(57)【要約】  本発明は、多能性幹細胞から下垂体組織を含む細胞塊を効率よく製造する手法を提供することを課題とする。下記工程（１）及び（２）を含む、下垂体組織を含む細胞塊の製造方法；（１）多能性幹細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し細胞の凝集体を形成させる第一工程、（２）第一工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）及び（２）を含む、下垂体組織を含む細胞塊の製造方法；
（１）多能性幹細胞をＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）第一工程で得られた凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程。
【請求項２】
下記工程（ａ）、（１）及び（２）を含む、下垂体組織を含む細胞塊の製造方法；
（ａ）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに２）未分化維持因子を含む培地で培養するａ工程、
（１）ａ工程で培養された多能性幹細胞をＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）第一工程で得られた凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含有する細胞塊を得る第二工程。
【請求項３】
下記工程（１）、（２−１）及び（２−２）を含む、下垂体組織を含む細胞塊の製造方法；
（１）多能性幹細胞をＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２−１）第一工程で得られた凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養する第二工程（１）、
（２−２）第二工程（１）で浮遊培養された凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程（２）。
【請求項４】
下記工程（ａ）、（１）、（２−１）及び（２−２）を含む、下垂体組織を含む細胞塊の製造方法；
（ａ）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに２）未分化維持因子を含む培地で培養するａ工程、
（１）ａ工程で培養された多能性幹細胞をＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２−１）第一工程で得られた凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養する第二工程（１）、
（２−２）第二工程（１）で浮遊培養された凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程（２）。
【請求項５】
前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質がＰＯＲＣＮ阻害剤であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記工程（１）、（２）、（２−１）及び（２−２）における浮遊培養が、さらにＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質の存在下で行われることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記工程（１）、（２）、（２−１）及び（２−２）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程がＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で実施されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記工程（１）、（２）、（２−１）及び（２−２）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程がＷｎｔシグナル伝達経路作用物質の存在下で実施されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記工程（１）、（２）、（２−１）及び（２−２）からなる群より選ばれるいずれか一つ以上の工程における浮遊培養が、さらにＮｏｔｃｈシグナル阻害剤の存在下でおこなわれることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記工程（１）、（２）、（２−１）及び（２−２）からなる群より選ばれるいずれか一つ以上の工程における浮遊培養が、さらにデキサメタゾンの存在下でおこなわれることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１１】
下記工程（１）〜（３）を含む、下垂体組織の製造方法；
（１）多能性幹細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）第一工程で得られた凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程、
（３）第二工程で得られた細胞塊から下垂体組織を回収する第三工程。
【請求項１２】
下記工程（１）、（２−１）、（２−２）及び（３）を含む、下垂体組織の製造方法；
（１）多能性幹細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２−１）第一工程で得られた凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養する第二工程（１）、
（２−２）第二工程（１）で浮遊培養された凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第２工程（２）、
（３）第二工程（２）で得られた細胞塊から下垂体組織を回収する第三工程。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の製造方法により得られる下垂体組織。
【請求項１４】
１）神経系細胞又は神経組織、２）下垂体組織及び３）間葉系細胞を含む細胞塊。
【請求項１５】
１）神経系細胞又は神経組織、２）下垂体組織及び４）神経提細胞並びに神経提由来細胞を含む細胞塊。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により製造される細胞塊又は請求項１１又は１２に記載の方法により製造される下垂体組織を含む、下垂体の障害に基づく疾患の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下垂体組織を含む細胞塊の製造方法及びその細胞塊に関するものである。さらに、細胞塊中に神経系細胞又は神経組織と、下垂体組織と、間葉系細胞とを含む細胞塊に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
下垂体は頭部に存在する内分泌器官であり、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、成長ホルモンといった生体の維持、成長に重要な各種の下垂体ホルモンを産生する。下垂体の形成不全や下垂体機能低下症、下垂体腺腫等の疾患により下垂体の機能不全が生じた場合、成長障害、生殖器関連の異常、副腎や甲状腺の異常に類する重篤な症状が生じる。一般に、障害を受けた下垂体組織が自然に再生し機能を回復することは稀である。
特許文献１及び非特許文献１、２には、ヒト多能性幹細胞をBMPシグナル伝達経路阻害因子乃至作用因子、ソニック・ヘッジホッグ（本明細書において、Shhと記載することがある）シグナル伝達経路作用因子、及びTGF-βシグナル伝達経路阻害剤存在下で分化誘導することにより、下垂体細胞を含む頭部プラコード由来細胞を製造したことが報告されている。しかしながら、製造された細胞は二次元的に培養されたものであり、機能の発揮に重要な生体の複雑な下垂体組織の構造を再現するには至っていない。そのため、効率よく立体的な下垂体組織を製造できる方法が切望されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開2016-538856号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Dincer et al. Cell Reports 5, 1387-1402, 2013.
【非特許文献２】Zimmer et al. Stem Cell Reports 6, 858-872, 2016
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、多能性幹細胞から下垂体組織を含む細胞塊を効率よく製造する手法を提供することである。特に、下垂体組織幹細胞を組織中に含有する高品質な下垂体組織を含む細胞塊を効率よく製造する手法を提供することである。具体的には、フィーダーフリー培養された多能性幹細胞を出発材料とすることができ、高価な組み換えタンパク質の使用量を低減してより安価に製造することで、効率よく製造する手法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決すべく検討を重ねたところ、多能性幹細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、BMPシグナル伝達経路作用物質とソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加することにより下垂体組織を含む細胞塊を効率よく製造できることを見出した。さらに、前記Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養する前に、多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、１）TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに２）未分化維持因子を含む培地で培養することにより細胞塊の製造効率を改善できることを見出した。加えて、BMPシグナル伝達経路作用物質の添加条件を最適化し、浮遊培養開始から72時間以内という最適な添加時期を同定することにより、従来よりも低濃度のBMP4による下垂体組織の分化誘導に成功した。すなわち、本発明は以下に関する。【０００７】
［１］下記工程（１）及び（２）を含む、下垂体組織を含む細胞塊の製造方法；
（１）多能性幹細胞をＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）第一工程で得られた凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程。
［２］下記工程（ａ）、（１）及び（２）を含む、下垂体組織を含む細胞塊の製造方法；
（ａ）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに２）未分化維持因子を含む培地で培養するａ工程、
（１）ａ工程で培養された多能性幹細胞をＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）第一工程で得られた凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含有する細胞塊を得る第二工程。
［３］下記工程（１）、（２−１）及び（２−２）を含む、下垂体組織を含む細胞塊の製造方法；
（１）多能性幹細胞をＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２−１）第一工程で得られた凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養する第二工程（１）、
（２−２）第二工程（１）で浮遊培養された凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程（２）。
［４］下記工程（ａ）、（１）、（２−１）及び（２−２）を含む、下垂体組織を含む細胞塊の製造方法；
（ａ）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに２）未分化維持因子を含む培地で培養するａ工程、
（１）ａ工程で培養された多能性幹細胞をＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２−１）第一工程で得られた凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養する第二工程（１）、
（２−２）第二工程（１）で得られた凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程（２）。
［５］前記工程（２）又は工程（２−１）におけるＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が、前記工程（１）における多能性幹細胞の浮遊培養開始時から０．５時間以降、７２時間以内に添加されることを特徴とする［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］前記工程（２）又は工程（２−１）におけるＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が、前記工程（１）で形成された凝集体の表層の細胞の１割以上が密着結合を形成している期間内に添加されることを特徴とする［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［７］前記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７及びＧＤＦ７からなる群から選ばれる少なくとも１種のタンパク質である、［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］前記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が、ＢＭＰ４である、［１］〜［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］前記工程（２）又は工程（２−１）における浮遊培養が、前記ＢＭＰ４の濃度が１０ｐＭ〜５ｎＭである培地でおこなわれることを特徴とする、［８］に記載の製造方法。
［１０］前記工程（２−２）におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の添加が、前記工程（２−１）におけるＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の添加から12時間以降、２０日以内に実施されることを特徴とする［３］〜［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質が非古典的Ｗｎｔ経路に対する阻害活性を有することを特徴とする、［１］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質がＰＯＲＣＮ阻害剤であることを特徴とする、［１］〜［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］前記ＰＯＲＣＮ阻害剤がＩＷＰ−２、ＩＷＰ−３、ＩＷＰ−４、ＩＷＰ−Ｌ６、ＩＷＰ−１２、ＬＧＫ−９７４、Ｗｎｔ−Ｃ５９、ＥＴＣ−１５９及びＧＮＦ−６２３１からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物であることを特徴とする、［１２］に記載の製造方法。
［１４］前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質がＫＹ−０２１１１又はＫＹ−０３−Ｉであることを特徴とする［１］〜［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１５］前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質がＴＡＮＫ阻害剤であることを特徴とする［１］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１６］前記ＴＡＮＫ阻害剤がＩＷＲ１−ｅｎｄｏ、ＸＡＶ９３９及びＭＮ−６４からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物であることを特徴とする［１５］に記載の製造方法。
［１７］前記工程（１）、（２）、（２−１）及び（２−２）における浮遊培養が、さらにＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質の存在下で行われることを特徴とする［１］〜［１６］のいずれかに記載の製造方法。
［１８］前記ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質がＡｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤であることを特徴とする、［１７］に記載の製造方法。
［１９］前記Ａｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤がＳＢ４３１５４２、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ５２５３３４、ＬＹ２１５７２９９、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ−２０８、ＥＷ−７１９７、Ａ  ８３−０１及びＲｅｐＳｏｘからなる群から選ばれる少なくも１種の化合物であることを特徴とする、［１８］に記載の製造方法。
［２０］前記ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質がＳＭＡＤ３阻害剤であることを特徴とする、［１７］に記載の製造方法。
［２１］前記ＳＭＡＤ３阻害剤がＳＩＳ３であることを特徴とする、［２０］に記載の製造方法。
［２２］ソニック・ヘッジホッグシグナルシグナル伝達経路作用物質がＳＡＧ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ及びＧＳＡ−１０からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物であることを特徴とする、［１］〜［２１］のいずれかに記載の製造方法。
［２３］前記工程（ａ）における培地に含まれるソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度が、１０ｎＭから７００ｎＭのＳＡＧに相当するソニック・ヘッジホッグシグナル伝達促進活性を有する濃度であることを特徴とする、［２２］に記載の製造方法。
［２４］前記工程（２）又は工程（２−１）における培地に含まれるソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度が、１００ｎＭから３μＭのＳＡＧに相当するソニック・ヘッジホッグシグナル伝達促進活性を有する濃度であることを特徴とする、［２２］又は［２３］に記載の製造方法。
［２５］前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、Ｉ型ＢＭＰ受容体阻害剤を含む、［３］〜［２４］のいずれかに記載の製造方法。
［２６］前記Ｉ型ＢＭＰ受容体阻害剤は、Ｋ０２２８８、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＬＤＮ−１９３１８９、ＬＤＮ−２１２８５４、ＬＤＮ−２１４１１７、ＭＬ３４７、ＤＭＨ１及びＤＭＨ２からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［２５］に記載の製造方法。
［２７］前記Ｉ型ＢＭＰ受容体阻害剤はＫ０２２８８を含み、前記Ｋ０２２８８の濃度が１０ｎＭ〜５０μＭである培地中で前記工程（２−２）を開始する、［２５］又は［２６］に記載の製造方法。
［２８］前記工程（１）、（２）、（２−１）及び（２−２）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程がＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で実施されることを特徴とする、［１］〜［２７］のいずれかに記載の製造方法。
［２９］前記工程（２−２）がＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で実施されることを特徴とする、［３］〜［２７］のいずれかに記載の製造方法。
［３０］前記ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質は、ＦＧＦ２及びＦＧＦ８、並びに、これらの改変体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［２８］又は［２９］に記載の製造方法。
［３１］前記工程（１）、（２）、（２−１）及び（２−２）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程がＷｎｔシグナル伝達経路作用物質の存在下で実施されることを特徴とする、［１］〜［３０］のいずれかに記載の製造方法。
［３２］前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質が前記工程（１）において添加されるＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の作用点よりも下流のシグナル伝達因子に作用することを特徴とする、［３１］に記載の製造方法。
［３３］前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質が古典的Ｗｎｔ経路を活性化させる物質であることを特徴とする、［３１］又は［３２］に記載の製造方法。
［３４］前記古典的Ｗｎｔ経路を活性化させる物質がβカテニンの分解の阻害、安定化を促進する作用を有することを特徴とする、［３１］〜［３３］のいずれかに記載の製造方法。
［３５］前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質がＧＳＫ３阻害剤であることを特徴とする、［３１］〜［３４］のいずれかに記載の製造方法。
［３６］前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質がＰＯＲＣＮ阻害剤であり、前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質がＧＳＫ３阻害剤であることを特徴とする、［３１］〜［３５］のいずれかに記載の製造方法。
［３７］前記ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＴＷＳ１１９、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＢＩＯ、ＡＺＤ２８５８、ＡＺＤ１０８０、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＴＤＺＤ−８、ＬＹ２０９０３１４、ＩＭ−１２、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ、Ｂｉｋｉｎｉｎ、Ａ  １０７０７２２、３Ｆ８、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、１０Ｚ−Ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ、ＮＳＣ  ６９３８６８、ＴＣ−Ｇ  ２４、ＴＣＳ  ２００２、ＴＣＳ  ２１３１１、ＣＰ２１Ｒ７及びこれら化合物の誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［３１］〜［３６］のいずれかに記載の製造方法。
［３８］前記ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１を含み、前記工程（１）、（２）、（２−１）および（２−２）からなる群より選ばれる少なくとも１つの工程に添加される前記ＣＨＩＲ９９０２１の濃度が１０ｎＭ〜５０μＭである、［３１］〜［３７］のいずれかに記載の製造方法。
［３９］前記Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質がＢＭＬ−２８４、ＳＫＬ２００１からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［３１］〜［３４］のいずれかに記載の製造方法。
［４０］前記工程（１）で実施される浮遊培養が、無血清培地を用いた浮遊培養であることを特徴とする、［１］〜［３９］のいずれかに記載の製造方法。
［４１］前記無血清培地が、血清代替物を含有することを特徴とする、［４０］に記載の製造方法。
［４２］前記工程（１）で実施される浮遊培養が、分散処理された多能性幹細胞を用いておこなわれることを特徴とする、［１］〜［４１］のいずれかに記載の製造方法。
［４３］前記工程（１）で実施される浮遊培養が、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で実施されることを特徴とする、［１］〜［４２］のいずれかに記載の製造方法。
［４４］前記工程（１）で添加されるＲＯＣＫ阻害剤の濃度が、１ｎＭから１ｍＭのＹ−２７６３２に相当する細胞保護能を有する濃度であることを特徴とする、［４３］に記載の製造方法。
［４５］前記工程（１）、（２）、（２−１）及び（２−２）からなる群より選ばれるいずれか一つ以上の工程における浮遊培養が、さらにＮｏｔｃｈシグナル阻害剤の存在下でおこなわれることを特徴とする、［１］〜［４４］のいずれかに記載の製造方法。
［４６］前記Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤がγセクレターゼ阻害剤である、［４５］に記載の製造方法。
［４７］前記γセクレターゼ阻害剤がＤＡＰＴである、［４６］に記載の製造方法。
［４８］前記工程（１）、（２）、（２−１）及び（２−２）からなる群より選ばれるいずれか一つ以上の工程における浮遊培養が、さらにデキサメタゾンの存在下でおこなわれることを特徴とする、［１］〜［４７］のいずれかに記載の製造方法。
［４９］前記多能性幹細胞が、霊長類多能性幹細胞であることを特徴とする、［１］〜［４８］のいずれかに記載の製造方法。
［５０］前記霊長類多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞であることを特徴とする、［４９］に記載の製造方法。
［５１］［１］〜［５０］のいずれかに記載の製造方法により得られる下垂体組織を含む細胞塊。
［５２］下記工程（１）〜（３）を含む、下垂体組織の製造方法；
（１）多能性幹細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）第一工程で得られた凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程、
（３）第二工程で得られた細胞塊から下垂体組織を回収する第三工程。
［５３］下記工程（１）、（２−１）、（２−２）及び（３）を含む、下垂体組織の製造方法；
（１）多能性幹細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２−１）第一工程で得られた凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養する第二工程（１）、
（２−２）第二工程（１）で浮遊培養された凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程（２）、
（３）第二工程（２）で得られた細胞塊から下垂体組織を回収する第三工程。
［５４］［５２］又は［５３］に記載の製造方法により得られる下垂体組織。
［５５］１）神経系細胞又は神経組織、２）下垂体組織及び３）間葉系細胞を含む細胞塊。
［５６］前記３）間葉系細胞が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｃａｄｈｅｒｉｎ−１１、Ｌａｍｉｎｉｎ、ＣＤ４４、ＣＤ９０及びＣＤ１０５からなる群から選ばれる少なくとも１種の間葉系細胞マーカーを発現することを特徴とする、［５５］に記載の細胞塊。
［５７］１）神経系細胞又は神経組織、２）下垂体組織及び４）神経提細胞又は神経提由来細胞を含む細胞塊。
［５８］前記４）神経提細胞が、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｓｏｘ１０、Ｓｌｕｇ、Ｓｎａｉｌ、Ｐａｘ３、Ｚｉｃ１、ＦｏｘＤ３、ｐ７５  ＮＴＲ、ＨＮＫ−１、ＣＨＤ７、Ｎｕｍｂ、Ａｓｃｌ１からなる群から選ばれる少なくとも１種の神経提細胞マーカーを発現することを特徴とする、［５７］に記載の細胞塊。
