(57)【要約】  本発明は、肝毒性が低減されたアンチセンスオリゴ核酸を提供することを目的とする。本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸は、塩基長が７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下であり、両末端からそれぞれ１ｎｔ以上、５ｎｔ以下の核酸残基が２’，４’−架橋型核酸であり、上記両末端の間に非２’，４’−架橋型の核酸残基を有し、上記非２’，４’−架橋型の核酸残基のうちの１以上の核酸残基の塩基が修飾されていることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基長が７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下であり、
両末端からそれぞれ１ｎｔ以上、５ｎｔ以下の核酸残基が２’，４’−架橋型核酸であり、
上記両末端の間に非２’，４’−架橋型の核酸残基を有し、
上記非２’，４’−架橋型の核酸残基のうちの１以上の核酸残基の塩基が修飾されていることを特徴とするアンチセンスオリゴ核酸。
【請求項２】
塩基が修飾されている上記非２’，４’−架橋型核酸残基がＴＧＣまたはＴＣＣの配列に含まれる請求項１に記載のアンチセンスオリゴ核酸。
【請求項３】
上記の修飾されている塩基が、５−ヒドロキシシトシン、４−アセチルシトシン、３−Ｃ1-6アルキルシトシン、５−Ｃ1-6アルキルシトシン、２−チオシトシン、２−チオチミン、ジヒドロチミン、プソイドチミン、２−チオウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、８−アミノグアニン、８−ハロゲノグアニン、７−デアザ−７−（２−フェニルエチニル）グアニン、７−デアザ−７−（２−ピリジルエチニル）グアニン、７−デアザ−７−［２−（Ｃ1-7アルカノイルオキシ−Ｃ1-6アルキル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（ヒドロキシ−Ｃ1-6アルキル）エチニル］グアニン、１−Ｃ1-6アルキルグアニン、２，２−ジ（Ｃ1-6アルキル）グアニン、２−Ｃ1-6アルキルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ1-6アルキルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ2-6アルケニルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ2-6アルキニルグアニン、７−デアザ−７−ハロゲノグアニン、イノシン、１−Ｃ1-6アルキルイノシン、キュェオシン、β，Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、β，Ｄ−マンノシルキュェオシン、Ｎ6−Ｃ2-6アルケニルアデニン、１−Ｃ1-6アルキルアデニン、２−Ｃ1-6アルキルアデニン、Ｎ6−Ｃ1-6アルキルアデニンまたは２−Ｃ1-6アルキルチオ−Ｎ6−Ｃ2-6アルケニルアデニンである請求項１に記載のアンチセンスオリゴ核酸。
【請求項４】
上記非２’，４’−架橋型の核酸残基がＤＮＡである請求項１〜３のいずれかに記載のアンチセンスオリゴ核酸。
【請求項５】
上記２’，４’−架橋型の核酸残基が下記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかの構造を有する請求項１〜４のいずれかに記載のアンチセンスオリゴ核酸。
【化１】
2018155450.tif 000041
［式中、
Ｘ1は、Ｏ、Ｓ、＞Ｎ（Ｒ3）基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ4）−基を示し（Ｒ3およびＲ4は、独立してＨまたはＣ1-6アルキル基を示す）、
Ｘ2は、下記式（ＩＶ）〜（ＶＩＩ）で表されるいずれかのグアニジノ基を示し、
【化２】
2018155450.tif 000042
（式中、Ｒ5〜Ｒ18は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-10シクロアルキル基、アミノ基の保護基または２−シアノエチルオキシカルボニル基を示す）
Ｘ3は、Ｏ、Ｓ、＞Ｎ（Ｒ19）基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ20）−基を示し（Ｒ19およびＲ20は、独立してＨまたはＣ1-6アルキル基を示す）
Ｙ1〜Ｙ3は、独立してＯ-またはＳ-を示し、
Ｂａｓｅは核酸塩基基を示し、
Ｒ1とＲ2は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル基を示すか、または、Ｒ1とＲ2が一緒になってＣ1-4アルキレン基を形成してもよく、
ｎは０以上２以下の整数を示す］
【請求項６】
上記２’，４’−架橋型の核酸残基が上記式（Ｉ）の構造を有し、Ｘ1がＯであり且つｎが１である請求項５に記載のアンチセンスオリゴ核酸。
【請求項７】
核酸残基の塩基への上記修飾の導入前に比して肝毒性が低減されている請求項１〜６のいずれかに記載のアンチセンスオリゴ核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝毒性が低いアンチセンスオリゴ核酸に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
核酸医薬品は従来型の医薬品とは異なり、特定の遺伝子の発現を細胞内で抑制できることから、これまでは治療困難であった疾患に対する革新的な医薬品創出につながることが期待されている。核酸医薬品に関する技術として、例えば、疾病に関わるｍＲＮＡの一部と相補的なアンチセンスオリゴ核酸を外部から導入し、二重鎖を形成させることにより病原ｍＲＮＡの翻訳過程を阻害して疾病の治療や予防を行うアンチセンス法が開発されている。【０００３】
しかし、アンチセンスオリゴ核酸は生体内でヌクレアーゼにより分解され易いという欠点を有する。また、標的ｍＲＮＡに対する結合親和性や特異性をさらに向上させる必要がある。そこで本発明者らの研究グループは、ヌクレアーゼ耐性や、立体構造の安定化による標的ｍＲＮＡへの結合親和性と特異性の改善のために、２’位と４’位を架橋した核酸分子を開発し（特許文献１〜５）、また、かかる架橋核酸を用い、ＰＣＳＫ９遺伝子への結合親和性などに優れた脂質異常症治療剤として有用なオリゴヌクレオチドを開発している（特許文献６）。【０００４】
ところが、ヒト臨床試験を見据えた核酸創薬研究が進展するにつれ、解決すべき新たな課題が顕在化している。その最たるものとして挙げられるのが、「人工オリゴヌクレオチドが潜在的に有する毒性の回避」である。【０００５】
例えばラットやマウスにアンチセンスオリゴ核酸を静脈投与すると約１２時間で肝臓に移行することが知られているが、アンチセンスオリゴ核酸の中には重篤な肝毒性を示すものがある。その機構としては、必ずしも明らかではないが、標的外のｍＲＮＡの発現抑制、自然免疫の活性化、未知のタンパク質遺伝子の発現促進などが考えられる。アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を予測する手段として、肝毒性を示すアンチセンスオリゴ核酸に共通する塩基配列を特定する研究が為されている（非特許文献１，２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０５２４３６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１４／０４６２１２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１４／１１２４６３号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２０１５／１２５７８３号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２０１６／０１７４２２号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２０１３／１１８７７６号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐｅｔｅｒ  Ｈ．Ｈａｇｅｄｏｒｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２３（５），ｐｐ．３０２−３１０（２０１３）
【非特許文献２】Ａｎｄｒｅｗ  Ｄ．Ｂｕｒｄｉｃｋら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，ｐｐ．１−１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性に関与するとされている塩基配列を特定する研究は為されている。しかし、上記非特許文献１，２で肝毒性に関与するとされている塩基配列は僅かｎｔ２またはｎｔ３であり、このように短い塩基配列を含まないアンチセンスオリゴ核酸をデザインすることが難しい場合がある。例えば、ｍＲＮＡは安定化のため部分的にループ構造や二重鎖などの自己構造を有しており、アンチセンスオリゴ核酸としては標的ｍＲＮＡの一本鎖にハイブリダイズするものをデザインすべきとの制限がある。しかも、標的ｍＲＮＡの一本鎖にハイブリダイズし且つ上記塩基配列を含まない塩基配列が、優れた活性を示し且つ肝毒性を示さないとは限らない。
そこで本発明は、肝毒性が低減されたアンチセンスオリゴ核酸を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、特に、アンチセンスオリゴ核酸において特定部分における核酸残基の塩基を修飾することにより活性を維持しつつ肝毒性を低減できることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。【００１０】
［１］  塩基長が７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下であり、
両末端からそれぞれ１ｎｔ以上、５ｎｔ以下の核酸残基が２’，４’−架橋型核酸であり、
上記両末端の間に非２’，４’−架橋型の核酸残基を有し、
上記非２’，４’−架橋型の核酸残基のうちの１以上の核酸残基の塩基が修飾されていることを特徴とするアンチセンスオリゴ核酸。【００１１】
［２］  塩基が修飾されている上記非２’，４’−架橋型核酸残基がＴＧＣまたはＴＣＣの配列に含まれる上記［１］に記載のアンチセンスオリゴ核酸。【００１２】
［３］  上記の修飾されている塩基が、５−ヒドロキシシトシン、４−アセチルシトシン、３−Ｃ1-6アルキルシトシン、５−Ｃ1-6アルキルシトシン、２−チオシトシン、２−チオチミン、ジヒドロチミン、プソイドチミン、２−チオウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、８−アミノグアニン、８−ハロゲノグアニン、７−デアザ−７−（２−フェニルエチニル）グアニン、７−デアザ−７−（２−ピリジルエチニル）グアニン、７−デアザ−７−［２−（Ｃ1-7アルカノイルオキシ−Ｃ1-6アルキル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（ヒドロキシ−Ｃ1-6アルキル）エチニル］グアニン、１−Ｃ1-6アルキルグアニン、２，２−ジ（Ｃ1-6アルキル）グアニン、２−Ｃ1-6アルキルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ1-6アルキルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ2-6アルケニルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ2-6アルキニルグアニン、７−デアザ−７−ハロゲノグアニン、イノシン、１−Ｃ1-6アルキルイノシン、キュェオシン、β，Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、β，Ｄ−マンノシルキュェオシン、Ｎ6−Ｃ2-6アルケニルアデニン、１−Ｃ1-6アルキルアデニン、２−Ｃ1-6アルキルアデニン、Ｎ6−Ｃ1-6アルキルアデニンまたは２−Ｃ1-6アルキルチオ−Ｎ6−Ｃ2-6アルケニルアデニンである上記［１］に記載のアンチセンスオリゴ核酸。【００１３】
［４］  上記非２’，４’−架橋型の核酸残基がＤＮＡである上記［１］〜［３］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴ核酸。【００１４】
［５］  上記２’，４’−架橋型の核酸残基が下記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかの構造を有する上記［１］〜［４］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴ核酸。【００１５】
【化１】
2018155450.tif 000002
【００１６】
［式中、
Ｘ1は、Ｏ、Ｓ、＞Ｎ（Ｒ3）基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ4）−基を示し（Ｒ3およびＲ4は、独立してＨまたはＣ1-6アルキル基を示す）
Ｘ2は、下記式（ＩＶ）〜（ＶＩＩ）で表されるいずれかのグアニジノ基を示し、【００１７】
【化２】
2018155450.tif 000003
【００１８】
（式中、Ｒ5〜Ｒ18は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-10シクロアルキル基、アミノ基の保護基または２−シアノエチルオキシカルボニル基を示す）
Ｘ3は、Ｏ、Ｓ、＞Ｎ（Ｒ19）基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ20）−基を示し（Ｒ19およびＲ20は、独立してＨまたはＣ1-6アルキル基を示す）
Ｙ1〜Ｙ3は、独立してＯ-またはＳ-を示し、
Ｂａｓｅは核酸塩基基を示し、
Ｒ1とＲ2は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル基を示すか、または、Ｒ1とＲ2が一緒になってＣ1-4アルキレン基を形成してもよく、
ｎは０以上２以下の整数を示す］【００１９】
［６］  上記２’，４’−架橋型の核酸残基が上記式（Ｉ）の構造を有し、Ｘ1がＯであり且つｎが１である上記［５］に記載のアンチセンスオリゴ核酸。【００２０】
［７］  核酸残基の塩基への上記修飾の導入前に比して肝毒性が低減されている上記［１］〜［６］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴ核酸。【００２１】
本開示において「Ｃ1-6アルキル基」は、炭素数１以上、６以下の直鎖状または分枝鎖状の一価飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等である。好ましくはＣ1-4アルキル基であり、より好ましくはＣ1-2アルキル基であり、最も好ましくはメチルである。【００２２】
「Ｃ2-6アルケニル基」は、炭素数が２以上、６以下であり、少なくとも一つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖状または分枝鎖状の一価不飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、エテニル（ビニル）、１−プロペニル、２−プロペニル（アリル）、イソプロペニル、２−ブテニル、３−ブテニル、イソブテニル、ペンテニル、イソペンテニル、ヘキセニル等である。【００２３】
「Ｃ2-6アルキニル基」は、炭素数が２以上、６以下であり、少なくとも一つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖状または分枝鎖状の一価不飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル（プロパルギル）、２−ブチニル、３−ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル等である。好ましくはＣ2-4アルキニル基であり、より好ましくはＣ2-3アルキニル基である。【００２４】
「Ｃ6-12アリール基」とは、炭素数が６以上、１２以下の一価芳香族炭化水素基をいう。例えば、フェニル、ナフチル、インデニル、ビフェニル等である。【００２５】
