(57)【要約】  本発明は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を生産する能力を有するアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属形質転換体を培養する工程を含む、ＡＬＰの製造方法、を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を生産する能力を有するアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属形質転換体を培養する工程を含む、ＡＬＰの製造方法。
【請求項２】
ＡＬＰは、Ｎ型糖鎖付加モチーフの一部に糖鎖が付加しない変異を含むＡＬＰである、
請求項１に記載のＡＬＰの製造方法。
【請求項３】
アスペルギルス属形質転換体は、ＡＬＰのＮ末端側に、ＣＤＨｓｓ、ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘ、ＣＤＨｃｙｔｂＫｅｘｍｕｔ１〜４、ＣＤＨａｌｌ、ＧｌａＢ、ＧｌａＢｓｓ、ＣｅｌＢｓｓ、ＣｅｌＢ、ＳＫＩＫ＿ＣＤＨｓｓ、ＡｓＡＰ１ｓｓ５４、及びＡｓＡＰ３ｓｓ７２からなる群より選択されるアスペルギルス属菌由来の分泌シグナルペプチドを有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する、
請求項１又は２に記載のＡＬＰの製造方法。
【請求項４】
アスペルギルス属形質転換体は、ＡＬＰをコードする塩基配列に対して、その５’末端側に：
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子：
（ａ）配列番号２〜１５のいずれかの塩基配列；
（ｂ）配列番号２〜１５のいずれかの塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列；
（ｃ）配列番号２〜１５のいずれかの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列；
あるいは、
以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかの分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子：
（ｄ）配列番号１７〜３０のいずれかのアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチド；
（ｅ）配列番号１７〜３０のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチド；
（ｆ）配列番号１７〜３０のいずれかのアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、かつＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチド；
を有する、
請求項１又は２に記載のＡＬＰの製造方法。
【請求項５】
ＡＬＰは、ＡＬＰＩＩ又はＩＶである、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＬＰの製造方法。
【請求項６】
ＡＬＰは、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのタンパク質：
（ｉ）配列番号３１又は３２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｉｉ）配列番号３１又は３２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡＬＰ活性を有するタンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号３１又は３２のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、かつＡＬＰ活性を有する活性を有するタンパク質；
あるいは、
以下の（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかの塩基配列によりコードされるタンパク質：
（ｉｖ）配列番号３３又は３４の塩基配列；
（ｖ）配列番号３３又は３４の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＡＬＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｖｉ）配列番号３３又は３４の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつ、ＡＬＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
を有する、
請求項１〜５のいずれか一項に記載のＡＬＰの製造方法。
【請求項７】
ＡＬＰは、３個のＮ型糖鎖付加モチーフのうち１個又は２個に変異を有し、変異を有する該Ｎ型糖鎖付加モチーフには糖鎖が付加していないＡＬＰＩＩである、
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＡＬＰの製造方法。
【請求項８】
ＡＬＰＩＩにおいて、Ｎ型糖鎖付加モチーフが有する変異は、配列番号３１の１２２位、２４９位、２５１位、及び４１０位のうちの１個又は２個である、
請求項７に記載のＡＬＰの製造方法。
【請求項９】
ＡＬＰＩＩにおいて、Ｎ型糖鎖付加モチーフが有する変異は、配列番号３１の１２２位におけるＡｓｎからＧｌｎ又はＬｙｓへの変異、２４９位におけるＡｓｎからＧｌｎ、Ａｓｐ又はＨｉｓへの変異、２５１位におけるＴｈｒからＣｙｓへの変異、４１０位におけるＡｓｎからＧｌｎ又はＬｙｓへの変異のうちの１個又は２個である、
請求項７又は８に記載のＡＬＰの製造方法。
【請求項１０】
アスペルギルス属形質転換体がショウユコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ：アスペルギルス・ソーヤ）、ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  （Ａｈｌｂｕｒｇ）  Ｃｏｈｎ：アスペルギルス・オリゼー）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ：アスペルギルス・リュウキュウエンシス）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｓａｍｉｉ）、又はアスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ）のいずれかの形質転換体である、
請求項１〜９のいずれか一項に記載のＡＬＰの製造方法。
【請求項１１】
アスペルギルス属形質転換体を培養した培養物から分泌画分を得る工程、及び、
分泌画分からＡＬＰを抽出する工程、
をさらに含む、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＡＬＰの製造方法。
【請求項１２】
ゲルろ過法によって測定される分子量が８０〜１５０ｋＤａである、糖鎖付加アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）ＩＩ。
【請求項１３】
ＡＬＰのＮ末端側に対して、ＣＤＨｓｓ、ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘ、ＣＤＨｃｙｔｂＫｅｘｍｕｔ１〜４、ＣＤＨａｌｌ、ＧｌａＢｓｓ、ＣｅｌＢｓｓ、ＣｅｌＢ、ＳＫＩＫ＿ＣＤＨｓｓ、ＡｓＡＰ１ｓｓ５４、及びＡｓＡＰ３ｓｓ７２からなる群より選択されるアスペルギルス属菌由来の分泌シグナルペプチドを有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する、アスペルギルス属形質転換用ベクター。
【請求項１４】
ＡＬＰをコードする塩基配列に対して、その５’末端側に：
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子：
（ａ）配列番号２〜１５のいずれかの塩基配列；
（ｂ）配列番号２〜１５のいずれかの塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列；
（ｃ）配列番号２〜１５のいずれかの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列；
あるいは、
以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかの分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子：
（ｄ）配列番号１７〜３０のいずれかのアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチド；
（ｅ）配列番号１７〜３０のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチド；
（ｆ）配列番号１７〜３０のいずれかのアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、かつＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチド；
を有する、アスペルギルス属形質転換用ベクター。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載のアスペルギルス属形質転換用ベクターを用いて形質転換された、アスペルギルス属形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルカリホスファターゼの製造方法及びそれを用いて得られるアルカリホスファターゼ、並びにその製造のためのベクター及び形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰと略称する。）は、分子生物学分野では、遺伝子組換え実験におけるＤＮＡの脱リン酸化に用いられ、ウェスタンブロッティングの抗体の標識等に利用されている。また、産業分野では、臨床検査の免疫学的方法における標識酵素として用いられている。
効率良く均質に抗体を標識するためには、さらには、そのように標識された抗体（標識抗体）を利用して精度の良い臨床検査結果を得るためには、標識される抗体自体が、できる限り均質なものであることが好ましい。そして、そのためには、標識酵素自体も、できる限り均質なものであることが望ましい。
例えば標識抗体を均質なものとする方法として、抗体を標識する工程の後工程においては、標識された抗体と、標識されきらなかった抗体と、余剰の標識酵素とを物理的分離手法を用いて分離して、標識された抗体のみを取得する作業が必要となる。この作業において、標識酵素自体が、例えば分子量の点であるいは酵素としての性能の点で、不均一な混合物のような状態であった場合には、標識抗体も不均一な分子量及び酵素としての性能を有することとなってしまう場合がある。【０００３】
分子量に関していえば、後工程の分離段階において、特定分子量の標識抗体のみを取得してくるという対処方法があるとはいえるが、その場合でも分子量の分離には限界がある。また、後処理で目的の標識抗体画分を取得する上での歩留まりが悪化することから、やはり最初の標識酵素自体の均質性を高めることに対するニーズが存在する。
また、ＡＬＰには複数のアイソフォームが存在することも知られており、それらは比活性においてもばらつきを有しているため、例えば異なる比活性特性等を有する複数のアイソフォームの混合物からなるＡＬＰ組成物を標識酵素として用いて抗体を標識したような場合においては、得られる標識抗体には活性の面での不均一性も生じてしまうこととなる。この観点からも、標識酵素自体の均質性を高めることに対するニーズが存在する。【０００４】
標識抗体の作製等に従来使用されてきたＡＬＰとしては、ウシ腸管からの抽出によって製造されるＡＬＰが挙げられる。このＡＬＰは、比活性が高く、標識酵素として有用であることから長年使用されてきているが、哺乳動物由来であるため、狂牛病等の感染症による原料輸出入制限、個体差による品質の大きなブレ等があり、安定供給性に劣るという問題が認識されている。また、ウシ腸管には複数のＡＬＰのアイソフォームが含まれており、抽出や精製を経て製造されている市販のＡＬＰ製品であっても、なお複数種のアイソフォームを含む混合物であることが実情である。よって、上述の標識酵素として抗体を標識し、それを臨床検査に用いたいという目的に対しては、このＡＬＰは酵素製品としての均一性に劣るという問題を有している。【０００５】
上記の認識を踏まえ、これまでに、より均質性の高いＡＬＰ製品を得るための様々な方法が検討されてきた。この方法として、例えば、ウシ腸管由来ＡＬＰを哺乳類細胞中で組換え発現させる方法が開示されている（例えば、特許文献１及び２参照）。この方法において、例えば、特定のアイソフォームをコードする遺伝子を選択し、その遺伝子のみを用いて組換え生産を行えば、発現されるタンパク質はその特定の１種のアイソフォームのみとすることができるため、比活性が大きく異なる複数のアイソフォームが混在してしまうことによる活性の不均一性を解消することができる。【０００６】
また、発現宿主としては、哺乳類細胞の代わりに酵母を宿主に採用して組換えＡＬＰを大量に生産する方法も知られている（例えば、特許文献３参照）。さらに、酵母で組換え生産を行う方法としては、酵母を発現宿主として得られたＡＬＰを取得後に、後工程として脱グリコシル化処理することにより、糖鎖量を低減したＡＬＰを得るという方法も提案されている（例えば、特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第９３／１８１３９号
【特許文献２】特許第４２９５３８６号
【特許文献３】特許第３６５７８９５号
【特許文献４】国際公開第２００４／０８３８６２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１及び２に開示されるようなウシ腸管由来ＡＬＰの組換え発現により得られるＡＬＰは、哺乳類細胞としてＣＨＯ細胞等を発現宿主として用いているため、ＡＬＰの生産量が少ないという課題を有する。【０００９】
