(57)【要約】  細胞電気生理センサは被検体細胞の電気的変化を測定する。細胞電気生理センサ用のチップは、ダイアフラムと、ダイアフラム上に設けられた二酸化シリコンを主成分とする熱酸化膜とを備える。ダイアフラムは、シリコン層と、シリコン層の上面に設けられた二酸化シリコン層とを有する。シリコン層と二酸化シリコン層とを貫通する貫通孔が設けられている。貫通孔は二酸化シリコン層で開口してかつ被検体細胞を捕捉する開口部を有する。熱酸化膜は貫通孔の内壁面に設けられて、貫通孔の開口部において二酸化シリコン層と溶融して一体化している。この細胞電気生理センサ用チップは、被検体細胞の性能のばらつきがあった場合においても、安定に被検体細胞を捕捉してギガシール性を実現できる。
2010016193.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体細胞の電気的変化を測定する細胞電気生理センサ用チップであって、
シリコン層と、前記シリコン層の上面に設けられた二酸化シリコン層とを有して、前記シリコン層と前記二酸化シリコン層とを貫通する貫通孔が設けられており、前記貫通孔は前記二酸化シリコン層で開口してかつ前記被検体細胞を捕捉する開口部を有する、ダイアフラムと、
前記貫通孔の内壁面に設けられて、前記貫通孔の前記開口部において前記二酸化シリコン層と溶融して一体化された、二酸化シリコンを主成分とする熱酸化膜と、
を備えた細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項２】
前記二酸化シリコン層と前記熱酸化膜とは平滑面で繋がっている、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項３】
前記二酸化シリコン層と前記熱酸化膜とは連続的に湾曲している表面で繋がっている、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項４】
前記二酸化シリコン層の厚みは０．３μｍ以上である、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項５】
前記熱酸化膜の厚みは１００〜２０００ｎｍである、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項６】
前記貫通孔の内径は、前記貫通孔の内部から前記開口部に向けて徐々に大きくなる、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項７】
前記熱酸化膜は前記ダイアフラムの表面を覆う、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項８】
前記ダイアフラムの周縁部に設けられた保持部をさらに備えた、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項９】
被検体細胞の電気的変化を測定する細胞電気生理センサであって、
シリコン層と、前記シリコン層の上面に設けられた二酸化シリコン層とを有して、前記シリコン層と前記二酸化シリコン層とを貫通する貫通孔が設けられており、前記貫通孔は前記二酸化シリコン層で開口してかつ前記被検体細胞を捕捉する開口部を有する、ダイアフラムと、
前記貫通孔の内壁面に設けられて、前記貫通孔の前記開口部において前記二酸化シリコン層と溶融して一体化された、二酸化シリコンを主成分とする熱酸化膜と、
を含むチップと、
前記ダイアフラムの上面に設けられた第１の電極槽と、
前記第１の電極槽内に設けられた第１の電極と、
前記ダイアフラムの下面に設けられて、前記第１の電極槽と前記貫通孔を通して連通する第２の電極槽と、
前記第２の電極槽に設けられた第２の電極と、
を備えた細胞電気生理センサ。
【請求項１０】
シリコン層と、前記シリコン層の上面に設けられた二酸化シリコン層とを有するウエハを準備するステップと、
前記ウエハの前記シリコン層と前記二酸化シリコン層とを貫通して、前記二酸化シリコン層で開口する開口部を有する貫通孔を形成するステップと、
前記貫通口の内壁面のうちの前記シリコン層の部分に二酸化シリコンを主成分とする熱酸化膜を形成するステップと、
前記熱酸化膜と前記二酸化シリコン層とを溶融させて前記開口部で一体化させるステップと、
を含む、細胞電気生理センサ用チップの製造方法。
【請求項１１】
前記貫通孔の前記内壁面から前記二酸化シリコン層の下面に沿って凹部を形成して、前記二酸化シリコン層が前記凹部から突出させるステップをさらに含み、
前記熱酸化膜と前記二酸化シリコン層とを溶融させて前記開口部で一体化させるステップは、前記二酸化シリコン層の前記突出する部分と前記熱酸化膜とを溶融させて前記開口部で一体化させるステップを含む、請求項１０に記載の細胞電気生理センサ用チップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の電気生理的活動の測定に用いられる細胞電気生理センサ用チップとこれを用いた細胞電気生理センサ、および細胞電気生理センサ用チップの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞膜に存在するイオンチャネルを電気生理学的に測定する方法として、微細加工技術を利用した基板型プローブが注目されている。これは、従来のパッチクランプ法のように、個々の細胞にマイクロピペットを挿入するという熟練作業を必要とせず、高スループットの自動化システムに適している。【０００３】
図１０は特許文献１に記載されている従来の細胞電気生理センサ１０１の断面図である。基板型プローブである細胞電気生理センサ１０１は、基板１０２と、基板１０２の上方に配置した電極槽１０３とを備えている。基板１０２は、基板１０２の上面から下面まで貫通する貫通孔１０５を有している。【０００４】
電極槽１０３の内部には第１電極１０６が配置され、貫通孔１０５の内部には第２電極１０７が配置されている。第２電極１０７は配線１０８を経て信号検出部に連結されている。【０００５】
次に、細胞電気生理センサ１０１の動作について以下に説明する。【０００６】
まず、電極槽１０３の内部に電解液１０９および被検体細胞１１０が注入される。被検体細胞１１０は貫通孔１０５の開口部１０４に捕捉されて保持される。【０００７】
被検体細胞１１０は貫通孔１０５の下方から吸引ポンプで吸引され、開口部１０４に密着した状態で保持される。すなわち、貫通孔１０５がマイクロピペットの先端穴と同様の役割を果たしている。このように開口部１０４に密着した状態で、第１電極１０６と第２電極１０７との間の電圧の反応前後の変化あるいは電流の反応前後の変化を測定する。これにより、細胞内外の電位差を求めて被検体細胞１１０のイオンチャネルの機能や薬理反応等の電気生理的物性細胞の生理的物性を分析する。【０００８】
従来の細胞電気生理センサ１０１においては、貫通孔１０５に捕捉された被検体細胞１１０は開口部１０４に安定して密着しない場合がある。細胞１１０が十分に密着していない状態では、細胞は第１電極１０６と第２電極１０７と間の高い電気抵抗値（ギガシール性）を高い再現性と安定性で得られない。【０００９】
被検体細胞１１０の大きさ、表面の性質、弾力性等の性質には個体差が認められ、個体差がギガシール性に影響を及ぼす。また、貫通孔１０５は非常に微細なので、ごみが付着すると貫通孔１０５近傍のギガシール性が低下する。その結果、貫通孔１０５で被検体細胞１１０を確実に安定して吸引し捕捉することができず、ギガシール性が低下する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第０２／０５５６５３号パンフレット
【発明の概要】
【００１１】
