(57)【要約】要約  ＨＣＶ治療薬の開発や評価系に用いることのできるＨＣＶ動物モデルを構築するために、ＨＣＶの複製機能を維持し、タマリンに感染することのできるＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスが開示されている。ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡは、Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡ及びＧＢウイルス−ＢのＲＮＡを含むＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡであって、前記Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡが、Ｃ型肝炎ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列における第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンを含むＮＡ４Ｂタンパク質をコードするＲＮＡを含む。
2010008010.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡ及びＧＢウイルス−ＢのＲＮＡを含むＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡであって、前記Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡが、Ｃ型肝炎ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列における第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンを含むＮＳ４Ｂタンパク質をコードするＲＮＡを含むことを特徴とする、ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ。
【請求項２】
（Ａ）Ｃ型肝炎ウイルスの、５’非翻訳領域のＲＮＡを含むＨＣＶ−５’側ＲＮＡ、
（Ｂ）ＧＢウイルス−Ｂの、Ｅ１タンパク質及びＥ２タンパク質をコードするＲＮＡを含むＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ、並びに
（Ｃ）Ｃ型肝炎ウイルスの、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ、並びに３’非翻訳領域のＲＮＡを含むＨＣＶ−３’側ＲＮＡ、
を含み、前記ＨＣＶ−５’側ＲＮＡ（Ａ）及びＨＣＶ−３’側ＲＮＡ（Ｃ）の間に、ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）が挿入される、請求項１に記載のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ。
【請求項３】
前記ＨＣＶ−５’側ＲＮＡ（Ａ）が、５’非翻訳領域のＲＮＡ及びコアタンパク質の一部又は全部をコードするＲＮＡを含み、
前記ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）が、コアタンパク質の一部、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、及びｐ６タンパク質をコードするＲＮＡを含み、
前記ＨＣＶ−３’側ＲＮＡ（Ｃ）が、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ、並びに３’非翻訳領域のＲＮＡを含む、
請求項２に記載のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ。
【請求項４】
前記ＨＣＶ−５’側ＲＮＡ（Ａ）及び前記ＨＣＶ−３’側ＲＮＡ（Ｃ）が、それぞれ、配列番号５７で示される塩基配列の相当する領域の塩基配列、又は該塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有し、霊長類の肝臓細胞内で増殖可能なウイルス粒子をコードする請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ。
【請求項５】
前記ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）が、コアタンパク質の全部、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、及びｐ６タンパク質をコードするＲＮＡを含み、
前記ＨＣＶ−３’側ＲＮＡ（Ｃ）が、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ、並びに３’非翻訳領域のＲＮＡを含む、
請求項２に記載のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ。
【請求項６】
（Ａ）Ｃ型肝炎ウイルスの、５’非翻訳領域のＲＮＡ並びにコアタンパク質及びＥ１タンパク質の一部をコードするＲＮＡを含むＨＣＶ−５’側ＲＮＡ、
（Ｂ）ＧＢウイルス−Ｂの、Ｅ１タンパク質の一部及びＥ２タンパク質をコードするＲＮＡを含むＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ、並びに
（Ｃ）Ｃ型肝炎ウイルスの、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ、並びに３’非翻訳領域のＲＮＡを含むＨＣＶ−３’側ＲＮＡ、
を含み、前記ＨＣＶ−５’側ＲＮＡ（Ａ）及びＨＣＶ−３’側ＲＮＡ（Ｃ）の間に、ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）が挿入され、前記ＨＣＶ−５’側ＲＮＡ（Ａ）によりコードされるＥ１タンパク質の一部は、Ｅ１タンパク質のＮ末端側の一部分であり、前記ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）によりコードされるＥ１タンパク質の一部は、Ｅ１タンパク質のＣ末端側の一部分であり、これらの両方の部分の融合によりＥ１タンパク質の全長がカバーされる、請求項１に記載のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ。
【請求項７】
前記ＨＣＶ−５’側ＲＮＡ（Ａ）によりコードされるＥ１タンパク質の一部は、Ｅ１タンパク質のＮ末端から３０アミノ酸以下の領域である請求項４記載のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ。
【請求項８】
前記ＨＣＶ−３’側ＲＮＡ（Ｃ）が、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ、並びに３’非翻訳領域のＲＮＡを含む、請求項５又は６記載のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ。
【請求項９】
前記ＨＣＶ−５’側ＲＮＡ（Ａ）及び前記ＨＣＶ−３’側ＲＮＡ（Ｃ）が、それぞれ、配列番号５７で示される塩基配列の相当する領域の塩基配列、又は該塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有し、前記ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）が、配列番号９９で示される塩基配列の相当する領域の塩基配列、又は該塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有し、霊長類の肝臓細胞内で増殖可能なウイルス粒子をコードする請求項５〜８のいずれか１項に記載のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ。
【請求項１０】
配列番号５５で表される塩基配列からなるＲＮＡである、請求項３記載のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ。
【請求項１１】
配列番号９３、９５若しくは９７で表される塩基配列、又はこれらの塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を含み、霊長類の肝臓細胞内で増殖可能なウイルス粒子をコードする請求項１記載のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ。
【請求項１２】
配列番号９３、９５又は９７で表される塩基配列からなるＲＮＡである、請求項１１記載のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡの相補的なＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂマイナス鎖キメラＲＮＡ。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡを含むＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルス。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡをコードする、ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＤＮＡ。
【請求項１６】
請求項１５に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＲＮＡ又は請求項１２に記載のＤＮＡから翻訳されるＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラタンパク質。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡを含む、ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ複製細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ、又は請求項１１に記載のＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスを接種された非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣＶ」と称することがある）とＧＢウイルスＢ（以下「ＧＢＶ−Ｂ」と称することがある）のキメラＲＮＡ及びそのキメラＲＮＡを含むキメラウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶはＣ型慢性肝炎の原因因子であり、ＷＨＯの統計によれば、世界中で１．７億人の感染者がいると推定されている。ＨＣＶは、フラビウイルス科、フラビウイルス属に分類されるウイルスであり、血液や血液成分を介して感染し、肝臓で増殖すると考えられている。ＨＣＶの感染者は、感染初期においては比較的軽微な症状を引き起こすのみであるが、高頻度に慢性化し、一定期間の無症候性期を経た後、慢性肝炎を発症する。そして感染が長期化するに従って、肝硬変へと病状が増悪化し、高い頻度で肝がんに至る。肝がんの９５％は肝炎ウイルスが関与しており、その８０％がＨＣＶの感染によると考えられている。【０００３】
ＨＣＶは約９６００塩基のプラス鎖ＲＮＡをゲノムとして持ち、遺伝子配列の解析から、少なくとも６種類の遺伝子型が存在していると推定されている。約９６００塩基のゲノムは、感染後、宿主細胞内でｍＲＮＡとして機能し、約３０００アミノ酸長の一つながりのポリプロテインが合成され、宿主のシグナルペプチダーゼ、シグナルペプチジルペプチダーセ、及びＨＣＶゲノムがコードするプロテアーゼにより切断される。その結果ｃｏｒｅ（コア）、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂの１０種類のタンパク質が産生される。この翻訳枠（オープンリーディングフレーム）以外に、５’末端、３’末端に非翻訳領域（ＵＴＲ）が存在し、翻訳調節、ゲノムの複製調節機能を担っている。【０００４】
このうちコア、Ｅ１及びＥ２はウイルスを構成する構造タンパク質であり、ウイルスゲノムはコア蛋白によりパッケージされ、キャプシドを形成し、脂質二重膜にアンカーしたＥ１、Ｅ２外皮蛋白によって取り囲まれ、ウイルス粒子（ビリオン）を形成すると考えられている。ｐ７についてはその機能は明らかではないが、ウイルスの増殖に必須であることが報告されている。ＮＳ２はメタルプロテアーゼであり、それ自身の切断に必要であるが、それ以外の機能については分かっていない。ＮＳ３からＮＳ５Ｂは複合体を形成し、宿主タンパク質とともに、ＲＮＡ複製装置を形成し、ゲノムＲＮＡの複製を行うと考えられている。【０００５】
Ｃ型慢性肝炎の治療には、広くインターフェロンが用いられている。近年、インターフェロンの剤型の改良や、インターフェロンとリバビリンとの併用療法などの投与方法の改善により、ＨＣＶが体内から駆除され、完治する割合も徐々に増加してきている。しかしながら、未だにインターフェロン投与による完治率は５割程度であり、インターフェロン投与による重篤な副作用や高齢者などに適応出来ない症例が多く、ＨＣＶに効果的な治療法や薬剤の開発が望まれている。【０００６】
ＨＣＶは、ヒトでは血液又は血液成分を介して感染するが、ヒト以外の生物では、類人猿（チンパンジー）に感染し、感染により肝炎を発症し慢性肝炎に至る場合もある。しかしながら、飼育が容易な小型の実験動物では、ＨＣＶに高率に感染するものは知られていない。【０００７】
一方、急性肝炎を発症した外科医から採取した血清を小型霊長類のタマリンに接種すると肝炎を誘発することが判明した。この原因不明の輸血性肝炎サルの血液を、分子生物学的手法で解析することにより、２種類のウイルスであるＧＢＶ−Ａ、及びＧＢＶ−Ｂが同定された（非特許文献１）。このうち、ＧＢＶ−Ｂは分子構造的にＨＣＶに最も近縁であり、新世界ザルのタマリンやマーモセットに感染し肝炎を誘発することが分かった（非特許文献２）。ＨＣＶは感染宿主域が狭く、適当な動物モデルが無いため、ＧＢＶ−Ｂとタマリンの動物モデルは、ＨＣＶの感染増殖の代替モデルとして利用可能と考えられている。しかしながら、ＧＢＶ−ＢはＨＣＶとの構造的類似性は確認されているものの、ＨＣＶとのアミノ酸相同性は約２８％と低く、ＨＣＶに特異的に作用する薬剤の開発及び評価系として、ＧＢＶ−Ｂとタマリンの動物モデルをそのまま用いても、ＨＣＶに特異的に作用する薬剤をスクリーニングすることはできない。【０００８】
ＧＢＶ−Ｂを用いたＨＣＶの動物モデルを構築するため、ＧＢＶ−Ｂ遺伝子をベースとして、ＧＢＶ−Ｂ遺伝子の一部の遺伝子を、対応するＨＣＶ遺伝子と置換したり、ＧＢＶ−Ｂ遺伝子に一部のＨＣＶ遺伝子を挿入して、ＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスを作製する試みが行われている。Ｒｉｊｎｂｒａｎｄらは、ＧＢＶ−Ｂの５’ＵＴＲの一部を対応するＨＣＶの５’ＵＴＲに置換えて、タマリンに感染可能であることを示した（非特許文献３）。また、Ｈａｑｓｈｅｎａｓらは、ＧＢＶ−Ｂの外皮蛋白Ｅ２の高可変領域１（ＨＶＲ１）にＨＣＶのＨＶＲ１を挿入したキメラウイルスを作製し、マーモセットでの感染を確認した（非特許文献４）。しかしながら、これらのキメラウイルスは、大部分がＧＢＶ−Ｂ遺伝子であり、ＨＣＶとしての複製機能を有していない。従って、これらのキメラウイルスは、ＨＣＶ治療薬の開発に有用であるとは言えない。【０００９】
【特許文献１】WO 2008/136470 A1
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」（米国）１９９５年、第６９巻、ｐ５６２１−５６３０
【非特許文献２】「ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」（米国）１９９９年、第２６２巻、ｐ４７０−４７８
【非特許文献３】「ヘパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）」（米国）２００５年、第４１巻、ｐ９８６−９９４
