(57)【要約】  本発明は、非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異が存在するか否かをEGFR阻害薬投与後に確認する工程を含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測方法を提供する。本発明はまた、EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅するプライマーセットを含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測用キットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異が存在するか否かをEGFR阻害薬投与後に確認する工程を含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測方法。
【請求項２】
EGFR阻害薬投与前の非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAがEGFR遺伝子の変異を含む、請求項１に記載の早期予測方法。
【請求項３】
EGFR遺伝子の変異がEGFR遺伝子のc.2573T＞GまたはEGFR遺伝子の１９番目エキソンの欠失の少なくとも１つを含む、請求項１または２に記載の早期予測方法。
【請求項４】
確認する工程が、配列番号１で表されるプライマーおよび配列番号２で表されるプライマーからなるプライマーセットを用いてEGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片を増幅することを含む、請求項３に記載の早期予測方法。
【請求項５】
確認する工程が、増幅されたEGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片を配列番号８で表される標識されたプローブで検出することをさらに含む、請求項４に記載の早期予測方法。
【請求項６】
確認する工程が、配列番号３で表されるプライマーおよび配列番号４で表されるプライマーからなるプライマーセットを用いてEGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片を増幅することを含む、請求項３〜５のいずれか1項に記載の早期予測方法。
【請求項７】
確認する工程が、増幅されたEGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片を配列番号１０で表される標識されたプローブで検出することをさらに含む、請求項６に記載の早期予測方法。
【請求項８】
確認する工程が、EGFR阻害薬投与後2週間以降に行われる、請求項１〜７のいずれか1項に記載の早期予測方法。
【請求項９】
EGFR阻害薬投与後に非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異の存在が確認されない場合、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性があると判定する工程をさらに含む、請求項１〜９のいずれか1項に記載の早期予測方法。
【請求項１０】
EGFR阻害薬がアファチニブである、請求項１〜９のいずれか1項に記載の早期予測方法。
【請求項１１】
EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅するプライマーセットを含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測用キット。
【請求項１２】
EGFR阻害薬投与前の血液試料由来のDNAがEGFR遺伝子の変異を含んでいる非小細胞肺がん患者のための、請求項１１に記載の早期予測用キット。
【請求項１３】
EGFR遺伝子の変異がEGFR遺伝子のc.2573T＞GまたはEGFR遺伝子の１９番目エキソンの欠失の少なくとも１つである、請求項１１または１２に記載の早期予測用キット。
【請求項１４】
EGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片を増幅するプライマーセットが、配列番号１で表されるプライマーおよび配列番号２で表されるプライマーからなるプライマーセットである、請求項１３に記載の早期予測用キット。
【請求項１５】
配列番号８で表される標識されたプローブをさらに含む、請求項１４に記載の早期予測用キット。
【請求項１６】
EGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片を増幅するプライマーセットが、配列番号３で表されるプライマーおよび配列番号４で表されるプライマーからなるプライマーセットである、請求項１３〜１５のいずれか1項に記載の早期予測用キット。
【請求項１７】
配列番号１０で表される標識されたプローブをさらに含む、請求項１６に記載の早期予測用キット。
【請求項１８】
EGFR阻害薬がアファチニブである、請求項１１〜１７のいずれか1項に記載の早期予測用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異が存在するか否かをEGFR阻害薬投与後に確認する工程を含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測方法に関する。本発明はまた、EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅するプライマーセットを含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
