(57)【要約】  若年性骨髄単球性白血病に対する新たな分子標的治療薬及びその用途を提供することを課題とする。ALKチロシンキナーゼ阻害剤又はJAK2チロシンキナーゼ阻害剤を含む、若年性骨髄単球性白血病治療薬が提供される。また、若年性骨髄単球性白血病を規定する新たな融合遺伝子が開示される。
2019039390.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ALKチロシンキナーゼ阻害剤又はJAK2チロシンキナーゼ阻害剤を含む、若年性骨髄単球性白血病治療薬。
【請求項２】
前記ALKチロシンキナーゼ阻害剤がALK及びROS1に対するチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項１に記載の若年性骨髄単球性白血病治療薬。
【請求項３】
前記ALKチロシンキナーゼ阻害剤がクリゾチニブ、アレクチニブ、セリチニブ又はTAE684である、請求項１に記載の若年性骨髄単球性白血病治療薬。
【請求項４】
前記JAK2チロシンキナーゼ阻害剤がルクソリチニブである、請求項１に記載の若年性骨髄単球性白血病治療薬。
【請求項５】
ALK又はROS1の融合遺伝子が陽性の患者に投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の若年性骨髄単球性白血病治療薬。
【請求項６】
他の薬剤と併用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の若年性骨髄単球性白血病治療薬。
【請求項７】
前記他の薬剤が抗がん剤である、請求項６に記載の若年性骨髄単球性白血病治療薬。
【請求項８】
以下のステップ(1)〜(3)を含む、若年性骨髄単球性白血病の検査方法：
(1)若年性骨髄単球性白血病患者から単離した白血病細胞を含む検体を用意するステップ；
(2)前記検体において、ALK又はROS1の融合遺伝子、又は該融合遺伝子がコードする融合タンパク質の存否を検出するステップ；
(3)前記融合遺伝子又は前記融合タンパク質が検出された場合、ALKチロシンキナーゼ阻害剤による治療に適合すると判定するステップ。
【請求項９】
若年性骨髄単球性白血病の原因としての、ALK又はROS1の融合遺伝子。
【請求項１０】
以下のステップ(i)〜(iii)を含む、若年性骨髄単球性白血病の治療に有効な物質のスクリーニング方法：
(i)ALK又はROS1の融合遺伝子を発現する細胞を用意するステップ；
(ii)試験物質の存在下、前記細胞を培養するステップ；
(iii)細胞の生存数又はコロニー数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ。
【請求項１１】
若年性骨髄単球性白血病の患者に対して、ALKチロシンキナーゼ阻害剤又はJAK2チロシンキナーゼ阻害剤を治療上有効量投与することを含む、若年性骨髄単球性白血病の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は若年性骨髄単球性白血病（JMML）の治療や診断等に有用な手段に関する。詳しくはJMML治療薬、JMMLに関わる新規融合遺伝子及びその用途等に関する。本出願は、２０１７年８月２５日に出願された日本国特許出願第２０１７−１６２３８９号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
若年性骨髄単球性白血病（JMML）は、骨髄単球系細胞の増殖、及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）に対する高感受性を特徴とする乳幼児及び小児期の稀な骨髄異形成/骨髄増殖性疾患（MDS/MPD）である（非特許文献１）。JMML症例の80％以上がPTPN11、NF1、NRAS、KRAS、CBLなどの古典的RAS経路関連遺伝子に、相互排他的に体細胞/生殖細胞系列変異を有することが特徴とされている（非特許文献２、３）。SETBP1（非特許文献４、５）及び他の遺伝子（非特許文献６、７）のセカンドヒット変異、遺伝子発現プロファイル（非特許文献８、９）、及びいくつかの遺伝子のプロモーター領域のメチル化プロファイル（非特許文献１０、１１）などが予後不良因子として同定されている。しかしながら、これらのバイオマーカー間の相互関係はいまだ明らかになっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Emanuel, P.D. Juvenile myelomonocytic leukemia. Curr Hematol Rep 3, 203-9 (2004).
【非特許文献２】Niemeyer, C.M. et al. Chronic myelomonocytic leukemia in childhood: a retrospective analysis of 110 cases. European Working Group on Myelodysplastic Syndromes in Childhood (EWOG-MDS). Blood 89, 3534-43 (1997).
【非特許文献３】Yoshida, N. et al. Correlation of clinical features with the mutational status of GM-CSF signaling pathway-related genes in juvenile myelomonocytic leukemia. Pediatr Res 65, 334-40 (2009).
【非特許文献４】Sakaguchi, H. et al. Exome sequencing identifies secondary mutations of SETBP1 and JAK3 in juvenile myelomonocytic leukemia. Nat Genet 45, 937-41 (2013).
【非特許文献５】Stieglitz, E. et al. Subclonal mutations in SETBP1 confer a poor prognosis in juvenile myelomonocytic leukemia. Blood 125, 516-24 (2015).
【非特許文献６】Caye, A. et al. Juvenile myelomonocytic leukemia displays mutations in components of the RAS pathway and the PRC2 network. Nat Genet 47, 1334-40 (2015).
【非特許文献７】Stieglitz, E. et al. The genomic landscape of juvenile myelomonocytic leukemia. Nat Genet 47, 1326-33 (2015).
【非特許文献８】Helsmoortel, H.H. et al. LIN28B overexpression defines a novel fetal-like subgroup of juvenile myelomonocytic leukemia. Blood 127, 1163-72 (2016).
【非特許文献９】Bresolin, S. et al. Gene expression-based classification as an independent predictor of clinical outcome in juvenile myelomonocytic leukemia. J Clin Oncol 28, 1919-27 (2010).
【非特許文献１０】Olk-Batz, C. et al. Aberrant DNA methylation characterizes juvenile myelomonocytic leukemia with poor outcome. Blood 117, 4871-80 (2011).
