(57)【要約】間葉系幹細胞の誘引剤、並びに当該誘引剤を含む、老化因子産生抑制剤、老化改善剤、及び真皮の再生促進剤の提供。アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物が、間葉系幹細胞誘因作用を有することを見いだしたことにより、間葉系幹細胞の誘引剤の発明に至った。また、間葉系幹細胞が、老化因子の産生を抑制し、また真皮線維芽細胞を活性化することを見出したことにより、当該誘引剤を含む、老化因子産生抑制剤、老化改善剤、及び真皮の再生促進剤に関する発明に至った。
2019017355.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１を含む、間葉系幹細胞の誘引剤。
【請求項２】
請求項１に記載の誘引剤を含む、老化因子産生抑制剤。
【請求項３】
請求項１に記載の誘引剤を含む、真皮の再生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１を含む間葉系幹細胞の誘引剤、並びに当該誘引剤を含む、老化因子産生抑制剤、老化改善剤、及び真皮の再生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織を新しく再生することを目指す再生医学の領域において、失われた組織の機能を回復させるために、各種幹細胞の活用が試みられている。再生医学は、医療領域のみならず、毛髪再生や皮膚再生など美容領域にも応用されてきている。【０００３】
幹細胞は、自己複製能と他の種類の細胞に分化する分化能を有する細胞と定義されている。幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）のように一個体を形成する全ての系統の細胞種へ分化することのできる分化万能性を有する幹細胞の他、成人の生体内の各組織にも、分化万能性はないが、複数系統へ分化できる分化多能性を有する体性幹細胞が存在することが知られている。【０００４】
胚性幹細胞は発生初期の胚からしか得ることができず、採取時の母体への危険性や倫理的な問題なども加わって、手軽に研究・臨床の場に利用することは難しく、美容領域での利用は困難である。また、誘導多能性幹細胞については、倫理的な問題は少ないものの、遺伝子を導入することによる癌化のリスクが存在する。したがって、美容領域では、胚性幹細胞や誘導多能性幹細胞の利用よりは、体性幹細胞の利用について研究が進んでいるが、その存在頻度が非常に低く単離が難しく、また自己複製能力と分化能力を維持させながら大量に培養することも困難である。【０００５】
体性幹細胞は、組織の損傷時における組織修復、組織の恒常性の維持や老化に寄与していることが知られている。体性幹細胞は、様々な組織において存在することが知られており、皮膚組織に存在する幹細胞としては、表皮層に存在する表皮幹細胞と、真皮層及び皮下脂肪層に存在する間葉系幹細胞などが知られている。【０００６】
表皮では、表皮基底層に表皮幹細胞が存在することが良く知られており、また毛包のバルジ領域と呼ばれる領域には、毛包上皮幹細胞や皮膚色素幹細胞が存在することが報告されている。一方、真皮には脂肪、グリア、軟骨、筋肉など複数の細胞系列に分化する皮膚由来前駆細胞（skin-derived precursors：SKP）が存在すること（非特許文献１：Wong CE et al., J Cell Biol. 175:1005-1015, 2006）が報告され、さらに真皮間葉系幹細胞と呼ばれる細胞が単離されている（特許文献１：WO2011/034106）。【０００７】
間葉系幹細胞は、皮膚が外傷を受けた際に、外傷部位に誘引されることが知られている。外傷部位に誘引された間葉系幹細胞は、周囲の皮膚細胞を活性化して、細胞増殖を促すとともに、自身も皮膚細胞へと分化して、外傷を塞ぎ、治癒に貢献すると考えられており、ある種のフラボノイドが、間葉系幹細胞の誘引作用を有することが示されている（非特許文献２：PLOS ONE DOI:10.137/journal.pone.0144166）。皮膚損傷の治癒に関与する間葉系幹細胞は、血管を介して運搬されてきた骨髄由来間葉系幹細胞の他に、皮下組織に存在する脂肪幹細胞や、皮脂腺、汗腺、毛包などの器官の周囲や、血管付近に存在していた真皮間葉系幹細胞であると考えられる。間葉系幹細胞としては、従来は骨髄由来幹細胞が主に研究の対象とされてきたが、脂肪組織から脂肪幹細胞が単離されると、その入手の容易性と、種々の細胞系列へと分化することができる多分化能を有することから、様々な再生治療への応用が期待されている（非特許文献３：World J Stem Cells 2014 January 26; 6(1): 65-68）。真皮間葉系幹細胞は、血管付近に存在しているが、その分化能や性質については未知の点が多く、その応用については今後の研究が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０３４１０６号
【特許文献２】特表２０１３−５０７９５６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J Cell Biol. 175:1005-1015, 2006
