(57)【要約】  被験物質のヒト神経細胞に対する興奮毒性の評価方法であって、（１）多能性幹細胞を分化誘導して製造されたヒト神経細胞と被験物質とを接触させる工程、（２）前記ヒト神経細胞に刺激を与える工程、（３）前記ヒト神経細胞の興奮の程度を測定する工程、及び（４）被験物質存在下で、前記ヒト神経細胞の興奮が増強した場合、該被験物質はヒト神経細胞に対して興奮毒性があると評価する工程を含む、被験物質のヒト神経細胞に対する興奮毒性の評価方法。
2019107481.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質のヒト神経細胞に対する興奮毒性の評価方法であって、
（１）多能性幹細胞を分化誘導して製造されたヒト神経細胞と被験物質とを接触させる工程、
（２）前記ヒト神経細胞に刺激を与える工程、
（３）前記ヒト神経細胞の興奮の程度を測定する工程、及び
（４）被験物質存在下で、前記ヒト神経細胞の興奮が増強した場合、該被験物質はヒト神経細胞に対して興奮毒性があると評価する工程
を含む、被験物質のヒト神経細胞に対する興奮毒性の評価方法。
【請求項２】
前記ヒト神経細胞が、多能性幹細胞を神経細胞に分化誘導した後、一度継代した細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒト神経細胞への刺激が電気刺激である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記電気刺激を、電圧１０〜１５Ｖ、刺激頻度８〜３０Ｈｚで行う、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒト神経細胞の興奮の程度を測定する工程が、前記ヒト神経細胞内のカルシウム動態の測定である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト神経細胞が、大脳皮質神経細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト神経細胞に対する興奮毒性の評価方法に関する。
本願は、２０１７年１１月３０日に、日本に出願された特願２０１７−２３０６１０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
治療薬候補物質の臨床適応までには、その多くが予期せぬ副作用で開発中止となる。なかでも、ヒトとは全く異なり、神経症状を評価しづらいモデル動物を用いた前臨床試験では副作用が見過ごされることが多い。そこで、ヒト第Ｉ相あるいは第ＩＩ相臨床試験に進んで初めて発露することが多い神経系副作用を予測し、治療薬開発スキームに組み込むことが求められている。【０００３】
しかしながら、神経系副作用のインビトロ副作用予測は、使用する細胞資源の不安定性と適切な評価方法の欠如から殆ど行われてこなかった。【０００４】
神経系副作用のインビトロ副作用予測方法として、ラットやモルモットから調製した神経細胞を用い、細胞内カルシウム濃度の上昇を測定することで、神経細胞の興奮性を評価することが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。また、特許文献１には、多能性幹細胞から神経細胞へ迅速且つ同調して分化させる方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１４８６４６号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Duflo F., et al., Electrical field stimulation to study inhibitory mechanisms in individual sensory neurons in culture., Anesthesiology., 100 (3), 740-743, 2004.
【非特許文献２】Vanden Berghe P. and Klingauf J., Spatial organization and dynamic properties of neurotransmitter release sites in the enteric nervous system., Neuroscience., 145 (1), 88-99, 2007.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１及び２の評価方法では、神経細胞を動物から調製するため、ヒト神経細胞を用いた評価方法ではない。また、当該評価方法は、細胞の安定供給にも問題があり、高スループットの評価には適していない。また、特許文献１に記載の方法により分化誘導した神経細胞を、神経細胞の興奮毒性の評価に適用できるか否かは検討されていない。このような背景のもと、安定的かつ高スループット評価に対応できる、インビトロ神経系副作用を予測可能な、被験物質の神経細胞に対する興奮毒性評価方法が求められている。そこで、本発明は、安定的かつ高スループット評価に対応できる、被験物質のヒト神経細胞に対する興奮毒性評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の態様を含む。
［１］被験物質のヒト神経細胞に対する興奮毒性の評価方法であって、
（１）多能性幹細胞を分化誘導して製造されたヒト神経細胞と被験物質とを接触させる工程、
（２）前記ヒト神経細胞に刺激を与える工程、
（３）前記ヒト神経細胞の興奮の程度を測定する工程、及び
（４）被験物質存在下で、前記ヒト神経細胞の興奮が増強した場合、該被験物質はヒト神経細胞に対して興奮毒性があると評価する工程
を含む、被験物質のヒト神経細胞に対する興奮毒性の評価方法。
［２］前記ヒト神経細胞が、多能性幹細胞を神経細胞に分化誘導した後、一度継代した細胞である、［１］に記載の方法。
［３］前記ヒト神経細胞への刺激が電気刺激である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記電気刺激を、電圧１０〜１５Ｖ、刺激頻度８〜３０Ｈｚで行う、［３］に記載の方法。
［５］前記ヒト神経細胞の興奮の程度を測定する工程が、前記ヒト神経細胞内のカルシウム動態の測定である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］前記ヒト神経細胞が、大脳皮質神経細胞である、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、安定的かつ高スループット評価に対応できるインビトロ神経系副作用を予測可能な、被験物質のヒト神経細胞に対する興奮毒性の評価方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１において、Ｂｅｐｒｉｄｉｌ添加時の細胞内カルシウムの変化を示した図である。
