(57)【要約】  土壌汚染や毒性が低く、抵抗性誘導効果および害虫忌避効果に優れた害虫忌避剤、およびその製造方法を提供する。脂肪酸をプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含む害虫忌避剤、および脂肪酸をプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含む、脂肪酸代謝物を含む害虫忌避剤の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸をプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含む害虫忌避剤。
【請求項２】
前記害虫忌避剤が、植物における害虫忌避物質分泌促進剤である請求項１記載の害虫忌避剤。
【請求項３】
前記脂肪酸が、炭素数４〜３０の脂肪酸である請求項１または２に記載の害虫忌避剤。
【請求項４】
前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である請求項１〜３のいずれか１項に記載の害虫忌避剤。
【請求項５】
前記代謝が、０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下での代謝である請求項１〜４のいずれか１項に記載の害虫忌避剤。
【請求項６】
前記代謝が、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下での代謝である請求項１〜５のいずれか１項に記載の害虫忌避剤。
【請求項７】
前記プロテオバクテリアが、前培養されたプロテオバクテリアである請求項１〜６のいずれか１項に記載の害虫忌避剤。
【請求項８】
前記前培養されたプロテオバクテリアが、菌数１×１０8〜９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌに前培養されたプロテオバクテリアである請求項７記載の害虫忌避剤。
【請求項９】
バイオサーファクタントを含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の害虫忌避剤。
【請求項１０】
前記代謝が、２０〜３０℃の条件下での代謝である請求項１〜９のいずれか１項に記載の害虫忌避剤。
【請求項１１】
植物の茎葉または根に接触されるように用いられる請求項１〜１０のいずれか１項に記載の害虫忌避剤。
【請求項１２】
脂肪酸をプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含む、脂肪酸代謝物を含む害虫忌避剤の製造方法。
【請求項１３】
前記害虫忌避剤が、植物における害虫忌避物質分泌促進剤である請求項１２記載の害虫忌避剤の製造方法。
【請求項１４】
前記脂肪酸が、炭素数４〜３０の脂肪酸である請求項１２または１３に記載の害虫忌避剤の製造方法。
【請求項１５】
前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の害虫忌避剤の製造方法。
【請求項１６】
前記脂肪酸代謝工程を、０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下で実施する請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の害虫忌避剤の製造方法。
【請求項１７】
前記脂肪酸代謝工程を、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下で実施する請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の害虫忌避剤の製造方法。
【請求項１８】
前記プロテオバクテリアが、前培養されたプロテオバクテリアである請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の害虫忌避剤の製造方法。
【請求項１９】
前記前培養されたプロテオバクテリアが、菌数１×１０8〜９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌに前培養されたプロテオバクテリアである請求項１８記載の害虫忌避剤の製造方法。
【請求項２０】
バイオサーファクタントを含む害虫忌避剤の製造方法である請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の害虫忌避剤の製造方法。
