(57)【要約】  本発明は、抗体治療及び／又はエンドトキシン吸収剤治療が効果的に作用する患者の診断方法と、かかる診断に用いる体外診断薬を提供し、このような自己免疫疾患患者のために特に有効な治療剤と治療方法を提供することを目的とするものであり、患者の免疫系細胞に表現されるＨＬＡ型のＤＲ座のＤＲ１５が陰性の患者を選抜することを特徴とする、抗体治療及び／又はエンドトキシン吸収剤治療に有効な自己免疫疾患患者の診断方法と、ＨＬＡ型のＤＲ遺伝子の標識プライマーと、ＤＲ１５遺伝子に相補な固定相プローブを必須の要素として含んでなるかかる自己免疫疾患の患者の体外診断薬、更には、免疫グロブリン及び／又はエンドトキシン吸収剤を含有する、免疫系細胞に表現されるＨＬＡ−ＤＲ１５が陰性である自己免疫疾患患者用治療剤、およびかかる自己免疫疾患患者に対して該治療剤を経口投与することを特徴とする自己免疫疾患の治療方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の免疫系細胞に表現されるＨＬＡ型のＤＲ遺伝子のＤＲ１５が陰性の患者を選抜することを特徴とする、抗体治療及び／又はエンドトキシン吸収剤治療に有効な自己免疫疾患患者の診断方法。
【請求項２】
ＨＬＡ型のＤＲ遺伝子の標識プライマーと、ＤＲ１５遺伝子に相補な固定相プローブを用いてＤＲ１５が陰性の患者を選抜することを特徴とする、請求項１に記載の抗体治療及び／又はエンドトキシン吸収剤治療に有効な自己免疫疾患患者の診断方法。
【請求項３】
自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項１又は２に記載の診断方法。
【請求項４】
ＨＬＡ型のＤＲ遺伝子の標識プライマーと、ＤＲ１５遺伝子に相補な固定相プローブを必須の要素として含んでなることを特徴とする抗体治療及び／又はエンドトキシン吸収剤治療に有効な自己免疫疾患患者の体外診断薬。
【請求項５】
ＨＬＡ型のＤＲ遺伝子の標識プライマーと、ＤＲ１５遺伝子に相補な固定相プローブ、および、ＤＲ遺伝子に共通して含まれる遺伝子配列に相補な固定相プローブを必須の要素として含んでなることを特徴とする抗体治療及び／又はエンドトキシン吸収剤治療に有効な自己免疫疾患患者の体外診断薬。
【請求項６】
自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項４又は５に記載の体外診断薬。
【請求項７】
免疫グロブリン及び／又はエンドトキシン吸収剤を含有する、免疫系細胞に表現されるＨＬＡ型のＤＲ遺伝子のＤＲ１５が陰性である自己免疫疾患患者用治療剤。
【請求項８】
自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項７記載の自己免疫疾患用治療剤。
【請求項９】
免疫グロブリンが抗細菌毒素抗体由来のものである、請求項７又は８に記載の自己免疫疾患用治療剤。
【請求項１０】
抗細菌毒素抗体が、抗エンドトキシン抗体、抗リピッドＡ抗体またはスーパー抗原性を有する細菌毒素に対する抗体のいずれか1種またはそれ以上を含有するものである、請求項７乃至９のいずれかに記載の自己免疫疾患用治療剤。
【請求項１１】
抗細菌毒素抗体が乳由来の抗体である、請求項７乃至１０のいずれかに記載の自己免疫疾患用治療剤。
【請求項１２】
免疫系細胞に表現されるＨＬＡ型のＤＲ遺伝子のＤＲ１５が陰性である自己免疫疾患患者に対して、免疫グロブリン及び／又はエンドトキシン吸収剤を含有する治療剤を経口投与することを特徴とする自己免疫疾患の治療方法。
【請求項１３】
自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項１２記載の自己免疫疾患の治療方法。
【請求項１４】
治療剤の投与量が、１日一人当たりヒト免疫グロブリンとして１０ｍｇ〜１０ｇ、乳清蛋白として１ｇ〜１００ｇ、又はエンドトキシン吸収剤として１０ｍｇ〜１０ｇである、請求項１２又は１３記載の自己免疫疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リウマチなどの自己免疫疾患患者のうち抗体治療等の処置が有効に作用する患者を判別するための自己免疫疾患患者の診断方法とこの診断に用いる体外診断薬、及びかかる患者のために使用する自己免疫疾患治療剤及びその治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫機構は、外来微生物はもとより、ガンなどの異常細胞も含めて正常な自己成分とは異なる異物性を識別し、免疫反応してこれらを攻撃・排除することにより、生体の恒常性を維持する機構である。したがって、自己の成分に対しては免疫が成立しないのが正常と考えられている。しかし、正常な免疫機構がバランスを失って失調をきたし、自己成分に対して攻撃・排除するに至ると、多種の難治性疾病を発症する。これらの疾病は総称して、自己免疫疾患といわれ、関節リウマチ、自己免疫性肝炎、自己免疫性胃炎、自己免疫性腎炎、内耳自己免疫病、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性甲状腺炎、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、多発性皮膚筋炎、乾癬、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、ギランバレー症候群などが知られている。【０００３】
また、自己免疫病は、自己に対する免疫応答のほかに、腸内細菌由来の毒素であるエンドトキシンやエンテロトキシンが消化管のバリヤーを通過して体内に移行することによって病気の発症や増悪が引き起こされるとも言われている。【０００４】
関節リウマチは、自己免疫病の中でも最も患者数が多い疾患である。本発明者らは、関節リウマチの予防・治療に資するため、病因の解明をおこなった。関節リウマチの病因は、内的要因として、患者の遺伝的要因が、外的要因として、食物中の異種動物由来のII型コラーゲン、およびエンドトキシン、エンテロトキシンの消化管からの吸収が原因となっているという考えのもとに研究を行なった。【０００５】
II型コラーゲンは関節軟骨を構成するコラーゲンで、皮膚、骨、血管のＩ型コラーゲンとは免疫学的にも抗原性が異なり、関節リウマチ患者においてはII型コラーゲンに対する抗体が多く見出されることから、関節リウマチにおける自己免疫の抗原であると考えられている（非特許文献１参照）。鶏、ウシなどのII型コラーゲンとヒトII型コラーゲンの間には、それぞれの抗体による交差反応が見られることから免疫学的に構造が類似している。このことは、食物中の異種由来II型コラーゲンの摂取に対して抗体を作る個体は、その抗体が自己の関節軟骨に反応し、自己免疫が成立する可能性があることを示唆している。【０００６】
この仮説の検証のために、マウスにおけるコラーゲン関節炎に関して、類似抗原およびエンドトキシンの関節炎誘発活性について、マウスを用いて検討した。ＤＢＡ／１系マウスはII型コラーゲン関節炎を容易に発症する遺伝形質を有するマウスである。このマウスに、ニワトリ由来II型コラーゲン、あるいは熱変性させたものを経口的に与えると、マウスの血液中にはマウスのII型コラーゲンに対する抗体が産生されるとともに、関節炎が発症した。この関節炎はエンドトキシン（別称「リポポリサッカライド」または「ＬＰＳ」という。）の併用で増悪した。またニワトリ由来II型コラーゲンを除いた、エンドトキシンのみの長期投与でも関節炎を発症した（非特許文献２参照）。【０００７】
エンドトキシンが関節リウマチ以外の自己免疫病にも、発症に関わっていることに関しては、自己免疫性溶血性貧血（例えば、非特許文献３参照）、自己免疫性胆管炎（例えば、非特許文献４参照）などに報告されている。即ち、エンドトキシンが関節リウマチ以外の自己免疫疾患に共通して疾病の発症に係っていることは、文献的にも支持されている。【０００８】
