(57)【要約】  本発明の課題は、高い免疫抑制作用及び／又は増殖性を示す接着性幹細胞を含む細胞集団及びその製造方法、並びに上記細胞集団を含む医薬組成物を提供することである。本発明によれば、接着性幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、以下に示す（ａ）および（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団を取得することを含む、製造方法：（ａ）前記細胞集団が、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である、製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
接着性幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、以下に示す（ａ）および（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団を取得することを含む、製造方法：
（ａ）前記細胞集団が、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である。
【請求項２】
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量が０．０２未満である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記細胞集団が、ＮＥＦＭ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が２５０以上である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
接着性幹細胞を含む細胞集団であって、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団：
（ａ）前記細胞集団が、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である。
【請求項５】
前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量が０．０２未満である、請求項４に記載の細胞集団。
【請求項６】
前記細胞集団が、ＮＥＦＭ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が２５０以上である、請求項４又は５に記載の細胞集団。
【請求項７】
前記接着性幹細胞が、胎児付属物に由来するものである、請求項４から６の何れか一項に記載の細胞集団。
【請求項８】
請求項４から７の何れか一項に記載の細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物。
【請求項９】
請求項４から７の何れか一項に記載の細胞集団と、投与可能な他の細胞とを含む、医薬組成物。
【請求項１０】
ヒトへの接着性幹細胞の１回の用量が１×１０１２個／ｋｇ体重以下である、請求項８又は９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記医薬組成物が、注射用製剤である、請求項８から１０の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記医薬組成物が、細胞塊又はシート状構造の移植用製剤である、請求項８から１１の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
免疫関連疾患の治療剤である、請求項８から１２の何れか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞などの接着性幹細胞を含む細胞集団の製造方法に関する。さらに本発明は、接着性幹細胞を含む細胞集団、並びに医薬組成物に関する。さらに本発明は、接着性幹細胞を含む細胞集団に関する指標を利用した、接着性幹細胞の免疫抑制作用及び／又は増殖性のモニタリング方法、ドナー及び／又はドナーから採取した生体試料の評価方法、並びに最適な酵素処理条件の判断及び／又は予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系間質細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ）ともよばれる間葉系幹細胞などの接着細性幹細胞は、骨髄、脂肪組織、歯髄などに存在することが報告されている体性幹細胞であり、最近では、胎盤、臍帯、卵膜などの胎児付属物にも存在することが明らかになっている。【０００３】
前記接着性幹細胞は、免疫抑制能を有するため、間葉系幹細胞を含む細胞製剤を経静脈的に投与することにより急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及び炎症性腸疾患であるクローン病などの治療が可能であることが報告されている。【０００４】
特許文献１には、羊膜間葉系細胞組成物の製造方法及び凍結保存方法、並びに治療剤について記載されている。特に、ジメチルスルホキシドを５〜１０質量％含有し、ヒドロキシルエチルデンプンを５〜１０質量％又はデキストランを１〜５質量％含有する溶液中に羊膜間葉系細胞を含む混合物を凍結保存することによって、凍結保存された羊膜間葉系細胞を移植に至適化した細胞製剤として製造できることが記載されている。【０００５】
特許文献２には、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、増殖能が異なる間葉系幹細胞を含む細胞集団を物理的刺激又は化学的刺激により処理することによって、相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞を選別する選別工程を含み、選別された相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞が、ＣＤ１０６陰性であり、メタロチオネインファミリー遺伝子の発現量が前記物理的刺激又は化学的刺激による処理前よりも増加していることを特徴とする、前記細胞集団の製造方法が記載されている。【０００６】
特許文献３には、（Ｄ）哺乳動物の羊膜から間葉系細胞の細胞集団を採取するステップと、（Ｅ）前記採取された細胞集団を４００〜３５０００／ｃｍ２の細胞濃度において播種し、２〜３日間初期培養するステップと、（Ｆ）前記初期培養の１／５０００以上１／１０未満の細胞濃度において播種し、１週間に２回の培地交換を行う継代培養を３〜４回繰り返すステップと、（Ｇ）前記継代培養において紡錘状の形態を有する細胞のコロニーが形成されたとき、細胞がコンフルエントになるまで同一の培養皿で培養を維持するステップとを含む、羊膜間葉系幹細胞集団を調製する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１５−６１５２０号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１７／０７３６５６号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２０１３／０７７４２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
近年、医療費が高騰する中で、バイオ医薬品に代表される高価な医薬品の医療経済性を重視する動きが活発化している。生きた細胞を有効成分とする細胞製剤の実現と普及のためには、細胞製剤の製造コストの削減が重要である。【０００９】
このような中、近年、接着性幹細胞集団は、分化能や増殖能、サイトカイン産生能が異なる様々な細胞を含むヘテロな細胞集団であることが分かってきた。細胞製剤の製造コストを削減するためには、高機能の接着性幹細胞、具体的には、高い治療効果や高い増殖性を示す接着性幹細胞集団を効率的に調製する必要がある。【００１０】
特許文献１には、羊膜間葉系細胞を含む混合物を、特定の凍結保存液にて凍結保存することにより、解凍後の羊膜間葉系細胞の生存率減少を抑制し、凍結保存された羊膜間葉系細胞を移植に至適化した細胞製剤として製造できることは記載されている。また、特許文献２には、物理的刺激又は化学的刺激により処理することによって、相対的に増殖能が高い間葉系幹細胞を調製できることは記載されている。しかしながら、特許文献１及び２には、間葉系幹細胞の中から特定の優れた特徴を有する間葉系幹細胞を選択的に調製すること、具体的には、高い免疫抑制作用及び増殖性を示す間葉系幹細胞を多く含む細胞集団を、間葉系幹細胞の特性を指標として選択的に調製することについて、記載も示唆もない。仮に特許文献１及び２に記載の製造方法を使用したとしても、得られる細胞は免疫抑制作用と比増殖速度が十分ではないため、細胞培養に要する時間と原材料費が余計にかかるだけでなく、有効成分である細胞を多量に含有させることでしか細胞製剤の薬効を高めることができないため、細胞製剤を低コストで製造することは困難である。【００１１】
特許文献３には、低密度で細胞を播種することによって、高い増殖能と分化能を有する間葉系幹細胞集団を調製しているものの、間葉系幹細胞集団に含まれる間葉系幹細胞の特性を指標として、高い免疫抑制作用及び増殖性を示す間葉系幹細胞を多く含む細胞集団を選択することについては記載も示唆もない。また、特許文献３に記載の間葉系幹細胞集団は、免疫抑制作用と比増殖速度が十分ではない。実際に、本発明者らが特許文献３に記載の調製方法を追試したところ、低密度で播種し継代培養を３〜４回繰り返すステップに２３日間もの時間を要するだけでなく、得られた間葉系幹細胞集団の比増殖速度は０．３４（１／ｄａｙ）であり不十分であることを確認した。従って、特許文献３に記載の調製方法を使用しても、細胞培養期間を短縮することは不可能であり、細胞製剤を低コストで製造することは困難である。【００１２】
本発明は、細胞製剤の製造コストの削減に有用な、高い免疫抑制作用及び／又は増殖性を示す接着性幹細胞を含む細胞集団及びその製造方法、並びに上記細胞集団を含む医薬組成物を提供することを課題とする。さらに本発明は、接着性幹細胞を含む細胞集団に関する指標を利用した、接着性幹細胞の免疫抑制作用及び／又は増殖性のモニタリング方法、ドナー及び／又はドナーから採取した生体試料の評価方法、並びに最適な酵素処理条件の判断及び／又は予測方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、接着性幹細胞を含む細胞集団において、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、かつＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である接着性幹細胞が含まれていることを見出し、さらに、上記した細胞特性を有する接着性幹細胞を含む細胞集団は、高い免疫抑制作用を示すことを見出した。さらに本発明者らは、上記した細胞特性を有する接着性幹細胞を含む細胞集団は、比増殖速度が高いことを見出した。さらに本発明者らは、接着性幹細胞を含む細胞集団において、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、かつＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上であることを指標として利用することによって、接着性幹細胞の免疫抑制作用及び／又は増殖性をモニタリングできることを見出した。さらに、高い免疫抑制作用及び／又は増殖性を示す接着性幹細胞を効率的に取得するという観点から、ドナー及び／又はドナーから採取した生体試料の品質を評価できることを見出した。さらに、高い増免疫抑制作用及び／又は増殖性を示す接着性幹細胞を効率的に取得するという観点から、ドナーから採取した生体試料の最適な酵素処理条件を判断及び／又は予測できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。【００１４】
すなわち、本明細書によれば、以下の発明が提供される。
［１］  接着性幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、以下に示す（ａ）および（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団を取得することを含む、製造方法：
（ａ）前記細胞集団が、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である。
［２］  前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量が０．０２未満である、［１］に記載の製造方法。
［３］  前記細胞集団が、ＮＥＦＭ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が２５０以上である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］  間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団を取得することを含む、製造方法：
（ａ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が０．３０より大きく、かつ
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量が１．５０未満である。
［５］  接着性幹細胞を含む細胞集団であって、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団：
（ａ）前記細胞集団が、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である。
［６］  前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量が０．０２未満である、［５］に記載の細胞集団。
［７］  前記細胞集団が、ＮＥＦＭ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が２５０以上である、［５］又は［６］に記載の細胞集団。
［８］  間葉系幹細胞を含む細胞集団であって、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団：
（ａ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が０．３０より大きく、かつ
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量が１．５０未満である。
［９］  前記接着性幹細胞が、胎児付属物に由来するものである、［５］から［８］の何れか一に載の細胞集団。【００１５】
［１０］  ［５］から［９］の何れか一に記載の細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物。
［１１］  ［５］から［９］の何れか一に記載の細胞集団と、投与可能な他の細胞とを含む、医薬組成物。
［１２］  ヒトへの接着性幹細胞の１回の用量が１×１０１２個／ｋｇ体重以下である、［１０］又は［１１］に記載の医薬組成物。
［１３］  前記医薬組成物が、注射用製剤である、［１０］から［１２］の何れか一に記載の医薬組成物。
［１４］  前記医薬組成物が、細胞塊又はシート状構造の移植用製剤である、［１０］から［１２］の何れか一に記載の医薬組成物。
［１５］  免疫関連疾患の治療剤である、［１０］から［１４］の何れか一に記載の医薬組成物。【００１６】
［１６］  比増殖速度が０．４０（１／ｄａｙ）以上である、［５］から［９］の何れか一に記載の細胞集団。
［１７］  前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＴＮＦＡＩＰ６遺伝子の相対発現量が０．５以上である、［５］から［９］の何れか一に記載の細胞集団。
［１８］  ［１］から［４］の何れか一に記載の製造方法により得られる、細胞集団。
［１８−２］  前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＴＮＦＡＩＰ６遺伝子の相対発現量が０．５以上である、［１］から［４］に記載の製造方法。【００１７】
［１９］  医薬組成物の製造のための、［５］から［９］の何れか一に記載の細胞集団の使用。
［２０］  前記医薬組成物が、ヒトへの接着性幹細胞の１回の用量が１×１０１２個／ｋｇ体重以下である医薬組成物である、［１９］に記載の使用。
［２１］  前記医薬組成物が、注射用製剤である、［１９］又は［２０］に記載の使用。
［２２］  前記医薬組成物が、細胞塊又はシート状構造の移植用製剤である、［１９］又は［２０］に記載の使用。
［２３］  前記医薬組成物が、免疫関連疾患の治療剤である、［１９］から［２２］の何れか一に記載の使用。【００１８】
［２４］  疾患の治療において使用するための、［５］から［９］の何れか一に記載の細胞集団。
［２５］  ヒトへの接着性幹細胞の１回の用量が１×１０１２個／ｋｇ体重以下である、［２４］に記載の細胞集団。
［２６］  注射用製剤である、［２４］又は［２５］に記載の細胞集団。
［２７］  細胞塊又はシート状構造の移植用製剤である、［２４］又は［２５］に記載の細胞集団。
［２８］  疾患が、免疫関連疾患である、［２４］から［２７］の何れか一に記載の細胞集団。【００１９】
［２９］  ［５］から［９］の何れか一に記載の細胞集団を、治療を必要とする患者又は被験者に投与することを含む、疾患の治療方法。
［３０］  ヒトへの接着性幹細胞の１回の用量が１×１０１２個／ｋｇ体重以下である、［２９］に記載の疾患の治療方法。
［３１］  注射用製剤である、［２９］又は［３０］に記載の疾患の治療方法。
［３２］  細胞塊又はシート状構造の移植用製剤である、［２９］又は［３０］に記載の疾患の治療方法。
［３３］  疾患が、免疫関連疾患である、［２９］から［３２］の何れか一に記載の疾患の治療方法。【００２０】
［３４］  ［５］から［９］の何れか一に記載の細胞集団と、媒体とを含む、組成物。
［３５］  接着性幹細胞を含む細胞集団において、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現の有無、並びにＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量を測定し、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を指標として接着性幹細胞の免疫抑制作用及び／又は増殖性をモニタリングする方法：
（ａ）前記細胞集団が、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である。
［３６］  間葉系幹細胞を含む細胞集団において、
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量を測定し、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を指標として間葉系幹細胞の増殖性及び／又は免疫抑制作用をモニタリングする方法。
（ａ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が０．３０より大きく、かつ
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量が１．５０未満である。
［３７］  ドナーから接着性幹細胞を含む細胞集団を採取し、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現の有無、並びにＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量を測定し、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を指標として評価する、ドナー及び／又はドナーから採取した生体試料の評価方法：
（ａ）前記細胞集団が、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である。
［３８］  ドナーから間葉系幹細胞を含む細胞集団を採取し、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量を測定し、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を指標として評価する、ドナー及び／又はドナーから採取した生体試料の評価方法。
（ａ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が０．３０より大きく、かつ
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量が１．５０未満である。
