(57)【要約】医薬品の中間体として有用な（Ｒ）−３−キヌクリジノールの効率的かつ工業的な製造方法を提供する。バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌由来のポリペプチド、または該ポリペプチドを生産する能力を付与された組換え生物を、３−キヌクリジノンもしくはその塩に作用させて還元することにより、（Ｒ）−３−キヌクリジノールを製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
（ａ３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
（ｂ１）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、および
（ｂ３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
からなる群から選択されるポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、または該生物体の処理物を、３−キヌクリジノンもしくはその塩に作用させ、３−キヌクリジノンを還元することを特徴とする（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法。
【請求項２】
（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）および（ｂ３）からなる群から選択されるポリペプチドを産生する生物が、
（Ａ１）配列表の配列番号２に記載のＤＮＡ、
（Ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ａ３）配列表の配列番号２に記載のＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ａ４）配列表の配列番号２に記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｂ１）配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ、
（Ｂ２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｂ３）配列表の配列番号４に記載のＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、および
（Ｂ４）配列表の配列番号４に記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
からなる群から選択されるＤＮＡを導入された組換え生物である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
組換え生物が  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
さらに、還元型補酵素再生能を有するポリペプチドを作用させる、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの生産能を付与された組換え生物により生産されたものである請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
還元型補酵素再生能を有するポリペプチドが、グルコース脱水素酵素である請求項４または５に記載の製造方法。
【請求項７】
バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌由来のポリペプチドを、３−キヌクリジノンもしくはその塩に作用させ、３−キヌクリジノンを還元することを特徴とする（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法。
【請求項８】
（ａ１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
（ａ３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
（ｂ１）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、および
（ｂ３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
からなる群から選択されるポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、または該生物体の処理物を、３−キヌクリジノンもしくはその塩に作用させ、前記３−キヌクリジノンを還元し、（Ｒ）−３−キヌクリジノールを製造する工程を有する、医薬品原薬の製造方法。
【請求項９】
医薬品原薬がソリフェナシンである、請求項８に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法に関する。光学活性な３−キヌクリジノールは、医薬品、農薬等の合成原料及び中間体として有用な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
（Ｒ）−３−キヌクリジノールは、医薬品、農薬等の合成原料及び中間体として有用な化合物である。（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法の一つに、微生物菌体を触媒とした３−キヌクリジノンの不斉還元法が挙げられる。【０００３】
しかし、これらの方法で用いられる微生物触媒は、ナカザワエ（Ｎａｋａｚａｗａｅａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、ロードトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、スポリディオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、アルカリジェネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、フィロバシディウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、オーレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ゲオトリカム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、ツカムレラ（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）属、クルシア（Ｋｕｒｔｈｉａ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に属する微生物の菌体に限られている（特許文献１、２、３、４）。【０００４】
また、このような微生物菌体を用いた反応では、その菌体に由来する不純物、あるいはその微生物が有する他の酵素による副反応などにより、生成物の単離が煩雑になることがしばしばある。また、生成物の光学純度が低い、生成物の蓄積濃度が低いなどの問題点もある。【０００５】
また、特定の酵素を触媒とした３−キヌクリジノンの不斉還元法による製法も報告されている。しかし、この方法で用いられる酵素は、ダチュラ（Ｄａｔｕｒａ）属、ヒヨス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）属の植物由来の酵素（特許文献５）、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の微生物由来の酵素（特許文献６）、およびロードトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属の微生物由来の酵素（特許文献７）に限られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−２４３７９５
【特許文献２】特開平１１−１９６８９０
【特許文献３】特開２００２−１５３２９３
【特許文献４】特開２０００−２４５４９５
【特許文献５】特開２００３−２３０３９８
【特許文献６】特開２００３−３３４０６９
【特許文献７】特開２００７−１２４９２２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、医薬品の中間体として有用な（Ｒ）−３−キヌクリジノールの効率的かつ工業的な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、（Ｒ）−３−キヌクリジノールの簡便かつ効率的な製造方法を開発すべく検討を重ねた結果、３−キヌクリジノンを（Ｒ）−３−キヌクリジノールに変換しうる新規なポリペプチドをバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属の微生物より新たに見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の１又は複数の特徴を有する。【００１０】
本発明は、
（ａ１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
（ａ３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
（ｂ１）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、および
（ｂ３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
からなる群から選択されるポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、または該生物体の処理物を、３−キヌクリジノンもしくはその塩に作用させ、３−キヌクリジノンを還元することを特徴とする（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法に関する。【００１１】
