(57)【要約】【課題】先天性疾患や腫瘍性疾患において、疾患責任遺伝子のエクソン毎の遺伝子変異の有無を、迅速・簡便に行う新規スクリーニング方法の開発。【解決手段】先ず、遺伝子変異を含むエクソンからなるヘテロデュプレックス産物をヘテロ接合部位特異的エンドヌクレアーゼやミスマッチを切断する化学物質で切断処理する。  次に、各エクソンのＰＣＲ産物を形成したプライマーの更にネスティッドプライマーをイントロン・コンセンサス領域に隣接するように設計してリアルタイムＰＣＲを施行し、野生型コントロールとの比較定量を行うことで、遺伝子変異のあるエクソンの有無を検出することができる。  本発明方法は、定量ＰＣＲ法を利用した遺伝子変異スクリーニング方法であり、定量法を利用することで高価な機器を用いることなく、迅速・簡便・安価に施行できる。本発明方法は、既存の先行技術では検出が困難なエクソン末端の変異をも正確に検出可能であり、先天性疾患や腫瘍性疾患の遺伝子変異部位の同定に有用である。【選択図】  図１
2010008071.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の手順が含まれることを特徴とする遺伝子変異のスクリーニング法。
（１）標的とする疾患遺伝子の各エクソンおよびイントロンのコンセンサス領域より外側にプライマーを設計し、ＰＣＲにて増幅する。
（２）ホモ接合型の遺伝子変異の場合、全て野生型の健常者遺伝子と変異型エクソンを含む患者遺伝子のＰＣＲ産物を等量ずつ混合するかまたは、ヘテロ接合型の遺伝子変異の場合、患者遺伝子のＰＣＲ産物のみを用いて、それぞれデュプレックスを形成させる。
（３）ヘテロ接合部位の切断処理を行う。
（４）イントロンのコンセンサス領域より外側に隣接するようにプライマーを設計し、リアルタイムＰＣＲにて各デュプレックスを増幅・定量する。
（５）野生型であるコントロールと比較し、量的な差異をみることで、遺伝子変異の有無を検出する。
【請求項２】
手順（１）において、標的とする疾患遺伝子の各エクソンおよびイントロンのコンセンサス領域より５塩基以上外側にプライマーを設計することを特徴とする請求の範囲１記載の遺伝子変異のスクリーニング方法。
【請求項３】
ヘテロ接合部位の切断がヘテロ接合部位特異的エンドヌクレアーゼもしくは一本鎖ＤＮＡ分解酵素での処理による切断、または化学物質を使用した切断であることを特徴とする請求の範囲１または２記載の遺伝子変異のスクリーニング法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リアルタイムＰＣＲを用いた定量法を利用して遺伝子変異のスクリーニングを迅速・簡便に行う新規方法である。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の特定領域における変異・欠失は、種々の先天性疾患および癌などの腫瘍性疾患の発症要因となるため、変異部位の同定は確定診断や治療方針の決定に役立つだけでなく、疾患メカニズムの解明や治療法の開発にとっても重要である。
先天性疾患や腫瘍性疾患の遺伝子検査を行うためには、疾患に関る全ての責任遺伝子に対して遺伝子変異部位の検出が必要となる。
しかし、責任遺伝子の数は１つとは限らず、また、１つの責任遺伝子が多数のエクソンを持つ場合もあるため、疾患に関わる遺伝子変異部位を検出するのは容易な作業ではない。
疾患によっては検査に膨大な時間、費用、労力を要するため、遺伝子検査自体を躊躇せざるを得ない場合も稀ではない。
そこで、効率的な遺伝子検査を実施する目的で、シークエンシングする前に遺伝子変異の有無をエクソン毎にスクリーニングする方法が用いられている。
例えば、ＳＳＣＰ (single-strand conformational polymorphism：一本鎖高次構造多型)法やＤＨＰＬＣ（Denaturing high performance liquid chromatography：熱変性高速液体クロマトグラフィー) 法などが挙げられる。
