(57)【要約】  癌、特に肺癌の診断に有用な遺伝子シグネチャーを提供し、かかるシグネチャーを利用した癌の診断方法を提供する。癌の予後を予測するための試験方法であって、癌患者から採取した生体試料における予後関連遺伝子の発現レベルを、当該遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として測定する工程を含み、当該遺伝子が２７７の遺伝子群を有する予後関連遺伝子シグネチャー（１）（予後関連遺伝子シグネチャー（１）は明細書中で定義した通りである）から選ばれる方法、および当該予後関連遺伝子の発現レベルを検出するための試薬を含む、癌の予後を予測するための診断薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の予後を予測するための試験方法であって、癌患者から採取した生体試料における予後関連遺伝子の発現レベルを、当該遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として測定する工程を含み、当該遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（１）から選ばれる２〜２７７の遺伝子である、方法。
予後関連遺伝子シグネチャー（１）：
ACTA2 (includes EG:59)；ACTB；ACTC1；ADAM10；ADAM12；ADAM17；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADORA2B；ADRBK2；ALOX15B；AREG；ARID3B；ATF2；ATP2C2 (includes EG:9914)；BCAR3；BMPR2；BPGM；CALML5；CASP1；CASP4；CAT；CCNA1；CCNB2；CCND1；CCND2；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDH3；CDKN1A；CENPF；CHAC1；CHODL；CHST11；CHST2；CLDN5；CLEC2B；COL13A1；COTL1；CREB1；CREB5；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CTNNB1；CTSF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYP1B1；CYP27B1；CYP2U1；CYR61；DDEF1IT1；DDEFL1；DDIT3；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；DUSP5；DYRK1A；E2F4；EFEMP1；EIF2AK2；ENC1；EPHA2；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FERMT1；FGF5；FOSL1；FZD10；GAD1；GAL；GAPDH；GBP2；GDNF；GLRX；GNB1；GNE；GNG11；GNG4；GOT2；GPNMB；GPX1；GPX3；GRB10；GRK6；GRN；GSTZ1；HADH；HBEGF；HES1；HGS；HIST1H4C；HIST3H3；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HMOX1；HNRPM；HOPX；HS3ST2；HSD11B1；HSD17B2；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；HSPC159；ID1；IDI1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；IL6；INHBA；INPP5D；INPPL1；IRF1；ISG20；ISG20L1；ITGB4；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JAG1；JAK3；JUND；KCNJ5；KCTD5；KIAA1199；KLK8；KRT14 (includes EG:3861)；KRT34；KRT5；KRT75；LDLR；LGALS7；LIF；LIMK2；LPXN；MAFF；MAP2K1；MAP2K3；MAP3K3；MAP3K6；MAPK11；MERTK；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MSN；MT1G；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYC；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NAV2 (includes EG:89797)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NFIX；NFKBIA；NMU；NNMT；NP (includes EG:4860)；NUPR1；NXT1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDE2A；PDGFB；PDIA3；PDIA4；PDK1；PFKFB3；PH-4；PHLDA2；PIK3C2B；PIK3CD；PKM2；PLA2G3；PLAT；PLCB3；PLCD1；PLCH2；PLD1；PLK1；PLK3；PNPLA3；PODXL；PPAP2A；PPP1R12B；PPP2R5B；PPRC1；PRKCDBP；PRKCI；PSAT1；PTGS1；PTRF；PYGB；PYGL；RAC2；RBP1；RDH16 (includes EG:8608)；RPL35；RPS14；S100A2；SAA4；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC25A37；SLC29A1；SMAD1；SMO；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；STX12；STYK1；TAF9；TCF4；TGFB2；THBS1；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TNF；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UBE2C；UBE2D1；UST；VANGL1；VAV3；VCP；VEGFA；WNT4；WNT5B；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
【請求項２】
癌がＥＧＦＲファミリー分子の過剰発現または変異した癌細胞に起因するものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
肺癌の予後を予測するものである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
肺癌がステージＩ〜ＩＶのいずれかのステージにあり、予後関連遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（２）から選ばれる２〜１４６の遺伝子である、請求項３記載の方法。
予後関連遺伝子シグネチャー（２）：
ACTC1；ADAM10；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADRBK2；ALOX15B；ARID3B；ATF2；BCAR3；BPGM；CASP4；CAT；CD3EAP；CDC42；CDKN1A；CENPF；CHODL；CHST2；CLEC2B；COL13A1；CREB1；CSNK1D；CTGF；CXCL1；CXCR7；CYP2U1；DDEFL1；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；EIF2AK2；ENC1；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FZD10；GAD1；GNB1；GNG11；GNG4；GPNMB；GRB10；HADH；HBEGF；HGS；HIST3H3；HMGCR；HMGCS1；HNRPM；HSD11B1；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；ID1；IER3；IGFBP2；IGFBP6；IL1F5；IL1RN；INHBA；INPP5D；ISG20；ITGB8；ITPR1；KCNJ5；KIAA1199；KRT34；KRT5；LDLR；LGALS7；LIF；MAP3K6；MAPK11；MLPH；MRAS；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NMU；NP (includes EG:4860)；NUPR1；ODC1；PAK2；PDGFB；PDK1；PFKFB3；PHLDA2；PIK3CD；PLA2G3；PLD1；PNPLA3；PPAP2A；PPP1R12B；PPRC1；PRKCI；PTRF；PYGL；RAC2；RDH16 (includes EG:8608)；RPS14；S100A2；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC29A1；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；TAF9；TGFB2；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UST；VANGL1；VCP；VEGFA；WNT4；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
【請求項５】
肺癌がステージＩにあり、予後関連遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（３）から選ばれる２〜１３９の遺伝子である、請求項３記載の方法。
予後関連遺伝子シグネチャー（３）：
ACTC1；ADAM10；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADRBK2；ALOX15B；ATF2；BPGM；CASP4；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDKN1A；CENPF；CHST2；CLEC2B；COTL1；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYR61；DDEFL1；DDX21；DUSP1；DUSP4；DUSP5；ETS2；FER1L4 (includes EG:80307)；FOSL1；FZD10；GAD1；GAPDH；GDNF；GNB1；GNG11；GNG4；GPNMB；GRB10；HBEGF；HGS；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HNRPM；HOPX；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；ID1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；INHBA；ISG20；ISG20L1；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JUND；KCNJ5；KIAA1199；KRT14 (includes EG:3861)；KRT5；LDLR；LGALS7；LIF；LPXN；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NMU；NP (includes EG:4860)；NUPR1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDGFB；PDIA4；PFKFB3；PHLDA2；PIK3CD；PLAT；PPAP2A；PPRC1；PTRF；RAC2；RDH16 (includes EG:8608)；RPS14；S100A2；SALL2；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SH2D2A；SLC25A37；SLC29A1；SMOX；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；TAF9；TGFB2；THRA；TIMP3；TMSB10；TSC22D1；TUBA1A；UBD；UBE2C；UST；VCP；VEGFA；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
【請求項６】
癌の予後を予測するための診断薬であって、下記予後関連遺伝子シグネチャー（１）から選ばれる２〜２７７の予後関連遺伝子の発現レベルを検出するための試薬を含有する診断薬。
予後関連遺伝子シグネチャー（１）：
ACTA2 (includes EG:59)；ACTB；ACTC1；ADAM10；ADAM12；ADAM17；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADORA2B；ADRBK2；ALOX15B；AREG；ARID3B；ATF2；ATP2C2 (includes EG:9914)；BCAR3；BMPR2；BPGM；CALML5；CASP1；CASP4；CAT；CCNA1；CCNB2；CCND1；CCND2；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDH3；CDKN1A；CENPF；CHAC1；CHODL；CHST11；CHST2；CLDN5；CLEC2B；COL13A1；COTL1；CREB1；CREB5；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CTNNB1；CTSF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYP1B1；CYP27B1；CYP2U1；CYR61；DDEF1IT1；DDEFL1；DDIT3；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；DUSP5；DYRK1A；E2F4；EFEMP1；EIF2AK2；ENC1；EPHA2；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FERMT1；FGF5；FOSL1；FZD10；GAD1；GAL；GAPDH；GBP2；GDNF；GLRX；GNB1；GNE；GNG11；GNG4；GOT2；GPNMB；GPX1；GPX3；GRB10；GRK6；GRN；GSTZ1；HADH；HBEGF；HES1；HGS；HIST1H4C；HIST3H3；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HMOX1；HNRPM；HOPX；HS3ST2；HSD11B1；HSD17B2；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；HSPC159；ID1；IDI1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；IL6；INHBA；INPP5D；INPPL1；IRF1；ISG20；ISG20L1；ITGB4；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JAG1；JAK3；JUND；KCNJ5；KCTD5；KIAA1199；KLK8；KRT14 (includes EG:3861)；KRT34；KRT5；KRT75；LDLR；LGALS7；LIF；LIMK2；LPXN；MAFF；MAP2K1；MAP2K3；MAP3K3；MAP3K6；MAPK11；MERTK；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MSN；MT1G；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYC；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NAV2 (includes EG:89797)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NFIX；NFKBIA；NMU；NNMT；NP (includes EG:4860)；NUPR1；NXT1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDE2A；PDGFB；PDIA3；PDIA4；PDK1；PFKFB3；PH-4；PHLDA2；PIK3C2B；PIK3CD；PKM2；PLA2G3；PLAT；PLCB3；PLCD1；PLCH2；PLD1；PLK1；PLK3；PNPLA3；PODXL；PPAP2A；PPP1R12B；PPP2R5B；PPRC1；PRKCDBP；PRKCI；PSAT1；PTGS1；PTRF；PYGB；PYGL；RAC2；RBP1；RDH16 (includes EG:8608)；RPL35；RPS14；S100A2；SAA4；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC25A37；SLC29A1；SMAD1；SMO；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；STX12；STYK1；TAF9；TCF4；TGFB2；THBS1；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TNF；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UBE2C；UBE2D1；UST；VANGL1；VAV3；VCP；VEGFA；WNT4；WNT5B；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