（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ｂ１）、（ｂ２）および（ｂ３）からなる群から選択されるポリペプチドを産生する生物が、
（Ａ１）配列表の配列番号２に記載のＤＮＡ、
（Ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ａ３）配列表の配列番号２に記載のＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ａ４）配列表の配列番号２に記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｂ１）配列表の配列番号４に記載のＤＮＡ、
（Ｂ２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｂ３）配列表の配列番号４に記載のＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、および
（Ｂ４）配列表の配列番号４に記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
からなる群から選択されるＤＮＡを導入された組換え生物であることが好ましい。【００１２】
組換え生物が  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）であることが好ましい。【００１３】
さらに、還元型補酵素再生能を有するポリペプチドを作用させることが好ましい。【００１４】
前記ポリペプチドが、還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの生産能を付与された組換え生物により生産されたものであることが好ましい。【００１５】
還元型補酵素再生能を有するポリペプチドが、グルコース脱水素酵素であることが好ましい。【００１６】
また、本発明は、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌由来のポリペプチドを、３−キヌクリジノンもしくはその塩に作用させ、３−キヌクリジノンを還元することを特徴とする（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法に関する。【００１７】
また、本発明は、
（ａ１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
（ａ３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
（ｂ１）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、および
（ｂ３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
からなる群から選択されるポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、または該生物体の処理物を、３−キヌクリジノンもしくはその塩に作用させ、前記３−キヌクリジノンを還元し、（Ｒ）−３−キヌクリジノールを製造する工程を有する、医薬品原薬の製造方法に関する。【００１８】
医薬品原薬がソリフェナシンであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の方法によれば、高い光学純度の（Ｒ）−３−キヌクリジノールを効率的かつ工業的に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明について実施形態を用いて詳細に説明する。なお、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００２１】
バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌由来のポリペプチド
本発明で用いるポリペプチドは、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌由来で、３−キヌクリジノンを還元して（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成する能力を有するポリペプチドから選択しうる。該ポリペプチドを有するバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌は、例えば、以下の方法で見出すことができる。
【００２２】
バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌を適当な培地で培養し、集菌後、緩衝液中、グルコースなどの栄養存在下で３−キヌクリジノンと反応させる。反応後、溶剤などで抽出を行い、ガスクロマトグラフィーなどで分析することにより、生成する３−キヌクリジノールの生成量およびその光学純度を確認すればよい。
【００２３】
バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌を培養するための培地としては、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いることができる。培養は、例えば、温度２５℃から３７℃、ｐＨ４〜８で振とうもしくは通気することで行い得る。
【００２４】
バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌からの本発明に用いるポリペプチドの単離は、公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下のように実施できる。
【００２５】
まず、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集める。得られた菌体を、超音波破砕機、あるいは、グラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得る。そして、熱処理、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いることにより、該無細胞抽出液から本発明に用いるポリペプチドを単離する。
【００２６】
単離したポリペプチドの３−キヌクリジノンに対する還元活性および立体選択性は、評価したいポリペプチドと３−キヌクリジノンとを作用させた後に、ガスクロマトグラフィーなどで分析することにより評価できる。また、３−キヌクリジノン還元活性については、以下の簡便な方法でも評価できる。
【００２７】
［３−キヌクリジノンに対する還元活性の測定方法］
３−キヌクリジノンに対する還元活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、３−キヌクリジノン１０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ  ０．２５ｍＭ、および粗酵素液を添加して３０℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する酵素活性を１Ｕと定義した。
【００２８】
本発明で用いるポリペプチドの起源は、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌由来であれば限定されるものではない。バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌としては、例えば、バークホルデリア・アンビファリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａ）、バークホルデリア・アンドロポゴニス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｉｓ）、バークホルデリア・アンチナ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｎｔｈｉｎａ）、バークホルデリア・カレドニカ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃａｌｅｄｏｎｉｃａ）、バークホルデリア・カリオフィリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｉ）、バークホルデリア・カリベンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃａｒｉｂｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデアリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデリア・ドロサ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｄｏｌｏｓａ）、バークホルデリア・エンドフンゴラム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｅｎｄｏｆｕｎｇｏｒｕｍ）、バークホルデリア・フェラリアエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｆｅｒｒａｒｉａｅ）、バークホルデリア・フンゴラム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｆｕｎｇｏｒｕｍ）、バークホルデリア・ギンセンギソリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）、バークホルデリア・グラディオリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｄｉｏｌｉ）、バークホルデリア・グラセイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｔｈｅｉ）  