(57)【要約】  ヒドロゲノフィラス属細菌に、下記(a1)、(a2)、又は(a3)のDNAと、(b)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより得られる形質転換体は、二酸化炭素を唯一の炭素源として利用して効率よくイソブタノールを製造することができる。(a1)配列番号1の塩基配列からなるDNA(a2)配列番号1と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつ2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA(a3)配列番号1と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の(a1)、(a2)、又は(a3)のDNA。
(a1)配列番号1の塩基配列からなるDNA
(a2)配列番号1と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつ2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(a3)配列番号1と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
【請求項２】
ヒドロゲノフィラス属細菌に、(a)請求項１に記載のDNA、及び(b)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより得られる形質転換体。
【請求項３】
(b)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が、下記(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)、又は(b6)のDNAである請求項２に記載の形質転換体。
(b1)配列番号2、3、4、若しくは5の塩基配列からなるDNA
(b2)配列番号2、3、4、若しくは5と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b3)配列番号2、3、4、若しくは5と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b4)配列番号6、7、8、若しくは9のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(b5)配列番号6、7、8、若しくは9と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b6)配列番号6、7、8、若しくは9のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
【請求項４】
ヒドロゲノフィラス属細菌がヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスである請求項２又は３に記載の形質転換体。
【請求項５】
請求項２〜４の何れかに記載の形質転換体を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含むイソブタノールの製造方法。
【請求項６】
ヒドロゲノフィラス属細菌に、下記(c1)、(c2)、(c3)、(c4)、(c5)、又は(c6)の(c)ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、及び(b)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより得られる形質転換体。
(c1)配列番号10の塩基配列からなるDNA
(c2)配列番号10と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(c3)配列番号10と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(c4)配列番号11のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(c5)配列番号11と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(c6)配列番号11のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
【請求項７】
(b)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が、下記(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)、又は(b6)のDNAである請求項６に記載の形質転換体。
(b1)配列番号2、3、4、若しくは5の塩基配列からなるDNA
(b2)配列番号2、3、4、若しくは5と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b3)配列番号2、3、4、若しくは5と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b4)配列番号6、7、8、若しくは9のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(b5)配列番号6、7、8、若しくは9と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b6)配列番号6、7、8、若しくは9のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
【請求項８】
ヒドロゲノフィラス属細菌がヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスである請求項６又は７に記載の形質転換体。
【請求項９】
請求項６〜８の何れかに記載の形質転換体を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含むエタノールの製造方法。
【請求項１０】
ヒドロゲノフィラス属細菌に(d)アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより得られる形質転換体。
【請求項１１】
(d)アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が、下記(d1)、(d2)、(d3)、(d4)、(d5)、(d6)、(d7)、(d8)、又は(d9)のDNAである請求項１０に記載の形質転換体。
(d1)配列番号12、又は13の塩基配列からなるDNA
(d2)配列番号12、又は13と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d3)配列番号12、又は13と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d4)配列番号14、又は15のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(d5)配列番号14、又は15と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d6)配列番号14、又は15のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d7)配列番号16、17、18、19、20、21、22、23、又は24のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(d8)配列番号16、17、18、19、20、21、22、若しくは23と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（但し、アミノ酸番号568のアミノ酸はLys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg、若しくはHisである）をコードするDNA、又は配列番号24と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（但し、アミノ酸番号575のアミノ酸はAsnである）をコードするDNA
(d9)配列番号16、17、18、19、20、21、22、若しくは23において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（但し、アミノ酸番号568のアミノ酸はLys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg、若しくはHisである）をコードするDNA、又は配列番号24において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（但し、アミノ酸番号575のアミノ酸はAsnである）をコードするDNA
【請求項１２】
(d7)のDNAが、配列番号25、26、27、又は28の塩基配列からなるDNAである請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項１３】
ヒドロゲノフィラス属細菌がヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスである請求項１０〜１２の何れかに記載の形質転換体。
【請求項１４】
請求項１０〜１３の何れかに記載の形質転換体を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含むエタノールの製造方法。
【請求項１５】
下記の(d7’)、(d8’)、又は(d9’)のポリペプチドからなるアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（但し、(d8’)及び(d9’)のポリペプチドのN末端から575番目のアミノ酸はAsnである）。
(d7’)配列番号24のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(d8’)配列番号24と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
(d9’)配列番号24のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
【請求項１６】
下記の(d10’)、(d11’)、又は(d12’)のDNAからなるアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（但し、(d11’)及び(d12’)のDNAの5'末端から1723〜1725番目の3ヌクレオチドはAAC又はAATである）。
(d10’)配列番号27、又は28の塩基配列からなるDNA
(d11’)配列番号27、又は28と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(ｄ12’）配列番号27、又は28と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
【請求項１７】
ヒドロゲノフィラス属細菌に、(e)アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより得られる形質転換体。
【請求項１８】
(e)アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子が、下記(e1)、(e2)、(e3)、(e4)、(e5)、(e6)、(e7)、(e8)、(e9)、(e10)、(e11)、又は(e12)のDNAである請求項１７に記載の形質転換体。
(e1)配列番号29、30、31、又は32の塩基配列からなるDNA
(e2)配列番号29、30、31、又は32と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e3)配列番号29、30、31、又は32と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e4)配列番号33、34、35、又は36のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(e5)配列番号33、34、35、又は36と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e6)配列番号33、34、35、又は36のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e7)配列番号33、34、35、又は36のアミノ酸配列のN末端に配列番号37のアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(e8)配列番号33、34、35、又は36と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列のN末端に配列番号37のアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e9)配列番号33、34、35、又は36のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列のN末端に配列番号37のアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e10)配列番号29、30、31、又は32の塩基配列の5’末端に配列番号38の塩基配列を付加した塩基配列からなるDNA
(e11)配列番号29、30、31、又は32と90％以上の同一性を有する塩基配列の5’末端に配列番号38の塩基配列を付加した塩基配列からなるDNAであり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e12)配列番号29、30、31、又は32と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAの塩基配列の5’末端に配列番号38の塩基配列を付加した塩基配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
【請求項１９】
ヒドロゲノフィラス属細菌がヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスである請求項１７、又は１８に記載の形質転換体。
【請求項２０】
請求項１７〜１９の何れかに記載の形質転換体を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含むアラニンの製造方法。
【請求項２１】
アラニンデヒドロゲナーゼのＮ末端に配列番号37のアミノ酸配列からなるポリペプチドを付加した修飾アラニンデヒドロゲナーゼ。
【請求項２２】
配列番号39のアミノ酸配列からなる請求項２１に記載の修飾アラニンデヒドロゲナーゼ。
【請求項２３】
アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’末端に配列番号38の塩基配列からなるポリヌクレオチドを付加した修飾アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子。
【請求項２４】
配列番号40の塩基配列からなる請求項２３に記載の修飾アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソブタノール、エタノール、又はアラニン生成能を有するヒドロゲノフィラス属細菌形質転換体、及びこの形質転換体を用いたイソブタノール、エタノール、又はアラニンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物を用いた化学品製造
2015年採択のパリ協定は、世界全体の温室効果ガスの排出量を迅速に削減することを定めている。これに従い、日本は2030年までに、二酸化炭素やメタンなどの温室効果ガス排出量を2013年に比べて26％削減することを目標としている。【０００３】
世界的に化学品製造の大半は石油原料に依存しており、温室効果ガスの排出量増大といった問題を抱えている。従って、化学品製造の脱石油化が求められており、バイオマスからグリーン化学品を製造するバイオリファイナリーの研究開発が各国で精力的に行われている。しかしながら、微生物発酵の原料とするためのバイオマスの糖類への変換には複雑な工程が必要であり、高コストとなる課題がある。【０００４】
脱石油化の研究の一環として、より高度のサステナビリティを有する炭素原料として二酸化炭素、メタン、一酸化炭素などのガスが注目されており、これらのガスを利用する微生物を用いた有価化学品やバイオ燃料を製造する技術に関心が寄せられている。中でも、温暖化への寄与率が高い二酸化炭素を固定して有効利用することへの期待が高い。【０００５】
イソブタノール製造
従来、バイオ燃料としては、エタノール、n-ブタノール、イソブタノールが使用されており、その効率的な製造方法が求められている。炭素数4のブタノールは、炭素数2のエタノールより燃料効率が高く、ガソリン（炭素数4〜10）やディーゼルエンジンへの混合が容易であるため既存のエンジンや給油設備をそのまま使用でき、空気中の水分の吸収が少ないため設備が腐食し難いといったメリットがある。中でも、イソブタノールはドロップイン型バイオジェット燃料の原料としてASTM規格に認証されており、航空分野における二酸化炭素排出量削減の取り組みとして、実用化に向けた技術開発が進められている。【０００６】
酵母や一部の細菌は少量のイソブタノールを生成する。イソブタノールは、必須アミノ酸であるバリンの生合成経路の代謝中間体である2-ケトイソ吉草酸から生成される。生体内の重要代謝物であるピルビン酸からは5ステップを経て生成される。即ち、アセトヒドロキシ酸 シンターゼ（Acetohydroxy acid synthase）の触媒作用によりピルビン酸からアセトラクテートが生成し、次いでアセトヒドロキシ酸 イソメロレダクターゼ（Acetohydroxy acid isomeroreductase）の触媒作用によりアセトラクテートから2,3-ジヒドロキシイソ吉草酸が生成し、次いで、ジヒドロキシ酸 デヒドラターゼ（Dihydroxy acid dehydratase）の触媒作用により2,3-ジヒドロキシイソ吉草酸から2-ケトイソ吉草酸が生成し、次いで、2-ケト酸 デカルボキシラーゼ（2-Keto-acid decarboxylase）（以下、「KDC」と言うことがある）（EC 4.1.1.1）の触媒作用により2-ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドが生成し、最後に、アルコール デヒドロゲナーゼ（Alcohol dehydrogenase）（以下、「ADH」と言うことがある）（EC 1.1.1.1）の触媒作用によりイソブチルアルデヒドからイソブタノールが生成する。【０００７】
組み換え微生物を用いてイソブタノールを製造する技術として、特許文献1は、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に、ピルビン酸からイソブタノールまでの5ステップからなる代謝経路をそれぞれ触媒する上記5つの酵素の遺伝子を導入した形質転換体を用いてイソブタノールを製造する方法を開示している。2-ケト酸 デカルボキシラーゼ遺伝子としてはラクトコッカス  ラクティス（Lactococcus lactis）のkivD遺伝子、又はスタフィロコッカス  エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）のipd遺伝子を用い、アルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子としてはサッカロミセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のadh2遺伝子、シュードモナス  プチダ（Pseudomonas putida）のadh遺伝子、又はエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）のadhP遺伝子を用いている。【０００８】
また、2-ケト酸 デカルボキシラーゼ遺伝子とアルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子だけを導入した形質転換体を用いてイソブタノールを生成する各種の方法が知られている。
非特許文献1は、エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）に、ラクトコッカス  ラクティス（Lactococcus lactis）のkivD遺伝子と、サッカロミセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のadh2遺伝子を導入した形質転換体を用いることを教えている。
非特許文献2は、エシェリヒア  コリに、ラクトコッカス  ラクティスのkivD遺伝子と、ラクトコッカス  ラクティスのadhA遺伝子を導入した形質転換体を用いることを教えている。
非特許文献3は、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）に、ラクトコッカス  ラクティスのkivD遺伝子と、サッカロミセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のadh2遺伝子を導入した形質転換体を用いることを教えている。
非特許文献4は、シェワネラ  オネイデンシス（Shewanella oneidensis）に、ラクトコッカス  ラクティスのkivD遺伝子と、ラルストニア  ユートロファ（Ralstonia eutropha）のadh遺伝子を導入した形質転換体を用いることを教えている。
非特許文献5は、シアノバクテリアのシネココッカス  エロンガタス（Synechococcus elongatus）に、ラクトコッカス  ラクティスのkivD遺伝子と、エシェリヒア  コリのyqhD遺伝子を導入した形質転換体を用いることを教えている。
非特許文献6は、ラルストニア  ユートロファ（Ralstonia eutropha）に、ラクトコッカス  ラクティスのkivD遺伝子と、ラルストニア  ユートロファ（Ralstonia eutropha）のadh遺伝子を高発現するプラスミドを導入した形質転換体を用いることを教えている。
非特許文献7は、ジオバチルス  サーモグルコシダシウス（Geobacillus thermoglucosidasius）に、ラクトコッカス  ラクティスのkivD遺伝子と、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスのadhA遺伝子を高発現するプラスミドを導入した形質転換体を用いることを教えている。【０００９】
2-ケト酸 デカルボキシラーゼ遺伝子としては、ラクトコッカス  ラクティスのkivD遺伝子の他に、バチルス  サブチリスのalsS遺伝子、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスのGeoth_3495遺伝子、ジオバチルス  サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）のGtng_0348遺伝子、クレブシェラ  ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）のipdC遺伝子、又はスタフィロコッカス  エピデルミディスのipd遺伝子を用いる方法も知られているが、これらの遺伝子を用いるより、ラクトコッカス  ラクティスのkivD遺伝子を用いる方が一般に、宿主内で発現する酵素活性が高いため、従来、主にラクトコッカス  ラクティスのkivD遺伝子が用いられている。【００１０】
上記方法のほとんどは、糖を炭素原料として用いてイソブタノールを生成する方法であって、二酸化炭素を炭素原料として用いてイソブタノールを生成する方法ではない。
ここで、非特許文献5の方法は、光合成細菌であるシアノバクテリアを宿主として用い、炭酸水素ナトリウムを炭素源として用いてイソブタノールを製造する方法である。シアノバクテリアは、植物に比べると炭酸固定能力は高いが、十分な炭酸固定能力ではないため、シアノバクテリアを宿主として用いる方法は、工業的なイソブタノール製造方法として実用化されていない。【００１１】
エタノール製造
従来、燃料、工業原料、飲料などとして用いられるエタノールの多くは、デンプンや各種のバイオマス資源由来の糖類を微生物を用いて発酵させることにより製造されている。
組み換え微生物を用いたエタノール生産方法としては、ピルビン酸を脱炭酸してアセトアルデヒドを生成する反応を触媒するピルビン酸  デカルボキシラーゼ（以下、「PDC」と言うことがある）(EC 4.1.1.1)遺伝子、及び／又はアセトアルデヒドからエタノールへの反応を触媒するアルコール  デヒドロゲナーゼ（以下、「ADH」と言うことがある）(EC 1.1.1.1)遺伝子を導入した形質転換体を用いる方法が知られている。【００１２】
従来の多くの方法は、ザイモモナス  モビリス（Zymomonas mobilis）由来のPDCを発現する遺伝子及びADHを発現する遺伝子を導入した形質転換体を用いている。例えば、特許文献2は、エシェリヒア コリなどの腸内細菌に、ザイモモナス  モビリス由来のpdc遺伝子及びadhB遺伝子を導入して得た形質転換体が効率よくエタノールを生成することを教えている。
その他の細菌のPDC遺伝子及びADH遺伝子を利用する方法として、非特許文献8は、エシェリヒア  コリにサルシナ  ベントリキュリ（Sarcina ventriculi）のpdc遺伝子及びラクトバチルス  ブレビス（Lactobacillus brevis）のadh遺伝子を導入した形質転換体を用いてエタノールを製造する方法を開示している。
また、非特許文献9は、バチルス  メガテリウム（Bacillus megaterium）にサルシナ  ベントリキュリのpdc遺伝子と、ジオバチルス  ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）のadh遺伝子を導入した形質転換体を用いてエタノールを製造する方法を開示している。
ピルビン酸  デカルボキシラーゼ遺伝子としては上記以外にも、グルコノバクター  オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、グルコノアセトバクター  ジアゾトロフィカス（Gluconoacetobacter diazotrophicus）、アセトバクター  パスツリアヌス（Acetobacter pasteurianus）、クロストリジウム  アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ザイモバクター  パルマエ（Zymobacter palmae）のピルビン酸  デカルボキシラーゼ遺伝子を利用することが知られている。また、アルコール  デヒドロゲナーゼ遺伝子としては上記以外にも、多様な微生物種のアルコール  デヒドロゲナーゼ遺伝子を利用することが知られている。