また、ヘテロデュプレックス(Heteroduplex)形成後にヘテロ接合部位特異的エンドヌクレアーゼ(endonuclease)処理し、変異を検出するスクリーニング法は幾つかの方法が知られている（例えば、特許文献１など）。【０００３】
【特許文献１】特表２００２−５１２０４３号公報
【非特許文献１】HUMAN MUTATION,27(12),1163-1173(2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記ＳＳＣＰ  やＤＨＰＬＣは既に導入されている施設も多いが、機器が高価である上、変異部位がエクソン末端に位置する場合、偽陰性のリスクが高くなるという欠点が克服されていない。
一方、ヘテロデュプレックスのヘテロ接合部位特異的エンドヌクレアーゼ処理を用いたスクリーニング法の一つとして、エンドヌクレアーゼ処理したＰＣＲ産物（各エクソン）をラベリングした後、オートシークエンサーのキャピラリーに泳動する方法がある。
この方法は正確な変異検出が可能であるが、手間が掛かる上に検出に長時間を要し、試薬代も高価となる。
また、別法として、エンドヌクレアーゼ処理したＰＣＲ産物（各エクソン）をそのままアガロース・ゲルに泳動する方法がある。
この方法では変異部位がＰＣＲ産物（各エクソン）の両端付近にあると検出不可能となる。
この解決法としてプライマーを更に１５０塩基程外側（イントロン内領域）に設定する方法が提唱されているが、イントロンは変異が生じ易いため、偽陽性の確率が高くなってしまう。
このように、迅速性、簡便性、正確性、経済性の全てに優れたスクリーニング法は未だ存在しないのが現状である（非特許文献１）。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明方法は、ヘテロデュプレックスのヘテロ接合部位を特異的に切断処理した後、デュプレックス形成用のプライマーより内側に、ネスティッドプライマー（nested primer）をイントロンのコンセンサス領域に隣接するように設計してリアルタイムＰＣＲを行い、野生型コントロールとの比較定量を行う（図１参照）ことにより、迅速・簡便・安価に変異の有無をスクリーニングする方法である。
本発明方法であれば、例え変異部位がエクソン末端に位置していても容易に検出可能であり、既存のスクリーニング法の様々な欠点を解決することができる。
以下、詳細に本発明を説明する。【０００６】
本発明方法は、以下の手順からなる方法である。
操作１：標的とした疾患遺伝子の各エクソンおよびイントロンのコンセンサス領域より外側にプライマーを設計し、ＰＣＲにて増幅する。
操作２：ホモ接合型の遺伝子変異（常染色体劣性遺伝病など）の場合、健常者遺伝子（全て野生型）と患者遺伝子（変異型を含む）のＰＣＲ産物を等量ずつ混合、ヘテロ接合型の遺伝子変異（常染色体優性遺伝病など）の場合、患者遺伝子のＰＣＲ産物のみを用いて、それぞれデュプレックスを形成させる。
操作３：ヘテロ接合部位の切断処理を行う。
操作４：切断処理されたＰＣＲ産物に対して、そのイントロンのコンセンサス領域より外側に隣接するようにプライマーを設計し、リアルタイムＰＣＲにて各デュプレックスを増幅・定量する。
操作５：野生型であるコントロールと比較し、量的な差異をみることで、遺伝子変異の有無を検出する。【０００７】
＜操作１＞
本発明方法が標的とする遺伝性疾患としては、例えば、先天性第ＶＩＩ因子欠乏症、全身白子、先天性魚鱗癬、テイ・サックス病、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、ガラクトース血症、糖原病Ｉ型、ウイルソン病、ウェルナー症候群、嚢胞性線維症、先天性筋ジストロフィー、鎌状赤血球貧血などの常染色体劣性遺伝病、先天性アンチトロンビン欠乏症、先天性プロテインＳ欠乏症などの常染色体優性遺伝病、血友病などの伴性劣性遺伝病が挙げられる。