、バークホルデリア・グルマエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅ）、バークホルデリア・グラミニス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、バークホルデリア・ホスピタ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｈｏｓｐｉｔａ）、バークホルデリア・クルリエンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｋｕｒｕｒｉｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・マルチボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）、バークホルデリア・フェナジニウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ）、バークホルデリア・フェノリラプトリクス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｅｎｏｌｉｒｕｐｔｒｉｘ）、バークホルデリア・フィマタム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｍａｔｕｍ）、バークホルデリア・フィトファーマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）、バークホルデアリア・プランタリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｌａｎｔａｒｉｉ）、  バークホルデリア・ピロシニア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ）、バークホルデリア・リゾキニカ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｒｈｉｚｏｘｉｎｉｃａ）、バークホルデリア・サッカリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓａｃｃｈａｒｉ）、バークホルデリア・セディミニコーラ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｅｄｉｍｉｎｉｃｏｌａ）、バークホルデリア・ソリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｏｌｉ）、バークホルデリア・ソルディデコーラ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｏｒｄｉｄｉｃｏｌａ）、バークホルデリア・スタビリス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｔ���ｂｉｌｉｓ）、バークホルデリア・テラエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｅｒｒａｅ）、バークホルデリア・テリコーラ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｅｒｒｉｃｏｌａ）、バークホルデリア・タイランデンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）、バークホルデルリア・トロピカ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ）、バークホルデリア・チュベラム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｕｂｅｒｕｍ）、バークホルデリア・ウボネンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｕｂｏｎｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ウナマエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｕｎａｍａｅ）、バークホルデリア・ベトナミエンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ゼノボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、などが挙げられる。
【００２９】
また、新たに自然界から分離した新種のバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌、例えばバークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）なども挙げられる。好ましくは、バークホルデリア・アンビファリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｍｂｉｆａｒｉａ）、バークホルデリア・アンチナ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｎｔｈｉｎａ）、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデアリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデリア・マルチボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）、バークホルデリア・ピロシニア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ）、バークホルデリア・スタビリス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｔａｂｉｌｉｓ）、バークホルデリア・ベトナミエンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）などが挙げられる。特に好ましくは、バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＹＴ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−６１３）、バークホルデリア・マルチボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）ＮＢＲＣ１０２０８６株、が挙げられる。
【００３０】
上記のバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌は、以下のカルチャーコレクションより入手可能である。
【００３１】
独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）。
独立行政法人理化学研究所  バイオリソースセンター  微生物材料開発室（ＪＣＭ）（〒３５１−０１９８  埼玉県和光市広沢２−１）
Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）（Ｍａｒｓｃｈｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ，  Ｄ−３８１２４  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
【００３２】
バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＹＴ株は、小野寺らにより見出された微生物であり（Ｙａｍａｄａ−Ｏｎｏｄｅｒａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００７），Ｖｏｌ．０１４，Ｎｏ．５，ｐｐ．４１６−４１９）、平成２０年８月１８日付けで、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−６１３として、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。
【００３３】
本発明で用いるポリペプチド
本発明で用いるポリペプチドとしては、配列表の配列番号１または３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる（（ａ１）および（ｂ１）のポリペプチド）。
【００３４】
また、本発明で用いるポリペプチドとしては、配列表の配列番号１または３に示したアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい（（ａ２）および（ｂ２）のポリペプチド）。これらのポリペプチドは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８９）等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有する限りは、上記ポリペプチドに包含される。
【００３５】
ここで「複数個のアミノ酸」とは、例えば、３５個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、または２個以下のアミノ酸、を意味する。
【００３６】
配列表の配列番号１または３に示したアミノ酸配列において、アミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加される場所は特に制限されないが、高度保存領域を避けるのが好ましい。ここで、高度保存領域とは、由来の異なる複数の酵素について、アミノ酸配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間でアミノ酸が一致している位置を表す。高度保存領域は、配列番号１に示したアミノ酸配列と、公知の微生物由来のアルコール脱水素酵素のアミノ酸配列とを、ＧＥＮＥＴＹＸ等のツールを用いて比較することにより確認することができる。
【００３７】
置換、挿入、欠失及び／又は付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。
【００３８】
