(57)【要約】本発明は、生体組織から多能性幹細胞を直接得る方法の提供及びそのようにして得られた多能性幹細胞の提供を目的としており、本発明は、生体組織から単離できるＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織から単離できるＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞。
【請求項２】
ＣＤ１０５陽性の請求項１記載の多能性幹細胞。
【請求項３】
ＣＤ１１７陰性及びＣＤ１４６陰性の請求項１又は２に記載の多能性幹細胞。
【請求項４】
ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＮＧ２陰性、ＣＤ３４陰性、ｖＷＦ陰性及びＣＤ２７１陰性の請求項１又は２に記載の多能性幹細胞。
【請求項５】
ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＣＤ２７１陰性、ＮＧ２陰性、ｖＷＦ陰性、Ｓｏｘ１０陰性、Ｓｎａｉ１陰性、Ｓｌｕｇ陰性、Ｔｙｒｐ１陰性及びＤｃｔ陰性の請求項１又は２に記載の多能性幹細胞。
【請求項６】
テロメラーゼ活性が低いか又は無い、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多能性幹細胞。
【請求項７】
三胚葉に分化する能力を持つ、請求項１〜６のいずれか１項に記載の多能性幹細胞。
【請求項８】
腫瘍性増殖を示さない、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多能性幹細胞。
【請求項９】
セルフリニューアル能を持つ、請求項１〜８のいずれか１項に記載の多能性幹細胞。
【請求項１０】
ストレス耐性である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の多能性幹細胞。
【請求項１１】
貪食能が高い、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の多能性幹細胞。
【請求項１２】
以下に示す２２個のオドラント受容体の少なくとも一つが陽性の請求項１〜１１のいずれか１項に記載の多能性幹細胞：
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ８，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｇ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ８Ｇ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ７，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｇ，ｍｅｍｂｅｒ  ３（ＯＲ７Ｇ３）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ４，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｄ，ｍｅｍｂｅｒ  ５（ＯＲ４Ｄ５）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ５，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ＡＰ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ５ＡＰ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  １０，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｈ，ｍｅｍｂｅｒ  ４（ＯＲ１０Ｈ４）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  １０，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｔ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ１０Ｔ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｍ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ２Ｍ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｔ，ｍｅｍｂｅｒ  ５（ＯＲ２Ｔ５）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ７，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｄ，ｍｅｍｂｅｒ  ４（ＯＲ７Ｄ４）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  １，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｌ，ｍｅｍｂｅｒ  ３（ＯＲ１Ｌ３）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ４，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｎ，ｍｅｍｂｅｒ  ４（ＯＲ４Ｎ４）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ，ｍｅｍｂｅｒ  ７（ＯＲ２Ａ７）；
ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ），ａｌｐｈａ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｔｙｐｅ（ＧＮＡＬ）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ６，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ６Ａ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｂ，ｍｅｍｂｅｒ  ６（ＯＲ２Ｂ６）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｃ，ｍｅｍｂｅｒ  １（ＯＲ２Ｃ１）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ５２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ，ｍｅｍｂｅｒ  １（ＯＲ５２Ａ１）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  １０，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｈ，ｍｅｍｂｅｒ  ３（ＯＲ１０Ｈ３）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  １０，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｈ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ１０Ｈ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ５１，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｅ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ５１Ｅ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ５，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｐ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ５Ｐ２）；及び
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  １０，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｐ，ｍｅｍｂｅｒ  １（ＯＲ１０Ｐ１）。
【請求項１３】
以下に示す５個のケモカイン受容体の少なくとも一つが陽性の請求項１〜１２のいずれか１項に記載の多能性幹細胞：
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５（ＣＣＲ５）；
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４（ＣＸＣＲ４）；
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １（ＣＣＲ１）；
Ｄｕｆｆｙ  ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ，ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＤＡＲＣ）；及び
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ７（ＣＸＣＲ７）。
【請求項１４】
中胚葉系組織または間葉系組織由来である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の多能性幹細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の多能性幹細胞を含む細胞塊または細胞画分。
【請求項１６】
生体組織から、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）の特性の少なくとも１つの特性を指標に多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法：
（ｉ）  ＳＳＥＡ−３陽性；
（ｉｉ）  ＣＤ１０５陽性；
（ｉｉｉ）  ＣＤ１１７陰性及びＣＤ１４６陰性；
（ｉｖ）  ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＮＧ２陰性、ＣＤ３４陰性、ｖＷＦ陰性及びＣＤ２７１陰性；
（ｖ）  ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＣＤ２７１陰性、ＮＧ２陰性、ｖＷＦ陰性、Ｓｏｘ１０陰性、Ｓｎａｉ１陰性、Ｓｌｕｇ陰性、Ｔｙｒｐ１陰性及びＤｃｔ陰性；並びに
（ｖｉ）  テロメラーゼ活性が低いか又は無い。
【請求項１７】
生体組織由来細胞を細胞ストレスに暴露し生き残った細胞を回収することを含む多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法。
【請求項１８】
細胞ストレスが、プロテアーゼ処理、低酸素条件下での培養、低リン酸条件下での培養、血清飢餓状態での培養、糖飢餓状態での培養、放射線曝露下での培養、熱ショックへの曝露下での培養、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養及び圧力処理下での培養から選択される、請求項１７に記載の多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法。
【請求項１９】
細胞ストレスが、トリプシン処理である、請求項１８に記載の多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法。
【請求項２０】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の派生細胞又は誘導細胞である多能性幹細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の派生細胞又は誘導細胞である分化した細胞。
【請求項２２】
請求項１〜１４及び２０のいずれか１項に記載の多能性幹細胞を含む医薬組成物。
【請求項２３】
請求項２１に記載の分化した細胞を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体組織由来の多能性幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラナリアやイモリは体の一部を切断された後でも体を再生し得る。これらの、高い再生能力は、間葉系に存在する多能性幹細胞（ａｄｕｌｔ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）の存在によっている。一方、ヒトなどの高等生物においては、組織再生能はこれらの動物に比較してはるかに低い。胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ：Ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ）は、多能性細胞の集まりと認識されており、外胚葉、中胚葉、内胚葉系の細胞に分化する能力を持つ。しかしながら、発生が進むと共にこのような多能性が制限されていき、組織に特化した細胞に分化していく。
近年、組織再生に貢献し得る成人幹細胞又は組織幹細胞が注目されている。しかし、哺乳類の成体に、プラナリアやイモリのように多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞が存在するか否かは不明であった。
成体から得られる分化能を有する細胞として、例えば骨、軟骨、脂肪細胞、神経細胞、骨格筋等への分化能を有する骨髄間葉系細胞画分（ＭＳＣ：Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）が報告されている（非特許文献１及び２を参照）。しかしながら、骨髄間葉系細胞画分は様々な細胞を含む細胞群であり、その分化能は多様でありながら本体がはっきりせず、また特定の細胞に分化させるために特定の化合物による刺激や遺伝子導入等が必要であり、分化誘導システムを構築する必要があった。
さらに、成体由来の多能性幹細胞としてｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（特許文献１、特許文献２、非特許文献３等を参照）が報告されていた。しかしながら、ｉＰＳ細胞の樹立には、間葉系細胞である皮膚線維芽細胞画分（ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）に特定の遺伝子や特定の化合物を体細胞に導入するという特定の物質を用いた誘導操作が必要であった。
【特許文献１】特許第４１８３７４２号公報
【特許文献２】特開２００８−３０７００７号公報
【非特許文献１】Ｍ．ＤＥＺＡＷＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１１３，１２，ｐｐ．１７０１−１７１０，（２００４）
【非特許文献２】Ｍ．ＤＥＺＡＷＡ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ，２００５  Ｊｕｌｙ  ８，３０９，ｐｐ．３１４−３１７，（２００５）
【非特許文献３】Ｏｋｉｔａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．ＳＣＩＥＮＣＥ，２００８  Ｎｏｖ  ７，３２２（５９０３），ｐｐ．９４９−９５３
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、生体組織から多能性幹細胞を直接得る方法の提供及びその方法により得られた多能性幹細胞の提供を目的とする。
本発明者らは、骨髄間葉系細胞画分（ＭＳＣ：Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）についての研究過程において、無処理のヒトＭＳＣ細胞から極めて低い頻度で特徴的な細胞塊が形成されることを見出した。初期の細胞塊の外見はＥＳ細胞に酷似していた。しかしながら、ＥＳ細胞とは異なり無限増殖をせずに、ある一定の期間である大きさに到達すると増殖が停止し、さらに毛、色素細胞などの種々の細胞を含む不均一な集団となった。また、この細胞塊について免疫細胞化学（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を行ったところ、外胚葉、中胚葉及び内胚葉マーカーにそれぞれ陽性の細胞が細胞塊内に混在して検出された。本発明者らは、この結果より、無処理の通常に維持・培養されている（ｎａｉｖｅ）ヒトＭＳＣ細胞画分中に多能性細胞に相当する細胞が存在する可能性を考え、さらに鋭意検討を行った。
生体がストレスに曝されたり、傷害を受けると休眠状態の組織幹細胞が活性化され、組織再生に寄与することが知られている。本発明者は、骨髄間葉系細胞画分や皮膚線維芽細胞画分等の間葉系細胞又は中胚葉系細胞を培養している際に種々の方法でストレス刺激を与え（例えば、無血清培養、Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）による培養、低酸素培養、トータル３時間の間欠的短時間トリプシン培養、８時間若しくは１６時間の長時間のトリプシン培養等）、生存している細胞を集め、メチルセルロース（ＭＣ）含有培地中で浮遊培養（ＭＣ培養という）を行った。その結果、最大直径１５０μｍまでの種々の大きさの胚様体様（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ）細胞塊の形成が認められた。特に長時間のトリプシン処理を行ったヒト皮膚線維芽細胞画分及びヒトＭＳＣ画分において、最も多くの胚様体様細胞塊の形成率が認められた。
本発明者らは、得られた胚様体様細胞塊中の細胞の特性を調べ、該細胞が多能性幹細胞の特性を有していることを見出した。さらに、本発明者らは、得られた胚様体様細胞塊中の細胞が従来報告されていた多能性幹細胞が有しない特性を有することを見出し、さらに、得られた細胞塊中の細胞の発現タンパク質を調べ、従来報告されていたＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞とは異なる発現パターンを示すことを見出した。
本発明者らは、さらに上記多能性幹細胞の表面抗原としてＳＳＥＡ−３が発現していることを見出し、ＳＳＥＡ−３の発現を指標に上記多能性幹細胞を生体組織からも単離し得ることを見出した。
本発明者らは、上記多能性幹細胞は、新規な多能性幹細胞であり、従来報告されていたＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞と異なり、生体組織から誘導操作なしに、直接得られる多能性幹細胞であることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明者らは、該多能性幹細胞をＭｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｅｎｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）と名付けた。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  生体組織から単離できるＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞。
該多能性幹細胞は、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞等の生体組織の培養物からも単離することができ、また単一細胞として単離することができる。
［２］  ＣＤ１０５陽性の［１］の多能性幹細胞。
［３］  ＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ）陰性及びＣＤ１４６陰性の［１］又は［２］の多能性幹細胞。
［４］  ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＮＧ２陰性、ＣＤ３４陰性、ｖＷＦ陰性及びＣＤ２７１陰性の［１］又は［２］の多能性幹細胞。
［５］  ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＣＤ２７１陰性、ＮＧ２陰性、ｖＷＦ陰性、Ｓｏｘ１０陰性、Ｓｎａｉ１陰性、Ｓｌｕｇ陰性、Ｔｙｒｐ１陰性及びＤｃｔ陰性の［１］又は［２］の多能性幹細胞。
［６］  テロメラーゼ活性が低いか又は無い、［１］〜［５］のいずれかの多能性幹細胞。
［７］  三胚葉に分化する能力を持つ、［１］〜［６］のいずれかの多能性幹細胞。
本発明の多能性幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの接着培養で三胚葉に分化する能力を有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導培養することにより、皮膚、肝、神経、筋、骨、脂肪等に分化し得る。また、ｉｎ  ｖｉｖｏで精巣に移植した場合にも三胚葉に分化する能力を有する。さらに、静注により生体に移植することで損傷を受けた臓器（皮膚、脊髄、肝、筋肉等）に生着し分化する能力を有する。
［８］  腫瘍性増殖を示さない、［１］〜［７］のいずれかの多能性幹細胞。
本発明の多能性幹細胞は、浮遊培養で増殖速度約１．３日で増殖するが１０日間程度で増殖が止まるという性質を有し、さらに精巣に移植した場合少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。
［９］  セルフリニューアル能を持つ、［１］〜［８］のいずれかの多能性幹細胞。
本発明の多能性幹細胞は、浮遊培養と接着培養の操作を繰り返すことにより増殖させることができる。また、本発明の多能性幹細胞は他の体性幹細胞と同じく、非対称分裂をする。
［１０］  ストレス耐性である、［１］〜［９］のいずれかの多能性幹細胞。
［１１］  貪食能が高い、［１］〜［１０］のいずれかの多能性幹細胞。
［１２］  以下に示す２２個のオドラント受容体の少なくとも一つが陽性の［１］〜［１１］のいずれかの多能性幹細胞：
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ８，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｇ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ８Ｇ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ７，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｇ，ｍｅｍｂｅｒ  ３（ＯＲ７Ｇ３）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ４，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｄ，ｍｅｍｂｅｒ  ５（ＯＲ４Ｄ５）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ５，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ＡＰ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ５ＡＰ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  １０，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｈ，ｍｅｍｂｅｒ  ４（ＯＲ１０Ｈ４）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  １０，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｔ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ１０Ｔ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｍ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ２Ｍ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｔ，ｍｅｍｂｅｒ  ５（ＯＲ２Ｔ５）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ７，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｄ，ｍｅｍｂｅｒ  ４（ＯＲ７Ｄ４）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  １，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｌ，ｍｅｍｂｅｒ  ３（ＯＲ１Ｌ３）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ４，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｎ，ｍｅｍｂｅｒ  ４（ＯＲ４Ｎ４）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ，ｍｅｍｂｅｒ  ７（ＯＲ２Ａ７）；
ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ），ａｌｐｈａ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｔｙｐｅ（ＧＮＡＬ）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ６，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ６Ａ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｂ，ｍｅｍｂｅｒ  ６（ＯＲ２Ｂ６）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｃ，ｍｅｍｂｅｒ  １（ＯＲ２Ｃ１）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ５２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ，ｍｅｍｂｅｒ  １（ＯＲ５２Ａ１）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  １０，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｈ，ｍｅｍｂｅｒ  ３（ＯＲ１０Ｈ３）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  １０，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｈ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ１０Ｈ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ５１，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｅ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ５１Ｅ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ５，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｐ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ５Ｐ２）；及び
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  １０，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｐ，ｍｅｍｂｅｒ  １（ＯＲ１０Ｐ１）。
［１３］  以下に示す５個のケモカイン受容体の少なくとも一つが陽性の［１］〜［１２］のいずれかの多能性幹細胞：
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５（ＣＣＲ５）；
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４（ＣＸＣＲ４）；
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １（ＣＣＲ１）；
Ｄｕｆｆｙ  ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ，ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＤＡＲＣ）；及び
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ７（ＣＸＣＲ７）。
［１４］  中胚葉系組織または間葉系組織由来である、［１］〜［１３］のいずれかの多能性幹細胞。
［１５］  ［１］〜［１４］のいずれかの多能性幹細胞を含む細胞塊または細胞画分。
［１６］  生体組織から、以下の（ｉ）〜（ｖｉ）の特性の少なくとも１つの特性を指標に多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法：
（ｉ）  ＳＳＥＡ−３陽性；
（ｉｉ）  ＣＤ１０５陽性；
（ｉｉｉ）  ＣＤ１１７陰性及びＣＤ１４６陰性；
（ｉｖ）  ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＮＧ２陰性、ＣＤ３４陰性、ｖＷＦ陰性及びＣＤ２７１陰性；
（ｖ）  ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＣＤ２７１陰性、ＮＧ２陰性、ｖＷＦ陰性、Ｓｏｘ１０陰性、Ｓｎａｉ１陰性、Ｓｌｕｇ陰性、Ｔｙｒｐ１陰性及びＤｃｔ陰性；並びに
（ｖｉ）  テロメラーゼ活性が低いか又は無い。
［１７］  生体組織由来細胞を細胞ストレスに暴露し生き残った細胞を回収することを含む多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法。
［１８］  細胞ストレスが、プロテアーゼ処理、低酸素条件下での培養、低リン酸条件下での培養、血清飢餓状態での培養、糖飢餓状態での培養、放射線曝露下での培養、熱ショックへの曝露下での培養、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養及び圧力処理下での培養から選択される、［１７］の多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法。
［１９］  細胞ストレスが、トリプシン処理である、［１８］の多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法。
［２０］  ［１］〜［１４］のいずれかの多能性幹細胞の派生細胞又は誘導細胞である多能性幹細胞。
該派生細胞又は誘導細胞として、例えば、遺伝子の導入や、化合物を添加により誘導した細胞が挙げられる。また、本発明の幹細胞由来のｉＰＳ細胞が挙げられる。
［２１］  ［１］〜［１４］のいずれかの多能性幹細胞の派生細胞又は誘導細胞である分化した細胞。
［２２］  ［１］〜［１４］及び［２０］のいずれかの多能性幹細胞を含む医薬組成物。
［２３］  ［２１］の分化した細胞を含む医薬組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎である米国仮出願６１／２１３，７８８号及び米国仮出願６１／２９０，１５９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１−１は、間葉系細胞画分、Ｍｕｓｅ細胞及びＭｕｓｅ細胞由来の胚様体様細胞塊の関係を示す図である。図１に示すように、ＳＳＥＡ−３陽性細胞を直接分離し、長時間のストレスをかけることなく浮遊培養することによりＭｕｓｅ細胞由来の肛様体様細胞塊を得ることができる。
図１−２は、Ｍｕｓｅ細胞を大量に増殖させる方法を示す図である。
図２は、Ｍｕｓｅ細胞由来の胚様体様細胞塊／無処理細胞画分での発現量の比が高い因子を示す図である。
図３は、Ｍｕｓｅ細胞由来の胚様体様細胞塊／ヒトＥＳ細胞での発現量の比が高い因子を示す図である。
図４は、ＭＡＣＳソーティングのプロトコールを示す図である。
図５は、ヒト線維芽細胞（Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）画分の１６時間の長時間トリプシン処理後（図５ａ）及び１８００〜２２００ｒｐｍ／分で３分間ボルテックス処理を行った後（図５ｂ）のトリパンブルー染色像にて死細胞の除去を示す写真である。
図６は、各種細胞の写真である。図６ａは富Ｍｕｓｅ細胞画分の中の１細胞（バーは１０μｍ）、図６ｂはヒトＥＳ細胞由来の胚様体細胞塊（バーは２５μｍ）、図６ｃは直径約２５μｍのＭｕｓｅ細胞由来の胚様体様細胞塊（バーは２５μｍ）、図６ｄはヒトＥＳ細胞由来細胞塊４日目のアルカリフォスファターゼ染色像（バーは２５μｍ）、図６ｅ〜ｇはＭｕｓｅ細胞由来の胚様体様細胞塊のＯｃｔ３／４（ｅ）、Ｓｏｘ２（ｆ）及びＰＡＲ４（ｇ）の免疫染色像を示す写真である。
図７−１は、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びヒトＭＳＣ（Ｈ−ＭＳＣ）画分由来の細胞塊の特徴を示す写真である。図７−１ａ及びｂは無処理ヒトＭＳＣ画分の通常の接着培養において自発的に生じた細胞塊（バーは１００μｍ）を示す。図７−１ｃ及びｄは０日目（ｃ）及び７日目（ｄ）のＨ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−１画分の長時間トリプシン処理後のＭＣ培養の状態を示し（バーは１００μｍ）、図７−１ｄの矢印はＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を示す。図７−１ｅ及びｆはＭＣ培養７日後のＨ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−１画分から形成されたＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を示す（バーは５０μｍ）。
図７−２は、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びヒトＭＳＣ（Ｈ−ＭＳＣ）画分由来の細胞塊の特徴を示す写真である。図７−２ｇ−ｌはＨ−ｆｉｂｒｏｂａｌｓｔ画分から形成されたＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊（図７−２ｇ、ｉ及びｋ）及びＨ−ＭＳＣ画分から形成されたＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊（図７−２ｈ、ｊ及びｌ）のＮａｎｏｇ（図７−２ｇ及びｊ）、Ｏｃｔ３／４（図７−２ｈ）、ＳＳＥＡ−３（図７−２ｉ）、ＰＡＲ４（図７−２ｋ）及びＳｏｘ２（図７−２ｌ）の局在を示す免疫染色の結果を示す（バーは５０μｍ）。
図７−３は、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びヒトＭＳＣ（Ｈ−ＭＳＣ）画分由来の細胞塊の特徴を示す写真である。図７−３ｍ−ｏはヒトＥＳ細胞（図７−３ｍ）、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分由来のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊（図７−３ｎ）及び無処理Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−１画分（図７−３ｏ）のアルカリフォスファターゼ染色の結果を示す（バーは５０μｍ）。
図７−４は、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びヒトＭＳＣ（Ｈ−ＭＳＣ）画分由来の細胞塊の特徴を示す電子顕微鏡写真である。図７−４ｐ−ｒはヒトＥＳ細胞胚様体（図７−４ｐ、ＭＣ培養３日目）、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−１画分由来のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊（図７−４ｑ及びｒ、ＭＣ培養５日目）の電子顕微鏡像を示す（バーは５μｍ）。
図８−１は、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊（Ｍ−ｃｌｕｓｔｅｒ）のクローナリティー及びセルフリニューアルを示す図であり、Ｍｕｓｅ細胞のクローナリティー及びセルフリニューアルを決定するために行った実験の概要を示す図である。
図８−２は、Ｍｕｓｅ細胞の浮遊細胞における増殖速度を示す図である。
図８−３は単一のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊（Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−１由来、第１世代（サイクル））から増殖した細胞（ｃｌｏｎａｌｌｙ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｃｅｌｌｓ）の正常核型を示す図である。
図９−１は、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊の分化を示す図である。ａ−ｃはＨ−ｆｉｂｏｒｏｂｌａｓ−１画分由来の分化細胞の塊のα平滑筋アクチン及び神経フィラメント（図９−１ａ及びｂ）並びにα−フェトプロテイン（図９−１ｃ）の局在を示す免疫染色像である（バーは図９−１ａが５００μｍ、図９−１ｂ及びｃが５０μｍ）。図９−１ａの矢頭は接着したＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を示す。
図９−２は無処理細胞画分、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分由来の第１及び第３世代のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊（Ｃｌｕｓｔｅｒ）をゲラチン上で培養し自発的分化を誘導した細胞群におけるα−フェトプロテイン（α−ＦＰ）、ＧＡＴＡ６、ＭＡＰ−２及びＮｋｘ２．５発現のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。陽性コントロールとしてはα−ＦＰに対してヒト胎児肝臓を、ＧＡＴＡ６、ＭＡＰ−２及びＮｋｘ２．５に対してはヒト胚全体を用いた。
図９−３ｅ−ｌは富Ｍｕｓｅ細胞画分を投与した免疫不全マウスの精巣を示す。図９−３ｅはコントロール（ｉｎｔａｃｔ）となる無傷の精巣並びにマウスＥＳ細胞（ｍＥＳ  ｃｅｌｌｓ）（８週）、ＭＥＦ（フィーダー細胞）（８週）、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊（Ｍ−ｃｌｕｓｔｅｒ）（６ヶ月）及び富Ｍｕｓｅ細胞画分（Ｍｕｓｅ）（６ヶ月）を投与した精巣を示す。図９−３ｆ−ｉは富Ｍｕｓｅ細胞画分又はＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を投与した精巣組織の神経フィラメントＭ（図９−３ｆ、写真では緑に染色）、α−フェトプロテイン（図９−３ｇ、写真では緑に染色）及び平滑筋アクチン（図９−３ｈ、図では赤に染色）の免疫染色像を示す（バーは５０μｍ）。図９−３ｉの３枚のパネルはヒトミトコンドリア（緑に染色）及び平滑筋アクチン（赤に染色）の二重染色像を示す（バーは２０μｍ）。図９−３ｊ−ｌは富Ｍｕｓｅ細胞画分を投与した精巣の組織像を示す（図９ｊ及びｋ）。図９ｋに認められるチューブ様の構造はヒトミトコンドリアに対する抗体で染色されている（バーは図９−３ｊが５００μｍ、図９−３ｋ−ｌが５０μｍ）。
図１０ａは、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（Ｆｉｂｒｏ−１，Ｆｉｂｒｏ−２）及びＨ−ＭＳＣ（ＭＳＣ−１，ＭＳＣ−２）のｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ及び未分化細胞状態に関与する因子の定量ＰＣＲの結果を示す図である（その２）。図中のカラムの模様は富Ｍｕｓｅ細胞画分及びＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊（７日目）の無処理細胞画分に比較した遺伝子発現レベルを示す。白は富Ｍｕｓｅ細胞群又はＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊／無処理細胞画分の比が１／３より大きく３より小さいものを示し、グレーは富Ｍｕｓｅ細胞画分又はＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊／無処理細胞画分の比が３より大きいものを示し、斜線は富Ｍｕｓｅ細胞画分又はＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊／無処理細胞画分の比が１／３より小さいものを示す。
図１０ｂは、Ｈ−ＭＳＣ由来の無処理細胞画分（Ｎａｉｖｅ）、富Ｍｕｓｅ細胞画分（Ｍｕｓｅ）及びＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊（Ｍ−ｃｌｕｓｔｅｒ）（７日目）のテロメラーゼ活性を示す図である。熱不活性化サンプル（Ｈｅａｔ）を陰性コントロールとして用いた。
図１１は、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分由来の無処理細胞画分、富Ｍｕｓｅ細胞画分及びＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊のＤＮＡマイクロアレイ分析の結果を示す図である。
図１２は、ヒト骨髄の単核球成分からＳＳＥＡ−３／ＣＤ１０５二重陽性細胞として直接採取したＭｕｓｅ細胞をＭＣ培養し、形成された胚様体様細胞塊を示す写真である。図１２ａはヒト骨髄から単離し８時間の長時間トリプシン処理を行った単核細胞画分をＭＣ培養し（８ｈｒ−ｈＢＭ−ＭＣ、７日）形成されたＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を示す（バーは１００μｍ）。図１２ｂは８ｈｒ−ｈＢＭ−ＭＣ（７日）により形成されたＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊のアルカリフォスファターゼ染色像を示す（バーは５０μｍ）。
図１３は、無処理Ｈ−ＭＳＣ−１画分（ｎａｉｖｅ１）、無処理Ｈ−ＭＳＣ−２画分（ｎａｉｖｅ２）（いずれもネガティブコントロール）、並びに８時間のトリプシン処理を行ったヒト骨髄由来単核細胞画分（８ｈｒ−ｈＢＭ）あるいはトリプシン処理を行わないヒト骨髄由来単核細胞画分（ｎａｉｖｅ  ｈＢＭ）から形成されたＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊をゲラチンの上で培養し自発的分化を誘導した細胞群におけるα−フェトプロテイン（α−ＦＰ）、ＧＡＴＡ６、ＭＡＰ−２及びＮｋｘ２．５のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す図である。
図１４は、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分（無処理細胞）及びＨ−ＭＳＣ画分（無処理細胞）のＦＡＣＳ分析の結果を示す図である。
図１５−１は、無処理細胞画分中のＳＳＥＡ−３陽性細胞（１５−１ａ左）、及びＦＡＣＳソーティングにより採取したＳＳＥＡ−３陽性細胞由来の単一Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊からクローン増殖したＳＳＥＡ−３陽性細胞（１５−１ａ右）の染色像を示す写真である。図中のバーは１００μｍである。
図１５−２は、Ｍｕｓｅ細胞（Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）の細胞分裂中の非対称分裂に関わる因子であるＮｕｍｂｌｉｋｅ（緑色）の局在を示す染色像を示す写真である。図中のバーは１０μｍである。
図１５−３は、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ由来のＳＳＥＡ−３陰性細胞（図１５−３ｃ）及びＳＳＥＡ−３陽性細胞（図１５−３ｄ）の電子顕微鏡写真である。図中のバーは５μｍである。
図１５−４は、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ由来Ｍｕｓｅ細胞のＯｃｔ３／４（緑色）（図１５−４ｅ）、Ｓｏｘ２（緑色）（図１５−４ｆ）及びＳＳＥＡ−３（赤色）（図１５−４ｇ）の染色像を示す写真である。
