(57)【要約】  二本鎖ＲＮＡと病原ウイルスとを有効成分とする魚類抗ウイルスワクチンおよび二本鎖ＲＮＡを有効成分として含有する魚類免疫賦活剤。本発明によれば、二本鎖ＲＮＡを投与し、または投与するとともに、様々な種類の病原ウイルス、これらをなんら処理しない、いわゆる生のウイルス、もしくは弱毒化したウイルスに暴露して取り込ませることで、抗ウイルス状態を誘導した後、あるいは抗ウイルス状態を誘導すると同時に、対象魚類の免疫を誘導、賦活、修飾ないし増強することができる。
2010024284.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ＲＮＡと病原ウイルスとを有効成分として含有する魚類抗ウイルスワクチン。
【請求項２】
病原ウイルスが非弱毒化病原ウイルスである、請求項１に記載の魚類抗ウイルスワクチン。
【請求項３】
非弱毒化病原ウイルスが伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、キジハタ神経壊死ウイルス（ＲＧＮＮＶ）および／またはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）である、請求項２に記載の魚類抗ウイルスワクチン。
【請求項４】
二本鎖ＲＮＡがＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）である、請求項１から請求項３のいずれかに記載の魚類抗ウイルスワクチン。
【請求項５】
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の投与量が１２．５μｇ以上である、請求項４に記載の魚類抗ウイルスワクチン。
【請求項６】
二本鎖ＲＮＡを有効成分として含有する魚類免疫賦活剤。
【請求項７】
病原ウイルスを有効成分として含有する、請求項６に記載の魚類免疫賦活剤。
【請求項８】
病原ウイルスが非弱毒化病原ウイルスである、請求項７に記載の魚類免疫賦活剤。
【請求項９】
非弱毒化病原ウイルスが伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、キジハタ神経壊死ウイルス（ＲＧＮＮＶ）および／またはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）である、請求項８に記載の魚類免疫賦活剤。
【請求項１０】
二本鎖ＲＮＡがＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）である、請求項６から請求項９のいずれかに記載の魚類免疫賦活剤。
【請求項１１】
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の投与量が１２．５μｇ以上である、請求項１０に記載の魚類免疫賦活剤。
【請求項１２】
病原ウイルスを取り込む前１４日ないし同時にＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を投与する魚類免疫付与方法。
【請求項１３】
病原ウイルスが非弱毒化病原ウイルスである、請求項１２に記載の魚類免疫付与方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖RNAを投与し、または投与するとともに、様々な種類の病原ウイルス、これらをなんら処理しない、いわゆる生のウイルス、もしくは弱毒化したウイルスを取り込ませることで、対象魚類の免疫を誘導、賦活、修飾ないし増強することができる魚類抗ウイルスワクチン、抗ウイルス状態を誘導する魚類免疫賦活剤、および魚類免疫付与方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば魚類では、サケ科魚類が対象である伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV；Infectious Hematopoietic Necrosis Virus)、サケ科魚類および海産魚類が対象であるウイルス性出血性敗血症ウイルス（VHSV；Viral Hemorrhagic Septicemia Virus）、海産魚類が対象である魚類ノダウイルス（Fish Nodavirus）およびマダイイリドウイルス（RSIV；Red Seabream Iridovirus）等、さまざまな病原ウイルスあるいは日和見病原ウイルスが知られており、いずれも高い病原性を有する。【０００３】
中でもIHNVが原因病原体である伝染性造血器壊死症（Infectious Hematopoietic Necrosis：IHN）はサケ科の魚の疾病の一つであり、致死性の極めて高い大変重篤な疾病である。IHNVはRhabdoviridae科Novirhabdovirus属に属し、約１１ｋのヌクレオチドからなるマイナス一本鎖型RNAゲノムを有していて、各々、ヌクレオカプシドタンパク質（N）、リンタンパク質（P）、マトリックスタンパク質（M）、糖タンパク質（G）、ビリオン非構造タンパク（NV)、およびポリメラーゼ（L）をコードする、3'-N-P-M-G-NV-L-5'の順で６つの遺伝子を含んでいる。IHNVの病原性は一般に稚魚が対象とされているが、近年、市場へ出荷可能なサイズに成長したニジマスにも及んでいることが明らかとなっている。【０００４】
ニジマス養殖場等においては、従来、ヨウ素を用いて魚卵を消毒したり、飼育海水を殺菌する等して特定病原体未感染（SPF；Specific-Pathogen-Free）魚の生産がなされている。また、特定病原体未感染の産卵魚におけるIHNV感染の診断には酵素免疫測定法（ELISA）が実用されている。しかしながら、養殖池においてはIHNVの水平感染を防ぐことが困難であり、IHNVワクチンの開発は不可欠であることから、従来、死菌ワクチンや弱毒化ワクチン、IHNVのGタンパクを有する遺伝子組換型ワクチン、IHNVのGタンパク遺伝子を有するDNAワクチン等のような数種類のIHNVワクチンが開発されている（非特許文献１等）。【０００５】
一方、魚類ノダウイルスが原因病原体であるウイルス性神経壊死症（VNN；Viral Nervous Necrosis）は、養殖実績のある海産硬骨魚のうちの２０種以上において致死性が極めて高く、海産硬骨魚にとって大変重篤な疾病の一つといえる。魚類ノダウイルスは、Nodaviridae科Betanodavirus属に属し、エンベロープを欠く直径２５ないし３０ｎｍの球形ウイルスであって、単一外殻タンパク質とプラス鎖ss-RNA２分子とからなっている。ノダウイルスは４つの遺伝子型ウイルスである、シマアジ神経壊死ウイルス（SJNNV；Striped Jacked Nervous Necrosis Virus）、トラフグ神経壊死ウイルス（TPNNV；Tiger Puffer NNV）、マツカワ神経壊死ウイルス（BFNNV；Barfin Flounder NNV）、およびキジハタ神経壊死ウイルス（RGNNV；Red-spotted Grouper NNV）に分類され、さらに、オヒョウから単離されたノダウイルス（TNNV；Turbot NNV）が新型の遺伝子型ウイルスとして報告されている。【０００６】
種苗生産場等においては、魚類ノダウイルスの垂直感染を防止するためにSPF産卵魚を選抜することが重要であるが、養殖生け簀で飼育する成長魚については、飼育海水を通じて魚類ノダウイルスの水平感染が生じるという問題があるため、従来、ホルマリン不活性化ワクチンや遺伝子組換外殻タンパク質を含むサブユニットワクチン、ウイルス様粒子ワクチン等の数種類の魚類ノダウイルスワクチンが開発されている（非特許文献２等）。【０００７】
また、VHSVが原因病原体であるウイルス性出血性敗血症（VHS；Viral Hemorrhagic Septicemia）は、日本では１９９９年に瀬戸内海の養殖ヒラメで発生が初めて確認されたが、致死性が極めて高く、今日では極東アジアの養殖ヒラメにおいて大変重篤な疾病の一つとされている。なお、VHSVは、Rhabdoviridae科 Novirhabdovirus属に属し、エンベロープを持つマイナス一本鎖ウイルスである。【０００８】
ヒラメの種苗生産場等においては、VHSVの垂直感染を防止し、安定的にVHSV未感染のヒラメ稚魚の生産がされているが、養殖生け簀で飼育する成長魚については、飼育海水を通じてVHSVの水平感染が生じるという問題があることから、死菌ワクチンや弱毒化ワクチン、VHSVの糖タンパクを有する遺伝子組換型ワクチン、VHSVのGタンパク遺伝子を有するDNAワクチン等のような数種類のVHSVワクチンが開発されている（非特許文献３等）。【０００９】
近年、IHNVや魚類ノダウイルス、VHSV、伝染性サケ貧血ウイルス（ISAV；Infectious Salmon Anemia Virus）等のウイルスが、伝染性膵臓壊死症ウイルス（IPNV；Infectious Pancreatic Necrosis Virus）やアクアレオウイルス（Aquareovirus）、アクアビルナウイルス（ABV；Aquabirnavirus）、ピコルナウイルス（Picornavirus）等のウイルスとともに混合感染することにより、抗ウイルス状態が誘導されるとの報告がなされている。また、Toll様受容体（TRL）アゴニストである合成二本鎖RNAポリイノシンポリシチジン酸（polyI:C）により、多様な細胞種において抗ウイルス状態が誘導されるとの報告がなされており、二本鎖RNAを用いたアジュバントや二本鎖RNAを含有するワクチンの開発がなされている（特許文献１および特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００５−８２５８１号公報
