(57)【要約】  本発明は、高感度で高特異度な腎臓がんの検出方法を提供する。本発明によれば、例えば、対象において腎臓がんを検出する方法であって、前記対象から得られた尿サンプルを規定倍率に希釈することと、希釈した尿サンプルに対して線虫が誘引行動を示すか否かを評価することと、を含み、前記規定倍率が２００以上の倍率である、方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において腎臓がんを検出する方法であって、
前記対象から得られた尿サンプルを規定倍率に希釈することと、
希釈した尿サンプルに対して線虫が誘引行動を示すか否かを評価することと、
を含み、
前記規定倍率が２００以上の倍率である、
方法。
【請求項２】
対象が、がんに罹患していると疑われる対象である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象が、腎臓病患者である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記規定倍率が、５００以上または１，０００以上の倍率である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記規定倍率が、１，０００から２０，０００の範囲の倍率である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
希釈した尿サンプルに対して線虫が誘引行動を示した場合には、尿サンプルが由来する対象ががんを有する、またはその可能性があることが示され、忌避行動を示した場合には、尿サンプルが由来する対象ががんを有しない、またはその可能性があることが示される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
線虫を含む、腎臓がんの診断キットであって、
対象から得られた尿サンプルを規定倍率に希釈することと、
希釈した尿サンプルに対して線虫が誘引行動を示すか否かを評価することを含み、
前記規定倍率が２００以上の倍率である、
腎臓がんの診断方法において用いられる、診断キット。
【請求項８】
対象において腎臓がんを検出するための、対象から得られた尿サンプルの使用であって、
当該使用は、前記尿サンプルを規定倍率に希釈することと、
希釈した尿サンプルに対して線虫が誘引行動を示すか否かを評価することを含み、
前記規定倍率が２００以上の倍率である、使用。
【請求項９】
対象においてがんを検出する方法であって、
前記対象から得られた尿サンプルを第１の規定倍率に希釈することと、
前記対象から得られた尿サンプルを第２の規定倍率に希釈することと、
希釈した尿サンプルに対して線虫が誘引行動を示すか否かを評価することと、
を含み、
前記第１の規定倍率が５〜１００の範囲の倍率であり、前記第２の規定倍率が２００以上の倍率である、
方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、
第２の規定倍率で希釈されたサンプルに対して線虫が誘引行動を示し、第１の規定倍率で希釈されたサンプルに対して線虫が忌避行動を示した場合に、当該尿サンプルが由来する対象が腎臓がんを有すること、またはその可能性があることが示される、方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、
第１の規定倍率で希釈されたサンプルに対して線虫が誘引行動を示し、第２の規定倍率で希釈されたサンプルに対して線虫が忌避行動を示した場合に、当該尿サンプルが由来する対象が腎臓がん以外のいずれかのがんを有すること、またはその可能性があることが示される、方法。
【請求項１２】
対象から得られた尿サンプルに対する線虫の走性行動の評価系において、腎臓がんの検出感度または特異度を向上させる方法であって、
前記対象から得られた尿サンプルを規定倍率以上に希釈することを含む、方法。
【請求項１３】
対象から得られた尿サンプルに対する線虫の走性行動の評価系であって、腎臓がんが疑われる対象または腎臓がん患者から得られた希釈尿サンプルであって、規定倍率が２００以上の倍率である希釈尿サンプルと、線虫とを含む、評価系。
【請求項１４】
がんが、早期がんである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法、請求項７に記載の診断キット、請求項８に記載の使用、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法、請求項１２に記載の方法、または請求項１３に記載の評価系。
【請求項１５】