しかし、これらの文献記載の方法は、糖を炭素原料として用いてエタノールを生成する方法であって、二酸化炭素を炭素原料として用いてエタノールを生成する方法ではない。【００１３】
二酸化炭素を炭素原料として用いてエタノールを生成する方法としては、光合成細菌であるシアノバクテリアを宿主とする方法が知られている。例えば、非特許文献10は、シネココッカス（Synechococcus）属細菌にザイモモナス  モビリス由来のpdc遺伝子及びadhB遺伝子を導入した形質転換体を用いてエタノールを製造する方法を開示している。
また、非特許文献11は、シネココッカス属細菌に、ザイモモナス  モビリスのpdc遺伝子とシネコシスティス（Synechocystis）属細菌のNADPH依存性ADH遺伝子（slr1192）を導入した形質転換体を用いてエタノールを製造する方法を開示している。
前述した通り、シアノバクテリアの炭酸固定能力は工業的に利用するほどは高くないため、シアノバクテリアを宿主として用いる方法は、工業的なエタノール製造方法として実用化されていない。【００１４】
また、組み換え微生物を用いたエタノールの製造方法として、アセチルCoAからアセトアルデヒドを介してエタノールを生成する反応を触媒するアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した形質転換体を用いる方法も知られている。
アセチルCoAからアセトアルデヒドを介してエタノールを生成する反応は、嫌気条件下でのエタノール生産に重要であることから、一般に、嫌気条件で生育する微生物を宿主としてアルコール生産を行う場合に、アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が使われている。
例えば、非特許文献12は、嫌気条件下で生育するパイロコッカス  フリオサス（Pyrococcus furiosus）に、アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子であるadhE遺伝子を導入した形質転換体を用いてエタノールを製造する方法を教えている。
また、非特許文献13は、嫌気条件下で生育するカルディセルロシラプター  ベッシー（Caldicellulosiruptor bescii）にadhE遺伝子を導入した形質転換体を用いてエタノールを製造する方法を教えている。
しかし、これらの文献記載の方法は、糖を炭素原料として用いてエタノールを生成する方法であって、二酸化炭素を炭素原料として用いてエタノールを生成する方法ではない。【００１５】
アラニン製造
アラニンは、医薬、食品、又は化学工業原料として重要なアミノ酸であり、その需要が増加している。アラニン製造には、アラニン  デヒドロゲナーゼ(EC 1.4.1.1)が利用されている。この酵素は、ピルビン酸とアンモニアとNADHからアラニンを生成する反応を触媒する。
微生物を用いてアラニンを製造する技術として、非特許文献14は、エシェリヒア  コリに、バチルス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）（現在のジオバチルス  ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus））のアラニン  デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入して得た形質転換体を用いてアラニンを生成する方法を教えている。
特許文献3は、エシェリヒア（Escherichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、又はブレビバクテリウム（Brevibacterium）属細菌に、アースロバクター（Arthrobacter）属細菌のアラニン  デヒドロゲナーゼ遺子を導入して得た形質転換体を用いてアラニンを生成する方法を教えている。
非特許文献15は、エシェリヒア  コリに、バチルス  スフェリカス（Bacillus sphaericus）（現在のリジニバチルス  スフェリカス（Lysinibacillus sphaericus））のアラニン  デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入して得た形質転換体を用いてアラニンを生成する方法を教えている。
非特許文献16は、ザイモモナス  モビリスに、バチルス  スフェリカス（現在のリジニバチルス  スフェリカス）のアラニン  デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入して得た形質転換体を用いてアラニンを生成する方法を教えている。
非特許文献17は、ラクトコッカス  ラクティスに、バチルス  スフェリカス（現在のリジニバチルス  スフェリカス）のアラニン  デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入して得た形質転換体を用いてアラニンを生成する方法を教えている。
非特許文献18は、コリネバクテリウム  グルタミカムに、バチルス  スフェリカス（現在のリジニバチルス  スフェリカス）のアラニン  デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入して得た形質転換体を用いてアラニンを生成する方法を教えている。
しかし、上記方法は何れも、糖を炭素原料として用いてアラニンを生成する方法であって、二酸化炭素を炭素原料として用いてアラニンを生成する方法ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開2010/113832号
【特許文献２】国際公開2001/96573号
【特許文献３】特開平6-277082号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels. Atsumi S, Hanai T, Liao JC. Nature (2008) 451:86-89
【非特許文献２】Engineering the isobutanol biosynthetic pathway in Escherichia coli by comparison of three aldehyde reductase/alcohol dehydrogenase genes. Atsumi S, Wu TY, Eckl EM, Hawkins SD, Buelter T, Liao JC. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2010) 85:651-657
【非特許文献３】Engineering Bacillus subtilis for isobutanol production by heterologous Ehrlich pathway construction and the biosynthetic 2-ketoisovalerate precursor pathway overexpression. Li S, Wen J, Jia X. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2011) 91:577-589
【非特許文献４】Isobutanol production from an engineered Shewanella oneidensis MR-1. Jeon JM, Park H, Seo HM, Kim JH, Bhatia SK, Sathiyanarayanan G, Song HS, Park SH, Choi KY, Sang BI, Yang YH. Bioprocess Biosyst. Eng. (2015) 38:2147-2154
【非特許文献５】Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde. Atsumi S, Higashide W, Liao JC. Nat. Biotechnol. (2009) 27:1177-1180
【非特許文献６】Studies on the production of branched-chain alcohols in engineered Ralstonia eutropha. Lu J, Brigham CJ, Gai CS, Sinskey AJ. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2012) 96:283-297
【非特許文献７】Isobutanol production at elevated temperatures in thermophilic Geobacillus thermoglucosidasius. Lin PP, Rabe KS, Takasumi JL, Kadisch M, Arnold FH, Liao JC. Metab. Eng. (2014) 24:1-8
【非特許文献８】Coexpression of pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase genes in Lactobacillus brevis. Liu S, Dien BS, Nichols NN, Bischoff KM, Hughes SR, Cotta MA.FEMS Microbiol. Lett. (2007) 274:291-297
【非特許文献９】Construction and expression of an ethanol production operon in Gram-positive bacteria. Talarico LA, Gil MA, Yomano LP, Ingram LO, Maupin-Furlow JA. Microbiology (2005) 151:4023-4031
【非特許文献１０】Ethanol synthesis by genetic engineering in cyanobacteria. Deng MD, Coleman JR. Appl. Environ. Microbiol. (1999) 65:523-528
【非特許文献１１】Combinatory strategy for characterizing and understanding the ethanol synthesis pathway in cyanobacteria cell factories.Luan G, Qi Y, Wang M, Li Z, Duan Y, Tan X, Lu X, Biotechnol. Biofuels (2015) 8:184
【非特許文献１２】Ethanol production by the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus by expression of bacterial bifunctional alcohol dehydrogenases.Keller MW, Lipscomb GL, Nguyen DM, Crowley AT, Schut GJ, Scott I, Kelly RM, Adams MWW. Microb. Biotechnol. (2017) 10:1535-1545
【非特許文献１３】Cellulosic ethanol production via consolidated bioprocessing at 75 °C by engineered Caldicellulosiruptor bescii.Chung D, Cha M, Snyder EN, Elkins JG, Guss AM, Westpheling J.Biotechnol. Biofuels (2015) 8:163
【非特許文献１４】Alanine production in an H+-ATPase- and lactate dehydrogenase-defective mutant of Escherichia coli expressing alanine dehydrogenase. Wada M, Narita K, Yokota A. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2007) 76:819-825
【非特許文献１５】Aerobic production of alanine by Escherichia coli aceF ldhA mutants expressing the Bacillus sphaericus alaD gene. Lee M, Smith GM, Eiteman MA, Altman E. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2004) 65:56-60
【非特許文献１６】Expression of an L-alanine dehydrogenase gene in Zymomonas mobilis and excretion of L-alanine. Uhlenbusch I, Sahm H, Sprenger GA. Appl. Environ. Microbiol. (1991) 57:1360-1366
【非特許文献１７】Conversion of Lactococcus lactis from homolactic to homoalanine fermentation through metabolic engineering. Hols P, Kleerebezem M, Schanck AN, Ferain T, Hugenholtz J, Delcour J, de Vos WM. Nat. Biotechnol. (1999) 17:588-592
【非特許文献１８】Engineering of sugar metabolism of Corynebacterium glutamicum for production of amino acid L-alanine under oxygen deprivation. Jojima T, Fujii M, Mori E, Inui M, Yukawa H. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2010) 87:159-165
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、二酸化炭素を唯一の炭素源として利用して効率よくイソブタノールを製造することができるヒドロゲノフィラス属細菌形質転換体、この形質転換体を用いて効率よくイソブタノールを製造する方法、及びヒドロゲノフィラス属細菌による高効率なイソブタノール製造を可能とする遺伝子を提供することを第１の課題とする。
本発明は、二酸化炭素を唯一の炭素源として利用して効率よくエタノールを製造することができるヒドロゲノフィラス属細菌形質転換体、及びこの形質転換体を用いて効率よくエタノールを製造する方法を提供することを第２の課題とする。
本発明は、二酸化炭素を唯一の炭素源として利用して効率よくアラニンを製造することができるヒドロゲノフィラス属細菌形質転換体、この形質転換体を用いて効率よくアラニンを製造する方法、及びヒドロゲノフィラス属細菌による高効率なアラニン製造を可能とする遺伝子を提供することを第３の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を得た。
宿主と遺伝子との適合性
ヒドロゲノフィラス属細菌は水素エネルギーを利用して二酸化炭素から有機物質を生成して生育する水素細菌である。一般的に水素細菌の生育速度は極めて遅いが、ヒドロゲノフィラス属細菌は生育速度が速く、植物や光合成細菌に比べて、炭酸固定能力が格段に高い。ヒドロゲノフィラス属細菌は、本来、イソブタノール、エタノールを生成しないため、これらの化合物の生成能を付与するためには、これらの化合物を生成する反応を触媒する酵素の遺伝子を導入する必要がある。また、ヒドロゲノフィラス属細菌は、アラニンを生成するが、工業規模でのアラニン生成能を付与するためには、アラニンを生成する反応を触媒する酵素の遺伝子を導入する必要がある。
しかし、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するベクターを用いて異種遺伝子をヒドロゲノフィラス属細菌に自然界の塩基配列のまま導入しても、機能するタンパク質を発現しない又は十分には発現しない場合が多い。【００２０】
イソブタノール製造
(i)  ヒドロゲノフィラス属細菌は、本来、イソブタノールを生成せず、2-ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子を持たない。ヒドロゲノフィラス属細菌に、2-ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子として、ラクトコッカス  ラクティスのkivD遺伝子、バチルス  サブチリスのalsS遺伝子、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスのGeoth_3495遺伝子、ジオバチルス  サーモデニトリフィカンスのGtng_0348遺伝子、又はクレブシェラ  ニューモニエのipdC遺伝子を導入しても、機能しない。特に、ラクトコッカス  ラクティスのkivD遺伝子は、種々の宿主内で機能して高活性を発現するため、イソブタノール生成方法に多用されている遺伝子であるが、ヒドロゲノフィラス属細菌内では機能しない。このように、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するベクターを用いて異種遺伝子をヒドロゲノフィラス属細菌に導入しても、機能するタンパク質を発現しない又は十分には発現しない場合が多い。
この点に関して、本発明者は、ヒドロゲノフィラス属細菌における多様な微生物由来の遺伝子の発現可否のデータを蓄積し、この情報蓄積をさらに進め系統化することにより、ラクトコッカス  ラクティスのkivD遺伝子のコドン使用をヒドロゲノフィラス属細菌のコドン使用頻度に最適化し、配列番号１の塩基配列からなるコドン最適化kivD遺伝子をヒドロゲノフィラス属細菌に導入することにより、高活性の2-ケト酸デカルボキシラーゼを発現させることに成功した。
(ii)  ヒドロゲノフィラス属細菌は、本来、イソブタノールを生成せず、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を持たない。
しかし、ヒドロゲノフィラス属細菌に異種微生物のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能し、高活性のアルコールデヒドロゲナーゼを発現する。中でも、クレブシェラ  ニューモニエのadhP遺伝子、ジオバチルス  サーモカテニュラタス（Geobacillus thermocatenulatus）のadhP遺伝子、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスのadhA遺伝子、及びadhP遺伝子は、ヒドロゲノフィラス属細菌内で特に高活性のアルコールデヒドロゲナーゼを発現する。
(iii)  ヒドロゲノフィラス属細菌に、上記(i)に記載のコドン最適化2-ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子と、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入して得た形質転換体は、二酸化炭素を唯一の炭素源として用いて効率よくイソブタノールを生成する。【００２１】
エタノール製造
第1のエタノール生成能を有する形質転換体
(i)  ヒドロゲノフィラス属細菌は、本来、エタノールを生成せず、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を持たない。ヒドロゲノフィラス属細菌に、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子として、従来エタノール生成の報告があるザイモモナス  モビリスのpdc遺伝子や、ザイモバクター  パルマエのpdc遺伝子、又はアセトバクター  パスツリアヌスのpdc遺伝子を導入しても、ヒドロゲノフィラス属細菌内では機能しない。
一方、グルコノバクター  オキシダンスのpdc遺伝子は、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能し、高活性のピルビン酸デカルボキシラーゼを発現する。
(ii)  ヒドロゲノフィラス属細菌は、本来、エタノールを生成せず、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を持たない。
しかし、ヒドロゲノフィラス属細菌に異種微生物のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能し、高活性のアルコールデヒドロゲナーゼを発現する。中でも、クレブシェラ  ニューモニエのadhP遺伝子、ジオバチルス  サーモカテニュラタスのadhP遺伝子、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスのadhA遺伝子、及びadhP遺伝子は、ヒドロゲノフィラス属細菌内で特に高活性のアルコールデヒドロゲナーゼを発現する。
(iii)  ヒドロゲノフィラス属細菌に、グルコノバクター  オキシダンスのpdc遺伝子と、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入して得た形質転換体は、二酸化炭素を唯一の炭素源として用いて効率よくエタノールを生成する。【００２２】
第２のエタノール生成能を有する形質転換体
(i)  ヒドロゲノフィラス属細菌は、本来、エタノールを生成せず、アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を持たない。
しかし、ヒドロゲノフィラス属細菌に異種微生物のアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能し、高活性のアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼを発現する。中でも、エシェリヒア  コリ、又はクロストリジウム  サーモセラム（Clostridium thermocellum）のadhE遺伝子は、ヒドロゲノフィラス属細菌内で、特に高活性のアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼを発現する。その結果、得られた形質転換体は、効率よくエタノールを生成する。
(ii)  アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼは好気条件下で活性が阻害されるが、エシェリヒア  コリのアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの568番目のGluをLys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg、又はHisに置換した変異アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ、及びクロストリジウム  サーモセラムのアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの575番目のAspをAsnに置換した変異アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼは、好気条件下で活性を示す。これらの変異アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼをコードする変異adhE遺伝子であるadhE(E568K、E568A、E568L、E568N、E568G、E568S、E568R、及びE568H)並びにadhE(D575N)のそれぞれを導入したヒドロゲノフィラス属細菌は、好気条件下で、高活性のアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼを発現する。
ヒドロゲノフィラス属細菌は、嫌気条件下では生育できないため、ヒドロゲノフィラス属細菌を用いた物質生産は好気条件で行う必要がある。この点、これらの変異adhE遺伝子を導入したヒドロゲノフィラス属細菌形質転換体は、二酸化炭素を唯一の炭素源として用いて、好気条件下で一層効率良くエタノールを生成できる。【００２３】
アラニン製造
(i)  ヒドロゲノフィラス属細菌は、生存に必要な量のアラニンを生成するが、工業的に利用できる量のアラニンは生成しない。ヒドロゲノフィラス属細菌に異種微生物のアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能し、高活性のアラニンデヒドロゲナーゼを発現し、得られた形質転換体は、二酸化炭素を唯一の炭素源として用いて効率よくアラニンを生成する。中でも、ジオバチルス  ステアロサーモフィラスのalaD1遺伝子、若しくはalaD2遺伝子、又はサーマス  サーモフィラス（Thermus thermophilus）のalaD1遺伝子、若しくはalaD2遺伝子は、ヒドロゲノフィラス属細菌内で、特に高活性のアラニンデヒドロゲナーゼを発現する。
(ii)  アラニンデヒドロゲナーゼのN末端にマルトース結合タンパク質のN末端部分のアミノ酸配列を付加した修飾アラニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、このアミノ酸配列を付加していないアラニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子に比べて、ヒドロゲノフィラス属細菌内で高い酵素活性を発現する。その結果、この修飾アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したヒドロゲノフィラス属細菌形質転換体は、二酸化炭素を唯一の炭素源として用いて一層効率良くアラニンを生成する。【００２４】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、下記の形質転換体及び化学品製造方法を提供する。
項１．  下記の(a1)、(a2)、又は(a3)のDNA。