【非特許文献２】PLOS ONE DOI:10.137/journal.pone.0144166
【非特許文献３】World J Stem Cells 2014 January 26; 6(1): 65-68
【非特許文献４】Cell, (2011)146, 761-771
【非特許文献５】Journal of Dermatological Science (2007) 48, 15- 24
【非特許文献６】Stem Cell Research & Theapy 2014, 5;21
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、幹細胞を誘引する作用を有する薬剤の開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、皮膚の老化現象を改善する化粧料を開発するに当たり、間葉系幹細胞の誘引を可能にする化粧品素材をスクリーニングしたところ、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物が、それぞれ間葉系幹細胞を誘引することを見出し、本発明に至った。したがって、本発明は、以下に関する。【００１２】
[１]  アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１を含む、間葉系幹細胞の誘引剤。
[２]  項目１に記載の誘引剤を含む、老化因子産生抑制剤。
[３]  項目１に記載の誘引剤、又は項目２に記載の老化因子産生抑制剤を含む、老化改善剤。
[４]  項目１に記載の誘引剤を含む、真皮の再生促進剤。
[５]  間葉系幹細胞の誘因を介して、間葉系幹細胞により治療又は改善される疾患の治療において使用するための、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出液。
［６］  前記疾患が、関節軟骨疾患、例えば変形性関節症等、心臓病、筋ジストロフィー、真皮の創傷又は損傷である、項目５に記載の抽出液。
[７]  アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１を投与することを含み、真皮に存在する間葉系幹細胞を誘引することを介する美容方法又は非治療的方法。
［８］間葉系幹細胞の誘因により、老化因子産生が抑制される、項目７に記載の美容方法又は非治療的方法。
［９］間葉系幹細胞の誘因により、真皮の再生が促進される、項目７に記載の美容方法又は非治療的方法。
［１０］間葉系幹細胞を誘引することにより、たるみやしわなどの外観上の老化を改善される、項目７〜９のいずれか一項に記載の美容方法又は非治療的方法。
[１１]  老化の治療又は予防において使用するための、間葉系幹細胞の誘引剤。
[１２]  真皮の再生治療において使用するための、間葉系幹細胞の誘引剤。
[１３]  前記誘引剤が、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出物を含む、項目１１又は１２に記載の誘引剤。
［１４］アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出物を、間葉系幹細胞の誘引剤としての非治療的使用。
［１５］アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出物の、間葉系幹細胞の誘因を介してしわ、たるみなどの外観上の老化を改善するため非治療的使用。
[１６]  間葉系幹細胞の誘引を必要とする対象において、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１を投与することを含む、老化の抑制方法。
[１７]  真皮の再生を必要とする対象において、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１を投与することを含む、真皮の再生促進方法。
[１８]  真皮に存在する間葉系幹細胞の誘引による老化の治療又は抑制のための製剤の製造のための、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出物の使用。
[１９]  真皮に存在する間葉系幹細胞の誘引による真皮の再生剤の製造のための、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出物の使用。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の間葉系幹細胞誘引剤は、間葉系幹細胞を誘引する作用を有する。間葉系幹細胞は、真皮線維芽細胞への分化、サイトカインの産生、及び老化因子の抑制のうちの少なくとも１の作用を介して、真皮線維芽細胞を活性化することができ、これにより老化を抑制又は改善し、真皮の再生を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１(Ａ)は、トランスウェルシステムの模式図を示しており、上層において通常（若い）線維芽細胞が培養され、下層において老化線維芽細胞が培養される。図１（Ｂ）〜（Ｄ）は、下層に細胞を培養しない場合（Blank）と、下層に老化線維芽細胞が培養された場合（+Senescent)における、（Ｂ）コラーゲン１Ａ１（COL1A1)、（Ｃ）エラスチン（ELN)、及び（Ｄ）マトリクスメタロプロテイナーゼ１（MMP１）の遺伝子発現量の比較を示すグラフである。
