(57)【要約】  本発明は、ＳＡＲＳコロナウイルスの新規なＣＴＬエピトープペプチドを提供することを目的とする。本発明は、配列番号１０，１１，１２，１３，１５，１７，１８，２３及び２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１０，１１，１２，１３，１５，１７，１８，２３及び２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
ペプチドがリポソームの表面に結合しているペプチド結合リポソームであって、
リポソームが、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質、及び、安定化剤を含有し、
ペプチドが、請求項１に記載のペプチドから選択される少なくとも１種である、
ペプチド結合リポソーム。
【請求項３】
前記リン脂質が、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基を有するリン脂質である、請求項２に記載のペプチド結合リポソーム。
【請求項４】
前記リン脂質が、オレオイル基を有するリン脂質である、請求項２に記載のペプチド結合リポソーム。
【請求項５】
前記リン脂質が、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル−ジアシルホスファチジルエタノールアミン、及び、マレイミド−ジアシルホスファチジルエタノールアミンから選ばれる少なくとも１つである、請求項２に記載のペプチド結合リポソーム。
【請求項６】
前記安定化剤がコレステロールである、請求項２に記載のペプチド結合リポソーム。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチドから選択される少なくとも１種が、リポソームに含まれる不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質に結合している、請求項２に記載のペプチド結合リポソーム。
【請求項８】
リポソームが以下の組成を有する、請求項２に記載のペプチド結合リポソーム：
（Ａ）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質  １〜９９．８モル％；
（Ｂ）安定化剤  ０．２〜７５モル％。
【請求項９】
以下の組成を有するペプチド結合リポソーム：
（Ｉ）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する酸性リン脂質  １〜８５モル％；
（ＩＩ）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する中性リン脂質  ０．０１〜８０モル％；
（ＩＩＩ）請求項１に記載のペプチドから選択される少なくとも１種が結合した、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質  ０．２〜８０モル％；
（ＩＶ）安定化剤  ０．２〜７５モル％。
【請求項１０】
細胞表面抗原ＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて請求項１に記載のペプチドから選択される少なくとも１種と接触させることにより調製された抗原提示細胞。
【請求項１１】
前記細胞が自己由来である請求項１０に記載の抗原提示細胞。
【請求項１２】
前記細胞が同種由来である請求項１０に記載の抗原提示細胞。
【請求項１３】
請求項１に記載のペプチドから選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、ＳＡＲＳコロナウイルス特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの誘導剤。
【請求項１４】
請求項１に記載のペプチドから選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、ＳＡＲＳコロナウイルスの感染を予防するためのワクチン。
【請求項１５】
請求項２〜９のいずれか一項に記載のペプチド結合リポソームを有効成分として含有する、ＳＡＲＳコロナウイルス特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの誘導剤。
【請求項１６】
請求項２〜９のいずれか一項に記載のペプチド結合リポソームを有効成分として含有する、ＳＡＲＳコロナウイルスの感染を予防するためのワクチン。
【請求項１７】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の抗原提示細胞を有効成分として含有する、ＳＡＲＳコロナウイルス特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの誘導剤。
【請求項１８】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の抗原提示細胞を有効成分として含有する、ＳＡＲＳコロナウイルスの感染を予防するためのワクチン。
【請求項１９】
ＣｐＧ−ＤＮＡをさらに含む、請求項１３又は１５に記載のＳＡＲＳコロナウイルス特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの誘導剤。
【請求項２０】
ＣｐＧ−ＤＮＡをさらに含む、請求項１４又は１６に記載のＳＡＲＳコロナウイルスの感染を予防するためのワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＡＲＳコロナウイルスの細胞傷害性Ｔ細胞エピトープペプチド及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
重症急性呼吸器症候群（Ｓｅｖｅｒｅ  Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＳＡＲＳ）は、新規のＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）による致死率の高い新興感染症である。２００３年の中国におけるアウトブレイク以来、８０００人以上が感染し約８００人が死亡した。しかしながら、未だに有効な予防・治療法がない。ＳＡＲＳ発生以降、ＳＡＲＳの原因ウイルスであるＳＡＲＳウイルスが同定され（非特許文献１）、その塩基配列が決定されている（非特許文献２）。【０００３】
ＳＡＲＳコロナウイルスは、一本鎖（＋）ＲＮＡウイルスのコロナウイルス科に属する新種のコロナウイルスである。ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムは非常に大きく、２９．７ｋｂあり（非特許文献２）、推定上の２３のタンパク質をコードする。主要な構造タンパク質としては、スパイク（Ｓｐｉｋｅ、１２５６ａａ）、ヌクレオカプシド（Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ、４２３ａａ）、膜（Ｍｅｍｂｒａｎｅ、２２２ａａ）及び小さなエンベロープ（Ｅｎｖｅｌｏｐｅ、７７ａａ）がある。非構造タンパク質としては、２つのポリプロテインｐｐ１ａ（４３８２ａａ、配列番号３１；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＰ１３４３９）とｐｐ１ｂ（２６９６ａａ）があり、これらのポリプロテインから個々のタンパク質がプロテアーゼによって部位特異的に切り出される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｋｓｉａｚｅｋ，  Ｔ．  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４８：１９５３−１９６６（２００３）
【非特許文献２】Ｍａｒｒａ，  Ｍ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：１３９９−１４０４（２００３）
【非特許文献３】Ｙａｎｇ，  Ｚ．  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２８：５６１−５６４（２００４）
【非特許文献４】Ｗａｎｇ．  Ｙ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：５６１２−５６１８（２００４）
【非特許文献５】Ｃｈｅｎ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７５：５９１−５９８（２００５）
【非特許文献６】Ｚｈｏｕ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７７：２１３８−２１４５（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまでに、スパイクタンパク質をコードするＤＮＡワクチンによりウイルス中和抗体が誘導されることが報告されている（非特許文献３）。有効な防御反応には体液性免疫及び細胞性免疫が必要であるが、ＳＡＲＳコロナウイルスに関する分野では、体液性免疫に比べて細胞性免疫は未だ研究が進んでいない。細胞性免疫においてウイルス防御に重要な役割を果たしているのは、細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＣＴＬ）であり、ＳＡＲＳコロナウイルス特異的ＣＴＬ活性を制御することがＳＡＲＳコロナウイルスに対する新たな治療となり得る可能性がある。この観点から、ＳＡＲＳコロナウイルスタンパクにおいて抗原性の強いＣＴＬエピトープペプチドの同定が望まれている。ＳＡＲＳコロナウイルス特異的なＣＴＬエピトープペプチドとしては、これまでに構造タンパク質であるスパイクタンパク質由来の部分ペプチドが数種類同定されている（非特許文献４〜６）。しかしながら、非構造タンパク質由来のＣＴＬエピトープペプチドについては、これまで何ら報告されていない。【０００６】