【請求項２１】
前記脂肪酸代謝工程を、２０〜３０℃の条件下で実施する請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の害虫忌避剤の製造方法。
【請求項２２】
植物に施用される害虫忌避剤の製造方法である請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の害虫忌避剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、害虫忌避剤および害虫忌避剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、植物害虫に対し殺虫を目的として、除虫菊の有効成分であるピレトリン、そしてピレトリンの誘導体由来のアレスリンなどの合成ピレスロイドなどをはじめとした薬剤が使用されてきた。ピレスロイド類は、哺乳類や鳥類に対する毒性は低い一方、昆虫類の神経細胞に強力に作用して神経毒をもたらし殺虫する。また、近年では昆虫類の神経伝達物質アセチルコリン受容体に結合することで殺虫するネオニコチノイド系殺虫剤も広範囲に殺虫剤として使用されている。【０００３】
しかしながら、このような虫にとって一般的に毒となる成分を用いて直接殺虫する殺虫方法では、受粉などに必要な有益昆虫や天敵虫も一様に殺虫してしまうという問題がある。また、ネオニコチノイドのように植物への浸透移行性などにより残効が長い殺虫剤では、有益昆虫が長期にわたって影響を受けてしまう恐れもあり、生態系の乱れが懸念される。さらに、過多の農薬散布による殺虫剤耐性虫の発生も問題となっている。土壌汚染などの環境への負荷の観点からも、化学合成農薬の使用量の削減が望まれている。【０００４】
そこで、害虫を忌避する方法や化学合成農薬を使用せずに天然物質に由来する薬剤を用いて植物を病害虫から防除する方法などの対策が報告されている。天然物質に由来する薬剤としては、例えば、特許文献１には、微生物バイオサーファクタントが記載されている。【０００５】
また、虫に対する毒ではなく、オレイン酸や脂肪酸エステル、合成でんぷんなどを有効成分とした気門封鎖系の殺虫剤を使用する方法も知られている。気門封鎖型殺虫剤は、害虫の気門を塞ぎ、窒息させることで殺虫効果を発揮する。大型の有益昆虫類を殺虫するリスクや薬剤耐性虫を発生させるリスクが少ないと考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００８−５０１０３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１には、バイオサーファクタントとして、ラムノリピドを含有させた発酵ブロス濾液を用いた病害虫を防除する方法が開示されており、これをイエバエや線虫を防除するための殺虫剤として使用することが記載されている。しかしながら、特許文献１記載の病害虫を防除する方法では、病害虫を死滅させるために直接薬剤を適用しなければならないため、病害虫が発生するごとに薬剤を施用する必要性がある。【０００８】
従来の気門封鎖型殺虫剤もまた、植物害虫に対して直接噴霧しなければならないため、発生の度に噴霧する必要がある。とりわけ、世代交代の早い高温期等においては、頻繁に噴霧しなければならない。【０００９】
また、従来の害虫を忌避する方法は、薬剤が徐々に揮散することで効力を発揮するものであって、害虫を忌避させる範囲を広くできる利点を有しているが、揮発によって薬剤が消失していくため、効果の持続性が短いという問題点がある。【００１０】
過酸化脂質をはじめ脂肪酸酸化物が抗菌作用を示すことは知られている。また、リノレン酸などの脂肪酸を原料にし、植物体内でジャスモン酸などが生合成されることも知られている。しかしながら、脂肪酸が微生物代謝によって酸化された脂肪酸代謝物に植物における忌避効果を誘導する作用があることは知られていない。【００１１】
本発明は、前記課題に鑑み、土壌汚染や毒性が低く、植物における忌避効果を長期的に発揮することのできる害虫忌避剤、およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、脂肪酸をプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含む害虫忌避剤に関する。【００１３】
