(57)【要約】新規構造からなるリピドＡを提供する。より詳しくは、優れた免疫活性化能を維持したまま、アレルギー反応や炎症等の副作用が軽減化された、アジュバントに使用可能なリピドＡを提供する。さらには、当該リピドＡを含むアジュバント組成物を提供する。グルコサミン二糖鎖と脂肪酸鎖の複合体からなり、グルコサミン二糖鎖の2位及び2'位に3-ヒドロキシ脂肪酸鎖が結合しており、当該3-ヒドロキシ脂肪酸鎖の少なくとも一方に、3-ヒドロキシ脂肪酸鎖からなる二次脂肪酸鎖がさらに結合していることを特徴とするリピドＡによる。当該リピドＡを含むアジュバントは、従来公知のアジュバントに比べて優れた免疫活性化作用を維持しつつ、アレルギー反応や炎症等の副作用が抑制されている。
2018155051.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコサミン二糖鎖と脂肪酸鎖の複合体からなるリピドＡであって、グルコサミン二糖鎖の2位及び2'位に3-ヒドロキシ脂肪酸鎖が結合しており、当該3-ヒドロキシ脂肪酸鎖の少なくとも一方に、3-ヒドロキシ脂肪酸鎖からなる二次脂肪酸鎖がさらに結合していることを特徴とするリピドＡ。
【請求項２】
さらに、グルコサミン二糖鎖の3位及び3'位の少なくとも１つに3-ヒドロキシ脂肪酸鎖が結合していることを特徴とする、請求項１に記載のリピドＡ。
【請求項３】
脂肪酸鎖が、3-ヒドロキシミリスチン酸鎖、3-ヒドロキシラウリン酸鎖及びカプリン酸鎖から選択されるいずれかである、請求項１又は２に記載のリピドＡ。
【請求項４】
グルコサミン二糖鎖の2位及び2'位と、3位及び3'位の少なくとも１つに結合する脂肪酸鎖が3-ヒドロキシミリスチン酸である、請求項１〜３のいずれかに記載のリピドＡ。
【請求項５】
グルコサミン二糖鎖の2位及び2'位に結合する少なくとも一方の二次脂肪酸鎖が3-ヒドロキシラウリン酸鎖である、請求項１〜４のいずれかに記載のリピドＡ。
【請求項６】
グルコサミン二糖鎖と脂肪酸鎖の複合体からなるリピドＡであって、グルコサミン二糖鎖の2位、2'位、3位及び3'位に3-ヒドロキシミリスチン酸鎖が結合しており、当該グルコサミン二糖鎖の2位に結合する3-ヒドロキシミリスチン酸鎖にカプリン酸鎖からなる二次脂肪酸鎖が結合しており、当該グルコサミン二糖鎖の2'位に結合する3-ヒドロキシミリスチン酸鎖に3-ヒドロキシラウリン酸鎖からなる二次脂肪酸鎖が結合していることを特徴とするリピドＡ。
【請求項７】
グルコサミン二糖鎖の4'位にリン酸基が結合してなる請求項１〜６のいずれかに記載のリピドＡ。
【請求項８】
リピドＡが、以下の化１１に示す化合物１１である、請求項１〜７のいずれかに記載のリピドＡ。
【化１１】
2018155051.tif 000011
【請求項９】
リピドＡが、アルカリゲネス属由来のリポ多糖に含まれるリピドＡである請求項１〜８のいずれかに記載のリピドＡ。
【請求項１０】
アルカリゲネス属由来のリポ多糖に含まれるリピドＡであって、グルコサミン二糖鎖の2位及び2'位に結合する２種の脂肪酸鎖が、二次脂肪酸鎖を含む脂肪酸鎖であることを特徴とするリピドＡ。
【請求項１１】
リピドＡが、化学合成方法により作製されたリピドＡである請求項１〜８のいずれかに記載のリピドＡ。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載のリピドＡを含むリポ多糖。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれかに記載のリピドＡを含むアジュバント組成物及び／又は免疫賦活化剤。
【請求項１４】
請求項１３に記載のアジュバント組成物及び／又は免疫賦活化剤を含むワクチン組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれかに記載のリピドＡの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規構造からなるリピドＡ（lipid A）に関し、さらには当該リピドＡを含むリポ多糖（Lipopolysaccharide: LPS）に関する。そして、当該リピドＡを含むアジュバント組成物に関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２０１７−３０１７９号優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
アジュバント（Adjuvant）はワクチンの効果を増強する因子の総称であり、抗原と共に投与されることで、その抗原の抗原性を増強する。アジュバントとしては、抗原が吸着する無機物の懸濁剤である沈降性アジュバントと、抗原水溶液を鉱油で包みミセルを形成し乳化する油乳剤である油性アジュバントなどに分類される。沈降性アジュバントの例としては水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム（Alum）、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン、ペペス、カルボキシビニルポリマーなどが挙げられる。水酸化アルミニウム等のアルミニウム塩はB型肝炎ワクチン等に用いられ、誘導される獲得免疫は抗体やTh2型である。水酸化アルミニウムでは、液性免疫は誘導されるが、細胞性免疫の誘導が低いこと、発熱やアレルギー反応誘導（IgE誘導）などの副反応の問題も挙げられている。油性アジュバントの例としては、流動パラフィン、ラノリン、フロイント（Freund）などが挙げられる。フロイントアジュバントでは、パラフィンとアラセルの混合物である不完全フロイントアジュバント（Incomplete Freund's adjuvant: IFA）や、IFAに死滅したミコバクテリア又は結核菌の死菌を加え、抗原性をさらに増強させた完全フロイントアジュバント（Complete Freund's adjuvant: CFA）などが挙げられる。CFA中には熱殺菌マイコバクテリウム、LPS、ムラミルジペプチド、並びに百日咳毒素（Pertussis toxin: PT）、コレラ毒素（Cholera Toxin）及び大腸菌（E. Coli）腸毒素等の微生物産物が含まれ、免疫調節特性を有することが知られている。大腸菌由来LPSはアジュバント試薬として使用されているが、毒性が強いためヒトへの投与はできない。【０００４】
LPSは、グラム陰性菌の細胞壁を構成するリポ多糖（Lipopolysaccharide）であり、エンドトキシンともいわれる。LPSは主にO特異多糖、コア多糖及びリピドＡから構成されている。LPSの生理作用発現は、宿主細胞の細胞膜表面に存在するトール様受容体（Toll-like Receptor: TLR）4を介して行われる。TLRは自然免疫に関係し、病原微生物を認識する受容体であり、TLR4は感染防御やワクチン等における抗原の免疫原性の増強に重要な役割を担う自然免疫系を活性化する代表的な受容体の１つである。TLR4の活性化は免疫反応を引き起こすことから、TLR4を活性化させる作用を有する化合物等は、免疫賦活剤、免疫不全症の治療薬、癌細胞の増殖を抑制する医薬等となり得る。TLR4アゴニストとしてLPSやLPS断片等が知られている。【０００５】
リピドＡは糖鎖に脂質が結合した構造を有し、二糖鎖の1位及び4'位の親水基や2位、3位、2'位や3'位に結合する脂肪酸鎖の種類と位置に多様性がある。リピドＡはLPSの活性中心であり、きわめて多彩な生物活性を有する。【０００６】
大腸菌やサルモネラ属菌（Salmonella spp.）のLPSに含まれるリピドＡの構造は既に解明されている。非特許文献１には、リピドＡ類似体を合成したことが報告されている。非特許文献２には、アルカリゲネス属（Alcaligenes）のリピドＡが、緑膿菌のリピドＡに似た構造的特徴を有することが報告されているが、その構造の詳細については明示されていない。腸管内の主要な常在菌であるバクテロイデス属（Bacteroides）、歯周病の原因であるポルフィロモナス属（Porphyromonas）等の菌が有するLPSの生物活性は、大腸菌やサルモネラ属菌が有するLPSの100分の1以下と報告されており、ピロリ菌LPSは発熱活性、致死活性が大腸菌由来LPSのそれぞれ1000分の1以下、500分の1以下であるといわれている。菌が有するLPSに含まれるリピドＡの構造は解明されていないものも多く、またその作用についても不明である。【０００７】
先天性免疫を増強しワクチンの効力を増強するための、効力が高く安全な新しい免疫活性化能を有する組成物として、リポタンパク質を含むアジュバントについて報告がある。前記アジュバントに含まれるリポタンパク質が少なくとも１つの五量体単位を含み、前記リポタンパク質が重量／体積比で前記アジュバントの少なくとも10％を含むリポタンパク質であることを特徴とする。ここでは、免疫活性化組成物について、タンパク質、LPS、及びペプチド等を含むことが開示されている。LPSとして、例えばフレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）若しくはプレジオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）等の第2のグラム陰性細菌、又は他のグラム陰性細菌の内因性のLPSであってもよいことが示され、グラム陰性細菌の一例として、アルカリゲネス属が例示されている（特許文献１、２）。しかしながら、アルカリゲネスは数多くの菌の一例として一行記載されているのみであり、アルカリゲネス由来LPSの構造が具体的に示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2015-78221号公報（特許6027082号公報）
【特許文献２】特表2012-502054号公報（特許5699081号公報）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J Endotoxin Res. 2005;11(6):341-7.
