発明のワンステップ骨分化誘導方法で分化誘導した細胞の各分化段階における代表的な遺伝子の発現を、タンパク質レベルで経時的に測定した結果を示す図である。
【図６】本発明のワンステップ骨分化誘導方法で分化誘導した7日目と10日目の細胞を基質に包まれたまま回収し走査型電子顕微鏡で観察を行った結果を示す図である。
【図７】本発明のワンステップ骨分化誘導方法で分化誘導した7日目と10日目の細胞を基質に包まれたまま回収した後、単一細胞に分散し、再播種して培養した細胞の観察結果を示す図である。
【図８】本発明のワンステップ骨分化誘導方法で分化誘導した7日目の細胞をNOD-SCIDマウスの頭蓋骨に作製した径4mmの欠損部に移植し、6週間後にマイクロCTにて骨再生像を観察した結果を示す図である。
【図９】本発明のワンステップ骨分化誘導方法で分化誘導した7日目の細胞をNOD-SCIDマウスの頭蓋骨に作製した径4mmの欠損部に移植し、6週間後に再生組織の組織標本を作製してHE染色または抗ヒトオステオポンチン抗体による免疫染色を施し、観察した結果を示す図である。
【図１０】本発明のワンステップ骨分化誘導方法で分化誘導した細胞の誘導開始前（D0）および誘導後2日目（D2）の遺伝子発現を網羅的に解析した結果を示す図である。
【図１１】本発明のワンステップ骨分化誘導方法において、BMP阻害剤またはWNT阻害剤を添加したときのカルシウム塩沈着量を測定し、いずれの阻害剤も添加していないときと比較した結果を示す図である。
【図１２】本発明のワンステップ骨分化誘導方法において、pan-レチノイン酸受容体アンタゴニスト（BMS493）を添加したときのカルシウム塩沈着量を測定し、BMS493を添加していないときと比較した結果を示す図である。
【図１３】本発明のワンステップ骨分化誘導方法において、各レチノイン酸受容体のsiRNAを添加したときのカルシウム塩沈着量を測定し、レチノイン酸受容体のsiRNAを添加していないときと比較した結果を示す図である。
【図１４】本発明のワンステップ骨分化誘導方法において、レチノイン酸に代えて、各レチノイン酸受容体アゴニストを添加したときのカルシウム塩沈着量を測定した結果を示す図である。
【図１５】COL1A1遺伝子の異常を有する骨形成不全症患者由来のiPS細胞、該iPS細胞のCOL1A1遺伝子変異をゲノム編集技術を用いて修復したiPS細胞および標準的iPS細胞から本発明のワンステップ骨分化誘導方法を用いて分化誘導した細胞の骨基質形成能を、アリザリンレッド染色で経時的に評価した結果を示す図である。
【図１６】COL1A1遺伝子の異常を有する骨形成不全症患者由来のiPS細胞、該iPS細胞のCOL1A1遺伝子変異をゲノム編集技術を用いて修復したiPS細胞および標準的iPS細胞から本発明のワンステップ骨分化誘導方法を用いて分化誘導した細胞の骨基質形成能を、カルシウム塩沈着量を経時的に測定して評価した結果を示す図である。
【図１７】COL1A1遺伝子の異常を有する骨形成不全症患者由来のiPS細胞、該iPS細胞のCOL1A1遺伝子変異をゲノム編集技術を用いて修復したiPS細胞および標準的iPS細胞から本発明のワンステップ骨分化誘導方法を用いて分化誘導した7日目と10日目の細胞における小胞体ストレス関連遺伝子（BiP遺伝子）の発現を解析した結果を示す図である。
【図１８】COL1A1遺伝子の異常を有する骨形成不全症患者由来のiPS細胞、該iPS細胞のCOL1A1遺伝子変異をゲノム編集技術を用いて修復したiPS細胞および標準的iPS細胞から本発明のワンステップ骨分化誘導方法を用いて分化誘導した細胞のI型コラーゲン分泌能を、抗I型コラーゲン抗体による免疫染色により観察した結果を示す図である。
【図１９】COL1A1遺伝子の異常を有する骨形成不全症患者由来のiPS細胞から本発明のワンステップ骨分化誘導方法を用いて分化誘導する際に、培地にラパマイシンまたはエベロリムスを添加して分化誘導した細胞の骨基質形成能を、アリザリンレッド染色で経時的に評価した結果を示す図である。
【図２０】COL1A1遺伝子の異常を有する骨形成不全症患者由来のiPS細胞から本発明のワンステップ骨分化誘導方法を用いて分化誘導する際に、培地にラパマイシンまたはエベロリムスを添加して分化誘導した細胞の骨基質形成能を、カルシウム塩沈着量を経時的に測定して評価した結果を示す図である。
【図２１】COL1A1遺伝子の異常を有する骨形成不全症患者由来のiPS細胞から本発明のワンステップ骨分化誘導方法を用いて分化誘導する際に、培地にラパマイシンまたはエベロリムスを添加して分化誘導した細胞における小胞体ストレス関連遺伝子（BiP遺伝子）の発現を解析した結果を示す図である。