【図２】図２は、トランスウェルシステムの下層の老化線維芽細胞において、ＣＦＤの遺伝子発現を抑制した場合（Ａ）の、上層の線維芽細胞におけるＭＭＰ１遺伝子発現の変化を示すグラフである（Ｂ）。
【図３】図３は、老化線維芽細胞と通常（若い）線維芽細胞との間における老化因子（Ａ）ＩＧＦＢＰ７、（Ｂ）ＲＳＰＯ４、及び（Ｃ）ＣＦＤの遺伝子発現量の比較を示すグラフである。
【図４】図４は、ＩＧＦＢＰ７及びＲＳＰＯ４を添加した場合に、（Ａ）ＭＭＰ１遺伝子が用量依存的に発現増加したこと、及び（Ｂ）コラーゲン１遺伝子が、発現低下したことを示すグラフである。
【図５】図５は、線維芽細胞と間葉系幹細胞との共培養系において、間葉系幹細胞の存在により、線維芽細胞層の厚さが増加することを示す写真（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。
【図６】図６は、コラーゲンゲルと間葉系幹細胞との共培養系において、間葉系幹細胞の存在により、コラーゲンゲルのサイズが低下することを示す写真（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。
【図７】図７は、老化線維芽細胞と間葉系幹細胞との共培養系において、間葉系幹細胞の存在により、老化因子であるＩＧＦＢＰ７の発現が低下することを示すグラフである。
【図８】図８は、（Ａ）アイリス抽出物、（Ｂ）オリーブ葉抽出物、及び（Ｃ）カミツレ抽出物が、それぞれ間葉系幹細胞の誘引作用を有することを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１を含む、間葉系幹細胞の誘引剤に関する。間葉系幹細胞誘引剤とは、間葉系幹細胞を誘引することができる薬剤をいう。
【００１６】
アイリス抽出物は、地中海沿岸を原産とするアヤメ科（Iridaceae)の多年草の抽出物をいう。より好ましくは、アヤメ科のシロバナイリス、ニオイイリス、ニオイアヤメ、オリス（Iris germanica Var.florentina）、又はその近縁種の抽出物をいう。抽出する部位としては、全草、葉、花、根が挙げられるが、特に根を原材料として用いた場合に、芳香性の抽出物が得られることから、根の抽出物が好ましい。抽出方法は任意の方法を用いることができるが、一例として、乾燥させた根について水蒸気蒸留や溶媒抽出を行うことで抽出物を得ることができる。また溶媒としては、任意の抽出溶媒を用いることができるが、エタノール水溶液や５０％（ｖ/ｖ）のブチレングリコールで抽出して得た抽出物を用いることもできる。
【００１７】
オリーブ葉抽出物は、インド・パンジャブ地方から地中海沿岸を原産とするモクセイ科の植物であるオリーブ（Olea europaea）又はその近縁種の葉に由来する抽出物であり、抗酸化作用、コラーゲン産生促進作用、抗炎症作用、抗アレルギー作用が期待されている。オリーブ葉抽出物は、オリーブの葉を原材料として抽出することが好ましく、抽出方法は任意の方法、例えば水蒸気蒸留や、溶媒抽出を行うことができる。溶媒としては、任意の抽出溶媒を用いることができるが、５０％（ｖ/ｖ）のブチレングリコールで抽出して得た抽出物を用いることもできる。
【００１８】
カミツレ抽出物は、ヨーロッパから西アジアにかけて広く分布するキク科の１年草であるカモミール（Matricaria chamomilla）又はその近縁種の抽出液である。カミツレ抽出物は、カモミールの花を原材料として抽出することが好ましく、抽出方法は任意の方法、例えば水蒸気蒸留や、溶媒抽出を行うことができる。溶媒としては、任意の抽出溶媒を用いることができるが、５０％（ｖ/ｖ）のエタノール水溶液やブチレングリコール水溶液で抽出して得た抽出物を用いることもできる。
【００１９】
これらの抽出物は、化粧品素材であることから、化粧料に配合することが好ましい。間葉系幹細胞誘引剤として、前記抽出物の１種を単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。間葉系幹細胞誘引剤は、既存の間葉系幹細胞誘引剤、例えばＳＤＦ１α（ＣＸＣＬ２０）などと組み合わせて使用されてもよい。アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及び／又はカミツレ抽出物を含む組成物を間葉系幹細胞誘引剤として用いることもできる。
【００２０】
植物抽出物を得るために用いる抽出溶媒としては、水、又は、メタノール、エタノール、プロパノールなどの脂肪族１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの脂肪族多価アルコール；アセトンなどのケトン類；ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステルなどのエステル類；キシレン、ベンゼン、トルエンなどの芳香族類；クロロホルムなどハロゲン化アルキル類などの有機溶媒が挙げられる。これらの抽出溶媒は、１種が単独で、又は２種以上が混合されて用いられ得る。混合されてなる抽出溶媒の混合比は、特に限定されるものではなく、適宜調整することができる。前記抽出溶媒としては、少なくとも水を含む水含有抽出溶媒が好ましい。