エンドトキシン、すなわち消化管内細菌毒素はグラム陰性菌の菌体外膜の構成成分の一つであり、科学的にはリピッドＡと多糖体部分より構成され、ＬＰＳと略称される。ＬＰＳはエンドトキシンショックとして知られる全身性の反応を引き起こす因子としても知られる。ＬＰＳの毒性はリピッドＡ部分にあることが知られている。グラム陰性菌で主として消化管に寄生する細菌としては、大腸菌、サルモネラ菌、エンテロバクター菌、セラチア菌、シゲラ菌、クレブシエラ菌、緑膿菌、プロテウス菌、エルシニア菌、ハフニア菌、モルガネラ菌、バクテロイデス菌、プレボテラ菌、フソバクテリア菌、ポルフィロモナス菌、レプトトリキア菌、バイロフィラ菌、べーヨネラ菌、メガスフェラ菌、アシダミノコッカス菌、カンピロバクター菌、ヘリコバクター菌などがある。【０００９】
マクロファージは細胞表面にＬＰＳの受容体を持ち、ＬＰＳの結合により活性化され、生体防禦機能の一環として、ＴＮＦやＩＬ−６をはじめとする炎症性のサイトカインを放出し、エンドトキシンショックの病態の大きな要因となっている。
また、ＬＰＳと同様な活性を示す他の細菌毒素として、ブドウ球菌のエンテロトキシン類に代表されるスーパー抗原が知られている。エンドトキシンがグラム陰性菌の菌体の構成成分であるのに対し、エンテロトキシンは、菌が分泌する細菌毒素で、化学的にはたんぱく質である。黄色ブドウ球菌が産生するエンテロトキシンは食中毒の原因毒素としてよく知られている。【００１０】
黄色ブドウ球菌エンテロトキシンの毒作用機序の研究から、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンはリンパ球とマクロファージを結び付けて結合する構造を有し、そのために数多くのリンパ球とマクロファージが同時に活性化され、ＴＮＦなどのサイトカインが一斉に産生されることが中毒死亡に至る毒性発現の原因となっていることが知られている。【００１１】
一般に、すべての抗原は、免疫の成立過程において、マクロファージに取り込まれ、抗原の構造情報をリンパ球に提示する過程で、マクロファージとリンパ球は結合し、リンパ球・マクロファージともに活性化し、両者から各種のサイトカインが産生され、リンパ球の細胞分裂・増殖が起こり、免疫が成立する。この場合に、免疫反応に係わるリンパ球は極めて少数であるので、産生されるサイトカイン量は少なく、生理的な異常が起こることはない。ところが、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンは、抗原の場合とは異なり、そのままで多くのリンパ球集団をマクロファージ集団に結びつけて活性化する性質があることから、スーパー抗原ともいわれる。黄色ブドウ球菌が産生するエンテロトキシンとしてはＳＥＡ、ＳＥＢ、その他２０種のスーパー抗原が知られている（例えば、非特許文献５参照）。このようなスーパー抗原としては、黄色ブドウ球菌以外では、スタフィロコッカス  インターメデイウス（Staphylococcus  intermedius）の産生するエンテロトキシン(ＳＥＣ)、Ａ群レンサ球菌が産生する複数の発熱毒素（ＳＰＥｓ）、エルシニア菌の産生するエルシニア・マイトジェン（ＹＰＥＭ）や、マイコプラズマの産生するマイコプラズマ・マイトジェン（ＭＡＭ）などが挙げられる。
このようにスーパー抗原もエンドトキシンと同様にサイトカインの産生を促すことから、関節リウマチその他の自己免疫疾患への関与が研究されている（非特許文献６参照）。【００１２】
本発明者らは、関節リウマチの動物モデルを用いた研究において、消化管内のエンドトキシン、エンテロトキシンの作用は免疫グロブリンを経口摂取させることにより抑制することができることを見出し、関節リウマチの予防、治療および再発予防機能を有することを開示した（特許文献１参照）。本明細書において、いわゆる抗体治療法とは、この特許文献１に記載したように、エンドトキシンやエンテロトキシンなどの細菌毒素に対する抗体、及びこれらの細菌毒素を産生する細菌に対する免疫グロブリンを経口摂取させる治療法である。また、消化管内のエンドトキシンに対してはエンドトキシン特異的吸収剤を経口摂取させることによりマウス関節リウマチモデルにおいて発症を抑制させることに成功し、新規な自己免疫疾患予防治療エンドトキシン吸収剤を開発した（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００６−１５１９１４号公報
【特許文献２】特願２００９−５３３２０６号明細書
【特許文献３】特開平１１−３３５３９６号公報
【特許文献４】特開２００２−２６３４８６号公報
【特許文献５】特開２００２−３１１０２９号公報
【特許文献６】特開２００４−２９２３５７号公報
【特許文献７】特表２００１−５１２１４０号公報
【特許文献８】特開平５−１９２１９８号公報
【特許文献９】特開平８−３０８５９６号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Terato  K.“Clin  Immunol  Immunopath”79  142-154  1996
【非特許文献２】Terato  K  et  al.“Br.  J.  Rheum.”35,828-838,  1996
【非特許文献３】Murakami  M  et  al.“J  Exp  Med.”180,  111-21,1994
【非特許文献４】Ballot  E“J  Autoimmunity”22  153-158  2004
【非特許文献５】重茂克彦「食品衛生」51巻81-90頁2005年
【非特許文献６】Wooley  PH  et  al.“Ann  Rh”
【非特許文献７】Kawai  S  et  al.  Anal  Biochem,  209  63-69  1993
【非特許文献８】Kawai  S  et  al.  Euro  J  Immunogenetics,  (1996)  23  471-486
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者らは、以上のような関節リウマチに代表される自己免疫疾患の発症メカニズムおよびその治療方法に関する研究を踏まえて、臨床治験を実施したところ、このような抗体治療法が有効である患者と、奏効が見られない患者が、患者の遺伝形質を判別することにより可能であることを見出した。
本発明は、このような新たな知見に基づき、自己免疫疾患患者のより適切で効果的な治療を達成するための、患者の診断方法の確立と、かかる診断に用いる体外診断薬、更にはかかる自己免疫疾患の治療剤と治療方法を提供することを目的とするものである。【００１６】
即ち、本発明は、抗体治療及び／又はエンドトキシン吸収剤治療が効果的に作用する患者を判別するための診断方法と、かかる診断に用いる新規な体外診断薬を提供し、更には、このような自己免疫疾患患者、その中でも特に関節リウマチ患者のために特に有効な治療剤と治療方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、抗体の経口投与が関節リウマチの改善に有効に作用する患者と無効な患者について、その属性、臨床検査値等を網羅的に探索し、種々の検討を行なった。その結果、驚くべきことに、ＨＬＡ型のＤＲ遺伝子においてＤＲ１５陰性の患者に抗体の有効例が多いのに対し、ＤＲ１５陽性の患者は無効であるか、有効例が非常に少ないことを見出し、これらの知見を基にして本発明を完成したものである。【００１８】
即ち、本発明は、以下の内容をその要旨とする発明である。
（１）患者の免疫系細胞に表現されるＨＬＡ型のＤＲ遺伝子のＤＲ１５が陰性の患者を選抜することを特徴とする、抗体治療及び／又はエンドトキシン吸収剤治療に有効な自己免疫疾患患者の診断方法。
（２）ＨＬＡ型のＤＲ遺伝子の標識プライマーと、ＤＲ１５遺伝子に相補な固定相プローブを用いてＤＲ１５が陰性の患者を選抜することを特徴とする、前記（１）に記載の抗体治療及び／又はエンドトキシン吸収剤治療に有効な自己免疫疾患患者の診断方法。
（３）自己免疫疾患が関節リウマチである、前記（１）又は（２）に記載の診断方法。
（４）ＨＬＡ型のＤＲ遺伝子の標識プライマーと、ＤＲ１５遺伝子に相補な固定相プローブを必須の要素として含んでなることを特徴とする抗体治療及び／又はエンドトキシン吸収剤治療に有効な自己免疫疾患患者の体外診断薬。
（５）ＨＬＡ型のＤＲ遺伝子の標識プライマーと、ＤＲ１５遺伝子に相補な固定相プローブ、および、ＤＲ遺伝子に共通して含まれる遺伝子配列に相補な固定相プローブを必須の要素として含んでなることを特徴とする抗体治療及び／又はエンドトキシン吸収剤治療に有効な自己免疫疾患患者の体外診断薬。  