【図２２】COL1A1遺伝子の異常を有する骨形成不全症患者由来のiPS細胞から本発明のワンステップ骨分化誘導方法を用いて分化誘導する際に、培地にラパマイシンまたはエベロリムスを添加して分化誘導した細胞のI型コラーゲン分泌能を、抗I型コラーゲン抗体による免疫染色により観察した結果を示す図である。
【図２３】COL1A1遺伝子の異常を有する骨形成不全症患者由来のiPS細胞から本発明のワンステップ骨分化誘導方法を用いて分化誘導する際に、培地にラパマイシンを添加して分化誘導した細胞の細胞内I型コラーゲン蓄積量を抗I型コラーゲン抗体による免疫染色により観察し、さらに画像解析ソフトを用いて蓄積量を定量した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
〔骨分化誘導方法〕
本発明は、多能性幹細胞から骨細胞を分化誘導する新規なワンステップ骨分化誘導方法を提供する。本発明の骨分化誘導方法は、以下の各工程を含むものであればよい。
工程（１）：多能性幹細胞をフィーダーフリー条件で培養する工程
工程（２）：ROCK阻害剤およびレチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む、骨分化誘導培地と多能性幹細胞用培地の混合培地を用いて培養する工程
工程（３）：レチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む骨分化誘導培地を用いて培養する工程
【００１０】
本発明の骨分化誘導方法に使用可能な多能性幹細胞としては、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であればよい。例えば、胚性幹細胞（ES細胞）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（ntES細胞）、精子幹細胞（GS細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが挙げられる。好ましくは、ES細胞、ntES細胞およびiPS細胞であり、より好ましくはiPS細胞である。多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞であることが好ましい。哺乳動物は特に限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ等が挙げられる。なかでもヒトが好ましい。ヒト多能性幹細胞を用いることにより、ヒトの再生医療に利用可能な安全な体細胞を取得することができる。なお、本発明の骨分化誘導方法においては、骨疾患に関連する異常を有しない多能性幹細胞が使用され、通常は健常個体由来の多能性幹細胞が使用される。
【００１１】
工程（１）において、多能性幹細胞をフィーダーフリー条件で培養する期間は特に限定されないが、オンフィーダー条件で維持培養されている多能性幹細胞を用いる場合は、３日間程度多能性幹細胞をフィーダーフリー条件で培養した後に工程（２）に移行することが好ましい。より詳細には、少なくとも66時間以上多能性幹細胞をフィーダーフリー条件で培養した後に工程（２）に移行することが好ましい。フィーダーフリー条件で維持培養されている多能性幹細胞を用いる場合は、任意の時点で工程（２）に移行すればよい。フィーダーフリー条件で多能性幹細胞を培養する方法は特に限定されず、公知の方法から選択して用いればよい。例えば、マトリゲル（商品名）、iMatrix-511（商品名）、IV型コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン等の細胞外マトリックスをコーティングした培養プレートを用いて行うことができる。培地、培養条件等は多能性幹細胞のフィーダーフリー培養に適した公知の培地や培養条件から適宜選択することができる。例えば、マトリゲルの場合はmTeSR培地（Ludwig TE, et al Nat Biotech 2006; 24: 185-187）、iMatrix-511の場合はStemFit培地（Nakagawa M, et al. Sci Rep 2014; 4: 3594）の組み合わせで用いることが好ましい。
【００１２】
