(57)【要約】  長期にわたって悪性腫瘍を拒絶し続けるべく、メモリー機能を有する内在性のＴ細胞又はＢ細胞の増強剤及び悪性腫瘍再発抑制剤を提供することを目的とする。  核酸送達媒体、インターロイキン７（ＩＬ−７）をコードする核酸、及びケモカイン（Ｃ−Ｃ  モチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）をコードする核酸を含む、投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤や投与対象におけるＴ細胞又はＢ細胞にメモリー機能を誘導する誘導剤を作製する。また、核酸送達媒体、インターロイキン７（ＩＬ−７）をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含む、悪性腫瘍再発抑制剤を作製する。
2019073973.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸送達媒体、インターロイキン７（ＩＬ―７）をコードする核酸、及びケモカイン（Ｃ−Ｃ  モチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）をコードする核酸を含む、投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤。
【請求項２】
核酸送達媒体が、免疫担当細胞、ウイルス、嫌気性菌、リポソーム、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、及びナノ粒子から選択される少なくとも１種以上であることを特徴とする、請求項１記載の投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤。
【請求項３】
核酸送達媒体が、悪性腫瘍細胞への集積能、又は悪性腫瘍細胞において特異的な増殖能を有することを特徴とする、請求項１又は２記載の投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤。
【請求項４】
核酸送達媒体が、悪性腫瘍細胞傷害能を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか記載の投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤。
【請求項５】
核酸送達媒体が免疫担当細胞であり、当該免疫担当細胞が悪性腫瘍抗原を認識する細胞表面分子を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか記載の投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤。
【請求項６】
悪性腫瘍抗原を認識する細胞表面分子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であることを特徴とする、請求項５記載の投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤。
【請求項７】
免疫担当細胞が、Ｔ細胞であることを特徴とする、請求項５又は６記載の投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤。
【請求項８】
メモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞が、セントラルメモリーＴ細胞であることと特徴とする、請求項１〜７のいずれか記載の投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか記載の投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤と薬学的に許容される添加剤とを含有する医薬組成物。
【請求項１０】
核酸送達媒体、インターロイキン７（ＩＬ―７）をコードする核酸、及びケモカイン（Ｃ−Ｃ  モチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）をコードする核酸を含む、悪性腫瘍再発抑制剤。
【請求項１１】
核酸送達媒体が、免疫担当細胞、ウイルス、嫌気性菌、リポソーム、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、及びナノ粒子から選択される少なくとも１種以上であることを特徴とする、請求項１０記載の悪性腫瘍再発抑制剤。
【請求項１２】
核酸送達媒体が、悪性腫瘍細胞への集積能、又は悪性腫瘍細胞において特異的な増殖能を有することを特徴とする、請求項１０又は１１記載の悪性腫瘍再発抑制剤。
【請求項１３】
核酸送達媒体が、悪性腫瘍細胞傷害能を有することを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか記載の悪性腫瘍再発抑制剤。
【請求項１４】
核酸送達媒体が免疫担当細胞であり、当該免疫担当細胞が悪性腫瘍抗原を認識する細胞表面分子を有することを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか記載の悪性腫瘍再発抑制剤。
【請求項１５】
核酸送達媒体が、悪性腫瘍細胞抗原を認識する細胞表面分子を有する免疫担当細胞であり、悪性腫瘍再発が、当該細胞表面分子が特異的に認識する悪性腫瘍抗原を有さない悪性腫瘍細胞に起因する悪性腫瘍再発であることを特徴とする、請求項１４記載の悪性腫瘍再発抑制剤。
【請求項１６】
悪性腫瘍細胞抗原を認識する細胞表面分子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であることを特徴とする、請求項１４又は１５記載の悪性腫瘍再発抑制剤
【請求項１７】
免疫担当細胞が、Ｔ細胞であることを特徴とする、請求項１４〜１６のいずれか記載の悪性腫瘍再発抑制剤。
【請求項１８】
核酸送達媒体が腫瘍溶解性ウイルスであることを特徴とする、請求項１１記載の悪性腫瘍再発抑制剤。
【請求項１９】
請求項１０〜１８のいずれか記載の悪性腫瘍再発抑制剤と薬学的に許容される添加剤とを含有する医薬組成物。
【請求項２０】
核酸送達媒体、インターロイキン７（ＩＬ−７）をコードする核酸、及びケモカイン（Ｃ−Ｃ  モチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）をコードする核酸を含む、投与対象におけるＴ細胞又はＢ細胞にメモリー機能を誘導する誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸送達媒体、インターロイキン７（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−７：ＩＬ−７）をコードする核酸、及びケモカイン（Ｃ−Ｃ  モチーフ）リガンド１９（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）  ｌｉｇａｎｄ  １９：ＣＣＬ１９）をコードする核酸を含む、投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤、悪性腫瘍再発抑制剤、及び投与対象におけるＴ細胞又はＢ細胞にメモリー機能を誘導する誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍は世界中で多くの罹患者がいる疾患であり、一般的に化学療法、放射線療法、又は外科療法が広く行われている。しかしながら、副作用が生じることや、一部の機能が失われることや、再発若しくは転移を治療できないこと等、様々な問題があった。そこで、より患者のクオリティ・オブ・ライフ（ＱＯＬ）を高く維持すべく、近年、免疫細胞療法の開発が進められている。この免疫細胞療法は、患者から免疫担当細胞を採取し、かかる免疫担当細胞の免疫機能を高めるように処置して増幅し、再度患者に移入する療法である。具体的には、患者からＴ細胞を採取し、かかるＴ細胞にＣＡＲをコードする核酸を導入して増幅し、再度患者に移入する療法（非特許文献１参照）が知られている。かかる療法は、現在世界中で臨床試験が進行しており、白血病やリンパ腫等の造血器悪性腫瘍等において有効性を示す結果が得られている。【０００３】
また、Ｔ細胞等の免疫担当細胞の免疫機能制御因子としては、サイトカイン、ケモカイン、シグナル制御タンパク質等、少なくとも数百種類の因子が知られている。その中でインターロイキン７（ＩＬ−７）はＴ細胞の生存に必須のサイトカインであり、骨髄、胸腺、リンパ器官・組織のストローマ細胞等の非造血細胞によって産生されることが知られている。かかるＩＬ−７の機能を利用したＴ細胞として、ＩＬ−７とＩＬ−７Ｒアルファを融合したキメラサイトカイン受容体を発現するＴ細胞（特許文献１参照）が開示されている。しかしながら、かかるＴ細胞におけるキメラサイトカイン受容体は、一つの融合タンパク質として、導入したＴ細胞の膜表面に限定して発現し、自己の細胞に対してのみリガンド非依存的にＩＬ−７Ｒ等のサイトカインシグナルを伝達するものに過ぎず、上記受容体を導入していないＴ細胞の機能を高めることはできなかった。【０００４】
また、ＣＣＬ１９やＣＣＬ２１、ＩＬ−７の発現低下がＳＩＲＰアルファ変異マウスにおける脾臓でのＴ細胞領域の維持欠損の原因となること（非特許文献２参照）や、ＣＣＬ１９やＣＣＬ２１、ＩＬ−７が二次リンパ組織（脾臓やリンパ節）においてＴ細胞の恒常性を維持する働きを有していること（非特許文献３参照）が開示されている。しかしながら、上記非特許文献２、３は二次リンパ組織のＴ細胞領域に恒常的に存在する非活性化Ｔ細胞に対する作用を示したものであり、抗腫瘍免疫応答と直接的な関係性を示すものではなかった。さらに、上記非特許文献２、３におけるＣＣＬ１９やＣＣＬ２１、ＩＬ−７発現細胞はＴ細胞ではなく、二次リンパ組織に存在する細網内皮系の細胞であった。【０００５】
一方、本発明者らは、ＩＬ−７とＣＣＬ１９を同時に発現することで、固形がんを顕著に抑制する免疫細胞療法（特許文献２、３参照）を提案した。かかる方法によって、宿主（レシピエント）における内在性の免疫担当細胞の活性化や腫瘍細胞への集積能を高めることができるが、当該免疫細胞療法によって長期に渡って再発等を防ぎ、悪性腫瘍を拒絶し続けることができるかは不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１２３０６１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１６／０５６２２８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１７／１５９７３６号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】中沢洋三  信州医誌  ６１（４）：１９７〜２０３（２０１３）
【非特許文献２】SATO-HASHIMOTO M. et al., J. Immunol., 2011, vol.187, no. 1,291-7
【非特許文献３】SIEGERT S. et al., Front. Immunol., 2012, vol.3, article 285
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のようにＩＬ−７とＣＣＬ１９を同時に発現するＣＡＲ発現Ｔ細胞やＴＣＲ発現Ｔ細胞等の免疫細胞療法を開発し、免疫担当細胞の増殖能、生存能、又は宿主の免疫担当細胞の集積能を顕著に向上させ、従来免疫細胞療法で十分な治療効果が認められなかった固形がんに適応できる技術の開発が進んでいる。しかしながら、悪性腫瘍は再発することが多く、たとえ上記免疫細胞療法で一時的に悪性腫瘍の治療ができても、長期にわたって悪性腫瘍を拒絶し続けるか否かは明らかでなかく、また、再発に対する予防策も検討されていなかった。そこで本発明の課題は、長期にわたって悪性腫瘍を拒絶し続けるべく、メモリー機能を有する内在性のＴ細胞又はＢ細胞の増強剤、悪性腫瘍再発抑制剤、及び内在性のＴ細胞又はＢ細胞にメモリー機能を誘導する誘導剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者ら、これまで自らが開発してきたＣＡＲ、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現するＴ細胞の更なる可能性を検討した中で、かかるＴ細胞を対象に投与すると、投与したＴ細胞だけでなく対象（宿主）における内在性のＴ細胞においてもメモリー機能を誘導してメモリー機能を有する細胞の絶対数が増加すること、及び悪性腫瘍の再発モデル実験において、ＣＡＲが認識する抗原を有さない細胞に対して悪性腫瘍形成を抑制することを見出した。さらにＣＡＲの代わりにＴＣＲを用いた場合や、Ｔ細胞の代わりにウイルスを用いた場合でも同様の効果があることを見出し、本発明を完成した。【００１０】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）核酸送達媒体、インターロイキン７（ＩＬ−７）をコードする核酸、及びケモカイン（Ｃ−Ｃ  モチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）をコードする核酸を含む、投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤。
（２）核酸送達媒体が、免疫担当細胞、ウイルス、嫌気性菌、リポソーム、間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）、ナノ粒子から選択される少なくとも１種以上であることを特徴とする、上記（１）記載の投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤。
（３）核酸送達媒体が、悪性腫瘍細胞への集積能、又は悪性腫瘍細胞において特異的な増殖能を有することを特徴とする、上記（１）又は（２）記載の投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤。
（４）核酸送達媒体が、悪性腫瘍細胞傷害能を有することを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれか記載の投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤。
（５）核酸送達媒体が免疫担当細胞であり、当該免疫担当細胞が悪性腫瘍抗原を認識する細胞表面分子を有することを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれか記載の投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤。
（６）悪性腫瘍抗原を認識する細胞表面分子が、キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＣＲ）であることを特徴とする、上記（５）記載の投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤。
（７）免疫担当細胞が、Ｔ細胞であることを特徴とする、上記（５）又は（６）記載の投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤。
（８）メモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞が、セントラルメモリーＴ細胞であることと特徴とする、上記（１）〜（７）のいずれか記載の投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤。
（９）上記（１）〜（８）のいずれか記載の投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤と薬学的に許容される添加剤とを含有する医薬組成物
（１０）核酸送達媒体、インターロイキン７（ＩＬ−７）をコードする核酸、及びケモカイン（Ｃ−Ｃ  モチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）をコードする核酸を含む、悪性腫瘍再発抑制剤。
（１１）核酸送達媒体が、免疫担当細胞、ウイルス、嫌気性菌、リポソーム、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ナノ粒子から選択される少なくとも１種以上であることを特徴とする、上記（１０）記載の悪性腫瘍再発抑制剤。
（１２）核酸送達媒体が、悪性腫瘍細胞への集積能、又は悪性腫瘍細胞において特異的な増殖能を有することを特徴とする、上記（１０）又は（１１）記載の悪性腫瘍再発抑制剤。
（１３）核酸送達媒体が、悪性腫瘍細胞傷害能を有することを特徴とする、上記（１０）〜（１２）のいずれか記載の悪性腫瘍再発抑制剤。
（１４）核酸送達媒体が免疫担当細胞であり、当該免疫担当細胞が悪性腫瘍抗原を認識する細胞表面分子を有することを特徴とする、上記（１０）〜（１３）のいずれか記載の悪性腫瘍再発抑制剤。
（１５）核酸送達媒体が、悪性腫瘍細胞抗原を認識する細胞表面分子を有する免疫担当細胞であり、悪性腫瘍再発が、当該細胞表面分子が特異的に認識する悪性腫瘍抗原を有さない悪性腫瘍細胞に起因する悪性腫瘍再発であることを特徴とする、上記（１４）記載の悪性腫瘍再発抑制剤。