「ハロゲノ基」としては、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基およびヨード基を例示することができ、クロロ基またはブロモ基が好ましい。【００２６】
「Ｃ3-10シクロアルキル基」は、炭素数３以上、１０以下の環状の一価飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、シクロプロピル、メチルシクロプロピル、ジメチルシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アダマンチル等である。好ましくはＣ3-6シクロアルキル基である。【００２７】
「アミノ基の保護基」としては、例えば、ｔ−ブトキシカルボニル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などのアルコキシカルボニル系保護基；ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル基、ｏ−ニトロベンジルオキシカルボニル基などのアリールメトキシカルボニル系保護基；ベンジル基、４−メトキシベンジル基、トリフェニルメチル基などのアリールメチル系保護基；ホルミル基やアセチル基などのアルカノイル系保護基；ベンゾイル基などのアロイル系保護基；２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基、ｏ−ニトロベンゼンスルホニル基などのアリールスルホニル系保護基などを挙げることができる。【００２８】
「Ｃ1-6アルキレン基」は、炭素数１以上、６以下の直鎖状または分枝鎖状の二価飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、メチレン、エチレン、メチルメチレン、ｎ−プロピレン、メチルエチレン、ｎ−ブチレン、メチルプロピレン、ジメチルエチレン、ｎ−ペンチレン、ｎ−ヘキシレン等である。好ましくはＣ1-4アルキレン基であり、より好ましくはＣ1-2アルキレン基であり、よりさらに好ましくはメチレンである。【００２９】
「Ｃ1-7アルカノイル基」とは、炭素数１〜７の脂肪族カルボン酸からＯＨを除いた残りの原子団をいう。例えば、ホルミル、アセチル、エチルカルボニル、ｎ−プロピルカルボニル、イソプロピルカルボニル、ｎ−ブチルカルボニル、イソブチルカルボニル、ｔ−ブチルカルボニル、ｎ−ペンチルカルボニル、ｎ−ヘキシルカルボニル等であり、好ましくはＣ1-4アルカノイル基であり、より好ましくはアセチルである。
【発明の効果】
【００３０】
本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性は、顕著に低減されている。さらに、本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸は、標的ｍＲＮＡに対する結合親和性が高く、且つ、生体内においてヌクレアーゼによる攻撃を受け難く安定であるといえる。よって本発明のアンチセンスオリゴ核酸は、実用性の高い核酸医薬になり得るものとして産業上極めて利用価値が高い。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。
【図２】図２は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。
【図３】図３は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。
【図４】図４は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。
【図５】図５は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。
【図６】図６は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。
【図７】図７は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、Ｒｐｓ６ｋｂ２遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。
【図８】図８は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。
【図９】図９は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。
【図１５】図１５は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。
【図１６】図１６は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。
【図１７】図１７は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。
【図１８】図１８は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。
【図１９】図１９は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。
【図２０】図２０は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、Ｒｐｓ６ｋｂ２遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。
【図２１】図２１は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。
【図２２】図２２は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、Ｒｐｓ６ｋｂ２遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。
【図２３】図２３は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。
【図２４】図２４は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。
【図２５】図２５は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。
【図２６】図２６は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。
【図２７】図２７は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。
【図２８】図２８は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を評価した結果を示すグラフである。
【図２９】図２９は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。
【図３０】図３０は、後記の実施例でアンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を評価した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸は、塩基長が７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下であり；両末端からそれぞれ１ｎｔ以上、５ｎｔ以下の核酸残基が２’，４’−架橋型核酸であり；上記両末端の間に非２’，４’−架橋型の核酸残基を有し；上記非２’，４’−架橋型の核酸残基のうちの１以上の核酸残基の塩基が修飾されていることを特徴とする。
【００３３】
本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸の塩基配列は、標的ｍＲＮＡに高い結合親和性をもってハイブリダイズでき且つ特定部分における１以上の核酸残基の塩基が修飾されていれば特に制限されない。塩基を修飾する前の元の塩基配列は、標的ｍＲＮＡに従って常法により決定すればよい。
【００３４】
例えば、標的ｍＲＮＡの翻訳開始部位を結合標的部位として選択すると、翻訳阻害活性の高いアンチセンスオリゴ核酸をデザインできることがある。また、ｍＲＮＡは分子内でヘアピンループ構造や二重鎖構造を形成していることがあり、結合標的部位としては、速度論的および熱力学的に一本鎖構造部位が好ましい。そこで、ｍＲＮＡの二次構造を計算で予測し、一本鎖構造であると予測される部位を結合標的部位として選択することができる。その他、二重鎖が形成されている箇所を選択的に切断するＲＮａｓｅＨを用いるランダムスクリーニングにより、標的ｍＲＮＡと二重鎖を最も形成し易い配列を特定することも可能である。
【００３５】
本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸における核酸塩基は、修飾塩基以外、一般的なアデニン、グアニン、ウラシル、チミンまたはシトシンであればよい。但し、メチルシトシンはチミンから容易に合成可能であるため、シトシンの代わりにメチルシトシンを用いてもよい。
【００３６】
本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸は、Ｓ化オリゴ核酸であってもよい。通常のオリゴ核酸ではリボース間がホスホジエステル結合で結合されているが、ホスホロチオエート結合でリボース間を結合することにより、エキソヌクレアーゼやエンドヌクレアーゼに対するオリゴ核酸の耐性が向上する。また、全てのリン酸基がＳ化されている完全型Ｓ化オリゴ核酸であってもよいし、一部のリン酸基がＳ化されているキメラ型Ｓ化オリゴ核酸であってもよい。
【００３７】
本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸の塩基長としては、７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下が好ましい。塩基長が７ｎｔ以上であれば、標的ｍＲＮＡに対する結合親和性や特異性を十分に確保することができる。一方、塩基長が３０ｎｔ以下であれば抗原性が十分に抑制され、また、合成もし易い。当該塩基長としては、１０ｎｔ以上が好ましく、１２ｎｔ以上がより好ましく、また、２５ｎｔ以下が好ましく、２０ｎｔ以下が好ましい。なお、塩基長が１７ｎｔのオリゴ核酸は４17＝１．７×１０10種あり、ヒトゲノムの全塩基数である２×３×１０9を超えるため、特異性の向上のため当該塩基長を１７ｎｔ以上にすることも可能である。
【００３８】
本発明のアンチセンスオリゴ核酸では、両末端からそれぞれ独立して１ｎｔ以上、５ｎｔ以下の核酸残基が２’，４’−架橋型核酸である。少なくとも両末端部位における核酸が２’，４’−架橋されていることにより、生体内において各種ヌクレアーゼによる攻撃を受け難くなっており、生体への投与後、生体内に長時間存在することができる。また、２’，４’−架橋により構造が安定化されていることから、標的ｍＲＮＡと二重鎖を形成し易い。
【００３９】
２以上の２’，４’−架橋型核酸残基における２’，４’−架橋構造は、互いに同一であってもよいし異なっていてもよい。２’，４’−架橋構造は、リボース部分の構造を安定化するものであれば特に制限されないが、例えば、上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の構造を挙げることができる。
【００４０】
２’，４’−架橋型核酸残基における核酸塩基は、一般的なアデニン、グアニン、ウラシル、チミンまたはシトシンであってもよいし、修飾されていてもよい。但し、メチルシトシンはチミンから容易に合成可能であるため、特に両末端部分においては、シトシンの代わりにメチルシトシンを用いてもよい。両末端部分における修飾塩基の数としては、両末端部分における２’，４’−架橋型核酸残基にもよるが、５以下または４以下が好ましく、３以下がより好ましく、１または２がよりさらに好ましい。両末端部分における修飾塩基は、非２’，４’−架橋型核酸残基における修飾塩基と同様のものを挙げることができる。
【００４１】
本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸は、２’，４’−架橋型核酸残基で構成される両末端の間に、１以上の非２’，４’−架橋型の核酸残基を有する。即ち、本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸の両末端部分以外は、非２’，４’−架橋型核酸残基で構成されている。以下、本開示においては、本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸の上記両末端部分以外の部分を「中間部分」ということがある。中間部分の非２’，４’−架橋型核酸残基は、２’位−４’位間が架橋されていなければＲＮＡ、ＤＮＡ、核酸誘導体、およびこれら２以上の組合わせであってもよい。核酸誘導体としては、例えば、２’−ハロゲノ核酸、２’−アセトキシ核酸などの２’−Ｃ1-6アルキルカルボニルオキシ核酸、２’−メトキシ核酸などの２’−Ｃ1-6アルキルオキシ核酸、２’−トリメチルシリルオキシ核酸などの２’−トリＣ1-6アルキルシリルオキシ核酸などを挙げることができる。しかし、上記中間部分の核酸がすべてＤＮＡであることが好ましい。中間部分の核酸がすべてＤＮＡである場合、標的ｍＲＮＡに対してＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖が形成され、当該二本鎖がＲＮＡｓｅＨの基質となり、標的ｍＲＮＡが切断される。ＲＮＡｓｅＨの基質の観点から、上記中間部分の長さとしては４ｎｔ以上が好ましく、５ｎｔ以上がより好ましく、６ｎｔ以上がよりさらに好ましい。一方、上記中間部分の長さとしては、抗原性の観点から、１０ｎｔ以下が好ましい。
【００４２】
本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸においては、上記中間部分中の１以上の核酸残基の塩基が修飾されている。本発明のアンチセンスオリゴ核酸の元の塩基配列は、標的ｍＲＮＡの結合標的部位の塩基配列に相補的であり、当該結合標的部位に対して強い結合親和性を有するため、標的ｍＲＮＡと二本鎖を形成すべき中間部分の塩基を修飾しても、結合親和性は維持されると考えられる。一方、アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性は、標的ｍＲＮＡ以外の化合物との相互作用が原因であり、そのような化合物との結合親和性は標的ｍＲＮＡに比べて低い可能性が高いため、本発明において上記中間部分中の１以上の核酸残基の塩基を修飾することにより、肝毒性が低減される程度にそのような化合物との相互作用が低減されると考えられる。
【００４３】
中間部分において塩基が修飾されている核酸残基の数としては、中間部分を構成する核酸残基の数にもよるが、５以下が好ましい。当該数が少ない程、標的ｍＲＮＡに対する結合親和性はより確実に維持されると考えられる。当該数としては４以下または３以下がより好ましく、２または１がよりさらに好ましく、１が特に好ましい。
【００４４】
塩基の修飾としては、例えば、基の置換、官能基の付加、官能基の除去が考えられる。塩基の修飾については、１つの塩基内であれば、２以上の修飾を組み合わせてもよい。また、基の置換には、塩基の複素環に結合している置換基の置換のみでなく、塩基の複素環を形成する基の置換であってもよい。例えば、塩基の複素環を形成する＝Ｎ−を＝Ｃ＜に置換することも可能である。例えば、アデニンおよびグアニンの７位における＝Ｎ−は、官能基の付加により＝Ｎ+＜になってもよいし＝Ｃ＜になってもよい。
【００４５】
シトシンを修飾する場合、好ましい置換基導入位置としては５位を挙げることができる。５位の置換基としては、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、Ｃ6-12アリール基、水酸基、アミノ基、Ｃ1-6アルキルアミノ基、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基、カルボキシ基、スルホン酸基などを挙げることができる。また、４位アミノ基に１個または２個のＣ1-6アルキル基、Ｃ2-6アルケニル基またはＣ2-6アルキニル基を導入してもよい。
【００４６】