工程（２）では、ROCK阻害剤およびレチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む、骨分化誘導培地と多能性幹細胞用培地の混合培地を用いて培養する。ROCK阻害剤としてはY-27632を好適に用いることができる。Y-27632の添加量は9μM〜11μMであればよく、好ましくは10μMである。ROCK阻害剤として、Fasudil/HA1077（Watanabe K, et al. Nature Biotech 2007）またはY-30141（Ishizaki T, et al. Mol Pharmacol 2000）を用いることもできる。Fasudil/HA1077の添加量は約10μMが好ましく、Y-30141の添加量は約1μMが好ましい。
【００１３】
レチノイン酸受容体αまたはβアゴニストにはレチノイン酸が含まれる。レチノイン酸受容体αアゴニストとしてはAm580、Am80、BMS753等が挙げられ、レチノイン酸受容体βアゴニストとしてはCD2314、AC55649、AC261066等が挙げられる。レチノイン酸受容体αまたはβアゴニストの添加量は、Am580は100nM〜1μM、Am80は500nM〜5μM、CD2314は1μM〜10μM、AC55649は1μM〜10μMであればよい。レチノイン酸は500nM〜5μMであればよく、好ましくは1μMである。
【００１４】
骨分化誘導培地は骨分化誘導に使用できる培地であればよく、公知の骨分化誘導培地および将来開発される骨分化誘導培地が含まれる。例えば、20%FBS、L-glutamine(2mM)、NEAA(1%)、β-ME (0.1mM)、β-glycerophosphate(10mM)、Dexamethosone(1nM)、Ascorbic acid(50μg/ml)を含有するKnockout DMEM培地を好適に用いることができる。その他に、間葉系幹細胞骨分化用無血清培地 STK3（DSファーマメディカル）、Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium（PromoCell）、Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium BulletKit（LONZA）、StemPro Osteogenesis Differentiation Kit（Thermo）等を使用することができる。多能性幹細胞用培地は多能性幹細胞の培養に使用できる培地であればよく、公知の多能性幹細胞用培地および将来開発される多能性幹細胞用培地が含まれる。例えば、mTeSR（商品名、Stemcell Technology社）、StemFit（商品名、味の素株式会社）等が挙げられる。骨分化誘導培地と多能性幹細胞用培地の混合培地の混合比率は、骨分化誘導培地：多能性幹細胞用培地として3:1〜5:1が好ましく、より好ましくは4:1である。
【００１５】
工程（２）では、ゼラチンコート上またはiMatrix-511（商品名）コート上で培養することが好ましい。工程（２）の培養期間は約2日間である。具体的には22時間〜26時間であってもよい。工程（３）はオンフィーダー条件で培養した多能性幹細胞ではマトリゲルあるいはゼラチンコート上で培養することが好ましい。フィーダーフリー条件で培養した多能性幹細胞はラミニン、IV型コラーゲン、フィブロネクチン、あるいはビトロネクチンコート上で培養することが好ましい。
【００１６】
工程（３）では、レチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む骨分化誘導培地を用いて培養する。レチノイン酸受容体αまたはβアゴニストおよび分化誘導培地は、工程（２）で使用したものと同じものを使用すればよい。
【００１７】
本発明の骨分化誘導方法は、工程（２）および工程（３）の合計培養期間、すなわち分化誘導期間が12日以内と非常に短期間であることを特徴とする。本発明の骨分化誘導方法は、通常10日間の分化誘導により最終分化した骨細胞を取得することができる。したがって、工程（３）の培養期間は少なくとも8日間であればよく、10日間を越えて培養する必要はない。工程（３）の培養期間は、8〜10日間であってもよい。
【００１８】
本発明の骨分化誘導方法により骨細胞が生成していることは、工程（３）の培養期間が終了した細胞の石灰化結節形成、カルシウム塩沈着、Ｉ型コラーゲン産生または分泌、骨細胞特異的遺伝子の発現等により確認することができる。これらの確認には、公知の方法を適宜用いることができる。石灰化結節形成は、例えば細胞をアリザリンレッド染色することにより確認することができる。カルシウム塩沈着は、例えばo-クレゾールフタレインコンプレキソン法（OCPC法）により確認することができる。Ｉ型コラーゲン産生または分泌は、例えば細胞をＩ型コラーゲン特異的抗体を用いて免疫染色することにより確認することができる。骨細胞特異的遺伝子の発現は、例えばPHEX遺伝子やSOST遺伝子の発現をRT-PCR法で確認することができる。
