(57)【要約】  本発明は、配列番号：１で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列におけるＴｈｒ８５を含む領域にエピトープを有し、Ｔｈｒ８５はシアル酸含有Ｏ型糖鎖が付加されている、がん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列におけるＴｈｒ８５を含む領域にエピトープを有し、Ｔｈｒ８５はシアル酸含有Ｏ型糖鎖が付加されている、がん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
配列番号：１で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列における７８番目から８５番目の領域（ＩＲＩＥＤＬＰＴ）にエピトープを有する、請求項１に記載のがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
以下の６つのＣＤＲのアミノ酸配列を少なくとも１つ有するか、
以下の６つのＣＤＲのアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を少なくとも１つ有するか、
以下の６つのＣＤＲのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を少なくとも１つ有する、がん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント：
重鎖ＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＮＡＡＭＹ（配列番号：２）
重鎖ＣＤＲ２：ＲＩＲＳＫＰＮＮＹＡＴＹＹＴＤＳＶＫＧ（配列番号：３）
重鎖ＣＤＲ３：ＴＶＧＧＮＮＹＡＡＡＹ（配列番号：４）
軽鎖ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号：５）
軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号：６）
軽鎖ＣＤＲ３：ＦＱＶＴＨＤＰＦＴ（配列番号：７）。
【請求項４】
配列番号：８又は１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖； 
配列番号：８又は１０で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：９又は１１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：９又は１１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；又は、
配列番号：９又は１１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、
を含む、がん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
Ｆｃ領域に１以上のＮ型糖鎖が結合し、該Ｎ型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない、請求項１から４のいずれか１項に記載のがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
請求項３又は４に記載のアミノ酸配列のいずれか１つをコードする核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項９】
請求項１から５のいずれか１項に記載のがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含む医薬組成物。
【請求項１０】
抗がん活性を有する物質を結合させた請求項１から５のいずれか１項に記載のがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含む医薬組成物。
【請求項１１】
腫瘍の予防又は治療剤である、請求項９又は１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有し、Ｔｈｒ８５にシアル酸含有Ｏ型糖鎖が付加されている、ヒトポドプラニン。 
【請求項１３】
以下のアミノ酸配列を有し、
ＩＲＩＥＤＬＰＴ
Ｔｈｒにシアル酸含有Ｏ型糖鎖が付加されている、糖ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗ポドプラニン抗体などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ポドプラニンは、血小板凝集因子及び転移促進因子として知られるムチン型糖タンパク質であり、C末端に膜貫通部位を有するI型膜貫通型タンパク質である。
ポドプラニンは、脳腫瘍、中皮腫、精巣腫瘍、卵巣がん、及び各種扁平上皮がん（口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、食道がん、肺がん、皮膚がん、子宮頸がん）などに高発現していることが知られている。したがって、抗ポドプラニン抗体は、ポドプラニンが高発現しているがん（腫瘍）において抗がん作用（抗腫瘍活性）を示すことが期待される。そのため、ポドプラニンに対する特異性や親和性がより高い抗体や、ポドプラニンを認識する新規抗体などが求められている。【０００３】
我々は近年、がん細胞に特異的な反応性を示すモノクローナル抗体作製技術（ＣａｓＭａｂ法）を開発した。ＣａｓＭａｂ法により、がん細胞と正常細胞に同一のアミノ酸配列の膜タンパク質が発現している場合、糖鎖などの翻訳後修飾の違いを利用し、がん細胞のみを攻撃する抗体医薬品を作製することが可能となった（非特許文献１−３）。【０００４】
これまで、ポドプラニンに対し、複数のがん細胞特異的抗体を作製した（特許文献１、非特許文献３−４）。ポドプラニンに対するがん細胞特異的抗体は、がん型ポドプラニンが高発現する肺がん、食道がん、脳腫瘍、悪性中皮腫などのがん細胞に高反応性を示すが、正常型ポドプラニンが高発現するリンパ管内皮細胞、肺胞上皮細胞、腎上皮細胞には全く反応しない。ＣａｓＭａｂ法によりこれまでに開発したモノクローナル抗体は、強いＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性を持ち、マウスのがん移植片モデルにおいて高い抗腫瘍効果を示したことから、がんに対する特異性のみならず、抗体医薬としての可能性を示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０５３３８１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kato Y, Ogasawara S, Oki H, Goichberg P, Honma R, Fujii Y, Kaneko MK. LpMab-12 Established by CasMab Technology Specifically Detects Sialylated O-glycan on Thr52 of Platelet Aggregation-stimulating Domain of Human Podoplanin. PLoS One, 11(3), e0152912, 2016
【非特許文献２】Kato Y, Kunita A, Abe S, Ogasawara S, Fujii Y, Oki H, Fukayama M, Nishioka Y, and Kaneko MK. The chimeric antibody chLpMab-7 targeting human podoplanin suppresses pulmonary metastasis via ADCC and CDC rather than via its neutralizing activity. Oncotarget, 36003-36018, 2015
【非特許文献３】Kato Y and Kaneko MK. A Cancer-specific Monoclonal Antibody Recognizes the Aberrantly Glycosylated Podoplanin. Sci Rep., 4, 5924, 2014
【非特許文献４】Kaneko MK, Yamada S, Nakamura T, Abe S, Nishioka Y, Kunita A, Fukayama M, Fujii Y, Ogasawara S, Kato Y*. Antitumor activity of chLpMab-2, a human-mouse chimeric cancer-specific antihuman podoplanin antibody, via antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Med., DOI: 10.1002/cam4.1049
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、医薬、診断薬及び試薬として有用な、新規な抗ポドプラニン抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明により樹立されたＰＭａｂ−１１７抗体及びその改変抗体は、ヒトポドプラニンのＴｈｒ８５に付加されたＯ型糖鎖（シアル酸を含む）をエピトープに含んでいることが分かった。また、ＰＭａｂ−１１７抗体及びその改変抗体は、ヒトポドプラニンが発現するがん細胞には強陽性であるが、正常細胞には反応性が低いため、がん細胞特異的抗体であることが分かった。ヒトポドプラニンのＴｈｒ８５に糖鎖が付加されていることはこれまで一切証明されておらず、またＯ型糖鎖が付加されたＴｈｒ８５をエピトープに含む抗体も全く樹立されていないことから、ＰＭａｂ−１１７は新規のエピトープを持つがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体である。
即ち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕
配列番号：１で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列におけるＴｈｒ８５を含む領域にエピトープを有し、Ｔｈｒ８５はシアル酸含有Ｏ型糖鎖が付加されている、がん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント。
