(57)【要約】  対象の筋肉の合成を促進できる発酵乳が提供される。乳タンパク質濃度が１．９質量％以上である発酵乳を、対象へ摂取させることにより、対象の筋肉の合成を促進することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳タンパク質濃度が１．９質量％以上である、筋肉合成促進用発酵乳。
【請求項２】
乳タンパク質濃度が３．０質量％以上である、請求項１に記載の筋肉合成促進用発酵乳。
【請求項３】
発酵乳が、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）およびストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）により発酵されたものである、請求項１または２に記載の筋肉合成促進用発酵乳。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の発酵乳を含む、筋肉合成促進用食品。
【請求項５】
乳タンパク質濃度が１．９質量％以上である発酵乳を、対象に摂取させることを含んでなる、筋肉合成促進方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本願特許出願は、２０１７年１２月１８日に出願された日本出願特願２０１７−２４２０７６号に基づく優先権の主張を伴うものであり、この日本出願の全開示内容は、引用することにより本願発明の開示の一部とされる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、乳タンパク質濃度が１．９質量％以上である筋肉合成促進用発酵乳に関する。
【背景技術】
【０００３】
サルコペニアなどに伴う筋肉の低下は、近年注目を集めている。筋肉の萎縮は、要介護および要支援のリスクを増加させ、高齢者のＱＯＬや健康寿命を低下させる大きな要因といわれている。従って、サルコペニアなどに伴う筋肉の低下の予防は超高齢社会を迎えた日本の大きな課題である。【０００４】
サルコペニアなどに伴う筋肉の低下の予防のためには、タンパク質や分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）を摂取すること、もしくは、吸収速度が速く血中アミノ酸濃度が増加しやすいタンパク質源を摂取することが重要である。例えば、ＢＣＡＡの一つであるロイシン（Ｌｅｕ）は、筋タンパク質の合成促進に重要な役割を果たしていることが知られており（非特許文献１〜３参照）、特に、高齢者では、血中のＬｅｕ濃度のピークを高くすることが筋肉合成に有用であることが示唆されている（非特許文献４〜６参照）。しかし、タンパク質やＢＣＡＡを多く摂取することは、そのような製品の製造適性の面や、摂取のし易さという点から困難であった。また、発酵乳における筋肉合成促進効果についてはこれまで全く知られていなかった。【０００５】
従って、筋肉の合成促進に用いることができる、製品の製造適性に優れ、摂取のし易い製品の開発が希求されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Anthony JC et al., 1999, Leucine supplementation enhances skeletal muscle recovery in rats following exercise., J Nutr. 1999, 129: 1102-1106.
【非特許文献２】Koopman R et al., 2005, Combined ingestion of protein and free leucine with carbohydrate increases postexercise muscle protein synthesis in vivo in male subjects., Am J Physiol Endocrinol Metab., 288: E645-E653.
【非特許文献３】Atherton PJ et al., 2010, Distinct anabolic signalling responses to amino acids in C2C12 skeletal muscle cells., Amino Acids., 38 :1533-1539.
【非特許文献４】Breen L & Phillips SM., 2011, Skeletal muscle protein metabolism in the elderly: Interventions to counteract the 'anabolic resistance' of ageing., Nutr Metab (Lond). 8:68. doi: 10.1186/1743-7075-8-68.
【非特許文献５】Katsanos CS et al., 2006, A high proportion of leucine is required for optimal stimulation of the rate of muscle protein synthesis by essential amino acids in the elderly., Am J Physiol Endocrinol Metab., 291: E381-E387.
【非特許文献６】Rieu I et al., 2006, Leucine supplementation improves muscle protein synthesis in elderly men independently of hyperaminoacidaemia. J Physiol., 575(Pt 1):305-315.
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、特定の発酵乳を対象へ摂取させることにより、対象の筋肉の合成を顕著に促進できることを見出した。
【０００８】
従って、本発明は、筋肉合成促進用発酵乳および筋肉合成促進方法等を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）乳タンパク質濃度が１．９質量％以上である、筋肉合成促進用発酵乳。
（２）乳タンパク質濃度が３．０質量％以上である、（１）に記載の筋肉合成促進用発酵乳。
（３）発酵乳が、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）およびストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）により発酵されたものである、（１）または（２）に記載の筋肉合成促進用発酵乳。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の発酵乳を含む、筋肉合成促進用食品。
（５）乳タンパク質濃度が１．９質量％以上である発酵乳を、対象に摂取させることを含んでなる、筋肉合成促進方法。
（６）筋肉合成促進用組成物の製造のための、乳タンパク質濃度が１．９質量％以上である発酵乳の使用。
