(57)【要約】  本発明は、ローヤルゼリーを含むストレスによって誘導される免疫機能変調改善剤に関する。本発明はまた、ローヤルゼリーを成分として含み、ストレスによって生じる身体的諸症状を予防または軽減する抗ストレス剤、医薬品、飲食品または食品添加物を提供する。
2010008005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ローヤルゼリーを含む、ストレスによって誘導される免疫機能変調改善剤。
【請求項２】
ローヤルゼリーを有効成分として含有することを特徴とする、ストレスによって誘導される免疫機能変調改善作用を有する医薬品。
【請求項３】
ローヤルゼリーを有効成分として含有することを特徴とする、ストレスによって誘導される免疫機能変調改善作用を有する飲食品。
【請求項４】
ローヤルゼリーを有効成分として含有することを特徴とする、ストレスによって誘導される免疫機能変調改善作用を有する食品添加物。
【請求項５】
ローヤルゼリーを摂取することを特徴とする、ストレスによって誘導される免疫機能変調を改善する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ローヤルゼリーを含む抗ストレス剤、具体的には、ストレスによって誘導される免疫機能変調改善剤に関する。また、本発明は、ローヤルゼリーを成分として含み、ストレスによって生じる身体的諸症状を予防または軽減する医薬品、飲食品または食品添加物に関する。【０００２】
長期にわたる強いストレスが健康に悪影響を与えるということは定説となっており、ストレスは循環器疾患、消化器疾患、精神疾患の発症と深く関わっている。また、ストレスが免疫系に種々の障害をもたらすことも良く知られている。【０００３】
しかし、ローヤルゼリーのストレスに対する効果は、具体的には、解明されていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、本発明者らの鋭意研究により、ローヤルゼリーが免疫機能を調整し、ストレスによって誘導された免疫機能変調を改善し、ストレスに対して体を守るうえで有効な働きを有することを初めて明らかにしたことによってなされた。
本発明は、抗ストレス剤およびストレスによって誘導される免疫機能変調改善剤を提供する。また、本発明は、ストレスによって生じる身体的諸症状を予防または軽減する医薬品、飲食品または食品添加物を提供する。【０００５】
本発明は、
１．ローヤルゼリーを含む、ストレスによって誘導される免疫機能変調改善剤、
２．ローヤルゼリーを有効成分として含有することを特徴とする、ストレスによって誘導される免疫機能変調を改善する作用を有する医薬品、
３．ローヤルゼリーを有効成分として含有することを特徴とする、ストレスによって誘導される免疫機能変調を改善する作用を有する飲食品、
４．ローヤルゼリーを有効成分として含有することを特徴とする、ストレスによって誘導される免疫機能変調を改善する作用を有する食品添加物、
５．ローヤルゼリーを摂取することを特徴とする、ストレスによって誘導される免疫機能変調を改善する方法、
６．ストレスによって誘導される末梢リンパ球数の減少を回復させる作用を有する、上記１に記載のストレスによって誘導される免疫機能変調改善剤、
７．ストレスによって誘導される顆粒性白血球数の増加を回復させる作用を有する、上記１に記載のストレスによって誘導される免疫機能変調改善剤、
８．ストレスによって誘導される胸腺萎縮を回復させる作用を有する、上記１に記載のストレスによって誘導される免疫機能変調改善剤、
９．ローヤルゼリーを含む、抗ストレス剤
に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ローヤルゼリー及びＰＢＳの経口投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける末梢白血球（ＷＢＣ）、リンパ球及び顆粒球の絶対数の動態である。Ａは、ＷＢＣの絶対数であり、Ｂは、リンパ球の絶対数であり、Ｃは、顆粒球の絶対数である。ローヤルゼリーをＰＢＳで希釈し、タンパク質２．０mgを含む希釈したローヤルゼリー溶液の３０μlを６週間に渡り２日毎に一回の投与レジュメで各マウスに投与した。
【図２】ローヤルゼリー及びＰＢＳの経口投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける末梢血中のＴ（ＣＤ３＋）及びＢ（Ｂ２２０＋）リンパ球の絶対数の動態である。Ａは、Ｔリンパ球の絶対数であり、Ｂは、Ｂリンパ球の絶対数である。
【図３】ローヤルゼリーの経口投与後４２日目におけるＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓、脾臓及び胸腺中の単核細胞（ＭＮＣ）の絶対数である。
【図４】ローヤルゼリーの経口投与後４２日目におけるマウスの肝臓中のＣＤ３＋Ｔ細胞、Ｂ２２０＋Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数である。
【図５】ローヤルゼリーの経口投与後４２日目におけるＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓中のＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数である。
【図６】ストレス負荷Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける末梢白血球（ＷＢＣ）、リンパ球及び顆粒球の絶対数である。Ａは、ＷＢＣの絶対数であり、Ｂは、リンパ球の絶対数であり、Ｃは、顆粒球の絶対数である。週に２回１２時間の拘束ストレスを受けたマウスに図１に記載された投与レジュメを用いてローヤルゼリーを投与した。コントロールには、ローヤルゼリーを含まないＰＢＳを投与した。０．０５未満のＰ値を統計学的に有意と判断した。