また、特許文献３に開示されるように酵母を発現宿主とした場合には、発現されるタンパク質に過剰に糖鎖が付加してしまうという、ハイパーグリコシレーションの課題が生じる。実際に、酵母を宿主として組換え生産したＡＬＰにおいては、ウシ腸管からの抽出によって製造されるＡＬＰに比べて、糖の付加量が極めて多く、しかもそれは不均一に多量に付加しているために、得られるＡＬＰは糖鎖の均一性の低い酵素となってしまうという課題を有する。酵素の不均一性の課題は、抗体を酵素標識する工程のみならず、ＡＬＰをコンジュゲート作製やセンサーへの応用に適用する場合にも、種々の工程におけるハンドリングの観点から課題となりえ、酵母で発現させる方法におけるＡＬＰへの糖鎖の過剰付加は産業上好ましくないと考えられる。
加えて、酵母細胞を宿主としたＡＬＰ発現系においては、哺乳類細胞を宿主として発現させる時よりも生産量は多いとは言えるものの、生産されるＡＬＰはほとんど細胞外に分泌されず、細胞中に蓄積される。すなわち、ＡＬＰを取得するためには、酵母細胞を破砕して、細胞中のあらゆるその他の成分との混合状態の中から目的のＡＬＰを精製する工程を要し、製造工程上の作業効率の面でも未だ改善の余地を有する。【００１０】
特許文献４に開示される、酵母発現ＡＬＰの後処理的な脱グリコシル化処理は、酵素処理によって糖鎖付加量を減らすことができ、特許文献３に開示される糖鎖が過剰付加してしまうことによる酵母発現ＡＬＰが有する課題を一部解決する点では、好ましいと考えられる。しかし、実際には、酵素処理による糖鎖の切断はランダム的であって、必要な量の糖鎖を残しつつ脱糖鎖処理を行うことは難しく、また、処理バッチごとに均質な切断を実現することも難しい。従って、やはり、糖鎖付加状態の均質性という点では、継続的で再現性ある製品の供給には未だ課題を有するといえる。また、ＡＬＰを精製してきた後で、後工程としての酵素処理を追加し、その上で、脱グリコシル化されたＡＬＰと、脱グリコシル化されきらないＡＬＰと、脱グリコシル化用の酵素をゲルろ過等の分離工程によって、さらに分離し目的の脱グリコシル化されたＡＬＰのみを取得してこなければならないという、煩雑な脱糖鎖処理の工程が新たに必要となるという課題を有する。【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、組換えＡＬＰの生産において、糖鎖が過剰かつ不均一に付加しすぎない単一アイソフォームのＡＬＰを高い生産性と分泌性を伴って製造できるＡＬＰの製造方法及びそれを用いて得られるＡＬＰＩＩ又はＩＶ、並びにその製造のためのベクター及び形質転換体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そこで、本発明者らは、上記課題の解決のために鋭意研究を重ねた結果、糖鎖付加されたＡＬＰを生産する能力を有するアスペルギルス属形質転換体を培養する工程を含むＡＬＰの製造方法を用いることにより、特にウシ組織由来のＡＬＰのＮ末端側に対して、特定のアスペルギルス属菌由来の分泌シグナルペプチドを有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する、アスペルギルス属形質転換用ベクターを用いて形質転換された、アスペルギルス属形質転換体を培養するＡＬＰの製造方法を用いることにより、糖鎖が過剰かつ不均一に付加しすぎない単一アイソフォームのＡＬＰを高い生産性で発現させることができ、しかも発現されるＡＬＰは非常に効率よくアスペルギルス属形質転換体の細胞外へと分泌されることを見出し、本発明を完成させた。【００１３】
即ち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
［１］
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を生産する能力を有するアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属形質転換体を培養する工程を含む、ＡＬＰの製造方法。
［２］
ＡＬＰは、Ｎ型糖鎖付加モチーフの一部に糖鎖が付加しない変異を含むＡＬＰである、
［１］に記載のＡＬＰの製造方法。
［３］
アスペルギルス属形質転換体は、ＡＬＰのＮ末端側に、ＣＤＨｓｓ、ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘ、ＣＤＨｃｙｔｂＫｅｘｍｕｔ１〜４、ＣＤＨａｌｌ、ＧｌａＢ、ＧｌａＢｓｓ、ＣｅｌＢｓｓ、ＣｅｌＢ、ＳＫＩＫ＿ＣＤＨｓｓ、ＡｓＡＰ１ｓｓ５４、及びＡｓＡＰ３ｓｓ７２からなる群より選択されるアスペルギルス属菌由来の分泌シグナルペプチドを有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する、
［１］又は［２］に記載のＡＬＰの製造方法。
［４］
アスペルギルス属形質転換体は、ＡＬＰをコードする塩基配列に対して、その５’末端側に：
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子：
（ａ）配列番号２〜１５のいずれかの塩基配列；
（ｂ）配列番号２〜１５のいずれかの塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列；
（ｃ）配列番号２〜１５のいずれかの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列；
あるいは、
以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかの分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子：
（ｄ）配列番号１７〜３０のいずれかのアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチド；
（ｅ）配列番号１７〜３０のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチド；
（ｆ）配列番号１７〜３０のいずれかのアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、かつＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチド；
を有する、
［１］又は［２］に記載のＡＬＰの製造方法。
［５］
ＡＬＰは、ＡＬＰＩＩ又はＩＶである、
［１］〜［４］のいずれかに記載のＡＬＰの製造方法。
［６］
ＡＬＰは、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのタンパク質：
（ｉ）配列番号３１又は３２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｉｉ）配列番号３１又は３２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡＬＰ活性を有するタンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号３１又は３２のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、かつＡＬＰ活性を有する活性を有するタンパク質；
あるいは、
以下の（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかの塩基配列によりコードされるタンパク質：
（ｉｖ）配列番号３３又は３４の塩基配列；
（ｖ）配列番号３３又は３４の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＡＬＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｖｉ）配列番号３３又は３４の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつ、ＡＬＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
を有する、
［１］〜［５］のいずれかに記載のＡＬＰの製造方法。
［７］
ＡＬＰは、３個のＮ型糖鎖付加モチーフのうち１個又は２個に変異を有し、変異を有する該Ｎ型糖鎖付加モチーフには糖鎖が付加していないＡＬＰＩＩである、
［１］〜［６］のいずれかに記載のＡＬＰの製造方法。
［８］
ＡＬＰＩＩにおいて、Ｎ型糖鎖付加モチーフが有する変異は、配列番号３１の１２２位、２４９位、２５１位、及び４１０位のうちの１個又は２個である、
［７］に記載のＡＬＰの製造方法。
［９］
ＡＬＰＩＩにおいて、Ｎ型糖鎖付加モチーフが有する変異は、配列番号３１の１２２位におけるＡｓｎからＧｌｎ又はＬｙｓへの変異、２４９位におけるＡｓｎからＧｌｎ、Ａｓｐ又はＨｉｓへの変異、２５１位におけるＴｈｒからＣｙｓへの変異、４１０位におけるＡｓｎからＧｌｎ又はＬｙｓへの変異のうちの１個又は２個である、
［７］又は［８］に記載のＡＬＰの製造方法。
［１０］
アスペルギルス属形質転換体がショウユコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ：アスペルギルス・ソーヤ）、ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  （Ａｈｌｂｕｒｇ）  Ｃｏｈｎ：アスペルギルス・オリゼー）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ：アスペルギルス・リュウキュウエンシス）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｓａｍｉｉ）、又はアスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ）のいずれかの形質転換体である、
［１］〜［９］のいずれかに記載のＡＬＰの製造方法。
［１１］
アスペルギルス属形質転換体を培養した培養物から分泌画分を得る工程、及び、
分泌画分からＡＬＰを抽出する工程、
をさらに含む、
［１］〜［１０］のいずれかに記載のＡＬＰの製造方法。
［１２］
ゲルろ過法によって測定される分子量が８０〜１５０ｋＤａである、糖鎖付加アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）ＩＩ。
［１２−１］
単離された［１２］に記載のＡＬＰＩＩ。
［１３］
ＡＬＰのＮ末端側に対して、ＣＤＨｓｓ、ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘ、ＣＤＨｃｙｔｂＫｅｘｍｕｔ１〜４、ＣＤＨａｌｌ、ＧｌａＢｓｓ、ＣｅｌＢｓｓ、ＣｅｌＢ、ＳＫＩＫ＿ＣＤＨｓｓ、ＡｓＡＰ１ｓｓ５４、及びＡｓＡＰ３ｓｓ７２からなる群より選択されるアスペルギルス属菌由来の分泌シグナルペプチドを有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する、アスペルギルス属形質転換用ベクター。
［１４］
ＡＬＰをコードする塩基配列に対して、その５’末端側に：
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子：
（ａ）配列番号２〜１５のいずれかの塩基配列；
（ｂ）配列番号２〜１５のいずれかの塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列；
（ｃ）配列番号２〜１５のいずれかの塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列；
あるいは、
以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかの分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子：
（ｄ）配列番号１７〜３０のいずれかのアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチド；
（ｅ）配列番号１７〜３０のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチド；
（ｆ）配列番号１７〜３０のいずれかのアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、かつＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチド；
を有する、アスペルギルス属形質転換用ベクター。
［１５］
［１３］又は［１４］に記載のアスペルギルス属形質転換用ベクターを用いて形質転換された、アスペルギルス属形質転換体。
［１６］
［１］〜［１１］のいずれかに記載のＡＬＰの製造方法によって得られる、糖鎖付加アルカリホスファターゼ。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、糖鎖が過剰かつ不均一に付加しすぎない単一アイソフォームのＡＬＰを高い生産性と分泌性を伴って製造できるＡＬＰの製造方法が提供され、また新規なＡＬＰＩＩ、ベクター、並びに形質転換体が提供され、産業上有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例３において、各培養上清画分と各菌体内画分のＡＬＰ活性測定を行い、分泌率を算出した結果と、比較例において、酵母発現での培養物のＡＬＰ活性測定を行い、分泌率を算出した結果とを比較して示すグラフである。
【図２】実施例５において、精製された各種ｂＩＡＰＩＩのＡＬＰ活性を測定し、比活性を算出した結果を示すグラフである。
【図３】実施例１０において、各培養上清画分と菌体内画分のＡＬＰ活性を測定し、分泌率を算出した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＡＬＰの製造方法（以下、本発明製造方法と略称する。）とは、ＡＬＰを生産する能力を有するアスペルギルス属形質転換体（以下、本発明形質転換体と略称する。）を培養する工程を含む製造方法である。より具体的には、ウシ腸管由来のＡＬＰを組換え発現によって製造する方法であって、ウシ腸管由来のＡＬＰを生産する能力を有する本発明形質転換体を培養する工程を含む製造方法である。
【００１７】
本発明製造方法は、ＡＬＰを生産する能力を有するアスペルギルス属形質転換体を用いる点が少なくとも公知の何れのＡＬＰの製造方法とも異なっている。また、このような本発明形質転換体を用いることにより、高い分泌率及び生産性でＡＬＰを製造することが可能である。
【００１８】