前記害虫忌避剤が、植物における害虫忌避物質分泌促進剤である害虫忌避剤が好ましい。【００１４】
前記脂肪酸が、炭素数４〜３０の脂肪酸である害虫忌避剤が好ましい。【００１５】
前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である害虫忌避剤が好ましい。【００１６】
前記代謝が、０．１〜８ｍｇ／ｌ（リットル）の溶存酸素濃度環境下での代謝である害虫忌避剤が好ましい。【００１７】
前記代謝が、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下での代謝である害虫忌避剤が好ましい。【００１８】
前記プロテオバクテリアが、前培養されたプロテオバクテリアである害虫忌避剤が好ましい。【００１９】
前記前培養されたプロテオバクテリアが、菌数１×１０8〜９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（ミリリットル）に前培養されたプロテオバクテリアである害虫忌避剤が好ましい。【００２０】
前記害虫忌避剤が、バイオサーファクタントを含む害虫忌避剤であることが好ましい。【００２１】
前記代謝が、２０〜３０℃の条件下での代謝である害虫忌避剤が好ましい。【００２２】
前記害虫忌避剤が、植物の茎葉または根に接触されるように用いられる害虫忌避剤であることが好ましい。【００２３】
また、本発明は、脂肪酸をプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含む、脂肪酸代謝物を含む害虫忌避剤の製造方法に関する。【００２４】
前記害虫忌避剤が、植物における害虫忌避物質分泌促進剤である害虫忌避剤の製造方法が好ましい。【００２５】
前記脂肪酸が、炭素数４〜３０の脂肪酸である害虫忌避剤の製造方法が好ましい。【００２６】
前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である害虫忌避剤の製造方法が好ましい。【００２７】
前記脂肪酸代謝工程を、０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下で実施する害虫忌避剤の製造方法が好ましい。【００２８】
前記脂肪酸代謝工程を、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下で実施する害虫忌避剤の製造方法が好ましい。【００２９】
前記プロテオバクテリアが、前培養されたプロテオバクテリアである害虫忌避剤の製造方法が好ましい。【００３０】
前記前培養されたプロテオバクテリアが、菌数１×１０8〜９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌに前培養されたプロテオバクテリアである害虫忌避剤の製造方法が好ましい。【００３１】
バイオサーファクタントを含む害虫忌避剤の製造方法である害虫忌避剤の製造方法が好ましい。【００３２】
前記脂肪酸代謝工程を、２０〜３０℃の条件下で実施する害虫忌避剤の製造方法が好ましい。【００３３】
植物に施用される害虫忌避剤の製造方法である害虫忌避剤の製造方法が好ましい。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の害虫忌避剤は、土壌汚染や毒性が低く、植物における長期的な忌避効果に優れる。また、本発明の害虫忌避剤の製造方法によれば、土壌汚染や毒性が低く、植物における長期的な忌避効果に優れる害虫忌避剤を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ワタアブラムシの忌避効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
害虫忌避剤
本発明の害虫忌避剤は、脂肪酸をプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含むことを特徴とする。
【００３７】
脂肪酸代謝物を植物の茎葉または根の一部に接触させることで、脂肪酸代謝物中に含まれ得る忌避物質による直接の害虫忌避効果に加えて、植物に抵抗性が誘導され得る。これは、脂肪酸代謝物中に、忌避物質に加えて、全身獲得抵抗性に関わるサリチル酸経路や、ジャスモン酸経路を活性化する物質またはこの物質の前駆体が含まれていることによると考えられる。抵抗性誘導の結果、植物自身に忌避物質を産生および／または分泌させたり、本来備わっている防虫に関する植物の機能をより発達させたりすることができる。したがって、本発明の害虫忌避剤は、植物からの害虫忌避物質の分泌を促進させることのできる物質を含む害虫忌避物質分泌促進剤である。そして、本発明の害虫忌避剤は、害虫忌避物質分泌促進物質に加えて、直接的な害虫忌避効果を有する忌避物質をさらに含んでいてもよい。