【図７】図６に記載された拘束ストレスに付随したローヤルゼリー及びＰＢＳの経口投与後のマウスの末梢血中のＣＤ３＋Ｔ細胞及びＢ２２０＋Ｂ細胞の絶対数である。Ａは、Ｔリンパ球の絶対数であり、Ｂは、Ｂリンパ球の絶対数である。０．０５未満のＰ値を統計学的に有意と判断した。
【図８】ローヤルゼリーの経口投与後４２日目でのＣ５７ＢＬ／６マウスの肝臓、脾臓及び胸腺における単核細胞（ＭＮＣ）の絶対数である。
【図９】ローヤルゼリーの経口投与及び週に２回の拘束ストレスに付した後４２日目でのＣ５７ＢＬ／６マウスの胸腺におけるＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞の絶対数である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
ローヤルゼリーは、乳黄白色のゼリー状液体であり、ミツバチの働蜂が羽化後３日から１０日後の間に主として花粉を食べ、これが心臓管という器官で代謝され、頭部の咽頭腺と大顎腺から分泌される。ローヤルゼリーは、ミツバチ社会では女王蜂のための特別食として与えられる。ローヤルゼリーを給餌された女王蜂は、ほかの働蜂の２倍の大きさに成長し、その寿命においても働蜂の平均３５−４０日に比べて３−５年という長い生存期間を維持することができるようになる。この間、女王蜂は１日に２，０００−３，０００個もの卵を産卵し、ミツバチの高度な社会性が維持される。【０００８】
拘束ストレスが末梢血液のＴ、Ｂリンパ球の反応を抑制し、逆に顆粒性白血球の反応を増強することが良く知られている。一方、ミツバチの作り出すローヤルゼリーには抗ストレス効果や疲労回復効果があると言われていることから、本発明者はストレスによって誘導されたリンパ球や顆粒性白血球数の異常な変化がローヤルゼリーによって回復するか否かの検討を末梢血液および免疫関連臓器（胸腺、脾臓、肝臓）におけるこれら細胞の動態を調べることによって検討してみた。【０００９】
ストレスを与えないマウスにローヤルゼリーを投与した場合、末梢血液や個々の臓器における総白血球数およびリンパ球数は、Ｔ、Ｂリンパ球数やＣＤ４／ＣＤ８Ｔリンパ球のサブセット数を含めて特に著明な変化を示さず、末梢血液の顆粒性白血球数にも変化が認められなかった。【００１０】
一方、拘束ストレスに曝したマウスでは、ローヤルゼリーを投与しなかった場合、末梢血におけるＴ、Ｂリンパ球を含む全リンパ球数の著明な減少が認められ、逆に顆粒性白血球数の増加が認められた。また、ストレス負荷を与えたマウスでは、脾臓、胸腺での単核細胞（ＭＮＣ）数も減少傾向を示した。【００１１】
これらの拘束ストレスマウスにローヤルゼリーを投与すると、末梢血のリンパ球、顆粒性白血球数の異常は著明に回復する傾向を示した。しかし、その回復効果はストレス負荷後１４日目と２８日目に限定的であり、４２日目には回復効果を認めることができなかった。また、ローヤルゼリーの投与は拘束ストレスによって著しく萎縮した胸腺において、ＣＤ４＋ＣＤ８＋陽性細胞を含む胸腺細胞数を十分とは言えないまでも回復させる効果を示した。末梢血や胸腺におけるリンパ球数の回復は、Ｔ／Ｂリンパ球、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔリンパ球、およびＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性細胞のサブセットにおいて、バランス良く回復することが示された。【００１２】
これらの結果から、ローヤルゼリーは正常な状態にある免疫機能には顕著な影響を及ぼさないものの、ストレスによって誘導された免疫変調をバランス良く回復させ、抗ストレス作用を示すことが明らかになった。【００１３】
長期にわたる強いストレスが健康に悪影響を与えるということは定説となっており、ストレスは循環器疾患、消化器疾患、精神疾患の発症と深く関わっている。また、ストレスが免疫系に種々の障害をもたらすことも良く知られている（１−３）。【００１４】
長期にわたるストレスが細胞性免疫と体液性免疫の双方に破綻を来たすことが知られているほか（４）、ストレスが副腎皮質ホルモンであるグルチココルチコイドを介して胸腺の著しい萎縮とリンパ球の新生を阻害し、抗体産生やサイトカインの産生低下を含む免疫不全を引き起こすことが報告されている（５−７）。【００１５】
また、拘束ストレスを与えたマウスでは、リンパ球減少症、逆に顆粒球増多症、胸腺萎縮、その他免疫機能に関わる多くの変調を引き起こすことが報告されている（８，９）。
さらに拘束ストレスは胸腺細胞のアポトーシスを誘導し・胸腺におけるＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞の減少を招くだけでなく、成熟リンパ球のアポトーシスとも相俟って顕著な末梢リンパ球の減少を招くと考えられている（６，７）。【００１６】
ストレスによって誘導されるこのような胸腺萎縮は、グルココルチコイドのレベルが上昇することと直接的な関係が認められている（６，７，１０）。【００１７】
一方、ローヤルゼリーは、女王蜂の成長と発達を促すための乳白色のゼリー状物質であり、これは働き蜂の咽頭腺から分泌される。ローヤルゼリーを給餌された幼虫は、体の大きさ、生命力、スタミナ、寿命などにおいて働き蜂よりも優れた生物学的性質を発達させ、たとえば働き蜂の寿命が３５−４０日間であるのに対して、女王蜂の寿命は５−７年に及ぶ。また、ローヤルゼリーはヒトに対しても多面的な機能を示すことが知られており（１１−１４）、そのひとつが免疫機能に及ぼす効果であり、ローヤルゼリーがマウスの抗体産生や免疫担当細胞の増殖を促進し、免疫機能の調整に関与することが報告されている（１５−１７）。【００１８】
