(57)【要約】  配列特異的ＤＮＡ切断酵素と核内受容体との融合タンパク質を、発現誘導型プロモーターの制御下で発現させる工程と、前記融合タンパク質を核内移行させ、核内移行した前記融合タンパク質が配列特異的にゲノムＤＮＡを切断し二本鎖ＤＮＡ切断を形成する工程と、ＤＮＡ切断修復機構を利用して、前記二本鎖ＤＮＡ切断を修復するとともに、前記二本鎖ＤＮＡ切断の近傍に遺伝子変異を導入する工程と、を備える、遺伝子変異導入方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列特異的ＤＮＡ切断酵素と核内受容体との融合タンパク質を、発現誘導型プロモーターの制御下で発現させることと、
前記融合タンパク質を核内移行させ、核内移行した前記融合タンパク質が配列特異的にゲノムＤＮＡを切断し二本鎖ＤＮＡ切断を形成することと、
ＤＮＡ切断修復機構を利用して、前記二本鎖ＤＮＡ切断を修復するとともに、前記二本鎖ＤＮＡ切断の近傍に遺伝子変異を導入することと、を備える、遺伝子変異導入方法。
【請求項２】
前記遺伝子変異を導入することにおいて、ドナーＤＮＡを共存させ、
前記ドナーＤＮＡは、前記ゲノムＤＮＡの前記二本鎖ＤＮＡ切断の位置を含む領域と配列同一性を有し、且つ前記ゲノムＤＮＡの塩基配列に対して１〜数個の所望の塩基変異を有する、請求項１に記載の遺伝子変異導入方法。
【請求項３】
前記所望の塩基変異がランダム変異を含む、請求項２に記載の遺伝子変異導入方法。
【請求項４】
前記配列特異的ＤＮＡ切断酵素がＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ又は人工ヌクレアーゼである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子変異導入方法。
【請求項５】
前記核内受容体がエストロゲン受容体又はグルココルチコイド受容体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子変異導入方法。
【請求項６】
前記発現誘導型プロモーターがドキシサイクリン誘導型プロモーターである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子変異導入方法。
【請求項７】
配列特異的ＤＮＡ切断酵素と核内受容体との融合タンパク質。
【請求項８】
前記配列特異的ＤＮＡ切断酵素がＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ又は人工ヌクレアーゼである、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記核内受容体がエストロゲン受容体又はグルココルチコイド受容体である、請求項７又は８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１１】
発現誘導型プロモーターと、前記発現誘導型プロモーターの下流に連結された請求項１０に記載の核酸とを含む、ベクター。
【請求項１２】
前記発現誘導型プロモーターがドキシサイクリン誘導型プロモーターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載のベクターが導入された細胞。
【請求項１４】
多能性幹細胞、腫瘍細胞又は樹立細胞株である、請求項１３に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子変異導入方法に関する。より具体的には、遺伝子変異導入方法、融合タンパク質、核酸、ベクター及び細胞に関する。本願は、２０１７年７月１８日に、日本に出願された特願２０１７−１３９２６８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
一塩基多型（ＳＮＰ）を含めた遺伝子変異が原因として生じる疾患の病態を理解したり、ゲノム変異を再現したりするためには、効率的なゲノム配列改変技術が必要である。近年のゲノム編集技術の進展により、ターゲット部位におけるゲノム配列の削除や挿入が可能となってきた。【０００３】
ゲノム編集では、ターゲット部位に二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を形成し、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路又は相同組換え（ＨＲ）経路を介した修復機構を利用している。ゲノム編集における二本鎖ＤＮＡ切断の修復では、ＮＨＥＪ経路による修復が主であり、ターゲット部位に塩基の欠失や挿入を起こすことができる。【０００４】
一方、ＨＲ経路は、主に細胞周期のＳ期とＧ２期に限定して起こる上、ＮＨＥＪ経路と比較して生じる頻度が少ない。このため、ゲノム編集では、ドナーＤＮＡを鋳型に用いた、ＨＲ経路による正確な塩基置換の効率は非常に低い。しかしながら、ターゲット部位に所望の塩基置換を導入するためには、ＨＲ経路による正確な塩基置換を誘導する必要がある。【０００５】
ゲノム編集において、ＨＲ経路を利用する方法として、様々な方法が検討されてきた。古典的には、十数ｋｂ程度の相同アームを持つプラスミドＤＮＡや最大数百ｋｂの相同アームを持つＢＡＣ  ＤＮＡをドナー（鋳型）として利用して、ゲノム編集によりＤＮＡ損傷を誘導した部位の近傍に薬剤選択カセットを導入しつつ、遺伝子変異を導入する方法が挙げられる。しかしながら、この方法では遺伝子変異導入部位の近傍に薬剤選択カセットが残ってしまう。【０００６】
そこで、薬剤選択カセットを予めｌｏｘＰ配列で挟んでおき、目的箇所に相同組換えで遺伝子変異が導入された後にＣｒｅ組換え酵素を反応させて除去したり、薬剤選択カセットの両側をゲノム編集酵素で切断して削除したり、トランスポゾンのターミナルリピート（ＴＲ）配列を予め薬剤選択カセットの両側に入れておき、トランスポザーゼを作用させて薬剤選択カセットを除去する方法等が必要となる。このため、これらの方法では少なくとも２回のサブクローニングプロセスが必要となり、目的細胞樹立までに手間と時間がかかる。【０００７】
ゲノム編集において、ＨＲ経路を利用する別の方法として、一本鎖ＤＮＡをドナーＤＮＡとして用いる方法が検討されている（例えば、非特許文献１を参照。）。２００塩基程度の一本鎖ＤＮＡは化学的なＤＮＡ合成技術により容易に作製可能であり、二本鎖ＤＮＡと比較して染色体上へのランダム挿入のリスクも少ない。【０００８】
しかしながら、一本鎖ＤＮＡをドナーＤＮＡとして用いた場合、相同組換え効率が低いことが知られている。このため、相同組換えにより所望の遺伝子変異が導入された細胞株を得るために、低頻度で組換え体を含む細胞集団の中から、組換え体をなるべく多く含む細胞集団をｄｒｏｐｌｅｔ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ法等の高感度なスクリーニング法で検出して抽出し、この操作を複数回繰り返すことで、ごく少数の組換え体をエンリッチするＳｉｂ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法等の追加の工程が必要になる。【０００９】
また、ＮＨＥＪ経路をＬ−７７７０５等の阻害剤で阻害することによりＨＲ経路を活性化して相同組換えの効率を上げる方法や、Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ等の細胞周期阻害剤で細胞周期を調整してＧ２−Ｍ期の細胞を増やすことでＨＲ効率を高める方法等も検討されている。また、一本鎖ＤＮＡの長さや向き、ゲノム編集におけるＤＳＢ形成部位からの距離等を最適化することで、ＨＲ効率を高める方法も報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Radecke F., et al., Targeted Chromosomal Gene Modification in Human Cells by Single-Stranded Oligodeoxynucleotides in the Presence of a DNA Double-Strand Break., MOLECULAR THERAPY, vol. 14 (6), 798-808, 2006.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ところで、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を含む多能性幹細胞は、その旺盛な増殖能力及び分化多様性により、病態の再現、創薬、細胞治療等、様々な分野での応用が進んでいる。このような背景のもと、多能性幹細胞を含む細胞に、正確に目的の遺伝子変異を導入する技術が求められている。【００１２】
しかしながら、従来のゲノム編集技術では、標的配列以外の位置に遺伝子変異を生じてしまう、いわゆるオフターゲット効果が問題となる場合がある。そこで、本発明は、標的配列に対する配列特異的ＤＮＡ切断酵素の特異性を向上させる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は以下の態様を含む。
［１］配列特異的ＤＮＡ切断酵素と核内受容体との融合タンパク質を、発現誘導型プロモーターの制御下で発現させることと、前記融合タンパク質を核内移行させ、核内移行した前記融合タンパク質が配列特異的にゲノムＤＮＡを切断し二本鎖ＤＮＡ切断を形成することと、ＤＮＡ切断修復機構を利用して、前記二本鎖ＤＮＡ切断を修復するとともに、前記二本鎖ＤＮＡ切断の近傍に遺伝子変異を導入することと、を備える、遺伝子変異導入方法。
［２］前記遺伝子変異を導入することにおいて、ドナーＤＮＡを共存させ、前記ドナーＤＮＡは、前記ゲノムＤＮＡの前記二本鎖ＤＮＡ切断の位置を含む領域と配列同一性を有し、且つ前記ゲノムＤＮＡの塩基配列に対して１〜数個の所望の塩基変異を有する、［１］に記載の遺伝子変異導入方法。
［３］前記所望の塩基変異がランダム変異を含む、［２］に記載の遺伝子変異導入方法。［４］前記配列特異的ＤＮＡ切断酵素がＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ又は人工ヌクレアーゼである、［１］〜［３］のいずれかに記載の遺伝子変異導入方法。
［５］前記核内受容体がエストロゲン受容体又はグルココルチコイド受容体である、［１］〜［４］のいずれかに記載の遺伝子変異導入方法。
［６］前記発現誘導型プロモーターがドキシサイクリン誘導型プロモーターである、［１］〜［５］のいずれかに記載の遺伝子変異導入方法。
［７］配列特異的ＤＮＡ切断酵素と核内受容体との融合タンパク質。
［８］前記配列特異的ＤＮＡ切断酵素がＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ又は人工ヌクレアーゼである、［７］に記載の融合タンパク質。
［９］前記核内受容体がエストロゲン受容体又はグルココルチコイド受容体である、［７］又は［８］に記載の融合タンパク質。
［１０］［７］〜［９］のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸。
［１１］発現誘導型プロモーターと、前記発現誘導型プロモーターの下流に連結された［１０］に記載の核酸とを含む、ベクター。
［１２］前記発現誘導型プロモーターがドキシサイクリン誘導型プロモーターである、［１１］に記載のベクター。
［１３］［１１］又は［１２］に記載のベクターが導入された細胞。
［１４］多能性幹細胞、腫瘍細胞又は樹立細胞株である、［１３］に記載の細胞。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、標的配列に対する配列特異的ＤＮＡ切断酵素の特異性を向上させる技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】（ａ）は、実験例１で作製したトランスポゾンベクターの構造を示す図である。（ｂ）は、実験例１におけるｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ（ＳＳＡ）アッセイに用いるレポーターベクターの構造を説明する図である。（ｃ）は、実験例１におけるＳＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図２】（ａ）は、実験例２で作製したトランスポゾンベクターの構造を示す図である。（ｂ）は、実験例２におけるＳＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図３】（ａ）は、実験例３で作製したトランスポゾンベクターの構造を示す図である。（ｂ）は、実験例３におけるＳＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図４】実験例４におけるＳＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図５】実験例５においてＣａｓ９  ｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図６】実験例６において、細胞の培地に添加したドキシサイクリン（Ｄｏｘ）及びデキサメタゾン（Ｄｅｘ）の濃度と、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）アッセイによるゲノム編集効率の測定結果を示す図である。