【００２１】
植物抽出物を得るための抽出の方法としては、特に制限されず、従来公知の一般的な抽出方法を採用することができる。抽出においては、抽出原料として各植物の抽出部位をそのまま若しくは乾燥させて用いることができる。抽出した後においては、必要に応じて、適宜、ろ過、脱臭、脱色などの精製処理を行うことができる。脂肪幹細胞誘引剤又は皮膚のたるみ若しくは老化改善剤は、最終製品に添加して用いられる。最終製品中に含まれる上記各抽出物の濃度は、特に限定されず、例えば、十分な脂肪幹細胞誘引効果を発揮する観点から概ね組成物に対して、抽出物を典型的には０．００１〜１０質量％の範囲、好ましくは０．００１〜１質量％の範囲、最も好ましくは０．０１〜０．５質量％の範囲で配合される。
【００２２】
本発明において間葉系幹細胞とは、一般に間葉系に分類される任意の組織由来の幹細胞をいう。間葉系に分類される組織として、骨髄、胎盤、脂肪組織、真皮などが挙げられ、それらの組織由来の幹細胞の例として、骨髄由来間葉系幹細胞（以下、単に骨髄幹細胞とする）、胎盤由来間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞（以下、単に脂肪幹細胞とする)、歯髄由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、真皮由来間葉系幹細胞（以下、単に真皮幹細胞とする）などが挙げられ、また毛乳頭細胞の一部も間葉系幹細胞であると考えられている。本発明の間葉系幹細胞の誘引剤は、任意の組織由来の間葉系幹細胞に対し誘引作用を有しうる。一例として、美容分野や皮膚再生分野での応用を鑑み、経皮投与で誘引作用を発揮させる観点から、特に真皮幹細胞、脂肪幹細胞、毛乳頭細胞に対して誘引作用を有することが好ましい。
【００２３】
骨髄由来間葉系幹細胞は、骨髄に存在する幹細胞である。骨髄幹細胞は、心筋細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞といった多様な組織への分化能を有している。骨髄由来間葉系幹細胞は、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０を陽性マーカーとして特徴付けられるが、これらのマーカーを発現する細胞に限定されることを意図するものではない。骨髄間葉系幹細胞は、組織の損傷などのシグナルに応じ、血液中に放出されて、創傷部における治癒機能を果たすと考えられている。
【００２４】
脂肪組織由来間葉系幹細胞とは、単に脂肪幹細胞ということもでき、脂肪組織中に存在する間葉系幹細胞の一種である。脂肪幹細胞は、遊走能力を有することが知られており（非特許文献３及び特許文献２)、脂肪組織中を移動することができると考えられている。脂肪幹細胞は、ＣＤ９０マーカー、ＣＤ１０５マーカー等の発現により特徴付けられるが、これらのマーカーを発現する細胞に限定されることを意図するものではない。
【００２５】
真皮由来間葉系幹細胞とは、単に真皮幹細胞ということもでき、真皮に存在する幹細胞である。真皮幹細胞は、線維芽細胞への分化、又は線維芽細胞の活性化を介して、線維芽細胞を補充して真皮層の恒常性の維持に寄与する。真皮間葉系幹細胞は、真皮層中、ペリサイト様の細胞集団として微小血管部位や、皮脂腺、汗腺、毛包などの器官の周囲に主に存在する。皮膚の損傷時に活性化し、線維芽細胞、筋線維芽細胞に分化して皮膚の再生・修復に寄与していると考えられる。真皮幹細胞は、ＣＤ３４及びＮＧ２の二重陽性により特徴付けられるが、これらのマーカーを発現する細胞に限定されることを意図するものではない。真皮幹細胞が存在する各器官の周囲には毛細血管が張り巡らされていることから、真皮幹細胞は、血管を通して補充されることが考えられる。したがって、真皮幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞と近い性質を有しうる。
【００２６】
間葉系幹細胞の誘引は、in vitro及びin vivoのいずれでも確認することができる。in vitroの実験では、間葉系幹細胞誘引剤の濃度差がある培地中で間葉系幹細胞を培養して遊走を検出することで、間葉系幹細胞誘引剤の誘引効果を決定することができる。in vivoでの確認は、間葉系幹細胞誘引剤を投与した後に組織切片にて間葉系幹細胞の数又は割合を算出することで、誘引の有無を調べることができる。
【００２７】
本発明の間葉系幹細胞の誘引剤は、投与された場合に投与部位に間葉系幹細胞を誘引することができる。誘引できる細胞は、間葉系幹細胞であれば限定されないが、特に骨髄幹細胞、真皮幹細胞、毛乳頭細胞、脂肪幹細胞を誘引可能である。さらに、より好ましい態様では、骨髄幹細胞及び真皮幹細胞を誘引可能である。経皮投与される場合には、間葉系幹細胞は、真皮層に誘引されうる。誘引された間葉系幹細胞は、様々な作用を介して、真皮の老化を抑制し、真皮の再生に寄与する。このような作用として、一例として老化細胞により分泌される老化因子の抑制、正常細胞を活性化、及び真皮細胞への分化が挙げられる。