非小細胞肺がんにおけるEGFR変異を検出するために従来は組織を用いての検査が行われてきたが、代替法として液性検体を用いた検出法が最近承認された（非特許文献１）。しかしながら、検査結果はEGFR阻害剤による治療の適応の可否を判断するためのみに用いられ、治療効果の予測や効果判定における診断意義については不明であった。さらには、血漿における分子遺伝学的寛解の早期評価が臨床的寛解および/またはより長期の有効性の評価の代替手段になりうるか否かについても不明であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Karlovich C et al. Assessment of EGFR Mutation Status in Matched Plasma and Tumor Tissue of NSCLC Patients from a Phase I Study of Rociletinib (CO-1686). Clin Cancer Res. 2016 May 15;22(10):2386-95.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異が存在するか否かをEGFR阻害薬投与後に確認する工程を含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測方法を提供することである。本発明の別の目的は、EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅するプライマーセットを含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、血漿中のEGFR変異が陽性である非小細胞肺がん患者にアフィチニブを投与し、血漿DNAのEGFR変異について分子遺伝学的完全寛解(CMR)が確認された患者は、そうでない患者よりも長期の無憎悪期間を有することを見出した。【０００６】
以上の知見に基づき、本発明が完成された。
即ち、本発明は下記のとおりである。
［１］非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異が存在するか否かをEGFR阻害薬投与後に確認する工程を含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測方法。
［２］EGFR阻害薬投与前の非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAがEGFR遺伝子の変異を含む、［１］に記載の早期予測方法。
［３］EGFR遺伝子の変異がEGFR遺伝子のc.2573T＞GまたはEGFR遺伝子の１９番目エキソンの欠失の少なくとも１つを含む、［１］または［２］に記載の早期予測方法。
［４］確認する工程が、配列番号１で表されるプライマーおよび配列番号２で表されるプライマーからなるプライマーセットを用いてEGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片を増幅することを含む、［３］に記載の早期予測方法。
［５］確認する工程が、増幅されたEGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片を配列番号８で表される標識されたプローブで検出することをさらに含む、［４］に記載の早期予測方法。
［６］確認する工程が、配列番号３で表されるプライマーおよび配列番号４で表されるプライマーからなるプライマーセットを用いてEGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片を増幅することを含む、［３］〜［５］のいずれか1つに記載の早期予測方法。
［７］確認する工程が、増幅されたEGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片を配列番号１０で表される標識されたプローブで検出することをさらに含む、［６］に記載の早期予測方法。
［８］確認する工程が、EGFR阻害薬投与後2週間以降に行われる、［１］〜［７］のいずれか1つに記載の早期予測方法。
［９］EGFR阻害薬投与後に非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異の存在が確認されない場合、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性があると判定する工程をさらに含む、［１］〜［８］のいずれか1つに記載の早期予測方法。
［１０］EGFR阻害薬がアファチニブである、［１］〜［９］のいずれか1つに記載の早期予測方法。
［１１］EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅するプライマーセットを含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測用キット。
［１２］EGFR阻害薬投与前の血液試料由来のDNAがEGFR遺伝子の変異を含んでいる非小細胞肺がん患者のための、［１１］に記載の早期予測用キット。
［１３］EGFR遺伝子の変異がEGFR遺伝子のc.2573T＞GまたはEGFR遺伝子の１９番目エキソンの欠失の少なくとも１つである、［１１］または［１２］に記載の早期予測用キット。
［１４］EGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片を増幅するプライマーセットが、配列番号１で表されるプライマーおよび配列番号２で表されるプライマーからなるプライマーセットである、［１３］に記載の早期予測用キット。
［１５］配列番号８で表される標識されたプローブをさらに含む、［１４］に記載の早期予測用キット。
［１６］EGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片を増幅するプライマーセットが、配列番号３で表されるプライマーおよび配列番号４で表されるプライマーからなるプライマーセットである、［１３］〜［１５］のいずれか1つに記載の早期予測用キット。
［１７］配列番号１０で表される標識されたプローブをさらに含む、［１６］に記載の早期予測用キット。
［１８］EGFR阻害薬がアファチニブである、［１１］〜［１７］のいずれか1つに記載の早期予測用キット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、EGFR阻害薬投与後の非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異が存在するか否かを確認することによって、早期にEGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性を予測できるようになり、従来方法より早い段階で治療方法の選択を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、化学療法を受けていない、EGFR感受性変異を有する進行性NSCLC患者に対するアファチニブ単剤治療の概要を示す図である。
