(57)【要約】脳梗塞部位の血管障害を回復して脳機能を改善させる脳梗塞治療材を提供する。本発明に係る脳梗塞治療材は、ＣＤ１０５陽性細胞、ＳＰ細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞及びＣＤ１５０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含む歯髄幹細胞を含有する。歯髄幹細胞の分泌蛋白質を含有することも可能である。移植された歯髄幹細胞は、神経前駆細胞又は神経細胞に直接分化せず、間接的に分化促進に関与して、脳梗塞部位を解消させて正常部位に治癒させる。
2010021412.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１０５陽性細胞、ＳＰ細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞及びＣＤ１５０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含む歯髄幹細胞並びに前記歯髄幹細胞の分泌蛋白質のうち少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする脳梗塞治療材。
【請求項２】
前記ＳＰ細胞が、ＣＤ３１陰性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１３３陽性、ＣＤ２７１陽性又はＣＤ１５０陽性の何れかであることを特徴とする請求項１記載の脳梗塞治療材。
【請求項３】
前記歯髄幹細胞が、脳梗塞周囲部で、細胞遊走因子、細胞増殖因子、血管新生因子及び神経栄養因子のうち少なくとも何れか一つを含む因子を発現することを特徴とする請求項１記載の脳梗塞治療材。
【請求項４】
前記細胞遊走因子が、ＳＤＦ１、ＧＣＳＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ及びＧＭＣＳＦのうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項３記載の脳梗塞治療材。
【請求項５】
前記神経栄養因子が、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＬＩＦ、ＭＹＣ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｅ３、ＴＰ５３及びＢＡＸのうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項３記載の脳梗塞治療材。
【請求項６】
前記細胞増殖因子が、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦの少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項３記載の脳梗塞治療材。
【請求項７】
前記血管新生因子が、ＰＧＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、ＡＮＰＥＰ、ＮＲＰ１、ＴＧＦβ、ＥＣＧＦ１、ＩＤ１及びＣＳＦ３のうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項３記載の脳梗塞治療材。
【請求項８】
前記歯髄幹細胞の濃度が、１×１０５セル／μｌ以上１×１０７セル／μｌ以下であることを特徴とする請求項１記載の脳梗塞治療材。
【請求項９】
前記歯髄幹細胞は、永久歯又は乳歯由来の歯髄幹細胞であることを特徴とする請求項１記載の脳梗塞治療材。
【請求項１０】
脳梗塞後、脳線条体に、ＣＤ１０５陽性細胞、ＳＰ細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞及びＣＤ１５０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含む歯髄幹細胞並びに前記歯髄幹細胞の分泌蛋白質のうち少なくとも何れか一つを注入することで、脳中枢神経組織を再生し、脳機能を回復させることを特徴とする脳組織再生方法。
【請求項１１】
前記ＳＰ細胞が、ＣＤ３１陰性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１３３陽性、ＣＤ２７１陽性又はＣＤ１５０陽性の何れかであることを特徴とする請求項１０記載の脳組織再生方法。
【請求項１２】
前記歯髄幹細胞が、脳梗塞周囲部で、細胞遊走因子、細胞増殖因子、血管新生因子及び神経栄養因子のうち少なくとも何れか一つを含む因子を発現していることを特徴とする請求項１０記載の脳組織再生方法。
【請求項１３】
前記歯髄幹細胞の濃度が、１×１０５セル／μｌ以上１×１０７セル／μｌ以下であることを特徴とする請求項１０記載の脳組織再生方法。
【請求項１４】
前記歯髄幹細胞は、永久歯又は乳歯由来の歯髄幹細胞であることを特徴とする請求項１０記載の脳組織再生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳梗塞治療材、及び、その脳梗塞治療材を使用する脳組織再生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳血管障害は我が国の死亡原因の第２位を占め、死亡しなくても寝たきりになる最も大きな原因となる。そのため、高齢化社会において、脳血管障害に対する適切な治療法の開発は急務である。
脳血管障害の中で脳梗塞・脳血栓等の虚血性脳血管障害は最も頻度が高く、脳梗塞で死亡する率は心筋梗塞と虚血性心疾患との合計より多い。
現在のところ、麻痺した原因が脳梗塞であれば最新治療が有効なのは発症後３時間以内といわれる。
そして、ｒｔＰａ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）点滴静注治療は、再開通効果を期待でき、障害が発生した脳機能のうち約３０％まで機能回復する。
しかしながら、ｒｔＰａ点滴静注治療は、脳内出血の副作用のため約２％しか使えないという欠点がある。
また、カテーテルを用いた血栓溶解療法は厚生省に認可されたが、保険で通ったこれに用いる薬はないのが現状である。
成体脳では新生ニューロンを産生する場所が、側脳室下帯と海馬歯状回の顆粒細胞層とに存在すると言われている。
また、脳梗塞後に生じる新しいニューロンは側脳室下帯由来であり、線条体の実質へ遊走し、鎖状細胞凝集体を形成し、線条体の神経に分化しシナプスを形成する。
また、血管は神経前駆細胞の分化制御に関わり、誘導される線条体の神経再生は血管に影響されると言われている。
脳梗塞に対して再生医療による治療法開発が進められ、ラット又はマウス脳梗塞モデルを用いた前臨床実験が行われている。
移植細胞としては骨髄、末梢血、脂肪又は臍帯血等に由来する幹細胞が使われている。また、胎生神経幹細胞又はＥＳ細胞等が使われている。これらの細胞は、脳内又は静脈内に注入している。
その結果、神経に直接分化して、脳梗塞部を減少させ、脳機能が回復されることもあるし、また梗塞周辺部の血管新生を促進することもある。
例えば、特許文献１には、脳梗塞により生じた神経損傷部位の治療等に重要な神経幹細胞を、インビトロ又はインビボで効率良く増殖誘導する方法が記載されている。
また、例えば、特許文献２には、間葉系幹細胞とＩＧＦ−１とを組み合わせてなる脳梗塞部位の医療薬が記載されている。
しかしながら、これらの技術では効率的な脳梗塞部位の機能回復は困難であり、脳梗塞部位の血管障害を回復して脳機能を改善させる実効的な手法が求められる。
【特許文献１】特開２００７−１３００２６号公報
【特許文献２】特開２００７−０１４７８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、このような課題に鑑みなされたものであり、実効的に、脳梗塞部位の血管障害を回復して脳機能を改善させる脳梗塞治療材、及び、そのような脳梗塞治療材を用いる脳組織再生方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記目的を達成するため、この発明の第１の観点に係る脳梗塞治療材は、ＣＤ１０５陽性細胞、ＳＰ細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞及びＣＤ１５０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含む歯髄幹細胞並びに前記歯髄幹細胞の分泌蛋白質のうち少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする。