【請求項７】
癌がＥＧＦＲファミリー分子の過剰発現または変異した癌細胞に起因するものである、請求項６記載の診断薬。
【請求項８】
肺癌の予後を予測するものである、請求項６または７記載の診断薬。
【請求項９】
肺癌がステージＩ〜ＩＶのいずれかのステージにあり、予後関連遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（２）から選ばれる２〜１４６の遺伝子である、請求項８記載の診断薬。
予後関連遺伝子シグネチャー（２）：
ACTC1；ADAM10；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADRBK2；ALOX15B；ARID3B；ATF2；BCAR3；BPGM；CASP4；CAT；CD3EAP；CDC42；CDKN1A；CENPF；CHODL；CHST2；CLEC2B；COL13A1；CREB1；CSNK1D；CTGF；CXCL1；CXCR7；CYP2U1；DDEFL1；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；EIF2AK2；ENC1；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FZD10；GAD1；GNB1；GNG11；GNG4；GPNMB；GRB10；HADH；HBEGF；HGS；HIST3H3；HMGCR；HMGCS1；HNRPM；HSD11B1；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；ID1；IER3；IGFBP2；IGFBP6；IL1F5；IL1RN；INHBA；INPP5D；ISG20；ITGB8；ITPR1；KCNJ5；KIAA1199；KRT34；KRT5；LDLR；LGALS7；LIF；MAP3K6；MAPK11；MLPH；MRAS；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NMU；NP (includes EG:4860)；NUPR1；ODC1；PAK2；PDGFB；PDK1；PFKFB3；PHLDA2；PIK3CD；PLA2G3；PLD1；PNPLA3；PPAP2A；PPP1R12B；PPRC1；PRKCI；PTRF；PYGL；RAC2；RDH16 (includes EG:8608)；RPS14；S100A2；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC29A1；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；TAF9；TGFB2；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UST；VANGL1；VCP；VEGFA；WNT4；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
【請求項１０】
肺癌がステージＩにあり、予後関連遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（３）から選ばれる２〜１３９の遺伝子である、請求項８記載の診断薬。
予後関連遺伝子シグネチャー（３）：
ACTC1；ADAM10；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADRBK2；ALOX15B；ATF2；BPGM；CASP4；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDKN1A；CENPF；CHST2；CLEC2B；COTL1；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYR61；DDEFL1；DDX21；DUSP1；DUSP4；DUSP5；ETS2；FER1L4 (includes EG:80307)；FOSL1；FZD10；GAD1；GAPDH；GDNF；GNB1；GNG11；GNG4；GPNMB；GRB10；HBEGF；HGS；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HNRPM；HOPX；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；ID1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；INHBA；ISG20；ISG20L1；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JUND；KCNJ5；KIAA1199；KRT14 (includes EG:3861)；KRT5；LDLR；LGALS7；LIF；LPXN；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NMU；NP (includes EG:4860)；NUPR1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDGFB；PDIA4；PFKFB3；PHLDA2；PIK3CD；PLAT；PPAP2A；PPRC1；PTRF；RAC2；RDH16 (includes EG:8608)；RPS14；S100A2；SALL2；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SH2D2A；SLC25A37；SLC29A1；SMOX；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；TAF9；TGFB2；THRA；TIMP3；TMSB10；TSC22D1；TUBA1A；UBD；UBE2C；UST；VCP；VEGFA；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
【請求項１１】
試薬が予後関連遺伝子の転写産物または翻訳産物に対する、プライマー、核酸プローブおよび抗体から選ばれる、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の診断薬。
【請求項１２】
固体表面に固定された、以下の予後関連遺伝子シグネチャー（１）：
ACTA2 (includes EG:59)；ACTB；ACTC1；ADAM10；ADAM12；ADAM17；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADORA2B；ADRBK2；ALOX15B；AREG；ARID3B；ATF2；ATP2C2 (includes EG:9914)；BCAR3；BMPR2；BPGM；CALML5；CASP1；CASP4；CAT；CCNA1；CCNB2；CCND1；CCND2；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDH3；CDKN1A；CENPF；CHAC1；CHODL；CHST11；CHST2；CLDN5；CLEC2B；COL13A1；COTL1；CREB1；CREB5；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CTNNB1；CTSF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYP1B1；CYP27B1；CYP2U1；CYR61；DDEF1IT1；DDEFL1；DDIT3；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；DUSP5；DYRK1A；E2F4；EFEMP1；EIF2AK2；ENC1；EPHA2；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FERMT1；FGF5；FOSL1；FZD10；GAD1；GAL；GAPDH；GBP2；GDNF；GLRX；GNB1；GNE；GNG11；GNG4；GOT2；GPNMB；GPX1；GPX3；GRB10；GRK6；GRN；GSTZ1；HADH；HBEGF；HES1；HGS；HIST1H4C；HIST3H3；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HMOX1；HNRPM；HOPX；HS3ST2；HSD11B1；HSD17B2；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；HSPC159；ID1；IDI1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；IL6；INHBA；INPP5D；INPPL1；IRF1；ISG20；ISG20L1；ITGB4；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JAG1；JAK3；JUND；KCNJ5；KCTD5；KIAA1199；KLK8；KRT14 (includes EG:3861)；KRT34；KRT5；KRT75；LDLR；LGALS7；LIF；LIMK2；LPXN；MAFF；MAP2K1；MAP2K3；MAP3K3；MAP3K6；MAPK11；MERTK；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MSN；MT1G；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYC；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NAV2 (includes EG:89797)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NFIX；NFKBIA；NMU；NNMT；NP (includes EG:4860)；NUPR1；NXT1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDE2A；PDGFB；PDIA3；PDIA4；PDK1；PFKFB3；PH-4；PHLDA2；PIK3C2B；PIK3CD；PKM2；PLA2G3；PLAT；PLCB3；PLCD1；PLCH2；PLD1；PLK1；PLK3；PNPLA3；PODXL；PPAP2A；PPP1R12B；PPP2R5B；PPRC1；PRKCDBP；PRKCI；PSAT1；PTGS1；PTRF；PYGB；PYGL；RAC2；RBP1；RDH16 (includes EG:8608)；RPL35；RPS14；S100A2；SAA4；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC25A37；SLC29A1；SMAD1；SMO；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；STX12；STYK1；TAF9；TCF4；TGFB2；THBS1；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TNF；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UBE2C；UBE2D1；UST；VANGL1；VAV3；VCP；VEGFA；WNT4；WNT5B；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750
から選ばれる２〜２７７の遺伝子にそれぞれハイブリダイズする核酸プローブを含む、癌の予後診断用アレイ。
【請求項１３】
前記核酸プローブが約２０から８０塩基長である、請求項１２記載のアレイ。
【請求項１４】
肺癌と診断された患者が肺癌を再発せずに長期間生存する可能性を予測する方法であって、
（ａ）当該患者から採取した癌細胞における予後関連遺伝子の発現レベルを、当該予後関連遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として、当該癌細胞におけるすべての転写産物もしくは発現産物の発現レベル、または転写産物もしくは発現産物の参照用セットの発現レベルに対して正規化して決定する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られたデータを統計解析に供する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた解析結果に基づいて、当該患者の長期間生存可能性が高いかまたは低いかを決定する工程
を含み、当該予後関連遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（１）から選ばれる２〜２７７の遺伝子である方法。
予後関連遺伝子シグネチャー（１）：
ACTA2 (includes EG:59)；ACTB；ACTC1；ADAM10；ADAM12；ADAM17；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADORA2B；ADRBK2；ALOX15B；AREG；ARID3B；ATF2；ATP2C2 (includes EG:9914)；BCAR3；BMPR2；BPGM；CALML5；CASP1；CASP4；CAT；CCNA1；CCNB2；CCND1；CCND2；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDH3；CDKN1A；CENPF；CHAC1；CHODL；CHST11；CHST2；CLDN5；CLEC2B；COL13A1；COTL1；CREB1；CREB5；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CTNNB1；CTSF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYP1B1；CYP27B1；CYP2U1；CYR61；DDEF1IT1；DDEFL1；DDIT3；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；DUSP5；DYRK1A；E2F4；EFEMP1；EIF2AK2；ENC1；EPHA2；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FERMT1；FGF5；FOSL1；FZD10；GAD1；GAL；GAPDH；GBP2；GDNF；GLRX；GNB1；GNE；GNG11；GNG4；GOT2；GPNMB；GPX1；GPX3；GRB10；GRK6；GRN；GSTZ1；HADH；HBEGF；HES1；HGS；HIST1H4C；HIST3H3；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HMOX1；HNRPM；HOPX；HS3ST2；HSD11B1；HSD17B2；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；HSPC159；ID1；IDI1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；IL6；INHBA；INPP5D；INPPL1；IRF1；ISG20；ISG20L1；ITGB4；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JAG1；JAK3；JUND；KCNJ5；KCTD5；KIAA1199；KLK8；KRT14 (includes EG:3861)；KRT34；KRT5；KRT75；LDLR；LGALS7；LIF；LIMK2；LPXN；MAFF；MAP2K1；MAP2K3；MAP3K3；MAP3K6；MAPK11；MERTK；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MSN；MT1G；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYC；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NAV2 (includes EG:89797)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NFIX；NFKBIA；NMU；NNMT；NP (includes EG:4860)；NUPR1；NXT1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDE2A；PDGFB；PDIA3；PDIA4；PDK1；PFKFB3；PH-4；PHLDA2；PIK3C2B；PIK3CD；PKM2；PLA2G3；PLAT；PLCB3；PLCD1；PLCH2；PLD1；PLK1；PLK3；PNPLA3；PODXL；PPAP2A；PPP1R12B；PPP2R5B；PPRC1；PRKCDBP；PRKCI；PSAT1；PTGS1；PTRF；PYGB；PYGL；RAC2；RBP1；RDH16 (includes EG:8608)；RPL35；RPS14；S100A2；SAA4；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC25A37；SLC29A1；SMAD1；SMO；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；STX12；STYK1；TAF9；TCF4；TGFB2；THBS1；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TNF；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UBE2C；UBE2D1；UST；VANGL1；VAV3；VCP；VEGFA；WNT4；WNT5B；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
