(57)【要約】  本発明は、糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体の量を増加させる方法を提供することを課題とする。  本発明は、「N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物（本発明に係る多糖類）の存在下に、糖鎖を有する物質を含有する試料と該糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチンとを接触させる、該糖鎖を有する物質と該レクチンとの複合体形成方法」、及び「本発明に係る多糖類を含有してなる、糖鎖を有する物質と該糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチンとの複合体形成促進剤。」に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物の存在下に、糖鎖を有する物質を含有する試料と該糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチンとを接触させる、該糖鎖を有する物質と該レクチンとの複合体形成方法。
【請求項２】
N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物が、該レクチンが親和性を有する糖鎖を持たないものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物がデキストラン硫酸若しくはその塩、又はコンドロイチン硫酸c若しくはその塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
下記（１）〜（２）から選択される、請求項１に記載の方法：
（１）N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖がデキストラン硫酸又はその塩で、糖鎖を有する物質がαフェトプロテイン-L3（AFP-L3）で、レクチンがレンズマメレクチンである、
（２）N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物がデキストラン硫酸若しくはその塩、又はコンドロイチン硫酸c若しくはその塩で、糖鎖を有する物質がα(2, 3)糖鎖遊離型前立腺特異抗原で、レクチンがイヌエンジュレクチンである。
【請求項５】
N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物を含有してなる、糖鎖を有する物質と該糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチンとの複合体形成促進剤。
【請求項６】
N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物が、該レクチンが親和性を有する糖鎖を持たないものである、請求項５に記載の複合体形成促進剤。
【請求項７】
N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物がデキストラン硫酸若しくはその塩、又はコンドロイチン硫酸c若しくはその塩である、請求項５に記載の複合体形成促進剤。
【請求項８】
下記（１）〜（２）から選択される、請求項５に記載の複合体形成促進剤：
（１）N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖がデキストラン硫酸又はその塩で、糖鎖を有する物質がαフェトプロテイン-L3（AFP-L3）で、レクチンがレンズマメレクチンである、
（２）N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物が、デキストラン硫酸若しくはその塩、又はコンドロイチン硫酸c若しくはその塩で、糖鎖を有する物質がα(2, 3)糖鎖遊離型前立腺特異抗原で、レクチンがイヌエンジュレクチンである。
【請求項９】
請求項１に記載の方法で糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体を形成させた後、該複合体の量を測定する、糖鎖を有する物質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体形成方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は、同一の単糖分子又は２種類以上の単糖分子がグリコシド結合を介して鎖状に結合した化合物である。【０００３】
糖鎖は、生体内ではタンパク質や脂質と結合した複合糖質の形態で、主に細胞表面に存在する。そして、細胞の増殖、細菌やウイルスの感染、神経の伸長、炎症、免疫などの、生体内の重要な生理作用に関与している。【０００４】
生体内に存在する糖タンパク質等の糖鎖を有する物質に付加している、糖鎖の種類とその数は、通常一定である。しかし、疾病特異的に糖鎖が変化する場合があり、そのような糖鎖は、診断のバイオマーカーとして用いられている。【０００５】
例えば、細胞の癌化及び癌の進行に伴い糖鎖が変化する糖鎖や糖タンパク質が知られており、それらは腫瘍マーカーとして知られている。【０００６】
糖鎖を有する腫瘍マーカーとしては、α-フェトプロテイン（AFP：肝臓癌マーカー）、前立腺特異抗原（prostate specific antigen, PSA：前立腺癌マーカー）、癌胎児性抗原（carcinoembryonic antigen, CEA：大腸癌等マーカー）、CA19-9（carbohydrate antigen 19-9, CA19-9：膵臓癌マーカー、消化器癌マーカー）、ポドカリキシン等が知られている。【０００７】
糖鎖を検出・分析する方法としては、レクチンを用いる方法が一般的である。レクチンとは、植物，動物，微生物等に存在するタンパク質又は糖タンパク質のうち、糖鎖を特異的に認識して結合するという性質を有する物質であって、酵素や抗体を除くものの総称である。レクチンは糖鎖に対する特異性が高いため、レクチンを利用して糖鎖を有する物質を特異的に検出することができる。【０００８】
レクチンを用いて糖鎖や糖鎖を有する物質を検出する方法としては、表面プラズモン共鳴法、レクチン電気泳動法（例えばキャピラリー電気泳動）、レクチンカラム法（例えばレクチンアフィニティークロマトグラフィー）、レクチンマイクロアレイ法、不溶性担体に固定化したレクチンやビオチン標識したレクチンを用いたサンドイッチ法等の免疫学的測定方法等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第4862093号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
レクチンは糖鎖の認識特異性は高いものの、糖鎖への結合力は、抗体の糖鎖への結合力と比べて非常に弱いことが知られている。例えば、抗原抗体反応の解離定数は10-9〜10-7程度であるが、レクチンと糖鎖間の解離定数は10-7〜10-3程度に過ぎない（Jun Hirabayashi, et al, Chem. Soc. Rev., vol.442, pp.4443-4458, 2013等）。そのため、レクチンと糖鎖とで、抗原抗体反応の如き強固な複合体を形成させることは難しい。それ故、レクチンと糖鎖を有する物質の複合体を形成させ、その複合体の量を測定することにより糖鎖を有する物質を測定する測定法を実施した場合、得られる複合体の量が十分でないため、満足するような測定感度が得られないという問題があった。【００１１】
なお、特許第4862093号公報（特許文献１）には、ポリアニオン性ポリマーの存在下に、抗体やレクチン等の分析物に対して親和性を有するアフィニティー分子と荷電キャリヤー分子との複合体を形成する方法が開示されている。しかし、該文献では、ポリアニオン性ポリマーの存在下に抗原抗体反応を行っているが、糖鎖を有する物質とレクチンとの反応については具体的な開示がない。そのため、特許文献１の開示内容からは、ポリアニオン性ポリマーが糖鎖−レクチン間の相互作用に何らかの影響を及ぼすのか否かについては、明らかでない。【００１２】
以上のことから、本発明の課題は、糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体の量を増加させる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者等は、上記の問題点を解決すべく鋭意研究の結果、糖鎖とレクチンとの複合体形成反応を、N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物の存在下に行うことにより、糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体の量が増加し、上記の問題点を解決することができることを見出し、本発明を完成した。【００１４】
本発明は、以下の構成よりなる。
（１）N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物の存在下に、糖鎖を有する物質を含有する試料と該糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチンとを接触させる、該糖鎖を有する物質と該レクチンとの複合体形成方法。
（２）N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物が、該レクチンが親和性を有する糖鎖を持たないものである、上記(１)に記載の方法。
（３）N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物が、デキストラン硫酸若しくはその塩、又はコンドロイチン硫酸c若しくはその塩である、上記(１)又は(２)に記載の方法。
（４）下記（ｉ）〜（ii）から選択される、上記(１)、(２)、(３)のいずれかに記載の方法  (ｉ)N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖がデキストラン硫酸又はその塩で、糖鎖を有する物質がαフェトプロテイン-L3（AFP-L3）で、レクチンがレンズマメレクチンである、
(ｉｉ)N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物がデキストラン硫酸若しくはその塩、又はコンドロイチン硫酸c若しくはその塩で、糖鎖を有する物質がα(2, 3)糖鎖遊離型前立腺特異抗原で、レクチンがイヌエンジュレクチンである。
（５）N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物を含有してなる、糖鎖を有する物質と該糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチンとの複合体形成促進剤。
（６）N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物が、該レクチンが親和性を有する糖鎖を持たないものである、上記(５)に記載の複合体形成促進剤。
（７）N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物が、デキストラン硫酸若しくはその塩、又はコンドロイチン硫酸c若しくはその塩である、上記(５)又は(９)６に記載の複合体形成促進剤。
（８）下記（ｉ）〜（ii）から選択される、上記(５)、(６)、(７)のいずれかに記載の複合体形成促進剤：
(ｉ)N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖がデキストラン硫酸又はその塩で、糖鎖を有する物質がαフェトプロテイン-L3（AFP-L3）で、レクチンがレンズマメレクチンである、
(ｉｉ)N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物が、デキストラン硫酸若しくはその塩、又はコンドロイチン硫酸c若しくはその塩で、糖鎖を有する物質がα(2, 3)糖鎖遊離型前立腺特異抗原で、レクチンがイヌエンジュレクチンである。
（９）上記(１)に記載の方法で糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体を形成させた後、該複合体の量を測定する、糖鎖を有する物質の測定方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の複合体形成方法を実施することにより、糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体の量が増加する。そのため、本発明の複合体形成方法を利用して、N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物の存在下に糖鎖を有する物質を測定すれば、糖鎖を有する物質の高感度な測定を行うことができる。【００１６】
また、本発明の複合体形成方法は、糖鎖に対するレクチンの親和性を利用したあらゆる反応、検出、測定、糖鎖の分析等に利用することができる。そして、検出や測定の感度を高める、高精度な糖鎖の分析が可能になる、糖鎖を有する物質を効率よく分離することが出来る、等の効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１で得られた、デキストラン硫酸ナトリウムを含有するAFP-L3溶液を用い、ビアコア（Biacore）による測定で得られたセンサーグラム（＋）と、デキストラン硫酸ナトリウムを含有しないAFP-L3溶液を用い、ビアコア（Biacore）による測定で得られたセンサーグラム（◆）である。
【図２】実施例１で得られた、コンドロイチン硫酸cナトリウムを含有するAFP-L3溶液を用い、ビアコア（Biacore）による測定で得られたセンサーグラム（□）と、コンドロイチン硫酸cナトリウムを含有しないAFP-L3溶液を用い、ビアコア（Biacore）による測定で得られたセンサーグラム（◆）である。
【図３】実施例２及び実施例３で使用したマイクロチップの模式図である。
【図４】実施例２及び実施例３で使用したマイクロチップのチップ内流路の模式図である。
【図５】実施例２で得られた、コンドロイチン硫酸cナトリウムの濃度と複合体１分画のピーク面積との関係を示すグラフである。
