(57)【要約】  水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体粒子に対して、水溶性高分子を変質させることなく結合させたリンカー分子を介して低原子価遷移金属を含む分子を修飾することで、分散性と触媒活性を失うことなく、さらに持続的な抗腫瘍効果を付与した酸化チタン−金属複合体粒子である超音波癌治療促進剤が提供される。本発明では、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体粒子の酸化チタン表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくともひとつの官能基を介してリンカー分子を結合させ、さらにリンカー分子を介して低原子価遷移金属を含む分子を修飾することで、分散性と触媒活性を保ちながら、さらに持続的な抗腫瘍効果を付与した、酸化チタン−金属複合体粒子である超音波癌治療促進剤を提供できる。この超音波癌治療促進剤は患部に集積し、超音波照射と併せた治療のための薬剤として利用できる。
2010016581.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化チタン粒子、および該酸化チタン粒子の表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくとも一つの官能基を介して結合されてなる水溶性高分子を含んでなる、酸化チタン複合体粒子と、
該酸化チタン複合体粒子の表面にさらに結合されてなるリンカー分子と
を含んでなり、該リンカー分子が、
（１）カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくとも一つの官能基を有し、
（２）ａ）炭素数６〜４０よりなる飽和又は不飽和の鎖状炭化水素基、ｂ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環複素環式基、又はｃ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環環状炭化水素基を含んでなる
化合物であって、該官能基同士で重合すること無く、該官能基を介して前記酸化チタンと結合され、
該リンカー分子を介して低原子価遷移金属を含む分子が前記酸化チタン複合体粒子にさらに結合されてなり、
超音波の照射による触媒活性を有する酸化チタン−金属複合体粒子であることを特徴とする超音波癌治療促進剤。
【請求項２】
前記リンカー分子の結合量が前記酸化チタン粒子の質量あたり、１×１０−６〜１×１０−３  ｍｏｌ／酸化チタン粒子‐ｇである、請求項１に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項３】
前記リンカー分子がカテコール類である、請求項１または２に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項４】
前記リンカー分子が、ドーパミン、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項３に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項５】
前記低原子価遷移金属を含む分子が、二価の鉄を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項６】
前記二価の鉄の結合量が、前記酸化チタン粒子の質量あたり、１×１０−６〜１×１０−３  ｍｏｌ／酸化チタン粒子‐ｇである、請求項５に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項７】
前記低原子価遷移金属を含む分子が、フェロセンカルボン酸である、請求項５に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項８】
前記水溶性高分子が重量平均分子量５０００〜４００００である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項９】
前記水溶性高分子が、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、ポリエチレンイミンの群から選択される少なくとも一種を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１０】
２０〜２００ｎｍの粒子径を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤と、該超音波癌治療促進剤が分散される溶媒とを含んでなる、分散液。
【請求項１２】
前記溶媒が、水系溶媒である、請求項１１に記載の分散液。
【請求項１３】
前記溶媒のｐＨが５〜８である、請求項１１または１２に記載の分散液。
【請求項１４】
前記溶媒が、生理食塩水である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の分散液。
【請求項１５】
前記超音波癌治療促進剤が、０．００１〜１質量％含有される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の分散液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体粒子に対して、水溶性高分子を変質させることなくリンカー分子を酸化チタン表面に結合させ、さらに該リンカー分子を介して低原子価遷移金属を含む分子が結合されてなり、超音波の照射による触媒活性を有し、さらに持続的な抗腫瘍効果を付与した酸化チタン−金属複合体粒子であることを特徴とする、超音波癌治療促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸化チタンはｐＨ６前後に等電点を有すると言われている。このため、酸化チタン粒子は中性付近の水系溶媒中では凝集を生じてしまい、これを均一に分散させることは極めて難しい。そのため、酸化チタン粒子を水系の分散媒に均一に分散させるため、今まで種々の試みがなされてきた。【０００３】
ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を分散剤として添加して、分散媒中における酸化チタン粒子の分散性を向上させることが知られている（特許文献１（特開平２−３０７５２４号公報）および特許文献２（特開２００２−６０６５１号公報）参照）。【０００４】
あるいは酸化チタン微粒子に、ポリアクリル酸やポリエチレングリコール等の親水性高分子を、カルボキシル基やジオール基等の官能基を介して酸化チタン表面に強く結合させた、表面改質酸化チタン微粒子も知られている（特許文献３（ＷＯ２００４／０８７５７７）および特許文献４（特開２００８−１６２９９５号公報）参照）。これらの技術は、酸化チタン表面が官能基同士で重合して覆い尽くされることが無いため、生体内環境に近い中性の生理食塩水においても安定した分散性を示し、かつ紫外線や超音波照射時の触媒活性機能を有するものである。【０００５】
また、超音波の照射による触媒活性を有する超音波癌治療促進剤が提案されている。（特許文献５（特開２００８−０９４８２４号公報）参照）。この技術は、酸化チタンを含む金属半導体粒子に超音波を照射することにより、高い安全性を確保しながら、ラジカル種や活性酸素種の発生に伴う抗腫瘍効果を期待できるものである。このとき、ヒドロキシラジカル等のラジカル種の寿命は非常に短いため、超音波照射を停止した直後から、それまで発生したラジカル種の量は著しく減少すると考えられる。【０００６】
ヒドロキシラジカルの発生については様々な方法が考えられているが、例えば二価の鉄等の低原子価遷移金属を用いて、過酸化水素をＨａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ機構によって分解する、いわゆるフェントン反応等がよく知られている（非特許文献１参照）。【０００７】
一方で、酸化チタンと鉄を複合化した材料が提案されている。例えば、鉄の磁性を利用して、複合化した酸化チタン微粒子を溶液から磁場によって回収する試みが提案がされている。具体的には、強磁性体金属の表面に酸化チタンを担持した系（特許文献６（特開平９−６６２３７号公報）参照）、軟磁性粉末表面に酸化チタンを担持した系（特許文献７（特開２０００−２８８４０４号公報）参照）、およびフェライト磁性粒子の表面に光触媒を担持した系（特許文献８（特開平１１−１５６２００号公報）参照）などが提案されている。あるいは、電荷分離の効率を上げる目的で、酸化チタンや酸化タングステンと鉄を複合化する提案もされている。（特許文献９（特開２００６−１９８４６５号公報）参照）。【０００８】
しかしながら、これら酸化チタンと鉄を複合化した材料は、酸化チタンのいわゆる光触媒としての機能を高めたり、利用したりする目的で検討されているものであり、超音波の照射による触媒活性に関しては何ら言及されていない。また、生体内環境において安定した分散性を示すための検討がなされたものではない。さらにこれらに加えて、フェントン反応を利用する検討もなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平２−３０７５２４号公報
【特許文献２】特開２００２−６０６５１号公報
【特許文献３】ＷＯ２００４／０８７５７７号パンフレット
【特許文献４】特開２００８−１６２９９５号公報
【特許文献５】特開２００８−０９４８２４号公報
【特許文献６】特開平９−６６２３７号公報
【特許文献７】特開２０００−２８８４０４号公報
【特許文献８】特開平１１−１５６２００号公報
【特許文献９】特開２００６−１９８４６５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】活性酸素種の化学〔季刊  化学総説  Ｎｏ．７〕  日本化学会編
【発明の概要】
【００１１】
本発明者らは、今般、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体粒子の酸化チタン表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくともひとつの官能基を介してリンカー分子を結合させることにより、前記水溶性高分子を変質させることなく、分散性と触媒活性を保ちながら、新たに低原子価遷移金属を含む分子を付与することが可能である、との知見を得た。