［３９］  ドナーから採取した生体試料を酵素処理して得られた細胞集団に対して、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現の有無、並びにＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量を測定し、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を指標として評価する、前記生体試料の最適な酵素処理条件を判断及び／又は予測する方法：
（ａ）前記細胞集団が、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である。
［４０］  ドナーから採取した生体試料を酵素処理して得られた細胞集団に対して、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量を測定し、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を指標として評価する、前記生体試料の最適な酵素処理条件を判断及び／又は予測する方法。
（ａ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が０．３０より大きく、かつ
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量が１．５０未満である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、高い免疫抑制作用を示す接着性幹細胞を含む細胞集団を取得することができる。また、本発明によれば、高い増殖性を示す接着性幹細胞を含む細胞集団を取得することができる。また、本発明によれば、接着性幹細胞を含む細胞集団において、高い免疫抑制作用及び／又は増殖性を経時的にモニタリングする手段を提供することができる。さらに、本発明によれば、高い免疫抑制作用及び／又は増殖性を示す接着性幹細胞を含む細胞集団形成の指標として、各種遺伝子のハウスキーピング遺伝子に対する相対発現量を使用することができ、これにより、細胞製剤（医薬組成物）を低コストで製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、実施例２の生存率についての結果を示す。
【図２】図２は、実施例７の生存率についての結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の実施形態について具体的に説明するが、下記の説明は本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が下記の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も本発明の範囲に含まれる。
【００２４】
［１］用語の説明
本明細書における「胎児付属物」は、卵膜、胎盤、臍帯、及び羊水を指す。さらに「卵膜」は、胎児の羊水を含む胎嚢であり、内側から羊膜、絨毛膜、及び脱落膜からなる。このうち、羊膜と絨毛膜は胎児を起源とする。「羊膜」は、卵膜の最内層にある血管に乏しい透明薄膜を指す。羊膜の内層（上皮細胞層ともよばれる）は分泌機能のある一層の上皮細胞で覆われ羊水を分泌し、羊膜の外層（細胞外基質層ともよばれ、間質に相当する）は接着性幹細胞を含む。
【００２５】
本明細書における「接着性幹細胞」は、下記の定義を満たす幹細胞を指し、「間葉系間質細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ)」や「間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）」も接着性幹細胞に含まれる。本明細書において、「間葉系幹細胞」は「ＭＳＣ」と記載されることがある。
【００２６】
「接着性幹細胞」としては、各種組織および器官から採取することができる体性幹細胞（組織幹細胞）のうち、下記の定義を満たす細胞を使用することができる。体性幹細胞（組織幹細胞）としては、骨髄由来間葉系幹細胞、造血幹細胞、臍帯血中の幹細胞、臍帯由来幹細胞、羊膜由来幹細胞、羊水幹細胞、胎盤絨毛細胞由来間葉系幹細胞、神経幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、膵幹細胞、滑膜間葉幹細胞、歯髄幹細胞、脱落乳歯由来歯髄由来幹細胞、精子幹細胞（ＧＳ細胞）、精巣多能性幹細胞（ｍＧＳ細胞）、角膜上皮幹細胞、角膜実質幹細胞、色素幹細胞、臓器における組織幹細胞等を挙げることができるが、特に限定されない。
【００２７】
接着性幹細胞の定義
i)標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す。
ii)表面抗原ＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ３２６が陰性。
本明細書における「接着性幹細胞集団」は、接着性幹細胞を含む細胞集団を意味し、その形態は特に限定されず、例えば、細胞ペレット、細胞シート、細胞凝集塊、細胞浮遊液又は細胞懸濁液などが挙げられる。
【００２８】
前記「接着性幹細胞」は上記の定義を満たしていればよく、骨、軟骨、脂肪等への分化能の有無については特に限定されない。例えば、本明細書における「接着性幹細胞」には、間葉系幹細胞のように、骨、軟骨、及び脂肪への分化能を有している細胞も含まれる。また、前記「接着性幹細胞」には、上記の定義を満たしているものの、骨、軟骨、脂肪等への分化能を有していない細胞も含まれる。また、前記「接着性幹細胞」には、上記の定義を満たしているものの、骨、軟骨、脂肪のうちいずれか１つ、又は２つにのみ分化する細胞も含まれる。
【００２９】
本明細書における「羊膜接着性幹細胞」は、羊膜に由来する接着性幹細胞を指し、「羊膜間葉系間質細胞」と区別なく用いられる。本明細書において、「羊膜間葉系幹細胞」は「羊膜ＭＳＣ」と記載されることがある。
【００３０】
本明細書における「表面抗原が陽性を呈する接着性幹細胞の比率」とは、後記する実施例に記載の通り、フローサイトメトリーによって解析した表面抗原について陽性である細胞の比率を示す。本明細書において、「表面抗原が陽性を呈する接着性幹細胞の比率」は「陽性率」と記載されることがある。
本明細書における「表面抗原が陰性を呈する接着性幹細胞の比率」とは、後記する実施例に記載の通り、フローサイトメトリーによって解析した表面抗原について陰性である細胞の比率を示す。本明細書において、「表面抗原が陰性を呈する接着性幹細胞の比率」は「陰性率」と記載されることがある。
【００３１】
本明細書における「増殖能」とは、細胞が細胞分裂を行うことにより、細胞数が増加する能力のことをいう。本明細書において、「増殖能が高い」は「増殖性が高い」と区別無く用いることができる。接着性幹細胞集団の増殖能は、培養１バッチあたりの取得細胞数、比増殖速度、倍加回数、倍加時間、及び／又は継代回数を用いて評価することができる。比増殖速度の測定方法は、本明細書中後記の通りである。
【００３２】
本明細書における「培養１バッチあたりの取得細胞数」は、１回の培養における、培養容器の単位表面積あたり、単位培養日数あたりの得られる細胞数を意味する。したがって、「培養１バッチあたりの取得細胞数」の単位は、（個／ｃｍ２／ｄａｙ）である。
【００３３】
本明細書における「免疫抑制作用」とは、生体の免疫応答を抑制する作用のことをいう。本明細書において、「免疫抑制作用」は「免疫抑制能」と区別無く用いることができる。接着性幹細胞集団の免疫抑制作用は、ＴＮＦＡＩＰ６（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ，ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６）遺伝子の発現量、混合リンパ球反応試験（ＭＬＲ試験）におけるヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）の増殖抑制率や動物実験を用いて評価することができる。免疫抑制作用の評価方法は、本明細書中後記の通りである。
【００３４】
［２］接着性幹細胞を含む細胞集団
本発明により提供される接着性幹細胞を含む細胞集団は、
（ａ）前記細胞集団が、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である、
ことを特徴とする。
【００３５】
本発明により提供される接着性幹細胞を含む細胞集団は、（ａ）前記細胞集団が、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である、という条件を満たすと、高い免疫抑制作用及び／又は増殖性を示す接着性幹細胞を含む細胞集団を形成する。そのため、本発明においては、前記条件を、高い免疫抑制作用及び／又は増殖性を示す細胞集団形成の指標とすることができる。また、前記指標を経時的に測定することで、接着性幹細胞の免疫抑制作用及び／又は増殖性の変化を迅速に把握し、予測することができる。さらに本発明によれば、前記の指標を利用することによって、ドナー自体及び／又はドナーから採取した生体試料の品質を評価することができる。さらに本発明によれば、前記指標を使用することによって、ドナーから採取した生体試料を酵素処理する際の酵素処理方法が、適切かどうかを判断及び／又は予測することができる。
【００３６】
ＰＬＩＮ２は、Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  ２を意味する。ＰＬＩＮ２遺伝子の配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：１２３として登録されている。ＰＬＩＮ２は、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子、或いは配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子である。
【００３７】
ＮＥＦＭは、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ，  ｍｅｄｉｕｍ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅを意味する。ＮＥＦＭ遺伝子の配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：４７４１として登録されている。ＮＥＦＭは、配列番号３に示す塩基配列からなる遺伝子、或いは配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子である。
【００３８】
ＳＤＨＡは、ハウスキーピング遺伝子の一種であり、Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ，ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａを意味する。ＳＤＨＡ遺伝子の配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：６３８９として登録されている。ＳＤＨＡは、配列番号５に示す塩基配列からなる遺伝子、或いは配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子である。
【００３９】
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量の上限は、例えば２０．０以下、１９．０以下、１８．０以下、１７．０以下、１６．０以下、１５．０以下、１４．０以下、１３．０以下、１２．０以下、１１．０以下、１０．０以下、９．０以下、８．９以下、８．８以下、８．７以下、８．６以下、８．５以下、８．４以下、８．３以下、８．２以下、８．１以下、８．０以下、７．９９以下、７．９８以下、７．９７以下、７．９６以下、７．９５以下、７．９４以下、７．８以下、７．７以下、７．６以下、７．５以下、７．４以下、７．３以下、７．２以下、７．１以下、７．０以下、６．９以下、６．８以下、６．７以下、６．６以下、６．５以下、６．４以下、６．３以下、６．２以下、６．１以下、６．０以下、５．９以下、５．８以下、５．７以下、５．６以下、５．５以下、５．４以下、５．３以下、５．２以下、５．１以下、又は５．０以下でもよい。
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量の下限は、例えば１．５１以上、１．５２以上、１．５３以上、１．５４以上、１．５５以上、１．５６以上、１．５７以上、１．５８以上、１．５９以上、１．６０以上、１．６１以上、１．６２以上、１．６３以上、１．６４以上、１．６５以上、１．６６以上、１．６７以上、１．６８以上、１．６９以上、１．７０以上、１．７１以上、１．７２以上、１．７３以上、１．７４以上、１．７５以上、１．７６以上、１．７７以上、１．７８以上、１．７９以上、１．８０以上、１．８１以上、１．８２以上、１．８３以上、１．８４以上、１．８５以上、１．８６以上、１．８７以上、１．８８以上、１．８９以上、１．９０以上、１．９１以上、１．９２以上、１．９３以上、１．９４以上、２．０以上、２．１以上、２．２以上、２．３以上、２．４以上、２．５以上、２．６以上、２．７以上、２．８以上、２．９以上、３．０以上、３．１以上、３．２以上、３．３以上、３．４以上、３．５以上、３．６以上、３．７以上、３．８以上、３．９以上、４．０以上、４．１以上、４．２以上、４．３以上、４．４以上、４．５以上、４．６以上、４．７以上、４．８以上、４．９以上、又は５．０以上でもよい。
【００４０】
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量の上限は、例えば０．０２０未満、０．０１９以下、０．０１８以下、０．０１７以下、０．０１６以下、０．０１５以下、０．０１４以下、０．０１３以下、０．０１２以下、０．０１１以下、０．０１０以下、０．００９以下、又は０．００８以下でもよい。
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量の下限は、例えば０．０００１以上、０．０００２以上、０．０００３以上、０．０００４以上、０．０００５以上、０．０００６以上、０．０００７以上、０．０００８以上、０．０００９以上、０．００１以上、０．００２以上、０．００３以上、０．００４以上、０．００５以上、０．００６以上、０．００７以上、０．００８以上でもよい。
【００４１】
ＮＥＦＭ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量の上限は、例えば４００００以下、４５０００以下、３００００以下、２５０００以下、２００００以下、１５０００以下、１００００以下、９０００以下、８０００以下、７０００以下、６０００以下、５０００以下、４９００以下、４８００以下、４７００以下、４６００以下、４５００以下、４４００以下、４３００以下、４２００以下、４１００以下、４０００以下、３９００以下、３８００以下、３７００以下、３６００以下、３５００以下、３４００以下、３３００以下、３２００以下、３１００以下、３０９０以下、３０８０以下、３０７０以下、３０６０以下、３０５０以下、３０４０以下、３０３０以下、３０２０以下、３０１０以下、３０００以下、２９００以下、２８００以下、２７００以下、２６００以下、２５００以下、２４００以下、２３００以下、２２００以下、２１００以下、２０００以下、１９００以下、１８００以下、１７００以下、１６００以下、１５００以下、１４００以下、１３００以下、１２００以下、１１００以下、又は１０００以下もよい。
【００４２】
ＮＥＦＭ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量の下限は、例えば２５０以上、２６０以上、２７０以上、２８０以上、２９０以上、３００以上、３１０以上、３２０以上、３３０以上、３４０以上、３５０以上、３６０以上、３７０以上、３８０以上、３９０以上、４００以上、４１０以上、４２０以上、４３０以上、４４０以上、４５０以上、４６０以上、４７０以上、４８０以上、４９０以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、又は１０００以上でもよい。
【００４３】
各遺伝子の検出及び／又はその発現量の測定は、例えば、マイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＲＴ−ＰＣＲ又はノーザンブロットハイブリダーゼーションにより行うことができるが、これらに限定されない。
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対する各遺伝子の相対発現量、及びＮＥＦＭ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量の測定方法としては、マイクロアレイを使用することができる。マイクロアレイは、具体的には、以下の手順（１）〜（５）にて行うことができる。なお、以下の手順（３）〜（５）は、株式会社理研ジェネシスに委託して実施することができる。
（１）凍結保存した細胞集団を解凍し、遠心分離により回収する。回収した細胞集団をリン酸バッファー（ＰＢＳ）にて洗浄し、遠心分離により回収する。
（２）ＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社製））を用いて、細胞集団からトータルＲＮＡを抽出、精製する。
（３）精製したトータルＲＮＡを鋳型として用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、さらに合成されたｃＤＮＡからｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによりｃＲＮＡに転写してビオチン標識を行う。
（４）ビオチン標識ｃＲＮＡをハイブリダイゼーションバッファーに加え、Ｈｕｍａｎ  ＧｅｎｅＧｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３Ａ  ２．０  Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）上で１６時間のハイブリダイゼーションを行う。ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて洗浄し、フィコエリスリン染色後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  ７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にてスキャンを行い、ＡＧＣＣ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｃｏｍｍａｎｄ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて画像解析し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いて数値化する。
（５）数値データファイルを、解析ソフトＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ（アジレント・テクノロジー社製）を用いて比較解析する。各細胞集団におけるＳＤＨＡ遺伝子又はＮＥＦＭ遺伝子の発現量に対する各遺伝子の相対発現量を算出する。
【００４４】
また、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対する各遺伝子の相対発現量及びＮＥＦＭ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量の測定方法としては、定量ＲＴ−ＰＣＲを使用することができる。定量ＲＴ−ＰＣＲは、具体的には、以下の手順Ａ（比較Ｃｔ法）又は手順Ｂ（検量線法）にて行うことができる。
（手順Ａ：比較Ｃｔ法）
（１）凍結保存した細胞集団を解凍し、遠心分離により回収する。回収した細胞集団をリン酸バッファー（ＰＢＳ）にて洗浄し、遠心分離により回収する。
（２）ＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社製））を用いて、細胞集団からトータルＲＮＡを抽出、精製する。
（３）精製したトータルＲＮＡを鋳型として、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡社製）を用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。
（４）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（東洋紡社製）を用いてＰＣＲ反応を行う。反応液の液量は２０μＬとする。ＰＣＲ反応条件は、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、９８℃２分ホールド、（９８℃１０秒、６０℃１０秒、６８℃３０秒）４０サイクルとする。
