(57)【要約】本発明は、細菌感染症の処置のためのダチョウ抗体含有組成物、およびダチョウ抗体を用いる細菌感染症処置方法を提供する。本発明はさらに、このようなダチョウ抗体の製造方法も提供する。この感染症は消化管感染症であり得る。このダチョウ抗体は、細菌由来成分を免疫原として作製され得る。この細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓなどであり得る。さらに、この細菌は、薬剤耐性菌であり得る。
2019088230.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
消化管内感染性細菌の感染症処置用組成物であって、前記細菌由来成分を免疫原とするダチョウ抗体を含む、組成物。
【請求項２】
前記細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ、Ｓｔａｏｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、緑膿菌、腸内細菌科細菌、エンテロコッカス・フェシウム、ヘリコバクター・ピロリ、カンピロバクター、サルモネラ菌および赤痢菌からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記感染症が消化管感染症である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記感染症が、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸および肛門のうちの少なくとも１つの場所における感染症を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
前記細菌由来成分が、前記細菌の菌体、ホモジネート、毒素、酵素、多糖類、色素、細胞壁、細胞質、芽胞、鞭毛、線毛、またはそれらの一部、あるいはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記免疫原が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａおよび毒素Ｂのうちの少なくとも１つを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記細菌が、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記免疫原が、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ毒素を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記細菌が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記免疫原が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのホモジネートを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記感染症が、前記細菌の薬剤耐性菌によるものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記細菌由来成分が、前記細菌のホモジネートを含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記細菌が、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを含む、請求項８に従属する場合の請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
医薬組成物である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
経口投与用の医薬組成物である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
食品組成物である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
キャンディーである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌感染症の処置のためのダチョウ抗体含有組成物、およびダチョウ抗体を用いる細菌感染症処置方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗生物質の開発は進められてきたものの、細菌感染症は依然として重要な治療対象の１つである。また、近年では抗生物質に対して耐性を獲得する薬剤耐性菌も出現し、その感染症が問題となっている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明者は、細菌由来の成分を免疫原として投与したダチョウから得られた抗体が細菌感染症の処置に有効であることを予想外に発見し、本発明を完成させた。実施例に記載されるように、驚くべきことに、ダチョウ抗体は同じ免疫原を用いてトリから得られた抗体よりも有意に優れた治療効果を有した。さらに、ダチョウ抗体は、免疫原として用いた細菌から派生した薬剤耐性菌による感染にも効果を奏することが予想外に明らかになった。また、本発明のダチョウ抗体は、消化管内で優れた安定性を示すことが予想外に明らかになった。さらに、本発明のダチョウ抗体は、キャンディーとして製剤化した場合に優れた安定性を示すことも予想外に明らかになった。【０００４】
本発明は、以下の項目を提供する。
（項目Ｘ１）
消化管内感染性細菌の感染症処置用組成物であって、前記細菌由来成分を免疫原とするダチョウ抗体を含む、組成物。
（項目Ｘ２）
前記細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ、Ｓｔａｏｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、緑膿菌、腸内細菌科細菌、エンテロコッカス・フェシウム、ヘリコバクター・ピロリ、カンピロバクター、サルモネラ菌および赤痢菌からなる群から選択される、項目Ｘ１に記載の組成物。
（項目Ｘ３）
前記感染症が消化管感染症である、項目Ｘ１または２に記載の組成物。
（項目Ｘ４）
前記感染症が、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸および肛門のうちの少なくとも１つの場所における感染症を含む、項目Ｘ１または２に記載の組成物。
（項目Ｘ５）
前記細菌由来成分が、前記細菌の菌体、ホモジネート、毒素、酵素、多糖類、色素、細胞壁、細胞質、芽胞、鞭毛、線毛、またはそれらの一部、あるいはこれらの任意の組み合わせを含む、項目Ｘ１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
（項目Ｘ６）
前記細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを含む、項目Ｘ１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
（項目Ｘ７）
前記免疫原が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａおよび毒素Ｂのうちの少なくとも１つを含む、項目Ｘ６に記載の組成物。
（項目Ｘ８）
前記細菌が、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａを含む、項目Ｘ１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
（項目Ｘ９）
前記免疫原が、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ毒素を含む、項目Ｘ８に記載の組成物。
（項目Ｘ１０）
前記細菌が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを含む、項目Ｘ１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
（項目Ｘ１１）
