(57)【要約】  特定の対象に対して用いられることを特徴とする、腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤等を提供することを目的とする。本発明は、ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置のチロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤を含む、前記チロシンがリン酸化された腫瘍細胞に対して使用する又は前記腫瘍細胞を有する被験者に使用するための、前記腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤に関する。
2019004464.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤を含む、前記チロシンがリン酸化された腫瘍細胞に対して使用する又は前記腫瘍細胞を有する被験者に使用するための、前記腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物。
【請求項２】
前記リン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤が、Src阻害剤、又はSrcの前記チロシンのリン酸化活性を向上させる因子の阻害剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記リン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤が、ダサチニブ、ボスチニブ、サラカチニブ、ポナチニブ、イロラセルチブ、N-ベンジル-2-(5-(4-(2-モルホリノエトキシ)フェニル)ピリジン-2-イル)アセトアミド、4-アミノ-5-(4-クロロフェニル)-7-(tert-ブチル)ピラゾロ-[3,4-d]ピリミジン、4-アミノ-5-(メチルフェニル)-7-(tert-ブチル)ピラゾロ-[3,4-d]ピリミジン、4-(4'-フェノキシアニリノ)-6,7-ジメトキシキナゾリン、2-((3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-メチレン)-4-シクロペンテン-1,3-ジオン、4-N-(5-シクロプロピル-1H-ピラゾール-3-イル)-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)-2-N-[(3-プロパン-2-イル-1,2-オキサゾール-5-イル)メチル]ピリミジン-2,4-ジアミン、[7-(2,6-ジクロロフェニル)-5-メチルベンゾ[1,2,4]トリアジン-3-イル]-[4-(2-ピロリジン-1-イルエトキシ)フェニル]アミン、[7-(2,6-ジクロロフェニル)-5-メチルベンゾ[1,2,4]トリアジン-3-イル]-{4-[2-(1-オキシピロリジン-1-イル)エトキシ]フェニル}アミン、及びレバスチニブ、並びにそれらの塩、水和物及び溶媒和物からなる群から選択されるSrc阻害剤である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
がんによる免疫抑制を解除するための薬剤と併用することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記がんによる免疫抑制を解除するための薬剤が、抗PD-1抗体又は抗PD-L1抗体を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
がんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤であって、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤を含む、前記チロシンがリン酸化された腫瘍細胞に対して使用する又は前記腫瘍細胞を有する被験者に使用するための、前記抗腫瘍作用増強剤。
【請求項７】
前記リン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤が、Src阻害剤又はSrcの前記チロシンのリン酸化活性を向上させる因子の阻害剤である、請求項６に記載の抗腫瘍作用増強剤。
【請求項８】
前記リン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤が、ダサチニブ、ボスチニブ、サラカチニブ、ポナチニブ、イロラセルチブ、N-ベンジル-2-(5-(4-(2-モルホリノエトキシ)フェニル)ピリジン-2-イル)アセトアミド、4-アミノ-5-(4-クロロフェニル)-7-(tert-ブチル)ピラゾロ-[3,4-d]ピリミジン、4-アミノ-5-(メチルフェニル)-7-(tert-ブチル)ピラゾロ-[3,4-d]ピリミジン、4-(4'-フェノキシアニリノ)-6,7-ジメトキシキナゾリン、2-((3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-メチレン)-4-シクロペンテン-1,3-ジオン、4-N-(5-シクロプロピル-1H-ピラゾール-3-イル)-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)-2-N-[(3-プロパン-2-イル-1,2-オキサゾール-5-イル)メチル]ピリミジン-2,4-ジアミン、[7-(2,6-ジクロロフェニル)-5-メチルベンゾ[1,2,4]トリアジン-3-イル]-[4-(2-ピロリジン-1-イルエトキシ)フェニル]アミン、[7-(2,6-ジクロロフェニル)-5-メチルベンゾ[1,2,4]トリアジン-3-イル]-{4-[2-(1-オキシピロリジン-1-イル)エトキシ]フェニル}アミン、及びレバスチニブ、並びにそれらの塩、水和物及び溶媒和物からなる群から選択されるSrc阻害剤である、請求項６又は７に記載の抗腫瘍作用増強剤。
【請求項９】
前記がんによる免疫抑制を解除するための薬剤と併用することを特徴とする、請求項６〜８のいずれか１項に記載の抗腫瘍作用増強剤。
【請求項１０】
前記がんによる免疫抑制を解除するための薬剤が、抗PD-1抗体又は抗PD-L1抗体を含む、請求項６〜９のいずれか１項に記載の抗腫瘍作用増強剤。
【請求項１１】
腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤の投与が適した被験者を特定するためのデータを取得する方法であって、
前記被験者から得られた腫瘍細胞における、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンのリン酸化を検出することを含み、
前記組成物又は前記抗腫瘍作用増強剤が、前記チロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤を含む、前記方法。
【請求項１２】
腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤の投与が適した被験者を特定するための抗体であって、
該抗体は、前記被験者から得られた腫瘍細胞における、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンのリン酸化を検出するものであり、
前記組成物又は前記抗腫瘍作用増強剤が、前記チロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤を含む、前記抗体。
【請求項１３】
腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤、のための候補物質のスクリーニング方法であって、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンのリン酸化に対しての、被検物質のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化活性を、ヒト生体外で測定すること、及び
測定された前記被検物質のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化活性に基づき、前記候補物質を選別すること
を含む、前記方法。
【請求項１４】
IDO1のリン酸化によって誘導されるSlug遺伝子の発現を抑制する又はSlugの合成を抑制する候補物質のスクリーニング方法であって、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンのリン酸化に対しての、被検物質のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化活性を、ヒト生体外で測定すること、及び
測定された前記被検物質のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化活性に基づき、前記候補物質を選別すること
を含む、前記方法。
【請求項１５】
腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤、のための候補物質のスクリーニング方法であって、
被検物質のSrc若しくはSlug阻害活性、又はSrc若しくはSlugを活性化する因子に対する阻害活性、又は被検物質によるSrc若しくはSlug合成、又はSrc遺伝子若しくはSlug遺伝子の発現を、ヒト生体外で測定すること、及び
測定された前記被検物質のSrc若しくはSlug阻害活性、又はSrc若しくはSlugを活性化する因子に対する阻害活性、又は測定された前記被検物質によるSrc若しくはSlug合成抑制、又はSrc遺伝子若しくはSlug遺伝子の発現抑制に基づき、前記候補物質を選別することを含み、
前記組成物又は前記抗腫瘍作用増強剤は、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンがリン酸化された腫瘍細胞に対して使用する若しくは前記腫瘍細胞を有する被験者に使用するための組成物又は抗腫瘍作用増強剤である、前記方法。
【請求項１６】
Slug遺伝子の発現を抑制する又はSlugの合成を抑制する候補物質のスクリーニング方法であって、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンがリン酸化されている細胞、及び／又はAhRが活性化されている細胞における、被検物質のSlug阻害活性又はSlugを活性化する因子に対する阻害活性、又は被検物質によるSlug遺伝子の発現又はSlug合成を、ヒト生体外で測定すること、及び
測定された前記被検物質のSlug阻害活性又はSlugを活性化する因子に対する阻害活性、又は測定された前記被検物質によるSlug遺伝子の発現抑制又はSlug合成抑制に基づき、前記候補物質を選別すること
を含む、前記方法。
【請求項１７】
Src阻害剤と、がんによる免疫抑制を解除するための薬剤とを含む、腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物。
【請求項１８】
がんによる免疫抑制を解除するための薬剤と併用して用いられる、Src阻害剤を含む腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物。
【請求項１９】
前記Src阻害剤が、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤である、請求項１７又は１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記腫瘍細胞が固形腫瘍におけるものである、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍免疫療法及び／又は抗腫瘍免疫療法増強剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ（indoleamine 2,3-dioxygenase：IDO）は、L−トリプトファンのN−ホルミル−キヌレニンへの変換を触媒する酵素であり、キヌレニン経路におけるトリプトファン代謝の第一段階を触媒する律速酵素である。同様に、L−トリプトファンのN−ホルミルキヌレニンへの変換を触媒する酵素として、トリプトファン-2,3-ジオキシゲナーゼ（tryptophan 2,3-dioxygenase：TDO）が知られている。
IDOやTDOががん組織などで発現すると、トリプトファン（Trp）を代謝してしまうことで、T細胞がTrpを利用できなくなること、及びIDOやTDOがTrpを代謝することでつくられるキヌレニンががん細胞から放出されて、周囲の免疫細胞の芳香族炭化水素受容体（aryl hydrocarbon receptor：AhR）を活性化し、その免疫細胞を抑制的にすることが知られている。そのため、IDOやTDOがTrpを代謝する酵素活性を抑制する薬剤（エパカドスタット(epacadostat)、インドキシモド(indoximod)等）が開発され、単剤での治療に加え、免疫チェックポイント阻害剤との併用療法が臨床応用されている（非特許文献１）。【０００３】
免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍免疫への効果から、従来にないがん治療薬として免疫チェックポイント阻害剤は注目されているが、実際に効果のある患者は限られており、またその効果によっても完治とならない患者もいることから、さらなる抗腫瘍免疫療法の開発が求められている。例えば、免疫チェックポイント阻害剤とBRAF/MEKキナーゼ阻害剤の併用について様々な試みがなされており（非特許文献２）、中にはこのような併用によりメラノーマにおいて抗腫瘍効果を増強することが報告されているものもあるが（非特許文献３）、依然として有用な抗腫瘍免疫療法の開発が期待されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】L. Brochez et al., Eur J Cancer 76, 2017, pp.167-182
【非特許文献２】Sangeetha M. Reddy et al. Curr Oncol Rep, 2016, 18(7), pp42-50
【非特許文献３】Ashish Kulkarni et al., ACS NANO, 2016, 10(10), pp.9227-9242)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、依然としてさらなる抗腫瘍免疫療法の開発が求められている。特に、特定の治療対象患者に対する個別化医療の要請はがん治療分野において特に強く、特定の対象を選定した上で、その対象に対して特に有用な薬剤を使用することが求められる。