（第１群：中性非極性アミノ酸）Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｍｅｔ，Ｃｙｓ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ
（第２群：中性極性アミノ酸）Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ
（第３群：酸性アミノ酸）Ｇｌｕ，Ａｓｐ  
（第４群：塩基性アミノ酸）Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ
【００３９】
また、本発明で用いるポリペプチドとしては、配列表の配列番号１または３に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ、３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドであってもよい（（ａ３）および（ｂ３）のポリペプチド）。
【００４０】
配列表の配列番号１または３のアミノ酸配列に対する配列同一性は９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上が更に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
【００４１】
なお、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列の配列同一性は８９．４％である。
【００４２】
アミノ酸配列の配列同一性は、配列表の配列番号１または３に示したアミノ酸配列と評価したいアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を比較総アミノ酸数で除して、さらに１００を乗じた値で表される。
【００４３】
３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有する限り、配列番号１または３に記載のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。たとえば、ヒスチジンタグやＨＡタグのようなタグ配列を付加しても良い。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また、３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。
【００４４】
なお、上記（ａ２）、（ａ３）、（ｂ２）または（ｂ３）のポリペプチドにおいて、３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性のレベルが低下する場合であっても、実質的に同等の活性があれば、本発明のポリペプチドに包含される。「実質的に同等の活性」とは、元の活性に対して、例えば５０〜１００％、通常７０〜１００％、好ましくは８０〜１００％、より好ましくは９０％あるいは９５〜１００％の活性を言う。活性の測定は、先述の方法で実施できる。
【００４５】
本発明で用いるポリペプチドをコードするＤＮＡ
本発明で用いるポリペプチドをコードするＤＮＡは、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で該ポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。天然よりクローニングされたＤＮＡ、ｃＤＮＡの他、合成によって得られるＤＮＡも含まれる。
【００４６】
該ポリペプチドが取得できれば、該ポリペプチドの起源となるバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌より、当業者であれば公知の方法で、このようなＤＮＡを取得できる。例えば、以下に示した方法で取得できる。
【００４７】
なお、本明細書において後述する、ＤＮＡクローニング、ベクターの調製及び形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）等の成書に記載されている方法により実施することができる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％（ｗ／ｖ）を意味する。
【００４８】
まず、先の「バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌由来のポリペプチドについて」で記載した方法により単離された本発明で用いるポリペプチドについて、適当なエンドペプチダーゼを用いて消化し、生じたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣにより分取する。そして、例えば、ＡＢＩ４９２型プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）により、これらのペプチド断片のアミノ酸配列の一部または全部を決定する。
【００４９】
このようにして得られたアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅するためのＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）プライマーを合成する。次に、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Ｖｉｓｓｅｒ等の方法（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，４１５（２０００））により、該ポリペプチドの起源となる微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）等を用いて行うことができる。
【００５０】
該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、インバース（Ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，８１８６（１９８８））により、その全体の配列を決定することができる。
【００５１】
このようにして得られる本発明のＤＮＡとして、例えば、配列表の配列番号１に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ（（Ａ２）のＤＮＡ）、または、配列表の配列番号３に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ（（Ｂ２）のＤＮＡ）が挙げられる。具体的には、配列表の配列番号２に示すＤＮＡ（（Ａ１）のＤＮＡ）、配列表の配列番号４に示すＤＮＡ（（Ｂ１）のＤＮＡ）を挙げることができる。
【００５２】
また、本発明で用いるＤＮＡとしては、配列表の配列番号２または４に記載のＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい（（Ａ３）および（Ｂ３）のＤＮＡ）。
【００５３】
また、本発明で用いるＤＮＡとしては、配列表の配列番号２または４に記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい（（Ａ４）および（Ｂ４）のＤＮＡ）。
【００５４】
ここで、「配列表の配列番号２または４に記載のＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ」とは、配列表の配列番号２または４に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡで、かつ３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを意味する。
【００５５】
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡをあげることができる。好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。
【００５６】
以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００５７】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号２または４に示されるＤＮＡと、配列同一性が７０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上のＤＮＡをあげることができ、コードされるポリペプチドが、３−キヌクリジノンとＮＡＤＰＨに作用して（Ｒ）−３−キヌクリジノールとＮＡＤＰを生成する活性を有する限り、上記ＤＮＡに包含される。
【００５８】
ここで、「配列同一性（％）」とは、対比される２つのＤＮＡを最適に整列させ、核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
【００５９】
配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ８，１９９４年９月，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍｅｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ  ５３７１１；Ｒｉｃｅ，Ｐ．（１９９６）Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ＥＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｐｅｔｅｒ  Ｒｉｃｅ，Ｔｈｅ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｈｉｎｘｔｏｎ  Ｈａｌｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＣＢ１０  １ＲＱ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、及び、ｔｈｅ  ＥｘＰＡＳｙ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（Ｇｅｎｅｖａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【００６０】