【００１９】
本発明の骨分化誘導方法により得られる骨芽細胞および骨細胞、ならびにこれらの細胞と細胞外基質で構成された骨様結節は、骨再生医療への応用、骨芽細胞あるいは骨細胞の増殖を促進する薬剤のスクリーニング、骨芽細胞あるいは骨細胞の機能に作用する薬剤のスクリーニング、骨芽細胞あるいは骨細胞の機能を改良する培養方法の開発（培地組成、酸素濃度、足場素材、牽引力等の物理作用、三次元培養等）、骨芽細胞から骨細胞への分化機構の解明、骨芽細胞あるいは骨細胞から分泌される細胞外基質、サイトカインおよびエクソソームの解析、骨芽細胞あるいは骨細胞と破骨細胞の相互作用の解析等に用いることができる。
【００２０】
本発明の骨分化誘導方法は、従来法と比較して下記の点が優れている。
（１）従来法では多能性幹細胞の段階から3週間以上必要とした骨分化誘導が、10日間という短期間で可能である点
（２）従来の多段階誘導法における、各段階の効率によって最終的な誘導効率が影響を受けるという欠点がなく、誘導効率が安定している点
（３）複数の高価な増殖因子を使用する従来法に比較して、誘導コストが安価である点
（４）（１）〜（３）の利点から、従来法より薬剤スクリーニングに適した方法である点
（５）従来法では明確に示されていない骨細胞への分化が確認されている点
【００２１】
〔スクリーニング方法〕
本発明は、上記本発明の骨分化誘導方法を利用して骨疾患治療薬をスクリーニングする方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、以下の各工程を含むものであればよい。
（Ｉ）多能性幹細胞をフィーダーフリー条件で培養する工程
（ＩＩ）ROCK阻害剤およびレチノイン酸受容体αまたはβアゴニストを含む、骨分化誘導培地と多能性幹細胞用培地の混合培地を用いて培養する工程
（ＩＩＩ）レチノイン酸受容体αまたはβアゴニストおよび被験物質を含む骨分化誘導培地を用いて培養する工程
（ＩＶ）石灰化結節形成量、カルシウム塩沈着量、Ｉ型コラーゲン産生または分泌量、および骨分化関連遺伝子発現量から選択される少なくとも１つを測定する工程
（Ｖ）被験物質を含まない骨分化誘導培地を用いて培養した細胞の測定値と比較し、骨分化能を亢進させる被験物質を選択する工程
【００２２】
本発明のスクリーニング方法に用いる多能性幹細胞は、上記本発明の骨分化誘導方法に使用可能な多能性幹細胞と同じである。本発明のスクリーニング方法に用いる多能性幹細胞は、骨疾患モデル多能性幹細胞であってもよく、骨疾患に関連する異常を有しない多能性幹細胞であってもよい。
【００２３】
本発明のスクリーニング方法に用いる骨疾患モデル多能性幹細胞として、例えば薬剤処理により骨形成能を亢進あるいは低下させた多能性幹細胞を用いることができる。薬剤としては、例えばステロイド、エストロゲン、それらの類似物、ビタミンD3などが挙げられる。薬剤処理以外では、ゲノム編集技術を用いて特定の関連遺伝子の機能を改変した多能性幹細胞、特定のmiRNAを導入した多能性幹細胞を用いることができる。
【００２４】
また、骨疾患モデル多能性幹細胞として、骨疾患患者の細胞から作製したiPS細胞を用いることができる。骨疾患患者の具体的疾患名としては、骨形成不全症、大理石骨病、濃化異骨症、骨斑紋病、流蝋骨症、骨線条症、異骨性骨硬化症、骨幹異形成症、過形成型骨関節症、Paget病、硬化性骨症、毛髪歯骨異形成症、骨粗鬆症（特発性、ステロイド性、低ビタミンD性）、低フォスファターゼ症、低リン血症性くる病、家族性拡張性骨溶解症、線維性骨異形成症、進行性骨化性線維異形成症、進行性骨性異形成症、鎖骨頭蓋異形成症、強直性脊椎炎、後縦靱帯骨化症、黄色靱帯骨化症、広汎性特発性骨増殖症、変形性関節症、偽関節、異所性骨化症、悪性腫瘍関連骨溶解症などが挙げられる。
【００２５】
本発明のスクリーニング方法に用いる骨疾患に関連する異常を有しない多能性幹細胞として、健常個体由来の多能性幹細胞を用いることができる。好ましくは、健常ヒト由来の多能性幹細胞である。
【００２６】
工程（Ｉ）は、上記本発明の骨分化誘導方法の工程（１）と同じように行うことができる。すなわち、オンフィーダー条件で維持培養されている多能性幹細胞を用いる場合は、３日間程度、少なくとも66時間以上、フィーダーフリー条件で培養した後工程（ＩＩ）に移行し、フィーダーフリー条件で維持培養されている多能性幹細胞を用いる場合は、任意の時点で工程（ＩＩ）に移行する。