本発明の一態様は、特定の対象に対して用いられることを特徴とする、腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤等を提供することを目的とする。また、本発明の一態様は、そのような対象を特定する方法（特定するためのデータを取得する方法）等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討した結果、がん組織内の一部のがん細胞において、IDO1の特定の部位におけるリン酸化を阻害すると、抗腫瘍免疫応答を増強し、抗腫瘍効果を奏することを新たに見出した。また、本発明者らは、IDO1の特定の部位におけるリン酸化の阻害は、がんによる免疫抑制を解除するための薬剤による治療との組合せにおいて特に有用であることを新たに見出した。本発明は、このような新たな知見に基づくものである。【０００７】
本発明の一実施態様は、以下のものに関する。
〔１〕ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤を含む、前記チロシンがリン酸化された腫瘍細胞に対して使用する又は前記腫瘍細胞を有する被験者に使用するための、前記腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物。
〔２〕前記リン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤が、Src阻害剤、又はSrcの前記チロシンのリン酸化活性を向上させる因子の阻害剤である、前記〔１〕に記載の組成物。
〔３〕前記リン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤が、ダサチニブ、ボスチニブ、サラカチニブ、ポナチニブ、イロラセルチブ、N-ベンジル-2-(5-(4-(2-モルホリノエトキシ)フェニル)ピリジン-2-イル)アセトアミド、4-アミノ-5-(4-クロロフェニル)-7-(tert-ブチル)ピラゾロ-[3,4-d]ピリミジン、4-アミノ-5-(メチルフェニル)-7-(tert-ブチル)ピラゾロ-[3,4-d]ピリミジン、4-(4'-フェノキシアニリノ)-6,7-ジメトキシキナゾリン、2-((3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-メチレン)-4-シクロペンテン-1,3-ジオン、4-N-(5-シクロプロピル-1H-ピラゾール-3-イル)-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)-2-N-[(3-プロパン-2-イル-1,2-オキサゾール-5-イル)メチル]ピリミジン-2,4-ジアミン、[7-(2,6-ジクロロフェニル)-5-メチルベンゾ[1,2,4]トリアジン-3-イル]-[4-(2-ピロリジン-1-イルエトキシ)フェニル]アミン、[7-(2,6-ジクロロフェニル)-5-メチルベンゾ[1,2,4]トリアジン-3-イル]-{4-[2-(1-オキシピロリジン-1-イル)エトキシ]フェニル}アミン、及びレバスチニブ、並びにそれらの塩、水和物及び溶媒和物からなる群から選択されるSrc阻害剤である、前記〔１〕又は〔２〕に記載の組成物。
〔４〕がんによる免疫抑制を解除するための薬剤と併用することを特徴とする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の組成物。
〔５〕前記がんによる免疫抑制を解除するための薬剤が、抗PD-1抗体又は抗PD-L1抗体を含む、前記〔４〕に記載の組成物。
〔６〕がんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤であって、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤を含む、前記チロシンがリン酸化された腫瘍細胞に対して使用する又は前記腫瘍細胞を有する被験者に使用するための、前記抗腫瘍作用増強剤。
〔７〕前記リン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤が、Src阻害剤又はSrcの前記チロシンのリン酸化活性を向上させる因子の阻害剤である、前記〔６〕に記載の抗腫瘍作用増強剤。
〔８〕前記リン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤が、ダサチニブ、ボスチニブ、サラカチニブ、ポナチニブ、イロラセルチブ、N-ベンジル-2-(5-(4-(2-モルホリノエトキシ)フェニル)ピリジン-2-イル)アセトアミド、4-アミノ-5-(4-クロロフェニル)-7-(tert-ブチル)ピラゾロ-[3,4-d]ピリミジン、4-アミノ-5-(メチルフェニル)-7-(tert-ブチル)ピラゾロ-[3,4-d]ピリミジン、4-(4'-フェノキシアニリノ)-6,7-ジメトキシキナゾリン、2-((3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-メチレン)-4-シクロペンテン-1,3-ジオン、4-N-(5-シクロプロピル-1H-ピラゾール-3-イル)-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)-2-N-[(3-プロパン-2-イル-1,2-オキサゾール-5-イル)メチル]ピリミジン-2,4-ジアミン、[7-(2,6-ジクロロフェニル)-5-メチルベンゾ[1,2,4]トリアジン-3-イル]-[4-(2-ピロリジン-1-イルエトキシ)フェニル]アミン、[7-(2,6-ジクロロフェニル)-5-メチルベンゾ[1,2,4]トリアジン-3-イル]-{4-[2-(1-オキシピロリジン-1-イル)エトキシ]フェニル}アミン、及びレバスチニブ、並びにそれらの塩、水和物及び溶媒和物からなる群から選択されるSrc阻害剤である、前記〔６〕又は〔７〕に記載の抗腫瘍作用増強剤。
〔９〕前記がんによる免疫抑制を解除するための薬剤と併用することを特徴とする、前記〔６〕〜〔８〕のいずれか１項に記載の抗腫瘍作用増強剤。
〔１０〕前記がんによる免疫抑制を解除するための薬剤が、抗PD-1抗体又は抗PD-L1抗体を含む、前記〔６〕〜〔９〕のいずれか１項に記載の抗腫瘍作用増強剤。
〔１１〕腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤の投与が適した被験者を特定するためのデータを取得する方法であって、
前記被験者から得られた腫瘍細胞における、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンのリン酸化を検出することを含み、
前記組成物又は前記抗腫瘍作用増強剤が、前記チロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤を含む、前記方法。
〔１２〕腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤の投与が適した被験者を特定するための抗体であって、
該抗体は、前記被験者から得られた腫瘍細胞における、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンのリン酸化を検出するものであり、
前記組成物又は前記抗腫瘍作用増強剤が、前記チロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤を含む、前記抗体。
〔１３〕腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤、のための候補物質のスクリーニング方法であって、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンのリン酸化に対しての、被検物質のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化活性を、ヒト生体外で測定すること、及び
測定された前記被検物質のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化活性に基づき、前記候補物質を選別すること
を含む、前記方法。
〔１４〕IDO1のリン酸化によって誘導されるSlug遺伝子の発現を抑制する又はSlugの合成を抑制する候補物質のスクリーニング方法であって、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンのリン酸化に対しての、被検物質のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化活性を、ヒト生体外で測定すること、及び
測定された前記被検物質のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化活性に基づき、前記候補物質を選別すること
を含む、前記方法。
〔１５〕腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤、のための候補物質のスクリーニング方法であって、
被検物質のSrc若しくはSlug阻害活性、又はSrc若しくはSlugを活性化する因子に対する阻害活性、又は被検物質によるSrc若しくはSlug合成、又はSrc遺伝子若しくはSlug遺伝子の発現を、ヒト生体外で測定すること、及び
測定された前記被検物質のSrc若しくはSlug阻害活性、又はSrc若しくはSlugを活性化する因子に対する阻害活性、又は測定された前記被検物質によるSrc若しくはSlug合成抑制、又はSrc遺伝子若しくはSlug遺伝子の発現抑制に基づき、前記候補物質を選別することを含み、
前記組成物又は前記抗腫瘍作用増強剤は、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンがリン酸化された腫瘍細胞に対して使用する若しくは前記腫瘍細胞を有する被験者に使用するための組成物又は抗腫瘍作用増強剤である、前記方法。
〔１６〕Slug遺伝子の発現を抑制する又はSlugの合成を抑制する候補物質のスクリーニング方法であって、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンがリン酸化されている細胞、及び／又はAhRが活性化されている細胞における、被検物質のSlug阻害活性又はSlugを活性化する因子に対する阻害活性、又は被検物質によるSlug遺伝子の発現又はSlug合成を、ヒト生体外で測定すること、及び
測定された前記被検物質のSlug阻害活性又はSlugを活性化する因子に対する阻害活性、又は測定された前記被検物質によるSlug遺伝子の発現抑制又はSlug合成抑制に基づき、前記候補物質を選別すること
を含む、前記方法。
〔１７〕Src阻害剤と、がんによる免疫抑制を解除するための薬剤とを含む、腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物。
〔１８〕がんによる免疫抑制を解除するための薬剤と併用して用いられる、Src阻害剤を含む腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物。
〔１９〕前記Src阻害剤が、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤である、請求項〔１７〕又は〔１８〕に記載の組成物。
〔２０〕前記腫瘍細胞が固形腫瘍におけるものである、請求項〔１７〕〜〔１９〕のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の一実施態様によれば、特定の腫瘍細胞に対して抗腫瘍効果を奏し得る。ここで、抗腫瘍効果とは、腫瘍細胞の増殖を阻害すること、及び／又は腫瘍細胞の浸潤を阻害すること、及び／又は腫瘍を縮小することを含み得る。
本発明の一実施態様によれば、がんによる免疫抑制を解除するための薬剤による治療との組合せにおいて有益な抗腫瘍効果を奏し得る。
本発明の一実施態様において、特定のがん治療に適した特定の対象を特定し得る。
本発明の一実施態様において、がん治療に有用な候補物質をスクリーニングし得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】マウスがん細胞MCA205を移植されたC57BL/6マウスにおける、腫瘍体積の増大を示すグラフである。MCA205 mockは、遺伝子挿入していない空ベクターを導入したMCA205を表し、MCA205 IDO1は、野生型マウスIDO1遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205を表し、MCA205 actAhRは、恒常的活性化型マウスAhR遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205を表す。
【図２】マウスがん細胞MCA205を移植されたC57BL/6マウスにおける、腫瘍体積の増大を示すグラフである。MCA205 mockは、遺伝子挿入していない空ベクターを導入したMCA205を表し、MCA205 IDO1WTは、野生型マウスIDO1遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205を表し、MCA205 IDO1HAは、H350Aのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したマウスIDO1変異遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205を表し、MCA205 IDO1YYFFは、Y115F及びY253Fのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したマウスIDO1変異遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205を表す。
【図３】マウスがん細胞MCA205を移植されたC57BL/6マウスにおける、細胞傷害性T細胞による抗腫瘍免疫活性の指標であるマウスIFN-γの産生量を示すグラフである。MCA205 mock、MCA205 IDO1WT、MCA205 IDO1HA及びMCA205 IDO1YYFFは、図２と同様である。
【図４】マトリゲルを用いた浸潤アッセイにより測定した、がん細胞の浸潤能を示すグラフである。MCA205 mock、MCA205 IDO1WT、MCA205 IDO1HA及びMCA205 IDO1YYFFは、図２と同様である。
【図５】大腸がん患者由来のがん組織および乳がん患者由来のがん組織について、IDO1におけるY249のリン酸化とSlugの局在化を免疫組織染色により示した写真である。