(a1)配列番号1の塩基配列からなるDNA
(a2)配列番号1と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつ2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(a3)配列番号1と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
項２．  ヒドロゲノフィラス属細菌に、(a)項１に記載のDNA、及び(b)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより得られる形質転換体。
項３．  (b)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が、下記(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)、又は(b6)のDNAである項２に記載の形質転換体。
(b1)配列番号2、3、4、若しくは5の塩基配列からなるDNA
(b2)配列番号2、3、4、若しくは5と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b3)配列番号2、3、4、若しくは5と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b4)配列番号6、7、8、若しくは9のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(b5)配列番号6、7、8、若しくは9と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b6)配列番号6、7、8、若しくは9のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
項４．  ヒドロゲノフィラス属細菌がヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスである項２又は３に記載の形質転換体。
項５．  項２〜４の何れかに記載の形質転換体を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含むイソブタノールの製造方法。【００２５】
項６．  ヒドロゲノフィラス属細菌に、下記(c1)、(c2)、(c3)、(c4)、(c5)、又は(c6)の(c)ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、及び(b)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより得られる形質転換体。
(c1)配列番号10の塩基配列からなるDNA
(c2)配列番号10と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(c3)配列番号10と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(c4)配列番号11のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(c5)配列番号11と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(c6)配列番号11のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
項７．  (b)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が、下記(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)、又は(b6)のDNAである項６に記載の形質転換体。
(b1)配列番号2、3、4、若しくは5の塩基配列からなるDNA
(b2)配列番号2、3、4、若しくは5と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b3)配列番号2、3、4、若しくは5と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b4)配列番号6、7、8、若しくは9のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(b5)配列番号6、7、8、若しくは9と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b6)配列番号6、7、8、若しくは9のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
項８．  ヒドロゲノフィラス属細菌がヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスである項６又は７に記載の形質転換体。
項９．  項６〜８の何れかに記載の形質転換体を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含むエタノールの製造方法。【００２６】
項１０．  ヒドロゲノフィラス属細菌に(d)アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより得られる形質転換体。
項１１．  (d)アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が、下記(d1)、(d2)、(d3)、(d4)、(d5)、(d6)、(d7)、(d8)、又は(d9)のDNAである項１０に記載の形質転換体。
(d1)配列番号12、又は13の塩基配列からなるDNA
(d2)配列番号12、又は13と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d3)配列番号12、又は13と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d4)配列番号14、又は15のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(d5)配列番号14、又は15と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d6)配列番号14、又は15のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d7)配列番号16、17、18、19、20、21、22、23、又は24のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(d8)配列番号16、17、18、19、20、21、22、若しくは23と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（但し、アミノ酸番号568のアミノ酸はLys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg、若しくはHisである）をコードするDNA、又は配列番号24と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（但し、アミノ酸番号575のアミノ酸はAsnである）をコードするDNA
(d9)配列番号16、17、18、19、20、21、22、若しくは23において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（但し、アミノ酸番号568のアミノ酸はLys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg、若しくはHisである）をコードするDNA、又は配列番号24において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（但し、アミノ酸番号575のアミノ酸はAsnである）をコードするDNA
項１２．  (d7)のDNAが、配列番号25、26、27、又は28の塩基配列からなるDNAである項１１に記載の形質転換体。
項１３．  ヒドロゲノフィラス属細菌がヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスである項１０〜１２の何れかに記載の形質転換体。
項１４．  項１０〜１３の何れかに記載の形質転換体を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含むエタノールの製造方法。【００２７】
項１５．  下記の(d7’)、(d8’)、又は(d9’)のポリペプチドからなるアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（但し、(d8’)及び(d9’)のポリペプチドのN末端から575番目のアミノ酸はAsnである）。
(d7’)配列番号24のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(d8’)配列番号24と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
(d9’)配列番号24のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
項１６．  下記の(d10’)、(d11’)、又は(d12’)のDNAからなるアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（但し、(d11’)及び(d12’)のDNAの5'末端から1723〜1725番目の3ヌクレオチドはAAC又はAATである）。
(d10’)配列番号27、又は28の塩基配列からなるDNA
(d11’)配列番号27、又は28と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(ｄ12’）配列番号27、又は28と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA。【００２８】
項１７．  ヒドロゲノフィラス属細菌に、(e)アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより得られる形質転換体。
項１８．  (e)アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子が、下記(e1)、(e2)、(e3)、(e4)、(e5)、(e6)、(e7)、(e8)、(e9)、(e10)、(e11)、又は(e12)のDNAである項１７に記載の形質転換体。
(e1)配列番号29、30、31、又は32の塩基配列からなるDNA
(e2)配列番号29、30、31、又は32と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e3)配列番号29、30、31、又は32と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e4)配列番号33、34、35、又は36のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(e5)配列番号33、34、35、又は36と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e6)配列番号33、34、35、又は36のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e7)配列番号33、34、35、又は36のアミノ酸配列のN末端に配列番号37のアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(e8)配列番号33、34、35、又は36と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列のN末端に配列番号37のアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e9)配列番号33、34、35、又は36のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列のN末端に配列番号37のアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e10)配列番号29、30、31、又は32の塩基配列の5’末端に配列番号38の塩基配列を付加した塩基配列からなるDNA
(e11)配列番号29、30、31、又は32と90％以上の同一性を有する塩基配列の5’末端に配列番号38の塩基配列を付加した塩基配列からなるDNAであり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(e12)配列番号29、30、31、又は32と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAの塩基配列の5’末端に配列番号38の塩基配列を付加した塩基配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
項１９．  ヒドロゲノフィラス属細菌がヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスである項１７、又は１８に記載の形質転換体。
項２０．  項１７〜１９の何れかに記載の形質転換体を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含むアラニンの製造方法。【００２９】
項２１．  アラニンデヒドロゲナーゼのＮ末端に配列番号37のアミノ酸配列からなるポリペプチドを付加した修飾アラニンデヒドロゲナーゼ。
項２２．  配列番号39のアミノ酸配列からなる項２１に記載の修飾アラニンデヒドロゲナーゼ。
項２３．  アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’末端に配列番号38の塩基配列からなるポリヌクレオチドを付加した修飾アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子。
項２４．  配列番号40の塩基配列からなる項２３に記載の修飾アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子。
【発明の効果】
【００３０】
二酸化炭素の増加を抑制する対策として、二酸化炭素の排出量の低減と排出された二酸化炭素の固定がある。二酸化炭素の排出量を低減するために、化石エネルギーに代えて太陽、風力、地熱などのエネルギーの利用が行われている。しかし、現実には、このようなエネルギーの利用によっても二酸化炭素の増加を十分に抑制できていない。そこで、排出された二酸化炭素の固定又は資源化を進める必要がある。
二酸化炭素は、物理的又は化学的に固定することもできるが、生物を利用して二酸化炭素を固定すれば、それにより食料、飼料、燃料などとして利用できる有機物を生産することができる。即ち、二酸化炭素そのものを資源として直接的に有価化学品に変換することができる。これにより、二酸化炭素の増加による地球温暖化と、食料、飼料、燃料の確保困難という2つの問題を共に解決できる。【００３１】
水素細菌は、水素と酸素の反応によって生じる化学エネルギーを利用し、二酸化炭素を唯一の炭素源として生育できる細菌であり、酸素、水素、及び二酸化炭素の混合ガスを原料として化学品を製造できるため、二酸化炭素を効率よく有機化することができ、また、単純な培地で培養することができる。一般的に水素細菌の生育は遅いが、水素細菌であるヒドロゲノフィラス属細菌は増殖速度が格段に速い。「三菱総合研究所報  No.34 1999」ではヒドロゲノフィラス属細菌を、『この増殖能力は植物の持つ炭酸固定能力とは比較出来ない程の高い効率であり、微生物の炭酸固定能力の高さを如実に物語っている』と評価している。【００３２】
ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するベクターを用いて異種遺伝子をヒドロゲノフィラス属細菌に自然界の塩基配列のまま導入しても、機能するタンパク質が発現しない場合が多い。本発明によれば、特定の遺伝子をヒドロゲノフィラス属細菌に導入することにより、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能し、イソブタノール、エタノール、又はアラニンを生成することができる。
上記の通り、ヒドロゲノフィラス属細菌は、二酸化炭素固定能力を有する生物の中でも、特に優れた二酸化炭素固定能力を有するため、本発明の形質転換体を用いれば、工業的に、二酸化炭素を固定してイソブタノール、エタノール、又はアラニンを製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）イソブタノール生成能を有する形質転換体
本発明のコドン最適化2-ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、ラクトコッカス  ラクティスの2-ケト酸デカルボキシラーゼのコドンを最適化したものであり、ラクトコッカス  ラクティスの2-ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子(kivD)とは塩基配列が異なっている。この遺伝子は、配列番号1の塩基配列からなるDNAである。このコドン最適化2-ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能して、2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を発現することができる。
なお、このコドン最適化2-ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子から発現する2-ケト酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列は、ラクトコッカス  ラクティスの2-ケト酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列（配列番号41）と同じである。
【００３４】
また、配列番号1と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらにより好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつ2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも、ヒドロゲノフィラス属細菌内で2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を発現させるために使用できる。
本発明において、塩基配列の同一性は、GENETYX ver.17（GENETYX 株式会社ゼネティックス製）により算出した値である。
【００３５】
また、配列番号1と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAを用いることもできる。
本発明において、「ストリンジェントな条件」は、6×SSCの塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、50〜60℃の温度条件下、16時間ハイブリダイゼーションを行い、0.1×SSCの塩濃度の溶液中で洗浄を行う条件をいう。
【００３６】
コドン最適化2-ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子（配列番号1）の上記ホモログの塩基配列は、コードする2-ケト酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列がラクトコッカス  ラクティスの2-ケト酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列（配列番号41）と同じである範囲で、配列番号1と異なっているのが望ましい。
本発明は、上記コドン最適化2-ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子又はそのホモログを含むベクター（特に、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するベクター）も包含する。
【００３７】
ヒドロゲノフィラス属細菌に、上記コドン最適化2-ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子又はそのホモログと共に、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより、ヒドロゲノフィラス属細菌はイソブタノールを生成するようになる。
従って、本発明は、宿主のヒドロゲノフィラス属細菌に、(a)(a1)配列番号1の塩基配列からなるDNA、(a2)配列番号1と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつ2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA、又は(a3)配列番号1と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA、及び(b)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子であるDNAを導入することにより得られる形質転換体を包含する。換言すれば、この形質転換体は、外来性の上記(a)及び(b)のDNAを有する。
【００３８】
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、イソブタノール生成効率が良い点で、(b1)クレブシェラ  ニューモニエのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(adhP)、ジオバチルス  サーモカテニュラタスのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(adhP)、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(adhP)遺伝子、及びジオバチルス  サーモグルコシダシウスのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(adhA)が好ましい。これらの遺伝子の塩基配列は、配列番号2、3、4、及び5である。
【００３９】
また、(b2)配列番号2、3、4、又は5と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらにより好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAや、(b3)配列番号2、3、4、又は5と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも好ましい。
【００４０】
また、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、(b4)配列番号6、7、8、又は9のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA、又は(b5)配列番号6、7、8、又は9と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらにより好ましくは99％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも好ましい。
配列番号6、7、8、及び9は、それぞれ、クレブシェラ  ニューモニエ、ジオバチルス  サーモカテニュラタス、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスのアルコールデヒドロゲナーゼADHP、及びジオバチルス  サーモグルコシダシウスのアルコールデヒドロゲナーゼADHAのアミノ酸配列である。
本発明において、アミノ酸配列の同一性は、GENETYX ver.17（GENETYX 株式会社ゼネティックス製）により算出した値である。
【００４１】
また、(b6)配列番号6、7、8、又は9のアミノ酸配列において1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも好ましい。
本発明において、複数個としては、1〜5個、中でも1〜3個、中でも1〜2個、特に1個が挙げられる。
【００４２】
本発明において、ある活性を有するポリペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合、置換後もそのポリペプチドがその活性を有するように（中でも、同程度の活性を有するように）置換するには、アミノ酸残基を化学的に類似した別のアミノ酸残基に置き換えればよい。例えば、ある疎水性アミノ酸残基を別の疎水性アミノ酸残基に置換したり、ある荷電アミノ酸残基を同じ電荷を有する別の荷電アミノ酸残基に置換することができる。このような置換を行うことができる化学的に類似したアミノ酸は、当業者によく知られている。非極性（疎水性）の側鎖を持つアミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられ、これらのアミノ酸間で置換可能である。極性の側鎖を持つアミノ酸の中で中性のものとしては、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられ、これらのアミノ酸間で置換可能である。正電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられ、これらのアミノ酸間で置換可能である。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられ、これらのアミノ酸間で置換可能である。
【００４３】
また本発明において、ある活性を有するポリペプチドをコードするDNA中のヌクレオチドを置換する場合、置換してもコードするポリペプチドのアミノ酸配列が変わらないように置換すれば、置換後もポリペプチドがその活性を有する（中でも、同程度の活性を有する）傾向にある。また、対応するアミノ酸残基が化学的に類似した別のアミノ酸残基に置換されるように、ヌクレオチドを置換すれば、置換後もそのポリペプチドがその活性を有する（中でも、同程度の活性を有する)傾向にある。
【００４４】