【非特許文献１１】Sakaguchi, H. et al. Aberrant DNA Methylation Is Associated with a Poor Outcome in Juvenile Myelomonocytic Leukemia. PLoS One 10, e0145394 (2015).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
JMMLの症例は、一般に、通常の化学療法に対して抵抗性であり、同種造血幹細胞移植が唯一の根治的治療であるが、5年全生存率は約50%と不良であり、新たな分子標的治療が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決すべく本発明者らは、150症例の検体（非常に稀な疾患であるJMMLの検体数としては世界的にも極めて多い）を収集し、全エキソームシークエンス、メチル化アレイ解析、RNAシークエンスを用いて包括的遺伝子解析を施行し、JMMLの新たな治療標的となる遺伝子変異の同定を目指した。その結果、３種類の融合遺伝子を同定することに成功した。JMMLでは70%以上の症例でPTPN11、NF1、NRAS、KRAS、CBLといったRAS経路関連遺伝子の体細胞あるいは生殖細胞系列の遺伝子変異（融合遺伝子の形成）を有することが知られているが、新たに同定された３種類の融合遺伝子は受容体型チロシンキナーゼ遺伝子の変異を伴うものであり、極めて特徴的である。この点において、当該３種類の融合遺伝子はJMMLの新たな治療標的となるものであり、その有用性ないし意義は大きい。また、受容体型チロシンキナーゼ遺伝子の変異を伴う融合遺伝子の存在を明らかにしたことは、JMMLに対する今後の治療戦略を立てる上で極めて重要な知見と評価できる。【０００６】
一方、ALKチロシンキナーゼ阻害剤であり、非小細胞肺がんの治療に使用されるクリゾチニブが、新たに同定された融合遺伝子陽性細胞の増殖をin vitroで抑制した。しかも、クリゾチニブは臨床的にも患者予後を改善した。極めて興味深いことに、クリゾチニブは融合遺伝子陰性のJMMLにおいても、同様に増殖抑制効果を示した。更なる検討の結果、クリゾチニブ以外のALKチロシンキナーゼ阻害剤にも腫瘍増殖抑制効果が認められた。これらの実験結果は、ALKチロシンキナーゼ阻害剤という、JMMLに対する既知の治療薬とは一線を画する薬剤がJMMLの有効な分子標的治療薬になり得ることを示す。【０００７】
更に検討を進める中、クリゾチニブがJAK2チロシンキナーゼに対しても阻害活性を示すことに注目し、JAK2チロシンキナーゼ阻害剤であるルクソリチニブの効果を調べた。その結果、ルクソリチニブにも腫瘍増殖抑制効果が認められた。この事実は、ALKチロシンキナーゼ阻害剤に加え、JAK2チロシンキナーゼ阻害剤もJMMLの分子標的治療薬になり得ることを示すものであり、治療戦略上、重要な意味をもつ。【０００８】
以下の発明は主として以上の知見及び考察に基づく。
［１］ALKチロシンキナーゼ阻害剤又はJAK2チロシンキナーゼ阻害剤を含む、若年性骨髄単球性白血病治療薬。
［２］前記ALKチロシンキナーゼ阻害剤がALK及びROS1に対するチロシンキナーゼ阻害剤である、［１］に記載の若年性骨髄単球性白血病治療薬。
［３］前記ALKチロシンキナーゼ阻害剤がクリゾチニブ、アレクチニブ、セリチニブ又はTAE684である、［１］に記載の若年性骨髄単球性白血病治療薬。
［４］前記JAK2チロシンキナーゼ阻害剤がルクソリチニブである、［１］に記載の若年性骨髄単球性白血病治療薬。
［５］ALK又はROS1の融合遺伝子が陽性の患者に投与される、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の若年性骨髄単球性白血病治療薬。
［６］他の薬剤と併用される、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の若年性骨髄単球性白血病治療薬。
［７］前記他の薬剤が抗がん剤である、［６］に記載の若年性骨髄単球性白血病治療薬。
［８］以下のステップ(1)〜(3)を含む、若年性骨髄単球性白血病の検査方法：
(1)若年性骨髄単球性白血病患者から単離した白血病細胞を含む検体を用意するステップ；
(2)前記検体において、ALK又はROS1の融合遺伝子、又は該融合遺伝子がコードする融合タンパク質の存否を検出するステップ；
(3)前記融合遺伝子又は前記融合タンパク質が検出された場合、ALKチロシンキナーゼ阻害剤による治療に適合すると判定するステップ。
［９］若年性骨髄単球性白血病の原因としての、ALK又はROS1の融合遺伝子。
［１０］以下のステップ(i)〜(iii)を含む、若年性骨髄単球性白血病の治療に有効な物質のスクリーニング方法：
(i)ALK又はROS1の融合遺伝子を発現する細胞を用意するステップ；
(ii)試験物質の存在下、前記細胞を培養するステップ；
(iii)細胞の生存数又はコロニー数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ。
［１１］若年性骨髄単球性白血病の患者に対して、ALKチロシンキナーゼ阻害剤又はJAK2チロシンキナーゼ阻害剤を治療上有効量投与することを含む、若年性骨髄単球性白血病の治療方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】150人の患者の臨床及び遺伝子プロファイル。各列は1人の患者を示しており、メチル化分析は150例中106例（71％）で施行された。JMML; 若年性骨髄単球性白血病、NS/MPD; ヌーナン症候群関連骨髄増殖性障害、LOH; ヘテロ接合性の喪失。
【図２】若年性骨髄単球性白血病（JMML）におけるチロシンキナーゼ融合遺伝子。（a-c）検出された融合タンパク質の構造。（a）UPN5で同定されたDCTN1-ALK、（b）UPN168で同定されたRANBP2-ALK、（c）UPN106で同定されたTBL1XR1-ROS1。MAM：MAMドメイン、LDL-R：低密度リポタンパク質受容体クラスAドメイン、TM：膜貫通ドメイン、TPR：テトラトリコペプチドリピートドメイン、RanBD1： Ran結合ドメイン、LisH：lis相同ドメイン、F-box like：F-box様ドメイン、FN TypeIII：フィブロネクチンIII型ドメイン。
【図３】RANBP2-ALK+CD34+細胞コロニー形成に対するクリゾチニブ（ALK/ROS1/MET阻害剤）の効果。RANBP2-ALKを有する患者由来の1×103個のCD34+細胞を、サイトカイン（+）または(-)の培地にクリゾチニブを0、20、80、200、500nM添加して、2週間培養した。（a）CFU-GMコロニーの顕微鏡的所見。（b、c）サイトカインを含む（b）、又は含まない（c）培地でのコロニーの数。CFU-GM：顆粒球マクロファージコロニー形成ユニット、BFU-E：赤芽球バースト形成ユニット。
【図４】RANBP2-ALK陽性患者へのクリゾチニブ投与と臨床経過。
【図５】コロニー形成に対するクリゾチニブの効果。(a)KRAS, p.G12A変異、（b）PTPN11, p.E76K突然変異、（c）CBLスプライス部位変異、（d）CBL, p.Y371H.変異。各変異陽性患者由来のCD34+細胞（培養あたり1×103）を用いて、サイトカイン（+）又は(-)の培地にクリゾチニブを0、200、500nM添加して2週間培養した。CFU-GM：顆粒球マクロファージコロニー形成ユニット。*, p <0.05; †, p <0.01。
