(57)【要約】【課題】安定化された抗ペリオスチン抗体固定化担体を提供すること、安定化されたペリオスチン測定試薬を提供すること、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗体の安定化方法を提供する。【解決手段】担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、界面活性剤及び糖、界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩、又は界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩を接触させたことを特徴とするものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ペリオスチン抗体を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体固定化担体であって、この担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）〜（３）から選択される安定化物質を接触させたことを特徴とする抗ペリオスチン抗体固定化担体。
（１）界面活性剤及び糖
（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
【請求項２】
請求項１記載の抗ペリオスチン抗体固定化担体を含むペリオスチンの測定試薬。
【請求項３】
抗ペリオスチン抗体を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗体の安定化方法であって、この担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）〜（３）から選択される安定化物質を接触させたことを特徴とする抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗体の安定化方法。
（１）界面活性剤及び糖
（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー疾患や他の疾患のマーカーとなりうるペリオスチン（骨芽細胞特異因子２又はＯＳＦ２とも呼ばれる）の測定に使用される抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチン測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体の安定化方法に関するものである。
本発明は、臨床検査、臨床病理学、免疫学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
ペリオスチンは、細胞外マトリックスタンパク質であり、そのＮ末端側よりＣ末端側にかけて順に、ＥＭＩ領域、Ｒ１領域、Ｒ２領域、Ｒ３領域、Ｒ４領域及びＣ末端領域よりなるものであるが、このペリオスチン遺伝子の発現レベルの測定がアレルギー性疾患の検査方法として有用であることが開示され、そして、アレルギー疾患の検査方法の発明が開示された（特許文献１及び非特許文献１参照。）。
また、このペリオスチン遺伝子の発現レベルの測定が特発性間質性肺炎の検査方法としても有用であることが開示された（特許文献２参照。）。
そして、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の使用により、ペリオスチン測定の正確性が改善されることが開示され（特許文献３参照。）、更に、ペリオスチンの特定領域を検出することによる正確性の改善された肺線維症又は間質性肺炎の検査方法等が開示された（特許文献４参照。）。【０００３】
なお、他に、ＯＳＦ２（ペリオスチン）に対するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びこれらの抗体を用いる診断方法等が開示され（特許文献５参照。）、Ｏｓｆ２／Ｃｂｆａ１と命名される新規造骨細胞特異的転写因子を測定するのに抗ＯＳＦ２（ペリオスチン）抗体を用いた免疫測定法が開示され（特許文献６参照。）、ヒトペリオスチンに対して特異的に結合する精製抗体及びこの抗体を用いる乳癌の骨への転移等を調べる診断アッセイ法等が開示され（特許文献７参照。）、そして、抗細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体及びこの抗体を用いるペリオスチンの定量方法等が開示されている（特許文献８参照。）。【０００４】
しかしながら、このように種々の疾患の検査に有用なペリオスチンの測定に使用するペリオスチン測定試薬は必ずしも安定なものではなく、その安定化が望まれていた。
特に、ペリオスチン測定試薬における抗ペリオスチン抗体が乾燥状態におかれた場合には、著しく不安定となり、その安定化が切望されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０２／０５２００６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０９／１４８１８４号パンフレット
【特許文献３】特開２０１２−５８０４８号公報
【特許文献４】国際公開第１３／０３５７９９号パンフレット
【特許文献５】特開平５−２６８９８２号公報
【特許文献６】特表２００２−５０２２５０号公報
【特許文献７】特表２００５−５０００５９号公報
【特許文献８】国際公開第０７／０７７９３４号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１８巻，９８〜１０４頁，２００６年発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述した通り、ペリオスチンの測定に使用されるペリオスチン測定試薬は必ずしも安定なものではなく、その安定化が望まれていた。
これに対して、本発明の課題は、安定化された抗ペリオスチン抗体固定化担体を提供すること、安定化されたペリオスチン測定試薬を提供すること、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗体の安定化方法を提供することである。
特に、乾燥状態におかれた抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、抗ペリオスチン抗体固定化担体及びペリオスチン測定試薬並びにこれらに用いる抗ペリオスチン抗体の安定化方法について検討を重ねたところ、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、界面活性剤及び糖、界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩、又は界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩を接触させることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。
［１］抗ペリオスチン抗体を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体固定化担体であって、この担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）〜（３）から選択される安定化物質を接触させたことを特徴とする抗ペリオスチン抗体固定化担体。
（１）界面活性剤及び糖
（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
［２］前記［１］記載の抗ペリオスチン抗体固定化担体を含むペリオスチンの測定試薬。
［３］抗ペリオスチン抗体を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法であって、この担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）〜（３）から選択される安定化物質を接触させたことを特徴とする抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法。
（１）界面活性剤及び糖
（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
【発明の効果】
【００１０】
本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチン測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法は、その抗ペリオスチン抗体固定化担体、及びペリオスチン測定試薬、並びに抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体が安定化されたものである。
特に、乾燥状態におかれた抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化に好適である。
以上のことより、本発明においては、抗ペリオスチン抗体固定化担体、及びペリオスチン測定試薬、並びに抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体は、長期間使用することができ、そして、長期間正確なペリオスチン測定値を提供することができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】抗体固定化担体試薬の乾燥処理後のマイクロタイタープレートのウェルの観察結果の画像を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００１３】
Ｉ．抗ペリオスチン抗体固定化担体
〔１〕総論
本発明における抗ペリオスチン抗体固定化担体は、抗ペリオスチン抗体を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体固定化担体であって、この担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）〜（３）から選択される安定化物質を接触させたことを特徴とするものである。
（１）界面活性剤及び糖
（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
【００１４】
本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体は、上記の構成により安定化されたものである。
【００１５】
〔２〕抗ペリオスチン抗体
１．抗体
本発明における抗ペリオスチン抗体は、ペリオスチンに特異的に結合する抗体である。
【００１６】
本発明において、抗ペリオスチン抗体は、ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体であればよく、特に限定はない。
【００１７】
この抗ペリオスチン抗体としては、例えば、ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗血清、抗体の断片〔Ｆａｂ及びＦ(ａｂ’)２など〕、又は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）等を挙げることができる。
【００１８】
なお、この抗ペリオスチン抗体は、遺伝子組み換え技術等により免疫原を免疫する動物とは異なる動物種のアミノ酸配列に変化させた抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体等）であってもよい。
【００１９】
そして、抗ペリオスチン抗体としては、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００２０】
また、本発明においては、２種以上の、抗ペリオスチン抗体を用いてもよい。
【００２１】
２．免疫原
本発明における抗ペリオスチン抗体を産生させるための免疫原について、以下説明を行う。
本発明における抗ペリオスチン抗体を産生させるための免疫原として、ペリオスチンの全部又は一部を用いることができる。
すなわち、ヒト又はウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス若しくはラットなどの哺乳動物又はニワトリなどの鳥類等由来のペリオスチン、又は遺伝子組み換え操作により得たペリオスチン等のペリオスチンの全部又は一部を用いることができる。
【００２２】
前記のペリオスチンの全部又は一部を免疫原とすることにより、本発明における抗ペリオスチン抗体を取得することができる。
なお、この抗ペリオスチン抗体を産生させるための免疫原は、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部又は一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜２個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等であってもよい。
【００２３】
また、抗体は、３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を認識できるとの報告（Ｆ．Ｈｕｄｅｃｚら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４７巻，２０１〜２１０頁，１９９２年発行）がある。
よって、本発明における抗ペリオスチン抗体の免疫原のアミノ酸配列の最小単位としては、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜２個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列の内、連続する３つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を考えることができるので、これらの連続する３つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列からなるトリペプチド、又はこれに他のアミノ酸若しくはペプチドが付加したもの等を、本発明における抗ペリオスチン抗体の免疫原の最小単位として考えることができる。
【００２４】
前記の免疫原としての、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等、又はペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜２個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等は、ヒト等の体液、細胞、組織もしくは臓器等より、公知の方法等により抽出、精製等して、取得することができる。
【００２５】
なお、本発明において、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を取得する方法としては特に限定はなく、如何なる方法によるものでもよく、例えば、公知の方法により取得することができる。
【００２６】
例えば、ヒトのペリオスチンを取得する方法として、次の方法（“Ｇ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１８巻，１号，７１３〜７２３頁，２００６年発行”）等を挙げることができる。
（ａ）  まず、ペリオスチン（ポリヌクレオチドの塩基配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮｕｍｂｅｒＤ１３６６６；アミノ酸配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮｕｍｂｅｒＢＡＡ０２８３７）にＶ５／Ｈｉｓタグを付加させたリコンビナントペリオスチンタンパク質を昆虫細胞であるＳ２細胞において発現させた上で精製する。
【００２７】
（ｂ）  すなわち、具体的には、Ｓ２細胞の形質転換体は次のように調製する。
ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）にペリオスチンの上記部分をコードするｃＤＮＡを挿入して、これをｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ−Ｖ５−ＨｉｓＡとする。
Ｓ２細胞にｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ−Ｖ５−ＨｉｓＡ及びハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドであるｐＡｃＨｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を公知の方法で共導入し、形質転換させる。
ハイグロマイシンにより形質転換体を選択し、安定形質転換体を得る。
そして、Ｓ２細胞の形質転換体では、カルボキシ末端にＶ５エピトープ／Ｈｉｓタグの結合したペリオスチンを発現させる。
【００２８】