【非特許文献４】「ジャーナル・オブ・ジェネラル・ヴィロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」（英国）２００７年、第８８巻、ｐ８９５−９０２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＨＣＶは、チンパンジー以外には、感染し増殖する動物モデルが存在しないため、効率的に薬剤の開発を行うことが困難であった。また、チンパンジーは動物保護法の適用により、動物実験に使用することが禁じられている。このような理由から、現在広く用いられているインターフェロン治療は、患者を被検体として直接治療法が開発、改良されてきており、患者に多大な負担を強いてきた。そのため、前臨床試験での小型の動物モデルを用いた医薬品の開発や評価が重要となっている。一方、小型霊長類のタマリンに感染するＧＢＶ−Ｂは、遺伝子構造がＨＣＶに類似し、肝炎症状を誘発することから、ＨＣＶの動物モデルとして期待されている。本発明の目的は、ＨＣＶ治療薬の開発や評価系に用いることのできるＨＣＶ動物モデルを構築するために、ＨＣＶの複製機能を維持し、タマリン又はマーモセットに感染することのできるＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ＨＣＶに特異的及び効果的に作用する薬剤の開発に使用することのできるＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスについて鋭意研究を行い、Ｃ型肝炎ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列における第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンを含むＮＳ４Ｂタンパク質をコードするＲＮＡを含むＨＣＶのＲＮＡと、ＧＢＶ−ＢのＲＮＡとを連結することによって、ＨＣＶとしての複製機能を維持し、そしてタマリンやマーモセットに持続感染し、増殖することのできるＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡを作製した。
このＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡの、ヒト肝がん由来細胞株における複製効率は、親株のＨＣＶの複製効率と比較して上昇していた。すなわち、本発明者は、得られたＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡが、ＨＣＶの複製機能を充分維持していることを見出した。
更に、このＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡをマーモセットの初代肝細胞に導入したところ、ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡは細胞内で自律的に増殖し、細胞上清中にコア蛋白を持続的に放出した。すなわち、本発明者は、ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡをマーモセットの初代肝細胞にトランスフェクションすることで、再感染可能なＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスを産生できることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。【００１２】
従って、本発明はＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡ及びＧＢウイルス−ＢのＲＮＡを含むＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡであって、前記Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡが、Ｃ型肝炎ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列における第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンを含むＮＳ４Ｂタンパク質をコードするＲＮＡを含むことを特徴とする、ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡに関する。
本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡの好ましい態様においては、
（Ａ）Ｃ型肝炎ウイルスの、５’非翻訳領域のＲＮＡを含むＨＣＶ−５’側ＲＮＡ、
（Ｂ）ＧＢウイルス−Ｂの、Ｅ１タンパク質及びＥ２タンパク質をコードするＲＮＡを含むＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ、並びに
（Ｃ）Ｃ型肝炎ウイルスの、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ、並びに３’非翻訳領域のＲＮＡを含むＨＣＶ−３’側ＲＮＡ、
を含み、前記ＨＣＶ−５’側ＲＮＡ（Ａ）及びＨＣＶ−３’側ＲＮＡ（Ｃ）の間に、ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）が挿入される。
本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡの別の好ましい態様においては、前記ＨＣＶ−５’側ＲＮＡ（Ａ）が、５’非翻訳領域のＲＮＡ及びコアタンパク質の一部又は全部をコードするＲＮＡを含み、
前記ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）が、コアタンパク質の一部、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、及びｐ６タンパク質をコードするＲＮＡを含み、
前記ＨＣＶ−３’側ＲＮＡ（Ｃ）が、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ、並びに３’非翻訳領域のＲＮＡを含み、より好ましくは、配列番号５５で表される塩基配列からなるＲＮＡである。
また、本発明は、前記ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡの相補的なＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂマイナス鎖キメラＲＮＡに関する。
また、本発明は、前記ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡを含むＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスに関する。
また、本発明は、前記ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡをコードする、ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＤＮＡに関する。
また、本発明は、前記ＲＮＡ又は請求項７に記載のＤＮＡから翻訳されるＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラタンパク質に関する。
また、本発明は、前記ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡを含む、ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ複製細胞に関する。
また、本発明は、前記ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ、又は請求項６に記載のＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスを接種された非ヒト動物に関する。
本明細書において、ＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラ遺伝子は、ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ及びＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＤＮＡを意味する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡによれば、ヒト肝臓由来細胞において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで高い効率で複製することのできるレプリコンＲＮＡを提供することが可能である。更に、マーモセットの初代肝細胞において自律的に複製し、持続感染及び再感染可能なＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルス粒子を産生することができる。
本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスを用いることにより、小型霊長類であるタマリンやマーモセットを用いたＨＣＶ動物モデルを構築することができる。そして、この動物モデルを利用することにより、ＨＣＶの基礎研究はもとより、肝炎の重症化を抑制、又は阻害する医薬品の開発や評価を行うことができ、より有効な感染の予防薬及び治療薬の開発及び評価が可能となる。
また、本発明は、このＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラ遺伝子が複製する細胞を提供する。このＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラ遺伝子が複製している細胞のＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラ複製系を用いて、ＨＣＶの増殖を抑制する薬剤のスクリーニングができる。また、動物モデルはスクリーニングされた薬剤の効果を評価する方法としても有効である。この場合、薬剤の評価をこの方法で行うことが重要であり、薬剤の管理に必須であれば、薬剤を製造する方法としても利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡをＨｕｈ−７細胞にトランスフェクションし、４時間、２４時間、４８時間、７２時間後の上清中のＨＣＶのコアタンパク質の濃度を測定した図である。
【図２】本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡを、タマリンの初代肝細胞にトランスフェクションし、上清中のＨＣＶのコアタンパク質の濃度を測定した図である。
【図３】本発明のin vitro合成ＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスを、タマリンの初代肝細胞に感染させ、上清中のＨＣＶゲノム数を測定した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡは、Ｃ型肝炎ウイルスのＲＮＡ及びＧＢウイルス−ＢのＲＮＡが連結したものであり、Ｃ型肝炎ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列における第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンを含むＮＳ４Ｂタンパク質をコードするＲＮＡを含む。本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡは、タマリンやマーモセット等の霊長類哺乳動物の肝臓細胞中で増殖可能なウイルス粒子をコードするものである。
第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンのそれぞれのアミノ酸番号は、３０１０個のアミノ酸からなるＣ型肝炎ウイルスの全長のポリプロテインにおけるアミノ酸番号を示している。第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンは、ＮＳ４Ｂタンパク質に含まれるアミノ酸である。本発明者らは、先にこれらのアミノ酸をコードする塩基配列を含むＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡを報告した（特許文献１）が、それまで、これらのアミノ酸を含むＮＳ４Ｂタンパク質は報告されていなかった。従って、これらのアミノ酸を含むＨＣＶポリプロテイン、これらのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含むＲＮＡレプリコンも報告されていなかった。
【００１６】
前記ＨＣＶのポリプロテインは、例えば、３０１０個のアミノ酸からなる遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスにおいては、第１番目〜第１９１番目のアミノ酸配列からなるコアタンパク質、第１９２番目〜第３８３番目のアミノ酸配列からなるＥ１タンパク質、第３８４番目〜第７４６番目のアミノ酸配列からなるＥ２タンパク質、第７４７番目〜第８０９番目のアミノ酸配列からなるｐ７タンパク質、第８１０番目〜第１０２６番目のアミノ酸配列からなるＮＳ２タンパク質、第１０２７番目〜第１６５７番目のアミノ酸配列からなるＮＳ３タンパク質、第１６５８番目〜第１７１１番目のアミノ酸配列からなるＮＳ４Ａタンパク質、第１７１２番目〜第１９７２番目のアミノ酸配列からなるＮＳ４Ｂタンパク質、第１９７３番目〜第２４１９番目のアミノ酸配列からなるＮＳ５Ａタンパク質、又は第２４２０番目〜第３０１０番目のアミノ酸配列からなるＮＳ５Ｂタンパク質からなる。本明細書において、ＨＣＶのポリプロテインは、ＨＣＶのＲＮＡから翻訳される一つながりのタンパク質を意味し、例えば遺伝子型１ｂのＨＣＶにおいては、３０１０アミノ酸からなるタンパク質である。
【００１７】
本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡは、３０１０個のアミノ酸からなるＣ型肝炎ウイルスの全長のポリプロテインにおける第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンをコードするポリヌクレオチドを含むことにより、ヒト肝臓由来の細胞で複製することができ、且つマーモセットの初代肝細胞において自律的に複製し、再感染可能なＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルス粒子を産生することができる。
【００１８】
ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡは、更に、キメラＲＮＡの複製及び感染を実質的に阻害しないＲＮＡを含むことができる。例えば、選択マーカー遺伝子、リポーター遺伝子、又はＩＲＥＳ配列を含むことができる。
【００１９】
本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡは、前記第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンをコードするポリヌクレオチドを含む限り限定されるものではないが、好ましくはＨＣＶの５’側ＲＮＡ、ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ、及びＨＣＶの３’側ＲＮＡの３つの部分を含み、より好ましくは、配列番号５５で表される塩基配列からなるキメラＲＮＡである。
（Ａ）ＨＣＶの５’側ＲＮＡ
ＨＣＶの５’側のＲＮＡは、少なくともＨＣＶの５’非翻訳領域のＲＮＡを含む。更に、ＨＣＶのコアタンパク質の一部又は全部をコードするＲＮＡを含むことができる。
ＨＣＶの遺伝子においては、例えば、一般的な遺伝子型１ｂのＨＣＶ遺伝子は、５’非翻訳領域のＲＮＡ（第１番〜第３４１番：以下、５’ＵＴＲと称することがある）と、それに続いて、前記のウイルス構造タンパク質であるコアタンパク質をコードするＲＮＡ（第３４２番〜第９１４番）、Ｅ１タンパク質をコードするＲＮＡ（第９１５番〜第１４９０番）、及びＥ２タンパク質をコードするＲＮＡ（第１４９１番〜第２５７９番）、並びに非構造タンパク質であるｐ７タンパク質をコードするＲＮＡ（第２５８０番〜第２７６８番）、ＮＳ２タンパク質をコードするＲＮＡ（第２７６９番〜第３４１９番）、ＮＳ３蛋白をコードするＲＮＡ（第３４２０番〜第５３１２番）、ＮＳ４Ａタンパク質をコードするＲＮＡ（第５３１３番〜第５４７４番）、ＮＳ４Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ（第５４７５番〜第６２５７番）、ＮＳ５Ａタンパク質をコードするＲＮＡ（第６２５８番〜第７５９８番）、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ（第７５９９番〜第９３７１番）と、更に３’非翻訳領域のＲＮＡ（第９３７２番以降：以下、３’ＵＴＲと称することがある）とからなっている。
【００２０】
５’ＵＴＲは、遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルス遺伝子においては、通常３４１ヌクレオチドからなり、ＨＣＶの５’側のＲＮＡは、その全長のヌクレオチド配列を含むことが好ましい。
また、コアタンパク質をコードするＲＮＡは、第３４２番〜第９１４番の５７３個のヌクレオチドからなり、ＨＣＶの５’側のＲＮＡは、その全部又は一部のヌクレオチドを含むことができる。
ＨＣＶの５’側ＲＮＡの塩基配列は、特に限定されるものではないが、配列番号５５の相当する領域の塩基配列に対して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する。ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡは、ＨＣＶの５’側ＲＮＡを含むことにより、５’ＵＴＲのＲＮＡ又はコアタンパク質をコードするＲＮＡの機能を阻害する薬剤をスクリーニングすることができる。
【００２１】