【図６】JMMLの確立されたリスク因子間の相関。臨床的特徴、遺伝的変化、発現・メチル化プロファイル、並びに転帰の間の共起性及び排他性。灰色の線は、JMMLに関連する各要因を示し、丸は、交差した2つの因子が統計的有意に同時に起こる、あるいは排他的に起こることを示す。
【図７】PTPN11 p.D61V変異陽性且つCD34陽性細胞のコロニー形成に対する各種ALKチロシンキナーゼ阻害剤及びJAK2チロシンキナーゼ阻害剤の効果。PTPN11 p.D61V変異陽性且つCD34陽性細胞（1×103個）を、サイトカイン（+）または(-)の培地に各種ALKチロシンキナーゼ阻害剤（アレクチニブ、セリチニブ又はTAE684）又はJAK2チロシンキナーゼ阻害剤（ルクソリチニブ）を所定濃度で添加して、2週間培養した。（a）クリゾチニブ添加培地でのコロニー数、（b）アレクチニブ添加培地でのコロニー数、（c）セリチニブ添加培地でのコロニー数、（d）TAE684添加培地でのコロニー数、（e）ルクソリチニブ添加培地でのコロニー数。*, p <0.05; †, p <0.01
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．若年性骨髄単球性白血病（JMML）の治療
本発明の第１の局面は若年性骨髄単球性白血病（JMML）の治療薬及びその用途に関する。「治療薬」とは、標的の疾病ないし病態（即ちJMML）に対する治療的又は予防的効果を示す医薬のことをいう。治療的効果には、標的疾患／病態に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること（軽症化）、症状の悪化を阻止ないし遅延すること等が含まれる。後者については、重症化を予防するという点において予防的効果の一つと捉えることができる。このように、治療的効果と予防的効果は一部において重複する概念であり、明確に区別して捉えることは困難であり、またそうすることの実益は少ない。尚、予防的効果の典型的なものは、標的疾患／病態に特徴的な症状の再発を阻止ないし遅延することである。標的疾患／病態に対して何らかの治療的効果又は予防的効果、或いはこの両者を示す限り、標的疾患／病態に対する治療薬に該当する。
【００１１】
本発明はALKチロシンキナーゼ阻害剤がin vitro及びin vivoでJMMLに対して薬効を示したという、驚くべき事実に基づく。ALK（Anaplastic Lymphoma Kinase）は受容体型チロシンキナーゼであり、CD246とも呼ばれる。ALK遺伝子と他の遺伝子が融合したALK融合遺伝子（EML4-ALK、TFG-ALK、KIF5B-ALK等）は、非小細胞肺がんの一部の症例等に認められる。ALK融合遺伝子ではALKチロシンキナーゼが恒常的に異常活性化し、がん化を引き起こす。ALK融合遺伝子を治療標的とした治療薬（ALKチロシンキナーゼ阻害剤）がいくつか開発されており、臨床応用されている（例えば非小細胞性肺がんの治療へのクリゾチニブの適用）。
【００１２】
ALKチロシンキナーゼ阻害剤の例を挙げるとクリゾチニブ（Crizotiniｂ）、アレクチニブ（Alectinib）、セリチニブ（Ceritinib）、及びTAE684である。JMMLの症例の中にROS1（c-ros oncogene 1）融合遺伝子（TBL1XR1-ROS1）陽性が認められた事実と、ALK及びROS1に対する阻害剤であるクリゾチニブがJMMLに薬効を示した事実に基づき、好ましくはROS1に対しても阻害効果を示すALKチロシンキナーゼ阻害剤を用いる。即ち、好ましい態様では、ALKチロシンキナーゼ阻害剤として、ALK及びROS1に対するチロシンキナーゼ阻害剤が採用される。「ALK及びROS1に対するチロシンキナーゼ阻害剤」とは、少なくともALKとROS1に対して阻害活性を示すものであり、他のチロシンキナーゼに対する阻害活性の有無は特に問わない。「ALK及びROS1に対するチロシンキナーゼ阻害剤」に該当するALKチロシンキナーゼ阻害剤としては、クリゾチニブ、セリチニブ及びロラチニブを例示できる。
【００１３】
ROS1は受容体型チロシンキナーゼの一種であり、ALKと同様にインスリン受容体ファミリーに属する。非小細胞性肺がんの症例においてROS1融合遺伝子（CD74-ROS1、SLC34A2-ROS1等）が同定されており、治療標的とされている。ROS1のチロシンキナーゼドメインは、ALKのチロシンキナーゼドメインに対して高い相同性を示す。
【００１４】
後述の実施例に示すようにALKチロシンキナーゼ阻害剤であるクリゾチニブは、新規融合遺伝子陽性のJMML細胞のみならず、新規融合遺伝子陰性のJMML細胞に対しても増殖抑制作用、即ち薬効を示した。この事実を考慮すれば、本発明の治療薬の対象（JMML患者）は特に限定されるものではなく、本発明の治療薬はJMMLの治療に広く利用され得る。但し、好ましい治療対象の例として、ALK融合遺伝子（例えばDCTN1-ALK融合遺伝子、RANBP2-ALK融合遺伝子）又はROS1融合遺伝子（例えばTBL1XR1-ROS1融合遺伝子）陽性の症例を挙げることができる。
【００１５】
本発明の一態様では、JAK2チロシンキナーゼ阻害剤であるルクソリチニブ（Ruxolitinib）がin vitroでJMMLに対して薬効を示したという事実に基づき、JAK2チロシンキナーゼ阻害剤を用いる。ルクソリチニブはJAK1及びJAK2サブタイプに選択的に作用する。JAK2チロシンキナーゼ阻害剤の具体例は、ルクソリチニブ、パクリチニブ（Pacritinib）、バリシチニブ（Baricitinib）である。
【００１６】
本発明の治療薬の有効成分として、ALKチロシンキナーゼ阻害剤又はJAK2チロシンキナーゼ阻害剤の薬理学的に許容される塩を用いても良い。「薬理学的に許容される塩」は特に限定されるものではなく、様々な塩、例えば、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等の利用が想定される。酸付加塩の例としては塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩が挙げられる。金属塩の例としてはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩が挙げられる。アンモニウム塩の例としてはアンモニウム、テトラメチルアンモニウムなどの塩が挙げられる。有機アミン付加塩の例としてはモルホリン付加塩、ピペリジン付加塩が挙げられる。アミノ酸付加塩の例としてはグリシン付加塩、フェニルアラニン付加塩、リジン付加塩、アスパラギン酸付加塩、グルタミン酸付加塩が挙げられる。
【００１７】
２種類以上の有効成分（ALKチロシンキナーゼ阻害剤若しくはその薬理学的に許容される塩、又はJAK2チロシンキナーゼ阻害剤若しくはその薬学的に許容される塩）を併用してもよい。また、上記の有効成分（ALKチロシンキナーゼ阻害剤若しくはその薬理学的に許容される塩、又はJAK2チロシンキナーゼ阻害剤若しくはその薬学的に許容される塩）に加えて、他の有効成分を混合してもよい。
【００１８】
