(57)【要約】  本願は、被験者における大腸癌を検出する方法であって、該被験者由来の試料における赤血球に結合した免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の量を測定することを含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における大腸癌を検出する方法であって、該被験者由来の試料における赤血球に結合した免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の量を測定することを含む方法。
【請求項２】
赤血球に結合したＩｇＧの量を被験者における大腸癌の可能性と関連づけることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該赤血球に結合した免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の量が免疫学的方法により測定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該赤血球に結合した免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の量が、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫蛍光測定法（ＦＩＡ）、免疫発光測定法、酵素免疫測定法、フローサイトメトリー法、およびウエスタンブロッティング法から選択される方法により測定される、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
標識された抗ＩｇＧ抗体を用いることを含む、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
該赤血球に結合した免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の量がフローサイトメトリー法により測定される、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
赤血球に結合したＩｇＧの量が平均蛍光強度として得られ、得られた平均蛍光強度がカットオフ値よりも高い場合に大腸癌を有している可能性が高い、または大腸に癌が転移している可能性が高いことを示す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該カットオフ値が平均蛍光強度２０〜６５である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法に使用するための、標識された抗ＩｇＧ抗体を含む剤。
【請求項１０】
赤血球に結合したＩｇＧの量を測定するための標識された抗ＩｇＧ抗体を含む大腸癌の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は大腸癌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌は、大腸（結腸、直腸、肛門）に発生する癌腫の総称である。大腸癌の検出方法には便潜血検査と内視鏡検査があり、これらはランダム化比較試験でその有用性が示されている。しかしながら便潜血検査は出血に基づいて癌を検出するので、出血を伴わない大腸癌を見逃す可能性があり、また被験者にとっては検査に先立って便を採取する煩雑さがある。内視鏡検査は一般に大腸癌の精密検査として行われるが、検査前には食事制限と下剤による前処理を必要とし、内視鏡を腸内に挿入することや侵襲を伴う生検など、被験者への負担が大きい。
大腸癌の検出方法として、血液や便からＤＮＡを検出する方法（非特許文献１）が開発されているものの、この方法は経済的コストがかかり、加えて、その有用性は確認には至っていない。また、大腸癌細胞が発現している異常な蛋白に対する自己抗体が産生されることを利用して、その自己抗体量をEnzyme-linked Immunosorbent assay （ELISA）法により測定する方法（非特許文献２）があるが、単一の異常蛋白に対する抗体の測定では不十分であると同時にどの異常蛋白が検出されているかを同定する必要があり操作は非常に煩雑である。【０００３】
上記の方法を代替または補完する簡便で低コストに実施可能な大腸癌の検出方法が望まれる。特に内視鏡検査は被験者への負担が大きいため、内視鏡検査を受けるべき被験者を適切にスクリーニングするために用い得る簡便な大腸癌の検出方法が望まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Inadomi JM.,Screening of Colorectal Noplasm. NEJM. 2017; 376; 149-156
【非特許文献２】Babel I. et al. Identification of Tumor-associated Autoantigens for the Diagnosis of Colorectal Cancer in Serum Using High Density Protein Microarrays. Mol. Cell. Proteomics. 2009; 8; 2382-2395.
【非特許文献３】Shen WW, Wu J, Cai L, Liu BY, Gao Y, Chen GQ et al.Expression of anion exchanger 1 sequestrates p16 in the cytoplasm in gastric and colonic adenocarcinoma. Neoplasia 2007；9:812-819.
【非特許文献４】Kay et al. Senescent cell antigen is immunologically related to band 3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983;80;1631-1635.
【非特許文献５】Lutz HU. Naturally Occurring Anti-Band 3 Antibodies in Clearance of Senescent and Oxidatively Stressed Human Red Blood Cells. Transfus Med Hemother. 2012 Oct; 39(5): 321-327.