（Ｂ）ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ
ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡは、少なくともＥ１タンパク質をコードするＲＮＡ、Ｅ２タンパク質をコードするＲＮＡを含むことが好ましい。更に、コアタンパク質をコードするＲＮＡの一部又は全部、及び／又はｐ６タンパク質をコードするＲＮＡの一部又は全部を含むことができる。
ＧＢＶ−Ｂの遺伝子は、５’非翻訳領域のＲＮＡ（第１番〜第４４５番：以下、５’ＵＴＲと称することがある）と、それに続いて、ウイルスの構造タンパク質であるコアタンパク質をコードするＲＮＡ（第４４６番〜第９１３番）、Ｅ１タンパク質をコードするＲＮＡ（第９１４番〜第１４８９番）、及びＥ２タンパク質をコードするＲＮＡ（第１４９０番〜第２２８４番）、並びに非構造タンパク質であるｐ６タンパク質をコードするＲＮＡ（第２２８５番〜第２４５２番）、ｐ７タンパク質をコードするＲＮＡ（第２４５３番〜第２６４１番）、ＮＳ２タンパク質をコードするＲＮＡ（第２６４２番〜第３２６５番）、ＮＳ３蛋白をコードするＲＮＡ（第３２６６番〜第５１２５番）、ＮＳ４Ａタンパク質をコードするＲＮＡ（第５１２６番〜第５２９０番）、ＮＳ４Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ（第５２９１番〜第６０３４番）、ＮＳ５Ａタンパク質をコードするＲＮＡ（第６０３５番〜第７２６７番）、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ（第７２６８番〜第９０３７番）と、更に３’非翻訳領域のＲＮＡ（第９０３８番以降：以下、３’ＵＴＲと称することがある）とからなっている。ＨＣＶの遺伝子との構造上の違いは、ＧＢＶ−Ｂがｐ６タンパク質をコードする領域を有していることである。
【００２２】
ＧＢＶ−ＢのＥ１タンパク質をコードするＲＮＡは、第９１４番〜第１４８９番の５７６個のヌクレオチドからなり、その全長のヌクレオチド配列を含むことが好ましい。Ｅ２タンパク質をコードするＲＮＡは、第１４９０番〜第２２８４番の７９５個のヌクレオチドからなり、その全長のヌクレオチドを含むことが好ましい。
Ｅ１タンパク質をコードするＲＮＡ、Ｅ２タンパク質をコードするＲＮＡを含むことにより、ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡは、タマリン及びマーモセットなどの実験動物、又はこれらの動物由来の細胞に感染することが可能になる。
【００２３】
また、コアタンパク質をコードするＲＮＡは、第４４６番〜第９１３番の４６８個のヌクレオチドからなり、ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡは、その全部又は一部のヌクレオチドを含むことができる。
更に、ｐ６タンパク質は、第２２８５番〜第２４５２番の１６８個のヌクレオチドからなり、ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡは、その全部又は一部のヌクレオチドを含むことができる。
ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡの塩基配列は、翻訳されたＧＢＶ−Ｂのタンパク質としての機能、すなわち、産生されたキメラウイルスがタマリン及びマーモセットなどの実験動物への感染能を有する限り、特に限定されない。
【００２４】
（Ｃ）ＨＣＶの３’側ＲＮＡ
ＨＣＶの３’側のＲＮＡは、少なくともＮＳ３タンパク質をコードするＲＮＡ、ＮＳ４Ａタンパク質をコードするＲＮＡ、ＮＳ４Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ、ＮＳ５Ａタンパク質をコードするＲＮＡ、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ、並びに３’非翻訳領域のＲＮＡを含む。更に、ＨＣＶのｐ７タンパク質をコードするＲＮＡ、ＮＳ２タンパク質をコードするＲＮＡを含むことができる。
ｐ７タンパク質をコードするＲＮＡは、第２５８０番〜第２７６８番の１８９個のヌクレオチドからなり、その全部又は一部のヌクレオチドを含むことができる。ＮＳ２タンパク質をコードするＲＮＡは、第２７６９番〜第３４１９番の６５１個のヌクレオチドからなり、その全長のヌクレオチドを含むことができる。
ＮＳ３タンパク質をコードするＲＮＡは、第３４２０番〜第５３１２番の１８９３個のヌクレオチドからなり、その全長のヌクレオチドを含むことが好ましい。
ＮＳ４Ａタンパク質をコードするＲＮＡは、第５３１３番〜第５４７４番の１６２個のヌクレオチドからなり、その全長のヌクレオチドを含むことが好ましい。
ＮＳ４Ｂタンパク質をコードするＲＮＡは、第５４７５番〜第６２５７番の７８３個のヌクレオチドからなり、その全長のヌクレオチドを含むことが好ましい。
ＮＳ５Ａタンパク質をコードするＲＮＡは、第６２５８番〜第７５９８番の１３４１個のヌクレオチドからなり、その全長のヌクレオチドを含むことが好ましい。
ＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡは、第７５９９番〜第９３７１番の１７７３個のヌクレオチドからなり、その全長のヌクレオチドを含むことが好ましい。
３’ＵＴＲのＲＮＡは、第９３７２番以降のＲＮＡであり、ウイルス株によってその長さは異なるが、通常４１ヌクレオチドの可変領域、株により長さの異なるポリＵ領域、及び９８ヌクレオチドの３’Ｘ領域からなる。ＨＣＶの３’側ＲＮＡは、その全長の３’ＵＴＲを含むことが好ましい。
【００２５】
ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡは、コアをコードするＲＮＡとして、ＨＣＶのコアをコードするＲＮＡ、ＧＢＶ−ＢのコアをコードするＲＮＡ、又はＨＣＶとＧＢＶ−ＢとのキメラのコアをコードするＲＮＡを含むことができる。ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡから翻訳されるこれらのコアタンパク質は、ＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルス粒子に含まれることができる。
ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡは、ＧＢＶ−Ｂのｐ６タンパク質をコードするＲＮＡの全部又は一部、ＨＣＶのｐ７タンパク質をコードするＲＮＡの全部又は一部、及び／又はＮＳ２タンパク質をコードするＲＮＡの全部又は一部を含むことができる。
【００２６】
前記ＨＣＶの３’側ＲＮＡは、Ｃ型肝炎ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列における第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンをコードするＲＮＡを含む。このアミノ酸は、ＮＳ４Ｂタンパク質に含まれており、この２つのアミノ酸配列をコードするＲＮＡを含むこと、より好ましくは、この２つのアミノ酸配列を含むＮＳ４ＢタンパクをコードするＲＮＡを含むことにより、本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡは、マーモセットの初代肝細胞においてもＲＮＡの複製、キメラウイルスの産生を行うことができると考えられる。
ＨＣＶの３’側ＲＮＡの塩基配列は、特に限定されるものではないが、配列番号５５の相当する領域の塩基配列に対して、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有する。
【００２７】
更に、ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡは、ＨＣＶの３’側ＲＮＡを含むことにより、非構造タンパク質の機能を阻害する薬剤、３’ＵＴＲのＲＮＡの機能を阻害する薬剤をスクリーニング又は評価することができる。
【００２８】
本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡは、前記ＨＣＶの５’側ＲＮＡ（Ａ）、ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）、及びＨＣＶの３’側ＲＮＡ（Ｃ）をその順番で結合したものが好ましい。すなわち、５’側ＲＮＡ（Ａ）、及びＨＣＶの３’側ＲＮＡ（Ｃ）の間にＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）が挿入されたものが好ましい。
【００２９】
本発明において、ＨＣＶ−ＲＮＡの遺伝子型は、特に限定されるものではないが、ＨＣＶの遺伝子型１ｂが好ましい。ＨＣＶ遺伝子は、その塩基配列によって、少なくとも６種類の遺伝子型に分類することが可能であり、遺伝子型１ｂは遺伝子型１に属する亜型である。遺伝子型１ｂのＨＣＶは、そのＲＮＡの塩基配列から分類されるが、例えば、配列番号５７の塩基配列に対して、９０％以上の相同性を示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを有するＨＣＶが含まれる。
【００３０】
本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡは、細胞内、例えば、ヒト肝細胞、タマリンの肝細胞、マーモセットの肝細胞で複製することも可能である。すなわち、レプリコンＲＮＡとして機能することもできる。レプリコンＲＮＡとして機能する場合、本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡは、タンパク質の鋳型となるプラス鎖ＲＮＡ、すなわち、ｍＲＮＡとして機能する。このプラス鎖ＲＮＡからマイナス鎖ＲＮＡが合成され、そのマイナス鎖ＲＮＡを鋳型として、プラス鎖ＲＮＡを合成することができる。本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂマイナス鎖キメラＲＮＡも、プラス鎖であるＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡの鋳型となる点で、有用である。
【００３１】
本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスは、前記ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡを含み、前記ＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラから翻訳されたウイルスを構成するいくつかのタンパク質を含むことができる。ウイルスを構成するタンパク質は、限定されるものではないが、例えば、ＨＣＶのコアタンパク質、ＨＣＶのコアタンパク質の一部とＧＢＶ−Ｂのコアタンパク質の一部からなるキメラコアタンパク質、ＧＢＶ−ＢのＥ１タンパク質、及びＥ２タンパク質を挙げることができる。
【００３２】
本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＤＮＡは、前記ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡに対応するするＤＮＡである限り、限定されるものではなく、例えば、ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡから逆転写酵素により合成された一本鎖のｃＤＮＡ、その１本鎖ｃＤＮＡとその相補鎖からなる二本鎖ＤＮＡ、又はプラスミドに組み込まれた二本鎖ＤＮＡなどを挙げることができる。
【００３３】
本発明のベクターは、前記ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＤＮＡを含むベクターである。特に限定されるものではないが、例えば、プラスミドベクター、直鎖状２本鎖ＤＮＡベクター並びに、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクター等のウイルスベクターを挙げることができるが、好ましくはプラスミドベクターである。
【００３４】
本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラタンパク質は、前記ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡから翻訳されたタンパク質であり、例えば、ＲＮＡのタンパク質をコードされた領域から翻訳される一本のキメラポリプロテイン（配列番号５６）、又はＨＣＶのコアタンパク質の一部とＧＢＶ−Ｂのコアタンパク質の一部からなるキメラコアタンパク質を挙げることができる。
【００３５】
本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡは、任意の遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。限定するものではないが、キメラＲＮＡは、例えば、以下のような方法で作製することができる。
前記のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡをコードするＤＮＡを、常法によりクローニングベクターに挿入して、ＤＮＡクローンを作製する。得られたＤＮＡをＲＮＡプロモーターの下流に挿入して、レプリコンＲＮＡを産生することのできるＤＮＡクローンを作製する。より具体的には、例えば、劇症Ｃ型肝炎患者から単離されたＴＰＦ１クローン（特許文献１）のコア蛋白１５６番目からＥ２蛋白までを欠失した遺伝子を構築し、ＧＢＶ−Ｂのコア蛋白１２４番目からｐ６蛋白までの遺伝子を化学合成し、ＨＣＶの欠失させた部分に挿入・連結し、ＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラ遺伝子を構築することができる。前記ＲＮＡプロモーターは、プラスミドクローン中に含まれるものであることが好ましい。ＲＮＡプロモーターとしては、限定するものではないが、Ｔ７  ＲＮＡプロモーター、ＳＰ６  ＲＮＡプロモーター、ＳＰ３  ＲＮＡプロモーターが挙げられ、Ｔ７  ＲＮＡプロモーターが特に好ましい。
【００３６】
本発明の好ましい態様として、さらに以下のものを挙げることができる。
【００３７】
すなわち、この態様（以下、便宜的に「Ｅ１融合型」と呼ぶことがある）では、ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡは、
（Ａ）Ｃ型肝炎ウイルスの、５’非翻訳領域のＲＮＡ並びにコアタンパク質及びＥ１タンパク質の一部をコードするＲＮＡを含むＨＣＶ−５’側ＲＮＡ、
（Ｂ）ＧＢウイルス−Ｂの、Ｅ１タンパク質の一部及びＥ２タンパク質をコードするＲＮＡを含むＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ、並びに
（Ｃ）Ｃ型肝炎ウイルスの、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ、並びに３’非翻訳領域のＲＮＡを含み、好ましくは、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ、並びに３’非翻訳領域のＲＮＡを含むＨＣＶ−３’側ＲＮＡ、
を含む。そして、前記ＨＣＶ−５’側ＲＮＡ（Ａ）及びＨＣＶ−３’側ＲＮＡ（Ｃ）の間に、ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）が挿入され、前記ＨＣＶ−５’側ＲＮＡ（Ａ）によりコードされるＥ１タンパク質の一部は、Ｅ１タンパク質のＮ末端側の一部分であり、前記ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）によりコードされるＥ１タンパク質の一部は、Ｅ１タンパク質のＣ末端側の一部分であり、これらの両方の部分の融合によりＥ１タンパク質の全長がカバーされる。
【００３８】
Ｅ１融合型において、ＨＣＶ−５’側ＲＮＡ（Ａ）中の５’非翻訳領域のＲＮＡ並びにコアタンパク質は、上記した通りであり、好ましくは配列番号５７に示す塩基配列の相当する領域（すなわち、５’非翻訳領域のＲＮＡは、配列番号５７に示す塩基配列の第１番〜第３４１番、コアタンパク質コード領域は、配列番号５７に示す塩基配列の第３４２番〜第９１４番）の塩基配列、又は該塩基配列と９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列であって、霊長類の肝臓細胞内で増殖可能なウイルス粒子を構築可能なものが好ましい。なお、塩基配列の「相同性」とは、比較すべき２つの塩基配列中の塩基ができるだけ多く一致するように両配列を整列させ、一致した塩基数を全塩基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばBLAST、FASTA、CLUSTAL W等の周知のプログラムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全塩基数は、１つのギャップを１つの塩基として数えた数となる。このようにして数えた全塩基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、相同性（％）は、長い方の配列の全塩基数で、一致した塩基数を除して算出される。