本発明で用いるポリペプチドを生産する組換え生物
本発明で用いるポリペプチドを生産する組換え生物として、上記で述べた（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ｂ１）、（Ｂ２）、（Ｂ３）または（Ｂ４）のいずれかに記載のＤＮＡを含有する組換え生物を挙げることができる。
【００６１】
本発明で用いるポリペプチドをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入して作製したポリペプチド発現ベクターを用いて宿主生物を形質転換すれば、本発明で用いるポリペプチドを生産する組換え生物が得られる。この生物が生育しうる培地を用いて培養することにより、本発明のポリペプチドを発現させることができる。更に、本発明で用いるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体中に導入する方法なども利用できる。
【００６２】
上記で用いる発現ベクターとしては、適当な宿主生物内で当該ＤＮＡがコードするポリペプチドを発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
【００６３】
このようなベクターは、例えば大腸菌の場合では、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮ１８（実施例２参照）、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３公報）などが挙げられる。
【００６４】
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
【００６５】
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００６６】
各種生物において利用可能なベクター、プロモーターなどに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。
【００６７】
本発明で用いるポリペプチドを発現させるために用いる宿主生物は、各ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むポリペプチド発現ベクターにより形質転換され、導入したＤＮＡがコードするポリペプチドを発現することができる生物であれば、特に制限されないが、宿主ベクター系の開発されている生物が好ましい。
【００６８】
利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などの細菌；ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などの放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、及びキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの酵母；ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などのカビなどが挙げられる。
【００６９】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕などの昆虫（Ｎａｔｕｒｅ  ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入及び発現効率からは微生物が好ましく、細菌がより好ましく、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（通称は大腸菌）が特に好ましい。
【００７０】
本発明で用いるポリペプチドをコードするＤＮＡを含むポリペプチド発現ベクターは、公知の方法により宿主生物に導入できる。
【００７１】
例えば、発現ベクターｐＵＣＮ１８に配列番号２に示すＤＮＡを導入したポリペプチド発現ベクターｐＮＢＳ（製造例１参照）を、宿主微生物である大腸菌に導入する場合、市販のＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）などを用いて、そのプロトコールに従って操作することにより、当該ベクターを宿主細胞に導入した組換え生物  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）（製造例４参照）が得られる。また、発現ベクターｐＵＣＮ１８に配列番号４に示すＤＮＡを導入したポリペプチド発現ベクターｐＮＢＭ（製造例２参照）についても、上記と同様に操作すれば、当該ベクターを宿主細胞に導入した組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ）（製造例４参照）が得られる。
【００７２】
また、本発明で用いるポリペプチド及び後述する還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの両ポリペプチドを、同一菌体内で発現させた組換え生物も育種することができる。すなわち、本発明で用いるポリペプチドをコードするＤＮＡ及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる。このようにして得られる組換え生物としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳＧ）（製造例４参照）などが挙げられる。これは、配列番号２に示すＤＮＡ、及び還元型補酵素再生能を有するグルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡ、の両ＤＮＡを発現ベクターｐＵＣＮ１８に導入した組換えベクターｐＮＢＳＧ（製造例１参照）を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１に導入した組換え生物である。
【００７３】
また、本発明で用いるポリペプチドをコードするＤＮＡ及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それらを同一の宿主細胞に導入することによっても、本発明で用いるポリペプチド及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの両ポリペプチドを同一菌体内で生産する組換え生物が育種できる。
【００７４】
このようにして得られる組換え生物としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）（製造例４参照）などが挙げられる。これは、配列番号２に示すＤＮＡを発現ベクターｐＵＣＮ１８に導入した組換えベクターｐＮＢＳ（製造例１参照）、還元型補酵素再生能を有するグルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡをプラスミドｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）に導入した組換えベクターｐＳＴＶＧ（製造例３参照）、の両組換えベクターを  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入した組換え生物である。
【００７５】
ポリペプチドもしくは組換え生物を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造
上記のポリペプチドもしくは該ポリペプチドを発現させた組換え生物を用いて、３−キヌクリジノンを還元して（Ｒ）−３−キヌクリジノールを製造する場合、以下のように実施され得る。但し、以下の方法に限定されるわけではない。
【００７６】
適当な溶媒、例えば１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）など、中に３−キヌクリジノンもしくはその塩を加え、ＮＡＤＰＨやＮＡＤＰ＋等の補酵素、及び該組換え生物の培養物及び／またはその処理物などを添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。
【００７７】
ここで、処理物とは、例えば、菌体破砕物、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、あるいはそれらの磨砕物、これらの混合物であり、該ポリペプチドの触媒活性が残存している物を意味する。また、本反応を行う際に、本発明のポリペプチド及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの両者を生産する組換え生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳＧ）（製造例４参照）やＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ，ｐＳＴＶＧ）（製造例４参照）などを用いれば、補酵素の使用量を大幅に減らすことが可能となる。還元型補酵素再生能を有するポリペプチドについては後に詳説する。
【００７８】
反応に用いる３−キヌクリジノンはそのものでもよく、またその塩でも良い。塩の種類としては、有機酸塩、無機酸塩どちらでも良い。前記塩の形成に用いる酸としては、フッ化水素酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸等の無機酸；蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、ピバル酸、クロロ酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、Ｌ−酒石酸、Ｄ−酒石酸、マンデル酸等のカルボン酸；メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸等のスルホン酸が挙げられる。好ましくは塩酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、ピバル酸、シュウ酸、Ｌ−酒石酸、Ｄ−酒石酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、又はカンファースルホン酸を用いることができる。より好ましくは塩酸、硫酸であり、最も好ましくは塩酸である。