【特許文献２】特開２００５−９７２６７号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Lorenzen N. et al. (2002) Dev. Comp. Immunol., 26: 173-179
【非特許文献２】Tanaka S. et al. (2001) J. Fish Dis., 24: 15-22
【非特許文献３】Lorenzen N. et al. (2002) Fish Shellfish Immunol., 12: 439-453
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、特許文献１および特許文献２に開示された発明においては、不活化ウイルスまたはサブユニット抗原である不活化抗原が用いられており、なんら処理をしていない、いわゆる生のウイルスはもちろん、弱毒化したウイルスは用いられていない。【００１３】
本発明は、二本鎖RNAを投与し、または投与するとともに、様々な種類の病原ウイルス、これらをなんら処理しない、いわゆる生のウイルス、もしくは弱毒化したウイルスを取り込ませることで、対象魚類の免疫を誘導、賦活、修飾ないし増強することができる魚類抗ウイルスワクチン、抗ウイルス状態を誘導する魚類免疫賦活剤、および魚類免疫付与方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、二本鎖RNAと病原ウイルスとを魚類に接種することにより、この病原ウイルスに対する免疫誘導がなされることを見出し、下記の各発明を完成した。【００１５】
（１）二本鎖RNAと病原ウイルスとを有効成分とする魚類抗ウイルスワクチン。【００１６】
（２）病原ウイルスが非弱毒化病原ウイルスである、（１）に記載の魚類抗ウイルスワクチン。【００１７】
（３）非弱毒化病原ウイルスが伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）、キジハタ神経壊死ウイルス（RGNNV）および／またはウイルス性出血性敗血症ウイルス（VHSV）の非弱毒化ウイルスである、（２）に記載の魚類抗ウイルスワクチン。【００１８】
（４）二本鎖RNAがPoly（I:C）である、（１）から（３）のいずれかに記載の魚類抗ウイルスワクチン。【００１９】
（５）Poly（I:C）の投与量が１２．５μｇ以上である、（４）に記載の魚類抗ウイルスワクチン。【００２０】
（６）二本鎖RNAを有効成分として含有する魚類免疫賦活剤。【００２１】
（７）病原ウイルスを有効成分として含有する、（６）に記載の魚類免疫賦活剤。【００２２】
（８）病原ウイルスが非弱毒化病原ウイルスである、（７）に記載の魚類免疫賦活剤。【００２３】
（９）非弱毒化病原ウイルスが伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）、キジハタ神経壊死ウイルス（RGNNV）および／またはウイルス性出血性敗血症ウイルス（VHSV）の非弱毒化ウイルスである、（８）に記載の魚類免疫賦活剤。【００２４】
（１０）二本鎖RNAがPoly（I:C）である、（６）から（９）のいずれかに記載の魚類免疫賦活剤。【００２５】
（１１）Poly（I:C）の投与量が１２．５μｇ以上である、（１０）に記載の魚類免疫賦活剤。【００２６】
（１２）病原ウイルスを取り込む前１４日ないし同時にPoly（I:C）を投与する魚類免疫付与方法。【００２７】
（１３）病原ウイルスが非弱毒化病原ウイルスである、（１２）に記載の魚類免疫付与方法。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、二本鎖RNAを投与し、または投与するとともに、様々な種類の病原ウイルス、これらをなんら処理しない、いわゆる生のウイルス、もしくは弱毒化したウイルスに暴露して取り込ませることで、抗ウイルス状態を誘導した後、あるいは抗ウイルス状態を誘導すると同時に、対象魚類の免疫を誘導、賦活、修飾ないし増強することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施例１〜実施例３において、Poly（I:C）投与後にIHNVを接種する生存試験結果を示す図である。Ａは実施例１での、Ｂは実施例２での、Ｃは実施例３での生存試験結果を各々示す。
【図２】実施例４において、IHNV特異的抗体の測定結果を示す図である。ＡはIHNV一次接種後、ＢはIHNV二次接種後の血液中のIHNV特異的抗体の測定結果を各々示す。
【図３】実施例６および実施例７において、Poly（I:C）投与後にRGNNVを接種する生存試験結果を示す図である。Ａは実施例６での、Ｂは実施例７での生存試験結果を各々示す。
【図４】実施例８において、RGNNV特異的抗体の測定結果を示す図である。ＡはRGNNV一次接種後、ＢはRGNNV二次接種後の血液中のRGNNV特異的抗体の測定結果を各々示す。
【図５】実施例１０において、マハタにおけるPoly（I:C）の有効投与量試験の結果を示す図である。Ａは経過日数に対する生存率を示し、ＢはPoly（I:C）投与量に対する投与１８日目の生存率を示す。
【図６】実施例１１において、RGNNVの有効一次接種量試験の結果を示す図である。
【図７】実施例１２において、マハタにおけるPoly（I:C）による抗ウイルス効果の持続期間試験の結果を示す図である。Ａは経過日数に対する生存率を示し、ＢはPoly（I:C）投与からRGNNV投与までの経過日数に対する生存率を示す。
【図８】実施例１３において、マハタにおけるPoly（I:C）の投与部位の検討結果を示す図である。
【図９】実施例１４および実施例１５において、Poly（I:C）投与後にVHSVを接種する生存試験結果を示す図である。Ａは実施例１４での、Ｂは実施例１５での生存試験結果を各々示す。
【図１０】実施例１６において、VHSV特異的抗体の測定結果を示す図である。ＡはVHSV一次接種後、ＢはVHSV二次接種後の血液中のVHSV特異的抗体の測定結果を各々示す。
【図１１】実施例１７および実施例１８において、Ａは、マハタにおけるPoly（I:C）の有効投与量試験の結果を示す図であり、Ｂは、マハタにおけるPoly（I:C）による抗ウイルス効果の持続期間試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明に係る魚類抗ウイルスワクチン、魚類免疫賦活剤、および魚類免疫付与方法について詳説する。本発明に係る魚類抗ウイルスワクチンは、二本鎖RNAと病原ウイルスとを有効成分とする。
【００３１】
本発明に係る魚類抗ウイルスワクチンは、何ら処理しない、いわゆる生のウイルス、もしくは弱毒化したウイルスを生体内に取り込ませることで免疫を生成するものであり、いわゆる生ワクチンに該当する。一般的な魚類ワクチンの場合、不活化した微生物やウイルス等が用いられるが、本発明に係る魚類抗ウイルスワクチンにおいては生のウイルスあるいは弱毒化ウイルスが用いられる。
【００３２】
すなわち、本発明において「病原ウイルス」とは、感染性（感染能）、病原性、免疫原性を有するウイルスをいい、不活化（死）ワクチンに用いられる、いわゆる不活化ウイルスを含まない。なお、感染性とは、ウイルスが宿主である魚類の体内で安定して増殖できる性質を、病原性とは、感染性のあるウイルスが宿主である魚類に感染したときに病気を起こす性質を、免疫原性とは、魚類に取り込まれたときに抗体およびまたは細胞媒介性による免疫応答をもたらす性質を、それぞれ意味する。
【００３３】
本発明における好ましい病原ウイルスとして、非弱毒化ウイルスを挙げることができるが、本発明において「非弱毒化ウイルス」とは、なんら処理しないウイルス、いわゆる生のウイルス（生ウイルス）をいい、特にビルレンス（virulence；毒力）を減弱させた、いわゆる弱毒化ウイルスを含まない。なお、ビルレンスとは、その病原体が感染したときどのくらい感染症を起こしやすいか、また発病したときにどのくらい重症化しやすいか、という力の強さを意味する。
【００３４】
非弱毒化ウイルスの種類は、魚類に対する感染性、病原性、免疫原性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、魚類ラブドウイルス、魚類イリドウイルス、魚類ノダウイルス、IPNVを含むABV属のウイルス、ISAV、アクアレオウイルス、ピコルナウイルス等を挙げることができ、さらに、魚類ラブドウイルスとしてはIHNV、VHSV、Hirame Rhabdovirus（HIRRV）、コイ春ウイルス血症ウイルス（SVCV；Spring Viremia of Carp Virus）等を、魚類イリドウイルスとしてはRSIV、 Lymphocystis Disease Virus (LCDV)等を、魚類ノダウイルスとしてはSJNNV、TPNNV、BFNNV、RGNNV、TNNV等を挙げることができる。
【００３５】
本発明における二本鎖RNAは特に限定されないが、例えば、Poly（I:C）やPoly（C:G）、Poly（U:A）等を挙げることができ、好ましい二本鎖RNAとして、Poly（I:C）を挙げることができる。また、本発明におけるPoly（I:C）の有効な投与量としては、１群において５０％以上の生存率を示す場合の投与量を挙げることができ、好ましい投与量として１２．５μｇ以上、より好ましい投与量として２５μｇ以上、さらに好ましい投与量として５０μｇ以上とすることができる。