（６）自己免疫疾患が関節リウマチである、前記（４）又は（５）に記載の体外診断薬。
（７）免疫グロブリン及び／又はエンドトキシン吸収剤を含有する、免疫系細胞に表現されるＨＬＡ型のＤＲ遺伝子のＤＲ１５が陰性である自己免疫疾患患者用治療剤。
（８）自己免疫疾患が関節リウマチである、前記（７）記載の自己免疫疾患用治療剤。
（９）免疫グロブリンが抗細菌毒素抗体由来のものである、前記（７）又は（８）に記載の自己免疫疾患用治療剤。
（１０）抗細菌毒素抗体が、抗エンドトキシン抗体、抗リピッドＡ抗体またはスーパー抗原性を有する細菌毒素に対する抗体のいずれか1種またはそれ以上を含有するものである、前記（７）乃至（９）のいずれかに記載の自己免疫疾患用治療剤。
（１１）抗細菌毒素抗体が乳由来の抗体である、前記（７）乃至（１０）のいずれかに記載の自己免疫疾患用治療剤。
（１２）免疫系細胞に表現されるＨＬＡ型のＤＲ遺伝子のＤＲ１５が陰性である自己免疫疾患患者に対して、免疫グロブリン及び／又はエンドトキシン吸収剤を含有する治療剤を経口投与することを特徴とする自己免疫疾患の治療方法。
（１３）自己免疫疾患が関節リウマチである、前記（１２）記載の自己免疫疾患の治療方法。
（１４）治療剤の投与量が、１日一人当たりヒト免疫グロブリンとして１０ｍｇ〜１０ｇ、乳清蛋白として１ｇ〜１００ｇ、又はエンドトキシン吸収剤として１０ｍｇ〜１０ｇである、前記（１２）又は（１３）記載の自己免疫疾患の治療方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の抗体治療及び／又はエンドトキシン吸収剤治療に有効な自己免疫疾患患者の診断方法と体外診断薬を用いることによって、関節リウマチに代表される自己免疫疾患患者のＨＬＡ型のＤＲ遺伝子のＤＲ１５が陰性か陽性かを予め診断することにより、本発明による抗体治療及び／又はエンドトキシン吸収剤治療のための治療剤を用いてこれらの患者をより効果的に治療することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
次に、本発明をさらに詳しく説明する。
既に述べたように、関節リウマチに代表される自己免疫疾患がII型コラーゲンやエンドトキシン、エンテロトキシンの消化管からの吸収が原因になっているという発症メカニズムに基づき、本発明者らは、上記抗体を含有する乳清タンパク濃縮物を主原料とする治療剤を関節リウマチ患者に経口投与し、治療効果を調べるとともに、患者のＨＬＡ−ＤＲ分析を行なった。その結果、意外なことにＨＬＡ−ＤＲ１５を有する患者、即ちＤＲ１５陽性の患者には効果が見られないことが多く、ＨＬＡ−ＤＲ１５を有さない患者、即ちＤＲ１５の陰性の患者に有効例が多いということが見出された。
【００２１】
本発明はこの知見に基づき、自己免疫疾患の患者において、ＤＲ１５遺伝子の有無を診断することにより、治療の有効性の確度を飛躍的に高めることが出来る診断方法と体外診断薬に関する発明を確立するに至った。更に、患者の免疫系細胞に表現されるＨＬＡ型のＤＲ遺伝子のＤＲ１５が陰性である自己免疫疾患の患者に対して、免疫グロブリン及び／又はエンドトキシン吸収剤を治療剤として経口投与する治療剤及び治療方法を提供するものである。
【００２２】
ヒト白血球型抗原（Human  Leukocyte  Antigen；ＨＬＡ）とは最も重要な組織適合性抗原（ＭＨＣ）の一つである。一般的に血液型というとＡ、Ｂ、Ｏ、ＡＢ型といった赤血球の抗原型を指すが、ＨＬＡ型は白血球の抗原型を示している。ただし、白血球以外にもＨＬＡは存在するため、現在ではヒト白血球型抗原の名称で呼ばれることはほとんどなく、ＨＬＡと略して呼ばれる。
【００２３】
ＨＬＡは、第６染色体に存在する主要組織適合複合体領域、略してＭＨＣ領域によりコードされた遺伝子群により支配される遺伝子産物である。このＭＨＣ領域は，すべての真核細胞膜表面上に表現されているＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ抗原系を支配するＭＨＣクラスＩ(または「ＨＬＡ−１」と記載される)遺伝子領域と、リンパ球やマクロファージなどの免疫応答を行う細胞において機能する遺伝子で、免疫系細胞にしか表現されていないＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ抗原系を支配するＭＨＣクラスII遺伝子（または「ＨＬＡ−２」と記載される）領域等で構成されている。ＨＬＡ型は、各人固有の遺伝性の抗原で、その組み合わせは数万通りもある。
ＨＬＡ検査は、臓器移植における臓器提供者、即ちドナーと臓器受容者即ちレシピエントとの適合性、ＨＬＡ適合血小板輸血、輸血後ＧＶＨ病の予防、各種疾患の診断の補助や親子鑑定などの際に実施されている。
【００２４】
ＨＬＡ−２の免疫応答における機能については、次の通りである。即ち、病原体または異物が侵入すると、マクロファージ、抗原提示細胞に取り込まれ、分解される。分解物の中から異物由来のペプチドがＨＬＡ−２分子の異物由来ペプチド収納溝に結合した状態で、細胞表面に現われる。一方、リンパ球の中で、異物由来ペプチドが結合したＨＬＡ−２結合物の形にフィットする受容体、即ちＴ細胞受容体を介してマクロファージに結合し、このリンパ球が増殖することにより獲得免疫が成立する。
【００２５】
ＨＬＡ−２遺伝子領域に含まれるＨＬＡ−ＤＲ遺伝子産物は、白血球の抗原分析から、現在のところ血清学的に抗原性の異なるＨＬＡ−ＤＲ１からＨＬＡ−ＤＲ１８の血清型に分類されている。ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子は各種疾患に罹り易さ、または罹り難さとの関連があり、例えば、関節リウマチはＨＬＡ−ＤＲ４を有する人に、潰瘍性大腸炎はＨＬＡ−ＤＲ１に、全身性エリテマトーデスはＨＬＡ−ＤＲ３に多いことが知られている。結核菌感染症はＨＬＡ−ＤＲ２に多いなどである。
特定の自己免疫病や特定の感染性疾患が、特定のＨＬＡ−ＤＲの血清型に多いことは、免疫異常や免疫抵抗性の獲得がＨＬＡ−２遺伝子により支配されていることを示している。
【００２６】
本発明者らは、このようなＨＬＡ−ＤＲ遺伝子と各種疾患との関連性を参考にして鋭意検討した結果、関節リウマチに代表される自己免疫疾患の患者の抗体治療又はエンドトキシン吸収剤による治療に際して、患者のＨＬＡ−ＤＲ１５を有しない患者、即ちＨＬＡ−ＤＲ１５が陰性の患者に対してのみかかる治療法が有効に作用することを見出したものである。
【００２７】
従って、本発明は、患者自身のＨＬＡ−ＤＲ遺伝子のＤＲ１５を判定することによって、抗体治療又はエンドトキシン吸収剤治療が有効に作用する自己免疫疾患の患者を簡便に診断することのできる、抗体治療又はエンドトキシン吸収剤治療に有効な自己免疫疾患患者の診断方法とかかる患者を判別するための体外診断薬である。
【００２８】
また、本発明は、このようなＨＬＡ型のＤＲ遺伝子のＤＲ１５が陰性であるために抗体治療又はエンドトキシン吸収剤治療に有効な自己免疫疾患患者に対して使用する、免疫グロブリン及び／又はエンドトキシン吸収剤を含有するＨＬＡ−ＤＲ１５が陰性の自己免疫疾患用治療剤である。
【００２９】
また、本発明は、このようなＨＬＡ型のＤＲ遺伝子のＤＲ１５が陰性であるために抗体治療又はエンドトキシン吸収剤治療に有効な自己免疫疾患患者に対して、免疫グロブリン及び／又はエンドトキシン吸収剤を含有する治療剤を経口投与するＨＬＡ−ＤＲ１５が陰性の自己免疫疾患患者の治療方法である。
【００３０】
本発明において、ＨＬＡ型の検査方法は一般的に用いられる方法で行うことができ、その方法は特に限定されない。
ＨＬＡ型の検査方法は、大別して抗血清法とＤＮＡタイピング法がある。ＤＮＡタイピング法は、まず、検査対照とするＨＬＡ遺伝子のプライマーを加えてＰＣＲ法により増殖する。増殖させたＨＬＡ遺伝子の抗原型を決める方法は、大別してＤＮＡ塩基配列を決めて判別する方法（特開２００４−２８３１６５号公報）と、相補ＤＮＡをプローブとしてプローブの結合性により判定する方法の２つがある（特許文献９及び非特許文献７参照）。ＤＮＡタイピング法、中でも相補プローブを固定相として抗原型を判別する方法は、多数検体を低コストで実施出来る利点があり、ＨＬＡタイピング試薬のキットも市販されている。