【００２８】
細胞は、時間経過に伴い分裂能が減少し、また細胞活性も変化する。このような細胞を老化細胞といい、老化細胞は時間経過のみならず、紫外線や活性酸素などのストレスにも影響を受けうる。老化細胞は、正常細胞が分泌する物質の分泌量を低下させ、また老化因子とよばれる物質を分泌するようになる。本発明者らは、老化因子としてＩＧＦＢＰ７、ＣＦＤ、又はＲＳＰＯ４を見出した。老化因子は、老化した細胞から産生される因子であって、他の細胞に作用することで老化に寄与する因子をいう。本発明で特定された老化因子は、維芽細胞に作用することで、真皮成分である膠原線維、例えばコラーゲンや弾性線維、例えばエラスチン、フィブリンなどの産生低下、膠原線維や弾性線維の分解酵素、例えばコラゲナーゼやプロテアーゼなどの活性促進を介して、皮膚老化に関与する。間葉系幹細胞は、老化細胞による老化因子の産生を抑制し、また老化因子の機能を抑制することができる。真皮に誘引された間葉系幹細胞は、老化因子の産生や機能に対し抑制的に作用することで、真皮成分の減少、真皮成分の分解を抑制することができ、それにより真皮の老化を抑制することができる。したがって、本発明の間葉系幹細胞の誘引剤は、老化因子産生抑制剤、皮膚老化改善剤として使用することができる。
【００２９】
間葉系幹細胞が、真皮層の細胞の活性を増加させることも知られている。その作用機序は定かではなく、以下のものに限定されるものではないが、間葉系幹細胞が産生するＴＧＦ−βなどのサイトカインが作用するものと考えられる。これにより真皮線維芽細胞が増殖し、また膠原線維や弾性線維などの真皮の弾性成分の産生を促進するとともに、これらの弾性線維や膠原線維の成熟にも関与する。また、間葉系幹細胞が、真皮線維芽細胞の分裂を促進するほかに、間葉系幹細胞自体が線維芽細胞へと分化することで真皮細胞が供給されることで真皮の再生が図られる。本発明の間葉系幹細胞の誘引剤は、膠原線維や弾性線維（例えばコラーゲン、エラスチン又はフィブリン）産生促進剤、真皮再生剤、又は老化改善剤として使用できる。
【００３０】
真皮の再生は、主に真皮の弾性成分が増加し、成熟することで、皮膚の弾力が回復することをいう。皮膚の外観を悪化させ、老けた印象を与えるシワやたるみは、真皮層中における弾性成分である弾性線維や膠原線維の含有量の低下に起因する。したがって、本発明の間葉系幹細胞の誘引剤は、シワ改善剤、たるみやハリの改善剤、老化改善剤として使用できる。
【００３１】
真皮は、線維芽細胞、組織球、肥満細胞、形質細胞、及び樹状細胞などの細胞成分と、細胞の間を埋める間質成分とから主に構成される。間質成分は、コラーゲンから構成される膠原線維、フィブリンやエラスチンから構成される弾性線維、及び線維や細胞の間に存在する糖タンパク質やプロテオグリカンを主成分とする基質に大別される。
【００３２】
本発明の間葉系幹細胞誘引剤は、皮膚のたるみやしわなどの外観の老化を患う対象に投与することができる。たるみの原因は、表情筋の機能低下、表情筋を支えている皮膚の弾力の低下、皮下脂肪の増大等が挙げられ、これらの原因は独立に又は協働して、たるみを引き起こし、外観の老化をもたらす。本発明では、皮膚のたるみを患う対象に投与されるが、このような対象は、たるみの主原因が、皮膚の弾力低下であることが好ましい。また、別の態様では、間葉系幹細胞誘因剤は、真皮の再生を必要とする対象に投与することができる。このような対象において皮膚の損傷部に投与することもできる。皮膚の損傷は、外傷、創傷、火傷、炎症部が挙げられる。特に、間葉系幹細胞の皮膚炎、例えばアトピー性皮膚炎などへの治療効果が知られている。したがって、間葉系幹細胞誘引剤は、皮膚の損傷や皮膚炎、特にアトピー性皮膚炎の治療薬として使用しうる。
【００３３】
間葉系幹細胞は、真皮線維芽細胞の他、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、及び神経細胞等の種々の細胞へと分化することが知られている（非特許文献３）。このような種々の細胞への分化能を利用することで、本発明の間葉系幹細胞の誘引剤を様々な疾患の治療に用いられうる。したがって、本発明のアイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１を含む間葉系幹細胞の誘引剤は、かかる疾患の治療又は予防用の医薬組成物として使用することができる。このような治療・予防用途は、上述される真皮再生、老化改善、創傷治癒などの皮膚に対する使用に限られるものではない。例えば、非特許文献３には、間葉系幹細胞の一つである脂肪幹細胞由来の軟骨細胞が、関節軟骨疾患、例えば変形性関節症等の治療に用いることができること、脂肪幹細胞由来の骨芽細胞が、骨欠損箇所に適用できること、心筋や血管細胞へと分化することで心機能の改善に寄与することが開示されている。さらに、脂肪幹細胞からの分泌因子により、血管新生の亢進、細胞アポトーシスの減少、及び神経発芽の促進が生じることから、脂肪幹細胞が標的細胞に分化する直接的な再生医療への応用の他に、分泌因子を介した間接的な再生医療への応用が期待されている。したがって、本発明の間葉系幹細胞誘引剤は、間葉系幹細胞の治療標的となる症状を治療又は改善するために用いることができる。