【００３６】
本発明における魚類免疫賦活剤は二本鎖RNAを有効成分とする。本発明において「免疫賦活剤」とは、魚類の体内に取り込まれることによって、まずは抗ウイルス状態を誘導する任意の物質をいい、その後、あるいはそれと同時に免疫応答（抗体および／または細胞媒介性）を誘導、賦活、修飾、増強等する任意の物質を含む。
【００３７】
本発明に係る魚類免疫賦活剤は、さらに、病原ウイルスを有効成分として含有してもよく、このような病原ウイルスとして、非弱毒化病原ウイルスを挙げることができる。
【００３８】
本発明における魚類抗ウイルスワクチンと魚類免疫賦活剤との態様は特に限定されず、例えば、魚類抗ウイルスワクチンについては、二本鎖RNAと病原ウイルスとを懸濁液あるいは溶液等に含んでいる態様、それぞれを懸濁液あるいは溶液等として対象魚類に投与し、対象魚類の体内で抗ウイルスワクチンとして機能する態様、あるいは二本鎖RNAを懸濁液あるいは溶液等として対象魚類に投与した後、または投与するとともに、この対象魚類を病原ウイルスに暴露等して取り込ませることにより、この対象魚類の体内で抗ウイルスワクチンとして機能する態様等を挙げることができる。また、魚類免疫賦活剤については、二本鎖RNAを懸濁液あるいは溶液等に含んでいる態様、これらに病原ウイルスを含んでいる態様、二本鎖RNAと病原ウイルスのそれぞれを懸濁液あるいは溶液等として対象魚類に投与し、対象魚類の体内で免疫賦活剤として機能する態様、あるいは二本鎖RNAを懸濁液あるいは溶液等として対象魚類に投与した後、または投与するとともに、この対象魚類を病原ウイルスに暴露等して取り込ませることにより、この対象魚類の体内で免疫賦活剤として機能する態様等を挙げることができる。
【００３９】
なお、本発明において「免疫賦活」は、「免疫誘導」、「免疫修飾」、「免疫刺激」、「免疫増強」、「免疫増進」、「免疫活性」、「免疫活性化」、「免疫向上」、あるいは「免疫亢進」と交換可能に用いられ、「免疫賦活剤」は、「免疫誘導剤」、「免疫修飾剤」、「「免疫刺激剤」、「免疫増強剤」、「免疫増進剤」、「免疫活性剤」、あるいは「免疫亢進剤」と交換可能に用いられる。また、「魚類抗ウイルスワクチン」、「魚類免疫賦活剤」は、各々、「魚用抗ウイルスワクチン」、「魚用免疫賦活剤」と交換可能に用いられる。
【００４０】
また、本発明において、生存率、ウイルス感染価、抗体の検出、Poly（I:C）の有効投与量、Poly（I:C）による抗ウイルス状態の持続期間の測定等に際しては、Reed L.J. et al.（1938） Am J Hygiene 27:493-497に従い、TCID50（Median Tissue Culture Infectious Dose）法が用いられている。
【００４１】
本発明に係る魚類免疫付与方法は、病原ウイルスを取り込む前１４日ないし同時にPoly（I:C）を投与する方法であり、病原ウイルスに対する免疫が付与されることで、１群において５０％以上の生存率を示す病原ウイルスとPoly（I:C）との投与のタイミングに特徴を有している。すなわち、病原ウイルスを取り込む前１４日ないし同時にPoly（I:C）を投与するのが好ましく、病原ウイルスを取り込む前７日ないし前日にPoly（I:C）を投与するのがより好ましく、病原ウイルスを取り込む前４日ないし前日にPoly（I:C）を投与するのがさらに好ましい。
【００４２】
以下、本発明に係る魚類抗ウイルスワクチン、魚類免疫賦活剤、および魚類免疫付与方法の実施例について説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００４３】
＜実施例１＞Poly（I:C）投与後のIHNV一次接種試験
１．実験材料
本実施例１で用いる実験材料として、次のものを用意した。【００４４】
（１）伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV；Infectious Hematopoietic Necrosis Virus）
IHNVとして、IHNV RtNag96を用いた。このIHNV RtNag96は１９９６年に長野県によって伝染性造血器壊死症（IHN；Infectious Hematopoietic Necrosis）に感染したニジマスから単離されたものである｛Nishizawa T. et al. (2006) Dis Aquat Org 71: 267-272｝。これを、胎児牛血清（FBS；Gibco)１０％(volume/volume)、ペニシリンＧ１００ＩＵ／ｍＬ、および硫酸ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを含むEagle MEM培地（MEM10；Gibco）を用いて、コイ上皮性細胞株（EPC；Epithelioma Papulosum Cyprini）細胞中で１５℃にて培養した。その後、１２０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離操作を行って得た培養上清を、小分けにして−８０℃で冷凍保存した。【００４５】
（２）Poly（I:C）
Poly（I:C）（シグマ）は、投与直前にDEPC水（ニッポンジーン）で１ｍｇ／ｍＬに調製した。【００４６】
（３）ニジマス（Oncorhynchus Mykiss）
ニジマスは、長野県水産試験場から提供された、体重が１．３ｇ±０．２ｇの特定病原体未感染（Specific-Pathogen-Free：SPF）ニジマスの稚魚を用いた。実験開始２週間前から実験終了までの間、１０〜１１℃、流速２４サイクル／日の１０Ｌタンクで飼育した。【００４７】
以下、本実施例１のみならず、実施例２および実施例３において上記実験材料を用いた。以下、各々を単に「IHNV」、「Poly（I:C）」、「ニジマス」と称する。【００４８】
２．Poly（I:C）の投与後のIHNV一次接種試験
Poly（I:C）の事前投与によるIHNVへの抵抗性を評価するために、以下の実験を行った。なお、「一次接種」とは、その個体にそのウイルスを初めて接種することをいう。【００４９】
（１）群設定
ニジマス２４０匹を、Poly（I:C）-IHNV群（１４０匹）、Poly（I:C）-Mock群（６０匹）、Cont.-IHNV群（２０匹）、およびCont.-Mock群（２０匹）の４群に分けた。ここで、「Poly（I:C）-IHNV群」とはPoly（I:C）を投与後にIHNVを一次接種した群、「Poly（I:C）-Mock群」とはPoly（I:C）を投与後にMEM10を投与した群、「Cont.-IHNV群」とはDEPC水を投与後にIHNVを一次接種した群、および「Cont.-Mock群」とはDEPC水を投与後にMEM10を投与した群であることを各々示す。また、以下、「Cont.」とはコントロールを意味し、「Mock」とは、「ウイルスなし」を意味する。【００５０】
（２）投与試験
まず、２週間の馴化後、Poly（I:C）-IHNV群とPoly（I:C）-Mock群とに１ｍｇ／ｍＬのPoly（I:C）を５０μＬずつ、Cont.-IHNV群とCont.-Mock群とにはDEPC水のみを５０μＬずつ、各々腹腔内投与した。この２日後に、Poly（I:C）-IHNV群とCont.-IHNV群とに１０５．０TCID50（TCID50；５０％組織培養感染量）のIHNVを５０μＬずつ、Poly（I:C）-Mock群とCont.-Mock群とにMEM10を５０μＬずつ、各々腹腔内に一次接種した。これらIHNVまたはMEM10を一次接種した日を０日として２１日目まで観察を行い、各群の生存率を図１Ａに示した。また、これら各群の生存率に基づいて相対生存率（RPS）を算出した｛Amend DF . et al. (1981) Dev. Biol. Stand. 49: 447-454｝。【００５１】
図１Ａに示すように、Poly（I:C）-IHNV群の２１日後の生存率は９５．７％でありCont.-IHNV群に比べて極めて高い値を示した。また、Cont.-IHNV群に対するPoly（I:C）-IHNV群のRPSは９５．２％を示した。このことから、Poly（I:C）を事前投与することによりIHNVに対する抵抗性を有することが明らかとなった。また、Poly（I:C）-Mock群の生存率が１００％であることから、Poly（I:C）投与による毒性等の影響がないことが確認できた。なお、Cont.-Mock群において死亡例はなかった。【００５２】
（３）サンプル採取
ELISAによるIHNV特異的抗体の検出のために、IHNVまたはMEM10の一次接種後２１日目において、Poly（I:C）-IHNV群とPoly（I:C）-Mock群との生存魚から尾静脈採血を行った。また、ウイルス感染価を測定するために、各群の生存魚から腎臓を採取した。【００５３】
＜実施例２＞IHNVの二次接種試験１（２１日目）
実施例１の生存魚を用いて、さらにIHNV二次接種試験をIHNV一次接種後２１日目に行い、IHNVに対する抵抗性を以下のとおり評価した。ここで「二次接種」とは、同じウイルスを二度接種することをいう。【００５４】
（１）群設定
実施例１で用いたPoly（I:C）-IHNV群の生存ニジマス４０匹、Poly（I:C）-Mock群の生存ニジマス４０匹、および何も投与していない新たなSPFニジマス４０匹を用いた。これらを、Poly（I:C）-IHNV-IHNV群（２０匹）、Poly（I:C）-IHNV-Mock群（２０匹）、Poly（I:C）-Mock-IHNV群（２０匹）、Poly（I:C）-Mock-Mock群（２０匹）、Naive-IHNV群（２０匹）、およびNaive-Mock群（２０匹）に各々分け、６群を設定した。【００５５】