本発明は、ＳＡＲＳコロナウイルスの新規なＣＴＬエピトープペプチドを提供することを目的とする。さらに詳しくは、本発明は、ＳＡＲＳコロナウイルスｐｐ１ａタンパク質由来の新規なＣＴＬエピトープを含むペプチド、ペプチド結合リポソーム及び抗原提示細胞を提供することを目的とする。また、当該ペプチド、ペプチド結合リポソーム又は抗原提示細胞を有効成分とするＳＡＲＳコロナウイルス特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの誘導剤、ＳＡＲＳコロナウイルスの感染を治療又は予防するためのワクチンなどを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、これまでに報告のないＳＡＲＳコロナウイルス由来のＣＴＬエピトープを同定するために、以下の検討を行った。まず、ＳＡＲＳコロナウイルスの非構造タンパク質であるｐｐ１ａタンパク質に着目し、予測したエピトープ候補ペプチドの中から３０種類のペプチドを選択した。次に、ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子であるＨＬＡ−Ａ２分子への結合アフィニティを有することを確認し、エピトープ候補ペプチドのうち特に９種類のペプチドが有意にＣＴＬ誘導活性を有することを見いだした。さらに、ペプチドを含むペプチド結合リポソームを免疫することにより、ＣＴＬ誘導が惹起されること、及び、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＣＴＬ応答が活性化されることを明らかにした。かかる知見に基づき、本発明者は、ＳＡＲＳコロナウイルスｐｐ１ａタンパク質由来の新規なＣＴＬエピトープを含むペプチドを提供することを可能とし、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、配列番号１０，１１，１２，１３，１５，１７，１８，２３及び２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。また、本発明のペプチドは、配列番号１０，１２，１５，１７及び２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことが好ましく、配列番号２４のアミノ酸配列を含むことがより好ましい。本発明のペプチドは、ＳＡＲＳコロナウイルス特異的な細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを含むペプチドであり、ＨＬＡ−Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを含むペプチドであることを特徴とする。【０００９】
本発明は、ペプチドがリポソームの表面に結合しているペプチド結合リポソームであって、リポソームが、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質、及び、安定化剤を含有し、ペプチドが、上記ペプチドから選択される少なくとも１種である、ペプチド結合リポソームを提供する。【００１０】
上記リン脂質は、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基を有するリン脂質であることが好ましく、オレオイル基を有するリン脂質であることがより好ましい。また、上記リン脂質は、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル−ジアシルホスファチジルエタノールアミン、及び、マレイミド−ジアシルホスファチジルエタノールアミンから選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。【００１１】
リポソームに含まれるリン脂質がこのような構成を備えることにより、病原体感染細胞を殺傷するためのＣＴＬを効率よく増強することができ、感染症を予防・治療することができる。【００１２】
上記安定化剤は、コレステロールであることが好ましい。この構成により、上記リポソームをより安定化することができる。【００１３】
上記ペプチドは、上記リポソームに含まれるリン脂質に結合していることが好ましい。これにより、ペプチドをリポソーム表面に提示することができ、より効果的にＳＡＲＳコロナウイルス特異的なＣＴＬ誘導を惹起することができる。【００１４】
また、本発明のペプチド結合リポソームは、リポソームが以下の組成を有することが好ましい。
（Ａ）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質  １〜９９．８モル％；
（Ｂ）安定化剤  ０．２〜７５モル％。【００１５】
また、本発明のペプチド結合リポソームは、以下の組成を有することが好ましい。
（Ｉ）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する酸性リン脂質  １〜８５モル％；
（ＩＩ）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する中性リン脂質  ０．０１〜８０モル％；
（ＩＩＩ）上記ペプチドから選択される少なくとも１種が結合した、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質  ０．２〜８０モル％；
（ＩＶ）安定化剤  ０．２〜７５モル％。【００１６】
本発明は、細胞表面抗原ＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて上記ペプチドから選択される少なくとも１種と接触させることにより調製された抗原提示細胞を提供する。上記細胞は、自己由来であることが好ましく、同種由来であることが好ましい。【００１７】
また、本発明は、上記ペプチドから選択される少なくとも１種、上記ペプチド結合リポソーム又は上記抗原提示細胞を有効成分として含有するＳＡＲＳコロナウイルス特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの誘導剤を提供する。【００１８】
本発明は、上記ペプチドから選択される少なくとも１種、上記ペプチド結合リポソーム又は上記抗原提示細胞を有効成分として含有するＳＡＲＳコロナウイルスの感染を予防するためのワクチンを提供する。【００１９】
さらに、本発明は、ＳＡＲＳコロナウイルスに対する免疫性を提供する必要がある対象に、免疫性を提供する方法であって、上記対象に上記ペプチドから選択される少なくとも１種、上記ペプチド結合リポソーム又は上記抗原提示細胞を投与することを含む方法を提供する。【００２０】
本発明は、ＳＡＲＳコロナウイルスに対して免疫性を提供する必要がある対象に、免疫性を提供する方法であって、上記対象から細胞を採取し、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて上記ペプチドから選択される少なくとも１種と接触させることにより抗原提示細胞を調製し、抗原提示細胞を上記対象に再注入することを含む方法を提供する。上記細胞は、リンパ系単核細胞であることが好ましく、樹状細胞であることがさらに好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、ＳＡＲＳコロナウイルスｐｐ１ａタンパク質由来の新規なＣＴＬエピトープを含むペプチド、ペプチド結合リポソーム及び抗原提示細胞を提供する。また、当該ペプチド、ペプチド結合リポソーム又は抗原提示細胞により、ＣＴＬ誘導が惹起されること、及び、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＣＴＬ応答が活性化されることから、本発明のペプチド、ペプチド結合リポソーム及び抗原提示細胞は、いずれもＳＡＲＳコロナウイルスの排除を目的としたＣＴＬ誘導剤及び／又はワクチンとして使用することができる。また、非構造タンパク質はウイルスの感染の過程において構造タンパク質よりも先に合成されるため、非構造タンパク質であるｐｐ１ａタンパク質由来のＣＴＬエピトープを用いて免疫反応を活性化することにより、ウイルス感染初期でのウイルス排除効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ペプチド結合リポソームを用いて免疫したマウスにおけるフローサイトメトリーによるＣＤ８とＩＦＮ−γの染色プロット
【図２】ｓｐｉｋｅ−１２０３ペプチド結合リポソームを用いて免疫したマウスにおけるフローサイトメトリーによるＣＤ８とＩＦＮ−γの染色プロット
【図３】ＣＦＳＥ標識された抗原提示細胞を追加免疫したマウスにおけるフローサイトメトリーによるＣＦＳＥの染色プロット
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、発明を実施するための最良の実施形態について詳細に説明する。
【００２４】
本発明におけるペプチドとは、ＳＡＲＳコロナウイルスｐｐ１ａタンパク質由来のＣＴＬエピトープを含むものであり、具体的には配列番号１０，１１，１２，１３，１５，１７，１８，２３及び２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、並びに、配列番号１０，１１，１２，１３，１５，１７，１８，２３及び２４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。また、配列番号１０，１２，１５，１７及び２４からなる群より選択されるアミノ酸配列が好ましく、配列番号２４のアミノ酸配列がより好ましい。これらのペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬエピトープを含むものであり、より具体的には、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ＣＴＬエピトープを含むものである。また、本発明のペプチドは、本来のＣＴＬエピトープ活性が損なわれないことを条件として、様々な形態（例えば、未変性、融合体、グリコシル化、非グリコシル化など）で用いることができ、Ｃ末端修飾（アミド化、エステル化、アルデヒド化等）、Ｎ末端修飾（アセチル化、ビオチン化、蛍光標識等）及び官能基の化学修飾（リン酸化、硫酸化、ビオチン等）を含んでいても良い。
【００２５】
ここで、ペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことができる。公知のペプチド合成法としては文献（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６６、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ  ２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６、ペプチド合成，丸善（株），１９７５、ペプチド合成の基礎と実験，丸善（株），１９８５、医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成，広川書店，１９９１）などに記載されている方法が挙げられる。
【００２６】
以上のような本発明のペプチドは、１種又は２種以上組み合わせることにより、ＳＡＲＳコロナウイルス特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの誘導剤、及び／又は、ＳＡＲＳコロナウイルスの感染を治療又は予防するためのワクチンとして使用することができる。すなわち本発明のペプチドはＨＬＡ−Ａ２分子と結合し、ＨＬＡ−Ａ２分子を発現する細胞に提示されてＣＴＬを強く誘導することができることから、本発明のペプチドは、ＳＡＲＳコロナウイルスの排除を目的としたＣＴＬ誘導剤及び／又はワクチンとして使用することができる。
【００２７】
本発明のペプチド結合リポソームに用いられるリポソームとは、閉鎖空間を有するリン脂質二重膜のことを指す。
【００２８】
本発明のペプチド結合リポソームに用いられるリポソームは、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質、及び、安定化剤を含有する。リン脂質としては、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基を有するリン脂質が好ましく用いられる。
