(57)【要約】  病状が徐々に進行するアルツハイマー病（ＡＤ）の特徴に応じた慢性進行型のＡＤモデル動物、即ち、アルツハイマー病の原因物質の一種であるアミロイドベータ蛋白（Ａβ）の脳内濃度が継続して増加するＡＤモデル動物を提供する。  キノリン酸、グルタミン酸若しくはこれらの塩若しくはこれらの誘導体又はこれらの混合物を、ネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳類の脳内に投与することにより得られる、脳内のＡβの濃度が継続して増加することを特徴とする、ＡＤモデル動物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳内のアミロイドベータ蛋白の濃度が継続して増加することを特徴とする、アルツハイマー病モデル動物。
【請求項２】
キノリン酸、グルタミン酸若しくはこれらの塩若しくはこれらの誘導体又はこれらの混合物を動物に投与して得られることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載のアルツハイマー病モデル動物。
【請求項３】
前記キノリン酸、グルタミン酸若しくはこれらの塩若しくはこれらの誘導体又はこれらの混合物を前記動物の脳内に投与して得られることを特徴とする、請求の範囲第１項又は第２項に記載のアルツハイマー病モデル動物。
【請求項４】
前記動物は、哺乳類である、請求の範囲第２項又は第３項に記載のアルツハイマー病モデル動物。
【請求項５】
前記哺乳類は、ネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ又はヤギである、請求の範囲第４項に記載のアルツハイマー病モデル動物。
【請求項６】
キノリン酸、グルタミン酸若しくはこれらの塩若しくはこれらの誘導体又はこれらの混合物を動物に投与することを特徴とする、アルツハイマー病モデル動物の作成方法。
【請求項７】
前記キノリン酸、グルタミン酸若しくはこれらの塩若しくはこれらの誘導体又はこれらの混合物を前記動物の脳内に投与することを特徴とする、請求の範囲第６項に記載のアルツハイマー病モデル動物の作成方法。
【請求項８】
前記動物は、哺乳類である、請求の範囲第６項又は第７項に記載のアルツハイマー病モデル動物の作成方法。
【請求項９】
前記哺乳類は、ネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ又はヤギである、請求の範囲第８項に記載のアルツハイマー病モデル動物の作成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病モデル動物及びその作成方法に関する。詳しくは、脳内のアミロイドベータ蛋白（ａｍｙｌｏｉｄ  β  ｐｒｏｔｅｉｎ；Ａβ）の濃度が継続して増加する病態モデル動物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）は、加齢に伴って増加する神経変性疾患であり、記憶障害、見当識障害、学習の障害、注意の障害、空間認知能力低下、問題解決能力の障害等の症状が徐々に進行する、慢性進行型認知障害である。症状の進行により社会的に適応不能となり、重度になると摂食、着替え、意思疎通等もできなくなり、最終的には寝たきりとなる。【０００３】
高齢化が急速に進む我が国において、現在約１８０万人とされる患者数が２５年後には約３６０万人に倍増すると試算されており（２００３年度厚生労働省推計）、その予防法及び治療法の開発は喫緊の社会的課題となっている。このＡＤに関連する研究は国内外で精力的に進められているが、依然としてその発症機構の全貌は不明であり、神経細胞死を抑制する根本治療薬は未だ開発されていない。【０００４】
ＡＤはＡβが凝集した老人班の蓄積に加え、微小管関連蛋白の１つであるタウ蛋白（ｔａｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が異常重合した神経原線線維変化の形成、更に領域特性のある神経細胞の脱落を病理学的特徴とする。これらの事実より、老人班の蓄積が神経原繊維変化の蓄積を促進していると考えられている。【０００５】