【非特許文献２】Biochem J. 1973 Jul;133(3):563-72.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、新規構造からなるリピドＡを提供することを課題とする。より詳しくは、優れた免疫活性化能を維持したまま、アレルギー反応や炎症等の副作用が軽減化された、アジュバントに使用可能なリピドＡを提供することを課題とする。さらには、当該リピドＡを含むアジュバント組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、アルカリゲネス由来LPSに含まれるリピドＡの構造を解析した結果、当該リピドＡを構成するグルコサミン二糖鎖の2位及び2'位に3-ヒドロキシ脂肪酸鎖が結合されており、さらに前記2位及び2'位に結合する3-ヒドロキシ脂肪酸鎖の少なくとも一方に3-ヒドロキシ脂肪酸鎖からなる二次脂肪酸鎖を含むことを初めて見出した。そして、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、前記リピドＡを含むLPSをアジュバントとして使用した場合に、アレルギー反応や炎症等の副作用が低く、より効果的な免疫活性化作用を示すことが確認され、本発明を完成した。【００１２】
本発明は、すなわち以下よりなる。
１．グルコサミン二糖鎖と脂肪酸鎖の複合体からなるリピドＡであって、グルコサミン二糖鎖の2位及び2'位に3-ヒドロキシ脂肪酸鎖が結合しており、当該3-ヒドロキシ脂肪酸鎖の少なくとも一方に、3-ヒドロキシ脂肪酸鎖からなる二次脂肪酸鎖がさらに結合していることを特徴とするリピドＡ。
２．さらに、グルコサミン二糖鎖の3位及び3'位の少なくとも１つに3-ヒドロキシ脂肪酸鎖が結合していることを特徴とする、前項１に記載のリピドＡ。
３．脂肪酸鎖が、3-ヒドロキシミリスチン酸鎖、3-ヒドロキシラウリン酸鎖及びカプリン酸鎖から選択されるいずれかである、前項１又は２に記載のリピドＡ。
４．グルコサミン二糖鎖の2位及び2'位と、3位及び3'位の少なくとも１つに結合する脂肪酸鎖が3-ヒドロキシミリスチン酸である、前項１〜３のいずれかに記載のリピドＡ。
５．グルコサミン二糖鎖の2位及び2'位に結合する少なくとも一方の二次脂肪酸鎖が3-ヒドロキシラウリン酸鎖である、前項１〜４のいずれかに記載のリピドＡ。
６．グルコサミン二糖鎖と脂肪酸鎖の複合体からなるリピドＡであって、グルコサミン二糖鎖の2位、2'位、3位及び3'位に3-ヒドロキシミリスチン酸鎖が結合しており、当該グルコサミン二糖鎖の2位に結合する3-ヒドロキシミリスチン酸鎖にカプリン酸鎖からなる二次脂肪酸鎖が結合しており、当該グルコサミン二糖鎖の2'位に結合する3-ヒドロキシミリスチン酸鎖に3-ヒドロキシラウリン酸鎖からなる二次脂肪酸鎖が結合していることを特徴とするリピドＡ。
７．グルコサミン二糖鎖の4'位にリン酸基が結合してなる前項１〜６のいずれかに記載のリピドＡ。
８．リピドＡが、以下の化１１に示す化合物１１である、前項１〜７のいずれかに記載のリピドＡ。
【化１１】
2018155051.tif 000003
９．リピドＡが、アルカリゲネス属由来のリポ多糖に含まれるリピドＡである前項１〜８のいずれかに記載のリピドＡ。
１０．アルカリゲネス属由来のリポ多糖に含まれるリピドＡであって、グルコサミン二糖鎖の2位及び2'位に結合する２種の脂肪酸鎖が、二次脂肪酸鎖を含む脂肪酸鎖であることを特徴とするリピドＡ。
１１．リピドＡが、化学合成方法により作製されたリピドＡである前項１〜８のいずれかに記載のリピドＡ。
１２．前項１〜１１のいずれかに記載のリピドＡを含むリポ多糖。
１３．前項１〜１１のいずれかに記載のリピドＡを含むアジュバント組成物及び／又は免疫賦活化剤。
１４．前項１３に記載のアジュバント組成物及び／又は免疫賦活化剤を含むワクチン組成物。
１５．前項１〜１１のいずれかに記載のリピドＡの作製方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のリピドＡの構造は、新規な構造を有する。本発明のリピドＡを含むLPSをアジュバントとして使用した場合、アジュバントとして汎用される水酸化アルミニウムと比較して優れており、大腸菌由来LPSと同程度の免疫誘導能を示すことが確認された。一方、毒性が強い大腸菌由来LPSに比べ、本発明のリピドＡを含むLPSは、アレルギー反応や炎症等の副作用が低いことが確認された。これにより、本発明のリピドＡを含むLPSは、優れた免疫活性化能を維持したまま、アレルギー反応や炎症等の副作用が低い、安全性が高く有効なアジュバントとして使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】アルカリゲネス由来LPSの構造を示す図である。
【図２】アルカリゲネス由来リピドＡの質量分析による構造解析結果（ａ）を示す図である。（実施例１）
【図３】アルカリゲネス由来リピドＡの質量分析による構造解析結果（ｂ１）を示す図である。（実施例１）
【図４】アルカリゲネス由来リピドＡの質量分析による構造解析結果（ｂ２）を示す図である。（実施例１）
【図５】アルカリゲネス由来リピドＡの質量分析による構造解析結果（ｃ）を示す図である。（実施例１）
【図６】アルカリゲネス由来リピドＡの質量分析による構造解析結果（ｄ）を示す図である。（実施例１）
【図７】アルカリゲネス由来リピドＡの質量分析による構造解析結果（ｅ）を示す図である。（実施例１）
【図８】アルカリゲネス由来リピドＡの質量分析による構造解析結果（ｆ）を示す図である。（実施例１）
【図９】アルカリゲネス由来リピドＡの質量分析による構造解析結果（ｇ）を示す図である。（実施例１）
【図１０】アルカリゲネス由来リピドＡの質量分析による構造解析結果（ｈ）を示す図である。（実施例１）
【図１１】アルカリゲネス由来リピドＡの質量分析による構造解析結果（ｉ）を示す図である。（実施例１）
【図１２】アルカリゲネス由来リピドＡの質量分析による構造解析結果（ｊ）を示す図である。（実施例１）
【図１３】アルカリゲネス由来LPSのTLR4又はTLR2に対する作用を確認した結果を示す図である。大腸菌由来LPSと同様にTLR4アゴニストとして機能することを示す図である。（実施例２）
【図１４】アルカリゲネス由来LPSは大腸菌由来LPSに対するアンタゴニスト作用がないことを確認した結果を示す図である。（実施例２）
【図１５】アルカリゲネス由来LPSをアジュバントとして使用したときの免疫誘導能を確認した結果を示す図である。アルカリゲネス由来LPSはTh1型及びTh2型応答も誘導し、アジュバントとして優れていることを示す図である。（実施例２）
【図１６】アルカリゲネス由来LPSをアジュバントとしてマウス腹腔内に投与したときの体重減少（Ａ）及びIgE産生量（Ｂ）を確認した結果を示す図である。アルカリゲネス由来LPSをアジュバントとして使用した場合に、体重減少はほとんどなく、IgE産生量も低く抑制された。アルカリゲネス由来LPSのアジュバントは、大腸菌由来LPSやAlumに比べて副作用が少なく安全性が高いことを示す図である。（実施例２）
【図１７】アルカリゲネス由来LPSをアジュバントとして腹腔内に投与したとき直腸での体温を測定した結果を示す図である。アルカリゲネス由来LPSのアジュバントは、大腸菌由来LPSに比べて副作用が少なく安全性が高いことを示す図である。（実施例２）
【図１８】アルカリゲネス由来LPSをアジュバントとして腹腔内に投与したとき肺組織所見を示す図である。アルカリゲネス由来LPSのアジュバントは、大腸菌由来LPSに比べて副作用が少なく安全性が高いことを示す図である。（実施例２）
【図１９】アルカリゲネス由来リピドＡと同等の構造を有するリピドＡの化学合成の方法を示す図である。（実施例３）
【図２０】アルカリゲネス由来LPSによるOVA特異的免疫応答能を確認した結果を示す図である。（実施例４）
【図２１】リピドＡ（化合物１１）によるOVA特異的免疫応答を確認した結果を示す図である。（実施例５）
【図２２】リピドＡ（化合物１１）によるマウス樹状細胞の活性化作用を確認した結果を示す図である。（実施例６）
【図２３】リピドＡ（化合物１１）によるヒト抹消血単核細胞の活性化作用を確認した結果を示す図である。（実施例７）
【発明を実施するための形態】
【００１５】
背景技術の欄にも示したように、LPSはグラム陰性菌の細胞壁外膜を構成する成分である。LPSは主にO特異多糖、コア多糖及びリピドＡから構成されている（図１参照）。本明細書において、「リピドＡ」とは糖鎖に脂質が結合した構造を有し、リン酸基が結合したグルコサミン二糖鎖と脂肪酸鎖の複合体からなる物質をいう。リピドＡの基本骨格における脂肪酸鎖の結合様式は、リピドＡの生物活性と密接な関係がある。リピドＡとして、現在は大腸菌に代表される６個のアシル基を含むグループ、クロモバクテリウムや緑膿菌に代表される６個のアシル基、５個のアシル基、及び４個のアシル基等を含むグループが知られている。これらは、いずれもグルコサミン二糖鎖を基本骨格とし、2位、3位、2'位及び3'位に3-ヒドロキシ脂肪酸鎖を結合している点で共通している。