【図７】実験例７において、Ｄｏｘ及びＤｅｘを培地に添加した後のゲノム編集効率の経時変化を測定した結果を示すグラフである。
【図８】実験例８におけるＴ７ＥＩアッセイの結果を示す写真である。
【図９】実験例９において、ＫＵ８０、ＫＵ７０、ＬＩＧ４をノックダウンし、各遺伝子のｍＲＮＡの発現を逆転写定量ＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。
【図１０】実験例９におけるアレルコピー数定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図１１】実験例１０におけるアレルコピー数定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図１２】実験例１１におけるアレルコピー数定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図１３】（ａ）は、実験例１２におけるＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ）アッセイの結果を示す写真である。（ｂ）は、実験例１２において塩基配列を解析した結果をまとめたグラフである。（ｃ）は実験例１２における代表的な相同組換えクローンのサンガーシーケンス波形データを示す図である。
【図１４】（ａ）は実験例１３における、Ｄｏｘ及びＤｅｘの添加のタイミングを示す図である。（ｂ）は、実験例１３におけるＲＦＬＰアッセイの結果を示す写真である。
【図１５】実験例１４におけるＴ７ＥＩアッセイの結果を示す写真である。
【図１６】実験例１５におけるＲＦＬＰアッセイの結果を示す写真である。
【図１７】実験例１６におけるＲＦＬＰアッセイの結果を示す写真である。
【図１８】（ａ）は、実験例１７において塩基配列を解析した結果をまとめたグラフである。（ｂ）は、‘ＮＮＣ’（ここで、Ｎはアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）又はシトシン（Ｃ）を表す。）の塩基配列からなるコドンがコードするアミノ酸を示す図である。（ｃ）は、実験例１７においてランダム変異が導入されたクローンの塩基配列及び当該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を示す図である。
【図１９】（ａ）は、実験例１８において塩基配列を解析した結果をまとめたグラフである。（ｂ）は、‘ＮＮＣ’（ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣを表す。）の塩基配列からなるコドンがコードするアミノ酸を示す図である。（ｃ）は、実験例１８においてランダム変異が導入されたクローンの塩基配列及び当該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を示す図である。
【図２０】実験例１９において塩基配列を解析した結果をまとめたグラフである。
【図２１】実験例１９においてランダム変異が導入されたクローンの塩基配列及び当該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を示す図である。
【図２２】（ａ）は、実験例２０において塩基配列を解析した結果をまとめたグラフである。（ｂ）は、‘ＮＮＣ’（ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣを表す。）の塩基配列からなるコドンがコードするアミノ酸を示す図である。（ｃ）は、実験例２０においてランダム変異が導入されたクローンの塩基配列及び当該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
［遺伝子変異導入方法］
１実施形態において、本発明は、配列特異的ＤＮＡ切断酵素と核内受容体との融合タンパク質を、発現誘導型プロモーターの制御下で発現させる工程（ａ）と、前記融合タンパク質を核内移行させ、核内移行した前記融合タンパク質が配列特異的にゲノムＤＮＡを切断し二本鎖ＤＮＡ切断を形成する工程（ｂ）と、ＤＮＡ切断修復機構を利用して、前記二本鎖ＤＮＡ切断を修復するとともに、前記二本鎖ＤＮＡ切断の近傍に遺伝子変異を導入する工程（ｃ）と、を備える、遺伝子変異導入方法を提供する。
【００１７】
実施例において後述するように、本実施形態の遺伝子変異導入方法（塩基置換方法）によれば、標的配列に対する配列特異的ＤＮＡ切断酵素の特異性を向上させることができる。
【００１８】
本明細書において、標的配列に対する配列特異的ＤＮＡ切断酵素の特異性を向上させるとは、例えば、ゲノム編集において、標的配列以外の位置に遺伝子変異を生じてしまう、いわゆるオフターゲット効果を抑制することを意味する。あるいは、標的配列に対する配列特異的ＤＮＡ切断酵素の特異性を向上させるとは、意図しない時にゲノムＤＮＡが切断されること、すなわち、ゲノムＤＮＡ切断のバックグラウンドを低減させることを意味する。
【００１９】
実施例において後述するように、本実施形態の遺伝子変異導入方法により、ゲノム編集におけるオフターゲット効果を抑制し、目的とする遺伝子変異の導入効率を高めることができる。したがって、本実施形態の遺伝子変異導入方法は、配列特異的ＤＮＡ切断酵素による標的配列以外の塩基配列の切断を抑制する方法であるということもできる。
【００２０】
また、実施例において後述するように、本実施形態の遺伝子変異導入方法によれば、ゲノムＤＮＡの切断を厳密に制御することができ、ゲノムＤＮＡ切断のバックグラウンドを低減させることができる。したがって、本実施形態の遺伝子変異導入方法は、配列特異的ＤＮＡ切断酵素の活性を厳密に制御する方法であるということもできる。
【００２１】
本実施形態の遺伝子変異導入方法は、細胞を対象として実施することができる。細胞としては、真核細胞が挙げられ、動物細胞、酵母等が挙げられる。動物細胞は、ヒト細胞であってもよく、非ヒト動物細胞であってもよい。また、動物細胞は多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。
【００２２】
（配列特異的ＤＮＡ切断酵素）
本明細書において、配列特異的ＤＮＡ切断酵素は、ゲノムＤＮＡを標的配列特異的に切断して二本鎖ＤＮＡ切断を形成するものであれば特に制限されない。配列特異的ＤＮＡ切断酵素が認識する標的配列の長さは、例えば、１０〜４０塩基程度であってよい。
【００２３】
一般的に、ゲノム編集に利用する配列特異的ＤＮＡ切断酵素は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと人工ヌクレアーゼに大別される。本実施形態の遺伝子変異導入方法において、配列特異的ＤＮＡ切断酵素はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであってもよく、人工ヌクレアーゼであってもよい。
【００２４】
また、配列特異的ＤＮＡ切断酵素は、例えばニッカーゼを複数組み合わせてＤＮＡを切断する態様であってもよい。ここで、ニッカーゼとは、二本鎖ＤＮＡのうちの一本鎖にニックを形成する酵素を意味する。例えば、ゲノムＤＮＡ上の近接した位置において、二本鎖ＤＮＡの双方の鎖にニックを形成することにより、二本鎖ＤＮＡ切断を形成することができる。
【００２５】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとは、ガイドとなる短鎖ＲＮＡが標的配列に結合し、２つのＤＮＡ切断ドメイン（ヌクレアーゼドメイン）を有するヌクレアーゼをリクルートして配列特異的な切断を誘導する酵素である。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとしては、Ｃａｓファミリータンパク質が挙げられる。
【００２６】
Ｃａｓファミリータンパク質としては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ等が挙げられる。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓファミリータンパク質のホモログであってもよく、Ｃａｓファミリータンパク質が改変されたものであってもよい。例えば、２つ存在する野生型のヌクレアーゼドメインの一方を不活性型に改変したニッカーゼ改変型のヌクレアーゼであってもよい。
【００２７】
人工ヌクレアーゼは、標的配列に特異的に結合するように設計・作製されたＤＮＡ結合ドメインと、制限酵素であるＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメイン（ヌクレアーゼドメイン）を連結した人工制限酵素である。人工ヌクレアーゼとしては、Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２８】
（核内受容体）
本実施形態の遺伝子変異導入方法において、配列特異的ＤＮＡ切断酵素は核内受容体との融合タンパク質を形成している。実施例において後述するように、発明者らは、配列特異的ＤＮＡ切断酵素と核内受容体との融合タンパク質に、核内受容体のリガンド（基質）を作用させることにより、融合タンパク質を核内移行させることができることを明らかにした。更に、上記の融合タンパク質が配列特異的ＤＮＡ切断酵素の活性を維持していることを明らかにした。
【００２９】
したがって、配列特異的ＤＮＡ切断酵素と核内受容体との融合タンパク質により、配列特異的ＤＮＡ切断酵素の細胞内局在を制御することができる。
【００３０】
核内受容体としては、配列特異的ＤＮＡ切断酵素との融合タンパク質を作製することにより、核への局在の制御が可能となるものであれば特に限定されず、例えば、エストロゲン受容体、グルココルチコイド受容体等が挙げられるがこれらに限定されない。核内受容体は、改変されたものであってもよい。例えば、エストロゲン受容体の改変体としては、ＥＲＴ２等が挙げられる。
【００３１】
エストロゲン受容体のリガンド（エストロゲン受容体を核内移行させる物質）としては、エストロゲン、エストロゲン誘導体等が挙げられる。エストロゲン誘導体としては、タモキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン等が挙げられる。また、グルココルチコイド受容体のリガンド（グルココルチコイド受容体を核内移行させる物質）としては、デキサメタゾン等が挙げられる。
【００３２】
（発現誘導型プロモーター）
本実施形態の遺伝子変異導入方法では、配列特異的ＤＮＡ切断酵素と核内受容体との融合タンパク質を、発現誘導型プロモーターの制御下で発現させる。発現誘導型プロモーターとしては、例えば、培地への発現制御物質の添加又は除去、光照射、温度変化等により発現を誘導することができるプロモーターを用いることができる。
【００３３】
発現誘導型プロモーターは、発現制御物質を培地に添加することにより、融合タンパク質の発現が誘導されるものであってもよいし、発現制御物質を培地から除去することにより、融合タンパク質の発現が誘導されるものであってもよい。より具体的な発現誘導型プロモーターとしては、例えば、ドキシサイクリン誘導型プロモーター（ＴｅｔＯプロモーター）が挙げられるがこれに限定されない。
【００３４】
発現誘導型プロモーターの制御下で配列特異的ＤＮＡ切断酵素と核内受容体との融合タンパク質を発現させることにより、融合タンパク質の発現を制御することが可能になる。すなわち、本実施形態の遺伝子変異導入方法では、配列特異的ＤＮＡ切断酵素が発現段階（転写）及び翻訳後段階の双方において二重に制御される。
【００３５】
実施例において後述するように、発明者らは、ゲノム編集において、配列特異的ＤＮＡ切断酵素の発現誘導及び細胞内局在の双方を制御することにより、標的配列に対する配列特異的ＤＮＡ切断酵素の特異性を向上させることができることを明らかにした。
【００３６】
（工程（ａ））
本工程では、配列特異的ＤＮＡ切断酵素と核内受容体との融合タンパク質を、発現誘導型プロモーターの制御下で発現させる。発現した融合タンパク質は、核内以外の場所、例えば細胞質内に局在する必要がある。
【００３７】
本工程は、例えば、発現誘導型プロモーターの下流に融合タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を連結したコンストラクトを細胞に導入し、使用した発現誘導型プロモーターに対応する方法で融合タンパク質の発現を誘導することにより行うことができる。
【００３８】
例えば、発現誘導型プロモーターがドキシサイクリン誘導型プロモーターであり、培地にドキシサイクリンを添加した時に発現誘導される場合には、細胞の培地にドキシサイクリンを添加することにより、誘導タンパク質を発現させることができる。これにより、必要なときのみに融合タンパク質を発現させ、標的配列に対する配列特異的ＤＮＡ切断酵素の特異性を向上させることができる。
【００３９】
