(57)【要約】本発明は、精子における卵子への融合能に基づいた妊孕可能性の推定、及び不妊症の原因の同定を可能にする妊孕性検査・診断方法、並びに該方法に用いられるポリヌクレオチド及び妊孕性検査キットを提供することを目的とする。本発明は、ヒトから採取された生体サンプルについて、ヒトのＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有する、妊孕性検査・診断方法、ヒト野生型ＰＧＡＭ４遺伝子の塩基配列または当該遺伝子の翻訳領域の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、妊孕性と相関性の高い一塩基置換変異の変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド、及びヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいる妊孕性検査キットを提供する。
2010106788.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトから採取された生体サンプルについて、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有し、
前記検出工程において、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の、第７５位の塩基、第１３８位の塩基、及び第５３９位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出する、妊孕性検査方法。
【請求項２】
前記検出工程において、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の、第７５位の塩基及び第５３９位の塩基からなる群より選択される１以上の変異の有無を検出する、請求項１記載の妊孕性検査方法。
【請求項３】
下記の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列：
（ａ）配列番号３で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからシトシンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列；
からなるポリヌクレオチド。
【請求項４】
下記の（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列： 
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列；
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列；
からなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第７５位の塩基がシトシンに置換された塩基配列又は第５３９位の塩基がアデニンに置換された塩基配列からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第１３８位の塩基がシトシンに置換された塩基配列からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項５又は６に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項５に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合し、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合しない、抗体。
【請求項９】
ヒトから採取された生体サンプルについて、発現しているＰＧＡＭ４ポリペプチドの変異の有無を、請求項８に記載の抗体を使用することで検出する検出工程を有する、妊孕性検査方法。
【請求項１０】
ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含む、ヒトの妊孕性検査キット。
【請求項１１】
前記ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬が、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第７５位の塩基、第１３８位の塩基、及び第５３９位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出することができる、請求項１０記載の妊孕性検査キット。
【請求項１２】
前記試薬が、抗ＰＧＡＭ４抗体である、請求項１１記載の妊孕性検査キット。
【請求項１３】
前記試薬が、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の変異検出部位の塩基を含む領域を増幅することができるプライマーセットである、請求項１１記載の妊孕性検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を可能にする技術に関するものである。具体的には、妊孕可能性と相関性のある遺伝子の欠損又は変異を検出し、妊孕可能性を検査・診断する方法、並びに、該方法に用いることができるキット、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、少子化の問題が頻繁に取り上げられ、この問題を解消するために様々な対策が模索されている。少子化の対策として、不妊症により子供を授からない夫婦を救済することが重要であることは言うまでもなく、有効な不妊治療法の開発が強く望まれている。【０００３】
不妊症の原因は男女同率であるが、男性不妊症は精子形成メカニズムの複雑さから、その治療法も含めて未解明の部分が多く、ヒト精子数の減少や生殖力の低下など生殖にまつわる問題の多くは原因不明である。体外受精（ＩＶＦ；Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）の技術発展により、精子の活動能が低い場合においても妊娠出産が可能となってきているものの、不妊の背後にある分子メカニズムの詳細は依然として明らかになっておらず、適切な治療法の選択が困難な場合や、十分な治療効果が得られない場合も多い。従って、より負担の少ない不妊治療のためには、不妊メカニズムの理解に立った遺伝子診断・生殖補助医療の開発が強く望まれている。【０００４】
非特許文献１によると、マウスにおける雄性不妊の研究により、妊孕性に影響を与える多くの遺伝子の存在が明らかになっており、これらの遺伝子の変異がヒトにおいても男性不妊を引き起こす一因となっている可能性がある。
一方、精子形成過程の減数分裂後に起こる形態学的変化には、エネルギー代謝に利用される酵素において、精子細胞特異的な構造もしくは機能変化が認められるとされ、精子特異的なｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ（非特許文献２参照。）、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ（非特許文献３参照。）、ａｌｄｏｌａｓｅ（非特許文献４参照。）、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（非特許文献５参照。）、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ（非特許文献６参照。）、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｍｕｔａｓｅ（非特許文献７参照。）、ｅｎｏｌａｓｅ（非特許文献８参照。）などが活性化される。非特許文献５では、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅのノックアウトマウス（オス）が不妊となり、精子の運動不良が認められることから、これら精子特異的な解糖系の酵素機能における異常は不妊の原因となる可能性が示唆される。【０００５】
マウスにおけるＰｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｍｕｔａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ（ＰＧＡＭ）は、Ｐｇａｍ−１とＰｇａｍ−２の２つの遺伝子にコードされ、Ｂ型、Ｍ型のホモ、及びヘテロのＰＧＡＭからなる３種類のアイソザイムを形成する。成長したマウスの睾丸では３種類のアイソザイムが検出されるが、新生児マウスの睾丸ではＭ型アイソザイムは認められず、出生後１４−１６日からＭ型が観察される。（非特許文献９参照。）。転写レベルでは、Ｂ型は脳と腎臓で強く、肝臓・甲状腺・筋肉・心臓で中程度発現しており、Ｍ型は筋肉と睾丸で強く、心臓・肺で中程度発現していることが明らかにされている（非特許文献１０参照。）。ヒト睾丸におけるＰＧＡＭの発現解析はないが、ＰＧＡＭ１（Ｂ型）は肝臓及び脳で発現し、ＰＧＡＭ２（Ｍ型）は筋肉での発現が確認されている（非特許文献１１参照。）。一方、ヒトにおいては、Ｂ型のアイソザイムとしてイントロンが含まれないＰＧＡＭ４（ＰＧＡＭ３、ＰＧＡＭ−Ｂ）が存在することが知られている(非特許文献１２参照)。成熟したヒト精巣においても、Ｂ型に加えＭ型のＰＧＡＭが発現していると考えられるが、精巣特異的に発現する遺伝子の多くはイントロンが含まれないため（非特許文献１３、１４参照）、ＰＧＡＭ４の精巣における機能が示唆される。従って、ＰＧＡＭ４をコードする遺伝子における変化は、精子におけるＰＧＡＭ機能に異常をもたらす可能性がある。その結果、解糖系によるエネルギー供給が低下し、精子の運動能が低下することにより受精に障害が起こる可能性が考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】マザック（Matzuk）、外１名、ネイチャー・セル・バイオロジー（Nature Cell Biology）、２００２年、第４（Ｓｕｐｐ１）巻、Ｓ４１〜Ｓ４９。
【非特許文献２】モリ（Mori）、外４名、モレキュラー・リプロダクション・アンド・デベロップメント(Molecular reproduction and development)、１９９６年、第４４巻第１号、第１４〜２２ページ。
【非特許文献３】ブール（Buehr）、外１名、ジャーナル・オブ・リプロダクション・アンド・ファーティリティ（Journal of reproduction and fertility）、１９８１年、第６３巻第１号、第１６９〜１７３ページ。
【非特許文献４】ベムガンチ（Vemuganti）、外５名、デベロップメンタル・バイオロジー（Developmental biology）、２００７年、第３０９巻第１号、第１８〜３１ページ。
【非特許文献５】ミキ（Miki）、外８名、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、２００４年、第１０１巻第４７号、第１６５０１〜１６５０６ページ。
【非特許文献６】マッカレイ（McCarrey）、外６名、デベロップメンタル・ジェネティックス（Developmental genetics）、１９９６年、第１９巻第４号、第３２１〜３３２ページ。
【非特許文献７】ブロセノ（Broceno）、外４名、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（European journal of biochemistry）、１９９５年、第２２７巻第３号、第６２９〜６３５ページ。
【非特許文献８】フォース（Force）、外４名、ジャーナル・オブ・アンドロロジー（Journal of andrology）、２００４年、第２５巻第５号、第８２４〜８２９ページ。
【非特許文献９】ファンデル（Fundele）、外４名、デベロップメンタル・バイオロジー（Developmental biology）、１９８７年、第１２４巻第２号、第５６２〜５６６ページ。
【非特許文献１０】ツァン（Zhang）、外８名、ジーン（Gene）、２００１年、２６４巻第２号、第２７３〜２７９ページ。
【非特許文献１１】サコダ（Sakoda）、外４名、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The journal of biological chemistry）、１９８８年、第２６３巻第３２号、第１６８９９〜１６９０５ページ。
【非特許文献１２】“Symbol Report: PGAM4”、［online］、２００５年４月２５日、Human Genome Organisation、［２００８年１２月２日検索］、インターネット〈URL：http://www.genenames.org/data/hgnc_data.php?hgnc_id=21731〉
【非特許文献１３】マッカレイ（McCarrey）、外１名、ネイチャー（Nature）、１９８７年、第３２６巻第６１１２号、第５０１〜５０５ページ。
【非特許文献１４】ダール（Dahl）、外４名、ゲノミクス（Genomics）、１９９０年、第８巻第２号、第２２５〜２３２ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
男性不妊を診断するための有効な遺伝子検査・診断方法は未だ十分に確立されていない。男性不妊の原因は生殖細胞自体の欠失から精子の受精不全まで多岐に渡る。従って、病態に応じた有効な治療法を確立するためには、様々な病態の原因を特定できる方法が望まれている。
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、精子運動におけるエネルギー供給に関わる酵素機能に基づいた妊孕可能性の推定、及び不妊症の原因の同定を可能にする妊孕性検査・診断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、精巣特異的なＰＧＡＭ４が機能的に低下すると精子運動におけるエネルギー供給が減少し、受精に至る確率が低下すると考えられることから、ヒトにおける精巣型ＰＧＡＭ４分子が妊孕性に関連し、ＰＧＡＭ４遺伝子の変異は、男性不妊を引き起こす(或いは引き起こしやすい)と考え、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子配列を解析し、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子に男性不妊症に関連した変異を見出し、本発明を完成させるに至った。【０００９】
すなわち本発明は下記の構成をとる。
（１）ヒトから採取された生体サンプルについて、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有し、前記検出工程において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の、第７５位の塩基、第１３８位の塩基、及び第５３９位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出する、妊孕性検査・診断方法。
（２）前記検査・診断方法の検出行程において、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の、第７５位の塩基及び第５３９位の塩基からなる群より選択される１以上の変異の有無を検出する、妊孕性検査・診断方法。
（３）下記の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列：
（ａ）配列番号３で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからシトシンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列；
からなるポリヌクレオチド。
（４）下記の（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列： 
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列；
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列と相補的な塩基配列；
からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（５）配列番号１で表される塩基配列において、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第７５位の塩基又は第５３９位の塩基が置換されており、この置換された塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（６）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、第１３８位の塩基がシトシンに置換された塩基配列からなる、ポリヌクレオチド。
