(57)【要約】  粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして９．１°、１０．３°、１３．８°、１７．７°、１８．３°、２４．０°、２７．４°、３１．２°、３９．５°（いずれも±０．２°）を示すピロロキノリンキノンのジナトリウム塩結晶、または粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして６．６°、１１．４°、１３．０°、２２．６°、２６．９°、２７．９°、３７．０°、３８．９°、４３．４°（いずれも±０．２°）を示すピロロキノリンキノンのトリナトリウム塩結晶。
2011007633.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして９．１°、１０．３°、１３．８°、１７．７°、１８．３°、２４．０°、２７．４°、３１．２°、３９．５°（いずれも±０．２°）を示すピロロキノリンキノンのジナトリウム塩結晶。
【請求項２】
粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして６．６°、１１．４°、１３．０°、２２．６°、２６．９°、２７．９°、３７．０°、３８．９°、４３．４°（いずれも±０．２°）を示すピロロキノリンキノンのトリナトリウム塩結晶。
【請求項３】
水溶性有機溶媒を１０〜９０（v/v）％含むピロロキノリンキノントリナトリウム塩の水溶液及び／又は懸濁液を用意し、該水溶液及び／又は懸濁液をｐＨ２〜５の範囲に調整してピロロキノリンキノンのジナトリウム塩を結晶化させることを含む、請求項１に記載のピロロキノリンキノンのジナトリウム塩結晶の製造方法。
【請求項４】
水溶性有機溶媒がアルコールであることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
アルコールがエタノールであることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
懸濁状態で結晶化を行うことを特徴とする請求項３から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ピロロキノリンキノンのトリナトリウム塩の水溶液及び／又は懸濁液に水溶性有機溶媒を１０〜９０（v/v）％の濃度になるように添加し、得られた水溶液及び／又は懸濁液をｐＨ６〜１０の範囲に保持してピロロキノリンキノンのトリナトリウム塩を結晶化させることを含む、請求項２に記載のピロロキノリンキノンのトリナトリウム塩結晶の製造方法。
【請求項８】
水溶性有機溶媒がアルコールであることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
アルコールがエタノールであることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ピロロキノリンキノンのトリナトリウム塩の水溶液及び／又は懸濁液をｐＨ６〜１０の範囲に保持して塩析を行うことによりピロロキノリンキノンのトリナトリウム塩を結晶化させることを含む、請求項２に記載のピロロキノリンキノンのトリナトリウム塩結晶の製造方法。
【請求項１１】
請求項１または２記載のピロロキノリンキノンのナトリウム塩結晶を含む機能性食品。
【請求項１２】
請求項１または２記載のピロロキノリンキノンのナトリウム塩結晶を含む医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピロロキノリンキノンのナトリウム塩の新規結晶およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）は新しいビタミンの可能性があることが提案されて注目を集めている（例えば、非特許文献１参照）。ＰＱＱは細菌に限らず、真核生物のカビ、酵母に存在し、補酵素として重要な働きを行っている。また、ＰＱＱについて近年までに細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防治療作用、創傷治癒作用、抗アレルギー作用、逆転写酵素阻害作用およびグリオキサラーゼＩ阻害作用−制癌作用、神経線維再生作用など多くの生理活性が明らかにされている。【０００３】
ＰＱＱは、有機化学的合成法（非特許文献２）および発酵法（特許文献１）などにより製造することが可能である。しかし、これらの方法で得られるＰＱＱは水や不純物の含量が多く、安定で純度の高いＰＱＱの結晶を得る技術が求められていた。【０００４】
