(57)【要約】  本発明は、タンパク質を含有するタンパク質成形体であって、該タンパク質成形体の内部にイオン液体が含まれている、タンパク質成形体に関する。本発明はまた、タンパク質成形体の成形用材料にイオン液体を含有させる工程を含む、タンパク質成形体の製造方法にも関する。本発明は更に、タンパク質と、イオン液体と、溶媒とを含む、タンパク質溶液にも関する。本発明は更にまた、イオン液体からなるタンパク質成形体用可塑剤にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を含有するタンパク質成形体であって、
該タンパク質成形体の内部にイオン液体が含まれている、タンパク質成形体。
【請求項２】
前記イオン液体が、前記タンパク質成形体の内部に分散して含まれている、請求項１に記載のタンパク質成形体。
【請求項３】
前記タンパク質が、構造タンパク質である、請求項１又は２に記載のタンパク質成形体。
【請求項４】
前記構造タンパク質が、フィブロインである、請求項３に記載のタンパク質成形体。
【請求項５】
前記フィブロインが、クモ糸フィブロインである、請求項４に記載のタンパク質成形体。
【請求項６】
前記イオン液体が、疎水性イオン液体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質成形体。
【請求項７】
繊維又はフィルムである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質成形体。
【請求項８】
前記イオン液体は、加熱重量減少率が１０質量％である温度が２００℃以上である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質成形体。
【請求項９】
タンパク質成形体の成形用材料にイオン液体を含有させる工程を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質成形体の製造方法。
【請求項１０】
前記イオン液体を含有させる工程が、タンパク質成形体の成形用材料の内部にイオン液体を浸入させる工程である、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記イオン液体を含有させる工程が、タンパク質成形体の成形用材料とイオン液体とを混合する工程である、請求項９記載の製造方法。
【請求項１２】
前記成形用材料が、前記タンパク質を溶媒に溶解させてなる成形用溶液である、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記イオン液体が混合された成形用溶液を凝固液に接触させて凝固させることによりタンパク質成形体を得る工程を更に含み、
前記凝固液が、該凝固液中にイオンを供給するイオン供給物質を有する、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記イオン供給物質が、前記タンパク質を凝集可能な物質である、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
タンパク質成形体の成形用材料を成形して成形体を得た後、当該成形体をイオン液体に含浸させる工程を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質成形体の製造方法。
【請求項１６】
タンパク質と、イオン液体と、溶媒とを含む、タンパク質溶液。
【請求項１７】
前記イオン液体の含有量が、全量を基準として１０〜２０質量％である、請求項１６に記載のタンパク質溶液。
【請求項１８】
前記タンパク質が、構造タンパク質である、請求項１６又は１７に記載のタンパク質溶液。
【請求項１９】
前記構造タンパク質が、フィブロインである、請求項１８に記載のタンパク質溶液。
【請求項２０】
前記フィブロインが、クモ糸フィブロインである、請求項１９に記載のタンパク質溶液。
【請求項２１】
イオン液体からなるタンパク質成形体用可塑剤。
【請求項２２】
前記タンパク質が、構造タンパク質である、請求項２１に記載のタンパク質成形体用可塑剤。
【請求項２３】
前記構造タンパク質が、フィブロインである、請求項２２に記載のタンパク質成形体用可塑剤。
【請求項２４】
前記フィブロインが、クモ糸フィブロインである、請求項２３に記載のタンパク質成形体用可塑剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質成形体及びその製造方法、タンパク質溶液、並びにタンパク質成形体用可塑剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境保全意識の高まりから、石油由来の材料の代替物質の検討が進められており、強度などの点で優れる構造タンパク質がその候補として挙げられる。例えば、構造タンパク質からなるキャストフィルム、ファイバー等の成形体が提案されている。【０００３】
構造タンパク質の一種である絹フィブロインからなるフィルム及び繊維に対し、柔軟性と強度を向上させる方法として、成形体にグリセロール等の可塑剤を添加することが開示されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００５／１０３１５８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１で可塑剤として使用しているグリセロール等の有機溶媒は揮発性であるため、これらの可塑剤を含有する成形体は、時間の経過と共に可塑剤が揮発及び離脱して、柔軟性及び伸度が徐々に低下することが避けられなかった。したがって、タンパク質成形体の柔軟性及び伸度を向上させるための代替法が求められている。【０００６】
本発明は、柔軟性及び伸度が向上したタンパク質成形体、及びその製造方法を提供することを目的とする。本発明はまた、当該タンパク質成形体の製造に用いられるタンパク質溶液を提供することを目的とする。本発明はさらに、タンパク質成形体に優れた柔軟性及び伸度を付与できるタンパク質成形体用可塑剤を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
タンパク質を含有するタンパク質成形体であって、
該タンパク質成形体の内部にイオン液体が含まれている、タンパク質成形体。
［２］
上記イオン液体が、上記タンパク質成形体の内部に分散して含まれている、［１］に記載のタンパク質成形体。
［３］
上記タンパク質が、構造タンパク質である、［１］又は［２］に記載のタンパク質成形体。
［４］
上記構造タンパク質が、フィブロインである、［３］に記載のタンパク質成形体。
［５］
上記フィブロインが、クモ糸フィブロインである、［４］に記載のタンパク質成形体。
［６］
上記イオン液体が、疎水性イオン液体である、［１］〜［５］のいずれかに記載のタンパク質成形体。
［７］
繊維又はフィルムである、［１］〜［６］のいずれかに記載のタンパク質成形体。
［８］
上記イオン液体は、加熱重量減少率が１０質量％である温度が２００℃以上である、［１］〜［７］のいずれかに記載のタンパク質成形体。
［９］
タンパク質成形体の成形用材料にイオン液体を含有させる工程を含む、［１］〜［８］のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
［１０］
上記イオン液体を含有させる工程が、タンパク質成形体の成形用材料の内部にイオン液体を浸入させる工程である、［９］に記載の製造方法。
［１１］
上記イオン液体を含有させる工程が、タンパク質成形体の成形用材料とイオン液体とを混合する工程である、［９］に記載の製造方法。
［１２］
上記成形用材料が、上記タンパク質を溶媒に溶解させてなる成形用溶液である、［１１］に記載の製造方法。
［１３］
上記イオン液体が混合された成形用溶液を凝固液に接触させて凝固させることによりタンパク質成形体を得る工程を更に含み、
上記凝固液が、該凝固液中にイオンを供給するイオン供給物質を有する、［１２］に記載の製造方法。
［１４］
上記イオン供給物質が、上記タンパク質を凝集可能な物質である、［１３］に記載の製造方法。
［１５］
タンパク質成形体の成形用材料を成形して成形体を得た後、当該成形体をイオン液体に含浸させる工程を含む、［１］〜［８］のいずれかに記載のタンパク質成形体の製造方法。
［１６］
タンパク質と、イオン液体と、溶媒とを含む、タンパク質溶液。
［１７］
上記イオン液体の含有量が、全量を基準として１０〜２０質量％である、［１６］に記載のタンパク質溶液。
［１８］
上記タンパク質が、構造タンパク質である、［１６］又は［１７］に記載のタンパク質溶液。
［１９］
上記構造タンパク質が、フィブロインである、［１８］に記載のタンパク質溶液。
［２０］
上記フィブロインが、クモ糸フィブロインである、［１９］に記載のタンパク質溶液。
［２１］
イオン液体からなるタンパク質成形体用可塑剤。
［２２］
上記タンパク質が、構造タンパク質である、［２１］に記載のタンパク質成形体用可塑剤。
［２３］
上記構造タンパク質が、フィブロインである、［２２］に記載のタンパク質成形体用可塑剤。
［２４］
