(57)【要約】  新規な抗結核薬及びその用途を提供することを課題とする。ジスルフィラム又はジエチルジチオカルバメート若しくはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する抗結核薬が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジスルフィラム又はジエチルジチオカルバメート若しくはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する抗結核薬。
【請求項２】
イソニアジド（Isoniazid）、リファンピシン（Ryfampicin）、ストレプトマイシン（Streptmycin）、カナマイシン（Kanamycine）、アミカシン（Amikacin）、エタンブトール（Ethambutol）、又はパラアミノサリチル酸（p-aminosalicylate）を有効成分とする抗結核薬と併用投与されることを特徴とする、請求項１に記載の抗結核薬。
【請求項３】
請求項１に記載の抗結核薬を対象に投与するステップを含む、結核の予防又は治療方法。
【請求項４】
イソニアジド（Isoniazid）、リファンピシン（Ryfampicin）、ストレプトマイシン（Streptmycin）、カナマイシン（Kanamycine）、アミカシン（Amikacin）、エタンブトール（Ethambutol）、又はパラアミノサリチル酸（p-aminosalicylate）を有効成分とする抗結核薬を併用投与することを特徴する、請求項３に記載の結核の予防又は治療方法。
【請求項５】
抗結核薬を製造するための、ジスルフィラム又はジエチルジチオカルバメート若しくはその薬学的に許容可能な塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗結核薬及びその用途（結核の予防や治療など）に関する。本出願は、２００９年１月３１日に出願された日本国特許出願第２００９−２１０２６号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
1993年のWHO結核非常事態宣言についで1999年7月の厚生労働省の結核緊急事態宣言が出され、結核は、対応が必要な感染症として本邦では認知されている。第二次世界大戦後、ストレプトマイシン(SM）、イソニアジド(INH）やリファンピシン(RFP)といった有効な結核治療薬が開発され、結核患者は順調に減少していたが、世界では毎年920万人が新規発症し、180万人以上が死亡しているのが現状であり、1980年代半ば以降、都市部を中心に漸増傾向に転じている。この原因として、化学療法の失敗例に起因する多剤耐性結核（MDR-TB）や、日和見感染による慢性疾患である非結核性抗酸菌M. avium-intracellulare complex(MAC)等の難治性抗酸菌症が増加傾向に転じさせた大きな理由である。MDR-TBに対しては1994年に打ち出されたDOTS戦略が世界的に著しい成果を挙げている。一方、南アフリカ等発展途上国においてはHIVとの二重感染で感染後１月以内に90％が亡くなる広範囲薬剤耐性結核菌（Extensively Drug-Resistant TB; XDR-TB）の出現が確認されている。日本では、従来11種の薬剤が使用されてきたが、フルオロキノロン(FQ)は保険適用が認められていないことやカプレオマイシン(CPM)が薬価基準から削除されるなど、使用できる薬剤が減少している。新薬開発が遅れている結核医療において、新規化学構造式と新たな作用機序を有する新薬の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Michael, 1991 Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1991, vol. 35, No. 4, p. 785-787
【非特許文献２】Theodore, 1998 Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1998, vol. 42, No. 6, p. 1488-1492
【非特許文献３】Menno J, 1998 Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 1998, vol. 42,No. 6, p. 817-820
【非特許文献４】Seema, 2007 Japanese journal of medical mycology, 2007, vol. 48, No. 3, p. 109-113
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