一方、最近の研究により、Ａβ二量体等のオリゴマー構造を有するＡβが神経毒の本体であることが解明されつつある。このことから、Ａβ産生調節機構の破綻がＡβの異常産生を起こし、それが神経を変性させて最終的には神経細胞の脱落を惹起するものと考えられている。近年、ヒトＡＤ脳内において神経毒キノリン酸の異常蓄積を伴うトリプトファンの異常代謝が確認されたことから（非特許文献１参照）、Ａβの異常産生を起こす因子は内在性神経毒のキノリン酸であり、このキノリン酸がＡＤの原因因子又は増悪因子である可能性が示唆されている。しかし、キノリン酸による神経障害のみでは、必ずしもＡβ産生を惹起するには不十分であることを示唆した報告もあり（非特許文献２参照）、Ａβとキノリン酸との関連性について結論は得られていない。【０００６】
他方、上記のＡＤに関連する研究において用いられるＡＤモデル動物としては、例えば、スウェーデンのＡＤ家系でみられる変異を導入したアミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）を過剰発現するトランスジェニックマウス（Ｔｇ２５７６）等が知られている。このマウスは、加齢に伴い脳内にＡβが蓄積するが、特殊なプロモーターを使用して強制的に変異ＡＰＰを発現させた非生理的な病態モデル動物である。よって、実際のＡＤのように、内在性Ａβの蓄積が慢性的に進行するモデル動物は存在していないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇ．  Ｊ．  Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ，Ｂ．  Ｊ．  Ｂｒｅｗ，Ｃ．  Ｅ．  Ｎｏｏｎａｎ，Ｏ．  Ｔａｋｉｋａｗａ，Ｋ．  Ｍ．  Ｃｕｌｌｅｎ，  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２００５，  ３１，  ｐ．３９５−４０４
【非特許文献２】Ｋ．  Ｉｖｅｒｆｅｌｄｔ，  Ｓ．  Ｉ．  Ｗａｌａａｓｔ，  Ｐ．  Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９９３，  ９０，  ｐ．４１４６−４１５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記従来技術の有する問題点に鑑みなされたものであり、その目的とするところは、病状が徐々に進行するＡＤの特徴を有する慢性進行型のＡＤモデル動物を提供することにある。【０００９】
本発明の他の目的は、ＡＤの原因物質の一種である内在性Ａβの脳内濃度が継続して増加するＡＤモデル動物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の上記目的は、下記の手段によって達成される。
（１）すなわち、本発明は、脳内のアミロイドベータ蛋白の濃度が継続して増加することを特徴とする、アルツハイマー病モデル動物である。
（２）本発明はまた、キノリン酸、グルタミン酸若しくはこれらの塩若しくはこれらの誘導体又はこれらの混合物を動物に投与して得られることを特徴とする、（１）に記載のアルツハイマー病モデル動物である。
（３）本発明はまた、前記キノリン酸、グルタミン酸若しくはこれらの塩若しくはこれらの誘導体又はこれらの混合物を前記動物の脳内に投与して得られることを特徴とする、（１）又は（２）に記載のアルツハイマー病モデル動物である。
（４）本発明はまた、前記動物は、哺乳類である、（２）又は（３）に記載のアルツハイマー病モデル動物である。
（５）本発明はまた、前記哺乳類は、ネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ又はヤギである、（４）に記載のアルツハイマー病モデル動物である。
（６）また、本発明は、キノリン酸、グルタミン酸若しくはこれらの塩若しくはこれらの誘導体又はこれらの混合物を動物に投与することを特徴とする、アルツハイマー病モデル動物の作成方法である。
（７）本発明はまた、前記キノリン酸、グルタミン酸若しくはこれらの塩若しくはこれらの誘導体又はこれらの混合物を前記動物の脳内に投与することを特徴とする、（６）に記載のアルツハイマー病モデル動物の作成方法である。