間葉系幹細胞の治療標的となる症状の改善として、発毛促進、創傷治癒、皮膚の再生、筋肉の再生、軟組織の再生、骨の再生、心筋の再生、又は神経の再生が挙げられる。これらうち、間葉系幹細胞の一つである脂肪幹細胞と発毛促進との関係については、非特許文献４に、皮膚幹細胞の活性を制御する皮膚Niche細胞として機能することで、毛包の再生に寄与することが明らかになっており、脂肪幹細胞の誘引により発毛促進を可能にすることが開示されている。また、脂肪幹細胞と創傷治癒及び/又は皮膚の再生との関係については、非特許文献５に、脂肪幹細胞と真皮線維芽細胞とが接触することで真皮線維芽細胞の増殖を促すことが開示されており、創傷治癒や皮膚の再生に利用可能であることが知られている。さらに、脂肪幹細胞と筋肉再生との関係については、非特許文献６に脂肪幹細胞の移植試験により、コラーゲン６型を標的とする先天性筋ジストロフィーでの治療効果が示されており、間葉系幹細胞の一つである脂肪幹細胞は、筋肉再生にも利用可能であることが開示されている。間葉系幹細胞により治療又は改善される疾患としては、関節軟骨疾患、例えば変形性関節症等、心臓病、筋ジストロフィー、老化が挙げられ、組織の損傷又は創傷が挙げられる。治療組織としては、特に間葉系幹細胞から分化される組織、例えば真皮、血管、筋肉、骨、毛、神経が挙げられ、これらの組織の再生にも利用されうる。したがって、本発明の組成物は、関節軟骨疾患、例えば変形性関節症等、心臓病、筋ジストロフィーの治療又は予防用組成物、又は各種臓器、例えば心臓、肝臓、骨、筋肉、神経、皮膚、毛の再生治療用の組成物として使用することもできる。
【００３４】
本発明の間葉系幹細胞誘引は、経口又は非経口投与など、任意の経路で投与することができるが、皮膚に直接投与する観点から経皮投与が好ましい。経皮投与された間葉系幹細胞誘引剤は、皮膚に存在する毛穴や汗腺などの付属器官を介して浸透することができる。付属器官は、通常真皮層の最深部に達していることから、付属器官を介して浸透することで、真皮層の深部へ薬物を送達しうる。皮膚のたるみ又は老化改善剤は、その粘度、表面張力、親水性、疎水性を適宜選択することができる。さらに、真皮深部への浸透を促進するために、本発明の皮膚のたるみ又は老化改善剤の適用後に、高周波数の振動又は音波を適用することもできる。皮膚の損傷部に投与する観点からは、軟膏や発布剤に剤形することで経皮投与に用いることができる。
【００３５】
本発明の間葉系幹細胞誘引剤は、化粧品、医薬品、又は医薬部外品に配合することができる。美容の目的では化粧品に配合することが好ましい。配合される化粧品の剤型は任意であり、液体、ゲル、気泡、乳液、クリーム、軟膏、シート等の形態で配合して用いることができる。配合される化粧品、医薬品、又は医薬部外品としては、外用薬用製剤、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パック等の基礎化粧料、洗顔料や皮膚洗浄料、除毛剤、脱毛剤、アフターシェーブローション、プレシェーブローション、シェービングクリーム、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ等のメークアップ化粧料、シャンプー、リンス、ヘアートリートメント、プレヘアートリートメント、整髪料、パーマ剤、ヘアートニック、染毛料、育毛・養毛料等の頭髪化粧料、浴用剤など様々な製品に応用できる。
【００３６】
本発明の間葉系幹細胞の誘引剤は、化粧料、医薬品などに配合して生体に投与することができるが、そのような使用に限られるものではない。例えば間葉系幹細胞を誘引する性質を用いて、in vitroにおいて間葉系幹細胞の単離に用いることもできる。
【００３７】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【００３８】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例】
【００３９】
実施例１：老化細胞による、正常細胞への影響
細胞培養
成人（２１歳）の背中の皮膚から樹立された真皮線維芽細胞を、１０％ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地で培養した。通常の線維芽細胞（若い線維芽細胞）として、１ヶ月未満の培養期間であり、Pｄｌ＜３０の細胞を用いた。同細胞を、３ヶ月以上培養し、増殖が遅くなった細胞（倍化時間が０．５／週未満、Ｐｄｌ＞５０）を老化線維芽細胞として用いた。通常の線維芽細胞を１２５０細胞／ｃｍ2の密度となるように、１０％ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地を満たした６ウェルのトランスウェルシステム（Falcon; Franklin Lakes, NJ)の上層に播種した。サブコンストラクト状態の老化線維芽細胞と通常の線維芽細胞を、それぞれトランスウェルシステムの下層の２つのウェルに播種した。トランスウェルシステムの上層及び下層を組み合わせて、３７℃５％ＣＯ2加湿雰囲気下で２日間培養後、上層の細胞と下層の細胞をそれぞれQiazole（Qiagen）を用いて回収した。【００４０】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