上記のコンストラクトは、細胞に一過性に導入してもよいし、予め細胞の染色体に組み込んでおいてもよい。上記のコンストラクトは、例えば、トランスポゾンベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、エピソーマルベクター、プラスミドベクター等に組み込まれていてもよい。
【００４０】
例えば、上記のコンストラクトがトランスポゾンベクターに組み込まれている場合、細胞に導入してトランスポザーゼを作用させることにより、容易に細胞の染色体中に組み込むことができる。また、トランスポザーゼを作用させることにより、染色体中に組み込まれた上記のコンストラクトを、染色体から切り出し、痕跡を残さずに除去することもできる。
【００４１】
（工程（ｂ））
本工程では、工程（ａ）で発現させた、配列特異的ＤＮＡ切断酵素と核内受容体との融合タンパク質を核内移行させる。
【００４２】
本工程は、例えば、細胞の培地に核内受容体のリガンド（核内受容体を核内移行させる物質）を添加することにより行うことができる。
【００４３】
例えば、核内受容体がＥＲＴ２である場合には、４−ヒドロキシタモキシフェンを培地に添加することにより、融合タンパク質を核内移行させることができる。また、核内受容体がグルココルチコイド受容体である場合には、デキサメタゾンを培地に添加することにより、融合タンパク質を核内移行させることができる。
【００４４】
これにより、必要なときのみに融合タンパク質を核内に移行させることができる。この結果、標的配列に対する配列特異的ＤＮＡ切断酵素の特異性を更に向上させることができる。すなわち、本実施形態の遺伝子変異導入方法では、配列特異的ＤＮＡ切断酵素が発現段階（転写）及び翻訳後段階の双方において二重に制御される。
【００４５】
核内移行した前記融合タンパク質は、標的配列特異的にゲノムＤＮＡを切断し、二本鎖ＤＮＡ切断を形成する。配列特異的ＤＮＡ切断酵素がＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである場合には、ガイドとなる短鎖ＲＮＡを共存させることにより、配列特異的な二本鎖ＤＮＡ切断を形成させることができる。ガイドとなる短鎖ＲＮＡとしては標的配列に対応したものを使用する。
【００４６】
ガイドとなる短鎖ＲＮＡとしては、例えばＣＲＩＳＰＲ−ｓｇＲＮＡを用いることができる。ｓｇＲＮＡは、細胞内に一過性に導入してもよいし、発現ベクターを用いて細胞内で発現させてもよい。発現ベクターを用いてｓｇＲＮＡを発現させる場合には、ｓｇＲＮＡを恒常的に発現させてもよいし、上述したものと同様の発現誘導型プロモーターの制御下で発現させてもよい。
【００４７】
ｓｇＲＮＡの発現ベクターは、例えば、トランスポゾンベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、エピソーマルベクター、プラスミドベクター等であってもよい。
【００４８】
（工程（ｃ））
本工程では、工程（ｂ）で形成された、二本鎖ＤＮＡ切断が、細胞自身が有するＤＮＡ切断修復機構により修復される。この過程において、二本鎖ＤＮＡ切断の近傍に遺伝子変異が導入される。ここで、近傍とは、通常、二本鎖ＤＮＡ切断部位又は二本鎖ＤＮＡ切断部位から１００塩基以内、例えば５０塩基以内、例えば２０塩基以内を意味する。遺伝子変異としては、挿入変異又は欠失変異（Ｉｎｄｅｌ）が挙げられる。
【００４９】
また、本工程をドナーＤＮＡの共存下で行うことにより、相同組換え（ＨＲ）を誘導することもできる。ここで、ドナーＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡの二本鎖ＤＮＡ切断の位置の前後を含む領域と配列同一性を有し、且つ前記ゲノムＤＮＡの塩基配列に対して１〜数個の所望の塩基変異を有するものを使用するとよい。前記ドナーＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡでもよいし、二本鎖ＤＮＡでもよい。また、前記ドナーＤＮＡは、単一配列でもよいし、複数の配列の混合物でもよい。
【００５０】
実施例において後述するように、本実施形態の遺伝子変異導入方法により、従来の１０倍以上もの高頻度で相同組換えを誘導することができる。したがって、本実施形態の遺伝子変異導入方法は、ゲノム編集における相同組換え効率を上昇させる方法であるということもできる。
【００５１】
また、実施例において後述するように、細胞に導入するドナーＤＮＡの量を増加させると、相同組換え効率が上昇する傾向にある。したがって、高い相同組換え効率を達成するためには、細胞に導入するドナーＤＮＡの量を増加させることが好ましい。例えば、配列特異的ＤＮＡ切断酵素と核内受容体との融合タンパク質の発現ベクターや、ガイドとなる短鎖ＲＮＡの発現ベクター等を、予め細胞の染色体に組み込んでおくことにより、細胞に導入するドナーＤＮＡの量を最大限に増やすことができる。
【００５２】
ドナーＤＮＡは、５０〜５，０００塩基程度の一本鎖ＤＮＡであってもよいし、５０〜５，０００塩基対程度の二本鎖ＤＮＡであってもよい。ドナーＤＮＡが一本鎖ＤＮＡである場合、ドナーＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの二本鎖のうちのいずれの鎖と配列同一性を有していてもよい。
【００５３】
ドナーＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの二本鎖ＤＮＡ切断の位置を含む領域と、９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の配列同一性を有することが好ましい。
【００５４】
本明細書において、配列同一性とは、対象の塩基配列が、基準となる塩基配列（基準塩基配列）に対して一致している割合を示す値である。基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の塩基数を算出し、下記式（１）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致した塩基数／対象塩基配列の総塩基数×１００  （１）
【００５５】
ドナーＤＮＡは、１〜数個の所望の塩基変異を有する。この結果、遺伝子変異が導入されることにより、細胞のゲノムが所望の塩基配列に置換される。ここで、数個とは１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個又は１個であることが好ましい。
【００５６】
また、所望の塩基変異はランダム変異を含んでいてもよい。この場合、前記ドナーＤＮＡは、複数の配列の混合物が望ましい。本明細書において、ランダム変異とは、ドナーＤＮＡの対象塩基を２種類以上の塩基の混合物にしたものをいう。
【００５７】
ランダム変異は、特定の塩基が２種類以上の塩基の混合物となるものであれば特に限定されず、例えば、‘Ｎ’、すなわち、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）又はシトシン（Ｃ）であってもよいし、例えば‘Ｂ’、すなわちＣ、Ｇ又はＴであってもよいし、例えば‘Ｋ’、すなわちＧ又はＴであってもよく、これらに限定されない。また、ランダム変異の数は１個であってもよいし、２個以上であってもよい。
【００５８】
ドナーＤＮＡを化学的に合成する場合、ランダム変異は２種類以上の塩基材料（アミダイト試薬）を等量又は任意の量比で混合して合成すること等により導入することができる。ドナーＤＮＡを酵素的に合成する場合、ランダム変異は２種類以上の塩基材料（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）を任意の量比で混合して合成すること等によっても導入することができる。または、上記の化学合成でランダム変異を持ったプライマーを合成し、ＲＮＡからの逆転写反応やＰＣＲ反応によりドナーＤＮＡを作製することもできる。あるいは、二本鎖ＤＮＡの片側のＤＮＡ鎖をニッケース（一本鎖ＤＮＡ切断酵素）で二箇所切断し、変性ゲル電気泳動で一本鎖ＤＮＡを単離することにより、ドナーＤＮＡを作製することもできる。
【００５９】
実施例において後述するように、ドナーＤＮＡにランダム変異を導入することにより、複数の変異を有する変異体を一度に取得することができる。
【００６０】
［融合タンパク質］
１実施形態において、本発明は、配列特異的ＤＮＡ切断酵素と核内受容体との融合タンパク質を提供する。本実施形態の融合タンパク質は、上述した遺伝子変異導入方法用に好適に用いることができる。
【００６１】
本実施形態の融合タンパク質において、配列特異的ＤＮＡ切断酵素としては、上述したものと同様であり、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであってもよいし、人工ヌクレアーゼであってもよい。
【００６２】
また、本実施形態の融合タンパク質において、核内受容体は上述したものと同様であり、エストロゲン受容体であってもよいし、グルココルチコイド受容体であってもよい。
【００６３】
［核酸］
１実施形態において、本発明は、上述した融合タンパク質をコードする核酸を提供する。本実施形態の核酸を発現させることにより、配列特異的ＤＮＡ切断酵素と核内受容体との融合タンパク質を得ることができる。したがって、本実施形態の核酸は、上述した遺伝子変異導入方法用に好適に用いることができる。
【００６４】
［ベクター］
１実施形態において、本発明は、発現誘導型プロモーターと、発現誘導型プロモーターの下流に連結された、上述した融合タンパク質をコードする核酸とを含む、ベクターを提供する。本実施形態のベクターは、上述した遺伝子変異導入方法用に好適に用いることができる。
【００６５】
本実施形態のベクターは、例えば、トランスポゾンベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、エピソーマルベクター、プラスミドベクター等であってもよい。
【００６６】
本実施形態のベクターにおいて、発現誘導型プロモーターは、上述したものと同様であり、例えば、ドキシサイクリン誘導型プロモーター、キュメート（Ｃｕｍａｔｅ）誘導型プロモーター、熱ショックプロモーター、光誘導プロモーター等が挙げられるがこれに限定されない。また、ｌｏｘＰサイトで挟まれたタンパク質翻訳ストップコドンやポリアデニン配列によって、Ｃｒｅ組換え酵素作用時に発現が誘導されるシステムでもよい。
【００６７】
上述したように、本実施形態のベクターを細胞に導入することにより、配列特異的ＤＮＡ切断酵素を発現段階及び翻訳後段階の双方において二重に制御することができる。
【００６８】
［細胞］
１実施形態において、本発明は、上記のベクターが導入された細胞を提供する。ここで、ベクターとは、すなわち、発現誘導型プロモーターと、配列特異的ＤＮＡ切断酵素と核内受容体との融合タンパク質をコードする核酸とが、この順に連結されたベクターである。本実施形態の細胞は、上述した遺伝子変異導入方法用に好適に用いることができる。
【００６９】
本実施形態の細胞において、ベクターは、例えば、トランスポゾンベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、エピソーマルベクター、プラスミドベクター等であってもよい。なかでも、トランスポゾンベクターが好ましい。
【００７０】
トランスポゾンベクターは容易に細胞の染色体に組み込むことができ、また、必要に応じて除去することも可能である。トランスポゾンは、例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｔｏｌ  ＩＩ、ｍａｒｉｎｅｒ等であってもよい。
【００７１】
本実施形態の細胞は、真核細胞が挙げられ、動物細胞、酵母等が挙げられる。動物細胞は、ヒト細胞であってもよく、非ヒト動物細胞であってもよい。また、動物細胞は多能性幹細胞であってもよく、腫瘍細胞であってもよい。また動物細胞は樹立された細胞株であってもよい。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。また、細胞株としては特に限定されず、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞等が挙げられる。
【００７２】
ベクターを細胞に導入する方法としては、公知の任意の手段を使用することができる。例えば、市販の装置を使用したエレクトロポレーション法が挙げられる。エレクトロポレーション法を実施する装置としては、例えばＮＥＰＡ２１（ネッパジーン社）、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ロンザ社）、Ｎｅｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフック社）、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（バイオラッド社）、ＥＣＭ８３９（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社）等を使用することができる。
【００７３】