以上の背景の下、本発明は新規な抗結核薬及びその用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、抗酒薬として使用されている薬剤ジスルフィラム（Disulfiram）に注目し、その結核菌に対する作用を検討した。その結果、ジスルフィラム及びその代謝産物ジエチルジチオカルバメート（Diethyldithiocarbamate; DDC）がヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis H37Rv (MTB)に対して強い抗菌活性を有することが明らかとなった。抗菌作用は既存の第一選択薬と第二選択薬の中間に位置する強さであった。in vitroでのMICは、既存の抗結核薬の第二選択薬と同等の0.78〜1.56μg/mlであった。ジスルフィラムは、1948年にErik Jacobsenらにより、アルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害作用が報告され、現在、慢性アルコール中毒に適応を持つ薬剤として普及している。これまでに、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Methicillin resistant Staphylococcus aureus）（非特許文献１）、ジアルジア（Giardia）（非特許文献２）、メトロニダゾール耐性トリコモナス・バギナリス（Metronidazole-resistant Trichomonas vaginalis）（非特許文献３）などの細菌、及びアスペルギルス属（Aspergillus spp）のような真菌（非特許文献４）にも抗菌活性を有することが報告されている。【０００６】
更に検討を進めた結果、ジスルフィラム及びDDCの抗菌活性、細胞内移行性、細胞毒性、一次作用点について有意義且つ興味深い知見が得られ、これらの化合物が抗結核薬の有効成分として極めて有効であることが示された。特に、結核菌に対する選択性が非常に高いこと、及び薬剤耐性菌に対しても抗菌活性を示したことは、当該化合物の有効性を強く支持する。【０００７】
以上の知見に基づき、次の発明が提供される。
［１］ジスルフィラム又はジエチルジチオカルバメート若しくはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する抗結核薬。
［２］イソニアジド（Isoniazid）、リファンピシン（Rifampicin）、ストレプトマイシン（Streptomycin）、カナマイシン（Kanamycin）、アミカシン（Amikacin）、エタンブトール（Ethambutol）、又はパラアミノサリチル酸（p-aminosalicylate）を有効成分とする抗結核薬と併用投与されることを特徴とする、［１］に記載の抗結核薬。
［３］［１］に記載の抗結核薬を対象に投与するステップを含む、結核の予防又は治療方法。
［４］イソニアジド（Isoniazid）、リファンピシン（Ryfampicin）、ストレプトマイシン（Streptmycin）、カナマイシン（Kanamycine）、アミカシン（Amikacin）、エタンブトール（Ethambutol）、又はパラアミノサリチル酸（p-aminosalicylate）を有効成分とする抗結核薬を併用投与することを特徴する、［３］に記載の結核の予防又は治療方法。
［５］抗結核薬を製造するための、ジスルフィラム又はジエチルジチオカルバメート若しくはその薬学的に許容可能な塩の使用。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】液体培地中での菌の濃度を指標にした抗菌活性測定法（BDT法）による既存薬剤の各種抗酸菌、黄色ブドウ球菌及び大腸菌に対する抗菌活性。各種抗菌薬の最小発育阻止濃度（MIC）を表にまとめた。
【図２】ジスルフィラム及びDDCの各種抗酸菌、黄色ブドウ球菌及び大腸菌に対する抗菌活性。ジスルフィラム及びDDCの最小発育阻止濃度（MIC）を表にまとめた。INH：イソニアジド、RFP：リファンピシン、SM：ストレプトマイシン、EB：エタンブトール、PAS：パラアミノサリチル酸、AMK：アミカシン、KM：カナマイシン、GM：ゲンタマイシン、TC：テトラサイクリン、DOXY：ドキシサイクリン、CAM： クラリスロマイシン、CPFX：シプロフロキサシン、VCM：バンコマイシン、PCG：ベンジルペニシリン、ABPC：アンピシリン
【図３】ジスルフィラム及びDDCの細胞毒性を示すグラフ。既存の抗結核薬と細胞毒性を比較した。A:A-549細胞に対する毒性。B:THP-1細胞に対する毒性。C:THP-1細胞に対する毒性。横軸は薬剤の濃度（対数）、縦軸はコントロールに対する比率（％）。
【図４】THP-1細胞に対するジスルフィラムの非毒性領域を示す表。既存の薬剤と比較した。INH：イソニアジド、RFP：リファンピシン、SM：ストレプトマイシン、EB：エタンブトール、DDC：ジエチルジチオカルバメート。
【図５】ジスルフィラム及びDDCの宿主細胞内寄生している結核菌に対する抗菌活性を示すグラフ。A:THP-1細胞での活性。B:A549細胞での活性。横軸は薬剤の濃度、縦軸はコロニー数の減少量（対数）。
【図６】ジスルフィラム及びDDCの抗結核菌作用のpH依存性を示す表。CPFX：シプロフロキサシン、DDC：ジエチルジチオカルバメート。
【図７】M. bovis BCGに対するジスルフィラムの作用様式（殺菌的、もしくは静菌的）の検討。薬剤感受性試験の結果をグラフにまとめた。Mycobacterium bovis BCGのコロニー数で薬剤の活性を評価した。A:イソニアジドに対する感受性、B:エタンブトールに対する感受性、C:ジスルフィラムに対する感受性、D:DDCに対する感受性、E:ジスルフィラムに対する感受性、D:DDCに対する感受性。横軸は薬剤添加後の日数である。A〜Dの縦軸は530nmの吸光度である。また、E及びFの縦軸はコロニー数（CFU）である。