【００３１】
ＨＬＡタイピング試薬のキットでは、血液や口腔内粘膜、毛根から採取した細胞のＤＮＡを抽出し、これにＨＬＡ−ＤＲ遺伝子のプライマーを加えてＰＣＲ法で遺伝子を増幅する。このプライマーには、あらかじめ、ビオチンや蛍光色素を結合させるなどの化学修飾を行なって、標識プライマーとしておくことにより、これを各ＤＲ遺伝子に相補的な配列を持つプローブを固定相として反応させると、標識物質の固定相との結合の有無からＤＲ遺伝子の判別を行なうことができる。
【００３２】
本発明の抗体治療及び／又はエンドトキシン吸収剤治療に有効な自己免疫疾患患者の診断方法及びその体外診断薬は、以下のプロセスを含む方法であり、ここで使用する診断薬である。
（イ）患者のＤＮＡに標識したＨＬＡ遺伝子のプライマーを加えて、ＰＣＲ法で標識された患者のＨＬＡ遺伝子を増殖させる、
（ロ）ＨＬＡ遺伝子が増幅されていることを確認する、
（ハ）別に用意したＨＬＡ１５に特異的な相補プローブを固定相としたものに加え、固定相とハイブリダイズするもの、即ちＨＬＡ-ＤＲ１５陽性のものと、ハイブリダイズしないもの、即ち、ＨＬＡ−ＤＲ１５陰性のものとを標識化合物を利用して識別する、
という３段階のプロセスを含むものである。このうち、（ロ）のプロセスは、通常ＰＣＲ生成物の検出において実施されるように、ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動によるチェックの他に、ＨＬＡ-ＤＲ遺伝子に共通するＤＮＡ塩基配列を相補プローブとして固定化したものを用意し、これとのハイブリダイズの有無を、（ハ）のＨＬＡ−ＤＲ１５の場合と同様な操作を行うことにより目的が達成される。
従って、ＤＲ１５遺伝子の陽性、陰性は、ＰＣＲ反応によるＨＬＡ−ＤＲ遺伝子増幅が確認された条件のもとで、ＤＲ−１５プローブにおける標識化合物の反応が陽性の場合がＨＬＡ−ＤＲ遺伝子が陽性、標識化合物の反応が陰性の場合にＨＬＡ-ＤＲ１５遺伝子が陰性と判定される。
【００３３】
市販のＨＬＡタイピングキットは１３種ＨＬＡ−ＤＲ抗原型を識別するために２４のプローブを用いるが、本発明はＤＲ１５のみで目的が達成できる。
本発明において、体外診断薬キットに使用するＤＲ１５のプローブとなる配列は、Kawaiらの文献に報告されているものである（非特許文献８参照）。即ち、次の表１に示すように、配列名DRB7011J、配列名DRB8601、および配列名DRB8603Jの３種とそれぞれの相補配列が知られている（配列表の配列番号１〜６参照）。表１にはこれらのプローブの反応特異性も示した。
【００３４】
【表１】
2010123069.tif 000002
【００３５】
ＤＲ１５のプローブの選択には、ＤＲＢ７０１１Ｊ単独でもよいが、これに、ＤＤＲＢ８６０３Ｊを併用し２つのプローブとする場合、さらに、これにＤＲＢ８６０１の３種とすることも可能である。ＤＲＢ８６０１を含める場合には、表1に示した如くＤＲ１、ＤＲ１６とも反応するため、反応がＤＲ１５との反応特異性を決めるためには、次の表２に示した配列名のプローブ、またはこれらの相補性配列をプローブとして、反応がＤＲ１またはＤＲ１６ではないことを確認する必要がある。
【００３６】
【表２】
2010123069.tif 000003
【００３７】
この体外診断薬は、ＤＲ遺伝子をＰＣＲ法により増幅して遺伝子検査を行うので、遺伝子が増幅されていることが前提である。ＰＣＲ生成物の検出は通常、ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動によるチェックが行われるが、ＤＲ遺伝子の共通配列をプローブとしたＤＮＡの検出をキットに加えることも可能である。共通配列プローブとしては、TGCAGACACAACTACGGGおよびその相補配列がある（配列表の配列番号７〜８参照）。
【００３８】
本発明の診断方法および体外診断薬に必要とされる固定相は、特許文献８に記載された方法によって、固定相、例えばマイクロプレートに一本鎖核酸として固定化することが好ましい。表１または表２に示したそれぞれの配列を、１つまたはそれ以上を直列に繰り返して含む配列を作り、これをＭ１３フアァージとプラスミドの複合ベクターに組み込み、一本鎖核酸を得る。配列の繰り返しは５〜２００コピーを導入したものであることが好ましい。
【００３９】
本発明の診断方法および体外診断薬にあっては、ＤＲ１５の有無が判別できればその目的が達成されるので、表１に示したＤＲ１５のプローブ３種の任意の１種またはそれ以上の混合物とＤＲ１、ＤＲ１６の７種のプローブの任意の１種またはそれ以上の混合物を固定相として用いることも可能である。３種のＤＲ１５プローブのうち、ＤＲ１またはＤＲ１６と交差反応するＤＲＢ８６０１を用いない体外診断薬とする場合には、ＤＲ１、ＤＲ１６の検出プローブは不要となる。
【００４０】
固定化する担体としては、核酸が非特異的に結合しうる素材、官能基が導入でき、官能基を通じて担体に結合させる素材のいずれでもよい。実際には、合成樹脂製のマイクロプレート、ビーズ、チューブなどを用いることができる。
【００４１】
担体に固定する方法としては、化学結合を介する方法が挙げられる（Nucleic  Acids  Res.,  15，5373-5390（1987））。例えば、アミノ基を導入した樹脂と核酸のアミノ基をグルタルアルデヒドなどの架橋剤を用いて両者を固定化する方法が挙げられる。
【００４２】
非特異的吸着による方法としては、核酸を直接担体に接触させて固定することもできる。例えば、マイクロプレートに核酸溶液を入れ、紫外線照射により効率よく固定することが知られている（特開昭６１-２１９４００号公報参照）。
【００４３】
本発明において、固定化されたプローブと試料ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの反応条件は、基本的には、従来の膜を用いる公知のハイブルイダイゼーションと同様である（Hames  BD,  Higgins  SJ,  Nicleic  Acid  Hybridization,  A  Practical  Approach,  IRL  Press  1985）。
【００４４】
本発明の診断方法および体外診断薬に使用する試料ＤＮＡは、ヒト白血球由来のＤＮＡであることが好ましい。もし、ＤＲ１５遺伝子が含まれているのであれば、検出されるように標識されていることが必要である。標識化の方法としては、（イ）目的核酸に標識物を直接導入する方法、（ロ）標識化されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して目的核酸と相補的な核酸を合成する方法、（ハ）標識化された単位核酸の存在下、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して目的核酸と相補的な核酸を合成するなどがあげられる。これらの方法の中で、特許文献９に記載されているような上記の（ロ）の方法が、標識したプライマーをＰＣＲ法によって増幅生成物として得ることができるので好ましい。
【００４５】
ここで使用する標識物質とは、ハイブリダイゼーション操作後にプローブに結合したＤＮＡを検出できるものであれば放射性、非放射性のいずれでもよい。取り扱いの容易さ、保存性、廃棄処理などの点から、非放射性物質であることが好ましい。非放射性物質としては、たとえば、ビオチン、２．４−ジニトロフェニル基、ジゴキシゲニン基、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、４−フルオレセインイソチオシアネート、ダンシル、アクリジンなどがある。これらによりオリゴヌクレオチドを標識する場合には、いずれも公知手段（特開昭５９-９３０９８号公報参照）により、標識化することができる。
【００４６】