【００２９】
不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基を有するリン脂質における、アシル基の炭素数は、好ましくは１６〜２２であり、更に好ましくは１８〜２２であり、最も好ましくは１８である。アシル基としては、具体的には、パルミトオレオイル基、オレオイル基、エルコイル基等が挙げられ、最も好ましくはオレオイル基である。不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質における、炭化水素基の炭素数は、好ましくは１６〜２２であリ、更に好ましくは１８〜２２であり、最も好ましくは１８である。炭化水素基としては、具体的には、テトラデセニル基、ヘキサデセニル基、オクタデセニル基、Ｃ２０モノエン基、Ｃ２２モノエン基、Ｃ２４モノエン基等が挙げられる。リン脂質が有するグリセリン残基の１−位、及び２−位に結合する不飽和のアシル基又は不飽和炭化水素基は、同一でも異なっていてもよい。工業的な生産性の観点から、１−位及び２−位の基が同一であることが好ましい。
【００３０】
実用上十分なレベルにＣＴＬ活性を増強させる点から、リン脂質は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基を有することが好ましい。アシル基の炭素数が１３未満であると、リポソームの安定性が悪くなったり、またＣＴＬ活性増強効果が不十分になる場合がある。また、アシル基の炭素数が２４を超えると、リポソームの安定性が悪くなる場合がある。
【００３１】
不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質としては、酸性リン脂質、中性リン脂質、ペプチドを結合することのできる官能基を有する反応性リン脂質などの種類が挙げられる。これらは、種々の要求に応じて、その種類、割合を適宜選択することができる。
【００３２】
酸性リン脂質としては、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール等を用いることができる。ＣＴＬ活性を実用上十分なレベルに増強する点、及び工業的な供給性、医薬品として用いるための品質などの点から、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基を有するジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、及びジアシルホスファチジルイノシトールが好ましく用いられる。酸性リン脂質は、リポソームの表面にアニオン性電離基を与えるので、リポソーム表面にマイナスのゼータ電位を付与する。このためリポソームは、電荷的な反発力を得、水性溶媒中で安定な製剤として存在できる。このように、酸性リン脂質は、水性溶媒中のリポソームの安定性を確保する点で重要である。
【００３３】
中性リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン等を用いることができる。本発明で用いることができる中性リン脂質は、ＣＴＬ活性増強を達成する範囲において、その種類・量を適宜選択して用いることができる。中性リン脂質は、酸性リン脂質及びペプチドを結合したリン脂質に比べ、リポソームを安定化する機能が高く、膜の安定性を向上させ得る。かかる観点から、本発明のペプチド結合リポソームに用いられるリポソームは、中性リン脂質を含有することが好ましい。ＣＴＬ活性増強効果を達成するために用いる酸性リン脂質、ペプチド結合のための反応性リン脂質及び安定化剤の含有量を確保した上で、中性リン脂質の使用量を決定できる。
【００３４】
本発明のペプチドは、リポソームに含まれる不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質に結合することにより、リポソームの表面に結合する。このペプチドの結合のためのリン脂質として、ペプチドが結合することのできる官能基を有する反応性リン脂質が用いられる。不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する反応性リン脂質は、種々の要求に応じて、その種類、割合が適宜選択される。前記リン脂質と同様に、反応性リン脂質においても、リン脂質に含まれる不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の炭素数が２４を超えるか、１４未満である場合は好ましくない。
【００３５】
反応性リン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン又はその末端変性体が挙げられる。また、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール及びこれらの末端変性体も反応性リン脂質として用いることができる。工業的な入手性、ペプチドとの結合工程の簡便性、収率などの点から、ホスファチジルエタノールアミン又はその末端変性体が好ましく用いられる。ホスファチジルエタノールアミンはその末端に抗体を結合することの出来るアミノ基を有する。更に、ＣＴＬ活性を実用上十分なレベルに増強する点、リポソーム中での安定性、及び工業的な供給性、医薬品として用いるための品質などの点から、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基を有するジアシルホスファチジルエタノールアミン又はその末端変性体が最も好ましく用いられる。
【００３６】
ジアシルホスファチジルエタノールアミンは、例えば、ジアシルホスファチジルコリンを原料に、ホスホリパーゼＤを用いてコリンとエタノールアミンを塩基交換反応させることで得ることができる。具体的には、ジアシルホスファチジルコリンを溶解したクロロホルム溶液と、ホスホリパーゼＤ及びエタノールアミンを溶解した水を適宜比率において混合し粗反応物を得ることができる。粗反応物を、クロロホルム／メタノール／水系溶媒を用いてシリカゲルカラムで精製し目的のジアシルホスファチジルエタノールアミンを得ることができる。当業者であれば、溶媒組成比などのカラム精製条件を適宜選択して実施することが可能である。
【００３７】
末端変性体としては、ジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に２価反応性化合物の一方の末端を結合させたジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体が挙げられる。２価反応性化合物としては、ジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基と反応することができるアルデヒド基又はコハク酸イミド基を少なくとも片方の末端に有する化合物が利用できる。アルデヒド基を有する２価反応性化合物として、グリオキサール、グルタルアルデヒド、サクシンジアルデヒド、テレフタルアルデヒドなどが挙げられる。好ましくは、グルタルアルデヒドが挙げられる。コハク酸イミド基を有する２価反応性化合物として、ジチオビス（サクシンイミジルプロピオネート）、エチレングリコール−ビス（サクシンイミジルサクシネート）、ジサクシンイミジルサクシネート、ジサクシンイミジルスベレート、又はジサクシンイミジルグルタレートがなど挙げられる。
【００３８】
また、一方の末端にサクシンイミド基、他方の片末端にマレイミド基を有する２価反応性化合物として、Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、スルホサクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−サクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート、Ｎ−サクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）プロピオネート、サクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドエチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホサクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドエチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）サクシンイミド、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド等が挙げられる。このような２価反応性化合物を用いると、官能基としてマレイミド基を有するジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体が得られる。以上のような２価反応性化合物の一方の末端の官能基をジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に結合し、ジアシルホスファチジルエタノールアミン末端変性体を得ることができる。
【００３９】
リポソームの表面にペプチドを結合する方法としては、例えば、上記の反応性リン脂質を含有するリポソームを調製し、次にペプチドを加えてリポソーム中の反応性リン脂質にペプチドを結合する方法を挙げることができる。また、予めペプチドを反応性リン脂質に結合しておき、次に、得られたペプチド結合反応性リン脂質を、反応性リン脂質以外のリン脂質及び安定化剤と混合することによっても、ペプチドを表面に結合したリポソームを得ることが出来る。反応性リン脂質へのペプチドの結合方法は、当該技術分野において周知である。
【００４０】
本発明のペプチド結合リポソームに用いられるリポソームは、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質を少なくとも１種、例えば２種以上、好ましくは３種以上含有する。例えば、本発明のペプチド結合リポソームに用いられるリポソームは、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル−ジアシルホスファチジルエタノールアミン、及びマレイミド−ジアシルホスファチジルエタノールアミンから選ばれる少なくとも１種、例えば２種以上、好ましくは３種以上の、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質を含有する。
【００４１】
また、本発明のペプチド結合リポソームに用いられるリポソームは、
不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数
１４〜２４の炭化水素基を有する酸性リン脂質、
不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数
１４〜２４の炭化水素基を有する中性リン脂質、及び
不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数
１４〜２４の炭化水素基を有する反応性リン脂質
を、それぞれ、少なくとも１種含有することが好ましい。