細胞電気生理センサは被検体細胞の電気的変化を測定する。細胞電気生理センサ用のチップは、ダイアフラムと、ダイアフラム上に設けられた二酸化シリコンを主成分とする熱酸化膜とを備える。ダイアフラムは、シリコン層と、シリコン層の上面に設けられた二酸化シリコン層とを有する。シリコン層と二酸化シリコン層とを貫通する貫通孔が設けられている。貫通孔は二酸化シリコン層で開口してかつ被検体細胞を捕捉する開口部を有する。熱酸化膜は貫通孔の内壁面に設けられて、貫通孔の開口部において二酸化シリコン層と溶融して一体化している。
【００１２】
この細胞電気生理センサ用チップは、被検体細胞の性能のばらつきがあった場合においても、安定に被検体細胞を捕捉してギガシール性を実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は本発明の実施の形態における細胞電気生理センサの断面図である。
【図２】図２は実施の形態における細胞電気生理センサ用チップの断面図である。
【図３Ａ】図３Ａは実施の形態における細胞電気生理センサ用チップの模式拡大断面図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは実施の形態における細胞電気生理センサ用チップの拡大断面図である。
【図４】図４は実施の形態における細胞電気生理センサ用チップの製造方法を示す断面図である。
【図５】図５は実施の形態における細胞電気生理センサ用チップの製造方法を示す断面図である。
【図６】図６は実施の形態における細胞電気生理センサ用チップの製造方法を示す断面図である。
【図７】図７は図６に示す細胞電気生理センサ用チップの拡大断面図である。
【図８Ａ】図８Ａは実施の形態における細胞電気生理センサ用チップの貫通孔を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは実施の形態における細胞電気生理センサ用チップの貫通孔を示す。
【図９】図９は実施の形態における他の細胞電気生理センサ用チップの断面を示す。
【図１０】図１０は従来の細胞電気生理センサの断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
図１は本発明の実施の形態における細胞電気生理センサ１の断面図である。細胞電気生理センサ１は、ダイアフラム２を有するチップ３と、ダイアフラム２の上面２Ａに配置された電極槽４と、ダイアフラム２の下面２Ｂに配置された電極槽６と、電極槽４に設けられた電極５と、電極槽６に設けられた電極７とを備える。電極槽４、６は電解液２０、２１でそれぞれ充填されるように構成されている。電極５は、電極槽４に充填された電解液２０と電気的に接続される。電極７は、電極槽６に充填された電解液２１と電気的に接続される。電極５、７は電極槽４、６間の電位差を検出する。ダイアフラム２には上面２Ａから下面２Ｂに貫通する貫通孔８が形成されている。貫通孔８を通して電極槽４、６は互いに連通している。
【００１５】
電極槽４には電解液２０と共に、複数の細胞１０が分散する培養液９が充填されるよう構成されている。培養液９自体が電解液であってもよい。貫通孔８を通して培養液９を吸引し、複数の細胞１０のうちの細胞１０Ａが貫通孔８を塞ぐ。このとき、細胞１０Ａは電極槽４、６内の電解液２０、２１間の電気抵抗を非常に大きくし、ギガシール性を実現する。細胞１０のうちの細胞１０Ａは被検体細胞となり、その生理化学的現象を測定することができる。
【００１６】
次に、細胞電気生理センサ１の重要な構成部品であるチップ３の構成について説明する。図２はチップ３の断面図である。２つのシリコン層と、これらのシリコン層に挟まれた二酸化シリコン層とを有するＳＯＩ基板をフォトエッチング技術で微細加工することによって、一括して多数個の高精度なチップ３を作製することができる。チップ３は、貫通孔８が形成されたダイアフラム２と、ダイアフラム２に接合するシリコン層１３とを備える。
【００１７】
ダイアフラム２は、シリコン層１１と、シリコン層１１の上面１１Ａに設けられた二酸化シリコン層１２とを有する。二酸化シリコン層１２は親水性に富むので、測定時における気泡の発生の抑制し、また気泡を容易に除去でき、したがって、電位差を高精度に測定することができる。電位差を測定する時に気泡が貫通孔８の近傍に残留していると、電極槽４、６内の電極液２０、２１間の電気抵抗を低くし、ギガシール性を大きく低下させて測定精度に大きな悪影響を及ぼす。二酸化シリコン層１２の厚みは０．３〜１０μｍが好ましい。
【００１８】
ダイアフラム２は数μｍの薄さとなることがあり、製造工程におけるハンドリングと実装を容易にするために、ダイアフラム２の周縁部にはシリコン層１３が設けられている。すなわち、シリコン層１３はチップ３を保持するための保持部として機能し、機械的強度を確保する機能と電解液２０や培養液９等の液体を貯留する機能を果たす。したがって、シリコン層１３はチップ３に不可欠な構成要件ではなく、チップ３の形状と構造によって所定の寸法に適宜選択することが好ましい。
【００１９】
シリコン層１１と二酸化シリコン層１２からなるダイアフラム２には上面２Ａと下面２Ｂを貫通する少なくとも１つの貫通孔８が設けられている。ダイアフラム２には上面２Ａと下面２Ｂを貫通する複数の貫通孔８が設けられてもよい。これにより。複数の被検体細胞１０Ａを同時に高いＳ／Ｎ比で測定することが可能となる。
【００２０】
チップ３の表面にはシリコン層１１、１３の表面を熱処理することによって形成された熱酸化膜１４が設けられている。熱酸化膜１４は二酸化シリコンよりなり、ダイアフラム２の表面を覆う。また、熱酸化膜１４は二酸化シリコン層１２とともにチップ３を構成するシリコン層１１、１３の表面を被覆し、絶縁性を確保しかつ親水性を高める。熱酸化膜１４の厚みは１００〜２０００ｎｍの範囲が好ましい。熱酸化膜１４の厚みが１００ｎｍを下回ると、シリコン層１１、１３の表面を完全に被覆することが困難となる。熱酸化膜１４の厚みが２０００ｎｍを超えると熱酸化膜１４を形成する時間が長くなり、チップ３の生産性を低下させる。
【００２１】
貫通孔８の内壁面８Ｃには熱酸化膜１４が設けられてシリコン層１１を被覆しており、これにより被検体細胞１０Ａを容易に捕捉できてギガシール性を向上させる。貫通孔８の内壁面８Ｃに設けられた熱酸化膜１４は、チップ３のシリコン層１１、１３を熱処理炉内で熱酸化することで形成することができる。したがって、表出したシリコン層１１、１３の表面を全て熱酸化膜１４で被覆することで、効率的に熱酸化膜１４を形成することができる。またこれにより、チップ３全体の親水性を高めることができて液体との濡れ性が高められて、チップ３の表面での気泡の発生を抑制できる。
【００２２】
ダイアフラム２の表面を絶縁材である二酸化シリコンで被覆することによって、電極５、７間の電気絶縁性を高め、細胞１０Ａの電気生理現象を高精度に高い再現性で測定することができる。
【００２３】
図３Ａは被検体細胞１０Ａを捕捉するチップ３の模式拡大断面図である。貫通孔８は二酸化シリコン層１２に開口する開口部８Ａと、開口部８Ａの反対側で開口する開口部８Ｂとを有する。開口部８Ａで被検体細胞１０Ａを捕捉する。貫通孔８の内壁面８Ｃでは、図３Ａに示すように、開口部８Ａに向かって熱酸化膜１４と二酸化シリコン層１２とが連続的に湾曲面を形成しながら平滑な面で繋がっている。
【００２４】
図３Ｂは実際のチップ３の拡大断面図である。図３Ｂに示すように、貫通孔８の内壁面８Ｃは開口部８Ａ、８Ｂの間で最小内径Ｒｍｉｎを有するように貫通孔８の内側へ突出するように滑らかな曲面で形成されていることが好ましい。図３Ｂでは、貫通孔８は、開口部８Ａ、８Ｂ間の略中央で最小内径Ｒｍｉｎを有し、開口部８Ａに向かって広がって径が大きくなっていることが好ましい。二酸化シリコン層１２の厚みは０．３μｍ以上とすることが好ましい。二酸化シリコン層１２の厚みが０．３μｍ以上であれば平滑な溶融面が得られるとともに、滑らかな湾曲面を形成することができる。
【００２５】