【図６】マウスがん細胞MCA205におけるSlug遺伝子発現量の、定量PCRによる解析結果を示すグラフである。MCA205 mock、MCA205 IDO1WT、MCA205 IDO1HA及びMCA205 IDO1YYFFは、図２と同様である。MCA205 actAhRは、図１と同様である。縦軸は、MCA205 mockの場合に検出されたmRNA量を1として相対的に示したものである。
【図７】マウスがん細胞MCA205におけるcyp1a1遺伝子発現量の、定量PCRによる解析結果を示すグラフである。MCA205 mock、MCA205 IDO1WT、MCA205 IDO1HA及びMCA205 IDO1YYFFは、図２と同様である。MCA205 active AhRは、恒常的活性化型マウスAhR遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205を表す（MCA205 actAhRと同じである）。縦軸は、MCA205 mockの場合に検出されたmRNA量を1として相対的に示したものである。
【図８】マウスがん細胞MCA205におけるSlug遺伝子発現量の、定量PCRによる解析結果を示すグラフである。MCA205 mock、MCA205 IDO1WT及びMCA205 IDO1YYFFは、図２と同様である。MCA205 IDO1Y115Fは、Y115Fのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したマウスIDO1変異遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205を表し、MCA205 IDO1Y253Fは、Y253Fのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したマウスIDO1変異遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205を表す。縦軸は、MCA205 mockの場合に検出されたmRNA量を1として相対的に示したものである。
【図９】マウスがん細胞MCA205を移植されたC57BL/6マウスにおける、腫瘍体積の増大を示すグラフである。MCA205 mockは、遺伝子挿入していない空ベクターを導入したMCA205を表し、MCA205 Slugは、Slug遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205を表す。
【図１０】マウスがん細胞MCA205を移植されたC57BL/6マウスにおける、細胞傷害性T細胞による抗腫瘍免疫活性の指標であるマウスIFN-γの産生量を示すグラフである。MCA205 mock及びMCA205 Slugは、図９と同様である。
【図１１】マウスがん細胞MCA205におけるSlug遺伝子発現量の、定量PCRによる解析結果を示すグラフである。MCA205 actAhR shSlugは、恒常的活性化型マウスAhR遺伝子を導入して恒常的に発現させ、かつ恒常的にSlug遺伝子発現をノックダウンさせたMCA205を表し、MCA205 actAhR NonTargetは、陰性対照を表す。縦軸は、MCA205 actAhR NonTargetの場合に検出されたmRNA量を1として相対的に示したものである。
【図１２】マウスがん細胞MCA205を移植されたマウスにおける、腫瘍体積の増大を示すグラフである。MCA205 mockは、遺伝子挿入していない空ベクターを導入したMCA205を表し、MCA205 actAhR shSlug及びMCA205 actAhR NonTargetは、図１１と同様である。
【図１３】マウスがん細胞MCA205を移植されたC57BL/6マウスにおける、細胞傷害性T細胞による抗腫瘍免疫活性の指標であるマウスIFN-γの産生量を示すグラフである。MCA205 mock、MCA205 actAhR shSlug及びMCA205 actAhR NonTargetは、図１１と同様である。
【図１４】ヒトがん細胞SW837におけるSlug遺伝子発現量の、定量PCRによる解析結果を示すグラフである。SW837 mockは、遺伝子挿入していない空ベクターを導入したSW837を表し、SW837 IDO1WTは、野生型ヒトIDO1遺伝子を導入して恒常的に発現させたSW837を表し、SW837 IDO1HAは、H346Aのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したヒトIDO1変異遺伝子を導入して恒常的に発現させたSW837を表し、SW837 IDO1YYFFは、Y111F及びY249Fのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したヒトIDO1変異遺伝子を導入して恒常的に発現させたSW837を表し、SW837 actAhRは、恒常的活性化型ヒトAhR遺伝子を導入して恒常的に発現させたSW837を表す。縦軸は、SW837 mockの場合に検出されたmRNA量を1として相対的に示したものである。
【図１５】大腸がん患者由来のがん組織について、IDO1におけるY249がリン酸化されている部位と、Srcの局在化と、Cskの局在化を免疫組織染色により示した写真である。
【図１６】大腸がん患者由来のがん組織について、IDO1におけるY249がリン酸化されている部位と、SrcにおけるY530がリン酸化されている部位を免疫組織染色により示した写真である。
【図１７】野生型ヒトIDO1遺伝子を導入して恒常的に発現させたヒトがん細胞SW837における、Y249がリン酸化したIDO1と総IDO1のタンパク質検出を示す写真である。mockは、野生型ヒトIDO1遺伝子を導入して恒常的に発現させ、かつ遺伝子挿入していない空ベクター（pcDNA3.1）を一過性に導入したヒトがん細胞SW837を表し、hSrc Y530Fは、野生型ヒトIDO1遺伝子を導入して恒常的に発現させ、かつY530Fのアミノ酸変異を有する活性化型Srcを合成するよう作製したヒトSrc変異遺伝子を更に導入して一過性に発現させたSW837を表す。
【図１８】ヒトがん細胞SW837において、FLAGタグを融合したヒトIDO1を一過性に発現させ、抗FLAG抗体M2で免疫沈降を行った後の沈降物あるいは免疫沈降前の細胞抽出液（Total lysate）におけるFLAG融合ヒトIDO1タンパク質あるいはGAPDHタンパク質をウエスタンブロット法で検出した結果を示す写真である。mockは、遺伝子挿入していない空ベクター（pME-FLAG）の使用を意味し、hIDO1 WTは、野生型ヒトIDO1遺伝子を表し、hIDO1 Y111Fは、Y111Fのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したヒトIDO1変異遺伝子を表し、hIDO1 Y249Fは、Y249Fのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したヒトIDO1変異遺伝子を表し、hIDO1 Y111,249FFは、Y111F及びY249Fのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したヒトIDO1変異遺伝子を表す。
【図１９】マウスがん細胞MCA205を移植されたC57BL/6マウスにおける、腫瘍体積の増大を示すグラフである。MCA205 mockは、遺伝子挿入していない空ベクターを導入したMCA205を表し、MCA205 IDO1WTは、野生型マウスIDO1遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205を表し、MCA205 IDO1Y253Fは、Y253Fのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したマウスIDO1変異遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205を表す。
【図２０】マウスがん細胞MC38を移植されたC57BL/6マウスにおける、腫瘍体積の増大を示すグラフである。MC38(IgG2a＋媒体)は、ラットIgG2aアイソタイプコントロール抗体と媒体を投与した場合を表し、MC38(IgG2a＋ダサチニブ)は、ラットIgG2aアイソタイプコントロール抗体とダサチニブを投与した場合を表し、MC38(α-PD-1＋媒体)は、抗PD-1抗体と媒体を投与した場合を表し、MC38(α-PD-1＋ダサチニブ)は、抗PD-1抗体とダサチニブを投与した場合を表す。
【図２１】マウスがん細胞MC38を移植されたC57BL/6マウスにおける、細胞傷害性T細胞による抗腫瘍免疫活性の指標であるマウスIFN-γの産生量を示すグラフである。MC38 IgG＋媒体、MC38 IgG＋ダサチニブ、MC38 α-PD1＋媒体及びMC38 α-PD1＋ダサチニブは、それぞれ、図２０におけるMC38(IgG2a＋媒体)、MC38(IgG2a＋ダサチニブ)、MC38(α-PD-1＋媒体)及びMC38(α-PD-1＋ダサチニブ)と同様である。
【図２２】野生型マウスIDO1遺伝子を導入したマウスがん細胞MCA205を移植されたC57BL/6マウスにおける、腫瘍体積の増大を示すグラフである。MCA205 IDO1WT(IgG2a＋媒体)は、ラットIgG2aアイソタイプコントロール抗体と媒体を投与した場合を表し、MCA205 IDO1WT(IgG2a＋ダサチニブ)は、ラットIgG2aアイソタイプコントロール抗体とダサチニブを投与した場合を表し、MCA205 IDO1WT(α-PD1＋媒体)は、抗PD-1抗体と媒体を投与した場合を表し、MCA205 IDO1WT(α-PD1＋ダサチニブ)は、抗PD-1抗体とダサチニブを投与した場合を表す。
【図２３】野生型マウスIDO1遺伝子を導入したマウスがん細胞MCA205を移植されたC57BL/6マウスにおける、腫瘍体積の増大を示すグラフである。MCA205 IDO1WT(水＋PBS)は、水とPBSを投与した場合を表し、MCA205 IDO1WT(水＋Y15)は、水とFAK阻害剤Y15を投与した場合を表し、MCA205 IDO1WT(1-MT＋PBS)は、１−メチル−Ｄ−トリプトファンとPBSを投与した場合を表し、MCA205 IDO1WT(1-MT＋Y15)は、１−メチル−Ｄ−トリプトファンとFAK阻害剤Y15を投与した場合を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明について詳述する。
本発明の一実施態様は、腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物に関する。
本発明の腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物は、IDO1の特定のチロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤を含む。また、本発明の腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物は、IDO1の特定のチロシンがリン酸化された腫瘍細胞に対して、又はIDO1の特定のチロシンがリン酸化された腫瘍細胞を有する被験者に対して使用されるものである。
本発明の一実施態様は、がんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤に関する。
本発明のがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤は、IDO1の特定のチロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤を含む。また、本発明のがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤は、IDO1の特定のチロシンがリン酸化された腫瘍細胞に対して、又はIDO1の特定のチロシンがリン酸化された腫瘍細胞を有する被験者に対して使用されるものである。
本発明の一実施態様は、Src阻害剤と、がんによる免疫抑制を解除するための薬剤とを含む、腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物に関する。
本発明の一実施態様は、がんによる免疫抑制を解除するための薬剤と併用して用いられる、Src阻害剤を含む腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物に関する。
【００１１】
本明細書において、「腫瘍細胞」とは、異常に増殖する細胞又は細胞集団のことであり、良性腫瘍及び悪性腫瘍を含む。腫瘍細胞は、単に腫瘍とも言い、固形腫瘍及び液性腫瘍を含む。腫瘍細胞（腫瘍）は、例えば、肺、胃、食道、肝臓、膵臓、腸、腎臓、脾臓、生殖器、泌尿器、脳、神経、骨髄、及びリンパ節等の臓器（器官）において存在し得る。
悪性腫瘍は、一般的にがんとも言われる。従って、本発明の腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、並びに本発明のがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤は、がんを治療するために使用し得る。ここで、がんは、癌種、肉腫及び血液悪性腫瘍（造血器腫瘍）をも含む広い意味で用いられる。本発明の腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、並びに本発明のがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤は、例えば、肺癌、胃癌、食道癌、肝臓癌、胆道癌、膵臓癌、大腸癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、乳癌、皮膚癌、喉頭癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、結腸直腸癌、黒色腫、頭頸部癌、骨軟部腫瘍、甲状腺癌、線維肉腫、皮膚線維肉腫、脂肪肉腫、筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、骨肉腫、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫等のがんの治療のために使用し得るが、これらに限定されるものではない。