ＡＬＰは、既知のＡＬＰや新たに探索して得られたＡＬＰであってもよく、遺伝子工学的技術あるいは変異処理等の方法を用い、異なる理化学的性質を有するＡＬＰに改変することにより得られたＡＬＰであってもよい。例えば、既知のＡＬＰとしてはウシ（Ｂｏｓｔａｕｒｕｓ）腸管由来のＡＬＰ〔ｂＩＡＰＩＩ；Ｍａｎｅｓ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，Ｎｏ．３６，２３３５３−２３３６０（１９９８）記載〕等が挙げられる。
【００１９】
ＡＬＰは、そのＮ末端側に分泌シグナルペプチド、及びそのＣ末端側にＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）付加シグナルペプチドを有してもよい。ＡＬＰを分泌発現させるために、ＧＰＩ付加シグナルペプチドは除去してもよく、本来の分泌シグナルペプチドを残したまま用いてもよく、宿主由来の分泌シグナルペプチドをそのＡＬＰ本来の分泌シグナルペプチドに代えて利用してもよい。Ｎ末端側に分泌シグナルペプチドを有するＡＬＰが本発明形質転換体内で発現された後、細胞内で分泌シグナルペプチド部分が削除され、その後、細胞から分泌シグナルペプチドを有していないＡＬＰが分泌される。一定の態様においては、上記の分泌シグナルペプチドは、Ｎ末端側に分泌シグナルペプチドとしての機能を有するペプチド部分（以下、「分泌シグナルペプチド部分」ともいう。）を有するキャリアタンパク質としてもよい。キャリアタンパク質は、Ｃ末端にリンカー（例えば、Ｋｅｘ２切断リンカー）が連結されたキャリアタンパク質を含むこともできる。ここで、分泌シグナルペプチド部分は、分泌シグナルペプチド自体と同じであってもよい。当該キャリアタンパク質は宿主によって効率的に分泌されるタンパク質の全部又はＮ末端の一部である。Ｋｅｘ２切断リンカーは、酵素番号ＥＣ３．４．２１．６１として定義されるセリンエンドペプチダーゼの切断モチーフＫＲ（リジン−アルギニンジペプチド）をＣ末端に含むペプチドである。分泌経路においてタンパク質配列中に存在する切断モチーフＫＲのＣ末端側のペプチド結合がセリンエンドペプチダーゼによって分解される。キャリアタンパク質及びＫｅｘ２切断リンカーからなる分泌シグナルペプチド部分をＮ末端側に有するＡＬＰが本発明形質転換体内で発現された後、細胞内で分泌シグナルペプチドが削除され、その後、細胞から分泌シグナルペプチドを含まないＡＬＰが分泌される。
ＡＬＰは単離されたＡＬＰであってもよく、単離する方法としては、例えば後述する抽出する工程が挙げられる。
【００２０】
本発明形質転換体において機能する分泌シグナルペプチド及びキャリアタンパク質の例としては、宿主由来セロビオースデヒドロゲナーゼ及びそのシトクロームドメイン、グルコアミラーゼ、エンドグルカナーゼ、アルカリホスファターゼ等の分泌タンパク質及びそのＮ末端側の一部（分泌シグナルペプチド部分）が挙げられる。
【００２１】
ＡＬＰのアミノ酸配列中に含まれるＮ型糖鎖付加モチーフ（Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ又はＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒのアミノ酸配列；ＸａａはＰｒｏ以外のアミノ酸を示す。）の数はアイソフォームによって異なり、例えばｂＩＡＰＩＩは３個のＮ型糖鎖付加モチーフを有する。本発明において、ＡＬＰは、少なくとも一つのＮ型糖鎖付加モチーフに糖鎖が付加したＡＬＰであればよく、本来有するＮ型糖鎖付加モチーフが２個以上ある場合はそのうちの１つを除いたＮ型糖鎖付加モチーフをＮ型糖鎖が結合しなくなるように改変したＮ型糖鎖付加モチーフ改変型ＡＬＰでもよい。Ｎ型糖鎖付加モチーフに糖鎖が結合しなくなるための改変としては、Ｎ型糖鎖付加モチーフの１番目のＡｓｎ残基を別のアミノ酸に変異させる、２番目のＸａａ残基をＰｒｏに変異させる、又は、３番目のＴｈｒ／Ｓｅｒ残基を別のアミノ酸に変異させること等が挙げられる。
【００２２】
次に、本発明形質転換体を作製するためのＡＬＰをコードする遺伝子及びそれを含むＤＮＡの取得方法について、ウシ腸管由来のＡＬＰを例として以下に説明する。
本発明に用いるＡＬＰをコードする遺伝子を得るには、一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を用いることができる。例えば、ウシ腸管細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷＩＬＥＹ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出する。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。
このようにして得られた染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーを作製する。
次いで、ウシ腸管由来のＡＬＰのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーからスクリーニングする方法あるいは上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法あるいは３’ＲＡＣＥ法等の適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。
【００２３】
このようにして得られたウシ腸管由来のＡＬＰをコードする遺伝子の好ましい一例として、ウシ腸管由来のＡＬＰ遺伝子〔ｂＩＡＰＩ；特許文献１又はＷｅｉｓｓｉｇ等，Ｂｉｏｃｈｅ．Ｊ．２６０，５０３−５０８（１９９３）〕、より好ましくは高比活性型のウシ腸管由来のＡＬＰ遺伝子〔ｂＩＡＰＩＩ等；特許文献２又はＭａｎｅｓ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，Ｎｏ．３６，２３３５３−２３３６０（１９９８）〕が挙げられる。また、ウシ腸管由来のＡＬＰのアミノ酸配列は公開されていることから、全アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをＤＮＡシンセサイザーにより合成して、相補鎖を会合させたうえでライゲーションして全長遺伝子を得ることもでき、全遺伝子中の一部分を合成したポリヌクレオチドを用い、部分的に相補鎖を会合させ、相補しあう部分をポリメラーゼで増幅し、全長遺伝子を得ることもできる。
【００２４】
好ましい遺伝子配列はＡＬＰの遺伝子配列とアミノ酸レベルで一致するコドンを最適化したＤＮＡ配列である。コドンの最適化とは、例えばＡＬＰ遺伝子配列の各コドンをサイレント突然変異によって最適化することを意味し、すなわち、アミノ酸レベルではなんら影響を与えないで選択された発現宿主により要求されるとおりに翻訳を増大させるためにＤＮＡレベルでの変異を加えることである。これらの遺伝子は、常法通り形質転換される宿主に応じて選択される各種ベクターにクローニングされることが好ましい。
【００２５】
ＡＬＰをコードする遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）は、ＡＬＰをコードする遺伝子を含むＰＣＲ増幅産物と各種ベクターとを、ＡＬＰをコードする遺伝子の発現が可能な形で結合することにより構築することができる。例えば、適当な制限酵素でＡＬＰをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断したプラスミドと連結することにより構築することができる。又は、プラスミドと相同的な配列を両末端に付加した該遺伝子を含むＤＮＡ断片と、インバースＰＣＲにより増幅したプラスミド由来のＤＮＡ断片とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社）などの市販の組換えベクター作製キットを用いて連結させることにより得ることができる。各種のベクターには、形質転換体で機能するプロモーターを含み、さらに、ターミネーター、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性マーカー遺伝子が含まれてもよい。
【００２６】
次に、本発明形質転換体について説明する。
本発明形質転換体は、特に限定されないが、上述したように得られた種々の組換え体ＤＮＡを用いて、アスペルギルス属菌株を形質転換又は形質導入し、種々の改変されたＡＬＰ遺伝子断片を保有する組換え体ＤＮＡを含むアスペルギルス属形質転換体として得ることができる。
【００２７】
本発明において、アスペルギルス属菌株とは、アスペルギルス属に属する菌株であれば特に限定されない。アスペルギルス属菌株としては、例えば、ショウユコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ：アスペルギルス・ソーヤ）、ニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  （Ａｈｌｂｕｒｇ）  Ｃｏｈｎ：アスペルギルス・オリゼー）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ：アスペルギルス・リュウキュウエンシス）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｓａｍｉｉ）、アスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ）等の菌株が挙げられる。これらの中でも、ショウユコウジカビ及びニホンコウジカビの菌株が、より確実に高い分泌率及び生産性でＡＬＰを得る観点から好ましい。
【００２８】
本発明の一態様において、本発明形質転換体は、ＡＬＰのＮ末端側に、アスペルギルス属菌由来の分泌シグナルペプチドを有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する。アスペルギルス属菌由来の分泌シグナルペプチドとしては、例えば、ＣＤＨｓｓ、ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘ、ＣＤＨｃｙｔｂＫｅｘｍｕｔ１〜４、ＣＨＤＨａｌｌ、ＧｌａＢｓｓ、ＧｌａＢ、ＣｅｌＢｓｓ、ＣｅｌＢ、ＳＫＩＫ＿ＣＤＨｓｓ、ＡｓＡＰ１ｓｓ５４、及びＡｓＡＰ３ｓｓ７２が挙げられ、より優れた分泌性を得る観点から、ＣＤＨｓｓ、ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘ、ＣＤＨｃｙｔｂＫｅｘｍｕｔ１〜４、ＣＤＨａｌｌ、ＧｌａＢ、ＧｌａＢｓｓ、ＣｅｌＢｓｓ、ＣｅｌＢ、ＳＫＩＫ＿ＣＤＨｓｓ、ＡｓＡＰ１ｓｓ５４、及びＡｓＡＰ３ｓｓ７２からなる群より選択されるものが好ましく、ＣＤＨｓｓ、ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘ、ＣＤＨｃｙｔｂＫｅｘｍｕｔ１、ＣＤＨｃｙｔｂＫｅｘｍｕｔ２、ＧｌａＢ、ＧｌａＢｓｓ、ＣｅｌＢｓｓ、ＣｅｌＢ、ＡｓＡＰ１ｓｓ５４、及びＡｓＡＰ３ｓｓ７２からなる群より選択されるものがより好ましく、ＣＤＨｓｓ、ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘ、ＣＤＨｃｙｔｂＫｅｘｍｕｔ１、ＣｅｌＢｓｓ、及びＣｅｌＢからなる群より選択されるものがさらに好ましく、ＣＤＨｓｓ及びＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘからなる群より選択されるものが特に好ましい。
【００２９】
ここで、ＡＬＰのＮ末端側に分泌シグナルペプチドを有するアミノ酸配列は、ＡＬＰのＮ末端側に直接的に分泌シグナルペプチドが結合されたアミノ酸配列であってもよく、ＡＬＰのＮ末端側にリンカー（例えば、Ｋｅｘ２切断リンカーをＣ末端に結合するキャリアタンパク質）を介する等により間接的に分泌シグナルペプチド部分が結合されたアミノ酸配列であってもよい。
【００３０】
本発明形質転換体の一態様において、ＡＬＰをコードする塩基配列に対して、その５’末端側に：
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子：
（ａ）配列番号２〜１５のいずれかの塩基配列；
（ｂ）配列番号２〜１５のいずれかの塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列；
（ｃ）配列番号２〜１５のいずれかの塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列；
あるいは、
以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかの分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子：
（ｄ）配列番号１７〜３０のいずれかのアミノ酸配列からなる分泌シグナルペプチド；
（ｅ）配列番号１７〜３０のいずれかのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチド；
（ｆ）配列番号１７〜３０のいずれかのアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチド；
を有する。
【００３１】
「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された」という場合、欠失、置換若しくは付加される塩基の個数は、結果として得られる塩基配列がＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする限り特に限定されない。また、ここでの「数個」は、２以上の整数を意味し、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、よりさらに好ましくは２個、３個又は４個である。各塩基配列における欠失、置換又は付加の位置は、結果として得られる塩基配列がＡＬＰの分泌活性を有する分泌シグナルペプチドをコードする限り、５’末端でも、３’末端でも、その中間であってもよい。
【００３２】
「配列番号Ｘの塩基配列とＹ％以上の相同性を有」するとは、２つの塩基配列の一致が最大になるように整列（アライメント）させたときに、共通する塩基数の、配列番号Ｘに示す全塩基数に対する割合が、Ｙ％以上であることを意味する。