本発明の診断方法および体外診断薬に使用する試料ＤＮＡの標識は、標識化されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ法によって増幅と同時に行われるのが好ましい。プライマーとしては配列TCGTGTCCCCACAGCACGTとCCGTGCACTGTGAAGCTCTがＤＲ遺伝子のＰＣＲ増幅のプライマーであり、それぞれをビオチン化したプライマーが配列名ＤＲＢＡＭ−Ｃ、およびＤＲＢＡＭ−Ｂとして報告されている（非特許文献８参照）。
【００４７】
本発明の診断方法および体外診断薬において、標識プライマーを用いて試料ＤＮＡよりＰＣＲ法により増幅した核酸と、プローブとのハイブリダイズの有無を検出する操作は、プライマーに結合させた標識に応じて適宜選択し、決定することができる。標識がラジオアイソトープ、蛍光物質、色素などの場合には、標識核酸が固相に結合した状態で検出操作を行うか、または、標識物を核酸と結合したまま、あるいは、標識物を核酸から切り離した状態で溶液中に遊離させた後、標識物質に応じた方法により検出操作をおこなう。例えば、標識物がビオチンである場合、通常よく行われている方法として、酵素標識アビジンを反応させることにより、ハイブリダイズ核酸に酵素を結合させたことになり、酵素反応により発色する基質を用いることにより、比色定量により検出が可能となる。
【００４８】
本発明において自己免疫疾患の治療に使用する免疫グロブリン抗体としては、鶏、アヒルなどの卵由来のもの、牛、馬、ヤギ、ヒツジなどの動物の血清由来のもの、牛、ヤギ、ヒツジ、馬、水牛、ラクダなどのいずれの哺乳類の乳由来のものなどを使用することができるが、容易にかつ安全に入手することができる乳由来の免疫グロブリンが好ましい。乳由来のものの場合は、その乳はワクチン接種を受けた哺乳動物から採取された乳でも、ワクチン接種を受けていない哺乳動物から採取された乳でもよい。
【００４９】
例えば、ウシが生乳中に分泌する抗体は、チーズ製造の残留液であるチーズホエー、又はカゼイン製造の残留物である酸ホエーなどの乳清タンパクの中から回収することができる。即ち、乳清タンパクには乳由来の免疫グロブリンが高濃度で含有されるので、これをそのまま本発明における免疫グロブリンとして使用することができる。更には、乳清タンパクは一般の市販品としても販売されており、乳清タンパク濃縮物（ＷＰＣ）、乳清タンパク単離物（ＷＰＩ）、脱塩ホエー粉などの形で使用できる。一般的にこれらの乳清タンパクのなかで免疫グロブリンの含有量の高いものが好ましい。乳清タンパクの中でも乳清タンパク濃縮物（ＷＰＣ）が免疫グロブリンの含有量の高いものが多く見られるので特に好ましい。
【００５０】
本発明においては、免疫グロブリンの中に、抗細菌毒素抗体、即ち、抗エンドトキシン抗体、抗リピッドＡ抗体、及びスーパー抗原活性に対する抗体から選ばれる一種以上の抗体が含まれていることが好ましい。前述したように、細菌内毒素であるエンドトキシン、リピッドＡ、スーパー抗原は微量で免疫系に異常を来たし、関節リウマチの発症に関与するとされており、これらの細菌毒素に対する抗体が含まれていることで、自己免疫疾患に対してより優れた治療効果を発揮することができる。
【００５１】
一般的に、各種の動物には大腸菌を初めとする多種の常在細菌が生息し、もしくは、しばしば感染を繰り返すことにより、自然に免疫されて、これらの菌体や、菌の産生する毒素に対する抗体を有している。これらの抗体は、ワクチンなどの人為的な免疫によらずに産生された抗体という意味で、自然抗体と呼ばれている。エンドトキシン、リピッドＡ、スーパー抗原、エンテロトキシンなどの細菌毒素に対する自然抗体として、抗エンドトキシン抗体、抗リピッドＡ抗体、スーパー抗原活性に対する抗体、抗エンテロトキシン抗体なども血液や乳汁中に検出されるので、これらの自然抗体が本発明の抗細菌毒素抗体として利用することができる。これらの抗体が、対応する毒素に結合すると、毒素の毒作用は失われる。これらの抗体の量を測定するために今日通常行われる方法として、実施例１に記載したごとく酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）がある。
【００５２】
本発明において、ＨＬＡ−ＤＲ１５が陰性である自己免疫疾患患者用の治療剤を製剤設計するに際しては、エンドトキシンに対する抗体を指標として設計する場合は、大腸菌Ｏ−１１１由来エンドトキシンに対する抗体が、１日分の摂取量中に４μｇ以上含まれているように、スーパー抗原に対する抗体を指標に設計する場合には、ブドウ球菌エンテロトキシンＢが同様に４μｇ以上、リピッドＡに対する抗体を指標に設計する場合には、同様に２μｇ以上になるように製造することが、治療効果を得るために好ましい。
【００５３】
本発明において、ＨＬＡ−ＤＲ１５が陰性である自己免疫疾患患者に対して免疫グロブリンを含有する治療剤を経口投与することによって治療する。その投与量は、有効成分の免疫グロブリンとして１０ｍｇ〜１０ｇである。免疫グロブリンを含有する治療剤として乳清タンパク濃縮物を投与する場合には、その一日の投与量は１ｇないし１００ｇであり、より好ましくは１ｇないし５０ｇである。一日の投与量が１ｇより少ないと十分な効果が得られず、また、１００ｇより多いと摂取するときの負担が大きくなる。
【００５４】
本発明の方法によりＨＬＡ−ＤＲ１５が陰性であると判別された自己免疫疾患患者に対しては、免疫グロブリンおよびこの抗体を含有する乳清タンパク濃縮物をそのまま摂取しても良いが、他の食品原料、食品添加物と混合、加工された食品として摂取しても良い。食品としては、様々な形態の食品があるが、例えば加工乳、乳飲料、ヨーグルト、乳酸菌飲料等の乳製品、果汁飲料、野菜汁飲料、清涼飲料等の嗜好飲料、錠菓、キャンディ、チョコレート、シリアル、チューインガム等の菓子類、アイスクリーム、プリン、ゼリー、ババロア等のデザート類、クリームチーズ、マヨネーズ、ピーナッツ、コンデンスミルク等のスプレッド、ココア、抹茶粉末、ふりかけ等の粉末食品、等を挙げることができる。これらのうち、その製造工程中で６５℃で３０分相当以上の加熱を受けていない加工食品であるほうが、抗体が多く残存するのでより好ましい。また、いわゆる免疫グロブリン抗体を含有する健康食品の形で摂取しても良い。
【００５５】
本発明の方法によって判別されたＨＬＡ−ＤＲ１５が陰性である自己免疫疾患患者用の治療剤として、免疫グロブリンのほかに、人体に安全に服用でき、消化管内のエンドトキシンを除去できるエンドトキシン吸収剤も有効である。
【００５６】
抗体は医薬品として用いるためには、大量生産が困難で、高額の生産コストがかかる。さらに、抗体は熱により活性が失われやすく物性が不安定で、たんぱく質であるために、経口摂取では消化酵素による抗体活性の失活などの問題点があり、経済的のみならず物性的に問題点が大きい。そこで、抗体に代わるものとして、物性が安定で大量生産可能、かつ低価格であるとともに、安全性のも問題のない除去剤として、本発明のエンドトキシン吸収剤が有用である。
【００５７】
注射剤などの製造にあたっては、微量であってもエンドトキシンの存在は発熱などの副作用の原因となるので、エンドトキシンを十分に除去する必要がある。そのために、エンドトキシンの特異的な除去剤が工業的に使用されている。これは、エンドトキシンに高い親和性を有する分子基を結合させた合成繊維や布、粒子による形成物であり、エンドトキシンを除きたい溶液にこれを接触させることによりエンドトキシンのみを特異的に吸収させ、エンドトキシンを除くことが出来る。
【００５８】
本発明に使用するエンドトキシン吸収剤も原理としては同じで、消化管内のエンドトキシンの除去を同様のメカニズムで作用するが、更に、経口摂取に適した物性とともに摂取して人体に安全であることが必要である。また、消化管に生息する細菌は１００兆個といわれ、ＬＰＳ保有腸内細菌も膨大な量があるので、ＬＰＳ除去活性が高いものであることが要求される。本発明に使用するエンドトキシン吸収剤は、これらの問題点にも対応し、エンドトキシン吸収活性と安全性の両面から、人体使用に適した新規エンドトキシン吸収剤である。
【００５９】
エンドトキシンの毒性活性は分子中のリピッドＡと呼ばれる脂質部分である。本発明に使用するエンドトキシン吸収剤は、エンドトキシンのリピッドＡと結合することのできるリピッドＡ結合分子とこれを担持する細粒子によって構成されている。このエンドトキシン吸収剤を摂取して、消化管内のエンドトキシンを吸着し便中に排泄させ、リウマチをはじめとする自己免疫疾患を予防、治療することができるものである。