【請求項１５】
肺癌患者に対して個別のゲノムプロファイルを作成する方法であって、
（ａ）当該患者から採取した癌細胞から抽出されたＲＮＡを遺伝子発明解析に供する工程；
（ｂ）予後関連遺伝子シグネチャー（１）：
ACTA2 (includes EG:59)；ACTB；ACTC1；ADAM10；ADAM12；ADAM17；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADORA2B；ADRBK2；ALOX15B；AREG；ARID3B；ATF2；ATP2C2 (includes EG:9914)；BCAR3；BMPR2；BPGM；CALML5；CASP1；CASP4；CAT；CCNA1；CCNB2；CCND1；CCND2；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDH3；CDKN1A；CENPF；CHAC1；CHODL；CHST11；CHST2；CLDN5；CLEC2B；COL13A1；COTL1；CREB1；CREB5；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CTNNB1；CTSF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYP1B1；CYP27B1；CYP2U1；CYR61；DDEF1IT1；DDEFL1；DDIT3；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；DUSP5；DYRK1A；E2F4；EFEMP1；EIF2AK2；ENC1；EPHA2；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FERMT1；FGF5；FOSL1；FZD10；GAD1；GAL；GAPDH；GBP2；GDNF；GLRX；GNB1；GNE；GNG11；GNG4；GOT2；GPNMB；GPX1；GPX3；GRB10；GRK6；GRN；GSTZ1；HADH；HBEGF；HES1；HGS；HIST1H4C；HIST3H3；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HMOX1；HNRPM；HOPX；HS3ST2；HSD11B1；HSD17B2；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；HSPC159；ID1；IDI1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；IL6；INHBA；INPP5D；INPPL1；IRF1；ISG20；ISG20L1；ITGB4；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JAG1；JAK3；JUND；KCNJ5；KCTD5；KIAA1199；KLK8；KRT14 (includes EG:3861)；KRT34；KRT5；KRT75；LDLR；LGALS7；LIF；LIMK2；LPXN；MAFF；MAP2K1；MAP2K3；MAP3K3；MAP3K6；MAPK11；MERTK；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MSN；MT1G；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYC；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NAV2 (includes EG:89797)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NFIX；NFKBIA；NMU；NNMT；NP (includes EG:4860)；NUPR1；NXT1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDE2A；PDGFB；PDIA3；PDIA4；PDK1；PFKFB3；PH-4；PHLDA2；PIK3C2B；PIK3CD；PKM2；PLA2G3；PLAT；PLCB3；PLCD1；PLCH2；PLD1；PLK1；PLK3；PNPLA3；PODXL；PPAP2A；PPP1R12B；PPP2R5B；PPRC1；PRKCDBP；PRKCI；PSAT1；PTGS1；PTRF；PYGB；PYGL；RAC2；RBP1；RDH16 (includes EG:8608)；RPL35；RPS14；S100A2；SAA4；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC25A37；SLC29A1；SMAD1；SMO；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；STX12；STYK1；TAF9；TCF4；TGFB2；THBS1；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TNF；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UBE2C；UBE2D1；UST；VANGL1；VAV3；VCP；VEGFA；WNT4；WNT5B；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750
から選ばれる２〜２７７遺伝子の当該癌細胞における発現レベルを測定し、当該発現レベルを、コントロール遺伝子に対して正規化し、必要に応じて、肺癌参照用組織セットに見られる量と比較する工程；ならびに
（ｃ）当該遺伝子発明解析によって得られるデータをまとめた報告を作成する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
肺癌は、１９８５年以来、世界中で最も共通する最も致命的な癌となっている(非特許文献１)。全体的な５年生存率は非常に低く、その解析の取り組みがなされているにも係らず、改善されるに至っていない。肺癌の初期ステージの患者は、手術を受けることを勧められるが、手術後の患者の予後は回復から転移性再発の死に至るまで多様であるように見受けられる。そこで、患者にとって治療の最大の恩恵を得る助けとなるために、信頼性のあるマーカーが早急に求められている。【０００２】
マイクロアレイを用いた遺伝子発現プロファイリングを利用して、多くの有望なバイオマーカーがすでに提案されている。しかしながら、これらのバイオマーカーの大多数は、解析に用いた被験者の数の少なさにより議論の余地がある。この問題に取り組むため、Sheddenらは、複数施設における442の肺腺癌の病理学的および臨床的注釈を付けた大規模なマイクロアレイデータの最大のセットを提供した(非特許文献２)。しかし、遺伝子クラスタリング等のいくつかの方法を用いることによって、ステージIサンプルの結果を予測することは困難であることがわかった。さらに、最近の報告では、低度に分化した悪性ヒト腫瘍が胚性幹細胞様遺伝子発現シグネチャーを明らかにしたことが示された(非特許文献３)。前記報告は、以前には記述されていなかった腫瘍の病原性と胚性幹細胞の状態とのリンクを同定した。【０００３】
非小細胞肺癌(NSCLC)を含む多くのタイプの癌において上皮増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)の過剰発現が報告されている(非特許文献４)。また、最近の研究では、ＥＧＦＲを含むＭＡＰＫ経路が肺腺癌において最も有意に変異していることも報告されている(非特許文献５)。【０００４】
一例として、乳癌の予後の診断ツールとして、再発リスクを予測する遺伝子検査法が知られており（特許文献１、２）、遺伝子テスト「マンマプリント」として販売されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００５−５１９６２４号公報
【特許文献２】特表２００７−５２１００５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Parkin, DM. et al., CA A Cancer Journal for Clinicians vol. 55 p74-108, 2005
【非特許文献２】Shedden, D. et al., Nature Medicine vol.14, pp.822-827, 2008
【非特許文献３】Ben-Porath, I. et al., Nature Genetics vol.40 p499- p507, 2008
【非特許文献４】Perez-Soler, R. et al., The Oncologist vol.9 p58-67, 2004
【非特許文献５】Ding, L. et al., Nature vol.455 p1069- 1075, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記したように、乳癌の予後の診断方法は比較的良く確立されつつあり、乳癌患者のＱＯＬを高めることが期待されている。しかし、肺癌の予後を的確に診断するツールの開発は遅れており、肺癌患者のＱＯＬを向上させることが望まれている。本発明の目的は、癌、特に肺癌の診断に有用な遺伝子シグネチャーを提供し、かかるシグネチャーを利用した癌の診断ツールを提供することにある。また、本発明の目的は、肺癌の初期ステージ、特にステージＩの新規予後マーカーを同定することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者らは、腫瘍の多様性により単に多数の腫瘍を比較するだけでは有効な予測因子に到達することが困難であるので、正常な肺細胞から共通のシグネチャーを見出しうるとの仮説を立てた。さらに、本発明者らは、非小細胞肺癌(NSCLC)を含む多くのタイプの癌においてＥＧＦＲの過剰発現が報告されているので(Perez-Soler, R. et al.)、ＥＧＦＲに焦点を当てた。また、最近の研究では、ＥＧＦＲを含むＭＡＰＫ経路が肺腺癌において最も有意に変異していることも報告されている(Ding, L. et al.)。総合的に判断して、本発明者らは、ＥＧＦで刺激した正常肺細胞が包括的に肺腺癌において高められるシグナルを模倣するという仮説を提案した。【０００９】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討した結果、正常な初代肺上皮細胞（SAEC: primary small airway epithelial cells）を培養し、上皮増殖因子（ＥＧＦ）もしくは上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤で処理した細胞または無処理細胞の遺伝子発現プロファイルを相互に比較し、状態空間モデルを用いて変動する遺伝子群を絞り込んだ。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、肺癌、特に初期ステージの肺癌の予後を予測することに成功し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕  癌の予後を予測するための試験方法であって、癌患者から採取した生体試料における予後関連遺伝子の発現レベルを、当該遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として測定する工程を含み、当該遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（１）から選ばれる２〜２７７の遺伝子である、方法。
予後関連遺伝子シグネチャー（１）：
ACTA2 (includes EG:59)；ACTB；ACTC1；ADAM10；ADAM12；ADAM17；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADORA2B；ADRBK2；ALOX15B；AREG；ARID3B；ATF2；ATP2C2 (includes EG:9914)；BCAR3；BMPR2；BPGM；CALML5；CASP1；CASP4；CAT；CCNA1；CCNB2；CCND1；CCND2；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDH3；CDKN1A；CENPF；CHAC1；CHODL；CHST11；CHST2；CLDN5；CLEC2B；COL13A1；COTL1；CREB1；CREB5；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CTNNB1；CTSF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYP1B1；CYP27B1；CYP2U1；CYR61；DDEF1IT1；DDEFL1；DDIT3；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；DUSP5；DYRK1A；E2F4；EFEMP1；EIF2AK2；ENC1；EPHA2；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FERMT1；FGF5；FOSL1；FZD10；GAD1；GAL；GAPDH；GBP2；GDNF；GLRX；GNB1；GNE；GNG11；GNG4；GOT2；GPNMB；GPX1；GPX3；GRB10；GRK6；GRN；GSTZ1；HADH；HBEGF；HES1；HGS；HIST1H4C；HIST3H3；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HMOX1；HNRPM；HOPX；HS3ST2；HSD11B1；HSD17B2；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；HSPC159；ID1；IDI1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；IL6；INHBA；INPP5D；INPPL1；IRF1；ISG20；ISG20L1；ITGB4；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JAG1；JAK3；JUND；KCNJ5；KCTD5；KIAA1199；KLK8；KRT14 (includes EG:3861)；KRT34；KRT5；KRT75；LDLR；LGALS7；LIF；LIMK2；LPXN；MAFF；MAP2K1；MAP2K3；MAP3K3；MAP3K6；MAPK11；MERTK；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MSN；MT1G；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYC；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NAV2 (includes EG:89797)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NFIX；NFKBIA；NMU；NNMT；NP (includes EG:4860)；NUPR1；NXT1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDE2A；PDGFB；PDIA3；PDIA4；PDK1；PFKFB3；PH-4；PHLDA2；PIK3C2B；PIK3CD；PKM2；PLA2G3；PLAT；PLCB3；PLCD1；PLCH2；PLD1；PLK1；PLK3；PNPLA3；PODXL；PPAP2A；PPP1R12B；PPP2R5B；PPRC1；PRKCDBP；PRKCI；PSAT1；PTGS1；PTRF；PYGB；PYGL；RAC2；RBP1；RDH16 (includes EG:8608)；RPL35；RPS14；S100A2；SAA4；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC25A37；SLC29A1；SMAD1；SMO；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；STX12；STYK1；TAF9；TCF4；TGFB2；THBS1；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TNF；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UBE2C；UBE2D1；UST；VANGL1；VAV3；VCP；VEGFA；WNT4；WNT5B；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