［５９］表面が非神経上皮組織で覆われ、非神経上皮組織の少なくも一部に２）下垂体組織が形成されていることを特徴とする［５５］〜［５８］いずれかに記載の細胞塊。
［６０］前記非神経上皮組織が、サイトケラチン、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＥｐＣＡＭからなる群から選ばれる少なくとも１種の非神経上皮組織マーカーを発現することを特徴とする、［５９］に記載の細胞塊。
［６１］前記非神経上皮組織が、１）神経系細胞又は神経組織及び３）間葉系細胞の少なくとも一方を被覆していることを特徴とする、［５５］又は［５６］に記載の細胞塊。
［６２］前記非神経上皮組織が、１）神経系細胞又は神経組織及び４）神経提細胞又は神経提由来細胞の少なくとも一方を被覆していることを特徴とする、［５７］又は［５８］に記載の細胞塊。
［６３］前記３）間葉系細胞が、細胞塊の表面を被覆している非神経上皮組織と、細胞塊の内側に存在する１）神経系細胞又は神経組織との間に存在することを特徴とする、［６１］に記載の細胞塊。
［６４］前記４）神経提細胞又は神経提由来細胞が、細胞塊の表面を被覆している非神経上皮組織と、細胞塊の内側に存在する１）神経系細胞又は神経組織との間に存在することを特徴とする、［６２］に記載の細胞塊。
［６５］前記非神経上皮組織が、口腔上皮またはその前駆組織であることを特徴とする［５９］〜［６４］のいずれかに記載の細胞塊。
［６６］前記２）下垂体組織が、下垂体ホルモン産生細胞を含むことを特徴とする、［５５］〜［６５］のいずれかに記載の細胞塊。
［６７］前記下垂体ホルモン産生細胞が、成長ホルモン（ＧＨ）産生細胞、プロラクチン（ＰＲＬ）産生細胞及び副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）産生細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、［６６］に記載の細胞塊。
［６８］前記下垂体組織が、下垂体組織幹細胞を含むことを特徴とする、［５５］〜［６７］のいずれか一項に記載の細胞塊。
［６９］前記下垂体組織幹細胞が、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ９、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｓ１００β、ＧＦＲα２、Ｐｒｏｐ１、ＣＤ１３３、β−Ｃａｔｅｎｉｎ、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４、Ｐａｘ６、コクサッキーウイルス・アデノウイルス共通受容体（ＣＸＡＤＲ）、ＰＲＲＸ１／２、Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２及びＡＣＥからなる群から選ばれる少なくとも１種の下垂体組織幹細胞マーカーを発現することを特徴とする、［６８］に記載の細胞塊。
［７０］前記下垂体組織幹細胞が下垂体ニッチを形成していることを特徴とする、請求項［６８］又は［６９］に記載の細胞塊。
［７１］前記１）神経系細胞又は神経組織が、腹側間脳・視床下部の細胞又は組織であることを特徴とする、［５５］〜［７０］いずれかに記載の細胞塊。
［７２］前記１）神経系細胞又は神経組織が、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性の神経上皮組織であることを特徴とする、［７１］に記載の細胞塊。
［７３］前記神経上皮組織の内部に脳室様の空胞が形成され、該空胞に接している神経上皮組織の面がＰＫＣ−ｚｅｔａ陽性の頂端面であることを特徴とする、［７２］に記載の細胞塊。
［７４］［１］〜［５０］のいずれか一項に記載の方法により製造される細胞塊又は請求項５２に記載の方法により製造される下垂体組織と、被験物質とを接触させる工程と、該被験物質が細胞塊又は下垂体組織に及ぼす影響を検定する工程とを含む、被験物質の毒性・薬効評価方法。
［７５］［１］〜［５０］のいずれか一項に記載の方法により製造される細胞塊又は［５２］に記載の方法により製造される下垂体組織を含む、被験物質の毒性・薬効評価用試薬。
［７６］［５２］に記載の方法により製造される下垂体組織の有効量を、移植を必要とする対象に移植する工程を含む、下垂体の障害に基づく非ヒト動物の疾患の治療方法。
［７７］［１］〜［５０］のいずれか一項に記載の方法により製造される細胞塊又は［５２］に記載の方法により製造される下垂体組織を含む、下垂体の障害に基づく疾患の治療薬。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、多能性幹細胞から下垂体組織を含む細胞塊を効率よく製造することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−１】図１−１上段は、実施例１において、ヒトES細胞から下垂体組織を含む細胞塊を作成する際の手順を模式的に示した図である。下段Ａ及びＢは実施例１において浮遊培養開始２８日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。下段Ｃ〜Ｋは、実施例１において浮遊培養開始２８日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｃ〜Ｅは、Lhx3、Nkx2.1とその核染色像をそれぞれ示す。Ｆ〜Ｈは、Lhx3、Nkx2.1とその核染色像をそれぞれ示す。Ｉ〜Ｋは、aPKC、Lamininとその核染色像をそれぞれ示す。
【図１−２】図１−２のＬ〜Ｘは、実施例１において浮遊培養開始後２８日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｌ〜Ｎは、Sox3、EpCAMとその核染色像をそれぞれ示す。Ｏ〜Ｑは、Tbx3、βIIIチューブリン(βIII Tub)とその核染色像をそれぞれ示す。Ｓ〜Ｕは、Emx2、Nestinとその核染色像をそれぞれ示す。Ｖ〜Ｘは、Pitx1、汎サイトケラチン（Pan-CK）とその核染色像をそれぞれ示す。下段Ｙは培養２８日目の下垂体組織を含む細胞塊の構造を模式的に表した図である。
【図２】図２上段は、実施例２において、ヒトES細胞から下垂体組織を含む細胞塊を作成する際の手順を模式的に示した図である。下段Ａ、Ｂは実施例２において浮遊培養開始７０日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。下段Ｃ〜Ｊは、浮遊培養開始７０日後あるいは８４日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。ＣとＤは、ACTHとその核染色像をそれぞれ示す。Ｅ〜Ｇは、プロラクチン（PRL）、汎サイトケラチン（PanCK）とその核染色像をそれぞれ示す。Ｈ〜Ｊは、成長ホルモン（GH）、汎サイトケラチン（PanCK）とその核染色像をそれぞれ示す。
【図３】図３上段は、参考例１において、ヒトES細胞から下垂体組織を含む細胞塊をBMP4の添加時期を変えて作成する際の手順を模式的に示した図である。下段Ａ〜Ｄは参考例１において浮遊培養開始１０日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。ＡはBMP4を添加しないコントロールの細胞の、Ｂ〜Ｄはそれぞれ浮遊培養を開始して１、２、３日目にBMP4を添加した細胞から形成される浮遊培養開始１０日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。
【図４】図４上段は、実施例３において、ヒトES細胞から細胞凝集体を調製する際の手順を模式的に示した図である。下段Ａ及びＢは、それぞれ、実施例３において浮遊培養開始２及び３日後の細胞凝集体の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。下段Ｃ〜Ｈは、浮遊培養開始２日後あるいは３日後の細胞凝集体における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｃは浮遊培養開始２日後、Ｆは浮遊培養開始３日後の細胞凝集体のZO-1の染色像である。Ｄは浮遊培養開始２日後、Ｇは浮遊培養開始３日後の細胞凝集体のSox2の染色像である。ＥはＣとＤに対する、ＨはＦとＧに対する核の対比染色像である。
【図５】図５上段は、実施例４において、ヒトES細胞から下垂体組織を含む細胞塊をSAGの添加濃度を変えて作成する際の手順を模式的に示した図である。下段Ａ〜Ｈは実施例４において浮遊培養開始２８日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。ＡはSAGを添加しないコントロールの細胞の、Ｂ〜Ｈはそれぞれ浮遊培養開始２日目に100、300、500、700nM、1、2、5μMのSAGを添加した細胞から形成される浮遊培養開始２８日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。
【図６】図６上段は、実施例５において、ヒトES細胞から下垂体組織を含む細胞塊の製造における浮遊培養開始前の化合物による前処理の効果を調べる手順を模式的に示した図である。下段Ａ〜Ｄは実施例５において浮遊培養開始２８日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。Ａは化合物による前処理を実施しなかった細胞塊、Ｂは300nM SAGで前処理を実施した細胞塊、Ｃは5μM SB431542で前処理を実施した細胞塊、ＤはSAGとSB431542を同時に添加して前処理を実施した細胞塊である。
【図７】図７上段は、実施例６において、ヒトES細胞から下垂体組織を含む細胞塊の製造における各Wntシグナル伝達経路阻害物質の効果を調べる手順を模式的に示した図である。下段Ａ〜Ｈは実施例６において浮遊培養開始２８日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。ＡはWntシグナル伝達経路阻害物質とSB431542を添加しないコントロール、ＢはSB431542を加え、Wntシグナル伝達経路阻害物質を添加しない条件、Ｃ〜Ｈはそれぞれ浮遊培養開始時にWntシグナル伝達経路阻害物質をその種類を変えて添加しさらに浮遊培養を行って浮遊培養開始後２８日目の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。
【図８】図８上段は、実施例７において、ヒトES細胞から下垂体組織を含む細胞塊をBMP4の添加濃度を変えて作成する際の手順を模式的に示した図である。下段Ａ〜Ｄは実施例７において浮遊培養開始２８日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。ＡはBMP4を添加しないコントロールの、Ｂ〜Ｄはそれぞれ浮遊培養開始後２日目に濃度を変えて（0.5nM、1.5nM、5nM）BMP4を添加しさらに浮遊培養を行って浮遊培養開始後２８日目の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。
【図９】図９上段は、実施例８において、ヒトES細胞から下垂体組織を含む細胞塊の製造における各TGFβシグナル伝達経路阻害物質の効果を調べる手順を模式的に示した図である。下段Ａ〜Ｇは実施例８において浮遊培養開始２８日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。ＡはTGFβシグナル伝達経路阻害物質とIWP-2を添加しないコントロール、ＢはIWP-2を加え、TGFβシグナル伝達経路阻害物質を添加しない条件、Ｃ〜Ｇはそれぞれ浮遊培養開始時にTGFβシグナル伝達経路阻害物質をその種類と濃度を変えて添加しさらに浮遊培養を行って浮遊培養開始後２８日目の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。
【図１０】図１０上段は、実施例９において、ヒトiPS細胞から下垂体組織を含む細胞塊を作成する際の手順を模式的に示した図である。下段Ａ及びＢは実施例９において浮遊培養開始２８日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。下段Ｃ〜Ｒは、浮遊培養開始２８日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｃ〜Ｆは、Lhx3、Nkx2.1、EpCAMの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｇ〜Ｊは、Six1、Pitx2、汎サイトケラチン（PanCK）の染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｋ〜Ｎは、Bf1、Sox2、E-Cadherinの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｏ〜Ｒは、Nestin、βIIIチューブリン（βIII Tub）、Vimentinの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。
【図１１】図１１上段は、実施例１０において、ヒトiPS細胞から神経組織及び非神経上皮組織を含む細胞塊を作成する際の手順を模式的に示した図である。下段Ａ〜Ｄは実施例１０において浮遊培養開始１３日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。下段Ｅ〜Ｐは、浮遊培養開始１３日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｅ〜ＧおよびＫ〜Ｍは、Dlx5、N-Cadherinの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｈ〜ＪおよびＮ〜Ｐは、Six1、E-Cadherinの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。
【図１２】図１２Ｑ〜ＡＢは、図１１に引き続き実施例１０において、浮遊培養開始１３日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｑ〜ＳおよびＷ〜Ｙは、Dlx5、N-Cadherinの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｔ〜ＶおよびＺ〜ＡＢは、Six1、E-Cadherinの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。
【図１３】図１３上段は、実施例１１において、ヒトiPS細胞から下垂体組織を含む細胞塊を作成する際の手順を模式的に示した図である。下段Ａは実施例１１において浮遊培養開始２８日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。下段Ｂ〜Ｉは、浮遊培養開始２８日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｂ〜ＥおよびＦ〜Ｉは、Lhx3、Nkx2.1、E-Cadherinの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。
【図１４】図１４Ｊ〜Ｖは、図１３に引き続き実施例１１において、浮遊培養開始２８日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｊ〜Ｍは、Nestin、Pitx2、Sox2の染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｎ〜Ｐは、Six1、Vimentinの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｑ〜Ｓは、Rx、N-Cadherinの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｔ〜Ｖは、Tbx3、汎サイトケラチンの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。
【図１５】図１５上段は、実施例１２において、ヒトiPS細胞から下垂体組織を含む細胞塊を作成する際の手順を模式的に示した図である。下段Ａ〜Ｄは実施例１２において浮遊培養開始２８日後の細胞塊の倒立顕微鏡の明視野観察像を示す図である。下段Ｅ〜Ｌは、浮遊培養開始２８日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｅ〜ＨおよびＩ〜Ｌは、Lhx3、Nkx2.1、E-Cadherinの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。
【図１６】図１６Ｍ〜Ｙは、図１５に引き続き実施例１２において、浮遊培養開始２８日後の細胞塊における各細胞マーカーの発現状況を蛍光免疫染色により調べた結果を示す図である。Ｍ〜Ｐは、Nestin、Pitx2、Sox2の染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｑ〜Ｓは、Six1、Vimentinの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｔ〜Ｖは、Rx、N-Cadherinの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。Ｗ〜Ｙは、Tbx3、汎サイトケラチンの染色像とその核染色像をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．定義
本発明において、「幹細胞」とは、分化能及び分化能を維持した増殖能（特に自己複製能）を有する未分化な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（pluripotent stem cell）、複能性幹細胞（multipotent stem cell）、単能性幹細胞（unipotent stem cell）等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成するすべての細胞（三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）由来の組織）に分化しうる能力（分化多能性（pluripotency））を有する幹細胞をいう。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。
【００１１】
多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ES細胞：Embryonic stem cell）、EG細胞(Embryonic germ cell)、人工多能性幹細胞（iPS細胞：induced pluripotent stem cell）等を挙げることができる。間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell；MSC）から得られるMuse細胞（Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell）や、生殖細胞（例えば精巣）から作製されたGS細胞も多能性幹細胞に包含される。胚性幹細胞は、1981年に初めて樹立され、1989年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。1998年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。ES細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はLIFを含む培地中で培養することにより製造することが出来る。ES細胞の製造方法は、例えば、WO96／22362、WO02／101057、US5，843，780、US6，200，806、US6，280，718等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるKhES−1、KhES−2及びKhES−3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。いずれもマウス胚性幹細胞である、EB5細胞は国立研究開発法人理化学研究所より、D3株はATCCより、入手可能である。ES細胞の一つである核移植ES細胞（ntES細胞）は、細胞株を取り除いた卵子に体細胞の細胞核を移植して作ったクローン胚から樹立することができる。
【００１２】
EG細胞は、始原生殖細胞をmSCF、LIF及びbFGFを含む培地中で培養することにより製造することができる(Cell, 70: 841-847, 1992)。
【００１３】
本発明における「人工多能性幹細胞」とは、体細胞を、公知の方法等により初期化（reprogramming）することにより、多能性を誘導した細胞である。具体的には、線維芽細胞や末梢血単核球等分化した体細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、Myc（c-Myc、N-Myc、L-Myc）、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組み合わせのいずれかの発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。2006年、山中らによりマウス細胞で人工多能性幹細胞が樹立された（Cell, 2006, 126(4)pp.663-676）。人工多能性幹細胞は、2007年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（Cell, 2007, 131(5) pp.861-872；Science, 2007, 318(5858) pp.1917-1920；Nat. Biotechnol., 2008, 26(1) pp.101-106）。人工多能性幹細胞として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加などにより体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる（Science, 2013, 341 pp. 651-654）。
【００１４】
人工多能性幹細胞を製造する際に用いられる体細胞としては、特に限定は無いが、組織由来の線維芽細胞、血球系細胞（例えば、末梢血単核球やT細胞）、肝細胞、膵臓細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞、等が挙げられる。
【００１５】
人工多能性幹細胞を製造する際に、数種類の遺伝子（例、Oct3/4、Sox2、Klf4、及びMycの4因子）の発現により初期化する場合、遺伝子を発現させるための手段は特に限定されない。前記手段としては、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター）を用いた感染法、プラスミドベクター（例えば、プラスミドベクター、エピソーマルベクター）を用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロネクチン法、エレクトロポレーション法）、RNAベクターを用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法）、タンパク質の直接注入法、等が挙げられる。
【００１６】
本発明に用いられる多能性幹細胞は、好ましくはＥＳ細胞又は人工多能性幹細胞である。
【００１７】
複能性幹細胞としては、造血幹細胞、神経幹細胞、網膜幹細胞、下垂体幹細胞、間葉系幹細胞等の組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞又は体性幹細胞とも呼ばれる）を挙げることができる。
【００１８】
遺伝子改変された多能性幹細胞は、例えば、相同組換え技術を用いることにより作製できる。改変される染色体上の遺伝子としては、例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。染色体上の 標的遺伝子の改変は、Manipulating the Mouse Embryo,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)；Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)；バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）；等に記載の方法を用いて行うことができる。
【００１９】
具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）のゲノム遺伝子を単離し、単離されたゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製されたターゲットベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子が改変された幹細胞を作製することができる。
【００２０】
標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)やCurrent Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987-1997)等に記載された公知の方法があげられる。ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム(Genome Systems製)やUniversal GenomeWalker Kits(CLONTECH製)などを用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することもできる。
【００２１】
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)；バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）；等に記載の方法にしたがって行うことができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型又はインサーション型のいずれでも用いることができる。選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、又はポリＡ選択などの方法を用いることができる。 
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等があげられる。
【００２２】
本発明における「哺乳動物」には、げっ歯類、有蹄類、ネコ目、霊長類等が包含される。げっ歯類には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等が包含される。有蹄類には、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等が包含される。ネコ目には、イヌ、ネコ等が包含される。本発明における「霊長類」とは、霊長目に属するほ乳類動物をいい、霊長類としては、キツネザルやロリス、ツバイなどの原猿亜目と、サル、類人猿、ヒトなどの真猿亜目が挙げられる。
【００２３】
本発明に用いる多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞であり、好ましくはげっ歯類（例、マウス、ラット）又は霊長類（例、ヒト、サル）の多能性幹細胞であり、最も好ましくはヒト多能性幹細胞である。
【００２４】
本発明において、「シグナル伝達」とは、細胞膜等に存在する受容体タンパク質が化学物質などと結合して構造変化を起こし、それを刺激として順次細胞内に伝達して、最終的に遺伝子発現やチャネルの開口などの反応をもたらす過程や機構といった、細胞が有する生化学的刺激に対する、情報の伝達、増幅、処理、応答機構を表す。本発明において、「シグナル伝達の下流」であるとは、一連のシグナル伝達に関わる因子の中で、ある因子に対して時間的、因果的に後の過程でリン酸化等の生化学的な変化を受ける相対的な関係性を表す。例えば、一連のシグナル伝達のメカニズム中で因子Aが因子Bをリン酸化することにより以降のシグナル伝達が生じるのであれば、因子Bは因子Aの下流のシグナル伝達因子である。
【００２５】
本発明において、「細胞接着（Cell adhesion）」とは、細胞と細胞同士の接着、及び細胞と細胞外マトリックスとの接着を言う。インビトロの人工培養環境下で生じる、細胞の培養器材等への接着も細胞接着に含有される。細胞接着の種類として、固定結合（anchoring junction）、連絡結合（communicating junction）、閉鎖結合（occluding junction）が挙げられる。
【００２６】