本発明において、ポリペプチドが2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有することは、被験ポリペプチドを、アルコールデヒドロゲナーゼ及びNADHの共存下で、2-ケトイソ吉草酸と反応させ、340nmの吸光度の減少を検出することにより確認する。2-ケト酸デカルボキシラーゼは、2-ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドを生成し、共存するアルコールデヒドロゲナーゼがイソブチルアルデヒドからイソブタノールを生成する。アルコールデヒドロゲナーゼがイソブチルアルデヒドからイソブタノールを生成する際にNADHを消費するため、NADH量の減少を340nmの吸光度減少を指標に検出する。具体的には、実施例の項目に記載の方法を実施する。被験ポリペプチドが少しでも340nmの吸光度を減少させれば2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性があると判定する。
【００４５】
また、本発明において、ポリペプチドがイソブチルアルデヒドを基質とするアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有することは、被験ポリペプチドを、NADHの共存下でイソブチルアルデヒドと反応させ、340nmの吸光度の減少を検出することにより確認する。アルコールデヒドロゲナーゼは、イソブチルアルデヒドからイソブタノールを生成し、それに伴いNADHがNADに変換されるため、NADH量の減少を340nmの吸光度減少を指標に検出する。具体的には、実施例の項目に記載の方法を実施する。被験ポリペプチドが少しでも340nmの吸光度を減少させればイソブチルアルデヒドを基質とするアルコールデヒドロゲナーゼ活性があると判定する。
【００４６】
（２）エタノール生成能を有する形質転換体
第1のエタノール生成能を有する形質転換体
本発明は、宿主のヒドロゲノフィラス属細菌に、(c)(c1)配列番号10の塩基配列からなるDNA、(c2)配列番号10と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上、中でも99％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA、又は(c3)配列番号10と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA、及び(b)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のDNAを導入することにより得られる形質転換体を包含する。換言すれば、この形質転換体は、外来性の(c)及び(b)のDNAを有する。この形質転換体は、(c)及び(b)のDNAを有することにより、エタノールを生成することができる。
【００４７】
配列番号10は、グルコノバクター  オキシダンスのピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pdc遺伝子)の塩基配列である。
【００４８】
また、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子としては、(c4)配列番号11のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA、(c5)配列番号11と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらにより好ましくは99％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA、又は(c6)配列番号11のアミノ酸配列において1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも用いることができる。
配列番号11は、グルコノバクター  オキシダンスのピルビン酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列である。
【００４９】
(b)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、エタノール生成効率が良い点で、(b1)クレブシェラ  ニューモニエのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(adhP)、ジオバチルス  サーモカテニュラタスのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(adhP)、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(adhP)遺伝子、及びジオバチルス  サーモグルコシダシウスのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(adhA)が好ましい。これらの遺伝子の塩基配列は、それぞれ、配列番号2、3、4、及び5である。
【００５０】
また、(b2)配列番号2、3、4、又は5と95％以上、中でも98％以上、中でも99％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも好ましく用いることができる。また、(b3)配列番号2、3、4、又は5と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも好ましく用いることができる。
【００５１】
また、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、(b4)配列番号6、7、8、又は9のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNAも好ましく用いることができる。さらに、(b5)配列番号6、7、8、又は9と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらにより好ましくは99％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAや、(b6)配列番号6、7、8、又は9のアミノ酸配列において1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも好ましく用いることができる。
配列番号6、7、8、及び9は、それぞれ、クレブシェラ  ニューモニエ、ジオバチルス  サーモカテニュラタス、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスのアルコールデヒドロゲナーゼADHP、及びジオバチルス  サーモグルコシダシウスのアルコールデヒドロゲナーゼADHAのアミノ酸配列である。
【００５２】
本発明において、ポリペプチドがピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有することは、被験ポリペプチドを、アルコールデヒドロゲナーゼ及びNADHの共存下でピルビン酸と反応させ、340nmの吸光度の減少を検出することにより確認する。ピルビン酸デカルボキシラーゼは、ピルビン酸からアセトアルデヒドを生成し、アルコールデヒドロゲナーゼはアセトアルデヒドからエタノールを生成する。アルコールデヒドロゲナーゼがアセトアルデヒドからエタノールを生成する際にNADHを消費するため、NADH量の減少を340nmの吸光度減少を指標に検出する。具体的には、実施例の項目に記載の方法を実施する。被験ポリペプチドが少しでも340nmの吸光度を減少させればピルビン酸デカルボキシラーゼ活性があると判定する。
【００５３】
また、本発明において、ポリペプチドがアセトアルデヒドを基質とするアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有することは、被験ポリペプチドを、NADHの共存下でアセトアルデヒドと反応させ、340nmの吸光度の減少を検出することにより確認する。アルコールデヒドロゲナーゼは、アセトアルデヒドからエタノールを生成し、それに伴いNADHがNADに変換されるため、NADH量の減少を340nmの吸光度減少を指標に検出する。具体的には、実施例の項目に記載の方法を実施する。被験ポリペプチドが少しでも340nmの吸光度を減少させればアセトアルデヒドを基質とするアルコールデヒドロゲナーゼ活性があると判定する。
【００５４】
第２のエタノール生成能を有する形質転換体
本発明は、宿主のヒドロゲノフィラス属細菌に、(d)アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のDNAを導入することにより得られる形質転換体を包含する。換言すれば、この形質転換体は、外来性の(d)アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のDNAを有する。この形質転換体は、(d)のDNAを有することにより、エタノールを生成することができる。
【００５５】
アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、エタノール生成効率が良い点で、(d1)エシェリヒア  コリのアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(adhE)、及びクロストリジウム  サーモセラムのアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(adhE)が好ましい。エシェリヒア  コリのadhEの塩基配列は、配列番号12であり、クロストリジウム  サーモセラムのadhEの塩基配列は、配列番号13である。
また、(d2)配列番号12又は13の塩基配列からなるDNAと90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上、中でも99％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAや、(d3)配列番号12又は13と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも好ましく用いることができる。
【００５６】
また、(d4)配列番号14又は15のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNAも好ましく用いることができる。さらに、(d5)配列番号14又は15と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上、中でも99％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAや、(d6)配列番号14又は15のアミノ酸配列において1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも好ましく用いることができる。
配列番号14は、エシェリヒア  コリのアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ(ADHE)のアミノ酸配列であり、配列番号15は、クロストリジウム  サーモセラムのアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ(ADHE)のアミノ酸配列である。
【００５７】
アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼは好気条件下で活性が阻害されるため、本発明では、ヒドロゲノフィラス属細菌内で、好気条件下で高活性を発現できるアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの使用を試みた。
その結果、エシェリヒア  コリのアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ(ADHE)のアミノ酸配列である配列番号14において、アミノ酸番号568のGluがLys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg、又はHisに置換された変異ADHEは、ヒドロゲノフィラス属細菌内で、好気条件下で高活性を発現できることが分かった。アミノ酸番号568のGluがそれぞれLys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg、及びHisに置換された変異ADHEのアミノ酸配列を配列番号16、17、18、19、20、21、22、及び23に示す。
中でも、配列番号14において、アミノ酸番号568のGluがLysに置換された配列番号16のアミノ酸配列からなる変異ADHE(E568K)が特に好ましい。
【００５８】
従って、本発明では、(d7)配列番号14において、アミノ酸番号568のGluがLys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg、又はHisに置換されたアミノ酸配列（配列番号16、17、18、19、20、21、22、又は23）からなるポリペプチドをコードするDNAを好ましく用いることができる。
【００５９】
また、(d8)配列番号14において、アミノ酸番号568のGluがLys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg、又はHisに置換されたアミノ酸配列（配列番号16、17、18、19、20、21、22、又は23）と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上、中でも99％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAや、(d9)配列番号14において、アミノ酸番号568のGluがLys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg、又はHisに置換されたアミノ酸配列（配列番号16、17、18、19、20、21、22、又は23）において1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも好ましく用いることができる。
但し、(d8)及び(d9)に記載のポリペプチドにおいて、アミノ酸番号568のアミノ酸は、それぞれ又は上記順で、Lys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg、又はHisである。
【００６０】
発現するアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの568番目のアミノ酸がLysとなる変異adhEの塩基配列は、エシェリヒア  コリのadhEの塩基配列である配列番号12において塩基番号1702〜1704のGAGがAAG又はAAAに置換された塩基配列である（塩基配列25又は26）。
また、発現するアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの568番目のアミノ酸がAlaとなるadhEの塩基配列は、配列番号12において塩基番号1702〜1704のGAGがGCT、GCC、GCA、又はGCGに置換された塩基配列である。
また、発現するアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの568番目のアミノ酸がLeuとなるadhEの塩基配列は、配列番号12において塩基番号1702〜1704のGAGがTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGに置換された塩基配列である。
また、発現するアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの568番目のアミノ酸がAsnとなるadhEの塩基配列は、配列番号12において塩基番号1702〜1704のGAGがAAT又はAACに置換された塩基配列である。
また、発現するアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの568番目のアミノ酸がGlyとなるadhEの塩基配列は、配列番号12において塩基番号1702〜1704のGAGがGGT、GGC、GGA、又はGGGに置換された塩基配列である。
また、発現するアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの568番目のアミノ酸がSerとなるadhEの塩基配列は、配列番号12において塩基番号1702〜1704のGAGがTCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGCに置換された塩基配列である。
また、発現するアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの568番目のアミノ酸がArgとなるadhEの塩基配列は、配列番号12において塩基番号1702〜1704のGAGがCGT、CGC、CGA、AGA、又はAGGに置換された塩基配列である。
また、発現するアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの568番目のアミノ酸がHisとなるadhEの塩基配列は、配列番号12において塩基番号1702〜1704のGAGがCAT又はCACに置換された塩基配列である。
中でも、ヒドロゲノフィラス属細菌によるエタノール生成効率が良い点で、配列番号25又は26が好ましく、配列番号25がより好ましい。
【００６１】
また、エシェリヒア  コリのアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ(ADHE)の配列番号14において、アミノ酸番号568のGluがLys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg、又はHisに置換された変異ADHEをコードする上記変異adhEの塩基配列と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上、中でも99％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA（エシェリヒア  コリの変異adhEのホモログ）や、エシェリヒア  コリのアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ(ADHE)の配列番号14において、アミノ酸番号568のGluがLys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg、又はHisに置換された変異ADHEをコードする上記変異adhEの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA（エシェリヒア  コリの変異adhEのホモログ）も好ましく用いることができる。
【００６２】
但し、エシェリヒア  コリの変異adhEの上記ホモログにおいて、エシェリヒア  コリの変異ADHEのアミノ酸番号568に対応する3ヌクレオチドの塩基配列は、エシェリヒア  コリの変異ADHEにおけるアミノ酸番号568のLys、Ala、Leu、Asn、Gly、Ser、Arg、又はHisに対応する何れかの3ヌクレオチドと同じである。
即ち、アミノ酸番号568がLysであるエシェリヒア  コリの変異ADHEをコードするDNAの上記ホモログにおいて塩基番号1702〜1704のヌクレオチドはAAG又はAAAである。
アミノ酸番号568がAlaであるエシェリヒア  コリの変異ADHEをコードするDNAのホモログにおいて塩基番号1702〜1704のヌクレオチドはGCT、GCC、GCA、又はGCGである。
アミノ酸番号568がLeuであるエシェリヒア  コリの変異ADHEをコードするDNAの上記ホモログにおいて塩基番号1702〜1704のヌクレオチドはTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、又はCTGである。
アミノ酸番号568がAsnであるエシェリヒア  コリの変異ADHEをコードするDNAの上記ホモログにおいて塩基番号1702〜1704のヌクレオチドはAAT又はAACである。
アミノ酸番号568がGlyであるエシェリヒア  コリの変異ADHEをコードするDNAの上記ホモログにおいて塩基番号1702〜1704のヌクレオチドはGGT、GGC、GGA、又はGGGである。
アミノ酸番号568がSerであるエシェリヒア  コリの変異ADHEをコードするDNAの上記ホモログにおいて塩基番号1702〜1704のヌクレオチドはTCT、TCC、TCA、TCG、AGT、又はAGCである。
アミノ酸番号568がArgであるエシェリヒア  コリの変異ADHEをコードするDNAの上記ホモログにおいて塩基番号1702〜1704のヌクレオチドはGCT、CGC、CGA、AGA、又はAGGである。
アミノ酸番号568がHisであるエシェリヒア  コリの変異ADHEをコードするDNAの上記ホモログにおいて塩基番号1702〜1704のヌクレオチドはCAT又はCACである。
【００６３】
また、クロストリジウム  サーモセラムのアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ(ADHE)のアミノ酸配列である配列番号15において、アミノ酸番号575のAspがAsnに置換された配列番号24のアミノ酸配列からなる変異ADHEは、ヒドロゲノフィラス属細菌内で、好気条件下で高活性を発現できることが分かった。
【００６４】
従って、本発明では、(d7)配列番号15において、アミノ酸番号575のAspがAsnに置換されたアミノ酸配列（配列番号24）からなるポリペプチドをコードするDNA（adhE(D575N)）を、好ましく、ヒドロゲノフィラス属細菌に導入することができる。
【００６５】
また、(d8)配列番号15においてアミノ酸番号575のAspがAsnに置換されたアミノ酸配列（配列番号24）と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上、中でも99％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（クロストリジウム  サーモセラムの変異ADHEのホモログ）をコードするDNAや、(d9)配列番号15においてアミノ酸番号575のAspがAsnに置換されたアミノ酸配列（配列番号24）において1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド（クロストリジウム  サーモセラムの変異ADHEのホモログ）をコードするDNAも好ましく用いることができる。
但し、(d8)及び(d9)に記載のクロストリジウム  サーモセラムの変異ADHEのホモログにおいて、アミノ酸番号575のアミノ酸はAsnである。
【００６６】
上記アミノ酸置換を生じる変異クロストリジウム  サーモセラムadhE遺伝子をヒドロゲノフィラス属細菌に導入することにより、得られた形質転換体は好気条件下でアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ活性を高発現できるようになる。
発現するアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼの575番目のアミノ酸がAsnとなる変異adhEの塩基配列は、クロストリジウム  サーモセラムのadhE遺伝子の塩基配列である配列番号13の塩基番号1723〜1725のGACがAAC又はAATに置換された塩基配列である（配列番号27又は28）。中でも、配列番号27の塩基配列からなるDNAが好ましい。
【００６７】
また、配列番号27又は28の塩基配列からなるDNAと90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上、中でも99％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA（クロストリジウム  サーモセラムの変異adhEのホモログ）や、配列番号27又は28と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA（クロストリジウム  サーモセラムの変異adhEのホモログ）も好ましく用いることができる。
但し、配列番号27又は28の塩基配列からなるクロストリジウム  サーモセラムの変異adhEのホモログにおいて、塩基番号1723〜1725のヌクレオチドはAAC又はAATである。
【００６８】
本発明は、(d7’)配列番号24のアミノ酸配列からなるポリペプチド、(d8’)配列番号24と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、又は(d9’)配列番号24のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドからなるアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼを提供する。但し、(d8’)及び(d9’)のポリペプチドのN末端から575番目のアミノ酸はAsnである。
このポリペプチドは、ヒドロゲノフィラス属細菌内で発現させて、エタノール生成に好適に用いることができ、或いは、酵素反応によるエタノール生成に用いることもできる。
【００６９】
また本発明は、(d10’)配列番号27、又は28の塩基配列からなるDNA、(d11’)配列番号27、又は28と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA、又は(d12’)配列番号配列番号27、又は28と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAからなるアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を提供する。但し、(d11’)及び(d12’)のDNAの5'末端から1723〜1725番目の3ヌクレオチドはAAC又はAATである。
また、本発明は、このアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクター（特に、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するベクター）を包含する。
このアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びそれを含むベクターは、ヒドロゲノフィラス属細に導入して、エタノール生成に好適に用いることができる。
【００７０】
アルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼは、アセチルCoAからアセトアルデヒドを生成する反応を触媒するアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性と、アセトアルデヒドからエタノールを生成する反応を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼ活性の両方を有する二機能性酵素である。
本発明では、被験ポリペプチドが、アセチルCoAを基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性とアセトアルデヒドを基質とするアルコールデヒドロゲナーゼ活性の両方を示す場合にアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼがあると判定する。
本発明において、ポリペプチドがアセチルCoAを基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有することは、被験ポリペプチドを、NADHの共存下でアセチルCoAと反応させ、340nmの吸光度の減少を検出することにより確認する。アルデヒドデヒドロゲナーゼは、アセチルCoAからアセトアルデヒドを生成し、それに伴いNADHがNADに変換されるため、NADH量の減少を340nmの吸光度減少を指標に検出する。被験ポリペプチドが少しでも340nmの吸光度を減少させればアセチルCoAを基質とするアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性があると判定する。
ポリペプチドがアセトアルデヒドを基質とするアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有することは、被験ポリペプチドを、NADHの共存下でアセトアルデヒドと反応させ、340nmの吸光度の減少を検出することにより確認する。アルコールデヒドロゲナーゼは、アセトアルデヒドからエタノールを生成し、それに伴いNADHがNADに変換されるため、NADH量の減少を340nmの吸光度減少を指標に検出する。具体的には、実施例の項目に記載の方法を実施する。被験ポリペプチドが少しでも340nmの吸光度を減少させればアセトアルデヒドを基質とするアルコールデヒドロゲナーゼ活性があると判定する。
【００７１】
（３）アラニン生成能を有する形質転換体
本発明は、宿主のヒドロゲノフィラス属細菌に、(e)アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより得られる形質転換体を包含する。換言すれば、この形質転換体は、外来性のアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を有する。ヒドロゲノフィラス属細菌は生存に必要な分のアラニンを生成するが、その量は工業的に利用できるものではない。本発明の形質転換体は、外来性のアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を有することにより、アラニンの生成量が向上している。
【００７２】
アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、アラニン生成効率が良い点で、(e1)ジオバチルス  ステアロサーモフィラスのアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子(alaD1)、ジオバチルス  ステアロサーモフィラスのアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子(alaD2)、サーマス  サーモフィラスのアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子(alaD1)、サーマス  サーモフィラスのアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子(alaD2)が好ましい。
ジオバチルス  ステアロサーモフィラスのalaD1の塩基配列は配列番号29であり、ジオバチルス  ステアロサーモフィラスのalaD2の塩基配列は配列番号30である。また、サーマス  サーモフィラスのalaD1の塩基配列は配列番号31であり、サーマス  サーモフィラスのalaD2の塩基配列は配列番号32である。
中でも、ジオバチルス  ステアロサーモフィラスのalaD2（配列番号30）が、特にヒドロゲノフィラス属細菌内でアラニンデヒドロゲナーゼ活性を高発現するため好ましい。
【００７３】
また、本発明では、(e2)配列番号29、30、31、又は32と95％以上、中でも98％以上、中でも99％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも好ましく用いることができる。また、(e3)配列番号29、30、31、又は32と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも好ましく用いることができる。
【００７４】
また、本発明では、アラニン生成効率が良い点で、(e4)配列番号33、34、35、又は36のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNAを好ましく用いることができる。さらに、(e5)配列番号33、34、35、又は36と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上、中でも99％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAや、(e6)配列番号33、34、35、又は36のアミノ酸配列において1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAも好ましく用いることができる。
配列番号33は、ジオバチルス  ステアロサーモフィラスのアラニンデヒドロゲナーゼALAD1のアミノ酸配列であり、配列番号34は、ジオバチルス  ステアロサーモフィラスのアラニンデヒドロゲナーゼALAD2のアミノ酸配列である。また、配列番号35は、サーマス  サーモフィラスのアラニンデヒドロゲナーゼALAD1のアミノ酸配列であり、配列番号36は、サーマス  サーモフィラスのアラニンデヒドロゲナーゼALAD2のアミノ酸配列である。
中でも、ジオバチルス  ステアロサーモフィラスのアラニンデヒドロゲナーゼALAD2が好ましい。
【００７５】
本発明では、アラニンデヒドロゲナーゼのN末端にマルトース結合タンパク質のN末端部分（配列番号37）を付加した修飾アラニンデヒドロゲナーゼが、ヒドロゲノフィラス属細菌において、一層高活性を発現することを見出した。従って、本発明は、ヒドロゲノフィラス属細菌に、アラニンデヒドロゲナーゼのN末端にマルトース結合タンパク質のN末端部分（配列番号37）を付加した修飾アラニンデヒドロゲナーゼをコードするDNA（修飾アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子）を導入することにより得られる形質転換体を提供する。即ち、ヒドロゲノフィラス属細菌に、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’末端にマルトース結合タンパク質のN末端部分をコードするDNA（配列番号38）を付加した修飾アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより得られる形質転換体を提供する。
この場合、マルトース結合タンパク質のN末端部分のC末端がアラニンデヒドロゲナーゼのN末端と連結するように付加する。また、マルトース結合タンパク質のN末端部分をコードするDNAの3’末端がアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’末端と連結するように付加する。
【００７６】
中でも、ジオバチルス  ステアロサーモフィラスのアラニンデヒドロゲナーゼALAD1、ALAD2、サーマス  サーモフィラスのアラニンデヒドロゲナーゼALAD1、ALAD2のN末端にマルトース結合タンパク質のN末端部分（配列番号37）を付加したものが好ましく、ジオバチルス  ステアロサーモフィラスのアラニンデヒドロゲナーゼALAD2（配列番号34）のN末端にマルトース結合タンパク質のN末端部分（配列番号37）を付加したものがより好ましい。
詳述すれば、(e7)配列番号33、34、35、又は36のアミノ酸配列のN末端にマルトース結合タンパク質のN末端部分のアミノ酸配列（配列番号37）が付加された修飾アミノ酸配列をコードするDNAをヒドロゲノフィラス属細菌の形質転換に好ましく用いることができる。ジオバチルス  ステアロサーモフィラスのアラニンデヒドロゲナーゼALAD2（配列番号34）のN末端にマルトース結合タンパク質のN末端部分（配列番号37）を付加した修飾アラニンデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は配列番号39である。
【００７７】
さらに、(e8)配列番号33、34、35、又は36と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上、中でも99％以上の同一性を有するアミノ酸配列のN末端にマルトース結合タンパク質のN末端部分のアミノ酸配列（配列番号番号37）が付加されたアミノ酸配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAや、(e9)配列番号33、34、35、又は36において1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列のN末端にマルトース結合タンパク質のN末端部分のアミノ酸配列（配列番号番号37）が付加されたアミノ酸配列からなり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAを用いることもできる。
【００７８】
また、(e10)配列番号29、30、31、又は32の塩基配列の5’末端に、マルトース結合タンパク質のN末端部分をコードする塩基配列（配列番号38）が付加された塩基配列からなるDNAを用いることもできる。中でも、ジオバチルス  ステアロサーモフィラスのalaD2の塩基配列である配列番号30の5’末端に、マルトース結合タンパク質のN末端部分の塩基配列（配列番号38）が付加された塩基配列からなるDNA（配列番号40）が好ましい。
さらに、(e11)配列番号29、30、31、又は32と90％以上、中でも95％以上、中でも98％以上、中でも99％以上の同一性を有する塩基配列の5’末端に、マルトース結合タンパク質のN末端部分をコードする塩基配列（配列番号38）が付加された塩基配列からなるDNAであり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAや、(e12)配列番号29、30、31、又は32と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAの塩基配列の5’末端に、マルトース結合タンパク質のN末端部分をコードする塩基配列（配列番号38）が付加された塩基配列からなるDNAであり、かつアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAを用いることもできる。
【００７９】
本発明は、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子の5’末端にマルトース結合タンパク質のN末端部分（配列番号37）をコードするポリヌクレオチド（配列番号38）を付加した修飾アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を包含する。修飾アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子の具体例や、好ましい修飾アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ヒドロゲノフィラス属細菌の形質転換に用いる修飾アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子について述べたとおりである。また、本発明は、この修飾アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクター（特に、ヒドロゲノフィラス属細菌内で機能するベクター）を包含する。
この修飾アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子、及びそれを含むベクターは、ヒドロゲノフィラス属細菌に導入して、アラニンを生成させるのに好適に使用できる。
【００８０】
また、本発明は、アラニンデヒドロゲナーゼのN末端にマルトース結合タンパク質のN末端部分（配列番号37）を付加した修飾アラニンデヒドロゲナーゼを包含する。修飾アラニンデヒドロゲナーゼの具体例や、好ましい修飾アラニンデヒドロゲナーゼは、ヒドロゲノフィラス属細菌の形質転換に用いる修飾アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子がコードする修飾アラニンデヒドロゲナーゼについて述べたとおりである。
この修飾アラニンデヒドロゲナーゼは、ヒドロゲノフィラス属細菌内で発現させて、アラニン生成に好適に用いることができ、或いは、酵素反応によるアラニン生成に用いることもできる。
【００８１】
本発明において、ポリペプチドがアラニンデヒドロゲナーゼ活性を有することは、被験ポリペプチドを、NADHの共存下でピルビン酸及び塩化アンモニウムと反応させ、340nmの吸光度の減少を検出することにより確認する。アラニンデヒドロゲナーゼは、ピルビン酸とアンモニアからアラニンを生成し、それに伴いNADHがNADに変換されるため、NADH量の減少を340nmの吸光度減少を指標に検出する。具体的には、実施例の項目に記載の方法を実施する。被験ポリペプチドが少しでも340nmの吸光度を減少させればアラニンデヒドロゲナーゼ活性があると判定する。
【００８２】
本発明において、ある活性を有するポリペプチドをコードするDNAの「ホモログ」は、そのDNAに類似した塩基配列を有し（中でも、そのDNAの塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなり）、かつその活性を有するポリペプチドをコードするDNA、又はそのDNAの塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつその活性を有するポリペプチドをコードするDNAをいう。
また、本発明において、ある活性を有するポリペプチドの「ホモログ」は、そのポリペプチドに類似したアミノ酸配列を有し（中でも、そのポリペプチドのアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつその活性を有するポリペプチドや、そのポリペプチドのアミノ酸配列において1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつその活性を有するポリペプチドをいう。
【００８３】
（４）形質転換体の製造方法
次に、ヒドロゲノフィラス属細菌に、上記イソブタノール生成のための遺伝子、上記エタノール生成のための遺伝子、又は上記アラニン生成のための遺伝子を導入して形質転換体を得る方法について説明する。
宿主
ヒドロゲノフィラス属細菌としては、ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス（Hydrogenophilus thermoluteolus）、ヒドロゲノフィラス  ハロラブダス（Hydrogenophilus halorhabdus）、ヒドロゲノフィラス  デニトリフィカンス（Hydrogenophilus denitrificans）、ヒドロゲノフィラス  ハルシ（Hydrogenophilus hirschii）、ヒドロゲノフィラス  アイランディカス（Hydrogenophilus islandicus）、ヒドロゲノフィラス属細菌Mar3株（Hydrogenophilus sp. Mar3）が挙げられる。中でも、炭酸固定微生物としてトップレベルの生育速度ひいては炭酸固定能力を有する点で、ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスが好ましい。
ヒドロゲノフィラス属細菌は地球上のいたる所から簡単に分離できる。ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスの好ましい株として、TH-1（NBRC 14978）株が挙げられる。ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスTH-1（NBRC 14978）株は、炭酸固定微生物としてトップの生育速度を示す〔Agricultural and Biological Chemistry, 41, 685-690 (1977)〕。ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスNBRC 14978株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されており、公に利用可能である。
【００８４】
形質転換
上記DNAを宿主に導入するためのプラスミドベクターは、ヒドロゲノフィラス属細菌内での自律複製機能を司るDNAを含めば良く、例えば、広宿主域ベクターであるpRK415(GenBank: EF437940.1)、pBHR1(GenBank: Y14439.1)、pMMB67EH(ATCC 37622)、pCAR1(NCBI Reference Sequence: NC_004444.1) 、pC194(NCBI Reference Sequence: NC_002013.1)、pK18mobsacB(GenBank: FJ437239.1)、pUB110(NCBI Reference Sequence: NC_001384.1)などが挙げられる。
また、好ましいプロモーターとしては、tacプロモーター、lacプロモーター、trcプロモーター、又はOxford Genetics社OXB1,OXB11〜OXB20の各プロモーターなどが挙げられ、好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnB T1T2 ターミネーター、バクテリオファージλt0転写ターミネーターなどが挙げられる。
形質転換は、塩化カルシウム法、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション法、電気パルス法などの公知の方法で行える。
【００８５】
ヒドロゲノフィラス属細菌は独立栄養条件で生育するが、従属栄養条件でも生育できるため、ヒドロゲノフィラス属細菌の宿主及び形質転換体の培養に用いる培地は、無機培地及び有機培地の何れであってもよい。糖、有機酸、アミノ酸などを含む有機培地を用いることができる。培地のpHは、6.2〜8程度とすればよい。
何れの場合も、水素、酸素、及び二酸化炭素を含む混合ガス、好ましくは水素、酸素、及び二酸化炭素からなる混合ガスを供給しながら培養すればよい。有機培地を使用する場合は、水素、酸素、及び二酸化炭素を含む混合ガス、例えば空気の通気で良い。二酸化炭素ガスを供給しない場合は、炭素源として炭酸塩を含む培地を用いればよい。混合ガスは、密閉された培養容器に封入又は連続供給して、振盪培養することで培地内に溶解させてもよく、培養容器を密閉型又は開放型とし、かつバブリングにより培地内に溶解させてもよい。
供給ガス中の水素、酸素、二酸化炭素の容量比（水素：酸素：二酸化炭素）は、1.75〜7.5：1：0.25〜3が好ましく、5〜7.5：1：1〜2がより好ましく、6.25〜7.5：1：1.5がさらにより好ましい。また、ヒドロゲノフィラス属細菌は好熱細菌であるため、培養温度は、35〜55℃が好ましく、37〜52℃がより好ましく、50〜52℃がさらにより好ましい。
【００８６】
（５）イソブタノール、エタノール、又はアラニンの製造方法
上記説明したヒドロゲノフィラス属細菌形質転換体を用いてイソブタノール、エタノール、又はアラニンを製造するに当たっては、水素、酸素、及び二酸化炭素を含む混合ガスを供給しながら、無機培地又は有機培地を用いて形質転換体を培養すればよい。
供給されるガスは、水素、酸素、及び二酸化炭素からなる混合ガスとすることが好ましいが、効率的にイソブタノール、エタノール、又はアラニンを生成できる範囲で異種ガスが混入していてもよい。
ヒドロゲノフィラス属細菌は、水素をエネルギー源として、二酸化炭素を唯一の炭素源として生育できるため、特に、炭素源として実質的に二酸化炭素だけを用いて（特に、二酸化炭素だけを用いて）上記化合物を製造することにより、効率的に二酸化炭素を固定できる。従って、有機物や炭酸塩などの炭素源を含まない無機培地を用いること、即ち、実質的に二酸化炭素だけを炭素源として（特に、二酸化炭素だけを炭素源として）培養することが好ましい。「炭素源として実質的に二酸化炭素だけを用いる」ことは、不可避の量の他の炭素源が混入する場合も包含する。なお、二酸化炭素を供給せず、糖、有機酸、アミノ酸などの有機物や炭酸塩を含む培地を用いることもできる。
培地のpHは、6.2〜8が好ましく、6.4〜7.4がより好ましく、6.6〜7がさらにより好ましい。この範囲であれば、菌の生育及び混合ガスの培地中への溶解が良く、目的化合物を効率よく製造できる。
【００８７】
バッチ培養の場合は、混合ガスを密閉された培養容器に封入して静置培養又は振盪培養すればよく、連続培養の場合は、混合ガスを密閉された培養容器に連続供給しながら振盪培養するか、又は密閉された培養容器を用いてバブリングにより混合ガスを培地内に導入しながら形質転換体を培養すればよい。混合ガスの培地中への溶解が良くなる点で振盪培養が好ましい。
供給ガス中の水素、酸素、二酸化炭素の容量比（水素：酸素：二酸化炭素）は、1.75〜7.5：1：0.25〜3が好ましく、5〜7.5：1：1〜2がより好ましく、6.25〜7.5：1：1.5がさらにより好ましい。この範囲であれば、菌の生育が良く、目的化合物を効率よく製造できる。
混合ガス又は原料ガスの供給速度は、培地1L当たり、10.5〜60 L／時間、中でも10.5〜40 L／時間、中でも10.5〜21 L／時間とすればよい。この範囲であれば、形質転換体の生育が良く、目的化合物を効率よく製造できると共に、混合ガスの無駄が抑えられる。
培養温度は、35〜55℃が好ましく、37〜52℃がより好ましく、50〜52℃がさらにより好ましい。この範囲であれば、形質転換体の生育が良く、目的化合物を効率よく製造できる。
【００８８】
目的化合物の回収
上記のようにして培養することにより、反応液中に目的化合物であるイソブタノール、エタノール、又はアラニンが生成される。反応液を回収することにより目的化合物を回収できるが、さらに、公知の方法で目的化合物を反応液から分離することもできる。そのような公知の方法として、エタノール、イソブタノールについては、分留、抽出、超音波霧化分離などが挙げられ、アラニンについては、各種クロマトグラフィー、晶析などが挙げられる。
【実施例】
【００８９】
（１）プラスミドベクターの構築
イソブタノール生成能付与のための遺伝子、エタノール生成能付与のための遺伝子、及びアラニン生成能付与のための遺伝子の導入に共通して用いたプラスミドベクターの構築方法を、以下に説明する。
先ず、広宿主域ベクターpRK415(GenBank: EF437940.1)〔Gene, 70, 191-197 (1998)〕を鋳型として、PCRを行った。テトラサイクリン遺伝子領域を除く残りのプラスミド領域のDNA断片を増幅すべく、下記の一対のプライマーを合成し、使用した。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。
pRK415プラスミド配列増幅用プライマー
(a-1) 5’-CGTGGCCAACTAGGCCCAGCCAGATACTCCCGATC-3’（配列番号42）
(b-1) 5’-TGAGGCCTCATTGGCCGGAGCGCAACCCACTCACT-3’（配列番号43）
なお、プライマー(a-1)及び(b-1)には、SfiI制限酵素部位が付加されている。【００９０】
ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子（以下、「nptII」と言うことがある）配列を含有するプラスミドpK18mobsacB(GenBank: FJ437239.1)〔Gene, 145, 69-73 (1994)〕を鋳型として、常法によりPCRを行った。PCRに際して、nptII遺伝子配列を含むDNA断片を増幅するべく、下記の一対のプライマーを合成し、使用した。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。
nptII遺伝子配列増幅用プライマー
(a-2) 5’-ctgGGCCTAGTTGGCCacgtagaaagccagtccgc-3’（配列番号44）
(b-2) 5’-tccGGCCAATGAGGCCtcagaagaactcgtcaaga-3’（配列番号45）
なお、プライマー(a-2)及び(b-2)には、SfiI制限酵素部位が付加されている。【００９１】
上記各PCRで生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した結果、pRK415プラスミドを鋳型とした場合は約8.7-kbのDNA断片が検出され、nptII遺伝子を鋳型とした場合は約1.1-kbのDNA断片が検出された。
このようにして調製したDNA断片をそれぞれ制限酵素SfiIで切断し、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製)を反応させてライゲーション液を得た。得られたライゲーション液で、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159-162 (1970)〕によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシンを含むLB寒天培地に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出した。このプラスミドDNAを制限酵素SfiIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、pRK415プラスミドに由来する約2.0-kb及び3.0-kb及び3.7-kbのDNA断片に加え、nptII遺伝子配列の約1.1-kb DNA断片が認められた。