【０００５】
本明細書において引用する先行技術文献の開示は全て参照することにより、本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、従来の検出方法を代替または補完できうる簡便な大腸癌の検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、大腸癌患者では赤血球膜上に結合した免疫グロブリンＩｇＧの量が他の癌患者および健常者に比べて有意に高いことを見出し、本願発明に至った。【０００８】
一つの態様において本願は、被験者における大腸癌を検出する方法であって、該被験者由来の試料における赤血球に結合した免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の量を測定することを含む方法を提供する。【０００９】
さらに一つの態様において本願は、赤血球に結合したＩｇＧの量を測定するための標識された抗ＩｇＧ抗体を含む大腸癌の検出キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】大腸癌患者群、胃癌患者群、および健常者群における赤血球に結合したＩｇＧの量をフローサイトメトリー法により測定した結果を示す。
【図２】大腸癌患者群および健常者群における赤血球に結合したＩｇＧの量をフローサイトメトリー法により測定した結果を用いたロジスティック回帰などにより得られたＲＯＣ曲線である。
【図３−１】健常者群に対するクームス試験の結果を示す。
【図３−２】胃癌患者群に対するクームス試験の結果を示す。
【図３−３】大腸癌患者群に対するクームス試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
下記の実施例に記載するとおり発明者は、大腸癌患者、胃癌患者、および健常者の血液サンプル中における赤血球に結合したＩｇＧ量をフローサイトメトリー法を用いて測定した結果、以下の事項を明かにした。
（１）大腸癌患者の赤血球に結合したＩｇＧの量は健常者の当該ＩｇＧの量に比べて有意に高い。
（２）大腸癌患者の赤血球に結合したＩｇＧの量は胃癌患者の当該ＩｇＧの量に比べて有意に高い。
（３）胃癌患者の当該ＩｇＧの量と健常者の当該ＩｇＧの量と間に有意な差はない。
【００１２】
加えて、下記の実施例に記載するとおり、赤血球に結合したＩｇＧの検出のための試験であるクームス試験においても、健常者および胃癌患者と比較して、大腸癌患者では赤血球に結合したＩｇＧの量が多い傾向が支持された。
これらの知見から、赤血球に結合したＩｇＧが大腸癌の検出に有用であることが明かとなった。
【００１３】
Anion exchanger 1（ＡＥ１、バンド３とも呼ばれる）は赤血球膜に多く存在する膜輸送タンパク質である。通常、ＡＥ１は赤血球膜上で血液に溶け込んだ二酸化炭素を検知して、赤血球内にあるヘモグロビンからの酸素放出を促す機能を果たす。大腸癌細胞中ではこのＡＥ１が異所性発現していることが知られている（非特許文献３）。
【００１４】
自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）は赤血球膜の抗原と反応する自己抗体が産生され、抗原抗体反応の結果赤血球が傷害を受け、赤血球寿命が著しく短縮（溶血）し、貧血をきたす病態である。
【００１５】
本願発明者らは、ＡＩＨＡを有する大腸癌患者における研究の結果、当該大腸癌患者におけるＡＩＨＡはＡＥ１に対する自己抗体が産生されたことに起因することを解明した。すなわち、大腸癌患者において、ＡＥ１に対する自己抗体（ＩｇＧ）が産生されていることが初めて明らかになった。この研究結果は本願出願時において未発表である。
【００１６】
通常、赤血球は酸化ストレスに曝されながら体内を循環し、老化して最終的にマクロファージに捕らえられる。この赤血球の寿命を規定する機構の１つとして、ＡＥ１とそれを認識する血清中の自然抗体との反応によるオプソニン化がある。老化した赤血球の細胞膜上のＡＥ１に血清中の自然抗体（抗ＡＥ１ ＩｇＧ）が結合し、当該抗体に対するレセプターを持つマクロファージによって老化赤血球は捕食される（非特許文献４および５）。
【００１７】
大腸癌患者においてはＡＥ１に対する自己抗体（ＩｇＧ）が産生されているとの知見から、大腸癌患者の赤血球膜に存在するＡＥ１には自然抗体に加えて自己抗体も結合し、結果として大腸癌患者においては赤血球膜に結合したＩｇＧが増えていることが推測される。なお、当該メカニズムの推測は本願発明を何ら制限するものではない。
【００１８】
一つの態様において本発明は、被験者における大腸癌を検出する方法であって、該被験者由来の試料における赤血球に結合したＩｇＧの量を測定することを含む方法を提供する。