これまでに、ＰＱＱのジナトリウム塩を燐酸バッファー中で蒸発濃縮することで、Ｘ線結晶構造解析において単結晶を示すＰＱＱのナトリウム塩結晶が得られていた（非特許文献３）。しかし、この方法は大量製造には向いていない。また、塩析での方法は大量使用するＮａＣｌのような塩が析出した固体中に混入するために、存在する塩を取り除く操作が必要で、その塩のために安定な品質を保証するための分析が困難になる欠点があった。【０００５】
このような欠点がないＰＱＱの結晶を得る方法として、水溶性有機溶媒を添加することで再結晶をする方法が報告されている（特許文献２）。しかし、この文献には結晶形の情報はなく、また、本発明者らがエタノールを使用した再結晶について確認実験を行ったところ、ＰＱＱジナトリウム塩の結晶性が低く、乾燥後も溶媒として用いたエタノールが残留しやすく、安定な品質の結晶を提供するのが困難であった。さらにエタノール再結晶法では、固体を析出させるために冷却設備を必要とし、処理費用が高くなる欠点があった。【０００６】
また、ＰＱＱトリナトリウム塩については、ジナトリウム塩と異なり、これまでに結晶に関する報告はなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第２７５１１８３号
【特許文献２】特公平７−１１３０２４号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nature, vol422, 24 April, 3003, p832
【非特許文献２】JACS, 第103巻, 第5599〜5600頁（1981）
【非特許文献３】JACS, 第111巻, 第6822〜6828頁（1989）
【発明の概要】
【０００９】
ＰＱＱの薬学的価値を考慮すると、温度、光、湿度または酸素レベルなどの保存条件を厳密に制御することなく長期間保存ができるような、安定で、明確な結晶形態の結晶を、再現可能に高純度で得ることが重要である。したがって、本発明の課題はＰＱＱナトリウム塩の安定な結晶を提供すること、そしてその製造法を提供することである。
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、ＰＱＱナトリウム塩の結晶化の条件を工夫することにより、上記課題を解決しうるＰＱＱのナトリウム塩の新規な結晶を高純度で得ることに成功し、本発明を完成させた。
【００１１】
本発明は以下のとおりである。
（１）粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして９．１°、１０．３°、１３．８°、１７．７°、１８．３°、２４．０°、２７．４°、３１．２°、３９．５°（いずれも±０．２°）を示すピロロキノリンキノンのジナトリウム塩結晶。
（２）粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして６．６°、１１．４°、１３．０°、２２．６°、２６．９°、２７．９°、３７．０°、３８．９°、４３．４°（いずれも±０．２°）を示すピロロキノリンキノンのトリナトリウム塩結晶。
（３）水溶性有機溶媒を１０〜９０（v/v）％含むピロロキノリンキノントリナトリウム塩の水溶液及び／又は懸濁液を用意し、該水溶液及び／又は懸濁液をｐＨ２〜５の範囲に調整してピロロキノリンキノンのジナトリウム塩を結晶化させることを含む、（１）に記載のピロロキノリンキノンジナトリウム塩結晶の製造方法。
（４）水溶性有機溶媒がアルコールであることを特徴とする（３）記載の方法。
（５）アルコールがエタノールであることを特徴とする（４）記載の方法。
（６）懸濁状態で結晶化を行うことを特徴とする（３）から（５）のいずれかに記載の方法。
（７）ピロロキノリンキノントリナトリウム塩の水溶液及び／又は懸濁液に水溶性有機溶媒を１０〜９０（v/v）％の濃度になるように添加し、得られた水溶液及び／又は懸濁液をｐＨ６〜１０の範囲に保持してピロロキノリンキノントリナトリウム塩を結晶化させることを含む、（２）に記載のピロロキノリンキノントリナトリウム塩結晶の製造方法。
（８）水溶性有機溶媒がアルコールであることを特徴とする（７）記載の方法。
（９）アルコールがエタノールであることを特徴とする（８）記載の方法。
（１０）ピロロキノリンキノントリナトリウム塩の水溶液及び／又は懸濁液をｐＨ６〜１０の範囲に保持して塩析を行うことによりピロロキノリンキノントリナトリウム塩を結晶化させることを含む、（２）記載のピロロキノリンキノントリナトリウム塩結晶の製造方法。
