(57)【要約】  本発明の目的は、発泡性アルコール飲料などのように、製造時に低温での酵母発酵が行われる場合に、酵母の増殖活性の鈍化によって発酵効率が低下する問題を解決するものである。  大豆蛋白質からグロブリンの一種であるβ−コングリシニンに富む画分を分画し、この画分を酵素分解したペプチドが酵母の低温増殖能を顕著に強化する作用を示すことを見出した。すなわち、本発明は、大豆β−コングリシニンの分解物を含むことを特徴とする酵母の低温発酵促進剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆β−コングリシニンの分解物を含むことを特徴とする酵母の低温発酵促進剤。
【請求項２】
大豆β−コングリシニンの分解物中における分子量１２０〜５００の画分の割合が６０％以上である請求項１記載の酵母の低温発酵促進剤。
【請求項３】
請求項１記載の低温発酵促進剤を添加した酵母生育用培地。
【請求項４】
請求項１記載の低温発酵促進剤を含む培地に酵母を接種し、１５℃以下で発酵する発酵飲食品の製造法。
【請求項５】
大豆β−コングリシニンの分解物を含むことを特徴とする酵母の低温ストレス保護剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母により低温域で発酵させて得られる食品の製造において、低温における酵母の発酵促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は、醤油・味噌・パン・酒といった多くの発酵飲食品を製造する過程で使われている。また、一部の酵母は分子生物学のモデル生物としても利用されている。このように酵母は産業界や学術界で広く利用されている微生物であり、温度や培地組成などの培養条件に関しては活発な研究が展開されている。酵母が効率良く増殖する上で、重要な環境因子の一つが温度である。酵母の至適温度は酵母の種類によって異なるが、30℃付近の温度でよく生育するものが多く、15℃以下という低温においては、酵母の増殖能力は大きく低下する。これは酵母の生育が環境ストレスの１つである低温ストレスによって阻害されるためと考えられる。【０００３】
また、酵母の増殖を左右するものに菌体外の栄養源の存在がある。酵母が増殖するには、糖などの炭素源、アミノ酸や蛋白質などの窒素源の他に、ビタミンなどの微量の栄養源が必要である。窒素源としては、通常硫酸アンモニウムのような無機物や、アミノ酸・タンパク質のような有機物が使われており、大豆を加水分解した大豆ペプチドも窒素源として利用されつつある。例えばビールや麦芽使用率が低いか又は麦芽を使用しないビール様飲料などの発泡性アルコール飲料の製造における酵母発酵において、大豆ペプチドが使用されている。しかしながら、発泡性アルコール飲料では、15℃以下という低温で発酵がしばしば行われているが、上述のように低温ストレスによって酵母の増殖活性が鈍くなり、これによって発酵効率が低下すると、発酵時間を長くする必要がある。この場合、風味の点では利点があるが、より短時間で低温発酵を終了することができれば製造効率上の利点はより大きい。【０００４】
このような課題に関連する知見として、アラビアガムとトラガントガムを添加して酵母を発酵させると、５℃でアルコールの産生が活発になることが分かっている（特許文献１）。また、大豆ペプチドを含む培地で培養した酵母は、冷凍に対して耐性が上昇することが記載されている（特許文献２）。しかしながら、特許文献１では、菌の増殖ではなくアルコールの生成量を見ており、菌の増殖活性に関しては言及されていない。また、15℃における効果も示されていない。また特許文献２の知見は非凍結域であって１５℃以下という低温域における酵母の増殖について何ら教示するものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−９９６５９号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００８／０４７５９６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】生物工学会誌、VOL.83（111）、532-533（2005）
