(57)【要約】【課題】炎症面積（PISA値、CAPRS値）等といった歯周組織の炎症度を簡便に予測する方法、及び当該方法に用いるデバイス（DNAチップ等）を提供する。【解決手段】唾液中の2種以上の細菌の細菌量を検出し、得られた検出結果を指標として歯周ポケット炎症面積を推定する方法であって、検出される細菌は、該細菌の細菌量と歯周ポケット炎症面積とが正の相関関係を示す細菌と、該細菌の細菌量と歯周ポケット炎症面積とが負の相関関係を示す細菌とを含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
唾液中の2種以上の細菌の細菌量を検出し、得られた検出結果を指標として歯周ポケット炎症面積を推定する方法であって、検出される細菌は、
該細菌の細菌量と歯周ポケット炎症面積とが正の相関関係を示す細菌と、
該細菌の細菌量と歯周ポケット炎症面積とが負の相関関係を示す細菌とを含む、方法。
【請求項２】
前記歯周ポケット炎症面積がPISA、又はCAPRSの値で表されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
正の相関関係を示す細菌が、Treponema denticola、Tannerella forsythia、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Porphyromonas gingivalis、Campylobacter rectus、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Selenomonas noxia、Veillonella parvula、Streptococcus gordonii、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Streptococcus intermedius、Capnocytophaga ochracea、Capnocytophaga sputigena、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium periodonticum、SR1 sp. OT 345、Porphyromonas catoniae、Selenomonas sputigena、Neisseria flavescens、Streptococcus sobrinus、Parvimonas micra、Peptostreptococcus stomatis、Treponema socranskii、Eubacterium saphenum、Eubacterium nodatum、Treponema medium、Filifactor alocis、及びPorphyromonas endodontalisからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
負の相関関係を示す細菌が、Streptococcus mutans、Actinomyces odontolyticus、Streptococcus mitis bv 2、Streptococcus mitis、Campylobacter concisus、Capnocytophaga gingivalis、Prevotella pallens、Streptococcus salivarius、Eubacterium sulci、Rothia mucilaginosa、Prevotella denticola、Veillonella atypica、Prevotella histicola、Megasphaera micronuciformis、及びStreptococcus parasanguinisからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
以下の（１）〜（４）工程を有する、請求項１に記載の方法。
（１）歯周ポケット炎症面積が既知の被験者の唾液サンプルから、唾液中の各種細菌の細菌量を検出する工程
（２）当該各種細菌の細菌量について、菌ごとに固有の歯周ポケット炎症面積との相関係数を求め、各種細菌の細菌量と歯周ポケット炎症面積との関係式を構築して予測モデルを作成する工程
（３）歯周ポケット炎症面積が未知の被験者の唾液サンプルから、唾液中の各種細菌の細菌量を検出する工程
（４）（３）で得られた各種細菌量を（２）で得られた関係式に入れて歯周ポケット炎症面積を推定する工程
【請求項６】
前記予測モデルの作成方法が、線形回帰、回帰木、モデル木、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン、バギング、ブースティング、ランダムフォレストの機械学習アルゴリズムから選ばれる１種を使用する方法である、請求項５に記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周ポケット炎症面積を推定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病の診断は歯周ポケットの測定、アタッチメントレベル、Ｘ線画像診断等によって行われている。しかしながら、これらの診断方法は被験体への負担が大きく、特に多人数について実施する場合は相当の時間を要する。さらに、これらの歯周病診断方法は操作手順が複雑であり、歯科医師の経験や技能に基づくため判定基準に個人差があるなどの問題がある。
そこで、これまでに、簡便な歯周病の診断方法が提案されている。例えば、特許文献１では、歯肉溝滲出液に含まれるタンパク質を歯周病疾患マーカーとして利用した歯周病診断方法が開示されている。また、特許文献２では、唾液中の複数のタンパク質を分析することにより、歯周ポケットの深さ（PPD）や歯肉出血指数（BOP）を予測する手法が開示されている。しかしながら、通常、PPDやBOPについては、測定箇所が１６８箇所（２８本の歯×６点法）も存在するため、実際にどの箇所について予測がされているのか不明である。【０００３】
他方、より一般的には、特許文献３に開示されているように、歯肉溝浸出液に存在する歯周病細菌の測定や、唾液中の歯周病細菌の測定が実施されている。唾液中に存在する歯周病細菌に対応する指標としては、歯周ポケットの深さ（PPD）と歯肉出血指数（BOP）から算出される、炎症面積（PISA値）が提唱されている（非特許文献１）。PISA値は、歯周ポケットの深さ（PPD）から計算されたPESA値（歯周ポケット内表面積）に対して歯肉出血指数（BOP）が乗算されることによって算出される。【０００４】
また、これとは別に滝沢らからはCAPRS値が提唱されている（非特許文献２）。本指標は文献記載のとおり、アタッチメントレベルから臨床歯根表面積（歯肉縁より根尖側に位置する歯根の表面積の総和；Clinical Area of ToothRoot Surface; CARS）を求めた後、その値から有効歯根表面積の値を引いて算出される。実際には、歯肉縁の位置は全て解剖的歯頚線と一致しているケースに置き換えて算出され、これは非特許文献１のFig1.(b)に示されるPESAの値と同一であると考えられる。CAPRS値は、歯肉出血指数（BOP）が計算に加味されていないが、文献記載のとおり面積そのものをポケット内面の炎症領域と近似的に捉え、PISA値とともに「歯周ポケット炎症面積」と考えることができる。【０００５】
これまで、これら「歯周ポケット炎症面積」を簡便に評価するために、唾液中の歯周病細菌数との関係について検討されたことがあるが、P.g菌（Porphyromonas gingivalis（ポルフィロモナス・ジンジバリス））の菌数とCAPRS値との間、及び、レッドコンプレックス菌（P.g菌、T.d菌（Treponema denticola（トレポネーマ・デンティコラ））、T.f菌（Tannerella forsythensis（タネレラ・フォーサイセンシス）））の菌数とCAPRS値との間には相関が無く（非特許文献２、図３a,b）、唾液サンプルから簡便に「歯周ポケット炎症面積」予測する方法は知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−５１５３６号公報
【特許文献２】特許第５８６９３２３号
【特許文献３】特許第４９１７８１５号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Periodontal inflamed surface area: quantifying inflammatory burden.J Clin Periodontol. 2008 Aug;35(8):668-73.
【非特許文献２】「歯周病の全身疾患関連検査マーカーとしての歯周ポケット面積評価法の臨床的意義」日本口腔検査学会雑誌第1巻第1号：7-12、2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような状況下において、唾液中の細菌量の検出結果に基づいて、歯周ポケット炎症面積を推定する方法の提供が望まれていた。
また、このような状況下において、唾液中の細菌量の検出結果に基づいて、炎症面積（PISA値）等といった歯周組織の炎症度を簡便に予測する方法の提供が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、歯周ポケット炎症面積を推定する方法、及び歯周組織の炎症度を包括的に推定する方法を提供するものである。【００１０】
[１]唾液中の2種以上の細菌の細菌量を検出し、得られた検出結果を指標として歯周ポケット炎症面積を推定する方法であって、検出される細菌は、該細菌の細菌量と歯周ポケット炎症面積とが正の相関関係を示す細菌と、
該細菌の細菌量と歯周ポケット炎症面積とが負の相関関係を示す細菌とを含む、方法。
[２] 前記歯周ポケット炎症面積がPISA、又はCAPRSの値で表されるものである、[１]に記載の方法。
[３] 正の相関関係を示す細菌が、Treponema denticola、Tannerella forsythia、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Porphyromonas gingivalis、Campylobacter rectus、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Selenomonas noxia、Veillonella parvula、Streptococcus gordonii、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Streptococcus intermedius、Capnocytophaga ochracea、Capnocytophaga sputigena、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Fusobacterium periodonticum、SR1 sp. OT 345、Porphyromonas catoniae、Selenomonas sputigena、Neisseria flavescens、Streptococcus sobrinus、Parvimonas micra、Peptostreptococcus stomatis、Treponema socranskii、Eubacterium saphenum、Eubacterium nodatum、Treponema medium、Filifactor alocis、及びPorphyromonas endodontalisからなる群から選ばれる少なくとも１種である、[１]又は[２]に記載の方法。
[４] 負の相関関係を示す細菌が、Streptococcus mutans、Actinomyces odontolyticus、Streptococcus mitis bv 2、Streptococcus mitis、Campylobacter concisus、Capnocytophaga gingivalis、Prevotella pallens、Streptococcus salivarius、Eubacterium sulci、Rothia mucilaginosa、Prevotella denticola、Veillonella atypica、Prevotella histicola、Megasphaera micronuciformis、及びStreptococcus parasanguinisからなる群から選ばれる少なくとも１種である、[１]〜[３]のいずれか１項に記載の方法。
[５] 以下の（１）〜（４）工程を有する、[１]〜[４]のいずれか１項に記載の方法。
（１）歯周ポケット炎症面積が既知の被験者の唾液サンプルから、唾液中の各種細菌の細菌量を検出する工程
（２）当該各種細菌の細菌量について、菌ごとに固有の歯周ポケット炎症面積との相関係数を求め、各種細菌の細菌量と歯周ポケット炎症面積との関係式を構築して予測モデルを作成する工程
（３）歯周ポケット炎症面積が未知の被験者の唾液サンプルから、唾液中の各種細菌の細菌量を検出する工程
（４）（３）で得られた各種細菌量を（２）で得られた関係式に入れて歯周ポケット炎症面積を推定する工程
[６] 前記予測モデルの作成方法が、線形回帰、回帰木、モデル木、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン、バギング、ブースティング、ランダムフォレストの機械学習アルゴリズムから選ばれる１種を使用する方法である、[５]に記載の方法。  [７]  唾液中の１種以上の細菌の細菌量を検出し、得られた検出結果を指標として、歯周組織の炎症度を包括的に推定する方法。
[８]  歯周組織の炎症度が、PISA又はCAPRSの値である、[７]に記載の方法。
[９]  検出される細菌の細菌量が、唾液中の該細菌のコピー数である、[７] 又は[８]に記載の方法。
[１０]  検出される細菌の細菌量が、唾液中の該細菌の16S rRNA配列情報に基づく細菌量である、[７]〜[８]のいずれか１項に記載の方法。
[１１]  検出される細菌が、Porphyromonas属、Tannerella属、Treponema属、Prevotella属、Campylobacter属、Fusobacterium属、Streptococcus属、Aggregatibacter属、Capnocytophaga属、Eikenella属、Actinomyces属、Veillonella属及びSelenomonas属から選ばれる少なくとも１種の属に属する細菌である、[７]〜[１０]のいずれか１項に記載の方法。
[１２]  検出される細菌が、Streptococcus mutans、Actinomyces odontolyticus、Streptococcus mitis bv 2、Streptococcus mitis、Campylobacter concisus、Prevotella intermedia、Campylobacter showae、Prevotella nigrescens、Eikenella corrodens、Capnocytophaga gingivalis、Actinomyces naeslundii II、Streptococcus constellatus、Campylobacter gracilis、Fusobacterium periodonticum、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Capnocytophaga sputigena、Capnocytophaga ochracea、Streptococcus intermedius、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Streptococcus gordonii、Veillonella parvula、Selenomonas noxia、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Campylobacter rectus、Porphyromonas gingivalis、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Tannerella forsythia及びTreponema denticolaから選ばれる少なくとも１種である、[７]〜[１１]のいずれか１項に記載の方法。
[１３]  検出される細菌は、該細菌の細菌量と歯周組織の炎症度とが正の相関関係となり得る細菌を含む、[７]〜[１２]のいずれか１項に記載の方法。
[１４]  前記正の相関関係となり得る細菌が、Fusobacterium periodonticum、Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Capnocytophaga sputigena、Capnocytophaga ochracea、Streptococcus intermedius、Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii、Streptococcus gordonii、Veillonella parvula、Selenomonas noxia、Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum、Campylobacter rectus、Porphyromonas gingivalis、Fusobacterium nucleatum subsp. animalis、Tannerella forsythia及びTreponema denticolaから選ばれる少なくとも１種である、[１３]に記載の方法。
[１５]  検出される細菌は、該細菌の細菌量と歯周組織の炎症度とが負の相関関係となり得る細菌を含む、[７]〜[１２]のいずれか１項に記載の方法。
[１６]  前記負の相関関係となり得る細菌が、Streptococcus mutans、Actinomyces odontolyticus、Streptococcus mitis bv 2、Streptococcus mitis、Campylobacter concisus、Prevotella intermedia、Campylobacter showae、Prevotella nigrescens、Eikenella corrodens、Capnocytophaga gingivalis、Actinomyces naeslundii II、Streptococcus constellatus及びCampylobacter gracilisから選ばれる少なくとも１種である、[１５]に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、唾液中の細菌量の検出結果に基づいて、歯周ポケット炎症面積を簡便に予測することができる。すなわち、精密な歯周病検査（ポケット実測や撮像）をしなくとも、採取した唾液を用いて、簡便に口腔全体の炎症度を推定することができる。
また、本発明によれば、唾液中の細菌量の検出結果に基づいて、炎症面積（PISA値、CAPRS値）といった歯周組織の炎症度を簡便に予測することができる。すなわち、精密な歯周病検査（ポケット実測や撮像）をしなくとも、採取した唾液を用いて、簡便に口腔全体の炎症度（炎症指標数値）を推定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】各細菌量のSN比から算出したPISA予測のモデル木を示す図である。
【図１−２】各細菌量のSN比から算出したPISA予測のモデル木を示す図である（図１−１の続き。図１−１の四角で囲った番号の１番と図１−２の２１番がつながっている。）。
【図２】図１のモデル木から予測されたPISA値（横軸）とPISA実測値（縦軸）との散布図を示す図である。