〔２〕  癌がＥＧＦＲファミリー分子の過剰発現または変異した癌細胞に起因するものである、前記〔１〕記載の方法。
〔３〕  肺癌の予後を予測するものである、前記〔１〕または〔２〕記載の方法。
〔４〕  肺癌がステージＩ〜ＩＶのいずれかのステージにあり、予後関連遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（２）から選ばれる２〜１４６の遺伝子である、前記〔３〕記載の方法。
予後関連遺伝子シグネチャー（２）：
ACTC1；ADAM10；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADRBK2；ALOX15B；ARID3B；ATF2；BCAR3；BPGM；CASP4；CAT；CD3EAP；CDC42；CDKN1A；CENPF；CHODL；CHST2；CLEC2B；COL13A1；CREB1；CSNK1D；CTGF；CXCL1；CXCR7；CYP2U1；DDEFL1；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；EIF2AK2；ENC1；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FZD10；GAD1；GNB1；GNG11；GNG4；GPNMB；GRB10；HADH；HBEGF；HGS；HIST3H3；HMGCR；HMGCS1；HNRPM；HSD11B1；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；ID1；IER3；IGFBP2；IGFBP6；IL1F5；IL1RN；INHBA；INPP5D；ISG20；ITGB8；ITPR1；KCNJ5；KIAA1199；KRT34；KRT5；LDLR；LGALS7；LIF；MAP3K6；MAPK11；MLPH；MRAS；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NMU；NP (includes EG:4860)；NUPR1；ODC1；PAK2；PDGFB；PDK1；PFKFB3；PHLDA2；PIK3CD；PLA2G3；PLD1；PNPLA3；PPAP2A；PPP1R12B；PPRC1；PRKCI；PTRF；PYGL；RAC2；RDH16 (includes EG:8608)；RPS14；S100A2；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC29A1；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；TAF9；TGFB2；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UST；VANGL1；VCP；VEGFA；WNT4；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
〔５〕  肺癌がステージＩにあり、予後関連遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（３）から選ばれる２〜１３９の遺伝子である、前記〔３〕記載の方法。
予後関連遺伝子シグネチャー（３）：
ACTC1；ADAM10；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADRBK2；ALOX15B；ATF2；BPGM；CASP4；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDKN1A；CENPF；CHST2；CLEC2B；COTL1；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYR61；DDEFL1；DDX21；DUSP1；DUSP4；DUSP5；ETS2；FER1L4 (includes EG:80307)；FOSL1；FZD10；GAD1；GAPDH；GDNF；GNB1；GNG11；GNG4；GPNMB；GRB10；HBEGF；HGS；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HNRPM；HOPX；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；ID1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；INHBA；ISG20；ISG20L1；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JUND；KCNJ5；KIAA1199；KRT14 (includes EG:3861)；KRT5；LDLR；LGALS7；LIF；LPXN；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NMU；NP (includes EG:4860)；NUPR1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDGFB；PDIA4；PFKFB3；PHLDA2；PIK3CD；PLAT；PPAP2A；PPRC1；PTRF；RAC2；RDH16 (includes EG:8608)；RPS14；S100A2；SALL2；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SH2D2A；SLC25A37；SLC29A1；SMOX；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；TAF9；TGFB2；THRA；TIMP3；TMSB10；TSC22D1；TUBA1A；UBD；UBE2C；UST；VCP；VEGFA；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
〔６〕  癌の予後を予測するための診断薬であって、下記予後関連遺伝子シグネチャー（１）から選ばれる２〜２７７の予後関連遺伝子の発現レベルを検出するための試薬を含有する診断薬。
予後関連遺伝子シグネチャー（１）：（上記と同義である）
〔７〕  癌がＥＧＦＲファミリー分子の過剰発現または変異した癌細胞に起因するものである、前記〔６〕記載の診断薬。
〔８〕  肺癌の予後を予測するものである、前記〔６〕または〔７〕記載の診断薬。
〔９〕  肺癌がステージＩ〜ＩＶのいずれかのステージにあり、予後関連遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（２）から選ばれる２〜１４６の遺伝子である、前記〔８〕記載の診断薬。
予後関連遺伝子シグネチャー（２）：（上記と同義である）
〔１０〕  肺癌がステージＩにあり、予後関連遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（３）から選ばれる２〜１３９の遺伝子である、前記〔８〕記載の診断薬。
予後関連遺伝子シグネチャー（３）：（上記と同義である）
〔１１〕  試薬が予後関連遺伝子の転写産物または翻訳産物に対する、プライマー、核酸プローブおよび抗体から選ばれる、前記〔６〕〜〔１０〕のいずれかに記載の診断薬。
〔１２〕  固体表面に固定された、以下の予後関連遺伝子シグネチャー（１）：（上記と同義である）
から選ばれる２〜２７７の遺伝子にそれぞれハイブリダイズする核酸プローブを含む、癌の予後診断用アレイ。
〔１３〕  前記核酸プローブが約２０から８０塩基長である、前記〔１２〕記載のアレイ。
〔１４〕  肺癌と診断された患者が肺癌を再発せずに長期間生存する可能性を予測する方法であって、
（ａ）当該患者から採取した癌細胞における予後関連遺伝子の発現レベルを、当該予後関連遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として、当該癌細胞におけるすべての転写産物もしくは発現産物の発現レベル、または転写産物もしくは発現産物の参照用セットの発現レベルに対して正規化して決定する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られたデータを統計解析に供する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた解析結果に基づいて、当該患者の長期間生存可能性が高いかまたは低いかを決定する工程
を含み、当該予後関連遺伝子が下記予後関連遺伝子シグネチャー（１）から選ばれる２〜２７７の遺伝子である方法。
予後関連遺伝子シグネチャー（１）：（上記と同義である）
〔１５〕  肺癌患者に対して個別のゲノムプロファイルを作成する方法であって、
（ａ）当該患者から採取した癌細胞から抽出されたＲＮＡを遺伝子発明解析に供する工程；
（ｂ）予後関連遺伝子シグネチャー（１）：（上記と同義である）
から選ばれる２〜２７７遺伝子の当該癌細胞における発現レベルを測定し、当該発現レベルを、コントロール遺伝子に対して正規化し、必要に応じて、肺癌参照用組織セットに見られる量と比較する工程；ならびに
（ｃ）当該遺伝子発明解析によって得られるデータをまとめた報告を作成する工程
を含む方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の試験方法および診断薬を用いることにより、癌の予後を精度良く予測することができ、癌患者に対してより効果的でより副作用の少ない治療方法を選択することが可能となる。本発明の試験方法および診断薬により得られた個々の患者の遺伝子発現プロファイルと当該患者の臨床的情報（性別、年齢、臨床ステージ等）とを組合せることにより、さらに精度の高い予後の予測が可能となる。本発明の予測方法およびゲノムプロファイルの作成方法は、癌患者のオーダーメード治療の進展に寄与することが期待される。本発明は、癌患者のＱＯＬの向上および医療経済への貢献のみならず、治療標的に対応した癌患者を事前に選別することによって、癌の新規治療薬または治療方法の開発の進展にも寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】予後関連遺伝子シグネチャー（２）を含むサブセットと他のサブセットとの関係を示す図である。
【図２】予後関連遺伝子シグネチャー（１）と（３）とを選別した基準を示すグラフである。
【図３】予後関連遺伝子シグネチャー（２）の全遺伝子の発現プロファイルを用いて、すべてのステージの肺癌患者の予後を予測可能であることを示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線である。
【図４】予後関連遺伝子シグネチャー（３）の全遺伝子の発現プロファイルを用いて、ステージＩ肺癌患者の予後を予測可能であることを示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線である。
【図５】予後関連遺伝子シグネチャー（２）の全遺伝子の発現プロファイルと患者の臨床的情報を組合せて、すべてのステージの肺癌患者の予後を予測可能であることを示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（Ａ．定義）
本発明において「癌の予後」とは、癌のたどる経過についての医学上の見通しをいう。本発明において「予後の予測」とは、患者が薬剤に芳しくまたは芳しくなく反応する可能性、そのような反応の程度、原発性癌の手術による除去および／または化学療法の後一定期間再発なしに生存する可能性のいずれかを意味する。本発明の試験方法および予測方法を臨床的に利用して、特定の患者に対して最も適切な治療法を選択することによって治療法を決定することができる。本発明の試験方法および予測方法は、ある患者が、外科的介入、所定の薬剤もしくは薬剤の併用による化学療法、または放射線療法などの治療計画に対して良好な反応を示す可能性があるか否か、または、手術もしくは化学療法の終了、またはその他の治療法の後に長期間生存する可能性があるか否かを予測するのに有益な手段である。癌の予後の予測時期は、癌の治療前、治療中、治療後のいずれであってもよい。
【００１４】
本発明において「長期生存」とは、手術またはその他の治療の後３年以上、好ましくは５年以上、より好ましくは８年以上、最も好ましくは１０年以上生存することを意味する。
【００１５】
本発明における癌は、ヒトに発生するあらゆる癌を包含するが、ＥＧＦＲファミリー分子の過剰発現または変異した癌細胞に起因する癌が望ましい。ＥＧＦＲファミリー分子の過剰発現または変異に起因する癌としては、胃癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、大腸癌などがあげられるが、これらに限定されるものではない。本発明は、癌の死亡率の上位を占め５年生存率が低い肺癌に対して、より有用な情報を提供することができる。
【００１６】
肺癌は、小細胞肺癌と非小細胞肺癌に分けられ、それぞれ、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの４つの病期に分類される。ここで、ステージＩとは肺内に癌が限局しておりリンパ節に転移がないこと、ステージＩＩとは肺内に癌が限局し肺内のリンパ節にのみ転移があるか、リンパ節に転移がないが癌が直接肺外の切除できる周囲に拡がっていること、ステージＩＩＩとは他の臓器に転移はしていないが、ステージＩＩより進んだ状態、およびステージＩＶとは他の臓器に転移していることと定義される。さらに、ステージＩ、ＩＩおよびＩＩＩは、それぞれステージＩＡとＩＢ、ステージＩＩＡとＩＩＢ、ステージＩＩＩＡとＩＩＩＢに分類される。肺癌の病期診断については、例えば、ＴＮＭ分類：肺癌取扱い規約、第５版、日本肺癌学会編、金原出版、１９９９、25-32頁を参照のこと。本発明は、非小細胞肺癌、中でも、ステージＩの予後の診断およびステージＩ〜ＩＶのすべてのステージの予後の診断に優れる。
【００１７】
本発明が測定対象とする生体試料は、癌患者に由来するものであれば特に限定されるものではないが、癌組織（癌細胞を含む）、血液、リンパ液、リンパ節（癌が転移したリンパ節を含む）などがあげられる。好ましくは、癌組織（原発性および転移性）および癌の転移が疑われるリンパ節である。
【００１８】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数形で用いられても複数形で用いられても、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドであって、未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡを意味する。したがって、例えば、本明細書で定義されているポリヌクレオチドには、１本鎖および２本鎖のＤＮＡ、１本鎖および２本鎖の領域を含むＤＮＡ、１本鎖および２本鎖のＲＮＡ、１本鎖および２本鎖の領域を含むＲＮＡ、１本鎖もしくは２本鎖であるか、または、１本鎖および２本鎖の領域を含むＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子などがあるが、これらに限定されるものではない。さらに、本発明において「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三重鎖領域をも包含する。このような領域にある鎖は、同一の分子または異なった分子に由来するものでもよい。該領域は、１つ以上の該分子のすべてを含んでいてもよいが、より一般的には、いくつかの分子の一領域のみを含む。三重鎖領域の分子の１つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」という用語は、具体的にはｃＤＮＡをも含む。さらに、イノシンなどの例外的塩基、または、トリチウム化された塩基などの修飾塩基を有するＤＮＡまたはＲＮＡも、「ポリヌクレオチド」の範囲に含まれる。一般的に、「ポリヌクレオチド」という用語は、未修飾ポリヌクレオチドの化学的、酵素的および／または代謝的に修飾された形態のすべてを包含するとともに、ウイルスならびに単細胞および多細胞などの細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態も包含する。