（７）上記（５）又は（６）に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（８）上記（５）に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合し、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合しない、抗体。
（９）ヒトから採取された生体サンプルについて、発現しているＰＧＡＭ４ポリペプチドの変異の有無を、上記（８）に記載の抗体を使用することで検出する検出工程を有する、妊孕性検査・診断方法。
（１０）ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含む、ヒトの妊孕性検査キット。
（１１）前記ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬が、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第７５位の塩基、第１３８位の塩基、及び第５３９位の塩基からなる群より選択される１以上の塩基の変異の有無を検出することができる、上記（１０）記載の妊孕性検査・診断キット。
（１２）前記試薬が、抗ＰＧＡＭ４抗体である、請求項１１記載の妊孕性検査・診断キット。
（１３）前記試薬が、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の変異検出部位の塩基を含む領域を増幅することができるプライマーセットである、上記（１１）記載の妊孕性検査キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の妊孕性検査・診断方法や妊孕性検査・診断キットを用いることにより、ヒトの妊孕可能性の推定や、不妊症の原因の同定を、高精度かつ簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】インベーダー法の原理を説明する模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明に係る妊孕性検査・診断方法は、ヒトから採取された生体サンプルについて、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出する検出工程を有する。ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損や特定の塩基の変異は、男性不妊との相関性が高い。したがって、被験者から生体サンプルを採取し、この生体サンプルを用いて被験者のＰＧＡＭ４遺伝子に欠損又は変異があるか否かを調べることにより、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定が可能になる。
【００１３】
配列番号１は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）にアクセッション番号ＮＣ＿００００２３．９で登録されている野生型ＰＧＡＭ４遺伝子の転写産物の塩基配列の中から、翻訳領域のみを抽出したものである。配列番号１に示すように、野生型ヒトＰＧＡＭ４遺伝子は、７６５ｂｐからなる翻訳領域を有している。また、配列番号２は、野生型ヒトＰＧＡＭ４タンパク質の推定アミノ酸配列を示すものである。ヒトゲノムプロジェクトによって構築されたヒトゲノムリソースによれば、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子は、ヒトＸ染色体長腕に位置している（Ｘｑ１３）。
【００１４】
本願発明者らは、後述する実施例に示す調査の結果、男性不妊症患者からなる集団の中に、配列番号１に示すヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域において塩基が置換している患者がいることを見出した。一方、これらの塩基置換は、妊孕性が確認されている男性からなる集団では見られなかった。
【００１５】
ヒトＰＧＡＭ４遺伝子に上記の置換変異が起こると、正常なタンパク質が発現しなくなったり、発現効率が低下するおそれがある。それゆえ、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の置換変異は、正常なＰＧＡＭ４タンパク質の翻訳量が低下することにより不妊症を引き起こす可能性が高いと推測される。
【００１６】
本発明において、変異とは、遺伝子の塩基配列において、塩基が欠失・置換・挿入されていることを意味する。本発明に係る妊孕性検査・診断方法の検出工程において検出されるＰＧＡＭ４遺伝子の変異は、男性不妊との相関性が高い変異である。具体的には、以下に述べる４個の変異のうち、少なくとも1つを検出することにより、検出工程に用いられた生体サンプルを採取されたヒトが、妊孕させやすいか否か、不妊症であるとすでに診断されている場合には、不妊症の原因がＰＧＡＭ４遺伝子の変異によるものであるか否かを検査することができ、この検査結果を受けて、医師が妊孕性の診断を行うことができる。なお、「ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第Ｘ位の塩基」とは、「翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第Ｘ位の塩基」を意味する。
【００１７】
男性不妊との相関性が高い変異として、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第７５位のグアニンがシトシンンに置換している変異がある。この塩基置換によって、推定アミノ酸配列の第２５位のトリプトファンがシステインにコードされるようになる。
【００１８】
また、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第１３８位のアデニンがシトシンに置換している変異がある。当該第１３８位の塩基は、推定アミノ酸配列の第４６位のアルギニンをコードするものであるが、この塩基置換によっては、コードされるアミノ酸は変化せず、アルギニンのままである。
【００１９】
また、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第５３９位のグアニンがアデニンに置換している変異がある。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１８０位のアルギニンがヒスチジンにコードされるようになる。
【００２０】
本発明に係る妊孕性検査・診断方法においては、特に、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第７５位の塩基又は第５３９位の塩基を検出することが好ましい。より妊孕性との相関性が高いためである。また、本発明に係る妊孕性検査・診断方法においては、上記の変異のうち、１種類の変異を検出するものであってもよく、複数種類の変異を検出するものであってもよい。
【００２１】
本発明に係る妊孕性検査・診断方法は、これらの一塩基変異を、妊孕性の遺伝子マーカーとして用いるものである。たとえば、これらの塩基の変異が検出されなかった場合、検出工程に用いられた生体サンプルが回収された被験者は、妊孕性に問題がない可能性が高いと推定できる。また、被験者がすでに不妊症患者であると診断されている場合は、不妊症の原因が、ＰＧＡＭ４遺伝子の機能欠損以外のものによる可能性が高いと判定できる。一方、変異が検出された場合は、その被験者は、妊孕可能性が低いと推定される。したがって被験者が不妊症患者には、本発明の妊孕性検査・診断方法を使用することで、その原因がＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異に起因した、ＰＧＡＭ４分子の機能欠損が原因である可能性が高いと判定できる。したがって、そのような被験者に対して、たとえばＴＥＳＥ−ＩＣＳＩ（Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｓｐｅｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ−Ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｓｐｅｒｍ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；精巣生検−顕微授精）等の適切な処置を施すことにより、早期に疾患を治癒することができる。すなわち、本発明に係る妊孕性検査方法は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を目的とした検査方法ともいえるものであり、該方法の結果により、不妊症の診断を行う上で重要な情報が提供されるため、被験者に対して、現存の治療法の中から適格な選択を提示することができる。このため、本発明に係る妊孕性検査方法等は、低妊孕性又は不妊症の診断において好ましく用いることができる。