ここで、「Poly（I:C）-IHNV-IHNV群」とは実施例１のPoly（I:C）-IHNV群にIHNVを二次接種した群、「Poly（I:C）-IHNV-Mock群」とは実施例１のPoly（I:C）-IHNV群にMEM10を投与した群、「Poly（I:C）-Mock-IHNV群」とは実施例１のPoly（I:C）-Mock群にIHNVを二次接種した群、「Poly（I:C）-Mock-Mock群」とは実施例１のPoly（I:C）-Mock群にMEM10を投与した群、「Naive-IHNV群」とは何も投与していないニジマスにIHNVを一次接種した群、および「Naive-Mock群」とは何も投与していないニジマスにMEM10を投与した群を各々示す。【００５６】
（２）投与試験
実施例１のIHNVまたはMEM10の一次接種後２１日目に、Poly（I:C）-IHNV-IHNV群、Poly（I:C）-Mock-IHNV群、およびNaive-IHNV群の３群には１０５．０TCID50のIHNVを５０μＬずつ、Poly（I:C）-IHNV-Mock群、Poly（I:C）-Mock-Mock群、およびNaive-Mock群の３群にはMEM10を５０μＬずつ、各々腹腔内に二次接種した。これらを二次接種した日を０日として２１日目まで観察を行い、各群の生存率を図１Ｂに示した。また、これら各群の生存率に基づいて実施例１と同様にRPSを算出した。【００５７】
図１Ｂに示すように、Poly（I:C）-IHNV-IHNV群では、２１日後の生存率は１００％であった。一方、Poly（I:C）-Mock-IHNV群とNaive-IHNV群とでは二次接種後７日目から死亡する個体が現れ、二次接種後２１日目の生存率はいずれも１０％であった。Poly（I:C）-Mock-IHNV群に対するPoly（I:C）-IHNV-IHNV群のRPSと、Naive-IHNV群に対するPoly（I:C）-IHNV-IHNV群のRPSとは、いずれも１００％であった。また、Poly（I:C）-IHNV-Mock群では９日目に１個体が死亡したのみで、２１日目の生存率は９５％であった。なお、Poly（I:C）-Mock-Mock群とNaive-Mock群との２群においては、死亡例はなかった。【００５８】
実施例１と本実施例２との結果から、Poly（I:C）の投与後２日目にIHNVを一次接種することによってIHNVに対する抵抗性を示し、さらに、２１日目にIHNVを二次接種しても生存できることが明らかとなった。一方、Poly（I:C）の投与後２１日以上経過してからIHNVを一次接種しても、IHNVに対して抵抗性を有さず死に至ることが明らかとなった。【００５９】
（３）サンプル採取
ELISAによるIHNV特異的抗体の検出のために、IHNVまたはMEM10の二次接種後２１日目において、Poly（I:C）-Mock-Mock群、Poly（I:C）-IHNV-Mock群、およびPoly（I:C）-IHNV-IHNV群の生存魚から尾静脈採血を行った。また、ウイルス感染価を測定するために各群の生存魚から腎臓を採取した。【００６０】
＜実施例３＞IHNVの二次接種試験２（４９日目）
実施例１の生存魚を用いて、さらにIHNV二次接種試験をIHNV一次接種後４９日目に行い、IHNVに対する抵抗性を以下のように評価した。【００６１】
（１）群設定
実施例１で用いたPoly（I:C）-IHNV群の生存ニジマス４０匹と、何も投与していない新たなSPFニジマス４０匹とを用いた。これらを、Poly（I:C）-IHNV-IHNV群（２０匹）、Poly（I:C）-IHNV-Mock群（２０匹）、Naive-IHNV群（２０匹）、およびNaive-Mock群（２０匹）に各々分け、４群を設定した。なお、「Poly（I:C）-IHNV-IHNV群」、「Poly（I:C）-IHNV-Mock群」、「Naive-IHNV群」、および「Naive-Mock群」は実施例２に示すものと同様である。【００６２】
（２）投与試験
実施例１にてIHNVまたはMEM10を一次接種後４９日目に、Poly（I:C）-IHNV-IHNV群とNaive-IHNV群との２群には１０５．０TCID50のIHNVを５０μＬずつ、Poly（I:C）-IHNV-Mock群とNaive-Mock群との２群にはMEM10を５０μＬずつ、各々腹腔内に二次接種した。この二次接種した日を再度０日として２１日目まで観察を行い、各群の生存率を図１Ｃに示した。また、これら各群の生存率に基づいて実施例１と同様にRPSを算出した。【００６３】
図１Ｃに示すように、Poly（I:C）-IHNV-IHNV群とPoly（I:C）-IHNV-Mock群とNaive-Mock群との３群には死亡例はなく、Naive-IHNV群にのみ６日目から死亡する個体が現れ、１６日目にはNaive-IHNV群のすべての個体が死亡した。そのためNaive-IHNV群の２１日後の生存率は０％であった。また、Naive-IHNV群に対するPoly（I:C）-IHNV-IHNV群のRPSは１００％であった。【００６４】
実施例１、実施例２、および本実施例３の結果から、Poly（I:C）の投与後２日目にIHNVを一次接種することによってIHNVに対して抵抗性を示し、さらに、４９日目にIHNVを二次接種しても生存できることが明らかとなった。【００６５】
＜実施例４＞IHNV特異的抗体の検出
１．実験材料
本実施例４で用いる実験材料として、次のものを用意した。
実施例１に記載のIHNVおよびウイルス性出血性敗血症ウイルス（VHSV；Viral Hemorrhagic Septicemia Virus）
ELISAによる抗体検出のためのウイルス抗原として、実施例１に記載のIHNVおよび日本の若狭湾内小浜湾で捕獲された天然ヒラメ（Paralichthys Olivanceus）から単離されたVHSV Obama25を用いた｛Takano R. et al. (2000) Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 20: 186-192等｝。【００６６】
２．ELISAによる抗体検出
実施例１および実施例２にてサンプル採取した血液を用いて、ELISAによるIHNV特異的抗体の検出を行った。【００６７】
具体的には、上記サンプル採取した血液を４℃で１６時間凝固させ、１２０００ｘｇにて４℃, １０分間の遠心分離操作を行って血清を得た。この血清は使用まで−２０℃で凍結保存した。IHNV特異的抗体の検出は、Kim et al. の方法｛Kim WS. et al. (2007) Dis. Aquat. Org. 78: 55-59、Kim WS. et al. (2008) Fish Pathol. 43: 112-116｝に基づくELISAによって行った。【００６８】
つまり、対象抗原であるIHNVとコントロール抗原であるVHSVとを１９０００ｘｇにて４℃, ３０分間の遠心分離操作を行った。得られた約１０８．０TCID50／ｍＬを含むIHNV上清またはVHSV上清をPBSで１０倍に希釈し、これをELISA用プレートに５０μＬ／ウエル添加して４℃にて一晩静置した。その後、０．０５％Tween20含有PBS（T-PBS)で３回洗浄し、５％スキムミルク含有PBSを添加して２５℃で１時間ブロッキングした。さらに、T-PBSで３回洗浄し、実施例１および実施例２で得られた血清（一次抗体）を５％スキムミルク含有PBSで４０倍に希釈して、これを５０μＬ／ウエルで添加して２５℃にて１時間静置した。その後、抗ニジマスIgMウサギ血清（二次抗体）、つづいてHRP標識抗ウサギIgGブタポリクロナール抗体（三次抗体；DAKO）を添加して、２５℃で３０分静置した。【００６９】
二次抗体と三次抗体とは、使用直前に５％スキムミルクで１０００倍に希釈したものを使用した。T-PBSで３回洗浄し、１ｍｇ／ｍＬのｏ−フェニレンジアミン、０．０３％の過酸化水素水、１００ｍＭのリン酸水素ナトリウム、および５０ｍＭのクエン酸を含む発色基質溶液５０μＬを加え、２５℃で３０分間反応させた。その後、２Ｎの硫酸を加えて発色反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（MTP-300；コロナ）を用いて吸光度４９２ｎｍ（OD492）にて測定した。IHNVを用いた吸光度からVHSVを用いた吸光度を差引きして算出された吸光度をIHNV特異的な抗体に対する吸光度（OD492）とした｛Kim WS. et al. (2008) Fish Pathol. 43: 112-116｝。【００７０】
その結果を図２Ａおよび図２Ｂに示す。図２Ａは実施例１（３）のサンプル由来の血清を用いた結果であり、図２Ｂは実施例２（３）のサンプル由来の血清を用いた結果である。すなわち、図２ＡはIHNV一次接種後２１日目の結果であり、図２ＢはIHNV一次接種後２１日目にIHNV二次接種を行い、さらに２１日経過した後の結果である。【００７１】
図２Ａに示すように、IHNV一次接種後２１日目における血清のELISA吸光度は、Poly（I:C）-Mock群で０．０２以下であるのに対し、Poly（I:C）-IHNV群で０〜０．０３となり、Poly（I:C）-IHNV群で若干高い傾向が示された。【００７２】