【図３】チップ間補正後の各細菌量のSN比からモデル木を作成し、そのモデル木から予測されたPISA値（横軸）とPISA実測値（縦軸）との散布図を示す図である。
【図４−１】全４６データの内３４データを用い、チップ間補正後の各細菌量のSN比から算出したPISA予測のモデル木を示す図である。
【図４−２】全４６データの内３４データを用い、チップ間補正後の各細菌量のSN比から算出したPISA予測のモデル木を示す図である（図４−１の続き。図４−１の四角で囲った番号の１番と図４−２の１１番、及び図４−１の１３番と図４−２の１２番がつながっている。）。
【図５】図４のモデル木作成に使用した３４データでの予測されたPISA値（横軸）とPISA実測値（縦軸）との散布図を示す図である。
【図６】全４６データの内、モデル作成につかっていない残り１２データのPISA実測値（縦軸）と図４のモデル木から予測されたPISA値（横軸）との散布図を示す図である。
【図７】PISA実測値と「総菌量に対する3菌の比率（公知）」との散布図（左）、PISA実測値とPISA予測値との散布図（右）の比較を示す図である。
【図８】PISA実測値と、正の相関を示す細菌と負の相関を示す細菌の比（「バランス指標」）との散布図を示す図である。
【図９】５６サンプルで試験を行い、PISA値（横軸）と統計的に有意な相関が認められた細菌種の細菌量を説明変数とし、重回帰分析で予測モデル式を作成してPISA値を予測（縦軸）した結果の散布図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００１４】
本発明の第一の態様である、歯周ポケット炎症面積を推定する方法の発明（以下、「第一の発明群」ともいう。）は、以下の工程を包含するものである。
ｉ）唾液中の2種以上の細菌の細菌量を検出する工程、及び、ｉｉ）得られた検出結果を指標として歯周ポケット炎症面積を推定する工程。  
本発明の第二の態様である、歯周組織の炎症度を包括的に推定する方法（以下、「第二の発明群」ともいう。）の発明は、以下の工程を包含するものである。
ｉ）唾液中（被験体、特にヒトの唾液中）の１種以上の細菌の細菌量を検出する工程、及び、ｉｉ）得られた検出結果を指標として歯周組織の炎症度を包括的に推定する工程。
【００１５】
１．唾液中の細菌の細菌量の検出に用いるオリゴヌクレオチドプローブ
本発明の方法においては、被験者から採取された唾液中から口腔内の細菌量を測定する際に、ＤＮＡチップを使用することができる。当該ＤＮＡチップには、例えば、以下のプローブ（ａ）（細菌特異的プローブ）を搭載することができ、さらに、プローブ（ｂ）（総量指標プローブ）やプローブ（ｃ）（絶対量指標プローブ）を搭載することもできる。
【００１６】
（ａ）細菌特異的プローブ：検出対象となる細菌の遺伝子（又はその一部）に特異的にハイブリダイズする核酸からなるプローブ
（ｂ）総量指標プローブ：すべての細菌の遺伝子にハイブリダイズする核酸からなるプローブ
（ｃ）絶対量指標プローブ：１種類又は複数種類の絶対量指標それぞれに特異的にハイブリダイズする核酸からなるプローブ
【００１７】
なお、一般的に、ＤＮＡチップとは、プローブが配置された基盤の総称である。また、ＤＮＡチップ及びＤＮＡマイクロアレイ等の名称については、それぞれ区別はせず、同義語であるとする。
【００１８】
（１）検出対象となる唾液中の細菌
本発明の方法において、検出対象（細菌量の測定対象）となる唾液中の細菌としては、限定はされないが、例えば、以下に列挙する各属に属する細菌、すなわち、Porphyromonas属、Tannerella属、Treponema属、Prevotella属、Campylobacter属、Fusobacterium属、Streptococcus属、Aggregatibacter属、Capnocytophaga属、Eikenella属、Actinomyces属、Veillonella属、Selenomonas属、Eubacterium属、Parvimonas属、Filifactor属、Haemophilus属、Alloprevotella属、Solobacterium属、Rothia属、Peptostreptococcus属、Gemella属、Corynebacterium属、Neisseria属、Granulicatella属、Megasphaera属及びSR1門から選ばれる少なくとも１種の属に属する細菌であることが好ましい。
より具体的には、以下に列挙する各種細菌から選ばれる少なくも１種、又は２種以上を検出対象とすることがより好ましい。
【００１９】
Porphyromonas gingivalis
Tannerella forsythia
Treponema denticola
Campylobacter gracilis
Campylobacter rectus
Campylobacter showae
Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii
Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum
Fusobacterium nucleatum subsp. animalis
Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum
Fusobacterium periodonticum
Prevotella intermedia
Prevotella nigrescens
Streptococcus constellatus
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Campylobacter concisus
Capnocytophaga gingivalis
Capnocytophaga ochracea
Capnocytophaga sputigena
Eikenella corrodens
Streptococcus gordonii
Streptococcus intermedius
Streptococcus mitis
Streptococcus mitis bv 2
Actinomyces odontolyticus
Veillonella parvula
Actinomyces naeslundii II
Selenomonas noxia
Streptococcus mutans
Eubacterium nodatum 
Parvimonas micra
Filifactor alocis
Streptococcus sobrinus
Porphyromonas pasteri
Veillonella atypica
Haemophilus parainfluenzae
Alloprevotella spp. (A. rava,OT 308)
Streptococcus parasanguinis
Actinomyces israelii
Prevotella pallens
Prevotella loescheii
Prevotella histicola
Solobacterium moorei
Prevotella melaninogenica
Selenomonas sputigena
Rothia dentocariosa
Rothia mucilaginosa
Veillonella rogosae
Peptostreptococcus stomatis
Prevotella denticola
Porphyromonas endodontalis
Streptococcus salivarius
Actinomyces graevenitzii
Treponema medium
Treponema socranskii
Gemella sanguinis
Porphyromonas catoniae
Corynebacterium matruchotii
Eubacterium saphenum
Neisseria flavescens
Granulicatella adiacens
Eubacterium sulci
Megasphaera micronuciformis
Prevotella shahii
SR1 sp. OT 345
【００２０】
「第一の発明群」においては、細菌の細菌量と歯周ポケット炎症面積とが正の相関関係（細菌量が増えたときに、歯周ポケット炎症面積は増える関係）を示す細菌（以下、「正の相関関係を示す細菌」と略記する場合がある。）、及び細菌の細菌量と歯周ポケット炎症面積とが負の相関関係（細菌量が増えたときに、歯周ポケット炎症面積は減る関係）を示す細菌（以下、「負の相関関係を示す細菌」と略記する場合がある。）が用いられる。
歯周ポケット炎症面積とは、PISA（periodontal inflamed surface area：歯周炎症表面積）やCAPRS（conccaled area in periodontal pockt of tooth root surfase : 歯周ポケット内歯根表面積）を含む炎症を示す面積であり、同様の概念の指標があればその指標も含まれる。
【００２１】
PISA値は、口腔全体の歯周組織の炎症部位面積を平方ミリメートル（ｍｍ２）で示したものであり、歯周ポケット表面積（PESA）とプロービング時の出血（bleeding on probing：BOP）の有無から算出することができる。歯周ポケット表面積（PESA）は、歯の種類ごとに事前に規定されている面積と歯周ポケットの深さ（PPD）から算出することができる。６点法の場合の自動計算スプレッドシート（エクセルファイル）が非特許文献１の追加情報として配布されており（https://www.parsprototo.info/pisa.html）、上記計算方法はエクセルファイルに記載の計算式をみれば誰でも確認できる。
【００２２】
CAPRS値は、文献記載のとおり、アタッチメントレベルから臨床歯根表面積（歯肉縁より根尖側に位置する歯根の表面積の総和；Clinical Area of ToothRoot Surface; CARS）を求めた後、その値から有効歯根表面積の値を引いて算出される。実際には、歯肉縁の位置は全て解剖的歯頚線と一致しているケースに置き換えて算出され、これは非特許文献１のFig1.(b)に示されるPESAの値と同一であると考えられる。CAPRS値は、歯肉出血指数（BOP）が計算に加味されていないが、文献記載のとおり面積そのものをポケット内面の炎症領域と近似的に捉え、PISA値とともに「歯周ポケット炎症面積」と考えることができる。  歯周ポケット炎症面積は、ＰＩＳＡ、又はＣＡＰＲＳの値で表されるものであることが好ましい。
【００２３】
正の相関関係を示す細菌と負の相関関係を示す細菌は、細菌量（またはSN比のような細菌量と比例する測定量）を測定できるツールにより確認することができる。ツールは特に限定はされず、例えばＤＮＡチップを用いることができる。
ＤＮＡチップを用いて確認する場合、口腔内試料をＤＮＡチップで測定し、その後歯周ポケット炎症面積と各細菌の細菌量またはＳＮ比のような測定量との相関係数を算出し、相関係数が正の値となる細菌群と負の値となる細菌群として分類、特定することができる。これらの細菌は、測定回数が４０回以上の場合に相関係数の絶対値が０．０２以上であることが好ましく、０．１以上であることがより好ましく、０．２以上であることがさらに好ましく、０．４以上であることが特に好ましく、０．６以上であることが最も好ましい。
後述する、歯周ポケット炎症面積を推定するための予測モデルの作成に実験誤差補正後のデータを用いる際は、細菌群の分類にも実験誤差補正後のデータを用いる。
【００２４】
正の相関関係を示す細菌としては、例えば、以下に列挙する細菌が好ましく挙げられる。これらのうちの少なくとも１種、好ましくは２種以上を検出対象とすることがより好ましい。
Treponema denticola
Tannerella forsythia
Fusobacterium nucleatum subsp. animalis
Porphyromonas gingivalis
Campylobacter rectus
Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum
Selenomonas noxia
Veillonella parvula
Streptococcus gordonii
Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii
Streptococcus intermedius
Capnocytophaga ochracea
Capnocytophaga sputigena
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum
Fusobacterium periodonticum
SR1 sp. OT 345
Porphyromonas catoniae
Selenomonas sputigena
Neisseria flavescens
Streptococcus sobrinus
Parvimonas micra
Peptostreptococcus stomatis
Treponema socranskii
Eubacterium saphenum
Eubacterium nodatum 
Treponema medium
Filifactor alocis
Porphyromonas endodontalis
【００２５】
負の相関関係を示す細菌としては、例えば、以下に列挙する細菌が好ましく挙げられる。これらのうちの少なくとも１種、好ましくは２種以上を検出対象とすることがより好ましい。
Streptococcus mutans
Actinomyces odontolyticus
Streptococcus mitis bv 2
Streptococcus mitis
Campylobacter concisus
Capnocytophaga gingivalis
Prevotella pallens
Streptococcus salivarius
Eubacterium sulci
Rothia mucilaginosa
Prevotella denticola
Veillonella atypica
Prevotella histicola
Megasphaera micronuciformis
Streptococcus parasanguinis
【００２６】
「第二の発明群」においては、細菌の細菌量が、歯周組織の炎症度等（PISA値又はCAPRS値）に対して、正の相関関係を有する細菌、又は、負の相関関係を有する細菌が、それぞれ好ましく挙げられる。
上記正の相関関係を有する細菌としては、例えば、以下に列挙する細菌が好ましく挙げられ、これらのうちの少なくとも１種、好ましくは２種以上を検出対象とすることがより好ましい。
【００２７】
Treponema denticola
Tannerella forsythia
Fusobacterium nucleatum subsp. animalis
Porphyromonas gingivalis
Campylobacter rectus
Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum
Selenomonas noxia
Veillonella parvula
Streptococcus gordonii
Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii
Streptococcus intermedius
Capnocytophaga ochracea
Capnocytophaga sputigena
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum
Fusobacterium periodonticum
【００２８】
また、上記負の相関関係を有する細菌としては、例えば、以下に列挙する細菌が好ましく挙げられ、これらのうちの少なくとも１種、好ましくは２種以上を検出対象とすることがより好ましい。
【００２９】
Streptococcus mutans
Actinomyces odontolyticus
Streptococcus mitis bv 2
Streptococcus mitis
Campylobacter concisus
Capnocytophaga gingivalis
【００３０】
（２）細菌特異的プローブ
本発明において、細菌特異的プローブとして使用され得るオリゴＤＮＡは、唾液中の細菌に由来する核酸の塩基配列のうちの特定の領域中の塩基配列とハイブリダイズすることができるものである。ここで、当該核酸は、染色体ＤＮＡやプラスミドＤＮＡ等を含むＤＮＡ及びＲＮＡのいずれでもよく限定はされないが、染色体ＤＮＡであることが好ましい。具体的には、本発明においてプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、前記細菌の染色体ＤＮＡ中の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とハイブリダイズすることができるものである。
本発明に用い得るプローブは、検出目的となる個々の細菌に特異的な塩基配列となるような領域を選択してその領域の塩基配列を設計することが好ましい。一般的に、プローブの設計の際には、特異的な領域を選択することに加え、融解温度（Ｔｍ）がそろっていて、二次構造を形成しにくいものである必要がある。
【００３１】
唾液中の細菌の各々の種に対応する特異的な塩基配列は、例えば、マルチプルアラインメントをとり、種間で異なる領域にプローブを設計するなどの手段により見出すことができる。アラインメントをとるためのアルゴリズムには、特に限定はないが、より具体的な解析プログラムとしては、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＸ１．８等のプログラムを利用することができる。アラインメントをとる際のパラメータは、各プログラムのデフォルト状態で実行してもよいが、プログラムの種類などに応じて適宜調整することができる。
プローブの特異性は、属レベルの特異性を基に同じ属の細菌を一括に検出するものであってもよいし、個々の種レベルで検出可能な特異性であってもよく、検出目的に応じて適宜選択・設計が可能である。
本発明において用い得る細菌特異的なプローブの例を、下記の表Ａに示す（配列番号１〜２９）。
【００３２】
（３）総量指標プローブ
総量指標プローブは、特定のプライマー対で増幅できた、検体中（唾液中）のすべての細菌を捕捉する目的のプローブである。細菌を検出する上では、検出対象細菌が、非検出対象細菌を含む全体の細菌の中でどの程度の割合であるのか、また、そもそも検体中にどれくらいの量の細菌が存在しているのかといった観点から、細菌の総量を検出することも重要となる。
【００３３】
非検出対象細菌は、存在や種類は分かっているが検出対象としなくてもよい細菌、及び存在や種類が不明である細菌の和（合計）として理解できる。
細菌の総量を検出するためには、例えば、ＤＮＡチップとは独立に細菌の総量を測定することも可能であるが、ＤＮＡチップ中に細菌の総量の指標となるプローブを搭載しておくことにより操作の簡便性が向上する。プローブについては、プライマー対によって増幅される塩基配列の中から、多種類の菌種に共通な塩基配列を使用してもよい。そのような配列が見つからない場合は、比較的共通な配列を複数設計し、それらを総合的に判断することで総量指標プローブとしてもよい。総量指標プローブは、好ましくは、検体中に含まれる細菌に由来する核酸にハイブリダイズするプローブ、詳しくは、前記特定のプライマー対により増幅される塩基配列のうちの、検出対象となる複数種類の細菌が共通に有する塩基配列を含むプローブである。総量指標プローブの例を、下記の表Ａ（配列番号３１）に示す。
【００３４】
総量指標は、個々の菌種特異的な増幅産物の合計量を表すため、一般的に量が多くなることから、目的のシグナル強度が、検出可能なシグナル強度の範囲を超えてしまうことがある。