図１６−１は、超免疫不全マウス（Ｎｏｇマウス）損傷組織におけるＧＦＰ標識ＳＳＥＡ−３陽性Ｍｕｓｅ細胞画分の分化を示す写真である。図１６−１Ｎ及びＯは圧迫損傷脊髄（４週間後）におけるＧＦＰ陽性細胞であり、ニューロフィラメント（赤色）及びヒトゴルジ複合体（白色）を発現している。ＯはＮの四角で囲んだ部分の拡大像である。図１６−１Ｐは損傷肝臓（４週間後）のＧＦＰ陽性標識細胞であり、ヒトアルブミン（赤色）及びヒトゴルジ複合体（白色）を発現している。
図１６−２は、ＲＴ−ＰＣＲで調べた、ＳＳＥＡ−３陽性Ｍｕｓｅ細胞を移植した肝臓におけるヒトアルブミンの発現を示す写真である。
図１６−３は、超免疫不全マウス（Ｎｏｇマウス）損傷組織におけるＧＦＰ標識ＳＳＥＡ−３陽性Ｍｕｓｅ細胞画分の分化を示す写真であり、ヒトジストロフィン（赤色）を発現している筋肉（３週間後）のＧＦＰ陽性細胞を示す写真である。
図１７−１は、単一Ｍｕｓｅ細胞から形成されたＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊から増殖させた細胞の分化を示す写真である。図１７−１Ａ〜Ｄは、神経誘導の結果を示し、Ａは形成されたｓｐｈｅｒｅを示し、さらにｓｈｐｅｒｅの免疫染色データとしてＡはネスチン、ＢはＭｕｓａｓｈｉ、ＣはＮｕｒｏＤの発現を示す。Ｅはこれらのｓｐｈｅｒｅをさらに神経系細胞への分化をさせたものであり、ＭＡＰ−２陽性細胞を示す。図１７−１Ｆ〜Ｇは、骨細胞誘導の結果を示し、オステオカルシン（Ｆ）及びＡＬＰ（Ｇ）の発現を示す。図１７−１Ｈ及びＩは、脂肪細胞誘導の結果を示し、Ｈは油滴を含む細胞を示し、Ｉはオイルレッド染色の結果を示す。図１７−１Ｊは、肝臓細胞誘導の結果を示し、α−フェトプロテイン陽性細胞を示す。
図１７−２は、ＲＴ−ＰＣＲで調べた、肝細胞誘導した細胞におけるヒトアルブミン及びヒトα−フェトプロテインの発現を示す写真である。
図１８−１は、ＲＴ−ＰＣＲで調べた、ＳＳＥＡ−３陽性Ｍｕｓｅ細胞におけるＳｏｘ１０、Ｓｎａｉｌ１、Ｓｌｕｇ、Ｔｙｒｐ１及びＤｃｔの発現を示す写真である。
図１８−２は、ＦＡＣＳで分析したＮＧ２、ＣＤ３４、ｖＷＦ、ＣＤ１１７、ＣＤ１４６及びＣＤ２７１の発現を示す図である。無処理ヒト皮膚線維芽細胞において、周皮細胞（ｐｅｒｉｃｙｔｅ）マーカーであるＮＧ２、内皮前駆細胞マーカーであるＣＤ３４及びｖＷＦは陰性であり、ＳＳＥＡ−３陽性細胞でも陰性であった。メラノブラストマーカーであるＣＤ１１７、周皮細胞（ｐｅｒｉｃｙｔｅ）マーカーであるＣＤ１４６、ＮＣＳＣマーカーであるＣＤ２７１は、無処理ヒト皮膚線維芽細胞では、わずかに陽性細胞が認められたが（それぞれ０．２％、０．２％及び０．８％）、それらはＳＳＥＡ−３陰性細胞であったためＭｕｓｅ細胞ではないと考えられる。
図１８−３は、Ｍｕｓｅ細胞がフェライトを貪食したことを示す図である。
図１９は、Ｍｕｓｅ細胞から作製したｉＰＳ細胞の形成を示す写真であり、図１９ａは、皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）由来Ｍｕｓｅ細胞から誘導されたヒトｉＰＳ細胞の形態を示し、図１９ｂ〜ｆは、多能性細胞マーカー（ｂがＮｏｎｏｇ、ｃがＯｃｔ３／４、ｄがＳｏｘ２、ｅがＳＳＥＡ−３、ｆがＴｒａ−１−６０）の発現を示す。
図２０は、Ｎｏｎｏｇ（Ｅ）、Ｏｃｔ３／４（Ｆ）、Ｓｏｘ２（Ｇ）及びＴｒａ−１−８１（Ｈ）の免疫組織化学の結果を示す写真である。
図２１は、Ｍｕｓｅ由来ｉＰＳ細胞（Ｍｉ−１，Ｍｉ−２）及びＳＳＥＡ−３陰性細胞から増殖したコロニー（（−）−１，（−）−２）のＲＴ−ＰＣＲにより調べた多能性マーカーの発現を示す写真である。
図２２−１は、Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｓｅをレトロウイルスで導入し、その後フィーダー細胞ＭＥＦ上で培養した３０日後のＳＳＥＡ−３陽性及び陰性細胞から形成されたコロニーのＴｒａ−１−８１免疫染色の結果を示す写真である。ヒトＥＳ細胞をコントロールとして用いている。ＳＳＥＡ−３陽性細胞からのコロニー（ａ１）及びヒトＥＳ細胞（ａ２）はＴｒａ−１−８１陽性であるが、ＳＳＥＡ−３陰性細胞からのコロニーはすべて陰性である。
図２２−２は、２２−１と同じくＭＥＦで３０日培養した段階におけるＳＳＥＡ−３陽性及び陰性細胞の多能性マーカー（内因性Ｏｃｔ３／４（ｅｎｄｏ  Ｏｃｔ）、内因性Ｓｏｘ２（ｅｎｄｏ  Ｓｏｘ２）、Ｎａｎｏｇ、内因性Ｋｌｆ４（ｅｎｄｏ  Ｋｌｆ４）、Ｒｅｘ１及びＵＴＦ１）の発現を示す写真である。ＳＳＥＡ−３陰性細胞群ではＳｏｘ２，Ｎａｎｏｇのシグナルが見られない。
図２２−３は、Ｍｕｓｅ細胞から誘導したｉＰＳ細胞（Ｍｕｓｅ細胞由来ｉＰＳ細胞）（図２２−３Ｃ及びＣ１）及びＳＳＥＡ−３陰性細胞から増殖したコロニー（図２２−３Ｄ及びＤ１）のコロニーを示す写真である。
図２３−１は、皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）由来Ｍｕｓｅ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化の様子を示す写真である。図２３−１ｉは、内胚葉マーカーであるα−フェトプロテイン（緑色）及び中胚葉マーカーである平滑筋アクチン（赤色、青色はＤＮＡ）の発現を示し、図２３−１ｊは、外胚葉マーカーである神経フィラメント（緑色）の発現を示す。
図２３−２は、Ｍｕｓｅ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化のＲＴ−ＰＣＲ分析結果を示す図であり、３胚葉マーカーの発現を示す。
図２３−３は、皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）由来Ｍｕｓｅ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞から形成されたテラトーマの組織構造を示す写真であり、ＨＥ（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ及びｅｏｓｉｎ）染色により、ｉＰＳ細胞が種々の組織に分化していることを示している。図２３−３ｍは、軟骨（ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、図２３−３ｎは筋肉（Ｍｕｓｃｌｅ）、図２３−３ｏは神経上皮（ｎｅｕｒａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）、図２３−３ｐは色素上皮（ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）、図２３−３ｑは円柱上皮（ｃｏｌｕｍｎａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）を示す。
図２４は、ＳＳＥＡ−３陰性細胞画分、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊及びＭｕｓｅ由来ｉＰＳ細胞のＮａｎｏｇ遺伝子及びＯｃｔ３／４遺伝子のＢｉｓｕｌｆｉｔｅ（亜硫酸水素塩）シーケンスの結果を示す図である。それぞれのカラムの数値は、転写開始部位（ＴＳＳ）の下流に対すＣｐＧの位置を示す。白丸はメチル化されていないシトシンを、黒丸は、メチル化されたシトシンを示す。
図２５は、無処理線維芽細胞（Ｎａｉｖｅ）、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊（Ｃｌｕｓｔｅｒ）及びｉＰＳ細胞中の細胞周期に関連した因子の定量ＰＣＲの結果を示す図である。「／Ｎａｉｖｅ」で示されるカラム中、白カラムは、無処理細胞に対するＭｕｓｅ画分又はＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊との比が２未満で１／２より大きいことを示す。また、塗りつぶされたカラムは比が２より大きいことを示し、斜線が引かれたカラムは、比が１／２より小さいことを示す。「／ｉＰＳ」で示されるカラム中、「＊」は、発現された遺伝子の量がｉＰＳよりＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊で大きいことを示し、「＊＊」は、発現された遺伝子の量がＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊よりｉＰＳで大きいことを示す。
図２６は、無処理線維芽細胞（Ｎａｉｖｅ）、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊（Ｃｌｕｓｔｅｒ）及びｉＰＳ細胞中の多能性及び未分化細胞状態に関連した因子の定量ＰＣＲの結果を示す図である。各カラムの意味は図２５と同じである。
図２７は、ヒト及びマウスモデルにおいて作製されたｉＰＳ細胞株の誘導効率に関する論文報告をまとめた図である。図２７は核のリプログラミングを誘導する転写因子の組合せを示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、生体の生体組織から直接得ることができる多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞又は多能性幹細胞画分及び該多能性幹細胞又は該多能性幹細胞画分を単離する方法、並びに該方法により得られた生体組織由来の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分である。本発明の多能性幹細胞をＭｕｓｅ細胞（ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｓｔｒｅｓｓ  ｅｎｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）という。
本発明において、細胞画分というときは、単離したい細胞を少なくとも一定量含む細胞群のことをいう。例えば、多能性幹細胞画分とは、多能性幹細胞を１％以上、１０％以上、３０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上、又は９５％以上含む細胞群が挙げられ、多能性幹細胞の培養によって得られる細胞塊や多能性幹細胞を濃縮した細胞群を含む。また、前記細胞画分を実質的に均一な細胞画分ということもある。
生体は、哺乳動物の生体をいい、ある程度発生が進んだ動物体をいう。本発明において、生体には、受精卵や胞胚期より発生段階が前の胚は含まれないが、胎児や胞胚を含む胞胚期以降の発生段階の胚は含まれる。哺乳動物は限定されないが、例えばヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が含まれる。本発明の多能性幹細胞は、生体の組織由来である点で、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）と明確に区別される。
中胚葉系組織とは、動物の初期発生途上で現れる中胚葉起源の組織をいい、筋肉系組織、結合組織、循環系組織、排泄系組織、生殖系組織等が含まれる。例えば、本発明の多能性幹細胞は、骨髄液や真皮結合組織等の皮膚組織から得ることができる。
間葉系組織とは、骨、軟骨、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、心臓、などの組織をいう。例えば、本発明の多能性幹細胞は、骨髄や皮膚から得ることができる。また、臍帯から得ることもできる。
細胞が組織から直接得ることができるとは、組織から単離することができ、外来遺伝子や外来タンパク質の導入又は化合物の投与などの化合物処理等の人為的な誘導操作を経ずに得られることを意味する。ここで、外来遺伝子は、限定されないが、例えば体細胞の核を初期化し得る遺伝子をいい、例えば、Ｏｃｔ３／４遺伝子等のＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子等のＫｌｆファミリー遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子等のＭｙｃファミリー遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子等のＳｏｘファミリー遺伝子が挙げられる。また、外来タンパク質としてはこれらの遺伝子がコードするタンパク質やサイトカインが挙げられる。さらに、化合物としては、例えば、上記の体細胞の核を初期化し得る遺伝子の発現を誘導する低分子化合物やＤＭＳＯ、還元剤として機能する化合物，ＤＮＡメチル化剤等が挙げられる。本発明の多能性幹細胞は、生体あるいは組織から直接得ることができるという点で、ｉＰＳ（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）細胞及びＥＳ細胞とは明確に区別される。なお、本発明においては、細胞の培養、細胞の表面マーカーを指標に細胞又は細胞画分を単離すること、細胞を細胞ストレスに曝露すること、及び細胞に物理的衝撃を与えることは、人為的な誘導操作には含まれない。また、本発明の多能性細胞は、リプログラミング又は脱分化の誘導を必要とせずに得られることを特徴としてもよい。
本発明の多能性幹細胞は、生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等に存在していると考えられ、本発明においては、これらの組織に存在している細胞又は細胞画分を単離する。本発明の多能性幹細胞は、例えば、骨髄に存在しており、骨髄から血液等を介して生体の各組織に供給される可能性がある。このため骨髄や、皮膚等の生体の各組織、さらには血液から単離することが可能である。
多能性幹細胞とは、ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙを有している細胞をいい、以下の特性を有する。
（１）  Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、ＳＳＥＡ−３、ＰＡＲ−４及びＳｏｘ２等の多能性マーカー（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｍａｒｋｅｒ）を発現する。
（２）  １細胞から増殖し、自己のクローンを作り続けるクローナリティー（Ｃｌｏｎａｌｉｔｙ）を有する。
（３）  自己複製（セルフリニューアル）能を有する。
（４）  ３胚葉系（内胚葉系、中胚葉系及び外胚葉系）へｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで分化し得る。
（５）  マウスの精巣や皮下に移植した場合、３胚葉系への分化を呈する。
（６）  アルカリフォスファターゼ染色で陽性となる。
本発明の多能性幹細胞は、ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙを有している点で、成人幹細胞、組織幹細胞とは明確に区別される。また、本発明の多能性幹細胞は、ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙを有している単一の又は複数の細胞として単離されている点で、骨髄間葉系細胞等の細胞画分とは明確に区別される。
さらに、本発明の多能性幹細胞は、以下の特性を有する。
（ｉ）  増殖速度が比較的緩やかで、分裂周期が１日以上、例えば１．２〜１．５日である。ただし、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞が示すような無限増殖は示さない。
（ｉｉ）  免疫不全マウスに移植した場合に内胚葉系、中胚葉系及び外胚葉系への分化を示す。ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞ではテラトーマが短期間で癌化するのに比べ、半年以上癌化しないことを特徴とする。
（ｉｉｉ）  浮遊培養により胚様体様細胞塊を形成する。
（ｉｖ）  浮遊培養にて胚様体様細胞塊を形成し、１０日程度で増殖が停止する。その後、接着培養に移動させることにより再増殖する。
（ｖ）  増殖の際に非対称分裂を伴う。
（ｖｉ）  核型は正常である。
（ｖｉｉ）  テロメラーゼ活性が無いか又は低い。ここで、テロメラーゼ活性が無いか又は低いとは、例えばＴＲＡＰＥＺＥ  ＸＬ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に検出できないか又は低いことをいう。テロメラーゼ活性が低いとは、例えば、ヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、あるいはＨｅｌａ細胞に比べて１／５以下、好ましくは１／１０以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。
（ｖｉｉｉ）  メチル化の状態については、Ｍｕｓｅ細胞から誘導したｉＰＳ細胞に関してはＮａｎｏｇおよびＯｃｔ３／４のプロモータ領域のメチル化レベルが低い。
（ｉｘ）  貪食能が高い。
（ｘ）  腫瘍性増殖を示さない。ここで、腫瘍性増殖を示さないとは、浮遊培養を行った場合、一定の大きさの細胞塊（クラスター）に達すると増殖が止まり、無限増殖しないことをいう。また免疫不全マウスの精巣に移植しても奇形腫を形成しないことである。なお、上記（ｉ）〜（ｉｖ）等も腫瘍性増殖を示さないことに関連する。
すなわち、本発明の細胞は、例えば以下の多能性幹細胞である。
（Ａ）  生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等から得られる細胞であって、当該細胞内に化学物質、外来遺伝子又は外来タンパク質を導入することなく直接得ることができる多能性幹細胞。
（Ｂ）  生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等が、骨髄、皮膚、血液、臍帯、脂肪などからなる群から選択される上記（１）の特性を有する多能性幹細胞。
（Ｃ）  リプログラミングまたは脱分化を誘導することなく得ることができる、上記（Ａ）又は（Ｂ）の多能性幹細胞。
（Ｄ）  精巣へ移植した場合に、少なくとも半年間は癌化しない、上記（Ａ）又は（Ｂ）の多能性幹細胞。
（Ｅ）  ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞のように無限増殖を示さない、上記（Ａ）又は（Ｂ）の多能性幹細胞。
（Ｆ）  生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等由来の多能性幹細胞であって、生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等の細胞をプロテアーゼで処理したときに生き残る、プロテアーゼに耐性である多能性幹細胞。
さらに、本発明の多能性幹細胞は、生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等の細胞に細胞ストレスをかけ、生き残った細胞を回収することにより単離することができる。ここで、細胞ストレスとは外的ストレスをいい、プロテアーゼ処理、低酸素条件下での培養、低リン酸条件下での培養、血清飢餓状態での培養、糖飢餓状態での培養、放射線曝露下での培養、熱ショックへの曝露下での培養、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養、圧力処理下での培養等によりストレスに曝露することをいう。この中でもプロテアーゼ処理、すなわちプロテアーゼ存在下での培養が好ましい。プロテアーゼは限定されず、トリプシン、キモトリプシン等のセリンプロテアーゼ、ペプシン等のアスパラギン酸プロテアーゼ、パパイン、キモパパイン等のシステインプロテアーゼ、サーモリシン等の金属プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、Ｎ−末端スレオニンプロテアーゼなどを用いることができる。プロテアーゼを培養に添加する際の添加濃度は限定されず、一般的にシャーレ等で培養した付着細胞を剥がすときに用いる濃度で用いればよい。本発明の多能性幹細胞は、上記外的ストレスに耐性を有する幹細胞、例えば、トリプシンに耐性を有する細胞ということができる。
生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等は限定されず、骨髄単核細胞、皮膚細胞等の線維芽細胞画分、歯髄組織、眼球組織、毛根組織等が含まれる。細胞としては、培養細胞も組織から採取した細胞も用いることもできる。この中でも、骨髄細胞、皮膚細胞が望ましく、例えば、ヒト骨髄間葉系細胞（ＭＳＣ）画分又はヒト皮膚線維芽細胞画分が挙げられる。骨髄間葉系細胞画分は、骨髄穿刺液を２〜３週間培養することにより得ることができる。
上記の各種のストレスを受けた組織の細胞の大部分は死滅し、生き残った細胞中に本発明の多能性幹細胞が含まれる。細胞にストレスをかけたのち、死細胞を除去する必要があるが、プロテアーゼを用いた場合は、これらの死細胞はプロテアーゼの作用により分解される。
また、細胞にストレスをかけた後に、細胞に物理的衝撃を与え壊れ易くなった細胞を除去してもよい。物理的衝撃は、例えば激しいピペッティング、激しい攪拌、ボルテックス等により与えることができる。
細胞に細胞ストレスをかけ、必要に応じて物理的衝撃を与えた後に、細胞群を遠心分離にかけ、生き残った細胞をペレットとして得て回収することにより、本発明の多能性幹細胞を単離することができる。また、このようにして得られた細胞からさらに、下記の表面マーカーを指標に本発明の多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離することもできる。
また、外傷や火傷等のストレスを受けた生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等を培養し、遊走した細胞を回収しても本発明の多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離することができる。傷害を受けた組織の細胞はストレスに曝露されるので、本発明においては、傷害を受けた生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等を培養することも生体の中胚葉系組織又は間葉系組織細胞等に細胞ストレスをかけるという。
一例として、これらの細胞をトリプシン処理する方法について説明する。このときのトリプシン濃度は、限定されないが、例えば接着細胞の通常の培養において、培養容器に接着した接着培養を剥がすときに用いられる濃度範囲で用いればよく、０．１〜１％、好ましくは０．１〜０．５％が例示される。例えば、１０〜５０万個の細胞を含む生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等由来の細胞を上記濃度のトリプシン溶液５ｍｌ中でインキュベーションすることにより外的ストレスに曝すことができる。トリプシン処理時間は、５〜２４時間、好ましくは５〜２０時間程度である。本発明においては、８時間以上のトリプシン処理、例えば８時間又は１６時間の処理を長時間トリプシン処理という。
トリプシン処理後、上記のように、ピペッティング、攪拌、ボルテックス等により物理的衝撃を与えることが望ましい。それは死んだ細胞あるいは死にかけている細胞を除去するためである。
トリプシン処理後の浮遊培養の際には細胞同士の凝集を防ぐために、例えば、メチルセルロースゲル等のゲル中でインキュベーションするのが望ましい。また、細胞の培養容器への付着を防ぎ浮遊状態を維持するために、容器をＰｏｌｙ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）等でコートしておくことが望ましい。
外的ストレスに曝した細胞を遠心分離により集め培養を行うと細胞塊（細胞クラスター）を形成する。この細胞塊の大きさは直径２５μｍから１５０μｍ程度である。本発明の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）は、この外的ストレスに曝して生き残った細胞集団中に濃縮した状態で含まれる。この細胞集団を富Ｍｕｓｅ細胞画分（Ｍｕｓｅ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）と呼ぶ。富Ｍｕｓｅ細胞画分中のＭｕｓｅ細胞の存在割合は、ストレス処理の方法により異なる。
このように本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分がストレスをかけた後も生存することは、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分がストレス耐性であることを示している。
生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等由来の細胞の培養に用いる培地、培養条件は通常の動物細胞の培養で用いる培地、培養条件を採用すればよい。また、公知の幹細胞培養用培地を用いてもよい。培地には、適宜ウシ胎児血清等の血清やペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質及び種々の生理活性物質を添加してもよい。
さらに、本発明は、本発明の生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等から直接得ることができる多能性幹細胞の派生細胞又は誘導細胞である多能性幹細胞も含む。派生細胞又は誘導細胞とは前記多能性幹細胞を培養して得られる細胞又は細胞群、あるいは前記多能性幹細胞に外来遺伝子の導入等の人為的な誘導操作を行い得られる細胞をいい、子孫細胞も含む。なお、本発明時点において報告されているｉＰＳ細胞は、皮膚線維芽細胞などの生体組織の分化した細胞に外来遺伝子導入等することによりリプログラミングした結果、多能性幹細胞に誘導された細胞といわれており、本発明の組織から直接得ることができ、すでに多能性幹細胞としての性質を有する細胞に外来遺伝子導入等の人為的な誘導操作を行い得られた細胞は、ｉＰＳ細胞と区別される。
本発明の多能性幹細胞を浮遊培養することにより、胚様体様（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ（ＥＢ  ｂｏｄｙ）−ｌｉｋｅ）細胞塊が得られるが、本発明はこの胚様体様細胞塊及び胚様体様細胞塊に含まれる細胞も包含する。胚様体は、本発明の多能性幹細胞を浮遊培養することにより、細胞塊として形成される。この際、本発明においては、本発明の多能性幹細胞を培養することにより得られる胚様体をＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊と呼ぶことがある（Ｍクラスター（Ｍ−ｃｌｕｓｔｅｒ）と呼ぶこともある）。胚様体様細胞塊を形成するための浮遊培養の方法として、メチルセルロース等の水溶性ポリマーを含有した培地を用いた培養（Ｎａｋａｈａｔａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ６０，３５２−３６１（１９８２））やハンギングドロップ培養（Ｋｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ）１６８：１３１−１３９，１９９８）等が挙げられる。本発明は前記胚様体様細胞塊からセルフリニューアルして得られる胚様体様細胞塊及び胚様体様細胞塊に含まれる細胞及び多能性幹細胞も包含する。ここで、セルフリニューアルとは、胚様体様細胞塊に含まれる細胞を培養し、再度胚様体様細胞塊を形成させることをいう。セルフリニューアルは１〜複数回のサイクルを繰り返せばよい。また、本発明は前記いずれかの胚様体様細胞塊及び胚様体様細胞塊に含まれる細胞から分化した細胞及び組織も包含する。
図１−１に間葉系細胞（ヒト線維芽細胞、ヒト骨髄間葉系細胞、新鮮骨髄液）画分とＭｕｓｅ細胞及びＭｕｓｅ細胞由来の胚様体様細胞塊の関連を示す。間葉系細胞様細胞塊に長時間トリプシン処理（Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ；ＬＴＴ）等のストレス刺激を与えると、Ｍｕｓｅ細胞が濃縮されＭｕｓｅ細胞を多く含む細胞画分が得られ（富Ｍｕｓｅ細胞画分と呼ぶ）、該細胞画分中のＭｕｓｅ細胞を浮遊培養すると胚様体様細胞塊（Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊）が得られる。胚様体様細胞塊をゼラチンでコートした培養皿で培養すると３胚葉の細胞に分化する。また、図１−１に示すように、ＳＳＥＡ−３陽性細胞を直接分離し、長時間のストレスをかけることなく浮遊培養することによりＭｕｓｅ細胞由来の胚様体様細胞塊を得ることができる。
Ｍｕｓｅ細胞は、浮遊培養で一旦増殖が停止しても、接着培養に移すことにより増殖を開始する。浮遊培養−接着培養−ＳＳＥＡ−３発現を指標にした分離を繰り返すことにより、Ｍｕｓｅ細胞を大量に増殖させることが可能である（図１−２）。
さらに、本発明の多能性幹細胞又は多能性細胞画分は、生体組織から細胞ストレスに暴露せずに直接単離することもできる。すなわち、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は、生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等から外来遺伝子を導入することなく、誘導操作なしに以下の方法で単離することができる。
生体組織は、限定されないが、生体の中胚葉系組織又は間葉系組織、例えば、骨髄、皮膚、臍帯等が挙げられる。骨髄を用いる場合、骨髄の単核球分画を用いることができる。単離は、Ｍｕｓｅ細胞の表面に多く発現している細胞表面マーカーを利用して行うことができ、例えばＳＳＥＡ−３の発現を指標に単離することができる。本発明の多能性幹細胞をＳＳＥＡ−３陽性Ｍｕｓｅ細胞ということもある。さらに、Ｍｕｓｅ細胞は多能性幹細胞マーカーであるＣＤ１０５を発現しており、ＳＳＥＡ−３陽性であり、ＣＤ１０５陽性である。従って、ＳＳＥＡ−３及びＣＤ１０５の両方の発現を指標に単離することができる。これらの細胞表面マーカーを利用することにより、本発明の多能性幹細胞を単一細胞として単離でき、単離した単一細胞を、培養により増殖させることができる。なお、本発明は、ヒト以外の哺乳動物の生体組織からＳＳＥＡ−３に相当するマーカーによって単離できる多能性幹細胞をも含むものとする。
一方、Ｍｕｓｅ細胞は、ＮＧ２、ＣＤ３４、ｖＷＦ（フォンビルブランド因子）、ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＣＤ１４６、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ）が陰性である。さらに、Ｓｏｘ１０、Ｓｎａｉ１、Ｓｌｕｇ、Ｔｙｒｐ１、Ｄｃｔが陰性である。
ＮＧ２、ＣＤ３４、ｖＷＦ、ＣＤ１１７、ＣＤ１４６、ＣＤ２７１などの表面抗原が陰性かどうか、発現が弱いかどうかはこれらの抗原に対する抗体であって、発色酵素、蛍光化合物等で標識した抗体を用いて細胞が染色されたか否かを顕微鏡観察等により決定することができる。例えば、これらの抗体を用いて細胞を免疫染色して、表面抗原の有無を決定することができ、また該抗体を結合させた磁性ビーズを用いても決定することができる。また、ＦＡＣＳ又はフローサイトメーターを用いても表面抗原があるかどうか決定することができる。フローサイトメーターとしては例えばＦＡＣＳＡｒｉａ（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＦＡＣＳ  ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社製）等を用いることができる。
また、Ｓｏｘ１０、Ｓｎａｉ１、Ｓｌｕｇ、Ｔｙｒｐ１、Ｄｃｔなどの転写因子に関してはＲＴ−ＰＣＲ等の手法により発現を調べることもできる。
これらの表面抗原が陰性とは、上記のようにＦＡＣＳを用いて分析した場合に、陽性細胞としてソーティングされないこと、あるいはＲＴ−ＰＣＲにより発現を調べた場合に、発現が認められないことをいい、これらの手法により検出できない程度発現していたとしても、本発明においては陰性とする。また、上記マーカーが陽性であることが公知の造血幹細胞等の細胞と同時に測定を行い、これらの陽性細胞と比較して、ほとんど検出されないか、あるいは有意に発現量が低い場合に陰性としてもよい。
本発明の細胞は、これらの細胞表面の抗原特性に基づいて単離することができる。
上記のように、Ｍｕｓｅ細胞は、ＳＳＥＡ−３陽性を指標に単離することができ、さらにＣＤ１０５の発現を指標に単離することができるが、さらに、ＮＧ２、ＣＤ３４、ｖＷＦ（フォンビルブランド因子）、ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＣＤ１４６、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ）、Ｓｏｘ１０、Ｓｎａｉ１、Ｓｌｕｇ、Ｔｙｒｐ１及びＤｃｔからなる群から選択される１１個のマーカーのうち少なくとも１個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個のマーカーの非発現を指標に単離することができる。例えば、ＣＤ１１７及びＣＤ１４６の非発現を指標に単離することができ、さらに、ＣＤ１１７、ＣＤ１４６、ＮＧ２、ＣＤ３４、ｖＷＦ及びＣＤ２７１の非発現を指標に単離することができ、さらに、上記の１１個のマーカーの非発現を指標に単離することができる。
表面マーカーを用いて単離する場合、生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等から１個又は複数個の本発明の多能性幹細胞を、培養等を経ることなく直接単離することが可能である。また、本発明の多能性幹細胞を、細胞形態を顕微鏡等を使って目視することにより同定して単離することが可能である。
生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等に細胞ストレスをかけた後に、生存した細胞群から表面マーカーを用いて単離してもよい。
また、上記のマーカーに加えて、本発明の多能性幹細胞又は多能性細胞画分は、他の特定の因子の高発現によっても特徴付けられる。
無処理の骨髄間葉系細胞画分又は皮膚線維芽細胞画分から本発明の多能性幹細胞であるＭｕｓｅ細胞が得られ、さらにＭｕｓｅ細胞を培養することによりＭｕｓｅ細胞由来の胚様体（ＥＢ）様細胞塊が得られる。Ｍｕｓｅ細胞、無処理細胞、Ｍｕｓｅ由来胚様体様細胞塊及びヒトＥＳ細胞において発現している因子を比較検討することにより、Ｍｕｓｅ細胞で高発現している因子がわかる。ここで、因子とは遺伝子転写産物、タンパク質、脂質、糖を含む。
図２に、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊／無処理細胞での発現量の比が高い因子を示す。特に以下の１８個の因子の比が高い。
（ｉ）ＳＳＥＡ−３
（ｉｉ）ｖ−ｆｏｓ  ＦＢＪ  ｍｕｒｉｎｅ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒａｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ
（ｉｉｉ）ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  １６，ｍｅｍｂｅｒ  ６（ｍｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ７）
（ｉｖ）ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １
（ｖ）Ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ，ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，Ｐ／Ｑ  ｔｙｐｅ，ａｌｐｈａ  １Ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ
（ｖｉ）ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １６  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ８１
（ｖｉｉ）ｃｈｉｔｉｎａｓｅ  ３−ｌｉｋｅ  １（ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−３９）
（ｖｉｉｉ）ｐｒｏｔｅａｓｅ，ｓｅｒｉｎｅ，３５
（ｉｘ）ｋｙｎｕｒｅｎｉｎａｓｅ（Ｌ−ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）
（ｘ）ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  １６，ｍｅｍｂｅｒ  ６（ｍｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ７）
（ｘｉ）ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ
（ｘｉｉ）ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ−ｌｉｋｅ  ５
（ｘｉｉｉ）ｃｈｉｔｉｎａｓｅ  ３−ｌｉｋｅ  １（ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−３９）
（ｘｉｖ）ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ，ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ  Ａ（ＡＢＣ１），ｍｅｍｂｅｒ  １３
（ｘｖ）ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ４
（ｘｖｉ）ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ−ｅｎｄｏｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｇ／Ｈ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）
（ｘｖｉｉ）ｓｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ  １
（ｘｖｉｉｉ）ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １０２Ｂ
本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は、上記因子の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８が高発現していることを特徴として、少なくとも２つの因子が高発現していることを指標に単離することができる。
図３に、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊／ヒトＥＳ細胞での発現量の比が高い因子を示す。特に以下の２０個の因子の比が高い。
（ａ）ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  １（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）
（ｂ）ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ
（ｃ）ｃｈｉｔｉｎａｓｅ  ３−ｌｉｋｅ  １（ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−３９）
（ｄ）Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｌｏｃｕｓ
（ｅ）ｃｈｉｔｉｎａｓｅ  ３−ｌｉｋｅ  １（ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−３９）
（ｆ）ｓｅｒｇｌｙｃｉｎ
（ｇ）ＭＲＮＡ  ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ｉｎｓｅｒｔ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ＥＵＲＯＩＭＡＧＥ  １９１３０７６
（ｈ）Ｒａｓ  ａｎｄ  Ｒａｂ  ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ  ２
（ｉ）ｌｕｍｉｃａｎ
（ｊ）ＣＬＣＡ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ２，ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ
（ｋ）ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ８
（ｌ）Ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ＬＯＣ１６６０７５
（ｍ）ｄｅｒｍａｔｏｐｏｎｔｉｎ
（ｎ）ＥＧＦ，ｌａｔｒｏｐｈｉｌｉｎ  ａｎｄ  ｓｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １
（ｏ）ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １
（ｐ）ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  １６，ｍｅｍｂｅｒ  ４（ｍｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ５）
（ｑ）ｓｅｒｇｌｙｃｉｎ
（ｒ）ｇｒｅｍｌｉｎ  ２，ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｋｎｏｔ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）
（ｓ）ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５
（ｔ）ｓｕｌｆｉｄｅ  ｑｕｉｎｏｎｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ−ｌｉｋｅ（ｙｅａｓｔ）
本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は、上記因子の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０が高発現していることを特徴として、少なくとも２つの因子が高発現していることを指標に単離することができる。
さらに、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は、上記（ｉ）〜（ｘｖｉｉｉ）の因子の少なくとも２つと上記（ａ）〜（ｔ）の因子の少なくとも２つが同時に高発現していてもよく、これらの遺伝子が高発現していることを指標に単離することができる。
さらに、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は多能性マーカー以外のオドラント（ｏｄｏｒａｎｔ）受容体（オルファクトリーレセプター；ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）群及びケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）受容体群の因子を発現していること、すなわち特定のオドラント受容体やケモカイン受容体陽性であることを特徴とする。
本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分で発現しているオドラント受容体として例えば、以下の２２個の受容体が挙げられる。