これらの疾患責任遺伝子の各エクソンを標的としてスクリーニングを行う。
操作１におけるプライマー（デュプレックス用プライマー）は、標的としたエクソンおよびイントロンのコンセンサス領域より外側になるように設計する。【０００８】
具体的には、プライマーの設計において、エクソンが大きい場合はＰＣＲを複数に分けるように設計する。
また、エクソンとイントロンの境界領域においては、イントロン内のコンセンサス配列（スプライシング時にｓｎＲＮＰｓが認識する配列）より少なくとも数塩基（５〜６塩基）以上外側に設定すればよく、好ましくは、数塩基〜１００塩基、より好ましくは、数十〜百塩基外側に離して設計すれば良い。
これにより、操作４の定量用プライマーがネスティッドＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ）となってターゲットの特異性が増すと共に、操作３で用いるエンドヌクレアーゼの非特異的なエキソヌクレアーゼ活性が定量用プライマー領域に及ぼす悪影響（プライマー領域が削り取られてプライマーが付かなくなること）を避けることが出来る。
ＰＣＲで使用する熱耐性ＤＮＡポリメラーゼは、複製ミスが生じないように校正機能のあるもの、例えば、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。
その他、ＰＣＲ条件などは、常法に従えばよい。【０００９】
＜操作２＞
患者検体を用いてデュプレックスを形成させる。
具体的には、ホモ接合型の遺伝子変異（常染色体劣性遺伝病など）の場合は健常者の遺伝子（ＰＣＲ産物）と患者の遺伝子（ＰＣＲ産物）とを１対１で混合、ヘテロ接合型の遺伝子変異（常染色体優性遺伝病など）の場合は患者自身の遺伝子（ＰＣＲ産物）のみを用いて、それぞれデュプレックスを形成させる。
その結果、変異の無いエクソンではホモデュプレックスのみ、変異のあるエクソンではホモデュプレックス：ヘテロデュプレックス＝１：１の割合で形成される。【００１０】
＜操作３＞
ヘテロ接合部位特異的な切断処理を行う。
具体的には、形成したデュプレックスを、ヘテロ接合部位特異的エンドヌクレアーゼであるＣＥＬ１やＴ７ヌクレアーゼまたは一本鎖ＤＮＡ分解酵素であるＳ１ヌクレアーゼなどを用いて処理すると、ヘテロデュプレックスのみミスマッチ部位で切断される。
また、ヌクレアーゼのような酵素の代わりにピペルジンなどの化学物質を使ってミスマッチ部位を切断する方法（Chemical Cleavage of Mismatch法）も使用できる。【００１１】
＜操作４＞
切断処理されたＰＣＲ産物（各エクソン）のイントロン・コンセンサス領域より外側に隣接するようにプライマーを設計してリアルタイムＰＣＲを行い、各デュプレックスを増幅・定量する。
リアルタイムＰＣＲのテンプレートとしては、デュプレックスでヌクレアーゼ処理したものと処理していないものをそれぞれ等量ずつ希釈（４００倍〜５００倍程度）して用いる。【００１２】
本操作での定量用プライマーは、最初のデュプレックス用プライマー（操作１）と同じプライマーを用いてもよい。
ここで、リアルタイムＰＣＲの特異性を高める目的、且つ、エキソヌクレアーゼ活性が生じた場合の偽陽性を避ける目的で、ネスティッドＰＣＲの手法を応用し、定量用プライマーをデュプレックス用プライマーより更に内側（数塩基〜百塩基程度まで）に離して設計することが好ましい。
また、定量用プライマーは、イントロン・コンセンサス配列より外側に隣接するように設計することで、イントロンのコンセンサス配列を含む全てのエクソン領域中の変異を検出することができる。【００１３】
＜操作５＞