前記ＳＰ細胞が、ＣＤ３１陰性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１３３陽性、ＣＤ２７１陽性又はＣＤ１５０陽性の何れかであることが好ましい。
前記歯髄幹細胞が、脳梗塞周囲部で、細胞遊走因子、細胞増殖因子、血管新生因子及び神経栄養因子のうち少なくとも何れか一つを含む因子を発現することが好ましい。
前記細胞遊走因子が、ＳＤＦ１、ＧＣＳＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ及びＧＭＣＳＦのうち少なくとも何れか一つであることが好ましい。
前記神経栄養因子が、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＬＩＦ、ＭＹＣ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｅ３、ＴＰ５３及びＢＡＸのうち少なくとも何れか一つであることが好ましい。
前記細胞増殖因子が、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦの少なくとも何れか一つであることが好ましい。
前記血管新生因子が、ＰＧＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、ＡＮＰＥＰ、ＮＲＰ１、ＴＧＦβ、ＥＣＧＦ１、ＩＤ１及びＣＳＦ３のうち少なくとも何れか一つであることが好ましい。
前記歯髄幹細胞の濃度が、１×１０５セル／μｌ以上１×１０７セル／μｌ以下であることが好ましい。
前記歯髄幹細胞は、永久歯又は乳歯由来の歯髄幹細胞であることが好ましい。
また、上記目的を達成するため、この発明の第２の観点に係る脳組織再生方法は、脳梗塞後、脳線条体に、ＣＤ１０５陽性細胞、ＳＰ細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞及びＣＤ１５０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含む歯髄幹細胞並びに前記歯髄幹細胞の分泌蛋白質のうち少なくとも何れか一つを注入することで、脳中枢神経組織を再生し、脳機能を回復させることを特徴とする。
前記ＳＰ細胞が、ＣＤ３１陰性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１３３陽性、ＣＤ２７１陽性又はＣＤ１５０陽性の何れかであることが好ましい。
前記歯髄幹細胞が、脳梗塞周囲部で、細胞遊走因子、細胞増殖因子、血管新生因子及び神経栄養因子のうち少なくとも何れか一つを含む因子を発現していることが好ましい。
前記歯髄幹細胞の濃度が、１×１０５セル／μｌ以上１×１０７セル／μｌ以下であることが好ましい。
前記歯髄幹細胞は、永久歯又は乳歯由来の歯髄幹細胞であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００５】
本発明に係る脳梗塞治療材及び脳組織再生方法は、従来にはなかった独創的で新規な脳梗塞治療材及び脳組織再生方法であり、実効的に、脳梗塞部位の血管障害を回復して脳機能を改善させる。これにより脳卒中等の脳障害症状を極めて実効的に改善することができ、高齢化社会における人命救助に大きく貢献し、計り知れない利益が得られる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１Ａは、脳線条体への細胞移植を説明する図である。
図１Ｂは、脳割断面のマクロ像である。
図２Ａは、脳梗塞周辺部の凍結切片をＤＣＸで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図であり、脳梗塞２４時間後にブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植して２１日目のものである。
図２Ｂは、脳梗塞部位の反対側である正常脳の部位の凍結切片をＤＣＸで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図である。
図２Ｃは、脳梗塞周辺部の、細胞を移植していないＰＢＳコントロールをＤＣＸで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図である。
図３Ａは、脳梗塞周辺部の凍結切片をニューロフィラメントで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図であり、脳梗塞２４時間後にブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植して２１日目のものである。
図３Ｂは、脳梗塞部位の反対側である正常脳の部位の凍結切片をニューロフィラメントで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図である。
図３Ｃは、脳梗塞周辺部の、細胞を移植していないＰＢＳコントロールをニューロフィラメントで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図である。
図４Ａは、脳梗塞周辺部の凍結切片をＮｅｕＮで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図であり、脳梗塞２４時間後にブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植して２１日目のものである。
図４Ｂは、脳梗塞部位の反対側である正常脳の部位の凍結切片をＮｅｕＮで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図である。
図４Ｃは、脳梗塞周辺部の、細胞を移植していないＰＢＳコントロールをＮｅｕＮで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図である。
図５は、脳梗塞２４時間後にブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植して２１日目における、神経前駆細胞の密度の統計学的解析を示す図である。
図６は、脳梗塞２４時間後にブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植して２１日目における、神経細胞の密度の統計学的解析を示す図である。
図７Ａは、脳梗塞部にブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植した場合における、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの発現を示す図である。
図７Ｂは、脳梗塞部にブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植した場合における、ＧＤＮＦ  ｍＲＮＡの発現を示す図である。
図７Ｃは、脳梗塞部にブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植した場合における、ＢＤＮＦ  ｍＲＮＡの発現を示す図である。
図７Ｄは、脳梗塞部にブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植した場合における、ＮＧＦ  ｍＲＮＡの発現を示す図である。
図８Ａは、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植した場合における、脳梗塞周辺部に遊走してきた移植細胞のＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ発現上昇を示す図である。
図８Ｂは、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
図９は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の培養上清の神経前駆細胞に対する遊走効果を示す図である。