【００１９】
「示差的に発現される遺伝子」、「示差的遺伝子発現」ならびに、単に「発現遺伝子」および「遺伝子発現」という用語は、互換的に使用され、癌、具体的には肺癌などの病気を患う被験者において、その発現が、正常または対照となる被験者における発現と比較して、より高いレベルかより低いレベルに活性化される遺伝子を意味する。この用語は、同じ病気の異なる段階で、その発現がより高いレベルまたはより低いレベルに活性化される遺伝子も包含する。また、示差的に発現される遺伝子は、核酸レベルまたは蛋白質レベルで活性化または抑制されてもよく、あるいは、異なったポリペプチド産物をもたらす選択的スプライシングを受けることもあると理解される。このような違いは、例えば、ポリペプチドのｍＲＮＡレベル、表面発現、分泌またはその他の分配における変化によって証明することができる。示差的遺伝子発現は、２つ以上の遺伝子またはそれらの遺伝子産物の間で発現を比較すること、または、２つ以上の遺伝子またはそれらの遺伝子産物の間における発現比率を比較すること、または、さらに、同じ遺伝子が異なってプロセッシングされた２つの産物であって、正常な被験者と、具体的には癌という病気を患う被験者の間で異なっているか、または、同じ病気のさまざまな段階で異なっている産物を比較することを包含しうる。示差的発現は、例えば、正常および病気の細胞間における、または、異なった病気が発症したか、異なった病気の段階にある細胞間における、遺伝子またはその発現産物の時間的または細胞内での発現パターンの定量的、および定性的な違いを含む。本発明の目的にとって、正常な被験者と癌に罹患した被験者において、または、被験者の癌発症の様々な段階において、ある遺伝子の発現に約２倍以上、好ましくは約４倍以上、より好ましくは約６倍以上、最も好ましくは約１０倍以上の違いがあるときに、「示差的遺伝子発現」が存在するとみなされる。
【００２０】
ＲＮＡ転写産物について「過剰発現」という用語は、標本中で決定されたＲＮＡのすべてまたは特定の参照用ｍＲＮＡセットであるかもしれない参照用ｍＲＮＡのレベルに対して正規化することによって決定された転写産物のレベルを意味するために用いられる。
【００２１】
「遺伝子増幅」という用語は、特定の細胞または細胞株において遺伝子または遺伝子断片の複数コピーを形成させる処理を意味する。複製領域（増幅されたＤＮＡの鎖）は、しばしば「単位複製配列（アンプリコン）」と呼ばれる。通常、産生するｍＲＮＡの量、すなわち遺伝子発現のレベルも、発現遺伝子のコピー数に比例して増加する。
【００２２】
（Ｂ．詳細な説明）
本発明を実施するに当たって、別途記載がない限り、分子生物学（組換え技術など）、微生物学、細胞生物学、および生化学の常法を用いるが、それらは、当技術分野の範囲内である。そのような技術は、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版（（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．， １９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，第４版（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ＆ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，ＢｌａｃｋＷｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，１９８７）；「ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｆ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）；および「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）などの文献で十分に説明されている。
【００２３】
本発明は、癌の予後を予測するための試験方法を提供する。本発明の試験方法は、癌患者から採取した生体試料における予後関連遺伝子の発現レベルを、当該遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として測定する工程を含むことを特徴とする。
【００２４】
本発明が指標とする予後関連遺伝子は、下記予後関連遺伝子シグネチャー（以下、単に「遺伝子シグネチャー」と省略する場合がある）（１）から選ばれる２〜２７７の遺伝子から構成される。予後関連遺伝子は、好ましくは３以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上または２５以上の遺伝子から構成される。
【００２５】
予後関連遺伝子シグネチャー（１）：
ACTA2 (includes EG:59)；ACTB；ACTC1；ADAM10；ADAM12；ADAM17；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADORA2B；ADRBK2；ALOX15B；AREG；ARID3B；ATF2；ATP2C2 (includes EG:9914)；BCAR3；BMPR2；BPGM；CALML5；CASP1；CASP4；CAT；CCNA1；CCNB2；CCND1；CCND2；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDH3；CDKN1A；CENPF；CHAC1；CHODL；CHST11；CHST2；CLDN5；CLEC2B；COL13A1；COTL1；CREB1；CREB5；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CTNNB1；CTSF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYP1B1；CYP27B1；CYP2U1；CYR61；DDEF1IT1；DDEFL1；DDIT3；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；DUSP5；DYRK1A；E2F4；EFEMP1；EIF2AK2；ENC1；EPHA2；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FERMT1；FGF5；FOSL1；FZD10；GAD1；GAL；GAPDH；GBP2；GDNF；GLRX；GNB1；GNE；GNG11；GNG4；GOT2；GPNMB；GPX1；GPX3；GRB10；GRK6；GRN；GSTZ1；HADH；HBEGF；HES1；HGS；HIST1H4C；HIST3H3；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HMOX1；HNRPM；HOPX；HS3ST2；HSD11B1；HSD17B2；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；HSPC159；ID1；IDI1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；IL6；INHBA；INPP5D；INPPL1；IRF1；ISG20；ISG20L1；ITGB4；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JAG1；JAK3；JUND；KCNJ5；KCTD5；KIAA1199；KLK8；KRT14 (includes EG:3861)；KRT34；KRT5；KRT75；LDLR；LGALS7；LIF；LIMK2；LPXN；MAFF；MAP2K1；MAP2K3；MAP3K3；MAP3K6；MAPK11；MERTK；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MSN；MT1G；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYC；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NAV2 (includes EG:89797)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NFIX；NFKBIA；NMU；NNMT；NP (includes EG:4860)；NUPR1；NXT1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDE2A；PDGFB；PDIA3；PDIA4；PDK1；PFKFB3；PH-4；PHLDA2；PIK3C2B；PIK3CD；PKM2；PLA2G3；PLAT；PLCB3；PLCD1；PLCH2；PLD1；PLK1；PLK3；PNPLA3；PODXL；PPAP2A；PPP1R12B；PPP2R5B；PPRC1；PRKCDBP；PRKCI；PSAT1；PTGS1；PTRF；PYGB；PYGL；RAC2；RBP1；RDH16 (includes EG:8608)；RPL35；RPS14；S100A2；SAA4；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC25A37；SLC29A1；SMAD1；SMO；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；STX12；STYK1；TAF9；TCF4；TGFB2；THBS1；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TNF；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UBE2C；UBE2D1；UST；VANGL1；VAV3；VCP；VEGFA；WNT4；WNT5B；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
【００２６】
前記遺伝子シグネチャー（１）を構成する個々の遺伝子は公知であり、その塩基配列およびアミノ酸配列も既知である。これら２７７遺伝子のリストを表１−１〜１−５に示す。
【００２７】
【表１−１】
2010064702.tif 000002
【００２８】
【表１−２】
2010064702.tif 000003
【００２９】
【表１−３】
2010064702.tif 000004
【００３０】
【表１−４】
2010064702.tif 000005
【００３１】
【表１−５】
2010064702.tif 000006
【００３２】
本発明の試験方法がステージＩ〜ＩＶの肺癌を対象とする場合、上記遺伝子シグネチャー（１）の中から選別した下記予後関連遺伝子シグネチャー（２）から選ばれる２〜１４６の遺伝子を指標とすることが好ましい。この実施態様において、予後関連遺伝子は、より好ましくは３以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上または２５以上の遺伝子から構成される。
【００３３】
予後関連遺伝子シグネチャー（２）：
ACTC1；ADAM10；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADRBK2；ALOX15B；ARID3B；ATF2；BCAR3；BPGM；CASP4；CAT；CD3EAP；CDC42；CDKN1A；CENPF；CHODL；CHST2；CLEC2B；COL13A1；CREB1；CSNK1D；CTGF；CXCL1；CXCR7；CYP2U1；DDEFL1；DDX21；DHCR7；DSCAM；DUSP1；DUSP4；EIF2AK2；ENC1；ETS2；EWSR1；FER1L4 (includes EG:80307)；FZD10；GAD1；GNB1；GNG11；GNG4；GPNMB；GRB10；HADH；HBEGF；HGS；HIST3H3；HMGCR；HMGCS1；HNRPM；HSD11B1；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；ID1；IER3；IGFBP2；IGFBP6；IL1F5；IL1RN；INHBA；INPP5D；ISG20；ITGB8；ITPR1；KCNJ5；KIAA1199；KRT34；KRT5；LDLR；LGALS7；LIF；MAP3K6；MAPK11；MLPH；MRAS；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYL7；MYL9 (includes EG:10398)；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NMU；NP (includes EG:4860)；NUPR1；ODC1；PAK2；PDGFB；PDK1；PFKFB3；PHLDA2；PIK3CD；PLA2G3；PLD1；PNPLA3；PPAP2A；PPP1R12B；PPRC1；PRKCI；PTRF；PYGL；RAC2；RDH16 (includes EG:8608)；RPS14；S100A2；SALL2；SCG5；SEH1L；SEPW1；SGCA；SH2D2A；SIGLEC15；SLC29A1；SMOX；SOD3；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；SRC；TAF9；TGFB2；THRA；TIMP3；TK2；TMSB10；TPM1；TRAF1；TSC22D1；TUBA1A；TUBA1B；UBD；UST；VANGL1；VCP；VEGFA；WNT4；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
【００３４】
本発明の試験方法がステージＩの肺癌を対象とする場合、前記遺伝子シグネチャー（１）の中から選別した下記予後関連遺伝子シグネチャー（３）から選ばれる２〜１３９の遺伝子を指標とすることが好ましい。この実施態様において、予後関連遺伝子は、より好ましくは３以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上または２５以上の遺伝子から構成される。ステージＩの肺癌の検体は、遺伝子発現の観点から相対的に均質であるので、遺伝子発現の相違に基づく予後の予想は一般に困難であるといわれているが、本発明の遺伝子シグネチャー（３）を指標とすることにより、予後の予測が容易となる。
【００３５】
予後関連遺伝子シグネチャー（３）：
ACTC1；ADAM10；ADAM19 (includes EG:8728)；ADAM8；ADCY6；ADRBK2；ALOX15B；ATF2；BPGM；CASP4；CD3EAP；CDC42；CDC42EP2；CDKN1A；CENPF；CHST2；CLEC2B；COTL1；CRYAB；CSNK1D；CTGF；CXCL1；CXCR7；CYP1A1；CYR61；DDEFL1；DDX21；DUSP1；DUSP4；DUSP5；ETS2；FER1L4 (includes EG:80307)；FOSL1；FZD10；GAD1；GAPDH；GDNF；GNB1；GNG11；GNG4；GPNMB；GRB10；HBEGF；HGS；HMGA2；HMGCR；HMGCS1；HNRPM；HOPX；HSPA1A；HSPA5；HSPA8；HSPB1；ID1；IER3；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL1A；IL1F5；IL1RN；INHBA；ISG20；ISG20L1；ITGB7；ITGB8；ITPR1；JUND；KCNJ5；KIAA1199；KRT14 (includes EG:3861)；KRT5；LDLR；LGALS7；LIF；LPXN；MLPH；MMP1 (includes EG:4312)；MMP12；MMP3；MRAS；MTHFD2；MTSS1；MVK；MYL9 (includes EG:10398)；MYLK；NCOR2；NDRG1；NFATC4；NFIL3；NMU；NP (includes EG:4860)；NUPR1；ODC1；PAK2；PALM；PCK2；PDGFB；PDIA4；PFKFB3；PHLDA2；PIK3CD；PLAT；PPAP2A；PPRC1；PTRF；RAC2；RDH16 (includes EG:8608)；RPS14；S100A2；SALL2；SEH1L；SEPW1；SERPINB5；SESN1；SH2D2A；SLC25A37；SLC29A1；SMOX；SOX2；SOX9；SPDEF；SPRY2；SPRY4；TAF9；TGFB2；THRA；TIMP3；TMSB10；TSC22D1；TUBA1A；UBD；UBE2C；UST；VCP；VEGFA；YWHAQ (includes EG:10971)；ZBED2およびZNF750.