対象が、人工透析患者である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法、請求項７に記載の診断キット、請求項８に記載の使用、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法、請求項１２に記載の方法、または請求項１３に記載の評価系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎臓がんの検出方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
線虫は、がん患者の尿サンプルに対して誘引行動を示し、健常者の尿サンプルに対して忌避行動を示すことが明らかとされ、線虫の走性行動に基づくがんの診断方法が開発されている（特許文献１）。この評価系では、尿サンプルを１０倍程度に希釈し、希釈したサンプルに対して線虫が誘引行動を示した場合には、当該サンプルが由来する対象はがんを有すると評価することができる。また、希釈倍率が高い場合には、当然ながら評価の精度は大幅に低下する（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２０１５／０８８０３９
【発明の概要】
【０００４】
本発明者らは、腎臓がんを高感度、高特異度で検出できる手法、または、腎臓がんの発症率が高いとされる透析患者において腎臓がんを高感度、高特異度で検出できる手法が求められていると考えた。
本発明は、腎臓がんの検出方法を提供する。
【０００５】
上記特許文献１（ＷＯ２０１５／０８８０３９）によれば、線虫はがん患者から得られた尿サンプルに対して誘引行動を示す一方で、健常者から得られた尿サンプルに対しては忌避行動を示す。尿サンプルは、特に水で１０倍に希釈した場合に、高感度かつ高特異度を達成することができるが、その希釈倍率が高まると（例えば、１００以上の希釈倍率では）感度および特異度が低下する。
【０００６】
本発明者らは、線虫を用いた誘引行動の評価系で腎臓がん患者由来の尿を上記希釈倍率で希釈して評価すると、他のがんと比較して感度や特異度が低いことを見出した。一方で、本発明者らは、上記評価系において、腎臓がん患者由来の尿サンプルを高倍率（例えば、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、または１，０００以上の希釈倍率）で希釈すると、腎臓がんの検出の感度および特異度が飛躍的に向上することを見出した。本発明者らはまた、上記の高希釈倍率された尿サンプルを上記評価系で評価すると、腎臓病患者からがん患者を鑑別することができることを見出した。本発明は、このような知見に基づくものである。
【０００７】
すなわち、本発明によれば、例えば、以下の発明が提供される。
（１）対象において腎臓がんを検出する方法であって、
前記対象から得られた尿サンプルを規定倍率に希釈することと、
希釈した尿サンプルに対して線虫が誘引行動を示すか否かを評価することと、
を含み、
前記規定倍率が２００以上（または、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、若しくは１，０００以上）の倍率である、
方法。
（２）対象が、がんに罹患していると疑われる対象である、上記（１）に記載の方法。
（３）対象が、腎臓病患者である、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記規定倍率が、５００以上または１，０００以上の倍率である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記規定倍率が、１，０００から２０，０００の範囲の倍率である、上記（４）に記載の方法。
（６）希釈した尿サンプルに対して線虫が誘引行動を示した場合には、尿サンプルが由来する対象ががんを有する、またはその可能性があることが示され、忌避行動を示した場合には、尿サンプルが由来する対象ががんを有しない、またはその可能性があることが示される、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）線虫を含む、腎臓がんの診断キットであって、
対象から得られた尿サンプルを規定倍率に希釈することと、
希釈した尿サンプルに対して線虫が誘引行動を示すか否かを評価することを含み、
前記規定倍率が２００以上（または、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、若しくは１，０００以上）の倍率である、
腎臓がんの診断方法において用いられる、診断キット。
（８）対象において腎臓がんを検出するための、対象から得られた尿サンプルの使用であって、
当該使用は、前記尿サンプルを規定倍率に希釈することと、
希釈した尿サンプルに対して線虫が誘引行動を示すか否かを評価することを含み、
前記規定倍率が２００以上（または、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、若しくは１，０００以上）の倍率である、使用。