回収した細胞ライセートから、RNeasy Protect Kit（Qiagen）を製品説明書に従い用いてＲＮＡを抽出し、そしてSuperscript VILO（Invitrogen）を製品説明書に従い用いてｃＤＮＡへと翻訳した。２８ＳｒＲＮＡを内部標準とし、下記の遺伝子についてのプライマー対を用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロッシュ）にてリアルタイムＰＣＲを行った。結果を図１に示す。Lightcycler software ver.3.5により計算されたサイクル閾値（Ｃｔ値）を、各サンプルのＧＡＰＤＨｍＲＮＡについて正規化した。
【表１】
2019017355.tif 000003
図１（Ａ）に示されるように、老化線維芽細胞を下層に播種した場合、下層に細胞を播種しなかった場合に比べてＭＭＰ１の発現が有意に増加し、またエラスチン及びコラーゲンの発現が有意に減少した。通常の線維芽細胞（若い線維芽細胞）を下層に播種した場合は、下層に細胞を播種しなかった場合に比べて有意な変化が示されなかった。この結果から、老化細胞から、何らかの老化因子が分泌されることにより、培地を共有する真皮線維芽細胞において、遺伝子発現の変化が生じることが明らかになった。【００４１】
老化線維芽細胞において発現が増加する遺伝子の特定
若い線維芽細胞と、老化線維芽細胞とにおける遺伝子発現の違いを、マイクロアレイ分析により調べた。若い線維芽細胞の遺伝子発現量と比較して、２．５倍以上の発現量を示した遺伝子を同定した。下記の表に記載の遺伝子を老化因子の候補とした：【００４２】
【表２】
2019017355.tif 000004
【００４３】
これらの老化因子の候補遺伝子のうち、ＣＦＤをノックダウンするようにｓｉＲＮＡを設計し（SI00030100又はSI00030107；Qiagen、両者は同様の阻害効果を有する）、ネガティブコントロールとしてｓｉＲＮＡ（SI030640318；Qiagen）を用いた。ｓｉＲＮＡを老化線維芽細胞に導入して、ＣＦＤ遺伝子をノックダウンした細胞を、上述の細胞培養法に従い、トランスウェルシステムの下層に播種し、上層の細胞と共に２日間培養を行った。下層の細胞と上層の細胞をそれぞれ取得し、下層の細胞についてはＣＦＤの発現、上層の細胞についてはＭＭＰ１の遺伝子発現を調べた。ＣＦＤがノックダウンされた老化線維芽細胞を下層に播種した場合に、上層の細胞からのＭＭＰ１の発現が低下した。結果を図２に示す。この結果により、ＣＦＤが老化因子であることを特定した。【００４４】
老化細胞における老化因子の発現
本発明者らにより特定された老化因子（ＣＦＤ）及び候補老化因子（ＩＧＦＢＰ７、ＲＳＰＯ４）の発現を、老化線維芽細胞と若い線維芽細胞とで比較した。老化線維芽細胞及び若い線維芽細胞をそれぞれ培養し、Qiazole（Qiagen）を用いて回収した。回収された細胞ライセートを、上述のＲＴ-ＰＣＲと同様の手法を用いて、老化因子の発現を調べた。下記のプライマー対を用いた。結果を図３に示す。本発明で特定された老化因子及び候補老化因子は、ともに老化線維芽細胞で発現が高くなることが示された。
【表３】
2019017355.tif 000005
【００４５】
老化因子の添加
候補老化因子（ＩＧＦＢＰ７、ＲＳＰＯ４）のタンパク質（Serotec、R&D SYSTEMSより購入）を若い線維芽細胞を培養する培地に、０μg/ｍｌ、１０μｇ/ｍｌの濃度で添加し、２日間培養後、細胞をそれぞれQiazole（Qiagen）を用いて回収した。回収した細胞ライセートについて、定量的ＲＴ−ＰＣＲの欄で記載したのと同様に、ＭＭＰ１及びコラーゲンの発現量を調べた。結果を図４に示す。ＩＧＦＢＰ７及びＲＳＰＯ４は、コラーゲンの発現を低下させ、またＭＭＰ１の発現を増加させた。これにより、ＩＧＦＢＰ７及びＲＳＰＯ４も老化因子として作用することが示された。【００４６】
実施例２：間葉系幹細胞による正常細胞の活性化
細胞培養
真皮線維芽細胞はLonzaより購入し、１２５０細胞／ｃｍ2の密度となるように、１０％ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地を満たした６ウェルのトランスウェルシステム（Falcon; Franklin Lakes, NJ)の上層に播種した。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）はLonzaより購入し、Gibco培地にて培養した。サブコンストラクト状態のＭＳＣを、トランスウェルシステムの下層のウェルに播種した。２４時間後に培地を１０％ＦＢＳ、２５０ｕＭアスコルビン酸を含むＤＭＥＭに交換し、共培養を開始した。７日後に上層をパラホルムアルデヒドにて固定し、ＨＥ染色を行い観察した（図５Ａ）。上層の厚みを計測して示した（図５Ｂ）。対照群としてＭＳＣ無しで線維芽細胞単独で培養を行った。ＭＳＣ存在下では、真皮線維芽細胞が活性化し、細胞の重層程度が増大した（スチューデントｔ検定：Ｐ＜０．０５）。【００４７】
実施例３：間葉系幹細胞によるコラーゲンゲルの成熟
細胞培養