（８）本発明はまた、前記動物は、哺乳類である、（６）又は（７）に記載のアルツハイマー病モデル動物の作成方法である。
（９）本発明はまた、前記哺乳類は、ネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ又はヤギである、（８）に記載のアルツハイマー病モデル動物の作成方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＡＤモデル動物によれば、脳内のＡβの濃度が継続して増加することを特徴とするものであるので、脳内Ａβの産生及び蓄積とを同時に評価することができる。【００１２】
また、このような評価が可能となるので、本発明のＡＤモデル動物を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける内在性Ａβの産生及び蓄積の抑制を指標とした、家族性ＡＤやアルツハイマー型老年認知症等のＡＤ及びＡＤの諸症状、例えば、記憶障害、実行機能障害、失認、失語、失行等の中核症状や、妄想、うつ、幻覚、不安、焦燥、睡眠障害、介護抵抗、食行動異常、暴言、暴力、徘徊等の周辺症状等の予防剤及び改善剤の開発システムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】キノリン酸投与後に各期間飼育したマウスの脳内のＡβ４０の濃度を測定した結果を示した図である。
【図２】キノリン酸投与後に各期間飼育したマウスの脳内のＡβ４２の濃度を測定した結果を示した図である。
【図３】キノリン酸投与後に各期間飼育したマウスの脳内の神経細胞の状態を撮影した光学顕微鏡写真（２０倍）である。
【図４】キノリン酸投与後に各期間飼育したマウスの海馬の湿重量を測定した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のＡＤモデル動物は、キノリン酸、グルタミン酸若しくはこれらの塩若しくはこれらの誘導体又はこれらの混合物を動物に投与して得られるものである。
【００１５】
キノリン酸又はグルタミン酸の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、塩酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過酸化水素塩等の無機酸塩、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ブロカイン塩等の脂肪族アミン塩、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等のアラルキルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等の複素環芳香族アミン塩、テトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩、アンモニウム塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩等の有機酸塩、又は、アスパラギン酸、グルタミン、アルギニン塩、リジン塩酸等のアミノ酸との塩等が挙げられる。なお、本発明においては、水和物等の溶媒和物の形であってもよい。
【００１６】
キノリン酸又はグルタミン酸の誘導体としては、例えば、直鎖状の若しくは分岐したメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、セカンダリーブチル基、ターシャリーブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、アンデシル基、ドデシル基等のアルキル基、ビニル基、１−プロペニル基、アリル基、イソプロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、２−ペンテニル基等のアルケニル基、エチニル基、プロパルギル基等のアルキニル基、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