【００６０】
本発明のエンドトキシン吸収剤におけるリピッドＡ結合物質としては、ペプチド抗生物質であるポリミキシンＢやＬＰＳ結合性を有する各種のペプチドが知られている。ポリミキシンＢとは、バチルス  ポリミキサ菌が産生する分子量１２００の塩基性ポリペプチド抗菌抗生物質で、これに類似した多くの化合物が報告されている。詳しくは、前記特許文献３〜７に記載されている。これらのいずれも本発明の目的のリピッドＡ結合物質として使用できる。
【００６１】
リピッドＡ結合物質を担持する担体としては、形状は服用に適した粒子または微粉末で、担体の素材としては、セルロース、アガロース、マンナン、グルカン、キチンなどの多糖体とそれらの誘導体、アクリル系、ポリスチレン系、ポリプロピレン系、ポリアミド系、ポリビニール系、などが挙げられる。
【００６２】
担体にリピッドＡ結合物質を共有結合させる方法は特に限定されるものではなく、固定化酵素の一般的な架橋試薬、例えば水溶性カルボジイミド試薬であるＥＣＤＩ、ヘキサメチレンジイソシアネート、２個のエポキシ基を有するプロピレングリコールジグリシジルエーテル、エピクロルヒドリンを用いることができる。
【００６３】
リピッドＡ結合物質と担体の結合物は無害であること、体内移行がないこと、胃酸やひとが分泌する消化酵素のみならず、消化管内の微生物により分解、変性を受けないものであることが望ましい。
【００６４】
ＬＰＳは分子量1万を上回る高分子で、ＬＰＳの吸着は主として担体粒子の表面であると考えられ、表面積が大きいことが要求される。そのためには、粒子粉末は小さい径であるほど活性が高くなる。しかし、粒子径が一定以下に小さくなると、消化管リンパ組織に貪食される安全性上の不都合が生ずる。そのため粒子径の下限は５μｍである。さらに、服用に際しては、服用しやすい粒子であることが望ましく、上限は５０μｍ程度のものが好ましい。そのための担体の粉砕は一般的な樹脂の粉砕技術を用いればよく、例えば、衝撃式、スクリーン式、摩砕式等の乾式法、媒体撹拌式等の湿式法が利用できる。
【００６５】
リピッドＡ結合物質と担体の結合物は、人が服用して用いるために、経口摂取で用いる一般の医薬品としての製剤、例えば、末剤、散剤、カプセル剤、錠剤、液剤として用いられる。これらの製剤は、通常の方法で、薬学的に許容される賦形剤、添加剤と共に各種製剤にすることができる。
また、治療予防の投与量、投与回数は通常は成人に対し、1日当たり約１０ｍｇ〜１ｇを1回〜３回に分けて投与することができる。
【００６６】
次に、本発明を実施例によって更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００６７】
以下の実施例において、免疫グロブリンの定量とＥＬＩＳＡによる抗細菌毒素（ＬＰＳ、ＳＥＢ、リピッドＡ）抗体の測定は次の方法によった。
免疫グロブリンの定量は、The  Binding  Site社（Birmingham，  U.K.）のBovine  IgG-NL  RIDキットを用い、一元平板免疫拡散法により総ウシＩｇＧ抗体含有量を測定した。【００６８】
ＥＬＩＳＡプレート（Nunc  439454）に、ＬＰＳ、ＳＥＢはそれぞれ０．１ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で、リピッドＡはクロロホルムとメタノールが４：１混合液に溶解後、メタノールで希釈し、ウェルに加え抗原をコートした。抗原なしのウェルには炭酸緩衝液またはメタノールを添加した。トリスアミノメタン、塩化ナトリウムを含むヤギ血清でブロックを行った。次に検量線作成のための精製抗大腸菌（E.  coli  O111）ＬＰＳ抗体、検体としたＷＰＣ溶液をブロック液で希釈し、ウェルに加え反応させた。第二抗体にはビオチン標識抗ウシＩｇＧヤギ抗体（Jackson  ImmunoResearch）を使用した。次に、アビジン結合パーオキシダーゼ（ExtrAvidin-Peroxidase、SIGMA社製）を反応させ、酵素基質として3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine溶液を添加し室温で１０分反応させた。その後、３％（v/v）塩酸で酵素反応を停止し、マイクロプレートリーダー（Bio  Rad社製、Model  550）で４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。抗体量は計量ソフトMicroplate  Manager  III（Bio-Rad社製）により算出した。抗原をコートしたウェルと抗原をコートしないウェルにおける計測値の差をその検体濃度における抗体の濃度とした。抗体含有量は検体希釈倍数を乗じてＷＰＣ１ｇ中の含有量として表した。【００６９】
（1）免疫グロブリン標準品の調製
抗体の定量的測定のための標準品として、大腸菌E.  coli  O111:Ｂ４株の加熱菌を油性アジュバント処理して妊娠ウシに免疫し、その初乳よりＬＰＳ抗原カラムとプロテインＧカラム（HiTrap  Protein  G  HP，Amersham  Bioscience製、Sweden）を用いて抗E.  coli  O111  ＬＰＳ抗体を精製した。精製する抗体溶液をカラムに流し、抗体のみカラムに吸着させ、カラムに吸着しない免疫グロブリンなどを中性バッファーで洗い出した。カラムに結合した抗ＬＰＳ抗体はｐＨ２．７の０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液で溶出した。溶出液を中和し、さらにプロテインＧカラムにかけた。精製品を得るため、ＬＰＳ抗原カラムとプロテインＧカラムによる精製を３回繰り返した。タンパク当たりのＥＬＩＳＡにおけるＬＰＳ抗体活性は３回以上の精製で比活性の上昇は見られなかった。この標品はアクリルアミドディスク電気泳動で単バンドであった。この精製抗体を免疫グロブリンの標準品とした。【００７０】
（2）粉末状乳清タンパク濃縮物含有粉末組成物の調製
乳清タンパク濃縮物（ＷＰＣ）であるProliant  8000（登録商標、James  Farrell＆Co.製）の６質量部に対して、フラクトオリゴ糖であるメイオリゴ  Ｐ（登録商標、明治製菓製）３質量部、乳清カルシウム（森永乳業製）０．８質量部、粉末セルロースであるＫＣフロック  Ｗ−３００Ｇ（登録商標、日本製紙ケミカル製）０．２質量部を混合し、１包１０ｇの粉末状の自己免疫疾患治療剤の組成物を作製した。この組成物は１包あたり２４３ｍｇのウシＩｇＧ免疫グロブリンを含み、細菌毒素に対する抗体については、上記の方法によって調べたところ、大腸菌Ｏ−２６由来エンドトキシンに対する抗体が７７μｇ、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢに対する抗体が１１μｇ、リピッドＡに対する抗体が６μg含有されていた。【００７１】
（3）錠剤型組成物の調製
表３に示した組成の乳清タンパク濃縮物を含む原料と、全組成物質量の１０％程度の水をＶ型ブレンダー中で混合し、ペレッターで造粒後、棚式乾燥機を用い水分量が６％となるまで乾燥した。ロータリー式打錠機により１．５トン／ｃｍ２の圧力をかけて、一錠あたり２ｇとなるように円形（直径２０ｍｍ、厚さ５ｍｍ）に打錠成形し、錠剤型の関節リウマチ治療剤組成物とした。この錠剤型の関節リウマチ治療剤の３錠中には、乳清タンパク濃縮物が４．５ｇ、大腸菌Ｏ−２６由来エンドトキシンに対する抗体は６μｇ含まれていた。【００７２】
【表３】
2010123069.tif 000004
【００７３】
（4）関節リウマチ患者のＨＬＡ型ＤＲ１５の判定による診断
リウマチ科クリニックにおいて、表４に示す治療中の関節リウマチ患者１７名（男１名、女１６名、年齢３１〜８０才、平均６０才、病歴０．２年〜３０年、平均９．７年）を対象として、次のようにしてまず各患者のＨＬＡ型ＤＲ１５の判定を行った。