本発明の効果及び製剤的な安定性などを損なわない限り、用途又は剤形などに応じて、医薬品に通常使用され得る任意の成分を本発明の治療薬に適宜配合してもよい。配合できる成分は特に制限されないが、例えば、担体成分または添加剤などが挙げられ、固形剤における担体成分又は添加剤としては、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、抗酸化剤、コーティング剤、着色剤、矯味剤、界面活性剤、可塑剤、甘味剤、着香剤の他、崩壊補助剤、発泡剤、吸着剤、防腐剤、湿潤剤、帯電防止剤などが例示できる。また、液剤における担体成分又は添加剤としては、例えば、溶剤、ｐＨ調整剤、清涼化剤、懸濁化剤、消泡剤、粘稠剤、溶解補助剤、界面活性剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、着香剤の他、防腐・抗菌剤、キレート剤、可溶化剤若しくは溶解補助剤、安定化剤、流動化剤、乳化剤、増粘剤、緩衝剤、等張化剤、分散剤などが例示できる。
【００１９】
製剤化する場合の剤形も特に限定されない。剤形の例は錠剤（素錠、糖衣錠、口腔内速崩壊錠、口腔内速溶解錠、チュアブル錠、発泡錠、トローチ剤、ドロップ剤、フィルムコーティング錠などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、及び座剤である。ゼリー状で嚥下しやすく成形したり（例えばゼリー状）、消化管での吸収性を改善したりすることも可能である。また、固形剤、半固形剤、液剤（例えば、煎剤や浸剤など）のいずれであってもよい。好ましい剤形の一つは錠剤である。錠剤の中でも、下痢の症状を感じたときに水無しでも手軽に服用することのできる口腔内速崩壊錠、口腔内速溶解錠、チュアブル錠などのような剤形や、不快な味を遮断することができる糖衣錠やフィルムコーティング錠などのような剤形は特に好ましいといえる。
【００２０】
本発明の治療薬は、当該技術分野における慣用の方法で或いはそれを応用して製造することができる。例えば、錠剤であれば、粉末状の活性成分と製薬上許容される担体成分（賦形剤など）とを混合し、圧縮成形することにより調製でき（直打法）、また、ドロップ剤は型に注入する方法で調製することができる。固形剤の内、顆粒剤などの粉粒剤は、種々の造粒法（押出造粒法、粉砕造粒法、乾式圧密造粒法、流動層造粒法、転動造粒法、高速攪拌造粒法など）により調製することができる。また、錠剤は、上記の造粒法と打錠法（湿式打錠法など）等を適宜組み合わせても調製できる（間接圧縮法）。更に、カプセル剤は、慣用の方法により、カプセル（軟質または硬質カプセル）内に粉粒剤（粉剤、顆粒剤など）を充填することにより調製できる。錠剤は、コーティングを施し、糖衣錠やフィルムコーティング錠としてもよい。更に、錠剤は単層錠であっても、二層錠などの積層錠であってもよい。液剤は、各成分を担体成分である水性媒体（精製水、熱精製水、エタノール含有精製水など）に溶解または分散させ、必要により加熱、濾過、布ごしまたは滅菌処理し、所定の容器に充填し、滅菌処理することなどにより調製できる。本発明の治療薬中の有効成分量は一般に剤形によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約0.01重量％〜約95重量％の範囲内で設定する。
【００２１】
本発明の治療薬はその剤形に応じて経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内、又は腹腔内注射、経皮、経鼻、経粘膜など）によって患者に適用される。また、全身的な投与と局所的な投与のいずれも採用し得る。これらの投与経路は互いに排他的なものではなく、任意に選択される二つ以上を併用することもできる（例えば、経口投与と同時に又は所定時間経過後に静脈注射等を行う等）。本発明の治療薬には、期待される治療効果を得るために必要な量（即ち治療上有効量）の有効成分が含有される。本発明の治療薬中の有効成分量は一般に剤形によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約0.1重量％〜約99重量％の範囲内で設定する。
【００２２】
本発明の治療薬の投与量は、期待される治療効果が得られるように設定される。治療上有効な投与量の設定においては一般に症状、患者の年齢、性別、及び体重などが考慮される。当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能である。投与量の一例として、クリゾチニブであれば、成人では１日当たり500mg、小児では１日当たり280mg/m2を挙げることができる。投与スケジュールとしては例えば１日１回〜数回、２日に１回、或いは３日に１回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、患者の病状や有効成分の効果持続時間などを考慮することができる。
【００２３】
本発明の治療薬と他の薬剤を併用することにしてもよい。例えば、JMMLに対する標準的な化学療法に本発明の治療薬を追加し、相加的ないし相乗的効果の発揮を図る。様々な併用態様が想定され、併用される薬剤の種類や数、投与スケジュール等は特に限定されない。併用される薬剤の代表例は抗がん剤であるが、分子標的治療薬、細胞療法等を併用することにしてもよい。抗がん剤の例は、アルキル化剤（例えばシクロフォスファミド、イホスファミド、メルファラン）、代謝拮抗剤（例えばメトトレキサート、6-メルカプトプリン、シタラビン、フルダラビン、クロファラビン）、抗がん抗生物質（例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン）、植物アルカロイド（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、エトポシド）、脱メチル化剤（例えばアザシチジン）である。尚、化学療法では、作用機序や副作用が異なる数種類の治療薬を組み合わせる多剤併用療法を行うのが基本となる。分子標的治療薬の例は、MEK阻害薬、JAK阻害薬、GM-CSF阻害薬等が挙げられる。また細胞療法の例としては、CAR-T療法等が挙げられる。
【００２４】
以上の記述から明らかな通り、本出願は、JMMLの患者に対してALKチロシンキナーゼ阻害剤又はJAK2チロシンキナーゼ阻害剤を治療上有効量投与することを特徴とする、JMMLの治療法も提供する。
【００２５】
２．JMMLの検査
本発明の第２の局面はJMMLの検査に関する。具体的には、以下のステップ(1)〜(3)を含む、JMMLの検査方法が提供される。
(1)若年性骨髄単球性白血病患者から単離した白血病細胞を含む検体を用意するステップ
(2)前記検体において、ALK又はROS1の融合遺伝子、又は該融合遺伝子がコードする融合タンパク質の存否を検出するステップ
(3)前記融合遺伝子又は前記融合タンパク質が検出された場合、ALKチロシンキナーゼ阻害剤による治療に適合すると判定するステップ
【００２６】
ステップ(1)では、検査に使用する検体を用意する。JMML患者から単離した白血病細胞を含む検体が用いられる。白血病細胞を含む限り、検体の種類や由来などは特に限定されない。例えば、骨髄から調製した細胞画分（骨髄細胞）や末梢血などの血液から調製した細胞画分（血液細胞）を検体として用いる。検体は、本発明の実施に先立って調製される。即ち、本発明の検査方法は、検体を調製するための骨髄等を患者から単離（採取）するステップを含むものではない。
【００２７】