また、シトシン、チミン、ウラシルの好適な修飾としては、２位カルボニル基のチオカルボニル基への置換を挙げることができる。また、チミンやウラシルの３位アミノ基にＣ1-6アルキル基を導入してもよい。
【００４７】
グアニンまたはアデニンを修飾する場合、好ましい置換基導入位置としては８位を挙げることができる。８位の置換基としては、アミノ基、Ｃ1-6アルキルアミノ基、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基などの親水性置換基の他、ハロゲノ基を挙げることができる。また、７位の＝Ｎ−を＝Ｃ＜に変換し、フェニルエチニル基を導入してもよい。
【００４８】
さらに具体的な修飾塩基としては、例えば、５−ヒドロキシシトシン、４−アセチルシトシン、３−Ｃ1-6アルキルシトシン、５−Ｃ1-6アルキルシトシン、２−チオシトシン等のシトシン誘導体；２−チオチミン、ジヒドロチミン、プソイドチミン等のチミン誘導体；２−チオウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン等のウリジン誘導体；８−アミノグアニン、８−ハロゲノグアニン、７−デアザ−７−（２−フェニルエチニル）グアニン、７−デアザ−７−［２−（４−ピリジル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（２−ピリジル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（３−ピリジル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（Ｃ1-7アルカノイルオキシ−Ｃ1-6アルキル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（ヒドロキシ−Ｃ1-6アルキル）エチニル］グアニン、１−Ｃ1-6アルキルグアニン、２，２−ジ（Ｃ1-6アルキル）グアニン、２−Ｃ1-6アルキルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ1-6アルキルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ2-6アルケニルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ2-6アルキニルグアニン、７−デアザ−７−ハロゲノグアニン、イノシン、１−Ｃ1-6アルキルイノシン、キュェオシン、β，Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、β，Ｄ−マンノシルキュェオシン等のグアニン誘導体；Ｎ6−Ｃ2-6アルケニルアデニン、１−Ｃ1-6アルキルアデニン、２−Ｃ1-6アルキルアデニン、Ｎ6−Ｃ1-6アルキルアデニンまたは２−Ｃ1-6アルキルチオ−Ｎ6−Ｃ2-6アルケニルアデニン等のアデニン誘導体を挙げることができる。
【００４９】
本発明者らは、修飾塩基を有する化合物として、以下の新規７−置換グアノシン誘導体（ＶＩＩＩ）を開発した。
【化３】
2018155450.tif 000004
［式中、
Ｒ31は、Ｈ、または、シリル系保護基、トリチル系保護基、カーバメート系保護基およびベンジルエーテル系保護基から選択される水酸基の保護基を示し；
Ｒ32およびＲ33は、独立して、ハロゲノ基、ニトロ基またはＣ1-6アルキル基に置換されていてもよいフェニル基、または、シアノ基で置換されていてもよいＣ1-6アルキル基を示し；
Ｒ34は、アミノ基の保護基を示し；
Ｒ35は、ハロゲノ基またはＲ36−Ｃ≡Ｃ−（Ｒ36は、Ｃ6-12アリール基、複素芳香環基、ヒドロキシ−Ｃ1-6アルキル基またはＣ1-7アルカノイルオキシ−Ｃ1-6アルキル基を示す。］
【００５０】
「シリル系保護基」としては、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、ジメチルイソプロピルシリル、ジエチルイソプロピルシリル、ジメチルテキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリベンジルシリル、トリ−ｐ−キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル、ｔ−ブチルメトキシフェニルシリルなどを挙げることができ、「トリチル系保護基」としては、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル、４−（４’−ブロモフェナシルオキシ）フェニルジフェニルメチル、４，４’，４”−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル、４，４’，４”−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル、４，４’，４”−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル、３−（イミダゾイル−１−イルメチル）ビス（４’，４”−ジメトキシフェニル）メチル、１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチルなどを挙げることができ、「カーバメート系保護基」としては、ｔ−ブトキシカルボニル、フルオレニルメチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどを挙げることができ、「ベンジルエーテル系保護基」としては、ベンジル、メトキシベンジル、ニトロベンジル、ハロベンジル、フェニルベンジルなどを挙げることができ、「アルカノイル系保護基」としては、ホルミル、アセチル、ハロゲノ化アセチル、ピバロイル、ベンゾイルなどを挙げることができる。また、「アミノ基の保護基」としては、前述したものを挙げることができる。
【００５１】
「複素芳香環基」とは、窒素原子、酸素原子または硫黄原子等のヘテロ原子を少なくとも１個有する５員環芳香族ヘテロシクリル基、６員環芳香族ヘテロシクリル基または縮合環芳香族ヘテロシクリル基をいう。例えば、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チエニル、フリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾール等の５員複素芳香環基；ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル等の６員複素芳香環基；インドリル、イソインドリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル等の縮合環複素芳香環基を挙げることができる。好ましくは窒素原子を含む複素芳香環基であり、より好ましくはピリジルである。
【００５２】
修飾すべき塩基は特に制限されない。例えば、本発明のアンチセンスオリゴ核酸の塩基長は７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下であるので、元となるアンチセンスオリゴ核酸の塩基配列を決定した後、１つずつ塩基を修飾していき、肝毒性低減効果が優れる修飾塩基を決定してもよい。しかし、後記の実施例の通り、ＴＧＣまたはＴＣＣの配列に含まれるチミン、グアニンまたはシトシンを修飾する場合に良好な肝毒性低減効果が見られる傾向があるので、これら配列に含まれる核酸残基の塩基を修飾することを一つの目安とすることができる。
【００５３】
本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸は、特に１つの核酸残基の塩基が修飾されていることにより、かかる修飾前のアンチセンスオリゴ核酸に比べて肝毒性が低減されている。例えば、肝毒性の指標となるＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）とＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）のアンチセンスオリゴ核酸投与後における血清濃度が、上記修飾前のアンチセンスオリゴ核酸を用いる以外は同様の条件で測定された血清濃度に対して、６０％以下または５０％以下であることが好ましく、４０％以下または２０％以下であることがより好ましく、１０％以下であることがよりさらに好ましく、５％以下であることが特に好ましい。また、本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸の投与後のＡＳＴの血清濃度としては、１００ＩＵ／Ｌ以下が好ましく、４０ＩＵ／Ｌ以下がより好ましく、また、ＡＬＴの血清濃度としては１００ＩＵ／Ｌ以下が好ましく、４０ＩＵ／Ｌ以下がより好ましく、２０ＩＵ／Ｌ以下がよりさらに好ましい。
【００５４】
本開示において、ＡＳＴおよびＡＬＴの血清濃度は、例えば、マウスまたはラットに１０ｍｇ／ｋｇ体重以上、３０ｍｇ／ｋｇ体重以下程度の所定投与量で、アンチセンスオリゴ核酸を静脈注射してから７０時間以上、１２０時間以下程度の所定時間経過後に採血し、遠心分離して得られた血清から測定すればよい。
【００５５】
本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸は、常法により製造することができる。例えば、本発明のアンチセンスオリゴ核酸の塩基長は７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下であることから、核酸の自動合成機を使って容易に製造することができる。
【００５６】
本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸は、標的ｍＲＮＡに対する相補塩基配列を有することから、標的ｍＲＮＡの翻訳を強く阻害できることができる上に、上記の通り肝毒性が低減されている。よって、標的ｍＲＮＡが関与する疾患を予防または治療するための医薬として有用である。
【００５７】
本発明のアンチセンスオリゴ核酸は、例えば、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤を配合して、非経口投与製剤またはリポソーム製剤とすることができる。また、例えば、当該技術分野で通常用いられる医薬用担体を配合して、液剤、クリーム剤、軟膏剤などの局所用の製剤を調製できる。
【００５８】
本発明のアンチセンスオリゴ核酸は、ヒト以外の動物およびヒトに投与することができる。その投与量は、患者の年齢、性別、体重、状態、疾患の種類、重篤度、予防的な使用であるか或いは治療的な使用であるかなどに応じて適宜調整すればよいが、例えば、成人のヒトに対する１回当たり及び体重１ｋｇ当たりの投与量として、０．０１μｇ以上、１００ｇ以下とすることができる。当該量としては、０．１μｇ以上または１．０μｇ以上が好ましく、１０μｇ以上または１００μｇ以上がより好ましく、１ｍｇ以上がよりさらに好ましく、また、１０ｇ以下または１．０ｇ以下が好ましく、１００ｍｇ以下または１０ｍｇ以下がより好ましく、５ｍｇ以下がよりさらに好ましい。また、投与回数としては、１ヶ月に１回から１日当たり３回以下程度の間で適宜調整すればよい。
【００５９】
本願は、２０１７年２月２１日に出願された日本国特許出願第２０１７−３０４８９号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１７年２月２１日に出願された日本国特許出願第２０１７−３０４８９号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。【００６１】
実施例１：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
（１）  アンチセンスオリゴ核酸の選別と合成
核酸医薬で問題となっている肝毒性の誘発機構としては、（ｉ）標的外遺伝子の発現抑制、（ｉｉ）自然免疫の活性化の他、（ｉｉｉ）核酸医薬に関係するタンパク質などの生体分子を介したシグナル経路が考えられる。上記機構（ｉ）および（ｉｉ）を回避し、上記機構（ｉｉｉ）の寄与により特に強い肝毒性を誘発するアンチセンスオリゴ核酸として＃１０１を選択した。株式会社ジーンデザインに、表１に示す配列を有する＃１０１およびその誘導体である＃１０１−Ｃ２−７の合成を外注した。得られたアンチセンスオリゴ核酸の分子量をマススペクトルにより測定した。＃１０１の分子量の理論値は４５８９．７２、実測値は４６００．６１であり、＃１０１−Ｃ２−７の分子量の理論値は４６０５．７２、実測値は４６０２．２２であった。【００６２】
【表１】
2018155450.tif 000005
【００６３】
上記配列中、大文字は下記構造を有する２’，４’−架橋型核酸（ＬＮＡ）を示し、小文字はＤＮＡを示し、mＣ中の塩基は５−メチルシトシンであり、ζ中の塩基は５−ヒドロキシシトシンである。【００６４】
【化４】
2018155450.tif 000006
【００６５】
各アンチセンスオリゴ核酸を生理食塩水（大塚製薬社製）に溶解して２ｍｇ／ｍＬ溶液とし、実験に用いるまで−３０℃で凍結保存した。【００６６】
（２）  肝毒性試験
５週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌマウス（日本チャールス・リバー株式会社）を１週間検疫馴化した後、実験に用いた。当該マウスを任意に４匹ずつ３群に分け、生理食塩水（大塚製薬社製）または各アンチセンスオリゴ核酸溶液を１０ｍＬ／ｋｇ体重（アンチセンスオリゴ核酸の投与量として２０ｍｇ／ｋｇ体重）の投与量で尾静脈内に単回投与した。投与から４日目（９６時間後）に、マウスを２．０〜４．０％のイソフルラン（ＤＳファーマアニマルヘルス社製）で吸入麻酔し、後大静脈腹部から可能な限り採血した。得られた血液を室温で２０〜６０分静置後、１７００×ｇで５分間遠心分離して血清を得た。血液採取の際、血液量が分析に必要な量に達しない場合は注射用水を用いて希釈した後、分析に用いた。生化学自動分析装置（「ＪＣＡ−ＢＭ６０７０」日本電子社製）を用いて、得られた血清中のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）とアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の濃度を測定した。なお、上記の動物実験の飼育と実験は、株式会社新日本科学の動物実験規定に準じ、株式会社新日本科学安全性研究所の動物実験施設内で行った。結果を図１に示す。図１中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【００６７】
図１に示す結果の通り、ＡＳＴとＡＬＴは肝機能障害の指標となる酵素であり、肝毒性が特に高い＃１０１によるこれら酵素の血清中濃度を、その中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５−ヒドロキシシトシンに変更するのみで有意に低減することができた。【００６８】
実施例２：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
上記実施例１において、アンチセンスオリゴ核酸＃１０１の代わりに、上記肝毒性誘発機構（ｉｉｉ）の寄与により強い肝毒性を誘発する＃１２、＃９８、＃１４、またはそれらの誘導体を用いた以外は同様にして肝毒性を評価した。＃１２の分子量の理論値は４６１４．７３、実測値は４６１４．２７であり、＃１２−Ｃ２−１０の分子量の理論値は４６３０．７３、実測値は４６２７．８６であり、＃９８の分子量の理論値は４６１３．７５、実測値は４６１２．７９であり、＃９８−Ｃ２−７の分子量の理論値は４６２９．７５、実測値は４６３１．１０であり、＃１４の分子量の理論値は４６０６．７１、実測値は４６０５．６６であり、＃１４−Ｃ２−６の分子量の理論値は４６２２．７１、実測値は４６１９．７２であった。本実施例で用いた各アンチセンスオリゴ核酸の配列を表２に、肝毒性の測定結果を図２に示す。図２中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【００６９】
【表２】
2018155450.tif 000007
【００７０】
図２に示す結果の通り、肝毒性が高いその他のアンチセンスオリゴ核酸＃１２、＃９８および＃１４においても、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５−ヒドロキシシトシンに変更するのみで、血清中のＡＳＴとＡＬＴの濃度を有意に低減することができた。また、ＡＳＴとＡＬＴの血清中濃度は、肝毒性が特に高い＃１０１程ではないが、上記変異により数％まで低減された。【００７１】