【００３３】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された」という場合、欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の個数は、結果として得られる分泌シグナルペプチドがＡＬＰの分泌活性を有する限り特に限定されない。また、ここでの「数個」は、２以上の整数を意味し、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、よりさらに好ましくは２個、３個又は４個である。各分泌シグナルペプチドにおける欠失、置換又は付加の位置は、結果として得られる分泌シグナルペプチドがＡＬＰの分泌活性を有する限り、Ｎ末端でも、Ｃ末端でも、その中間であってもよい。
【００３４】
「配列番号Ｘのアミノ酸配列とＹ％以上の相同性を有」するとは、２つの分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列の一致が最大になるように整列（アライメント）させたときに、共通するアミノ酸残基数の、配列番号Ｘに示す全アミノ酸残基数に対する割合が、Ｙ％以上であることを意味する。
【００３５】
配列番号１の塩基配列は、ウシ腸管由来アルカリホスファターゼＩＶ（ｂＩＡＰＩＶ）のＮ末端側の分泌シグナルペプチド（ｂＩＡＰＩＶｓｓ）をコードする塩基配列である。
配列番号２の塩基配列は、麹菌セロビオースデヒドロゲナーゼ（ＣＤＨ）由来の分泌シグナルペプチド（ＣＤＨｓｓ）をコードする塩基配列である。
配列番号３の塩基配列は、キャリアタンパク質である麹菌ＣＤＨ由来のシトクロームｂドメインとＫｅｘ２切断リンカーからなる分泌シグナルペプチド（ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘ）をコードする塩基配列である。
配列番号４の塩基配列は、キャリアタンパク質である麹菌ＣＤＨ由来のシトクロームｂドメインとＫｅｘ２切断リンカー変異体１からなる分泌シグナルペプチド（ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘｍｕｔ１）をコードする塩基配列である。
配列番号５の塩基配列は、キャリアタンパク質である麹菌ＣＤＨ由来のシトクロームｂドメインとＫｅｘ２切断リンカー変異体２からなる分泌シグナルペプチド（ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘｍｕｔ２）をコードする塩基配列である。
配列番号６の塩基配列は、キャリアタンパク質である麹菌ＣＤＨ由来のシトクロームｂドメインとＫｅｘ２切断リンカー変異体３からなる分泌シグナルペプチド（ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘｍｕｔ３）をコードする塩基配列である。
配列番号７の塩基配列は、キャリアタンパク質である麹菌ＣＤＨ由来のシトクロームｂドメインとＫｅｘ２切断リンカー変異体４からなる分泌シグナルペプチド（ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘｍｕｔ４）をコードする塩基配列である。
配列番号８の塩基配列は、キャリアタンパク質である麹菌ＣＤＨとＫｅｘ２切断リンカーからなる分泌シグナルペプチドキャリアタンパク質（ＣＤＨａｌｌ）をコードする塩基配列である。
配列番号９の塩基配列は、麹菌グルコアミラーゼＢ由来の分泌シグナルペプチド（ＧｌａＢｓｓ）をコードする塩基配列である。
配列番号１０の塩基配列は、キャリアタンパク質である麹菌グルコアミラーゼＢとＫｅｘ２切断リンカーからなる分泌シグナルペプチド（ＧｌａＢ）をコードする塩基配列である。
配列番号１１の塩基配列は、麹菌エンドグルカナーゼ由来の分泌シグナルペプチド（ＣｅｌＢｓｓ）をコードする塩基配列である。
配列番号１２の塩基配列は、キャリアタンパク質である麹菌エンドグルカナーゼとＫｅｘ２切断リンカーからなる分泌シグナルペプチド（ＣｅｌＢ）をコードする塩基配列である。
配列番号１３の塩基配列は、麹菌ＣＤＨ由来の分泌シグナルペプチドの開始コドン直後にＳＫＩＫのアミノ酸配列が挿入された分泌シグナルペプチド（ＳＫＩＫ＿ＣＤＨｓｓ）をコードする塩基配列である。
配列番号１４の塩基配列は、麹菌ＡＬＰ由来の分泌シグナルペプチド１（ＡｓＡＰ１ｓｓ５４）をコードする塩基配列である。
配列番号１５の塩基配列は、麹菌ＡＬＰ由来の分泌シグナルペプチド３（ＡｓＡＰ１ｓｓ７２）をコードする塩基配列である。
【００３６】
配列番号１６のアミノ酸配列は、ウシ腸管由来アルカリホスファターゼＩＶ（ｂＩＡＰＩＶ）のＮ末端側の分泌シグナルペプチド（ｂＩＡＰＩＶｓｓ）のアミノ酸配列である。
配列番号１７のアミノ酸配列は、麹菌セロビオースデヒドロゲナーゼ由来の分泌シグナルペプチド（ＣＤＨｓｓ）のアミノ酸配列である。
配列番号１８のアミノ酸配列は、キャリアタンパク質である麹菌ＣＤＨ由来のシトクロームｂドメインとＫｅｘ２切断リンカーからなる分泌シグナルペプチド（ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘ）のアミノ酸配列である。
配列番号１９のアミノ酸配列は、キャリアタンパク質である麹菌ＣＤＨ由来のシトクロームｂドメインとＫｅｘ２切断リンカー変異体１からなる分泌シグナルペプチド（ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘｍｕｔ１）のアミノ酸配列である。
配列番号２０のアミノ酸配列は、キャリアタンパク質である麹菌ＣＤＨ由来のシトクロームｂドメインとＫｅｘ２切断リンカー変異体２からなる分泌シグナルペプチド（ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘｍｕｔ２）のアミノ酸配列である。
配列番号２１のアミノ酸配列は、キャリアタンパク質である麹菌ＣＤＨ由来のシトクロームｂドメインとＫｅｘ２切断リンカー変異体３からなる分泌シグナルペプチド（ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘｍｕｔ３）のアミノ酸配列である。
配列番号２２のアミノ酸配列は、キャリアタンパク質である麹菌ＣＤＨ由来のシトクロームｂドメインとＫｅｘ２切断リンカー変異体４からなる分泌シグナルペプチド（ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘｍｕｔ４）のアミノ酸配列である。
配列番号２３のアミノ酸配列は、キャリアタンパク質である麹菌ＣＤＨとＫｅｘ２切断リンカーからなる分泌シグナルペプチド（ＣＤＨａｌｌ）のアミノ酸配列である。
配列番号２４のアミノ酸配列は、麹菌グルコアミラーゼＢ由来の分泌シグナルペプチド（ＧｌａＢｓｓ）のアミノ酸配列である。
配列番号２５のアミノ酸配列は、キャリアタンパク質である麹菌グルコアミラーゼＢとＫｅｘ２切断配列からなる分泌シグナルペプチド（ＧｌａＢ）のアミノ酸配列である。
配列番号２６のアミノ酸配列は、麹菌エンドグルカナーゼ由来の分泌シグナルペプチド（ＣｅｌＢｓｓ）のアミノ酸配列である。
配列番号２７のアミノ酸配列は、キャリアタンパク質である麹菌エンドグルカナーゼとＫｅｘ２切断配列からなる分泌シグナルペプチド（ＣｅｌＢ）のアミノ酸配列である。
配列番号２８のアミノ酸配列は、麹菌ＣＤＨ由来の分泌シグナルペプチドの開始コドン直後にＳＫＩＫのアミノ酸配列が挿入された分泌シグナルペプチド（ＳＫＩＫ＿ＣＤＨｓｓ）のアミノ酸配列である。
配列番号２９のアミノ酸配列は、麹菌ＡＬＰ由来の分泌シグナルペプチド１（ＡｓＡＰ１ｓｓ５４）のアミノ酸配列である。
配列番号３０のアミノ酸配列は、麹菌ＡＬＰ由来の分泌シグナルペプチド３（ＡｓＡＰ１ｓｓ７２）のアミノ酸配列である。
【００３７】
本明細書においては、ＡＬＰの組換え発現に際し、分泌シグナルペプチドが細胞外にＡＬＰを分泌させるように機能することを「ＡＬＰの分泌活性」という。得られた本発明形質転換体において、分泌シグナルペプチドのＡＬＰの分泌活性を調べるには、例えば、次のように行うことができる。アスペルギルス属菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、アスペルギルス属菌株の培養を効率良く行える天然培地又は合成培地に、形質転換体を接種し、温度２０〜４２℃、好ましくは約３０℃で１０〜１２０時間震盪培養しながらインキュベートする。炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース等の糖、デキストラン、デンプン等の炭水化物が挙げられる。この中でも、デキストランが好ましい。窒素源としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス等が挙げられる。中でも、酵母エキスとペプトンが好ましい。無機塩類としては、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムが挙げられる。中でも、硫酸マグネシウムが好ましい。また、培養液にはＡＬＰ活性に必要な金属イオンとしてマグネシウムイオン及び亜鉛イオンを添加することが望ましい。次いで、得られる培養物を回収し、遠心分離又は遠心等により培養上清と菌体を含む残渣に分ける。残渣の菌体を細胞壁溶解酵素、界面活性剤、ＥＤＴＡ等の薬剤、超音波、マルチビーズショッカー等により菌体を破壊し、遠心分離等により菌体破砕上清を得る。得られる培養上清及び菌体破砕上清を使用して、ＡＬＰ活性を測定する。本発明においては、培養上清画分のＡＬＰ活性が確認されることを以って、ＡＬＰの分泌活性を有するという。また、ＡＬＰの分泌活性の強度は、下記式の分泌率として示すことができる。
分泌率＝（培養上清総活性［Ｕ］÷（培養上清総活性［Ｕ］＋菌体内画分総活性［Ｕ］）×１００）
本発明形質転換体のＡＬＰの分泌活性は、特に限定されないが、例えば後述の実施例におけるＡＰＩＶｓｓを分泌シグナルペプチドとして用いた場合の分泌率と同等以上の分泌活性であることが好ましく、より具体的には後述の実施例において測定される分泌率として、１０％以上であることがより好ましく、２０％以上であることがさらに好ましく、３０％以上であることがよりさらに好ましい。
【００３８】
このようにしてＡＬＰの生産能を有する本発明形質転換体を得ることができる。本発明の一態様としての本発明形質転換体は、ＡＬＰが、Ｎ型糖鎖付加モチーフの一部に糖鎖が付加しないように、デザインされた遺伝子を有する。
より具体的には、ウシ腸管由来のＡＬＰアイソフォームＩＩ（ｂＩＡＰＩＩ又はＡＬＰＩＩ）が、３個のＮ型糖鎖付加モチーフのうち１個又は２個に変異を有し、変異を有する該Ｎ型糖鎖付加モチーフには糖鎖が付加しないように、デザインされた遺伝子を有する。さらに具体的には、そのウシ腸管由来のＡＬＰＩＩにおいて、Ｎ型糖鎖付加モチーフが有する変異が、配列番号３１の１２２位、２４９位、２５１位、及び４１０位のうちの１個又は２個である。より具体的には、そのウシ腸管由来のＡＬＰＩＩにおいて、Ｎ型糖鎖付加モチーフが有する変異は、配列番号３１の１２２位におけるＡｓｎからＧｌｎ又はＬｙｓへの変異、２４９位におけるＡｓｎからＧｌｎ、Ａｓｐ又はＨｉｓへの変異、２５１位におけるＴｈｒからＣｙｓへの変異、４１０位におけるＡｓｎからＧｌｎ又はＬｙｓへの変異のうちの１個又は２個である。
【００３９】
このような本発明形質転換体が有する遺伝子の一例として、配列番号３１の１２２位のＡｓｎがＧｌｎに、４１０位のＡｓｎがＧｌｎに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００４０】
また、本発明の一態様としての本発明形質転換体は、ＡＬＰＩＩ又はＩＶであるように、デザインされた遺伝子を有する。具体的なこれらのＡＬＰは、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのタンパク質：
（ｉ）配列番号３１又は３２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｉｉ）配列番号３１又は３２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡＬＰ活性を有するタンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号３１又は３２のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつＡＬＰ活性を有する活性を有するタンパク質；
あるいは、
以下の（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかの塩基配列によりコードされるタンパク質：
（ｉｖ）配列番号３３又は３４の塩基配列；
（ｖ）配列番号３３又は３４の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＡＬＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｖｉ）配列番号３３又は３４の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつ、ＡＬＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
を有する。
【００４１】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された」という場合、欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の個数は、結果として得られるタンパク質がＡＬＰ活性を有する限り特に限定されない。また、ここでの「数個」は、２以上の整数を意味し、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、よりさらに好ましくは２個、３個又は４個である。各タンパク質における欠失、置換又は付加の位置は、結果として得られるタンパク質がＡＬＰ活性を有する限り、Ｎ末端でも、Ｃ末端でも、その中間であってもよい。
【００４２】
「配列番号Ｘのアミノ酸配列とＹ％以上の相同性を有」するとは、２つのタンパク質のアミノ酸配列の一致が最大になるように整列（アライメント）させたときに、共通するアミノ酸残基数の、配列番号Ｘに示す全アミノ酸残基数に対する割合が、Ｙ％以上であることを意味する。
【００４３】
