(57)【要約】  SCA36型変異を有するニューロン内で自発的に生じるRNAfociを、NOP56  pre-mRNAの切断を誘導することなく、効果的に抑制することができるASOの提供を目的とする。  配列番号２で表される塩基配列が１回以上連続した塩基配列を有し、NOP56遺伝子のpre-mRNAと相補的なオリゴヌクレオチドであって、前記pre-mRNAにハイブリダイズして形成される構造体がRNaseH耐性であること、を特徴とするオリゴヌクレオチド。
2018212271.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表される塩基配列が１回以上連続した塩基配列を有し、NOP56遺伝子のpre-mRNAと相補的なオリゴヌクレオチドであって、
前記pre-mRNAにハイブリダイズして形成される構造体がRNaseH耐性であること、
を特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
デオキシヌクレオシドを４ヌクレオシド以上連続して含まないことを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
糖部修飾ヌクレオシドを全ヌクレオシド中２０％以上含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記糖部修飾ヌクレオシドが、2’位修飾型ヌクレオシド、架橋型ヌクレオシド、及び置換型ヌクレオシドから選ばれる１種以上の糖部修飾ヌクレオシドである、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記2’位修飾型ヌクレオシドが、2’-フルオロヌクレオシド、2’-O-メチルヌクレオシド、及び2’-O-メトキシエチルヌクレオシドから選ばれる１種以上の2’位修飾型ヌクレオシドである、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記架橋型ヌクレオシドが、BNA、ENA、LNAから選ばれる１種以上の架橋型ヌクレオシドである、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記置換型ヌクレオシドが、モルフォリノである、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
少なくとも１以上の修飾されたヌクレオシド間結合を有する、請求項１−６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記修飾されたヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
１８−３０ヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項１−９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号４または１０で表される塩基配列を有することを特徴とする、請求項１−１０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１−１１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含む、脊髄小脳変性症３６型の予防又は治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１７年５月１８日付け出願の日本国特許出願２０１７−０９９３７４号の優先権を主張しており、ここに折り込まれるものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、脊髄小脳変性症36型の予防又は治療用組成物に関し、さらに詳しくは、NOP56遺伝子を標的とするアンチセンス核酸を用いた前記組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
脊髄小脳変性症（Spinocerebellar  ataxia:SCA）は、運動失調を主要症候とし、小脳及び脳幹から脊髄にかけての神経細胞の変性・脱落を伴う神経難病である。我が国では約3万人の患者が把握されており、そのうちの約30％は遺伝性である。【０００４】
遺伝性の脊髄小脳変性症は、その原因遺伝子ごとに分類されており、現在までに1型〜36型まで報告されている。このうち、36型（Spinocerebellar  ataxia  type  36:SCA36）は日本で見出された疾患であり、NOP56遺伝子のイントロン１内に存在するGGCCTG（配列番号１）リピートの異常伸長が原因であることが明らかにされている（非特許文献１、２）。さらに、SCA36型の患者の剖検組織の解析から、患部のニューロンでは特異的に、NOP56  pre-mRNA内の前記リピート領域を核として他RNAやタンパクが凝集した構造体（RNA  fociと呼ばれる）が形成されることが報告されており、このRNA  fociの形成が発症に深く関わると考えられている（非特許文献３）。特定遺伝子内のリピート配列の異常伸長を原因とする神経変性疾患では、病変部位のニューロン内でRNA  fociが形成される場合が多く（例として、非特許文献４）、当該モデル動物において前記RNA  fociの形成を抑制すると、症状が改善することが知られているからである（例として、非特許文献５）。【０００５】
一方、近年の核酸医薬品に係る技術の進歩は目覚ましく、抗体医薬品に続く次世代医薬品として大きな期待を集めている。
核酸医薬品とは、一般に、「核酸あるいは修飾型核酸が直鎖状に結合したオリゴ核酸を薬効本体とし、タンパク質を介さずに直接生体に作用し得るもので、化学合成により製造される医薬品」のことである。核酸医薬品のうち、細胞内部で機能するものとしては、アンチセンスオリゴヌクレオチド（以降、ASOと略記する場合がある）やsiRNAが挙げられ、既に複数のASOが医薬品として承認されている。【０００６】
ASOは、その作用機序の違いから、Gapmer型とBlock型に大別されている。
Gapmer型ASOとは、RNaseHによる標的RNAの切断を誘導し得るASOである。RNaseHは、細胞内に普遍的に存在し、DNA／RNA二重鎖構造を認識して該RNAを切断するエンドリボヌクレアーである。そのため、Gapmer型ASOは、標的RNAにハイブリダイズしてDNA／RNA二重鎖構造を安定に形成できるように、中央にデオキシリボヌクレオチドからなる領域を有し、その両側にヌクレアーゼ耐性の修飾ヌクレオチドを配した構造を一般に有する。
これに対し、Block型ASOとは、RNaseHによる標的RNAの切断を誘導することなく、標的RNAに結合することでその機能を阻害し得るASOである。代表的なものとしては、標的RNAのスプライシング制御部位に結合して該RNAのスプライシングパターンを変化させるスプライシング制御型や、miRNAに結合して該miRNAの（他のRNAとの）ハイブリダイゼーション能力をブロックするmiRNA阻害型等が挙げられる。【０００７】
これらのASOのうち、核酸医薬品として最も実績を上げているのはGapmer型ASOである。標的RNAそのものが切断されるため、標的RNAの存在によって生じる弊害を不可逆的に阻止し得るからである。しかしながら、標的RNAの切断は同時に該RNAからのタンパク発現も阻止してしまうため、該タンパク発現の停止または発現量の減少が問題となるケースには適用が制限されるという事情があった。【０００８】
NOP56遺伝子にコードされるNOP56タンパクは、60Sリボソームサブユニットのアセンブリーに必要なpre-rRNAのプロセシングを担うボックスC/D型核小体低分子RNAタンパク複合体（box  C/D  small  nucleolar  ribonucleoprotein  complexes）の構成成分である（非特許文献６）。そして、出芽酵母のNOP56遺伝子の温度感受性変異株では、高温下ではpre-rRNAのプロセシングが滞り、60Sリボソームサブユニットのアセンブリーが阻害されて生存不能となることが報告されている（非特許文献７）。【０００９】
このような事情から、SCA36型変異を有するNOP56  pre-mRNAを核とするRNA  fociの形成阻害には、該pre-mRNAの切断を誘導しないASO（すなわち、Block型ASO）の使用が望ましいと考えられる。しかしながら、Block型ASOの作用機序は、基本的に、ASO分子が標的RNAに結合することによって生じる立体障害である。標的RNAの鎖長が短い場合には、その全長にわたってASOを結合させることで目的を達成し得るが（例として、miRNA阻害型ASO）、標的RNAの鎖長が長い場合には、ASOの過剰投与による未知の影響を排除するために、結合させる部位（標的配列）の選定が必要となる。この点において、標的RNAのスプライシングパターンの変更を目的とする場合には、標的配列の候補を挙げることは容易かもしれないが（例として、スプライシング制御型ASO）、リピート配列の異常伸長に起因するRNA  fociの形成阻害を目的とする場合には、標的配列の検討は困難を極める。同じ配列が何百回と繰り返して連続する配列に対し、どの部分に注目すべきか、有効な示唆がないからである。
さらに、前記RNA  fociは、当該リピート領域に他のRNAやタンパクが結合して凝集化したものであるため、該リピート領域に結合し得るASOの投与は凝集化を一段と促進するものと懸念されていた。【００１０】
このように、NOP56  pre-mRNAの切断を誘導することなく、SCA36型変異を有するニューロンの内部で生じるRNA  fociの形成を効果的に抑制し得るASOの開発が求められているが、その具体的な道筋は不明であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Kobayashi,  H,  Abe,  K,  Matsuura,  T,  Ikeda,  Y,  Hitomi,  T,  Akechi,  Y,  et  al.  (2011).  Expansion  of  intronic  GGCCTG  hexanucleotide  Repeat  in  NOP56  Causes  SCA36,  a  type  of  Spinocerebellar  ataxia  accompanied  by  Motor  Neuron  Involvement.  Am  J  Hum  Genet  89:  121-130.