図２Ｂに示すように、IHNV二次接種後２１日目における血清のELISA吸光度は、Poly（I:C）-Mock-Mock群で０．０１以下であるのに対し、Poly（I:C）-IHNV-Mock群の吸光度は０〜０．８０であってその平均値は０．１５であり、Poly（I:C）-IHNV-IHNV群の吸光度は０．０６〜０．５８であってその平均値は０．２４であった。【００７３】
これらの結果から、図２ＢのPoly（I:C）-IHNV-Mock群では図２ＡのPoly（I:C）-IHNV群よりも高い吸光度を示すことから、IHNV特異的抗体はPoly（I:C）を投与後にIHNV一次接種によって、一次接種後２１日目〜４２日目に産生されることが示された。さらに、Poly（I:C）-IHNV-IHNV群ではPoly（I:C）-IHNV-Mock群よりも高い吸光度を示すことから、IHNV特異的抗体はIHNV二次接種によって産生が促進されることが示された。【００７４】
＜実施例５＞ウイルス感染価の測定
実施例１（３）および実施例２（３）において生存魚から採取した腎臓を用いてウイルス感染価を測定した。具体的には、採取した腎臓を９倍量(volume/weight)のハンクス平衡塩（HBSS；Gibco）で磨砕した後、０．４５μｍのＨＡフィルター（Advantec）で濾過し、ＨＢＳＳを用いて濾液の１０倍希釈列を作製した。この各希釈列を９６穴マイクロプレートに培養しておいたEPC細胞に４穴ずつ接種した。１５℃で１４日間培養後、各希釈例を接種した穴の細胞の変性（CPE）を観察し、５０％組織培養感染量（TCID50）を算出して試験液１ｍＬあたりのウイルス感染価に換算した。【００７５】
実施例１（３）、つまりIHNV一次接種後２１日目に採取した腎臓を用いた結果では、Poly（I:C）-IHNV群でIHNV感染がなかったのに対し、Cont.-IHNV群の腎臓で１０７．１〜１０７．６TCID50／ｇ（組織あたり）のIHNV感染価が検出された。なお、Poly（I:C）-Mock群およびCont.-Mock群でIHNVは検出されなかった。【００７６】
実施例２（３）、つまりIHNV二次接種後２１日目に採取した腎臓を用いた結果、Poly（I:C）-IHNV-IHNV群の全検体においては、いずれも１０１．５TCID50／ｇ（組織あたり）以下の値を示した。これは、IHNV感染を示す値より大幅に低いことから、IHNV感染がないことが示された。【００７７】
＜実施例６＞Poly（I:C）投与後の魚類ノダウイルスRGNNV接種試験
１．実験材料
本実施例６で用いる実験材料として、次のものを用意した。
（１）魚類ノダウイルスであるキジハタ神経壊死ウイルス（RGNNV；Red-spotted Grouper Nervous Necrosis Virus）
RGNNVとして、RGNNV SgNag05を用いた。このRGNNVは、長崎県水産試験場にてウイルス性神経壊死症（VNN；Viral Nervous Necrosis）に感染したマハタから単離されたものである｛Nishizawa T. et al. (2008) Dis Aquat Org, 79: 19-25, Kokawa Y. et al. (2008) Aquaculture, (in press)｝。FBS（Gibco）１０％（volume/volume）、ペニシリンＧ１５０ＩＵ／ｍＬ、および硫酸ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを含むLeibovitz L-15培地（L-15；Gibco）を用いて、SSN-1細胞中で２５℃にて培養した。これを１２０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離操作を行って得た培養上清を、小分けにして−８０℃で冷凍保存した。【００７８】
（２）Poly（I:C）
Poly（I:C）（シグマ）は、投与直前にDEPC水（ニッポンジーン）で２ｍｇ／ｍＬに調製した。【００７９】
（３）マハタ（Epinephelus Septemfasciatus） 
マハタは、長崎県水産試験場で生育された、平均体重が１１５±２５ｇ（６０〜１４０ｇ）のSPFマハタを用いた。実験開始日から実験終了までの間、２５℃、流速２４サイクル／日の４０Ｌタンクで、紫外線滅菌水を用いて試験群毎に飼育した。【００８０】
以下、本実施例６のみならず、実施例７ないし実施例９において上記実験材料を用いた。以下、各々を単に「RGNNV」、「Poly（I:C）」、「マハタ」と称する。【００８１】
２．Poly（I:C）の投与後のRGNNV一次接種試験
Poly（I:C）の事前投与によるRGNNVへの抵抗性を評価するために、以下の実験を行った。【００８２】
（１）群設定
マハタ１６０匹を、Poly（I:C）-RGNNV群（４０匹）、Poly（I:C）-Mock群（４０匹）、Cont.-RGNNV群（４０匹）、およびCont.-Mock群（４０匹）の４群に分けた。ここで、「Poly（I:C）-RGNNV群」とはPoly（I:C）投与後にRGNNVを一次接種した群、「Poly（I:C）-Mock群」とはPoly（I:C）投与後にL-15を投与した群、「Cont.-RGNNV群」とはDEPC水投与後にRGNNVを一次接種した群、および「Cont.-Mock群」とはDEPC水投与後にL-15を投与した群であることを各々示す。【００８３】
（２）投与試験
まず、Poly（I:C）-RGNNV群とPoly（I:C）-Mock群とに２ｍｇ／ｍＬのPoly（I:C）を１００μＬずつ、Cont.-RGNNV群とCont.-Mock群とにはDEPC水のみを１００μＬずつ、筋肉内投与した。この２日後に、Poly（I:C）-RGNNV群とCont.-RGNNV群とには１０４．３.TCID50のRGNNVを１００μＬずつ、Poly（I:C）-Mock群とCont.-Mock群とにはL-15を１００μＬずつ、各々筋肉内に一次接種した。これらRGNNVまたはL-15を一次接種した日を０日として１８日目まで給餌せずに観察を行い、各群の生存率を図３Ａに示した。また、これら各群の生存率に基づいて実施例１と同様にRPSを算出した。 【００８４】
図３Ａに示すように、Poly（I:C）-RGNNV群では死亡例はなかったのに対し、Cont.-RGNNV群では、典型的なVNNの発症によりRGNNV一次接種の４日目から死亡する個体が現れ、８日目にはすべて死亡した。また、Poly（I:C）-Mock群とCont.-Mock群とでは、RGNNV一次接種による死亡例はなかった。このことから、Poly（I:C）を事前投与することによりRGNNVに対する抵抗性を有することが明らかとなった。また、Poly（I:C）-Mock群の死亡例がないことから、Poly（I:C）投与による毒性等の影響がないことが確認できた。なお、Poly（I:C）-Mock群において、不慮の事故による死亡が一例生じた。【００８５】
（３）サンプル採取
ELISAによるRGNNV特異的抗体の検出のために、RGNNVまたはL-15の一次接種後２１日目にCont.-Mock群、Poly（I:C）-Mock群、およびPoly（I:C）-RGNNV群の各生存魚各１０匹から尾静脈採血を行った。【００８６】
＜実施例７＞RGNNVの二次接種試験
実施例６の生存魚を用いて、さらにRGNNV接種試験をRGNNV一次接種後２１日目に行い、RGNNVに対する抵抗性を以下のとおり評価した。【００８７】
（１）群設定
実施例５で用いたPoly（I:C）-RGNNV群の生存マハタ４０匹、Poly（I:C）-Mock群の生存マハタ４０匹、および何も投与していない新たなSPFマハタ４０匹を用いた。これらを、Poly（I:C）-RGNNV-RGNNV群（２０匹）、Poly（I:C）-RGNNV-Mock群（２０匹）、Poly（I:C）-Mock-RGNNV群（２０匹）、Poly（I:C）-Mock-Mock群（２０匹）、Naive-RGNNV群（２０匹）、およびNaive-Mock群（２０匹）に各々分け、６群を設定した。【００８８】
ここで、「Poly（I:C）-RGNNV-RGNNV群」とは実施例５のPoly（I:C）-RGNNV群にRGNNVを二次再接種した群、「Poly（I:C）-RGNNV-Mock群」とは実施例５のPoly（I:C）-RGNNV群にL-15を投与した群、「Poly（I:C）-Mock-RGNNV群」とは実施例５のPoly（I:C）-Mock群にRGNNVを二次接種した群、「Poly（I:C）-Mock-Mock群」とは実施例５のPoly（I:C）-Mock群にL-15を投与した群、「Naive-RGNNV群」とは何も投与していないマハタにRGNNVを一次接種した群、および「Naive-Mock群」とは何も投与していないマハタにL-15を投与した群を各々示す。【００８９】
（２）投与試験
実施例６のRGNNVまたはL-15の一次接種後２１日目に、Poly（I:C）-RGNNV-RGNNV群、Poly（I:C）-Mock-RGNNV群、およびNaive-RGNNV群の３群には１０４．３TCID50／１００μＬのRGNNVを１００μＬずつ、Poly（I:C）-RGNNV-Mock群、Poly（I:C）-Mock-Mock群、およびNaive-Mock群の３群にはL-15を１００μＬずつ、各々筋肉内に二次接種した。これらを二次接種した日を０日として１４日目まで給餌せずに観察を行い、各群の生存率を図３Ｂに示した。【００９０】