腫瘍組織の間質細胞に発現したIDO1もトリプトファンを代謝し、抗腫瘍免疫を抑制することから、間質細胞に発現したIDO1において、本明細書に記載の特定のチロシンのリン酸化が認められる被験者に対しても、本発明の腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、並びに本発明のがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤を使用し得る。
【００１２】
本発明の腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、並びに本発明のがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤は、IDO1の特定のチロシンがリン酸化された腫瘍細胞に対して特に抗腫瘍効果を奏し得る。
抗腫瘍効果は、固形腫瘍の場合、腫瘍細胞の増殖を阻害すること、腫瘍細胞の浸潤を阻害すること、又は腫瘍の大きさが縮小することを指標として評価し得る。また、液性腫瘍の場合、抗腫瘍効果は、血液中の腫瘍細胞の数が減少することを指標として評価し得る。
IDO1の特定のチロシンとは、ヒトIDO1（配列番号：１）の場合、111位及び／又は249位におけるチロシンであり、非ヒトIDO1の場合、ヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置におけるチロシンである。非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置におけるチロシンは、各動物において位置は様々であるが、例えば、マウスIDO1（配列番号：２）においては、115位のチロシンがヒトIDO1の111位のチロシンに対応し、253位のチロシンがヒトIDO1の249位のチロシンに対応する。
なお、IDO1には２つの免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ITIM）が存在しており、ヒトIDO1の111位チロシンが存在する箇所をITIM1、ヒトIDO1の249位チロシンが存在する箇所をITIM2と称する。ITIM1とITIM2は類似した機能を有していると考えられている。
【００１３】
本発明者らは、腫瘍細胞において、ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置におけるチロシンのリン酸化が、抗腫瘍免疫の抑制や腫瘍細胞の増殖等に関与していることを見出した。更に、本発明者らは、腫瘍細胞において、ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置におけるチロシンのリン酸化を阻害すると、抗腫瘍免疫応答を増強して抗腫瘍効果を奏すること、また、腫瘍細胞中のIDO1量が顕著に減少することを見出した。
従って、本発明の腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、並びに本発明のがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤は、ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置のチロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤を含むことを特徴とする。好ましくは、本発明の腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、並びに本発明のがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤は、ヒトIDO1の249位、又は非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の249位に対応する位置のチロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤を含む。
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置のチロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤としては、例えば、Src阻害剤、又はSrcの前記特定のチロシンのリン酸化活性を向上させる因子の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
Src阻害剤としては、キナーゼであるSrcの作用を阻害する化合物や抗体、及びSrc遺伝子の発現を阻害する化合物や核酸等が挙げられる。具体的なSrc阻害剤としては、Lauren N. Puls et al., The Oncologist 2011; 16:566-578等の文献や当業者の知識に基づき、Src阻害活性を有することが知られているもの等を使用し得る。例えば、Src阻害剤としては、ダサチニブ(dasatinib)、ボスチニブ(bosutinib)、サラカチニブ(saracatinib)、ポナチニブ(ponatinib)、イロラセルチブ(ilorasertib)、N-ベンジル-2-(5-(4-(2-モルホリノエトキシ)フェニル)ピリジン-2-イル)アセトアミド（KX2-391；CAS番号:897016-82-9）、4-アミノ-5-(4-クロロフェニル)-7-(tert-ブチル)ピラゾロ-[3,4-d]ピリミジン（PP2；CAS番号:172889-27-9）、4-アミノ-5-(メチルフェニル)-7-(tert-ブチル)ピラゾロ-[3,4-d]ピリミジン（PPH1；CAS番号:172889-26-8）、4-(4'-フェノキシアニリノ)-6,7-ジメトキシキナゾリン（Src Kinase Inhibitor I；CAS番号:179248-59-0）、2-((3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシフェニル)-メチレン)-4-シクロペンテン-1,3-ジオン（TX-1123；CAS番号:157397-06-3）、4-N-(5-シクロプロピル-1H-ピラゾール-3-イル)-6-(4-メチルピペラジン-1-イル)-2-N-[(3-プロパン-2-イル-1,2-オキサゾール-5-イル)メチル]ピリミジン-2,4-ジアミン（XL-228；CAS番号:898280-07-4）、[7-(2,6-ジクロロフェニル)-5-メチルベンゾ[1,2,4]トリアジン-3-イル]-[4-(2-ピロリジン-1-イルエトキシ)フェニル]アミン（TG100435）、[7-(2,6-ジクロロフェニル)-5-メチルベンゾ[1,2,4]トリアジン-3-イル]-{4-[2-(1-オキシピロリジン-1-イル)エトキシ]フェニル}アミン（TG100855）、及びレバスチニブ(rebastinib)（DCC2036）、並びにそれらの塩、水和物及び溶媒和物等が挙げられるものの、これらに限定されるものではない。
塩、水和物及び溶媒和物は、特に限定されないが、医薬的に許容されるものである限り、適宜選択し得る。医薬的に許容される塩としては、特に限定されないが、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩及びリン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、サリチル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、ステアリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩及びｐ−トルエンスルホン酸塩等の有機酸塩、アルカリ金属塩（ナトリウム塩及びカリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩及びマグネシウム塩等）及びアンモニウム塩等の無機塩基塩、ジエチルアミン塩等の有機塩基塩、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩等の酸性アミノ酸塩、並びにアルギニン塩、リジン塩及びオルニチン塩等の塩基性アミノ酸塩が挙げられる。
【００１５】
Srcの前記特定のチロシンのリン酸化活性を向上させる因子の阻害剤には、Srcの活性化を亢進する因子の阻害剤や、Src遺伝子の発現を活性化する因子の阻害剤も含まれる。Srcの前記特定のチロシンのリン酸化活性を向上させる因子の阻害剤としては、FAK阻害剤等が挙げられる。例えば、具体的なFAK阻害剤としては、1,2,4,5-ベンゼンテトラアミン四塩酸塩（Y15；CAS番号:4506-66-5）、デファクチニブ(defactinib)、6-[4-(3-メチルスルホニルベンジルアミノ)-5-トリフルオロメチルピリミジン-2-イルアミノ]-3,4-ジヒドロ-1H-キノリン-2-オン（PF-573228；CAS番号:8692288-64-2）、及び2-[[2-(2-メトキシ-4-モルホリン-4-イルアニリノ)-5-(トリフルオロメチル)ピリジン-4-イル]アミノ]-N-メチルベンズアミド（PND-1186；CAS番号:1061353-68-1）、PF-00562271（CAS番号：939791-38-5）、並びにそれらの塩、水和物及び溶媒和物等が挙げられるものの、これらに限定されるものではない。
塩、水和物及び溶媒和物は、特に限定されないが、医薬的に許容されるものである限り、適宜選択し得る。医薬的に許容される塩としては、上記に例示したものが挙げられる。
【００１６】
本発明の一実施態様では、本発明の腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物は、がんによる免疫抑制を解除するための薬剤と併用される。
本発明の一実施態様では、本発明のがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤は、がんによる免疫抑制を解除するための薬剤と併用される。
このようながんによる免疫抑制を解除するための薬剤との併用により、優れた抗腫瘍効果を発揮することができ、その抗腫瘍効果は相乗的であり得る。特に、Src阻害剤であるダサチニブ、ボスチニブ及びポナチニブは、本願出願時において、慢性骨髄性白血病や再発又は難治性のフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病を治療するための医薬として使用されているが、本発明の腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、並びに本発明のがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤は、固形腫瘍（IDO1の上記特定のチロシンがリン酸化された固形腫瘍）に対しても有用であることは驚くべきことであり、また、がんによる免疫抑制を解除するための薬剤との併用により、がんによる免疫抑制を解除するための薬剤の固形腫瘍（IDO1の上記特定のチロシンがリン酸化された固形腫瘍）に対しての抗腫瘍作用をも増強すること、その抗腫瘍作用の増強は相乗的であり得ることは非常に驚くべきことである。
なお、本発明の腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、並びに本発明のがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤は、がんによる免疫抑制を解除するための薬剤以外の薬剤との併用が妨げられるものではない。
【００１７】
がんによる免疫抑制を解除するための薬剤としては、例えば、抗PD-1抗体（ニボルマブ(nivolumab)、ペムブロリズマブ(pembrolizumab)等）、抗PD-L1抗体（アテゾリズマブ(atezolizumab)、デュルバルマブ(durvalumab)、アベルマブ(avelumab)等）、抗CTLA-4抗体（イピリブマブ(Ipilimumab)、トレメリムマブ(tremelimumab)等）、IDO酵素活性阻害剤（１−メチル−トリプトファン、エパカドスタット、インドキシモド等）、及びTDO酵素活性阻害剤（(E)-6-フルオロ-3-[2-(3-ピリジル)ビニル]-1H-インドール（680C91）、トランス-6-フルオロ-3-[2-(1H-テトラゾール-5-イル)ビニル]-1H-インドール（LM10）等）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
好ましくは、本発明の腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、並びに本発明のがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤は、抗PD-1抗体及び／又は抗PD-L1抗体と併用される。より好ましくは、本発明の腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、並びに本発明のがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤は、Src阻害剤を含み、かつ抗PD-1抗体及び／又は抗PD-L1抗体と併用される。Src阻害剤と抗PD-1抗体及び／又は抗PD-L1抗体との併用、特にSrc阻害剤と抗PD-1抗体との併用は、より良好な抗腫瘍効果を奏し得る。
【００１８】
本発明の腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、並びに本発明のがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤は、医薬的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、安定剤等の医薬に使用し得る添加物を含んでもよい。このような添加物は当業者の技術常識に基づき適宜選択され得る。
本発明の腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、並びに本発明のがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤は、IDO酵素活性阻害剤を用いて治療したがん患者において、IDO酵素活性阻害剤の効果が見られなくなった場合に特に有用であり得る。これは、ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置のチロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤は、IDO酵素活性阻害剤と作用点が異なるためである。
【００１９】
本発明の一実施態様は、腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤の投与が適した被験者を特定するためのデータを取得する方法であって、