即ち、ＥＤＴＡを加えたチューブに患者の血液を約５ｍＬ採血した。この１ｍＬをGen  TLE  solution  I(タカラハ゛イオ製)５ｍＬを入れた１０ｍＬプラスチック容器に加え、直ちにボルテックスした後１０分静置した。毎分１２０００回で１０分間遠心し、上澄みを除き、沈殿にGen  TLE  solution  IIの１０ｍＬを加え３回転倒混和し、毎分１２０００回で５分間遠心した。上澄みを除きGen  TLE  solution  IIIの５ｍＬを加え、２０秒間ボルテックスし、上澄みを新しい１０ｍＬ容器に移した。これにイソプロパノール５ｍＬを加え、転倒混和した。毎分１２０００回転で１０分間遠心し、上澄みを除き、ＤＮＡの沈殿を得た。このＤＮＡはさらに７０％エタノール、次いで１００％エタノール各１０ｍＬで遠心洗浄した。ＰＣＲバッファー（２０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭｐＨ８．８のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）１ｍＬに溶解し、２６０ｎｍの吸光度は約１であった。【００７４】
次に、ＰＣＲによるＨＫＡ抗原遺伝子の増幅は、市販キット（湧永製薬製、ＭＰＨ−２ＨＬＡタイピング試薬  ＨＬＡ−ＤＲ）を用いて、以下のようにして行った。抽出したＤＮＡの５μＬを、デオキシヌクレオシド三リン酸である増幅液（クラスII）８５μＬ、ビオチン標識ＤＲ抗原プライマー液９．５μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ液０．５μＬの混合液計９５μＬを含むＰＣＲ用チューブに加え、ＰＣＲ装置（Takara  PCR  Thermal  Cycler  モデル  TP100）にセットし、９６℃、５分の加熱後、１サイクルが９６℃で３０秒、６２℃で1分、次に７２℃で1分として、計４０サイクル繰り返し、最後に４℃に冷却し、ＰＣＲ反応を終了し、増幅ＤＮＡ液を得た。【００７５】
増殖させたＨＬＡ−ＤＲ遺伝子のプローブとのハイブリダイゼーションと検出は以下のごとくに行った。
増殖させたＤＮＡを１本鎖に変性するために、内容積１．５ｍＬの変性用チューブにキット添付のアルカリ変性液３００μＬを入れた。次いで、ＰＣＲ反応終了後の増幅ＤＮＡ液９０μＬを加えて混和し、常温で５分間放置した。これに、氷上で冷やしたキット添付の中和液９００μＬを加え混和し、氷上に放置した。キットは1検体あたり、２４穴にＨＬＡ−ＤＲ抗原ＤＮＡのプローブが２枚の９６穴プレート、ＨＬＡ−ＤＲプレート１、およびＨＬＡ−ＤＲプレート２の各Ｎｏ．１ウエルからＮｏ．１２ウエルの２４穴に５０μＬずつ分注し、液の蒸発を防ぐためにシールした後、３７℃のインキュベーターに６０分放置し、プローブとの反応を待った。各ウエルを常温の洗浄液３００μＬで３回洗浄した。ビオチン標識にストレプトアビジン結合ＨＲＰ酵素を結合させるために、あらかじめ３７℃に温めておいた酵素溶液５０μＬを加え、３７℃のインキュベーター内に１５分放置した。各ウエルを洗浄液３００μＬで３回洗浄した後、あらかじめ３７℃に温めておいた発色基質ＡＢＴＳ液の５０μＬを各ウエルに分注し、３７℃のインキュベーター内に１５分置いた。次いで、キット附属の反応停止液５０μＬ加え、ＥＬＩＳＡプレートリーダー  ＢｉｏＲａｄ  モデル５５０により４１５ｎｍでの吸光度を測定した。キット用の判定ソフトにより、各プローブにおける発色吸光度のカットオフ値を元に判定し、ＨＬＡ−ＤＲ抗原型を決めた。その結果を表５に示した。【００７６】
（5）関節リウマチ患者への薬物投与試験
このＤＲ１５が陰性の患者９名、ＤＲ１５が陽性の患者８名の計１７名の患者に対して、上記(2)で作製した関節リウマチ治療剤組成物を１日１０ｇ（乳清タンパクとして６ｇ）、３ヶ月間摂取させた。１ヶ月ごとに圧痛関節数（ＴＪＣ)、腫脹関節数（ＳＪＣ)、急性期蛋白（ＣＲＰ）、赤血球沈降速度（赤沈、ＥＳＲ）、リウマチ因子、メタロプロテナーゼー３（ＭＭＰ３）、身体機能評価（ｍＨＡＱ）、患者による疼痛評価（ＶＡＳ−１）、患者による全般的活動性評価（ＶＡＳ−２）、医師による全般的活動性評価（ＶＡＳ−３）、を行い、ヨーロッパリウマチ会議基準疾患活動性ＤＡＳ２８（ＥＳＲ）、ＤＡＳ２８(ＣＲＰ)を測定するとともに、患者の愁訴を加え、医師の臨床総合臨床評価を行って、乳清タンパク抗体の関節リウマチ患者における有用性の評価を行った。また、摂取開始前に血液を採取し、白血球ＨＬＡ型の検査、血清ＴＮＦ値、血清ＩＬ−６値、関節軟骨コラーゲン抗体、抗大腸菌ＬＰＳ抗体の測定を行った。【００７７】
なお、このリウマチ治療剤組成物を投与する前の各患者の病状は表４の通りであり、ＤＲ１５が陰性の患者のほうがＤＲ１５が陽性の患者に比べて病状が重く、各患者のサイトカインレベル、抗コラーゲン抗体レベル、抗大腸菌抗体レベルは表５の通りであり、ＤＲ１５が陰性の患者のほうがＤＲ１５が陽性の患者に比べて大腸菌に対する抗体が多かった。【００７８】
【表４】
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【００７９】
【表５】
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【００８０】
（6）試験結果およびその評価
この薬物投与試験の効果の判定は、次の基準により評価した。即ち、関節リウマチの病態評価に通常実施される８つのカテゴリーの検査項目、即ち、腫脹関節数（ＳＪＣ），疼痛関節数（ＴＪＣ）、急性期反応物質（ＣＲＰ）、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、関節破壊マーカー（ＭＭＰ３）、患者全般活動性評価（ＶＡＳ−２）、医師による全般活動性評価（ＶＡＳ−３）、身体機能評価（ｍＨＡＱ）の各項目において２０％以上の改善が３ヶ月間継続している場合をポイント１とし、ポイント１が３検査項目回以上ある場合、即ちポイント３以上のものを有効と判断した。これらの結果をまとめて表６に示す。【００８１】
また、ポイント３以下であっても、医師の総合判定(ＶＡＳ−３)において２０％ないしそれ以上の改善が得られ、且つ、一般健康指標、貧血、疲労感、薬剤の減量を可能にしたなどの条件を総合的に勘案して、やや有効としたものに患者７と患者８の２つの症例があった。(表６、症例７，８)【００８２】
これらの１７名の患者を白血球型ＨＬＡ−ＤＲ１５の有無で２群に分け、乳清タンパク抗体を含む治療剤摂取前の患者暦を表４、表５に示した。
治療開始前の２群を比較すると、患者年齢、罹患期間、リウマチ因子には有意な差は認められないが、関節リウマチの重症度（越智分類）において、ＨＬＡ１５陰性群に多関節型やムチランス型が多く、重い病状であった。疾患活動性の指標となるＤＡＳ２８の値は，ＤＡＳ２８（ＣＲＰ），ＤＡＳ２８（ＥＳＲ）ともに白血球型ＨＬＡ−ＤＲ１５が陽性の患者に比べて、ＨＬＡ−ＤＲ１５が陰性の患者群では有意に高く、病状が悪いことを示していた。ｍＨＡＱは患者の日常生活のｍＨＡＱ（身体機能）の評価値では、統計的に有意ではない、（ＤＲ１５陰性群１２．２±７．２対ＤＲ１５陽性群６．４±６．６、ｐ＝０．１１７）が、ＤＲ１５陰性群の患者で大きく、骨破壊の程度についてもＤＲ１５陰性群において２＋がみられるなど、病状が悪いことを示していた。【００８３】
次に、この１７例の患者における乳清タンパク抗体を３ヶ月投与後の効果を、ＨＬＡ−ＤＲ１５の有無により２群に分け、それぞれの評価結果を表６に示した。
関節リウマチ薬物療法剤による治療効果の評価は、通常、各検査項目について、薬物使用前後における各検査の測定値より、その変化率％｛（前値−後値／前値）×１００｝をしらべ、２０％以上の改善が認められる場合を、其の検査について改善があったと認めることが通常実施されている。表６には、２０％以上の改善が得られた場合を太字で示した。【００８４】
【表６】
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【００８５】