【非特許文献２】Ikeda,  Y,  Ohta,  Y,  Kobayashi,  H,  Okamoto,  M,  Takamatsu,  K,  Ota,  T,  et  al.  (2012).  Clinical  features  of  SCA36  A  novel  spinocerebellar  ataxia  with  motor  neuron  involvement  (Asidan).  Neurology  79:  333-341.
【非特許文献３】Liu,  W,  Ikeda,  Y,  Hishikawa,  N,  Yamashita,  T,  Deguchi,  K,  and  Abe,  K  (2014).  Characteristic  RNA  foci  of  the  abnormal  hexanucleotide  GGCCUG  repeat  expansion  in  spinocerebellar  ataxia  type  36  (Asidan).  Eur  J  Neurol  21:  1377-1386.
【非特許文献４】Donnelly,  CJ,  Zhang,  PW,  Pham,  JT,  Heusler,  AR,  Mistry,  NA,  Vidensky,  S,  et  al.  (2013).  RNA  toxicity  from  the  ALS/FTD  C9ORF72  expansion  is  mitigated  by  antisense  intervention.  Neuron  80:  415-428.
【非特許文献５】Jiang,  J,  et  al.  (2016).  Gain  of  toxicity  from  ALS/FTD-linked  repeat  expansions  in  C9ORF72  is  alleviated  by  antisense  oligonucleotides  targeting  GGGGCC-Containing  RNAs.  Neuron  90:  535-550.
【非特許文献６】Hayano,  T.,  Yanagida,  M.,  Yamauchi,  Y.,  Shinkawa,  T.,  Isobe,  T.,  and  Takahashi,  N  (2003).  Proteomic  analysis  of  human  Nop56p-associated  pre-ribosomal  ribonucleoprotein  complexes:  possible  link  between  Nop56p  and  the  nucleolar  protein  treacle  responsible  for  Treacher  Collins  syndrome.  J.  Biol.  Chem.  278:  34309-34319.
【非特許文献７】Gautier,  T.,  Berges,  T.,  Tollervey,  and  D.,  Hurt, E  (1997).  Nucleolar  KKE/D  repeat  proteins  Nop56p  and  Nop58p  interact  with  Nop1p  and  are  require  for  ribosome  biogenesis.  Mol.  Cell.  Biol.  17:  7088-7098.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、前記従来技術が抱える問題に鑑みてなされたものであり、SCA36型変異を有するニューロン内で自発的に生じるRNAfociを、NOP56  pre-mRNAの切断を誘導することなく、効果的に抑制することができるASOの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題を解決するために、SCA36型患者からiPSCを樹立し、該iPSをニューロンへと分化誘導して、RNA  fociを自発的に生じるヒトニューロン（SCA36-iPSN）を得た。そして、当該SCA36-iPSNを解析系とすることで、GGCCUG配列に相補的な塩基配列（配列番号２）が１回以上連続した塩基配列を有し、RNaseHによる該pre-mRNAの切断を誘導しないASOが、SCA36変異を有するニューロン内で生じるRNA  fociを効果的に抑制できることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１４】
本発明は以下を包含する。なお、配列番号２とは、NOP56  pre-mRNAのイントロン１内に存在するリピート領域のリピート単位（GGCCUG、配列番号３）に相補的な塩基配列（CAGGCC）のことである。
［１］  配列番号２で表される配列が１回以上連続した配列を有し、NOP56遺伝子のpre-mRNAと相補的なオリゴヌクレオチドであって、
前記pre-mRNAにハイブリダイズして形成される構造体がRNaseH耐性であること、
を特徴とするオリゴヌクレオチド。
［２］  デオキシヌクレオシドを４ヌクレオシド以上連続して含まないことを特徴とする、前記［１］に記載のオリゴヌクレオチド。
［３］  糖部修飾ヌクレオシドを全ヌクレオシド中２０％以上含むことを特徴とする、前記［１］又は［２］に記載のオリゴヌクレオチド。
［４］  前記糖部修飾ヌクレオシドが、2’位修飾型ヌクレオシド、架橋型ヌクレオシド、及び置換型ヌクレオシドから選ばれる１種以上の糖部修飾ヌクレオシドである、前記［３］に記載のオリゴヌクレオチド
［５］  前記2’位修飾型ヌクレオシドが、2’-フルオロヌクレオシド、2’-O-メチルヌクレオシド、及び2’-O-メトキシエチルヌクレオシドから選ばれる１種以上の2’位修飾型ヌクレオシドである、前記［４］に記載のオリゴヌクレオチド。
［６］  前記架橋型ヌクレオシドが、BNA、ENA、LNAから選ばれる１種以上の架橋型ヌクレオシドである、前記［４］に記載のオリゴヌクレオチド。
［７］  前記置換型ヌクレオシドが、モルフォリノである、前記［４］に記載のオリゴヌクレオチド。
［８］  少なくとも１以上の修飾されたヌクレオシド間結合を有する、前記［１］−［６］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
［９］  前記修飾されたヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、前記［８］に記載のオリゴヌクレオチド。
［１０］  １８−３０ヌクレオチドからなることを特徴とする、前記［１］−［９］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
［１１］  配列番号４または１０で表される塩基配列を有することを特徴とする、前記［１］−［１０］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