【００４２】
本発明において、リポソームの安定化剤としては、ステロール類やトコフェロール類を用いることができる。ステロール類としては、一般にステロール類として知られるものであればよく、例えば、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロールなどが挙げられ、入手性などの点から、特に好ましくは、コレステロールが用いられる。トコフェロール類としては、一般にトコフェロールとして知られるものであればよく、例えば、入手性などの点から、市販のα−トコフェロールが好ましく挙げられる。
【００４３】
さらに、本発明の効果を損なわない限り、本発明のペプチド結合リポソームに用いられるリポソームは、リポソームを構成することのできる、公知のリポソーム構成成分を含んでいてもよい。
【００４４】
本発明のペプチド結合リポソームに用いられるリポソームの組成としては、例えば以下を挙げることができる：
（Ａ）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質  １〜９９．８モル％；
（Ｂ）安定化剤    ０．２〜７５モル％。
【００４５】
なお、各成分の含有量は、ペプチド結合リポソームの全構成成分に対するモル％として表示する。
【００４６】
上記成分（Ａ）の含有量は、リポソームの安定性の観点から、好ましくは１０〜９０モル％、より好ましくは３０〜８０モル％、更に好ましくは５０〜７０モル％である。
【００４７】
上記成分（Ｂ）の含有量は、リポソームの安定性の観点から、好ましくは５〜７０モル％、より好ましくは１０〜６０モル％、更に好ましくは２０〜５０モル％である。安定化剤の含有量が７５モル％を越えるとリポソームの安定性が損なわれ好ましくない。
【００４８】
上記成分（Ａ）には、以下が含まれる：
（ａ）ペプチドが結合していない、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質、及び
（ｂ）ペプチドが結合した、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質。
【００４９】
上記成分（ａ）の含有量は、通常０．０１〜８５モル％、好ましくは０．１〜８０モル％、より好ましくは０．１〜６０モル％、更に好ましくは０．１〜５０モル％である。
【００５０】
上記成分（ｂ）の含有量は、通常０．２〜８０モル％、好ましくは０．３〜６０モル％、より好ましくは０．４〜５０モル％、更に好ましくは０．５〜２５モル％である。含有量が０．２モル％未満であると、ペプチド量が低下するため、実用上十分なレベルにＣＴＬを活性化することが困難となり、８０モル％を超えると、リポソームの安定性が低下する。
【００５１】
上記成分（ａ）のリン脂質には、通常、上述の酸性リン脂質及び中性リン脂質が含まれる。また、上記成分（ｂ）のリン脂質には、上述の反応性リン脂質が含まれる。
【００５２】
酸性リン脂質の含有量は、通常１〜８５モル％、好ましくは２〜８０モル％、より好ましくは４〜６０モル％、更に好ましくは５〜４０モル％である。含有量が１モル％未満であると、ゼータ電位が小さくなりリポソームの安定性が低くなり、また、実用上十分なレベルにＣＴＬを活性化することが困難となる。一方、含有量が８５モル％を超えると、結果として、リポソーム中のペプチド結合リン脂質の含有量が低下し、実用上十分なレベルにＣＴＬを活性化することが困難となる。
【００５３】
中性リン脂質の含有量は、通常０．０１〜８０モル％、好ましくは０．１〜７０モル％、より好ましくは０．１〜６０モル％、更に好ましくは０．１〜５０モル％である。含有量が８０．０モル％を越えると、リポソーム中に含まれる酸性リン脂質、ペプチド結合リン脂質及びリポソームの安定化剤の含有量が低下し、実用上十分なレベルにＣＴＬを活性化することが困難となる。
【００５４】
ペプチドが結合したリン脂質は、前記の反応性リン脂質にペプチドが結合して得られるもので、反応性リン脂質がペプチドと結合する割合は、本発明の効果を妨げない範囲において、結合に用いる官能基の種類、結合処理条件等を適宜実施して選択することができる。例えば、ジアシルホスファチジルエタノールアミンの末端アミノ基に２価反応性化合物であるジサクシンイミジルサクシネートの片末端を結合して得たジアシルホスファチジルエタノールアミンの末端変性体を反応性リン脂質として用いる場合、結合処理諸条件の選択によって反応性リン脂質の１０〜９９％をペプチドと結合することができる。この場合、ペプチドと結合していない反応性リン脂質は、酸性リン脂質となってリポソーム中に含有される。
【００５５】
本発明のペプチド結合リポソームの好ましい態様としては、以下の組成を挙げることが出来る：
（Ｉ）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する酸性リン脂質  １〜８５モル％；
（ＩＩ）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する中性リン脂質  ０．０１〜８０モル％；
（ＩＩＩ）上記ペプチドから選択される少なくとも１種が結合した、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質  ０．２〜８０モル％；
（ＩＶ）安定化剤  ０．２〜７５モル％。
（合計  １００モル％）
【００５６】
本発明のペプチド結合リポソームに用いられるリポソームのより好ましい態様としては、以下の組成を挙げることが出来る：
上記成分（Ｉ）２〜８０モル％
上記成分（ＩＩ）０．１〜７０モル％
上記成分（ＩＩＩ）０．３〜６０モル％
上記成分（ＩＶ）１０〜７０モル％
（合計  １００モル％）
【００５７】
本発明のペプチド結合リポソームに用いられるリポソームの更に好ましい態様としては、以下の組成を挙げることが出来る：
上記成分（Ｉ）４〜６０モル％
上記成分（ＩＩ）０．１〜６０モル％
上記成分（ＩＩＩ）０．４〜５０モル％
上記成分（ＩＶ）２０〜６０モル％
（合計  １００モル％）
【００５８】
本発明のペプチド結合リポソームに用いられるリポソームのとりわけ好ましい態様としては、以下の組成を挙げることが出来る：
上記成分（Ｉ）５〜４０モル％
上記成分（ＩＩ）０．１〜５０モル％
上記成分（ＩＩＩ）０．５〜２５モル％
上記成分（ＩＶ）２５〜５５モル％
（合計  １００モル％）
【００５９】
本発明のペプチド結合リポソームに用いられるリポソーム中のリン脂質に含まれる不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の炭素数が１４〜２４であることを特徴とするが、本発明の効果を妨げない範囲で、炭素数が１４未満又は２４を超える不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基を含むリン脂質を含んでいても差支えない。本発明のペプチド結合リポソームに用いられるリポソーム中のリン脂質に含まれる全ての不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の合計数に対して、炭素数が１４〜２４である不飽和アシル基又は不飽和炭化水素基の数の割合は、例えば５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７５％以上、更に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９７％以上（例えば実質的に１００％）である。
【００６０】
本発明のペプチド結合リポソームに用いられるリポソームは、本発明の効果を妨げない限り、炭素数が１４〜２４の範囲のアシル基又は炭化水素基を有する、リン脂質以外の脂質を含んでもよい。該脂質の含有量は、通常は４０モル％以下であり、好ましくは２０モル％以下、より好ましくは１０モル％以下、更に好ましくは５モル％以下（例えば実質的に０モル％）である。
【００６１】
本発明に用いられるリポソームは、構成成分であるリン脂質、反応性リン脂質、安定化剤、ペプチド等を用い、適宜配合や加工を行い、これを適当な溶媒に添加するなどの方法で得ることができる。例えば、エクスツルージョン法、ボルテックスミキサー法、超音波法、界面活性剤除去法、逆相蒸発法、エタノール注入法、プレベシクル法、フレンチプレス法、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルジョン法、アニーリング法、凍結融解法などの製造方法が挙げられる。リポソームの粒径は特に限定されるものではないが、保存安定性などの点から、粒径は２０〜６００ｎｍが挙げられ、好ましくは３０〜５００ｎｍ、次に好ましくは４０〜４００ｎｍであり、更に好ましくは、５０〜３００ｎｍであり、最も好ましくは７０〜２３０ｎｍである。
【００６２】
なお、本発明においては、リポソームの物理化学的安定性を向上させるために、リポソーム調製過程又は調製後に、リポソームの内水相及び／又は外水相に、糖類又は多価アルコール類を添加しても良い。特に、長期保存あるいは製剤化途上での保管が必要な場合には、リポソームの保護剤として、糖あるいは多価アルコールを添加・溶解し、凍結乾燥により水分を除いてリン脂質組成物の凍結乾燥物とすることが好ましい。
【００６３】
糖類としては、例えばグルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース等の単糖類；サッカロース、ラクトース、セロビオース、トレハロース、マルトース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース等の三糖類；シクロデキストリン等のオリゴ糖；デキストリン等の多糖類；キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等の糖アルコールなどが挙げられる。これらの糖類の中では単糖類又は二糖類が好ましく、中でもグルコース又はサッカロースが入手性などの点からより好ましく挙げられる。
【００６４】
多価アルコール類としては、例えば、グリセリン、ジグリセリン、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、ヘキサグリセリン、ヘプタグリセリン、オクタグリセリン、ノナグリセリン、デカグリセリン、ポリグリセリンなどのグリセリン系化合物；ソルビトール、マンニトールなどの糖アルコール系化合物；エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ペンタエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ヘプタエチレングリコール、オクタエチレングリコール、ノナエチレングリコールなどが挙げられる。このうち、グリセリン、ジグリセリン、トリグリセリン、ソルビトール、マンニトール、分子量４００〜１０，０００のポリエチレングリコールが入手性の点から好ましく挙げられる。リポソームの内水相及び／又は外水相に含ませる、糖類あるいは多価アルコール類の濃度は、リポソーム液に対する重量濃度で、例えば１〜２０重量％が挙げられ、好ましくは２〜１０重量％が挙げられる。
【００６５】