また、ベクターを細胞に導入する方法として、トランスフェクション用試薬を使用してもよい。トランスフェクション用試薬としては、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（サーモフィッシャーサイエンティフック社）、ＳｔｅｍＦｅｃｔ（ＳＴＥＭＧＥＮ社）、ＦｕＧＥＮＥ６／ＨＤ（プロメガ社）、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフック社）、ｊｅｔＰＲＩＭＥ  Ｋｉｔ（ポリプラストランスフェクション社）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（オズバイオサイエンス社）、ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ３０００（オズバイオサイエンス社）、リン酸カルシウム法用試薬等を使用可能である。
【００７４】
また、ベクターがウイルスベクターである場合には、ウイルスが細胞へ侵入する機構を利用することにより、細胞に遺伝子を導入することができる。細胞へのベクターの導入回数は、１回であってもよく、複数回であってもよい。
【００７５】
ところで、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＨＧＭＤ、http://www.hgmd.cf.ac.uk/）には、２０１７年３月１日現在、１９７，９５２件のヒト遺伝子変異が登録されている。
【００７６】
これらの遺伝子変異の中には、一塩基変異によるミスセンス変異（アミノ酸が変わる変異）又はナンセンス変異（ストップコドンとなる変異）が最も件数が多く、１１１，１３５件登録されている。
【００７７】
これらの一塩基変異の働きを解析するため、あるいは修復するためには、相同組換え技術が非常に簡便であり有効である。しかしながら、従来、特にヒト多能性幹細胞で高効率に相同組換えを誘導することは困難であった。
【００７８】
これに対し、実施例において後述するように、本実施形態の細胞を用いることにより、挿入変異、欠失変異、相同組換えによる塩基置換、相同組換えによるランダム変異等を容易に高効率に導入することができる。これにより、様々な遺伝子変異疾患の病態解明や治療への応用が可能となる。
【００７９】
また、本実施形態の細胞は、疾患の解明や治療に限らず、例えば、産業上有用なタンパク質を作製すること等に利用することもできる。配列特異的に遺伝子変異を導入する方法は、タンパク質の機能解析や機能改変に幅広く用いられている方法である。配列特異的に遺伝子変異を導入することにより、例えば、タンパク質の安定性を高める、タンパク質の可溶性を高める、酵素活性を高める、酵素活性を不活性化する、基質特異性を変換する、分子進化を行う等を行うことができる。例えば、酵素等に配列特異的に遺伝子変異を導入することにより、産業上有用な酵素を作製すること等が可能である。
【実施例】
【００８０】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００８１】
［実験例１］
（発現誘導型ＤＮＡ切断酵素の検討）
発現誘導型プロモーターの制御下で配列特異的ＤＮＡ切断酵素を発現させ、ＤＮＡ切断活性を検討した。配列特異的ＤＮＡ切断酵素として、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用した。また、Ｃａｓ９遺伝子として、ヒトコドン頻度に合わせて塩基配列を最適化したものを使用した。また、発現誘導型プロモーターとして、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導型プロモーター（ＴｅｔＯプロモーター）を使用した。具体的には、まず、図１（ａ）に示す構造を有するトランスポゾンベクターを作製した。【００８２】
図１（ａ）中、「３’ＴＲ」及び「５’ＴＲ」は、それぞれ３’側及び５’側に配置したｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン特異性末端逆位配列を表し、「ＴｅｔＯ」はＴｅｔＯプロモーターを表し、「Ｃａｓ９」はＣａｓ９遺伝子を表し、「ＮＬＳ」は核移行シグナル配列を表し、「ＩＲＥＳ」はＩｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅを表し、「ｍＣｈｅｒｒｙ」はｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質遺伝子を表し、「ｐＡ」はポリＡ付加シグナル配列を表し、「ＥＦ１α  ｐｒｏ」はＥＦ１αプロモーターを表し、「ｒｔＴＡ」はリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子を表し、「ＰｕｒｏＲ」はピューロマイシン耐性遺伝子を表し、「ＨｙｇｒｏＲ」はハイグロマイシン耐性遺伝子を表す。【００８３】
図１（ａ）に示す構造を有するトランスポゾンベクター及びｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼを細胞中で共発現させると、トランスポザーゼにより「３’ＴＲ」及び「５’ＴＲ」に挟まれた領域が切り出され、宿主細胞ゲノム中のＴＡＴＡ部位に組み込まれ、安定発現細胞株が樹立される。また、トランスポゾンベクターが導入された細胞は、ピューロマイシン又はハイグロマイシンを用いて薬剤選択することができる。【００８４】
トランスポゾンベクターが導入された細胞では、ＥＦ１αプロモーター制御下でｒｔＴＡを恒常的に発現する。また、ｒｔＴＡは、細胞の培地中にＤｏｘを添加するとＴｅｔＯプロモーターに結合し、Ｃａｓ９遺伝子を発現させる。【００８５】
これらのベクターを用いて、ヒトのジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子のエクソン４５番におけるＤＮＡ切断活性について、ルシフェラーゼレポーターを用いたｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ（ＳＳＡ）アッセイにより検討した。【００８６】
《ＳＳＡアッセイ》
図１（ｂ）は、ＳＳＡアッセイに用いるレポーターベクターの構造を説明する図である。図１（ｂ）に示すように、レポーターベクターは、ＣＭＶプロモーターの下流にＦｉｒｅｆｌｙシフェラーゼ（Ｆｉｒｅｆｌｙ  Ｌｕｃ）遺伝子の５’側フラグメント及び３’側フラグメントを有し、その間にＣＲＩＳＰＲ−ｓｇＲＮＡの標的配列を有している。Ｆｉｒｅｆｌｙシフェラーゼ遺伝子の５’側フラグメント及び３’側フラグメントは、それぞれ約７００ｂｐのオーバーラップ配列を有している。図１（ｂ）左側に示すレポーターベクターより発現されるＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼは不活性型である。【００８７】
レポーターベクター中の標的配列がＣａｓ９によって切断されると、ＨＲ経路又はＳＳＡ経路により修復される。その結果、レポーターベクターの構造が図１（ｂ）右側に示すように変化し、活性型のＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼが発現されるようになる。したがって、Ｆｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼの活性を測定することにより、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断活性を測定することができる。【００８８】
本実験例では、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５番に存在する塩基配列（配列番号１）を標的配列として使用した。また、ｓｇＲＮＡ発現ベクターとして、配列番号４に記載の塩基配列を有するオリゴＤＮＡ及び配列番号７に記載の塩基配列を有するオリゴＤＮＡを混合してＰＣＲ反応を行い、得られた増幅断片をトランスポゾンベクターに組み込んだものを使用した。【００８９】
まず、上記のレポーターベクター１００ｎｇ、内部標準としてウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ）を発現するｐｈＲＬ−ＴＫベクター２０ｎｇ、図１（ａ）に示す構造を有するＣａｓ９発現ベクター２００ｎｇ、上記のｓｇＲＮＡ発現ベクター２００ｎｇを、遺伝子導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００、サーモフィッシャーサイエンティフック社）を用いてヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、９６ウェルプレートに５０，０００個／１００μＬ／ウェルとなるように播種した。【００９０】
また、Ｄｏｘを、０、０．００６５、０．０６５、０．６５及び６．５μＭの終濃度で培地に添加し、Ｃａｓ９の発現を誘導した。【００９１】
続いて、遺伝子導入の翌日に、市販のキット（「Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ」Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ２９２０、プロメガ社）を用いてルシフェラーゼレポーター活性を解析した。【００９２】
図１（ｃ）は、ウミシイタケルシフェラーゼの活性を基準として、Ｆｉｒｅｆｌｙシフェラーゼの活性を測定した結果を示すグラフである。図１（ｃ）中、「Ｎ．Ｃ．」はｓｇＲＮＡ発現ベクターを添加していない陰性対照の結果を表し、「Ｎｏ  Ｃａｓ９」はＣａｓ９発現ベクターを添加していない陰性対照の結果を表し、「ＥＦ１α−Ｃａｓ９」はＣａｓ９を恒常的に発現するＣａｓ９の発現ベクターを細胞に導入した結果を表し、「ＴｅｔＯ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ（ＰｕｒｏＲ）」は図１（ａ）に示すピューロマイシン耐性遺伝子を有するＣａｓ９発現ベクターを細胞に導入した結果を表し、「ＴｅｔＯ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ（ＨｙｇｒｏＲ）」は図１（ａ）に示すハイグロマイシン耐性遺伝子を有するＣａｓ９発現ベクターを細胞に導入した結果を表す。また、「＊」はスチューデントのｔ検定によりｐ＜０．０５で統計的有意差が存在することを表す。【００９３】
その結果、ＰｕｒｏＲとＨｙｇｒｏＲのいずれのＣａｓ９発現ベクターを使用した場合でも、Ｄｏｘ濃度依存的にＣａｓ９によるＤＮＡ切断活性を制御することができたことが明らかとなった。【００９４】
しかしながら、Ｄｏｘ未添加のサンプルにおいても、陰性対照（Ｃａｓ９無し又はｓｇＲＮＡ無し）と比較して有意なＤＮＡ切断活性が検出された。この結果から、発現誘導型プロモーターによる転写レベルの制御だけでは、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断活性の制御が不十分であることが明らかとなった。【００９５】
［実験例２］
（配列特異的ＤＮＡ切断酵素の細胞内局在制御の検討）
配列特異的ＤＮＡ切断酵素の細胞内局在を制御することができるか否か、また、配列特異的ＤＮＡ切断酵素の細胞内局在を制御することによりＤＮＡ切断活性を制御できるか否かについて検討した。配列特異的ＤＮＡ切断酵素として、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用した。また、Ｃａｓ９遺伝子として、ヒトコドン頻度に合わせて塩基配列を最適化したものを使用した。【００９６】
配列特異的ＤＮＡ切断酵素の細胞内局在を制御する手法として、Ｃａｓ９と改変エストロゲン受容体（ＥＲＴ２）又はグルココルチコイド受容体（ＧＲ）との融合タンパク質を作製した。Ｃａｓ９とＥＲＴ２との融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７５に示し、Ｃａｓ９とＧＲとの融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７６に示す。【００９７】
ＥＲＴ２及びＧＲは、基質の非存在下では細胞質に局在するが、基質の存在下では核内移行することが知られている。ＥＲＴ２の基質は４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）であり、ＧＲの基質はデキサメタゾン（Ｄｅｘ）である。【００９８】
具体的には、まず、図２（ａ）に示す構造を有するトランスポゾンベクターをそれぞれ作製した。図２（ａ）中、「ＥＦ１α  ｐｒｏ」はＥＦ１αプロモーターを表し、「ａｔｔＲ１」及び「ａｔｔＲ２」はλファージ由来のＤＮＡ組換え配列を表し、「ＣｍＲ」はクロラムフェニコール耐性遺伝子を表し、「ｃｃｄＢ」はｃｃｄＢ遺伝子を表し、「ｐＡ」はポリＡ付加シグナル配列を表し、「Ｃａｓ９」はＣａｓ９遺伝子を表し、「ＮＬＳ」は核移行シグナル配列を表し、「ＥＲＴ２」はＥＲＴ２遺伝子を表し、「ＧＲ」はＧＲ遺伝子を表す。なお、完成したトランスポゾンベクターにおいては、図２（ａ）における「ＣｍＲ」及び「ｃｃｄＢ」が、Ｃａｓ９−ＮＬＳ、Ｃａｓ９−ＥＲＴ２、又はＣａｓ９−ＧＲにそれぞれ置換されている。【００９９】