図１０は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の培養上清の神経前駆細胞に対する増殖効果を示す図である。
図１１は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の培養上清の神経前駆細胞に対するアポトーシス抑制効果を示す図である。
図１２は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を脳梗塞ラットに移植した場合において、運動麻痺スコアを経時的に算定し、統計学的な解析を示す図である。
図１３は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞、ブタ骨髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞、及び、ブタ脂肪組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を、夫々、脳梗塞ラットに移植した場合において、運動麻痺スコアを経時的に算定し、統計学的な解析を示す図である。
図１４Ａは、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の血管への分化誘導を示す図である。
図１４Ｂは、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の脂肪への分化誘導を示す図である。
図１４Ｃは、脂肪への分化誘導がないコントロールの結果を示す図である。
図１４Ｄは、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲによる脂肪への分化誘導の測定結果を示す図である。
図１４Ｅは、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の象牙芽細胞への分化誘導を示す図である。
図１４Ｆは、象牙芽細胞への分化誘導がないコントロールの結果を示す図である。
図１４Ｇは、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲによる象牙芽細胞への分化誘導の測定結果を示す図である。
図１５Ａは、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞のｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ形成を示すものである。
図１５Ｂは、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の神経分化能を示すものである。
図１５Ｃは、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞のｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ形成を示すものである。
図１５Ｄは、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の神経分化能を示すものである。
図１６は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の培養上清の神経前駆細胞に対する遊走効果を説明する図である。
図１７は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の培養上清の神経前駆細胞に対する増殖効果を説明する図である。
図１８は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の神経前駆細胞に対するアポトーシス抑制効果を示す図である。
図１９は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞を脳梗塞２４時間後に脳組織内線条体に細胞移植した２１日目において、ＤＣＸで免疫染色し、脳梗塞周辺部の神経前駆細胞の密度を統計学的解析した図である。
図２０は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞を脳梗塞２４時間後に脳組織内線条体に細胞移植した２１日目において、ＮｅｕＮで免疫蛍光染色し、脳梗塞周辺部の神経細胞の密度を統計学的解析した図である。
図２１は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を脳梗塞２４時間後に脳組織内線条体に細胞移植した２１日目において、ＤＣＸで免疫染色し、脳梗塞周辺部の神経前駆細胞の密度を統計学的解析した図である。
図２２は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を脳梗塞２４時間後に脳組織内線条体に細胞移植した２１日目において、ＮｅｕＮで免疫染色し、脳梗塞周辺部の神経細胞の密度を統計学的解析した図である。
図２３は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を脳梗塞ラットに移植後、運動麻痺スコアを経時的に算定し、統計学的な解析を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（脳梗塞治療材）
本実施形態に係る脳梗塞治療材は、歯髄幹細胞、歯髄幹細胞の分泌蛋白質、又はこれらの混合物を含有する。
本発明者は、歯髄幹細胞、又は、歯髄幹細胞の分泌蛋白質を脳梗塞部位に移植することにより、脳梗塞部位周辺の神経前駆細胞及び神経幹細胞の分化促進に間接的に寄与するという、従来には全く見られなかった独創的な新知見に基づいて、本発明を完成させた。
歯髄幹細胞は、例えば骨髄幹細胞及び脂肪幹細胞等の他の幹細胞よりも、脳梗塞部位を解消させる点において有利である。
歯髄組織は、例えば骨髄組織及び脂肪組織と比較して、幹細胞の含有率が高く、幹細胞の分取が容易である。例えば、ＳＰ細胞の比較では、ブタ歯髄組織：ブタ骨髄組織：ブタ脂肪組織＝３％：０．３％：１．３％である。また、ＶＥＧＦＲ２陽性細胞の比較では、ブタ歯髄組織：ブタ骨髄組織：ブタ脂肪組織＝８７％：４３％：４６％である。
また、歯髄幹細胞は、例えば骨髄幹細胞よりも増殖率が高いという点において利点がある。例えば、ブタ歯髄幹細胞は、ブタ骨髄幹細胞よりも、ＳＰ細胞継代時間の差が約２倍である。
また、歯髄幹細胞は、例えば骨髄幹細胞及び脂肪幹細胞と比較して、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＭＰ３、ＶＥＧＦ等の血管誘導因子を多く発現するという点において利点がある。例えば、ＣＤ１０５陽性のｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲでは、イヌ歯髄幹細胞は、イヌ脂肪幹細胞よりも、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦにおいて、夫々、∞倍、３．８倍、３．６倍多く発現する。
また、歯髄幹細胞は、例えば骨髄幹細胞、大動脈幹細胞及び脂肪幹細胞よりも、試験管内マトリジェル上で管状構造を形成しやすい。
また、歯髄幹細胞は、例えば骨髄幹細胞及び脂肪幹細胞よりも、血流を有意に回復し、血管新生を有意に促進する点において利点がある。例えば、下肢虚血マウスに移植すると、ブタ歯髄幹細胞は、ブタ骨髄幹細胞及びブタ脂肪幹細胞よりも、有意に血管を新生する。
また、歯髄幹細胞は、例えば骨髄幹細胞及び脂肪幹細胞と比較して、ＢＤＮＦ、ＮＰＹ、ＴＧＦＢ１及びＴＧＦＢ３等の神経誘導因子を多く発現するという点において利点がある。例えば、ＢＤＮＦにおいて、歯髄幹細胞は、骨髄幹細胞より１９倍多く発現し、脂肪幹細胞より２倍多く発現する。また、ＮＰＹにおいて、歯髄幹細胞は、骨髄幹細胞より７倍多く発現し、脂肪幹細胞より９倍多く発現する。
また、骨髄幹細胞は、骨髄穿刺の負担が大きいうえに、加齢に伴い幹細胞数が減少する点において不利である。脂肪幹細胞は、幹細胞を得るまでの採取量が多量であるため、採取効率が悪い。臍帯血幹細胞は、幹細胞の存在頻度が低いうえに、分娩から細胞採取までの時間及び臍帯血量に影響を受けやすく、安定して幹細胞を採取することができない点において不利である。ＥＳ細胞は、倫理的及び社会的問題があるうえに、安全性にも問題がある。胎生由来の神経幹細胞においても、倫理的及び社会的問題があるうえに、安全性にも問題がある。