【００１２】
したがって、本発明は、水溶性高分子により水系溶媒中で分散性を保ち、超音波の照射による触媒活性を利用した抗腫瘍効果を有する酸化チタン複合体粒子に対して、水溶性高分子を変質させることなくリンカー分子を介して低原子価遷移金属を含む分子を修飾することで、分散性と触媒活性を失うことなく、さらに持続的な抗腫瘍効果を付与した酸化チタン−金属複合体粒子であることを特徴とする超音波癌治療促進剤の提供をその目的としている。
【００１３】
すなわち、本発明によれば、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体粒子の酸化チタン表面にリンカー分子を結合し、さらに該リンカー分子を介して低原子価遷移金属を含む分子を結合させることにより、水溶性高分子を変質させることなく高い分散性を保持し、なおかつ超音波の照射による触媒活性を有し、さらに持続的な抗腫瘍効果を付与した酸化チタン−金属複合体粒子であることを特徴とする超音波癌治療促進剤を提供することができる。該超音波癌治療促進剤に対して超音波照射をすることで、超音波照射を停止した後も、系中に蓄積した過酸化水素と、該超音波癌治療促進剤に結合した低原子価遷移金属を含む分子とのフェントン反応によって、発生を継続的に行い、これに伴う持続的な抗腫瘍効果を得ることが可能である。該超音波癌治療促進剤を生体に投与して粒子の大きさによるＥＰＲ効果で患部である癌近傍に集積させ、さらに超音波照射を行うことで高い抗腫瘍効果を得ることができる。よって本発明の該超音波癌治療促進剤は、患部に集積させ、さらに超音波を照射することにより行われる、超音波癌治療を促進する薬剤として利用できる。
【００１４】
そして、本発明の超音波癌治療促進剤は、
酸化チタン粒子、および該酸化チタン粒子の表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくとも一つの官能基を介して結合されてなる水溶性高分子を含んでなる、酸化チタン複合体粒子と、
該酸化チタン複合体粒子の表面にさらに結合されてなるリンカー分子と
を含んでなり、該リンカー分子が、
（１）カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくとも一つの官能基を有し、
（２）ａ）炭素数６〜４０よりなる飽和又は不飽和の鎖状炭化水素基、ｂ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環複素環式基、又はｃ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環環状炭化水素基を含んでなる
化合物であって、該官能基同士で重合すること無く、該官能基を介して前記酸化チタンと結合され、
該リンカー分子を介して低原子価遷移金属を含む分子が前記酸化チタン複合体粒子にさらに結合されてなり、
超音波の照射による触媒活性を有する酸化チタン−金属複合体粒子であることを特徴とするものである。
【００１５】
また、本発明による分散液は、上記超音波癌治療促進剤と、該超音波癌治療促進剤が分散される溶媒とを含んでなるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の超音波癌治療促進剤の一例を示す図である。
【図２】例９において各種粒子について測定された、超音波照射による一重項酸素の発生に起因する、一重項酸素検出用蛍光試薬を介した蛍光強度を示す図である。
【図３】例１１において酸化チタン複合体粒子Ｅについて測定された、超音波照射時のヒドロキシラジカルの発生に起因する、ヒドロキシラジカル検出用蛍光試薬を介した蛍光強度を示す図である。
【図４】例１２において酸化チタン複合体粒子Ｄおよび酸化チタン複合体粒子Ｅについて測定された、超音波照射時のヒドロキシラジカルの発生に起因する、ヒドロキシラジカル検出用蛍光試薬を介した蛍光強度を示す図である。
【図５】例１４において酸化チタン複合体粒子Ｄおよび酸化チタン複合体粒子Ｆについて測定された、過酸化水素添加時のヒドロキシラジカルの発生に起因する、ヒドロキシラジカル検出用蛍光試薬を介した蛍光強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明による超音波癌治療促進剤は、酸化チタン粒子と、水溶性高分子と、リンカー分子と、低原子価遷移金属を含む分子とからなる酸化チタン−金属複合体粒子を含む。図１に、超音波癌治療促進剤の一例を示す。図１に示されるように、超音波癌治療促進剤は、酸化チタン粒子１の表面に水溶性高分子２およびリンカー分子３を介して低原子価遷移金属を含む分子４が結合されたものである。酸化チタン粒子１と、水溶性高分子２およびリンカー分子３との結合は、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基を介して形成される。
【００１８】
すなわち、これらの官能基は酸化チタンとの間で強固な結合を形成するため、酸化チタン粒子の高い触媒活性に関わらず分散性を保持できる。また、リンカー分子を介して低原子価遷移金属を含む分子の結合を保持することが可能である。なお、本発明における結合形態は、体内における安全性の観点から、体内への投与後２４〜７２時間後に分散性が確保されている程度の結合形態であればよい。生理条件での分散が安定しており、かつ超音波照射後も水溶性高分子の遊離が無く、正常細胞へのダメージが少ない点で、共有結合であるのが望ましい。
【００１９】
カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基は、３官能シラノール基のような相互に三次元的に縮合重合して重合物で酸化チタン粒子の表面を覆い尽くしてしまう官能基とは異なり、官能基同士で重合することが無いため、図１に示されるように酸化チタン粒子の表面に剥き出しの部分を確保することができると考えられる。その結果、表面が重合体で覆われることによって起こりうる失活を抑制しつつ、酸化チタン粒子の触媒活性を十分に発揮させることができる。
【００２０】
そして、酸化チタン粒子の表面に結合した水溶性高分子は、電荷あるいは水和の作用によって、酸化チタン粒子の分散が困難とされる中性付近の水系溶媒中であって、本発明の抗腫瘍剤を分散させることができる。抗体等の機能性分子を、酸化チタン粒子の表面に結合した水溶性高分子に対して導入する方法については公知である。このような場合は、水溶性高分子と機能性分子を化学結合するために、水溶性高分子は反応性の高い極性基を含んでなることが必要である。この水溶性高分子に含まれる極性基は、機能性分子が結合されると失われる。このことにより、水溶性高分子の極性自体に変化が生じる。つまり、酸化チタン粒子の表面に結合した水溶性高分子のもつ電荷あるいは水和の作用によって分散しているバランスが、機能性分子の結合前後において変化すると考えられる。この酸化チタン粒子の表面に結合した水溶性高分子の変質に伴う電荷あるいは水和のバランスをうまくコントロールすることでのみ達成しうる。一方、本発明における酸化チタン粒子の表面に結合したリンカー分子を介して結合した低原子価遷移金属を含む分子については、水溶性高分子を変質させることなく結合させることにより、水溶性高分子による高い分散性を保持できる。このため、水溶性高分子の変質によって生じる分散性の変化を考慮することなく、結合に際して自由度の高い分子設計が可能である。
【００２１】
本発明の超音波癌治療促進剤によれば、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体粒子の酸化チタン表面にリンカー分子を結合し、さらに該リンカー分子を介して低原子価遷移金属を含む分子を結合させることにより、水溶性高分子を変質させることなく高い分散性を保持する酸化チタン−金属複合体粒子であることを特徴とする超音波癌治療促進剤を作製することができる。本発明の超音波癌治療促進剤に対して超音波照射をすることでラジカル種の発生に伴う抗腫瘍効果を得ることができる。一般的にラジカル種は高い反応性をもつが寿命が短く、ごく僅かに拡散して近傍の物質と反応する。このため、超音波照射を停止した直後から、それまで発生したラジカル種の量は著しく減少すると考えられる。本発明の超音波癌治療促進剤は、上述のように低原子価遷移金属を含む分子を結合することにより、超音波照射を停止した後も、超音波照射によって系中に蓄積した過酸化水素と、該超音波癌治療促進剤に結合した低原子価遷移金属を含む分子とがフェントン反応を起こしてラジカルの発生を継続的に行い、これに伴う持続的な抗腫瘍効果を得ることが可能である。本発明の超音波癌治療促進剤を静脈注射等によって生体に投与して患部である癌近傍に集積させ、さらに超音波照射を行うことで、持続的な効果を付与した高い抗腫瘍効果を得ることができる。よって本発明の超音波癌治療促進剤は、投与後に患部へ集積させ、さらに超音波を照射することにより行われる超音波癌治療を促進するための薬剤としての効果を期待できる。
【００２２】
また、酸化チタン粒子の表面の一部に鉄を含む結晶を複合化したり、逆に鉄を含む酸化鉄粒子等の表面の一部に酸化チタンの結晶を複合化する方法については公知である。このような場合は、酸化チタン粒子表面を覆ってしまったり、酸化チタンの結晶量が制限されたりする。そのため、超音波照射による酸化チタン粒子の触媒活性を十分に発揮させることが難しいと考えられる。一方、本発明の超音波癌治療促進剤は、酸化チタン粒子の表面にカルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくともひとつの官能基を含むリンカー分子を結合し、さらに該リンカー分子を介して低原子価遷移金属を含む分子を結合させることにより、酸化チタン粒子の表面に強固に結合することが可能であり、さらに、図１に示されるように酸化チタン粒子の表面に剥き出しの部分を多く確保することができると考えられる。その結果、表面が覆われることによって起こりうる失活を抑制し、酸化チタン粒子の触媒活性を十分に発揮させることができる。