【００１９】
本発明の方法において被験者は特に限定されず、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを対象とする。該被験者には例えば、癌と診断されたことがない者（例えば治療中の疾患がない者、または癌以外の疾患患者）および大腸癌以外の癌を有する者が含まれ得る。
【００２０】
本発明の方法において「検出」とは、赤血球に結合したＩｇＧの量を被験者における大腸癌の有無の可能性と関連づけることを意味する。例えば、赤血球に結合したＩｇＧの量を指標として、被験者が大腸癌を有するもしくはその可能性が高い、または大腸癌以外の癌が大腸に転移しているもしくはその可能性が高いと判定されることを意味する。
【００２１】
すなわち、本発明の方法は、癌と診断されたことがない者においては、例えば健康診断の際に、大腸癌を有している可能性を調べるために使用されうる。大腸癌以外の癌を有する者においては、本発明の方法は、該癌が大腸に転移している可能性を調べるために使用されうる。
【００２２】
本発明の方法に用いられる被験者由来の試料は、被験者から採取されたものであってかつ赤血球を含むものである限り特に限定されない。好ましい例として血液およびリンパ液が挙げられ、より好ましくは血液が挙げられる。
【００２３】
本発明の方法において、「赤血球」はＩｇＧの結合箇所を有しているものであれば、その状態は特に限定されず、その例としては、例えば、赤血球細胞に加え、赤血球細胞が溶血した赤血球ゴーストであってもよい。赤血球細胞または赤血球ゴーストを破砕して得られた赤血球膜の状態でＩｇＧの量の測定に供されても良い。
【００２４】
本発明の方法において、赤血球に結合したＩｇＧの量を測定する方法は、特に限定されず、当業者に知られる方法により行うことができる。大腸癌を検出するという本方法の目的を達成できる限り、該赤血球に結合したＩｇＧの量を測定する方法は、定量的方法であっても定性的方法であっても良いが、定量的方法であることが望ましい。該ＩｇＧの量を測定する方法の例として、免疫学的方法が挙げられ、例えば放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫蛍光測定法（ＦＩＡ）、免疫発光測定法、酵素免疫測定法（例えば、Enzyme Immunoassay（ＥＩＡ）、Enzyme-linked Immunosorbent assay（ＥＬＩＳＡ）、イムノクロマト法、ラッテクス粒子凝集法）、フローサイトメトリー法（免疫学的手法を伴う）、ウエスタンブロッティング法などが挙げられる。好ましい方法の例としてＥＬＩＳＡ法およびフローサイトメトリー法が挙げられる。各測定方法の具体的な操作条件は当該技術分野の当業者の知識に基づいて適宜設定されうる。
【００２５】
放射免疫測定法（ＲＩＡ）で標識に用いうる放射性物質としては、例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ、３５Ｓ、および３２Ｐが挙げられる。
免疫蛍光測定法（ＦＩＡ）で標識に用いうる蛍光物質としては、例えば、Ｅｕ（ユーロピウム）、ＦＩＴＣ、ＴＭＲＩＴＣ、Ｃｙ３、ＰＥ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ等が挙げられる。
免疫発光測定法で標識に用いうる発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン等が挙げられる。
酵素免疫測定法またはウエスタンブロッティング法で標識に用いうる酵素としては、例えば西洋わさびペルオキシターゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコースオキシターゼ（ＧＯ）等が挙げられる。
フローサイトメトリー法で標識に用いうる蛍光色素または蛍光物質として、ＦＩＴＣ（fluorescein  isothiocyanate）、ＰＥ（phycoerythrin）、ＡＰＣ（Allophycocyanin）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＡＰＣ−Ｈ７等が挙げられる。
さらに、抗体または抗原とこれらの標識物質との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【００２６】
本発明の方法の実施形態の一つにおいて、免疫学的方法が用いられる場合に、抗ＩｇＧ抗体が使用されうる。抗ＩｇＧ抗体は当業者に周知の方法により作成されることができ、市販のものであってもよい。上記の標識物質で標識された抗ＩｇＧ抗体が使用され得、そのような抗ＩｇＧ抗体は当業者に周知の方法により作成されることができ、市販のものであってもよい。