（５）比較対象の遺伝子に対する測定対象の遺伝子の相対発現量（Ｘ）は、Ｘ＝２｛−（Ｙ−Ｚ）｝により算出する。ここで、Ｙは測定対象の遺伝子のＣｔ値、Ｚは比較対象の遺伝子のＣｔ値である。
（手順Ｂ：検量線法）
（１）凍結保存した細胞集団を解凍し、遠心分離により回収する。回収した細胞集団をリン酸バッファー（ＰＢＳ）にて洗浄し、遠心分離により回収する。
（２）ＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社製））を用いて、細胞集団からトータルＲＮＡを抽出、精製する。
（３）精製したトータルＲＮＡを鋳型として、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡社製）を用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。
（４）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（東洋紡社製）を用いてＰＣＲ反応を行う。反応液の液量は２０μＬとする。ＰＣＲ反応条件は、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、９８℃２分ホールド、（９８℃１０秒、６０℃１０秒、６８℃３０秒）４０サイクルとする。なお、検量線作成用のサンプルとして、合成したｃＤＮＡを等倍で１〜５段階希釈したものを使用する。
（５）ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）が表示する、比較対象の遺伝子及び測定対象の遺伝子の発現量を記録する。
（６）比較対象の遺伝子に対する測定対象の相対発現量（Ｗ）は、Ｗ＝α／βにより算出する。ここで、αは測定対象の遺伝子の発現量、βは比較対象の遺伝子の発現量である。
【００４５】
上記の定量ＲＴ−ＰＣＲでは、以下のプライマー配列を使用することができる。
ＰＬＩＮ２−ｆ：５−ＧＣＴＧＡＧＣＡＣＡＴＴＧＡＧＴＣＡＣＧ−３（配列番号７）
ＰＬＩＮ２−ｒ：５−ＴＧＧＴＡＣＡＣＣＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＧ−３（配列番号８）
ＮＥＦＭ−ｆ：５−ＴＡＧＡＡＡＴＣＧＣＴＧＣＧＴＡＣＡＧＡＡＡＡＣ−３（配列番号９）
ＮＥＦＭ−ｒ：５−ＴＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＡ−３（配列番号１０）
ＳＤＨＡ−ｆ：５−ＴＧＧＧＡＡＣＡＡＧＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧ−３（配列番号１１）
ＳＤＨＡ−ｒ：５−ＣＣＡＣＣＡＣＴＧＣＡＴＣＡＡＡＴＴＣＡＴＧ−３（配列番号１２）
【００４６】
上記した遺伝子発現量を測定するタイミングは、特に限定されないが、例えば、生体試料から細胞を分離した直後、培養工程の途中、培養工程における純化後、ｎ回継代した直後（ｎは１以上の整数を示す）、維持培養の途中、凍結保存前、解凍後、又は医薬組成物として製剤化する前などが挙げられる。
【００４７】
本発明の一態様によれば、本発明により提供される接着性幹細胞を含む細胞集団は、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、及び／又はＣＤ９０が陽性を呈する接着性幹細胞の比率が９０％以上であることを満たしていてもよい。
ＣＤ１０５は、分化クラスター１０５を意味し、Ｅｎｄｏｇｌｉｎとしても知られているタンパク質である。
ＣＤ７３は、分化クラスター７３を意味し、５−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ、或いはＥｃｔｏ−５’−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅとしても知られているタンパク質である。
ＣＤ９０は、分化クラスター９０を意味し、Ｔｈｙ−１としても知られているタンパク質である。
【００４８】
細胞集団においてＣＤ１０５が陽性を呈する接着性幹細胞の比率は、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。
細胞集団においてＣＤ７３が陽性を呈する接着性幹細胞の比率は、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。
細胞集団においてＣＤ９０が陽性を呈する接着性幹細胞の比率は、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。
【００４９】
本発明の一態様によれば、本発明により提供される接着性幹細胞を含む細胞集団は、ＣＤ１６６が陽性を呈する接着性幹細胞の比率が３０％以上であることを満たしていてもよい。
ＣＤ１６６は、分化クラスター１６６を意味し、Ａｃｔｉｖａｅｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＡＬＣＡＭ）としても知られているタンパク質である。
【００５０】
細胞集団においてＣＤ１６６が陽性を呈する接着性幹細胞の比率は、３１％以上、３２％以上、３３％以上、３４％以上、３５％以上、３６％以上、３７％以上、３８％以上、３９％以上、４０％以上、４１％以上、４２％以上、４３％以上、４４％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。
【００５１】
本発明の一態様によれば、本発明により提供される接着性幹細胞を含む細胞集団は、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９ａｌｐｈａ、ＣＤ１９、及び／又はＨＬＡ−ＤＲが陰性を呈する接着性幹細胞の比率が９５％以上であることを満たしていてもよい。
ＣＤ４５は、分化クラスター４５を意味し、ＰＴＰＲＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ，Ｃ）、或いはＬＣＡ（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）としても知られているタンパク質である。
ＣＤ３４は、分化クラスター３４を意味し、Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＣＤ３４としても知られているタンパク質である。
ＣＤ１１ｂは、分化クラスター１１ｂを意味し、ＩＴＧＡＭ（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ，ａｌｐｈａ  Ｍ）としても知られているタンパク質である。
ＣＤ７９ａｌｐｈａは、分化クラスター７９ａｌｐｈａを意味し、Ｂ−ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｐｈａ  ｃｈａｉｎ、或いはＭＢ−１  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎとしても知られているタンパク質である。
ＣＤ１９は、分化クラスター１９を意味し、Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＣＤ１９としても知られているタンパク質である。
ＨＬＡ−ＤＲは、Ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｇｅｎ  Ｄ  ｒｅｌａｔｅｄを意味し、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとしても知られているタンパク質である。
【００５２】
細胞集団においてＣＤ４５が陰性を呈する接着性幹細胞の比率は、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。
細胞集団においてＣＤ３４が陰性を呈する接着性幹細胞の比率は、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。
細胞集団においてＣＤ１１ｂが陰性を呈する接着性幹細胞の比率は、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。
細胞集団においてＣＤ７９ａｌｐｈａが陰性を呈する接着性幹細胞の比率は、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。
細胞集団においてＣＤ１９が陰性を呈する接着性幹細胞の比率は、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。
細胞集団においてＨＬＡ−ＤＲが陰性を呈する接着性幹細胞の比率は、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。
【００５３】
本発明の一態様によれば、本発明により提供される接着性幹細胞を含む細胞集団は、ＣＤ３２４及び／又はＣＤ３２６が陰性を呈する接着性幹細胞の比率が９５％以上であることを満たしていてもよい。
ＣＤ３２４は、分化クラスター３２４を意味し、ＣＤＨ１遺伝子によってコードされるＣａｄｈｅｒｉｎ  １、或いはＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎとしても知られているタンパク質である。
ＣＤ３２６は、分化クラスター３２６を意味し、ＥＰＣＡＭ遺伝子によってコードされるＥｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅとしても知られているタンパク質である。
細胞集団においてＣＤ３２４が陰性を呈する接着性幹細胞の比率は、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。
細胞集団においてＣＤ３２６が陰性を呈する接着性幹細胞の比率は、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。
【００５４】
各表面抗原の測定は、例えば、フローサイトメトリー、又は細胞染色により行うことができるが、これらに限定されない。蛍光標識抗体を用いるフローサイトメトリーにおいて、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出された場合、当該細胞は当該表面抗原について「陽性」と判定される。蛍光標識抗体は、任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。細胞染色において、着色するか若しくは蛍光を発する細胞が顕微鏡下にて観察された場合、当該細胞は当該表面抗原について「陽性」と判定される。細胞染色は、抗体を使用する免疫細胞染色であってもよく、抗体を使用しない非免疫細胞染色であってもよい。
【００５５】
各表面抗原に対して陽性である細胞の比率（陽性率）は、具体的には、フローサイトメトリーのドットプロット展開解析を用いて、以下の手順（１）〜（８）にて測定することができる。
（１）凍結保存した細胞集団を解凍し、遠心分離により回収する。回収した細胞集団をリン酸バッファー（ＰＢＳ）にて洗浄し、遠心分離により回収する。
（２）４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞集団を固定した後、リン酸バッファー（ＰＢＳ）にて洗浄し、２％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１．０×１０６個／ｍＬとなるように細胞懸濁液を調製する。前記細胞懸濁液を１００μＬずつ分注する。
（３）分注した細胞懸濁液を遠心分離し、得られた細胞ペレットに０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを１００μＬずつ添加する。次いで、各表面抗原に対応する抗体、又はそのアイソタイプコントロール用抗体を添加する。各反応液を混和した後、４℃にて２０分間静置する。
（４）０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを添加し、遠心分離により細胞集団を洗浄した後、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳにて懸濁し、セルストレーナー（３５μｍナイロンメッシュフィルター）（コーニング社製／品番：３５２２３５）にてフィルターろ過する。
（５）フィルターろ過により得られた細胞懸濁液を、ＢＤ  ＡｃｃｕｒｉＴＭ  Ｃ６  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ベクトン・ディッキンソン社製）にてＡＬＬ  Ｅｖｅｎｔ  １００００で解析する。
（６）測定結果を、縦軸にＳＳＣ（側方散乱光）（数値範囲：０以上１６７７７２１５以下）、横軸を抗体に標識された色素の蛍光強度（数値範囲：１０１以上１０７．２以下）としたドットプロットで展開する。
（７）ドットプロット展開図において、アイソタイプコントロール用抗体で測定した総細胞のうち、より蛍光強度が強い細胞集団が１．０％以下となる全ての領域（ゲート）を選択する。
（８）各表面抗原に対応する抗体で測定した総細胞のうち、（７）で選択したゲート内に含まれる細胞の割合を算出する。
【００５６】
なお、各表面抗原に対して陰性である細胞の比率（陰性率）は、以下の式により算出する。
陰性率（％）＝１００−陽性率
上記した表面抗原を検出するタイミングは、特に限定されないが、例えば、生体試料から細胞を分離した直後、培養工程の途中、培養工程における純化後、ｎ回継代した直後（ｎは１以上の整数を示す）、維持培養の途中、凍結保存前、解凍後、又は医薬組成物として製剤化する前などが挙げられる。
【００５７】
本発明により提供される接着性幹細胞を含む細胞集団の増殖能は、比増殖速度により評価することができる。比増殖速度は、単位時間あたりの細胞数の増加として定義され、比増殖速度：μ＝ｌｎ（ｍｔ２／ｍｔ１）／（ｔ２−ｔ１） で表される。ここで、ｔ１及びｔ２は培養日数、ｍｔ１ はｔ１日目における細胞数、ｍｔ２はｔ２日目における細胞数である（ただし、ｔ２＞ｔ１）。したがって、比増殖速度の単位は、（個／個／ｄａｙ）＝（１／ｄａｙ）である。
【００５８】
本発明における接着性幹細胞を含む細胞集団の比増殖速度は、医薬組成物の製造に必要となる細胞数を低コストかつ短期間で取得する観点から、好ましくは０．４０（１／ｄａｙ）以上であり、より好ましくは０．４１（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．４２（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．４３（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．４４（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．４５（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．４６（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．４８（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．５０（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．５２（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．５４（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．５５（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．５６（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．５８（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．６０（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．６２（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．６４（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．６６（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．６８（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．７０（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．７２（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．７４（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．７６（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．７８（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．８０（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．８２（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．８４（１／ｄａｙ）以上であり、さらに好ましくは０．８６（１／ｄａｙ）以上であり、特に好ましくは０．８７（１／ｄａｙ）以上である。また、本発明における接着性幹細胞を含む細胞集団の比増殖速度の上限は、特に限定されないが、例えば、１．０（１／ｄａｙ）以下、又は０．９０（１／ｄａｙ）以下である。
【００５９】
本発明の細胞集団においては、接着性幹細胞は、生体外での培養開始後、好ましくは２０日以降まで、さらに好ましくは２５日以降まで、３０日以降まで、３５日以降まで、４０日以降まで、４５日以降まで、５０日以降まで、５５日以降まで、６０日以降まで、６５日以降まで、７０日以降まで、７５日以降まで、８０日以降まで、８５日以降まで、９０日以降まで、９５日以降まで、１００日以降まで、１０５日以降まで、又は１１０日以降まで、培養することが可能である。
【００６０】
本発明により提供される接着性幹細胞を含む細胞集団の継代可能回数は、１回以上、好ましくは２回以上、より好ましくは３回以上、さらに好ましくは４回以上、さらに好ましくは５回以上、さらに好ましくは６回以上、さらに好ましくは８回以上、さらに好ましくは１０回以上、さらに好ましくは１２回以上、さらに好ましくは１４回以上、さらに好ましくは１６回以上、さらに好ましくは１８回以上、さらに好ましくは２０回以上、さらに好ましくは２２回以上、さらに好ましくは２４回以上、さらに好ましくは２５回以上である。また、継代可能回数の上限は、特に限定されないが、例えば、５０回以下、４５回以下、４０回以下、３５回以下又は３０回以下である。
【００６１】
本発明により提供される接着性幹細胞を含む細胞集団は、継代されていてもよい。継代回数の下限は、好ましくは１回以上、さらに好ましくは２回以上、さらに好ましくは３回以上、さらに好ましくは４回以上、さらに好ましくは５回以上である。また、継代回数の上限は、好ましくは２５回以下、さらに好ましくは２０回以下、さらに好ましくは１５回以下、さらに好ましくは１０回以下である。
【００６２】
本発明により提供される接着性幹細胞を含む細胞集団は、好ましくは１０回以上、さらに好ましくは２０回以上、３０回以上、４０回以上、５０回以上、又は６０回以上、集団倍加することが可能である。また、本発明により提供される接着性幹細胞を含む細胞集団は、例えば、１００回以下、９０回以下、８０回以下又は７０回以下、集団倍加することが可能であるが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明により提供される接着性幹細胞を含む細胞集団は、集団倍加されていてもよい。集団倍加回数の下限は、好ましくは５回以上、さらに好ましくは１０回以上、さらに好ましくは１５回以上、さらに好ましくは２０回以上、さらに好ましくは２５回以上、さらに好ましくは３０回以上である。また、集団倍加回数の上限は、好ましくは６０回以下、さらに好ましくは５５回以下、さらに好ましくは５０回以下である。
【００６４】
集団倍加回数とは、ある一定の培養期間において細胞集団が分裂した回数であり、[ｌｏｇ１０（培養終了時の細胞数）−ｌｏｇ１０（培養開始時の細胞数）]／ｌｏｇ１０（２）の計算式にて算出される。継代培養を行った場合は、継代毎の集団倍加回数を上記の式で計算した後、累積することによって、総集団倍加回数が算出される。
【００６５】