【００２３】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる水溶性高分子は、酸化チタン粒子の表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくともひとつの官能基を介して結合されてなることが好ましい。これによって、酸化チタン粒子の表面に強固に結合することが可能であり、また、３官能シラノール基のような相互に三次元的に縮合重合して重合物で酸化チタン粒子の表面を覆い尽くしてしまう官能基とは異なり、官能基同士で重合することが無いため、図１に示されるように酸化チタン粒子の表面に剥き出しの部分を多く確保することができると考えられる。その結果、表面が重合体で覆われることによって起こりうる失活を抑制し、酸化チタン粒子の触媒活性を十分に発揮させることができる。
【００２４】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる水溶性高分子は、酸化チタン−金属複合体粒子を水系溶媒中で分散させることができれば特に限定されないが、電荷を有するものとしては、アニオン性またはカチオン性を有する水溶性高分子、また、電荷を有さずに水和によって分散性を与えるものとしてはノニオン性を有する水溶性高分子が挙げられ、これらの少なくとも一種を含んでなる。
【００２５】
本発明の好ましい態様によれば、前記水溶性高分子は重量平均分子量２０００〜１０００００である。水溶性高分子の重量平均分子量はサイズ排除クロマトグラフィーを用いて求めた値である。前記分子量をこの範囲とすることで、水溶性高分子のもつ電荷あるいは水和の作用によって、酸化チタン粒子の分散が困難とされる中性付近の水系溶媒中であって酸化チタン−金属複合体粒子を分散させることができる。より好ましい範囲は５０００〜１０００００であり、さらに好ましくは５０００〜４００００である。
【００２６】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる水溶性高分子は、アニオン性を有する水溶性高分子として本発明の超音波癌治療促進剤を水系溶媒中で分散させることができればいずれも使用可能であるが、複数のカルボキシル基を有するものとしては、例えばカルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルセルロース、ポリカルボン酸類、およびカルボキシル基単位を有する共重合体（コポリマー）などが挙げられる。具体的には、水溶性高分子の加水分解性および溶解度の観点から、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸等のポリカルボン酸類、およびアクリル酸／マレイン酸やアクリル酸／スルフォン酸系モノマーの共重合体（コポリマー）がより好適に使用され、さらに好ましくはポリアクリル酸である。
【００２７】
アニオン性を有する水溶性高分子として、ポリアクリル酸を用いる場合、分散性の観点からポリアクリル酸の重量平均分子量は２０００〜１０００００であるのが好ましく、より好ましくは５０００〜４００００であり、さらに好ましくは５０００〜２００００である。
【００２８】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる水溶性高分子は、カチオン性を有する水溶性高分子として本発明の超音波癌治療促進剤を水系溶媒中で分散させることができればいずれも使用可能であるが、複数のアミノ基を有するものとしては、例えばポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリアミン類、およびアミン単位を有する共重合体（コポリマー）などが挙げられる。具体的には、水溶性高分子の加水分解性および溶解度の観点から、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等のポリアミン類がより好適に使用され、さらに好ましくはポリエチレンイミンである。
【００２９】
カチオン性を有する水溶性高分子として、ポリエチレンイミンを用いる場合、分散性の観点からポリエチレンイミンの重量平均分子量は２０００〜１０００００であるのが好ましく、より好ましくは５０００〜４００００であり、さらに好ましくは５０００〜２００００である。
【００３０】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる水溶性高分子は、ノニオン性を有する水溶性高分子として本発明の超音波癌治療促進剤を水系溶媒中で分散させることができればいずれも使用可能であるが、好ましくは水酸基および／またはポリオキシアルキレン基を有する高分子が挙げられる。そのような水溶性高分子の好ましい例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、デキストランあるいはそれらを含有するコポリマーが挙げられ、より好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデキストランであり、さらに好ましくはポリエチレングリコールである。
【００３１】
ノニオン性を有する水溶性高分子として、ポリエチレングリコールを用いる場合、分散性の観点からポリエチレングリコールの重量平均分子量は２０００〜１０００００であるのが好ましく、より好ましくは５０００〜４００００である。
【００３２】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いるリンカー分子は、酸化チタン粒子表面に結合してなるが、該リンカー分子はカルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくともひとつの官能基を有する。
【００３３】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いるリンカー分子は、ａ）炭素数６〜４０よりなる飽和又は不飽和の鎖状炭化水素基、ｂ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環複素環式基、又はｃ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環環状炭化水素基を含んでなる化合物である。
【００３４】
上記炭素数よりなるリンカー分子は、前記水溶性高分子と比べて分子の大きさが小さい。また、リンカー分子は酸化チタン表面に結合してなる。このため、本発明の酸化チタン−金属複合体粒子において、外殻に水溶性高分子が位置するのに対し、より内部の位置にリンカー分子を有する構造をとる。該外殻は本発明の抗腫瘍剤の分散性に対する影響が最も大きい。すなわち外殻に位置する水溶性高分子に対して、内部に位置するリンカー分子が分散性に与える影響は小さくなり、好適に用いることが出来る。
【００３５】
本発明の超音波癌治療促進剤に結合されたリンカー分子の量は、酸化チタン粒子の質量：１ｇあたり、１．０×１０−６〜１．０×１０−３  ｍｏｌであり、より好ましくは１．０×１０−６〜１．０×１０−４  ｍｏｌ／酸化チタン粒子‐ｇである。この範囲であると、本発明の超音波癌治療促進剤は生体内環境に近い、１０％タンパク質溶液を溶媒としても分散することができるため、好適に用いることができる。さらに、この範囲であると、本発明の超音波癌治療促進剤は超音波を照射する際に触媒活性を有し、ラジカル種を発生することができるため、好適に用いることができる。
【００３６】
そのようなリンカー分子の例としては、芳香族化合物やアルキル構造をもつ分子等が考えられ、より具体的には、ベンゼン環をもつ分子として、カテコール、メチルカテコール、ターシャリーブチルカテコールドーパ、ドーパミン、ジヒドロキシフェニルエタノール、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、ジヒドロキシフェニル酢酸等の、分子内にカテコールの構造を有する、カテコール類などがあげられる。また、他の環状分子として、フェロセン、フェロセンカルボン酸、アスコルビン酸、ジハイドロキシシクロブテンジエン、アリザリン、ビナフタレンジオール等が好適に使用できる。さらに、アルキル構造をもつ分子としては、ヘキシル基、オクチル基、ラウリル基、パルミチル基、ステアリル基などのアルキル基を有する分子があげられる。あるいは、ヘキセニル基、オクテニル基、オレイル基などのアルケニル基、または、シクロアルキル基などの飽和又は不飽和脂肪族炭化水素基をもつものなどがあげられる。
【００３７】
本発明の好ましい態様によれば、リンカー分子を介して結合する低原子価遷移金属を含む分子において、低原子価遷移金属はＨａｒｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ機構によって過酸化水素を分解してヒドロキシラジカルを発生することが知られており（非特許文献（活性酸素種の化学〔季刊  化学総説  Ｎｏ．７〕  日本化学会編）参照）、低原子価遷移金属として、例えば二価の鉄イオンを用いた場合はＦｅｎｔｏｎ反応としてよく知られている。また、ヒドロキシラジカルを含む各種のラジカルは細胞障害作用を有している。そのため、リンカー分子を介してこれらの低原子価遷移金属を含む分子が結合していれば、過酸化水素が存在する限りラジカルを発生することが可能となり、細胞障害作用を持続することができる。すなわち、超音波照射を停止した後も、系中に蓄積した過酸化水素と、本発明の抗腫瘍剤に結合した低原子価遷移金属を含む分子とのフェントン反応によって、より酸化力の強いヒドロキシラジカルを発生を継続的に行い、これに伴う持続的な抗腫瘍効果を得ることが可能である。ただし、低原子価遷移金属を含む分子として錯体を用いた場合、フリーのヒドロキシラジカルだけではなく、例えば鉄錯体を用いた場合に生じうるフェリル錯体等、いわゆるＣｒｙｐｔｏ−ＨＯ・の形で酸化反応に関与することも考えられる。このような低原子価遷移金属としては、二価の鉄の他に、三価のチタン、二価のクロム、一価の銅などが挙げられる。さらに、このような低原子価遷移金属を含む分子としては、フェロセンカルボン酸、ビシンコニン酸と一価の銅との錯体等が挙げられる。
【００３８】
本発明の好ましい様態によれば、リンカー分子を介して結合する二価の鉄の結合量は前記酸化チタン粒子の質量あたり、１×１０−６〜１×１０−３  ｍｏｌ／酸化チタン粒子‐ｇである。結合量がこれ以上になると、ラジカル種の生成量が減少し、癌治療促進剤としての機能が低下する。また、鉄の結合量がこれ以下である場合も、同様にラジカル種の生成量が減少する。
【００３９】