【００１６】
本発明のリピドＡは、４〜６個のアシル基を含み、好ましくは６個である。具体的にはグルコサミン二糖鎖の2位及び2'位には各々結合する２個の脂肪酸鎖を含み、3位及び3'位には各々結合する０〜２個、好ましくは２個の脂肪酸鎖を含み、グルコサミン二糖鎖の2位及び2'位に結合する２個のヒドロキシ脂肪酸鎖の水酸基にさらに飽和脂肪酸がそれぞれ０〜１個、好ましくは１個結合した二次脂肪酸鎖を含む脂肪酸鎖であることを特徴とする（図１参照）。本明細書において、一次脂肪酸鎖とは、グルコサミンと直接結合している脂肪酸鎖をいい、二次脂肪酸鎖とは当該一次脂肪酸鎖に結合している脂肪酸鎖をいう。二次脂肪酸鎖が結合している脂肪酸鎖は分枝状の脂肪酸鎖を示す。
【００１７】
すなわち本発明のリピドＡは、グルコサミン二糖鎖と脂肪酸鎖の複合体からなるリピドＡであって、グルコサミン二糖鎖の2位及び2'位に3-ヒドロキシ脂肪酸鎖が結合しており、当該3-ヒドロキシ脂肪酸鎖の少なくとも一方に、3-ヒドロキシ脂肪酸鎖からなる二次脂肪酸鎖がさらに結合していることを特徴とする。さらに、グルコサミン二糖鎖の3位及び3'位の少なくとも一方に3-ヒドロキシ脂肪酸鎖が結合していることを特徴とする。
【００１８】
本発明のリピドＡを構成する一次脂肪酸鎖の炭素数は、各脂肪酸鎖ごとに１２〜１６であり、好ましくは１４（ミリスチン酸）である。本発明のリピドＡを構成するグルコサミンの2位及び2'位に各々結合する２個の脂肪酸鎖のいずれか少なくとも一方に二次脂肪酸鎖が結合している。各二次脂肪酸鎖の炭素数は１０〜１２であり、好ましくは１０（カプリン酸）であり、2'位に結合する２個の脂肪酸鎖における二次脂肪酸鎖の炭素数は１２（ラウリン酸）である。例えば、本発明のリピドＡを構成するグルコサミン二糖鎖の2位及び2'位と、3位及び3'位の少なくとも１つに結合する脂肪酸鎖は、3-ヒドロキシミリスチン酸であるのが好適である。グルコサミン二糖鎖の2位及び2'位に結合する少なくとも一方の二次脂肪酸鎖は、3-ヒドロキシラウリン酸鎖であるのが好適である。具体的には、本発明のリピドＡはグルコサミン二糖鎖と脂肪酸鎖の複合体からなり、グルコサミン二糖鎖の2位、2'位、3位及び3'位に3-ヒドロキシミリスチン酸鎖が結合しており、当該グルコサミン二糖鎖の2位に結合する3-ヒドロキシミリスチン酸鎖にカプリン酸鎖からなる二次脂肪酸鎖が結合しており、当該グルコサミン二糖鎖の2'位に結合する3-ヒドロキシミリスチン酸鎖に3-ヒドロキシラウリン酸鎖からなる二次脂肪酸鎖が結合しているのが最も好適である（図１参照）。
【００１９】
本発明のリピドＡ分子において、グルコサミン二糖鎖の還元端（4'）又は非還元端（1）にはリン酸基を含むことができる。特にグルコサミン二糖鎖の4'位にリン酸基が結合していることが好ましい。本発明のリピドＡに、O特異多糖やコア多糖を結合し、LPSを作製することもできる。ここで使用可能なO特異多糖やコア多糖は、LPSを構成する多糖であればよく特に限定されない。アルカリゲネス由来、例えば、アルカリゲネス属フェカーリス（Alcaligenes faecalis）由来のO特異多糖やコア多糖が好適である。具体的には、図１左側に示す糖鎖を例示することができる。O特異多糖やコア多糖は、グルコサミン二糖鎖の6'部位に結合可能である。本発明は、本発明のリピドＡとO特異多糖やコア多糖を含むLPSにも及ぶ。
【００２０】
本発明のリピドＡは、化学合成により作製することもできるし、アルカリゲネス由来のLPSを抽出し、さらにリピドＡを分離して作製することもできる。本発明のリピドＡは、アルカリゲネス由来のリピドＡに限定されず、化学合成により作製されたリピドＡであってもよい。
【００２１】
本発明のリピドＡを、アルカリゲネス由来のLPSを抽出し、さらにリピドＡを分離して作製する場合、菌体からのLPSの抽出は、自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる方法により行うことができる。具体的には、以下の２種類の手法により乾燥菌体よりLPSを抽出可能である。
１）市販のLPS抽出キット（iNtRON Biotechnology Inc.）をアルカリゲネスの乾燥菌体に対して使用する。
２）アルカリゲネスの乾燥菌体を石油エーテルとクロロホルムとフェノールの混合溶媒や加熱されたフェノールと水の混合溶媒を用いてLPSを抽出した後、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、プロテイナーゼによって処理し、透析及び体積排除カラム（General Electric Company: Sephacryl S-400 HR）によって精製する。
抽出したアルカリゲネス由来LPSを、例えば酢酸水溶液で処理し、生じた沈殿物を水で洗浄することでアルカリゲネスのリピドＡを得ることが可能である。
【００２２】
本発明のリピドＡを、化学合成により作製する場合は、以下に示す方法によることができる。本発明のリピドＡは、グルコサミン塩酸塩を出発原料として化合物１を経ることで合成可能である（図１８参照）。この化合物１はそれぞれ異なる条件で切断可能な保護基で保護されているため、様々な種類の脂肪酸鎖及びリン酸基を持つリピドＡの合成に適用できる。
【００２３】
本発明のリピドＡは、具体的には以下の方法で合成することができる（図１８参照）。
化合物１の3位にミリスチン酸誘導体２を2-メチル-6-ニトロ安息香酸無水物（MNBA）とN,N-ジメチル-4-アミノピリジン（DMAP）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）を用いて導入し、化合物３を得る。化合物３の2'位のトリクロロエトキシカルボニル（Troc）基を亜鉛-銅合金を用いて切断した後、遊離となったアミノ基に、二次脂肪酸鎖としてラウリン酸を有するミリスチン酸誘導体４を、1-[ビス（ジメチルアミノ）メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム 3-オキシドヘキサフルオロホスフェート（HATU）とDMAPを用いることで導入し、化合物５を得る。化合物５の2位のアリルオキシカルボニル基（Alloc）をテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）とN-（トリメチルシリル）ジメチルアミン（TMSDMA）を用いて切断する。続いて、遊離となったアミノ基に、二次脂肪酸鎖としてカプリン酸を有するミリスチン酸誘導体である化合物６を、HATUとDMAPを用いて導入し、化合物７を得る。化合物７の3'位のパラメトキシベンジル基（MPM）を、2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-p-ベンゾキノン（DDQ）と2,6-ジ-tert-ブチルピリジンによって切断し、遊離となった水酸基にミリスチン酸誘導体２をMNBAとDMAP及びDIPEAを用いて導入し、化合物８を得る。化合物８の4'位及び6'位のベンジリデン基にトリフルオロ酢酸（TFA）を作用させて切断し、トリチルクロライドとピリジンを用いて6'位にトリチル基を導入し、化合物９を得る。化合物９の1位のアリル基を、（1,5）-（シクロオクタジエン）-ビス（メチルジフェニルホスフィン）イリジウム（1）ヘキサフルオロホスフェートを用いて異性化させた後、ヨウ素と水を作用させることで切断し、化合物１０を得る。化合物１０に対し、ジベンジル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト、テトラゾール、続いて、ジメチルジオキシラン（DMDO）を作用させることで1位と4'位にリン酸基を導入した。最終脱保護として、水酸化パラジウムを用いた接触水素化を行うことで、全てのベンジル基及びトリチル基を切断し、アルカリゲネス由来リピドＡと同じ構造からなる化合物１１を得ることができる。
【００２４】
本発明のリピドＡは、例えばモノホスホリルリピドＡ（MPL）、リピドＡ誘導体（例えば低毒性リピドＡ誘導体）、3-O-脱アシル化MPL等の処理を行うことなく、アジュバント組成物又は免疫賦活化剤に適用することができる。本発明は、本発明のリピドＡを含むアジュバント組成物又は免疫賦活化剤にも及ぶ。
【００２５】