貫通孔８の開口部８Ａでの熱酸化膜１４の表面８８も二酸化シリコンを主成分とした溶融面である。表面８８は熱酸化膜１４を形成した後、さらに熱処理炉などで１１５０℃以上の温度に保持しながら二酸化シリコン層１２と熱酸化膜１４を溶融させて表面８８を平滑化する。
【００２６】
貫通孔８の開口部８Ａおよび内壁面８Ｃの二乗平均粗さＲｑは５．０ｎｍ以下とすることが好ましい。二乗平均粗さＲｑは、表面粗さの分布の平均値と測定値との偏差の二乗を平均した値の平方根で定義される。
【００２７】
実施の形態において、貫通孔８の最小内径Ｒｍｉｎは３μｍである。最小内径Ｒｍｉｎは細胞１０の大きさ、形状、性質に応じて適宜選択することが好ましい。例えば、被検体細胞１０Ａの大きさが５〜５０μｍ程度の場合に、被検体細胞１０Ａと開口部との密着性を高めるために貫通孔８の最小内径Ｒｍｉｎを３μｍ以下とすることが望ましい。また貫通孔８の深さは１５μｍ以下である。
【００２８】
次に、細胞電気生理センサ１を用いた細胞電位の測定方法について図１〜図３Ａを用いて説明する。
【００２９】
まず、図１に示すように、電極槽４に培養液９から液を入れ替えることによって、被検体細胞１０Ａを含む細胞１０が浮遊する電解液２０（細胞外液）で電極槽４を満たし、電極槽６を電解液２１（細胞内液）で満たす。貫通孔８は電解液２０、２１の境界となる。
【００３０】
実施の形態では、細胞１０は哺乳類筋細胞である。電解液２０はＫ＋イオンが１５５ｍＭ程度、Ｎａ＋イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ−イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液である。電解液２１は、Ｋ＋イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ＋イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ−イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液である。電解液２０、２１とは同じ組成の電解液であってもよい。
【００３１】
次に、ダイアフラム２の上面から加圧するか、下面を減圧することによって、細胞１０と電解液２０とを貫通孔８へ引き込む。これにより、細胞１０のうちの被検体細胞１０Ａが貫通孔８を塞ぐように開口部８Ａに捕捉、保持される。
【００３２】
次に、ダイアフラム２の下面側から吸引するか、もしくはダイアフラム２の下方からナイスタチン等の薬剤を投入することにより、被検体細胞１０Ａに微細小孔を形成する。
【００３３】
その後、被検体細胞１０Ａへ刺激をダイアフラム２の上方から与える。この刺激は、例えば化学薬品、毒物などの化学的な刺激や、または機械的変位、光、熱、電気、電磁波などの物理的な刺激である。
【００３４】
被検体細胞１０Ａがこの刺激に対して活発に反応する場合には、被検体細胞１０Ａは細胞膜が保有するチャネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。これにより、細胞内外の電位勾配が変化するので、図１に示す電極５、電極７によってその電気的変化を検出し、細胞の薬理反応などを検討することができる。
【００３５】
次に、実施の形態における細胞電気生理センサ１の製造方法について説明する。図４〜図７は細胞電気生理センサ１のチップ３の製造方法を説明するための断面図である。
【００３６】
まず、シリコン層１１と、シリコン層１１上の二酸化シリコン層１２と、二酸化シリコン層１２上のシリコン層１３とを有して、二酸化シリコン層１２がシリコン層１１、１３間に位置するウエハを準備する。このウエハはＳＯＩ基板として市販されている。実施の形態では、シリコン層１１の厚みが１５μｍ、二酸化シリコン層１２の厚みが１μｍ、シリコン層１３の厚みが２５０μｍである。
【００３７】
図４に示すようにシリコン層１１の表面にレジストマスク２５を形成する。レジストマスク２５に、所望する貫通孔８の断面と略同形状のマスクホールをパターニングする。
【００３８】
次に、シリコン層１１をエッチングして二酸化シリコン層１２に達する貫通孔９８を形成する。このときのエッチング方法としては、高精度な微細加工が可能なドライエッチングが望ましい。そしてドライエッチングを行う場合、深さに対する内径の比であるアスペクト比の高い貫通孔９８を形成するために、エッチングを促進するエッチングガスとエッチングを抑制する抑制ガスとを交互に用いる。
【００３９】
実施の形態では、エッチングガスとしてＳＦ６、抑制ガスとしてＣ４Ｆ８を用いる。外部コイルの誘導結合法によりプラズマを生成し、ここへエッチングガスとしてＳＦ６を導入するとＦラジカルを生成し、Ｆラジカルがシリコン層１１と反応してシリコン層１１は化学的にエッチングされる。
【００４０】
この時、シリコン層１１に高周波電圧を印加すると、シリコン層１１にはマイナスのバイアス電圧が発生する。すると、エッチングガスに含まれるプラスイオン（ＳＦ５＋）がシリコン層１１に向かって垂直に衝突し、このイオン衝撃によってシリコン層１１が物理的にエッチングされる。このようにして、ドライエッチングはシリコン層１１の垂直方向（下方）に進む。
【００４１】
一方、抑制ガスＣ４Ｆ８を用いる際には、シリコン層１１に高周波電圧を印加しない。そうすることによって、シリコン層１１にはバイアス電圧は全く発生しない。従って、抑制ガスＣ４Ｆ８に含まれるＣＦ＋は、偏向を受けることなく、シリコン層１１の孔９８の内壁面に均一に付着し、均一な膜を形成する。
【００４２】
ＣＦ＋は保護膜となって堆積してエッチングを抑制する。この保護膜は貫通孔９８の壁面部分だけでなく底面にも形成される。しかし、底面に形成された保護膜は内壁面に形成された保護膜に比較してプラスイオン（ＳＦ５＋）による衝撃により容易に除去されるので、エッチングは下方に進む。このようなエッチングが進むと、孔９８は二酸化シリコン層１２の表面に到達する。二酸化シリコン層１２は上記のエッチング条件ではエッチングされないので、貫通孔９８を形成するエッチングの深さ方向への進行は二酸化シリコン層１２でストップする。さらに続けてエッチングを行うと、表出した二酸化シリコン層１２の表面にエッチングイオンが蓄積する。このままエッチングが進むと、エッチンガスのイオンと二酸化シリコン層１２の表面に蓄積したエッチングガスのイオンとが反発し、エッチングイオンが横方向へと進行し始める。したがって、二酸化シリコン層１２の近傍において、貫通孔９８の内壁面９８Ｃから二酸化シリコン層１２の下面に沿ってシリコン層１１に凹部９９を形成する。凹部９９はシリコン層１１から二酸化シリコン層１２に向かって徐々にテーパ状に径が大きくなる。凹部９９は導電体であるシリコン層１１と絶縁体である二酸化シリコン層１２が積層されている。エッチングガスのイオンは導体であるシリコン層１１に比べて絶縁体である二酸化シリコン層１２の表面に蓄積されやすくなる。したがって、また蓄積したエッチングガスのイオンと進入してきたエッチングガスのイオンが反発して、エッチングが横方向へと進行して凹部９９を形成する。凹部９９の深さは１μｍ程度である。凹部９９の深さはエッチング時間によって制御することが可能である。
【００４３】
なお、エッチングガスとしてはＣＦ４、抑制ガスとしてはＣＨＦ３を用いることもできる。
【００４４】
次に、二酸化シリコン層１２をドライエッチングして貫通孔９８に繋がる貫通孔９７を形成する。このときのドライエッチングに用いるエッチングガスとしては、例えばＣＦ４とＡｒの混合ガスを用いることができる。プラズマ励起されたＡｒガスが直進性の高いのでエッチングガスとなり、ＣＦ４とＡｒの混合ガスはＡｒイオンのようなスパッタを行うエッチング成分を多く含むことによって貫通孔９８の開口部より直進して進入して絶縁体である二酸化シリコン層１２のみをエッチングすることができる。