構築されたプラスミドをpCYK01と命名した。【００９２】
（２）遺伝子発現用クローニングベクターの構築
(2-1)λt0ターミネーター配列のDNA断片の調製
λt0ターミネーター配列のDNAを作成するため、下記の一対のプライマーを合成し、PCRに使用した。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて行った。各プライマー同士のエクステンションとするため、鋳型のDNAは含んでいない。
λt0ターミネーター配列調製用プライマー
(a-3) 5’-GCATTAATCcttggactcctgttgatagatccagtaatgacctcagaactccatctggatttgttcagaacgctcggttgccg -3’（配列番号46）
(b-3) 5’-caccgtgcagtcgatgGATctggattctcaccaataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgaacaaatccagatggag -3’（配列番号47）
プライマー(a-3)及び(b-3)の3’側の塩基配列は互いに相補的になっている。
生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した結果、λt0ターミネーター配列に相当する、約0.13-kbのDNA断片が検出された。【００９３】
(2-2)tacプロモーター配列のDNA断片の調製
Tacプロモーターを含有するプラスミドpMAL-c5X(ニュー・イングランド・バイオラボ社製)を鋳型として、PCRを行った。PCRに際して、tacプロモーター配列を増幅するべく、下記の一対のプライマーを合成し、使用した。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法で行った。
tacプロモーター配列増幅用プライマー
(a-4) 5’-TTATTGGTGAGAATCCAGATCCATCGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCT-3’（配列番号48）
(b-4) 5’-gcaagcttggagtgatcatcgtATGCATATGCGTTTCTCCTCCAGATCCctgtttcctgtgtgaaattgt
-3’（配列番号49）
生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した結果、tacプロモーターに相当する約0.3-kbのDNA断片が検出された。【００９４】
(2-3)λt0ターミネーター及びtacプロモーター配列の導入
上記(2-1)及び(2-2)で調製したDNA断片をアガロースゲルから切り出し、ゲルを凍結及び融解することで、ゲルからDNAを回収した。回収したλt0ターミネーター配列及びtacプロモーター配列に相当するDNA断片を混合して鋳型とし、オーバーラップエクステンションPCR（overlap extension PCR）を行った。オーバーラップエクステンションPCRに際しては、λt0ターミネーターの下流にtacプロモーターが連結したDNAを作成するべく、上記の(a-3)と(b-4)のプライマーの組み合わせを使用した。なお、鋳型DNA断片を増幅する際に用いたプライマーである(b-3)及び(a-4)の5’側の塩基配列は互いに相補的になっている。また、プライマー(a-3)及び(b-4)には、それぞれPshBI、HindIII制限酵素部位が付加されている。
生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した結果、λt0ターミネーターの下流にtacプロモーターが連結したDNAに相当する、約0.4-kbのDNA断片が検出された。【００９５】
PCRにより増幅した、λt0ターミネーターの下流にtacプロモーターが連結した約0.4-kbのDNA断片及び上述のクローニングベクターpCYK01の約9.8-kbのDNA断片を、制限酵素PshBI及びHindIIIで切断し、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。
得られたライゲーション液で、塩化カルシウム法によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシンを含むLB寒天培地に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出した。このプラスミドDNAを制限酵素PshBI及びHindIIIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCYK01の約9.6-kbのDNA断片に加え、λt0ターミネーターの下流にtacプロモーターが連結した約0.4-kbのDNA断片が認められた。【００９６】
(2-4)rrnB T1T2双方向ターミネーター（以下、「rrnBターミネーター」と言うことがある）の導入
rrnBターミネーター配列を含有するプラスミドpMAL-c5X(ニュー・イングランド・バイオラボ社製)を鋳型として、PCRを行った。PCRに際して、rrnBターミネーター配列を増幅するべく、下記の一対のプライマーを合成し、使用した。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法で行った。
rrnBターミネーター配列増幅用プライマー
(a-5) 5’-ctcgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtg-3’（配列番号50）
(b-5) 5’-CGCAATTGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATC-3’（配列番号51）
なお、プライマー(a-5)及び(b-5)には、それぞれ、EcoRI及びMunI制限酵素部位が付加されている。
生成した反応液を1%アガロースゲルにより電気泳動に供した結果、rrnBターミネーター配列に相当する約0.6-kbのDNA断片が検出された。【００９７】
上記のPCRにより増幅したrrnBターミネーター配列を含む約0.6-kbのDNA断片を制限酵素EcoRI及びMunIで切断し、上記(2-3)で作成した約10.0-kbのプラスミドのDNA断片を制限酵素EcoRIで切断し、T4 DNAリガーゼ(タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。
得られたライゲーション液で、塩化カルシウム法によりエシェリヒア コリJM109を形質転換し、カナマイシンを含むLB寒天培地に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出し、このプラスミドを制限酵素EcoRI及びMunIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、上記(2-3)のプラスミドの約10.0-kbのDNA断片に加え、rrnBターミネーター配列に相当する約0.6-kbのDNA断片が認められた。
構築された遺伝子発現用クローニングベクターをpCYK21と命名した。【００９８】
（３）イソブタノール生成能を有する形質転換体
(3-1)ラクトコッカス  ラクティスの2-ケト酸 デカルボキシラーゼ遺伝子のコドン最適化
ラクトコッカス  ラクティスの2-ケト酸 デカルボキシラーゼ(2-keto acid decarboxylase)をコードする遺伝子kivDのコドン使用をヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスTH-1株(NBRC 14978)のコドン使用頻度に最適化し、その塩基配列のDNA断片（配列番号1）をジェンスクリプトジャパン株式会社にて遺伝子合成した。
合成したコドン最適化遺伝子の約1.7-kbのDNA断片及び上述のクローニングベクターpCYK21の約10.6-kbのDNA断片を各々制限酵素NdeI及びHindIIIで切断し、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。【００９９】
得られたライゲーション液で、電気パルス法（エレクトロポレーション法）により、ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスTH-1株(NBRC 14978)を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むA固体培地〔(NH4)2SO4   3.0 g、KH2PO4  1.0 g、K2HPO4  2.0 g、NaCl  0.25 g、FeSO4・7H2O  0.014 g、MgSO4・7H2O  0.5 g、CaCl2  0.03 g、MoO3  4.0 mg、ZnSO4・7H2O  28 mg、CuSO4・5H2O  2.0 mg、H3BO3  4.0 mg、MnSO4・5H2O  4.0 mg、CoCl2・6H2O  4.0 mg、寒天 15gを蒸留水1Lに溶解(pH 7.0)〕に塗布し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
A固体培地上の生育株をカナマイシン50μg/mlを含むA液体培地〔(NH4)2SO4   3.0 g、KH2PO4  1.0 g、K2HPO4  2.0 g、NaCl  0.25 g、FeSO4・7H2O  0.014 g、MgSO4・7H2O  0.5 g、CaCl2  0.03 g、MoO3  4.0 mg、ZnSO4・7H2O  28 mg、CuSO4・5H2O  2.0 mg、H3BO3  4.0 mg、MnSO4・5H2O  4.0 mg、CoCl2・6H2O  4.0 mgを蒸留水1Lに溶解(pH 7.0)〕5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、このプラスミドを制限酵素NdeI及びHindIIIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCYK21の約10.6-kbのDNA断片に加え、コドン最適化遺伝子の約1.7-kbのDNA断片が認められた。
コドン最適化ラクトコッカス  ラクティスkivD遺伝子を含むプラスミドをpC-opt-kivDと命名した。pC-opt-kivDを有するヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス組み換え株をKDC01株と命名した。【０１００】
(3-2)比較例の2-ケト酸 デカルボキシラーゼ遺伝子のクローニング
ラクトコッカス  ラクティスNBRC 100933、バチルス  サブチリスNBRC 13719、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスNBRC 107763、ジオバチルス  サーモデニトリフィカンスATCC 29492、及びクレブシェラ  ニューモニエNBRC 14940から、常法に従い、ゲノムDNAを抽出した。【０１０１】
上記5種のゲノムDNAのそれぞれを鋳型として用いて、ラクトコッカス  ラクティスの2-ケト酸 デカルボキシラーゼ遺伝子kivDを含むDNA断片、バチルス  サブチリスの2-ケト酸 デカルボキシラーゼ活性を有するアセト乳酸合成酵素（Acetolactate synthase）遺伝子alsSを含むDNA断片、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスの2-ケト酸 デカルボキシラーゼ活性を有するアセト乳酸合成酵素遺伝子Geoth_3495を含むDNA断片、ジオバチルス  サーモデニトリフィカンスの2-ケト酸 デカルボキシラーゼ活性を有するアセト乳酸合成酵素遺伝子Gtng_0348を含むDNA断片、及びクレブシェラ  ニューモニエの2-ケト酸 デカルボキシラーゼ活性を有するインドールピルビン酸デカルボキシラーゼ（Indolepyruvate decarboxylase）遺伝子ipdCを含むDNA断片をPCR法により増幅した。PCRには、以下のプライマーを用いた。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。【０１０２】
ラクトコッカス  ラクティスkivD遺伝子増幅用プライマー
(a-6)  5’-GCACATATGTATACAGTAGGAGATTACCTATTAGA-3’（配列番号52）
(b-6)  5’-GCAGGATCCTTATGATTTATTTTGTTCAGCAAATA-3’（配列番号53）
なお、プライマー(a-6)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-6)には、BamHI制限酵素部位が付加されている。
バチルス  サブチリスalsS遺伝子増幅用プライマー
(a-7)  5’-GCACATATGACAAAAGCAACAAAAGAACAAAAATC-3’（配列番号54）
(b-7)  5’-GCAGGATCCTAGAGAGCTTTCGTTTTCATGAGTTC-3’（配列番号55）
なお、プライマー(a-7)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-7)には、BamHI制限酵素部位が付加されている。
ジオバチルス  サーモグルコシダシウスGeoth_3495遺伝子増幅用プライマー
(a-8)  5’-CGAGTCCATATGAAACAGACTATCCGCAATATCAG-3’（配列番号56）
(b-8)  5’-GCAGGATCCTTACCGAGAATTCGAGCGCTTTCGCA-3’（配列番号57）
なお、プライマー(a-8)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-8)には、BamHI制限酵素部位が付加されている。
ジオバチルス  サーモデニトリフィカンスGtng_0348遺伝子増幅用プライマー
(a-9)  5’-CGAGTCCATATGAAAAAGCGGGTGATGCGTGGCCT-3’（配列番号58）
(b-9)  5’-GCAGGATCCTCATCTGTCTGACAGTCTCATCGTCA-3’（配列番号59）
なお、プライマー(a-9)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-9)には、BamHI制限酵素部位が付加されている。
クレブシェラ  ニューモニエipdC遺伝子増幅用プライマー
(a-10)  5’-CGAGTCCATATGCAACCGACCTACACTATTGGGGA-3’（配列番号60）
(b-10)  5’-CGCGGATCCTTAAACGCGGCTGTTTCGCTCCTCAA-3’（配列番号61）
なお、プライマー(a-10)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-10)には、BamHI制限酵素部位が付加されている。【０１０３】
生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供し、ラクトコッカス  ラクティスkivD遺伝子、バチルス  サブチリスalsS遺伝子、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスGeoth_3495遺伝子、ジオバチルス  サーモデニトリフィカンスGtng_0348遺伝子、クレブシェラ  ニューモニエipdC遺伝子のそれぞれについて、約1.7-kbのDNA断片が検出された。【０１０４】
上記PCRにより増幅したラクトコッカス  ラクティスkivD遺伝子、バチルス  サブチリスalsS遺伝子、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスGeoth_3495遺伝子、ジオバチルス  サーモデニトリフィカンスGtng_0348遺伝子、クレブシェラ  ニューモニエipdC遺伝子のそれぞれを含む約1.7-kbのDNA断片及び上述のクローニングベクターpCYK21の約10.6-kbのDNA断片を、各々制限酵素NdeI及びBamHIで切断し、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。【０１０５】
得られたライゲーション液で、電気パルス法により、ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスTH-1株(NBRC 14978)を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むA固体培地に塗布し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
A固体培地上の各生育株をカナマイシン50μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、これらのプラスミドを制限酵素NdeI及びBamHI切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCYK21の約10.6-kbのDNA断片に加え、ラクトコッカス  ラクティスkivD遺伝子、バチルス  サブチリスalsS遺伝子、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスGeoth_3495遺伝子、ジオバチルス  サーモデニトリフィカンスGtng_0348遺伝子、クレブシェラ  ニューモニエipdC遺伝子のそれぞれの長さ約1.7-kbの挿入断片が認められた。【０１０６】
ラクトコッカス  ラクティスkivD遺伝子を含むプラスミドをpC-Lla-kivD、バチルス  サブチリスalsS遺伝子を含むプラスミドをpC-Bsu-alsS、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスGeoth_3495遺伝子を含むプラスミドをpC-Gtg-3495、ジオバチルス  サーモデニトリフィカンスGtng_0348遺伝子を含むプラスミドをpC-Gtd-0348、クレブシェラ  ニューモニエipdC遺伝子を含むプラスミドをpC-Kpn-ipdCと命名した。【０１０７】
(3-3)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
クレブシェラ  ニューモニエNBRC 14940、ジオバチルス  サーモカテニュラタスNBRC 15316、及びジオバチルス  サーモグルコシダシウスNBRC 107763から、常法に従い、ゲノムDNAを抽出した。【０１０８】
上記3種のゲノムDNAのそれぞれを鋳型として用いて、クレブシェラ  ニューモニエのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子adhPを含むDNA断片、ジオバチルス  サーモカテニュラタスのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子adhPを含むDNA断片、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子adhPを含むDNA断片、及びジオバチルス  サーモグルコシダシウスのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子adhAを含むDNA断片をPCR法により増幅した。PCRには、以下のプライマーを用いた。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。【０１０９】
クレブシェラ  ニューモニエadhP遺伝子増幅用プライマー
(a-11)  5’-CGAGTCCATATGAAGGCAGCTGTTGTTACCCACGA-3’（配列番号62）
(b-11)  5’-CGCGAATTCTTAGCTACGCAGATCGATAACCATAC-3’（配列番号63）
なお、プライマー(a-11)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-11)には、EcoRI制限酵素部位が付加されている。
ジオバチルス  サーモカテニュラタスadhP遺伝子増幅用プライマー
(a-12)  5’-CGAGTCCATATGAAAGCCGCCGTTGTTCACAAATT-3’（配列番号64）
(b-12)  5’-GCAGGATCCTTACATTGTTAAAACAATGCGGCCAT-3’（配列番号65）
なお、プライマー(a-12)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-12)には、BamHI制限酵素部位が付加されている。
ジオバチルス  サーモグルコシダシウスadhP遺伝子増幅用プライマー
(a-13)  5’-CGAGTCCATATGAAAGCGGCAGTTGTCAACGATTT-3’（配列番号66）
(b-13)  5’-CGCGAATTCTTAACGGTTGACACCGATGGTTAAAA-3’（配列番号67）
なお、プライマー(a-13)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-13)には、EcoRI制限酵素部位が付加されている。
ジオバチルス  サーモグルコシダシウスadhA遺伝子増幅用プライマー
(a-14)  5’-CGAGTCCATATGAAAGCACTTACATACCTAGGGCC-3’（配列番号68）
(b-14)  5’-GCAGGATCCTTAACTGTTGGAAATAATGACTTTTA-3’（配列番号69）
なお、プライマー(a-14)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-14)には、BamHI制限酵素部位が付加されている。【０１１０】
生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供し、クレブシェラ  ニューモニエadhP遺伝子、ジオバチルス  サーモカテニュラタスadhP遺伝子、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスadhP遺伝子、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスadhA遺伝子のそれぞれについて、約1.0-kbのDNA断片が検出された。【０１１１】
上記PCRにより増幅したジオバチルス  サーモカテニュラタスadhP遺伝子、及びジオバチルス  サーモグルコシダシウスadhA遺伝子のそれぞれを含む約1.0-kbのDNA断片及び上述のクローニングベクターpCYK21の約10.6-kbのDNA断片を、各々制限酵素NdeI及びBamHIで切断し、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。
また、PCRにより増幅したクレブシェラ  ニューモニエadhP遺伝子、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスadhP遺伝子のそれぞれを含む約1.0-kbのDNA断片及び上述のクローニングベクターpCYK21の約10.6-kbのDNA断片を、各々制限酵素NdeI及びEcoRIで切断し、T4 DNAリガーゼ(タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。【０１１２】
得られたライゲーション液で、電気パルス法により、ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス TH-1株(NBRC 14978)を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むA固体培地に塗布し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
A固体培地上の各生育株をカナマイシン50μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、これらのプラスミドを制限酵素NdeI及びBamHI、又はNdeI及びEcoRIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCYK21の約10.6-kbのDNA断片に加え、クレブシェラ  ニューモニエadhP遺伝子、ジオバチルス  サーモカテニュラタスadhP遺伝子、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスadhP遺伝子、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスadhA遺伝子のそれぞれの長さ約1.0-kbの挿入断片が認められた。【０１１３】
クレブシェラ  ニューモニエadhP遺伝子を含むプラスミドをpC-Kpn-adhP、ジオバチルス  サーモカテニュラタスadhP遺伝子を含むプラスミドをpC-Gtc-adhP、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスadhP遺伝子を含むプラスミドをpC-Gtg-adhP、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスadhA遺伝子を含むプラスミドをpC-Gtg-adhAと命名した。
各ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス組み換え株が有するプラスミドを表1に示す。【０１１４】
【表１】
2019207812.tif 000002
【０１１５】
(3-4)ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス  イソブタノール生成遺伝子導入株における導入遺伝子発現の確認
2-ケト酸 デカルボキシラーゼの活性測定
上記のようにして得た各2-ケト酸 デカルボキシラーゼ遺伝子導入株をカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入し、50℃にて20時間、振盪培養を行った。
このようにして培養増殖された菌体を、遠心分離(4℃、15,000 rpm, 1分間) により回収した。超音波処理で菌体細胞を破砕した後、遠心分離(4℃、15,000 rpm, 5分間)により得た細胞破砕上清を粗酵素液として用い、以下の方法により2-ケト酸  でカルボキシラーゼ活性を測定した。粗酵素液、50 mM Tris-HCl (pH 6.8)、 2.5 mM MgSO4、0.2 mM thiamine pyrophosphate (TPP)、3.0 mM NADH、30 mM  2-ケトイソ吉草酸（2-ketoisovalerate）、0.5 U/ml ウマ由来アルコール  デヒドロゲナーゼ（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社）を混合し、50℃で反応を行い、NADHに由来する340 nmの吸光度減少を追跡し、反応初速度を解析した。反応初速度とタンパク質濃度から比活性を算出した。1分間あたり、1μmolのイソブチルアルデヒドを産生せしめる酵素量を1 U(Unit)と定義した。【０１１６】