【非特許文献２】Journal Of Bioschience and Bioengineering, Vol.105, No.4, 360-366 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、発泡性アルコール飲料などのように、製造時に低温での酵母発酵が行われる場合に、酵母の増殖活性の鈍化によって発酵効率が低下する問題を解決するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題に鑑み、本発明者は鋭意研究を行った結果、大豆蛋白質からグロブリンの一種であるβ−コングリシニンに富む画分を分画し、この画分を酵素分解したペプチドが酵母の低温増殖能を顕著に強化する作用を示すことを見出した。そして該画分の低温増殖能は、酵母の細胞内酵素の活性が低温によって低下し、酵母の活動が抑制される、いわゆる低温ストレスから保護する作用に基づくものであることを見出した。本発明はかかる知見に基づき完成するに到ったものである。【０００９】
すなわち本発明は、
（１）大豆β−コングリシニンの分解物を含むことを特徴とする酵母の低温発酵促進剤、
（２）大豆β−コングリシニンの分解物中における分子量１２０〜５００の画分の割合が６０％以上である前記(1)記載の酵母の低温発酵促進剤、
（３）前記(1)記載の低温発酵促進剤を添加した酵母生育用培地、
（４）前記(1)記載の低温発酵促進剤を含む培地に酵母を接種し、１５℃以下で発酵する発酵飲食品の製造法、
（５）大豆β−コングリシニンの分解物を含むことを特徴とする酵母の低温ストレス保護剤、である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、大豆β−コングリシニン分解物を培地に添加することにより、酵母を低温ストレスから保護し、その結果低温における酵母の増殖を促進することができる。発酵を早く進めるためには、低温下で酵母を増殖させることが必須であるが、本発明ではその増殖時間を短縮できることにより、従来よりも短時間で発酵食品の製造が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】各種大豆蛋白分解物の培地への添加による低温における酵母の増殖効果を調べた結果を示すグラフである（縦軸：酵母の１ｍＬ辺りの菌数、横軸：培養時間）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の酵母の低温発酵促進剤は、大豆β−コングリシニンの分解物を含むことを特徴とするものである。以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００１３】
（大豆β−コングリシニン）
大豆蛋白質を構成する蛋白質は、超遠心分析による沈降係数から、２Ｓ，７Ｓ，１１Ｓ，１５Ｓの各グロブリンに分類される。このうち、７Ｓグロブリン と１１Ｓグロブリンはグロブリン画分の主要な構成蛋白成分である。このうち、免疫学的命名法にいうβ−コングリシニンは７Ｓグロブリンに、グリシニンは１１Ｓグロブリンに実質的に相当するものである。また、大豆のグロブリン画分には、これら以外のマイナーな酸沈殿性大豆蛋白質群が存在し、これらはレシチンや糖脂質などの極性脂質を多く随伴するため、包括的に「脂質親和性蛋白質」（以下、「ＬＰ」と略記することがある。）と呼ばれている（国際公開WO2006／129647号公報参照）。
【００１４】
このように、大豆蛋白質はβ−コングリシニン（７Ｓグロブリン）、グリシニン(１１Ｓグロブリン)、ＬＰの３つに分画でき（上記公報参照）、本発明においてはこれらのうち、β−コングリシニンを原料として選択したものである。β−コングリシニンはα、α´、βという３つのサブユニットから構成される３量体であり、これには血中の中性脂肪を低減させる効果があることが知られている。
【００１５】
大豆蛋白質からβ−コングリシニンに富む画分を分画する手段は公知の手段を用いることができる。特にβ−コングリシニンが粗蛋白質中４０重量％以上含まれるのが好ましく、５０重量％以上がより好ましい。好ましい製造法としては、国際公開WO2006／129647号公報やWO2002／028198号公報に記載される方法が挙げられる。β−コングリシニンに富む画分のβ−コングリシニンの純度は蛋白質中６０％以上であるのが好ましく、８０％以上がより好ましい。
【００１６】
（大豆β−コングリシニンの分解物）
本発明のβ−コングリシニン分解物は、β−コングリシニンをプロテアーゼで分解することにより得られるペプチド混合物である。β−コングリシニン分解物は、分解度が高い方が好ましく、分解物中の分子量１２０〜５００の画分の割合が６０％以上であるのが好ましく、６４％以上であるのがより好ましい。また非特許文献２によると、アミノ酸は遊離の形で存在するよりペプチド態である方が望ましいと考えられるため、分子量１２０未満の画分の割合は１０％以下であるのが好ましく、５％以下であるのがより好ましい。さらに、ペプチド態はより低分子であることが望ましいことから、分子量５００以上の画分の割合は４０％以下が好ましく、３５％以下がより好ましい。