（７）筋肉合成促進用組成物の製造のための、乳タンパク質濃度が３．０質量％以上である、（６）に記載の発酵乳の使用。
（８）発酵乳が、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）およびストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）により発酵されたものである、（６）または（７）に記載の、使用。
（９）筋肉合成促進用食品の製造のための、（６）〜（８）のいずれかに記載の発酵乳の使用。
【００１０】
本発明の発酵乳を対象へ摂取させることにより、対象の筋肉の合成を顕著に促進できる点で有利である。また、本発明の発酵乳は製造適性に優れ、摂取し易い点でも有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、投与後の経過時間（分）に対する門脈血中総アミノ酸量（μＭ）を表す。「投与物なし（第１群）」とは脱脂発酵乳および脱脂乳のいずれも投与していない群を表す。「脱脂発酵乳（第７〜１１群）」と、「脱脂乳（第２〜６群）」についての二元配置分散分析の結果は、Ｆｏｏｄ  Ｅｆｆｅｃｔ：ｐ＜０．０１、Ｔｉｍｅ  Ｅｆｆｅｃｔ：Ｐ＜０．００１、およびＦｏｏｄ×Ｔｉｍｅ  Ｅｆｆｅｃｔ：Ｐ＜０．０１である。交互作用（Ｆｏｏｄ×Ｔｉｍｅ  Ｅｆｆｅｃｔ）が有意であったので各時点での単純主効果の対比較を実施し、結果を図１中に示した。図１中、「＊＊」は脱脂発酵乳と脱脂乳の間のＰ値が＜０．０１であることを表し、「＊＊＊」は脱脂発酵乳と脱脂乳の間のＰ値が＜０．００１であることを表す。このことは「脱脂発酵乳（第７〜１１群）」の門脈血中総アミノ酸量は、「脱脂乳（第２〜６群））」よりも３０分後、６０分後の各ポイントで両群を比較した場合に有意差があることを意味する。また、図１中、「†」は「投与物なし（第１群）」に対するＰ値が＜０．０５であることを表し、「†††」は「投与物なし（第１群）」に対するＰ値が＜０．００１であることを表す。
【図２】図２は、投与後の経過時間（分）に対する門脈血中ロイシン量（μＭ）を表す。「投与物なし（第１群）」とは脱脂発酵乳および脱脂乳のいずれも投与していない群を表す。「脱脂発酵乳（第７〜１１群）」と、「脱脂乳（第２〜６群）」についての二元配置分散分析の結果は、Ｆｏｏｄ  Ｅｆｆｅｃｔ：ｐ＜０．０５、Ｔｉｍｅ  Ｅｆｆｅｃｔ：Ｐ＜０．００１、およびＦｏｏｄ×Ｔｉｍｅ  Ｅｆｆｅｃｔ：Ｐ＜０．００１である。交互作用（Ｆｏｏｄ×Ｔｉｍｅ  Ｅｆｆｅｃｔ）が有意であったので各時点での単純主効果の対比較を実施し、結果を図２中に示した。図２中、「＊＊＊」は脱脂発酵乳と脱脂乳の間のＰ値が＜０．００１であることを表す。このことは「脱脂発酵乳（第７〜１１群）」の門脈血中ロイシン量は、「脱脂乳（第２〜６群）」よりも３０分後、６０分後の各ポイントで両群を比較した場合に有意差があることを意味する。図２中、「†††」は「投与物なし（第１群）」に対するＰ値が＜０．００１であることを表す。
【図３】図３は、投与後の経過時間（分）に対する骨格筋合成速度（ＦＳＲ（Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｒａｔｅ））を表す。「投与物なし（第１群）」とは脱脂発酵乳および脱脂乳のいずれも投与していない群を表す。「脱脂発酵乳（第７〜１１群）」と、「脱脂乳（第２〜６群）」についての二元配置分散分析の結果は、Ｆｏｏｄ  Ｅｆｆｅｃｔ：ｐ＜０．０１、Ｔｉｍｅ  Ｅｆｆｅｃｔ：Ｐ＜０．０５、およびＦｏｏｄ×Ｔｉｍｅ  Ｅｆｆｅｃｔ：Ｐ＝０．９３である。交互作用（Ｆｏｏｄ×Ｔｉｍｅ  Ｅｆｆｅｃｔ）が有意でなく、群（Ｆｏｏｄ  Ｅｆｆｅｃｔ）の主効果が有意であるということは、「脱脂発酵乳（第７〜１１群）」と「脱脂乳（第２〜６群）」のＦＳＲは３０分後、６０分後、９０分後、１２０分後、および２４０分後において同様の推移（３０〜６０分後を最大値として時間経過とともに低下していく）を示すが、投与２４０分後までの経過時間全体としてのＦＳＲは「脱脂発酵乳（第７〜１１群）」で「脱脂乳（第２〜６群）」より有意に高い値で推移したことを意味する。図３中、「†」は「投与物なし（第１群）」に対するＰ値が＜０．０５であることを表し、「†††」は「投与物なし（第１群）」に対するＰ値が＜０．００１であることを表す。
【図４】図４は、投与後の経過時間（分）に対する門脈血中総アミノ酸量（μＭ）を表す。「投与物なし（第Ａ群）」とは脱脂発酵乳および脱脂乳のいずれも投与していない群を表す。脱脂発酵乳（第Ｅ〜Ｇ群）」と、「脱脂乳（第Ｂ〜Ｄ群）」についての二元配置分散分析の結果は、Ｆｏｏｄ  Ｅｆｆｅｃｔ：Ｐ＜０．０５、Ｔｉｍｅ  Ｅｆｆｅｃｔ：Ｐ＜０．００１、およびＦｏｏｄ×Ｔｉｍｅ  Ｅｆｆｅｃｔ：Ｐ＜０．０１である。交互作用（Ｆｏｏｄ×Ｔｉｍｅ  Ｅｆｆｅｃｔ）が有意であったので各時点での単純主効果の対比較を実施し、結果を図４中に示した。図４中、「＊＊＊」は脱脂発酵乳と脱脂乳の間のＰ値が＜０．００１であることを表す。このことは「脱脂発酵乳（第Ｅ〜Ｇ群）」の門脈血中総アミノ酸量は、「脱脂乳（第Ｂ〜Ｄ群）」よりも３０分後において両群を比較した場合に有意差があることを意味する。また、図４中、「††」は「投与物なし（第Ａ群）」に対するＰ値が＜０．０１であることを表し、「†††」は「投与物なし（第Ａ群）」に対するＰ値が＜０．００１であることを表す。
【図５】図５は、投与後の経過時間（分）に対する門脈血中ロイシン量（μＭ）を表す。「投与物なし（第Ａ群）」とは脱脂発酵乳および脱脂乳のいずれも投与していない群を表す。「脱脂発酵乳（第Ｅ〜Ｇ群）」と、「脱脂乳（第Ｂ〜Ｄ群）」についての二元配置分散分析の結果は、Ｆｏｏｄ  Ｅｆｆｅｃｔ：Ｐ＜０．００１、Ｔｉｍｅ  Ｅｆｆｅｃｔ：Ｐ＜０．００１、およびＦｏｏｄ×Ｔｉｍｅ  Ｅｆｆｅｃｔ：Ｐ＜０．００１である。交互作用（Ｆｏｏｄ×Ｔｉｍｅ  Ｅｆｆｅｃｔ）が有意であったので各時点での単純主効果の対比較を実施し、結果を図５中に示した。図５中、「＊」は脱脂発酵乳と脱脂乳の間のＰ値が＜０．０５であることを表し、「＊＊＊」は脱脂発酵乳と脱脂乳の間のＰ値が＜０．００１であることを表す。このことは「脱脂発酵乳（第Ｅ〜Ｇ群）」の門脈血中ロイシン量は、「脱脂乳（第Ｂ〜Ｄ群）」よりも３０分後、６０分後の各ポイントで両群を比較した場合に有意差があることを意味する。図５中、「†††」は「投与物なし（第Ａ群）」に対するＰ値が＜０．００１であることを表す。
【図６】図６は、投与後の経過時間（分）に対する骨格筋合成速度（ＦＳＲ（Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｒａｔｅ））を表す。「投与物なし（第Ａ群）」とは脱脂発酵乳および脱脂乳のいずれも投与していない群を表す。「脱脂発酵乳（第Ｅ〜Ｇ群）」と、「脱脂乳（第Ｂ〜Ｄ群）」についての二元配置分散分析の結果は、Ｆｏｏｄ  Ｅｆｆｅｃｔ：Ｐ＜０．０５、Ｔｉｍｅ  Ｅｆｆｅｃｔ：Ｐ＜０．０５、およびＦｏｏｄ×Ｔｉｍｅ  Ｅｆｆｅｃｔ：Ｐ＝０．１６である。交互作用（Ｆｏｏｄ×Ｔｉｍｅ  Ｅｆｆｅｃｔ）が有意でなく、群（Ｆｏｏｄ  Ｅｆｆｅｃｔ）の主効果が有意であるということは、投与後の時間に関わらず、投与後３０〜９０分後において、「脱脂発酵乳（第Ｅ〜Ｇ群）」の方が、「脱脂乳（第Ｂ〜Ｄ群）」より有意に高い値で推移したことを意味する。図６中、「†」は「投与物なし（第Ａ群）」に対するＰ値が＜０．０５であることを表す。