そこで、本発明者らはローヤルゼリーがストレスによって誘導された免疫機能障害をいかに回復させるかを検討する目的で本実験を行った。実験では、拘束ストレス下においたマウスにローヤルゼリーを経口投与し、ストレスがもたらした異常な末梢リンパ球や顆粒性白血球の数をローヤルゼリーが正常に戻す効果を発揮するとともに、萎縮した胸腺を回復させることを明らかにした。この結果は、ローヤルゼリーが免疫機能を調整し、ストレスに対して体を守るうえで有効な働きを有することを初めて明らかにしたものである。【００１９】
本発明には、従来公知の任意のローヤルゼリーを用いることができる。本発明のローヤルゼリーを分泌するミツバチの種類としては、セイヨウミツバチ（Apis mellifera）、トウヨウミツバチ（Apis cerana）、オオミツバチ（Apis dorsata）、コミツバチ（Apis florea）などを挙げることができる。【００２０】
本発明のローヤルゼリーの産地は、日本、南米、北米、豪州、中国、欧州などが挙げられる。これらのローヤルゼリーは、未加工のままか、あるいは適宜の精製工程で処理した上で、ヒトをはじめとする哺乳類に適用したときに、自己抗体の産生に関連する疾患の治療、予防に効果を発揮するものである限り、形態、純度、調製方法にかかわりなく、有利に用いることができる。【００２１】
周知のように、ローヤルゼリーは既に健康維持食品、あるいは特定保健食品として古くから広く利用されてきており、その安全性については十分担保されている。【００２２】
本発明の組成物は、有効成分であるローヤルゼリーに加えて、ヒトを含む哺乳類への経口的又は経皮的適用ないしは皮膚外用が許容され得る成分を配合することができる。このような成分としては、例えば、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、アミノ酸、繊維質、糖質、脂質、脂肪酸、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、香辛料、防腐剤、乳化剤、界面活性剤、賦形剤、増量剤、増粘剤、保存剤を挙げることができる。これらの成分を１種又は２種以上含有させることも有利に実施できる。【００２３】
本発明の組成物は、従来公知の任意の経路、例えば、経口的又は非経口的に使用することができる。本発明の組成物の有効な摂取量又は投与量は、対象とするヒトをはじめとする哺乳動物の種類、年齢、性別などに応じて適宜決定することができ、例えば、有効成分の質量換算で、体重１ｋｇあたり、通常、０．０１〜１００ｍｇ／回、望ましくは、０．１ｍｇ〜５０ｍｇ／回、経口的に１日１回又は数回に分けて、効果に応じて、連日又は１日以上の間隔をおいて摂取するか又は投与すればよい。【００２４】
本発明の組成物を製造するには、対象とする動物類やその摂取方法又は投与方法などを考慮して、ローヤルゼリーと、飲食物、化粧品、医薬品、医薬部外品、飼料、餌料、ペットフードなどの分野において使用可能な１種又は２種以上の成分とを、適宜の配合比率で混合し、適宜、希釈、濃縮、乾燥、濾過、遠心分離などの工程を実施して、所望の形状に成形して抗アレルギー剤を配合してなる組成物を調製すればよい。各成分を配合する順序や、当該工程を実施する時期は、本発明の効果が損なわれないかぎり、その順序や時期に制限はない。【００２５】
本発明の組成物は、例えば乳酸飲料や乳酸菌飲料等の飲食物の形態で用いることもできる。また、錠剤等の医薬品の形態として用いることもできる。
【実施例１】
【００２６】
以下に、具体的な実験例をあげて本発明をさらに詳しく説明する。【００２７】
材料と方法
実験動物：実験には６−１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスを用いた。マウスは、実験期間を通じて琉球大学附属実験動物施設において、ＳＰＦ（Specific Pathogen Free）の環境で飼育した。また、すべての実験は実験計画書により琉球大学の動物実験実施指針に基づいて許可を受けて実施した。【００２８】
ローヤルゼリーと投与方法：実験に使用したローヤルゼリーは、山口喜久二方式有機養蜂によって生産された生ローヤルゼリー（１８）をジャパンローヤルゼリー社から提供を受けた。ローヤルゼリーはＰＢＳで希釈し、その３０ml（タンパク量２mg相当）を２日間ごとにマウスに経口投与した。同様のスケジュールでＰＢＳを投与したマウスを対照とした。【００２９】
拘束ストレス：マウスヘのストレス負荷は、マウスをステンレス製の金網に挟んで自由に動けないように拘束して実施した。拘束ストレス負荷は週２回、夜間１２時間にわたって６週間続けた（１９−２１）。末梢血液細胞の分析：マウスからの採血は、マウス尾部をカットすることによって流出する血液をヘパリン処理したキャピラリーチューブに採取して行った。この血液について、リンパ球とそのサブセット、顆粒球数の計測を行った。採取した血液をスライドガラスに塗布し、ギムザ染色液で染色した後、顕微鏡下で単核細胞（ＭＮＣ）の形態的特徴からリンパ球、顆粒性白血球数を計測した。また、ＭＮＣについて、蛍光色素でラベルした単クローン抗体で免疫染色し、その細胞表面のフェノタイプ（細胞表面抗原タイプ）をもとにリンパ球のサブセットの計測をフローサイトメーターで分析した。【００３０】