【００２７】
工程（ＩＩ）は、上記本発明の骨分化誘導方法の工程（２）と同じように行うことができる。
【００２８】
工程（ＩＩＩ）は、レチノイン酸受容体αまたはβアゴニスト以外に被験物質を含む骨分化誘導培地を使用すること以外は、上記本発明の骨分化誘導方法の工程（３）と同じように行うことができる。工程（ＩＩＩ）では、被験物質を含まない骨分化誘導培地を使用して同じ期間培養する対照群を設けておく。
【００２９】
被験物質は特に限定されず、例えば、核酸、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿等が挙げられる。被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。これら被験物質は塩を形成していてもよく、被験物質の塩としては生理学的に許容される酸や塩基との塩が用いられる。被験物質濃度は、用いる被験物質に応じて適宜選択すればよい。
【００３０】
工程（ＩＶ）では、工程（ＩＩＩ）の培養期間終了後に、石灰化結節形成量、カルシウム塩沈着量、Ｉ型コラーゲン産生または分泌量、および骨分化関連遺伝子発現量から選択される少なくとも１つを測定する。各測定項目は、上記本発明の骨分化誘導方法において例示したような公知の方法を用いて測定することができる。
【００３１】
工程（Ｖ）では、被験物質を含まない骨分化誘導培地を用いて培養した細胞（対照群）の測定値と比較し、骨分化能を亢進させる被験物質を選択する。すなわち、選択した測定項目において、対照群の測定値より高値を示す被験物質を、骨分化能を亢進させる被験物質として選択することができる。骨分化能を亢進させる被験物質は、その測定値が対照群の測定値より10％高いもの、20％高いもの、30％高いもの、40％高いもの、50％高いものであってもよい。
【００３２】
本発明のスクリーニング方法により選択された被験物質は、骨分化能を亢進させることができるので、各種骨疾患の治療用医薬の有効成分として有用である。治療対象疾患は特に限定されないが、例えば、骨形成不全症、大理石骨病、濃化異骨症、骨斑紋病、流蝋骨症、骨線条症、異骨性骨硬化症、骨幹異形成症、過形成型骨関節症、Paget病、硬化性骨症、毛髪歯骨異形成症、骨粗鬆症（特発性、ステロイド性、低ビタミンD性）、低フォスファターゼ症、低リン血症性くる病、家族性拡張性骨溶解症、線維性骨異形成症、進行性骨化性線維異形成症、進行性骨性異形成症、鎖骨頭蓋異形成症、強直性脊椎炎、後縦靱帯骨化症、黄色靱帯骨化症、広汎性特発性骨増殖症、変形性関節症、偽関節、異所性骨化症、悪性腫瘍関連骨溶解症などが挙げられる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３４】
〔実施例１：レチノイン酸を用いたワンステップ骨分化誘導方法の評価〕
（１）レチノイン酸を用いたワンステップ骨分化誘導方法（図１参照）
（1-1）オンフィーダーiPS細胞を用いる場合（図１上段参照）
3日間（D-3〜D0）、マトリゲルコート上でmTeSR（商品名、Stemcell Technology社）によりフィーダーフリー培養した後、ゼラチンコート上に播種し、最初の2日間（D0〜D2）は、ROCK阻害剤（ROCKi）とレチノイン酸（RA）を添加した骨分化誘導培地（OI medium）とmTeSRの混合培地（混合比4対1）で培養した。その後、レチノイン酸（RA）を添加した骨分化誘導培地でD10まで培養した。レチノイン酸を添加しない培地を用いて培養したものを対照とした。【００３５】
（1-2）フィーダーフリーiPS細胞を用いる場合（図１下段参照）
StemFit AK03N（商品名、味の素ヘルシーサプライ社）を用いてラミニンコート上でフィーダーフリー培養したiPS細胞を、最初の2日間（D0〜D2）は、ROCK阻害剤（ROCKi）とレチノイン酸（RA）を添加した骨分化誘導培地（OI medium）とmTeSRの混合培地（混合比4対1）で培養した。その後、レチノイン酸（RA）を添加した骨分化誘導培地でD10まで培養した。レチノイン酸を添加しない培地を用いて培養したものを対照とした。【００３６】
（２）骨分化能の評価：骨基質形成能