（ｃ）  Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の精製は次のように行う。
ペリオスチン遺伝子安定形質転換体Ｓ２細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導する。
これにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌される。
この培養上清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に透析した後、ニッケルレジン（Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ、Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ国Ｈｉｌｄｅｎ）と混合して、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させる。
レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出させる。
溶出されたＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をＰＢＳ等に透析し、精製されたヒトのペリオスチンタンパク質を取得する。
【００２９】
また、ヒトのペリオスチンは、次の方法によっても取得することができる。
すなわち、ペリオスチンのｃＤＮＡを、ＧＥＸ−ＫＧベクター（“ＫＬ．Ｇｕａｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９２巻，２６２〜２６７頁，１９９１年発行”）に組み込んで、大腸菌ＢＬ２１にトランスフェクションする。
これをアンピシリン入りＬＢ培地にて培養し、菌体よりグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）により、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を付加したペリオスチンを精製する。
これにトロンビンにてＧＳＴを切断し、ＧＳＴを付加しないペリオスチンを取得する。
これをブラッドフォード法にて定量して、その量（濃度）が明確となったヒトのペリオスチンを取得することができる。
【００３０】
更に、ヒトのペリオスチンは、例えば、“Ｉ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４６巻，５号，７１３〜７２３頁，２００９年発行”などに記載された方法等によっても取得することができる。
【００３１】
なお、ヒトのペリオスチンのＥＭＩ領域は、例えば、“Ｉ．Ｋｉｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８５巻，３号，２０２８〜２０３９頁，２０１０年発行”、又は“Ｔ．Ｍａｒｕｈａｓｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８５巻，１７号，１３２９４〜１３３０３頁，２０１０年発行”などに記載された方法等により取得することができる。
【００３２】
また、ヒトのペリオスチンのＲ１領域、Ｒ２領域又はＲ３領域はそれぞれ、“Ｉ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１４６巻，５号，７１３〜７２３頁，２００９年発行”などに記載された方法等により取得することができる。
【００３３】
また、ヒトのペリオスチンのＲ４領域及びＣ末端領域のアミノ酸配列はそれぞれ、“Ｉ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１４６巻，５号，７１３〜７２３頁，２００９年発行”などに記載された方法等により取得することができる。
【００３４】
なお、前記の免疫原は、液相法及び固相法等のペプチド合成の方法により合成することができ、更にペプチド自動合成装置を用いてもよく、日本生化学会編「生化学実験講座１  タンパク質の化学ＩＶ」，東京化学同人，１９７５年、泉屋ら「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善，１９８５年、日本生化学会編「続生化学実験講座２  タンパク質の化学  下」，東京化学同人，１９８７年等に記載された方法に従い合成することができ、前記のアミノ酸配列に、欠失、置換、挿入又は付加を施した変異体を作製することも容易である。
また、非天然型アミノ酸の導入、各アミノ酸残基の化学修飾やシステイン残基を導入することにより分子内を環化させて構造を安定化させる等の修飾を施してもよい。
【００３５】
更に、前記の免疫原は、対応する核酸塩基配列を持つＤＮＡ又はＲＮＡより遺伝子工学技術を用いて調製してもよく、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法Ｉ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法ＩＩ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法ＩＩＩ」，東京化学同人，１９８７年等を参照して調製すればよい。
【００３６】
ところで、免疫原が低分子物質の場合には、免疫原に担体（キャリア）を結合させたものを動物等に免疫するのが一般的ではあるが、アミノ酸数５のペプチドを免疫原としてこれに対する特異抗体を産生させたとの報告（木山ら，「日本薬学会第１１２回年会講演要旨集３」，１２２頁，１９９２年発行）もあるので、担体を使用することは必須ではない。
【００３７】
なお、抗体を産生させる際に担体（キャリア）を使用する場合の担体としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリアラニルリシン、ジパルミチルリシン、破傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公知なものを用いることができる。
【００３８】
免疫原と担体の結合法は、グルタルアルデヒド法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド法、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル法、ビスジアゾ化ベンジジン法又はＮ−サクシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸法等の公知の結合法を用いることができる。
また、ニトロセルロース粒子、ポリビニルピロリドン又はリポソーム等の担体に免疫原を吸着させたものを免疫原とすることもできる。
【００３９】
３．ポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の調製方法
ペリオスチンに特異的に結合することができるポリクローナル抗体、すなわち、ポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体は、以下の操作により調製することができる。
【００４０】
このポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の産生用の免疫原としては、前記の免疫原を用いることができる。
【００４１】
前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体（キャリア）の結合物を、哺乳動物（マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ロバ、若しくはラクダなど）又は鳥類（ニワトリ、アヒル、若しくはダチョウなど）等に免疫する。
【００４２】
なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫する免疫動物としては、その体内でのペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた、すなわちペリオスチンの生産に関わる遺伝子をノックアウトした動物がより好ましい。
【００４３】
その理由は、その動物の体内で生産されたペリオスチンが、ペリオスチンなどの免疫原等の免疫により体内に産生した抗ペリオスチン抗体と結合してしまうことにより、抗ペリオスチン抗体の抗体活性が低下してしまう可能性が、前記のノックアウト動物においては低いからである。
また、前記のノックアウト動物においては、その動物の体内でペリオスチンが生産されないため、免疫されたペリオスチンを異物と認識し易く、よって抗体の産生が高くなるためである。
【００４４】
このペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた動物としては、例えば、ペリオスチンについてのノックアウトマウス（“Ｈ．Ｒｉｏｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５巻，２４号，１１１３１〜１１１４４頁，２００５年発行”）等を挙げることができる。
【００４５】
ところで、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫原、担体、免疫動物の種類、免疫注射部位等により決められるものであるが、マウスの場合には一匹当り一回につき０．１μｇ〜５ｍｇの前記免疫原、又は前記免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。
【００４６】
なお、この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントと添加混合して免疫注射することが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、化学合成アジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知のものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
【００４７】
初回免疫後、１〜２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。
この追加免疫注射の回数としては、２〜６回が一般的である。
この場合も、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら全採血を行い、血清を分離して抗体を含む抗血清を得る。
【００４８】
この抗血清を、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィー等の方法、あるいはこれらの方法を組み合わせて抗体の精製を行い、ポリクローナル抗体を得る。
【００４９】
以上の操作により、ペリオスチンに結合することができるポリクローナル抗体（ポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体）を得ることができる。
【００５０】
ところで、免疫原と担体の結合物を用いて動物等に免疫した場合には、得られたポリクローナル抗体中に、この担体に対する抗体が存在するので、このような担体に対する抗体の除去処理を行うことが好ましい。
【００５１】
この除去処理方法としては、担体を、得られたポリクローナル抗体の溶液中に添加して生成した凝集物を取り除くか、担体を不溶化固相に固定化してアフィニティークロマトグラフィーにより除去する方法等を用いることができる。
【００５２】
４．モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の調製方法
ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体、すなわち、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体は、以下の操作により調製することができる。
【００５３】
このモノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５〜４９７頁，１９７５年発行）によるハイブリドーマ、又はエプスタン−バーウイルス等のウイルスによる腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得ることができる。
【００５４】
更に、抗体遺伝子のｃＤＮＡライブラリーから、マカフェティーらのファージディスプレイ法（Ｍ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８巻，５５２〜５５４頁，１９９０年発行）を用いてモノクローナル抗体を作製することも可能である。
【００５５】
なお、例えば、細胞融合法によるモノクローナル抗体の調製は、下記の操作により行うことができる。
【００５６】
（１）  まず、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を、哺乳動物（マウス、ハムスター、ラット、又はラビットなど、例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）又は鳥類（ニワトリなど）等に免疫する。
【００５７】
なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫する免疫動物としては、その体内でのペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた、すなわちペリオスチンの生産に関わる遺伝子をノックアウトした動物がより好ましい。
【００５８】
その理由は、その動物の体内で生産されたペリオスチンが、ペリオスチンなどの免疫原等の免疫により体内に産生した抗ペリオスチン抗体と結合してしまうことにより、抗ペリオスチン抗体の抗体活性が低下してしまう可能性が、前記のノックアウト動物においては低いからである。
また、前記のノックアウト動物においては、その動物の体内でペリオスチンが生産されないため、免疫されたペリオスチンを異物と認識し易く、よって抗体の産生が高くなるためである。
【００５９】
このペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた動物としては、例えば、ペリオスチンについてのノックアウトマウス（“Ｈ．Ｒｉｏｓら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２５巻，２４号，１１１３１〜１１１４４頁，２００５年発行”）等を挙げることができる。
【００６０】
ところで、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により適宜決められるものであるが、例えば、マウスの場合には一匹当り一回につき０．１μｇ〜５ｍｇの前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。
【００６１】
なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して免疫注射することが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、化学合成アジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内、足蹠又は背部等の部位に行えばよい。
【００６２】
（２）  初回免疫後、１〜２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内、足蹠又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。
この追加免疫注射の回数としては２〜６回が一般的である。
この場合も前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
【００６３】
（３）  初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。
【００６４】
（４）  この最終免疫の３〜５日後に、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。
【００６５】
（５）  この免疫動物より得られた抗体産生能を有する細胞と哺乳動物等（マウス、ヌードマウス、ラットなど）の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを細胞融合させるのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク〔ＪＣＲＢ〕９０８５）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１株（ＪＣＲＢ  ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３株（ＪＣＲＢ  ００２８）又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４株（ＪＣＲＢ  ００２９）等を用いることができる。