【発明の具体的説明】
【００１２】
微生物の寄託
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ＯＬＬ２０５０１３株は、２０１７年２月３日付け（原寄託日）で独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４１１の下でブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００１３】
Streptococcus thermophiles ＯＬＳ３２９０株は、２００４年１月１９日付け（原寄託日）で独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９６３８の下でブダペスト条約に基づき国際寄託されている。なお、本寄託菌株は２０１３年９月３０日（発行日）（移管請求は２０１３年９月６日に受領された）に、国内寄託（原寄託）からブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。
【００１４】
本発明の発酵乳は、乳タンパク質濃度が１．９質量％以上である筋肉合成促進用発酵乳（または、筋肉合成増強用発酵乳）である。発酵乳としては、特に限定されるものではないが、好ましくはヨーグルトである。
【００１５】
本発明の発酵乳は、乳に乳酸菌等の発酵微生物を加えて、発酵させた培養物として得ることができる。本発明の発酵乳の製造に際し、乳酸菌スターターを所定量、例えば発酵乳の原料に対して０．１〜１０質量％、好ましくは０．２〜３質量％、さらに好ましくは０．５〜２質量％を添加して発酵ミックスとする。発酵乳の原料にスターターとして接種する発酵微生物としては、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococus lactis）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）等の乳酸桿菌や、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）等の乳酸球菌や、ビフィズス菌や、プロピオン酸菌や、酵母等の中から選ばれる１種または２種以上を用いることができ、好ましくは、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）およびラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）の組み合わせを用いることができる。発酵乳の原料にスターターとして接種する発酵微生物として、より好ましくは、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）２０３８株およびストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）１１３１株の組み合わせ、または、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）ＯＬＬ２０５０１３株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４１１）およびストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）ＯＬＳ３２９０株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９６３８）の組み合わせを用いることができる。発酵乳の原料にスターターとして接種する発酵微生物として、特に好ましくは、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）ＯＬＬ２０５０１３株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４１１）およびストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）ＯＬＳ３２９０株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９６３８）の組み合わせを用いることができる。
【００１６】
本発明の発酵乳に含まれる無脂乳固形分の含有量は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、発酵乳に対して、好ましくは８〜２０質量％であり、より好ましくは１４〜１７質量％である。ここで、無脂乳固形分とは、発酵乳中の全固形分から脂質を除いた成分を意味し、例えば、タンパク質、灰分、および糖質が含まれる。また、本発明の発酵乳の無脂乳固形分中のタンパク質には、乳発酵成分由来のタンパク質が含まれる。乳発酵成分は、生体から採取された乳のみならず、その分画または、加工したものを発酵して得ることができる。乳の分画または加工品としては、好ましくは牛乳の分画または加工品であり、例えば、部分脱脂乳、脱脂乳、脱脂濃縮乳、還元全乳、還元脱脂粉乳、還元部分脱脂乳、乳たんぱく質濃縮物（ＭＰＣ）、分離ミルクたんぱく質（ＭＰＩ）、ホエー、酸カゼイン、発酵乳またはクワルク等を製造した際に得られるカゼインホエー、酸ホエー、クワルクホエー、カゼイン、カゼインナトリウム、脱脂粉乳、全粉乳、ホエーたんぱく濃縮物（ＷＰＣ）、ホエーたんぱく分離物（ＷＰＩ）、α―ラクトアルブミン、β―ラクトグロブリン、ラクトフェリン、バター、バターミルク、クリーム、ホエーペプチド、大豆ホエー等を挙げることができ、脱脂濃縮乳、ＭＰＣ、ＭＰＩ、脱脂粉乳が特に好ましい。
【００１７】
本発明の発酵乳に含まれる無脂乳固形分中の乳タンパク質濃度の下限は、特に制限はされないが、好ましくは３０質量％であり、より好ましくは３４質量％であり、さらに好ましくは４２質量％である。また、本発明の発酵乳に含まれる無脂乳固形分中の乳タンパク質濃度の上限は、特に制限はされないが、好ましくは８０質量％であり、より好ましくは６５質量％であり、さらに好ましくは６０質量％である。
【００１８】
また、本発明の発酵乳中の乳タンパク質濃度の下限は、特に制限はされないが、好ましくは１．９質量％であり、より好ましくは３．０質量％であり、さらに好ましくは４．０質量％であり、特に好ましくは５．８質量％である。また、本発明の発酵乳中の乳タンパク質濃度の上限は、特に制限はされないが、好ましくは１５質量％であり、より好ましくは１２質量％であり、さらに好ましくは１１質量％であり、さらに好ましくは１０質量％であり、特に好ましくは８質量％である。本発明の発酵乳中の乳タンパク質濃度の好ましい範囲としては、５．８〜８質量％であり、より好ましい範囲としては、６〜７質量％であり、さらに好ましい範囲としては６〜６．５質量％である。本発明の発酵乳中の乳タンパク質濃度は、例えばケルダール法により測定することができる。