【００２２】
本発明に係る妊孕性検査・診断方法において用いられる生体サンプルは、ヒトから採取されたものであって、ＰＧＡＭ４遺伝子由来の核酸やタンパク質を含有することが期待できるサンプルであれば、特に限定されるものではなく、たとえば、血液、血清、血漿、頬の内側等の粘膜、精液、精巣生検によって被験者から採取した精巣内の組織（例えば精細管）、精子細胞、精漿等を挙げることができる。ここで、ＰＧＡＭ４遺伝子由来の核酸とは、ＰＧＡＭ４遺伝子のゲノムＤＮＡや、該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ等を意味する。また、ＰＧＡＭ４遺伝子由来のタンパク質とは、ＰＧＡＭ４遺伝子から発現されるタンパク質であるＰＧＡＭ４分子やその分解物等を意味する。特に、ＰＧＡＭ４遺伝子由来のタンパク質を検出対象とする場合には、生体サンプルとして、精液、精巣生検によって被験者から採取した精巣内の組織（例えば精細管）、精子細胞、精漿等を用いることが好ましい。精漿は、たとえ精子細胞を含んでいなくても、精子細胞が破壊等されることにより放出された、精子細胞で発現するタンパク質を含んでいると考えられている。
【００２３】
なお、生体サンプルを適宜希釈等することによりそのまま検出工程に用いてもよく、該生体サンプルから予め抽出したゲノムＤＮＡ等のＤＮＡを用いてもよい。また、該生体サンプルからｍＲＮＡ等のＲＮＡを抽出した後、逆転写反応により該ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを検出工程に用いてもよい。
【００２４】
本発明に係る妊孕性検査・診断方法の検出工程において、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異を検出する方法としては特に限定されず、遺伝子の変異や多型の検出等において用いられる公知の各種手法、たとえば、サンガー法を基礎とする塩基配列決定法、インベーダー法、Ｔａｑｍａｎプローブ法、ＳＭＭＤ法（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＭＡＳＡ法、及び塩基伸長法、並びにそれらを改変した方法等を用いることができる。検出感度及び精度に優れているため、インベーダー法やＴａｑｍａｎプローブ法等のように、変異部位を特異的に認識する塩基配列を有するプローブやプライマーを用いて検出する方法であることが好ましい。
【００２５】
ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異を検出するためのプローブやプライマーは、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子及びその周辺の塩基配列に基づき、常法により設計し、合成することができる。なお、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子及びその周辺の塩基配列は、たとえばＮＣＢＩヒトゲノムリソース（ＮＣＢＩ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｇｕｉｄｅ／ｈｕｍａｎ／）等の公知のデータベースから当業者であれば容易に入手することができる。
【００２６】
たとえば、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを用いて、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第７５位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１０１番目の塩基がグアニンからシトシンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第７５位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号３で表される塩基配列は、ＰＧＡＭ４遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第７５位の塩基に相当する。
【００２７】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを用いて、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第５３９位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号５で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がグアニンからアデニンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第５３９位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号５で表される塩基配列において、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号５で表される塩基配列は、ＰＧＡＭ４遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第５３９位の塩基に相当する。
【００２８】
同じく、ｍＲＮＡやこれから逆転写反応により得られるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを用いて、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第１３８位の塩基の変異の有無を検出するためのプライマー等としては、配列番号４で表される塩基配列において、１０１番目の塩基がアデニンからシトシンに置換されており、当該１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。また、当該第１３８位の塩基において、変異が生じていない野生型であることを検出するためのプライマー等として、同じく配列番号４で表される塩基配列において、１０１番目の塩基を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることができる。なお、配列番号４で表される塩基配列は、ＰＧＡＭ４遺伝子の部分塩基配列であって、１０１番目の塩基が、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第１３８位の塩基に相当する。
【００２９】
このように、上述する各変異の有無を検出するためのプライマー等としては、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の塩基配列（配列番号１で表される塩基配列）において、当該変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを、それぞれ用いることができる。また、ヒト野生型ＰＧＡＭ４遺伝子のゲノムＤＮＡにおいて、当該変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを、それぞれ用いることもできる。これらのポリヌクレオチドの長さとしては、１０〜７０塩基長であることが好ましく、１０〜５０塩基長であることがより好ましく、１０〜３０塩基長であることがさらに好ましい。なお、変異の有無の検出精度が改善されるため、該ポリヌクレオチド中、当該変異部位の塩基と対合し得る塩基の位置は特に限定されるものではないが、３’末端から１〜５塩基以内にあることが好ましく、３’末端にあることがより好ましい。