【図２】実施例２において、Ａｍｏｘａｐｉｎ、Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ及びＬｉｎｏｐｉｒｄｉｎをそれぞれ添加した時の細胞内カルシウムの変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１実施形態において、本発明は、被験物質のヒト神経細胞に対する興奮毒性の評価方法であって、
（１）多能性幹細胞を分化誘導して製造されたヒト神経細胞と被験物質とを接触させる工程、
（２）前記ヒト神経細胞に刺激を与える工程、
（３）前記ヒト神経細胞の興奮の程度を測定する工程、及び
（４）被験物質存在下で、前記ヒト神経細胞の興奮が増強した場合、該被験物質はヒト神経細胞に対して興奮毒性があると評価する工程
を含む、被験物質のヒト神経細胞に対する興奮毒性評価方法を提供する。
以下に、本実施形態について詳細に説明する。
【００１２】
本実施形態の興奮毒性の評価方法に用いるヒト神経細胞は、多能性幹細胞から、特許文献１に記載された方法に従って、分化誘導することにより製造することができる。具体的には、以下のようにして、多能性幹細胞からヒト神経細胞を調製することができる。なお、以降の記載では、本発明の興奮毒性評価方法に用いられる神経細胞を、本来の（すなわち、生来の）神経細胞と区別するために、ｉＮと呼ぶ場合がある。また、Ｎｇｎ２遺伝子を神経細胞化因子（又は、Ｎ化因子）と呼ぶ場合がある。
【００１３】
＜多能性幹細胞から神経細胞を製造する方法＞
多能性幹細胞に、Ｎｇｎ２をコードする核酸を、トランスポゾンを用いて導入し、該遺伝子の発現を３日間以上維持することで、神経細胞へと迅速且つ同調して分化させることができる。前記Ｎｇｎ２遺伝子の発現誘導は、培養下、又は動物体内のいずれでも行うことができる。
以下に、これらの方法を構成する技術について詳述する。
【００１４】
＜多能性幹細胞＞
本実施形態の興奮毒性評価方法に用いる、多能性幹細胞とは、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞のことである。例として、以下に限定するものではないが、胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、精子幹細胞（ＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）などが含まれる。これらのうち、本実施形態の興奮毒性評価方法に用いるのに好ましい多能性幹細胞は、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、及びｉＰＳ細胞である。以下、各幹細胞について説明する。
【００１５】
（Ａ）胚性幹細胞
ＥＳ細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
ＥＳ細胞は、受精卵の８細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。
【００１６】
ヒトＥＳ細胞株は、例えばＷＡ０１（Ｈ１）及びＷＡ０９（Ｈ９）は、ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから、ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。
【００１７】
（Ｂ）精子幹細胞
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ。神経膠細胞系由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ））を含む培養液で自己複製可能であるし、またＥＳ細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる。
【００１８】
（Ｃ）胚性生殖細胞
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ＥＳ細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞因子（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ）などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる。
【００１９】
（Ｄ）人工多能性幹細胞
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、特定の初期化因子を、ＤＮＡ又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である。初期化因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ  ＲＮＡ又はＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ  ＲＮＡ、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３又はＧｌｉｓ１等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。
【００２０】
上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ  １２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ（例えば、ＨＤＡＣ１  ｓｉＲＮＡ  Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨｕＳＨ  ２９ｍｅｒ  ｓｈＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＤＡＣ１（ＯｒｉＧｅｎｅ）等）等の核酸性発現阻害剤など］、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６、ＳＬ３２７及びＰＤ０３２５９０１）、Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３阻害剤（例えば、Ｂｉｏ及びＣＨＩＲ９９０２１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＢＩＸ−０１２９４等の低分子阻害剤、Ｓｕｖ３９ｈｌ、Ｓｕｖ３９ｈ２、ＳｅｔＤＢｌ及びＧ９ａに対するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ等の核酸性発現阻害剤など）、Ｌ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｇｏｎｉｓｔ（例えば、Ｂａｙｋ８６４４）、酪酸、ＴＧＦβ阻害剤又はＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、６１６４５３及びＡ−８３−０１）、ｐ５３阻害剤（例えば、ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ）、ＡＲＩＤ３Ａ阻害剤（例えば、ＡＲＩＤ３Ａに対するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ）、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５及びｍｉｒ−３０２などのｍｉＲＮＡ、Ｗｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（例えば、ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｗｎｔ３ａ）、神経ペプチドＹ、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンＥ２及びプロスタグランジンＪ２）、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、ＵＴＦ１、ＩＲＸ６、ＧＬＩＳｌ、ＰＩＴＸ２、ＤＭＲＴＢｌ等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
【００２１】
初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴ及びポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
【００２２】
一方、ＤＮＡの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。
【００２３】
また、ＲＮＡの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、５−メチルシチジン及びｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅを取り込ませたＲＮＡを用いても良い。
【００２４】
ｉＰＳ細胞誘導のための培養液としては、例えば、１０〜１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＤＭＥ培養液（これらの培養液にはさらに、ＬＩＦ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）又は市販の培養液［例えば、マウスＥＳ細胞培養用培養液（ＴＸ−ＷＥＳ培養液、トロンボＸ社）、霊長類ＥＳ細胞培養用培養液（霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（ｍＴＥＳＲ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）］などが含まれる。
【００２５】
培養法の例としては、たとえば、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約４〜７日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養用培養液で培養し、該接触から約３０〜約４５日又はそれ以上ののちにｉＰＳ様コロニーを生じさせることができる。
【００２６】
あるいは、３７℃、５％  ＣＯ２存在下にて、フィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液（これにはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約２５〜約３０日又はそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる、もしくは細胞外基質（例えば、Ｌａｍｉｎｉｎ−５及びマトリゲル（ＢＤ社））を用いる方法が例示される。
【００２７】
この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（０．１％以上、１５％以下の酸素濃度）によりｉＰＳ細胞を樹立しても良い。
上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ１００ｃｍ２あたり約５×１０３〜約５×１０６細胞の範囲である。
【００２８】
ｉＰＳ細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したｉＰＳ細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、ｉＰＳ細胞を選択することができる。
【００２９】
なお、本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ＥＳ細胞などの生殖系列細胞又は分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、及び成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、及び株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞及び脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
【００３０】
また、病態のモデル細胞を作製するという観点から、疾患性の体細胞を用いてもよい。ここで疾患とは、神経変性疾患が例示される。上述した神経細胞を製造する方法を用いて病態のモデル細胞を作製する場合、神経変性疾患の患者由来の体細胞を用いてｉＰＳ細胞を製造してもよい。ここで、「神経変性疾患」とは、神経細胞の変性又は欠損により起きる病気のことであり、アルツハイマー型認知症、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ハンチントン病、及び脊髄小脳変性症などが例示される。例えば、アルツハイマー型認知症の患者の体細胞とは、プレセニリン１遺伝子又はプレセリニン２遺伝子に変異がある体細胞が例示され、プレセニリン１の変異はこれまで３０以上の変異が報告されており、例えば、Ｄ２５７又はＤ３８５をアラニン、又はグルタミン酸に置換した変異が挙げられるが、特にこれらへ限定されない。
【００３１】
（Ｅ）核移植により得られたクローン胚由来のＥＳ細胞