【００３９】
Ｅ１融合型では、ＨＣＶ−５’側ＲＮＡ（Ａ）は、Ｅ１タンパク質のＮ末端側の一部をコードする領域も含む。ＨＣＶのＥ１タンパク質は、上記の通り、配列番号５７に示す塩基配列の第９１５番〜第１４９０番であるので、この配列の５’側の一部領域又はこれと９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列であって、タマリンやマーモセット等の霊長類の肝臓細胞内で増殖可能なウイルス粒子を構築可能なものが好ましい。ここで、Ｅ１タンパク質のＮ末端側の一部をコードする領域は、Ｅ１タンパク質のＮ末端から３０アミノ酸以下の領域であることが霊長類肝臓細胞内での増殖性の観点から好ましい。下記実施例では、ＨＣＶ−５’側ＲＮＡ（Ａ）により、Ｅ１タンパク質のＮ末端から１１アミノ酸がコードされるｖ１１−Ｅ１２キメラＲＮＡ及び２７アミノ酸がコードされるｖ２７−Ｅ１２キメラＲＮＡを構築し、いずれもマーモセット初代肝臓細胞中での優れた増殖性が確認されている。
【００４０】
続くＧＢウイルス−ＢのＲＮＡ（ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ）（Ｂ）は、Ｅ１タンパク質のＣ末端側の一部分と、Ｅ２タンパク質をコードする。なお、ここで、「Ｃ末端側の一部分」とは、ＨＣＶ−５’側ＲＮＡ（Ａ）によりコードされるＥ１タンパク質の部分領域よりもＣ末端側という意味であり、好ましい態様では、Ｅ１タンパク質の大部分は、ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）によりコードされる。ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡの全長の塩基配列を配列番号９９、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１００に示す。配列番号９９に示す塩基配列中、Ｅ１タンパク質コード領域は、第９１４番〜第１４８９番であり、Ｅ２タンパク質コード領域は、第１４９０番〜第２２８４番である。ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）は、さらに、ｐ６タンパク質もコードすることが好ましい。配列番号９９に示す塩基配列中、ｐ６タンパク質コード領域は、第２２８５番〜第２４５２番である。ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）は、配列番号９９に示す、相当する領域の塩基配列又はこれと９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列であって、霊長類の肝臓細胞内で増殖可能なウイルス粒子を構築可能なものが好ましい。
【００４１】
Ｅ１融合型では、Ｅ１タンパク質は、ＨＣＶ−５’側ＲＮＡ（Ａ）とＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）の両者によりコードされるが、これらの両方の部分の融合によりＥ１タンパク質の全長がカバーされる。なお、両者によりコードされる領域は、一部重複してもよい。この場合、重複領域のサイズは、アミノ酸で１個〜２４個程度が好ましい。例えば、下記実施例で作製したｖ１１キメラ遺伝子では、ＨＣＶ−５’側ＲＮＡ（Ａ）により、Ｅ１タンパク質のＮ末端から１１アミノ酸がコードされ、一方、ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）により、Ｅ１タンパク質のＮ末端から３番目のアミノ酸からコードされているのでアミノ酸８個分が重複している。同様に、ｖ２７では、ＨＣＶ−５’側ＲＮＡ（Ａ）により、Ｅ１タンパク質のＮ末端から２７アミノ酸がコードされ、一方、ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）により、Ｅ１タンパク質のＮ末端から３番目のアミノ酸からコードされているのでアミノ酸２４個分が重複している。
【００４２】
続くＨＣＶ−３’側ＲＮＡ（Ｃ）は、上記と同様であり、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ、並びに３’非翻訳領域のＲＮＡを含み、好ましくは、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ、並びに３’非翻訳領域のＲＮＡを含む。上記の通り、ｐ７タンパク質は、配列番号５７に示す塩基配列中、ｐ７タンパク質コード領域は第２５８０番〜第２７６８番であり、ＮＳ２タンパク質コード領域は第２７６９番〜第３４１９番であり、ＮＳ３蛋白コード領域は第３４２０番〜第５３１２番であり、ＮＳ４Ａタンパク質コード領域は第５３１３番〜第５４７４番であり、ＮＳ４Ｂタンパク質コード領域は第５４７５番〜第６２５７番であり、ＮＳ５Ａタンパク質コード領域は第６２５８番〜第７５９８番であり、及びＮＳ５Ｂタンパク質コード領域は、第７５９９番〜第９３７１番であり、３’非翻訳領域のＲＮＡは第９３７２番以降である。ＨＣＶ−３’側ＲＮＡ（Ｃ）は、配列番号５７に示される塩基配列中のこれらの領域の塩基配列該塩基配列と９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列であって、霊長類の肝臓細胞内で増殖可能なウイルス粒子を構築可能なものが好ましい。
【００４３】
なお、言うまでもなく、上記（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の領域は、読み枠を合わせて連結され、それによりコードされるタンパク質は、タマリンやマーモセット等の霊長類の肝臓細胞内で増殖可能なウイルス粒子をコードするものである。Ｅ１融合型の好ましい具体例としては、下記実施例で構築したｖ１１−Ｅ１２キメラＲＮＡ（配列番号９３）及びｖ２７−Ｅ１２キメラＲＮＡ（配列番号９５）並びにこれらと好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有し、霊長類の肝臓細胞内で増殖可能なウイルス粒子をコードするものを挙げることができる。
【００４４】
また、別の好ましい態様として、コアタンパク質の全部がＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡによりコードされるもの（以下、便宜的に「コアＧＢ型」）と呼ぶことがある）を挙げることができる。すなわち、コアＧＢ型では、
（Ａ）Ｃ型肝炎ウイルスの、５’非翻訳領域のＲＮＡを含むＨＣＶ−５’側ＲＮＡ、
（Ｂ）ＧＢウイルス−Ｂの、Ｅ１タンパク質及びＥ２タンパク質をコードするＲＮＡを含むＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ、並びに
（Ｃ）Ｃ型肝炎ウイルスの、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ、並びに３’非翻訳領域のＲＮＡを含み、好ましくは、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードするＲＮＡ、並びに３’非翻訳領域のＲＮＡを含むＨＣＶ−３’側ＲＮＡ、
を含む。
【００４５】
コアＧＢ型において、ＨＣＶ−５’側ＲＮＡ（Ａ）中の５’非翻訳領域のＲＮＡは、上記したＥ１融合型の５’非翻訳領域のＲＮＡと同様であり、その好ましいものもＥ１融合型の場合と同様である。
【００４６】
コアＧＢ型では、続くコアタンパク質が、ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）によりコードされる。ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ中のコアタンパク質コード領域は、配列番号９９に示される塩基配列中、第４４６番〜第９１３番であり、コアＧＢ型のコアタンパク質コード領域は、配列番号９９のこの領域の塩基配列又は該塩基配列と好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有し、霊長類の肝臓細胞内で増殖可能なウイルス粒子をコードするものが好ましい。
【００４７】
続くＥ１タンパク質コード領域もその全長がＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）によりコードされる。上記のとおり、配列番号９９に示す塩基配列中、Ｅ１タンパク質コード領域は、第９１４番〜第１４８９番であり、Ｅ２タンパク質コード領域は、第１４９０番〜第２２８４番である。ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）は、さらに、ｐ６タンパク質もコードすることが好ましい。配列番号９９に示す塩基配列中、ｐ６タンパク質コード領域は、第２２８５番〜第２４５２番である。ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）は、配列番号９９に示す、相当する領域の塩基配列又はこれと９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列であって、霊長類の肝臓細胞内で増殖可能なウイルス粒子を構築可能なものが好ましい。
【００４８】
Ｅ１タンパク質コード領域よりも下流の構造（ＨＣＶ−３’側ＲＮＡ（Ｃ）も含めて）は、上記したＥ１融合型と同様であり、上記したＥ１融合型についてのこれらの領域の説明がそのまま当てはまる。
【００４９】
なお、言うまでもなく、上記（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の領域は、読み枠を合わせて連結され、それによりコードされるタンパク質は、タマリンやマーモセット等の霊長類の肝臓細胞内で増殖可能なウイルス粒子をコードするものである。コアＧＢ型の好ましい具体例としては、下記実施例で構築したＣ６キメラＲＮＡ（配列番号９７）及びこれと好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有し、霊長類の肝臓細胞内で増殖可能なウイルス粒子をコードするものを挙げることができる。
【００５０】
Ｅ１融合型やコアＧＢ型も、上記と同様、任意の遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。限定するものではないが、キメラＲＮＡは、例えば、以下のような方法で作製することができる。
【００５１】
前記のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡをコードするＤＮＡを、常法によりクローニングベクターに挿入して、ＤＮＡクローンを作製する。得られたＤＮＡをＲＮＡプロモーターの下流に挿入して、レプリコンＲＮＡを産生することのできるＤＮＡクローンを作製する。より具体的には、例えば、劇症Ｃ型肝炎患者から単離されたＴＰＦ１クローンを、それがコードするアミノ酸配列の１８０４番目がロイシン、１９６６番目がリジンになるように変異させたpTPF1/4B（特許文献１、配列番号５７）中の、上記ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）によりコードされる領域を欠失したＤＮＡを構築し、一方、上記ＧＢＶ−Ｂ−ＲＮＡ（Ｂ）のＤＮＡを化学合成し、ＨＣＶの欠失させた部分に挿入・連結し、ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＤＮＡを構築することができる。前記ＲＮＡプロモーターは、プラスミドクローン中に含まれるものであることが好ましい。ＲＮＡプロモーターとしては、限定するものではないが、Ｔ７  ＲＮＡプロモーター、ＳＰ６  ＲＮＡプロモーター、ＳＰ３  ＲＮＡプロモーターが挙げられ、Ｔ７  ＲＮＡプロモーターが特に好ましい。なお、Ｅ１融合型及びコアＧＢ型の好ましい例の具体的な構築方法は下記実施例に詳細に記載されている。
【００５２】
本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡは、前記のＤＮＡが挿入されたベクターから作製することが可能である。ＤＮＡクローンを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。ＲＮＡ合成は、５’非翻訳領域から、常法により開始させることができる。鋳型ＤＮＡがプラスミドクローンの場合には、そのプラスミドクローンから、ＲＮＡプロモーターの下流に連結された前記ＤＮＡ領域を制限酵素によって切り出し、そのＤＮＡ断片を鋳型として用いてＲＮＡを合成することもできる。なお、好ましくは合成されるＲＮＡの３’末端がウイルスゲノムＲＮＡの３’非翻訳領域と一致し、他の配列が付加されたり削除されたりしないことが好ましい。例えば、本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡの１つの好ましい態様の場合は、ＨＣＶの５’ＵＴＲの上流にＴ７ＲＮＡプロモーター、３’ＵＴＲ末端に制限酵素ＸｈｏＩ部位を有したベクターに挿入し、ＸｈｏＩ消化後、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによりＨＣＶゲノムＲＮＡを合成することができる。
【００５３】
本発明の複製細胞は、前記のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡを任意の細胞に導入することによって作製することができる。ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡを導入する細胞としては、特に限定されないが、サル肝由来細胞、又はヒト肝由来細胞が好ましい。サル肝由来細胞としては、マーモセット初代肝細胞、又はタマリン初代肝細胞を挙げることができる。また、ヒト肝がん由来細胞としては、例えばＨｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、又はＨｅｐ３Ｂ細胞、あるいはＩＭＹ−Ｎ９細胞が挙げられ、その他のがん細胞としては、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、又は２９３細胞を挙げることができる。
【００５４】
ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡの細胞内への導入は、任意のトランスフェクション法により行うことができる。そのような導入法としては、例えば、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リポフェクション法を挙げることができる。例えば、ヒト肝がん由来細胞株のＨｕｈ７細胞に導入する場合は、エレクトロポレーションが特に好ましい。サル肝由来細胞に導入する場合は、リポフェクション法が好ましい。
【００５５】
前記複製細胞を用いることによって、Ｃ型肝炎ウイルスの感染を制御する物質をスクリーニングすることが可能である。「Ｃ型肝炎ウイルスの感染を制御」とは、例えば、ＨＣＶのＲＮＡの複製の制御（例えば、促進又は抑制）、ＲＮＡからタンパク質への翻訳の制御（例えば、促進又は抑制）を意味する。
具体的には、複製細胞と試験物質を接触させ、ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡの増加度を分析することによって試験物質のスクリーニングを行うことができる。ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡの増加度とは、レプリコンＲＮＡの複製の速度又は量の変化を意味する。具体的には、複製細胞中のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡの量を検出又は測定し、対照の被検物質と接触しない複製細胞のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡの量と比較することによって、被検物質をスクリーニングすることができる。また、細胞中又は上清中のＣ型肝炎ウイルスのタンパク質、ＧＢＶ−Ｂのタンパク質、又はＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラタンパク質の量を検出又は測定し、対照の被検物質と接触しない複製細胞のそれと比較することによっても、被検物質をスクリーニングすることが可能である。スクリーニングにおいて検出又は測定することのできるＣ型肝炎ウイルスタンパク質は、特に限定されないが、好ましくは、コアタンパク質であり、市販のキットを用いてコアタンパク質を測定することも可能である。また、スクリーニング方法を自動化することによって、ハイスループットのスクリーニング方法に適応することも可能である。
【００５６】