臓器からの細胞採取：ローヤルゼリー投与後４２日目のマウスから心臓穿刺により全採血を行った後、胸腺、肝臓、脾臓を摘出した。胸腺からのＭＮＣは、胸腺をイーグルのＭＥＭ培地（５０mM ＨＥＰＥＳを含む）内で組織を細切し、２００ゲージのステンレス網を通過させて採取した。脾臓細胞の場合、摘出した脾臓を２００ゲージのステンレス網の上で圧迫し、メッシュを通過した細胞をＭＥＭ培地（５０mM ＨＥＰＥＳと２％非働化牛胎児血清を含む）に採取した。細胞浮遊液は、その後、１５００rpmで遠心し、その沈査を３mlの赤血球溶解液（１５５mU ＮＨ４Ｃｌ、１０mM ＫＨＣＯ３、１７０mM Ｔｒｉｓ）で４℃、３分間処理し、赤血球を溶血処理した。最後に、ＭＮＣを遠心によって洗浄し、ＭＥＭ培地に浮遊させて用いた。一方、肝臓のＭＮＣは摘出した肝臓を細切し、同様にステンレスメッシュを通過させて採取したＭＣＣをＭＥＭ培地に浮遊させ、洗浄後、３５％Ｐｅｒｃｏｌｌ液に重層して２０００ｒｐ皿で１５分間遠心した。その沈査を５．０mlの赤血球溶解液で４℃、１０分間溶血処理した細胞を２回の遠心洗浄の後、使用した（２２）。これらのＭＮＣは、以下のように蛍光色素標識単クローン抗体を用いて免疫蛍光染色し、細胞解析にかけた。【００３１】
フローサイトメトリー：フローサイトメーターによる分析は、マウスの細胞表面抗原に対する蛍光標識単クローン抗体を用いて行った。用いた標識単クローン抗体（抗ＣＤ８、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ４５／Ｂ２２０）はＦＩＴＣ標識されたものをPharmingen社から購入した。また、ＰＥで標識した抗ＣＤ４５（ｃｌｏｎｅ２Ｄ１）抗体もBecton Deckinson社から購入し、使用した。標識単クローン抗体で染色するにあたり、非特異的な染色を避けるために、抗ＣＤ３２／ＣＤ１６非標識単クローン抗体液で細胞を前処理したのち、各々の標識単クローン抗体による免疫染色を行った。末梢血リンパ球の分析は、抗ＣＤ４５標識抗体でゲートをかけたＣＤ４５陽性細胞について行った。細胞浮遊液のなかの死細胞はforward scatter、side scatter、propidium iodideゲートにより分析から除外した。【００３２】
統計処理：統計的有意差はコンピュータソフトウエアを用いたスチューデントのｔ検定を行い、０．０５以下のＰ値をもって統計的に有意と判定した。【００３３】
結果
末梢血液の総白血球、リンパ球、顆粒性白血球数、並びにＴＩＢリンパ球数に及ぼすローヤルゼリーの影響【００３４】
ストレスを与えないマウスにおける免疫細胞に及ぼすローヤルゼリー投与の影響を先ず調べるために、ローヤルゼリーあるいはＰＢＳを投与したマウス群で総白血球（ＷＢＣ）数、リンパ球、顆粒球数を比較した。図１Ａ−Ｃに示したように、ローヤルゼリー投与マウス、および対照としたＰＢＳ投与マウスで、末梢血のＷＢＣ数、リンパ球、顆粒球数に大きな差を認めなかった。【００３５】
さらにローヤルゼリー投与がＴ、Ｂリンパ球数に影響を及ぼすかどうかについても検討してみた。その結果、リンパ球のなかのＴリンパ球数とＢリンパ球数との間でも、ローヤルゼリー投与による有意の差を認めることができなかった（図２）。【００３６】
胸腺、肝臓、脾臓における白血球数、およびリンパ球サブセットに及ぼすローヤルゼリー投与の影響【００３７】
ストレス負荷をかけないマウスで、ローヤルゼリーの経口投与が胸腺や肝臓、脾臓でのＭＮＣの動態に影響を及ぼすかどうかを検討するために、実験開始後４２日目に摘出した肝臓、脾臓、胸腺における総ＭＮＣを計測し、その結果を図３に示した。【００３８】
これらの臓器に分布するＭＮＣ数にも、ローヤルゼリー投与群とＰＢＳ投与対照群の間で全く差を認めなかった。【００３９】
また、これらのＭＮＣについて、肝臓および脾臓におけるＴリンパ球（ＧＤ３＋）、Ｂリンパ球（Ｂ２２０＋）、およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔリンパ球サブセットの数を比較した。図４に示したごとく、肝臓でのＢ２２０＋細胞に減少傾向が見られたものの、その差は統計的に有意のものではなく、これらの臓器におけるＭＮＣサブセットにはほとんど差を認めなかった。胸腺細胞についても、ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットヘのローヤルゼリー投与の影響を検討したが、これらのサブセットに関しても用投与による差をほとんど認めることができなかった（図５）。【００４０】
拘束ストレスマウスの末梢血液における総白血球、リンパ球数、顆粒球数の変化とローヤルゼリー投与の影響【００４１】
マウスを拘束ストレスに暴露した場合、末梢血液中のＷＢＣ数、リンパ球数のいずれも著明な減少傾向を示し（図６Ａ，Ｂ）、逆に末梢血液の顆粒性白血球の数は、ストレス負荷後、急激に増加する傾向を示した（図６Ｃ）。【００４２】
一方、ストレスに曝したマウスにローヤルゼリーを投与することによって、リンパ球数はローヤルゼリー投与から１４日目と２８日目で対照マウスに比べて有意（１４日目ｐ＜０．０５；２８日目ｐ＜０．０００５）の増加を示した（図６Ｂ）。反対に、ストレスによって増加した顆粒性白血球の数は、ローヤルゼリー投与によってやはり１４日目と２８日目で対照マウスに比して著明な減少を示した（図６Ｃ）。【００４３】
ローヤルゼリーを投与されたストレスマウスにおけるこのようなリンパ球の増加と顆粒性白血球の減少を反映して、末梢血液中のＷＢＣ数はローヤルゼリー投与群とＰＢＳ群の間で著明な差を認めなかった（図６Ａ）。【００４４】
ストレスに曝したマウスでは、リンパ球の減少と顆粒性白血球の増加を反映して、顆粒性白血球とリンパ球の比率が１４日目で７：１、２８日目で３：１であったものが、ローヤルゼリーを投与することによってこれらの比率が１４日目で２．５：１、２８日目で１：１．２となり、２８日目にはほとんど正常なレベルの比率となった。しかしながら、ローヤルゼリーによるこのような回復効果は、さらにストレスをかけ続けることによって認められなくなり、４２日目においてはローヤルゼリー投与群とＰＢＳ投与群との問で差が認められなくなった。これらの結果は、ローヤルゼリーが短期的にストレスによって誘導される免疫細胞数の変化を効果的に正常状態に維持する効果をもつことを示しているが、ストレスが長期に及ぶと回復効果が十分に発揮されないことを示唆している。【００４５】