上記フィブロインが、クモ糸フィブロインである、［２３］に記載のタンパク質成形体用可塑剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、柔軟性及び伸度が向上したタンパク質成形体、及びその製造方法が提供される。本発明によればまた、当該タンパク質成形体の製造に用いられるタンパク質溶液が提供される。本発明によればさらに、タンパク質成形体に優れた柔軟性及び伸度を付与できるタンパク質成形体用可塑剤が提供される。また、本発明に係るタンパク質成形体は、応力の減少を一定程度抑制することができるため、柔軟性及び伸度の向上に加え、タフネスも向上している。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】タンパク質原料繊維を製造するための紡糸装置の一例を概略的に示す説明図である。
【図２】（Ａ）実施例１のタンパク質繊維断面のエネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＸ）スペクトルである。（Ｂ）実施例２のタンパク質繊維断面のＥＤＸスペクトルである。
【図３】実施例１及び実施例２のタンパク質繊維断面における炭素に対するリンの割合を示すグラフである。
【図４】実施例１及び実施例２のタンパク質繊維の引張試験結果を示すグラフである。
【図５】（Ａ）試験例２のタンパク質フィルム断面のＥＤＸスペクトルである。（Ｂ）試験例２のタンパク質フィルム断面のＥＤＸによる面分析の結果を示す図である。
【図６】試験例３でクモ糸フィブロインの溶解性を観察した結果を示す写真である。
【図７】試験例３でクモ糸フィブロインの溶解性を観察した結果を示す写真である。
【図８】試験例４のタンパク質フィルムＡ断面の走査型電子顕微鏡画像を示す写真である。（Ａ）タンパク質フィルムＡの表面を撮影した画像である。（Ｂ）タンパク質フィルムＡの端部（エッジ）を撮影した画像である。
【図９】（Ａ）試験例４のタンパク質フィルムＡ断面のＥＤＸスペクトルである。（Ｂ）試験例４のタンパク質フィルムＡ断面のＥＤＸによる面分析の結果を示す図である。
【図１０】試験例４のタンパク質フィルムの引張試験結果を示すグラフである。（Ａ）タンパク質フィルムＡ（イオン液体あり）の引張試験結果を示すグラフである。（Ｂ）タンパク質フィルムＢ（イオン液体なし）の引張試験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１１】
［タンパク質成形体］
本実施形態に係るタンパク質成形体は、タンパク質を含有するタンパク質成形体であって、該タンパク質成形体の内部にイオン液体が含まれているものである。本実施形態に係るタンパク質成形体は、イオン液体を内部に含むことにより、柔軟性及び伸度が向上する。また、本実施形態に係るタンパク質成形体は、応力の減少を一定程度抑制することができるため、柔軟性及び伸度の向上に加え、タフネスも向上している。本実施形態に係るタンパク質成形体は、本発明による効果をより一層顕著に発揮できることから、タンパク質成形体の内部にイオン液体が分散して含まれていることが好ましい。
【００１２】
（タンパク質）
本実施形態に係るタンパク質成形体は、タンパク質を主成分として含む。当該タンパク質は、特に限定されるものではなく、遺伝子組換え技術により微生物等で製造したものであってもよく、合成により製造されたものであってもよく、また天然由来のタンパク質を精製したものであってもよい。
【００１３】
上記タンパク質は、例えば、構造タンパク質及び当該構造タンパク質に由来する人造構造タンパク質であってもよい。構造タンパク質とは、生体内で構造及び形態等を形成又は保持するタンパク質を意味する。構造タンパク質としては、例えば、フィブロイン、ケラチン、コラーゲン、エラスチン及びレシリン等を挙げることができる。
【００１４】
構造タンパク質は、フィブロインであってもよい。フィブロインは、例えば、絹フィブロイン、クモ糸フィブロイン、及びホーネットシルクフィブロインからなる群より選択される１種以上であってよい。特に、構造タンパク質は、絹フィブロイン、クモ糸フィブロイン又はこれらの組み合わせであってもよい。絹フィブロインとクモ糸フィブロインとを併用する場合、絹フィブロインの割合は、例えば、クモ糸フィブロイン１００質量部に対して、４０質量部以下、３０質量部以下、又は１０質量部以下であってよい。
【００１５】
絹フィブロインとしては、セリシン除去絹フィブロイン、セリシン未除去絹フィブロイン、又はこれらの組み合わせであってもよい。セリシン除去絹フィブロインは、絹フィブロインを覆うセリシン、及びその他の脂肪分などを除去して精製したものである。このようにして精製した絹フィブロインは、好ましくは、凍結乾燥粉末として用いられる。セリシン未除去絹フィブロインは、セリシンなどが除去されていない未精製の絹フィブロインである。
【００１６】
クモ糸フィブロインは、天然クモ糸タンパク質、及び天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチド（人造クモ糸タンパク質）からなる群より選ばれるクモ糸ポリペプチドを含有していてもよい。
【００１７】
天然クモ糸タンパク質としては、例えば、大吐糸管しおり糸タンパク質、横糸タンパク質、及び小瓶状腺タンパク質が挙げられる。大吐糸管しおり糸は、結晶領域と非晶領域（無定形領域とも言う。）からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つ。クモ糸の横糸は、結晶領域を持たず、非晶領域からなる繰り返し領域を持つという特徴を有する。横糸は、大吐糸管しおり糸に比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。
【００１８】
大吐糸管しおり糸タンパク質は、クモの大瓶状線で産生され、強靭性に優れるという特徴を有する。大吐糸管しおり糸タンパク質としては、例えば、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する大瓶状腺スピドロインＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２、並びに二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来するＡＤＦ３及びＡＤＦ４が挙げられる。ＡＤＦ３は、ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つである。天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは、これらのしおり糸タンパク質に由来するポリペプチドであってもよい。ＡＤＦ３に由来するポリペプチドは、比較的合成し易く、また、強伸度及びタフネスの点で優れた特性を有する。
【００１９】
横糸タンパク質は、クモの鞭毛状腺（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｇｌａｎｄ）で産生される。横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する鞭毛状絹タンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられる。
【００２０】
天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは、組換えクモ糸タンパク質であってよい。組換えクモ糸タンパク質としては、天然型クモ糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体等が挙げられる。このようなポリペプチドの好適な一例は、大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えクモ糸タンパク質（「大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチド」ともいう。）である。
【００２１】
フィブロイン様タンパク質である大吐糸管しおり糸由来のタンパク質及びカイコシルク由来のタンパク質としては、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。ここで、（Ａ）ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、アミノ酸残基数は２〜２７である。（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、２〜２０、４〜２７、４〜２０、８〜２０、１０〜２０、４〜１６、８〜１６、又は１０〜１６の整数であってよい。また、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されてもよい。ＲＥＰは２〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。ｍは２〜３００の整数を示し、１０〜３００の整数であってもよい。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。大吐糸管しおり糸由来のタンパク質の具体例としては、配列番号１及び配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。
【００２２】