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ８，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｇ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ８Ｇ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ７，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｇ，ｍｅｍｂｅｒ  ３（ＯＲ７Ｇ３）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ４，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｄ，ｍｅｍｂｅｒ  ５（ＯＲ４Ｄ５）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ５，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ＡＰ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ５ＡＰ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  １０，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｈ，ｍｅｍｂｅｒ  ４（ＯＲ１０Ｈ４）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  １０，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｔ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ１０Ｔ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｍ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ２Ｍ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｔ，ｍｅｍｂｅｒ  ５（ＯＲ２Ｔ５）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ７，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｄ，ｍｅｍｂｅｒ  ４（ＯＲ７Ｄ４）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  １，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｌ，ｍｅｍｂｅｒ  ３（ＯＲ１Ｌ３）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ４，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｎ，ｍｅｍｂｅｒ  ４（ＯＲ４Ｎ４）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ，ｍｅｍｂｅｒ  ７（ＯＲ２Ａ７）；
ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ），ａｌｐｈａ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｔｙｐｅ（ＧＮＡＬ）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ６，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ６Ａ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｂ，ｍｅｍｂｅｒ  ６（ＯＲ２Ｂ６）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｃ，ｍｅｍｂｅｒ  １（ＯＲ２Ｃ１）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ５２，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ，ｍｅｍｂｅｒ  １（ＯＲ５２Ａ１）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  １０，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｈ，ｍｅｍｂｅｒ  ３（ＯＲ１０Ｈ３）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  １０，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｈ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ１０Ｈ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ５１，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｅ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ５１Ｅ２）；
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  ５，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｐ，ｍｅｍｂｅｒ  ２（ＯＲ５Ｐ２）；及び
ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｆａｍｉｌｙ  １０，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｐ，ｍｅｍｂｅｒ  １（ＯＲ１０Ｐ１）
本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分で発現しているケモカイン受容体としては以下の５個の受容体が挙げられる。
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５（ＣＣＲ５）；
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４（ＣＸＣＲ４）；
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １（ＣＣＲ１）；
Ｄｕｆｆｙ  ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ，ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＤＡＲＣ）；及び
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ７（ＣＸＣＲ７）
本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は、上記の嗅覚受容体の少なくとも１個を発現しており、あるいは、上記のケモカイン受容体の少なくとも１個を発現している。
これらのオドラント受容体やケモカイン受容体と受容体に結合する遊走因子の作用で本発明の多能性幹細胞は、損傷組織へ遊走し、生着し、その場で分化する。例えば、肝臓、皮膚、脊髄、筋肉が損傷した場合、特定の遊走因子と細胞表面に発現しているオドラント受容体の働きで、それぞれの組織に遊走し、生着し、肝臓（内胚葉）、皮膚（外胚葉）、脊髄（外胚葉）、筋肉（中胚葉）細胞に分化し、組織を再生することができる。
さらに、本発明の多能性幹細胞であるＭｕｓｅ細胞が豊富に含まれる富Ｍｕｓｅ細胞画分において、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ−４、ｃ−Ｍｙｃ、ＤＰＰＡ２、ＥＲＡＳ、ＧＲＢ７、ＳＰＡＧ９、ＴＤＧＦ１等がアップレギュレートされており、Ｍｕｓｅ細胞の細胞塊において、ＤＡＺＬ、ＤＤＸ４、ＤＰＰＡ４、Ｓｔｅｌｌａ、Ｈｏｘｂ１、ＰＲＤＭ１、ＳＰＲＹ２等がアップレギュレートされている。
また、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分においては、造血幹細胞マーカーであるＣＤ３４及びＣＤ１１７の発現は認めらないかもしくは発現が極めて低い。
本発明は、Ｍｕｓｅ細胞のみならず、Ｍｕｓｅ細胞を濃縮した細胞集団、Ｍｕｓｅ細胞を増殖させた細胞集団、Ｍｕｓｅ細胞を分化させた細胞集団を含み、さらに、Ｍｕｓｅ細胞やＭｕｓｅ細胞由来の細胞を含む研究用キット、細胞チップ、治療用デバイスも含む。
本発明の多能性幹細胞は、ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙを有しており、あらゆる組織へと分化し得る。該多能性幹細胞又は多能性細胞画分は、再生医療等に用いることができる。例えば、各種組織、各種器官等の再生に用いることができる。具体的には皮膚、脳脊髄、肝臓、筋肉等が挙げられる。本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分を損傷あるいは障害を受けた組織、器官等に直接あるいは近傍に投与することにより、該多能性幹細胞はその組織、器官内に侵入し、その組織特有の細胞に分化し、組織、器官の再生、再建に貢献し得る。また、静脈投与等により全身投与してもよい。この場合、該多能性幹細胞は、例えば、損傷を受けた組織や器官をホーミング等により指向し、そこに到達・侵入した上で、その組織や器官の細胞に分化し、組織、器官の再生、再建に貢献し得る。
投与は、例えば皮下注、静注、筋注、腹腔内注等の非経口投与や経口投与、あるいは胚への子宮内注射等により行うことができる。また、局所投与でも全身投与でもよい。局所投与は例えばカテーテルを利用して行うことができる。投与量は、再生しようとする器官、組織の種類や、サイズにより適宜決定することができる。
再生しようとする器官は限定されず、骨髄、脊髄、血液、脾臓、肝臓、肺、腸管、眼、脳、免疫系、循環系、骨、結合組織、筋、心臓、血管、膵臓、中枢神経系、末梢神経系、腎臓、膀胱、皮膚、上皮付属器、乳房−乳腺、脂肪組織、および口、食道、膣、肛門を含む粘膜等を含む。また、治療対象となる疾患として、癌、心血管疾患、代謝疾患、肝疾患、糖尿病、肝炎、血友病、血液系疾患、脊髄損傷等の変性または外傷性神経疾患、自己免疫疾患、遺伝的欠陥、結合組織疾患、貧血、感染症、移植拒絶、虚血、炎症、皮膚や筋肉の損傷等が挙げられる。
細胞は医薬として許容される基材と共に投与してもよい。該基材は例えばコラーゲン等でできた生体親和性が高い物質や、生分解性の物質できており、粒子状、板状、筒状、容器状等の形状とすればよく、細胞を該基材に結合させあるいは該基材中に収容して投与すればよい。
また、本発明の多能性幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化誘導し、さらに分化した細胞を用いて組織を構築させ、該分化した細胞又は該組織を移植してもよい。本発明の多能性幹細胞は、腫瘍化しないので、移植した前記分化した細胞又は該組織に本発明の多能性幹細胞が未分化のまま含まれていても癌化の可能性が低く安全である。これらの再生医療において、移植した細胞又は組織のレシピエントによる拒絶を避けるためには、再生医療を受けようとする患者から中胚葉系組織又は間葉系組織等を採取し、該組織から本発明の多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離し、利用することが望ましい。さらに、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分を組織の変性や機能不全を原因とする疾患の治療に用いることができる。この場合、例えば、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分をｅｘ  ｖｉｖｏで濃縮し、増殖させ、あるいは分化させて体内に戻せばよく、例えば、多能性幹細胞を特定の組織の細胞に分化させ、該細胞を治療しようとする組織に移植すればよい。また、細胞の移植により、ｉｎ  ｓｉｔｕ細胞治療を行うこともできる。この場合、対象細胞の例として、肝臓細胞、神経細胞やグリア細胞などの神経系細胞、皮膚細胞、骨格筋細胞などの筋肉細胞が挙げられ、本発明の多能性幹細胞をこれらの細胞に分化させ、移植し、ｉｎ  ｓｉｔｕで治療を行うことができる。該治療により、例えば、パーキンソン病、脳梗塞、脊髄損傷、筋変性疾患などを治療することができる。本発明の多能性幹細胞は、腫瘍化しないので、このような治療に用いても癌化の可能性が低く安全である。
また、本発明の多能性幹細胞を、分化させて血液や血液成分を形成させることにより、血液や血液成分をｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成させることができる、血液成分として、赤血球、白血球、血小板等が挙げられる。このようにして形成させた血液や血液成分を、自家輸血や他家輸血に用いることができる。
上記のように、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分を治療に用いる場合、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれで分化させてもよい。本発明の多能性幹細胞は、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄間質、骨格筋、平滑筋、心筋、眼、内皮、上皮、肝、膵、造血、グリア、神経細胞、稀突起膠細胞等に分化する。本発明の多能性幹細胞の分化は、分化因子の存在下で、培養することにより達成することができる。分化因子としては、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびイソプロテレノール；あるいは繊維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）等が挙げられる。本発明は、本発明の多能性幹細胞から分化した細胞も包含する。
本発明の多能性幹細胞を治療に用いる場合、タンパク質性の抗癌物質や生理活性物質等をコードする遺伝子を導入してもよい。これにより、本発明の多能性幹細胞は、治療薬のデリバリー機能も有することになる。このような物質として例えば、抗血管新生薬が挙げられる。
本発明は、Ｍｕｓｅ細胞、Ｍｕｓｅ細胞からできた胚様体様細胞塊、及びＭｕｓｅ細胞や前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞若しくは組織・器官を含む、細胞移植治療用材料若しくは細胞移植治療用組成物、又は再生医療用材料若しくは再生医療用組成物を包含する。該組成物はＭｕｓｅ細胞、Ｍｕｓｅ細胞からできた胚様体様細胞塊、又はＭｕｓｅ細胞や前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞若しくは組織・器官に加えて、医薬的に許容される緩衝液や希釈液等を含む。
さらに、患者から細胞を採取し、Ｍｕｓｅ細胞を単離し、該Ｍｕｓｅ細胞を用いて種々の診断に用いることができる。例えば、Ｍｕｓｅ細胞から患者の遺伝子を採取し、遺伝子情報を得て、該情報を反映させた正確な診断が可能になる。例えば、被験体の細胞由来のＭｕｓｅ細胞を分化させることで、被験者と同じ遺伝子背景などの性質を持った各組織・器官の細胞を得ることができるため、疾病の診断や病態解明、薬剤の効果や副作用の診断、などに関し、各々の被験者の性質に合わせ適切な診断を行うことができる。すなわち、Ｍｕｓｅ細胞、Ｍｕｓｅ細胞からできた胚様体様細胞塊、及びＭｕｓｅ細胞や前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞若しくは組織・器官は診断用材料として用いることができ、例えば、本発明は、被験体からＭｕｓｅ細胞を単離し、該Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞から分化させて得られた、被験体と同じ遺伝子背景を有する組織や器官を用いて被験体の疾病等を診断する方法を包含する。
また、Ｍｕｓｅ細胞を分化させることで体細胞を大量に得ることができるため、疾病のメカニズム解明等の基礎的研究、治療薬開発、薬剤の効果や毒性に関するスクリーニング、薬剤評価などを行うことができる。すなわち、Ｍｕｓｅ細胞、Ｍｕｓｅ細胞からできた胚様体様細胞塊、及びＭｕｓｅ細胞や前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞若しくは組織・器官を薬剤評価や薬剤スクリーニングの材料として用いることができる。例えば、本発明はＭｕｓｅ細胞を分化・増殖させ、体細胞を得て、該体細胞に候補薬剤を投与し、体細胞の応答を調べることにより、薬剤のスクリーニングや薬剤評価を行う方法を包含する。
また、種々の（例えば様々なＨＬＡ型の）Ｍｕｓｅ細胞をライブラリー化したＭｕｓｅ細胞バンクを構築することで、上記のＭｕｓｅ細胞利用場面における細胞を必要に応じて提供できる体制を実現でき、例えば、上記に挙げた目的の他、緊急に要する細胞移植治療のための拒絶反応の無い（少ない）細胞提供、などを行うことができる。すなわち、本発明は種々の遺伝子特性を有するＭｕｓｅ細胞を単離し、集めることにより、異なる遺伝子特性を有するＭｕｓｅ細胞のライブラリー、すなわちＭｕｓｅ細胞バンクを作製する方法を包含する。また、Ｍｕｓｅ細胞だけでなく、Ｍｕｓｅ細胞からできた胚様体様細胞塊、及びＭｕｓｅ細胞や前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞若しくは組織・器官を得てライブラリーやバンクを構築することもできる。本発明においては、これらのＭｕｓｅ細胞からできた胚様体様細胞塊、及びＭｕｓｅ細胞や前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞若しくは組織・器官を得てライブラリーやバンクも細胞ライブラリー又は細胞バンクと称する。本発明は、このようにして作製した細胞ライブラリー又は細胞バンクを包含する。該細胞ラブラリー又は細胞バンクは例えば、異なる遺伝的特性を有する細胞等が収納された複数のチューブ等の容器からなり、該細胞は凍結されていてもよい。例えば、被験体において、組織や器官を移植し、あるいは再生する必要が生じた場合に、上記細胞ライブラリー又は細胞バンクから、前記被験体に遺伝的背景等に関して適合した細胞を選択し、該細胞を用いて移植や再生治療を行うことができる。
本発明は、疾患の治療のために、本発明の多能性幹細胞や該細胞画分や該細胞由来の派生細胞や誘導細胞の治療上有効な量を治療を必要としている患者に投与することを含む治療方法を包含する。ここで、有効な量とは、例えば、投与する細胞数で特定することができ、疾患の種類や重篤度により適宜決定することができる。上記治療法においては、本発明の多能性幹細胞は、テラトーマ（奇形腫）を形成しないため、患者にテラトーマが形成されない。また、自己細胞由来のＭｕｓｅ細胞を投与する場合、患者を放射線照射や化学療法等の処置により骨髄機能を欠損させる必要はないが、自己細胞ではないＭｕｓｅ細胞を用いる場合は、上記処置を行えばよい。
さらに、Ｍｕｓｅ細胞は、ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）のソースとなり得る。Ｍｕｓｅ細胞をソースとしたｉＰＳ細胞の作製効率は他の細胞（例えば、ＳＳＥＡ−３発現を指標に分画していない皮膚線維芽細胞）をソースとした場合に比べはるかに（少なくとも２５倍以上）高い。
Ｍｕｓｅ細胞に特定の遺伝子を導入し、あるいは特定の化合物を導入すること等により細胞形質を変化させることによりｉＰＳ細胞を作製することができる。細胞形質の変化は、リプログラミングや癌化を含み、現在知られている方法、あるいは将来的に確立されるあらゆる方法を用いることができる。
例えば、特許４１８２７４２号の記載に従って遺伝子をＭｕｓｅ細胞に導入し、あるいは図２７の記載に従って、Ｍｕｓｅ細胞からｉＰＳ細胞を確立することができる。また、図２７に記載の方法以外に、化学物質、外来遺伝子又は外来タンパク質を導入して、ｉＰＳ細胞を樹立することが可能であるといえる。Ｍｕｓｅ細胞からのｉＰＳ細胞の確立は、例えば後述の実施例に記載の方法で行うことができる。
このようにしてＭｕｓｅ細胞から得られたｉＰＳ細胞をＭｕｓｅ由来ｉＰＳ細胞（Ｍｕｓｅ−ｉＰＳＣ）と呼ぶことがあり、本発明は該Ｍｕｓｅ由来ｉＰＳ細胞をも包含する。Ｍｕｓｅ由来ｉＰＳ細胞は、Ｍｕｓｅ細胞由来の増殖性を有する多能性幹細胞ということができる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
富Ｍｕｓｅ細胞画分及びＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊の調製並びに特性分析
材料及び方法
本実施例において、以下の細胞を用いた。
間葉系細胞として、２株のヒト皮膚線維芽細胞画分及び４株のヒトＭＳＣ（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）画分を用いた。ヒト線維芽細胞画分は、（１）Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−１（正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、Ｌｏｎｚａ社より入手）及び（２）Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−２（成人ヒト皮膚線維芽（ＨＤＦＡ）、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社より入手）を用いた。ヒトＭＳＣ画分としては、Ｈ−ＭＳＣ−１、Ｈ−ＭＳＣ−２、Ｈ−ＭＳＣ−３及びＨ−ＭＳＣ−４をＬｏｎｚａ社及びＡＬＬＣＥＬＬＳ社より入手して用いた。ヒトＭＳＣ画分については、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，Ｍ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，１４３−１４７（１９９９）；Ｄｅｚａｗａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１３，１７０１−１７１０（２００４）；Ｄｅｚａｗａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９，３１４−３１７（２００５）に詳細に記載されている。
細胞は１０％ＦＢＳ及び０．１ｍｇ／ｍｌカナマイシン含有α−ＭＥＭ（ａｌｐｈａ−ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。入手したものの最初の培養を第１代とし、その後細胞が９５％コンフルエントになったところで、細胞培養液：培地の比を１：２として継代し、４〜１０代継代したものを用いた。
ヒトＥＳ細胞（ｈＥＳＣ）は京都大学より入手したｋｙｏｔｏ  ｈＥＳＣ−１（ＫｈＥＳ−１）を用いた。
マウスＥＳ細胞（ＴＴ２細胞）及びヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−１）はＣ５７ＢＬ／６マウスの１２．５日胚より確立したマウス由来フィーダー細胞存在下で維持した。
以下の方法で実験を行った。
１．間葉系細胞のストレス刺激
ストレス刺激として低栄養条件での培養、低血清濃度での培養、低酸素濃度での培養、繰返しトリプシン処理、長時間トリプシン処理を行うため以下の培養条件を採用した。
（１）無血清培地（ＳＴＥＭＰＲＯ  ＭＳＣ  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた２日間の培養（無血清）
（２）Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた２日間の培養（ＨＢＳＳ）
（３）１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用いての低酸素濃度（１％）での２日間の培養（１０％ＦＢＳ＋ＬｏｗＯ２）
（４）トリプシン中（０．２５％トリプシン−ＨＢＳＳ）での１時間インキュベーション３回の処理（トータル３時間のトリプシン処理）（Ｔｒｙ  ３×１ｈｒ）
（５）トリプシン中での８時間インキュベーション（ＬＴＴ  ８ｈｒ）
（６）トリプシン中での１６時間インキュベーション（ＬＴＴ  １６ｈｒ）
陰性対照として、ヒト末梢血単核細胞画分を用いた。
上記（４）、（５）及び（６）の条件の場合、１００，０００個〜５００，０００個の細胞を５ｍｌトリプシン溶液中に浮遊させて培養を行った。上記の（１）〜（３）のストレス刺激の場合、刺激後、細胞を５分間のトリプシン処理により集め、（４）〜（６）のストレス刺激の場合、細胞を直接チューブに集めた。
ストレス刺激後に生じる大量の死細胞はボルテックス処理することにより破壊した。すなわち、最大５００，０００個の細胞を含む５ｍｌの培地を１５ｍｌのファルコンチューブに移し、ボルテックスミキサー（ＩＫＡ  Ｗｏｒｋｓ社）を用いて１８００〜２２００ｒｐｍ／ｍｉｎで３分間ボルテックス処理を行った。その後、２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した。生細胞の回収率は約７０〜８０％であった。
２．ＭＣ培養
本実施例においては、細胞をメチルセルロース含有培地中で浮遊培養した。メチルセルロース含有培地中での培養をＭＣ培養と呼ぶ。ＭＣ培養については、Ｎａｋａｈａｔａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ６０，３５２−３６１（１９８２）に記載されている。
細胞が容器底に付着するのを防ぐために、培養ディッシュをＰｏｌｙ−ＨＥＭＡ（Ｐｏｌｙ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）でコートした。すなわち、６００ｍｇのｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ（ＳＩＧＭＡ社）を９５％エタノール４０ｍｌに３７℃で攪拌して溶解し、ディッシュに添加し（９６ウェル培養ディッシュの場合４０μｌ／ウェル、１２ウェルディッシュの場合２００μｌ／ウェル）、一晩乾燥させた。
ＭＣ（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｈ４１００）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社より入手）を２０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭに最終濃度２％で懸濁した。ゲル状のＭＣ培地中の細胞濃度は細胞同士の凝集を抑える十分な細胞間距離を確保できる８０００細胞／ｍｌとした。細胞とＭＣ培地を穏やかなピペッティングにより十分混合し、ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡコートした培養ディッシュに移した。乾燥を防ぐために、１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを３日毎に最初のＭＣ培養の容積の１／１０量、ゆっくりと添加した。
細胞塊（細胞塊は、本発明の多能性幹細胞Ｍｕｓｅ細胞由来の細胞塊であるためＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊と呼ぶ）のクローニングは７日目に行った。０．０１ＭのＰＢＳを培地に添加し、２０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上清を捨てた。この処理を３回繰返し、細胞を洗浄した。回収した細胞ペレットを１０μｌの０．０１Ｍ含有トリパンブルー溶液に懸濁し、スライドガラスに載せ位相差顕微鏡を用いて写真を撮った。直径２５μｍより大きい、ヒトＥＳ細胞と外観が似ているトリパンブルー陰性細胞塊のみをＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊として数えた。Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊の形成率は細胞塊の数／すべての生細胞数（すべてのトリパンブルー陰性細胞）により算出した。細胞計数の際、細胞塊はその大きさにかかわらず１細胞として数えた。これは、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊中に含まれる細胞の数の正確な計測は困難だからである。
ヒトＥＳ細胞においては、細胞を注意深くフィーダー細胞が含まれないように単離し、上記の方法でＭＣ培養を行った。培養３日目に位相差顕微鏡観察像を得た。
３．単一細胞浮遊培養
９６ウェルディッシュを上記の方法でｐｏｌｙ−ＨＥＭＡでコートし、１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用いて限界希釈法にて、単一細胞をそれぞれのウェルに播き、位相差顕微鏡にてウェル中の実際の細胞数を計数し、細胞が入っていないウェル、あるいは複数入っているウェルは計測から除外した。培養１０日目に胚様体（ＥＢ）（Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊）形成を計数した。それぞれの細胞株に対して３回の実験を行い、一回の実験では最低２５０ウェル以上の観察を行った。
４．アルカリフォスファターゼ染色
Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分由来のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を集め生理食塩水で数回洗浄し、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｋｉｔ（ｓｉｇｍａ社）を用いて染色した。
５．Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化
ＭＣ培養又は単一細胞浮遊培養の７〜１０日後、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分由来の胚様体様細胞塊をガラスマイクロピペットにより採取し、ゼラチンコート培養ディッシュ又はカバーガラス上に移しさらに７日間培養すると細胞塊から細胞が広がる。かかる細胞における分化の有無を免疫組織化学分析及びＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。
６．免疫組織化学
細胞を０．０１Ｍ  ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分由来の富Ｍｕｓｅ細胞画分又はＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を遠心分離により集め、ＯＣＴコンパウンド中に埋め込み８μｍの凍結切片を作製した。細胞塊は、ゼラチンコートスライドガラス上で固定し、免疫組織化学分析に供した。
１次抗体として、Ｎａｎｏｇ（１：５００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）、Ｏｃｔ３／４（１：８００，大阪大学  Ｄｒ．Ｈ．Ｈａｍａｄａより入手）、Ｓｏｘ２（１：１０００，Ａｂｃａｍ社）、ＰＡＲ４（１：１００，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）、ＳＳＥＡ−３（１：２０，ＤＳＨＢ社）、平滑筋アクチン（１：１００，Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ社）、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔＭ（１：２００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）、α−フェトプロテイン（１：１００，ＤＡＫＯ社）、マウスＮｕｍｂｌｉｋｅ（１：５００，カリフォルニア大学サンフランシスコ校のＤｒ．Ｙｕｈ−Ｎｕｎｇ  Ｊａｎより入手）及びｔｙｐｅ１コラーゲン（１：２０，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に対する抗体を用いた。２次抗体として、Ａｌｅｘａ４８８又は５６８とコンジュゲートした抗ウサギＩｇＧ、抗マウスＩｇＧ又は抗マウスＩｇＭ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いて、免疫組織化学分析を行った。
７．核型の決定
Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分由来のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊（Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊から単一細胞を取り再度Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を形成させることを１〜３回繰り返したもの）からの増殖細胞（ｃｌｏｎａｌｌｙ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｃｅｌｌｓ）の核型をｑｕｉｎａｃｒｉｎｅ−Ｈｏｅｃｈｓｔ染色により決定した。
８．免疫不全マウス精巣への細胞の注入
無処理細胞画分、並びにＨ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分由来の富Ｍｕｓｅ細胞画分及びＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を用いた。富Ｍｕｓｅ細胞画分の場合、長時間トリプシン処理後血清を添加し、０．０１Ｍ  ＰＢＳで３回洗浄した。Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊もＭＣ培養から採取後に同ＰＢＳで３回洗浄した。１×１０５個の細胞をＰＢＳに浮遊し、ＮＯＧマウス（登録商標）（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ＲγＫＯ  Ｊｉｃ、８週齢、財団法人  実験動物中央研究所より入手）の精巣にガラスマイクロチューブを用いて注入した。Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を用いた場合、レーザ共焦点顕微鏡の３Ｄグラフィック分析手法を用いて、５０個のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を取り、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊のトータル体積を測定し核の数で除することにより、それぞれの構成細胞の平均体積を測定した。測定の結果、１．５×１０５細胞／μｌであることが算定され、この算定にしたがって上記数の細胞を集め、ＮＯＧマウス精巣に注入した。マウスは注入６ヵ月後に実験に供した。
対照試験として、１×１０６のマウスＥＳ細胞（陽性対照）及びマイトマイシンＣ処理ＭＥＦ（マウス胚性フィーダー細胞）（陰性対照）をＳＣＩＤマウス精巣に注入し、注入後８週後に実験に供した。
９．光学顕微鏡により細胞の高解像度分析
Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分由来の富Ｍｕｓｅ細胞画分及びＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊について、安定な高解像度光学顕微鏡を用いてヒトＭＳＣ、線維芽細胞及び神経細胞などの細胞タイプの観察を行った。
１０．電子顕微鏡による極薄切片観察
Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分由来のＳＳＥＡ−３陽性細胞及びＳＳＥＡ−３陰性細胞、並びにヒトＥＳ細胞の細胞塊を遠心分離により集め、１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）中２．５％グルタルアルデヒドで３０分間固定し、１％寒天中に包埋し、１ｍｍ３に切り、ＰＢＳで洗浄後、１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）中２％ＯｓＯ４で４℃で１０分間染色した。サンプルを蒸留水で洗浄後、５滴の２％酢酸ウラニルで４℃で２０分間染色した。蒸留水で洗浄後、染色サンプルを５０％、７０％又は９０％エタノールを用いて４℃で１０分間脱水し、次いで１００％エタノールを３回交換することにより完全に脱水した。得られたサンプルを酸化プロピレンで５分間置換し、酸化プロピレン中５０％エポキシレジン中に６０分間包埋した。これを純粋なエポキシレジンに包埋し、６０℃オーバーナイトで硬化させた。超薄切片は７０〜８０ｎｍの厚さで作製し、ＣＣＤカメラ付きの１００ｋＶ電子顕微鏡で観察した。
１１．Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊の増殖速度
Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分由来のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊について細胞群の倍化時間を測定するために、それぞれのＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊をひとつずつ９６ウェルプレートに移し、１５分間のトリプシン処理を行った後にガラスマイクロピペットを用いてピペッティングを行った。細胞の数を計測し、所定の時間後ごとに少なくとも２０〜３０個のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊について分析した。
１２．ＲＴ−ＰＣＲ
無処理細胞画分（２４ウェルスケール中の約１０，０００細胞）及びＨ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分（２４ウェルスケール中の約１０，０００細胞）由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏで単一Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊から分化した細胞（１〜３サイクル）を用いた。トータルＲＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  ＸＳ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社）を用いて抽出、精製し、第１鎖ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて調製した。ＰＣＲ反応は適切なプライマーを設計し、Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用いて行った。用いたプライマーは以下のとおりであった。
陽性対照としては、α−フェトプロテインプライマーについてはヒト胎児肝臓（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）を用い、それ以外はヒト完全胚（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）を用いた。
１３．定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）
無処理細胞画分、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−１、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−２、Ｈ−ＭＳＣ−１及びＨ−ＭＳＣ−２由来の富Ｍｕｓｅ細胞画分及びＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊からのトータルＲＮＡをＲｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ社）により集め、ｃＤＮＡをＲＴ２  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｋｉｔ（ＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて合成した。プライマーはＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社より特注し、７３００ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて定量的ＰＣＲを行った。得られたデータはΔΔＣＴ方法（Ｌｉｖａｋ  ＫＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４０２−４０８，２００１）により解析した。
１４．ＤＮＡマイクロアレイ分析
無処理細胞画分、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−１、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−２、Ｈ−ＭＳＣ−１及びＨ−ＭＳＣ−２由来の富Ｍｕｓｅ細胞画分及びＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊、並びに４名の健常者由来ヒト末梢血単核細胞画分混合物を用いた。ｔｏｔａｌＲＮＡをＲｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ社）により集め、ＤＮＡマイクロアレイにより分析した（タカラバイオ社）。アレイシグナルは、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  Ｖ１．１ソフトウェア）により処理しノーマライズした。Ｐａｔｈｗａｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ６．０（Ａｒｉａｄｎｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ社）を用いて発現変動が認められた遺伝子を遺伝子オントロジーの機能的カテゴリーに割り当てた。階層的クラスタリングは、ＭｅＶ４による群平均クラスタリングの手法を用いて、遺伝子の発現変動に基づいてユークリッド距離を用いて行った（Ｓａｅｅｄ  ＡＩ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３４（２）：３７４−３７８，２００３）。
１５．テロメラーゼ活性の検出
Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分由来の富Ｍｕｓｅ細胞画分、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊及びＨｅｌａ細胞を用いた。テロメラーゼ活性は、ＴＲＡＰＥＺＥ  ＸＬ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）とＥｘ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いて検出した。蛍光強度はマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社）を用いて測定した。
１６．Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ（亜硫酸水素塩）シーケンス
無処理細胞画分、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分由来の富Ｍｕｓｅ細胞画分及びＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊由来の１μｇのゲノムＤＮＡをＣｐＧｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）で処理した。ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製した。ヒトＯｃｔ３／４及びＮａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域をＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にサブクローニングしそれぞれのサンプルについて１０クローンまでをＭ１３ユニバーサルプライマーを用いて配列決定し、プロモータ領域のメチル化の状態を調べた。ＰＣＲ増幅には、Ｓｈｉｍａｚａｋｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：４４８９−４４９８，１９９３に記載のプライマーを用いた。
１７．ヒト骨髄穿刺液からのＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊形成
３人の健常人からのヒト骨髄穿刺液（ＡＬＬＣＥＬＬＳ社より入手）から単核細胞画分をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ  Ｔｕｂｅ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ  ＰｏＣ  ＡＳ社）を用いて集め、８時間の長時間トリプシン処理を行った後にＭＣ培養を行った。またトリプシン処理をせずに直接そのままでＭＣ培養にも持って行った。７日目に細胞数を測定した。
１８．ＭＡＣＳソーティング
３人の健常人からのヒト骨髄穿刺液（ＡＬＬＣＥＬＬＳ社より入手）由来の単核細胞画分を抗ＣＤ１０５抗体とマイクロビーズのコンジュゲートと反応させ、ＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いてソーティングした。ＣＤ１０５陽性細胞をフラクション１（間葉系細胞群）として集め、さらにＣＤ１０５陰性細胞を抗ＣＤ３４抗体及び抗ＣＤ１１７抗体の混合物とマイクロビーズのコンジュゲートとインキュベートし、再度ソーティングし、ＣＤ３４陽性・ＣＤ１１７陽性細胞（フラクション２；造血幹細胞群にあたる）及びＣＤ１０５陰性・ＣＤ３４陰性・ＣＤ１１７陰性細胞（フラクション３）を得た（図４）。集めたサンプルを８時間の長時間トリプシン処理を行った後にＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊の形成を測定した。
１９．免疫組織化学