本発明において、「密着結合（Tight junction）」とは、細胞間の接着のうち、脊椎動物と脊索動物で見られる閉鎖結合のことを表す。密着結合は上皮細胞間に形成される。生体由来の組織中並びに本発明の製造方法等で作成された細胞塊中に密着結合が存在しているかどうかは、例えば密着接合の構成成分に対する抗体（抗クローディン抗体、抗ZO-1抗体等）を用いた免疫組織化学等の手法により検出することが出来る。
【００２７】
本発明における「浮遊培養」あるいは「浮遊培養法」とは、細胞、細胞凝集体又は細胞塊が培養液に浮遊して存在する状態を維持しつつ培養すること、及び当該培養を行う方法を言う。すなわち浮遊培養は、細胞、細胞凝集体又は細胞塊を培養器材等に接着させない条件で行われ、培養器材等に接着させる条件でおこなわれる培養（接着培養、あるいは、接着培養法）は、浮遊培養の範疇に含まれない。この場合、細胞が接着するとは、細胞、細胞凝集体又は細胞塊と培養器材の間に、細胞接着の一種である強固な細胞−基質間結合（cell-substratum junction）ができることをいう。より詳細には、浮遊培養とは、細胞、細胞凝集体又は細胞塊と培養器材等との間に強固な細胞−基質間結合を作らせない条件での培養をいい、接着培養とは、細胞、細胞凝集体又は細胞塊と培養器材等との間に強固な細胞−基質間結合を作らせる条件での培養をいう。
浮遊培養中の細胞凝集体あるいは細胞塊においては、細胞と細胞が面接着する。浮遊培養中の細胞凝集体あるいは細胞塊では、細胞−基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。一部の態様では、浮遊培養中の細胞凝集体又は細胞塊では、内在の細胞−基質間結合が凝集体あるいは細胞塊の内部に存在するが、細胞−基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。
細胞と細胞が面接着(plane attachment）するとは、細胞と細胞が面で接着することをいう。より詳細には、細胞と細胞が面接着するとは、ある細胞の表面積のうち別の細胞の表面と接着している割合が、例えば、１％以上、好ましくは３％以上、より好ましくは５％以上であることをいう。細胞の表面は、膜を染色する試薬（例えばDiI）による染色や、細胞接着因子（例えば、E-cadherinやN-cadherin）の免疫組織化学等の手法により検出できる。
【００２８】
浮遊培養を行う際に用いられる培養器は、「浮遊培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、スピナーフラスコ又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、基底膜標品、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等によるコーティング処理、又は、正電荷処理等の表面加工）されていないものなどを使用できる。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を低下させる目的で人工的に処理（例えば、MPCポリマー等の超親水性処理、タンパク低吸着処理等）されたものなどを使用できる。スピナーフラスコやローラーボトル等を用いて回転培養してもよい。培養器の培養面は、平底でもよいし、凹凸があってもよい。
【００２９】
本発明において細胞の培養に用いられる培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ−１２培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。
多能性幹細胞の培養には、上記基礎培地をベースとした多能性幹細胞培養用の培地、好ましく公知の胚性幹細胞及び／又は人工多能性幹細胞用の培地や、フィーダーフリー下で多能性幹細胞を培養するための培地を用いることができる。例えばEssential 8培地や、TeSR培地、mTeSR培地、mTeSR-E8培地、StemFit培地等のフィーダーフリー培地を挙げることができる。
【００３０】
本発明における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。
【００３１】
無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、KnockoutTMSerum Replacement （Life Technologies社製：以下、ＫＳＲと記すこともある。）、Chemically-defined Lipid concentrated（Life Technologies社製）、GlutamaxTM（Life Technologies社製）、B27（Life Technologies社製）、N2（Life Technologies社製）が挙げられる。
【００３２】
浮遊培養で用いる無血清培地は、適宜、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
【００３３】
調製の煩雑さを回避するために、かかる無血清培地として、市販のＫＳＲ（ライフテクノロジー（Life Technologies）社製）を適量（例えば、約０．５％から約３０％、好ましくは約１％から約２０％）添加した無血清培地（例えば、Ｆ−１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に1 × chemically−defined Lipid concentrated、５％ＫＳＲ及び４５０μＭ１−モノチオグリセロールを添加した培地）を使用してもよい。また、ＫＳＲ同等品として特表２００１−５０８３０２に開示された培地が挙げられる。
【００３４】
本発明における「血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含む培地を意味する。当該培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、１−モノチオグリセロール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。例えば、マトリゲル等の基底膜標品を使用して多能性幹細胞を網膜組織等に分化誘導する場合には、血清培地を用いることができる（Cell Stem Cell, 10(6), 771-775 (2012)）。
【００３５】
本発明における培養は、好ましくはゼノフリー条件でおこなわれる。「ゼノフリー」とは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物種由来の成分が排除された条件を意味する。
【００３６】
本発明に用いる培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、好ましくは、含有成分が化学的に決定された培地（Chemically defined medium; CDM）である。
【００３７】
本発明における「基底膜（Basement membrane）」様の構造とは、細胞外マトリックスより構成される薄い膜状の構造を意味する。基底膜は生体においては、上皮細胞の基底側（basal）に形成される。基底膜の成分としては、IV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカン）、エンタクチン／ニドゲン、サイトカイン、成長因子等が挙げられる。生体由来の組織中並びに本発明の製造方法等で作製された細胞塊中に基底膜が存在しているかどうかは、例えばPAM染色等の組織染色、並びに基底膜の構成成分に対する抗体（抗ラミニン抗体、抗IV型コラーゲン抗体等）を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。
【００３８】
本発明における「基底膜標品」とは、その上に基底膜形成能を有する所望の細胞を播種して培養した場合に、上皮細胞様の細胞形態、分化、増殖、運動、機能発現などを制御する機能を有する基底膜構成成分を含むものをいう。例えば、本発明により製造された細胞・組織を分散させ、更に接着培養を行う際には、基底膜標品存在下で培養することができる。ここで、「基底膜構成成分」とは、動物の組織において、上皮細胞層と間質細胞層などとの間に存在する薄い膜状をした細胞外マトリクス分子をいう。基底膜標品は、例えば基底膜を介して支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、該細胞の脂質溶解能を有する溶液やアルカリ溶液などを用いて支持体から除去することで作製することができる。基底膜標品としては、基底膜調製物として市販されている商品（例えば、ＭａｔｒｉｇｅｌTM（ベクトン・ディッキンソン社製：以下、マトリゲルと記すこともある））やGeltrexTM（Life Technologies社製）、基底膜成分として公知の細胞外マトリックス分子（例えば、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなど）を含むものが挙げられる。
【００３９】
本発明において、Engelbreth-Holm-Swarm （EHS）マウス肉腫等の組織乃至細胞から抽出、可溶化されたマトリゲル（Corning社製）等の基底膜標品を細胞並びに組織の培養に用いることができる。同様に細胞培養に用いる基底膜成分として、ヒト可溶化羊膜（生物資源応用研究所社製）、HEK293細胞に産生させたヒト組み換えラミニン（BioLamina社製）、ヒト組み換えラミニン断片（ニッピ社製）、ヒト組み換えビトロネクチン（Thermo Fisher社製）等も用いることができるが、異なる生物種由来の成分混入を回避する観点、及び感染症のリスクを回避する観点から、好ましくは、成分の明らかな組み換えタンパク質である。
【００４０】
本発明において、「物質Ｘを含む培地」及び「物質Ｘの存在下」とは、それぞれ外来性（exogenous）の物質Ｘが添加された培地または外来性の物質Ｘを含む培地及び外来性の物質Ｘの存在下を意味する。外来性の物質Ｘは、例えば培地中に存在する細胞または組織が当該物質Ｘを内在的（endogenous）に発現、分泌もしくは産生する内在的な物質Ｘと区別される。
例えば、「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地」とは、外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が添加された培地または外来性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地を意味する。
【００４１】
本発明において、「フィーダー細胞」とは、幹細胞を培養するときに共存させる当該幹細胞以外の細胞のことである。多能性幹細胞の未分化維持培養に用いられるフィーダー細胞としては、例えば、マウス線維芽細胞（MEF）、ヒト線維芽細胞、又は、SNL細胞等が挙げられる。フィーダー細胞としては、増殖抑制処理したフィーダー細胞が好ましい。増殖抑制処理としては、増殖抑制剤（例えば、マイトマイシンC）処理又はUV照射等が挙げられる。多能性幹細胞の未分化維持培養に用いられるフィーダー細胞は、液性因子（好ましくは未分化維持因子）の分泌や、細胞接着用の足場（細胞外基質）の作成により、多能性幹細胞の未分化維持に貢献する。
【００４２】
本発明において、細胞の「凝集体」（Aggregate）とは、培地中に分散していた細胞が集合して形成された塊であって、細胞同士が接着している塊をいう。細胞塊、胚様体（Embryoid body）、スフェア（Sphere）、スフェロイド（Spheroid）、オルガノイド（Organoid）も細胞の凝集体に包含される。好ましくは、細胞の凝集体において、細胞同士が面接着している。一部の態様において、凝集体の一部分あるいは全部において、細胞同士が細胞−細胞間結合（cell-cell junction）及び／又は細胞接着（cell adhesion）、例えば接着結合(adherence junction)、を形成している場合がある。本発明における「凝集体」として具体的には、下記「２．下垂体組織を含む細胞塊の製造方法」における、第一工程で生成する、浮遊培養開始時に分散していた細胞が形成する凝集体が挙げられる。
本発明において、「均一な凝集体」とは、複数の凝集体を培養する際に各凝集体の大きさが一定であることを意味し、凝集体の大きさを最大径の長さで評価する場合、均一な凝集体とは、最大径の長さの分散が小さいことを意味する。より具体的には、凝集体の集団全体のうちの75％以上の凝集体が、当該凝集塊の集団における最大径の平均値±100%、好ましくは平均値±50％の範囲内、より好ましくは平均値±20％の範囲内であることを意味する。
【００４３】
本発明において、「均一な凝集体を形成させる」とは、細胞を集合させて細胞の凝集体を形成させ浮遊培養する際に、一定数の分散した細胞を迅速に凝集させることで大きさが均一な細胞の凝集体を形成させることをいう。
「分散させる」とは、細胞や組織を酵素処理や物理処理等の分散処理により、小さな細胞片（２細胞以上１００細胞以下、好ましくは５０細胞以下）又は単一細胞まで分離させることをいう。一定数の分散した細胞とは、細胞片又は単一細胞を一定数集めたもののことをいう。
多能性幹細胞を分散させる方法としては、例えば、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理が挙げられる。これらの処理を組み合わせて行ってもよい。好ましくは、細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。
機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。
細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、DNase又はパパイン等の酵素類や、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤のいずれかを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えば、Accumax（Innovative cell technologies社製）やTrypLE Select (Life Technologies社製)を用いることもできる。
細胞保護剤添加処理に用いられる細胞保護剤としては、FGFシグナル伝達経路作用物質、ヘパリン、ROCK阻害物質、血清、又は血清代替物を挙げることができる。好ましい細胞保護剤としては、ROCK阻害物質が挙げられる。
例えば、多能性幹細胞を分散させる方法として、多能性幹細胞のコロニーを、細胞保護剤としてROCK阻害物質の存在下、細胞分散液（Accumax）で処理し、さらにピペッティングにより分散させる方法が挙げられる。
【００４４】
本発明の製造方法においては、多能性幹細胞を迅速に集合させて多能性幹細胞の凝集体を形成させることが好ましい。このように多能性幹細胞の凝集体を形成させると、形成された凝集体から分化誘導される細胞において上皮様構造を再現性よく形成させることができる。凝集体を形成させる実験的な操作としては、例えば、ウェルの小さなプレート（例えば、ウェルの底面積が平底換算で0.1〜2.0 cm2程度のプレート）やマイクロポアなどを用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することで細胞を凝集させる方法が挙げられる。ウェルの小さなプレートとして、例えば２４ウェルプレート（面積が平底換算で1.88 cm2程度）、４８ウェルプレート（面積が平底換算で1.0 cm2程度）、９６ウェルプレート（面積が平底換算で0.35 cm2程度、内径6〜8mm程度）、３８４ウェルプレートが挙げられる。好ましくは、９６ウェルプレートが挙げられる。ウェルの小さなプレートの形状として、ウェルを上から見たときの底面の形状としては、多角形、長方形、楕円、真円が挙げられ、好ましくは真円が挙げられる。ウェルの小さなプレートの形状として、ウェルを横から見たときの底面の形状としては、外周部が高く内凹部が低くくぼんだ構造が好ましく、例えば、U底、V底、M底が挙げられ、好ましくはU底またはV底、最も好ましくはV底が挙げられる。ウェルの小さなプレートとして、細胞培養皿（例えば、６０ｍｍ〜１５０ｍｍディッシュ、カルチャーフラスコ）の底面に凹凸、又は、くぼみがあるものを用いてもよい。ウェルの小さなプレートの底面は、細胞非接着性の底面、好ましくは前記細胞非接着性コートした底面を用いるのが好ましい。
多能性幹細胞の凝集体が形成されたことや、凝集体を形成する各細胞において上皮様構造が形成されたことは、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき判断することが可能である。
【００４５】
本発明における「組織」とは、形態や性質が異なる複数種類の細胞が一定のパターンで立体的に配置した構造を有する細胞集団の構造体をさす。
【００４６】
本発明において、「神経組織」とは、発生期又は成体期の大脳、中脳、間脳、小脳、脊髄、網膜、末梢神経等の、神経系細胞によって構成される組織を意味する。神経組織は、層構造をもつ上皮構造（神経上皮）を形成することがあり、神経組織中の神経上皮は光学顕微鏡を用いた明視野観察により存在量を評価することができる。
【００４７】
本発明において、「間脳」とは、第三脳室に接した中枢神経系の神経組織をさす。間脳には、視床上部、視床、視床下部、下垂体といった組織が含まれる。
【００４８】
本発明において、「視床下部」とは、下垂体に接した間脳の一領域を指す。視床下部はさらに背側視床下部及び腹側視床下部に領域化される。視床下部はRx、Vax1、Six3といったマーカーを用いて同定することが出来る。背側視床下部はOtp、Brn2、バゾプレシンといったマーカーを用いて同定することが出来る。腹側視床下部はNkx2.1、SF1といったマーカーを用いて同定することが出来る。
【００４９】
本発明において、「脳室」とは、中枢神経組織によって形成された腔所をさす。生体においては通常脳脊髄液等の組織液で満たされている無細胞性の構造であり、神経組織の頂端面側が脳室に面している。脳室を取り巻く脳室周囲層は神経幹細胞が存在し、発生期に細胞の増殖とニューロン産生が生じる領域である。本発明の製造方法で製造される細胞塊並びに組織中に脳室が含まれるかどうかは、例えば中枢神経組織マーカー（Bf1、Pax6等）及び頂端面マーカー（PKC-zeta等）を用いた免疫組織化学等の手法により検出することが出来る。
【００５０】
本発明において、「神経系細胞（Neural cell）」とは、外胚葉由来組織のうち表皮系細胞以外の細胞を表す。すなわち、神経系前駆細胞、ニューロン（神経細胞）、グリア細胞、神経幹細胞、ニューロン前駆細胞及びグリア前駆細胞等の細胞を含む。神経系細胞には、下述する網膜組織を構成する細胞（網膜細胞）、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞、神経網膜細胞、網膜色素上皮細胞も包含される。神経系細胞は、Nestin、TuJ1、PSA-NCAM、N-cadherin等をマーカーとして同定することができる。
ニューロンは、神経回路を形成し情報伝達に貢献する機能的な細胞であり、TuJ1、Dcx、HuC/D等の幼若神経細胞マーカー、及び／又は、Map2、NeuN等の成熟神経細胞マーカーの発現を指標に同定することができる。
グリア細胞（glial cell）としては、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミュラーグリア等が挙げられる。アストロサイトのマーカーとしてはGFAP、オリゴデンドロサイトのマーカーとしてはo4、ミュラーグリアのマーカーとしてはCRALBP等が挙げられる。
神経幹細胞とは、神経細胞及びグリア細胞への分化能（多分化能）と、多分化能を維持した増殖能（自己複製能ということもある）を持つ細胞である。神経幹細胞のマーカーとしてはNestin、 Sox2、Musashi、Hesファミリー、CD133等が挙げられるが、これらのマーカーは前駆細胞全般のマーカーであり神経幹細胞特異的なマーカーとは考えられていない。神経幹細胞の数は、ニューロスフェアアッセイやクローナルアッセイ等により評価することができる。
ニューロン前駆細胞とは、増殖能をもち、神経細胞を産生し、グリア細胞を産生しない細胞である。ニューロン前駆細胞のマーカーとしては、Tbr2、Tα１等が挙げられる。あるいは、幼若神経細胞マーカー（TuJ1, Dcx, HuC/D）陽性かつ増殖マーカー（Ki67, pH3, MCM）陽性の細胞を、ニューロン前駆細胞として同定することもできる。 
グリア前駆細胞とは、増殖能をもち、グリア細胞を産生し、神経細胞を産生しない細胞である。
神経系前駆細胞（Neural Precursor cell）は、神経幹細胞、ニューロン前駆細胞及びグリア前駆細胞を含む前駆細胞の集合体であり、増殖能とニューロン及びグリア細胞産生能をもつ。神経系前駆細胞はNestin, GLAST, Sox2，Sox1, Musashi, Pax6等をマーカーとして同定することができる。あるいは、神経系細胞のマーカー陽性かつ増殖マーカー（Ki67, pH3, MCM）陽性の細胞を、神経系前駆細胞として同定することもできる。
【００５１】
本発明において、「非神経上皮組織」とは、上皮構造を有する組織のうち神経上皮組織以外の組織を表す。上皮組織は外胚葉、中胚葉、内胚葉、栄養外胚葉のいずれの胚葉からも形成される。上皮組織には上皮、中皮、内皮が含まれる。非神経上皮組織に含まれる組織の例としては、表皮、角膜上皮、鼻腔上皮、口腔上皮、気管上皮、気管支上皮、気道上皮、腎上皮、腎皮質上皮、胎盤上皮等が挙げられる。
上皮組織は通常種々の細胞間結合によりつながれており、単層または重層化した層構造を有する組織を形成する。これら上皮組織の有無の確認、存在量の定量は光学顕微鏡による観察か、上皮細胞マーカーに対する抗体（抗E-Cadherin抗体、抗N-Cadherin抗体、抗EpCAM抗体等）を用いた免疫組織化学等の手法により可能である。
【００５２】
本発明において、「上皮細胞極性（Epithelial polarity）」とは上皮細胞内に空間的に形成されている構成成分および細胞機能の分布の偏りを表す。例えば、角膜上皮細胞は眼球の最も外層に局在し、頂端側（apical）では涙液を保持するための膜結合型ムチン（MUC-1、4、16）等の頂端側特異的なタンパク質を発現し、基底側（basal）では基底膜に接着するためのα6インテグリン、β1インテグリン等の基底側特異的なタンパク質を発現している。
生体由来の組織中並びに本発明の製造方法等で作製された細胞塊中の上皮細胞並びに上皮組織に上皮細胞極性が存在しているかどうかは、Phalloidin、頂端側マーカー（抗MUC-1抗体、抗PKC-zeta抗体等）並びに基底側マーカー（抗α6インテグリン抗体、抗β１インテグリン抗体等）を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。
【００５３】
本発明において、「プラコード（placode）」とは、主に脊椎動物の発生過程において表皮外胚葉の一部が肥厚して形成される器官の原基のことを表す。プラコードに由来する組織としては、水晶体、鼻、内耳、三叉神経、腺性下垂体等が挙げられる。プラコード、またはその前駆組織である前プラコード領域（preplacode region）のマーカーとしては、Six1、Six4、Dlx5、Eya2、Emx2、Bf1等が挙げられる。
【００５４】
本発明において、「下垂体プラコード」とは、胚発生の過程で表皮外胚葉の領域に形成される肥厚した構造であって、下垂体前駆細胞マーカーを発現するものをいう。下垂体前駆細胞マーカーとしては、Lim3、Pitx1/2、Islet1/2等を挙げることができる。下垂体プラコードは、Lim3、Pitx1及びIslet1/2からなる群から選択される少なくとも1つ、好ましくは全ての下垂体前駆細胞マーカーを発現する。下垂体プラコードが陥入し、発生途中の袋状の構造であるラトケ嚢（Rathke's pouch）を形成し、さらに発生が進むと腺性下垂体を形成する。
【００５５】
本発明において、「腺性下垂体」とは、少なくとも1種の前葉又は中葉の下垂体細胞を含む組織をいう。下垂体細胞には、生理機能を調節するホルモンを産生する下垂体ホルモン産生細胞と、非ホルモン産生細胞が含まれる。下垂体ホルモン産生細胞としては、成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞、甲状腺刺激ホルモン（TSH）産生細胞、卵胞刺激ホルモン（FSH）産生細胞、黄体化ホルモン（LH）産生細胞等の前葉を構成する細胞；メラニン細胞刺激ホルモン（MSH）産生細胞等の中葉を構成する細胞が挙げられる。非ホルモン産生細胞としては、血管内皮細胞、周皮細胞、濾胞星状細胞、下垂体幹細胞、下垂体前駆細胞が含まれる。
【００５６】
一態様において、腺性下垂体は、成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞、及び副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞からなる群から選択される少なくとも1種、好ましくは2種、より好ましくは3種の下垂体ホルモン産生細胞を含む。更なる態様において、腺性下垂体は、成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞、甲状腺刺激ホルモン（TSH）産生細胞、卵胞刺激ホルモン（FSH）産生細胞、及び黄体化ホルモン（LH）産生細胞からなる群から選択される少なくとも1種、好ましくは2種以上（2、3、4、5又は6種）の下垂体ホルモン産生細胞を含む。生体由来の組織中並びに本発明の製造方法等で作成された細胞塊中に腺性下垂体および下垂体ホルモン産生細胞が含まれているかどうかは、成長ホルモン（GH）産生細胞マーカー（抗Pit1抗体、抗GH抗体等）、プロラクチン（PRL）産生細胞マーカー（抗Pit1抗体、抗PRL抗体等）、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞マーカー（抗T-Pit抗体、抗NeuroD1抗体、抗ACTH抗体等）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）産生細胞マーカー（抗GATA2抗体、抗ACTH抗体等）、卵胞刺激ホルモン（FSH）産生細胞、及び黄体化ホルモン（LH）産生細胞マーカー（抗GATA2抗体、抗SF1抗体、抗FSH抗体、抗LH抗体等）を用いた免疫組織化学および分泌されたホルモンに対するELISA等の手法により検出することが出来る。
【００５７】
本発明において「下垂体幹細胞」とは、下垂体に存在し、下垂体組織の再生や下垂体ホルモン産生細胞の供給に寄与する未分化な複能性幹細胞、前駆細胞のことをいう。本発明の製造方法で製造される細胞塊並びに組織中に下垂体幹細胞が含まれているかどうかは、例えばSox2、Sox9、E-Cadherin、Nestin、S100β、GFRα2、Prop1、CD133、β-Catenin、Klf4、Oct4、Pax6、コクサッキーウイルス・アデノウイルス共通受容体（CXADR）、PRRX1/2、Ephrin-B2、ACE、YAP１、TAZといった下垂体幹細胞マーカー及びKi67、リン酸化ヒストンH3、MCMといった細胞増殖マーカーに対する抗体を用いた免疫組織化学、BrdU、EdU、IdU等の核酸アナログを用いた増殖細胞標識アッセイ、蛍光標識ジペプチド（β-alanyl-lysyl-N-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid）の取り込みアッセイ、下垂体スフェア（pitusphere）形成アッセイ等の手法により、検出することができる。
【００５８】
本発明において、「ニッチ」、もしくは「幹細胞ニッチ」とは幹細胞の増殖、分化、性質の維持等に関わる微小環境をいう。生体におけるニッチの例としては、造血幹細胞ニッチ、毛包幹細胞ニッチ、腸管上皮幹細胞ニッチ、筋幹細胞ニッチ、下垂体ニッチなどが挙げられる。これらのニッチにおいては、それぞれの組織特有の幹細胞とニッチを提供する支持細胞とが存在し、支持細胞が提供するサイトカイン、ケモカイン、細胞外マトリックス、細胞接着因子、細胞間シグナル伝達因子等により幹細胞が維持されている。
【００５９】
本発明において、「下垂体ニッチ」とは、下垂体幹細胞の増殖、分化、性質の維持等に関わる微小環境をいう。下垂体ニッチとしては、発生期の袋状のラトケ嚢の中空部の痕跡として下垂体前葉と中葉の間に残る遺残腔（ラトケ裂溝）周辺に存在するMaginal Cell Layer (MCL)ニッチ、および下垂体前葉に散在する実質層(Parenchymal)ニッチが挙げられる。
【００６０】