表６の結果から、２０％以上の改善を示す変化率（太字で示した）はＤＲ１５陰性群に多いことが一見してわかる。すなわち、ＨＬＡ−ＤＲ１５陰性群において乳清タンパク抗体の効果は、９患者１０検査項目計９０評価ポイントにおいて、変化率２０％以上のポイントは４４（＝４４/９０）であったのに対し、ＨＬＡ−ＤＲ１５陽性群のそれは１１／８０で、ｐ＜０．０１で有意であった。また、変化奏功する結果が得られた検査８項目すなわちＴＪＣ、ＳＪＣ、ＣＲＰ、ＥＳＲ、ＭＭＰ−３、ｍＨＡＱ、ＶＡＳ−２、ＶＡＳ−３の和を表６の評価点スコアーの欄に示した。評価点のＤＲ１５陰性群の平均±評価点スコアーが４．０±２．８７であったのに対し、ＤＲ１５陽性群のそれは１．１±１．７で、統計検定の結果を最下段に示したごとく、ｐ＝０．０２５と有意な差であった。  さらに、表６の代表的な改善点の欄に示した全身症状を加味した最終評価により、ＤＲ１５陽性群が１／８例にて有効であったのに対し、ＤＲ１５陰性群では８／９例にて有効であった。【００８６】
以上の結果は関節リウマチ患者に乳清タンパク抗体を用いるにあたっては、まず患者のＨＬＡ型ＤＲ１５の判定による関節リウマチ患者の診断を行い、ＤＲ１５が陰性の患者を選ぶことにより、このような患者に対して乳清タンパク抗体が効果的に作用し、関節リウマチ患者をより効果的に治療できることが分かった。
【実施例２】
【００８７】
ＨＬＡ−ＤＲ１５鑑別用の体外診断薬の作成
特許文献８（特開平５−１９２１９８号公報）に開示された方法に基づき、ＤＲ１５遺伝子のプローブとして、表１のＤＲＢ７０１１Ｊ及びＤＲＢ８６０３Ｊの配列について、また共通プローブ（Ｃｏｍｍｏｎ）としてはＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＡＧＧＧ配列について、それぞれの配列が約５０回繰り返された配列を含む一本鎖ＤＮＡを調製した。得られた一本鎖ＤＮＡをマイクロタイタープレートに次のようにして固定した。まず、０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍトリス−塩酸、および０．１５Ｍ塩化マグネシウム（ｐＨ８．０）溶液にＤＲＢ７０１１Ｊ及びＤＲＢ８６０３Ｊ由来の一本鎖ＤＮＡがそれぞれの濃度が４μｇ／ｍＬになるように、この２プローブの混合溶液とした。また、共通プローブ由来の一本鎖ＤＮＡは、４μｇ／ｍＬ溶液とした。これらの一本鎖ＤＮＡ溶液を、マイクロタイタープレートに１ウエル当たり１００μＬずつ加えた。プレートにふたをして３７℃で１６時間放置した後、ウエル内の液を除き、３０分間３７℃に放置し乾燥した。乾燥プレートは５×１０５μＪの紫外線照射をＵＶ照射装置（Stratalinker  2400  (Stratagene,  La  Jolla,  CA）)を用いて行った後、洗浄緩衝液０．２ｍＬ（１Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス−塩酸、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．１％ツイーン２０（ｐＨ９．３））で３回洗浄し、使用時まで４℃の温度で放置した。
このようにしてウエル内の固定相にＤＲ１５遺伝子のプローブと共通プローブが固定された本発明の抗体治療及び／又はエンドトキシン吸収剤治療に有効な自己免疫疾患患者の体外診断薬を得た。【００８８】
次に、ヒト白血球より抽出したＤＮＡをサンプルとして、段落番号[００４６]に記載した配列名ＤＲＢＡＭ−Ｃ及びＤＲＢＡＭ−Ｂの配列をビオチン標識プライマーとして、ＰＣＲ法により３０サイクルの増殖を行った。得られた増幅物を９６℃で１０分加熱し、急速氷冷により熱変性した後、その５μＬをハイブリダイゼーション溶液（０．７５Ｍ食塩、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム、塩酸添加によりｐＨ７．０溶液としたもの）の１００μＬが入れられた、本発明の体外診断薬である上記の一本鎖ＤＮＡが固定されたウエルに添加し、５８℃で１時間放置してハイビブリダイズした。ウエル液を捨てた後、マイクロプレート洗浄機を用いて、６５℃に加温したＴＭＡＣ溶液（３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム、５０ｍＭトリス−塩酸、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）３００μＬで３回洗浄した。さらにウエルを３００μＬの酵素希釈液（０．１Ｍ食塩、０．１Ｍトリス−塩酸、２ｍＭＭｇＣｌ２、０．０５％ツイーン２０、ｐＨ７．５液）により３回洗浄した。次いで、酵素希釈液で５０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識アビジンを１００μＬ加え、室温にて１５分間放置した。液を除いた後、酵素希釈液３００μＬで３回洗浄した。発色基質(ＡＢＴＳ)液（１．５ｍＭ  ２,２’−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホニックアシッド）ジアンモニウム、０．０１５％過酸化水素水、０．２Ｍ酒石酸緩衝液  ｐＨ４．４）を加え、１５分室温で反応させた後、４１５ｎｍの吸光度を測定した。【００８９】
表４に示した１７例の患者について、ここで得られた本発明による体外診断薬キットによる診断を行い、ＤＲ１５の陰性（−）及び陽性（＋）の診断を行った。その結果は表７に示したとおりであり、各患者のＤＲ１５陰性・陽性の判定がなされ、これは実施例１によるＤＲ型診断に基ずく結果と同じであり、抗体治療又はエンドトキシン吸収剤治療が奏功する自己免疫疾患患者を診断することができた。【００９０】
【表７】
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【実施例３】
【００９１】
エンドトキシン吸収剤の調製例
（1）エポキシアクリル樹脂ポリミキシンＢ結合体ＲＰＭＢ
硫酸ポリミキシン３００万単位（ファイザー株式会社製）を０．１ＭＮａＣｌ溶液２００ｍＬに溶かし、水酸化ナトリウムを加えてｐＨを８に調整し、ビーカーに入れた。これにエポキシ活性基を有するポリアクリル樹脂（アンバーザイム；米国ロームアンドハース社製）４ｇを加え、攪拌プロペラで７２時間攪拌した。樹脂を５μｍメンブレンフィルター上で精製水１０００ｍＬで洗浄し、あらかじめ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ８．０に調整した１Ｍグリシン溶液５０ｍＬを含むビーカーに入れ、一夜置き、ろ過した後、精製水２リットルを流して洗浄した。樹脂に残留する水分はデシケータ内に置いて乾燥させ、エポキシアクリル樹脂ポリミキシンＢ結合体であるポリミキシン結合樹脂（以下球状ＲＰＭＢとする）３．９ｇを得た。【００９２】
（2）エポキシアクリル樹脂ポリミキシンＢ結合体ＲＰＭＢ−１
エポキシ活性基を有するポリアクリル樹脂（商品名：アンバーザイム、米国ロームアンドハース社製）４ｇを乳鉢にいれた。硫酸ポリミキシンＢ３００万単位を０．１ＭのＮａＣｌ溶液２００ｍＬに溶かし、水酸化ナトリウムを加えてｐＨを８に調整した。調整したポリミキシン溶液を少量ずつ加え、乳棒を用いて樹脂を擂り潰した。すべてのポリミキシン溶液を加え、７２時間マグネチックスタラーで攪拌した。樹脂を５μｍメンブレンフィルター上で精製水１００ｍＬを注いで洗浄し、これをあらかじめ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ８．０に調整した１Ｍグリシン溶液５０ｍＬを含むビーカーに入れ、一夜放置し、ろ過した後、精製水２リットルを流して洗浄した。樹脂に残留する水分はデシケータ内に置いて乾燥させ、エポキシアクリル樹脂ポリミキシンＢ結合体であるポリミキシン結合樹脂（ＲＰＭＢ-１）３．２ｇを得た。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
関節リウマチ患者などの自己免疫疾患の患者について、本発明の体外診断薬によって患者の診断を行ない、予め患者のＨＬＡ型ＤＲ１５が陰性か陽性かを判定し、ＤＲ１５が陰性の患者に対して本発明の抗体治療剤またはエンドトキシン吸収剤を投与することによって、より効果的に自己免疫疾患の患者の治療を行うことができ、この分野での自己免疫疾患の患者の効果的な治療に有用である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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