定量用プライマー（操作４）を用いたリアルタイムＰＣＲ（SYBR Green Iなどインターカレーター用蛍光色素を使用）にてイントロン・コンセンサス領域を含む各エクソンの両端から増幅・定量すると、ホモデュプレックスのみのエクソン（変異の無いエクソン）では切断処理していない場合に比較して減少することは無いが、ヘテロデュプレックスを含むエクソン（変異のあるエクソン）では理論上５０％に減少するため、遺伝子変異の有無を簡便に検出できる。
リアルタイムＰＣＲの増幅効率が最大の場合、５０％の差異は１サイクル分に相当する。
しかし機器に小幅ながら測定誤差が含まれるため、５０％の差異を１サイクル以上の差異として表出した方がより確実にスクリーニングすることが可能となる。
そこで、インターカレーター用蛍光色素がＰＣＲ阻害作用を持つことを利用し、インターカレーター用蛍光色素の濃度を上げてリアルタイムＰＣＲを行うことで、サイクル数の差異を大きくしてスクリーニングを容易にすることが出来る。
また、他のＰＣＲ阻害物質を加えることでも同じ効果が得られる。【００１４】
ヘテロ接合部位特異的エンドヌクレアーゼや一本鎖ＤＮＡ分解酵素に非特異的なヌクレアーゼ活性が生じることがある。
すなわち、ホモデュプレックスのみの野生型コントロールでも切断処理後に減少する場合がある。
また、ＰＣＲ条件によっては増幅効率に差がみられる場合もあるため、野生型コントロール無しでの減少率では結果にばらつきが生じる。
そこで、ヌクレアーゼなどの非特異的な活性や、ＰＣＲ条件による増幅効率への影響を排除するため、以下の２段階の補正方法を用いることが好ましい。
（１）患者検体と同様、エクソン毎に野生型コントロールを準備し、各エクソンのデュプレックスを等量ずつ、切断処理しないものと切断処理したものに分けて定量する。
この時、切断処理しないデュプレックスを１００として補正し、切断処理したデュプレックスをそれぞれ定量する。
その結果、野生型コントロール、患者検体共に、非特異的ヌクレアーゼ活性等の影響を受けた減少率を得る。
（２）次に、患者検体の各エクソンの減少率を、野生型コントロールの各エクソンの減少率を１００として補正する。
この補正で得られた結果を、各エクソンの真の減少率とすることで、非特異的ヌクレアーゼ活性などの影響を結果から排除することが出来る。【００１５】
本発明方法は、常染色体劣性遺伝病（先天性第ＶＩＩ因子欠乏症、全身白子、先天性魚鱗癬、テイ・サックス病、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、ガラクトース血症、糖原病Ｉ型、ウイルソン病、ウェルナー症候群、嚢胞性線維症、先天性筋ジストロフィー、鎌状赤血球貧血など）や伴性劣性遺伝病（血友病など）の遺伝子変異を検出するキットに利用することができる。
キットは、ヘテロデップレックス形成用として遺伝子変異や一塩基多型の無い完全な野生型（Ｗｉｌｄ  Ｔｙｐｅ）遺伝子、疾患特異的プライマーセット、ヘテロ接合部位特異的ヌクレアーゼ酵素または一本鎖ＤＮＡ分解酵素、緩衝液などをキットの構成要素とすればよい。
また、該キットにおいて野生型遺伝子は、定量用コントロールとすることもできる。
【発明の効果】
【００１６】
先天性疾患や癌の遺伝子変異部位を同定しようとする場合、本発明方法のようなスクリーニング方法にて事前に各エクソンの変異の有無をスクリーニングすれば、変異のあるエクソンのみシークエンス出来るため、全エクソンをシークエンスする場合に比較して、時間・手間・費用全てを大幅に軽減することが出来る。
ここで、既存のスクリーニング法には無い、本発明のスクリーニング方法における技法とその発明効果について列挙する。【００１７】
（１）デュプレックス用のＰＣＲプライマーを外側に設計し、エンドヌクレアーゼ処理後、定量用プライマーはイントロン・コンセンサス領域に隣接するように設計する。
この方法により、
i）ネスティッドＰＣＲとしてターゲット遺伝子の特異性が上がる、
ii）エンドヌクレアーゼの非特異的エキソヌクレアーゼ活性を無効化できる、
iii）エクソン末端の変異をも容易に検出できる（偽陰性の主原因を解決）、