本発明により提供される接着性幹細胞を含む細胞集団の免疫抑制作用は、ＴＮＦＡＩＰ６（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ，ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６）遺伝子の発現量、混合リンパ球反応試験（ＭＬＲ試験）におけるヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）の増殖抑制率、及び／又は動物実験により評価することができる。
ＴＮＦＡＩＰ６（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ，ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６）遺伝子の配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースにＩＤ：７１３０として登録されている。ＴＮＦＡＩＰ６は、配列番号１３に示す塩基配列からなる遺伝子、或いは配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子である。
【００６６】
ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子の発現量は、例えば、マイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＲＴ−ＰＣＲ又はノーザンブロットハイブリダーゼーションによりの評価することができるが、これらに限定されない。
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＴＮＦＡＩＰ６遺伝子の相対発現量の測定方法としては、マイクロアレイを使用することができる。マイクロアレイは、上述の手順により行うことができる。
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＴＮＦＡＩＰ６遺伝子の相対発現量の下限は、０．５以上、０．６以上、０．７以上、０．８以上、０．９以上、１．０以上、１．１以上、１．２以上、１．３以上、１．４以上、１．５以上、１．６以上、１．７以上、１．８以上、、１．９以上又は２．０以上でもよい。また、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＴＮＦＡＩＰ６遺伝子の相対発現量の上限は、特に限定されないが、例えば、４．０以下、３．０以下、又は２．０以下である。
【００６７】
混合リンパ球反応試験（ＭＬＲ試験）におけるヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）の増殖抑制率は、以下の手順（１）〜（６）により評価することができる。
（１）対象となる細胞集団を、接着培養用９６ウェルプレートに２×１０４個／ウェルとなるよう播種し、終濃度にして１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（非働化済み）を含むαＭＥＭで２４時間接着培養する。
（２）２４時間接着培養した細胞集団に、終濃度にして１０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣを添加し、３７℃で２時間インキュベートする。
（３）共培養群として、マイトマイシンＣを添加した細胞集団に、２×１０５個／ウェルのｈＰＢＭＣを播種する。単独培養群（対照群）として、細胞集団を含まないウェルに２×１０５個／ウェルのｈＰＢＭＣを播種する。各々の群（共培養群、単独培養群）に対して、終濃度にして２．５μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を添加し、３７℃で９６時間培養する。
（４）９６時間培養した後、ｈＰＢＭＣを含む上清を回収し、自動セルカウンターＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ社製）を用いてｈＰＢＭＣの総細胞数及び死細胞数を計測する。
（５）以下の式により、ｈＰＢＭＣの生細胞数を算出する。
ｈＰＢＭＣの生細胞数＝ｈＰＢＭＣの総細胞数−ｈＰＢＭＣの死細胞数
（６）以下の式により、ｈＰＢＭＣの増殖抑制率を算出する。
ｈＰＢＭＣの増殖抑制率（％）＝１００−（共培養群におけるｈＰＢＭＣの生細胞数／単独培養群におけるｈＰＢＭＣの生細胞数）×１００
【００６８】
上記した免疫抑制作用を評価するタイミングは、特に限定されないが、例えば、生体試料から細胞を分離した直後、培養工程の途中、培養工程における純化後、ｎ回継代した直後（ｎは１以上の整数を示す）、維持培養の途中、凍結保存前、解凍後、又は医薬組成物として製剤化する前などが挙げられる。
本発明により提供される接着性幹細胞を含む細胞集団の細胞生存率は、例えば、トリパンブルー染色、ＭＴＴ（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）アッセイ等により測定することができるが、これらに限定されない。
本発明により提供される接着性幹細胞を含む細胞集団の細胞生存率は、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％である。
【００６９】
接着性幹細胞の由来は特に限定されないが、例えば、胎児付属物、骨髄、脂肪、又は歯髄に由来する接着性幹細胞を使用することができる。接着性幹細胞は、好ましくは、胎児付属物に由来する接着性幹細胞であり、より好ましくは、羊膜に由来する接着性幹細胞である。接着性幹細胞は、自己、同種異系又は異種の生体試料から単離された接着性幹細胞であり、好ましくは、同種異系の生体試料から単離された接着性幹細胞である。
接着性幹細胞は、遺伝子組み換えされた又は遺伝子組み換えされていない接着性幹細胞であり、好ましくは、遺伝子組み換えされていない接着性幹細胞である。
【００７０】
本発明の細胞集団は、任意の数の接着性幹細胞を含むことができる。本発明の細胞集団は、例えば、１．０×１０１個、１．０×１０２個、１．０×１０３個、１．０×１０４個、１．０×１０５個、１．０×１０６個、１．０×１０７個、１．０×１０８個、１．０×１０９個、１．０×１０１０個、１．０×１０１１個、１．０×１０１２個、１．０×１０１３個以上又は以下の接着性幹細胞を含むことができるが、これらに限定されない。
本発明の細胞集団は、接着性幹細胞以外に、任意の成分を含んでもよい。上記の成分としては、例えば、塩類、多糖類（例えば、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）、デキストランなど）、タンパク質（例えば、アルブミンなど）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アミノ酸、培地成分（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に含まれる成分など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００７１】
本発明の細胞集団は、使用直前まで凍結状態にて保存することができる。上記の細胞集団は、接着性幹細胞以外に、凍結保存液を含んでもよい。上記の凍結保存液としては、市販の凍結保存液を用いてもよい。例えば、ＣＰ−１（登録商標）（極東製薬工業社製）、ＢＡＭＢＡＮＫＥＲ（リンフォテック社製）、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（日本全薬工業社製）、ＲｅｐｒｏＣｒｙｏ  ＲＭ（リプロセル社製）、ＣｒｙｏＮｏｖｏ（Ａｋｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ＭＳＣ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（ＨｅｍａＣａｒｅ社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の細胞集団は、媒体と組み合わせた組成物として提供してもよい。媒体としては、好ましくは液体媒体（例えば、培地、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、凍結保存液、又は後記する製薬上許容し得る媒体など）を使用することができる。
【００７２】
本発明の細胞集団と媒体とを含む組成物は、任意の細胞濃度とすることができる。本発明の細胞集団と媒体とを含む組成物の細胞濃度は、例えば、１．０×１０１個／ｍＬ、１．０×１０２個／ｍＬ、１．０×１０３個／ｍＬ、１．０×１０４個／ｍＬ、１．０×１０５個／ｍＬ、１．０×１０６個／ｍＬ、１．０×１０７個／ｍＬ、１．０×１０８個／ｍＬ、１．０×１０９個／ｍＬ、１．０×１０１０個／ｍＬ以上又は以下の細胞濃度とすることができるが、これらに限定されない。
【００７３】
［３］接着性幹細胞を含む細胞集団の製造方法
本発明による接着性幹細胞を含む細胞集団の製造方法は、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団を取得することを含む方法である。
（ａ）前記細胞集団が、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である。
即ち、本発明による接着性幹細胞を含む細胞集団の製造方法は、接着性幹細胞を含む細胞集団を、上記（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を維持する条件下で調製する工程を含む方法である。上記の（ａ）及び（ｂ）の条件は、高い免疫抑制作用及び／又は増殖性を示す接着性幹細胞を含む細胞集団形成の指標であり、本発明の製造方法は、前記指標を満たせば特に制限されない。
【００７４】
本発明の製造方法は、接着性幹細胞を含む生体試料（例えば、羊膜などの胎児付属物など）を酵素処理することにより、接着性幹細胞を含む細胞集団を取得する細胞集団取得工程を含むものでもよい。上記の細胞集団取得工程は、羊膜を帝王切開により得る工程を含む工程でもよい。上記の細胞集団取得工程は、接着性幹細胞を含む生体試料を洗浄する工程を含むものでもよい。
【００７５】
羊膜は、上皮細胞層と細胞外基質層からなり、後者には羊膜接着性幹細胞が含まれている。羊膜上皮細胞は、他の上皮細胞同様、特徴として上皮接着因子（ＥｐＣＡＭ：ＣＤ３２６）を発現しているのに対し、羊膜接着性幹細胞はＣＤ３２６の上皮特異的表面抗原を発現しておらず、フローサイトメトリーで容易に区別可能である。
本発明における接着性幹細胞を含む細胞集団は、好ましくは胎児付属物から採取した上皮細胞層と細胞外基質層とを含む試料を少なくともコラゲナーゼで処理して得た細胞集団である。
【００７６】
胎児付属物から採取した試料（好ましくは上皮細胞層と細胞外基質層とを含む試料）の酵素処理は、好ましくは、胎児付属物の細胞外基質層に含まれる接着性幹細胞を遊離することができ、かつ上皮細胞層を分解しない酵素（又はその組み合わせ）による処理である。上記の酵素としては、特に限定されないが、例えば、コラゲナーゼ及び／又は金属プロテイナーゼを挙げることができる。金属プロテイナーゼとしては、非極性アミノ酸のＮ末端側を切断する金属プロテイナーゼであるサーモリシン及び／又はディスパーゼを挙げることができるが、特に限定されない。
【００７７】
コラゲナーゼの活性濃度は、好ましくは５０ＰＵ／ｍｌ以上、より好ましくは１００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは２００ＰＵ／ｍｌ以上である。また、コラゲナーゼの活性濃度は、特に限定されないが、例えば、１０００ＰＵ／ｍｌ以下、９００ＰＵ／ｍｌ以下、８００ＰＵ／ｍｌ以下、７００ＰＵ／ｍｌ以下、６００ＰＵ／ｍｌ以下、５００ＰＵ／ｍｌ以下である。ここで、ＰＵ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｕｎｉｔ）とは、ｐＨ７．５、３０℃において、ＦＩＴＣ−ｃｏｌｌａｇｅｎ  １ｕｇを１分間で分解する酵素量と定義する。
【００７８】
金属プロテイナーゼ（例えば、サーモリシン及び／又はディスパーゼ）の活性濃度は、好ましくは５０ＰＵ／ｍｌ以上、より好ましくは１００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは２００ＰＵ／ｍｌ以上である。また、金属プロテイナーゼの活性濃度は、好ましくは１０００ＰＵ／ｍｌ以下、より好ましくは９００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは８００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは７００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは６００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは５００ＰＵ／ｍｌ以下である。ここで、金属プロテイナーゼとしてディスパーゼを用いた態様において、ＰＵ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｕｎｉｔ）とは、ｐＨ７．５、３０℃において、乳酸カゼインから１分間に１ｕｇのチロシンに相当するアミノ酸を遊離する酵素量と定義される。上記の酵素濃度の範囲において、胎児付属物の上皮細胞層に含まれる上皮細胞の混入を防止しながら、細胞外基質層に含まれる接着性幹細胞を効率よく遊離させることができる。コラゲナーゼ及び／又は金属プロテイナーゼの好ましい濃度の組み合わせは、酵素処理後の胎児付属物の顕微鏡観察や、取得した細胞のフローサイトメトリーにより決定することができる。
【００７９】
生細胞を効率的に回収する観点から、コラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼを組み合わせて胎児付属物を同時一括に処理することが好ましい。この場合の金属プロテイナーゼとしては、サーモリシン及び／又はディスパーゼを使用することができるが、これらに限定されない。コラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼを含有する酵素液を用いて胎児付属物を一回のみ処理することにより、接着性幹細胞を簡便に取得することができる。また、同時一括に処理することにより、細菌やウィルス等のコンタミネーションのリスクを低減することができる。
【００８０】
胎児付属物の酵素処理は、生理食塩液やハンクス平衡塩溶液等の洗浄液を用いて洗浄した羊膜を酵素液に浸漬し、撹拌手段によって撹拌しながら処理することが好ましい。上記の撹拌手段としては、胎児付属物の細胞外基質層に含まれる接着性幹細胞を効率よく遊離させる観点から、例えば、スターラー又はシェーカーを使用することができるが、これらに限定されない。撹拌速度は、特に限定されないが、スターラー又はシェーカーを用いた場合、例えば、１０ｒｐｍ以上、３０ｒｐｍ以上、又は５０ｒｐｍ以上である。また、撹拌速度は、特に限定されないが、スターラー又はシェーカーを用いた場合、例えば、１００ｒｐｍ以下、８０ｒｐｍ以下、又は６０ｒｐｍ以下である。酵素処理時間は、特に限定されないが、例えば、１０分以上、３０分以上、５０分以上、７０分以上、又は９０分以上である。また、酵素処理時間は、特に限定されないが、例えば、６時間以下、４時間以下、２時間以下、１００分以下である。酵素処理温度は、特に限定されないが、例えば、１６℃以上、２０℃以上、２４℃以上、２８℃以上、３２℃以上、又は３６℃以上である。また、酵素処理温度は、特に限定されないが、例えば、４０℃以下、３９℃以下、又は３８℃以下である。
【００８１】
本発明の製造方法において、所望により、遊離した接着性幹細胞を含む酵素溶液からフィルター、遠心分離や中空糸分離膜、セルソーター等の公知の方法により遊離した接着性幹細胞を分離及び／又は回収することができる。好ましくは、フィルターによって遊離した接着性幹細胞を含む酵素溶液を濾過する。前記酵素溶液をフィルターによって濾過する態様においては、遊離した細胞のみがフィルターを通過し、分解されなかった上皮細胞層はフィルターを通過できずにフィルター上に残るため、遊離した接着性幹細胞を容易に分離及び／又は回収することができるだけでなく、細菌やウィルス等のコンタミネーションのリスクも低減することができる。フィルターとしては、特に限定されないが、例えば、メッシュフィルターを挙げることができる。メッシュフィルターのポアサイズ（メッシュの大きさ）は、特に限定されないが、例えば、４０μｍ以上、６０μｍ以上、８０μｍ以上、又は９０μｍ以上である。また、メッシュフィルターのポアサイズは、特に限定されないが、例えば、２００μｍ以下、１８０μｍ以下、１６０μｍ以下、１４０μｍ以下、１２０μｍ以下、又は１００μｍ以下である。濾過速度に関しては特に限定されないが、メッシュフィルターのポアサイズを上記の範囲とすることにより、接着性幹細胞を含む酵素溶液を自然落下により濾過することができ、これにより細胞生存率の低下を防止することができる。
【００８２】
メッシュフィルターの材質としては、ナイロンが好ましく用いられる。研究用として汎用されるＦａｌｃｏｎセルストレーナーなどの４０μｍ、７０μｍ、９５μｍ、又は１００μｍのナイロンメッシュフィルターを含有するチューブが利用可能である。また、血液透析などで使用されている医療用メッシュクロス（ナイロン及びポリエステル）が利用できる。さらに、体外循環時に使用される動脈フィルター（ポリエステルメッシュフィルター、ポアサイズ：４０μｍ以上１２０μｍ以下）も利用可能である。他の材質、例えば、ステンレスメッシュフィルター等も用いることが可能である。
【００８３】
接着性幹細胞をフィルター通過させる場合、自然落下（自由落下）が好ましい。ポンプ等を用いた吸引など強制的なフィルター通過も可能であるが、細胞に損傷を与えることを避けるため、できるだけ弱い圧力とすることが望ましい。
フィルターを通した接着性幹細胞は、倍量又はそれ以上の培地又は平衡塩緩衝液で濾液を希釈した後、遠心分離により回収することができる。平衡塩緩衝液としては、生理食塩液、ダルベッコリン酸バッファー（ＤＰＢＳ）、アール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸バッファー（ＰＢＳ）等を用いることができるが、これらに限定されない。
【００８４】
上記の細胞集団取得工程で得られた細胞集団は、（ａ）前記細胞集団が、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である、という条件下において調製する。前記条件は、高い免疫抑制作用及び／又は増殖性を示す接着性幹細胞を含む細胞集団を取得する際の指標として有用である。調製方法としては、前記指標を満たすものであれば、特に限定されない。そのような方法としては、例えば、セルソーターにて上記（ａ）を満たす細胞集団を分取し、次いで、得られた細胞集団について、上記（ｂ）を満たす細胞集団を選択することや、上記（ｂ）を満たす細胞集団を選択し、次いで、得られた細胞集団について、セルソーターにて上記（ａ）を満たす細胞集団を分取することが挙げられる。また、前記指標を満たす他の調製方法としては、細胞集団を、上記（ａ）及び（ｂ）を満たす条件下において培養することが挙げられる。
【００８５】
前記指標を満たす培養方法としては、例えば、細胞集団を、コーティングしていないプラスチック製培養容器に１００〜２００００個／ｃｍ２の密度で播種し、培養することを複数回繰り返す工程を挙げることができる。細胞集団を播種する際の密度の下限は、さらに好ましくは２００個／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは４００個／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは６００個／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは８００個／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは１０００個／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは１２００個／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは１４００個／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは１６００個／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは１８００個／ｃｍ２以上であり、さらに好ましくは２０００個／ｃｍ２以上である。細胞集団を播種する際の密度の上限は、さらに好ましくは１８０００個／ｃｍ２以下であり、さらに好ましくは１６０００個／ｃｍ２以下であり、さらに好ましくは１４０００個／ｃｍ２以下であり、さらに好ましくは１２０００個／ｃｍ２以下であり、さらに好ましくは１００００個／ｃｍ２以下であり、さらに好ましくは８０００個／ｃｍ２以下である。
【００８６】