前記被験者から得られた腫瘍細胞における、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンのリン酸化を検出することを含み、
前記組成物又は前記抗腫瘍作用増強剤が、前記チロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤を含む、前記方法に関する。
なお、非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置におけるチロシンについては、前述のとおりである。また、前記チロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤についても、前述のとおりである。
【００２０】
被験者から得られた腫瘍細胞における、ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置のチロシンのリン酸化を検出することの具体的な工程は、例えば、前記特定のチロシンがリン酸化されたIDO1に特異的に結合する抗体を、被験者から得られた腫瘍組織又は腫瘍細胞又はその腫瘍細胞から産生されたIDO1と接触させ、抗原抗体反応を検出する工程を含む。抗体と腫瘍組織又は腫瘍細胞又はIDO1との接触は、例えば、腫瘍組織切片、又は腫瘍細胞を含む培地、又はIDO1を含む培地若しくは腫瘍細胞に由来する抽出液中に抗体を添加して、インキュベートすることにより行われるが、これに限定されるものではない。抗原抗体反応の検出は、当業者に周知の方法により行うことができ、免疫組織染色法、ウエスタンブロット法、ELISA法、EIA法、表面プラズモン共鳴法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、抗原抗体反応の検出は、抗体及び／又は抗原を、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素等で標識し、その標識の物理的及び／又は化学的特性を利用した測定方法により行うこともできる。
前記特定のチロシンがリン酸化されたIDO1に特異的に結合する抗体は、周知の抗体作製技術を利用して作製することができる。例えば、ヒトIDO1の249位におけるチロシンがリン酸化されたIDO1に特異的に結合する抗体は、ヒトIDO1の249位におけるリン酸化チロシンの周辺配列のペプチドを抗原として、マウス、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ等の動物を免疫して、産生された抗体を当該動物の血液中から回収し、抗体を精製することにより、所望の抗体を得ることができる。このような抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。
【００２１】
前述の抗体は、腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤の投与が適した被験者を特定するための抗体として利用し得る。そのため、本発明の一実施態様によれば、腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤の投与が適した被験者を特定するための抗体であって、
該抗体は、前記被験者から得られた腫瘍細胞における、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンのリン酸化を検出するものであり、
前記組成物又は前記抗腫瘍作用増強剤が、前記チロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤を含む、前記抗体が提供される。
なお、非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置におけるチロシンについては、前述のとおりである。また、前記チロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害剤又は脱リン酸化剤についても、前述のとおりである。
【００２２】
本発明の一実施態様は、腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤、のための候補物質のスクリーニング方法であって、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンのリン酸化に対しての、被検物質のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化活性を、ヒト生体外で測定すること、及び
測定された前記被検物質のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化活性に基づき、前記候補物質を選別すること
を含む、前記方法に関する。
なお、非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置におけるチロシンについては、前述のとおりである。
本明細書において、「スクリーニング」とは、特定の性質を有する所望の物質を、被検物質（評価対象物）の中から選別することをいう。
【００２３】
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置のチロシンのリン酸化に対しての、被検物質のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化活性を、ヒト生体外で測定することの具体的な工程は、例えば、以下の工程を含み得るが、以下に限定されるものではない。
（１）被検物質を、前記特定の部位のチロシンがリン酸化され得るIDO1に、又は前記特定の部位のチロシンがリン酸化され得るIDO1を産生する細胞に、接触させる工程、及び
（２）IDO1における前記特定の部位のリン酸化チロシンを検出する工程。
上記（１）の工程は、当業者に周知の技術を用いて行うことができ、例えば、被検物質及びIDO1の両者を媒体中に添加しインキュベートすること、又は被検物質をIDO1を産生する細胞を含む培地、又はIDO1を含む培地若しくは当該細胞に由来する抽出液中に添加しインキュベートすることにより行われ得る。
上記（２）の工程は、当業者に周知の技術を用いて行うことができ、例えば、前記特定の部位のチロシンがリン酸化されたIDO1に特異的に結合する抗体を、上記（１）の工程により被検物質と接触させたIDO1又は細胞を含む媒体、培地又は抽出液中に添加しインキュベートして、抗原抗体反応を検出することで、IDO1における前記特定の部位のリン酸化チロシンの量を測定することにより行われ得る。前記特定の部位のチロシンがリン酸化されたIDO1に特異的に結合する抗体としては、前述の抗体を使用し得る。リン酸化チロシンの量の測定は、当業者に周知の方法により行うことができ、ウエスタンブロット法やELISA法等により行うことができる。
【００２４】
測定された被検物質のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化活性に基づき、候補物質を選別することの具体的な工程は、例えば、被検物質の非存在下でのIDO1における前記特定の部位のリン酸化チロシンと、被検物質の存在下で検出したIDO1における前記特定の部位のリン酸化チロシンの量を比較する工程を含む。このような比較は、当業者に周知の技術を用いて行うことができ、例えば、上記（２）の工程により測定したリン酸化チロシンの量を、被検物質の非存在下で測定する以外は同様に測定したリン酸化チロシンの量と比較することにより行うことができる。比較の結果、被検物質の存在下で測定したリン酸化チロシンの量が、被検物質の非存在下で測定したリン酸化チロシンの量よりも少なければ、被検物質は、IDO1における前記特定のチロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害活性又は脱リン酸化活性を有すると評価できる。そして、そのようなリン酸化阻害活性又は脱リン酸化活性を有する被検物質は、腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤、のための候補物質である。
【００２５】
本発明の一実施態様は、IDO1のリン酸化によって誘導されるSlug遺伝子の発現を抑制する又はSlugの合成を抑制する候補物質のスクリーニング方法であって、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンのリン酸化に対しての、被検物質のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化活性を、ヒト生体外で測定すること、及び
測定された前記被検物質のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化活性に基づき、前記候補物質を選別すること
を含む、前記方法に関する。
なお、非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置におけるチロシンについては、前述のとおりである。
Slugは、上皮間葉転換に関わる転写因子であり腫瘍細胞の転移に関わることが知られており、例えば、ヒトSlugのアミノ酸配列は配列番号：３に示され、マウスSlugのアミノ酸配列は配列番号：４に示されるとおりである。
【００２６】
本発明者らは、腫瘍細胞に発現したSlugが抗腫瘍免疫を抑制すること、腫瘍細胞でのAhR活性化は抗腫瘍免疫を抑制すること、腫瘍細胞で活性化したAhRによる抗腫瘍免疫の抑制はSlug遺伝子の抑制により顕著に解除され、抗腫瘍免疫活性が増強されること、腫瘍細胞に発現したIDO1はSlugの発現を誘導し、その誘導はIDO1酵素活性の阻害によっても抑制できるが、前記特定のチロシンのリン酸化の阻害によっても抑制できることを新たに見出した。
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置のチロシンのリン酸化に対しての、被検物質のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化活性を、ヒト生体外で測定することの具体的な工程は、前述した、腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤、のための候補物質のスクリーニング方法におけるものと同様である。
測定された被検物質のリン酸化阻害活性又は脱リン酸化活性に基づき、候補物質を選別することの具体的な工程は、前述した、腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤、のための候補物質のスクリーニング方法におけるものと同様である。IDO1における前記特定のチロシンのリン酸化に対するリン酸化阻害活性又は脱リン酸化活性を有すると評価できる被検物質は、IDO1のリン酸化によって誘導されるSlug遺伝子の発現を抑制する又はSlugの合成を抑制する候補物質である。
【００２７】
本発明の一実施態様は、腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤、のための候補物質のスクリーニング方法であって、
被検物質のSrc若しくはSlug阻害活性、又はSrc若しくはSlugを活性化する因子に対する阻害活性、又は被検物質によるSrc若しくはSlug合成、又はSrc遺伝子若しくはSlug遺伝子の発現を、ヒト生体外で測定すること、及び
測定された前記被検物質のSrc若しくはSlug阻害活性、又はSrc若しくはSlugを活性化する因子に対する阻害活性、又は測定された前記被検物質によるSrc若しくはSlug合成抑制、又はSrc遺伝子若しくはSlug遺伝子の発現抑制に基づき、前記候補物質を選別することを含み、
前記組成物又は前記抗腫瘍作用増強剤は、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンがリン酸化された腫瘍細胞に対して使用する若しくは前記腫瘍細胞を有する被験者に使用するための組成物又は抗腫瘍作用増強剤である、前記方法に関する。
なお、非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置におけるチロシンについては、前述のとおりである。
【００２８】
被検物質のSrc若しくはSlug阻害活性、又はSrc若しくはSlugを活性化する因子に対する阻害活性、又は被検物質によるSrc若しくはSlug合成、又はSrc遺伝子若しくはSlug遺伝子の発現を、ヒト生体外で測定することの具体的な工程は、例えば、以下の工程を含み得るが、以下に限定されるものではない。
（１’）被検物質を、Srcに、Slugに、Srcを産生する細胞に、又はSlugを産生する細胞に、接触させる工程、及び
（２’）Srcにおける特定のチロシン（ヒトSrcにおいては530位のチロシン）のリン酸化を検出する、Slugの核局在を検出する、Src産生量を測定する、Slug産生量を測定する、Src遺伝子発現量を測定する、又はSlug遺伝子発現量を測定する工程。
上記（１’）の工程は、当業者に周知の技術を用いて行うことができ、例えば、被検物質と、Src又はSlugとを媒体中に添加しインキュベートすること、又は被検物質を、Srcを産生する細胞、又はSlugを産生する細胞を含む培地、又はSrc又はSlugを含む培地若しくは当該細胞に由来する抽出液中に添加しインキュベートすることにより行われ得る。
上記（２’）の工程は、当業者に周知の技術を用いて行うことができる。上記（２’）の工程として、一態様では、例えば、530位のチロシンがリン酸化されたヒトSrcに特異的に結合する抗体を、上記（１’）の工程により被検物質と接触させたSrc又はSrcを産生する細胞を含む媒体、培地又は抽出液中に添加しインキュベートして、抗原抗体反応を検出することで、ヒトSrcにおける530位のリン酸化チロシンの量を測定することにより行われ得る。530位のチロシンがリン酸化されたヒトSrcに特異的に結合する抗体としては、市販のものを用いてもよいし、当業者に周知の抗体作製技術を用いて作製してもよい。リン酸化チロシンの量の測定は、ウエスタンブロット法やELISA法等により行うことができる。
【００２９】
上記（２’）の工程として、一態様では、例えば、Src又はSlugに特異的に結合する抗体を、上記（１’）の工程により被検物質と接触させたSrcを産生する細胞又はSlugを産生する細胞を含む媒体、培地又は抽出液中に添加しインキュベートして、抗原抗体反応を検出することで、Src産生量又はSlug産生量を測定することにより行われ得る。Src又はSlugに特異的に結合する抗体としては、市販のものを用いてもよいし、当業者に周知の抗体作製技術を用いて作製してもよい。Src産生量又はSlug産生量の測定は、当業者に周知の方法により行うことができ、ウエスタンブロット法やELISA法等により行うことができる。
