(57)【要約】  土壌汚染や毒性が低く、殺虫効果に優れた殺虫剤、およびその製造方法を提供する。炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含む殺虫剤、および炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含む、脂肪酸代謝物を含む殺虫剤の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含む殺虫剤。
【請求項２】
前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である請求項１記載の殺虫剤。
【請求項３】
前記代謝が、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下での代謝である請求項１または２記載の殺虫剤。
【請求項４】
前記プロテオバクテリアが、前培養されたプロテオバクテリアである請求項１〜３のいずれか１項に記載の殺虫剤。
【請求項５】
前記前培養されたプロテオバクテリアが、菌数１×１０8〜９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌに前培養されたプロテオバクテリアである請求項４記載の殺虫剤。
【請求項６】
バイオサーファクタントを含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の殺虫剤。
【請求項７】
前記代謝が、２０〜３０℃の条件下での代謝である請求項１〜６のいずれか１項に記載の殺虫剤。
【請求項８】
炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含む、脂肪酸代謝物を含む殺虫剤の製造方法。
【請求項９】
前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である請求項８記載の殺虫剤の製造方法。
【請求項１０】
前記脂肪酸代謝工程を、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下で実施する請求項８または９記載の殺虫剤の製造方法。
【請求項１１】
前記プロテオバクテリアが、前培養されたプロテオバクテリアである請求項８〜１０のいずれか１項に記載の殺虫剤の製造方法。
【請求項１２】
前記前培養されたプロテオバクテリアが、菌数１×１０8〜９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌに前培養されたプロテオバクテリアである請求項１１記載の殺虫剤の製造方法。
【請求項１３】
バイオサーファクタントを含む殺虫剤の製造方法である請求項８〜１２のいずれか１項に記載の殺虫剤の製造方法。
【請求項１４】
前記脂肪酸代謝工程を、２０〜３０℃の条件下で実施する請求項８〜１３のいずれか１項に記載の殺虫剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、殺虫剤および殺虫剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、植物害虫に対し殺虫を目的として、除虫菊の有効成分であるピレトリン、そしてピレトリンの誘導体由来のアレスリンなどの合成ピレスロイドなどをはじめとした薬剤が使用されてきた。ピレスロイド類は、哺乳類や鳥類に対する毒性は低い一方、昆虫類の神経細胞に強力に作用して神経毒をもたらし殺虫する。また、近年では昆虫類の神経伝達物質アセチルコリン受容体に結合することで殺虫するネオニコチノイド系殺虫剤も広範囲に殺虫剤として使用されている。【０００３】
しかしながら、このような虫にとって一般的に毒となる成分を用いて直接殺虫する殺虫方法では、受粉などに必要な有益昆虫や天敵虫も一様に殺虫してしまうという問題がある。生態系の乱れが懸念される。また、ネオニコチノイドのように植物への浸透移行性などにより残効が長い殺虫剤では、有益昆虫が長期にわたって影響を受けてしまう恐れもある。さらに、過多の農薬散布による殺虫剤耐性虫の発生も問題となっている。土壌汚染などの環境への負荷の観点からも、化学合成農薬の使用量の削減が望まれている。【０００４】
一方、虫に対する毒ではなく、オレイン酸や脂肪酸エステル、合成でんぷんなどを有効成分とした気門封鎖系の殺虫剤の使用も知られている。気門封鎖型殺虫剤は、害虫の気門を塞ぎ、窒息させることで効果を発揮するため、大型の有益昆虫類を殺虫するリスクや薬剤耐性虫を発生させるリスクが少ないと考えられている。【０００５】