【００４５】
このとき、導電体であるシリコン層１１は若干エッチングされるが、貫通孔９８を形成したときに保護膜が形成されていることから貫通孔９８や凹部９９の形状をほぼ維持することができる。
【００４６】
以上説明してきたように、ダイアフラム２の積層体の２種類の材料が同一のガスに対してそれぞれ異なったエッチングレートを持つことによって、導電体であるシリコン層１１をエッチングする際には絶縁体である二酸化シリコン層１２がエッチングされず、絶縁体である二酸化シリコン層１２をエッチングする際には導電体であるシリコン層１１がエッチングされない。これにより、貫通孔９８の所定の形状を容易に形成することができる。
【００４７】
次に、図５に示すように、シリコン層１３の上面にレジストマスク２６を形成した後、シリコン層１１のエッチングと同じエッチング条件にてシリコン層１３をエッチングすることによって凹部１１３を形成する。このエッチングの深さ方向への進行は二酸化シリコン層１２でストップする。二酸化シリコン層１２がエッチングをストップさせるエッチングストップ層としての役割を果たすことができる。二酸化シリコン層１２の貫通孔９８の開口部９９では二酸化シリコン層１２の部分１１２が突出している。
【００４８】
その後、大気中の熱処理炉の中に投入し、酸素を含む雰囲気で加熱していくとシリコン層１１、１３の表面が酸化され、表出したシリコン層１１、１３の表面に均一に熱酸化膜１４が形成される。熱酸化膜１４の厚みは２００〜２３０ｎｍである。熱酸化膜１４は７００℃以上の温度で形成することが可能である。
【００４９】
次に、熱処理炉の中で二酸化シリコンの溶融温度以上に温度を昇温させていくと二酸化シリコン層１２の部分１１２および熱酸化膜１４の表面が溶融し始めて平滑化される。同時に、貫通孔９８の開口部で突出する二酸化シリコン層１２の部分１１２が貫通孔８の内壁面に垂れ下がるように流動し、図６と図７に示すように、貫通孔９８の内壁面に形成された熱酸化膜１４に繋がって開口部８Ａに向かって平滑に湾曲している面を有する貫通孔８が形成される。
【００５０】
貫通孔８の内壁が、ダイアフラム２を形成する二酸化シリコン層１２の表面から貫通孔８の内部に向けて貫通孔８の内側に湾曲する滑らかな曲面で構成されている。これによって、電極槽４から貫通孔８の内部へ、さらに貫通孔８の内部から電極槽６へ流路の断面積を連続的に変化させることができ、流体の抵抗損失を低減することができる。その結果、貫通孔８に液体が流れやすくなり、被検体細胞１０Ａを的確に吸引し、貫通孔８への捕捉率を向上させることができる。さらに、これによって気泡の発生の抑制と除去を効率良く行うことができる。
【００５１】
貫通孔８の開口部８Ａの近傍の二酸化シリコン層１２を図８Ａに示す。このように、二酸化シリコン層１２は貫通孔８の開口部８Ａから内壁面８Ｃまで非常に平滑な表面を有する。このような平滑な表面で貫通孔８の内壁面８Ｃで二酸化シリコン層１２と熱酸化膜１４とが連続的に繋がり、かつ被検体細胞１０Ａを捕捉保持する開口部８Ａを形成するためには二酸化シリコン層１２の厚みを０．３μｍ以上とすることが好ましい。二酸化シリコン層１２の厚みが０．３μｍを下回ると表面が不連続となる、あるいは平滑な湾曲した形状を有する表面性の再現性が低下する。
【００５２】
これに対して、熱酸化膜１４を形成する温度で熱処理された貫通孔８の開口部８Ａの近傍の二酸化シリコン層１２を図８Ｂに示す。図８Ｂに示す表面は、図８Ａに示す溶融して平滑化された表面に比べて明らかに平滑性に劣る。
【００５３】
チップ３を半導体プロセスで作製する際、図８Ｂに示すように、シリコン片からなる複数のシリコン個片６１が二酸化シリコン層１２に付着する場合がある。シリコン個片６１は、安定した細胞１０Ａの生理化学的変化の測定を阻害する。シリコン個片６１が貫通孔８の近傍に残留しても、熱処理でシリコン個片を熱酸化させて二酸化シリコンに変化させて溶融させることによって、シリコン個片６１は二酸化シリコン層１２と一体化して平滑性と親水性に優れた表面を有するチップ３を提供することが可能となる。
【００５４】
この構造によって、細胞１０の多少のサイズの個体差があったとしても、被検体細胞１０Ａを安定して貫通孔８の開口部８Ａに密着させて捕捉することができる。
【００５５】
シリコン層に形成された微小形状の貫通孔８の内部に気泡が発生すると、この気泡によって抵抗値が変動し、測定誤差を発生させる場合がある。また、この気泡が貫通孔８を完全に塞いでしまうと、電極槽４、６とが完全に絶縁されてしまい、測定が実質不可能になる。実施の形態によるチップ３では、親水性を有する二酸化シリコンでチップ３の表面を被覆することによって、貫通孔８の内部の気泡を低減することが可能となり、細胞電気生理センサ１の測定誤差を抑制することができる。
【００５６】
貫通孔８の開口部８Ａの２乗平均粗さＲｑが５．０ｎｍ以下の平滑な表面を有し、かつダイアフラム２の上面の２乗平均粗さＲｑが５．０ｎｍ以下の滑らかに隆起する隆起部１８Ａを有する。したがって、図３Ａに示すように、開口部８Ａの湾曲面に沿って被検体細胞１０Ａを捕捉して、チップ３は被検体細胞１０Ａを貫通孔８の開口部８Ａに確実に密着させることができ、細胞電気生理センサ１の測定精度を向上させることができる。
【００５７】
貫通孔８の形状や、貫通孔８の開口部８Ａの形状は、二酸化シリコン層１２と熱酸化膜１４を熱溶融させる温度や時間を変えることにより、容易に変えることができる。
【００５８】
図３Ｂに示すように、熱溶融の時間により最小内径Ｒｍｉｎの位置を貫通孔８内部で容易に調整できる。最小内径Ｒｍｉｎは細胞１０Ａの径より十分小さいので、被検体細胞１０Ａは貫通孔８を通り抜けることなく確実に保持される。したがって、被検体細胞１０Ａの大きさに合うように貫通孔８の開口部８Ａの形状や貫通孔８の形状を容易に調整できる。
【００５９】
図９は実施の形態による他のチップ３の断面図である。図３Ｂに示すチップ３での二酸化シリコン層１２を１１５０℃の温度で熱溶融させる時間より短い時間で熱溶融させると、図９に示すように、最小内径Ｒｍｉｎの位置が開口部８Ａに比べて開口部８Ｂにより近くすることができる。さらに、貫通孔８の位置Ｐ２で湾曲面である内壁面８Ｃの曲率半径ＣＲ２は、位置Ｐ２と異なる位置Ｐ１での湾曲面である内壁面８Ｃの曲率半径ＣＲ１は異なる。具体的には、位置Ｐ１は位置Ｐ２に比べて開口部８Ａにより近く、曲率半径ＣＲ１は曲率半径ＣＲ２より小さい。この形状により、被検体細胞１０Ａをより確実に保持することができる。
【００６０】
このように、熱溶融温度、熱溶融時間を適宜調整することによって、細胞１０の大きさ、形状、性質に応じて、貫通孔８の形状を適宜調整することが可能となる。
【００６１】
なお、実施の形態において、「上面」「下面」等の方向を示唆する用語はシリコン層１１、１３や二酸化シリコン層１２等の細胞電気生理センサの構成部品の相対的な位置関係にのみ依存する相対的な方向を示し、上下方向等の絶対的な方向を示すものではない。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明にかかる細胞電気生理センサ用チップは、被検体細胞の性能のばらつきがあった場合においても、安定に被検体細胞を捕捉してギガシール性を実現でき、高精度かつ高効率な測定が求められる医療・バイオ分野において有用である。
【符号の説明】
【００６３】
１    細胞電気生理センサ
２    ダイアフラム
３    チップ
４    電極槽（第１の電極槽）
５    電極（第１の電極）
６    電極槽（第２の電極槽）
７    電極（第２の電極）
８    貫通孔
８Ａ    開口部
８Ｃ    内壁面
１０Ａ    被検体細胞
１１    シリコン層
１２    二酸化シリコン層
１３    保持部
１４    熱酸化膜
【図１】
2010016193.tif 000003