前記アジュバント組成物は、主にTh1型及びTh2型の免疫応答を誘導する。一方、水酸化アルミニウムや抗原のみの場合は、Th2型の免疫応答のみを誘導する。ここで、Th2型の免疫応答は、アレルギーに関与するともいわれており、本発明のリピドＡを含むアジュバント組成物は、優れた免疫誘導能を保持しつつ、体重減少やアレルギー等の副作用が軽減化された優れた効果を有する。高レベルのTh1型サイトカイン（例えばIFN-γ、TNF-α、IL-2及びIL-12）は、投与される抗原に対する細胞介在免疫応答の誘導を促進する傾向にあると考えられるため、本発明のアジュバント組成物は、免疫賦活化剤としても使用することができる。
【００２６】
本発明のアジュバント組成物又は免疫賦活化剤は、免疫応答を誘導又は増強しうる医薬組成物とすることができる。医薬組成物の例として、例えば抗原と本発明のアジュバント組成物と薬学的に許容される担体とを含む、ワクチン組成物とすることができる。免疫賦活化剤には、特定の抗原を含まず、薬学的に許容される担体を含むことができる。上記薬学的に許容される担体としては、リン酸カルシウム、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、リポソーム、及び微粒子等が例示されるが、これらに限定されるものではない。これらの組成物は、宿主において免疫応答を誘導することができる。別の特定の実施形態では、この免疫応答は、前記抗原に特異的である。前記特定の実施形態のいずれかによれば、前記抗原は、宿主において、体液性応答及び細胞性応答から選択される免疫応答を誘導することができる。前記特定の実施形態のいずれかによれば、前記組成物は、宿主において、Th1型Ｔリンパ球応答、Th2型Ｔリンパ球応答、細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）応答、抗体応答、サイトカイン応答、リンホカイン応答、ケモカイン応答、ならびに炎症性応答から選択される少なくとも１種の免疫応答を誘導することができる。前記組成物は、宿主においてインターフェロン−γ（IFN-γ）、腫瘍壊死因子−α（TNF-α）、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-16、IL-18、IL-23、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、CCL4及びCCL5から選択されるサイトカイン等を産生することができる。さらに記憶Ｔ細胞応答、記憶Ｂ細胞応答、エフェクターＴ細胞応答、細胞傷害性Ｔ細胞応答、エフェクターＢ細胞応答から選択されるリンパ球応答、から選択される少なくとも１種の免疫応答を誘導することができる。
【００２７】
本発明のワクチン組成物に含みうる抗原、又は免疫賦活化剤が応答しうる抗原としては特に限定されないが、例えば細菌、ウイルス及び真菌等の感染病原体やその断片が挙げられる。他の態様によれば、少なくとも１種のがん細胞に由来する抗原であってもよい。さらに他の実施形態によれば、自己免疫疾患に関連する少なくとも１種のエピトープ、生体分子、細胞又は組織に由来するか、あるいはこれらと免疫学的に交差反応性である物質であってもよい。自己免疫疾患に関連する抗原として、具体的には、前記自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスの場合はsnRNPから選択され、前記自己免疫疾患がグレーブス病の場合はチログロブリン、チロトロピン受容体及び甲状腺上皮細胞のうちの少なくとも１種であり、前記自己免疫疾患が血小板減少性紫斑病の場合は血小板であり、前記自己免疫疾患が天疱瘡の場合は天疱瘡抗原、デスモグレイン-3、デスモプラキン、エンボプラキン及び水疱性類天疱瘡抗原のうちの少なくとも１種であり、前記自己免疫疾患が多発性硬化症の場合はミエリン塩基性タンパク質であり、前記自己免疫疾患が1型糖尿病の場合は膵島β細胞であり、そして前記自己免疫疾患が重症無力症の場合はアセチルコリン受容体等が挙げられる。
【実施例】
【００２８】
本発明の理解を助けるために、以下に実施例及び実験例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例等に限定されるものでないことはいうまでもない。【００２９】
（実施例１）アルカリゲネス由来LPSを構成するリピドＡの構造解析
本実施例では、アルカリゲネス属フェカーリス（Alcaligenes faecalis）のLPSを構成するリピドＡの構造解析を行った。前記アルカリゲネスの乾燥菌体を石油エーテル、クロロホルム及びフェノールの混合溶媒や加熱されたフェノールと水の混合溶媒を用いて抽出し、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、プロテイナーゼによって処理し、透析及び体積排除カラム（General Electric Company: Sephacryl S-400 HR）によってLPSを分離精製した。分離したLPSを、酢酸水溶液にて処理し、生じた沈殿物を水で洗浄することでリピドＡを得た。【００３０】
上記方法より得たリピドＡを、質量分析により構造解析した。質量分析による解析結果ａ〜ｊを、図２〜１２に示した。ａ（図２）に示すとおりアルカリゲネス由来リピドＡの分子イオンピークがm/z=1756, 1602, 1376に観察され、脂肪酸鎖部分に構造多様性を有することが示された。m/z=1756は６個の脂肪酸鎖、m/z=1602は５個の脂肪酸鎖、m/z=1376は４個の脂肪酸鎖から成る。さらに詳細な解析を行ったところ、ｂ１（図３）に示す解析では、m/z=552.3, 574.3, 588.3に２価の分子イオンが観測され、それぞれ脂肪酸鎖組成の異なる３個の脂肪酸鎖から成る。ａ〜ｂ（図２〜４）に示すようにアルカリゲネス由来リピドＡの脂肪酸鎖の数は３〜６個であり、脂肪酸鎖の種類にも多様性を有することが考えられた。脂肪酸鎖としては、C14は3-ヒドロキシミリスチン酸、C12は3-ヒドロキシラウリン酸、C10はカプリン酸をそれぞれ示す。３〜５個の脂肪酸鎖を有するリピドＡの骨格は、６個の脂肪酸鎖を持つリピドＡの部分構造であることが推測されたため、６個の脂肪酸鎖を持つアルカリゲネス由来リピドＡ（m/z=1756）を中心に更なる構造解析を進めた。【００３１】
ｃ（図５）に示す様に、６個の脂肪酸鎖を持つリピドＡの1位のリン酸基が脱離したピークが観測された（m/z=1677）。ｄ（図６）は、前述のm/z=1677のピークをプリカーサーイオンとしてMS/MSを行った結果である。3-ヒドロキシラウリン酸が脱離し、m/z=1460のフラグメントイオンピークを与えた。この3-ヒドロキシラウリン酸は、容易に脱離したことから、二次脂肪酸鎖として結合していると考えられた。ｅ（図７）は、ｄ（図６）の結果からさらにm/z=1460をプリカーサーイオンとして、タンデム質量分析（MS/MS）を行った結果である。3-ヒドロキシミリスチン酸が脱離し、m/z=1216のフラグメントイオンピークを与えた。ｆ（図８）は、ｅ（図７）の結果からさらにm/z=1216をプリカーサーイオンとしてMS/MSを行った結果である。3-ヒドロキシミリスチン酸が脱離し、m/z=972のフラグメントイオンピークを与えた。ｇ（図９）は、ｆ（図８）の結果からさらにm/z=972をプリカーサーイオンとしてMS/MSを行った結果である。カプリン酸が脱離し、m/z=799のフラグメントイオンピークを与えた。【００３２】
以上の結果から、アルカリゲネス由来リピドＡを構成する脂肪酸鎖は3-ヒドロキシミリスチン酸が４個、3-ヒドロキシラウリン酸が１個、カプリン酸が１個であり、かつ2位及び2'位には二次脂肪酸鎖が結合した3-ヒドロキシミリスチン酸が結合していると考えられた。【００３３】
ｈ（図１０）とｉ（図１１）は、ａ（図２）のそれぞれm/z=1376と1602をプリカーサーイオンとしてMS/MSを測定した結果であり、どちらもm/z=710.4にグリコシド結合の切断によって生成した還元末端側フラグメントイオンピークを与えた。この結果から、2位に3-ヒドロキシミリスチン酸、3位に3-ヒドロキシミリスチン酸が結合し、かつ2'位に3-ヒドロキシラウリン酸を二次脂肪酸鎖として持つ3-ヒドロキシミリスチン酸、3'位に3-ヒドロキシミリスチン酸が結合していると考えられた。【００３４】
ｊ（図１２）はm/z=1676をプリカーサーイオンとしてMS/MSを行った結果であり、2位はカプリン酸を二次脂肪酸鎖として持つ3-ヒドロキシミリスチン酸が結合していると考えられた。以上の結果から、2位はカプリン酸を二次脂肪酸鎖として持つ3-ヒドロキシミリスチン酸、3位は3-ヒドロキシミリスチン酸、2'位は3-ヒドロキシラウリン酸を二次脂肪酸鎖として持つ3-ヒドロキシミリスチン酸、3'位は3-ヒドロキシミリスチン酸がそれぞれ結合した構造を有していると考えられた。【００３５】
さらにNMRによる詳細な構造決定を行い、アルカリゲネス由来LPSの構造を決定した。【００３６】
（実施例２）アルカリゲネス由来LPSの作用