そのような状況を防ぐためには、ハイブリダイゼーションに供する検体量を制限することが望ましい。又は、プローブを設計する際には、例えば当該プローブのＴｍ値を低くする。具体的にはＧＣ含量を少なくすることや、プローブの配列長自体を短くする方法が考えられる。
また、ハイブリダイゼーションに際して、増幅された核酸と総量指標プローブとのハイブリダイゼーションに対して競合的に作用するような核酸を添加することで、シグナル強度の低減化を図ることが可能である。このような核酸としては、例えば、総量指標プローブと全て又は部分的に同じ配列を有する核酸、又は総量指標プローブの相補配列を全て又は部分的に有する核酸などが挙げられる。
【００３５】
（４）絶対量指標プローブ
絶対量指標プローブは、絶対量指標の核酸にのみハイブリダイズするプローブである。
本明細書において、絶対量指標とは、増幅反応やハイブリダイゼーション反応の前に、検体中に一定量添加する核酸である。絶対量指標は、通常の増幅反応を行えば増幅反応が確実に行われる核酸であり、いわゆる陽性コントロールとしての役割を果たす。
従って、絶対量指標に特異的なプローブを、ＤＮＡチップに搭載しておけば、その検出結果から、増幅反応やハイブリダイゼーション等が適切に実施されたかを確認することができる。また、絶対量指標を１種類設定した場合、多少増幅効率やハイブリダイゼーション効率が増減した場合に、絶対量指標のシグナル強度を比較することにより補正係数を算出することができる。複数のＤＮＡチップにおいて、補正したシグナル強度は比較することができる。
【００３６】
絶対量指標用プローブの例を、下記の表Ａ（配列番号３０）に示す。
に示す。また絶対量指標の例を、下記の配列番号７４に示す。
【００３７】
絶対量指標用プローブ：
CTATTCGACCAGCGATATCACTACGTAGGC（配列番号３０）
【００３８】
絶対量指標：
GTGAGAAGCCTACACAAACGTAACGTCAGGGCTAAGACAAACGCTAACGGTACACCCTAGATGGGAGCTTGTAGCTAGATCGCTAAGTCCTACCGACATGTAGGCATACTCACGAAGGCAATTCCCTGAAAGCCTCGTCTTATCCCGAACTTGGCATCTGCTGATACGTCAGGTTGAACGCGTACATTTACCTGTCATGCGTGGGCCTTCTCCGAATAGCCTACGTAGTGATATCGCTGGTCGAATAGGCGGATTGCTCATAAATGCACATTGGCTAAGGCCCACGGAACACGAATCACGTGAGATCACTTACTATTCGACGGAACTACTATACGCACCGGGACATGCAAGTAGCGTCCCACAAGCATAAGGAACTCTATACTCGCCATCTACGCAGCTACAGGGGATACACGTATGAGCGGTTACGAAGTAAAGCCGAGATAGAGCGGTCTTTAGAGAAAAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC（配列番号７４）
【００３９】
絶対量指標を増幅反応前に添加するのであれば、特定のプライマー対にて増幅される核酸であること、すなわちプライマー対と相補な塩基配列を所持していること、かつ、ハイブリダイゼーションで検出するためには、検出対象細菌、非検出対象細菌いずれにおいても所持していない塩基配列を所持している必要がある。
特定のプライマーとは、増幅対象配列が限定されるという意味であり、プライマー対は必ずしも１対である必要はない。必要に応じて２対以上のプライマー対を用いるマルチプレックス手法も適用できる。プライマー対の例を、下記の表Ｂに示す。細菌増幅用プライマー対（配列番号３２、３３）や、絶対量指標用プライマー対（配列番号３４、３５）を利用することが可能である。
【００４０】
絶対量指標は、例えば、産業技術総合研究所が開発した定量解析用核酸標準物質を利用しても良いし、新たに設計しても良い。設計する場合には、例えば、ソフトウェア「ＥＸＣＥＬ」（ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ社製）のＲＮＤＢＥＴＷＥＥＮ関数を使用し、１から４までの整数をランダムにＸ個（Ｘは任意の数）発生させ、それをつなげて１から４までの数値のみから構成されるＸ桁の数値とし、１をＡ、２をＴ、３をＣ、４をＧと置き換えることにより、ＡＴＧＣのＸ塩基によるランダム配列を多数得ることができる。
これらの配列につき、ＧとＴの和がＡとＴの和と同数になる配列のみを抜粋し、抜粋された配列を、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに対してＢｌａｓｔ検索し、生物由来の核酸に対し、類似配列の少ないものを選抜し、配列の両末端にプライマー配列を付加することで、設計可能である。また、設計された配列を適宜連結させて長くしたり、部分的に除去して短くしたりすることも可能である。
【００４１】
増幅反応時における反応効率をなるべく一定にするために、検出対象細菌にて増幅される塩基長と絶対量指標の増幅塩基長は大きな差のないようにすることが望ましい。例えば、検出対象細菌の増幅産物が５００ｂｐ程度となるのであれば、絶対量指標の増幅産物は３００ｂｐから１０００ｂｐ程度とすることが望ましい。
一方で、増幅後に電気泳動等で増幅鎖長を確認する場合においては、検出対象細菌とは異なる長さの増幅産物となるように設計した上で、絶対量指標由来の増幅産物を検出対象細菌のバンドとは異なる位置で検出し、ハイブリダイゼーションの前に増幅反応の成否を確認することも可能である。
最後に、検体中に含まれる絶対量指標はあまりにも濃度が高いと検出対象の細菌と増幅反応における競合が激しくなり、本来検出できるはずの検出対象細菌が検出できなくなる可能性もあるため、アプリケーションに応じて適宜濃度調整をする必要がある。
【００４２】
【表Ａ】
2019088271.tif 000002
【００４３】
【表Ｂ】
2019088271.tif 000003
【００４４】
本発明に用いるプローブを設計する際は、ハイブリダイゼーションにおけるストリンジェンシーを考慮することが好ましい。ストリンジェンシーをある程度緊密にすることによって、各種細菌において各々の核酸中の特定の領域間で類似する塩基配列領域が存在しても、他の異なる領域を区別してハイブリダイズすることができる。また、当該特定の領域間の塩基配列がほとんど異なる場合は、ストリンジェンシーを緩やかに設定することができる。
【００４５】
このようなストリンジェンシーの条件としては、例えば、緊密条件の場合は５０〜６０℃の条件下でのハイブリダイゼーションであり、ゆるやかな条件の場合は３０〜４０℃の条件下でのハイブリダイゼーションである。ハイブリダイゼーションの条件において、ストリンジェントな条件としては、例えば、「０．２４Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、４０℃」、「０．２４Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、３７℃」、「０．２４Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、３０℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「０．２４Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、５０℃」、「０．２４Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、５５℃」、「０．０６Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．０６Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、６０℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、プローブを添加して１時間以上５０℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、０．２４Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０中、５０℃で２０分の洗浄を４回、最後に、０．２４Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ  ＮａＣｌ、５０℃で１０分の洗浄を１回行う方法もある。ハイブリダイゼーション、又は洗浄の際の温度を上げることにより、よりストリンジェントな条件を設定することができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、条件を設定することができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４ｔｈ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （２０１２）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９８７−１９９７））  等を参照することができる。
【００４６】
本発明に用いるプローブの長さは、限定はされないが、例えば、１０塩基以上が好ましく、より好ましくは１６〜５０塩基であり、さらに好ましくは１８〜３５塩基である。プローブの長さが適切であれば（前記範囲内であれば）、非特異的なハイブリダイゼーション（ミスマッチ）を抑制し、特異的な検出に使用することができる。
【００４７】
本発明に用いるプローブの設計の際には、Ｔｍを確認しておくことが好ましい。Ｔｍとは、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッド形成する温度を意味し、鋳型ＤＮＡ又はＲＮＡとプローブとが二本鎖を形成してハイブリダイズするためには、ハイブリダイゼーションの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こりやすくなるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。従って、設計しようとする核酸断片のＴｍはハイブリダイゼーションを行う上で重要な因子である。Ｔｍの確認には、公知のプローブ設計用ソフトウェアを利用することができ、本発明で利用可能なソフトウェアとしては、例えばＰｒｏｂｅ  Ｑｕｅｓｔ（登録商標；ダイナコム社）などが挙げられる。またＴｍの確認は、ソフトウェアを使わずに自ら計算することによっても行うことができる。その場合には、最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｍｅｔｈｏｄ）、Ｗａｌｌａｎｃｅ法、ＧＣ％法等に基づく計算式を利用することができる。本発明のプローブにおいては、限定はされないが、平均Ｔｍが約３５〜７０℃又は４５〜６０℃であることが好ましい。なお、プローブとして特異的なハイブリダイズが可能な条件としては、その他にもＧＣ含量等があり、その条件は当業者に周知である。
また、本発明に用いるプローブを構成するヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡ、又はＰＮＡのいずれであってもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＰＮＡの２種以上のハイブリッドであってもよい。
【００４８】
本発明に用いるプローブとしては、具体的には、例えば、以下の（ｄ）又は（ｅ）のＤＮＡの塩基配列を含むものが好ましく挙げられる。例えば、表Ｂに示すプライマー（配列番号３２〜３５）を用いて増幅する場合、前掲の表Ａ（配列番号１〜３１）に示す配列をプローブとすることが可能であり、配列番号１〜３１に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列を用いることが好ましい。また、配列番号１〜３１に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列の相補配列であってもよく、配列番号１〜３１に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列と実質的に同一の配列又は配列番号１〜３１に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列の相補配列と実質的に同一の配列であってもよい。
ここで、実質的に同一とは、配列番号１〜３１に記載の配列又は相補配列に対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするものである。
【００４９】
（ｄ）  配列番号１〜３１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）  上記（ｄ）のＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ唾液中の細菌に由来する核酸の塩基配列のうちの少なくとも一部の塩基配列を検出し得る機能を有するＤＮＡ
【００５０】
上記（ｄ）の各種ＤＮＡについて、それらの具体的な塩基配列、プローブ名、検出対象となる口腔内細菌については、前掲の表Ａの記載が参照できる。
また、上記（ｅ）のＤＮＡは、上記（ｄ）の各種ＤＮＡ若しくはそれと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、又はこれらを断片化したものをプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、及びサザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法を実施し、ｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーは、公知の方法で作製されたものを利用してもよいし、市販のｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーを利用してもよく、限定はされない。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、前記と同様のものを参照することができる。上記（ｅ）のＤＮＡに関し、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション時の条件であって、バッファーの塩濃度が２４〜３９０ｍＭ、温度が４０〜６５℃、好ましくは塩濃度が４８．８〜１９５ｍＭ、温度が４５〜６０℃の条件を意味する。具体的には、例えば９７．５ｍＭで５０℃等の条件を挙げることができる。さらに、このような塩濃度や温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、反応時間などの諸条件も考慮し、前記（ｅ）のＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。ハイブリダイズするＤＮＡとしては、前記（ｄ）のＤＮＡの塩基配列に対して少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列であることが好ましく、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【００５１】
本発明に用いるプローブは、例えば、通常のオリゴヌクレオチド合成法を使用して化学合成する（精製はＨＰＬＣ等により行う）ことにより作製することができる。そのようなプローブは、例えば、Ｐｒｏｂｅ  Ｑｕｅｓｔ（登録商標：ダイナコム社製）により設計することができる。また、本発明のプローブには、例えば、タグ配列などの付加配列が含まれていてもよい。
本発明の方法において、検出目的となる前述した唾液中の細菌が有する核酸の塩基配列は、当該塩基配列そのものである必要はなく、塩基配列の一部が欠失、置換、挿入等により変異が生じたものであってもよい。したがって、検出目的の核酸の塩基配列は、当該塩基配列に相補的な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつそれぞれの塩基配列に由来する機能や活性を有する変異型遺伝子も対象とすることができ、プローブは、このような変異型遺伝子の塩基配列を基礎として設計することもできる。ここで「ストリンジェントな条件」は、前記と同様の条件を適用することができる。
【００５２】
２．DNAチップ
前記したように、本発明の方法においては、唾液中の細菌量の検出・測定に、ＤＮＡチップを用いることができる。当該ＤＮＡチップは、、歯周組織の炎症度を包括的に推定するという用途に用いられるものであり、前記１.項で説明した各種オリゴヌクレオチドプローブが支持体となる基盤に複数配置されたものである。
【００５３】
支持体となる基盤の形態としては、平板（ガラス板、樹脂板、シリコン板等）、棒状、ビーズ等のいずれの形態のものも使用できる。支持体として、平板を使用する場合は、その平板上に、所定の間隔もって、所定のプローブを種類毎に固定することができる（スポッティング法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０，  ４６７−４７０  （１９９５）等参照）。また、平板上の特定の位置で、所定のプローブを種類毎に逐次合成していくこともできる（フォトリソグラフィー法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１，  ７６７−７７３  （１９９１）等参照）。他の好ましい支持体の形態としては、中空繊維を使用するものが挙げられる。支持体として中空繊維を使用する場合は、所定のプローブを種類毎に各中空繊維に固定し、すべての中空繊維を集束させ固定した後、繊維の長手方向で切断を繰り返すことにより得られるＤＮＡチップ（以下「繊維型ＤＮＡチップ」と言う）が好ましく例示できる。このマイクロアレイは、貫通孔基板に核酸を固定化したタイプのものと説明することもでき、いわゆる「貫通孔型ＤＮＡチップ」とも言われる（特許第３５１０８８２号公報等参照）。
【００５４】
プローブの支持体への固定方法は限定されず、どのような結合様式でもよい。また、支持体に直接固定することに限定はされず、例えば、予め支持体をポリリジン等のポリマーでコーティング処理し、処理後の支持体にプローブを固定することもできる。さらに、支持体として中空繊維等の管状体を使用する場合は、管状体にゲル状物を保持させ、そのゲル状物にプローブを固定することもできる。
以下、ＤＮＡチップの一形態である繊維型ＤＮＡチップに関して詳細に説明する。このＤＮＡチップは、例えば、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を経て作製することができる。
【００５５】
（ｉ）  複数本の中空繊維を、中空繊維の長手方向が同一方向となるように３次元に配列して配列体を製造する工程
（ｉｉ）  前記配列体を包埋し、ブロック体を製造する工程
（ｉｉｉ）  オリゴヌクレオチドプローブを含むゲル前駆体重合性溶液を前記ブロック体の各中空繊維の中空部に導入して重合反応を行い、プローブを含むゲル状物を中空部に保持させる工程
（ｉｖ）  中空繊維の長手方向と交差する方向で切断して、ブロック体を薄片化する工程
【００５６】
中空繊維に使用される材料としては、限定はされないが、例えば、特開２００４−１６３２１１号公報等に記載の材料が好ましく挙げられる。