【００１９】
本発明の発酵乳には、さらに食物繊維、安定剤、脂質、ビタミン、ミネラルなどを含んでいてもよい。
【００２０】
食物繊維としては、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、食品中に元来存在する可食性のもの、物理的、酵素的もしくは化学的処理により得られたもの、または合成されたものが挙げられる。また、食物繊維は、高分子水溶性食物繊維であっても低分子水溶性食物繊維であっても、不溶性食物繊維であってもよい。かかる食物繊維としては、セルロース、カルボキシメチルセルロース、寒天、キサンタンガム、サイリウム種皮、ジュランガム、低分子アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ポリデキストロース、アラビアガム、難消化性デキストリン、ビートファイバー、グァーガム、グァーガム酵素分解物、小麦胚芽、湿熱処理デンプン（難消化性デンプン）、レジスタントスターチ、タマリンドシードガム、ローカストビーンガム、プルラン、イヌリン等の多糖類が挙げられる。また、食物繊維として、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖、ビートオリゴ糖、ゲンチオリゴ糖、キシロオリゴ糖、大豆オリゴ糖等のオリゴ糖またはそれらオリゴ糖の組み合わせが挙げられる。
【００２１】
安定剤としては、水溶性大豆多糖類、セルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、アルギン酸プロピレングリコールエステル、でんぷん、加工でんぷん、カラギナン、キサンタンガム、ジェランガム、タマリンドシードガム、タラガムおよびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００２２】
脂質としては、食品または医薬用途に使用可能なものであれば特に限定されず、いずれのものであっても良い。このような脂質としては、植物性油脂、動物性油脂、微生物油脂、合成トリグリセリド、リン脂質等が挙げられる。これらは、単独で使用しても、任意に組み合わせて使用しても良い。
【００２３】
ビタミンとしては、食品または医薬用途に使用可能なものであれば特に限定されず、１種であっても複数の混合物であっても良い。
【００２４】
ミネラルとしては、食品または医薬用途に使用可能なものであれば特に限定されず、１種であっても複数の混合物であっても良い。
【００２５】
本発明において、「筋肉合成促進」とは、本発明の筋肉合成促進用発酵乳を対象が摂取しない場合と比較して、本発明の筋肉合成促進用発酵乳を対象が摂取した場合に僅かでも多く筋肉の合成がみられれば、筋肉合成促進効果を有するとする。ここで、「筋肉合成速度上昇」とは、対象の絶食下での筋肉の合成速度に対して、本発明品などのタンパク質を含んだ食品を対象が摂取した場合に僅かでも筋肉の合成速度が速くなれば、筋肉合成速度上昇効果を有するとする。さらに、筋肉合成速度の上昇はタンパク質を含んだ食品を摂取してから数時間にわたり認められることが知られており、そのタンパク質合成速度上昇の積算がタンパク質を含んだ食品の実質の「筋肉合成促進効果」である。つまり、本発明の好ましい態様によれば、本発明の「筋肉合成促進」とは、同じ乳タンパク質濃度を有する発酵していない乳を摂取した場合と比較して、本発明の発酵乳を摂取した場合の方が摂取後のある一定時間の筋合成速度上昇の程度が大きい、および／または摂取後ある時間幅における筋合成速度上昇持続時間が長い場合に、筋肉合成促進効果を顕著に有するとする。本発明のより好ましい態様によれば、本発明の「筋肉合成促進」とは、同じ乳タンパク質濃度を有する発酵していない乳を摂取した場合と比較して、本発明の発酵乳を摂取した場合の方がＦＳＲが速い場合に、筋肉合成促進効果をより顕著に有するとする。
【００２６】
本発明の筋肉合成促進用発酵乳は、好ましくは骨格筋合成促進用発酵乳である。骨格筋とは、筋肉の中で骨格に付着し、関節の可動や姿勢制御などの役割を持つものであり、心筋以外の横紋筋を意味する。
【００２７】
また、本発明の好ましい態様によれば、本発明の筋肉合成促進用発酵乳を摂取した対象は、同じ乳タンパク質濃度を有する発酵していない乳を対象が摂取した場合と比較して摂取後の経過時間全体で、骨格筋合成速度（ＦＳＲ）が、例えば、好ましくは０．１％／日以上、より好ましくは０．３％／日以上、さらに好ましくは０．５％／日以上上昇する。本発明のより好ましい態様によれば、本発明の筋肉合成促進用発酵乳を摂取した対象は、同じ乳タンパク質濃度を有する発酵していない乳を対象が摂取した場合と比較して摂取後の各時点（例えば、摂取後３０分、６０分、９０分、１２０分、および２４０分）のいずれか若しくはいずれの時点においても骨格筋合成速度（ＦＳＲ）が、例えば、好ましくは０．１％／日以上、より好ましくは０．３％／日以上、さらに好ましくは０．５％／日以上上昇する。
【００２８】
本発明の別の好ましい態様によれば、本発明の筋肉合成促進用発酵乳を摂取した対象は、絶食状態の対象の骨格筋合成速度から好ましくは０．１％／日以上、より好ましくは０．３％／日以上、さらに好ましくは０．５％／日以上上昇した値を、好ましくは６０分以上、より好ましくは１２０分以上、さらに好ましくは２４０分以上推移し続けることができる。
【００２９】
本発明の特に好ましい態様によれば、本発明の筋肉合成促進用発酵乳を摂取した対象は、同じ乳タンパク質濃度を有する発酵していない乳を対象が摂取した場合と比較して摂取後の経過時間全体で、骨格筋合成速度（ＦＳＲ）が、例えば、好ましくは０．１％／日以上、より好ましくは０．３％／日以上、さらに好ましくは０．５％／日以上上昇するものであり、かつ絶食状態の対象の骨格筋合成速度から好ましくは０．１％／日以上、より好ましくは０．３％／日以上、さらに好ましくは０．５％／日以上上昇した値を、好ましくは６０分以上、より好ましくは１２０分以上、さらに好ましくは２４０分以上推移し続けることができる。
【００３０】
本発明の特に好ましい別の態様によれば、本発明の筋肉合成促進用発酵乳を摂取した対象は、同じ乳タンパク質濃度を有する発酵していない乳を対象が摂取した場合と比較して摂取後の各時点（例えば、摂取後３０分、６０分、９０分、１２０分、および２４０分）のいずれか若しくはいずれの時点においても骨格筋合成速度（ＦＳＲ）が、例えば、好ましくは０．１％／日以上、より好ましくは０．３％／日以上、さらに好ましくは０．５％／日以上上昇するものであり、かつ絶食状態の対象の骨格筋合成速度から好ましくは０．１％／日以上、より好ましくは０．３％／日以上、さらに好ましくは０．５％／日以上上昇した値を、好ましくは６０分以上、より好ましくは１２０分以上、さらに好ましくは２４０分以上推移し続けることができる。