石灰化結節形成能は、細胞をエチルアルコールで固定後、アリザリンレッド染色溶液を10分間反応させ、洗浄後、陽性結節を定性的に評価した。カルシウム塩の沈着量はo-クレゾールフタレインコンプレキソン（OCPC）液による発光量により定量的に計測した。アリザリンレッド染色の結果を図２に、カルシウム塩沈着量の結果を図３に示した。オンフィーダー細胞（414C2および409B2）およびフィーダーフリー細胞（1231A3）のいずれにおいても、レチノイン酸の添加により、骨分化能が著しく亢進していることが明らかになった。【００３７】
（３）骨分化能の評価：遺伝子発現
多能性幹細胞から最終分化細胞までの、各分化段階における代表的な遺伝子の発現をmRNAレベルで経時的に評価した。経時的に細胞を回収して、RNAを抽出しcDNAを合成した。各遺伝子に特異的なプライマーを用いて定量的PCRを行い、発現量を評価した。
結果を図４に示した。レチノイン酸を添加しない培養条件（図中「RA(-)」）では、0日目にiPS細胞に特異的な遺伝子が発現し、10日目に骨細胞前駆細胞（osteoprogenitor）に特異的な遺伝子の発現が認められたが、前骨芽細胞（preosteoblast）以降の各分化段階の代表的な遺伝子の発現は認められなかった。一方、レチノイン酸を添加した培養条件（図中「RA(+)」）では、経時的に、iPS細胞、骨細胞前駆細胞（osteoprogenitor）、前骨芽細胞（preosteoblast）、骨芽細胞（osteoblast）に特異的な遺伝子の発現が認められ、さらに、既存の方法では誘導が困難であった骨細胞（osteocyte）に特異的な遺伝子（SOST）の発現が認められた。したがって、レチノイン酸を用いたワンステップ骨分化誘導方法により、10日間でヒト多能性幹細胞から骨細胞（osteocyte）を分化誘導できることが判明した。【００３８】
（４）骨分化能の評価：タンパク質発現
多能性幹細胞から最終分化細胞までの、各分化段階における代表的な遺伝子の発現をタンパク質レベルで評価した。細胞をパラホルムアルデヒドで固定後、各タンパク質に対する抗体を反応させ、洗浄後、蛍光標識された二次抗体を反応させ、蛍光強度により発現を評価した。
結果を図５に示した。mRNAレベルでの発現と一致して、前骨芽細胞（preosteoblast）、骨芽細胞（osteoblast）および骨細胞（osteocyte）に特異的な遺伝子の発現が、タンパク質レベルで確認された。【００３９】
（５）骨分化能の評価：細胞形態
骨分化誘導7日目と10日目に細胞を基質に包まれたまま回収し、走査型電子顕微鏡で観察を行った。結果を図６に示した。(A)は7日目の観察結果であり、(B)は10日目の観察結果である。7日目の組織中には、比較的球形で突起の少ない細胞が観察されたのに対し、10日目では、多数の細胞突起により周囲の細胞とネットワークを形成している細胞が観察された。いずれも既報における骨芽細胞および骨細胞の形態像と一致していた。【００４０】
さらに、回収した細胞をコラゲナーゼ処理により可及的に単一細胞として、再度播種し、数日間培養を行った後に観察した。結果を図７に示した。(A)は7日目の細胞を単一分散して再播種した細胞の観察結果であり、多くの細胞が円形の形態を呈していた。(B)は10日目の細胞を単一分散して再播種した細胞の観察結果であり、図６の(B)と類似した多数の細胞突起を有する星形の細胞が多数観察された。これらの結果は、成体における骨芽細胞および骨細胞と類似した細胞がワンステップ骨分化誘導方法により誘導されていることを示すものである。【００４１】
（６）骨分化能の評価：in vivoでの骨形成能の画像評価
骨芽細胞が主体である7日目の段階で細胞を一塊として回収し、NOD-SCIDマウスの頭蓋骨に作製した径4mmの欠損部に移植した。6週間後に犠死させ、マイクロCTにて骨再生像を観察した。さらに、再生組織の組織標本を作製し、HE染色および抗ヒトオステオポンチン抗体による免疫染色を行った。
マイクロCTでの観察結果を図８に示した。(A)は細胞移植を行わなかった群の結果、(B)はレチノイン酸を添加した骨分化誘導培地を用いて培養した細胞を移植した結果、(C)はレチノイン酸を添加しない骨分化誘導培地を用いて培養した細胞を移植した結果である。 (A)の細胞移植を行わなかった群では、欠損は自然修復されなかった。(C)の群では、6匹中4匹で、未分化iPS細胞の残存を示唆する腫瘍の形成を認めた。一方(B)の群では、腫瘍の形成はなく、骨再生像が観察された。なお、(A)および(B)の画像は、頭蓋骨を取り出してCT画像を撮影し、その三次元画像を、欠損部を上から観る方向で再構築したものであり、(C)の画像は、欠損部に形成された腫瘍を周囲の頭蓋骨を含めて取り出してCT画像を撮像し、その三次元画像を横から立体的に観察したものである。【００４２】