前記指標を満たす他の培養方法としては、例えば、細胞集団を、コーティング剤によりコーティングしたプラスチック製培養容器に１００〜２００００個／ｃｍ２の密度で播種し、培養することを複数回繰り返す工程を挙げることができる。細胞集団を播種する際の密度の好ましい条件は、上記した条件と同様である。
【００８７】
コーティング剤としては、例えば、細胞外基質、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、ラミニン、エンタクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩ、ゼラチン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−Ｄ−リジン、マトリゲル（登録商標）マトリックスを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００８８】
上記の培養に用いる培地は、任意の動物細胞培養用液体培地を基礎培地とし、必要に応じて他の成分（アルブミン、血清、血清代替試薬、増殖因子、ヒト血小板溶解物など）を適宜添加することにより調製することができる。
【００８９】
基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ（Ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）培地、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２  Ｈａｍ））等の培地を使用することができるが、特に限定されない。
【００９０】
また、上記の培養に用いる培地は、市販の無血清培地を用いてもよい。例えば、ＳＴＫ１やＳＴＫ２（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、ＥＸＰＲＥＰ  ＭＳＣ   Ｍｅｄｉｕｍ（バイオミメティクスシンパシーズ社製）、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｓｔｅｍｇｒo  ヒト接着性幹細胞培地（コーニング社製）などが挙げられるが、特に限定されない。
前記基礎培地に対して添加する他の成分としては、例えば、アルブミン、血清、血清代替試薬、増殖因子、又はヒト血小板溶解物などが挙げられる。前記基礎培地にアルブミンを添加する態様においては、アルブミンの濃度は０．０５％より多く５％以下が好ましい。また、前記基礎培地に血清を添加する態様においては、血清の濃度は５％以上が好ましい。増殖因子を添加する態様においては、増殖因子を培地中で安定化させるための試薬（ヘパリンなどのタンパク、ゲル、多糖類など）を、増殖因子に加えてさらに添加してもよいし、あらかじめ安定化させた増殖因子を前記基礎培地に対して添加してもよい。増殖因子は例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、及びそれらのファミリーを使用することができるが、特に限定されない。
【００９１】
前記指標を満たすさらに他の培養方法としては、例えば、培養に用いる基礎培地に、ヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を添加して培養することが挙げられる。ヒト血小板溶解物は、細菌やウィルスの不活性化及び／又は滅菌処理がされていることが好ましい。上記のヒト血小板溶解物としては、市販のヒト血小板溶解物を用いてもよい。例えば、Ｓｔｅｍｕｌａｔｅ（Ｃｏｏｋ  Ｒｅｇｅｎｔｅｃ社製）、ＰＬＴＭａｘ（Ｍｉｌｌ  Ｃｒｅｅｋ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＵｌｔｒａＧＲＯ（ＡｖｅｎｔａＣｅｌｌ  ＢｉｏＭｅｄｉａｌ社製）、ＰＬＵＳ（Ｃｏｍｐａｓｓ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
培地中におけるヒト血小板溶解物の終濃度は、好ましくは１％以上であり、さらに好ましくは２％以上であり、さらに好ましくは３％以上であり、さらに好ましくは４％以上であり、さらに好ましくは５％以上である。培地中における血小板溶解物の終濃度は、好ましくは２０％以下であり、さらに好ましくは１８％以下であり、さらに好ましくは１６％以下であり、さらに好ましくは１４％以下であり、さらに好ましくは１２％以下であり、さらに好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは９％以下であり、さらに好ましくは８％以下であり、さらに好ましくは７％以下であり、さらに好ましくは６％以下である。
【００９３】
ヒト血小板溶解物を添加するタイミングは、特に限定されないが、例えば、培養工程の最初、培養工程の途中、培養工程における純化後、ｎ回継代した直後（ｎは１以上の整数を示す）、維持培養の途中、凍結保存前、又は解凍後などが挙げられる。
【００９４】
接着性幹細胞の培養は、例えば、以下のような工程にて行うことができる。まず、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。次に、プラスチック製培養容器に細胞を播種し、３％以上５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境にて、培地を用いてコンフルエント率９５％以下となるように培養する。上記の培地としては、例えば、αＭＥＭ、Ｍ１９９、或いはこれらを基礎とする培地を挙げることができるが、これらに限定されない。上記のような培養により取得した細胞は、１回培養した細胞である。
【００９５】
上記の１回の培養の培養期間としては、例えば２から１５日間を挙げることができ、より具体的には、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、８日間、１０日間、１２日間、１４日間、又は１５日間を挙げることができる。
【００９６】
上記の１回培養した細胞は、例えば、以下のようにさらに継代し、培養することができる。まず、１回培養した細胞を、細胞剥離手段にて処理してプラスチック製培養容器から剥離させる。次に、得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。最後に、プラスチック製培養容器に細胞を播種し、３％以上、５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境にて、培地を用いてコンフルエント率９５％以下となるように培養する。上記の培地としては、例えば、αＭＥＭ、Ｍ１９９、或いはこれらを基礎とする培地を挙げることができるが、これらに限定されない。上記のような継代及び培養により取得した細胞は、１回継代した細胞である。同様の継代及び培養を行うことにより、ｎ回継代した細胞を取得することができる（ｎは１以上の整数を示す）。継代回数ｎの下限は、細胞を大量に製造する観点から、例えば、１回以上、好ましくは２回以上、より好ましくは３回以上、さらに好ましくは４回以上、さらに好ましくは５回以上である。また、継代回数ｎの上限は、細胞の老化を抑える観点から、例えば、２５回以下、２０回以下、１５回以下、１０回以下であることが好ましい。
【００９７】
上記の細胞剥離手段として、例えば、細胞剥離剤を使用してもよい。細胞剥離剤としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等を使用することができるが、特に限定されない。細胞剥離剤として、市販の細胞剥離剤を用いてもよい。例えば、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。また、細胞剥離手段として、物理的な細胞剥離手段を使用してもよく、例えば、セルスクレーパー（コーニング社製）を使用することができるが、これに限定されない。細胞剥離手段は、単独で使用してもよく、複数を組み合わせて使用してもよい。
【００９８】
本発明の製造方法によれば、高い免疫抑制作用及び／又は増殖性を示す接着性幹細胞を含む細胞集団を得ることができる。培養１バッチあたりの取得細胞数（単位表面積あたり、単位培養日数あたりの得られる細胞数）の下限は、播種細胞数、播種密度等によって異なるが、例えば、５．０×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、６．０×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、８．０×１０３（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、１．０×１０４（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、１．１×１０４（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上、又は１．２×１０４（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以上である。また、培養１バッチあたりの取得細胞数の上限は、特に限定されないが、例えば、１．０×１０５（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下、８．０×１０４（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下、６．０×１０４（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下、４．０×１０４（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下、又は２．０×１０４（個／ｃｍ２／ｄａｙ）以下である。
【００９９】
本発明の製造方法によれば、高い免疫抑制作用及び／又は増殖性を示す接着性幹細胞を含む細胞集団を得ることができる。これにより、本発明の製造方法によって得られる接着性幹細胞は、生体外での培養開始後、好ましくは２０日以降まで、さらに好ましくは３０日以降まで、４０日以降まで、５０日以降まで、６０日以降まで、７０日以降まで、８０日以降まで、９０日以降まで、１００日以降まで、又は１１０日以降まで、培養することが可能である。
また、本発明の製造方法によって得られる接着性幹細胞を含む細胞集団は、生体外での培養開始後、集団倍加回数が好ましくは１０回以上、２０回以上、３０回以上、４０回以上、５０回以上、又は６０回以上になるまで培養することが可能である。
【０１００】
本発明の製造方法は、（ａ）前記細胞集団が、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である、という条件を指標として、高い免疫抑制作用及び／又は増殖性を示す接着性幹細胞を含む細胞集団を識別する識別工程を含むものでもよい。
【０１０１】
前記接着性幹細胞を含む細胞集団を識別するための手段は、好ましくは、マイクロアレイ及び／又は定量ＲＴ−ＰＣＲである。
ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子及び／又はＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量は、マイクロアレイを用いて、上述の手順に従って測定することができる。
上記した識別を行うタイミングは、特に限定されないが、例えば、生体試料から細胞を分離した直後、培養工程の途中、培養工程における純化後、ｎ回継代した直後（ｎは１以上の整数を示す）、維持培養の途中、凍結保存前、解凍後、又は医薬組成物として製剤化する前などが挙げられる。
【０１０２】
また、本発明の製造方法は、上記（ａ）及び（ｂ）を指標として前記接着性幹細胞を含む細胞集団を識別した後に、識別した細胞集団を選択的に分離する工程を含むことができる。前記識別した細胞集団を選択的に分離するための手段は、特に限定されないが、例えば、セルソーターによる細胞集団の分取、培養による細胞集団の純化などが挙げられる。
また、本発明の製造方法は、前記接着性幹細胞を含む細胞集団を凍結保存する工程を含むことができる。前記細胞集団を凍結保存する工程を含む態様においては、前記細胞集団を解凍後、必要に応じて前記細胞集団を識別、分離、回収、及び／又は培養してもよい。また、前記細胞集団を解凍後、そのまま使用してもよい。
【０１０３】
前記接着性幹細胞を含む細胞集団を凍結保存するための手段は、特に限定されないが、例えば、プログラムフリーザー、ディープフリーザー、液体窒素への浸漬などが挙げられる。プログラムフリーザーを用いた場合、凍結する際の温度は、好ましくは−３０℃以下、−４０℃以下、−５０℃以下、−８０℃以下、−９０℃以下、−１００℃以下、−１５０℃以下、−１８０℃以下、又は−１９６℃（液体窒素温度）以下である。プログラムフリーザーを用いた場合、凍結する際の好ましい凍結速度は、例えば、−１℃／分、−２℃／分、−５℃／分、−９℃／分、−１０℃／分、−１１℃／分、又は−１５℃／分である。上記の凍結手段としてプログラムフリーザーを用いた場合、例えば、−２℃／分以上−１℃／分以下の凍結速度で−５０℃以上−３０℃以下の間の温度（例えば、−４０℃）まで温度を下げ、さらに−１１℃／分以上−９℃／分以下（例えば、−１０℃／分）の凍結速度で−１００℃以上−８０℃以下の温度（例えば、−９０℃）まで温度を下げることができる。また、上記の凍結手段として液体窒素への浸漬を用いた場合、例えば、−１９６℃まで急速に温度を下げて凍結させた後、液体窒素（気相）中で凍結保存することができる。
【０１０４】
上記の凍結手段により凍結する際、上記の細胞集団は、任意の保存容器に入った状態で凍結されてよい。上記の保存容器としては、例えば、クライオチューブ、クライオバイアル、凍結用バッグ、輸注バッグなどが挙げられるが、これらに限定されない。
上記の凍結手段により凍結する際、上記の細胞集団は、任意の凍結保存液中で凍結されてもよい。上記の凍結保存液としては、市販の凍結保存液を用いてもよい。例えば、ＣＰ−１（登録商標）（極東製薬工業社製）、ＢＡＭＢＡＮＫＥＲ（リンフォテック社製）、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（日本全薬工業社製）、ＲｅｐｒｏＣｒｙｏ  ＲＭ（リプロセル社製）、ＣｒｙｏＮｏｖｏ（Ａｋｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ＭＳＣ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（ＨｅｍａＣａｒｅ社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
上記の凍結保存液は、所定濃度の多糖類を含有することができる。多糖類の好ましい濃度は、例えば、１質量％以上、２質量％以上、４質量％以上、又は６質量％以上である。また、多糖類の好ましい濃度は、例えば、２０質量％以下、１８質量％以下、１６質量％以下、１４質量％以下、又は１３質量％以下である。多糖類としては、例えば、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）又はデキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ４０など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。
上記の凍結保存液は、所定濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有することができる。ＤＭＳＯの好ましい濃度は、例えば、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、４質量％以上、又は５質量％以上である。また、ＤＭＳＯの好ましい濃度は、例えば、２０質量％以下、１８質量％以下、１６質量％以下、１４質量％以下、１２質量％以下、又は１０質量％以下である。
【０１０６】
上記の凍結保存液は、０質量％より多い所定濃度のアルブミンを含有するものでもよい。アルブミンの好ましい濃度は、例えば、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、又は４質量％以上である。また、アルブミンの好ましい濃度は、例えば、３０質量％以下、２０質量％以下、１０質量％以下、又は９質量％以下である。アルブミンとしては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、マウスアルブミン、ヒトアルブミン等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１０７】
本発明の製造方法は、前記接着性幹細胞を含む細胞集団を洗浄する工程を含むことができる。上記の接着性幹細胞を含む細胞集団を洗浄する工程において使用される洗浄液としては、例えば、生理食塩液、ダルベッコリン酸バッファー（ＤＰＢＳ）、アール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸バッファー（ＰＢＳ）等を挙げることができるが、これらに限定されない。細胞集団を洗浄することにより、アレルゲン、エンドトキシン等を低減又は除去することができる。上記のアレルゲンとしては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ブタトリプシン、ブタヘパリンなどを挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１０８】
本発明の製造方法は、前記接着性幹細胞を含む細胞集団から必要に応じて望まれない細胞凝集塊を除去する工程を含むことができる。上記の接着性幹細胞を含む細胞集団から望まれない細胞凝集塊を除去する工程は、接着性幹細胞を含む細胞集団（細胞懸濁液）をフィルター濾過する工程を含む工程でもよい。
本発明の製造方法は、前記接着性幹細胞を含む細胞集団を保存容器に充填する工程を含むことができる。上記の保存容器としては、例えば、クライオチューブ、クライオバイアル、凍結用バッグ、輸注バッグなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
［４］接着性幹細胞の免疫抑制作用及び／又は増殖性をモニタリングする方法、ドナー及び／又はドナーから採取した生体試料の評価方法、並びに最適な酵素処理条件の判断及び／又は予測方法
本発明においては、接着性幹細胞を含む細胞集団において、（ａ）前記細胞集団が、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である、という条件を指標として測定することによって（好ましくは経時的に測定することによって）、接着性幹細胞の免疫抑制作用及び／又は増殖性をモニタリングすることができる。前記モニタリングが必要な工程としては、例えば、培養する工程、凍結保存する工程、及び／又は製剤化する工程である。
【０１１０】
培養する工程においては、指標を経時的に測定することで、接着性幹細胞の免疫抑制作用及び／又は増殖性の変化を迅速かつ簡便に把握且つ予測することができる。上記指標を満たす接着性幹細胞を含む細胞集団においては、接着性幹細胞が高い免疫抑制作用及び／又は増殖性を維持することが分かる。一方、上記指標から値が逸脱した培養状態が継続している場合には、接着性幹細胞の免疫抑制作用及び／又は増殖性が低下しつつあることが予測できる。免疫抑制作用及び／又は増殖性が低下しつつあることを指標から読み取った場合には、培養条件（播種密度、培地、増殖因子、血清の変更など）を必要に応じて適切に変更することによって、接着性幹細胞の免疫抑制作用及び／又は増殖性の低下を抑制することができる。また、上記指標を満たさない場合には、例えばセルソーティング技術を利用することによって、上記指標を満たす接着性幹細胞を含む細胞集団を分取し、前記細胞集団における接着性幹細胞を再度播種して継代培養することによって、接着性幹細胞の免疫抑制作用及び／又は増殖性の低下を抑制することができる。培養初期段階においては、その工程の最終段階において前記指標を満たすように培養条件（播種密度、培地、増殖因子、血清の変更など）を設計して、少なくとも最終段階においては、上記指標を満たすことができればよい。
【０１１１】