中空繊維は、その長手方向の長さが同一となるように３次元に配列される（工程（ｉ））。配列方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法（特開平１１−１０８９２８号公報参照）や、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ね合わせ、それらの孔部に中空繊維を通過させ、その後２枚の多孔板の間隔を開いて仮固定し、２枚の多孔板間における中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させて硬化させる方法（特開２００１−１３３４５３号公報参照）などが挙げられる。
【００５７】
製造された配列体はその配列が乱れないように包埋される（工程（ｉｉ））。包埋の方法としては、ポリウレタン樹脂及びエポキシ樹脂等を繊維間の隙間に流し込む方法のほか、繊維どうしを熱融着により接着する方法等が好ましく挙げられる。
包埋された配列体には、各中空繊維の中空部に、オリゴヌクレオチドプローブを含むゲル前駆体重合性溶液（ゲル形成溶液）を充填し、中空部内で重合反応を行う（工程（ｉｉｉ））。これにより、各中空繊維の中空部に、プローブが固定されたゲル状物を保持させることができる。
ゲル前駆体重合性溶液とは、ゲル形成重合性モノマー等の反応性物質を含有する溶液であって、該モノマー等を重合、架橋させることにより該溶液がゲル状物となることが可能な溶液をいう。そのようなモノマーとしては、例えば、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ビニルピロリドン、メチレンビスアクリルアミド等が挙げられる。この場合、溶液には重合開始剤等が含まれていてもよい。
【００５８】
中空繊維内にプローブを固定した後、中空繊維の長手方向と交差する方向（好ましくは直交する方向）で、ブロック体を切断して薄片化する（工程（ｉｖ））。このようにして得られた薄片は、ＤＮＡチップとして使用できる。当該ＤＮＡチップの厚みは、０．０１ｍｍ〜１ｍｍ程度であることが好ましい。ブロック体の切断は、例えば、ミクロトーム及びレーザー等により行うことができる
前記した繊維型ＤＮＡチップとしては、例えば、三菱ケミカル社製ＤＮＡチップ（Ｇｅｎｏｐａｌ  ＴＭ）等が好ましく挙げられる。
繊維型ＤＮＡチップでは、前記のように、プローブはゲル内で３次元的に配列され、３次元構造を維持することが可能となる。そのため、表面をコートしたスライドガラスにプローブを結合させた平面ＤＮＡチップに比べて、検出効率が上昇し、高感度で高再現性の検査をすることが可能となる。
また、ＤＮＡチップに配置されるプローブの種類の数は、１つのＤＮＡチップに５００種類以下、好ましくは２５０種類以下、さらに好ましくは１００種類以下が好ましい。このように配置されたプローブ数（種類）をある程度制限することにより、目的の口腔内細菌をより高感度で検出することが可能となる。なお、プローブの種類は塩基配列によって区別される。従って、通常、同じ遺伝子に由来のプローブであっても塩基配列が１個でも異なれば別の種類として特定する。
【００５９】
３．唾液中の細菌の検出（細菌量の測定）
本発明の方法において、唾液中の細菌量を測定するために当該細菌を検出する方法は、例えば、下記の工程を含む方法である。
【００６０】
（ｉ）被験者から採取した口腔内試料としての唾液を検体とし、検体中（唾液中）の核酸を抽出する工程
（ｉｉ）抽出した核酸を、前記した本発明のオリゴヌクレオチドプローブ又は本発明のＤＮＡチップに接触させる工程
（ｉｉｉ）ＤＮＡチップから得られたシグナル強度から細菌量を算出する工程
【００６１】
以下に、当該検出方法の詳細を工程ごとに説明する。
（１）工程（ｉ）について
本工程では、被験者又は被生物から採取した口腔内試料としての唾液を検体とし、検体中（唾液中）に含まれる細菌の核酸を抽出する。唾液を採取する方法は特には限定されず、例えば、市販の唾液採取キットを利用する方法、綿棒を口に含み唾液を採取する方法、唾液を容器に直接採取する方法等が挙げられる。
唾液を採取する被験者は、特に限定はされないが、例えば、歯周病などの口内炎症を患っている患者に加え、歯周病などの口内炎症の自覚が無い者、又は心疾患など歯周病と関連が示唆される全身疾患患者や妊婦などでもよいし、あるいは、歯周病の罹患の疑いのない健常者であってもよい。
次いで、得られた唾液中に存在する細菌の核酸抽出を行う。抽出の方法は限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、機器による自動抽出法、市販の核酸抽出キットを利用する方法、プロテイナーゼＫ処理後にフェノール抽出する方法、クロロホルムを利用する方法又は簡易抽出方法として、試料を加熱、溶解する方法等が挙げられる。また、特に検体中から核酸を抽出せず、次の工程に進んでも良い。
【００６２】
検体から得られた核酸は、そのままＤＮＡチップ等に接触させてもよいし、ＰＣＲ等により所望の塩基配列領域を増幅し、その増幅断片をＤＮＡチップ等に接触させてもよく、限定はされない。得られた核酸をテンプレートとして増幅する領域は、本発明に用いるプローブ、又はＤＮＡチップに配置したオリゴヌクレオチドの塩基配列を含む核酸領域をコードする部位である。増幅する所望の領域は、限定はされず、細菌の種を問わず保存性の高い領域の塩基配列を利用し、多種類の混合物を一度に増幅して得ることができる。このような増幅のための配列は、実験的に単離、精製し、単離されたポリヌクレオチドの塩基配列を解析し、その配列に基づいて決定してもよいし、また、塩基配列等の各種データベースで既知の塩基配列を検索し、アラインメントを取ることなどによって、Ｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏで決定してもよい。核酸又はアミノ酸などのデータベースは、特に限定されるものではないが、例えば、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）、ＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｒｙ，  ＥＭＢＬ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａ  ｌｉｂｒａｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋ（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａ  ｂａｎｋ）、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＴａｘｏｎｏｍｙデータベース等を利用できる。
【００６３】
具体的に、増幅する所望の部位としては、細菌の染色体ＤＮＡ中のリボソームＲＮＡ  （１６Ｓ  ｒＲＮＡ）遺伝子であることが好ましい。当該領域の増幅に用い得るＰＣＲプライマーとしては、例えば、前掲の表Ｂの配列番号３２、３３が好ましく挙げられる。なお、ＰＣＲ法による核酸の増幅は、定法に従って行うことができる。
本工程において抽出した核酸及びその増幅断片は、適宜標識化し、ハイブリダイズさせた後の検出過程において利用することも可能である。具体的には、ＰＣＲプライマーの末端を各種レポーター色素で標識しておく方法、反応性のヌクレオチドアナログを逆転写反応時に取り込ませる方法、ビオチン標識したヌクレオチドを取り込ませる方法などが考えられる。さらに、調製後に蛍光標識試薬と反応させて標識することも可能である。蛍光試薬としては、例えば、各種レポーター色素（例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＶＩＣ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ等）を用いることができる。    
【００６４】
（２）工程（ｉｉ）について
本工程では、工程（ｉ）で得た核酸又はその増幅断片を、本発明に用いるプローブ又はＤＮＡチップに接触させるが、具体的には、当該核酸等を含むハイブリダイゼーション溶液を調製し、当該溶液中の核酸等を、ＤＮＡチップに搭載されたオリゴヌクレオチドプローブに結合（ハイブリダイズ）させる。ハイブリダイゼーション溶液は、ＳＤＳやＳＳＣ等の緩衝液を用いて、定法に従い、適宜調製することができる。
ハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション溶液中の核酸等が、ＤＮＡチップに搭載されたオリゴヌクレオチドプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るよう、反応条件（緩衝液の種類、ｐＨ、温度等）を適宜設定して行うことができる。なお、ここで言う「ストリンジェントな条件」とは、類似配列によるクロスハイブリダイゼーションを生じにくい、又は類似配列によってクロスハイブリダイゼーションした核酸を解離させる条件のことをいい、具体的には、ハイブリダイゼーション反応時又はハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップの洗浄条件を意味する。
例えば、ハイブリダイゼーション反応時の条件としては、反応温度は、３５〜７０℃が好ましく、より好ましくは４０〜６５℃であり、ハイブリダイズさせる際の時間は、約１分〜１６時間が好ましい。
【００６５】
また、ハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップの洗浄条件としては、洗浄液組成は、０．２４Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０であることが好ましく、洗浄時の温度は、３５〜８０℃又は４０〜６５℃が好ましく、より好ましくは４５〜６０℃である。より具体的には、塩（ナトリウム）濃度が４８〜７８０ｍＭであり、温度が３７〜８０℃である条件が好ましく、より好ましくは塩濃度が９７．５〜３９０ｍＭであり、温度が４５〜６０℃である条件である。
【００６６】
洗浄後は、プローブに結合した核酸等の標識を検出できる装置により、スポットごとに検出強度を測定する。例えば、前記核酸等を蛍光標識化していた場合は、各種蛍光検出装置、例えば、ＣＲＢＩＯ（日立ソフトウェアエンジニアリング社製）、ａｒｒａｙＷｏＲｘ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ４２８  Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，社製）、ＧｅｎｅＰｉｘ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）、ＳｃａｎＡｒｒａｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）、ジェノパールリーダー（三菱ケミカル社製）などを用いて、蛍光強度を測定することができる。これらの装置については、蛍光スキャナーの場合は、例えば、レーザーの出力、検出部の感度を適宜調整してスキャンを行うことができ、ＣＣＤカメラ型のスキャナーの場合は、露光時間を適宜調節してスキャンを行うことができる。スキャンの結果に基づく定量方法は、定量ソフトウェアにより行う。定量ソフトウェアに特に限定はなく、スポットの蛍光強度の平均値、中央値等を用いて定量することができる。また、定量にあたっては、ＤＮＡフラグメントのスポット範囲の寸法精度などを考慮し、プローブを搭載していないスポットの蛍光強度をバックグラウンドとして用いるなど、調整を行うことが好ましい。
【００６７】
（３）工程（ｉｉｉ）について
本工程では、前記の手順で得られたシグナル強度より、検出対象菌種の細菌の細菌量を算出する。たとえば、検出対象細菌を検出するためのプローブのシグナル強度とバックグラウンドのシグナル強度からＳＮ比として示す方法がある。または、あらかじめ細菌ごとに細菌の染色体ＤＮＡの濃度を変えて複数条件にて検出し、各濃度条件で得られるシグナル強度をもとに、細菌ごとに染色体ＤＮＡ濃度を算出する換算係数（検量線）を取得しておき、それぞれの条件で得られたシグナル強度から染色体ＤＮＡの濃度を算出する方法などが好ましい。本発明においては、例えば、検出対象の細菌の16S rRNA配列情報に基づく、シグナル強度から、細菌量を算出することが好ましい。また、検出対象の細菌のゲノムコピー数を、細菌量とすることも好ましく採用できる。ゲノムコピー数は、ＤＮＡチップで検出されたシグナル強度に、事前に決定していた各細菌量算出係数を乗算し（且つ、必要に応じ、検出検体の希釈率を乗算し）、算出できる。各細菌量算出係数は、各細菌由来ゲノムＤＮＡを検出したときのシグナル強度を測定し検量線を作成しておき、各細菌のシグナル強度から各細菌量を逆算する係数として求めておくことができる。
いずれの場合でも、各ＤＮＡチップの検出対象細菌のシグナル強度に補正係数を考慮することが好ましい。
【００６８】
４．歯周組織の炎症度の推定
本発明の方法は、唾液中の細菌の細菌量の検出結果を指標として、歯周ポケット炎症面積を推定する方法である。また、本発明の方法は、前記検出結果を指標として、歯周組織の炎症度を包括的に推定する方法である。
唾液中の細菌の細菌量の検出には、いかなるツールを用いてもよく、前記３.項で説明したようにＤＮＡチップを用いる方法や、その他、酵素活性で菌の存在を確認する方法、電気的抵抗を測定し菌の総量を測定する方法、位相差顕微鏡と染色により細菌を数え上げる方法、培養して生菌数を測定する方法、リアルタイムPCRで個々の細菌数を定量する方法等が挙げられる。
【００６９】
当該推定においては、細菌量、または細菌量と比例する測定量として、ＤＮＡチップの蛍光強度やシグナル強度のＳＮ比、リアルタイムPCRのCt値、酵素活性値、電気的に測定した場合の抵抗値、目視で数え上げた計数値等に基づいて、歯周ポケット炎症面積や歯周組織の炎症度を推定する。
【００７０】
歯周ポケット炎症面積を推定する具体的な方法としては、以下の方法が挙げられる。
（１）歯周ポケット炎症面積（PISA値、CAPRS値等）が既知の（実測されたＰＰＤ等から算出可能な）被験者の唾液サンプルから、唾液中の各種細菌の細菌量を検出する。
（２）当該各種細菌の細菌量について、菌ごとに固有の歯周ポケット炎症面積との相関係数を求め、各種細菌の細菌量と歯周ポケット炎症面積との関係式を構築して予測モデルを作成する。
（３）歯周ポケット炎症面積が未知の被験者の唾液サンプルから、唾液中の各種細菌の細菌量を検出する。
（４）（３）で得られた各種細菌量を（２）で得られた関係式に入れて歯周ポケット炎症面積を推定する。
【００７１】
予測モデルの作成方法は、特に限定はされないが、例えば、線形回帰、回帰木、モデル木、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン、バギング、ブースティング、ランダムフォレスト等の機械学習アルゴリズムなど、各種統計解析法を使用する方法があげられる。このうち、後述する実施例で示したモデル木では、あらかじめモデルを規定する必要が無く、具体的には、統計ソフトウェア「Ｒ」（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ）の「ｃａｒｅｔ」パッケージを用いた、「Ｍ５」メソッドでの最適化が、好ましく挙げられる。
【００７２】
歯周ポケット炎症面積が実測されている被験者の唾液サンプル（予測モデル作成に使用するデータ数）は、予測モデル作成に使用する細菌数（変数）以上の数を用いることが好ましい。データ数が蓄積されるごとに予測モデルを更新してもよい。
【００７３】
「第一の発明群」においては、検出される予測モデル作成に使用する細菌として、細菌の細菌量と歯周ポケット炎症面積と正の相関関係を示す細菌と、細菌の細菌量と歯周ポケット炎症面積と負の相関関係を示す細菌の、両方を用いる。歯周病の進行がない健康な人では、歯周ポケット炎症面積と正の相関関係を示す細菌が検出されないことも多く（細菌数０となってしまう）、正の相関関係を示す細菌のみでは、歯周ポケット炎症面積が小さい値の範囲について予測モデルが作成できないためである。
【００７４】
予測モデル作成に使用する細菌の例示は前記１．項に記載した通りであるが、最終的に予測精度が向上するように、細菌は、菌単独の相関係数の大きさだけでなく、歯周ポケット炎症面積の変動に応答するその菌の変化量の正確さや、菌同士の細菌量の相関係数を考慮（多重共線関係を避ける）して選択される。
【００７５】
正の相関を示す細菌として、好ましくは以下の細菌が挙げられる。
Porphyromonas gingivalis,Tannerella forsythia,Treponema denticola,Campylobacter rectus,Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii,Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum,Fusobacterium nucleatum subsp. animalis,Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum,Fusobacterium periodonticum,Aggregatibacter actinomycetemcomitans,Capnocytophaga ochracea,Capnocytophaga sputigena,Streptococcus gordonii,Streptococcus intermedius,Veillonella parvula,Selenomonas noxia,Solobacterium moorei,Prevotella loescheii,Veillonella rogosae,Actinomyces israelii,Corynebacterium matruchotii,SR1 sp. OT 345,Porphyromonas catoniae,Selenomonas sputigena,Neisseria flavescens,Streptococcus sobrinus,Parvimonas micra,Peptostreptococcus stomatis,Treponema socranskii,Eubacterium saphenum,Eubacterium nodatum ,Treponema medium,Filifactor alocis,Porphyromonas endodontalis
【００７６】
正の相関を示す細菌として、さらに好ましくは以下の細菌が挙げられる。
,Porphyromonas gingivalis,Tannerella forsythia,Treponema denticola,Campylobacter rectus,Fusobacterium nucleatum subsp. animalis,Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum,Veillonella parvula,Selenomonas noxia,Eubacterium saphenum,Eubacterium nodatum ,Treponema medium,Filifactor alocis,Porphyromonas endodontalis
正の相関を示す細菌としては、１種以上を用いることが好ましく、４種以上を用いることがより好ましく、８種以上を用いることがさらに好ましく、１２種以上を用いることが特に好ましい。また、１００種以下を用いることが好ましく、７５種以下を用いることがより好ましく、５０種以下を用いることがさらに好ましく、２５種以下を用いることが特に好ましい。
【００７７】