マウス精巣を０．０２ＭＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドを用いて固定した。切片は凍結切片として１０μｍの厚さで作製した。サンプルを０．０２ＭＰＢＳで洗浄し、２０％ＢｌｏｃｋＡｃｅ（雪印社）含有バッファーを用いてブロッキングした後に免疫組織化学分析用の１次抗体とインキュベートした。用いた１次抗体は、抗平滑筋アクチン抗体（１：２００、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ社）、抗ＭＡＰ−２抗体（１：２００、Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社）及び抗α−フェトプロテイン抗体（１：１０、ＤＡＫＯ社）であった。
２次抗体としては、Ａｌｅｘａ４８８又はＡｌｅｘａ５６８を結合した抗ウサギＩｇＧ抗体、Ａｌｅｘａ５６８を結合した抗マウスＩｇＧ抗体を用い、ＤＡＰＩ存在下で反応させた。サンプルはニコン共焦点顕微鏡システムＣ１ｓｉ（ニコン）を用いて観察した。
２０．フローサイトメトリー及び細胞ソーティング
細胞をフィコエリトリン標識抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ２９抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４９ｆ抗体、抗ＣＤ５４抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ９０抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＤ１６６抗体、抗ＣＤ２７１抗体又は抗ｖＷＦ抗体（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）又は抗ＳＳＥＡ−３抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）とインキュベートした。抗ＳＳＥＡ−３抗体を用いる場合、細胞をさらにＦＩＴＣ結合抗ラットＩｇＭ抗体と反応させた。２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．５％ウシ血清アルブミンを添加したカルシウム及びマグネシウムを含まない０．０２Ｍ  ＰＢＳをＦＡＣＳ抗体希釈液として用いた。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によりＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア又はＦＡＣＳＡｒｉａによりＤＩＡソフトウェアを用いてデータ解析を行った。細胞をＦＡＣＳ抗体希釈液中で抗ＳＳＥＡ−３抗体とインキュベートしＦＡＣＳＡｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により低流速及び４ｗａｙ  ｐｕｒｉｔｙソーティングモードでソーティングし、細胞のソーティングを行った。
２１．統計解析
データは、平均±ＳＥＭで表す。データは、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法による一対比較によりＡＮＯＶＡを用いて比較した。
結果
Ａ．Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分のストレス刺激
Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分とＨ−ＭＳＣ画分のストレス刺激の結果の一例を表１に示す。
ストレス刺激とボルテックス処理後、トリパンブルー染色により生細胞数を計測し、生存率を計算した。生細胞を回収し、７日間のＭＣ培養に供した。条件（２）の場合、大量の死細胞が存在し、生細胞回収効率が低かったため、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊はうまく計測できなかった。表１には「ＮＤ（ｎｏｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）」で示した。
６つの条件中で、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分の１６時間トリプシン処理及びＨ−ＭＳＣ画分の８時間のトリプシン処理が最も効率的な刺激であった。２株のＨ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及び４株のＨ−ＭＳＣ画分を用いて繰返しこの実験を行ったところ、同様の傾向が認められた。陰性対照（ヒト末梢血単核細胞画分）においては、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊は認められなかった。代表的な観察値を表１に示す。
【表１】
2011007900.tif 000002
2011007900.tif 000003
ＮＤ（ｎｏｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）：大量の死細胞が存在し、生細胞回収効率が低かったため、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を計測できなかった
Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊形成効率から判断すると、１６時間（Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分）及び８時間（Ｈ−ＭＳＣ画分）のトリプシン処理が６つの条件の中で最も効率的であると考えられた。１６時間又は８時間トリプシン処理、１８００〜２０００ｒｐｍ／ｍｉｎでの３分間のボルテックス及び２０００ｒｐｍ１５分間の遠心分離の一連の操作をＭｕｓｅ細胞の濃縮のための長時間トリプシン処理（ＬＴＴ）と名付けた。ボルテックス処理後の細胞の回収率は約７０〜８０％であった（図５）。
Ｂ．Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊の判定基準
本実施例において、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊の判定基準を設けた。Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分由来の富Ｍｕｓｅ細胞画分中の単一細胞の平均直径は１０〜１３μｍであった（図６ａ）。これらの細胞をＭＣ培養すると、細胞は分裂を開始した。分裂するとそれぞれの細胞のサイズは小さくなり、８〜１０μｍの細胞から構成される多細胞塊が徐々に形成された（図７ｅ及び７ｆ）。それぞれの細胞のサイズと外観は、ＭＣ培養したヒトＥＳ細胞に類似していた（図６ｂ及び６ｃ）。７日目に、ほとんどの多細胞塊は２５μｍより大きくなり、直径１００〜１５０μｍになった。該細胞塊はＥＳ細胞と類似した外観を有していた。Φ２５μｍのフィルターを用いることにより、２５μｍより大きい塊を回収した（図６ｂ）。Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分の１００個のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊までの免疫細胞化学によりほとんどのＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊は多能性マーカーＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＰＡＲ４及びＳＳＥＡ−３が陽性であることがわかり、アルカリフォスファターゼ染色でも陽性であった（図６ｅ−ｇ）。２５μｍより小さい細胞塊の場合、マーカーは検出される場合とされない場合があり、また多能性マーカーの局在はこれらのマーカーに典型的なパターンを示さない場合もあった。さらに、細胞の外観はむしろ富Ｍｕｓｅ細胞画分に類似している場合があった。
上記結果より、直径２５μを超える多細胞塊を、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊とした。
Ｃ．ヒト間葉系細胞画分から形成される細胞塊の分析
生体がストレスに曝されたり、傷害を受けると休眠状態の組織幹細胞が活性化されることが知られている。本実施例において、Ｈ−ＭＳＣ画分及びＨ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分に種々の方法でストレスをかけ（無血清処理、Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）による処理、低酸素処理、トータル３時間、８時間若しくは１６時間のトリプシン処理等）、生存した細胞を集め、その後メチルセルロース（ＭＣ）含有培地中で浮遊培養（ＭＣ培養という）を行い、さらに８０００細胞／ｍＬの密度で７日間ＭＣ培養を行った（図７−１ｄ）。その結果、最大で約直径１５０μｍまでの種々の大きさの細胞塊の生成が認められた（図７−１ｅ及びｆ）。図７−１ｃはＨ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−１画分のＭＣ培養の０日目の状態を、図７−１ｄは７日目の状態を示す。１６時間のトリプシン処理を行ったＨ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及び８時間のトリプシン処理を行ったＨ−ＭＳＣ画分において、最も多くの細胞塊の形成が認められた。図７−１ｅ及びｆにＨ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−１画分から形成された細胞塊（Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊）の状態を示す。図７−１ｅはＭＣ培養７日目の状態であり、図７−１ｆは単一細胞の浮遊培養１０日目の状態である。細胞塊をサイズごとにフィルターを用いて分画し、免疫細胞化学分析を行った。直径２５μｍを超える細胞塊中に、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、ＳＳＥＡ−３、ＰＡＲ−４及びＳｏｘ２の多能性幹細胞マーカーが陽性であり（図７−２ｇ−ｌ）、さらにアルカリフォスファターゼ染色で陽性の細胞（図７−３ｍ−ｏ）が検出された。これらの細胞について電子顕微鏡を用いて観察したところ、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分から形成した細胞塊において、ＥＳ細胞と同様の核／細胞質比、細胞内器官の減少、核中の１つ若しくは２つの巨大な核小体の存在という特徴が認められた（図７−４ｐ−ｒ）。
生体のＨ−ＭＳＣ画分及びＨ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分から、多能性マーカー陽性及びアルカリフォスファターゼ染色陽性を示す細胞塊を浮遊培養で形成し得る細胞を見出した。本発明者らは、これらの細胞をＭｕｓｅ細胞（ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｓｔｒｅｓｓ  ｅｎｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）と名付けた。１６時間のトリプシン処理を行ったＨ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及び８時間のトリプシン処理を行ったＨ−ＭＳＣ画分から形成した細胞集団を「富Ｍｕｓｅ細胞画分（Ｍｕｓｅ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）」と呼び、該集団から得た単一細胞を浮遊細胞したところ、富Ｍｕｓｅ細胞画分の９〜１０％において、細胞塊の形成（Ｍｕｓｅ細胞由来細胞塊：Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊）が認められた。このことは、富Ｍｕｓｅ細胞画分には約９〜１０％のＭｕｓｅ細胞が含まれることを示している。
単離したＭｕｓｅ細胞の増殖について調べたところ、培養開始後１〜２日目で細胞分裂が観察され、細胞は１０日目頃までは約１．３日の分裂周期で増殖した（図８−２）。しかし、１１〜１２日目には増殖速度は低下し、１４日目に直径１５０μｍの大きさの細胞塊が形成された時点で増殖が停止した。Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を５分のトリプシン処理でばらばらにし単一細胞とし、単一浮遊培養を行ったところ、細胞は生存したが、増殖速度は分裂周期が５〜７日と非常に低いままであり、細胞によっては細胞増殖の停止も観察された（図８−１の（１））。このことは、これらの細胞塊の増殖が制限され、一旦速度が低下すると、浮遊培養において、増殖速度は再上昇しにくいことを示す。しかしながら、単一のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を接着培養に移すと、増殖を再開した。５〜７日後、比較的小規模の増殖細胞群（３０００〜５０００細胞）を５分のトリプシン処理でばらばらにし、ＭＣ培養すると、約４０％の効率で細胞塊の形成が認められた（図８−１の（２））。細胞群のスケールをさらに上げて約５〜１０×１０４に達したところで、トリプシンで長時間処理すると、再びＭｕｓｅ細胞（２ｎｄ  ｃｙｃｌｅ）を生成し、約１０％の率でＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を形成した（図８−１）。トリプシンでの長時間処理−浮遊培養−接着培養を５回繰り返したところ、それぞれの世代において、同様の特性及びＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊形成率を示した。５ｃｙｃｌｅ目のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊においても、多能性マーカー及びアルカリフォスファターゼは陽性であった。
これらの現象が変異などを起こした異常な細胞によるものでないことを確認するために核型検査を行った。Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊由来の細胞（ｃｌｏｎａｌｌｙ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｃｅｌｌｓ）においては多くは正常な核型を有し、染色体の異常は認められなかった（図８−３）。このことにより正常な細胞による現象であることを示す。
上記の結果は、Ｍｕｓｅ細胞が自己複製（セルフリニューアル）能を有し、クローン増殖することを示している。Ｍｕｓｅ細胞は、Ｍｕｓｅ細胞−Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊−クローン増殖の一連のサイクルにより増殖する。従って、間葉系細胞集団から大量のＭｕｓｅ細胞を得ることが可能であると予測される。
Ｄ．Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊の３胚葉細胞への分化
分化能を確かめるため、単一のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊をゼラチンでコートしたディッシュに移し分化させた。７日目にα平滑筋アクチン（中胚葉マーカー）、デスミン（中胚葉マーカー）、神経フィラメント−Ｍ（外胚葉マーカー）、αフェトプロテイン（内胚葉マーカー）及びサイトケラチン７（内胚葉マーカー）が検出された（図９−１ａ−ｃ）。ＲＴ−ＰＣＲにより、１から３サイクルの培養を行ったＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊（第１から３ｃｙｃｌｅ）はαフェトプロテイン及びＧＡＴＡ６（内胚葉マーカー）、微小管結合タンパク質２：ＭＡＰ−２（中胚葉マーカー）及びＮｋｘ２．５（中胚葉マーカー）を発現していることが確認されたが、無処理のＨ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ又はＭＳＣ群はゼラチンコートしたディッシュ上での培養でも分化が認められなかった（図９−２）。
さらに、富Ｍｕｓｅ細胞画分、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊及びＥＳ細胞を免疫不全マウスの精巣に注入し、テラトーマ（奇形腫）を形成するか否かを確かめた（図９−３ｅ）。組織学検査の結果、ＥＳ細胞ではすべてのマウスにおいて８週以内にテラトーマの形成が認められた。しかしながら、富Ｍｕｓｅ細胞画分では１３頭中１０頭で、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊では１１頭中１０頭で、図９−３ｅに示すように、移植されたヒト細胞の残存と、種々の細胞種への分化が認められた。テラトーマは少なくとも６ヶ月まで富Ｍｕｓｅ細胞画分及びＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊の移植群において形成が全く認められなかった。移植したヒト細胞は抗ヒトミトコンドリア抗体によって標識されるが、それらの細胞は同時に外胚葉マーカー（神経フィラメント）、内胚葉マーカー（α−フェトプロテイン）及び中胚葉マーカー（平滑筋アクチン）を発現することが確認された（図９−３ｆ−ｉ）。
これらのデータは、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分、Ｈ−ＭＳＣ画分由来Ｍｕｓｅ細胞及びＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊はｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも３胚様に分化し得ることを示している。
Ｅ．定量的ＰＣＲ
多能性及び分化状態に関連したマーカーの発現を図１０に示す。Ｎａｎｏｇの発現は、富Ｍｕｓｅ細胞画分及び細胞クラスターにおいては、無処理細胞に比べそれほど高くなかった。多能性幹細胞の幾つかにおいては、Ｎａｎｏｇはそれほど発現しない（Ｃｈｏｕ  ＹＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３５，４４９−４６１（２００８）；Ｂｕｉ  ＨＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１３５（２３）：３９３５−３９４５（２００８））。Ｎａｎｏｇと同様に、Ｑ−ＰＣＲでのＯｃｔ−４はマウスＥＳ細胞に比較するとリプログラミング体細胞において低い（Ｂｕｉ  ＨＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１３５（２３）：３９３５−３９４５（２００８））。従って、Ｎａｎｏｇ及び他の多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）マーカーの発現量はｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙにとってそれほど重要ではない。
Ｆ．富Ｍｕｓｅ細胞画分及びＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊の遺伝子発現
定量ＰＣＲにより多能性及び非分化状態に関連するいくつかのマーカーが富Ｍｕｓｅ細胞画分及びＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊でアップレギュレートされていることが示された。富Ｍｕｓｅ細胞画分は上記のように９〜１０％のＭｕｓｅ細胞を含んでいるに過ぎないが、Ｒｅｘ１（ＺＦＰ４２）、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ−４、ｃ−Ｍｙｃ、ＤＰＰＡ２（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ２）、ＥＲＡＳ、ＧＲＢ７（Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｏｕｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７）、ＳＰＡＧ９（Ｓｐｅｒｍ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＤＧＦ１（ｔｅｒａｔｏｃａｒｕｃｉｎｏｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ１が、無処理細胞画分に比べて高度に又は適度にアップレギュレートされていた。Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊においては、ＤＡＺＬ（ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ−ｌｉｋｅ）、ＤＤＸ４（ＶＡＳＡ）、ＤＰＰＡ４（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ４）、Ｓｔｅｌｌａ、Ｈｏｘｂ１、ＰＲＤＭ１及びＳＰＲＹ２（ｓｐｒｏｕｔｙ  ｈｏｍｏｌｏｇ２）が無処理細胞に比べてアップレギュレートされていた（図１０ａ）。
Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分由来の、無処理細胞画分、富Ｍｕｓｅ細胞画分及びＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊の全体的な遺伝子発現を、ヒト末梢血単核細胞画分をコントロールとして比較したところ、無処理細胞画分、富Ｍｕｓｅ細胞画分及びＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊の間で幾つかの遺伝子において発現パターンの変化が認められた（図１０ａ）。
富Ｍｕｓｅ細胞画分及びＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊におけるテロメラーゼ活性は低かった。このことは、テロメラーゼ活性がＭｕｓｅ細胞の増殖活性にそれほど関与していないことを示している（図１０ｂ）。
Ｇ．ＤＮＡマイクロアレイによる全体的遺伝子発現
１０８プローブのピアソン相関分析を、ヒト末梢血単核細胞（陰性対照）、無処理細胞画分、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分由来の富Ｍｕｓｅ細胞画分及びＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊について行った（図１１）。
また、ＤＮＡマイクロアレイにより、発現しているオドラント受容体及びケモカイン受容体をピックアップした。
Ｈ．生体におけるＭｕｓｅ細胞の存在
上記に示した検討は、安定な培養細胞を用いて行った。細胞を成体から取り出して培養した場合、生体内とは異なる特性を持ち得るので、Ｍｕｓｅ細胞やＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊がアーティファクトな産物である可能性は否定できない。そこで、ヒト生体すなわちヒト骨髄細胞から培養を経ないで直接Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を得ることを試みた。ヒト骨髄穿刺液から単核細胞画分を単離し、直接ＭＣ培養に供するか（ｎａｉｖｅ  ｈＢＭ−ＭＣ）、あるいは８時間のトリプシン処理を行った後にＭＣ培養に供した（８ｈｒ−ｈＢＭ−ＭＣ、トリプシン処理後の単核細胞画分の生存率は約３．５％であった）。７日後、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊の形成が無処理のｎａｉｖｅ  ｈＢＭ−ＭＣでは約０．００４％の効率で認められ、８ｈｒ−ｈＢＭ−ＭＣでは約０．３％すなわち約７５倍の効率であった（図１２ａ）。これらのＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊はアルカリフォスファターゼ染色陽性であった（図１２ｂ）。無処理のｎａｉｖｅ  ｈＢＭ−ＭＣ及び８ｈｒ−ｈＢＭ−ＭＣ由来の単一Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊からクローン増殖した細胞のＲＴ−ＰＣＲにより、α−フェトプロテイン、ＧＡＴＡ６、ＭＡＰ−２及びＮｋｘ２．５の発現が認められた（図１３）。これらの結果は、ヒト骨髄中にｉｎ  ｖｉｖｏにおいてもＭｕｓｅ細胞が存在し、８時間のトリプシン処理で富化しＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を形成させることができることを示している。さらに、骨髄の多くのタイプの細胞中で、Ｍｕｓｅ細胞がＣＤ１０５陽性間葉系細胞画分に属していることが確認された。
上記のように、ヒト骨髄穿刺液から直接単離した単核細胞画分中の無処理ｈＢＭ−ＭＣの形成効率は０．００４％と著しく低かった。培養中の細胞においては、細胞集団の構成が変化し得るため、安定的な培養を行っている細胞は、骨髄から単離した無処理単核球とは異なるＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊形成傾向を示すと考えられる。これを確認するため、次いで、ヒト骨髄穿刺液を培養し、初代ＭＳＣを回収しＭＣ培養を行ったところ、約０．２％のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊形成が認められた。これらの初代ＭＳＣをさらに２回又は５回継代培養したところ、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊形成効率は無処理細胞画分に対して約０．５％〜１．０％それぞれ上昇した。無処理のＨ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びヒトＭＳＣ画分の約１．２％がＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を形成する。これらの結果は、Ｍｕｓｅ細胞のようなストレス耐性を有する細胞は継代培養等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養環境で残り、このため安定な継代培養細胞画分が骨髄穿刺液から直接単離した単核細胞画分よりもより高いＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊形成効率を示したことを示唆する。
骨髄はＭＳＣ、造血系細胞、内皮細胞を含む多種の単核細胞を含む。どの画分がＭｕｓｅ細胞を含むかを調べるために、ヒト骨髄穿刺液から単離した単核細胞画分を、ＣＤ３４、ＣＤ１１７（いずれも造血幹細胞マーカー）及びＣＤ１０５（間葉系細胞のマーカー）に対する抗体を用いて直接ＭＡＣＳソーティングに供し、各々の画分を８時間トリプシン処理し、７日間ＭＣ培養を行った。ＣＤ３４陽性、ＣＤ１１７陽性画分にはＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊はほとんど検出されなかったが、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１０５陽性画分にはＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１０５陰性画分の５０倍のクラスターの形成が認められた。この結果は、Ｍｕｓｅ細胞は主にＣＤ１０５陽性間葉系細胞画分中に存在することを示唆している。
Ｉ．ＭＡＣＳソーティング
骨髄単核細胞画分からのそれぞれのフラクションの収率は、フラクション１（ＣＤ１０５陽性フラクション）で１．８％、フラクション２（ＣＤ３４陽性・ＣＤ１１７陽性フラクション）で８．５％、フラクション３（ＣＤ３４陰性・ＣＤ１１７陰性・ＣＤ１０５陰性フラクション）で８９．７％であった。フラクション１、２及び３の細胞塊形成率は、それぞれ０．５％、０％及び０．０１％であった。従って、フラクション１の細胞塊形成率はフラクション３の約５０倍であった。
Ｊ．ＦＡＣＳソーティング
一例として、ＳＳＥＡ−３をマーカーとしてＦＡＣＳソーティングを行った。
Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ及びＨＭＳＣの両方について、ＳＳＥＡ−３陽性細胞及びＳＳＥＡ−３陰性細胞をＦＡＣＳソーティングにより分離し、単一細胞懸濁培養に供した。ＳＳＥＡ−３陽性細胞の約５０〜６０％がＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を形成した。一方、ＳＳＥＡ−３陰性細胞ではＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を形成しなかった。
Ｋ．Ｍｕｓｅ細胞の特徴
ＦＡＣＳ分析により、無処理Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分は間葉系細胞に発現するＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５陽性の画分を含むことがわかった。しかし、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７１、ＣＤ１６６、ＣＤ２７１及びフォンビルブランド（ｖＷＦ）因子は陰性であった。富Ｍｕｓｅ細胞画分においては、ＣＤ４４及びＣＤ５４が陰性となったＳＳＥＡ−３陽性画分は約０．７〜１．９％であった（図１４）。
ＳＳＥＡ−３は多能性のマーカーの１つであるので、無処理のＨ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分中のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊形成率（約１．２％）及び富Ｍｕｓｅ細胞画分での形成率（９〜１０％）は、それぞれのＳＳＥＡ−３の陽性率（無処理細胞画分は約０．７〜０．９％、富Ｍｕｓｅ細胞画分では７〜８．３％）に似ていた。ＳＳＥＡ−３の陽性率は、Ｍｕｓｅ細胞のある状態を示している可能性がある。免疫組織化学によると、無処理のＨ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分中のＳＳＥＡ−３陽性細胞の数は１％未満であった。そこで、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及びＨ−ＭＳＣ画分由来の富Ｍｕｓｅ細胞画分からＳＳＥＡ−３陽性細胞をソーティングし、単一浮遊培養を行った。その結果、ＳＳＥＡ−３陽性細胞の５０〜６０％がＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を形成した。これは富Ｍｕｓｅ細胞画分のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊形成の約６〜７倍、無処理細胞画分のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊形成の約６０倍である。一方ＳＳＥＡ−３陰性の細胞画分からはＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊の形成は認められなかった。ＦＡＣＳによるソーティングにより得られたＳＳＥＡ−３陽性細胞画分由来の単一細胞塊からクローン増殖により得られた細胞（３，０００〜５，０００細胞）のＳＳＥＡ−３陽性率は約４５％であった（図１５−１ａ）。このことは、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊の形成過程において、非対称性分裂が関与しており、単一Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊のクローン増殖においても同様であることを示唆している。実際、非対称性分裂に関与していることが知られているＮｕｍｂｌｉｋｅは、２つの細胞への分裂の過程で１つの細胞中にのみ存在する（図１５−２ｂ）。これらの結果は、非対称性細胞分裂がＭｕｓｅ細胞の増殖に関与していることを示唆する。
電子顕微鏡観察により、Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分及び長時間トリプシン処理後にソーティングしたＨ−ＭＳＣ画分由来ＳＳＥＡ−３陰性細胞において核の変形と細胞質中の小胞が観察され、細胞が障害を受けていることが示された。しかし、ＳＳＥＡ−３陰性細胞と陽性細胞の間で明らかな形態的な差は認められなかった（図１５−３ｃ及びｄ）。
ＳＳＥＡ−３陽性細胞の重要性は、移植実験においても示された。ＳＳＥＡ−３陰性細胞画分を移植した場合、ＳＳＥＡ−３陽性細胞画分を移植した場合に比べて、組織マーカーの発現はほとんどの細胞で認められなかった。
富Ｍｕｓｅ細胞画分において、ほとんどのＳＳＥＡ−３陽性細胞はＯｃｔ３／４及びＳｏｘ２を共発現しており、細胞質中に検出された（図１５−４ｅ及びｇ）。しかし、核中で発現している細胞は極めて少なかった（図１５−４ｆ）。この結果は、ＳＳＥＡ−３がＭｕｓｅ細胞の良いマーカーとなり得ることを示している。一方、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊の細胞においては、Ｏｃｔ３／４及びＳｏｘ２は核中に主に局在していた（図７−２ｈ及びｌ）。この２つのマーカーの細胞内局在の差異は細胞状態の差異を反映している可能性がある。
Ｍｕｓｅ細胞が長時間のトリプシン処理により人工的に誘導された可能性も否定できない。多くのＭｕｓｅ細胞が骨髄中のＣＤ１０５陽性細胞画分に存在する。さらに、ＳＳＥＡ−３陽性細胞は、Ｍｕｓｅ細胞の特性を示す。そこで、ヒト成体骨髄穿刺液からＳＳＥＡ−３及びＣＤ１０５の二重陽性（ｄｏｕｂｌｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞として、Ｍｕｓｅ細胞を直接得ることを試みた。二重陽性細胞は、骨髄由来単核球中に０．０２５％〜０．０５％存在し、それを長時間のトリプシン処理なしに、直接単一細胞浮遊培養に供した。７日後、１１．４±１．２％の細胞（単核球の０．００３〜０．００５％に相当する）が、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を形成し、アルカリフォスファターゼ陽性であった。次いで、単一Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を接着培養により３，０００細胞まで増殖させ、単一浮遊培養に供した。これらの細胞中、３３．５±３．１％の細胞が第２世代のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を形成した。また、単一Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊からゼラチンでコートした培養ディッシュで増殖させた細胞についてＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、α−フェトプロテイン、ＧＡＴＡ６、ＭＡＰ−２及びＮｋｘ２．５の発現が認められた。これは、ヒト成体骨髄中にＭｕｓｅ細胞の特性を有する細胞が存在することを示唆する。
上記のように、ストレス刺激により非幹細胞を除去することにより幹細胞を富化することができた。Ｍｕｓｅ細胞を長時間トリプシン処理とその後のＳＳＥＡ−３陽性細胞のソーティングにより効率的に集めることができた。Ｍｕｓｅ細胞は、多能性マーカーを発現しアルカリフォスファターゼ染色陽性であり、外胚葉、中胚葉及び内胚葉系細胞に分化し得るＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を形成した。また、増殖速度の測定において腫瘍形成性増殖に関する特徴を有しておらず、テロメラーゼ活性も有していなかった。このことは、Ｍｕｓｅ細胞は爆発的増殖を防ぐための多重のセキュリティーシステムを有していることを示している。Ｍｕｓｅ細胞の非腫瘍形成性特性はＭｕｓｅ細胞をマウス精巣に注入する実験においても認められた。この特性は生体機能のバランスを維持する上で都合がよく、この特性がなければ、異常増殖や異形成により生体は破壊され、腫瘍形成やテラトーマ形成をもたらす。
Ｍｕｓｅ細胞の多能性は接着培養系では顕在化せず、浮遊培養で観察された。
通常、Ｍｕｓｅ細胞は不活性休眠状態にあり生体が、危機的状態に陥ったり、あるいは重篤な傷害を被り、又は飢餓若しくは虚血状態等のストレス過多状態が維持されるとある種のシグナルが伝達されて活性化すると考えられる。その後、Ｍｕｓｅ細胞は組織再生に貢献し、細胞間相互作用や組織化に貢献する。
【実施例２】
【０００７】
ＳＳＥＡ−３を利用して単離したＭｕｓｅ細胞の特性分析
実施例１の検討において、ＦＡＣＳにより得たＳＳＥＡ−３陽性細胞画分が多能性幹細胞の特性を有していること、すなわちＭｕｓｅ細胞であることが判明したが（上記Ｊ、Ｋ等）、さらに、単離したＳＳＥＡ−３陽性細胞を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化能及びｉｎ  ｖｉｖｏでの分化能を検討し、さらにＭｕｓｅ由来ｉＰＳ細胞の確立を行った。
１．損傷組織への移植によるｉｎ  ｖｉｖｏでの分化能の検討
ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）−レンチウイルスで標識したＳＳＥＡ−３陽性Ｍｕｓｅ細胞を単離し、脊髄（圧迫損傷）、肝臓（ＣＣｌ４を腹腔内注射、劇症肝炎モデル）又は腓腹筋（ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ注射）に損傷を与えた免疫不全マウス（ＮＯＧマウス）に静脈注射により移植した。ヒト皮膚細胞由来のＭｕｓｅ細胞をＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）−レンチウイルスで標識し（Ｈａｙａｓｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．２９（８）：１４０９−２０，２００９）、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊が標識細胞由来であることをＧＦＰにより確認した。脊髄損傷はＮＯＧマウスに対してレベルＴｈ９で行い（Ｆａｒｏｏｑｕｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，１００；１３−２２，２０００）、ＮＯＧマウスの腓腹筋にｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎを投与し筋肉変性を誘発し、四塩化炭素をＮＯＧマウスに腹腔内投与し、肝臓変性を誘発した。筋肉及び肝臓については２日後、脊髄については７日後に１×１０５のＭｕｓｅ細胞を静脈注射により移植した（各６頭のマウスを使用）。コントロールとして、ＧＦＰ標識ＭＥＣ集団を静脈注射したマウスを用いた。移植の３又は４週間後に、マウスをパラホルムアルデヒドで固定し、免疫組織化学及び共焦点レーザ顕微鏡観察に供した。
脊髄損傷の４週間後、ＧＦＰ及びヒトゴルジ複合体陽性細胞がニューロフィラメントを形成していた。（図１６−１Ｎ及びＯ）。また、４週間後、再生している肝臓において、ＧＦＰ及びヒトゴルジ複合体陽性細胞がヒトアルブミンを発現していた（図１６−１Ｐ）。ＲＴ−ＰＣＲの結果によりＭｕｓｅ細胞を移植したＮＯＧマウス肝臓においてヒトアルブミンの形成が示された（図１６−２）。ＧＦＰ陽性細胞を再生している筋肉に注射した場合、３週間でヒトジストロフィンを発現した（図１６−３）。一方、ＳＳＥＡ−３陰性ヒト皮膚線維芽細胞画分を移植した場合、細胞のインテグレートは顕著に少なく、組織マーカーが陽性の細胞はほとんど認められなかった。これらの結果は、Ｍｕｓｅ細胞が損傷組織に統合され、それぞれ、ｉｎ  ｖｉｖｏで外胚葉、中胚葉及び内胚葉に分化し得ることを示す。
２．単一Ｍｕｓｅ細胞由来のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊からの増殖細胞の分化
Ｍｕｓｅ細胞の分化調節に誘導システムが有効かどうかを検討した。単一ＳＳＥＡ−３陽性Ｍｕｓｅ細胞由来のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を接着培養に供し、増殖させた。単一Ｍｕｓｅ細胞由来の増殖細胞を回収し、４つの群に分け、それぞれの群に対して、神経、骨細胞、脂肪細胞及び幹細胞への分化誘導を行った（ｎ＝５）。
神経誘導のためには、細胞をｐｏｌｙ−ＨＥＭＡでコートしたディッシュを用いて１×１０５／ｍｌの密度でＢ−２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むＮＥＵＲＯＢＡＳＡＩ培地（Ｇｉｂｃｏ社）中で７日間培養し、ｓｐｈｅｒｅ（球状の細胞塊）を形成させた。分化させるためにｓｐｈｅｒｅをポリ−Ｌ−リシンでコートしたガラス上に移し、２５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ及び２５ｎｇ／ｍｌ  ＢＤＮＦを含む２％ＦＢＳ中で１０日間培養した。
骨細胞誘導のためには、細胞を４．２×１０３細胞／ｃｍ２の密度でＨｕｍａｎ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の骨細胞誘導培地を用いて１４日間培養した。
脂肪細胞誘導のためには、細胞を２．１×１０４細胞／ｃｍ２の密度でＨｕｍａｎ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の脂肪細胞誘導培地を用いて１４日間培養した。
肝臓細胞誘導のためには、細胞を２．０×１０４細胞／ｃｍ２の密度でＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１０ｎＭデキサメタゾン及び１００ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦを含む１０×ＩＴＳ（ＧＩＢＯＣＯ社）、５０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ４を含む）を用いてコラーゲンコートしたディッシュ上で１４日間培養した。
神経誘導によりｓｐｈｅｒｅが形成され、ｓｐｈｅｒｅは神経幹細胞マーカーであるネスチン、Ｍｕｓａｓｈｉ及びＮｅｕｒｏＤ陽性であることが確認された（図１７−１Ａ〜Ｄ）。これらのｓｐｈｅｒｅを分化培地中で培養するとＭＡＰ−２又はＧＦＡＰ陽性細胞に分化した（図１７−１Ｅ、ＭＡＰ−２、ＧＦＡＰいずれも８９±５．７％の陽性率）。細胞を骨細胞誘導したとき、オステオカルシン陽性細胞（９７±３．５％）及びアルカリフォスファターゼが認められた（図１７−１Ｆ及びＧ）。脂肪細胞分化については、オイルレッドで染色される脂肪滴を有する細胞が形成された（９０±４．９％）（図１７−１Ｈ〜Ｉ）。肝細胞誘導にヒトαフェトプロテイン陽性細胞（図１７−１Ｊ、８７±７．６％）並びにヒトアルブミンとヒトαフェトプロテイン陽性細胞（図１７−２）の形成がＲＴ−ＰＣＲにより認められた。これらの結果は、Ｍｕｓｅ細胞の３胚葉への分化が、非常に高い効率で誘導により調節できることを示している。
３．ヒト成人皮膚からのＳＳＥＡ−３陽性細胞の採取
培養細胞を培養したり、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を形成させることなく、ヒト成人皮膚から直接Ｍｕｓｅ細胞を単離することを試みた。
ヒト健常人（ｎ＝３）からの皮膚（ＢＩＯＰＲＥＤＩＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより入手）の上皮及び脂肪組織を除き真皮を得、真皮を１０％  ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ中コラゲナーゼ／ジスパーゼと共に３７℃で３６時間インキュベートした。濾過により消化された皮膚細胞を回収し、１５００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、α−ＭＥＭで洗浄し、０．２５％トリプシン−ＨＢＳＳで５分間インキュベートした。細胞をさらにＦＡＣＳバッファーで千兆誌、ＳＳＥＡ−３とインキュベートし、ＦＡＣＳを用いてＳＳＥＡ−３陽性細胞をソーティングした。約７ｃｍ２の皮膚組織から１．３±０．３×１０４の単一細胞を回収することができた。ＳＳＥＡ−３陽性細胞は、回収した単一細胞の１．７±０．２％であった。
ＳＳＥＡ−３陽性細胞の２１．０±１．７％が、限界希釈による単一細胞浮遊培養で７日でＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を形成した。Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊はＡＬＰ陽性であり、単一のＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊からゼラチンでコートしたディッシュを用いて増殖させた細胞について、ＲＴ−ＰＣＲで確認したところ、ＭＡＰ−２、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ６及びα−フェトプロテインを発現していた。この結果は、Ｍｕｓｅ細胞と同じ性質を有する細胞が上述の成人ヒト骨髄液と同様に、成人ヒト皮膚にも存在することを示している。