図３Ｂに示すように、Poly（I:C）-RGNNV-RGNNV群において死亡例はなかった。一方、Poly（I:C）-Mock-RGNNV群は二次接種後１４日目の生存率が５％であり、Naive-RGNNV群ではRGNNV二次接種後６日目以内にすべて死亡した。なお、Poly（I:C）-RGNNV-Mock群とPoly（I:C）-Mock-Mock群とNaive-Mock群との３群においては、RGNNV二次接種による死亡例はなかった。このことから、Poly（I:C）を投与後にRGNNV一次接種した群は、RGNNV二次接種に対しても抵抗性を有することが明らかとなった。なお、Poly（I:C）-RGNNV-Mock群において、不慮の事故による死亡が一例生じた。【００９１】
実施例６と本実施例７との結果から、Poly（I:C）の投与後２日目にRGNNVを一次接種することによってRGNNVに対する抵抗性を示し、しかもその抵抗性がその後さらに２１日を経過しても持続することが明らかとなった。一方、Poly（I:C）の投与後２１日以上経過してからRGNNVを接種しても、RGNNVに対して抵抗性を有さず死に至ることが明らかとなった。【００９２】
（３）サンプル採取
ELISAによるRGNNV特異的抗体の検出のために、RGNNVまたはL-15の二次接種後１４日目において、Poly（I:C）-Mock-Mock群とPoly（I:C）-RGNNV-Mock群とPoly（I:C）-RGNNV-RGNNV群との魚から尾静脈採血を行った。また、ウイルス感染価を測定するために、各群の生存魚または死亡した魚から脳を摘出した。【００９３】
＜実施例８＞RGNNV特異的抗体の検出
実施例６および実施例７においてサンプル採取した血液を用いて、ELISAによるRGNNV特異的抗体の検出を行った。具体的な方法は、実施例４と同様に血清を得、IHNVに代えてRGNNVをELISA用プレートに固定化してKim et al. の方法に基づくELISAによって行った。【００９４】
その結果を図４Ａおよび図４Ｂに示す。図４Ａは実施例６（３）のサンプル由来の血清を用いた結果であり、図４Ｂは実施例７（３）のサンプル由来の血清を用いた結果である。すなわち、図４ＡはRGNNV一次接種後２１日目の結果であり、図４ＢはRGNNV一次接種後２１日目にRGNNV二次接種を行い、さらに１４日経過した後の結果である。【００９５】
図４Ａに示すように、RGNNV一次接種後２１日目における血清のELISA吸光度は、Cont.-Mock群およびPoly（I:C）-Mock群で０．０８以下であるのに対し、Poly（I:C）-RGNNV群での吸光度は０．２〜０．８６であってその平均値は０．３３であった。これらの結果から、Poly（I:C）投与後にRGNNVを一次接種することにより、RGNNVに対する抗体が産生されることが明らかとなった。【００９６】
また、図４Ｂに示すように、RGNNV二次接種後１４日目における血清のELISA吸光度は、Poly（I:C）-RGNNV-RGNNV群で０．０１〜１．０８であってその平均値は０．４１であった。これに対し、Poly（I:C）-RGNNV-Mock群での吸光度は０．１１〜０．４９であってその平均値は０．２８であり、Poly（I:C）-Mock-Mock群での吸光度は０．０９以下であった。すなわちPoly（I:C）-RGNNV-RGNNV群において高い傾向が示された。【００９７】
これらの結果から、実施例４のIHNV特異的抗体と同様に、Poly（I:C）-RGNNV-RGNNV群ではPoly（I:C）-RGNNV-Mock群よりも高い吸光度を示すことから、RGNNV特異的抗体はRGNNV二次接種によって産生が促進されることが示された。【００９８】
＜実施例９＞ウイルス感染価の測定
実施例７（３）において生存魚から採取した脳を用いて、実施例５に記載の方法でウイルス感染価を測定した。【００９９】
実施例７（３）、つまりRGNNV二次接種後１４日目に摘出した脳を用いた結果、Poly（I:C）-Mock-RGNNV群とNaive-RGNNV群との死魚では、RGNNV感染価は１０８．３〜１０９．１TCID50  ／ｇ（組織あたり）であった。一方、Poly（I:C）-RGNNV-RGNNV群の生存魚では、RGNNV感染価は検出限界の１０４．３TCID50  ／ｇ（組織あたり）以下の１０１．８TCID50  ／ｇ（組織あたり）以下であった。すなわち、Poly（I:C）-RGNNV-RGNNV群の生存魚は、Poly（I:C）-Mock-RGNNV群やNaive-RGNNV群の死魚に比べて明らかに低い感染価を示した。なお、Poly（I:C）-Mock-Mock群の生存魚ではRGNNV感染価は検出されなかった。【０１００】
これらの結果から、Poly（I:C）投与後にRGNNV一次接種によって生存している魚は、RGNNVに対する免疫を獲得していたことが示された。【０１０１】
＜実施例１０＞Poly（I:C）の有効投与量試験
実施例６（３）と同様の手法で飼育した、平均体重が７１±１０ｇのSPFマハタを１群１２匹として７群用意した。まず、各群に各々２ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．１２５ｍｇ／ｍＬ、および０．０６３ｍｇ／ｍＬのPoly（I:C）溶液またはDEPC水を、各々１００μＬずつ筋肉内投与した。この２日後に１０４．３TCID50のRGNNVを１００μＬずつ、各々筋肉内に一次接種した。RGNNVを一次接種した日を０日として１８日目まで観察を行い、各群の生存率を図５Ａおよび図５Ｂに示した。図５Ａは経過日数に対する生存率を示し、図５ＢはPoly（I:C）投与量に対する投与１８日目の生存率を示す。【０１０２】
図５Ａおよび図５Ｂに示すように、RGNNV接種後１８日目の生存率は、Poly（I:C）投与量が５０μｇ以上の群では９０％以上であるのに対し、同２５μｇ以上の群では５０％、同１２．５μｇ以下の群ではRGNNV接種後１８日目までにすべて死亡した。この結果から、Poly（I:C）が抗ウイルス状態を誘導するための投与量として、好ましくは２５μｇ以上、さらに好ましくは５０μｇ以上であることが示された。なお、Poly（I:C）投与量が２００μｇのマハタについて、副作用等は観察されなかった。【０１０３】
＜実施例１１＞RGNNVの有効一次接種量試験
実施例６（３）と同様の手法で飼育した、平均体重が５３ｇのSPFマハタを１群１２匹として６群用意した。全群に２ｍｇ／ｍＬのPoly（I:C）溶液を１００μＬずつ、筋肉内投与した。この２日後、各群に各々L-15、１００．３TCID50、１０１．３TCID50、１０２．３TCID50、１０３．３TCID50、および１０４．３TCID50のRGNNVを１００μＬずつ筋肉内に一次接種した。RGNNVまたはL-15を一次接種した日を０日として２１日目に、全群の筋肉内に１０４．３TCID50のRGNNVを１００μＬずつ二次接種した。RGNNVを二次接種した日を０日として２１日目まで観察を行い、各群の生存率を図６に示した。【０１０４】
図６に示すように、RGNNV二次接種後２１日目の生存率は、RGNNV一次接種量が１０１．３TCID50以下の群およびL-15を投与した群では２５％であるのに対し、同１０２．３TCID50の群では６５％、同１０３．３TCID50の群では８３％、同１０４．３TCID50の群では１００％であった。この結果から、Poly（I:C）投与後にRGNNVを接種することにより抗ウイルス状態を誘導するためのRGNNV一次接種量として、好ましくは１０３．３TCID50以上、さらに好ましくは１０４．３TCID50以上であることが示された。【０１０５】
＜実施例１２＞Poly（I:C）による抗ウイルス効果の持続期間試験
実施例６（３）と同様の手法で飼育した、平均体重が７８±１５ｇのSPFマハタを用意し、１群２０匹とする群を６群準備した。全群に２ｍｇ／ｍＬのPoly（I:C）溶液を１００μＬずつ、筋肉内投与した。そして、各群にPoly（I:C）投与の同日、１日後、２日後、４日後、７日後、および１４日後のタイミングで各々１０４．３TCID50のRGNNVを１００μＬずつ、各々筋肉内に一次接種した。RGNNVを一次接種した日を０日として１４日目まで観察を行い、各群の生存率を図７Ａおよび図７Ｂに示した。図７Ａは経過日数に対する生存率を示し、図７ＢはPoly（I:C）投与からRGNNV投与までの経過日数に対する生存率を示す。【０１０６】
図７Ａおよび図７Ｂに示すように、Poly（I:C）投与と同時または投与１日後、２日後および４日後にRGNNVを一次接種した群の生存率は、９５％以上を示した。一方、Poly（I:C）投与７日後および１４日後にRGNNVを一次接種した群の生存率は、各々７５％、２０％であった。これらの結果から、Poly（I:C）による抗ウイルス効果は少なくとも７日間は持続するが、その後低下することが明らかとなった。すなわち、Poly（I:C）をRGNNV接種と同時ないし７日前に投与することにより、高ウイルス活性を有するRGNNVへの抵抗性を効果的に誘導することを意味している。【０１０７】
＜実施例１３＞Poly（I:C）投与部位の検討
実施例６（３）と同様の手法で飼育した、平均体重が５３ｇのSPFマハタを１群１０匹として４群用意した。それらのうち３群には各々、筋肉内、鼻腔、エラに２ｍｇ／ｍＬのPoly（I:C）溶液を、１００μＬずつ投与した。残りの１群はコントロールとして、筋肉内にDEPC水を１００μＬ投与した。この２日後に、Poly（I:C）溶液またはDEPC水を投与した部位、すなわち各々、筋肉内、鼻腔、エラに１０４．３TCID50のRGNNVを１００μＬずつ一次接種した。RGNNVを一次接種した日を０日として２１日目まで観察を行い、各群の生存率を図８に示した。【０１０８】