「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された」という場合、欠失、置換若しくは付加される塩基の個数は、結果として得られる塩基配列がＡＬＰ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されない。また、ここでの「数個」は、２以上の整数を意味し、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、よりさらに好ましくは２個、３個又は４個である。各塩基配列における欠失、置換又は付加の位置は、結果として得られる塩基配列がＡＬＰ活性を有するタンパク質をコードする限り、５’末端でも、３’末端でも、その中間であってもよい。
【００４４】
「配列番号Ｘの塩基配列とＹ％以上の相同性を有」するとは、２つの塩基配列の一致が最大になるように整列（アライメント）させたときに、共通する塩基数の、配列番号Ｘに示す全塩基数に対する割合が、Ｙ％以上であることを意味する。
【００４５】
得られた本発明形質転換体のＡＬＰ活性を調べるには、ＡＬＰの分泌活性を調べるために上述したようにＡＬＰ活性を測定する。
本発明形質転換体のＡＬＰ活性は、特に限定されないが、例えば形質転換前の野生株を培養して得られる分泌画分と同等以上の活性であることが好ましく、より具体的には分泌画分における後述する酵素活性値（Ｕ／ｍｌ）が１０（Ｕ／ｍｌ）以上であることがより好ましい。
【００４６】
配列番号３１のアミノ酸配列は、ウシ腸管由来アルカリホスファターゼＩＩ（ｂＩＡＰＩＩ）のアミノ酸配列である。
配列番号３２のアミノ酸配列は、ウシ腸管由来アルカリホスファターゼＩＶ（ｂＩＡＰＩＶ）のアミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号３３の塩基配列は、ウシ腸管由来アルカリホスファターゼＩＩ（ｂＩＡＰＩＩ）をコードする塩基配列である。
配列番号３４の塩基配列は、ウシ腸管由来アルカリホスファターゼＩＶ（ｂＩＡＰＩＶ）をコードする塩基配列である。
【００４８】
次に、本発明製造方法が含み得る各工程について説明する。
本発明形質転換体を培養する工程は、特に限定されないが、本発明変異化物を固体培養法又は液体培養法のいずれで培養してもよく、液体培養法で培養することが好ましい。
【００４９】
本発明形質転換体を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆、小麦麹の浸出液等の１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、塩化コバルト、硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
【００５０】
培養は、好ましくは２０〜３７℃で、具体的には３０℃前後で１０〜１２０時間、通気攪拌深部培養、振とう培養等により行われる。
【００５１】
本発明製造方法は、本発明形質転換体を培地に培養する工程により得られる培養物から、ウシ腸管由来のＡＬＰを採取することによりウシ腸管由来のＡＬＰを製造することができる。本発明製造方法は、通常の酵素採取手段により本発明形質転換体を培養した培養物からウシ腸管由来のＡＬＰを採取することができ、好ましくは本発明形質転換体を培養した培養物から分泌画分を得る工程、及び、分泌画分からウシ腸管由来のＡＬＰを抽出する工程をさらに含むことが好ましい。
【００５２】
本発明形質転換体を培養した培養物から分泌画分を得るには、例えば、培養物から細胞内画分を分離すればよく、例えば、ろ過、遠心分離等の操作により細胞内画分を分離する。本発明形質転換体は、ウシ腸管由来のＡＬＰの分泌率が高いため、細胞内画分に存在するよりも容易に抽出することが可能な分泌画分にウシ腸管由来のＡＬＰが多く存在する傾向にある。これにより、本発明製造方法は、培養物から容易にウシ腸管由来のＡＬＰを得ることができる。
【００５３】
得られた分泌画分からウシ腸管由来のＡＬＰを抽出するためには、通常の酵素精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈殿法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲルろ過クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等を単独で又は適宜組み合わせて行うことが好ましい。このようにして、ウシ腸管由来のＡＬＰを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一のバンドを示すまでに抽出することができる。また、このような方法を適宜組み合わせて、用途に応じた精製度合の異なる標品に調整することもできる。
【００５４】
また、培養工程により得られる培養物中の細胞内画分からもウシ腸管由来のＡＬＰを採取してもよい。この場合には、培養物又は分離した細胞内画分を洗菌することが好ましく、これをそのまま用いることもでき、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ−１００等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法等により、菌体からウシ腸管由来のＡＬＰを採取することが好ましい。
【００５５】
本発明のウシ腸管由来のＡＬＰの比活性は、好ましくは６５００Ｕ／ｍｇ以上である。ＡＬＰの比活性の測定方法としては、酵素の反応により変換される基質の発色量の増減を測定する方法等が主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、ｐ−ニトロフェニルリン酸の変換により生じるｐ−ニトロフェノールの吸光度増加を測定する方法について示す。なお、酵素力価は、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として測定したとき、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量を１Ｕと定義した。
Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：１．０Ｍ  ＭｇＣｌ2溶液
２．０３ｇのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容する。
（２）試薬２：ジエタノールアミン（ＤＥＡ）バッファー（用時調製）
５２．２ｇＤＥＡ（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ社）を４００ｍＬイオン交換水に溶解し、０．２５ｍｌ  ＭｇＣｌ2溶液（試薬１）を加える。その後、３７℃に暖めてから、２Ｎ  ＨＣｌでｐＨ９．８に調整し、イオン交換水で５００ｍｌに定容する。
（３）試薬３：０．６５Ｍ  ｐ−ニトロフェニルリン酸溶液
２４７ｍｇ  ｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ社）を１ｍｌのイオン交換水に溶解する。
（４）酵素希釈液
活性測定値が、０．１０〜０．２０Ｕ／ｍｌになるようにＤＥＡバッファー（試薬２）で希釈する。
Ｂ．活性測定法
２．９０ｍｌのＤＥＡバッファー（試薬２）と０．０５ｍｌのｐ−ニトロフェニルリン酸溶液（試薬３）を混和し、３７℃で５分加温する。その後、０．０５ｍｌの酵素希釈液を添加し、混合の後、分光光度計（Ｕ−３０１０、日立ハイテクノロジーズ社）により、４０５ｎｍにおける吸光度を測定する。測定値（ΔＯＤｔｅｓｔ）は、４０５ｎｍにおける２分後から４分後の１分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液（ΔＯＤｂｌａｎｋ）は、酵素液の代わりに０．０５ｍｌのＤＥＡバッファーを加える以外は前記と同様にしたものである。下記の計算式に従い、算出した値を酵素活性値（Ｕ／ｍｌ）とした。
【数１】
2019069977.tif 000002
１８．２：上記の測定条件下でのミリモル分子吸光係数（ｃｍ2／ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）１．０：光路長（ｃｍ）
Ｃ．比活性の算出
酵素溶液のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）は分光光度計（Ｕ−３０１０、日立ハイテクノロジーズ社）を用いて２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、１．０ＯＤ＝１．０ｍｇ／ｍｌとして算出した。酵素活性値（Ｕ／ｍｌ）をタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）で除して、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
【００５６】
本発明において、ゲルろ過法によって測定されるＡＬＰＩＩの分子量は、好ましくは１５０ｋＤａ以下であり、より好ましくは８０〜１５０ｋＤａであり、さらに好ましくは９０〜１３５ｋＤａである。ゲルろ過法によって測定される分子量は、後述する実施例に記載の方法のとおり又はその方法に準じて測定される。
【００５７】
本発明のアスペルギルス属形質転換用ベクターの一態様において、これは、ウシ腸管由来のＡＬＰのＮ末端側に対して、上述したアスペルギルス属菌由来の分泌シグナルペプチドを有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する。また、本発明のアスペルギルス属形質転換用ベクターの一態様において、これは、ウシ腸管由来のＡＬＰをコードする塩基配列に対して、その５’末端側に上述した塩基配列が結合した塩基配列からなる遺伝子を有する。本発明形質転換体は、これらの本発明のアスペルギルス属形質転換用ベクターを用いて形質転換されることにより、作製することができる。
【００５８】
以下に、実施例により本発明を詳述する。
【実施例】
【００５９】
［実施例１．ＣＤＨｓｓ―ｂＩＡＰＩＩを挿入したＤＮＡコンストラクトの作製］
（１−１）コンストラクト用プラスミドの作製
国際公開第２０１６／１２１２８５号パンフレットの「［例１．遺伝子ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣを挿入したＤＮＡコンストラクトの作製］（３）コンストラクト用プラスミドの作製」に記載の方法と同様の方法で、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社）に付属されているｐＵＣ１９  ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ  ＶｅｃｔｏｒのマルチクローニングサイトにあるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅに翻訳伸長因子遺伝子ｔｅｆ１のプロモーター配列であるＰｔｅｆ、アルカリプロテアーゼ遺伝子ａｌｐのターミネーター配列であるＴａｌｐ、及びウリジン要求性を相補する形質転換マーカー遺伝子ｐｙｒＧを連結させたコンストラクト用プラスミドを作製した。【００６０】
（１−２）遺伝子挿入ＤＮＡコンストラクトの作製
コンストラクト用プラスミドのＰｔｅｆ及びＴａｌｐの間に、対象遺伝子であるｂＩＡＰＩＩを連結させたＤＮＡコンストラクトを次のとおりに作製した。
鋳型ＤＮＡとして上記で得られたコンストラクト用プラスミド、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＴ１００TM  サーマルサイクラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施することによりコンストラクト用プラスミドのベクター断片を得た。使用したプライマーを下記に示す。増幅したベクター断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。【００６１】
【表１】
2019069977.tif 000003
【００６２】
ウシ腸管由来のアルカリホスファターゼＩＩ（ｂＩＡＰＩＩ）のＮ末端側分泌シグナルペプチド（配列番号３６）の代わりに麹菌セロビオースデヒドロゲナーゼ由来分泌シグナルペプチド（ＣＤＨｓｓ）を融合したｂＩＡＰＩＩ遺伝子を麹菌にコドン最適化したＣＤＨｓｓ―ｂＩＡＰＩＩ合成遺伝子（配列番号３７）を委託合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）。鋳型ＤＮＡとして上記で得られたＣＤＨｓｓ―ｂＩＡＰＩＩ合成遺伝子、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＴ１００TM  サーマルサイクラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施し、挿入遺伝子ＤＮＡ断片を得た。増幅するために使用したプライマーを下記に示す。なお、配列のうち、小文字の配列はコンストラクト用プラスミド（Ｐｔｅｆ及びＴａｌｐの間）に連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。【００６３】
【表２】
2019069977.tif 000004
【００６４】
上記のとおりに増幅したベクター断片と、ＣＤＨｓｓ―ｂＩＡＰＩＩＤＮＡ断片とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して、そのキットに添付されたプロトコールに従って連結して、ＣＤＨｓｓ―ｂＩＡＰＩＩが挿入された遺伝子挿入ＤＮＡコンストラクト（ｐｂＩＡＰＩＩ）を得た。このようにして得られたＤＮＡコンストラクトは、その上流から、ｐＵＣ１９由来のＤＮＡ断片とＰｔｅｆのＤＮＡ断片とＣＤＨｓｓのＤＮＡ断片とｂＩＡＰＩＩのＤＮＡ断片とＴａｌｐのＤＮＡ断片とｐｙｒＧのＤＮＡ断片とｐＵＣ１９由来のＤＮＡ断片とが連結されたものである。すなわち、ｐＵＣ１９  ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ（クロンテック社）のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅに、Ｐｔｅｆ−ＣＤＨｓｓ―ｂＩＡＰＩＩ−Ｔａｌｐ−ｐｙｒＧの配列が順に連結されたＤＮＡコンストラクトが得られた。
その後、氷水中で大腸菌コンピテントセルＥＣＯＳ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）にＤＮＡコンストラクト液を１／１０量混合し、５分間氷水中で放置した後、４２℃、４５秒間処理することで形質転換した。その後、５０ μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）プレートへ塗り広げた。これを３７℃で一晩静置培養し、コロニーを形成させた。