【図２】図２は、デジタルPCR法の手順を示す図である。(A)標的核酸を含む試料を40μLになるようにアッセイ試薬と混合した。(B)マイクロ流体チップを用いて、アッセイ試薬を含む試料を800万の個々の5pLの液滴に分割し、任意の液滴内に１つだけ標的分子が存在するようにした。(C)PCR増幅によって特定の配列を含む液滴に蛍光を発光させた。(D)読み取りチップ上のマイクロ流体チャンネルに位置するレーザースポットに液滴を１つずつ通過させることによって蛍光シグナル強度を計測した。
【図３】図３は、アファチニブ単剤治療を受けたEGFR感受性変異を有する進行性NSCLC患者の特徴を示す表である。
【図４】図４は、アファチニブ投与時における血漿中EGFR変異の陽性患者と陰性患者の無増悪期間中央値(mPFS)を示す図である。
【図５】図５(A)は、アファチニブ投与後、2週間目までにアファチニブ投与を中止した患者を検証の対象から除いた上で、2週間でCMRとなった患者は、2週間でCMRとならなかった患者と比べてPFSが有意に長かったことを示す図である。図５(B)は、アファチニブ投与後、4週間目までにアファチニブ投与を中止した患者を検証の対象から除いた上で、4週間でCMRとなった患者もまた、4週間でCMRとならなかった患者と比べてPFSが有意に長かったことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異が存在するか否かをEGFR阻害薬投与後に確認する工程を含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測方法を提供する（以下「本発明の方法」と省略する場合がある）。
【００１０】
本発明の方法は、非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異が存在するか否かをEGFR阻害薬投与後に確認する工程を含む（以下「本発明の確認工程」と省略する場合がある）。
【００１１】
本発明の方法における非小細胞肺がんは、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がんなどが含まれ、そのいずれであってもよい。
【００１２】
本発明の方法における非小細胞肺がん患者は、非小細胞肺がんに罹患していると病理診断された患者であれば特に制限はない。非小細胞肺がんのステージは任意のステージであってよいが、ステージIII、ステージIVである場合に本発明の方法がより有効性を有する。本発明の方法における非小細胞肺がん患者は術後再発した患者であってもよい。また、本発明の方法における非小細胞肺がん患者は、EGFR阻害薬による治療を受けていない患者であることが好ましい。EGFR阻害薬としては、ゲフィチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ、アファチニブが挙げられるが、それらに制限されない。
【００１３】
本発明の方法における血液試料は、非小細胞肺がん患者から採取した、DNAを含有する血液試料であれば特に制限はなく、例えば、血液、血清または血漿などが挙げられる。血液または血清には白血球由来の断片化したゲノムDNAが混入している可能性があるため、血漿を利用することが好ましい。DNAは、血液、血清および血漿から公知の手段で単離することができ、例えば、QIAmp Circulating Nucleic Acid Kitなどの市販品を用いて単離することができる。
【００１４】
本発明の方法における血液試料由来のDNAは、細胞から血中に遊離したDNAをいい、がん患者においては、腫瘍細胞から遊離される循環腫瘍DNA（ctDNA）を多く含む。循環DNAの濃度はがん患者で上昇していることが知られ、がん細胞のアポトーシス、壊死またはがん細胞からの分泌によって血中に流出すると考えられており、原発巣のコピー数多型、遺伝子変異、またはメチル化を反映していることが報告されている。従って、EGFR阻害薬投与前の非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAは、EGFR遺伝子の変異を含んでいることが好ましい。
【００１５】
本発明の方法におけるEGFR遺伝子の変異は、EGFRの機能が活性化される変異であればどのような変異であってもよく、その中でも、EGFR遺伝子の19番目エキソンの欠失（表１に記載されたアミノ酸の欠失）、EGFRの858番目のアミノ酸であるLeuがArgに置換される結果となるようなEGFR遺伝子の変異を少なくとも１つ含む。19番目エキソンが欠失したEGFR遺伝子としては、表１に記載された塩基配列の欠失が挙げられる。EGFRの858番目のアミノ酸であるLeuがArgに置換される結果となるようなEGFR遺伝子の変異としては、EGFR遺伝子のc.2573T＞Gが挙げられる。また、本発明の方法におけるEGFR遺伝子の変異は、上記以外のEGFR遺伝子の変異であってもよく、Lindeman NI et al., Molecular testing guideline for selection of lung cancer patients for EGFR and ALK tyrosine kinase inhibitors: guideline from the College of American Pathologists, International Association for the Study of Lung Cancer, and Association for Molecular Pathology., Journal of Thoracic Oncology, Volume 8, Number 7, page 823-859, July 2013にこれまでに報告されたEGFR遺伝子の変異が列挙されており、それらであってもよい。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
本発明の確認工程は、非小細胞肺がん患者にEGFR阻害薬投与後に行われる。EGFR阻害薬としては、EGFRの機能を阻害できればとくに制限はないが、ゲフィチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ、アファチニブなどがあげられる。その中でも、アファチニブが好ましい。
【００１８】