〔２〕
配列番号：１で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列における７８番目から８５番目の領域（ＩＲＩＥＤＬＰＴ）にエピトープを有する、〔１〕に記載のがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント。
〔３−１〕
以下の６つのＣＤＲのアミノ酸配列を少なくとも１つ有するか、
以下の６つのＣＤＲのアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を少なくとも１つ有するか、
以下の６つのＣＤＲのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を少なくとも１つ有する、がん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント：
重鎖ＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＮＡＡＭＹ（配列番号：２）
重鎖ＣＤＲ２：ＲＩＲＳＫＰＮＮＹＡＴＹＹＴＤＳＶＫＧ（配列番号：３）
重鎖ＣＤＲ３：ＴＶＧＧＮＮＹＡＡＡＹ（配列番号：４）
軽鎖ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号：５）
軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号：６）
軽鎖ＣＤＲ３：ＦＱＶＴＨＤＰＦＴ（配列番号：７）。
〔３−２〕
以下の６つのＣＤＲのアミノ酸配列を少なくとも１つ有するか、
以下の６つのＣＤＲのアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を少なくとも１つ有するか、
以下の６つのＣＤＲのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を少なくとも１つ有する、〔１〕又は〔２〕に記載のがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント：
重鎖ＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＮＡＡＭＹ（配列番号：２）
重鎖ＣＤＲ２：ＲＩＲＳＫＰＮＮＹＡＴＹＹＴＤＳＶＫＧ（配列番号：３）
重鎖ＣＤＲ３：ＴＶＧＧＮＮＹＡＡＡＹ（配列番号：４）
軽鎖ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号：５）
軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号：６）
軽鎖ＣＤＲ３：ＦＱＶＴＨＤＰＦＴ（配列番号：７）。
〔４−１〕
配列番号：８又は１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖； 
配列番号：８又は１０で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：９又は１１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：９又は１１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；又は、
配列番号：９又は１１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、
を含む、がん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント。
〔４−２〕
配列番号：８又は１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖； 
配列番号：８又は１０で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：９又は１１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：９又は１１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；又は、
配列番号：９又は１１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、
を含む、〔１〕から〔３−２〕のいずれかにがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント。
〔５〕
Ｆｃ領域に１以上のＮ型糖鎖が結合し、該Ｎ型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない、〔１〕から〔４−２〕のいずれかに記載のがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメント。
〔６〕
〔３〕又は〔４〕に記載のアミノ酸配列のいずれか１つをコードする核酸。
〔７〕
〔６〕に記載の核酸を含む発現ベクター。
〔８〕
〔７〕に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
〔９〕
〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含む医薬組成物。
〔１０〕
抗がん活性を有する物質を結合させた〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含む医薬組成物。
〔１１〕
腫瘍の予防又は治療剤である、〔９〕又は〔１０〕に記載の医薬組成物。
〔１２〕
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有し、Ｔｈｒ８５にシアル酸含有Ｏ型糖鎖が付加されている、ヒトポドプラニン。 
〔１３〕
以下のアミノ酸配列を有し、
ＩＲＩＥＤＬＰＴ（配列番号：１２）
Ｔｈｒにシアル酸含有Ｏ型糖鎖が付加されている、糖ペプチド。
【発明の効果】
【０００９】
がん細胞特異的抗体によれば、抗がん活性をがん細胞特異的に発揮することができるので、副作用が極限まで低減された医薬を得ることができる。また、がん細胞を標的とする薬剤の送達にも有用であり、診断薬や試薬としての有用性も高い。
本発明によれば、医薬、診断薬及び試薬として有用な、新規な抗ポドプラニン抗体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヒトポドプラニンのアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。
【図２】ＰＭａｂ−１１７及びＮＺ−１を用いたフローサイトメトリーにおける蛍光強度をＥＣ８００（Ｓｏｎｙ社）で測定した結果を示す。
【図３】ｃｈＰＭａｂ−１１７の重鎖ＤＮＡ配列（配列番号：１３）を示す。
【図４】ｃｈＰＭａｂ−１１７の軽鎖ＤＮＡ配列（配列番号：１４）を示す。
【図５】ｃｈＰＭａｂ−１１７の重鎖アミノ酸配列（配列番号：８）を示す。
【図６】ｃｈＰＭａｂ−１１７の軽鎖アミノ酸配列（配列番号：９）を示す。
【図７】ｃｈＰＭａｂ−１１７を用いたフローサイトメトリーにおける蛍光強度をＥＣ８００（Ｓｏｎｙ社）で測定した結果を示す。
【図８】ｃｈＰＭａｂ１１７−ｍＧ２ａの重鎖ＤＮＡ配列（配列番号：１５）を示す。
【図９】ｃｈＰＭａｂ１１７−ｍＧ２ａの軽鎖ＤＮＡ配列（配列番号：１６）を示す。
【図１０】ｃｈＰＭａｂ１１７−ｍＧ２ａの重鎖アミノ酸配列（配列番号：１０）を示す。
【図１１】ｃｈＰＭａｂ１１７−ｍＧ２ａの軽鎖アミノ酸配列（配列番号：１１）を示す。
【図１２】ｃｈＰＭａｂ１１７−ｍＧ２ａを用いたフローサイトメトリーにおける蛍光強度をＥＣ８００（Ｓｏｎｙ社）で測定した結果を示す。
【図１３】ヒトポドプラニンのＮ末ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔにおける、ＰＭａｂ−１１７を用いたフローサイトメトリーにおける蛍光強度をＥＣ８００（Ｓｏｎｙ社）で測定した結果を示す。
【図１４】ヒトポドプラニンのＮ末ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔにおける、ｃｈＰＭａｂ−１１７を用いたフローサイトメトリーにおける蛍光強度をＥＣ８００（Ｓｏｎｙ社）で測定した結果を示す。
【図１５】ヒトポドプラニンの各種糖鎖不全株における、ＰＭａｂ−１１７及びｃｈＰＭａｂ−１１７を用いたフローサイトメトリーにおける蛍光強度をＥＣ８００（Ｓｏｎｙ社）で測定した結果を示す。
【図１６】７５番目以降のすべてのＳｅｒ／Ｔｈｒのアラニン置換のヒトポドプラニンにおける、ＰＭａｂ−１１７、ｃｈＰＭａｂ−１１７及びＮＺ−１を用いたフローサイトメトリーにおける蛍光強度をＥＣ８００（Ｓｏｎｙ社）で測定した結果を示す。
【図１７】７７番目から８９番目のすべてのアミノ酸のアラニン置換のヒトポドプラニンにおける、ＰＭａｂ−１１７、ｃｈＰＭａｂ−１１７及びＮＺ−１を用いたフローサイトメトリーにおける蛍光強度をＥＣ８００（Ｓｏｎｙ社）で測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（抗ポドプラニン抗体）
本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、配列番号：１で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列におけるＴｈｒ８５を含む領域にエピトープを有し、Ｔｈｒ８５はシアル酸含有Ｏ型糖鎖が付加されている、がん細胞特異的抗ポドプラニン抗体である。Ｏ型糖鎖は、Ｏ−結合型糖鎖ともいう。
【００１２】
本明細書において「抗体」とは、一対のジスルフィド結合で安定化された２本の重鎖（Ｈ鎖）と２本の軽鎖（Ｌ鎖）が会合した構造をとる。重鎖は、重鎖可変領域ＶＨ、重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ１とＣＨ２の間に位置するヒンジ領域からなり、軽鎖は、軽鎖可変領域ＶＬと軽鎖定常領域ＣＬとからなる。この中で、ＶＨとＶＬからなる可変領域断片（Ｆｖ）が、抗原結合に直接関与し、抗体に多様性を与える領域である。また、ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、ＣＨ１からなる抗原結合領域をＦａｂ領域と呼び、ヒンジ領域、ＣＨ２、ＣＨ３からなる領域をＦｃ領域と呼ぶ。