［１２］  前記［１］−［１１］のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含む、脊髄小脳変性症３６型の予防又は治療用組成物。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、NOP56  pre-mRNAの切断を誘導することなく、SCA36型変異を有するヒトニューロン内で生じるRNA  fociを効果的に抑制することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。また、RNA  fociの形成阻害を作用機序とする、SCA36型の予防又は治療用組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本書では、iPSCからニューロンへと分化誘導して得られた細胞をiPSNと呼ぶ場合がある。また、本書では、イントロンがスプライシングによって除去される前の（イントロンを有する）mRNAをpre-mRNAと表記し、イントロンが除去されたmRNAをmRNAと表記する。【００１７】
以下の図面において、Control-1〜Control-3は、健常者3名に由来するiPSCまたはiPSNについての結果、SCA36-1〜SCA36-3は、SAC36型患者3名に由来するiPSCまたはiPSNについての結果であることを表す。また、グラフ中のエラーバーは平均±標準誤差（n=3）を表し、図中のアスタリスク（＊）は、有意性検定の結果、p  value＜0.05、ダブルアスタリスク（＊＊）はp  value＜0.01、ダブルアスタリスク（＊＊）はp  value＜0.001で有意性が認められたことを表す。【００１８】
【図１】図１a：健常者及びSAC36型患者由来体細胞から樹立したiPSCに対し、免疫染色法を用いて、未分化マーカーであるNANOG（緑）及びSSEA4（赤）の発現を解析した結果である。図中のバーは、500μｍを表す。図１b：健常者及びSAC36型患者由来体細胞から樹立したiPSCに対して、repeat-primed  PCR法を用いて、NOP56遺伝子のイントロン１内のGGCCTGリピートの数を解析した結果を表す。図１c：健常者及びSAC36型患者由来iPSCから得られたiPSNに対し、ニューロンマーカータンパク（β-III  tubulin、緑）、運動ニューロンマーカータンパク（Islet1、SMI32、いずれも赤）の発現を、免疫染色法を用いて解析した結果である。図中のバーは、50μｍを表す。図１d：図１cにおいて、総細胞数（すなわち、DAPI陽性細胞数）に占めるβ-III  tubulin陽性細胞数（左パネル）、Islet1陽性細胞数（中央パネル）、またはSMI32陽性細胞数（右パネル）の割合を、Contro-iPSNとSAC36-iPSN間で比較した結果を表す。
【図２】図２a：Contro-iPSN及びSAC36-iPSNに対し、FISH法を用いて、NOP56  pre-mRNA中のGGCCUG（配列番号３）が繰り返したリピート領域を核とするRNA  fociの有無を解析した結果である。図中のバーは、10μｍを表す。図２b：図２aの解析において、総細胞数（DAPI陽性細胞数）に占める前記RNA  fociを有する細胞（直径が60μｍ以上のCy3シグナルを核内に有する細胞数）の割合をプロットしたグラフである。図２c：β-III  tubulin陽性細胞（ニューロン）及びIslet1陽性細胞（運動ニューロン）の核内で、RNA  fociが形成されていることを示す免疫染色結果である。
【図３】図３a：NOP56  pre-mRNAの一部（エクソン１〜エクソン２までの領域）と、５種類のASO（ASO-A〜ASO-E）の標的部位を表す模式図である。図３b：SAC36-iPSNに対し、ASO-A〜ASO-E及びコントロールASO1から選ばれるいずれか一つのASOを導入してから48時間後に、RNA  foci形成を解析した免疫染色結果である。図３c：図３bにおいてRNA  fociを有する細胞数を測定し、ASO-A〜ASO-Eのいずれかを導入したiPSNにおける該細胞数を、Control  ASO1を導入したiPSNにおける該細胞数に対する相対値で表したグラフである。図３d：ASOを導入していない、健常人及びSCA36型患者由来iPSNにおけるNOP56  mRNAの発現レベルを比較解析したグラフである。図３e：図３bのiPSNについて、NOP56  mRNAの発現量を解析した結果である。
【図４】図４a：NOP56  pre-mRNAの一部（エクソン１〜エクソン２までの領域）と、３種類のASO（ASO-F〜ASO-H）の標的部位を表す模式図である。図４b：SAC36-iPSNに対し、ASO-F〜ASO-H及びコントロールASO2から選ばれるいずれか一つのASOを導入してから48時間後に、RNA  foci形成を解析した免疫染色結果である。図４c：図４bにおいてRNA  fociを有する細胞数を測定し、Control  ASO2を導入したiPSNにおける該細胞数に対する相対値で表したグラフである。図４d：図４bにおいてRNA  fociの総面積を測定し、Control  ASO2を導入したiPSNにおける該総面積に対する相対値で表したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に、本発明の好適な実施形態について詳述する。なお、本発明におけるNOP56遺伝子は、ヒトのNOP56遺伝子である。
【００２０】
［脊髄小脳変性症36型とNOP56遺伝子］
脊髄小脳変性症36型（SCA36と略記する場合がある）は、脊髄小脳変性症に典型的な小脳性失調に加えて、舌萎縮や筋繊維の群萎縮といった筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic  lateral  sclerosis:ALS）に似た運動ニューロン徴候も認められることから、脊髄小脳変性症と運動ニューロン疾患の交差点的な疾患として注目を集めている常染色体優性遺伝型の神経変性疾患である。日本の研究者によって見出され、nucleolar  protein  56（NOP56と略記）タンパク（NP_006383）をコードするNOP56遺伝子のイントロン１内に存在するGGCCTGリピートが異常伸長していることが原因であることが明らかにされた。当該リピート数は、健常人では約3−14の範囲内だが、SCA36型患者では約650−2,500にも伸長しており、他のリピート病（例として、C9ORF72遺伝子内のGGGGCCリピートの異常伸長を原因とするALS/FTD）と比較して、健常者と患者のリピート数の差が大きいことも特徴である（非特許文献１−３）。
【００２１】
一部のリピート病では、当該疾患で侵されるニューロン内において、原因遺伝子から転写されたpre-mRNA中の異常伸長したリピート領域を核として、他のRNAやタンパクが凝集して巨大な凝集塊（RNA  foci）を形成することが知られている（非特許文献４）。そして、当該変異型遺伝子を有するモデル昆虫及びモデルマウスに対し、当該pre-mRNAに結合してRNaseHによる分解を誘導するASOを投与すると、該変異型遺伝子に由来する毒性が軽減されることが報告されている（Zhang,  K,  et  al.  (2015).  The  C9orf72  repeat  expansion  disrupts  nucleocytoplasmic  transport.  Nature  525:  56-61、及び非特許文献５）。