本発明の好ましい態様によれば、リンカー分子を介して結合する分子としては、低原子価遷移金属を含む分子の他にも含んでいても何ら問題はない。そのようなリンカー分子を介して結合する分子としては、特に制限はないが、例えば本発明の超音波癌治療促進剤を積極的に癌部位へ集積させるため、抗体分子を結合してもよい。該抗体の抗原は癌細胞もしくは新生血管等の癌近傍組織に由来することが望ましい。あるいは、抗体をＦａｂ領域等に低分子化させたフラグメントを用いることも何ら問題はない。
【００４０】
また、本発明の抗腫瘍剤を積極的に癌部位へ集積させるため、リンカー分子を介して結合する分子は抗体に限らず、例えば癌細胞もしくは新生血管等の癌近傍組織に由来する部位と相互作用を示すペプチドやアミノ酸配列であってもよい。より具体的には５−アミノレブリン酸、メチオニン、システイン、グリシン等が挙げられる。あるいは、糖鎖を含んでもよい。さらに、結合性を有する核酸を含んでいても良い。核酸としては、特に制限はなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸塩基、ＰＮＡ等のペプチド核酸、あるいはそれらが高次構造を形成するアプタマー等を用いることもできる。
【００４１】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いるリンカー分子は、上記機能を与える分子と酸化チタン表面に結合する官能基がさらに別のリンカーを介して結合してなる分子であってもなんら問題はない。
【００４２】
本発明の好ましい態様によれば、前記リンカーは、例えば生体分子同士を異なる官能基同士で結合する際に用いられるヘテロバイファンクショナルなクロスリンカーなどが考えられる。リンカーの具体例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−［α−マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸、Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド・ＴＦＡ、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド、Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸、Ｎ−［ε−マレイミドカプロン酸］ヒドラジド、Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−κ−マレイミドウンデカン酸、Ｎ−［κ−マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド、スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酪酸ヒドラジド・ＨＣｌ、３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジド、Ｎ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアネート、Ｎ−スクシンイミジル［４−アジドフェニル］−１，３’−ジチオプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル  Ｓ−アセチルチオアセテート、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオプロピオネート、スクシンイミジル  ３−［ブロモアセトアミド］プロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル  ヨードアセテート、Ｎ−スクシンイミジル［４−イオドアセチル］アミノベンゾエート、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート、スクシンイミジル６−［（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノネート］、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α［２−ピリジルジチオ］トルエン、Ｎ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート、Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、Ｎ−［κ−マレイミドウンデカノイルオキシ］−スルホスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノネート、スルホスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルチチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノネート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート，Ｎ−［ε−トリフルオロアセチルカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル、クロロトリアジン、ジクロロトリアジン、トリクロロトリアジン等が挙げられる。また、リンカーはさらに他のリンカー同士が結合されるような複数種類のリンカーから構成されてもよい。
【００４３】
本発明の好ましい態様によれば、酸化チタン粒子と水溶性高分子およびまたはリンカー分子との結合に用いられるジオール基としては、エンジオール基であることが好ましく、より好ましくはα−ジオール基である。これらの官能基を用いることで、優れた酸化チタン粒子への結合を実現することができる。
【００４４】
本発明の好ましい態様によれば、酸化チタン粒子が、アナターゼ型酸化チタンまたはルチル型酸化チタンであるのが好ましい。紫外線や超音波の照射による触媒活性を利用する場合にはアナターゼ型酸化チタンが好ましく、化粧料のように高い屈折率等の性質を利用する場合にはルチル型酸化チタンが好ましい。
【００４５】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる超音波癌治療促進剤は２０〜２００ｎｍの粒子径を有し、より好ましくは５０〜２００ｎｍであり、さらに好ましくは５０〜１５０ｎｍである。この粒径範囲であると、癌腫瘍への到達を目的として患者の体内に投与されると、ドラッグデリバリーシステムのように、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  Ｅｆｆｅｃｔ（ＥＰＲ効果）により癌組織に効率的に到達して蓄積される。そして、上述の通り、４００ｋＨｚ〜２０ＭＨｚの超音波の照射によりラジカル種の特異的生成が起こる。したがって、超音波の照射により高い効率で癌組織を殺傷することができる。
【００４６】
本発明の別の好ましい態様によれば、超音波癌治療促進剤が５０ｎｍ未満（例えば数ｎｍ）の粒子径を有する場合、見かけ上のサイズを大きくしてＥＰＲ効果を得ることもできる。すなわち、５０〜１５０ｎｍの粒子径を有する二次粒子の形態を有するように半導体粒子同士を多官能リンカーで連結する等の方法にて結合されることで、ＥＰＲ効果により高い癌治療効果を実現することができる。
【００４７】
本発明において超音波癌治療促進剤の粒子径は、動的光散乱法により測定することができる。具体的には、粒径分布測定装置（ゼータサイザーナノ、マルバーンインスツルメント社製）を用いて、キュミュラント解析で得られる、Ｚ−ａｖｅｒａｇｅ  ｓｉｚｅで示される値として得ることができる。
【００４８】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の超音波癌治療促進剤が、溶媒に分散されて分散液の形態とされてなるのが好ましい。これにより、本発明の超音波癌治療促進剤を、点滴、注射、塗布等の種々の方法により、患者の体内に効率的に投与する超音波癌治療促進剤として用いることができる。分散液の液性は限定されず、ｐＨ３〜１０の広範囲にわたって高い分散性を実現可能である。なお、体内投与における安全性の観点から、分散液は、ｐＨ５〜９であるのが好ましく、より好ましくは５〜８、特に中性の液性を有するのが好ましい。また、本発明の好ましい態様によれば、溶媒は水系溶媒であるのが好ましく、さらに好ましくはｐＨ緩衝液または生理食塩水である。水系溶媒の好ましい塩濃度は２Ｍ以下であり、体内投与における安全性の観点から２００ｍＭ以下がより好ましい。本発明の超音波癌治療促進剤は分散体に対して、０．００１〜１質量％以下含有されることが好ましく、より好ましくは０．００１〜０．１質量％である。この範囲内であれば、投与後、２４〜７２時間後に患部（腫瘍）に効果的に粒子を蓄積させることが可能となる。すなわち、患部（腫瘍）に粒子濃度が蓄積しやすくなるとともに、血中での粒子の分散性も確保されて凝集隗が形成しにくくなるため、投与後に血管の閉塞などの二次的弊害を招くおそれも無い。
【００４９】
本発明の超音波癌治療促進剤は、点滴、注射、塗布等の種々の方法により、患者の体内に投与することができる。特に静脈または皮下による投与経路で用いられる場合は、粒子の大きさによるＥＰＲ効果と、血中の滞留性を利用して、所謂ＤＤＳ的な治療により、患者の負担を軽減する観点から好ましい。そして、体内に投与された酸化チタン−金属複合体粒子は、ドラッグデリバリーシステムのように、癌組織に到達して集積される。
【００５０】
本発明の超音波癌治療促進剤は、抗体等をさらに複合化して患部に近い血管や臓器等を経由する投与経路で用いられる場合は、生体内環境での高い分散性および粒子に結合した抗体等と患部に由来する抗原との相互作用により、所謂局所ＤＤＳ的な治療により、患者の負担を軽減する観点から好ましい。そして、体内に投与された酸化チタン−金属複合体粒子は、ドラッグデリバリーシステムのように、癌組織に到達して集積される。
【００５１】
本発明の超音波癌治療促進剤は、超音波の照射を受け、該照射により細胞毒となることができる。この超音波癌治療促進剤は、体内に投与され、超音波照射を受け、該照射により細胞毒となることで、細胞を殺傷することができるが、体内に限らず、試験管内においても殺対象である細胞を殺傷することができる。本発明において、殺対象は特に限定されないが、癌細胞であるのが好ましい。すなわち、本発明による超音波癌治療促進剤によれば、超音波や紫外線の照射により活性化して癌細胞を殺傷する薬剤として用いることができる。