【図６】実施例３で得られた、デキストラン硫酸ナトリウムの濃度と複合体１分画のピーク面積との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
［１］本発明の複合体形成方法
本発明の複合体形成方法は、「N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物の存在下に、糖鎖を有する物質を含有する試料と該糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチンとを接触させる、該糖鎖を有する物質と該レクチンとの複合体形成方法。」である。
【００１９】
「糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチン」を、以下、単に「レクチン」と記載する場合がある。
【００２０】
N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖
本発明に係るN-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖としては、一般に多糖といわれるものであって、構成糖としてN-アセチルグルコサミンを有さない、水溶性のものが挙げられる。
【００２１】
例えば、一種類の単糖がグリコシド結合によって多数重合したホモ多糖（単純多糖）、複数種の単糖がグリコシド結合によって多数重合したヘテロ多糖（複合多糖）、又は糖アルコール等であって、構成糖としてN-アセチルグルコサミンを有さない、水溶性のものが挙げられる。
【００２２】
水溶性のホモ多糖（単純多糖）であって、構成糖としてN-アセチルグルコサミンを有さないものとしては、デキストラン、アガロース、カラギーナン、デキストラン硫酸、カルボキシメチルデキストラン、フコイダン、フノラン、キトサン、およびこれらの誘導体等が挙げられる。
【００２３】
水溶性のヘテロ多糖（複合多糖）であって、構成糖としてN-アセチルグルコサミンを有さないものとしては、ポルフィラン、グルコマンナン、アルギン酸、キサンタンガム、およびこれらの誘導体等が挙げられる。
【００２４】
水溶性の糖アルコールであって、構成糖としてN-アセチルグルコサミンを有さないものとしては、エリスリトール、キシリトール、およびこれらの誘導体等が挙げられる。
【００２５】
これらのN-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖の中でも水溶性のホモ多糖が好ましく、デキストラン硫酸及びその誘導体がより好ましく、デキストラン硫酸が特に好ましい。
【００２６】
本発明に係るN-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖は、例えばリチウム塩、ナトリウム塩，カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩，マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩，トリエチルアミン塩，ジメチルアミン塩等の有機アミン塩であってもよい。
【００２７】
その好ましい塩は、多糖又は多糖を有する化合物の種類によって異なるが、ナトリウム塩が好ましく、デキストラン硫酸ナトリウムがより好ましい。
【００２８】
また、本発明に係るN-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖の分子量は、数百〜数百万、好ましくは約1,000〜1,000,000、より好ましくは約5,000〜500,000である。
【００２９】
N-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物
本発明に係るN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物としては、多糖にタンパク質や脂質が結合した所謂複合糖質であって、その多糖部分の構成糖としてN-アセチルグルコサミンを有さない、水溶性のものが挙げられる。
【００３０】
例えばグリコサミノグリカンにタンパク質が結合したプロテオグリカン等の複合糖質であって、そのグリコサミノグリカン部分の構成糖としてN-アセチルグルコサミンを有さない、水溶性のものが挙げられる。
【００３１】
そのような水溶性のプロテオグリカンとしては、コンドロイチン硫酸a，コンドロイチン硫酸b，コンドロイチン硫酸ｃ，コンドロイチン硫酸d，コンドロイチン硫酸e等のコンドロイチン硫酸、およびこれらの誘導体等が挙げられる。その中でも、コンドロイチン硫酸c及びその誘導体が好ましく、コンドロイチン硫酸cが特に好ましい。
【００３２】
本発明に係るN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物は、例えばリチウム塩、ナトリウム塩，カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩，マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩，トリエチルアミン塩，ジメチルアミン塩等の有機アミン塩であってもよい。
【００３３】
その好ましい塩は、多糖又は多糖を有する化合物の種類によって異なるが、ナトリウム塩が好ましい。例えば、コンドロイチン硫酸ナトリウムが好ましく、コンドロイチン硫酸cナトリウムがより好ましい。
【００３４】
また、本発明に係るN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物の分子量は、数百〜数百万、好ましくは約1,000〜1,000,000、より好ましくは約5,000〜500,000である。
【００３５】
本発明に係るN-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物としては、「その存在下に糖鎖を有する物質とレクチンとを接触させて反応させる際に、その反応時の条件下で、該反応液中で均一な溶解状態になる程度の、十分な水溶性を示すもの」が選択される。その好ましい具体例は、上記した通りである。
【００３６】
なお、「N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物」をまとめて、以下「本発明に係る多糖類」と記載する場合がある。
【００３７】
糖鎖を有する物質
本発明に係る「糖鎖を有する物質」は、「レクチンが親和性を有する（結合する）糖鎖構造を有する糖鎖」を有する物質であればよく、特に限定されない。  
【００３８】
糖鎖を有する物質の具体例としては、例えばAFP，PSA，CA19-9，CA125，PIVKA-II，ポドカリキシン等の腫瘍マーカー、α1-グロブリン，α2-グロブリン，β-グロブリン，γ-グロブリン，フェチュイン等の血清タンパク質、コラーゲン等の繊維タンパク質、ゴナドトロピン，甲状腺刺激ホルモン，ヒト絨毛性腺刺激ホルモン（hCG），黄体形成ホルモン（LH），卵胞刺激ホルモン（FSH），甲状腺刺激ホルモン（TSH）等のホルモン類、リボヌクレアーゼ，タカアミラーゼ，γ-グルタミルトランスフェラーゼ（γ-GTP），アルカリ性ホスファターゼ，コリンエステラーゼ，リゾチーム等の酵素類、フィブロネクチン，プロテオグリカン等の細胞間物質、α1-酸性糖タンパク質、α1-アンチトリプシン、α2-マクログロブリン、α2-HS糖タンパク質、トランスフェリン、ハプトグロビン、セルロプラスミン、癌胎児性抗原（CEA）、免疫グロブリン（IgG，IgM，IgA，IgD，IgE）、補体成分（C1，C1q，C1r，C1s，C4，C2，C3，C5，C6，C7，C8，C9）、インターフェロン、血液凝固因子（フィブリノーゲン，プロトロンビン，V因子，VII因子，IX因子，X因子，XI因子，XII因子，XIII因子等）、アンチトロンビンIII、エリスロポエチン、多能性幹細胞（ES細胞、iPS細胞等）の未分化マーカー（SSEQ-1、SSEA-3/4、ポドカリキシン等）等が挙げられる。
【００３９】
本発明に係る糖鎖を有する物質としてはAFP、PSA、ポドカリキシンが好ましく、AFP及びPSAがより好ましい。
【００４０】
本発明に係る糖鎖を有する物質には、レクチンが親和性を有する糖鎖構造を有する「糖鎖」も含まれる。例えば、アミロース、アミロペクチン、セルロース、グリコーゲン等が挙げられる。マウスES細胞等の未分化幹細胞で発現が確認されているLewis X (Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNac)や、糖タンパク質等から遊離した糖鎖の断片等も、本発明に係る糖鎖を有する物質に含まれる。好ましくは、Lewis X (Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNac)が挙げられる。
【００４１】
本発明に係る「糖鎖を有する物質」に係る糖鎖としては、レクチンが親和性を有する糖鎖構造を有するものが挙げられる。
【００４２】
例えば、上記した糖鎖を有する物質が持つ糖鎖が挙げられる。また、その一例として、癌患者の血液中等に観察される糖鎖が挙げられる。
【００４３】
その具体例としては、例えば
(１)フコースが付加された糖鎖：肝臓癌患者で観察される、APF-L3の糖鎖であるFucα1→6GlcNac (コアフコース)（Kobayashi Y. et al., J. Biol. Chem., vol.287, No.41, pp. 33973-33982, October 5, 2012）等、
(２)末端にシアル酸が付加された糖鎖：肝臓癌患者で観察される、PSAの糖鎖であるSiaα2→3Gal（Chikara Oyama et al., Glycobiology, vol.14, No.8, pp.671-679, 2004、Yoneyama T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol.448, No.4, pp.390-396, 2014, Tomokazu Ishikawa et al., J. Urology, vol.196, p.e331）等、
(３)N-アセチルガラクトサミンが付加された糖鎖：肝臓癌患者で観察される、PSAの糖鎖であるGalNacβ1-R（特許第5630757、Takatoshi Kaya, et al., Anal. Chem., vol. 87, No. 3, pp. 1797-1803, 2015）等、
が挙げられる。
【００４４】
例えば、AFPは肝細胞癌マーカーであるが、肝細胞癌だけでなく慢性肝炎や肝硬変でも血中濃度が高値を示す。しかし、肝細胞癌患者の血清中には、糖鎖にα-L-フコース残基やN-アセチルグルコサミン残基（バイセクティング N-アセチルグルコサミン）が付加した糖鎖（Fucα1→6GlcNac）を持つAFP(AFP-L3)が高頻度で観察されることが確認されている。
【００４５】
また、PSAは前立腺癌マーカーとして知られている。正常者の血清中に観察されるPSAは、大部分が糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 6)結合したN型糖鎖を有するPSAである。しかし、前立腺癌患者の血清中には、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖（Siaα2→3Gal）を持つPSA（以下、「α(2,3)糖鎖PSA」と記載する）が増加することが知られている(Tajiri M. et al., 2008, vol. 18, pp. 2-8)。
【００４６】
糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖（Siaα2→3Gal）とは、具体的には以下の構造をいう。
2018174044.tif 000002
【００４７】
α(2,3)糖鎖PSAの糖鎖の構造の一例を下記式(I)に示す。
2018174044.tif 000003
【００４８】
また、細胞の未分化マーカーや分化マーカーとして知られている糖タンパク質の糖鎖も本発明に係る糖鎖を有する物質として挙げられる。
【００４９】
例えば、近年ES細胞、iPS細胞等の多能性幹細胞の細胞表面に存在することが明らかとなった糖鎖構造である、（Fucα1-2Galβ1-3GlcNac）や（Fucα1-2Galβ1-3GalNac）が挙げられる。また、該糖鎖構造を有する未分化糖鎖マーカーとして、複合糖質であるポドカリキシン（Podocalyxin）が同定されている（WO2013/065302号）。
【００５０】
糖鎖を有する物質を含有する試料
本発明に係る糖鎖を有する物質を含有する試料としては、例えば血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、腹水、糞便懸濁液、腹水、組織抽出液、組織切片、組織生検試料、器官等の、ヒトや動物等の生体由来試料、又はこれらの生体由来試料から調製されたもの、ウイルス，細菌，細胞等の微生物又はこれらから調製されたものが挙げられる。
【００５１】
これらの中でも、血液、血清、又は血漿が好ましく、血清がより好ましい。
【００５２】
細胞抽出液、上記微生物由来の抽出液、又は該抽出液から調製されたものも本発明に係る糖鎖を有する物質を含有する試料として用いることができる。
【００５３】
また、上記細菌，細胞等の中には、糖タンパク質を分泌するものがある。また、細胞膜等に存在する糖タンパク質から糖鎖が遊離する場合もある。そのため、上記の生体由来試料や微生物の培養液も、本発明に係る糖鎖を有する物質を含有する試料として用いることができる。
【００５４】
本発明に係る糖鎖を有する物質を含有する試料は、水や適当な緩衝液に希釈して用いてもよい。
【００５５】
そのために用いられる水としては、例えば蒸留水、脱イオン水等の精製水等が挙げられる。
【００５６】
緩衝液としては、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液、Tris-HCl緩衝液、MES緩衝液、HEPES緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。これらの緩衝液の緩衝剤濃度としては、通常5〜1,000mM、好ましくは5〜300mMの範囲から適宜選択される。そのpHも特に限定されないが、例えば5〜9の範囲が挙げられる。