可変領域のうち、直接抗原と接触する領域は特に変化が大きく、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）と呼ばれる。ＣＤＲ以外の比較的変異の少ない部分をフレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ：ＦＲ）と呼ぶ。軽鎖と重鎖の可変領域には、それぞれ３つのＣＤＲ（重鎖ＣＤＲ１〜３、及び軽鎖ＣＤＲ１〜３）が存在する。
【００１３】
本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。また、本発明の抗ポドプラニン抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのいずれのアイソタイプであってもよい。
本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリなどの非ヒト動物を免疫して作製したものであってもよいし、組換え抗体であってもよく、キメラ型抗体（キメラ抗体）、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体などであってもよい。キメラ型抗体（キメラ抗体）とは、異なる種に由来する抗体の断片が連結された抗体をいう。
「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の抗体に特徴的なアミノ酸配列で、ヒト抗体の対応する位置を置換した抗体を意味し、例えば、マウス又はラットを免疫して作製した抗体の重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３を有し、重鎖及び軽鎖のそれぞれ４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含むその他のすべての領域がヒト抗体に由来する抗体などが挙げられる。かかる抗体は、ＣＤＲ移植抗体と呼ばれる場合もある。用語「ヒト化抗体」は、ヒト型キメラ抗体を含む場合もある。
【００１４】
本明細書において、抗ポドプラニン抗体の「抗原結合フラグメント」とは、抗ポドプラニン抗体のフラグメントであって、ポドプラニンに結合するフラグメントをいう。具体的には、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１領域からなるＦａｂ；２つのＦａｂがヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結されているＦ（ａｂ’）２；ＶＬ及びＶＨからなるＦｖ；ＶＬ及びＶＨを人工のポリペプチドリンカーで連結した一本鎖抗体であるｓｃＦｖのほか、ｄｉａｂｏｄｙ型、ｓｃＤｂ型、ｔａｎｄｅｍ  ｓｃＦｖ型、ロイシンジッパー型等の二重特異性抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、配列番号：１で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列における７８番目から８５番目の領域（７８−ＩＲＩＥＤＬＰＴ−８５）であって、８５位のスレオニンにシアル酸含有Ｏ型糖鎖が付加されているヒトポドプラニンの糖ペプチド部分にエピトープを有することが好ましい。
ヒトポドプラニンのアミノ酸配列における７８番目から８５番目の領域（７８−ＩＲＩＥＤＬＰＴ−８５）にエピトープを有する本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、ペプチドと糖鎖の両方をエピトープに含んで認識する抗体である。
７８−ＩＲＩＥＤＬＰＴ−８５で表されるアミノ酸配列は、配列番号：１で表されるヒトポドプラニンにおける７８番目から８５番目のアミノ酸に相当する。そして、Ｔは、配列番号：１のアミノ酸配列における８５位のスレオニン（Ｔｈｒ８５）に相当する。
本発明においては、抗ポドプラニン抗体のエピトープである、Ｔｈｒにシアル酸含有Ｏ型糖鎖が付加されているＩＲＩＥＤＬＰＴ（配列番号：１２）で表される糖ペプチドも提供する。また、本発明は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有し、Ｔｈｒ８５にシアル酸含有Ｏ型糖鎖が付加されている、ヒトポドプラニンを提供する。
【００１６】
本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、以下の６つのＣＤＲの少なくとも１つを有していてもよい。これらのＣＤＲは、ＰＭａｂ−１１７のＣＤＲ配列である。
重鎖ＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＮＡＡＭＹ（配列番号：２）
重鎖ＣＤＲ２：ＲＩＲＳＫＰＮＮＹＡＴＹＹＴＤＳＶＫＧ（配列番号：３）
重鎖ＣＤＲ３：ＴＶＧＧＮＮＹＡＡＡＹ（配列番号：４）
軽鎖ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号：５）
軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号：６）
軽鎖ＣＤＲ３：ＦＱＶＴＨＤＰＦＴ（配列番号：７）  
本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、配列番号：１で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列におけるＴｈｒ８５を含む領域にエピトープを有し、Ｔｈｒ８５はシアル酸含有Ｏ型糖鎖が付加されている、がん細胞特異的抗ポドプラニン抗体であって、上記６つのＣＦＲの少なくとも１つを有することが好ましい。当該抗ポドプラニン抗体は、、配列番号：１で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列における７８番目から８５番目の領域（７８−ＩＲＩＥＤＬＰＴ−８５）であって、８５位のスレオニンにシアル酸含有Ｏ型糖鎖が付加されているヒトポドプラニンの糖ペプチド部分にエピトープを有することがより好ましい。
【００１７】
本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、６つのＣＤＲのうち少なくとも１つを含むものであればよいが、６つのＣＤＲのうち複数のＣＤＲを含んでいてもよく、例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、又は６つ含むものとすることができる。
本発明に係る抗ポドプラニン抗体が、６つのＣＤＲを含む場合、当該抗ポドプラニン抗体は、配列番号：２〜４で表される重鎖ＣＤＲ１〜３及び配列番号：５〜７で表される軽鎖ＣＤＲ１〜３を有する。
【００１８】
本発明に係る抗ポドプラニン抗体が、配列番号：２〜４で表される重鎖ＣＤＲ１〜３及び配列番号：５〜７で表される軽鎖ＣＤＲ１〜３のいずれか１つを含む場合において、その少なくとも１つに、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００１９】
本明細書において「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体や誘導体を含む。アミノ酸は慣用的な一文字表記又は三文字表記で示される場合もある。本明細書における「アミノ酸」としては、天然タンパク質性Ｌ−アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられる。
非天然アミノ酸としては、例えば、主鎖の構造が天然型と異なる、α，α−二置換アミノ酸（α−メチルアラニン等）、Ｎ−アルキル−α−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、α−ヒドロキシ酸や、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジン等）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジン等）、及び側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸等）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
本明細書において「１から数個のアミノ酸の付加、置換又は欠失を有する」という場合、付加、置換又は欠失されるアミノ酸の個数は、結果として得られるポリペプチドがＣＤＲとしての機能を保持する限り特に限定されないが、例えば、１個、２個、３個又は４個とすることができる。「１個のアミノ酸の付加、置換又は欠失を有」していてもよく、「１〜２個のアミノ酸の付加、置換又は欠失を有」していてもよく、「１〜３個のアミノ酸の付加、置換又は欠失を有」していてもよく、「１〜４個のアミノ酸の付加、置換又は欠失を有」していてもよい。
アミノ酸の欠失、置換又は付加の位置は、ＣＤＲとしての機能が保持される限り、アミノ酸が欠失、置換又は付加されるＣＤＲ配列のどこであってもよい。
【００２１】
本発明に係る抗ポドプラニン抗体が、配列番号：２〜４で表される重鎖ＣＤＲ１〜３及び配列番号：５〜７で表される軽鎖ＣＤＲ１〜３のいずれか１つを含む場合において、その少なくとも１つが、配列番号：２〜４で表される重鎖ＣＤＲ１〜３及び配列番号：５〜７で表される軽鎖ＣＤＲ１〜３の対応するアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００２２】
本明細書において、「８０％以上の同一性を有する」とは、変異前のアミノ酸配列と当該アミノ酸配列から変異した配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列一致が最大になるようにアライメントしたときに、共通するアミノ酸残基の数が、変異前のアミノ酸配列のアミノ酸数の８０％以上であることを意味する。
同一性は８０％以上であって、ＣＤＲとしての機能を保持する限り特に限定されないが、例えば８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上とすることができる。