（９）対象においてがんを検出する方法であって、
前記対象から得られた尿サンプルを第１の規定倍率に希釈することと、
前記対象から得られた尿サンプルを第２の規定倍率に希釈することと、
希釈した尿サンプルに対して線虫が誘引行動を示すか否かを評価することと、
を含み、
前記第１の規定倍率が５〜１００の範囲の倍率であり、前記第２の規定倍率が２００以上（または、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、若しくは１，０００以上）の倍率である、
方法。
（１０）上記（９）に記載の方法であって、
第２の規定倍率で希釈されたサンプルに対して線虫が誘引行動を示し、第１の規定倍率で希釈されたサンプルに対して線虫が忌避行動を示した場合に、当該尿サンプルが由来する対象が腎臓がんを有すること、またはその可能性があることが示される、方法。
（１１）上記（９）に記載の方法であって、
第１の規定倍率で希釈されたサンプルに対して線虫が誘引行動を示し、第２の規定倍率で希釈されたサンプルに対して線虫が忌避行動を示した場合に、当該尿サンプルが由来する対象が腎臓がん以外のいずれかのがんを有すること、またはその可能性があることが示される、方法。
（１２）対象から得られた尿サンプルに対する線虫の走性行動の評価系において、腎臓がんの検出感度または特異度を向上させる方法であって、
前記対象から得られた尿サンプルを規定倍率以上、例えば、２００倍以上（または、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、若しくは１，０００以上）に希釈することを含む、方法。
（１３）対象から得られた尿サンプルに対する線虫の走性行動の評価系であって、腎臓がんが疑われる対象または腎臓がん患者から得られた希釈尿サンプルであって、規定倍率が２００以上（または、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、若しくは１，０００以上）の倍率である希釈尿サンプルと、線虫とを含む、評価系。
（１４）がんが、早期がんである、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法、上記（７）に記載の診断キット、上記（８）に記載の使用、上記（９）〜（１１）のいずれかに記載の方法、上記（１２）に記載の方法、または上記（１３）に記載の評価系。
（１５）対象が、人工透析患者である、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法、上記（７）に記載の診断キット、上記（８）に記載の使用、上記（９）〜（１１）のいずれかに記載の方法、上記（１２）に記載の方法、または上記（１３）に記載の評価系。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、実施例１において実施した線虫を用いた誘引行動の評価系の模式図を示す。この評価系では、寒天培地を含むシャーレ上で線虫の尿サンプルへの走性行動を評価した。
【図２Ａ】図２Ａは、腎臓がん患者から得られた尿サンプルを１００倍希釈して得られた希釈尿サンプルを用いた線虫の行動評価結果を示す。図２Ａでは、縦軸は走性インデックスを示し、横軸はサンプル番号を示す。図の左端からサンプル番号１〜１９がこの順番で並んでいる。
【図２Ｂ】図２Ｂは、腎臓がん患者から得られた尿サンプルを１０倍希釈して得られた希釈尿サンプルを用いた線虫の行動評価結果を示す。図２Ｂでは、縦軸は走性インデックスを示し、横軸はサンプル番号を示す。図の左端からサンプル番号１〜１９がこの順番で並んでいる。
【図３Ａ】図３Ａは、腎臓がん患者から得られた尿サンプルを１，０００倍希釈して得られた希釈尿サンプルを用いた線虫の行動評価結果を示す。図３Ａでは、縦軸は走性インデックスを示し、横軸はサンプル番号を示す。図の左端からサンプル番号１〜１９がこの順番で並んでいる。
【図３Ｂ】図３Ｂは、腎臓がん患者から得られた尿サンプルを１０，０００倍希釈して得られた希釈尿サンプルを用いた線虫の行動評価結果を示す。図３Ｂでは、縦軸は走性インデックスを示し、横軸はサンプル番号を示す。図の左端からサンプル番号１〜１９がこの順番で並んでいる。
【発明の具体的な説明】
【０００９】
本明細書では、「線虫」とは、セノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）を意味する。線虫は、生物研究においてモデル生物として世界中で広く飼育され、研究されているポピュラーな生物であり、飼育が容易で、嗅覚が優れているという特徴を有する。
【００１０】
本明細書では、「がん」とは、腎臓がん、胃がん、子宮がん、肝臓がん、乳がん、直腸結腸がん、食道がん、すい臓がん、前立腺がん、胆管がん、肺がん、血液がん、白血病、リンパ腫等のがん種を意味する。