【００５７】
なお、本明細書では、「糖鎖を有する物質を含有する試料」と「糖鎖を有する物質」を特に区別せずに用いている場合がある。すなわち、本明細書において単に「糖鎖を有する物質を含有する試料」と記載した場合、「糖鎖を有する物質」の意味を含む場合がある。
【００５８】
レクチン
本発明で用いられるレクチンは、複合体を形成する対象となる糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有し、該糖鎖を認識して該糖鎖に結合するレクチンであればよく、そのような性質を有するレクチンを、既知のレクチンから任意に選択すればよい。中でも、該糖鎖に特異的に結合するレクチンが好ましい。
【００５９】
レクチンの由来は限定されず、動物、植物、真菌細菌、ウイルス等に由来するレクチンであってもよい。また、天然由来レクチンであっても、リコンビナント品であっても、市販されているレクチンであってもよい。
【００６０】
レクチンの具体例としては、例えばロータスマメレクチン（LTL）、エンドウマメレクチン（PSA）、レンズマメレクチン（Lens culimaris agglutinin：LCA）、ハリエニシダレクチン（UEA-1）、麹菌レクチン（AOL）、ヒイロチャワンタケレクチン（AAL）、マッシュルームレクチン（ABA）、ジャカリンレクチン（Jacalin）、ピーナッツレクチン（PNA）、ノダフジレクチン（WFA）、センニンコクレクチン（ACA）、オーセージオレンジレクチン（MPA）、食用カタツムリレクチン（HPA）、ヘアリーベッチレクチン（VVA）、ドリコスマメレクチン（DBA）、ダイズレクチン（SBA）、バンディラマメレクチン（GSL-I、GSL-IA4、GSL-II、GSL-IB4）、シカクマメレクチン（PTL-I），インゲンマメレクチン（PHA-E、PHA-L）、ムラサキモクワンジュレクチン（BPL）、セイヨウニワトコレクチン（SNA）、ニホンニワトコレクチン（SSA）、キカラスウリレクチン（TJA-II、TJA-I）、イヌエンジュレクチン（Maackia amurensis Lectin、MAA、MAH）、小麦胚芽レクチン（WGA）、チョウセンアサガオレクチン（DSA）、トマトレクチン（LEL）、ジャガイモレクチン（STL）、イラクサレクチン（UDA）、アメリカヤマゴボウレクチン（PWM）、デイゴマメレクチン（ECA）、ヒママメレクチン（RCA120）、ラッパズイセンレクチン（NPA）、タチナタマメレクチン（ConA）、マツユキソウレクチン（GNA）、アマリリスレクチン（HHL）、セイヨウマユミレクチン（EEL）等が挙げられる。
【００６１】
また、多能性幹細胞の未分化マーカーが有する糖鎖を認識するレクチンが挙げられる。例えば、多能性幹細胞の未分化マーカーとして知られるポドカリキシンが有する糖鎖である（Fucα1-2Galβ1-3GlcNac）や（Fucα1-2Galβ1-3GalNac）を認識するレクチンである、BC2LCNが挙げられる（Tateno H, et al., J. Biol. Chem., vol.286, No.23, pp.20345-20353, 2011）。BC2LCNは、グラム陰性細菌（Burkholderia cenocepacia）由来のBC2L-Cタンパク質のＮ末端ドメインに対応したレクチンである（GenBank Accession No. YP_002232818）。
【００６２】
本発明で用いられるレクチンとしては、LCA、MAA、又はBC2LCNが好ましく、LCA又はMAAがより好ましい。
【００６３】
下記表１に、本発明で用いられるレクチンの例と、それぞれのレクチンの由来（Origin）、そのレクチンが親和性を有する糖鎖構造（Specificity）の例を併せて示す。
【００６４】
【表１】
2018174044.tif 000004
【００６５】
レクチンは、検出可能な標識物質で標識されていてもよい。
【００６６】
レクチンを標識するために用いられる標識物質としては、例えば蛍光色素（フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、Cy5、Alexa Fluor 647等）、酵素（西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ）、補酵素、化学発光物質、放射性物質（32P、14C、125I、3H、131I等）、ビオチン等の標識物質が挙げられる。また、標識物質は直接レクチンに結合させてもよいし、適当なスペーサーを介して結合させてもよい。
【００６７】
レクチンは、標識物質の種類に応じた自体公知の標識方法で、標識すればよい。
【００６８】
さらに、レクチンは不溶性担体等の固相に固定化されていてもよい。固相として用いられる不溶性担体としては、通常この分野で用いられる担体であれば何れも使用可能である。その形状は、例えば粒子（ラテックス粒子、ビーズ、磁気ビーズ等）、チューブ、カーボンナノチューブ、チップ、ディスク状片、微粒子、薄膜、微細管、プレート、マイクロプレート、フィルター等の通常この分野で用いられる形状であればよく、その材質も特に限定されない。
【００６９】
また、レクチンを基板に固定化して作製されたマイクロチップ、マイクロアレイ、マクロアレイ、マイクロタイタープレートも、本発明に用いることができる。
【００７０】
レクチンを不溶性担体に固定化する方法としては、使用する不溶性担体の種類に応じた自体公知の固定化方法が挙げられる。
【００７１】
本発明の複合体形成方法
本発明の複合体形成方法は、最終的に「本発明に係る多糖類を含有する、糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体」が得られる方法であればよい。本発明に係る多糖類の存在下に、糖鎖を有する物質を含有する試料と該糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチンとを接触させる方法であって、最終的に「本発明に係る多糖類を含有する、糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体の溶液」が得られる方法が好ましい。
【００７２】
本発明の複合体形成方法としては、具体的には例えば、
（i）糖鎖を有する物質を含有する試料を、本発明に係る多糖類又は本発明に係る多糖類を含有する溶液と混合して混合液を得た後、得られた混合液を、該糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチン又は該レクチンを含有する溶液と混合して反応させる方法、
（ii）糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチン又は該レクチンを含有する溶液を、本発明に係る多糖類又は本発明に係る多糖類を含有する溶液と混合して混合液を得た後、得られた混合液を、糖鎖を有する物質を含有する試料と混合して反応させる方法、
（iii）糖鎖を有する物質を含有する試料を本発明に係る多糖類又は本発明に係る多糖類を含有する溶液と混合して混合液を得た後、得られた混合液を、該糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチンと本発明に係る多糖類とを含有する溶液と混合して反応させる方法、
（iv）糖鎖を有する物質を含有する試料を、該糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチン又は該レクチンを含有する溶液と混合して反応させた後、得られた反応液を、本発明に係る多糖類又は本発明に係る多糖類を含有する溶液と混合して混合液を得る方法、等が挙げられる。
【００７３】
本発明の複合体形成方法においては、本発明に係る多糖類の存在下に、糖鎖を有する物質の糖鎖とレクチンとが反応して、糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体を形成する。
【００７４】
すなわち、上記の方法において「反応」とは、糖鎖を有する物質とレクチンとの糖鎖との複合体形成反応を指す。
【００７５】
上記方法の中でも、(i)〜(iii)の方法が好ましく、(i)又は(iii)の方法がより好ましい。
【００７６】
本発明の複合体形成方法を自動分析装置を用いて行う場合には、使用する試液のいずれかに本発明に係る多糖類を含有させればよい。本発明に係る多糖類を含有する溶液を、自動分析装置の試薬を入れるセルの一つにセットして用いてもよい。そして、自動分析装置を用いた測定において、糖鎖を有する物質とレクチンとを、本発明の多糖類の存在下で接触させ、糖鎖を有する物質の糖鎖とレクチンとを反応させればよい。
【００７７】
本発明に係る多糖類を含有する溶液に用いられる溶媒としては、水又は緩衝液等が挙げられる。
【００７８】
レクチンを含有する溶液に用いられる溶媒としては、例えば緩衝液が挙げられる。
【００７９】
本発明に係る多糖類とレクチンとを含有する溶液に用いられる溶媒としては、例えば緩衝液が挙げられる。
【００８０】
本発明に係る多糖類を含有する溶液に用いられる水としては、例えば蒸留水、脱イオン水等の精製水等が挙げられる。
【００８１】
本発明に係る多糖類を含有する溶液、レクチンを含有する溶液、及びレクチンと本発明に係る多糖類とを含有する溶液に用いられる緩衝液の具体例としては、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液、Tris-HCl緩衝液、MES緩衝液、HEPES緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体形成反応を、市販のキットや、自動分析装置等の測定機器を用いて行う場合には、キットに添付の緩衝液、自動分析装置専用の緩衝液等（例えば、後記するビアコアＴＭ用のHBS-EPバッファー等）を用いてもよい。
【００８２】
また、これらの緩衝液の緩衝剤濃度としては、通常5〜1,000mM、好ましくは5〜300mMの範囲から適宜選択される。そのpHも特に限定されないが、例えば5〜9の範囲が挙げられる。
【００８３】
また、これらの緩衝液には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、反応促進剤、タンパク質、塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害したりせず、糖鎖とレクチンとの反応を阻害しないものが含まれていてもよい。またその濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
【００８４】
糖鎖を有する物質を含有する溶液に用いられる溶媒の具体例及びその条件等は、前記した通りである。
【００８５】
本発明に係る多糖類を含有する溶液中の本発明に係る多糖類の濃度、レクチンを含有する溶液中のレクチンの濃度、及び糖鎖を有する物質を含有する試料中の糖鎖を有する物質の濃度は、本発明に係る多糖類の存在下に糖鎖を有する物質とレクチンとを接触させ、反応させたときの反応液中の濃度がそれぞれ目的の濃度範囲内になるような濃度であればよい。
【００８６】
例えば、本発明に係る多糖類を含有する溶液中の本発明に係る多糖類の濃度は、0.01(w/v)%〜50(w/v)%、好ましくは0.1(w/v)%〜25(w/v)%、より好ましくは0.5(w/v)%〜15(w/v)%、更に好ましくは0.5〜10(w/v)%である。
【００８７】
レクチンを含有する溶液中のレクチンの濃度は、1μg/mL〜30mg/mL、好ましくは10μg/mL〜20mg/mL、より好ましくは1〜10mg/mLである。
【００８８】
糖鎖を有する物質を含有する試料中の糖鎖を有する物質の濃度は、1pg/mL〜1mg/mL、好ましくは10pg/mL〜100μg/mL、より好ましくは1ng〜50μg/mLである。
【００８９】
本発明の複合体形成方法において、本発明に係る多糖類の存在下に糖鎖を有する物質とレクチンとを接触させ、反応させた際の、反応液中の本発明に係る多糖類の濃度は、使用する本発明に係る多糖類の種類や、その後に行う測定法、分析法等により異なるが、0.01(w/v)%〜50(w/v)%、好ましくは0.1(w/v)%〜25(w/v)%、より好ましくは0.5(w/v)%〜15(w/v)%、更に好ましくは0.5〜10(w/v)%である。
【００９０】
後述するキャピラリー電気泳動装置のマイクロ流路内で糖鎖を有する物質とレクチンを反応させる場合は、マイクロ流路内での本発明に係る多糖類の濃度は、0.01(w/v)%〜50(w/v)%、好ましくは0.1(w/v)%〜25(w/v)%、より好ましくは1(w/v)%〜15(w/v)%、更に好ましくは4〜10(w/v)%である。
【００９１】
レクチンの該反応液中の濃度は、1μg/mL〜30mg/mL、好ましくは10μg/mL〜20mg/mL、より好ましくは1〜10mg/mLである。
【００９２】
糖鎖を有する物質の該反応液中の濃度は、1pg/mL〜1mg/mL、好ましくは10pg/mL〜100μg/mL、より好ましくは1ng〜50μg/mLである
【００９３】
なお、上記方法(iii)の場合には、最終的に得られた「本発明に係る多糖類を含有する、糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体の溶液」中の本発明に係る多糖類の濃度、レクチンの濃度、及び糖鎖を有する物質の濃度が、それぞれ上記した目的の濃度範囲内になればよい。
【００９４】
糖鎖を有する物質を含有する試料とレクチンとを接触させ反応させる条件、及び本発明に係る多糖類の存在下に糖鎖を有する物質を含有する試料とレクチンとを接触させ反応させる条件としては、糖鎖を有する物質の糖鎖とレクチンとが十分に反応し、糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体を形成できる条件であればよい。
【００９５】
例えば、糖鎖を有する物質を含有する試料とレクチンとの反応時の温度は、糖鎖を有する物質の糖鎖とレクチンとの反応を抑制しない範囲であれば特に限定されず、10〜50℃、好ましくは20〜40℃の範囲が挙げられる。また、その反応時間は、用いられるレクチン並びにpH及び温度等の反応条件により異なる。例えば１〜60分、好ましくは1〜15分程度で反応させればよい。