【００６６】
細胞融合は、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リポソームもしくはセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融合法により行うことができる。
ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞との融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択的に培養し、増殖させることができる。
【００６７】
（６）  このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を、ヒト又はウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、ラット若しくはニワトリなどの動物等（例えば、ヒトのペリオスチンの測定に用いる場合にはヒト由来のものが好ましく、ウシのペリオスチンの測定に用いる場合にはウシ由来のものが好ましく、イヌのペリオスチンの測定に用いる場合にはイヌ由来のものが好ましい）のペリオスチンの全部又は一部よりなるタンパク質又はペプチド等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などの免疫学的測定法等により測定することにより、「ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体（モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体）」を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【００６８】
（７）  このハイブリドーマ選択方法と限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて行うことにより、本発明における、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の産生細胞株を単離して得ることができる。
【００６９】
（８）  このモノクローナル抗体産生細胞株を適当な培地で培養して、その培養上清から本発明における、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を得ることができるが、培地としては無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、この場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等の培地を用いることができる。
また、このモノクローナル抗体産生細胞株を、これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたまった腹水より本発明における、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を得ることもできる。
【００７０】
（９）  このようにして得られた、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィーなどの方法、あるいはこれらの方法を組み合わせること等により、精製された、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を得ることができる。
【００７１】
（１０）なお、前記（６）の通り、得られたハイブリドーマの培養上清を、ヒト又はイヌ等の動物のペリオスチンの全部又は一部よりなるタンパク質又はペプチド等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などの免疫学的測定法等により測定することにより、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【００７２】
（１１）  この「モノクローナル抗体である、抗ペリオスチン抗体」を産生するハイブリドーマより、前記（７）〜（９）のようにして、「モノクローナル抗体である、抗ペリオスチン抗体」を得ることができる。
【００７３】
なお、得られた「モノクローナル抗体である、抗ペリオスチン抗体」は、ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体である。
【００７４】
〔３〕抗ペリオスチン抗体固定化担体
１．担体
本発明における担体は、抗ペリオスチン抗体を固定化するものである。
【００７５】
本発明において担体は、抗ペリオスチン抗体を固定化することができるものであればよく、特に限定はない。
【００７６】
この担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるマイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又は試験片等の形状の担体を挙げることができる。
【００７７】
また、この担体としては、例えば、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子等の担体を挙げることができる。
【００７８】
２．抗ペリオスチン抗体の担体への固定化
本発明における抗ペリオスチン抗体の担体への固定化は、固定化をすることができるのであればよく、特に限定はない。
【００７９】
本発明においては、抗ペリオスチン抗体と担体とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により吸着、結合させて抗ペリオスチン抗体を担体に固定化することができる。
【００８０】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗ペリオスチン抗体と担体を緩衝液などの溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液などに溶解した抗ペリオスチン抗体と担体を接触させたりすること等により行うことができる。
【００８１】
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗ペリオスチン抗体と担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗ペリオスチン抗体と担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
【００８２】
また、更に非特異的反応や担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗ペリオスチン抗体を固定化させた担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【００８３】
〔４〕安定化物質
１．総論
本発明における抗ペリオスチン抗体固定化担体は、抗ペリオスチン抗体を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体固定化担体であって、この担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）〜（３）から選択される安定化物質を接触させたことを特徴とするものである。
（１）界面活性剤及び糖
（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
【００８４】
２．担体に固定化した抗ペリオスチン抗体への安定化物質の接触
本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に本発明における安定化物質を接触させる方法は、当該接触を行うことができるのであればよく、特に限定はない。
【００８５】
当該接触の方法としては、例えば、本発明における安定化物質を含む溶液を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に注ぐことにより接触させたり、本発明における安定化物質を含む溶液を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に塗布することにより接触させたり、又は担体に固定化した抗ペリオスチン抗体を本発明における安定化物質を含む溶液に含浸させて接触させたりする方法等を挙げることができる。
【００８６】
３．界面活性剤及び糖の接触
本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤及び糖を接触させるに当たっては、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させた後に糖を接触させてもよく、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させた後に界面活性剤を接触させてもよく、又は担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤と糖を同時に接触させてもよい。
【００８７】
本発明においては、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤と糖を同時に接触させること、又は担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させた後に界面活性剤を接触させることが好ましく、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させた後に界面活性剤を接触させることがより好ましい。
【００８８】
４．界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩の接触
本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩を接触させるに当たっては、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させた後にアルギニン若しくはその塩を接触させてもよく、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体にアルギニン若しくはその塩を接触させた後に界面活性剤を接触させてもよく、又は担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤とアルギニン若しくはその塩を同時に接触させてもよい。
【００８９】
本発明においては、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤とアルギニン若しくはその塩を同時に接触させること、又は担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させた後に界面活性剤を接触させることが好ましく、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体にアルギニン若しくはその塩を接触させた後に界面活性剤を接触させることがより好ましい。
【００９０】
５．界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
の接触
本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩を接触させるに当たっては、その順序は問わない。
そして、界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩から選ばれる二つ以上の本発明における安定化物質を、同時に担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に接触させてもよい。
【００９１】
本発明においては、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖とアルギニン若しくはその塩を同時又は別々に接触させた後に、界面活性剤を接触させることが好ましい。
【００９２】
〔５〕界面活性剤
１．界面活性剤
本発明における界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤等を挙げることができる。
【００９３】
（１）非イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ）  ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリスチリルフェニルエーテル、又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレンエーテル化合物。
【００９４】
（ｂ）  グリセリン脂肪酸部分エステル、ソルビタン脂肪酸部分エステル、ペンタエリスリトール脂肪酸部分エステル、プロピレングリコールモノ脂肪酸エステル、又はショ糖脂肪酸部分エステルなどの多価アルコール部分エステル化合物。
【００９５】
（ｃ）  ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸部分エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸部分エステル、又はポリオキシエチレン化ひまし油などのポリオキシエチレン化多価アルコール脂肪酸エステル。
【００９６】
（ｄ）  脂肪酸ジエタノールアミド、Ｎ，Ｎ−ビス−２−ヒドロキシアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルキルアミン、トリエタノールアミン脂肪酸エステル、又はトリアルキルアミンオキシドなどのアミド若しくはアミン化合物。
【００９７】
（２）陰イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ）  脂肪族モノカルボン酸塩、Ｎ−アシロイルサルコシン塩、Ｎ−アシロイル−β−アラニン塩、若しくはＮ−アシロイルグルタミン酸塩などの脂肪族化合物カルボン酸塩；又はアビエチン酸塩などの環式化合物カルボン酸塩。
【００９８】
（ｂ）  ジアルキルスルホコハク酸塩、アルカンスルホン酸塩、若しくはヒドロキシアルカンスルホン酸塩などの脂肪族化合物スルホン酸塩；直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル（分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルキルフェノキシポリオキシエチレンプロピルスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェノールスルホン酸塩、若しくはナフタレンスルホン酸塩−ホルムアルデヒド縮合物などの環式化合物スルホン酸塩；又はＮ−メチル−Ｎ−オレイルタウリンナトリウム、若しくはＮ−アルキルスルホコハク酸モノアミド二ナトリウム塩などの含窒素化合物スルホン酸塩。
【００９９】
（ｃ）  硫酸化ひまし油、硫酸化牛脚油、脂肪酸アルキルエステル・硫酸エステル塩、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、脂肪酸モノグリセリド硫酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンアルキロイルアミド硫酸塩などの脂肪族化合物硫酸エステル塩；又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル硫酸エステル塩などの環式化合物硫酸エステル塩。
【０１００】
（ｄ）  アルキルリン酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル塩などの脂肪族化合物リン酸エステル塩；又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸エステル塩などの環式化合物リン酸エステル塩。
【０１０１】
（ｅ）  スチレン−無水マレイン酸共重合物の部分けん化物、又はオレフィン−無水マレイン酸共重合物の部分けん化物などの重合型高分子化合物のけん化物。
【０１０２】
（ｆ）  ナフタレンスルホン酸塩−ホルマリン縮合物などの重縮合型高分子化合物。
【０１０３】
（３）陽イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ）  モノアルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、又はトリアルキルアミン塩などの脂肪族化合物アミン塩。
【０１０４】
（ｂ）  テトラアルキルアンモニウム塩などの脂肪族化合物第四級アンモニウム塩；又はトリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、２−アルキル−１−アルキル−１−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、若しくはＮ，Ｎ−ジアルキルモルホリニウム塩などの環状化合物第四級アンモニウム塩。