また、害虫を忌避する方法や化学合成農薬を使用せずに天然物質に由来する薬剤を用いて植物を病害虫から防除する方法などの対策が報告されている。天然物質に由来する薬剤としては、例えば、特許文献１には、微生物バイオサーファクタントが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００８−５０１０３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１には、バイオサーファクタントとして、ラムノリピドを含有させた発酵ブロス濾液を用いた病害虫を防除する方法が開示されており、これをイエバエや線虫を防除するための殺虫剤として使用することが記載されている。しかしながら、特許文献１に記載の薬剤では、蛾の幼虫のような大型の害虫まで殺虫できないという問題があった。【０００８】
本発明は、前記課題に鑑み、土壌汚染や毒性が低く、殺虫効果に優れた殺虫剤、およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌ（リットル）の溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含む殺虫剤に関する。【００１０】
前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である殺虫剤が好ましい。【００１１】
前記代謝が、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下での代謝である殺虫剤が好ましい。【００１２】
前記プロテオバクテリアが、前培養されたプロテオバクテリアである殺虫剤が好ましい。【００１３】
前記前培養されたプロテオバクテリアが、菌数１×１０8〜９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（ミリリットル）に前培養されたプロテオバクテリアである殺虫剤が好ましい。【００１４】
前記殺虫剤が、バイオサーファクタントを含む殺虫剤であることが好ましい。【００１５】
前記代謝が、２０〜３０℃の条件下での代謝である殺虫剤が好ましい。【００１６】
また、本発明は、炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含む、脂肪酸代謝物を含む殺虫剤の製造方法に関する。【００１７】
前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である殺虫剤の製造方法が好ましい。【００１８】
前記脂肪酸代謝工程を、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下で実施する殺虫剤の製造方法が好ましい。【００１９】
前記プロテオバクテリアが、前培養されたプロテオバクテリアである殺虫剤の製造方法が好ましい。【００２０】
前記前培養されたプロテオバクテリアが、菌数１×１０8〜９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌに前培養されたプロテオバクテリアである殺虫剤の製造方法が好ましい。【００２１】
バイオサーファクタントを含む殺虫剤の製造方法である殺虫剤の製造方法が好ましい。【００２２】
前記脂肪酸代謝工程を、２０〜３０℃の条件下で実施する殺虫剤の製造方法が好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の殺虫剤は、土壌汚染や毒性が低く、殺虫効果に優れる。また、本発明の殺虫剤の製造方法によれば、土壌汚染や毒性が低く、殺虫効果に優れる殺虫剤を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ワタアブラムシ成虫に対する殺虫効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
殺虫剤
本発明の殺虫剤は、炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含むことを特徴とする。
【００２６】
脂肪酸代謝物を害虫に接触させることで、害虫、特には微小害虫を気門封鎖によって殺虫することができる。本発明の殺虫剤は、殺虫剤に対する薬剤抵抗性を獲得しやすいような世代交代が早い微小害虫や、従来の殺虫剤に対する薬剤抵抗性を発達させた害虫にも有効であると考えられる。かつ脂肪酸代謝物は、化学合成農薬と比べその毒性が遥かに低い。また、脂肪酸代謝物を植物に施用した場合、トライコーム等の発達が確認できることから、脂肪酸代謝物は、感染特異的タンパク質（pathogenesis-related (PR) protein）の生成に関与する遺伝子群やサリチル酸またはジャスモン酸を生成する酵素産生に関わる遺伝子群などを活性化して、植物に全身獲得抵抗性を誘導していると考えられる。これは、脂肪酸代謝物中に抵抗性誘導に関係するサリチル酸経路やジャスモン酸経路を活性化する物質またはこの物質の前駆体が含まれていることによると考えられる。