図８に示すように、RGNNV一次接種後２１日目の生存率は、Poly（I:C）投与部位が筋肉内および鼻腔の群では１００％であるのに対し、同部位がエラの群では５０％、コントロールの群ではRGNNV接種後１０日目までにすべて死亡した。この結果から、Poly（I:C）が抗ウイルス状態を誘導するための投与部位として、好ましくはエラ、さらに好ましくは鼻腔および／または筋肉であることが示された。【０１０９】
＜実施例１４＞Poly（I:C）投与後の魚類ラブドウイルスVHSV接種試験
１．実験材料
本実施例１４で用いる実験材料として、次のものを用意した。
（１）魚類ラブドウイルスであるウイルス性出血性敗血症ウイルス（VHSV；Viral Hemorrhagic Septicemia Virus）
VHSVとして、VHSV Obama25を用いた。これを、FBS（Gibco）１０％（volume/volume）、ペニシリンＧ １５０ＩＵ／ｍＬ、および硫酸ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを含むEagle MEM培地（MEM10；Gibco）を用いて、ファットヘッドミノー由来上皮性株化（FHM)細胞中で２０℃にて培養した。その後、１２０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離操作を行って得た培養上清を、小分けにして−８０℃で冷凍保存した。【０１１０】
（２）Poly（I:C）
Poly（I:C）（シグマ）は、投与直前にDEPC水（シグマ）で２ｍｇ／ｍＬに調製した。【０１１１】
（３）ヒラメ（Paralichthys Olivanceus） 
ヒラメは、長崎県総合水産試験場から提供された、体重が３１．７±２．９ｇのSPFヒラメを用いた。このヒラメは隔離された飼育槽において１６±１℃の紫外線滅菌海水により生育された。実験に先立ち、そのうちの数匹について、ＦＨＭ細胞を用いたウイルス培養によりVHSVに感染していないことを確認した。実験の間は、１６±１℃、流速１４サイクル／日の４０Ｌタンクで、紫外線滅菌海水を用いて試験群毎に飼育した。【０１１２】
以下、本実施例１４のみならず、実施例１５ないし実施例１８において上記実験材料を用いた。以下、各々を単に「VHSV」、「Poly（I:C）」、「ヒラメ」と称する。【０１１３】
２．Poly（I:C）の投与後のVHSV一次接種試験
Poly（I:C）の事前投与によるVHSVへの抵抗性を評価するために、以下の実験を行った。【０１１４】
（１）群設定
ヒラメ１２６匹を、Poly（I:C）-VHSV群（４２匹）、Poly（I:C）-Mock群（４２匹）およびCont.-VHSV群（４２匹）の３群に分けた。ここで、「Poly（I:C）-VHSV群」とはPoly（I:C）投与後にVHSVを一次接種した群、「Poly（I:C）-Mock群」とはPoly（I:C）投与後にMEM10を投与した群および「Cont.-VHSV群」とはDEPC水投与後にVHSVを一次接種した群であることを各々示す。【０１１５】
（２）投与試験
まず、Poly（I:C）-VHSV群とPoly（I:C）-Mock群とに２ｍｇ／ｍＬのPoly（I:C）を１００μＬずつ、Cont.-VHSV群とCont.-Mock群とにはDEPC水のみを１００μＬずつ、筋肉内投与した。この２日後に、Poly（I:C）-VHSV群とCont.-VHSV群とには１０４．３TCID50のVHSVを１００μＬずつ、Poly（I:C）-Mock群にはMEM10を１００μＬずつ、各々筋肉内に一次接種した。これらVHSVまたはMEM10を一次接種した日を０日として２８日目まで、１度／日、十分な給餌をして飼育して観察を行い、各群の生存率を図９Ａに示した。なお、これら各群の生存率に基づくRPSは１００％である。【０１１６】
図９Ａに示すように、Poly（I:C）-VHSV群およびPoly（I:C）-Mock群の２８日後の生存率は１００％であったのに対し、Cont.-VHSV群では、典型的なVHSの発症によりVHSV一次接種の４日目から死亡する個体が現れ、９日目にはすべて死亡した。このことから、Poly（I:C）を事前投与することによりVHSVに対する抵抗性を有することが示された。また、Poly（I:C）-Mock群の死亡例がないことから、Poly（I:C）投与による毒性等の影響がないことが示された。【０１１７】
（３）サンプル採取
ELISAによるVHSV特異的抗体の検出のために、VHSVまたはMEM10の一次接種後２５日目において、Poly（I:C）-Mock群とPoly（I:C）-VHSV群との生存魚から尾静脈採血を行った。【０１１８】
＜実施例１５＞VHSVの二次接種試験
実施例１４の生存魚を用いて、さらにVHSV二次接種試験をVHSV一次接種後２８日目に行い、VHSVに対する抵抗性を以下のとおり評価した。【０１１９】
（１）群設定
実施例１４で用いたPoly（I:C）-VHSV群の生存ヒラメ４２匹および何も投与していない新たなSPFヒラメ２１匹を用いた。これらを、Poly（I:C）-VHSV-VHSV群（２１匹）、Poly（I:C）-VHSV-Mock群（２１匹）およびNaive-VHSV群（２１匹）に各々分け、３群を設定した。【０１２０】
ここで、「Poly（I:C）-VHSV-VHSV群」とは実施例１４のPoly（I:C）-VHSV群にVHSVを二次接種した群、「Poly（I:C）-VHSV-Mock群」とは実施例１４のPoly（I:C）-VHSV群にMEM10を投与した群および「Naive-VHSV群」とは何も投与していないヒラメにVHSVを一次接種した群を各々示す。【０１２１】
（２）投与試験
実施例１４のVHSVの一次接種後２８日目に、Poly（I:C）-VHSV-VHSV群およびNaive-VHSV群には１０４．３TCID50のVHSVを１００μＬずつ、Poly（I:C）-VHSV-Mock群にはMEM10を１００μＬずつ、各々筋肉内に二次接種した。これらを二次接種した日を０日として２０日目まで観察を行い、各群の生存率を図９Ｂに示した。【０１２２】
図９Ｂに示すように、Poly（I:C）-VHSV-VHSV群およびPoly（I:C）-VHSV-Mock群では、２０日後の生存率は１００％であった。一方、Naive-VHSV群ではVHSV二次接種後６日目以内にすべて死亡した。このことから、Poly（I:C）を投与後にVHSVを一次接種した群は、VHSV二次接種に対しても抵抗性を有することが示された。【０１２３】
実施例１４と本実施例１５との結果から、Poly（I:C）の投与後２日目にVHSVを一次接種することによってVHSVに対する抵抗性を示し、しかもその抵抗性がその後さらに、２８日を経過しても持続することが明らかとなった。【０１２４】
（３）サンプル採取
ELISAによるVHSV特異的抗体の検出のために、VHSVまたはMEM10の二次接種後２０日目において、Poly（I:C）-VHSV-Mock群とPoly（I:C）-VHSV-VHSV群との生存魚から尾静脈採血を行った。【０１２５】
＜実施例１６＞VHSV特異的抗体の検出
実施例１４および実施例１５においてサンプル採取した血液を用いて、ELISAによるVHSV特異的抗体の検出を行った。具体的な方法は、実施例４と同様に血清を得、IHNVに代えてVHSVをELISA用プレートに固定化してKim et al. (2008)の方法に基づくELISAによって行った。なお、海産魚ではコントロール抗原は不要であるため用いていない。また、Kim et al. の方法に基づく判定基準は、ELISA吸光度がそれぞれ、０．１以下で陰性（特異的抗体が存在しない）、０．１〜０．２でボーダー（特異的抗体が存在するか否かが判別不可）、および０．２以上で陽性（特異的抗体が存在する）とされている。【０１２６】
その結果を図１０Ａおよび図１０Ｂに示す。図１０Ａは実施例１４（３）のサンプル由来の血清を用いた結果であり、図１０Ｂは実施例１５（３）のサンプル由来の血清を用いた結果である。すなわち、図１０ＡはVHSV一次接種後２５日目の結果であり、図１０ＢはVHSV一次接種後２８日目にVHSV二次接種を行い、さらに２０日経過した後の結果である。【０１２７】
図１０Ａに示すように、VHSV一次接種後２５日目における血清のELISA吸光度は、Poly（I:C）-Mock群で０．１以下でその平均値が０．０３であるのに対し、Poly（I:C）-VHSV群での吸光度は０．０２〜１．１５であってその平均値は０．１３であった。Kim et al. (2008)の方法に基づく判定基準に従って判定したところ、Poly（I:C）-Mock群では全個体が陰性であり、Poly（I:C）-VHSV群では陰性が４０％、ボーダーにあるものが３６％、陽性が２４％であった。【０１２８】
これらの結果から、Poly（I:C）投与後にVHSVを一次接種することによりVHSVに対する抗体が産生されるものの、VHSV一次接種後２５日目においてはその量は少量であることが明らかとなった。【０１２９】
また、図１０Ｂに示すように、VHSV二次接種後２０日目における血清のELISA吸光度は、Poly（I:C）-VHSV-VHSV群で０．１７〜２．１４であってその平均値は０．５９であった。これに対し、Poly（I:C）-VHSV-Mock群での吸光度は０．１６〜１．８６であってその平均値は０．５５であった。すなわちPoly（I:C）-VHSV-VHSV群において高い傾向が示された。また、Kim et al. (2008)の方法に基づく判定基準に従って判定したところ、Poly（I:C）-VHSV-VHSV群では２１個体中１９個体（９０％以上）が陽性で残り２個体がボーダーにあり、Poly（I:C）-VHSV-Mock群では２１個体中２０個体（９５％）が陽性で残り１個体（５％）がボーダーにあった。【０１３０】