横糸タンパク質に由来するタンパク質としては、例えば、式３：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式３中、ＲＥＰ２はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘはアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選ばれる一つのアミノ酸を示す。ｏは８〜３００の整数を示す。）を挙げることができる。具体的には、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号２で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）のリピート部分及びモチーフに該当するＮ末端から１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列（ＰＲ１配列と記す。）と、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３８８４７、ＧＩ：２８３３６４９）のＣ末端から８１６残基目から９０７残基目までのＣ末端アミノ酸配列を結合し、結合した配列のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００２３】
コラーゲン由来のタンパク質としては、例えば、式４：［ＲＥＰ３］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式４中、ｐは５〜３００の整数を示す。ＲＥＰ３は、Ｇｌｙ一Ｘ一Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号３で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００２４】
レシリン由来のタンパク質としては、例えば、式５：［ＲＥＰ４］ｑで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式５中、ｑは４〜３００の整数を示す。ＲＥＰ４はＳｅｒ一Ｊ一Ｊ一Ｔｙｒ一Ｇｌｙ一Ｕ−Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ４は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＰ  ６１１１５７、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに置換し、かつ９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００２５】
エラスチン由来のタンパク質としては、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。具体的には、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号５で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００２６】
ケラチン由来のタンパク質として、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ  ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。具体的には、配列番号６で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＣＹ３０４６６のアミノ酸配列）を含むタンパク質を挙げることができる。
【００２７】
上述した構造タンパク質及び当該構造タンパク質に由来するタンパク質は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２８】
（タンパク質の製造方法）
上記のタンパク質は、例えば、当該タンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
【００２９】
タンパク質をコードする核酸の製造方法は、特に制限されない。例えば、天然の構造タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的に合成する方法によって、当該核酸を製造することができる。核酸の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した構造タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製及び／又は確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸を合成してもよい。
【００３０】
調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、目的とするタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
【００３１】
発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、目的とするタンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
【００３２】
宿主としては、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
【００３３】
原核生物の宿主の好ましい例としては、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ等を挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物としては、例えば、ブレビバチルス・アグリ等を挙げることができる。セラチア属に属する微生物としては、例えば、セラチア・リクエファシエンス等を挙げることができる。バチルス属に属する微生物としては、例えば、バチルス・サチラス等を挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物としては、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等を挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム等を挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物としては、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等を挙げることができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物としては、例えば、シュードモナス・プチダ等を挙げることができる。
【００３４】
原核生物を宿主とする場合、目的タンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム株式会社製）、ｐＧＥＸ（ファルマシア株式会社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
【００３５】
真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
【００３６】
真核生物を宿主とする場合、目的タンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。
【００３７】
発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版（コールド・スプリング・ハーバー研究所、１９８９年）に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
【００３８】
タンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、当該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
【００３９】
宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、当該宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、その培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００４０】
炭素源としては、上記形質転換された宿主が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
【００４１】
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
【００４２】
また、培養中、必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換された宿主を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換された宿主を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換された宿主を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００４３】