負の相関祖示す細菌として、好ましくは以下の細菌が挙げられる。Streptococcus mitis,Streptococcus mitis bv 2,Actinomyces odontolyticus,Streptococcus mutans,Campylobacter concisus,Capnocytophaga gingivalis,Prevotella pallens,Streptococcus salivarius,Eubacterium sulci,Rothia mucilaginosa,Prevotella denticola,Veillonella atypica,Prevotella histicola,Megasphaera micronuciformis,Streptococcus parasanguinis,Gemella sanguinis,Alloprevotella spp. (A. rava,OT 308),Prevotella melaninogenica,Actinomyces graevenitzii,Prevotella shahii,Rothia dentocariosa,Granulicatella adiacens,Porphyromonas pasteri,Haemophilus parainfluenzae
【００７８】
負の相関祖示す細菌として、さらに好ましくは以下の細菌が挙げられる。,Actinomyces odontolyticus,Streptococcus mutans,Prevotella pallens
負の相関を示す細菌としては、１種以上を用いることが好ましく、２種以上を用いることがより好ましく、４種以上を用いることがさらに好ましく、８種以上を用いることが特に好ましい。また、１００種以下を用いることが好ましく、７５種以下を用いることがより好ましく、５０種以下を用いることがさらに好ましく、２５種以下を用いることが特に好ましい。
【００７９】
ところで、本発明においては、予め規定された数の被験者（１次母標本）において統計解析処理を行い、データベースに記憶させておく。そして、歯周組織の炎症度と唾液中の細菌量との間の相関関係の解析結果から、被験者のそれぞれがどのような歯周組織の炎症度を有するのか、又は歯周ポケット内歯根表面積を有するのかを推定することができる。従って、被験者個人（一人）の検査を行う場合、上記複数の被験者由来のデータを母標本として、当該被験者個人のデータが、データベースに記憶させておいた母標本のデータのどこに位置するか又は当てはまるかを調べることによって、当該被験者個人に対する歯周組織の炎症度又は歯周ポケット内歯根表面積を推定することができる。なお、上記被験者個人のデータを母標本の値に組み込み、再度統計解析処理した後、当該被験者個人が母標本のどこに位置するかを調べるようにしてもよい。
【００８０】
本発明の方法によれば、唾液中の細菌種及びその細菌量に基づいて、歯周組織の炎症度（PISA値、CAPRS値）を推定・予測することができるため、従来、PISA値やCAPRS値を実測していた場合に比べて、格段に簡便に且つ大量の被験体に対しても、一定の算出基準の下で、歯周組織の炎症度を算出することができる。また、本発明においては、歯周組織の炎症度としては、陽性度だけではなく陰性度についても推定・予測の範囲に含まれる。よって、歯周組織の炎症度に対して、細菌量が逆相関する細菌種（常在菌）に着目した場合は、被験体の口腔内について健常状態が維持されているかどうかの推定・予測も行うことができる。さらには、歯周組織の炎症度に対して、細菌量が相関する細菌種、逆相関する細菌種の比を指標としてもよい。
【００８１】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００８２】
唾液サンプルの採取
大阪大学歯学部附属病院にて、歯周病治療中の２０代〜７０代の男女被験者計４６人から、唾液１ｍｌ以上、４６サンプルを採取した。採取した唾液は使用前まで−２０℃で凍結して保管した。【００８３】
唾液サンプルと対応付けられたPISA値の算出
＜臨床情報の取得＞
すべてのサンプルについて下記の臨床情報を記録した。下記２項目は歯科において広く活用されている指標である。
（ｉ）歯周ポケットの深さ（ＰＰＤ）：歯周プローブをポケットに挿入した際の，歯肉辺縁からプローブ先端までの距離を示す。６点法で頬側近心、頬側中央、頬側遠心、舌側近心、舌側中央、舌側遠心を測定し、１ｍｍ単位で数値化した。
（ｉｉ）プロービング時の出血（ＢＯＰ）：歯周プローブをポケットに挿入した際に出血の有無を示す。上記の６点法と対応した位置に対して出血がない場合を０、出血がある場合を１とした。
（ｉ）歯周ポケットの深さ（ＰＰＤ）と（ｉｉ）プロービング時の出血（ＢＯＰ）を、表１にまとめた。【００８４】
【表１−１】
2019088271.tif 000004
【表１−２】
2019088271.tif 000005
【表１−３】
2019088271.tif 000006
【表１−４】
2019088271.tif 000007
【表１−５】
2019088271.tif 000008
【表１−６】
2019088271.tif 000009
【表１−７】
2019088271.tif 000010
【表１−８】
2019088271.tif 000011
【表１−９】
2019088271.tif 000012
【表１−１０】
2019088271.tif 000013
【表１−１１】
2019088271.tif 000014
【表１−１２】
2019088271.tif 000015
【表１−１３】
2019088271.tif 000016
【表１−１４】
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【表１−１５】
2019088271.tif 000018
【表１−１６】
2019088271.tif 000019
【００８５】
＜ＰＩＳＡ値の算出＞
続いて、記録した６点法による歯周病検査結果から、公知文献（Ｎｅｓｓｅ，  Ｗ．，  Ａｂｂａｓ，  Ｆ．，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｌｏｅｇ，  Ｉ．，  Ｓｐｉｊｋｅｒｖｅｔ，  Ｆ．Ｋ．，Ｄｉｊｋｓｔｒａ  ，Ｐ．Ｕ．，  Ｖｉｓｓｉｎｋ，  Ａ．：  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｉｎｆｌａｍｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｒｅａ：  ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｕｒｄｅｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ，  ３５：  ６６８−６７３，  ２００８．）を参照し、表２に示すようにＰＩＳＡ（Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｉｎｆｌａｍｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｒｅａ）を算出した。ＰＩＳＡは口腔全体の歯周組織の炎症部位面積を平方ミリメートル（ｍｍ２）で示したものである。
表３に、４６名のＰＩＳＡ値をまとめて示した。【００８６】
【表２−１】
2019088271.tif 000020
【表２−２】
2019088271.tif 000021
【００８７】
【表３】
2019088271.tif 000022
【００８８】
唾液サンプル中の口腔内細菌の検出
＜唾液からのＤＮＡの抽出＞
１−１  ビーズ破砕
２ｍｌのチューブに前述の唾液のうち４００μｌ、滅菌水４００μｌと０．１ｍｍガラスビーズ０．４ｇ（トミー精工社製＃ＧＢ−０１）を入れフタをしっかり締めた後、マイクロスマッシュ（トミー精工社製）にセットし、３２００ｒｐｍで５分間ビーズ破砕した。その後、ビーズ等を落とすためにチューブを遠心機にセットし、１８００ｇで５分間軽く遠心した。上清４００μｌを新しい１．５ｍｌチューブに分注した。【００８９】
１−２  酵素処理
１−１のサンプルに対してキアゲン社のＢｕｆｆｅｒ  ＡＴＬ９０μｌ、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ  １０μｌ、Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＬ１００μｌを混合し、合計６００μｌとし、５６℃で１時間インキュベートした。【００９０】
１−３  カラム精製
インキュベート後、エタノール１２０μｌを加えてボルテックスした。続いてＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を使用し、キットのカラムに７２０μｌ全量を入れて１４０００ｒｐｍで１分間遠心した後、溶出液を廃棄した。その後、キットのプロトコールに従い、Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＷ１  ５００μｌ、Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＷ２  ５００μｌでカラムを洗浄した。続いて、空の状態で１４０００ｒｐｍで１分間遠心した後、滅菌水２０μｌでＤＮＡを溶出した。４６サンプルでそれぞれ約４〜２０ｎｇ／μｌのＤＮＡ溶液を取得した。【００９１】
＜細菌ＤＮＡの増幅反応＞
前記のＤＮＡ溶液を希釈して２０ｐｇ／μｌとし、これをＰＣＲテンプレートとした。サンプル中の口腔内細菌の１６ＳｒＲＮＡの検出対象領域の配列を増幅するために、以下の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを実施した。ＰＣＲ用キットは、Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴＭ）  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ社製）を用い、ＰｒｏＦｌｅｘ（ＴＭ）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により行った。プライマーは下記の配列を有するプライマーを用いた。なお、フォワードプライマーは５’末端がＣｙ５で標識化されているものを用いた。【００９２】
フォワードプライマー（細菌増幅用）：
５’−Ｃｙ５−ＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ−３’  （配列番号３２）
リバースプライマー（細菌増幅用）：
５’−ＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＡＣＣ−３’  （配列番号３３）【００９３】
フォワードプライマー（絶対量指標増幅用）：
５’−Ｃｙ５−ＧＡＧＡＡＧＣＣＴＡＣＡＣＡＡＡＣＧＴＡＡＣＧＴＣ−３’  （配列番号３４）
リバースプライマー（絶対量指標増幅用）：
５’−ＣＴＣＴＡＡＡＧＡＣＣＧＣＴＣＴＡＴＣＴＣＧＧ−３’（配列番号３５）【００９４】
＜反応液組成＞
２×Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ                                             １０μＬ    
４μＭフォワードプライマー（細菌増幅用）              １μＬ    
４μＭリバースプライマー（細菌増幅用）                １μＬ    
４μＭフォワードプライマー（絶対量指標増幅用）        １μＬ    
４μＭリバースプライマー（絶対量指標増幅用）          １μＬ    
テンプレートＤＮＡ                                    ５μＬ    
絶対量指標                                            １μＬ        
合計                                                ２０μＬ【００９５】
＜反応条件＞
９５℃で１分間加熱後、「解離：９８℃（１０ｓｅｃ）→アニーリング：５５℃（３０ｓｅｃ）→合成：７２℃（２０ｓｅｃ）」を１サイクルとして計４０サイクル行い、４℃で冷却し、増幅産物を得た。【００９６】
＜ＤＮＡチップ：口腔内細菌検出用ＤＮＡチップの製造＞
貫通孔型のＤＮＡチップを、特開２００７−７４９５０号公報（メチル化ＤＮＡ及び／又は非メチル化ＤＮＡの検出方法）の実施例１に記載の方法と同様の方法で製造を行った。
ただし、搭載させたオリゴヌクレオチドプローブは、表４に示す配列情報をもつプローブを用いた。【００９７】
【表４】
2019088271.tif 000023
【００９８】
＜ＤＮＡチップへのハイブリダイゼーション＞
以下のように各溶液を混合し、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。【００９９】
ＰＣＲ後に得たＤＮＡ増幅産物  ２０μＬ
１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ                  ４８μＬ
１Ｍ  ＮａＣｌ                        ４８μＬ
０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０              ２０μＬ
水                                    ６５μＬ    
合計                                ２００μＬ【０１００】
ＤＮＡチップのハイブリダイゼーション、洗浄には自動ハイブリ洗浄装置（型式：ＡＨＦ−２００、三菱ケミカル社製）を用いた。
２００μＬのハイブリダイゼーション溶液を前記ＤＮＡチップに接触させ、５０℃で１６時間ハイブリダイゼーションした。
ハイブリダイゼーション後、下記の条件でＤＮＡチップを洗浄した。０．２４Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０溶液１０００μＬで２２０秒の洗浄を１２回繰り返し、続いて、０．２４Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ  ＮａＣｌ１０００μＬで２２０秒の洗浄を４回繰り返した。
洗浄終了後に、各チップを室温の０．２４Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／０．２４Ｍ  ＮａＣｌ混合溶液に移した。【０１０１】
＜検出＞
前記洗浄後、ジェノパールリーダー（型式：ＧＲ−Ｓ１、三菱ケミカル社製）を用い、下記条件でＤＮＡチップの各スポットの蛍光強度を測定した。【０１０２】
＜検出条件＞
中心励起波長  ：６３３ｎｍ
露光時間  ：０．１、１、４、４０秒【０１０３】
＜結果＞
検出対象細菌用プローブを搭載したスポットの蛍光強度を、バックグラウンド値（プローブを搭載していないスポットの蛍光強度の中央値）で除算し、ハイブリダイゼーションに由来する蛍光強度（以後、シグナル強度と呼ぶ）のＳＮ比を算出した。【０１０４】
細菌量に基づいたＰＩＳＡ値の予測
＜ＰＩＳＡ値と細菌量の相関解析＞
まず、サンプルごとに、ＰＩＳＡ値および各細菌量を示すＳＮ比のデータを対応させた。その結果を、表５に示した。【０１０５】
【表５−１】
2019088271.tif 000024
【表５−２】
2019088271.tif 000025
【表５−３】
2019088271.tif 000026
【表５−４】
2019088271.tif 000027
【０１０６】
その後、エクセルの「データ分析」を用いてＰＩＳＡと細菌のＳＮ比との相関係数を求め、表６にまとめた。【０１０７】
【表６】
2019088271.tif 000028
【０１０８】
各細菌量を示すＳＮ比と口腔内全体のＰＩＳＡ値との比較において、相関が高いものから順にＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ.ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｒｅｃｔｕｓであった。これらには、「Ｒｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘ」が含まれており、口腔全体の炎症度の指標になると考えられた。一方、逆相関を示すものとしては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ  ｂｖ  ２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｎｃｉｓｕｓであった。これらは口腔全体の健康度の指標になると考えられた。【０１０９】
続いて、表５に示したデータを用いて、各細菌量のＳＮ比をもとに機械学習の手法を用い、ＰＩＳＡ値をモデル木で予測するモデルの作成を行った。解析には、統計ソフトウェア「Ｒ」（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ）の「ｃａｒｅｔ」パッケージを用い、「Ｍ５」メソッドでの最適化を実行した。【０１１０】
表５のデータを「ｂａｃｔｅｒｉａ」として読み込ませた後、次のコマンドを実行した。
m <- train(PISA~.,data=bacteria ,method="M5")
ＰＩＳＡを目的変数とし、説明変数を表５の細菌全種類としてモデル木を生成させるコマンドである。４６サンプルデータすべてを使用した。【０１１１】
実行した最適モデルをm$finalModelと結果の出力コマンドを入力して出力させたところ、以下の予測モデルを得た。結果を、図１に示した。【０１１２】
M5 unpruned model tree:
(using smoothed linear models)
Actinomyces.odontolyticus <= 20.1 : 
|   Campylobacter.concisus <= 2.2 : 
|   |   Capnocytophaga.sputigena <= 2.15 : 
|   |   |   Tannerella.forsythia <= 6.9 : 
|   |   |   |   Streptococcus.mutans <= 5.3 : LM1 (2/12.282%)
|   |   |   |   Streptococcus.mutans >  5.3 : LM2 (2/32.179%)
|   |   |   Tannerella.forsythia >  6.9 : 
|   |   |   |   Streptococcus.mutans <= 2.95 : LM3 (3/16.447%)
|   |   |   |   Streptococcus.mutans >  2.95 : LM4 (3/2.075%)
|   |   Capnocytophaga.sputigena >  2.15 : 
|   |   |   Streptococcus.gordonii <= 35.45 : LM5 (2/1.965%)
|   |   |   Streptococcus.gordonii >  35.45 : LM6 (3/26.323%)
|   Campylobacter.concisus >  2.2 : 
|   |   Treponema.denticola <= 15.35 : 
|   |   |   Fusobacterium.nucleatum.subsp..nucleatum <= 38.35 : LM7 (3/2.882%)
|   |   |   Fusobacterium.nucleatum.subsp..nucleatum >  38.35 : 
|   |   |   |   Actinomyces.odontolyticus <= 10.9 : LM8 (3/4.64%)
|   |   |   |   Actinomyces.odontolyticus >  10.9 : LM9 (2/2.948%)
|   |   Treponema.denticola >  15.35 : LM10 (3/39.648%)
Actinomyces.odontolyticus >  20.1 : 
|   Tannerella.forsythia <= 2.85 : 