【００３８】
本発明の害虫忌避剤は、従来の害虫忌避剤と比べてより長期的な忌避効果を発揮でき、また従来の殺虫剤に対する薬剤抵抗性を発達させた害虫にも有効であると考えられる。かつ、脂肪酸代謝物は、化学合成農薬と比べその毒性が遥かに低い。
【００３９】
本発明における代謝とは、プロテオバクテリアが外分泌または内分泌する酵素等により脂肪酸の分解が行われることをいう。例えば、脂肪酸を含有する培地でプロテオバクテリアを培養する方法が挙げられる。
【００４０】
プロテオバクテリアは、脂肪酸の代謝に関わる酵素であるリポキシゲナーゼ（lipoxygenase：ＬＯＸ）を産生する遺伝子を持っており、脂肪酸代謝物を生成できる。
【００４１】
本発明において用いられる脂肪酸の炭素数は４〜３０であり、１０〜２０が好ましい。炭素数が４未満の場合は、融点・沸点が低いため、培養時の温度で揮発性が高まり培地中に残存しにくくなる傾向がある。また、炭素数が３０を超える場合は、融点・沸点が高くなるため、培養時の温度で固体となり培地と混合できず分離してしまう傾向がある。ただし、融点は水素結合の数によって炭素数のみに依存しない場合もある。
【００４２】
本発明において用いられる脂肪酸は、代謝効率の観点や培地中で固化することを抑制する観点から、２０〜３０℃で液体であることが好ましく、２０℃で液体であることがより好ましい。
【００４３】
本発明の脂肪酸は、飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸のいずれか、または両方を含む混合物とすることができる。また、植物油やグリセリドの形態や遊離脂肪酸を用いることができるが、分解速度に優れるという理由から遊離脂肪酸（モノカルボン酸）が好ましい。
【００４４】
炭素数４〜３０の遊離脂肪酸としては、酪酸（ブチル酸）、吉草酸（バレリアン酸）、カプロン酸、エナント酸（ヘプチル酸）、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、ミード酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸などが挙げられ、なかでも炭素数が１０〜２０のカプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、ミード酸、アラキドン酸が好ましく、炭素数が１８のオレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸がより好ましい。
【００４５】
脂肪酸を含有する培地を使用する場合の脂肪酸の含有量は、１２０ｇ／ｌ以下が好ましく、１００ｇ／ｌ以下がより好ましく、６０ｇ／ｌ以下がさらに好ましい。１２０ｇ／ｌを超える場合は、培地の水分との乳化が困難となり、代謝効率が悪化する恐れやプロテオバクテリアの生育を阻害する恐れがある。また、脂肪酸の含有量の下限は特に限定されないが、１．０ｇ／ｌ以上が好ましい。
【００４６】
脂肪酸を含有する培地は、他にミネラル成分を含有することが好ましい。ミネラル成分としては、特に限定されず微生物培養に通常用いられるミネラル成分を挙げることができる。例えば、マグネシウム（Ｍｇ）、リン（Ｐ）、ナトリウム（Ｎａ）またはカリウム（Ｋ）を有する成分が挙げられる。これらの成分は単独で使用することも、複数を併用することもできる。好ましくはこれらの成分のうちの２種類、さらに好ましくは３種類以上が使用され得る。培地中のミネラル成分の含有量は特に限定されず、従来の好気性細菌の培養方法で使用される量とすることができるが、植物への施用時に塩害が発生する恐れがあるため、好ましくは１５ｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｇ／ｌ以下で使用され得る。
【００４７】
本発明にて用いられるプロテオバクテリアは、本発明の効果を損なわない限り特に限定されない。好ましくは脂肪酸の代謝効率や生育効率の観点から、増殖に適した温度（至適温度）が１０〜４０℃のプロテオバクテリアが好ましく、２０〜３０℃のプロテオバクテリアがより好ましい。