前記免疫原が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのホモジネートを含む、項目Ｘ１０に記載の組成物。
（項目Ｘ１２）
前記感染症が、前記細菌の薬剤耐性菌によるものである、項目Ｘ１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目Ｘ１３）
前記細菌由来成分が、前記細菌のホモジネートを含む、項目Ｘ１２に記載の組成物。
（項目Ｘ１４）
前記細菌が、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを含む、項目Ｘ８に従属する場合の項目Ｘ１３に記載の組成物。
（項目Ｘ１５）
医薬組成物である、項目Ｘ１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
（項目Ｘ１６）
経口投与用の医薬組成物である、項目Ｘ１５に記載の組成物。
（項目Ｘ１７）
食品組成物である、項目Ｘ１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
（項目Ｘ１８）
キャンディーである、項目Ｘ１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目Ｙ１）細菌の感染症処置用組成物であって、上記細菌由来成分を免疫原とするダチョウ抗体を含む、組成物。
（項目Ｙ２）上記感染症が消化管感染症である、項目Ｙ１に記載の組成物。
（項目Ｙ３）上記細菌由来成分が、上記細菌の菌体、ホモジネート、毒素、細胞質、細胞壁またはこれらの任意の組み合わせを含む、項目Ｙ１または２に記載の組成物。
（項目Ｙ４）上記細菌がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである、項目Ｙ１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
（項目Ｙ５）上記免疫原がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａおよび／または毒素Ｂである、項目Ｙ４に記載の組成物。
（項目Ｙ６）上記細菌がＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａである、項目Ｙ１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
（項目Ｙ７）上記免疫原がＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ毒素である、項目Ｙ６に記載の組成物。
（項目Ｙ８）上記細菌がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓである、項目Ｙ１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
（項目Ｙ９）上記免疫原がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのホモジネートである、項目Ｙ８に記載の組成物。
（項目Ｙ１０）上記感染症が、上記細菌の薬剤耐性菌によるものである、項目Ｙ１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
（項目Ｙ１１）上記細菌由来成分が、上記細菌のホモジネートである、項目Ｙ１０に記載の組成物。
（項目Ｙ１２）上記細菌がメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓである、項目Ｙ８に従属する場合の項目Ｙ１０に記載の組成物。
（項目Ｙ１３）医薬組成物である、項目Ｙ１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
（項目Ｙ１４）経口投与用の医薬組成物である、項目Ｙ１３に記載の組成物。
（項目Ｙ１５）食品組成物である、項目Ｙ１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
（項目Ｙ１６）キャンディーである、項目Ｙ１２〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の、細菌由来の成分を免疫原として投与したダチョウから得られた抗体は、細菌感染症の処置に有効であり得る。また、薬剤耐性菌による感染症にも本発明のダチョウ抗体は有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、クロストリディウム・ディフィシル毒素Ａによる３Ｔ３細胞の細胞変性に対する、ダチョウＩｇＹ抗体およびニワトリＩｇＹ抗体の効果を示す。
【図２】図２は、クロストリディウム・ディフィシル毒素Ａによる３Ｔ３細胞の細胞変性に対する、ダチョウＩｇＹ抗体およびニワトリＩｇＹ抗体の効果を示す。
【図３】図３は、ダチョウＩｇＹ抗体接種マウスにおける、クロストリディウム・ディフィシル毒素Ａ投与後の生存曲線を示す。
【図４】図４は、ニワトリＩｇＹ抗体接種マウスにおける、クロストリディウム・ディフィシル毒素Ａ投与後の生存曲線を示す。
【図５】図５は、ダチョウＩｇＹ抗体接種マウスにおける、クロストリディウム・ディフィシル毒素Ｂ投与後の生存曲線を示す。
【図６】図６は、ニワトリＩｇＹ抗体接種マウスにおける、クロストリディウム・ディフィシル毒素Ｂ投与後の生存曲線を示す。
【図７】図７は、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａの毒素（ＣＴ）を免疫原とするダチョウＩｇＹ抗体のＣＴへの反応性を示す。
【図８】図８は、ダチョウ抗体とＣＴとを投与したハムスターの消化管病変の病理解剖写真を示す。図８ＡはＰｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ  ＩｇＹとＣＴを投与したハムスターの、図８ＢはＣＴで免疫したダチョウＩｇＹとＣＴを投与したハムスターの結果である。
【図９】図９は、ダチョウ抗体キャンディーとＣＴとを投与したハムスターの消化管病変の病理解剖写真を示す。図９ＡはＰｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ  ＩｇＹキャンディーとＣＴを投与したハムスターの、図８ＢはＣＴで免疫したダチョウＩｇＹキャンディーとＣＴを投与したハムスターの結果である。
【図１０】図１０は、ダチョウ抗体キャンディーとＣＴとを投与したハムスターにおける臓器重量を示す。
【図１１】図１１は、ダチョウＩｇＹ抗体によるＳ．ａｕｒｅｕｓの増殖抑制試験の結果を示す。
【図１２】図１２は、ダチョウＩｇＹ抗体によるＭＲＳＡの増殖抑制試験の結果を示す。
【図１３】図１３は、ウサギＩｇＧ抗体によるＳ．ａｕｒｅｕｓの増殖抑制試験の結果を示す。
【図１４】図１４は、ウサギＩｇＧ抗体によるＭＲＳＡの増殖抑制試験の結果を示す。
【図１５】図１５は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａを免疫原とするダチョウ抗体およびニワトリ抗体を経口投与したマウスの糞中の抗体活性を時間経過とともに示す。
【図１６】図１６は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂを免疫原とするダチョウ抗体およびニワトリ抗体を経口投与したマウスの糞中の抗体活性を時間経過とともに示す。
【図１７】図１７は、コレラ毒素を免疫原とするダチョウ抗体およびニワトリ抗体を経口投与したマウスの糞中の抗体活性を時間経過とともに示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【０００８】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
【０００９】
（定義）
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
【００１０】
本明細書において、「約」とは、示される値の±１０％の変動までが許容されることを指す。
【００１１】
本明細書において、疾患の「処置」とは、疾患の予防および治療の両方の概念を包含する。
【００１２】