（タンパク質の単離及び精製）
発現させたタンパク質の単離及び精製は、通常用いられている方法で行うことができる。例えば、当該タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学株式会社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア株式会社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
【００４４】
また、タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてタンパク質の不溶体を回収する。回収したタンパク質の不溶体はタンパク質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法によりタンパク質の精製標品を得ることができる。当該タンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該タンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、その培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００４５】
（タンパク質成形体）
本実施形態に係るタンパク質成形体は、例えば、上述したタンパク質を任意の形状に成形したものであってよい。本実施形態に係るタンパク質成形体は、不可避的な成分、例えば、タンパク質に含まれていた夾雑物を含み得る。タンパク質成形体の形状としては、特に限定されるものではないが、例えば、繊維、フィルム、ゲル、及び多孔質体等を挙げることができる。本実施形態に係るタンパク質成形体は、その内部にイオン液体が含まれているものである。
【００４６】
（イオン液体）
本実施形態に係るタンパク質成形体の内部に含まれるイオン液体としては、特に限定されるものではないが、例えば、１００℃以下で液状となる有機塩であってよい。イオン液体としては、例えば、イミダゾリウム、ピロリジニウム、ピペリジニウム、ピリジニウム、第４級アンモニウム、第４級ホスホニウム、スルホニウム、及びこれらの誘導体等の陽イオンと、ハロゲン、トリフラート、テトラフルオロボラート、ヘキサフルオロホスフェイト、カルボン酸等の陰イオンとの塩を挙げることができる。タンパク質の溶解性の観点から、イミダゾリウム又はその誘導体を陽イオンとするイミダゾリウム塩を用いるのが好ましい。
【００４７】
イミダゾリウム塩としては、例えば、１，３−ジメチルイミダゾリウム塩、１−エチル−３−メチルイミダゾリウム塩、１−メチル−３−プロピルイミダゾリウム塩、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム塩、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウム塩、１−メチル−３−ｎ−オクチルイミダゾリウム塩、１−（２−ヒドロキシエチル）−３−メチルイミダゾリウム塩、１−デシル−３−メチルイミダゾリウム塩、１−エチル−２，３−ジメチルイミダゾリウム塩、１，２−ジメチル−３−プロピルイミダゾリウム塩、２，３−ジメチル−１−プロピルイミダゾリウム塩、１−ブチル−２，３−ジメチルイミダゾリウム塩、１−ヘキシル−２，３−ジメチルイミダゾリウム塩が挙げられ、１−エチル−３−メチルイミダゾリウム塩、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム塩、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウム塩が好ましい。
【００４８】
イオン液体は、疎水性イオン液体であってもよく、親水性イオン液体であってもよい。疎水性イオン液体としては、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミド（［Ｅｍｉｍ］［ＴＦＳＩ］）、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミド（［Ｂｍｉｍ］［ＴＦＳＩ］）、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミド（［Ｈｍｉｍ］［ＴＦＳＩ］）、１−デシル−３−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメタンスルホニル）イミド（［Ｄｍｉｍ］［ＴＦＳＩ］）、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムトリフルオロメタンスルフォナート（［Ｈｍｉｍ］［ОＴｆ］）、１−メチル−３−ｎ−オクチルイミダゾリウムトリフルオロメタンスルフォナート（［Ｏｍｉｍ］［ОＴｆ］）、１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムクロリド（［Ｈｍｉｍ］［Ｃｌ］）、等が挙げられる。疎水性イオン液体を使用することにより、タンパク質成形体からのイオン液体の離脱をより抑制することができる。親水性イオン液体としては、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド（［Ｅｍｉｍ］［Ｃｌ］）、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド（［Ｂｍｉｍ］［Ｃｌ］）、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムジメチルホスフェイト（［Ｅｍｉｍ］［ＤＭＰ］）、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムジエチルホスフェイト（［Ｅｍｉｍ］［ＤＥＰ］）、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート（［Ｅｍｉｍ］［Ａｃｅｔ］）、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート（［Ｂｍｉｍ］［Ａｃｅｔ］）、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェイト（［Ｂｍｉｍ］［ＰＦ６］）等が挙げられる。親水性イオン液体を使用することにより、タンパク質成形体の成形用溶液、タンパク質溶液をより容易に調製することができる。
【００４９】
イオン液体は、一般的に、蒸気圧が極めて低く、不揮発性である。したがって、本実施形態に係るタンパク質成形体は、イオン液体をその内部に安定に保持することができ、柔軟性及び伸度が向上するという効果を安定に維持することができる。
【００５０】
イオン液体としては、加熱重量減少率が１０質量％である温度が２００℃以上であるものを使用してもよい。これにより、本実施形態に係るタンパク質成形体は、高温環境下でも柔軟性及び伸度が向上するという効果を安定に維持することができる。加熱重量減少率は、イオン液体を５０〜５００℃まで準静的な速さ（５℃／ｍｉｎ）で昇温したときの、加熱開始からの重量変化から算出される値である。
【００５１】
（タンパク質成形体中のイオン液体の含有量）
本発明に係るタンパク質成形体中のイオン液体の含有量は、特に限定されるものではなく、タンパク質成形体の種類、イオン液体の種類、タンパク質の種類等に応じて適宜設定してよい。タンパク質成形体中のイオン液体の含有量は、例えば、０質量％を超えて、かつタンパク質成形体を成形できる範囲（例えば、６５質量％）である。
【００５２】
［タンパク質成形体の製造方法］
本実施形態に係るタンパク質成形体は、例えば、タンパク質成形体の成形用材料にイオン液体を混合してから成形する方法、タンパク質成形体の成形用材料の内部にイオン液体を浸入させてから成形する方法、及び常法に従い成形を行った成形体をイオン液体に浸漬させる方法等により製造することができる。タンパク質成形体の成形用材料にイオン液体を混合してから成形する方法は、例えば、タンパク質を溶解させた溶液（成形用溶液）にイオン液体を添加することにより得た溶液、又はタンパク質の粉末とイオン液体を混合した混合物にタンパク質溶解用の溶媒を更に混合することにより得た溶液を成形用材料（成形用溶液）として使用し、常法に従い成形を行いタンパク質成形体を得る方法が挙げられる。また、タンパク質成形体の成形用材料の内部にイオン液体を浸入させてから成形する方法は、例えば、タンパク質粉末（成形用材料）にイオン液体を添加、混合し、タンパク質粉末の吸液性に基づいて粉末内部にイオン液体を浸入させて得た材料を成形用材料として使用し、所定の方法で成形を行ってタンパク質成形体を得る方法が挙げられる。
【００５３】
（タンパク質成形体の成形用材料）
タンパク質成形体の成形用材料は、タンパク質の粉末を含む成形用固体材料であってもよく、タンパク質を溶媒に溶解させた成形用溶液であってもよい。成形用溶液は、タンパク質と溶媒を含むものである。
【００５４】
（溶媒）
成形用溶液に用いられる溶媒としては、タンパク質を溶解できるものであれば特に制限されず、例えば、ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）及びギ酸等のプロトン性極性溶媒、並びにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）等の非プロトン性極性溶媒が挙げられる。