本実施例では、アルカリゲネス属フェカーリス（Alcaligenes faecalis）からLPSを抽出し、各種作用を確認した。本実施例では、市販のLPS抽出キット（iNtRON Biotechnology Inc.）を用いてLPSを抽出し、LPS試料とした。比較例として使用する大腸菌由来のLPSは大腸菌O111由来LPSを用いた。【００３７】
１．アルカリゲネス由来LPSの免疫活性１
アルカリゲネス由来LPSのTLR4アゴニスト活性を、TLR4ノックアウト（KO）マウスの骨髄由来樹状細胞を用いて確認した。また、TLR2 KOマウスについても確認した。
野生型マウスとして、１０週齢の雌のBalb/c（ニホンクレア）を用いた。TLR2 KOマウス又はTLR4 KOマウスとして、１０週齢の雌のC57/BL6（オリエンタルバイオ）を用いた。【００３８】
各マウスの骨髄から細胞を回収し、赤血球を溶血した後、GM-CSF入りのRPMI1640培地で６日間培養し、骨髄由来樹状細胞に分化、誘導した。樹状細胞はCD11c抗体が結合したMACSビーズで単離精製し、実験に供した。1×105個の樹状細胞を含む培養液に、各濃度のLPSを加えて３７℃で４８時間培養し、その後培養上清を回収した。培養液として、10%のウシ胎児血清（FCS）入りのRPMI1640培地を用いた。Mockとして、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いた。培養液中のIL-6量を、R&D Systems社の ELISAキットで測定した。【００３９】
上記の結果、野生型マウス樹状細胞に対し、アルカリゲネス由来LPSは大腸菌由来LPSと同様にLPSの濃度依存的にTLR4に作用し、IL-6の産生を認めた。TLR4 KOマウス由来樹状細胞に各LPSで処理しても殆どIL-6の産生を認めなかった（図１３）。一方、TLR2 KOマウス由来樹状細胞に各LPSを加えた場合は、添加するLPSの濃度依存的にIL-6の産生を認めた（図１３）。このことから、アルカリゲネス由来LPSは大腸菌由来LPSと同様にTLR4に作用し、TLR4アゴニストとして機能することが確認された。【００４０】
２．アルカリゲネス由来LPSの免疫活性２
大腸菌由来LPSによる樹状細胞でのIL-6の産生に対して、アルカリゲネス由来LPSが及ぼす影響を確認した。上記１の野生型マウスの樹状細胞に各濃度のアルカリゲネス由来LPSを加え、さらに100pg/mLの大腸菌由来LPSを加えて３７℃で４８時間培養し、IL-6の産生を上記１と同手法により測定した。その結果、アルカリゲネス由来LPSは大腸菌由来LPSによるIL-6の産生を阻害せず、大腸菌由来LPSに対するアンタゴニスト作用がないことが確認された（図１４）。【００４１】
３．アルカリゲネス由来LPSのアジュバント活性
1μgの卵白アルブミン（Ovalbumin：Sigma, A5503、以下単に「OVA」ともいう）を抗原とし、アジュバントとしてアルカリゲネス又は大腸菌由来のLPS（100μg）、あるいは200μLのアラムアジュバント（Imject Alum Adjuvant：Thermo Fisher Scientific Inc, 77161、以下単に「Alum」ともいう）を８週齢（雌）のBalb/cマウス（ニホンクレア）に各々投与したときのOVA特異抗体産生能を調べた。回収した血清中のOVA特異的抗体を、ELISA法にて測定した。【００４２】
上記の結果、抗体産生能は大腸菌由来LPSをアジュバントとしたときに最も高く、アルカリゲネス由来LPSのアジュバント活性はAlumと同程度であった。産生するIgGサブタイプについても確認した。IgG1産生能は大腸菌由来LPSが最も高く、アルカリゲネス由来LPSはAlumよりも高い値であった。一方、IgG2aについてはAlumでも抗原のみでも殆ど産生されなかったが、大腸菌由来LPSの場合が最も高く、アルカリゲネス由来LPSの場合でも産生が認められた。これにより、アルカリゲネス由来LPSは、アジュバントとして抗原と共に使用したときに、IgG1及びIgG2aについて産生を認め、Th1型及びTh2型応答を誘導することが確認された（図１５）。【００４３】
４．副作用の確認１
10μgのOVAと、100μgのアルカリゲネス若しくは大腸菌由来のLPS、又は200μLのAlum（Thermo Fisher Scientific Inc）を８週齢（雌）のBalb/cマウス（ニホンクレア）の背部皮下に投与し、各マウスの体重の変化及びIgE産生量を確認した。体重は経時的に測定し、７日後に血清を回収し、ELISA法にてOVA特異的IgE抗体を、DSマウスIgE ELISA（OVA）キット（DSファーマメディカル株式会社）を用いて測定した。【００４４】
上記の結果、大腸菌由来LPSを投与した場合に、投与２日目で体重が大幅に減少した。一方、アルカリゲネス由来LPSを投与した場合の体重変化はPBSや抗原単独投与の場合と殆ど差を認めなかった（図１６Ａ）。IgEの誘導量はAlumが最も高く、アジュバントとして使用した場合に抗原特異的なアレルギー症状を示すおそれが高かった。一方、アルカリゲネス由来LPSのアジュバントは、IgE誘導量が最も低かった（図１６Ｂ）。これらの結果より、アルカリゲネス由来LPSのアジュバントは、大腸菌由来LPSやAlumに比べて副作用が少なく安全性が高いことが確認された。【００４５】
５．副作用の確認２
１０週齢（雌）のBalb/cマウス（ニホンクレア）に、1.5 mgの大腸菌由来又はアルカリゲネス由来のLPSを腹腔内投与したときの直腸体温を直腸温度計で毎時間測定した。さらに、各LPS投与した７時間後に肺組織を摘出し、HE染色にて肺組織に及ぼす影響を確認した。PBSで処理したものをMockとした。【００４６】
上記の結果、大腸菌由来LPSを投与した場合に体温の低下が最も激しかったのに対し、アルカリゲネス由来LPSを投与した場合には、やや低下するにとどまった（図１７）。肺組織では、大腸菌由来LPSを投与した場合に炎症所見が確認されたのに対し、アルカリゲネス由来LPSを投与した場合にはMockの場合と殆ど差を認めなかった（図１８）。これらの結果より、アルカリゲネス由来LPSは、大腸菌由来LPSに比べて副作用が少なく安全性が高いことが確認された。【００４７】
（実施例３）本発明のリピドＡの合成
本実施例では、本発明のリピドＡの合成方法について説明する。グルコサミン塩酸塩を出発原料として化合物１を経ることで本発明のリピドＡを合成した（図１９参照）。【００４８】
本発明のリピドＡの合成法は以下の通りである。化合物１の3位にミリスチン酸誘導体２をMNBAとDMAP、DIPEAを用いて導入し、化合物３を得た。化合物３の2'位のTroc基を亜鉛-銅合金を用いて切断した後、遊離となったアミノ基に、二次脂肪酸鎖としてラウリン酸を有するミリスチン酸誘導体４をHATUとDMAPを用いることで導入し、化合物５を得た。化合物５の2位のAllocをテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）とTMSDMAを用いて切断した。続いて遊離となったアミノ基に、二次脂肪酸鎖としてカプリン酸を有するミリスチン酸誘導体６をHATUとDMAPを用いて導入し、化合物７を得た。化合物７の3'位のMPMを、DDQと2,6-ジ-tert-ブチルピリジンによって切断し、遊離となった水酸基にミリスチン酸誘導体２をMNBAとDMAP及びDIPEAを用いて導入し、化合物８を得た。化合物８の4'位及び6'位のベンジリデン基をTFAを作用させることで切断し、トリチルクロライドとピリジンを用いて6'位にトリチル基を導入し、化合物９を得た。化合物９の1位のアリル基を、（1,5）-（シクロオクタジエン）-ビス（メチルジフェニルホスフィン）イリジウム（1）ヘキサフルオロホスフェートを用いて異性化させた後、ヨウ素と水を作用させることで切断し、化合物１０を得た。化合物１０に対し、ジベンジル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト、テトラゾール、続いて、DMDOを作用させることで1位と4'位にリン酸基を導入した。最終脱保護として、水酸化パラジウムを用いた接触水素化を行うことで、全てのベンジル基及びトリチル基を切断し、アルカリゲネス属リピドＡと同じ構造からなる化合物１１を得た。【００４９】
NMRによる構造解析結果