再生組織の観察結果を図９に示した。(A)はレチノイン酸を添加した骨分化誘導培地を用いて培養した細胞を移植したマウスの再生組織のHE染色像、(B)は、未処置NOD-SCIDマウスの頭蓋骨のHE染色像、(C)はレチノイン酸を添加した骨分化誘導培地を用いて培養した細胞を移植したマウスの再生組織の抗ヒトオステオポンチン抗体による免疫染色像、(D)は未処置NOD-SCIDマウスの頭蓋骨の抗ヒトオステオポンチン抗体による免疫染色像である。(A)では(B)と類似した膜性骨化像が観察された。再生組織の起源を確認するために、抗ヒトオステオポンチン抗体を用いた免疫染色を行ったところ、(C)では新生骨に沿ってヒトオステオポンチン陽性であり、対照の(D)では陰性であったことから、新生骨がヒト由来であることが明らかになった。【００４３】
〔実施例２：レチノイン酸によるBMPおよびWNTシグナル誘導の検討〕
レチノイン酸による骨分化誘導におけるBMPおよびWNTシグナルの意義について検討した。
（１）レチノイン酸によるBMPおよびWNTシグナル分子の発現誘導
誘導開始前（D0）および2日目（D2）の遺伝子発現をマイクロアレイにて網羅的に解析した。結果を図１０に示す。それぞれの遺伝子についての経過中の比較で、発現が高いものを赤で、低いものを青で示す。レチノイン酸によってレチノイン酸の下流の分子に加えて、BMPリガンドおよびその下流遺伝子、そしてWNTリガンドとその下流遺伝子の発現が亢進していることが判明した。【００４４】
（２）BMPおよびWNTの骨分化誘導への関与
次にBMPおよびWNTの骨分化誘導に関して、それぞれの阻害剤を用いて検討した。結果を図１１に示す。BMP阻害剤（LDN）およびWNT阻害剤（IWR1）を添加した培地を用いて10日間培養した後のカルシウム塩沈着量を測定したところ、レチノイン酸による増加は阻害された。これらの結果より、レチノイン酸による骨分化誘導においてBMPおよびWNTの両者のシグナルが関与していることが判明した。【００４５】
〔実施例３：受容体特異的アゴニストを用いたワンステップ骨分化誘導方法の検討〕
レチノイン酸（RA）は核内受容体であるレチノイン酸受容体（RAR）α、RARβまたはRARγと複合体を形成して標的配列に結合することで、その作用を発揮する。そこでワンステップ骨分化誘導方法におけるレチノイン酸の作用を受容体アゴニストにより代替する方法を検討した。【００４６】
（１）アンタゴニストまたはsiRNAによる受容体特異的阻害
まず全ての受容体に対するアンタゴニスト（pan-RARアンタゴニスト）であるBM493を添加した培地を用いて10日間培養した後のカルシウム塩沈着量を評価するとRAの効果は完全に消去され、RAの効果がRARを介したものであることが確認された（図１２）。
次に各RARに対するsiRNAの効果を解析した。その結果、RARγに対するsiRNA（γ#１およびγ#２）の添加は無効であったが、RARαに対するsiRNA（α#１およびα#２）およびRARβに対するsiRNA（β#１およびβ#２）を添加することで骨形性能が低下し、RARαに対するsiRNAとRARβに対するsiRNAを併用（α#１β#１およびα#２β#２）することで更に阻害されることが判明した（図１３）。図中、CTLはコントロールsiRNAを添加したもの、(-)はsiRNAを添加していないものを示す。【００４７】
（２）各受容体特異的アゴニストを用いた分化誘導
レチノイン酸（RA）に代えて、レチノイン酸受容体（RAR）に対するアゴニストを添加した骨分化誘導培地を用いてワンステップ骨分化誘導を行い、10日目にカルシウム塩沈着量を評価した。結果を図１４に示した。RARαに対するアゴニストであるAm580（200nM）およびAm80(1μM)またはRARβに対するアゴニストであるCD2314（3μM）およびAC55649（3μM）を添加することにより、レチノイン酸添加と同様にカルシウム塩沈着量が亢進したが、RARγに対するアゴニストであるR667（100nM）およびCD437（1μM）にはそのような作用は認められなかった。これらの結果から、レチノイン酸による骨分化誘導能はRARαまたはRARβに対するアゴニストにより代替されることが判明した。【００４８】
〔実施例４：骨疾患の病態再現の検討〕
樹立したワンステップ骨分化誘導方法が骨疾患の病態再現に有用であるか否かを、代表的な骨系統疾患である骨形成不全症（以下OI）をモデルとして検討した。