Lonzaから取得した線維芽細胞が保持するコラーゲンゲルを、１０％ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地を満たした６ウェルのトランスウェルシステム（Falcon; Franklin Lakes, NJ)の上層に配置した。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）はLonzaより購入し、MessenPro培地にて培養した。サブコンストラクト状態のＭＳＣを、トランスウェルシステムの下層のウェルに播種した。２４時間後に培地を１０％ＦＢＳ、２５０ｕＭアスコルビン酸を含むＤＭＥＭに交換し、培養を開始した。２日後に上から撮影を行い、コラーゲンゲルの表面積を比較した。対照群としてＭＳＣ無しでコラーゲンの培養を行った。結果を図６に示す（スチューデントｔ検定：Ｐ＜０．０５）。ＭＳＣが存在下では、コラーゲンゲルが収縮していることが分かる。この収縮は、コラーゲンが成熟することに伴い、弾力が増した結果と考えられる。【００４８】
実施例４：間葉系幹細胞による老化因子の抑制
細胞培養
老化線維芽細胞を、１２５０細胞／ｃｍ2の密度となるように、１０％ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地を満たした６ウェルのトランスウェルシステム（Falcon; Franklin Lakes, NJ)の上層に播種した。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）はLonzaより購入し、MessenPro培地にて培養した。サブコンストラクト状態のＭＳＣを、トランスウェルシステムの下層のウェルに播種した。２４時間後に培地を１０％ＦＢＳ、２５０μＭアスコルビン酸を含むＤＭＥＭに交換し、共培養を開始した。２日後にQiazole（Qiagen）を用いて細胞を回収した。回収された細胞ライセートを、上述のＲＴ-ＰＣＲと同様の手法を用いて、老化因子（ＩＧＦＢＰ７）の遺伝子発現を調べた。結果を図７に示す。対照群としてＭＳＣ無しで線維芽細胞単独で培養を行った。ＭＳＣ存在下では、ＩＧＦＢＰ７の遺伝子発現は有意に減少した（スチューデントｔ検定：Ｐ＜０．０５）。【００４９】
実施例５：間葉系幹細胞の誘引作用の決定
間葉系幹細胞の誘引試験
間葉系由来幹細胞（Lonza)を、MessenPro RS培地(DMEM；GIBCO/BRL (Carlsbad, CA))を含むフラスコ中で、３７℃５％ＣＯ2加湿下で培養した。サブコンフルエントになった際にAccutase（PAA (Linz, Austria)）を用いて細胞を回収し、そして２μMのPKH６７（Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)）を用いて製品説明書に従い標識化した。３×１０4標識細胞／wellを２４well Fluoroblok plate(Becton Dickinson (Mountain View, CA))の上部ウェルに播種した。６時間のインキュベーション後に、培地をサプリメントを伴わないMessenPro RS培地(DMEM；GIBCO/BRL (Carlsbad, CA))に置き換えた。インキュベーションを１２時間続け、試験物質をFluoroblokの下部ウェルに０．１％の濃度で加えた。８時間後、Fluorobolok膜の下側を、蛍光フィルターを備えた顕微鏡を通して写真を撮り、膜を通して誘引された細胞を、Image J. を用いて孔サイズよりも大きい蛍光領域として計数した。脂肪由来幹細胞の誘引活性は、対照ウェルでの蛍光値と、試験ウェルでの蛍光値との比較により評価した。【００５０】
試験抽出物として、多数の化粧品素材をスクリーニングに供したところ、その中で、
アイリス抽出物（香栄興業）、オリーブ葉抽出物（丸善製薬）、及びカミツレ抽出物（丸善製薬）が、優れた間葉系幹細胞誘因活性を有することが示された。アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物を添加したウェルは、抽出物を伴わず、抽出溶媒のみを含む対照ウェルと比較して有意に高い蛍光を示した（表１、図５Ａ及びＢ、スチューデントｔ検定：Ｐ＜０．０５）。アイリス抽出物、オリーブ葉抽出物、及びカミツレ抽出物の場合、その抽出溶媒は、５０％ブチレングリコールであり、試験抽出物の代わりにこの溶媒のみを対照ウェルに加えた。
【図１】
2019017355.tif 000006
【図２】
2019017355.tif 000007
【図３】
2019017355.tif 000008
【図４】
2019017355.tif 000009
【図５】
2019017355.tif 000010
【図６】
2019017355.tif 000011
【図７】
2019017355.tif 000012
【図８】
2019017355.tif 000013
【配列表】
2019017355000001.app
【国際調査報告】
2019017355.tif 000014
2019017355.tif 000015
2019017355.tif 000016
2019017355.tif 000017
2019017355.tif 000018