|   |   Streptococcus.gordonii <= 19.6 : 
|   |   |   Actinomyces.naeslundii.II <= 4.05 : LM11 (5/2.414%)
|   |   |   Actinomyces.naeslundii.II >  4.05 : LM12 (3/3.304%)
|   |   Streptococcus.gordonii >  19.6 : 
|   |   |   Control.DNA <= 837.15 : LM13 (3/4.132%)
|   |   |   Control.DNA >  837.15 : LM14 (2/0.098%)
|   Tannerella.forsythia >  2.85 : 
|   |   Streptococcus.constellatus <= 1.75 : LM15 (3/14.832%)
|   |   Streptococcus.constellatus >  1.75 : 
|   |   |   Porphyromonas.gingivalis <= 1.35 : LM16 (2/9.58%)
|   |   |   Porphyromonas.gingivalis >  1.35 : LM17 (2/2.751%)
LM num: 1
.outcome = 
5.9609 * Treponema.denticola 
+ 2.719 * Streptococcus.gordonii 
- 2.4637 * Actinomyces.odontolyticus 
- 43.3698 * Streptococcus.mutans 
+ 161.5714 * Capnocytophaga.sputigena 
- 0.4833 * Control.DNA 
+ 3.734 * Tannerella.forsythia 
+ 1510.5973
LM num: 2
.outcome = 
5.9609 * Treponema.denticola 
+ 2.719 * Streptococcus.gordonii 
- 2.4637 * Actinomyces.odontolyticus 
- 43.3698 * Streptococcus.mutans 
+ 161.5714 * Capnocytophaga.sputigena 
- 0.4833 * Control.DNA 
+ 3.734 * Tannerella.forsythia 
+ 1507.5864
LM num: 3
.outcome = 
5.9609 * Treponema.denticola 
+ 2.719 * Streptococcus.gordonii 
- 2.4637 * Actinomyces.odontolyticus 
- 26.3717 * Streptococcus.mutans 
+ 161.5714 * Capnocytophaga.sputigena 
- 0.4833 * Control.DNA 
+ 3.9077 * Tannerella.forsythia 
+ 1392.5945
LM num: 4
.outcome = 
5.9609 * Treponema.denticola 
+ 2.719 * Streptococcus.gordonii 
- 2.4637 * Actinomyces.odontolyticus 
- 26.3717 * Streptococcus.mutans 
+ 161.5714 * Capnocytophaga.sputigena 
- 0.4833 * Control.DNA 
+ 3.9077 * Tannerella.forsythia 
+ 1394.1708
LM num: 5
.outcome = 
5.9609 * Treponema.denticola 
+ 1.2546 * Streptococcus.gordonii 
- 2.4637 * Actinomyces.odontolyticus 
- 26.3717 * Streptococcus.mutans 
+ 201.9643 * Capnocytophaga.sputigena 
- 0.4833 * Control.DNA 
+ 5.5586 * Tannerella.forsythia 
+ 1565.177
LM num: 6
.outcome = 
5.9609 * Treponema.denticola 
+ 1.336 * Streptococcus.gordonii 
- 2.4637 * Actinomyces.odontolyticus 
- 26.3717 * Streptococcus.mutans 
+ 201.9643 * Capnocytophaga.sputigena 
- 0.4833 * Control.DNA 
+ 5.5586 * Tannerella.forsythia 
+ 1555.611
LM num: 7
.outcome = 
13.3672 * Treponema.denticola 
+ 2.719 * Streptococcus.gordonii 
- 2.4637 * Actinomyces.odontolyticus 
- 30.4289 * Streptococcus.mutans 
- 0.4833 * Control.DNA 
+ 5.5586 * Tannerella.forsythia 
- 0.3524 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..nucleatum 
+ 1314.4003
LM num: 8
.outcome = 
13.3672 * Treponema.denticola 
+ 2.719 * Streptococcus.gordonii 
- 1.3817 * Actinomyces.odontolyticus 
- 30.4289 * Streptococcus.mutans 
- 0.4833 * Control.DNA 
+ 5.5586 * Tannerella.forsythia 
- 0.3171 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..nucleatum 
+ 1293.9573
LM num: 9
.outcome = 
13.3672 * Treponema.denticola 
+ 2.719 * Streptococcus.gordonii 
- 1.3181 * Actinomyces.odontolyticus 
- 30.4289 * Streptococcus.mutans 
- 0.4833 * Control.DNA 
+ 5.5586 * Tannerella.forsythia 
- 0.3171 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..nucleatum 
+ 1294.0756
LM num: 10
.outcome = 
15.293 * Treponema.denticola 
+ 2.719 * Streptococcus.gordonii 
- 2.4637 * Actinomyces.odontolyticus 
- 30.4289 * Streptococcus.mutans 
- 0.4833 * Control.DNA 
+ 5.5586 * Tannerella.forsythia 
+ 1320.5275
LM num: 11
.outcome = 
3.3786 * Treponema.denticola 
+ 5.1956 * Streptococcus.gordonii 
- 2.8861 * Actinomyces.odontolyticus 
- 0.5662 * Control.DNA 
+ 29.9183 * Tannerella.forsythia 
- 2.6289 * Actinomyces.naeslundii.II 
+ 826.1665
LM num: 12
.outcome = 
3.3786 * Treponema.denticola 
+ 5.1956 * Streptococcus.gordonii 
- 2.8861 * Actinomyces.odontolyticus 
- 0.5662 * Control.DNA 
+ 29.9183 * Tannerella.forsythia 
- 2.9643 * Actinomyces.naeslundii.II 
+ 825.1613
LM num: 13
.outcome = 
3.3786 * Treponema.denticola 
+ 5.4972 * Streptococcus.gordonii 
- 2.8861 * Actinomyces.odontolyticus 
- 0.6637 * Control.DNA 
+ 29.9183 * Tannerella.forsythia 
+ 0.4481 * Actinomyces.naeslundii.II 
+ 906.7614
LM num: 14
.outcome = 
3.3786 * Treponema.denticola 
+ 5.4972 * Streptococcus.gordonii 
- 2.8861 * Actinomyces.odontolyticus 
- 0.6694 * Control.DNA 
+ 29.9183 * Tannerella.forsythia 
+ 0.4481 * Actinomyces.naeslundii.II 
+ 910.6162
LM num: 15
.outcome = 
-215.5803 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 3.3786 * Treponema.denticola 
+ 3.1851 * Streptococcus.gordonii 
- 2.8861 * Actinomyces.odontolyticus 
- 56.1926 * Streptococcus.constellatus 
- 0.5662 * Control.DNA 
+ 36.302 * Tannerella.forsythia 
+ 1327.7476
LM num: 16
.outcome = 
-221.29 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 3.3786 * Treponema.denticola 
+ 3.1851 * Streptococcus.gordonii 
- 2.8861 * Actinomyces.odontolyticus 
- 53.2351 * Streptococcus.constellatus 
- 0.5662 * Control.DNA 
+ 36.302 * Tannerella.forsythia 
+ 1307.8776
LM num: 17
.outcome = 
-221.29 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 3.3786 * Treponema.denticola 
+ 3.1851 * Streptococcus.gordonii 
- 2.8861 * Actinomyces.odontolyticus 
- 53.2351 * Streptococcus.constellatus 
- 0.5662 * Control.DNA 
+ 36.302 * Tannerella.forsythia 
+ 1307.1008
【０１１３】
p <- predict(m,newdata=bacteria)とコマンドを入力し、作成した予測モデル「ｍ」に対して、実測した各細菌量のＳＮ比データの４６サンプル分を代入し、４６サンプルに対応する予測ＰＩＳＡ値「ｐ」得た。
引き続き、cor(p,bacteria$PISA)をコマンドを入力し、予測ＰＩＳＡ値「ｐ」と実測のＰＩＳＡ値の相関係数を計算させたところ、相関係数0.8759666となった。
予測ＰＩＳＡ値「ｐ」と実測のＰＩＳＡ値の散布図を図２に示す。
このモデルに示すようにDNAチップのSN比からPISA値を予測可能であることが示された。
特に表６に示した各細菌量を示すＳＮ比と口腔内全体のＰＩＳＡ値との比較において、負の相関係数をもつ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｎｃｉｓｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ．ＩＩ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓと、正の相関係数をもつＣａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐｕｔｉｇｅｎａ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの細菌群のＳＮ比からＰＩＳＡ値を予測可能であることが示された。
【実施例２】
【０１１４】
実施例１と同一の検出結果を用いて細菌量に基づいたＰＩＳＡ値の予測を行った。
＜ＰＩＳＡ値と細菌量の相関解析＞
まず、サンプルごとに、ＰＩＳＡ値および各細菌量を示すＳＮ比のデータを対応させた。その後、すべてのサンプルの絶対量指標プローブのＳＮ比の中央値を算出し、個々のサンプルの絶対量指標プローブのＳＮ比をこの中央値で除算した。これをチップ間補正値とする。続いて、個々のサンプルのすべての細菌のＳＮ比データを、個々のサンプルのチップ間補正値で除算することにより、チップ間のＳＮ比データを標準化した。その結果を、表７に示した。【０１１５】
【表７−１】
2019088271.tif 000029
【表７−２】
2019088271.tif 000030
【表７−３】
2019088271.tif 000031
【表７−４】
2019088271.tif 000032
【０１１６】
その後、エクセルの「データ分析」を用いてＰＩＳＡと細菌のＳＮ比との相関係数を求め、表８に示した。【０１１７】
【表８】
2019088271.tif 000033
【０１１８】
各細菌量を示すＳＮ比と口腔内全体のＰＩＳＡ値との比較において、相関が高いものから順にＴａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ.ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｎｏｘｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｒｅｃｔｕｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍであった。これらには、「Ｒｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘ」が含まれており、口腔全体の炎症度の指標になると考えられた。一方、逆相関を示すものとしては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ  ｂｖ  ２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｎｃｉｓｕｓであった。これらは口腔全体の健康度の指標になると考えられた。【０１１９】
続いて、表７に示したデータを用いて、各細菌量のＳＮ比をもとに機械学習の手法を用い、ＰＩＳＡ値をモデル木で予測するモデルの作成を行った。解析には、統計ソフトウェア「Ｒ」（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ）の「ｃａｒｅｔ」パッケージを用い、「Ｍ５」メソッドでの最適化を実行した。【０１２０】
表７のデータを「ｂａｃｔｅｒｉａ」として読み込ませた後、次のコマンドを実行した。
m <- train(PISA~.,data=bacteria ,method="M5")
ＰＩＳＡを目的変数とし、説明変数を表７の細菌全種類としてモデル木を生成させるコマンドである。４６サンプルデータすべてを使用した。【０１２１】
実行した最適モデルをm$finalModelと結果の出力コマンドを入力して出力させたところ、以下の予測モデルを得た。【０１２２】
M5 unpruned model tree:
(using smoothed linear models)
Treponema.denticola <= 6.1 : 
|   Campylobacter.concisus <= 1.45 : 
|   |   Actinomyces.odontolyticus <= 53.95 : 
|   |   |   Streptococcus.mutans <= 15 : 
|   |   |   |   Tannerella.forsythia <= 4.9 : 
|   |   |   |   |   Porphyromonas.gingivalis <= 1.45 : LM1 (2/25.547%)
|   |   |   |   |   Porphyromonas.gingivalis >  1.45 : LM2 (2/24.859%)
|   |   |   |   Tannerella.forsythia >  4.9 : LM3 (3/3.438%)
|   |   |   Streptococcus.mutans >  15 : LM4 (2/7.664%)
|   |   Actinomyces.odontolyticus >  53.95 : 
|   |   |   Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis <= 2.2 : LM5 (2/3.144%)
|   |   |   Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis >  2.2 : LM6 (2/2.358%)
|   Campylobacter.concisus >  1.45 : 
|   |   Capnocytophaga.ochracea <= 1.15 : 
|   |   |   Fusobacterium.periodonticum <= 2.35 : LM7 (2/4.372%)
|   |   |   Fusobacterium.periodonticum >  2.35 : LM8 (2/1.326%)
|   |   Capnocytophaga.ochracea >  1.15 : 
|   |   |   Total.bacteria <= 2252.6 : LM9 (4/4.488%)
|   |   |   Total.bacteria >  2252.6 : 
|   |   |   |   Capnocytophaga.ochracea <= 1.55 : LM10 (4/2.777%)
|   |   |   |   Capnocytophaga.ochracea >  1.55 : 
|   |   |   |   |   Tannerella.forsythia <= 2.9 : 
|   |   |   |   |   |   Tannerella.forsythia <= 2.35 : LM11 (2/11.398%)
|   |   |   |   |   |   Tannerella.forsythia >  2.35 : LM12 (2/1.572%)
|   |   |   |   |   Tannerella.forsythia >  2.9 : LM13 (3/17.057%)
Treponema.denticola >  6.1 : 
|   Campylobacter.rectus <= 6.4 : 
|   |   Veillonella.parvula <= 1.25 : 
|   |   |   Streptococcus.gordonii <= 36.15 : LM14 (3/12.485%)