（１６）悪性腫瘍細胞抗原を認識する細胞表面分子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であることを特徴とする、上記（１４）又は（１５）記載の悪性腫瘍再発抑制剤。
（１７）免疫担当細胞が、Ｔ細胞であることを特徴とする、上記（１４）〜（１６）のいずれか記載の悪性腫瘍再発抑制剤。
（１８）核酸送達媒体が腫瘍溶解性ウイルスであることを特徴とする、上記（１１）記載の悪性腫瘍再発抑制剤。
（１９）上記（１０）〜（１８）のいずれか記載の悪性腫瘍再発抑制剤と薬学的に許容される添加剤とを含有する医薬組成物。
（２０）核酸送達媒体、インターロイキン７（ＩＬ−７）をコードする核酸、及びケモカイン（Ｃ−Ｃ  モチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）をコードする核酸を含む、投与対象におけるＴ細胞又はＢ細胞にメモリー機能を誘導する誘導剤。【００１１】
また、本発明の他の態様としては、以下のとおりである。
１）投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤の調製のための、核酸送達媒体、インターロイキン７（ＩＬ−７）をコードする核酸、及びケモカイン（Ｃ−Ｃ  モチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）をコードする核酸の使用；
２）核酸送達媒体、インターロイキン７（ＩＬ−７）をコードする核酸、及びケモカイン（Ｃ−Ｃ  モチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）をコードする核酸を対象に投与する、メモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強方法；
３）悪性腫瘍再発抑制剤の調製のための、核酸送達媒体、インターロイキン７（ＩＬ−７）をコードする核酸、及びケモカイン（Ｃ−Ｃ  モチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）をコードする核酸の使用；
４）核酸送達媒体、インターロイキン７（ＩＬ−７）をコードする核酸、及びケモカイン（Ｃ−Ｃ  モチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）をコードする核酸を対象に投与する、悪性腫瘍再発の抑制方法；
５）投与対象におけるＴ細胞又はＢ細胞にメモリー機能を誘導する誘導剤の調製のための、核酸送達媒体、インターロイキン７（ＩＬ−７）をコードする核酸、及びケモカイン（Ｃ−Ｃ  モチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）をコードする核酸の使用；
６）核酸送達媒体、インターロイキン７（ＩＬ−７）をコードする核酸、及びケモカイン（Ｃ−Ｃ  モチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）をコードする核酸を対象に投与する、Ｔ細胞又はＢ細胞へのメモリー機能の誘導方法；
７）核酸送達媒体が、免疫担当細胞、ウイルス、嫌気性菌、リポソーム、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ナノ粒子から選択される少なくとも１種以上であることを特徴とする、上記（２０）記載の投与対象におけるＴ細胞又はＢ細胞にメモリー機能を誘導する誘導剤。
８）核酸送達媒体が、悪性腫瘍細胞への集積能、又は悪性腫瘍細胞において特異的な増殖能を有することを特徴とする、上記（２０）又は７）記載の投与対象におけるＴ細胞又はＢ細胞にメモリー機能を誘導する誘導剤。
９）核酸送達媒体が、悪性腫瘍細胞傷害能を有することを特徴とする、上記（２０）、７）又は８）のいずれか記載の投与対象におけるＴ細胞又はＢ細胞にメモリー機能を誘導する誘導剤。
１０）核酸送達媒体が免疫担当細胞であり、当該免疫担当細胞が悪性腫瘍抗原を認識する細胞表面分子を有することを特徴とする、上記（２０）、７）〜９）のいずれか記載の投与対象におけるＴ細胞又はＢ細胞にメモリー機能を誘導する誘導剤。
１１）悪性腫瘍抗原を認識する細胞表面分子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であることを特徴とする、上記１０）記載の投与対象におけるＴ細胞又はＢ細胞にメモリー機能を誘導する誘導剤。
１２）免疫担当細胞が、Ｔ細胞であることを特徴とする、上記１０）又は１１）記載の投与対象におけるＴ細胞又はＢ細胞にメモリー機能を誘導する誘導剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤を用いれば、投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞を増強することが可能となる。さらに、本発明の悪性腫瘍再発抑制剤を用いれば、悪性腫瘍治療後の再発を抑制することが可能となる。また、本発明のＴ細胞又はＢ細胞にメモリー機能を誘導する誘導剤を用いれば、投与対象におけるＴ細胞又はＢ細胞にメモリー機能を誘導することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（ａ）は実施例１において、悪性腫瘍組織におけるＴ細胞の局在を標識抗体によって染色し、顕微鏡で観察した結果を示す図である。（ｂ）は、上記（ａ）で観察した結果を画像解析処理して、投与したドナーＴ細胞とレシピエントの内在性Ｔ細胞のエリア（μｍ２）を示すグラフである。
【図２】実施例２において、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（７×１９）又はかかるＴ細胞と共に抗ＣＤ９０．２抗体（ａｎｔｉ−ＣＤ９０．２）をマウスに投与した場合の投与後１４日目の悪性腫瘍体積（ｍｍ３）を調べたグラフである。
【図３】実施例３において、投与したドナーＴ細胞及びレシピエントの内在性Ｔ細胞のメモリー化を調べた結果を示すグラフである。
【図４】実施例３において、投与したドナーＴ細胞及びレシピエントの内在性Ｔ細胞のメモリー化の機能をＩＦＮ−γの生産により調べた結果を示すグラフである。（ａ）は、ＣＤ９０．１陽性のドナーＴ細胞におけるＩＦＮ−γ陽性細胞の割合、（ｂ）はＣＤ９０．２陽性の内在性ＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ陽性細胞をフローサイトメトリーで検出した結果である。
【図５Ａ】実施例４において、ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の処理の前におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーの変化（α鎖：処理前、ＣＡＲ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を調べた結果を示すグラフである。
【図５Ｂ】実施例４において、ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の処理の前におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーの変化（α鎖：処理前、ＣＡＲ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）を調べた結果を示すグラフである。
【図５Ｃ】実施例４において、ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の処理の後におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーの変化（α鎖：処理後、ＣＡＲ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を調べた結果を示すグラフである。
【図５Ｄ】実施例４において、ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の処理の後におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーの変化（α鎖：処理後、ＣＡＲ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）を調べた結果を示すグラフである。
【図６Ａ】実施例４において、ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の処理の前におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーの変化（β鎖：処理前、ＣＡＲ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を調べた結果を示すグラフである。
【図６Ｂ】実施例４において、ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の処理の前におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーの変化（β鎖：処理前、ＣＡＲ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）を調べた結果を示すグラフである。
【図６Ｃ】実施例４において、ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の処理の後におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーの変化（β鎖：処理後、ＣＡＲ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を調べた結果を示すグラフである。
【図６Ｄ】実施例４において、ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の処理の後におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーの変化（β鎖：処理後、ＣＡＲ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）を調べた結果を示すグラフである。
【図７Ａ】実施例５において、Ｐ８１５−ｈＣＤ２０を接種後１４０日目に、腫瘍を治療して根治したマウス（ｔｕｍｏｒ−ｒｅｊｅｃｔｅｄ  ｍｉｃｅ）又はコントロールのナイーブマウス（ｎａｉｖｅ  ｍｉｃｅ）に対してＰ８１５−ｈＣＤ２０又はｈＣＤ２０を発現していない親株のＰ８１５を左右の脇腹にそれぞれ接種し、腫瘍体積の測定結果を示す図である。
【図７Ｂ】実施例５において、３ＬＬ−ｈＣＤ２０を接種後１４０日目に、腫瘍を治療して根治したマウス（ｔｕｍｏｒ−ｒｅｊｅｃｔｅｄ  ｍｉｃｅ）又はコントロールのナイーブマウス（ｎａｉｖｅ  ｍｉｃｅ）に対して３ＬＬ−ｈＣＤ２０又はｈＣＤ２０を発現していない親株の３ＬＬを左右の脇腹にそれぞれ接種し、腫瘍体積の測定結果を示す図である。
【図８】実施例６において、腫瘍の再発抑制効果を確認するための実験プロトコール図である。
【図９Ａ】実施例６において、後述するＡＣＣ−ＭＥＳＯ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃを投与し、ｄａｙ１に抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（７×１９  ＣＡＲ−Ｔ）を投与した群及びｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ＣＡＲ−Ｔ）を投与した群におけるｄａｙ１、３、７、１０、１４、２１、３１、３８のマウスを露光時間３０秒で撮影した結果を示す図である。
【図９Ｂ】実施例６において、後述するＡＣＣ−ＭＥＳＯ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃを投与し、ｄａｙ１に抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（７×１９  ＣＡＲ−Ｔ）を投与した群及びｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ＣＡＲ−Ｔ）を投与した群におけるｄａｙ４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３のマウスを露光時間３０秒で撮影した結果を示す図である。ｄａｙ１２９の左から２番目の個体は死亡したため写真を省略する。
【図１０】実施例６において、後述するＡＣＣ−ＭＥＳＯ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ投与からの日数とマウスの生存率との関係を示したグラフである。
【図１１】実施例６において、後述するＡＣＣ−ＭＥＳＯ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ投与からの日数とトータルの蛍光量との関係を示したグラフである。
【図１２】実施例７において、（ａ）は脾臓細胞におけるＣＤ８＋ＧＦＰ＋細胞の割合をフローサイトメトリーで解析した結果、（ｂ）はＣＤ８＋ＧＦＰ＋細胞絶対数をフローサイトメトリーで解析した結果を示す図である。
【図１３】実施例７において、（ａ）はｎａｉｖｅ  ＢＤＡ／２マウスのＣＤ８＋脾臓細胞及びＰ１Ａ特異的ＴＣＲ／ＩＬ−７／ＣＣＬ１９／ｅＧＦＰ発現Ｔ細胞で処理したマウスのＣＤ８＋ＧＦＰ−又はＣＤ８＋ＧＦＰ＋脾臓細胞におけるＣＤ４４＋細胞の細胞数を示す図であり、（ｂ）は（ａ）おけるＣＤ４４＋細胞の割合を示す図である。
【図１４】実施例７において、Ｐ８１５で処理した粘膜型マスト細胞（Ｍｕｃｏｓａｌ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ：ＭＭＣ）と５日間ほど共培養し、培地の上清中のＩＦＮ−γの濃度をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）によって検出した結果を示す図である。
【図１５】実施例８において、（ａ）は遺伝子組換えワクシニアウイルスＬＣ１６ｍＯ  ＴＫ−ＳＰ−マウスＩＬ−７−Ｆ２Ａ−マウスＣＣＬ１９−Ｆ２Ａ−ｅＧＦＰ（ＴＫ−ＩＣＥ）の構造、（ｂ）は遺伝子組換えワクシニアウイルスＬＣ１６ｍＯ  ＴＫ−ＳＰ−Ｌｕｃ−Ｆ２Ａ−ｅＧＦＰ（ＴＫ−ＬＥ）の構造を示す図である。
【図１６】実施例８において、遺伝子組換えワクシニアウイルスＴＫ−ＩＣＥ又はＴＫ−ＬＥを感染させたＡ５４９細胞及びＣＴ２６細胞におけるワクシニアウイルスの細胞変性効果とｅＧＦＰ蛍光発現との関係を観察像で示す図である。
【図１７】実施例８において、遺伝子組換えワクシニアウイルスＴＫ−ＩＣＥ又はＴＫ−ＬＥを感染させたＡ５４９細胞又はＣＴ２６細胞におけるＩＬ−７及びＣＣＬ１９の分泌量を調べた図である。
【図１８】実施例８において、マウス大腸癌ＣＴ２６細胞をマウスの両腹部の皮下に移植する概念を示す図である。
【図１９】実施例９において、マウス大腸癌細胞ＣＴ２６を用いた腫瘍両側皮下移植ＢＡＬＢ／ｃマウスモデルに対し、遺伝子組換えワクシニアウイルスＴＫ-ＩＣＥ又はＴＫ-ＬＥを腫瘍内投与後の腫瘍サイズ（ｍｍ３）の推移を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書における「メモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤」としては、核酸送達媒体、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含んでいれば特に制限されず、かかる増強剤により、メモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞を増強することが可能となる。また、本明細書における「Ｔ細胞又はＢ細胞にメモリー機能を誘導する誘導剤」としては、核酸送達媒体、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含んでいれば特に制限されず、かかる誘導剤により、Ｔ細胞又はＢ細胞にメモリー機能を誘導することが可能となる。なお、以下、本明細書において、上記「メモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強剤」又は上記「Ｔ細胞又はＢ細胞にメモリー機能を誘導する誘導剤」をまとめて、「本件増強剤又は誘導剤」ともいう。
【００１５】
本明細書における「悪性腫瘍再発抑制剤」としては、核酸送達媒体、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含んでいれば特に制限されず、かかる悪性腫瘍再発抑制剤により、悪性腫瘍再発を抑制することが可能となる。なお、以下、本明細書において、上記「悪性腫瘍再発抑制剤」を、「本件悪性腫瘍再発抑制剤」ともいう。
【００１６】
ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸としては、ヒト由来の核酸を好適に挙げることができる。上記それぞれの核酸は導入する細胞の種類に応じて適宜選択でき、かかるそれぞれの核酸の配列情報は、公知の文献やＮＣＢＩ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）等のデータベースを検索して適宜入手することができる。ＩＬ−７をコードする核酸としては、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を挙げることができ、ＩＬ−７における細胞増殖率又は細胞生存率の亢進作用を有する限り、配列番号１に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸をコードする塩基配列でもよい。ＣＣＬ１９をコードする核酸としては、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を挙げることができ、ＣＣＬ１９における細胞の遊走作用を有する限り、配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸をコードする塩基配列を用いてもよい。なお、上記ＩＬ−７における細胞増殖率又は細胞生存率の亢進作用やＣＣＬ１９における細胞の遊走作用は、上記特許文献２に記載の方法により確認することができる。
【００１７】
本明細書において、用語「同一性」は、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列近似性の程度（これは、クエリー配列と他の好ましくは同一の型の配列（核酸若しくはタンパク質配列）とのマッチングにより決定される）を意味する。「同一性」を計算及び決定する好ましいコンピュータープログラム法としては、例えば、ＧＣＧ  ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）（Altschul et al.，J.Mol.Biol.1990，215:403-410;Altschul et al．，Nucleic Acids Res.1997,25:3389-3402;Devereux et al．，Nucleic Acid Res．1984,12:387）、並びにＢＬＡＳＴＮ  ２．０（Gish W．，http://blast．Wustl．edu，1996−2002）、並びにＦＡＳＴＡ（Pearson及びLipman,Proc.Natl．Acad．Sci．USA 1988,85:2444−2448）、並びに最も長く重複した一対のコンティグを決定及びアライメントするＧＣＧ  ＧｅｌＭｅｒｇｅ（Wibur及びLipman,SIAM J.Appl.Math.1984,44:557-567;Needleman及びWunsch,J．Mol．Biol．1970，48:443-453）を挙げることができる。
【００１８】
上記ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸は、プロモーターやターミネーター等の制御配列や、薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子等の選択マーカー配列を含有するベクターに組み込まれていてもよい。さらに、ベクター内には、自殺遺伝子をコードする核酸や、２Ａペプチド又はＩＲＥＳをコードする核酸を含んでいてもよい。上記ベクター、自殺遺伝子をコードする核酸や、２Ａペプチド又はＩＲＥＳをコードする核酸については、上記特許文献２、３を参照に入手又は作製することが可能である。上記プロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、ＨＩＦプロモーター等を挙げることができる。また、上記ベクターとしては、例えば、ｐＭＳＧＶベクター（Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002)）やｐＭＳＣＶベクター（タカラバイオ社製）等のレトロウイルスベクター又はかかるベクター由来のものを挙げることができる。
【００１９】
また、ＩＬ―７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸と共に、ＩＬ−１５、ＣＣＬ２１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＰ−１０、ＣＣＬ４、Ｆｌｔ３Ｌ、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ、ＭＩＰ−１α、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、チェックポイント阻害抗体若しくはその断片等の他の免疫機能制御因子をコードする核酸を含んでいてもよい。ただし、本件増強剤又は誘導剤や本件悪性腫瘍再発抑制剤は、免疫機能制御因子をコードする核酸として少なくともＩＬ―７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有していれば、上記他の免疫機能制御因子をコードする核酸を含有していなくても、本件増強剤又は誘導剤や本件悪性腫瘍再発抑制剤としての効果を十分に発揮できる。
【００２０】
上記「メモリー機能」とは、過去に腫瘍抗原による刺激を受けた経験を有し、再び悪性腫瘍細胞に接した場合に、過去に腫瘍抗原による刺激を受けたことがないナイーブＴ細胞に比べてより早く且つ強力に活性化し、悪性腫瘍細胞に対する高い免疫機能を発揮する機能を意味する。また、メモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞としては、セントラルメモリーＴ細胞、メモリーＢ細胞を挙げることができる。かかるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒ）等のそれぞれの陽性／陰性（＋／−）や発現強度を総合的に評価することで確認することができ、ヒト、マウス等の対象に応じて適宜いずれのＣＤを測定すればよいかを選択することが可能である。なお、本願において、以下、陽性を「＋」、陰性を「−」と記載することもある。
【００２１】
上記「メモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の増強」とは、メモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞を含む細胞集団において、メモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の割合が増加することや、メモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の絶対数が増加することや、メモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の細胞あたりのメモリー機能が増強することを意味する。
【００２２】
上記「Ｔ細胞又はＢ細胞にメモリー機能を誘導」とは、ナイーブＴ細胞又はナイーブＢ細胞を含む細胞集団において、かかるナイーブＴ細胞又はナイーブＢ細胞が腫瘍抗原による刺激を受けて免疫記憶を獲得することにより、メモリー機能を有するように誘導することや、既にメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞において、そのメモリー機能がより高まるように誘導することや、既にメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞の生体内での数を増加させることを意味する。具体的には、例えばナイーブＴ細胞をセントラルメモリーＴ細胞に誘導することを挙げることができる。
【００２３】
上記投与対象としては、哺乳動物又は哺乳動物細胞を好適に挙げることができ、かかる哺乳動物の中でも、ヒト、マウス、イヌ、ラット、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、サル、チンパンジーをより好適に挙げることができ、ヒトを特に好適に挙げることができる。
【００２４】
上記「核酸送達媒体」としては、免疫担当細胞、ウイルス、嫌気性菌、リポソーム、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ナノ粒子から選択される少なくとも１種以上であればよく、複数種を混合して用いてもよい。
【００２５】
ここで、上記免疫担当細胞としては、免疫応答に関与し、ＩＬ―７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を導入することでＩＬ―７及びＣＣＬ１９を発現できる細胞であれば特に制限されないが、生体から分離（採取）された免疫担当細胞であることが好ましく、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｂ細胞等のリンパ球系細胞や、単球、マクロファージ、樹状細胞等の抗原提示細胞や、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞等の顆粒球であって分離されたものを挙げることができ、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、マウス等の哺乳動物から分離されたＴ細胞、好ましくはヒトから分離されたＴ細胞を好適に挙げることができる。なお、上記分離されたＴ細胞としては、Ｔ細胞以外に他の細胞も含んでいてもよいが、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％の割合でＴ細胞を含んでいればよい。また、Ｔ細胞は、血液、骨髄液等の体液や、脾臓、胸腺、リンパ節等の組織、若しくは原発腫瘍、転移性腫瘍、がん性腹水等のがん組織に浸潤する免疫細胞から免疫担当細胞を含む細胞集団を分離して得ることができる。前記細胞集団に含まれるＴ細胞の割合を高めるため、分離した前記細胞集団を、必要に応じて定法により更に単離又は精製して得ることもできる。またＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から作製されたものを利用してもよい。かかるＴ細胞としては、アルファ・ベータＴ細胞、ガンマ・デルタＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、ＮＫＴ細胞を挙げることができる。なお、免疫担当細胞の由来と投与対象とは同じであっても異なってもよいが、同じであることが好ましい。さらに、投与対処がヒトの場合において、免疫担当細胞としては、投与対象としての患者本人から採取した自家細胞を用いても、他人から採取した他家細胞を用いてもよい。すなわち、ドナーとレシピエントは一致しても不一致でもよいが、一致することが好ましい。
【００２６】
上記ウイルスとしては、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を封入でき、悪性腫瘍細胞に感染しうるウイルスであれば特に制限されないが、腫瘍溶解性ウイルスであることが好ましい。上記腫瘍溶解性ウイルス(oncolytic virus)とは、正常細胞に感染してもほとんど増殖しないが、悪性腫瘍細胞に感染すると増殖し、悪性腫瘍細胞を死滅（悪性腫瘍細胞傷害）させる能力を有するウイルスを意味するものであり、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第１８巻、第２号、２０１０年２月、２３３〜２３４ページに総説されている。かかる腫瘍溶解性ウイルスとしては悪性腫瘍細胞に感染して悪性腫瘍細胞を死滅させる能力を有する限り特に限定されないが、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性麻疹ウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス、腫瘍溶解性牛痘ウイルス、腫瘍溶解性ムンプスウイルス、腫瘍溶解性コクサッキーウイルス等を挙げることができる。また、上記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスとしては、Kim MK et al. Science Translational Medicine. 2013 May 15;5(185):185ra63、Heo J, et al.  Nature Medicine, 2013 (3):329-36. doi: 10.1038/nm.3089. Epub 2013 Feb 10.、国際公開第２０１２／０９４３８６号パンフレットに記載のものを用いてもよいがこれに限られない。また、上記腫瘍溶解性アデノウイルスとしては、Tedcastle A et al. Mol Ther. 2016;24:796-804, Marino N, Illingworth S, Kodialbail P, Patel A, Calderon H, Lear R, Fisher KD, Champion BR, Brown ACN. PLoS One 2017;12(5):e0177810、Freedman JD, et al. EMBO Mol Med 9:1067-1087 (2017)、Lang FF et al., Journal of Clinical Oncology (2018)、James M. et al. The Journal of Oncology, 188(6):2391-7, 2012、特許第３８６７９６８号公報及び特許第５５７４２８４号公報に記載のものを用いてもよいがこれに限られない。また、上記腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスとしては、Mazzacurati et al., Mol Ther, 2015 Jan;23(1):99-107、Hirooka Y, et al. BMC Cancer 2018, 18, 596、Nakatake R, et al. Cancer Sci. 2018 Mar, 109(3);600-610.及びAndtbacka RHI, et al. J Clin Oncol. 2015;33:2780-2788に記載のものを用いてもよいがこれに限られない。また、上記腫瘍溶解性レオウイルスとしては、Mahalingam, et al, Cancers 2018, 10, 160に記載のものを用いてもよいがこれに限られない。また、上記腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルスとしては、Journal of Virology. 2016 Jun; 90(11):5343-5352.に記載のものを用いてもよいがこれに限られない。また、上記腫瘍溶解性水泡口内炎ウイルス病ウイルスとしては、Muik A. et al. Cancer Res; 74(13); 3567-78. に記載のものを用いてもよいがこれに限られない。なお、腫瘍溶解性ウイルスは遺伝子改変によりタンパク質を発現する機能を付加しているものもあるが、そのようなタンパク質の代わりに、又は加えてさらに上記ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現させてもよい。
【００２７】
上記嫌気性菌としては、細胞内にＩＬ―７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を導入することでＩＬ―７及びＣＣＬ１９を発現できる嫌気性菌であれば特に制限されないが、悪性腫瘍細胞に集積する能力を有する嫌気性グラム陽性菌であることが好ましく、ビフィズス菌等のビフィドバクテリウム属菌、ラクトバシラス属菌、リステリア属菌を挙げることができる。なお、嫌気性菌は酸素が少ない環境下で生育しやすいことから、悪性腫瘍細胞に集積しやすいことが知られている。
【００２８】
上記リポソームとしては、腫瘍細胞にＩＬ―７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を封入でき、リン脂質二重膜から構成される脂質ナノカプセルであれば特に制限されず、かかるリポソームは、市販品を用いることや常法によって合成することによって得ることができる。
【００２９】
上記ＭＳＣとしては、細胞内にＩＬ―７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を導入することでＩＬ―７及びＣＣＬ１９を発現でき、悪性腫瘍細胞に集積する能力を有するＭＳＣであれば特に制限されない。
【００３０】
上記ナノ粒子としては、腫瘍細胞にＩＬ―７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を送達できる能力を有し、ナノメートルオーダー、好ましくは直径５〜８００ｎｍの粒子体であれば特に制限されず、金ナノ粒子等の金属ナノ粒子やシリカナノ粒子を挙げることができる。かかるナノ粒子は市販品を用いることや常法によって合成することによって得ることができる。
【００３１】