【００５２】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の超音波癌治療促進剤が集積された癌組織に超音波処理が行われる。使用する超音波の周波数は、４００ｋＨｚ〜２０ＭＨｚが好ましく、より好ましくは６００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ、さらに好ましくは１ＭＨｚ〜１０ＭＨｚである。超音波の照射時間は治療対象である癌組織の位置および大きさを考慮して適宜決定されるべきであり、特に限定されない。こうして、患者の癌組織を超音波により高い効率で殺傷して、高い癌治療効果を実現することができる。超音波は生体内の深部に外部より到達させることが可能で、本発明の酸化チタン−金属複合体粒子と併せて用いることにより、非侵襲の状態で生体内深部に存在するような患部やターゲット部位の治療が実現できる。さらに、患部やターゲット部位に本発明の酸化チタン−金属複合体粒子が集積することにより、周辺の正常細胞に悪影響を及ぼさない程度の微弱な超音波で本発明の酸化チタン−金属複合体粒子を集積させた局所のみに作用させることができる。
【００５３】
ところで、これらの半導体粒子が超音波の照射により活性化して細胞を殺傷する効果は、超音波照射によりラジカル種を生成させることにより得ることができる。すなわち、これらの半導体粒子が与える生物的殺傷効果はラジカル種の質的・量的な増加にあると考えられる。その理由は以下の通り推察される。すなわち、超音波照射のみでは系中には過酸化水素とヒドロキシルラジカルが発生するが、本発明者らの知見によれば、酸化チタンなどの半導体粒子の存在下では、過酸化水素及びヒドロキシルラジカルの生成が促進される。また、これら半導体粒子の存在下、特に酸化チタンの存在下では、スーパーオキサイドアニオンと一重項酸素の生成が促進されるように見受けられる。これらラジカル種の特異的生成は、ナノメートルオーダーの微粒子を用いた場合、超音波照射時の周波数が４００ｋＨｚ〜２０ＭＨｚの範囲、好ましくは６００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲、より好ましくは１ＭＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲で顕著に観察される現象であると考えられる。
【実施例】
【００５４】
以下に実施例を示す。特に断りのない限り、「％」は質量％を意味する。【００５５】
例１：ポリエチレングリコールを結合した酸化チタン複合体粒子の作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性酸化チタンゾルを調製した。この酸化チタンゾルを１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、超音波発生器ＭＩＤＳＯＮＩＣ２００（カイジョー製）を用いて２００ｋＨｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経を動的光散乱法により測定した。この測定は、超音波処理を行った後の酸化チタンゾルを１２Ｎの硝酸で１０００倍に希釈した後、分散液０．１ｍｌを石英測定セルに仕込み、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス製）を用いて、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は３６．４ｎｍであった。蒸発皿を用いて、５０℃下で酸化チタンゾル溶液の濃縮を行い、最終的に固形成分２０％の酸性酸化チタンゾルを調製した。【００５６】
次に、ポリオキシエチレン−モノアリル−モノメチルエーテルと無水マレイン酸の共重合体（平均分子量；３３６５９−日本油脂製）１ｇに水５ｍｌを添加し加水分解後得られた溶液と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同仁化学製）を、超純水を用いてそれぞれ濃度が５０ｍｇ／ｍｌおよび５０ｍＭとなるように混合に調整した。調整した溶液に４−アミノサリチル酸（分子量Ｍｎ＝１５３．１４：ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を濃度５０ｍＭになるよう混合して４ｍｌの溶液を得た。この溶液を室温にて７２時間振とう撹拌して反応させた。反応後、得られた溶液を透析膜であるスペクトラ／ポア  ＣＥ  透析用チューブ（分画分子量＝３５００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に移して超純水４ｌに対して室温にて２４時間で透析を行った。透析後にすべてナスフラスコに移し替えて一晩凍結乾燥し、得られた粉末に４ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：和光純薬工業製）を添加して混合し、４−アミノサリチル酸結合ポリエチレングリコール溶液とした。【００５７】
次にＤＭＦを用いて４−アミノサリチル酸結合ポリエチレングリコール溶液が終濃度２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％、先に得られたアナタ−ゼ型二酸化チタンゾルが終濃度で固形成分０．２５％となるよう調整し、２．５ｍｌの反応溶液とした。この反応溶液を水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し変え、８０℃で６時間加熱反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、エバポレータでＤＭＦを除去した後に、蒸留水１ｍｌを添加してポリエチレングリコールを結合した酸化チタン複合体粒子の分散液とした。さらに、ＨＰＬＣ：ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、カラム：ＨｉＰｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ＨＲ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、移動相：リン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）、流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ］に付したところ、素通り画分にＵＶ吸収のピークが確認され、この画分を回収した。この分散液を蒸留水で０．０５（ｗｔ／ｖｏｌ）％水溶液に希釈して７２時間静置後、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の確認を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレングリコールを結合した酸化チタン複合体粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて測定した。キュミュラント解析の結果、分散粒径は５４．２ｎｍであった。【００５８】
例２：ポリアクリル酸を結合した酸化チタン複合体粒子の作製
例１と同様に、最終的に固形成分２０％の酸性酸化チタンゾルを調製した。【００５９】
この酸性酸化チタンゾル０．６ｍｌをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で２０ｍｌとなるよう調整して分散させ、平均分子量５０００のポリアクリル酸（和光純薬工業製）０．３ｇを溶解したＤＭＦ１０ｍｌを添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し変え、１５０℃で５時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで反応液を冷却し、反応液に対して２倍量のイソプロパノールを添加した。室温で３０分間静置後、２０００ｇにて１５ｍｉｎ遠心分離により沈殿を回収した。回収した沈殿表面をエタノールで洗浄後、１．５ｍｌの水を加えてポリアクリル酸を結合した酸化チタン複合体粒子の分散液を得た。この分散液を蒸留水で１００倍に希釈し、分散粒径およびゼータ電位を動的光散乱法により測定した。この測定は、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリアクリル酸を結合した酸化チタン複合体粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は５３．６ｎｍ、ゼータ電位は−４５．０８ｍＶであった。【００６０】
例３：ポリエチレンイミンを結合した酸化チタン複合体粒子の作製
例１と同様に、最終的に固形成分２０％の酸性酸化チタンゾルを調製した。【００６１】
得られた酸化チタンゾル３ｍｌを２０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に分散させ、平均分子量１００００のポリエチレンイミン（和光純薬工業製）４５０ｍｇを溶解したＤＭＦ１０ｍｌを添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し変え、１５０℃で５時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで反応液を冷却し、反応液に対して２倍量のアセトンを添加した。室温で３０分間静置後、２０００ｇにて１５ｍｉｎ遠心分離により沈殿を回収した。回収した沈殿表面をエタノールで洗浄後、１．５ｍｌの水を加えてポリエチレンイミンを結合した酸化チタン複合体粒子の分散液を得た。この分散液を蒸留水で１００倍に希釈し、分散粒径およびゼータ電位を動的光散乱法により測定した。この測定は、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレンイミンを結合した酸化チタン複合体粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は５７．５ｎｍ、ゼータ電位は４７．５ｍＶであった。【００６２】
例４：酸化チタン複合体粒子へのジヒドロキシフェニルプロピオン酸の結合
例１で得られた、酸化チタン複合体粒子とジヒドロキシフェニルプロピオン酸を用いて、超純水中で表１に示す組成で混合し、合計１ｍｌに調製した。それぞれの組成において酸化チタン複合体粒子Ａ〜Ｃとした。【００６３】