実施例３：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
ＧＲ（Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｏｃｏｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）はステロイド受容体の一種であり、ステロイドホルモンであるヒドロコルチゾンに対する受容体として働く一方で、リガンド依存的に核内移行して転写因子としても働く。そこで、これを標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１２（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ．，２０１２，２２，５，３４４−３５９）を選択し、株式会社ジーンデザインに、表３に示す配列を有するＰｏｓｉ１２およびその誘導体であるＰｏｓｉ１２−Ｃ２−１１の合成を外注した。Ｐｏｓｉ１２の分子量の理論値は４６１１．７１、実測値は４６１０．８１であり、Ｐｏｓｉ１２−Ｃ２−１１の分子量の理論値は４６２７．７１、実測値は４６２５．６５であった。【００７２】
【表３】
2018155450.tif 000008
【００７３】
得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例１（２）と同様に、マウス血清中のＡＬＴ濃度を測定した。結果を図３（１）に示す。【００７４】
また、各アンチセンスオリゴ核酸によるＧＲ遺伝子の発現抑制活性を測定した。具体的には、上記肝毒性試験において採血した後、マウスを凍結安楽死させ、肝臓を摘出して重量を測定した。摘出した肝臓において肉眼的に異常のみられない部位から約１００ｍｇを試料として採取した。採取した試料の重量を測定後、液体窒素にて凍結させ、超低温フリーザーで保存した。凍結保存した肝臓試料を、氷冷下でホモジネーター（Ｓｈａｋｅ  Ｍａｓｔｅｒ  ａｕｔｏ，  Ｂｉｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）とＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて可能な限りホモジナイズし、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡのＵＶ吸収スペクトルを、Ｎａｎｏ  ＶｕｅあるいはＮａｎｏ  Ｖｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社）を用いて測定し，ＲＮＡ濃度とＯ．Ｄ．２６０／Ｏ．Ｄ．２８０比から純度を算出した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡについてＯｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＳＹＢＲ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ  Ｌｔｄ）を用いて定量ＰＣＲを行い、生理食塩水投与群に対してアンチセンスオリゴ核酸投与群の標的遺伝子の発現比率を算出し、活性を評価した。結果を図３（２）に示す。【００７５】
図３（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１２による肝毒性は、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５−ヒドロキシシトシンに変更するのみで４０％に低減された。その一方で、図３（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１２の中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５−ヒドロキシシトシンに変更しても、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性は変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。【００７６】
実施例４：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
マウスＧＲを標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１４（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ．，２０１２，２２，５，３４４−３５９）を選択し、株式会社ジーンデザインに、表４に示す配列を有するＰｏｓｉ１４およびその誘導体であるＰｏｓｉ１４−Ｃ２−６の合成を外注した。Ｐｏｓｉ１４の分子量の理論値は４６９１．７８、実測値は４６９１．１０であり、Ｐｏｓｉ１４−Ｃ２−６の分子量の理論値は４７０７．７８、実測値は４７０５．２４であった。【００７７】
【表４】
2018155450.tif 000009
【００７８】
得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＧＲ遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図４に示す。【００７９】
図４（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１４による肝毒性は、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５−ヒドロキシシトシンに変更するのみで７０％に低減され、その低減度は、異常測定値を除外すると１３％となった。その一方で、図４（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１４の中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５−ヒドロキシシトシンに変更しても、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性は変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。【００８０】
実施例５：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
ＰＣＳＫ９（Ｐｒｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｋｅｘｉｎ  ９）はエンドプロテアーゼの一種であり、ＬＤＬのレセプターに結合して分解することによりＬＤＬの取り込み量を減らし、結果的に血中ＬＤＬ濃度を上昇させる。そこでマウスＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１５を選択し、株式会社ジーンデザインに、表５に示す配列を有するＰｏｓｉ１５およびその誘導体であるＰｏｓｉ１５−Ｃ２−４およびＰｏｓｉ１５−Ｃ２−１１の合成を外注した。Ｐｏｓｉ１５の分子量の理論値は４５８６．７７、実測値は４５８６．７３であり、Ｐｏｓｉ１５−Ｃ２−４の分子量の理論値は４６０２．７７、実測値は４６００．６１であり、Ｐｏｓｉ１５−Ｃ２−１１の分子量の理論値は４６０２．７７、実測値は４６０２．０９であった。【００８１】
【表５】
2018155450.tif 000010
【００８２】
得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図５に示す。【００８３】
図５（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１５による肝毒性は、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５−ヒドロキシシトシンに変更するのみで４０％または６０％に低減され、その低減度は、異常測定値を除外すると３０％または４０％となった。その一方で、図５（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１５の中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５−ヒドロキシシトシンに変更しても、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性はほとんど変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。【００８４】
実施例６：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
マウスＰＣＳＫ９を標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１７を選択し、株式会社ジーンデザインに、表６に示す配列を有するＰｏｓｉ１７およびその誘導体であるＰｏｓｉ１７−Ｃ２−１０の合成を外注した。Ｐｏｓｉ１７の分子量の理論値は４３００．５４、実測値は４３００．９２であり、Ｐｏｓｉ１７−Ｃ２−１０の分子量の理論値は４３１６．５４、実測値は４３１４．４６であった。【００８５】
【表６】
2018155450.tif 000011
【００８６】
得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図６に示す。図６中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【００８７】
図６（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１７による肝毒性は、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５−ヒドロキシシトシンに変更するのみで５０％に有意に低減された。その一方で、図６（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１７の中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５−ヒドロキシシトシンに変更しても、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性はほとんど変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。【００８８】
実施例７：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
Ｒｐｓ６ｋｂ２（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ６  ｋｉｎａｓｅ  ｂｅｔａ−２）は、リボソームタンパク質Ｓ６をリン酸化する酵素として同定されたセリン−スレオニンキナーゼであり、増殖因子やストレスなどの刺激により活性化され、細胞周期やタンパク質合成の調節をしている。これを標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＮｏ．９７を選択し、株式会社ジーンデザインに、表７に示す配列を有するＮｏ．９７およびその誘導体であるＮｏ．９７−Ｃ２−７、Ｎｏ．９７−Ｃ２−９およびＮｏ．９７−Ｃ２−１０の合成を外注した。Ｎｏ．９７の分子量の理論値は４１８２．４０、実測値は４１８３．０６であり、Ｎｏ．９７−Ｃ２−７の分子量の理論値は４１９８．４０、実測値は４１９７．５４であり、Ｎｏ．９７−Ｃ２−９の分子量の理論値は４１９８．４０、実測値は４１９６．６０であり、Ｎｏ．９７−Ｃ２−１０の分子量の理論値は４１９８．４０、実測値は４１９９．４０であった。【００８９】
【表７】
2018155450.tif 000012
【００９０】
得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＲｐｓ６ｋｂ２の発現抑制活性を測定した。結果を図７に示す。図７中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【００９１】
図７（１）に示す結果の通り、Ｎｏ．９７による肝毒性は、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５−ヒドロキシシトシンに変更するのみで３３％、２０％または３５％に低減された。その一方で、図７（２）に示す結果の通り、Ｎｏ．９７の中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５−ヒドロキシシトシンに変更しても、Ｒｐｓ６ｋｂ２遺伝子の発現抑制活性はほとんど変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。【００９２】
実施例８：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
上記実施例１において、アンチセンスオリゴ核酸＃１０１の誘導体として＃１０１−Ｔ６−５を用いた以外は同様にして肝毒性を評価した。＃１０１−Ｔ６−５の分子量の理論値は４６０５．７８、実測値は４６０５．１０であった。本実施例で用いた各アンチセンスオリゴ核酸の配列を表８に、肝毒性の測定結果を図８に示す。図８中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【００９３】
【表８】
2018155450.tif 000013
【００９４】
上記配列中、κ中の塩基は２−チオカルボニルチミンであり、κは以下の構造を有する。【００９５】
【化５】
2018155450.tif 000014
【００９６】
図８に示す結果の通り、肝毒性が非常に高いアンチセンスオリゴ核酸＃１０１の中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのチミンを２−チオカルボニルチミンに変換することにより、血清中のＡＳＴとＡＬＴの濃度を低減することができた。【００９７】
実施例９：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
上記実施例１において、アンチセンスオリゴ核酸＃１０１の代わりに＃９８、＃１４、またはそれらの誘導体を用いた以外は同様にして肝毒性を評価した。＃９８−Ｔ６−５の分子量の理論値は４６２９．８１、実測値は４６３１．０５であり、＃１４−Ｔ６−４の分子量の理論値は４６２２．７７、実測値は４６２３．１１であった。本実施例で用いた各アンチセンスオリゴ核酸の配列を表９に、肝毒性の測定結果を図９に示す。図９中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【００９８】
【表９】
2018155450.tif 000015
【００９９】
肝毒性が高いその他のアンチセンスオリゴ核酸＃９８および＃１４においても、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちのチミンを２−チオカルボニルチミンに変更するのみで、血清中のＡＳＴとＡＬＴの濃度を有意に低減することができた。【０１００】
実施例１０：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
マウスＧＲを標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１２（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ．，２０１２，２２，５，３４４−３５９）を選択し、株式会社ジーンデザインに、表１０に示す配列を有するＰｏｓｉ１２およびその誘導体であるＰｏｓｉ１２−Ｔ６−４の合成を外注した。Ｐｏｓｉ１２−Ｔ６−４の分子量の理論値は４６２７．７７、実測値は４６２９．０３であった。【０１０１】
【表１０】
2018155450.tif 000016
【０１０２】
得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＧＲ遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図１０に示す。図１０中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【０１０３】