【図２】
2010016193.tif 000004
【図３Ａ】
2010016193.tif 000005
【図３Ｂ】
2010016193.tif 000006
【図４】
2010016193.tif 000007
【図５】
2010016193.tif 000008
【図６】
2010016193.tif 000009
【図７】
2010016193.tif 000010
【図８Ａ】
2010016193.tif 000011
【図８Ｂ】
2010016193.tif 000012
【図９】
2010016193.tif 000013
【図１０】
2010016193.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成21年12月8日(2009.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の電気生理的活動の測定に用いられる細胞電気生理センサ用チップとこれを用いた細胞電気生理センサ、および細胞電気生理センサ用チップの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞膜に存在するイオンチャネルを電気生理学的に測定する方法として、微細加工技術を利用した基板型プローブが注目されている。これは、従来のパッチクランプ法のように、個々の細胞にマイクロピペットを挿入するという熟練作業を必要とせず、高スループットの自動化システムに適している。
【０００３】
図１０は特許文献１に記載されている従来の細胞電気生理センサ１０１の断面図である。基板型プローブである細胞電気生理センサ１０１は、基板１０２と、基板１０２の上方に配置した電極槽１０３とを備えている。基板１０２は、基板１０２の上面から下面まで貫通する貫通孔１０５を有している。
【０００４】
電極槽１０３の内部には第１電極１０６が配置され、貫通孔１０５の内部には第２電極１０７が配置されている。第２電極１０７は配線１０８を経て信号検出部に連結されている。
【０００５】
次に、細胞電気生理センサ１０１の動作について以下に説明する。
【０００６】
まず、電極槽１０３の内部に電解液１０９および被検体細胞１１０が注入される。被検体細胞１１０は貫通孔１０５の開口部１０４に捕捉されて保持される。
【０００７】
被検体細胞１１０は貫通孔１０５の下方から吸引ポンプで吸引され、開口部１０４に密着した状態で保持される。すなわち、貫通孔１０５がマイクロピペットの先端穴と同様の役割を果たしている。このように開口部１０４に密着した状態で、第１電極１０６と第２電極１０７との間の電圧の反応前後の変化あるいは電流の反応前後の変化を測定する。これにより、細胞内外の電位差を求めて被検体細胞１１０のイオンチャネルの機能や薬理反応等の電気生理的物性細胞の生理的物性を分析する。
【０００８】
従来の細胞電気生理センサ１０１においては、貫通孔１０５に捕捉された被検体細胞１１０は開口部１０４に安定して密着しない場合がある。細胞１１０が十分に密着していない状態では、細胞は第１電極１０６と第２電極１０７と間の高い電気抵抗値（ギガシール性）を高い再現性と安定性で得られない。
【０００９】
被検体細胞１１０の大きさ、表面の性質、弾力性等の性質には個体差が認められ、個体差がギガシール性に影響を及ぼす。また、貫通孔１０５は非常に微細なので、ごみが付着すると貫通孔１０５近傍のギガシール性が低下する。その結果、貫通孔１０５で被検体細胞１１０を確実に安定して吸引し捕捉することができず、ギガシール性が低下する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第０２／０５５６５３号パンフレット
【発明の概要】
【００１１】
細胞電気生理センサは被検体細胞の電気的変化を測定する。細胞電気生理センサ用のチップは、ダイアフラムと、ダイアフラム上に設けられた二酸化シリコンを主成分とする熱酸化膜とを備える。ダイアフラムは、シリコン層と、シリコン層の上面に設けられた二酸化シリコン層とを有する。シリコン層と二酸化シリコン層とを貫通する貫通孔が設けられている。貫通孔は二酸化シリコン層で開口してかつ被検体細胞を捕捉する開口部を有する。熱酸化膜は貫通孔の内壁面に設けられて、貫通孔の開口部において二酸化シリコン層と溶融して一体化している。
【００１２】
この細胞電気生理センサ用チップは、被検体細胞の性能のばらつきがあった場合においても、安定に被検体細胞を捕捉してギガシール性を実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施の形態における細胞電気生理センサの断面図
【図２】実施の形態における細胞電気生理センサ用チップの断面図
【図３Ａ】実施の形態における細胞電気生理センサ用チップの模式拡大断面図
【図３Ｂ】実施の形態における細胞電気生理センサ用チップの拡大断面図
【図４】実施の形態における細胞電気生理センサ用チップの製造方法を示す断面図
【図５】実施の形態における細胞電気生理センサ用チップの製造方法を示す断面図
【図６】実施の形態における細胞電気生理センサ用チップの製造方法を示す断面図
【図７】図６に示す細胞電気生理センサ用チップの拡大断面図
【図８Ａ】実施の形態における細胞電気生理センサ用チップの貫通孔を示す図
【図８Ｂ】実施の形態における細胞電気生理センサ用チップの貫通孔を示す図
【図９】実施の形態における他の細胞電気生理センサ用チップの断面を示す図
【図１０】従来の細胞電気生理センサの断面図
【発明を実施するための形態】
【００１４】
図１は本発明の実施の形態における細胞電気生理センサ１の断面図である。細胞電気生理センサ１は、ダイアフラム２を有するチップ３と、ダイアフラム２の上面２Ａに配置された電極槽４と、ダイアフラム２の下面２Ｂに配置された電極槽６と、電極槽４に設けられた電極５と、電極槽６に設けられた電極７とを備える。電極槽４、６は電解液２０、２１でそれぞれ充填されるように構成されている。電極５は、電極槽４に充填された電解液２０と電気的に接続される。電極７は、電極槽６に充填された電解液２１と電気的に接続される。電極５、７は電極槽４、６間の電位差を検出する。ダイアフラム２には上面２Ａから下面２Ｂに貫通する貫通孔８が形成されている。貫通孔８を通して電極槽４、６は互いに連通している。
【００１５】
電極槽４には電解液２０と共に、複数の細胞１０が分散する培養液９が充填されるよう構成されている。培養液９自体が電解液であってもよい。貫通孔８を通して培養液９を吸引し、複数の細胞１０のうちの細胞１０Ａが貫通孔８を塞ぐ。このとき、細胞１０Ａは電極槽４、６内の電解液２０、２１間の電気抵抗を非常に大きくし、ギガシール性を実現する。細胞１０のうちの細胞１０Ａは被検体細胞となり、その生理化学的現象を測定することができる。
【００１６】
次に、細胞電気生理センサ１の重要な構成部品であるチップ３の構成について説明する。図２はチップ３の断面図である。２つのシリコン層と、これらのシリコン層に挟まれた二酸化シリコン層とを有するＳＯＩ基板をフォトエッチング技術で微細加工することによって、一括して多数個の高精度なチップ３を作製することができる。チップ３は、貫通孔８が形成されたダイアフラム２と、ダイアフラム２に接合するシリコン層１３とを備える。
【００１７】
ダイアフラム２は、シリコン層１１と、シリコン層１１の上面１１Ａに設けられた二酸化シリコン層１２とを有する。二酸化シリコン層１２は親水性に富むので、測定時における気泡の発生の抑制し、また気泡を容易に除去でき、したがって、電位差を高精度に測定することができる。電位差を測定する時に気泡が貫通孔８の近傍に残留していると、電極槽４、６内の電極液２０、２１間の電気抵抗を低くし、ギガシール性を大きく低下させて測定精度に大きな悪影響を及ぼす。二酸化シリコン層１２の厚みは０．３〜１０μｍが好ましい。
【００１８】