得られたコロニーを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３７℃、一晩振とう培養した。培養後の培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体について、ＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、そのキットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡ（ＤＮＡコンストラクト）を抽出した。
抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入された各ＤＮＡの塩基配列を決定することにより、ＣＤＨｓｓ―ｂＩＡＰＩＩが挿入されたＤＮＡコンストラクト（ＤＮＡコンストラクト名：ｐｂＩＡＰＩＩ）が得られたことを確認した。【００６５】
（１−３）部位特異的変異によるＮ型糖鎖付加モチーフ改変型ＡＬＰ遺伝子挿入ＤＮＡコンストラクトの作製
Ｎ型糖鎖付加モチーフ改変型ＡＬＰ＿Ａｓｎ１２２Ｇｌｎ（Δ１）を生成するために、ＣＤＨｓｓ―ｂＩＡＰＩＩが挿入された遺伝子挿入ＤＮＡコンストラクト（ｐｂＩＡＰＩＩ）をテンプレートとし、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＴ１００TM  サーマルサイクラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施した。使用したプライマーを下記に示す。増幅したＤＮＡ断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。上記のＤＮＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して、そのキットに添付されたプロトコールに従って連結して、Ｎ型糖鎖付加モチーフへの変異Ａｓｎ１２２Ｇｌｎを含むＣＤＨｓｓ―ｂＩＡＰＩＩが挿入された遺伝子挿入ＤＮＡコンストラクト（ｐΔ１）を得た。以降、下記表に基づいて順次部位特的変異を導入することで各種のＮ型糖鎖付加モチーフ改変型ＡＬＰ遺伝子挿入ＤＮＡコンストラクトを得た。【００６６】
【表３】
2019069977.tif 000005
【００６７】
［実施例２．形質転換Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅの作製］
（２−１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ  ＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株
各遺伝子挿入ＤＮＡコンストラクトをエタノール沈殿した後に、ＴＥバッファーに溶解して、所望の濃度に調製したＤＮＡ溶液を、下記の手順でＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ  ＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株（ｐｙｒＧ遺伝子の上流４８ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ、下流２４０ｂｐ欠損株）の形質転換に用いた。【００６８】
（２−２）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ  ＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株の形質転換
５００ｍｌ容三角フラスコ中の２０ｍＭウリジンを含むポリペプトンデキストリン液体培地１００ｍｌに、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ  ＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株の分生子を接種し、３０℃で約２０時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び２０μｇの遺伝子挿入ＤＮＡコンストラクトを用いて、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、次いで０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社；ｐＨ６）を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅを得た。
得られた形質転換Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅは、ウリジン要求性を相補する遺伝子であるｐｙｒＧが導入されることにより、ウリジン無添加培地に生育できるようになることで、目的の遺伝子が導入された株として選択できた。【００６９】
［実施例３．形質転換Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅの各種ＡＬＰ生産］
３Ｌ容ジャーファーメンター中の液体培地（２％（ｗ／ｖ）ハイポリペプトン（日本製薬社）、２％（ｗ／ｖ）パインデックス＃２（松谷化学工業社）、１％（ｗ／ｖ）酵母エキス（オリエンタル酵母社）、０．２５％（ｗ／ｖ）ＫＨ2ＰＯ4（和光純薬工業社）、０．２５％（ｗ／ｖ）Ｋ2ＨＰＯ4（和光純薬工業社）、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（和光純薬工業社）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2（和光純薬工業社）、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ2（和光純薬工業社）；ｐＨ未調整）１８００ｍｌに、各種形質転換株の分生子を接種し３０℃、撹拌速度２５０ｒｐｍ、通気毎分２５Ｌ、０．０５ＭＰａ圧力下で培養を開始し、４８時間後から撹拌速度５００ｒｐｍに変更し、計５日間培養を行った。次いで、培養後の培養物をミラクロス（カルバイオケム社）でろ過分離し、培養上清と菌体を回収した。回収した菌体を蒸留水で洗浄した後、菌体をペーパータオルに挟むことによって水分を押し出して湿菌体を得た。得られた湿菌体を秤量し、５０ｍｇ湿菌体／ｍｌになるようＴｒｉｓバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ2）を添加して、ホモジナイズ処理後、一部をジルコニアビーズと共に２ｍｌスクリューキャップバイアルに入れ、ビーズショッカー（ＭＳ−１００Ｒ、トミー精工社）を用いて２５００ｒｐｍ、２０秒間の破砕を２回繰り返した。次いで、１５０００×ｇで５分間遠心し、得られた遠心上清を菌体内画分とした。
得られた培養上清画分と菌体内画分のＡＬＰ活性測定を上述した「Ｂ．活性測定法」以下の記載に従い、分泌率（培養上清総活性［Ｕ］÷（培養上清総活性［Ｕ］＋菌体内画分総活性［Ｕ］）×１００）を計算した（図１）。【００７０】
［比較例．形質転換Ｓ．ｐｏｍｂｅの各種ｂＩＡＰＩＩ生産］
特開２００８−５７３４号の実施例５で得られるＡＬＰ生産酵母Ｓ．ｐｏｍｂｅの培養液を同様に作製し、その培養液を遠心分離して菌体と培養上清画分に分け、続いて菌体をＴｒｉｓバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ2）に懸濁してビーズショッカーで菌体を破砕し、菌体内画分を取得した。得られた培養上清画分と菌体内画分について、実施例３と同様の方法でＡＬＰ活性測定を行い、実施例３と同様に分泌率を計算した（図１）。【００７１】
麹菌Ａ．ｓｏｊａｅで発現した場合、各ＤＮＡコンストラクト（ＤＮＡコンストラクト名：ｐｂＩＡＰＩＩ、ｐΔ１、ｐΔ１ｋ、ｐΔ１３、及びｐΔ１ｋ３）に対応する各種ｂＩＡＰＩＩ（ＡＬＰ名：ｂＩＡＰＩＩ、Δ１、Δ１ｋ、Δ１３、及びΔ１ｋ３）の分泌率は７５％以上と非常に高いが、酵母Ｓ．ｐｏｍｂｅで発現した場合、ｂＩＡＰＩＩの分泌率は７％程度であった。また、酵母発現ではＮ型糖鎖付加モチーフの数が減るにつれて分泌率が低下していたが、麹菌発現ではＮ型糖鎖付加モチーフ数に依らず常に分泌率が高かった。【００７２】
［実施例４．各種ＡＬＰの精製］
培養上清を８０００ｒｐｍ、９０分間間遠心分離して上清を回収し、限外ろ過膜ＡＩＰ−１０１０（旭化成社）により濃縮、Ｔｒｉｓバッファーで透析した。内液を回収し０．４５μｍフィルター（材質ＰＥＳ、ミリポア社）を通過したろ液を回収した。Ｔｒｉｓバッファーで平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社）陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに試料を吸着させた後、１Ｍ  ＮａＣｌを含むＴｒｉｓバッファーでグラジエント溶出した。終濃度３０％になるように硫酸アンモニウムを加え、０．２μｍフィルター（材質ＰＥＳ、ミリポア社）を通過したろ液を回収した。次いで、３０％硫酸アンモニウムを含むＴｒｉｓバッファーで平衡化したＴＯＹＯＰｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ―６５０Ｃ（東ソー社）疎水カラムクロマトグラフィーに試料を吸着させた後、Ｔｒｉｓバッファーでグラジエント溶出し、限外ろ過膜アミコンウルトラ−１５（分画分子量３０ｋＤａ、ミリポア社）を用いて濃縮した。次いで、Ｔｒｉｓバッファーで平衡化したＨｉｌｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（ＧＥヘルスケア社）ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより分画精製した。【００７３】
［実施例５．比活性の測定］
精製された各種ＡＬＰのＡＬＰ活性を測定し、タンパク質量を２８０ｎｍの吸光度により求め、比活性を算出した（図２）。
麹菌発現したｂＩＡＰＩＩ、Δ１、Δ１ｋ、Δ１３、及びΔ１ｋ３は６０００Ｕ／ｍｇ以上の高い比活性を示した。【００７４】
［実施例６．形質転換Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅによるｂＩＡＰＩＩ生産］
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ  ＮＢＲＣ４２３９株の代わりにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＲＩＢ４０株を用いた以外は実施例２〜５と同じ手順で、形質転換Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ発現ｂＩＡＰＩＩを調製した。【００７５】
［実施例７．分子量の測定］
精製された各種ＡＬＰの分子量をＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２２０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ、アジレント社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した。０．１Ｍ  ＮａＣｌを含んだ１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０で平衡化したＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ（７．５ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ、東ソー社）に精製ＡＬＰ溶液５０μＬをアプライし、カラム温度２５℃、流速１ｍＬ／ｍｉｎで同バッファーにより溶出させ、２８０ｎｍの吸光度を測定した。分子量マーカー（ＭＷ−Ｍａｒｋｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、オリエンタル酵母工業社）により検量線を作成し、精製ＡＬＰの分子量を算出した（表４）。対照として、市販の酵母組換え発現ウシ腸管由来ＡＬＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ：Ｒｏｃｈｅ＿ＡＬＰ、Ｒｏｃｈｅ社）、脱糖鎖処理された酵母組換え発現ウシ腸管由来ＡＬＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ, Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｅｄ：Ｒｏｃｈｅ＿ＡＬＰ＿ＣＲ、Ｒｏｃｈｅ社）、及び高比活性なウシ腸管抽出物由来ＡＬＰ（ＡＬＰ１３Ｇ、ＢＢＩ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）を用いた。【００７６】
【表４】
2019069977.tif 000006
【００７７】
アミノ酸配列中のＮ型糖鎖付加モチーフ数はｂＩＡＰＩＩにおいては３つ、Δ１及びΔ１ｋにおいては２つ、Δ１３及びΔ１ｋ３のおいては１つ含まれる。各種ＡＬＰに付加される糖鎖量はＮ型糖鎖付加モチーフ数に比例すると考えられ、糖鎖の量に応じて分子量も増加すると考えられる。実際、特開２００８−５７３４号に記載の酵母Ｓ．ｐｏｍｂｅで発現されたｂＩＡＰＩＩの分子量は１１００ｋＤａ、Δ１ｋの分子量は４４０ｋＤａ、Δ１３及びΔ１ｋ３の分子量は１２０ｋＤａであり（特開２００８−５７３４号の表５）、Ｎ型糖鎖付加モチーフ数の減少に応じてＡＬＰの分子量が低下していた。一方で、麹菌Ａ．ｓｏｊａｅで発現して得られた各種ＡＬＰにおいても同様の傾向がみられ、さらに、麹菌Ａ．ｓｏｊａｅ又はＡ．ｏｒｙｚａｅで発現した各種ＡＬＰの分子量は酵母Ｓ．ｐｏｍｂｅで発現された同じＮ型糖鎖付加モチーフ数を有するＡＬＰよりも分子量が著しく低下していた。市販のＰｉｃｈｉａ  Ｐａｔｏｒｉｓで発現されたウシ腸管由来ＡＬＰ（Ｒｏｃｈｅ＿ＡＬＰ）、脱糖鎖処理されたＲｏｃｈｅ＿ＡＬＰ＿ＣＲ、高比活性なウシ腸管由来ＡＬＰ（ＡＬＰ１３Ｇ；ＢＢＩ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）の分子量はそれぞれ２２０ｋＤａ、１４５ｋＤａ、１３１ｋＤａであった。市販のウシ腸管由来ＡＬＰよりも麹菌で発現した各種ＡＬＰの方が分子量は小さかった。【００７８】