【００１７】
酵素分解は上記大豆たん白質スラリーまたは水溶液を基質とし、プロテアーゼ処理を行う。ここで用いるプロテアーゼは動物起源、植物起源あるいは微生物起源は問わず、プロテアーゼの分類において「金属プロテアーゼ」,「酸性プロテアーゼ」,「チオールプロテアーゼ」,「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼ、好ましくは「金属プロテアーゼ」,「チオールプロテアーゼ」,「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼの中から適宜選択することができる。特に２種類以上、あるいは３種類以上の異なった分類に属する酵素を、順次もしくは同時に作用させる分解方法がジペプチドやトリペプチド等の比較的分子量の低いペプチドの割合を増加させることができ好ましい。
【００１８】
このプロテアーゼの分類は、酵素化学の分野において通常行われている活性中心のアミノ酸の種類による分類方法である。各々の代表として「金属プロテアーゼ」にはＢａｃｉｌｌｕｓ中性プロテイナーゼ, Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ中性プロテイナーゼ, Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ中性プロテイナーゼ,サモアーゼ等、「酸性プロテアーゼ」にはペプシン, Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ酸性プロテイナーゼ,スミアームAP等、「チオールプロテアーゼ」にはブロメライン,パパイン等、「セリンプロテアーゼ」にはトリプシン,キモトリプシン,ズブチリシン, Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓアルカリプロテアーゼ, アルカラーゼ, ビオプラーゼ等が挙げられる。これら以外の酵素でも作用pHや阻害剤との反応性により、その分類を確認することができる。活性中心が異なる酵素間では、基質への作用部位が大きく異なるために、「切れ残り」を減らし、効率良く酵素分解物を得ることができる。或いは異なった起源(起源生物)の酵素を併用することで、更に効率よく酵素分解物を製造することが出来る。同分類でも起源が異なれば、基質であるたんぱく質への作用部位も異なり、結果としてジペプチドやトリペプチドの割合を増やすことができる。これらプロテアーゼはエキソ活性が少ないものが好ましい。
【００１９】
反応ｐＨや反応温度は、用いるプロテアーゼの特性に合わせて設定すればよく、通常反応ｐＨは至適ｐＨ付近で行い、反応温度は至適温度付近で行えばよい。概ね反応温度は２０〜８０℃、好ましくは４０〜６０℃で反応を行うことができる。反応後は酵素の失活するに十分な温度（６０〜１００℃程度）で加熱し、残存酵素活性を失活させる。
得られた反応液は、そのまま或いは濃縮して用いることもできるが、通常、殺菌して粉霧乾燥、凍結乾燥等して乾燥粉末の状態で利用することができる。また反応液を任意のｐＨに調整しておくこともでき、またｐＨ調整時に発生する沈殿物や懸濁物を遠心分離や濾過等により除去することもできる。またさらに活性炭や吸着樹脂により精製を行うこともできる。
【００２０】
（分子量分布測定法）
得られたβ−コングリシニン分解物の分子量分布を測定する場合、以下のゲルろ過カラムを用いたHPLC法により測定することとする。カラム１本を使用してペプチド用ゲル濾過システムを組み、分子量マーカーとなる既知ペプチドをチャージし、分子量と保持時間の関係において検量線を求める（表１）。酵素分解した分解物（１％）を10,000×ｇ、１０分で遠心分離した上清を、ゲル濾過用溶媒で２倍希釈し、その５μlをアプライした。各分子量画分の含有量比率％については、全体の吸光度のチャート面積に対する、特定の分子量範囲（時間範囲）の面積の割合によって求めた。（カラム：Superdex Peptide 7.5/300GL、溶媒：１％SDS/10mMリン酸緩衝液, pH8.0、25℃、流速：0.25ml/min、検出：OD220nm）。
【００２１】
（表１）分子量標準物質
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【００２２】