ヒト成人皮膚は、ＳＫＰ（皮膚由来前駆細胞）、ＮＣＳＣ（神経堤幹細胞）、メラノブラスト（ＭＢ）、血管周囲細胞（ＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）等の種々のタイプの幹細胞や前駆細胞を含んでいる。Ｍｕｓｅ細胞がこれらの幹細胞等と同じである可能性を排除するために、Ｍｕｓｅ細胞におけるＳｎａｉ１（ＳＫＰのマーカー）、Ｓｌｕｇ（ＳＫＰのマーカー）、Ｓｏｘ１０（ＮＣＳＣのマーカー）、ＣＤ２７１（ＮＣＳＣのマーカー）、Ｔｙｒｐ１（ＭＢのマーカー）、Ｄｃｔ（ＭＢのマーカー）、ＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ）（ＭＢのマーカー）、ＣＤ１４６（ＰＣ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＮＧ２（ＰＣのマーカー）、ＣＤ３４（ＥＰ及びＡＤＳＣのマーカー）及びフォンビルブランド因子（ＥＰのマーカー）の発現を分析した。これらのマーカーのいずれもＳＳＥＡ−３陽性細胞において、ＦＡＣＳ分析又はＲＴ−ＰＣＲで認められなかった（図１８−１及び図１８−２）。この結果は、Ｍｕｓｅ細胞はヒト成人皮膚に存在することが公知である幹細胞や前駆細胞と異なる細胞であることを示している。
さらに、フェライト粒子を用いてＭｕｓｅ細胞の貪食能を調べたところ、Ｍｕｓｅ細胞はフェライト粒子を容易に取り込み、高い貪食能を有していた（図１８−３）。
４．Ｍｕｓｅ由来ｉＰＳ細胞（Ｍｕｓｅ−ｉＰＳＣ）の確立
ｉＰＳ細胞は、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｌｉｎ２８遺伝子等を導入し作製されている。Ｍｕｓｅ細胞は、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）マーカーを発現し、外胚葉、内胚葉及び中胚葉系細胞に分化し得るという点で、ｉＰＳ細胞と類似した特性を有している。そこで、Ｍｕｓｅ細胞がｉＰＳ細胞のよい材料となり得るかを検討した。
方法は以下のとおりであった。
Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分由来のＳＳＥＡ−３陽性細胞及び陰性細胞に、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３１，８６１−８７２（２００７）の記載に従って、レトロウイルスベクターを用いて、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、ＫＬＦ４及びｃ−Ｍｙｃの４つの因子を導入し、培養した。以下に、方法の詳細を示す。
プラスミドの確立
ｐＭＸｓレトロウイルスベクター（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にヒトＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃのｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅを組み込んだ。
レトロウイルスの感染及びｉＰＳ細胞の確立
ＰＬＡＴ−Ａ細胞を１００ｍｍ  ｄｉｓｈに５×１０６細胞の密度でまき、一晩培養した。次の日に、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤを用いてトランスフェクションをを行った。トランスフェクションから２４時間後、新しい培地に交換した。３日後に上清を回収し、０．４５μｍのフィルターに通し、４μｇ／ｍｌのポリブレンを加えた。６０ｍｍ  ｄｉｓｈに１×１０５細胞の密度でまいたＮＨＤＦ（皮膚線維芽細胞）にウイルス溶液を感染させた。２４時間後、ウイルスの入っていない新しい培地に交換した。ウイルス感染から４日後にトリプシンにより剥がした細胞を、ＭＥＦ（フィーダー細胞）の上に３×１０４細胞の密度でまいた。翌日、培地を４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを加えたＰｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  ｍｅｄｉｕｍに交換した。その後２日に１回培地交換を行い、３０日後、コロニーをピックアップし、２４ウェルプレートにまいた。
ＰＣＲ分析
ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりＲＮＡを精製した。５００ｎｇのＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩを用いて逆転写した。内因性のＯｃｔ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、ＮａｎｏｇのプライマーとＰＣＲの条件等はａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３１，８６１−８７２（２００７）に記載の通りで行った。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるｉＰＳ細胞の分化
コラゲナーゼによりｉＰＳ細胞を採取した。細胞の塊をＰｏｌｙ−ＨＥＭＡでコーティングしたｄｉｓｈに、２０％  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１×１０−４Ｍ  ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ、１×１０−４Ｍ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｎａｃａｌａｉ）、０．５％  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にて培養した。培地は２日に一回交換した。７日後、ＥＢをゼラチンコートしたｄｉｓｈにまき、同じ培地で一週間培養した。
テラトーマの形成
６０ｍｍ  ｄｉｓｈのｉＰＳ細胞をＲｏｃｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒにより処理し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）により採取しチューブに集めて遠心後、ＰＢＳに浮遊させた。これをＮＯＧ  ｍｏｕｓｅ（登録商標）（財団法人  実験動物中央研究所）の精巣に注射した。１２週後に４％パラホルムアルデヒドにより固定した。パラフィン切片はＨＥ（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ＆  Ｅｏｓｉｎ）染色を行った。
以下の結果が得られた。
Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分由来のＳＳＥＡ−３陽性細胞及び陰性細胞に、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３１，８６１−８７２（２００７）の記載に従って、レトロウイルスベクターを用いて、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、ＫＬＦ４及びｃ−Ｍｙｃの４つの因子を導入し、５日後にＭＥＦ上に再度まきなおし、培養した。ｃｏｌｏｎｙ  ｐｉｃｋｕｐを行う直前、すなわちＭＥＦ上での培養３０日目においては、ＳＳＥＡ−３陰性細胞中で形成されたコロニーは非ＥＳ細胞様コロニーであり、ＥＳ細胞のマーカーであるＴｒａ−１−８０陽性のコロニーはまったく見られなかった。一方、多くのＳＳＥＡ−３陽性細胞においては陰性の細胞群の約７倍ほどの数のコロニーを形成し、それらはＴｒａ−１−８０は陽性であった。注目すべきは、ＳＳＥＡ−３陰性細胞（コロニーやコロニーを形成していない細胞すべてを回収）では、ＲＴ−ＰＣＲで測定したところ、ＭＥＦ上３０日目のｃｏｌｏｎｙ  ｐｉｃｋ  ｕｐ直前でもＮｏｎｏｇ、Ｓｏｘ２などの多能性に密接に関連した重要な遺伝子は陰性であった。一方、ＳＳＥＡ−３陽性細胞において、内因性のＯｃｔ３／４、ＫＬＦ４及びＲｅｘ１がアップレギュレーションされており、さらにＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２が発現していた。予測されていたとおり、ＳＳＥＡ−３陽性細胞をｃｏｌｏｎｙ  ｐｉｃｋ  ｕｐし、新たなＭＥＦ（フィーダー細胞）上に移した場合、無処理Ｈ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ画分細胞を用いた場合よりも３０倍ほど高い効率でｉＰＳを作製することができた。これらのｉＰＳ細胞において、免疫細胞化学、ＲＴ−ＰＣＲ及びＱ−ＰＣＲにより、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−ａ−８０、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ−１、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）及びヒトＥＳ細胞において発現している因子がアップレギュレーションしており、あるいは新たに発現していた（図１９、２１）。また、得られたＭｕｓｅ細胞由来ｉＰＳ細胞において、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＴＲＡ−１−８１が発現していた（図１９）。ＲＴ−ＰＣＲにより、Ｍｕｓｅ細胞由来ｉＰＳ細胞ではＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４及びＳｏｘ２が発現しているが、ＳＳＥＡ−３陰性細胞由来コロニーでは発現していないことがわかった（図２１）。
ＳＳＥＡ−３陽性細胞とＳＳＥＡ−３陰性細胞画分とで、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子の導入効率はほとんど同じであった。導入した細胞をマウスフィーダー細胞上でディッシュ当たり１×１０５の密度で培養した。両方の各群でコロニーを形成したが、ＳＳＥＡ−３陰性細胞画分から形成されたコロニー数は、ＳＳＥＡ−３陽性細胞画分の７分の１程度であった。さらに、ＳＳＥＡ−３陽性細胞画分と異なり、ＳＳＥＡ−３陰性細胞画分では、ヒト多能性幹細胞マーカーであるＴＲＡ−１−８１陽性コロニーは、コロニーを採取する直前の培養３０日後でも認められなかった（図２２−１）。ＲＴ−ＰＣＲにより、内因性Ｓｏｘ２及びＮａｎｏｇはＳＳＥＡ−３陽性細胞由来画分のみで発現しており、ＳＳＥＡ−３陰性細胞画分では発現していなかった（図２２−２）。
さらに、ＳＳＥＡ−３陽性及び陰性細胞画分をそれぞれ継代し、ｉＰＳ細胞株を確立した。３継代後、ヒトＥＳ細胞様の形態（平らなコロニー）を示したそれぞれのコロニー（図２２−３Ｃ及びＣ１）についてＲＴ−ＰＣＲを行い、内因性ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＮａｎｏｇを発現しているコロニーをｉＰＳコロニーとしてカウントした。その結果、ｉＰＳ細胞は、ＳＳＥＡ−３陽性細胞由来コロニーのみから形成され、効率は０．０３％であった。ＳＳＥＡ−３陰性細胞由来コロニーからは形成されなかった（図２２−３Ｄ及びＤ１）。
さらに、Ｍｕｓｅ細胞から確立したｉＰＳ細胞は、外胚葉、内胚葉及び中胚葉系細胞に分化し、マウス精巣にてテラトーマを形成した（図２３−１〜２３−３）。
Ｍｕｓｅ細胞の増殖活性は、増殖速度及びテロメラーゼ活性の観点からそれほど高くない。このことは、Ｍｕｓｅ細胞は、マウス精巣中で３胚葉性の細胞に分化するが、テラトーマは形成しないことと対応している。もし、Ｍｕｓｅ細胞が皮膚や骨髄等のヒト成人組織において維持されている場合、その増殖は厳密に調節されているはずであり、そうでなければ、Ｍｕｓｅ細胞は生体のすべての部分で腫瘍を形成してしまうであろうことを考えても妥当である。さらに、ある条件下で培養した杯盤葉上層（ｅｐｉｂｌａｓｔ）幹細胞がマウス精巣中でテラトーマを形成しないことが示されていることを考慮すると（Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３５，４４９−４６１（２００８））、多能性細胞が常にテラトーマを形成するとは言えない。Ｍｕｓｅ細胞は、最初から多能性マーカーの発現や分化能等において多能性細胞の特性を示すので、Ｍｕｓｅ細胞は単独でｉＰＳ細胞になり、増殖活性が上昇し、マウス精巣中でテラトーマを形成するようになることが予測される。ｉＰＳの誘導メカニズムは解明されていないが、間葉系細胞中のＭｕｓｅ細胞における腫瘍性増殖性の獲得の可能性がある。
無処理ヒト皮膚線維芽細胞画分から約０．００１％の効率でｉＰＳ細胞が確立できたが、これはＫ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３１，８６１（２００７）の報告と一致する。従って、ＳＳＥＡ−３陽性細胞からのｉＰＳ細胞作製効率は、無処理線維芽細胞に対して３０倍高かった。このことは、ｉＰＳ細胞の形成に主にＭｕｓｅ細胞が寄与していることを示唆している。
免疫組織化学及びＲＴ−ＰＣＲにより、Ｍｕｓｅ由来ｉＰＳ細胞から得た胚様体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで外胚葉（ニューロフィラメント及びＭＡＰ−２）、中胚葉（ＳＭＡ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及びＮｋｘ２．５）、及び内胚葉細胞（α−フェトプロテイン及びＧＡＴＡ−６）に分化することがわかった。さらに、免疫不全マウス精巣にＭｕｓｅ由来ｉＰＳ細胞を投与したところ、テラトーマの形成が観察された。一方、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊を精巣に注射した場合、６ヶ月後においてもテラトーマの形成は認められず、ＭＥＦを注射したコントロールと比べて大きさもそれほど大きくならなかった。しかし、ヒトミトコンドリア並びにＳＭＡ、α−フェトプロテイン及びニューロフィラメントが陽性の細胞が同定された。この結果は、Ｍｕｓｅ由来ｉＰＳ細胞と異なり、元々のＭｕｓｅ細胞はテラトーマを形成しないが、免疫不全マウス中で外胚葉、中胚葉及び内胚葉に分化し得ることを示す。
Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊とＭｕｓｅ由来ｉＰＳ細胞について定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を行った。結果を図２５及び２６に示す。細胞周期調節に関連した遺伝子の発現パターンは、大きく異なっていた。細胞周期進行に関連した遺伝子のほとんどは、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊ではダウンレギュレートされていたが、Ｍｕｓｅ由来ｉＰＳ細胞ではアップレギュレートされていた。一方、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊とＭｕｓｅ由来ｉＰＳ細胞において、多能性及び未分化状態に関与した遺伝子の発現は同様の傾向を示した。ただし、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊におけるＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４及びＳｏｘ２の発現レベルはＭｕｓｅ由来ｉＰＳ細胞よりはるかに低かった。Ｎａｎｏｇ遺伝子及びＯｃｔ３／４遺伝子のプロモータ領域のシトシン・グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）はＭｕｓｅ由来ｉＰＳ細胞でＭｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊に比べてメチル化の程度は小さかった。なお、Ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモータ領域のＣｐＧのメチル化はＳＳＥＡ−３陰性無処理細胞画分に比べて、Ｍｕｓｅ細胞由来胚様体様細胞塊で低かった（図２４）。この結果は、Ｍｕｓｅ細胞とＭｕｓｅ由来ｉＰＳ細胞の間の多能性マーカーの発現レベルの差を説明する。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明により、生殖細胞や初期胚を利用することなく、かつ外来遺伝子の導入や特定の化合物の導入等の人為的な誘導操作を経ずに、生体組織から多能性幹細胞を得ることができる。外来遺伝子の導入等の人為的操作を経ないために、本発明の多能性幹細胞は効率的に作製することが可能であり、治療に用いる場合であっても安全に用いることができる。また、本発明の多能性幹細胞は、再生医療や機能不全組織の治療等に用いることができ、さらに、細胞分化や組織再生の研究等に用いることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図２】
2011007900.tif 000004
【図３】
2011007900.tif 000005
【図４】
2011007900.tif 000006
【図８−２】
2011007900.tif 000007
【図１０ａ】
2011007900.tif 000008
【図２５】
2011007900.tif 000009
【図２６】
2011007900.tif 000010
【図２７】
2011007900.tif 000011
【図１−１】
2011007900.tif 000012
【図１−２】
2011007900.tif 000013
【図５】
2011007900.tif 000014
【図６】
2011007900.tif 000015
【図７−１】
2011007900.tif 000016
【図７−２】
2011007900.tif 000017
【図７−３】
2011007900.tif 000018
【図７−４】
2011007900.tif 000019
【図８−１】
2011007900.tif 000020
【図８−３】
2011007900.tif 000021
【図９−１】
2011007900.tif 000022
【図９−２】
2011007900.tif 000023
【図９−３】
2011007900.tif 000024
【図１０ｂ】
2011007900.tif 000025
【図１１】
2011007900.tif 000026
【図１２】
2011007900.tif 000027
【図１３】
2011007900.tif 000028
【図１４】
2011007900.tif 000029
【図１５−１】
2011007900.tif 000030
【図１５−２】
2011007900.tif 000031
【図１５−３】
2011007900.tif 000032
【図１５−４】
2011007900.tif 000033
【図１６−１】
2011007900.tif 000034
【図１６−２】
2011007900.tif 000035
【図１６−３】
2011007900.tif 000036
【図１７−１】
2011007900.tif 000037
【図１７−２】
2011007900.tif 000038
【図１８−１】
2011007900.tif 000039
【図１８−２】
2011007900.tif 000040
【図１８−３】
2011007900.tif 000041
【図１９】
2011007900.tif 000042
【図２０】
2011007900.tif 000043
【図２１】
2011007900.tif 000044
【図２２−１】
2011007900.tif 000045
【図２２−２】
2011007900.tif 000046
【図２２−３】
2011007900.tif 000047
【図２３−１】
2011007900.tif 000048
【図２３−２】
2011007900.tif 000049
【図２３−３】
2011007900.tif 000050
【図２４】
2011007900.tif 000051
【手続補正書】
【提出日】平成23年5月31日(2011.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体の中胚葉系組織又は間葉系組織からSSEA-3の発現を指標に単離できる、以下の性質の少なくとも1つを有する、SSEA-3陽性及びCD105陽性の多能性幹細胞：
(i)  テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
(ii)  三胚葉に分化する能力を持つ；
(iii)  腫瘍性増殖を示さない；
(iv)  セルフリニューアル能を持つ；
(v)  ストレス耐性である；及び
(vi)  貪食能が高い。
【請求項２】
CD117陰性及びCD146陰性の請求項１に記載の多能性幹細胞。
【請求項３】
CD117陰性、CD146陰性、NG2陰性、CD34陰性、vWF陰性及びCD271陰性の請求項１に記載の多能性幹細胞。
【請求項４】
CD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、Sox10陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrp1陰性及びDct陰性の請求項１に記載の多能性幹細胞。
【請求項５】
以下に示す２２個のオドラント受容体の少なくとも一つが陽性の請求項１〜４のいずれか１項に記載の多能性幹細胞：
olfactory receptor, family 8, subfamily G, member 2 (OR8G2)；
olfactory receptor, family 7, subfamily G, member 3 (OR7G3)；
olfactory receptor, family 4, subfamily D, member 5 (OR4D5)；
olfactory receptor, family 5, subfamily AP, member 2 (OR5AP2)；
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 4 (OR10H4)；
olfactory receptor, family 10, subfamily T, member 2 (OR10T2)；
olfactory receptor, family 2, subfamily M, member 2 (OR2M2)；
olfactory receptor, family 2, subfamily T, member 5 (OR2T5)；
olfactory receptor, family 7, subfamily D, member 4 (OR7D4)；
olfactory receptor, family 1, subfamily L, member 3 (OR1L3)；
olfactory receptor, family 4, subfamily N, member 4 (OR4N4)；
olfactory receptor, family 2, subfamily A, member 7 (OR2A7)；
guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha activating activity polypeptide, olfactory type (GNAL)；
olfactory receptor, family 6, subfamily A, member 2 (OR6A2)；
olfactory receptor, family 2, subfamily B, member 6 (OR2B6)；
olfactory receptor, family 2, subfamily C, member 1 (OR2C1)；
olfactory receptor, family 52, subfamily A, member 1 (OR52A1)；
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 3 (OR10H3)；
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 2 (OR10H2)；
olfactory receptor, family 51, subfamily E, member 2 (OR51E2)；
olfactory receptor, family 5, subfamily P, member 2 (OR5P2)；及び
olfactory receptor, family 10, subfamily P, member 1 (OR10P1)。
【請求項６】
以下に示す５個のケモカイン受容体の少なくとも一つが陽性の請求項１〜５のいずれか１項に記載の多能性幹細胞：
chemokine (C-C motif) receptor 5（CCR5)；
chemokine (C-X-C motif) receptor 4（CXCR4)；
chemokine (C-C motif) receptor 1（CCR1)；
Duffy blood group, chemokine receptor(DARC)；及び
chemokine (C-X-C motif) receptor 7(CXCR7)。
【請求項７】
生体組織から、以下の(i)〜(vi)の特性の少なくとも１つの特性を指標に請求項１〜６のいずれか１項に記載の多能性幹細胞を単離する方法：
(i)  SSEA-3陽性；
(ii)  CD105陽性；
(iii)  CD117陰性及びCD146陰性；
(iv)  CD117陰性、CD146陰性、NG2陰性、CD34陰性、vWF陰性及びCD271陰性；
(v)  CD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、Sox10陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrp1陰性及びDct陰性；並びに
(vi)  テロメラーゼ活性が低いか又は無い。
【請求項８】
生体組織由来細胞を細胞ストレスに暴露し生き残った細胞を回収することを含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の多能性幹細胞を単離する方法。
【請求項９】
細胞ストレスが、プロテアーゼ処理、低酸素条件下での培養、低リン酸条件下での培養、血清飢餓状態での培養、糖飢餓状態での培養、放射線曝露下での培養、熱ショックへの曝露下での培養、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養及び圧力処理下での培養から選択される、請求項８に記載の多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法。
【請求項１０】
細胞ストレスが、トリプシン処理である、請求項９に記載の多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の派生細胞又は誘導細胞である多能性幹細胞。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の派生細胞又は誘導細胞である分化した細胞。
【手続補正書】
【提出日】平成23年10月24日(2011.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体の中胚葉系組織、間葉系組織又は培養間葉系細胞からSSEA-3の発現を指標に単離できる、以下の性質のすべてを有する、SSEA-3陽性及びCD105陽性の多能性幹細胞：
(i)  テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
(ii)  三胚葉のいずれの胚葉の細胞へも分化する能力を持つ；
(iii)  腫瘍性増殖を示さない；及び
(iv)  セルフリニューアル能を持つ。
【請求項２】
生体の中胚葉系組織又は間葉系組織からSSEA-3の発現を指標に直接単離できる、請求項１記載の多能性幹細胞。
【請求項３】
浮遊培養及び接着培養を組合わせた培養により増殖する、請求項１又は２に記載の多能性幹細胞。
【請求項４】
CD117陰性及びCD146陰性の請求項１〜３のいずれか１項に記載の多能性幹細胞。
【請求項５】
CD117陰性、CD146陰性、NG2陰性、CD34陰性、vWF陰性及びCD271陰性の請求項１〜３のいずれか１項に記載の多能性幹細胞。
【請求項６】
CD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、Sox10陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrp1陰性及びDct陰性の請求項１〜３のいずれか１項に記載の多能性幹細胞。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の多能性幹細胞を含む細胞集団。
【請求項８】
中胚葉系組織、間葉系組織又は培養間葉系細胞からSSEA-3の発現を指標に請求項１〜６のいずれか１項に記載の多能性幹細胞を単離し培養し増殖させる方法。
【請求項９】
さらに、以下の(i)〜(v)の特性の少なくとも１つの特性を指標に多能性幹細胞を単離する、請求項８記載の方法：
(i)  CD105陽性；
(ii)  CD117陰性及びCD146陰性；
(iii)  CD117陰性、CD146陰性、NG2陰性、CD34陰性、vWF陰性及びCD271陰性；
(iv)  CD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、Sox10陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrp1陰性及びDct陰性；並びに
(v)  テロメラーゼ活性が低いか又は無い。
【請求項１０】
生体組織由来細胞をトリプシン処理し生き残った細胞を回収することを含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の多能性幹細胞を単離する方法。
【手続補正書】
【提出日】平成24年5月1日(2012.5.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  生体組織から分離できる多能性幹細胞画分
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体組織由来の多能性幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラナリアやイモリは体の一部を切断された後でも体を再生し得る。これらの、高い再生能力は、間葉系に存在する多能性幹細胞(adult pluripotent stem cell)の存在によっている。一方、ヒトなどの高等生物においては、組織再生能はこれらの動物に比較してはるかに低い。胚盤胞の内部細胞塊（ICM: Inner cell mass)は、多能性幹細胞の集まりと認識されており、外胚葉、中胚葉、内胚葉系の細胞に分化する能力を持つ。しかしながら、発生が進むと共にこのような多能性が制限されていき、組織に特化した細胞に分化していく。
【０００３】
近年、組織再生に貢献し得る成人幹細胞又は組織幹細胞が注目されている。しかし、哺乳類の成体に、プラナリアやイモリのように多能性（pluripotent）幹細胞が存在するか否かは不明であった。
【０００４】
成体から得られる分化能を有する細胞として、例えば骨、軟骨、脂肪細胞、神経細胞、骨格筋等への分化能を有する骨髄間葉系細胞画分（MSC: Bone marrow stromal cell)が報告されている（非特許文献１及び２を参照）。しかしながら、骨髄間葉系細胞画分は様々な細胞を含む細胞群であり、その分化能は多様でありながら本体がはっきりせず、また特定の細胞に分化させるために特定の化合物による刺激や遺伝子導入等が必要であり、分化誘導システムを構築する必要があった。
【０００５】
さらに、成体由来の多能性幹細胞としてiPS細胞（induced pluripotent stem cell）（特許文献１、特許文献２、非特許文献３等を参照）が報告されていた。しかしながら、iPS細胞の樹立には、間葉系細胞である皮膚線維芽細胞画分(dermal fibroblast)に特定の遺伝子や特定の化合物を体細胞に導入するという特定の物質を用いた誘導操作が必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第4183742号公報
【特許文献２】特開2008-307007号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】M. DEZAWA et al., The Journal of Clinical Investigation, 113, 12, pp. 1701-1710, (2004)
【非特許文献２】M. DEZAWA et al., SCIENCE, 2005 July 8, 309, pp. 314-317, (2005)
【非特許文献３】Okita K. et al. SCIENCE, 2008 Nov 7, 322(5903), pp.949-953 
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、生体組織から多能性幹細胞を直接得る方法の提供及びその方法により得られた多能性幹細胞の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、骨髄間葉系細胞画分（MSC: Bone marrow stromal cell)についての研究過程において、無処理のヒトMSC細胞から極めて低い頻度で特徴的な細胞塊が形成されることを見出した。初期の細胞塊の外見はES細胞に酷似していた。しかしながら、ES細胞とは異なり無限増殖をせずに、ある一定の期間である大きさに到達すると増殖が停止し、さらに毛、色素細胞などの種々の細胞を含む不均一な集団となった。また、この細胞塊について免疫細胞化学(immunocytochemistry)を行ったところ、外胚葉、中胚葉及び内胚葉マーカーにそれぞれ陽性の細胞が細胞塊内に混在して検出された。本発明者らは、この結果より、無処理の通常に維持・培養されている(naive)ヒトMSC細胞画分中に多能性幹細胞に相当する細胞が存在する可能性を考え、さらに鋭意検討を行った。
【００１０】
上記検討の結果、本発明者らは、上記多能性幹細胞の表面抗原としてSSEA-3が発現していることを見出し、SSEA-3の発現を指標に上記多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分を生体組織からも分離し得ることを見出した。
【００１１】
本発明者らは、上記多能性幹細胞は、新規な多能性幹細胞であり、従来報告されていたES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞と異なり、生体組織から遺伝子導入などの誘導操作なしに、直接得られる多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分であることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明者らは、該多能性幹細胞をMuse細胞（Multilineage-differentiating Stress Enduring cells)と名付けた。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  生体組織からSSEA-3陽性で分離できる細胞画分であって、SSEA-3陽性の多能性幹細胞を含む多能性幹細胞画分。
該多能性幹細胞画分は、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞等の生体組織の培養物からも分離することができる。
[２]  多能性幹細胞がCD105陽性の[１]の多能性幹細胞画分。
【００１３】
[３]  多能性幹細胞がCD117(c-Kit)陰性及びCD146陰性の[１]又は[２]の多能性幹細胞画分。
[４]  多能性幹細胞がCD117陰性、CD146陰性、NG2陰性、CD34陰性、vWF陰性及びCD271陰性の[１]又は[２]の多能性幹細胞画分。
【００１４】
[５]  多能性幹細胞がCD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、Sox10陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrp1陰性及びDct陰性の[１]又は[２]の多能性幹細胞画分。
[６]  多能性幹細胞がテロメラーゼ活性が低いか又は無い、[１]〜[５]のいずれかの多能性幹細胞画分。
【００１５】
[７]  多能性幹細胞が三胚葉に分化する能力を持つ、[１]〜[６]のいずれかの多能性幹細胞画分。
本発明の多能性幹細胞は、in vitroの接着培養で三胚葉に分化する能力を有し、in vitroで誘導培養することにより、皮膚、肝、神経、筋、骨、脂肪等に分化し得る。また、in vivoで精巣に移植した場合にも三胚葉に分化する能力を有する。さらに、静注により生体に移植することで損傷を受けた臓器（皮膚、脊髄、肝、筋肉等）に生着し分化する能力を有する。
【００１６】
[８]  多能性幹細胞が腫瘍性増殖を示さない、[１]〜[７]のいずれかの多能性幹細胞画分。
本発明の多能性幹細胞は、浮遊培養で増殖速度約１．３日で増殖するが10日間程度で増殖が止まるという性質を有し、さらに精巣に移植した場合少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。
【００１７】
[９]  多能性幹細胞がセルフリニューアル能を持つ、[１]〜[８]のいずれかの多能性幹細胞画分。
本発明の多能性幹細胞は、浮遊培養と接着培養の操作を繰り返すことにより増殖させることができる。また、本発明の多能性幹細胞は他の体性幹細胞と同じく、非対称分裂をする。
【００１８】
[１０]  多能性幹細胞がストレス耐性である、[１]〜[９]のいずれかの多能性幹細胞画分。
[１１]  多能性幹細胞が貪食能が高い、[１]〜[１０]のいずれかの多能性幹細胞画分。
【００１９】
[１２]  多能性幹細胞が以下に示す２２個のオドラント受容体の少なくとも一つが陽性の[１]〜[１１]のいずれかの多能性幹細胞画分：
olfactory receptor, family 8, subfamily G, member 2 (OR8G2)；
olfactory receptor, family 7, subfamily G, member 3 (OR7G3)；
olfactory receptor, family 4, subfamily D, member 5 (OR4D5)；
olfactory receptor, family 5, subfamily AP, member 2 (OR5AP2)；
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 4 (OR10H4)；
olfactory receptor, family 10, subfamily T, member 2 (OR10T2)；
olfactory receptor, family 2, subfamily M, member 2 (OR2M2)；
olfactory receptor, family 2, subfamily T, member 5 (OR2T5)；
olfactory receptor, family 7, subfamily D, member 4 (OR7D4)；
olfactory receptor, family 1, subfamily L, member 3 (OR1L3)；
olfactory receptor, family 4, subfamily N, member 4 (OR4N4)；
olfactory receptor, family 2, subfamily A, member 7 (OR2A7)；
guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha activating activity polypeptide, olfactory type (GNAL)；
olfactory receptor, family 6, subfamily A, member 2 (OR6A2)；
olfactory receptor, family 2, subfamily B, member 6 (OR2B6)；
olfactory receptor, family 2, subfamily C, member 1 (OR2C1)；
olfactory receptor, family 52, subfamily A, member 1 (OR52A1)；
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 3 (OR10H3)；
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 2 (OR10H2)；
olfactory receptor, family 51, subfamily E, member 2 (OR51E2)；
olfactory receptor, family 5, subfamily P, member 2 (OR5P2)；及び
olfactory receptor, family 10, subfamily P, member 1 (OR10P1)。
【００２０】
[１３]  多能性幹細胞が以下に示す５個のケモカイン受容体の少なくとも一つが陽性の[１]〜[１２]のいずれかの多能性幹細胞画分：
chemokine (C-C motif) receptor 5（CCR5)；
chemokine (C-X-C motif) receptor 4（CXCR4)；
chemokine (C-C motif) receptor 1（CCR1)；
Duffy blood group, chemokine receptor(DARC)；及び
chemokine (C-X-C motif) receptor 7(CXCR7)。
【００２１】
[１４]  多能性幹細胞が中胚葉系組織または間葉系組織由来である、[１]〜[１３]のいずれかの多能性幹細胞画分。
[１５]  [１]〜[１４]のいずれかの多能性幹細胞画分から単一細胞として単離できるSSEA-3陽性の多能性幹細胞。
【００２２】
[１６]  生体組織から、以下の(i)〜(vi)の特性の少なくとも１つの特性を指標に多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分を分離する方法：
(i)  SSEA-3陽性；
(ii)  CD105陽性；
(iii)  CD117陰性及びCD146陰性；
(iv)  CD117陰性、CD146陰性、NG2陰性、CD34陰性、vWF陰性及びCD271陰性；
(v)  CD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、Sox10陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrp1陰性及びDct陰性；並びに
(vi)  テロメラーゼ活性が低いか又は無い。
【００２３】
[１７]  生体組織由来細胞を細胞ストレスに暴露し生き残った細胞を回収することを含む多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分を富化（又は濃縮）する方法。
【００２４】
生体がストレスに曝されたり、傷害を受けると休眠状態の組織幹細胞が活性化され、組織再生に寄与することが知られている。本発明者は、骨髄間葉系細胞画分や皮膚線維芽細胞画分等の間葉系細胞又は中胚葉系細胞を培養している際に種々の方法でストレス刺激を与え（例えば、無血清培養、Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)による培養、低酸素培養、トータル３時間の間欠的短時間トリプシン培養、８時間若しくは16時間の長時間のトリプシン培養等）、生存している細胞を集め、メチルセルロース（MC)含有培地中で浮遊培養（MC培養という）を行った。その結果、最大直径150μmまでの種々の大きさの胚様体様（embryoid body-like）細胞塊の形成が認められた。特に長時間のトリプシン処理を行ったヒト皮膚線維芽細胞画分及びヒトMSC画分において、最も多くの胚様体様細胞塊の形成率が認められた。
【００２５】
本発明者らは、得られた胚様体様細胞塊中の細胞の特性を調べ、該細胞が多能性幹細胞の特性を有していることを見出した。さらに、本発明者らは、得られた胚様体様細胞塊中の細胞が従来報告されていた多能性幹細胞が有しない特性を有することを見出し、さらに、得られた細胞塊中の細胞の発現タンパク質を調べ、従来報告されていたES細胞、iPS細胞などの多能性幹細胞とは異なる発現パターンを示すことを見出した。
【００２６】
[１８]  細胞ストレスが、プロテアーゼ処理、低酸素条件下での培養、低リン酸条件下での培養、血清飢餓状態での培養、糖飢餓状態での培養、放射線曝露下での培養、熱ショックへの曝露下での培養、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養及び圧力処理下での培養から選択される、[１７]の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分を富化する方法。