上記（２’）の工程として、一態様では、例えば、上記（１’）の工程により被検物質と接触させたSrcを産生する細胞又はSlugを産生する細胞からRNAを抽出し、定量PCR法によりSrc遺伝子発現量又はSlug遺伝子発現量を測定することにより行われ得る。
【００３０】
測定された前記被検物質のSrc若しくはSlug阻害活性、又はSrc若しくはSlugを活性化する因子に対する阻害活性、又は測定された前記被検物質によるSrc若しくはSlug合成抑制、又はSrc遺伝子若しくはSlug遺伝子の発現抑制に基づき、前記候補物質を選別することの具体的な工程は、例えば、被検物質の非存在下での測定結果と、被検物質の存在下での測定結果を比較する工程を含む。このような比較は、当業者に周知の技術を用いて行うことができ、例えば、上記（２’）の工程により測定した、Srcにおける特定の部位（ヒトSrcにおいては530位）のリン酸化チロシンの量、Src産生量、Slug産生量、Src遺伝子発現量又はSlug遺伝子発現量を、被検物質の非存在下で測定する以外は同様に測定したものと比較することにより行うことができる。
比較の結果、被検物質の存在下で測定した、Srcにおける特定の部位（ヒトSrcにおいては530位）のリン酸化チロシンの量が、被検物質の非存在下で測定したものよりも多ければ、被検物質は、腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤、のための候補物質である。また、比較の結果、被検物質の存在下で測定した、Src産生量、Slug産生量、Src遺伝子発現量又はSlug遺伝子発現量が、被検物質の非存在下で測定したものよりも少なければ、被検物質は、腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤阻害用組成物、又はがんによる免疫抑制を解除するための薬剤の抗腫瘍作用増強剤、のための候補物質である。
【００３１】
本発明の一実施態様は、Slug遺伝子の発現を抑制する又はSlugの合成を抑制する候補物質のスクリーニング方法であって、
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は
非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置
のチロシンがリン酸化されている細胞、及び／又はAhRが活性化されている細胞における、被検物質のSlug阻害活性又はSlugを活性化する因子に対する阻害活性、又は被検物質によるSlug遺伝子の発現又はSlug合成を、ヒト生体外で測定すること、及び
測定された前記被検物質のSlug阻害活性又はSlugを活性化する因子に対する阻害活性、又は測定された前記被検物質によるSlug遺伝子の発現抑制又はSlug合成抑制に基づき、前記候補物質を選別すること
を含む、前記方法に関する。
なお、非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置におけるチロシンについては、前述のとおりである。
【００３２】
ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置のチロシンがリン酸化されている細胞、及び／又はAhRが活性化されている細胞における、被検物質のSlug阻害活性又はSlugを活性化する因子に対する阻害活性、又は被検物質によるSlug遺伝子の発現又はSlug合成を、ヒト生体外で測定することの具体的な工程は、例えば、以下の工程を含み得るが、以下に限定されるものではない。
（１''）被検物質を、ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置のチロシンがリン酸化されている細胞、及び／又はAhRが活性化されている細胞、及び／又は当該細胞から産生されたSlugに接触させる工程、及び
（２''）Slugの核局在を検出する、Slug産生量を測定する、又はSlug遺伝子発現量を測定する工程。
上記（１''）の工程は、当業者に周知の技術を用いて行うことができ、例えば、被検物質を、ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置のチロシンがリン酸化されている細胞、及び／又はAhRが活性化されている細胞を含む培地、及び／又は当該細胞から産生されたSlugを含む培地、媒体若しくは当該細胞に由来する抽出液中に添加しインキュベートすることにより行われ得る。
上記（２''）の工程は、当業者に周知の技術を用いて行うことができる。上記（２''）の工程として、一態様では、例えば、Slugに特異的に結合する抗体を、上記（１''）の工程により被検物質と接触させた細胞又はSlugを含む培地、媒体若しくは抽出液中に添加しインキュベートして、抗原抗体反応を検出することで、Slug産生量を測定することにより行われ得る。Slugに特異的に結合する抗体としては、市販のものを用いてもよいし、当業者に周知の抗体作製技術を用いて作製してもよい。Slug産生量の測定は、当業者に周知の方法により行うことができ、ウエスタンブロット法やELISA法等により行うことができる。
上記（２''）の工程として、一態様では、例えば、上記（１''）の工程により被検物質と接触させた細胞からRNAを抽出し、定量PCR法によりSlug遺伝子発現量を測定することにより行われ得る。
【００３３】
測定された前記被検物質のSlug阻害活性又はSlugを活性化する因子に対する阻害活性、又は測定された前記被検物質によるSlug遺伝子の発現抑制又はSlug合成抑制に基づき、前記候補物質を選別することの具体的な工程は、例えば、被検物質の非存在下での測定結果と、被検物質の存在下での測定結果を比較する工程を含む。このような比較は、当業者に周知の技術を用いて行うことができ、例えば、上記（２''）の工程により測定した、Slug産生量又はSlug遺伝子発現量を、被検物質の非存在下で測定する以外は同様に測定したものと比較することにより行うことができる。
比較の結果、被検物質の存在下で測定した、Slug産生量又はSlug遺伝子発現量が、被検物質の非存在下で測定したものよりも少なければ、被検物質は、Slug遺伝子の発現を抑制する又はSlugの合成を抑制する候補物質である。
【００３４】
また、上記（１''）の工程により被検物質と接触させた細胞において、AhR活性を測定することが好ましい。この測定結果を、被検物質の非存在下での測定結果と比較し、被検物質のAhR活性に対する影響を測定することが好ましい。この場合において、被検物質のAhR活性に対する影響がなく、かつ被検物質の存在下で測定した、Slug産生量又はSlug遺伝子発現量が、被検物質の非存在下で測定したものよりも少なければ、被検物質は、AhR活性化に由来するSlug遺伝子の発現誘導に関わるシグナル伝達経路における阻害因子であるか、又は前記発現誘導により合成されるSlugの阻害因子であり得る。なお、AhR活性の測定は、Cyp1a1発現を検出するなどして、当業者に周知の方法により行うことができる。
また、上記（１''）の工程により被検物質と接触させた細胞において、前記チロシンのリン酸化を測定することが好ましい。この測定結果を、被検物質の非存在下での測定結果と比較し、被検物質の前記チロシンのリン酸化に対する影響を測定することが好ましい。この場合において、被検物質の前記チロシンのリン酸化に対する影響がなく、かつ被検物質の存在下で測定した、Slug産生量又はSlug遺伝子発現量が、被検物質の非存在下で測定したものよりも少なければ、被検物質は、前記チロシンのリン酸化に由来するSlug遺伝子の発現誘導に関わるシグナル伝達経路における阻害因子であるか、又は前記発現誘導により合成されるSlugの阻害因子であり得る。なお、前記チロシンのリン酸化の測定は、前述に記載の方法のとおり行うことができる。
【００３５】
更に、このスクリーニング方法においては、ヒトIDO1の111位及び／又は249位、又は非ヒトIDO1におけるヒトIDO1の111位及び／又は249位に対応する位置のチロシンがリン酸化されている細胞と、AhRが活性化されている細胞との両方を用いることが好ましい。得られる測定結果をそれぞれ比較検討することにより、被検物質がAhR活性化に由来するSlug遺伝子の発現誘導に関わるシグナル伝達経路における阻害因子であるか、若しくはAhR活性化に由来するSlug遺伝子の発現誘導により合成されるSlugの阻害因子であるか、又は前記チロシンのリン酸化に由来するSlug遺伝子の発現誘導に関わるシグナル伝達経路における阻害因子であるか、若しくは前記チロシンのリン酸化に由来するSlug遺伝子の発現誘導により合成されるSlugの阻害因子であるかを判断し得る。
【実施例】
【００３６】
以下において、本発明について、具体的な実施例を参照しながら更に詳細に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。【００３７】
（実施例１）
遺伝子を導入して恒常的に発現させたがん細胞の作製
１．変異遺伝子の作製
ヒトIDO1へのY111F、Y249F、H346A変異の導入、マウスIDO1へのY115F、Y253F、H350A変異の導入、ヒトSrcへのY530F変異の導入は、Kunkel法を用いて行った。
恒常的活性化型ヒトAhR遺伝子は、ヒトAhRのアミノ酸1番目から294番目の領域と、アミノ酸428番目から848番目の領域に対応する塩基配列をPCR増幅後に接合して作成した。恒常的活性化型マウスAhR遺伝子は、マウスAhRのアミノ酸1番目から288番目の領域と、アミノ酸422番目から805番目の領域に対応する塩基配列をPCR増幅後に接合して作成した。【００３８】
２．がん細胞への遺伝子導入
がん細胞（マウスがん細胞MCA205、ヒトがん細胞SW837）への恒常的遺伝子発現には、レンチウイルスを用いた。レンチウイルスベクターCSII-CDF-MCS-IRES-puro-PREのmulti cloning site (MCS)に遺伝子を挿入し、293T細胞にエンベローププラスミドpCMV-VSV-G-RSV-Rev、パッケージングプラスミドpMDLg/pRREとともに遺伝子導入し、培養上清からレンチウイルスを濃縮した。がん細胞にレンチウイルスを感染させ、ピューロマイシンを添加して選択することにより、遺伝子の恒常発現株を樹立した。比較のため、遺伝子挿入していない空ベクターから作成したレンチウイルスを感染させた細胞株を準備した。【００３９】
（実施例２）
マウスがん細胞MCA205における、IDO1又は活性化型AhR遺伝子発現の腫瘍増殖への影響の評価
1x106個のがん細胞をC57BL/6マウスの腹側皮下に移植し、2日おきに腫瘍の長径と短径を測定した。腫瘍体積は0.5×(長径)×(短径)2で計算した。
がん細胞は、実施例１の２．のとおり作製したものであり、以下のものを使用した。
・遺伝子挿入していない空ベクターを導入したMCA205（MCA205 mock）
・野生型マウスIDO1遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205（MCA205 IDO1）
・恒常的活性化型マウスAhR遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205（MCA205 actAhR）
各群（n=5）について、腫瘍体積の平均値と標準偏差を図１に示す。IDO1遺伝子発現及びAhR遺伝子発現の影響により、それぞれ腫瘍体積の増大が観察された。【００４０】
（実施例３）
マウスがん細胞MCA205における、IDO1遺伝子変異の腫瘍増殖への影響の評価
１．腫瘍体積の測定
1x106個のがん細胞をC57BL/6マウスの腹側皮下に移植し、2日おきに腫瘍の長径と短径を測定した。腫瘍体積は0.5×(長径)×(短径)2で計算した。
がん細胞は、実施例１の２．のとおり作製したものであり、以下のものを使用した。
・遺伝子挿入していない空ベクターを導入したMCA205（MCA205 mock）
・野生型マウスIDO1遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205（MCA205 IDO1WT）
・H350Aのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したマウスIDO1変異遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205（MCA205 IDO1HA）
・Y115F及びY253Fのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したマウスIDO1変異遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205（MCA205 IDO1YYFF）
各群（n=5）について、腫瘍体積の平均値と標準偏差を図２に示す。野生型マウスIDO1遺伝子を発現させた場合、mockに比べ顕著に大きい腫瘍を形成した。一方、マウスIDO1におけるH350Aのアミノ酸変異を示すよう変異させた遺伝子を発現させた場合、並びにマウスIDO1におけるY115F及びY253Fのアミノ酸変異を示すよう変異させた遺伝子を発現させた場合には、mockと同等の小さい腫瘍を形成した。【００４１】
マウスIDO1におけるH350Aのアミノ酸変異は、IDOがTrpを代謝する酵素活性を低下させるものである。IDOがTrpを代謝する酵素活性を抑制する薬剤として、エパカドスタットやインドキシモドが開発され、がん免疫療法において利用されている。これに対して、マウスIDO1におけるY115F及びY253Fのアミノ酸変異は、IDO1におけるITIMのリン酸化部位を欠失させるものである。上記の結果より、IDO1におけるITIMのリン酸化部位を欠失させることで腫瘍増殖を阻害でき、しかもその増殖阻害作用は、IDOの酵素活性を抑制することに匹敵するものであることが示された。【００４２】
２．抗原特異的IFN-γ産生の評価
上記１のとおりがん細胞を移植したマウスより、がん細胞の移植後16日目に脾臓から脾臓細胞を単離し、各群毎に、まとめて2×108個を、RPMI1640に10% FCSと50μM 2-メルカプトエタノールを添加した培地20 mlに懸濁し、がん抗原であるgp70のH-2Kb拘束性エピトープペプチドKSPWFTTL（配列番号：５）を10 μg/μLの濃度で添加して培養した。5日後にCD8aマイクロビーズ（Miltenyi Biotec社）を用いたMACSソーティングによりCD8陽性T細胞を回収した。回収したCD8陽性T細胞1x105個を、ナイーブマウスから採取して30Gyの放射線を照射した1x105個の脾臓細胞と、0.01、0.1又は1.0 μg/mLの濃度のペプチドとともに、96ウェルプレートを用いて200 μLの液量で、各条件3ウェルで24時間培養した。このペプチドとしては、gp70のH-2Kb拘束性エピトープペプチド、あるいは陰性対照としてβ‐ガラクトシダーゼのH-2Kb拘束性エピトープペプチドDAPIYTNV（配列番号：６）を用いた。培養後の培養上清を回収し、細胞傷害性T細胞による抗腫瘍免疫活性の指標であるマウスIFN-γ産生量を、BD Pharmingen社のOptEIAマウスIFN-γ ELISAセットを用いて測定した。