|   |   |   Streptococcus.gordonii >  36.15 : 
|   |   |   |   Tannerella.forsythia <= 11.5 : LM15 (2/8.205%)
|   |   |   |   Tannerella.forsythia >  11.5 : LM16 (2/1.572%)
|   |   Veillonella.parvula >  1.25 : LM17 (3/55.578%)
|   Campylobacter.rectus >  6.4 : 
|   |   Total.bacteria <= 1916.55 : LM18 (2/4.176%)
|   |   Total.bacteria >  1916.55 : LM19 (2/1.965%)
LM num: 1
.outcome = 
0.1154 * Total.bacteria 
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 32.2177 * Tannerella.forsythia 
+ 3.4246 * Treponema.denticola 
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis 
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii 
- 2.8479 * Actinomyces.odontolyticus 
- 4.1907 * Streptococcus.mutans 
+ 353.0028
LM num: 2
.outcome = 
0.1154 * Total.bacteria 
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 32.2177 * Tannerella.forsythia 
+ 3.4246 * Treponema.denticola 
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis 
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii 
- 2.8479 * Actinomyces.odontolyticus 
- 4.1907 * Streptococcus.mutans 
+ 354.0939
LM num: 3
.outcome = 
0.1154 * Total.bacteria 
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 32.2177 * Tannerella.forsythia 
+ 3.4246 * Treponema.denticola 
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis 
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii 
- 2.8479 * Actinomyces.odontolyticus 
- 4.1907 * Streptococcus.mutans 
+ 353.0353
LM num: 4
.outcome = 
0.1154 * Total.bacteria 
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 32.2177 * Tannerella.forsythia 
+ 3.4246 * Treponema.denticola 
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis 
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii 
- 2.8479 * Actinomyces.odontolyticus 
- 5.4232 * Streptococcus.mutans 
+ 347.5507
LM num: 5
.outcome = 
0.1154 * Total.bacteria 
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 32.2177 * Tannerella.forsythia 
+ 3.4246 * Treponema.denticola 
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis 
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii 
- 3.3806 * Actinomyces.odontolyticus 
+ 263.7849
LM num: 6
.outcome = 
0.1154 * Total.bacteria 
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 32.2177 * Tannerella.forsythia 
+ 3.4246 * Treponema.denticola 
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis 
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii 
- 3.3806 * Actinomyces.odontolyticus 
+ 262.54
LM num: 7
.outcome = 
0.1154 * Total.bacteria 
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 27.5903 * Tannerella.forsythia 
+ 3.4246 * Treponema.denticola 
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis 
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii 
- 0.6784 * Actinomyces.odontolyticus 
+ 33.5894
LM num: 8
.outcome = 
0.1154 * Total.bacteria 
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 27.5903 * Tannerella.forsythia 
+ 3.4246 * Treponema.denticola 
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis 
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii 
- 0.6784 * Actinomyces.odontolyticus 
+ 32.468
LM num: 9
.outcome = 
0.0649 * Total.bacteria 
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 43.8294 * Tannerella.forsythia 
+ 3.4246 * Treponema.denticola 
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis 
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii 
- 0.6784 * Actinomyces.odontolyticus 
+ 146.6484
LM num: 10
.outcome = 
0.0785 * Total.bacteria 
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 44.0191 * Tannerella.forsythia 
+ 3.4246 * Treponema.denticola 
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis 
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii 
- 0.6784 * Actinomyces.odontolyticus 
+ 93.2371
LM num: 11
.outcome = 
0.0785 * Total.bacteria 
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 45.0694 * Tannerella.forsythia 
+ 3.4246 * Treponema.denticola 
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis 
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii 
- 0.6784 * Actinomyces.odontolyticus 
+ 91.1073
LM num: 12
.outcome = 
0.0785 * Total.bacteria 
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 45.0694 * Tannerella.forsythia 
+ 3.4246 * Treponema.denticola 
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis 
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii 
- 0.6784 * Actinomyces.odontolyticus 
+ 91.0077
LM num: 13
.outcome = 
0.0785 * Total.bacteria 
- 87.6234 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 45.1623 * Tannerella.forsythia 
+ 3.4246 * Treponema.denticola 
+ 10.3816 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis 
+ 4.5488 * Streptococcus.gordonii 
- 0.6784 * Actinomyces.odontolyticus 
+ 93.4098
LM num: 14
.outcome = 
-0.0279 * Total.bacteria 
- 142.0103 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 9.7177 * Tannerella.forsythia 
+ 5.5503 * Treponema.denticola 
+ 24.5588 * Campylobacter.rectus 
+ 16.8253 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis 
+ 10.5169 * Streptococcus.gordonii 
+ 793.003 * Veillonella.parvula 
- 497.9287
LM num: 15
.outcome = 
-0.0279 * Total.bacteria 
- 142.0103 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 9.7177 * Tannerella.forsythia 
+ 5.5503 * Treponema.denticola 
+ 24.5588 * Campylobacter.rectus 
+ 16.8253 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis 
+ 10.4819 * Streptococcus.gordonii 
+ 793.003 * Veillonella.parvula 
- 489.1573
LM num: 16
.outcome = 
-0.0279 * Total.bacteria 
- 142.0103 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 9.7177 * Tannerella.forsythia 
+ 5.5503 * Treponema.denticola 
+ 24.5588 * Campylobacter.rectus 
+ 16.8253 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis 
+ 10.4819 * Streptococcus.gordonii 
+ 793.003 * Veillonella.parvula 
- 489.4669
LM num: 17
.outcome = 
-0.0279 * Total.bacteria 
- 142.0103 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 9.7177 * Tannerella.forsythia 
+ 5.5503 * Treponema.denticola 
+ 24.5588 * Campylobacter.rectus 
+ 16.8253 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis 
+ 10.4024 * Streptococcus.gordonii 
+ 853.2173 * Veillonella.parvula 
- 506.1734
LM num: 18
.outcome = 
-0.0958 * Total.bacteria 
- 142.0103 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 9.7177 * Tannerella.forsythia 
+ 5.5503 * Treponema.denticola 
+ 32.3143 * Campylobacter.rectus 
+ 16.8253 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis 
+ 7.3721 * Streptococcus.gordonii 
+ 686.8925 * Veillonella.parvula 
+ 139.0553
LM num: 19
.outcome = 
-0.0958 * Total.bacteria 
- 142.0103 * Porphyromonas.gingivalis 
+ 9.7177 * Tannerella.forsythia 
+ 5.5503 * Treponema.denticola 
+ 32.3143 * Campylobacter.rectus 
+ 16.8253 * Fusobacterium.nucleatum.subsp..animalis 
+ 7.3721 * Streptococcus.gordonii 
+ 686.8925 * Veillonella.parvula 
+ 143.569
Number of Rules : 19
【０１２３】
引き続き、p <- predict(m,newdata=bacteria)とコマンドを入力し、作成した予測モデル「ｍ」に対して実測した各細菌量のＳＮ比データの４６サンプル分を代入し４６サンプルに対応する予測ＰＩＳＡ値「ｐ」を得た。
実際のＰＩＳＡ値と予測ＰＩＳＡ値の相関係数を算出するためcor(p,bacteria$PISA)をコマンドを実行し、予測ＰＩＳＡ値「ｐ」と実測のＰＩＳＡ値の相関係数を計算させたところ、相関係数0.9291664を得た。予測ＰＩＳＡ値「ｐ」と実測のＰＩＳＡ値の散布図を、図３に示す。このモデルに示すようにＤＮＡチップのＳＮ比からＰＩＳＡ値を予測可能であることが示された。【０１２４】
特に、表８に示した各細菌量を示すＳＮ比と口腔内全体のＰＩＳＡ値との比較において、負の相関係数をもつ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｎｃｉｓｕｓと、正の相関係数をもつＴａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ.ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｒｅｃｔｕｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｏｃｈｒａｃｅａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍの細菌群のＳＮ比からＰＩＳＡ値を予測可能であることが示された。
【実施例３】
【０１２５】
実施例２に記載の表７と同一データを用いて、各細菌量のＳＮ比をもとに機械学習の手法を用い、ＰＩＳＡ値をモデル木で予測するモデルの作成を行った。解析には、統計ソフトウェア「Ｒ」（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ）の「ｃａｒｅｔ」パッケージ「Ｍ５」メソッドを用いた。
予測モデルの構築では４６サンプルのうち、ランダムに３４サンプルを抽出してクロスバリデーション法に用いた。クロスバリデーション法におけるモデル構築訓練データと検証データの比率は７５：２５とし学習回数は１０回とした。
モデル構築後、モデル構築には全く使用していない残りの１２サンプルのデータを将来の未知データとして用い、検証に使用した。
より具体的には、表７の表をデータフレーム名「bacteria」とした後、以下のコマンドにより実行した。【０１２６】
fitControl <- trainControl(method="CV",p=0.75, number=10)
train.index <- sample(nrow(bacteria),nrow(bacteria)*0.75)
#モデル作成用データのセット
data.train <- bacteria[train.index,]
#テスト用データのセット
data.test <- bacteria[-train.index,]
data.m5 <- train(data.train[,-1],data.train$PISA,method="M5",trControl=fitControl)
（クロスバリデーション法におけるモデル構築訓練データと検証データの比率は７５：２５とし学習回数は１０回とした。）
data.m5$results  #構築モデルの表示
#未知データでの検証結果
PISA.pred <- predict(data.m5,newdata=data.test[,-1])
#相関係数の計算
cor(PISA.pred,data.test$PISA)
#散布図の出力
plot(PISA.pred,data.test$PISA)
#トレーニングデータでの結果
PISA.predtr <- predict(data.m5,newdata=data.train[,-1])
#相関係数の計算
cor(PISA.predtr,data.train$PISA)
#散布図の出力
plot(PISA.predtr,data.train$PISA)
【０１２７】
その結果、構築モデルは以下の結果が得られた（図４）。
M5 unpruned model tree:
(using smoothed linear models)
Tannerella.forsythia <= 3.589 : 