【表１】
2010016581.tif 000003
【００６４】
調整した溶液を室温で４時間静置した。反応後の溶液について可視光域における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計により確認したところ、吸光度の増大が認められたため、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸が結合したと考えられた。また、反応前と反応後の溶液をキャピラリ電気泳動にて以下の条件で、フォトダイオードアレイ検出器の吸収波長２１４ｎｍのピークを確認することによりジヒドロキシフェニルプロピオン酸の変化量を求めた。
・装置：Ｐ／ＡＣＥ  ＭＤＱ（ベックマンコールター製）
・キャピラリ：フューズドシリカキャピラリ  ５０μｍ  ｉ．ｄ  ×  ６７ｃｍ（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｌｅｎｇｔｈ  ５０ｃｍ）（ベックマンコールター製）
・移動相：５０ｍＭ  ホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．０）
・電圧：２５ｋＶ
・温度：２０℃
求めた変化量より、酸化チタン粒子の質量あたり結合したジヒドロキシフェニルプロピオン酸量は表２で表される結果であった。【００６５】
【表２】
2010016581.tif 000004
【００６６】
さらに、この溶液１ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＮＡＰ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水１．５ｍｌで回収して未反応のジヒドロキシフェニルプロピオン酸を除去した。ジヒドロキシフェニルプロピオン酸の除去はキャピラリ電気泳動にて上記と同様に確認し、フリーのジヒドロキシフェニルプロピオン酸がないことを確認した。これらからジヒドロキシフェニルプロピオン酸を結合した酸化チタン複合体粒子（酸化チタン複合体粒子Ａ〜Ｃ）の作製を確認した。【００６７】
例５：酸化チタン複合体粒子へのフェロセンカルボン酸および塩酸ドーパミンの結合（酸化チタン−金属複合体粒子の作製）
フェロセンカルボン酸（和光純薬工業製）および塩酸ドーパミン（和光純薬工業製）を１ｍＭとなるようジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；和光純薬工業製）に溶解した。また、同様にＤＭＦを用いて２００ｍＭ  Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ−ｏｘｙ−ｔｒｉｓｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰｙＢｏｐ；メルク製）、２００ｍＭ  １−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨｏＢｔ；同仁化学製）、２０ｍＭ  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ；和光純薬工業製）をそれぞれ調製した。これらのうち、フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンは元濃度の１／４、またその他は元濃度の１／１０となるよう混合してＤＭＦで２０ｍｌに溶液調整した。この混合溶液を緩やかに攪拌しながら、室温で２０時間反応を行った。【００６８】
反応溶液の一部を超純水で１０倍に希釈し、この溶液を逆相クロマトグラフィ（ＨＰＬＣシステム：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）、カラム：Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  ＲＰ−１８ｅ  １００−３ｍｍ（メルク製）、移動相：Ａ  メタノール（和光純薬工業製）Ｂ  ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（和光純薬工業製）、流速：２ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて解析した。紫外線検出器で波長２１０ｎｍに設定し、インジェクション（０．０２ｍｌ）後、１〜１０ｍｉｎにおいてメタノールが１００％となるようグラジエント溶出を行った結果、フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体と考えられるピークを確認した。また、フェロセンカルボン酸および塩酸ドーパミンそれぞれ単独のピークは検出限界以下であった。これらのことから、フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体の生成を確認した。【００６９】
反応溶液の残りを減圧下で１０倍に濃縮し、反応濃縮溶液とした。例１で得られた、酸化チタン複合体粒子を超純水にて固形成分１％に調整し、そこに反応濃縮溶液を１／１０量混合して、全量で１ｍｌとした。この混合溶液を緩やかに攪拌しながら、室温で１時間反応を行った。反応後、沈殿成分を遠心分離（１５００ｇ、１０ｍｉｎ）して上澄みを回収し、この溶液１ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＮＡＰ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水１．５ｍｌで回収して未反応のフェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体およびＤＭＦを除去した。この溶液について可視光域（４００ｎｍ）における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計（ＵＶ１６００；島津製作所製）により確認したところ増大が認められたため、フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体が結合したと考えられた。これらからフェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体が結合した酸化チタン−金属複合体粒子の作製を確認した。【００７０】
例６：ジヒドロキシフェニルプロピオン酸を結合した酸化チタン−金属複合体粒子への抗体の結合
例４において、例１で得られた酸化チタン複合体粒子の代わりに、例５で得られた酸化チタン−金属複合体粒子を用いた以外はまったく同様にしてジヒドロキシフェニルプロピオン酸を結合した酸化チタン−金属複合体粒子を作成した。【００７１】
次に、この酸化チタン−金属複合体粒子の溶液と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同仁化学製）を、超純水を用いてそれぞれ濃度が２０ｍｇ／ｍｌおよび８０ｍＭとなるように混合した。混合した溶液を室温にて１０分間反応した。脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４）に溶液交換し、酸化チタン濃度にして２０ｍｇ／ｍｌの粒子の溶液を得た。これと同一の緩衝液で調製した抗ヒト血清アルブミン（抗ＨＳＡ）モノクローナル抗体（マウスＩｇＧ：ＭＳＵ−３０４、コスモバイオ製）を３ｍｇ／ｍｌになるように添加し、全量で１ｍｌの溶液とした。４℃で２４時間反応後、終濃度が０．５Ｍとなるようエタノールアミンを添加して、さらに４℃で１時間反応した。この溶液を酸化チタン濃度にして１ｍｇ／ｍｌに調製し、ＨＰＬＣ：ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、カラム：ＨｉＰｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００ＨＲ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、移動相：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ］に１ｍｌ付したところ、素通り画分および結合に用いた抗ＨＳＡモノクローナル抗体が単体で確認される画分にＵＶ吸収のピークが確認され、これらの画分を回収した。素通り画分は分離された分子の大きさから抗体分子を結合した酸化チタン−金属複合体粒子を含む溶液だと考えられた。また、抗ＨＳＡモノクローナル抗体が単体で確認される画分については、ブラッドフォード法でタンパク質濃度を測定した結果、反応前後で抗体濃度の減少が確認された。以上のことから、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸を結合した酸化チタン−金属複合体粒子の、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸を介して抗体分子を結合した、酸化チタン−金属複合体粒子が作製できることを確認した。【００７２】
例７：酸化チタン複合体粒子の分散性評価
例１で得られた酸化チタン複合体粒子（酸化チタン複合体粒子Ｄとする）および例４で得られた酸化チタン複合体粒子Ａ〜Ｃを、それぞれリン酸緩衝生理食塩水に対して、固形成分０．０５％になるように添加し、１時間、室温にて静置した。その後、例１と同様にゼータサイザーナノＺＳを用いて分散粒径およびゼータ電位を動的光散乱法により測定した。結果を表３に示す。酸化チタン複合体粒子Ａ〜Ｄにおいて、分散粒径およびゼータ電位に大きな変化がないことが確認された。【００７３】
【表３】
2010016581.tif 000005
【００７４】
例８：酸化チタン−金属複合体粒子の分散性評価
例５で得られた酸化チタン−金属複合体粒子を、リン酸緩衝生理食塩水に対して、固形成分０．０５％になるように添加し、１時間、室温にて静置した。その後、例１と同様にゼータサイザーナノＺＳを用いて分散粒径およびゼータ電位を動的光散乱法により測定した。その結果、分散粒径は５２．５ｎｍでゼータ電位は−４．４８ｍＶであり、例７の結果と比べて大きな変化がないことが確認された。【００７５】
例９：酸化チタン複合体粒子の超音波照射による一重項酸素生成能の評価