【００１１】
本明細書では、「腎臓がん」とは、腎臓にできるがんを意味し、腎細胞がん、および腎盂がんを含む。
【００１２】
腎細胞がんは、表１−１に示されるＴＮＭ分類に基づいて病期を判定することができる。
【００１３】
【表１−１】
2019039415.tif 000002
さらに、腎臓がんのステージは、下記表１−２に基づいて判定することができる。
【表１−２】
2019039415.tif 000003
【００１４】
腎盂・尿管がんは、日本泌尿器科学会・日本病理学会・日本医学放射線学会編「泌尿器科・病理放射線科  腎盂・尿管・膀胱癌取扱い規約  2011年4月（第1版）」（金原出版）等に基づいてステージ（ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶのいずれか）を決定することができる。
【００１５】
本明細書では、「腎臓病」とは、腎臓の機能低下に基づく疾患または状態を意味する。腎臓病は、主に腎臓の糸球体や尿細管が冒されることにより生じる。
腎臓の機能は、一度損なわれると回復しない場合が多く、慢性腎臓病または慢性腎不全と呼ばれる病態となる。
慢性腎臓病は、例えば、下記（1）若しくは（2）又はその両方が3ヶ月以上持続した状態として定義できる：
（1）尿検査、画像診断、血液検査、病理などで腎障害の存在が明らかで、特に0.15g/gCr以上のタンパク尿（30mg/gCr以上のアルブミン尿）が観察される；
（2）推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）が60 (mL/分/1.73m2)未満に低下している。
男性のｅＧＦＲは以下の計算式に基づいて算出することができる：
eGFR (mL/分/1.73m2)=194×血清クレアチニン値（mg/dL）-1.094×年齢（歳）-0.287
｛女性のｅＧＦＲは、男性のeGFRを0.739倍して求める｝。
腎臓病は、さらに推算糸球体濾過量によって重症度を評価することができる。
【表２】
2019039415.tif 000004
【００１６】
本明細書では、「対象」とは、哺乳動物、例えば、ヒトを意味する。対象がヒトである場合、対象は患者と呼ばれることがある。対象は、がんを有する対象、またはがんを有することが疑われる対象（以下、単に「がんが疑われる対象」ということがある）であり得る。
【００１７】
本明細書では、「約」とは、その後に続く数値の上下１０％までの数値、または５％までの数値を含むことを意味する。
【００１８】
本明細書では、「走性行動」とは、誘引行動または忌避行動を意味する。誘引行動とは、ある物質からの物理的距離を縮める行動を意味し、忌避行動とは、ある物質からの物理的距離を広げる行動を意味する。誘引行動を誘発する物質を誘引物質といい、忌避行動を誘発する物質を忌避物質という。
【００１９】
線虫（C. elegans）は嗅覚により誘引物質に対して誘引し、忌避物質から忌避するという性質を有している。誘引物質に対して誘引する行動を誘引行動といい、忌避物質から忌避する行動を忌避行動という。また、誘引行動と忌避行動とを合わせて走性行動という。線虫は、がん患者の尿サンプルに対して誘引行動を示す一方で、健常者の尿サンプルに対して忌避行動を示す。
【００２０】
本明細書では、「がんを検出する方法」または類似の表現は、「がんの有無に関する予備的情報を得る方法」、「がんの診断のための予備的情報を得る方法」、「がんの診断の予備的方法」、「がんの可能性が検出される方法」または「がん細胞を検出する方法」と読み替えることができる。本明細書では、がんを検出する方法は、産業上利用可能な方法であり得る。
【００２１】
［１］本発明によれば、対象において腎臓がんを検出する方法であって、
（１）前記対象から得られた尿サンプルを規定倍率に希釈することと、
（２）希釈した尿サンプルに対して線虫が誘引行動を示すか否かを評価することと、
を含み、
前記規定倍率が２００以上（または、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、若しくは１，０００以上）の倍率である、
方法が提供される。
【００２２】
本発明において、対象は、ヒト対象とすることができる。本発明では、対象は、腎臓病（例えば、慢性腎臓病）に罹患した患者であり得る。本発明では、対象は、例えば、がんが疑われる対象であり得、または、がん（例えば、腎臓がん以外のがん、または腎臓がん）を有する対象であり得る。本発明のある態様において、対象は、腎臓病を有する対象であり得る。本発明のある態様において、対象は、腎臓病を有し、かつがんが疑われる対象であり得る。本発明のある態様において、対象は、腎臓がん以外のがんを有し、かつ腎臓病を有する対象であり得る。本発明のある態様において、対象は、腎臓がんを有し、かつ腎臓病を有する対象であり得る。本発明のある態様において、対象は、人工透析を受けている対象であり得る。本発明のある態様では、対象は、ＣＤＫステージが１、２、３ａ、３ｂ、４および５からなる群から選択されるステージを有する慢性腎臓病患者であり得る。本発明では、いずれのＣＤＫステージを有する慢性腎臓病患者においても、腎臓がんを検出することができる。