|   Capnocytophaga.ochracea <= 1.085 : LM1 (3/3.579%)
|   Capnocytophaga.ochracea >  1.085 : 
|   |   Prevotella.intermedia <= 1.135 : 
|   |   |   Total.bacteria <= 2072.974 : LM2 (2/2.188%)
|   |   |   Total.bacteria >  2072.974 : LM3 (3/2.889%)
|   |   Prevotella.intermedia >  1.135 : 
|   |   |   Treponema.denticola <= 2.289 : LM4 (3/0.856%)
|   |   |   Treponema.denticola >  2.289 : LM5 (2/4.57%)
Tannerella.forsythia >  3.589 : 
|   Capnocytophaga.sputigena <= 1.786 : 
|   |   Eikenella.corrodens <= 1.067 : 
|   |   |   Fusobacterium.periodonticum <= 1.502 : LM6 (3/2.054%)
|   |   |   Fusobacterium.periodonticum >  1.502 : 
|   |   |   |   Streptococcus.mitis <= 3.972 : LM7 (2/7.05%)
|   |   |   |   Streptococcus.mitis >  3.972 : 
|   |   |   |   |   Aggregatibacter.actinomycetemcomitans <= 1.334 : LM8 (3/5.601%)
|   |   |   |   |   Aggregatibacter.actinomycetemcomitans >  1.334 : LM9 (2/21.879%)
|   |   Eikenella.corrodens >  1.067 : LM10 (3/7.804%)
|   Capnocytophaga.sputigena >  1.786 : 
|   |   Tannerella.forsythia <= 12.803 : 
|   |   |   Total.bacteria <= 2244.721 : LM11 (2/6.126%)
|   |   |   Total.bacteria >  2244.721 : LM12 (2/103.221%)
|   |   Tannerella.forsythia >  12.803 : 
|   |   |   Total.bacteria <= 1907.395 : LM13 (2/25.331%)
|   |   |   Total.bacteria >  1907.395 : LM14 (2/1.945%)
LM num: 1
.outcome = 
0.1964 * Total.bacteria 
+ 8.473 * Treponema.denticola 
- 3.7524 * Streptococcus.mitis 
+ 136.0844
LM num: 2
.outcome = 
0.1872 * Total.bacteria 
+ 8.473 * Treponema.denticola 
- 102.9193 * Prevotella.intermedia 
- 3.7524 * Streptococcus.mitis 
+ 297.6459
LM num: 3
.outcome = 
0.1877 * Total.bacteria 
+ 8.473 * Treponema.denticola 
- 102.9193 * Prevotella.intermedia 
- 3.7524 * Streptococcus.mitis 
+ 295.2116
LM num: 4
.outcome = 
0.1964 * Total.bacteria 
+ 10.9568 * Treponema.denticola 
- 102.9193 * Prevotella.intermedia 
- 3.7524 * Streptococcus.mitis 
+ 261.0986
LM num: 5
.outcome = 
0.1964 * Total.bacteria 
+ 11.1029 * Treponema.denticola 
- 102.9193 * Prevotella.intermedia 
- 3.7524 * Streptococcus.mitis 
+ 261.4416
LM num: 6
.outcome = 
0.1528 * Total.bacteria 
+ 6.7947 * Tannerella.forsythia 
+ 6.5901 * Treponema.denticola 
+ 29.1856 * Aggregatibacter.actinomycetemcomitans 
+ 74.536 * Capnocytophaga.sputigena 
- 197.1112 * Eikenella.corrodens 
- 5.6233 * Streptococcus.mitis 
+ 637.0725
LM num: 7
.outcome = 
0.1528 * Total.bacteria 
+ 6.7947 * Tannerella.forsythia 
+ 6.5901 * Treponema.denticola 
+ 32.1268 * Aggregatibacter.actinomycetemcomitans 
+ 74.536 * Capnocytophaga.sputigena 
- 197.1112 * Eikenella.corrodens 
- 5.6233 * Streptococcus.mitis 
+ 625.658
LM num: 8
.outcome = 
0.1528 * Total.bacteria 
+ 6.7947 * Tannerella.forsythia 
+ 6.5901 * Treponema.denticola 
+ 32.301 * Aggregatibacter.actinomycetemcomitans 
+ 74.536 * Capnocytophaga.sputigena 
- 197.1112 * Eikenella.corrodens 
- 5.6233 * Streptococcus.mitis 
+ 627.695
LM num: 9
.outcome = 
0.1528 * Total.bacteria 
+ 6.7947 * Tannerella.forsythia 
+ 6.5901 * Treponema.denticola 
+ 32.3574 * Aggregatibacter.actinomycetemcomitans 
+ 74.536 * Capnocytophaga.sputigena 
- 197.1112 * Eikenella.corrodens 
- 5.6233 * Streptococcus.mitis 
+ 627.9978
LM num: 10
.outcome = 
0.1528 * Total.bacteria 
+ 6.7947 * Tannerella.forsythia 
+ 6.5901 * Treponema.denticola 
+ 22.9812 * Aggregatibacter.actinomycetemcomitans 
+ 74.536 * Capnocytophaga.sputigena 
- 273.7656 * Eikenella.corrodens 
- 5.6233 * Streptococcus.mitis 
+ 673.9955
LM num: 11
.outcome = 
0.1989 * Total.bacteria 
+ 14.1331 * Tannerella.forsythia 
+ 6.5901 * Treponema.denticola 
+ 90.7394 * Capnocytophaga.sputigena 
- 6.2112 * Streptococcus.mitis 
+ 410.322
LM num: 12
.outcome = 
0.1989 * Total.bacteria 
+ 14.1331 * Tannerella.forsythia 
+ 6.5901 * Treponema.denticola 
+ 90.7394 * Capnocytophaga.sputigena 
- 6.2112 * Streptococcus.mitis 
+ 409.7214
LM num: 13
.outcome = 
0.1989 * Total.bacteria 
+ 14.1331 * Tannerella.forsythia 
+ 6.5901 * Treponema.denticola 
+ 90.7394 * Capnocytophaga.sputigena 
- 6.2112 * Streptococcus.mitis 
+ 497.6085
LM num: 14
.outcome = 
0.1989 * Total.bacteria 
+ 14.1331 * Tannerella.forsythia 
+ 6.5901 * Treponema.denticola 
+ 90.7394 * Capnocytophaga.sputigena 
- 6.2112 * Streptococcus.mitis 
+ 501.0283
Number of Rules : 14
【０１２８】
構築したモデルに対しトレーニングデータを入力した結果において、実際のＰＩＳＡの値と予測値の相関係数は0.9318094となった。その結果を、図５の散布図で示した。【０１２９】
一方、構築したモデルに対し未知データを入力した検証結果では、実際のＰＩＳＡの値と予測値の相関係数は 0.5986115となった。その結果を、図６の散布図で示した。
この結果より、未知のデータに対してもＰＩＳＡの値を予測できることが示された。
特に、表８に示した各細菌量を示すＳＮ比と口腔内全体のＰＩＳＡ値との比較において、負の相関係数をもつ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓと、正の相関係数をもつＴａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｉａ、  Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｏｃｈｒａｃｅａ、  Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐｕｔｉｇｅｎａ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ  、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍの細菌群のＳＮ比からＰＩＳＡ値を予測可能であることが示された。
【実施例４】
【０１３０】
＜既存の判定方法との比較＞
唾液を検体とした歯周病の状態の判定については、歯周疾患者における抗菌療法の診療ガイドライン（日本歯周病学会編集）によると、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａの3種類の細菌数の合計が、総菌数に対して０．０５％未満の場合を「軽度」、総菌数に対して０．０５％以上０．５％未満の場合を「中程度」、総菌数に対して０．５％以上の場合を「重度」であると判定することができる。
そこで、表７に示したSN比の内、レッドコンプレックスであるPorphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Treponema denticolaの３菌種のSN比の合計値と、総菌量を示すTotal bacteriaのSN比の比率を算出して既存の指標とした。この指標により、前述の「軽度」、「中程度」、「重度」を判定した。
判定した結果とPISA実測値、実施例３の結果に基づくPISA予測値、３菌のSN比、Total bacteriaのSN比を、表９にまとめた。
【０１３１】
【表９】
2019088271.tif 000034
【０１３２】
表９に示したＰＩＳＡ実測値をＸ軸とし、既存の「３菌の比率」をＹ軸にしたグラフを、図７の左グラフに示した。また同様に、ＰＩＳＡ実測値をＸ軸とし、ＰＩＳＡ予測値をＹ軸にしたグラフを、図７の右グラフに示した。ＰＩＳＡ実測値との決定係数は既存の方法が０．４１程度、本発明による方法が０．６６程度となり、既存の方法と比べて精度よく歯周病の状態を予測できることが示された。また、既存の方法で「重度」と判定されたサンプルの「ＰＩＳＡ予測」の平均値は、１４２４、「中程度」と判定されたサンプルのＰＩＳＡ予測の平均値は、７３６となり従来の指標との比較もできることが示された。
【実施例５】
【０１３３】
表７、８のデータを元に、細菌量がＰＩＳＡと「正の相関」示す上位３菌種（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ  ｆｏｒｓｙｔｈｉａ）と細菌量がＰＩＳＡと「負の相関」示す上位３菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ  ｂｖ  ２）を選択し、それぞれの３種ずつの細菌のＳＮ比の合計の比（正の相関を示す細菌と負の相関を示す細菌の比：「バランス指標」とする）を算出した。
算出した値（Ｘ軸）とＰＩＳＡ値（Ｙ軸）との散布図を、図８に示した。その結果、ＸとＹ関係について、決定係数０．４１程度の関係性があることが分かった。すなわち、バランス指標を用いた場合においてもＰＩＳＡを推定できることが分かった。
【実施例６】
【０１３４】
近年新たに議論されている細菌種について検討するため実施例１と同様に新たに表１０に記載の細菌プローブを搭載したDNAチップを作成した。
【表１０】
2019088271.tif 000035
【０１３５】
実施例１と同一のサンプルに一部追加収集した５６サンプルについて、PISAのデータも収集し、それらのサンプルについて、表１０に記載の新たなDNAチップで蛍光強度データを取得した。取得時の実験条件は実施例１と同様に実施したが、以下の２点のみ変更した。
PCRに使用したプライマーを以下のように変更して実施した。
R、Yは混合塩基を示しており、RはAとG、YはCとTを示す。【０１３６】
フォワードプライマー（細菌増幅用）：
５’−Ｃｙ５−ＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号７２）
リバースプライマー（細菌増幅用）：
５’−ＣＲＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＹＧＴＴ−３’（配列番号７３）
フォワードプライマー（絶対量指標増幅用）:
５’−Ｃｙ５−ＧＡＧＡＡＧＣＣＴＡＣＡＣＡＡＡＣＧＴＡＡＣＧＴＣ−３’（配列番号３４）
リバースプライマー（絶対量指標増幅用）:
５’−ＣＴＣＴＡＡＡＧＡＣＣＧＣＴＣＴＡＴＣＴＣＧＧ−３’（配列番号３５）【０１３７】
また、ハイブリダイゼーション温度、時間を５０℃で１６時間とした。
ひきつづき得られた蛍光強度を以下のように処理した。
検出対象細菌用プローブを搭載したスポットの蛍光強度を、バックグラウンド値（プローブを搭載していないスポットの蛍光強度の中央値）で減算し、ハイブリダイゼーションに由来するシグナル強度を算出した。このとき、シグナル強度がある閾値を下回るものについては、ノイズと判断し「0」とする。ここでは閾値として、プローブを搭載していないスポット30個の傾向強度のうち上下位5つを除いた20個の値の標準偏差の3倍の値を用いた。【０１３８】
さらに、全体の細菌に対する各細菌の相対比を、検出対象細菌のプローブのシグナル強度を総菌量指標用プローブのシグナル強度で除算して算出した。この後の解析には、これら総量に対する相対比をlog10で変換したものを用いた。ただし、値が「0」のものについては計算できないため、log10変換後の数値を―4に置き換えた。こうして、５６検体すべてについてデータを得た。この結果とPISAについて検体ごとにまとめたものを表１１に示した。
【表１１−１】
2019088271.tif 000036
【表１１−２】
2019088271.tif 000037
【表１１−３】
2019088271.tif 000038
【表１１−４】
2019088271.tif 000039
【表１１−５】
2019088271.tif 000040
【表１１−６】
2019088271.tif 000041
【０１３９】
PISAと各細菌のlog10(総量に対する相対比)の値の相関係数を３６種類すべてについて算出し、さらにそれら相関係数の絶対値が０．２より大きい細菌種を選抜した。相関係数が正の値を示すもの、負の値を示すものを以下に示す（表１２）。
【表１２】
2019088271.tif 000042
【０１４０】
相関係数が負の値を示す細菌群は、Prevotella pallens,Streptococcus salivarius,Eubacterium sulci,Rothia mucilaginosa,Prevotella denticola,Veillonella atypica,Prevotella histicola,Megasphaera micronuciformis,Streptococcus parasanguinisの９菌種とした。【０１４１】
相関係数が正の値を示す細菌群は、SR1 sp. OT 345,Porphyromonas catoniae,Selenomonas sputigena,Neisseria flavescens,Streptococcus sobrinus,Parvimonas micra,Peptostreptococcus stomatis,Treponema socranskii,Eubacterium saphenum,Eubacterium nodatum ,Treponema medium,Filifactor alocis,Porphyromonas endodontalis
の１３菌種とした。【０１４２】
続いて、上記の２２菌種のlog10変換後の数値を説明変数とし、ＰＩＳＡ値を目的変数として重回帰分析で予測するモデルの作成を行った。解析には、統計ソフトウェア「Ｒ」（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ）を用い、「lm」関数を用いて実行した。【０１４３】
表１１のPISAと当該細菌のデータ（22種類、５６サンプルデータ）を「data01」として読み込ませた後、次のコマンドを実行した。
res1 <- lm(PISA~.,data=data01)
（PISAを目的変数として、22種類の細菌を説明変数として、５６サンプルのデータで重回帰分析を実施するコマンド）【０１４４】
実行した予測モデル式res1に各細菌量のデータを代入して得られる予測PISA値と実際のPISAとの相関係数は0.8618542となった。この散布図を図９に示した。
【配列表フリーテキスト】
【０１４５】
配列番号１〜７４：合成ＤＮＡ
【図１−１Ａ】
2019088271.tif 000043
【図１−１Ｂ】
2019088271.tif 000044
【図１−２Ａ】
2019088271.tif 000045
【図１−２Ｂ】
2019088271.tif 000046
【図２】
2019088271.tif 000047
【図３】
2019088271.tif 000048
【図４−１Ａ】
2019088271.tif 000049
【図４−１Ｂ】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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