【００２７】
本発明における代謝とは、０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下においてプロテオバクテリアが外分泌または内分泌する酵素等により炭素数４〜３０の脂肪酸の分解が行われることをいう。例えば、０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下、脂肪酸を含有する培地でプロテオバクテリアを培養する方法が挙げられる。
【００２８】
プロテオバクテリアは、脂肪酸の代謝に関わる酵素であるリポキシゲナーゼ（lipoxygenase：ＬＯＸ）を産生する遺伝子を持っており、脂肪酸代謝物を生成できる。
【００２９】
酸素濃度の調整によって、脂肪酸が低分子化される。そして、バイオサーファクタントと脂肪酸代謝物との混合物によるミセルが形成され、ミセル状になることで比較的大型の害虫にも殺虫作用が有効になったものと推定される。ミセルはバイオサーファクタントだけでは形成されない。このため、特表２００８−５０１０３９号公報記載の技術では理論上ミセルは形成されないため、本発明の効果は生じ得ない。
【００３０】
本発明にて用いられる脂肪酸の炭素数は４〜３０であり、１０〜２０が好ましい。炭素数が４未満の場合は、融点・沸点が低いため、培養時の温度で揮発性が高まり培地中に残存しにくくなる傾向がある。また、炭素数が３０を超える場合は、融点・沸点が高くなるため、培養時の温度で固体となり培地と混合できず分離してしまう傾向がある。ただし、融点は水素結合の数によって炭素数のみに依存しない場合もある。
【００３１】
本発明において用いられる脂肪酸は、代謝効率の観点や培地中で固化することを抑制する観点から、２０〜３０℃で液体であることが好ましく、２０℃で液体であることがより好ましい。
【００３２】
本発明の脂肪酸は、飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸のいずれか、または両方を含む混合物とすることができる。また、植物油やグリセリドの形態や遊離脂肪酸を用いることができるが、分解速度に優れるという理由から遊離脂肪酸（モノカルボン酸）が好ましい。
【００３３】
炭素数４〜３０の遊離脂肪酸としては、酪酸（ブチル酸）、吉草酸（バレリアン酸）、カプロン酸、エナント酸（ヘプチル酸）、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、ミード酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸などが挙げられ、なかでも炭素数が１０〜２０のカプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、ミード酸、アラキドン酸が好ましく、炭素数が１８のオレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸がより好ましい。
【００３４】
脂肪酸を含有する培地を使用する場合の脂肪酸の含有量は、１２０ｇ／ｌ以下が好ましく、１００ｇ／ｌ以下がより好ましく、６０ｇ／ｌ以下がさらに好ましい。１２０ｇ／ｌを超える場合は、培地の水分との乳化が困難となり、代謝効率が悪化する恐れやプロテオバクテリアの生育を阻害する恐れがある。また、脂肪酸の含有量の下限は特に限定されないが、１．０ｇ／ｌ以上が好ましい。
【００３５】
脂肪酸を含有する培地は、他にミネラル成分を含有することが好ましい。ミネラル成分としては、特に限定されず微生物培養に通常用いられるミネラル成分を挙げることができる。例えば、マグネシウム（Ｍｇ）、リン（Ｐ）、ナトリウム（Ｎａ）またはカリウム（Ｋ）を有する成分が挙げられる。これらの成分は単独で使用することも、複数を併用することもできる。好ましくはこれらの成分のうちの２種類、さらに好ましくは３種類以上が使用され得る。培地中のミネラル成分の含有量は特に限定されず、従来の好気性細菌の培養方法で使用される量とすることができるが、植物への施用時に塩害が発生する恐れがあるため、好ましくは１５ｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｇ／ｌ以下で使用され得る。
【００３６】
本発明にて用いられるプロテオバクテリアは、本発明の効果を損なわない限り特に限定されない。好ましくは脂肪酸の代謝効率や生育効率の観点から、増殖に適した温度（至適温度）が１０〜４０℃のプロテオバクテリアが好ましく、２０〜３０℃のプロテオバクテリアがより好ましい。