抗ＩｇＧ抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、感度の高さを考慮してポリクローナル抗体であることが望ましい。好ましい抗ＩｇＧ抗体の例としてポリクローナル抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（DAKO製、code-Nr.F0202）が挙げられる。
【００２７】
（フローサイトメトリー法）
本発明の方法の実施形態の一つにおいて、被験者由来の試料が血液であって、かつ、フローサイトメトリー法が採用される場合、フローサイトメトリーを行う前に、例えば、血液から血漿成分層、白血球層、および血小板層を除き、赤血球層にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えて赤血球浮遊液を得、これに例えばＦＩＴＣで標識された抗ＩｇＧ抗体が処理されうる。赤血球を抗ＩｇＧ抗体で処理する方法は特に限定されず、赤血球の量、抗ＩｇＧ抗体の処理時間、処理温度などの種々の処理条件は、フローサイトメトリーの条件などに合わせて適宜決定することができる。蛍光色素や蛍光物質は、検出する赤血球数、フローサイトメトリーの条件設定等によって、例えば上記の例から適宜選択されうる。これらの操作により、抗ＩｇＧ抗体で処理された赤血球の懸濁液が得られる。
【００２８】
次いで、抗ＩｇＧ抗体で処理された赤血球の懸濁液を検体として、フローサイトメトリーを行う。フローサイトメーターの操作方法、操作条件、および解析条件は使用するフローサイトメーターや検体に応じて適宜調整されうる。
【００２９】
例えば、
（１）前方散乱光パルス面積（ＦＳＣ−Ａ）と側方散乱光パルス面積（ＳＳＣ−Ａ）で展開し、赤血球領域にゲーティングする。
（２）ゲーティングした領域の細胞をヒストグラムで展開し、抗体に付加された蛍光色素の平均蛍光強度（mean fluorescence intensity：MFI）を測定する
ことにより、測定されうる。
アイソタイプコントロール抗体（測定条件等により適宜選択されうる）で同様に処理された赤血球の懸濁液についてもＭＦＩを測定し、（抗ＩｇＧ抗体でのＭＦＩ）−（アイソタイプコントロール抗体でのＭＦＩ）＝測定値（ＭＦＩ）としてもよい。
【００３０】
なお、「ゲーティング」とは、サンプルの中の関心のある細胞集団だけを選び出し、その細胞のみのヒストグラムを作ることをいう（「ゲートを設定する」ともいう）。
【００３１】
本発明の方法の実施形態の一つにおいて、本方法はさらに赤血球に結合したＩｇＧの量を被験者における大腸癌の可能性と関連づける工程をさらに含み得る。
【００３２】
赤血球に結合したＩｇＧの量が定量的に測定される場合、被験者の大腸癌の可能性の判定は、例えば、当該ＩｇＧの測定値を、参照値または予め設定されたカットオフ値と比較することにより行われ得る。
【００３３】
本発明の方法において参照値とは、比較対象とする非大腸癌者由来試料（正常試料）における、赤血球に結合したＩｇＧの測定値である。非大腸癌者の例には、健常者（治療中の疾患がない人）、癌以外の疾患を有する者、および大腸癌以外の癌を有する者が挙げられ、貧血を指摘されたことがない者が好ましい。参照値の算出には複数の者のサンプル（多い方が好ましい）の平均値を用いることが好ましく、例えば２人以上であり、好ましくは５人以上である。被験者の赤血球に結合したＩｇＧの測定値が参照値よりも高いとき、例えば参照値の１０２％以上、１０５％以上、１１０％以上、１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、または２００％以上である場合に、該被験者は例えば大腸癌を有している、または大腸に癌が転移していると判定されうる。あるいは、参照値に対して、被験者の赤血球に結合したＩｇＧの測定値が以下の上限値および下限値を適宜選択する組合せからなる範囲内にある場合に、該被験者は例えば大腸癌を有している、または大腸に癌が転移していると判定されうる。
上限値：１０２％、１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％；
下限値：１０１％、１０２％、１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％。
【００３４】