【図８】黄色ブドウ球菌に対するジスルフィラムの作用様式（殺菌的、もしくは静菌的）の検討。薬剤感受性試験の結果をグラフにまとめた。スタフィロコッカス・アウレウスのコロニー数で薬剤の活性を評価した。A:ジスルフィラムに対する感受性、B:DDCに対する感受性、C:CPFXに対する感受性。横軸は薬剤添加後の時間である。縦軸は530nmの吸光度である。
【図９】M. smegmatisに対するジスルフィラムの作用様式（殺菌的、もしくは静菌的）の検討。薬剤感受性試験の結果をグラフにまとめた。Mycobacterium smegmatisのコロニー数で薬剤の活性を評価した。A:ジスルフィラムに対する感受性、B:DDCに対する感受性、C:リゾチームに対する感受性。横軸は薬剤添加後の時間である。縦軸は530nmの吸光度である。
【図１０】ジスルフィラム及びDDCのコリンエステラーゼ阻害作用を示すグラフ（A)と各薬剤のIC50（B)。Aの横軸は薬剤の濃度、縦軸は残存活性（％）。
【図１１】ジスルフィラム及びDDCの薬剤耐性M. smegmatisに対する抗菌作用を示す表。
【図１２】7H11寒天平板法により各薬剤のMIC（minimum inhibitory concentration：最小発育阻止濃度）を測定した結果。INH：イソニアジド、RFP：リファンピシン、SM：ストレプトマイシン、EB：エタンブトール、KM：カナマイシン、PAS：パラアミノサリチル酸、CPFX：シプロフロキサシン、DSF：ジスルフィラム、DDC：ジエチルジチオカルバメート。
【図１３】ジスルフィラム類縁化合物の抗菌活性を示す表。DSF：ジスルフィラム、DDC：ジエチルジチオカルバメート。
【図１４】臨床分離株（薬剤感受性株）に対するジスルフィラム及びDDCの抗菌活性を示す表。
【図１５】臨床分離株（薬剤耐性株）に対するジスルフィラム及びDDCの抗菌活性を示す表。INH：イソニアジド、RFP：リファンピシン、EB：エタンブトール、LVFX：レボフロキサシン、SPFX：スパフロキサシン、CPFX：シプロフロキサシン、KM：カナマイシン、SM：ストレプトマイシン、PAS：パラアミノサリチル酸、TH：エチオナミド、PZA：ピラジナミド、DSF：ジスルフィラム、DDC：ジエチルジチオカルバメート。
【図１６】ジスルフィラム及びDDCに関する薬剤耐性頻度を示す表。INH：イソニアジド、RFP：リファンピシン、SM：ストレプトマイシン、EB：エタンブトール、KM：カナマイシン、CPFX：シプロフロキサシン、PAS：パラアミノサリチル酸、DSF：ジスルフィラム、DDC：ジエチルジチオカルバメート。
【図１７】結核慢性感染モデルマウスを用いた実験系の概要。RFP：リファンピシン、DSF：ジスルフィラム。
【図１８】結核慢性感染モデルマウスの体重変化を示すグラフ。A:リファンピシリンを20mg/kg（R20）、10mg/kg（R10）又は5mg/kg（R5）で投与し、体重変化を記録した。B:ジスルフィラムを160mg/kg（D160）、80mg/kg（D80）又は40mg/kg（D40）で投与し、体重変化を記録した。
【図１９】ジスルフィラムの感染防御効果を示すグラフ。ヒト型結核菌を感染させたマウスにジスルフィラム（40mg/kg（D40）、80mg/kg（D80）又は160mg/kg（D160））、リファンピシン（5mg/kg（R5）、10mg/kg（R10）又は20mg/kg（R20））又は5%アラビアガム（コントロール群）を投与した後、肺、脾臓及び肝臓を摘出してコロニーアッセイを行った。肺（左）及び脾臓（右）の対数菌数（logCFU）の平均値（n=5）を示した。エラーバーは平均±標準偏差を示す（n=5）。スチューデントのt検定により評価した。*, p<0.05（対コントロール群）、**, p<0.01（対コントロール群）、***, p<0.001（対コントロール群）。
【図２０】ジスルフィラムの毒性を検討した結果のグラフ。ヒト型結核菌を感染させたマウスにジスルフィラム（40mg/kg（D40）、80mg/kg（D80）又は160mg/kg（D160））、リファンピシン（5mg/kg（R5）、10mg/kg（R10）又は20mg/kg（R20））又は5%アラビアガム（コントロール群）を投与した後、肝臓及び血清中の肝障害マーカーを検出した。GOT（左）及びGPT（右）の相対活性を示す。エラーバーは平均±標準偏差を示す（n=5）。スチューデントのt検定により評価した。*, p<0.05（対コントロール群）、**, p<0.01（対コントロール群）、***, p<0.001（対コントロール群）。NSは有意差なし。