【００３７】
プロテオバクテリアは、脂肪酸の代謝効率に優れるという理由から、前培養されたプロテオバクテリアであることが好ましく、菌数が１×１０8〜９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌまで前培養されていることがより好ましい。
【００３８】
本発明においては、前述のように、代謝は、０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下で行われる。溶存酸素濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満の場合は、プロテオバクテリアの活動が低下し脂肪酸の代謝効率が極めて低くなる傾向がある。また、溶存酸素濃度が８ｍｇ／ｌを超える場合は、プロテオバクテリアによる代謝工程と並行して、基質である脂肪酸の培地中の酸素による分解が進行してしまい、代謝効率が低下し、ひいては有効成分である代謝産物の産生量が低下してしまう恐れがある。より好ましくは、溶存酸素濃度は０．１〜５ｍｇ／ｌであり、さらに好ましくは０．１〜４ｍｇ／ｌである。なお、溶存酸素濃度は株式会社堀場製作所製の溶存酸素計でＰＯ電極に隔膜ガルバニ電極法または隔膜ポーラログラフ法により測定される値とする。
【００３９】
代謝における温度は使用するプロテオバクテリアに応じて適宜調整することができ、脂肪酸の代謝効率の観点から、２０〜３０℃が好ましい。
【００４０】
本発明において、殺虫剤は、脂肪酸代謝物に加えバイオサーファクタントを含有し得る。脂肪酸代謝物が水に分散されやすくなり、殺虫剤の取扱性の観点から好ましいと考えられる。本発明に係るバイオサーファクタントとは、微生物が疎水性の高い物質を取り込むために産生し、細胞外へと分泌する界面活性剤様の物質を意味する。本発明において、プロテオバクテリアによって分泌されたバイオサーファクタントは、脂肪酸代謝物の水への分散も容易にするため、脂肪酸代謝物を含む殺虫剤の噴霧処理などが効率よく簡単に行えるようになる。しかしながら、バイオサーファクタントとしては、脂肪酸の分解時に本発明のプロテオバクテリアによって産生されたバイオサーファクタントだけではなく、他の微生物が産生したバイオサーファクタントが使用されてもよく、すなわち、本発明の殺虫剤には他の微生物によって産生されたバイオサーファクタントがさらに添加されてもよい。人工的に合成された界面活性剤と比較して、バイオサーファクタントは生物に関する毒性が低く、また、生分解性も高いため、より環境に優しい殺虫剤が得られると考えられる。また、プロテオバクテリアによる脂肪酸分解を促進させるために、他の微生物が産生したバイオサーファクタントが、プロテオバクテリアによる脂肪酸分解において添加されてもよい。プロテオバクテリアによる脂肪酸の取り込みが促進される可能性がある。
【００４１】
本発明の殺虫剤は、土壌汚染や毒性は低いが、殺虫効果には優れる気門封鎖型殺虫剤である。さらに、本発明の殺虫剤は、植物に施用された場合に、植物に全身獲得抵抗性を誘導して抵抗性遺伝子発現量を増加させ、害虫に対する殺虫成分を植物に産生させることができる。しかも、本発明の殺虫剤は、サリチル酸経路およびジャスモン酸経路ともに、上流および下流の遺伝子の両方を発現させることができるので、抵抗性誘導が持続し、持続的な殺虫効果が得られると考えられる。
【００４２】
本発明の殺虫剤は、微小害虫を殺虫するために用いられ得る。微小害虫としては、これらに限定される訳ではないが、ワタアブラムシなどのアブラムシ科、ハダニ科、コガネムシ科、ヤガ科、ハバチ科などの害虫および／またはその幼虫が例示される。
【００４３】
本発明の殺虫剤の施用方法としては特に限定されない。例えば、害虫、害虫のついた植物および／または土壌に施用することが可能である。また、施用される植物も限定されるものではなく、植物一般に対して良好に用いることができる。例えば、ナス科、ウリ科、バラ科などの双子葉類植物、イネ科などの単子葉類植物が挙げられる。
【００４４】
製造方法
本発明の脂肪酸代謝物を含む殺虫剤の製造方法は、炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含むことを特徴とする。
【００４５】
本発明における脂肪酸代謝工程は、０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下においてプロテオバクテリアが外分泌または内分泌する酵素等により炭素数４〜３０の脂肪酸の分解が行われる工程である。例えば、０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下、脂肪酸を含有する培地でプロテオバクテリアを培養することにより行われる工程が挙げられる。