【００４８】
プロテオバクテリアは、脂肪酸の代謝効率に優れるという理由から、前培養されたプロテオバクテリアであることが好ましく、菌数が１×１０8〜９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌまで前培養されていることがより好ましい。
【００４９】
本発明においては、代謝が、所定の溶存酸素濃度環境下で行われることが好ましい。代謝における溶存酸素濃度は、０．１ｍｇ／ｌ以上であることが好ましい。溶存酸素濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満の場合は、プロテオバクテリアの脂肪酸分解能が低下し脂肪酸の代謝効率が極めて低くなる傾向がある。また、溶存酸素濃度は例えば、８ｍｇ／ｌ以下であることが好ましい。溶存酸素濃度が８ｍｇ／ｌを超える場合は、プロテオバクテリアによる代謝工程と並行して、基質である脂肪酸の培地中の酸素による分解が進行してしまい、代謝効率が低下し、ひいては有効成分である代謝産物の産生量が低下してしまう恐れがある。好ましくは、溶存酸素濃度は、０．１〜８ｍｇ／ｌであり、より好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｌであり、さらに好ましくは０．１〜４ｍｇ／ｌである。なお、溶存酸素濃度は株式会社堀場製作所製の溶存酸素計でＰＯ電極に隔膜ガルバニ電極法または隔膜ポーラログラフ法により測定される値とする。
【００５０】
代謝における温度は使用するプロテオバクテリアに応じて適宜調整することができるが、脂肪酸の代謝効率の観点から、２０〜３０℃が好ましい。
【００５１】
本発明において、害虫忌避剤は、脂肪酸代謝物に加えバイオサーファクタントを含有し得る。脂肪酸代謝物が水に分散されやすくなり、害虫忌避剤の取扱性の観点から好ましいと考えられる。本発明に係るバイオサーファクタントとは、微生物が疎水性の高い物質を取り込むために産生し、細胞外へと分泌する界面活性剤様の物質を意味する。本発明において、プロテオバクテリアによって分泌されたバイオサーファクタントは、脂肪酸代謝物の水への分散も容易にするため、脂肪酸代謝物を含む害虫忌避剤の噴霧処理や灌注などが効率よく簡単に行えるようになる。しかしながら、バイオサーファクタントとしては、脂肪酸の分解時に本発明のプロテオバクテリアによって産生されたバイオサーファクタントだけではなく、他の微生物が産生したバイオサーファクタントが使用されてもよく、すなわち、本発明の害虫忌避剤には他の微生物によって産生されたバイオサーファクタントがさらに添加されてもよい。人工的に合成された界面活性剤と比較して、バイオサーファクタントは生物に関する毒性が低く、また、生分解性も高いため、より環境に優しい害虫忌避剤が得られると考えられる。また、プロテオバクテリアによる脂肪酸分解を促進させるために、他の微生物が産生したバイオサーファクタントが、プロテオバクテリアによる脂肪酸分解において添加されてもよい。プロテオバクテリアによる脂肪酸の取り込みが促進される可能性がある。
【００５２】
本発明の害虫忌避剤は、土壌汚染や毒性が低く、かつ植物において長期的な忌避効果を誘導し得るという害虫忌避剤としての優れた効果を有する。本発明の害虫忌避剤は、施用される植物において感染特異的タンパク質（pathogenesis-related (PR) protein）の生成に関与する遺伝子群やサリチル酸またはジャスモン酸を生成する酵素産生に関わる遺伝子群などを活性化して全身獲得抵抗性を誘導することができる。例えば、ジャスモン酸により誘導される抗害虫性のプロテアーゼ・インヒビターや昆虫忌避物質などの二次代謝産物等の生合成が増加されると推定している。しかも、本発明の害虫忌避剤は、サリチル酸経路およびジャスモン酸経路ともに、上流および下流の遺伝子の両方を発現させることができるので、抵抗性誘導が持続し、持続的な忌避効果が得られるため特に有利である。
【００５３】
本発明の害虫忌避剤は、植物の病害虫への抵抗性に関わる器官の発達を誘導し得る。器官の発達の具体例としては、毛状突起（トライコーム）の増加した形成が挙げられる。トライコームは、傷害に応答したジャスモン酸シグナル伝達の活性化により発達することが知られており、トライコームの発達は、植物に抵抗性が誘導されたことを示すものである。トライコームは、その先端から揮発性の害虫忌避成分を放出し得る。したがって、トライコームを発達させることにより、揮発性害虫忌避成分のより効率的な拡散が可能となり、植物の防御機能を高めることができる。また、種によっては、トライコーム自身に虫を絡め捕る機能があることも知られている。さらに、トライコーム密度の増加は、植食性昆虫に対する物理的な障壁としての防虫効果も高め得るため、植物自身の害虫忌避効果がより活性化され得る。