（１１）（１）または（２）記載のピロロキノリンキノンのナトリウム塩結晶を含む機能性食品。
（１２）（１）または（２）記載のピロロキノリンキノンのナトリウム塩結晶を含む医薬。
【００１２】
本発明により、高純度で安定なＰＱＱナトリウム塩の結晶を提供し、さらにその安定的な製造方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１で得られた結晶の粉末Ｘ線回折スペクトルを示す図。
【図２】実施例１で得られた結晶の熱分析データを示す図。
【図３】実施例３で得られた結晶の粉末Ｘ線回折スペクトルを示す図。
【図４】比較例１において再結晶法で得られた固体の粉末Ｘ線回折スペクトルを示す図。
【図５】比較例２においてメタノール中で結晶化して得られた固体の粉末Ｘ線回折スペクトルを示す図。
【図６】比較例３において単結晶データからシミュレートした粉末Ｘ線回折スペクトルを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）は、式１で表される構造の物質を意味する。
【化１】
2011007633.tif 000003
【００１５】
本願の第一の発明に係る結晶（以下、結晶１と呼ぶ）は、粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた反射角２θのピークとして９．１°、１０．３°、１３．８°、１７．７°、１８．３°、２４．０°、２７．４°、３１．２°、３９．５°（いずれも±０．２°）を示すＰＱＱジナトリウム塩の結晶である。
【００１６】
粉末Ｘ線回折による回折角２θの測定は、例えば、以下の測定条件で行うことができる。
装置：株式会社マックサイエンス製Ｍ１８ＸＣＥ
Ｘ線：Cu／管電圧４０kV／管電流１００Ma
発散スリット：1°
散乱スリット：1°
受光スリット：0.3mm
スキャンスピード：4.000°／min
サンプリング幅：0.020°
【００１７】
なお、これらのピークは、その他、モノクロメータが装着された一般的な粉末Ｘ線回折装置で観測することもできる。なお、本発明で規定する結晶形は測定誤差も含まれることから、ピークの角度に関する合理的な同一性があればよい。
【００１８】
従来のエタノール再結晶法で得られたＰＱＱジナトリウム塩の場合、このような多くの回折ピークは現れず、従来のものは結晶性が低い固体であると考えられた。
【００１９】
結晶１を製造する方法としては、例えば、水にＰＱＱのトリナトリウム塩を溶解及び／又は懸濁させ、この溶液及び／又は懸濁液に水溶性有機溶媒を１０〜９０（v/v）％、好ましくは２０〜８０（v/v）％の濃度になるように加えた後、ｐＨを２〜５の範囲に調整して結晶化させる方法が挙げられる。また、水溶性有機溶媒にＰＱＱトリナトリウム塩を溶解及び／又は懸濁させた後、水溶性有機溶媒濃度が１０〜９０（v/v）％、好ましくは２０〜８０（v/v）％の濃度になるように水を加えた後、ｐＨを２〜５の範囲に調整して結晶化させてもよい。あるいは、水溶性有機溶媒を１０〜９０（v/v）％、好ましくは２０〜８０（v/v）％含む水性媒体にＰＱＱのトリナトリウム塩を溶解及び／又は懸濁させた後、ｐＨを２〜５の範囲に調整して結晶化させてもよい。
【００２０】
原料に用いるＰＱＱのトリナトリウム塩は、有機化学的合成法(例えば、JACS、第103巻、5599〜5600頁(1981))および発酵法(例えば、特開平1-218597号公報や特許2692167号)などにより製造することが可能である。原料に用いるＰＱＱのトリナトリウム塩は結晶でもよいし、非晶質でもよい。また、不純物を含んでいてもよい。
【００２１】
使用可能な水溶性有機溶媒の具体的な例をあげると、メタノール、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、メトキシエタノール、ジエチレングリコール、メトキシジエチレングリコール、グリセリン、メトキシプロパノール、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、乳酸エチル、ヒドロキシイソブチル酸メチル等がある。このうちアルコールがより好ましく、エタノールが特に好ましい。
この有機溶媒は貧溶媒としてＰＱＱの溶解度を下げるために使用するが、その濃度は初期のＰＱＱトリナトリウム塩の量にあわせて上記範囲内で適宜設定すればよい。
【００２２】
結晶の一般的製造方法においては、固体を溶媒に溶解後、貧溶媒を加えて結晶を析出させる。