ｎｔ  ＥＳ細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のＥＳ細胞であり、受精卵由来のＥＳ細胞とほぼ同じ特性を有している。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたＥＳ細胞がｎｔ  ＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＥＳ）細胞である。ｎｔ  ＥＳ細胞の作製のためには、核移植技術とＥＳ細胞作製技術（上記）との組み合わせが利用される。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
【００３２】
（Ｆ）Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｅｎｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ（Ｍｕｓｅ細胞）
Ｍｕｓｅ細胞は、線維芽細胞又は骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは８時間又は１６時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、ＳＳＥＡ−３及びＣＤ１０５が陽性である。
【００３３】
本実施形態の興奮毒性評価方法においては、病態のモデル細胞を作製するという観点から、疾患の原因となる遺伝子を導入した多能性幹細胞を用いることができる。変異遺伝子を有する多能性幹細胞として、アルツハイマー型認知症の患者の体細胞を単離して製造されたｉＰＳ細胞等が挙げられる。
本実施形態の興奮毒性評価方法に用いる多能性幹細胞において、アルツハイマー型認知症モデル細胞とは、当該多能性幹細胞から上述した方法によって得られる、神経細胞を含む。本実施形態の興奮毒性評価方法に用いる多能性幹細胞において、好ましい病態のモデル細胞は、ヒト細胞である。
【００３４】
＜神経細胞＞
本実施形態の興奮毒性評価方法において、神経細胞とは、β−ＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎ、ＮＣＡＭ、ＭＡＰ２等の神経細胞のマーカー遺伝子を１以上発現し、且つ、神経突起を有する細胞と定義される。よって、本発明に係る方法で製造された神経細胞（すなわち、ｉＮ）の判定基準もこれに従う。さらに、本発明において製造される神経細胞は、グルタミン酸作動性であることが好ましい。そして、本発明において神経細胞を製造するとは、上記定義を満たす細胞を含有する細胞集団を得ることを意味し、好ましくは、該細胞を５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％以上含有する細胞集団を得ることである。
なお、Ｔｕｊ１は抗β−ＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎであることから、前記β−ＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎを発現している細胞を、Ｔｕｊ１陽性細胞と呼ぶ場合がある。
【００３５】
本実施形態の興奮毒性評価方法に用いる多能性幹細胞において、Ｎｇｎ２をコードする核酸は、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであっても、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのいずれであってもよい。好ましくは、二本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＲＮＡである。例えば、Ｎｇｎ２をコードする核酸が二本鎖ＤＮＡの場合（本明細書においてＮｇｎ２遺伝子という場合もある）は、該核酸は適当な発現ベクターに挿入された形態で、多能性幹細胞に導入され得る。一方、Ｎｇｎ２をコードする核酸が一本鎖ＲＮＡの場合、当該ＲＮＡは、分解を抑制するため、５−メチルシチジン及びｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅを取り込ませたＲＮＡを用いても良く、フォスファターゼ処理による修飾ＲＮＡであってもよい。なお、本明細書では、Ｎｇｎ２をコードするＲＮＡ及びＮｇｎ２タンパク質を包括してＮｇｎ２遺伝子産物という場合がある。
【００３６】
本発明の興奮毒性評価方法に用いる神経細胞を製造する方法では、前記Ｎ化因子による神経細胞誘導を阻害しない限り、他の神経発生に関わる転写因子をコードする核酸を、Ｎ化因子とともに多能性幹細胞に導入してもよい。そのような転写因子として、例えば、Ａｓｃｌ１をコードする核酸、Ｂｒｎ２をコードする核酸、Ｍｙｔ１ｌをコードする核酸、及びＨＢ９をコードする核酸等が挙げられる。
【００３７】
＜核酸の導入方法＞
Ｎｇｎ２をコードする核酸を多能性幹細胞に導入する方法は特に限定されないが、例えば、以下の方法を用いることができる。
【００３８】
前記核酸がＤＮＡの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクターに導入した形態で、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって多能性幹細胞内に導入することができる。
ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが例示される。また、プラスミドベクターとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用することができる。そして、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが挙げられる。このうち、プラスミドベクター、及び人工染色体ベクターが好ましく、最も好ましくはプラスミドベクターである。
【００３９】
これらのベクターには、Ｎｇｎ２遺伝子が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができ、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、蛍光タンパク質、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。
【００４０】