、１−シクロヘキセニル基等のシクロアルキル基、シクロアルキル基、フェニル基、ｏ−トリル基、ｍ−トリル基、ｐ−トリル基、ｏ−シリル基、ｍ−シリル基、ｐ−シリル基、メシチル基、ｏ−クメニル基、ｍ−クメニル基、ｐ−クメニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、１−アンチリル基、２−アンチリル基、５−アンチリル基、１−フェナンチリル基、９−フェナンチリル基等のアリール基、ベンジル基、フェネチル基、α−メチルベンジル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、ｏ−フェニレン基、ｍ−フェニレン基、ｐ−フェニレン基、スチリル基、シンナミル基、ｏ−ビフェニリル基、ｍ−ビフェニリル基、ｐ−ビフェニリル基等のアラルキル基、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、イオド基、イオドシル基、イオジル基等のハロゲン基、ヒドロキシ基、ヒドロペルオキシ基等のヒドロキシ基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基、フェノキシ基、ベンジロキシ基等のアルコキシ基、カルボキシ基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基等のカルボン酸基、ホルミロキシ基、アセトキシ基、ベンゾイロキシ基等のエステル基、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、オクタノイル基、ドデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、オレオイル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、クロロホルミル基、ピルボイル基、オキサロ基、メトキサリル基、シクロヘキシルカルボニル基、ベンゾイル基、ｏ−トルオイル基、ｍ−トルオイル基、ｐ−トルオイル基、シンナモイル基、１−ナフソイル基、２−ナフソイル基等が、カルボニル基としては、アセトニル基、フェナシル基、ｏ−サリシル基、ｏ−サリシロイル基、ｏ−アニシル基、ｍ−アニシル基、ｐ−アニシル基、ｏ−アニソイル基、ｍ−アニソイル基、ｐ−アニソイル基等のアシル基、メルカプト基、メチルチオ基、エチルチオ基、フェニルチオ基等のチオール基、チオホルミル基、チオアセチル基、チオカルボキシ基、ジチオカルボキシ基、チオカルバモイル基等のチオカルボニル基、スルフィノ基、スルホ基、メシル基、フェニルスルホニル基、ｏ−トリルスルホニル基、ｍ−トリルスルホニル基、トシル基、スルファモイル基、スルホアミノ基等のスルホニル基、アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、アニリノ基、ｏ−トルイジノ基、ｍ−トルイジノ基、ｐ−トルイジノ基、ｏ−キシリジノ基、ｍ−キシリジノ基、ｐ−キシリジノ基、ヒド���キシアミノ基等のアミノ基、シアノ基、イソシアノ基、シアネート基、イソシアネート基、チオシアネート基、イソチオシアネート基等のシアノ基、アセトアミド基、ベンズアミド基、スクシニミド基、カルバモイル基等のアミド基、ニトロソ基、ニトロ基、ピクリル基等のニトロ基、ヒドラジノ基、フェニラゾ基、１−ナフチラゾ基、２−ナフチラゾ基、アジド基、ウレイド基、アミジノ基、グアミジノ基等のアゾ基、２−フリル基、２−フルフリル基、２−チエニル基、２−テニル基、２−テノイル基、２−ピロリル基、２−ピリジル基、１−ピペリジノ基、４−ピペリジル基、４−モルホリノ基、２−モルホリニル基、２−クイノリル基等の複素環基等の置換基が導入されたもの等が挙げられる。
【００１７】