［実施例８．各種分泌シグナルペプチドが融合したｂＩＡＰＩＶを挿入したＤＮＡコンストラクトの作製］
（８−１）コンストラクト用プラスミドの作製
実施例１−１のＣＤＨｓｓ―ｂＩＡＰＩＩを挿入したＤＮＡコンストラクト用プラスミドと同様の手順で、各種分泌シグナルペプチドが融合したｂＩＡＰＩＶを挿入したＤＮＡコンストラクト用プラスミドを作製した。【００７９】
（８−２）ウシ腸管由来アルカリホスファターゼＩＶ（ｂＩＡＰＩＶ）遺伝子挿入ＤＮＡコンストラクトの作製
コンストラクト用プラスミドのＰｔｅｆ及びＴａｌｐの間に、対象遺伝子であるｂＩＡＰＩＶ遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトを次のとおりに作製した。
鋳型ＤＮＡとして上記で得られたコンストラクト用プラスミド、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＴ１００TM  サーマルサイクラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施することによりコンストラクト用プラスミドのベクター断片を得た。使用したプライマーを下記に示す。増幅したベクター断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。【００８０】
【表５】
2019069977.tif 000007
【００８１】
ウシ腸管由来アルカリホスファターゼＩＶ（ｂＩＡＰＩＶ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号配列；ＡＡＣ３３８５４）を麹菌にコドン最適化し、Ｃ末端側の膜結合シグナルペプチドをコードする領域を除いたｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子（配列番号６０）を委託合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）。鋳型ＤＮＡとして上記で得られたｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＴ１００TM  サーマルサイクラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施し、ｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子ＤＮＡ断片を得た。増幅するために使用したプライマーを下記に示す。なお、配列のうち、小文字の配列はコンストラクト用プラスミド（Ｐｔｅｆ及びＴａｌｐの間）に連結するための付加配列を示す。増幅したＤＮＡ断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。【００８２】
【表６】
2019069977.tif 000008
【００８３】
上記のとおりに増幅したベクター断片と、ｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子ＤＮＡ断片とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して、そのキットに添付されたプロトコールに従って連結して、ｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子が挿入された遺伝子挿入ＤＮＡコンストラクト（ｐｂＩＡＰＩＶ）を得た。このようにして得られたＤＮＡコンストラクトは、上流から、ｐＵＣ１９由来のＤＮＡ断片とＰｔｅｆのＤＮＡ断片とｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子ＤＮＡ断片とＴａｌｐのＤＮＡ断片とｐｙｒＧのＤＮＡ断片とｐＵＣ１９由来のＤＮＡ断片とが連結されたものである。すなわち、ｐＵＣ１９  ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ（クロンテック社）のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅに、Ｐｔｅｆ−ｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子−Ｔａｌｐ−ｐｙｒＧの配列が順に連結されたＤＮＡコンストラクトが得られた。
その後、氷水中で大腸菌コンピテントセルＥＣＯＳ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）にＤＮＡコンストラクト液を１／１０量混合し、５分間氷水中で放置した後、４２℃、４５秒間処理することで形質転換した。その後、５０ μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）プレートへ塗り広げた。これを３７℃で一晩静置培養し、コロニーを形成させた。
得られたコロニーを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３７℃、一晩振とう培養した。培養後の培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体について、ＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡ（ＤＮＡコンストラクト）を抽出した。
抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入された各ＤＮＡの塩基配列を決定することにより、ｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子が挿入されたＤＮＡコンストラクト（ｐｂＩＡＰＩＶ）が得られたことを確認した。【００８４】
（８−３）各種分泌シグナルペプチドを有するｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子挿入ＤＮＡコンストラクトの作製
ｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子がコードするＮ末端側分泌シグナルペプチドが表３に示す分泌シグナルペプチド（Ｋｅｘ２切断リンカーを融合したキャリアタンパク質としての分泌シグナルペプチドを含む。）に置き換えられたｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子が挿入された種々のＤＮＡコンストラクトを次のとおりに作製した。【００８５】
【表７】
2019069977.tif 000009
【００８６】
鋳型ＤＮＡとしてｐｂＩＡＰＩＶ、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＴ１００TM  サーマルサイクラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施することにより、ｐｂＩＡＰＩＶの分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列が除かれた、コンストラクト用プラスミドのベクター断片を得た。使用したプライマーを下記に示す。増幅したベクター断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。【００８７】
【表８】
2019069977.tif 000010
【００８８】
国際公開第２０１６／１２１２８５号パンフレットの「［例１．遺伝子ＡｓＥｇｔＡ、ＡｓＥｇｔＢ又はＡｓＥｇｔＣを挿入したＤＮＡコンストラクトの作製］（２）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ  ＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡの抽出」と同様の操作で得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＴ１００TM  サーマルサイクラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施した。キャリアタンパク質となるセロビオースデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼＢ、及びエンドグルカナーゼの遺伝子（それぞれｃｄｈ、ｇｌａｂ、及びｃｅｌｂ）を増幅するために使用したプライマーを下記表に示す。下表に記載の各プライマーを用いることで、各キャリアタンパク質のＣ末端にＫｅｘ２切断配列を含むリンカー配列（配列番号６１）が連結したアミノ酸配列（配列番号２３、２５、２７）をコードするＤＮＡ断片を取得した。増幅したＣＤＨ遺伝子、ＧｌａＢ遺伝子、及びＣｅｌＢ遺伝子のＤＮＡ断片を１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。【００８９】
【表９】
2019069977.tif 000011
【００９０】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して、ＣＤＨ遺伝子、ＧｌａＢ遺伝子、及びＣｅｌＢ遺伝子のＤＮＡ断片と、コンストラクト用プラスミドのベクター断片とをそれぞれ連結して、ＣＤＨ遺伝子、ＧｌａＢ遺伝子、及びＣｅｌＢ遺伝子が挿入された遺伝子挿入ＤＮＡコンストラクト（ｐＣＤＨａｌｌ、ｐＧｌａＢ、及びｐＣｅｌＢ）を得た。このようにして得られたＤＮＡコンストラクトは、その上流から、ｐＵＣ１９由来のＤＮＡ断片とＰｔｅｆのＤＮＡ断片と、各種キャリアタンパク質遺伝子のＤＮＡ断片と分泌シグナルペプチドをコードする塩基を含まないｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子ＤＮＡ断片とＴａｌｐのＤＮＡ断片とｐｙｒＧのＤＮＡ断片とｐＵＣ１９由来のＤＮＡ断片とが連結されたものである。すなわち、ｐＵＣ１９  ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ（クロンテック社）のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅに、Ｐｔｅｆ−各種キャリアタンパク質の遺伝子−Ｋｅｘ２切断配列を含むリンカーをコードする塩基配列−分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列を含まないｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子−Ｔａｌｐ−ｐｙｒＧの配列が順に連結されたＤＮＡコンストラクト（ｐＣＤＨａｌｌ、ｐＧｌａＢ、及びｐＣｅｌＢ）が得られた。【００９１】
得られたＤＮＡコンストラクトを用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。その後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）プレートへ塗り広げた。これを３７℃で一晩静置培養し、コロニーを形成させた。
得られたコロニーを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３７℃、一晩振とう培養した。培養後の培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体について、ＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡ（ＤＮＡコンストラクト）を抽出した。
抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡコンストラクト（ｐＣＤＨａｌｌ、ｐＧｌａＢ、及びｐＣｅｌＢ）が得られたことを確認した。【００９２】
次いで、ｂＩＡＰＩＶの分泌シグナルシグナルペプチドがＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ由来セロビオースデヒドロゲナーゼシトクロームｂドメイン（ＣＤＨｃｙｔｂ）及びＫｅｘ２切断配列を含むリンカー配列（配列番号６１）からなる分泌シグナルペプチド（配列番号１８）に置き換えられたｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトを以下の手順で作製した。鋳型ＤＮＡとして上記で得られたｐＣＤＨａｌｌ、配列番号７１及び７２のプライマー、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＴ１００TM  サーマルサイクラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施し、ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘ−ｂＩＡＰＩＶのコンストラクトＤＮＡ断片を得た。ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘ＿ｂＩＡＰＩＶのコンストラクトＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。
上述の方法でプレート培養し、得られたコロニーを培養後、菌体からプラスミドＤＮＡを回収した。抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定することによりＤＮＡコンストラクト（ｐＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘ）が得られたことを確認した。【００９３】
次いで、ｂＩＡＰＩＶの分泌シグナルシグナルペプチドがＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅセロビオースデヒドロゲナーゼ由来分泌シグナルペプチド（ＣＤＨｓｓ；配列番号１７）に置き換えられたｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトを以下の手順で作製した。鋳型ＤＮＡとして上記で得られたｐＣＤＨａｌｌ、配列番号７３及び７４のプライマー、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＴ１００TM  サーマルサイクラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施し、ＣＤＨｓｓ−ｂＩＡＰＩＶのコンストラクトＤＮＡ断片を得た。ＣＤＨｓｓ＿ｂＩＡＰＩＶのコンストラクトＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。