【００５５】
成形用溶液には、溶解促進剤としての無機塩が更に含まれていてもよい。無機塩としては、例えば、ルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩が挙げられる。ルイス塩基としては、例えば、オキソ酸イオン（硝酸イオン、過塩素酸イオン等）、金属オキソ酸イオン（過マンガン酸イオン等）、ハロゲン化物イオン、チオシアン酸イオン、シアン酸イオン等が挙げられる。ルイス酸としては、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン等の金属イオン、アンモニウムイオン等の多原子イオン、錯イオン等が挙げられる。ルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩の具体例としては、塩化リチウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、硝酸リチウム、過塩素酸リチウム、及びチオシアン酸リチウム等のリチウム塩、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硝酸カルシウム、過塩素酸カルシウム、及びチオシアン酸カルシウム等のカルシウム塩、塩化鉄、臭化鉄、ヨウ化鉄、硝酸鉄、過塩素酸鉄、及びチオシアン酸鉄等の鉄塩、塩化アルミニウム、臭化アルミニウム、ヨウ化アルミニウム、硝酸アルミニウム、過塩素酸アルミニウム、及びチオシアン酸アルミニウム等のアルミニウム塩、塩化カリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、硝酸カリウム、過塩素酸カリウム、及びチオシアン酸カリウム等のカリウム塩、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びチオシアン酸ナトリウム等のナトリウム塩、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、硝酸亜鉛、過塩素酸亜鉛、及びチオシアン酸亜鉛等の亜鉛塩、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、硝酸マグネシウム、過塩素酸マグネシウム、及びチオシアン酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化バリウム、臭化バリウム、ヨウ化バリウム、硝酸バリウム、過塩素酸バリウム、及びチオシアン酸バリウム等のバリウム塩、並びに塩化ストロンチウム、臭化ストロンチウム、ヨウ化ストロンチウム、硝酸ストロンチウム、過塩素酸ストロンチウム、及びチオシアン酸ストロンチウム等のストロンチウム塩が挙げられる。
【００５６】
成形用溶液の粘度は、適宜設定すればよい。成形用溶液をドープ液として用いる場合、成形用溶液の粘度は、例えば、３５℃において１００〜１５，０００ｃＰ（センチポイズ）とすることができる。成形用溶液の粘度は、例えば京都電子工業社製の商品名“ＥＭＳ粘度計”を使用して測定することができる。
【００５７】
成形用溶液にイオン液体を予め混合する場合、タンパク質の溶解量をより向上させる観点から、イオン液体の含有量は、成形用溶液全量を基準として、１０〜２０質量％であることが好ましい。
【００５８】
成形用溶液中のタンパク質の含有量は、成形用溶液全量を基準として、１５質量％以上、３０質量％以上、４０質量％以上又は５０質量%以上であることができる。成形用溶液の製造効率の観点から、タンパク質の含有量は、成形用溶液全量を基準として、７０質量％以下、６５質量％以下、又は６０質量％以下であることができる。
【００５９】
本実施形態に係るタンパク質成形体の製造方法の具体例を、タンパク質成形体が、タンパク質繊維、タンパク質フィルム、タンパク質ゲル、タンパク質多孔質体又はタンパク質モールド成形体の場合を例として、以下説明する。
【００６０】
（タンパク質繊維の製造方法）
本実施形態に係るタンパク質繊維は、上述したタンパク質を紡糸したものであり、上述したタンパク質を主成分として含む。タンパク質繊維は、上述した成形用溶液をドープ液とし、公知の紡糸方法によって製造することができる。すなわち、例えば、クモ糸フィブロインを主成分として含むタンパク質繊維を製造する際には、まず、上述したタンパク質の製造方法に準じて製造したクモ糸フィブロインを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ギ酸又はヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）等の溶媒に、溶解促進剤としての無機塩と共に添加し溶解して、ドープ液を作製する。イオン液体は、ドープ液に予め添加しておいてもよい。次いで、このドープ液を用いて、湿式紡糸、乾式紡糸又は乾湿式紡糸等の公知の紡糸方法により紡糸して、目的とするタンパク質繊維を得ることができる。ドープ液がイオン液体を含む場合も、同様にして目的とするタンパク質繊維を得ることができる。
【００６１】
図１は、タンパク質繊維を製造するための紡糸装置の一例を示す概略図である。図１に示す紡糸装置１０は、乾湿式紡糸用の紡糸装置の一例であり、押出し装置１と、凝固浴槽２０と、洗浄浴槽２１と、乾燥装置４とを、上流側から順に有している。
【００６２】
押出し装置１は貯槽７を有しており、ここにドープ液（紡糸原液）６が貯留される。凝固浴槽２０に凝固液１１（例えば、メタノール、飽和クエン酸（水／エタノール＝１：１、質量／質量））が貯留される。ドープ液６は、貯槽７の下端部に取り付けられたギヤポンプ８により、凝固液１１との間にエアギャップ１９を開けて設けられたノズル９から押し出される。押し出されたドープ液６は、エアギャップ１９を経て凝固液１１内に供給される。凝固液１１内でドープ液６から溶媒が除去されてタンパク質が凝固する。凝固したタンパク質は、洗浄浴槽２１に導かれ、洗浄浴槽２１内の洗浄液１２により洗浄された後、洗浄浴槽２１内に設置された第一ニップローラ１３と第二ニップローラ１４により、乾燥装置４へと送られる。このとき、例えば、第二ニップローラ１４の回転速度を第一ニップローラ１３の回転速度よりも速く設定すると、回転速度比に応じた倍率で延伸されたタンパク質繊維３６が得られる。洗浄液１２中で延伸されたタンパク質繊維は、洗浄浴槽２１内を離脱してから、乾燥装置４内を通過する際に乾燥され、その後、ワインダーにて巻き取られる。このようにして、タンパク質繊維が、紡糸装置１０により、最終的にワインダーに巻き取られた巻回物５として得られる。なお、１８ａ〜１８ｇは糸ガイドである。また、ドープ液がイオン液体を含むものである場合、得られるタンパク質繊維は、その内部にイオン液体が分散して含まれるものとなる。
【００６３】
凝固液１１としては、脱溶媒できる溶液であればよく、例えば、メタノール、エタノール及び２−プロパノール等の炭素数１〜５の低級アルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセロール等のグリコール系溶媒、並びにアセトン等を挙げることができる。凝固液１１は、適宜水を含んでいてもよい。
【００６４】
凝固液１１は、凝固液中にイオンを供給するイオン供給物質を更に含むものであってよい。イオン供給物質としては、例えば、塩化カルシウム、硫酸アンモニウム及び塩化マグネシウム等の無機塩、並びにクエン酸及びシュウ酸等の有機酸を挙げることができる。凝固液が無機塩、有機酸を含む場合、その浸透圧により、凝固浴中でのタンパク質繊維からのイオン液体の離脱を抑制することができる。凝固液が有機酸を含む場合、イオン液体の離脱抑制に加えて、タンパク質の凝集を促進することができる。このような観点から、無機塩及び有機酸等のイオン供給物質は、凝固液中に飽和量含まれていることが好ましい。
【００６５】
凝固液１１としては、飽和量の無機塩又は有機酸を含むエタノール系溶液（エタノールを５０質量％以上含む溶液）、飽和量の有機酸を含むイソプロパノールであることが好ましく、飽和量のクエン酸を含む水−エタノール溶液（飽和クエン酸溶液（水／エタノール＝１：１、質量／質量））、飽和量のクエン酸を含むイソプロパノールであることがより好ましい。
【００６６】
凝固液１１の温度は、０〜３０℃であることが好ましい。凝固したタンパク質が凝固液１１中を通過する距離（実質的には、糸ガイド１８ａから糸ガイド１８ｂまでの距離）は、脱溶媒が効率的に行える長さがあればよく、例えば、２００〜５００ｍｍである。凝固液１１中での滞留時間は、例えば、０．０１〜３分であってよく、０．０５〜０．１５分であることが好ましい。また、凝固液１１中で延伸（前延伸）をしてもよい。
【００６７】
タンパク質繊維は、延伸工程を経て延伸糸とすることができる。延伸方法としては、湿熱延伸、乾熱延伸等を挙げることができる。
【００６８】
湿熱延伸は、タンパク質繊維を得る際に洗浄浴槽２１内で実施されてもよい。湿熱延伸は、温水中、温水に有機溶剤等を加えた溶液中等で行う。湿熱延伸の温度としては、例えば、５０〜９０℃であってよく、７５〜８５℃が好ましい。湿熱延伸では、未延伸糸を、例えば、１倍〜１０倍延伸することができ、２〜８倍延伸することが好ましい。