【０１０５】
（ｃ）  ポリエチレンポリアミン脂肪族アミド塩、ポリエチレンポリアミン脂肪族アミドの尿素縮合物の塩、又はポリエチレンポリアミン脂肪族アミド尿素縮合物の第四級アンモニウム塩などのポリエチレンポリアミン誘導体。
【０１０６】
（４）両性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ）  Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−アルキル−Ｎ−カルボキシアルキレンアンモニウムベタインなどのカルボキシベタイン化合物。
【０１０７】
（ｂ）  Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキレンカルボン酸塩などのアミノカルボン酸化合物。
【０１０８】
（ｃ）  Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキル−Ｎ−スルホアルキレンアンモニウムベタインなどのスルホベタイン化合物。
【０１０９】
（ｄ）  Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ビスポリオキシエチレン硫酸エステル塩などのアミノ硫酸エステル化合物。
【０１１０】
（ｅ）  ２−アルキル−１−ヒドロキシエチル−１−カルボキシメチルイミダゾリニウム塩などのイミダゾリン化合物。
【０１１１】
本発明においては、１種類の界面活性剤だけを用いてもよく、又は２種類以上の界面活性剤を組み合わせて用いてもよい。
【０１１２】
本発明における界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸部分エステルがより好ましく、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートが特に好ましい。
【０１１３】
２．濃度
本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させる際の界面活性剤の濃度は、特に限定されないが、当該接触時に、０．００１％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。
【０１１４】
なお、当該接触時の界面活性剤の好ましい濃度の下限は、より好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）以上であり、更に好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上である。
【０１１５】
また、当該接触時の界面活性剤の好ましい濃度であるが、上限は特にはないが、コスト等のことを考えると５％（ｗ／ｖ）迄で十分である。
【０１１６】
なお、当該接触時の界面活性剤の好ましい濃度の上限は、より好ましくは１％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以下である。
【０１１７】
なお、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させる場合、界面活性剤を含有する溶液（試薬）を用いるときは、当該担体に固定化した抗ペリオスチン抗体と界面活性剤との接触時に、当該界面活性剤の濃度が前記の濃度となるよう、当該界面活性剤を当該溶液（試薬）に含有させることが好ましい。
【０１１８】
３．温度及び時間
担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させる場合、その際の温度及び時間は、適宜選択すればよい。
【０１１９】
なお、この接触時の温度は、界面活性剤を含有する溶液が凍結する温度より上の温度であって、適宜適した温度であればよい。
また、この接触時の温度が高すぎると抗ペリオスチン抗体等の成分が変性、失活してしまうので、当該接触時の温度は、関係する成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
この接触時の温度は、２〜４０℃が好ましく、２〜３０℃がより好ましく、２〜２０℃が更に好ましく、２〜１０℃が特に好ましい。
【０１２０】
そして、前記接触の時間は、適宜適した時間接触させればよいが、通常、６時間以上が好ましく、１２時間以上がより好ましく、１８時間以上が特に好ましい。
【０１２１】
なお、この接触時間の上限は特にはない。
但し、強いて挙げるとすると、作業時間が長くなることによりコストが上昇するとの観点に立てば、接触時間は２０日以内とすることが好ましく、１５日以内とすることがより好ましく、１０日以内とすることが特に好ましい。
【０１２２】
４．乾燥
担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させた後、当該抗ペリオスチン抗体を乾燥状態とすることが、抗ペリオスチン抗体固定化担体の運搬等の取扱い上都合が良い。
【０１２３】
当該抗ペリオスチン抗体を乾燥状態とする方法としては、例えば、凍結乾燥、真空乾燥、風を当てての乾燥、又は自然乾燥等を挙げることができるが、自然乾燥が好ましい。
【０１２４】
〔６〕糖
１．糖
【０１２５】
本発明における糖としては、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、又はオリゴ糖等を挙げることができる。
【０１２６】
また、本発明における糖としては、例えば、三炭糖、四炭糖、五炭糖、又は六炭糖等を構成成分とするものを挙げることができる。
【０１２７】
そして、本発明における糖として、より具体的には、例えば、グルコース、ガラクトース、アラビノース、キシロース、エリトロース、フルクトース、リブロース、フコース、マンノース、ラムノース、リボース、キシロース、スクロース（サッカロース）、トレハロース、イソトレハロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、イソマルトース、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、又は乳果オリゴ糖等を挙げることができる。
【０１２８】
本発明における糖としては、二糖が好ましく、スクロース及びトレハロースがより好ましく、スクロースが特に好ましい。
【０１２９】
２．濃度
本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させる際の糖の濃度は、特に限定されないが、当該接触時に、０．１％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。
【０１３０】
なお、当該接触時の糖の好ましい濃度の下限は、より好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以上であり、更に好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは５％（ｗ／ｖ）以上である。
【０１３１】
また、当該接触時の糖の好ましい濃度であるが、上限は特にはないが、コスト等のことを考えると２０％（ｗ／ｖ）迄で十分である。
【０１３２】
なお、当該接触時の糖の好ましい濃度の上限は、より好ましくは１５％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以下である。
【０１３３】
なお、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させる場合、糖を含有する溶液（試薬）を用いるときは、当該担体に固定化した抗ペリオスチン抗体と糖との接触時に、当該糖の濃度が前記の濃度となるよう、当該糖を当該溶液（試薬）に含有させることが好ましい。
【０１３４】
３．温度及び時間
担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させる場合、その際の温度及び時間は、適宜選択すればよい。
【０１３５】
なお、この接触時の温度は、糖を含有する溶液が凍結する温度より上の温度であって、適宜適した温度であればよい。
また、この接触時の温度が高すぎると抗ペリオスチン抗体等の成分が変性、失活してしまうので、当該接触時の温度は、関係する成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
この接触時の温度は、２〜４０℃が好ましく、２〜３０℃がより好ましく、２〜２０℃が更に好ましく、２〜１０℃が特に好ましい。
【０１３６】
そして、前記接触の時間は、適宜適した時間接触させればよいが、通常、６時間以上が好ましく、１２時間以上がより好ましく、１８時間以上が特に好ましい。
なお、この接触時間の上限は特にはない。
但し、強いて挙げるとすると、作業時間が長くなることによりコストが上昇するとの観点に立てば、接触時間は２０日以内とすることが好ましく、１５日以内とすることがより好ましく、１０日以内とすることが特に好ましい。
【０１３７】
４．乾燥
担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させた後、当該抗ペリオスチン抗体を乾燥状態とすることが、抗ペリオスチン抗体固定化担体の運搬等の取扱い上都合が良い。
【０１３８】
当該抗ペリオスチン抗体を乾燥状態とする方法としては、例えば、凍結乾燥、真空乾燥、風を当てての乾燥、又は自然乾燥等を挙げることができるが、自然乾燥が好ましい。
【０１３９】
〔７〕アルギニン又はその塩
１．アルギニンの塩
本発明において、アルギニンとしては、Ｌ−アルギニン又はＤ−アルギニンのいずれでもよい。
また、本発明において、アルギニンの塩としては、例えば、塩酸塩等を挙げることができる。
【０１４０】
２．濃度
本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体にアルギニン又はその塩を接触させる際のアルギニン又はその塩の濃度は、特に限定されないが、当該接触時に、１０ｍＭ以上であることが好ましい。
【０１４１】
なお、当該接触時のアルギニン又はその塩の好ましい濃度の下限は、より好ましくは５０ｍＭ以上であり、更に好ましくは１００ｍＭ以上であり、特に好ましくは２００ｍＭ以上である。
【０１４２】
また、当該接触時のアルギニン又はその塩の好ましい濃度であるが、上限は特にはないが、コスト等のことを考えると８５０ｍＭ迄で十分である。
【０１４３】
なお、当該接触時のアルギニン又はその塩の好ましい濃度の上限は、より好ましくは７００ｍＭ以下であり、特に好ましくは５００ｍＭ以下である。
【０１４４】
なお、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体にアルギニン又はその塩を接触させる場合、アルギニン又はその塩を含有する溶液（試薬）を用いるときは、当該担体に固定化した抗ペリオスチン抗体とアルギニン又はその塩との接触時に、当該アルギニン又はその塩の濃度が前記の濃度となるよう、当該アルギニン又はその塩を当該溶液（試薬）に含有させることが好ましい。
【０１４５】
３．温度及び時間
担体に固定化した抗ペリオスチン抗体にアルギニン又はその塩を接触させる場合、その際の温度及び時間は、適宜選択すればよい。
【０１４６】
なお、この接触時の温度は、アルギニン又はその塩を含有する溶液が凍結する温度より上の温度であって、適宜適した温度であればよい。
また、この接触時の温度が高すぎると抗ペリオスチン抗体等の成分が変性、失活してしまうので、当該接触時の温度は、関係する成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
この接触時の温度は、２〜４０℃が好ましく、２〜３０℃がより好ましく、２〜２０℃が更に好ましく、２〜１０℃が特に好ましい。
【０１４７】
そして、前記接触の時間は、適宜適した時間接触させればよいが、通常、６時間以上が好ましく、１２時間以上がより好ましく、１８時間以上が特に好ましい。
【０１４８】
なお、この接触時間の上限は特にはない。
但し、強いて挙げるとすると、作業時間が長くなることによりコストが上昇するとの観点に立てば、接触時間は２０日以内とすることが好ましく、１５日以内とすることがより好ましく、１０日以内とすることが特に好ましい。
【０１４９】
４．乾燥
担体に固定化した抗ペリオスチン抗体にアルギニン又はその塩を接触させた後、当該抗ペリオスチン抗体を乾燥状態とすることが、抗ペリオスチン抗体固定化担体の運搬等の取扱い上都合が良い。
【０１５０】
当該抗ペリオスチン抗体を乾燥状態とする方法としては、例えば、凍結乾燥、真空乾燥、風を当てての乾燥、又は自然乾燥等を挙げることができるが、自然乾燥が好ましい。
【０１５１】
〔８〕．ペリオスチンの測定試薬
１．総論
本発明のペリオスチンの測定試薬は、前記の抗ペリオスチン抗体固定化担体を含むものである。
【０１５２】
本発明のペリオスチンの測定試薬は、上記の構成により安定化されたものである。
【０１５３】
２．ペリオスチンの測定試薬
本発明のペリオスチンの測定試薬は、前記の抗ペリオスチン抗体固定化担体を含むものであるが、このようなものであれば、特にその測定原理に限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。
【０１５４】
本発明のペリオスチンの測定試薬は、試料に含まれるペリオスチンを抗ペリオスチン抗体との抗原抗体反応を利用して測定する測定試薬である。
【０１５５】
この試料に含まれるペリオスチンを抗ペリオスチン抗体との抗原抗体反応を利用して測定する測定試薬の測定原理としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年発行；国際公開第９８／２３９６３号パンフレット）等を挙げることができる。
【０１５６】
そして、本発明のペリオスチンの測定試薬による測定は、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法をも、適用することができる。
また、本発明のペリオスチンの測定試薬による測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
【０１５７】
本発明のペリオスチンの測定試薬は、二つ以上の測定試薬より構成されるものであってよい。
【０１５８】
なお、本発明のペリオスチンの測定試薬の溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。
【０１５９】
この水系溶媒としては、例えば、水、若しくは生理食塩水等を挙げることができ、又は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕、リン酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。
【０１６０】
この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ５〜ｐＨ１０の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。
【０１６１】
また、本発明のペリオスチンの測定試薬には、抗ペリオスチン抗体固定化担体の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質；カルシウムイオンなどの各種金属イオン；カルシウム塩などの各種塩類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；又は、非特異的反応抑制物質等の１種又は２種以上を適宜含有させてもよい。
【０１６２】
なお、これらを本発明のペリオスチンの測定試薬に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
【０１６３】
なお、本発明のペリオスチンの測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料に含まれるペリオスチンの測定に使用することができる。
また、本発明のペリオスチンの測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料に含まれるペリオスチンの測定に使用することもできる。
【０１６４】
前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、又は校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
【０１６５】
なお、本発明のペリオスチンの測定試薬は、測定試薬キットであることが好ましい。
【０１６６】
３．抗ペリオスチン抗体
本発明のペリオスチンの測定試薬においては、抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体とは別に、上記「〔１〕抗ペリオスチン抗体」の項に記載された抗体を使用することができ、例えば、以下の抗体を使用することができる。
（ｉ）  ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体