本明細書において、「被験体」とは、任意のヒトまたは非ヒトの動物を意味する。例えば、本発明の方法および組成物を、細菌感染症に罹患した被験体の治療に、または細菌感染症に罹患するリスクのある被検体の予防に用いることができる。
【００１３】
本明細書において、「免疫原」とは、それに結合する抗体を取得しようとする標的物質を指す。免疫原は、例えば、細胞、細胞内成分、細胞外成分、細胞膜、細胞壁、生物の分泌物またはアレルギー物質などであり得、ここで、免疫原は、精製されていても、未精製でもよい。
【００１４】
本明細書において、ある細菌の「薬剤耐性菌」とは、当該細菌が変異等により、当該細菌には有効な薬剤（特に、抗生物質）に対する耐性を獲得した細菌をいう。
【００１５】
（ダチョウ抗体）
本発明のダチョウ抗体は、細菌由来成分を免疫原として雌ダチョウに接種し、その卵黄から回収することによって得られるＩｇＹ抗体であり得る。本明細書において、ある物質を免疫原として得られる抗体には、ダチョウに当該物質を投与した場合に産生される抗体、および抗原結合性を変化させないようにこの抗体を改変した抗体が含まれる。例えば、このような改変された抗体として、ＣＤＲを変化させないように改変した抗体、定常ドメインのみを改変した抗体が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、任意の周知の技術を使用してこのような抗体を作製することができる。また、当業者であれば、免疫原である物質が特定されれば、いずれの抗体がこの物質を免疫原として得られる抗体であるかを容易に特定することができる。一つの実施形態では、本発明の抗体は、ダチョウにおいて産生された抗体をさらに改変したものであってもよい。
【００１６】
一つの実施形態では、本発明の抗体はポリクローナル抗体であってよく、ここで、ポリクローナル抗体は単一の物質（例えば、単一種の微生物、単一種のタンパク質など）を免疫原として得られる抗体であってもよいし、複数の物質（例えば、複数種の微生物、単一種の微生物における複数種のタンパク質など）を免疫原として得られる抗体であってもよい。一つの実施形態では、本発明の抗体は、単離、精製または濃縮された特定の１種または複数種の抗体であってもよい。一つの実施形態では、本発明の抗体または本発明の抗体のうちの少なくとも１種類は、当該抗体を得る際に使用した免疫原またはその成分に結合または特異的に結合する。
【００１７】
細菌由来成分は、細菌に由来する任意の成分であり得、代表的には未処理の菌体、細菌ホモジネート、細菌が産生する毒素、酵素、多糖類、もしくは色素、細菌の細胞壁もしくは細胞質、芽胞、鞭毛または線毛、あるいはそれらの一部であり得、好ましくは細菌のホモジネートまたは毒素であり得る。好ましくは、免疫原としての細菌由来成分はホモジネートである。好ましくは、免疫原としての細菌由来成分は、細菌が産生する毒素、例えば、内毒素、外毒素、莢膜、芽胞であり得る。例えば、細菌成分として、エンテロトキシン、ＴＳＳＴ−１、コアグラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、プロテインＡ、ピオシアニン、ピオベルジン、ピオルビン、エキソトキシンＡ、ヘモリジン、アルカリペプチダーゼ、エラスターゼ、エキソエンザイムＳ、ラムノリピド、カビ毒素：マイコトキシンなどが挙げられ、本発明の抗体または本発明の抗体のうちの少なくとも１種は、これらの成分のいずれかに結合または特異的に結合し得る。薬剤耐性菌による感染症の処置のためには、細菌のホモジネートを免疫原としたダチョウ抗体が好ましくあり得る。
【００１８】
好ましい実施形態においては、本発明の組成物において使用される抗体は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのホモジネート、毒素Ａおよび／または毒素Ｂを免疫原としてダチョウを免疫することによって得られた抗体であり得る。別の好ましい実施形態においては、本発明の組成物において使用される抗体は、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａのホモジネートおよび／またはコレラ毒素を免疫原としてダチョウを免疫することによって得られた抗体であり得る。別の好ましい実施形態においては、本発明の組成物において使用される抗体は、Ｓｔａｏｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのホモジネートおよび／またはコレラ毒素を免疫原としてダチョウを免疫することによって得られた抗体であり得る。
【００１９】
本発明の１つの実施形態において、免疫原は、菌体またはアレルゲンをリン酸緩衝液（PBS）中でホモジナイザーによってホモジナイズすることによって得ることができる。ホモジナイズは、ｐＨ約６〜約８、好ましくはｐＨ約７において、冷蔵下（4度）で行い得る。ホモジナイザーとしては、タンパク抽出用の高回転の機械を用いることができる。好ましくは、ホモジナイザー後は遠心分離をせずにそのまま、その液体を免疫原として鳥類を免疫する。プロテアーゼ阻害剤や安定化剤は使用しないが、トレハロースを液体の4％となるように追加してもよい。さらに、このようにして得られた液体をアジュバントに混和して免疫してもよいが、アジュバントを用いなくても抗体は産生され得る。
【００２０】
本発明はまた、細菌感染症の処置に有用なダチョウ抗体の製造方法も提供し得る。公知の方法を利用して、雌のダチョウから本発明の抗体を取得することができる。免疫の際には、免疫原とともにアジュバンド、塩および安定化剤などの任意の添加成分を利用することができる。また、免疫の際には、免疫原は、任意の好適な条件（例えば、投与量、投与部位、ｐＨ、温度など）で投与できる。免疫は、初回免疫の後、追加免疫を行ってもよい。
ダチョウへの免疫は、代表的には、以下のように行われるが、これに限定されない。
・初回免疫：フロイントの完全アジュバントなどの適切なアジュバントに免疫原を混和し、メスのダチョウの腰部の筋肉内に接種する。
・追加免疫：初回免疫後、隔週毎に３回追加免疫する。フロイントの不完全アジュバントなどの適切なアジュバントに免疫原を混和し、メスのダチョウの腰部の筋肉内に接種する。
追加免疫２週後以降に産卵されるダチョウ卵より抗体を精製する。
【００２１】
（細菌感染症）
本発明のダチョウ抗体は、細菌由来の成分を免疫原としてダチョウから産生するものであり、当該細菌の感染症の処置に有用であり得る。
【００２２】
本発明のダチョウ抗体が感染症処置に有用な細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ；クロストリディウム・ディフィシル）、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ；ビブリオ・コレラ）、Ｓｔａｏｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ；黄色ブドウ球菌）、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、腸内細菌科細菌、エンテロコッカス・フェシウム、ヘリコバクター・ピロリ、カンピロバクター、サルモネラ菌、淋病菌、肺炎レンサ球菌、赤痢菌、インフルエンザ菌、結核菌などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のダチョウ抗体は、経口投与した場合であっても消化管全体（胃、小腸および大腸を含む）に活性を保持したまま送達され得るため、消化管の深部（胃、小腸、大腸など）に病巣を形成する細菌による感染症に対しても経口投与による有効な処置を提供し得る。そのため、本発明は、特に経口投与の形態において、消化管内感染性細菌（例えば、上記細菌）を有効に処置する。１つの実施形態において、本発明の抗体により処置される細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ、Ｓｔａｏｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（例えば、薬剤耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌、腸内細菌科細菌、エンテロコッカス・フェシウム、ヘリコバクター・ピロリ、カンピロバクター、サルモネラ菌および赤痢菌からなる群から選択される消化管内感染性細菌である。