【００９６】
本発明の複合体形成方法に用いられる、本発明に係る多糖類とレクチンの選択方法は以下の通りである。
すなわち、本発明の複合体形成方法に用いられる本発明に係る多糖類は、本発明の複合体形成方法に用いられるレクチンが親和性を有する糖鎖構造を持たないものを選択する。すなわち、ある糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体を形成させる場合、該糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有し、該糖鎖を認識して結合するレクチンを選択する。そして、本発明に係る多糖類としては、選択した該レクチンが親和性を有する糖鎖構造を持たないものを選択する。
【００９７】
例えば、ある糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体を形成させる場合において、上記表１に記載されたレクチンを選択した場合、本発明に係る多糖類としては、表１に記載されたそのレクチンが親和性を有する糖鎖構造（Specificity）を持たない、本発明に係る糖鎖を選択する。
【００９８】
具体的な例を挙げると、例えば変異糖鎖（Fucα1→6GlcNAc）を持つAFP（AFP-L3）とレクチンとの複合体を形成させる場合、この変異糖鎖（Fucα1→6GlcNAc）に親和性を有するレクチンとして、例えばLCAを用いることができる。この場合、AFP-L3とLCAの接触時（反応時）に共存させる本発明に係る多糖類として、LCAが親和性を有する糖鎖（Fucα1→6GlcNAc、α-Man）を持たないものを選択する。そのような本発明に係る多糖類としては、例えばデキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、又はこれらの塩（例えばデキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸cナトリウム）等が挙げられる。
【００９９】
デキストラン硫酸は、グルコースが１,6結合により重合したデキストランの一部が硫酸化された構造を持つ。コンドロイチン硫酸は、D-グルクロン酸（GlcUA）とN-アセチル-D-ガラクトサミン（GalNAc）の２糖が反復する糖鎖に硫酸が結合した構造を持つ。しかし、デキストラン硫酸もコンドロイチン硫酸も、LCAが親和性を有する糖鎖（Fucα1→6GlcNAc、α-Man）を持たない。
【０１００】
例えば、変異糖鎖（Siaα2→3Gal）を持つPSAとレクチンとの複合体を形成さる場合、糖鎖（Siaα2→3Gal）に親和性を有するレクチンとして、例えばMAAを用いることができる。この場合、PSAとMAAの反応時に共存させる本発明に係る多糖類は、MAAが親和性を有する糖鎖（Siaα2→3Galβ1→4GlcNAc）を持たないものを選択する。そのような本発明に係る多糖類としては、例えばデキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、又はこれらの塩（例えばデキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸cナトリウム等）が挙げられる。
【０１０１】
細胞表面に未分化マーカーである（Fucα1-2Galβ1-3GlcNac）及び／又は（Fucα1-2Galβ1-3GalNac）を持つ多能性幹細胞とレクチンとの複合体を形成させる場合、該糖鎖に親和性を有するレクチンとして、例えばBC2LCNを用いることができる。この場合、多能性幹細胞とBC2LCNの接触時（反応時）に共存させる本発明に係る多糖類は、BC2LCNが親和性を有する糖鎖である（Fucα1-2Galβ1-3GlcNac）を持たず、（Fucα1-2Galβ1-3GalNac）も持たないものを選択する。そのような本発明に係る多糖類としては、例えばデキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、又はこれらの塩（例えばデキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸cナトリウム等）が挙げられる。
【０１０２】
本発明の複合体形成方法の具体例を以下に示すが、これに限定されない。
【０１０３】
(i) 1pg/mL〜1mg/mLのAFP-L3を含有する血清等の試料を、0.01(w/v)%〜50(w/v)%のデキストラン硫酸ナトリウムを含有する5〜1000mM Tris-HCl緩衝液（pH5〜9）等の緩衝液と混合して混合液を得る。得られた混合液を、1μg/mL〜30mg/mLのLCAと0.01(w/v)%〜50(w/v)%のデキストラン硫酸ナトリウムを含有する5〜1000mM Tris-HCl緩衝液（pH5〜9）等の緩衝液と混合して、10〜50℃で1〜60分間反応させる。該反応液中のAFP-L3の濃度は1pg/mL〜1mg/mL、デキストラン硫酸ナトリウムの濃度は0.01(w/v)%〜50(w/v)%、LCAの濃度は1μg/mL〜30mg/mLである。
【０１０４】
(ii) 1pg/mL〜1mg/mLのAFP-L3を含有する血清等の試料を、0.01(w/v)%〜50(w/v)%のコンドロイチン硫酸cナトリウムを含有する5〜1000mM Tris-HCl緩衝液（pH5〜9）等の緩衝液と混合して混合液を得る。得られた混合液を、1μg/mL〜30mg/mLのLCAと0.01(w/v)%〜50(w/v)%のコンドロイチン硫酸cナトリウムを含有する5〜1000mM Tris-HCl緩衝液（pH5〜9）等の緩衝液と混合して、10〜50℃で1〜60分間反応させる。該反応液中のAFP-L3の濃度は1pg/mL〜1mg/mL、コンドロイチン硫酸cナトリウムの濃度は0.01(w/v)%〜50(w/v)%、LCAの濃度は1μg/mL〜30mg/mLである。
【０１０５】
(iii) 1pg/mL〜1mg/mLのα(2, 3)糖鎖遊離型PSAを含有する血清等の試料を、0.01(w/v)%〜50(w/v)%のデキストラン硫酸ナトリウムを含有する5〜1000mM Tris-HCl緩衝液（pH5〜9）等の緩衝液と混合して混合液を得る。得られた混合液を、1μg/mL〜30mg/mLのMAAと0.01(w/v)%〜50(w/v)%のデキストラン硫酸ナトリウムを含有する5〜1000mM Tris-HCl緩衝液（pH5〜9）等の緩衝液と混合して、10〜50℃で1〜60分間反応させる。該反応液中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの濃度は1pg/mL〜1mg/mL、デキストラン硫酸ナトリウムの濃度は0.01(w/v)%〜50(w/v)%、MAAの濃度は1μg/mL〜30mg/mLである。
【０１０６】
(iv) 1pg/mL〜1mg/mLのα(2, 3)糖鎖遊離型PSAを含有する血清等の試料を、0.01(w/v)%〜50(w/v)%のコンドロイチン硫酸cナトリウムを含有する5〜1000mM Tris-HCl緩衝液（pH5〜9）等の緩衝液と混合して混合液を得る。得られた混合液を、1μg/mL〜30mg/mLのMAAと0.01(w/v)%〜50(w/v)%のコンドロイチン硫酸cナトリウムを含有する5〜1000mM Tris-HCl緩衝液（pH5〜9）等の緩衝液と混合して、10〜50℃で1〜60分間反応させる。該反応液中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの濃度は1pg/mL〜1mg/mL、コンドロイチン硫酸cナトリウムの濃度は0.01(w/v)%〜50(w/v)%、MAAの濃度は1μg/mL〜30mg/mLである。
【０１０７】
(v) 1pg/mL〜1mg/mLのAFP-L3を含有する血清等の試料を、1μg/mL〜30mg/mLのLCAと0.01(w/v)%〜50(w/v)%のデキストラン硫酸ナトリウム又はコンドロイチン硫酸cナトリウムを含有する5〜1000mM Tris-HCl緩衝液（pH5〜9）等の緩衝液と混合して、10〜50℃で1〜60分間反応させる。該反応液中のAFP-L3の濃度は1pg/mL〜1mg/mL、デキストラン硫酸ナトリウム又はコンドロイチン硫酸cナトリウムの濃度は0.01(w/v)%〜50(w/v)%、LCAの濃度は1μg/mL〜30mg/mLである。
【０１０８】
(vi) 1pg/mL〜1mg/mLのα(2, 3)糖鎖遊離型PSAを含有する血清等の試料を、1μg/mL〜30mg/mLのMAAと0.01(w/v)%〜50(w/v)%のデキストラン硫酸ナトリウム又はコンドロイチン硫酸cナトリウムを含有する5〜1000mM Tris-HCl緩衝液（pH5〜9）等の緩衝液と混合して10〜50℃で1〜60分間反応させる。該反応液中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの濃度は1pg/mL〜1mg/mL、デキストラン硫酸ナトリウム又はコンドロイチン硫酸cナトリウムの濃度は0.01(w/v)%〜50(w/v)%、MAAの濃度は1μg/mL〜30mg/mLである。
【０１０９】
(vii) 1pg/mL〜1mg/mLのAFP-L3を含有する血清等の試料を、0.01(w/v)%〜50(w/v)%のデキストラン硫酸ナトリウム又はコンドロイチン硫酸cナトリウムを含有する5〜1000mM HBS-EP緩衝液（pH5〜9）等の緩衝液と混合して混合液を得る。得られた混合液を、センサーチップ等の固相に固定化されたLCAと接触させて、10〜50℃で1〜60分間反応させる。該反応液中のAFP-L3の濃度は1pg/mL〜1mg/mL、デキストラン硫酸ナトリウム又はコンドロイチン硫酸cナトリウムの濃度は0.01(w/v)%〜50(w/v)%、LCAの濃度は1μg/mL〜30mg/mLである。
【０１１０】
(viii) 1pg/mL〜1mg/mLのα(2, 3)糖鎖遊離型PSAを含有する血清等の試料を、0.01(w/v)%〜50(w/v)%のデキストラン硫酸ナトリウム又はコンドロイチン硫酸cナトリウムを含有する5〜1000mM HBS-EP緩衝液（pH5〜9）等の緩衝液と混合して混合液を得る。得られた混合液を、センサーチップ等の固相に固定化されたMAAと接触させて、10〜50℃で1〜60分間反応させる。該反応液中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの濃度は1pg/mL〜1mg/mL、デキストラン硫酸ナトリウム又はコンドロイチン硫酸cナトリウムの濃度は0.01(w/v)%〜50(w/v)%、MAAの濃度は1μg/mL〜30mg/mLである。
【０１１１】
なお、本発明の複合体形成方法により糖鎖を有する物質とレクチンの複合体の量が増加する理由は明確ではないが、例えば本発明に係る多糖類の存在下に糖鎖を有する物質とレクチンを反応させることにより、一旦生成した複合体が安定化し、糖鎖を有する物質とレクチンとに再分離しなくなるか、又は分離する量が減少し、結果として本発明に係る多糖類の非存在下に反応させた場合よりも、該複合体の量が増加することが考えられる。
または、本発明に係る多糖類が存在することにより、レクチンの糖鎖を有する物質の糖鎖に対する親和性が高くなり、そのため、本発明に係る多糖類の非存在下に糖鎖を有する物質とレクチンを接触させた場合よりも、本発明に係る多糖類の存在下に糖鎖を有する物質とレクチンを接触させた場合の方が、該複合体の量が増加する、ということが考えられる。
【０１１２】
［２］本発明の複合体形成方法の応用
【０１１３】
本発明の複合体形成方法は、糖鎖に対するレクチンの親和性を利用するあらゆる測定方法、分析方法、検出方法等に利用することができる。
【０１１４】
上記した糖鎖に対するレクチンの親和性を利用する測定方法、分析方法、又は検出方法としては、例えば表面プラズモン共鳴法、キャピラリー電気泳動、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、レクチンマイクロアレイ法、ELISA、組織染色、電気泳動法、フローサイトメトリー等が挙げられる。
【０１１５】
上記の方法の中でも、表面プラズモン共鳴法又はキャピラリー電気泳動が好ましい。
【０１１６】
以下に、本発明の複合体形成方法を、上記したそれぞれの方法に応用する方法を例に取り、説明する。
【０１１７】
それぞれの方法に用いられる本発明に係る多糖類、糖鎖を有する物質、糖鎖を有する物質を含有する試料、及びレクチン等の、各成分の具体例、各成分の溶液に用いられる溶媒、該溶液中の各成分の濃度、反応条件等は、上記した本発明の複合体形成方法に関する説明に記載した通りである。
【０１１８】
また、以下に説明する各応用方法において用いられる本発明に係る多糖類とレクチンの選択条件も、上記した通りである。
【０１１９】
なお、本発明の複合体形成方法を実施した後、糖鎖を有する物質の測定、糖鎖の検出、糖鎖構造の解析等を実施する場合、本発明に係る多糖類の存在下で測定・検出等を実施することが好ましい。
【０１２０】
つまり、複合体形成後は、目的の反応や目的の測定・検出が終了するまで（例えば複合体の測定・検出が目的の場合は、測定・検出が終了するまで）、複合体を含有する溶液中に、本発明に係る多糖類を共存させておくことが好ましい。該溶液の種類、及び溶液中の多糖類の濃度は、上記した通りである。
【０１２１】
例えば、後記する免疫学的測定法等において、複合体を形成しなかった遊離の糖鎖を有する物質やレクチンを洗浄処理等で除く場合、本発明に係る多糖類を含有する洗浄液を用いて洗浄処理を行うことが好ましい。また、本発明に係る多糖類の存在下に該複合体の量を測定することが好ましい。
【０１２２】
表面プラズモン共鳴法への応用
表面プラズモン共鳴法は、表面プラズモンが金属／液体界面で励起した場合に起こる、いわゆる表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance ＝ SPR）の光学現象を利用して生体分子間の相互作用を解析（測定）する分子間相互作用解析システムである。
【０１２３】
本発明の複合体形成方法を表面プラズモン共鳴法へ応用する方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
【０１２４】