他の態様として、上記ベクターには、前記遺伝子をコードする核酸を染色体内に挿入するため、又は染色体に挿入された該核酸を必要に応じて切除するために、この発現カセット（プロモーター、遺伝子配列及びターミネーターを含む遺伝子発現単位）の前後にトランスポゾン配列を有していてもよい。トランスポゾン配列として特に限定されないが、ｐｉｇｇｙＢａｃが例示される。トランスポゾンを用いて染色体内に発現カセットを導入するためには、トランスポゼースを当該発現カセットを有するベクターと供に同細胞へ導入することが望ましい。本発明において、トランスポゼースを導入するためには、前述のベクターに当該トランスポゼースをコードする核酸を含有させてもよく、また、他のベクターに当該トランスポゼースをコードする核酸を含有させ、同時に細胞へ導入しても良い。さらに、当該トランスポゼースをコードする遺伝子産物を直接導入しても良い。本発明において、好ましいトランスポゼースは、上述のトランスポゾン配列へ対応するトランスポゼースであり、好ましくはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースである。
【００４１】
神経誘導因子がＲＮＡの形態の場合、例えばエレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって多能性幹細胞内に導入しても良い。
【００４２】
神経誘導因子がタンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴ及びポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって多能性幹細胞内に導入してもよい。
【００４３】
＜Ｎｇｎ２の発現誘導＞
Ｎｇｎ２をコードする核酸は、誘導可能なプロモーターに機能的に接合させることで、所望の時期に、Ｎｇｎ２の発現を誘導することができる。そのような誘導可能なプロモーターとしては、薬剤応答性プロモーターを挙げることができ、その好適な例として、テトラサイクリン応答性プロモーター（ｔｅｔＯ配列が７回連続したテトラサイクリン応答配列（ＴＲＥ）を有するＣＭＶ最小プロモーター）が挙げられる。該プロモーターは、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ；ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｅｔＲ（ｒＴｅｔＲ）とＶＰ１６ＡＤから構成される融合タンパク質）の発現下において、テトラサイクリン又はその誘導体が供給されることにより活性化されるプロモーターである。よって、テトラサイクリン応答性プロモーターを用いて前記遺伝子の発現誘導を行う場合には、前記活性化因子を発現する様式を併せ持つベクターを用いるとさらに好適である。前記テトラサイクリンの誘導体としては、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ、本願では以降、ＤＯＸと略記する）を好適に用いることができる。
【００４４】
また、上記以外の薬剤応答性プロモーターを用いた発現誘導系としては、エストロゲン応答性プロモーターを用いた発現誘導システム、ＲＳＬ１によって誘導されるプロモーターを用いたＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ哺乳類誘導性発現システム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ｃｕｍａｔｅによって誘導されるプロモーターを用いたＱ−ｍａｔｅシステム（Ｋｒａｃｋｅｌｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）又はＣｕｍａｔｅ誘導性発現システム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＮＲＣ）社）、及びエクジソン応答性配列を有するプロモーターを用いたＧｅｎｏＳｔａｔ誘導性発現システム（Ｕｐｓｔａｔｅ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）等が挙げられる。
【００４５】
上記に示されるような薬剤応答性プロモーターに基づく発現誘導システムを備えた発現ベクター（すなわち、薬剤応答性誘導ベクター）を用いる場合、当該プロモーターの活性化を誘導し得る薬剤（例えば、前記テトラサイクリン応答性プロモーターを含むベクターの場合には、テトラサイクリン又はＤＯＸ）を培地に所望の期間添加し続けることで、Ｎｇｎ２の発現を維持することができる。そして、培地から当該薬剤を除去する（例えば、該薬剤を含まない培地に置換する）ことで、前記遺伝子の発現を停止させることが可能である。
【００４６】
さらに、Ｎｇｎ２の発現誘導は、当該遺伝子を構成的プロモーターに機能的でない形で接合させておき、所望の時期に当該接合状態を機能的な接合状態に変換することで誘導してもよい。このような例としては、前記構成的プロモーターと前記遺伝子をコードする配列の間に、ＬｏｘＰ配列で挟まれた特定の配列（例えば、薬剤耐性遺伝子をコードする配列や転写終結を誘導する配列）を配しておき、所望の時期にＣｒｅを作用させて前記ＬｏｘＰ配列で挟まれた配列を除去することで、前記接合状態を機能的な接合状態に変換する方法等が挙げられる。さらに、前記ＬｏｘＰ配列の代わりにＦＲＴ配列又はトランスポゾン配列を、前記Ｃｒｅの代わりにＦＬＰ（ｆｌｉｐａｓｅ）又は当該トランスポゾンを用いてもよい。なお、この目的で好適に用いることができるトランスポゾンとして、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンが挙げられる。
【００４７】
上記目的で用いることができる構成的プロモーターとしては、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｏｕｓｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）  ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫ（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）プロモーター、ＥＦ−αプロモーター、及びＣＡＧプロモーター等が挙げられる。
【００４８】
上記のようにＣｒｅ、ＦＬＰ、トランスポゾンを用いて接合状態を変換することで発現誘導を行った場合には、所望の期間経過後に再度Ｃｒｅ、ＦＬＰ、トランスポゾンを作用させて前記配列（ＬｏｘＰ配列、ＦＲＴ配列、又はトランスポゾン配列）で挟まれた配列を除去することで、前記遺伝子の発現を停止させることもできる。
【００４９】
また、別の態様として、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターやプラスミド、エピソーマルベクターなどの、容易に細胞内から消失させ得るベクターを用いることで前記遺伝子の発現期間を制御することも可能である。
【００５０】
神経細胞の製造において、導入したＮｇｎ２の発現は、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間のいずれにおいても本発明の効果を奏することができ、長期になることで神経細胞の製造に不利益を生じることはないが、好ましくは３日以上１４日以下、特に好ましくは７日以上１４日以下である。