【図２１】ジスルフィラムの毒性を検討した結果のグラフ。ヒト型結核菌を感染させたマウスにジスルフィラム（40mg/kg（D40）、80mg/kg（D80）又は160mg/kg（D160））、リファンピシン（5mg/kg（R5）、10mg/kg（R10）又は20mg/kg（R20））又は5%アラビアガム（コントロール群）を投与した後、肝臓及び血清中の肝障害マーカーを検出した。ALPレベル（左）及びChE阻害効果（右）を示す。エラーバーは平均±標準偏差を示す（n=5）。スチューデントのt検定により評価した。*, p<0.05（対コントロール群）、**, p<0.01（対コントロール群）、***, p<0.001（対コントロール群）。NSは有意差なし。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の第１の局面は抗結核薬に関する。本発明の抗結核薬では、ジスルフィラム（1-(ジエチルチオカルバモイルジスルファニル)-N,N-ジエチル-メタンチオアミド）又はその代謝産物であるジエチルジチオカルバメート若しくはその塩を有効成分として用いる。ここでの塩は薬学的に許容可能な限りその種類は特に限定されず、塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、ホウ酸等との塩（無機酸塩）や、ギ酸、酢酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸等との塩（有機酸塩）をその例として挙げることができる。これらの塩の調製は慣用手段によって行なうことができる。
【００１０】
ジスルフィラムについては、1948年にErik Jacobsenらにより、アルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害作用が報告され、現在、慢性アルコール中毒に適応を持つ薬剤として普及している。ジスルフィラムの構造を以下に示す。
【化１】
2010087260.tif 000002
【００１１】
ジスルフィラムは生体内で下記の通り代謝されることが知られている。
【化２】
2010087260.tif 000003
【００１２】
ジスルフィラムは抗酒薬として臨床で用いられており、容易に入手可能である。例えば田辺三菱製薬株式会社、ナカライテスク株式会社、和光純薬株式会社、SIGNA-ALORICH Groupがジスルフィラムを販売している。ジエチルジチオカルバメートについてはナカライテスク株式会社から入手可能である。
【００１３】
有効成分の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
【００１４】
製剤化する場合の剤型も特に限定されず、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、及び坐剤などとして調製できる。このように製剤化した本発明の薬剤はその形態に応じて経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、筋肉、腹腔内注射など）によって対象に適用され得る。ここでの「対象」は特に限定されないが、好ましくはヒトである。本発明の抗結核薬における有効成分の含量は一般に剤型によって異なるが、所望の投与量を達成できるように例えば約0.001重量％〜約90重量％とする。
【００１５】
上記の有効成分に加え、既存の抗結核剤を含む抗結核薬としてもよい。異なる作用点の薬剤を組み合わせることにすれば多面的な抗結核作用を発揮することができる。同一又は類似の薬剤を組み合わせた場合には抗結核作用の増強を期待できる。既存の抗結核剤の例として、イソニアジド（Isoniazid）、リファンピシン（Rifampicin）、ストレプトマイシン（Streptomycin）、カナマイシン（Kanamycin）、アミカシン（Amikacin）、エタンブトール（Ethambutol）、パラアミノサリチル酸（p-aminosalicylate）が挙げられる。
【００１６】
本発明の他の局面では以上の抗結核薬を使用した、結核に対する予防方法又は治療方法（以下では、便宜上これら二つの方法を包括して「治療方法」と呼ぶ）が提供される。本発明の治療方法は、上記本発明の抗結核薬を生体に投与するステップを含む。投与経路は特に限定されず例えば経口、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、経粘膜などを挙げることができる。これらの投与経路は互いに排他的なものではなく、任意に選択される二つ以上を併用することもできる（例えば、経口投与と同時に又は所定時間経過後に静脈注射等を行う等）。尚、投与が容易である点から経口投与によることが好ましい。
【００１７】
抗結核薬の投与量は症状、投与対象の年齢、性別、及び体重などによって異なるが、当業者であれば適宜適当な投与量を設定することが可能である。例えば、成人（体重約60kg）を対象として一日当たりの有効成分量が約100mg〜約1000mg、好ましくは約250mg〜約500mgとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの設定においては、投与対象の病状や薬剤の効果持続時間などを考慮することができる。
【００１８】
本発明の抗結核薬は単独で又は他の抗結核薬との併用によって投与される。他の抗結核薬の例は、イソニアジド（Isoniazid）、リファンピシン（Rifampicin）、ストレプトマイシン（Streptomycin）、カナマイシン（Kanamycin）、アミカシン（Amikacin）、エタンブトール（Ethambutol）、又はパラアミノサリチル酸（p-aminosalicylate）を有効成分とする抗結核薬である。
【実施例】
【００１９】
１．既存の抗結核薬及びジスルフィラムの結核菌に対する抗菌活性
（１）方法（BDT法）