【００６９】
乾熱延伸は、電気管状炉、乾熱板等を使用して行うことができる。温度としては、例えば、１４０℃〜２７０℃であってよく、１６０℃〜２３０℃が好ましい。乾熱延伸では、未延伸糸を、例えば、０．５〜８倍延伸することができ、１〜４倍延伸することが好ましい。
【００７０】
湿熱延伸及び乾熱延伸はそれぞれ単独で行ってもよく、これらを多段で、又は組み合わせて行ってもよい。すなわち、一段目延伸を湿熱延伸で行い、二段目延伸を乾熱延伸で行う、又は一段目延伸を湿熱延伸で行い、二段目延伸を湿熱延伸で行い、更に三段目延伸を乾熱延伸で行う等、湿熱延伸及び乾熱延伸を適宜組み合わせて行うことができる。
【００７１】
最終的な延伸倍率は、その下限値が、未延伸糸に対して、好ましくは、１倍超、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上のうちのいずれかであり、上限値が、好ましくは４０倍以下、３０倍以下、２０倍以下、１５倍以下、１４倍以下、１３倍以下、１２倍以下、１１倍以下、１０倍以下である。
【００７２】
ドープ液がイオン液体を含まないものである場合、例えば、上述の方法に従って成形した成形体をイオン液体に浸漬することにより、内部にイオン液体が分散して含まれるタンパク質繊維を得ることができる。
【００７３】
（タンパク質フィルムの製造方法）
本実施形態に係るタンパク質フィルムは、上述した成形用溶液をドープ液とし、当該ドープ液を基材表面にキャスト成形し、乾燥及び／又は脱溶媒を行うことで製造することができる。イオン液体は、ドープ液に予め添加しておいてもよい。ドープ液がイオン液体を含む場合も、同様にして目的とするタンパク質フィルムを得ることができる。
【００７４】
具体的には、まず、ドープ液を基材表面に所定の厚さで（例えば、乾燥及び／又は脱溶媒後の厚さで１〜１０００μｍとなるように）塗布する。
【００７５】
基材は、樹脂基板、ガラス基板、金属基板等であってよい。基材は、キャスト成形後のフィルムを容易に剥離できる観点から、好ましくは樹脂基板である。樹脂基板としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂フィルム、ポリプロピレン（ＰＰ）フィルム、又はこれらのフィルム表面にシリコーン化合物を固定化させた剥離フィルムであってよい。基材は、ＤＭＳＯ溶媒に対して安定であり、ドープ溶液を安定してキャスト成形でき、成形後のフィルムを容易に剥離できる観点から、より好ましくは、ＰＥＴフィルム又はＰＥＴフィルム表面にシリコーン化合物を固定化させた剥離フィルムである。
【００７６】
乾燥及び／又は脱溶媒は、例えば、真空乾燥、熱風乾燥、風乾、及び液中浸漬から選ばれる少なくとも一種の手段で行われる。液中浸漬は、例えば、タンパク質繊維の製造方法で説明した凝固液（脱溶媒液）にキャストフィルムを浸漬して脱溶媒させるものであってもよい。凝固液（脱溶媒液）の温度は、０℃〜２００℃であってよく、好ましくは０〜９０℃である。溶媒はできるだけ脱離したほうが好ましい。なお、フィルムを液中で延伸する場合、脱溶媒は延伸と同時に行うこともできる。また、脱溶媒は、フィルムを延伸させた後に行ってもよい。
【００７７】
乾燥及び／又は脱溶媒後の未延伸フィルムは、水中で１軸延伸又は２軸延伸することができる。２軸延伸は、逐次延伸でも同時２軸延伸でもよい。２段以上の多段延伸をしてもよい。延伸倍率は、縦、横ともに、好ましくは１．０１〜６倍、より好ましくは１．０５〜４倍である。この範囲であると応力−歪のバランスがとりやすい。水中延伸は、２０〜９０℃の水温で行われることが好ましい。延伸後のフィルムは、５０〜２００℃の乾熱で５〜６００秒間熱固定することが好ましい。この熱固定により、常温における寸法安定性が得られる。なお、１軸延伸したフィルムは１軸配向フィルムとなり、２軸延伸したフィルムは２軸配向フィルムとなる。
【００７８】
フィルムは、カラーフィルムであってもよい。この場合、染料などの着色剤を例えばＤＭＳＯ溶媒に溶解又は分散させてＤＭＳＯ着色液を作製し、この着色液とドープ液とを混合して得られた溶液を、上述したのと同様にキャスト成形によりフィルムを作製する。その後、乾燥及び／又は脱溶媒して未延伸着色フィルムにするか、又は延伸して延伸フィルムとする。カラーフィルムは、反射板、マーカー、紫外線防止膜、スリット糸などに応用できる。
【００７９】
ドープ液がイオン液体を含むものである場合、得られるタンパク質フィルムは、その内部にイオン液体が分散して含まれるものとなる。ドープ液がイオン液体を含まないものである場合、例えば、上述の方法に従って成形した成形体をイオン液体に浸漬することにより、内部にイオン液体が分散して含まれるタンパク質フィルムを得ることができる。
【００８０】
（タンパク質ゲルの製造方法）
本実施形態に係るタンパク質ゲルは、上述した成形用溶液を使用し、当該成形用溶液の溶媒を水溶性溶媒に置換する工程（置換工程）、及び必要に応じてゲルを所定の形状に成形する工程（成形工程）を含む製造方法により製造することができる。イオン液体は、成形用溶液に予め添加しておいてもよい。成形用溶液がイオン液体を含む場合も、同様にして目的とするタンパク質ゲルを得ることができる。
【００８１】
置換工程では、成形用溶液中の溶媒を水溶性溶媒に置換する。水溶性溶媒は、水を含む溶媒をいい、例えば、水、水溶性緩衝液、生理食塩水等が挙げられる。水溶性溶媒は、人体への適応性が高い観点から、好ましくは水である。水としては、特に限定されないが、純水、蒸留水、超純水等を用いることができる。
【００８２】
置換工程は、成形用溶液を透析膜内に入れ、水溶性溶媒中に浸漬し、水溶性溶媒を１回以上入れ替える方法により行われることが好ましい。具体的には、成形用溶液を透析膜に入れ、成形用溶液の１００倍以上の量の水溶性溶媒（１回分）の中に３時間静置し、この水溶性溶媒入れ替えを計３回以上繰り返すことがより好ましい。透析膜は、タンパク質を透過させないものであればよく、例えばセルロース透析膜等であってよい。水溶性溶媒の置換を繰り返すことにより、成形用溶液中に存在していた溶媒の量をゼロに近づけることができる。水溶性溶媒に置換する工程の後半では、透析膜は使用しなくてもよい。
【００８３】
成形工程は、成形用溶液を調製する工程と置換工程との間に実施され、成形用溶液を型枠に流し込み所定の形状に成形する工程であってもよく、置換工程の後に実施され、置換工程で得られたゲルを切断して所定の形状に成形する工程であってもよい。
【００８４】
以上のようにして、例えば水分率が８５．０〜９９．９質量％のタンパク質ゲルを得ることができる。また、成形用溶液がイオン液体を含むものである場合、得られるタンパク質ゲルは、その内部にイオン液体が分散して含まれるものとなる。一方、成形用溶液がイオン液体を含まないものである場合、例えば、上述の方法に従って成形した成形体をイオン液体に浸漬することにより、内部にイオン液体が分散して含まれるタンパク質ゲルを得ることができる。
【００８５】
（タンパク質多孔質体の製造方法）
本実施形態に係るタンパク質多孔質体は、上述した成形用溶液を使用し、当該成形用溶液の溶媒を水溶性溶媒に置換する工程（置換工程）、置換工程で得られたゲルを乾燥する工程（乾燥工程）、及び必要に応じてゲルを所定の形状に成形する工程（成形工程）を含む製造方法により製造することができる。イオン液体は、成形用溶液に予め添加しておいてもよい。成形用溶液がイオン液体を含む場合も、同様にして目的とするタンパク質多孔質体を得ることができる。
【００８６】
置換工程及び成形工程は、タンパク質ゲルの製造方法で説明したものと同じ態様を例示できる。
【００８７】
乾燥工程では真空凍結乾燥を用いることが好ましい。真空凍結乾燥時の真空度は２００パスカル（Ｐａ）以下が好ましく、１５０パスカル以下がより好ましく、１００パスカル以下が更に好ましい。真空乾燥によりゲルから水分が蒸発し、この蒸発潜熱により温度が下がり凍結状態となる。真空凍結乾燥時のゲルの温度は７０℃以下が好ましく、６０℃以下がより好ましく、５０℃以下が更に好ましい。なお、真空凍結乾燥に先立って、−１０〜−４５℃の温度で１０〜３６時間程度予備凍結をしてもよい。凍結乾燥後の水分率は５．０％以下が好ましく、３．０％以下がより好ましい。
【００８８】
以上のようにして、タンパク質多孔質体を得ることができる。また、成形用溶液がイオン液体を含むものである場合、得られるタンパク質多孔質体は、その内部にイオン液体が分散して含まれるものとなる。一方、成形用溶液がイオン液体を含まないものである場合、例えば、上述の方法に従って成形した成形体をイオン液体に浸漬することにより、内部にイオン液体が分散して含まれるタンパク質多孔質体を得ることができる。
【００８９】
（タンパク質モールド成形体の製造方法）
本実施形態に係るタンパク質モールド成形体は、上述した成形用材料（成形用固体材料）を使用して常法に従って製造することができる。具体的には、まず、成形用材料を加圧成形機の金型に導入した後、金型を加熱すると共に成形用材料に対して加圧する。所定の加圧下で混合物が所定の温度に達するまで加熱及び加圧を継続して、成形用材料が加熱加圧された混合物を得る。次いで、冷却器（例えば、スポットクーラー）を用いて金型の温度を下降させ、混合物が所定の温度になったところで内容物を取り出してモールド成形体を得ることができる。成形用材料（成形用固体材料）は、予め内部にイオン液体を侵入させた材料を使用してもよい。すなわち、タンパク質の粉末にイオン液体を添加し、混合して、粉末内部に浸入させた材料を使用してもよい。