それに対して、歯髄幹細胞は、智歯及び乳歯は採取に際して人体への侵襲性が少なく、医療廃棄物であるため倫理的問題は少なく、入手時期が限定されることもなく、採取において特別な器具及び技術を必要とせず、本明細書において示されるように高い増殖能及び多分化能を有する点において、他の幹細胞よりも有利である。
歯髄幹細胞は形質を維持したまま凍結保存が可能であり、骨髄幹細胞と比べて、Ｔ細胞の同種反応を抑制する免疫抑制活性が非常に高い。
歯髄幹細胞は、ＣＤ１０５陽性細胞、ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞及びＣＤ１５０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含む。
ＳＰ細胞とは、Ｇｏｏｄｅｌｌら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．ｖｏｌ．１８３，１９９６年）によって発見された未分化細胞であり、フローサイトメトリーでの解析でＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２という蛍光色素を細胞に取り込ませてＵＶで励起すると４０５ｎｍ及び６００ｎｍに蛍光を発する通常の細胞（未分化細胞以外の細胞）からサイトグラム上は異なった位置（左横下の蛍光の暗い部分、すなわち、“Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｂｌｕｅ弱陽性かつＨｏｅｃｈｓｔ  Ｒｅｄ弱陽性”）に出現する細胞集団のことである。
ＳＰ細胞は、ＣＤ３１陰性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１３３陽性、ＣＤ２７１陽性又はＣＤ１５０陽性の何れかである。
歯髄幹細胞は、脳梗塞周囲部で、細胞遊走因子、細胞増殖因子、血管新生因子又は神経栄養因子を発現する。
細胞遊走因子は、ＳＤＦ１、ＧＣＳＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ及びＧＭＣＳＦのうち少なくとも何れか一つである。
神経栄養因子は、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＬＩＦ、ＭＹＣ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｅ３、ＴＰ５３及びＢＡＸのうち少なくとも何れか一つである。
細胞増殖因子は、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦのうち少なくとも何れか一つである。
血管新生因子は、ＰＧＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、ＡＮＰＥＰ、ＮＲＰ１、ＴＧＦβ、ＥＣＧＦ１、ＩＤ１及びＣＳＦ３のうち少なくとも何れか一つである。
脳梗塞治療材に含有される歯髄幹細胞の濃度は、特に限定されるものではないが、例えば１×１０５セル／μｌ以上１×１０７セル／μｌ以下とすることが好ましい。歯髄幹細胞の濃度が１×１０５セル／μｌより小さいと、神経前駆細胞及び神経細胞の分化促進に対する寄与が小さくなる可能性がありうる。一方、歯髄幹細胞の濃度が１×１０７セル／μｌより大きいと、不要な歯髄幹細胞を脳梗塞部位に移植する可能性があり得るからである。
歯髄幹細胞は、脳機能改善の治療を受ける対象動物自身から抽出した細胞（自家細胞）でもよいし、また、脳機能改善の治療を受ける対象動物以外の動物から抽出した細胞（他家細胞、異種細胞）でもよい。
歯髄幹細胞は、永久歯又は乳歯由来のものを使用することができる。特に、ヒト乳歯由来の歯髄細胞には、ＣＤ１０５＋が約３０％と多く含まれ、（ヒト永久歯由来ＣＤ３１−ＳＰ細胞ではＣＤ１０５＋は約２０％）、乳歯由来の歯髄幹細胞あるいは歯髄細胞は永久歯由来の歯髄幹細胞と同様に、試験管内血管誘導、下肢虚血部位での血流回復、血管新生促進効果を示す。また、ＣＤ１５０＋は乳歯歯髄細胞に０．５％含まれ、永久歯ＣＤ３１−ＳＰ細胞の０．２％より多い。乳歯由来の歯髄細胞は永久歯由来歯髄細胞よりも試験管内血管誘導、下肢虚血部位での血流回復・血管新生促進効果が高い。
本実施形態に係る脳梗塞治療材は、歯髄幹細胞のみならず、歯髄幹細胞の分泌蛋白質を含むものでもよい。
ここで、分泌蛋白質とは、細胞外に分泌される蛋白質である。分泌蛋白質は、Ｎ末端に分泌シグナルペプチドと呼ばれる配列を持っている。
（脳組織再生方法）
本実施形態に係る脳組織再生方法は、上述した脳梗塞治療材を、脳梗塞後、脳線条体に注入することで、脳中枢神経組織を再生し、脳機能を回復させる。
脳線条体への注入は、特に限定されるものではないが、例えば、頭頂骨の一部に穴を開けて開口することにより、行うことができる。
ここで、脳梗塞とは、脳の血管がつまったり、細くなったりして、血液の流れが悪くなり、脳の組織が死んでしまうことである。
脳線条体とは、終脳の皮質下構造である。脳線条体は、運動機能及び意志決定機能等に深く関わり、大脳基底核の主要な構成要素の一つである。
脳線条体は、新線条体又は腹側線条体のいずれでもよい。新線条体は、背側線条体とも呼ばれ、被穀と尾状核とから構成される。腹側線条体は、側坐核及び嗅結節等を含む。
脳梗塞治療材は、特に限定されるものではないが、例えば、脳梗塞発生後２４時間以内に脳線条体に注入することができる。
【実施例】
【０００８】
（実施例１）
本施例では、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ移植によるラット脳梗塞後の神経再生を示す。
ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットを用いて、中大脳動脈閉鎖術を行い、脳梗塞モデルラットを作成した。
ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞をＤｉＩにて蛍光ラベルした後、脳梗塞２４時間後に、図１Ａ及び図１Ｂに示されるように、脳組織内の脳線条体の注入部Ｐｉに細胞移植した。なお、コントロールとしては、ＰＢＳを注入したものを用いた。
図１Ａにおいて、Ｂはｂｒｅｇｍａを示し、それは頭蓋の矢状縫合と冠状縫合との交点である。Ｌ１は６．０ｍｍであり、Ｌ２は１．０ｍｍである。
図１Ｂは、冠状断マクロ像である。Ｌ３は５．０ｍｍであり、Ｌ４は６．０ｍｍである。ＭＬはミッドラインを示す。
細胞移植後２１日目に灌流固定し、通法どおりに凍結切片を作製し、神経前駆細胞マーカーのＤＣＸ、神経マーカーのｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ及びＮｅｕＮを用いて、免疫染色を行った。
図２Ａは、脳梗塞後にＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植し、凍結切片をＤＣＸで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図である。図２Ｂは、脳梗塞部位の反対側である正常脳の部位をＤＣＸで免疫染色したものである。図２Ｃは、脳梗塞後にＰＢＳを注入し、ＤＣＸで免疫染色したものである。
この脳梗塞モデルラットでは、１か月後、大脳半球の１／４〜１／３に梗塞が生じていた。神経前駆細胞のマーカーのＤＣＸで免疫染色（緑色）すると、梗塞部周囲にＤｉＩにて染色（赤色）された移植細胞が集積し、その細胞とＤＣＸ陽性細胞は近接しているものの、重複はみられなかった。脳梗塞部位の反対側及びＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植していない脳梗塞部周囲でも若干の陽性細胞がみられた。
次に、図３Ａは、脳梗塞後にＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植し、凍結切片をｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図である。図３Ｂは、脳梗塞部位の反対側である正常脳の部位をｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔで免疫染色したものである。図３Ｃは、脳梗塞後にＰＢＳを注入し、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔで免疫染色したものである。