96ウェルプレートに薬剤溶液が2倍希釈系列になるように作製した。そこに菌液(O.D.=0.1の100倍希釈)を一定量ずつ加え、37℃、5％CO2存在下で培養した。目視により、菌が増殖していない薬剤最小濃度を最小発育阻止濃度(MIC）とした。また、これを被検体とし、10μlずつ7H11固形培地にまき、最小殺菌濃度(MBC）を求めた。実験は、独立して２回行い、その平均値を算出した。【００２０】
（２）結果
結果を図１及び２に示す。既存の抗結核薬INH, SM, EB, PAS等が抗酸菌特異的な抗菌活性を有することが確認できた。TC系は広域スペクトラムな活性を有し、β-ラクタム剤PCG, ABPCは結核菌には有効ではなく、他のグラム陽性菌やグラム陰性菌に有効であることが示された。MAC感染症治療薬であるCPFXは、ヒト型結核菌に強い抗菌活性を有するが、広域スペクトラムであるため、常在菌への影響が懸念される。【００２１】
ジスルフィラムは、M. tuberculosis H37Rvに対して最小発育阻止濃度が0.78〜1.56μg/mlであった。ジスルフィラムは、血中のグルタチオンレダクターゼによりジエチルジチオカルバメート(DDC)に代謝され、肝代謝を受け尿中排泄される。DDCは、同じ抗酸菌群でも迅速発育型のM. smegmatisや、グラム陽性菌S. aureus、グラム陰性菌E. coliには抗菌活性を示さない狭域スペクトラムな化合物であることが示された。ジスルフィラム、DDCのMBC/MIC値が共に1であったことから、殺菌的に作用している可能性が示唆された(データ示さず)。【００２２】
２．ジスルフィラムの細胞毒性試験
（１）方法
各細胞懸濁液を96ウェルプレートにまき、予め作製した薬剤の希釈液を添加し、37℃で3日間培養後、クリスタルバイオレットで染色し、595nmの吸光度を測定した。実験は独立して３回行い、平均値を算出した。細胞にはTHP-1(1.0×106cells/ml)、MRC-5(1.5×105cells/ml)、A-549(3.0×105cells/ml)を用いた。【００２３】
（２）結果
結果を図３に示す。細胞毒性が現れない最小濃度は、ジスルフィラムが80μg/ml、DDCが300μg/mlであった。図４より、ジスルフィラムのTD50値は、RFPのその値に相当することが分かった。しかし、RFPはMICが低いため、治療域は広くとれる。一方、ジスルフィラムの治療域は既存の薬剤と比べて狭いことが示唆された。尚、過去の報告により、ジスルフィラムの経口投与での体内動態については安全性が確立されている。【００２４】
３．細胞内移行性及びpH依存的薬剤感受性の変化
結核菌は宿主体内寄生菌の一つであり、ヒトMφの食胞内で潜伏感染し、老化や免疫力低下に伴い再燃する、肺結核症の原因菌である。そのMφ内の食胞は、やや酸性(pH 6.1〜6.5)に傾いており、栄養も制限がかかった環境にある。既存の薬剤では、CAM、CPFX、INH等は酸性条件下では活性が低下することが分かっている。そこで、ヒトMφ様細胞を用いてジスルフィラムの細胞内移行性を調べるとともに、酸性条件でのジスルフィラムの抗菌活性を検討した。【００２５】
３−１．ジスルフィラムの細胞内移行性についての検討
（１）方法
THP-1をPMA 100 ng/mlで二日間処理し、24ウェルプレートに1.0×106 cells/mlまいた。1日間インキュベートし5.0×107 cfu/mlのH37Rvを4時間感染させた後、HBSSで細胞を2回洗い、SMで20時間処理した。HBSSで2回洗い、薬剤の希釈系列を作製して加え、4時間処理した。HBSSで2回洗い、0.1 ％ SDS溶液で細胞を溶解後、コロニーアッセイを行った。14日間培養し、コロニー数で評価した。実験は独立して３回行い、平均値を算出した。【００２６】
（２）結果
結果を図５に示した。ヒトMφ様細胞THP-1、及びII型肺胞上皮細胞A549株において、INH、RFPは、細胞内の生菌を有意に減少させることが確認できた。SM、PAS等は、細胞内の菌には有効では無かった。ジスルフィラムは、10μg/ml以上で細胞内の生菌に有効であることが示された。力価としては、ジスルフィラム30μg/mlは、RFP1μg/mlに相当することが示された。一方、DDCNaは、濃度依存的な殺菌作用は見られなかったが、細胞内の菌にも有効であることが示唆された。ジスルフィラムは、第一選択薬INH、RFPよりは劣るが、細胞内及びMφへ移行し、細胞内寄生菌を殺菌できる可能性が示唆された。【００２７】
３−２．pH依存的薬剤感受性の変化についての検討
（１）方法（BDT法）
10 % ADC及び0.02 % Tyroxapolを含む7H9培地(pH 6.6, pH 6.2)、及び改変Kirchner培地(pH 6.8, pH 5.6)を作製した。実験は独立して３回行い、MTB, M. bovis BCG, M. smegmatisに対する抗菌活性を測定した。【００２８】
（２）結果
結果を図６に示した。ジスルフィラム及びDDCNaは、pH 6.2、pH 5.4の酸性条件かでも抗菌活性が低下しないことが示された。類縁カルバメートであるDimethyldithiocarbamateは、酸性条件下、性状が不安定になり、DMAやCS2に分解されるとも報告されている（Owens, R 1964, Boyce Thompson Institute, 1964, Vol. 22, p. 241-257）。ヒト食胞Mφ内は、pHが6.8付近である。そして、Mφが活性化し、P-L fusion（ファゴソーム−リソソーム融合）が起こるとpHが6.2付近まで下がり、最終的にリソソーム内の酸性殺菌物質等の影響を受けpHが4.5まで下がると考えられている。この結果と図５の結果より、ジスルフィラムは、Mφ内でも有効である可能性が示唆された。【００２９】