（ｉｉ）  ペリオスチンに特異的に結合することができるポリクローナル抗体
（ｉｉｉ）  ペリオスチンに特異的に結合することができるモノクローナル抗体
【０１６７】
なお、本発明のペリオスチンの測定試薬において、例えば、ペリオスチン一分子に二分子の抗体を抗原抗体反応させる場合、これらの抗体のいずれもが抗ペリオスチン抗体である必要がある。
例えば、酵素標識抗体と固定化抗体を用いるＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法の測定試薬においては、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる酵素標識抗体及び固定化抗体のいずれもが、この抗ペリオスチン抗体である必要がある。
なお、この場合、この固定化抗体は、前記の担体に固定化した抗ペリオスチン抗体である。
【０１６８】
ところで、前記の抗ペリオスチン抗体は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを含有してもよい。
【０１６９】
なお、この抗ペリオスチン抗体の詳細については、前記の「〔１〕抗ペリオスチン抗体」の項に記載した通りである。
【０１７０】
４．標識抗体を用いた免疫学的測定方法を測定原理とする測定試薬
本発明のペリオスチンの測定試薬が、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、発光免疫測定法又はイムノクロマトグラフィー法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法、すなわち標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法を測定原理とする場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施する時には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる固定化抗体（担体に固定化した抗ペリオスチン抗体）及び標識抗体のいずれもの抗体が抗ペリオスチン抗体である必要がある。
【０１７１】
標識物質としては、酵素免疫測定法の測定試薬の場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素又はアミラーゼ等を用いることができる。
また、蛍光免疫測定法の測定試薬の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等を用いることができる。
そして、放射免疫測定法の測定試薬の場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。
また、発光免疫測定法の測定試薬においては、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。
また、イムノクロマトグラフィー法の測定試薬の場合には、金コロイド粒子等を用いることができる。
【０１７２】
抗ペリオスチン抗体と酵素等の標識物質との結合法は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗ペリオスチン抗体と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗ペリオスチン抗体と標識物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。
【０１７３】
測定の操作法は公知の方法等（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年発行；北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１  酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年発行）等により行うことができる。
【０１７４】
例えば、抗ペリオスチン抗体固定化担体（担体＝抗ペリオスチン抗体）と試料を反応させ、同時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「担体＝抗ペリオスチン抗体＝ペリオスチン＝標識抗体」の複合体を抗原抗体反応により形成させる。
なお、この抗ペリオスチン抗体固定化担体は、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）〜（３）から選択される安定化物質を接触させる処理を行っておいたものである。
（１）界面活性剤及び糖
（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
【０１７５】
そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「担体＝抗ペリオスチン抗体＝ペリオスチン」を介して担体に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量より試料に含まれていたペリオスチンの量（濃度）のみを測定することができる。
【０１７６】
具体的には、酵素免疫測定法の測定試薬の場合は、例えば抗体に標識した酵素に、その至適条件下で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。
また、蛍光免疫測定法の測定試薬の場合には蛍光物質標識による蛍光強度等を、放射免疫測定法の測定試薬の場合には放射性物質標識による放射線量等を測定する。
そして、発光免疫測定法の測定試薬の場合は発光反応系による発光量等を測定する。
【０１７７】
なお、前記の抗ペリオスチン抗体は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを使用してもよい。
【０１７８】
５．凝集反応法による免疫学的測定方法を測定原理とする測定試薬
本発明のペリオスチンの測定試薬が、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定方法により実施する場合には、すなわち、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法（凝集反応法）を測定原理とする場合には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる抗体が「担体に固定化した抗ペリオスチン抗体」である必要がある。
【０１７９】
なお、前記の凝集反応法による測定試薬においては、溶媒として、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。
【０１８０】
なお、ラテックス比濁法を測定原理とする測定試薬の場合、担体として用いるラテックス粒子の粒径については、特に制限はないものの、ラテックス粒子が測定対象物質（ペリオスチン）を介して結合し、凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝集塊の測定の容易さ等の理由より、ラテックス粒子の粒径は、その平均粒径が、０．０４〜１μｍであることが好ましい。
【０１８１】
また、ラテックス比濁法を測定原理とする測定試薬の場合、抗ペリオスチン抗体を固定化させたラテックス粒子を含ませる濃度については、試料中のペリオスチンの濃度、抗ペリオスチン抗体のラテックス粒子表面上での分布密度、ラテックス粒子の粒径、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概にいうことはできない。
【０１８２】
しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、ラテックス粒子に固定化された「抗ペリオスチン抗体」と試料に含まれていた「ペリオスチン」との抗原抗体反応時（測定反応時）に、「抗ペリオスチン抗体」を固定化させたラテックス粒子の濃度が、反応混合液中において０．００５〜１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の「抗ペリオスチン抗体を固定化させたラテックス粒子」を測定試薬に含ませることが好ましい。
【０１８３】
また、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合、担体として用いる粒子の粒径については、特に制限はないものの、その平均粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．５〜１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。そして、これらの粒子の比重は、１〜１０の範囲内にあることが好ましく、１〜２の範囲内にあることがより好ましい。
【０１８４】
なお、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合の測定に使用する容器としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる、試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を挙げることができる。
これらの容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜を持つ形状であることが好ましい。
【０１８５】
測定の操作法は公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と「担体に固定化した抗ペリオスチン抗体」を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。
また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と「担体に固定化した抗ペリオスチン抗体」を反応させ、凝集の状態を目視的に測定する。
なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。
【０１８６】
測定の操作法の例を以下挙げる。
例えば、まず、本発明の「抗ペリオスチン抗体固定化担体」を含むペリオスチン測定試薬等を調製し、準備する。
なお、この抗ペリオスチン抗体固定化担体は、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）〜（３）から選択される安定化物質を接触させる処理を行っておいたものである。
（１）界面活性剤及び糖
（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
【０１８７】
次に、例えば、「抗ペリオスチン抗体固定化担体」を含むペリオスチン測定試薬と、試料とを混合し、これにより、「抗ペリオスチン抗体固定化担体」の抗ペリオスチン抗体と試料とを接触させる。
【０１８８】
これにより、「抗ペリオスチン抗体固定化担体」の「抗ペリオスチン抗体」と、試料に含まれていた「ペリオスチン」との、抗原抗体反応を行わせる。
【０１８９】
そして、これより生成した、「抗ペリオスチン抗体固定化担体」（抗ペリオスチン抗体＝担体＝抗ペリオスチン抗体）と「ペリオスチン」との複合体凝集物（…〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体＝担体＝抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体＝担体＝抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕…）を測定する。
【０１９０】
この生成した複合体凝集物の測定は、この複合体凝集物が存在する測定反応時の反応混合液の透過光又は散乱光などの吸光度等の測定を、エンドポイント法又はレート法等により行うことにより、実施する。
【０１９１】
そして、試料を測定して得た吸光度等の測定値を、標準物質（ペリオスチンの濃度が既知の試料）を測定して得た吸光度等の測定値と比較して、試料中に含まれていたペリオスチンの濃度（定量値）を算出する。
【０１９２】
なお、透過光又は散乱光などの吸光度等の測定は、透過光を測定しても、又は散乱光を測定してもよく、そして、１波長測定であっても、又は２波長測定（２つの波長による差又は比）であってもよい。
なお、測定波長は、３４０ｎｍから１，０００ｎｍの中から選ばれるのが一般的である。
【０１９３】
なお、本発明におけるペリオスチンの測定は、用手法により行ってもよいし、又は測定装置等の装置を用いて行ってもよい。
測定装置は、汎用自動分析装置であっても、専用の測定装置（専用機）であってもよい。
【０１９４】
また、本発明におけるペリオスチンの測定は、１ステップ法（１試薬法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。
【０１９５】
なお、本発明におけるペリオスチンの測定において、抗ペリオスチン抗体は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを使用してもよい。
【０１９６】
なお、以下、ラテックス比濁法を測定原理とする方法によりペリオスチンの測定を行う場合を例にとって、より具体的に説明を行う。
【０１９７】
（１）  まず、ペリオスチンの測定試薬として、以下のものを調製し、準備する。
第１試薬：緩衝液（水系溶媒）
【０１９８】
第２試薬：本発明の「抗ペリオスチン抗体固定化ラテックス粒子」を含有する緩衝液
なお、この抗ペリオスチン抗体固定化ラテックス粒子は、ラテックス粒子（担体）に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（ａ）〜（ｃ）から選択される安定化物質を接触させる処理を行っておいたものである。
（ａ）界面活性剤及び糖
（ｂ）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
（ｃ）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
【０１９９】
（２）  血清等の試料の一定量と前記の第１試薬の一定量を混合し、一定温度下で一定時間静置する。
なお、試料と第１試薬の混合比率（量比）は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１℃〜３０℃）又は微温（３０℃〜４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい。（例えば、３７℃等）
【０２００】
（３）  一定時間後、前記の試料と第１試薬との混合液に、前記の第２試薬の一定量を添加、混合し、反応混合液として、一定温度下で一定時間静置する。
これにより、「抗ペリオスチン抗体固定化ラテックス粒子」と試料とを接触させる。
なお、第２試薬の添加量は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１℃〜３０℃）又は微温（３０℃〜４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい。（例えば、３７℃等）
そして、前記の静置の時間は、１分間以上、かつ１０分間以下の一定時間であることが好ましく、３分間以上、かつ５分間以下の一定時間であることがより好ましい。
【０２０１】
試料と第１試薬との混合液への第２試薬の添加、混合により、ラテックス粒子に固定化した抗ペリオスチン抗体と、試料に含まれていたペリオスチンとの抗原抗体反応を行わせる。
【０２０２】
そして、この抗原抗体反応により、「…〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体＝ラテックス粒子＝抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕−〔抗ペリオスチン抗体＝ラテックス粒子＝抗ペリオスチン抗体〕−〔ペリオスチン〕…」等の架橋が形成され、ペリオスチンを介した、「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」同士の複合体凝集物が生成する。
【０２０３】
（４）  そして、分析装置又は分光光度計等において、反応混合液に光を照射して、生成したラテックス粒子同士の複合体凝集物により生じるシグナルである適当な波長の透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加を測定することにより、生成した前記複合体凝集物の量、すなわち、試料に含まれていたペリオスチンの量を求める。
【０２０４】
（５）  そして、「試料の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値〕」と、「標準液又は標準血清等の標準物質〔濃度既知のペリオスチンを含む試料〕の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値〕」とを比較することにより、測定を行った試料に含まれるペリオスチンの量（濃度）の算出を行う。
【０２０５】