本発明においては、ドナーから接着性幹細胞を含む細胞集団を取得し、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現の有無、並びにＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量を測定し、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である、という条件を指標として測定することによって、ドナー自体及び／又はドナーから採取した生体試料の品質を評価することができる。上記指標を満たす接着性幹細胞を含む細胞集団が得られる場合（好ましくは容易に得られる場合）には、ドナー及び／又はドナーから採取した生体試料の品質が高い免疫抑制能及び／又は高い増殖能を有するという観点から良好であることを確認できる。一方、前記接着性幹細胞を含む細胞集団における上記相対発現量が、上記指標から逸脱している場合には、ドナーから採取した生体試料の品質が不良であるため、培養条件（播種密度、培地、増殖因子、血清の変更など）を適切に変更することによって、接着性幹細胞の免疫抑制作用及び／又は増殖性の低下を抑制することができる。また、前記接着性幹細胞を含む細胞集団における上記相対発現量が、上記指標から逸脱している場合には、例えばセルソーティング技術を利用することによって、上記指標を満たす接着性幹細胞を含む細胞集団を分取し、前記細胞集団における接着性幹細胞を播種して培養することによって、接着性幹細胞の免疫抑制作用及び／又は増殖性の低下を抑制することができる。培養初期段階においては、その工程の最終段階において前記指標を満たすように培養条件（播種密度、培地、増殖因子、血清の変更など）を設計して、少なくとも最終段階においては、上記指標を満たすことができればよい。なお、ドナーから採取した生体試料の品質を確認する場合については、生体試料の調製及び処理方法、細胞集団の培養方法は特に限定されず、任意の方法を採用することができる。
【０１１２】
本発明においては、ドナーから採取した生体試料を酵素処理して得られた細胞集団に対して、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現の有無、並びにＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量を測定し、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である、という条件を指標として評価することで、前記生体試料の最適な酵素処理条件を判断及び／又は予測することができる。上記指標を満たす接着性幹細胞を含む細胞集団が得られる場合（好ましくは容易に得られる場合）には、ドナーから採取した生体試料の酵素処理方法が適切であることを判断及び／又は予測することができる。一方、上記指標から値が逸脱した培養状態が継続している場合には、ドナーから採取した生体試料の酵素処理方法が不適切であると判断及び／又は予測することができる。なお、最適な酵素処理方法を判断及び／又は予測する場合については、生体試料の調製及び処理方法、細胞集団の培養方法は特に限定されず、任意の方法を採用することができる。
【０１１３】
上記の指標は必要なタイミングで測定すればよく、特に限定されないが、生体試料から細胞を分離した直後、培養工程の途中、培養工程における純化後、ｎ回継代した直後（ｎは１以上の整数を示す）、維持培養の途中、凍結保存前、解凍後、又は医薬組成物として製剤化する前などが挙げられる。
【０１１４】
［５］医薬組成物
本発明による接着性幹細胞を含む細胞集団は、医薬組成物として使用することができる。即ち、本発明によれば、本発明による細胞集団と、製薬上許容し得る媒体とを含む、医薬組成物が提供される。本発明によればさらに、本発明による接着性幹細胞を含む細胞集団と、投与可能な他の細胞とを含む、医薬組成物が提供される。
本発明の医薬組成物は、細胞治療剤、例えば、難治性疾患治療剤として使用することができる。
本発明の医薬組成物は、免疫関連疾患の治療剤として使用することができる。本発明の医薬組成物を治療部位に効果が計測できる量投与することで、上記の免疫関連疾患を治療することができる。
【０１１５】
本発明によれば、医薬組成物のために使用される、本発明による接着性幹細胞を含む細胞集団が提供される。
本発明によれば、細胞治療剤のために使用される、本発明による接着性幹細胞を含む細胞集団が提供される。
本発明によれば、免疫関連疾患の治療のために使用される、本発明による接着性幹細胞を含む細胞集団が提供される。
本発明によれば、患者又は被験者に投与して、免疫応答の抑制のために使用される、本発明による接着性幹細胞を含む細胞集団が提供される。
【０１１６】
本発明によれば、患者又は被験者に、本発明による接着性幹細胞を含む細胞集団の治療有効量を投与する工程を含む、患者又は被験者に細胞を移植する方法、並びに患者又は被験者の疾患の治療方法が提供される。
本発明によれば、医薬組成物の製造のための、本発明による接着性幹細胞を含む細胞集団の使用が提供される。
本発明によれば、細胞治療剤の製造のための、本発明による接着性幹細胞を含む細胞集団の使用が提供される。
本発明によれば、免疫関連疾患の治療剤の製造のための、本発明による接着性幹細胞を含む細胞集団の使用が提供される。
本発明によれば、患者又は被験者に投与して、免疫応答の抑制に必要な治療剤の製造のための、本発明による接着性幹細胞を含む細胞集団の使用が提供される。
【０１１７】
本発明の医薬組成物は、接着性幹細胞を含む細胞集団を、製薬上許容し得る媒体により希釈したものでもよい。上記の製薬上許容し得る媒体は、患者又は被験者に投与し得る溶液であれば特に限定されない。製薬上許容し得る媒体は、輸液製剤であってもよく、例えば、注射用水、生理食塩液、５％ブドウ糖液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液、アミノ酸液、開始液（１号液）、脱水補給液（２号液）、維持輸液（３号液）、術後回復液（４号液）、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ  Ａ（登録商標）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
本明細書における「患者又は被験者」とは、典型的にはヒトであるが、他の動物であってもよい。他の動物としては、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、サル（カニクイザル、アカゲザル、コモンマーモセット、ニホンザル）、フェレット、ウサギ、げっ歯類（マウス、ラット、スナネズミ、モルモット、ハムスター）等の哺乳動物、ニワトリ、ウズラ等の鳥類が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
本明細書における「免疫関連疾患」としては、患者又は被験者の免疫応答が関わる疾患であれば特に限定されないが、例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、糖尿病、全身性エリテマトーデス、膠原病、菌状息肉症、多発性硬化症、乾癬、自己免疫性水疱症、関節リウマチ等を挙げることができる。
本明細書における「治療」としては、例えば、患者又は被験者の生命予後、機能予後、生存率、体重減少、貧血、下痢、下血、腹痛、発熱、食欲低下、栄養失調、嘔吐、疲労、発疹、炎症、潰瘍、びらん、瘻孔、狭窄、腸閉塞、内出血、直腸出血、痙攣、疼痛、肝機能低下、又は血液検査項目のうち、少なくとも１つを有意に改善することが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
本発明の医薬組成物は、患者又は被験者の治療の際に用いられる任意の成分を含んでもよい。上記の成分としては、例えば、塩類（例えば、生理食塩水、リンゲル液、ビカネイト輸液）、多糖類（例えば、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）、デキストランなど）、タンパク質（例えば、アルブミンなど）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アミノ酸、培地成分（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に含まれる成分など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。
本発明の医薬組成物は、保存安定性、等張性、吸収性、及び／又は粘性を増加するための種々の添加剤、例えば、乳化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、湿潤剤、抗酸化剤、キレート剤、増粘剤、ゲル化剤、ｐＨ調整剤等を含んでもよい。前記増粘剤としては、例えば、ＨＥＳ、デキストラン、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。増粘剤の濃度は、選択される増粘剤によるが、患者又は被験者に投与した場合に安全であり、かつ所望の粘性を達成する濃度の範囲で、任意に設定することができる。
【０１２０】
本発明の医薬組成物は、接着性幹細胞以外に、１つ又は複数の他の医薬を含んでもよい。上記の他の医薬としては、例えば、抗生物質、アルブミン製剤、ビタミン製剤、抗炎症剤等が挙げることができるが、これらに限定されない。上記の抗炎症剤としては、５−アミノサリチル酸製剤、ステロイド製剤、免疫抑制剤、生物学的製剤等が挙げられるが、これらに限定されない。上記の５−アミノサリチル酸製剤としては、例えば、サラゾスルファピリジン、メサラジンなどを挙げることができるが、これらに限定されない。上記のステロイド製剤としては、例えば、コルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロンなどを挙げることができるが、これらに限定されない。上記の免疫抑制剤としては、例えば、タクロリムス、シクロスポリン、メトトレキサート、アザチプリン、６−メルカプトプリンなどを挙げることができるが、上記の生物学的製剤としては、例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、ウステキヌマブ、セクキヌマブ、イキセキズマブ、ブロダルマブ、トシリズマブ、ベドリズマブ、フィルゴチニブ、ゴリムマブ、セルトリズマブペゴル、アバタセプト、エタネルセプトなどを挙げることができるが、これらに限定されない。また、上記の他の医薬は、他の型の細胞であってもよい。
【０１２１】
また、上記の他の医薬は、投与可能な他の細胞であってもよい。投与可能な他の細胞としては、血液由来細胞（白血球、赤血球、単核球等）、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、血管壁細胞、周皮細胞、線維芽細胞、骨格筋芽細胞、上皮細胞、間質細胞、成熟脂肪細胞、臓器の実質細胞（肝実質細胞、心筋細胞等）、神経細胞等が挙げられるが、特に限定されない。
【０１２２】
本発明の医薬組成物のｐＨは、中性付近のｐＨ、例えば、ｐＨ５．５以上、ｐＨ６．０以上、ｐＨ６．５以上又はｐＨ７．０以上とすることができ、またｐＨ１０．５以下、ｐＨ９．５以下、ｐＨ８．５以下又はｐＨ８．０以下とすることができるが、これらに限定されない。
本発明の医薬組成物の細胞濃度としては、患者又は被験者に投与した場合に、投与していない患者又は被験者と比較して疾患に対して治療効果を得ることができるような細胞の濃度である。具体的な細胞濃度は、投与形態、投与方法、使用目的、及び患者又は被験者の年齢、体重及び症状等によって適宜決定することができる。本発明の医薬組成物の細胞濃度の下限は、特に限定されないが、例えば、１．０×１０５個／ｍＬ以上、１．０×１０６個／ｍＬ以上、１．２×１０６個／ｍＬ以上、１．４×１０６個／ｍＬ以上、１．６×１０６個／ｍＬ以上、１．８×１０６個／ｍＬ以上、２．０×１０６個／ｍＬ以上、３．０×１０６個／ｍＬ以上、４．０×１０６個／ｍＬ以上、５．０×１０６個／ｍＬ以上、６．０×１０６個／ｍＬ以上、７．０×１０６個／ｍＬ以上、８．０×１０６個／ｍＬ以上、９．０×１０６個／ｍＬ以上、９．５×１０６個／ｍＬ以上、又は１．０×１０７個／ｍＬ以上である。本発明の医薬組成物の細胞濃度の上限は、特に限定されないが、例えば、１．０×１０１０個／ｍＬ以下、１．０×１０９個／ｍＬ以下、８．０×１０８個／ｍＬ以下、６．０×１０８個／ｍＬ以下、４．０×１０８個／ｍＬ以下、２．０×１０８個／ｍＬ以下、又は１．０×１０８個／ｍＬ以下である。
【０１２３】
本発明の医薬組成物は、好ましくは液剤であり、より好ましくは注射用液剤である。注射用液剤としては、例えば、国際公開ＷＯ２０１１／０４３１３６号公報、特開２０１３−２５６５１０号公報などにおいて、注射に適した液体調製物が知られている。本発明の医薬組成物も、上記文献に記載されている注射用液剤とすることができる。
また、上記液剤は細胞の懸濁液でもよく、細胞が液剤中に分散した液体調製物でもよい。さらに前記液剤に含まれる細胞の形態は特に限定されないが、例えばシングルセルでもよいし、細胞凝集塊でもよい。
【０１２４】
本発明の医薬組成物が注射用液剤である場合、注射用液剤の細胞濃度の下限は、疾患に対する治療効果を高める観点から、１．０×１０６個／ｍＬ以上、１．２×１０６個／ｍＬ以上、１．４×１０６個／ｍＬ以上、１．６×１０６個／ｍＬ以上、１．８×１０６個／ｍＬ以上、２．０×１０６個／ｍＬ以上、３．０×１０６個／ｍＬ以上、４．０×１０６個／ｍＬ以上、５．０×１０６個／ｍＬ以上、６．０×１０６個／ｍＬ以上、７．０×１０６個／ｍＬ以上、８．０×１０６個／ｍＬ以上、９．０×１０６個／ｍＬ以上、９．５×１０６個／ｍＬ以上、又は１．０×１０７個／ｍＬ以上であることが好ましい。また、注射用液剤の細胞濃度の上限は、注射用液剤の調製と投与を容易にする観点から、１．０×１０９個／ｍＬ以下、８．０×１０８個／ｍＬ以下、６．０×１０８個／ｍＬ以下、４．０×１０８個／ｍＬ以下、２．０×１０８個／ｍＬ以下、又は１．０×１０８個／ｍＬ以下であることが好ましい。
【０１２５】
また、本発明の一態様によれば、本発明の医薬組成物は、細胞塊又はシート状構造の移植用製剤であってもよい。細胞塊状構造の移植用製剤としては、例えば、国際公開ＷＯ２０１７／１２６５４９号公報において、分離された細胞を接着剤（例えば、フィブリノーゲン）により接着させることにより得られる細胞集塊を含む移植用製剤が知られている。また、シート状構造の移植用製剤としては、例えば、国際公開ＷＯ２００６／０８０４３４号公報、特開２０１６−５２２７２号公報などにおいて、温度応答性培養皿（例えば、ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）（セルシード社製））を用いて培養することにより得られる細胞シートや、シート状細胞培養物とフィブリンゲルとの積層体、細胞懸濁液をシート状の基材に塗布した細胞塗布シートなどが知られている。本発明の医薬組成物も、例えば上記文献に記載されている方法を用いることにより、各種の細胞塊又はシート状構造の移植用製剤とすることができる。
【０１２６】
また、本発明の一態様によれば、本発明の医薬組成物は、細胞と任意のゲルと混合したゲル製剤であってもよい。ゲル製剤としては、例えば、特表２０１７−５２９３６２号公報において、接着性幹細胞−ヒドロゲル組成物を有効成分として含有する細胞治療剤が知られている。本発明の医薬組成物も、上記文献に記載されているゲル製剤とすることができる。
本発明の医薬組成物の投与方法は、特に限定されないが、例えば、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、リンパ節内注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、胸腔内注射、局所への直接注射、直接貼付、又は局所に直接移植することなどが挙げられる。本発明の一態様によれば、注射用液剤を注射器に充填して、注射針やカテーテルを通じて静脈内、動脈内、心筋内、間節腔内、肝動脈内、筋肉内、硬膜外、歯肉、脳室内、皮下、皮内、腹腔内、門脈内に投与することができるが、これらに限定されない。医薬組成物の投与方法については、例えば、特開２０１５−６１５２０号公報、Ｏｎｋｅｎ  ＪＥ，ｔ  ａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ２００６Ｌａｓ  Ｖｅｇａｓ，ＮＶ，  Ａｂｓｔｒａｃｔ  １２１．、Ｇａｒｃｉａ−Ｏｌｍｏ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｓ  Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ２００５；４８：１４１６−２３．などにおいて、静脈内注射、点滴静脈注射、局所への直接注射、局所への直接移植などが知られている。本発明の医薬組成物も、上記文献に記載されている各種方法により投与することができる。
【０１２７】
本発明の医薬組成物の用量としては、患者又は被験者に投与した場合に、投与していない患者又は被験者と比較して疾患に対して治療効果を得ることができるような細胞の量である。具体的な用量は、投与形態、投与方法、使用目的、及び患者又は被験者の年齢、体重、及び症状等によって適宜決定することができる。ヒトへの接着性幹細胞の１回の用量は、特に限定されないが、例えば、１×１０４個／ｋｇ体重以上、１×１０５個／ｋｇ体重以上、５×１０５個／ｋｇ体重以上、１×１０６個／ｋｇ体重以上、２×１０６個／ｋｇ体重以上、４×１０６個／ｋｇ体重以上、６×１０６個／ｋｇ体重以上、又は８×１０６個／ｋｇ体重以上である。また、ヒトへの接着性幹細胞の１回の用量は、特に限定されないが、例えば、１×１０１２個／ｋｇ体重以下、１×１０１１個／ｋｇ体重以下、１×１０１０個／ｋｇ体重以下、１×１０９個／ｋｇ体重以下、５×１０８個／ｋｇ体重以下、１×１０８個／ｋｇ体重以下、８×１０７個／ｋｇ体重以下、６×１０７個／ｋｇ体重以下、４×１０７個／ｋｇ体重以下、又は２×１０７個／ｋｇ体重以下である。
【０１２８】
本発明の医薬組成物が注射用液剤である場合、注射用液剤のヒトへの接着性幹細胞の１回の用量は、疾患に対する治療効果を高める観点から、１×１０５個／ｋｇ体重以上、５×１０５個／ｋｇ体重以上、１×１０６個／ｋｇ体重以上、２×１０６個／ｋｇ体重以上、４×１０６個／ｋｇ体重以上、６×１０６個／ｋｇ体重以上、又は８×１０６個／ｋｇ体重以上であることが好ましい。また、注射用液剤のヒトへの接着性幹細胞の１回の用量は、注射用液剤の調製と投与を容易にする観点から、１×１０９個／ｋｇ体重以下、５×１０８個／ｋｇ体重以下、１×１０８個／ｋｇ体重以下、８×１０７個／ｋｇ体重以下、６×１０７個／ｋｇ体重以下、４×１０７個／ｋｇ体重以下、又は２×１０７個／ｋｇ体重以下であることが好ましい。
【０１２９】
本発明の医薬組成物の投与頻度は、患者又は被験者に投与した場合に、疾患に対して治療効果を得ることができるような頻度である。具体的な投与頻度は、投与形態、投与方法、使用目的、及び患者又は被験者の年齢、体重、及び症状等によって適宜決定することができるが、例えば、４週間に１回、３週間に１回、２週間に１回、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、又は１週間に７回である。
【０１３０】
本発明の医薬組成物の投与期間は、患者又は被験者に投与した場合に、疾患に対して治療効果を得ることができるような期間である。具体的な投与期間は、投与形態、投与方法、使用目的、及び患者又は被験者の年齢、体重、及び症状等によって適宜決定することができるが、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、又は８週間である。
【０１３１】
本発明の医薬組成物を患者又は被験者に投与するタイミングは、特に限定されないが、例えば、発症直後、発症からｎ日以内（ｎは１以上の整数を示す）、診断直後、診断からｎ日以内（ｎは１以上の整数を示す）、寛解の前、寛解の間、寛解の後、再燃の前、再燃の間、再燃の後などが挙げられる。
本発明の医薬組成物は、使用直前まで凍結状態にて保存することができる。凍結保存の温度は、好ましくは−３０℃以下、−４０℃以下、−５０℃以下、−８０℃以下、−９０℃以下、−１００℃以下、−１５０℃以下、−１８０℃以下、又は−１９６℃（液体窒素温度）以下である。本発明の医薬組成物を患者又は被験者に投与する際には、３７℃で急速に解凍して使用することができる。
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【０１３２】
＜比較例１：指標の検討＞
以下に示す比較例１及び実施例１では、高い免疫抑制作用及び／又は増殖性を示す接着性幹細胞を含む細胞集団を取得するための指標を検討した。
（工程１：羊膜の採取）
インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦（ドナーＡ）から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った滅菌バットに収容し、卵膜の断端から羊膜を用手的に剥離した。羊膜をハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）にて洗浄し、付着した血液及び血餅を除去した。【０１３３】
（工程２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収）
ドナーＡから取得した羊膜を、２４０ＰＵ／ｍＬコラゲナーゼと２００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩとを含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）に浸し、３７℃にて９０分間、５０ｒｐｍの条件にて振盪攪拌することにより羊膜を酵素処理した。酵素処理後の溶液を目開き９５μｍのナイロンメッシュでろ過することにより羊膜の未消化物を取り除き、羊膜ＭＳＣを含む細胞懸濁液を回収した。