カットオフ値は、例えば、次のように求めることができる。先ず、大腸癌患者由来の試料における赤血球に結合したＩｇＧの量を測定する。このとき、対象となる大腸癌患者の数は多い方が好ましく、例えば２例以上、５例以上、１０例以上、２０例以上、または１００例以上である。また、２例以上の非大腸癌者由来試料（正常試料）における赤血球に結合したＩｇＧの量も測定しておくことが好ましく、対象となる非大腸癌者の例数は、例えば２例以上、５例以上、１０例以上、２０例以上、または１００例以上である。そして、大腸癌患者由来の試料群と正常試料群の両方を含む全体から、赤血球に結合したＩｇＧの量のカットオフ値を、統計処理により求める。統計処理としては、例えば、Ｙｏｕｄｅｎ  Ｉｎｄｅｘ等が挙げられる。
被験者の赤血球に結合したＩｇＧの測定値がカットオフ値よりも高いとき、該被験者は例えば大腸癌を有している、または大腸に癌が転移していると判定されうる。
【００３５】
本発明の方法の実施形態の一つにおいて、血液試料における赤血球に結合したＩｇＧの量がフローサイトメトリー法により測定される場合、該ＩｇＧの量は平均蛍光強度として算出され得、大腸癌を有する（または有する可能性が高い）者と大腸癌を有さない（または有さない可能性が高い）者とを区別するカットオフ値は例えば、平均蛍光強度２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、６０以上、または６５以上であり得る。あるいは、カットオフ値は以下の範囲内に含まれうる：平均蛍光強度２０〜６５、２５〜６０、または３０〜５５、３２〜４０。また、カットオフ値は以下の上限値および下限値を適宜選択する組合せからなる範囲内に含まれてもよい。
上限値：平均蛍光強度６５、６０、５５、４５、４０、３５、３２．３、３２；
下限値：平均蛍光強度４０、３２．３、３２、３０、２５、２０。
好ましいカットオフ値の例は平均蛍光強度３２．３である。
【００３６】
本発明の方法の実施形態の一つにおいて、赤血球に結合したＩｇＧの量を被験者における大腸癌の可能性と関連づける工程は、期間をおいて測定した同一被験者由来の赤血球に結合したＩｇＧの量を比較することによって行ってもよい。例えば予め測定した該ＩｇＧの量に対し、期間をおいて（例えば１、２、３、６、１２、１８箇月後、２年後、３年後）の測定した該ＩｇＧの量と比較して有意に増加している場合、該被験者は例えば大腸癌を有している、または大腸に癌が転移していると判定されうる。
【００３７】
一つの態様において本願は、赤血球に結合したＩｇＧの量を測定するための標識された抗ＩｇＧ抗体を含む大腸癌の検出キットを提供する。本検出キットに含まれる標識された抗ＩｇＧ抗体は測定方法に応じ、例えば上記に例示する標識物質で標識されていている。
【００３８】
本発明のキットは、標識された抗ＩｇＧ抗体の他に、試薬又は被験試料の収容容器、および当該キットが大腸癌の検出に使用されることが示されたラベルを含んでいてもよい。また、該標識された抗ＩｇＧ抗体を使用して大腸癌を検出する方法を記載した使用説明書等をさらに含めることもできる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４０】
＜実施例１＞フローサイトメトリー法による赤血球に結合したＩｇＧの量の測定
大腸癌患者（２３名）、胃癌患者（１１名）、および健常者（２0歳以上の現在治療中の疾患がなく、貧血を指摘されたことがない者）（５名）より血液を採取し、赤血球に結合したＩｇＧの量を以下の方法により測定した。【００４１】
（試験方法）
１．赤血球浮遊液の作成
（１）採取した血液（２ｍＬ）をＥＤＴＡ採血管に入れて静置し、血漿、白血球、および血小板部分を除去した。
（２）得られた赤血球を１５ｍＬ用のファルコンチューブに移した。
（３）リン酸緩衝生理食塩水を加えて合計１４ｍＬにし、ペレットができないように適宜転倒混和して攪拌した。
（４）３０００ｒｐｍで５分間、４℃にて遠心分離し、上清をアスピレーターで除去した。
（５）上記（３）および（４）を更に２回繰り返して赤血球を洗浄した。
（６）リン酸緩衝生理食塩水１０ｍＬを入れた１５ｍＬ容ファルコンチューブに洗浄後の赤血球ペレット１００μＬを加え、軽くピペッティングで混ぜて、１％赤血球浮遊液とした。【００４２】
２．抗体とのインキュベーション
（１）ＦＡＣＳチューブ２本に上記で得られた１％赤血球浮遊液を１００μＬ分注した。
（２）一方にＤＡＫＯの抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（DAKO ポリクローナル抗ヒトIgG-FITC code-Nr.F0202）、他方にアイソタイプコントロール抗体（abcam Rabbit IgG (FITC) ab37406）を各１０μＬ添加した。