センサーチップに、測定対象である糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチンを固定化する。測定対象の試料と本発明に係る多糖類とを含有する溶液を調製し、表面プラズモン共鳴分光装置の流路からレクチンを固定化したセンサーチップの表面に流せばよい。
【０１２５】
上記で用いられる測定対象の試料と本発明に係る多糖類とを含有する溶液を得る方法としては、最終的に該溶液が得られるような方法であればよい。例えば、該試料に本発明に係る多糖類又はその溶液を添加する方法や、該試料と本発明に係る多糖類を水や適当な緩衝液に溶解する方法が挙げられる。後記する他の測定方法に係る「測定対象の試料と本発明に係る多糖類とを含有する溶液」も、同様の方法で得られる。
【０１２６】
表面プラズモン共鳴法での測定は、表面プラズモン共鳴分光装置に添付の使用説明書に従って、その測定にとって至適な条件で行えばよい。
【０１２７】
装置の流路から流す、糖鎖を有する物質を含有する試料と本発明に係る多糖類とを含有する溶液中の本発明に係る多糖類の濃度は0.01(w/v)%〜50(w/v)%、好ましくは0.1(w/v)%〜25(w/v)%、より好ましくは0.5(w/v)%〜15(w/v)%、更に好ましくは0.5〜10(w/v)%である。
【０１２８】
本発明の複合体形成方法を実施すれば、従来の表面プラズモン共鳴法と比較して、糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体をより多く得ることができる。そのため、従来の表面プラズモン共鳴法に本発明の複合体形成方法を適用し、その糖鎖を有する物質が結合したレクチンを確認又は解析することによって、該物質が有する糖鎖の構造の情報をより正確且つ高感度に得ることができる。
【０１２９】
また、近年、疾病のマーカーである変異糖鎖を有する糖タンパク質を表面プラズモン共鳴法で検出・測定する方法が実施されるようになってきた（Takatoshi Kaya, et al., Anal. Chem., vol. 87, No. 3, pp. 1797-1803, 2015）。本発明に係る複合体形成方法を用いた表面プラズモン共鳴法を実施すれば、該変異糖鎖を有する糖タンパク質を高感度に検出することができるため、本発明の方法は、疾病等の判定等、臨床検査の分野において極めて有用である。
【０１３０】
表面プラズモン共鳴法の代表的な分析システムとして、ビアコアTM法がある。ビアコア法は、一般には単にビアコア(Biacore)と呼ばれる。また、「ビアコア」と言った場合、ビアコアの分析システムに用いられるビアコア機器を指すこともある。
【０１３１】
本発明に係る多糖類としてデキストラン硫酸ナトリウムを用い、レクチンとしてLCAを用いた本発明に係る複合体形成方法によるビアコア法によりAFP-L3を検出する方法の一例を、以下に説明する。
【０１３２】
常法によりLCAをビアコア専用チップ（センサーチップ）上に固定化する。また、測定対象の試料とデキストラン硫酸ナトリウム（0.01(w/v)%〜50(w/v)%）とを含有する緩衝液（例えばビアコア専用ランニングバッファーであるHBS-EP）を調製する。この溶液を、例えば10〜50℃、好ましくは20〜40℃、流速10〜50μL/minで、センサーチップに送液して反応させる。これにより、試料中にAFPが含まれていれば、センサーチップ上にAFP-L3とLCAの複合体が形成される。送液を開始した60〜180秒後に、ビアコアによる測定を行う。別にバッファー、AFPを含有するバッファー、AFPと本発明に係る多糖類を含有するバッファー等を用いて同様の測定を行い、得られた値をもとにバックグラウンド値の調整を行う。得られたビアコアによる測定結果をもとに、常法によりAFP-L3の量を得ることができる。
【０１３３】
予め濃度既知のAFP-L3を用いて同様にビアコアによる測定を行って得られた検量線を用いて、AFP-L3の量を決定してもよい。
【０１３４】
キャピラリー電気泳動への応用
本発明の複合体形成方法により糖鎖を有する物質と糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチンとの複合体を形成させ、得られた複合体をキャピラリー電気泳動により分離し、該複合体の量を測定することにより、糖鎖を有する物質の量を測定することができる。
【０１３５】
本発明の複合体形成方法をキャピラリー電気泳動へ応用する方法として、例えば、以下の［方法１］及び［方法２］が挙げられる。
【０１３６】
［方法１］
「測定対象の試料を、測定対象の糖鎖を有する物質に特異的に結合する抗体と反応させ、糖鎖を有する物質と抗体との抗原抗体複合体を得る。得られた抗原抗体複合体を、本発明に係る多糖類及び該糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチンの存在下にキャピラリー電気泳動に付し、該糖鎖を有する物質を、該レクチンの糖鎖に対する親和性の程度に基づいて分離し、測定することにより、糖鎖を有する物質を測定する。」という方法である。
【０１３７】
糖鎖を有する物質に特異的に結合する抗体としては、糖鎖を有する物質に特異的に結合する抗体一種を用いてもよいし、糖鎖を有する物質に特異的に結合するが、互いに異なるエピトープを認識する二種以上の抗体を用いてもよい。
【０１３８】
糖鎖を有する物質が糖タンパク質の場合、糖鎖を有する物質に特異的に結合する抗体としては、糖タンパク質のタンパク質部分（コアタンパク質）に特異的に結合する抗体が挙げられる。
【０１３９】
また、抗体は、検出可能な標識物質で標識されていてもよい。
【０１４０】
抗体を一種用いる場合でも二種以上用いる場合でも、いずれかの抗体は、陰イオン性物質等の荷電キャリヤー分子で標識されていてもよい。荷電キャリヤー分子としては、DNA等の核酸鎖が挙げられる。
【０１４１】
このような目的に使用される核酸鎖の種類としては、キャピラリー電気泳動に通常用いられているものであればよいし、また該核酸の抗体への結合方法は、自体公知の方法が挙げられる。
【０１４２】
なお、抗体は荷電キャリヤー分子と検出可能な標識物質の両方で標識されていてもよい。
【０１４３】
キャピラリー電気泳動は、キャピラリーチップで行われる電気泳動（（マイクロ）チップキャピラリー電気泳動）であってもよい。
【０１４４】
本発明に係るキャピラリー電気泳動に使用する泳動溶液、泳動条件、操作方法、反応条件等は、キャピラリー電気泳動を本発明に係る多糖類の存在下に行う以外は自体公知の方法に準ずればよい。
【０１４５】
キャピラリー電気泳動を市販の全自動測定装置を用いて行う場合には、予め移動相となる泳動溶液に本発明に係る多糖類とレクチンを含有させればよい。そして、糖鎖を有する物質と抗体との抗原抗体複合体とレクチンを、全自動測定装置の流路内で本発明に係る多糖類の存在下に反応させ、続けてキャピラリー電気泳動を実施すればよい。その他は、該装置に添付の取扱説明書に記載の条件で、該取扱説明書に記載の方法に従って、キャピラリー電気泳動を実施すればよい。
【０１４６】
キャピラリー電気泳動の全自動測定装置としては、例えばミュータスワコーi30（和光純薬工業(株)製）等が挙げられる。
【０１４７】
キャピラリー電気泳動を行う場合、泳動溶液中の本発明に係る多糖類の濃度は、0.01(w/v)%〜50(w/v)%、好ましくは0.1(w/v)%〜25(w/v)%、より好ましくは1(w/v)%〜15(w/v)%、更に好ましくは4〜10(w/v)%である。
【０１４８】
キャピラリー電気泳動を行う場合、泳動溶液中のレクチンの濃度は、キャピラリー電気泳動により分離する間、糖鎖を有する物質の糖鎖とレクチンとが完全に結合することができる量よりも高濃度であることが望ましい。すなわちレクチンの濃度は、1μg/mL〜30mg/mL、好ましくは10μg/mL〜20mg/mL、より好ましくは1〜10mg/mLである。
【０１４９】
抗原抗体複合体とレクチンとを本発明に係る多糖類の存在下に接触させ、反応させる際の、反応液中の本発明に係る多糖類の濃度、要すれば、複合体を分離し、検出させる際の溶液中の、本発明に係る多糖類の濃度（マイクロ流路内での濃度）は0.01(w/v)%〜50(w/v)%、好ましくは0.1(w/v)%〜25(w/v)%、より好ましくは1(w/v)%〜15(w/v)%、更に好ましくは4〜10(w/v)%である。
【０１５０】
抗原抗体複合体とレクチンとを本発明に係る多糖類の存在下に接触させ、反応させる際の、レクチンの濃度、要すれば、複合体を分離し、検出させる際の溶液中の、レクチンの濃度（マイクロ流路内での濃度）は、1μg/mL〜30mg/mL、好ましくは10μg/mL〜20mg/mL、より好ましくは1〜10mg/mLである。
【０１５１】
［方法２］
測定対象の試料と、該糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチンを標識物質で標識した標識レクチンとを、上記した本発明の複合体形成方法に従って、本発明に係る多糖類の存在下に接触させ、反応させる。次いで、得られた反応液中の[標識レクチン−糖鎖を有する物質]の複合体を、キャピラリー電気泳動を行って分離する。キャピラリー電気泳動を行う際、本発明に係る多糖類を溶解させた泳動溶液を用いてもよい。そして、[標識レクチン−糖鎖を有する物質]の複合体由来の標識物質の量を測定することにより、試料中の糖鎖を有する物質の量を測定することができる。
【０１５２】
泳動溶液中の本発明に係る多糖類及びレクチンの濃度、糖鎖を有する物質と標識レクチンとを本発明に係る多糖類の存在下に接触させ、反応させる際の、反応液中の本発明に係る多糖類の濃度、要すれば、複合体を分離し、検出させる際の、溶液中の本発明に係る多糖類の濃度（マイクロ流路内での濃度）、及びレクチンの濃度、要すれば、複合体を分離し、検出させる際の、溶液中のレクチンの濃度（マイクロ流路内での濃度）等は、上記した［方法１］の場合に準ずる。
【０１５３】
本発明の複合体形成方法とキャピラリー電気泳動法を実施することにより、例えばPSAを、その糖鎖の違いにより分離測定できる。
【０１５４】
上記方法の中でも、［方法１］が好ましい。
【０１５５】
本発明の複合体形成方法をキャピラリー電気泳動法に応用することにより、従来法と比較して、得られる糖鎖を有する物質とレクチンの複合体をより多く得ることができるので、キャピラリー電気泳動により検出される複合体のピークのシグナル値（ピーク面積等）が増大する。その結果、より高感度な糖鎖を有する物質の測定が可能となる。
【０１５６】
レクチンとしてMAAを用い、本発明に係る多糖類としてデキストラン硫酸ナトリウム又はコンドロイチン硫酸ｃナトリウムを用い、上記した［方法１］で、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAを分離し、測定する方法の一例を、以下に具体的に説明する。
【０１５７】
なお、α(2,3)糖鎖PSA等のPSAには、それぞれα１-アンチキモトリプシンやα2-マクログロブリンなどの結合タンパク質と結合した結合型と、結合タンパク質と結合していない遊離型が存在する。
【０１５８】
まず、測定対象の試料と、遊離型PSAに特異的に結合する抗PSA抗体（抗PSA抗体１）を検出可能な標識物質（例えば蛍光物質）で標識した標識抗PSA抗体１とを液相中で反応させる。試料中にPSAが含まれていれば、PSAは、蛍光標識抗PSA抗体１と結合して、以下の2種の複合体を形成する。
・[標識抗PSA抗体１−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA]複合体
・[標識抗PSA抗体１−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA]複合体
【０１５９】
得られた上記複合体を含む反応液と、PSAに特異的に結合する抗PSA抗体（抗PSA抗体２）をDNAで標識したDNA標識抗PSA抗体２を0.001〜10μM、好ましくは0.01〜1μM含有する試液2〜50μLと、泳動用緩衝液と、内部標準物質（例えば蛍光物質：HiLyte647[（AnaSpec社製）等）を、1〜10psiで30〜60秒の加圧法により、例えば、内径5〜500μm、好ましくは50〜200μm、より好ましくは50〜100μm、長さ１〜10cmのキャピラリーに導入し、20〜40℃保温下に5秒〜30分、好ましくは10秒〜15分反応させる。この反応により、以下の複合体１及び複合体２が得られる。
【０１６０】
複合体１：[標識抗PSA抗体１−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA−DNA標識抗PSA抗体２]の複合体、
複合体２：[標識抗PSA抗体１−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA−DNA標識抗PSA抗体２]の複合体
【０１６１】
次いで、複合体１及び複合体２を含む反応液を、MAA（1μg/mL〜30mg/mL）とデキストラン硫酸ナトリウムやコンドロイチン硫酸cナトリウム等の本発明に係る多糖類（0.01(w/v)%〜50(w/v)%）とを含有する泳動緩衝液（移動相）中でキャピラリー電気泳動に付す。複合体１はMAAと相互作用するが、複合体２はMAAと相互作用しないので、複合体１の方が複合体２よりも遅く泳動される。そのため、検出される標識抗PSA抗体１由来の標識物質のピークの出現位置が、複合体１と複合体２とで異なる。そこで、ピークの位置をもとに、複合体１のピーク及び複合体２のピークをそれぞれ知ることができる。
【０１６２】
α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの量は、複合体１のピーク面積やピークの高さに基づいて求めることができる。
【０１６３】
上記方法において、複合体１と複合体２を本発明に係る多糖類の存在下にMAAと反応させることにより、検出される複合体が増大するので、より高感度にα(2,3)糖鎖遊離型PSAを測定することができる。
【０１６４】
上記で用いられる抗PSA抗体1（遊離型PSAに特異的に結合する抗体）、抗PSA抗体２（PSAに特異的に結合する抗体）は、市販の抗体であってもよい。
【０１６５】