上記「核酸送達媒体が、悪性腫瘍細胞への集積能を有する」とは、核酸送達媒体が悪性腫瘍細胞に特異的に集積する能力を意味する。具体的には、ａ）核酸送達媒体が悪性腫瘍細胞の細胞表面分子を認識する物質を有し、かかる物質の作用により核酸送達媒体が悪性腫瘍細胞に集積する能力や、ｂ）腫瘍組織の血管壁は正常組織の血管よりも１桁以上広い数百ナノメートルの隙間が開いていることを利用したＥＰＲ（enhanced permeability and retention）効果により核酸送達媒体が悪性腫瘍細胞へ集積する能力を挙げることができる。上記核酸送達媒体が悪性腫瘍細胞の細胞表面分子を認識する物質としては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）やＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を挙げることができる。かかるＣＡＲやＴＣＲは、上記特許文献２、３に記載のものを利用することができる。したがって、悪性腫瘍細胞への集積能を有する核酸送達媒体としてはＣＡＲ発現免疫担当細胞や、ＴＣＲ発現免疫担当細胞を挙げることができる。なお、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは、がん細胞の細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ：ｓｃＦｖ）と、Ｔ細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域を融合させた人工的なキメラタンパク質である。
【００３２】
上記「悪性腫瘍細胞において特異的な増殖能を有する」とは、正常細胞に感染してもほとんど増殖しないが、悪性腫瘍細胞に感染すると増殖する能力を意味し、例えば、腫瘍溶解性ウイルスが有する、悪性腫瘍細胞において特異的に増殖する能力を挙げることができる。したがって、悪性腫瘍細胞において特異的な増殖能を有する核酸送達媒体としては腫瘍溶解性ウイルスを挙げることができる。
【００３３】
上記「悪性腫瘍細胞傷害能を有する」とは、悪性腫瘍細胞を傷害して悪性腫瘍細胞を溶解又は死滅させる能力を意味する。なお、悪性腫瘍細胞を溶解又は死滅させることによって、悪性腫瘍細胞内の悪性腫瘍抗原が溶解又は死滅した細胞周辺に放出されることとなる。
【００３４】
上記「悪性腫瘍抗原を認識する細胞表面分子」としては、悪性腫瘍の細胞表面に有する悪性腫瘍抗原を認識する細胞表面分子であればよく、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）やＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を挙げることができる。かかるＣＡＲやＴＣＲは、上記特許文献２、３に記載のものを利用することができる。したがって、悪性腫瘍抗原を認識する細胞表面分子を有する免疫担当細胞としてはＣＡＲ発現免疫担当細胞や、ＴＣＲ発現免疫担当細胞を挙げることができる。
【００３５】
上記悪性腫瘍抗原としては、悪性腫瘍細胞において正常細胞よりも高く発現する、あるいは悪性腫瘍細胞に特異的に発現するタンパク質、糖脂質等の物質を意味し、かかる悪性腫瘍抗原としては、腫瘍関連抗原や癌精巣抗原、血管新生関連抗原、遺伝子変異による悪性腫瘍新生抗原（ネオアンチゲン）のエピトープペプチドを挙げることができ、具体的には、ＷＴ１、ＭＡＲＴ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、Ｇｌｙｐｉｃａｎ−３、ＫＩＦ２０Ａ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＡＦＰ−１、ｇｐ１００、ＭＵＣ１、ＰＡＰ−１０、ＰＡＰ−５、ＴＲＰ２−１、ＳＡＲＴ−１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＮＥＩＬ３、ＭＰＨＯＳＰＨ１、ＤＥＰＤＣ１、ＦＯＸＭ１、ＣＤＨ３、ＴＴＫ、ＴＯＭＭ３４、ＵＲＬＣ１０、ＫＯＣ１、ＵＢＥ２Ｔ、ＴＯＰＫ、ＥＣＴ２、ＭＥＳＯＴＨＥＬＩＮ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｐ１Ａ、５Ｔ４、Ｂ７−Ｈ６、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＥＡ、ｃＭｅｔ、ＣＳ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＥｒｂＢ２、ＦＡＰ、ＦＲ−α、ＨＥＲ２、ＩＬ１３Ｒａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＲＰ、ＤＬＬ３、ＰＲＳＳ２１、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｃｌａｕｄｉｎ１８、ＣＡＩＸ、Ｌ１−ＣＡＭ、ＦＡＰ−α、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＦＲ−α等のタンパク質や、ＧＤ２、ＧＭ２等の糖脂質を挙げることができる。
【００３６】
上記「核酸送達媒体、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含む」には、核酸送達媒体の中にＩＬ―７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含む態様も含まれる。例えば、核酸送達媒体が免疫担当細胞の場合には、免疫担当細胞内にＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸が含まれていればよい。また、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸が免疫担当細胞のゲノムに組み込まれた状態でも、ゲノムに組み込まれない状態（例えば、エピソーマルな状態）でもよい。
【００３７】
上記核酸送達媒体が免疫担当細胞の場合、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を、当該免疫担当細胞へ導入すること、すなわち、免疫担当細胞に、外来性のＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸（好ましくは、プロモーターの下流に作動可能に連結されている外来性のＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸）を導入することにより本件増強剤又は誘導剤や本件悪性腫瘍再発抑制剤を作製することができる。導入する方法としては、免疫担当細胞にＤＮＡを導入する方法であればよく、例えば、エレクトロポレーション法（Cytotechnology,3,133(1990)）、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５号公報）、リポフェクション法（Proc.Natl.Acad.Sci.U．S.A.,84,7413(1987)）、ウイルス感染法等の方法を挙げることができる。かかるウイルス感染法としては、導入する核酸を含むベクターと、パッケージングプラスミドとをＧＰ２−２９３細胞（タカラバイオ社製）、Ｐｌａｔ−ＧＰ細胞（コスモ・バイオ社製）、ＰＧ１３細胞（ATCC CRL-10686）、ＰＡ３１７細胞（ATCC CRL-9078）等のパッケージング細胞にトランスフェクションして組換えウイルスを作製し、かかる組換えウイルスをＴ細胞に感染させる方法（上記特許文献２）を挙げることができる。
【００３８】
さらに、上記核酸送達媒体がウイルスの場合、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を、当該ウイルスへ導入すること、すなわち、ウイルスに外来性のＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸（好ましくは、プロモーターの下流に作動可能に連結されている外来性のＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸）を導入して、「ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を有し、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９を発現するウイルス」を作製できる。かかる作製したウイルスを本件増強剤又は誘導剤や本件悪性腫瘍再発抑制剤として用いることができる。
【００３９】
同様に、上記核酸送達媒体が嫌気性菌、リポソーム、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の場合にも、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を、当該嫌気性菌、リポソーム、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）へ導入すること、すなわち、嫌気性菌、リポソーム、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に外来性のＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸（好ましくは、プロモーターの下流に作動可能に連結されている外来性のＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸）を導入して、「ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を有し、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９を発現する嫌気性菌、リポソーム、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）」を作製できる。かかる作製した嫌気性菌、リポソーム、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を本件増強剤又は誘導剤や本件悪性腫瘍再発抑制剤として用いることができる。また、上記「ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を有し、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９を発現するウイルス」、「ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を有し、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９を発現する嫌気性菌」、「ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を有し、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９を発現するリポソーム」、又は「ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を有し、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９を発現する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）」を悪性腫瘍の増殖抑制剤として用いてもよい。
【００４０】
また、上記ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を、免疫担当細胞へ導入する他の方法としては、免疫担当細胞にＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を、公知の遺伝子編集技術を用いて、適切なプロポーターの制御下で発現可能なように、細胞のゲノムに組み込む方法であってもよい。公知の遺伝子編集術としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ）、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）−Ｃａｓシステム等のエンドヌクレアーゼを用いる技術を例示することができる。
【００４１】
本件増強剤又は誘導剤や、本件悪性腫瘍再発抑制剤として、「ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、悪性腫瘍抗原を認識する細胞表面分子としてＣＡＲを有する免疫担当細胞、すなわち、ＣＡＲ、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＣＡＲ、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９を発現する免疫担当細胞」を作製する場合には、以下のいずれかの方法によって作製することができる。
（１）ＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現するベクター、及びＣＡＲをコードする核酸を含有し、ＣＡＲを発現するベクター、の２種類を同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
（２）ＣＡＲをコードする核酸とＩＬ−７をコードする核酸を含有し、ＣＡＲとＩＬ−７を発現するベクター、及びＣＡＲをコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＣＡＲとＣＣＬ１９を発現するベクター、の２種類を同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
（３）ＣＡＲをコードする核酸とＩＬ−７をコードする核酸を含有し、ＣＡＲとＩＬ−７を発現するベクター、及びＩＬ−７をコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＩＬ−７とＣＣＬ１９を発現するベクター、の２種類のベクターを同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
（４）ＣＡＲをコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＣＡＲとＣＣＬ１９を発現するベクター、及びＩＬ−７をコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＩＬ−７とＣＣＬ１９を発現するベクター、の２種類のベクターを同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
（５）ＣＡＲをコードする核酸とＩＬ−７をコードする核酸を含有し、ＣＡＲとＩＬ−７を発現するベクター、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＣＣＬ１９を発現するベクター、の２種類のベクターを同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
（６）ＣＡＲをコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＣＡＲとＣＣＬ１９を発現するベクター、及びＩＬ−７をコードする核酸を含有し、ＩＬ−７を発現するベクター、の２種類のベクターを同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
（７）ＣＡＲをコードする核酸を含有し、ＣＡＲを発現するベクター、ＩＬ−７をコードする核酸を含有し、ＩＬ−７を発現するベクター、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＣＣＬ１９を発現するベクターの３種類のベクターを同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
【００４２】
同様に、本件増強剤又は誘導剤や、本件悪性腫瘍再発抑制剤として、「ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、悪性腫瘍抗原を認識する細胞表面分子としてＴＣＲを有する免疫担当細胞、すなわち、ＴＣＲ、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＴＣＲ、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９を発現する免疫担当細胞」を作製する場合には、以下のいずれかの方法によって作製することができる。
（１）ＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現するベクター、及びＴＣＲをコードする核酸を含有し、ＴＣＲを発現するベクター、の２種類のベクターを同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
（２）ＴＣＲをコードする核酸とＩＬ−７をコードする核酸を含有し、ＴＣＲとＩＬ−７を発現するベクター、及びＴＣＲをコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＴＣＲとＣＣＬ１９を発現するベクター、の２種類のベクターを同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
（３）ＴＣＲをコードする核酸とＩＬ−７をコードする核酸を含有し、ＴＣＲとＩＬ−７を発現するベクター、及びＩＬ−７をコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＩＬ−７とＣＣＬ１９を発現するベクター、の２種類のベクターを同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