ステップ(2)では、検体におけるALK融合遺伝子（例えばDCTN1-ALK融合遺伝子又はRANBP2-ALK融合遺伝子）又はROS1融合遺伝子（例えばTBL1XR1-ROS1融合遺伝子）、或いは当該融合遺伝子（例えばDCTN1-ALK融合遺伝子、TBL1XR1-ROS1融合遺伝子又はRANBP2-ALK融合遺伝子のいずれか）をコードする融合タンパク質の存否を検出する。前者の態様（融合遺伝子を検出）ではゲノムDNA又はmRNAが検出対象となる。ゲノムDNAを検出対象とした場合には、融合遺伝子の形成の有無が検出されることになる。他方、mRNAを検出対象とした場合には、融合遺伝子の形成の有無又は発現の有無、或いはこの両者が検出されることになる。融合遺伝子の検出手段は特に限定されない。例えば、RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）法、PCR法、PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism)法、PCR-SSCP（single strand conformation polymorphism)法、RNAシーケンス解析、ターゲットシーケンス解析、FISH（Fluorescence in situ hybridization)法、全ゲノム解析、Invader（登録商標、Third Wave Technologies社）法、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）、CGH（Comparative Genomic Hybridization）法、ドットハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等の検出手段を利用できる。ゲノムDNA及びmRNAの抽出、精製などは公知の方法で行うことができる。調製用のキットも各種市販されており、それらを利用することにしてもよい。
【００２８】
DCTN1-ALK融合遺伝子、TBL1XR1-ROS1融合遺伝子及びRANBP2-ALK融合遺伝子は、本発明者らの検討によって見出された、JMML患者由来の新規な融合遺伝子である。図２にこれらの融合遺伝子の切断点及び構造を示した。当該情報に基づき、各融合遺伝子の検出に使用するプライマーやプローブを設計・調製することができる。尚、核酸増幅反応を利用した検出手段（上掲のRT-PCR法やPCR法）に利用可能なプライマーの具体例は後述する。
【００２９】
後者の態様（融合タンパク質の検出）の場合、例えば、免疫学的測定法によって融合タンパク質を検出することができる。免疫学的測定法によれば迅速で感度のよい検出が可能となる。また、操作も簡便である。免疫学的測定法では、融合タンパク質に対する抗体が使用され、当該抗体の結合性（結合量）を指標として融合タンパク質が検出される。免疫学的測定法の例は、ウエスタンブロット法、免疫組織化学、蛍光免疫測定法（FIA法）、酵素免疫測定法（EIA法）、放射免疫測定法（RIA法）、フローサイトメトリー（FCM）、免疫沈降法、イムノクロマト法、ELISA法等である。
【００３０】
ステップ(3)では、ステップ(2)の検出結果に基づき、ALKチロシンキナーゼ阻害剤による治療への適合性（即ち、治療すべき患者であるか否か）を評価する。具体的には、ステップ(2)における検出対象である融合遺伝子又は融合タンパク質が検出された場合に「ALKチロシンキナーゼ阻害剤による治療に適合する」と判定する。このように、治療方針の決定又はそのための補助的情報ないし根拠を得るための指標として、上記融合遺伝子の形成で特徴付けられる遺伝学的異常（以下では、「本発明の遺伝学的異常」と呼ぶことがある）が用いられる。ここでの判定は、その判定基準から明らかな通り、医師や検査技師など専門知識を有する者の判断によらずとも自動的／機械的に行うことができる。
【００３１】
本発明の検査方法は治療開始前又は治療開始後に実施される。本発明の検査方法を治療開始前に実施し、その結果を利用すれば、より適切な処置が可能になる。即ち、治療方針を策定及び決定するための手段として本発明を利用できる。一方、治療開始後に本発明の検査方法を実施すれば、例えば、治療方針の変更に本発明を利用できる。即ち本発明は、治療方針を見直す際の科学的根拠を与える手段としても有用である。本発明の検査方法を経時的に複数回実施し、治療効果のモニターや治療方針の改訂／見直しを図ることにしてもよい。
【００３２】
３．薬剤のスクリーニング方法
本発明は更に、JMMLにおいて新たな治療標的となる融合遺伝子を同定した成果に基づき、JMMLの治療に有効な物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法で同定された物質は、特に、ALK融合遺伝子（例えばDCTN1-ALK融合遺伝子、RANBP2-ALK融合遺伝子）又はROS1融合遺伝子（例えばTBL1XR1-ROS1融合遺伝子）陽性の患者に対する治療薬又は治療薬候補として有望といえる。
【００３３】
本発明のスクリーニング方法では以下のステップ(i)〜(iii)を行う。
(i)ALK又はROS1の融合遺伝子を発現する細胞を用意するステップ
(ii)試験物質の存在下、前記細胞を培養するステップ；
(iii)細胞の生存数又はコロニー数を測定し、前記試験物質の有効性を判定するステップ。
【００３４】
本発明のスクリーニング方法では、まず、ALK融合遺伝子（例えばDCTN1-ALK融合遺伝子、RANBP2-ALK融合遺伝子）又はROS1融合遺伝子（例えばTBL1XR1-ROS1融合遺伝子）を発現する細胞を用意する（ステップ(i)）。換言すれば、新規融合遺伝子陽性の細胞を用意する。例えば、樹立された血液細胞株（具体的には、NALM6、HEK293T等）に新規融合遺伝子を導入して強制発現させたものを、ここでの細胞として使用することができる。新規融合遺伝子陽性の患者から単離した細胞、当該細胞の継代細胞、又は当該細胞から樹立した細胞株を使用することも可能である。
【００３５】
ステップ(ii)では、試験物質の存在下、用意した細胞を培養する。使用する細胞の数は特に限定されず、検出感度、実験設備等を考慮して定めることができる。例えば、1回のスクリーニング操作に1×102個〜1×106個の細胞を用いることができる。
【００３６】
培養液中の試験物質の存在量（添加量）は任意に設定可能であるが、正常細胞を同様の条件で培養した際に致命的な影響を与えない範囲で添加量を設定するとよい。当業者であれば予備実験によって適切な添加量を設定可能である。
【００３７】
培養時間は、試験物質の作用・効果が十分に評価できるように設定されるものであるが、特に限定されない。例えば、培養時間を10分〜１月の範囲内で設定することができる。尚、目的の作用・効果を示す物質が見出された場合には、その物質が作用・効果を示すまでに要する時間を基に、以降のスクリーニングにおける培養時間を設定することができる。
【００３８】
試験物質としては様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例として、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミンを例示できる。試験物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系を構築することができる。細胞抽出液、培養上清などを試験物質として用いてもよい。また、既存の薬剤、栄養食品、食品添加物等を試験物質としてもよい。２種類以上の試験物質を同時に添加することにより、試験物質間の相互作用、相乗作用などを調べることにしてもよい。
【００３９】