【００２３】
本発明において、検出される腎臓がんは、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶから選択されるいずれかのがんである。本発明の方法は、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶのいずれのがんの検出にも適しているが、早期がん（すなわち、ステージＩのがんおよびステージＩＩのがん）、例えば、ステージＩの腎臓がんの検出に適している。
【００２４】
本発明において、規定倍率は、例えば、１００を超える倍率であり、例えば、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、１０００以上、２０００以上、３０００以上、４０００以上、５０００以上、６０００以上、７０００以上、８０００以上、９０００以上、または、１００００以上の倍率であり得る。本発明において、規定倍率はまた、特に限定されないが例えば、１０００００以下の倍率、５００００以下の倍率、４００００以下の倍率、３００００以下の倍率、２００００以下の倍率、１９０００以下の倍率、１８０００以下の倍率、１７０００以下の倍率、１６０００以下の倍率、１５０００以下の倍率、１４０００以下の倍率、１３０００以下の倍率、１２０００以下の倍率、１１０００以下の倍率、または１００００以下の倍率であり得る。本発明において規定倍率は、特に限定されないが例えば、２００〜５００００の範囲の倍率、２００〜４００００の範囲の倍率、２００〜３００００の範囲の倍率、２００〜２００００の範囲の倍率、５００〜２００００の範囲の倍率、５００〜１５０００の範囲の倍率、５０００〜１５０００の範囲の倍率、５００〜３００００の範囲の倍率、５００〜５００００の範囲の倍率、２０００〜５００００の範囲の倍率、３０００〜５００００の範囲の倍率、４０００〜５００００の範囲の倍率、５０００〜５００００の範囲の倍率、５０００〜３００００の範囲の倍率、または１０００〜１００００の範囲の倍率であり得る。ある特定の態様では、規定倍率は、例えば、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約１１０００、約１２０００、約１３０００、約１４０００、約１５０００、約１６０００、約１７０００、約１８０００、約１９０００、または約２００００であり得る。
【００２５】
本発明のある態様では、規定倍率は、例えば、上記規定倍率の範囲に含まれる複数の規定倍率とすることができる（例えば、上記［１］（１）において希釈系列を作成することができる）。希釈系列は、複数の規定倍率のいずれかからの希釈系列、例えば、２〜２０倍の希釈系列、例えば、５倍〜１０倍の範囲の希釈系列、１０倍の希釈系列とすることができる。
【００２６】
本発明において、尿サンプルの希釈は、例えば、水、例えば、蒸留水または滅菌水等の溶媒で行うことができる。
【００２７】
尿サンプルに対して線虫が誘引行動を示すか否かは、線虫と一定の距離（例えば、１ｃｍ〜５ｃｍ）離して配置された尿サンプルに対して線虫が近づいたか、遠ざかったかを観察することにより評価することができる。一部の線虫が、尿サンプルに対して近づき、一部の線虫が、尿サンプルから遠ざかった場合には、尿サンプルに近づいた線虫の割合が、尿サンプルから遠ざかった線虫の割合よりも高い場合には、線虫が被検試料に対して誘引行動を示したと評価することができる。また、尿サンプルに近づいた線虫の割合が、尿サンプルから遠ざかった線虫の割合よりも低い場合には、線虫が尿サンプルに対して忌避行動を示したと評価することができる。
また、例えば、下記式により走性インデックスを求めて、線虫が誘引行動を示したか、忌避行動を示したかを評価してもよい。
【００２８】
走性インデックス
（走性インデックス）＝
｛（尿サンプルに近づいた線虫個体数）−（尿サンプルから遠ざかった線虫個体数）｝／全線虫個体数
【００２９】
走性インデックスは、−１〜＋１の間の数値をとり、誘引行動を示した場合には正の値を、忌避行動を示した場合には負の値を取る。そして、数値の絶対値が大きいほど、走性行動が強く表れたと解釈できる。
【００３０】
本発明の方法は、ある態様では、
（３）線虫が被検試料に対して示した走性行動に基づいて、尿サンプルを誘引物質であるかまたは忌避物質であるか評価することをさらに含んでもよい。
【００３１】