【００３１】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の発酵乳（例えば、乳タンパク質濃度が１．９質量％以上である発酵乳）を含む筋肉合成促進用食品（好ましくは、骨格筋合成促進用食品）が提供される。ここで、食品とは、下記の食品組成物と同じものであってもよく、具体的には、本発明の発酵乳を含有できる食品であればどのような形態のものであってもよいが、例えば、即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品などの即席食品類；清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、アルコール飲料などの飲料類；パン、パスタ、麺、ケーキミックス、パン粉などの小麦粉製品；飴、キャラメル、チューイングガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、バー、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、ムース、デザート菓子などの菓子類；ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、たれ類、ドレッシング類、つゆ類、カレー・シチューの素類などの調味料；加工油脂、バター、マーガリン、マヨネーズなどの油脂類；乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、アイスクリーム類、クリーム類などの乳製品；農産缶詰、ジャム・マーマレード類、シリアルなどの農産加工品；冷凍食品、流動食などが挙げられる。
【００３２】
筋肉合成促進の有無は、例えば、筋肉合成速度に基づいて判断される。筋肉合成速度の測定は、例えば、ＦＳＲを測定することによって行われ、具体的には本願明細書の実施例に記載の方法によりＦＳＲを測定することができる。
【００３３】
本発明の別の態様によれば、乳タンパク質濃度が１．９質量％以上である発酵乳を、対象に摂取させることを含んでなる、筋肉合成促進方法（好ましくは、骨格筋合成促進方法）が提供される。本発明の別の好ましい態様によれば、乳タンパク質濃度が１．９質量％以上である発酵乳を対象に摂取させることを含んでなる、筋肉合成促進方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）が提供される。ここで、「ヒトに対する医療行為」とは、医師等の処方を必要として、ヒトに対して医薬品を摂取させる（投与する）行為などを意味する。また、上記実施態様において、対象は、好ましくは、スポーツ選手、スポーツ愛好者（アスリート）、生活習慣病の改善のために運動を必要とする者、高齢者などの健康増進のために運動を必要とする者、乳幼児及び／又は子供などの発育／成長の過程で筋肉を作っていく必要のある者、又は筋肉低下疾患（例えば、サルコペニア）を患い、運動により筋肉合成の促進を必要とする患者やそのような疾患を予防するために運動を必要とする者が挙げられる。本発明の筋肉合成促進方法は、本発明の筋肉合成促進用発酵乳について、本願明細書に記載された内容に従って実施することができる。
【００３４】
本発明の筋肉合成促進用発酵乳を対象に摂取させる（投与する）時期は、特に限定されないが、血液中のアミノ酸濃度を速やかに上昇させるという特徴を鑑みると、血液中のアミノ酸濃度が低くなっている状態での摂取がとくに有効であると考えられ、朝、昼、晩の食事の際や、食間、また運動後に好適に用いることができる。
【００３５】
ここで、対象とは、筋肉の合成促進を必要とする対象であることが好ましく、筋肉合成促進効果、筋肉分解抑制効果、抗疲労・疲労回復効果、筋肉痛抑制効果、予備能力向上効果を期待または必要とする対象がより好ましい。例えば、健康増進、運動能力向上、潜在的もしくは顕在的な疲労の回復を目的として、高齢者、栄養失調者、病中・病後者、運動者などが挙げられる。また、この対象はヒト以外の動物（馬、牛などの家畜、犬、猫などの愛玩動物、動物園などで飼育されている鑑賞動物など）であってもよいが、ヒトであることが好ましい。
【００３６】
本発明の筋肉合成促進方法は、好ましくは、骨格筋合成促進方法である。
【００３７】
本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明の筋肉合成促進方法において、前記発酵乳（例えば、乳タンパク質濃度が１．９質量％以上である発酵乳）をタンパク質含量で一食あたり１ｇ以上となるように摂取させることができる。具体的には、１〜４０ｇ、好ましくは３〜３０ｇ、より好ましくは５〜２５ｇ、さらに好ましくは８〜２０ｇ、特に好ましくは１０〜１５ｇとなるように摂取させることができる。
【００３８】
本発明の別の態様によれば、筋肉合成促進（好ましくは骨格筋合成促進）のための、乳タンパク質濃度が１．９質量％以上である発酵乳の使用が提供される。本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明の使用は、非治療的使用である。
【００３９】
本発明の別の態様によれば、乳タンパク質濃度が１．９質量％以上である発酵乳を含む、筋肉合成促進用食品組成物（筋肉合成促進用食品）が提供される。本発明において、食品組成物（食品）とは、医薬組成物（医薬品）以外のものであって、溶液、懸濁液、乳濁液、粉末、ペースト、半固体成形物、固体成形物など、経口摂取可能な形態であればよく特に限定されない。食品組成物（食品）とは、具体的には、本発明の発酵乳を含有できる食品であればどのような形態のものであってもよく、例えば、即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品などの即席食品類；清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、アルコール飲料などの飲料類；パン、パスタ、麺、ケーキミックス、パン粉などの小麦粉製品；飴、キャラメル、チューイングガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、バー、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、ムース、デザート菓子などの菓子類；ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、たれ類、ドレッシング類、つゆ類、カレー・シチューの素類などの調味料；加工油脂、バター、マーガリン、マヨネーズなどの油脂類；乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、アイスクリーム類、クリーム類などの乳製品；農産缶詰、ジャム・マーマレード類、シリアルなどの農産加工品；冷凍食品、流動食などが挙げられる。
【００４０】
また、食品には、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、機能性表示食品、特定保健用食品、病者用食品、乳幼児用調製粉乳、妊産婦もしくは授乳婦用粉乳、または筋肉合成促進のために用いられる物である旨の表示を付した食品のような分類のものも包含される。また、本発明において、食品とは飲料を含む概念である。
【００４１】