しかし、本発明では固体が存在する懸濁状態でも結晶化を行うことができる。懸濁状態で操作を行えることは使用する装置の容積の低減ができ、さらに排出する排水が低減できるために好ましい。
【００２３】
結晶１を得るための具体的な操作方法としては、まず、原料のＰＱＱのトリナトリウム塩を含む水溶液及び／又は懸濁液を用意する。この際、水１Ｌ当たり０．５〜８０ｇのＰＱＱのトリナトリウム塩を加えることが好ましい。次に、当該水溶液及び／又は懸濁液に水溶性有機溶媒を添加することでＰＱＱのトリナトリウム塩の溶解度を下げる。この時に固体が析出しても問題がない。そして、ｐＨを計測しながら酸を添加し、ｐＨを２〜５に調整すればよい。
また、水溶性有機溶媒にＰＱＱのトリナトリウム塩を加えて溶解及び／又は懸濁させた後、水を加え、その後ｐＨを２〜５の範囲に調整して結晶化させてもよい。この際、加えた水溶性有機溶媒と水の合計量の１Ｌ当たり０．５〜８００ｇのＰＱＱのトリナトリウム塩を加えることが好ましい。
あるいは、水溶性有機溶媒を含む水性媒体にＰＱＱのトリナトリウム塩を加えて溶解及び／又は懸濁させた後、ｐＨを２〜５の範囲に調整して結晶化させてもよい。この際、水性媒体１Ｌ当たり０．５〜８００ｇのＰＱＱのトリナトリウム塩を加えることが好ましい。
ｐＨ調整のために加える酸の種類は特に制限されないが、塩酸、臭化水素酸、沃化水素酸、過塩素酸、硝酸、硫酸などの無機酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸などが挙げられ、その中でも塩酸が好ましい。
ｐＨが安定し、ｐＨ２〜５の間の所定の値で一定になった状態で、濾過、または遠心分離等により析出した結晶を分離して、結晶１を得ることができる。
【００２４】
ＰＱＱのトリナトリウム塩を含む水溶液及び／又は懸濁液に、水溶性有機溶媒を加える際の両液体の温度は、液の凍結が発生しない限り特に制限はないが、高温にすればエネルギー効率が落ちることから、−３０℃〜８０℃が好ましい。水溶性有機溶媒を添加した後、酸を添加してｐＨを２〜５にする際の溶液もしくは懸濁液の温度は、液の凍結が発生しない限り特に制限はないが、高温にすればエネルギー効率が落ち、また低温にすれば結晶化の速度が落ちることから、５℃〜８０℃が好ましい。必要に応じて攪拌し、その後静置するのが好ましい。攪拌時間は、例えば、５分〜７日とすることができる。静置時間は、例えば、５分〜１５日とすることができる。
【００２５】
得られた溶液では、ＰＱＱジナトリウム塩の結晶（結晶１）が生成する。後述の実施例２では、高速液体クロマトグラフィーで求めた純度が９９．５％となり、この結晶化法により、極めて高純度のＰＱＱ結晶を得ることができる。
なお、結晶１は含水物であっても良く、上記ピークを有する限り、特に制限されない。
【００２６】
本願第二の発明に係る結晶（結晶２）は、粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークとして６．６°、１１．４°、１３．０°、２２．６°、２６．９°、２７．９°、３７．０°、３８．９°、４３．４°（いずれも±０．２°）を示すＰＱＱトリナトリウム塩の結晶である。これらのピークは上記結晶１と同様の測定法による粉末Ｘ線回折で規定される。
【００２７】
結晶２は、例えば、上述したような原料のＰＱＱトリナトリウム塩を含む水溶液及び／又は懸濁液を用い、ｐＨ６〜１０の範囲で結晶化を行うことで得ることができる。
【００２８】
結晶化はナトリウムイオン存在下の塩析もしくは水溶性有機溶媒を加えることによる析出で行うことができる。トリナトリウム塩結晶の場合、ジナトリウム塩結晶と異なり、ナトリウムイオンが大過剰にあっても分析が困難になる危険性は低いため、塩析でも問題がない。ｐＨを６〜１０にあわせ、食塩、硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、燐酸ナトリウムなどを加える塩析によって得ることができる。加える塩の濃度は加えた塩が溶解する限り制限はないが、０．２wt%以上、３０wt%以下が好ましい。なお、水溶液及び／又は懸濁液がすでにｐＨが６〜１０になっている場合はｐＨ調整の必要はない。
【００２９】