本明細書において、配列番号：２〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列と「８０％以上の同一性を有する」とは、配列番号：２〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列と変異した配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列を比較して、一致が最大になるようにアライメントしたときに、共通するアミノ酸残基の数が、配列番号：２〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列のアミノ酸数の８０％以上であることを意味する。
【００２３】
重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列にアミノ酸を付加、置換、又は欠失させたアミノ酸配列からなるＣＤＲや、重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するＣＤＲは、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、チェーンシャフリング法、ＣＤＲウォーキング法などの公知の方法を用いて作製され得る。これらの方法によれば、ファージディスプレイ法によってＣＤＲに種々の変異を有する抗体又は抗体断片をファージ表面に提示させ、抗原を使用してスクリーニングすることにより、より親和性が成熟したＣＤＲを得られることが当業者によく知られている（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９５：６０３７−６０４２（１９９８）；Ｓｃｈｉｅｒ，Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２６３：５５１−５６７（１９９６）；Ｓｃｈｉｅｒ，Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：２８−４３（１９９６）；Ｙａｎｇ，Ｗ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４：３９２−４０３（１９９５）。）。
【００２４】
本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、
配列番号：８又は１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；
配列番号：８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；又は、
配列番号：８又は１０で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
を含むことが好ましい。
配列番号：８で表されるアミノ酸配列は、ｃｈＰＭａｂ−１１７のキメラ型抗体の重鎖のアミノ酸配列であり、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列は、ｃｈＰＭａｂ−１１７−ｍＧ２ａのキメラ型抗体の重鎖のアミノ酸配列である。
【００２５】
本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、
配列番号：９又は１１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；
配列番号：９又は１１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；又は、
配列番号：９又は１１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含むことが好ましい。
配列番号：９で表されるアミノ酸配列は、ｃｈＰＭａｂ−１１７のキメラ型抗体の軽鎖のアミノ酸配列であり、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列は、ｃｈＰＭａｂ−１１７−ｍＧ２ａのキメラ型抗体の軽鎖のアミノ酸配列である。
【００２６】
本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、
配列番号：８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；及び
配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；を含むことがより好ましく、
配列番号：８で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；及び
配列番号：９で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；を含んでいてもよく、
配列番号：８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖；及び
配列番号：９で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖；を含んでいてもよい。
【００２７】
本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、
配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖；及び
配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖；を含むことがより好ましく、
配列番号：１０で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む重鎖；及び
配列番号：１１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列を含む軽鎖；を含んでいてもよく、
配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖；及び
配列番号：１１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖；を含んでいてもよい。
【００２８】
本明細書において、重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失という場合、付加、置換、又は欠失するアミノ酸の数は、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個とすることができる。その他の用語は、上述したとおりである。
【００２９】
本明細書において、配列番号：８〜１１のいずれかで表されるアミノ酸配列と「８０％以上の同一性を有する」とは、配列番号：８〜１１のいずれかで表されるアミノ酸配列と変異した配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列を比較して、一致が最大になるようにアライメントしたときに、共通するアミノ酸残基の数が、配列番号：８〜１１のいずれかで表されるアミノ酸配列のアミノ酸数の８０％以上であることを意味する。
【００３０】
本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、Ｆｃ領域に１以上のＮ型糖鎖が結合し、該Ｎ型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体であってもよい。Ｎ型糖鎖は、Ｎ−結合型糖鎖ともいう。
例えばＩｇＧ抗体のＦｃ領域には、Ｎ型糖鎖の結合部位が２ヶ所存在し、この部位に複合型糖鎖が結合している。Ｎ型糖鎖とは、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列のＡｓｎに結合する糖鎖をいい、Ａｓｎに結合した共通した構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（−Ａｓｎ）を有する。非還元末端の２つのマンノース（Ｍａｎ）に結合する糖鎖の種類により、高マンノース型、混成型、及び複合型などに分類される。
Ｎ型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にはフコースが結合し得るが、フコースが結合していない場合、結合している場合に比較してＡＤＣＣ活性が著しく上昇することが知られている。このことは例えば、国際公開第２００２／０３１１４０号に記載されており、その開示は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＤＣＣ活性が著しく向上することにより、抗体を医薬として用いる場合に投与量を少なくすることができるので、副作用を軽減させることが可能であると共に、治療費も低減させることができる。
【００３１】
本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、抗がん活性を有する物質を結合させて用いてもよい。
本明細書において、「抗がん活性を有する物質」とは、腫瘍サイズの低下（遅延又は停止）、腫瘍の転移の阻害、腫瘍増殖の阻害（遅延又は停止）、及びがんと関連する一つ又は複数の症状の緩和、の少なくとも１つを生じさせる物質を意味する。具体的には、毒素、抗がん剤、ラジオアイソトープなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
抗がん活性を有する毒素としては、例えば、緑膿菌外毒素（ＰＥ）又はその細胞障害性フラグメント（例えばＰＥ３８）、ジフテリア毒素、リシンＡなどが挙げられる。抗がん活性を有する毒素は、抗ポドプラニン抗体と共に毒素が取り込まれる細胞、即ちポドプラニンを発現しているがん細胞のみに毒性を発揮するので、周囲の細胞に悪影響を与えず、特異的に効果を得られるという利点がある。本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、腫瘍細胞に発現する抗ポドプラニンに特異的に結合するので、有用である。
【００３３】
抗がん剤としては、例えば、アドリアマイシン、ダウノマイシン、マイトマイシン、シスプラチン、ビンクリスチン、エピルビシン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、アクラシノマイシン、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミド、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、タモキシフェン、デキサメタゾン等の低分子化合物や、免疫担当細胞を活性化するサイトカイン（例えば、ヒトインターロイキン２、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激因子、ヒトインターロイキン１２）等のタンパク質などが挙げられる。