【００３６】
本発明の試験方法において、予後関連遺伝子の発現レベルは、下記本発明の癌の予後を予測するための診断薬を用いて、自体公知の方法により測定することができる。予後関連遺伝子の発現レベルの測定方法は、後述する。
【００３７】
本発明の診断薬は、前記遺伝子シグネチャー（１）から選ばれる２〜２７７の予後関連遺伝子の発現レベルを検出するための試薬を含有する。
【００３８】
前記試薬は、予後関連遺伝子の発現レベルを検出可能な物質または手段であればいずれを選んでもよいが、好適には、予後関連遺伝子の転写産物または翻訳産物に対する、プライマー、核酸プローブおよび抗体からなる群より選ぶことができる。
【００３９】
本発明の診断薬に含まれるプライマーは、予後関連遺伝子の増幅及び検出を可能とする限り特に限定されない。例えば、プライマーのサイズは、少なくとも約１２塩基長以上、好ましくは約１５〜１００塩基長、より好ましくは約１６〜５０塩基長、さらにより好ましくは約１８〜３５塩基長である。また、遺伝子増幅法の種類に応じて必要とされるプライマー数が異なるため、本発明の診断薬に含まれるプライマー数は特に限定されないが、本発明の診断薬は、１種類の予後関連遺伝子に対して２以上のプライマーを含んでもよい。２以上のプライマーは、予め混合されていても、混合されていなくてもよい。このようなプライマーは、自体公知の方法により作製することができる。プライマーの設計方法については後述する。
【００４０】
本発明の診断薬に含まれる核酸プローブは、予後関連遺伝子の転写産物の検出を可能とする限り特に限定されない。核酸プローブはＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸またはそれらのキメラ分子などであり得るが、安定性、簡便性等を考慮するとＤＮＡが好ましい。核酸プローブはまた、１本鎖または２本鎖のいずれでもよい。核酸プローブのサイズは、予後関連遺伝子の転写産物に特異的にハイブリダイズし得る限り特に限定されないが、例えば約１５または１６塩基長以上、好ましくは約１５〜１０００塩基長、より好ましくは約２０〜５００塩基長、さらにより好ましくは約２０〜８０塩基長である。核酸プローブは、核酸アレイのように基板上に固定された形態で提供されてもよい。このような核酸プローブは、自体公知の方法により作製することができる。
【００４１】
本発明の診断薬に含まれる抗体は、予後関連遺伝子の翻訳産物に特異的に結合し得る抗体である限り特に限定されない。例えば、翻訳産物に対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。抗体はまた、抗体のフラグメント（例、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)２）、組換え抗体（例、ｓｃＦｖ）であってもよい。抗体は、プレート等の基板上に固定された形態で提供されてもよい。抗体は、自体公知の方法により作製することができる。
【００４２】
例えば、ポリクローナル抗体は、予後関連遺伝子の翻訳産物あるいはその部分ペプチド（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）等のキャリアタンパク質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバント（例、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物があげられる。
【００４３】
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法（例、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん―基礎と臨床―」、第2-14頁、サイエンスフォーラム出版、1985年）により作製することができる。例えば、マウスに予後関連遺伝子の翻訳産物等を市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例、NS-1, P3X63Ag8など）を細胞融合して前記翻訳産物に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法［J. Immunol. Methods,81(2): 223-228 (1985)］でも電圧パルス法［Hybridoma, 7(6): 627-633 (1988)］であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択することができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清及び動物の腹水から取得することができる。
【００４４】
本発明の診断薬は、前記試薬に加え、予後関連遺伝子の転写産物または翻訳産物と試薬との複合体を測定する手段を含む、キットの形態で提供されていてもよい。この場合、キットに含まれる試薬および測定手段は、互いに隔離された形態、例えば、異なる容器に格納された形態で提供され得る。測定用手段は、試薬の種類に応じて、標識用物質で標識された検出物質であってもよい。標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質などがあげられる。
【００４５】
本発明の診断薬は、試薬および測定用手段に加え、さらなる構成要素を含むキットの形態で提供されてもよい。より詳細には、本発明の診断薬がキットの形態で提供される場合、試薬および測定用手段の種類に応じたさらなる構成要素を含み得る。例えば、試薬がプライマーである場合、キットは、逆転写酵素、核酸抽出液または核酸抽出装置をさらに含み得る。試薬が核酸プローブである場合、キットは、核酸抽出液または核酸抽出装置をさらに含んでいてもよい。測定用手段が抗体である場合、キットは、蛋白質抽出液または蛋白質抽出装置をさらに含んでいてもよい。
【００４６】
また、本発明の診断薬がキットの形態で提供される場合、癌患者から生体試料を採取し得る手段をさらに含み得る。かかる採取手段は、特に限定されないが、例えば、生検針等の生検器具、採血器具があげられる。
【００４７】
本発明の診断薬は、アレイの形態で提供されることが好ましく、核酸アレイ（マイクロアレイと同義）、抗体アレイが例示される。
【００４８】
好ましい核酸アレイは、固体表面に固定された、予後関連遺伝子シグネチャー（１）から選ばれる２〜２７７の遺伝子にそれぞれハイブリダイズする核酸プローブを含む、癌の予後診断用アレイである。
【００４９】
核酸アレイの支持体となる固体としては、当該分野で通常用いられている支持体であれば特に限定されず、例えば、メンブレン（例えば、ナイロン膜）、ガラス、プラスチック、金属などがあげられる。本発明における核酸アレイの形態としては、当該分野で周知の形態を用いることができ、例えば、支持体上で核酸が直接合成されるアレイ（いわゆるアフィメトリクス方式）、支持体上に核酸が固定化されるアレイ（いわゆるスタンフォード方式）、繊維型アレイ、電気化学的アレイ（ＥＣＡ）等があげられる（例、特開２００５−１０２６９４参照）。
【００５０】
本発明は、本発明の試験方法および診断薬を適用することにより、肺癌と診断された患者が肺癌を再発せずに長期間生存する可能性を予測する方法を提供する。本発明の予測方法は、下記工程：
（ａ）当該患者から採取した癌細胞における予後関連遺伝子の発現レベルを、当該予後関連遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として、当該癌細胞におけるすべての転写産物もしくは発現産物の発現レベル、または転写産物もしくは発現産物の参照用セットの発現レベルに対して正規化して決定する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られたデータを統計解析に供する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた解析結果に基づいて、当該患者の長期間生存可能性が高いかまたは低いかを決定する工程
を含むことを特徴とする。
【００５１】
本発明の予測方法で用いられる予後関連遺伝子は、上述した通りである。本発明の予測方法により、長期間の生存可能性ばかりではなく、臨床的ステージ分類(ＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＶ)も可能となる。
【００５２】
また、本発明は、本発明の試験方法および診断薬を適用することにより、肺癌患者に対して個別のゲノムプロファイルを作成する方法を提供する。本発明のゲノムプロファイルの作成方法は、下記工程：
（ａ）当該患者から採取した癌細胞から抽出されたＲＮＡを遺伝子発明解析に供する工程；
（ｂ）予後関連遺伝子シグネチャー（１）から選ばれる２以上の遺伝子の癌細胞における発現レベルを測定し、当該発現レベルを、コントロール遺伝子に対して正規化し、必要に応じて、肺癌参照用組織セットに見られる量と比較する工程；ならびに
（ｃ）該遺伝子発明解析によって得られるデータをまとめた報告を作成する工程
を含むことを特徴とする。
【００５３】
本発明のゲノムプロファイリングで用いられる予後関連遺伝子は、上述した通りである。
【００５４】
本発明の方法に適用可能な、遺伝子発現解析方法を以下に説明する。
【００５５】
（１．遺伝子発現プロファイリング）
遺伝子発現プロファイリングの方法には、ポリヌクレオチド解析に基づく方法、ポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法、およびプロテオミクスによる方法などがある。最も一般的に用いられる方法で、サンプル中のｍＲＮＡ発現を定量するために当技術分野において知られている方法には、ノーザンブロッティングおよびインサイチュハイブリダイゼーション（（Ｐａｒｋｅｒ ＆ Ｂａｒｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０６：２４７−２８３（１９９９））；ＲＮａｓｅプロテクション・アッセイ法（Ｈｏｄ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：８５２−８５４（１９９２））；および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）などのＰＣＲ法（Ｗｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：２６３−２６４（１９９２））などがある。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの二重鎖またはＤＮＡ−蛋白質二重鎖などの特定の二重鎖を識別できる抗体を用いることもできる。配列決定による遺伝子発現解析法の代表的な方法には、遺伝子発現連続解析法（ＳＡＧＥ）、および大規模並列シグネチャー配列決定法（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析法などがある。
【００５６】
（２．ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリング法）
（ａ 逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ））
上記技術の中で、最も感度が高く、最も融通がきく定量法はＲＴ−ＰＣＲであって、異なったサンプル集団、正常組織と癌組織、薬物治療の有無などにおけるｍＲＮＡレベルを比較したり、遺伝子発現のパターンの特徴を調べたり、密接に関係したｍＲＮＡを区別したり、また、ＲＮＡの構造を解析するために利用できる。
【００５７】
最初の工程は、生体試料からＲＮＡを単離することである。出発物質は、一般的には、ヒトの癌または癌細胞株、およびそれぞれに対応する正常な組織または細胞株から単離された全ＲＮＡである。このように、ＲＮＡは、乳房、肺、結腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、子宮などの癌など、さまざまな原発性癌、転移性癌または癌細胞株から、あるいは、健康なドナーから採取した生体試料から単離することができる。ＲＮＡが原発性癌または転移性癌に由来するものであれば、凍結されたか、または保管されているパラフィン包埋され固定（ホルマリン固定）された組織サンプルからＲＮＡを抽出することができる。
【００５８】
ＲＮＡを抽出するための一般的な方法が、当技術分野において周知されており、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９７）など、分子生物学の標準的な教科書に開示されている。具体的には、Ｑｉａｇｅｎなどの製造業者から入手した精製キット、緩衝液セット、およびプロテアーゼを用いて、製造業者の指示に従ってＲＮＡ単離を行うことができる。例えば、培養されている細胞の全ＲＮＡは、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙミニカラムを用いて単離することができる。これ以外の市販されているＲＮＡ単離用キットには、登録商標ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ全ＤＮＡおよびＲＮＡ精製キット（登録商標ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、およびパラフィンブロックＲＮＡ単離用キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）などがある。組織サンプルからの全ＲＮＡは、ＲＮＡ Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を用いて単離することができる。癌から調製されたＲＮＡは、例えば、塩化セシウム濃度勾配遠心法によって精製してもよい。
【００５９】
ＲＮＡは、ＰＣＲの鋳型としては利用できないため、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの第一の工程は、ＲＮＡ鋳型を逆転写させてｃＤＮＡとした後、ＰＣＲ反応でそれを指数的に増幅させることである。２つの最も広く使用されている逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写工程は、一般的には、環境および発現プロファイリングの目的に応じて、特異的プライマー、ランダムなヘキサマー、またはオリゴ−ｄＴプライマーを用いて開始される。例えば、ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて製造業者の指示に従って、抽出されたＲＮＡを逆転写することができる。そして、得られたｃＤＮＡを、次のＰＣＲ反応における鋳型として用いることができる。