【００５１】
＜培養条件＞
本実施形態の興奮毒性評価方法に用いる神経細胞の製造方法において、前記Ｎｇｎ２をコードする核酸が導入された多能性幹細胞を、培養下で神経細胞に分化誘導する際に用いる培地としては、基本培地のみ、又は、神経栄養因子を添加した基本培地を用いることができる。そのような基本培地としては、例えば、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ）及びこれらの混合培地などが包含される。基本培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。
【００５２】
必要に応じて、培地は、例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アルブミン、トランスフェリン、アポトランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよく、また、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、セレン酸、プロゲステロン及びプトレシンなどの１つ以上の物質も含有してもよい。
【００５３】
このうち、Ｂ２７サプリメントを含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、又は、インスリン、アポトランスフェリン、セレン酸、プロゲステロン及びプトレシンを含有するＤＭＥＭ及びＦ１２の混合培地を基本培地として好適に用いることができる。
【００５４】
本実施形態の興奮毒性評価方法に用いる神経細胞の製造方法においては、神経細胞の分化誘導の際に、マウス細胞、特に、マウスのグリア細胞と共培養しなくとも神経細胞に誘導可能である。よって、夾雑物を混入させないことを目的として、マウス細胞との共培養を行わないことが望ましい。
【００５５】
本実施形態の興奮毒性評価方法に用いる神経細胞の製造方法において、神経細胞の分化誘導を行う際の培養温度は、特に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。
【００５６】
Ｎｇｎ２をコードする外来性の核酸は誘導可能なプロモーターの制御下にあることが好ましく、より好ましくは、薬剤応答性プロモーターの制御下である。これらの外来性核酸が染色体内に挿入された多能性幹細胞は、未分化能と高い増殖能を維持しており、前記形質を保持したまま増殖させることできる。さらに凍結保存を行っても前記形質が失われないことから、細胞株として安定に維持することが可能である。また、前記プロモーターが応答する薬剤と接触させることにより、迅速且つ同調して神経細胞へと分化し得る細胞である。
【００５７】
＜ヒト神経細胞に対する興奮毒性評価方法＞
本発明は、被験物質のヒト神経細胞に対する興奮毒性の評価方法を提供する。本発明の被験物質のヒト神経細胞に対する興奮毒性の評価方法は、以下の工程を含む。
（１）多能性幹細胞を分化誘導して製造されたヒト神経細胞と被験物質とを接触させる工程、
（２）前記ヒト神経細胞に刺激を与える工程、
（３）前記ヒト神経細胞の興奮の程度を測定する工程、及び
（４）被験物質存在下で、前記ヒト神経細胞の興奮が増強した場合、該被験物質はヒト神経細胞に対して興奮毒性があると評価する工程
【００５８】
本発明の被験物質のヒト神経細胞に対する興奮毒性の評価方法に用いられる、ヒト神経細胞としては、多能性幹細胞を分化誘導して製造したヒト神経細胞であれば、いずれでもよいが、例えば、前記の多能性幹細胞を分化誘導して製造したヒト神経細胞等が挙げられる。多能性幹細胞を分化誘導して製造したヒト神経細胞としては、例えば、大脳皮質神経細胞等が挙げられる。
【００５９】
神経細胞は、多能性幹細胞から分化誘導した後、一度継代した細胞であることが好ましい。実施例において後述するように、一度継代することにより、ウェル間の細胞数差、ウェル内での神経細胞の位置の偏りを最小限とし、興奮毒性の評価をより正確に測定することが可能となる。
【００６０】
継代は、ヒト神経細胞を酵素処理し、単細胞単位にまで単離浮遊させ、４０、７０、又は１００μｍのメッシュポアサイズ、好ましくは７０μｍのメッシュポアサイズのセルストレイナー処理の後、５〜４０×１０４個／ｃｍ２、好ましくは、１５×１０４個／ｃｍ２の細胞密度で、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）に、Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ａ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）０．５％、Ｇｌｕｔａｍａｘ１％、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加した培地等に播種することにより行うことが好ましい。
【００６１】
また、前記ヒト神経細胞は、９６穴透明底プレート等の培養器にコート液でコートした培養器に播種するのが好ましい。該コート液としては、０．５〜４％、好ましくは２％のマトリゲル（Ｍコート）、０．００２〜０．００５％、好ましくは０．００３％Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅと、０．５〜４％、好ましくは１％合成ヒトビトロネクチン基質（Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）ＩＩ−ＳＣ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ等）との混合物（ＰＳコート）、０．００２〜０．００５％  ｗ／ｖ、好ましくは０．００３％  ｗ／ｖ  Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅと、０．５〜４％、好ましくは１％合成ヒトビトロネクチン基質（Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）ＩＩ−ＳＣ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ等）と、０．５〜４％、好ましくは２％マトリゲルと、の混合物（ＰＳＭコート）、０．００２〜０．００５％、好ましくは０．００３％Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅと、０．５％〜４％、好ましくは１％合成ヒトビトロネクチン基質（Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）ＩＩ−ＳＣ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ等）と、０．５％〜４％、好ましくは２％マトリゲルと、０．００２〜０．００５％  ｗ／ｖ、好ましくは０．００３％ヒトＩ型コラーゲン様リコンビナントペプチド（Ｃｅｌｌｎｅｓｔ等）と、の混合物（ＰＳＭＣコート）等が用いられる。