ステップ(ii)に続くステップ(iii)では、培養後の細胞の生存数又はコロニー数を測定し、試験物質の細胞増殖阻害活性（細胞傷害活性）、即ち有効性を判定する。例えば、試験物質の存在下で培養する細胞（試験群）と、試験物質の非存在下で培養する細胞（対照群）とを用意し、各群について細胞生存数又はコロニー数を測定し、比較する。比較結果から、試験物質が存在した結果として細胞生存率／コロニー数が変化した程度が求められる。対照群に比較して試験群の生細胞数／コロニー数が少ない（細胞生存率が低い）場合、即ち試験物質に細胞増殖阻害活性が認められた場合、当該試験物質がJMMLに対して有効であると判定できる。一態様では、当該場合において、当該試験物質が新規融合遺伝子陽性の症例に対して有効であると判定する。試験群において生存率の顕著な低下が認められた場合、当該試験物質の有効性は特に高いと判定できる。対照群を設定するのではなく、試験群における培養前後の細胞数を比較することによっても、試験物質の有効性を判定することが可能である。但し、上記の如き対照群を設定した方が信頼性の高い結果を得ることができる。
【００４０】
好ましい一態様では、サイトカイン（例えばGM-CSFを使用することができる）の存在下で細胞を培養する試験群（サイトカイン添加群）と非存在下で細胞を培養する試験群（サイトカイン非添加群）を設け、両試験群の生細胞数／コロニー数に基づき判定する。このようにすれば、サイトカインが豊富に存在する生体内に近い環境での評価が可能である。尚、この態様においても、各々について対照群（試験物質の非存在下で細胞を培養）を設け、試験群と対照群を比較評価した上で判定することが好ましい。
【００４１】
本発明のスクリーニング方法で選抜された物質（スクリーニング結果物）は、JMML（特に新規融合遺伝子陽性の症例）に対する医薬の有効成分として有力な候補（リード化合物）となる。選抜された物質が十分な薬効を有する場合にはそのまま医薬の有効成分として使用することができる。一方で十分な薬効を有しない場合であっても化学的修飾などの改変を施してその薬効を高めた上で医薬の有効成分としての使用に供することができる。勿論、十分な薬効を有する場合であっても、更なる薬効の増大を目的として同様の改変を施してもよい。
【００４２】
４．融合遺伝子、融合タンパク質
本発明は更に、JMMLの発症原因となる、３種類の新規融合遺伝子、即ち、DCTN1-ALK融合遺伝子、TBL1XR1-ROS1融合遺伝子、及びRANBP2-ALK融合遺伝子も提供する。DCTN1-ALK融合遺伝子は、DCTN1遺伝子では エクソン28に切断点が存在し、ALK遺伝子ではイントロン19に切断点が存在しており、DCTN1遺伝子のエクソン26までと、ALK遺伝子のエクソン20以降が連結された構造を有する。同様に、TBL1XR1-ROS1融合遺伝子は、TBL1XR1遺伝子ではイントロン12に切断点が存在し、ROS1遺伝子ではエクソン36に切断点が存在しており、TBL1XR1遺伝子のイントロン12の一部までと、ROS1遺伝子のエクソン36以降が連結された構造を有する。また、RANBP2-ALK融合遺伝子は、RANBP2遺伝子ではイントロン18に切断点が存在し、ALK遺伝子ではイントロン19   に切断点が存在し、RANBP2遺伝子のエクソン18までと、ALK遺伝子のエクソン20以降が連結された構造を有する。
【００４３】
DCTN1-ALK融合遺伝子の典型的なゲノム塩基配列を配列番号１にcDNA塩基配列を配列番号２に、TBL1XR1-ROS1融合遺伝子の典型的なゲノム塩基配列を配列番号３にcDNA塩基配列を配列番号４に、RANBP2-ALK融合遺伝子の典型的なゲノム塩基配列を配列番号５にcDNA塩基配列を配列番号６にそれぞれ示す。
【００４４】
本発明は新規融合遺伝子の発現産物である融合タンパク質も提供する。具体的にはDCTN1-ALK融合遺伝子によってコードされるDCTN1-ALK融合タンパク質、TBL1XR1-ROS1融合遺伝子によってコードされるTBL1XR1-ROS1融合タンパク質、及びRANBP2-ALK融合遺伝子によってコードされるRANBP2-ALK融合タンパク質が提供される。DCTN1-ALK融合タンパク質は、RANBP2由来のcoiled coilドメイン、ALK由来のキナーゼドメインを含む。同様に、TBL1XR1-ROS1融合タンパク質はTBL1XR1由来のFN typeIIIドメイン、ROS1由来のキナーゼドメインを含む。また、RANBP2-ALK融合タンパク質は、RANBP2由来のTPRドメイン、ALK由来のキナーゼドメインを含む。DCTN1-ALK融合タンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号７に、TBL1XR1-ROS1融合タンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号８に、RANBP2-ALK融合タンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号９にそれぞれ示す。
【００４５】
本発明の融合遺伝子及び融合タンパク質は、例えば、治療標的や診断マーカーとして、或いは治療剤の適合性判断の指標などとして有用である。
【００４６】
本発明の融合遺伝子及び融合タンパク質は、例えば、該当する融合遺伝子陽性の患者から分離、精製することによって、単離された状態に調製することができる。また、本明細書が開示する配列情報に基づき、化学合成、遺伝子工学的手法などによって調製してもよい。
【００４７】
尚、本明細書で特に言及しない事項（条件、操作方法など）については常法に従えばよく、例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)、Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）、Current protocols in Immunology, John Wiley& Sons Inc等を参考にすることができる。
【実施例】
【００４８】
JMMLに対する新たな分子標的治療の創出を目指し、以下の検討を行った。
１．包括的遺伝子解析
（１）方法
135例のJMML患者、及び15例のヌーナン症候群関連骨髄増殖性疾患（NS/MPD）患者の白血病細胞を含む骨髄、又は末梢血中の単核球から、QIAamp DNA Blood Mini Kit（キアゲン社）を用いてDNA、RNeasy Mini Kit(キアゲン社)を用いてRNAをそれぞれ抽出した。Agilent 2200 TapeStationとRNA ScreenTape(アジレント社)を用いてRNAの分解度を確認した。【００４９】
＜全エキソーム解析＞
60例のJMML患者、9例のNS/MPD患者から得られたDNAから、SureSelect XT target enrichment system及びSureSelect Human All Exon v3 or v5 bait(アジレント社）を用いて全エキソーム解析用のライブラリーを作成した。HiSeq 2500(イルミナ社)を用いて次世代シーケンスを行い、得られたシーケンスデータをGenomon（http://genomon.hgc.jp/exome/) を用いて解析し、遺伝子変異を同定した。【００５０】
＜PCRベース ターゲットディープシーケンス解析＞
86例のJMML患者、及び6例のNS/MPD患者から得られたDNAから、Quick Taq HS DyeMix（TOYOBO社）を用いてPTPN11、NRAS、KRAS、CBL、NF1、SETBP1、JAK3、SH3BP1の遺伝子領域を増幅し、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社)、NotI(Fermentas社）、T4 DNA ligase(Takara Bio社）を用いて精製した後、Illumina pair-end library protocol（イルミナ社）を用いて解析用ライブラリーを作成した。その後、エキソーム解析と同様の手順でシーケンス、解析を行った。【００５１】