本発明に利用する動物としては哺乳類が好ましく、具体的には、トガリネズミ科、モグラ科、ソレノドン科、ニシインドトガリネズミ科等のトガリネズミ目、ハリネズミ科等のハリネズミ目、オオコウモリ科、オナガコウモリ科、サシオコウモリ科、ブタバナコウモリ科、ミゾコウモリ科、アラコウモリ科、キクガシラコウモリ科、カグラコウモリ科、ウオクイコウモリ科、クチビルコウモリ科、チスイコウモリ科、ヘラコウモリ科、アシナガコウモリ科、ツメナシコウモリ科、スイツキコウモリ科、サラモチコウモリ科、ヒナコウモリ科、ツギホコウモリ科、オヒキコウモリ科等のコウモリ目（翼手目）、コビトキツネザル科、イタチキツネザル科、キツネザル科、インドリ科、アイアイ科、ロリス科、ガラゴ科、メガネザル科、オマキザル科、マーモセット科、オナガザル科、テナガザル科、オランウータン科、ヒト科等のサル目（霊長目）、ウサギ科、ナキウサギ科等のウサギ目（兎目、重歯目）、リス科、グンディ科、ヤマネ科、メクラネズミ科、ヨルマウス科、アシナガマウス科、キヌゲネズミ科、ネズミ科、トビネズミ科、ビーバー科、ウロコオリス科、トビウサギ科、ヤマアラシ科、アメリカヤマアラシ科（キノボリヤマアラシ科）、ヨシネズミ科、デバネズミ上科、デバネズミ科、デグー科、アメリカトビネズミ科、カプロミス科、ヌートリア科、アグーチ科（パカ科）、パカラナ科、テンジクネズミ科、カピバラ科、チンチラ科、チンチラネズミ科等のネズミ目（齧歯目）、ネコ科、マングース科、ジャコウネコ科、ハイエナ科、キノボリジャコウネコ科、イヌ科、レッサーパンダ科、アライグマ科、イタチ科、スカンク科、クマ科、アザラシ科、アシカ科等のネコ目（食肉目）、サイ科、ウマ科、バク科等のウマ目（奇蹄目）、ラクダ科、イノシシ科、ペッカリー科、マメジカ科、ジャコウジカ科、シカ科、キリン科、プロングホーン科、ウシ科、カバ科、マッコウクジラ科、コマッコウ科、アカボウクジラ科、インドカワイルカ科、ヨウスコウカワイルカ科、アマゾンカワイルカ科、ラプラタカワイルカ科、マイルカ科、ネズミイルカ科、イッカク科、セミクジラ科、コセミクジラ科、コククジラ科、ナガスクジラ科等のクジラ偶蹄目（鯨偶蹄目）、ジュゴン科、マナティー科等のジュゴン目（海牛目）等が挙げられ、これらの中では、ネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等が好ましく、特に、ネズミ等が好適に利用される。
【００１８】
本発明のＡＤ動物は、以下の手順により作成される。
【００１９】
まず、４〜４０週齢の上記哺乳類を、１２時間の明暗サイクルで、水と使用する上記哺乳類に適した飼料を自由に摂取できるようにして、２４〜２５℃で、１ゲージに３〜５匹ずつ又は単独で飼育する。
【００２０】
次に、１０〜１００ｍＭの上記脳内投与化合物又はその混合物を、０．０１〜１．０Ｎの水酸化ナトリウム等の中和剤で中和し、０．９％の生理食塩水やリン酸緩衝食塩水等の希釈剤で１０〜１００倍に希釈して０．１〜１０ｍＭの脳内投与溶液を得る。
【００２１】
次に、上記哺乳類に、２．０〜２．５％のイソフルラン等の麻酔剤を用いて麻酔をかけ、脳固定装置に脳を固定してその頭皮を切開し、所定位置に穴を開ける。次いで、脳固定装置に固定された全容量が１０μｌ〜１０ｍｌの注射器を使用し、電動式注入ポンプを用いて、上述した脳内投与化合物溶液を一定の速度で脳内に注入する。なお、注射器に装着する注射針は、哺乳類の脳サイズに応じて１８〜３０ゲージのものを使用する。
【００２２】
その後、上記哺乳類の頭皮を縫合して完全に覚醒するまで３０．０〜３７．０℃に温めたパッド等の保温材上に放置するか、或いは３０．０〜３７．０℃の保温庫内で覚醒させ、本発明のＡＤモデル動物を得る。
【００２３】
上記の作成方法により得られる本発明のＡＤモデル動物は、脳内のＡβの濃度が継続して増加する特徴を有している。
【００２４】
一方、従来のＡＤモデル動物は、例えば、ＡＤ家系でみられる変異アミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）を過剰発現するトランスジェニックマウス（Ｔｇ２５７６）やＡＰＰ／Ｌｏｎｄｏｎ等のように、変異ＡＰＰを非生理的に過剰発現させて、その脳内にＡβの濃度が増加するという共通点を有している。しかし、従来のＡＤモデル動物は、外来性Ａβが蓄積されるだけであり、本発明のように内在性Ａβの継続的な蓄積とは異なる。従って、本発明のＡＤモデル動物は、従来のＡＤモデル動物とは本質的に異なるものであることは明らかである。
【００２５】