抗PSA抗体１（遊離型PSAに特異的に結合する抗体）の市販品としては、例えば例えばAnti PSAモノクローナル抗体 8A6 （HyTest社）、Anti PSAモノクローナル抗体（PS1）（HyTest社）、Anti PSAモノクローナル抗体（クローン108）（Anogen社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（PS2）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（2H9）（アブカム社）等が挙げられる。
【０１６６】
PSA抗体２（PSAに特異的に結合する抗体）は、遊離型PSAと結合型PSAの両方に結合できる抗体でよい。例えば、PSAのコアタンパク質に特異的に結合する抗体が挙げられる。その市販品としては、Anti PSAモノクローナル抗体 5A6（HyTest社）、Anti PSAモノクローナル抗体 5G6（HyTest社）、Anti PSAモノクローナル抗体（PS6）（HyTest社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（EP1588Y）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（A67-B/E3）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（35H9）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（KLK3/801）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（3E6）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（8301）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（A5D5）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（PSA 28/A4）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（1H12）（アブカム社）等が挙げられる。
【０１６７】
レクチンアフィニティークロマトグラフィーへの応用
糖タンパク質、糖ペプチド、糖鎖等を精製する方法として、レクチンアフィニティークロマトグラフィーがよく用いられる。
【０１６８】
レクチンアフィニティークロマトグラフィーでは、試料を、測定対象の糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチンをアガロース等の固相に固定化した充填剤を充填したカラムに流す。試料中に測定対象の糖鎖を有する物質があれば、該糖鎖とレクチンの相互作用により生じる糖鎖を有する物質の溶出の遅れに基づいて、目的の糖鎖を有する物質を分離し、測定する。
【０１６９】
本発明の複合体形成方法をレクチンアフィニティークロマトグラフィーに応用する方法としては、例えば本発明に係る多糖類を含有する移動相を用いて、通常のレクチンアフィニティークロマトグラフィーを行う方法が挙げられる。
【０１７０】
移動相中の本発明に係る多糖類の濃度は、0.01(w/v)%〜50(w/v)%、好ましくは0.1(w/v)%〜25(w/v)%、より好ましくは0.5(w/v)%〜15(w/v)%、更に好ましくは0.5〜10(w/v)%である。
【０１７１】
本発明の複合体形成方法をレクチンアフィニティークロマトグラフィーに応用することにより、糖鎖を有する物質を、従来より効率よく分離することができる。
【０１７２】
レクチンマイクロアレイ法への応用
国立研究開発法人産業技術総合研究所糖鎖医工学研究センター等の開発したレクチンマイクロアレイ法に、本発明の複合体形成方法を適用することができる。
【０１７３】
レクチンアレイ（レクチンマイクロアレイ）とは、特異性（親和性）の異なる数十種のレクチンをスライドガラス上にスポット状に並べて固定化したアレイである。
【０１７４】
本発明の複合体形成方法をレクチンマイクロアレイ法へ応用する方法として、例えば、以下の［方法１］及び［方法２］が挙げられる。
【０１７５】
［方法１］
糖鎖を有する物質と本発明に係る多糖類とを含有する溶液をレクチンマイクロアレイと相互作用させた後、そのマイクロアレイを、糖鎖を有する物質に特異的に結合する抗体を蛍光標識した蛍光標識抗体と反応させる。次いで、上記と同様の方法で蛍光標識抗体由来の蛍光を検出することにより糖鎖を有する物質が結合したレクチンを知ることができるので、その結果をもとに、糖鎖を有する物質の糖鎖を解析することができる。
【０１７６】
［方法２］
糖鎖を有する物質を蛍光物質等の検出可能な標識物質で標識した糖鎖を有する物質の標識物と本発明に係る多糖類とを含有する溶液をレクチンマイクロアレイと相互作用させた後、励起光を照射してエバネッセント場を発生させる。次いで、糖鎖を有する物質の標識物由来のシグナルを検出することにより糖鎖を有する物質が結合したレクチンを知ることができるので、その結果をもとに、糖鎖を有する物質の糖鎖を解析することができる。
【０１７７】
糖鎖を有する物質と本発明に係る多糖類とを含有する溶液中の、本発明に係る多糖類の濃度は、0.01(w/v)%〜50(w/v)%、好ましくは0.1(w/v)%〜25(w/v)%、より好ましくは0.5(w/v)%〜15(w/v)%、更に好ましくは0.5〜10(w/v)%である。
【０１７８】
レクチンマイクロアレイによる測定は、例えばMICROARRAY METHODS AND PROTOCOLS（CRC Press）, edited by Robert S. Matson, “”Chapter 9：Lectin Microarrays”, Masao Yamada, p.141, 2009に記載のプロトコルに従って実施すればよい。
【０１７９】
上記した方法の中でも、［方法１］が好ましい。
【０１８０】
レクチンマイクロアレイ法は、洗浄操作を行うことなくレクチンアレイの蛍光を検出できる方法であるが、本発明の形成方法をレクチンマイクロアレイ法に応用することにより、レクチンに対して親和性が弱い糖鎖であっても、より多くの量の糖鎖−レクチン複合体がマイクロアレイ上に維持される。そのため、該糖鎖の情報をより高精度に得ることができる。
【０１８１】
免疫学液測定方法（サンドイッチ法）への応用
本発明の複合体形成方法を免疫学液測定方法（サンドイッチ法）へ応用する場合は、本発明に係る多糖類の存在下に、糖鎖を有する物質とレクチンを反応させる以外は、公知の免疫学的測定方法（サンドイッチ法）に準じた測定を行えばよい。
【０１８２】
、本発明の複合体形成方法を、固相を用いたサンドイッチ法に応用する方法として、例えば、以下の［方法１］及び［方法２］が挙げられる。
［方法１］
測定対象である糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチンを固相に固定化する。測定対象の試料と本発明に係る多糖類とを含有する溶液を、上記固相と接触させ、反応させる。又は、本発明に係る多糖類を含有する溶液、測定対象の試料の順に上記固相と接触させて反応させてもよく、測定対象の試料、本発明に係る多糖類を含有する溶液の順に、上記固相と接触させて反応させてもよい。
【０１８３】
固相を洗浄処理した後、測定対象の糖鎖を有する物質に特異的に結合する抗体を検出可能な標識物質で標識した標識抗体の溶液を、固相と接触させ、反応させる。糖鎖を有する物質が糖タンパク質の場合には、そのコアタンパク質に特異的な抗体を用いればよい。固相を洗浄処理し、未反応の標識抗体を除去する。
【０１８４】
標識抗体の標識物質に応じた測定方法で、該固相上に形成された[レクチン−糖鎖を有する物質−標識抗体]の複合体由来の標識物質の量を測定する。そしてその結果に基づいて、糖鎖を有する物質を測定する。
［方法２］
測定対象の糖鎖を有する物質に特異的に結合する抗体を固相に固定化する。糖鎖を有する物質が糖タンパク質の場合には、そのコアタンパク質に特異的な抗体を用いればよい。
【０１８５】
その後、測定対象の試料を、上記固相と接触させ、反応させる。
【０１８６】
次いで、固相を洗浄処理した後、本発明に係る多糖類と測定対象である糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチンを検出可能な標識物質で標識した標識レクチンとを含有する溶液を、上記固相と接触させ、反応させる。又は、本発明に係る多糖類を含有する溶液、糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチンを検出可能な標識物質で標識した標識レクチンを含有する溶液の順に、上記固相と接触させて反応させてもよく、該標識レクチンを含有する溶液、本発明に係る多糖類を含有する溶液の順に、上記固相と接触させて反応させてもよい。
固相を洗浄処理し、未反応の標識レクチン等を除去する。
【０１８７】
標識レクチンの標識物質に応じた方法で、該固相上に形成された[抗体−糖鎖を有する物質−標識レクチン]の複合体由来の標識物質の量を測定する。そしてその結果に基づいて、糖鎖を有する物質を測定する。
【０１８８】
［方法１］及び［方法２］において、測定対象の試料とレクチンとを反応させる際の反応液中の本発明に係る多糖類の濃度は、0.01(w/v)%〜50(w/v)%、好ましくは0.1(w/v)%〜25(w/v)%、より好ましくは0.5(w/v)%〜15(w/v)%、更に好ましくは0.5〜10(w/v)%ある。
【０１８９】
［方法１］及び［方法２］で用いられる、各反応後に固相を洗浄処理する際の洗浄液、並びに［方法１］で用いられる標識抗体の溶液は、本発明に係る多糖類を含有していることが好ましい。洗浄液中の本発明に係る多糖類の濃度は、上記した通りである。
【０１９０】
また、本発明に係る多糖類の存在下に、[抗体−糖鎖を有する物質−標識レクチン]の複合体由来の標識物質の量を測定することが好ましい。測定時の本発明に係る多糖類の濃度は、上記した反応液中の濃度と同じでよい。
【０１９１】
上記した方法の中でも、［方法２］がより好ましい。
【０１９２】
本発明の複合体形成方法を免疫学的測定方法に応用すれば、糖鎖を有する物質とレクチンの複合体をより多く得ることができるので、より高感度な糖鎖を有する物質の測定が可能となる。
【０１９３】
電気泳動法への応用
測定対象の試料を常法によりゲル電気泳動後、PVDF膜等のメンブレンに転写する。次いで適宜メンブレンをブロッキング処理した後、得られたメンブレンを、糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチンを検出可能な標識物質で標識した標識レクチンと本発明に係る多糖類とを含有する溶液に浸漬させ、メンブレン上で糖鎖を有する物質と標識レクチンとの複合体を形成させる。次いで、標識物質に応じた測定方法で標識物質を検出することにより、糖鎖を有する物質を高感度に検出し、測定することができる。
【０１９４】
標識レクチンとして糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチンをビオチンで標識したビオチン標識レクチンを用いる場合には、次のように行う。まず糖鎖を有する物質を含有する試料をゲル電気泳動後、メンブレンに転写する。該メンブレンを、ビオチン標識レクチンと本発明に係る多糖類とを含有する溶液に浸漬させて、メンブレン上で糖鎖を有する物質とビオチン標識レクチンとの複合体を形成させる。次いで、メンブレンをHRP標識アビジン溶液（本発明に係る多糖類を含んでいてもよい）に浸漬させる。更に、そのメンブレンを発色液に浸漬させて発色させる。その発色を検出することにより、糖鎖を有する物質を検出し、測定する。
【０１９５】
上記で使用される、標識レクチンと本発明に係る多糖類とを含有する溶液又はビオチン標識レクチンと本発明に係る多糖類とを含有する溶液中の、本発明に係る多糖類の濃度は、0.01(w/v)%〜50(w/v)%、好ましくは0.1(w/v)%〜25(w/v)%、より好ましくは0.5(w/v)%〜15(w/v)%、更に好ましくは0.5〜10(w/v)%である。
【０１９６】
本発明の複合体形成方法を電気泳動法に応用することにより、メンブレン上に形成される糖鎖を有する物質と標識レクチンの複合体の量が増加するので、該複合体の標識レクチン由来のシグナル値が増大する。その結果、より高感度な糖鎖を有する物質の検出や測定が可能となる。
【０１９７】
組織染色への応用
常法により作製した組織切片を、検出対象である糖鎖に親和性を有するレクチンを蛍光物質や放射性物質等の検出可能な標識物質で標識した標識レクチンと本発明に係る多糖類とを含有する溶液に浸漬させて、組織切片上の糖鎖と標識レクチンとの複合体を形成させることにより、組織切片をより効率よく標識することができる。
【０１９８】
上記組織染色に用いられる標識レクチンと本発明に係る多糖類とを含有する溶液中の、本発明に係る多糖類の濃度は、0.01(w/v)%〜50(w/v)%、好ましくは0.1(w/v)%〜25(w/v)%、より好ましくは0.5(w/v)%〜15(w/v)%、更に好ましくは0.5〜10(w/v)%である。
【０１９９】
フローサイトメトリーへの応用
細胞膜に存在する検討対象（標的）の糖鎖に親和性を有するレクチンを検出可能な標識物質で標識したレクチンを細胞に結合させ、細胞分離装置（セルソーター）を用いた通常のフローサイトメトリーを実施すれば、レクチンの糖鎖特異性を利用して、細胞表面（細胞膜上）にある糖鎖の種類に基づいて細胞の亜集団を分画することができる。
【０２００】
該方法に本発明の複合体形成方法を応用する方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
【０２０１】
細胞を、標的の糖鎖（細胞が細胞膜上に有していると思われる糖鎖）に親和性を有するレクチンを蛍光物質で標識した標識レクチンと本発明に係る多糖類とを含有する溶液と接触させて、細胞膜上の糖鎖と蛍光標識レクチンとの複合体を形成させる。その後、通常のセルソーターを用いた蛍光を検出する方法で、標識レクチンが結合した細胞と結合しなかった細胞を分離する。セルソーターで細胞を分離する際の分離液は、本発明に係る多糖類を含有していてもよい。
【０２０２】
細胞を、蛍光標識レクチンと本発明に係る多糖類とを含有する溶液と接触させる際の本発明に係る多糖類の濃度は、0.01(w/v)%〜50(w/v)%、好ましくは0.1(w/v)%〜25(w/v)%、より好ましくは0.5(w/v)%〜15(w/v)%、更に好ましくは0.5〜10(w/v)%である。