【００２２】
［SCA36型RNA  fociを効果的に抑制するオリゴヌクレオチド］
本発明にかかるオリゴヌクレオチドは、SCA36型変異を有するヒトニューロン内で自発的に生じるRNA  foci（SCA36型RNA  fociと呼ぶ場合がある）の形成を、NOP56  pre-mRNAの切断を誘導することなく、効果的に抑制し得るものである。ここで、SCA36型変異とは、NOP56遺伝子のイントロン１内に存在するGGCCTG（配列番号１）配列の繰り返し数（リピート数）が異常に増加した変異のことをいい、本願においては、当該リピート数が600以上のものを異常とする。よって、SCA36型RNA  fociとは、ヒトNOP56  pre-mRNA内のイントロン１内の異常伸長したGGCCTGリピート領域を核として形成されるRNA  fociのことである。本願では、SCA36型RNA  fociを、単にRNA  fociと呼ぶ場合がある。
【００２３】
本発明にかかるオリゴヌクレオチドは、配列番号２で表される塩基配列が１回以上連続した塩基配列を有し、NOP56遺伝子のpre-mRNAと相補的なオリゴヌクレオチド（すなわち、ASO）であって、NOP56  pre-mRNAのリピート領域の少なくとも一部に結合した後、RNaseHによるNOP56  pre-mRNAの切断を誘導しないものである。そのため、本発明にかかるオリゴヌクレオチドは、デオキシヌクレオシドを４ヌクレオシド以上連続して含まないことを要する。RNaseHは、RNA-DNAのヘテロ二本鎖構造であって４塩基対以上の長さのものを基質として認識するからである。よって、この条件を満たすものであれば、本発明にかかるオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、及びそれらが混在したものであってよい。なお、本書において、ASOの標的RNAへの“結合”とは、該標的RNAに“ハイブリダイズすること”をいう。
さらに、安定性向上の観点から、本発明にかかるオリゴヌクレオチドは、NOP56  pre-mRNAへの結合を阻害しない範囲内で修飾されていることが好ましい。そのような修飾の例として、糖部修飾及び塩基部修飾が挙げられる。
【００２４】
本発明に好適に用いることができる糖部修飾ヌクレオシドの例としては、2’位修飾型ヌクレオシド、架橋型ヌクレオシド、置換型ヌクレオシドが挙げられる。
2’位修飾型ヌクレオシドの例としては、糖の2’位のOH基が、H、OR、R、SH、SR、NH2、NHR、NR2、CN、及びHalogenから選択される基で置換されたヌクレオシドが挙げられる。前記Rは、C1-C6、好ましくはC1-C6のアルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、又はアルキニル基であり、特に好ましくはメチル基、エチル基、メトキシエチル基、アミノ基、アミノプロピル基、又はイソプロピル基である。また、前記Halogenは、好ましくはF、Cl、Br、又はIであり、特に好ましくはFである。
このうち、2’-フルオロ、2’-O-メチル、又は2’-O-メトキシエチル修飾されたヌクレオシドを特に好適に用いることができる。
【００２５】
架橋型ヌクレオシドの例としては、2’位の酸素原子と4’位の炭素原子がメチレン結合を介して架橋した2’,4’-BNA(bridge  nucleic  acid、別名：LNA(Locked  Nucleic  Acid))（Koshkin  et  al.,  J.  American  Chemical  Society,  120:13252-13253,  1998）、BNAcoc、BNANC、ENA(2’-O,4’-C-Ethylene-bridged  Nucleic  Acids）（WO2000/047599）、cEt  BNA、フラノース環の酸素原子を硫黄原子に置換した４’−チオヌクレオシド（Dande,  P.,  et  al,  J.  Med.  Chem.,  49:1624-1634,  2006、WO2004/18494)等が挙げられる。
このうち、LNA、ENAが特に好ましく、最も好ましくはENAである。
【００２６】
置換型ヌクレオシドの例としては、モリフォリノ環に置換したヌクレオシド（モリフォリノと略記される場合がある）が挙げられる（米国特許第5,034,506号参照）。
【００２７】
塩基部修飾ヌクレオシドの例としては、5位で修飾されたウリジン又はシチジン（例として、5-（2-アミノ）プロピルウリジン、5-ブロモウリジン）、8位で修飾されたアデノシン及びグアノシン（例として、8-ブロモ−グアノシン）、デアザヌクレオチド（例として、7-デアザアデノシン）、及びO-及びN-アルキル化ヌクレオシド（例として、N6-メチルアデノシン）等が挙げられる。
【００２８】
本発明にかかるASOは、１８−３０ヌクレオチドからなることが好ましい。全ヌクレオシド中、20％以上のヌクレオシドが前記修飾を受けていることが好ましく、さらに好ましくは、糖部修飾を受けていることが好ましい。特に、ENAを用いる場合には、20−50％のヌクレオシドがENAであることが好ましい。50％を超えると、高次機能的に緩衝作用が強まり、本発明の効果が得られない場合があるからである。また、モリフォリノを用いる場合には、100％モリフォリノであることが好ましい。
【００２９】
さらに、本発明に係るASOは、前記糖部修飾または塩基部修飾に加えて、ヌクレオシド間がホスホロチオエート結合（S化）、ホスホロジチオアート結合、ホスホルアミダート結合等で結合していてもよい。このうち、好ましくは、ホスホロチオエート結合である。
【００３０】
上記修飾はいずれも公知技術であり、オリゴ核酸の生体内安定性を向上させる方法として汎用されている（Summerton  and  Weller,  Antisense  Nuc.  Acid  Drug  Dev.,  7:187-195(1997)；Hyrup  et  al.,  Bioorgan.Med.Chem.,4:5-23(1996)、参照）。
【００３１】
また、組織特異的なデリバリーや細胞膜透過性の向上を目的として、ペプチド、アプタマー、疎水性分子等を本発明にかかるマイクロRNA及び当該前駆体の末端（5’端及び／又は3’端）ヌクレオチドにコンジュゲートしてもよい。この目的に好適な疎水性分子としては、コレステロール、ビタミンＥ（α-tocopherol）、パルミトイル基等が挙げられる（WO2005/115481、Uno  Y.,  et  al,  Human  Gene  Therapy,  22:711-719,2011）。
【００３２】
なお、上記の修飾は組み合わせて用いてもよい。
【００３３】