【００５４】
さらに、本発明の害虫忌避剤は、脂肪酸代謝物中に、植食者誘導性揮発性物質である揮発性アルデヒド、アルコールおよびそれらのエステル体に加え、これらの前駆物質をさらに含有していてもよい。前駆物質は、植物に吸収されたり、自然環境下で分解されたりすることにより、揮発性アルデヒド、アルコールおよびそれらのエステル体に変換され得る。したがって、害虫忌避剤の植物への適用時から、前駆物質が揮発性アルデヒド、アルコールおよびそれらのエステル体へと変換されるまでの時間の遅れによって、忌避効果に持続性がさらに付与されると考えられる。
【００５５】
本発明の害虫忌避剤は、農業害虫を忌避するために用いられ得る。農業害虫としては、これらに限定される訳ではないが、ワタアブラムシなどのアブラムシ科、ハダニ科、コガネムシ科、ハスモンヨトウなどのヤガ科、チュウレンジハバチなどのハバチ科などの害虫が例示される。本発明の害虫忌避剤は、殺虫剤に対する感受性が低いことが知られているハスモンヨトウの幼虫などに対しても忌避効果を示すため、従来防除が困難であるとされてきた害虫に対しても効果を発揮できるという点で優れている。
【００５６】
本発明の害虫忌避剤の植物への施用方法としては特に限定されない。例えば、植物の茎葉もしくは根への噴霧、植物の茎葉もしくは根の浸漬、および／または、植物の生育環境である土壌に対する土壌灌注によって施用され得る。また、施用される植物も限定されるものではなく、植物一般に対して良好に用いることができる。例えば、ナス科、ウリ科、バラ科などの双子葉類植物、イネ科などの単子葉類植物が挙げられる。
【００５７】
製造方法
本発明の脂肪酸代謝物を含む害虫忌避剤の製造方法は、脂肪酸をプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含むことを特徴とする。
【００５８】
本発明の製造方法により得られる害虫忌避剤は、植物における害虫忌避物質分泌促進剤である。すなわち、本発明の脂肪酸代謝工程により、植物からの害虫忌避物質の分泌を促進させることのできる物質が製造され得る。本発明の脂肪酸代謝工程は、このような害虫忌避物質分泌促進物質に加えて、直接的な害虫忌避効果を有する忌避物質が製造される工程であってもよい。
【００５９】
本発明における脂肪酸代謝工程は、プロテオバクテリアが外分泌または内分泌する酵素等により脂肪酸の分解が行われる工程である。例えば、脂肪酸を含有する培地でプロテオバクテリアを培養することにより行われる工程が挙げられる。
【００６０】
脂肪酸代謝工程は、所定の溶存酸素濃度環境下で行われることが好ましい。例えば、脂肪酸代謝工程における溶存酸素濃度は、０．１ｍｇ／ｌ以上であることが好ましい。溶存酸素濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満の場合は、プロテオバクテリアの脂肪酸分解能が低下し脂肪酸の代謝効率が極めて低くなる傾向がある。また、溶存酸素濃度は例えば、８ｍｇ／ｌ以下であることが好ましい。溶存酸素濃度が８ｍｇ／ｌを超える場合は、プロテオバクテリアによる代謝工程と並行して、基質である脂肪酸の培地中の酸素による分解が進行してしまい、代謝効率が低下し、ひいては有効成分である代謝産物の産生量が低下してしまう恐れがある。好ましくは、溶存酸素濃度は、０．１〜８ｍｇ／ｌであり、より好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｌであり、さらに好ましくは０．１〜４ｍｇ／ｌである。なお、溶存酸素濃度は株式会社堀場製作所製の溶存酸素計でＰＯ電極に隔膜ガルバニ電極法または隔膜ポーラログラフ法により測定される値とする。
【００６１】
溶存酸素濃度は、培養容器、振とう数、通気量などによって、調整することができる。
【００６２】
脂肪酸代謝工程における培養条件は、溶存酸素濃度を所定の範囲とすること以外は、従来の好気性細菌を培養する条件と同様の条件とすることができる。例えば、フラスコによる振とうや、スピナーフラスコまたはジャーファメンターによる通気培養により３〜７日間培養する方法が挙げられる。