水溶性有機溶媒を加える場合、メタノール、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、メトキシエタノール、ジエチレングリコール、メトキシジエチレングリコール、グリセリン、メトキシプロパノール、アセトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、乳酸エチル、ヒドロキシイソブチル酸メチル等が挙げられる。このうちアルコールがより好ましく、エタノールが特に好ましい。水溶性有機溶媒は１０〜９０（v/v）％の濃度になるように加えることが好ましく、２０〜８０（v/v）％の濃度になるように加えることがより好ましい。
なお、結晶２も含水物であっても良く、上記ピークを有する限り特に制限されない。
【００３０】
ＰＱＱは、細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防治療作用、創傷治癒作用、抗アレルギー作用、逆転写酵素阻害作用およびグリオキサラーゼＩ阻害作用−制癌作用、神経線維再生など多く薬理効果を有する。
したがって、本発明のＰＱＱ結晶１および２は、医薬または機能性食品の有効成分とすることができる。即ち、皮膚外用剤、注射剤、経口剤、坐剤等の形態、あるいは、日常食する飲食物、栄養補強食、各種病院食等の形態で提供可能である。なお、調製の際に使用される添加剤としては、液剤としては水、果糖、ブドウ糖等の糖類、落下生油、大豆油、オリーブ油等の油類、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のグリコール類を用いることができる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤などの固形剤の賦型剤としては乳糖、ショ糖、マンニット等の糖類、滑沢剤としてはカオリン、タルク、ステアリン酸マグネシウム等、崩壊剤としてデンプン、アルギン酸ナトリウム、結合剤としてポリビニルアルコール、セルロース、ゼラチン等、界面活性剤としては脂肪酸エステル等、可塑剤としてグリセリン等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。必要に応じて溶解促進剤、充填剤等を加えてもよい。
【００３１】
また、ＰＱＱは、単独でも、他の素材と組み合わせても使用できる。組み合わせ可能な素材としては、ビタミンＢ 群、ビタミンＣ およびビタミンＥ 等のビタミン類、アミノ酸類、アスタキサンチン、α-カロテン、β-カロテン等のカロテノイド類、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸等のω3脂肪酸類、アラキドン酸等のω6脂肪酸類などが例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明のＰＱＱ結晶（結晶１および結晶２）は、純度が高く、保存安定性に優れたものなので長期貯蔵可能で、医薬や機能性食品の有効成分として好適に使用することができる。
【００３３】
以下実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。  
【００３４】
＜参考例１＞
原料のＰＱＱトリナトリウム塩は以下のようにして得た。
特許公報2692167号の実施例１に基づき、ハイホミクロビウム  メチロボラム  DSM1869を培養して得られた培養液を遠心分離して、菌体を除去し、ＰＱＱを含有する培養上澄液を得た。なお、この菌株はDSM（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)から入手できるものである。
Sephadex G-10（ファルマシア製）カラムに、この培養上澄液を通過させてＰＱＱを吸着させ、ＮａＣｌ水溶液で溶出させて得られたｐＨ７．５のＰＱＱ水溶液にさらにＮａＣｌを６０g/L濃度になるように加えて冷却し、ＰＱＱトリナトリウム塩を得た。得られたＰＱＱトリナトリウム塩の、高速液体クロマトグラフィーのＵＶ吸収によるＰＱＱ純度は９９．０％であった。
【００３５】
ＰＱＱナトリウム塩の分析は以下の分析条件で行った。ＰＱＱ濃度、及び純度を、高速液体クロマトグラフィーにより以下に示す条件で測定した。次に、同じ溶液に含まれるＮａ濃度を、陽イオンクロマトグラフィーにより、以下に示す条件で測定した。また上記の溶液中に含まれるＰＱＱとＮａの濃度から、ＰＱＱナトリウム塩に含まれるＰＱＱとＮａの物質量比を求めた。この物質量比が２．０±０．２であればＰＱＱジナトリウム塩であり、３．０±０．２であればＰＱＱトリナトリウム塩である。
【００３６】
（ＰＱＱ分析）
装置： 島津製作所、高速液体クロマトグラフィー、LC-20A
カラム：YMC-Pack ODS-TMS(5μm)、150x4.6mm I.D.