ダイアフラム２は数μｍの薄さとなることがあり、製造工程におけるハンドリングと実装を容易にするために、ダイアフラム２の周縁部にはシリコン層１３が設けられている。すなわち、シリコン層１３はチップ３を保持するための保持部として機能し、機械的強度を確保する機能と電解液２０や培養液９等の液体を貯留する機能を果たす。したがって、シリコン層１３はチップ３に不可欠な構成要件ではなく、チップ３の形状と構造によって所定の寸法に適宜選択することが好ましい。
【００１９】
シリコン層１１と二酸化シリコン層１２からなるダイアフラム２には上面２Ａと下面２Ｂを貫通する少なくとも１つの貫通孔８が設けられている。ダイアフラム２には上面２Ａと下面２Ｂを貫通する複数の貫通孔８が設けられてもよい。これにより。複数の被検体細胞１０Ａを同時に高いＳ／Ｎ比で測定することが可能となる。
【００２０】
チップ３の表面にはシリコン層１１、１３の表面を熱処理することによって形成された熱酸化膜１４が設けられている。熱酸化膜１４は二酸化シリコンよりなり、ダイアフラム２の表面を覆う。また、熱酸化膜１４は二酸化シリコン層１２とともにチップ３を構成するシリコン層１１、１３の表面を被覆し、絶縁性を確保しかつ親水性を高める。熱酸化膜１４の厚みは１００〜２０００ｎｍの範囲が好ましい。熱酸化膜１４の厚みが１００ｎｍを下回ると、シリコン層１１、１３の表面を完全に被覆することが困難となる。熱酸化膜１４の厚みが２０００ｎｍを超えると熱酸化膜１４を形成する時間が長くなり、チップ３の生産性を低下させる。
【００２１】
貫通孔８の内壁面８Ｃには熱酸化膜１４が設けられてシリコン層１１を被覆しており、これにより被検体細胞１０Ａを容易に捕捉できてギガシール性を向上させる。貫通孔８の内壁面８Ｃに設けられた熱酸化膜１４は、チップ３のシリコン層１１、１３を熱処理炉内で熱酸化することで形成することができる。したがって、表出したシリコン層１１、１３の表面を全て熱酸化膜１４で被覆することで、効率的に熱酸化膜１４を形成することができる。またこれにより、チップ３全体の親水性を高めることができて液体との濡れ性が高められて、チップ３の表面での気泡の発生を抑制できる。
【００２２】
ダイアフラム２の表面を絶縁材である二酸化シリコンで被覆することによって、電極５、７間の電気絶縁性を高め、細胞１０Ａの電気生理現象を高精度に高い再現性で測定することができる。
【００２３】
図３Ａは被検体細胞１０Ａを捕捉するチップ３の模式拡大断面図である。貫通孔８は二酸化シリコン層１２に開口する開口部８Ａと、開口部８Ａの反対側で開口する開口部８Ｂとを有する。開口部８Ａで被検体細胞１０Ａを捕捉する。貫通孔８の内壁面８Ｃでは、図３Ａに示すように、開口部８Ａに向かって熱酸化膜１４と二酸化シリコン層１２とが連続的に湾曲面を形成しながら平滑な面で繋がっている。
【００２４】
図３Ｂは実際のチップ３の拡大断面図である。図３Ｂに示すように、貫通孔８の内壁面８Ｃは開口部８Ａ、８Ｂの間で最小内径Ｒｍｉｎを有するように貫通孔８の内側へ突出するように滑らかな曲面で形成されていることが好ましい。図３Ｂでは、貫通孔８は、開口部８Ａ、８Ｂ間の略中央で最小内径Ｒｍｉｎを有し、開口部８Ａに向かって広がって径が大きくなっていることが好ましい。二酸化シリコン層１２の厚みは０．３μｍ以上とすることが好ましい。二酸化シリコン層１２の厚みが０．３μｍ以上であれば平滑な溶融面が得られるとともに、滑らかな湾曲面を形成することができる。
【００２５】
貫通孔８の開口部８Ａでの熱酸化膜１４の表面８８も二酸化シリコンを主成分とした溶融面である。表面８８は熱酸化膜１４を形成した後、さらに熱処理炉などで１１５０℃以上の温度に保持しながら二酸化シリコン層１２と熱酸化膜１４を溶融させて表面８８を平滑化する。
【００２６】
貫通孔８の開口部８Ａおよび内壁面８Ｃの二乗平均粗さＲｑは５．０ｎｍ以下とすることが好ましい。二乗平均粗さＲｑは、表面粗さの分布の平均値と測定値との偏差の二乗を平均した値の平方根で定義される。
【００２７】
実施の形態において、貫通孔８の最小内径Ｒｍｉｎは３μｍである。最小内径Ｒｍｉｎは細胞１０の大きさ、形状、性質に応じて適宜選択することが好ましい。例えば、被検体細胞１０Ａの大きさが５〜５０μｍ程度の場合に、被検体細胞１０Ａと開口部との密着性を高めるために貫通孔８の最小内径Ｒｍｉｎを３μｍ以下とすることが望ましい。また貫通孔８の深さは１５μｍ以下である。
【００２８】
次に、細胞電気生理センサ１を用いた細胞電位の測定方法について図１〜図３Ａを用いて説明する。
【００２９】
まず、図１に示すように、電極槽４に培養液９から液を入れ替えることによって、被検体細胞１０Ａを含む細胞１０が浮遊する電解液２０（細胞外液）で電極槽４を満たし、電極槽６を電解液２１（細胞内液）で満たす。貫通孔８は電解液２０、２１の境界となる。
【００３０】
実施の形態では、細胞１０は哺乳類筋細胞である。電解液２０はＫ＋イオンが１５５ｍＭ程度、Ｎａ＋イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ−イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液である。電解液２１は、Ｋ＋イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ＋イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ−イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液である。電解液２０、２１とは同じ組成の電解液であってもよい。
【００３１】
次に、ダイアフラム２の上面から加圧するか、下面を減圧することによって、細胞１０と電解液２０とを貫通孔８へ引き込む。これにより、細胞１０のうちの被検体細胞１０Ａが貫通孔８を塞ぐように開口部８Ａに捕捉、保持される。
【００３２】
次に、ダイアフラム２の下面側から吸引するか、もしくはダイアフラム２の下方からナイスタチン等の薬剤を投入することにより、被検体細胞１０Ａに微細小孔を形成する。
【００３３】
その後、被検体細胞１０Ａへ刺激をダイアフラム２の上方から与える。この刺激は、例えば化学薬品、毒物などの化学的な刺激や、または機械的変位、光、熱、電気、電磁波などの物理的な刺激である。
【００３４】
被検体細胞１０Ａがこの刺激に対して活発に反応する場合には、被検体細胞１０Ａは細胞膜が保有するチャネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。これにより、細胞内外の電位勾配が変化するので、図１に示す電極５、電極７によってその電気的変化を検出し、細胞の薬理反応などを検討することができる。
【００３５】
次に、実施の形態における細胞電気生理センサ１の製造方法について説明する。図４〜図７は細胞電気生理センサ１のチップ３の製造方法を説明するための断面図である。
【００３６】
まず、シリコン層１１と、シリコン層１１上の二酸化シリコン層１２と、二酸化シリコン層１２上のシリコン層１３とを有して、二酸化シリコン層１２がシリコン層１１、１３間に位置するウエハを準備する。このウエハはＳＯＩ基板として市販されている。実施の形態では、シリコン層１１の厚みが１５μｍ、二酸化シリコン層１２の厚みが１μｍ、シリコン層１３の厚みが２５０μｍである。
【００３７】
図４に示すようにシリコン層１１の表面にレジストマスク２５を形成する。レジストマスク２５に、所望する貫通孔８の断面と略同形状のマスクホールをパターニングする。
【００３８】
次に、シリコン層１１をエッチングして二酸化シリコン層１２に達する貫通孔９８を形成する。このときのエッチング方法としては、高精度な微細加工が可能なドライエッチングが望ましい。そしてドライエッチングを行う場合、深さに対する内径の比であるアスペクト比の高い貫通孔９８を形成するために、エッチングを促進するエッチングガスとエッチングを抑制する抑制ガスとを交互に用いる。