【００３０】
なお、ヒトの妊孕性を検査するためのキットであって、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬を含んでいる妊孕性検査キットを用いることにより、本発明に係る妊孕性検査・診断方法をより簡便に行うことができる。本発明に係る妊孕性検査キットとしては、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第７５位の塩基、第１３８位の塩基、又は第５３９位の塩基の変異を検出するための試薬を含んでいることが好ましく、第７５位の塩基又は第５３９位の塩基の変異を検出するための試薬を含んでいることがより好ましい。また、これらの変異のうちの、１種類の変異を検出するための試薬を含むキットであってもよく、複数種類の変異を検出するための試薬を含むキットであってもよい。
【００３１】
これらの塩基の変異を検出するための試薬としては、たとえば、当該塩基を含む核酸領域をＰＣＲ等により増幅させるためのプライマーの組と、得られた増幅産物の塩基配列を決定するための塩基配列決定試薬とを含んでいてもよい。該塩基配列決定試薬としては、たとえば、上述したヒト野生型ＰＧＡＭ４遺伝子の塩基配列又はその翻訳領域の塩基配列において、当該変異部位を含む１０〜１００の連続した塩基配列と、相同的又は相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを、予め蛍光色素等により標識したハイブリダイゼーションプローブ等が挙げられる。その他、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異を検出する方法がＰＣＲ−ＲＦＬＰ法である場合には、該ＲＦＬＰ法において用いられる制限酵素であってもよい。
【００３２】
また、本発明に係る妊孕性検査・診断方法及び妊孕性検査キットは、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出するものであれば、その態様は特に限定されるものではない。たとえば、上記妊孕性検査・診断方法及び妊孕性検査キットは、被験者のヒトＰＧＡＭ４遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていることを検出するものであってもよく、被験者のヒトＰＧＡＭ４遺伝子に、該遺伝子の機能欠損を引き起こす変異が含まれていないことを検出するものであってもよい。
【００３３】
より具体的には、一実施形態において、本発明に係る妊孕性検査・診断方法及び妊孕性検査キットは、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子内の領域のうち、上記の各変異部位（以下、「変異検出部位」という）の塩基を含む領域の塩基配列を決定することにより、上記の置換変異の有無を検出するものであってもよい。塩基配列の決定には、サンガー法やこれを応用した公知の各種手法を用いることができる。
【００３４】
この場合、妊孕性検査キットには、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の上記の変異検出部位を含む領域を増幅させるために、変異検出部位を挟むようにして設計されたプライマーの組が含まれることができる。このプライマーの組には、より詳細には、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の変異検出部位よりも上流の塩基配列の一部または全部を有するプライマーと、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の変異検出部位よりも下流の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列を有するプライマーとが含まれる。
【００３５】
被験者から採取された生体サンプルに含まれるゲノムＤＮＡを鋳型として上記のプライマーの組を用いてＰＣＲを行うことにより、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の変異検出部位の塩基を含む領域がＤＮＡフラグメントとして増幅され、さらに、上記のプライマーの組の一方又は両方のプライマーを用いて塩基配列の決定を行うことにより、置換変異の有無を確実かつ簡便に検出することができる。塩基配列の決定は、たとえば、ＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ.）等を取扱説明書に従って使用することにより、簡単に実施することができる。
【００３６】
また、ＤＮＡフラグメントの増幅のためのＰＣＲに用いられるプライマーとは別のプライマーを、塩基配列の決定に用いられるプライマーとして用いてもよい。すなわち、妊孕性検査キットには、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーの組と、塩基配列の決定に用いられるプライマーとを含んでいてもよい。
【００３７】
上記のＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーの組は、互いのプライマーによって挟まれる領域の長さが５ｋｂ以下であることが好ましく、３ｋｂ以下であることがより好ましく、２ｋｂ以下であることがさらに好ましく、１．５ｋｂ以下であることが特に好ましい。互いのプライマーによって挟まれる領域の長さを短くすることによって、上記の変異検出部位の塩基を含む領域の増幅を効果的に行うことができる。
【００３８】
また、塩基配列の決定に用いられるプライマーは、上記の変異検出部位の塩基から２ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．５ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．０ｋｂ以内の位置に設定されることがより好ましく、０．７ｋｂ以内の位置に設定されることが特に好ましい。上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
【００３９】
さらに、塩基配列の決定に用いるプライマーは、上記の変異検出部位の塩基から２０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが好ましく、３０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがより好ましく、４０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがさらに好ましく、５０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが特に好ましい。また、上記プライマーの組は、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の変異検出部位の塩基を含む２０ｂｐ以上の領域を増幅させるものであることが好ましい。プライマーの近傍は、塩基配列の決定結果が不正確になる傾向にあるが、上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
【００４０】
なお、それぞれのプライマーは、ＰＧＡＭ４遺伝子又はその周辺と同一の塩基配列、或いは相補的な塩基配列を少なくとも１０塩基以上有することが好ましく、１５塩基以上有することがより好ましく、１８塩基以上有することがさらに好ましく、２０塩基以上有することが特に好ましい。ＰＧＡＭ４遺伝子又はその周辺と同一の（或いは相補的な）塩基配列の長さを長くすることにより、ＰＧＡＭ４遺伝子の各変異部位のうちの少なくとも一方を含む目的の領域のみを確実に増幅させることができる。
【００４１】