本発明において「神経提」とは、脊椎動物の初期発生において表皮外胚葉と神経板の間に形成される構造を表し、「神経提細胞又は神経提由来細胞」は神経提に存在する細胞乃至神経堤に由来し遊走、分化した細胞を表す。神経提由来細胞として例えば、末梢神経系の神経細胞、支持細胞、色素細胞、内分泌細胞、平滑筋、頭部骨格細胞、間葉系細胞等が挙げられる。本発明の製造方法で製造される細胞塊及び組織中に神経提細胞及び神経提由来細胞が含まれるかどうかは、Nestin、Sox10、Sox9、Slug、Snail、Twist、FoxD3、TFAP2、Pax3、Pax7、HNK-1、p75NTRといった神経提細胞マーカーに対する抗体を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。
【００６１】
本発明において「間葉系細胞」とは、主に中胚葉並びに神経堤に由来し、結合組織を形成する非上皮性の細胞である。これらの細胞のうちの一部は、間葉系幹細胞と呼ばれる複能性を有した体性幹細胞である。本発明の製造方法で製造される細胞塊並びに組織中に間葉系細胞が含まれるかどうかは、Nestin、Vimentin、Cadherin-11、Laminin、CD44といった間葉系細胞マーカーに対する抗体を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。間葉系幹細胞が含まれるかどうかは、CD9、CD13、CD29、CD44、CD55、CD59、CD73、CD105、CD140b、CD166、VCAM-1、STRO-1、c-Kit、Sca-1、Nucleostemin、CDCP1、BMPR2、BMPR1A及びBPMR1Bといった間葉系幹細胞マーカーに対する抗体を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。
【００６２】
２．下垂体組織を含む細胞塊の製造方法
本発明は、下垂体組織を含む細胞塊及びその製造方法を提供する。以下、本発明の製造方法とも称する。
本発明の製造方法の一態様は、下記工程（１）及び（２）を含む、下垂体組織を含む細胞塊の製造方法である。
（１）多能性幹細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）第一工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程。
【００６３】
本発明の製造方法の好ましい一態様は、下記工程（ａ）、（１）及び（２）を含む下垂体組織を含む細胞塊の製造方法である。
（ａ）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、１）TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに２）未分化維持因子を含む培地で培養するａ工程、
（１）ａ工程で培養された細胞をWntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）第一工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質とソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含有する細胞塊を得る第二工程。
【００６４】
本発明の製造方法のより好ましい一態様は、下記工程（１）、（２−１）及び（２−２）を含む、下垂体組織を含む細胞塊の製造方法である。
（１）多能性幹細胞をＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２−１）第一工程で得られた凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養する第二工程（１）、
（２−２）第二工程（１）で浮遊培養された凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程（２）。
【００６５】
本発明の製造方法のさらなる一態様は、下記工程（ａ）、（１）、（２−１）及び（２−２）を含む、下垂体組織を含む細胞塊の製造方法である。
（ａ）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに２）未分化維持因子を含む培地で培養するａ工程、
（１）ａ工程で培養された細胞をＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２−１）第一工程で得られた凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養する第二工程（１）、
（２−２）第二工程で浮遊培養された凝集体を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の存在下に浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程（２）。
【００６６】
＜工程（ａ）＞
多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、１）TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに２）未分化維持因子を含む培地で培養するa工程について説明する。
工程（ａ）において、多能性幹細胞をTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質で処理してから、第一工程において浮遊培養に付すことにより、多能性幹細胞の状態が変わり、非神経上皮組織の形成効率が改善し、凝集体の質が向上し、分化しやすく、細胞死が生じにくく、凝集体の内部が密な未分化性を維持した細胞凝集体を高効率で製造することができる。
【００６７】
工程（ａ）は、フィーダー細胞非存在下で実施することが好ましい。
本発明におけるフィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）とは、フィーダー細胞を実質的に含まない（例えば、全細胞数に対するフィーダー細胞数の割合が3%以下）条件を意味する。
【００６８】
工程（ａ）において用いられる培地は、フィーダーフリー条件下で、多能性幹細胞の未分化維持培養を可能にする培地（フィーダーフリー培地）であれば、特に限定されない。例えば、未分化維持因子を含み、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含む培地が挙げられる。
【００６９】
工程（ａ）において用いられる培地は、未分化維持培養を可能にするため、未分化維持因子を含む。未分化維持因子は、多能性幹細胞の分化を抑制する作用を有する物質であれば特に限定はない。当業者に汎用されている未分化維持因子としては、プライムド多能性幹細胞（Primed pluripotent stem cells）（例えば、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞）の場合、FGFシグナル伝達経路作用物質、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質、insulin等を挙げることができる。FGFシグナル伝達経路作用物質として具体的には、線維芽細胞増殖因子（例えば、bFGF、FGF4やFGF8）が挙げられる。また、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質としては、TGFβシグナル伝達経路作用物質、Nodal/Activinシグナル伝達経路作用物質が挙げられる。TGFβシグナル伝達経路作用物質としては、例えばTGFβ1、TGFβ2が挙げられる。Nodal/Activinシグナル伝達経路作用物質としては、例えばNodal、ActivinA、ActivinBが挙げられる。ヒト多能性幹細胞（ヒトES細胞、ヒトiPS細胞）を培養する場合、工程（ａ）における培地は、好ましくは未分化維持因子として、bFGFを含む。
【００７０】
本発明に用いる未分化維持因子は、通常哺乳動物の未分化維持因子である。哺乳動物としては、上記のものを挙げることができる。未分化維持因子は、哺乳動物の種間で交差反応性を有し得るので、培養対象の多能性幹細胞の未分化状態を維持可能な限り、いずれの哺乳動物の未分化維持因子を用いてもよいが、好適には培養する細胞と同一種の哺乳動物の未分化維持因子が用いられる。例えば、ヒト多能性幹細胞の培養には、ヒト未分化維持因子（例、bFGF、FGF4、FGF8、EGF、Nodal、ActivinA、ActivinB、TGFβ1、TGFβ2等）が用いられる。ここで「ヒトタンパク質X」とは、タンパク質X（未分化維持因子等）が、ヒト生体内で天然に発現するタンパク質Xのアミノ酸配列を有することを意味する。
【００７１】
本発明に用いる未分化維持因子は、好ましくは単離されている。
「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。従って、「単離されたタンパク質X」には、培養対象の細胞や組織から産生され細胞や組織及び培地中に含まれている内在性のタンパク質Xは包含されない。「単離されたタンパク質X」の純度（総タンパク質重量に占めるタンパク質Xの重量の百分率）は、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上、最も好ましくは100％である。
本発明は、一態様において、単離された未分化維持因子を提供する工程を含む。また、一態様において、工程（ａ）に用いる培地中へ、単離された未分化維持因子を外来的（又は外因的）に添加する工程を含む。あるいは、工程（ａ）に用いる培地に予め未分化維持因子が添加されていてもよい。
【００７２】
工程（ａ）において用いられる培地中の未分化維持因子濃度は、培養する多能性幹細胞の未分化状態を維持可能な濃度であり、当業者であれば、適宜設定することができる。例えば、未分化維持因子として、フィーダー細胞非存在下でbFGFを用いる場合、その濃度は、通常約4ng/mL〜約500ng/mL、好ましくは約10ng/mL〜約200ng/mL、より好ましくは約30ng/mL〜約150ng/mLである。
【００７３】
フィーダーフリー培地として、多くの合成培地が開発・市販されており、例えばEssential 8培地が挙げられる。Essential 8培地は、DMEM/F12培地に、添加剤として、L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium (64 mg/l), sodium selenium(14 μg/1), insulin(19.4mg /l), NaHCO3(543 mg/l), transferrin (10.7 mg/l), bFGF (100 ng/mL)、及び、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質（TGFβ1(2 ng/mL) またはNodal (100 ng/mL)）を含む（Nature Methods, 8, 424-429 (2011)）。市販のフィーダーフリー培地としては、例えば、Essential 8（Life Technologies社製）、S-medium（DSファーマバイオメディカル社製）、StemPro(Life Technologies社製)、hESF9、mTeSR1 (STEMCELL Technologies社製)、mTeSR2 (STEMCELL Technologies社製)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies社製)が挙げられる。またこの他に、フィーダーフリー培地としては、StemFit（味の素社製）が挙げられる。上記工程（ａ）ではこれらを用いることにより、簡便に本発明を実施することができる。StemFit培地は、Scientific Reports (2014), 4, 3594.に記載の通り、未分化維持成分としてbFGFを含有する。
【００７４】
工程（ａ）において用いられる培地は、血清培地であっても無血清培地であってもよいが、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、好ましくは、無血清培地である。
【００７５】
工程（ａ）において用いられる培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、好ましくは、含有成分が化学的に決定された培地である。
【００７６】
工程（ａ）における多能性幹細胞の培養は、浮遊培養及び接着培養のいずれの条件でおこなわれてもよいが、好ましくは、接着培養によりおこなわれる。
【００７７】
工程（ａ）におけるフィーダーフリー条件での多能性幹細胞の培養においては、培地として前記フィーダーフリー培地を用いるとよい。
工程（ａ）におけるフィーダーフリー条件での多能性幹細胞の培養においては、フィーダー細胞に代わる足場を多能性幹細胞に提供するため、適切なマトリクスを足場として用いてもよい。足場であるマトリクスにより、表面をコーティングした細胞容器中で、多能性幹細胞を接着培養する。
【００７８】
足場として用いることのできるマトリクスとしては、ラミニン（Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)）、ラミニン断片(Nat Commun 3, 1236 (2012))、基底膜標品 (Nat Biotechnol 19, 971-974 (2001))、ゼラチン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、ビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）等が挙げられる。
【００７９】
「ラミニン」とは、α、β、γ鎖からなるヘテロ三量体分子であり、サブユニット鎖の組成が異なるアイソフォームが存在する細胞外マトリックスタンパク質である。具体的には、ラミニンは、５種のα鎖、４種のβ鎖および３種のγ鎖のヘテロ三量体の組合せで約１５種類のアイソフォームを有する。α鎖（α１〜α５）、β鎖（β１〜β４）およびγ鎖（γ１〜γ４）のそれぞれの数字を組み合わせて、ラミニンの名称が定められている。例えばα５鎖、β１鎖、γ１鎖の組合せによるラミニンをラミニン５１１という。本発明においては、好ましくはラミニン５１１が用いられる（Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)）。
【００８０】
本発明で用いるラミニン断片は、多能性幹細胞への接着性を有しており、フィーダーフリー条件での多能性幹細胞の維持培養を可能とするものであれば特に限定されないが、好ましくは、Ｅ８フラグメントである。ラミニンＥ８フラグメントは、ラミニン５１１をエラスターゼで消化して得られたフラグメントの中で、強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである（EMBO J., 3:1463-1468, 1984、J. Cell Biol., 105:589-598, 1987）。本発明においては、好ましくはラミニン５１１のＥ８フラグメントが用いられる（Nat Commun 3, 1236 (2012)、Scientific Reports 4, 3549 (2014)）。本発明に用いられるラミニンＥ８フラグメントは、ラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく、組換え体であってもよい。あるいは、遺伝子組み換え動物（カイコ等）に産生させたものであってもよい。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、本発明においては、好ましくは、組換え体のラミニン断片が用いられる。ラミニン５１１のＥ８フラグメントは市販されており、例えばニッピ株式会社等から購入可能である。
【００８１】
化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、本発明において用いられるラミニン又はラミニン断片は、好ましくは単離されている。
【００８２】
好ましくは、工程（ａ）におけるフィーダーフリー条件での多能性幹細胞の培養においては、単離されたラミニン５１１又はラミニン５１１のＥ８フラグメント（最も好ましくは、ラミニン５１１のＥ８フラグメント）により、表面をコーティングした細胞容器中で、ヒト多能性幹細胞を接着培養する。
【００８３】
工程（ａ）における多能性幹細胞の培養時間は、続く工程（１）において形成される凝集体の質を向上させる効果が達成可能な範囲で特に限定されないが、通常０．５〜１４４時間、好ましくは２〜９６時間、より好ましくは６〜４８時間、更に好ましくは１２〜４８時間、より更に好ましくは１８〜２８時間（例、２４時間）である。即ち、工程（１）開始の０．５〜１４４時間（好ましくは、１８〜２８時間）前に工程（ａ）を開始し、工程（ａ）を完了した後引き続き工程（１）がおこなわれる。
【００８４】
工程（ａ）における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃である。またＣＯ２濃度は、例えば約１％から約１０％、好ましくは約５％である。
【００８５】
好ましい一態様において、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、bFGFを含有する無血清培地中で、接着培養する。当該接着培養は、好ましくは、ラミニン５１１、ラミニン５１１のＥ８フラグメント又はビトロネクチンで表面をコーティングした細胞容器中で実施される。当該接着培養は、好ましくは、フィーダーフリー培地としてStemFitを用いて実施される。
【００８６】
好ましい一態様において、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、bFGFを含有する無血清培地中で、浮遊培養する。当該浮遊培養では、ヒト多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞の凝集体を形成してもよい。
【００８７】
ソニック・ヘッジホッグ（Ｓｈｈ）シグナル伝達経路作用物質とは、Shhにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。Shhシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、Hedgehogファミリーに属する蛋白質（例えば、ShhやIhh）、Shh受容体、Shh受容体アゴニスト、Smoアゴニスト、Purmorphamine、GSA-10、Hh-Ag1.5、20(S)-Hydroxycholesterol又はSAG（Smoothened Agonist；N-Methyl-N'-(3-pyridinylbenzyl)-N'-(3-chlorobenzo[b]thiophene-2-carbonyl)-1,4-diaminocyclohexane）等が挙げられる。Shhシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはSAGである。培地中のShhシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。SAGは、工程（ａ）においては通常、約1nM〜約2000nM、好ましくは約10nM〜約1000nM、特に好ましくは約10nMから約700nM、より好ましくは約100nM〜約600nM、更に好ましくは約100nM〜約500nMの濃度で使用される。また、SAG以外のShhシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、前記濃度のSAGと同等のShhシグナル伝達促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。SAG等のShhシグナル伝達促進活性は、当業者に周知の方法、例えばGli1遺伝子の発現に着目したレポータージーンアッセイにて決定することができる（Oncogene (2007) 26, 5163-5168）。例えば、10nMから700nMのSAGに相当するShhシグナル伝達促進活性を有するShhシグナル伝達経路作用物質としては、20nMから2μMのPurmorphamine、20nMから3μMのGSA-10、10nMから1μMのHh-Ag1.5等が挙げられる。
【００８８】
TGFβファミリーシグナル伝達経路（すなわちTGFβスーパーファミリーシグナル伝達経路）とは、TGFβ、Nodal/Activin、又はBMPをリガンドとし、細胞内でSmadファミリーにより伝達されるシグナル伝達経路である。
【００８９】
TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とは、TGFβファミリーシグナル伝達経路、すなわちSmadファミリーにより伝達されるシグナル伝達経路を阻害する物質を表し、具体的にはTGFβシグナル伝達経路阻害物質、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質を挙げることができる。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質としては、TGFβシグナル伝達経路阻害物質が好ましい。
【００９０】
TGFβシグナル伝達経路阻害物質としては、TGFβに起因するシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定は無く、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、TGFβに直接作用する物質（例えば、タンパク質、抗体、アプタマー等）、TGFβをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等）、TGFβ受容体とTGFβの結合を阻害する物質、TGFβ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質（例えば、TGFβ受容体の阻害剤、Smadの阻害剤等）を挙げることができる。TGFβシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質として、Lefty等が挙げられる。
【００９１】
TGFβシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することができる。具体的には、SB431542（本明細書中、SB431と略記する場合がある）、SB505124、SB525334、LY2157299、LY2109761、GW788388、LY364947、SD-208、EW-7197、A 83-01、RepSox等のAlk5/TGFβR1阻害剤、SIS3等のSMAD3阻害剤が挙げられる。ここでSB431542（4-(5-ベンゾール[1,3]ジオキソール-5-イル-4-ピリジン-2-イル-1H-イミダゾール-2-イル)-ベンズアミド）及びA-83-01（3-(6-メチル-2-ピリジニル)-N-フェニル-4-(4-キノリニル)-1H-ピラゾール-1-カルボチオアミド）は、TGFβ受容体(ALK5)及びActivin受容体(ALK4/7)の阻害剤（すなわちTGFβR阻害剤）として公知の化合物である。SIS3は、TGFβ受容体の制御下にある細胞内シグナル伝達因子であるSMAD3のリン酸化を阻害するTGFβシグナル伝達経路阻害物質である。本発明で用いられるTGFβシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはSB431542又はA-83-01である。
培地中のTGFβシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。工程（ａ）におけるTGFβシグナル伝達経路阻害物質としてSB431542を用いる場合は、通常、約1nM〜約100μM、好ましくは約10nM〜約50μM、より好ましくは約100nM〜約50μM、更に好ましくは約1μM〜約10μMの濃度で使用される。また、SB431542以外のTGFβシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、前記濃度のSB431542と同等のTGFβシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
【００９２】
＜工程（１）＞
未分化条件で維持された多能性幹細胞、好ましくは工程（ａ）で得られた多能性幹細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程について説明する。
【００９３】
Ｗｎｔシグナル伝達経路とは、Ｗｎｔファミリー・タンパク質をリガンドとし、主としてＦｒｉｚｚｌｅｄを受容体とするシグナル伝達経路である。当該シグナル経路としては、β−Ｃａｔｅｎｉｎによって伝達される古典的Ｗｎｔ経路（Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ）に加えて、β-カテニン非依存性の非古典的Ｗｎｔ経路（Ｎｏｎ−Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ）等が挙げられる。非古典的Ｗｎｔ経路としては、Ｐｌａｎａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｐｏｌａｒｉｔｙ（ＰＣＰ）経路、Ｗｎｔ／Ｃａｌｃｉｕｍ経路、Ｗｎｔ−ＲＡＰ１経路、Ｗｎｔ−Ｒｏｒ２経路、Ｗｎｔ−ＰＫＡ経路、Ｗｎｔ−ＧＳＫ３ＭＴ経路、Ｗｎｔ−ａＰＫＣ経路、Ｗｎｔ−ＲＹＫ経路、Ｗｎｔ−ｍＴＯＲ経路等が挙げられる。非古典的Ｗｎｔ経路では、Ｗｎｔ以外の他のシグナル伝達経路でも活性化される共通のシグナル伝達因子が存在するが、本発明ではそれらの因子もＷｎｔシグナル伝達経路の構成因子とし、それらの因子に対する阻害物質もＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質に含まれる。
【００９４】
本発明において、Wntシグナル伝達経路阻害物質とはWntファミリー・タンパク質により惹起されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り限定されない。核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、Wnt のプロセシングと細胞外への分泌を阻害する物質、Wntに直接作用する物質（例えば、タンパク質、抗体、アプタマー等）、Wntをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等）、Wnt受容体とWntの結合を阻害する物質、Wnt受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質を挙げることができる。Wntシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質として、secreted Frizzled Related Protein（sFRP）クラスに属するタンパク質（sFRP1から5、Wnt Inhibitory Factor-1（WIF-1）、Cerberus）、 Dickkopf（Dkk）クラスに属するタンパク質（Dkk1から4、Kremen）等が挙げられる。
【００９５】
Wntシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することができる。Wntシグナル伝達経路阻害物質として例えば、Porcupine阻害剤（PORCN阻害剤とも称する）、DKK阻害剤、Frizzled阻害剤、Dvl阻害剤、Tankyrase阻害剤（TANK阻害剤とも称する）、カゼインキナーゼ1阻害剤、カテニン応答性転写阻害剤、p300阻害剤、CBP阻害剤、BCL-9阻害剤（Am J Cancer Res. 2015; 5(8): 2344-2360）等が挙げられる。また、作用機序は報告されていないが、Wntシグナル伝達経路阻害物質としてKY-02111、KY-03-Iが挙げられる。PORCN阻害剤として例えば、IWP-2、IWP-3、IWP-4、IWP-L6、IWP-12、LGK-974、ETC-159、GNF-6231、Wnt-C59などが挙げられる。TANK阻害剤として例えば、IWR1-endo、XAV939、MN-64、WIKI4、TC-E 5001、JW 55、AZ6102などが挙げられる。本発明で用いられるWntシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはPORCN阻害剤、TANK阻害剤またはKY-02111であり、より好ましくはPORCN阻害剤である。本発明で用いられるPORCN阻害剤は、好ましくはIWP-2又はWnt-C59である。本発明で用いられるTANK阻害剤は、好ましくはXAV939である。
本発明で用いられるWntシグナル伝達経路阻害物質は、非古典的Ｗｎｔ経路（Ｎｏｎ−Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ）に対する阻害活性を有することもまた好ましい。非古典的Ｗｎｔ経路に対する阻害活性を有するWntシグナル伝達経路阻害物質としては例えばPORCN阻害剤、抗Frizzled抗体、Box5ペプチド等が挙げられる。Porcupineは古典的Ｗｎｔ経路のリガンドであるWnt１やWnt３a等に加えて、非古典的Ｗｎｔ経路のリガンドであるWnt5aやWnt5b、Wnt11の脂質修飾に関わることが知られており（Dev Biol. 2012 Jan 15;361(2):392-402.、Biochem J. 2007 Mar 15; 402(Pt 3): 515-523.）、PORCN阻害剤は古典的Ｗｎｔ経路と非古典的Ｗｎｔ経路の双方を阻害する。