〔９〕．試料
本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチンの測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体の安定化方法における試料としては、血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、涙液、鼻汁、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、糞便、腹水若しくは羊水などの体液；あるいは血管若しくは肝臓などの臓器、組織又は細胞などの抽出液等、ペリオスチンが含まれる可能性のある生体試料等の試料であれば対象となる。
【０２０６】
なお、測定に用いる試料の形態は、液体であることが好ましいので、もし試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の処理を既知の方法に従って行い、液体試料としてもよい。
【０２０７】
また、必要に応じて、試料は濃縮処理を行ってもよい。
【０２０８】
また、試料は、その測定の前に、希釈液を添加することにより希釈処理を行ってもよい。
例えば、試料を抗ペリオスチン抗体固定化担体と接触させ、結合させる前に、試料に希釈液を添加することにより希釈処理を行ってもよい。
この希釈液として、各種水系溶媒を用いることができる。
例えば、水、生理食塩水又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等の水系溶媒を用いることができる。
なお、この緩衝液のｐＨについては、ｐＨ５〜ｐＨ１０の範囲にあることが好ましい。
【０２０９】
また、試料が血液（全血）である場合、この全血試料を、水又は界面活性剤を含有する水系溶媒等の低張液と混合し、赤血球を破裂させる処理を行うことが、その後の測定を支障なく行う上で、好ましい。
【０２１０】
〔１０〕．測定対象物質
本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチンの測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体の安定化方法における測定対象物質はペリオスチンである。
【０２１１】
この本発明における測定対象物質としてのペリオスチンとしては、特に限定はなく、ヒト又はウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス若しくはラットなどの哺乳動物又はニワトリなどの鳥類等由来のペリオスチン等を挙げることができる。
【０２１２】
この測定対象物質としてのペリオスチンとしては、ヒトのペリオスチンが特に好ましい。
【０２１３】
〔１１〕．抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法
本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法は、抗ペリオスチン抗体を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法であって、この担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）〜（３）から選択される安定化物質を接触させたことを特徴とするものである。
（１）界面活性剤及び糖
（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
【０２１４】
本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法は、上記の構成により、抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体を安定化することができるものである。
【０２１５】
なお、本発明における抗ペリオスチン抗体、抗ペリオスチン抗体固定化担体、糖、界面活性剤、アルギニン及びその接触方法等の詳細は、前記の通りである。
【実施例】
【０２１６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【０２１７】
〔実施例１〕（本発明の効果の確認−１）
ヒト血清中のペリオスチンの測定を行い、本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチンの測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法の効果を確かめた。【０２１８】
１．ペリオスチンの調製
ペリオスチン（ヌクレオチド配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮｕｍｂｅｒＤ１３６６６のヌクレオチド配列、アミノ酸配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮｕｍｂｅｒＢＡＡ０２８３７のアミノ酸配列）にＶ５／Ｈｉｓタグを付加させたリコンビナントペリオスチンタンパク質を昆虫細胞であるＳ２細胞において発現させた上で精製した。【０２１９】
具体的には、Ｓ２細胞の形質転換体は次のように調製した。
ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）にペリオスチンの上記部分をコードするｃＤＮＡを挿入して、これをｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ−Ｖ５−ＨｉｓＡとした。【０２２０】
次に、Ｓ２細胞にこのｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ−Ｖ５−ＨｉｓＡ及びハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドであるｐＡｃＨｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を公知の方法で共導入し、形質転換した。【０２２１】
次に、ハイグロマイシンにより形質転換体を選択し、安定形質転換体を得た。
そして、Ｓ２細胞の形質転換体では、カルボキシ末端にＶ５／Ｈｉｓタグの結合したペリオスチンを発現させた。【０２２２】
そして、このＣ末端に６個のヒスチジンが結合したＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の精製は次のように行った。
まず、ペリオスチン遺伝子安定形質転換体Ｓ２細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導した。
これにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌された。【０２２３】
次に、この培養上清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕に透析した後、ニッケルレジン（Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ、Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ国Ｈｉｌｄｅｎ）と混合して、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させた。
次に、レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出することにより、ペリオスチンを取得した。
なお、作成したプラスミドのＤＮＡの配列を確認し、組み込まれた配列が目的通りのものであることを確認した。【０２２４】
２．抗ペリオスチンモノクローナル抗体
〔１〕抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製−１回目
以下の手順により、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製を行った。（１回目）【０２２５】
（１）  前記１で調製したペリオスチン溶液１容量に対して、化学合成アジュバントとしてのＴｉｔｅｒ  Ｍａｘ  Ｇｏｌｄ（フナコシ社、日本国東京都）を１容量の割合で混合した。【０２２６】
（２）  次に、雌ラットの足蹠に免疫原として、１０〜５０μｇの前記のペリオスチン溶液とＴｉｔｅｒ  Ｍａｘ  Ｇｏｌｄとの混合物を皮下注射し、１０日〜２週間後、再度ラットの足蹠に免疫原として、１０〜５０μｇの前記のペリオスチン溶液とＴｉｔｅｒ  Ｍａｘ  Ｇｏｌｄとの混合物を皮下注射した。
なお、ここで、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット〔雌、６〜８週齢〕（日本チャールズリバー社、日本国神奈川県横浜市）を用いた。【０２２７】
（３）  最終免疫より３〜４日後に、免疫したラットの膝窩、鼠径、腸骨リンパ節内の細胞と、ミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ細胞）を１対１から１０対１の割合で混合し、一般的な方法でポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００、Ｒｏｃｈｅ社、スイス国）を加えて細胞融合させ、生育したハイブリドーマコロニーを選別した。【０２２８】
具体的には、細胞融合は次のように行った。
混合した前記リンパ節細胞とミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ細胞）を遠心して上清を除き、室温でポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００、Ｒｏｃｈｅ社、スイス国）１ｍＬに１分間かけて懸濁した後、３７℃で１分間撹拌した。
血清不含培地１ｍＬを１分間かけて加え、その後、血清不含培地１０ｍＬを１分間かけて加えた。
細胞を数回洗浄した後、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン含有培地に懸濁して９６穴マイクロタイタープレートに分注して、３７℃において５％ＣＯ２存在下で培養した。【０２２９】
生育したモノクローナル抗体産生細胞株（融合細胞株）の選別の方法としては、細胞融合から７〜１４日後、免疫原に使用した前記のペリオスチンを固定化し、融合細胞培養上清を一次抗体としたＥＬＩＳＡ法の系にて行った。【０２３０】
このＥＬＩＳＡ法は具体的には、次のように行った。
１μｇ／ｍＬの前記のペリオスチンを９６穴マイクロタイタープレートに分注し、数時間固定化させた。
この固定化溶液を洗浄した後、融合細胞培養上清を各ウェルに加え、１時間室温にて静置した。【０２３１】
融合細胞培養上清を洗浄して、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）を加え１時間室温に静置した。【０２３２】
この二次抗体を洗浄後、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ社、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、米国）を加えて発色させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。【０２３３】
生育した融合細胞株の中から一つのクローンを確立し、ＳＳ１８Ａ株と命名した。【０２３４】
（４）  この選別したモノクローナル抗体産生細胞株からＩｇＧを次のように精製した。
このモノクローナル抗体産生細胞株を、ＧＩＴ培地（日本製薬社、日本国東京都）を用いてＣＯ２インキュベータ内３７℃で培養した。【０２３５】
培養後、上清中のＩｇＧをプロテインＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）に結合させた。
結合させたＩｇＧを、５０ｍＭクエン酸水溶液（ｐＨ２．６）で溶出した。【０２３６】
溶出液４容量に対して、１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕１容量を添加し、精製ＩｇＧとして、ラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体を前記のモノクローナル抗体産生細胞株より取得した。【０２３７】
すなわち、ＳＳ１８Ａ株のモノクローナル抗体産生細胞株からラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体（以下、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」という）を得ることができた。【０２３８】
〔２〕抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製−２回目
前記〔１〕とは別の時に、前記〔１〕の（１）〜（４）の記載の通りに操作を行い、再度、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製を行った。（２回目）【０２３９】
その結果、生育した融合細胞株の中から一つのクローンを確立し、ＳＳ１７Ｂ株と命名した。【０２４０】
そして、ＳＳ１７Ｂ株のモノクローナル抗体産生細胞株からラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体（以下、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ）」という）を得ることができた。【０２４１】
３．試料
５種類のヒトの血清試料を各々試料として用いた。
これらをそれぞれ、血清１、血清２、血清３、血清４及び血清５とした。【０２４２】
４．測定試薬
〔１〕抗体固定化担体試薬
５種類の抗体固定化担体試薬を、下記の通り調製した。
［１］抗体固定化担体試薬（対照１）
（１）  前記２の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８〜２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。【０２４３】
（２）  次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。【０２４４】
（３）  次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で３回洗浄した後、この液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（対照１）を調製した。【０２４５】
［２］抗体固定化担体試薬（対照２）
（１）  前記２の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８〜２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。【０２４６】
（２）  次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。【０２４７】
（３）  次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルよりブロッキング液を吸い出し、除去した。【０２４８】
（４）  次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］の３００μＬを注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。【０２４９】
（５）  次に、前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェル中の溶液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（対照２）を調製した。【０２５０】
［３］抗体固定化担体試薬（本発明１）
前記［２］の（４）における０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を、０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］及び１０％（ｗ／ｖ）のスクロースを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液に替えること以外は、前記［２］の（１）〜（５）の通りに操作を行い、抗体固定化担体試薬（本発明１）を調製した。【０２５１】
［４］抗体固定化担体試薬（本発明２）
前記［２］の（４）における０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を、０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］及び５００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液に替えること以外は、前記［２］の（１）〜（５）の通りに操作を行い、抗体固定化担体試薬（本発明２）を調製した。【０２５２】