図１０（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１２による肝毒性は、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのチミンを２−チオカルボニルチミンに変更するのみで４０％に低減された。その一方で、図１０（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１２の中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのチミンを２−チオカルボニルチミンに変更しても、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性は変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。【０１０４】
実施例１１：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
マウスＧＲを標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１４（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ．，２０１２，２２，５，３４４−３５９）を選択し、株式会社ジーンデザインに、表１１に示す配列を有するＰｏｓｉ１４およびその誘導体であるＰｏｓｉ１４−Ｔ６−４の合成を外注した。Ｐｏｓｉ１４−Ｔ６−４の分子量の理論値は４７０７．８４、実測値は４７０８．３８であった。【０１０５】
【表１１】
2018155450.tif 000017
【０１０６】
得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＧＲ遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図１１に示す。図１１中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【０１０７】
図１１（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１４による肝毒性は、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのチミンを２−チオカルボニルチミンに変更するのみで３％に低減された。その一方で、図１１（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１４の中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのチミンを２−チオカルボニルチミンに変更しても、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性は変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。【０１０８】
実施例１２：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
マウスＰＣＳＫ９を標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１７（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ．，２０１２，２２，５，３４４−３５９）を選択し、株式会社ジーンデザインに、表１２に示す配列を有するＰｏｓｉ１７およびその誘導体であるＰｏｓｉ１７−Ｔ６−４の合成を外注した。Ｐｏｓｉ１７−Ｔ６−４の分子量の理論値は４３１６．６０、実測値は４３１６．０８であった。【０１０９】
【表１２】
2018155450.tif 000018
【０１１０】
得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図１２に示す。図１２中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【０１１１】
図１２（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１７による肝毒性は、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのチミンを２−チオカルボニルチミンに変更するのみで６０％に低減された。その一方で、図１２（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１７の中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのチミンを２−チオカルボニルチミンに変更しても、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性はほとんど変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。【０１１２】
実施例１３：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
上記実施例１において、アンチセンスオリゴ核酸＃１０１の誘導体として＃１０１−Ｇ３−６を用いた以外は同様にして肝毒性を評価した。＃１０１−Ｇ３−６の分子量の理論値は４６０４．７３、実測値は４６０５．４５であった。本実施例で用いた各アンチセンスオリゴ核酸の配列を表１３に、肝毒性の測定結果を図１３に示す。図１３中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【０１１３】
【表１３】
2018155450.tif 000019
【０１１４】
上記配列中、λ中の塩基は８−アミノグアニンであり、λは以下の構造を有する。【０１１５】
【化６】
2018155450.tif 000020
【０１１６】
図１３に示す結果の通り、肝毒性が非常に高いアンチセンスオリゴ核酸＃１０１の中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８−アミノグアニンに変更するのみで、血清中のＡＳＴとＡＬＴの濃度を低減することができた。【０１１７】
実施例１４：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
上記実施例１において、アンチセンスオリゴ核酸＃１０１の代わりに＃１２、＃９８、＃１４、またはそれらの誘導体を用いた以外は同様にして肝毒性を評価した。＃１２−Ｇ３−９の分子量の理論値は４６２９．７４、実測値は４６２８．１９であり、＃９８−Ｇ３−６の分子量の理論値は４６２８．７６、実測値は４６２８．９３であり、＃１４−Ｇ３−５の分子量の理論値は４６２１．７２、実測値は４６２１．３９であった。本実施例で用いた各アンチセンスオリゴ核酸の配列を表１４に、肝毒性の測定結果を図１４に示す。図１４中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【０１１８】
【表１４】
2018155450.tif 000021
【０１１９】
図１４に示す結果の通り、肝毒性が高いその他のアンチセンスオリゴ核酸＃１２、＃９８および＃１４においても、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８−アミノグアニンに変更するのみで、血清中のＡＳＴとＡＬＴの濃度を有意に低減することができた。【０１２０】
実施例１５：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
上記実施例１において、アンチセンスオリゴ核酸＃１０１またはその誘導体である＃１０１−Ｇ４−６を用いた以外は同様にして肝毒性を評価した。＃１０１−Ｇ４−６の分子量の理論値は４６６８．６１、実測値は４６７０．３１であった。本実施例で用いた各アンチセンスオリゴ核酸の配列を表１５に、肝毒性の測定結果を図１５に示す。図１５中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【０１２１】
【表１５】
2018155450.tif 000022
【０１２２】
上記配列中、μ中の塩基は８−ブロモグアニンであり、μは以下の構造を有する。【０１２３】
【化７】
2018155450.tif 000023
【０１２４】
図１５に示す結果の通り、肝毒性が非常に高いアンチセンスオリゴ核酸＃１０１の中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８−ブロモグアニンに変更するのみで、血清中のＡＳＴとＡＬＴの濃度を低減することができた。【０１２５】
実施例１６：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
上記実施例１において、アンチセンスオリゴ核酸＃１０１の代わりに＃１２、＃９８、＃１４、またはそれらの誘導体を用いた以外は同様にして肝毒性を評価した。＃１２−Ｇ４−９の分子量の理論値は４６９３．６２、実測値は４６９２．５０であり、＃９８−Ｇ４−６の分子量の理論値は４６９２．６４、実測値は４６９３．４５であり、＃１４−Ｇ４−５の分子量の理論値は４６８５．６０、実測値は４６８３．８６であった。本実施例で用いた各アンチセンスオリゴ核酸の配列を表１６に、肝毒性の測定結果を図１６に示す。図１６中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【０１２６】
【表１６】
2018155450.tif 000024
【０１２７】
図１６に示す結果の通り、肝毒性が高いその他のアンチセンスオリゴ核酸＃１２、＃９８および＃１４においても、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８−ブロモグアニンに変更するのみで、血清中のＡＳＴとＡＬＴの濃度を有意に低減することができた。【０１２８】
実施例１７：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
マウスＧＲを標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１４（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ．，２０１２，２２，５，３４４−３５９）を選択し、株式会社ジーンデザインに、表１７に示す配列を有するＰｏｓｉ１４およびその誘導体であるＰｏｓｉ１４−Ｇ４−１０の合成を外注した。Ｐｏｓｉ１４−Ｇ４−１０の分子量の理論値は４７７０．６７、実測値は４７７１．４６であった。【０１２９】
【表１７】
2018155450.tif 000025
【０１３０】
得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＧＲ遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図１７に示す。図１７中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【０１３１】
図１７（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１４による肝毒性は、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８−ブロモグアニンに変更するのみで３０％に低減された。その一方で、図１７（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１４の中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８−ブロモグアニンに変更しても、ＧＲ遺伝子の発現抑制活性はほとんど変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。【０１３２】
実施例１８：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
マウスＰＣＳＫ９を標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１５を選択し、株式会社ジーンデザインに、表１８に示す配列を有するＰｏｓｉ１５およびその誘導体であるＰｏｓｉ１５−Ｇ４−８の合成を外注した。Ｐｏｓｉ１５−Ｇ４−８の分子量の理論値は４６６５．６６、実測値は４６６６．０１であった。【０１３３】
【表１８】
2018155450.tif 000026
【０１３４】
得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図１８に示す。図１８中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【０１３５】
図１８（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１５の中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８−ブロモグアニンに変更した場合にはＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性はやや低下したが、図１８（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１５による肝毒性は１％まで有意に低減された。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性をそれほど低下させることなく肝毒性を低減することができる。【０１３６】
実施例１９：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
マウスＰＣＳＫ９を標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１７を選択し、株式会社ジーンデザインに、表１９に示す配列を有するＰｏｓｉ１７およびその誘導体であるＰｏｓｉ１７−Ｇ４−３、Ｐｏｓｉ１７−Ｇ４−５およびＰｏｓｉ１７−Ｇ４−８の合成を外注した。Ｐｏｓｉ１７−Ｇ４−３の分子量の理論値は４３７９．４３、実測値は４３７８．５４であり、Ｐｏｓｉ１７−Ｇ４−５の分子量の理論値は４３７９．４３、実測値は４３７７．２５であり、Ｐｏｓｉ１７−Ｇ４−８の分子量の理論値は４３７９．４３、実測値は４３７８．３４であった。【０１３７】
【表１９】
2018155450.tif 000027
【０１３８】
得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図１９に示す。図１９中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【０１３９】
図１９（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１７による肝毒性は、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８−ブロモグアニンに変更するのみで、３％、９％または２０％まで有意に低減された。Ｐｏｓｉ１７−Ｇ４−８による肝毒性低減効果は、異常測定値を除外すると３％にまで低下した。その一方で、図１９（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１７の中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８−ブロモグアニンに変更しても、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性はほとんど変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。【０１４０】
実施例２０：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
マウスＲｐｓ６ｋｂ２を標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＮｏ．９７を選択し、株式会社ジーンデザインに、表２０に示す配列を有するＮｏ．９７およびその誘導体であるＮｏ．９７−Ｇ４−８の合成を外注した。Ｎｏ．９７−Ｇ４−８の分子量の理論値は４２６１．２９、実測値は４２６１．１１であった。【０１４１】
【表２０】
2018155450.tif 000028