神経細胞のマーカーのｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔで免疫染色すると、その陽性細胞は脳梗塞周辺部に集積している細胞と近接しているものの、重複はみられなかった。細胞を移植していない脳梗塞周辺部では、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ陽性細胞はごくわずかしかみられなかった。
次に、図４Ａは、脳梗塞後にＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植し、凍結切片をＮｅｕＮで免疫蛍光染色した共焦点レーザー顕微鏡図である。図４Ｂは、脳梗塞部位の反対側である正常脳の部位をＮｅｕＮで免疫染色したものである。図４Ｃは、脳梗塞後にＰＢＳを注入し、ＮｅｕＮで免疫染色したものである。
ＮｅｕＮにおいても、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔと同様に、陽性細胞は脳梗塞周辺部に集積している細胞と近接しているものの重複はみられなかった。また、細胞を移植していない脳梗塞周辺部では陽性細胞はごくわずかしかみられなかった。なお、ＮｅｕＮ染色は、神経細胞核特異的な蛋白質を染色する方法で、未分化の神経幹細胞と分化した神経細胞とを区別する際等に使用される。
これまで、脳梗塞後には、側脳室下帯由来の神経前駆細胞及び神経幹細胞が線条体の実質へ遊走し、神経に分化しシナプスを形成すると言われていた。ところが、図２Ａ〜図２Ｃ、図３Ａ〜図３Ｃ、及び、図４Ａ〜図４Ｃの結果から明らかなように、ＰＢＳ注入では神経前駆細胞は脳梗塞により線条体に遊走するが神経の分化がみられないこと、また細胞移植した場合、ＤＣＸ、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ、及び、ＮｅｕＮ陽性細胞と重複がみられないことから、移植細胞は神経前駆細胞又は神経細胞に直接分化せず、間接的に分化促進に関与しているということが考えられる。
次に、脳梗塞全体部を含む領域（幅６ｍｍ）において、１．２ｍｍごとに５枚の連続切片を免疫染色し、移植したＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の遊走がみられる脳梗塞部周囲の典型部を２カ所ずつ、１サンプルにつき計１０カ所、ＫＥＹＥＮＣＥ蛍光顕微鏡にて撮影し、Ｄｙｎａｍｉｃ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔを用いてＤＣＸ及びＮｅｕＮの蛍光密度を測定することにより神経前駆細胞及び神経細胞密度を統計学的に分析した。
図５に、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を移植した場合における、神経前駆細胞の密度の統計学的解析を示す。図６に、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を移植した場合における、神経細胞の密度の統計学的解析を示す。
図５に示されるように、脳梗塞部周囲における神経前駆細胞は細胞移植により、ＰＢＳコントロールと比較して約２倍に増加した。
また、図６に示されるように、脳梗塞部周囲における神経細胞は細胞移植により、ＰＢＳコントロールと比較して約８倍に増加した。
このように、ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を脳梗塞部位に移植することにより、脳梗塞周辺部へ神経前駆細胞が遊走し、増殖が促進され、アポトーシスが抑制され、さらに神経細胞への分化が促進されていることが示唆される。
次に、インサイチューハイブリダイゼーションにより神経栄養因子の発現を検討した。
図７Ａは、脳梗塞部位周囲におけるＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの発現を示す。図７Ｂは、脳梗塞周辺部におけるＧＤＮＦ  ｍＲＮＡの発現を示す。図７Ｃは、脳梗塞周辺部におけるＢＤＮＦ  ｍＲＮＡの発現を示す。図７Ｄは、脳梗塞周辺部におけるＮＧＦｍＲＮＡの発現を示す。図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、及び、図７Ｄに示されるように、移植細胞は脳梗塞周辺部においてＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ、ＧＤＮＦ  ｍＲＮＡ、ＢＤＮＦ  ｍＲＮＡ、及び、ＮＧＦ  ｍＲＮＡを強く発現していた。
また、特にＶＥＧＦに注目して、ブタに特異的に反応するプライマー
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を用いたＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲによるＶＥＧＦの発現を検討した。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲは、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化したリアルタイムＰＣＲ専用の装置を使用する。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲは、ＰＣＲの増幅量をリアルタイムモニターして解析するものであり、電気泳動が不要で迅速性と定量性に優れる。
図８Ａは、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植した脳梗塞周辺部のＶＥＧＦの発現を示す図であり、図８Ｂは、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲによる測定結果を示す図である。図８Ａ及び図８Ｂに示されるように、脳梗塞周辺部では正常のブタの脳の相当部と比べて１０００倍以上のＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ発現上昇がみられ、脳梗塞を生じていないところに移植した場合の約２８倍の上昇がみられた。
このように、ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植することにより、移植細胞から分泌されるＶＥＧＦをはじめとする神経栄養因子により、脳梗塞周辺部の神経前駆細胞及び神経幹細胞の分化が促進されると考えられる。
次に、培養神経前駆細胞（ＳＨＳＹ５Ｙ  ヒト神経芽腫細胞）を用いて、ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の培養上清の遊走、増殖、及び、抗アポトーシス効果を検討した。
図９は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の培養上清の遊走効果を示す図である。図９に示されるように、ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の培養上清の遊走効果は優れていた。
図１０は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の培養上清の増殖効果を示す図である。図１０に示されるように、ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の培養上清の増殖効果は特に優れていた。
抗アポトーシス効果は４００ｎＭ  ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅによりアポトーシスを生じさせ、フローサイトメトリーによる壊死細胞及びアポトーシス細胞の割合を測定した。
図１１は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の培養上清のアポトーシス抑制効果を示す図である。図１１に示されるように、ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞の培養上清のアポトーシス抑制効果は優れていた。