本発明のＡＤモデル動物における、脳内のＡβの濃度が増加する作用機序は必ずしも明らかではないが、上記脳内投与溶液が脳内に投与されたことにより、Ａβの生合成亢進或いは分解抑制が起こり、Ａβの脳内レベルが増加すると考えられる。
【００２６】
従来のＡβ産生調節研究の多くは、本来脳内で共存しているグリア細胞が存在しない条件、更には血液循環のない非生理的なｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養神経細胞で行われている。本発明のＡＤ病態モデル動物は脳内のＡβ濃度が継続して増加を示すことから、生理的な条件に近いｉｎ  ｖｉｖｏでのＡβ産生調節研究を可能とする。
【００２７】
従って、本発明を利用することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける内在性Ａβの産生及び蓄積機構の抑制を指標とした、家族性ＡＤやアルツハイマー型老年認知症等のＡＤ及びアルツハイマー病の諸症状、例えば、記憶障害、実行機能障害、失認、失語、失行等の中核症状や、妄想、うつ、幻覚、不安、焦燥、睡眠障害、介護抵抗、食行動異常、暴言、暴力、徘徊等の周辺症状等の予防剤及び改善剤の開発システムを提供することができる。
【００２８】
なお、本発明のＡＤモデル動物は、上記した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加え得ることは勿論である。
【実施例】
【００２９】
［参考例１］
被験動物の飼育【００３０】
８週齢の雄性マウス（日本エルエスシー（株）、『Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ』）を使用した。マウスは１ゲージに常温（２４±１℃）で３〜５匹飼育したものを用いた。これらのマウスは、１２時間の明暗サイクル（明期：８：００〜２０：００、暗期２０：００・〜８：００）で、水と一般飼料（日本クレア（株）、『ＣＥ−２』）は自由に摂取できるようにして飼育した。【００３１】
［参考例２］
キノリン酸溶液の調製【００３２】
２００ｍＭのキノリン酸を１Ｎの水酸化ナトリウムで中和し、０．９％の生理食塩水で５倍に希釈して４０ｍＭのキノリン酸溶液を得た。【００３３】
［実施例１］
キノリン酸溶液の海馬内注射【００３４】
参考例１のマウスに、２．０−２．５％のイソフルランを用いて麻酔をかけ、このマウスの頭皮を切開し、所定位置（体軸：ブレグマ縫合から２．５ｍｍ後ろ、背腹：表皮表面から深さ２．０ｍｍ、側面：中心から右に２．７ｍｍ）に穴を開けた。次いで、２６−ゲージ針が装着された１０μｌ−ハミルトン注射器に接続された注射ポンプ（ＫＤサイエンティフィック社、『ＫＤＳ３１０』）を用いて参考例２で得られたキノリン酸溶液１μｌの海馬内注射を、０．５μｌ／分の速度で行った。【００３５】
その後、マウスの頭皮を縫合して完全に覚醒するまで３７℃に温めたパッド上に置き、覚醒した後はゲージに単独で収容した。そして、これらのマウス７群について、それぞれ１日、３日、７日、１４日及び２８日間水と一般飼料を与えて飼育した。【００３６】
［比較例１］
生理食塩水の海馬内注射【００３７】
参考例２で得られたキノリン酸溶液の代わりに生理食塩水を用いた以外は実施例１と同様の手順で、生理食塩水の海馬内注射を行った後にマウスを各期間飼育した。【００３８】
［実施例２］
脳内Ａβ（Ａβ４０）の検出【００３９】
実施例１及び比較例１で得られた飼育期間が異なるマウスを頚椎脱臼によりそれぞれ屠殺し、各マウスから取り出した海馬を、ドライアイスを用いて−８０℃で凍結保存した。後日、凍結した各海馬を氷上で解凍し、各海馬１５０ｍｇに対して１ｍｌの７０％ギ酸を添加して均質化して破砕物を得た。得られた各破砕物を、超遠心分離機（ベックマン・コールター（株）、『Ｏｐｔｉｍａ  ＭＡＸ−Ｅ』）及びロータ（ベックマン・コールター（株）、『ＭＬＣ−５０』）を用いて１０００００×ｇで４℃、１時間超遠心し、各上澄み液を回収して−８０℃で凍結保存した。後日、凍結した各上澄み液を氷上で解凍し、次いで１Ｍのトリスベースで中和して得られた各中和液１００μｌを、１時間以内にＡβ４０用ＥＬＩＳＡキット（和光純薬工業社製）の各抗体固相化マイクロプレートに移し、４℃で一晩それぞれインキュベートした。