【００２７】
[１９]  細胞ストレスが、トリプシン処理である、[１８]の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分を富化する方法。
[２０]  [１５]の多能性幹細胞の派生細胞又は誘導細胞である多能性幹細胞。
該派生細胞又は誘導細胞として、例えば、遺伝子の導入や、化合物を添加により誘導した細胞が挙げられる。また、本発明の多能性幹細胞由来のiPS細胞が挙げられる。
【００２８】
[２１]  [１５]の多能性幹細胞の派生細胞又は誘導細胞である分化した細胞。
[２２]  [１５]及び[２０]のいずれかの多能性幹細胞を含む医薬組成物。
[２３]  [２１]の分化した細胞を含む医薬組成物。
【００２９】 
本明細書は本願の優先権の基礎である米国仮出願61/213,788号及び米国仮出願61/290,159号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【００３０】
【図面の簡単な説明】
【図１−１】  図１-１は、間葉系細胞画分、Muse細胞及びMuse細胞由来の胚様体様
細胞塊の関係を示す図である。間葉系細胞画分に長時間トリプシン処理（Long term trypsin incubation; LTT)等のストレス刺激を与えると、Muse細胞が濃縮されMuse細胞を多く含む細胞画分が得られ（富Muse細胞画分と呼ぶ）、該細胞画分中のMuse細胞を浮遊培養すると胚様体様細胞塊（Muse細胞由来胚様体様細胞塊）が得られる。胚様体様細胞塊をゼラチンでコートした培養皿で培養すると３胚葉の細胞に分化する。図１−１に示すように、SSEA-3陽性細胞を直接分離し、長時間のストレスをかけることなく浮遊培養することによりMuse細胞由来の胚様体様細胞塊を得ることができる。
【図１−２】  図１-２は、Muse細胞を大量に増殖させる方法を示す図である。
【図２】  図２は、Muse細胞由来の胚様体様細胞塊/無処理細胞画分での発現量の比
が高い因子を示す図である。
【図３】  図３は、Muse細胞由来の胚様体様細胞塊/ヒトES細胞での発現量の比が高
い因子を示す図である。
【図４】  図４は、MACSソーティングのプロトコールを示す図である。
【図５】  図５は、ヒト線維芽細胞(H-fibroblast)画分の16時間の長時間トリプシン
処理後（図５a)及び1800〜2200rpm/分で３分間ボルテックス処理を行った後（図５b)のトリパンブルー染色像にて死細胞の除去を示す写真である。
【図６】  図６は、各種細胞の写真である。図６aは富Muse細胞画分の中の１細胞（
バーは10μm）、図６bはヒトES細胞由来の胚様体細胞塊（バーは25μm)、図６cは直径約25μmのMuse細胞由来の胚様体様細胞塊（バーは25μm)、図６dはヒトES細胞由来細胞塊４日目のアルカリフォスファターゼ染色像（バーは25μm)、図６e〜gはMuse細胞由来の胚様体様細胞塊のOct3/4(e)、Sox2(f)及びPAR4(g)の免疫染色像を示す写真である。
【図７−１】  図７-１は、H-fibroblast画分及びヒトMSC(H-MSC)画分由来の細胞塊
の特徴を示す写真である。図７-１a及びbは無処理ヒトMSC画分の通常の接着培養において自発的に生じた細胞塊（バーは100μm）を示す。図７-１c及びdは０日目(c)及び７日目（d)のH-fibroblast-1画分の長時間トリプシン処理後のMC培養の状態を示し（バーは100μm）、図７-１dの矢印はMuse細胞由来胚様体様細胞塊を示す。図７-１e及びfはMC培養７日後のH-fibroblast-1画分から形成されたMuse細胞由来胚様体様細胞塊を示す（バーは50μm）。
【図７−２】  図７-２は、H-fibroblast画分及びヒトMSC(H-MSC)画分由来の細胞塊
の特徴を示す写真である。図７-２g-lはH-fibrobalst画分から形成されたMuse細胞由来胚様体様細胞塊（図７-２g、i及びk）及びH-MSC画分から形成されたMuse細胞由来胚様体様細胞塊（図７-２h、j及びl)のNanog（図７-２g及びj）、Oct3/4（図７-２h）、SSEA-3（図７-２i)、PAR4（図７-２k)及びSox2（図７-２ｌ)の局在を示す免疫染色の結果を示す（バーは50μm）。
【図７−３】図７-３は、H-fibroblast画分及びヒトMSC(H-MSC)画分由来の細胞塊の
特徴を示す写真である。図７-３m-oはヒトES細胞（図７-３m）、H-fibroblast画分由来のMuse細胞由来胚様体様細胞塊（図７-３n）及び無処理H-fibroblast-1画分(図７-３o）のアルカリフォスファターゼ染色の結果を示す（バーは50μm）。
【図７−４】  図７-４は、H-fibroblast画分及びヒトMSC(H-MSC)画分由来の細胞塊
の特徴を示す電子顕微鏡写真である。図７-４p-rはヒトES細胞胚様体（図７-４p、MC培養３日目）、H-fibroblast-1画分由来のMuse細胞由来胚様体様細胞塊（図７-４q及びr、MC培養５日目）の電子顕微鏡像を示す（バーは５μm）。
【図８−１】  図８-１は、Muse細胞由来胚様体様細胞塊（M-cluster)のクローナリ
ティー及びセルフリニューアルを示す図であり、Muse細胞のクローナリティー及びセルフリニューアルを決定するために行った実験の概要を示す図である。
【図８−２】  図８-２は、Muse細胞の浮遊培養における増殖速度を示す図である。
【図８−３】  図８-３は単一のMuse細胞由来胚様体様細胞塊（H-fibroblast-1由来
、第１世代（サイクル））から増殖した細胞(clonally expanded cells)の正常核型を示す図である。
【図９−１】  図９-１は、Muse細胞由来胚様体様細胞塊の分化を示す図である。a-
cはH-fiboroblas-1画分由来の分化細胞の塊のα平滑筋アクチン及び神経フィラメント（図９-１a及びb）並びにα-フェトプロテイン(図９-１c）の局在を示す免疫染色像である（バーは図９-１aが500μm、図９-１b及びcが50μm）。図９-１aの矢頭は接着したMuse細胞由来胚様体様細胞塊を示す。
【図９−２】  図９-２は無処理細胞画分、H-fibroblast画分由来の第１及び第３世
代のMuse細胞由来胚様体様細胞塊（1st細胞塊、3rd細胞塊)をゲラチン上で培養し自発的分化を誘導した細胞群におけるα-フェトプロテイン（α-FP）、GATA6、MAP-2及びNkx2.5発現のRT-PCR分析の結果を示す。陽性コントロールとしてはα-FPに対してヒト胎児肝臓を、GATA6、MAP-2及びNkx2.5に対してはヒト胚全体を用いた。
【図９−３】  図９-３e-lは富Muse細胞画分を投与した免疫不全マウスの精巣を示す
。図９-３eはコントロール(intact)となる無傷の精巣並びにマウスES細胞(mES cells)（８週）、MEF(フィーダー細胞）（８週）、Muse細胞由来胚様体様細胞塊(M-cluster)（６ヶ月）及び富Muse細胞画分(Muse)（６ヶ月）を投与した精巣を示す。図９-３f-iは富Muse細胞画分又はMuse細胞由来胚様体様細胞塊を投与した精巣組織の神経フィラメントM（図９-３f、写真では緑に染色）、α-フェトプロテイン（図９-３g、写真では緑に染色）及び平滑筋アクチン（図９-３h、図では赤に染色）の免疫染色像を示す（バーは50μm）。図９-３iの３枚のパネルはヒトミトコンドリア（緑に染色）及び平滑筋アクチン（赤に染色）の二重染色像を示す（バーは20μm）。図９-３j-lは富Muse細胞画分を投与した精巣の組織像を示す（図９j及びk）。図９−３ｌに認められるチューブ様の構造はヒトミトコンドリアに対する抗体で染色されている（バーは図９-３jが500μm、図９-３k-lが50μm)。
【図１０a】  図１０aは、H-fibroblast(Fibro-1, Fibro-2)及びH-MSC(MSC-1, MSC-2
)のpluripotency及び未分化細胞状態に関与する因子の定量PCRの結果を示す図である（その２）。図中のカラムの模様は富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊（７日目）（細胞塊）の無処理細胞画分に比較した遺伝子発現レベルを示す。白は富Muse細胞群又はMuse細胞由来胚様体様細胞塊/無処理細胞画分の比が1/３より大きく３より小さいものを示し、グレーは富Muse細胞画分又はMuse細胞由来胚様体様細胞塊/無処理細胞画分の比が３より大きいものを示し、斜線は富Muse細胞画分又はMuse細胞由来胚様体様細胞塊/無処理細胞画分の比が1/3より小さいものを示す。
【図１０b】  図１０bは、H-MSC由来の無処理細胞画分（Naive)、富Muse細胞画分(M
use)及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊(M-cluster)（７日目）のテロメラーゼ活性を示す図である。熱不活性化サンプル（Heat)を陰性コントロールとして用いた。
【図１１】  図１１は、H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の無処理細胞画分（無
処理）、富Muse細胞画分（Muse）及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊（EB）のDNAマイクロアレイ分析の結果を示す図である。
【図１２】  図１２は、ヒト骨髄の単核球成分からSSEA-3/CD105二重陽性細胞として
直接採取したMuse細胞を含む多能性幹細胞画分をMC培養し、形成された胚様体様細胞塊を示す写真である。図１２aはヒト骨髄から分離し８時間の長時間トリプシン処理を行った単核細胞画分をMC培養し（8hr-hBM-MC、７日)形成されたMuse細胞由来胚様体様細胞塊を示す（バーは100μm）。図１２bは8hr-hBM-MC（７日）により形成されたMuse細胞由来胚様体様細胞塊のアルカリフォスファターゼ染色像を示す（バーは50μm）。
【図１３】  図１３は、無処理H-MSC-1画分（naive 1）、無処理H-MSC-2画分（naiv
e 2)（いずれもネガティブコントロール）、並びに８時間のトリプシン処理を行ったヒト骨髄由来単核細胞画分（8hr-hBM)あるいはトリプシン処理を行わないヒト骨髄由来単核細胞画分（naive hBM)から形成されたMuse細胞由来胚様体様細胞塊をゲラチンの上で培養し自発的分化を誘導した細胞群におけるα-フェトプロテイン（α-FP)、GATA6、MAP-2及びNkx2.5のRT-PCR分析の結果を示す図である。
【図１４】  図１４は、H-fibroblast画分（無処理細胞） 及びH-MSC画分（無処理細
胞）のFACS分析の結果を示す図である。
【図１５−１】  図１５-１は、無処理細胞画分中のSSEA-3陽性細胞（１５-１a左）
、及びFACSソーティングにより採取したSSEA-3陽性細胞由来の単一Muse細胞由来胚様体様細胞塊からクローン増殖したSSEA-3陽性細胞（１５−１a右）の染色像を示す写真である。図中のバーは100μmである。
【図１５−２】  図１５−２は、Muse細胞（H-fibroblast由来)の細胞分裂中の非対
称分裂に関わる因子であるNumblike（緑色）の局在を示す染色像を示す写真である。図中のバーは10μmである。
【図１５−３】  図１５-３は、H-fibroblast由来のSSEA-3陰性細胞（図１５-３c)
及びSSEA-3陽性細胞（図１５−３d）の電子顕微鏡写真である。図中のバーは５μmである。
【図１５−４】  図１５-４は、H-fibroblast由来Muse細胞のOct3/4（緑色）（図１
５-４e）、Sox2（緑色）（図１５-４f）及びSSEA-3（赤色）（図１５-４g）の染色像を示す写真である。
【図１６−１】  図１６-１は、超免疫不全マウス(Nog マウス)損傷組織におけるGF
P標識SSEA-3陽性Muse細胞画分の分化を示す写真である。図１６-１N及びOは圧迫損傷脊髄（４週間後）におけるGFP陽性細胞であり、ニューロフィラメント（赤色）及びヒトゴルジ複合体（白色）を発現している。OはNの四角で囲んだ部分の拡大像である。図１６-１Pは損傷肝臓（４週間後）のGFP陽性標識細胞であり、ヒトアルブミン（赤色）及びヒトゴルジ複合体（白色）を発現している。
【図１６−２】  図１６-２は、RT-PCRで調べた、SSEA-3陽性Muse細胞画分を移植し
た肝臓におけるヒトアルブミンの発現を示す写真である。
【図１６−３】  図１６-３は、超免疫不全マウス(Nog マウス)損傷組織におけるGF
P標識SSEA-3陽性Muse細胞画分の分化を示す写真であり、ヒトジストロフィン（赤色）を発現している筋肉（３週間後）のGFP陽性細胞を示す写真である。
【図１７−１】  図１７-１は、単一Muse細胞から形成されたMuse細胞由来胚様体様
細胞塊から増殖させた細胞の分化を示す写真である。図１７-１A〜Dは、神経誘導の結果を示し、Aは形成されたsphereを示し、さらにshpereの免疫染色データとしてBはネスチン、CはMusashi、DはNuroDの発現を示す。Eはこれらのsphereをさらに神経系細胞への分化をさせたものであり、MAP-2陽性細胞を示す。図１７-１F〜Gは、骨細胞誘導の結果を示し、オステオカルシン（F)及びALP（G)の発現を示す。図１７-１H及びIは、脂肪細胞誘導の結果を示し、Hは油滴を含む細胞を示し、Iはオイルレッド染色の結果を示す。図１７-１Jは、肝臓細胞誘導の結果を示し、α-フェトプロテイン陽性細胞を示す。
【図１７−２】  図１７-２は、RT-PCRで調べた、肝細胞誘導した細胞におけるヒト
アルブミン及びヒトα-フェトプロテインの発現を示す写真である。
【図１８−１】  図１８-1は、RT-PCRで調べた、SSEA-3陽性Muse細胞画分におけるSo
x10、Snail1、８lug、Tyrp1及びDctの発現を示す写真である。
【図１８−２】  図１８−２は、FACSで分析したNG2、CD34、vWF、CD117、CD146及び
CD271の発現を示す図である。無処理ヒト皮膚線維芽細胞において、周皮細胞（pericyte)マーカーであるNG２、内皮前駆細胞マーカーであるCD34及びvWFは陰性であり、SSEA-3陽性細胞でも陰性であった。メラノブラストマーカーであるCD117、周皮細胞（pericyte)マーカーであるCD146、NCSCマーカーであるCD271は、無処理ヒト皮膚線維芽細胞では、わずかに陽性細胞が認められたが（それぞれ0.2％、0.2％及び0.8％）、それらはSSEA-3陰性細胞であったためMuse細胞ではないと考えられる。
【図１８−３】  図１８-３は、Muse細胞がフェライトを貪食したことを示す図であ
る。
【図１９】  図１９は、Muse細胞から作製したiPS細胞の形成を示す写真であり、図
１９aは、皮膚線維芽細胞（NHDF）由来Muse細胞から誘導されたヒトiPS細胞の形態を示し、図１９b〜fは、多能性細胞マーカー（bがNonog、cがOct3/4、dがSox2、eがSSEA-3、fがTra-1-60)の発現を示す。
【図２０】  図２０は、Nonog（E)、Oct3/4（F)、Sox2（G)及びTra-1-81（H)の免疫
組織化学の結果を示す写真である。
【図２１】  図２１は、Muse由来iPS細胞（Mi-1,Mi-2）及びSSEA-3陰性細胞から増殖
したコロニー（(-)-1, (-)-2）のRT-PCRにより調べた多能性マーカーの発現を示す写真である。
【図２２−１】  図２２-１は、Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myseをレトロウイルスで導
入し、その後フィーダー細胞MEF上で培養した30日後のSSEA-3陽性及び陰性細胞から形成されたコロニーのTra-1-81免疫染色の結果を示す写真である。ヒトES細胞をコントロールとして用いている。SSEA-3陽性細胞からのコロニー（a1）及びヒトES細胞（a2）はTra-1-81陽性であるが、SSEA-3陰性細胞からのコロニーはすべて陰性である。
【図２２−２】  図２２-２は、２２−１と同じくMEFで３０日培養した段階における
SSEA-3陽性及び陰性細胞の多能性マーカー（内因性Oct3/4（endo Oct)、内因性Sox2（endo Sox2)、Nanog、内因性Klf4（endo Klf4）、Rex1及びUTF1）の発現を示す写真である。SSEA-3陰性細胞群ではSox2, Nanogのシグナルが見られない。
【図２２−３】  図２２-３は、Muse細胞から誘導したiPS細胞(Muse細胞由来iPS細
胞)（図２２-３C及びC1)及びSSEA-3陰性細胞から増殖したコロニー（図２２-３D及びD1)のコロニーを示す写真である。
【図２３−１】  図２３-１は、皮膚線維芽細胞（NHDF）由来Muse細胞から誘導され
たiPS細胞のin vitroでの分化の様子を示す写真である。図２３-１iは、内胚葉マーカーであるα-フェトプロテイン（緑色）及び中胚葉マーカーである平滑筋アクチン（赤色、青色はDNA)の発現を示し、図２３-１jは、外胚葉マーカーである神経フィラメント（緑色）の発現を示す。
【図２３−２】  図２３-２は、Muse細胞から誘導されたiPS細胞のin vitroでの分化
のRT-PCR分析結果を示す図であり、３胚葉マーカーの発現を示す。
【図２３−３】  図２３-３は、皮膚線維芽細胞（NHDF）由来Muse細胞から誘導され
たiPS細胞から形成されたテラトーマの組織構造を示す写真であり、HE（Hematoxylin及びeosin)染色により、iPS細胞が種々の組織に分化していることを示している。図２３-３mは、軟骨（cartilage)、図２３-３nは筋肉(Muscle)、図２３-３oは神経上皮（neural epithelium）、図２３-３pは色素上皮（pigmented epithelium）、図２３-３qは円柱上皮（columnar epithelium)を示す。
【図２４】  図２４は、SSEA-3陰性細胞画分、Muse細胞由来胚様体様細胞塊及びMuse
由来iPS細胞のNanog遺伝子及びOct3/4遺伝子のBisulfite（亜硫酸水素塩）シーケンスの結果を示す図である。それぞれのカラムの数値は、転写開始部位（TSS)の下流に対すCpGの位置を示す。白丸はメチル化されていないシトシンを、黒丸は、メチル化されたシトシンを示す。
【図２５】  図２５は、無処理線維芽細胞（Naive)、Muse細胞由来胚様体様細胞塊（
Cluster)及びiPS細胞中の細胞周期に関連した因子の定量PCRの結果を示す図である。「/Naive」で示されるカラム中、白カラムは、無処理細胞に対するMuse画分又はMuse細胞由来胚様体様細胞塊との比が２未満で1/2より大きいことを示す。また、塗りつぶされたカラムは比が２より大きいことを示し、斜線が引かれたカラムは、比が1/2より小さいことを示す。「/iPS」で示されるカラム中、「＊」は、発現された遺伝子の量がiPSよりMuse細胞由来胚様体様細胞塊で大きいことを示し、「＊＊」は、発現された遺伝子の量がMuse細胞由来胚様体様細胞塊よりiPSで大きいことを示す。
【図２６】  図２６は、無処理線維芽細胞（Naive)、Muse細胞由来胚様体様細胞塊（
Cluster)及びiPS細胞中の多能性及び未分化細胞状態に関連した因子の定量PCRの結果を示す図である。各カラムの意味は図２５と同じである。
【図２７】  図２７は、ヒト及びマウスモデルにおいて作製されたiPS細胞株の誘導
効率に関する論文報告をまとめた図である。図２７は核のリプログラミングを誘導する転写因子の組合せを示している。
【００３１】
【発明を実施するための形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜本明細書中に用いる用語の説明＞
本発明は、生体の生体組織から直接得ることができる多能性(pluripotent)幹細胞又は多能性幹細胞画分及び該多能性幹細胞又は該多能性幹細胞画分を分離する方法、並びに該方法により得られた生体組織由来の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分である。本発明の多能性幹細胞をMuse細胞（multilineage differentiating stress enduring cells)という。
【００３２】
本発明において、細胞画分というときは、単離したい細胞を少なくとも一定量含む細胞群のことをいう。例えば、多能性幹細胞画分とは、多能性幹細胞を１％以上、10％以上、30％以上、50％以上、70％以上、90％以上、又は95％以上含む細胞群が挙げられ、多能性幹細胞の培養によって得られる細胞塊や多能性幹細胞を濃縮した細胞群を含む。また、前記細胞画分を実質的に均一な細胞画分ということもある。
【００３３】
生体は、哺乳動物の生体をいい、ある程度発生が進んだ動物体をいう。本発明において、生体には、受精卵や胞胚期より発生段階が前の胚は含まれないが、胎児や胞胚を含む胞胚期以降の発生段階の胚は含まれる。哺乳動物は限定されないが、例えばヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が含まれる。本発明の多能性幹細胞は、生体の組織由来である点で、胚性幹細胞（ES細胞）や胚性生殖幹細胞（EG細胞）と明確に区別される。
【００３４】
中胚葉系組織とは、動物の初期発生途上で現れる中胚葉起源の組織をいい、筋肉系組織、結合組織、循環系組織、排泄系組織、生殖系組織等が含まれる。例えば、本発明の多能性幹細胞は、骨髄液や真皮結合組織等の皮膚組織から得ることができる。
【００３５】
間葉系組織とは、骨、軟骨、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、心臓、などの組織をいう。例えば、本発明の多能性幹細胞は、骨髄や皮膚から得ることができる。また、臍帯から得ることもできる。
【００３６】
細胞又は細胞画分が組織から直接得ることができるとは、組織から分離することができ、外来遺伝子や外来タンパク質の導入又は化合物の投与などの化合物処理等の人為的な誘導操作を経ずに得られることを意味する。ここで、外来遺伝子は、限定されないが、例えば体細胞の核を初期化し得る遺伝子をいい、例えば、Oct3/4遺伝子等のOctファミリー遺伝子、Klf遺伝子等のKlfファミリー遺伝子、c-Myc遺伝子等のMycファミリー遺伝子、Sox2遺伝子等のSoxファミリー遺伝子が挙げられる。また、外来タンパク質としてはこれらの遺伝子がコードするタンパク質やサイトカインが挙げられる。さらに、化合物としては、例えば、上記の体細胞の核を初期化し得る遺伝子の発現を誘導する低分子化合物やDMSO、還元剤として機能する化合物, DNA メチル化剤等が挙げられる。本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は、生体あるいは組織から直接得ることができるという点で、iPS(induced pluripotent stem cell)細胞及びES細胞とは明確に区別される。なお、本発明においては、細胞の培養、細胞の表面マーカーを指標に細胞又は細胞画分を分離すること、細胞を細胞ストレスに曝露すること、及び細胞に物理的衝撃を与えることは、人為的な誘導操作には含まれない。また、本発明の多能性幹細胞は、リプログラミング又は脱分化の誘導を必要とせずに得られることを特徴としてもよい。
【００３７】
多能性幹細胞とは、pluripotencyを有している細胞をいい、以下の特性を有する。
（１）  Nanog、Oct3/4、SSEA-3、PAR-4及びSox2等の多能性マーカー（Pluripotent marker）を発現する。
（２）  １細胞から増殖し、自己のクローンを作り続けるクローナリティー（Clonality）を有する。
（３）  自己複製（セルフリニューアル）能を有する。
【００３８】
（４）  ３胚葉系（内胚葉系、中胚葉系及び外胚葉系）へin vitro及びin vivoで分化し得る。
（５）  マウスの精巣や皮下に移植した場合、３胚葉系への分化を呈する。
（６）  アルカリフォスファターゼ染色で陽性となる。
【００３９】
また、多能性幹細胞は、pluripotencyを有している点で、成人幹細胞、組織幹細胞とは明確に区別される。
【００４０】
＜本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分の説明＞
本発明の多能性幹細胞は、生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等に存在していると考えられ、本発明においては、これらの組織に存在している細胞又は細胞画分を分離する。本発明の多能性幹細胞は、例えば、骨髄に存在しており、骨髄から血液等を介して生体の各組織に供給される可能性がある。このため骨髄や、皮膚等の生体の各組織、さらには血液から本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分を分離することが可能である。
また、本発明の多能性幹細胞画分は、SSEA-3の発現を指標としてpluripotencyを有している単一の又は複数の細胞を含む細胞画分として分離されている点で、骨髄間葉系細胞等の細胞画分とは明確に区別される。
【００４１】
さらに、本発明の多能性幹細胞は、以下の特性を有する。
（i）  増殖速度が比較的緩やかで、分裂周期が１日以上、例えば1.2〜1.5日である。ただし、ES細胞やiPS細胞が示すような無限増殖は示さない。
（ii）  免疫不全マウスに移植した場合に内胚葉系、中胚葉系及び外胚葉系への分化を示す。ES細胞やiPS細胞ではテラトーマが短期間で癌化するのに比べ、半年以上癌化しないことを特徴とする。
（iii)  浮遊培養により胚様体様細胞塊を形成する。
（iv)  浮遊培養にて胚様体様細胞塊を形成し、10日程度で増殖が停止する。その後、接着培養に移動させることにより再増殖する。
（v）  増殖の際に非対称分裂を伴う。
【００４２】
（vi）  核型は正常である。
（vii）  テロメラーゼ活性が無いか又は低い。ここで、テロメラーゼ活性が無いか又は低いとは、例えばTRAPEZE XL telomerase detection kit（Millipore社）を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に検出できないか又は低いことをいう。テロメラーゼ活性が低いとは、例えば、ヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、あるいはHela細胞に比べて1/5以下、好ましくは1/10以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。
（viii）  メチル化の状態については、Muse細胞から誘導したiPS細胞に関してはNanogおよびOct3/4のプロモータ領域のメチル化レベルが低い。
（ix）  貪食能が高い。
（x）  腫瘍性増殖を示さない。ここで、腫瘍性増殖を示さないとは、浮遊培養を行った場合、一定の大きさの細胞塊（クラスター）に達すると増殖が止まり、無限増殖しないことをいう。また免疫不全マウスの精巣に移植しても奇形腫を形成しないことである。なお、上記(i)〜(iv)等も腫瘍性増殖を示さないことに関連する。
【００４３】
すなわち、本発明の細胞は、例えば以下の多能性幹細胞である。
（A）  生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等から得られる細胞であって、当該細胞内に化学物質、外来遺伝子又は外来タンパク質を導入することなく直接得ることができる多能性幹細胞。
（B）  生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等が、骨髄、皮膚、血液、臍帯、脂肪などからなる群から選択される上記（１）の特性を有する多能性幹細胞。
（C）  リプログラミングまたは脱分化を誘導することなく得ることができる、上記（A）又は（B）の多能性幹細胞。
【００４４】
（D）  精巣へ移植した場合に、少なくとも半年間は腫瘍形成しない、上記（A）又は（B）の多能性幹細胞。
（E）  ES細胞、iPS細胞のように無限増殖を示さない、上記（A）又は（B）の多能性幹細胞。
（F）  生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等由来の多能性幹細胞であって、生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等の細胞をプロテアーゼで処理したときに生き残る、プロテアーゼに耐性である多能性幹細胞。
【００４５】
＜本発明の多能性幹細胞画分を分離する方法＞
本発明の多能性幹細胞画分は、生体組織から細胞ストレスに暴露せずに直接分離することもできる。すなわち、本発明の多能性幹細胞画分は、生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等から外来遺伝子を導入することなく、誘導操作なしに以下の方法で分離することができる。
【００４６】
生体組織は、限定されないが、生体の中胚葉系組織又は間葉系組織、例えば、骨髄、皮膚、臍帯等が挙げられる。骨髄を用いる場合、骨髄の単核球分画を用いることができる。分離は、Muse細胞の表面に多く発現している細胞表面マーカーを利用して行うことができ、例えばSSEA-3の発現を指標に分離することができる。本発明の多能性幹細胞画分に含まれる多能性幹細胞をSSEA-3陽性Muse細胞ということもある。さらに、Muse細胞は間葉系細胞マーカーであるCD105を発現しており、SSEA-3陽性であり、CD105陽性である。従って、SSEA-3及びCD105の両方の発現を指標にMuse細胞を含む多能性幹細胞画分を分離することができる。これらの細胞表面マーカーを利用することにより、本発明の多能性幹細胞画分を分離でき、該多能性幹細胞画分から単離した単一細胞を、培養により増殖させることができる。なお、本発明は、ヒト以外の哺乳動物の生体組織からSSEA-3に相当するマーカーによって分離できる多能性幹細胞画分をも含むものとする。
【００４７】
一方、Muse細胞は、NG2、CD34、vWF（フォンビルブランド因子）、c-kit（CD117)、CD146、CD271（NGFR)が陰性である。さらに、Sox10、Snai1、Slug、Tyrp1、Dctが陰性である。
【００４８】
NG2、CD34、vWF、CD117、CD146、CD271などの表面抗原が陰性かどうか、発現が弱いかどうかはこれらの抗原に対する抗体であって、発色酵素、蛍光化合物等で標識した抗体を用いて細胞が染色されたか否かを顕微鏡観察等により決定することができる。例えば、これらの抗体を用いて細胞を免疫染色して、表面抗原の有無を決定することができ、また該抗体を結合させた磁性ビーズを用いても決定することができる。また、FACS又はフローサイトメーターを用いても表面抗原があるかどうか決定することができる。フローサイトメーターとしては例えばFACSAria(ベクトン・ディッキンソン社製)、FACS vantage(ベクトン・ディッキンソン社製)、FACS Calibur(ベクトン・ディッキンソン社製)等を用いることができる。
【００４９】
また、Sox10、Snai1、Slug、Tyrp1、Dctなどの転写因子に関してはRT-PCR等の手法により発現を調べることもできる。
【００５０】
これらの表面抗原が陰性とは、上記のようにFACSを用いて分析した場合に、陽性細胞としてソーティングされないこと、あるいはRT-PCRにより発現を調べた場合に、発現が認められないことをいい、これらの手法により検出できない程度発現していたとしても、本発明においては陰性とする。また、上記マーカーが陽性であることが公知の造血幹細胞等の細胞と同時に測定を行い、これらの陽性細胞と比較して、ほとんど検出されないか、あるいは有意に発現量が低い場合に陰性としてもよい。
【００５１】
本発明の多能性幹細胞画分は、これらの細胞表面の抗原特性に基づいて分離することができる。
【００５２】
＜Muse細胞由来胚様体様細胞塊の説明＞
本発明の多能性幹細胞を浮遊培養することにより、胚様体様(Embryoid body(EB body)-like)細胞塊が得られるが、本発明はこの胚様体様細胞塊及び胚様体様細胞塊に含まれる細胞も包含する。胚様体は、本発明の多能性幹細胞を浮遊培養することにより、細胞塊として形成される。この際、本発明においては、本発明の多能性幹細胞を培養することにより得られる胚様体をMuse細胞由来胚様体様細胞塊と呼ぶことがある（Mクラスター（M-cluster）と呼ぶこともある）。胚様体様細胞塊を形成するための浮遊培養の方法として、メチルセルロース等の水溶性ポリマーを含有した培地を用いた培養（Nakahata, T. et al., Blood 60, 352-361 (1982)）やハンギングドロップ培養（Keller,J.Physiol.(Lond)168:131-139,1998）等が挙げられる。本発明は前記胚様体様細胞塊からセルフリニューアルして得られる胚様体様細胞塊及び胚様体様細胞塊に含まれる細胞及び多能性幹細胞も包含する。ここで、セルフリニューアルとは、胚様体様細胞塊に含まれる細胞を培養し、再度胚様体様細胞塊を形成させることをいう。セルフリニューアルは１〜複数回のサイクルを繰り返せばよい。また、本発明は前記いずれかの胚様体様細胞塊及び胚様体様細胞塊に含まれる細胞から分化した細胞及び組織も包含する。
【００５３】
図１-１に間葉系細胞（ヒト線維芽細胞、ヒト骨髄間葉系細胞、新鮮骨髄液）画分とMuse細胞及びMuse細胞由来の胚様体様細胞塊の関連を示す。間葉系細胞様細胞塊に長時間トリプシン処理（Long term trypsin incubation; LTT)等のストレス刺激を与えると、Muse細胞が濃縮されMuse細胞を多く含む細胞画分が得られ（富Muse細胞画分と呼ぶ）、該細胞画分中のMuse細胞を浮遊培養すると胚様体様細胞塊（Muse細胞由来胚様体様細胞塊）が得られる。胚様体様細胞塊をゼラチンでコートした培養皿で培養すると３胚葉の細胞に分化する。また、図１-１に示すように、SSEA-3陽性細胞を直接分離し、長時間のストレスをかけることなく浮遊培養することによりMuse細胞由来の胚様体様細胞塊を得ることができる。
【００５４】
Muse細胞は、浮遊培養で一旦増殖が停止しても、接着培養に移すことにより増殖を開始する。浮遊培養−接着培養−SSEA-3発現を指標にした分離を繰り返すことにより、Muse細胞を大量に増殖させることが可能である（図１-２）。
【００５５】
＜本発明の多能性幹細胞画分のマーカー＞
上記のように、Muse細胞を含む多能性幹細胞画分は、SSEA-3陽性を指標に分離することができ、さらにCD105の発現を指標に分離することができるが、さらに、NG2、CD34、vWF（フォンビルブランド因子）、c-kit（CD117)、CD146、CD271（NGFR)、Sox10、Snai1、Slug、Tyrp1及びDctからなる群から選択される１１個のマーカーのうち少なくとも１個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。例えば、CD117及びCD146の非発現を指標に分離することができ、さらに、CD117、CD146、NG2、CD34、vWF及びCD271の非発現を指標に分離することができ、さらに、上記の１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。
【００５６】
表面マーカーを用いて分離する場合、生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等から１個又は複数個の本発明の多能性幹細胞画分を、培養等を経ることなく直接分離することが可能である。また、本発明の多能性幹細胞画分を、細胞形態を顕微鏡等を使って目視することにより同定して分離することが可能である。
【００５７】
生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等に細胞ストレスをかけた後に、生存した細胞群から表面マーカーを用いて分離してもよい。
【００５８】
また、上記のマーカーに加えて、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は、他の特定の因子の高発現によっても特徴付けられる。
【００５９】
無処理の骨髄間葉系細胞画分又は皮膚線維芽細胞画分から本発明の多能性幹細胞画分が得られ、さらに多能性幹細胞画分を培養することによりMuse細胞由来の胚様体（EB)様細胞塊が得られる。Muse細胞、無処理細胞、Muse由来胚様体様細胞塊及びヒトES細胞において発現している因子を比較検討することにより、Muse細胞で高発現している因子がわかる。ここで、因子とは遺伝子転写産物、タンパク質、脂質、糖を含む。
【００６０】
図２に、Muse細胞由来胚様体様細胞塊/無処理細胞での発現量の比が高い因子を示す。特に以下の１８個の因子の比が高い。
(i) SSEA-3
(ii) v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog
(iii) solute carrier family 16, member 6 (monocarboxylic acid transporter 7)
(iv) tyrosinase-related protein 1
(v) Calcium channel, voltage-dependent, P/Q type, alpha 1A subunit
(vi) chromosome 16 open reading frame 81
(vii) chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39)
(viii) protease, serine, 35
(ix) kynureninase (L-kynurenine hydrolase)
(x) solute carrier family 16, member 6 (monocarboxylic acid transporter 7)
(xi) apolipoprotein E
(xii) synaptotagmin-like 5
(xiii) chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39)
(xiv) ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 13
(xv) angiopoietin-like 4
(xvi) prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (prostaglandin G/H synthase and cyclooxygenase)
(xvii) stanniocalcin 1
(xviii) coiled-coil domain containing 102B
【００６１】
本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は、上記因子の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、10、11、12、13、14、15、16、17又は18が高発現していることを特徴として、少なくとも２つの因子が高発現していることを指標に分離することができる。
【００６２】
図３に、Muse細胞由来胚様体様細胞塊/ヒトES細胞での発現量の比が高い因子を示す。特に以下の２０個の因子の比が高い。
(a) matrix metallopeptidase 1 (interstitial collagenase)
(b) epiregulin
(c) chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39)
(d) Transcribed locus
(e) chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39)
(f) serglycin
(g) MRNA full length insert cDNA clone EUROIMAGE 1913076
(h) Ras and Rab interactor 2
(i) lumican
(j) CLCA family member 2, chloride channel regulator
(k) interleukin 8
(l) Similar to LOC166075
(m) dermatopontin
(n) EGF, latrophilin and seven transmembrane domain containing 1
(o) insulin-like growth factor binding protein 1
(p) solute carrier family 16, member 4 (monocarboxylic acid transporter 5)
(q) serglycin
(r) gremlin 2, cysteine knot superfamily, homolog (Xenopus laevis)
(s) insulin-like growth factor binding protein 5
(t) sulfide quinone reductase-like (yeast)
【００６３】
本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は、上記因子の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20が高発現していることを特徴として、少なくとも２つの因子が高発現していることを指標に分離することができる。
【００６４】
さらに、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は、上記(i)〜(xviii)の因子の少なくとも２つと上記(a)〜(t)の因子の少なくとも２つが同時に高発現していてもよく、これらの遺伝子が高発現していることを指標に分離することができる。
【００６５】
さらに、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は多能性マーカー以外のオドラント（odorant）受容体（オルファクトリーレセプター; olfactory receptor）群及びケモカイン（chemokine）受容体群の因子を発現していること、すなわち特定のオドラント受容体やケモカイン受容体陽性であることを特徴とする。
【００６６】
本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分で発現しているオドラント受容体として例えば、以下の２２個の受容体が挙げられる。
olfactory receptor, family 8, subfamily G, member 2 (OR8G2)；
olfactory receptor, family 7, subfamily G, member 3 (OR7G3)；
olfactory receptor, family 4, subfamily D, member 5 (OR4D5)；
olfactory receptor, family 5, subfamily AP, member 2 (OR5AP2)；
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 4 (OR10H4)；
olfactory receptor, family 10, subfamily T, member 2 (OR10T2)；
olfactory receptor, family 2, subfamily M, member 2 (OR2M2)；
olfactory receptor, family 2, subfamily T, member 5 (OR2T5)；
olfactory receptor, family 7, subfamily D, member 4 (OR7D4)；
olfactory receptor, family 1, subfamily L, member 3 (OR1L3)；
olfactory receptor, family 4, subfamily N, member 4 (OR4N4)；
olfactory receptor, family 2, subfamily A, member 7 (OR2A7)；
guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha activating activity polypeptide, olfactory type (GNAL)；
olfactory receptor, family 6, subfamily A, member 2 (OR6A2)；
olfactory receptor, family 2, subfamily B, member 6 (OR2B6)；
olfactory receptor, family 2, subfamily C, member 1 (OR2C1)；
olfactory receptor, family 52, subfamily A, member 1 (OR52A1)；
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 3 (OR10H3)；