【００３４】
抗がん活性を有するラジオアイソトープとしては、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、２１１Ａｔ、９０Ｙなどが挙げられる。ラジオアイソトープは、抗ポドプラニン抗体が結合する細胞、即ちポドプラニンを発現している細胞の周囲の細胞にも毒性を発揮する。一般に、腫瘍細胞は均一ではなく、すべての腫瘍細胞がポドプラニンを発現しているわけではないので、周囲のポドプラニン陰性の腫瘍細胞を殺すためにラジオアイソトープは有用である。なお、ラジオアイソトープを結合させる場合、抗ポドプラニン抗体はＦａｂやｓｃＦｖなどの低分子抗体としてもよい。
【００３５】
抗がん活性を有する物質は、公知の方法によって抗ポドプラニン抗体に直接結合させることができる。また、例えば、抗ポドプラニン抗体を表面に修飾させたリポソームなどの担体に抗がん活性を有する物質を封入してもよい。
【００３６】
抗がん活性を有する物質が蛋白質やポリペプチドの場合は、本発明に係る抗ポドプラニン抗体をコードする核酸（後述）と抗がん活性を有する物質をコードするＤＮＡを連結し、適当な発現ベクターに挿入することにより、抗がん活性を有する物質と抗ポドプラニン抗体との融合タンパク質として発現させてもよい。
【００３７】
（核酸）
本発明は、本発明に係る抗ポドプラニン抗体をコードする核酸も包含する。核酸は、天然の核酸であっても人工の核酸であってもよく、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのキメラが挙げられるが、これらに限定されない。抗ポドプラニン抗体をコードする核酸の塩基配列は、当業者が公知の方法又はそれに準ずる方法に従って決定することができ、公知の方法又はそれに準ずる方法で調製することができる。
【００３８】
本発明に係る核酸は、
以下の６つのＣＤＲのアミノ酸配列、
以下の６つのＣＤＲのアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列、
以下の６つのＣＤＲのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
重鎖ＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＮＡＡＭＹ（配列番号：２）
重鎖ＣＤＲ２：ＲＩＲＳＫＰＮＮＹＡＴＹＹＴＤＳＶＫＧ（配列番号：３）
重鎖ＣＤＲ３：ＴＶＧＧＮＮＹＡＡＡＹ（配列番号：４）
軽鎖ＣＤＲ１：ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号：５）
軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号：６）
軽鎖ＣＤＲ３：ＦＱＶＴＨＤＰＦＴ（配列番号：７）
配列番号：８又は１０で表されるアミノ酸配列
配列番号：８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列 
配列番号：８又は１０で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
配列番号：９又は１１で表されるアミノ酸配列
配列番号：９又は１１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の付加、置換、又は欠失を含むアミノ酸配列、又は、
配列番号：９又は１１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸であってよい。
【００３９】
本発明に係る抗ポドプラニン抗体をコードする核酸としては、例えば、配列番号：１３で表されるｃｈＰＭａｂ−１１７の重鎖をコードするＤＮＡ、配列番号：１４で表されるｃｈＰＭａｂ−１１７の軽鎖をコードするＤＮＡ、配列番号：１５で表されるｃｈＰＭａｂ１１７−ｍＧ２ａの重鎖をコードするＤＮＡ、配列番号：１６で表されるｃｈＰＭａｂ１１７−ｍＧ２ａの軽鎖をコードするＤＮＡなどが挙げられるが、これらに限定されない。
ｃｈＰＭａｂ−１１７及びｃｈＰＭａｂ１１７−ｍＧ２ａのＣＤＲのそれぞれをコードする核酸は、配列番号：１３〜１６のいずれかで表されるＤＮＡ配列に含まれている。
【００４０】
（発現ベクター）
本発明は、本発明に係る核酸を含む発現ベクターも包含する。発現ベクターは、使用する宿主細胞にあわせて適宜選択することができ、例えば、プラスミド、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、カリフラワーモザイクウイルスベクターやタバコモザイクウイルスベクター等の植物ウイルスベクター、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。これらの発現ベクターには、公知の方法（制限酵素を利用する方法など）で、本発明に係る核酸を挿入することができる。
【００４１】
本発明に係る発現ベクターは、本発明に係る核酸、例えば、本発明に係る抗ポドプラニン抗体をコードする核酸に加え、さらに、抗体遺伝子の発現を調節するプロモーター、複製起点、選択マーカー遺伝子などを含むことができる。プロモーター及び複製起点は、宿主細胞とベクターの種類によって適宜選択することができる。
【００４２】
（形質転換体）
本発明は、本発明に係るベクターを含む形質転換体を包含する。形質転換体は、本発明に係るベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクトすることによって得ることができる。宿主細胞としては、例えば、哺乳類細胞（ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞等）、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞（サッカロミセス属、アスペルギルス属等）といった真核細胞や、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、枯草菌等の原核細胞などを用いることができる。
【００４３】
（抗ポドプラニン抗体の製造方法）
本発明に係る抗ポドプラニン抗体の製造方法は限定されないが、例えば、抗ポドプラニンモノクローナル抗体は、ポドプラニン又はその断片で免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞などと融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、抗ポドプラニンポリクローナル抗体は、ポドプラニン又はその断片で免疫した動物の血清から得ることができる。また、本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、非ヒト動物を免疫する際、Ｔｈｒ８５に結合する糖鎖以外の糖鎖を付加したポドプラニンを用いてもよい。
本発明に係る抗ポドプラニン抗体の製造方法において用いられるポドプラニン又はその断片は、配列番号：１で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列におけるＴｈｒ８５を含む領域を有し、Ｔｈｒ８５はシアル酸含有Ｏ型糖鎖が付加されている。好ましくは、配列番号：１で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列における７８番目から８５番目の領域（ＩＲＩＥＤＬＰＴ）を有し、Ｔｈｒ８５はシアル酸含有Ｏ型糖鎖が付加されている。
【００４４】
本発明に係る抗ポドプラニン抗体を遺伝子組換え法で作製する場合、例えば、本発明に係る抗ポドプラニン抗体をコードする核酸を含む発現ベクターで適当な宿主を形質転換し、この形質転換体を適当な条件で培養して抗体を発現させ、公知の方法に従って単離精製すればよい。
単離精製方法としては、例えば、プロテインＡ等を用いたアフィニティーカラム、その他のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析などが挙げられ、これらを適宜組み合わせることができる。
【００４５】
所定のエピトープの配列に結合する抗体は、当業者が公知の方法又はそれに準ずる方法で作製することができる。例えば、エピトープ配列を含むペプチドを固相担体に固定し、当該ペプチドと複数の抗体の結合を検出することにより、同エピトープに特異的に結合する抗体を得ることができる。
ここで、「複数の抗体」としては、動物を抗原タンパク質又はその部分ペプチドで免疫することによって得たものを用いてもよいし、ファージディスプレイ法によって作製した抗体ライブラリ又は抗体フラグメントライブラリを用いてもよい。ファージディスプレイ法によるライブラリを用いる場合、エピトープ配列を含むペプチドを固相担体に固定しパニングを繰り返すことによって、同エピトープに特異的に結合する抗体を得ることもできる。
【００４６】
ヒト型キメラ抗体及びヒトＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体を産生するハイブリドーマのｍＲＮＡから抗体遺伝子をクローン化し、これをヒト抗体遺伝子の一部と遺伝子組換え技術で連結することによって作製することができる。
ヒト型キメラ抗体の場合、マウス抗体を産生するハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＬＨ）をＰＣＲでクローニングして配列を解析する。次に、一致率の高い抗体塩基配列から、リーダー配列を含む５’プライマーを作製し、５’プライマーと可変部３’プライマーによって上記ｃＤＮＡから、シグナル配列から可変領域の３’末端までをＰＣＲでクローニングする。一方で、ヒトＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖の定常領域をクローニングし、重鎖と軽鎖それぞれについて、マウス抗体由来可変領域と、ヒト抗体由来定常領域とをＰＣＲによるＯｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  Ｈａｎｇｉｎｇ法で連結し、増幅する。得られたＤＮＡを適当なベクターに挿入し、これを形質転換して、ヒト型キメラ抗体を得ることができる。
【００４７】
ヒトＣＤＲ移植抗体の場合、使用するマウス抗体可変部と最も相同性の高いヒト抗体可変部を選択してクローン化し、メガプライマー法を用いた部位選択的突然変異導入により、ＣＤＲの塩基配列を改変する。フレームワーク領域を構成するアミノ酸配列をヒト化すると抗原との特異的な結合ができなくなる場合には、フレームワークの一部のアミノ酸をヒト型からラット型に変換してもよい。