1H NMRスペクトル測定はJEOL ECA 500 MHz NMR spectrometerを用いて、指定した溶媒中、３０℃で行った。化学シフトはテトラメチルシラン（0 ppm）を基準物質としてδ値で表した。質量分析はmicrOTOF-QIII/compact（BRUKER）又はOrbitrap XL（登録商標）（Thermo Fisher Scientific）をそれぞれ用いて測定した。薄層クロマトフラフィーはKieselgel 60F254 Plates（Merck, 0.25 mm thickness）を用いた。中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、指定した溶媒系でKieselgel 60（Merck, 0.040-0.063 mm）を用い、0.1-0.3 MPaにて行った。ゲル浸透クロマトグラフィーは指定した溶媒系でSephadex LH-20 を用い、大気圧下にて行った。特に言及しない限り、非水中の反応はアルゴン雰囲気下で行った。【００５０】
【化３】
2018155051.tif 000004
【００５１】
既知の化合物１（500 mg, 532μmol）と(R)-3-（ベンジルオキシ）ミリスチン酸２（267 mg, 799 μmol）をジクロロメタン（10 mL）とN,N-ジメチルホルムアミド（10 mL） の混合溶媒に溶解し、DIPEA（139 μL, 799 μmol）、MNBA（367.0 mg, 1.07 mmol）とDMAP（6.59 mg, 53.9μmol）を加え室温で１５時間撹拌した。反応溶液をクロロホルムで希釈した後、10%クエン酸水溶液を加えて撹拌し、クロロホルムで抽出した。有機層を10%クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を瀘去して減圧濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン／酢酸エチル = 97 : 3）で精製し、上記式で表される化合物３を白色固体（662 mg, 収率98%）として得た。【００５２】
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.51 (dd, J = 8.0, 2.0 Hz, 2H, C6H5-CH), 7.40-7.19 (m, 15H, C6H5-CH, C6H5-CH2, CH3O-C6H4-CH2), 6.85 (d, J = 8.5 Hz, 2H, CH3O-C6H4-), 5.85-5.79 (m, 2H, OCH2-CH=CH2 of Alloc and allyl groups), 5.57 (s, 1H, C6H5-CH), 5.35 (dd, J = 9.5, 11.0 Hz, 1H, H-3), 5.23 (ddd, J = 1.0, 10.0, 34.0 Hz, 2H, OCH2-CH=CH2 of Alloc group), 5.22 (d, J = 17.0, 33.5 Hz, 2H, OCH2-CH=CH2 of Allyl group), 5.02 (d, J = 14.0 Hz, 1H, 2-NH), 4.94 (br s, 1H, 2'-NH), 4.87 (d, J = 3.5 Hz, 1H, H-1), 4.81 (d, J = 11.0 Hz, 1H, CH3O-C6H4-CH2-), 4.65-4.43 (m, 10H, H-1' CH3O-C6H4-CH2-, OCH2-CH=CH2 of Alloc group, -COO-CH2-CCl3, CH2-C6H5), 4.33 (dd, J = 11.5, 5.0 Hz, 1H, H-3'), 4.15 (dd, J = 5.0, 12.0, Hz, 1H, OCH2-CH=CH2 of allyl group), 4.05 (d, J = 9.0 Hz, 1H, H-6a), 3.96-3.92 (m, 3H, H-4', H-2, OCH2-CH=CH2 of allyl group), 3.88-3.77 (m, 3H, β-CH of acyl chain, H-5, H-6'a), 3.79 (s, 3H, CH3O-C6H4-) 3.77-3.63 (m, 3H, H-6'b, H-6b, H-4), 3.45-3.33 (m, 2H, H-2', H-5'), 2.50 (ddd, J = 81.0, 15.5, 6.5 Hz, 2H, α-CH2 of acyl chain), 1.64-1.49 (m, 2H, γ-CH2 of acyl chain), 1.40-1.20 (m, 18H, acyl chain), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 3H, CH2-CH3 of acyl chain).
MS (ESI-LIT-orbitrap MS, positive) Calcd. for C65H83Cl3N2O16 [M+Na]+ : 1275.4700, Found 1275.4723【００５３】
【化５】
2018155051.tif 000005
【００５４】
亜鉛粉末（1.5 g）を水に懸濁させ、１時間超音波処理を行った後、硫酸銅水溶液を加え、濾取することで亜鉛/銅を得た。化合物３（200 mg, 159μmol）を1,4-ジオキサン（10 mL）と酢酸（10 mL）の混合溶媒に溶解し、亜鉛／銅を加え室温で７時間撹拌した。亜鉛／銅をメンブレンフィルターにより瀘去し、トルエンを加えて減圧濃縮した。得られた残渣をクロロホルムに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を瀘去して減圧濃縮した。得られた残渣と(R)-3-[[(R)-3-(ベンジルオキシ)ラウロイル]オキシ]ミリスチン酸４（93.3 mg, 175μmol）をクロロホルム（10 mL）とN,N-ジメチルホルムアミド（10 mL）の混合溶媒に溶解し、HATU（90.9 mg, 239μmol）とDMAP（1.95 mg, 15.9μmol）を加え、室温で１９時間撹拌した。反応溶液をクロロホルムで希釈した後、10%クエン酸水溶液を加えて撹拌し、有機層を10%クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を瀘去して減圧濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム）で精製し、上記式で表される化合物５を白色固体（223 mg, 収率88%）として得た。【００５５】
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.47 (m, 2H, C6H5-CH), 7.40-7.19 (m, 20H, C6H5-CH, C6H5-CH2, CH3O-C6H4-CH2), 6.80 (d, J = 8.5 Hz, 2H, CH3O-C6H4-), 5.87-5.79 (m, 3H, 2'-NH, OCH2-CH=CH2 of Alloc and allyl groups), 5.52 (s, 1H, C6H5-CH), 5.35 (dd, J = 9.5, 11.0 Hz, 1H, H-3), 5.30-5.16 (m, 4H, OCH2-CH=CH2 of Alloc group, OCH2-CH=CH2 of Allyl group), 5.08 (t, J = 5.0, β-CH of acyl chain) 5.03 (d, J = 9.5 Hz, 1H, H-1'), 4.97 (d, J = 8.0, 1H, 2-NH), 4.85 (d, J = 3.5 Hz, 1H, H-1), 4.76 (d, J = 11.5 Hz, 1H, CH3O-C6H4-CH2-), 4.61-4.42 (m, 9H, CH3O-C6H4-CH2-, OCH2-CH=CH2 of Alloc group, CH2-C6H5), 4.31 (dd, J = 10.0, 5.5 Hz, 1H, H-3'), 4.22 (t, J = 5.0, β-CH of acyl chain), 4.16 (dd, J = 5.0, 12.0, Hz, 1H, OCH2-CH=CH2 of allyl group), 3.99 (d, J = 10.0 Hz, 1H, H-6a), 3.96-3.92 (m, 2H, H-2, OCH2-CH=CH2 of allyl group), 3.88-3.77 (m, 4H, β-CH of acyl chain, H-4', H-5, H-6'a), 3.80 (s, 3H, CH3O-C6H4-) 3.77-3.63 (m, 3H, H-6'b, H-6b, H-4), 3.48-3.33 (m, 2H, H-2', H-5'), 2.59-2.19 (m, 6H, α-CH2 of acyl chain), 1.64-1.49 (m, 6H, γ-CH2 of acyl chain), 1.40-1.20 (m, 50H, acyl chain), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 9H, CH2-CH3 of acyl chain).