（４）ＴＣＲをコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＴＣＲとＣＣＬ１９を発現するベクター、及びＩＬ−７をコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＩＬ−７とＣＣＬ１９を発現するベクター、の２種類のベクターを同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
（５）ＴＣＲをコードする核酸とＩＬ−７をコードする核酸を含有し、ＴＣＲとＩＬ−７を発現するベクター、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＣＣＬ１９を発現するベクター、の２種類のベクターを同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
（６）ＴＣＲをコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＴＣＲとＣＣＬ１９を発現するベクター、及びＩＬ−７をコードする核酸を含有し、ＩＬ−７を発現するベクター、の２種類のベクターを同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
（７）ＴＣＲをコードする核酸を含有し、ＴＣＲを発現するベクター、ＩＬ−７をコードする核酸を含有し、ＩＬ−７を発現するベクター、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＣＣＬ１９を発現するベクターの３種類のベクターを同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
【００４３】
さらに、上記「ＴＣＲ、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９を発現する免疫担当細胞」を作製する場合には、予め所望の腫瘍抗原に特異的なＴＣＲを発現する免疫担当細胞を調製し、かかるＴＣＲ発現免疫担当細胞を用いて以下のいずれかの方法によって作製することもできる。
（１）ＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現するベクターを上記ＴＣＲ発現免疫担当細胞に導入する方法；
（２）ＩＬ−７をコードする核酸を含有し、ＩＬ−７を発現するベクター、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＣＣＬ１９を発現するベクターの２種類を同時に、又は段階的に上記ＴＣＲ発現免疫担当細胞に導入する方法；
【００４４】
このほか、本件増強剤又は誘導剤や、本件悪性腫瘍再発抑制剤として、「ＣＡＲ、ＴＣＲ、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９を発現する免疫担当細胞」を作製してもよい。具体的には、上記「ＣＡＲ、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９を発現する免疫担当細胞を作製する場合」に記載した各ベクターの全て又はいずれかに、さらにＴＣＲをコードする核酸を含めてＴＣＲも発現するように作製する方法や、上記「ＴＣＲ、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９を発現する免疫担当細胞を作製する場合」に記載した各ベクターの全て又はいずれかに、さらにＣＡＲをコードする核酸を含めてＣＡＲも発現するように作製する方法や、上記「ＴＣＲ発現免疫担当細胞」に、上記「ＣＡＲ、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９を発現する免疫担当細胞を作製する場合」に記載した各ベクターを導入して作製する方法を挙げることができる。
【００４５】
さらに、本件増強剤又は誘導剤や、本件悪性腫瘍再発抑制剤において、免疫担当細胞にＣＡＲを有する場合には、「異なる悪性腫瘍抗原を認識する複数、好ましくは２種類のＣＡＲを発現する免疫担当細胞」を作製してもよい。具体的には、上記「ＣＡＲ、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９を発現する免疫担当細胞を作製する場合」に記載した各ベクターにおいて、異なる悪性腫瘍抗原を認識する複数、好ましくは２種類のＣＡＲをコードする核酸を含めて、複数、好ましくは２種類のＣＡＲを発現するように作製する方法を挙げることができる。特に、たとえば悪性腫瘍抗原Ｘを認識するＣＡＲをコードする核酸及びＩＬ−７をコードする核酸を含有し、悪性腫瘍抗原Ｘを認識するＣＡＲ及びＩＬ−７を発現するベクターと、悪性腫瘍抗原Ｙを認識するＣＡＲをコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、悪性腫瘍抗原Ｙを認識するＣＡＲ及びＣＣＬ１９を発現するベクターを作製して免疫担当細胞に導入すれば、Ｘ及びＹを悪性腫瘍抗原として有する細胞の周辺にＩＬ−７とＣＣＬ１９が分泌され、より腫瘍特異性を高めることが可能となる。
【００４６】
なお、上記核酸送達媒体が免疫担当細胞、ウイルス、嫌気性菌、又は間葉系幹細胞の場合、免疫担当細胞、ウイルス、嫌気性菌、又は間葉系幹細胞を培養して得られた培養物であって、当該免疫細胞を含有するものを用いてもよい。
【００４７】
上記悪性腫瘍再発抑制剤における「悪性腫瘍再発」としては、一般的な化学療法、放射線療法、又は外科療法等によって悪性腫瘍治療後に再度悪性腫瘍が生じることを意味する。かかる悪性腫瘍再発としては、核酸送達媒体の悪性腫瘍細胞への集積能、又は悪性腫瘍細胞において特異的な増殖能に対して抵抗性を有する悪性腫瘍細胞に起因する再発であることが好ましい。
【００４８】
ここで、「悪性腫瘍細胞への集積能に対して抵抗性を有する悪性腫瘍細胞に起因する再発」とは、例えば、核酸送達媒体が悪性腫瘍抗原を認識する細胞表面分子を有する免疫担当細胞であり、悪性腫瘍再発が、細胞表面分子が特異的に認識する悪性腫瘍抗原を有さない、又は細胞表面分子が特異的に認識する悪性腫瘍抗原を失った悪性腫瘍細胞に起因する悪性腫瘍再発を挙げることができる。また、「核酸送達媒体の悪性腫瘍細胞において特異的な増殖能に対して抵抗性を有する悪性腫瘍細胞に起因する再発」とは、例えば、悪性腫瘍溶解性ウイルスによる感染に対して感受性を有さない、又は悪性腫瘍溶解性ウイルスによる感染に対して感受性を失った悪性腫瘍細胞に起因する腫瘍再発を挙げることができる。かかる「悪性腫瘍細胞への集積能に対して抵抗性を有する悪性腫瘍細胞に起因する再発」は、例えば再発した組織の悪性腫瘍細胞における悪性腫瘍抗原を調べることによって確認することができる。
【００４９】
上記悪性腫瘍再発抑制剤は、免疫治療を行った悪性腫瘍を有する対象に投与するために使用することができる。長期的な再発抑制を目的として、免疫治療を行った日から１００日以後に免疫治療を行った悪性腫瘍を有する対象投与するために使用することもできる。
【００５０】
本件増強剤又は誘導剤や、本件悪性腫瘍再発抑制剤は、薬学的に許容される添加剤を含有していてもよい。さらに、本件増強剤又は誘導剤や、本件悪性腫瘍再発抑制剤として用いるための説明書を含んでもよい。また、本件増強剤又は誘導剤や、本件悪性腫瘍再発抑制剤に薬学的に許容される添加剤を含有して医薬組成物としてもよい。以下、「本件増強剤と薬学的に許容される添加剤とを含有する医薬組成物」、「本件誘導剤と薬学的に許容される添加剤とを含有する医薬組成物」、及び「本件悪性腫瘍再発抑制剤と薬学的に許容される添加剤とを含有する医薬組成物」をまとめて「本件医薬組成物」ともいう。前記添加剤としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、細胞培養培地、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール及びこれらの組合せ、安定剤、可溶化剤及び界面活性剤、緩衝剤及び防腐剤、等張化剤、充填剤、並びに潤滑剤を挙げることができる。
【００５１】
本件増強剤又は誘導剤、本件悪性腫瘍再発抑制剤、又は本件医薬組成物は、当業者に既知の方法を用いて、悪性腫瘍の治療又は再発抑制を必要とする被検体に投与することができ、投与方法としては、静脈内、腫瘍内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、髄内、心臓内、関節内、滑液嚢内、頭蓋内、髄腔内、及びくも膜下（髄液）への注射を挙げることができる。
【００５２】
本件増強剤又は誘導剤、本件悪性腫瘍再発抑制剤、又は本件医薬組成物は、１日４回、３回、２回又は１回、１日おき、２日おき、３日おき、４日おき、５日おき、週１回、７日おき、８日おき、９日おき、週２回、月１回又は月２回独立して投与する方法を挙げることができる。
【００５３】
本件増強剤又は誘導剤、本件悪性腫瘍再発抑制剤、又は本件医薬組成物の投与量は被験体の年齢、性別、健康、及び体重等により適宜決定することができる。例えば、核酸送達媒体が免疫担当細胞の場合には、ヒト成人に対して、体重１ｋｇあたり、１×１０３〜１×１０9個、好ましくは１×１０４〜１×１０8個、より好ましくは１×１０５〜１×１０7個を挙げることができる。また、核酸送達媒体が腫瘍溶解性ウイルスの場合には、ヒト成人に対して、投与あたり約１０２〜１０１０プラーク形成単位（ＰＦＵ）、好ましくは１０５〜１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）を挙げることができる。
【００５４】
本明細書における悪性腫瘍としては、固形悪性腫瘍でも血液悪性腫瘍でもよく、神経膠腫、メラノーマ、悪性中皮腫、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、未分化がん、大細胞がん、小細胞がん、皮膚がん、甲状腺がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、頭頸部がん、頸部がん、子宮がん、肝臓がん、腎臓がん、膵臓がん、脾臓がん、肺がん、気管がん、気管支がん、大腸がん、結腸がん、小腸がん、胃がん、食道がん、胆道がん、胆嚢がん、精巣がん、卵巣がん、脳腫瘍等のがんや、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織のがんのほか、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫等の肉腫や、肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫等の芽腫や、胚細胞腫瘍や、リンパ腫や、白血病、骨髄腫を挙げることができる。
【００５５】
本件増強剤又は誘導剤、本件悪性腫瘍再発抑制剤、又は本件医薬組成物は、他の抗腫瘍剤と併用して用いることができる。また、本件増強剤又は誘導剤、本件悪性腫瘍再発抑制剤、又は本件医薬組成物を用いる方法と放射線によるがん治療法を組み合わせてもよい。上記他の抗腫瘍剤としては、シクロホスファミド、ベンダムスチン、イオスファミド、ダカルバジン等のアルキル化薬、ペントスタチン、フルダラビン、クラドリビン、メソトレキセート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、エノシタビン等の代謝拮抗薬、リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツズマブ等の分子標的薬、イマチニブ、ゲフェチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダサチニブ、スニチニブ、トラメチニブ等のキナーゼ阻害剤、ボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、シクロスポリン、タクロリムス等のカルシニューリン阻害薬、イダルビジン、ドキソルビシンマイトマイシンＣ等の抗がん性抗生物質、イリノテカン、エトポシド等の植物アルカロイド、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン等のプラチナ製剤、タモキシフェン、ビカルダミド等のホルモン療法薬、インターフェロン、ニボルマブ、ペンブロリズマブ等の免疫制御薬を挙げることができる。
【００５６】
上記本件増強剤又は誘導剤、本件悪性腫瘍再発抑制剤、又は本件医薬組成物と他の抗がん剤とを併用して用いる」方法としては、他の抗がん剤を用いて処理し、その後本件増強剤又は誘導剤、本件悪性腫瘍再発抑制剤、又は本件医薬組成物を用いる方法や、本件増強剤又は誘導剤、本件悪性腫瘍再発抑制剤、又は本件医薬組成物と他の抗がん剤を同時に用いる方法や、本件増強剤又は誘導剤、本件悪性腫瘍再発抑制剤、又は本件医薬組成物を用いて処理し、その後他の抗がん剤を用いる方法を挙げることができる。また、本件増強剤又は誘導剤、本件悪性腫瘍再発抑制剤、又は本件医薬組成物と他の抗がん剤と併用した場合には、がんの治療効果がより向上するとともに、それぞれの投与回数又は投与量を減らすことで、それぞれによる副作用を低減させることが可能となる。
【００５７】
本明細書において引用された、学術文献、特許出願等の参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。【００５９】
（抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞及び抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞の作製）
後述の実施例において用いる「抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ、マウスＩＬ−７、及びマウスＣＣＬ１９を発現するＴ細胞（抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞：以下の実施例又は図面において「７×１９」ともいう）」及び「抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞：以下の実施例又は図面において「Ｃｏｎｖ．」ともいう）」は、上記特許文献３及びＴａｍａｄａらの文献（Nature Biotechnology doi:10.1038/nbt.4086）に記載の方法に準じて作製した。以下、作製方法を簡潔に記載する。なお、上記「抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ、マウスＩＬ−７、及びマウスＣＣＬ１９を発現するＴ細胞」は、悪性腫瘍細胞抗原を認識する細胞表面分子として抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲを有するＴ細胞であり、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含む。【００６０】
抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は、まず、あらかじめ抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲをコードする核酸、マウスＩＬ−７をコードする核酸、及びマウスＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲとＩＬ−７とＣＣＬ１９を発現するｐＭＳＧＶベクターを作製した。次に、かかるベクターをＣＤ９０．１陽性（ＣＤ９０．１＋）、ＣＤ９０．２陰性（ＣＤ９０．２−）のコンジェニックマウス（Bar Harbor社製）の脾臓及びリンパ節からＰａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Miltenyi Biotec社製）を用いてマウス生体から分離したマウスＴ細胞にレトロウイルスを用いて導入して作製した。一方、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲを発現するＴ細胞（抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞）は、あらかじめ抗ヒト２０  ＣＡＲを発現するｐＭＳＧＶベクターを作製し、かかるベクターを上記分離したマウスＴ細胞にレトロウイルスを用いて導入して作製した。なお、遺伝子導入無しの上記分離したマウスＴ細胞（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｄｕｃｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）は以下の実施例又は図面において「ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｄｕｃｔｅｄ」ともいう。ここで、上記のとおり分離したマウスＴ細胞に抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲをコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を導入するためにレトロウイルスベクターであるｐＭＳＧＶベクターを用いている。そのため、上記それぞれの核酸を導入したマウスＴ細胞を培養して増殖した場合には、マウスＴ細胞質内にレトロウイルスベクターを含んでいるものもあるが、多くはマウスＴ細胞において、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲをコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸がゲノムに組み込まれる。マウスＴ細胞において、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲをコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸がゲノムに組み込まれた場合には、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９は導入した外来の組換えコンストラクトから発現することとなる。【００６１】