（酵母の低温発酵促進剤）
本発明は、上記のようにして得られたβ−コングリシニン分解物を酵母の低温発酵促進剤として用いることに特徴がある。通常、食品製造に利用される酵母の至適温度は２０〜３０℃程度であり、１５℃以下の低温域においては酵母の増殖速度が著しく低下する。発酵食品の製造過程において、酵母の生育状態は重要な鍵となっており、発酵に費やされる日数も比較的長い。しかし、本発明の低温発酵促進剤により、低温における酵母の増殖速度を早めることができ、製造日数を短縮することが可能となる。
ここで本発明において「低温」とは室内温（２０℃前後）よりも低い程度の温度をいい、具体的には１５℃以下の温度を示し、より限定的には１２℃以下である。ただし培養液が凍結してしまう凍結域の温度ではそもそも酵母が増殖できず、さらに酵母の活性の低下にも繋がるので、少なくとも培養液の凍結域の温度以上であることを示す。具体的には０℃以上、より限定的には３℃以上である。
【００２３】
（酵母培養用培地）
本発明の低温発酵促進剤を酵母の主要な窒素源の一つとして培地に配合し、酵母生育用培地とすることができる。例えば酵母の増殖培地中に０．１〜１０％添加することにより得られる。酵母生育用培地の種類は、天然培地、合成培地、半合成培地のいずれでもよく、液体培地、固体培地のいずれでもよい。他の窒素源としてペプトン、酵母抽出物、酵母窒素ベース、硫化アンモニウム、アミノ酸、ヌクレオチド等も添加することができ、炭素源としてはグルコース、ガラクトース、ラフィノース、デキストロース等を添加することができる。
この酵母生育用培地で酵母を１５℃以下の低温で培養すると、低温であっても増殖が活発となる。これは酵母の受ける低温ストレスからβ−コングリシニン分解物が酵母を保護する低温ストレス保護剤としての作用による。
【００２４】
（発酵飲食品の製造）
本発明の低温発酵促進剤は上記のように市販の酵母生育用培地の培地成分として添加できるほか、低温での酵母発酵により製造される発酵飲食品の製造において、発酵前原料として混合し、これに酵母を接種して発酵させることも有効である。
低温で酵母発酵により製造されうる発酵飲食品の例としては、酒類としてビールや麦芽の使用率が低いもしくは０％であるビール様飲料等の発泡性アルコール飲料、ワイン、ウイスキー、清酒、焼酎などが挙げられ、調味料として醤油、みそ、食酢などが挙げられ、一般食品としてパン、発酵乳、発酵バター、ケフィール、漬物などが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、低温で酵母発酵を行うあらゆる発酵飲食品に対して適用可能である。
発酵飲食品中への低温発酵促進剤の添加量は通常０．１〜１０％とすることができる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により本発明のより具体的な実施態様について説明する。【００２６】
（製造例１）各種大豆蛋白質画分の調製
佐本らの方法（M Samoto etc, Food Chemistry, 102, 317-322, 2007.）に準じて以下の通り、β−コングリシニン、グリシニン、ＬＰの各種大豆蛋白質画分を調製した。
１）低変性脱脂大豆に加熱処理を施してＮＳＩ（水溶性窒素指数、AOCS公式分析法BA-11-65 NSIによる）を低下させた脱脂大豆（ＮＳＩ７０％）の温水抽出スラリーを遠心分離機にてオカラ画分を除き脱脂豆乳とした。
２）次に脱脂豆乳のｐＨを５．８に調整して遠心分離機にて沈殿カード画分を回収した。この画分が「グリシニン画分」である。
３）次に、残りの上清のｐＨを５．０に調整し、５５℃で１０分間放置後、次いでｐＨ５．５に調整後、遠心分離機にて沈殿カード画分を回収した。この画分が脂質親和性蛋白を多く含む「ＬＰ画分」である。
４）次に、残りの上清のｐＨを４．５に調整し、遠心分離機にて沈殿カード画分を回収した。この画分が「β−コングリシニン画分」である。
５）得られた各画分を中和して１４０℃×１０秒の加熱処理後、噴霧乾燥した。
各画分の純度はグリシニン画分が９６％、β−コングリシニン画分が９１％であった。【００２７】
（製造例２）分離大豆蛋白の調製
別途、低変性脱脂大豆から以下のように分離大豆蛋白を調製した。
１）低変性脱脂大豆の温水抽出スラリーを遠心分離機にてオカラ画分を除き脱脂豆乳とした。
２）得られた脱脂豆乳をｐＨを４．５に調整して等電点沈殿せしめ、遠心分離機にて酸沈殿カードを得て中和した。
３）次にこの中和液を噴霧乾燥し、分離大豆蛋白（ＳＰＩ）とした。【００２８】