iv）スクリーニングに必要な領域（イントロンのコンセンサス配列を含む全てのエクソン領域）のみチェックできるため偽陽性が生じ難い。
（２）常に野生型をコントロールとして対野生型比（野生型を１００とする）を算出し、その補正値で値を出すことで、エンドヌクレアーゼの非特異的なヌクレアーゼ活性を無効化できる。
その他の手技上、或いは測定上の影響を最小限にする様、補正することができる。
（３）本発明方法はリアルタイムＰＣＲの定量法を用いた初の遺伝子変異スクリーニング法であるが、定量法を用いることで、エクソン末端に変異があっても、エクソンの中心に位置する変異と同様、容易な検出が可能となる。
更には、リアルタイムＰＣＲの特性を生かした、迅速・簡便・安価なスクリーニング方法を実現することができる。
（４）先天性アンチトロンビン欠乏症のような常染色体優性遺伝病を含めた全ての先天性疾患に対する、キット化ができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】定量法を利用した新規スクリーニング法の概要を示す。
【図２】２種類のプラスミドＤＮＡ（リファレンスＧとリファレンスＣ）の塩基配列における相違する塩基（ＧとＣの違い、囲み文字）を示す。
【図３】遺伝子変異を含むエクソンと同様の産物となるヘテロデュプレックス産物をヘテロ接合部位特異的エンドヌクレアーゼで処理した後、リアルタイムＰＣＲにて定量したものを示す（超純水で処理したデュプレックス産物を１００として補正）。尚、図中の“Ｈｏｍｏ“とは野生型のみのデュプレックス産物を意味し、”Ｈｅｔｅｒｏ“とは野生型と変異型を１：１で混合したデュプレックス産物を意味する。
【図４】プロテインＳ欠損症の患者検体を用い、本発明方法にてエクソン末端に位置する遺伝子変異を検出した結果を示す（野生型コントロールを１００として補正）。
【図５】アンチトロンビン欠乏症の患者検体を用い、本発明方法にてイントロンのコンセンサス領域に位置する遺伝子変異を検出した結果を示す（野生型コントロールを１００として補正）。
【図６】アンチトロンビン欠乏症の患者検体と正常検体（野性型）を１：１で混合した試料に対して本発明方法を実施した結果を示す（野生型コントロールを１００として補正）。
【図７】アンチトロンビン欠乏症の患者検体を用い、一本鎖ＤＮＡ分解酵素を用いた本発明方法にてエクソンの中心領域に位置する遺伝子変異を検出した結果を示す（野生型コントロールを１００として補正）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、実施例で本発明を説明するが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００２０】
リファレンスＧ（配列番号１）およびリファレンスＣ（配列番号２）の塩基配列を含む２種類のプラスミドＤＮＡを使用した。
相違は図１の囲み文字ＧとＣの違いのみである。
（１）プライマーセット
Forward Primer: ACACCTGATCAAGCCTGTTCATTTGATTAC（配列番号３）
Reverse Primer: CGCCAAAGAATGATCTGCGGAGCTT（配列番号４）
プライマーはＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲで共通。
（２）デュプレックス形成
上記のプライマーを用いて、リファレンスＧ、およびリファレンスＣのＰＣＲ産物（632bp：PolymeraseはKODを使用）を得た後、ホモデュプレックス（リファレンスＧのみ）、ヘテロデュプレックス（リファレンスＧ、およびリファレンスＣを1対1で混合）をそれぞれ形成させた。
・デュプレックス形成条件（サーマルサイクラー使用）
95℃              2 min
95℃〜85℃        5 sec. (2℃/sec.)