この結果、ラクトコッカス  ラクティスのコドン最適化kivDを導入したKDC01株では、0.65 U/mgの目的とする2-ケト酸 デカルボキシラーゼ活性が検出された。
一方、ラクトコッカス  ラクティスの天然型のkivDを導入したKDC02株、バチルス  サブチリスのalsSを導入したKDC03株、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスのGeoth_3495を導入したKDC04株、ジオバチルス  サーモデニトリフィカンスのGtng_0348を導入したKDC05株、及びクレブシェラ  ニューモニエのipdCを導入したKDC06株では、2-ケト酸 デカルボキシラーゼ活性は認められなかった。
また、同様の実験を空ベクター（pCYK21）を導入したヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス TH-1株に対して行った結果、2-ケト酸 デカルボキシラーゼ活性は認められなかった。【０１１７】
イソブチルアルデヒドを基質とするアルコール  デヒドロゲナーゼの活性測定
上記のようにして得た各ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスのアルコール  デヒドロゲナーゼ遺伝子導入株をカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入し、50℃にて20時間、振とう培養を行った。
このようにして培養増殖された各菌体を、遠心分離(4℃、15,000 rpm, 1分間) により回収した。超音波処理で菌体細胞を破砕した後、遠心分離(4℃、15,000 rpm, 5分間)により得た細胞破砕上清を粗酵素液として用い、以下の方法によりアルコール  デヒドロゲナーゼ活性を測定した。粗酵素液、50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、0.2 mM NADH、100 mM イソブチルアルデヒドを混合し、50℃で反応を行い、NADHに由来する340 nmの吸光度減少を追跡し、反応初速度を解析した。反応初速度とタンパク質濃度から比活性を算出した。1分間あたり、1μmolのイソブタノールを産生せしめる酵素量を1 U(Unit)と定義した。【０１１８】
この結果、表2に示すように、クレブシェラ  ニューモニエadhP遺伝子、ジオバチルス  サーモカテニュラタスadhP遺伝子、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスadhP遺伝子、ジオバチルス  サーモグルコシダシウスadhA遺伝子の何れを導入した形質転換体でも活性が認められた。一方、同様の実験を空ベクター（pCYK21）を導入したヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス  TH-1株に対して行った結果、アルコール  デヒドロゲナーゼ活性は認められなかった。【０１１９】
【表２】
2019207812.tif 000003
【０１２０】
(3-5)イソブタノール生成株の作製
クレブシェラ  ニューモニエのアルコール  デヒドロゲナーゼをコードするadhP遺伝子を含む DNA断片を、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いたPCRにより、常法により増幅した。鋳型DNAとしてプラスミドpC-Kpn-adhPを用い、下記一対のプライマーを用いた。
クレブシェラ  ニューモニエadhP遺伝子増幅用プライマー
(a-15)  5’-CGCGGTACCGGATCTGGAGGAGAAACGCATATGAA-3’（配列番号70）
(b-15)  5’-CGCGGTACCTTAACGGTTGACACCGATGGTTAAAA-3’（配列番号71）
なお、プライマー(a-15)及び(b-15)には、KpnI制限酵素部位が付加されている。
生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した結果、クレブシェラ  ニューモニエadhP遺伝子の約1.0-kbのDNA断片が検出された。【０１２１】
上記のようにして得たクレブシェラ  ニューモニエのアルコール  デヒドロゲナーゼをコードするadhP遺伝子を含む DNA断片及び上述のコドン最適化ラクトコッカス  ラクティスkivD遺伝子を含むプラスミドpC-opt-kivDの約12.3-kbのDNA断片を各々制限酵素KpnIで切断し、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。
得られたライゲーション液で、電気パルス法により、ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスTH-1(NBRC 14978)を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むA固体培地に塗布し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
A固体培地上の生育株をカナマイシン50μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、このプラスミドを制限酵素KpnIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpC-opt-kivDの約12.3-kbのDNA断片に加え、クレブシェラ  ニューモニエadhP遺伝子の約1.0-kbの挿入断片が認められた。
コドン最適化ラクトコッカス  ラクティスkivD遺伝子の下流にクレブシェラ  ニューモニエadhP遺伝子を含むプラスミドを、pC-opt-kivD&Kpn-adhPと命名した。
また、この株をヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスIBU-1株と命名した。【０１２２】
(3-6)イソブタノール生成
(3-5)の項目で得たヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスのイソブタノール生成遺伝子導入株(IBU-1)をカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地に白金耳を用いて植菌し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを培養に伴い供給し、50℃にて30時間、振盪培養した。
培養後、遠心分離(4℃、15,000 rpm、1分間) により得た培養上清のイソブタノールを定量した結果、培地上清中に4mMのイソブタノールの生成が確認された。【０１２３】
（４）エタノール生成能を有する形質転換体
(4-1) ピルビン酸 デカルボキシラーゼ遺伝子のクローニング
グルコノバクター  オキシダンスNBRC 3292、ザイモモナス  モビリスNBRC 13756、ザイモバクター  パルマエNBRC 102412、アセトバクター  パスツリアヌスNBRC 105184から、常法に従い、ゲノムDNAを抽出した。【０１２４】
上記4種のゲノムDNAのそれぞれを鋳型として用いて、グルコノバクター  オキシダンス、ザイモモナス  モビリス、ザイモバクター  パルマエ、及びアセトバクター  パスツリアヌスのピルビン酸  デカルボキシラーゼ遺伝子pdcを含むDNA断片をPCR法により増幅した。PCRには、以下のプライマーを用いた。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。【０１２５】
グルコノバクター  オキシダンスpdc遺伝子増幅用プライマー
(a-16)  5’- GCACATATGACTTATACTGTCGGACATTATCTTGC -3’（配列番号72）
(b-16)  5’- GCAGGATCCTTAGACGCTCTGGGGCTTGCGGGAGT -3’（配列番号73）
なお、プライマー(a-16)にはNdeI制限酵素部位が付加されており、プライマー(b-16)にはBamHI制限酵素部位が付加されている。
ザイモモナス  モビリスpdc遺伝子増幅用プライマー
(a-17)  5’-CGAGTCCATATGAAGGCAGCTGTTGTTACCCACGA-3’（配列番号74）
(b-17)  5’-CGCGTCGACTTAGCTACGCAGATCGATAACCATAC-3’（配列番号75）
なお、プライマー(a-17)には、NdeI制限酵素部位が付加されており、プライマー(b-17)には、SalI制限酵素部位が付加されている。
ザイモバクター  パルマエpdc遺伝子増幅用プライマー
(a-18)  5’-GCACATATGTATACCGTTGGTATGTACTTGGCAGA-3’（配列番号76）
(b-18)  5’-GCAGTCGACTTACGCTTGTGGTTTGCGAGAGTTGG-3’（配列番号77）
なお、プライマー(a-18)には、NdeI制限酵素部位が付加されており、プライマー(b-18)には、SalI制限酵素部位が付加されている。
アセトバクター  パスツリアヌスpdc遺伝子増幅用プライマー
(a-19)  5’-GCACATATGACATATACAGTCGGCATGTATCTTGC-3’（配列番号78）
(b-19)  5’-GCAGTCGACTCAGGATACCTGCGGTTTTCTGGAAT-3’（配列番号79）
なお、プライマー(a-19)には、NdeI制限酵素部位が付加されており、プライマー(b-19)には、SalI制限酵素部位が付加されている。【０１２６】
生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供し、グルコノバクター  オキシダンス、ザイモモナス  モビリス、ザイモバクター  パルマエ、及びアセトバクター  パスツリアヌスのpdc遺伝子それぞれについて、約1.7-kbのDNA断片が検出された。【０１２７】
上記PCRにより増幅したグルコノバクター  オキシダンス由来pdc遺伝子の約1.7-kbのDNA断片及び上述のクローニングベクターpCYK21の約10.6-kbのDNA断片を各々制限酵素NdeI及びBamHIで切断し、T4 DNAリガーゼ(タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。
上記PCRにより増幅したザイモモナス  モビリス、ザイモバクター  パルマエ、及びアセトバクター  パスツリアヌスのpdc遺伝子それぞれを含む約1.7-kbのDNA断片及び上述のクローニングベクターpCYK21の約10.6-kbのDNA断片を、各々制限酵素NdeI及びSalIで切断し、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。【０１２８】
得られたライゲーション液で、電気パルス法により、ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス TH-1株(NBRC 14978)を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むA固体培地に塗布し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
A固体培地上の各生育株をカナマイシン50μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出した。
グルコノバクター  オキシダンス由来pdc遺伝子を含むプラスミドを制限酵素NdeI及びBamHIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCYK21の約10.6-kbのDNA断片に加え、グルコノバクター  オキシダンス由来pdc遺伝子の長さ約1.7-kbの挿入断片が認められた。
また、ザイモモナス  モビリス、ザイモバクター  パルマエ、及びアセトバクター  パスツリアヌスの各pdc遺伝子を含むプラスミドを制限酵素NdeI及びSalIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCYK21の約10.6-kbのDNA断片に加え、ザイモモナス  モビリス、ザイモバクター  パルマエ、及びアセトバクター  パスツリアヌスのpdc遺伝子それぞれの長さ約1.7-kbの挿入断片が認められた。【０１２９】
グルコノバクター  オキシダンス由来pdc遺伝子を含むプラスミドをpC-Gox-pdc、ザイモモナス  モビリスpdc遺伝子を含むプラスミドをpC-Zmo-pdc、ザイモバクター  パルマエpdc遺伝子を含むプラスミドをpC-Zpa-pdc、アセトバクター  パスツリアヌスpdc遺伝子を含むプラスミドをpC-Apa-pdcと命名した。【０１３０】
(4-2)アルコール  デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
「（３）イソブタノール生成能を有する形質転換体」の(3-3)の項目で説明した通りである。【０１３１】
(4-3)アルデヒド-アルコール  デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
エシェリヒア コリK12 MG1655から、常法によりゲノムDNAを抽出した。また、クロストリジウム  サーモセラムATCC 27405のゲノムDNAを、独立行政法人  製品評価技術基盤機構（NBRC）より入手した。
これらのゲノムDNAをそれぞれ鋳型として用いて、アルデヒド-アルコール  デヒドロゲナーゼ遺伝子adhEを含むDNA断片をPCR法により増幅した。PCRには、以下のプライマーを用いた。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。
エシェリヒア コリadhE遺伝子増幅用プライマー
(a-20)  5’-GCACATATGGCTGTTACTAATGTCGCTGAACTTAA-3’（配列番号80）
(b-20)  5’-GCAGGATCCTTAAGCGGATTTTTTCGCTTTTTTCT-3’（配列番号81）
なお、プライマー(a-20)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-20)には、BamHI制限酵素部位が付加されている。
クロストリジウム  サーモセラムadhE遺伝子増幅用プライマー
(a-21)  5’-GCACATATGACGAAAATAGCGAATAAATACGAAGT-3’（配列番号82）
(b-21)  5’-GCACTGCAGTTATTTCTTCGCACCTCCGTAATAAG-3’（配列番号83）
なお、プライマー(a-21)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-21)には、PstI制限酵素部位が付加されている。【０１３２】
生成した反応液2μlを1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供し、エシェリヒア コリ由来adhE遺伝子、クロストリジウム  サーモセラム由来adhE遺伝子のそれぞれについて、約2.7-kbのDNA断片が検出された。【０１３３】
上記PCRにより増幅したエシェリヒア コリ由来adhE遺伝子の約2.7-kbのDNA断片及び上述のクローニングベクターpCYK21の約10.6-kbのDNA断片を各々制限酵素NdeI及びBamHIで切断し、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。
また、上記PCRにより増幅したクロストリジウム  サーモセラム由来adhE遺伝子の約2.7-kbのDNA断片及び上述のクローニングベクターpCYK21の約10.6-kbのDNA断片を各々制限酵素NdeI及びPstIで切断し、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。【０１３４】
得られたライゲーション液で、電気パルス法により、ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス TH-1(NBRC 14978)を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むA固体培地に塗布し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
A固体培地上の各生育株をカナマイシン50μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、このプラスミドを制限酵素NdeI及びBamHI、又はNdeI及びPstIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCYK21の約10.6-kbのDNA断片に加え、エシェリヒア コリ由来adhE遺伝子、又はクロストリジウム  サーモセラム由来adhE遺伝子の長さ約2.7-kbの挿入断片が認められた。
エシェリヒア コリ由来adhE遺伝子を含むプラスミドをpC-Eco-adhE、クロストリジウム  サーモセラム由来adhE遺伝子を含むプラスミドをpC-Cth-adhEと命名した。【０１３５】
各形質転換体に導入されたプラスミドを表3に示す。
【表３】
2019207812.tif 000004
【０１３６】
(4-4)ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス  エタノール生成遺伝子導入株における導入遺伝子発現の確認
ピルビン酸  デカルボキシラーゼの活性測定
ピルビン酸  デカルボキシラーゼ遺伝子（pdc遺伝子）導入PDC01株、PDC02株、PDC03株、及びPDC04株をカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入し、50℃にて20時間、振盪培養した。
培養により増殖した菌体を、遠心分離(4℃、15,000 rpm, 1分間) により回収した。超音波処理で菌体細胞を破砕した後、遠心分離(4℃、15,000 rpm, 5分間)により得た細胞破砕上清を粗酵素液として用い、以下の方法によりピルビン酸  デカルボキシラーゼ活性を測定した。粗酵素液、250 mM sodium phosphate (pH 6.2)、 1 mM MgCl2、1 mM thiamine pyrophosphate (TPP)、0.4 mM NADH、100 mM ピルビン酸、0.02 mg/ml 酵母アルコール  デヒドロゲナーゼ（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社）を混合し、50℃で反応を行い、NADHに由来する340 nmの吸光度減少を追跡し、反応初速度を解析した。反応初速度とタンパク質濃度から比活性を算出した。1分間あたり、1μmolのアセトアルデヒドを産生せしめる酵素量を1 U(Unit)と定義した。【０１３７】
この結果、グルコノバクター  オキシダンスのpdc遺伝子を導入したPDC01株では、3.0 U/mgの目的とするピルビン酸  デカルボキシラーゼ活性が検出された。
一方、ザイモモナス  モビリスpdc遺伝子を導入したPDC02株、ザイモバクター  パルマエpdc遺伝子を導入したPDC03株、アセトバクター  パスツリアヌスpdc遺伝子を導入したPDC04株では、ピルビン酸  デカルボキシラーゼ活性が検出されなかった。
また、同様の実験をヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス野生株(空ベクター（pCYK21）のみを有するTH-1株)に対して行ったところ、ピルビン酸  デカルボキシラーゼ活性は認められなかった。【０１３８】
アセトアルデヒドを基質とするアルコール  デヒドロゲナーゼの活性測定
ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスのアルコール  デヒドロゲナーゼ遺伝子導入ADH01株、ADH02株、ADH03株、及びADH04株をそれぞれカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地5mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入し、50℃にて20時間、振盪培養した。
培養により増殖した各菌体を、遠心分離(4℃、15,000 rpm, 1分間) により回収した。超音波処理で菌体細胞を破砕した後、遠心分離(4℃、15,000 rpm、5分間)により得た細胞破砕上清を粗酵素液として用い、以下の方法によりアセトアルデヒドを基質とするアルコール  デヒドロゲナーゼ活性を測定した。粗酵素液、50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、0.2 mM NADH、90 mM アセトアルデヒドを混合し、50℃で反応を行い、NADHに由来する340 nmの吸光度減少を追跡し、反応初速度を解析した。反応初速度とタンパク質濃度から比活性を算出した。1分間あたり、1μmolのエタノールを産生せしめる酵素量を1 U(Unit)と定義した。
この結果、表4に示す通り、ADH01〜ADH04株について、目的とするアルコール  デヒドロゲナーゼ活性が検出された。特に高い活性を示したのは、クレブシェラ  ニューモニエ由来adhP遺伝子、ジオバチルス  サーモグルコシダシウス由来adhP遺伝子であった。また、ジオバチルス  サーモカテニュラタス由来adhP遺伝子、ジオバチルス  サーモグルコシダシウス由来adhA遺伝子についてもアルコール  デヒドロゲナーゼ活性が検出された。ここで、同様の実験を空ベクター（pCYK21）を導入したヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス  TH-1株に対して行ったところ、アルコール  デヒドロゲナーゼ活性は認められなかった。【０１３９】
ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスのadhP、又はadhA遺伝子導入株のアセトアルデヒドを基質としたアルコール  デヒドロゲナーゼ活性を表4に示す。
【表４】
2019207812.tif 000005
【０１４０】
(4-5)adhE遺伝子への部位特異的変異導入
部位特異的変異導入プラスミドの構築
adhEにコードされるアルデヒド-アルコール  デヒドロゲナーゼは好気条件下では活性が阻害される。好気条件下でも高い活性を示すよう、上記プラスミドpC-Eco-adhEを用いて、568番目のグルタミン酸（E568）部位をリジン(K)に置換したエシェリヒア コリ由来adhEの変異体(adhE(E568K))を、インバースPCR（inverse PCR）によって作成し、部位特異的変異が導入されたプラスミドを取得し、pC-Eco-E568Kと命名した。
また、クロストリジウム  サーモセラム由来adhEについては、上記プラスミドpC-Cth-adhEを用いて、575番目のアスパラギン酸（D575）部位をアスパラギン(N)に置換したクロストリジウム  サーモセラム由来adhEの変異体(adhE(D575N))を、インバースPCRによって作成し、部位特異的変異が導入されたプラスミドを取得し、pC-Cth-D575Nと命名した。【０１４１】
インバースPCRは、pC-Eco-adhE、及びpC-Cth-adhEをそれぞれ鋳型とし、下記プライマーを用いて、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、常法により行った。
エシェリヒア コリadhE遺伝子E568K変異導入用プライマー
(a-22)  5’-GAAGCTGGCGCTGCGCTTTATGGATATCCGTAAAC-3’（配列番号84）
(b-22)  5’-TCGAAGTGAGTTTCCGGATGTTCGTACATAACCCA-3’（配列番号85）
クロストリジウム  サーモセラムadhE遺伝子D575N変異導入用プライマー
(a-23)  5’-ATGGCAATGAGATTTATGGATATAAGAAAGAGAGT-3’（配列番号86）
(b-23)  5’-GTTCATAAAGTCAACTTCCGGATGTTCATACATCA-3’（配列番号87）
生成した反応液を1%アガロースゲルにより電気泳動に供し、エシェリヒア コリ由来adhEのE568K変異体及びクロストリジウム  サーモセラム由来adhEのD575N変異体のそれぞれについて、約13-kbのDNA断片が検出された。【０１４２】
増幅した各DNA断片をT4 Polynucleotide Kinase(タカラバイオ株式会社製)を用いてリン酸化処理し、次いでT4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製)を用いて結合(セルフライゲーション)させた。
得られたライゲーション液で、電気パルス法により、ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスNBRC 14978を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むA固体培地に塗布し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
A固体培地上の各生育株をカナマイシン50μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出した。このプラスミドを、エシェリヒア コリ由来adhEのE568K変異遺伝子の場合は制限酵素NdeI及びBamHI、クロストリジウム  サーモセラム由来adhEのD575N変異遺伝子の場合は制限酵素NdeI及びPstIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、それぞれプラスミドpCYK21の約10.6-kbのDNA断片に加え、長さ約2.7-kbの挿入断片が認められた。【０１４３】
変異adhE遺伝子が導入されたヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス組み換え株が有するプラスミドを表5に示す。
【表５】
2019207812.tif 000006
【０１４４】