【０１４２】
得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度とＲｐｓ６ｋｂ２遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図２０に示す。図２０中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【０１４３】
図２０（１）に示す結果の通り、Ｎｏ．９７による肝毒性は、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８−ブロモグアニンに変更するのみで９％まで有意に低減された。その一方で、図２０（２）に示す結果の通り、Ｎｏ．９７の中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８−ブロモグアニンに変更しても、Ｒｐｓ６ｋｂ２遺伝子の発現抑制活性はほとんど変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。【０１４４】
実施例２１：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
上記実施例５において、Ｐｏｓｉ１５の誘導体であるＰｏｓｉ１５−Ｇ６−８を用いた以外は同様にして肝毒性と活性を評価した。Ｐｏｓｉ１５−Ｇ６−８の分子量の理論値は４６８５．９０、実測値は４６８３．０３であった。本実施例で用いた各アンチセンスオリゴ核酸の配列を表２１に、肝毒性の測定結果を図２１に示す。図２１中の「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【０１４５】
【表２１】
2018155450.tif 000029
【０１４６】
上記配列中、α中の塩基は７−フェニルエチニルグアニンであり、αは以下の構造を有する。【０１４７】
【化８】
2018155450.tif 000030
【０１４８】
図２１（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１５による肝毒性は、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを７−フェニルエチニルグアニンに変更するのみで、異常測定値を除いて５％まで有意に低減された。その一方で、図２１（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１５の中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを７−フェニルエチニルグアニンに変更しても、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性はほとんど変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。【０１４９】
実施例２２：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
マウスＲｐｓ６ｋｂ２およびマウスＧＲを標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＮｏ．９７とＰｏｓｉ１４をそれぞれ選択し、株式会社ジーンデザインに、表２２に示す配列を有するＮｏ．９７、Ｐｏｓｉ１４、および中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８−アミノグアニンに変更した誘導体の合成を外注した。また、マウスＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１５とＰｏｓｉ１７をそれぞれ選択し、株式会社ジーンデザインに、表２２に示す配列を有するＰｏｓｉ１５、Ｐｏｓｉ１７、および中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８−アミノグアニンに変更した誘導体の合成を外注した。【０１５０】
【表２２】
2018155450.tif 000031
【０１５１】
得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度と、マウスＲｐｓ６ｋｂ２遺伝子、マウスＧＲ遺伝子またはマウスＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図２２〜２５に示す。【０１５２】
図２２〜２５の（１）に示す結果の通り、Ｎｏ．９７、Ｐｏｓｉ１４、Ｐｏｓｉ１５およびＰｏｓｉ１７による肝毒性は、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８−アミノグアニンに変更するのみで明らかに低減された。その一方で、図２２〜２５の（２）に示す結果の通り、Ｎｏ．９７、Ｐｏｓｉ１４、Ｐｏｓｉ１５およびＰｏｓｉ１７の中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを８−アミノグアニンに変更しても、マウスＲｐｓ６ｋｂ２遺伝子、マウスＧＲ遺伝子およびマウスＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性は一部を除いてほとんど変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。【０１５３】
実施例２３：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
強い肝毒性を誘発するアンチセンスオリゴ核酸として＃１２を選択し、株式会社ジーンデザインに、表２３に示す配列を有する＃１２と、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを以下に構造を示す７−置換グアニンに変更した誘導体の合成を外注した。なお、７−置換グアノシン誘導体の導入に用いた化合物は新規であるので、その合成方法は後記する。【０１５４】
【表２３】
2018155450.tif 000032
【０１５５】
【化９】
2018155450.tif 000033
【０１５６】
得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度を測定した。結果を図２６に示す。図２６に示す結果の通り、＃１２による肝毒性は、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンの第７位に置換基を導入するのみで、有効に低減された。【０１５７】
実施例２４：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性と活性の評価
マウスＧＲおよびマウスＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴ核酸としてＰｏｓｉ１４とＰｏｓｉ１５をそれぞれ選択し、株式会社ジーンデザインに、表２４に示す配列を有するＰｏｓｉ１４、Ｐｏｓｉ１５、および中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを７−置換グアニンに変更した誘導体の合成を外注した。【０１５８】
【表２４】
2018155450.tif 000034
【０１５９】
得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度と、マウスＧＲ遺伝子またはマウスＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性を測定した。結果を図２７，２８に示す。【０１６０】
図２７，２８の（１）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１４およびＰｏｓｉ１５による肝毒性は、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを７−置換グアニンに変更するのみで明らかに低減された。その一方で、図２７，２８の（２）に示す結果の通り、Ｐｏｓｉ１４およびＰｏｓｉ１５の中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのグアニンを７−置換グアニンに変更しても、マウスＧＲ遺伝子およびマウスＰＣＳＫ９遺伝子の発現抑制活性はほとんど変わらなかった。このように本発明によれば、アンチセンスオリゴ核酸の活性を低下させることなく肝毒性を低減することができる。【０１６１】
実施例２５：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
強い肝毒性を誘発するアンチセンスオリゴ核酸として＃１０１を選択し、株式会社ジーンデザインに、表２５に示す配列を有する＃１０１と、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンを５−ヒドロキシシトシンに変更した誘導体の合成を外注した。【０１６２】
【表２５】
2018155450.tif 000035
【０１６３】
得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度を測定した。結果を図２９に示す。図２９に示す結果の通り、＃１０１による肝毒性は、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つのシトシンの５−ヒドロキシシトシンに変更するのみで、有効に低減された。【０１６４】
実施例２６：  アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の評価
強い肝毒性を誘発するアンチセンスオリゴ核酸として＃１０１を選択し、株式会社ジーンデザインに、表２６に示す配列を有する＃１０１と、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１〜３つの塩基を５−ヒドロキシシトシン（ζ）、２−チオカルボニルチミン（κ）または８−ブロモグアニン（μ）に変更した誘導体の合成を外注した。【０１６５】
【表２６】
2018155450.tif 000036
【０１６６】
得られた各アンチセンスオリゴ核酸に関して、上記実施例３と同様にしてマウス血清中のＡＬＴ濃度を測定した。結果を図３０に示す。図３０に示す結果の通り、＃１０１による肝毒性は、中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの１つの塩基を誘導体に変更するのみで有効に低減され、同中間部分における非２’，４’−架橋型核酸残基のうちの２以上の塩基を誘導体に変更すると、肝毒性の減弱効果はより一層高まることが実証された。【０１６７】
実施例２７：  ７−デアザ−７−ヨードグアノシン誘導体の合成【０１６８】
【化１０】
2018155450.tif 000037
【０１６９】
（１）  化合物２の合成
化合物１は、Ｆ．Ｓｅｅｌａら，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２００４，８，１２０３−１２１０およびＭ．Ｍａｃｋｏｖａら，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２０１５，１６，２２２５−２２３６に従って合成した。
テトラメチルグアニジン（４．３ｍＬ，３５ｍｍｏｌ）およびピリジン−２−アルドキシム（４．３ｇ，３５ｍｍｏｌ）を化合物１（５．１ｇ，７．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ／１，４−ｄｉｏｘａｎｅ混合溶液（１７０ｍＬ，ＤＭＦ：１，４−ｄｉｏｘａｎｅ＝１：１）に加え、窒素雰囲気下、室温で一晩攪拌した。酢酸エチルで希釈し、１規定塩酸水溶液、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥したのち濃縮し、残渣を得た。残渣をメタノールで洗浄し、白色固体である化合物２（４．９ｇ）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δＨ：１．２２（９Ｈ，ｓ），２．３８（３Ｈ，ｓ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．６４（１Ｈ，ｍ），２．９１（１Ｈ，ｍ），４．４５−４．６２（３Ｈ，ｍ），５．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），６．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．１，５．５Ｈｚ），７．３４−７．４１（５Ｈ，ｍ），７．８８−７．９４（４Ｈ，ｍ），１０．９６（１Ｈ，ｓ），１１．９５（１Ｈ，ｓ）【０１７０】
（２）  化合物３の合成
氷冷下において１規定ナトリウムメトキシド（１２．４ｍＬ，１２．４ｍｍｏｌ）を化合物２（４．５ｇ，６．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ／メタノール混合溶液（１５１．５ｍＬ，ＴＨＦ：メタノール＝１５０：１．５）に加え、窒素雰囲気下、氷冷下１５分攪拌した。氷冷下において酢酸（０．８ｍＬ）を加え濃縮し、残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール＝９／１）で精製し、白色固体である化合物３（３．０ｇ）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δＨ：１．２３（９Ｈ，ｓ），２．０９（１Ｈ，ｍ），２．３６（１Ｈ，ｍ），３．５０（２Ｈ，ｍ），３．７６（１Ｈ，ｓ），４．２９（１Ｈ，ｓ），４．９３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），５．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ），６．４５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．１，５．５Ｈｚ），７．４５（１Ｈ，ｓ），１０．９７（１Ｈ，ｓ），１１．９０（１Ｈ，ｓ）【０１７１】
（３）  化合物４の合成
ジメトキシトリチルクロリド（０．８ｇ，２．４ｍｍｏｌ）を化合物３（１．０ｇ，２．２ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（１５ｍＬ）に加え、窒素雰囲気下、一晩攪拌した。メタノールを加え１時間攪拌した後、クロロホルムで希釈し、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥したのち濃縮し、残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝９４／５／１）で精製し、白色固体である化合物４（１．３ｇ）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δＨ：１．２０（９Ｈ，ｓ），２．１５（１Ｈ，ｍ），２．４０（１Ｈ，ｍ），３．０４（１Ｈ，ｍ），３．１３（１Ｈ，ｍ），３．７０（６Ｈ，ｓ），３．８６（１Ｈ，ｍ），４．２７（１Ｈ，ｍ），５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），６．４３（１Ｈ，ｍ），６．８１−６．８４（４Ｈ，ｍ），７．１５−７．３５（１０Ｈ，ｍ），１０．９４（１Ｈ，ｓ），１１．９０（１Ｈ，ｓ）【０１７２】
（４）  化合物５の合成
２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．２７ｍＬ，１．２ｍｍｏｌ）をジイソプロピルエチルアミン（０．２８ｍＬ，１．７ｍｍｏｌ）と化合物４（０．５ｇ，０．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３０ｍＬ）に加え、窒素雰囲気下、１時間攪拌した。ジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥したのち濃縮し、残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン＝１０／９／１）で精製し、白色固体である標題化合物（０．４ｇ）を得た。
31Ｐ  ＮＭＲ（１２２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δＰ：１４８．５３，１４８．９１【０１７３】