85℃〜25℃      600 sec. (0.1℃/sec.)
4℃               2 min 以上
（３）酵素処理
ＣＥＬ１ヌクレアーゼで４２℃、２０分間、次いで、４℃、２分間処理した。
（４）リアルタイムＰＣＲによる定量
上記（１）のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。
定量検体は以下の４つ。
・Homo + water → ホモデュプレックスのみを超純水にて処理したもの。
・Homo + CEL1  → ホモデュプレックスのみをヘテロ接合部位特異的エンドヌクレアーゼ（CEL1）にて酵素処理したもの。
・Hetero + water → ホモデュプレックスとヘテロデュプレックスが１：１での存在下、超純水にて処理したもの。
・Hetero + CEL1  → ホモデュプレックスとヘテロデュプレックスが１：１での存在下、ヘテロ接合部位特異的エンドヌクレアーゼ（CEL1）にて酵素処理したもの。
（４）結果
図３に示すように、ホモデュプレックスとヘテロデュプレックスが１：１で存在する場合、ヘテロ接合部位特異的エンドヌクレアーゼにて酵素処理し定量すると、超純水処理のコントロールと比較して約５０％に減少する為、簡便に変異の有無を検出可能である。
【実施例２】
【００２１】
プロテインＳ欠損症で、エクソン２の末端にヘテロ接合型の変異（×印）がある患者検体に対して、本発明方法を実施した。
先行技術では検出の非常に困難な部位である。
（１）プライマーセット
デュプレックス形成用ＰＣＲプライマー（PROS1遺伝子、エクソン２増幅）
Forward Primer: GGCAGAAAATGATTTTAACTCTTATTGT（配列番号５）
Reverse Primer: TGGAAATGTTCAGTCTGTAGTTGTAT（配列番号６）
リアルタイムＰＣＲ用プライマー
Forward Primer: ATATAAACTGATTGTTTCCTTC（配列番号７）
Reverse Primer: AGTTTCCATAAATGCTTACCGTT（配列番号８）
（２）デュプレックス形成
上記のデュプレックス形成用ＰＣＲプライマーを用いて、健常者DNAと患者ＤＮＡのPROS1遺伝子、エクソン２領域（polymeraseはKODを使用）を得た後、ホモデュプレックス（健常者検体のみ）、ヘテロデュプレックス（患者検体のみ）をそれぞれ形成させた。
・デュプレックス形成条件（サーマルサイクラー使用）：実施例１に同じ。
（３）酵素処理：実施例１に同じ。
（４）リアルタイムＰＣＲによる定量
上記（１）のリアルタイムＰＣＲ用プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。
定量検体は以下の４つ。
・野生型のデュプレックスのみを超純水にて処理したもの。
・野生型のデュプレックスのみをヘテロ接合部位特異的エンドヌクレアーゼ（CEL1）にて酵素処理したもの。
・患者検体によるホモデュプレックスとヘテロデュプレックスが１：１での存在下、超純水にて処理したもの。
・患者検体によるホモデュプレックスとヘテロデュプレックスが１：１での存在下、ヘテロ接合型特異的エンドヌクレアーゼ（SEL1）にて酵素処理したもの。
（５）結果
図４に示すように、患者検体では、野生型コントロールの変動量を１００として補正した場合の理論値（５０％）に近い４６．２５％に減少する為、先行技術では検出の困難なエクソン末端の変異であっても容易に検出可能であることが示された。
【実施例３】
【００２２】
アンチトロンビン欠乏症で、エクソン５に隣接したイントロン領域コンセンサス配列末端にヘテロ接合型の変異（×印）がある患者検体に対して、本発明方法を実施した。先行技術では検出の非常に困難な部位である。
（１）プライマーセット
デュプレックス形成用ＰＣＲプライマー（Antithrombin遺伝子、エクソン５増幅）