元の配列において、１又は２個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列からなるＣＤＲや、元の配列に８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＣＤＲは、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、チェーンシャフリング法、ＣＤＲウォーキング法などの公知の方法を用いて作製され得る。
これらの方法により、ファージディスプレイ法によってＣＤＲに種々の変異を有する抗体又は抗体断片をファージ表面に提示させ、抗原を使用してスクリーニングすることにより、より親和性が成熟したＣＤＲを得られることが当業者によく知られている（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９５：６０３７−６０４２（１９９８）；Ｓｃｈｉｅｒ，Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２６３：５５１−５６７（１９９６）；Ｓｃｈｉｅｒ，Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：２８−４３（１９９６）；Ｙａｎｇ，Ｗ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４：３９２−４０３（１９９５）。）。本発明は、このような方法で成熟させたＣＤＲを含む抗体も包含する。
【００４８】
その他の抗体の製造方法として、トリコスタチンＡ処理ニワトリＢ細胞由来ＤＴ４０細胞株から抗体産生株を取得するＡｄｌｉｂ法（Ｓｅｏ，Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６：７３１−７３６，２００２）、マウス抗体遺伝子が破壊されヒト抗体遺伝子が導入されたマウスであるＫＭマウスを免疫してヒト抗体を作製する方法（Ｉｔｏｈ，Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，９２：１３１３−１３２１，２００１；Ｋｏｉｄｅ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８４：１１４１−１１５１，１９９８）などがあり、これらも本発明に係る抗体の産生に応用することができる。
【００４９】
本発明に係る抗ポドプラニン抗体の抗原結合フラグメントは、当該フラグメントをコードするＤＮＡを用いて上述の方法で発現させてもよいし、また、全長の抗体を得てからパパイン、ペプシンなどの酵素で処理して断片化してもよい。
【００５０】
本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、作製方法や精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、形態などが異なり得る。しかしながら、得られた抗体が、本発明に係る抗ポドプラニン抗体と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明に係る抗ポドプラニン抗体を、大腸菌などの原核細胞で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加される。本発明は、かかる抗体も包含する。
【００５１】
本発明に係る抗ポドプラニン抗体が、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ型糖鎖を有する抗体である場合、かかる抗体は公知の方法又はそれに準ずる方法に従って製造することができる。かかる抗体の製造方法は、例えば、国際公開第２００２／０３１１４０号、特開２００９−２２５７８１号公報に記載されており、その開示は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
具体的には、例えば、本発明に係る抗ポドプラニン抗体をコードするＤＮＡを含むベクターを用いて、ＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性、又はα−１，６−フコシルトランスフェラーゼの活性が低下又は欠失した細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養した後、目的とする抗ポドプラニン抗体を精製することによって得ることができる。
ＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、例えば、ＧＤＰ−ｍａｎｎｏｓｅ  ４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ（ＧＭＰ）、ＧＤＰ−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ  ３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ，４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（Ｆｘ）、ＧＤＰ−ｂｅｔａ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＧＦＰＰ）が挙げられる。
ここで、細胞は特に限定されないが、哺乳動物細胞が好ましく、例えば上記酵素活性を低下又は欠失されたＣＨＯ細胞を用いることができる。
上記方法によって得られる抗体組成物は、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合している抗体を含む場合もあるが、フコースが結合している抗体の割合は、抗体全体の２０重量％以下、好ましくは１０重量％以下、さらに好ましくは５重量％以下、最も好ましくは３重量％以下である。
【００５２】
また、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ型糖鎖を有する抗体は、本発明に係る抗ポドプラニン抗体をコードするＤＮＡを含むベクターを昆虫卵に導入し、孵化させて昆虫を成長させ、必要に応じて交配を行ってトランスジェニック昆虫を作製し、当該トランスジェニック昆虫又はその分泌物から抗ポドプラニン抗体を抽出することによっても得ることができる。昆虫としてはカイコを用いることができ、その場合、繭から抗体を抽出することができる。
この方法によって得られる抗体組成物も、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合している抗体を含む場合もあるが、フコースが結合している抗体の割合は、抗体全体の２０重量％以下、好ましくは１０重量％以下、さらに好ましくは５重量％以下、最も好ましくは３重量％以下である。
【００５３】
（本発明に係る抗ポドプラニン抗体の活性）
抗体医薬の薬効メカニズムは、抗体が有する２つの生物活性に基づいている。１つは標的抗原特異的な結合活性であり、結合することによって標的抗原分子の機能を中和する活性である。標的抗原分子の機能の中和はＦａｂ領域を介して発揮される。
【００５４】
もう１つは、エフェクター活性と呼ばれる抗体の生物活性である。エフェクター活性は、抗体のＦｃ領域を介して、抗体依存性細胞障害活性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞障害活性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＣＤＣ）、アポトーシスの直接誘導などの態様で発揮される。
本発明に係る抗ポドプラニン抗体の活性は、以下の方法で測定することができる。
【００５５】
（１）結合活性
抗体の結合活性は公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）、蛍光抗体法、ＦＡＣＳ法などで、測定することができる。
【００５６】
（２）ＡＤＣＣ活性
ＡＤＣＣ活性とは、標的細胞の細胞表面抗原に本発明に係る抗ポドプラニン抗体が結合した際、そのＦｃ部分にＦｃγ受容体保有細胞（エフェクター細胞）がＦｃγ受容体を介して結合し、標的細胞に障害を与える活性を意味する。
ＡＤＣＣ活性は、ポドプラニンを発現している標的細胞とエフェクター細胞と本発明に係る抗ポドプラニン抗体を混合し、ＡＤＣＣの程度を測定することによって知ることができる。エフェクター細胞としては、例えば、マウス脾細胞、ヒト末梢血や骨髄から分離した単球核を利用することができる。標的細胞としては、例えばポドプラニン陽性中皮腫細胞やポドプラニン陽性膠芽腫細胞を用いることができる。標的細胞をあらかじめ５１Ｃｒなどで標識し、これに本発明に係る抗ポドプラニン抗体を加えてインキュベーションし、その後標的細胞に対して適切な比のエフェクター細胞を加えてインキュベーションを行う。インキュベーション後、上清を採取し、上清中の上記標識をカウントすることにより、測定することが可能である。
【００５７】
（３）ＣＤＣ活性
ＣＤＣ活性とは、補体系による細胞障害活性を意味する。
ＣＤＣ活性は、ＡＤＣＣ活性の試験において、エフェクター細胞に代えて補体を用いることにより測定することができる。
【００５８】
（４）腫瘍増殖抑制活性
腫瘍増殖抑制活性は、腫瘍モデル動物を利用して測定することができる。例えば、マウスの皮下に腫瘍を移植し、本発明に係る抗ポドプラニン抗体を投与する。非投与群と投与群における腫瘍組織の体積を比較することにより、腫瘍増殖抑制効果を測定することができる。
なお、腫瘍増殖抑制活性は、個々の細胞の増殖を抑制する結果生じるものであっても、細胞死を誘導する結果生じるものであってもよい。
【００５９】
（医薬組成物）
本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、ポドプラニンを発現する腫瘍の予防又は治療に用いてもよい。本発明に係る医薬組成物は、本発明に係る抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含み、さらに薬学的に許容できる担体や添加物を含む。
【００６０】
本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、腫瘍細胞を標的とする薬物の送達に用いてもよい。本発明に係る医薬組成物は、抗がん活性を有する物質を結合させた抗ポドプラニン抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含んでいてもよく、さらに薬学的に許容できる担体や添加物を含んでいてもよい。