MS (ESI-LIT-orbitrap MS, positive) Calcd. for C95H136N2O18 [M+Na]+ : 1615.9680, Found 1615.9742【００５６】
【化７】
2018155051.tif 000006
【００５７】
化合物５（210 mg, 132μmol）をクロロホルム（3 mL）に溶解し、TMSDMAとテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）を加えて室温で８０分間撹拌した。反応溶液に水を加えて撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を瀘去して減圧濃縮した。得られた残渣と(R)-3-（カプロイルオキシ）ミリスチン酸６（57.8 mg, 145μmol）をクロロホルム（3 mL）とN,N-ジメチルスルホキシド（3 mL）の混合溶媒に溶解し、トリメチルシリルジメチル HATU（75.1 mg, 198μmol）とDMAP（1.61 mg, 13.2μmol）を加え、室温で１８時間撹拌した。反応溶液をクロロホルムで希釈した後、10%クエン酸水溶液を加えて撹拌し、有機層を10%クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を瀘去して減圧濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム）で精製し、上記式で表される化合物７を白色固体（193 mg, 収率78%）として得た。【００５８】
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.47 (m, 2H, C6H5-CH), 7.46-7.17 (m, 20H, C6H5-CH, C6H5-CH2, CH3O-C6H4-CH2), 6.79 (d, J = 8.0 Hz, 2H, CH3O-C6H4-), 5.88-5.79 (m, 3H, 2-NH, 2'-NH, OCH2-CH=CH2 of allyl groups), 5.52 (s, 1H, C6H5-CH), 5.33-5.20 (m, 3H, H-3, OCH2-CH=CH2 of Allyl group), 5.07 (m, 2H, β-CH of acyl chain) 4.97 (d, J = 8.0 Hz, 1H, 1'-H), 4.81 (d, J = 3.5, 1H, H-1), 4.76 (d, J = 11.0 Hz, 1H, CH3O-C6H4-CH2-), 4.61-4.42 (m, 7H, CH3O-C6H4-CH2-, CH2-C6H5), 4.31 (dd, J = 10.5, 5.0 Hz, 1H, H-3'), 4.24-4.20 (m, 2H,  β-CH of acyl chain), 4.16 (dd, J = 5.0, 12.0, Hz, 1H, OCH2-CH=CH2 of allyl group), 3.98 (d, J = 10.0 Hz, 1H, H-6a), 3.93 (dd, J = 9.0, 5.0 Hz, 1H, OCH2-CH=CH2 of allyl group), 3.88-3.77 (m, 3H, H-4', H-5, H-6'a), 3.80 (s, 3H, CH3O-C6H4-) 3.77-3.63 (m, 3H,H-2, H-6'b, H-6b, H-4), 3.48-3.33 (m, 2H, H-2', H-5'), 2.59-2.17 (m, 10H, α-CH2 of acyl chain), 1.61-1.49 (m, 8H, γ-CH2 of acyl chain), 1.40-1.20 (m, 82H, acyl chain), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 15H, CH2-CH3 of acyl chain).
MS (ESI-LIT-orbitrap MS, positive) Calcd. for C115H176N2O19 [M+Na]+ : 1912.2760, Found 1912.2801【００５９】
【化８】
2018155051.tif 000007
【００６０】
化合物７（150 mg, 79.4μmol）をジクロロメタン（3 mL）に溶解し、2,6-ジ-tert-ブチルピリジン（53.4 μL, 238μmol）を加えて０℃で３０分間撹拌した。この溶液にDDQ（27.0 mg, 119μmol）と水（100μL）を加えて０℃で２０時間撹拌した。反応溶液をクロロホルムで希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて撹拌し、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を瀘去して減圧濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム）で精製し、白色固体を得た。この白色固体と(R)-3-（ベンジルオキシ）ミリスチン酸２（24.9 mg, 74.6μmol）をジクロロメタン（2 mL）とN,N-ジメチルホルムアミド（2 mL）の混合溶媒に溶解し、DIPEA（21.7μL, 124μmol）、MNBA（32.1 mg, 93.2 μmol）とDMAP（0.76 mg, 6.2μmol）を加え４０℃で４４時間撹拌した。反応溶液をクロロホルムで希釈した後、10%クエン酸水溶液を加えて撹拌し、クロロホルムで抽出した。有機層を10%クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を瀘去して減圧濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム）で精製し、上記式で表される化合物８を白色固体（108 mg, 収率67%）として得た。【００６１】
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.38 (m, 2H, C6H5-CH), 7.31-7.18 (m, 23H, C6H5-CH, C6H5-CH2), 5.90 (d, J = 9.5 Hz, 1H, 2'-NH), 5.88-5.83 (m, 1H, OCH2-CH=CH2 of allyl groups), 5.77 (d, J = 8.5 Hz, 1H, 2-NH) 5.39 (s, 1H, C6H5-CH), 5.39 (t, J = 10.0 Hz, 1H, H-3), 5.34-5.18 (m, 3H, OCH2-CH=CH2 of Allyl group, β-CH of acyl chain), 5.07 (quint, J = 6.0 Hz, 1H, β-CH of acyl chain), 5.00 (quint, J = 6.0 Hz, 1H, β-CH of acyl chain), 4.80 (d, J = 4.0 Hz, 1H, H-1), 4.74 (d, J = 8.0, 1H, H-1'), 4.59-4.38 (m, 8H, CH2-C6H5), 4.30 (dd, J = 10.5, 5.5 Hz, 1H, H-3'), 4.20 (dt, J = 5.0, 12.0 Hz, 1H, H-5'), 4.15 (dd, J = 5.0, 12.0, Hz, 1H, OCH2-CH=CH2 of allyl group), 3.97 (d, J = 9.5 Hz, 1H, H-6a), 3.93 (dd, J = 9.0, 5.0 Hz, 1H, OCH2-CH=CH2 of allyl group), 3.94-3.77 (m, 5H, H-2, H-4', H-6'a, β-CH of acyl chain), 3.77-3.57 (m, 4H, H-2, H-4', H-6'b, H-6b,), 3.47 (dt, J = 5.0, 12.0 Hz, 1H, H-2'), 2.72-2.03 (m, 12H, α-CH2 of acyl chain), 1.61-1.41 (m, 10H, γ-CH2 of acyl chain), 1.40-1.20 (m, 100H, acyl chain), 0.88 (m, 18H, CH2-CH3 of acyl chain).