拘束ストレスマウスにおける末梢Ｔ／Ｂリンパ球数に及ぼすローヤルゼリーの効果
ローヤルゼリーがストレスによって誘導された末梢リンパ珠数の減少を回復させる効果を示したが、ローヤルゼリーが末梢血液のＴリンパ球とＢリンパ球のいずれに対して回復効果を発揮しているのかが問題となる。そこで、末梢Ｔリンパ球とＢリンパ球の数をローヤルゼリー投与群とＰＢＳ対照群との間で検討したところ、両リンパ球ともにリンパ球数が著明な回復を示す１４日目と２８日目において同様に回復することが認められた（図７Ａ、Ｂ）。その結果、総リンパ球数が回復傾向を示すなかでＴ／Ｂリンパ球の比率には大きな偏りのないことが確認された。【００４６】
拘束ストレスマウスの胸腺、肝臓、脾臓における白血球細胞の動態とローヤルゼリーの影響
拘束ストレスに曝したマウスの胸腺、肝臓、および脾臓におけるＭＮＣ数の変化とローヤルゼリーの投与による回復効果を見るために、ストレスマウスの４２日目の胸腺、肝臓、脾臓の細胞数を比較した。拘束ストレスに曝すことによって、脾臓、胸腺の細胞数は著明な減少を示し、このマウスにローヤルゼリーを投与することによって脾臓細胞での回復効果は認められないものの、胸腺での細胞数が増加、回復する傾向が示された。しかし、胸腺におけるＭＮＣ数の差は、ローヤルゼリー投与群と非投与群の間で統計的に有意のものではなかった（図８）。【００４７】
また、肝臓、脾臓ではこれらＭＮＣの間でＣＤ３、Ｂ２２０、ＣＤ４、ＣＤ８陽性のリンパ球サブセットの数にも差が見られなかった（データは示さず。）。一方、胸腺ではローヤルゼリー投与マウスにおいて、総ＭＮＣ数が増加する傾向のなかでＣＤ４＋、ＧＤ８＋細胞数、ならびにＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性細胞数が各々バランス良く回復する傾向をみることができた（図９）。【００４８】
討論
ストレスは現代社会にあって日常生活の一部である。また、ストレスは免疫機能にとって障害的に作用し（２３，２４）、病気への感受性を高めることが証明されている（１−３）。それ故に、ストレスの影響を弱めるための方法は、身体的、精神的、かっ生理学的な面を含めて健康維持に不可欠のものである。ラットを用いた実験で、ローヤルゼリーが酸化ストレスに対して効果的であったという報告があるが（２５）、精神的ストレスのモデルのひとつである拘束ストレスに曝されたマウスでの免疫機能に及ぼすローヤルゼリーの賦活効果については未だに報告がない。ローヤルゼリーが抗体産生を増強し免疫担当細胞の増殖を刺激することを通して、免疫機能を賦活化するという報告があることから（１１，１２，１６）、本研究では、拘束ストレスによって誘導された免疫変調に及ぼす脳の免疫調節機能に関して実験を行った。実験では拘束ストレスに曝したマウスに誘導される深刻な免疫不全状態に対してローヤルゼリーがどのような改善効果を発揮するかについて検討した。【００４９】
マウスを週に２日、１２時間にわたって慢性的に拘束するストレスを６週間にわたって与えたところ、末梢白血球数や胸腺細胞、脾臓、肝臓ＭＮＣの著明な減少が認められた。また、末梢血液では、リンパ球の著しい減少と相反して顆粒性白血球の増加が顕著であった。このマウスにローヤルゼリーを投与したところ、減少したリンパ球数がかなりの程度増加・回復し、逆に増加した顆粒性白血球が減少することを認め、拘束ストレスによってもたらされたリンパ球減少症と顆粒球増多症をローヤルゼリーによって顕著に回復することを確認した。ローヤルゼリーはリンパ球に対して増殖活性物質を含み、顆粒球に対しては抑制因子を含むことが推測された。【００５０】
ローヤルゼリーが拘束ストレス下でマウスの末梢リンパ球の産生を上方制御するという今回の事実は、ローヤルゼリーがマウスの免疫担当細胞の増殖を増強させる成分を含むという以前の報告（１５）と一致するものである。また、ストレスによって誘導された顆粒球増多症を下方制御したという結果は、ローヤルゼリーがマクロファージの前炎症性サイトカインの抑制を介して抗炎症性の反応を示したといういくつかの結果で説明できる（２６−２８）。これらの結果は、循環性リンパ球や顆粒性白血球に対してローヤルゼリーが完全ではないものの有意の正常化効果を示し、ローヤルゼリー投与が拘束ストレスによって誘導される免疫機能の変調に対して有効な働きを発揮することを示唆するものである。【００５１】
一方、拘束ストレス下でローヤルゼリーが循環性の免疫細胞の恒常性を維持したことの考え得る説明として、胸腺からの持続的なＴ細胞の供給がリンパ球のロスを補充したことをあげることができる。この考えは、ストレス下でローヤルゼリーが胸腺の総細胞数、ならびにＣＤ４、ＧＤ８陽性Ｔ細胞数の部分的に回復させたという今回のデータを一致するものであろう。胸腺からのＣＤ４、ＣＤ８Ｔ細胞、そして骨髄からのＢ細胞の追加的供給が、末梢Ｔ、Ｂリンパ球数の正常なレベル維持をアシストしたのかも知れない。このことは、ローヤルゼリーがＸ線照射マウスの造血機能に対してマクロファージの活性や造血幹細胞の増殖を誘導することによって造血機能の障害からマウスを守るという結果（２９，３０）と一致するものである。【００５２】
末梢血へのＴ細胞を提供する胸腺Ｔ細胞に対する上方制御と全身性免疫応答の誘導におけるローヤルゼリーの重要性も報告されている（２４）。末梢血液におけるローヤルゼリーのこのような効果に関わらず、ローヤルゼリーが肝臓や脾臓におけるＭＮＣ数やそのサブセット数の変化を改善するという効果を今回の実験では確認できなかった。今回の実験では、肝臓や脾臓に対するローヤルゼリー投与の影響を４２日目のマウスで観察したが、この時期には既にローヤルゼリーによる末梢血の免疫細胞に対する調節的な効果も認められなくなっていた時期である。このため、末梢血での財の効果が認められた１４日目、あるいは２８日目の時期に検討した場合には、これらの臓器でも末梢血液と同様のローヤルゼリーによる効果が認められる可能性を除外することはできない。【００５３】