【００６１】
担体及び添加物の例としては、水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等の薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
本発明に係る医薬組成物は、様々な形態、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤などとすることができる。好ましい態様は、注射剤であり、非経口（例えば、静脈内、経皮、腹腔内、筋内）で投与することが好ましい。
【００６３】
本発明に係る医薬組成物は、ポドプラニンが関連する疾患、例えば、腫瘍、血栓症、動脈硬化症などの治療に有効である。
ポドプラニンが関連する腫瘍としては、脳腫瘍、中皮腫、精巣腫瘍、卵巣がん、及び扁平上皮がんなどが挙げられる。ここで、扁平上皮がんには、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、食道がん、肺がん、皮膚がん、子宮頸がんが含まれるがこれらに限定されない。
【００６４】
本発明は、本発明に係る抗ポドプラニン抗体を治療有効量投与することを含むポドプラニンが関連する疾患の治療方法も包含する。
本明細書において、治療有効量とは、治療する疾患の一つ又は複数の症状が、それによりある程度緩和される作用物質の量を意味する。抗がん剤の場合、腫瘍サイズの低下；腫瘍の転移の阻害（遅延又は停止）；腫瘍増殖の阻害（遅延又は停止）、及びがんと関連する一つ又は複数の症状の緩和、の少なくとも１つを示す量を意味する。
具体的には、本発明に係る抗ポドプラニン抗体の投与量は、例えば、０．０２５〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ又は０．１〜３ｍｇ／ｋｇとすることができるが、これに限定されない。
【００６５】
（マーカー、診断薬）
ポドプラニンは特定の腫瘍細胞において高発現している。本発明に係る抗ポドプラニン抗体は、がん、特に脳腫瘍、中皮腫、精巣腫瘍、卵巣がん、及び各種扁平上皮がん（口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、食道がん、肺がん、皮膚がん、子宮頸がん）などポドプラニンが高発現するがんの診断に有用である。本発明に係る抗ポドプラニン抗体が腫瘍細胞特異的に結合するので、診断に特に有用である。
本発明は、本発明に係る抗ポドプラニン抗体を含むがんの診断薬、がんの診断のための本発明に係る抗ポドプラニン抗体の使用、本発明に係る抗ポドプラニン抗体を用いるがんの診断方法をも包含する。
【００６６】
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
また、本明細書において、本発明に係る抗ポドプラニン抗体として記載している内容は、本発明に係る抗ポドプラニン抗体を本発明に係る抗ポドプラニン抗体の抗原結合フラグメントと読み換えて理解することができる。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明を実施例及び比較例に基づいて具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。【００６８】
１．新規の糖ペプチドエピトープに対する抗ポドプラニン抗体の樹立
ラットに合計4回（10日間に1回）、LN229/hPDPN細胞を1x108個ずつ免疫した。ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay）法により、がん細胞株から精製したリコンビナントタンパク質に反応する抗体をスクリーニングした。
選択されたがん細胞特異的抗ポドプラニン抗体を、PMab-117（rat IgM, kappa）と名付けた。【００６９】
リコンビナントタンパク質は、以下のようにして精製した。
LN229/hPDPN細胞を静置培養し、合計10 g回収する。0.5% Triton/PBS溶液を10 mL添加し、氷上で細胞をピペッティングにより可溶化した。可溶化した溶液を15,000 rpm, 30分遠心した。上清をanti-FLAG抗体（M2）のアフィニティーカラム（シグマアルドリッチ社）1 mLに加え、4℃で18時間反応させた。10 mLのPBSで3回洗浄し、0.1 mg/mLのFLAG peptide（シグマアルドリッチ社）を1 mLずつ添加し、カラムに吸着したリコンビナントタンパク質を溶出させた。OD280で吸光度を測定し、溶出したフラクションを濃縮し、最終濃度を0.1 mg/mLに調整した。【００７０】
ELISA法は、以下のように行った。
精製したポドプラニン1 mg/mLを96 well plate（Nunc MaxiSorp; サーモフィッシャー社）に37℃で30分固相化し、SuperBlock/PBST（サーモフィッシャー社）を用いて、37℃で30分ブロッキングを行った。同様に、マウスハイブリドーマ由来の培養上清、anti-rat IgG-HRP (ダコ社)を37℃30分の条件で順次反応させ、TMB-Ultra(サーモフィッシャー社)で発色させた。マイクロプレートリーダー（バイオラッド社）を用いて、吸光度の測定（OD655nm）を行った。【００７１】
２．PMab-117を用いたフローサイトメトリー
抗ポドプラニン抗体（PMab-117；rat IgM, kappa）のポドプラニン発現株に対する反応性をフローサイトメトリーにて調べた。まず、ヒトポドプラニンを発現した各種細胞株に、PMab-117(培養上清)を4℃で30分反応させ、さらに抗rat IgG-Oregon Green抗体（サーモフィッシャー社）を4℃で30分反応させた。ネガティブコントロールとして二次抗体のみを用いた。
蛍光強度をEC800（Sony社）で測定した。結果を図２に示す。
PMab-117は、膠芽腫(LN319)や肺がん（PC-10）などのがん細胞上のポドプラニンに高反応性を示したが、腎上皮細胞（HEK-293T）には全く反応しなかった。一方、抗ポドプラニン抗体のNZ-1抗体は、LN319やPC-10だけでなく、HEK-293Tにも高い反応性を示した。この結果から、PMab-117はがん細胞特異的であることが示された。【００７２】
３．ヒトキメラ型PMab-117（chPMab-117）の作製と、アミノ酸配列及び抗体遺伝子の塩基配列の決定
抗ポドプラニン抗体（PMab-117；rat IgM, kappa）のハイブリドーマ細胞1×106個からQIAGEN RNeasy mini kit（キアゲン社）を使用してトータルRNAを抽出した。トータルRNA 1μgからSuperScript III First-Strand Syntheses kit（サーモフィッシャー社）を使用してcDNA合成を行った。以下の実験では、cDNAを鋳型として使用した。
ヒトキメラ型PMab-117（chPMab-117）を作製するために、PMab-117のVH領域をコードするDNAをPCRで増幅し、ヒトIgG1のCH1、ヒンジ領域、CH2、CH3領域をコードするDNAを保持したpCAGベクターに組み込んだ（pCAG-CHhG1／PMab-117HVH（G418））。また、PMab-117のVL領域をコードするDNAをPCRで増幅し、ヒトkappa鎖のCK領域をコードするDNAを保持したpCAGベクターに組み込んだ（pCAG-hIgCKb／PMab-117LVL（zeocin））。
H鎖の増幅に以下のプライマーを使用した。
InF.HindIII-chP117H：CGGTATCGAT AAGCTTAGTA TGTTGGTGCT GCAG（配列番号：１７）
InFr.chP117HVH-BamHI：GGCCCTTGGT GGATCCTGAA GAGACAGTGA CCAG（配列番号：１８）
L鎖の増幅に以下のプライマーを使用した。
InF.HindIII-P117L：CGGTATCGATAAGCTTAAAATGAAAGTGCCTGTTAG（配列番号：１９）
InFr.chP117LVL-BamHI：ATGGTGCAGCGGATCCCCGTTTTATTTCCAACTTC（配列番号：２０）
PCR反応にはQIAGEN HotStar HiFidelity Polymerase Kit（キアゲン社）を使用した。温度条件は、最初に95℃5分、次に94℃15秒、50℃1分、72℃1分を35サイクル、最後に72℃10分とした。増幅したPCR産物はQIAGEN PCR purification kitにて精製し、ベクタープライマーから塩基配列の決定を行った。
塩基配列からアミノ酸配列を予測した。chPMab-117の重鎖DNA配列、軽鎖DNA配列、重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列、を、配列番号：１３、１４、８及び９として、図３〜図６に示す。
＜PMab-117のCDR＞
PMab-117の重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3のアミノ酸配列は、配列番号：２〜７のとおりであった。
重鎖CDR1：GFTFSNAAMY（配列番号：２）
重鎖CDR2：RIRSKPNNYATYYTDSVKG（配列番号：３）
重鎖CDR3：TVGGNNYAAAY（配列番号：４）
軽鎖CDR1：RSSQSLVHSNGNTYLE（配列番号：５）
軽鎖CDR2：KVSNRFS（配列番号：６）
軽鎖CDR3：FQVTHDPFT（配列番号：７）；【００７３】
４．chPMab-117によるフローサイトメトリー
ヒトキメラ型PMab-117（chPMab-117）のポドプラニン発現株に対する反応性をフローサイトメトリーにて調べた。まず、ヒトポドプラニンを発現した各種細胞株に、chPMab-117（10 μg/mL）を4℃で30分反応させ、さらに抗rat IgG-Oregon Green抗体（サーモフィッシャー社）、抗human IgG-FITC抗体（サーモフィッシャー社）をそれぞれ4℃で30分反応させた。ネガティブコントロールとして二次抗体のみを用いた。
蛍光強度をEC800（Sony社）で測定した。結果を図７に示す。
chPMab-117は、膠芽腫(LN319)や肺がん（PC-10）などのがん細胞上のポドプラニンに高反応性を示したが、ポドプラニン強発現の腎上皮細胞（HEK-293T）には全く反応しなかった。PMab-117の結果（図２）と同様に、chPMab-117ががん特異的抗体であることが示された。【００７４】