【００３９】
実施の形態では、エッチングガスとしてＳＦ６、抑制ガスとしてＣ４Ｆ８を用いる。外部コイルの誘導結合法によりプラズマを生成し、ここへエッチングガスとしてＳＦ６を導入するとＦラジカルを生成し、Ｆラジカルがシリコン層１１と反応してシリコン層１１は化学的にエッチングされる。
【００４０】
この時、シリコン層１１に高周波電圧を印加すると、シリコン層１１にはマイナスのバイアス電圧が発生する。すると、エッチングガスに含まれるプラスイオン（ＳＦ５＋）がシリコン層１１に向かって垂直に衝突し、このイオン衝撃によってシリコン層１１が物理的にエッチングされる。このようにして、ドライエッチングはシリコン層１１の垂直方向（下方）に進む。
【００４１】
一方、抑制ガスＣ４Ｆ８を用いる際には、シリコン層１１に高周波電圧を印加しない。そうすることによって、シリコン層１１にはバイアス電圧は全く発生しない。従って、抑制ガスＣ４Ｆ８に含まれるＣＦ＋は、偏向を受けることなく、シリコン層１１の孔９８の内壁面に均一に付着し、均一な膜を形成する。
【００４２】
ＣＦ＋は保護膜となって堆積してエッチングを抑制する。この保護膜は貫通孔９８の壁面部分だけでなく底面にも形成される。しかし、底面に形成された保護膜は内壁面に形成された保護膜に比較してプラスイオン（ＳＦ５＋）による衝撃により容易に除去されるので、エッチングは下方に進む。このようなエッチングが進むと、孔９８は二酸化シリコン層１２の表面に到達する。二酸化シリコン層１２は上記のエッチング条件ではエッチングされないので、貫通孔９８を形成するエッチングの深さ方向への進行は二酸化シリコン層１２でストップする。さらに続けてエッチングを行うと、表出した二酸化シリコン層１２の表面にエッチングイオンが蓄積する。このままエッチングが進むと、エッチンガスのイオンと二酸化シリコン層１２の表面に蓄積したエッチングガスのイオンとが反発し、エッチングイオンが横方向へと進行し始める。したがって、二酸化シリコン層１２の近傍において、貫通孔９８の内壁面９８Ｃから二酸化シリコン層１２の下面に沿ってシリコン層１１に凹部９９を形成する。凹部９９はシリコン層１１から二酸化シリコン層１２に向かって徐々にテーパ状に径が大きくなる。凹部９９は導電体であるシリコン層１１と絶縁体である二酸化シリコン層１２が積層されている。エッチングガスのイオンは導体であるシリコン層１１に比べて絶縁体である二酸化シリコン層１２の表面に蓄積されやすくなる。したがって、また蓄積したエッチングガスのイオンと進入してきたエッチングガスのイオンが反発して、エッチングが横方向へと進行して凹部９９を形成する。凹部９９の深さは１μｍ程度である。凹部９９の深さはエッチング時間によって制御することが可能である。
【００４３】
なお、エッチングガスとしてはＣＦ４、抑制ガスとしてはＣＨＦ３を用いることもできる。
【００４４】
次に、二酸化シリコン層１２をドライエッチングして貫通孔９８に繋がる貫通孔９７を形成する。このときのドライエッチングに用いるエッチングガスとしては、例えばＣＦ４とＡｒの混合ガスを用いることができる。プラズマ励起されたＡｒガスが直進性の高いのでエッチングガスとなり、ＣＦ４とＡｒの混合ガスはＡｒイオンのようなスパッタを行うエッチング成分を多く含むことによって貫通孔９８の開口部より直進して進入して絶縁体である二酸化シリコン層１２のみをエッチングすることができる。
【００４５】
このとき、導電体であるシリコン層１１は若干エッチングされるが、貫通孔９８を形成したときに保護膜が形成されていることから貫通孔９８や凹部９９の形状をほぼ維持することができる。
【００４６】
以上説明してきたように、ダイアフラム２の積層体の２種類の材料が同一のガスに対してそれぞれ異なったエッチングレートを持つことによって、導電体であるシリコン層１１をエッチングする際には絶縁体である二酸化シリコン層１２がエッチングされず、絶縁体である二酸化シリコン層１２をエッチングする際には導電体であるシリコン層１１がエッチングされない。これにより、貫通孔９８の所定の形状を容易に形成することができる。
【００４７】
次に、図５に示すように、シリコン層１３の上面にレジストマスク２６を形成した後、シリコン層１１のエッチングと同じエッチング条件にてシリコン層１３をエッチングすることによって凹部１１３を形成する。このエッチングの深さ方向への進行は二酸化シリコン層１２でストップする。二酸化シリコン層１２がエッチングをストップさせるエッチングストップ層としての役割を果たすことができる。二酸化シリコン層１２の貫通孔９８の開口部９９では二酸化シリコン層１２の部分１１２が突出している。
【００４８】
その後、大気中の熱処理炉の中に投入し、酸素を含む雰囲気で加熱していくとシリコン層１１、１３の表面が酸化され、表出したシリコン層１１、１３の表面に均一に熱酸化膜１４が形成される。熱酸化膜１４の厚みは２００〜２３０ｎｍである。熱酸化膜１４は７００℃以上の温度で形成することが可能である。
【００４９】
次に、熱処理炉の中で二酸化シリコンの溶融温度以上に温度を昇温させていくと二酸化シリコン層１２の部分１１２および熱酸化膜１４の表面が溶融し始めて平滑化される。同時に、貫通孔９８の開口部で突出する二酸化シリコン層１２の部分１１２が貫通孔８の内壁面に垂れ下がるように流動し、図６と図７に示すように、貫通孔９８の内壁面に形成された熱酸化膜１４に繋がって開口部８Ａに向かって平滑に湾曲している面を有する貫通孔８が形成される。
【００５０】
貫通孔８の内壁が、ダイアフラム２を形成する二酸化シリコン層１２の表面から貫通孔８の内部に向けて貫通孔８の内側に湾曲する滑らかな曲面で構成されている。これによって、電極槽４から貫通孔８の内部へ、さらに貫通孔８の内部から電極槽６へ流路の断面積を連続的に変化させることができ、流体の抵抗損失を低減することができる。その結果、貫通孔８に液体が流れやすくなり、被検体細胞１０Ａを的確に吸引し、貫通孔８への捕捉率を向上させることができる。さらに、これによって気泡の発生の抑制と除去を効率良く行うことができる。
【００５１】
貫通孔８の開口部８Ａの近傍の二酸化シリコン層１２を図８Ａに示す。このように、二酸化シリコン層１２は貫通孔８の開口部８Ａから内壁面８Ｃまで非常に平滑な表面を有する。このような平滑な表面で貫通孔８の内壁面８Ｃで二酸化シリコン層１２と熱酸化膜１４とが連続的に繋がり、かつ被検体細胞１０Ａを捕捉保持する開口部８Ａを形成するためには二酸化シリコン層１２の厚みを０．３μｍ以上とすることが好ましい。二酸化シリコン層１２の厚みが０．３μｍを下回ると表面が不連続となる、あるいは平滑な湾曲した形状を有する表面性の再現性が低下する。
【００５２】
これに対して、熱酸化膜１４を形成する温度で熱処理された貫通孔８の開口部８Ａの近傍の二酸化シリコン層１２を図８Ｂに示す。図８Ｂに示す表面は、図８Ａに示す溶融して平滑化された表面に比べて明らかに平滑性に劣る。
【００５３】
チップ３を半導体プロセスで作製する際、図８Ｂに示すように、シリコン片からなる複数のシリコン個片６１が二酸化シリコン層１２に付着する場合がある。シリコン個片６１は、安定した細胞１０Ａの生理化学的変化の測定を阻害する。シリコン個片６１が貫通孔８の近傍に残留しても、熱処理でシリコン個片を熱酸化させて二酸化シリコンに変化させて溶融させることによって、シリコン個片６１は二酸化シリコン層１２と一体化して平滑性と親水性に優れた表面を有するチップ３を提供することが可能となる。
【００５４】
この構造によって、細胞１０の多少のサイズの個体差があったとしても、被検体細胞１０Ａを安定して貫通孔８の開口部８Ａに密着させて捕捉することができる。
【００５５】