培地中のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。例えばWntシグナル伝達経路阻害物質としてPORCN阻害剤の１種であるIWP-2を用いる場合は、その濃度は通常約0.01μM〜約30μM、好ましくは約0.1μM〜約30μM、より好ましくは、約2μMである。PORCN阻害剤の１種であるWnt-C59を用いる場合は、その濃度は通常約1pM〜約30μM、好ましくは約100pM〜約30μM、より好ましくは、約1nM〜約1μMである。TANK阻害剤の１種であるXAV939を用いる場合は、その濃度は通常約0.01μM〜約30μM、好ましくは約0.1μM〜約30μM、より好ましくは、約1μMである。KY-02111を用いる場合は、その濃度は通常約0.01μM〜約30μM、好ましくは約0.1μM〜約30μM、より好ましくは、約5μMである。
【００９６】
工程（１）では、Wntシグナル伝達経路阻害物質及びTGFβシグナル伝達経路阻害物質存在下で浮遊培養することが、間葉系細胞を形成させる観点で好ましい。
工程（１）において用いられるTGFβシグナル伝達経路阻害物質としては工程（ａ）で例示したものと同様のものが用いられる。工程（ａ）及び工程（１）のTGFβシグナル伝達経路阻害物質は同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
培地中のTGFβシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。工程（１）においてTGFβシグナル伝達経路阻害物質としてSB431542を用いる場合は、通常、約1nM〜約100μM、好ましくは約10nM〜約50μM、より好ましくは約100nM〜約50μM、更に好ましくは約500nM〜約10μMの濃度で使用される。また、SB431542以外のTGFβシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、前記濃度のSB431542と同等のTGFβシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
【００９７】
工程（１）において用いられる培地は、上記定義の項で記載したようなものである限り特に限定されない。工程（１）において用いられる培地は血清含有培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、本発明においては、無血清培地が好適に用いられる。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、ＩＭＤＭとＦ−１２の１：１の混合液に5％ＫＳＲ、４５０μＭ１−モノチオグリセロール及び１ｘChemically Defined Lipid Concentrateが添加された培地、又は、GMEMに５％〜２０％ＫＳＲ、NEAA、ピルビン酸、２-メルカプトエタノールが添加された培地）を使用することが好ましい。無血清培地へのＫＳＲの添加量としては、例えばヒトＥＳ細胞の場合は、通常約１％から約３０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。
【００９８】
工程（１）における凝集体の形成に際しては、まず、工程（ａ）で得られた多能性幹細胞の分散操作を行うことが好ましい。分散操作により得られた「分散された細胞」とは例えば７割以上が単一細胞であり２〜５０細胞の塊が３割以下存在する状態が挙げられる。
分散された細胞として、好ましくは 、８割以上が単一細胞であり、２〜５０細胞の塊が２割以下存在する状態が挙げられる。分散された細胞とは、細胞同士の接着（例えば面接着）がほとんどなくなった状態があげられる。一部の態様において、分散された細胞とは、細胞―細胞間結合（例えば、接着結合）がほとんどなくなかった状態が挙げられる。
工程（ａ）で得られた多能性幹細胞の分散操作は、前述した、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理を含んでよい。これらの処理を組み合わせて行ってもよい。好ましくは、細胞保護剤添加処理と同時に、細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。
細胞保護剤添加処理に用いられる細胞保護剤としては、FGFシグナル伝達経路作用物質、ヘパリン、ROCK阻害物質、ミオシン阻害物質、血清、又は血清代替物を挙げることができる。好ましい細胞保護剤としては、ROCK阻害物質が挙げられる。分散により誘導される多能性幹細胞（特に、ヒト多能性幹細胞）の細胞死を抑制するために、Rho-associated coiled-coilキナーゼ（ROCK）の阻害物質を第一工程培養開始時から添加してもよい。ROCK阻害物質としては、Y-27632、Fasudil（HA1077）、H-1152、HA-100等を挙げることができる。あるいは、調製済みの細胞保護剤を用いることもできる。調製済みの細胞保護剤としては、例えばRevitaCell Supplement(Thermo Fisher Scientific社製)、CloneR(Stemcell Technologies社製)が挙げられる。
細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、DNase又はパパイン等の酵素類や、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤のいずれかを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えば、TrypLE Select (Thermo Fisher Scientific社製)やTrypLE Express (Thermo Fisher Scientific社製)、Accumax（Innovative Cell Technologies社製）を用いることもできる。
機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。
分散された細胞は上記培地中に懸濁される。
【００９９】
そして、分散された多能性幹細胞の懸濁液を、上記培養器中に播き、分散させた多能性幹細胞を、培養器に対して、非接着性の条件下で培養することにより、複数の細胞を集合させて凝集体を形成する。
【０１００】
この際、分散された多能性幹細胞を、10cmディッシュのような、比較的大きな培養器に播種することにより、1つの培養器中に複数の細胞の凝集体を同時に形成させてもよいが、凝集体ごとの大きさのばらつきを生じにくくする観点で、例えば、９６ウェルマイクロプレートのようなマルチウェルプレート（Ｕ底、Ｖ底）の各ウェルに一定数の分散された多能性幹細胞を入れて、これを静置培養すると、細胞が迅速に凝集することにより、各ウェルにおいて１個の凝集体を形成させることが好ましい。この凝集体を複数のウェルから回収することにより、均一な凝集体の集団を得ることができる。
【０１０１】
工程（１）では、凝集体の調製の煩雑さを回避する観点から、各ウェル内に凝集体が入ったままの状態でプレート全体の培地を一度に交換することが可能な三次元細胞培養容器を用いてもよい。三次元細胞培養容器としては、例えばPrimeSurface96スリットウェルプレート（住友ベークライト社製）等が挙げられる。
【０１０２】
工程（１）における多能性幹細胞の濃度は、細胞の凝集体をより均一に、効率的に形成させるように適宜設定することができる。例えば９６ウェルマイクロウェルプレートを用いてヒト多能性幹細胞（例、工程（ａ）から得られたヒトiPS細胞）を浮遊培養する場合、１ウェルあたり通常約１×１０３から約1×１０５細胞、好ましくは約３×１０３から約５×１０４細胞、より好ましくは約４×１０３から約２×１０４細胞、更に好ましくは約４×１０３から約１．６×１０４細胞、特に好ましくは約８×１０３から約１．２×１０４細胞となるように調製した液をウェルに添加し、プレートを静置して凝集体を形成させる。
【０１０３】
工程（１）における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、例えば約１％から約１０％、好ましくは約５％である。
【０１０４】
工程（１）において、培地交換操作を行う場合、例えば、元ある培地を捨てずに新しい培地を加える操作（培地添加操作）、元ある培地を半量程度（元ある培地の体積量の３０〜９０％程度、例えば４０〜６０％程度）捨てて新しい培地を半量程度（元ある培地の体積量の３０〜９０％、例えば４０〜６０％程度）加える操作（半量培地交換操作）、元ある培地を全量程度（元ある培地の体積量の９０％以上）捨てて新しい培地を全量程度（元ある培地の体積量の９０％以上）加える操作（全量培地交換操作）が挙げられる。
ある時点で、特定の成分（例えば、分化誘導因子）を添加する場合、例えば、終濃度を計算した上で、元ある培地を半量程度捨てて、特定の成分を終濃度よりも高い濃度で含む新しい培地を半量程度加える操作（半量培地交換操作）を行ってもよい。
ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、例えば、培地交換操作を、１日に複数回、好ましくは１時間以内に複数回（例えば２〜３回）行ってもよい。また、ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、細胞または凝集体を別の培養容器に移してもよい。
培地交換操作に用いる道具は特に限定されないが、例えば、ピペッター、ピペットマン、マルチチャンネルピペットマン、連続分注器、などが挙げられる。例えば、培養容器として９６ウェルプレートを用いる場合、マルチチャンネルピペットマンを使ってもよい。
【０１０５】
細胞の凝集体を形成させるために必要な浮遊培養の時間は、細胞を均一に凝集させるように、用いる多能性幹細胞によって適宜決定可能であるが、均一な細胞の凝集体を形成するためにはできる限り短時間であることが望ましい。分散された細胞が、細胞凝集体が形成されるに至るまでの工程は、細胞が集合する工程、及び集合した細胞が細胞凝集体を形成する工程にわけられる。分散された細胞を播種する時点（すなわち浮遊培養開始時）から細胞が集合するまでは、例えば、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）の場合には、好ましくは約２４時間以内、より好ましくは約１２時間以内に集合した細胞を形成させる。分散された細胞を播種する時点（すなわち浮遊培養開始時）から細胞凝集体が形成されるまでの工程では、例えば、ヒト多能性幹細胞（例、iPS細胞）の場合には、好ましくは約７２時間以内、より好ましくは約４８時間以内に凝集体が形成される。この凝集体形成までの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心条件などを調整することにより適宜調節することが可能である。
【０１０６】
細胞の凝集体が形成されたことは、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき判断することが可能である。
【０１０７】
凝集体が形成された後、そのまま、凝集体の培養を継続してもよい。工程（１）における浮遊培養の時間は、通常８時間〜６日間程度、好ましくは１２時間〜４８時間程度である。
【０１０８】
＜工程（２）＞及び＜工程（２−１）＞
工程（１）で得られた細胞凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程、あるいは工程（１）で得られた細胞凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養する第二工程（１）について説明する。
【０１０９】
BMPシグナル伝達経路作用物質とは、BMPにより媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。BMPシグナル伝達経路作用物質としては、例えばBMP2、BMP4もしくはBMP7等のBMPタンパク質、GDF7等のGDFタンパク質、抗BMP受容体抗体、又は、BMP部分ペプチドなどが挙げられる。BMP2タンパク質及びBMP4タンパク質は例えばR＆D Systemsから、BMP7タンパク質はBiolegend社から、GDF7タンパク質は例えば和光純薬から入手可能である。BMPシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはBMP4である。
培地中のBMPシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。BMPシグナル伝達経路作用物質としてBMP4を用いる場合は、通常、約1pM〜約100nM、好ましくは約10pM〜約50nM、より好ましくは約10pM〜約25nM、更に好ましくは約10pM〜約5nMの濃度で使用される。また、BMP4以外のBMPシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、前記濃度のBMP4と同等のBMPシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
【０１１０】
工程（２）又は工程（２−１）において用いられるShhシグナル伝達経路作用物質としては工程（ａ）で例示したものと同様のものが用いられる。工程（ａ）及び工程（２）又は工程（２−１）のShhシグナル伝達経路作用物質は同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
培地中のShhシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。工程（２）又は工程（２−１）においてShhシグナル伝達経路作用物質としてSAGを用いる場合は、通常、約1nM〜約5μM、好ましくは約10nM〜約4.5μM、より好ましくは約50nM〜約4μM、更に好ましくは約100nM〜約3μMの濃度で使用される。
【０１１１】
工程（２）又は工程（２−１）において用いられる培地は、BMPシグナル伝達経路作用物質とShhシグナル伝達経路作用物質を含む限り特に限定されない。工程（２）又は工程（２−１）において用いられる培地は血清含有培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、本発明においては、無血清培地が好適に用いられる。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、ＩＭＤＭとＦ−１２の１：１の混合液に5％ＫＳＲ、４５０μＭ１−モノチオグリセロール及び１ｘChemically Defined Lipid Concentrateが添加された培地、又は、GMEMに５％〜２０％ＫＳＲ、NEAA、ピルビン酸、２-メルカプトエタノールが添加された培地）を使用することが好ましい。無血清培地へのＫＳＲの添加量としては、例えばヒトＥＳ細胞の場合は、通常約１％から約３０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。第二工程において、第一工程で得られた多能性幹細胞の凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質とShhシグナル伝達経路作用物質含む培地（好適には無血清培地）中で浮遊培養に付して細胞塊を形成させることにより、細胞塊の質が向上し、下垂体組織を含む細胞塊を高効率に作成できる。
【０１１２】
工程（２）又は工程（２−１）において、BMPシグナル伝達経路作用物質とShhシグナル伝達経路作用物質の添加時期は、同一であっても良いし、異なっていても良い。好ましくは、同一もしくはBMPシグナル伝達経路作用物質を添加した後に、Shhシグナル伝達経路作用物質を添加する。Shhシグナル伝達経路作用物質の添加時期は、BMPシグナル伝達経路作用物質の添加より１２日以内、好ましくは１０日以内、より好ましくは６日以内である。工程（２−１）に引き続き工程（２−２）を実施する態様の場合には、Shhシグナル伝達経路作用物質の添加は、後述する工程（２−２）の開始と同時に行っても良い。
【０１１３】
＜工程（２−２）＞
工程（２−１）で得られた細胞凝集体を、さらにＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を含む培地中で浮遊培養して、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程（２）について説明する。
【０１１４】
本発明において、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質とはＢＭＰファミリー・タンパク質により惹起されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り限定されない。核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えばＢＭＰのプロセシングと細胞外への分泌を阻害する物質、ＢＭＰに直接作用する物質（例えばタンパク質、抗体、アプタマー等）、ＢＭＰをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、ＢＭＰ受容体とＢＭＰの結合を阻害する物質、ＢＭＰ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質を挙げることができる。ＢＭＰ受容体にはＩ型ＢＭＰ受容体とＩＩ型ＢＭＰ受容体が存在し、Ｉ型ＢＭＰ受容体としてはＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＶＲ、ＩＩ型ＢＭＰ受容体としてはＴＧＦ−ｂｅｔａ  Ｒ−ＩＩ、ＡｃｔＲ−ＩＩ、ＡｃｔＲ−ＩＩＢ、ＢＭＰＲ２、ＭＩＳＲ−ＩＩが知られている。
【０１１５】
ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質として、例えばＮｏｇｇｉｎ、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ、Ｇｒｅｍｌｉｎ、Ｉｎｈｉｂｉｎ、Ｔｗｉｓｔｅｄ  Ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ、Ｃｏｃｏ、ＤＡＮファミリーに属する分泌タンパク質等が挙げられる。上記工程（２−１）において培養液中にＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加していることから、以降のＢＭＰシグナル伝達経路をより効果的に阻害するという観点から、工程（２−２）におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、細胞外へのＢＭＰの分泌よりも下流のシグナル伝達経路を阻害する物質、例えばＢＭＰ受容体とＢＭＰの結合を阻害する物質、ＢＭＰ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質等を含むことが好ましく、より好ましくはＩ型ＢＭＰ受容体の阻害剤を含む。
【０１１６】
ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することもできる。ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質としては、例えばＫ０２２８８（３−［（６−Ａｍｉｎｏ−５−（３，４，５−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−３−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ］ｐｈｅｎｏｌ，３−［６−Ａｍｉｎｏ−５−（３，４，５−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−３−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ］−ｐｈｅｎｏｌ）、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（６−［４−［２−（１−Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］ｐｈｅｎｙｌ］−３−（４−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）、ＬＤＮ−１９３１８９（４−［６−［４−（１−Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−３−ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＬＤＮ−２１２８５４（５−［６−［４−（１−Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉＭｉｄｉｎ−３−ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＬＤＮ−２１４１１７（１−（４−（６−ｍｅｔｈｙｌ−５−（３，４，５−ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ−３−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）、ＭＬ３４７（５−［６−（４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−３−ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ））、ＤＭＨ１（４−（６−（４−Ｉｓｏｐｒｏｐｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−３−ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＤＭＨ２（４−［６−［４−［２−（４−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−３−ｙｌ］−ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）等が挙げられる。これらの物質は単独又は組み合わせて用いてもよい。
【０１１７】
本発明で用いられるＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはＩ型ＢＭＰ受容体阻害剤であり、より好ましくはＫ０２２８８、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＬＤＮ−１９３１８９、ＬＤＮ−２１２８５４、ＬＤＮ−２１４１１７、ＭＬ３４７、ＤＭＨ１及びＤＭＨ２からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはＫ０２２８８を含む。
【０１１８】
培地中のＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。下垂体組織の形成効率の観点から、工程（２−２）におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質としてＫ０２２８８を用いる場合は、通常約１ｎＭ〜約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜約５０μＭ、より好ましくは約１００ｎＭ〜約５０μＭ、さらに好ましくは約５００ｎＭ〜約２５μＭの濃度で使用される。ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質としてＬＤＮ−１９３１８９を用いる場合は、通常約１ｎＭ〜約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜約１０μＭ、より好ましくは約２５ｎＭ〜約１μＭ、さらに好ましくは約１００ｎＭ〜約５００ｎＭの濃度で使用される。ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質としてＬＤＮ−２１２８５４を用いる場合は、通常約１ｎＭ〜約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜約１０μＭ、より好ましくは約２５ｎＭ〜約５μＭ、さらに好ましくは約２５０ｎＭ〜約３μＭの濃度で使用される。ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質としてＭＬ−３４７を用いる場合は、通常約１ｎＭ〜約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜約５０μＭ、より好ましくは約１００ｎＭ〜約５０μＭ、さらに好ましくは約１μＭ〜約２５μＭの濃度で使用される。ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質としてＤＭＨ２を用いる場合は、通常約１ｎＭ〜約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜約１０μＭ、より好ましくは約２５ｎＭ〜約５μＭ、さらに好ましくは約５０ｎＭ〜約３μＭの濃度で使用される。また、Ｋ０２２８８以外のＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、上記濃度のＫ０２２８８と同等のＢＭＰシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
【０１１９】
工程（２−２）において用いられる培地は、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を含む限り特に限定されない。工程（２−２）において用いられる培地は、工程（１）乃至工程（２−１）と共通の培地であることもまた好ましい。工程（２−２）において用いられる培地は血清含有培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、本発明においては、無血清培地が好適に用いられる。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、ＩＭＤＭとＦ−１２の１：１の混合液に５％ＫＳＲ、４５０μＭ１−モノチオグリセロール及び１ｘＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅが添加された培地、又は、ＧＭＥＭに５％〜２０％ＫＳＲ、ＮＥＡＡ、ピルビン酸、２−メルカプトエタノールが添加された培地）を使用することが好ましい。無血清培地へのＫＳＲの添加量としては、例えばヒトＥＳ細胞の場合は、通常約１％から約３０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。
【０１２０】
工程（２−２）において、工程（２−１）に引き続きＳｈｈシグナル伝達経路作用物質を培地中に添加することもまた好ましい。Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質としては工程（ａ）で例示したものと同様のものが用いられる。工程（ａ）、（２−１）及び（２−２）のＳｈｈシグナル伝達経路作用物質は同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
培地中のＳｈｈシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。工程（２−２）においてＳｈｈシグナル伝達経路作用物質としてＳＡＧを用いる場合は、通常、約１ｎＭ〜約５μＭ、好ましくは約１０ｎＭ〜約４．５μＭ、より好ましくは約５０ｎＭ〜約４μＭ、更に好ましくは約１００ｎＭ〜約３μＭの濃度で使用される。工程（２−１）においてBMPシグナル伝達経路作用物質を添加した後に、Shhシグナル伝達経路作用物質を添加する場合、Shhシグナル伝達経路作用物質の添加と工程（２−２）の開始を同時に行っても良い。
【０１２１】
工程（２）、（２−１）及び（２−２）では、浮遊培養が、さらにＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質の存在下で行われることが好ましい。
工程（２）、（２−１）及び（２−２）において用いられるＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質としては工程（ａ）で例示したものと同様のものが用いられる。工程（ａ）、工程（１）、（２）、（２−１）及び（２−２）のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質は同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