上記のプライマーの組としては、たとえば、配列番号６で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号７で表される塩基配列からなるプライマーとからなる組を用いることができるが、本発明に用いることのできるプライマーの塩基配列がこの配列に限定されないことはいうまでもない。ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の塩基配列及びその周辺の塩基配列は、当業者であれば上述したヒトゲノムリソースやジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）から容易に入手することができるので、入手した塩基配列を基に、Ｏｌｉｇｏ（登録商標、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ.）又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発）等を用いてプライマーを設計することができる。
各プライマーは、たとえばホスホロアミダイト法等の公知の方法によって合成することができ、たとえばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ.の３９２型シンセサイザー等を取扱説明書に従って使用することによって簡単に合成することができる。
【００４２】
なお、上記の各プライマーには、蛍光標識が付されていてもよい。プライマーに蛍光標識が付されている場合、ダイプライマー法によって、放射性同位元素を用いることなく増幅領域の塩基配列を決定することができる。
一方、各プライマーに蛍光標識が付されていない場合、ダイターミネータ法によって塩基配列を決定することができる。この場合、上記妊孕性検査キットには、上記のプライマーの組に加えて、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの各単量体からなるデオキシリボ核酸、蛍光標識されＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの各単量体からなるジデオキシリボ核酸（所謂ダイターミネータ）、及びポリメラーゼ等がさらに含まれていてもよい。
【００４３】
一実施形態において、本発明に係る妊孕性検査・診断方法及び妊孕性検査キットは、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の上記の変異検出部位における塩基の置換変異の有無を、インベーダー法によって検出するものであってもよい。インベーダー法の詳細については、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖらによる論文（Lyamichev V et al., Nat biotechnol. 17, 292, 1999）に記載されており、本明細書ではこれを援用する。
【００４４】
図１は、インベーダー法の原理を説明する模式図である。インベーダー法では、非蛍光標識プローブのインベーダーオリゴ２及びアレルオリゴ３と、蛍光標識プローブのフレットプローブ５とが用いられる。
インベーダープローブ２は、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａと対応するように設計される（いずれの塩基とも相補的な塩基ではない）。一方、アレルオリゴ３は、ターゲット遺伝子１とは無関係な塩基配列であるフラップ３ｂと、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａに相補するように設計されたヌクレオチド３ａとが連結したものである。ここで、フラップ３ｂは、ヌクレオチド３ａの５’末端側に連結されている。
このように設計されたインベーダープローブ２とアレルオリゴ３をターゲット遺伝子１とハイブリダイゼーションさせると、ターゲット遺伝子１に対してアレルオリゴ３とインベーダープローブ２が重なり合った構造をとりながらハイブリダイズし、変異検出部位１ａにおいてインベーダープローブ２がアレルオリゴ３の下に１塩基のみ侵入する。すると、フラップエンドヌクレアーゼ（「クリアベース（ｃｌｅａｖａｓｅ）」ともいう）４がこの侵入構造を認識し、アレルオリゴ３を重なった塩基の３’側で切断する。その結果、フラップ３ｂと変異検出部位とが連結したフラップ遊離体３ｃが生成される。
フレットプローブ５は、５’末端側が自身とハイブリダイゼーションでき、かつ、３’末端側がフラップ３ｂとハイブリダイゼーションできるヌクレオチド５ａと、蛍光色素５ｂと、クエンチャー（発光抑制体）５ｃとからなる。ここで、ヌクレオチド５ａは、 ３’末端がフラップ遊離体３ｃと相補的な塩基配列となっている。また、蛍光色素５ｂは、ヌクレオチド５ａの５’末端に結合している。ただし、フレットプローブ５においては、クエンチャー５ｃにより蛍光色素５ｂの蛍光が抑制されている。
このようなフレットプローブ５に対してフラップ遊離体３ｃがハイブリダイゼーションすると、フラップ遊離体３ｃの変異検出部位について、再び３進入構造が形成される。その結果、上述のフラップエンドヌクレアーゼ４がこの侵入構造を再び認識し、フレットプローブ５の５’末端部分が切断される。その結果、フレットプローブ５の５’末端に結合していた蛍光色素５ｂが遊離し、蛍光が生じる。
【００４５】
従って、本発明に係る妊孕性検査・診断方法及び妊孕性検査キットは、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無をインベーダー法により検出するものであってもよい。この場合、妊孕性検査キットには、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、インベーダープローブ２、アレルオリゴ３及びフレットプローブ５等が含まれることが好ましい。
【００４６】
置換変異が有る場合に蛍光が生じるようにする場合には、インベーダープローブ２は、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基が変異型ＰＧＡＭ４遺伝子の各変異型塩基と対応するように設計される（但し、相補的でない）。また、アレルオリゴ３のヌクレオチド３ａは、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基が変異型ＰＧＡＭ４遺伝子の上記の変異型塩基と相補するように設計される。そして、フレットプローブ５は、上記インベーダープローブ２及び上記アレルオリゴ３が変異型ＰＧＡＭ４遺伝子とハイブリダイズしてインベーダープローブ２による侵入構造が形成された場合にフラップエンドヌクレアーゼ４によって切断されるフラップ遊離体３ｃを検出できるように設計される。
上記の構成により、被験者のＰＧＡＭ４遺伝子において上記の塩基が変異型置換している場合は、ターゲット遺伝子にハイブリダイズしたヌクレオチド３ａの５’末端にインベーダープローブ２の３’末端が侵入することにより、ヌクレオチド３ｃが切り出されて蛍光が生じる。一方、被験者のＰＧＡＭ４遺伝子が野生型である場合は、インベーダープローブ２の末端部分による侵入構造が形成されないのでヌクレオチド３ｃが切り出されないため蛍光が生じない。
【００４７】
また、上記の例では、被験者の有するＰＧＡＭ４遺伝子が置換変異型の場合に蛍光が生じる構成としたが、本発明はこれに限定されず、被験者の有するＰＧＡＭ４遺伝子が野生型の場合に蛍光が生じ、置換変異型の場合に蛍光が抑制される構成としてもよく、或いは野生型と変異型で異なった蛍光色素を使用するなど様々に改変することができる。
なお、上記の各方法において、ＰＧＡＭ４遺伝子のセンス鎖（コドンをコードする側の鎖）を調べることによって置換変異の有無を判定する構成について詳細に説明したが、アンチセンス鎖を調べることによっても同様に判定することができるのはいうまでもない。
【００４８】
本発明に係る妊孕性検査・診断方法及び妊孕性検査キットは、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無をタンパク質レベルで検出するものであってもよい。すなわち、本発明に係る検出方法及び妊孕性検査キットは、ヒトにおいて、正常なヒトＰＧＡＭ４タンパク質が発現しているか否かを判定するものであってもよく、異常なヒトＰＧＡＭ４タンパク質が発現しているか否かを判定するものであってもよい。ここで、正常タンパク質とは、ヒト野生型ＰＧＡＭ４ポリペプチドであり、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを意味する。一方、異常タンパク質とは、たとえば、ヒト野生型ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、一塩基置換変異等の変異が生じているポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとは異なるポリペプチドを意味する。具体的には、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒト野生型ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の塩基配列（配列番号１で表される塩基配列）からなるポリヌクレオチドにおいて、第７５位の塩基がシトシンに置換された塩基配列、又は第５３９位の塩基がチミンに置換された塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチドである。