本発明にかかるオリゴヌクレオチドは、配列番号２で表される塩基配列が１回以上連続した塩基配列を有するものだが、当該配列の繰り返し数は1回であってもよい。１回である場合には、NOP56  pre-mRNAのGGCCTGリピート領域の開始部位に相補的な塩基配列を有することが好ましい。当該オリゴヌクレオチドは、SCA36型変異を有するNOP56  pre-mRNAに１分子しか結合し得ないにも関わらず、優れたRNA  foci形成阻害効果を奏するものだからである。当該オリゴヌクレオチドは、低用量で高い治療効果が期待できることから、非常に有益である。
そのような塩基配列の例として、配列番号１０で表される塩基配列を挙げることができる。本発明には、配列番号１０で表される塩基配列を有し、上記糖部修飾及び／または塩基部修飾を受けたオリゴヌクレオチドを好適に用いることができる。当該好適なオリゴヌクレオチドの例としては、配列番号１０で表されるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３４】
また、配列番号２で表される塩基配列が２回以上連続した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号４で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。本発明には、配列番号４で表される塩基配列を有し、上記糖部修飾及び／または塩基部修飾を受けたオリゴヌクレオチドを好適に用いることができる。当該好適なオリゴヌクレオチドの例としては、配列番号４で表されるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３５】
［SCA36型の予防または治療用組成物］
本発明にかかるSCA36型の予防又は治療用組成物は、前記SCA36型RNA  fociを効果的に抑制するASOを有効成分として含むものである。本発明にかかる組成物は、前記有効成分の他に、医薬的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント等を含むことができ、通常の製薬に用いられる方法によって製造することができる。
【００３６】
本発明にかかる組成物の好適な態様の一つとして、液体の組成物が挙げられる。当該液体の組成物は、前記有効成分を、医薬上許容される液体担体に溶解又は懸濁することで製造してもよい。前記液体担体としては、例えば、水、生理的食塩水、注射用水溶液、リンゲル液等の公知の液体担体を用いることができ、さらに薬学的に許容される塩が含まれていてもよい。本発明にかかる組成物が前記単離された核酸を含む場合には、前記液体担体として核酸医薬用キャリアーを追加してもよく、そのような例としてカチオン性脂質やアテロコラーゲン（特許第5145557号）等が挙げられる。また、本発明にかかる組成物が前記ウイルスベクターにコードされる核酸を含む場合には、前記賦形剤として１以上の二価アルコール又は多価アルコールと、非イオン性界面活性剤（例として、ソルビタンエステルやTWEEN化合物）を追加してもよい（WO00/32233参照）。
【００３７】
本発明にかかる液体の組成物は、前記有効成分を薬物送達用ナノ粒子に封入した後、該ナノ粒子を医薬上許容される液体担体に懸濁することで製造してもよい。薬物送達用ナノ粒子は、脂質、タンパク質、多糖類、及び合成高分子等多様な材料から調製される粒子径１０〜１０００ｎｍの粒子分散液または固形粒子であり、リポソーム、ミセル、金属ナノ粒子、及び高分子ナノ粒子等が例示される。リポソームの具体例としては、N-［2,3-（ジオレイルオキシ）プロピル］-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）やジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）等を主成分とするものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、前記ナノ粒子の表面は、生体適合性や送達特性の向上を目的として種々の物質で修飾されていてもよい。
これらの薬物送達用ナノ粒子は、当業者に周知の方法に従って製造することが可能である。
【００３８】
本発明にかかる液体の組成物の好適な実施形態の一つとして、前記有効成分を内包させた乳酸・グリコール酸共重合体（poly-lactide-co-glycolide;PLGA）からなるナノ粒子（PLGAナノ粒子）の分散液が挙げられる。当該PLGAナノ粒子の平均粒子径は、動的光散乱法による値として50-200nm、より好ましくは60-150nm、最も好ましくは70-100nmであり、粒子表面はキトサンで修飾されていてもよい。また、当該分散液には、分散安定化剤（例として、ポリビニルアルコール等）やpH調整剤（例として、クエン酸水和物等）が含まれていてもよい。
PLGAナノ粒子の製造と本発明にかかる有効成分の該粒子への封入は、例えば、特許4340744号に記載された方法に従って行っても良い。PLGAナノ粒子は、生体適合性、生体内分解性、及び徐放性に非常に優れることから、前述した本発明にかかる有効成分を内包するPLGAナノ粒子の分散液は、吸入薬剤、筋注薬剤、ステント等として用いることも可能である（Tsukada  Y.,  et  al,  New  Developments  in  Polyactic  Acid  Research,  published  by  Nova  Science  Publishers、  Chapter  6、pp153-182、2015；塚田雄亮他、PLGAナノ粒子が拓く新たなDDS製品の開発と実用化、医薬ジャーナル、第50巻、第73-80頁、2014年、参照のこと）。
【００３９】
［投与方法］
本発明にかかるSCA36型の予防又は治療用組成物は、当該分野において公知の方法を用いて患者に投与することができる。例えば、前記液体の組成物を、静脈注射や輸液によって全身投与してもよく、又は、定位固定注射、ニードルやカテーテル、浸透圧ポンプやインフュージョンポンプ、薬剤溶出型ステント等を用いて脳室又は髄腔内に局所的に投与してもよい。さらに、本発明にかかる組成物が前記有効成分をウイルスベクターにコードされる状態で含む場合には、筋肉（好ましくは骨格筋）への定位固定注射によって投与してもよい。
【００４０】
ニードル又はカテーテルを脳室又は脊髄に注入して薬剤を送達する方法は、当該分野において公知である（Stein  et  al.,  J.  Virol,  73:3424-3429,1999;Davidson  et  al.,  PNAS,  97:3428-3432,2000;Alisky  and  Davidson,  Hum.Gene  Ther.,  11:2315-2329,2000等）。そして、浸透圧ポンプやインフュージョンポンプを用いた脳への薬物送達は、Convection-enhanced  delivery（CED）（米国特許6,309,634号）として良く知られている。例えば、米国特許5735814号、6042579号、5814014号では埋め込み可能なポンプ及びカテーテルを用いた脳への注入システムが開示されており、これらの方法を用いてもよい。また、薬物を脳及び脊髄に送達するための装置も多数市販されており（例えば、SynchroMed（登録商標）、EL  Infusion  System社製）、これらの装置を用いてもよい。