他方、統計的な有意差はなかったものの、拘束ストレスで有意に減少した胸腺細胞は、総細胞数、およびＣＤ４／ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４、ＧＤ８陽性Ｔ細胞のいずれのサブセットにおいてもローヤルゼリー投与による良好な回復効果が示された。１４日目と２８日目における末梢血でＴリンパ球数の回復、および４２日目での胸腺での上記の結果を考え合わせると、ローヤルゼリーが胸腺での１４日、２８日目の間におけるＴ細胞の分化に大きく関与したことが推測される。【００５４】
ローヤルゼリーが肝臓や脾臓において十分なＭＮＣ数の回復効果を発揮し得なかった原因として考えられる他の理由としては、胸腺で回復したリンパ球の移動やホーミングの問題が考えられる。ストレスを受けた肝臓や脾臓では、リンパ球の移動やホーミングにおける障害があったことが考えられるし、そのホーミングの障害ゆえに、ローヤルゼリーによるリンパ球の回復効果がこれらの器官におけるリンパ球の数に反映されなかった可能性がある。これらの推測を明らかにするためには、さらなる今後の研究が必要である。【００５５】
ローヤルゼリーがストレスによって誘導されたリンパ球減少症を改善し、顆粒球増多症を抑制したという今回の実験は、ローヤルゼリーが前炎症性反応と抗炎症性反応を同時に引き起こしたという意味においてユニークなものである。ローヤルゼリーが前炎症性反応を誘導し、そして抗炎症反応の働きにも関与するということが既に報告されているが、ひとつの実験システムでこれらの現象が同時発生的に証明されたという報告はみられていない。【００５６】
ローヤルゼリーがリンパ球の反応による前炎症性反応と抗炎症性反応という、相反する現象を同時に誘導したという事実は、ローヤルゼリーが個別にこれらの反応に関与したというよりも、免疫系全体を調和的に保つというホメオスターシスの働きを発揮したと考えると考え易い。いずれにしても、リンパ球の減少は免疫能の低下をもたらすものであり、また、顆粒球の過剰な反応はある種の病気やストレス状況下で全身性の炎症反応や組織障害に関与することが知られている。今回の実験でローヤルゼリーがストレス誘導性の顆粒球増多症を抑制したことは、ローヤルゼリーが顆粒性白血球による炎症反応や組織ダメージの治療に有効であることを示唆している。過去に報告された事実と今回の結果に基づいて考えると、拘束ストレスの影響をローヤルゼリーが部分的に和らげることはローヤルゼリーの有益な種々の成分が宿主にとってバランスの良い効果につながったと仮定することができる。【００５７】
参考文献
１．Sagiyama K, Tsuchida M, Kawamura H, Wang S, Li C, Bai X, Nagura T, Nozoe S,AboT(2004)Age-related bias in function of naatural killer T cells and gramlocytes after stress: reciprocal association ofsteroid homones anf sympathetic nerves. Clin Exp Immunol 135:56-63
２．Pruett S B, Fan R, Myers L P, Wu W J, Collier S (2000) Quantitative analysis of theneuroendocrine-immune axis : linear modeling of the effects of exogenous corticosterone and restraint stresson lymphocyte subpopulations in the spleen and thymus in female B6C3F1 mice. Brain Behav Immun14:270-87
３．Breslau N, Davis G C (1986) Chronic stress and major depression. Arch Gen Psychiatry 43:309-14
４．Galosy R A, Clark L K, Vasko M R, Crawford I L (1981) Neurophysiology and neurophafmacology ofcardiovascular regulation and stress. Neusosci Biobehav Rev 5:137-75
５．Tapp W N, Natelson B H (1988) Consequences of stress: a multiplicative function of health status. FASEBJ 2:2268-71
６．Millan S, Gonzalez-Quizano M I, Giordano M, Soto L, Martin A I, Lopez-Calderon A (1996) Short and longrestraint differentially affect humoral and cellular immune functions. Life Sci 59:1431-42
７．Fujiwara R, Shibata H, Komori T, Ybkoyama M M, Okazaki Y, Ohmori M (1999) The mechanisms of immune suppression by high pressure stress in mice. J Pharm Pharmacol 51:1397-404