【００９０】
金型を加熱する際の温度は、８０〜３００℃であることが好ましく、１００〜１８０℃であることがより好ましく、１００〜１３０℃であることが更に好ましい。金型を加圧する際の圧力は、５ｋＮ以上であることが好ましく、１０ｋＮ以上であることがより好ましく、２０ｋＮ以上であることが更に好ましい。また、所定の加熱加圧条件に達した後、その条件での処理を続ける時間（保温時間）は、０〜１００分であることが好ましく、１０〜５０分であることがより好ましく、５〜３０分であることが更に好ましい。
【００９１】
以上のようにして、タンパク質モールド成形体を得ることができる。また、成形用材料がイオン液体を含むものである場合、得られるタンパク質モールド成形体は、その内部にイオン液体が分散して含まれるものとなる。一方、成形用材料がイオン液体を含まないものである場合、例えば、上述の方法に従って成形したモールド成形体をイオン液体に浸漬することにより、内部にイオン液体が分散して含まれるタンパク質モールド成形体を得ることができる。
【００９２】
［タンパク質溶液］
本発明に係るタンパク質溶液は、タンパク質と、イオン液体と、溶媒とを含む。タンパク質溶液は、イオン液体を含む成形用溶液で説明したものと同じ態様を例示できる。本実施形態に係るタンパク質溶液は、タンパク質を溶媒に溶解した溶液（例えば、成形用溶液）にイオン液体を添加して混合することによって調製することもできるし、タンパク質粉末にイオン液体を添加して溶解させた後、更に溶媒を添加して混合することによって調製することもできる。本実施形態に係るタンパク質溶液は、本発明に係るタンパク質成形体の製造に好適に用いることができる。
【００９３】
［タンパク質成形体用可塑剤］
本発明に係るタンパク質成形体は、イオン液体を内部に含むことにより、柔軟性及び伸度が向上する。すなわち、イオン液体は、タンパク質成形体の可塑剤として機能している。したがって、本発明の一実施形態において、イオン液体からなるタンパク質成形体用可塑剤が提供される。本実施形態に係るタンパク質成形体用可塑剤は、タンパク質成形体に優れた柔軟性及び伸度を付与できる。イオン液体の好適な態様、可塑剤（イオン液体）の好適な使用方法等は、既述のとおりである。
【実施例】
【００９４】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００９５】
［試験例１：タンパク質繊維の製造及び評価］
＜（１−１）クモ糸タンパク質（クモ糸フィブロイン：ＰＲＴ７９９）の製造＞
（クモ糸タンパク質をコードする遺伝子の合成、及び発現ベクターの構築）
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号８で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ７９９」ともいう。）を設計した。【００９６】
配列番号８で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列を有し、さらにＮ末端に配列番号７で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されている。
次に、ＰＲＴ７９９をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。【００９７】
ＰＲＴ７９９をコードする核酸を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表１）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。【００９８】
【表１】
2018221680.tif 000002
【００９９】
当該シード培養液を５００ｍｌの生産培地（下記表２）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。【０１００】
【表２】
2018221680.tif 000003
【０１０１】
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、ＰＲＴ７９９を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存したＰＲＴ７９９に相当するサイズのバンドの出現により、ＰＲＴ７９９の発現を確認した。【０１０２】
（ＰＲＴ７９９の精製）
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ  グアニジン緩衝液（８Ｍ  グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ  リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質（ＰＲＴ７９９）を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。【０１０３】
得られた凍結乾燥粉末におけるＰＲＴ７９９の精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｌｔｄ．）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、ＰＲＴ７９９の精製度は約８５％であった。【０１０４】
＜（１−２）タンパク質繊維の製造＞
（ドープ液の調製）
（１−１）で得られたクモ糸フィブロイン（ＰＲＴ７９９）に対して、イオン液体である１−エチル−３−メチルイミダゾリウムジメチルホスフェイト（［Ｅｍｉｍ］［ＤＭＰ］）を添加した後、更にＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）を加えて原料混液を作製した。この原料混液中のクモ糸フィブロイン濃度は２２質量％であり、イオン液体濃度は１５質量％であった。その後、この原料混液を９５℃にて１．５時間攪拌しながら加熱してクモ糸フィブロインを溶解させ、ドープ液とした（ドープ液の組成：ＰＲＴ７９９／［Ｅｍｉｍ］［ＤＭＰ］／ＤＭＡｃ＝２２／１５／６３（質量比））。【０１０５】
（紡糸）
上記のようにして得られたドープ液を図１に示される紡糸装置１０に準じた紡糸装置を使用して、乾湿式紡糸によりタンパク質繊維を得た。乾湿式紡糸は、下記の条件で行った。
吐出部のノズル（ディスポーザブルニードル）内径：０．３ｍｍ
凝固液（飽和クエン酸溶液（水／エタノール＝１：１、質量／質量））
乾燥温度：６０℃
延伸倍率：２．４倍
上記条件下、洗浄浴槽を１回のみ通したタンパク質繊維（実施例１）及び洗浄浴槽を２回通したタンパク質繊維（実施例２）を製造した。【０１０６】
＜（１−３）タンパク質繊維中のイオン液体含有量の評価＞
エネルギー分散型Ｘ線分析装置を備えた走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ−７１００Ｆ、日本電子株式会社製）を用いて、実施例１及び２のタンパク質繊維断面の撮像及び元素分析を実施した。【０１０７】
結果を図２及び図３に示す。図２（Ａ）は、実施例１のタンパク質繊維断面のエネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＸ）スペクトルであり、図２（Ｂ）は、実施例２のタンパク質繊維断面のＥＤＸスペクトルである。また、図３は、実施例１及び実施例２のタンパク質繊維断面における炭素に対するリン（［Ｅｍｉｍ］［ＤＭＰ］由来である）の割合を示すグラフである。【０１０８】
図２（Ａ）及び（Ｂ）に示すとおり、実施例１及び２のタンパク質繊維断面のＥＤＸスペクトル（点分析）において、イオン液体として用いた［Ｅｍｉｍ］［ＤＭＰ］のリン由来である２．０ｋｅＶにピークが認められた。また、図３に示すとおり、凝固後の洗浄回数（洗浄浴槽を通した回数）が少ない実施例１のタンパク質繊維は、実施例２のタンパク質繊維と比べて、炭素に対するリン（［Ｅｍｉｍ］［ＤＭＰ］由来である）の割合が有意に高かった。これらの結果から、実施例１及び２のタンパク質繊維の内部にイオン液体が残存している（含有されている）こと、凝固後の洗浄回数が少ない実施例１のタンパク質繊維の方がイオン液体の含有量が高いことが理解できる。【０１０９】
＜（１−４）タンパク質繊維の引張試験＞
実施例１及び２のタンパク質繊維をつかみ治具間距離２０ｍｍの試験紙片に接着剤で固定し、温度２０℃、相対湿度６５％の条件で、インストロン社製引張試験機３３４２を用いて引張速度１０ｃｍ／分で応力及び伸度測定を行った。ロードセル容量１０Ｎ、つかみ冶具はクリップ式とした。【０１１０】
タフネスは、次の算出式に従って求めた。
タフネス＝［Ｅ／（ｒ２×π×Ｌ）×１０００］（単位：ＭＪ／ｍ３）
ここで、
Ｅ：破壊エネルギー（単位：Ｊ）
ｒ：繊維の半径（単位：ｍｍ）
π：円周率
Ｌ：引張り試験測定時のつかみ治具間距離：２０ｍｍ【０１１１】
結果を図４及び表３に示す。図４は、実施例１及び実施例２のタンパク質繊維の引張試験結果を示すグラフである。図４のグラフは、縦軸が引張応力（ＭＰａ）、横軸が引張ひずみ（％）を示す。表３は、引張試験結果から求めた引張応力、引張ひずみ、ヤング率及びタフネスの値を示す（サンプル数ｎ＝１１の平均値）。【０１１２】