（３）得られた混合液を軽くｖｏｒｔｅｘした後、各チューブを遮光して、室温で３０分間インキュベートした。
（４）次いで、３７℃に加温したリン酸緩衝生理食塩水を各チューブに３〜４ｍＬ加えて洗浄し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し上清を除去した。得られたペレットをほぐし、洗浄および遠心分離をさらに１回繰り返した。
（５）得られたペレットをほぐしてリン酸緩衝生理食塩水を加えて、合計約５００μＬ程度にした。
（６）これをフローサイトメトリー解析に付した。【００４３】
３．フローサイトメトリー
（１）ベクトンディッキンソン社製ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴ（商標）ＩＩを使用して、前方散乱光パルス面積（ＦＳＣ−Ａ）と側方散乱光パルス面積（ＳＳＣ−Ａ）で展開し、赤血球領域にゲーティングした。
（２）ゲーティングした領域の細胞をヒストグラムで展開し、抗体に付加された蛍光色素の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。
（３）（抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体でのＭＦＩ）−（アイソタイプコントロール抗体でのＭＦＩ）を計算し、測定値（ＭＦＩ）とした。【００４４】
（試験方法）
測定結果を図１に示す。
大腸癌患者群および健常者群の測定結果を用いて、ロジスティック回帰をプラットフォームとして描いたＲＯＣ曲線を図２に示す。「感度−（１−特異度）」を計算し、この値が最も大きくなる値（カットオフ値）は、３２．３であった。【００４５】
＜実施例２＞クームス試験
大腸癌患者（２３名）、胃癌患者（１１名）、および健常者（２0歳以上の現在治療中の疾患がなく、貧血を指摘されたことがない者）（５名）より血液を採取し、凝集反応により赤血球に結合したＩｇＧを検出した。【００４６】
凝集反応の分類は表１のとおりである。
結果を図３に示す。
【表１】
2019069980.tif 000002
【００４７】
（試験方法）
１．試験管法
（１）リン酸緩衝生理食塩水１０ｍＬに被験者赤血球を１滴入れる。
（２）混和後、３，０００ｒｐｍで２〜５分遠心する。
（３）上清を除去し、リン酸緩衝生理食塩水１０ｍＬでペレットを再浮遊させる。
（４）混和後、３，０００ｒｐｍで２〜５分遠心分離する。
（５）（３）、（４）を３回繰り返す。
（６）できる限り上清を取り除いた後、リン酸緩衝生理食塩水で３〜５％赤血球浮遊液をつくる。
（７）抗ＩｇＧ抗体用、抗Ｃ３ｄ抗体用、陰性対照用に各１本ずつ試験管を用意する。
（８）各試験管に上記の３〜５％赤血球浮遊液を１滴ずつ滴下し、自動血球洗浄装置（HITACHI himac MC450製）で１回洗浄する。
それぞれの試験管にガンマ  クローン抗ＩｇＧ（IMMUCOR製）、オーソ  バイオクローン  抗Ｃ３ｄ（オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス（株）製）、またはリン酸緩衝生理食塩水（陰性コントロール）２滴を滴下する。
（９）混和後、３，０００〜３，５００ｒｐｍで１５〜３０秒間遠心分離する。
（１０）静かに試験管を振りながら凝集の有無を判定する。
（１１）抗ＩｇＧ陰性の場合、Ｃｈｅｃｃｅｌｌ（登録商標）（Ｗｅａｋ）（IMMUCOR製）を１滴加えて遠心して判定を行う。【００４８】
２．カラム法
（１）被験者血球調整用試験管を２本用意し、リン酸緩衝生理食塩水を５００μＬずつ分注する。
（２）一方に試験管法と同様の方法で４回洗浄した被験者赤血球を２０μＬ、もう一方に未洗浄の被験者赤血球を２０μＬ加えて、洗浄・未洗浄の３〜５％赤血球浮遊液を調製する。
（３）オーソ  バイオビュー抗ＩｇＧカセット（オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス（株））を用意し、カセットに洗浄・未洗浄を記入する。
（４）使用するカセットチューブの上部のホイルをはがす。
（５）洗浄・未洗浄の３〜５％血球浮遊液を各カセットチューブの反応槽に１０μＬ加える。
（６）専用遠心機でカセットを遠心分離（７９５ｒｐｍで２分後、１，５１０ｒｐｍで３分）する。
（７）各カセットチューブのカラムを前方および後方より観察して、凝集もしくは溶血の有無を観察し、判定する。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【国際調査報告】
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