【００２３】
本発明のダチョウ抗体は、消化管感染症に有用であり得る。これは、以下に説明するとおり、本発明のダチョウ抗体が、食品（ドリンクを含む）に配合でき、消化管に簡便にアクセスできるからであるが、特に本発明のダチョウ抗体の用途は消化管感染症に限定されない。１つの実施形態において、本発明の抗体は、口内、食道、喉、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸および肛門のうちの少なくとも１つの場所における細菌感染症の処置を目的とし得る。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸および肛門のうちの少なくとも１つの場所における細菌感染症の処置を目的とし得る。また、本発明のダチョウ抗体は、錠剤、液体、注射薬、皮膚塗布薬、点鼻薬、点眼薬、口腔内スプレー、洗浄薬など任意の剤形で投与され得る。
【００２４】
本発明のダチョウ抗体は、細菌の感染症に有用であるだけでなく、当該細菌から派生し、薬剤耐性を獲得した薬剤耐性菌にも有用であり得る。薬剤耐性菌の薬剤耐性獲得のメカニズムはいくつかあるが、代表的には、薬剤分解酵素や修飾酵素の産生能の獲得、薬剤作用部位の変異、菌体内への薬剤侵入孔の減少、薬剤排出機構の獲得・増強などが挙げられる。理論に束縛されることを意図しないが、本発明のダチョウ抗体は、これらの耐性獲得機構とは異なる機構によって細菌の増殖や感染症を抑制することができるため、ある細菌を免疫原として作製したダチョウ抗体が、当該細菌から派生した薬剤耐性菌に対しても効果を発揮するものと考えられる。あるいは、本発明のダチョウ抗体は、細菌が抗生物質・薬剤の耐性のために変異して獲得し産生する蛋白合成酵素（例えば、細菌増殖のための酵素）、薬剤分解酵素などに対してダチョウ抗体が結合し、中和するものと考えられる。
【００２５】
したがって、以下の実施例においてはＳ．ａｕｒｅｕｓを免疫原として作製したダチョウ抗体がメチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓにも有効であった具体例を記載したが、本発明はこれに限定されるものではなく、任意の細菌と、その細菌から派生した任意の薬剤に対する耐性菌に本発明の原理が適用され得ることが当業者には容易に理解される。
【００２６】
（医薬およびその投与）
本発明は、被験体の細菌感染症の処置方法であって、当該細菌を免疫原として作製したダチョウ抗体を当該被験体に投与する工程を包含する処置方法も提供する。
【００２７】
本明細書において「医薬」とは、当該分野でもっとも広義に解釈され、任意の薬を含み、薬事法上の医薬品、医薬部外品等のほか、人に適用するものだけでなく、動物に適用するもの（獣医薬）をも包含する概念として使用され、腸内細菌叢バランスの改善等のプロバイオティクス、プレバイオティクスまたはシンバイオティクスの効果によって、それを必要とする疾患、障害または状態の治療または予防を意図する任意の用途の薬剤、組成物等を包含することが理解される。そのような例として、医療分野、獣医科学等における応用が挙げられる。通常、医薬は固体または液体の賦形剤を含むとともに、必要に応じて安定剤、ｐＨ調整剤、固形化剤（例えば、水あめ）、崩壊剤、香味剤、遅延放出剤、滑沢剤、結合剤、着色剤などの添加剤を含むことができる。医薬品の形態は、キャンディー、錠剤、注射剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、徐放製剤などを含むが、これらに限定されない。本発明の成分、微生物、化合物、プロバイオティクス、プレバイオティクスまたはシンバイオティクス等は、医薬的に許容されうる一般的な担体または賦形剤などの成分と一緒にして医薬組成物とすることができる。
【００２８】
本発明の抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、鞘内、経口、局所的または吸入経路によって、ボーラスとしてかまたはある期間にわたる持続的注入によって、薬学的に許容される任意の投薬形態で投与され得る。本発明は特に消化管感染症に有用であり、消化管感染症の処置のためには消化管へ作用を及ぼしやすい経口投与が特に好ましい。１つの実施形態において、本発明の抗体の経口投与により、口内、食道、喉、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸および肛門において治療効果が奏され得る。１つの実施形態において、本発明のダチョウ抗体は、経口投与した場合に、胃を超えてその後の消化管（例えば、小腸および大腸）においても十分量が分解されずに活性であり得るという予想外の性質を示し得るため、特に経口投与による使用に適し得る。さらに消化管からの菌血症、毒血症などにも応用できる（例えば、ダチョウ抗体の注射により）。
【００２９】
本発明の抗体の適切な投与量は、処置する細菌感染症の種類、重症度および経過、抗体を予防または治療のどちらの目的で投与するか、以前の治療、被検体の病歴および抗体への応答、ならびに主治医の自由裁量に依存し得る。本発明の抗体は、１回でまたは一連の処置にわたって適切に患者に投与され得る。
【００３０】
本発明のダチョウ抗体は、感染症のタイプおよび重症度に応じて、抗体約１μｇ／ｋｇから約２０ｇ／ｋｇが、患者に投与するための最初の候補の投与量であり得る。
【００３１】
本発明の抗体は、細菌感染症の処置に有用な他の薬剤（例えば抗生物質）と組み合わせて投与されてもよい。このような他の薬剤としては、βラクタム系（ペニシリン系、セフェム系）、アミノグリコシド系、マクロライド系、テトラサイクリン系、キノロン系、クリンダマイシン系、ゲンタマイシン系、クロラムフェニコール系、マイトマイシン系、バンコマイシン系、メシチリン系、ナイスタチン系、カルバペネム系、アンフォテリシン系、ポリエーテル系、ペプチド系の抗生物質、スルホンアミド系、ニトロフラン系、イソニコチン酸ヒドラジド系、ピラジナマイド系、ヒ素化合物系、アンチモン化合物系、キノリン化合物系の化学療法薬などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
（食品）
本明細書において「食品」とは、当該分野で日常的に使用される意味を有し、人間が食することができるすべての食料（飲料を含む）を指し、一実施形態としては加工品を挙げることができる。たとえば菓子類、乳製品、穀類加工品などの加工食品に、本発明の成分、微生物、化合物、プロバイオティクス、プレバイオティクスまたはシンバイオティクス等を混入させることができる。また、「健康食品」および「機能性食品」とは、業界で一般的に使用される意味を有し、腸内細菌叢バランスの改善等のプロバイオティクス、プレバイオティクスまたはシンバイオティクスのために特別に処方された、医薬品または一般の食品とは区別される食品の一種を指す。このような食品の例としては、例えば、食事前または食事とともに被験者に一定期間摂取させる食品を想定することができるがこれに限定されない。本発明の食品は、飲料も含み得る。
【００３３】
１つの実施形態において、本発明は消化管感染症の処置（治療、予防またはその両方）を企図しているため、消化管において抗体が効力を発揮するように食品に含まれることが好ましい。
【００３４】
１つの好ましい実施形態において、本発明の抗体はキャンディーによって被験体に経口投与され得る。
【００３５】
特に、ダチョウの場合、卵黄抗体は酸やアルカリに強く、耐熱性が高い。具体的には、１２０℃でも抗体活性が維持され得る点に留意されたい。また、胃内の低ｐＨ環境でも抗体活性は維持され得、小腸内のアルカリ環境でも抗体活性は維持され得る。本発明者は、経口投与した本発明のダチョウ抗体は便中においても活性であり得ることを見出した。胃および小腸の過酷なｐＨ環境および消化管（例えば、胃および小腸）に存在する種々のタンパク質分解酵素の存在にもかかわらず、便中において抗体活性が保持され得ることは予想外の発見であった。１つの実施形態において、キャンディーとして調製した本発明のダチョウ抗体は、ＥＬＩＳＡによって評価した場合に、キャンディーとして調製する前の当該抗体と比較して、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１５％、少なくとも１０％、少なくとも７％、少なくとも５％、少なくとも２％または少なくとも１％の免疫原結合性を保持する。キャンディー化によってある程度の免疫原結合性の低下が観察される場合もあり得るが、このような場合であっても、キャンディー化は有利であり得る。また、当業者であれば、活性低下を考慮して必要なレベルの活性が得られるようにキャンディーを調製することができる。