【００６０】
ＰＣＲの工程では、さまざまな熱安定的ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼを使用するが、一般的には、５’−３’ヌクレアーゼ活性をもつが、３’−５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性をもたないＴａｑＤＮＡポリメラーゼが用いられる。すなわち、登録商標ＴａｑＭａｎ ＰＣＲは、一般的には、ＴａｑポリメラーゼまたはＴｔｈポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用して、その標的単位複製配列に結合しているハイブリダイゼーション用プローブを加水分解するが、同じ５’ヌクレアーゼ活性をもつ酵素を使用することもできる。２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ反応に特有の単位複製配列を生成させる。この２つのプライマーの間に存在する塩基配列を検出するために別のオリゴヌクレオチド、すなわちプローブを設計する。このプローブは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長することはできず、レポーター用の蛍光色素およびクエンチャー用の蛍光色素で標識されている。これら２種類の色素がプローブ上にあって互いに近くにあるときには、レポーター用色素からレーザーによって発生する光は、クエンチャー用の色素で消光されている。増幅反応の過程で、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素が、鋳型依存的にプローブを切断する。その結果得られたプローブ断片は溶液中に解離して、放出されたレポーター用色素からのシグナルが、第２のフルオロフォアの消光作用から解放される。レポーター用色素の一分子は、新しい分子が合成される度に放出されるため、消光されないレポーター用色素の検出に基づいて、データを定量的に解釈することが可能となる。
【００６１】
登録商標ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、登録商標ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００配列検出キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）など市販の装置を用いて行うことができる。好適な実施態様において、５’ヌクレアーゼ法は、登録商標ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００配列検出キットなどのリアルタイム定量用ＰＣＲ装置上で行う。この装置は、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラおよびコンピュータからなる。この装置は、サーモサイクラー上の９６ウェルのフォーマットの中にあるサンプルを増幅する。増幅過程で、レーザーによって発生させた蛍光シグナルを、９６ウェルすべてについて、光ファイバーケーブルを通じてリアルタイムで集めて、ＣＣＤで検出する。この装置は、器具を作動させるため、およびデータを解析するためのソフトウエアを含む。
【００６２】
５’ヌクレアーゼアッセイのデータは、まず、Ｃｔすなわち限界サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）として表現される。上記したように、蛍光値は、サイクル毎に記録され、増幅反応のその時点までに増幅された産物の量を示す。蛍光シグナルが統計的に有意であると最初に記録された時点が限界サイクル（Ｃｔ）である。
【００６３】
誤差とサンプル対サンプルにおける変動作用を最小にするために、通常、内部標準を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施する。理想的な内部標準は、さまざまな組織の中で一定のレベルで発現され、実験処理によって影響されないものである。遺伝子発現のパターンを正規化するためにもっとも頻繁に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβ−アクチンのｍＲＮＡである。
【００６４】
ＲＴ−ＰＣＲ技術のより新しい変法は、リアルタイム定量的ＰＣＲであって、二重標識された蛍光発生プローブ（例、登録商標Ｔａｑｍａｎプローブ）によってＰＣＲ産物の蓄積を決定する。リアルタイムＰＣＲは、各標的配列に対する内部競合分子を正規化するために利用する定量的な競合ＰＣＲにも、サンプル中に含まれる正規化用遺伝子、またはＲＴ−ＰＣＲ用のハウスキーピング遺伝子を用いる定量的な比較ＰＣＲにも適合する。更なる詳細については、例えば、Ｈｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６−９９４（１９９６）を参照されたい。
【００６５】
（ｂ．マスアレイ装置）
Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって開発されたマスアレイによる遺伝子発現プロファイリング法において、ＲＮＡを単離し逆転写した後、得られたｃＤＮＡを、一塩基を除くすべての位置で標的となるｃＤＮＡ領域に一致する合成ＤＮＡ分子（競合分子）で固定して、内部標準として使用する。このｃＤＮＡ／競合分子の混合液をＰＣＲで増幅してから、エビ由来アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）酵素によるＰＣＲ後処理を行ない、その結果、残ったヌクレオチドを脱リン酸化する。アルカリホスファターゼを不活性化させた後、競合分子およびｃＤＮＡのＰＣＲ産物にプライマー伸長処理を行って、競合分子およびｃＤＮＡに由来するＰＣＲ産物に対し異なった質量シグナルを生じさせる。これらの生成物は、精製された後、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）による解析に必要な成分を予め搭載しているチップアレイに分注される。そして、作成された質量スペクトルのピーク領域の比率を解析することによって反応液中に存在するｃＤＮＡを定量する。更なる詳細については、例えば、Ｄｉｎｇ ａｎｄ Ｃａｎｔｏｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：３０５９−３０６４（２００３）を参照されたい。
【００６６】
（ｃ．その他のＰＣＲ法）
さらなるＰＣＲによる技術には、例えば、ディファレンシャルディスプレイ法（Ｌｉａｎｇ ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６７−９７１（１９９２））；増幅断片長多型法（ｉＡＦＬＰ）（Ｋａｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１２：１３０５−１３１２（１９９９））；登録商標ビーズアレイ技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｏｌｉｐｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），Ｊｕｎｅ ２００２；Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７２：５６１８（２０００））；遺伝子発現の迅速アッセイ法において、市販されているＬｕｍｉｎｅｘ１００ＬａｂＭＡＰ装置と複数に色分けされたミクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いた遺伝子発現検出用ビーズアレイ（ＢＡＤＧＥ）（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．１１：１８８８−１８９８（２００１））；および高カバー率遺伝子発現プロフィール（ＨｉＣＥＰ）解析法（Ｆｕｋｕｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３１（１６）ｅ９４（２００３））などがある。
【００６７】
（３．マイクロアレイ）
示差的遺伝子発現は、マイクロアレイ技術を用いても同定または確認することができる。すなわち、新鮮な癌組織またはパラフィン包埋された癌組織のいずれにおいても、マイクロアレイ技術を用いて、予後関連遺伝子の発現プロファイルを決定することができる。この方法においては、目的とするポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドなど）をマイクロチップ基板上にプレートするか、整列させる。そして、整列させた配列を、目的とする細胞または組織由来の特異的ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。ＲＴ−ＰＣＲと同様に、ＲＮＡの由来源は、癌または癌細胞株、および対応する正常組織または細胞株から単離した全ＲＮＡである。ＲＮＡの由来源が原発性癌の場合には、凍結されたか、または保管されているパラフィン包埋され固定（ホルマリン固定）された組織サンプルからＲＮＡを抽出することができ、日常の医療業務において、ごく普通に調製して保存することができる。
【００６８】
マイクロアレイ技術の具体的な実施態様において、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅された挿入配列を高密度で基板に乗せる。目的とする組織から抽出されたＲＮＡの逆転写によって蛍光標識を取り込むことにより、蛍光標識されたｃＤＮＡを作製することができる。チップに適用された標識ｃＤＮＡは、アレイ上のＤＮＡスポットに特異性をもってハイブリダイズする。非特異的結合を除去するための高厳密性洗浄の後、共焦点レーザー顕微鏡、またはＣＣＤカメラなど、別の検出法によってチップを走査する。各アレイ上成分のハイブリダイゼーションを定量すると、対応するｍＲＮＡの豊富さを見積もることが可能になる。二色蛍光法によって、２種類のＲＮＡ由来源から作成され、別々に標識されたｃＤＮＡを対毎にアレイにハイブリダイズさせる。こうして、これら２種類の由来源からの各特定遺伝子に対応する転写産物の相対的な豊富さが同時に決定される。ハイブリダイゼーションを小規模化させたことによって、多数の遺伝子の発現パターンの簡便で迅速な評価が利用可能になる。このような方法は、細胞当り数コピーしか発現されない希少な転写産物を検出するのに必要とされる感度をもつことが示されており、少なくとも約２倍の発現レベルの違いを再現性をもって検出することが示されている（Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（２）：１０６−１４９（１９９６）。また、本発明においては、一色蛍光法によって検出することも可能である。マイクロアレイ解析法は、製造業者の指示に従って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ技術、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのマイクロアレイ技術またはＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術を用いるなどして、市販されている装置によって実施することができる。
【００６９】
（４．遺伝子発現連続解析法（ＳＡＧＥ））
遺伝子発現連続解析法（ＳＡＧＥ）は、各転写産物に対するハイブリダイゼーション・プローブを用意する必要なしに、多数の遺伝子転写産物を同時かつ定量的に解析できる方法である。まず、短い配列タグ（約１０〜１４塩基対）を各転写産物内部のユニークな位置から得る場合には、各転写産物を個別に同定するのに十分な情報を含むタグを作成する。そして、多数の転写産物を一緒に連結させて、長い連続した分子を形成させると、配列決定することができ、多数のタグの同一性を同時に明らかにすることができる。転写産物の集団の発現パターンを、各タグの量を決定し、各タグに対応する遺伝子を同定することによって定量的に評価することができる。さらなる詳細については、例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４−４８７ （１９９５）；およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ８８：２４３−５１（１９９７）を参照されたい。
【００７０】
（５．大規模並列シグネチャー配列決定法（ＭＰＳＳ））
この方法は、Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：６３０−６３４（２０００）に記載されているが、ゲルによらないシグネチャー配列決定法を、個別の直径５μｍのマイクロビーズ上の何百万もの鋳型のインビトロにおけるクローニングと組み合わせる配列決定法である。まず、インビトロ・クローニングによって、ＤＮＡ鋳型のマイクロビーズライブラリーを構築する。その後、フロー・セルにおいて高密度（一般的には３×１０６マイクロビーズ／ｃｍ２よりも大きい）で、鋳型を含むマイクロビーズの平らなアレイを組み立てる。各マイクロビーズ上のクローニングされた鋳型の遊離末端を、ＤＮＡ断片の分離を必要としない蛍光によるシグネチャー配列決定法を用いて同時に解析する。
【００７１】
（６．免疫組織化学法）
免疫組織化学法も、本発明の予後関連遺伝子の発現レベルを検出するのに適している。すなわち、各予後関連遺伝子産物に対して特異的な抗体を用いて発現を検出する。これらの抗体は、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチン、またはホースラディッシュ・ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどのハプテン標識によって抗体そのものを直接標識して検出することができる。あるいは、非標識一次抗体を、抗血清、ポリクローナル抗血清、または一次抗体に特異的なモノクローナル抗体を含む、標識された二次抗体とともに用いる。免疫組織化学法のプロトコールおよびキットは、当技術分野において周知されていて市販されている。
【００７２】
（７．プロテオミクス）