【００４６】
脂肪酸代謝工程における溶存酸素濃度は、０．１〜８ｍｇ／ｌである。溶存酸素濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満の場合は、プロテオバクテリアの活動が低下し脂肪酸の代謝効率が極めて低くなる傾向がある。また、溶存酸素濃度が８ｍｇ／ｌを超える場合は、プロテオバクテリアによる代謝工程と並行して、基質である脂肪酸の培地中の酸素による分解が進行してしまい、代謝効率が低下し、ひいては有効成分である代謝産物の産生量が低下してしまう恐れがある。より好ましくは、溶存酸素濃度は０．１〜５ｍｇ／ｌであり、さらに好ましくは０．１〜４ｍｇ／ｌである。なお、溶存酸素濃度は株式会社堀場製作所製の溶存酸素計でＰＯ電極に隔膜ガルバニ電極法または隔膜ポーラログラフ法により測定される値とする。
【００４７】
溶存酸素濃度は、培養容器、振とう数、通気量などによって、調整することができる。
【００４８】
脂肪酸代謝工程における培養条件は、溶存酸素濃度を所定の範囲とすること以外は、従来の好気性細菌を培養する条件と同様の条件とすることができる。例えば、フラスコによる振とうや、スピナーフラスコまたはジャーファメンターによる通気培養により３〜７日間培養する方法が挙げられる。
【００４９】
培養日数は、脂肪酸の乳化、分解等が充分に行われる日数とすることが好ましいが、撹拌や菌量によって培養日数は変化する。なお、脂肪酸代謝工程の終了は、脂肪酸の分解状態を、波長２３０ｎｍにおける吸光度の測定、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）等で確認することが好ましい。
【００５０】
脂肪酸代謝工程における温度は使用するプロテオバクテリアに応じて適宜調整することができ、脂肪酸の代謝効率の観点から、２０〜３０℃の条件下で実施することが好ましい。
【００５１】
脂肪酸代謝工程における脂肪酸およびプロテオバクテリアは、本発明の殺虫剤の説明で前述したものを使用することができる。
【００５２】
なお、プロテオバクテリアの前培養工程としては、特に限定されず通常の好気性細菌の培養方法とすることができる。前培養液から遠心分離等により菌体のみを回収し、脂肪酸代謝工程に用いることが好ましい。
【００５３】
本発明の製造方法により得られる殺虫剤は、脂肪酸代謝物に加えバイオサーファクタントを含有し得る。本発明に係るバイオサーファクタントとは、微生物が疎水性の高い物質を取り込むために産生し、細胞外へと分泌する界面活性剤様の物質を意味する。本発明において、プロテオバクテリアによって分泌されたバイオサーファクタントは、脂肪酸代謝物の水への分散も容易にする。殺虫剤の取扱性が向上すると考えられる。
【００５４】
本発明の殺虫剤は、培地、バイオサーファクタントを含むプロテオバクテリアの外分泌物、菌体などとの混合物である培養液として得られる。当該培養液をそのまま本発明の殺虫剤としてもよく、培養液から遠心分離などにより菌体を除去した上澄み液を殺虫剤としてもよい。培養液は原液のままでも使用することができるが、害虫のついた植物に施用する場合、原液のまま用いると高温時に植物への処理部分が、ミネラル分が蒸発濃縮され浸透圧の影響で縮む恐れがあるため、原液を希釈して使用することが望ましい。希釈倍率としては本発明の効果を発揮する限り特に限定されないが、１０〜１０００倍希釈が好ましく、１０〜１００倍希釈がさらに好ましい。なお、除去した菌体を再度、脂肪酸を含有する培地で培養することにより本発明の脂肪酸代謝工程を繰り返し行うことが可能である。
【実施例】
【００５５】
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。【００５６】
試験用殺虫剤の調製
＜前培養工程＞
ガラス製三角フラスコ内の１ｌ（リットル）の水にペプトン（Ｄｉｆｃｏ製のタンパク質酵素加水分解物）２０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物１．５ｇおよびリン酸水素二カリウム１．５ｇ、または、１ｌ（リットル）の水にペプトン（Ｄｉｆｃｏ製のタンパク質酵素加水分解物）１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇおよび塩化ナトリウム１０ｇを溶解させ、１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌を行い、室温まで冷却後、プロテオバクテリアの菌液を植菌した。なお、培養容器の口はシリコン栓で密栓した。植菌後の容器をバイオシェーカー（タイテック株式会社製のＢＲ−２３ＵＭ）を用い、２５±５℃、１２０ｒｐｍの条件下で、２４時間培養を行った。培養液中の菌数は５×１０8ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった。培養後、培養液を１５，０００×Ｇ、２０℃の条件で遠心分離することで培養液から菌体を回収した。【００５７】