【００４１】
投与量及び投与頻度は、対象における症状の重さ、年齢、体重等の種々の要因に応じて調節することができる。
なお、本発明における“健常者”とは、SCA36型に罹患していない者の意である。
【００４２】
［対象疾患］
本発明にかかる組成物は、NOP56遺伝子のイントロン1内のGGCCTGリピートが異常伸長（具体的には、600回以上）しているヒトに対し、予防又は治療薬として好適に投与することができる。
【００４３】
［ニューロン及び運動ニューロン］
本発明においてニューロンとは、β-III  tubulin等のニューロンのマーカー遺伝子を１以上発現し、且つ、神経突起（β-III  tubulin陽性の突起（ニューライト））を有する細胞と定義される。また、本発明において運動ニューロンとは、Islet1、SMI32等の運動ニューロンのマーカー遺伝子を１以上発現するニューロンと定義される。さらに本発明では、細胞体が肥厚したニューロン、運動ニューロンを、各々、成熟ニューロン、成熟運動ニューロンと呼ぶ場合がある。
【実施例】
【００４４】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。最初に、本願実施例で用いた主な手法について説明する。【００４５】
［手法１］RNA  foci陽性細胞の検出
RNA  foci陽性細胞の検出は、配列番号１４（CCAGGCCCAGGCCCAG）で表される塩基配列を有し、5’末端がCy3で蛍光標識された2',4'-BNA（2',4'-BridgedNucleicAcid,LNA）からなるオリゴヌクレオチド（Gene  Design社製）をプローブとして、FISH（fluorescence  in  situ  hybridization）法により行った。当該オリゴヌクレオチドは、NOP56遺伝子のpre-mRNAのイントロン１内のGGCCUGリピートを含む領域に相補的であり、SCA36型患者の剖検組織におけるRNA  fociの検出に用いられたものである。陰性コントロールとしては、当該プローブと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ（以降、陰性コントロールプローブと呼ぶ）を用いた。【００４６】
具体的には、細胞に対し、4％パラホルムアルデヒド固定（10分間）、70％エタノールによるpermeabilization（氷上）、50％ホルムアミド含有２×  SSCによる平衡化（66℃で30分間）を行った後、予めdenatureさせた前記プローブ（40nM）を加えてハイブリダイズさせた（52℃で3時間）。続いて、細胞を50％ホルムアミド含有２×  SSCで洗浄し（52℃で20分間を2回）、さらに１×  SSCで洗浄した後（室温で3回）、DAPI染色を行った。その後、ProLong  Gold  antifade  reagentをマウントし、LSM710  microscope（Carl  Zeiss社製）及びIN  CELL  Analyzer  6000を用いて解析した。
RNase処理をする場合には、前記固定を行った後、細胞を50  μg/mlとなるようにDNase-free  RNase  A（Roche社製）を添加し、37℃で1.5時間インキューベーションした。【００４７】
ニューロンまたは運動ニューロン内におけるRNA  fociの検出には、前記１×  SSCによる洗浄後、細胞をブロッキングバッファー（5％ウシ血清アルブミン及び0.2％  TritonX-100含有バッファー）で処理してから（室温で20分間）、免疫染色を行った。一次抗体として、抗β-III  tubulin抗体（1:2,000;  Cell  Signaling  Technology社製）または抗Islet1抗体（1:200;  Developmental  Studies  Hybridoma  Bank社製）を使用し（4℃でovernight）、二次抗体にはAlexaがコンジュゲートしたものを用いた（室温で1時間）。Fluor-conjugatedを用いた免疫染色を行った。PBSで3回洗浄した後、DAPI染色を行い、ProLong  Gold  antifade  reagentをマウントし、LSM710  microscope（Carl  Zeiss社製）及びIN  CELL  Analyzer  6000を用いて解析した。
解析では、直径が0.60μｍ以上のCy3シグナルをRNA  fociとしてキャプチャーし、IN  CELL  Developer  toolbox  software  1.92を用いてRNA  foci陽性細胞数を自動的に計測した。本願では、前記RNA  fociを１以上有する細胞を、RNA  foci陽性細胞とする。なお、この方法で検出されるRNA  fociはすべてDAPIシグナル内にあったことから、核内に生じたRNA  fociであると考えられる。【００４８】
［手法２］iPSNへのASOの導入
ASOは、健常者またはSCA36型患者由来iPSNの培養系に、終濃度が400  nMとなるように添加し、AmaxaTM  4D-NucleofectorTM（LONZA社製）を用いたエレクトロポーレーション法によって導入した。導入後48時間培養を行い、各種の解析を行った。実施例で使用したASOの配列を表1に示す。
【表１】
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【００４９】
本願実施例で得られた結果に対する有意性検定は、two-tailed  Student’s  t-tests又はDunnett  post  hoc  testを用いて行った。P  value＜0.05の場合に有意性ありと判断した。【００５０】
［実施例１］SCA36型変異を有するヒトニューロンの作製
ヒト健常者由来iPSCは、理化学研究所バイオリソースセンター（http://ja.brc.riken.jp/）から入手したもの（Cntrol-1,2）、及びMishimaらの方法（Mishima  T,  Ishikawa,  T,  Imamura,  K,  Kondo,  T,  Koshiba,  Y,  Takahashi,  R,  et  al.  (2016).  Cytoplasmic  aggregates  of  dynactin  in  iPSC-derived  tyrosine  hydroxylase-positive  neurons  from  a  patient  with  Perry  syndrome.  Parkinsonism  Relat  Disord  30:  67-72.AC）に従って製造したもの（Cntrol-3）を用いた。
SAC36型患者由来iPSC（SAC36-1〜SAC36-3）は、Okitaらの方法（Okita,  K,  Yamakawa,  T,  Matsumura,  Y,  Sato,  Y,  Amano,  N,  Watanabe,  A,  et  al.  (2013).  An  Efficient  Nonviral  Method  to  Generate  Integration-Free  Human-Induced  Pluripotent  Stem  Cells  from  Cord  Blood  and  Peripheral  Blood  Cells.  Stem  Cells  31:  458-466.）に従って製造した。【００５１】