【０２０３】
また、本発明に係る多糖類を溶解させた分離液を用いてセルソーターで細胞を分離する場合、分離液中の本発明に係る多糖類の濃度は、0.01(w/v)%〜50(w/v)%、好ましくは0.1(w/v)%〜25(w/v)%、より好ましくは0.5(w/v)%〜15(w/v)%、更に好ましくは0.5〜10(w/v)%である。
【０２０４】
本発明の複合体形成方法をフローサイトメトリーに応用することにより、得られる糖鎖を有する物質を有する細胞とレクチンの複合体の量が増加するので、分離して得られるレクチンが結合した細胞の量が増加する。すなわち、効率よく標的の糖鎖を有する細胞を回収することが出来る。
【０２０５】
また、再生医療においては、使用する細胞の品質管理が不可欠である。近年、細胞表面の糖鎖を解析することによって、ES細胞、iPS細胞の分化／未分化を識別することができることが明らかにされた。また、未分化細胞の糖鎖を特異的に認識するレクチンが発見された（Tateno H, et al., J. Biol. Chem., vol.286, No.23, pp.20345-20353, 2011）。これらの知見に基づいて、未分化細胞や分化細胞の品質を管理する技術が開発されている（国際公開WO2013/065302号公報、国際公開WO2013/128914号公報）。
【０２０６】
例えば、未分化細胞の糖鎖を特異的に認識するレクチンを検出可能な標識物質で標識した標識レクチンを用い、本発明の複合体形成方法により、未分化細胞と標識レクチンとの複合体を形成させる。次いで、未分化細胞と分化細胞をセルソーターで分離することにより、未分化細胞と分化細胞とを効率よく分別することができる。
【０２０７】
その他の本発明の複合体形成反応を応用可能な技術としては、例えばレクチンを用いる血液型(亜型)の判定方法が挙げられる。血液型判定用試薬のいずれかに本発明に係る多糖類を添加させたものを用いて、判定を実施すればよい。
【０２０８】
以上例示した方法の中でも、プラズモン共鳴法及びキャピラリー電気泳動へ応用することが好ましく、特にプラズモン共鳴法へ応用することが好ましい。
【０２０９】
［３］本発明の糖鎖を有する物質の測定方法
本発明の糖鎖を有する物質の測定方法とは、「本発明の複合体形成方法で糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体を形成させた後、該複合体の量を測定する、糖鎖を有する物質の測定方法。」である。
本発明の糖鎖を有する物質の測定方法における、本発明の複合体形成方法の詳細は、上記した「本発明の複合体形成方法」に記載した通りである。
本発明の複合体形成方法で糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体を形成させた後は、該複合体の量を測定することにより、糖鎖を有する物質を測定すればよい。該複合体の具体的な測定方法としては、例えば上記した表面プラズモン共鳴法、キャピラリー電気泳動、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、レクチンマイクロアレイ法、サンドイッチ法等の免疫学的測定方法、電気泳動法等が挙げられる。その具体的な条件や方法等は、上記した各方法の説明に記載した通りである
【０２１０】
［４］本発明の複合体形成促進剤
本発明の複合体形成促進剤は、「本発明の多糖類を含有してなる、糖鎖を有する物質と該糖鎖を有する物質の糖鎖に親和性を有するレクチンとの複合体形成促進剤。」である。
【０２１１】
本発明の複合体形成促進剤に含有させる本発明に係る多糖類としては、上記の本発明の複合体形成方法に関する説明に記載した、N-アセチルグルコサミンを有さない水溶性多糖又はN-アセチルグルコサミンを有さない多糖を有する水溶性化合物が挙げられる。その好ましい態様及び具体例も、上記した通りである。
具体的には、例えばデキストラン硫酸又はその塩、コンドロイチン硫酸cナトリウム又はその塩等が挙げられる。
【０２１２】
本発明の複合体形成促進剤が溶液の場合、本発明に係る複合体形成促進剤の溶液中の本発明に係る多糖類の濃度は、0.01(w/v)%〜50(w/v)%、好ましくは0.1(w/v)%〜25(w/v)%、より好ましくは0.5(w/v)%〜15(w/v)%、更に好ましくは0.5〜10(w/v)%である。
【０２１３】
本発明の複合体形成促進剤が溶液の場合、該溶液に用いられる溶媒の具体例としては、水又は緩衝液が挙げられる。
【０２１４】
溶媒として用いられる水としては、この分野において使用される水であれば特に制限はなく、具体的には、例えば蒸留水、脱イオン水等の精製水等が挙げられる。
【０２１５】
溶媒として用いられる緩衝液の具体例としては、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液、Tris-HCl緩衝液、MES緩衝液、HEPES緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。
【０２１６】
また、これらの緩衝液の緩衝剤濃度としては、通常5〜1,000mM、好ましくは5〜300mMの範囲から適宜選択される。そのpHも特に限定されないが、例えば5〜9の範囲が挙げられる。
【０２１７】
本発明の複合体形成促進剤は、レクチンを含んでいてもよい。レクチンの具体例は、上記の本発明の複合体形成方法に関する説明に記載した通りである。例えば、LCA、MAA、BC2LCN等が挙げられる。また、本発明に係る複合体形成促進剤中のレクチンの濃度は、1μg/mL〜30mg/mL、好ましくは10μg/mL〜20mg/mL、より好ましくは1〜10mg/mLである。
【０２１８】
本発明の複合体形成促進剤が本発明の多糖類とレクチンとを含有するものである場合、本発明の多糖類は、上記した本発明の複合体形成方法において説明した通り、該レクチンが親和性を有する糖鎖を持たないものから選択される。
本発明の多糖類とレクチンとを含有する本発明の複合体形成促進剤の具体例としては、例えば以下の組成のものが挙げられる。
（１）0.01(w/v)%〜50(w/v)%のデキストラン硫酸又はその塩と1μg/mL〜30mg/mLのLCAを5〜1000mM Tris-HCl緩衝液（pH5〜9）等の緩衝液に溶解させた、複合体形成促進剤、
（２）0.01(w/v)%〜50(w/v)%のデキストラン硫酸又はその塩と1μg/mL〜30mg/mLのMAAを5〜1000mM Tris-HCl緩衝液（pH5〜9）等の緩衝液に溶解させた、複合体形成促進剤、
（３）0.01(w/v)%〜50(w/v)%のコンドロイチン硫酸c又はその塩と1μg/mL〜30mg/mLのMAAを含有する5〜1000mM Tris-HCl緩衝液（pH5〜9）等の緩衝液に溶解させた、複合体形成促進剤。
【０２１９】
本発明の複合体形成促進剤には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、反応促進剤、タンパク質、塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害したりせず、糖鎖とレクチンとの反応を阻害しないものが含まれていてもよい。またその濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
【０２２０】
更にまた、本発明の複合体形成促進剤には、その複合体形成促進剤の使用説明書等を組合せても良い。当該「説明書」とは、本発明の複合体形成促進剤の特徴、使用方法等が文章又は図表等により実質的に記載されている、本発明補複合体形成促進剤の取扱説明書、添付文書、あるいはパンフレット（リーフレット）等を意味する。
【０２２１】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【実施例】
【０２２２】
実施例１：AFP-L3の検出
（１）測定機器等
測定機器： Biacore X (GE Healthcare UK Ltd.製)
チップ： Sensor Chip CM5 (GE Healthcare UK Ltd.製)
ランニングバッファー： HBS-EP バッファー（10mM HEPES, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005 % Surfactant P 20, pH7.4, GE Healthcare UK Ltd.製）【０２２３】
（２）試薬等
糖鎖を有する物質として、AFP-L3（α-フェトプロテインのLCA結合性分画、和光純薬工業(株)製）を用いた。【０２２４】
本発明に係る多糖類として、デキストラン硫酸ナトリウム(M.W. 36,000〜50,000、和光純薬工業(株)製)、及びコンドロイチン硫酸cナトリウム(M.W. 40,000〜80,000、和光純薬工業(株)製)を用いた。【０２２５】
（３）サンプル溶液
HBS-EPバッファー及び上記試薬を用いて、下記のサンプル溶液をそれぞれ調製した。
・1μM(4w/v%)デキストラン硫酸ナトリウムを含有する28μg/mL AFP-L3溶液
・1μM(1w/v%)コンドロイチン硫酸cナトリウムを含有する28μg/mL AFP-L3溶液
・28μg/mL AFP-L3溶液【０２２６】
（４）センサーチップへのLCA固定化
アミンカップリングキット（GE Healthcare UK Ltd.製）を用いて、LCA(Lens Culinaris Agglutinin、)をSensor Chip CM5（CMセンサーチップ、GE Healthcare UK Ltd.製）のセンサーチップ上に固定化した。【０２２７】
（５）ビアコアによる測定
以下の測定は、Biacore X (GE Healthcare UK Ltd.製)を用いて行った。
上記(３)で調製したサンプル溶液60μLを、温度25℃、流速30μL、結合時間120秒間の条件でゆっくりと送液して、LCAが固定化されているセンサーチップに流し、AFP-L3とLCAとを反応させた。送液直後から、経時的にBiacore Xによる測定を行った。次いでHBS-EPバッファーのみを、180秒間（解離時間）送液した。得られた測定結果を、ビアコア専用解析ソフトであるBIAevaluation(Version4.1) を用いて解析して、センサーグラムを得た。【０２２８】
（６）結果
得られたセンサーグラムを図1及び図２に示す。【０２２９】
図１及び図２において、横軸は時間（s (秒)）、縦軸は、レスポンスの値（RU, Resonance Unit、共鳴単位）を示す。RUの大きさは、AFP-L3とLCAとの複合体の量を反映する。【０２３０】
また、図１において、＋はデキストラン硫酸ナトリウムを含有するAFP-L3溶液を用いて得られた結果を、◆はデキストラン硫酸ナトリウムを含有しないAFP-L3溶液を用いて得られた結果をそれぞれ示す。【０２３１】
図２において、□はコンドロイチン硫酸cナトリウムを含有するAFP-L3溶液を用いて得られた結果を、◆はコンドロイチン硫酸cナトリウムを含有しないAFP-L3溶液を用いて得られた結果をそれぞれ示す。【０２３２】
なお、AFP-L3とLCAの反応は120秒間行い、その後HBS-EPバッファーのみをLCAを固定化したセンサーチップに流した。従って、図１及び図２において、横軸の120secの時点からは、HBS-EPバッファーのみがセンサーチップに送液されている（ビアコアでは「解離」という。）。【０２３３】
図１及び図２から明らかな通り、デキストラン硫酸ナトリウム又はコンドロイチン硫酸cナトリウムの存在下でAFP-L3とLCAを反応させた場合、デキストラン硫酸ナトリウム又はコンドロイチン硫酸cナトリウムがない状態でAFP-L3とLCAを反応させたと場合と比較して、解離時のAFP-L3とLCAの複合体の量が多かった。すなわち、本発明の多糖類の存在下にAFP-L3とLCAを接触させ、反応させると、本発明の多糖類の非存在下にAFP-L3とLCAを接触させ、反応させた場合と比較してAFP-L3とLCAとの複合体量が増加していることが分かる。【０２３４】
実施例２．α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの検出−１
（１）試料及び試液の調製
１）DNA標識抗PSA抗体の調製
下記の手順に従って、DNAが結合したPSA抗体Fab’フラグメントを調製した。
2018174044.tif 000005
【０２３５】
すなわち、先ず、常法により５'末端にNH2基が導入された250bpのDNA断片を精製し（精製末端アミノ化DNA）、次いで、このDNA断片に導入されたNH2基とスルホサクシニミジル 4-（p-マレイミドフェニル）ブチレイト（Sulfo-SMPB）リンカー（スクシンイミド基とマレイミド基を有するリンカー、ピアス社製）のスクシンイミド基とを常法により反応させた。次いで、ゲルろ過処理を行い、未反応リンカーを除去して、リンカーが結合した250bpDNA断片を得た。得られたリンカー結合250bpDNA断片と、予め抗ヒトPSAマウスモノクローナル抗体 （Anti PSAモノクローナル抗体 5G6、HyTest社製）を用いて常法に従い調製した抗PSA抗体5G6 Fab'フラグメントとを反応させた。得られた反応物を、DEAEカラムを用いて精製し、250bpDNA断片が結合した抗PSA抗体5G6 Fab'フラグメント（以下、「DNA標識抗PSA抗体」と記載する。）を調製した。【０２３６】
なお、用いたAnti PSAモノクローナル抗体 5G6は、ヒトPSAに対して親和性を有する抗体で、結合型PSA及び遊離型PSAの両方に結合することができる。すなわち該抗体は、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA」と「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA」の両方に結合することができる。
２）蛍光標識抗遊離型PSA抗体の調製
Anti PSAモノクローナル抗体5G6とは異なるPSAのエピトープを認識し、かつ遊離型PSAのみと特異的に結合する抗ヒトPSAモノクローナル抗体（Anti PSAモノクローナル抗体 8A6、HyTest社製）を常法により処理して、抗PSA抗体8A6 Fab'フラグメントを得た。得られたフラグメントのアミノ基に、常法により蛍光物質HiLyte647（AnaSpec社製）を導入して、HiLyte647標識抗遊離型PSA抗体8A6 Fab'フラグメント（以下、「蛍光標識抗遊離型PSA抗体」と記載する。）を得た。【０２３７】