【００３６】
本発明のキャンディーは、例えば、砂糖と水飴を混合して加熱した飴生地を６０〜１１０℃にした状態で、前記飴生地にダチョウ黄卵抗体１部に対して水または食用油脂１部〜１００部で溶解した溶解抗体を添加し、該溶解抗体が前記飴生地の全体に均一に分散されるまで冷却しながら混練して、そして所望形状に成形することによって製造され得る。このような高温での処理に耐えられるのはダチョウ抗体の１つの特徴である。１つの実施形態において、本発明のダチョウ抗体は、キャンディー内に封入することで、例えば溶液中と比較して、より長期間の保存安定性を達成し得る。理論に束縛されることを望むものではないが、キャンディー中の自由水の少なさに起因して本発明のダチョウ抗体は安定化され得る。また、キャンディーとして製された本発明のダチョウ抗体は、携行に便利であり得る。
【実施例】
【００３７】
（実施例１：ダチョウおよびニワトリにクロストリディウム・ディフィシル毒素を免疫して作製した卵黄抗体の反応性）
抗体作製方法：
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ（５０μｇ）と毒素Ｂ（５０μｇ）（ハーバード大学Ｃｉａｒａｎ  Ｐ．Ｋｅｌｌｙ教授提供）の混合液をフロイントの完全アジュバント０．２ｍＬと混和し、いずれも成熟した雌のダチョウおよびニワトリにそれぞれ初回免疫した（計５羽のダチョウおよび５羽のニワトリに接種した）。ダチョウ１羽にもニワトリ１羽にも同量の抗原を接種した点に留意されたい。初回免疫後、２週目と４週目に上記と同量の抗原とフロイントの不完全アジュバントの混和液を、各鳥に追加免疫した。初回免疫後８週目に得られた各鳥からの卵の卵黄より卵黄抗体（ＩｇＹ）を精製した。得られた卵黄抗体の反応性をＥＬＩＳＡにより検証した。【００３８】
ＥＬＩＳＡ法：
９６穴ＥＬＩＳＡプレートの各穴に各毒素１０μｇを別々に固層化した（室温で４時間）。その後、ダチョウ抗体（各３羽のダチョウから得た卵黄からの抗体の混合物）、ニワトリ抗体（各３羽のニワトリから得た卵黄からの抗体の混合物）の段階希釈液（原液は２ｍｇ／ｍＬ）を各穴に滴下し、室温で１時間反応させた。洗浄後、各抗体に対するＨＲＰ標識２次抗体を室温で１時間反応させた。十分な洗浄後、ペルオキシダーゼ用発色キット（Ｓ−Ｂｉｏ  ＳＵＭＩＬＯＮ）を用いてプレートリーダーにて吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。免疫前の各鳥種の卵黄抗体の２倍以上の吸光度値を示す最大希釈倍率をＥＬＩＳＡ値として示した。【００３９】
結果：
ダチョウおよびニワトリから毒素ＡおよびＢに反応するＩｇＹ抗体が作製された。同量の抗原を免疫したのにもかかわらず、巨大なダチョウでも反応性が高い抗体が産生されており、ダチョウが少量の抗原から高感度の抗体を産生できることが理解される（表１）。毒素Ａについてはダチョウ抗体とニワトリ抗体の反応性は同等であるが、毒素Ｂに関してはニワトリ抗体のほうがダチョウ抗体よりも反応性が高かった。【００４０】
【表１】
2019088230.tif 000003
【００４１】
（実施例２：クロストリディウム・ディフィシル毒素を免疫して作製したＩｇＹ抗体の毒素中和化効果）
実施例１において作製したダチョウ抗体およびニワトリ抗体のクロストリディウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢに対する中和活性（不活性化）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、およびマウスを用いた動物実験において検証した。【００４２】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの中和活性：
９６ウェルマイクロプレートに３Ｔ３細胞を培養し、各濃度のクロストリディウム・ディフィシル毒素Ａ（１０−３、１０−２、１０−１、１、１０μｇ／ｍＬ）を添加した。その後、全てのウェルにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）または実施例１において作製したＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  毒素に対するダチョウＩｇＹ（ｏｓｔｒｉｃｈ  ＩｇＹ）（５ｍｇ／ｍＬ）またはニワトリＩｇＹ（ｃｈｉｃｋｅｎ  ＩｇＹ）（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。４８時間後に顕微鏡下で細胞を観察し、細胞変性効果を示すウェルの割合を算出した（図１）。【００４３】
同様に９６ウェルマイクロプレートに３Ｔ３細胞を培養し、各濃度のクロストリディウム・ディフィシル毒素Ｂ（１０−８から１０−１μｇ／ｍＬ）を添加した。その後、全てのウェルにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）または実施例１において作製したクロストリディウム・ディフィシル毒素に対するダチョウＩｇＹ（ｏｓｔｒｉｃｈ  ＩｇＹ）（５ｍｇ／ｍＬ）またはニワトリＩｇＹ（ｃｈｉｃｋｅｎ  ＩｇＹ）（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。４８時間後に顕微鏡下で細胞を観察し、細胞変性効果を示すウェルの割合を算出した（図２）。【００４４】
３Ｔ３細胞に毒素を添加すると、変性した細胞はウェル内で丸く浮かぶ。２０％以上がこのような丸く浮いた細胞になったときに、毒素による細胞変性効果が生じたと判断した。【００４５】
ＰＢＳ投与群（コントロール）およびニワトリＩｇＹ抗体と比較して、ダチョウＩｇＹでは細胞変性効果が著しく抑制された。各毒素に対する反応性（ＥＬＩＳＡ）はダチョウＩｇＹとニワトリＩｇＹとで顕著な差はないが、細胞に対する毒素の不活性化（中和性）という点においては、ニワトリＩｇＹではほとんど効果がないのに対してダチョウＩｇＹでは予想外に効果的であった。【００４６】
結果として、ダチョウＩｇＹは極めて高い細胞変性の抑制効果を示したが、ニワトリＩｇＹはダチョウＩｇＹの２倍量を添加したにもかかわらず、抑制効果がほとんど示されなかった。【００４７】
動物実験による検証：
クロストリディウム・ディフィシル毒素Ａ
Ｃ５４ＢＬマウス（６週齢メス）に免疫前ダチョウＩｇＹ（ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ  Ｏｓｔｒｉｃｈ  ＩｇＹ）（ネガティブコントロール）または実施例１において作製したクロストリディウム・ディフィシル毒素に対するダチョウＩｇＹ（Ｏｓｔｒｉｃｈ  ＩｇＹ  ａｇａｉｎｓｔ  ＣＤＴ）を、マウス１匹につきそれぞれ３ｍｇ腹腔内投与した（各ＩｇＹにつきマウス２０匹）。２時間後に、致死量のクロストリディウム・ディフィシル毒素Ａ（２００ｎｇ／マウス）を腹腔内投与し、その後の生死を経時的に記録した（図３）。Ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ  ＩｇＹを投与したマウスはクロストリディウム・ディフィシル毒素Ａにより、１００分までに全て死亡したが、クロストリディウム・ディフィシル毒素に対するダチョウＩｇＹ投与群では、すべてのマウスが生存した。つまり、クロストリディウム・ディフィシル毒素を免疫原として作製したダチョウＩｇＹ抗体はマウス体内でクロストリディウム・ディフィシル毒素Ａを中和（不活性化）でき、致死を完全に抑制できることが示された。【００４８】