測定温度：40℃
検出：260nmにおける吸光度
溶離液：100mM CH3COOH/100mM CH3COONH4 (30/70, pH5.1)
溶出速度：1.5mL/min
【００３７】
（Ｎａ分析）
ポンプ： 島津製作所、LC-6A
カラムオーブン：島津製作所、HIC-6A
測定温度：40℃
検出器：東ソー株式会社、電気伝導度計CM-8000
カラム：昭和電工株式会社、Shodex、IC Y-521
溶離液：4mM HNO3
溶出速度：1.0mL/min
【実施例１】
【００３８】
（結晶化）ＰＱＱジナトリウム塩の結晶
参考例１で調製したＰＱＱトリナトリウム塩をイオン交換水に完全に溶解し、ＰＱＱ１２ｇ／Ｌを含む溶液を５００ｇ用意した。ここにエタノールを５００ｍＬ添加した。この時、赤色固体が析出した。ｐＨメーターで測定を行いながら、塩酸を滴下し、ｐＨを３．６にした後、室温下で１時間攪拌した。吸引ろ過で結晶を回収し、室温下で１６時間の減圧乾燥を行った。その結果、ＰＱＱジナトリウム塩の結晶を収率９５mol%で得た。得られた結晶の粉末Ｘ線回折スペクトルを下に示す条件で測定した。結果を図１に示す。粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークで９．１°、１０．３°、１３．８°、１７．７°、１８．３°、２４．０°、２７．４°、３１．２°、３９．５°の±０．２°のピークが現れている。【００３９】
装置：株式会社マックサイエンス製Ｍ１８ＸＣＥ
Ｘ線：Cu／管電圧40kV／管電流100mA
発散スリット：1°
散乱スリット：1°
受光スリット：0.3mm
スキャンスピード：4.000°／min
サンプリング幅：0.02
得られた固体は結晶性であった。
【実施例２】
【００４０】
ＰＱＱジナトリウム塩の結晶の製造
参考例１で調製したＰＱＱ２０ｇを含むＰＱＱトリナトリウム塩の固体６０ｇをイオン交換水５００ｍＬとエタノール５００ｍＬの混合液に加えた。この時、固体は溶けきっていない。ここに室温下で塩酸を加え、ｐＨを３．５にした。塩酸の添加は約２時間かけてゆっくり滴下して行った。ｐＨが安定した後、濾過してＰＱＱジナトリウム塩結晶を収率９９mol％で得た。また、原料のＰＱＱトリナトリウム塩に含まれるＰＱＱの液体クロマトグラフィーによる純度は９９．０％だったのに対し、得られたＰＱＱジナトリウム塩に含まれるＰＱＱの純度は９９．５％と、０．５％向上した。【００４１】
ここで得た結晶を減圧乾燥した後、粉末Ｘ線回折を実施例１と同様に行った結果、実施例１と同様の結果を得た。【００４２】
(熱分析)
得られた固体をリガク社製Thermo plus EVO TG8120を使用して熱重量分析(TG)、示差熱分析(DSC)を行った。空気気流下で室温から１０℃／分の速度で上昇させた。
その結果を図２に示す。水分の蒸発が１００℃付近で生じているほかは２７０℃までは変化せず、非常に安定な物質であった。【００４３】
また、以下に示す条件でガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、エタノールの残留は認められなかった。
（固体中の残留エタノール分析）
得られた固体５０ｍｇを０．５ｍＬの蒸留水に懸濁し、遠心上清に含まれるエタノールをガスクロマトグラフィーを用いて以下の条件で分析し、固体中に含まれるエタノール含量を求めた。
装置：島津製作所、ガスクロマトグラフィー、GC-2014
検出：ＦＩＤ、２１０℃
キャリア：高純度窒素、40mL/min
【実施例３】
【００４４】
ＰＱＱトリナトリウム塩の結晶
参考例１で調製したＰＱＱトリナトリウム塩をイオン交換水にすべて溶解し、ＰＱＱ１２ｇ/Lを含む溶液を５００ｇ用意した。ｐＨメーターで測定を行ったところ、液のｐＨは７．０であった。ここに食塩２５ｇ添加した。この時、赤色固体が析出した。室温下で１時間攪拌した後、吸引ろ過で結晶を回収し、室温下で１６時間の減圧乾燥を行った。その結果、ＰＱＱトリナトリウム塩の結晶を収率９８mol%で得た。得られた結晶の粉末Ｘ線回折スペクトルを下に示す条件で測定した。結果を図３に示す。粉末Ｘ線回折でＣｕ Ｋα放射線を用いた２θのピークで６．６°、１１．４°、１３．０°、２２．６°、２６．９°，２７．９°、３７．０°、３８．９°，４３．４°の±０．２°を有していた。【００４５】