８．Shimzu T, Kawamura T, Miyaji C, Oya H, Bannai M, Yamamoto S, Weerasinghe A, Halder R C, WatanabeH, Hatakeyama K, Abo T (2000) Resistance of extrathymic T cells to stress and the role of endogenousglucocolticoids in stress associated immnosuppression. Scand J Immunol 51:285-92
９．Tarcic N, Ovadia H, Weiss D W, Weidenfeld J (1998) Restraint stress-induced thymic involution and cell apoptosis are dependent on endogenous glucocorticoids. J Neuroimmunol 82:40-6
１０．Ayala A, Herdon C D, Lehman D L, DeMaso C M, Ayala C A, Chaudry I H (1995) The induction ofaccelerated thymic programmed cell death during polymicrobial sepsis: control by corticosteroids but nottmmor necrosis factor. Shock 3:259-67
１１．Sver L, Orsolic N, Tadic Z, Njari B, Valpotic I, Basic I (1996) A royal jery as a new potentialimmmmomodulator in rats and mice. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 19:31-8
１２．Okamoto I, Taniguchi Y, Kunikata T, Kohno K, Iwaki K, Ikeda M, Kurmoto M (2003) Mjor royal jellyproten modulates immune responses in vitro and in vivo. Life Sci 73:2029-45
１３．Nagai T, Inoue R, Suzuki N, Nagashima T (2006) Antioxidant properties of enzymatic hydrolysates fromroyal jelly. J Med Food 9:363-7
１４．Narita Y, Nomura J, Ohta S, Inoh Y, Suzuki K M, Araki Y, Okada S, Matsumoto I, Isohama Y, Abe K,Miyata T, Mishima S (2006) Royal jelly stimulates bone formation: physiologic and nutrigenomic studieswith mice and cell lines. Biosci Biotechnol Biochem 70:2508-14
１５．Hidaka S, Okamoto Y, Uchiyama S, Nakatsmma A, Hashikmoto K, 0hnishi S T, Yamaguchi M (2006) Royaljelly prevents osteoporosis in rats: beneficial effects in ovariectomy model and in bone tissue culture model. Evid Based Complement Altemat Med 3:339-48
１６．Majtan J, Kovacova E, Bilikova K, Simuth J (2006) The immunostimulatory effct of the recombinant apalbumin 1-major honeybee royal jelly protein-on TNF alpha release. Int Immunopharmacol 6:269-78
１７．Stocker A, Schramel P, Kettrup A, Bengsch E (2005) Trace and mineral elements in royal jelly andhomeostatic effects. J Trace Elem Med Biol 19:183-9
１８．Yamaguchi K. Innovation of natural beekeeping and quality control of beeproducts for promisingapiculture. Current problems of beekeeping and recurrence of natural bee-culture for resolution of theproblems. J Yunan Agricultural Univ 2004;19:322-9.
１９．Moroda T, Iiai T, Tsukahara A, Fukmda M, Suzuki S, Tada T, Hatakeyama K, Abo T (1997) Association of granulocytes with ulcer formation in the stomach of rodents exposed to restraint stress. Biomed Res 18:423-37