同様に、Ｃ５４ＢＬマウス（６週齢メス）に免疫前ニワトリＩｇＹ（ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ  Ｏｓｔｒｉｃｈ  ＩｇＹ）（ネガティブコントロール）または実施例１において作製したクロストリディウム・ディフィシル毒素に対するニワトリＩｇＹ（ｃｈｉｃｋｅｎ  ＩｇＹ  ａｇａｉｎｓｔ  ＣＤＴ）をマウス１匹につきそれぞれ６ｍｇ腹腔内投与した（各ＩｇＹにつきマウス２０匹）。２時間後に、致死量のクロストリディウム・ディフィシル毒素Ａ（２００ｎｇ／マウス）を腹腔内投与し、その後の生死を経時的に記録した（図４）。Ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ  ＩｇＹを投与したマウスもクロストリディウム・ディフィシル毒素に対するニワトリＩｇＹを投与したマウスもクロストリディウム・ディフィシル毒素Ａにより、１００分までに全て死亡した。つまり、クロストリディウム・ディフィシルに対するニワトリＩｇＹ抗体は、ダチョウＩｇＹの２倍量をマウスに投与したにもかかわらず、クロストリディウム・ディフィシル毒素Ａによる致死を全く抑制できないことが示された。【００４９】
クロストリディウム・ディフィシルＢ：
Ｃ５７ＢＬマウス（６週齢メス）に免疫前ダチョウＩｇＹ（ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ  Ｏｓｔｒｉｃｈ  ＩｇＹ）（ネガティブコントロールとして）または実施例１において作製したクロストリディウム・ディフィシル毒素に対するダチョウＩｇＹ（Ｏｓｔｒｉｃｈ  ＩｇＹ  ａｇａｉｎｓｔ  ＣＤＴ）をマウス１匹につきそれぞれ３ｍｇ腹腔内投与した（各ＩｇＹにつきマウス２０匹）。２時間後に、致死量のクロストリディウム・ディフィシル毒素Ｂ（２００ｎｇ／マウス）を腹腔内投与し、その後の生死を経時的に記録した（図５）。Ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ  ＩｇＹを投与したマウスはクロストリディウム・ディフィシル毒素Ｂにより、４２０分までに全て死亡したが、クロストリディウム・ディフィシル毒素を免疫原として作製したダチョウＩｇＹ抗体投与では、すべてが生存した。つまり、クロストリディウム・ディフィシル毒素を免疫原として作製したダチョウＩｇＹ抗体はマウス体内でクロストリディウム・ディフィシル毒素Ｂを中和（不活性化）でき、致死を完全に抑制できることが示された。【００５０】
同様に、Ｃ５４ＢＬマウス（６週齢メス）に免疫前ニワトリＩｇＹ（ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ  Ｏｓｔｒｉｃｈ  ＩｇＹ）（ネガティブコントロールとして）または実施例１において作製したクロストリディウム・ディフィシル毒素に対するニワトリＩｇＹ（ｃｈｉｃｋｅｎ  ＩｇＹ  ａｇａｉｎｓｔ  ＣＤＴ）をマウス１匹につきそれぞれ６ｍｇ腹腔内投与した（各ＩｇＹにつきマウス２０匹）。２時間後に、致死量のクロストリディウム・ディフィシル毒素Ｂ（２００ｎｇ／マウス）を腹腔内投与し、その後の生死を経時的に記録した（図６）。Ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ  ＩｇＹを投与したマウスはクロストリディウム・ディフィシル毒素Ｂにより１００分までに全て死亡した。クロストリディウム・ディフィシルに対するニワトリＩｇＹ抗体を投与したマウスでは４２０分後では僅か２０％が生存した。つまり、クロストリディウム・ディフィシルに対するニワトリＩｇＹ抗体はダチョウＩｇＹの２倍量をマウスに投与したにもかかわらず、クロストリディウム・ディフィシル毒素Ｂによる致死抑制は極めて低いことが示された。【００５１】
以上のとおり、マウスにクロストリディウム・ディフィシル毒素ＡおよびＢを腹腔内２００ｎｇ投与すると１００％致死が認められるが、毒素投与前にダチョウＩｇＹを腹腔内投与（３ｍｇ）しておくと毒素Ａ（図３）および毒素Ｂ（図５）共に全てが生存した（つまり致死率０％）。しかしながら、ニワトリＩｇＹを腹腔内投与した場合は６ｍｇ（ダチョウＩｇＹの２倍量）でも、毒素Ａでは致死率が１００％（図４）、Ｂでは２０％（図６）であった。つまり、ダチョウＩｇＹはマウス体内においてもクロストリディウム・ディフィシル毒素を不活性化でき高い予防・治療効果を有するが、ニワトリＩｇＹはほとんど効果が観察されず、予想外にダチョウＩｇＹが優れていることが明らかになった。【００５２】
（実施例３：コレラ毒素を免疫して作製したダチョウＩｇＹ抗体）
要旨：
本実施例においては、ダチョウにＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａの毒素（ＣＴ）を免疫することにより、高感度の抗ＣＴダチョウＩｇＹを作製することに成功した（図７）。【００５３】
ハムスターを用いた動物実験により、抗ＣＴダチョウＩｇＹの経口投与によりコレラ毒素による症状を抑えられることが判明した（図８）。理論に束縛されることは望まないが、これは、消化管内でダチョウＩｇＹがコレラ毒素と抗原抗体反応し、その毒性を抑制できるからであると考えられる。【００５４】
さらに、ダチョウＩｇＹ含有キャンディーの摂取により、コレラ毒素による症状を抑えられることが判明した（図９、図１０）。理論に束縛されることは望まないが、これは、消化管内でダチョウＩｇＹキャンディー内からのＩｇＹがコレラ毒素と抗原抗体反応し、毒性を抑制できるからであると考えられる。【００５５】
以上の結果から、ダチョウにより高感度抗体が大量生産でき、さらに経口摂取によりコレラの症状抑制ができることが分かる。したがって、食品として実用化も期待される。また、他の消化管感染症対策用の経口用抗体としても期待される。【００５６】
抗体作製方法：
成熟したメスダチョウを用いた。コレラ毒素（ＣＴ）（シグマ・アルドリッチ、東京、日本）（５０μｇ）をフロイントの完全アジュバント０．２ｍＬと混和し、１羽のダチョウに初回免疫した。初回免疫後、２週目と４週目に上記と同量の抗原とフロイントの不完全アジュバントの混和液を追加免疫した。初回免疫後８週目に得られた各鳥からの卵の卵黄より卵黄抗体（ＩｇＹ）を精製した。得られた卵黄抗体（ＩｇＹ）の反応性をＥＬＩＳＡにより検証した。【００５７】
ＥＬＩＳＡ法：
９６穴ＥＬＩＳＡプレートの各穴にＣＴ（１０μｇ）を別々に固層化した（室温で４時間）。その後、ダチョウＩｇＹの段階希釈液（原液は２ｍｇ／ｍＬ）を各穴に滴下し、室温で１時間反応させ、洗浄後、各抗体に対するＨＲＰ標識２次抗体を室温で１時間反応させた。十分な洗浄後、ペルオキシダーゼ用発色キット（Ｓ−Ｂｉｏ  ＳＵＭＩＬＯＮ）を用いてプレートリーダーにて吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。【００５８】
結果：
ＣＴを免疫して作製したダチョウＩｇＹは免疫前ダチョウＩｇＹ（ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ  ＩｇＹ）と比較してＣＴに対して強い反応性を示した（図７）。ダチョウ卵黄１個から約４ｇのＩｇＹが精製されたので、高品質（反応性が高い）ＩｇＹが大量生産されることになる。【００５９】
チャイニーズハムスターへの抗体投与：
免疫前ダチョウＩｇＹ（Ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ  ＩｇＹ）（ネガティブコントロール）およびコレラ毒素を免疫して作製したダチョウＩｇＹ（Ｏｓｔｒｉｃｈ  ＩｇＹ）それぞれ１４ｍｇを成熟したチャイニーズハムスター（１２ヶ月齢雌）に経口投与した（各ＩｇＹを計１０匹に投与）。１０分後に、ＰＢＳに溶解したコレラ毒素（ＣＴ）１００μｇを各ハムスターに経口投与した。ＣＴ投与６時間後に消化管病変を病理解剖により評価した。【００６０】
結果：Ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ  ＩｇＹとＣＴを投与したハムスター全てにおいて、消化管（特に十二指腸〜結腸）の膨大と水溶性内容物の貯留が顕著に認められた（図８Ａ）。一方、  Ｏｓｔｒｉｃｈ  ＩｇＹとＣＴを投与したハムスターにおいて、９０％の個体で病変は認められなかった（消化管の膨大など）（図８Ｂ）。【００６１】
結論：コレラ毒素に対するダチョウＩｇＹを経口摂取することでコレラ感染時の毒素による発症が抑制された。【００６２】
（実施例４：キャンディーによる投与）