本発明のペプチド結合リポソームを製造する場合、ペプチドを結合させる前のリポソームを作製した後、ペプチドを結合させることにより簡便にペプチド結合リポソームを得ることができる。例えば、リン脂質、安定化剤及び膜表面にペプチドを結合するための反応性リン脂質を含有したリポソーム、例えばリポソーム液を調製し、その外水相に前記の糖類の一つであるスクロースを２〜１０重量％程度加えて溶解する。この糖添加製剤を１０ｍｌガラス製バイヤルに移して棚段式凍結乾燥機内に置き、−４０℃等に冷却して試料を凍結した後、常法により凍結乾燥物を得る。ここで得たリポソームの凍結乾燥物は、水分が取り除かれているため長期の保存が可能であり、必要時に特定のペプチドを加えて後の工程を実施することにより、本発明のペプチド結合リポソームを簡便に迅速に得ることができる。ペプチドとリポソームの相互作用が強く不安定性が強い場合などは、このようにリポソームの凍結乾燥物の段階で保存し、必要な際にペプチドを結合して用いると非常に簡便である。
【００６６】
本発明のペプチド結合リポソームに用いられるリポソームは、ペプチドが結合したリン脂質を有し得る。ペプチドが結合したリン脂質を含有するリポソームを得る方法としては、次の（Ａ）及び（Ｂ）による方法が挙げられる。
（Ａ）リン脂質、反応性リン脂質、安定化剤を含有するリポソームを調製し、これにペプチド及び２価反応性化合物を添加し、リポソーム中に含有される反応性リン脂質の官能基と、ペプチドの官能基とを、２価反応性化合物を介して連結する。ここで用いることができる２価反応性化合物は、反応性リン脂質の末端変性体調製において用いたものを同様に用いることができる。具体的には、アルデヒド基を有する２価反応性化合物として、グリオキサール、グルタルアルデヒド、サクシンジアルデヒド、テレフタルアルデヒドなどが挙げられる。好ましくは、グルタルアルデヒドが挙げられる。更に、コハク酸イミド基を有する２価反応性化合物として、ジチオビス（サクシンイミジルプロピオネート）、エチレングリコール−ビス（サクシンイミジルサクシネート）、ジサクシンイミジルサクシネート、ジサクシンイミジルスベレート、又はジサクシンイミジルグルタレートなどが挙げられる。また、片末端にサクシンイミド基、もう一方の片末端にマレイミド基を有する２価反応性化合物として、Ｎ−サクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、スルホサクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−サクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート、Ｎ−サクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）プロピオネート、サクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドエチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホサクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドエチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）サクシンイミド、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド等を使用することが出来る。かかる２価反応性化合物を使用すると、官能基としてマレイミド基を有する反応性リン脂質（例えばホスファチジルエタノールアミン）の末端変性体が得られる。
（Ｂ）リン脂質、反応性リン脂質、安定化剤を含有するリポソームを調製し、これにペプチドを添加し、リポソームに含まれる反応性リン脂質の官能基と、ペプチドの官能基を連結して結合させる方法。
【００６７】
前記（Ａ）及び（Ｂ）における結合の種類としては、例えば、イオン結合、疎水結合、共有結合等が挙げられるが、好ましくは共有結合である。更に共有結合の具体例としては、シッフ塩基結合、アミド結合、チオエーテル結合、エステル結合などが挙げられる。以上の２つの方法いずれとも、リポソームに含まれる反応性リン脂質にペプチドを結合することができ、リポソーム中にペプチドを結合したリン脂質が形成される。
【００６８】
前記の（Ａ）の方法において、原料となるリポソームとペプチドとを２価反応性化合物を介して結合させる方法の具体例としては、例えば、シッフ塩基結合を利用する方法が挙げられる。シッフ塩基結合を介してリポソームとペプチドとを結合する方法としては、アミノ基を表面に有するリポソームを調製し、ペプチドをリポソームの懸濁液に添加し、次に、２価反応性化合物としてジアルデヒドを加え、リポソーム表面のアミノ基とペプチド中のアミノ基とをシッフ塩基を解して結合する方法を挙げることができる。
【００６９】
この結合手順の具体例としては、例えば、次の方法が挙げられる。
（Ａ−１）アミノ基を表面に有するリポソームを得るために、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する反応性リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）をリポソーム原料脂質（リン脂質、リポソームの安定化剤等）中に混合して、アミノ基がリポソーム表面に所定量存在するリポソームを作成する。
（Ａ−２）前記リポソーム懸濁液に、ペプチドを添加する。
（Ａ−３）次に、２価反応性化合物としてグルタルアルデヒドを加えて、所定の時間反応させてリポソームとペプチドとの間にシッフ塩基結合を形成する。
（Ａ−４）その後、余剰のグルタルアルデヒドの反応性を失活させるため、アミノ基含有水溶性化合物としてグリシンをリポソーム懸濁液に加えて反応させる。
（Ａ−５）ゲルろ過、透析、限外ろ過、遠心分離などの方法により、リポソームに未結合のペプチド、グルタルアルデヒドとグリシンとの反応産物、及び余剰のグリシンを除去して、ペプチド結合リポソーム懸濁液を得る。
【００７０】
前記の（Ｂ）の方法の具体例としては、アミド結合、チオエーテル結合、シッフ塩基結合、エステル結合などを形成することのできる官能基を有する反応性リン脂質をリン脂質膜に導入する方法が挙げられる。このような官能基の具体例としては、サクシンイミド基、マレイミド基、アミノ基、イミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基などが挙げられる。リポソームに導入する反応性リン脂質の例としては、前記の不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する反応性リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）のアミノ基末端の末端変性物を用いることができる。
【００７１】
この結合手順の具体例として、ジアシルホスファチジルエタノールアミンを用いた場合を例にとって、以下説明する。
（Ｂ−１）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基を有するジアシルホスファチジルエタノールアミンとジサクシンイミジルサクシネートを公知の方法で片末端のみ反応させて、官能基としてサクシンイミド基を末端に有するジサクシンイミジルサクシネート結合ジアシルホスファチジルエタノールアミンを得る。
（Ｂ−２）前記ジサクシンイミジルサクシネート結合ジアシルホスファチジルエタノールアミンと他のリポソーム構成成分（リン脂質、安定化剤等）とを公知の方法で混合し、表面に官能基としてサクシンイミド基を有するリポソーム組成物を作成する。
（Ｂ−３）前記リポソーム組成物懸濁液に、ペプチドを加え、ペプチド中のアミノ基と、リン脂質膜表面のサクシンイミド基とを反応させる。
（Ｂ−４）未反応のペプチド、反応副生物等を、ゲルろ過、透析、限外ろ過、遠心分離などの方法により除去して、ペプチド結合リン脂質を含有するリポソーム懸濁液を得る。
【００７２】
リポソームとペプチドとを結合する場合、官能基として含有されることが多いアミノ基又はチオール基を対象とすることが実用上好ましい。アミノ基を対象とする場合には、サクシンイミド基と反応させることによりシッフ塩基結合を形成させることが出来る。チオール基を対象とする場合には、マレイミド基と反応させることによりチオエーテル結合を形成させることが出来る。
【００７３】
本発明における抗原提示細胞は、細胞表面抗原ＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて１種又は２種以上のペプチドと接触させることにより調製された細胞である。細胞は、自己由来及び／又は同種由来の細胞であることが好ましい。また、細胞としては、細胞表面抗原ＨＬＡ−Ａ２（例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１）を発現する細胞が挙げられる。好ましいものは、リンパ系単核細胞（Ｔ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、樹状細胞など）であり、さらに好ましくは、樹状細胞である。
【００７４】
本発明の抗原提示細胞は、対象に投与（注入）することによって、ＳＡＲＳコロナウイルス特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの誘導剤、及び／又は、ＳＡＲＳコロナウイルスの感染を治療又は予防するためのワクチンとして使用することができる。すなわち本発明の抗原提示細胞は本発明のペプチドを細胞表面に提示するものであり、ＣＴＬを強く誘導することができることから、ＳＡＲＳコロナウイルスの排除を目的としたＣＴＬ誘導剤及び／又はワクチンとして使用することができる。抗原提示細胞は細胞数１０７あたり、好ましくは１〜１００μＭ、より好ましくは５〜５０μＭ、例えば、１０μＭのペプチドを用いて調製したものであることが好ましい。
【００７５】
本発明のペプチド、ペプチド結合リポソーム及び抗原提示細胞は、ＳＡＲＳコロナウイルス特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの誘導剤、及び／又は、ＳＡＲＳコロナウイルスの感染を治療又は予防するためのワクチンとして用いることができる。対象はヒトを含めた任意の動物であってよい。特定の実施形態では、対象はヒトである。本発明の誘導剤及び／又はワクチンは、有効成分とされる物質の性状に応じた一般的な医薬組成物の形態とし、組成物の直接送達は、一般に非経口的注射（例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、組織の間隙の空間への注射等）によって達成される。他の投与法としては、粘膜投与（例えば、経口、経鼻、また肺）、眼を通じた投与、経皮的投与及び坐剤が挙げられる。
【００７６】