＜脂肪酸代謝工程＞
ガラス製三角フラスコ内の１ｌ（リットル）の滅菌水に、リノール酸（和光純薬工業株式会社製の一級リノール酸）１２ｇ、硫酸マグネシウム七水和物１．５ｇおよび／またはリン酸水素二カリウム１．５ｇ、および前培養工程から得られた菌体の全量を加えた。これを、バイオシェーカー（タイテック株式会社製のＢＲ−２３ＵＭ）を用い、２０℃、１２０ｒｐｍ、溶存酸素濃度４ｍｇ／ｌの条件下で、４日間培養を行った。なお、リノール酸の分解は、リノール酸中間生成物の１つである酸化脂質の培養液中の濃度を株式会社島津製作所製の分光光度計ＢｉｏＳｐｅｃ−ｍｉｎｉを用いて波長２３０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、確認した。培養後、菌体を含む培養液を試験用殺虫剤とし、下記の評価を行った。【００５８】
ワタアブラムシ成虫に対する殺虫効果
・実施例１〜３
最大長さ１０ｃｍのキュウリの本葉を２ｃｍ四方に切り取り、その葉裏にワタアブラムシ成虫２０頭を定着させたものを準備した。試験用殺虫剤の原液（実施例１）ならびにその１０倍および１００倍希釈液（実施例２および３）を、噴霧量１９０μｌ／ｃｍ2で虫体に噴霧した。シャーレの中に葉と虫を載置し、本発明の殺虫剤を噴霧し、２４時間後に、生存虫数、死虫数を測定した。対照として、虫体に水を噴霧し、同様に供試虫の生存虫数、死虫数を測定した。以下の式に基づいて補正死虫率を求めた。
補正死虫率（％）＝｛（対照における生存虫率−処理後の生存虫率）／対照における生存虫率｝×１００
ここで、補正死虫率が高いものほど殺虫効果が高かったことを示している。結果を図１に示す。【００５９】
・比較例１〜６
試験用殺虫剤に替えて、既存の、オレイン酸ナトリウムを有効成分として含有する気門封鎖型殺虫剤（比較例１）、ヒドロキシプロピルデンプンを有効成分として含有する気門封鎖型殺虫剤（比較例２）、ピレトリンを有効成分とする殺虫剤（比較例３）、アセタミプリドを有効成分とする殺虫剤（比較例４）、代表的なバイオサーファクタントであるサーファクチンナトリウムの１％溶液（比較例５）、および、１％ＳＤＳ（比較例６）を用いたこと以外は実施例１〜３と同様に処理して補正死虫率を求めた。結果を図１に示す。【００６０】
図１に示されるように、希釈なしの試験用殺虫剤（原液）で処理した場合、補正死虫率は１００％であり、既存殺虫剤と同等である補正死虫率を示した。したがって、本発明の殺虫剤が、従来の気門封鎖型殺虫剤やピレスロイド系およびアセタミプリド系の殺虫剤と同等の優れた殺虫効果を有していることがわかる。【００６１】
ガ幼虫に対する殺虫効果
・実施例４
屋外で栽培中のバラより採取したガ幼虫を約２５℃で４８時間飼育した後、体長別に３つの群（１．０ｃｍ未満、１．０〜２．０ｃｍ、２．０ｃｍより大きい）に分けた。シャーレ内にバラの葉を置き、その上に３つの群のうちのいずれか一つの群のガ幼虫１頭を置いた。各群につきそれぞれ４頭（体長１．０ｃｍ未満）、５頭（体長１．０〜２．０ｃｍ）、５頭（体長２．０ｃｍより大きい）のガ幼虫を用いた。試験用殺虫剤を水で３０倍に希釈した希釈液を１．１ｍｌの噴霧量で虫体に噴霧した。シャーレの蓋を閉じて暗所で静置し、２４時間後に、ガ幼虫の生死を観察し、死虫率を産出した。対照として、ガ幼虫に水を噴霧したものを同様に試験した。結果を表１に示す。【００６２】
【表１】
2018168582.tif 000002
【００６３】
表１に示されるように、試験用殺虫剤の３０倍希釈液を噴霧した場合、２０％〜１００％の死虫率を示し、水を噴霧した場合よりも高い死虫率を示した。特に、体長１．０ｃｍ未満の幼齢幼虫では、死虫率は１００％であり、高い殺虫効果が確認された。したがって、本発明の殺虫剤が優れた殺虫効果、とりわけ微小害虫に対する高い殺虫効果を有していることがわかる。【００６４】
上記の結果より、本発明の殺虫剤および本発明の製造方法により製造される殺虫剤が、土壌汚染や毒性が低く、殺虫効果に優れた殺虫剤であることがわかる。
【図１】
2018168582.tif 000003
【国際調査報告】
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