得られた細胞懸濁液に関し、フローサイトメーターを用いて、ＭＳＣの代表的な陽性マーカーとして知られている表面抗原の一つであるＣＤ９０の発現が陽性である細胞の比率を解析し、高純度で羊膜から羊膜ＭＳＣを分離できていることを確認した。
表面抗原解析は、ベクトン・ディッキンソン（ＢＤ）社のＢＤ  ＡｃｃｕｒｉＴＭ  Ｃ６  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用い、解析細胞数：１０，０００ｃｅｌｌｓ、流速設定：Ｓｌｏｗ（１４μＬ／ｍｉｎ）にて実施した。本測定では、アイソタイプコントロール用抗体として、ＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１, κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ社製／型番：５５０６１６）を使用し、ＣＤ９０抗原に対する抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ９０（ＢＤ社製／型番：５５５５９５）を使用した。【０１３４】
（工程３：羊膜ＭＳＣの培養）
上述の「工程２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収」で得られた羊膜ＭＳＣを含む細胞集団の一部を、培養容器のＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（コーニング社製）に６０００個／ｃｍ２の密度で播種し、終濃度にして１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（非働化済み）及び１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）にてサブコンフルエントになるまで接着培養した。この接着培養した細胞を、０継代目の細胞集団と呼ぶ。
ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて０継代目の細胞集団を剥離し、１／５量の細胞集団をＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、継代培養を行った。この継代培養した細胞集団を、１継代目の細胞集団と呼ぶ。
サブコンフルエントに達した時点でＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔを用いて１継代目の細胞集団を剥離し、培地を用いて希釈し、遠心分離により回収した。回収した細胞集団をＲＰＭＩ１６４０にて懸濁した。これに等量のＣＰ−１（登録商標）溶液（ＣＰ−１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）（極東製薬工業社製）を加え、−８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で凍結保存した。その後、解凍して１５０００〜１８０００個／ｃｍ２の密度でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種し、サブコンフルエントになるまで継代培養した。この継代培養した細胞集団を、２継代目の細胞集団と呼ぶ。【０１３５】
ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔを用いて２継代目の細胞集団を剥離し、１／５量の細胞集団をＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、継代培養を行った。この継代培養した細胞集団を、３継代目の細胞集団と呼ぶ。
サブコンフルエントに達した時点でＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔを用いて３継代目の細胞集団を剥離し、培地を用いて希釈し、遠心分離により回収した。回収した細胞集団をＲＰＭＩ１６４０にて懸濁した。これに等量のＣＰ−１（登録商標）溶液を加え、−８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で凍結保存した。その後、解凍して６０００個／ｃｍ２の密度でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種し、サブコンフルエントになるまで継代培養した。この継代培養した細胞集団を、４継代目の細胞集団と呼ぶ。
ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔを用いて４継代目の細胞集団を剥離し、１／５量の細胞集団をＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、継代培養を行った。この継代培養した細胞集団を、５継代目の細胞集団と呼ぶ。
サブコンフルエントに達した時点でＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔを用いて５継代目の細胞集団を剥離し、培地を用いて希釈し、遠心分離により回収した。回収した細胞集団をＲＰＭＩ１６４０にて懸濁した。これに等量のＣＰ−１（登録商標）溶液を加え、−８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で凍結保存した。【０１３６】
（工程４：表面抗原解析）
比較例１の５継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各表面抗原（ＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ１０５の陽性率、ＣＤ４５の陽性率及び陰性率）を測定した。
表面抗原解析は、ベクトン・ディッキンソン（ＢＤ）社のＢＤ  ＡｃｃｕｒｉＴＭ  Ｃ６  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用い、解析細胞数：１０，０００ｃｅｌｌｓ、流速設定：Ｓｌｏｗ（１４μＬ／ｍｉｎ）にて実施した。本測定では、アイソタイプコントロール用抗体として、ＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１, κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ社製／型番：５５０６１６）を使用し、ＣＤ７３抗原に対する抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ７３（ＢＤ社製／型番：５６１２５４）を、ＣＤ９０抗原に対する抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ９０（ＢＤ社製／型番：５５５５９５）を、ＣＤ１０５抗原に対する抗体としてＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＦＩＴＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製／型番：３２３２０３）を、ＣＤ４５抗原に対する抗体としてＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ４５（ＢＤ社製／型番：５５５４８２）を使用した。
表面抗原解析の結果、比較例１の５継代目の細胞集団では、ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５の陽性率はいずれも９０％以上であり（具体的にはＣＤ７３：１００％、ＣＤ９０：１００％、ＣＤ１０５：９８％）、ＣＤ４５の陽性率は５％未満（陰性率は９５％以上）であった（具体的にはＣＤ４５の陽性率：０％（陰性率：１００％））。以上の結果から、比較例１の５継代目の細胞集団は、接着性幹細胞を含む細胞集団であることが確認された。【０１３７】
（工程５：遺伝子発現解析）
比較例１の５継代目の細胞集団に関し、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いてＰＬＩＮ２遺伝子、ＮＥＦＭ遺伝子、及びＳＤＨＡ遺伝子の発現を解析した。定量ＲＴ−ＰＣＲは、具体的には、以下の手順Ａ（比較Ｃｔ法）にて行った。
（手順Ａ：比較Ｃｔ法）
（１）凍結保存した細胞集団を解凍し、遠心分離により回収した。回収した細胞集団をリン酸バッファー（ＰＢＳ）にて洗浄し、遠心分離により回収した。
（２）ＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社製））を用いて、細胞集団からトータルＲＮＡを抽出、精製した。
（３）精製したトータルＲＮＡを鋳型として、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡社製）を用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。
（４）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（東洋紡社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。反応液の液量は２０μＬとした。ＰＣＲ反応条件は、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、９８℃２分ホールド、（９８℃１０秒、６０℃１０秒、６８℃３０秒）４０サイクルとした。
（５）比較対象の遺伝子に対する測定対象の遺伝子の相対発現量（Ｘ）は、Ｘ＝２｛−（Ｙ−Ｚ）｝により算出した。ここで、Ｙは測定対象の遺伝子のＣｔ値、Ｚは比較対象の遺伝子のＣｔ値である。
その結果、比較例１の５継代目の細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．１１、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量が０．０４であった。以上より、比較例１の５継代目の細胞集団は、以下に示す（ｂ）の条件を満たさないことが分かった。
（ｂ）ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である。【０１３８】
なお、比較例１の５継代目の細胞集団に関し、以下の手順Ｂ（検量線法）にて定量ＲＴ−ＰＣＲを行った場合は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が０．２７、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量が１．５１であった。
（手順Ｂ：検量線法）
（１）凍結保存した細胞集団を解凍し、遠心分離により回収した。回収した細胞集団をリン酸バッファー（ＰＢＳ）にて洗浄し、遠心分離により回収した。
（２）ＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社製））を用いて、細胞集団からトータルＲＮＡを抽出、精製した。
（３）精製したトータルＲＮＡを鋳型として、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡社製）を用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。
（４）合成したｃＤＮＡを鋳型として、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。反応液の液量は２０μＬとした。ＰＣＲ反応条件は、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、５０℃２分ホールド、９５℃２分ホールド、（９５℃３秒、６０℃３０秒）６０サイクルとした。なお、検量線作成用のサンプルとして、合成したｃＤＮＡを等倍で１〜５段階希釈したものを使用した。
（５）ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）が表示した、比較対象の遺伝子及び測定対象の遺伝子の発現量を記録した。
（６）比較対象の遺伝子に対する測定対象の相対発現量（Ｗ）は、Ｗ＝α／βにより算出した。ここで、αは測定対象の遺伝子の発現量、βは比較対象の遺伝子の発現量である。【０１３９】
（工程６：ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子の発現量の評価）
比較例１の５継代目の細胞集団のＴＮＦＡＩＰ６遺伝子の発現量を、マイクロアレイを用いて評価した。その結果、比較例１の５継代目の細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＴＮＦＡＩＰ６遺伝子の相対発現量が０．４１であった。【０１４０】
（工程７：ｈＰＢＭＣの増殖抑制率の評価）
比較例１の５継代目の細胞集団の免疫抑制作用を、混合リンパ球反応試験（ＭＬＲ試験）により評価した。その結果、比較例１の５継代目の細胞集団は、ｈＰＢＭＣの増殖抑制率が４２．０％であった。【０１４１】
（工程８：比増殖速度の評価）
比較例１及び実施例１の５継代目の細胞集団の比増殖速度を評価した。その結果、比較例１の細胞集団の比増殖速度は０．２４（１／ｄａｙ）であった。【０１４２】
＜実施例１：指標の検討＞
（工程１：羊膜の採取）
比較例１におけるドナーと同じドナー（ドナーＡ）及び比較例１におけるドナーとは異なるドナー（ドナーＢ）から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した以外は、比較例１の工程１と同様の手法にて羊膜を取得した。【０１４３】
（工程２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収）
比較例１の工程２と同様の手法にて羊膜ＭＳＣを含む細胞懸濁液を回収した。得られた細胞懸濁液に関し、比較例１と同様にしてＣＤ９０の発現が陽性である細胞の比率を解析し、高純度で羊膜から羊膜ＭＳＣを分離できていることを確認した。【０１４４】
（工程３：羊膜ＭＳＣの培養）
１０％のＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むαＭＥＭの代わりに、５％のヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含むαＭＥＭを用いた以外は、比較例１の工程３と同様の手法にて、５継代目の細胞集団を取得した。【０１４５】
（工程４：表面抗原解析）
比較例１の工程４と同様の手法にて、実施例１の５継代目の細胞集団の表面抗原解析を行った。その結果、実施例１のドナーＡに由来する５継代目の細胞集団では、ＣＤ７３、９０、１０５の陽性率はいずれも９０％以上であり（具体的にはＣＤ７３：９８％、ＣＤ９０：１００％、ＣＤ１０５：１００％）、ＣＤ４５の陽性率は５％未満（陰性率は９５％以上）であった（具体的にはＣＤ４５の陽性率：０％（陰性率：１００％））。また、実施例１のドナーＢに由来するの５継代目の細胞集団では、ＣＤ７３、９０、１０５の陽性率はいずれも９０％以上であり（具体的にはＣＤ７３：１００％、ＣＤ９０：９９％、ＣＤ１０５：９８％）、ＣＤ４５の陽性率は５％未満（陰性率は９５％以上）であった（具体的にはＣＤ４５の陽性率：０％（陰性率：１００％））。以上の結果から、実施例１の５継代目の細胞集団は、接着性幹細胞を含む細胞集団であることが確認された。【０１４６】
（工程５：遺伝子発現解析）
比較例１の工程５に記載された手順Ａ（比較Ｃｔ法）にて、実施例１の５継代目の細胞集団の遺伝子発現解析を行った。各遺伝子の相対発現量を表１に示す。【０１４７】
【表１】
2019132025.tif 000002
【０１４８】
表１に示すように、実施例１のドナーＡに由来する５継代目の細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．９５、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量が０．０００６、ＮＥＦＭ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が３０５１であった。また、実施例１のドナーＢに由来する５継代目の細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が５．３２、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量が０．０１７、ＮＥＦＭ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が３１５であった。
よって、実施例１の５継代目の細胞集団は、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の条件を満たすことが分かった。
（ａ）前記細胞集団が、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である。【０１４９】
なお、比較例１の工程５に記載された手順Ｂ（検量線法）にて遺伝子発現解析を行った場合、実施例１の５継代目の細胞集団の各遺伝子の相対発現量は表２のようになった。【０１５０】
【表２】
2019132025.tif 000003
【０１５１】
（工程６：ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子の発現量の評価）
比較例１の工程６と同様の手法にて、実施例１のドナーＡに由来する５継代目の細胞集団のＴＮＦＡＩＰ６遺伝子の発現量を評価した。その結果、実施例１のドナーＡに由来する５継代目の細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＴＮＦＡＩＰ６遺伝子の相対発現量が１．９６であった。以上より、実施例１のドナーＡに由来する５継代目の細胞集団は、免疫抑制関連サイトカインをコードする遺伝子であるＴＮＦＡＩＰ６遺伝子を高発現し、高い免疫抑制作用を示すことが示唆された。【０１５２】
（工程７：ｈＰＢＭＣの増殖抑制率の評価）
比較例１の工程７と同様の手法にて、実施例１のドナーＡに由来する５継代目の細胞集団の免疫抑制作用を評価した。その結果、実施例１のドナーＡに由来する５継代目の細胞集団は、ｈＰＢＭＣの増殖抑制率が５４．４％であった。以上より、実施例１のドナーＡに由来する５継代目の細胞集団は、ＰＨＡの刺激により活性化されたｈＰＢＭＣの増殖を顕著に抑制し、高い免疫抑制作用を示すことが分かった。
よって、上記（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団は、高い免疫抑制作用を示すことが分かった。また、高い免疫抑制作用を示す接着性幹細胞を含む細胞集団を取得するための指標として、上記（ａ）及び（ｂ）の条件が有効であることが示唆された。【０１５３】
（工程８：比増殖速度の評価）
比較例１の工程８と同様の手法にて、実施例１の５継代目の細胞集団の比増殖速度を評価した。比増殖速度の測定結果を表３に示す。【０１５４】
【表３】
2019132025.tif 000004
【０１５５】
表３に示すように、実施例１のドナーＡに由来する細胞集団の比増殖速度は０．５５（１／ｄａｙ）、実施例１のドナーＢに由来する細胞集団の比増殖速度は０．８７（１／ｄａｙ）であった。以上より、実施例１の５継代目の細胞集団は、高い増殖性を示すことが分かった。
よって、上記（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団は、高い増殖性を示すことが分かった。また、高い増殖性を示す接着性幹細胞を含む細胞集団を取得するための指標として、上記（ａ）及び（ｂ）の条件が有効であることが示唆された。【０１５６】
以上の結果より、上記（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団は、高い免疫抑制作用を示すことに加えて、高い増殖性を示すことが分かった。また、高い免疫抑制作用及び／又は増殖性を示す接着性幹細胞を含む細胞集団を取得するための指標として、上記（ａ）及び（ｂ）の条件が有効であることが示唆された。つまり、本発明によれば、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を指標とすることによって、高い免疫抑制作用及び／又は増殖性を示す接着性幹細胞を含む細胞集団を取得することができ、これにより、細胞培養期間を短縮することが可能となり、製造コストを下げることができる。【０１５７】
＜実施例２：ｈＰＢＭＣ誘発ＧＶＨＤマウスを用いた免疫抑制作用の検討＞
以下に示す実施例２では、下記（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団が、動物実験において免疫抑制作用を示すか検討した。