続いて、実験例１と同様にして、これらのベクターを用いて、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５番におけるＤＮＡ切断活性について、ルシフェラーゼレポーターを用いたＳＳＡアッセイにより検討した。【０１００】
ＳＳＡアッセイは、４−ＯＨＴを、０、０．００２５、０．０２５、０．２５及び２．５８μＭの終濃度で培地に添加するか、Ｄｅｘを、０、０．００３７、０．０１５、０．０６、０．２５及び１μＭの終濃度で培地に添加した点以外は、実験例１と同様にして行った。【０１０１】
図２（ｂ）は、ウミシイタケルシフェラーゼの活性を基準として、Ｆｉｒｅｆｌｙシフェラーゼの活性を測定した結果を示すグラフである。図２（ｂ）中、「ｓｇＲＮＡ  ｏｎｌｙ」はｓｇＲＮＡ発現ベクターのみを細胞に導入した陰性対照の結果を表し、「Ｃａｓ９−ＮＬＳ  ｏｎｌｙ」はＣａｓ−ＮＬＳの発現ベクターのみを細胞に導入した陰性対照の結果を表し、「Ｃａｓ９−ＥＲＴ２  ｏｎｌｙ」はＣａｓ−ＥＲＴ２の発現ベクターのみを細胞に導入した陰性対照の結果を表し、「Ｃａｓ９−ＧＲ  ｏｎｌｙ」はＣａｓ−ＧＲの発現ベクターのみを細胞に導入した陰性対照の結果を表し、「Ｃａｓ９−ＮＬＳ＋ｓｇＲＮＡ」はＣａｓ−ＮＬＳの発現ベクター及びｓｇＲＮＡの発現ベクターを細胞に導入した結果を表し、「ＥＦ１α−Ｃａｓ９−ＥＲＴ２＋ｓｇＲＮＡ」は、Ｃａｓ−ＥＲＴ２の発現ベクター及びｓｇＲＮＡの発現ベクターを細胞に導入した結果を表し、「ＥＦ１α−Ｃａｓ９−ＧＲ＋ｓｇＲＮＡ」は、Ｃａｓ−ＧＲの発現ベクター及びｓｇＲＮＡの発現ベクターを細胞に導入した結果を表す。また、「＊」はスチューデントのｔ検定によりｐ＜０．０５で統計的有意差が存在することを表す。【０１０２】
その結果、基質（４−ＯＨＴ又はＤｅｘ）の濃度依存的にＣａｓ９によるＤＮＡ切断活性を制御することができたことが明らかとなった。【０１０３】
この結果から、配列特異的ＤＮＡ切断酵素と核内受容体との融合タンパク質に基質を添加することにより、配列特異的ＤＮＡ切断酵素の細胞内局在を制御することができることが明らかとなった。【０１０４】
また、この結果から、上記の基質濃度範囲において、Ｃａｓ９とＥＲＴ２との融合タンパク質よりも、Ｃａｓ９とＧＲとの融合タンパク質の方が高いＤＮＡ切断活性を示すことが明らかとなった。【０１０５】
一方、基質未添加のサンプルにおいても、陰性対照（Ｃａｓ９無し又はｓｇＲＮＡ無し）と比較して、Ｃａｓ９−ＧＲについて有意なＤＮＡ切断活性が検出された。この結果から、配列特異的ＤＮＡ切断酵素と核内受容体との融合タンパク質による細胞内局在の制御だけでは、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断活性の制御が不十分であることが明らかとなった。【０１０６】
［実験例３］
（配列特異的ＤＮＡ切断酵素の発現誘導及び細胞内局在の二重制御の検討）
配列特異的ＤＮＡ切断酵素の発現誘導及び細胞内局在の双方を制御することによりＤＮＡ切断活性を制御できるか否かについて検討した。【０１０７】
具体的には、まず、図３（ａ）に示す構造を有するトランスポゾンベクターを作製した。図３（ａ）中、「３’ＴＲ」、「５’ＴＲ」、「ＴｅｔＯ」、「Ｃａｓ９」、「ＧＲ」、「ＩＲＥＳ」、「ｍＣｈｅｒｒｙ」、「ｐＡ」、「ＥＦ１α  ｐｒｏ」、「ｒｔＴＡ」、「ＰｕｒｏＲ」、「ＨｙｇｒｏＲ」は上述したものと同じ意味を表す。以下、図３（ａ）に示すような、発現誘導及び細胞内局在の双方を制御することができるＣａｓ９の発現ベクターを「二重制御型Ｃａｓ９発現ベクター」といい、発現誘導及び細胞内局在の双方を制御することができるＣａｓ９を「二重制御型Ｃａｓ９」等という場合がある。【０１０８】
続いて、実験例１と同様にして、これらのベクターを用いて、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５番におけるＤＮＡ切断活性について、ルシフェラーゼレポーターを用いたＳＳＡアッセイにより検討した。【０１０９】
ＳＳＡアッセイは、Ｄｅｘを、０、０．００１、０．１及び１０μＭの終濃度で培地に添加し、また、Ｄｏｘを添加しなかったか、２μＭの終濃度で培地に添加した点以外は、実験例１と同様にして行った。【０１１０】
図３（ｂ）は、ウミシイタケルシフェラーゼの活性を基準として、Ｆｉｒｅｆｌｙシフェラーゼの活性を測定した結果を示すグラフである。図３（ｂ）中、「ＥＦ１α−Ｃａｓ９−ＮＬＳ」はＣａｓ９−ＮＬＳを恒常的に発現する発現ベクターのみを細胞に導入した結果を表し、「ＴｅｔＯ−Ｃａｓ９−ＧＲ（ＰｕｒｏＲ）」は図３（ａ）に示すピューロマイシン耐性遺伝子を有するＣａｓ９−ＧＲの発現ベクターのみを細胞に導入した結果を表し、「ＴｅｔＯ−Ｃａｓ９−ＧＲ（ＨｙｇｒｏＲ）」は図３（ａ）に示すハイグロマイシン耐性遺伝子を有するＣａｓ９−ＧＲの発現ベクターのみを細胞に導入した結果を表し、「ＥＦ１α−Ｃａｓ９−ＮＬＳ＋ｓｇＲＮＡ」はＣａｓ−ＮＬＳを恒常的に発現する発現ベクター及びｓｇＲＮＡの発現ベクターを細胞に導入した結果を表し、「ＴｅｔＯ−Ｃａｓ９−ＧＲ（ＰｕｒｏＲ）＋ｓｇＲＮＡ」は図３（ａ）に示すピューロマイシン耐性遺伝子を有するＣａｓ９−ＧＲの発現ベクター及びｓｇＲＮＡの発現ベクターを細胞に導入した結果を表し、「ＴｅｔＯ−Ｃａｓ９−ＧＲ（ＨｙｇｒｏＲ）＋ｓｇＲＮＡ」は図３（ａ）に示すハイグロマイシン耐性遺伝子を有するＣａｓ９−ＧＲの発現ベクター及びｓｇＲＮＡの発現ベクターを細胞に導入した結果を表す。また、「Ｎ．Ｓ．」は統計的有意差が存在しないことを表す。【０１１１】
その結果、二重制御型Ｃａｓ９発現ベクターを細胞に導入し、Ｄｏｘ及びＤｅｘの二剤で同時に処理した場合にＤＮＡ切断活性が誘導されたことが明らかとなった。一方、基質未添加条件では、ＤＮＡ切断活性が陰性対照（ｓｇＲＮＡ無し）と同程度にまで抑制されたことが明らかとなった。【０１１２】
［実験例４］
（二重制御型Ｃａｓ９発現ベクターによるＤＮＡ切断活性の経時変化）
二重制御型Ｃａｓ９発現ベクター及びｓｇＲＮＡ発現ベクターを細胞に導入し、Ｄｏｘ及びＤｅｘの二剤で同時に処理した場合のＤＮＡ切断活性の経時変化を検討した。具体的には、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５番におけるＤＮＡ切断活性を、実験例１と同様にして、ルシフェラーゼレポーターを用いたＳＳＡアッセイにより測定した。【０１１３】
二重制御型Ｃａｓ９発現ベクターとしては「ＴｅｔＯ−Ｃａｓ９−ＧＲ（ＰｕｒｏＲ）」を使用した。また、対照として、二重制御型Ｃａｓ９発現ベクターの代わりに、Ｃａｓ９−ＧＲを恒常的に発現する発現ベクターである「ＥＦ１α−Ｃａｓ９−ＧＲ」、Ｄｏｘの存在下でＣａｓ９−ＮＬＳを発現する発現ベクターである「ＴｅｔＯ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ（ＰｕｒｏＲ）」を導入したサンプルについても同様の測定を行った。また、Ｃａｓ９の発現ベクターを導入しなかったサンプル「Ｎｏ  Ｃａｓ９」についても同様の測定を行った。【０１１４】
各発現ベクターを細胞に導入した後、Ｄｏｘ及びＤｅｘを、それぞれ２μＭ及び１μＭの終濃度で培地に添加し、経時的にＤＮＡ切断活性を測定した。【０１１５】
図４は、各サンプルについて、ウミシイタケルシフェラーゼの活性を基準として、Ｆｉｒｅｆｌｙシフェラーゼの活性を測定した結果を示すグラフである。その結果、ＥＦ１α−Ｃａｓ９−ＧＲ発現ベクター、ＴｅｔＯ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ（ＰｕｒｏＲ）発現ベクターを細胞に導入した場合には、いずれも、Ｄｏｘ及びＤｅｘ未添加時（０時間）においてもＤＮＡ切断活性が検出された。これに対し、二重制御型Ｃａｓ９発現ベクターであるＴｅｔＯ−Ｃａｓ９−ＧＲ（ＰｕｒｏＲ）を細胞に導入した場合には、Ｄｏｘ及びＤｅｘ未添加時（０時間）におけるＤＮＡ切断活性は、Ｃａｓ９未添加（Ｎｏ  Ｃａｓ９）の場合と同程度にまで抑制することができることが明らかとなった。【０１１６】
また、二重制御型Ｃａｓ９発現ベクターであるＴｅｔＯ−Ｃａｓ９−ＧＲ（ＰｕｒｏＲ）を細胞に導入した場合には、Ｄｏｘ及びＤｅｘの添加後８時間から２４時間にかけて明瞭にＤＮＡ切断活性が誘導されたことが明らかとなった。【０１１７】
［実験例５］
（二重制御型Ｃａｓ９発現ベクター及びｓｇＲＮＡ発現ベクターを導入したｉＰＳ細胞の作製）
いずれもｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターである、二重制御型Ｃａｓ９発現ベクター及びｓｇＲＮＡ発現ベクターを、ｉＰＳ細胞に導入し、終濃度１〜１５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｃａｔ．Ｎｏ．２９４５５−５４、ナカライテスク）又は終濃度１００〜２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１０６８７−０１０、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いた約５日間の薬剤選択により、染色体安定導入細胞集団を得た。ｓｇＲＮＡ発現ベクターとしては、実験例１で使用したものと同様の、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５番に存在する塩基配列を標的配列とするものを使用した。ｉＰＳ細胞としては１３８３Ｄ２株を使用し、定法にしたがって培養した。【０１１８】
続いて、得られたｉＰＳ細胞集団の培地に、Ｄｏｘを２μＭの終濃度で添加し、逆転写定量ＰＣＲにより、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡの発現量の経時変化を検討した。Ｃａｓ９のｃＤＮＡのＰＣＲには、配列番号７３のセンスプライマー及び配列番号７４のアンチセンスプライマーを使用した。【０１１９】
図５は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡの発現量の測定結果を示すグラフである。図５中、「Ｐｕｒｏ」はピューロマイシンを表す。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡの発現量は、ＡＣＴＢ  ｍＲＮＡの発現量を基準とした相対値として表す。【０１２０】
その結果、ピューロマイシン５μｇ／ｍＬ又は１５μｇ／ｍＬで薬剤選択した細胞集団のいずれにおいても、Ｄｏｘを添加することによりＣａｓ９  ｍＲＮＡの転写が誘導され、誘導後少なくとも７２時間はｍＲＮＡの発現が継続することが明らかとなった。【０１２１】
［実験例６］
（ゲノム編集におけるＤｏｘ及びＤｅｘの至適濃度の検討）
二重制御型Ｃａｓ９発現ベクター及びｓｇＲＮＡ発現ベクターを導入したｉＰＳ細胞でゲノム編集を行う場合のＤｏｘ及びＤｅｘの至適濃度を検討した。実験例５で作製したｉＰＳ細胞の培地にＤｏｘ及びＤｅｘを種々の濃度で添加し、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５番に存在する標的位置における遺伝子変異導入活性についてＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）アッセイにより測定した。【０１２２】
《Ｔ７ＥＩアッセイ》
Ｔ７ＥＩアッセイは次のようにして行った。まず、ＣＲＩＳＰＲ−ｓｇＲＮＡの標的ゲノム部位をＰＣＲ反応により増幅した。本実験例においては、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５番に存在する標的位置を含む領域を増幅する、センスプライマー（配列番号１４）及びアンチセンスプライマー（配列番号１５）を使用した。【０１２３】
続いて、得られたＰＣＲ産物を精製した。続いて、精製後のＰＣＲ産物（４００ｎｇ）に１／１０容量の１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２（ＮＥＢ社）バッファーを添加し、９５℃で５分間加熱して二本鎖ＤＮＡを熱変性した後、徐々に温度を下げることにより再アニーリングした。より具体的には、９５℃から８５℃まで−２℃／秒で冷却し、８５℃から２５℃まで−０．１℃／秒で冷却した。【０１２４】
続いて、再アニール後のＰＣＲ産物に１０単位のＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０３０２Ｓ、ＮＥＢ社）を添加し、３７℃で１５分間処理した。続いて、反応液量の１／１０容量の０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液を添加することによりＴ７ＥＩの活性を停止させ、その後サンプルは低温（氷上）を維持した。【０１２５】
続いて、Ｔ７ＥＩ処理したＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動し、切断バンドと未切断バンドのＤＮＡシグナル強度をＩｍａｇｅＪソフトウェアで定量するか、又は全自動電気泳動システム（「ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ  ２２００」、アジレントテクノロジーズ社）を用いてＤＮＡ断片のサイズとバンド強度を解析した。【０１２６】