５．マウスキメラ型PMab-117（chPMab117-mG2a）の作製
PMab-117のH鎖とL鎖の可変領域をマウスIgG2aの定常領域をpCAGベクター（インビボージェン社）に組み込み、マウスキメラ型PMab-117（chPMab117-mG2a）の発現プラスミドを作製した。
H鎖の増幅に以下のプライマーを使用した。
InF.HindIII-chP117H：CGGTATCGAT AAGCTTAGTA TGTTGGTGCT GCAG（配列番号：１７）
InFr.P117HVH-mG2a:GGCTGTTGTT TTGGCTGAAG AGACAGTGAC CAGA（配列番号：２１）
L鎖の増幅に以下のプライマーを使用した。
InF.HindIII-P117L：CGGTATCGATAAGCTTAAAATGAAAGTGCCTGTTAG（配列番号：１９）
InF.mIgCKter-NotI：TCTAGAGTCG CGGCCGCCTA ACACTCATTC CTGT（配列番号：２２）【００７５】
chPMab117-mG2aの重鎖DNA配列、軽鎖DNA配列、重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列を、配列番号：１５、１６、１０及び１１として、図８〜図１１に示す。【００７６】
６．chPMab117-mG2aによるフローサイトメトリー
ExpiCHO細胞株（サーモフィッシャー社）にリポフェクション法によりchPMab117-mG2aのH鎖、L鎖のプラスミドを導入し、培養上清中にchPMab117-mG2aのリコンビナント抗体を発現させた。培養上清を遺伝子導入から2日後に回収し、4℃で30分、LN319細胞と反応させ、さらに抗mouse IgG-FITC抗体（サーモフィッシャー社）を4℃で30分反応させた。ネガティブコントロールとして、二次抗体のみを用いた。
蛍光強度をCell Analyzer EC800（Sony社）で測定した。結果を図１２に示す。
chPMab117-mG2aは、chPMab117と同様に、膠芽腫細胞(LN319)のポドプラニンに高反応性を示した。【００７７】
７．PMab-117のエピトープ解析?１
PMab-117はがん特異的抗体（CasMab）であることが分かったため、その認識配列（エピトープ）の解析を行った。
ヒトポドプラニンのN末deletion mutantは以下の通りである。
dN23：N末が23番目のアミノ酸の完全長のポドプラニン
dN37：N末が37番目のアミノ酸のdeletion mutant
dN46：N末が46番目のアミノ酸のdeletion mutant
dN55：N末が55番目のアミノ酸のdeletion mutant
dN65：N末が65番目のアミノ酸のdeletion mutant
dN75：N末が75番目のアミノ酸のdeletion mutant
dN85：N末が85番目のアミノ酸のdeletion mutant
dN95：N末が95番目のアミノ酸のdeletion mutant
これらのdeletion mutantに、PMab-117(培養上清)、chPMab-117（10 μg/mL）を4℃で30分反応させ、さらに抗rat IgG-Oregon Green抗体（サーモフィッシャー社）、抗human IgG-FITC抗体（サーモフィッシャー社）をそれぞれ4℃で30分反応させた。ネガティブコントロールとして二次抗体のみを用いた。
蛍光強度をEC800（Sony社）で測定した。結果を図１３及び図１４に示す。
dN85（N末が85番目のアミノ酸のdeletion mutant）で反応性が消失したことから、PMab-117のエピトープのN末が、75番目〜85番目の間から開始することが分かった。【００７８】
８．PMab-117のエピトープ解析?2
ヒトポドプラニンの各種糖鎖不全株に、PMab-117(培養上清)、chPMab-117（10 μg/mL）を4℃で30分反応させ、さらに抗rat IgG-Oregon Green抗体（サーモフィッシャー社）、抗human IgG-FITC抗体（サーモフィッシャー社）をそれぞれ4℃で30分反応させた。ネガティブコントロールとして二次抗体のみを用いた。
蛍光強度をEC800（Sony社）で測定した。結果を図１５に示す。
ヒトポドプラニンのシアル酸欠損株やガラクトース欠損株に対する反応が消失したことから、PMab-117のエピトープには、O型糖鎖に付加したシアル酸が含まれることが分かった。【００７９】
９．PMab-117のエピトープ解析?3
75番目以降のすべてのSer/Thrのアラニン置換のヒトポドプラニンに、PMab-117(培養上清)、chPMab-117（１0μg/ml）を4℃で30分反応させ、さらに抗rat IgG-Oregon Green抗体（サーモフィッシャー社）、抗human IgG-FITC抗体（サーモフィッシャー社）をそれぞれ4℃で30分反応させた。ネガティブコントロールとして二次抗体のみ、ポジティブコントロールとしてNZ-12を用いた。
蛍光強度をEC800（Sony社）で測定した。結果を図１６に示す。
T85Aに対し、PMab-117の反応性が消失した。よって、PMab-117のエピトープには、Thr85が含まれていることが示された。【００８０】
１０．PMab-117のエピトープ解析?4
77番目から89番目のすべてのアミノ酸のアラニン置換のヒトポドプラニンに、PMab-117(１0 μg/mL)、chPMab-117（１0 μg/mL）を4℃で30分反応させ、さらに抗rat IgG-Oregon Green抗体（サーモフィッシャー社）、抗human IgG-FITC抗体（サーモフィッシャー社）をそれぞれ4℃で30分反応させた。ネガティブコントロールとして二次抗体のみ、ポジティブコントロールとしてNZ-12を用いた。
蛍光強度をEC800（Sony社）で測定した。結果を図１７に示す。
I78A, I80A, D82A, T85Aに対し、PMab-117の反応性が消失し、E81Aに対しPMab-117の反応性が減弱した。また、I78A, I80A, E81A, D82A, T85Aに対し、chPMab-117の反応性が消失した。よって、PMab-117のエピトープには、Ile78, Ile80, Glu81, Asp82, Thr85の５つのアミノ酸が含まれていることが示された。【００８１】
図１５により、PMab-117のエピトープにはシアル酸を含むO型糖鎖が含まれており、さらに、図１６により、ヒトポドプラニンのThr85がPMab-117のエピトープに含まれていることから、PMab-117のエピトープにはシアル酸を含むO型糖鎖が付加されたThr85が必須であることが示された。さらに、Thr85周辺のアミノ酸をアラニンに置換し、PMab-117, chPMab-117, NZ-12の反応性を調べた。図１７により、Ile78, Ile80, Glu81, Asp82, Thr85の５つのアミノ酸が、PMab-117のエピトープとして特に重要であることが判明した。
以上より、ヒトポドプラニンのThr85を含む糖ペプチドが、がん特異性を示す重要な標的であることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明に係る抗ポドプラニン抗体及びその抗原結合フラグメントは、医薬、診断薬及び試薬として有用であり、産業上の利用可能性を有する。
【配列表フリーテキスト】
【００８３】
配列番号：１  ヒトポドプラニンのアミノ酸配列を示す。
配列番号：２  ＰＭａｂ−１１７の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３  ＰＭａｂ−１１７の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号：４  ＰＭａｂ−１１７の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号：５  ＰＭａｂ−１１７の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号：６  ＰＭａｂ−１１７の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号：７  ＰＭａｂ−１１７の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号：８  ｃｈＰＭａｂ−１１７の重鎖アミノ酸配列を示す。
配列番号：９  ｃｈＰＭａｂ−１１７の軽鎖アミノ酸配列を示す。
配列番号：１０  ｃｈＰＭａｂ１１７−ｍＧ２ａの重鎖アミノ酸配列を示す。
配列番号：１１  ｃｈＰＭａｂ１１７−ｍＧ２ａの軽鎖アミノ酸配列を示す。
配列番号：１２  配列番号：１で表されるヒトポドプラニンのアミノ酸配列の７８番目から８５番目の領域に相当するアミノ酸配列を示す。
配列番号：１３  ｃｈＰＭａｂ−１１７の重鎖ＤＮＡ配列を示す。
配列番号：１４  ｃｈＰＭａｂ−１１７の軽鎖ＤＮＡ配列を示す。
配列番号：１５  ｃｈＰＭａｂ１１７−ｍＧ２ａの重鎖ＤＮＡ配列を示す。
配列番号：１６  ｃｈＰＭａｂ１１７−ｍＧ２ａの軽鎖ＤＮＡ配列を示す。
配列番号：１７  Ｈ鎖の増幅に使用したプライマーＩｎＦ．ＨｉｎｄＩＩＩ−ｃｈＰ１１７Ｈを示す。
配列番号：１８  Ｈ鎖の増幅に使用したプライマーＩｎＦｒ．ｃｈＰ１１７ＨＶＨ−ＢａｍＨＩを示す。
配列番号：１９  Ｌ鎖の増幅に使用したプライマーＩｎＦ．ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｐ１１７Ｌを示す。
配列場号：２０  Ｌ鎖の増幅に使用したプライマーＩｎＦｒ．ｃｈＰ１１７ＬＶＬ−ＢａｍＨＩを示す。
配列番号：２１  Ｈ鎖の増幅に使用したプライマーＩｎＦｒ．Ｐ１１７ＨＶＨ−ｍＧ２ａを示す。
配列番号：２２  Ｌ鎖の増幅に使用したプライマーＩｎＦ．ｍＩｇＣＫｔｅｒ−ＮｏｔＩを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2018179302.tif 000014
【図１４】
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【図１５】
2018179302.tif 000016
【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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