本発明の複製細胞は、ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ、ＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラタンパク質、及びＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスを産生することができる。また、本発明の複製細胞におけるＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡの複製は、一過性の複製でも持続的な複製でもよい。更に、複製細胞によりＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスが産生される場合は、産生されたウイルスが細胞に再感染することもできる。
【００５７】
本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ、又はＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスを実験動物に接種することにより、ＨＣＶ感染のモデル動物を作成することができる。
非ヒトの実験動物としては、ＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスが複製又は感染するものであれば、特に限定されないが、好ましくは小型霊長類であり、より好ましくはマーモセット又はタマリンである。
【００５８】
ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡの実験動物への投与方法としては、特に限定されるものではないが、腹腔内、筋肉内、脊髄内、頭蓋内、静脈内、呼吸器内、経口投与、又は肝内投与を挙げることができ、肝内への直接投与が好ましい。また、ＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスの実験動物への投与方法も、特に限定されるものではないが、腹腔内、筋肉内、脊髄内、頭蓋内、静脈内、呼吸器内、経口投与、又は肝内投与を挙げることができ、静脈内投与が好ましい。
【００５９】
ＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ及びＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスが、複製又は感染した実験動物を用いることによって、Ｃ型肝炎ウイルスの感染を制御する物質をスクリーニング、又は評価することが可能である。
例えば、実験動物に試験物質を投与し、ＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスの増加度、肝炎の発症などを分析することによって試験物質のスクリーニング又は評価を行うことができる。
【００６０】
《作用》
本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡに用いるＨＣＶのＲＮＡは、Ｃ型肝炎ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列における第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンを含むＮＳ４Ｂタンパク質をコードするＲＮＡを含む。一般的なＨＣＶでは、第１８０４番のアミノ酸はグルタミンであり、第１９６６番のアミノ酸はグルタミン酸であるが、第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンと置換されることにより、ＲＮＡの複製効率が驚異的に上昇する。そのため、前記ＲＮＡを含むキメラウイルスは、タマリンの細胞、若しくは生体内、又はマーモセットの細胞若しくは生体内での複製及び増殖の効率が高いと考えられる。前記のＨＣＶのＲＮＡは、キメラウイルスでない場合でも、タマリンやマーモセットの細胞で複製することができると考えられるが、ＧＢＶ−ＢのＲＮＡとのキメラＲＮＡとすることによって、複製効率又は感染効率が上昇すると考えられる。特に、第１８０４番のロイシン及び第１９６６番のリジンを含む、ＨＣＶの遺伝子型１ｂのＲＮＡにおいて、複製効率が上昇すると考えられるため、キメラＲＮＡに用いるＨＣＶのＲＮＡは、遺伝子型１ｂが好ましい。更に、本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡ、又はＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスは、Ｈｕｈ−７の細胞における複製機能を有しており、ＨＣＶとしての複製機能を維持していると考えられる。そのため、本発明の非ヒト動物は、ＨＣＶの予防薬及び治療薬の開発するために有用である。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００６２】
参考例  高感染性ＨＣＶ（pTPF1/4B）の構築（特許文献１、配列番号５７）【００６３】
《参考例１：劇症Ｃ型肝炎ウイルス全長遺伝子の単離及び解析》
（Ａ）血清からのＲＮＡの抽出
劇症肝炎患者の急性期に採取した血清250μLより、High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche diagnostics corporation)を用い、メーカーの推奨する方法に従い、ＲＮＡを精製した。【００６４】
（Ｂ）ｃＤＮＡの合成及びＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅
精製したＲＮＡにXR58Rプライマーを加え、SuperSucript II reverse transcriptase (Invitrogen社)により、メーカーの推奨する方法に従い、42℃、1時間逆転写反応を行わせ、cDNAを得た。得られた反応液にRNaseH（Invitrogen）を加え、37℃、30分反応させ、RNAを分解した。この反応液を、HC-LongA1プライマーと1b9405Rプライマー及びTakara LA Taq DNA polymerase (宝酒造)を用い、94℃、20秒、68℃、9分間からなる30回のサーマルサイクル反応によるポリメラーゼチェインリアクション（PCR）を行い、cDNAを増幅した。更に、得られた反応液の一部を、HC85FとHC9302Rプライマーを用いてPCRを行い、HCV cDNAを増幅した。【００６５】
（Ｃ）ｃＤＮＡのクローニング
増幅したＤＮＡ断片は、0.7%アガロースゲルを用い電気泳動によって分離し、QIAquick gel purification kit (QIAGEN社)を用い、メーカーの推奨する方法に従って、DNA断片を回収した。回収したDNA断片は、pGEM-T easyベクター（Promega社）と連結反応させ、そのプラスミドによりDH5α株を形質転換した。アンピシリン耐性の形質転換体を選択し、2YT培地を用いて培養した。培養した菌体からWizard Plus SV Miniprep DNA Purification Systemを用いプラスミドを精製した。【００６６】
（Ｄ）塩基配列の決定
HCV cDNAの塩基配列は、HCVの遺伝子型１ｂの塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、決定した。CEQ DTCS Quick Start Kit（ベックマン・コールター）を用い、メーカーの推奨する方法に従い、反応を行い、CEQ2000 XL DNA analysis system (Software version 4.0.0、ベックマン・コールター)により解析した。得られたデータをSequencher (Version 4.1.2、Gene Codes Corporation)により解析した。得られたHCVクローンをpTPF1-0193と命名した。【００６７】
（Ｅ）５’非翻訳領域のｃＤＮＡの取得と塩基配列の決定
更に、前記の（Ａ）の工程で得られたRNAより、5’RACE法により、5’非翻訳領域の末端のcDNAを取得した。5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version2.0 (Invitrogen社)のキットを用い、添付の指示書に従って、実施した。
cDNA合成のためのアンチセンスプライマーは、Chiba-asを使用した。SuperScript II Reverse Transcriptase（Invitrogen）でcDNAを合成し、S.N.A.P columnで精製後、cDNAにTdT-tailing反応を行い、dCTPを付加した。キットに添付の5’RACE Abridged Anchorプライマー及びKY78プライマーでTakara LA Taq DNA polymerase（宝酒造）を用いて、１回目のPCRを行った。このPCR産物の一部を鋳型として、キットに添付のUTPプライマーとKM2プライマーで、Takara LA Taq DNA polymerase（宝酒造）を用いて２回目のPCRを行い、PCR産物を得た。このPCR産物をpGEM-T easyベクターにクローニングし、前記（Ｄ）の工程に従い、塩基配列を決定した。得られた配列における第1位から第709位までを含むHCV cDNAクローンをpTPF1-0007と命名した。【００６８】
（Ｆ）３’非翻訳領域のｃＤＮＡの取得と塩基配列の決定
前記の（Ａ）の工程で得られたRNAより、３’RACE法により、３’非翻訳領域の末端のcDNAを取得した。まず、患者のRNAにPoly(A) Tailing Kit（Ambion）を用いて、添付の指示書に従い、Poly(A)を付加した。XR58Rプライマーの代わりにdT-Adpプライマーを、1st  PCRのプライマーとして3UTR-1Fプライマー及びAdpプライマーを、２nd PCRのプライマーとしてXR58F及びAdpプライマーを用いた以外は、前記工程（Ｂ）〜（Ｄ）の操作を繰り返した。得られたHCV cDNAクローンを pTPF1-8994と命名した。【００６９】
得られたＨＣＶ株をTPF1株と命名した。TPF1株は、全長9594塩基のＨＣＶであった。得られたTPF1株のポリヌクレオチドは、その342番から9374番の間に、3010個の一つながりのアミノ酸をコードする翻訳領域を有するものであった。【００７０】
《参考例２：サブジェノミックＲＮＡレプリコンの作成》
Ｃ型肝炎ウイルスTPF1株の全長のポリヌクレオチドを、pBluescriptIISK(+)のT7 RNAプロモーター配列の下流に挿入した（以下、pTPF1と称する）。【００７１】
次に、pTPF1の構造タンパク質をコードする領域と非構造タンパク質をコードする領域の一部を、ネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンリン酸転移酵素、NPT-II）及びEMCV-IRES（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）と入れ替えて、plasmid DNA pRepTPF1を構築した。この構築手順は、既報（Lohmann et al., Science, (1999) 285, p.110-113）に従った。【００７２】
具体的にはまずpTPF1を制限酵素AgeI及びBsrGIで切断し、その切断部位に、pTPF1由来の5’UTRからCore領域におよぶ配列とpcDNA3.1(+)由来のネオマイシン耐性遺伝子とをPCR増幅により増幅し制限酵素AgeIとPmeIで切断した断片、及びEMCV-IRESからNS3領域におよぶ配列をPCR増幅により結合し制限酵素PmeI及びBsrGIで切断した断片を連結挿入した。このplasmid DNA pRepTPF1をXbaIで切断したものを鋳型に、Megascript T7 kit (Ambion)を用いてRNAを合成した。メーカーの推奨する方法にてRNAを精製した。【００７３】
ヒト肝がん細胞（Huh7、JCRB0403）はDulbecco’s modified Eagle medium (D-MEM, IWAKI)に10%ウシ胎仔血清（FBS）、ペニシリンとストレプトマイシンをそれぞれ50 U/mL、50 μg/mLとなるように加えたものを培養液として、5%二酸化炭素付加、37℃で培養を行った。コンフルエントになる前の細胞をトリプシン、EDTA処理により培養皿から剥離させ、血清添加培地に再懸濁することによりトリプシンを不活化する。PBSで2回洗浄後、1.25% DMSOを添加したCytomix（120mM Potassium chloride、10mM Potassium phosphate、5mM Magnesium chloride、25mM HEPES、0.15mM Calcium chloride、2mMEGTA、pH7.6）に再懸濁し、ギャップ0.4 cmのエレクトロポレーションキュベットに移す。【００７４】
適当量のRNAを細胞に加えた後、５分間氷上で十分冷却する。エレクトロポレーター（Bio-Rad）で、960uF、２５０Vにてパルスを加える。直ちに8mLの培地に再懸濁し、一部をプレートに播く。一定時間培養した後、培養プレートにG418（ネオマイシン）を1mg/mLの濃度で添加した。その後、4日間隔で培養液を交換しながら培養を継続した。播種時から約20日間培養後の培養プレートから生存細胞のコロニーをクローン化し、培養を継続した。このようなコロニーのクローニングにより、pRepTPF1レプリコンRNAが自律複製している細胞を樹立することができた。レプリコンRNA複製の有無は、細胞性RNAに含まれる複製レプリコンRNAのコピー数を、定量的RT-PCR法にて解析した。【００７５】
マイナス鎖の定量方法
レプリコンRNAの自律複製が起こっていることは、細胞中にHCV RNAの5’UTR領域のマイナス鎖が検出できるか否かで調べた。マイナス鎖の特異的な定量法は特願平08−187097号公報に記載のマイナス鎖RNAの特異的検出法と同様の方法で行った。
pRepTPF-1を鋳型にin vitroで合成したRNAをエレクトロポレーションで導入した細胞から、有意な量のマイナス鎖が検出でき、細胞内においてレプリコンRNAが自律的に複製していることが確認された。【００７６】
《参考例３：適応変異の解析》
参考例２に従って、pRepTPF1を鋳型にin vitroで合成したRNAをHuh7細胞へトランスフェクションすることで樹立したレプリコンRNA複製細胞株から、ISOGEN（日本ジーン）を用いて、メーカーの推奨する条件に従い細胞内RNAを抽出した。【００７７】
この細胞内RNAから参考例１でTPF1より遺伝子を取得したのと同様の手順で、レプリコンRNAのほぼ全領域にわたるDNAを増幅した。具体的には、抽出した細胞内RNAを鋳型としてSuperSucript II reverse transcriptase (Invitrogen)とXR58RプライマーとによりレプリコンRNAに対するcDNAを合成した。【００７８】
このcDNAの一部をＰＣＲにより増幅し、pGEM-T easyベクターにクローニングしたクローンの配列を決定したところ、塩基数5752番目のＡがＴ、6237番目のGがAへの置換が認められた。その結果、アミノ酸番号1804に相当するアミノ酸がQ（グルタミン）からL（ロイシン）、アミノ酸番号1966に相当するアミノ酸がE（グルタミン酸）からK（リジン）へそれぞれ変異した。【００７９】
次に、前記のアミノ酸置換がレプリコンRNAの複製に及ぼす影響について検討した。まず、参考例２において作製したHCV RNAレプリコン pRepTPF1にアミノ酸番号1804（QからLへ）及びアミノ酸番号1906（EからKへ）の適応変異をQuick Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いメーカーの推奨する方法に従い、導入した。このアミノ酸置換を導入したレプリコンRNAをpRep4Bと命名した。【００８０】
変異を引き起こす塩基配列を有しないpRepTPF1及びアミノ酸変異を有するpRep4Bのplasmid DNAをXbaIで切断したものを鋳型に、Megascript T7 kit (Ambion)を用いてRNAを合成した。メーカーの推奨する方法にてRNAを精製した。精製したそれぞれのRNAをHuh7細胞にトランスフェクションし、G418存在下で約20日間培養を行いクリスタルバイオレットで生存細胞を染色した。染色されたコロニー数を計測し、トランスフェクションしたレプリコンRNA量1μg当りのコロニー数を計算した。【００８１】
RepTPF1 RNA 1μgをトランスフェクションした場合には1個のG418耐性コロニーが選択され、Rep4B RNA 1μgをトランスフェクションした場合には104個のコロニーが選択された。つまり、レプリコンRNAにおけるアミノ酸変異を引き起こす塩基変異は、Huh7細胞においてレプリコンRNAの複製効率を増大させる適応変異であると考えられた。【００８２】
《参考例４：HCV RNAの複製に対する適応変異の効果》
参考例２において作成した完全長HCV DNA pTPF1を制限酵素SfiIで切断し、その切断部位に、pRep4Bを制限酵素SfiIで切断した断片を連結挿入することで、適応変異が挿入された完全長HCV DNA pTPF1/4Bを作製した。この塩基配列（ＲＮＡで 表記）を配列番号５７、これがコードするアミノ酸配列を配列番号５８に示す。【００８３】
《実施例１：ＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラ遺伝子の構築》