【００６３】
培養日数は、脂肪酸の乳化、分解等が充分に行われる日数とすることが好ましいが、撹拌や菌量によって培養日数は変化する。なお、脂肪酸代謝工程の終了は、脂肪酸の分解状態を、波長２３０ｎｍにおける吸光度の測定、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）等で確認することが好ましい。
【００６４】
脂肪酸代謝工程における温度は使用するプロテオバクテリアに応じて適宜調整することができ、脂肪酸の代謝効率の観点から、２０〜３０℃の条件下で実施することが好ましい。
【００６５】
脂肪酸代謝工程における脂肪酸およびプロテオバクテリアは、本発明の害虫忌避剤の説明で前述したものを使用することができる。
【００６６】
なお、プロテオバクテリアの前培養工程としては、特に限定されず通常の好気性細菌の培養方法とすることができる。前培養液から遠心分離等により菌体のみを回収し、脂肪酸代謝工程に用いることが好ましい。
【００６７】
本発明の製造方法により得られる害虫忌避剤は、脂肪酸代謝物に加えバイオサーファクタントを含有し得る。本発明に係るバイオサーファクタントとは、微生物が疎水性の高い物質を取り込むために産生し、細胞外へと分泌する界面活性剤様の物質を意味する。プロテオバクテリアによって分泌されたバイオサーファクタントは、脂肪酸代謝物の水への分散も容易にする。本発明の害虫忌避剤の取扱性が向上すると考えられる。
【００６８】
本発明の害虫忌避剤は、培地、バイオサーファクタントを含むプロテオバクテリアの外分泌物、菌体などとの混合物である培養液として得られる。当該培養液をそのまま本発明の害虫忌避剤としてもよく、培養液から遠心分離などにより菌体を除去した上澄み液を害虫忌避剤としてもよい。本発明の製造方法により得られる害虫忌避剤は、植物に施用される。培養液は原液のままでも使用することができるが、原液の場合は高温時に植物への処理部分が、ミネラル分が蒸発濃縮され浸透圧の影響で縮む恐れがあるため、原液を希釈して使用することが望ましい場合がある。希釈倍率としては本発明の効果を発揮する限り特に限定されないが、１０〜１０００倍希釈が好ましく、１０〜１００倍希釈がさらに好ましい。なお、除去した菌体を再度、脂肪酸を含有する培地で培養することにより本発明の脂肪酸代謝工程を繰り返し行うことが可能である。
【実施例】
【００６９】
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。【００７０】
試験用害虫忌避剤の調製
＜前培養工程＞
ガラス製三角フラスコ内の１ｌ（リットル）の水にペプトン（Ｄｉｆｃｏ製のタンパク質酵素加水分解物）２０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物１．５ｇおよびリン酸水素二カリウム１．５ｇ、または、１ｌ（リットル）の水にペプトン（Ｄｉｆｃｏ製のタンパク質酵素加水分解物）１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇおよび塩化ナトリウム１０ｇを溶解させ、１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌を行い、室温まで冷却後、プロテオバクテリアの菌液を植菌した。なお、培養容器の口はシリコン栓で密栓した。植菌後の容器をバイオシェーカー（タイテック株式会社製のＢＲ−２３ＵＭ）を用い、２５℃±５℃、１２０ｒｐｍの条件下で、２４時間培養を行った。培養液中の菌数は５×１０8ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった。培養後、培養液を１５，０００×Ｇ、２０℃の条件で遠心分離することで培養液から菌体を回収した。【００７１】
＜脂肪酸代謝工程＞
ガラス製三角フラスコ内の１ｌ（リットル）の滅菌水に、リノール酸（和光純薬工業株式会社製の一級リノール酸）１２ｇ、硫酸マグネシウム七水和物１．５ｇおよび／またはリン酸水素二カリウム１．５ｇ、および前培養工程から得られた菌体の全量を加えた。これを、バイオシェーカー（タイテック株式会社製のＢＲ−２３ＵＭ）を用い、２０℃、１２０ｒｐｍ、溶存酸素濃度４ｍｇ／ｌの条件下で、４日間培養を行った。なお、リノール酸の分解は、リノール酸中間生成物の１つである酸化脂質の培養液中の濃度を株式会社島津製作所製の分光光度計ＢｉｏＳｐｅｃ−ｍｉｎｉを用いて波長２３０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、確認した。培養後、菌体を含む培養液を試験用害虫忌避剤とし、下記の評価を行った。【００７２】