４．薬剤感受性試験
（１）方法（M. bovis BCG）
7H9液体培地で対数増殖期初期（early log phase）まで培養した菌液を3.6 mlずつ試験管に分注した。濃度が1 MIC、10 MIC、50 MICとなるよう薬剤を作製し、菌液の入った試験管に400μl加え、37℃で培養した。薬剤を加えた日を0日とし、2、4、7、10、14、21日に吸光度測定およびコロニーアッセイを行った。14日間培養後のコロニー数で評価した。【００３０】
（２）結果
結果を図７に示す。M. bovis BCGとMTBは、遺伝子学的に99.5 %以上の相同性を示すことが明らかとなっている。また、増殖においても相関が見られたため、M. bovis BCGを用いて薬剤感受性試験を行った。以前の報告により、ジスルフィラムは他のバクテリアに対して殺菌的作用を有することが分かっている。図７Ｅ、Ｆより、ジスルフィラムとDDCは、他のバクテリアに対するのと同様、対数増殖期の菌液に対しても殺菌的作用を有することが示唆された。また、興味深いことに、ジスルフィラム、DDCは溶菌的作用を有することが示唆された（図７Ｃ、Ｄ）。溶菌的作用とは、細胞壁の崩壊を伴い、死細胞を残さず死滅することと定義されている。その活性を有する化合物としてリゾチーム（lysozyme）やペニシリンG(PCG)がある。しかし、BCGに対するリゾチームのMICは50μg/mlであり、この濃度下では培地が懸濁してしまい濃度依存的な可視的溶菌が確認できない。一方、PCGが抗酸菌に有効でないことも言うまでもない。そこで、他のバクテリアが溶菌するか検討した。図８Ｃより、S. aureusは、CPFX高濃度下で溶菌することが確認できたが、ジスルフィラム又はDDCでは溶菌は起こらなかった。M. smegmatisでも同様の結果だった（図９）。これらの結果より、ジスルフィラム及びDDCはヒト型及びウシ型結核菌特異的に溶菌的活性を有することが示唆された。また、他の既存の薬剤に溶菌的活性を有するものがないことから既存の薬剤との相乗効果が期待できる。【００３１】
５．コリンエステラーゼ阻害作用に関する検討
（１）方法（DTNB法）
96ウェルプレートに0.01 % DTNB (5, 5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid )溶液を150μlまき、5 %ヨウ化アセチルチオコリンを5μl添加した。予めFBS（未非動化）を溶媒として、各薬剤の希釈系列を作製した。この溶液2μlをプレートへ添加し、37℃で培養し、10分後に吸光度405 nmの波長を測定した。IC50でコリンエステラーゼ阻害作用を評価した。ポジティブコントロールとして臭化ネオスチグミンを用いた。【００３２】
（２）結果
結果を図１０に示す。有機硫黄系カルバメートは殺虫剤、殺菌剤及び除草剤に大別される。この中には人体に影響を与える有害な作用としてコリンエステラーゼ阻害作用を有しているものが含まれる。DTNB法による検討の結果、ジスルフィラムとDDCは低濃度ではChE阻害作用を示さなかった。尚、ジスルフィラムがChE阻害作用を有さないことについては過去にも報告がある。【００３３】
６．7H11寒天平板法によるMICの測定
Shishido Y (2007 Dec;11(12):1334-8. Anti-tuberculosis drug susceptibility testing of Mycobacterium bovis BCG Tokyo strain.)、Maurice L. Cohn (Am Rev Respir Dis. 1968 Aug;98(2):295-6.The 7H11 medium for the cultivation of mycobacteria.)の報告を参考にして、7H11 OADC強化寒天培地を用いて、M. bovis BCG Tokyo172株に対する最小発育阻止濃度(MIC）を測定した。
（１）方法
7H11寒天に105〜106 CFU/mlの菌液を100μl播き、10〜14日間培養後のコロニー数を計数し、コロニーが5個以下を陰性、5個超を陽性とした。菌液は7H9-グリセロール-6.6液体培地で対数増殖期まで培養したものを用いた。実験は２連で3回行った。【００３４】
（２）結果
INH、SM、EBについては以前の報告と同等の値が示されたが、RFPについては少し強い作用を認めた（図１２）。ジスルフィラムはカナマイシンと同等の抗菌活性を有していた。【００３５】
７．ジスルフィラム、DDCの類縁化合物の抗菌活性
ジスルフィラム類縁化合物ジアルキルジチオカルバメート（dialkyldithiocarbamates）が、M. leprae等一部の抗酸菌に抗菌活性を示すことが報告されている(Vadim, 2006 J Antimicrob Chemother. 2006 Jun;57(6):1134-8. Epub 2006 Apr 4. Synthesis and antileprosy activity of some dialkyldithiocarbamates.)。今回、テトラアルキルチウラム二硫化物であるチウラム及びジスルフィラム並びに複数のジアルキルジチオカルバメート（ジメチルジチオカルバメート、ジエチルジチオカルバメート、ジブチルジチオカルバメート、ジベンジルジチオカルバメート)について抗酸菌に対するMICを測定した。