培地中のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。工程（２）、（２−１）及び（２−２）においてＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質としてSB431542を用いる場合は、通常、約1nM〜約100μM、好ましくは約10nM〜約50μM、より好ましくは約100nM〜約50μM、更に好ましくは約500nM〜約10μMの濃度で使用される。また、SB431542以外のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、前記濃度のSB431542と同等のTGFβシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
【０１２２】
本発明において、工程（１）、（２）、（２−１）及び（２−２）のいずれか１つ以上の工程を、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うことが好ましい。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質とは、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）により媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である限り特に限定はされない。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＦＧＦ１、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦと称することもある）、ＦＧＦ８等のＦＧＦタンパク質、抗ＦＧＦ受容体抗体、ＦＧＦ部分ペプチド等が挙げられる。これらの物質は単独又は組み合わせて用いてもよい。
【０１２３】
ＦＧＦ２タンパク質およびＦＧＦ８タンパク質は、例えば富士フィルム和光純薬株式会社から入手可能である。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはＦＧＦ２及びＦＧＦ８、並びに、これらの改変体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、より好ましくはＦＧＦ２を含み、さらに好ましくは組み換えヒトＦＧＦ２を含む。
【０１２４】
培地中のＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。神経組織部の上皮構造形成、プラコードへの分化及び細胞の生存と増殖の促進の観点からは、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質としてＦＧＦ２を用いる場合は、通常約１ｐｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｐｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約１００ｐｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約５００ｐｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用される。また、ＦＧＦ２以外のＦＧＦシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＦＧＦ２と同等のＦＧＦシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
【０１２５】
培地中でのＦＧＦタンパク質の活性を保持する目的から、ＦＧＦタンパク質を含む培地中にヘパリン、ヘパラン硫酸を添加することも好ましい。ヘパリンはナトリウム塩として例えば富士フィルム和光純薬株式会社から入手可能である。培地中のヘパリン又はヘパラン硫酸の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。培地中のヘパリンナトリウムの濃度は、通常約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約５００ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌである。ヘパラン硫酸を用いる場合、上記濃度のヘパリンと同様のＦＧＦタンパク質保護の活性をもつ濃度であることが好ましい。３７℃等での細胞培養環境下でＦＧＦタンパク質の活性を保持する目的から、例えば米国特許ＵＳ８７７２４６０Ｂ２号に記載のＴｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＦＧＦ２等のＦＧＦの改変体や生分解性ポリマーにＦＧＦ２を結合させたＳｔｅｍＢｅａｄｓ  ＦＧＦ２等のＦＧＦ２徐放性ビーズを用いることもまた好ましい。Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＦＧＦ２は、例えばＨｕｍａｎＺｙｍｅ社から入手可能である。ＳｔｅｍＢｅａｄｓ  ＦＧＦ２は例えばＳｔｅｍＣｕｌｔｕｒｅ社から入手可能である。
【０１２６】
本発明において、凝集体内部の神経系細胞または組織の生存、増殖を促進する観点から、工程（１）、（２）、（２−１）及び（２−２）のいずれか１つ以上の工程を、Wntシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともできる。前述の通り、Wntシグナル伝達経路として古典的Ｗｎｔ経路（Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ）、非古典的Ｗｎｔ経路（Ｎｏｎ−Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ）等が挙げられる。非古典的Ｗｎｔ経路としては、Ｐｌａｎａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｐｏｌａｒｉｔｙ（ＰＣＰ）経路、Ｗｎｔ／Ｃａｌｃｉｕｍ経路、Ｗｎｔ−ＲＡＰ１経路、Ｗｎｔ−Ｒｏｒ２経路、Ｗｎｔ−ＰＫＡ経路、Ｗｎｔ−ＧＳＫ３ＭＴ経路、Ｗｎｔ−ａＰＫＣ経路、Ｗｎｔ−ＲＹＫ経路、Ｗｎｔ−ｍＴＯＲ経路等が挙げられる。
【０１２７】
本発明において、Wntシグナル伝達経路作用物質とはWntファミリー・タンパク質により惹起されるシグナル伝達を活性化し得るものである限り限定されない。核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、Wnt の自己分泌を促進する物質、Wntを安定化させ分解を抑制する物質、Wntの組み換えタンパク質、Wnt の部分配列ペプチドおよびその派生物や誘導体、Wnt受容体に作用し活性化させる物質、Wntの細胞内シグナル伝達機構を活性化させる物質、Wntの細胞内シグナル伝達因子およびその改変体（β Catenin S33Y等）、Wnt応答配列下流の遺伝子発現を活性化させる物質等を挙げることができる。Wntシグナル伝達経路作用物質として知られているタンパク質として、Wnt、R−Spondin等が挙げられる。
【０１２８】
Wntシグナル伝達経路作用物質として、当業者に周知の化合物を使用することもできる。Wntシグナル伝達経路作用物質としての活性を有する化合物として例えば塩化リチウム、AMBMP hydrochloride、SGC AAK1 1、Foxy 5、CHIR99021、CHIR98014、TWS119、SB216763、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、IM-12、Indirubin、Bikinin、A 1070722、3F8、Kenpaullone、10Z-Hymenialdisine、Indirubin-3'-oxime、NSC 693868、TC-G 24、TCS 2002、TCS 21311、CP21R7、BML-284、SKL2001、WAY 262611、IIIC3a、Methyl Vanillate、IQ-1及びこれら化合物の誘導体等が挙げられる。
【０１２９】
本発明において、工程（１）にてWntシグナル伝達経路阻害物質を添加しているが、作用点の異なるWntシグナル伝達経路作用物質とWntシグナル伝達経路阻害物質を併用することで、前述の複数あるWntシグナル伝達経路のうち特定の経路のみを活性化、あるいは阻害することができる。本発明において、Wntシグナル伝達経路作用物質が工程（１）にて添加するWntシグナル伝達経路阻害物質の下流の因子に作用する物質であることが好ましい。本発明において、添加するWntシグナル伝達経路作用物質が古典的Ｗｎｔ経路（Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ）を活性化させる物質であることもまた好ましく、細胞内のWntシグナル伝達因子であるβカテニンの分解の阻害、安定化作用によりWntシグナル伝達経路を活性化させる物質であることがさらに好ましい。βカテニンの分解の阻害、安定化作用を有する物質としては、例えばGSK3阻害剤およびBML-284、SKL2001等が挙げられる。添加するWntシグナル伝達経路作用物質がβカテニン応答性転写（β-catenin responsive transcription：CRT）を促進・活性化させる物質であることもまた好ましい。
【０１３０】
本発明における好ましいWntシグナル伝達経路作用物質とWntシグナル伝達経路阻害物質の組み合わせとして、GSK3阻害剤とPORCN阻害剤が挙げられる。GSK3阻害剤とPORCN阻害剤を併用した場合、古典的Ｗｎｔ経路は活性化され、非古典的Ｗｎｔ経路は阻害される。GSK3阻害剤とPORCN阻害剤を併用した場合、本発明において好ましいGSK3阻害剤はCHIR99021、CHIR98014、SB216763、SB415286、BIOからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはCHIR99021を含む。GSK3阻害剤とPORCN阻害剤を併用した場合、本発明において好ましいPORCN阻害剤はIWP-2、IWP-3、IWP-4、IWP-L6、IWP-12、LGK-974、ETC-159、GNF-6231、Wnt-C59からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはIWP-2を含む。また、GSK3阻害剤とKY02111乃至その誘導体等を組み合わせて用いても良い。GSK3阻害剤とは作用機序の異なるβカテニンの分解の阻害、安定化作用を有する物質としては例えばBML-284、SKL2001が挙げられ、これら化合物およびその誘導体もPORCN阻害剤、KY02111乃至その誘導体等と組み合わせて用いても良い。
【０１３１】
培地中のＷｎｔシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。凝集体内部の神経系細胞または組織の生存、増殖の促進の観点からは、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合は、通常約１０ｐＭ〜約１０ｍＭ、好ましくは約１００ｐＭ〜約１ｍＭ、より好ましくは約１ｎＭ〜約１００μＭ、さらに好ましくは約１０ｎＭ〜約３０μＭ、最も好ましくは約１００ｎＭ〜約３μＭの濃度で使用される。また、ＣＨＩＲ９９０２１以外のＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＣＨＩＲ９９０２１と同等のＷｎｔシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
【０１３２】
本発明において、工程（１）、（２）、（２−１）及び（２−２）のいずれか１つ以上の工程において、細胞死を抑制し、細胞の増殖を促進する観点から、培地中にさらなる増殖因子を添加することもまた好ましい。添加される増殖因子の種類は、上記目的を達成可能な限り特に限定されない。かかる目的で用いられる増殖因子としては、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＩＧＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ：ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４／５、毛様体神経栄養因子（Ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ：ＣＮＴＦ）、血管内皮細胞増殖因子（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、色素上皮由来因子（Ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＥＤＦ）、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）等が挙げられる。これらの増殖因子は、上記目的を達成可能な濃度で添加すればよい。
【０１３３】
本発明の工程（１）、（２）、（２−１）及び（２−２）のいずれか１つ以上の工程において、細胞死を抑制し、細胞の増殖を促進する観点から、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）等の血小板由来成長因子受容体作用物質を培地中に添加することもまた好ましい。ＰＤＧＦにはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの四種類の遺伝子が存在し、ＡＡ、ＡＢ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤのホモまたは特定の組み合わせのヘテロの二量体を形成してリガンドとして機能する。ＰＤＧＦ受容体にはαおよびβの二種類の遺伝子が存在し、αα、αβ、ββの組み合わせのホモ又はヘテロの二量体を形成して受容体として機能する。このうち、プラコードを含む非神経外胚葉ではＰＤＧＦＲβがよく発現しており、本発明で用いる血小板由来成長因子受容体作用物質は好ましくはＰＤＧＦＲββ又はＰＤＧＦＲαβに対する作用を有しており、より好ましくはＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤのいずれかを含み、さらに好ましくはＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣのいずれかを含む。ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤは組み換えタンパク質としてＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社もしくはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社等から入手可能である。
【０１３４】
本発明の工程（１）、（２）、（２−１）及び（２−２）のいずれか１つ以上の工程において、下垂体組織の製造効率を向上させる観点から、プラコード領域への分化を促進する化合物を添加することもまた好ましい。上記のような作用を有する化合物として、例えば米国特許ＵＳ２０１６０３２６４９１Ａ１号に記載のＢＲＬ−５４４４３、Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ、Ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄｅ等が挙げられる。プラコード領域への分化を促進する化合物としてＢＲＬ−５４４４３を用いる場合は通常１０ｎＭ〜１００μＭ、Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅを用いる場合は通常１０ｎＭ〜１００μＭ、Ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄｅを用いる場合は通常１０ｎＭ〜１００μＭの濃度で用いられる。
【０１３５】
本発明の工程（２）及び（２−２）のいずれかの工程において、製造された細胞塊を長期培養することにより、分化の進んだ細胞を含む、より成熟した細胞塊を得ることもできる。このような培養を成熟培養とも称する。工程（２）及び（２−２）の成熟培養過程において、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、無血清培地が好適に用いられる。工程（２）及び（２−２）の成熟培養において、用いる培地は工程（２）及び（２−２）で用いたものと同様の物を用いることもできる。また、神経細胞等の培養に用いる既知の培地、例えばＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地の１：１混合液に０．５％  Ｎ２  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔと１％  Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地（Ｎ２Ｂ２７培地）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地にＳｔｅｍＰｒｏ  ＮＳＣ  ＳＦＭ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地（ＳｔｅｍＰｒｏ  ＮＳＣ  ＳＦＭ培地）等を用いることもできる。成熟培養を実施する際には、浮遊培養の開始時に用いた培養容器で培養を継続することもできる。また、新しい培養容器、例えば浮遊培養用ディッシュ、浮遊培養用フラスコ等に細胞塊を移し培養を実施することもできる。
【０１３６】
本発明の工程（２）、工程（２−１）及び（２−２）のいずれかの工程において、細胞死を抑制し、細胞の増殖を促進する観点から、高酸素の雰囲気下で培養することもまた好ましい。培養過程における高酸素条件は、例えば細胞を培養するインキュベーターに酸素ボンベを接続し、人工的に酸素を供給することにより実現できる。かかる目的での酸素濃度は、通常２５％から８０％であり、より好ましくは３０％から６０％である。
【０１３７】
本発明の工程（２）、工程（２−１）及び（２−２）のいずれかの工程において、細胞塊を培養する培地中への酸素供給量を増やす観点から、ガス交換効率の高い培養器材を用いることもできる。このような培養器材の例として、細胞培養ディッシュ、プレートの底面をガス透過性のフィルムとしたＬｕｍｏｘディッシュ（ザルスタット株式会社製）、ＶＥＣＥＬＬ  ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（株式会社ベセル製）等が挙げられる。
【０１３８】
本発明の工程（２）、工程（２−１）及び（２−２）のいずれかの工程において、培地に副腎皮質ホルモン類を添加することにより、細胞塊を副腎皮質ホルモン類により処理することもまた好ましい。副腎皮質ホルモン類は工程（１）において添加されてもよい。副腎皮質ホルモン類処理により、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢からACTH産生細胞以外の下垂体ホルモン産生細胞（即ち、GH産生細胞、PRL産生細胞、TSH産生細胞、LH産生細胞、FSH産生細胞等）への分化が促進される。副腎皮質ホルモン類としては、ハイドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン等の天然糖質コルチコイド；デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン等の人工的に合成された糖質コルチコイド等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１３９】
培地中における、副腎皮質ホルモン類の濃度は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から、下垂体ホルモン産生細胞（但し、ACTH産生細胞を除く）への分化を促進し得る限り特に限定されず、また、副腎皮質ホルモン類の種類により適宜設定することができる。例えば、ハイドロコルチゾンの場合、通常100 ng/ml以上、好ましくは、1 μg/ml以上である。下垂体ホルモン産生細胞（但し、ACTH産生細胞を除く）への分化に悪影響がない限りハイドロコルチゾン濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000 μg/ml以下、好ましくは100 μg/ml以下である。一態様において、培地中のハイドロコルチゾン濃度は、通常100 ng/ml〜1000 μg/ml、好ましくは1〜100 μg/mlである。副腎皮質ホルモン類として、デキサメタゾンを使用する場合、その培地中の濃度は、ハイドロコルチゾンの1/25程度とすることが出来る。
【０１４０】
本発明の工程（２）、（２−１）及び（２−２）において、培地に副腎皮質ホルモン類を添加する時期は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から、下垂体ホルモン産生細胞（但し、ACTH産生細胞を除く）への分化を促進し得る限り特に限定されず、本発明の工程（２）、（２−１）及び（２−２）の培養工程開始時から培地に副腎皮質ホルモン類を添加してもよいし、培養工程開始後、副腎皮質ホルモン類を添加しない培地中で一定期間培養後、培地に副腎皮質ホルモン類を添加してもよい。好適には、本発明の工程（２）、（２−１）及び（２−２）を開始後、細胞凝集塊中に、ACTH産生細胞の出現が確認された段階で、培地に副腎皮質ホルモン類を添加する。即ち、細胞凝集塊中に、ACTH産生細胞の出現が確認されるまでは、細胞凝集塊を副腎皮質ホルモン類を添加しない培地中で培養し、ACTH産生細胞の出現が確認された後に、副腎皮質ホルモン類を含む培地中で第3の培養工程を継続する。ACTH産生細胞の出現は、ACTHに対する抗体を用いて免疫組織学的染色により確認することが出来る。ヒト多能性幹細胞を用いた場合、一般的に、本発明の工程（２）、（２−１）及び（２−２）の培養工程開始から37日以降であれば、ACTH産生細胞の出現が期待できるので、一態様において、本発明の工程（２）、（２−１）及び（２−２）の培養工程開始から37日以降に、培地に副腎皮質ホルモン類を添加する。
【０１４１】
細胞凝集塊を副腎皮質ホルモン類で処理する期間は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から、下垂体ホルモン産生細胞（但し、ACTH産生細胞を除く）への分化を促進し得る限り特に限定されないが、通常、副腎皮質ホルモン類非処理群と比較して、副腎皮質ホルモン類処理群において、下垂体ホルモン産生細胞（但し、ACTH産生細胞を除く）への分化の促進が確認されるまで、細胞凝集塊を副腎皮質ホルモン類で処理する。処理期間は、通常、７日以上、好ましくは１２日以上である。処理期間の上限値は、特に限定されないが、副腎皮質ホルモン類非処理群と比較して、副腎皮質ホルモン類処理群において、下垂体ホルモン産生細胞（但し、ACTH産生細胞を除く）への分化の促進が確認された段階で、培地から副腎皮質ホルモン類を除去してもよい。
【０１４２】
尚、培地への副腎皮質ホルモン類の添加は、ACTH産生細胞の分化誘導に対しては、フィードバック阻害により、抑制的に作用する。
【０１４３】
本発明において、Notchシグナル伝達経路とは、細胞膜上に発現する受容体であるNotchタンパク質と隣接細胞の膜上に発現するNotchリガンド（DeltaやJaggedなど）との直接相互作用により活性化されるシグナル伝達経路を表す。Notchシグナルが伝達された細胞においては、Notchタンパク質が段階的にプロセシングを受け膜上で切り出された細胞内ドメインが核内へと運ばれて下流遺伝子の発現を制御する。
【０１４４】
本発明の工程（２）、（２−１）及び（２−２）において用いる培地は、好ましくはNotchシグナル伝達経路阻害剤（Notchシグナル阻害剤）を含む。Notchシグナル阻害剤は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から下垂体ホルモン産生細胞（特に、ACTH産生細胞）への分化を促進する。Notchシグナル阻害剤により、ACTH産生の上流制御をする転写因子Tbx19の発現が上昇する。
Notchシグナル阻害剤は、工程（１）において用いる培地に含まれていても良い。
【０１４５】
Notchシグナル阻害剤は、Notchにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、機能欠失型のNotch受容体及びリガンド、Notchのプロセシング（S1切断）を阻害する物質、Notch及びNotchリガンドの糖鎖修飾を阻害する物質、細胞膜移行を阻害する物質、Notchの細胞内ドメイン（NICD）のプロセシング（S２切断、S３切断）を阻害する物質（γセクレターゼ阻害剤）、NICDを分解する物質、NICD依存的な転写を阻害する物質等を挙げることができる。
【０１４６】
Notchシグナル阻害剤として、当業者に周知の化合物を使用することもできる。Notchシグナル阻害剤としての活性を有する化合物として例えばDAPT（N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-l-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester）、DBZ、MDL28170等、あるいはOnco Targets Ther. 2013; 6: 943-955.に記載の物質等が挙げられる。なかでも、DAPTが好ましい。
【０１４７】
培地中におけるNotchシグナル阻害剤の濃度は、下垂体プラコード及び／又はラトケ嚢から下垂体ホルモン産生細胞（特に、ACTH産生細胞）への分化を促進し得るような濃度である限り特に限定されないが、例えばDAPTの場合、通常0．1 μM以上、好ましくは、1μM以上である。下垂体ホルモン産生細胞への分化に悪影響がない限りDAPT濃度の上限値は特にないが、培養コストの観点から、通常1000μM以下、好ましくは、100μM以下である。一態様において、培地中のDAPT濃度は、通常0．1〜1000μM、好ましくは1〜100μM（例、10μM）である。
【０１４８】
３．下垂体組織を含む細胞塊
本発明は、１）神経系細胞又は神経組織、２）下垂体組織、及び３）間葉系細胞を含む細胞塊を提供する。またあるいは、１）神経系細胞又は神経組織、２）下垂体組織、及び４）神経提細胞又は神経提由来細胞を含む細胞塊を提供する。以下、本発明の細胞塊とも称する。本発明の細胞塊は、好ましくは上記した本発明の製造方法により製造することができる。
【０１４９】
本発明の細胞塊における１）神経系細胞又は神経組織は、好ましくは中枢神経系の細胞若しくは組織、又はその前駆組織であり、中枢神経系の細胞又は組織としては、網膜、大脳皮質、間脳（例、視床下部）及びそれらの組織に由来する細胞が挙げられ、より好ましくは間脳またはその前駆組織であり、さらに好ましくは組織中に脳室様の構造を有している間脳またはその前駆組織である。１）神経系細胞又は神経組織は、例えばN-Cadherin陽性の神経上皮組織である。
【０１５０】
本発明の細胞塊における２）下垂体組織は、好ましくは非神経上皮組織と連続して形成されており、非神経上皮組織及び下垂体組織が１）神経系細胞又は神経組織及び３）間葉系細胞の少なくとも一方を被覆していること、あるいは非神経上皮組織及び下垂体組織が１）神経系細胞又は神経組織及び４）神経堤細胞又は神経堤由来細胞の少なくとも一方を被覆していること、がさらに好ましい。
前記非神経上皮組織が口腔上皮またはその前駆組織であることもまた好ましい。下垂体組織は下垂体ホルモン産生細胞を含むことが好ましく、下垂体組織幹細胞を含むことが好ましく、濾胞星状細胞を含むことが好ましく、下垂体ホルモン産生細胞、下垂体組織幹細胞、濾胞星状細胞すべてを含むことがさらに好ましい。下垂体ホルモン産生細胞としては、例えば成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞及び副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞からなる群から選ばれる少なくとも1種が挙げられる。
下垂体組織中に下垂体ニッチが形成されていることもまた好ましく、下垂体ニッチが下垂体前葉と中葉の間に残る遺残腔周辺のMCLニッチ様の構造であることもまた好ましく、下垂体ニッチが実質層ニッチ様の構造であることもまた好ましく、MCLニッチ様の構造と実質層ニッチ様の構造をともに含むことがさらに好ましい。
【０１５１】
本発明の細胞塊における３）間葉系細胞は、好ましくは頭部間葉系細胞である。
３）間葉系細胞は、細胞塊の表面を被覆している非神経上皮組織と、細胞塊の内側に存在する１）神経系細胞又は神経組織との間に存在することが好ましい。