例１で得られた酸化チタン複合体粒子（酸化チタン複合体粒子Ｄとする）および例４で得られた酸化チタン複合体粒子Ａ〜Ｃを、それぞれリン酸緩衝生理食塩水に対して、固形成分０．０５％になるように調製した。また、コントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水のみを調製した。各溶液３ｍｌに対して、一重項酸素の生成を測定する試薬のＳｉｎｇｌｅｔ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）をマニュアルに従い混合して試験溶液とした。超音波照射装置（オージー技研製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ-２：１ＭＨｚ）を用いて、０．４Ｗ／ｃｍ２で５０％  ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ運転で３分間超音波を照射し、測定サンプルとして照射前後の溶液を４００μｌずつ採取した。各測定サンプルについて一重項酸素生成に起因する、Ｅｘ＝４８８ｎｍ、Ｅｍ＝５２５ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ；島津製作所製）により測定した。その結果は、図２に示される通りであった。図２に示されるように、コントロールと比べて酸化チタン複合体粒子Ａ〜Ｄは、超音波照射により一重項酸素をより効率的に生成することが確認された。また、酸化チタン粒子の質量あたり結合したリンカー量が多いほど、一重項酸素の生成は抑制されると考えられた。【００７６】
例１０：酸化チタン複合体粒子へのジヒドロキシフェニルプロピオン酸の結合２
例１で得られた、酸化チタン複合体粒子およびジヒドロキシフェニルプロピオン酸を用いて、１）２０ｍｍｏｌ／ｌの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ＝３．６）、２）２０ｍｍｏｌ／ｌのＭＥＳ緩衝溶液（同仁化学製；ｐＨ＝６．０）、３）２０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ緩衝溶液（同仁化学製；ｐＨ＝８．１）中で、酸化チタン複合体粒子が終濃度２％、またジヒドロキシフェニルプロピオン酸が終濃度で５０ｍｍｏｌ／ｌとなるよう混合し、合計０．８ｍｌに調製した。【００７７】
調整した溶液を４０℃で２５時間攪拌した。それぞれの溶液について紫外−可視光域（２００−６００ｎｍ）における吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計により確認した。ジヒドロキシフェニルプロピオン酸のみを混合した溶液について、１）２０ｍｍｏｌ／ｌの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ＝３．６）中においては、調整後０時間と比べてほとんど変化がなかったのに対し、２）２０ｍｍｏｌ／ｌのＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ＝６．０）および３）２０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ＝８．１）中においては、調整後０時間と比べて吸収スペクトルの変化が確認され、目視によっても薄赤色に変色していることが確認された。これらのことから、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸はｐＨ＝６．０以上において変化を生じ、不安定であると考えられた。また、酸化チタン複合体粒子およびジヒドロキシフェニルプロピオン酸を混合した溶液について、１）２０ｍｍｏｌ／ｌの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ＝３．６）中においては、調整後０時間と比べて吸収スペクトルの変化が確認され、目視によっても濃茶色に変色していることが確認された。ジヒドロキシフェニルプロピオン酸のみにおいては大きな変化がなかったことから、この変化は酸化チタン複合体粒子にジヒドロキシフェニルプロピオン酸が結合、電荷移動を生じたためと考えられた。【００７８】
次に、１）２０ｍｍｏｌ／ｌの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ＝３．６）中において、調整後０時間と２５時間攪拌後の溶液をキャピラリ電気泳動にて以下の条件で、フォトダイオードアレイ検出器の吸収波長２１４ｎｍのピークを確認することによりジヒドロキシフェニルプロピオン酸の変化量を求めた。
・装置：Ｐ／ＡＣＥ  ＭＤＱ（ベックマンコールター製）
・キャピラリ：フューズドシリカキャピラリ  ５０μｍ  ｉ．ｄ  ×  ６７ｃｍ（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｌｅｎｇｔｈ  ５０ｃｍ）（ベックマンコールター製）
・移動相：５０ｍＭ  ホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．０）
・電圧：２５ｋＶ
・温度：２０℃
求めた変化量より、１）２０ｍｍｏｌ／ｌの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ＝３．６）中における酸化チタン粒子の質量あたり結合したジヒドロキシフェニルプロピオン酸量は７．７×１０−４  ジヒドロキシフェニルプロピオン酸‐ｍｏｌ／酸化チタン粒子‐ｇであった。【００７９】
例１１：酸化チタン−金属複合体粒子の超音波照射によるヒドロキシラジカル生成能の評価
例５で得られたフェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体が結合した酸化チタン−金属複合体粒子（酸化チタン複合体粒子Ｅとする）を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に対して、固形成分０．０５％になるように調製した。また、コントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）のみを用いた。各溶液３ｍｌを用意して試験溶液とした。超音波照射装置（オージー技研製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ-２：１ＭＨｚ）を用いて、３分間超音波照射（０．４Ｗ／ｃｍ２、５０％パルス）を行い、照射後に各溶液に対して、ヒドロキシラジカルの生成を測定する試薬のヒドロキシフェニルフルオレセイン（ＨＰＦ、第一化学薬品製）をマニュアルに従い混合し、室温で１５分および３０分静置、各静置時間における測定サンプルとして照射前後の溶液を４００μｌずつ採取した。各測定サンプルについてヒドロキシラジカル生成に起因する、Ｅｘ＝４９０ｎｍ、Ｅｍ＝５１５ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ；島津製作所製）により測定した。その結果は、図３に示される通りであった。図３に示されるように、コントロールと比べて酸化チタン複合体粒子Ｅは、超音波照射によりヒドロキシラジカルを効率的に生成することが確認された。また、酸化チタン複合体粒子Ｅは静置時間に伴って蛍光値が増大することから、持続的にヒドロキシラジカルを生成すると考えられた。【００８０】
例１２：酸化チタン複合体粒子および酸化チタン−金属複合体粒子の超音波照射によるヒドロキシラジカル生成能の評価
例１で得られた酸化チタン複合体粒子（酸化チタン複合体粒子Ｄとする）および例５で得られたフェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体が結合した酸化チタン−金属複合体粒子（酸化チタン複合体粒子Ｅとする）を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に対して、固形成分０．０５％になるように調製した。また、コントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）のみを用意した。各溶液３ｍｌを用意して試験溶液とした。超音波照射装置（オージー技研製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＥＳ-２：１ＭＨｚ）を用いて、３分間超音波照射（０．４Ｗ／ｃｍ２、５０％パルス）を行い、照射後に各溶液に対して、ヒドロキシラジカルの生成を測定する試薬のヒドロキシフェニルフルオレセイン（ＨＰＦ、第一化学薬品製）をマニュアルに従い混合し、室温で３０分静置、各静置時間における測定サンプルとして照射前後の溶液を４００μｌずつ採取した。各測定サンプルについてヒドロキシラジカル生成に起因する、Ｅｘ＝４９０ｎｍ、Ｅｍ＝５１５ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ；島津製作所製）により測定した。その結果は、図４に示される通りであった。コントロールと比べて酸化チタン複合体粒子Ｄおよび酸化チタン複合体粒子Ｅは、超音波照射によりヒドロキシラジカルを効率的に生成することが確認された。また、酸化チタン複合体粒子Ｄに比べて酸化チタン複合体粒子Ｅは相対的に多くのヒドロキシラジカルを生成することが確認された。このことから、酸化チタン−金属複合体粒子は超音波照射時のヒドロキシラジカルの生成を増大することが確認された。【００８１】
例１３：酸化チタン複合体粒子へのフェロセンカルボン酸および塩酸ドーパミンの結合（酸化チタン−金属複合体粒子の作製）
フェロセンカルボン酸（和光純薬工業製）および塩酸ドーパミン（和光純薬工業製）を５ｍＭとなるようジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；和光純薬工業製）に溶解した。また、同様にＤＭＦを用いて２００ｍＭ  Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ−ｏｘｙ−ｔｒｉｓｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰｙＢｏｐ；メルク製）、２００ｍＭ  １−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨｏＢｔ；同仁化学製）、４０ｍＭ  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ；和光純薬工業製）をそれぞれ調製した。これらのうち、フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンは元濃度の１／４、またその他は元濃度の１／８となるよう混合してＤＭＦで８ｍｌに溶液調整した。この混合溶液を緩やかに攪拌しながら、室温で２０時間反応を行った。【００８２】