シリコン層に形成された微小形状の貫通孔８の内部に気泡が発生すると、この気泡によって抵抗値が変動し、測定誤差を発生させる場合がある。また、この気泡が貫通孔８を完全に塞いでしまうと、電極槽４、６とが完全に絶縁されてしまい、測定が実質不可能になる。実施の形態によるチップ３では、親水性を有する二酸化シリコンでチップ３の表面を被覆することによって、貫通孔８の内部の気泡を低減することが可能となり、細胞電気生理センサ１の測定誤差を抑制することができる。
【００５６】
貫通孔８の開口部８Ａの２乗平均粗さＲｑが５．０ｎｍ以下の平滑な表面を有し、かつダイアフラム２の上面の２乗平均粗さＲｑが５．０ｎｍ以下の滑らかに隆起する隆起部１８Ａを有する。したがって、図３Ａに示すように、開口部８Ａの湾曲面に沿って被検体細胞１０Ａを捕捉して、チップ３は被検体細胞１０Ａを貫通孔８の開口部８Ａに確実に密着させることができ、細胞電気生理センサ１の測定精度を向上させることができる。
【００５７】
貫通孔８の形状や、貫通孔８の開口部８Ａの形状は、二酸化シリコン層１２と熱酸化膜１４を熱溶融させる温度や時間を変えることにより、容易に変えることができる。
【００５８】
図３Ｂに示すように、熱溶融の時間により最小内径Ｒｍｉｎの位置を貫通孔８内部で容易に調整できる。最小内径Ｒｍｉｎは細胞１０Ａの径より十分小さいので、被検体細胞１０Ａは貫通孔８を通り抜けることなく確実に保持される。したがって、被検体細胞１０Ａの大きさに合うように貫通孔８の開口部８Ａの形状や貫通孔８の形状を容易に調整できる。
【００５９】
図９は実施の形態による他のチップ３の断面図である。図３Ｂに示すチップ３での二酸化シリコン層１２を１１５０℃の温度で熱溶融させる時間より短い時間で熱溶融させると、図９に示すように、最小内径Ｒｍｉｎの位置が開口部８Ａに比べて開口部８Ｂにより近くすることができる。さらに、貫通孔８の位置Ｐ２で湾曲面である内壁面８Ｃの曲率半径ＣＲ２は、位置Ｐ２と異なる位置Ｐ１での湾曲面である内壁面８Ｃの曲率半径ＣＲ１は異なる。具体的には、位置Ｐ１は位置Ｐ２に比べて開口部８Ａにより近く、曲率半径ＣＲ１は曲率半径ＣＲ２より小さい。この形状により、被検体細胞１０Ａをより確実に保持することができる。
【００６０】
このように、熱溶融温度、熱溶融時間を適宜調整することによって、細胞１０の大きさ、形状、性質に応じて、貫通孔８の形状を適宜調整することが可能となる。
【００６１】
なお、実施の形態において、「上面」「下面」等の方向を示唆する用語はシリコン層１１、１３や二酸化シリコン層１２等の細胞電気生理センサの構成部品の相対的な位置関係にのみ依存する相対的な方向を示し、上下方向等の絶対的な方向を示すものではない。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明にかかる細胞電気生理センサ用チップは、被検体細胞の性能のばらつきがあった場合においても、安定に被検体細胞を捕捉してギガシール性を実現でき、高精度かつ高効率な測定が求められる医療・バイオ分野において有用である。
【符号の説明】
【００６３】
１    細胞電気生理センサ
２    ダイアフラム
３    チップ
４    電極槽（第１の電極槽）
５    電極（第１の電極）
６    電極槽（第２の電極槽）
７    電極（第２の電極）
８    貫通孔
８Ａ    開口部
８Ｃ    内壁面
１０Ａ    被検体細胞
１１    シリコン層
１２    二酸化シリコン層
１３    保持部
１４    熱酸化膜
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体細胞の電気的変化を測定する細胞電気生理センサ用チップであって、
シリコン層と、前記シリコン層の上面に設けられた二酸化シリコン層とを有して、前記シリコン層と前記二酸化シリコン層とを貫通する貫通孔が設けられており、前記貫通孔は前記二酸化シリコン層で開口してかつ前記被検体細胞を捕捉する開口部を有する、ダイアフラムと、
前記貫通孔の内壁面に設けられて、前記貫通孔の前記開口部において前記二酸化シリコン層と溶融して一体化された、二酸化シリコンを主成分とする熱酸化膜と、
を備えた細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項２】
前記二酸化シリコン層と前記熱酸化膜とは平滑面で繋がっている、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項３】
前記二酸化シリコン層と前記熱酸化膜とは連続的に湾曲している表面で繋がっている、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項４】
前記二酸化シリコン層の厚みは０．３μｍ以上である、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項５】
前記熱酸化膜の厚みは１００〜２０００ｎｍである、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項６】
前記貫通孔の内径は、前記貫通孔の内部から前記開口部に向けて徐々に大きくなる、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項７】
前記熱酸化膜は前記ダイアフラムの表面を覆う、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項８】
前記ダイアフラムの周縁部に設けられた保持部をさらに備えた、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項９】
被検体細胞の電気的変化を測定する細胞電気生理センサであって、
シリコン層と、前記シリコン層の上面に設けられた二酸化シリコン層とを有して、前記シリコン層と前記二酸化シリコン層とを貫通する貫通孔が設けられており、前記貫通孔は前記二酸化シリコン層で開口してかつ前記被検体細胞を捕捉する開口部を有する、ダイアフラムと、
前記貫通孔の内壁面に設けられて、前記貫通孔の前記開口部において前記二酸化シリコン層と溶融して一体化された、二酸化シリコンを主成分とする熱酸化膜と、
を含むチップと、
前記ダイアフラムの上面に設けられた第１の電極槽と、
前記第１の電極槽内に設けられた第１の電極と、
前記ダイアフラムの下面に設けられて、前記第１の電極槽と前記貫通孔を通して連通する第２の電極槽と、
前記第２の電極槽に設けられた第２の電極と、
を備えた細胞電気生理センサ。
【請求項１０】
シリコン層と、前記シリコン層の上面に設けられた二酸化シリコン層とを有するウエハを準備するステップと、
前記ウエハの前記シリコン層と前記二酸化シリコン層とを貫通して、前記二酸化シリコン層で開口する開口部を有する貫通孔を形成するステップと、
前記貫通口の内壁面のうちの前記シリコン層の部分に二酸化シリコンを主成分とする熱酸化膜を形成するステップと、
前記熱酸化膜と前記二酸化シリコン層とを溶融させて前記開口部で一体化させるステップと、
を含む、細胞電気生理センサ用チップの製造方法。
【請求項１１】
前記貫通孔の前記内壁面から前記二酸化シリコン層の下面に沿って凹部を形成して、前記二酸化シリコン層が前記凹部から突出させるステップをさらに含み、
前記熱酸化膜と前記二酸化シリコン層とを溶融させて前記開口部で一体化させるステップは、前記二酸化シリコン層の前記突出する部分と前記熱酸化膜とを溶融させて前記開口部で一体化させるステップを含む、請求項１０に記載の細胞電気生理センサ用チップの製造方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
2010016193.tif 000020
【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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