これらの結果から、実施例４のIHNV特異的抗体および実施例８のRGNNV特異的抗体と同様、Poly（I:C）-VHSV-VHSV群ではPoly（I:C）-VHSV-Mock群よりも高い吸光度を示すことから、VHSV特異的抗体はVHSV二次接種によって産生が促進されることが示唆された。また、図１０ＢのPoly（I:C）-VHSV-Mock群では図１０ＡのPoly（I:C）-VHSV群よりも高い吸光度を示すことから、VHSV特異的抗体はPoly（I:C）を投与後にVHSV一次接種によって、一次接種後２６日目〜４８日目に多く産生されることが示された。【０１３１】
＜実施例１７＞Poly（I:C）の有効投与量試験
平均体重が３２ｇのSPFヒラメを１群１０匹として６群用意した。まず、各群に各々０．１２５ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、および２ｍｇ／ｍＬのPoly（I:C）溶液またはDEPC水を、各々１００μＬずつ筋肉内投与した。この２日後に１０４．３TCID50のVHSVを１００μＬずつ、各々筋肉内に一次接種した。VHSVを一次接種した日を０日として２８日目まで観察を行い、各群の生存率を図１１Ａに示した。この間、ヒラメはKokawa et al. (2008)の方法に基づき、流速３６０サイクル／日の２Ｌタンクで紫外線滅菌海水を用いて個別飼育した。【０１３２】
図１１Ａに示すように、VHSV接種後２８日目の生存率は、Poly（I:C）投与量が２５μｇ以上の群では１００％であるのに対し、同１２．５μｇの群では９０％であった。DEPC水を投与した群では９日目までにすべて死亡した。この結果から、Poly（I:C）が抗ウイルス状態を誘導するための投与量として、好ましくは１２．５μｇ以上、さらに好ましくは２５μｇ以上であることが示された。【０１３３】
＜実施例１８＞Poly（I:C）による抗ウイルス効果の持続期間試験
平均体重が３２ｇのSPFヒラメを用意し、１群１０匹とする群を７群準備した。全群に２ｍｇ／ｍＬのPoly（I:C）溶液を１００μＬずつ、筋肉内投与した。そして、各群にPoly（I:C）投与の２日前、同日、１日後、２日後、４日後、７日後、および１４日後のタイミングで各々１０４．３TCID50のVHSVを１００μＬずつ、各々筋肉内に一次接種した。VHSVを一次接種した日を０日として２１日目まで観察を行い、各群の生存率を図１１Ｂに示した。【０１３４】
図１１Ｂに示すように、Poly（I:C）投与２日前にVHSVを一次接種した群の生存率は０％であった。すなわち、VHSV一次接種から２日後にPoly（I:C）を投与しても抗ウイルス効果は得られないことが示された。また、Poly（I:C）投与と同時または投与１４日後にVHSVを一次接種した群の生存率は５０％であり、Poly（I:C）投与１日後、２日後および４日後および７日後にVHSVを一次接種した群の生存率は１００％を示した。これらの結果から、Poly（I:C）をVHSV接種の前日ないし１４日前に投与することにより、高ウイルス活性を有するVHSVへの抵抗性を効果的に誘導することが示された。【０１３５】
以上、実施例１〜実施例５の、Poly（I:C）を事前に投与した後にIHNV接種を行ったニジマスの実験結果、実施例６〜実施例９の、Poly（I:C）を事前に投与した後にRGNNV接種を行ったマハタの実験結果、および実施例１４〜実施例１６の、Poly（I:C）を事前に投与した後にVHSV接種を行ったヒラメの実験結果は一致した。このことから、Poly（I:C）により交叉免疫性を獲得することができることが明らかとなった。また、一次接種によりこのウイルスに対する抗体が産生され、ウイルスの二次接種により産生がさらに促進されることから、この接種ウイルスに対する免疫を獲得したことが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年7月7日(2010.7.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
二本鎖ＲＮＡと非弱毒化病原ウイルスとを有効成分として含有する魚類抗ウイルスワクチン。
【請求項３】
非弱毒化病原ウイルスが伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、キジハタ神経壊死ウイルス（ＲＧＮＮＶ）および／またはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）である、請求項２に記載の魚類抗ウイルスワクチン。
【請求項４】
二本鎖ＲＮＡがＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）である、請求項２または請求項３に記載の魚類抗ウイルスワクチン。
【請求項５】
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の投与量が１２．５μｇ以上である、請求項４に記載の魚類抗ウイルスワクチン。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
二本鎖ＲＮＡと非弱毒化病原ウイルスとを有効成分として含有する魚類免疫賦活剤。
【請求項９】
非弱毒化病原ウイルスが伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、キジハタ神経壊死ウイルス（ＲＧＮＮＶ）および／またはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）である、請求項８に記載の魚類免疫賦活剤。
【請求項１０】
二本鎖ＲＮＡがＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）である、請求項８または請求項９に記載の魚類免疫賦活剤。
【請求項１１】
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の投与量が１２．５μｇ以上である、請求項１０に記載の魚類免疫賦活剤。
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
非弱毒化病原ウイルスを取り込む前１４日ないし同時にＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を投与する魚類免疫付与方法。
【手続補正書】
【提出日】平成22年12月17日(2010.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非弱毒化病原ウイルスを取り込ませる前１４日ないし同時に投与する二本鎖ＲＮＡと前記取り込ませる非弱毒化病原ウイルスとを有効成分として含有する魚類抗ウイルスワクチン。
【請求項２】
非弱毒化病原ウイルスが伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、キジハタ神経壊死ウイルス（ＲＧＮＮＶ）および／またはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）である、請求項１に記載の魚類抗ウイルスワクチン。
【請求項３】
二本鎖ＲＮＡがＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）である、請求項１または請求項２に記載の魚類抗ウイルスワクチン。
【請求項４】
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の投与量が１２．５μｇ以上である、請求項３に記載の魚類抗ウイルスワクチン。
【請求項５】
非弱毒化病原ウイルスを取り込ませる前１４日ないし同時に投与する二本鎖ＲＮＡと前記取り込ませる非弱毒化病原ウイルスとを有効成分として含有する魚類免疫賦活剤。
【請求項６】
非弱毒化病原ウイルスが伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、キジハタ神経壊死ウイルス（ＲＧＮＮＶ）および／またはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）である、請求項５に記載の魚類免疫賦活剤。
【請求項７】
二本鎖ＲＮＡがＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）である、請求項５または請求項６に記載の魚類免疫賦活剤。
【請求項８】
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の投与量が１２．５μｇ以上である、請求項７に記載の魚類免疫賦活剤。
【請求項９】
下記（１）および（２）の工程を有する、魚類免疫付与方法；
（１）Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を投与する工程、
（２）Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の投与と同時ないし１４日後に非弱毒化病原ウイルスを取り込ませる工程。
【国際調査報告】
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