【００７９】
反応は５〜８０℃、好ましくは１０〜６０℃、より好ましくは２０〜４０℃の温度で行われ、反応中反応液のｐＨは３〜１０、好ましくは４〜９、より好ましくは５〜８に維持する。反応はバッチ式あるいは連続方式で行われ得る。バッチ方式の場合は、反応基質は０．０１〜１００％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１〜７０％、より好ましくは０．５〜５０％の仕込み濃度で添加されうる。また、反応の途中で新たに基質を追加添加しても良い。
【００８０】
また更に、トリトン（ナカライテスク株式会社製）、スパン（関東化学株式会社製）、ツイーン（ナカライテスク株式会社製）などの界面活性剤を反応液に添加することも効果的である。更に、基質及び／または還元反応の生成物であるアルコール体による反応の阻害を回避する目的で、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、トルエン、ヘキサンなどの水に不溶な有機溶媒を反応液に添加してもよい。更に、基質の溶解度を高める目的で、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの水に可溶な有機溶媒を添加することもできる。
【００８１】
還元反応により生成した（Ｒ）−３−キヌクリジノールの採取は、特に限定されないが、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ヘキサン、ｎ−ブタノール、ジクロロメタン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留やシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製すれば高純度の（Ｒ）−３−キヌクリジノールを容易に得ることができる。
【００８２】
本発明で得られる（Ｒ）−３−キヌクリジノールとは、（Ｒ）−３−キヌクリジノールが（Ｓ）−３−キヌクリジノールより多く含まれる３−キヌクリジノールである。その光学純度としては、通常８５％ｅ．ｅ．以上、好ましくは９０％ｅ．ｅ．以上、より好ましくは９５％ｅ．ｅ．以上、更に好ましくは９７％ｅ．ｅ．以上であり、最も好ましいのは９９％ｅ．ｅ．以上である。
【００８３】
ポリペプチドもしくは形質転換体を用いて製造した光学活性アルコールを原料とする医薬品原薬の製造方法
前記の方法で得られる（Ｒ）−３−キヌクリジノールを原料として、有用な医薬品原薬を製造することができる。有用な医薬品原薬としては、（Ｒ）−３−キヌクリジノールをビルディングブロックとして用いる医薬品原薬が好ましく、その中でもソリフェナシンであることが特に好ましい。例えば、公知の方法（例えば、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４８，６５９７−６６０６（２００５）に記載の方法）で、（１Ｓ，３’Ｒ）−キヌクリジン−３’−イル  １−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−２−カルボン酸（ソリフェナシン）が容易に製造できる。
【００８４】
還元型補酵素再生能を有するポリペプチド
本発明で用いるポリペプチドの生産能を有する組換え生物を用いて、３−キヌクリジノンを還元して（Ｒ）−３−キヌクリジノールを合成する場合、補酵素としてＮＡＤＰＨが必要となる。上記のように、反応系にＮＡＤＰＨを必要な量だけ添加しても実施しうる。しかし、酸化された該補酵素（ＮＡＤＰ＋）を還元型ＮＡＤＰＨに変換する能力（以後還元型補酵素再生能と呼ぶ）を有する酵素をその基質と共に、つまり補酵素再生系を本発明で用いるポリペプチドと組み合わせて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。還元型補酵素再生能を有する酵素としては、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素及びグルコース脱水素酵素等を用いることができる。好適には、グルコース脱水素酵素が用いられる。
【００８５】
このような反応は、補酵素再生系を不斉還元反応系内に添加することによっても行われ得るが、本発明の酵素をコードするＤＮＡ及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者により形質転換された組換え生物を触媒とした場合は、還元型補酵素再生能を有する酵素を別に調製し反応系内に添加しなくても、効率的に反応を行うことができる。このような組換え生物は、先述の方法により得られる。
【実施例】
【００８６】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。【００８７】
（製造例１）組換えベクターｐＮＢＳおよびｐＮＢＳＧの構築
（バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＹＴ株由来の３−キヌクリジノン還元活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの取得）
バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＹＴ株（ＮＩＴＥ  Ｐ−６１３）より、３−キヌクリジノン還元活性を有するポリペプチド（今後、本ポリペプチドをＲＢＳと呼ぶ）をコードするＤＮＡをＰＣＲにより取得した。【００８８】
（バークホルデリア・エスピー  ＹＴ株の染色体ＤＮＡの調製）
５００ｍｌ容坂口フラスコに、バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、アデカノールＬＧ−１０９（日油社製）０．１ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５０ｍｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。この培地に、予め同培地にて前培養しておいたバークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＹＴ株の培養液を５ｍｌ接種し、３０℃で１８時間振盪しながら培養を行った。この培養液から、Ｍｕｒｒａｙ等の方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８，４３２１，１９８０）に記載の方法に従って染色体ＤＮＡを抽出した。【００８９】
（ＰＣＲ反応）
プライマー１：５’−ＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＣＣＣＣＧ−３’（配列表の配列番号５）、プライマー２：５’−ＴＡＴＡＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＡＣＧＣＧＡＧ−３’（配列表の配列番号６）を用いて、バークホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＹＴ株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後に新たな終止コドン（ＴＡＡ）とＫｐｎＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡ（ＲＢＳ遺伝子）が得られた。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。【００９０】
（組換えベクターｐＮＢＳの構築）
得られたＲＢＳ遺伝子をＮｄｅＩ及びＫｐｎＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＫｐｎＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＢＳを構築した。【００９１】
（グルコース脱水素酵素遺伝子をさらに含む組換えベクターｐＮＢＳＧの構築）
プライマー３：５’−ＡＡＧＧＴＡＣＣＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＡＡＧＡＴＴＴＡＧＡＡＧＧＧ−３’（配列表の配列番号７）と、プライマー４：５’−ＡＴＡＴＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＡＴＣＣＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＴＧＧＡＡＴＧＡＴＧＧＧＴＡＣ−３’（配列表の配列番号８）を用い、プラスミドｐＧＤＫ１（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８６，３８９（１９８９）に記載の方法で取得及び調製可能）を鋳型としてＰＣＲを行い、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後、ＧＤＨと呼ぶ）遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列が、さらにその直前にＫｐｎＩ認識部位が付加され、かつ、終止コドンの直後に更なる終止コドンＴＡＡおよびＸｂａＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡ（ＧＤＨ遺伝子）を取得した。【００９２】
得られたＧＤＨ遺伝子をＫｐｎＩおよびＸｂａＩで消化し、プラスミドｐＮＢＳのＲＢＳ遺伝子の下流のＫｐｎＩ認識部位とＸｂａＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＢＳＧを構築した。【００９３】
（製造例２）組換えベクターｐＮＢＭの構築
（バークホルデリア・マルチボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）ＮＢＲＣ１０２０８６株由来の３−キヌクリジノン還元活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの取得）