【００６２】
培養器のコートは室温あるいは３７℃で３０分間〜４時間、好ましくは２時間行い、その後コート液は吸引除去する。培養器は、乾燥して、その後ヒト神経細胞を播種するか、又は直ちにヒト神経細胞を播種する。培養器に播種したヒト神経細胞は、３〜７日後に、本実施形態の興奮毒性評価方法に供する。
【００６３】
本実施形態の興奮毒性評価方法において、前記ヒト神経細胞に刺激を与える方法としては、ヒト神経細胞に刺激を与え、脱分極させることができる方法であれば特に制限はないが、例えば、電気刺激による方法、グルタミン酸等の興奮性神経シナプストランスミッター等を添加する方法等が挙げられる。
【００６４】
本実施形態の興奮毒性評価方法において、ヒト神経細胞の興奮の程度を測定する方法としては、神経細胞の興奮の程度を測定できる方法であれば、特に制限はないが、例えば、神経細胞内のカルシウム動態を測定する方法、細胞内電位の変化に反応して蛍光強度が変化する化合物を添加した際の蛍光強度の変化を測定する方法等が挙げられる。
【００６５】
前記カルシウムイオン動態の測定方法としては、細胞内カルシウムイオン動態が測定できれば、特に制限はなく、公知の測定方法等を用いることができる。公知の測定方法としては、例えば、Ｆｌｕｏ−８、Ｆｌｕｏ−４、ｆｕｒａ−２、ｉｎｄｏ−１等のカルシウムインジケーター色素を用いる方法、カルシウム二価イオン感受性微少電極を用いる方法、蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）を利用する方法、カルシウムイオン感受性発光タンパク質エクオリンを用いる方法、ＧＦＰ遺伝子改変体にカルモジュリンタンパク質を遺伝的に結合させたカルシウムセンサータンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク（ＥＧＦＰ）、カルモジュリン（ＣａＭ）、ミオシン軽鎖フラグメント（Ｍ１３）を遺伝子工学的に結合させたＧＣａＭＰ）を発現させ用いる方法等が挙げられる。カルシウムインジケーター色素は、ヒト神経細胞に添加後、必要に応じ、ＰＢＳ、ＨＥＳＳ緩衝液等で洗浄した後に、細胞に移行した色素濃度を測定する。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  Ｆ−１２７（シグマアルドリッチ社製）等を用いて、カルシウムインジケーター色素の細胞内への移行を促進してもよい。
【００６６】
ヒト神経細胞への刺激として電気刺激を用い、前記ヒト神経細胞の興奮の程度を、細胞内カルシウム動態を測定する、本実施形態の興奮毒性評価方法の具体例を以下に示す。
【００６７】
細胞内カルシウム動態は、ＦＤＳＳ／μＣｅｌｌ（浜松ホトニクス社製）を用いて測定することができる。記録はＥｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ４８０ｎｍ／Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ５４０ｎｍを使用し、サンプリングインターバルは３０〜１０００ｍｓｅｃ、好ましくは１００ｍｓｅｃとする。ＦＤＳＳ装置の刺激電極を用いて、細胞外フィールド電気刺激（Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｆｉｅｌｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ：  ＥＦＳ）後の、細胞内カルシウム動態を経時的にモニタリングする。ＥＦＳ刺激電極には、電気刺激機能がついた９６電極アレイ刺激装置を用いる。
【００６８】
神経細胞の電気刺激（ＥＦＳ刺激）は、通常、単相刺激、電圧は２０Ｖ、パルス幅３ｍｓｅｃ、刺激頻度５０Ｈｚの条件で行われる。これに対し、本実施形態の興奮毒性評価方法では、単相刺激、電圧は１０〜１５Ｖ、好ましくは１２．５Ｖ、パルス幅は１〜６ｍｓｅｃ、好ましくは４ｍｓｅｃ、刺激頻度は８〜３０Ｈｚ、好ましくは１０Ｈｚの条件で電気刺激を行うことが好ましい。このように、より弱い細胞外電気刺激を用いた薬剤検討を行うことにより、強すぎる電気刺激ではマスクされる可能性がある微小な変化を見出すことができる。
【００６９】
ＥＦＳ刺激の３０秒前からモニタリングを開始し、ＥＦＳ刺激前の基線が安定した状態でＥＦＳ刺激を加え、以後合計６００秒程度の細胞内カルシウム動態を、蛍光強度の変化として記録する。
【００７０】
得られた蛍光強度変化の実波形を、ΔＦ（変化強度）／Ｆ０（基線強度）＝（１００％  ｐｅａｋ  ｈｅｉｇｈｔ−ｂｏｔｔｏｍ  ｈｅｉｇｈｔ）／ｂｏｔｔｏｍ  ｈｅｉｇｈｔ）として経時的にモニタリングし、ΔＦ／Ｆ０が最大変化を示したピークを数値化し、被験物質存在下でのΔＦ／Ｆ０の変化を測定する。
【００７１】
本発明の被験物質のヒト神経細胞に対する興奮毒性の評価方法において、被験物質存在下、被験物質非存在下それぞれで、前記ヒト神経細胞の興奮の程度を測定し、被験物質非存在下での前記ヒト神経細胞の興奮の程度よりも、被験物質存在下での、前記ヒト神経細胞の興奮の程度が増強した場合、該被験物質はヒト神経細胞に対して興奮毒性があると評価することができる。
【００７２】
例えば、被験物質存在下で電気刺激したときの細胞内のカルシウム濃度が、被験物質非存在下で電気刺激したときの細胞内カルシウム濃度よりも増加した場合、当該被験物質は、ヒト神経細胞に対して興奮毒性があると評価することができる。
【実施例】
【００７３】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００７４】
［実施例１］
（神経細胞の調製）
健常人より樹立した人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）に、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターを用いてヒトＮｇｎ２遺伝子をドキシサイクリン制御下に発現するコンストラクトを導入した。なお、遺伝子のゲノム挿入位置や導入量により、成熟した神経細胞以外にＮＥＳＴＩＮタンパク質陽性の幼弱な神経幹細胞が混在し、培養期間を延長すると段階的に神経細胞と入れ換わる現象が見られた。そこで、ベクター導入時のｉＰＳ細胞の播種密度を１８００個／ｃｍ２に下げ、Ｇ４１８による薬剤耐性セレクションを、播種４８時間後から開始することで、コンストラクトを導入したｉＰＳ細胞のシングルセル由来のコロニーを形成させ、コロニーを単離、株化した。この株化したｉＰＳ細胞を４８〜１２０株程度神経細胞へ分化させ、その様子を観察して、幼弱な神経幹細胞が混ざることがない株を選択して以下の実験に用いた。【００７５】