すなわち、非経口的に投与する場合には、注射剤、経鼻剤、局所投与剤（経皮剤等）、直腸投与剤等の投与形態で投与することができる。経口的に投与する場合、通常当分野で用いられる投与形態で投与することができる。注射剤としては、例えば無菌の溶液又は懸濁液、乳剤等が挙げられ、具体的には水、水−プロピレングリコール溶液、緩衝化液、０．４％の生理食塩水等が挙げられる。さらに液状製剤とした場合は凍結保存、又は、凍結乾燥等により水分を除去して保存することができる。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。局所投与剤としては、例えばクリーム、軟膏、ローション、経皮剤等が挙げられる。経口剤又は直腸投与剤としては、例えばカプセル、錠剤、ピル、散剤、ドロップ、座剤、液剤等が挙げられる。
【００７７】
以上の剤形は通常当分野で行われている手法により、薬学的に許容される賦形剤、添加剤と共に製剤化される。薬学的に許容される賦形剤、添加剤としては、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤、ｐＨ調節剤、張度調節剤、浸潤剤等が挙げられる。また、薬学的に許容される担体としては、例えば炭酸マグネシウム、ラクトース、ぺクチン、澱粉、メチルセルロース等が挙げられる。
【００７８】
本発明のペプチド、ペプチド結合リポソーム又は抗原提示細胞を有効成分として含有する誘導剤、並びに、本発明のペプチド、ペプチド結合リポソーム又は抗原提示細胞を有効成分として含有するワクチンは、その効果を増強するため、アジュバンドをさらに含有してもよい。アジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲル、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント、ポリ（Ｉ，Ｃ）、ＣｐＧ−ＤＮＡ等が挙げられる。中でも、ＣｐＧ−ＤＮＡが好ましい。ＣｐＧ−ＤＮＡは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡであり、樹状細胞を活性化することにより、本発明のペプチド、ペプチド結合リポソーム又は抗原提示細胞によるＣＴＬ誘導を増強することができる。
【００７９】
製剤中の本発明のペプチドの投与量、製剤の投与回数は症状、年齢、体重、投与形態等によって異なるが、通常０．０１μｇ〜１ｍｇ、好ましくは０．１μｇ〜５００μｇ、より好ましくは１．０μｇ〜１００μｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。例えば、初期免疫（すなわち、治療的又は予防的投与）では成人患者に関して１．０μｇ〜５００μｇのペプチドを投与し、患者の血液における特異的なＣＴＬ活性の測定による患者の応答及び状態に応じて、数週間から数ヶ月にわたるブースティング療法に従う１．０μｇ〜１００μｇのペプチドのブースティング投与がそれに続く。また、本発明の抗原提示細胞の投与細胞数は、好ましくは１０９〜１０６個、より好ましくは１０８〜１０７個であるが、症状、年齢、体重、投与形態等により適宜調整することができる。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限するものではない。【００８１】
（実施例１：ＣＴＬエピトープの予測）
２種類のエピトープ予測コンピュータソフトＢＩＭＡＳ（ＵＲＬ：http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/）及びＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ＵＲＬ：http://www.syfpeithi.de/）を用いて、ｐｐ１ａのエピトープ候補を検索した。ＨＬＡ分子：ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、及び、ペプチド長：９〜１０アミノ酸残基を対象として検索した中から、２種類の解析方法の両方において高い予測スコアを示すエピトープ候補ペプチドを３０種類選抜した。これら３０種類のエピトープ候補ペプチドのアミノ酸配列を表１に示す。３０種類のエピトープ候補ペプチドについて、それぞれ合成ペプチドを作製し、実際にエピトープとして機能し得るペプチドを検索し、同定した９種類のエピトープペプチドの機能をさらに解析するために以下の実施例１〜６を行った。【００８２】
【表１】
2010061919.tif 000002
【００８３】
（実施例２：ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子への結合アフィニティの測定）
表１に挙げた３０種類のエピトープ候補ペプチドについて、主要組織適合抗原複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣ）クラスＩ分子であるＨＬＡ−Ａ＊０２０１への結合アフィニティを測定した。測定には、ヒトリンパ球系細胞株であるＴ２細胞を用いた。Ｔ２細胞は、ＴＡＰ遺伝子の欠失により自己抗原由来の自己ペプチドが輸送できないため、ペプチドを結合しないＨＬＡ−Ａ＊０２０１を細胞表面に発現する。細胞外部に添加したペプチドがＨＬＡ−Ａ＊０２０１に結合すると、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１複合体を形成し、安定化する。この原理を利用し、形成されたＨＬＡ−Ａ＊０２０１複合体量と添加したペプチドの濃度との関係から結合アフィニティを算出した。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１複合体を検出する抗体として、抗ＨＬＡ−Ａ２モノクローナル抗体ＢＢ７．２（ＡＴＣＣ）を用いた。また、Ｃ型肝炎ウイルスのエピトープ（ＮＳ３−１５８５）をコントロールとして用いた。【００８４】
具体的には、Ｔ２細胞を種々の濃度のペプチドと共に３７℃で一晩インキュベーションした。その後、抗ＨＬＡ−Ａ２抗体ＢＢ７．２と反応させ、次に、ＦＩＴＣ標識した二次抗体を反応させた細胞をフローサイトメトリーにより解析した。ＮＳ３−１５８５をパルスしたＴ２細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を基準（１００％）とし、それぞれのペプチドについて５０％の平均蛍光強度を示すペプチド濃度をＢＬ５０（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｅｖｅｌ）として表２に示した。ＢＬ５０が１００μＭ未満、１００〜２００μＭ、及び、２００μＭよりも高い場合をそれぞれ結合アフィニティが“Ｈｉｇｈ”、“Ｍｅｄｉｕｍ”、及び、“Ｌｏｗ”の３段階に分類したところ、高い結合アフィニティを示すペプチドが２４種類存在した。【００８５】
【表２】
2010061919.tif 000003
【００８６】
（実施例３：ペプチドをパルスした抗原提示細胞を用いて免疫したマウスにおけるペプチド特異的ＣＴＬの誘導）
表１に挙げた３０種類のエピトープ候補ペプチドについて、ペプチド特異的にＣＴＬが誘導されるか否かを調べるため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにてペプチドをパルスしたマウス脾臓細胞でマウスに免疫し、その脾臓細胞をペプチドで刺激した後、ＣＴＬ誘導活性を測定した。マウスには、マウスＭＨＣクラスＩとβ２−マイクログロブリン(β２−ｍ)をノックアウトしたマウスにヒトＭＨＣクラスＩの一つであるＨＬＡ−Ａ＊０２０１とヒトβ２−ｍ遺伝子を導入したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス（ＨＤＤ  ＩＩマウス、パスツール研究所、フランス；Ｄｒ．Ｆ．Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒより供与された）を用いた。ＣＤ８陽性細胞においてインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生が亢進した細胞の割合を指標として、ＣＴＬ誘導活性を測定した。【００８７】
ナイーブなＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスから調製した脾臓細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて各ペプチド１０μＭと共に３７℃、１時間インキュベートした。ペプチドでパルスした脾臓細胞を別個体のナイーブなＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスに静脈注射して免疫した。【００８８】
免疫１週間後、免疫したマウスから脾臓細胞を調製し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む培地に懸濁して、９６ウェルプレートの１ウェル当たりの細胞数が２ｘ１０６細胞となるように撒いた。そして、それぞれのウェルに各ペプチド（終濃度１０μＭ）と、２５倍希釈したＧｏｌｇｉＰｌｕｓＴＭ溶液（日本ＢＤ）を５μＬとを添加して３７℃、５時間インキュベートした。ここで、ＧｏｌｇｉＰｌｕｓＴＭは、細胞内の輸送をとめることで、産生したＩＦＮ−γの分泌を阻害するために用いた。細胞を洗浄後、細胞表面のＦｃ受容体をブロックすることにより非特異的反応を抑えるために、１００μＬのＦＡＣＳバッファー（２％ＦＣＳ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）に懸濁した１０６細胞当たり１μｇのＦｃＢｌｏｃｋ抗体（日本ＢＤ）を添加し、４℃、１０分間インキュベートした。【００８９】
次に、ＣＤ８陽性細胞検出のため、細胞懸濁液にフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ＣＤ８抗体を０．５μｇ添加し、４℃、３０分間インキュベートした後、細胞を２回洗浄して染色した。更に、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を用いて、次の手順で細胞内のＩＦＮ−γを染色した。まず、細胞を１ウェル当たり１００μＬのＣｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍＴＭ溶液（日本ＢＤ）を添加し、４℃、２０分間静置して細胞を固定、細胞膜を浸透化した。細胞を２回洗浄した後に回収した。次に、フィコエリスリン（ＰＥ）標識抗ＩＦＮ−γ抗体を０．５μｇ添加し、４℃、３０分間インキュベートした。細胞を洗浄後、１００μＬのＦＡＣＳ  ｆｉｘバッファー（２％ＦＣＳ、０．１％アジ化ナトリウム及び１％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ）に懸濁し、フローサイトメトリー解析に呈した。【００９０】
それぞれのエピトープ候補ペプチドについて、ＣＤ８陽性細胞内ＩＦＮ−γ陽性細胞の割合（％）を表３に示す。【００９１】
【表３】
2010061919.tif 000004
【００９２】
その結果、３０種類の候補ペプチドのうち、９種類のペプチド（ｐｐ１ａ−２１８７、ｐｐ１ａ−２２０７、ｐｐ１ａ−２３４０、ｐｐ１ａ−２５４６、ｐｐ１ａ−２７５５、ｐｐ１ａ−２９９０、ｐｐ１ａ−３４４４、ｐｐ１ａ−３６８７及びｐｐ１ａ−３７０９；配列番号１０，１１，１２，１３，１５，１７，１８，２３及び２４）で、有意にＣＤ８陽性細胞内ＩＦＮ−γ陽性細胞を誘導したので、これら９種類のペプチドをエピトープと決定した。その中には、実施例２においてＨＬＡ−Ａ＊０２０１への結合アフィニティが低いもの（ｐｐ１ａ−２２０７及びｐｐ１ａ−２３４０）及び中程度のもの（ｐｐ１ａ−２７５５）が含まれていた。【００９３】