（１）方法
96ウェルプレートに薬剤溶液が2倍希釈系列になるように作製した。そこに菌液(O. D. =0.1の100倍希釈)を一定量ずつ加え、37℃、5％CO2存在下で培養した。目視により菌が増殖していない薬剤最小濃度を最小発育阻止濃度(MIC）とした。実験は２連で行い、その平均値を算出した。【００３６】
（２）結果
ジアルキルジチオカルバメートのアルキル鎖を伸長させることでMICが高くなることが示された（図１３）。また、芳香族環を有すると更に抗菌活性が低下した。一方で、チウラムの方がジスルフィラムよりも抗菌活性が強いことが示唆された。しかし、殺菌性プラスチック包帯材(一缶あたり60 mg含有)や農薬として使用されるチウラムのADIは、8.4μg/kg/日と定められている。体重60 kgの成人例では、504μg/日になり、ヒトへの投与は不可能である。よって現段階では、ヒトに投与された経験があるジスルフィラム及びDDCが有力な薬剤であるといえる。【００３７】
８．臨床分離株DS-TB、MDR-TBに対する抗菌活性の測定
肺結核患者から検出された結核菌に対するMICを測定した。
（１）方法
薬剤感受性株(20株)と薬剤耐性株(22株)をフリーズバンクから解凍後、MycoBroth（商品名、極東製薬工業）で7〜10日間培養し、一度継代した菌液(7〜10日間)を用いた。その菌液をMcFarland No. 1に相当する濁度(0.16〜0.20)まで希釈し、さらに50倍希釈になるように播いた。実験は2連で2回行った。その他の手順は７．の方法に準じた。【００３８】
薬剤感受性株(20株)についてのジスルフィラムのMICは0.78〜1.56μg/ml、DDCのMICは1.56〜3.13μg/mlであった（図１４）。一方、薬剤耐性株(22株)についてのジスルフィラムのMICは0.78〜1.56μg/ml、DDCのMICは1.56〜3.13μg/mlであった（図１５）。薬剤感受性株に対するMICと薬剤耐性株に対するMICが同等であったことから、ジスルフィラムとDDCは既存の薬剤との交差耐性が無いことが示唆された。また、新薬候補化合物であるキノロン系(MXFX, GFLX, LVFX)耐性株に対してもジスルフィラムとDDCが抗菌活性を有することが示された。【００３９】
９．ジスルフィラム及びDDCの薬剤耐性頻度の算出
G. Canettiらの報告(Bull World Health Organ. 1963;29:565-78. MYCOBACTERIA: LABORATORY METHODS FOR TESTING DRUG SENSITIVITY AND RESISTANCE.)を参考にして、ジスルフィラム及びDDCの薬剤耐性頻度を検討した。
（１）方法
ジスルフィラム、DDC、SM、EB及びKMのそれぞれについて20μg/ml含有7H11寒天（X-plate）を作製した。また、INH、RFP、CPFX及びPASのそれぞれについて1μg/ml含有7H11寒天（X-plate）を作製した。1.8×108 CFU/mlの菌液の希釈系列を作り、各薬剤のプレートに100μlずつ添加した。2週間培養後のコロニー数から耐性頻度を求めた。実験は2連で2回行った。また、得られた耐性菌を3回継代培養し(6週)、10株ずつ保存した。【００４０】
（２）結果
ジスルフィラムの耐性頻度は既存の薬剤と同程度であった（図１６）。また、DDCよりもジスルフィラムの方が耐性菌が出現し難いことが示唆された。【００４１】
１０．in vivoにおけるジスルフィラムの感染防御効果についての検討
１０−１．マウスの体重変化の記録
（１）方法
5週齢のメス健常マウスにヒト型結核H37Rvを感染させ、28日間飼育した（図１７）。その後、各薬剤（RFP及びジスルフィラム）を経口投与にて28日間反復投与し、49日間の体重変化を1週間ごとに記録した。
（２）結果
RFP（図１８Ａ）、ジスルフィラム（図１８Ｂ）のいずれについても顕著な体重変化を認めなかった。【００４２】
１０−２．ジスルフィラムの感染防御効果
（１）方法
5週齢のメス健常マウスにヒト型結核H37Rvを感染させ、28日間飼育した（図１７）。その後、各薬剤（RFP及びジスルフィラム）を経口投与にて28日間反復投与した。体重（g）は一週間おきに測定した。感染57日目に肺、脾臓、肝臓を摘出し、それぞれのホモジネートをコロニーアッセイに供した（図１７）。
（２）結果
RFPは投与量20mg/kgで肺内寄生菌を有意に減少させた（図１９）。ジスルフィラムは投与量80〜160mg/kgで肺内寄生菌を有意に減少させた（図１９）。感染防御効果に関してジスルフィラム80 mg/kgはRFP 10 mg/kgに相当することが示された。【００４３】
１０−３．ジスルフィラムの毒性についての検討
（１）方法
5週齢のメス健常マウスにヒト型結核H37Rvを感染させ、28日間飼育した（図１７）。その後、各薬剤（RFP及びジスルフィラム）を経口投与にて28日間反復投与した。そして、摘出した肝臓ホモジネート及び血清中の肝障害マーカーの発現を既報の方法に準じて測定した。また、コリンエステラーゼ（ChE）阻害作用を５．の方法に準じて調べた。【００４４】