また、EGFR阻害薬の投与量は、EGFR阻害薬の種類、投与経路、患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、通常、経口の場合には成人で１日あたり有効成分量として、数ｍｇ〜２ｇ程度、好ましくは５ｍｇ〜数十ｍｇ程度を、１日１〜数回にわけて投与することができる。注射の場合には成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよく、１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。特にアファチニブの場合、経口投与で１日１回４０ｍｇ投与することができる。
【００１９】
本発明の確認工程は、非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異を検出することができる方法であれば特に制限されず、例えば、RFLP法、PCR-SSCP法、ASOハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンス法、ARMS法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、RNaseA切断法、化学切断法、DOL法、TaqMan PCR法、インベーダー法、MALDI-TOF/MS法、TDI法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法、UCAN法、DNAチップまたはDNAマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法、ECA法、デジタルPCR法などにより実施することができるが、EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅する工程を含む方法が好ましい。EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅する工程を含む方法としてはPCRを利用した方法が挙げられ、PCRを利用した方法の中でもデジタルPCR法が好ましく挙げられる。
【００２０】
本発明の確認工程において、EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅する工程を含む方法を用いる場合、EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅するためのプライマーセットが用いられる。プライマーセットは、本発明の確認工程において検出すべきEGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅し得るように設計されたものであればいかなるものであってもよい。例えば、該プライマーセットは、EGFR遺伝子の部分塩基配列であって、検出すべき変異部位より5’側の相補鎖配列の一部にハイブリダイズする、約15〜約50塩基、好ましくは約15〜約30塩基の塩基配列を含む核酸と、該変異部位の塩基より3’側の配列の一部にハイブリダイズする、約15〜約50塩基、好ましくは約15〜約30塩基の塩基配列を含む核酸との組み合わせであり、それらによって増幅される核酸の断片長が約50〜約1,000塩基、好ましくは約50〜約500塩基、より好ましくは約50〜約200塩基である、一対の核酸が挙げられる。
【００２１】
本発明の方法におけるEGFR遺伝子の変異がEGFR遺伝子のc.2573T＞Gである場合、EGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片は、配列番号１で表されるプライマーおよび配列番号２で表されるプライマーからなるプライマーセットを用いて増幅することができる。また、本発明の方法におけるEGFR遺伝子の変異が、EGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失である場合、EGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片は、配列番号３で表されるプライマーおよび配列番号４で表されるプライマーからなるプライマーセットを用いて増幅することができる。
【００２２】
本発明の確認工程において増幅されたEGFR遺伝子の変異を含むDNA断片は、公知の手段で検出することができ、例えば、EGFR遺伝子の変異を含む塩基配列に相補的な塩基配列を含む標識されたプローブで検出することができる。該プローブは、その5’末端がFAMやTETなどの蛍光色素で、中央付近や3’末端がZENやIABkFなどのクエンチャー（消光物質）でそれぞれ標識されており、そのままの状態ではクエンチャーが蛍光エネルギーを吸収するため蛍光は検出されない。プローブは野生型EGFRおよび変異型EGFRの双方のアレルについて調製し、一括検出のために互いに蛍光波長の異なる蛍光色素（例えば、一方のアレルをFAM、他方をTET）で標識することが好ましい。また、プローブからのPCR伸長反応が起こらないように3’末端はリン酸化されている。プローブとハイブリダイズする領域を含むゲノムDNAの部分配列を増幅するように設計されたプライマーおよびTaq DNAポリメラーゼとともにPCRを行うと、プローブが鋳型DNAとハイブリダイズし、同時にPCRプライマーからの伸長反応が起こるが、伸長反応が進むとTaq DNAポリメラーゼの5’ヌクレア−ゼ活性によりハイブリダイズしたプローブが切断され、蛍光色素が遊離してクエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光が検出される。鋳型の増幅により蛍光強度は指数関数的に増大する。
【００２３】
本発明の確認工程において、増幅されたEGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片は配列番号８で表される標識されたプローブで検出することができる。また、増幅されたEGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片は配列番号１０で表される標識されたプローブで検出することができる。
【００２４】
本発明の確認工程は、EGFR阻害薬の投与後であればどの時点で実施されてもよいが、EGFR阻害薬の投与後２週間目以降であることが好ましい。
【００２５】