【表３】
2018221680.tif 000004
【０１１３】
イオン液体の含有量が高い実施例１のタンパク質繊維は、実施例２のタンパク質繊維と比べて、引張ひずみの値が顕著に増加していた。すなわち、イオン液体がタンパク質繊維を可塑化することが理解できる。【０１１４】
［試験例２：タンパク質フィルムの製造及び評価］
＜（２−１）タンパク質フィルムの製造＞
試験例１の（１−１）で得られたクモ糸フィブロイン（ＰＲＴ７９９）に対して、イオン液体である１−エチル−３−メチルイミダゾリウムジメチルホスフェイト（［Ｅｍｉｍ］［ＤＭＰ］）を添加した後、更にＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）を加えて原料混液を作製した。この原料混液中のクモ糸フィブロイン濃度は２２質量％であり、イオン液体濃度は１５質量％であった。その後、この原料混液を９５℃にて１．５時間攪拌しながら加熱してクモ糸フィブロインを溶解させ、タンパク質溶液を得た（組成：ＰＲＴ７９９／［Ｅｍｉｍ］［ＤＭＰ］／ＤＭＡｃ＝２２／１５／６３（質量比））。【０１１５】
上記タンパク質溶液０．５ｍＬをガラス製基板に厚さ２００μｍとなるようにキャストし、これを１６０℃で１０分間加熱して乾燥及び脱溶媒させてタンパク質フィルムを得た。得られたタンパク質フィルムの膜厚は、１００〜２００μｍであった。【０１１６】
＜（２−２）タンパク質フィルム中のイオン液体含有量の評価＞
試験例１の（１−３）と同様に、タンパク質フィルム断面の撮像及び元素分析を実施した。【０１１７】
結果を図５に示す。図５（Ａ）は、タンパク質フィルム断面のＥＤＸスペクトルである。図５（Ｂ）は、タンパク質フィルム断面のＥＤＸによる面分析（リン存在量）の結果を示す図である。【０１１８】
図５（Ａ）に示すとおり、タンパク質フィルム断面のＥＤＸスペクトル（点分析）において、イオン液体として用いた［Ｅｍｉｍ］［ＤＭＰ］のリン由来である２．０ｋｅＶにピークが認められた。また、図５（Ｂ）に示すとおり、タンパク質フィルム内部にリンが散在してした。リンは、イオン液体に由来するものであるから、当該タンパク質フィルムの内部にイオン液体が分散して含まれていることが理解できる。【０１１９】
［試験例３：タンパク質溶液の製造及び評価］
試験例１の（１−１）で得られたクモ糸フィブロイン（ＰＲＴ７９９）のタンパク質溶液の調製にあたり、イオン液体及び溶媒の組成が溶解性に与える影響を評価した。【０１２０】
具体的には、表４及び表５に示す組成及び組成比（重量比）にて、実施例３及び４、並びに比較例１〜４の溶液の調製を試みた。イオン液体として、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムアセテート（［Ｂｍｉｍ］［Ａｃｅｔ］）及び１−エチル−３−メチルイミダゾリウムジメチルホスフェイト（［Ｅｍｉｍ］［ＤＭＰ］）を使用した。溶媒として、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）を使用した。まず、表４及び表５に示す組成比に従って、各成分をガラス製容器に計り、次いで、１００℃で１時間攪拌しながら加熱し、クモ糸フィブロインの溶解性を目視で確認した。【０１２１】
【表４】
2018221680.tif 000005
【０１２２】
【表５】
2018221680.tif 000006
【０１２３】
結果を図６及び図７に示す。図６及び図７は、実施例３及び４、並びに比較例１〜４のクモ糸フィブロインの溶解性を観察した結果を示す写真である。図６及び図７に示すとおり、イオン液体及び溶媒の双方を含む実施例３及び４では、イオン液体及び溶媒の種類に依らず、クモ糸フィブロインが完全に溶解したタンパク質溶液が得られた。一方、イオン液体のみを含む比較例１及び３、並びに溶媒のみを含む比較例２及び４では、クモ糸フィブロインを溶解させることはできなかった。【０１２４】
［試験例４：タンパク質フィルムの製造及び評価］
＜（４−１）タンパク質フィルムの製造＞
試験例１の（１−１）で得られたクモ糸フィブロイン（ＰＲＴ７９９）に対して、ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）を添加し、５０℃で３時間撹拌しながら加熱してクモ糸フィブロインを溶解させた。次いで、得られた溶液にイオン液体である１−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムクロリド［Ｈｍｉｍ］［Ｃｌ］を添加し、５０℃で１時間転倒混和してタンパク質溶液を得た（組成：ＰＲＴ７９９／［Ｈｍｉｍ］［Ｃｌ］／ＨＦＩＰ＝１０／２．５／８７．５（質量比））。【０１２５】
上記タンパク質溶液０．５ｍＬをポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）フィルムに厚さ２００μｍとなるようにキャストし、これを常温常圧で１時間の後６０℃真空で４８時間加熱して乾燥及び脱溶媒させてタンパク質フィルムＡを得た。得られたタンパク質フィルムＡの膜厚は、３０〜６０μｍであった。【０１２６】
比較のため、イオン液体を添加しなかったこと以外は同様にして、タンパク質フィルムＢを得た。【０１２７】
＜（４−２）タンパク質フィルムＡの形態観察＞
走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ−７１００Ｆ、日本電子株式会社製）を使用して、タンパク質フィルムＡの形態を観察した。結果を図８に示す。図８（Ａ）は、タンパク質フィルムＡの表面を撮影した画像である。図８（Ｂ）は、タンパク質フィルムＡの端部（エッジ）を撮影した画像である。図８に示すとおり、タンパク質フィルムＡは、フィルム全体が均質であった。【０１２８】
＜（４−３）タンパク質フィルムＡ中のイオン液体含有量の評価＞
試験例１の（１−３）と同様に、タンパク質フィルムＡ断面の撮像及び元素分析を実施した。【０１２９】
結果を図９に示す。図９（Ａ）は、タンパク質フィルムＡ断面のＥＤＸスペクトルである。図９（Ｂ）は、タンパク質フィルムＡ断面のＥＤＸによる面分析（塩素存在量）の結果を示す図である。図９（Ａ）のＥＤＸスペクトルは、図９（Ｂ）中、四角で囲った領域で測定したものである。【０１３０】
図９（Ａ）に示すとおり、タンパク質フィルムＡ断面のＥＤＸスペクトル（点分析）において、イオン液体として用いた［Ｈｍｉｍ］［Ｃｌ］の塩素由来である２．６ｋｅＶにピークが認められた。また、図９（Ｂ）に示すとおり、タンパク質フィルムＡ内部に塩素が散在してした。塩素は、イオン液体に由来するものであるから、当該タンパク質フィルムＡの内部にイオン液体が分散して含まれていることが理解できる。【０１３１】
＜（４−４）タンパク質フィルムの物性評価＞
タンパク質フィルムＡ及びタンパク質フィルムＢを１０ｍｍの長さに切断して試験片とした。インストロン社製引張試験機３３４２を用いて、試験片を長さ方向に引っ張り、引張応力（縦軸）−ひずみ応力（横軸）曲線を測定した。試験条件は、以下のとおりである。
引張速度：１０ｍｍ／分
つかみ治具間距離：５０ｍｍ
温度／湿度：非制御
ロードセル容量：１０Ｎ
また、タフネスは、試験例１の（１−４）と同様にして求めた。【０１３２】
結果を図１０及び表６に示す。図１０（Ａ）は、タンパク質フィルムＡの引張試験結果を示すグラフである。図１０（Ｂ）は、タンパク質フィルムＢの引張試験結果を示すグラフである。図１０のグラフは、縦軸が引張応力（ＭＰａ）、横軸が引張ひずみ（％）を示す。表６は、引張試験結果から求めた引張応力、引張ひずみ及びタフネスの値を示す。【０１３３】
【表６】
2018221680.tif 000007
【０１３４】
イオン液体を添加していないタンパク質フィルムＢと比べて、イオン液体を添加したタンパク質フィルムＡは、引張ひずみの値が顕著に増加しており、イオン液体がタンパク質フィルムを可塑化することが理解できる。また、イオン液体を添加していないタンパク質フィルムＢと比べて、イオン液体を添加したタンパク質フィルムＡは、タフネスも向上しており、イオン液体を含有することによりタンパク質フィルムの伸度及びタフネスを高め得ることが理解できる。
【符号の説明】
【０１３５】
１…押出し装置、４…乾燥装置、６…ドープ液、１０…紡糸装置、２０…凝固浴槽、２１…洗浄浴槽。
【図１】
2018221680.tif 000008
【図２】
2018221680.tif 000009
【図３】
2018221680.tif 000010
【図４】
2018221680.tif 000011
【図５】
2018221680.tif 000012
【図６】
2018221680.tif 000013
【図７】
2018221680.tif 000014
【図８】
2018221680.tif 000015
【図９】
2018221680.tif 000016
【図１０】
2018221680.tif 000017
【配列表】
2018221680000001.app
【国際調査報告】
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2018221680.tif 000019
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