免疫前ダチョウＩｇＹ（Ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ  ＩｇＹ）（ネガティブコントロール）または実施例３においてコレラ毒素を免疫原として作製したダチョウＩｇＹ（ａｎｔｉ  ＣＴ）を含有した３ｇのキャンディー（ＩｇＹ含有量０．２ｍｇ）を成熟したチャイニーズハムスター（１２ヶ月齢雌）に経口投与した（各ＩｇＹキャンディーを計１０匹に投与）。【００６３】
キャンディーは、以下のように作製した。まず、メイプルシロップを１１０℃に加熱し、水分を蒸発させた。７０℃に冷却したのちダチョウ抗体液（コレラ毒素に対するダチョウＩｇＹ液（１５ｍｇ／ｍＬ、リン酸緩衝液に溶解））を添加し（キャンディー３ｇにダチョウＩｇＹ０．２ｍｇが配合できるように抗体液を添加する）、その後、一気に冷蔵庫において冷却して固形化した。十分に固まった状態で３ｇずつに切り分け、ハムスターに経口投与した。【００６４】
経口投与は、１０分後にコレラ毒素（ＣＴ）１００μｇずつ各ハムスターに行った。ＣＴ投与６時間後に消化管病変を病理解剖により評価した。また各臓器の重量を計測し、各ＩｇＹキャンディー投与１０匹の平均値、ＳＤおよび有意差検定（ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ）を行った（＊Ｐ＜０．０５  有意差有り）。【００６５】
結果：Ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ  ＩｇＹ含有キャンディーとＣＴを投与したハムスター全てにおいて、消化管（特に十二指腸〜結腸）の膨大と水溶性内容物の貯留が顕著に認められた（図９Ａ）。一方、ＣＴを免疫原としたダチョウＩｇＹ含有キャンディーとＣＴを投与したハムスターにおいては、全ての個体で病変（消化管の膨大など）は認められなかった（図９Ｂ）。臓器重量においても、ＣＴを免疫原として作製したダチョウＩｇＹ含有キャンディーの経口投与で各消化管の膨大が抑制された（図１０）【００６６】
結論：コレラ毒素に対するダチョウＩｇＹ含有食品を経口摂取することでコレラ感染時の毒素による発症が抑制された。コレラ感染の経口予防薬や治療用の食品となる可能性が示された。【００６７】
（実施例４：薬剤耐性菌に対するダチョウ抗体の有用性）
黄色ブドウ球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ；ＮＢＲＣ１０２１３５）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｏｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（以下、ＭＲＳＡ）（Ｌ２０Ａ株ＪＣＭ１６５５４）の２つの細菌を用いて、ダチョウ抗体の薬剤耐性菌による感染症治療への可能性を検討した。【００６８】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの培養懸濁液を遠心分離し、沈殿させた。培養液を取り去り、リン酸緩衝液（ｐＨ７）を加え細菌を浮遊させ、ホモジナイザーにて細菌菌体を４℃で破砕した。このホモジネートをダチョウに免疫した。【００６９】
ダチョウへの免疫
初回免疫：フロイントの完全アジュバントにタンパク質量として１００μｇの上記それぞれのホモジネートを混和し、メスのダチョウの腰部の筋肉内に接種した。
追加免疫：初回免疫後、上記３パターンともに隔週毎に３回追加免疫した。フロイントの不完全アジュバントに１００μｇの細菌ホモジネート液を混和し、メスのダチョウの腰部の筋肉内に接種した。【００７０】
追加免疫２週後以降に産卵されるダチョウ卵より抗体を精製した。【００７１】
抗体の精製： 
卵黄からの抗体（ＩｇＹ）の精製は以下のように行った。【００７２】
まず、卵黄に５倍量のＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５％ＮａＮ３）と同量の１０％デキストラン硫酸／ＴＢＳを加え２０分攪拌した。そして１ＭＣａＣｌ２／ＴＢＳを卵黄と同量加え攪拌し、１２時間静置した。その後、１５０００ｒｐｍで２０分遠心し上清を回収した。次に、最終濃度４０％になるように硫酸アンモニウムを加え４℃で１２時間静置した。その後、１５０００ｒｐｍで２０分遠心し、沈殿物を回収した。最後に、卵黄と同量のＴＢＳに再懸濁し、ＴＢＳにて透析した。この過程により９０％以上の純度のＩｇＹの回収が可能であった。１個の卵黄より２〜４ｇのＩｇＹ抗体を精製することができた。【００７３】
ダチョウＩｇＹ抗体によるＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＭＲＳＡの増殖抑制効果
培養前の細菌液（Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＭＲＳＡ）のそれぞれに、１ｍｇ／ｍＬとなるようにダチョウＩｇＹまたはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を混和し、それぞれ寒天培地（半径１０ｃｍのシャーレに細菌液０．１ｍｌを培養）にて１８時間培養した。細菌のコロニーをカウントしＰＦＵ（プラークフォーミングユニット）を算出した。【００７４】
結果：Ｓ．ａｕｒｅｕｓを免疫して作製したダチョウＩｇＹはＳ．ａｕｒｅｕｓ（図１１）だけでなく、さらにＭＲＳＡ（図１２）の増殖を顕著に抑制することが判明した。免疫前ダチョウＩｇＹ（ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ  ｏｓｔｒｉｃｈ  ＩｇＹ）（ネガティブコントロール）にはＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＭＲＳＡ共に抑制効果が認められなかった。したがって、細菌を免疫して作製するダチョウＩｇＹは、多剤耐性菌などの薬剤耐性菌の抑制剤として期待できる可能性が示された。【００７５】
比較例：ウサギＩｇＧ抗体による薬剤耐性菌の増殖抑制効果の検討
Ｓ．ａｕｒｅｕｓのホモジネートを免疫して作製したウサギＩｇＧ（ポリクローナル抗体）を用いて、実施例４と同様にＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＭＲＳＡの増殖抑制能を検討した。【００７６】
抗体作製法：
ウサギへの免疫法は、接種場所がウサギ後肢皮内接種である以外はダチョウと同様であった（接種量、回数も同一）。初回免疫の２か月目にウサギより全血液を採取し、血清を分離し、プロテインＧカラムにてＩｇＧを精製した。ＥＬＩＳＡではＳ．ａｕｒｅｕｓのホモジネートに対するダチョウＩｇＹおよびウサギＩｇＧの反応性はそれぞれ、ＥＬＩＳＡ値４０４，８００、ＥＬＩＳＡ値２０２，４００であり、同等のであった。【００７７】
ウサギＩｇＧ（ポリクローナル抗体）によるＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＭＲＳＡの増殖抑制効果
培養前の細菌液（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、ＭＲＳＡ）に１０ｍｇ／ｍＬとなるようにウサギＩｇＧまたはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を混和し、それぞれ寒天培地（半径１０ｃｍのシャーレに細菌液０．１ｍｌを培養）にて１８時間培養した。ウサギＩｇＧを用いたＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＭＥＲＳの増殖抑制試験には、実施例４のダチョウＩｇＹの１０倍量の／ｍＬを用いた点に留意されたい。細菌のコロニーをカウントしＰＦＵ（プラークフォーミングユニット）を算出した。【００７８】
結果：Ｓ．ａｕｒｅｕｓを免疫して作製したウサギＩｇＧはＳ．ａｕｒｅｕｓの増殖を抑制した（図１３）一方で、ＭＲＳＡの増殖は抑制されなかった（図１４）。免疫前ウサギＩｇＧ（ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ）（ネガティブコントロール）にはＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＭＲＳＡ共に抑制効果が認められなかった。したがって、ある細菌を免疫原として作製した抗体が、その細菌から派生した薬剤耐性菌にも効果を有するというダチョウ抗体において見出された事象（実施例４）は、他の生物由来の抗体では見られないダチョウ抗体特異的なものであることが示された。【００７９】