Ｔ細胞の培養には、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μＭの２メルカプトエタノール、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地を用いた。【００６２】
［実施例１］
＜Ｔ細胞の局在＞
ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の抗腫瘍効果を調べるために、腫瘍組織において、投与したドナーＴ細胞と同様に宿主（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）由来の内在性Ｔ細胞が腫瘍組織に浸潤しているかどうかを調べた。まず、７−１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（ＳＬＣ社製）に２．５×１０６個の３ＬＬ−ｈＣＤ２０（ヒトＣＤ２０を発現するように遺伝子組換えを行ったマウス肺がん由来細胞３ＬＬ）を皮下接種した（０日目）。その後７日目に抗がん剤であるシクロホスファミド（ＣＰＡ：１００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与した。１０日目に、ＣＤ９０．１陽性（ＣＤ９０．１＋）、ＣＤ９０．２陰性（ＣＤ９０．２−）コンジェニックマウスから生成した１×１０６個の上記抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞、上記抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、若しくは遺伝子導入無しの上記分離したマウスＴ細胞を静脈内に投与した。１９日目に、腫瘍組織をマウスから摘除した。プライマリー染色において、ビオチン標識した抗ＣＤ９０．１抗体（clone OX-7 BioLegend社製：ドナーＴ細胞に結合）及び抗ＣＤ３抗体（ｃｌｏｎｅ  １７Ａ２：Tonbo biosciences社製：ドナーＴ細胞とレシピエントの内在性Ｔ細胞の両方に結合）の組み合わせを用い、セカンド染色としてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８接合ストレプトアビジン（Thermo Fisher Scientific社製:green）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７接合抗ラットＩｇＧ２ｂ（Abcam社製:red）を用いた。核はＤＡＰＩ（Thermo Fisher Scientific社製:blue）で染色した。顕微鏡による観察は４００倍で行った。結果を図１（ａ）に示す。セカンド染色により、ビオチン標識した抗ＣＤ９０．１抗体が結合した細胞は緑色に、抗ＣＤ３抗体が結合した細胞は赤色で示されるため、ドナーＴ細胞である抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は黄色（緑色＋赤色：ＣＤ９０．１＋＋ＣＤ３＋）に、レシピエントの内在性Ｔ細胞は赤色（ＣＤ９０．１-＋ＣＤ３＋）であったが、図１（ａ）ではグレースケールで示す。【００６３】
また、図１（ａ）によって標識された各ポジティブ領域をＨｙｂｒｉｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍ（KEYENCE社製）を用いて定量した結果を図１（ｂ）に示す。図１（ｂ）中、黒カラムはレシピエント（ホスト）の内在性Ｔ細胞（図１（ａ）右図における赤色）の面積、白カラムは投与したドナーＴ細胞（図１（ａ）右図における黄色）の面積を示す。図１（ａ）、（ｂ）により、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与した場合には、投与したＴ細胞だけでなく、レシピエント（ホスト）の内在性Ｔ細胞も腫瘍局所における集積が増強していること、換言すれば、腫瘍局所にＩＬ−７及びＣＣＬ１９を分泌させることで、内在性Ｔ細胞も腫瘍局所における集積が増強していることが明らかとなった。【００６４】
［実施例２］
＜抗腫瘍効果におけるＴ細胞の関与＞
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２．５×１０６個の３ＬＬ−ｈＣＤ２０を皮下接種した（０日目）。その後３日目にＣＤ９０．１陽性（ＣＤ９０．１＋）、ＣＤ９０．２陰性（ＣＤ９０．２−）コンジェニックマウスから生成した１×１０６個の抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞（Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ：Ｃｏｎｖ．）若しくは抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（７×１９）を静脈内に投与した。内在性Ｔ細胞に発現するＣＤ９０．２（Ｔｈｙ１．２）に対する抗体である抗ＣＤ９０．２抗体（ａｎｔｉ−ＣＤ９０．２：本発明者らがＡＴＣＣから購入したハイブリドーマを用いて作製）を１日目から２回／週ほど腹腔内に投与した。投与量は、初回の２回は１ｍｇ／マウスとし、その後は０．５ｍｇ／マウスとした。それぞれの群（ｎ＝５）の１４日目の腫瘍体積のｍｅａｎ±ＳＤを図２に示す。○はそれぞれのマウスの値を示す。【００６５】
図２に示すように、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与した場合には悪性腫瘍の増殖が抑制されており、抗腫瘍効果が極めて高く、腫瘍が消失していたが、抗ＣＤ９０．２抗体を投与することによって抗腫瘍効果が５０％程度低減していた。したがって、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞による抗腫瘍効果には、レシピエントの内在性Ｔ細胞も関与していること、換言すれば、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞による抗腫瘍効果は、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞自身だけでなく、レシピエントの内在性のＴ細胞が大きく関与していることが明らかとなった。【００６６】
［実施例３］
＜レシピエントの内在性Ｔ細胞のメモリー化＞
抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞による、ドナーのＣＡＲ−Ｔ細胞及び内在性Ｔ細胞のメモリー機能獲得及びメモリー機能を有する細胞の増加について、メモリー細胞のマーカーであるＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌにより評価した。【００６７】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２．５×１０６個の３ＬＬ−ｈＣＤ２０を皮下接種した（０日目）。その後３日目にＣＤ９０．１陽性（ＣＤ９０．１＋）、ＣＤ９０．２陰性（ＣＤ９０．２−）コンジェニックマウスから生成した１×１０６個の上記抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞（Ｃｏｎｖ．）若しくは上記抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（７×１９）を静脈内に投与した。２８日目に、脾臓細胞を採取して次の解析に用いた。【００６８】
ドナーＴ細胞はＣＤ９０．１陽性細胞（ＣＤ９０．１＋）、レシピエントＴ細胞はＣＤ９０．２陽性細胞（ＣＤ９０．２＋）で同定した。ＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるメモリーＴ細胞マーカー（ＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌ）及びＣＡＲの発現はフローサイトメトリーで行った。ドットプロット又はヒストグラムの数値はそれぞれのゲートにおける細胞の割合を示す。結果を図３に示す。【００６９】
また、メモリー化の機能、すなわち刺激に対する反応性獲得をＩＦＮ−γの生産により調べた。まず、２８日目に採取した脾臓細胞を、マイトマイシンＣ（協和発酵キリン社製）で９０分、３７℃で処理した３ＬＬ−ｈＣＤ２０又はｈＣＤ２０を発現していないその親株３ＬＬと共培養して刺激した。ＩＦＮ−γの生産は細胞内サイトカイン染色によって調べた。結果を図４に示す。図４中、（ａ）のヒストグラムにおける数値は、ＣＤ９０．１陽性ドナーＴ細胞におけるＩＦＮ−γポジティブ細胞の割合を示す。図４中、（ｂ）はＣＤ９０．２陽性の内在性ＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ陽性細胞をフローサイトメトリーで検出した結果を示す。ドットプロットの数値は、それぞれの４象限における細胞の割合を示す。【００７０】
図３に示すように、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞（Ｃｏｎｖ．）を投与した場合には、ＣＤ９０．２ゲート細胞（レシピエントの内在性Ｔ細胞）においてセントラルメモリーＴ細胞（メモリーＴ細胞マーカーであるＣＤ４４陽性及びＣＤ６２Ｌ陽性細胞）がＣＤ４陽性細胞において５．５％、ＣＤ８陽性細胞において２４．８％であった。一方、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（７×１９）を投与した場合には、ＣＤ９０．２ゲート細胞（レシピエントの内在性Ｔ細胞）においてセントラルメモリーＴ細胞がＣＤ４陽性細胞において６．７６％、ＣＤ８陽性細胞において４９．２％であり、いずれもセントラルメモリーＴ細胞の割合が増加していた。したがって、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（７×１９）を投与すること、すなわちＩＬ−７とＣＣＬ１９を一つの細胞から分泌させることにより、レシピエントの内在性Ｔ細胞を活性化すると共に、レシピエントの内在性Ｔ細胞をセントラルメモリーＴ細胞に分化誘導し、セントラルメモリーＴ細胞の数を増加すると共に脾臓細胞群におけるセントラルメモリーＴ細胞の割合を増加可能であることが明らかとなった。換言すれば、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は、投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞の誘導剤や、投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞の増強剤として用いることができることが明らかとなった。【００７１】
一方、ＣＤ９０．１ゲート細胞（ドナーＴ細胞）においてセントラルメモリーＴ細胞がＣＤ４陽性細胞において７５．８％、ＣＤ８陽性細胞において９０．７％であり、ドナーＴ細胞自身もセントラルメモリーＴ細胞に誘導されていることが確認された。なお、Ｃｏｎｖ．においてＣＤ９０．１ゲート細胞が０％であり、ＣＤ９０．１陽性細胞が検出されていない（ｎ．ｄ．）のは、Ｃｏｎｖ．ではＩＬ−７とＣＣＬ１９を発現させておらず、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の生存率が低いためである。【００７２】
さらに、図４に示すように、３ＬＬの刺激により、ドナー細胞においてＣＤ４陽性細胞では９０．５％、ＣＤ８陽性細胞では９３．６％がＩＦＮ−γを生産していた。また、レシピエントの内在性Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ発現無し）においても、ＣＤ４陽性細胞においてＣｏｎｖ．では０．９５７％であるのに対し、７×１９では１４．９％もの細胞がＩＦＮ−γを生産していた。したがって、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞によりＩＬ−７とＣＣＬ１９を分泌させることで、ドナーＴ細胞及びレシピエント細胞のいずれもが刺激によりＩＦＮ−γを生産しており、メモリー機能を獲得していることが明らかとなった。【００７３】
［実施例４］
＜Ｔ細胞受容体の遺伝子発現パターンの変化＞
Ｔ細胞のエピトープ多様性を調べるために、ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の処理の前後におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーの変化を調べた。ＤＢＡ／２マウス（ｎ＝５）に５×１０5個のＰ８１５−ｈＣＤ２０（ヒトＣＤ２０を発現するように遺伝子組換えを行ったマウス肥満細胞腫Ｐ８１５）を皮下接種した（０日目）。その後１０日目にシクロホスファミド（ＣＰＡ：１００ｍｇ／ｋｇ）及び１×１０６個の抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を静脈内に投与して腫瘍を治療した。Ｐ８１５腫瘍細胞投与から１４０日目に、上記により腫瘍を治療して根治したマウス（腫瘍拒絶マウス：Ｔｕｍｏｒ−ｒｅｊｅｃｔｅｄ ｍｉｃｅ）から脾臓細胞を採取し、セルソーター（ＳＨ８００：ソニー社製）でソートしたＣＡＲ陽性Ｔ細胞又はＣＡＲ陰性Ｔ細胞を増殖するために４日間Ｐ８１５−ｈＣＤ２０又はｈＣＤ２０を発現していない親株（ｈＣＤ２０陰性：ｈＣＤ２０−）Ｐ８１５と共に培養した。その後、ＴＣＲレパートリー解析のために、ＣＤ８陽性かつＣＡＲ陽性（ＣＤ８＋ＣＡＲ＋）又はＣＤ８陽性かつＣＡＲ陰性（ＣＤ８＋ＣＡＲ−）ポピュレーションをフローサイトメーターでソートした。コントロールとして、マウスに投入する前のＣＤ８陽性かつＣＡＲ陽性、又は、ＣＤ８陽性かつＣＡＲ陰性ポピュレーションをソートした。ＴＣＲレパートリーは次世代シークエンサーで解析し、α及びβ鎖におけるＶ及びＪ領域の使用頻度を３−Ｄグラフで示した。結果を図５Ａ−Ｄ、図６Ａ−Ｄに示す。図５Ａ−Ｄはα鎖、図６Ａ−Ｄはβ鎖であり、また、図５Ａ、Ｂ、図６Ａ、Ｂは各細胞投入前、図５Ｃ、Ｄ、図６Ｃ、Ｄは各細胞投入後である。図中の左上の数値は１−Pielou均等度指数 (a higher number indicates a less diversity)で算出したdiversity indexesを示し、数値が低いほど多様性が高いことを示す。【００７４】
なお、Ｔ細胞受容体はＴ細胞の細胞膜上に発現している抗原受容体分子である。α鎖とβ鎖、又はγ鎖とδ鎖からなるヘテロ二量体として存在しており、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原分子を認識することでＴ細胞を活性化することが知られている。【００７５】
図５Ａ−Ｄ、図６Ａ−Ｄにおけるdiversity indexesから明らかなように、α鎖、β鎖のいずれも抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の投与によりdiversity indexes値が増加していた。したがって、投与した抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞だけでなく、レシピエントの内在性Ｔ細胞もＴＣＲの多様性が低下しており、腫瘍局所でＩＬ−７及びＣＣＬ１９を分泌すると共に腫瘍細胞を破壊することで腫瘍抗原に対してメモリー機能を有すると思われるＴ細胞が選択的に増加していることが明らかとなった。【００７６】
［実施例５］
＜腫瘍の再発抑制−１＞