本発明の別の態様によれば、筋肉合成促進用食品組成物（食品）の製造のための、乳タンパク質濃度が１．９質量％以上である発酵乳の使用が提供される。
【００４２】
本発明の別の態様によれば、筋肉合成を促進するための、乳タンパク質濃度が１．９質量％以上である発酵乳が提供される。
【００４３】
本発明の筋肉合成促進方法に用いられる発酵乳等や、本発明の食品組成物に含まれる発酵乳等などは、上記本発明の筋肉合成促進用発酵乳と同じであってもよい。
【実施例】
【００４４】
以下の例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。【００４５】
［実施例１］
本発明の脱脂発酵乳の調製
下記表１に記載の配合によりベースミックスを調合した。調合後、９５℃で殺菌し、スターターを添加して４３℃で発酵した（終了時のｐＨは４．３）。発酵後、冷却し、均質化した後、６５℃で３０分間殺菌した。調合後のベースミックスの組成を表２に示した。
スターターとして、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）２０３８株とストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）１１３１株（いずれの菌も「明治ブルガリアヨーグルト」（登録商標、株式会社明治製）から入手した）とを組み合わせて用いた。
また、ベースミックスの配合に用いた脱脂粉乳は株式会社明治より入手した。【００４６】
【表１】
2019124355.tif 000002
【００４７】
【表２】
2019124355.tif 000003
【００４８】
［実施例２］
筋合成促進作用の評価
７週齢のＳＤ系雄ラット（日本クレア株式会社より入手した）の７日間以上の馴化飼育終了後、体重を測定し、平均より大きくはずれた個体を除外し、下記の１１群に分けた（第２群〜第１１群はｎ＝８であり、第１群のみｎ＝１２で行った）。試験前日からラットを約１８時間絶食させた。脱脂乳は、表１に記載のベースミックスを調合、９５℃で殺菌し、冷却後に均質化した後、６５℃で３０分間殺菌して調製したものを用いた。脱脂発酵乳は実施例１と同様の方法で調製したものを用いた。
第１群：脱脂乳および脱脂発酵乳のいずれの投与も行わずに、上記の約１８時間絶食後に解剖を行った（投与の０分後とした）。
第２群：脱脂乳を投与し、その投与の３０分後に解剖を行った。
第３群：脱脂乳を投与し、その投与の６０分後に解剖を行った。
第４群：脱脂乳を投与し、その投与の９０分後に解剖を行った。
第５群：脱脂乳を投与し、その投与の１２０分後に解剖を行った。
第６群：脱脂乳を投与し、その投与の２４０分後に解剖を行った。
第７群：脱脂発酵乳を投与し、その投与の３０分後に解剖を行った。
第８群：脱脂発酵乳を投与し、その投与の６０分後に解剖を行った。
第９群：脱脂発酵乳を投与し、その投与の９０分後に解剖を行った。
第１０群：脱脂発酵乳を投与し、その投与の１２０分後に解剖を行った。
第１１群：脱脂発酵乳を投与し、その投与の２４０分後に解剖を行った。【００４９】
第１群以外のラットに上記の試験溶液（脱脂乳または脱脂発酵乳）を経口投与し、その投与後に上記のタイミングで解剖を実施した。解剖の１５分前には、骨格筋合成速度測定のトレーサーである重水素ラベルフェニルアラニンを尾静脈より注射した（４５ｍｇ／ｋｇＢＷ）。解剖はイソフルラン麻酔下で行い、門脈採血後、腹部大静脈より全採血し、安楽死させた。足底筋をラットから摘出後、直ちに液体窒素で凍結させた。【００５０】
＜門脈血中アミノ酸測定＞
血漿に、７％トリクロロ酢酸を１：１の割合で添加し、遠心分離を行い除蛋白した後、０．２μｍフィルター（クロマトディスク４Ａ、ＧＬサイエンス製）で濾過し分析サンプルとした。アミノ酸分析はＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して以下の条件で定量した。
（１）ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ装置：ＷａｔｅｒｓＴＱＤ（日本Ｗａｔｅｒｓ製）
（２）ＬＣ条件
・ＬＣ用カラム：ＩｎｔｒａｄａＡｍｉｎｏＡｃｉｄ  ３ｕｍ，  ５０＊３ｍｍ（Ｉｎｔａｃｔ社製）
・移動相Ａ：
アセトニトリル（和光ＬＣ−ＭＳ用（和光純薬工業株式会社製））９％
テトラヒドロフラン（ＨＰＬＣ用  安定剤不含（和光純薬工業株式会社製））７５％
１Ｍギ酸アンモニウム（ＨＰＬＣ用（和光純薬工業株式会社製））０．４％
ギ酸（ＨＰＬＣ用（和光純薬工業株式会社製））０．３％
超純水１５．３％
・移動相Ｂ：
アセトニトリル２０％
１Ｍギ酸アンモニウム８％
超純水７２％
・移動相流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
・カラム温度：３５℃
・移動相比率：０％Ｂ（０−２．５ｍｉｎ）
０〜１７％Ｂ（グラジエント、２．５−６．５ｍｉｎ）
１００％Ｂ（６．５−１０ｍｉｎ）
０％Ｂ（１０−１２ｍｉｎ）
Ｔｏｔａｌ  ｒｕｎｎｉｎｇ  ｔｉｍｅ（１２ｍｉｎ）
（３）ＭＳ／ＭＳ条件
・ＣａｐｉｌｌａｒｙＶｏｌｔａｇｅ：３０００Ｖ
・ＳｏｕｒｃｅＴｅｍｐ：１２０℃
・ＤｅｓｏｌｖａｔｉｏｎＴｅｍｐ：４００℃
・ＣｏｎｅＧａｓＦｌｏｗ：４８Ｌ／ｈ
・ＣｏｎｅＶｏｌｔａｇｅ：２５Ｖ
・ＣｏｎｅＥｎｅｒｇｙ：１５ｅＶ
（４）定量
アミノ酸混合標準液  Ｈ型（和光純薬工業株式会社製）に、アスパラギン酸、グルタミン酸、トリプトファンを添加して、２０種類のアミノ酸混合標準液（２５０μＭ）として用いた。このアミノ酸混合標準液の希釈系列を検量線として用いて、各サンプルのアミノ酸濃度を定量した。【００５１】
＜ＦＳＲ測定＞
（１）骨格筋のホモジナイズ
凍結保存した足底筋全量（約２５０〜３００ｍｇ）をビーズ入りホモジナイズチューブ（ＣＫ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔ  Ｔｕｂｅ  ７ｍＬ）に移し、氷冷した３ｍＬの０．３Ｍ過塩素酸溶液を加え、高速細胞破砕装置Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍ＆Ｓ社）を用いてホモジナイズした。【００５２】
（２）上清の分離と筋ホモジナイズサンプルの洗浄
筋ホモジナイズサンプル１ｍＬを遠心分離（４℃、８０００×ｇ、１５ｍｉｎ）した後、上清を分離した。上清は０．２μｍフィルターでろ過し、「（５）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるフェニルアラニンの定量」に用いた（筋上清定量用サンプル）。上清を分離した筋ホモジナイズサンプルは、超純水を用いて１ｍＬで洗浄を２回行った後、１Ｌの０．１Ｎ  ＨＣｌに懸濁した。【００５３】
（３）筋ホモジナイズサンプルのタンパク質加水分解
９００μＬの６Ｎ  ＨＣｌ（１％フェノール）に洗浄後の筋ホモジナイズサンプル１００μＬを添加し、ＰＩＣＯ−ＴＡＧワークステーション（日本Ｗａｔｅｒｓ製）を用いて、窒素置換後、減圧密封した。ヒートブロックを用いて１５０℃で１時間加熱し、筋タンパク質の加水分解を行った（筋加水分解物）。【００５４】