実施例２８：  ７−デアザ−７−（２−フェニルエチニル）グアノシン誘導体の合成【０１７４】
【化１１】
2018155450.tif 000038
【０１７５】
（１）  化合物６の合成
ヨウ化銅（６ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．０９ｍＬ，０．６ｍｍｏｌ）、エチニルベンゼン（０．０４ｍＬ，０．４ｍｍｏｌ）および化合物４（０．２ｇ，０．３ｍｍｏｌ）を含むアセトニトリル溶液（５ｍＬ）に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（３５ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、８０℃で２時間攪拌した。反応液をセライト濾過した後、濃縮し残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：トリエチルアミン＝９８：２）で精製し、標題化合物（０．１５ｇ）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δＨ：１．３０（９Ｈ，ｓ），１．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），２．４２（２Ｈ，ｍ），３．２８（１Ｈ，ｍ），３．４０（１Ｈ，ｍ），３．７３（６Ｈ，ｓ），４．０３（１Ｈ，ｍ），４．５５（１Ｈ，ｍ），６．４４（１Ｈ，ｍ），６．８１−６．８４（４Ｈ，ｍ），７．１３（１Ｈ，ｓ），７．１７−７．３３（１０Ｈ，ｍ），７．４１−７．４３（２Ｈ，ｍ），７．５０−７．５４（２Ｈ，ｍ），７．９１（１Ｈ，ｓ），１１．６９（１Ｈ，ｓ）【０１７６】
（２）  化合物７の合成
２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．１６ｍＬ，０．７ｍｍｏｌ）を、ジイソプロピルエチルアミン（０．１５ｍＬ，１．２ｍｍｏｌ）および化合物６（０．４ｇ，０．５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２０ｍＬ）に加え、窒素雰囲気下、１時間攪拌した。ジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥したのち濃縮し、残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン＝１０／９／１）で精製し、白色固体である標題化合物（０．４ｇ）を得た。
31Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δＰ：１４８．７０，１４８．９７【０１７７】
実施例２９：  ７−デアザ−７−［２−（４−ピリジル）エチニル］グアノシン誘導体の合成【０１７８】
【化１２】
2018155450.tif 000039
【０１７９】
（１）  化合物８の合成
ヨウ化銅（２ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．０４ｍＬ，０．３ｍｍｏｌ）、ｐ−エチニルピリジン（２０ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）および化合物４（０．１ｇ，０．１ｍｍｏｌ）を含むアセトニトリル溶液（２．５ｍＬ）に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１０ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、８０℃で１時間攪拌した。反応液をセライト濾過した後、濃縮し残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル／トリエチルアミン＝９８／２）で精製し、淡黄色固体である標題化合物（０．０８ｇ）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δＨ：１．３１（９Ｈ，ｓ），２．２１（１Ｈ，ｍ），２．４３（２Ｈ，ｍ），３．３０（１Ｈ，ｍ），３．４０（１Ｈ，ｍ），３．７３（６Ｈ，ｓ），４．０６（１Ｈ，ｍ），４．５７（１Ｈ，ｂｒｓ），６．４１（１Ｈ，ｔｒ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），６．８０−６．８３（４Ｈ，ｍ），７．２８−７．４３（１０Ｈ，ｍ），７．１７−７．２２（２Ｈ，ｍ），８．１４（１Ｈ，ｓ），８．５３−８．５５（２Ｈ，ｍ），１１．７８（１Ｈ，ｓ）【０１８０】
（２）  化合物９の合成
２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．１５ｍＬ，０．７ｍｍｏｌ）を、ジイソプロピルエチルアミン（０．３ｍＬ，１．７ｍｍｏｌ）および化合物８（０．５ｇ，０．７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３０ｍＬ）に加え、窒素雰囲気下、１時間攪拌した。ジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥したのち濃縮し、残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン＝１０／９／１）で精製し、白色固体である標題化合物（０．５ｇ）を得た。
31Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δＰ：１４８．６４，１４９．０７【０１８１】
実施例３０：  ７−デアザ−７−［２−（アセトキシメチル）エチニル］グアノシン誘導体の合成【０１８２】
【化１３】
2018155450.tif 000040
【０１８３】
（１）  化合物１０の合成
ヨウ化銅（４ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．０９ｍＬ，０．７ｍｍｏｌ）、１−アセトキシ−２−プロピン（２０ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）および化合物４（０．１ｇ，０．１ｍｍｏｌ）を含むアセトニトリル溶液（２．５ｍＬ）に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２２ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、８０℃で１時間攪拌した。反応液をセライト濾過した後、濃縮し残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝９８／１／１）にて精製後、アミノシリカゲルシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝９８／１／１）にて再精製し、淡黄色固体である標題化合物（０．０８ｇ）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δＨ：１．２８（９Ｈ，ｓ），２．０８（３Ｈ，ｓ），２．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ），２．３７（２Ｈ，ｍ），３．２４（１Ｈ，ｍ），３．３７（１Ｈ，ｍ），３．７７（６Ｈ，ｓ），４．０１（１Ｈ，ｍ），４．５０（１Ｈ，ｂｒｓ），４．９１（２Ｈ，ｓ），６．３８（１Ｈ，ｍ），６．８０−６．８３（４Ｈ，ｍ），７．０７（１Ｈ，ｓ），７．８１−７．４１（９Ｈ，ｍ），８．０３（１Ｈ，ｓ），１１．７３（１Ｈ，ｓ）【０１８４】
（２）  化合物１１の合成
２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．１ｍＬ，０．４ｍｍｏｌ）を、ジイソプロピルエチルアミン（０．２ｍＬ，１．０ｍｍｏｌ）および化合物１０（０．３ｇ，０．４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２０ｍＬ）に加え、窒素雰囲気下、１時間攪拌した。ジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥したのち濃縮し、残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン＝１０／９／１）で精製し、白色固体である標題化合物（０．３ｇ）を得た。
31Ｐ  ＮＭＲ（１２２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δＰ：１４８．７２，１４９．０４
【図１】
2018155450.tif 000043
【図２】
2018155450.tif 000044
【図３】
2018155450.tif 000045
【図４】
2018155450.tif 000046
【図５】
2018155450.tif 000047
【図６】
2018155450.tif 000048
【図７】
2018155450.tif 000049
【図８】
2018155450.tif 000050
【図９】
2018155450.tif 000051
【図１０】
2018155450.tif 000052
【図１１】
2018155450.tif 000053
【図１２】
2018155450.tif 000054
【図１３】
2018155450.tif 000055
【図１４】
2018155450.tif 000056
【図１５】
2018155450.tif 000057
【図１６】
2018155450.tif 000058
【図１７】
2018155450.tif 000059
【図１８】
2018155450.tif 000060
【図１９】
2018155450.tif 000061
【図２０】
2018155450.tif 000062
【図２１】
2018155450.tif 000063
【図２２】
2018155450.tif 000064
【図２３】
2018155450.tif 000065
【図２４】
2018155450.tif 000066
【図２５】
2018155450.tif 000067
【図２６】
2018155450.tif 000068
【図２７】
2018155450.tif 000069
【図２８】
2018155450.tif 000070
【図２９】
2018155450.tif 000071
【図３０】
2018155450.tif 000072
【配列表】
2018155450000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月5日(2018.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基長が７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下であり、
両末端からそれぞれ１ｎｔ以上、５ｎｔ以下の核酸残基が２’，４’−架橋型核酸であり、
上記両末端の間に非２’，４’−架橋型の核酸残基を有し、
上記非２’，４’−架橋型の核酸残基のうちの１以上の核酸残基の塩基が修飾されており、
上記修飾塩基のうち１以上が、７−デアザ−７−（２−フェニルエチニル）グアニン、７−デアザ−７−［２−（４−ピリジル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（２−ピリジル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（３−ピリジル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（Ｃ１−７アルカノイルオキシ−Ｃ１−６アルキル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−Ｃ１−６アルキルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ２−６アルケニルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ２−６アルキニルグアニンまたは７−デアザ−７−ハロゲノグアニンであることを特徴とするアンチセンスオリゴ核酸。
【請求項２】
塩基が修飾されている上記非２’，４’−架橋型核酸残基がＴＧＣまたはＴＣＣの配列に含まれる請求項１に記載のアンチセンスオリゴ核酸。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
上記非２’，４’−架橋型の核酸残基がＤＮＡである請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴ核酸。
【請求項５】
上記２’，４’−架橋型の核酸残基が下記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかの構造を有する請求項１、２、４のいずれかに記載のアンチセンスオリゴ核酸。
【化１】
2018155450.tif 000073
［式中、
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、＞Ｎ（Ｒ３）基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ４）−基を示し（Ｒ３およびＲ４は、独立してＨまたはＣ１−６アルキル基を示す）、
Ｘ２は、下記式（ＩＶ）〜（ＶＩＩ）で表されるいずれかのグアニジノ基を示し、
【化２】
2018155450.tif 000074
（式中、Ｒ５〜Ｒ１８は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、アミノ基の保護基または２−シアノエチルオキシカルボニル基を示す）
Ｘ３は、Ｏ、Ｓ、＞Ｎ（Ｒ１９）基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ２０）−基を示し（Ｒ１９およびＲ２０は、独立してＨまたはＣ１−６アルキル基を示す）
Ｙ１〜Ｙ３は、独立してＯ−またはＳ−を示し、
Ｂａｓｅは核酸塩基基を示し、
Ｒ１とＲ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル基を示すか、または、Ｒ１とＲ２が一緒になってＣ１−４アルキレン基を形成してもよく、
ｎは０以上２以下の整数を示す］
【請求項６】
上記２’，４’−架橋型の核酸残基が上記式（Ｉ）の構造を有し、Ｘ１がＯであり且つｎが１である請求項５に記載のアンチセンスオリゴ核酸。
【請求項７】
核酸残基の塩基への上記修飾の導入前に比して肝毒性が低減されている請求項１、２、４〜６のいずれかに記載のアンチセンスオリゴ核酸。
【請求項８】
アンチセンスオリゴ核酸のデザイン方法であって、
上記アンチセンスオリゴ核酸の塩基長が７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下であり、上記アンチセンスオリゴ核酸の両末端からそれぞれ１ｎｔ以上、５ｎｔ以下の核酸残基が２’，４’−架橋型核酸であり、上記両末端の間に非２’，４’−架橋型の核酸残基を有し、
上記非２’，４’−架橋型の核酸残基のうちの１以上の核酸残基の塩基を修飾することにより、上記アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を低減することを特徴とする方法。
【請求項９】
アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の低減方法であって、
上記アンチセンスオリゴ核酸の塩基長が７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下であり、上記アンチセンスオリゴ核酸の両末端からそれぞれ１ｎｔ以上、５ｎｔ以下の核酸残基が２’，４’−架橋型核酸であり、上記両末端の間に非２’，４’−架橋型の核酸残基を有し、
上記非２’，４’−架橋型の核酸残基のうちの１以上の核酸残基の塩基を修飾することにより、上記アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を低減することを特徴とする方法。
【請求項１０】
塩基が修飾されている上記非２’，４’−架橋型核酸残基がＴＧＣまたはＴＣＣの配列に含まれる請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