動物を利用したがん再発モデルを次の方法により行った。まず、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞で処理したマウスにおいて、レシピエントＴ細胞の腫瘍特異的メモリー応答を調べた。７−１０週齢の担がんマウス（ＤＢＡ／２：ｎ＝４：ＳＬＣ社製）に５×１０５個のＰ８１５−ｈＣＤ２０を皮下接種した。その後１０日目に抗がん剤であるシクロホスファミド（ＣＰＡ：１００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与した。１４日目に、１×１０６個の抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を静脈内に接種した。Ｐ８１５−ｈＣＤ２０を接種後１４０日目に、腫瘍を治療して根治したマウス（ｔｕｍｏｒ−ｒｅｊｅｃｔｅｄ  ｍｉｃｅ）又はコントロールのナイーブマウス（ｎａｉｖｅ  ｍｉｃｅ）に対して、Ｐ８１５−ｈＣＤ２０又はｈＣＤ２０を発現していない親株のＰ８１５を左右の脇腹にそれぞれ接種した。腫瘍の体積は２回／週測定した。結果を図７Ａに示す。また、上記Ｐ８１５−ｈＣＤ２０の代わりに３ＬＬ−ｈＣＤ２０又はｈＣＤ２０を発現していない親株の３ＬＬを接種したＣ５７ＢＬ／６マウスを用いて同様の解析を行った。結果を図７Ｂに示す。なお、親株のＰ８１５及び３ＬＬはヒトＣＤ２０を発現しないため、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の細胞表面分子が特異的に認識する悪性腫瘍抗原を有さない悪性腫瘍細胞となる。【００７７】
図７Ａにおける横軸は、ナイーブマウスについては最初にＰ８１５−ｈＣＤ２０又はＰ８１５を投与した日（０日）からの日数、腫瘍を治療して根治したマウスにおいては、最初のＰ８１５−ｈＣＤ２０接種後１４０日目に再度Ｐ８１５−ｈＣＤ２０を接種した日（０日）からの日数である。また、図７Ｂにおける横軸は、ナイーブマウスについては最初に３ＬＬ−ｈＣＤ２０又は３ＬＬを接種した日（０日）からの日数、腫瘍を治療して根治したマウスにおいては、再度３ＬＬ−ｈＣＤ２０を接種した日（０日）からの日数である。図７Ａ、７Ｂにおける縦軸は腫瘍の体積（ｍｍ３）である。【００７８】
図７Ａ、７Ｂの下段に示すように、腫瘍を治療して根治したマウス（ｔｕｍｏｒ−ｒｅｊｅｃｔｅｄ  ｍｉｃｅ）においてＰ８１５−ｈＣＤ２０又は３ＬＬ−ｈＣＤ２０を接種した場合には腫瘍は形成されていなかった。すなわち、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞で腫瘍を治療することで、ＣＡＲが認識する抗原を有する腫瘍細胞に起因する腫瘍の再発を抑制できることが明らかとなった。さらに、驚くべきことに、図７Ａ、７Ｂの上段に示すように、腫瘍を治療して根治したマウスにおいて細胞表面にＣＤ２０を有さない親株のＰ８１５又は３ＬＬを接種した場合に、腫瘍の形成がナイーブマウスと比較して著しく抑制されていた。すなわち、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞で処理することで、ＣＡＲが認識する抗原を有さない腫瘍細胞に起因する腫瘍の形成、換言すればＣＡＲが認識する抗原を有さない腫瘍細胞に起因する腫瘍再発も抑制できることが明らかとなった。このように、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与することで投与対象の免疫機能に影響を与え、ＣＡＲの標的抗原を発現していない親株の腫瘍に対しても投与対象は長期的に拒絶し続け、再発を抑制することについては、ＣＡＲ−Ｔ細胞の標的分子特異的反応性という観点から予想外であった。上記実施例４におけるＴ細胞受容体の遺伝子発現パターンの変化の結果と合わせると、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の投与により、腫瘍細胞の破壊が起こり、その結果として腫瘍細胞が元来有する腫瘍抗原に対して、レシピエントの内在性Ｔ細胞が反応し、長期のメモリー機能が誘導されたと考えられる。すなわち、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の投与により腫瘍細胞を破壊すると共に腫瘍局所でＩＬ−７及びＣＣＬ１９を分泌することで、極めて効率的にＥｐｉｔｏｐｅ  Ｓｐｒｅａｄｉｎｇ現象を誘導し、メモリー機能を誘導及び増強することで悪性腫瘍の再発を抑制すると考えられる。なお、上記がん再発モデルでは、最初にＰ８１５−ｈＣＤ２０、Ｐ８１５、３ＬＬ−ｈＣＤ２０、及び３ＬＬを皮下に接種し、１４０日目には上記それぞれの細胞を左右の脇腹にそれぞれ接種している。そのため、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の投与により、単に悪性腫瘍の再発を抑制しただけでなく、悪性腫瘍の転移を抑制するとも考えられる。したがって、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は「悪性腫瘍転移抑制剤」としても利用可能であると考えられる。【００７９】
［実施例６］
＜腫瘍の再発抑制−２＞
腫瘍の再発抑制効果を確認するために、ヒト悪性胸膜中皮腫細胞株をマウスに投与して腫瘍を形成させ、その後抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の投与の有無による１４３日間の腫瘍再発の有無を調べた。具体的な実験プロトコールを図８に示す。また、図８中の「ＡＣＣ−ＭＥＳＯ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ」、「抗メソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞」、「抗メソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞」の調製方法、Ｔ細胞の活性化方法は以下のとおりである。【００８０】
（ＡＣＣ−ＭＥＳＯ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ株の作製）
愛知県がんセンター研究所  関戸好孝先生から分与いただいたメソセリン陽性腫瘍細胞株であるヒト悪性中皮種細胞株ＡＣＣ−ＭＥＳＯ１にレンチウイルスを用いて緑色蛍光タンパク質−ルシフェラーゼ（ＧＦＰ−Ｌｕｃ）の遺伝子導入を行った。【００８１】
ｄａｙ０に９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでＡＣＣ−ＭＥＳＯ１を蒔いた。培地は１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ社製）を使用した。ｄａｙ１に発光細胞作製用レンチウイルス粒子であるＲｅｄｉＦｅｃｔ  Ｒｅｄ−ＦＬｕｃ−ＧＦＰ（PerkinElmer社製）をＭＯＩ  １００で加えて形質導入を開始した。その際に遺伝子導入効率を高めるため、Ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ  Ｂｒｏｍｉｄｅ（Sigma-aldrich社製）を再終濃度４μｇ／ｍＬとなるように培地に加えた。ウイルス添加２４時間後（ｄａｙ２）にウイルスを含む培地を除去して培地の交換を行った。培養継続後、ＧＦＰを発現する細胞のみをＳＨ８００（SONY社製）でソーティングし、ＡＣＣ−ＭＥＳＯ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ株とした。【００８２】
（抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、及び抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞の作製）
抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、及び抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞）は、特願２０１７−２４７１０９号及び国際公開第２０１６／０５６２２８号パンフレットに記載の方法に基づいて作製した。簡潔に記載すると、配列番号３に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号４に示すリンカーのアミノ酸配列と配列番号５に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列からなる抗ヒトメソセリン一本鎖抗体、ヒトＣＤ８膜貫通領域及びヒトＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ細胞内シグナルモチーフを順次備えた第３世代ＣＡＲコンストラクト（配列番号６）を作製した。かかるコンストラクトのＣ末端に配列番号１に示すヒトＩＬ−７と、それに続く配列番号７に示すピコルナウイルス由来の２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）、配列番号２に示すヒトＣＣＬ１９、及びヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）を順次備えたコンストラクトを作製し、ｐＭＳＧＶ１レトロウイルス発現ベクター（Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002)）に挿入してヒトＩＬ−７／ＣＣＬ１９及びＨＳＶ−ｔｋを発現するｐＭＳＧＶ１レトロウイルス発現ベクターを作製した。得られたｐＭＳＧＶ１レトロウイルス発現ベクターをレトロウイルスによりマウスＴ細胞に導入して抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を作製した。同様に、上記ヒトＩＬ−７／ＣＣＬ１９及びＨＳＶ−ｔｋを発現するｐＭＳＧＶ１レトロウイルス発現ベクターの代わりに上記抗ヒトメソセリン一本鎖抗体、ヒトＣＤ８膜貫通領域及びヒトＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ細胞内シグナルモチーフを順次備えた第３世代ＣＡＲコンストラクトを発現するｐＭＳＧＶ１レトロウイルス発現ベクターをレトロウイルスによりマウスＴ細胞に導入して抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞）を作製した。シグナルペプチドは、配列番号８に示すシグナルペプチドを用いた。【００８３】
（Ｔ細胞の活性化）
ｄａｙ０に健常人ドナーから採取した２×１０６個の末梢血単核球を、レトロネクチン２５μＬ／ｍＬ（タカラバイオ社製）と、抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体５μｇ／ｍＬ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、５μｇ／ｍＬ）を固層化させた細胞培養用６ｗｅｌｌプレートで、ＩＬ−２  ２００ＩＵ／ｍＬ（Peprotech社製）と共に３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養を開始した。培養液にはＯｐＴｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ（Gibco社製）にＬ−グルタミン２ｍＭ（Gibco社製）、１％ペニシリンーストレプトマイシン（和光純薬工業社製）及びファンギゾン２．５μｇ／ｍＬ（ブリストル・マイヤーズスクイブ社製）を加えたものを用いた。３日間培養し、ｄａｙ３にＴ細胞が活性化して形態変化が起きていることを顕微鏡下にて確認した。【００８４】
（腫瘍の再発観察）
まず、ｄａｙ０に８週齢の雌ＮＳＧ免疫不全マウスに対して２×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅで上記ＡＣＣ−ＭＥＳＯ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃを胸腔内投与した。ｄａｙ１にＩｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ：ＩＶＩＳ）を用いて胸腔内への腫瘍生着を確認した。ｄａｙ１に健常ドナーの末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ：ＰＢＭＣ）から作製し凍結保存していた上記ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、及び上記方法で活性化したＴ細胞を解凍した。上記ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞と上記抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞のＣＡＲ発現率はそれぞれ４９．６％、３２．５％であったため、ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞に上記活性化Ｔ細胞を加えて両者のＣＡＲ発現率を合わせた後、１×１０５ｃｅｌｌｓの上記ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を投与する群（Ｎ＝５）、１×１０５ｃｅｌｌｓの上記抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与する群（Ｎ＝５）を準備した。ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞及び抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の投与は尾静脈より静脈内投与にて行った。さらに、ｄａｙ３以降、ＩＶＩＳを用いた腫瘍蛍光強度の測定（発光量：Ｔｏｔａｌ  Ｆｌｕｘ（ｐｈｏｔｏｎｓ/ｓｅｃ）を行った。結果を図９Ａ、Ｂに示す。また、上記結果における投与からの日数とマウスの生存率との関係をグラフ化したものを図１０に、投与からの日数とトータルの蛍光量（ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓｅｃｏｎｄ）との関係をグラフ化したものを図１１に示す。図９Ａ、Ｂ、図１０、及び図１１中、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与したものを「７×１９  ＣＡＲ−Ｔ」で示し、ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  抗メソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を投与したものを「Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ＣＡＲ−Ｔ」で示している。なお、本実施例６では内在性Ｔ細胞が欠損しているＮＳＧ免疫不全マウスをレシピエントとして使用しているため、レシピエントの内在性Ｔ細胞の影響は除かれており、投与した抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞自体の効果を評価していることとなる。【００８５】
図９Ａ、Ｂ、図１０、及び図１１に示すように、ｄａｙ２１頃には７×１９  ＣＡＲ−Ｔ、Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ＣＡＲ−Ｔのいずれも腫瘍蛍光強度がほとんど観察されていない。７×１９  ＣＡＲ−Ｔにおいては、その後ｄａｙ１４３まで腫瘍蛍光が観察されておらず、再発が完全に抑制されていることが確認された。一方、Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ＣＡＲ−Ｔではｄａｙ４５あたりから腫瘍蛍光が観察され始めて、ｄａｙ１１５には腫瘍蛍光強度が高まり、ｄａｙ１２９には１匹死亡し、ｄａｙ１４３には残りの４匹も死亡した。したがって、ＣＡＲ−ＩＬ−７−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の投与、すなわち腫瘍局所でＩＬ−７及びＣＣＬ１９を分泌すると共に腫瘍細胞を破壊することで悪性腫瘍の再発を抑制できることが明らかとなった。【００８６】
［実施例７］
＜レシピエントの内在性Ｔ細胞のメモリー化＞
上記では悪性腫瘍抗原を認識する細胞表面分子としてＣＡＲを有するＴ細胞を用いたが、ＣＡＲの代わりに悪性腫瘍抗原を認識する細胞表面分子としてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞を用いてレシピエントの内在性Ｔ細胞のメモリー化を調べた。【００８７】
（Ｐ１Ａ特異的ＴＣＲ／ＩＬ−７／ＣＣＬ１９／ｅＧＦＰ発現Ｔ細胞の作製）
Ｐ８１５の腫瘍抗原であるＰ１Ａに特異的なＴＣＲ、マウスＩＬ−７、マウスＣＣＬ１９、及びＧＦＰを発現するＴ細胞の作製は上記特許文献３に記載の方法に準じて行った。簡潔に記載すると以下のとおりである。【００８８】
マウスＩＬ−７（ストップコドン無し）と、それに続くピコルナウイルス由来の２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）、マウスＣＣＬ１９をコードするＩＬ−７−Ｆ２Ａ−ＣＣＬ１９  ＤＮＡ断片を人工合成した（ライフテクノロジー社製）。上記で合成したＩＬ−７−Ｆ２Ａ−ＣＣＬ１９  ＤＮＡ断片を、Ｆ２Ａ−ｅＧＦＰ配列を有するｐＭＳＧＶレトロウイルス発現ベクター（上記特許文献３）のマルチクローニングサイトに、制限酵素（ＮＣＯＩ及びＥＣＯＲＩ）処理及びライゲーションにより挿入し、ＩＬ−７−Ｆ２Ａ−ＣＣＬ１９−Ｆ２Ａ−ｅＧＦＰ  ＤＮＡ断片（配列番号９）を含むｐＭＳＧＶベクター（ＩＬ−７×ＣＣＬ１９−ｅＧＦＰ発現ベクター）を得た。また、コントロールとしてｅＧＦＰを含み、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を含まないｐＭＳＧＶベクター（ｅＧＦＰコントロールベクター）を作製した。なお、配列番号９において、１〜４６２番目の塩基がＩＬ−７（１〜７５番目の塩基はＩＬ−７のシグナル配列）、４６３〜５３７番目の塩基がＦ２Ａ、５３８〜８６１番目の塩基がＣＣＬ１９（５３８〜６１２番目の塩基はＣＣＬ１９のシグナル配列）、８６８〜９４２がＦ２Ａ、９４６〜１６６２番目の塩基がｅＧＦＰをコードする核酸、１６６３〜１６６５番目の塩基がストップコドンである。【００８９】