各iPSCについて免疫染色を行い、未分化細胞のマーカー遺伝子（NANOG、SSEA4）の発現を維持していること（すなわち、未分化能を維持していること）を確認した（図１a）。また、repeated-primed  PCR法（参照：Kobayashi,  H,  Abe,  K,  Matsuura,  T,  Ikeda,  Y,  Hitomi,  T,  Akechi,  Y,  et  al.  (2011).  Expansion  of  Intronic  GGCCTG  Hexanucleotide  Repeat  in  NOP56  Causes  SCA36,  a  Type  of  Spinocerebellar  Ataxia  Accompanied  by  Motor  Neuron  Involvement.  Am  J  Hum  Genet  89:  121-130.）を行い、NOP56遺伝子のイントロン１内のGGCCTGリピート長が、Control-1〜Control-3由来iPSCでは正常の範囲内だが、SCA36-1〜SCA36-3では異常伸長していることを確認した（図１b、表２）。
【表２】
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【００５２】
これらのiPSCに対し、SFEBq（quick  embryoid  body-like  aggregate  method）法を用いて、ニューロンへと分化誘導した（Egawa,  N,  Kitaoka,  S,  Tsukita,  K,  Naitoh,  M,  Takahashi,  K,  Yamamoto,  T,  et  al.  (2012).  Drug  Screening  for  ALS  Using  Patient-Specific  Induced  Pluripotent  Stem  Cells.  Sci  Transl  Med  4:  145ra104.  及び、Maury,  Y,  Come,  J,  Piskorowski,  RA,  Salah-Mohellibi,  N,  Chevaleyre,  V,  Peschanski,  M,  et  al.  (2015).  Combinatorial  analysis  of  developmental  cues  efficiently  converts  human  pluripotent  stem  cells  into  multiple  neuronal  subtypes.  Nat  Biotechnol  33:  89-96.）。【００５３】
具体的には、iPSCを単一細胞に解離させ、低接着性U型96-well  plate内で迅速に再凝集させた後、該細胞凝集塊を、5%  KSR（Invitrogen社製）、minimum  essential  medium-nonessential  amino  acids（Invitrogen社製）、L-glutamine（Sigma-Aldrich社製）、2-mercaptoethanol（Wako社製）、2μM  dorsomorphin（Sigma-Aldrich社製）、10  μM  SB431542（Cayman社製）、3  μM  CHIR99021（Cayman社製）、及び12.5  ng/mL  fibroblast  growth  factor（Wako社製）を含むDulbecco’s  modified  Eagle’s  medium/Ham’s  F12（Thermo  Fisher  Scientific社製）培地中で11日間培養した。なお、当該培地中で培養を開始した日を、分化誘導開始日（すなわち、Day0）とする。Day4に、100nM  レチノイン酸（Sigma-Aldrich社製）と500  nM  Smoothened  ligand（Enzo  Life  Sciences社製）を添加し、さらに、B27  Supplement（Thermo  Fisher  Scientific社製）、100  nM  retinoic  acid、500  nM  Smoothened  ligand、及び10  μM  DAPT（Selleck社製）を含むneurobasal  medium（Thermo  Fisher  Scientific社製）中で培養を行った。Day16に、前記凝集塊を、Accumax（Innovative  Cell  Technologies社製）を用いて単一細胞に解離させた後、Matrigel（BD  Biosciences社製）でコートしたディッシュに播種して接着させた。その後、10  ng/ml  brain-derived  neurotrophic  factor（R&D  Systems社製）、10  ng/ml  glial  cell  line-derived  neurotrophic  factor（R&D  Systems社製）、及び10  ng/ml  neurotrophin-3（R&D  Systems社製）を含むneurobasal  medium中で8日間培養した。【００５４】
Day24の細胞に対し、ニューロンのマーカータンパク（β-III  tubulin）と運動ニューロンのマーカータンパク（Islet1、SMI32）に対する抗体を用いて免疫染色した結果を図１cに示す。いずれのiPSCから分化誘導した場合も、細胞体が肥厚し、且つ、β-III  tubulin陽性の突起（ニューライト）を伸展させた成熟ニューロンが多数確認された（図１c、上段パネル）。さらに、β-III  tubulin・Islet1二重陽性細胞（図１c、上段パネル）、及びSMI32陽性細胞（図１c、下段パネル）も多数確認され、その一部は運動ニューロンに分化していることが確認された。【００５５】
当該免疫染色において、各抗体の陽性細胞数を解析した結果を図１dに示す。総細胞数（DAPI陽性細胞数）に対し、Control-iPSC、SCA36-iPSCのいずれから分化誘導した場合にも、半数以上もの細胞がβ-III  tubulin陽性、すなわち、ニューロンへと分化誘導されたことがわかる（図１d、左パネル）。これは、神経分化誘導因子を培地に添加して分化誘導を行う手法としては、非常に高い分化誘導効率である。さらに、いずれから分化誘導した場合にも、運動ニューロン（すなわち、Islet1陽性細胞またはSMI32陽性細胞）を20％以上含んでいることも明らかとなった（図１d、中央及び右パネル）。当該効率も非常に高い分化誘導効率である。また、これらの陽性細胞数は、Control-iPSCから分化誘導した細胞、SCA36-iPSCから分化誘導した細胞間で有意差がないことから、SCA36-iPSCは、Control-iPSCと同程度のニューロン（運動ニューロンを含む）への分化能を有していることも確認された。