バークホルデリア・マルチボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）ＮＢＲＣ１０２０８６株より、３−キヌクリジノン還元活性を有するポリペプチド（今後、本ポリペプチドをＲＢＭと呼ぶ）をコードするＤＮＡをＰＣＲにより取得した。なお、バークホルデリア・マルチボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）ＮＢＲＣ１０２０８６株からの染色体ＤＮＡの調製は、バークホルデリア・エスピー  ＹＴ株の染色体ＤＮＡの調製と同様に行なった。【００９４】
（ＰＣＲ反応）
プライマー５：５’−ＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＣＧＣＧＣＴＧＣＡＣＧＣＣＣＣＣＧＴＡＣＧ−３’（配列表の配列番号９）、プライマー６：５’−ＴＡＴＡＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＣＡＣＣＧＣＧＣＧＴＣＧＡＡＣＧＣＧＡＧＣＧＴＣ−３’（配列表の配列番号１０）を用いて、バークホルデリア・マルチボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）ＮＢＲＣ１０２０８６株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号４に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後に新たな終止コドン（ＴＡＡ）とＫｐｎＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡ（ＲＢＭ遺伝子）が得られた。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。【００９５】
（組換えベクターｐＮＢＭの構築）
ＲＢＭ遺伝子をＮｄｅＩ及びＫｐｎＩで消化し、上述のプラスミドｐＵＣＮ１８のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＫｐｎＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＢＭを構築した。【００９６】
（製造例３）組換えベクターｐＳＴＶＧの構築
プライマー７：５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＡＡＧＡＴＴＴＡＧＡＡＧＧ−３’（配列表の配列番号１１）と、プライマー８：５’−ＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＣＣＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＴＧＧ−３’（配列表の配列番号１２）を用い、プラスミドｐＧＤＫ１（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８６，３８９（１９８９）に記載の方法で取得及び調製可能）を鋳型としてＰＣＲを行い、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後、ＧＤＨと呼ぶ）遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列が、さらにその直前にＥｃｏＲＩ認識部位が付加され、かつ、終止コドンの直後にＳａｌおよびＰｓｔＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡ（ＧＤＨ遺伝子）を取得した。得られたＧＤＨ遺伝子をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、プラスミドｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入して、組換えベクターｐＳＴＶＧを構築した。【００９７】
（製造例４）ポリペプチドを発現する組換え生物の作製
組換えベクターｐＮＢＳを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）を得た。【００９８】
また同様に、組換えベクターｐＮＢＳＧを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳＧ）を得た。【００９９】
さらに、組換えベクターｐＮＢＳおよびｐＳＴＶＧの２つの組換えベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）を得た。【０１００】
さらに、組換えベクターｐＮＢＭを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ）を得た。【０１０１】
さらに、組換えベクターｐＮＢＭおよびｐＳＴＶＧの２つの組換えベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ，ｐＳＴＶＧ）を得た。【０１０２】
（製造例５）ポリペプチドの発現
３種の組換え生物（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳＧ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ））、および、ベクタープラスミドｐＵＣＮ１８を含む組換え生物であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）（比較例）のそれぞれを、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン  １．６％、イーストエキス  １．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。【０１０３】
また、２種の組換え生物（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ，ｐＳＴＶＧ））、および、ベクタープラスミドｐＵＣＮ１８及びｐＳＴＶ２８を含む組換え生物であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８，ｐＳＴＶ２８）（比較例）のそれぞれを、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む２×ＹＴ培地（トリプトン  １．６％、イーストエキス  １．０％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。【０１０４】
（製造例６）還元活性の測定
上記の培養で得られたそれぞれの培養液について、遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（日本ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液の３−キヌクリジノン還元活性およびＧＤＨ活性を測定した。【０１０５】
３−キヌクリジノンに対する還元活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、３−キヌクリジノン１０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ０．２５ｍＭ、および粗酵素液を添加して３０℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する酵素活性を１Ｕと定義した。【０１０６】
ＧＤＨ活性は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭ、および粗酵素液を添加して２５℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１Ｕと定義した。【０１０７】
それぞれの組換え生物の３−キヌクリジノン還元活性およびＧＤＨ活性を以下に示す。【０１０８】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）およびＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８，ｐＳＴＶ２８）（共に比較例）については、３−キヌクリジノン還元活性、ＧＤＨ活性共に０．１Ｕ／ｍｇ以下であった。【０１０９】
ＲＢＳのみを発現させたＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）の３−キヌクリジノン還元活性は１００Ｕ／ｍｇであった。ＲＢＳ、ＧＤＨを共発現させたＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳＧ）の３−キヌクリジノン還元活性は６０Ｕ／ｍｇ、ＧＤＨ活性は４４０Ｕ／ｍｇであった。また、ＲＢＳ、ＧＤＨを共発現させたＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，  ｐＳＴＶＧ）の３−キヌクリジノン還元活性は１２０Ｕ／ｍｇ、ＧＤＨ活性は１２０Ｕ／ｍｇであった。【０１１０】
ＲＢＭのみを発現させたＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ）の３−キヌクリジノン還元活性は４０Ｕ／ｍｇであった。ＲＢＭ、ＧＤＨを共発現させたＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ，ｐＳＴＶＧ）の３−キヌクリジノン還元活性は４０Ｕ／ｍｇ、ＧＤＨ活性は１４０Ｕ／ｍｇであった。【０１１１】
以上のように、５種の組換え生物のいずれにおいても、３−キヌクリジノン還元活性を有し、ＲＢＳもしくはＲＢＭの発現が認められた。また、ＧＤＨ遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳＧ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ，ｐＳＴＶＧ）では、ＧＤＨの発現がそれぞれ認められた。【０１１２】