装置：株式会社マックサイエンス製Ｍ１８ＸＣＥ
Ｘ線：Cu／管電圧40kV／管電流100mA
発散スリット：1°
散乱スリット：1°
受光スリット：0.3mm
スキャンスピード：4.000°／min
サンプリング幅：0.02
得られた固体は結晶性であった。
【実施例４】
【００４６】
ＰＱＱトリナトリウム塩の結晶
参考例１で調製したＰＱＱトリナトリウム塩をイオン交換水にすべて溶解し、ＰＱＱ１２ｇ/Lを含む溶液を５００ｇ用意した。ｐＨメーターで測定を行ったところ、液のｐＨは７．０であった。ここにエタノール５００ｍＬ添加した。この時、赤色固体が析出した。室温下で１時間攪拌した後、吸引ろ過で結晶を回収し、室温下で１６時間の減圧乾燥を行った。その結果、ＰＱＱトリナトリウム塩の結晶を収率８９mol%で得た。得られた結晶の粉末を実施例３と同じ条件でＸ線回折スペクトルを測定した。
その結果、実施例３と同じ位置にピークが観測された。
また、実施例２と同様にして熱分析と固体中の残留エタノール分析を行ったところ、非常に熱安定性が高く、エタノールの残留も認められなかった。【００４７】
[比較例１]
エタノール再結晶法によるＰＱＱジナトリウム塩の固体析出
参考例１で調製したＰＱＱトリナトリウム塩をイオン交換水にすべて溶解し、ＰＱＱ１０ｇ/Ｌを含む溶液を８００ｇ用意した。塩酸を加えてｐＨを３．５にした後、ここにエタノールを２００ｍＬ添加した。この時、赤色固体が析出した。室温下で５時間攪拌した後、５℃で２４時間静置し、固体を析出させた。連続遠心分離で固体を回収し、５０℃で減圧乾燥を行った。
得られた固体の粉末Ｘ線回折スペクトルを実施例１と同様の条件で測定した。結果を図４に示す。得られた固体には低角側でピークが見られるほかはほとんどピークが見られず、結晶性が低かった。【００４８】
実施例２と同様の条件でガスクロマトグラフィーによる分析を行ったところ、エタノールが、０．０２％固体内に残留していることが分かった。
また、実施例２と同様の条件で熱分析を行ったところ、３０℃付近から重量減少がみられ、不安定であった。【００４９】
[比較例２]
メタノール中での結晶化によるＰＱＱジナトリウム塩の固体析出
特許文献２で記載のあるＰＱＱジナトリウム塩固体の結晶化実験を再現し、本願発明の結晶との比較を行った。
実施例１で得たPQQのジナトリウム塩結晶０．２１ｇを約６０℃の水３０ｍＬに溶かした。これにメタノール５０ｇ加えた。混合した時点では均一の溶液であった。これを４℃で一晩放置すると固体が析出した。これを遠心分離して減圧乾燥した後、得られた固体の粉末Ｘ線回折スペクトルを実施例１と同様の条件で測定した。結果を図５に示す。本願実施例１、２に見られるピークと異なる位置にピークがあった。
また、実施例２と同様にして熱分析と固体中の残留エタノール分析を行ったところ、熱安定性が低く、エタノールの残留も認められた。【００５０】
[比較例３]
単結晶データの粉末Ｘ線データへの変換
JACS、第111巻、第6822〜6828頁（1989）に報告されているＰＱＱジナトリウム塩について、同文献に記載の単結晶のＸ線結晶構造解析のデータを使用し、この結晶による粉末Ｘ線回折によるピークがどの様になるかシュミレーションした。
解析ソフトRIETAN2000を使用してWINDOWS（登録商標） XP, 1GHz以上のCPUのパーソナルコンピューターで計算した結果を図６に示す。
このように本発明の結晶とは異なる位置にピークがある。【００５１】
以下に実施例１，３、比較例１，２，３の結果を表１にまとめた。
【表１】
2011007633.tif 000004
【００５２】
２θの値は、それぞれ明確に異なり、異なる結晶形であることを示している。本発明の結晶形が新規であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のＰＱＱ結晶は医薬や機能性食品等の分野で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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