（４）筋加水分解物定量用サンプルの調製
筋加水分解物２００μＬを遠心エバポレータ―を用いて濃縮した。濃縮物を１０％アセトニトリル１００μＬに溶解させ０．２μｍフィルターでろ過し、筋加水分解物定量用サンプルとした。【００５５】
（５）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるフェニルアラニンの定量
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＴＱＤ、日本Ｗａｔｅｒｓ製）を用いて、筋上清定量用サンプルおよび筋加水分解物定量用サンプルについて、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）および重水素ラベルフェニルアラニン（Ｐｈｅ（Ｒｉｎｇ−Ｄ５））の濃度を定量した。以下の通りの分析条件で行った。
＜ＬＣ条件＞
・ＬＣ用カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ
・移動相Ａ：０．０５％トリフルオロ酢酸／超純水
・移動相Ｂ：０．０５％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル
・移動相流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
・カラム温度：４０℃
・サンプル注入量：３μＬ
・移動相比率
０〜３．４ｍｉｎ：Ａ１００％→Ａ８５％Ｂ１５％（グラジエント）
３．４〜４．５ｍｉｎ：Ａ７０％  Ｂ３０％
４．５〜６．０ｍｉｎ：Ａ５０％  Ｂ５０％
６．０〜８．０ｍｉｎ：Ａ２０％  Ｂ８０％
８．０〜１０．５ｍｉｎ：Ａ１００％
Ｔｏｔａｌ  ｒｕｎｎｉｎｇ  ｔｉｍｅ：１０．５ｍｉｎ
＜ＭＳ／ＭＳ条件＞
・フラグメントイオン
Ｐｈｅ：ｍ／ｚ１６６．１９  ＞  １２０．１０
Ｐｈｅ（Ｒｉｎｇ−Ｄ５）：ｍ／ｚ１７１．１９  ＞  １２５．１０
・ＣａｐｉｌｌａｒｙＶｏｌｔａｇｅ：３０００Ｖ
・ＳｏｕｒｃｅＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：１２０℃
・ＤｅｓｏｌｖａｔｉｏｎＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：４００℃
・Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  ＧａｓＦｌｏｗ：８４９Ｌ／ｈ
・ＣｏｎｅＧａｓＦｌｏｗ：４８Ｌ／ｈ
・ＣｏｎｅＶｏｌｔａｇｅ：２５Ｖ
・ＣｏｎｅＥｎｅｒｇｙ：１５ｅＶ【００５６】
（６）骨格筋合成速度（ＦＳＲ（Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｒａｔｅ））の算出
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるフェニルアラニン（Ｐｈｅ）および重水素ラベルフェニルアラニン（Ｒｉｎｇ−Ｄ５）（Ｐｈｅ（Ｒｉｎｇ−Ｄ５））の定量結果を基に、次式（Ｉ）によってＦＳＲを算出した（A. Kanda et al., Br J Nutr, Feb. 7, 1-7, 2013）。
【数１】
2019124355.tif 000004
［上記式（Ｉ）中、
Ｅａ：骨格筋中に遊離状態で存在するフェニルアラニンのエンリッチメント
（＝筋上清定量用サンプル中のエンリッチメント）
Ｅｂ：骨格筋中にタンパク質に同化して存在するフェニルアラニンのエンリッチメント
（＝筋加水分解物定量用サンプル中のエンリッチメント）
ｔ：Ｐｈｅ（Ｒｉｎｇ−Ｄ５）を尾静脈投与してから、摘出した骨格筋を凍結保存するまでの時間（単位：日）
エンリッチメント＝Ｐｈｅ（Ｒｉｎｇ−Ｄ５）／（Ｐｈｅ＋Ｐｈｅ（Ｒｉｎｇ−Ｄ５））］。【００５７】
＜統計解析＞
統計手法は、階層的な解析を実施した。つまり、まず群（Ｆｏｏｄ）と投与後の経過時間（Ｔｉｍｅ：反復計測ではない）およびＦｏｏｄ×Ｔｉｍｅによる二元配置分散分析を実施し、Ｆｏｏｄの主効果、またはＦｏｏｄ×Ｔｉｍｅの交互作用が有意であった場合、次のような手順で群間の対比較を実施した。まず、Ｆｏｏｄの主効果が有意でかつＦｏｏｄ×Ｔｉｍｅの交互作用が有意でなかった場合は、ＦｏｏｄとＴｉｍｅでの分散分析モデルを再度構築して対比較を実施した。Ｆｏｏｄ×Ｔｉｍｅの交互作用が有意であった場合は、単純主効果検定により各時間での対比較を実施した。さらに、各群でどのＴｉｍｅポイントで投与物なしの場合（ベースライン）との差異があるのかを検討するために、対照群（第１群）と脱脂発酵乳（第２〜６群）、脱脂乳群（第７〜１１群）ごとのＤｕｎｎｅｔｔ検定を実施した。全ての解析はＰ値が０．０５未満の場合を有意とし、統計解析にはＪＭＰ１１（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．）を用いた。【００５８】
結果を図１および図２に示す。図１および２の結果から、タンパク質濃度を揃えて脱脂乳または脱脂発酵乳を投与した場合、脱脂発酵乳の投与時には、脱脂乳の投与時と比較して、門脈血中の総アミノ酸、ロイシン濃度が投与３０分後、６０分後で有意に高い値を示し、脱脂発酵乳は、脱脂乳と比較して所定のアミノ酸の吸収速度が速いことが確認された。更に、驚くべきことに足底筋のＦＳＲは３０〜２４０分後まで、脱脂乳よりも脱脂発酵乳で有意に高く推移した（図３参照）。これらの結果より、脱脂発酵乳は、脱脂乳より高い筋肉合成促進効果、特に骨格筋合成促進効果を有することが示された。したがって、当該発酵乳は、タンパク質源として特に骨格筋合成に有用であり、スポーツのため、または高齢者の健康維持のために有用である可能性が強く示唆された。【００５９】
［実施例３］
７週齢の雄性ＳＤラット（日本クレア株式会社より入手した）を、馴化飼育終了後、絶食させた（約１８時間）。ＦＳＲ評価試験当日、体重が全体の平均より大きく外れた個体を除外したあと、ラットを８匹ずつ以下の７群に分けた（第Ａ群〜第Ｇ群はｎ＝８であった）。試験前日からラットを約１８時間絶食させた。【００６０】
脱脂乳は、無脂乳固形分（ＳＮＦ）が１６％になるよう調合後、９５℃で殺菌し、冷却後に均質化（１５ＭＰａ）した後、６５℃で３０分殺菌して調製したものを用いた。脱脂発酵乳は、発酵温度を４２℃とし、スターターとして、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）ＯＬＬ２０５０１３株（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４１１）とストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）ＯＬＳ３２９０株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９６３８）を用いた点以外は、実施例１と同様に調製した。発酵終了時のｐＨは４．３〜４．４であった。各試験溶液は、調製後、−２０℃で保存し、投与の直前に解凍して常温にしたものを用いた。各試験溶液の性状を、表３に示した。  