［５］抗体固定化担体試薬（本発明３）
前記［２］の（４）における０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を、０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース及び５００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液に替えること以外は、前記［２］の（１）〜（５）の通りに操作を行い、抗体固定化担体試薬（本発明３）を調製した。【０２５３】
〔２〕標識抗体試薬
前記２の〔２〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ）」にパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を公知の方法により結合させてＰＯＤ標識抗ペリオスチンモノクローナル抗体を調製した。
これを標識抗体試薬とした。【０２５４】
５．抗体固定化担体試薬の保存
〔１〕２〜８℃保存
前記４の〔１〕の［１］〜［５］のそれぞれの抗体固定化担体試薬について２〜８℃で１週間保存した。
〔２〕３７℃保存
前記４の〔１〕の［１］〜［５］のそれぞれの抗体固定化担体試薬について３７℃で１週間保存した。【０２５５】
６．測定
（１）  前記３の試料それぞれについて、その１００μＬを前記５の〔１〕の２〜８℃で１週間保存した各々の抗体固定化担体試薬のマイクロタイタープレートのウェルに注入し、２５℃にて１８〜２４時間静置し、反応を行わせた。
これにより、試料に含まれるペリオスチンを、前記のウェルに固定化した「抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）」に結合させた。【０２５６】
（２）  次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で５回洗浄した。【０２５７】
（３）  前記４の〔２〕の標識抗体試薬を、０．５％のカゼイン及び１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）で５０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、その１００μＬを前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて９０分間静置し、反応を行わせた。【０２５８】
これにより、前記の固定化した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」に結合しているペリオスチンに、ＰＯＤを標識した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ）」を結合させた。【０２５９】
（４）  次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で５回洗浄した。【０２６０】
（５）  次に、ＰＯＤの基質液〔０．８ｍＭの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、２．５ｍＭの過酸化水素、及び３０ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．９）〕の１００μＬを前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて１０分間静置し、反応を行わせ、発色させた。【０２６１】
（６）  その後、前記（５）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．７Ｎの硫酸を注入し、この反応を停止させた。【０２６２】
（７）  次に、分光光度計を用いて、前記（６）のマイクロタイタープレートの各ウェルについて、４５０ｎｍ（主波長）及び５５０ｎｍ（副波長）それぞれにおける吸光度の測定を行った。
そして、測定した４５０ｎｍ（主波長）における吸光度から５５０ｎｍ（副波長）における吸光度を差し引いた吸光度差の値を求めた。【０２６３】
なお、この吸光度差の値は、試料に含まれていたペリオスチンの濃度に基づくものである。【０２６４】
（８）  前記１で調製したペリオスチンを試料希釈液〔０．５％のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕で希釈して、ペリオスチンの希釈系列を作成し、これらを標準試料とした。【０２６５】
次に、これらの標準試料のそれぞれについて、前記（１）〜（７）の記載の通りに測定を行い、前記の抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）における「ペリオスチン濃度−吸光度差」の標準曲線（検量線）を作成した。【０２６６】
（９）  前記（７）において測定したマイクロタイタープレートの各ウェルの吸光度差の値を、前記（８）で作成した「ペリオスチン濃度−吸光度差」の標準曲線（検量線）に当てはめ、各試料に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。【０２６７】
（１０）  また、前記（１）における「２〜８℃で１週間保存した各々の抗体固定化担体試薬のマイクロタイタープレート」に替えて、前記５の〔２〕の「３７℃で１週間保存した各々の抗体固定化担体試薬のマイクロタイタープレート」を用いること以外は、前記（１）〜（９）の記載の通りに操作を行い、各試料に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。【０２６８】
７．測定結果
前記６における試料に含まれていたペリオスチンの測定結果を表１に示した。【０２６９】
【表１】
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【０２７０】
この表において、左側より、２〜８℃で保存した抗体固定化担体試薬を使用した場合のペリオスチン測定値（ｎｇ／ｍＬ）、３７℃で保存した抗体固定化担体試薬を使用した場合のペリオスチン測定値（ｎｇ／ｍＬ）、そして、「３７℃で保存した抗体固定化担体試薬を使用した場合のペリオスチン測定値」を「２〜８℃で保存した抗体固定化担体試薬を使用した場合のペリオスチン測定値」で除したときの百分率（％）［以下、「３７℃／２〜８℃比率」という］をそれぞれ示す。【０２７１】
８．考察
本実施例の測定結果である、表１の「３７℃／２〜８℃比率」より、次のことが分かる。【０２７２】
（１）  抗体固定化担体試薬（対照１）の使用時に比べて、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させた抗体固定化担体試薬（対照２）の使用時は、「３７℃／２〜８℃比率」は下がっている。【０２７３】
（２）  抗体固定化担体試薬（対照１）の使用時に比べて、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤及び糖を接触させた抗体固定化担体試薬（本発明１）の使用時は、「３７℃／２〜８℃比率」は大幅に上がっている。【０２７４】
（３）  抗体固定化担体試薬（対照１）の使用時に比べて、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤及びアルギニン塩酸塩を接触させた抗体固定化担体試薬（本発明２）の使用時は、「３７℃／２〜８℃比率」は大幅に上がっている。【０２７５】
（４）  抗体固定化担体試薬（対照１）の使用時に比べて、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤、糖及びアルギニン塩酸塩を接触させた抗体固定化担体試薬（本発明３）の使用時は、「３７℃／２〜８℃比率」は大幅に上がっている。【０２７６】
以上のことより、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤及び糖を接触させた場合、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤及びアルギニン塩酸塩を接触させた場合、並びに担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤、糖及びアルギニン塩酸塩を接触させた場合は、抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体が安定化されることが確かめられた。【０２７７】
〔実施例２〕（本発明の効果の確認−２）
ヒト血清中のペリオスチンの測定を行い、本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチンの測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法の効果を再度確かめた。【０２７８】
１．試料
１種類のヒトの血清試料を試料として用いた。【０２７９】
２．測定試薬
〔１〕抗体固定化担体試薬
２種類の抗体固定化担体試薬を、下記の通り調製した。
［１］抗体固定化担体試薬（対照）
（１）  前記実施例１の２の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８〜２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固定化した。【０２８０】
（２）  次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。【０２８１】
（３）  次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で３回洗浄した後、この液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（対照）を調製した。【０２８２】
［２］抗体固定化担体試薬（本発明）
（１）  前記実施例１の２の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８〜２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。【０２８３】
（２）  次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。【０２８４】
（３）  次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルよりブロッキング液を吸い出し、除去した。【０２８５】
（４）  次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース及び５００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液の３００μＬを注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。【０２８６】
（５）  次に、前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェル中の溶液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（本発明）を調製した。【０２８７】
〔２〕標識抗体試薬
前記実施例１の２の〔２〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ）」にパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を公知の方法により結合させてＰＯＤ標識抗ペリオスチンモノクローナル抗体を調製した。
これを標識抗体試薬とした。【０２８８】
３．抗体固定化担体試薬の保存
前記２の〔１〕の［１］及び［２］のそれぞれの抗体固定化担体試薬について５℃で１２０日間保存した。【０２８９】
４．測定
前記２の〔１〕の［１］の抗体固定化担体試薬（対照）については、５℃保存１９日目に以下の測定を行った。
また、前記２の〔１〕の［２］の抗体固定化担体試薬（本発明）については、５℃保存１９日目、７７日目及び１２０日目にそれぞれ以下の測定を行った。【０２９０】
（１）  前記１の試料について、その１００μＬを前記２の〔１〕の［１］の抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレートのウェルに注入し、２５℃にて１８〜２４時間静置し、反応を行わせた。
これにより、試料に含まれるペリオスチンを、前記のウェルに固定化した「抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）」に結合させた。【０２９１】
（２）  次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で５回洗浄した。【０２９２】
（３）  前記２の〔２〕の標識抗体試薬を、０．５％のカゼイン及び１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）で５０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、その１００μＬを前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて９０分間静置し、反応を行わせた。【０２９３】
これにより、前記の固定化した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」に結合しているペリオスチンに、ＰＯＤを標識した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ）」を結合させた。【０２９４】
（４）  次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で５回洗浄した。【０２９５】
（５）  次に、ＰＯＤの基質液〔０．８ｍＭの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、２．５ｍＭの過酸化水素、及び３０ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．９）〕の１００μＬを前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて１０分間静置し、反応を行わせ、発色させた。【０２９６】
（６）  その後、前記（５）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．７Ｎの硫酸を注入し、この反応を停止させた。【０２９７】
（７）  次に、分光光度計を用いて、前記（６）のマイクロタイタープレートの各ウェルについて、４５０ｎｍ（主波長）及び５５０ｎｍ（副波長）それぞれにおける吸光度の測定を行った。
そして、測定した４５０ｎｍ（主波長）における吸光度から５５０ｎｍ（副波長）における吸光度を差し引いた吸光度差の値を求めた。【０２９８】
なお、この吸光度差の値は、試料に含まれていたペリオスチンの濃度に基づくものである。【０２９９】
（８）  前記実施例１の１で調製したペリオスチンを試料希釈液〔０．５％のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕で希釈して、ペリオスチンの希釈系列を作成し、これらを標準試料とした。【０３００】
次に、これらの標準試料のそれぞれについて、前記（１）〜（７）の記載の通りに測定を行い、前記の抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）における「ペリオスチン濃度−吸光度差」の標準曲線（検量線）を作成した。【０３０１】
（９）  前記（７）において測定したマイクロタイタープレートの各ウェルの吸光度差の値を、前記（８）で作成した「ペリオスチン濃度−吸光度差」の標準曲線（検量線）に当てはめ、各試料に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。【０３０２】
（１０）  また、前記（１）における「抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレート」に替えて、前記２の〔１〕の［２］の「抗体固定化担体試薬（本発明）のマイクロタイタープレート」を用いること以外は、前記（１）〜（９）の記載の通りに操作を行い、試料に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。【０３０３】
５．測定結果
前記４における試料に含まれていたペリオスチンの測定結果を表２に示した。【０３０４】
【表２】
2018194134.tif 000003
【０３０５】
なお、この表において、（カッコ）内の数値は、５℃保存後のペリオスチン測定値を保存開始時のペリオスチン測定値で除したときの百分率（％）をそれぞれ示す。【０３０６】
６．考察