「プロテオミクス」という用語は、一定の時点でサンプル（例、組織、生物、または細胞培養物）の中に存在する蛋白質の全部と定義されている。とりわけ、プロテオミクスは、あるサンプルにおける蛋白質発現の全体的な変化を調べること（「発現プロテオミクス」とも呼ばれる）を含む。プロテオミクスは、一般的に以下の工程を含む：（１）２−Ｄゲル電気泳動（２−Ｄ ＰＡＧＥ）によるサンプル中の各蛋白質の分離、（２）このゲルから回収された各蛋白質の同定、例えば、質量分析またはＮ−末端配列決定法、および（３）バイオインフォマティクスを用いたデータ解析。プロテオミクス法は、他の遺伝子発現プロファイリング法の有用な補助法であり、本発明の予後関連遺伝子の産物を検出するために単独または他の方法と組み合わせて使用することができる。
【００７３】
最後に、遺伝子発現データを解析して、調べた癌サンプルで同定された特徴的な遺伝子発現パターンに基づき、癌の予後の予測された可能性に応じて、患者に利用できる最良の治療選択肢を同定する。
【００７４】
（肺癌遺伝子セット、アッセイされた遺伝子の結果、および遺伝子発現データの臨床への応用）
本発明の重要な態様は、肺癌組織による一定の遺伝子の測定された発現を用いて、予後情報を提供することである。そのためには、測定されたＲＮＡの量の差異と、用いたＲＮＡの品質のばらつきの両方を補正（正規化）する必要がある。そのため、このアッセイ法は、一般的には、ＧＡＰＤＨおよびＣｙｐ１のような周知のハウスキーピング遺伝子など、一定の正規化遺伝子の発現を測定して取り込む。あるいは、正規化は、測定した遺伝子のすべて、またはそれらの大きなサブセットのシグナルの平均値または中央値（Ｃｔ）に基づくことも可能である。患者の癌ｍＲＮＡの測定・正規化された量を、肺癌組織の参照用セットで見られる量と遺伝子毎に比較する。この参照用セットにおける肺癌組織の数（Ｎ）は十分に大きいので、別の参照用セットが（全体として）、本質的には同一の挙動をとることは確実である。この条件に合えば、具体的なセットにおける各肺癌組織の同一性は、測定される遺伝子の相対量に対して有意な影響を与えないはずである。
【００７５】
（イントロンに基づくＰＣＲ用のプライマーおよびプローブの設計）
本発明の一つの態様によれば、ＰＣＲ用のプライマーおよびプローブは、増幅する遺伝子に存在するイントロン配列に基づいて設計される。したがって、プライマー／プローブ設計における最初の工程は、該遺伝子内のイントロン配列を明らかにすることである。これは、Ｋｅｎｔ，Ｗ．Ｊ．，Ｇｅｎｍｏｍｅ Ｒｅｓ．１２（４）：６５６−６４（２０００）によって開発されたＤＮＡ ＢＬＡＳＴのような公開されているソフトウエアによって、または、その変法を含むＢＬＡＳＴソフトウエアによって行うことができる。
【００７６】
ＰＣＲプライマーの設計において考慮される最も重要な要素は、プライマーの長さ、融解温度（Ｔｍ）、およびＧ／Ｃ含有量、特異性、相補的プライマー配列、および３’−末端の配列などである。一般的に、最適なＰＣＲプライマーは、通常１７〜３０塩基の長さであって、例えば、約５０〜６０％など、約２０〜８０％のＧ＋Ｃ塩基を含む。Ｔｍは、５０から８０℃の間であり、例えば約５０から７０℃が一般的には好適である。
【００７７】
ＰＣＲ用のプライマーおよびプローブの設計に関するさらなる手引きについては、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ， Ｃ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．，「Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｆｏｒ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ．」 ｉｎ： ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５，ｐｐ．１３３−１５５；Ｉｎｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ，「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲｓ」 ｉｎ：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９４，ｐｐ．５−１１；およびＰｌａｓｔｅｒｅｒ，Ｔ．Ｎ．Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔ：Ｐｒｉｍｅｒ ａｎｄ ｐｒｏｂｅ ｄｅｓｉｇｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．７０：５２０−５２７（１９９７）などを参照されたい。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。【００７９】
材料
組換えヒト上皮増殖因子（EGF）は、CHEMICON Internationalから購入した。組換えヒトNeuregulin1-β1/Heregulin1-β1 EGFドメインは、R&D systemsから購入した。Gefitinibは、購入したIressa（登録商標、AstraZeneca)の錠剤から抽出した。【００８０】
細胞培養
正常ヒト末梢気道上皮細胞(SAECs)をLonza Walkersvilleから購入し、SAGM培地(CAMBREX)中で生育させた。A549、PC9およびPC13を、RPMI1640培地((Nakarai tesque)10%ウシ胎仔血清(FBS)(JRH Biosciences)、100 U/mlペニシリン(Nakarai tesque)および100μg/mlストレプトマイシン(Nakarai tesque)を補足)中で生育させた。細胞は、37℃、5%CO2条件下で培養した。【００８１】
ウエスタンブロッティング
細胞を溶解緩衝液(50mM HEPES、150mM NaCl、1% Triton X-100、10% glycerol、1mM EGTA、1mM PMSF、100 U/ml aprotininおよび1mM Na3VO4)、またはSDS-サンプル緩衝液(100mM Tris-HCl、pH6.8、200mM DTT、4% SDS、0.2% BPBおよび20% glycerol)で溶解させた。タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、PVDFメンブラン(Immobilon-P; Millipore Corp.)上に移した。前記メンブランを特定の抗体でブロットし、化学発光物質(PerkinElmer Life ScienceまたはMillipore Corp.)で可視化した。【００８２】
抗体
抗ヒトEGFR抗体は、Medical & Biological Laboratories co.から購入した。抗c-ErbB2/c-Neu(Ab-3)抗体は、Calbiochemから購入した。抗-erbB-3/HER-3(clone2F12)抗体は、upstateから購入した。抗HER4/ErbB4(111B2)抗体、抗ホスホp44/42マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)(Thr202/Tyr204)抗体、抗p44/42 MAPK抗体、抗ホスホAkt(Ser473)抗体、抗Akt抗体、抗ホスホEGFR(Tyr845)抗体、抗ホスホEGFR(Tyr992)抗体、抗ホスホEGFR(Tyr1045)抗体、抗ホスホEGFR Tyr(1068)抗体、抗ホスホHER2/ErbB2(Tyr1248)抗体、抗ホスホHER3/ErbB3(Tyr1289)(21D3)抗体および抗ホスホStat3(Tyr705)(D3A7)抗体は、CellSignaling Technologyから購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗マウス/ラット/ウサギイムノグロブリンG (IgG)抗体(Amersham Biosciences Co.)、HRPコンジュゲート抗ヤギIgG Ab(Santa Cruz Biotechnology)も使用した。【００８３】
細胞増殖アッセイ
細胞を、試験対象の物質（EGF(100ng/ml)またはEGFR阻害剤(0.5μM)）を含む培地とともに96ウェルのコラーゲン被覆プレート上に播種し、当該細胞を37℃で24時間または72時間インキュベートした。CellTiter 96（登録商標、Promega)を用いて、製造業者の指示書に従って細胞数を決定した後、RNAを回収した。【００８４】
RNAの単離
全RNAは、TRIzol（登録商標）試薬(Invitrogen)を用いて製造業者の指示書に従って、各試料から単離した。全RNAの品質および完全性を、2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)で評価した。8を超えるRNA完全数(RIN)を有するRNA試料をさらなる解析に用いた。【００８５】
マイクロアレイ解析
Agilent low RNA input linear amplification kit (Agilent Technologies)を用いて、製造業者の指示書に従ってRNA試料を標識した。簡潔に記載すると、Cyanine 3-CTPを用いて、500ngの全RNAの増幅および標識を行った。ハイブリダイゼーションは、gene expression hybridization kit(Agilent Technologies)を用いて製造業者の指示書に従って行った。すなわち、1.65μgのサンプルcRNAを断片化に供し(30分、60℃)、次いで、ロータリーオーブン(10rpm、65℃、17時間)中で、44K Agilent Whole Human Genome Oligo Microarray(G41112F)(Agilent Technologies)上でハイブリダイゼーションを行った。スライドを分解（disassembled）し、製造業者の指示書に従って、Agilent Gene Expression Wash Buffer 1および2(Agilent Technologies)で洗浄した。【００８６】
マイクロアレイデータの取得および処理
マイクロアレイを、Agilent社が提供するパラメーター(Green PMTを100%で設定、スキャン解像度を5μmに設定)を用いてダイナミックオートフォーカスマイクロアレイスキャナー(Agilent Technologies)でスキャンした。Feature Extraction Software v7 (Agilent Technologies)を用いて、生のシグナル値および定性flag (存在、境界、非存在)を得た。メジアンシフト正規化を各マイクロアレイ由来のシグナルに適用した。すなわち、マイクロアレイ上の処理したシグナルのメジアンが1である。ベースとともに対数変換した後の正規化したシグナルを用いた。【００８７】
状態空間モデル解析
既報(Yamaguchi, R. et al., Genome Informatics Vol. 21, p.101-113, 2008)に従い、状態空間モデルを用いて、時系列発現データを解析した。【００８８】
生存解析
すべての生存データは、原刊行物(Beer, DG. et al., Nature Medicine vol.14, pp.822-827, 2008)から抽出した。原刊行物では、６つの医療機関で回収したサンプルを、４つの研究室に分配して、各研究室でマイクロアレイ解析を行い、４つのデータセットを得た。このデータセットをUM、HLM、MSKおよびCAN/DFと名付けた。原刊行物ではこれらのデータセットのうち、トレーニングセットとして、UMおよびHLM由来の結合データを用い、その結果を他の２研究室由来の独立したデータセットを使用して検証しているため、本発明においても同様に行った。すなわち、UMおよびHLMと類似であるが外的な検証セットとしてMSKを使用し、前記３セットとは体系的に異なる検証セットとしてCAN/DFデータを使用した。評価を行うため、原刊行物に従って、Coxの比例ハザードモデルの単変量解析における共変量として、それぞれ予測されたリスクスコアを使用した。グラフ表示には、Kaplan-Meier法による生存曲線をプロットした。【００８９】
結果を図１〜図５に示す。図１および図２は、上記のように処理したマイクロアレイデータおよび状態空間モデル解析を用いて得られた、予後関連遺伝子シグネチャー（１）、（２）および（３）の関係を示す。予後関連遺伝子シグネチャー（２）は、図１におけるＳｅｔＤ＿ｓｕｂ２に相当し、予後関連遺伝子シグネチャー（１）および（３）は、それぞれ、図２におけるＳｅｔ  Ｉｐ０４およびＳｅｔ  Ｉｐ０４ｓ０１に相当する。図３〜図５は、予後関連遺伝子シグネチャー（２）および（３）を用いて肺癌の予後を予測したＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線である。この結果から、シグネチャー（２）は全てのステージの肺癌について、シグネチャー（３）はステージＩの肺癌について、有効であることが分かった。【００９０】
癌は多様であるから、多数の癌を比較して、標的を診断し治療するための重要な制御因子を発見することは困難である。本発明者らは、初代の正常細胞を用いて癌の共通の特性を明確にするという、新しいコンセプトを提供した。また、マイクロアレイを用いた遺伝子発現プロファイリングと状態空間モデルを用いて変動する遺伝子群を絞り込むことによって、重要となる制御システムを抽出することに成功した。本研究結果により、EGFで刺激した正常肺細胞に由来する遺伝子セットが肺腺癌のすべてのステージおよびステージＩの患者の再発を有意に予測することが示され、これらの予後関連遺伝子を予後診断ツールとして使用できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明の試験方法および診断薬を用いることにより、癌の予後の診断方法が進歩し、癌患者に対してより効果的でより副作用の少ない治療方法を選択することが可能となる。本発明は、癌患者のＱＯＬの向上および医療経済にも寄与することが期待される。【００９２】
本出願は、日本国で出願された特願２００８−３１１４８１(出願日：２００８年１２月５日)を基礎としており、そこに開示される内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図３】
2010064702.tif 000007
【図４】
2010064702.tif 000008
【図５】
2010064702.tif 000009
【図１】
2010064702.tif 000010
【図２】
2010064702.tif 000011
【国際調査報告】
2010064702.tif 000012
2010064702.tif 000013
2010064702.tif 000014
2010064702.tif 000015
2010064702.tif 000016
2010064702.tif 000017