上記で得られた細胞株を５日間、ドキシサイクリンを添加した培地で培養し、神経細胞に分化誘導した。続いて、分化誘導した神経細胞を一度継代した。具体的には、分化誘導した神経細胞をＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により酵素処理し、単細胞単位にまで単離、浮遊させ、４０μｍのメッシュポアサイズのセルストレイナー処理の後、３．３×１０５個／ｃｍ２の細胞密度で播種した。神経細胞培地には、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に、Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ａ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）０．５％、Ｇｌｕｔａｍａｘ１％、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加したものを用いた。【００７６】
播種する培養器は、ＳＢＳ規格の９６穴透明底プレートを用いた。上記で調製した神経細胞は、０．００３％  ｗ／ｖ  Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ、１％合成ヒトビトロネクチン基質（Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）ＩＩ−ＳＣ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ；Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）、２％マトリゲル及び０．００３％ヒトＩ型コラーゲン様リコンビナントペプチド（Ｃｅｌｌｎｅｓｔ社製）の混合物を用いてコートした培養器に播種した。培養器のコートは３７℃で２時間行った。コート液は吸引除去し、直ちに細胞を播種した。【００７７】
［実施例２］
（細胞内カルシウム動態のモニタリング）
細胞播種後７日目に、細胞内カルシウムインジケーター色素である２μＭ  Ｆｌｕｏ−８を添加し、添付文書に従ってインキュベートし、ＨＥＳＳ緩衝液で洗浄を行った。色素の細胞内移行を促進するため、０．００１％  ｗ／ｖ  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  Ｆ−１２７（シグマアルドリッチ社製）をインキュベート液に添加した。【００７８】
Ｎ型カルシウムチャネル阻害薬であるＢｅｐｒｉｄｉｌ（Ｂｏｕｒｇｕｉｇｎｏｎ  ｅｔａｌ．１９８９）を、２５μＭを最大濃度として、５倍の希釈系列を、１．６、８、４０、２００ｎＭ、５、２５μＭの７段階調整し、細胞内カルシウム動態に与える影響を以下のようにして評価した。【００７９】
細胞内カルシウムの測定には、ＦＤＳＳ／μＣｅｌｌ（浜松ホトニクス社製）を用いた。測定波長には、Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ４８０ｎｍ／Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ５４０ｎｍを使用し、サンプリングインターバルは、１００ｍｓｅｃとした。
ＦＤＳＳ装置の刺激電極を用いて、細胞外フィールド電気刺激（Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｆｉｅｌｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ：  ＥＦＳ）後の、細胞内カルシウム動態を経時的にモニタリングした。ＥＦＳ刺激電極には、電気刺激機能がついた９６電極アレイ刺激装置を用いた。【００８０】
電気刺激は、単相刺激、電圧１２．５Ｖ、パルス幅４ｍｓｅｃ、刺激頻度１０Ｈｚの条件で行った。ＥＦＳ刺激の３０秒前からモニタリングを開始し、ＥＦＳ刺激前の基線が安定した状態でＥＦＳ刺激を加え、以後合計６００秒の細胞内カルシウム動態を、蛍光強度の変化として記録した。【００８１】
なお、神経細胞の分化誘導において、上記の通り、細胞株を５日間培養し、分化誘導した神経細胞を、一度継代することにより、ウェル間の細胞数差を最小化でき、またＦＤＳＳによる細胞内カルシウム動態のモニタリングにおいてノイズ原因となるウェル内での神経細胞の位置により生じ得る偏りを最小限とすることができた。これにより、電気刺激の際、電圧１２．５Ｖ、パルス幅４ｍｓｅｃ、刺激頻度１０Ｈｚという、弱い電気刺激で細胞内カルシウムの測定を行うことが可能となり、強すぎる電気刺激ではマスクされる可能性がある微小な蛍光強度の変化を見出すことができた。【００８２】
陰性コントロールとして、ＤＭＳＯ溶媒を用いた。その結果を図１に示す。図１に示したように、陰性コントロールであるＤＭＳＯ溶媒の場合は、ΔＦ／Ｆ０に変化はなかったが、Ｂｅｐｒｉｄｉｌでは細胞内カルシウムの変化が阻害された。【００８３】
［実施例３］
（興奮毒性を有する化合物添加時の細胞内カルシウム動態）
被験物質として、Ｂｅｐｒｉｄｉｌの代わりに、米国を始めとする統一毒性評価系の検討部会（ＨＥＳＩ）でも使用される薬剤である、Ａｍｏｘａｐｉｎ、Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ及びＬｉｎｏｐｉｒｄｉｎをそれぞれ用い、実施例２と同様にして細胞内カルシウム動態を測定した。【００８４】
その結果を図２に示す。図２に示したように、神経興奮毒性があることが知られているＡｍｏｘａｐｉｎ、Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ及びＬｉｎｏｐｉｒｄｉｎのそれぞれについて、本発明の興奮毒性評価方法において、Ｂｅｌｌ−ｓｈａｐｅ型の用量依存的な興奮毒性が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明によれば、被験物質のヒト神経細胞に対する興奮毒性の評価方法を提供することができる。本発明の興奮毒性評価方法は、９６ウェルフォーマットのハイスループットスクリーニング系に応用することも可能であり、治療薬シーズの導出段階、あるいは開発候補物質の前臨床インビトロ神経興奮毒性評価系としても適応でき、治療薬開発に有用である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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