洗浄液３００μｌで各プレートを５回洗浄した後に、ＨＲＰ標識抗体溶液１００μｌを添加し、４℃で２時間それぞれインキュベートした。次に、上記の洗浄液３００μｌで各プレートを５回洗浄した後にＴＭＢ溶液１００μｌを添加し３０分室温で反応させた。次いで、停止液１００μｌをそれぞれに添加して反応を停止させ、マイクロプレートリーダ（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ（株））を用いて吸光度４５０ｎｍで、各飼育期間のマウスの脳内のＡβ４０の濃度を測定した結果を図１にそれぞれ示した。なお、標準曲線は、ヒトＡβ４０を用いて作成した。【００４０】
［実施例３］
脳内Ａβ（Ａβ４２）の検出【００４１】
Ａβ４２用高感度ＥＬＩＳＡキット（和光純薬工業社製）の各抗体固相化マイクロプレートを使用し、２回目のインキュベートを１時間行った以外は、実施例２と同様にして、脳内のＡβ４２の濃度を測定した結果を図２に示した。【００４２】
図１及び図２の結果から明らかなとおり、実施例１のマウスの脳内のＡβ４０及びＡβ４２の濃度は、キノリン酸を投与した後の飼育期間が長期になるにつれ、増加していくことが確認できた。これらの結果から、実施例１のマウスの脳内では、Ａβの増加に伴って神経細胞死が生じ、ヒトＡＤ患者で観察されるような顕著な脳萎縮が起こるものと推測される。また、一般的なマウスの寿命を２．５年とし、人間の寿命を７５年としたときのマウスの２８日は、人間の２〜３年に相当するので、本発明が、２〜３年かけて急速に病状が悪化するＡＤの良い動物モデルとなる可能性が示唆された。【００４３】
［実施例４］
神経細胞死の検出【００４４】
実施例１で得られたマウスのうち、キノリン酸溶液投与後７、１４及び２８日間飼育したもの、並びに比較例１で得られたマウスのうち、生理食塩水投与後２８日間飼育したものに対し、イソフラレン麻酔下で心臓から生理食塩水を約１０分間還流して血液を除去した脳をそれぞれ取り出した。次に、取り出した脳を４％パラホルムアルデヒドに一晩浸けてそれぞれ固定した。次に、固定した脳から実施例１に示した海馬内投与位置から約０．２ｍｍ以内の組織を取り出して、厚さ１０μｍの切片をそれぞれ作製した。最後に、作製した切片にニッスル染色を施し、光学顕微鏡（２０倍）を用いてマウス脳内における神経細胞死を確認した結果を図３に示した。【００４５】
図３の結果から明らかなとおり、キノリン酸溶液投与した後１４日及び２８日間飼育したマウスにおいて、脳内のＡβ４０及びＡβ４２の増加に伴う顕著な神経細胞死が確認された。【００４６】
［実施例５］
脳萎縮の検出【００４７】
実施例１及び比較例１で得られた飼育期間が異なるマウス、キノリン酸溶液投与後３月及び６月間飼育した以外は実施例１と同様にして飼育したマウス、並びに生理食塩水投与後３月及び６月間飼育した以外は比較例１と同様にして飼育したマウスを頚椎脱臼によりそれぞれ屠殺し、各マウスから取り出した海馬の湿重量を測定した結果を図４に示した。【００４８】
図４の結果から明らかなとおり、キノリン酸溶液投与後２８日、３月及び６月間飼育したマウスの海馬の湿重量は、それぞれ約２０、４０及び４５％減少しており、キノリン酸溶液の投与により神経細胞死が生じて海馬の顕著な委縮が生じていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
上述したように、本発明のＡＤモデル動物を使用することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける内在性Ａβの産生及び蓄積の抑制を指標とした、家族性ＡＤやアルツハイマー型老年認知症等のＡＤ及びＡＤの諸症状、例えば、記憶障害、実行機能障害、失認、失語、失行等の中核症状や、妄想、うつ、幻覚、不安、焦燥、睡眠障害、介護抵抗、食行動異常、暴言、暴力、徘徊等の周辺症状等の予防剤及び改善剤の開発システムとして利用した場合極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【国際調査報告】
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