（実施例４：リポソーム及びペプチド結合リポソームの調整）
実施例３において特に高いＣＴＬ誘導活性を示した９種類のＣＴＬエピトープペプチド（ｐｐ１ａ−２１８７、ｐｐ１ａ−２２０７、ｐｐ１ａ−２３４０、ｐｐ１ａ−２５４６、ｐｐ１ａ−２７５５、ｐｐ１ａ−２９９０、ｐｐ１ａ−３４４４、ｐｐ１ａ−３６８７及びｐｐ１ａ−３７０９；配列番号１０，１１，１２，１３，１５，１７，１８，２３及び２４）について、以下の方法により、ペプチド結合リポソームを調製した。また、同様の方法で、ヘルパーペプチド（アミノ酸配列：ＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬ；配列番号３２）を結合させたリポソームを調製した。なお、ヘルパーペプチドとして、Ｄｒ．Ａ．Ｓｅｔｔｅら（Ｇｌｅｎｎ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６２：３９１５−３９２５（１９９９）等）によって使用されているＨＢＶ  ｃｏｒｅ  １２８ヘルパーペプチドに基づき合成したもの（Ｏｐｅｒｏｎ社）を用いた。【００９４】
（４−１）末端変性ホスファチジルエタノールアミンからなる反応性リン脂質（サクシンイミジル基−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）の合成
ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン２ｇ及びトリエチルアミン１８０μｌをクロロホルム５０ｍｌに溶解及び添加し、３００ｍｌ容の４つ口フラスコに入れた。このフラスコをマグネットスターラーで室温で攪拌しつつ、別に調製した２価反応性化合物であるジサクシンイミジルスベレート３ｇをクロロホルム８０ｍｌに溶解した溶液を、常法に従って４時間にわたって滴下し、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基にジサクシンイミジルスベレートの片末端を反応させた。この粗反応溶液をナス型フラスコに移し、エバポレーターによって溶媒を留去した。次に、このフラスコに粗反応物を溶解できるだけのクロロホルムを少量加えて高濃度粗反応物溶液を得、クロロホルム／メタノール／水（６５／２５／１、体積比）で平衡化したシリカゲルを用いて常法に従ってカラムクロマトグラフィーを行い、目的のジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基にジサクシンイミジルスベレートの片末端が結合した画分のみを回収し、溶媒を留去して目的のサクシンイミジル基−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを得た。【００９５】
（４−２）脂質混合粉末の調製
ジオレオイルホスファチジルコリン１．３３５４ｇ（１．６９８７ｍｍｏｌ）、実施例４−１において調整したサクシンイミジル基−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン０．２８８６ｇ（０．２８３１ｍｍｏｌ）、コレステロール０．７６６３ｇ（１．９８１８ｍｍｏｌ）及びジオレオイルホスファチジルグリセロールナトリウム塩０．４５１３ｇ（０．５６６２ｍｍｏｌ）をナス型フラスコに取り、クロロホルム／メタノール／水（６５／２５／４、体積比）混合溶剤５０ｍｌを入れ、４０℃にて溶解した。次に、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶剤を留去し、脂質の薄膜を作製した。さらに、注射用蒸留水を３０ｍｌ添加し、攪拌して均一のスラリーを得た。このスラリーを凍結させ、凍結乾燥機にて２４時間乾燥させ脂質混合粉末を得た。【００９６】
（４−３）リポソームの調製
次に、別途作製した緩衝液Ａ（１．０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、０．２５Ｍ  サッカロース、ｐＨ７．４）６０ｍｌを上記脂質混合粉末の入ったナス型フラスコ内に入れ、４０℃にて攪拌しながら脂質を水和させ、リポソームを得た。次に、エクストルーダーを用いてリポソームの粒径を調整した。まず、８μｍのポリカーボネートフィルターを通過させ、続いて５μｍ、３μｍ、１μｍ、０．６５μｍ、０．４μｍ及び０．２μｍの順にフィルターを通過させた。その結果、リポソーム粒子の平均粒径２０６ｎｍ（動的光散乱法による測定）が得られた。【００９７】
（４−４）ペプチド結合リポソームの調製
実施例４−３において得られたリポソーム１．５ｍｌを試験管に採取し、別に調製した３ｍｌの各ペプチド溶液（１．２５ｍＭ）／緩衝液Ａを加えた後、５℃で４８時間穏やかに攪拌し反応させた。この反応液を、緩衝液Ａで平衡化したＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂを用いて常法に従ってゲル濾過した。なお、リポソーム画分は白濁しているので、目的画分は容易に認識できるが、ＵＶ検出器等で確認しても良い。ここで得られたリポソーム懸濁液中のリン濃度を測定し（リン脂質テスト、Ｗａｋｏ）リン脂質由来のリン濃度を２ｍＭとなるように緩衝液Ａで希釈調整し、各ペプチド結合リポソームの懸濁液を得た。【００９８】
（実施例５：ペプチド結合リポソームを用いて免疫したマウスにおけるペプチド特異的ＣＴＬの誘導）
実施例３において特に高いＣＴＬ誘導活性を示した９種類のＣＴＬエピトープペプチド（ｐｐ１ａ−２１８７、ｐｐ１ａ−２２０７、ｐｐ１ａ−２３４０、ｐｐ１ａ−２５４６、ｐｐ１ａ−２７５５、ｐｐ１ａ−２９９０、ｐｐ１ａ−３４４４、ｐｐ１ａ−３６８７及びｐｐ１ａ−３７０９；配列番号１０，１１，１２，１３，１５，１７，１８，２３及び２４）について、ペプチド結合リポソームを用いて免疫したマウスにおけるＣＴＬ誘導活性を測定した。【００９９】
実施例４において調製したペプチド結合リポソーム（２５μｌ）、ヘルパーペプチド結合リポソーム（２５μｌ）及びＣｐＧモチーフをもつオリゴ核酸（５μｇ、塩基配列：５’−ｔｃｃａｔｇａｃｇｔ  ｔｃｔｇａｔｇｔｔ−３’；配列番号３３）を混合して得られた免疫溶液をナイーブなＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの足蹠（ｆｏｏｔ  ｐａｄ）に免疫した。免疫後１週間飼育し、その後は実施例３と同じ方法によりＣＴＬ誘導活性を測定した。なお、コントロールとして、ペプチド結合リポソームの代わりにペプチドを結合していないリポソームを用いた。ＣｐＧモチーフをもつオリゴ核酸として、Ｎａｇａｔａ．  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５：４９１４−４９２１（２００７）を基に、遺伝子合成したもの（北海道システムサイエンス株式会社）を用いた。【０１００】
ペプチド結合リポソームを用いて免疫したマウスにおけるフローサイトメトリーによるＣＤ８とＩＦＮ−γの染色プロットを図１に示す。各グラフの右上枠内の各ドットが、ＣＤ８陽性細胞内ＩＦＮ−γ陽性細胞に相当し、枠内の数値がＣＤ８陽性細胞内ＩＦＮ−γ陽性細胞の割合（％）を示す。その結果、含むペプチド結合リポソームを免疫することにより、ＣＴＬ誘導が引き起こされることが分かった。【０１０１】
（比較例）
実施例５の比較対照実験として、以下の実験を行った。ｐｐ１ａのＣＴＬエピトープペプチドの代わりにＳＡＲＳ−ＣｏＶのスパイクタンパク質のＣＴＬエピトープペプチド（ｓｐｉｋｅ−１２０３、アミノ酸配列：ＦＩＡＧＬＩＡＩＶ；配列番号３４）を用い、ナイーブなＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの大腿筋への筋肉注射によって免疫したこと以外は、実施例４と同じ手法でＣＴＬ誘導活性を測定した。【０１０２】
ｓｐｉｋｅ−１２０３ペプチド結合リポソームを用いて免疫したマウスにおけるフローサイトメトリーによるＣＤ８とＩＦＮ−γの染色プロットを図２に示す。解析の結果、これまでに知られているスパイクタンパク質のＣＴＬエピトープペプチド（ｓｐｉｋｅ−１２０３）を用いた場合のＣＤ８陽性細胞内ＩＦＮ−γ陽性細胞の割合（％）は０．２９であった。実施例４の結果と比較すると、ｐｐ１ａ由来の８種類のＣＴＬエピトープペプチド（ｐｐ１ａ−２１８７、ｐｐ１ａ−２２０７、ｐｐ１ａ−２３４０、ｐｐ１ａ−２５４６、ｐｐ１ａ−２７５５、ｐｐ１ａ−２９９０、ｐｐ１ａ−３６８７及びｐｐ１ａ−３７０９；配列番号１０，１１，１２，１３，１５，１７，２３及び２４）が、スパイクタンパク質のＣＴＬエピトープペプチドよりも高いＣＴＬ誘導活性を示すことが分かった。【０１０３】
（実施例６：ペプチド結合リポソームを使って免疫したマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＴＬアッセイ）
実施例４において高いＣＴＬ誘導活性を示した５種類のＣＴＬエピトープペプチド（ｐｐ１ａ−２１８７、ｐｐ１ａ−２３４０、ｐｐ１ａ−２７５５、ｐｐ１ａ−２９９０及びｐｐ１ａ−３７０９；配列番号１０，１２，１５，１７及び２４）について、ペプチド結合リポソームを用いて免疫したマウスのｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＴＬ応答活性を測定した。【０１０４】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＴＬ応答活性測定の原理は以下の通りである。ペプチドをパルスしていない標的細胞（ネガティブコントロール）を低濃度のｃａｒｂｏｘｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ（ＣＦＳＥ）で標識し、一方、ペプチドをパルスした標的細胞を高濃度（１０倍）のＣＦＳＥで標識する。２種類の細胞集団を同細胞数ずつ混ぜたものを、予めペプチド結合リポソームを用いて免疫したマウスに細胞移入する。その後、移入したマウスから脾臓細胞を回収して脾臓細胞懸濁液を調製し、フローサイトメトリー解析により、ＣＦＳＥ標識された移入細胞の比率を測定する。抗原ペプチドに対するＣＴＬ応答活性のないマウスでは等量のＣＦＳＥ標識された移入細胞が回収される。しかしながら、抗原ペプチドに対するＣＴＬ応答活性を有するマウスでは、抗原ペプチドで覆われた標的細胞が溶解されるため、フローサイトメトリーによって高ＣＦＳＥ標識細胞の減少を定量することによってｉｎ  ｖｉｖｏでの溶解度合いを測定できる。【０１０５】
具体的には、以下の手法により測定した。