さらに、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を脳梗塞ラットに移植した後、経時的に運動麻痺スコアを算定し、細胞移植による運動感覚機能の回復効果を検討した。
運動麻痺スコアの算出は、下記に示す方法によった。
１…尻尾を持って持ち上げたとき、麻痺側の上肢を突っ張らない。（１点）
２…麻痺側の下肢を引っ張ると下肢を引っ込めない。（１点）
３…体を麻痺側に倒すとそちらに傾く。（１点）
４…歩行させても歩けない。（１点）
５…直径５０ｃｍの円の中から１０秒以内に歩いて抜け出せない。（１点）  ２０秒以内に歩いて抜け出せない。（２点）  ３０秒以内に歩いて抜け出せない。（３点）
６−１…麻痺側の上肢に上方向の抵抗を加えると突っ張らない。（１点）
６−２…麻痺側の上肢に前方向の抵抗を加えると突っ張らない。（１点）
６−３…麻痺側の上肢に横方向の抵抗を加えると突っ張らない。（１点）
図１２は、運動麻痺スコアを経時的に算定し、統計学的な解析を示す図である。日数は、細胞を移植してからの日付である。なお、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
図１２に示されるように、細胞移植による運動感覚機能の回復効果をみると、細胞移植をした場合は９日目で運動麻痺のほぼ回復がみられるが、ＰＢＳコントロールではほとんど回復はみられなかった。運動麻痺スコアを経時的に算定し、統計学的な解析を行うと、６日以降で細胞移植群はコントロール群のＰＢＳ注入に比べて有意に運動機能が回復することが明らかとなった。また、ブタ歯髄ｔｏｔａｌ細胞は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を分取する前の状態の細胞であり、そこにはブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞のみならずその他の細胞も含まれている。ブタ歯髄ｔｏｔａｌ細胞を移植した場合は、ＰＢＳコントロールよりも運動機能は回復しているものの、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を移植した場合よりも、運動機能の回復は劣る。これより、運動機能の回復は、ブタ歯髄ｔｏｔａｌ細胞を移植するよりも、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞のみを選択して移植するほうが優れていることが判明した。
また、本発明者は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞、ブタ歯髄ｔｏｔａｌ細胞、ブタ骨髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞、及び、ブタ脂肪組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞を、夫々、比較して、運動麻痺スコアを経時的に算定し、統計学的な解析を行った。図１３に示されるように、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞は、ブタ骨髄組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞及びブタ脂肪組織由来ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞よりも、有意に運動機能が回復することが明らかとなった。従って、歯髄幹細胞が骨髄幹細胞及び脂肪幹細胞よりも脳梗塞の機能改善に有利であることが示唆された。
（実施例２）
本実施例では、実施例１と異なり、ヒト歯髄組織由来の歯髄細胞を使用する。表１は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−ＳＰ細胞及びブタ歯髄組織由来ＣＤ３１−ＳＰ細胞の性質を示すものである。
【表１】
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表１に示すように、フローサイトメトリーにて、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−ＳＰ細胞は、ブタ歯髄組織由来ＣＤ３１−ＳＰ細胞と比較して、ＣＤ９０及びＣＤ１５０を高発現していた。また、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−ＳＰ細胞は、ヒトｔｏｔａｌ歯髄細胞と比較して、ＣＤ１０５を高発現していた。
本施例では、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞移植による、ラット脳梗塞後の神経再生を示す。
表２は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の性質を示すものである。
【表２】
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表２に示すように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びヒトｔｏｔａｌ歯髄細胞よりも、神経幹細胞のマーカーＣＤ２４及びＣＤ２７１、並びにより未分化な幹細胞マーカーＣＤ１５０を高発現していた。よって、ＣＤ１０５＋細胞はＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びヒトｔｏｔａｌ歯髄細胞よりも神経幹細胞及びより未分化な幹細胞をより多く含むことが示唆される。
次に、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の特徴を明らかにするために、多分化能を検討した。
図１４Ａに示されるように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、血管に誘導された。
また、図１４Ｂに示されるように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、脂肪に誘導された。一方、図１４Ｃに示されるように、ＰＢＳコントロールでは、脂肪への誘導は見られなかった。図１４Ｄは、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲによる測定結果である。なお、ＰＰＡＲγは脂肪細胞に特異的な分化マーカーである。
また、図１４Ｅに示されるように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、象牙芽細胞に誘導された。一方、図１４Ｆに示されるように、ＰＢＳコントロールでは、象牙芽細胞への誘導は見られなかった。図１４Ｇは、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲによる測定結果である。なお、Ｄｓｐｐ及びＥｎａｍｅｌｙｓｉｎは象牙芽細胞に特異的な分化マーカーである。
図１４Ｄ及び図１４Ｇで示したプライマーである、ＰＰＡＲγ、β−アクチン、Ｄｓｐｐ、及び、Ｅｎａｍｅｌｙｓｉｎ（マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）２０）については、表３に示す。
【表３】
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次に、図１５Ａに示されるように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞はｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ形成を示した。また、図１５Ｂに示されるように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は神経分化能を有していた。
また、図１５Ｃに示されるように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞はｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ形成を示した。また、図１５Ｄに示されるように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は神経分化能を有していた。