本発明の方法は、EGFR阻害薬の投与後、EGFR阻害薬投与前のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異の存在が確認されない場合、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性があると判断することができる。従って、本発明の方法は、EGFR阻害薬投与後に非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異の存在が確認されない場合、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性があると判定する工程をさらに含む。ここで、EGFR阻害薬投与後の非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいて検出される変異EGFR遺伝子の頻度が、健常人の血液試料由来のDNAにおいて疑陽性として検出される変異EGFR遺伝子の頻度（カットオフ値）未満になる場合、EGFR遺伝子の変異の存在が確認されない（または分子遺伝学的完全寛解(CMR)）と判定することができる。検出される変異EGFR遺伝子としては、19番目エキソンが欠失したEGFR遺伝子、EGFRの858番目のアミノ酸であるLeuがArgに置換される結果となるようなEGFR遺伝子が挙げられる。19番目エキソンが欠失したEGFR遺伝子としては、表１に記載された塩基配列の欠失が挙げられる。EGFRの858番目のアミノ酸であるLeuがArgに置換される結果となるようなEGFR遺伝子の変異としては、EGFR遺伝子のc.2573T＞Gが挙げられる。カットオフ値としては、１９番目エキソンの欠失は4 events、c.2573T＞Gは2 eventsが挙げられるが、これらに制限されない。
【００２６】
本発明はまた、EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅するプライマーセットを含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測用キットを提供する（以下「本発明のキット」と省略する場合がある）。
【００２７】
本発明のキットにおける、EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅するプライマーセットとしては、本発明の方法で用いられるプライマーセットであってよい。より具体的には、配列番号１で表されるプライマーおよび配列番号２で表されるプライマーからなるプライマーセット、配列番号３で表されるプライマーおよび配列番号４で表されるプライマーからなるプライマーセットが挙げられる。
【００２８】
本発明のキットは、上記プライマーセットを用いて増幅されるEGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を、高感度で、定量的に検出することができる、該増幅断片内のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有し、検出を容易かつ鋭敏にするための標識物質で標識された核酸プローブを、さらに含むことが好ましい。例えば、本発明のキットは、増幅されたEGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片を検出するためのプローブとして、配列番号８で表される標識されたプローブをさらに含むことができる。また、本発明のキットは、増幅されたEGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片を検出するためのプローブとして、配列番号１０で表される標識されたプローブをさらに含むことができる。
【００２９】
本発明のキットに用いられるプライマーセットおよびプローブは、公知の塩基配列情報に基づいて、該塩基配列および／またはその相補鎖配列の一部もしくは全部を市販のDNA/RNA自動合成機等を用いて化学的に合成することによって得ることができる。該プライマーセットおよびプローブを含むキットは、乾燥した状態もしくはアルコール沈澱の状態で、固体として提供することもできるし、水もしくは適当な緩衝液（例：TE緩衝液等）中に溶解した状態で提供することもできる。
【００３０】
本発明のキットは、上記のプライマーセットおよびプローブに加えて、EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片の検出のための反応において必要な他の物質であって、共存状態で保存することにより反応に悪影響を及ぼさない物質をさらに含有することができる。あるいは、本発明のキットは、当該他の物質を、上記のプライマーセットおよびプローブを含む試薬とは別個の試薬として含む、試薬キットとして提供されてもよい。当該他の物質としては、例えば、反応緩衝液、dNTPs、耐熱性DNAポリメラーゼ等が挙げられる。
【００３１】
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示にすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００３２】
化学療法（EGFR-TKI）を受けていない、EGFR感受性変異を有する進行性NSCLC患者は、病勢増悪(PD)または毒性中止まで1日1回アファチニブ単剤治療(40 mg/body)を受けた（図１）。投与開始時（０日）、２週間、４週間、８週間、１２週間、２４週間、４８週間およびPD時における患者由来の血漿DNAを得た。3種の臨床的に相関のあるEGFR変異(exon 19 deletion、exon 20 T790Mおよびexon 21 L858R)がmultiplexed, pico-droplet digital PCRアッセイ(RainDrop(R) system, RainDance Technologies, Billerica, MA)を血漿DNAを用いて解析した(図２)。分子遺伝学的完全寛解(CMR)を「EGFR阻害薬投与後の非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいて検出される変異EGFR遺伝子の頻度が、健常人の血液試料由来のDNAにおいて疑陽性として検出される変異EGFR遺伝子の頻度（カットオフ値）未満になる場合」と定義した。カットオフ値としては、exon 19 deletionは4 events, exon 21 L858Rは2 events, exon 20 T790は3 eventsを用いた。本実施例に記載の研究はUMIN (ID: 000015847)に登録されている。【００３３】