（ａ）前記細胞集団が、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である。【０１５８】
（工程１：羊膜の採取）
比較例１及び実施例１におけるドナーとは異なるドナー（ドナーＥ）から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した以外は、比較例１の工程１と同様の手法にて羊膜を取得した。
（工程２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収）
比較例１の工程２と同様の手法にて羊膜ＭＳＣを含む細胞懸濁液を回収した。
（工程３：羊膜ＭＳＣの培養）
実施例１の工程３と同様の手法にて細胞集団を取得した。【０１５９】
（工程４：遺伝子発現解析）
比較例１の工程５と同様の手順Ａ（比較Ｃｔ法）にて、ドナーＥに由来する５継代目の細胞集団の遺伝子発現解析を行った。各遺伝子の相対発現量を表４に示す。【０１６０】
【表４】
2019132025.tif 000005
【０１６１】
表４に示すように、ドナーＥに由来する５継代目の細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が７．９４、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量が０．０００４、ＮＥＦＭ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が２０３４３であった。
よって、ドナーＥに由来する５継代目の細胞集団は、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の条件を満たすことが分かった。
（ａ）前記細胞集団が、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である。【０１６２】
また、表４に示すように、ドナーＥに由来する５継代目の細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量が０．０２未満であった。【０１６３】
さらに、表４に示すように、ドナーＥに由来する５継代目の細胞集団は、ＮＥＦＭ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が２５０以上であった。【０１６４】
（工程５：ｈＰＢＭＣの増殖抑制率の評価）
ドナーＥに由来する５継代目の細胞集団の免疫抑制作用を、混合リンパ球反応試験（ＭＬＲ試験）により評価した。その結果、上記の細胞集団は、ｈＰＢＭＣの増殖抑制率が５３．２％であった。以上より、実施例１のドナーＡに由来する５継代目の細胞集団は、ＰＨＡの刺激により活性化されたｈＰＢＭＣの増殖を抑制し、免疫抑制作用を示すことが分かった。【０１６５】
（工程６：ｈＰＢＭＣ誘発ＧＶＨＤマウスを用いた免疫抑制作用の評価）
ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）により移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を誘発させたマウス（ｈＰＢＭＣ誘発ＧＶＨＤマウス）において、ドナーＥに由来する５継代目の細胞集団の免疫抑制作用を評価した。
ｈＰＢＭＣ誘発ＧＶＨＤマウスの作製は、Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００９，８７：１６５４−１６５８．、Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１７  Ｍａｙ；１７（５）：１２１６−１２２８．の記載を参考に実施した。具体的には、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ＲγＫＯ（ＮＯＧ）系統の７−８週齡の雄マウスに対して、３．０×１０６個／０．２ｍＬ／ＨｅａｄのｈＰＢＭＣを１．２ｍＬ／分の速度で尾静脈内に投与した。ｈＰＢＭＣを投与した日をＤａｙ０とした。
凍結保存したドナーＥに由来する５継代目の細胞集団を解凍し、生理食塩水を用いて希釈し、遠心分離した。上清の一部を除去し、１．６×１０６個／ｍＬとなるよう調製し、細胞集団を再懸濁した。上記のｈＰＢＭＣを用いて作製されたｈＰＢＭＣ誘発ＧＶＨＤマウスに対して、上記の細胞集団を１．２ｍＬ／分の速度で尾静脈内に投与した。投与量は８．０×１０６個／５ｍＬ／ｋｇ体重とした。投与回数は３回とし、前期投与群ではＤａｙ７、１４、２１に、後期投与群ではＤａｙ２１、２８、３５に投与した。なお、対照群は、上記の細胞集団を投与していないｈＰＢＭＣ誘発ＧＶＨＤマウスとした。
上記の各群について、生存率について評価した。生存率の評価については、生存時間解析（Ｌｏｇ−ＲＡＮＫ検定）を行った。また、生存率の評価については危険率５％未満（ｐ＜０．０５）の場合を有意差ありと判定した。【０１６６】
生存率についての結果を図１に示す。
その結果、前期投与群では、対照群に対してｈＰＢＭＣ誘発ＧＶＨＤマウスの生存率が有意に改善された。後期投与群では、対照群に対してｈＰＢＭＣ誘発ＧＶＨＤマウスの生存率が改善傾向を示した。また、前期投与群では、対照群に対してｈＰＢＭＣ誘発ＧＶＨＤマウスの体重減少が抑制傾向を示した。以上より、ドナーＥに由来する５継代目の細胞集団は、ｈＰＢＭＣ誘発ＧＶＨＤマウスにおけるＧＶＨＤを改善することが示唆された。
よって、上記（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団は、混合リンパ球反応試験（ＭＬＲ試験）だけでなくｈＰＢＭＣ誘発ＧＶＨＤマウスにおいても免疫抑制作用を示すことが明らかになった。また、高い免疫抑制作用を示す接着性幹細胞を含む細胞集団を取得するための指標として、上記（ａ）及び（ｂ）の条件が有効であることが示唆された。【０１６７】
（工程７：比増殖速度の評価）
ドナーＥに由来する５継代目の細胞集団の比増殖速度を評価した。その結果、ドナーＥに由来する５継代目の細胞集団の比増殖速度は０．４４（１／ｄａｙ）であった。
よって、上記（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団は、高い増殖性を示すことが分かった。また、高い増殖性を示す接着性幹細胞を含む細胞集団を取得するための指標として、上記（ａ）及び（ｂ）の条件が有効であることが示唆された。【０１６８】
以上の実施例２の結果を総括すると、表５のようになる。
【表５】
2019132025.tif 000006
【０１６９】
表５より、上記（ａ）及び（ｂ）の細胞特性を有する細胞集団は、混合リンパ球反応試験（ＭＬＲ試験）及びｈＰＢＭＣ誘発ＧＶＨＤマウスにおいて高い免疫抑制作用を示すことに加えて、高い増殖性を示すことが分かった。また、高い免疫抑制作用及び／又は増殖性を示す接着性幹細胞を含む細胞集団を取得するための指標として、上記（ａ）及び（ｂ）の条件が有効であることが示唆された。つまり、本発明によれば、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を指標とすることによって、高い免疫抑制作用及び／又は増殖性を示す接着性幹細胞を含む細胞集団を取得することができ、これにより、細胞培養期間を短縮することが可能となり、製造コストを下げることができる。【０１７０】
＜実施例３：医薬組成物の製造＞
実施例１の５継代目の細胞集団の一部を医薬組成物の調製に供する。２．０×１０８個の接着性幹細胞、６．８ｍＬのＣＰ−１（登録商標）溶液、３．２ｍＬの２５％ヒト血清アルブミン溶液、及び１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を含有する医薬組成物（細胞製剤）を調製する。当該医薬組成物を凍結用バッグに封入し、凍結状態で保存する。尚、使用時に医薬組成物を解凍し、患者又は被験者に供することができる。【０１７１】
＜実施例４：羊膜由来接着性幹細胞の調製＞
比較例１、実施例１及び実施例２におけるドナーとは異なるドナー２名（ドナーＦ、Ｇ）から卵膜を採取した以外は、実施例１の工程１〜３と同様の手法にて、２継代目の細胞集団を取得した。【０１７２】
＜比較例２：骨髄由来接着性幹細胞の調製＞
市販の骨髄液（ＡｌｌＣｅｌｌｓ社／品番：ＡＢＭ００３）全量を播種し、終濃度にして１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（非働化済み）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）にて初代培養した。得られた骨髄由来接着性幹細胞を含む０継代目の細胞集団の一部を、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（コーニング社製）に６０００個／ｃｍ２の密度で播種し、終濃度にして１０％ＦＢＳ（非働化済み）を含むαＭＥＭにて継代培養した。得られた骨髄由来接着性幹細胞を含む細胞集団を、ＣＰ−１（登録商標）溶液を含む細胞保存液にて凍結保存した。【０１７３】
＜実施例５：表面抗原解析＞
（表面抗原解析）
上記実施例４、比較例１及び比較例２で得られた細胞集団に関し、フローサイトメトリーのドットプロット展開解析を用いて各表面抗原（ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ４５、ＣＤ３２６）解析を行った。フローサイトメトリーのドットプロット展開解析方法は、上記した手順（１）〜（８）の通りである。
各表面抗原に対して陽性となる細胞の比率を表６に示す。【０１７４】
【表６】
2019132025.tif 000007
【０１７５】
表６に示すように、各細胞集団において、ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５の陽性率はいずれも９０％以上であり、ＣＤ４５、ＣＤ３２６の陽性率は５％未満（陰性率は９５％以上）であった。【０１７６】
＜実施例６：遺伝子の発現量の評価＞
比較例１の工程５に記載された手順Ａ（比較Ｃｔ法）にて、上記実施例４、比較例１及び比較例２で得られた細胞集団の遺伝子発現解析を行った。各遺伝子の相対発現量を表７に示す。【０１７７】
【表７】
2019132025.tif 000008
【０１７８】
表７に示すように、羊膜細胞集団−Ｆ、Ｇ、Ａ及び骨髄細胞集団は、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であった。また、羊膜細胞集団−Ｆ及びＧにおけるＳＤＨＡ遺伝子に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量はいずれの細胞集団においても１．５０以上であった（羊膜細胞集団−Ｆ：２．０２、羊膜細胞集団−Ｇ：２．１２）。一方、羊膜細胞集団−Ａおよび骨髄細胞集団におけるＳＤＨＡ遺伝子に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量は１．５０未満であった（羊膜細胞集団−Ａ：１．１１、骨髄細胞集団：１．３１）。以上より、羊膜細胞集団−Ｆ、Ｇは、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の条件を満たすことが分かった。一方、羊膜細胞集団−Ａ及び骨髄細胞集団は、上記（ｂ）の条件を満たさないことが分かった。
（ａ）前記細胞集団が、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である。【０１７９】
また、表７に示すように、羊膜細胞集団−Ｆ、Ｇ及び骨髄細胞集団は、ＳＤＨＡ遺伝子に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量が０．０２未満であった。羊膜細胞集団−Ａは、ＳＤＨＡ遺伝子に対するＮＥＦＭ遺伝子の相対発現量が０．０２以上であった。【０１８０】
さらに、表７に示すように、羊膜細胞集団−Ｆ、Ｇは、ＮＥＦＭ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が２５０以上であった。羊膜細胞集団−Ａおよび骨髄細胞集団は、ＮＥＦＭ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が２５０未満であった。【０１８１】
＜実施例７：ｈＰＢＭＣ誘発ＧＶＨＤマウスを用いた免疫抑制作用の評価＞
ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）により移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を誘発させたマウス（ｈＰＢＭＣ誘発ＧＶＨＤマウス）において、上記実施例４、比較例１及び比較例２で得られた細胞集団（羊膜細胞集団−Ｆ、Ａ及び骨髄細胞集団）の免疫抑制作用を評価した。【０１８２】
投与回数を３回から４回（Ｄａｙ７、１４、２１及び２８に投与）に変更したこと以外は、実施例２の工程６と同様の手法にて動物実験を実施した。なお、対照群は、上記の細胞集団を投与していないｈＰＢＭＣ誘発ＧＶＨＤマウスとした。【０１８３】
上記の各群について、生存率の推移について評価した。生存率の評価については、生存時間解析（Ｌｏｇ−ＲＡＮＫ検定）を行った。また、生存率の推移については危険率５％未満（ｐ＜０．０５）の場合を有意差ありと判定した。【０１８４】
生存率について結果を図２に示す。
図２に示すように、羊膜細胞集団−Ｆ投与群では、対照群に対してｈＰＢＭＣ誘発ＧＶＨＤマウスの生存率が有意に改善された。羊膜細胞集団−Ａ投与群、及び骨髄細胞集団投与群では、対照群に対してｈＰＢＭＣ誘発ＧＶＨＤマウスの生存率が改善傾向を示した。また、羊膜細胞集団−Ｆ投与群では、対照群に対してｈＰＢＭＣ誘発ＧＶＨＤマウスの体重減少が抑制傾向を示した。以上より、羊膜細胞集団−Ｆは、他の細胞集団（羊膜細胞集団−Ａ、骨髄細胞集団）と比較して、ｈＰＢＭＣ誘発ＧＶＨＤマウスにおけるＧＶＨＤを改善する効果が高いことが明らかとなった。つまり、上記羊膜細胞集団−Ｆは他の細胞集団と比較して高い免疫作用を示している。したがって、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を満たす細胞集団は、高い免疫抑制作用を示すことが示唆された。これにより、上記（ａ）及び（ｂ）の条件は、高い免疫抑制作用を示す接着性幹細胞を含む細胞集団を取得するための指標として有効であるといえる。【０１８５】
＜実施例８：異なるドナーから採取した生体試料の品質評価＞
以下に示す実施例８では、下記（ａ）及び（ｂ）の条件を指標とすることによって、ドナー自体及びドナーから採取した生体試料の品質を評価することができるか検討した。
（ａ）前記細胞集団が、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である。【０１８６】
（工程１：羊膜の採取）
比較例１、実施例１、実施例２及び実施例４におけるドナーとは異なるドナー２名（ドナーＣ、Ｄ）から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した以外は、比較例１の工程１と同様の手法にて羊膜を取得した。【０１８７】
（工程２：羊膜の酵素処理及び羊膜ＭＳＣの回収）
実施例１の工程２と同様の手法にて羊膜ＭＳＣを含む細胞懸濁液を回収した。
（工程３：羊膜ＭＳＣの培養）
実施例１の工程３と同様の手法にて、０継代目の細胞集団を取得した。
（工程４：遺伝子発現解析）
比較例１の工程５に記載された手順Ａ（比較Ｃｔ法）にて、各ドナー（ドナーＣ、Ｄ）に由来する０継代目の細胞集団の遺伝子発現解析を行った。その結果、ドナーＣに由来する０継代目の細胞集団は、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を満たさなかった。一方、ドナーＤに由来する０継代目の細胞集団は、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を満たした。【０１８８】
（工程５：比増殖速度の評価）
各ドナー（ドナーＣ、Ｄ）に由来する０継代目の細胞集団の比増殖速度を評価した。比増殖速度の測定結果を表８に示す。【０１８９】
【表８】
2019132025.tif 000009
【０１９０】
表８に示すように、ドナーＣに由来する０継代目の細胞集団の比増殖速度は０．１８（１／ｄａｙ）、ドナーＤに由来する０継代目の細胞集団の比増殖速度は０．４６（１／ｄａｙ）であった。以上より、ドナーＤに由来する０継代目の細胞集団は、高い増殖性を示すことが分かった。
以上の結果から、羊膜から同一の方法で羊膜ＭＳＣを採取・培養しても、ドナーの相違によって取得した細胞集団の増殖性に大きく差が出ることが示され、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を調べれば、ドナー自体及びドナーから採取した生体試料の品質を評価できることが示唆された。つまり、本発明によれば、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を指標とすることによって、ドナー自体及びドナーから採取した生体試料の品質を評価することができ、増殖性の高い接着性幹細胞の含有量が高い生体試料を予め選定（ドナースクリーニング）することができる。これにより、不要な細胞培養を省くことが可能となり、或いは細胞培養期間を短縮することが可能となり、製造コストを下げることができる。【０１９１】
＜実施例９：培養工程におけるモニタリング＞
以下に示す実施例９では、培養工程において下記（ａ）及び（ｂ）の条件を指標とすることによって、接着性幹細胞の免疫抑制作用及び／又は増殖性をモニタリングすることができるか検討した。
（ａ）前記細胞集団が、ＰＬＩＮ２遺伝子およびＮＥＦＭ遺伝子の発現が陽性であり、
（ｂ）前記細胞集団が、ＳＤＨＡ遺伝子の発現量に対するＰＬＩＮ２遺伝子の相対発現量が１．５０以上である。【０１９２】
（工程３：羊膜ＭＳＣの培養）
実施例８の工程３にて取得したドナーＤに由来する０継代目の細胞集団は、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を満たしたため、以降の継代培養を行うこととした。上記の細胞集団を、実施例１の工程３と同様の手法にて継代培養し、１〜５継代目の細胞集団を取得した。継代培養を行うごとに、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を満たすか確認した。また、実施例８の工程３にて取得したドナーＣに由来する０継代目の細胞集団は、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を満たさなかったため、以降の継代培養を行わないこととした。
（工程４：遺伝子発現解析）
比較例１の工程５に記載された手順Ａ（比較Ｃｔ法）にて、ドナーＤに由来する１、２、３、４、５継代目の細胞集団の遺伝子発現解析を行った。その結果、各々の細胞集団は、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を満たした。【０１９３】
（工程５：比増殖速度の評価）
ドナーＤに由来する１、２、３、４、５継代目の細胞集団の比増殖速度を評価した。各々の細胞集団の比増殖速度の測定結果を表９に示す。【０１９４】
【表９】
2019132025.tif 000010
【０１９５】
表９に示すように、ドナーＤに由来する１、２、３、４、５継代目の細胞集団の比増殖速度は、それぞれ、０．６４（１／ｄａｙ）、０．６８（１／ｄａｙ）、０．４１（１／ｄａｙ）、０．５６（１／ｄａｙ）、０．４０（１／ｄａｙ）であった。以上より、各々の細胞集団は、いずれも継代培養の後も高い増殖性を示すことが分かった。【０１９６】
（工程６：ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子の発現量の評価）
ドナーＤに由来する１、２、３、４、５継代目の細胞集団のＴＮＦＡＩＰ６遺伝子の発現量を評価することができる。各々の細胞集団は、ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子を発現し、免疫抑制作用を有する。
以上より、培養工程において上記（ａ）及び（ｂ）の条件を指標とすることによって、接着性幹細胞の免疫抑制作用及び／又は増殖性をモニタリングすることができる。つまり、本発明によれば、前記指標を測定することによって（好ましくは経時的に測定することによって）、接着性幹細胞の免疫抑制作用及び／又は増殖性の変化を迅速に把握し、予測することができる。これにより、細胞培養期間を短縮することが可能となり、製造コストを下げることができる。
【図１】
2019132025.tif 000011
【図２】
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【配列表】
2019132025000001.app
【国際調査報告】
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