本書では、以降、前記方法に従ってControl-iPSC、SCA36-iPSCからニューロンへと分化誘導した細胞を、Control-iPSN、SCA36-iPSNと各々呼ぶ場合がある。【００５６】
［実施例２］SCA36-iPSNにおけるRNA  foci形成
SCA36-iPSNについて、患者におけるニューロンと同様にRNA  fociが生じるかどうか、手法1に従って解析した。結果を図２に示す。
図２a上段パネルに示されるように、Control-iPSNでは、3名の健常者に由来するいずれのiPSNにおいても、プローブに由来するシグナルは実質的に検出されなかった。すなわち、健常者由来ニューロンでは、NOP56遺伝子のpre-mRNAのGGCCUGリピート領域を核とするRNA  fociは生じないことが確認された。【００５７】
これに対し、SCA36-iPSNでは、3名の患者に由来するiPSNすべてにおいて、プローブ由来の強い蛍光シグナルであって、直径が0.60μｍ以上のもの（すなわち、RNA  foci）を核内に有する細胞が認められた（図２a下段パネル）。当該陽性細胞数を計測した結果を図２bに示す。SCA36-iPSNでは、60％以上の細胞においてRNA  fociが自発的に生じたことがわかる。さらに、前記プローブ処理に続けて抗β-III  tubulin抗体または抗Islet1抗体による免疫染色を行ったところ（手法１）、ほぼすべてのβ-III  tubulin陽性細胞またはIslet1陽性細胞において、前記プローブ由来の強いシグナルが核内に検出された。
よって、SCA36患者由来iPSCから分化誘導して得られるニューロン及び運動ニューロンでは、NOP56  pre-mRNA内のGGCCUGリピート領域を核とするRNA  fociが自発的に生じることが明らかとなった。【００５８】
なお、結果は割愛するが、前記プローブの代わりに、該プローブと相補的な塩基配列を有するプローブ（陰性コントロールプローブ）を用いた場合には、Control-iPSN、SCA36-iPSNともに、プローブに由来するシグナルは実質的に検出されなかった。また、SCA36-iPSNにおいて、前記プローブ処理の後にRNaseA処理を行うと、プローブに由来する蛍光シグナルは検出されなかった。
よって、前記SCA36-iPSNで検出されたプローブ由来の蛍光シグナルは、該プローブがNOP56  pre-mRNA内のGGCCUGリピート領域にハイブリットすることで生じたものであり、NOP56遺伝子（すなわち、DNA）にハイブリットすることで生じたものではないことが確認されている。【００５９】
［実施例３］ASOによるRNA  foci形成阻害
次に、SCA36-iPSNにおいて自発的に生じるRNA  fociを、効果的に抑制し得るASOの検討を行った。
表２に記載した５種類のASO（ASO-A〜E）を［手法２］に従ってControl-iPSN、SCA36-iPSNに導入し、［手法１］に従ってRNA  fociの有無を解析した。各ASOの標的部位を図３aに示す。図３a及び表１からわかるように、ASO-AとASO-Bは、GGCCUG配列に相補的な塩基配列（配列番号２）が連続して繰り返した配列からなるので、当該リピート領域内に複数分子が結合し得るものである。これに対し、ASO-C〜ASO-Eは、NOP56  pre-mRNA内の特定部位に１分子のみ結合し得るものである。そして、ASO-AのみがBlock型で、ASO-B〜ASO-EはGapmer型である。【００６０】
Control-ASO1を導入した場合にはRNA  fociを有する細胞が多数認められたが（図３b、最上段パネル）、ASO-A〜Eを導入した場合には、いずれの患者由来SCA36-iPSNにおいても、RNA  fociを有する細胞はわずかであった（図３b、上から2番目以降のパネル）。図３cに、RNA  fociを有する細胞数の測定結果を示す。Gapmer型であるASO-B〜Eを導入した場合には、RNA  fociを有する細胞数がコントロール（陰性コントロールプローブを導入したiPSN）と比べて大幅に減少し、さらに、Block型であるASO-Aを導入した場合にも、前記Gapmer型ASOと同程度にまでRNA  foci陽性細胞数が減少した（図３c）。【００６１】
これに対し、NOP56  mRNAの発現量（成熟mRNA量）は、ASO-B〜Eを導入した場合にはコントロールよりも顕著に低下する傾向にあったが、ASO-Aを導入した場合には発現量の低下は認められなかった（図３e）。なお、ASOを導入していない状態において、SCA36型患者由来iPSNにおけるNOP56  mRNAの発現量は、健常人由来iPSNのそれよりも既に有意に減少していた（図３d）。【００６２】
よって、Block型であっても、リピート領域内に複数分子結合できるASOであれば、NOP56  pre-mRNAの切断を誘導することなく、標的RNAの切断を誘導し得るGapmer型ASOと同程度にまでRNA  foci形成を阻害できることが示された。【００６３】
さらに、NOP56  pre-mRNAに１分子しか結合できないBlock型ASOを作製して、その効果を検討した。
表１及び図４aからわかるように、ASO-F〜Hは、モルフォルノ修飾されているのでRNaseHによる標的RNAの切断を誘導せず、且つ、NOP56  pre-mRNAに１分子しか結合し得ないASOである。このうち、ASO-Fは、GGCCUG配列に相補的な塩基配列（配列番号２）を１つだけ有し、NOP56  pre-mRNAの当該リピート領域の開始部位に結合するASOである。そして、ASO-GとASO-Hは、GGCCUG配列に相補的な塩基配列（配列番号２）を有さないので、NOP56  pre-mRNAの当該リピート領域以外の部分に結合するASOである。【００６４】
ASO-Fを導入した場合には、コントロールに比べて、いずれの患者由来SCA36-iPSNにおいても、RNA  fociを有する細胞数及び該RNA  fociの面積が大幅に減少した（図４c、d）。これに対し、ASO-GとASO-Hを導入した場合では、コントロールと比べて有意差のない場合があり、安定した抑制効果を奏し得るものではなかった（図４c、d）。
よって、GGCCUG配列に相補的な塩基配列（配列番号２）を１つ以上含み、当該リピート領域の開始部位を標的とするASOであれば、NOP56  pre-mRNAに１分子しか結合しないBlock型であっても、RNA  foci形成を効果的に阻害できることが示された。【００６５】
以上より、GGCCUG配列に相補的な塩基配列（配列番号２）が１回以上連続した塩基配列を有し、且つ、RNaseHの標的とならずにヒトNOP56  pre-mRNAに安定に結合できるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、SCA36型変異を有するニューロン内で自発的に起こるRNA  fociを効果的に抑制できることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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