(4-6)アセトアルデヒドを基質としたアルデヒド-アルコール  デヒドロゲナーゼの活性測定
（4-3）の項目で作成したヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスのアルデヒド−アルコール  デヒドロゲナーゼ遺伝子導入株（ADH05、ADH06）、及び（4-5）の項目で作成したヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスの変異アルデヒド−アルコール  デヒドロゲナーゼ遺伝子導入株（ADH07、ADH08）を、カナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地5mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入し、50℃にて20時間、振盪培養した。
培養により増殖した各菌体を、遠心分離(4℃、15,000 rpm、1分間) により回収した。超音波処理で菌体細胞を破砕した後、遠心分離(4℃、15,000 rpm、5分間)により得た細胞破砕上清を粗酵素液として用い、以下の方法によりアセトアルデヒドを基質とするアルコール  デヒドロゲナーゼ活性を測定した。粗酵素液、50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、0.2 mM NADH、90 mM アセトアルデヒドを混合し、50℃で反応を行い、NADHに由来する340 nmの吸光度減少を追跡し、反応初速度を解析した。反応初速度とタンパク質濃度から比活性を算出した。1分間あたり、1μmolのエタノールを産生せしめる酵素量を1 U(Unit)と定義した。【０１４５】
なお、前述した通り、adhE遺伝子がコードするアルデヒド-アルコールデヒドロゲナーゼは、アセチルCoAをアセトアルデヒドに変換する反応を触媒するアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性と、アセトアルデヒドをエタノールに変換する反応を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼ活性の双方を有する二機能性の酵素である。ここでは、アセトアルデヒドを基質としてエタノールを生成する反応を指標に、adhE遺伝子の発現を評価したが、上記各菌株は、アセチルCoAをアセトアルデヒドに変換する反応を触媒するアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性も有していた。【０１４６】
この結果、表6に示すように、変異遺伝子を導入したADH07及びADH08株は、それぞれ、野生型遺伝子を導入したADH05及びADH06株に比べ1.5倍及び3.4倍に活性が向上した。
【表６】
2019207812.tif 000007
【０１４７】
(4-7)エタノール生成株の作製
クレブシェラ  ニューモニエのアルコール  デヒドロゲナーゼをコードするadhP遺伝子を含む DNA断片を、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いたPCRにより、常法により増幅した。鋳型DNAとしてプラスミドpC-Kpn-adhPを用い、下記一対のプライマーを用いた。
ジオバチルス  サーモグルコシダシウスadhP遺伝子増幅用プライマー
(a-24)  5’-CGCGGTACCGGATCTGGAGGAGAAACGCATATGAA-3’（配列番号88）
(b-24)  5’-CGCGGTACCTTAACGGTTGACACCGATGGTTAAAA-3’（配列番号89）
なお、プライマー(a-24)及び(b-24)には、KpnI制限酵素部位が付加されている。
生成した反応液を1%アガロースゲルを用いた電気泳動に供した結果、ジオバチルス  サーモグルコシダシウス由来adhP遺伝子に相当する、約1.0-kbのDNA断片が検出された。【０１４８】
上記PCRにより増幅したクレブシェラ  ニューモニエadhP遺伝子の約1.0-kbのDNA断片及びグルコノバクター  オキシダンスpdc遺伝子を含むプラスミドpC-Gox-pdcの約12.3-kbのDNA断片を各々制限酵素KpnIで切断し、T4 DNAリガーゼ (タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。【０１４９】
得られたライゲーション液で、電気パルス法により、ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスNBRC 14978を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むA固体培地に塗布し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
A固体培地上の生育株をカナマイシン50μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、このプラスミドを制限酵素KpnIで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpC-Gox-pdcの約12.3-kbのDNA断片に加え、クレブシェラ  ニューモニエadhP遺伝子の約1.0-kbの挿入断片が認められた。
グルコノバクター  オキシダンスpdc遺伝子の下流にジオバチルス  サーモグルコシダシウスadhP遺伝子を含むプラスミドを、pC-Gox-pdc&Kpn-adhPと命名した。
また、このプラスミドを有する菌株をヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスETH-1株と命名した。【０１５０】
(4-8)エタノール生成
(4-7)の項目で得たヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスのエタノール生成遺伝子導入株(ETH-1株)をカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地に白金耳を用いて植菌し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを培養に伴い供給し、50℃にて30時間、振盪培養した。
培養後、遠心分離(4℃、15,000 rpm、1分間) により得た培養上清のエタノールの定量を行ったところ、培地上清中に10mMのエタノールが生成されていた。【０１５１】
（５）アラニン生成能を有する形質転換体の作製
(5-1)ゲノムDNAの調製
ジオバチルス  ステアロサーモフィラス ATCC  12980から常法によりゲノムDNAを抽出した。また、サーマス  サーモフィラス HB8株(ATCC  27634)のゲノムDNAをタカラバイオ株式会社から購入した。【０１５２】
(5-2)alaD遺伝子を含むDNA断片のクローン化
アラニン  デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むDNA断片を、ジオバチルス  ステアロサーモフィラス ATCC  12980のゲノムDNA、及びサーマス  サーモフィラス HB8株(ATCC  27634)のゲノムDNAをそれぞれ鋳型として用い、下記一対のプライマーを用いて、PCRにより増幅した。PCRは、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて常法により行った。
ジオバチルス  ステアロサーモフィラスalaD1遺伝子増幅用プライマー
(a-25)  5’-TCCGGCGGGCATATGAAGATCGGCATTCCAAAAGA-3’（配列番号90）
(b-25)  5’-AAGAATTCCAGCGGCTCATATACGATACCGTTCGG-3’（配列番号91）
なお、プライマー(a-25)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-25)には、EcoRI制限酵素部位が付加されている。
ジオバチルス  ステアロサーモフィラスalaD2遺伝子増幅用プライマー
(a-26)  5’-TCCGGCGGGCATATGATTATTGGAGTGCCAAAGGA-3’（配列番号92）
(b-26)  5’-AAGAATTCTTAGTTGGCAGCCAACGTTTTCCCGAG-3’（配列番号93）
なお、プライマー(a-26)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-26)には、EcoRI制限酵素部位が付加されている。
サーマス  サーモフィラスalaD1遺伝子増幅用プライマー
(a-27)  5’-CCGGCGGGCATATGGTGATCGGCGTGCCGAAGGAG-3’（配列番号94）
(b-27)  5’-AAGAATTCTCACCCCCTCAAGGCCTCCTCGGGAGG-3’（配列番号95）
なお、プライマー(a-27)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-27)には、EcoRI制限酵素部位が付加されている。
サーマス  サーモフィラスalaD2遺伝子増幅用プライマー
(a-28)  5’-CGGCGGGCATATGgagttcggcgtgcccagagaac-3’（配列番号96）
(b-28)  5’-AAGAATTCtcattctaggtggcctcctttctcgcc-3’（配列番号97）
なお、プライマー(a-28)には、NdeI制限酵素部位が、プライマー(b-28)には、EcoRI制限酵素部位が付加されている。
生成した反応液を1%アガロースゲルにより電気泳動に供し、ジオバチルス  ステアロサーモフィラスalaD1遺伝子の場合は約1.6kbのDNA断片が、ジオバチルス  ステアロサーモフィラスalaD2遺伝子、サーマス  サーモフィラスalaD1遺伝子、サーマス  サーモフィラスalaD2遺伝子の場合はそれぞれ約1.1kbのDNA断片が検出された。【０１５３】
上記PCRにより増幅したジオバチルス  ステアロサーモフィラスalaD1遺伝子の約1.6-kbのDNA断片、ジオバチルス  ステアロサーモフィラスalaD2遺伝子の約1.1-kbの各DNA断片、サーマス  サーモフィラスalaD1遺伝子の約1.1-kbの各DNA断片、及びサーマス  サーモフィラスalaD2遺伝子の約1.1-kbの各DNA断片のそれぞれと、上記クローニングベクターpCYK21の約10.6-kbのDNA断片を各々制限酵素NdeI及びEcoRIで切断し、T4 DNAリガーゼ(タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。【０１５４】
得られたライゲーション液で、電気パルス法により、ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスNBRC 14978を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むA固体培地に塗布し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
A固体培地上の各生育株をカナマイシン50μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、これらのプラスミドを制限酵素NdeI及びEcoRIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCYK21の約10.6-kbのDNA断片に加え、ジオバチルス  ステアロサーモフィラスalaD1遺伝子の場合は長さ約1.6-kbの挿入断片が、ジオバチルス  ステアロサーモフィラスalaD2遺伝子、サーマス  サーモフィラスalaD1遺伝子、及びサーマス  サーモフィラスalaD2遺伝子の場合はそれぞれ約1.1-kbのDNA断片が認められた。【０１５５】
ジオバチルス  ステアロサーモフィラスalaD1遺伝子を含むプラスミドをpC-Gst-alaD1、ジオバチルス  ステアロサーモフィラスalaD2遺伝子を含むプラスミドをpC-Gst-alaD2、サーマス  サーモフィラスalaD1遺伝子を含むプラスミドをpC-Tth-alaD1、サーマス  サーモフィラスalaD2遺伝子を含むプラスミドをpC-Tth-alaD2と命名した。これらのヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス組み換え株が有するプラスミドを表7に示す。【０１５６】
【表７】
2019207812.tif 000008
【０１５７】
(5-3)アラニン  デヒドロゲナーゼの活性測定
ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスのアラニン  デヒドロゲナーゼ遺伝子導入ALA01株、ALA02株、ALA03株、及びALA04株を、それぞれカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地5mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入し、50℃にて20時間、振盪培養した。
培養により増殖した各菌体を、遠心分離(4℃、15,000 rpm, 1分間) により回収した。超音波処理で菌体細胞を破砕した後、遠心分離(4℃、15,000 rpm、5分間)により得た細胞破砕上清を粗酵素液として用い、以下の方法によりアラニン  デヒドロゲナーゼ活性を測定した。粗酵素液、100 mM Tris-HCl (pH 8.5)、100 mM NH4Cl、0.1 mM NADH、60 mM ピルビン酸を混合し、50℃で反応を行い、NADHに由来する340 nmの吸光度減少を追跡し、反応初速度を解析した。反応初速度とタンパク質濃度から比活性を算出した。1分間あたり、1μmolのアラニンを産生せしめる酵素量を1 U(unit)と定義した。
ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスのalaD遺伝子導入株が産生したアラニン  デヒドロゲナーゼの活性を表8に示す。【０１５８】
【表８】
2019207812.tif 000009
表8に示す通り、ALA01株、ALA02株、ALA03株、及びALA04株について目的とするアラニン  デヒドロゲナーゼ活性が検出された。特に高い活性を示したのは、ジオバチルス  ステアロサーモフィラス由来alaD2遺伝子であった。一方、同様の実験を空ベクター（pCYK21）を導入したヒドロゲノフィラス  サーモルテオラス  TH-1株に対して行った結果、アラニン  デヒドロゲナーゼ活性は認められなかった。【０１５９】
(5-4)遺伝子発現量向上のためのN末端へのポリペプチドの付加
付加するポリペプチドをコードするDNA断片の調製
付加するポリペプチドをコードするDNA断片を調製するため、下記の各一対ずつのオリゴヌクレオチドを合成した。各一対のオリゴヌクレオチドは互いに相補的な配列である。
MKIEEGKLVIHの配列（配列番号37）のポリペプチド（マルトース結合タンパク質のN末端配列）
(a-29)  5’-TATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCCA-3’（配列番号98）
(b-29)  5’-TATGGATTACCAGTTTACCTTCTTCGATTTTCA-3’（配列番号99）
MSKIKHの配列（配列番号100）のポリペプチド〔Journal of Bioscience and Bioengineering, 123, 540-546 (2017)〕
(a-30)  5’-TATGAGCAAGATCAAACA-3’（配列番号101）
(b-30)  5’-TATGTTTGATCTTGCTCA-3’（配列番号102）
MDFPVAEDRRHの配列（配列番号103）のポリペプチド（グルタチオン S-トランスフェラーゼのN末端配列）
(a-31)  5’-TATGTCGCCGATCCTCGGCTACTGGAAAATCCA-3’（配列番号104）
(b-31)  5’-TATGGATTTTCCAGTAGCCGAGGATCGGCGACA-3’（配列番号105）
MTENAEKFLWHの配列（配列番号106）のポリペプチド（β-グルコシダーゼのN末端配列）
(a-32)  5’-TATGACCGAGAACGCCGAAAAATTCCTTTGGCA-3’（配列番号107）
(b-32)  5’-TATGCCAAAGGAATTTTTCGGCGTTCTCGGTCA-3’（配列番号108）
(a-29)と(ｂ-29)、(a-30)と(ｂ-30)、(a-31)と(ｂ-31)、(a-32)と(ｂ-32)のオリゴヌクレオチドをそれぞれ等モル(mol)ずつ混合し、混合液を98℃から20℃まで緩やかに冷却し、オリゴヌクレオチドがアニーリングすることで、ポリペプチド配列をコードする二本鎖DNA断片を調製した。なお、このDNA断片の両端は制限酵素NdeI切断による突出末端と同等である。【０１６０】
また、MGKDHLIHNVHKEEHAHAHNKHの配列（配列番号109）（HAT配列）をコードする塩基配列からなるDNA断片を作成するため、下記の一対のプライマーを用いて、ライフテクノロジーズ社製の「DNAサーマルサイクラー」を用い、反応試薬としてKOD FX Neo(東洋紡株式会社製)を用いて、PCRを行った。各プライマー同士のエクステンションとするため、鋳型のDNAは含んでいない。
HAT配列調製用プライマー
(a-33)  5’-CGCATATGGGCAAGGATCATCTCATCCACAATGTCCACAAAGAGG-3’（配列番号110）
(b-33)  5’-CGCATATGCTTGTTGTGGGCATGAGCGTGCTCCTCTTTGTGGACA-3’（配列番号111）
プライマー(a-33)及び(b-33)の3’側の塩基配列は互いに相補的になっている。なお、プライマー(a-33)及び(b-33)には、NdeI制限酵素部位が付加されている。
生成した反応液を1%アガロースゲルにより電気泳動した結果、HAT配列に相当する、約0.1-kbのDNA断片が検出された。増幅したHAT配列の約0.1-kbのDNA断片を制限酵素NdeIで切断した。【０１６１】
ポリペプチド融合タンパク質の発現ベクターの構築
ジオバチルス  ステアロサーモフィラスalaD2遺伝子を含有するプラスミドpC-Gst-alaD2を制限酵素NdeIで切断した。このプラスミドと、両末端に制限酵素NdeI切断突出を有する上記各DNA断片（「付加するポリペプチドをコードするDNA断片の調製」の項目で調製した5種の二本鎖DNA断片）のそれぞれとを混合し、T4 DNAリガーゼ(タカラバイオ株式会社製)を用いて互いに結合させた。【０１６２】
得られたライゲーション液で、電気パルス法により、ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスNBRC 14978を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むA固体培地に塗布し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入したチャンバー内で、50℃にて60時間培養した。
A固体培地上の各生育株をカナマイシン50μg/mlを含むA液体培地5 mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、試験管にH2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入して、50℃で震盪培養した。培養液よりプラスミドDNAを抽出、これらのプラスミドを制限酵素NdeIでそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。【０１６３】
融合ペプチドとして、マルトース結合タンパク質のN末端配列を付加するプラスミドをpMBP-Gst-alaD2、MSKIKHの配列を付加するプラスミドをpSKIK-Gst-alaD2、グルタチオン S-トランスフェラーゼのN末端配列を付加するプラスミドをpGST-Gst-alaD2、β-グルコシダーゼのN末端配列を付加するプラスミドをpGlu-Gst-alaD2、HATタグの配列を付加するプラスミドをpHAT-Gst-alaD2と命名した。【０１６４】
各組み換え株が有するプラスミドを表9に示す。
【表９】
2019207812.tif 000010
【０１６５】
(5-5)N末端側ポリペプチド融合によるalaD2遺伝子発現の影響
(5-4)の項目で作製した、ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスのポリペプチド融合アラニン  デヒドロゲナーゼ遺伝子導入株を、カナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地5mlの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを封入し、50℃にて20時間、振盪培養した。
培養により増殖した各菌体を、遠心分離(4℃、15,000 rpm, 1分間) により回収した。超音波処理で菌体細胞を破砕した後、遠心分離(4℃、15,000 rpm、5分間)により得た細胞破砕上清を粗酵素液として用い、以下の方法によりアラニン  デヒドロゲナーゼ活性を測定した。粗酵素液、100 mM Tris-HCl (pH 8.5)、100 mM NH4Cl、0.1 mM NADH、60 mM ピルビン酸を混合し、50℃で反応を行い、NADHに由来する340 nmの吸光度減少を追跡し、反応初速度を解析した。反応初速度とタンパク質濃度から比活性を算出した。1分間あたり、1μmolのアラニンを産生せしめる酵素量を1 U(unit)と定義した。【０１６６】
ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスのalaD遺伝子導入株が産生するアラニン  デヒドロゲナーゼの活性を表10に示す。
【表１０】
2019207812.tif 000011
表10に示す通り、ジオバチルス  ステアロサーモフィラスのalaD2遺伝子を導入した株(ALA02株)より高いアラニンデヒドロゲナーゼ活性を示したのは、ALA05株だけであった。【０１６７】
(5-6)アラニン生成
ヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスのアラニン  デヒドロゲナーゼ遺伝子導入株ALA05をカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地に白金耳を用いて植菌し、H2:O2:CO2＝7.5:1:1.5の混合ガスを培養に伴い供給し、50℃にて30時間、振盪培養した。
培養後、遠心分離(4℃、15,000 rpm、1分間) により得た培養上清のアラニンの定量を行ったところ、培地上清中5mMのアラニンが生成していた。【０１６８】
（６）寄託菌株
下記表11に示す各菌株を、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818）に寄託した。受託日、受託番号を表11に示す。従って、これらの菌株は公に利用可能である。
【表１１】
2019207812.tif 000012
【０１６９】
また、本明細書に記載した全ての菌株（ATCC株、及びNBRC株を含む）は、ブダペスト条約の下で国際寄託されているか、条件なく誰でも分譲を受けることができる機関が保有しているか、又は市販されており、公に利用可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１７０】
本発明の形質転換体は、二酸化炭素を唯一の炭素源として、イソブタノール、エタノール、又はアラニンを効率よく生成するため、二酸化炭素の増加による地球温暖化と、食料、飼料、燃料の確保困難という2つの問題を共に解決できる。
【配列表】
2019207812000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月16日(2018.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の(a1)、(a2)、又は(a3)のDNA。
(a1)配列番号1の塩基配列からなるDNA
(a2)配列番号1と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつ2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(a3)配列番号1と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
【請求項２】
ヒドロゲノフィラス属細菌に、(a)請求項１に記載のDNA、及び(b)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより得られる形質転換体。
【請求項３】
(b)アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が、下記(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)、又は(b6)のDNAである請求項２に記載の形質転換体。
(b1)配列番号2、3、4、若しくは5の塩基配列からなるDNA
(b2)配列番号2、3、4、若しくは5と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAであり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b3)配列番号2、3、4、若しくは5と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b4)配列番号6、7、8、若しくは9のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA
(b5)配列番号6、7、8、若しくは9と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b6)配列番号6、7、8、若しくは9のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA
【請求項４】
ヒドロゲノフィラス属細菌がヒドロゲノフィラス  サーモルテオラスである請求項２又は３に記載の形質転換体。
【請求項５】
請求項２〜４の何れかに記載の形質転換体を、二酸化炭素を実質的に唯一の炭素源として用いて培養する工程を含むイソブタノールの製造方法。
【国際調査報告】
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