＜captureベース ターゲットディープシーケンス解析＞
12例のJMML患者、及び2例のNS/MPD患者から得られたDNAから、184遺伝子をターゲットとしたSureSelect custom bait（アジレント社  Muramatsu, H. et al. Clinical utility of next-generation sequencing for inherited bone marrow failure syndromes. Genet Med (2017).）及びSureSelect XT target enrichment system（アジレント社）を用いて解析用ライブラリーを作成した。その後、エキソーム解析と同様の手順でシーケンス、解析を行った。【００５２】
＜RNAシーケンス解析＞
117例のJMML患者、及び12例のNS/MPD患者から得られたRNAから、NEBNext Ultra RNA Prep Kit for Illumina(New England Biolabs社)を用いてRNAシーケンス解析用のライブラリーを作成した。HiSeq 2500(イルミナ社)を用いて次世代シーケンスを行い、得られたシーケンスデータをTophat-fusionソフトウェアを用いて解析し、融合遺伝子を検出した。
＜ゲノムワイドDNAメチル化解析＞
95例のJMML患者、11例のNS/MPD患者から得られたDNAからInfinium HumanMethylation450 BeadChip(イルミナ社）を用いて解析を行いβ値を計算した。【００５３】
（２）結果・考察
各症例の臨床所見、検査所見、遺伝子解析結果の概要を図１に示す。過去の報告と同様、89%の症例でRAS経路関連遺伝子変異を認めた。またDNAのメチル化解析の結果、高メチル化プロファイルと低メチル化プロファイルの2群に大別された。【００５４】
２．発現解析
105例でRNA-seqのデータを基に遺伝子発現プロファイルの解析を行った。全遺伝子ベースの階層的クラスタリングの結果、4群のクラスターが同定された。クラスターA1はPTPN11変異と有意に相関し、予後不良であった。さらに、骨髄異形成症候群（MDS）及び白血病の分類のためにデザインされたdiagnostic classification model (DC model)に関連した435遺伝子を用いた階層的クラスタリングも同様に施行したところ、3つのクラスター（クラスター1-3）が同定された。クラスター1は先行研究（非特許文献９）におけるAML-typeの発現プロファイルに対応しており、また高メチル化プロファイル、PTPN11・NF1変異、2つ以上の変異、クラスターA1と相関し、予後不良であった［5年全生存率（5-year OS）（95％CI）：47.2％（28.2％〜64.1％）  対  61.4％（47.2％〜72.7％）、p = 0.20、5年無移植生存率（5-year TFS）（95％CI）：0％  対  28.5％（17.3％〜40.7％）、p = 2.6×10-6］。それに加え、differential expression analysisの手法を用いて、高メチル化プロファイルと低メチル化プロファイルの2群間で発現の異なる遺伝子を解析したところ、LIN28Bが高メチルプロファイルにおいて最も有意に発現が亢進していることを同定した。LIN28Bの高発現は、先行研究においてJMMLの不良予後マーカーとして同定されており（非特許文献８）、高メチル化プロフィールを有する患者において、LIN28B高発現が高頻度に認められた（p = 2.1×10-13）。【００５５】
３．JMMLにおける受容体型チロシンキナーゼ融合遺伝子の発見
（１）方法
105人のJMML患者の、白血病細胞を含む骨髄から、RNeasy Mini Kit(キアゲン社)を用いてRNAを抽出した。Agilent 2200 TapeStationとRNA ScreenTape(アジレント社)を用いてRNAの分解度を確認した後、NEBNext Ultra RNA Prep Kit for Illumina(New England Biolabs社)を用いてRNAシーケンス解析用のライブラリーを作成した。HiSeq 2500(イルミナ社)を用いて次世代シーケンスを行い、得られたシーケンスデータをTophat-fusionソフトウェアを用いて解析し、融合遺伝子を検出した。【００５６】
（２）結果・考察
3例について、受容体型チロシンキナーゼに関連した融合遺伝子が検出された（図２）。検出された融合遺伝子はいずれもin-frameで融合していた。古典的RAS経路変異を有さない16例中3例（19%）でチロシンキナーゼ関連融合遺伝子が検出された。このうちDCTN1-ALK、RANBP2-ALKは非小細胞性肺がんなどで機能獲得型の変異として報告されている。残るTBL1XR1-ROS1も、TBL1XR1、ROS1はどちらも別の遺伝子と融合し、腫瘍形成に関連することが報告されている遺伝子であった。一般的に受容体型チロシンキナーゼに関連した融合遺伝子は、チロシンキナーゼのキナーゼドメインと、融合パートナーの二量体形成に関連するドメインが融合することが機能獲得につながると報告されており、予測されるTBL1XR1-ROS1融合タンパク質も、ROS1のキナーゼドメイン、及びTBL1XR1の二量体形成に関連するドメインを保持していることから、この融合が機能獲得につながることが強く示唆された。ALK、ROS1はともに融合遺伝子形成により、RAS経路を強く活性化して腫瘍形成に関与することが報告されており、古典的RAS経路遺伝子変異とは別の機序でRAS経路を活性化し、JMMLの発症に関連することが示唆された。【００５７】
４．RANBP2-ALK陽性例におけるクリゾチニブのin vitroでの腫瘍増殖抑制効果
（１）方法
RANBP2-ALK融合遺伝子陽性患者（UPN168）の骨髄から抽出されたCD34陽性細胞（1×103個）をMethoCultTM H4434 classic(サイトカイン（＋）)又はMethoCultTM H4230(サイトカイン（−）)(STEMCELL Technologies社）にDMSO（Sigma-Aldrich社）で希釈したクリゾチニブ（ALK/ROS1/MET阻害薬  ファイザー社）を0、20、80、200、500nM添加した培地で2週間培養した。2週間後にそれぞれの培地でのcolony forming unit-granulocyte macrophage（CFU-GM）、burst-forming unit-erythroid (BFU-E)の数をカウントした。【００５８】
（２）結果・考察
結果を図３に示す。サイトカイン（＋）、サイトカイン（−）いずれの培地においても、クリゾチニブは濃度依存的にJMMLのコロニー形成を阻害した。クリゾチニブはRANBP2-ALK陽性JMML症例においてin vitroで増殖抑制効果を示し、臨床的にも有用である可能性が示唆された。【００５９】
５．RANBP2-ALK陽性患者へのクリゾチニブ投与
（１）方法及び臨床経過（図４）