（実施例１）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ）を製造例５に記載した条件で培養後、超音波ホモゲナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１００ｍｌを得た。この無細胞抽出液１００ｍｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”ＩＩ、天野エンザイム社製）７００Ｕ、グルコース７ｇ、ＮＡＤＰ＋３ｍｇ、３−キヌクリジノン塩酸塩５ｇを添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で２４時間攪拌した。反応液の一部をサンプリングし、６Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ１３以上とした後にｎ−ブタノールで抽出した。抽出液を下記のガスクロマトグラフィー（１）の条件で分析し、（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換率を測定した。また、抽出液を下記のガスクロマトグラフィー（２）の条件で分析することにより、（Ｒ）−３−キヌクリジノールの光学純度を測定した。その結果、（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換率は９８％であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【０１１３】
［ガスクロマトグラフィーによる分析条件（１）］
カラム：Ｒｔｘ−５ａｍｉｎｅキャピラリーカラム（０．２５ｍｍ（内径）×３０ｍ；Ｒｅｓｔｅｋ社製）
検出器：水素炎イオン化検出器
注入部温度：２２０℃、カラム温度：１５０℃、
検出器温度：２２０℃
キャリアーガス：ヘリウム、流量１３０ＫＰａ。【０１１４】
［ガスクロマトグラフィーによる分析条件（２）］
カラム：γ−ＤＥＸ２２５キャピラリーカラム（０．２５ｍｍ（内径）×３０ｍ；Ｓｐｅｌｃｏ社製）
検出器：水素炎イオン化検出器
注入部温度：２２０℃、カラム温度：１５０℃、
検出器温度：２２０℃
キャリアーガス：ヘリウム、流量７０ＫＰａ。【０１１５】
（実施例２）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳＧ）を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳＧ）を製造例５に記載した条件で培養し、培養液１００ｍｌを得た。この培養液１００ｍｌに、グルコース７ｇ、ＮＡＤＰ＋３ｍｇ、３−キヌクリジノン塩酸塩５ｇを添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で２４時間攪拌した。反応液の一部をサンプリングし、実施例１と同様に処理、分析することにより、（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換率とその光学純度を測定した。その結果、変換率は９９％以上であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【０１１６】
（実施例３）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）を製造例５に記載した条件で培養し、培養液１００ｍｌを得た。この培養液１００ｍｌに、グルコース７ｇ、ＮＡＤＰ＋３ｍｇ、３−キヌクリジノン塩酸塩５ｇを添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で２４時間攪拌した。反応液の一部をサンプリングし、実施例１と同様に処理、分析することにより、（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換率とその光学純度を測定した。その結果、変換率は９９％以上であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【０１１７】
（実施例４）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ）を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ）を製造例５に記載した条件で培養後、超音波ホモゲナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１００ｍｌを得た。この無細胞抽出液１００ｍｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ”Ａｍａｎｏ”ＩＩ、天野エンザイム社製）７００Ｕ、グルコース７ｇ、ＮＡＤＰ＋３ｍｇ、３−キヌクリジノン塩酸塩５ｇを添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で２４時間攪拌した。反応液の一部をサンプリングし、実施例１と同様に処理、分析することにより、（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換率とその光学純度を測定した。その結果、変換率は９９％以上であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【０１１８】
（実施例５）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ，ｐＳＴＶＧ）を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＭ，ｐＳＴＶＧ）を製造例５に記載した条件で培養し、培養液１００ｍｌを得た。この培養液１００ｍｌに、グルコース７ｇ、ＮＡＤＰ＋３ｍｇ、３−キヌクリジノン塩酸塩５ｇを添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で２４時間攪拌した。反応液の一部をサンプリングし、実施例１と同様に処理、分析することにより、（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換率とその光学純度を測定した。その結果、変換率は９９％以上であり、その光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【０１１９】
（実施例６）組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＢＳ，ｐＳＴＶＧ）を製造例５に記載した条件で培養し、培養液３００ｍｌを得た。この培養液３００ｍｌに、グルコース５７ｇ、ＮＡＤＰ＋３０ｍｇ、３−キヌクリジノン塩酸塩４６．５ｇを添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で４０時間攪拌した。反応終了後、反応液を１０Ｎ  ＮａＯＨにてｐＨ１３に調整し、反応液の２倍量のｎ−ブタノールで３回抽出した。減圧下で溶媒を留去後、乾燥すると（Ｒ）−３−キヌクリジノールの結晶３４．２ｇが得られた。実施例１に記載の方法で分析したところ、得られた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。【０１２０】
（実施例７）（１Ｓ，３’Ｒ）−キヌクリジン−３’−イル  １−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−２−カルボン酸塩酸塩の製造
（工程１）
ジクロロメタン２００ｍｌに（Ｓ）−１−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン１０．６ｇと炭酸カリウム１０．６ｇを加え、氷中で冷却しながら、ジクロロメタン２０ｍｌとクロロぎ酸エチル５．８ｍｌを混合した溶液を添加し、室温で一晩攪拌した。一晩後、反応液に水を添加し、室温で３０分攪拌した。有機層を分離した後、水と飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水した後、減圧濃縮した。濃縮液をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、（Ｓ）−１−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−２−カルボン酸を得た。【０１２１】
（工程２）
トルエン１２０ｍｌに精製した（Ｓ）−１−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−２−カルボン酸１２ｇと実施例６に記載の方法で得られた（Ｒ）−３−キヌクリジノール１６．３ｇを加え、水素化ナトリウム１．７ｇを添加した後、１４０℃で３時間加熱した。反応後、室温まで冷却し、飽和食塩水を添加した後、酢酸エチルで抽出した。抽出液を水で洗浄した後、２０％塩酸で抽出した。水層を１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ１０に調整した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで脱水した。抽出液を減圧濃縮した後、塩酸を加えたアセトニトリルとジエチルエーテル中で結晶化し、無色の結晶の（１Ｓ，３’Ｒ）−キヌクリジン−３’−イル  １−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−２−カルボン酸塩酸塩１０．１ｇを得た。
製造した（Ｒ）−３−キヌクリジノールを原料に用いて、容易に医薬品原薬（１Ｓ，３’Ｒ）−キヌクリジン−３’−イル  １−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−２−カルボン酸塩酸塩（ソリフェナシン塩酸塩）を製造できた。
【配列表】
2010123062000001.app
【国際調査報告】
2010123062.tif 000002
2010123062.tif 000003
2010123062.tif 000004
2010123062.tif 000005