（製造例３）各種大豆蛋白分解物の製造
製造例１，２で得られたβ−コングリシニン、グリシニン、ＬＰ及び分離大豆蛋白から国際公開WO2006/134752号公報を参考に、以下のようにプロテアーゼによる酵素分解物を調製した。
3%大豆たんぱく質溶液に対して、サモアーゼ(起源；Bacillus thermoproteolyticus, 金属プロテアーゼ, 大和化成)を対たん白質あたり2%加え、pH9.0, 58℃で60分間作用させた。次にビオプラーゼ(起源；Bacillus sp., セリンプロテアーゼ, ナガセケムテック)を対たんぱく質あたり1%加え、pH7.5, 58℃で60分間作用させた。スミチームFP(起源；Aspergillus sp., 金属プロテアーゼ, 新日本化学工業)を対たんぱく質あたり1%加え、pH7.5, 58℃で60分間作用させた。以上の処理の後、90℃, 20分で反応を停止した後、試料とした。
得られた4種類の酵素分解物の分子量を非特許文献２に記載の方法に従って分子量を測定した。測定結果を表２に示す。【００２９】
（表２）β−コングリシニン分解物の分子量分布
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【００３０】
β−コングリシニン分解物において、ジペプチドやトリペプチドが多く含まれる分子量１２０〜５００の画分の割合が６６．９％であり、６０％以上の割合を占めていた。一方、遊離アミノ酸が多く含まれる分子量１２０未満の画分の割合は３．１％であり、１０％に満たなかった。また分子量５００以上の比較的高分子のペプチド画分の割合は３０％であり、４０％に満たなかった（表２）。他の分解物における画分割合もβ−コングリシニン分解物と概ね同等であり、分子量分布には大きな差はなく、いずれも同様の酵素分解が行われていることが示された。【００３１】
（実施例１）
製造例３で得られたβ−コングリシニン分解物による低温増殖促進効果を見るために、酵母の低温培養実験を行った。比較対象として、同じく製造例３で得られたグリシニン分解物、ＬＰ分解物、分離大豆蛋白分解物を用いた。
培地は酵母生育用であるＳＤ培地に窒素源として各種大豆蛋白分解物を添加した。具体的には、Yeast Nitrogen Base w/o amino acids and anmoniuum sulfate０．１７％、グルコース２％、アデニン１４．６ｍｇ／Ｌ、ウラシル２０ｍｇ／Ｌ、リジン塩酸塩３０ｍｇ／Ｌ、ロイシン９０ｍｇ／Ｌ、ヒスチジン２０ｍｇ／Ｌの混合物に、各種大豆蛋白分解物を乾物重量で1%となるように混合して培地を作成した。この培地に出芽酵母「ＹＰＨ４９９株」を１ｍＬあたりの細胞数が１０６個になるように植菌し、１０℃での細胞数を経時的（0時間、24時間、72時間）に見た。【００３２】
図１の結果に示すとおり、β−コングリシニン分解物を添加した場合、他の大豆蛋白分解物を添加した場合と比較すると、７２時間の発酵時間において酵母数に顕著な差がみられ、10℃という低温域において酵母の増殖が顕著に促進されていた。一方、他のグリシニン分解物やLP分解物は分離大豆蛋白分解物における酵母の増殖速度と同等であり、これらにはβ−コングリシニン分解物のような顕著な酵母の低温発酵促進効果はみられなかった。
以上の通り、同じ大豆蛋白質由来のペプチドでありながら、特に大豆蛋白質の画分の一つであるβ−コングリシニンのペプチドが顕著な酵母の低温発酵促進効果を有することが明らかとなった。
またβ−コングリシニン分解物を添加することで、低温域でも酵母が増殖可能になることが示されたが、これは低温によって細胞内酵素の活性が低下し、酵母の活動が抑制されるという現象がβ−コングリシニンによって緩和されているためと考えられる。その意味でβ−コングリシニン分解物は低温ストレス保護剤としての効果を有していると言える。
【符号の説明】
【００３３】
▲Total ：分離大豆蛋白分解物
○７Ｓ  ：β−コングリシニン分解物
□１１Ｓ：グリシニン分解物
＊ＬＰ  ：ＬＰ（脂質親和性蛋白質）分解物
【図１】
2010061575.tif 000004
【配列表】
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【国際調査報告】
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2010061575.tif 000006
2010061575.tif 000007
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