OIはI型コラーゲンの異常により、骨組織が脆弱となり、骨折を繰り返す疾患である。分子病態としては、コラーゲン遺伝子の異常により正常なコラーゲン三重鎖が形成されないことによるコラーゲン分泌の低下、それによる石灰化の低下等の骨形性能の異常と、異常コラーゲンが小胞体（ER）内に蓄積することによるERストレスによる細胞死が主たる病態である。【００４９】
（１）OI患者由来iPS細胞を用いた病態再現
COL1A1遺伝子の異常を有するOI患者2名（OI#1およびOI#2）よりiPS細胞を樹立した（OI#1-1およびOI#2-1）。更にそれぞれよりゲノム編集技術を用いて変異を修復したiPS細胞（resOI#1-1およびresOI#2-1）を作製した。それぞれと標準的iPS細胞（WT1,414C2;WT2,409B2）をワンステップ骨分化誘導方法に供して骨分化を誘導し、誘導後10日目での石灰化結節形成能、カルシウム塩沈着量、ERストレス関連遺伝子発現量およびI型コラーゲン分泌能について比較した。
アリザリンレッド染色の結果を図１５に、カルシウム塩沈着量の結果を図１６に、ERストレス関連遺伝子発現量の結果を図１７に、I型コラーゲン分泌能の結果を図１８にそれぞれ示した。OI#1-1およびOI#2-1をワンステップ骨分化誘導方法に供した場合、アリザリンレッド陽性石灰化結節数はWT1およびWT2と比較して低下し、変異修復細胞（resOI#1-1およびresOI#2-1）で改善した（図１５）。この傾向は、カルシウム塩沈着量の定量でより顕著であった（図１６）。ERストレス関連遺伝子であるBiP遺伝子の発現に関しても、OI#1-1およびOI#2-1で亢進したものが、resOI#1-1およびresOI#2-1ではWT1およびWT2のレベルまで低下した（図１７）。I型コラーゲンの分泌状況を抗I型コラーゲン抗体による免疫染色で検討した結果においても、OI#1-1およびOI#2-1では分泌量が低下し、かつその分布が極めて不規則であったものが、resOI#1-1およびresOI#2-1ではWT1およびWT2と同等の結果が認められた（図１８）。これらの結果は、OI#1-1およびOI#2-1で認められた表現型の変化がそれぞれのCOL1A1遺伝子の変異に起因するものであることを示すものであり、ワンステップ骨分化誘導方法と疾患由来iPS細胞を用いて、OIという遺伝性疾患の病態をin vitroで再現できることを実証するものである。【００５０】
〔実施例５：創薬スクリーニングツールとしての応用〕
これまでOIに対する治療戦略の1つとして、ラパマイシンによりmTOR蛋白複合体の機能を阻害し、オートファジーを亢進させることで、不良タンパク質の細胞内蓄積を軽減する方法が患者由来初代培養細胞を用いて報告されている。そこでワンステップ骨分化誘導方法で、mTOR阻害剤の効果が再現できるかを検討した。誘導2日目から培地にラパマイシン（10nM）またはエベロリムス（100nM）を添加して、10日目に分化能を評価した。【００５１】
アリザリンレッド染色の結果を図１９に、カルシウム塩沈着量の結果を図２０に、ERストレス関連遺伝子であるBiP遺伝子の発現量の結果を図２１に、I型コラーゲン分泌能の結果を図２２にそれぞれ示した。ラパマイシンまたはエベロリムスを培地に添加することにより、アリザリンレッド陽性石灰化結節の形性能とカルシウム塩沈着量が改善することが判明した。また、ERストレスも軽減していることが示唆された。I型コラーゲンの分泌および分布に関しても、ラパマイシンまたはエベロリムス添加により著しく改善することが判明した。【００５２】
細胞内のI型コラーゲンの蓄積を定量的に測定した結果を図２３に示した。(A)は細胞内のI型コラーゲンを、抗I型コラーゲン抗体を用いて免疫染色した結果であり、(B)は(A)の画像から画像解析ソフトを用いて細胞内I型コラーゲン蓄積量を定量した結果を示す図である。(A)に示したように、ラパマイシンを添加していない細胞（Vehicle）では、I型コラーゲンは主として細胞内に局在して細胞外の染色が乏しいのに対し、ラパマイシンを培地に添加した細胞では、細胞内の染色性は低下した。(B)に示したように、ラパマイシン添加による細胞内I型コラーゲン蓄積量の低下は、統計的に有意な低下であることが明らかになった。
以上の結果より、ワンステップ骨分化誘導方法は、候補治療薬の有効性を示すことできる方法であると考えられる。【００５３】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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