MS (ESI-LIT-orbitrap MS, positive) Calcd. for C128H200N2O20 [M+Na]+ : 2108.4587, Found 2108.4644【００６２】
【化９】
2018155051.tif 000008
【００６３】
化合物８（20 mg, 9.58μmol）をジクロロメタン（1 mL）と水（0.1 mL）とTFA（0.1 mL）に溶解し、０℃で２０分間撹拌した。反応溶液をトルエンで希釈した後、減圧濃縮した。得られた残渣をジクロロメタン（1 mL）に溶解し、ピリジン（7.7μL, 95.8μmol）と塩化トリチル（2.94 mg, 10.54μmol）を加えて室温で６時間撹拌した。反応溶液をクロロホルムで希釈した後、10%クエン酸水溶液を加えて撹拌し、クロロホルムで抽出した。有機層を10%クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を瀘去して減圧濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム）で精製し、上記式で表される化合物９を白色固体（14.6 mg, 収率68%）として得た。【００６４】
MS (ESI-LIT-orbitrap MS, positive) Calcd. for C140H210N2O20 [M+Na]+ : 2252.5369, Found 2252.5422【００６５】
【化１０】
2018155051.tif 000009
【００６６】
（1,5）-（シクロオクタジエン）-ビス（メチルジフェニルホスフィン）イリジウム（1）ヘキサフルオロホスフェートをアルゴン雰囲気下でテトラヒドロフラン（0.5 mL）に溶解させた後、アルゴンを水素に置換した。溶液が赤色から黄色に変化したことを確認した後、水素をアルゴンに置換することで活性化イリジウム錯体のテトラヒドロフラン溶液を得た。化合物９（10 mg, 4.49μmol）をテトラヒドロフラン（0.5 mL）に溶解し、活性化イリジウム錯体のテトラヒドロフラン溶液を加え室温で１６時間撹拌した。反応溶液に水（50μL）とヨウ素（3.42 mg, 13.5μmol）を加え、室温で３０分間撹拌した。反応溶液をクロロホルムで希釈した後、20%チオ硫酸ナトリウム水溶液を加え撹拌し、クロロホルムで抽出した。有機層を20%チオ硫酸ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を瀘去して減圧濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム）で精製し、上記式で表される化合物１０を白色固体（11.0 mg, quant.）として得た。【００６７】
MS (ESI-LIT-orbitrap MS, positive) Calcd. for C137H206N2O20 [M+Na]+ : 2222.5056, Found 2222.5033【００６８】
【化１１】
2018155051.tif 000010
【００６９】
化合物１０（6.0 mg, 2.73μmol）をジクロロメタン（1.0 mL）に溶解し、モレキュラーシーブス4A、テトラゾール（1.3 mg, 19.1μmol）とジベンジル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト（4.52μL, 13.6μmol）を加え室温で１６時間撹拌した。反応溶液にDMDOを加え、室温で２時間撹拌した。反応溶液をクロロホルムで希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え撹拌し、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和塩化ナトリウム水溶液で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を瀘去して減圧濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／アセトン=99:1）で精製した。得られた白色固体をテトラヒドロフラン（2 mL）と水（0.2 mL）と酢酸（0.1 mL）の混合溶媒に溶解し、水酸化パラジウム／炭素（3.0 mg）を加え水素雰囲気下（20 kgf/cm2）室温で１９時間撹拌した。反応溶液にトリエチルアミンを加えて撹拌した後、水酸化パラジウム/炭素をメンブレンフィルターにより瀘去し、減圧濃縮した。得られた残渣を1,4-ジオキサンに溶解させ、凍結乾燥を行うことにより上記式で表される本発明のリピドＡである化合物１１を白色固体として得た。【００７０】
MS (ESI-LIT-orbitrap MS, negative) Calcd. for C90H170N2O26P2 [M-2H]2- : 877.5688, Found 877.5755【００７１】
（実施例４）アルカリゲネス由来LPSによる卵白アルブミン（OVA）特異的免疫応答
本実施例では、実施例２に記載の方法と同手法により抽出したアルカリゲネス属フェカーリス由来LPSについて、マウスでのOVA特異的免疫応答の増強を確認した。比較例として使用する大腸菌由来LPSは大腸菌O111由来LPSを用いた。【００７２】
10μg/doseのOVA（Sigma, A5503）を抗原とし、アジュバントとしてアルカリゲネス又は大腸菌由来のLPS（100μg）、あるいは200μLのAlum（Thermo Fisher Scientific Inc）を８週齢の雌BALB/c（ニホンクレア）に皮下注射で２回投与した（０日目と７日目）。最終免疫から７日目に脾臓を回収し、脾臓細胞からCD4マイクロビーズ（Miltenyi biotec, 130-049-201）を用いてCD4陽性細胞を分離した。また脾臓細胞に放射線（30 Gy）を照射し、抗原提示細胞として用いた。CD4陽性細胞（2×105 cells/well）及び抗原提示細胞（2×105 cells/well）を96穴プレート（Thermo, 163320）に播種し、OVA（1 mg/mL）を添加して３７℃、5% CO2環境下で培養した。培養４日目に培養上清を回収し、Mouse Th1/TH2/Th17 cytokine kit（BD biosciences, 560485）を用いて培養上清中のIL-17A濃度を測定した。【００７３】
その結果、脾臓細胞の培養上清中のIL-17Aについて大腸菌由来のLPSで処理した細胞が最も高い値を示した（図２０）。このことから、アルカリゲネス由来LPSはTh1, Th2に加え、Th17細胞も誘導できることが示された。【００７４】
（実施例５）本発明のリピドＡによる卵白アルブミン（OVA）特異的免疫応答
本実施例では、リピドＡについてマウスでのOVA特異的抗体産生能の増強を確認した。本実施例のリピドＡとして実施例３で合成されたリピドＡ（化合物１１）を用いた。なお、リピドＡ（化合物１１）はアルカリゲネス属フェカーリス由来リピドＡと同等の構造を有する。【００７５】
10μg/doseのOVA（Sigma, A5503）を抗原とし、アジュバントとしてリピドＡ（1 μg）を８週齢の雌BALB/c（ニホンクレア）に皮下注射で２回投与した（０日目と１０日目）。最終免疫から７日目に採血し、採取した血液は氷上で３０分間静置した後に遠心分離（3,000×g、１０分間、４℃）を行い、血清を回収し、−３０℃で保管した。【００７６】
ELISA法によって血清中のOVA特異的なIgG抗体を検出した。OVAをPBS（ナカライテスク, 27575-31）に1 mg/mLで溶解し、96穴プレート（Thermo, 442404）に0.1 mL/well加え、４℃で一晩保管し、固相化した。溶液を捨て、1% BSA（ナカライテスク, 01859-47）添加PBSを0.1 mL/well加えた。室温で２時間反応させた後に溶液を捨て、0.05% Tween20（ナカライテスク, 28353-85）添加PBSで３回洗浄した。1% BSA-0.05% Tween20添加PBSで血清を希釈し、0.1 mL/well添加した。室温で２時間反応させた後に溶液を捨て、0.05% Tween20添加PBSで３回洗浄した。1% BSA-0.05% Tween20添加PBSで4,000倍に希釈した抗体（抗マウスIgG抗体、SouthernBiotech）を0.1 mL/well添加した。室温で１時間反応させた後に溶液を捨て、0.05% Tween20添加PBSで３回洗浄した。TMB（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine：KPL, 50-76-03）を0.1 mL/well加え、室温で２分間反応させた後に0.5N HCl（ナカライテスク, 37345-15）を0.05 mL/well添加した。マイクロプレートリーダー（バイオラッド, iMark）を用いてOD450 nmの波長で測定した。【００７７】
その結果、リピドＡを投与したマウスの方が、血清中のOVA特異的なIgG抗体が高い値を示した（図２１）。このことから、リピドＡは、アルカリゲネス属フェカーリス由来LPSと同様にアジュバントとして使用可能であることが示された。【００７８】
（実施例６）本発明のリピドＡによるマウス樹状細胞の活性化
本実施例では実施例５に示したリピドＡ（化合物１１）について、マウス樹状細胞の活性化を確認した。活性化はサイトカイン（IL-6）の産生能により確認した。【００７９】
細胞の培養は10% 牛胎児血清（Gibco, 10437-028）、1% ピルビン酸ナトリウム（ナカライテスク, 06977-34）、0.1% 2-メルカプトエタノール（Gibco, 21985-023）、1% ペニシリン及びストレプトマイシン（ナカライテスク, 26253-84）添加RPMI 1640（Sigma, R8758）で行った（以下、「cRPMI培地」）。マウス樹状細胞（BMDC：Bone marrow-derived dendritic cell）は、４〜６週齢の雌BALB/cの大腿骨及び下腿骨から骨髄細胞を採取し、当該骨髄細胞をGM-CSF（10μg/mL）添加cRPMI培地で６日間培養後、CD11c MACSビーズ（Miltenyi biotec, 130-052-001）を用いてCD11c陽性細胞を分離し、調製した。６日間の培養中、２日に１回培地を半量交換した。当該CD11c陽性マウス樹状細胞を、以下「BMDC」と称する。BMDC（1×105 cells/well）を96穴プレート（Thermo, 163320）に播種し、リピドＡを0.1〜10 pg/mLの濃度で添加して３７℃、5% CO2環境下で培養した。培養４８時間後に培養上清を回収し、Mouse Th1/TH2/Th17 cytokine kit（BD Biosciences）を用いて培養上清中のIL-6の濃度を測定した。【００８０】
その結果、リピドＡの添加濃度依存的にIL-6の産生量が増加した（図２２）。このことから、前記リピドＡによりマウス樹状細胞が活性化されることが確認された。【００８１】
（実施例７）本発明のリピドＡによるヒト抹消血単核細胞の活性化
本実施例では実施例５に示したリピドＡ（化合物１１）について、ヒトの末梢血単核細胞の活性化を確認した。末梢血単核細胞の活性化はサイトカイン（IL-6、IL-1β）の産生能により確認した。【００８２】
2.8×105 cells/wellのヒト末梢血単核細胞（Wako, 555-24481）を96穴プレート（Thermo, 163320）に播種し、リピドＡ（1 ng/mL）を添加して３７℃、5% CO2環境下で培養した。培養２４時間後に培養上清を回収し、Human inflammatory cytokine kit（BD biosciences、551811）を用いて上清中のIL-6とIL-1βの濃度を測定した。【００８３】
その結果、リピドＡの添加によりIL-6及びIL-1βの産生量の増加が確認された（図２３）。このことから、前記リピドＡによりヒトの末梢血単核細胞が活性化されることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
以上詳述したように、本発明のリピドＡは新規な構造からなる。本発明のリピドＡを含むアジュバント組成物又は免疫賦活化剤は、優れた免疫活性化能を維持したまま、アレルギー反応や炎症等の副作用が軽減化された、安全性が高く有効な医薬組成物として使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2018155051.tif 000024
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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