２０．Ito C, Shen H, Toyota H, Kubota Y, Sakurai E, Watanabe T, Sato M (1999) Effects of the acute and chronic restraint stresses on the central histaminergic neuron system of Fisher rat. Neurosci Lett 262:143-5
２１．Tilbrook A J, Canny J B, Serapaglia M D, Ambrose T J, Clarke I J (1999) Suppression of the secretion of luteinizeing hommone due to isolation/restraint stress in gonadectomised rams and wews is influenced by sex steroids. J Endocrinol 160:469-81
２２．Mannoor M K, Weerasinghe A, Halder R C, Morshed S R M, Ariyasjnghe A, Watanabe H, Sekikawa H, Abo T (2001) Resistance to malarial infection is achieved by the coopeation of NK1.1+ and NK1.1- subsets of intermediate TCT cells which are constituents of innate immunity. Cell Immunol 211:96-104
２３．Carrasco G. A, Van de Kar L. D (2003) Neuroendocrine pharmacology of stress, Eur J Pharmacol 463(1-3) 235-272.
２４．Chrousos G P (2000) The stress response and immune function: clinical implications. The 19999 Novera H. Spector Lecture, Ann N Y Acad Sci 917:38-66.
２５．El-Nekeety A A, El-Kholy W, Abbas N F, Ebaid A, Amra H A, Abdel-Wahhab M A (2007) Efficacy of royal jelly against the oxidative stress of fumonisin in rats. Toxicon. 50(2)256-69
２６．Kohno K, Okamoto I, Sano O, Arai N, Iwaki K, Ikeda M, Kurimoto M (2004) Royal jelly inhibits the production of proinflammatory cytokines by activated macrophages. Biosci Biotechnol Biochem 68:138-45
２７．Emori Y, Oka H, Kobayashi N, Ohya O, Tamaki H, Hayashi Y, Nomoto K (1999) Protcctive effect of royal jelly on immune dysfunction in aged mice. Biotherapy 13:281-7
２８．Fujii A, Kobayashi S, Kuboyama N, Furukawa Y, Kaneko Y, Ishihara S, Yamamoto H, Tamura T (1990) Augmentation of wound healing by royal jelly in streptozotocin-diabetic rats. Jpn J Phamaco 53:331-7
２９．2006 Cheng Y H, Ding S T, Chang M H (2006). Effect of fumonisins on macropharge immune functions and gene expression of cytokins in broilers, Arch. Anim. Nutr. 60(4):267-276.
３０．Emori Y, H., Oka H, Ohya O, Tamaki H, Hayashi H, Nomoto K (1998). The protective effect of royal jelly against the hemopoiesis dysfunction in X-irradiated mice, Biotherapy 12:313-319.
【図１】
2010008005.tif 000003
【図２】
2010008005.tif 000004
【図３】
2010008005.tif 000005
【図４】
2010008005.tif 000006
【図５】
2010008005.tif 000007
【図６】
2010008005.tif 000008
【図７】
2010008005.tif 000009
【図８】
2010008005.tif 000010
【図９】
2010008005.tif 000011
【国際調査報告】
2010008005.tif 000012
2010008005.tif 000013
2010008005.tif 000014
2010008005.tif 000015
2010008005.tif 000016
2010008005.tif 000017
2010008005.tif 000018