【０１５２】
本発明の細胞塊における４）神経提細胞又は神経提由来細胞は好ましくは頭部神経提細胞又は頭部神経提由来細胞である。
４）神経提細胞又は神経提由来細胞は、細胞塊の表面を被覆している非神経上皮組織と、細胞塊の内側に存在する１）神経系細胞又は神経組織との間に存在することが好ましい。４）神経提細胞又は神経提由来細胞は、３）間葉系細胞であることもまた好ましい。
【０１５３】
本発明の細胞塊は、例えば１）神経上皮組織の内部に脳室様の空胞が形成され、該空胞に接している１）神経上皮組織の面がPKC-zeta陽性の頂端面である。
【０１５４】
本発明の細胞塊に含まれる３）間葉系細胞は、例えば、Nestin、Vimentin、Cadherin-11、Laminin、CD44、CD90及びCD105からなる群から選ばれる少なくとも１種の間葉系細胞マーカーを発現する。
本発明の細胞塊に含まれる３）神経提細胞又は神経提由来細胞は、例えば、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｓｏｘ１０、Ｓｌｕｇ、Ｓｎａｉｌ、Ｐａｘ３、Ｚｉｃ１、ＦｏｘＤ３、ｐ７５  ＮＴＲ、ＨＮＫ−１、ＣＨＤ７、Ｎｕｍｂ、Ａｓｃｌ１からなる群から選ばれる少なくとも１種の神経提細胞マーカーを発現する。
本発明に含まれうる非神経上皮組織は、例えば、サイトケラチン、E-Cadherin及びEpCAMからなる群から選ばれる少なくとも１種の非神経上皮組織マーカーを発現する。
本発明の細胞塊に含まれうる下垂体組織幹細胞は、例えばSox2、Sox9、E-Cadherin、Nestin、S100β、GFRα2、Prop1、CD133、β-Catenin、Klf4、Oct4、Pax6、コクサッキーウイルス・アデノウイルス共通受容体（CXADR）、PRRX1/2、Ephrin-B2及びACEからなる群から選ばれる少なくとも１種の下垂体幹細胞マーカーを発現する。
【０１５５】
４．下垂体組織の製造方法
本発明は、下垂体組織の製造方法を提供し、該方法は下記工程（１）〜（３）を含む。
（１）多能性幹細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）第一工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養し、下垂体組織を含む細胞塊を得る第二工程、
（３）第二工程で得られた細胞塊から下垂体組織を回収する第三工程。
第一工程及び第二工程は、上記、「２．下垂体組織を含む細胞塊の製造方法」の第一工程及び第二工程と同様にして実施することができる。また、所望により第一工程の前にａ工程を実施してもよい。あるいは、所望により第二工程の代わりに第二工程（１）及び第二工程（２）を実施してもよい。
第二工程又は第二工程（２）で得られた細胞塊から下垂体組織を回収する第三工程は、通常、顕微鏡観察下でピンセット等を用い、細胞塊の外側（ラトケ嚢部分）に形成される下垂体組織を剥離・回収することによっておこなわれる。下垂体組織は、例えばNature communications，2016，7.に記載されているように、得られた細胞塊の表層にある半透明な薄い上皮として判別することができる。第三工程における下垂体組織の回収方法として、凍結融解、好ましくは緩慢凍結法を用いることもできる。当該方法は、外側に下垂体組織及び内側に間葉系神経や神経上皮組織を有する細胞塊を凍結融解することで物理的処理を施すことなく外側の下垂体組織が細胞塊から剥離されるというものである。
【０１５６】
５．毒性・薬効性評価用試薬及び毒性・薬効評価方法
本発明の細胞塊、本発明の製造方法により製造される細胞塊、又は該細胞塊から回収される組織は、下垂体組織であり得る。従って、本発明の細胞塊、本発明の製造方法により製造される細胞塊又は該細胞塊から回収される下垂体組織を含有してなる、被験物質の毒性・薬効性評価用試薬が提供され得る。
また、本発明は、上述の細胞塊又は該細胞塊から回収される下垂体組織を用いて、毒性・薬効評価方法を提供することができる。
例えば、細胞塊又は該細胞塊から回収される下垂体組織と、被験物質とを接触させる工程と、
該被験物質が該細胞塊又は下垂体組織に及ぼす影響を検定する工程とを含む、被験物質の毒性・薬効評価方法が挙げられる。
【０１５７】
６．治療薬及び疾患の治療方法
本発明の細胞塊、本発明の製造方法により製造される細胞塊又は該細胞塊から回収される下垂体組織を含有してなる、下垂体の障害に基づく疾患の治療薬が提供され得る。
下垂体の障害に基づく疾患の治療薬としては、例えば本発明の細胞塊もしくは本発明の製造方法により製造される細胞塊を含む懸濁液を含む移植片が挙げられる。
懸濁液としては、例えば細胞塊を人工涙液または生理食塩水に懸濁した液が挙げられる。懸濁液は、細胞塊から単離された非神経上皮細胞を含んでいてもよく、細胞の接着を促進する因子、例えば細胞外基質やヒアルロン酸等を含んでいてもよい。
細胞塊に替えて細胞塊から回収した下垂体組織を用いてもよい。
【０１５８】
さらに、本発明の細胞塊、本発明の製造方法により製造される細胞塊から、下垂体組織の有効量を、移植を必要とする対象に移植する工程を含む、下垂体の障害に基づく疾患の治療方法が提供され得る。
前記下垂体の障害に基づく疾患は、下垂体の障害に基づく動物の疾患であってよく、下垂体の障害に基づく非ヒト動物の疾患であってよい。下垂体の障害に基づく疾患としては、具体的には、汎下垂体機能低下症、下垂体性小人症、副腎皮質機能低下症、部分的下垂体機能低下症、下垂体前葉ホルモン単独欠損症などが挙げられる。
【０１５９】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。また、使用する試薬及び材料は特に限定されない限り商業的に入手可能である。
【実施例】
【０１６０】
実施例１：ヒトES細胞から作製された下垂体組織を含む細胞塊
ヒトES細胞（KhES-1株、京都大学より入手）を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作としては、まずサブコンフレントになったヒトES細胞（KhES-1株）を、PBSにて洗浄後、Accumax（Innovative Cell Technologies社製）を用いて酵素処理を行った後、StemFit培地を添加しセルスクレーパーを用いて培養ディッシュ表面より細胞を剥がし、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。その後、前記単一細胞へ分散されたヒトES細胞を、Laminin511-E8にてコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Y27632（ROCK阻害物質、和光純薬社製、10 μM）存在下、StemFit培地にてフィーダーフリー培養した。前記プラスチック培養ディッシュとして、６ウェルプレート（Corning社製、細胞培養用、培養面積9.5 cm2）を用いた場合、前記単一細胞へ分散されたヒトES細胞の播種細胞数は１．２×１０4とした。播種した１日後に、Y27632を含まないStemFit培地に全量培地交換した。以降、１日〜２日に一回Y27632を含まないStemFit培地にて全量培地交換した。その後、播種した７日後にサブコンフレント（培養面積の６割が細胞に覆われる程度）になるまで培養した。培養した細胞を分化誘導に用いる際には、播種した６日後にStemfit培地の培地交換と同時にSB-431542(TGFβシグナル伝達経路阻害物質、和光純薬社製、５μM)とSAG(Shhシグナル伝達経路作用物質、Enzo Life Sciences社製、300nM)を添加した。【０１６１】
このようにして調製したサブコンフレントのヒトES細胞を、PBSにて洗浄後、Accumaxを用いて酵素処理を行った後、分化誘導用の無血清培地を添加しセルスクレーパーを用いて培養ディッシュ表面より細胞を剥がし、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトES細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の１ウェルあたり１×１０4細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12+Glutamax培地(Thermo Fisher Scientific社製)とIMDM+Glutamax培地(Thermo Fisher Scientific社製)の１：１混合液に5％ Knockout Serum Replacement(Thermo Fisher Scientific社製)、４５０μＭ １−モノチオグリセロール（和光純薬社製）、１ｘ Chemically defined lipid concentrate(Thermo Fisher Scientific社製)、50 unit/mlペニシリン-50μg/mlストレプトマイシン(ナカライテスク社製)を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目、工程１開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度２０μM）、IWP-2（Wntシグナル伝達経路阻害物質、Tocris Bioscience社製、2μM）、SB-431542（TGFβシグナル伝達経路阻害物質、和光純薬社製、1μM）を添加した。
浮遊培養開始後2日目にY27632を含まず、IWP-2、SB-431542、BMP4（BMPシグナル伝達経路作用物質）、SAGを含む無血清培地を1ウェルあたり100μｌ加えた。BMP4は添加する培地に3nM添加し、ウェル中の終濃度を1.5nMとし、SAGは添加する培地に4μM添加し、ウェル中の終濃度を2μMとなるようにした。その後、浮遊培養開始後6、10、13、17、21及び24日目にY27632とBMP4を含まず、IWP-2、SB-431542とSAGを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。
浮遊培養開始後28日目に細胞塊をディッシュに回収し、倒立顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて、明視野観察を行った（図１Ａ−Ｂ）。図１Ａ右下のスケールバーは1000μm、図１Ｂ右下のスケールバーは200μmを示す。その結果、上記分化誘導法によりヒトES細胞から浮遊培養28日目までに神経組織及び非神経上皮組織を含む直径約1mm前後の細胞塊が形成された。細胞塊の表面には厚さ30μm前後の上皮様の構造が形成されていた。【０１６２】
前記、浮遊培養開始後28日目の細胞塊を、それぞれ4%パラホルムアルデヒドで室温15分固定した後、20％スクロース/ＰＢＳに4℃で一晩浸漬し凍結保護処理後、凍結切片を作成した。これらの凍結切片に関し、下垂体の初期マーカーである抗Lhx3抗体（メルクミリポア社製、ウサギ）、プラコードマーカーである抗Emx2抗体（R&D Systems社製、ヒツジ）、口腔上皮・下垂体プラコードマーカーであるPitx1抗体（Santa Cruz Biotechnology社製、ヤギ）、腹側間脳マーカーである抗Nkx2.1抗体（メルクミリポア社製、マウス）、抗Tbx3抗体（R&D Systems社製、ヤギ）、抗Sox3抗体（R&D Systems社製、ヤギ）、非神経上皮組織マーカーである抗CD326/EpCAM抗体（Acris Antibodies社製、マウス）、抗汎サイトケラチン抗体（Sigma Aldrich社製、マウス）、未分化神経及び神経堤・間葉系細胞マーカーである抗Nestin抗体（Spring Bioscience社製、ウサギ）、基底膜マーカーである抗Laminin抗体（協和ファーマケミカル社製、マウス）、頂端面マーカーである抗aPKC抗体（Santa Cruz Biotechnology社製、ウサギ）、神経細胞マーカーである抗βIIIチューブリン（Tuj1）抗体（Sigma Aldrich社製、マウス）を用いて蛍光免疫染色を行った。蛍光標識二次抗体としてAlexa488標識ロバ抗ウサギ抗体（Thermo Fisher Scientific社製）、CF555標識ロバ抗マウス抗体（Biotium社製）、CF555標識ロバ抗ヤギ抗体、CF543標識ロバ抗ヒツジ抗体、Alexa647標識ロバ抗マウス抗体を用いて多重染色を行い、核の対比染色にはHoechst33342 (Sigma Aldrich社製）を用いた。図１Ｅは図１ＣとＤ、図１Ｈは図１ＦとＧ、図１Ｋは図１ＩとＪ、図１Ｎは図１ＬとＭ、図１Ｑは図１ＯとＰ、図１Ｕは図１ＳとＴ、図１Ｘは図１ＶとＷに対する核の対比染色像である。染色した切片の観察および画像の取得には正立蛍光顕微鏡Axio Imager M2（ツァイス社製）および附属ソフトウェアのAxio Visionを用いた。図１Ｃ〜Ｅ、図１Ｆ右下のスケールバーは200μm、図１Ｉ、図１Ｌ、図１Ｏ、図１Ｓ右下のスケールバーは100μm、図１Ｖ右下のスケールバーは50μmを示す。【０１６３】
その結果、上記分化誘導法で誘導された浮遊培養開始後28日目の細胞塊の内側はNkx2.1、Tbx3、Sox3、βIIIチューブリン陽性の腹側間脳・視床下部の神経上皮組織が存在し（図１Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｏ、Ｐ）、外側はEpCAM、汎サイトケラチン陽性の非神経上皮組織であることが分かった（図１Ｍ、Ｗ）。内側の神経上皮組織のさらに内側はaPKC陽性の頂端面であり、細胞の存在しない空胞である脳室様の組織が形成されていることが分かった（図１Ｉ、＊部）。外側の非神経上皮組織の内側にラミニン等から形成される基底膜様の構造が形成されていた（図１Ｊ）。さらに、非神経上皮組織の一部はLhx3、Emx2、Pitx1陽性であり、非神経上皮組織が陥入しているラトケ嚢様の構造と下垂体プラコードが形成されていることが分かった（図１Ｃ、Ｆ、Ｓ、Ｖ）。加えて、外側の非神経上皮組織と内側の神経上皮組織の間に、Nestin陽性、汎サイトケラチン、ラミニン弱陽性、βIIIチューブリン陰性の頭部間葉系細胞が存在していた。上記の結果より、本発明の製造法により、非神経上皮と、神経上皮と、間葉系細胞とを含み、外側が非神経上皮に覆われ、内側に脳室様の構造を有する腹側間脳・視床下部様の神経上皮組織が形成され、非神経上皮と神経上皮の間に頭部間葉系細胞が存在し、外側の非神経上皮の一部が下垂体プラコードである細胞塊が製造可能であることが示された。浮遊培養開始後28日目の細胞塊の模式図を図１Ｙに示す。【０１６４】
実施例２：ヒトES細胞から作製された下垂体組織を含む細胞塊の長期培養による成熟
ヒトES細胞（KhES-1株、京都大学より入手）を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作としては、実施例１と同様に行った。【０１６５】
その後、実施例１と同様の条件で、96ウェルプレートでの浮遊培養を実施した。
浮遊培養開始後28日目に細胞塊を10cm浮遊培養用ディッシュ（住友ベークライト社製）へとディッシュ１枚あたり４８個の細胞塊を移し、無血清培地を用いて培養84日目まで浮遊培養を実施した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12+Glutamax培地(Thermo Fisher Scientific社製)とIMDM+Glutamax培地(Thermo Fisher Scientific社製)の１：１混合液に10％ Knockout Serum Replacement(Thermo Fisher Scientific社製)、４５０μＭ １−モノチオグリセロール（和光純薬社製）、１ｘ Chemically defined lipid concentrate(Thermo Fisher Scientific社製)、50 unit/mlペニシリン-50μg/mlストレプトマイシン(ナカライテスク社製)、2μM SAGを添加した無血清培地をディッシュ１枚あたり１５ｍｌ用い、３日乃至４日に一回半量の培地を交換した。【０１６６】
前記、浮遊培養開始後70日目の細胞塊を、倒立顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて明視野観察を行った（図２Ａ、Ｂ）。図２Ａ右下のスケールバーは1000μm、図２Ｂ右下のスケールバーは200μmを示す。その結果、浮遊培養開始後70日目には、厚さ100μm前後の上皮組織に覆われた細胞塊が形成されていることが分かった。上記細胞塊の一部を4%パラホルムアルデヒドで固定し、残りの細胞塊をさらに浮遊培養した。その際の培地には、上記無血清培地にさらに10μM Dexamethasone（Sigma Aldrich社製、マウス）を添加したものを用い、浮遊培養開始後84日目まで培養したのちに4%パラホルムアルデヒドで固定した。上記培養70日目と84日目の細胞塊から実施例１と同様の方法で凍結切片を作成し、下垂体のホルモン産生細胞マーカーである抗副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）抗体（Lab Vision社製、マウス）、抗プロラクチン（PRL）抗体（Cell Marque社製、ウサギ）、抗成長ホルモン抗体（R&D Systems社製、ヤギ）および非神経上皮組織マーカーである抗汎サイトケラチン抗体を用いて実施例１と同様の方法で蛍光免疫染色と観察を行った。図２Ｄは図２Ｃの、図２Ｇは図２ＥおよびＦの、図２Ｊは図２ＨおよびＩの細胞核の対比染色像である。図２Ｃ、図２Ｅ右下のスケールバーは100μm、図２Ｈ右下のスケールバーは50μmを示す。【０１６７】
その結果、浮遊培養開始後70日目の細胞塊には下垂体のホルモン産生細胞マーカーであるACTH陽性の細胞が存在していた（図２Ｃ）。
さらに、Dexamethasoneを添加して14日間培養した浮遊培養開始後84日目の細胞塊には、下垂体のホルモン産生細胞マーカーであるPRL陽性の細胞とGH陽性の細胞がそれぞれ存在していた（図２Ｅ、Ｈ）。これらの結果から、上記分化誘導法によりヒト多能性幹細胞から下垂体のホルモン産生細胞が分化誘導されたことが分かった。【０１６８】
参考例１：ヒトES細胞からの下垂体組織を含む細胞塊の製造におけるBMP4添加時期の検討（１）
ヒトES細胞（KhES-1株、京都大学より入手）を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作は、実施例１と同様に実施した。【０１６９】
その後、実施例１と同様の条件で、96ウェルプレートでの浮遊培養を開始した。
浮遊培養期間中にBMPシグナル伝達経路作用物質を添加しない条件をコントロールとした（-BMP4条件、図３Ａ）。その後、浮遊培養開始後１、２または３日目にBMPシグナル伝達経路作用物質を添加する条件（Day1〜3+BMP4条件、図３Ｂ〜Ｄ）では、Y27632を含まず、IWP-2、SB-431542、BMP4を含む無血清培地を1ウェルあたり１００μｌ加えた。BMP4は添加する培地に3nM添加し、ウェル中の終濃度が1.5nMとなるようにした。浮遊培養開始後6日目にY27632とBMP4を含まず、IWP-2とSB-431542を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。浮遊培養開始後10日目に、倒立顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて、明視野観察を行った（図３Ａ−Ｄ）。図３Ａ−Ｄ右下のスケールバーは、200μmを示す。【０１７０】
その結果、BMP4を添加しない条件では、表面の滑らかな胚様体が形成され、胚様体表面に非神経上皮様の構造は確認できなかった（図３Ａ）。分化誘導開始1日目および2日目にBMP4を添加した条件(Day1、2+BMP4)では、神経上皮様の構造を有する中心部を非神経上皮様の層が覆っている二層構造を有した、神経組織及び非神経上皮組織を含む細胞塊が形成されていた（図３Ｂ、Ｃ）。両条件を比較すると、2日目にBMP4を添加することにより、1日目にBMP4を添加した条件の胚様体（図３Ｂ）よりも大きな胚様体（図３Ｃ）が形成された。分化誘導開始３日目にBMP4を添加した条件では、外側の非神経上皮様の組織が形成されず、表面の滑らかな神経上皮様の組織からのみなる胚様体が形成された（図３Ｄ）。上記の結果より、ヒト多能性幹細胞から将来の下垂体組織の基となる非神経上皮組織で被覆された細胞塊の形成には、BMPシグナル伝達経路作用物質を浮遊培養開始後72時間以内に添加することが効果的であることが分かった。【０１７１】
実施例３：ヒトES細胞からの下垂体組織を含む細胞塊の製造におけるBMP4添加時期の検討（２）
ヒトES細胞（KhES-1株、京都大学より入手）を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作は、実施例１と同様に実施した。【０１７２】
その後、実施例１と同様の条件で、96ウェルプレートでの浮遊培養を開始した。
培地を添加することなく浮遊培養開始後２日目及び３日目に倒立顕微鏡を用いて、凝集体の明視野観察を行った。図４Ａ右下のスケールバーは、200μmを示す。観察の結果、BMP4の添加に好ましい時期である浮遊培養開始後２日目の凝集体は表面に凹凸がみられ、歪な形状であった（図４Ａ）。一方で、浮遊培養開始後３日目の凝集体は２日目に見られた凹凸が減少し、球体に近い形状を呈していた（図４Ｂ）。【０１７３】
前記、浮遊培養開始後２日目及び３日目の凝集体を、実施例１に記載の方法で固定し、凍結切片を作製した。これらの凍結切片に関し、密着結合マーカーである抗ZO-1抗体（Thermo Fisher Scientific社製、ウサギ）と神経幹細胞及び多能性幹細胞マーカーである抗Sox2抗体（Santa Cruz Biotechnology社製、ヤギ）を用いて蛍光免疫染色を行った。蛍光標識二次抗体及び核の対比染色は実施例１に記載の物を使用した。図４Ｃ右下のスケールバーは、100μmを示す。その結果、浮遊培養開始後２日目の凝集体では、凝集体の最も表層の細胞の一部がZO-1陽性であり、密着結合を形成していた（図４Ｃ）。一方で、浮遊培養開始後３日目の凝集体では、ZO-1陽性の細胞は凝集体の内部に取り込まれ、最も表層には局在が見られなかった（図４Ｆ）。加えて、浮遊培養開始後３日目の凝集体では、外層の細胞同士がより密着した領域と、凝集体内部の細胞が疎らでSox2強陽性領域の二層構造が、より明確に確認できるようになっていた（図４Ｄ、Ｇ）。上記の結果より、神経組織及び非神経上皮組織を含む細胞塊の製造過程におけるBMP4添加時期を決定するための手法として、凝集体の最も表層の細胞における密着結合の検出が利用可能であることが分かった。【０１７４】
実施例４：ヒトES細胞からの下垂体組織を含む細胞塊の製造におけるソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質添加条件の検討
ヒトES細胞（KhES-1株、京都大学より入手）を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作は、実施例１と同様に実施した。【０１７５】
その後、実施例１と同様の条件で、96ウェルプレートでの浮遊培養を開始した。
浮遊培養開始後２日目にY27632を含まず、IWP-2、SB-431542、BMP4、SAGを含む無血清培地を1ウェルあたり１００μｌ加えた。BMP4は添加する培地に3nM添加し、ウェル中の終濃度が1.5nMとなるようにし、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としてSAGを終濃度が100、300、500、700nM、1、2、5μMの各濃度条件となるよう添加した。浮遊培養期間中にソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を添加しない条件をコントロールとした（-SAG条件、図５Ａ）。
浮遊培養開始後6、10、13、17、21、24日目にY27632とBMP4を含まず、IWP-2、SB-431542と各濃度のSAGを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。
浮遊培養開始後28日目に、倒立顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて、明視野観察を行った（図５Ａ−Ｈ）。図５Ａ右下のスケールバーは、1000μmを示す。【０１７６】
その結果、浮遊培養中にSAGを添加しない条件では、細胞塊の表面に非神経上皮様の構造を有する球形に近い組織が形成されていた（図５Ａ）。一方で、各濃度のSAGを添加した条件では、添加しない条件と比較してより大きく、表面の非神経上皮組織がラトケ嚢様に陥入し、細胞塊内部に神経上皮様の組織と間葉系細胞が存在する細胞塊が形成された（図５Ｂ-Ｈ）。上記の結果から、下垂体組織を有する細胞塊の製造には浮遊培養中のSAG濃度は100nMから5μMまでが適正であることが分かった。特に、SAGを終濃度が100nM、300nM、500nM、700nM、1μM又は2μMとなるように培養２日目に添加した条件（図５Ｂ−Ｇ）では、5μM添加した条件（図５Ｈ）と比較して、細胞塊の大きさが大きく、細胞塊表面の下垂体組織の形成が良好であった。【０１７７】
実施例５：ヒトES細胞からの下垂体組織を含む細胞塊の製造における分化誘導前の化合物処理の効果
ヒトES細胞（KhES-1株）を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。具体的な維持培養操作としては、実施例１と同様に行った。
培養した細胞を分化誘導する前処理として、播種した６日後にStemfit培地の培地交換と同時に何も添加しない条件（Control）、300nM SAGのみを添加した条件（+300nM SAG）、５μM SB-431542のみを添加した条件（+５μM SB-431542）、SAG とSB431542を同時に添加した条件（+SAG/SB）の４条件の細胞を維持培養した。【０１７８】
上記処理の翌日に、サブコンフレントとなった４条件のヒトES細胞を、それぞれ実施例１に記載の方法で浮遊培養による下垂体組織を含む細胞塊への分化誘導を実施した。
浮遊培養開始後28日目に、倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った（図６Ａ−Ｄ）。図６Ａ右下のスケールバーは、1000μmを示す。その結果、浮遊培養前に化合物（SAG及び／又はSB431542）を添加しない条件では、形成された細胞塊が小さく、外側の非神経上皮組織と内側の神経上皮組織の間に間葉系細胞が確認できなかった（図６Ａ）。300nM SAGのみで処理した条件では、無添加条件と比較して細胞塊が大きくなり、間葉系細胞の存在も確認できた（図６Ｂ）。５μM SB-431542のみを添加した条件及びSAG とSB431542を同時に添加した条件ではさらに大きな下垂体組織を含む細胞塊が形成された（図６Ｃ、Ｄ）。
上記の結果から、浮遊培養開始前に化合物処理を実施することで下垂体組織を含む細胞塊の形成効率が向上し、さらにその条件として５μM SB-431542のみを添加した条件（+５μM SB-431542）およびSAG とSB431542を同時に添加した条件（+SAG/SB）が好ましいことが分かった。【０１７９】
実施例６：ヒトES細胞からの下垂体組織を含む細胞塊の製造におけるWntシグナル伝達経路阻害物質添加条件の検討
ヒトES細胞（KhES-1株）を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作としては、実施例１と同様に行った。【０１８０】
その後、浮遊培養開始時に添加するWntシグナル伝達経路阻害物質の種類又は有無を変更する以外は実施例１と同様の条件で、96ウェルプレートでの浮遊培養を実施した。その際のWntシグナル伝達経路阻害物質として、PORCN阻害剤であるIWP-2、C-59（Cayman Chemicals社製、500nM）、LGK974（Cayman Chemicals社製、5μM）、TANK阻害剤であるXAV939（Cayman Chemicals社製、1μM）、IWR1-endo（メルクミリポア社製、1μM）および作用機序が報告されていないKY02111（Cayman Chemicals社製、5μM）を浮遊培養開始時に添加し、Wntシグナル伝達経路阻害物質無添加のコントロールとしてDMSOのみを添加した条件を実施した。
浮遊培養開始後2日目にY27632を含まず、各Wntシグナル伝達経路阻害物質、SB-431542、BMP4、SAGを含む無血清培地を1ウェルあたり100μｌ加えた。BMP4は添加する培地に3nM添加し、ウェル中の終濃度を1.5nMとし、SAGは添加する培地に4μM添加し、ウェル中の終濃度を2μMとなるようにした。
浮遊培養開始後6、10、13、17、21、24日目にY27632とBMP4を含まず、各Wntシグナル伝達経路阻害物質、SB-431542およびSAGを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。上記条件に加えて、浮遊培養中にSB431542とWntシグナル伝達経路阻害物質を両方とも加えない条件も実施した。