試料および方法
試料回収
全被験者からBD BiosciencesのVacutainer EDTA採血管に全血を採取した。該血液を4℃で10分間、1500×gで遠心分離し、血漿上清（2〜3.5 mL）を50mLコニカルチューブ(BD Falcon)に移し、使用まで-80℃で保存した。血漿DNAを製造元の指示に従い、QIAmp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany)を用いて、単離した。血漿DNAをAVEバッファー(45 μL)に溶解した。血漿DNA約20μLをSpeedVac (Thermo Scientific)によって約10μLに濃縮した。【００３４】
マルチプレックス形式におけるEGFR変異検出
３つの共通EGFR変異および対応する各野生型配列を同定するためにマルチプレックスアッセイを開発した。簡潔には、TaqMan Genotyping Master Mix (Life Technologies) 20.0μLを10μMのフォワードおよびリバースプライマー2.0μL、4μM FAMおよびTET標識プローブ2.0μL、Droplet Stabilizer (RainDance Technologies, Billerica, MA) 4.0μL、DNaseおよびRNase不含滅菌水4.0μLを含むアッセイ試薬と混合した。最終反応量は患者由来の血漿DNA試料8μLを含む40μLだった。プライマー、プローブおよびクエンチャーの配列を、その濃度とともに表２および表３に示す。【００３５】
【表２】
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【００３６】
【表３】
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【００３７】
製造元の指示に従い、液滴作製マイクロ流体チップ(Souse chip, RainDance Technologies)で流体力学的流動収束により、血漿DNA試料を含むアッセイ溶液から均一なサイズの水滴の集団（エマルジョン）を作製した。８つの0.2 mLコニカル底PCRチューブを含むPCRチューブストリップ(Axygen, Tewksbury, MA)にエマルジョンを集めた。エマルジョンおよびキャリアオイルを総量75μL含むPCRチューブストリップを8-Strip Dome Cap (Axygen)でしっかりと閉め、熱蓋を備えるサーマルサイクラ―(Proflex PCR system, Life Technologies)で設置した。エマルジョンを表４に記載した条件でサーマルサイクルした。【００３８】
【表４】
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【００３９】
サーマルサイクルしたエマルジョンを第2マイクロ流体チップ(Souse chip, RainDance Technologies)に移し、製造元の指示に従い、エンドポイント蛍光シグナルを計測した。【００４０】
データ解析
液滴イベントデータを製造元の指示に従いRainDrop Analystソフトウェア(RainDance Technologies)で解析した。簡潔には、試料データを液滴サイズゲートテンプレート(RainDance Technologies)でロードした。ポジティブコントロール試料由来のデータを用いて、RainDrop Analystソフトウェア内に補正マトリクスを作成した。補正マトリクスを各試料由来のデータに適用し、TETおよびFAM蛍光分子からのクロストーク蛍光シグナルを除いた。ポジティブコントロールにおける野生型または変異型クラスターを含むエリアの手動選別によって野生型および変異型ゲートのサイズと位置を決定した。
各未知試料については、PCR陽性液滴イベントの数を各ゲート内でカウントした。各ゲート内のイベントの数を未処理液滴の総数を用いて、アッセイごとのイベントの数に変換した。臨床試料を解析する場合、組織試料におけるEGFR変異ステータスの結果を、血漿試料中のEGFR変異ステータスの結果が表れるまで隠した。【００４１】
結果
本実施例では55名の患者を検証した(図３)。アファチニブの有効性は以前の報告と同程度であった（全寛解率：78.6%、無増悪期間中央値(mPFS)：14.2ヶ月）。投与開始時において、患者の62.5%(35/56)において血漿中のEGFR変異が陽性であった。血漿中のEGFR変異陽性患者は、陰性患者よりもわずかに短いPFSを有したが、有意ではなかった(p = 0.24, log-rank)(図４)。投与開始時において血漿中のEGFR変異が陽性であった患者のうち、60.6%が2週間で、87.5%が4週間でそれぞれCMRに達した(図５)。2週間目までにアファチニブ投与を中止した患者を検証の対象から除いた上で、2週間でCMRとなった患者は、2週間でCMRにならなかった患者と比べてPFSが有意に長かった(13.6 versus 7.5ヶ月, p = 0.0001)。4週間目までにアファチニブ投与を中止した患者を検証の対象から除いた上で、4週間でCMRとなった患者もまた、4週間でCMRにならなかった患者と比べてPFSが有意に長かった(13.6 versus 5.1ヶ月, p < 0.0001)。4週間までにCMRとなった患者のうち、CMRに達するまでの時間はPFSに影響を与えなかった(p = 0.59)。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、EGFR阻害薬投与後の非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異が存在するか否かを確認することによって、早期にEGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性を予測できるようになり、従来方法より早い段階で治療方法の選択を可能にする。
本出願は、米国仮特許出願番号62/507,010を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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