上記の修飾されている塩基が、５−ヒドロキシシトシン、４−アセチルシトシン、３−Ｃ１−６アルキルシトシン、５−Ｃ１−６アルキルシトシン、２−チオシトシン、２−チオチミン、ジヒドロチミン、プソイドチミン、２−チオウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、８−アミノグアニン、８−ハロゲノグアニン、７−デアザ−７−（２−フェニルエチニル）グアニン、７−デアザ−７−（２−ピリジルエチニル）グアニン、７−デアザ−７−［２−（Ｃ１−７アルカノイルオキシ−Ｃ１−６アルキル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル）エチニル］グアニン、１−Ｃ１−６アルキルグアニン、２，２−ジ（Ｃ１−６アルキル）グアニン、２−Ｃ１−６アルキルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ１−６アルキルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ２−６アルケニルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ２−６アルキニルグアニン、７−デアザ−７−ハロゲノグアニン、イノシン、１−Ｃ１−６アルキルイノシン、キュェオシン、β，Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、β，Ｄ−マンノシルキュェオシン、Ｎ６−Ｃ２−６アルケニルアデニン、１−Ｃ１−６アルキルアデニン、２−Ｃ１−６アルキルアデニン、Ｎ６−Ｃ１−６アルキルアデニンまたは２−Ｃ１−６アルキルチオ−Ｎ６−Ｃ２−６アルケニルアデニンである請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
上記の修飾されている塩基が、７−デアザ−７−（２−フェニルエチニル）グアニン、７−デアザ−７−［２−（４−ピリジル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（２−ピリジル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（３−ピリジル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（Ｃ１−７アルカノイルオキシ−Ｃ１−６アルキル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−Ｃ１−６アルキルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ２−６アルケニルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ２−６アルキニルグアニンまたは７−デアザ−７−ハロゲノグアニンである請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
上記非２’，４’−架橋型の核酸残基がＤＮＡである請求項８〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
上記２’，４’−架橋型の核酸残基が下記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかの構造を有する請求項８〜１３のいずれかに記載の方法。
【化３】
2018155450.tif 000075
［式中、
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、＞Ｎ（Ｒ３）基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ４）−基を示し（Ｒ３およびＲ４は、独立してＨまたはＣ１−６アルキル基を示す）、
Ｘ２は、下記式（ＩＶ）〜（ＶＩＩ）で表されるいずれかのグアニジノ基を示し、
【化４】
2018155450.tif 000076
（式中、Ｒ６〜Ｒ１８は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、アミノ基の保護基または２−シアノエチルオキシカルボニル基を示す）
Ｘ３は、Ｏ、Ｓ、＞Ｎ（Ｒ１９）基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ２０）−基を示し（Ｒ１９およびＲ２０は、独立してＨまたはＣ１−６アルキル基を示す）
Ｙ１〜Ｙ３は、独立してＯ−またはＳ−を示し、
Ｂａｓｅは核酸塩基基を示し、
Ｒ１とＲ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル基を示すか、または、Ｒ１とＲ２が一緒になってＣ１−４アルキレン基を形成してもよく、
ｎは０以上２以下の整数を示す］
【請求項１５】
上記２’，４’−架橋型の核酸残基が上記式（Ｉ）の構造を有し、Ｘ１がＯであり且つｎが１である請求項１４に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月7日(2018.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基長が７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下であり、
両末端からそれぞれ１ｎｔ以上、５ｎｔ以下の核酸残基が２’，４’−架橋型核酸であり、
上記両末端の間に非２’，４’−架橋型の核酸残基を有し、
上記非２’，４’−架橋型の核酸残基のうちの１以上の核酸残基の塩基が修飾されていることを特徴とするアンチセンスオリゴ核酸。
【請求項２】
塩基が修飾されている上記非２’，４’−架橋型核酸残基がＴＧＣまたはＴＣＣの配列に含まれる請求項１に記載のアンチセンスオリゴ核酸。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
上記の修飾されている塩基が、５−ヒドロキシシトシン、４−アセチルシトシン、３−Ｃ１−６アルキルシトシン、５−Ｃ１−６アルキルシトシン、２−チオシトシン、２−チオチミン、ジヒドロチミン、プソイドチミン、２−チオウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、８−アミノグアニン、８−ハロゲノグアニン、７−デアザ−７−（２−フェニルエチニル）グアニン、７−デアザ−７−（２−ピリジルエチニル）グアニン、７−デアザ−７−［２−（Ｃ１−７アルカノイルオキシ−Ｃ１−６アルキル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル）エチニル］グアニン、１−Ｃ１−６アルキルグアニン、２，２−ジ（Ｃ１−６アルキル）グアニン、２−Ｃ１−６アルキルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ１−６アルキルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ２−６アルケニルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ２−６アルキニルグアニン、７−デアザ−７−ハロゲノグアニン、イノシン、１−Ｃ１−６アルキルイノシン、キュェオシン、β，Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、β，Ｄ−マンノシルキュェオシン、Ｎ６−Ｃ２−６アルケニルアデニン、１−Ｃ１−６アルキルアデニン、２−Ｃ１−６アルキルアデニン、Ｎ６−Ｃ１−６アルキルアデニンまたは２−Ｃ１−６アルキルチオ−Ｎ６−Ｃ２−６アルケニルアデニンである請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴ核酸。
【請求項５】
上記非２’，４’−架橋型の核酸残基がＤＮＡである請求項１、２または４に記載のアンチセンスオリゴ核酸。
【請求項６】
上記２’，４’−架橋型の核酸残基が下記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかの構造を有する請求項１、２、４または５に記載のアンチセンスオリゴ核酸。
【化１】
2018155450.tif 000077
［式中、
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、＞Ｎ（Ｒ３）基、−Ｃ（−Ｏ）−Ｏ−基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ４）−基を示し（Ｒ３およびＲ４は、独立してＨまたはＣ１−６アルキル基を示す）、
Ｘ２は、下記式（ＩＶ）〜（ＶＩＩ）で表されるいずれかのグアニジノ基を示し、
【化２】
2018155450.tif 000078
（式中、Ｒ５〜Ｒ１８は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、アミノ基の保護基または２−シアノエチルオキシカルボニル基を示す）
Ｘ３は、Ｏ、Ｓ、＞Ｎ（Ｒ１９）基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ２０）−基を示し（Ｒ１９およびＲ２０は、独立してＨまたはＣ１−６アルキル基を示す）
Ｙ１〜Ｙ３は、独立してＯ−またはＳ−を示し、
Ｂａｓｅは核酸塩基基を示し、
Ｒ１とＲ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル基を示すか、または、Ｒ１とＲ２が一緒になってＣ１−４アルキレン基を形成してもよく、
ｎは０以上２以下の整数を示す］
【請求項７】
上記２’，４’−架橋型の核酸残基が上記式（Ｉ）の構造を有し、Ｘ１がＯであり且つｎが１である請求項６に記載のアンチセンスオリゴ核酸。
【請求項８】
核酸残基の塩基への上記修飾の導入前に比して肝毒性が低減されている請求項１、２、４〜６のいずれかに記載のアンチセンスオリゴ核酸。
【請求項９】
アンチセンスオリゴ核酸のデザイン方法であって、
上記アンチセンスオリゴ核酸の塩基長が７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下であり、上記アンチセンスオリゴ核酸の両末端からそれぞれ１ｎｔ以上、５ｎｔ以下の核酸残基が２’，４’−架橋型核酸であり、上記両末端の間に非２’，４’−架橋型の核酸残基を有し、
上記非２’，４’−架橋型の核酸残基のうちの１以上の核酸残基の塩基を修飾することにより、上記アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を低減することを特徴とする方法。
【請求項１０】
アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性の低減方法であって、
上記アンチセンスオリゴ核酸の塩基長が７ｎｔ以上、３０ｎｔ以下であり、上記アンチセンスオリゴ核酸の両末端からそれぞれ１ｎｔ以上、５ｎｔ以下の核酸残基が２’，４’−架橋型核酸であり、上記両末端の間に非２’，４’−架橋型の核酸残基を有し、
上記非２’，４’−架橋型の核酸残基のうちの１以上の核酸残基の塩基を修飾することにより、上記アンチセンスオリゴ核酸の肝毒性を低減することを特徴とする方法。
【請求項１１】
塩基が修飾されている上記非２’，４’−架橋型核酸残基がＴＧＣまたはＴＣＣの配列に含まれる請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記の修飾されている塩基が、５−ヒドロキシシトシン、４−アセチルシトシン、３−Ｃ１−６アルキルシトシン、５−Ｃ１−６アルキルシトシン、２−チオシトシン、２−チオチミン、ジヒドロチミン、プソイドチミン、２−チオウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、８−アミノグアニン、８−ハロゲノグアニン、７−デアザ−７−（２−フェニルエチニル）グアニン、７−デアザ−７−（２−ピリジルエチニル）グアニン、７−デアザ−７−［２−（Ｃ１−７アルカノイルオキシ−Ｃ１−６アルキル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル）エチニル］グアニン、１−Ｃ１−６アルキルグアニン、２，２−ジ（Ｃ１−６アルキル）グアニン、２−Ｃ１−６アルキルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ１−６アルキルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ２−６アルケニルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ２−６アルキニルグアニン、７−デアザ−７−ハロゲノグアニン、イノシン、１−Ｃ１−６アルキルイノシン、キュェオシン、β，Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、β，Ｄ−マンノシルキュェオシン、Ｎ６−Ｃ２−６アルケニルアデニン、１−Ｃ１−６アルキルアデニン、２−Ｃ１−６アルキルアデニン、Ｎ６−Ｃ１−６アルキルアデニンまたは２−Ｃ１−６アルキルチオ−Ｎ６−Ｃ２−６アルケニルアデニンである請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
上記の修飾されている塩基が、７−デアザ−７−（２−フェニルエチニル）グアニン、７−デアザ−７−［２−（４−ピリジル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（２−ピリジル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（３−ピリジル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（Ｃ１−７アルカノイルオキシ−Ｃ１−６アルキル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−［２−（ヒドロキシ−Ｃ１−６アルキル）エチニル］グアニン、７−デアザ−７−Ｃ１−６アルキルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ２−６アルケニルグアニン、７−デアザ−７−Ｃ２−６アルキニルグアニンまたは７−デアザ−７−ハロゲノグアニンである請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
上記非２’，４’−架橋型の核酸残基がＤＮＡである請求項９〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
上記２’，４’−架橋型の核酸残基が下記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかの構造を有する請求項９〜１４のいずれかに記載の方法。
【化３】
2018155450.tif 000079
［式中、
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、＞Ｎ（Ｒ３）基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ４）−基を示し（Ｒ３およびＲ４は、独立してＨまたはＣ１−６アルキル基を示す）、
Ｘ２は、下記式（ＩＶ）〜（ＶＩＩ）で表されるいずれかのグアニジノ基を示し、
【化４】
2018155450.tif 000080
（式中、Ｒ５〜Ｒ１８は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、アミノ基の保護基または２−シアノエチルオキシカルボニル基を示す）
Ｘ３は、Ｏ、Ｓ、＞Ｎ（Ｒ１９）基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ２０）−基を示し（Ｒ１９およびＲ２０は、独立してＨまたはＣ１−６アルキル基を示す）
Ｙ１〜Ｙ３は、独立してＯ−またはＳ−を示し、
Ｂａｓｅは核酸塩基基を示し、
Ｒ１とＲ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル基を示すか、または、Ｒ１とＲ２が一緒になってＣ１−４アルキレン基を形成してもよく、
ｎは０以上２以下の整数を示す］
【請求項１６】
上記２’，４’−架橋型の核酸残基が上記式（Ｉ）の構造を有し、Ｘ１がＯであり且つｎが１である請求項１５に記載の方法。
【国際調査報告】
2018155450.tif 000081
2018155450.tif 000082
2018155450.tif 000083
2018155450.tif 000084