図６は、培地に添加したＤｏｘ及びＤｅｘの濃度と、Ｔ７ＥＩアッセイによるゲノム編集効率（Ｉｎｄｅｌ、挿入変異又は欠失変異）の測定結果を示す図である。その結果、Ｄｏｘ及びＤｅｘの双方の濃度依存的にゲノム編集効率（ＤＮＡ切断活性）が上昇することが明らかとなった。【０１２７】
［実験例７］
（ゲノム編集の経時変化の検討）
続いて、実験例６と同様にして、ゲノム編集の経時変化を検討した。具体的には、実験例５で作製したｉＰＳ細胞の培地に、Ｄｏｘ及びＤｅｘを、それぞれ終濃度２μＭ及び１μＭで添加し、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５番に存在する標的位置における遺伝子変異導入活性についてＴ７ＥＩアッセイにより測定した。【０１２８】
図７は、Ｄｏｘ及びＤｅｘを添加後のゲノム編集効率（Ｉｎｄｅｌ）の経時変化を測定した結果を示すグラフである。その結果、ゲノム編集はＤｏｘ及びＤｅｘをそれぞれ終濃度２μＭ及び１μＭで添加後、６時間後に検出され始め、２４時間後にプラトーに達したことが明らかとなった。【０１２９】
［実験例８］
（オフターゲットについての検討）
上述した実験例の結果から、二重制御型Ｃａｓ９発現ｉＰＳ細胞において、高効率でオンターゲット切断活性が確認された。そこで、二重制御型Ｃａｓ９発現ｉＰＳ細胞におけるオフターゲットについての影響を検討した。【０１３０】
ヒトのジストロフィン遺伝子のエクソン４５番における標的配列に対し、３つのミスマッチまでを持つ全ての潜在的オフターゲットについて、実験例６と同様にして、Ｔ７ＥＩアッセイにより挿入変異又は欠失変異を測定した。【０１３１】
下記表１に、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５番における標的配列（オンターゲット）及び検討したオフターゲット（ＯＴ１〜ＯＴ５）の位置、塩基配列、配列番号及びオンターゲットに対するミスマッチの数を示す。表１中、塩基配列の小文字は、オンターゲットと異なる塩基配列を表す。【０１３２】
【表１】
2019017321.tif 000002
【０１３３】
また、下記表２に、オンターゲット及び各オフターゲットについてのＴ７ＥＩアッセイで、ＰＣＲ反応に用いたセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの配列番号を示す。【０１３４】
【表２】
2019017321.tif 000003
【０１３５】
具体的には、実験例５で作製したｉＰＳ細胞の培地に、Ｄｏｘ及びＤｅｘを、それぞれ終濃度２μＭ及び１μＭで添加した。続いて、２４時間後又は４８時間後に、表１に示すオンターゲット及び各オフターゲットについて、それぞれＴ７ＥＩアッセイにより遺伝子変異導入を検討した。Ｔ７ＥＩアッセイは、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、表２に示すプライマーを用いた点以外は実験例６と同様にして行った。【０１３６】
図８は、Ｔ７ＥＩアッセイの結果を示す写真である。図８中、「ＤＭＤ  ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ」はジストロフィン遺伝子のエクソン４５番におけるオンターゲットの結果であることを表し、「ＯＴ１」〜「ＯＴ５」は、それぞれ、各オフターゲットの結果であることを表す。また、ＯＴ１における「Ａｌｕ  ｐｏｌｙＡ  ａｒｔｉｆａｃｔ」はアーティファクトであることを表す。【０１３７】
その結果、オフターゲットには遺伝子変異導入は全く見られなかったことが明らかとなった。この結果から、二重制御型Ｃａｓ９発現ｉＰＳ細胞における、Ｄｏｘ及びＤｅｘによるゲノム編集の誘導において、少なくとも４８時間以内の誘導であれば、高い配列認識特異性が維持されることが明らかとなった。【０１３８】
［実験例９］
（ＨＲ経路による塩基置換効率の検討１）
ＮＨＥＪ経路におけるＤＮＡ修復因子である、ＫＵ８０、ＫＵ７０、ＬＩＧ４の発現を、ｓｉＲＮＡを用いてノックダウンすることにより、ＨＲ経路による塩基置換効率（遺伝子変異導入効率）が上昇するか否かについて検討した。【０１３９】
《ノックダウン効率の確認》
まず、ヒト胎児由来腎臓細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＫＵ８０、ＫＵ７０、ＬＩＧ４に対するｓｉＲＮＡを導入した。ｓｉＲＮＡには市販のものを用いた。ＫＵ８０に対するｓｉＲＮＡとして、カタログ番号「ｓ１４９５３」（配列番号８、アプライドバイオシステムズ社）及びカタログ番号「ｓ１４９５２」（配列番号９、アプライドバイオシステムズ社）を使用した。また、ＫＵ７０に対するｓｉＲＮＡとして、カタログ番号「ｓ５２５９４」（配列番号１０、アプライドバイオシステムズ社）及びカタログ番号「ｓ５４１５５」（配列番号１１、アプライドバイオシステムズ社）を使用した。また、ＬＩＧ４に対するｓｉＲＮＡとして、カタログ番号「ｓ８１８１」（配列番号１２、アプライドバイオシステムズ社）及びカタログ番号「ｓ８１７９」（配列番号１３、アプライドバイオシステムズ社）を使用した。【０１４０】
《逆転写定量ＰＣＲ》
続いて、逆転写定量ＰＣＲにより、ＫＵ８０、ＫＵ７０、ＬＩＧ４のｍＲＮＡの発現量を測定した。【０１４１】
ＫＵ８０のｃＤＮＡのＰＣＲには、ｓｉＲＮＡとして、カタログ番号「ｓ１４９５３」のものを用いた場合には配列番号５７のセンスプライマー及び配列番号５８のアンチセンスプライマーを使用した。また、ｓｉＲＮＡとして、カタログ番号「ｓ１４９５２」のものを用いた場合には配列番号５９のセンスプライマー及び配列番号６０のアンチセンスプライマーを使用した。【０１４２】
ＫＵ７０のｃＤＮＡのＰＣＲには、ｓｉＲＮＡとして、カタログ番号「ｓ５２５９４」のものを用いた場合には配列番号６１のセンスプライマー及び配列番号６２のアンチセンスプライマーを使用した。また、ｓｉＲＮＡとして、カタログ番号「ｓ５４１５５」のものを用いた場合には配列番号６３のセンスプライマー及び配列番号６４のアンチセンスプライマーを使用した。【０１４３】
ＬＩＧ４のｃＤＮＡのＰＣＲには、ｓｉＲＮＡとして、カタログ番号「ｓ８１８１」のものを用いた場合には配列番号６５のセンスプライマー及び配列番号６６のアンチセンスプライマーを使用した。また、ｓｉＲＮＡとして、カタログ番号「ｓ８１７９」のものを用いた場合には配列番号６７のセンスプライマー及び配列番号６８のアンチセンスプライマーを使用した。【０１４４】
いずれの遺伝子についても、内部標準にＧＡＰＤＨ遺伝子又はＡＣＴＢ遺伝子のｃＤＮＡを増幅するプライマーを用いてサンプルの標準化を行い、比較Ｃｔ法で定量した。ＧＡＰＤＨ遺伝子のＰＣＲには、配列番号６９のセンスプライマー及び配列番号７０のアンチセンスプライマーを使用した。ＡＣＴＢ遺伝子のＰＣＲには、配列番号７１のセンスプライマー及び配列番号７２のアンチセンスプライマーを使用した。【０１４５】
図９は、ＫＵ８０、ＫＵ７０、ＬＩＧ４のｍＲＮＡの発現を逆転写定量ＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。その結果、いずれのｓｉＲＮＡを使用した場合においても、ＫＵ８０、ＫＵ７０又はＬＩＧ４をノックダウンできることが確認された。【０１４６】
続いて、ＫＵ８０、ＫＵ７０、ＬＩＧ４に対するｓｉＲＮＡを導入してから４８時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＥＦ１α−Ｃａｓ９−ＮＬＳ発現ベクター、ｓｇＲＮＡ発現ベクター及び一本鎖ＤＮＡドナーを導入し、アレルコピー数定量ＰＣＲによりＨＲ経路による塩基置換効率（相同組換え効率）を測定した。【０１４７】
一本鎖ＤＮＡドナーとしては、配列番号３５に示す塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ（ＤＭＤ−ｓｓＯＤＮ１）を使用した。また、ｓｇＲＮＡ発現ベクターとしては、実験例１で使用したものと同様の、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５番に存在する塩基配列を標的配列とするものを使用した。【０１４８】
《アレルコピー数定量ＰＣＲ》
相同組換え前の野生型のジストロフィン遺伝子の塩基配列を特異的に認識するプライマー（センスプライマー：配列番号４２、アンチセンスプライマー：配列番号４４）、及び相同組換え後の塩基配列を特異的に認識するプライマー（センスプライマー：配列番号４３、アンチセンスプライマー：配列番号４４）を用いた定量ＰＣＲにより、それぞれの塩基配列のＤＮＡコピー数を測定した。ヒトゲノムのアレルコピー数の内部標準として、ＮＡＮＯＧ遺伝子領域を増幅するプライマー（センスプライマー：配列番号４５、アンチセンスプライマー：配列番号４６）又はＡＣＴＢ遺伝子領域を増幅するプライマー（センスプライマー：配列番号４７、アンチセンスプライマー：配列番号４８）を用いてサンプルの標準化を行い、比較Ｃｔ法で定量した。【０１４９】
図１０はアレルコピー数定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。図１０中、「ｎｏ  ｓｉＲＮＡ」はｓｉＲＮＡを導入しなかった細胞の結果であることを表し、「Ｋｕ８０  ＫＤ」はＫｕ８０に対するｓｉＲＮＡを導入した細胞の結果であることを表し、「Ｋｕ７０  ＫＤ」はＫｕ７０に対するｓｉＲＮＡを導入した細胞の結果であることを表し、「ＬＩＧ４  ＫＤ」はＬＩＧ４に対するｓｉＲＮＡを導入した細胞の結果であることを表し、「ｍｉｘ」はＫｕ８０、Ｋｕ７０及びＬＩＧ４に対するｓｉＲＮＡを混合して導入した細胞の結果であることを表し、「＋ｓｓＯＤＮ」は一本鎖ＤＮＡドナーを細胞に導入した結果であることを表し、「Ｎ．Ｄ．」は検出されなかったことを表し、「野生型」は野生型の塩基配列を有するアレルであることを表し、「ＨＲ」は相同組換え後の塩基配列を有するアレルであることを表す。【０１５０】
その結果、ＫＵ８０、ＫＵ７０、ＬＩＧ４をそれぞれ単独でノックダウンした場合においても、ＫＵ８０、ＫＵ７０及びＬＩＧ４を同時にノックダウンした場合においても、相同組換え効率の有意な上昇は観察されないことが明らかとなった。【０１５１】
［実験例１０］
（ＨＲ経路による塩基置換効率の検討２）
続いて、ｓｉＲＮＡを細胞に導入する代わりに、相同組換え効率を上昇させることが報告されている化合物である、Ｌ７５５５０７、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ又はＹＭ１５５を細胞の培地に添加した点以外は実験例９と同様にして、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５番に存在する塩基配列を標的配列とした、相同組換えによる塩基置換効率を検討した。【０１５２】
図１１はアレルコピー数定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。図１１中、「Ｌ７」はＬ７５５５０７を培地に添加した細胞の結果であることを表し、「ＢＡ」はＢｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａを培地に添加した細胞の結果であることを表し、「ＹＭ」はＹＭ１５５を培地に添加した細胞の結果であることを表し、「ｓｓＯＤＮ（＋）」は一本鎖ＤＮＡドナーを細胞に導入した結果であることを表し、「ｓｓＯＤＮ（−）」は一本鎖ＤＮＡドナーを細胞に導入しなかった結果であることを表し、「野生型」は野生型の塩基配列を有するアレルであることを表し、「ＨＲ」は相同組換え後の塩基配列を有するアレルであることを表す。【０１５３】
その結果、Ｌ７５５５０７、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ又はＹＭ１５５を細胞に作用させた場合においても、相同組換え効率の有意な上昇は観察されないことが明らかとなった。【０１５４】
［実験例１１］
（ＨＲ経路による塩基置換効率の検討３）
続いて、実験例５で作製した、二重制御型Ｃａｓ９発現ベクター及びｓｇＲＮＡ発現ベクターを導入したｉＰＳ細胞に、エレクトロポレーションにより一本鎖ＤＮＡドナーを導入し、相同組換え効率を検討した。一本鎖ＤＮＡドナーとしては、配列番号３５に示す塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを使用した。なお、上記のｉＰＳ細胞は、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡが既に染色体に安定に導入されているため、一本鎖ＤＮＡドナーを最大限に導入することが可能である。【０１５５】
ｉＰＳ細胞０．５×１０６個あたり、１．５、３、６及び１２μｇの一本鎖ＤＮＡドナーを導入し、培地中に終濃度２μＭのＤｏｘ及び終濃度１μＭのＤｅｘを添加した。続いて、２４〜４８時間培養後、各細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、実験例９と同様にして、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５番に存在する塩基配列を標的配列とした、相同組換えによる塩基置換効率を検討した。【０１５６】