この表より、「抗体固定化担体試薬（本発明）のマイクロタイタープレート」を用いる本発明の場合は、５℃保存１２０日目迄、ペリオスチンの測定値に変化がないことが分かる。【０３０７】
これに対して、「抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレート」を用いる対照の場合は、５℃保存１９日目で、ペリオスチンの測定値が大幅に低下してしまっていることが分かる。【０３０８】
以上のことより、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤、糖及びアルギニンを接触させた場合は、抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体が安定化されることが再度確かめられた。【０３０９】
〔実施例３〕（本発明の効果の確認−３）
ヒト血清中のペリオスチンの測定を行い、本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチンの測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法の効果を再度確かめた。【０３１０】
１．抗ペリオスチンモノクローナル抗体
〔１〕抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製−３回目
前記実施例１の２とは別の時に、前記実施例１の２の〔１〕の（１）〜（４）の記載の通りに操作を行い、再度、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製を行った。（３回目）【０３１１】
その結果、生育した融合細胞株の中から一つのクローンを確立し、ＳＳ２０Ａ株と命名した。【０３１２】
そして、ＳＳ２０Ａ株のモノクローナル抗体産生細胞株からマウス抗ペリオスチンモノクローナル抗体（以下、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ２０Ａ）」という）を得ることができた。【０３１３】
〔２〕抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製−４回目
前記実施例１の２及び前記〔１〕とは別の時に、前記実施例１の２の〔１〕の（１）〜（４）の記載の通りに操作を行い、再度、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製を行った。（４回目）【０３１４】
その結果、生育した融合細胞株の中から一つのクローンを確立し、ＳＳ１９Ｄ株と命名した。【０３１５】
そして、ＳＳ１９Ｄ株のモノクローナル抗体産生細胞株からマウス抗ペリオスチンモノクローナル抗体（以下、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１９Ｄ）」という）を得ることができた。【０３１６】
２．試料
１種類のヒトの血清試料を試料として用いた。【０３１７】
３．測定試薬
〔１〕抗体固定化担体試薬
２種類の抗体固定化担体試薬を、下記の通り調製した。
［１］抗体固定化担体試薬（対照）
（１）  前記１の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ２０Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８〜２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ２０Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固定化した。【０３１８】
（２）  次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。【０３１９】
（３）  次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で３回洗浄した後、この液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（対照）を調製した。【０３２０】
［２］抗体固定化担体試薬（本発明）
（１）  前記１の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ２０Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８〜２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ２０Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。【０３２１】
（２）  次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。【０３２２】
（３）  次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルよりブロッキング液を吸い出し、除去した。【０３２３】
（４）  次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース及び５００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液の３００μＬを注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。【０３２４】
（５）  次に、前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェル中の溶液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（本発明）を調製した。【０３２５】
〔２〕標識抗体試薬
前記１の〔２〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１９Ｄ）」にパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を公知の方法により結合させてＰＯＤ標識抗ペリオスチンモノクローナル抗体を調製した。
これを標識抗体試薬とした。【０３２６】
３．抗体固定化担体試薬の保存
前記３の〔１〕の［１］及び［２］のそれぞれの抗体固定化担体試薬について５℃及び３０℃各々の温度で１５０日間保存した。【０３２７】
４．測定
前記３の〔１〕の［１］の抗体固定化担体試薬（対照）については、保存開始日、保存３０日目及び１５０日目にそれぞれ以下の測定を行った。
また、前記３の〔１〕の［２］の抗体固定化担体試薬（本発明）については、保存開始日、保存３０日目、５５日目及び１５０日目にそれぞれ以下の測定を行った。【０３２８】
（１）  前記２の試料について、その１００μＬを前記３の〔１〕の［１］の抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレートのウェルに注入し、２５℃にて１８〜２４時間静置し、反応を行わせた。
これにより、試料に含まれるペリオスチンを、前記のウェルに固定化した「抗ペリオスチン抗体（ＳＳ２０Ａ）」に結合させた。【０３２９】
（２）  次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で５回洗浄した。【０３３０】
（３）  前記３の〔２〕の標識抗体試薬を、０．５％のカゼイン及び１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）で５０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、その１００μＬを前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて９０分間静置し、反応を行わせた。【０３３１】
これにより、前記の固定化した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ２０Ａ）」に結合しているペリオスチンに、ＰＯＤを標識した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１９Ｄ）」を結合させた。【０３３２】
（４）  次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で５回洗浄した。【０３３３】
（５）  次に、ＰＯＤの基質液〔０．８ｍＭの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、２．５ｍＭの過酸化水素、及び３０ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．９）〕の１００μＬを前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて１０分間静置し、反応を行わせ、発色させた。【０３３４】
（６）  その後、前記（５）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．７Ｎの硫酸を注入し、この反応を停止させた。【０３３５】
（７）  次に、分光光度計を用いて、前記（６）のマイクロタイタープレートの各ウェルについて、４５０ｎｍ（主波長）及び５５０ｎｍ（副波長）それぞれにおける吸光度の測定を行った。
そして、測定した４５０ｎｍ（主波長）における吸光度から５５０ｎｍ（副波長）における吸光度を差し引いた吸光度差の値を求めた。【０３３６】
なお、この吸光度差の値は、試料に含まれていたペリオスチンの濃度に基づくものである。【０３３７】
（８）  前記実施例１の１で調製したペリオスチンを試料希釈液〔０．５％のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕で希釈して、ペリオスチンの希釈系列を作成し、これらを標準試料とした。【０３３８】
次に、これらの標準試料のそれぞれについて、前記（１）〜（７）の記載の通りに測定を行い、前記の抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）における「ペリオスチン濃度−吸光度差」の標準曲線（検量線）を作成した。【０３３９】
（９）  前記（７）において測定したマイクロタイタープレートの各ウェルの吸光度差の値を、前記（８）で作成した「ペリオスチン濃度−吸光度差」の標準曲線（検量線）に当てはめ、各試料に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。【０３４０】
（１０）  また、前記（１）における「抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレート」に替えて、前記３の〔１〕の［２］の「抗体固定化担体試薬（本発明）のマイクロタイタープレート」を用いること以外は、前記（１）〜（９）の記載の通りに操作を行い、試料に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。【０３４１】
５．測定結果
前記４における試料に含まれていたペリオスチンの測定結果を表３に示した。【０３４２】
【表３】
2018194134.tif 000004
【０３４３】
なお、この表において、（カッコ）内の数値は、保存後のペリオスチン測定値を保存開始日のペリオスチン測定値で除したときの百分率（％）をそれぞれ示す。【０３４４】
６．考察
この表より、「抗体固定化担体試薬（本発明）のマイクロタイタープレート」を用いる本発明の場合は、５℃保存１５０日目迄、ペリオスチンの測定値にほとんど変化がないことが分かる。【０３４５】
また、この表より、「抗体固定化担体試薬（本発明）のマイクロタイタープレート」を用いる本発明の場合は、３０℃保存１５０日目迄、ペリオスチンの測定値の低下を抑制できていることが分かる。【０３４６】
これに対して、「抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレート」を用いる対照の場合は、５℃保存時及び３０℃保存時とも１５０日目で、ペリオスチンの測定値が大幅に低下してしまっていることが分かる。【０３４７】
以上のことより、本発明の場合は、抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体が安定化されることが再度確かめられた。【０３４８】
〔実施例４〕（本発明の効果の確認−４）
本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチンの測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法の効果を再度確かめた。【０３４９】
１．測定試薬
２種類の抗体固定化担体試薬を、下記の通り調製した。
［１］抗体固定化担体試薬（対照）
（１）  前記実施例１の２の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８〜２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固定化した。【０３５０】
（２）  次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。【０３５１】
（３）  次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルよりブロッキング液を吸い出し、除去した。【０３５２】
（４）  次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース及び５００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液の３００μＬを注入し、４℃で２４時間静置した。【０３５３】
（５）  次に、前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェル中の溶液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（対照１）を調製した。【０３５４】
［２］抗体固定化担体試薬（本発明）
（１）  前記実施例１の２の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８〜２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。【０３５５】
（２）  次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。【０３５６】
（３）  次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルよりブロッキング液を吸い出し、除去した。【０３５７】
（４）  次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース及び５００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液の３００μＬを注入し、４℃で１８〜２４時間静置した。【０３５８】
（５）  次に、前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェル中の溶液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（本発明）を調製した。【０３５９】
２．抗体固定化担体試薬の乾燥
前記１の［１］及び［２］のそれぞれの抗体固定化担体試薬について、室温で２４時間、真空乾燥により乾燥処理を行った。【０３６０】
３．観察
前記１の［１］及び［２］のそれぞれの抗体固定化担体試薬について、前記２において乾燥処理を行った後のマイクロタイタープレートのウェルを観察した。【０３６１】
４．測定結果
前記３における観察結果であるそれぞれの画像を図１に示した。【０３６２】
５．考察
本実施例の測定結果である図１より、「抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレート」のウェルにおいては乾燥処理後に抗体固定化層が結晶化により凸状となってしまっているのに対して、「抗体固定化担体試薬（本発明）のマイクロタイタープレート」のウェルにおいては乾燥処理後に抗体固定化層が結晶化せず平滑であることが分かる。【０３６３】
以上のことより、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させた場合は、抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体が結晶化されず平滑に固定化されることが確かめられた。
【図１】
2018194134.tif 000005
【国際調査報告】
2018194134.tif 000006
2018194134.tif 000007
2018194134.tif 000008
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