本発明の方法では、尿サンプルに対して線虫が誘引行動を示した場合には、対象が腎臓がんを有すること、またはその可能性があることが示される。本発明の方法では、例えば、尿サンプルに対して線虫が忌避行動を示した場合には、対象が腎臓がんを有しないこと、またはその可能性があることが示される。
【００３２】
本発明では、複数の規定倍率で希釈されたサンプルに対する線虫の走性行動を評価してもよい。すなわち、本発明によれば、対象においてがんを検出する方法であって、
前記対象から得られた尿サンプルを第１の規定倍率に希釈することと、
前記対象から得られた尿サンプルを第２の規定倍率に希釈することと、
希釈した尿サンプルに対して線虫が誘引行動を示すか否かを評価することと、
を含み、
前記第１の規定倍率が５〜１００の範囲の倍率であり、前記第２の規定倍率が２００以上（または、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、若しくは１，０００以上）の倍率である、
方法が提供され得る。
【００３３】
特許文献１によれば、腎臓がん以外のがんは広く線虫の走性行動によって検出される。線虫の走性行動は、尿サンプルを５〜１００倍、好ましくは約１０倍で希釈することによって最も高感度および高特異度に評価できる。一方で、本発明によれば、尿を生産する器官である腎臓のがんは、２００倍以上（または、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、若しくは１，０００以上）の規定倍率で希釈することで、高感度および高特異度に評価できる。したがって、特定の対象の尿に由来する第１の規定倍率で希釈したサンプルと、当該対象の尿に由来する第２の規定倍率で希釈したサンプルとを用意し、それぞれに対して線虫の走性行動を評価することで、対象が腎臓がんを有すること、または対象が非腎臓がん（すなわち、腎臓がん以外のがん）を有することが示される。
【００３４】
また、第２の規定倍率は、上記［１］の規定倍率と同様に、例えば、１００を超える倍率であり、例えば、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、１０００以上、２０００以上、３０００以上、４０００以上、５０００以上、６０００以上、７０００以上、８０００以上、９０００以上、または、１００００以上の倍率であり得る。本発明において、規定倍率はまた、特に限定されないが例えば、５００００以下の倍率、４００００以下の倍率、３００００以下の倍率、２００００以下の倍率、１９０００以下の倍率、１８０００以下の倍率、１７０００以下の倍率、１６０００以下の倍率、１５０００以下の倍率、１４０００以下の倍率、１３０００以下の倍率、１２０００以下の倍率、１１０００以下の倍率、または１００００以下の倍率であり得る。本発明において規定倍率は、特に限定されないが例えば、２００〜５００００の範囲の倍率、２００〜４００００の範囲の倍率、２００〜３００００の範囲の倍率、２００〜２００００の範囲の倍率、５００〜２００００の範囲の倍率、５００〜１５０００の範囲の倍率、５００〜３００００の範囲の倍率、５００〜５００００の範囲の倍率、２０００〜５００００の範囲の倍率、３０００〜５００００の範囲の倍率、４０００〜５００００の範囲の倍率、５０００〜５００００の範囲の倍率、５０００〜３００００の範囲の倍率、または１０００〜１００００の範囲の倍率であり得る。ある特定の態様では、規定倍率は、例えば、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約１１０００、約１２０００、約１３０００、約１４０００、約１５０００、約１６０００、約１７０００、約１８０００、約１９０００、または約２００００であり得る。上述の通り、希釈系列を作成して実施してもよい。
【００３５】
例えば、特定の対象の尿に由来する第１の規定倍率で希釈したサンプルに対して線虫が誘引行動を示した場合には、当該対象が非腎臓がんを有すること、またはその可能性があることが示され得る。例えばまた、特定の対象の尿に由来する第２の規定倍率で希釈したサンプルに対して線虫が誘引行動を示した場合には、当該対象が腎臓がんを有すること、またはその可能性があることが示され得る。例えば、特定の対象の尿に由来する第１の規定倍率で希釈したサンプルに対して線虫が誘引行動を示し、かつ、第２の規定倍率で希釈したサンプルに対して線虫が忌避行動を示した場合には、当該対象は、非腎臓がんを有すること、またはその可能性があることが示され得る。例えば、特定の対象の尿に由来する第２の規定倍率で希釈したサンプルに対して線虫が誘引行動を示し、かつ、第１の規定倍率で希釈したサンプルに対して線虫が忌避行動を示した場合には、当該対象は、腎臓がんを有すること、またはその可能性があることが示され得る。対象、希釈溶媒、走性行動の評価方法、がんの検出方法は、上記と同様である。