Ｙ．Ｌｉｕから入手した、Ｈ−２Ｌｄ拘束性のＰ８１５の腫瘍抗原であるＰ１Ａに特異的なＴＣＲを発現するトランスジェニックマウス（Sarma, S., Y. Guo, Y. Guilloux, C. Lee, X.-F. Bai, Y. Liu. 1999. J. Exp. Med. 189:811.）から脾臓細胞を採取し、脾臓細胞由来のＰ８１５の腫瘍抗原であるＰ１Ａに特異的なＴＣＲを発現するマウスＴ細胞（Ｐ１Ａ特異的ＴＣＲ−Ｔ細胞）を得た。次に、ＩＬ−７×ＣＣＬ１９−ｅＧＦＰ発現ベクター及びｅＧＦＰコントロールベクターを導入したレトロウイルスを作製し、上記Ｐ１Ａ特異的ＴＣＲ−Ｔ細胞を含む脾臓細胞（３×１０６個／ウェル）をＰ１Ａペプチドで４８時間活性化した細胞に形質導入して、Ｐ１Ａ特異的ＴＣＲ／ＩＬ−７／ＣＣＬ１９／ｅＧＦＰ発現Ｔ細胞（７×１９  Ｐ１Ａ−ＣＴＬ）又はＰ１Ａ特異的ＴＣＲ／ｅＧＦＰ発現Ｔ細胞（ｃｏｎｖ．  Ｐ１Ａ−ＣＴＬ）を得た。各発現ベクターの形質導入はサロゲートマーカーとしてｅＧＦＰを検出するフローサイトメトリー解析によって確認した。得られたそれぞれのＴ細胞のｅＧＦＰの発現レベルは、いずれの実験においても７０〜８０％であった。【００９０】
Ｐ１Ａ特異的ＴＣＲ／ＩＬ−７／ＣＣＬ１９／ｅＧＦＰ発現Ｔ細胞又はＰ１Ａ特異的ＴＣＲ／ｅＧＦＰ発現Ｔ細胞それぞれでマウスを処理した場合の脾臓細胞におけるＣＤ８＋ＧＦＰ＋細胞の割合及びＣＤ８＋ＧＦＰ＋細胞絶対数をフローサイトメトリーで解析した結果を図１２（ａ）、（ｂ）に示す。脾臓細胞においてＰ１Ａ特異的ＴＣＲ／ＩＬ−７／ＣＣＬ１９／ｅＧＦＰ発現Ｔ細胞で処理した場合には、ＣＤ８＋ＧＦＰ＋細胞の割合及びＣＤ８＋ＧＦＰ＋細胞絶対数が増加していることが確認された。【００９１】
次に、ｎａｉｖｅ  ＢＤＡ／２マウスのＣＤ８＋脾臓細胞及びＰ１Ａ特異的ＴＣＲ／ＩＬ−７／ＣＣＬ１９／ｅＧＦＰ発現Ｔ細胞で処理したマウスのＣＤ８＋ＧＦＰ−又はＣＤ８＋ＧＦＰ＋脾臓細胞におけるＣＤ４４の発現をフローサイトメトリーで解析した結果を図１３（ａ）、（ｂ）に示す。図１３（ａ）は代表的なＣＤ４４＋細胞の細胞数、図１３（ｂ）はＣＤ４４＋細胞の割合を示す。図１３（ａ）、（ｂ）に示すように、投与したＴ細胞（ＧＦＰ＋  ｇａｔｅｄ）だけでなく、レシピエントの内在性Ｔ細胞（ＧＦＰ−  ｇａｔｅｄ）もＣＤ４４＋の割合がｎａｉｖｅ  Ｔ細胞と比較して２倍以上増加していた。したがって、Ｐ１Ａ特異的ＴＣＲ／ＩＬ−７／ＣＣＬ１９／ｅＧＦＰ発現Ｔ細胞はレシピエントの内因性Ｔ細胞をメモリー化する作用、すなわちレシピエントの内因性Ｔ細胞のメモリー機能を誘導し、レシピエントの内因性Ｔ細胞のメモリー機能を増強する作用を有することが確認された。【００９２】
さらに、メモリー化の機能、すなわち刺激に対する反応性獲得を確認するために、ＩＦＮ−γの生産により調べた。Ｔ細胞を脾臓細胞から磁気で単離し、Ｐ８１５で処理した粘膜型マスト細胞（Ｍｕｃｏｓａｌ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ：ＭＭＣ）と５日間ほど共培養した。培地の上清中のＩＦＮ−γの濃度をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）によって検出した結果を図１４に示す。図１４に示すように、Ｐ１Ａ特異的ＴＣＲ／ＩＬ−７／ＣＣＬ１９／ｅＧＦＰ発現Ｔ細胞はＩＦＮ−γの生産が多いことが確認された。したがって、Ｐ１Ａ特異的ＴＣＲ／ＩＬ−７／ＣＣＬ１９／ｅＧＦＰ発現Ｔ細胞はレシピエントの内在性Ｔ細胞の抗腫瘍活性を向上させことが確認された。このことから、レシピエントにおいて再発抑制効果を誘導することが考えらえた。【００９３】
［実施例８］
＜ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現するウイルス＞
上記では核酸送達媒体として免疫担当細胞を用いたが、腫瘍局所にＩＬ−７及びＣＣＬ１９が分泌されれば免疫担当細胞を用いなくても投与対象におけるメモリー機能を有するＴ細胞又はＢ細胞を増強することや、悪性腫瘍再発を抑制することが可能であるはずである。そこで、核酸送達媒体として免疫担当細胞の代わりにウイルスを用いて解析を行った。【００９４】
（マウスＩＬ−７及びマウスＣＣＬ１９を発現する遺伝子組換えワクシニアウイルスの作製）
マウスＩＬ−７及びマウスＣＣＬ１９を発現する遺伝子組換えワクシニアウイルスは上記特許文献３及び国際公開第２０１１／１２５４６９号パンフレットに記載の方法に準じて、以下の方法で作製した。ｐＴａｇＢＦＰ−Ｎベクター（FP172、Evrogen社)のＤＮＡを鋳型として、２つのプライマー（5’-ATG GCC GGA CCG GCC ACC GGT CGC CAC CAT GAG CGA G-3’：配列番号１０）と（5’-TCG AAT TCG CTA GCG GCC GCT TAA TTA AGC TTG TGC CCC AG-3’：配列番号１１）によって、青色蛍光タンパク質（Ｂｌｕｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＦＰ）遺伝子領域を増幅した。そのＰＣＲ産物を制限酵素ＳｆｉＩとＥｃｏＲＩで切断し、それをｐＴＫ−ＳＰ−ＬＧベクター(国際公開第２０１１／１２５４６９号パンフレット)の同じ制限酵素部位にクローニングし、合成ワクシニアウイルスプロモーター（Hammond JM. et al., Journal of Virological Methods. 1997; 66(1):135-138）下にＢＦＰを連結したｐＴＫ−ＳＰ−ＢＦＰを構築した。次に、ｐＡｍＣｙａｎ１−Ｎ１ベクター（タカラバイオ社製）を制限酵素ＡｇｅＩとＮｏｔＩで切断し、その蛍光タンパク質ＡｍＣｙａｎ１断片を、ｐＴＫ−ＳＰ−ＢＦＰの同じ制限酵素で処理した部位へクローニングし、ｐＴＫ−ＳＰ−ＡｍＣｙａｎ１を構築した。【００９５】
マウスＩＬ−７と、それに続くピコルナウイルス由来の２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）、マウスＣＣＬ１９、Ｆ２Ａ、ｅＧＦＰをコードするＤＮＡ断片を含むｐＭＳＧＶプラスミド（上記特許文献３）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、Ｂｌｕｎｔ処理後、ＮｃｏＩで切断して得たマウスＩＬ−７−Ｆ２Ａ−マウスＣＣＬ１９−Ｆ２Ａ−ｅＧＦＰ断片を、ｐＴＫ−ＳＰ−ＡｍＣｙａｎ１を制限酵素ＮｈｅＩで切断し、Ｂｌｕｎｔ処理後、ＮｃｏＩで切断した部位へクローニングし、トランスファーベクタープラスミドｐＴＫ−ＳＰ−マウスＩＬ−７−Ｆ２Ａ−マウスＣＣＬ１９−Ｆ２Ａ−ｅＧＦＰを構築した。【００９６】
ｐＧＬ４．２０(プロメガ社製)のＤＮＡを鋳型として、２つのプライマー（5’-GCT CCG GAC GCC ACC ATG GAA GAT GCC AAA AAC-3’（配列番号１２）と5’-GCG AAT TCC ACG GCG ATC TTG CCG CCC TTC T-3’（配列番号１３））によって、ホタルルシフェラーゼ遺伝子領域を増幅した。そのＰＣＲ産物を制限酵素ＢｓｐＥＩ及びＥｃｏＲＩで切断して得たＬｕｃ断片、及びｐＴＫ−ＳＰ−マウスＩＬ−７−Ｆ２Ａ−マウスＣＣＬ１９−Ｆ２Ａ−ｅＧＦＰを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｓｒＧＩで切断して得たｅＧＦＰの一部を含む断片を同時に、ｐＴＫ−ＳＰ−マウスＩＬ−７−Ｆ２Ａ−マウスＣＣＬ１９−Ｆ２Ａ−ｅＧＦＰを制限酵素ＢｓｐＥＩとＢｓｒＧＩで切断した部位へクローニングし、トランスファーベクタープラスミドｐＴＫ−ＳＰ−Ｌｕｃ−Ｆ２Ａ−ｅＧＦＰを構築した。【００９７】
図１５（ａ）、（ｂ）に示すウイルスゲノムを持つ組換えワクシニアウイルスの回収のため、６ｗｅｌｌディッシュに８０％コンフルエントに培養されたＣＶ１細胞にワクシニアウイルス（ＬＣ１６ｍＯ）をＭＯＩ＝０．０２〜０．１で感染させ、室温で１時間吸着後、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（プロメガ社製）と混合したトランスファーベクタープラスミドＤＮＡ（ｐＴＫ−ＳＰ−マウスＩＬ−７−Ｆ２Ａ−マウスＣＣＬ１９−Ｆ２Ａ−ｅＧＦＰ又はｐＴＫ−ＳＰ−Ｌｕｃ−Ｆ２Ａ−ｅＧＦＰ）をマニュアルに従って細胞に添加して取り込ませ、３７℃にて２〜５日間培養した。細胞を回収し凍結融解後、ソニケーション処理し、ほぼコンフルエントになったＢＳＣ１細胞に適当に希釈して接種し、０．８％メチルセルロースを含むＥａｇｌｅ  ＭＥＭ、５％ＦＢＳ培地を加え、３７℃で２〜５日間培養した。培地を除き、ＢＦＰ発現プラークをチップの先で掻き取り、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地(Invitrogen社製)に浮遊させた。ＢＳＣ１細胞にてさらに３回以上この操作を繰り返し、プラーク純化した。プラーク純化後に採取したプラークの浮遊液をソニケーション後、その２００μＬよりＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ（Roche社製）を用いマニュアルに従ってゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによるスクリーニングに供した。２つのプライマー（5’-ATT TCT CCG TGA TAG GTA TCG ATG-3’（配列番号１４）と5’-AAC GGT TTA CGT TGA AAT GTC C-3’配列番号１５）によってＰＣＲを行い、所定の大きさのＰＣＲプロダクトが検出されたクローンについて、ＰＣＲプロダクトの塩基配列をダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンを選択し、Ａ５４９細胞にて増幅させた後、ＲＫ１３細胞にてウイルス力価を測定し、遺伝子組換えワクシニアウイルスＬＣ１６ｍＯ  ＴＫ−ＳＰ−マウスＩＬ−７−Ｆ２Ａ−マウスＣＣＬ１９−Ｆ２Ａ−ｅＧＦＰ（ＴＫ−ＩＣＥ：図１５（ａ））又はＬＣ１６ｍＯ  ＴＫ−ＳＰ−Ｌｕｃ−Ｆ２Ａ−ｅＧＦＰ（ＴＫ−ＬＥ：図１５（ｂ））として以下の実験に供した。【００９８】
Ａ５４９細胞（１×１０５細胞／ｗｅｌｌ）又はＣＴ２６細胞（５×１０４細胞／ｗｅｌｌ）を２４ｗｅｌｌプレートに播種し３７℃培養後、ＴＫ−ＩＣＥ又はＴＫ−ＬＥをＡ５４９細胞ＭＯＩ＝０．１又はＣＴ２６細胞ＭＯＩ＝１０でそれぞれ感染させ（ｎ＝３）、感染から２４、４８、７２時間後に細胞を蛍光顕微鏡（オリンパス社製）にて観察を行い（図１６）、上清を回収した。各２４、４８、７２時間後に回収した上清を１００倍希釈し、ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  Ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−７  （Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製  ＤＹ４０７）、ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  Ｍｏｕｓｅ  ＣＣＬ−１９  （R＆D Systems社製 DY440）及びＤｕｏＳｅｔ  Ａｎｃｉｌｌａｒｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ２  （R＆D Systems社製 DY008）によって、上清０．５ｍＬ中のＩＬ−７及びＣＣＬ１９の分泌量を測定した。測定結果を図１７に示す。【００９９】
図１６、１７に示すように、感染２４、４８、７２時間のＡ５４９細胞及びＣＴ２６細胞におけるｅＧＦＰ蛍光発現はＴＫ−ＩＣＥとＴＫ−ＬＥで同程度であり、Ａ５４９細胞では感染４８時間後にはほとんど全ての細胞において検出され、ＣＴ２６細胞では時間の経過に伴ってｅＧＦＰ蛍光の発現が増加していた。また、Ａ５４９細胞及びＣＴ２６細胞において、ＴＫ−ＩＣＥを感染させた場合には感染２４時間後よりＩＬ−７及びＣＣＬ１９は検出され、Ａ５４９細胞では感染４８時間後にはほぼプラトーに達しており、ＣＴ２６細胞では時間の経過に伴って上昇していた。一方、ＴＫ−ＬＥを感染させた場合にはＩＬ−７及びＣＣＬ１９は検出限界以下であった。上記結果から、ＴＫ−ＩＣＥは腫瘍細胞を破壊すると共に、ＩＬ−７、ＣＣＬ１９を分泌することが確認された。【０１００】
［実施例９］
＜抗腫瘍効果＞
上記実施例８により、上記で作製した遺伝子組換えワクシニアウイルスＴＫ−ＩＣＥは、腫瘍細胞に感染してがん細胞を破壊すると共に、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を分泌することが確認された。そこで、遺伝子組換えワクシニアウイルスＴＫ−ＩＣＥの抗腫瘍効果を調べた。【０１０１】
図１８に示すようにマウス大腸癌ＣＴ２６細胞（５×１０５細胞）をＢＡＬＢ／ｃマウスの両腹部の皮下に移植し成長させた。次に、各遺伝子組換えワクシニアウイルス（３−５×１０７プラーク形成単位（ＰＦＵ））を合計３回（０、２、４日）、両腹部に形成した腫瘍のうち大きい方を選択し、その選択した腫瘍内に投与し、以後両腹部の腫瘍径測定によりウイルスの抗腫瘍効果を検討した。尚、１回目の投与前の投与側の腫瘍は４３〜１０２ｍｍ３、非投与側の腫瘍は２４〜８２ｍｍ３であった。結果を図１９に示す。【０１０２】
図１９の結果から、ＩＬ−７とＣＣＬ１９を発現しないＴＫ−ＬＥ投与群（Ｎ＝７）では、ＰＢＳ投与群（Ｎ＝８）と比べ投与側の腫瘍では腫瘍の増殖を抑制していたが、非投与群では腫瘍に対する抑制効果は見られなかった。それに対して、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現するＴＫ−ＩＣＥ投与群（Ｎ＝４）では、ＰＢＳ投与群（Ｎ＝４）と比べ投与側の腫瘍だけではなく非投与側の腫瘍においても腫瘍増殖の抑制が見られた。なお、図示はしていないが、ＴＫ−ＬＥが感染した腫瘍細胞で発現する発光酵素（ルシフェラーゼを）を、基質（ルシフェリン）を投与して発光の有無を確認することで非侵襲的にウイルスを検出する方法により、一方の腹側の腫瘍に投与した遺伝子組換えワクシニアウイルスは、他腹側の腫瘍にまで移ることはないことを確認した。したがって、ＴＫ−ＩＣＥによる腫瘍細胞の破壊と共に腫瘍局所でのＩＬ−７及びＣＣＬ１９の分泌によって、投与対象の腫瘍免疫が惹起されると共に内在性Ｔ細胞のメモリー機能が増強されることで、投与側の腫瘍の消失だけではなく非投与側の腫瘍の増殖抑制が確認され、当該悪性腫瘍の再発を抑制すると考えられる。
【図１】
2019073973.tif 000003
【図２】
2019073973.tif 000004
【図３】
2019073973.tif 000005
【図４】
2019073973.tif 000006
【図５Ａ】
2019073973.tif 000007
【図５Ｂ】
2019073973.tif 000008
【図５Ｃ】
2019073973.tif 000009
【図５Ｄ】
2019073973.tif 000010
【図６Ａ】
2019073973.tif 000011
【図６Ｂ】
2019073973.tif 000012
【図６Ｃ】
2019073973.tif 000013
【図６Ｄ】
2019073973.tif 000014
【図７Ａ】
2019073973.tif 000015
【図７Ｂ】
2019073973.tif 000016
【図８】
2019073973.tif 000017
【図９Ａ】
2019073973.tif 000018
【図９Ｂ】
2019073973.tif 000019
【図１０】
2019073973.tif 000020
【図１１】
2019073973.tif 000021
【図１２】
2019073973.tif 000022
【図１３】
2019073973.tif 000023
【図１４】
2019073973.tif 000024
【図１５】
2019073973.tif 000025
【図１６】
2019073973.tif 000026
【図１７】
2019073973.tif 000027
【図１８】
2019073973.tif 000028
【図１９】
2019073973.tif 000029
【配列表】
2019073973000001.app
【国際調査報告】
2019073973.tif 000030
2019073973.tif 000031
2019073973.tif 000032
2019073973.tif 000033
2019073973.tif 000034
2019073973.tif 000035
2019073973.tif 000036
2019073973.tif 000037
2019073973.tif 000038
2019073973.tif 000039