（１）Ｃ１５６キメラ遺伝子（配列番号５５）
ヒト肝がん細胞株で増殖が確認されているＨＣＶ遺伝子を含む上記ｐＴＰＦ１／４ＢをＡｇｅ  Ｉプライマー５’−ＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧ−３’（配列番号１０１）とＳｐｌ  Ｉプライマーの５’−ＡＣＣＣＧＴＡＣＧＣＣＡＴＧＣＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＧ−３’（配列番号１０２）の存在下で、Ｔａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用い、９４℃、２０秒、６８℃、３０秒間からなる２０回のサーマルサイクル反応によるポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）を行うことにより、ＴＰＦ１ゲノムの５’ＵＴＲからコア蛋白の１５６番目までを増幅した。【００８４】
増幅した断片は、０．７％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、メーカーの推奨する方法にてＤＮＡ断片を回収した。回収したＴＰＦ１断片は、メーカーの推奨する方法に従いｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）と連結反応させ、そのプラスミドによりＤＨ５α株を形質転換させた。アンピシリン耐性で、ＩＰＴＧとＸ−ｇａｌを加えた寒天培地上での平板培養で白色コロニーを形成する形質転換体を選び、アンピシリンを１００μｇ／ｍＬとなるよう加えた２ＹＴ培地にて培養した。培養した菌体からＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いｐｌａｓｍｉｄを精製した。【００８５】
精製したプラスミドに組み込まれているＴＰＦ１断片の配列は、ベクター及びＨＣＶ配列に適合する適宜準備したプライマーを用い、ＣＥＱ  ＤＴＣＳ  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｋｉｔ（ベックマン・コルター）により、メーカーの推奨する方法に従い反応を行い、ＣＥＱ２０００  ＸＬ  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０．０、ベックマン・コールター）により解析した。得られたデータを基に、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１．２、Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い配列データの統合、解析を行いｐＴＰＦ１−ＡｇｅＳｐｌの塩基配列を確認した。【００８６】
一方、ＧＢＶ−Ｂの外皮蛋白を含む遺伝子については、コア蛋白１２４番目からｐ６蛋白までの遺伝子を以下の合成遺伝子を用いて構築した。
ＧＢＢＣ−ｓ１（配列番号１）：５’−ＣＧＴＡＣＧＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＴＣＡＡＣＴＧＧＧＣＴＡＣＴＧＧＴＴＧＧＴＴＣＧＧＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＴＴ−３’
ＧＢＢＣＥ１−ｓ２（配列番号２）：５’−ＴＧＴＧＧＴＡＴＧＴＣＴＧＣＴＡＴＣＴＴＴＧＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＡＧＴＧＧＧＧＣＧＣＧＧＧＴＣＡＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡ−３’
ＧＢＢＥ１−ｓ３（配列番号３）：５’−ＣＡＣＡＡＡＴＡＣＣＡＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＣＡＡＴＴＧＣＴＧＣＣＡＧＣＧＴＡＡＴＣＡＧＧＴＴＡＴＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＣＣ−３’
ＧＢＢＥ１−ｓ４（配列番号４）：５’−ＴＴＣＣＡＣＴＴＧＣＣＴＡＣＡＣＧＡＧＣＣＴＧＧＴＴＧＴＧＴＧＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＡＣＧＡＧＴＧＣＴＧＧＧＴＴＣＣＣＧＣ−３’
ＧＢＢＥ１−ｓ５（配列番号５）：５’−ＣＡＡＴＣＣＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＣＡＣＣＣＴＴＣＣＡＡＴＴＧＧＡＣＴＧＧＣＡＣＧＧＡＣＴＣＣＴＴＣＴＴＧＧＣＴＧＡＣＣＡ−３’
ＧＢＢＥ１−ｓ６（配列番号６）：５’−ＣＡＴＴＧＡＴＴＴＴＧＴＴＡＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＴＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡＣＧＣＣＣＴＴＧＡＣＡＴＴＧＧＴＧＡＧＴＴＧＴＧ−３’
ＧＢＢＥ１−ｓ７（配列番号７）：５’−ＴＧＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＴＡＧＴＣＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＴＴＧＴＣＡＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＴＡＴＴＣＡＣＡＴＡＧＡＣＣＴ−３’
ＧＢＢＥ１−ｓ８（配列番号８）：５’−ＣＡＡＴＧＡＡＡＣＴＧＧＴＡＣＴＴＧＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＣＣＣＡＣＴＧＧＡＡＴＡＧＡＴＣＣＴＧＧＧＴＴＣＣＴＡＧＧ−３’
ＧＢＢＥ１−ｓ９（配列番号９）：５’−ＧＴＴＴＡＴＣＧＧＧＴＧＧＡＴＧＧＣＣＧＧＣＡＡＧＧＴＣＧＡＧＧＣＴＧＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＣＴＴＣ−３’
ＧＢＢＥ１−ｓ１０（配列番号１０）：５’−ＡＣＡＡＧＴＡＣＣＡＴＡＣＧＣＴＡＴＴＧＣＧＡＣＴＡＴＧＴＴＴＡＧＣＡＧＴＧＴＡＣＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＧＧＴＴＧＧＣＧＣ−３’
ＧＢＢＥ１−ｓ１１（配列番号１１）：５’−ＴＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＴＧＣＣＴＣＴＣＧＧＧＧＣＡＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＧＴＴＧＣＴＣＣＴＡＧＣＧＣＴＴＡＴＧＣＴＴＴＡ−３’
ＧＢＢＥ１２−ｓ１２（配列番号１２）：５’−ＣＡＴＡＧＡＡＧＣＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＴＧＣＣＣＡＣＴＧＧＡＴＧＣＴＣＡＡＴＡＧＣＴＧＡＧＴＴ−３’
ＧＢＢＥ２−ｓ１３（配列番号１３）：５’−ＴＴＧＣＴＣＧＣＣＴＴＴＧＡＴＧＡＴＡＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＧＣＣＡＣＴＣＴＴＡＴＴＴＧＡＧＴＧＡＧＡＡＴＧＴＧＴＣＡＧＡ−３’
ＧＢＢＥ２−ｓ１４（配列番号１４）：５’−ＡＧＴＣＡＴＴＴＧＴＴＡＣＡＧＴＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＣＣＡＧＧＣＣＴＡＴＣＡＣＴＣＴＡＧＡＧＴＡＴＡＡＣＡＡＣＴＣＣＡＴ−３’
ＧＢＢＥ２−ｓ１５（配列番号１５）：５’−ＡＴＣＴＴＧＧＴＡＣＣＣＣＴＡＴＡＣＡＡＴＣＣＣＴＧＧＴＧＣＧＡＧＧＧＧＡＴＧＴＡＴＧＧＴＴＡＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＴＡＡ−３’
ＧＢＢＥ２−ｓ１６（配列番号１６）：５’−ＣＡＣＡＴＧＧＧＧＴＴＧＣＴＧＣＣＧＴＡＴＴＣＧＣＡＡＴＧＴＧＣＣＡＴＣＧＴＡＣＴＧＣＡＣＴＡＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡＴＧＣ−３’
ＧＢＢＥ２−ｓ１７（配列番号１７）：５’−ＡＧＴＧＴＧＧＡＡＣＧＡＣＡＣＴＣＧＣＡＡＣＡＣＴＴＡＣＧＡＡＧＣＡＴＧＣＧＧＴＧＴＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＣＡＡＣ−３’
ＧＢＢＥ２−ｓ１８（配列番号１８）：５’−ＣＧＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＣＧＧＣＴＣＡＧＣＣＣＴＧＡＡＡＴＴＧＧＣＴＡＴＡＴＴＡＣＡＡＴＡＣＣＣＴＧＧＧＴＣＴＡＡＡＧＡ−３’
ＧＢＢＥ２−ｓ１９（配列番号１９）：５’−ＡＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＣＴＣＡＴＡＡＴＴＧＧＡＴＧＴＣＡＧＧＣＣＡＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＧＡＧＧＧＡＴＣＡＧＡＴＡＣＣＣＣ−３’
ＧＢＢＥ２−ｓ２０（配列番号２０）：５’−ＴＡＴＡＧＴＴＴＡＣＴＴＴＴＡＴＧＡＣＣＣＴＧＴＧＡＡＴＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＣＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＧＧＣＴＡＧ−３’
ＧＢＢＥ２−ｓ２１（配列番号２１）：５’−ＧＴＴＧＣＣＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＴＴＣＴＴＧＧＴＴＡＣＡＧＧＴＴＣＣＧＣＡＡＧＧＧＴＴＴＴＡ−３’
ＧＢＢＥ２−ｓ２２（配列番号２２）：５’−ＣＡＧＴＧＡＴＧＴＧＡＡＡＧＡＣＣＴＡＧＣＣＡＣＡＧＧＡＴＴＧＡＴＣＡＣＣＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＡＡＡＡＴＴＡ−３’
ＧＢＢＥ２−ｓ２３（配列番号２３）：５’−ＴＣＡＧＧＴＣＴＴＡＴＡＴＴＣＣＧＣＣＡＣＧＧＧＴＧＣＴＴＴＧＴＣＴＣＴＴＡＣＧＧＧＡＧＴＴＡＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＧＴ−３’
ＧＢＢＥ２−ｓ２４（配列番号２４）：５’−ＧＧＴＧＣＴＡＡＴＴＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＧＴＧＴＧＧＣＡＧＣＡＡＧＴＡＴＣＴＴＡＴＴＴＴＡＧＣＣＴＡＣＣＴＣＴＧＴＴＡ−３’
ＧＢＢＥ２Ｐ６−ｓ２５（配列番号２５）：５’−ＣＴＴＧＴＣＣＣＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＧＣＧＣＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＣＣＴＴＴＧＣＧＴＣＣＴＧＴＧＣＴＣＣＣＡＴＣＣＣＡ−３’
ＧＢＢＰ６−ｓ２６（配列番号２６）：５’−ＧＴＣＧＴＡＴＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＡＴＧＴＴＴＴＧＴＣＴＡＡＡＧＣＴＣＡＡＧＴＡＧＣＴＣＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴ−３’
ＧＢＢＰ６−ｓ２７（配列番号２７）：５’−ＧＡＴＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＴＴＧＣＴＡＴＣＴＣＣＧＣＴＧＣＡＧＧＣＴＡＣＧＴＴＡＴＧＣＴＧＣＣＣＴＴＴＴＡＧＧＧＴＴ−３’
ＧＢＢＰ６−ａｓ１（配列番号２８）：５’−ＧＣＣＣＧＣＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＣＡＡＡＣＣＣＴＡＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＡＴＡＡＣＧＴＡＧＣＣＴＧ−３’
ＧＢＢＰ６−ａｓ２（配列番号２９）：５’−ＣＡＧＣＧＧＡＧＡＴＡＧＣＡＡＣＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＧＧＡＧＣＴＡＣＴＴＧＡＧＣＴＴＴＡＧＡＣ−３’
ＧＢＢＰ６−ａｓ３（配列番号３０）：５’−ＡＡＡＡＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＡＴＡＣＧＡＣＴＧＧＧＡＴＧＧＧＡＧＣＡＣＡＧＧＡＣＧＣＡＡＡＧＧＧＴＡＡ−３’
ＧＢＢＥ２−ａｓ４（配列番号３１）：５’−ＣＣＡＧＡＡＧＣＧＣＧＣＣＣＡＡＡＡＣＡＡＡＧＧＧＡＣＡＡＧＴＡＡＣＡＧＡＧＧＴＡＧＧＣＴＡＡＡＡＴＡＡＧＡＴＡＣＴＴＧ−３’
ＧＢＢＥ２−ａｓ５（配列番号３２）：５’−ＣＴＧＣＣＡＣＡＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＡＧＡＡＴＴＡＧＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣＴＴＧＧＴＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＧＴＡＡＧＡＧＡＣ−３’
ＧＢＢＥ２−ａｓ６（配列番号３３）：５’−ＡＡＡＧＣＡＣＣＣＧＴＧＧＣＧＧＡＡＴＡＴＡＡＧＡＣＣＴＧＡＴＡＡＴＴＴＴＴＣＣＡＧＧＣＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＧＴＧＡＴＣ−３’
ＧＢＢＥ２−ａｓ７（配列番号３４）：５’−ＡＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＡＧＧＴＣＴＴＴＣＡＣＡＴＣＡＣＴＧＴＡＡＡＡＣＣＣＴＴＧＣＧＧＡＡＣＣＴＧＴＡＡＣＣＡＡＧＡＡ−３’
ＧＢＢＥ２−ａｓ８（配列番号３５）：５’−ＣＣＡＣＧＴＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＧＧＧＴＡＣＣＧＧＧＣＡＡＣＣＴＡＧＣＣＣＡＣＣＴＣＴＣＣＧＧＴＧＧＴＡＧＧＡＧＡＧＴＧ−３’
ＧＢＢＥ２−ａｓ９（配列番号３６）：５’−ＧＡＡＴＴＣＡＣＡＧＧＧＴＣＡＴＡＡＡＡＧＴＡＡＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＴＡＴＣＴＧＡＴＣＣＣＴＣＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＴＧＧ−３’
ＧＢＢＥ２−ａｓ１０（配列番号３７）：５’−ＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＡＴＴＡＴＧＡＧＧＴＴＴＡＡＡＣＡＴＴＴＣＴＴＴＡＧＡＣＣＣＡＧＧＧＴＡＴＴＧＴＡＡＴＡＴＡＧＣＣ−３’
ＧＢＢＥ２−ａｓ１１（配列番号３８）：５’−ＡＡＴＴＴＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧＣＣＧＴＴＧＴＧＣＣＡＴＧＣＧＧＴＴＧＴＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＧＴＴＡＣＡＣＣＧＣＡＴＧＣＴ−３’
ＧＢＢＥ２−ａｓ１２（配列番号３９）：５’−ＴＣＧＴＡＡＧＴＧＴＴＧＣＧＡＧＴＧＴＣＧＴＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＡＴＣＡＧＴＧＣＣＣＡＴＡＧＴＧＣＡＧＴＡＣＧＡＴＧＧＣ−３’
ＧＢＢＥ２−ａｓ１３（配列番号４０）：５’−ＡＣＡＴＴＧＣＧＡＡＴＡＣＧＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＣＡＴＧＴＧＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＡＴＴＴＡＡＣＣＡＴＡＣＡＴＣＣＣＣＴＣ−３’
ＧＢＢＥ２−ａｓ１４（配列番号４１）：５’−ＧＣＡＣＣＡＧＧＧＡＴＴＧＴＡＴＡＧＧＧＧＴＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＧＴＴＡＴＡＣＴＣＴＡＧＡＧＴＧＡＴＡＧＧＣ−３’
ＧＢＢＥ２−ａｓ１５（配列番号４２）：５’−ＣＴＧＧＴＣＣＡＣＴＴＴＧＧＡＣＴＧＴＡＡＣＡＡＡＴＧＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡＴＴＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＴＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
ＧＢＢＥ２−ａｓ１６（配列番号４３）：５’−ＣＡＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＡＴＣＡＴＣＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＡＡＡＡＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＴＧＧＧＣＡＣＣ−３’