各群について、各条件3ウェルの測定値の平均と標準偏差を図３に示す。野生型マウスIDO1遺伝子を発現させた場合、IFN-γの産生はmockに比べ顕著に低下し、抗腫瘍免疫活性が低下していることが示された。一方、マウスIDO1におけるH350Aのアミノ酸変異を示すよう変異させた遺伝子を発現させた場合、並びにマウスIDO1におけるY115F及びY253Fのアミノ酸変異を示すよう変異させた遺伝子を発現させた場合、IFN-γの産生はmockに比べて低下しているものの、野生型マウスIDO1遺伝子を発現させた場合と比べて増大しており、抗腫瘍免疫活性が、野生型マウスIDO1遺伝子を発現させた場合と比べて増強されていることが示された。【００４３】
３．がん細胞の浸潤能の評価
Roche社のXCELLigence SyetemおよびCIM-Plate 16を用い、2.5%マトリゲルの上に無血清培地に懸濁した2万個のがん細胞、マトリゲルの下に10% ウシ胎仔血清を含む培地、さらにその下に細胞を検出する電極を配置し、電極に到達した細胞数を、電気抵抗を指標としたcell indexとして検出することにより、がん細胞の浸潤能を評価した。
培養開始後48時間でのcell indexの値を図４に示す（n=3）。野生型マウスIDO1遺伝子を発現させた場合、mockに比べ浸潤能の増大が観察された。一方、マウスIDO1におけるH350Aのアミノ酸変異を示すよう変異させた遺伝子を発現させた場合、並びにマウスIDO1におけるY115F及びY253Fのアミノ酸変異を示すよう変異させた遺伝子を発現させた場合には、mockと同等の浸潤能が観察された。【００４４】
（実施例４）
がん細胞における、IDO1遺伝子変異によるSlug遺伝子発現と腫瘍増殖と抗腫瘍免疫への影響の評価
１．がん患者組織の免疫組織染色
大腸がん患者および乳がん患者のがん組織パラフィン切片を、VECTOR社のVECTASTAIN Elite ABC KITを用いて推奨プロトコールにより染色した。抗原賦活化は10mM クエン酸(pH6.0)で行った。IDO1 pTyr249の染色には、以下のとおり作製した抗体を使用し、Slugの染色には、abcam社のab27568を使用した。
〈ヒトIDO1 リン酸化Tyr249特異的抗体の作製〉
ヒトIDO1のリン酸化Tyr249の周辺配列DGLV(pY)EGFWEDPKEFAGGSC（配列番号：７）のペプチドを抗原としてウサギを免疫して、抗体を作製した。対応する非リン酸化ペプチドに対する抗体を吸収除去し、抗体を精製した。
光学顕微鏡により観察した免疫組織染色の結果を図５に示す。これにより、ヒトIDO1における249位のチロシン（ITIM2）のリン酸化が起きている部位と、Slugが高発現している部位が一致していることが示された。【００４５】
２．定量PCRによる遺伝子発現解析
がん細胞から、QIAGEN社のRNeasy mini kitを用いてRNAを抽出し、Invitrogen社のoligo dTとSuperscript IIIを用いてcDNAを合成した。5'-TTACCCAGTGGCCTTTCTCCTC-3'（配列番号：８）及び5'-GGTTCGAATGTGCATCTTCAGG-3'（配列番号：９）をプライマーとして用い、CYBER GREENを用いた定量PCR法により、マウスSlug遺伝子の発現量を測定した。また、5'-GGTTGGCCACTTTGACCCTTAC-3'（配列番号：１０）及び5'-AACCTCCCCAAACTCATTGCTC-3'（配列番号：１１）をプライマーとして用い、CYBER GREENを用いた定量PCR法により、マウスCyp1a1遺伝子の発現量を測定した。相対比較に必要な内在性コントロールとして、5'-CATGACAACTTTGGCATTGTGG-3'（配列番号：１２）及び5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'（配列番号：１３）をプライマーとして用い、CYBER GREENを用いた定量PCR法により、マウスGAPDHの発現量を測定した。
がん細胞は、実施例１の２．のとおり作製したものであり、以下のものを使用した。
・遺伝子挿入していない空ベクターを導入したMCA205（MCA205 mock）
・野生型マウスIDO1遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205（MCA205 IDO1WT）
・H350Aのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したマウスIDO1変異遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205（MCA205 IDO1HA）
・Y115F及びY253Fのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したマウスIDO1変異遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205（MCA205 IDO1YYFF）
・恒常的活性化型マウスAhR遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205（MCA205 actAhR）
・Y115Fのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したマウスIDO1変異遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205（MCA205 IDO1Y115F）
・Y253Fのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したマウスIDO1変異遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205（MCA205 IDO1Y253F）【００４６】
結果を図６及び図７に示す。野生型マウスIDO1遺伝子を発現させた場合、mockに比べてマウスSlug遺伝子の発現量が顕著に増大した。また、恒常的活性化型AhR遺伝子を発現させた場合も、mockに比べてマウスSlug遺伝子の発現量が顕著に増大した。一方、マウスIDO1におけるH350Aのアミノ酸変異を示すよう変異させた遺伝子を発現させた場合、並びにマウスIDO1におけるY115F及びY253Fのアミノ酸変異を示すよう変異させた遺伝子を発現させた場合には、野生型マウスIDO1遺伝子にくらべ顕著に低いマウスSlug遺伝子の発現量を示した。
Cyp1a1（シトクロムP450 1A1）は、AhRが発現誘導する下流分子の一つであり、Cyp1a1発現はAhR活性の指標となる。AhR遺伝子を発現させた場合、マウスCyp1a1遺伝子の発現量が顕著に増大した（MCA205 active AhRの数値は219.97である）。また、野生型マウスIDO1遺伝子を発現させた場合、並びにマウスIDO1におけるY115F及びY253Fのアミノ酸変異を示すよう変異させた遺伝子を発現させた場合にも、mockに比べてマウスCyp1a1遺伝子の発現量が増大した。
マウスIDO1におけるY115FあるいはY253Fの単独の変異によるSlug遺伝子発現への影響を図８に示す。野生型マウスIDO1遺伝子を発現させた場合、mockに比べてマウスSlug遺伝子の発現量が顕著に増大し、マウスIDO1におけるY115F及びY253Fのアミノ酸変異を示すよう変異させた遺伝子を発現させた場合には、野生型マウスIDO1遺伝子にくらべ顕著に低いマウスSlug遺伝子の発現量を示した。マウスIDO1におけるY115Fのアミノ酸変異を示すよう変異させた遺伝子を発現させた場合、マウスIDO1におけるY253Fのアミノ酸変異を示すよう変異させた遺伝子を発現させた場合においても、野生型マウスIDO1遺伝子にくらべ顕著に低いマウスSlug遺伝子の発現量を示した。
以上の結果より、IDO1におけるITIMのリン酸化部位の欠失は、AhR活性への影響の観点からは野生型IDO1と大差ないようであるが、Slug遺伝子の発現を顕著に抑制するものであることが示された。【００４７】
３．腫瘍体積の測定
1x106個のがん細胞をC57BL/6マウスの腹側皮下に移植し、2日おきに腫瘍の長径と短径を測定した。腫瘍体積は0.5×(長径)×(短径)2で計算した。
がん細胞としては以下のものを使用した。
・遺伝子挿入していない空ベクターを導入したMCA205（MCA205 mock）
・マウスSlug遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205（MCA205 Slug）
各群（n=5）について、腫瘍体積の平均値と標準偏差を図９に示す。マウスSlug遺伝子を発現させた場合、mockに比べ顕著に大きい腫瘍を形成した。これにより、Slug遺伝子が、腫瘍の増殖を亢進することが示された。【００４８】
４．抗原特異的IFN-γ産生の評価
上記３のとおりがん細胞を移植したマウスより、がん細胞の移植後14日目に脾臓から脾臓細胞を単離した点、培養開始６日後にCD8aマイクロビーズを用いたMACSソーティングによりCD8陽性T細胞を回収した点以外は、実施例３の２．と同じようにマウスIFN-γ産生量を測定した。
各群について、各条件3ウェルの測定値の平均と標準偏差を図１０に示す。マウスSlug遺伝子を発現させた場合、IFN-γの産生はmockに比べ顕著に低下し、抗腫瘍免疫活性が低下していることが示された。【００４９】
（実施例５）
AhR活性化により誘導されるSlugの腫瘍増殖と抗腫瘍免疫への影響の評価
１．shRNAによるSlug遺伝子発現ノックダウン
shRNAによるSlug遺伝子発現ノックダウンにはレンチウイルスベクターHIV-U6i-blastを用いた。マウスSlugのノックダウンにはGCAGACCCACTCTGATGTAAA（配列番号：１４）を標的配列としたshRNAを用いた。陰性対照として非特異配列CAACAAGATGAAGAGCACCAA（配列番号：１５）を標的配列にしたNonTarget shRNAを用いた。標的配列を挿入して作成したレンチウイルスベクターを、293T細胞にエンベローププラスミドpCMV-VSV-G-RSV-Rev、パッケージングプラスミドpMDLg/pRREとともに遺伝子導入し、培養上清からレンチウイルスを濃縮した。作成したレンチウイルスを、実施例１の２．に記載のとおり遺伝子導入して得た、恒常的活性化型マウスAhR遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205に感染後、ブラストサイジンS塩酸塩を添加して選択することにより、恒常的ノックダウン細胞株を樹立し、MCA205 actAhR shSlugとした。NonTarget shRNAを導入したものは、MCA205 actAhR NonTargetとした。【００５０】
２．定量PCRによる遺伝子発現解析
上記のとおり作製した細胞（MCA205 actAhR shSlug及びMCA205 actAhR NonTarget）から、QIAGEN社のRNeasy mini kitを用いてRNAを抽出し、Invitrogen社のoligo dTとSuperscript IIIを用いてcDNAを合成した。5'-TTACCCAGTGGCCTTTCTCCTC-3' 及び5'-GGTTCGAATGTGCATCTTCAGG-3' をプライマーとして用い、CYBER GREENを用いた定量PCR法により、マウスSlug遺伝子の発現量を測定した。相対比較に必要な内在性コントロールとして、5'-CATGACAACTTTGGCATTGTGG-3'及び5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'をプライマーとして用い、CYBER GREENを用いた定量PCR法により、マウスGAPDHの発現量を測定した。
結果を図１１に示す。MCA205 actAhR NonTargetに比べて、恒常的にSlug遺伝子発現をノックダウンさせたMCA205 actAhR shSlugでは、マウスSlug遺伝子の発現量が顕著に低下した。【００５１】
３．腫瘍体積の測定
1x106個のがん細胞をC57BL/6マウスの腹側皮下に移植し、2日おきに腫瘍の長径と短径を測定した。腫瘍体積は0.5×(長径)×(短径)2で計算した。
がん細胞としては以下のものを使用した。
・遺伝子挿入していない空ベクターを導入したMCA205（MCA205 mock）
・恒常的活性化型マウスAhR遺伝子を導入して恒常的に発現させ、かつ恒常的にSlug遺伝子発現をノックダウンさせたMCA205（MCA205 actAhR shSlug）
・恒常的活性化型マウスAhR遺伝子を導入して恒常的に発現させ、かつNonTarget shRNAを導入したMCA205（MCA205 actAhR NonTarget）
各群（n=5）について、腫瘍体積の平均値と標準偏差を図１２に示す。MCA205 actAhR NonTargetでは、mockに比べ顕著に大きい腫瘍を形成した。一方、恒常的にSlug遺伝子発現をノックダウンさせたMCA205 actAhR shSlugでは、mockと同等の小さい腫瘍を形成した。これにより、Slug遺伝子を抑制することにより、腫瘍の増殖を阻害できることが示された。【００５２】
４．抗原特異的IFN-γ産生の評価
上記３のとおりがん細胞を移植したマウスより、がん細胞の移植後14日目に脾臓から脾臓細胞を単離した以外は、実施例３の２．と同じようにマウスIFN-γ産生量を測定した。
各群について、各条件3ウェルの測定値の平均と標準偏差を図１３に示す。恒常的にSlug遺伝子発現をノックダウンさせたMCA205 actAhR shSlugでは、IFN-γの産生が顕著に増大し、抗腫瘍免疫活性が増強されていることが示された。【００５３】
（実施例６）
ヒトがん細胞SW837における、IDO1遺伝子変異のSlug遺伝子発現への影響の評価