ワタアブラムシの忌避効果
・実施例１〜２
最も長い部分の長さが１０ｃｍ程度のキュウリの本葉を２ｃｍ四方に切り取り、試験用害虫忌避剤（原液）およびその１０倍希釈液に１０秒間浸漬させた（実施例１および２）。シャーレ（径９ｃｍ）内に、試験用害虫忌避剤に浸漬した葉（試験区）と水に浸漬した葉（対照区）とを３ｃｍ間隔で１枚ずつ置いたものを準備した。それぞれのシャーレ内の葉と葉との間に、ろ紙（１ｃｍ×１ｃｍ)を置き、ろ紙上にワタアブラムシ成虫を２０匹置いた。シャーレの蓋を閉じて暗所で静置し、２４時間後に、試験区および対照区の葉上に集積したワタアブラムシの数を計測し忌避率を求めた。忌避（％）は以下の式に基づいて求めた。
忌避率（％）＝（１−試験区の集積虫数／対照区の集積虫数）×１００
結果を図１に示す。【００７３】
・比較例１〜２
試験用害虫忌避剤に替えて、代表的なバイオサーファクタントであるサーファクチンナトリウムの０．１％溶液（比較例１）、および、忌避効果があるとされる柑橘系香気成分シトロネラの０．４％溶液（比較例２）を用いたこと以外は実施例１〜２と同様に処理して観察した。結果を図１に示す。【００７４】
図１に示されるように、試験用害虫忌避剤（原液あるいはその１０倍希釈液）で処理した試験区は、比較例１のサーファクチンナトリウムや比較例２のシトロネラと比較して高い忌避率を示した。特に、試験用害虫忌避剤の原液を用いた実施例１では、ワタアブラムシの忌避率が１００％に達し、強力なワタアブラムシ忌避効果が確認された。一方、バイオサーファクタントを使用した比較例１では忌避率は６８％にとどまり、また、シトロネラを使用した比較例２では忌避効果は３０％となり、不十分な結果となった。したがって、本発明の害虫忌避剤が優れた忌避効果を有していることがわかる。【００７５】
ミニバラにおける害虫忌避効果
・実施例３
屋外で栽培中のミニバラ（品種：ルージュ）６株に対して、試験用害虫忌避剤を水で１００倍に希釈した希釈液を週一回の頻度で葉茎散布（３０ｍｌ／株程度）および土壌灌注（５０ｍｌ／株程度）することで処理した。処理は、６〜７月の間実施し、処理後、自然発生した害虫寄生および食害を調べた。対照として無処理区を設けた。害虫寄生は、１株あたりの寄生頭数または１株あたりの寄生葉数の平均値で評価した。食害は、虫害度で評価した。ここで、虫害度とは、計測対象の各株の食害を０〜４の５段階で評価し、各食害段階の株数を計測し、その株数に食害の段階を表す数値（０〜４）を乗じて合計した数値を計測対象の全株数に４を乗じた数字で除して、１００倍したものをいう。なお、食害の段階は、以下のように定義する。葉の枚数が１００枚以上の株を計測対象とし、段階０は、食害を受けた葉がない、段階１が食害を受けた葉が３枚以下、段階２は食害を受けた葉が１０枚以下、段階３は食害を受けた葉が３０枚以下、段階４が食害を受けた葉が３０枚を超える場合とそれぞれ定義する。例えば、１０本の株を例にして説明すると、食害の段階が０（数値０）の株が２本、段階１（数値１）の株が２本、段階２（数値２）の株が１本、段階３（数値３）の株が２本、段階４（数値４）の株が３本の場合は、虫害度は（（０×２本＋1×２本＋２×１本＋３×２本＋４×３本）／４×１０本）×１００で計算され、虫害度は５５となる。結果を表１に示す。また、評価の判定は下記の基準に基づき判断した。
×：無処理区と比較して、抑制効果なし
○：無処理区と比較して、抑制効果あり【００７６】
【表１】
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【００７７】
表１に示されるように、試験用害虫忌避剤の１００倍希釈液で処理した試験区においては、無処理区と比較して、害虫寄生および食害ともに低かった。したがって、本発明の害虫忌避剤が優れた害虫忌避効果を有していることがわかる。【００７８】
上記の結果より、本発明の害虫忌避剤および本発明の製造方法により製造される害虫忌避剤が、土壌汚染や毒性が低く、害虫忌避効果に優れた害虫忌避剤であることがわかる。
【図１】
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【国際調査報告】
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