予め、各ペプチドを用いて調製したペプチド結合リポソームをマウスに免疫し、ペプチド特異的ＣＴＬを誘導した移入用マウスを用意した。なお、コントロールとして、ペプチド結合リポソームの代わりにペプチドを結合していないリポソームで免疫したマウスを用いた。免疫の１週間後、別個体のナイーブマウスから脾臓細胞を調製し、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）  ２ｍＬ当たりの細胞数が２ｘ１０８細胞となるように懸濁して、２本のチューブにそれぞれ１ｍＬのアリコットを分取した。一方のチューブのみに終濃度１０μＭとなるようにペプチドを添加し、２本のチューブを３７℃、１〜２時間インキュベートした。細胞を１回洗浄した後、２０ｍＬのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡに懸濁し、短時間ボルテックスした。その後、ペプチドをパルスした細胞のチューブに１０μＬの５ｍＭ  ＣＦＳＥを添加し、すぐに、ペプチドとインキュベートしていない細胞のチューブに１μＬの５ｍＭ  ＣＦＳＥを添加して、両方のチューブをボルテックスにより懸濁し、３７℃のウォーターバスにて１０分間インキュベートした。両方の細胞集団を遠心して１回洗浄し、生細胞数をカウントした上で、それぞれの細胞集団を５ｘ１０７細胞／ｍＬとなるようにＨＢＳＳに懸濁した。各細胞懸濁液を等量ずつ混ぜて免疫溶液とし、予め免疫したマウスに細胞懸濁液２００μＬ（１ｘ１０７細胞／個体）を静脈注射することにより細胞移入した。移入から１２時間後、マウスから脾臓細胞を回収し、脾臓１個当たり１ｍＬのＰＢＳ／１％ＦＢＳ／５ｍＭ  ＥＤＴＡに脾臓細胞を懸濁した。遠心後、１ｍＬのＦＡＣＳ  ｆｉｘバッファーに懸濁し、この脾臓細胞懸濁液１００μＬを２ｍＬのＦＡＣＳバッファーで希釈した後、フローサイトメトリー解析に呈した。【０１０６】
ＣＦＳＥ標識された標的細胞を移入したマウスにおけるフローサイトメトリーによるＣＦＳＥの染色プロットを図３に示す。各グラフの一番右のピークがペプチドをパルスした細胞の集団を示し、右から二番目のピークがペプチドをパルスしていない細胞を示す。それぞれのＣＴＬエピトープペプチドにおいて、リポソームを免疫したコントロール（左のグラフ）に比べ、ペプチド結合リポソームを免疫したもの（右のグラフ）では、ペプチドをパルスした細胞数が減少していることがわかった。ＣＴＬによる標的細胞のペプチド特異的溶解率（％）は、それぞれｐｐ１ａ−２１８７：７９．２％、ｐｐ１ａ−２３４０：６８．５％、ｐｐ１ａ−２７５５：７０．５％、ｐｐ１ａ−２９９０：７３．４％及びｐｐ１ａ−３７０９：９６．３であり、いずれも高いＣＴＬ応答活性を持つことが明らかとなった。中でも、ｐｐ１ａ−３７０９は特に高いＣＴＬ応答活性を持つことが分かった。したがって、これらのＣＴＬエピトープペプチド（ｐｐ１ａ−２１８７、ｐｐ１ａ−２３４０、ｐｐ１ａ−２７５５、ｐｐ１ａ−２９９０及びｐｐ１ａ−３７０９；配列番号１０，１２，１５，１７及び２４）は、ＣＴＬ応答活性の高いドミナントペプチドであることが明らかとなった。
【図１】
2010061919.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【配列表】
2010061919000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年6月1日(2011.6.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２４，１０，１１，１２，１３，１５，１７，１８及び２３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
ペプチドがリポソームの表面に結合しているペプチド結合リポソームであって、
リポソームが、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質、及び、安定化剤を含有し、
ペプチドが、請求項１に記載のペプチドから選択される少なくとも１種である、
ペプチド結合リポソーム。
【請求項３】
前記リン脂質が、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基を有するリン脂質である、請求項２に記載のペプチド結合リポソーム。
【請求項４】
前記リン脂質が、オレオイル基を有するリン脂質である、請求項２に記載のペプチド結合リポソーム。
【請求項５】
前記リン脂質が、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、サクシンイミジル−ジアシルホスファチジルエタノールアミン、及び、マレイミド−ジアシルホスファチジルエタノールアミンから選ばれる少なくとも１つである、請求項２に記載のペプチド結合リポソーム。
【請求項６】
前記安定化剤がコレステロールである、請求項２に記載のペプチド結合リポソーム。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチドから選択される少なくとも１種が、リポソームに含まれる不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質に結合している、請求項２に記載のペプチド結合リポソーム。
【請求項８】
リポソームが以下の組成を有する、請求項２に記載のペプチド結合リポソーム：
（Ａ）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質  １〜９９．８モル％；
（Ｂ）安定化剤  ０．２〜７５モル％。
【請求項９】
以下の組成を有するペプチド結合リポソーム：
（Ｉ）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する酸性リン脂質  １〜８５モル％；
（ＩＩ）不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有する中性リン脂質  ０．０１〜８０モル％；
（ＩＩＩ）請求項１に記載のペプチドから選択される少なくとも１種が結合した、不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４のアシル基又は不飽和結合を１個有する炭素数１４〜２４の炭化水素基を有するリン脂質  ０．２〜８０モル％；
（ＩＶ）安定化剤  ０．２〜７５モル％。
【請求項１０】
細胞表面抗原ＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて請求項１に記載のペプチドから選択される少なくとも１種と接触させることにより調製された抗原提示細胞。
【請求項１１】
前記細胞が自己由来である請求項１０に記載の抗原提示細胞。
【請求項１２】
前記細胞が同種由来である請求項１０に記載の抗原提示細胞。
【請求項１３】
請求項１に記載のペプチドから選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、ＳＡＲＳコロナウイルス特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの誘導剤。
【請求項１４】
請求項１に記載のペプチドから選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、ＳＡＲＳコロナウイルスの感染を予防するためのワクチン。
【請求項１５】
請求項２〜９のいずれか一項に記載のペプチド結合リポソームを有効成分として含有する、ＳＡＲＳコロナウイルス特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの誘導剤。
【請求項１６】
請求項２〜９のいずれか一項に記載のペプチド結合リポソームを有効成分として含有する、ＳＡＲＳコロナウイルスの感染を予防するためのワクチン。
【請求項１７】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の抗原提示細胞を有効成分として含有する、ＳＡＲＳコロナウイルス特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの誘導剤。
【請求項１８】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の抗原提示細胞を有効成分として含有する、ＳＡＲＳコロナウイルスの感染を予防するためのワクチン。
【請求項１９】
ＣｐＧ−ＤＮＡをさらに含む、請求項１３又は１５に記載のＳＡＲＳコロナウイルス特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬの誘導剤。
【請求項２０】
ＣｐＧ−ＤＮＡをさらに含む、請求項１４又は１６に記載のＳＡＲＳコロナウイルスの感染を予防するためのワクチン。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
（実施例１：ＣＴＬエピトープの予測）
２種類のエピトープ予測コンピュータソフトＢＩＭＡＳ（ＵＲＬ：http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/）及びＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ＵＲＬ：http://www.syfpeithi.de/）を用いて、ｐｐ１ａのエピトープ候補を検索した。ＨＬＡ分子：ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、及び、ペプチド長：９〜１０アミノ酸残基を対象として検索した中から、２種類の解析方法の両方において高い予測スコアを示すエピトープ候補ペプチドを３０種類選抜した。これら３０種類のエピトープ候補ペプチドのアミノ酸配列を表１に示す。３０種類のエピトープ候補ペプチドについて、それぞれ合成ペプチドを作製し、実際にエピトープとして機能し得るペプチドを検索し、同定した９種類のエピトープペプチドの機能をさらに解析するために以下の実施例４及び５を行った。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
ＣＦＳＥ標識された標的細胞を移入したマウスにおけるフローサイトメトリーによるＣＦＳＥの染色プロットを図３に示す。各グラフの一番右のピークがペプチドをパルスした細胞の集団を示し、右から二番目のピークがペプチドをパルスしていない細胞を示す。それぞれのＣＴＬエピトープペプチドにおいて、リポソームを免疫したコントロール（左のグラフ）に比べ、ペプチド結合リポソームを免疫したもの（右のグラフ）では、ペプチドをパルスした細胞数が減少していることがわかった。ＣＴＬによる標的細胞のペプチド特異的溶解率（％）は、それぞれｐｐ１ａ−２１８７：７９．２％、ｐｐ１ａ−２３４０：６８．５％、ｐｐ１ａ−２７５５：７０．５％、ｐｐ１ａ−２９９０：７３．４％及びｐｐ１ａ−３７０９：９６．３％であり、いずれも高いＣＴＬ応答活性を持つことが明らかとなった。中でも、ｐｐ１ａ−３７０９は特に高いＣＴＬ応答活性を持つことが分かった。したがって、これらのＣＴＬエピトープペプチド（ｐｐ１ａ−２１８７、ｐｐ１ａ−２３４０、ｐｐ１ａ−２７５５、ｐｐ１ａ−２９９０及びｐｐ１ａ−３７０９；配列番号１０，１２，１５，１７及び２４）は、ＣＴＬ応答活性の高いドミナントペプチドであることが明らかとなった。
【国際調査報告】
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