（２）電気泳動（マイクロチップキャピラリー電気泳動）
全自動蛍光免疫測定装置ミュータスワコー i30（和光純薬工業（株）製）を用い、装置の取扱説明書に従い、以下に示した手順にてマイクロチップキャピラリー電気泳動を行った。【０２３８】
１）泳動用試料Aの調製
Yoneyama T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 448, No. 4, pp. 390-396, 2014の「2. Materials and methods (2.7 Forced expression of FLAG-tag-fused S2,3PSA)」に開示された方法に従ってリコンビナント遊離型PSA［以下、「r遊離型PSA」と略記する。r遊離型PSAは、リコンビナントα(2, 3)遊離型PSA（以下、rα(2, 3)遊離型PSAと略記する）と、リコンビナントα(2, 3)遊離型PSA以外の遊離型PSAを含有する。］を取得した。取得したr遊離型PSA溶液中のPSA濃度を測定し、PBS(-)(和光純薬工業（株）製)で希釈して１ng/mL PSAタンパク質濃度となるように調製したサンプル溶液を得た。得られたサンプル溶液を２μL、上記(１)２)で調製した1μM 蛍光標識抗遊離型PSA抗体を１μL、及び泳動緩衝液１〔5％ (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、3％(w/v) グリセロール、150mM NaCl、0.01％ BSA、75mM Tris-HCl、10mM MESを含有する。pH 7.5〕７μLを0.5mLチューブに加えて混合して、10μLの反応液を調製した。【０２３９】
なお、この反応液中の蛍光標識抗遊離型PSA抗体の最終濃度は、100nMである。【０２４０】
上記反応で得られた[蛍光標識抗遊離型PSA抗体−r遊離型PSA]複合体を含有する溶液（すなわち[蛍光標識抗遊離型PSA抗体−rα(2, 3)糖鎖遊離型PSA]複合体と[蛍光標識抗遊離型PSA抗体−rα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA]複合体を含有する溶液）（10μL）を、泳動用試料Aとした。【０２４１】
２）泳動用試液の調製
下記の各試液を調製した。
・泳動緩衝液２（MAAとコンドロイチン硫酸cナトリウム含有）
5.0％ (w/v) ポリエチレングリコール(PEG8000)、3％(w/v) グリセロール、10mM NaCl、0.01 ％ BSAを含有する75mM Tris-HClバッファー(pH 7.5)を調製した。これにMAA（VECTOR社製）を終濃度（泳動緩衝液２中の濃度）4mg/mLとなるように、また本発明に係る多糖類としてコンドロイチン硫酸cナトリウム（和光純薬工業(株)製）を、終濃度(w/v)（泳動緩衝液２中の濃度）がそれぞれ0%、2.8%、3.4%、3.5%、3.6%、3.8%、4.1%、4.3%、4.5%となるように添加し、混合したものを調製し、泳動緩衝液２とした。
・泳動緩衝液３
2％ (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、3％(w/v) グリセロール、0.01 ％ BSA、125mM HEPES、75mM Tris-HClを含有するバッファー(pH調製なし)を、泳動緩衝液３とした。
・泳動緩衝液４
2％ (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、3％(w/v) グリセロール、0.01 ％ BSAを含有する75mM Tris-HClバッファー(pH 7.5)を、泳動緩衝液４とした。
・DNA標識抗体液（DNA標識抗PSA抗体含有）
上記(１)１)で得られたDNA標識抗PSA抗体 100nMを含有するバッファー〔2％ (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000) 、0.5mM EDTA(2Na)、3％(w/v) グリセロール、50mM NaCl、0.01 ％ BSA、75mM BisTris(pH 6.0)を含有する。〕を調製し、DNA標識抗体液とした。
・蛍光液
30nM HiLyte647、20％(w/v) グリセロールを含有する50mM BisTris(pH 6.0)を、蛍光液とした。蛍光液は測定機器（ミュータスワコー i30）の検出部での位置確認等の調整のために用いられる。【０２４２】
３）電気泳動手順
ｉ）泳動用試料Ａ及び泳動用試液の導入
上記（２）１)で調製した泳動用試料Ａ 5.4μLを、ミュータスワコー i30専用マイクロチップの所定ウェル（SPウェル）に分注した。次いで、下記のように該マイクロチップの各ウェルに上記(２)２)で調製した各試液を分注した。
・R2ウェル（R2(FLB)ウェル、R2(LB)ウェル）：泳動緩衝液２（MAAとコンドロイチン硫酸cナトリウム含有）を10.0μLずつ、
・R3ウェル：泳動緩衝液３を10.0μL、
・R4ウェル：泳動緩衝液４を5.4μL、
・C1ウェル：DNA標識抗体液を3.0μL、
・FDウェル：蛍光液を7.0μL。【０２４３】
使用したマイクロチップの模式図を図３に示す。【０２４４】
図３において、Wasteウェルは、各ウェル（R2、R3、R4、C1）の試液及び泳動用試料Ａを分析用流路に導入する際の廃液だめ（ドレイン用ウェル）として使用する。【０２４５】
次いで、各4つのWasteウェル（ドレイン用ウェル）間に30秒間、-５psiの圧力を印加して、チップの分析用流路に泳動用試料Ａ及び各試液を導入した。【０２４６】
ｉｉ）ITP（反応、濃縮、分離）、及び検出
使用したマイクロチップのチップ内流路を模式化したものを図４に示す。【０２４７】
図４において、WはWasteウェルを示す。R3ウェル側が陰極、R2(LB)ウェル側が陽極になる。また、図４において、泳動用試料Ａ及び各試液の配置部分を点部分と白部分（点のない部分）とに色分けして示す。【０２４８】
チップの分析用流路に泳動用試料Ａ及び各試液を導入した後、以下の方法でPSAの分離及び検出を行った。【０２４９】
図４のR3ウェル−R2(LB)ウェル間に、4000Vの電圧を印加して、30℃で、試液中のDNA標識抗PSA抗体を泳動用試料Ａ中の[蛍光標識抗遊離型PSA抗体−r遊離型PSA]複合体と接触させて、[蛍光標識抗遊離型PSA抗体−r遊離型PSA−DNA標識抗PSA抗体]の複合体を形成させ、これを等速電気泳動（ITP）で濃縮した。等速電気泳動の泳動方向は図４に“ITP”と点線により示される。【０２５０】
遊離型PSAを捕捉するための各標識抗体による免疫反応時間は約200秒であった。【０２５１】
ここで形成された複合体は、具体的には[蛍光標識抗遊離型PSA抗体−rα(2, 3)糖鎖遊離型PSA−DNA標識抗PSA抗体]の複合体（複合体１）と[蛍光標識抗遊離型PSA抗体−rα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA−DNA標識抗PSA抗体]の複合体（複合体２）である。【０２５２】
R2(FLB)とR2(LB)のチャネルクロス部分まで等速電気泳動されて複合体が当該チャネルクロス部分を通り抜けたことを、電圧の変化で判断して、陰電極をR3からR2(FLB)に切り替えた。そして、更に検出部分（R2(FLB)とR2(LB)のチャネルクロス部分から２cm下流のキャピラリー部分）で、[蛍光標識抗遊離型PSA抗体−r遊離型PSA−DNA標識抗PSA抗体]の複合体のピークが検出されるまで、MAAとコンドロイチン硫酸cナトリウムの存在下でキャピラリーゲル電気泳動(CE)を行った。CEが行われた位置及び電気泳動の泳動方向は、図４に“CE”と点線により示した。【０２５３】
MAAとコンドロイチン硫酸cナトリウムの存在下でキャピラリーゲル電気泳動を行う間に、コンドロイチン硫酸cナトリウム存在下に複合体１及び複合体２は、MAAと接触し、反応する。反応時の、反応液中のMAAの濃度は4mg/mL、及びコンドロイチン硫酸cナトリウムの濃度(w/v%)は0%、2.8%、3.4%、3.5%、3.6%、3.8%、4.1%、4.3%又は4.5%である。【０２５４】
検出は、635nmレーザー励起によりR2(FLB)とR2(LB)のチャネルクロス部分から２cmのキャピラリー部分の蛍光強度をフォトダイオード（富士フィルム(株）製）により経時的に測定することによって行った。【０２５５】
（３）結果
得られた電気泳動像（エレクトロフェログラム）より、MAAと反応した[蛍光標識抗遊離型PSA抗体-rα(2, 3)糖鎖遊離型PSA-DNA標識抗PSA抗体]の複合体（複合体１）分画のピーク面積を、i30装置付属の解析用ソフトで求めた。【０２５６】
結果を図５に示す。図５において、縦軸は複合体１分画のピーク面積を示し、横軸はMAAと複合体１及び複合体２の反応時の、コンドロイチン硫酸cナトリウムの濃度（％（w/v%））を示す。【０２５７】
図５から明らかな如く、複合体１のピーク面積は、コンドロイチン硫酸cナトリウムの濃度依存的に増大した。このことより、糖鎖とレクチンとの反応をコンドロイチン硫酸cナトリウムの存在下に行うことにより、コンドロイチン硫酸cナトリウムの非存在下に同反応を行った場合と比較して、複合体１の量が増加することが分かる。【０２５８】
なお、泳動用試薬２はポリエチレングリコール（PEG8000；5%）を含有するので、コンドロイチン硫酸cナトリウム濃度が『０(w/v)％』となる条件下では、ポリエチレングリコール存在下且つコンドロイチン硫酸cナトリウムの非存在下に糖鎖を有する物質とレクチンとの反応を行うことになる。図５から明らかな通り、ポリエチレングリコール存在下且つコンドロイチン硫酸cナトリウムの非存在下に糖鎖を有する物質とレクチンとの反応を行った場合には、複合体１が殆ど検出できなかった。以上の結果から、本発明に係る多糖類非存在下で、高分子ポリマーであるポリエチレングリコールの存在下に糖鎖を有する物質とレクチンを反応させても、その複合体の量を増加させる効果がないことが分かる。【０２５９】
実施例３．α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの検出−２
（１）試料及び試液の調製、及び電気泳動（マイクロチップキャピラリー電気泳動）
下記の泳動緩衝液２を用いる以外は、実施例２で使用したものと同じ泳動用試液、機器等を用い、実施例２と同様の方法で、[蛍光標識抗遊離型PSA抗体-α(2, 3)糖鎖遊離型PSA-DNA標識抗PSA抗体]の複合体（複合体１）の検出を行った。
・泳動緩衝液２（本発明に係る多糖類含有）
5.0％ (w/v) ポリエチレングリコール(PEG8000)、3％(w/v) グリセロール、10mM NaCl、0.01 ％ BSAを含有する75mM Tris-HClバッファー(pH 7.5)を調製した。これにMAA（VECTOR社製）を終濃度（泳動緩衝液２中の濃度）4mg/mLとなるように、また本発明に係る多糖類としてデキストラン硫酸ナトリウム（M.W. 6,500〜10,000）（Sigma社製）を、終濃度（泳動緩衝液２中の濃度）(w/v)が0%、3.0%、5.0%、5.5%、6.0%、6.7%、7.0%、7.7%、8.1%となるように添加し、混合したものを調製し、泳動緩衝液２とした。【０２６０】
なお、デキストラン硫酸ナトリウム存在下に複合体１及び複合体２をMAAと反応させた時の、反応液中のMAAの濃度は4mg/mL、及びデキストラン硫酸ナトリウムの濃度(w/v%)は、0%、3.0%、5.0%、5.5%、6.0%、6.7%、7.0%、7.7%、又は8.1%である。【０２６１】
（２）結果
得られた電気泳動像（エレクトロフェログラム）より、MAAと反応した[蛍光標識抗遊離型PSA抗体-α(2, 3)糖鎖遊離型PSA-DNA標識抗PSA抗体]の複合体（複合体１）分画のピーク面積を、i30装置付属の解析用ソフトで求めた。【０２６２】
結果を図６に示す。図６において、縦軸は複合体１分画のピーク面積を示し、横軸はMAAと複合体１及び複合体２の反応時の本発明の多糖類（デキストラン硫酸）の濃度（％（w/v%））を示す。【０２６３】
図６から明らかな如く、複合体１のピーク面積は、デキストラン硫酸ナトリウムの添加濃度依存的に増大した。このことより、糖鎖とレクチンとの反応をデキストラン硫酸ナトリウムの存在下に行うことにより、デキストラン硫酸ナトリウムの非存在下に同反応を行った場合と比較して、複合体１の量が増加することが分かる。【０２６４】
なお、泳動用試薬２はポリエチレングリコール（PEG8000；5%）を含有するので、デキストラン硫酸ナトリウム濃度が『０(w/v)％』となる条件下では、ポリエチレングリコール存在下且つデキストラン硫酸ナトリウムの非存在下に糖鎖とレクチンとの反応を行うことになる。図６から明らかな通り、ポリエチレングリコール存在下且つデキストラン硫酸ナトリウムの非存在下に糖鎖を有する物質とレクチンとの反応を行った場合には、複合体１が殆ど検出できなかった。以上の結果から、本発明に係る多糖類非存在下で、高分子ポリマーであるポリエチレングリコールの存在下に糖鎖を有する物質とレクチンを反応させても、その複合体の量を増加させる効果がないことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０２６５】
本発明の複合体形成方法によれば、糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体の量が増加する。【０２６６】
そのため、糖鎖を有する物質の測定に、本発明の複合体形成方法を適用することにより、糖鎖を有する物質の高感度な測定を行うことができる。【０２６７】
また、本発明の複合体形成方法は、糖鎖に対するレクチンの親和性を利用したあらゆる反応、検出、測定、糖鎖の分析等に利用することができる。そして、検出や測定の感度を高め、また、高精度な糖鎖の分析を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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