次に、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞につき、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲによる神経栄養因子及び幹細胞マーカーの発現を検討し、結果を下記表４に示す。
【表４】
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なお、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ３、ＶＥＧＦＡ、Ｓｔａｔ３、及び、Ｂｍｉ１のプライマーについては、表５に示す。
【表５】
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ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞はｔｏｔａｌの歯髄細胞に比べてｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ）及びｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＮＧＦ）  ｍＲＮＡの発現が４〜５倍と高かった。ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞に比べ、ＢＤＮＦについては約４倍高い発現がみられ、ＮＧＦ  ｍＲＮＡについては約５．６倍の高い発現がみられた。両細胞画分のＶＥＧＦＡ  ｍＲＮＡはｔｏｔａｌの歯髄細胞に比べて４〜５倍の発現がみられた。
一方、ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ）  ｍＲＮＡについては、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞はｔｏｔａｌの歯髄細胞に比べて約４倍の発現の増加がみられた。また、ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ）  ｍＲＮＡにつき、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞に比べ、約１０．２倍の発現の増加がみられた。
即ち、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は、ＢＤＮＦ及びＮＧＦを強く発現していることが明らかとなった。また、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、ＧＤＮＦ  ｍＲＮＡを強く発現していることが明らかとなった。
幹細胞マーカーであるＳｔａｔ３  ｍＲＮＡについては、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞はヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の約５．８倍強く発現していた。幹細胞マーカーであるＢｍｉ１  ｍＲＮＡについては、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞はヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の約４倍強く発現していた。
以上より、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の遊走及び増殖促進効果は主にＢＤＮＦ及びＮＧＦによるものであり、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞のそれは主にＧＤＮＦによるものと考えられる。
次に、培養神経前駆細胞（ＳＨＳＹ５Ｙ  ヒト神経芽腫細胞）を用いて、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の培養上清の遊走、増殖効果、及び、アポトーシス抑制効果を検討した。
図１６は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の培養上清の遊走促進を説明する図である。図１６に示すように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の上清は、コントロールに比べ有意に遊走を促進した。
図１７は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の培養上清の増殖促進を説明する図である。図１７に示すように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の上清は、コントロールに比べ有意に増殖を促進した。また、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の培養上清は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の培養上清よりも、２４時間後において有意差を有して増殖を促進しており、更に４８時間後において両者の有意差は顕著なものであった。
図１８は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞のアポトーシス抑制効果を示す図である。図１８に示すように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の培養上清は、コントロールに比べ有意にアポートシスを抑制した。また、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の培養上清は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞の培養上清よりも、より顕著にアポートシスを抑制した。
次に、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞を、脳梗塞後に脳組織内線条体に細胞移植し、経時的に運動麻痺スコアを算定し、細胞移植による運動機能の回復効果を検討した。
実施例１と同様に、ＳＤラットを用いて、脳梗塞モデルを作成した。ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びＣＤ１０５＋細胞をＤｉＩにて蛍光ラベルした後、脳梗塞２４時間後に、脳組織内線条体に細胞移植した。
コントロールとしては、ＰＢＳを注入したものを用いた。脳梗塞２１日後に灌流固定し、通法どおりに凍結切片を作製し、神経前駆細胞マーカーのＤＣＸ及び神経マーカーのＮｅｕＮを用いて免疫染色を行った。更に、細胞移植後、経時的に運動麻痺スコアを算定し、細胞移植による運動感覚機能の回復効果を検討した。
図１９は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞を脳梗塞後に脳組織内線条体に細胞移植後、２１日目において、ＤＣＸで免疫染色し、神経前駆細胞の密度を統計学的解析した図である。図１９に示すように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞を移植すると、脳梗塞部周囲における神経前駆細胞は細胞移植により約３倍に増加した。
図２０は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞を脳梗塞後に脳組織内線条体に細胞移植後、２１日目において、ＮｅｕＮで免疫蛍光染色し、神経細胞の密度を統計学的解析した図である。神経細胞は反対側の正常脳の相当部と比較して神経走行は乱れているものの、図２０に示すように、脳梗塞周囲に、ＰＢＳ注入に比べて有意に神経細胞の増加がみられた。
図２１は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を、別々の脳梗塞ＳＤラットに対し、脳組織内線条体に夫々細胞移植後、２１日目において、ＤＣＸで免疫染色し、神経前駆細胞の密度を統計学的解析して比較した図である。図２１に示すように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞よりも、神経前駆細胞の増殖促進能が顕著であった。