Forward Primer: CCAAAGGATCTCTTAATCCAAACTGA（配列番号９）
Reverse Primer: GCATGCCTTAACACTGGAAAC（配列番号１０）
リアルタイムＰＣＲ用プライマー
Forward Primer: TCTGTGGATTGAAGCCAACTTT（配列番号１１）
Reverse Primer: CTGCTGTTCATGCATCTCCT（配列番号１２）
（２）デュプレックス形成
上記のデュプレックス形成用ＰＣＲプライマーを用いて、健常者ＤＮＡと患者ＤＮＡのアンチトロンビン遺伝子、エクソン５領域（polymeraseはKODを使用）を得た後、ホモデュプレックス（健常者検体のみ）、ヘテロデュプレックス（患者検体のみ）をそれぞれ形成させた。
・デュプレックス形成条件（サーマルサイクラー使用）：実施例１に同じ。
（３）酵素処理：実施例１に同じ。
（４）リアルタイムＰＣＲによる定量
上記（１）のリアルタイムＰＣＲ用プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。
定量検体は以下の４つ。
・野生型のデュプレックスのみを超純水にて処理したもの。
・野生型のデュプレックスのみをヘテロ接合部位特異的エンドヌクレアーゼ（CEL1）にて酵素処理したもの。
・患者検体によるホモデュプレックスとヘテロデュプレックスが１：１での存在下、超純水にて処理したもの。
・患者検体によるホモデュプレックスとヘテロデュプレックスが１：１での存在下、ヘテロ接合型特異的エンドヌクレアーゼ（SEL1）にて酵素処理したもの。
（５）結果
図５に示すように、患者検体では、野生型コントロールの変動量を１００として補正した場合の理論値（５０％）に近い４２．４３％に減少する為、先行技術では検出の非常に困難なイントロン・コンセンサス領域末端の変異であっても容易に検出可能であることが示された。
【実施例４】
【００２３】
アンチトロンビン欠乏症は抗原量によってI型とII型のパターンがあり、II型の場合、常染色体優性遺伝、或いは常染色体劣性遺伝のどちらの可能性もあり得る。
従って、II型を想定して患者検体と野性型を１：１で混合し、本発明方法を実施した。
尚、患者検体はエクソン４の中心付近にヘテロ接合型の変異（×印）が存在する検体を使用した。
（１）プライマーセット
デュプレックス形成用ＰＣＲプライマー（アンチトロンビン遺伝子、エクソン４増幅）
Forward Primer: ACACTATAATATGGATATGCTTGTGTCAAT（配列番号１３）
Reverse Primer: GCTCCTTTCTATTCTTTCTCCAAC（配列番号１４）
リアルタイムＰＣＲ用プライマー
Forward Primer: CCTCCTATGAATGTTTGTGT（配列番号１５）
Reverse Primer: CTTTTGGTCAGACTACCTT（配列番号１６）
（２）デュプレックス形成
上記のデュプレックス形成用ＰＣＲプライマーを用いて、健常者ＤＮＡと患者ＤＮＡのアンチトロンビン遺伝子、エクソン４領域（polymeraseはKODを使用）を得た後、ホモデュプレックス（健常者検体のみ）、ヘテロデュプレックス（健常者デュプレックスと患者デュプレックスを１：１で混合）をそれぞれ形成させた。
・デュプレックス形成条件（サーマルサイクラー使用）：実施例１に同じ。
（３）酵素処理：実施例１に同じ。
（４）リアルタイムＰＣＲによる定量
上記（１）のリアルタイムＰＣＲ用プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。
定量検体は以下の４つ。
・野生型のデュプレックスのみを超純水にて処理したもの。
・野生型のデュプレックスのみをヘテロ接合部位特異的エンドヌクレアーゼ（CEL1）にて酵素処理したもの。