UPN168（RANBP2-ALK陽性）は、従来のAML型化学療法に対して抵抗性で、経過中にblast crisisを発症し、急激な腫瘍細胞の増加を認めた。通常の化学療法、造血幹細胞移植治療では根治が非常に困難であると考えられた。診断時及び91日目の骨髄単核球から抽出したRNAを鋳型として、ThermoScript RT-PCRシステム（Thermo社）を用いてcDNAを合成した。RANBP2とALKの配列に対応する以下のプライマーセットを用いて、PrimeSTAR GXL DNAポリメラーゼを用いたRT-PCRを行った。
＜RANBP2-ALK cDNAプライマーセット（設計位置RANBP2 exon15, ALK exon20、プロダクトサイズ671 bp）＞
フォワード（RANBP2-ALK forward primer）：ATTTTTCACAGGAAGGCAGAAGACATTGA（配列番号１０）
リバース（RANBP2-ALK reverse primer）：GTCTTGCCAGCAAAGCAGTAG（配列番号１１）【００６０】
RT-PCRの結果、いずれの検体からもRANBP2-ALKが検出された。前述したように、クリゾチニブ（ファイザー社）はin vitroで腫瘍抑制効果を示し、本症例において有効である可能性が示唆された。【００６１】
以上の内容を患者及び患者両親に説明し、同意を得た上で、従来の化学療法に加えて104日目よりクリゾチニブ（280mg/m2/day）の経口投与を開始した。クリゾチニブの投与量は、難治性固形腫瘍・未分化大細胞リンパ腫の小児患者に対するクリゾチニブの第I相試験の結果に基づいて決定した（Mosse, Y.P. et al. Safety and activity of crizotinib for paediatric patients with refractory solid tumours or anaplastic large-cell lymphoma: a Children's Oncology Group phase 1 consortium study. Lancet Oncol 14, 472-80 (2013)）。その後、135日目に採取した末梢血単核球から抽出したRNAを用いて同様の評価を行ったところ陰性となった。ALK break apart FISH及びモノソミー7 FISHも同様に陰性化が確認され、分子生物学的完解が達成されたと判断した。その後、HLA一致同胞より、骨髄移植が施行され、移植後11か月で無病生存が確認されている。【００６２】
（２）考察
クリゾチニブはRANBP2-ALK陽性JMML症例において、臨床的に有用であった。尚、ALK-ROS1融合遺伝子を有する残りの2例は、クリゾチニブの投与は行われておらず、腫瘍の進行で亡くなっていた。【００６３】
６．古典的RAS経路変異陽性JMML検体でのクリゾチニブの腫瘍増殖抑制効果の確認
（１）方法
既存のRAS経路遺伝子変異陽性の4人のJMML患者の骨髄から抽出された、CD34陽性細胞（1×103個）をMethoCultTM H4434 classic(サイトカイン（＋）)又はMethoCultTM H4230 (サイトカイン（−）)(STEMCELL Technologies社）にDMSO（Sigma-Aldrich社）で希釈したクリゾチニブ（ファイザー社）を0、200、500nM添加した培地で2週間培養した。2週間後にそれぞれの培地でのcolony forming unit-granulocyte macrophage（CFU-GM）の数をカウントした。
（２）結果・考察
4例全例でクリゾチニブは濃度依存的に、JMMLのコロニー形成を阻害した。この効果はCBL変異症例と比較し、KRAS、PTPN11遺伝子変異陽性症例で強くみられた。クリゾチニブはALK融合遺伝子陰性で、古典的RAS遺伝子変異陽性例でも腫瘍の増殖を抑制する可能性が示唆された。【００６４】
７．統合遺伝子解析
本研究は、ゲノムワイドメチル化プロファイリング、RNA-seq、及びリシークエンシングデータを含むJMMLの最初の統合遺伝子解析であり、メチル化と遺伝子発現プロファイル、遺伝子変化、臨床検査及び他の検査所見との間の相互関係の評価を行った。高メチル化プロファイルは、診断時高年齢、HbF高値、血小板数低下、PTPN11及び2つ以上の遺伝子変異、LIN28B過剰発現、及びAML様発現プロファイルを含む、JMMLの確立された危険因子と高度に一致し、予後不良な群であることを同定した（図６）。高メチル化プロファイル群は、診断時に芽球がAMLのレベルまで増加していなくとも、「AML型」のメチル化及び発現プロファイルを示し、予後不良であった。これまでに報告されている種々の臨床バイオマーカーは、JMML患者の同じ予後不良群の異なる面を反映している可能性があり、臨床特徴（年齢、HbFレベル、血小板数）及びLIN28B発現は、この予後不良群のサロゲートマーカーとして使用できる可能性を示唆している。【００６５】
８．クリゾチニブ以外のALKチロシンキナーゼ阻害剤、及びルクソリチニブ（JAK2チロシンキナーゼ阻害剤）のin vitroでの腫瘍増殖抑制効果
（１）方法
PTPN11 p.D61V変異陽性且つCD34陽性細胞（1×103個）をMethoCultTM H4434 classic(サイトカイン（＋）)又はMethoCultTM H4230(サイトカイン（−）)(STEMCELL Technologies社）にDMSO（Sigma-Aldrich社）で希釈したアレクチニブ、セリチニブ又はTAE684又はルクソリチニブを所定濃度で添加した培地で2週間培養した。コントロールとして、クリゾチニブを添加した試験群を設けた。2週間後にそれぞれの培地でのcolony forming unit-granulocyte macrophage（CFU-GM）の数をカウントした。【００６６】
（２）結果・考察
結果を図７に示す。サイトカイン（＋）、サイトカイン（−）いずれの培地においても、アレクチニブ、セリチニブ及びTAE684は濃度依存的にJMMLのコロニー形成を阻害した。また、ルクソリチニブにも濃度依存的なコロニー形成の阻害を認めた。【００６７】
９．まとめ
高メチル化プロファイル、AML型発現プロファイル、2つ以上の遺伝子変異を有し、予後不良なJMMLのサブグループを同定することに成功し、臨床的・生物学的予後不良因子が相互に関連していることが明らかとなった。また、受容体型チロシンキナーゼに関連した新たな融合遺伝子（DCTN1-ALK、RANBP2-ALK、及びTBL1XR1-ROS1）が同定された。更には、ALK/ROS1/MET阻害剤であるクリゾチニブ等のALKチロシンキナーゼ阻害剤がJMMLの有望な分子標的薬となり得ることが明らかとなった。一方、JAK2チロシンキナーゼ阻害剤もJMMLの分子標的治療薬になり得ることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の治療薬はJMMLに対する新たな治療戦略を提供する。本発明はJMMLの治療成績の向上、予後改善などに貢献し得る。JMMLの症例から同定された新たな融合遺伝子は治療標的として有用であることはもとより、JMMLの検査／診断マーカーとしても有用である。【００６９】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【配列表フリーテキスト】
【００７０】
配列番号１０：人工配列の説明：RANBP2-ALK forward primer
配列番号１１：人工配列の説明：RANBP2-ALK reverse primer
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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