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 2 (OR10H2)；
olfactory receptor, family 51, subfamily E, member 2 (OR51E2)；
olfactory receptor, family 5, subfamily P, member 2 (OR5P2)；及び
olfactory receptor, family 10, subfamily P, member 1 (OR10P1)
【００６７】
本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分で発現しているケモカイン受容体としては以下の５個の受容体が挙げられる。
chemokine (C-C motif) receptor 5（CCR5)；
chemokine (C-X-C motif) receptor 4（CXCR4)；
chemokine (C-C motif) receptor 1（CCR1)；
Duffy blood group, chemokine receptor(DARC)；及び
chemokine (C-X-C motif) receptor 7(CXCR7)
【００６８】
本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は、上記の嗅覚受容体の少なくとも１個を発現しており、あるいは、上記のケモカイン受容体の少なくとも１個を発現している。
【００６９】
これらのオドラント受容体やケモカイン受容体と受容体に結合する遊走因子の作用で本発明の多能性幹細胞は、損傷組織へ遊走し、生着し、その場で分化する。例えば、肝臓、皮膚、脊髄、筋肉が損傷した場合、特定の遊走因子と細胞表面に発現しているオドラント受容体の働きで、それぞれの組織に遊走し、生着し、肝臓（内胚葉）、皮膚（外胚葉）、脊髄（外胚葉）、筋肉（中胚葉）細胞に分化し、組織を再生することができる。
【００７０】
さらに、本発明の多能性幹細胞であるMuse細胞が豊富に含まれる富Muse細胞画分において、Rex1、Sox２、KLF-4、c-Myc、DPPA2、ERAS、GRB7、SPAG9、TDGF1等がアップレギュレートされており、Muse細胞の細胞塊において、DAZL、DDX4、DPPA4、Stella、Hoxb1、PRDM1、SPRY2等がアップレギュレートされている。
【００７１】
また、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分においては、造血幹細胞マーカーであるCD34及びCD117の発現は認めらないかもしくは発現が極めて低い。
【００７２】
＜本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分の利用＞
本発明は、Muse細胞のみならず、Muse細胞を濃縮した細胞集団、Muse細胞を増殖させた細胞集団、Muse細胞を分化させた細胞集団を含み、さらに、Muse細胞やMuse細胞由来の細胞を含む研究用キット、細胞チップ、治療用デバイスも含む。
【００７３】
本発明の多能性幹細胞は、pluripotencyを有しており、あらゆる組織へと分化し得る。該多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は、再生医療等に用いることができる。例えば、各種組織、各種器官等の再生に用いることができる。具体的には皮膚、脳脊髄、肝臓、筋肉等が挙げられる。本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分を損傷あるいは障害を受けた組織、器官等に直接あるいは近傍に投与することにより、該多能性幹細胞はその組織、器官内に侵入し、その組織特有の細胞に分化し、組織、器官の再生、再建に貢献し得る。また、静脈投与等により全身投与してもよい。この場合、該多能性幹細胞は、例えば、損傷を受けた組織や器官をホーミング等により指向し、そこに到達・侵入した上で、その組織や器官の細胞に分化し、組織、器官の再生、再建に貢献し得る。
【００７４】
投与は、例えば皮下注、静注、筋注、腹腔内注等の非経口投与や経口投与、あるいは胚への子宮内注射等により行うことができる。また、局所投与でも全身投与でもよい。局所投与は例えばカテーテルを利用して行うことができる。投与量は、再生しようとする器官、組織の種類や、サイズにより適宜決定することができる。
【００７５】
再生しようとする器官は限定されず、骨髄、脊髄、血液、脾臓、肝臓、肺、腸管、眼、脳、免疫系、循環系、骨、結合組織、筋、心臓、血管、膵臓、中枢神経系、末梢神経系、腎臓、膀胱、皮膚、上皮付属器、乳房−乳腺、脂肪組織、および口、食道、膣、肛門を含む粘膜等を含む。また、治療対象となる疾患として、癌、心血管疾患、代謝疾患、肝疾患、糖尿病、肝炎、血友病、血液系疾患、脊髄損傷等の変性または外傷性神経疾患、自己免疫疾患、遺伝的欠陥、結合組織疾患、貧血、感染症、移植拒絶、虚血、炎症、皮膚や筋肉の損傷等が挙げられる。
【００７６】
細胞は医薬として許容される基材と共に投与してもよい。該基材は例えばコラーゲン等でできた生体親和性が高い物質や、生分解性の物質できており、粒子状、板状、筒状、容器状等の形状とすればよく、細胞を該基材に結合させあるいは該基材中に収容して投与すればよい。
【００７７】
また、本発明の多能性幹細胞をin vitroで分化誘導し、さらに分化した細胞を用いて組織を構築させ、該分化した細胞又は該組織を移植してもよい。本発明の多能性幹細胞は、腫瘍化しないので、移植した前記分化した細胞又は該組織に本発明の多能性幹細胞が未分化のまま含まれていても癌化の可能性が低く安全である。これらの再生医療において、移植した細胞又は組織のレシピエントによる拒絶を避けるためには、再生医療を受けようとする患者から中胚葉系組織又は間葉系組織等を採取し、該組織から本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分を分離し、利用することが望ましい。さらに、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分を組織の変性や機能不全を原因とする疾患の治療に用いることができる。この場合、例えば、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分をex vivoで濃縮し、増殖させ、あるいは分化させて体内に戻せばよく、例えば、多能性幹細胞を特定の組織の細胞に分化させ、該細胞を治療しようとする組織に移植すればよい。また、細胞の移植により、in situ 細胞治療を行うこともできる。この場合、対象細胞の例として、肝臓細胞、神経細胞やグリア細胞などの神経系細胞、皮膚細胞、骨格筋細胞などの筋肉細胞が挙げられ、本発明の多能性幹細胞をこれらの細胞に分化させ、移植し、in situで治療を行うことができる。該治療により、例えば、パーキンソン病、脳梗塞、脊髄損傷、筋変性疾患などを治療することができる。本発明の多能性幹細胞は、腫瘍化しないので、このような治療に用いても癌化の可能性が低く安全である。
【００７８】
また、本発明の多能性幹細胞を、分化させて血液や血液成分を形成させることにより、血液や血液成分をex vivo、in vitroで形成させることができる、血液成分として、赤血球、白血球、血小板等が挙げられる。このようにして形成させた血液や血液成分を、自家輸血や他家輸血に用いることができる。
【００７９】
上記のように、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分を治療に用いる場合、ex vivo、in vivo、in vitroのいずれで分化させてもよい。本発明の多能性幹細胞は、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄間質、骨格筋、平滑筋、心筋、眼、内皮、上皮、肝、膵、造血、グリア、神経細胞、稀突起膠細胞等に分化する。本発明の多能性幹細胞の分化は、分化因子の存在下で、培養することにより達成することができる。分化因子としては、塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）、血管内皮成長因子（VEGF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）およびイソプロテレノール；あるいは繊維芽細胞成長因子4（FGF4）、肝細胞成長因子（HGF）等が挙げられる。本発明は、本発明の多能性幹細胞から分化した細胞も包含する。
【００８０】
本発明の多能性幹細胞を治療に用いる場合、タンパク質性の抗癌物質や生理活性物質等をコードする遺伝子を導入してもよい。これにより、本発明の多能性幹細胞は、治療薬のデリバリー機能も有することになる。このような物質として例えば、抗血管新生薬が挙げられる。
【００８１】
本発明は、Muse細胞、Muse細胞からできた胚様体様細胞塊、及びMuse細胞や前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞若しくは組織・器官を含む、細胞移植治療用材料若しくは細胞移植治療用組成物、又は再生医療用材料若しくは再生医療用組成物を包含する。該組成物はMuse細胞、Muse細胞からできた胚様体様細胞塊、又はMuse細胞や前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞若しくは組織・器官に加えて、医薬的に許容される緩衝液や希釈液等を含む。
【００８２】
さらに、患者から細胞を採取し、Muse細胞を単離し、該Muse細胞を用いて種々の診断に用いることができる。例えば、Muse細胞から患者の遺伝子を採取し、遺伝子情報を得て、該情報を反映させた正確な診断が可能になる。例えば、被験体の細胞由来のMuse細胞を分化させることで、被験者と同じ遺伝子背景などの性質を持った各組織・器官の細胞を得ることができるため、疾病の診断や病態解明、薬剤の効果や副作用の診断、などに関し、各々の被験者の性質に合わせ適切な診断を行うことができる。すなわち、Muse細胞、Muse細胞からできた胚様体様細胞塊、及びMuse細胞や前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞若しくは組織・器官は診断用材料として用いることができ、例えば、本発明は、被験体からMuse細胞を単離し、該Muse細胞又はMuse細胞から分化させて得られた、被験体と同じ遺伝子背景を有する組織や器官を用いて被験体の疾病等を診断する方法を包含する。
【００８３】
また、Muse細胞を分化させることで体細胞を大量に得ることができるため、疾病のメカニズム解明等の基礎的研究、治療薬開発、薬剤の効果や毒性に関するスクリーニング、薬剤評価などを行うことができる。すなわち、Muse細胞、Muse細胞からできた胚様体様細胞塊、及びMuse細胞や前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞若しくは組織・器官を薬剤評価や薬剤スクリーニングの材料として用いることができる。例えば、本発明はMuse細胞を分化・増殖させ、体細胞を得て、該体細胞に候補薬剤を投与し、体細胞の応答を調べることにより、薬剤のスクリーニングや薬剤評価を行う方法を包含する。
【００８４】
また、種々の（例えば様々なHLA型の）Muse細胞をライブラリー化したMuse細胞バンクを構築することで、上記のMuse細胞利用場面における細胞を必要に応じて提供できる体制を実現でき、例えば、上記に挙げた目的の他、緊急に要する細胞移植治療のための拒絶反応の無い（少ない）細胞提供、などを行うことができる。すなわち、本発明は種々の遺伝子特性を有するMuse細胞を単離し、集めることにより、異なる遺伝子特性を有するMuse細胞のライブラリー、すなわちMuse細胞バンクを作製する方法を包含する。また、Muse細胞だけでなく、Muse細胞からできた胚様体様細胞塊、及びMuse細胞や前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞若しくは組織・器官を得てライブラリーやバンクを構築することもできる。本発明においては、これらのMuse細胞からできた胚様体様細胞塊、及びMuse細胞や前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞若しくは組織・器官を得てライブラリーやバンクも細胞ライブラリー又は細胞バンクと称する。本発明は、このようにして作製した細胞ライブラリー又は細胞バンクを包含する。該細胞ライブラリー又は細胞バンクは例えば、異なる遺伝的特性を有する細胞等が収納された複数のチューブ等の容器からなり、該細胞は凍結されていてもよい。例えば、被験体において、組織や器官を移植し、あるいは再生する必要が生じた場合に、上記細胞ライブラリー又は細胞バンクから、前記被験体に遺伝的背景等に関して適合した細胞を選択し、該細胞を用いて移植や再生治療を行うことができる。
【００８５】
本発明は、疾患の治療のために、本発明の多能性幹細胞や該細胞画分や該細胞由来の派生細胞や誘導細胞の治療上有効な量を治療を必要としている患者に投与することを含む治療方法を包含する。ここで、有効な量とは、例えば、投与する細胞数で特定することができ、疾患の種類や重篤度により適宜決定することができる。上記治療法においては、本発明の多能性幹細胞は、テラトーマ（奇形腫）を形成しないため、患者にテラトーマが形成されない。また、自己細胞由来のMuse細胞を投与する場合、患者を放射線照射や化学療法等の処置により骨髄機能を欠損させる必要はないが、自己細胞ではないMuse細胞を用いる場合は、上記処置を行えばよい。
【００８６】
さらに、本発明は、本発明の生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等から直接得ることができる多能性幹細胞の派生細胞又は誘導細胞である多能性幹細胞も含む。派生細胞又は誘導細胞とは前記多能性幹細胞を培養して得られる細胞又は細胞群、あるいは前記多能性幹細胞に外来遺伝子の導入等の人為的な誘導操作を行い得られる細胞をいい、子孫細胞も含む。
【００８７】
さらに、Muse細胞は、iPS細胞(induced pluripotent stem cell）のソースとなり得る。Muse細胞をソースとしたiPS細胞の作製効率は他の細胞（例えば、SSEA-3発現を指標に分画していない皮膚線維芽細胞）をソースとした場合に比べ、はるかに（少なくとも25倍以上）高い。
【００８８】
Muse細胞に特定の遺伝子を導入し、あるいは特定の化合物を導入すること等により細胞形質を変化させることによりiPS細胞を作製することができる。細胞形質の変化は、リプログラミングや癌化を含み、現在知られている方法、あるいは将来的に確立されるあらゆる方法を用いることができる。
【００８９】
例えば、特許4182742号の記載に従って遺伝子をMuse細胞に導入し、あるいは図２７の記載に従って、Muse細胞からiPS細胞を確立することができる。また、図２７に記載の方法以外に、化学物質、外来遺伝子又は外来タンパク質を導入して、iPS細胞を樹立することが可能であるといえる。Muse細胞からのiPS細胞の確立は、例えば後述の実施例に記載の方法で行うことができる。なお、本発明時点において報告されているiPS細胞は、皮膚線維芽細胞などの生体組織の分化した細胞に外来遺伝子導入等することによりリプログラミングした結果、多能性幹細胞に誘導された細胞といわれており、本発明の組織から直接得ることができ、すでに多能性幹細胞としての性質を有する細胞に外来遺伝子導入等の人為的な誘導操作を行い得られた細胞は、iPS細胞と区別される。
【００９０】
このようにしてMuse細胞から得られたiPS細胞をMuse由来iPS細胞（Muse-iPSC）と呼ぶことがあり、本発明は該Muse由来iPS細胞をも包含する。Muse由来iPS細胞は、Muse細胞由来の増殖性を有する多能性幹細胞ということができる。
【００９１】
＜ストレスによる富Muse細胞画分の取得＞
さらに、本発明の多能性幹細胞は、生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等の細胞に細胞ストレスをかけ、生き残った細胞を回収することにより富化することができる。ここで、細胞ストレスとは外的ストレスをいい、プロテアーゼ処理、低酸素条件下での培養、低リン酸条件下での培養、血清飢餓状態での培養、糖飢餓状態での培養、放射線曝露下での培養、熱ショックへの曝露下での培養、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養、圧力処理下での培養等によりストレスに曝露することをいう。この中でもプロテアーゼ処理、すなわちプロテアーゼ存在下での培養が好ましい。プロテアーゼは限定されず、トリプシン、キモトリプシン等のセリンプロテアーゼ、ペプシン等のアスパラギン酸プロテアーゼ、パパイン、キモパパイン等のシステインプロテアーゼ、サーモリシン等の金属プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、N-末端スレオニンプロテアーゼなどを用いることができる。プロテアーゼを培養に添加する際の添加濃度は限定されず、一般的にシャーレ等で培養した付着細胞を剥がすときに用いる濃度で用いればよい。本発明の多能性幹細胞は、上記外的ストレスに耐性を有する幹細胞、例えば、トリプシンに耐性を有する細胞ということができる。
【００９２】
生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等は限定されず、骨髄単核細胞、皮膚細胞等の線維芽細胞画分、歯髄組織、眼球組織、毛根組織等が含まれる。細胞としては、培養細胞も組織から採取した細胞も用いることもできる。この中でも、骨髄細胞、皮膚細胞が望ましく、例えば、ヒト骨髄間葉系細胞（MSC)画分又はヒト皮膚線維芽細胞画分が挙げられる。骨髄間葉系細胞画分は、骨髄穿刺液を２〜３週間培養することにより得ることができる。
【００９３】
上記の各種のストレスを受けた組織の細胞の大部分は死滅し、生き残った細胞中に本発明の多能性幹細胞が含まれる。細胞にストレスをかけたのち、死細胞を除去する必要があるが、プロテアーゼを用いた場合は、これらの死細胞はプロテアーゼの作用により分解される。
【００９４】
また、細胞にストレスをかけた後に、細胞に物理的衝撃を与え壊れ易くなった細胞を除去してもよい。物理的衝撃は、例えば激しいピペッティング、激しい攪拌、ボルテックス等により与えることができる。
【００９５】
細胞に細胞ストレスをかけ、必要に応じて物理的衝撃を与えた後に、細胞群を遠心分離にかけ、生き残った細胞をペレットとして得て回収することにより、本発明の多能性幹細胞を富化することができる。また、このようにして得られた細胞画分からさらに、下記の表面マーカーを指標に本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分を分離することもできる。
【００９６】
また、外傷や火傷等のストレスを受けた生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等を培養し、遊走した細胞を回収しても本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分を富化することができる。傷害を受けた組織の細胞はストレスに曝露されるので、本発明においては、傷害を受けた生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等を培養することも生体の中胚葉系組織又は間葉系組織細胞等に細胞ストレスをかけるという。
【００９７】
一例として、これらの細胞をトリプシン処理する方法について説明する。このときのトリプシン濃度は、限定されないが、例えば接着細胞の通常の培養において、培養容器に接着した接着培養を剥がすときに用いられる濃度範囲で用いればよく、0.1〜１％、好ましくは0.1〜0.5％が例示される。例えば、10〜50万個の細胞を含む生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等由来の細胞を上記濃度のトリプシン溶液５ml中でインキュベーションすることにより外的ストレスに曝すことができる。トリプシン処理時間は、５〜24時間、好ましくは５〜20時間程度である。本発明においては、８時間以上のトリプシン処理、例えば８時間又は16時間の処理を長時間トリプシン処理という。
【００９８】
トリプシン処理後、上記のように、ピペッティング、攪拌、ボルテックス等により物理的衝撃を与えることが望ましい。それは死んだ細胞あるいは死にかけている細胞を除去するためである。
【００９９】
トリプシン処理後の浮遊培養の際には細胞同士の凝集を防ぐために、例えば、メチルセルロースゲル等のゲル中でインキュベーションするのが望ましい。また、細胞の培養容器への付着を防ぎ浮遊状態を維持するために、容器をPoly(2-hydroxyethyl methacrylate)等でコートしておくことが望ましい。
【０１００】
外的ストレスに曝した細胞を遠心分離により集め培養を行うと細胞塊（細胞クラスター）を形成する。この細胞塊の大きさは直径25μmから150μm程度である。本発明の多能性幹細胞（Muse細胞）は、この外的ストレスに曝して生き残った細胞集団中に濃縮した状態で含まれる。この細胞集団を富Muse細胞画分(Muse enriched population）と呼ぶ。富Muse細胞画分中のMuse細胞の存在割合は、ストレス処理の方法により異なる。
【０１０１】
このように本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分がストレスをかけた後も生存することは、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分がストレス耐性であることを示している。
【０１０２】
生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等由来の細胞の培養に用いる培地、培養条件は通常の動物細胞の培養で用いる培地、培養条件を採用すればよい。また、公知の幹細胞培養用培地を用いてもよい。培地には、適宜ウシ胎児血清等の血清やペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質及び種々の生理活性物質を添加してもよい。
【実施例】
【０１０３】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１  富Muse細胞画分、SSEA-3陽性細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊の調製並びに特性分析
材料及び方法
本実施例において、以下の細胞を用いた。
【０１０４】
間葉系細胞として、２株のヒト皮膚線維芽細胞画分及び４株のヒトMSC（bone marrow stromal cell)画分を用いた。ヒト線維芽細胞画分は、（１）H-fibroblast-1（正常ヒト線維芽細胞（NHDF）、Lonza社より入手）及び（２）H-fibroblast-2（成人ヒト皮膚線維芽（HDFA)、ScienCell社より入手）を用いた。ヒトMSC画分としては、H-MSC-1、H-MSC-2、H-MSC-3及びH-MSC-4をLonza社及びALLCELLS社より入手して用いた。ヒトMSC画分については、Pittenger, M. F. et al. Science 284, 143-147 (1999)；Dezawa, M. et al. J Clin Invest 113, 1701-1710 (2004)；Dezawa, M. et al. Science 309, 314-317 (2005)に詳細に記載されている。
【０１０５】
細胞は10％FBS及び0.1mg/mlカナマイシン含有α-MEM(alpha-minimum essential medium)を用いて、37℃、５％CO2条件下で培養した。入手したものの最初の培養を第１代とし、その後細胞が95％コンフルエントになったところで、細胞培養液：培地の比を1:2として継代し、４〜10代継代したものを用いた。
【０１０６】
ヒトES細胞（hESC）は京都大学より入手したkyoto hESC-1(KhES-1)を用いた。
マウスES細胞（TT2細胞）及びヒトES細胞（KhES-1)はC57BL/6マウスの12.5日胚より確立したマウス由来フィーダー細胞存在下で維持した。
【０１０７】
以下の方法で実験を行った。
１．間葉系細胞のストレス刺激
ストレス刺激として低栄養条件での培養、低血清濃度での培養、低酸素濃度での培養、繰返しトリプシン処理、長時間トリプシン処理を行うため以下の培養条件を採用した。
（１）無血清培地（STEMPRO MSC SFM（Invitrogen社）を用いた２日間の培養（無血清）
（２）Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)バッファー（Invitrogen社）を用いた２日間の培養（HBSS)
（３）10％FBS含有α-MEMを用いての低酸素濃度（１％)での２日間の培養（10％FBS＋LowO2）
（４）トリプシン中（0.25％トリプシン-HBSS）での１時間インキュベーション３回の処理（トータル３時間のトリプシン処理）（Try 3× 1hr)
（５）トリプシン中での８時間インキュベーション(LTT 8hr)
（６）トリプシン中での16時間インキュベーション(LTT 16hr)
陰性対照として、ヒト末梢血単核細胞画分を用いた。
【０１０８】
上記（４）、（５）及び（６）の条件の場合、100,000個〜500,000個の細胞を５mlトリプシン溶液中に浮遊させて培養を行った。上記の（１）〜（３）のストレス刺激の場合、刺激後、細胞を５分間のトリプシン処理により集め、（４）〜（６）のストレス刺激の場合、細胞を直接チューブに集めた。
【０１０９】
ストレス刺激後に生じる大量の死細胞はボルテックス処理することにより破壊した。すなわち、最大500,000個の細胞を含む５mlの培地を15mlのファルコンチューブに移し、ボルテックスミキサー（IKA Works社）を用いて1800〜2200rpm/minで３分間ボルテックス処理を行った。その後、2000rpmで15分間遠心分離を行い、上清を除去した。生細胞の回収率は約70〜80％であった。
【０１１０】
２．MC培養
本実施例においては、細胞をメチルセルロース含有培地中で浮遊培養した。メチルセルロース含有培地中での培養をMC培養と呼ぶ。MC培養については、Nakahata, T. et al., Blood 60, 352-361 (1982)に記載されている。
【０１１１】
細胞が容器底に付着するのを防ぐために、培養ディッシュをPoly-HEMA(Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)でコートした。すなわち、600mgのpoly-HEMA（SIGMA社）を95％エタノール40mlに37℃で攪拌して溶解し、ディッシュに添加し（96ウェル培養ディッシュの場合40μl/ウェル、12ウェルディッシュの場合200μl/ウェル）、一晩乾燥させた。
【０１１２】
MC(MethoCult H4100）(StemCell technologies社より入手）を20％FBS含有α-MEMに最終濃度２％で懸濁した。ゲル状のMC培地中の細胞濃度は細胞同士の凝集を抑える十分な細胞間距離を確保できる8000細胞/mlとした。細胞とMC培地を穏やかなピペッティングにより十分混合し、poly-HEMAコートした培養ディッシュに移した。乾燥を防ぐために、10％FBS含有α-MEMを３日毎に最初のMC培養の容積の1/10量、ゆっくりと添加した。
【０１１３】
細胞塊（細胞塊は、本発明の多能性幹細胞Muse細胞由来の細胞塊であるためMuse細胞由来胚様体様細胞塊と呼ぶ）のクローニングは７日目に行った。0.01MのPBSを培地に添加し、2000rpmで20分間遠心し、上清を捨てた。この処理を３回繰返し、細胞を洗浄した。回収した細胞ペレットを10μlの0.01M含有トリパンブルー溶液に懸濁し、スライドガラスに載せ位相差顕微鏡を用いて写真を撮った。直径25μmより大きい、ヒトES細胞と外観が似ているトリパンブルー陰性細胞塊のみをMuse細胞由来胚様体様細胞塊として数えた。Muse細胞由来胚様体様細胞塊の形成率は細胞塊の数/すべての生細胞数（すべてのトリパンブルー陰性細胞）により算出した。細胞計数の際、細胞塊はその大きさにかかわらず１細胞として数えた。これは、Muse細胞由来胚様体様細胞塊中に含まれる細胞の数の正確な計測は困難だからである。
【０１１４】
ヒトES細胞においては、細胞を注意深くフィーダー細胞が含まれないように単離し、上記の方法でMC培養を行った。培養３日目に位相差顕微鏡観察像を得た。
【０１１５】
３．単一細胞浮遊培養
96ウェルディッシュを上記の方法でpoly-HEMAでコートし、10％FBS含有α-MEMを用いて限界希釈法にて、単一細胞をそれぞれのウェルに播き、位相差顕微鏡にてウェル中の実際の細胞数を計数し、細胞が入っていないウェル、あるいは複数入っているウェルは計測から除外した。培養10日目に胚様体（EB)（Muse細胞由来胚様体様細胞塊）形成を計数した。それぞれの細胞株に対して３回の実験を行い、一回の実験では最低250ウェル以上の観察を行った。
【０１１６】
４．アルカリフォスファターゼ染色
H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来のMuse細胞由来胚様体様細胞塊を集め生理食塩水で数回洗浄し、Leukocyte Alkaline Phosphatase kit(sigma社）を用いて染色した。
【０１１７】
５．Muse細胞由来胚様体様細胞塊のin vitroでの分化
MC培養又は単一細胞浮遊培養の７〜10日後、H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の胚様体様細胞塊をガラスマイクロピペットにより採取し、ゼラチンコート培養ディッシュ又はカバーガラス上に移しさらに７日間培養すると細胞塊から細胞が広がる。かかる細胞における分化の有無を免疫組織化学分析及びRT-PCR分析に供した。
【０１１８】
６．免疫組織化学
細胞を0.01M PBS中４％パラホルムアルデヒドで固定し、H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分又はMuse細胞由来胚様体様細胞塊を遠心分離により集め、OCTコンパウンド中に埋め込み８μmの凍結切片を作製した。細胞塊は、ゼラチンコートスライドガラス上で固定し、免疫組織化学分析に供した。
【０１１９】
１次抗体として、Nanog (1:500, Chemicon社)、Oct3/4 (1:800,大阪大学 Dr. H. Hamadaより入手)、Sox2 (1:1000, Abcam社)、PAR4(1:100, Santa Cruz社)、SSEA-3(1:20, DSHB社)、平滑筋アクチン(1:100, Lab Vision社)、neurofilament M (1:200, Chemicon社)、α-フェトプロテイン(1:100, DAKO社)、マウスNumblike (1:500, カリフォルニア大学サンフランシスコ校のDr. Yuh-Nung Janより入手)及びtype 1コラーゲン(1:20, Southern Biotech社)に対する抗体を用いた。２次抗体として、Alexa 488又は568とコンジュゲートした抗ウサギIgG、抗マウスIgG又は抗マウスIgM抗体(Molecular Probes社)を用いて、免疫組織化学分析を行った。
【０１２０】
７．核型の決定
H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来のMuse細胞由来胚様体様細胞塊（Muse細胞由来胚様体様細胞塊から単一細胞を取り再度Muse細胞由来胚様体様細胞塊を形成させることを１〜３回繰り返したもの）からの増殖細胞(clonally expanded cells)の核型をquinacrine-Hoechst染色により決定した。
【０１２１】
８．免疫不全マウス精巣への細胞の注入
無処理細胞画分、並びにH-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊を用いた。富Muse細胞画分の場合、長時間トリプシン処理後血清を添加し、0.01M PBSで３回洗浄した。Muse細胞由来胚様体様細胞塊もMC培養から採取後に同PBSで３回洗浄した。１×105個の細胞をPBSに浮遊し、NOGマウス（登録商標）（NOD/Shi-scid, IL-2RγKO Jic、８週齢、財団法人  実験動物中央研究所より入手）の精巣にガラスマイクロチューブを用いて注入した。Muse細胞由来胚様体様細胞塊を用いた場合、レーザ共焦点顕微鏡の３Dグラフィック分析手法を用いて、50個のMuse細胞由来胚様体様細胞塊を取り、Muse細胞由来胚様体様細胞塊のトータル体積を測定し核の数で除することにより、それぞれの構成細胞の平均体積を測定した。測定の結果、1.5×105細胞/μlであることが算定され、この算定にしたがって上記数の細胞を集め、NOGマウス精巣に注入した。マウスは注入６ヵ月後に実験に供した。
【０１２２】
対照試験として、１×106のマウスES細胞（陽性対照）及びマイトマイシンC処理MEF（マウス胚性フィーダー細胞）（陰性対照）をSCIDマウス精巣に注入し、注入後８週後に実験に供した。
【０１２３】
９．光学顕微鏡により細胞の高解像度分析
H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊について、安定な高解像度光学顕微鏡を用いてヒトMSC、線維芽細胞及び神経細胞などの細胞タイプの観察を行った。
【０１２４】
１０．電子顕微鏡による極薄切片観察
Muse細胞由来胚様体様細胞塊、H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来のSSEA-3陽性細胞及びSSEA-3陰性細胞、並びにヒトES細胞の細胞塊を遠心分離により集め、100mMリン酸バッファー（pH7.2)中2.5％グルタルアルデヒドで30分間固定し、１％寒天中に包埋し、1mm3に切り、PBSで洗浄後、100mMリン酸バッファー(pH7.2)中２％OsO4で４℃で10分間染色した。サンプルを蒸留水で洗浄後、５滴の２％酢酸ウラニルで４℃で20分間染色した。蒸留水で洗浄後、染色サンプルを50％、70％又は90％エタノールを用いて４℃で10分間脱水し、次いで100％エタノールを３回交換することにより完全に脱水した。得られたサンプルを酸化プロピレンで５分間置換し、酸化プロピレン中50％エポキシレジン中に60分間包埋した。これを純粋なエポキシレジンに包埋し、60℃オーバーナイトで硬化させた。超薄切片は70〜80nmの厚さで作製し、CCDカメラ付きの100kV 電子顕微鏡で観察した。
【０１２５】
１１．Muse細胞由来胚様体様細胞塊の増殖速度
H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来のMuse細胞由来胚様体様細胞塊について細胞群の倍化時間を測定するために、それぞれのMuse細胞由来胚様体様細胞塊をひとつずつ96ウェルプレートに移し、15分間のトリプシン処理を行った後にガラスマイクロピペットを用いてピペッティングを行った。細胞の数を計測し、所定の時間後ごとに少なくとも20〜30個のMuse細胞由来胚様体様細胞塊について分析した。
【０１２６】
１２．RT-PCR
無処理細胞画分（24ウェルスケール中の約10,000細胞）及びH-fibroblast画分及びH-MSC画分（24ウェルスケール中の約10,000細胞）由来のin vitroで単一Muse細胞由来胚様体様細胞塊から分化した細胞（１〜３サイクル）を用いた。トータルRNAを、NucleoSpin RNA XS(Macherey-Nagel社）を用いて抽出、精製し、第１鎖cDNAをSuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (Invitrogen)を用いて調製した。PCR反応は適切なプライマーを設計し、Ex Taq DNA polymerase (タカラバイオ社）を用いて行った。用いたプライマーは以下のとおりであった。
【０１２７】
陽性対照としては、α-フェトプロテインプライマーについてはヒト胎児肝臓（Clonetech社）を用い、それ以外はヒト完全胚（Clonetech社）を用いた。
【０１２８】
１３．定量的PCR（Q-PCR)
無処理細胞画分、H-fibroblast-1、H-fibroblast-2、H-MSC-1及びH-MSC-2由来の富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊からのトータルRNAをRneasy Mini Kit（Qiagen GmbH社）により集め、cDNAをRT2 First Strand Kit(SA Biosciences社）を用いて合成した。プライマーはSA Biosciences社より特注し、7300 real time PCRシステム（Applied Biosystems社)を用いて定量的PCRを行った。得られたデータはΔΔCT方法（Livak KJ et al., Methods 25: 402-408, 2001）により解析した。
【０１２９】
１４．DNAマイクロアレイ分析
無処理細胞画分、H-fibroblast-1、H-fibroblast-2、H-MSC-1及びH-MSC-2由来の富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊、並びに４名の健常者由来ヒト末梢血単核細胞画分混合物を用いた。totalRNAをRneasy Mini Kit（Qiagen GmbH社）により集め、DNAマイクロアレイにより分析した（タカラバイオ社）。アレイシグナルは、Affimetrix Expression Console V1.1ソフトウェア）により処理しノーマライズした。Pathway Studio 6.0(Ariadne genomics社）を用いて発現変動が認められた遺伝子を遺伝子オントロジーの機能的カテゴリーに割り当てた。階層的クラスタリングは、MeV4による群平均クラスタリングの手法を用いて、遺伝子の発現変動に基づいてユークリッド距離を用いて行った（Saeed AI et al., Biotechniques 34(2):374-378, 2003）。
【０１３０】
１５．テロメラーゼ活性の検出
H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分、Muse細胞由来胚様体様細胞塊及びHela細胞を用いた。テロメラーゼ活性は、TRAPEZE XL telomerase detection kit（Millipore社）とEx Taqポリメラーゼ（タカラバイオ社）を用いて検出した。蛍光強度はマイクロプレートリーダー（TECAN社）を用いて測定した。
【０１３１】
１６．Bisulfite（亜硫酸水素塩）シーケンス
無処理細胞画分、H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊由来の１μgのゲノムDNAをCpGenome DNA modification kit(chemicon社）で処理した。DNAをQIAquick column(Qiagen社）で精製した。ヒトOct3/4及びNanog遺伝子のプロモータ領域をPCRにより増幅し、PCR産物をpCR2.1-TOPO中にサブクローニングしそれぞれのサンプルについて10クローンまでをM13ユニバーサルプライマーを用いて配列決定し、プロモータ領域のメチル化の状態を調べた。PCR増幅には、Shimazaki T et al., EMBO J, 12:4489-4498, 1993に記載のプライマーを用いた。
【０１３２】
１７．ヒト骨髄穿刺液からのMuse細胞由来胚様体様細胞塊形成
３人の健常人からのヒト骨髄穿刺液（ALLCELLS社より入手）から単核細胞画分をLymphoprep Tube（Axis-Shield PoC AS社）を用いて集め、８時間の長時間トリプシン処理を行った後にMC培養を行った。またトリプシン処理をせずに直接そのままでMC培養にも持って行った。７日目に細胞数を測定した。
【０１３３】
１８．MACSソーティング
３人の健常人からのヒト骨髄穿刺液（ALLCELLS社より入手）由来の単核細胞画分を抗CD105抗体とマイクロビーズのコンジュゲートと反応させ、MSカラム（Miltenyi Biotech社）を用いてソーティングした。CD105陽性細胞をフラクション１（間葉系細胞群）として集め、さらにCD105陰性細胞を抗CD34抗体及び抗CD117抗体の混合物とマイクロビーズのコンジュゲートとインキュベートし、再度ソーティングし、CD34陽性・CD117陽性細胞（フラクション２；造血幹細胞群にあたる）及びCD105陰性・CD34陰性・CD117陰性細胞（フラクション３）を得た（図４）。集めたサンプルを８時間の長時間トリプシン処理を行った後にMuse細胞由来胚様体様細胞塊の形成を測定した。
【０１３４】
１９．免疫組織化学
マウス精巣を0.02MPBS中４％パラホルムアルデヒドを用いて固定した。切片は凍結切片として10μmの厚さで作製した。サンプルを0.02MPBSで洗浄し、20％BlockAce（雪印社）含有バッファーを用いてブロッキングした後に免疫組織化学分析用の１次抗体とインキュベートした。用いた１次抗体は、抗平滑筋アクチン抗体（1:200、Lab Vision社）、抗MAP-2抗体（1:200、Biogenesis社）及び抗α-フェトプロテイン抗体（1:10、DAKO社）であった。
【０１３５】
２次抗体としては、Alexa488又はAlexa568を結合した抗ウサギIgG抗体、Alexa568を結合した抗マウスIgG抗体を用い、DAPI存在下で反応させた。サンプルはニコン共焦点顕微鏡システムC1si（ニコン）を用いて観察した。
【０１３６】
２０．フローサイトメトリー及び細胞ソーティング
細胞をフィコエリトリン標識抗CD11c抗体、抗CD29抗体、抗CD34抗体、抗CD44抗体、抗CD45抗体、抗CD49f抗体、抗CD54抗体、抗CD71抗体、抗CD90抗体、抗CD105抗体、抗CD166抗体、抗CD271抗体又は抗vWF抗体（Beckton Dickinson社）又は抗SSEA-3抗体（Millipore社）とインキュベートした。抗SSEA-3抗体を用いる場合、細胞をさらにFITC結合抗ラットIgM抗体と反応させた。２mM EDTA及び0.5％ウシ血清アルブミンを添加したカルシウム及びマグネシウムを含まない0.02M PBSをFACS抗体希釈液として用いた。FACSCalibur（Becton Dickinson)によりCellQuestソフトウェア又はFACSAriaによりDIAソフトウェアを用いてデータ解析を行った。細胞をFACS抗体希釈液中で抗SSEA-3抗体とインキュベートしFACSAria（Becton Dickinson)により低流速及び4 way purityソーティングモードでソーティングし、細胞のソーティングを行った。
【０１３７】
２１．統計解析
データは、平均±SEMで表す。データは、Bonferroni法による一対比較によりANOVAを用いて比較した。
【０１３８】 
結果
Ａ．ヒト間葉系細胞画分から形成される細胞塊の分析
生体がストレスに曝されたり、傷害を受けると休眠状態の組織幹細胞が活性化されることが知られている。本実施例において、H-MSC画分及びH-fibroblast画分に種々の方法でストレスをかけ（無血清処理、Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)による処理、低酸素処理、トータル３時間、８時間若しくは16時間のトリプシン処理等）、生存した細胞を集め、その後メチルセルロース（MC)含有培地中で浮遊培養（MC培養という）を行い、さらに8000細胞/mLの密度で７日間MC培養を行った（図７-１d）。その結果、最大で約直径150μmまでの種々の大きさの細胞塊の生成が認められた（図７-１e及びf）。図７-１cはH-fibroblast-1画分のMC培養の０日目の状態を、図７-１dは７日目の状態を示す。16時間のトリプシン処理を行ったH-fibroblast画分及び８時間のトリプシン処理を行ったH-MSC画分において、最も多くの細胞塊の形成が認められた。図７-１e及びfにH-fibroblast-1画分から形成された細胞塊（Muse細胞由来胚様体様細胞塊）の状態を示す。図７-１eはMC培養７日目の状態であり、図７-１fは単一細胞の浮遊培養10日目の状態である。細胞塊をサイズごとにフィルターを用いて分画し、免疫細胞化学分析を行った。直径25μmを超える細胞塊中に、Nanog、Oct3/4、SSEA-3、PAR-4及びSox2の多能性幹細胞マーカーが陽性であり（図７-２g-l)、さらにアルカリフォスファターゼ染色で陽性の細胞(図７-３m-o)が検出された。これらの細胞について電子顕微鏡を用いて観察したところ、H-fibroblast画分及びH-MSC画分から形成した細胞塊において、ES細胞と同様の核／細胞質比、細胞内器官の減少、核中の１つ若しくは２つの巨大な核小体の存在という特徴が認められた（図７-４p-r）。
【０１３９】