【００３６】
本発明によれば、線虫を含む、腎臓がんの診断キットであって、
対象から得られた尿サンプルを規定倍率に希釈することと、
希釈した尿サンプルに対して線虫が誘引行動を示すか否かを評価することを含み、
前記規定倍率が２００以上（または、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、若しくは１，０００以上）の倍率である、
腎臓がんの診断方法において用いられる、診断キットが提供される。対象、希釈溶媒、走性行動の評価方法、がんの検出方法は、上記と同様である。また、規定倍率は、上記［１］の規定倍率または上記第２の規定倍率と同様に設定することができる。
【００３７】
本発明によれば、線虫を含む、腎臓がんの診断キットであって、本発明の腎臓がんの検出方法に用いられる、診断キットが提供される。対象、希釈溶媒、走性行動の評価方法、がんの検出方法は、上記と同様である。
【００３８】
本発明によれば、対象において腎臓がんを検出するための、対象から得られた尿サンプルの使用であって、
当該使用は、前記尿サンプルを規定倍率に希釈することと、
希釈した尿サンプルに対して線虫が誘引行動を示すか否かを評価することを含み、
前記規定倍率が２００以上（または、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、若しくは１，０００以上）の倍率である、使用が提供される。対象、希釈溶媒、走性行動の評価方法、がんの検出方法は、上記と同様である。また、規定倍率は、上記［１］の規定倍率または上記第２の規定倍率と同様に設定することができる。
【００３９】
本発明によれば、対象から得られた尿サンプルに対する線虫の走性行動の評価系において、腎臓がんの検出感度または特異度を向上させる方法であって、
前記対象から得られた尿サンプルを２００倍以上（または、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、若しくは１，０００以上）に希釈することを含む、方法が提供される。対象、希釈溶媒、走性行動の評価方法、がんの検出方法は、上記と同様である。また、希釈倍率は、上記［１］の規定倍率または上記第２の規定倍率と同様に設定することができる。
【００４０】
本発明ではまた、対象から得られた尿サンプルに対する線虫の走性行動の評価系であって、腎臓がんが疑われる対象または腎臓がん患者から得られた希釈尿サンプルであって、希釈倍率が２００以上（または、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、若しくは１，０００以上）の倍率である希釈尿サンプルと、線虫とを含む、評価系が提供される。対象、希釈溶媒、走性行動の評価方法、がんの検出方法は、上記と同様である。また、希釈倍率は、上記［１］の規定倍率または上記第２の規定倍率と同様に設定することができる。
【００４１】
本明細書では、「がんを検出する方法」は、がんを適切ながん療法によって治療することをさらに含んでいてもよい。したがって、本発明によれば、腎臓がんを治療する方法であって、本発明の検出方法によって、腎臓がんを検出することと、腎臓がんが検出された対象において腎臓がんを治療することとを含む、方法が提供される。腎臓がんの治療は、腎臓がんに適したがん療法（例えば、腎臓がんに対する抗癌剤の投与、放射線療法、免疫療法、または外科的切除）により行うことができる。
【００４２】
以下、実施例により本発明を説明するが、実施例は例示であって、発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。
【実施例】
【００４３】
実施例１：腎臓がんまたは腎臓病を有する患者における線虫を用いた尿検査
腎臓病患者においては、尿の量が少なく、また、尿に異常がある場合がある。また、腎臓病により透析を受ける患者においては、がんの発症率が向上する。本実施例では、線虫の嗅覚に基づくがんの検出と、腎臓病との鑑別診断を試みた。【００４４】
まず、尿検体を腎臓病患者１９名（うち、腎臓がん患者１０名、透析患者２名、および好酸性腺腫１名）から得た。腎臓がん患者はいずれも、医師により腎臓がんと診断された患者であり、検体の腫瘍サイズはいずれも、ＴＮＭ分類においてｐＴ１ａ（原発腫瘍において４ｃｍ以下）であり、ステージＩの腎臓がんであった。患者の詳細は、下記表３に示される通りであった。【００４５】
表３：被検患者のＣＤＫステージと腫瘍サイズ
ＣＤＫステージ１、  腫瘍サイズｐＴ１：２例
ＣＤＫステージ２、  腫瘍サイズｐＴ１：３例
ＣＤＫステージ３ａ、腫瘍サイズｐＴ１：３例
ＣＤＫステージ３ｂ、腫瘍サイズｐＴ１：１例
ＣＤＫステージ３ｂ、好酸性腺腫      ：１例
ＣＤＫステージ３ｂ、腫瘍検出されず  ：１例
ＣＤＫステージ４、  腫瘍サイズｐＴ１：１例