【００４９】
なお、生体サンプル中に含まれているヒトＰＧＡＭ４タンパク質が正常タンパク質か異常タンパク質かを検出する方法としては、特に限定されるものではないが、たとえば、ヒトＰＧＡＭ４タンパク質の正常タンパク質と異常タンパク質のいずれか一方のみを認識する抗体を用いることにより、生体サンプル中に含まれているヒトＰＧＡＭ４タンパク質が正常タンパク質か異常タンパク質かを検出することができる。また、本発明に係る妊孕性検査キットに含まれるヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ヒトＰＧＡＭ４の異常タンパク質と結合し、かつ、正常タンパク質と結合しないことを特徴とする抗体を用いてもよい。なお、このような抗体は、ヒトＰＧＡＭ４の異常タンパク質を抗原として、常法により作製したポリクローナル抗体やモノクローナル抗体の中から、ヒトＰＧＡＭ４の正常タンパク質と交差しないものを選択することにより、作製することができる。
【００５０】
このような抗体は、具体的には、上述した第７５位もしくは第５３９位のアミノ酸の置換変異を含むヒト変異型ＰＧＡＭ４ポリペプチド又は変異部分を含むそのフラグメントを抗原として、実験動物を免疫処置することにより製造することができる（たとえば、Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910-914；Francis, M. J. et al., J. Gen. Virol. 66: 2347-2354 (1985)を参照のこと。）
一般的には、動物は遊離ペプチドによって免疫化することができる。ただし、遊離ペプチドを高分子キャリア（たとえば、ヒーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキシド）にカップリングすることによって効率的に免疫化できるようになる場合もある。たとえば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーによってキャリアにカップリングすることができる。一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングすることができる。
ウサギ、ラット及びマウスのような動物は、遊離ペプチドまたはキャリア−カップリングペプチドと、Ｆｒｅｕｎｄのアジュバントとを含むエマルジョンを腹腔内及び／または皮内に注射することにより免疫化することができる。ＥＬＩＳＡにより検出できる程度に有用な力価の抗ペプチド抗体を得るためには、約２週間の間隔で追加免疫注射を行うことが望ましい。
そして、免疫化された動物から血液を採取し、血清からＩｇＧ画分を抽出することにより抗体を得ることができる。また、抗体を公知の技術によって精製することにより、抗体の力価が向上する。
本発明に係る抗体は、上述したヒト変異型ＰＧＡＭ４ポリペプチドに結合する一方で、ヒト野生型ＰＧＡＭ４ポリペプチドには結合しないものである。それゆえ、上記の手順によって得られた抗体のうち、ヒト野生型ＰＧＡＭ４タンパク質と結合しないものを選出することによって、本発明に係る抗体を得ることができる。上記の選出を容易にするためには、動物に注射する抗原ペプチドとして、ヒト変異型ＰＧＡＭ４ポリペプチドの変異部分とその周辺のアミノ酸配列からなる１０残基程度のオリゴペプチドを選択することが望ましい。
【００５１】
このように、一実施形態において、本発明に係る妊孕性検査・診断方法及び妊孕性検査キットは、上述した各変異のうち、第７５位もしくは第５３９位の少なくとも一の塩基置換を含むヒト変異型ＰＧＡＭ４遺伝子によってコードされるヒト変異型ＰＧＡＭ４タンパク質と結合し、かつ、ヒト野生型ＰＧＡＭ４タンパク質と結合しない抗体を用いて、ヒトから採取された生体サンプル中にヒト変異型ＰＧＡＭ４タンパク質が発現しているかを判定するものであってもよい。
上記抗体を用いてヒト変異型ＰＧＡＭ４タンパク質が発現しているか否かを調べ、被験者においてヒト変異型ＰＧＡＭ４タンパク質が発現されていると判定された場合は、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子に上述した置換変異が生じていることが強く示唆され、同時に、その被験者は、妊孕可能性が低い、あるいは不妊症の可能性が高いと推定することができる。また、被験者が不妊症の場合は、不妊症の原因がヒトＰＧＡＭ４遺伝子の異常に起因していると推定することができる。
【００５２】
また、他の実施形態において、本発明に係る検出方法及び妊孕性検査キットは、ヒトにおいて正常なヒトＰＧＡＭ４タンパク質が発現しているか否かを判定するものであってもよく、正常なヒトＰＧＡＭ４タンパク質の発現量の多寡を判定するものであってもよい。
より具体的には、本発明に係る妊孕性診断方法の検出工程が、ヒト野生型ＰＧＡＭ４タンパク質と結合し、かつ、異常ヒトＰＧＡＭ４タンパク質と結合しないことを特徴とする抗体を用いることにより、生体サンプル中にヒト野生型ＰＧＡＭ４タンパク質が存在しているか否かを検出するものであってもよい。また、本発明に係る妊孕性診断キットに含まれるヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、ヒト野生型ＰＧＡＭ４タンパク質と結合し、かつ、異常タンパク質と結合しないことを特徴とする抗体（抗ＰＧＡＭ４抗体）を用いてもよい。
抗ＰＧＡＭ４抗体を用いてヒトＰＧＡＭ４タンパク質の発現の有無や発現量を調べ、被験者においてヒトＰＧＡＭ４タンパク質が発現していないと判定された場合や、ヒトＰＧＡＭ４タンパク質の発現量が遺伝子変異が生じていない被験者よりも少ないと判定された場合には、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子が欠失または変異していることが示唆され、同時に、その被験者は、妊孕可能性が低い、あるいは不妊症の可能性が高いと推定することができる。また、被験者が不妊症の場合には、不妊症の原因が正常なヒトＰＧＡＭ４タンパク質が発現していないことによるものと推定することができる。
【００５３】
抗体を用いて、生体サンプル中のヒト野生型ＰＧＡＭ４タンパク質またはヒト変異型ＰＧＡＭ４タンパク質を検出する手法は、特に限定されず、公知のいずれの手法を用いてもよい。たとえば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）等が挙げられる。
妊孕性診断キットがウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡを利用する妊孕性診断方法に好適なキットである場合、妊孕性診断キットには、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子の欠損又は変異の有無を検出するための試薬として、抗ヒト野生型ＰＧＡＭ４タンパク質抗体又は抗ヒト変異型ＰＧＡＭ４抗体に加えて、発色反応に必要なペルオキシダーゼ等の特異的酵素で標識した抗グロブリン抗体が含まれていてもよい。
【００５４】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例１】
【００５５】
本実施例においては、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子配列を解析し、ヒトＰＧＡＭ４遺伝子に男性不妊症に関連した変異の検出を行った。
［解析対象者］