第Ａ群：投与物：脱脂乳および脱脂発酵乳のいずれの投与も行わずに、上記の約１８時間絶食後に解剖を行った（投与の０分後とした）。
第Ｂ群：脱脂乳を投与し、その投与の３０分後に解剖を行った。
第Ｃ群：脱脂乳を投与し、その投与の６０分後に解剖を行った。
第Ｄ群：脱脂乳を投与し、その投与の９０分後に解剖を行った。
第Ｅ群：脱脂発酵乳を投与し、その投与の３０分後に解剖を行った。
第Ｆ群：脱脂発酵乳を投与し、その投与の６０分後に解剖を行った。
第Ｇ群：脱脂発酵乳を投与し、その投与の９０分後に解剖を行った。
第Ａ群以外のラットに上記の試験溶液（脱脂乳または脱脂発酵乳）を経口投与し、その投与後に、上記のタイミングで解剖を実施した。解剖の１５分前には、骨格筋合成速度測定のトレーサーである重水素ラベルフェニルアラニンを尾静脈より注射した（４５ｍｇ／ｋｇＢＷ）。解剖はイソフルラン麻酔下で行い、門脈血を部分採血後、腹部大静脈より全採血し、安楽死させた。下腿三頭筋を摘出後、直ちに液体窒素で凍結させた。【００６１】
【表３】
2019124355.tif 000005
【００６２】
＜門脈血中アミノ酸測定＞
血漿を３％スルホサリチル酸処理により除たんぱく質した後、Ｉｎｔｒａｄａ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄカラム（Ｉｎｔａｃｔ社製）を使用したＬＣ−ＭＳＭＳ法により門脈血中の２０種のアミノ酸を外部標準法にて定量した。【００６３】
＜ＦＳＲ測定＞
骨格筋のホモジナイズ、上清の分離と筋ホモジナイズサンプルの洗浄、および筋ホモジナイズサンプルのタンパク質加水分解は、実施例２と同様に実施し、筋加水分解物を得た。筋加水分解物２００μＬを遠心エバポレータ―を用いて濃縮した。濃縮物を２５μＭ内部標準含有１０％アセトニトリル８０μＬに溶解させ（原液）、また２５μＭ内部標準含有１０％アセトニトリルを用いて２０倍希釈した（２０倍希釈液）。原液、２０倍希釈液それぞれを０．２μｍフィルターでろ過し、筋加水分解物定量用サンプル（原液、２０倍希釈液）とした。内部標準には１３Ｃ９，１５Ｎ，α，β１，β２，２，３，４，５，６−Ｄ８−Ｐｈｅ（ＩＣ−Ｐｈｅとする、Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＴＱＤ，Ｗａｔｅｒｓ）を用いて、筋上清定量用サンプルおよび筋加水分解物定量用サンプル（原液、２０倍希釈液）について、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）および重水素ラベルフェニルアラニン（Ｐｈｅ（Ｒｉｎｇ−Ｄ５））のエンリッチメントを計測した。ＬＣ条件は実施例２と同じ条件とした。ＭＳ／ＭＳ条件は、フラグメントイオンにＩＣ−Ｐｈｅ：ｍｚ１８４．１７＞１３７．１７を追加した点以外は、実施例２と同じ条件とした。【００６４】
・エンリッチメントの測定方法を以下に示す。
Ｄ５−Ｐｈｅのエンリッチメント＝Ｒｅｓ（Ｄ５−Ｐｈｅ）／（Ｒｅｓ（Ｄ５−Ｐｈｅ）＋Ｒｅｓ（Ｐｈｅ））
Ｒｅｓ（Ｄ５−Ｐｈｅ）＝ＩＣ−Ｐｈｅに対するＤ５−Ｐｈｅの相対ピーク強度
Ｒｅｓ（Ｐｈｅ）＝ＩＣ−Ｐｈｅに対するＰｈｅの相対ピーク強度【００６５】
＜骨格筋合成速度（ＦＳＲ）の算出＞
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって算出した足底筋のたんぱく質中および遊離のＰｈｅ（Ｒｉｎｇ−Ｄ５）のエンリッチメントを基に、上記式（Ｉ）に従い、骨格筋合成速度（ＦＳＲ）を算出した。【００６６】
＜統計解析手法＞
統計手法は、階層的な解析を実施した。つまり、まず脱脂乳、脱脂発酵乳（Ｆｏｏｄ）と投与後時間（Ｔｉｍｅ：反復計測ではない）およびＦｏｏｄ×Ｔｉｍｅによる２元配置分散分析を実施し、Ｆｏｏｄの主効果、またはＦｏｏｄ×Ｔｉｍｅの交互作用が有意であった場合、次のような手順で群間の対比較を実施した。まず、Ｆｏｏｄの主効果が有意でかつＦｏｏｄ×Ｔｉｍｅの交互作用が有意でなかった場合は群間のＦＳＲに差異が認められると判断した。Ｆｏｏｄ×Ｔｉｍｅの交互作用が有意であった場合は、単純主効果検定を実施し、有意差が認められた時間での対比較を実施した。Ｐ値が０．０５未満の場合を有意とした。更に、各群でどのＴｉｍｅポイントで投与なしの場合（ベースライン）との差異があるのかを検討するために、投与なし群と脱脂乳、脱脂発酵乳群ごとのＤｕｎｎｅｔｔ検定を実施した。統計解析にはＪＭＰ１１（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．）を用いた。【００６７】
＜脱脂乳または脱脂発酵乳投与後のアミノ酸吸収＞
門脈血中の総アミノ酸（ＴＡＡ）、ロイシン（Ｌｅｕ）濃度（量）を図３および４に示した。
脱脂乳投与後の門脈血中のＴＡＡ濃度は、３０分後および９０分後で絶食時より有意に高くなったものの、ロイシン濃度の有意な変動は認められなかった。これに対して、脱脂発酵乳では、ＴＡＡ、Ｌｅｕともに投与３０分後で、絶食時より有意に高くなった。また、ＴＡＡは投与後３０分、Ｌｅｕは投与３０分後および６０分後の門脈血中濃度は脱脂乳より顕著に高かった。この結果から、適切なスターターを用いて発酵させることにより、原料脱脂乳と比較してアミノ酸の吸収性を高くできることが分かった。【００６８】
＜脱脂乳または脱脂発酵乳投与後のＦＳＲ推移＞
足底筋のＦＳＲの結果を図５に示した。
群（Ｆｏｏｄ）と時間を要因とした二元配置分散分析では、群および時間の主効果が有意であり、群×時間の交互作用は認められなかった。つまり、投与後の時間に関わらず、投与後３０〜９０分後において、脱脂発酵乳投与群で脱脂乳投与群より足底筋ＦＳＲが顕著に高く推移したことが示された。
また、投与を実施していない投与なし群と各群の各時点でのＦＳＲの差異を解析したところ、脱脂乳群では全ての時点で投与なし群との有意な差異が認められなかったのに対し、脱脂発酵乳群では投与後３０分後で有意な上昇を認め、投与６０分後でも上昇している傾向が確認できた（Ｐ＝０．０７）。
【受託番号】
【００６９】
ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４１１
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９６３８
2019124355.tif 000006
2019124355.tif 000007
【図１】
2019124355.tif 000008
【図２】
2019124355.tif 000009
【図３】
2019124355.tif 000010
【図４】
2019124355.tif 000011
【図５】
2019124355.tif 000012
【図６】
2019124355.tif 000013
【国際調査報告】
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2019124355.tif 000015
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