浮遊培養開始後28日目に、倒立顕微鏡（キーエンス社製、BIOREVO）を用いて、明視野観察を行った（図7Ａ〜Ｈ）。図７Ａ右下のスケールバーは、1000μmを示す。【０１８１】
その結果、SB431542とWntシグナル伝達経路阻害物質を両方とも加えない条件、およびSB431542を添加し、Wntシグナル伝達経路阻害物質を添加しない条件では、細胞塊の表面に非神経上皮組織が形成されなかった（図７Ａ、Ｂ）。一方で、Wntシグナル伝達経路阻害物質であるIWP-2、KY02111、C59、LGK974、XAV939、IWR1-endoを添加した条件では、表面に非神経上皮構造を有する細胞塊が形成された（図７Ｃ-Ｈ）。特に、2μM IWP-2、5μM KY02111、1μM XAV939、1μM IWR1eを添加した際に大きく状態の良い細胞塊が形成された（図７Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）。上記の結果より、PORCN阻害剤、TANK阻害剤等を用いてWntシグナル伝達経路を阻害することによりBMPシグナルによる下垂体組織を含む細胞塊表面の非神経上皮組織形成が促進されることが分かった。【０１８２】
実施例７：ヒトES細胞からの下垂体組織を含む細胞塊の製造におけるBMP4添加濃度の検討 
ヒトES細胞（KhES-1株、京都大学より入手）を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作としては、実施例１と同様に行った。
その後、実施例１と同様の条件で、96ウェルプレートでの浮遊培養を開始した。
浮遊培養開始後2日目にY27632を含まず、IWP-2、SB-431542、BMP4、SAGを含む無血清培地を1ウェルあたり100μｌ加えた。その際に、BMP4の添加量は0.5nM 、1.5nM、5nM 及び無添加コントロールの4条件とした。BMP4は添加する培地に設定した条件の2倍の濃度で添加し、ウェル中の終濃度が設定した条件となるようにした。SAGは添加する培地に4μM添加し、ウェル中の終濃度を2μMとなるようにした。
浮遊培養開始後6、10、13、17、21及び24日目にY27632とBMP4を含まず、IWP-2、SB-431542およびSAGを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。
浮遊培養開始後28日目に、倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った（図8Ａ〜Ｄ）。図８Ａ右下のスケールバーは、1000μmを示す。【０１８３】
その結果、BMP4を添加しない条件では、細胞塊表面に非神経上皮構造が形成されなかった（図８Ａ）。一方で、0.5nM、1.5nM、5nMのBMP4を添加した条件では、いずれも細胞塊表面に非神経上皮構造が形成された（図８Ｂ−Ｄ）。上記の結果より、浮遊培養２日目にBMP4を単回添加することで、下垂体組織を含む細胞塊表面の非神経上皮組織形成が生じることが分かった。【０１８４】
実施例８：ヒトES細胞からの下垂体組織を含む細胞塊の製造におけるTGFβシグナル伝達経路阻害条件の検討
ヒトES細胞（KhES-1株）を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作としては、実施例１と同様に行った。
その後、浮遊培養開始時に添加するTGFβシグナル伝達経路阻害物質の濃度及び種類を変更する以外は実施例１と同様の条件で、96ウェルプレートでの浮遊培養を実施した。その際のTGFβシグナル伝達経路阻害物質として、SB431542（1 or 10μM）、A 83-01（Cayman Chemicals社製、1 or 10μM）、RepSox（Cayman Chemicals社製、1μM）を各濃度条件で添加した。
その後、浮遊培養開始後2日目にY27632を含まず、IWP-2、各TGFβシグナル伝達経路阻害物質、BMP4、SAGを含む無血清培地を1ウェルあたり100μｌ加えた。BMP4は添加する培地に3nM添加し、ウェル中の終濃度を1.5nMとし、SAGは添加する培地に4μM添加し、ウェル中の終濃度を2μMとなるようにした。
浮遊培養開始後6、10、13、17、21、24日目にY27632とBMP4を含まず、IWP-2、各TGFβシグナル伝達経路阻害物質およびSAGを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。上記条件に加えて、浮遊培養中にTGFβシグナル伝達経路阻害物質とIWP-2を両方とも加えない条件、及びIWP-2を加え、TGFβシグナル伝達経路阻害物質を加えない条件も実施した。【０１８５】
その結果、工程（１）においてTGFβシグナル伝達経路阻害物質とIWP-2を両方とも加えない条件では、浮遊培養開始後28日目の細胞塊表面に非神経上皮構造が形成されなかった（図９Ａ）。IWP-2を加え、TGFβシグナル伝達経路阻害物質を加えない条件では、細胞塊表面に非神経上皮構造が形成されたが、形成された細胞塊が小さく、外側の非神経上皮組織と内側の神経上皮組織の間に間葉系細胞が確認できなかった（図９Ｂ）。各TGFβシグナル伝達経路阻害物質を添加した条件では、外側の非神経上皮組織と内側の神経上皮組織の間に間葉系細胞が存在する大きな下垂体組織を含む細胞塊が形成された（図９Ｃ−Ｇ）。上記の結果から、浮遊培養中にTGFβシグナル伝達経路阻害物質を添加することにより、外側の非神経上皮組織と内側の神経上皮組織の間に間葉系細胞が存在する大きな下垂体組織を含む細胞塊を製造できることが分かった。【０１８６】
実施例９：ヒトiPS細胞から作製された神経組織及び非神経上皮組織を含む細胞塊
ヒトiPS細胞（201B7株、iPSアカデミアジャパンより入手）を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作としては、実施例１と同様に実施した。
その後、実施例１と同様の条件で、96ウェルプレートでの浮遊培養を実施した。
浮遊培養開始後2日目にY27632を含まず、IWP-2、SB-431542、SAG、BMP4を含む無血清培地を1ウェルあたり100μｌ加えた。BMP4は添加する培地に3nM添加し、ウェル中の終濃度を1.5nMとし、SAGは添加する培地に4μM添加し、ウェル中の終濃度を2μMとなるようにした。
浮遊培養開始後6、10、13、17、21、24日目にY27632とBMP4を含まず、IWP-2、SB-431542及びSAGを含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。
浮遊培養開始後28日目に倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った（図１０Ａ、Ｂ）。図１０Ａ右下のスケールバーは1000μm、図１０Ｂ右下のスケールバーは200μmを示す。その結果、実施例１にてヒトES細胞株KhES-1から作製した際と同様に、ヒトiPS細胞株201B7から中心部の神経組織を非神経上皮組織が取り巻く細胞塊が形成されていることが分かった。
上記培養28日目の細胞塊を実施例１と同様の方法で固定し、凍結切片を作成した。これらの凍結切片に関し、下垂体の初期マーカーである抗Lhx3抗体、口腔上皮・下垂体プラコードマーカーである抗Pitx2抗体（R&D Systems社製、ヒツジ）、非神経上皮・プラコードマーカーである抗Six1抗体（Atlas Antibodies社製、ウサギ）、腹側間脳マーカーである抗Nkx2.1抗体、未分化神経およびプラコードマーカーであるSox2抗体、終脳およびプラコードマーカーであるBf1抗体（タカラバイオ社製、ウサギ）、非神経上皮組織マーカーである抗CD326/EpCAM抗体（R&D Systems社製、ヤギ）、抗汎サイトケラチン抗体、抗E-Cadherin抗体（Santa Cruz Biotechnology社製、マウス）未分化神経及び神経堤・間葉系細胞マーカーである抗Nestin抗体、神経細胞マーカーである抗βIIIチューブリン（Tuj1）抗体、間葉系細胞マーカーである抗Vimentin抗体（R&D Systems社製、ヤギ）を用いて蛍光免疫染色を行った。蛍光標識二次抗体として実施例１で用いたものに加えAlexa647標識ロバ抗ヤギ抗体（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて多重染色を行い、核の対比染色にはHoechst33342を用いた。図１０Ｆは図１０Ｃ、Ｄ、Ｅ、図１０Ｊは図１０Ｇ、Ｈ、Ｉ、図１０Ｎは図１０Ｋ、Ｌ、Ｍ、図１０Ｒは図１０Ｏ、Ｐ、Ｑに対する核の対比染色像である。染色した切片の観察および画像の取得には正立蛍光顕微鏡Axio Imager M2（ツァイス社製）および附属ソフトウェアのAxio Visionを用いた。図１０Ｃ右下のスケールバーは200μm、図１０Ｏ右下のスケールバーは100μmを示す。【０１８７】
その結果、ヒトiPS細胞株201B7より上記分化誘導法で誘導された浮遊培養開始後28日目の細胞塊の内側はNkx2.1、Sox2、Bf1、βIIIチューブリン陽性の腹側間脳・視床下部の神経上皮組織が存在し、外側はEpCAM、汎サイトケラチン、E-Cadherin、Pitx2陽性の口腔の非神経上皮組織であることが分かった。さらに、非神経上皮組織の一部はLhx3、Bf1、Sox2陽性であり、非神経上皮組織が陥入しているラトケ嚢様の構造と下垂体プラコードが形成されていることが分かった。加えて、外側の非神経上皮組織と内側の神経上皮組織の間に、Nestin、Vimentin陽性、汎サイトケラチン、ラミニン弱陽性、βIIIチューブリン陰性の頭部間葉系細胞が存在していた。上記の結果より、ヒトES細胞と同様にヒトiPS細胞から本発明の製造法により、非神経上皮と、神経上皮と、間葉系細胞とを含み、外側が非神経上皮に覆われ、内側に脳室様の構造を有する腹側間脳・視床下部様の神経上皮組織が形成され、非神経上皮と神経上皮の間に頭部間葉系細胞が存在し、外側の非神経上皮の一部が下垂体プラコードである細胞塊が製造可能であることが示された。【０１８８】
実施例１０：Wntシグナル伝達経路作用物質と阻害物質を併用してヒトiPS細胞から作製された神経組織及び非神経上皮組織を含む細胞塊
ヒトiPS細胞（HC-6#10株、理化学研究所より入手）を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作としては、実施例１と同様に実施した。【０１８９】
このようにして調製したサブコンフレントのヒトiPS細胞を、PBSにて洗浄後、Accumaxを用いて酵素処理を行った後、分化誘導用の無血清培地を添加しセルスクレーパーを用いて培養ディッシュ表面より細胞を剥がし、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトES細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の１ウェルあたり９×１０３細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12+Glutamax培地(Thermo Fisher Scientific社製)とIMDM+Glutamax培地(Thermo Fisher Scientific社製)の１：１混合液に5％ Knockout Serum Replacement(Thermo Fisher Scientific社製)、４５０μＭ １−モノチオグリセロール（和光純薬社製）、１ｘ Chemically defined lipid concentrate(Thermo Fisher Scientific社製)、50 unit/mlペニシリン-50μg/mlストレプトマイシン(ナカライテスク社製)を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目、工程１開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度２０μM）、SB-431542（TGFβシグナル伝達経路阻害物質、和光純薬社製、1μM）IWP-2（Wntシグナル伝達経路阻害物質、Tocris Bioscience社製、2μM）を添加した。加えて、Wntシグナル伝達経路作用物質としてCHIR99021（Cayman Chemical社製）を300nM、1μM、３μM添加した条件、および無添加のコントロールとしてDMSOのみを添加した条件に対の計４条件を設定した。尚、本実施例中、CHIR99021をCHIRと称する場合もある。
浮遊培養開始後2日目にY27632を含まず、SB-431542、IWP-2、BMP4（BMPシグナル伝達経路作用物質）及び各設定条件のCHIR99021を含む無血清培地を1ウェルあたり100μｌ加えた。BMP4は添加する培地に3nM添加し、ウェル中の終濃度を1.5nMとした。非神経上皮及びプラコードを含む細胞塊を誘導するための手法として、浮遊培養開始後３日目にY27632とBMP4を含まず、IWP−2、SB−431542、K02288（BMPシグナル伝達経路阻害物質、AdooQ  Bioscience社製）、FGF2-TS（FGFシグナル伝達経路作用物質、HumanZyme社製）及びHeparin  Sodium（富士フィルム和光純薬社製）を含む無血清培地を用いて半量培地交換を行った。K02288、FGF2とHeparin  Sodiumは添加する培地にそれぞれ2μM、40ng／ml、20μg／ml添加し、ウェル中の終濃度が1μM、20ng／ml、10μg／mlとなるようにした。浮遊培養開始後6日目、10日目に半量培地交換を行った。
浮遊培養開始後１３日目に倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った（図１１Ａ〜D）。図１１Ａ右下のスケールバーは1000μmを示す。その結果、実施例１にてヒトES細胞株KhES-1から作製した際と同様に、ヒトiPS細胞株HC-6#10株から中心部の神経組織を非神経上皮組織が取り巻く細胞塊が形成されていることが分かった。また、浮遊培養開始後３日目にBMPシグナル伝達経路阻害物質とFGFシグナル伝達経路作用物質を添加しても非神経上皮組織が表面に形成されることが分かった。さらに、Wntシグナル伝達経路阻害物質であるIWP-2存在下でも、Wntシグナル伝達経路作用物質であるCHIR99021は作用し、濃度依存的に細胞塊が大きくなる一方で、3μM CHIR99021添加条件では細胞塊表面の非神経上皮組織形成が阻害されていることが分かった。
上記培養１３日目の細胞塊を実施例１と同様の方法で固定し、凍結切片を作成した。これらの凍結切片に関し、非神経上皮・プラコードマーカーである抗Six1抗体、中枢神経系・プラコードマーカーである抗Dlx5抗体（Atlas Antibodies社製、ウサギ）、抗E-Cadherin抗体（R&D Systems社製、ヤギ）、抗N-Cadherin抗体（BD Biosciences社製、マウス）を用いて蛍光免疫染色を行った（図１１Ｅ〜Ｐ、図１２Ｑ〜AB）。染色した切片の観察および画像の取得には正立蛍光顕微鏡Axio Imager M2（ツァイス社製）および附属ソフトウェアのAxio Visionを用いた。図１１Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、図１２Ｑ、Ｔ、Ｗ、Ｚ右下のスケールバーは100μmを示す。【０１９０】
その結果、ヒトiPS細胞株HC-6#10より上記分化誘導法で誘導された浮遊培養開始後１３日目の細胞塊は、CHIR無添加条件および300nM、1μMのCHIRを添加した条件において、Dlx5、Six1、E-Cadherin、N-Cadherin陽性の非神経上皮ないしプラコード前駆組織の形成が見られた（図１１Ｅ〜Ｐ、図１２Ｑ〜V）。３μMのCHIRを添加した条件では、非神経上皮の形成が見られず、別の組織への分化が生じていることが示唆された（図１２W〜AB）。また、CHIR無添加条件および300nM、1μMのCHIRを添加した条件を比較したところ、CHIR無添加条件に対して300nM CHIRを添加した条件のほうがより大きな細胞塊が形成され、内部の神経組織の生存と上皮形成が促進されていた。一方で、1μMのCHIRを添加した条件では外側の非神経上皮の肥厚化・プラコード形成が抑制されていた。上記の結果から、Wntシグナル伝達経路阻害物質であるIWP-2存在下で一定の程度（３μM CHIR99021以下程度）のβカテニン依存的な古典的Ｗｎｔ経路活性化は細胞塊全体の成長、内部の神経組織の生存と上皮形成の促進に有効であることが示された。【０１９１】
実施例１１：Wntシグナル伝達経路作用物質と阻害物質を併用してヒトiPS細胞から作製された神経組織及び下垂体組織を含む細胞塊
ヒトiPS細胞（HC-6#10株、理化学研究所より入手）を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作としては、実施例１と同様に実施した。【０１９２】
このようにして調製したサブコンフレントのヒトiPS細胞を、PBSにて洗浄後、Accumaxを用いて酵素処理を行った後、分化誘導用の無血清培地を添加しセルスクレーパーを用いて培養ディッシュ表面より細胞を剥がし、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトES細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の１ウェルあたり９×１０３細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12+Glutamax培地(Thermo Fisher Scientific社製)とIMDM+Glutamax培地(Thermo Fisher Scientific社製)の１：１混合液に5％ Knockout Serum Replacement(Thermo Fisher Scientific社製)、４５０μＭ １−モノチオグリセロール（和光純薬社製）、１ｘ Chemically defined lipid concentrate(Thermo Fisher Scientific社製)、50 unit/mlペニシリン-50μg/mlストレプトマイシン(ナカライテスク社製)を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目、工程１開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度２０μM）、SB-431542（TGFβシグナル伝達経路阻害物質、和光純薬社製、1μM）IWP-2（Wntシグナル伝達経路阻害物質、Tocris Bioscience社製、2μM）を添加した。加えて、Wntシグナル伝達経路作用物質としてCHIR99021（Cayman Chemical社製）を300nM添加した。
浮遊培養開始後2日目にY27632を含まず、SB-431542、IWP-2、CHIR99021、BMP4（BMPシグナル伝達経路作用物質）、SAG（Shhシグナル伝達経路作用物質）を含む無血清培地を1ウェルあたり100μｌ加えた。BMP4は添加する培地に3nM添加し、ウェル中の終濃度を1.5nMとした。SAGは添加する培地に1.4μM添加し、ウェル中の終濃度を700nMとなるようにした。
浮遊培養開始後６、１０、１３日目にY27632、BMP4を含まず、SAG、SB-431542、IWP-2、CHIR99021を同濃度含む無血清培地で半量培地交換を行った。浮遊培養開始後１７、２１、２４日目にSAG、SB-431542、IWP-2、CHIR99021に加えて形成されたプラコード前駆組織をさらに成長させる目的でFGF2-TS（FGFシグナル伝達経路作用物質、HumanZyme社製、20ng/ml）、ヘパリンナトリウム（FGF安定化剤、富士フイルム和光純薬社製、10μg/ml）を含む無血清培地で半量培地交換を行った。
浮遊培養開始後２８日目に倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った（図１３Ａ）。図１１Ａ右下のスケールバーは1000μmを示す。その結果、実施例１にてヒトES細胞株KhES-1から作製した際と同様に、SAGを添加した条件においてヒトiPS細胞株HC-6#10株から中心部の神経組織を非神経上皮組織が取り巻く細胞塊が形成されていることが分かった。
上記培養２８日目の細胞塊を実施例１と同様の方法で固定し、凍結切片を作成した。これらの凍結切片に関し、Lhx3、Nkx2.1、E-Cadherin、Nestin、Pitx2、Sox2、Six1、Vimentin、Rx、N-Cadherin、Tbx3、汎サイトケラチンに対する抗体を用いて実施例１と同様の方法で蛍光免疫染色を行った（図１３Ｂ〜Ｉ、図１４Ｊ〜Ｖ）。図１３Ｅ、Ｉ、図１４Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｖは同行の免疫染色像に対する細胞核の対比染色像である。【０１９３】
その結果、ヒトiPS細胞株HC-6#10株より上記Wntシグナル伝達経路作用物質とFGFシグナル伝達経路作用物質を添加した分化誘導法で誘導された浮遊培養開始後28日目の細胞塊の内側はNkx2.1、Sox2、Tbx3、Rx、N-Cadherin陽性の腹側間脳・視床下部の神経上皮組織が存在し、外側は汎サイトケラチン、E-Cadherin、Pitx2陽性の口腔の非神経上皮組織であることが分かった。さらに、非神経上皮組織の一部はLhx3、Six1、Sox2陽性であり、非神経上皮組織が陥入しているラトケ嚢様の構造と下垂体プラコードが形成されていることが分かった。加えて、外側の非神経上皮組織と内側の神経上皮組織の間に、Nestin、Vimentin陽性、汎サイトケラチン弱陽性の頭部間葉系細胞が存在していた。上記の結果より、ヒトiPS細胞からWntシグナル伝達経路作用物質とFGFシグナル伝達経路作用物質を添加した分化誘導条件により、非神経上皮と、神経上皮と、間葉系細胞とを含み、外側が非神経上皮に覆われ、内側に脳室様の構造を有する腹側間脳・視床下部様の神経上皮組織が形成され、非神経上皮と神経上皮の間に頭部間葉系細胞が存在し、外側の非神経上皮の一部が下垂体プラコードである細胞塊が製造可能であることが示された。【０１９４】
実施例１２：BMPシグナル伝達経路作用物質を添加して一定期間後にBMPシグナル伝達経路阻害物質を用いてヒトiPS細胞から作製された神経組織及び非神経上皮組織を含む細胞塊
ヒトiPS細胞（HC-6#10株、理化学研究所より入手）を、Scientific Reports, 4, 3594 (2014)に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で培養した。フィーダーフリー培地としてはStemFit培地、フィーダーフリー足場にはLaminin511-E8を用いた。
具体的な維持培養操作としては、実施例１と同様に実施した。【０１９５】
このようにして調製したサブコンフレントのヒトiPS細胞を、PBSにて洗浄後、Accumaxを用いて酵素処理を行った後、分化誘導用の無血清培地を添加しセルスクレーパーを用いて培養ディッシュ表面より細胞を剥がし、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。その後、前記単一細胞に分散されたヒトES細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（PrimeSurface 96V底プレート，住友ベークライト社製）の１ウェルあたり９×１０３細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で浮遊培養した。その際の無血清培地（gfCDM+KSR）には、F-12+Glutamax培地(Thermo Fisher Scientific社製)とIMDM+Glutamax培地(Thermo Fisher Scientific社製)の１：１混合液に5％ Knockout Serum Replacement(Thermo Fisher Scientific社製)、４５０μＭ １−モノチオグリセロール（和光純薬社製）、１ｘ Chemically defined lipid concentrate(Thermo Fisher Scientific社製)、50 unit/mlペニシリン-50μg/mlストレプトマイシン(ナカライテスク社製)を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目、工程１開始）に、前記無血清培地にY27632（終濃度２０μM）、SB-431542（TGFβシグナル伝達経路阻害物質、和光純薬社製、1μM）、IWP-2（Wntシグナル伝達経路阻害物質、Tocris Bioscience社製、2μM）、CHIR99021（Wntシグナル伝達経路作用物質、Cayman Chemical社製、300nM）を添加した。
浮遊培養開始後2日目にY27632を含まず、SB-431542、IWP-2、CHIR99021、BMP4（BMPシグナル伝達経路作用物質）、SAG（Shhシグナル伝達経路作用物質）を含む無血清培地を1ウェルあたり100μｌ加えた。BMP4は添加する培地に3nM添加し、ウェル中の終濃度を1.5nMとした。SAGは添加する培地に1.4μM添加し、ウェル中の終濃度を700nMとなるようにした。浮遊培養開始後３、６、１０、１３日目にY27632、BMP4を含まず、SAG、SB-431542、IWP-2、CHIR99021を同濃度含む無血清培地で半量培地交換を行った。また、その際に浮遊培養開始後３、６、１０日目のいずれかの時点でK02288（BMPシグナル伝達経路阻害物質、Adooq BioScience社製、300nM）を半量培地交換時に添加する条件、およびコントロールとして溶媒のDMSOを添加した4条件を設定した。K02288は添加する培地に600nM添加し、ウェル中の終濃度を300nMとした。浮遊培養開始後１７、２１、２４日目にSAG、SB-431542、IWP-2、CHIR99021、K02288に加えて形成されたプラコード前駆組織をさらに成長させる目的で終濃度が20ng/ml FGF2-TS、10μg/mlヘパリンナトリウムとなる無血清培地で半量培地交換を行った。浮遊培養開始後２８日目に倒立顕微鏡を用いて明視野観察を行った（図１５Ａ〜D）。図１５Ａ右下のスケールバーは1000μmを示す。その結果、K02288無添加のコントロールに加えて、浮遊培養開始後３、６、１０日目のいずれかの時点でK02288を添加した条件でも、中心部の神経組織を非神経上皮組織が取り巻く細胞塊が形成されていることが分かった。
さらに、浮遊培養開始後６日目にK02288を添加し分化誘導した上記培養２８日目の細胞塊を実施例１と同様の方法で固定し、凍結切片を作成した。これらの凍結切片に関し、Lhx3、Nkx2.1、E-Cadherin、Nestin、Pitx2、Sox2、Six1、Vimentin、Rx、N-Cadherin、Tbx3、汎サイトケラチンに対する抗体を用いて実施例１と同様の方法で蛍光免疫染色を行った（図１５Ｅ〜Ｌ、図１６Ｍ〜Ｙ）。図１５Ｈ、Ｌ、図１６Ｐ、Ｓ、Ｖ、Ｙは同行の免疫染色像に対する細胞核の対比染色像である。
その結果、ヒトiPS細胞株HC-6#10株より上記BMPシグナル伝達経路作用物質を添加して一定期間後にBMPシグナル伝達経路阻害物質を添加する分化誘導法で誘導された浮遊培養開始後28日目の細胞塊の内側はNkx2.1、Sox2、Tbx3、Rx、N-Cadherin陽性の腹側間脳・視床下部の神経上皮組織が存在し、外側は汎サイトケラチン、E-Cadherin、Pitx2陽性の口腔の非神経上皮組織であることが分かった。さらに、非神経上皮組織の一部はLhx3、Six1、Sox2陽性であり、非神経上皮組織が陥入しているラトケ嚢様の構造と下垂体プラコードが形成されていることが分かった。加えて、外側の非神経上皮組織と内側の神経上皮組織の間に、Nestin、Vimentin陽性、汎サイトケラチン弱陽性の頭部間葉系細胞が存在していた。さらに、BMPシグナル伝達経路阻害物質を添加することにより、細胞塊表面における下垂体プラコードマーカーLhx3陽性細胞の割合が極めて高い細胞塊を得ることができた。
上記の結果より、ヒトiPS細胞からBMPシグナル伝達経路作用物質を添加して一定期間後にBMPシグナル伝達経路阻害物質を添加する分化誘導条件により、非神経上皮の一部に形成される下垂体プラコードの割合を高めることができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１９６】
本発明によれば、多能性幹細胞から腹側間脳等の中枢神経系組織、頭部間葉系細胞と下垂体組織をともに含んでなる細胞塊を低コストに効率よく製造することが可能になる。
本出願は、日本で出願された特願2017-226312(出願日:2017年11月24日)を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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