（実施例５：Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ成分を免疫原とするダチョウ抗体の消化管内安定性）
実施例１と同様に、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａを免疫原として作製したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａに対するダチョウＩｇＹまたはニワトリＩｇＹを溶解した水溶液（５ｍｇ抗体／ｍＬ）を、成熟雌マウス（Ｃ５７ＢＬ）に１ｍｇ抗体／匹の用量で経口投与した（各抗体につき５匹）。
投与後、１時間ごとに糞を肛門から回収し、５匹分をまとめて糞の２０倍重量のＰＢＳに溶解しＥＬＩＳＡに用いた。マウスに経口投与した抗体の１０倍希釈液を「抗体液」としてＥＬＩＳＡに用いた。【００８０】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂを免疫原とする抗体に関しても同様の実験を行った。すなわち、実施例１と同様に、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂを免疫原として作製したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂに対するダチョウＩｇＹまたはニワトリＩｇＹを溶解した水溶液（５ｍｇ抗体／ｍＬ）を、成熟雌マウス（Ｃ５７ＢＬ）に１ｍｇ抗体／匹の用量で経口投与した（各抗体につき５匹）。
投与後、１時間ごとに糞を肛門から回収し、５匹分をまとめて糞の２０倍重量のＰＢＳに溶解しＥＬＩＳＡに用いた。マウスに経口投与した抗体の１０倍希釈液を「抗体液」としてＥＬＩＳＡに用いた。【００８１】
ＥＬＩＳＡ測定は、実施例１と同様に実施した。【００８２】
毒素Ａおよび毒素Ｂを免疫原とする抗体の結果を、それぞれ図１５および図１６に示す。投与３時間後以降の結果から、ダチョウから取得した抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ抗体および抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ抗体はいずれも、糞の中で抗原との結合活性を保持することが判明した。他方、ニワトリ抗体ではこのような活性は認められなかった。この結果は、ダチョウ由来の抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ抗体および抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ｂ抗体は、経口投与後、胃酸や消化酵素に曝露されるにもかかわらず、消化管内で機能的であることを示す。【００８３】
（実施例６：コレラ成分を免疫原とするダチョウ抗体の消化管内安定性）
実施例３と同様に作製したコレラ毒素に対するダチョウＩｇＹまたはニワトリＩｇＹを溶解した水溶液（５ｍｇ抗体／ｍＬ）を、成熟雌マウス（Ｃ５７ＢＬ）に１ｍｇ抗体／匹の用量で経口投与した（各抗体につき５匹）。
投与後、１時間ごとに糞を肛門から回収し、５匹分をまとめて糞の２０倍重量のＰＢＳに溶解しＥＬＩＳＡに用いた。マウスに経口投与した抗体の１０倍希釈液を「抗体液」としてＥＬＩＳＡに用いた。【００８４】
ＥＬＩＳＡ測定は、実施例１と同様に実施した。【００８５】
結果を図１７に示す。投与３時間後以降の結果から、ダチョウから取得した抗コレラ毒素ＩｇＹは、糞の中で抗原との結合活性を保持することが判明した。他方、ニワトリＩｇＹではこのような活性は認められなかった。この結果は、ダチョウ由来の抗コレラ毒素ＩｇＹは、経口投与後、胃酸や消化酵素に曝露されるにもかかわらず、消化管内で機能的であることを示す。【００８６】
（実施例７：各抗体のキャンディー内安定性）
キャンディーとして調製したダチョウ抗体の安定性を試験した。
各抗体は以下の通りに作製した。実施例１と同様に、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ（ホモジネートまたは毒素）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（ホモジネートまたは毒素）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ホモジネートまたはエンテロトキシン）を免疫原として雌のダチョウまたは雌のニワトリに免疫し、卵よりＩｇＹを精製した。【００８７】
ホモジネートは以下のように調製した。各細菌の培養懸濁液をそれぞれ遠心分離し、沈殿させた。培養液を除去し、リン酸緩衝液（ｐＨ７）を加え細菌を浮遊させ、ホモジナイザーにて細菌菌体を４℃で破砕した。【００８８】
実施例１と同様に、ＥＬＩＳＡで抗体価を測定し、それぞれの抗体価が６５５３６になるように、抗体液量を調整した。【００８９】
これらの抗体を以下の通りキャンディーとして調製した。砂糖と水飴を混和して加熱し９０度に溶解した状態で各ダチョウＩｇＹ（ＥＬＩＳＡ値６５５３６）または各ニワトリＩｇＹ（ＥＬＩＳＡ値６５５３６）を添加し全体的に分散するまで混錬して冷却し、各粒が３ｇとなるように成形した。１つの飴を１０ｍＬのＰＢＳに溶解し、それを原液としてＥＬＩＳＡに用いた。コントロールとして、免疫前ダチョウＩｇＹ（１５ｍｇ／ｍＬ）と免疫前ニワトリＩｇＹ（１５ｍｇ／ｍＬ）をキャンディー３ｇ毎に０．１ｍＬになるように混和した。【００９０】
作製したキャンディー中の抗体の活性をＥＬＩＳＡで評価した。ここで、ＥＬＩＳＡは以下の通り実施した。９６穴ＥＬＩＳＡプレートの各穴に各抗原（２μｇ）を別々に固層化した（室温で４時間）。その後、各抗体を混和したキャンディーの溶解液の段階希釈液を各穴に滴下し、室温で１時間反応させ、洗浄後、各抗体に対するＨＲＰ標識２次抗体を室温で１時間反応させた。十分な洗浄後、ペルオキシダーゼ用発色キット（Ｓ−Ｂｉｏ  ＳＵＭＩＬＯＮ）を用いてプレートリーダーにて吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。免疫前ダチョウＩｇＹまたは免疫前ニワトリＩｇＹを用いた時の吸光度の２倍以上を示す最大希釈倍率をＥＬＩＳＡ値とした。ここで、キャンディーの基材がＥＬＩＳＡ測定の障害となるため、ＥＬＩＳＡ測定に供した試料は、キャンディー調製時の半分の濃度となるように抗体を含むように希釈した。【００９１】
その結果、以下の表に示す通りのＥＬＩＳＡ値が測定された。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【００９２】
コレラおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対するダチョウＩｇＹはキャンディーに加工しても高い活性が認められたが、ニワトリのＩｇＹはほとんど失活した。全ての抗体が活性を維持していた場合の測定ＥＬＩＳＡ値は３２７６８と計算されるため、ダチョウ抗体では、例えば、抗コレラ菌体ホモジネート抗体において１２．５％、抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ抗体において５０％がキャンディー化後でも活性を維持していたと計算できる。表皮ブドウ球菌に関しては、ダチョウおよびニワトリＩｇＹ共に失活した。【００９３】
これらの結果から、ダチョウＩｇＹはキャンディーに加工しても高い抗原反応性が保持され得ること、およびダチョウ抗体の安定性は標的とする抗原によって異なり得ることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明により、細菌の感染症の処置（治療および予防）用の医薬品や食品（キャンディー等）が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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