図２２は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を、別々の脳梗塞ＳＤラットに対し、脳組織内線条体に夫々細胞移植後、２１日目において、ＮｅｕＮで免疫染色し、神経細胞の密度を統計学的解析して比較した図である。図２２に示すように、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞よりも、神経細胞の分化促進能が顕著であった。
よって、ヒト歯髄組織由来の移植細胞は、ブタ歯髄組織由来の移植細胞と同様に、神経前駆細胞又は神経細胞に直接分化せず、間接的に分化促進に関与することが実証された。
図２３は、ヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞を、別々の脳梗塞ＳＤラットに対して移植後、運動麻痺スコアを経時的に算定し、統計学的な解析を比較する図である。日数は、細胞を移植してからの日付である。図２３に示すように、運動麻痺スコアを算定すると、ヒト歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞及びヒト歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、ＰＢＳ注入に比べて、両者ともに、有意な運動麻痺の回復がみられた。
上述の実施例にて示されたように、歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞及び歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は、細胞遊走能、細胞増殖能、及び、アポートシス抑制能に優れており、また、神経前駆細胞増殖能及び神経細胞の分化促進能に優れている。
また、上述の実施例にて示されたように、歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞よりも、細胞増殖能、及び、アポートシス抑制能に優れている。歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞の歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞に対する顕著な優位は、予測できるものではなく、本発明者の実験により始めて明らかになったものである。
更に、歯髄組織由来ＣＤ３１−；ＣＤ１４６−ＳＰ細胞は、分取するためにフローサイトメトリーを使用するところ、フローサイトメトリーは他個体に由来する細胞のコンタミネーションの可能性がある。そのため、フローサイトメトリーを使用する分取では、安全性の観点から、臨床では使用できない。一方、歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞は、特に限定されるものではないが、例えば免疫磁気ビーズ法にて分取できる。免疫磁気ビーズ法は、チューブの中に試料と免疫磁気ビーズ（細胞の表面抗原に対する抗体に磁気ビーズがついたもの）を入れて反応させ、カラムにサンプルを吸着させ、分離する方法であり、コンタミネーションの危険性がない。そのため、歯髄組織由来ＣＤ１０５＋細胞を使用する脳梗塞治療材は、臨床にて即座に使用でき、脳血管障害に対する適切な治療手段を直ちに提供できるという大きな利点を有する。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明に係る脳梗塞治療材は、神経前駆細胞増殖能に優れており、神経細胞の分化促進能にも優れている。また、本発明に係る脳梗塞治療材は、臨床にて即座に使用でき、脳血管障害に対する適切な治療手段を直ちに提供できる。
［配列表］
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【図５】
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【図６】
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【図８Ａ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年11月5日(2009.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１０５陽性細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞及びＣＤ１５０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含む歯髄幹細胞並びに前記歯髄幹細胞の分泌蛋白質のうち少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする脳梗塞治療材。
【請求項２】
ＣＤ１０５陽性ＳＰ細胞、ＣＤ２４陽性ＳＰ細胞、ＣＤ１３３陽性ＳＰ細胞、ＣＤ２７１陽性ＳＰ細胞及びＣＤ１５０陽性ＳＰ細胞のうち少なくとも何れか一つを含む歯髄幹細胞並びに前記歯髄幹細胞の分泌蛋白質のうち少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする脳梗塞治療材。
【請求項３】
前記歯髄幹細胞が、脳梗塞周囲部で、細胞遊走因子、細胞増殖因子、血管新生因子及び神経栄養因子のうち少なくとも何れか一つを含む因子を発現することを特徴とする請求項１記載の脳梗塞治療材。
【請求項４】
前記細胞遊走因子が、ＳＤＦ１、ＧＣＳＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ及びＧＭＣＳＦのうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項３記載の脳梗塞治療材。
【請求項５】
前記神経栄養因子が、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＬＩＦ、ＭＹＣ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｅ３、ＴＰ５３及びＢＡＸのうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項３記載の脳梗塞治療材。
【請求項６】
前記細胞増殖因子が、ｂＦＧＦ及びＰＤＧＦの少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項３記載の脳梗塞治療材。
【請求項７】
前記血管新生因子が、ＰＧＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ１０、ＡＮＰＥＰ、ＮＲＰ１、ＴＧＦβ、ＥＣＧＦ１、ＩＤ１及びＣＳＦ３のうち少なくとも何れか一つであることを特徴とする請求項３記載の脳梗塞治療材。
【請求項８】
前記歯髄幹細胞の濃度が、１×１０５セル／μｌ以上１×１０７セル／μｌ以下であることを特徴とする請求項１記載の脳梗塞治療材。
【請求項９】
前記歯髄幹細胞は、永久歯又は乳歯由来の歯髄幹細胞であることを特徴とする請求項１記載の脳梗塞治療材。
【請求項１０】
脳梗塞後、脳線条体に、ＣＤ１０５陽性細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞及びＣＤ１５０陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含む歯髄幹細胞並びに前記歯髄幹細胞の分泌蛋白質のうち少なくとも何れか一つを注入することで、脳中枢神経組織を再生し、脳機能を回復させることを特徴とする脳組織再生方法。
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
前記歯髄幹細胞が、脳梗塞周囲部で、細胞遊走因子、細胞増殖因子、血管新生因子及び神経栄養因子のうち少なくとも何れか一つを含む因子を発現していることを特徴とする請求項１０記載の脳組織再生方法。
【請求項１３】
前記歯髄幹細胞の濃度が、１×１０５セル／μｌ以上１×１０７セル／μｌ以下であることを特徴とする請求項１０記載の脳組織再生方法。
【請求項１４】
前記歯髄幹細胞は、永久歯又は乳歯由来の歯髄幹細胞であることを特徴とする請求項１０記載の脳組織再生方法。
【国際調査報告】
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