図１２はアレルコピー数定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。図１２中、「ｓｓＯＤＮ」は一本鎖ＤＮＡドナーを表し、「野生型」は野生型の塩基配列を有するアレルであることを表し、「ＨＲ」は相同組換え後の塩基配列を有するアレルであることを表す。【０１５７】
その結果、一本鎖ＤＮＡドナーの導入量の増加に伴って相同組換え効率が上昇することが明らかとなった。また、最大で相同組換えによる遺伝子変異が導入されたアレルの割合は３０％に達した。この割合は、二重制御型Ｃａｓ９を使用しない系において発明者らが通常観察している相同組換え効率と比較して１０倍以上の高効率であった。【０１５８】
［実験例１２］
（ＨＲ経路による塩基置換効率の検討４）
続いて、実験例５で作製した、二重制御型Ｃａｓ９発現ベクター及びｓｇＲＮＡ発現ベクターを導入したｉＰＳ細胞に、実験例１１で用いたものとは塩基配列が異なる一本鎖ＤＮＡドナーを導入し、相同組換え効率を検討した。一本鎖ＤＮＡドナーとしては、配列番号３６に示す塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ（ＤＭＤ−ｓｓＯＤＮ−ＡｇｅＩ）を使用した。この一本鎖ＤＮＡドナーによる相同組換えが生じた場合、ＡｇｅＩ制限酵素サイトが生成される。【０１５９】
具体的には、ｉＰＳ細胞０．５×１０６個あたり１２μｇの一本鎖ＤＮＡドナーを導入し、培地中に終濃度２μＭのＤｏｘ及び終濃度１μＭのＤｅｘを添加した。続いて、２４〜４８時間培養後、各細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ）アッセイにより、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５番に存在する塩基配列を標的配列とした、相同組換えによる塩基置換効率を検討した。【０１６０】
《ＲＦＬＰアッセイ》
まず、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５番に存在する標的位置を含む領域を増幅する、センスプライマー（配列番号４９）及びアンチセンスプライマー（配列番号５０）を使用したＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ産物を精製した。【０１６１】
続いて、精製ＰＣＲ産物を制限酵素ＡｇｅＩで消化し、２％アガロースゲル電気泳動し、切断バンドと未切断バンドのＤＮＡシグナル強度をＩｍａｇｅＪソフトウェアで定量し、相相同組換えを起こしたアレルを定量した。【０１６２】
図１３（ａ）は、ＲＦＬＰアッセイにおけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。図１３（ａ）中、「ＤＭＤ」はジストロフィン遺伝子を表し、「ｓｓＯＤＮ」は一本鎖ＤＮＡドナーを表し「ＨＲ」は相同組換えを表す。その結果、相同組換えによる遺伝子変異が導入されたアレルの割合は１９．７±１．０％と測定された。【０１６３】
また、ＲＦＬＰアッセイに用いたゲノムＤＮＡを鋳型として、標的位置を含む領域をＰＣＲ増幅してＴＡクローニングし、ＰＣＲ産物の各クローンをサンガーシークエンスで解析した。ＴＡクローニングには、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ３６００、プロメガ社）又はｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１３６０、プロメガ社）を使用した。【０１６４】
図１３（ｂ）は、解析結果をまとめたグラフである。図１３（ｂ）中、「Ｋｎｏｃｋ−ｉｎ」は一本鎖ＤＮＡドナーによる相同組換えを表し、「Ｉｎｄｅｌ」は挿入変異又は欠失変異を表し、「ＷＴ」は野生型の配列を表す。また、図１３（ｃ）は代表的な相同組換えクローンのサンガーシーケンスデータを示す図である。その結果、４７．２％のクローン（３４／７２）では何らかの挿入欠損変異が観察された。また、１３．９％のクローン（１０／７２）で一本鎖ＤＮＡドナーによる相同組換えが観察された。【０１６５】
［実験例１３］
（Ｄｏｘ及びＤｅｘの添加のタイミングがＨＲ経路による塩基置換効率に与える影響の検討）
Ｄｏｘ及びＤｅｘの添加のタイミングがＨＲ経路による塩基置換効率に与える影響の検討を検討した。具体的には、実験例５で作製した、二重制御型Ｃａｓ９発現ベクター及びｓｇＲＮＡ発現ベクターを導入したｉＰＳ細胞に、実験例１２で用いたものと同じ一本鎖ＤＮＡドナーを導入した。【０１６６】
また、様々なタイミングで培地にＤｏｘ及びＤｅｘを添加し、実験例１２と同様にして、ＲＦＬＰアッセイにより、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５番に存在する塩基配列を標的配列とした、相相同組換えによる塩基置換効率を検討した。Ｄｏｘ及びＤｅｘの終濃度は、それぞれ２μＭ及び１μＭとした。【０１６７】
図１４（ａ）はＤｏｘ及びＤｅｘの添加のタイミングを示す図である。図１４（ａ）中、「ｓｓＯＤＮ」は一本鎖ＤＮＡドナーを表す。図１４（ａ）に示すように、エレクトロポレーションによる一本鎖ＤＮＡドナーの導入の２４時間前（−２４）、１２時間前（−１２）、６時間前（−６）、２時間前（−２）、一本鎖ＤＮＡドナーの導入時（０）、６時間後（６）、１２時間後（１２）、２４時間後（２４）にＤｏｘ及びＤｅｘを添加した。【０１６８】
図１４（ｂ）は、ＲＦＬＰアッセイにおけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。図１４（ｂ）中、「ＫＩ」はノックインを意味し、相同組換えによる遺伝子変異が導入されたアレルの割合を表す。その結果、一本鎖ＤＮＡドナーを細胞に導入する１２時間前から１２時間後の間にＤｏｘ及びＤｅｘの添加を開始すると、相同組換え効率が上昇することが明らかとなった。【０１６９】
［実験例１４］
（ＩＬＦ３（ＮＦ１１０）遺伝子座におけるゲノム編集効率の検討１）
上記実験例でゲノム編集の標的配列としたジストロフィン遺伝子はＸ染色体上に存在する遺伝子であった。そこで、上記実験例とは異なる位置でのゲノム編集効率を検討した。具体的には、１９番染色体上にあるＩＬＦ３（ＮＦ１１０）遺伝子中の塩基配列を標的配列としてゲノム編集効率を検討した。【０１７０】
まず、配列番号５に記載の塩基配列を有するオリゴＤＮＡ及び配列番号７に記載の塩基配列を有するオリゴＤＮＡを混合してＰＣＲ反応を行い、得られた増幅断片をトランスポゾンベクターに組み込み、ヒトのＩＬＦ３（ＮＦ１１０）遺伝子中に存在する塩基配列（配列番号２）を標的配列とするｓｇＲＮＡ発現ベクターを作製した。【０１７１】
続いて、実験例５と同様にして、二重制御型Ｃａｓ９発現ベクター及びｓｇＲＮＡ発現ベクターをｉＰＳ細胞に導入し、薬剤選択により、染色体安定導入細胞集団を得た。【０１７２】
続いて、細胞の培地にＤｏｘ及びＤｅｘを、それぞれ終濃度２μＭ及び１μＭで添加し、ＩＬＦ３（ＮＦ１１０）遺伝子中に存在する標的位置における遺伝子変異導入活性について実験例６と同様のＴ７ＥＩアッセイにより測定した。【０１７３】
本実験例においては、ＩＬＦ３（ＮＦ１１０）遺伝子中に存在する標的位置を含む領域を増幅する、センスプライマー（配列番号１６）及びアンチセンスプライマー（配列番号１７）を使用した。【０１７４】
図１５は、Ｔ７ＥＩアッセイの結果を示す写真である。図１５中、「Ｉｎｄｅｌ」は挿入変異又は欠失変異を表す。その結果、ＩＬＦ３（ＮＦ１１０）遺伝子においても、Ｄｏｘ及びＤｅｘの添加により、３５．０±０．９％の高効率で遺伝子変異を導入することができることが明らかとなった。【０１７５】
［実験例１５］
（ＩＬＦ３（ＮＦ１１０）遺伝子座におけるゲノム編集効率の検討２）
実験例１４で作製した、二重制御型Ｃａｓ９発現ベクター及びｓｇＲＮＡ発現ベクターを導入したｉＰＳ細胞に、一本鎖ＤＮＡドナーを導入し、相同組換え効率を検討した。一本鎖ＤＮＡドナーとしては、配列番号３７に示す塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ（ＮＦ１１０−ｓｓＯＤＮ）を使用した。この一本鎖ＤＮＡドナーによる相同組換えが生じた場合、ＰｓｔＩ制限酵素サイトが生成される。【０１７６】
具体的には、ｉＰＳ細胞０．５×１０６個あたり１２μｇの一本鎖ＤＮＡドナーを導入し、培地中に終濃度２μＭのＤｏｘ及び終濃度１μＭのＤｅｘを添加した。続いて、２４〜４８時間培養後、各細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ＲＦＬＰアッセイにより、ＩＬＦ３（ＮＦ１１０）遺伝子中に存在する塩基配列を標的配列とした、相相同組換えによる塩基置換効率を検討した。【０１７７】
ＲＦＬＰアッセイにおいて、ＩＬＦ３（ＮＦ１１０）遺伝子中の標的位置を含む領域の増幅は、センスプライマー（配列番号５１）及びアンチセンスプライマー（配列番号５２）を使用したＰＣＲ反応により行った。【０１７８】
図１６は、ＲＦＬＰアッセイにおけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。図１６中、「ｓｓＯＤＮ」は一本鎖ＤＮＡドナーを表し、「ＨＲ」は相同組換えを表す。その結果、相同組換えによる遺伝子変異が導入されたアレルの割合は１４．０±１．０％と測定された。【０１７９】
［実験例１６］
（ＨＬＡ−Ａ遺伝子座におけるゲノム編集効率の検討）
続いて、６番染色体上のＨＬＡ−Ａ遺伝子中の塩基配列を標的配列としてゲノム編集効率を検討した。【０１８０】
まず、配列番号６に記載の塩基配列を有するオリゴＤＮＡ及び配列番号７に記載の塩基配列を有するオリゴＤＮＡを混合してＰＣＲ反応を行い、得られた増幅断片をトランスポゾンベクターに組み込み、ヒトのＨＬＡ−Ａ遺伝子中に存在する塩基配列（配列番号３）を標的配列とするｓｇＲＮＡ発現ベクターを作製した。【０１８１】
続いて、実験例５と同様にして、二重制御型Ｃａｓ９発現ベクター及びｓｇＲＮＡ発現ベクターをｉＰＳ細胞に導入し、薬剤選択により、染色体安定導入細胞集団を得た。【０１８２】
続いて、得られたｉＰＳ細胞に、一本鎖ＤＮＡドナーを導入し、相同組換え効率を検討した。一本鎖ＤＮＡドナーとしては、配列番号３８に示す塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ（ＨＬＡ−ｓｓＯＤＮ１）、及び配列番号３９に示す塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ（ＨＬＡ−ｓｓＯＤＮ２）を使用した。【０１８３】
これらの一本鎖ＤＮＡドナーによる相同組換えが生じた場合、いずれもＡｖｒＩＩ制限酵素サイトが生成される。また、これらの一本鎖ＤＮＡドナーのうち、ＨＬＡ−ｓｓＯＤＮ２は、ＰＡＭ配列に点変異（一塩基変異）を有し、相同組換え後に同じｇＲＮＡによって再切断が起こらないようにデザインした。【０１８４】
続いて、ｉＰＳ細胞０．５×１０６個あたり３μｇの一本鎖ＤＮＡドナーをそれぞれ導入し、培地中に終濃度２μＭのＤｏｘ及び終濃度１μＭのＤｅｘを添加した。続いて、２４〜４８時間培養後、各細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ＲＦＬＰアッセイにより、ＨＬＡ−Ａ遺伝子中に存在する塩基配列を標的配列とした、相相同組換えによる塩基置換効率を検討した。【０１８５】
ＲＦＬＰアッセイにおいて、ＨＬＡ−Ａ遺伝子中の標的位置を含む領域のＰＣＲ増幅は、特異性を高めるためにＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲにより行った。Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲでは、まず、センスプライマー（配列番号５３）及びアンチセンスプライマー（配列番号５４）を使用したＰＣＲ反応を行い、続いて、得られたＰＣＲ産物を鋳型としてセンスプライマー（配列番号５５）及びアンチセンスプライマー（配列番号５６）を使用したＰＣＲ反応を行った。【０１８６】
図１７は、ＲＦＬＰアッセイにおけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。図１７中、「ｓｓＯＤＮ１」及び「ｓｓＯＤＮ２」は、それぞれ上述した一本鎖ＤＮＡドナーを表し、「ＨＲ」は相同組換えを表す。その結果、相同組換えによる遺伝子変異が導入されたアレルの割合は、３９．８±２．６％及び３１．３±２．２％であり、高効率で相同組換えによる遺伝子変異が導入されたことが明らかとなった。【０１８７】
続いて、一本鎖ＤＮＡドナーとしてＨＬＡ−ｓｓＯＤＮ１を導入したサンプルのＰＣＲ産物をＴＡクローニングし、各クローンをサンガーシーケンスで確認した。その結果、１０／１８クローンで挿入欠損変異が観察されたが、７／１８株で望み通りの相同組換え（Ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）が観察された。【０１８８】