上述の方法でプレート培養し、得られたコロニーを培養後、菌体からプラスミドＤＮＡを回収した。抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定することによりＤＮＡコンストラクト（ｐＣＤＨｓｓ）が得られたことを確認した。【００９４】
次いで、ｂＩＡＰＩＶの分泌シグナルシグナルペプチドがＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅセロビオースデヒドロゲナーゼ由来分泌シグナルペプチド（ＣＤＨｓｓ）の開始メチオニン直後にＳＫＩＫを挿入した分泌シグナル（ＳＫＩＫ＿ＣＤＨｓｓ；配列番号２８）に置き換えられたｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトを以下の手順で作製した。鋳型ＤＮＡとして上記で得られたｐＣＤＨｓｓ、配列番号７５及び７６のプライマーＰＣＲの酵素としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＴ１００TM  サーマルサイクラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施し、ＳＫＩＫ＿ＣＤＨｓｓ−ｂＩＡＰＩＶのコンストラクトＤＮＡ断片を得た。ＳＫＩＫ＿ＣＤＨｓｓ−ｂＩＡＰＩＶのコンストラクトＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。
上述の方法でプレート培養し、得られたコロニーを培養後、菌体からプラスミドＤＮＡを回収した。抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定することによりＤＮＡコンストラクト（ｐＳＫＩＫ＿ＣＤＨｓｓ）が得られたことを確認した。【００９５】
次いで、ｂＩＡＰＩＶの分泌シグナルシグナルペプチドがＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ由来セロビオースデヒドロゲナーゼシトクロームｂドメイン（ＣＤＨｃｙｔｂ）及びＫｅｘ２切断リンカー変異１〜４を含むリンカー配列（配列番号６２〜６５）からなる分泌シグナルペプチド（配列番号１９〜２２）に置き換えられたｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトを以下の手順で作製した。鋳型ＤＮＡとして上記で得られたｐＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘ、配列番号７７〜８１のプライマー、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＴ１００TM  サーマルサイクラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施し、ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘｍｕｔ１＿ｂＩＡＰＩＶ、ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘｍｕｔ２＿ｂＩＡＰＩＶ、ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘｍｕｔ３＿ｂＩＡＰＩＶ、ＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘｍｕｔ４＿ｂＩＡＰＩＶ、のコンストラクトＤＮＡ断片を得た。得られたコンストラクトＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。
上述の方法でプレート培養し、得られたコロニーを培養後、菌体からプラスミドＤＮＡを回収した。抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定することによりＤＮＡコンストラクト（ｐＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘｍｕｔ１、ｐＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘｍｕｔ２、ｐＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘｍｕｔ３、ｐＣＤＨｃｙｔｂｋｅｘｍｕｔ４）が得られたことを確認した。【００９６】
次いで、ｂＩＡＰＩＶの分泌シグナルシグナルペプチドがＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅグルコアミラーゼ由来分泌シグナルペプチド（配列番号２４）に置き換えられたｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトを以下の手順で作製した。鋳型ＤＮＡとして上記で得られたｐｂＩＡＰＩＶ、配列番号８２及び８３のプライマー、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＴ１００TM  サーマルサイクラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施し、ＧｌａＢｓｓ＿ｂＩＡＰＩＶのコンストラクトＤＮＡ断片を得た。得られたコンストラクトＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。
上述の方法でプレート培養し、得られたコロニーを培養後、菌体からプラスミドＤＮＡを回収した。抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定することによりＤＮＡコンストラクト（ｐＧｌａＢｓｓ）が得られたことを確認した。【００９７】
次いで、ｂＩＡＰＩＶの分泌シグナルシグナルペプチドがＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅエンドグルカナーゼ由来分泌シグナルペプチド（ＣｅｌＢｓｓ；配列番号２６）に置き換えられたｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトを以下の手順で作製した。鋳型ＤＮＡとして上記で得られたｐＣｅｌＢ、配列番号８４及び８５のプライマー、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＴ１００TM  サーマルサイクラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施し、ＣｅｌＢｓｓ＿ｂＩＡＰＩＶのコンストラクトＤＮＡ断片を得た。ＣｅｌＢｓｓ＿ｂＩＡＰＩＶのコンストラクトＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。
上述の方法でプレート培養し、得られたコロニーを培養後、菌体からプラスミドＤＮＡを回収した。抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定することにより、ｂＩＡＰＩＶ遺伝子の上流にＣｅｌＢｓｓをコードする遺伝子が挿入されたＤＮＡコンストラクト（ｐＣｅｌＢｓｓ）が得られたことを確認した。【００９８】
次いで、ｂＩＡＰＩＶの分泌シグナルシグナルペプチドがＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅアルカリホスファターゼ由来分泌シグナルペプチド（配列番号２９及び３０）に置き換えられたｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトを以下の手順で作製した。鋳型ＤＮＡとして上記で得られたｐｂＩＡＰＩＶ、ＰＣＲの酵素としてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、配列番号８６〜８９のプライマー、反応試薬として本酵素に付属のもの、装置としてＴ１００TM  サーマルサイクラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を使用して、本酵素に添付されたプロトコールに従ってインバースＰＣＲを実施し、ＡｓＡＰ１ｓｓ＿ｂＩＡＰＩＶ及びＡｓＡＰ３ｓｓ＿ｂＩＡＰＩＶのコンストラクトＤＮＡ断片を得た。得られたコンストラクトＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。
上述の方法でプレート培養し、得られたコロニーを培養後、菌体からプラスミドＤＮＡを回収した。抽出したプラスミドＤＮＡ中に挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定することによりＤＮＡコンストラクト（ｐＡｓＡＰ１ｓｓ５４及びｐＡｓＡＰ３ｓｓ７２）が得られたことを確認した。【００９９】
［実施例９．形質転換Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅの作製］
実施例８で得られた各種分泌シグナルペプチドを有するｂＩＡＰＩＶ合成遺伝子を挿入したＤＮＡコンストラクトを用い、実施例２に記載の方法に従って、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ  ＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株の形質転換株を取得した。【０１００】
［実施例１０．形質転換Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅのフラスコ培養試験］
５０ｍＬ容三角フラスコ中の液体培地（２％（ｗ／ｖ）ハイポリペプトン（日本製薬社）、２％（ｗ／ｖ）パインデックス＃２（松谷化学工業社）、１％（ｗ／ｖ）酵母エキス（オリエンタル酵母社）、０．２５％（ｗ／ｖ）ＫＨ2ＰＯ4（和光純薬工業社）、０．２５％（ｗ／ｖ）Ｋ2ＨＰＯ4（和光純薬工業社）、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（和光純薬工業社）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2（和光純薬工業社）、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ2（和光純薬工業社）；ｐＨ未調整）２０ｍｌに、実施例９で得られた各種形質転換株の分生子を接種し３０℃、撹拌速度１８０ｒｐｍで培養を開始し、計３日間培養を行った。次いで、培養後の培養物をミラクロス（カルバイオケム社）でろ過分離し、培養上清と菌体を回収した。回収した菌体を蒸留水で洗浄した後、菌体をペーパータオルに挟むことによって水分を押し出して湿菌体を得た。得られた湿菌体を秤量し、５０ｍｇ湿菌体／ｍｌになるようＴｒｉｓバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ2）を添加して、ホモジナイズ処理後、一部をジルコニアビーズと共に２ｍｌスクリューキャップバイアルに入れ、ビーズショッカー（ＭＳ−１００Ｒ、トミー精工社）を用いて２５００ｒｐｍ、２０秒間の破砕を２回繰り返した。次いで、１５０００×ｇで５分間遠心し、得られた遠心上清を菌体内画分とした。
得られた培養上清画分と菌体内画分のＡＬＰ活性測定を特開２００８−５７３４号に記載の方法で行い、分泌率（培養上清総活性［Ｕ］÷（培養上清総活性［Ｕ］＋菌体内画分総活性［Ｕ］）×１００）を計算した（図３）。【０１０１】
【表１０】
2019069977.tif 000012
【表１１】
2019069977.tif 000013
【表１２】
2019069977.tif 000014
【表１３】
2019069977.tif 000015
【表１４】
2019069977.tif 000016
【表１５】
2019069977.tif 000017
【表１６】
2019069977.tif 000018
【表１７】
2019069977.tif 000019
【表１８】
2019069977.tif 000020
【表１９】
2019069977.tif 000021
【表２０】
2019069977.tif 000022
【表２１】
2019069977.tif 000023
【表２２】
2019069977.tif 000024
【表２３】
2019069977.tif 000025
【表２４】
2019069977.tif 000026
【表２５】
2019069977.tif 000027
【表２６】
2019069977.tif 000028
【表２７】
2019069977.tif 000029
【表２８】
2019069977.tif 000030
【表２９】
2019069977.tif 000031
【表３０】
2019069977.tif 000032
【表３１】
2019069977.tif 000033
【表３２】
2019069977.tif 000034
【表３３】
2019069977.tif 000035
【表３４】
2019069977.tif 000036
【表３５】
2019069977.tif 000037
【表３６】
2019069977.tif 000038
【０１０２】
本出願は、２０１７年１０月３日に出願された日本国特許出願２０１７−１９３６２４号に基づく優先権を主張するものであり、この内容はここに参照として組み込まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明によれば、糖鎖が過剰かつ不均一に付加しすぎない単一アイソフォームのＡＬＰを高い生産性と分泌性を伴って製造できるＡＬＰの製造方法が提供され、また新規なＡＬＰＩＩ、ベクター、並びに形質転換体が提供され、産業上有用である。
【図１】
2019069977.tif 000039
【図２】
2019069977.tif 000040
【図３】
2019069977.tif 000041
【配列表】
2019069977000001.app
【国際調査報告】
2019069977.tif 000042
2019069977.tif 000043
2019069977.tif 000044
2019069977.tif 000045
2019069977.tif 000046
2019069977.tif 000047
2019069977.tif 000048
2019069977.tif 000049