・健常者（野生型）検体と患者検体によるホモデュプレックスとヘテロデュプレックスが３：１での存在下、超純水にて処理したもの。
・健常者（野生型）検体と患者検体によるホモデュプレックスとヘテロデュプレックスが３：１での存在下、ヘテロ接合型特異的エンドヌクレアーゼ（SEL1）にて酵素処理したもの。
（５）結果
図６に示すように、患者検体では、野生型コントロールの変動量を１００として補正した場合の理論値（７５％）に近い７６．４１％に減少する為、先天性アンチトロンビン欠乏症II型の様なホモ接合型かヘテロ接合型かが不明な変異においても、患者検体と健常者検体を１：１で混合することで、容易に変異検出が可能であることが示された。
【実施例５】
【００２４】
アンチトロンビン欠乏症で、エクソン１の中心付近にヘテロ接合型の変異（×印）がある患者検体に対して、一本鎖DNA分解酵素（Ｓ１ヌクレアーゼ）を用いて本発明方法を実施した。
（１）プライマーセット
デュプレックス形成用ＰＣＲプライマー（Antithrombin遺伝子、エクソン１増幅）
Forward Primer: TGGGCTCTACACTTTGCTT（配列番号１７）
Reverse Primer: GAGGTCATTCCTGTGAGTC（配列番号１８）
リアルタイムＰＣＲ用プライマー
Forward Primer: TCATCAGCCTTTGACCTCA（配列番号１９）
Reverse Primer: GAGGTCACAAAACCCAGTAG（配列番号２０）
（２）デュプレックス形成
上記のデュプレックス形成用ＰＣＲプライマーを用いて、健常者ＤＮＡと患者ＤＮＡのアンチトロンビン遺伝子、エクソン１領域（polymeraseはKODを使用）を得た後、ホモデュプレックス（健常者検体のみ）、ヘテロデュプレックス（患者検体のみ）をそれぞれ形成させた。
・デュプレックス形成条件（サーマルサイクラー使用）：実施例１に同じ。
（３）酵素処理：Ｓ１ヌクレアーゼ、２３℃  １５分
（４）リアルタイムＰＣＲによる定量
上記（１）のリアルタイムＰＣＲ用プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。
定量検体は以下の４つ。
・野生型のデュプレックスのみを超純水にて処理したもの。
・野生型のデュプレックスのみを一本鎖DNA分解酵素（Ｓ１ヌクレアーゼ）にて酵素処理したもの。
・患者検体によるホモデュプレックスとヘテロデュプレックスが１：１での存在下、超純水にて処理したもの。
・患者検体によるホモデュプレックスとヘテロデュプレックスが１：１での存在下、一本鎖DNA分解酵素（Ｓ１ヌクレアーゼ）にて酵素処理したもの。
（５）結果
図７に示すように、患者検体では、野生型コントロールの変動量を１００として補正した場合の理論値（５０％）に比べ、６４．２２％に減少するため、変異の有無の判定基準となる減少率の線引きを行えば、一本鎖DNA分解酵素を用いても十分スクリーニングが可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
先天性疾患の遺伝子変異部位を同定しようとする場合、本発明のスクリーニング法にて事前に各エクソンの変異の有無をスクリーニングすれば、変異のあるエクソンのみシークエンス出来、時間・手間・費用全てにおいて大幅に軽減することができる。
また、本発明方法は、先行するスクリーニング技術よりも迅速・簡便であり、現行法では変異検出の困難なエクソン末端をも正確に検出できるという利点を持つ。
本発明方法を利用したキットは、遺伝子の変異を迅速・簡便にスクリーニングすることができ、現行の遺伝子検査をより簡便化することに役立ち、広く遺伝子医療、および人々に貢献することが出来る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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