［実験例１７］
（ランダム変異の導入１）
上述した実施例の結果から、二重制御型Ｃａｓ９発現ベクター及びｓｇＲＮＡ発現ベクターを導入したｉＰＳ細胞に、一本鎖ＤＮＡドナーを導入してゲノム編集を行うことにより、遺伝子変異導入後の細胞の薬剤選択や選別を行わなくても、高効率で相同組換えによる遺伝子変異導入株が得られることが明らかとなった。そこで、発明者らは、この技術を応用すれば、ゲノム配列のある特定箇所において、ランダム変異を導入可能であると考え、検討した。【０１８９】
まず、ＣＲＩＳＰＲ−ｓｇＲＮＡのジストロフィン遺伝子切断箇所の近傍にランダムな塩基を２箇所導入した一本鎖ＤＮＡドナー（ＤＭＤ−ｓｓＯＤＮ−ＮＮ１、配列番号４０）を作製した。【０１９０】
続いて、この一本鎖ＤＮＡドナーを、実験例５で作製したｉＰＳ細胞０．５×１０６個あたり１２μｇ導入した。続いて、細胞の培地にＤｏｘ及びＤｅｘを、それぞれ終濃度２μＭ及び１μＭで添加し、相同組換えを誘導した。続いて、２４〜４８時間培養後、各細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、標的位置を含む領域をＰＣＲ増幅してＴＡクローニングし、ＰＣＲ産物の各クローンをサンガーシークエンスで解析した。【０１９１】
図１８（ａ）は、解析結果をまとめたグラフである。図１８（ａ）中、「ＤＭＤ  ｌｏｃｕｓ」はジストロフィン遺伝子座を表し、「Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ」はランダム変異を表し、「Ｉｎｄｅｌ」は挿入変異又は欠失変異を表し、「ＷＴ」は野生型の塩基配列を表す。【０１９２】
その結果、１５．９％のクローン（２４／１５１）で何らかの挿入欠損が見られたものの、３５．１％のクローン（５３／１５１）で、ランダムな塩基置換が起こり、他の挿入欠損は存在しないことが確認された。【０１９３】
図１８（ｂ）は、‘ＮＮＣ’（ここで、Ｎは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）又はシトシン（Ｃ）を表す。）の塩基配列からなるコドンがコードするアミノ酸を示す図である。図１８（ｂ）に示すように、‘ＮＮＣ’の塩基配列からなるコドンの最初の二塩基にランダム変異を導入した結果、アミノ酸をコードするコドン配列を４２＝１６通りに変化させることが可能である。【０１９４】
図１８（ｃ）は、ランダム変異が導入されたクローンの塩基配列及び当該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を示す図である。文字の大きさが塩基又はアミノ酸の存在割合に対応する。その結果、ランダム変異の導入により、可能性のある全ての変異が導入されたことが明らかとなった。【０１９５】
［実験例１８］
（ランダム変異の導入２）
実験例１７と同様の実験をＨＬＡ−Ａ遺伝子に対して行った。まず、ＣＲＩＳＰＲ−ｓｇＲＮＡのＨＬＡ−Ａ遺伝子切断箇所の近傍にランダムな塩基を２箇所導入した一本鎖ＤＮＡドナー（ＨＬＡ−ｓｓＯＤＮ−ＮＮ、配列番号４１）を作製した。【０１９６】
続いて、この一本鎖ＤＮＡドナーを、実験例１６で作製したｉＰＳ細胞０．５×１０６個あたり６μｇ導入した。続いて、細胞の培地にＤｏｘ及びＤｅｘを、それぞれ終濃度２μＭ及び１μＭで添加し、相同組換えを誘導した。続いて、２４〜４８時間培養後、各細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、標的位置を含む領域をＰＣＲ増幅してＴＡクローニングし、ＰＣＲ産物の各クローンをサンガーシークエンスで解析した。【０１９７】
ＨＬＡ−Ａ遺伝子中の標的位置を含む領域のＰＣＲ増幅は、まず、センスプライマー（配列番号５３）及びアンチセンスプライマー（配列番号５４）を使用したＰＣＲ反応を行い、続いて、得られたＰＣＲ産物を鋳型としてセンスプライマー（配列番号５５）及びアンチセンスプライマー（配列番号５６）を使用したＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲにより行った。【０１９８】
図１９（ａ）は、解析結果をまとめたグラフである。図１９（ａ）中、「ＨＬＡ−Ａ  ｌｏｃｕｓ」はＨＬＡ−Ａ遺伝子座を表し、「Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ」はランダム変異を表し、「Ｉｎｄｅｌ」は挿入変異又は欠失変異を表し、「ＷＴ」は野生型の塩基配列を表す。【０１９９】
その結果、１５．８％のクローン（２４／１５２）で何らかの挿入欠損が見られたものの、４０．１％のクローン（６１／１５２）で、ランダムな塩基置換が起こり、他の挿入欠損は存在しないことが確認された。【０２００】
図１９（ｂ）は、‘ＮＮＣ’（ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣを表す。）の塩基配列からなるコドンがコードするアミノ酸を示す図である。図１９（ｂ）に示すように、‘ＮＮＣ’の塩基配列からなるコドンの最初の二塩基にランダム変異を導入した結果、アミノ酸をコードするコドン配列を４２＝１６通りに変化させることが可能である。【０２０１】
図１９（ｃ）は、ランダム変異が導入されたクローンの塩基配列及び当該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を示す図である。文字の大きさが塩基又はアミノ酸の存在割合に対応する。その結果、ランダム変異の導入により、可能性のある全ての変異が導入されたことが明らかとなった。【０２０２】
［実験例１９］
（ランダム変異の導入３）
実験例１７と同様の実験を、さらに多くの‘ＮＮ’配列を持つ一本鎖ＤＮＡドナーを用いて行った。まず、ＣＲＩＳＰＲ−ｓｇＲＮＡのジストロフィン遺伝子切断箇所の近傍の２箇所、４箇所、６箇所又は８箇所にランダムな塩基を導入した一本鎖ＤＮＡドナー（ＤＭＤ−ｓｓＯＤＮ−ＮＮ１〜５、配列番号４０、７７〜８０）を作製した。【０２０３】
続いて、これらの一本鎖ＤＮＡドナーを、それぞれ、実験例１６で作製したｉＰＳ細胞０．５×１０６個あたり６μｇずつ導入した。続いて、細胞の培地にＤｏｘ及びＤｅｘを、それぞれ終濃度２μＭ及び１μＭで添加し、相同組換えを誘導した。【０２０４】
続いて、４８〜７２時間培養後、各細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、標的位置を含む領域をＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物の各ＤＮＡ分子の塩基配列をＩｌｌｕｍｉｎａ社のＨｉＳｅｑシーケンサーを用いて解析した。【０２０５】
図２０は、解析結果をまとめたグラフである。図２０中、「Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ」はランダム変異を表し、「Ｉｎｄｅｌ」は挿入変異又は欠失変異を表し、「ＷＴ」は野生型の塩基配列を表す。その結果、一本鎖ＤＮＡドナーを導入した細胞において、５．３％から１３．２５％の配列でランダムな塩基置換が起こり、他の挿入欠損は存在しないことが確認された。【０２０６】
また、図２１は、ランダム変異が導入されたクローンの塩基配列及び当該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を示す図である。文字の大きさが塩基又はアミノ酸の存在割合に対応する。その結果、ランダム塩基配列を持つ一本鎖ＤＮＡドナーの導入により、塩基配列の２、４、６又は８箇所にランダム変異が導入され、その結果、アミノ酸配列の１、２、３又は４箇所にランダム変異が導入されたことが明らかとなった。【０２０７】
［実験例２０］
（ランダム変異の導入４）
実験例１７と同様の実験を、ヒト胎児腎臓由来細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して行った。まず、いずれもｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターである、二重制御型Ｃａｓ９発現ベクター及びｓｇＲＮＡ発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は定法にしたがって培養した。ｓｇＲＮＡ発現ベクターとしては、実験例１で使用したものと同様の、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５番に存在する塩基配列を標的配列とするものを使用した。【０２０８】
続いて、終濃度１〜１５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｃａｔ．Ｎｏ．２９４５５−５４、ナカライテスク）又は終濃度１００〜２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１０６８７−０１０、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いた約５日間の薬剤選択により、染色体安定導入細胞集団を得た。【０２０９】
続いて、ＣＲＩＳＰＲ−ｓｇＲＮＡのＤＭＤ遺伝子切断箇所の近傍にランダムな塩基を２箇所導入した一本鎖ＤＮＡドナー（ＤＭＤ−ｓｓＯＤＮ−ＮＮ１、配列番号４０）を、上記で作製したＨＥＫ２９３Ｔ細胞０．５×１０６個あたり１２μｇ導入した。【０２１０】
続いて、細胞の培地にＤｏｘ及びＤｅｘを、それぞれ終濃度２μＭ及び１μＭで添加し、相同組換えを誘導した。続いて、３〜６日間培養後、各細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、標的位置を含む領域をＰＣＲ増幅してＴＡクローニングし、ＰＣＲ産物の各クローンをサンガーシークエンスで解析した。【０２１１】
図２２（ａ）は、解析結果をまとめたグラフである。図２２（ａ）中、「Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ」はランダム変異を表し、「Ｉｎｄｅｌ」は挿入変異又は欠失変異を表し、「ＷＴ」は野生型の塩基配列を表す。その結果、４２．４％のクローン（２８／６６）で何らかの挿入欠損が見られたものの、４７．０％のクローン（３１／６６）で、ランダムな塩基置換が起こり、他の挿入欠損は存在しないことが確認された。【０２１２】
図２２（ｂ）は、‘ＮＮＣ’（ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣを表す。）の塩基配列からなるコドンがコードするアミノ酸を示す図である。図２２（ｂ）に示すように、‘ＮＮＣ’の塩基配列からなるコドンの最初の二塩基にランダム変異を導入した結果、アミノ酸をコードするコドン配列を４２＝１６通りに変化させることが可能である。【０２１３】
図２２（ｃ）は、ランダム変異が導入されたクローンの塩基配列及び当該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を示す図である。文字の大きさが塩基又はアミノ酸の存在割合に対応する。その結果、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた場合においても、ランダム塩基配列を持つ一本鎖ＤＮＡドナーの導入により、アミノ酸配列にランダム変異を導入できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０２１４】
本発明によれば、標的配列に対する配列特異的ＤＮＡ切断酵素の特異性を向上させる技術を提供することができる。
また、本発明によれば、標的配列に任意の配列を欠損、挿入、又は置換する技術を提供することができる。ここでいう任意の配列とは、自然界に存在する配列でもよいし、自然界に存在しない配列でもよい。
また、本発明によれば、疾患の原因と想定される遺伝子配列を導入することにより、又は疾患の原因と想定される遺伝子配列を修復して健常配列に変換することにより、疾患の原因を解明する技術を提供することができる。ここで、対象疾患としては、例えば、前述のＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＨＧＭＤ）に登録されている遺伝子変異及び疾患が挙げられるが、これに限定されない。
また、本発明によれば、複数の細胞に別々の任意の配列を挿入、又は置換する技術を提供することができる。そして、複数の細胞が別々の配列を持つことを利用して、細胞を個別に区別する技術を提供することができる。例えば、細胞で発現している遺伝子に、細胞を区別する配列を挿入又は置換した後に、シングルセルＲＮＡ−ｓｅｑ解析を行うことにより、シングルセルＲＮＡ−ｓｅｑのデータがどの細胞から由来するものかをシーケンスデータから遡って解析することができる。
また、本発明によれば、疾患の原因とされる遺伝子配列を修復して健常配列に変換することにより、疾患を治療する技術を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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