非閉塞性不妊症の日本人男性被験者（Ｎ＝３８３）を、精子形成の欠損の程度に基づいてサブグループに分割した。これらの不妊症被験者のうち、１３％は非閉塞性無精子症であり、３１％は重症精子過少症（＜５×１０６細胞／ｍＬ）であり、３３％が運動無力症であり、残り２３％が形態的に異常のないものであった。遺伝的要因を調べたところ、これらの被験者は何れも原発性特発性不妊症であった（Guideline for sperm donation. Fertil Steril. 2004: 82(suppl 1): S9 -S12）。コントロール群（Ｎ＝２５１）は産婦人科医院にいる妊婦のもとに生まれた子供の父親であり、妊孕性が確認された男性とした。全ての提供者からは、サンプルがゲノムＤＮＡ解析に使用される旨のインフォームドコンセントを取得した（大阪大学病院泌尿器科）。【００５６】
［変異スクリーニング］
以下の各工程では、特に断りがない限り、常法又はキットに添付されている取扱説明書に従って各処理を行った。
ゲノムＤＮＡは、プロテアーゼ処理とフェノール抽出により血液サンプル又は精液サンプルから単離し調製した（Sambrook J et al., Isolation of DNA from Mammalian Cells. New York: Cold Spring Harbor Press. 1989: pp. 9.16-9.21）。血液由来ゲノムＤＮＡはＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて増幅したＤＮＡを使用した。
ＰＧＡＭ４遺伝子のタンパク質をコードする翻訳領域を含むＤＮＡを、表１に示したプライマーＦ及びプライマーＲを用いて、表２に示したＰＣＲ反応条件に従って増幅した。
なお、プライマーＦは、５’末端の塩基が、ＰＧＡＭ４遺伝子の塩基配列において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基とした場合の第−９８位の塩基とハイブリダイズするように設計されたプライマーである。一方、プライマーＲは、５’末端の塩基が、ＰＧＡＭ４遺伝子の塩基配列において、翻訳開始コドンのアデニンを第１位の塩基とした場合の第８５０位の塩基とハイブリダイズするように設計されたプライマーである。【００５７】
【表１】
2010106788.tif 000003
【００５８】
【表２】
2010106788.tif 000004
【００５９】
得られたＰＣＲ増幅フラグメントを、ＡＭＰｕｒｅ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にて精製した。この精製されたＰＣＲ増幅フラグメントを鋳型とし、当該アンプリコンを増幅した際に使用したプライマーを用いて、シーケンシング反応を行った。具体的には、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行い、ＣｌｅａｎＳＥＱ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にて精製した反応産物をＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ  ３７３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）によって解析した。両方向の決定結果を比較し、塩基配列を決定した。【００６０】
［シークエンス解析結果］
不妊症被験者及び妊孕性確認被験者のそれぞれについて、プライマーＦとＲで増幅されるアンプリコンの塩基配列を解析したところ、表３に示すように、置換変異が合計４個検出された。
このうち、アミノ酸の変化を伴う置換変異は２個であり、このうちの１個は妊孕性確認被験者にも検出されたが、残る１個は妊孕性確認被験者からは全く検出されなかった。また、妊孕性確認被験者からも検出された２個の置換変異のうちの１個は、不妊症被験者に有意に多かった。
一方、アミノ酸の変化を伴わない２個の置換変異のうち、１個は妊孕性確認被験者にも検出されたが、残る１個は妊孕性確認被験者からは全く検出されなかった。
これらの結果から、妊孕性確認被験者からは全く検出されなかった２個の置換変異と、不妊症被験者に有意に多かった１個の置換変異が、妊孕性との相関性があることが確認された。以下、この３個の置換変異について、それぞれ説明する。【００６１】
【表３】
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【００６２】
ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第１３８位のアデニンが両方のアレルにおいてシトシンに置換している被験者が、不妊症被験者３８１人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第４６位のアルギニンは変わらない。この置換変異は、妊孕性確認被験者２４９人には見出されなかった。【００６３】
ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第７５位のグアニンが両方のアレルにおいてシトシンに置換している被験者が、不妊症被験者３７６人の中に１７人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第２５位のトリプトファンがシステインにコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者２４１人のうち、両方のアレルにおいてシトシンに置換している被験者が３人見出された。【００６４】
また、ＰＧＡＭ４遺伝子の翻訳領域の第５３９位のグアニンが両方のアレルにおいてアデニンに置換している被験者が、不妊症被験者３８３人の中に１人見出された。この塩基置換によって推定アミノ酸配列の第１８０位のアルギニンがヒスチジンにコードされるようになる。この置換変異は、妊孕性確認被験者２５１人には見出されなかった。【００６５】
これらの置換変異の中でも、特に、第７５位の塩基の置換変異の出現率が高く、男性不妊症との相関性が高かった。【００６６】
上記の置換変異が見出された被験者は、正常なＰＧＡＭ４のタンパク質の翻訳量が低減したことにより、ＰＧＡＭ４タンパク質の働きが不十分になって不妊症になったものと推測された。なお、妊孕性確認被験者では全く検出されなかったアミノ酸置換を伴わない置換変異（第１３８位の置換変異）は、転写産物の安定性や翻訳効率に影響を与えるか、或いは他の変異とリンクした変異である可能性がある。【００６７】
本研究により、上記の置換変異以外にも一塩基多型がＰＧＡＭ４遺伝子内に見出されたが、これらの一塩基多型は、そのパターンが不妊症被験者と妊孕性確認被験者との間で有意な相違を見せず、特に妊孕性に影響を与えるものとは認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明に係る妊孕性検査・診断方法等を用いることにより、ヒトの妊孕可能性の推定や、不妊症の原因の同定を行うことができ、妊症の現象解明や治療法の確立並びに不妊症の診断に有用なツールが提供されるので、製薬分野や医療分野において本発明を好適に利用することができる。たとえば、本発明であるPGAM4遺伝子の他に、既知の発明であるSCOT-ｔ遺伝子（特許第4229973号）、PRM２遺伝子（特許第4276691）、TP遺伝子（特開2007-089409）、Centrin1遺伝子（特開2008-237114）、TSSK遺伝子（特開2008-067649）、Meisetz遺伝子（特開2009-065882）の遺伝子変異やSNPを同時に調べることにより、日本人男性不妊症の10％以上の男性不妊症原因遺伝子を明らかにすることができる。男性の不妊症の原因に性染色体異常（Y染色体変異）が知られており、その出現頻度は5−10％であるが、先進国において男性不妊症患者の原因診断として性染色体異常の検査がルーティーンに行われている。この現状を考えると、本発明を含むキットは10％以上の男性不妊症の原因遺伝子を同定でき、科学的根拠に基づいた不妊症治療法の選択や患者のカウンセリングのために、臨床現場での有用なツールとしてルーティーンに利用されることが期待される。
【符号の説明】
【００６９】
１…ターゲット遺伝子、１ａ…変異（又は一塩基多型）検出部位、２…インベーダーオリゴ、３…アレルオリゴ、３ａ…ヌクレオチド、３ｂ…フラップ、３ｃ…フラップ遊離体、４…フラップエンドヌクレアーゼ、５…フレットプローブ、５ａ…ヌクレオチド、５ｂ…蛍光色素、５ｃ…クエンチャー（発光抑制体）。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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