ＣＤＫステージ４、  腫瘍検出されず  ：２例
ＣＤＫステージ５、  腫瘍検出されず  ：３例
透析患者        、  腫瘍検出されず  ：２例【００４６】
図１に示されるように、尿サンプルを滅菌水で１００倍に希釈して、表面が平らな寒天プレート１０上の辺縁部１１に塗布し、線虫は、前記寒天プレートの中央部１２に塗布し、線虫が尿サンプルに対して誘引行動を示すか、忌避行動を示すかを観察した。線虫が誘引行動を示したか忌避行動を示したかは、下記の走性インデックスにより評価した。【００４７】
走性インデックス
（走性インデックス）＝
｛（領域１３の線虫個体数）−（領域１４の線虫個体数）｝／全線虫個体数
（式中、領域１３は、寒天プレート１０を二点鎖線で３つの領域に分けた場合に尿サンプル側の領域であり、領域１４は、上記３つの領域の尿サンプルとは離れた領域である。）【００４８】
結果は、図２Ａおよび２Ｂに示される通りであった。【００４９】
図２Ａに示されるように、１００倍希釈の尿サンプルでは、いくつかのがん患者由来の尿に対して線虫が誘引行動を示し、がんを検出できた。一方で、腎臓病のみを有する患者由来の尿に対してはいずれも線虫は忌避行動を示した。一方で、図２Ｂに示されるように、１０倍希釈の尿サンプルでは、いくつかのがん患者由来の尿に対して、線虫が弱い誘引行動を示すにすぎなかった。図２Ａに示されるように、１００倍希釈の尿サンプルにおいても、線虫に誘引行動を誘発させることができないサンプルの存在が目立った。【００５０】
次に、尿サンプルの希釈倍率を様々に変えて上記と同様の尿検査を行った。図３Ａおよび３Ｂには、１，０００倍希釈した尿および１０，０００倍希釈した尿による尿検査結果を示す。【００５１】
図３Ａに示されるように、１，０００倍希釈した尿を用いた尿検査では、多くのがん患者由来の尿サンプルに対して線虫は誘引行動を示した。図３Ｂに示されるように、１０，０００倍希釈した尿を用いた尿検査では、さらに多くのがん患者由来の尿サンプルに対して線虫は誘引行動を示した。図３Ｂに示されるように、１０，０００倍希釈した尿を用いた尿検査では、複数のサンプルにおいて誘引行動を安定的に強く検出することができた。また、図３Ａおよび３Ｂに示されるように、腎臓病患者由来の尿に対する忌避行動も複数のサンプルで安定的に強く検出することができた。【００５２】
また、表３によれば、様々な慢性腎臓病（ＣＫＤ）ステージの患者が今回の検査の対象として含まれていたが、図３Ａおよび３Ｂに示されるように、腎臓がんの診断が、検査対象のＣＫＤステージの影響を受けるようすは観察されなかった。なお、図３Ｂにおいて、左から４番目のサンプルは、ＣＤＫステージ２の患者由来であり、左から１０番目のサンプルは、ＣＤＫステージ３ｂの患者由来であった。【００５３】
希釈倍率を増加させることによって（すなわち、尿サンプルを薄めることによって）、がんの検出感度および特異度が向上することが、本実施例により明らかとなった。また、この希釈倍率の条件下で、腎臓病患者の尿に対しては複数のサンプルで安定的に強く忌避行動を示すことも明らかとなった。このように、線虫の走性行動を用いたがんの評価系では、高倍率の希釈により、腎臓がん患者を高感度および高特異度で検出することができた。線虫の走性行動を用いたがんの評価系ではまた、腎臓がん患者（例えば、Ｎｏ．１８）を腎臓病患者と鑑別することができた。また、好酸性腺腫（Ｎｏ．９）も、本発明の評価系ではがんと鑑別することができた。【００５４】
また、透析患者は、非透析患者に対してがんの発症率が高いことが知られている。今回の結果から、透析患者における、がん発症のモニタリングに線虫を用いた尿検査を用いることができることが示唆された。また、ｐＴ１ａまたはステージＩの腎臓がんを診断できることから、本発明の方法は、腎臓がんの早期診断に有用であることが明らかとなった。特に、透析患者においてがんの誘発率が高いとの報告があり、このような透析患者において尿検査による腎臓がんの早期診断の途を切り拓くものである。【００５５】
線虫は、匂いが強すぎると、誘引物質に対して忌避行動を示すことがある（例えば、Yoshida et al., Nature Communication, 2012およびTaniguchi et al., Science Signaling, 2014参照）。可能性として、腎臓がん患者の尿は、がん由来成分の濃度が高く、低い希釈倍率では忌避行動を惹起し易い可能性が考えられる。そして、通常（１０〜１００倍希釈）よりも高希釈倍率の場合（例えば、１，０００倍〜１０，０００倍）のときに良好に検出が可能になったと考察された。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【国際調査報告】
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