ＧＢＢＥ２１−ａｓ１７（配列番号４４）：５’−ＣＴＧＡＴＧＧＧＧＴＴＴＣＣＡＧＡＧＧＴＣＧＣＴＴＣＴＡＴＧＴＡＡＡＧＣＡＴＡＡＧＣＧＣＴＡＧＧＡＧＣＡＡＣＴＧＡＴＡＣ−３’
ＧＢＢＥ１−ａｓ１８（配列番号４５）：５’−ＣＡＣＴＴＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＧＣＡＴＡＧＴＡＧＡＴＣＡＧＡＧＣＧＣＣＡＡＣＣＧＣＣＡＧＧＴＡＧＴＧＴＡＣＡＣＴＧＣＴＡ−３’
ＧＢＢＥ１−ａｓ１９（配列番号４６）：５’−ＡＡＣＡＴＡＧＴＣＧＣＡＡＴＡＧＣＧＴＡＴＧＧＴＡＣＴＴＧＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＴＧＧＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＣ−３’
ＧＢＢＥ１−ａｓ２０（配列番号４７）：５’−ＴＣＧＡＣＣＴＴＧＣＣＧＧＣＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＡＴＡＡＡＣＣＣＴＡＧＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＴＣＴＡＴＴＣＣＡＧＴＧＧＧＣ−３’
ＧＢＢＥ１−ａｓ２１（配列番号４８）：５’−ＡＣＴＴＣＣＡＧＧＴＡＡＣＡＡＧＴＡＣＣＡＧＴＴＴＣＡＴＴＧＡＧＧＴＣＴＡＴＧＴＧＡＡＴＡＡＧＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＡＣＡ−３’
ＧＢＢＥ１−ａｓ２２（配列番号４９）：５’−ＡＧＣＣＡＧＴＣＡＣＣＧＡＣＴＡＡＴＡＣＡＣＡＣＧＣＡＣＣＡＣＡＣＡＡＣＴＣＡＣＣＡＡＴＧＴＣＡＡＧＧＧＣＧＴＣＡＣＡＧ−３’
ＧＢＢＥ１−ａｓ２３（配列番号５０）：５’−ＧＴＣＡＣＡＡＧＡＧＣＧＣＣＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＴＣＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣ−３’
ＧＢＢＥ１−ａｓ２４（配列番号５１）：５’−ＣＡＡＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＴＧＡＧＡＴＧＴＡＣＧＧＡＴＴＧＧＣＧＧＧＡＡＣＣＣＡＧＣＡＣＴＣＧＴＣＣＧＣＡＣＡＧＡＴＣ−３’
ＧＢＢＥ１−ａｓ２５（配列番号５２）：５’−ＡＣＡＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＧＴＧＴＡＧＧＣＡＡＧＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＣＡＡＴＡＧＡＴＡＡＣＣＴＧＡＴＴＡＣＧＣＴＧＧ−３’
ＧＢＢＥ１Ｃ−ａｓ２６（配列番号５３）：５’−ＣＡＧＣＡＡＴＴＧＧＴＣＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＡＴＴＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＴＣＡＧＴＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＣＣＡＣＴＡＣＡＧ−３’
ＧＢＢＣ−ａｓ２７（配列番号５４）：５’−ＧＧＡＣＡＧＧＣＣＡＡＡＧＡＴＡＧＣＡＧＡＣＡＴＡＣＣＡＣＡＡＡＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＣＣＧＡＡＣＣＡＡＣＣＡＧＴＡＧＣＣＣＡ−３’【００８７】
各合成遺伝子の５’末端のリン酸化のため、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（宝酒造）を用いてリン酸化反応を行った。これらのリン酸化産物を混合し、９５℃から室温まで徐冷することで、各合成遺伝子をアニーリングさせ、Ｔａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造）を用いて連結反応を行った。この連結物をＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（宝酒造）を用いて二本鎖ＤＮＡ末端の平滑化を行った。この二本鎖ＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターにクローニングし、塩基配列を決定し、目的のＧＢＶ−Ｂ遺伝子であることを確認した。【００８８】
また、ｐＴＰＦ１／４ＢのＸｂａ  Ｉ部位をＸｈｏ  Ｉ部位に変換させるため、ｐＴＰＦ１／４Ｂに塩基数９５９４番目のＴからＣへの遺伝子変異をＱｕｉｃｋ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いメーカーの推奨する方法に従い、変異を導入した。この変異を導入したプラスミドをｐＴＰＦ１／４Ｂ−Ｘｈｏと命名した。【００８９】
そして、ｐＴＰＦ１／４ＢからＰＣＲによりクローニングされ、制限酵素で消化されたＡｇｅ  Ｉ−Ｓｐｌ  Ｉ断片とｐＴＰＦ１／４Ｂから制限酵素で消化されたＢｂｖＣ  Ｉ−Ｒｓｒ  ＩＩ断片並びに制限酵素で消化されたＧＢＶ−Ｂ遺伝子のＳｐｌ  Ｉ−ＢｂｖＣ  Ｉ断片をｐＴＰＦ１／４Ｂ−ＸｈｏのＡｇｅ  Ｉ−Ｒｓｒ  ＩＩで消化されたベクターに連結することにより、ＧＢＶ−Ｂ外皮蛋白を有するＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラプラスミドｐＴＰＦ／ＧＢＢ−Ｃ１５６Ｅ１２を構築した。【００９０】
（２）ｖ１１キメラ遺伝子（配列番号９３）
ｐＴＰＦ１／４Ｂを前述のＡｇｅ  ＩプライマーとＥｃｏＲ  Ｖ（ｖ１１）プライマーの５’−ＧＡＴＡＴＣＧＴＡＣＡＧＣＣＣＧＧＡＴＡＣＧＴＴＧＣＧＣＡＣ−３’（配列番号１０３）の存在下で、Ｔａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用い、９４℃、２０秒、６８℃、３０秒間からなる２０回のサーマルサイクル反応によるＰＣＲを行うことにより、ＴＰＦ１ゲノムの５’ＵＴＲからＥ１蛋白の１１番目までを増幅した。この増幅産物を実施例１でＨＣＶ遺伝子断片（ｐＴＰＦ１−ＡｇｅＳｐｌ）を取得したのと同様の手法を用いｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクターと連結反応を行い、常法に従い配列を決定した。その結果、ｐＴＰＦ１−ＡｇｅＥｃｏＲ（ｖ１１）の塩基配列を確認した。【００９１】
一方、ＧＢＶ−Ｂの外皮蛋白を含む遺伝子については、ｐＴＰＦ／ＧＢＢ−Ｃ１５６Ｅ１２をＳｎａＢＩプライマー５‘−ＴＡＣＧＴＡＡＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＡＡＡＴＡＣＣＡＣＡ−３’（配列番号１０４）とＢｂｖＣＩプライマー５‘−ＣＣＴＣＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＣＡＡＡＣＣＣＴＡＡＡＡＧＧＧ−３’（配列番号１０５）の存在下で，Ｔａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用い、９４℃、２０秒、６８℃、９０秒間からなる２０回のサーマルサイクル反応によるＰＣＲを行うことにより、ＧＢＶ−Ｂ ゲノムのＥ１蛋白の３番目からｐ６蛋白までを増幅した。この増幅産物をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターと連結反応を行い、配列を決定した。その結果、ｐＧＢＶ−Ｂ  ＳｎａＢｂｖの塩基配列を確認した。【００９２】
そして、ｐＴＰＦ１／４ＢからＰＣＲによりクローニングされ、制限酵素で消化されたＡｇｅ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｖ（ｖ１１）断片と制限酵素で消化されたＧＢＶ−Ｂ遺伝子のＳｎａ  ＢＩ−ＢｂｖＣ  Ｉ断片をｐＴＰＦ１／４Ｂ−ＸｈｏのＡｇｅ  Ｉ−ＢｂｖＣＩで消化されたベクターに連結することにより、ＧＢＶ−Ｂ外皮蛋白を有するＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラプラスミドｐＴＰＦ／ＧＢＢ−ｖ１１Ｅ１２を構築した。【００９３】
（３）ｖ２７キメラ遺伝子（配列番号９５）
上記ｐＴＰＦ１／４Ｂを前述のＡｇｅ  ＩプライマーとＥｃｏＲ  Ｖ（ｖ２７）プライマーの５’−ＧＡＴＡＴＣＣＧＣＴＧＣＣＴＣＡＴＡＣＡＣＡＡＴＧＣＴＴＧＡ−３’（配列番号１０６）の存在下で、Ｔａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用い、９４℃、２０秒、６８℃、９０秒間からなる２０回のサーマルサイクル反応によるＰＣＲを行うことにより、ＴＰＦ１ゲノムの５’ＵＴＲからＥ１蛋白の２７番目までを増幅した。この増幅産物を実施例１でＨＣＶ遺伝子断片（ｐＴＰＦ１−ＡｇｅＳｐｌ）を取得したのと同様の手法を用いｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクターと連結反応を行い、常法に従い配列を決定した。その結果、ｐＴＰＦ１−ＡｇｅＥｃｏＲ（ｖ２７）の塩基配列を確認した。【００９４】
そして、ｐＴＰＦ１／４ＢからＰＣＲによりクローニングされ、制限酵素で消化されたＡｇｅ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｖ（ｖ２７）断片と上述のｐＧＢＶ−Ｂ  ＳｎａＢｂｖを制限酵素Ｓｎａ  ＢＩ−ＢｂｖＣ  Ｉで消化した断片をｐＴＰＦ１／４Ｂ−ＸｈｏのＡｇｅ  Ｉ−ＢｂｖＣＩで消化されたベクターに連結することにより、ＧＢＶ−Ｂ外皮蛋白を有するＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラプラスミドｐＴＰＦ／ＧＢＢ−ｖ２７Ｅ１２を構築した。【００９５】
（４）Ｃ６キメラ遺伝子（配列番号９７）
ＴＰＦ１の５‘ＵＴＲを有するＧＢＶ−Ｂのコア蛋白からＥ１の１２５番目までの遺伝子を以下の合成遺伝子を用いて構築した。
ＧＢＢＣ−ｓ２８（配列番号５９）：５‘−ＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＧＡＣＣＧＧＧＴＣＣＴＴＴＣＴＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＧＣＴＣＡ−３’
ＧＢＢＣ−ｓ２９（配列番号６０）：５‘−ＡＴＧＣＣＴＧＧＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＧＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧＴＧＴＴＧＧＧＴＣＧＣＧＡ−３’
ＧＢＢＣ−ｓ３０（配列番号６１）：５‘−ＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＴＣＴＣＧＴＡＧＡＣＣ−３’
ＧＢＢＣ−ｓ３１（配列番号６２）：５‘−ＧＴＧＣＡＴＣＡＴＧＣＣＴＧＴＴＡＴＴＴＣＴＡＣＴＣＡＡＡＣＡＡＧＴＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＡＣＧＣＧＣＡＡ−３’
ＧＢＢＣ−ｓ３２（配列番号６３）：５‘−ＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＣＧＣＡＧＧＣＴＴＣＡＴＡＴＣＣＴＧＴＧＴＣＣＡＴＴＡＡＡＡＣＡＴＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＧＧＧＡＣＡ−３’
ＧＢＢＣ−ｓ３３（配列番号６４）：５‘−ＡＣＧＡＧＣＡＡＡＧＣＧＣＡＡＡＧＴＣＣＡＧＣＧＣＧＡＴＧＣＴＣＧＧＣＣＴＣＧＴＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＴＧＣＴＧＧＴＡＴ−３’
ＧＢＢＣ−ｓ３４（配列番号６５）：５‘−ＣＣＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＧＣＡＧＡＣＡＴＴＧＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＴＧＧＴＴＧＧＧＧＡＣＧＣＣＡ−３’
ＧＢＢＣ−ｓ３５（配列番号６６）：５‘−ＡＧＡＣＣＣＴＣＧＣＣＡＴＡＡＧＴＣＴＣＧＣＡＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴＣＣＴＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＣＣＴＴＴＧＧＧＧＴＧＧＡＴ−３’
ＧＢＢＣ−ｓ３６（配列番号６７）：５‘−ＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＡＣＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＣＣＴＣＴＡＧＴＡＧＧＣＣＣＧＣＴＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧ−３’
ＧＢＢＣ−ｓ３７（配列番号６８）：５‘−ＡＣＣＡＧＴＣＴＧＣＣＡＧＡＴＡＧＴＡＣＧＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＴＣＡＡＣＴＧＧＧＣＴＡＣＴＧＧＴＴＧＧＴＴ−３’
ＧＢＢＣ−ｓ３８（配列番号６９）：５‘−ＣＧＧＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＴＴＴＧＴＧＧＴＡＴＧＴＣＴＧＣＴＡＴＣＴＴＴＧＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＡＧＴＧＧＧＧＣＧＣＧ−３’
ＧＢＢＣ−ｓ３９（配列番号７０）：５‘−ＧＧＴＣＡＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＡＡＡＴＡＣＣＡＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＣＡＡＴＴＧＣＴＧＣＣＡＧＣＧＴＡＡＴＣＡＧＧＴ−３’
ＧＢＢＣ−ｓ４０（配列番号７１）：５‘−ＴＡＴＣＴＡＴＴＧＴＴＣＴＣＣＴＴＣＣＡＣＴＴＧＣＣＴＡＣＡＣＧＡＧＣＣＴＧＧＴＴＧＴＧＴＧＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＡＣＧＡ−３’
ＧＢＢＣ−ｓ４１（配列番号７２）：５‘−ＧＴＧＣＴＧＧＧＴＴＣＣＣＧＣＣＡＡＴＣＣＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＣＡＣＣＣＴＴＣＣＡＡＴＴＧＧＡＣＴＧＧＣＡＣＧＧＡＣＴＣ−３’
ＧＢＢＣ−ｓ４２（配列番号７３）：５‘−ＣＴＴＣＴＴＧＧＣＴＧＡＣＣＡＣＡＴＴＧＡＴＴＴＴＧＴＴＡＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＴＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡＣＧＣＣＣＴＴＧＡ−３’
ＧＢＢＣ−ｓ４３（配列番号７４）：５‘−ＣＡＴＴＧＧＴＧＡＧＴＴＧＴＧＴＧＧＴＧＣＧＴＧＴＧＴＡＴＴＡＧＴＣＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＴＴＧＴＣＡＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴ−３’
ＧＢＢＣ−ｓ４４（配列番号７５）：５‘−ＴＡＴＴＣＡＣＡＴＡＧＡＣＣＴＣＡＡＴＧＡＡＡＣＴＧＧＴＡＣＴＴＧＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＣＣＣＡＣＴＧＧＡＡＴＡＧＡ−３’
ＧＢＢＣ−ａｓ２８（配列番号７６）：５‘−ＣＣＴＡＧＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＴＣＴＡＴＴＣＣＡＧＴＧＧＧＣＡＣＴＴＣＣＡＧＧＴＡＡＣＡＡＧＴＡＣＣＡＧＴＴＴＣＡＴＴＧ−３’
ＧＢＢＣ−ａｓ２９（配列番号７７）：５‘−ＡＧＧＴＣＴＡＴＧＴＧＡＡＴＡＡＧＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＡＣＡＡＧＣＣＡＧＴＣＡＣＣＧＡＣＴＡＡＴＡＣＡＣＡＣＧＣＡＣＣＡ−３’
ＧＢＢＣ−ａｓ３０（配列番号７８）：５‘−ＣＡＣＡＡＣＴＣＡＣＣＡＡＴＧＴＣＡＡＧＧＧＣＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＡＣＡＡＧＡＧＣＧＣＣＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＴＧ−３’
ＧＢＢＣ−ａｓ３１（配列番号７９）：５‘−ＴＧＧＴＣＡＧＣＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＴＣＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣＣＡＡＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＴＧＡＧＡＴＧＴＡＣＧＧＡＴＴＧ−３’