生体のH-MSC画分及びH-fibroblast画分から、多能性マーカー陽性及びアルカリフォスファターゼ染色陽性を示す細胞塊を浮遊培養で形成し得る細胞を見出した。本発明者らは、これらの細胞をMuse細胞(multilineage differentiating stress enduring cells)と名付けた。16時間のトリプシン処理を行ったH-fibroblast画分及び８時間のトリプシン処理を行ったH-MSC画分から形成した細胞集団を「富Muse細胞画分（Muse-enriched population）」と呼び、該集団から得た単一細胞を浮遊培養したところ、富Muse細胞画分の９〜10％において、細胞塊の形成（Muse細胞由来細胞塊：Muse細胞由来胚様体様細胞塊）が認められた。このことは、富Muse細胞画分には約９〜10％のMuse細胞が含まれることを示している。
【０１４０】
富Muse細胞画分から得た単一細胞の増殖について調べたところ、培養開始後１〜２日目で細胞分裂が観察され、細胞は10日目頃までは約1.3日の分裂周期で増殖した（図８-２）。しかし、11〜12日目には増殖速度は低下し、14日目に直径150μmの大きさの細胞塊が形成された時点で増殖が停止した。Muse細胞由来胚様体様細胞塊を５分のトリプシン処理でばらばらにし単一細胞とし、単一浮遊培養を行ったところ、細胞は生存したが、増殖速度は分裂周期が５〜７日と非常に低いままであり、細胞によっては細胞増殖の停止も観察された（図８-１の（１））。このことは、これらの細胞塊の増殖が制限され、一旦速度が低下すると、浮遊培養において、増殖速度は再上昇しにくいことを示す。しかしながら、単一のMuse細胞由来胚様体様細胞塊を接着培養に移すと、増殖を再開した。５〜７日後、比較的小規模の増殖細胞群（3000〜5000細胞）を５分のトリプシン処理でばらばらにし、MC培養すると、約40％の効率で細胞塊の形成が認められた（図８-１の（２））。細胞群のスケールをさらに上げて約５〜10×104に達したところで、トリプシンで長時間処理すると、再びMuse細胞（2nd cycle）を生成し、約10％の率でMuse細胞由来胚様体様細胞塊を形成した（図８-１）。トリプシンでの長時間処理-浮遊培養-接着培養を５回繰り返したところ、それぞれの世代において、同様の特性及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊形成率を示した。５cycle目のMuse細胞由来胚様体様細胞塊においても、多能性マーカー及びアルカリフォスファターゼは陽性であった。
【０１４１】
これらの現象が変異などを起こした異常な細胞によるものでないことを確認するために核型検査を行った。Muse細胞由来胚様体様細胞塊由来の細胞(clonally expanded cells)においては多くは正常な核型を有し、染色体の異常は認められなかった(図８-３）。このことにより正常な細胞による現象であることを示す。
【０１４２】
上記の結果は、Muse細胞が自己複製（セルフリニューアル）能を有し、クローン増殖することを示している。Muse細胞は、Muse細胞-Muse細胞由来胚様体様細胞塊-クローン増殖の一連のサイクルにより増殖する。従って、間葉系細胞集団から大量のMuse細胞を得ることが可能であると予測される。
Ｂ．H-fibroblast画分及びH-MSC画分のストレス刺激
H-fibroblast画分とH-MSC画分のストレス刺激の結果の一例を表１に示す。
【０１４３】
ストレス刺激とボルテックス処理後、トリパンブルー染色により生細胞数を計測し、生存率を計算した。生細胞を回収し、７日間のMC培養に供した。条件（２）の場合、大量の死細胞が存在し、生細胞回収効率が低かったため、Muse細胞由来胚様体様細胞塊はうまく計測できなかった。表１には「ND(not determined)」で示した。
【０１４４】
６つの条件中で、H-fibroblast画分の16時間トリプシン処理及びH-MSC画分の８時間のトリプシン処理が最も効率的な刺激であった。２株のH-fibroblast画分及び４株のH-MSC画分を用いて繰返しこの実験を行ったところ、同様の傾向が認められた。陰性対照（ヒト末梢血単核細胞画分）においては、Muse細胞由来胚様体様細胞塊は認められなかった。代表的な観察値を表１に示す。
【０１４５】
【表１】
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【０１４６】
Muse細胞由来胚様体様細胞塊形成効率から判断すると、16時間（H-fibroblast画分）及び８時間（H-MSC画分）のトリプシン処理が６つの条件の中で最も効率的であると考えられた。16時間又は８時間トリプシン処理、1800〜2000rpm/minでの３分間のボルテックス及び2000rpm１５分間の遠心分離の一連の操作をMuse細胞の濃縮のための長時間トリプシン処理（LTT)と名付けた。ボルテックス処理後の細胞の回収率は約70〜80％であった（図５)。
【０１４７】
Ｃ．Muse細胞由来胚様体様細胞塊の判定基準
本実施例において、Muse細胞由来胚様体様細胞塊の判定基準を設けた。H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分中の単一細胞の平均直径は10〜13μmであった（図６a)。これらの細胞をMC培養すると、細胞は分裂を開始した。分裂するとそれぞれの細胞のサイズは小さくなり、８〜10μmの細胞から構成される多細胞塊が徐々に形成された（図７e及び７f)。それぞれの細胞のサイズと外観は、MC培養したヒトES細胞に類似していた（図６b及び６c)。７日目に、ほとんどの多細胞塊は25μmより大きくなり、直径100〜150μmになった。該細胞塊はES細胞と類似した外観を有していた。Φ25μmのフィルターを用いることにより、25μmより大きい塊を回収した（図６b）。H-fibroblast画分及びH-MSC画分の100個のMuse細胞由来胚様体様細胞塊までの免疫細胞化学によりほとんどのMuse細胞由来胚様体様細胞塊は多能性マーカーNanog、Oct3/4、Sox2、PAR4及びSSEA-3が陽性であることがわかり、アルカリフォスファターゼ染色でも陽性であった（図６e-g)。25μmより小さい細胞塊の場合、マーカーは検出される場合とされない場合があり、また多能性マーカーの局在はこれらのマーカーに典型的なパターンを示さない場合もあった。さらに、細胞の外観はむしろ富Muse細胞画分に類似している場合があった。
上記結果より、直径25μを超える多細胞塊を、Muse細胞由来胚様体様細胞塊とした。
【０１４８】
Ｄ．Muse細胞由来胚様体様細胞塊の３胚葉細胞への分化
分化能を確かめるため、単一のMuse細胞由来胚様体様細胞塊をゼラチンでコートしたディッシュに移し分化させた。７日目にα平滑筋アクチン（中胚葉マーカー）、デスミン（中胚葉マーカー）、神経フィラメント-M（外胚葉マーカー）、αフェトプロテイン（内胚葉マーカー）及びサイトケラチン7（内胚葉マーカー）が検出された(図９-１a-c）。RT-PCRにより、１から３サイクルの培養を行ったMuse細胞由来胚様体様細胞塊（第１から３cycle）はαフェトプロテイン及びGATA６（内胚葉マーカー）、微小管結合タンパク質２：MAP-2（中胚葉マーカー）及びNkx2.5（中胚葉マーカー）を発現していることが確認されたが、無処理のH-fibroblast又はMSC群はゼラチンコートしたディッシュ上での培養でも分化が認められなかった（図９-２）。
【０１４９】
さらに、富Muse細胞画分、Muse細胞由来胚様体様細胞塊及びES細胞を免疫不全マウスの精巣に注入し、テラトーマ（奇形腫）を形成するか否かを確かめた（図９-３e）。組織学検査の結果、ES細胞ではすべてのマウスにおいて８週以内にテラトーマの形成が認められた。しかしながら、富Muse細胞画分では１３頭中１０頭で、Muse細胞由来胚様体様細胞塊では１１頭中１０頭で、図９-３eに示すように、移植されたヒト細胞の残存と、種々の細胞種への分化が認められた。テラトーマは少なくとも６ヶ月まで富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊の移植群において形成が全く認められなかった。移植したヒト細胞は抗ヒトミトコンドリア抗体によって標識されるが、それらの細胞は同時に外胚葉マーカー（神経フィラメント）、内胚葉マーカー（α-フェトプロテイン）及び中胚葉マーカー（平滑筋アクチン）を発現することが確認された（図９-３f-i）。
【０１５０】
これらのデータは、H-fibroblast画分、H-MSC画分由来Muse細胞及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊はin vitroでも in vivoでも３胚様に分化し得ることを示している。
【０１５１】
Ｅ．定量的PCR
多能性及び分化状態に関連したマーカーの発現を図１０に示す。Nanogの発現は、富Muse細胞画分及び細胞クラスターにおいては、無処理細胞に比べそれほど高くなかった。多能性幹細胞の幾つかにおいては、Nanogはそれほど発現しない（Chou YF et al., Cell 135, 449-461 (2008)； Bui HT et al., Development. 135(23):3935-3945 (2008))。Nanogと同様に、Q-PCRでのOct-4はマウスES細胞に比較するとリプログラミング体細胞において低い（Bui HT et al., Development. 135(23):3935-3945 (2008))。従って、Nanog及び他の多能性（pluripotency)マーカーの発現量はpluripotencyにとってそれほど重要ではない。
【０１５２】
Ｆ．富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊の遺伝子発現
定量PCRにより多能性及び非分化状態に関連するいくつかのマーカーが富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊でアップレギュレートされていることが示された。富Muse細胞画分は上記のように９〜10％のMuse細胞を含んでいるに過ぎないが、Rex1（ZFP42)、Sox2、KLF-4、c-Myc、DPPA2（developmental pluripotency associated 2）、ERAS、GRB7（Growth factor receptor-bound protein 7)、SPAG9（Sperm associated antigen）、TDGF1（teratocarucinoma-derived growth factor1が、無処理細胞画分に比べて高度に又は適度にアップレギュレートされていた。Muse細胞由来胚様体様細胞塊においては、DAZL(azoospermia-like)、DDX4（VASA)、DPPA4（developmental pluripotency associated 4）、Stella、Hoxb1、PRDM1及びSPRY2（sprouty homolog2)が無処理細胞に比べてアップレギュレートされていた（図１０a）。
【０１５３】
H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の、無処理細胞画分、富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊の全体的な遺伝子発現を、ヒト末梢血単核細胞画分をコントロールとして比較したところ、無処理細胞画分、富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊の間で幾つかの遺伝子において発現パターンの変化が認められた（図１０a)。
【０１５４】
富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊におけるテロメラーゼ活性は低かった。このことは、テロメラーゼ活性がMuse細胞の増殖活性にそれほど関与していないことを示している（図１０b）。
【０１５５】
Ｇ．DNAマイクロアレイによる全体的遺伝子発現
108プローブのピアソン相関分析を、ヒト末梢血単核細胞（陰性対照）、無処理細胞画分、H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊について行った（図１１)。
また、DNAマイクロアレイにより、発現しているオドラント受容体及びケモカイン受容体をピックアップした。
【０１５６】
Ｈ．生体におけるMuse細胞の存在
上記に示した検討は、安定な培養細胞を用いて行った。細胞を成体から取り出して培養した場合、生体内とは異なる特性を持ち得るので、Muse細胞やMuse細胞由来胚様体様細胞塊がアーティファクトな産物である可能性は否定できない。そこで、ヒト生体すなわちヒト骨髄細胞から培養を経ないで直接Muse細胞由来胚様体様細胞塊を得ることを試みた。ヒト骨髄穿刺液から単核細胞画分を分離し、直接MC培養に供するか（naive hBM-MC)、あるいは８時間のトリプシン処理を行った後にMC培養に供した（8hr-hBM-MC、トリプシン処理後の単核細胞画分の生存率は約3.5％であった）。７日後、Muse細胞由来胚様体様細胞塊の形成が無処理のnaive hBM-MCでは約0.004％の効率で認められ、8hr-hBM-MCでは約0.3％すなわち約75倍の効率であった（図１２a）。これらのMuse細胞由来胚様体様細胞塊はアルカリフォスファターゼ染色陽性であった（図１２ｂ）。無処理のnaive hBM-MC及び8hr-hBM-MC由来の単一Muse細胞由来胚様体様細胞塊からクローン増殖した細胞のRT-PCRにより、α-フェトプロテイン、GATA6、MAP-2及びNkx2.5の発現が認められた（図１３）。これらの結果は、ヒト骨髄中にin vivoにおいてもMuse細胞が存在し、８時間のトリプシン処理で富化しMuse細胞由来胚様体様細胞塊を形成させることができることを示している。さらに、骨髄の多くのタイプの細胞中で、Muse細胞がCD105陽性間葉系細胞画分に属していることが確認された。
【０１５７】
上記のように、ヒト骨髄穿刺液から直接分離した単核細胞画分中の無処理hBM-MCの形成効率は0.004％と著しく低かった。培養中の細胞においては、細胞集団の構成が変化し得るため、安定的な培養を行っている細胞は、骨髄から分離した無処理単核球とは異なるMuse細胞由来胚様体様細胞塊形成傾向を示すと考えられる。これを確認するため、次いで、ヒト骨髄穿刺液を培養し、初代MSCを回収しMC培養を行ったところ、約0.2％のMuse細胞由来胚様体様細胞塊形成が認められた。これらの初代MSCをさらに２回又は５回継代培養したところ、Muse細胞由来胚様体様細胞塊形成効率は無処理細胞画分に対して約0.5％〜1.0％それぞれ上昇した。無処理のH-fibroblast画分及びヒトMSC画分の約1.2％がMuse細胞由来胚様体様細胞塊を形成する。これらの結果は、Muse細胞のようなストレス耐性を有する細胞は継代培養等のin vitro培養環境で残り、このため安定な継代培養細胞画分が骨髄穿刺液から直接分離した単核細胞画分よりもより高いMuse細胞由来胚様体様細胞塊形成効率を示したことを示唆する。
【０１５８】
骨髄はMSC、造血系細胞、内皮細胞を含む多種の単核細胞を含む。どの画分がMuse細胞を含むかを調べるために、ヒト骨髄穿刺液から分離した単核細胞画分を、CD34、CD117（いずれも造血幹細胞マーカー）及びCD105（間葉系細胞のマーカー）に対する抗体を用いて直接MACSソーティングに供し、各々の画分を８時間トリプシン処理し、７日間MC培養を行った。CD34陽性、CD117陽性画分にはMuse細胞由来胚様体様細胞塊はほとんど検出されなかったが、CD34陰性、CD117陰性、CD105陽性画分にはCD34陰性、CD117陰性、CD105陰性画分の50倍のクラスターの形成が認められた。この結果は、Muse細胞は主にCD105陽性間葉系細胞画分中に存在することを示唆している。
【０１５９】
Ｉ．MACSソーティング
骨髄単核細胞画分からのそれぞれのフラクションの収率は、フラクション１（CD105陽性フラクション）で1.8％、フラクション２（CD34陽性・CD117陽性フラクション）で8.5％、フラクション３（CD34陰性・CD117陰性・CD105陰性フラクション）で89.7％であった。フラクション１、２及び３の細胞塊形成率は、それぞれ0.5％、０％及び0.01％であった。従って、フラクション１の細胞塊形成率はフラクション３の約50倍であった。
【０１６０】
Ｊ．SSEA-3陽性細胞をFACSソーティングにより分離
一例として、SSEA-3をマーカーとしてFACSソーティングを行った。
H-fibroblast及びHMSCの両方について、SSEA-3陽性細胞及びSSEA-3陰性細胞をFACSソーティングにより分離し、単一細胞懸濁培養に供した。SSEA-3陽性細胞の約50〜60％がMuse細胞由来胚様体様細胞塊を形成した。一方、SSEA-3陰性細胞ではMuse細胞由来胚様体様細胞塊を形成しなかった。
【０１６１】
Ｋ．SSEA-3陽性細胞画分の特徴
FACS分析により、無処理H-fibroblast画分及びH-MSC画分は間葉系細胞に発現するCD44、CD49f、CD54、CD90、CD105陽性の画分を含むことがわかった。しかし、CD11c、CD34、CD45、CD71、CD166、CD271及びフォンビルブランド（vWF)因子は陰性であった。富Muse細胞画分においては、CD44及びCD54が陰性となったSSEA-3陽性画分は約0.7〜1.9％であった（図１４）。
【０１６２】
SSEA-3は多能性のマーカーの１つであるので、無処理のH-fibroblast画分及びH-MSC画分中のMuse細胞由来胚様体様細胞塊形成率（約1.2％）及び富Muse細胞画分での形成率（９〜10％）は、それぞれのSSEA-3の陽性率（無処理細胞画分は約0.7〜0.9％、富Muse細胞画分では７〜8.3％）に似ていた。SSEA-3の陽性率は、Muse細胞のある状態を示している可能性がある。免疫組織化学によると、無処理のH-fibroblast画分及びH-MSC画分中のSSEA-3陽性細胞の数は１％未満であった。そこで、H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分からSSEA-3陽性細胞をソーティングし、単一浮遊培養を行った。その結果、SSEA-3陽性細胞の50〜60％がMuse細胞由来胚様体様細胞塊を形成した。これは富Muse細胞画分のMuse細胞由来胚様体様細胞塊形成の約６〜７倍、無処理細胞画分のMuse細胞由来胚様体様細胞塊形成の約60倍である。一方SSEA-３陰性の細胞画分からはMuse細胞由来胚様体様細胞塊の形成は認められなかった。FACSによるソーティングにより得られたSSEA-3陽性細胞画分由来の単一細胞塊からクローン増殖により得られた細胞（3,000〜5,000細胞）のSSEA-3陽性率は約45％であった（図１５-１a）。このことは、Muse細胞由来胚様体様細胞塊の形成過程において、非対称性分裂が関与しており、単一Muse細胞由来胚様体様細胞塊のクローン増殖においても同様であることを示唆している。実際、非対称性分裂に関与していることが知られているNumblikeは、２つの細胞への分裂の過程で１つの細胞中にのみ存在する（図１５-２b）。これらの結果は、非対称性細胞分裂がMuse細胞の増殖に関与していることを示唆する。
【０１６３】
電子顕微鏡観察により、H-fibroblast画分及び長時間トリプシン処理後にソーティングしたH-MSC画分由来SSEA-3陰性細胞において核の変形と細胞質中の小胞が観察され、細胞が障害を受けていることが示された。しかし、SSEA-3陰性細胞と陽性細胞の間で明らかな形態的な差は認められなかった（図１５-３c及びd）。
【０１６４】
SSEA-3陽性細胞の重要性は、移植実験においても示された。SSEA-3陰性細胞画分を移植した場合、SSEA-3陽性細胞画分を移植した場合に比べて、組織マーカーの発現はほとんどの細胞で認められなかった。
【０１６５】
富Muse細胞画分において、ほとんどのSSEA-3陽性細胞はOct3/4及びSox2を共発現しており、細胞質中に検出された（図１５-４e及びg）。しかし、核中で発現している細胞は極めて少なかった（図１５-４f）。この結果は、SSEA-3がMuse細胞の良いマーカーとなり得ることを示している。一方、Muse細胞由来胚様体様細胞塊の細胞においては、Oct3/4及びSox2は核中に主に局在していた（図７-２h及びl）。この２つのマーカーの細胞内局在の差異は細胞状態の差異を反映している可能性がある。
【０１６６】
Muse細胞が長時間のトリプシン処理により人工的に誘導された可能性も否定できない。多くのMuse細胞が骨髄中のCD105陽性細胞画分に存在する。さらに、SSEA-3陽性細胞は、Muse細胞の特性を示す。そこで、ヒト成体骨髄穿刺液からSSEA-3及びCD105の二重陽性(double positive)細胞として、Muse細胞を直接得ることを試みた。二重陽性細胞は、骨髄由来単核球中に0.025％〜0.05％存在し、それを長時間のトリプシン処理なしに、直接単一細胞浮遊培養に供した。７日後、11.4±1.2％の細胞（単核球の0.003〜0.005％に相当する）が、Muse細胞由来胚様体様細胞塊を形成し、アルカリフォスファターゼ陽性であった。次いで、単一Muse細胞由来胚様体様細胞塊を接着培養により3,000細胞まで増殖させ、単一浮遊培養に供した。これらの細胞中、33.5±3.1％の細胞が第２世代のMuse細胞由来胚様体様細胞塊を形成した。また、単一Muse細胞由来胚様体様細胞塊からゼラチンでコートした培養ディッシュで増殖させた細胞についてRT-PCRを行ったところ、α-フェトプロテイン、GATA6、MAP-2及びNkx2.5の発現が認められた。これは、ヒト成体骨髄中にMuse細胞の特性を有する細胞が存在することを示唆する。
【０１６７】
Ｌ．まとめ
上記のように、ストレス刺激により非幹細胞を除去することにより幹細胞を富化することができた。Muse細胞を長時間トリプシン処理とその後のSSEA-3陽性細胞のソーティングにより効率的に集めることができた。Muse細胞は、多能性マーカーを発現しアルカリフォスファターゼ染色陽性であり、外胚葉、中胚葉及び内胚葉系細胞に分化し得るMuse細胞由来胚様体様細胞塊を形成した。また、増殖速度の測定において腫瘍形成性増殖に関する特徴を有しておらず、テロメラーゼ活性も有していなかった。このことは、Muse細胞は爆発的増殖を防ぐための多重のセキュリティーシステムを有していることを示している。Muse細胞の非腫瘍形成性特性はMuse細胞をマウス精巣に注入する実験においても認められた。この特性は生体機能のバランスを維持する上で都合がよく、この特性がなければ、異常増殖や異形成により生体は破壊され、腫瘍形成やテラトーマ形成をもたらす。
【０１６８】
Muse細胞の多能性は接着培養系では顕在化せず、浮遊培養で観察された。
通常、Muse細胞は不活性休眠状態にあり生体が、危機的状態に陥ったり、あるいは重篤な傷害を被り、又は飢餓若しくは虚血状態等のストレス過多状態が維持されるとある種のシグナルが伝達されて活性化すると考えられる。その後、Muse細胞は組織再生に貢献し、細胞間相互作用や組織化に貢献する。
【０１６９】 
実施例２  SSEA-3を利用して分離したMuse細胞を含むSSEA-3陽性細胞画分の特性分析
実施例１の検討において、FACSにより得たSSEA-3陽性細胞画分が多能性幹細胞の特性を有していること、すなわちMuse細胞を含むことが判明したが（上記J、K等）、さらに、分離したSSEA-3陽性細胞画分を用いて、in vitroでの分化能及びin vivoでの分化能を検討し、さらにMuse由来iPS細胞の確立を行った。
【０１７０】
１．損傷組織への移植によるin vivoでの分化能の検討
GFP（緑色蛍光タンパク質）-レンチウイルスで標識したSSEA-3陽性細胞画分を分離し、脊髄（圧迫損傷）、肝臓（CCl4を腹腔内注射、劇症肝炎モデル）又は腓腹筋（cardiotoxin注射）に損傷を与えた免疫不全マウス（NOGマウス）に静脈注射により移植した。ヒト皮膚細胞由来のSSEA-3陽性細胞画分をGFP（緑色蛍光タンパク質）-レンチウイルスで標識し（Hayase M et al., J Cereb Blood Flow Metab. 29(8): 1409-20, 2009）、Muse細胞由来胚様体様細胞塊が標識細胞由来であることをGFPにより確認した。脊髄損傷はNOGマウスに対してレベルTh9で行い（Farooque M et al., Acta Neuropathol., 100; 13-22, 2000）、NOGマウスの腓腹筋にcardiotoxinを投与し筋肉変性を誘発し、四塩化炭素をNOGマウスに腹腔内投与し、肝臓変性を誘発した。筋肉及び肝臓については２日後、脊髄については７日後に１×105のSSEA-3陽性細胞画分を静脈注射により移植した（各６頭のマウスを使用）。コントロールとして、GFP標識MEC集団を静脈注射したマウスを用いた。移植の３又は４週間後に、マウスをパラホルムアルデヒドで固定し、免疫組織化学及び共焦点レーザ顕微鏡観察に供した。
【０１７１】
脊髄損傷の４週間後、GFP及びヒトゴルジ複合体陽性細胞がニューロフィラメントを形成していた。（図１６-１N及びO)。また、４週間後、再生している肝臓において、GFP及びヒトゴルジ複合体陽性細胞がヒトアルブミンを発現していた（図１６-１P）。RT-PCRの結果によりSSEA-3陽性細胞画分を移植したNOGマウス肝臓においてヒトアルブミンの形成が示された(図１６-２)。GFP陽性細胞を再生している筋肉に注射した場合、３週間でヒトジストロフィンを発現した(図１６-３)。一方、SSEA-3陰性ヒト皮膚線維芽細胞画分を移植した場合、細胞のインテグレートは顕著に少なく、組織マーカーが陽性の細胞はほとんど認められなかった。これらの結果は、Muse細胞が損傷組織に統合され、それぞれ、in vivoで外胚葉、中胚葉及び内胚葉に分化し得ることを示す。
【０１７２】
２．単一Muse細胞由来のMuse細胞由来胚様体様細胞塊からの増殖細胞の分化
Muse細胞の分化調節に誘導システムが有効かどうかを検討した。単一SSEA-3陽性Muse細胞由来のMuse細胞由来胚様体様細胞塊を接着培養に供し、増殖させた。単一Muse細胞由来の増殖細胞を回収し、４つの群に分け、それぞれの群に対して、神経、骨細胞、脂肪細胞及び幹細胞への分化誘導を行った(n=5)。
【０１７３】
神経誘導のためには、細胞をpoly-HEMAでコートしたディッシュを用いて１×105/mlの密度でB-27 supplementを含むNEUROBASAI培地（Gibco社）中で７日間培養し、sphere（球状の細胞塊）を形成させた。分化させるためにsphereをポリ-L-リシンでコートしたガラス上に移し、25ng/ml FGF及び25ng/ml BDNFを含む２％ FBS中で10日間培養した。
【０１７４】
骨細胞誘導のためには、細胞を4.2×103細胞/cm2の密度でHuman Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit (R&D Systems)の骨細胞誘導培地を用いて14日間培養した。
【０１７５】
脂肪細胞誘導のためには、細胞を2.1×104細胞/cm2の密度でHuman Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit (R&D Systems)の脂肪細胞誘導培地を用いて14日間培養した。
【０１７６】
肝臓細胞誘導のためには、細胞を2.0×104細胞/cm2の密度でDMEM（10％FBS、10nMデキサメタゾン及び100ng/ml HGFを含む10×ITS（GIBOCO社）、50ng/ml FGF4を含む）を用いてコラーゲンコートしたディッシュ上で14日間培養した。
【０１７７】
神経誘導によりsphereが形成され、sphereは神経幹細胞マーカーであるネスチン、Musashi及びNeuroD陽性であることが確認された(図１７-１A〜D)。これらのsphereを分化培地中で培養するとMAP-2又はGFAP陽性細胞に分化した（図１７-１E、MAP-2、GFAPいずれも89±5.7％の陽性率）。細胞を骨細胞誘導したとき、オステオカルシン陽性細胞（97±3.5％）及びアルカリフォスファターゼが認められた（図１７-１F及びG)。脂肪細胞分化については、オイルレッドで染色される脂肪滴を有する細胞が形成された（90±4.9％)(図１７-１H〜I)。肝細胞誘導にヒトαフェトプロテイン陽性細胞（図１７-１J、87±7.6％）並びにヒトアルブミンとヒトαフェトプロテイン陽性細胞（図１７-２)の形成がRT-PCRにより認められた。これらの結果は、Muse細胞の３胚葉への分化が、非常に高い効率で誘導により調節できることを示している。
【０１７８】
３．ヒト成人皮膚からのSSEA-3陽性細胞の採取
培養細胞を培養したり、Muse細胞由来胚様体様細胞塊を形成させることなく、ヒト成人皮膚から直接Muse細胞を含むSSEA-3陽性細胞画分を分離することを試みた。
【０１７９】
ヒト健常人（n=3)からの皮膚（BIOPREDIC Internationalより入手）の上皮及び脂肪組織を除き真皮を得、真皮を10％ FBSを含むα-MEM中コラゲナーゼ/ジスパーゼと共に37℃で36時間インキュベートした。濾過により消化された皮膚細胞を回収し、1500rpmで20分間遠心分離し、α-MEMで洗浄し、0.25％トリプシン-HBSSで５分間インキュベートした。細胞をさらにFACSバッファーで洗浄し、SSEA-3とインキュベートし、FACSを用いてSSEA-3陽性細胞をソーティングした。約７cm2の皮膚組織から1.3±0.3×104の単一細胞を回収することができた。SSEA-3陽性細胞は、回収した単一細胞の1.7±0.2％であった。
【０１８０】
SSEA-3陽性細胞の21.0±1.7％が、限界希釈による単一細胞浮遊培養で７日でMuse細胞由来胚様体様細胞塊を形成した。Muse細胞由来胚様体様細胞塊はALP陽性であり、単一のMuse細胞由来胚様体様細胞塊からゼラチンでコートしたディッシュを用いて増殖させた細胞について、RT-PCRで確認したところ、MAP-2、Brachyury、Nkx2.5、GATA6及びα-フェトプロテインを発現していた。この結果は、Muse細胞と同じ性質を有する細胞が上述の成人ヒト骨髄液と同様に、成人ヒト皮膚にも存在することを示している。
【０１８１】
ヒト成人皮膚は、SKP（皮膚由来前駆細胞）、NCSC（神経堤幹細胞）、メラノブラスト（MB)、血管周囲細胞（PC)、内皮前駆細胞（EP)、脂肪由来幹細胞（ADSC)等の種々のタイプの幹細胞や前駆細胞を含んでいる。Muse細胞がこれらの幹細胞等と同じである可能性を排除するために、Muse細胞におけるSnai1（SKPのマーカー）、Slug（SKPのマーカー）、Sox10（NCSCのマーカー）、CD271（NCSCのマーカー）、Tyrp1（MBのマーカー）、Dct（MBのマーカー）、CD117(c-Kit)（MBのマーカー）、CD146（PC及びADSCのマーカー）、NG2（PCのマーカー）、CD34（EP及びADSCのマーカー）及びフォンビルブランド因子（EPのマーカー）の発現を分析した。これらのマーカーのいずれもSSEA-3陽性細胞において、FACS分析又はRT-PCRで認められなかった（図１８-1及び図１８-２)。この結果は、Muse細胞はヒト成人皮膚に存在することが公知である幹細胞や前駆細胞と異なる細胞であることを示している。
【０１８２】
さらに、フェライト粒子を用いてMuse細胞の貪食能を調べたところ、Muse細胞はフェライト粒子を容易に取り込み、高い貪食能を有していた（図１８-３）。
【０１８３】
４．Muse由来iPS細胞（Muse-iPSC)の確立
iPS細胞は、Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、Klf4遺伝子、c-Myc遺伝子、Nanog遺伝子、Lin28遺伝子等を導入し作製されている。Muse細胞は、多能性(pluripotency)マーカーを発現し、外胚葉、内胚葉及び中胚葉系細胞に分化し得るという点で、iPS細胞と類似した特性を有している。そこで、Muse細胞がiPS細胞のよい材料となり得るかを検討した。
【０１８４】
方法は以下のとおりであった。
H-fibroblast画分由来のSSEA-3陽性細胞及び陰性細胞に、Takahashi et al., Cell, 131, 861-872(2007)の記載に従って、レトロウイルスベクターを用いて、Nanog、Oct3/4、KLF4及びc-Mycの４つの因子を導入し、培養した。以下に、方法の詳細を示す。
【０１８５】
プラスミドの確立
pMXsレトロウイルスベクター(Cell Biolabs)にヒトOct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycのopen reading frameを組み込んだ。
【０１８６】
レトロウイルスの感染及びiPS細胞の確立
PLAT-A細胞を100mm dishに5×106細胞の密度でまき、一晩培養した。次の日に、Fugene HDを用いてトランスフェクションをを行った。トランスフェクションから24時間後、新しい培地に交換した。3日後に上清を回収し、0.45μmのフィルターに通し、4μg/mlのポリブレンを加えた。60mm dishに1×105細胞の密度でまいたNHDF（皮膚線維芽細胞）にウイルス溶液を感染させた。24時間後、ウイルスの入っていない新しい培地に交換した。ウイルス感染から4日後にトリプシンにより剥がした細胞を、MEF（フィーダー細胞）の上に3×104細胞の密度でまいた。翌日、培地を4ng/ml bFGFを加えたPrimate ES mediumに交換した。その後２日に１回培地交換を行い、30日後、コロニーをピックアップし、24ウェルプレートにまいた。
【０１８７】
PCR分析
RNeasy mini kit(QIAGEN)によりRNAを精製した。500ngのRNAをSuperScriptIIを用いて逆転写した。内因性のOct、Sox2、Klf4、Myc、NanogのプライマーとＰＣＲの条件等はakahashi et al., Cell, 131, 861-872(2007)に記載の通りで行った。
【０１８８】
in vitroにおけるiPS細胞の分化
コラゲナーゼによりiPS細胞を採取した。細胞の塊をPoly-HEMAでコーティングしたdishに、20％ Knockout serum replacement(Invitrogen)、2mM L-Glutamine、1×10-4M nonessential amino acid、1×10-4M 2-mercaptoethanol(Nacalai)、0.5％Penicillin/Streptomycinを含むDMEM/F12培地にて培養した。培地は2日に一回交換した。7日後、EBをゼラチンコートしたdishにまき、同じ培地で一週間培養した。
【０１８９】
テラトーマの形成
60mm dishのiPS細胞をRock inhibitorにより処理し、Accutase（登録商標）により採取しチューブに集めて遠心後、PBSに浮遊させた。これをNOG mouse（登録商標）（財団法人  実験動物中央研究所）の精巣に注射した。12週後に４％パラホルムアルデヒドにより固定した。パラフィン切片はHE（Hematoxylin & Eosin)染色を行った。
【０１９０】
以下の結果が得られた。
H-fibroblast画分由来のSSEA-3陽性細胞及び陰性細胞に、Takahashi et al., Cell, 131, 861-872(2007)の記載に従って、レトロウイルスベクターを用いて、Nanog、Oct3/4、KLF4及びc-Mycの４つの因子を導入し、５日後にMEF上に再度まきなおし、培養した。colony pickupを行う直前、すなわちＭＥＦ上での培養3０日目においては、SSEA-3陰性細胞中で形成されたコロニーは非ES細胞様コロニーであり、ＥＳ細胞のマーカーであるTra-1-80陽性のコロニーはまったく見られなかった。一方、多くのSSEA-3陽性細胞においては陰性の細胞群の約７倍ほどの数のコロニーを形成し、それらはTra-1-80は陽性であった。注目すべきは、SSEA-3陰性細胞(コロニーやコロニーを形成していない細胞すべてを回収)では、RT-PCRで測定したところ、ＭＥＦ上３０日目のcolony pick up直前でもNonog、Sox2などの多能性に密接に関連した重要な遺伝子は陰性であった。一方、SSEA-3陽性細胞において、内因性のOct3/4、KLF4及びRex1がアップレギュレーションされており、さらにNanog、Sox2が発現していた。予測されていたとおり、SSEA-3陽性細胞をcolony pickupし、新たなMEF（フィーダー細胞）上に移した場合、無処理H-fibroblast画分細胞を用いた場合よりも３０倍ほど高い効率でiPSを作製することができた。これらのiPS細胞において、免疫細胞化学、RT-PCR及びQ-PCRにより、Tra-1-60、Tra-a-80、Rex1、UTF-1、テロメラーゼ逆転写酵素（TERT)及びヒトES細胞において発現している因子がアップレギュレーションしており、あるいは新たに発現していた（図１９、２１）。また、得られたMuse細胞由来iPS細胞において、Nanog、Oct3/4、Sox2及びTRA-1-81が発現していた（図１９)。RT-PCRにより、Muse細胞由来iPS細胞ではNanog、Oct3/4及びSox2が発現しているが、SSEA-3陰性細胞由来コロニーでは発現していないことがわかった（図２１)。
【０１９１】
SSEA-3陽性細胞とSSEA-3陰性細胞画分とで、Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、Klf4遺伝子およびc-Myc遺伝子の導入効率はほとんど同じであった。導入した細胞をマウスフィーダー細胞上でディッシュ当たり１×105の密度で培養した。両方の各群でコロニーを形成したが、SSEA-3陰性細胞画分から形成されたコロニー数は、SSEA-3陽性細胞画分の７分の１程度であった。さらに、SSEA-3陽性細胞画分と異なり、SSEA-3陰性細胞画分では、ヒト多能性幹細胞マーカーであるTRA-1-81陽性コロニーは、コロニーを採取する直前の培養30日後でも認められなかった（図２２-１）。RT-PCRにより、内因性Sox2及びNanogはSSEA-3陽性細胞由来画分のみで発現しており、SSEA-3陰性細胞画分では発現していなかった（図２２-２)。
【０１９２】
さらに、SSEA-3陽性及び陰性細胞画分をそれぞれ継代し、iPS細胞株を確立した。３継代後、ヒトES細胞様の形態（平らなコロニー）を示したそれぞれのコロニー（図２２-３C及びC1)についてRT-PCRを行い、内因性oct3/4、Sox2及びNanogを発現しているコロニーをiPSコロニーとしてカウントした。その結果、iPS細胞は、SSEA-3陽性細胞由来コロニーのみから形成され、効率は0.03％であった。SSEA-3陰性細胞由来コロニーからは形成されなかった（図２２-３D及びD1)。
【０１９３】
さらに、Muse細胞から確立したiPS細胞は、外胚葉、内胚葉及び中胚葉系細胞に分化し、マウス精巣にてテラトーマを形成した（図２３-１〜２３-３)。
【０１９４】
Muse細胞の増殖活性は、増殖速度及びテロメラーゼ活性の観点からそれほど高くない。このことは、Muse細胞は、マウス精巣中で３胚葉性の細胞に分化するが、テラトーマは形成しないことと対応している。もし、Muse細胞が皮膚や骨髄等のヒト成人組織において維持されている場合、その増殖は厳密に調節されているはずであり、そうでなければ、Muse細胞は生体のすべての部分で腫瘍を形成してしまうであろうことを考えても妥当である。さらに、ある条件下で培養した杯盤葉上層（epiblast）幹細胞がマウス精巣中でテラトーマを形成しないことが示されていることを考慮すると（Chou et al., Cell, 135, 449-461(2008))、多能性幹細胞が常にテラトーマを形成するとは言えない。Muse細胞は、最初から多能性マーカーの発現や分化能等において多能性幹細胞の特性を示すので、Muse細胞は単独でiPS細胞になり、増殖活性が上昇し、マウス精巣中でテラトーマを形成するようになることが予測される。iPSの誘導メカニズムは解明されていないが、間葉系細胞中のMuse細胞における腫瘍性増殖性の獲得の可能性がある。
【０１９５】
無処理ヒト皮膚線維芽細胞画分から約0.001％の効率でiPS細胞が確立できたが、これはK. Takahashi et al., Cell 131, 861 (2007)の報告と一致する。従って、SSEA-3陽性細胞からのiPS細胞作製効率は、無処理線維芽細胞に対して30倍高かった。このことは、iPS細胞の形成に主にMuse細胞が寄与していることを示唆している。
【０１９６】
免疫組織化学及びRT-PCRにより、Muse由来iPS細胞から得た胚様体は、in vitroで外胚葉（ニューロフィラメント及びMAP-2）、中胚葉（SMA、Brachyury及びNkx2.5）、及び内胚葉細胞（α-フェトプロテイン及びGATA-6）に分化することがわかった。さらに、免疫不全マウス精巣にMuse由来iPS細胞を投与したところ、テラトーマの形成が観察された。一方、Muse細胞由来胚様体様細胞塊を精巣に注射した場合、６ヶ月後においてもテラトーマの形成は認められず、MEFを注射したコントロールと比べて大きさもそれほど大きくならなかった。しかし、ヒトミトコンドリア並びにSMA、α-フェトプロテイン及びニューロフィラメントが陽性の細胞が同定された。この結果は、Muse由来iPS細胞と異なり、元々のMuse細胞はテラトーマを形成しないが、免疫不全マウス中で外胚葉、中胚葉及び内胚葉に分化し得ることを示す。
【０１９７】
Muse細胞由来胚様体様細胞塊とMuse由来iPS細胞について定量PCR（Q-PCR）を行った。結果を図２５及び２６に示す。細胞周期調節に関連した遺伝子の発現パターンは、大きく異なっていた。細胞周期進行に関連した遺伝子のほとんどは、Muse細胞由来胚様体様細胞塊ではダウンレギュレートされていたが、Muse由来iPS細胞ではアップレギュレートされていた。一方、Muse細胞由来胚様体様細胞塊とMuse由来iPS細胞において、多能性及び未分化状態に関与した遺伝子の発現は同様の傾向を示した。ただし、Muse細胞由来胚様体様細胞塊におけるNanog、Oct3/4及びSox2の発現レベルはMuse由来iPS細胞よりはるかに低かった。Nanog遺伝子及びOct3/4遺伝子のプロモータ領域のシトシン・グアニンジヌクレオチド（CpG)はMuse由来iPS細胞でMuse細胞由来胚様体様細胞塊に比べてメチル化の程度は小さかった。なお、Nanog遺伝子のプロモータ領域のCpGのメチル化はSSEA-3陰性無処理細胞画分に比べて、Muse細胞由来胚様体様細胞塊で低かった（図２４)。この結果は、Muse細胞とMuse由来iPS細胞の間の多能性マーカーの発現レベルの差を説明する。
【０１９８】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞からSSEA-3の発現が陽性であることを指標に分離できる細胞画分であって、以下の性質のすべてを有する多能性幹細胞、を含む細胞画分：
(i)  SSEA-3陽性；
(ii)  CD105陽性；
(iii)  テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
(iv)  三胚葉のいずれの胚葉の細胞へも分化する能力を持つ；
(v)  腫瘍性増殖を示さない；及び
(vi)  セルフリニューアル能を持つ。
【請求項２】
細胞画分が、生体の間葉系組織からSSEA-3の発現を指標に直接分離できる、請求項１記載の細胞画分。
【請求項３】
多能性幹細胞が、浮遊培養及び接着培養を組合わせた培養により増殖する、請求項１又は２に記載の細胞画分。
【請求項４】
多能性幹細胞が、CD117陰性及びCD146陰性の請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞画分。
【請求項５】
多能性幹細胞が、CD117陰性、CD146陰性、NG2陰性、CD34陰性、vWF陰性及びCD271陰性の請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞画分。
【請求項６】
多能性幹細胞が、CD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、Sox10陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrp1陰性及びDct陰性の請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞画分。
【請求項７】
間葉系組織又は培養間葉系細胞からSSEA-3の発現が陽性であることを指標に請求項１〜６のいずれか１項に記載の多能性幹細胞を含む細胞画分を得る方法。
【請求項８】
さらに、(i)の特性を指標に、あるいは(i)と（ii）〜(v)の特性の少なくとも１つの特性を指標に多能性幹細胞を含む細胞画分を得る、請求項７記載の方法：
(i)  CD105陽性
(ii)  CD117陰性及びCD146陰性；
(iii)  CD117陰性、CD146陰性、NG2陰性、CD34陰性、vWF陰性及びCD271陰性；
(iv)  CD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、Sox10陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrp1陰性及びDct陰性；並びに
(v)  テロメラーゼ活性が低いか又は無い。
【国際調査報告】
2011007900.tif 000053
2011007900.tif 000054
2011007900.tif 000055
2011007900.tif 000056