反応溶液の一部を超純水で１０倍に希釈し、この溶液を逆相クロマトグラフィ（ＨＰＬＣシステム：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）、カラム：Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  ＲＰ−１８ｅ  １００−３ｍｍ（メルク製）、移動相：Ａ  メタノール（和光純薬工業製）Ｂ  ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（和光純薬工業製）、流速：２ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて解析した。紫外線検出器で波長２１０ｎｍに設定し、インジェクション（０．０２ｍｌ）後、１〜１０ｍｉｎにおいてメタノールが１００％となるようグラジエント溶出を行った結果、フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体と考えられるピークを確認した。また、フェロセンカルボン酸および塩酸ドーパミンそれぞれ単独のピークは検出限界以下であった。これらのことから、フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体の生成を確認した。【００８３】
反応溶液の残りを減圧乾燥し、ＤＭＦで１ｍｌに溶液調整し、反応濃縮溶液とした。例１で得られた、酸化チタン複合体粒子をＤＭＦで固形成分０．６２５％に調整し、そこに反応濃縮溶液をそれぞれ、１／１０量、１／３０量、１／９０量混合して、ＤＭＦで全量３ｍｌとした。これらの混合溶液を緩やかに攪拌しながら、室温で５時間反応を行った。反応後、減圧乾燥して超純水を１ｍｌ程度加え、沈殿成分を遠心分離（１５００ｇ、１０ｍｉｎ）して上澄みを回収し、それぞれの溶液１ｍｌを遠心膜分離装置Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（ＭＷＣＯ＝１０００００、ミリポア製）に移し、超純水１４ｍｌを加えて遠心分離（１５００ｇ、１５ｍｉｎ）を行い、ろ液を除去した。この遠心ろ過操作を６回繰り返して、未反応のフェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体およびＤＭＦを除去した。これらの溶液について超純水で固形成分０．５％に調整し、可視光域（４００ｎｍ）における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計（ＵＶ１６００；島津製作所製）により確認したところ、それぞれ混合したフェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体の量に依存して増大が認められたため、フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体が結合したと考えられた。これらからフェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体が結合した酸化チタン−金属複合体粒子の作製を確認した。【００８４】
例１４：酸化チタン−金属複合体粒子の過酸化水素添加によるヒドロキシラジカル生成能の評価
例１で得られた酸化チタン複合体粒子（酸化チタン複合体粒子Ｄとする）および、例１３で反応濃縮溶液を１／９０量混合して得られた酸化チタン−金属複合体粒子（酸化チタン複合体粒子Ｆとする）を、超純水で固形成分１．０％になるように調製した。この酸化チタン複合体粒子Ｄおよび酸化チタン複合体粒子Ｆの溶液０．２ｍｌに対して、それぞれリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）の１０倍濃度溶液を０．０５ｍｌ、超純水を０．１５ｍｌ、１０ｍＭの過酸化水素（和光純薬工業製）を０．１ｍｌ混合し、すぐにヒドロキシラジカルの生成を測定する試薬のヒドロキシフェニルフルオレセイン（ＨＰＦ、第一化学薬品製）をマニュアルに従い混合し、測定サンプルとした。各測定サンプルについて、ヒドロキシラジカル生成に起因するＥｘ＝４９０ｎｍ、Ｅｍ＝５１５ｎｍにおける蛍光強度を、蛍光分光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ；島津製作所製）を用いて、混合直後と混合後４０分で測定した。その結果は、図５に示される通りであった。酸化チタン複合体粒子Ｄと比べて酸化チタン複合体粒子Ｆは、過酸化水素の混合によりヒドロキシラジカルを効率的に生成することが確認された。このことから、酸化チタン−金属複合体粒子は過酸化水素存在時のヒドロキシラジカルの生成を増大することが確認された。【００８５】
例１５：酸化チタン−金属複合体粒子タンパク質溶液中での分散安定性の評価
ウシ胎児血清（ジャパン・バイオシーラム製）を１０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％含むように調整したＦ１２培地（ＧＩＢＣＯ製）に対して、例１３で反応濃縮溶液を１／１０量混合して得られた酸化チタン−金属複合体粒子を含む分散液を終濃度０．０５（ｗｔ／ｖｏｌ）％になるように添加し、１時間および１８時間室温で静置して、それぞれの時間における分散粒径の測定を、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス製）を用いて例１と同様に行った。その結果、１時間静置後において分散粒径は５２．９ｎｍ、また、１８時間静置後において分散粒径は５４．０ｎｍであった。以上のことから、タンパク質溶液中において酸化チタン−金属複合体粒子の分散粒径の変化はほとんど認められず、安定した分散性を示した。
【図１】
2010016581.tif 000006
【図２】
2010016581.tif 000007
【図３】
2010016581.tif 000008
【図５】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年12月20日(2010.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化チタン粒子、および該酸化チタン粒子の表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくとも一つの官能基を介して結合されてなる水溶性高分子を含んでなる、酸化チタン複合体粒子と、
該酸化チタン複合体粒子の表面にさらに結合されてなるリンカー分子と
を含んでなり、該リンカー分子が、
（１）カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくとも一つの官能基を有し、
（２）ａ）炭素数６〜４０よりなる飽和又は不飽和の鎖状炭化水素基、ｂ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環複素環式基、又はｃ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環環状炭化水素基を含んでなる
化合物であって、該官能基同士で重合すること無く、該官能基を介して前記酸化チタンと結合され、
該リンカー分子を介して低原子価遷移金属を含む分子が前記酸化チタン複合体粒子にさらに結合されてなり、
超音波の照射による触媒活性を有する酸化チタン−金属複合体粒子であることを特徴とする超音波癌治療促進剤。
【請求項２】
前記リンカー分子の結合量が前記酸化チタン粒子の質量あたり、１×１０−６〜１×１０−３  ｍｏｌ／酸化チタン粒子‐ｇである、請求項１に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項３】
前記リンカー分子がカテコール類である、請求項１または２に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項４】
前記リンカー分子が、ドーパミン、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項３に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項５】
前記低原子価遷移金属を含む分子が、二価の鉄を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項６】
前記二価の鉄の結合量が、前記酸化チタン粒子の質量あたり、１×１０−６〜１×１０−３  ｍｏｌ／酸化チタン粒子‐ｇである、請求項５に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項７】
前記低原子価遷移金属を含む分子が、フェロセンカルボン酸である、請求項５に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項８】
前記水溶性高分子が重量平均分子量５０００〜４００００である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項９】
前記水溶性高分子が、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、ポリエチレンイミンの群から選択される少なくとも一種を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１０】
２０〜２００ｎｍの粒子径を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の超音波癌治療促進剤と、該超音波癌治療促進剤が分散される溶媒とを含んでなる、分散液。
【請求項１２】
前記超音波癌治療促進剤が、０．００１〜１質量％含有される、請求項１１に記載の分散液。
【国際調査報告】
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