ＧＢＢＣ−ａｓ３２（配列番号８０）：５‘−ＧＣＧＧＧＡＡＣＣＣＡＧＣＡＣＴＣＧＴＣＣＧＣＡＣＡＧＡＴＣＡＣＡＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＧＴＧＴＡＧＧＣＡＡＧＴＧＧＡＡ−３’
ＧＢＢＣ−ａｓ３３（配列番号８１）：５‘−ＧＧＡＧＡＡＣＡＡＴＡＧＡＴＡＡＣＣＴＧＡＴＴＡＣＧＣＴＧＧＣＡＧＣＡＡＴＴＧＧＴＣＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＡＴＴＴＧＴＧ−３’
ＧＢＢＣ−ａｓ３４（配列番号８２）：５‘−ＴＣＴＧＧＧＴＣＡＧＴＧＡＣＣＣＧＣＧＣＣＣＣＡＣＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡＧＧＣＣＡＡＡＧＡＴＡＧＣＡＧＡＣＡＴＡＣＣＡＣＡ−３’
ＧＢＢＣ−ａｓ３５（配列番号８３）：５‘−ＡＡＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＣＣＧＡＡＣＣＡＡＣＣＡＧＴＡＧＣＣＣＡＧＴＴＧＡＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＧＣＧＴＡＣＴ−３’
ＧＢＢＣ−ａｓ３６（配列番号８４）：５‘−ＡＴＣＴＧＧＣＡＧＡＣＴＧＧＴＣＧＡＡＣＧＡＣＣＧＣＴＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣＧＧＧＣＣＴＡＣＴＡＧＡＧＧＴＧＴＧＴＧＡ−３’
ＧＢＢＣ−ａｓ３７（配列番号８５）：５‘−ＧＴＴＧＴＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＴＣＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＧＴＡＡＴＣＣＡＧＡＡＧＧＡＴＴＣＣＡＡＧＡＴＴＧＣＧＡＧＡＣ−３’
ＧＢＢＣ−ａｓ３８（配列番号８６）：５‘−ＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＴＣＴＴＧＧＣＧＴＣＣＣＣＡＡＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＣＡＡＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＡＡＴＧＴＣ−３’
ＧＢＢＣ−ａｓ３９（配列番号８７）：５‘−ＴＧＣＡＡＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＡＴＴＡＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＣＡＴＣＧＣＧＣＴＧＧＡＣＴ−３’
ＧＢＢＣ−ａｓ４０（配列番号８８）：５‘−ＴＴＧＣＧＣＴＴＴＧＣＴＣＧＴＴＧＴＣＣＣＣＴＴＴＣＡＡＣＡＧＡＴＧＴＴＴＴＡＡＴＧＧＡＣＡＣＡＧＧＡＴＡＴＧＡＡＧＣＣ−３’
ＧＢＢＣ−ａｓ４１（配列番号８９）：５‘−ＴＧＣＧＴＣＴＧＣＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＧＣＧＴＴＣＴＧＧＧＣＧＣＡＧＧＴＡＣＡＧＧＡＣＴＴＧＴＴＴＧＡＧＴＡＧＡＡＡＴＡ−３’
ＧＢＢＣ−ａｓ４２（配列番号９０）：５‘−ＡＣＡＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡ−３’
ＧＢＢＣ−ａｓ４３（配列番号９１）：５‘−ＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＧＣＧＡＣＣＣＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴＣＴＣＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＣＣ−３’
ＧＢＢＣ−ａｓ４４（配列番号９２）：５‘−ＣＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧＧＴＴＧＡＴＣＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＣＣＣＧＧＴＣＧＴＣＣＴＧＧＣＡＡＴＴＣＣ−３’【００９６】
各合成遺伝子の５’末端のリン酸化のため、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（宝酒造）を用いてリン酸化反応を行った。これらのリン酸化産物を混合し、９５℃から室温まで徐冷することで、各合成遺伝子をアニーリングさせ、Ｔａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造）を用いて連結反応を行った。この連結物をＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（宝酒造）を用いて二本鎖ＤＮＡ末端の平滑化を行った。この二本鎖ＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターにクローニングし、塩基配列を決定し、目的遺伝子であるＴＰＦ１  ５‘ＵＴＲを有するＧＢＶ−Ｂのコア蛋白からＥ１の１２５番目までの遺伝子であることを確認した。【００９７】
そして、上記で合成されたＴＰＦ１  ５‘ＵＴＲとＧＢＶ−Ｂのコア蛋白からＥ１の１２５番目までの遺伝子を制限酵素ＡｇｅＩ−ＡｖｒＩＩで消化された遺伝子断片をＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラプラスミドｐＴＰＦ／ＧＢＢ−Ｃ１５６Ｅ１２を制限酵素ＡｇｅＩ−ＡｖｒＩＩで消化されたベクターに連結することにより、ＧＢＶ−Ｂのコア蛋白からｐ６蛋白までを有するＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラプラスミドｐＴＰＦ／ＧＢＢ−Ｃ６を構築した。【００９８】
《実施例２：ＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラ遺伝子のＨｕｈ７細胞における増殖》
実施例１において構築したｐＴＰＦ／ＧＢＢ−Ｃ１５６Ｅ１２をＸｈｏＩで切断し、それを鋳型に、Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）又はＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ  Ｔ７−Ｆｌａｓｈ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いてＲＮＡを合成した。メーカーの推奨する方法にてＲＮＡを精製した。【００９９】
ヒト肝がん細胞（Ｈｕｈ７、ＪＣＲＢ０４０３）はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ，ＩＷＡＫＩ）に１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリンを５０Ｕ／ｍＬ及びストレプトマイシンを５０μｇ／ｍＬとなるように加えたものを培養液として、５％二酸化炭素付加、３７℃で培養を行った。コンフルエントになる前の細胞をトリプシン、ＥＤＴＡ処理により培養皿から剥離させ、血清添加培地に再懸濁することによりトリプシンを不活化した。ＰＢＳで２回洗浄後、１．２５％ＤＭＳＯを添加したＣｙｔｏｍｉｘ（１２０ｍＭ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、１０ｍＭ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５ｍＭ  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１５ｍＭ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、２ｍＭＥＧＴＡ、ｐＨ７．６）に再懸濁し、ギャップ０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移す。【０１００】
１０μｇのＲＮＡを細胞に加えた後、５分間氷上で十分冷却する。エレクトロポレーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、９６０μＦ、２５０Ｖにてパルスを加える。トランスフェクションを行った細胞は、直ちに１０ｍＬの培地に再懸濁し、１２ｗｅｌｌプレートに（直径２２．１ｍｍ）に１ｍＬずつ播き培養を開始した。４時間、２４時間、４８時間及び７２時間に培養上清を回収した。回収した培養上清は、２ｋｒｐｍで１０分間遠心し上清を回収した。上清１００μＬをＨＣＶコア抗原のキット（富士レビオ、ルミパルス）を使用し測定した。【０１０１】
図１に示すように、エレクトロポレーターを用いて細胞内にＲＮＡを導入した実験区（エレクトロポレーション有り）におけるコア抗原の測定値は２４時間から上昇し、７２時間後も増加していた。一方、対照区（エレクトロポレーション無し）は上清中のコア抗原の測定値は検出限界以下であることを確認した。この結果は本願発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラ遺伝子が細胞中において複製し、コア蛋白質を上清中に分泌していることを示している。ＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラ遺伝子が、ｉｎ−ｖｉｔｒｏで複製可能であることを示したものである。【０１０２】
《実施例３：ＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラ遺伝子のマーモセット初代肝臓細胞における増殖》
実施例２においてＨｕｈ７細胞において複製可能であったＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラ遺伝子型が、マーモセット初代肝臓細胞において複製可能か評価を試みた。実施例２と同様の方法を用いてｐＴＰＦ／ＧＢＢ−Ｃ１５６Ｅ１２のＲＮＡを合成した。【０１０３】
マーモセット初代肝臓細胞（ＢＩＯＰＲＥＤＩＣ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ）は、メーカーの推奨する方法にて培養を行った。具体的には、凍結マーモセット初代肝細胞を３７℃のウォーターバスにおいて溶解し、予め３７℃に温めておいたＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１％  ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた培養液３０ｍＬに懸濁した。細胞は１ｋｒｐｍ（１６０×ｇ）で１分間遠心により上清を除去し、細胞ペレットをＷｉｌｌｉａｍ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１％  Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４μｇ／ｍＬ  Ｂｏｖｉｎｅ  ｉｎｓｕｌｉｎと１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を加えた培養液で約６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように再懸濁した。再懸濁を行った細胞は、コラーゲンタイプＩコート２４ｗｅｌｌプレート（直径１５．６ｍｍ）に０．５ｍＬずつ播き５％二酸化炭素付加、３７℃で培養を行った培養を開始した。【０１０４】
１日間培養を行ったマーモセット初代肝臓細胞に、精製したＴＰＦ／ＧＢＢ−Ｃ１５６Ｅ１２及び遺伝子導入試薬ＨｉｌｙＭａｘ（ＤＯＪＩＮＤＯ）をそれぞれ１ｗｅｌｌあたり２μｇと４μＬ添加し、５％二酸化炭素付加、３７℃で４時間培養を行った。遺伝子導入方法は、メーカーの推奨する方法にて行った。４時間培養後、ＰＢＳで３回洗浄を行い、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅに（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１％  Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂｏｖｉｎｅ  ｉｎｓｕｌｉｎとＨｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ  ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅをそれぞれ４μｇ／ｍＬ、５０μＭとなるように加えたものを培養液（増殖培地）として、５％二酸化炭素付加、３７℃で培養を開始した。４時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１４４時間、１９２時間、２４０時間、２８８時間及び３３６時間に培養上清を回収した。回収した培養上清は、２ｋｒｐｍで１０分間遠心し上清を回収した。上清１００μＬをＨＣＶコア抗原のキット（富士レビオ、ルミパルス）を使用し測定した。【０１０５】
図２に示すように、コア抗原の測定値は２４時間、１４４時間及び２４０時間において対照区（エレクトロポレーション無し）に比べ高い値を示した。この結果は本願発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラ遺伝子が、マーモセット初代肝臓細胞中において持続的に複製し、コア蛋白質を上清中に散発的に分泌していることを示している。ＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラ遺伝子が、マーモセットの生体内（肝臓）において持続的に複製可能であることを示したものである。【０１０６】
《実施例４：ＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスのマーモセット初代肝臓細胞への感染》
実施例１において構築したｐＴＰＦ／ＧＢＢ−Ｃ１５６Ｅ１２、ｐＴＰＦ１／ＧＢＢ−ｖ１１Ｅ１２、ｐＴＰＦ／ＧＢＢ−ｖ２７Ｅ１２およびｐＴＰＦ／ＧＢＢ−Ｃ６をＸｈｏＩで切断し、実施例２と同様の方法を用いてＲＮＡを合成した。【０１０７】
マーモセット初代肝臓細胞は、実施例３に記載の方法にて培養を行った。再懸濁を行った細胞は、コラーゲンタイプＩコート６ｗｅｌｌプレート（直径３４．６ｍｍ）に２ｍＬずつ播き５％二酸化炭素付加、３７℃で培養を行った培養を開始した。【０１０８】
１日間培養を行ったマーモセット初代肝臓細胞に、精製したＴＰＦ／ＧＢＢキメラＲＮＡ４種と遺伝子導入試薬ＨｉｌｙＭａｘをそれぞれ１ｗｅｌｌあたり５μｇと１５μＬ添加し、５％二酸化炭素付加、３７℃で４時間培養を行った。遺伝子導入方法は、メーカーの推奨する方法にて行った。４時間培養後、ＰＢＳで３回洗浄後増殖培地を添加し、５％二酸化炭素付加、３７℃で培養を開始した。４８時間に培養上清を回収し、回収した培養上清は、２ｋｒｐｍで１０分間遠心し上清を回収した。回収した培養上清は、感染試験に使用するまで−８０℃で保存した。【０１０９】
また、被感染細胞としてマーモセット初代肝臓細胞を新規に溶解し、コラーゲンタイプＩコート６ｗｅｌｌプレートにて培養を行った。1日間培養を行った細胞に、遺伝子導入後４８時間に回収した培養上清（５倍希釈）を５００μＬ添加し、５％二酸化炭素付加、３７℃で６時間培養を行った。６時間培養後、ＰＢＳで３回洗浄後増殖培地を添加し、５％二酸化炭素付加、３７℃で培養を開始した。２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１６８時間、１９２時間および２１６時間に培養上清を回収した。回収した培養上清は、２ｋｒｐｍで１０分間遠心し上清を回収した。ＴＰＦ１／ＧＢＢキメラの再感染の有無は、培養上清中に含まれるキメラウイルスのゲノム数を定量的ＲＴ−ＰＣＲにて測定した。【０１１０】
図３に示すように、感染試験に使用した全てのＴＰＦ１／ＧＢＢキメラウイルスのゲノム数は一旦検出限界近傍にまで減少したが、その後増加に転じた。この結果は、本願発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−ＢキメラＲＮＡをマーモセット初代肝細胞に遺伝子導入することで得られる培養上清中には、ｎａｉｖｅな同細胞に対して再感染可能なキメラウイルス粒子が存在していることを示している。ＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスが、マーモセットの生体内（肝臓）において再感染可能であることを示したものである。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明のＨＣＶ／ＧＢＶ−Ｂキメラウイルスを、小型霊長類であるタマリンやマーモセットに感染することにより、ＨＣＶの動物モデルを構築することができる。そして、この動物モデルを利用することにより、肝炎の重症化を抑制、又は阻害する医薬品の開発や評価を行うことができ、より有効な感染の予防薬及び治療薬の開発及び評価が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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