がん細胞から、QIAGEN社のRNeasy mini kitを用いてRNAを抽出し、Invitrogen社のoligo dTとSuperscript IIIを用いてcDNAを合成した。5'-ACTGTGTGGACTACCGCTGCTC-3'（配列番号：１６）及び5'-CCCCCGTGTGAGTTCTAATGTG-3'（配列番号：１７）をプライマーとして用い、CYBER GREENを用いた定量PCR法により、ヒトSlug遺伝子の発現量を測定した。相対比較に必要な内在性コントロールとして、5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'（配列番号：１８）及び5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'（配列番号：１９）をプライマーとして用い、CYBER GREENを用いた定量PCR法により、ヒトGAPDHの発現量を測定した。
がん細胞は、実施例１の２．のとおり作製したものであり、以下のものを使用した。
・遺伝子挿入していない空ベクターを導入したSW837（SW837 mock）
・野生型ヒトIDO1遺伝子を導入して恒常的に発現させたSW837（SW837 IDO1WT）
・H346Aのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したヒトIDO1変異遺伝子を導入して恒常的に発現させたSW837（SW837 IDO1HA）
・Y111F及びY249Fのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したヒトIDO1変異遺伝子を導入して恒常的に発現させたSW837（SW837 IDO1YYFF）
・恒常的活性化型ヒトAhR遺伝子を導入して恒常的に発現させたSW837（SW837 actAhR）
結果を図１４に示す。野生型ヒトIDO1遺伝子を発現させた場合、mockに比べてヒトSlug遺伝子の発現量が顕著に増大した。また、恒常的活性化型AhR遺伝子を発現させた場合も同様に、mockに比べてヒトSlug遺伝子の発現量が顕著に増大した。一方、ヒトIDO1におけるH346Aのアミノ酸変異を示すよう変異させた遺伝子を発現させた場合、並びにヒトIDO1におけるY111F及びY249Fのアミノ酸変異を示すよう変異させた遺伝子を発現させた場合には、mockと同等のヒトSlug遺伝子の発現量を示した。【００５４】
（実施例７）
がん細胞における、ITIMのリン酸化とSrcの関係の評価
１．がん患者組織の免疫組織染色
大腸がん患者のがん組織パラフィン切片を、VECTOR社のVECTASTAIN Elite ABC KITを用いて推奨プロトコールにより染色した。抗原賦活化は10mM クエン酸(pH6.0)で行った。IDO1 pTyr249の染色には、実施例４の１．のとおり作成した抗体を使用し、Srcの染色には、R&D社のAF3389を使用し、Cskの染色には、Santa Cruz社のsc-286を使用し、Src pY530の染色には、abcam社のab60028の抗体を使用した。
なお、Cskは、SrcのC-末端チロシンをリン酸化して、Srcの活性を負に制御するタンパク質である。Src pY530は、530位のチロシンがリン酸化されたSrcを表し、このリン酸化によりSrcの活性は負に制御されている。
光学顕微鏡により観察した免疫組織染色の結果を図１５及び１６に示す。これにより、ヒトIDO1における249位のチロシン（ITIM2）のリン酸化が起きている部位は、Srcが発現し、かつCskが発現していない部位と良い一致を示した。【００５５】
２．がん細胞に発現したヒトIDO1 Tyr249をリン酸化するキナーゼの同定
実施例１の２．のとおり作製した、野生型ヒトIDO1遺伝子を恒常的に発現させたヒトがん細胞SW837（SW837 IDO1WT）に対して、pcDNA3.1に挿入したヒトSrc Y530FをLipofectamine LTXを用いて一過性に遺伝子導入した。2日後に、Roche社の脱リン酸化酵素阻害剤カクテル（PhosSTOP EASYpack）とRoche社のタンパク質分解酵素阻害剤カクテル（complete, EDTA-free）を添加した細胞可溶化バッファー (20mM Tris pH7.4, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.1% deoxycholate, 1mM EDTA) で可溶化し、細胞可溶化物を10%アクリルアミドゲルで電気泳動しPVDF膜に転写した。実施例４の１．のとおり作成したヒトIDO1リン酸化Tyr249特異的抗体により、ヒトIDO1 Tyr249のリン酸化をウエスタンブロット法で検出し、抗ヒトIDO1抗体（Thermo PA1-40279）により、ヒトIDO1の全タンパク質をウエスタンブロット法で検出した。
結果を図１７に示す。ヒトSrc Y530FをSW837 IDO1WT細胞中で発現させると、ヒトIDO1 Tyr249（ITIM2）のチロシンのリン酸化が亢進することが示された。ヒトSrc Y530Fでは、Srcの活性を負に制御する530位のチロシンのリン酸化が阻害されており、活性化型であるヒトSrc Y530Fの発現によりITIM2のチロシンのリン酸化が亢進するということは、SrcがITIM2のチロシンのリン酸化を担うキナーゼであることが示された。【００５６】
（実施例８）
ヒトIDO1タンパク質量へのアミノ酸変異による影響の評価
N末端側にFLAGタグを付加する発現ベクターpME-FLAGに、IDO1の野生型又は変異体を挿入し、このベクターによりヒトがん細胞SW837にLipofectamine LTXを用いて一過性に遺伝子導入した。導入した遺伝子は以下のとおりである。
・遺伝子挿入していない空ベクター（mock）
・野生型ヒトIDO1遺伝子（hIDO1 WT）
・Y111Fのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したヒトIDO1変異遺伝子（hIDO1 Y111F）
・Y249Fのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したヒトIDO1変異遺伝子（hIDO1 Y249F）
・Y111F及びY249Fのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したヒトIDO1変異遺伝子（hIDO1 Y111,249FF）【００５７】
遺伝子導入から40時間後に、Roche社の脱リン酸化酵素阻害剤カクテル（PhosSTOP EASYpack）とRoche社のタンパク質分解酵素阻害剤カクテル（complete, EDTA-free）を添加した細胞可溶化バッファー（20mM Tris pH7.4, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.1% deoxycholate, 1mM EDTA）で可溶化し、抗FLAG抗体M2で免疫沈降した。Src阻害剤であるダサチニブ(dasatinib)の添加を、野生型IDO1を遺伝子導入してから16時間後あるいは34時間後に0.3 μMあるいは3 μMの濃度で行った。免疫沈降前の細胞可溶化物 (total lysate)、免疫沈降物それぞれを10%アクリルアミドゲルで電気泳動しPVDF膜に転写した。免疫沈降物中あるいはtotal lysate中のIDO1タンパク質を抗FLAG抗体M2によるウエスタンブロット法で検出し、total lysate中のGAPDHタンパク質を抗GAPDH抗体（Santa Cruz社）によるウエスタンブロット法で検出した。
結果を図１８に示す。Y249Fのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したヒトIDO1変異遺伝子（hIDO1 Y249F）を導入した場合、並びにY111F及びY249Fのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したヒトIDO1変異遺伝子を導入した場合、IDO1タンパク質量が顕著に減少した。また、Src阻害剤であるダサチニブの添加により、濃度依存的かつ時間依存的に、IDO1タンパク質量が顕著に減少することが示された。【００５８】
（実施例９）
マウスがん細胞MCA205における、IDO1遺伝子変異の腫瘍増殖への影響の評価
１．腫瘍体積の測定
1x106個のがん細胞をC57BL/6マウスの腹側皮下に移植し、2日おきに腫瘍の長径と短径を測定した。腫瘍体積は0.5×(長径)×(短径)2で計算した。
がん細胞は、実施例１の２．のとおり作製したものであり、以下のものを使用した。
・遺伝子挿入していない空ベクターを導入したMCA205（MCA205 mock）
・野生型マウスIDO1遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205（MCA205 IDO1WT）
・Y253Fのアミノ酸変異を有するIDO1を合成するよう作製したマウスIDO1変異遺伝子を導入して恒常的に発現させたMCA205（MCA205 IDO1Y253F）
各群（n=5）について、腫瘍体積の平均値と標準偏差を図１９に示す。野生型マウスIDO1遺伝子を発現させた場合、mockに比べ顕著に大きい腫瘍を形成した。一方、マウスIDO1におけるY253Fのアミノ酸変異を示すよう変異させた遺伝子を発現させた場合には、mockに近い小さい腫瘍を形成した。【００５９】
マウスIDO1におけるY253Fのアミノ酸変異は、IDO1におけるY253のリン酸化部位を欠失させるものである。上記の結果より、IDO1におけるY253単独のリン酸化を阻害することによってもIDO1による腫瘍増殖促進を阻害する効果を持つことが示された。【００６０】
（実施例１０）
マウスがん細胞MC38移植マウスに対する抗PD-1抗体とダサチニブの併用治療
１．腫瘍体積の測定
Day0において、5x105個のMC38をC57BL/6マウスの腹側に移植した。なお、MC38は、内在性にIDO1を発現しているマウスがん細胞である。
移植してから4日後、6日後及び8日後（Day4、Day6、Day8）に、抗PD-1抗体（BioXCell社、クローンRMP-1-14）あるいは対応するRat IgG2a isotype control抗体（BioXCell社、クローン2A3）を200 μg／匹で腹腔内投与した。
ダサチニブは、100 mMでDMSOに溶解したものを0.5%メチルセルロースで希釈し、0.2 mg／100 μl／匹でDay4から1日1回経口投与した。対照群では、DMSOを同じ比率で希釈した媒体を100 μl／匹でDay4から1日1回経口投与した。
2日おきに腫瘍の長径と短径を測定した。腫瘍体積は0.5×(長径)×(短径)2で計算した。
各群（n=5）について、腫瘍体積の平均値と標準偏差を図２０に示す。薬剤としてダサチニブを単独投与した群、及び抗PD-1抗体を単独投与した群においては、いずれの薬剤も投与していない群と比べて小さい腫瘍を形成し、ほぼ同等の腫瘍増殖阻害作用を示した。また、ダサチニブと抗PD-1抗体とを併用した群においては、顕著な腫瘍の縮小が認められ、ダサチニブと抗PD-1抗体との併用により優れた腫瘍増殖阻害作用を示した。【００６１】
２．抗原特異的IFN-γ産生の評価
上記１のとおりがん細胞を移植したマウスより、がん細胞の移植後20日目に脾臓から脾臓細胞を単離した以外は、実施例３の２．と同じようにマウスIFN-γ産生量を測定した。
各群について、各条件3ウェルの測定値の平均と標準偏差を図２１に示す。薬剤としてダサチニブを単独投与した群においては、薬剤を投与していない群と比べてIFN-γの産生が増大し、抗腫瘍免疫活性が増強されていることが示された。また、ダサチニブと抗PD-1抗体とを併用した群においては、IFN-γの産生が顕著に増大し、抗腫瘍免疫活性が顕著に増強されていることが示された。【００６２】
（実施例１１）
野生型マウスIDO1遺伝子を発現したマウスがん細胞MCA205 IDO1WT移植マウスに対する抗PD-1抗体とダサチニブの併用治療
Day0において、野生型マウスIDO1遺伝子を発現したマウスがん細胞MCA205 IDO1WTを、5x105個、C57BL/6マウスの腹側に移植した以外は、実施例１０の１．と同じように腫瘍の長径と短径を測定し、同じように腫瘍体積の測定を行った。
各群（n=5）について、腫瘍体積の平均値と標準偏差を図２２に示す。薬剤としてダサチニブを単独投与した群、及び抗PD-1抗体を単独投与した群においては、いずれの薬剤も投与していない群と比べて小さい腫瘍を形成した。また、ダサチニブと抗PD-1抗体とを併用した群においては、顕著な腫瘍の縮小が認められ、ダサチニブと抗PD-1抗体との併用により優れた腫瘍増殖阻害作用を示した。【００６３】
（実施例１２）
野生型マウスIDO1遺伝子を発現したマウスがん細胞MCA205 IDO1WT移植マウスに対するIDO1酵素活性阻害剤1-MTとFAK阻害剤Y15の併用治療
Day0において、野生型マウスIDO1遺伝子を発現したマウスがん細胞MCA205 IDO1WTを、5x105個、C57BL/6マウスの腹側に移植した。
移植してから5日後（Day5）から、１−メチル−Ｄ−トリプトファン(1-Methyl-D-tryptophan) (1-MT、SIGMA社、1N NaOHで溶解後、塩酸でpH7.4に合わせた4 mg/mL水溶液)あるいは水を吸水瓶から自由飲水で投与した。
FAK阻害剤Y15 (MedChem Express)は、PBSに溶解し600 μg／100 μl／匹で、Day5から1日1回腹腔内投与した。対照群では、PBSを100 μl／匹で、Day5から1日1回腹腔内投与した。
2日おきに腫瘍の長径と短径を測定した。腫瘍体積は0.5×(長径)×(短径)2で計算した。
各群（n=5）について、腫瘍体積の平均値と標準偏差を図２３に示す。薬剤としてY15を単独投与した群、及び1-MTを単独投与した群においては、いずれの薬剤も投与していない群と比べて小さい腫瘍を形成した。また、Y15と1-MTとを併用した群においては、顕著な腫瘍の縮小が認められ、Y15と1-MTとの併用により優れた腫瘍増殖阻害作用を示した。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、がん治療薬として利用することができ、また、がん治療薬の開発のために利用することができる。
更には、本発明は、がん免疫療法における利用が期待され、特に、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体及びIDO酵素活性阻害剤等のがんによる免疫抑制を解除するための薬剤との併用療法において有用であり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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