（２）結果
ジスルフィラムを投与した場合の各マーカーのレベルはRFPを投与した場合と同等以下であった（図２０、図２１左）。特に、低投与量ではコントロールと同等であり、ジスルフィラムの肝毒性は高くないことが示唆された。コリンエステラーゼ阻害効果（図２１右）からも、ジスルフィラムの毒性が高くないことが示された。【００４５】
＜まとめ＞
結核は慢性の呼吸器感染症であり、新規の抗結核薬に求められるのは、経口投与可能であり且つ既存の薬剤と交差耐性がなく、しかも体内動態について細胞内、肺内移行性に優れ、さらには対数増殖期、分裂休止期ともに結核菌に対して殺菌的な活性を示す狭域スペクトラムを有することである。今回の結果から、ジスルフィラム及びDDCはこれらの条件を満たすことが示された。また、薬剤耐性M. smegmatisに対しても有効であったことから（図１１）、既存の薬剤とは作用点は異なることが示唆された(データ示さず)。また、ヒト型及びウシ型結核菌特異的に溶菌的作用を有することが判明した。既存の抗結核薬に溶菌的作用を有するものがないことから、ジスルフィラム又はDDCを既存の抗結核薬と併用した場合、相乗効果が発揮されることを大いに期待できる。ところで、結核治療期間中のジスルフィラムの併用について議論される点として、Dopamine-β-hydroxylaseの競合によるINHとの相互作用がある。しかし、1994年に始まったDOTS戦略及び2006年のMDR-TBに対するDOTS-Plus protocol療法によるコンプライアンスの上昇に伴い、INHとの相互作用については現在否定的である。実際、中枢性副作用はみられなかったという報告もある（W. J. Burman, 2002, The international journal of tuberculosis and lung disease, 2002, vol. 6, No. 9, p. 839-842）。経口投与による毒性を検討した結果、ジスルフィラムの毒性は高くないことが示された（図１８〜２１）。カルバメートと聞くと思い浮かぶのがChE阻害作用である。ジスルフィラムはカルバメートの一種であるが、殺虫剤として用いられるものとは異なりChE阻害作用は否定されている。また、図２より、ジスルフィラムは、体内でDDCに代謝されることで、菌交代現象が起こりにくくなる可能性が示唆された。【００４６】
現在、結核の治療の主流は2RHZ+4RHの多剤併用療法であり、これには6〜9月間を要する。また、MDR-TBは2年間以上を費やす。TB-Alliance、WHO Stop TB Partnershipは「2剤以上の新薬の同時臨床導入」を基本に2010〜2015年までに結核の標準治療期間を3〜4月に短縮するための戦略プログラムを提起している。その候補としてNitroimidazol系（OPC-67683, PA-824）やQuinolone系(MXFX）をはじめ、各種抗結核薬の臨床試験が進められている。【００４７】
上市以来、ジスルフィラム（ノックビン、antabuse）は慢性アルコール中毒治療薬として使用されてきた。近年、病原性細菌、寄生原生生物、真菌への抗菌活性が報告されている。また、Trichomonas muris、Candida albicansに対してはin vivoでの有効性も証明されている。しかしながら、結核菌に対してジスルフィラムが有効であるとの報告は皆無である。【００４８】
ジスルフィラムはジンクフィンガー活性（Zinc-finger-activity）を有し、HIV-1のNCp7 proteinからZn2＋を脱離させ、ウイルス複製を阻害する作用を発揮することが報告されている（Hathout, 1996, Drug Metabolism and disposition, 1996, vol. 24, No. 12, p. 1395-1400）。肺結核症はHIVの合併症としても重要である。南アフリカを中心としたXDR-TBの出現は主にHIV蔓延国で起こっている（SCIENCE, 2008, vol 319, No. 15 p. 894-895）。XDR-TBに感染したHIV患者の死亡率は90%を超え、発症後約2週間で死に至ると報告されている。また、TBに感染したHIV患者に対しては抗結核薬の使用が制限される現状にある。本発明者らの検討の結果、対数増殖期の結核菌に対して溶菌的作用を有する化合物（ジスルフィラム、DDC）が見出された。当該化合物の作用メカニズムの解明は、結核医療だけでなくAIDS治療の発展にも寄与するかもしれない。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の抗結核薬は、（１）結核菌に対する選択性が高い、（２）殺菌的に作用する、といった特徴を有する化合物を有効成分とするものであり、結核の治療又は予防に極めて有用である。また、有効成分の化合物が薬剤耐性菌に対しても抗菌活性を示したことから、薬剤耐性結核菌に対しても有効であることが大いに期待できる。本発明の抗結核薬を他の抗結核薬と併用することも可能である。【００５０】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
2010087260.tif 000004
【図２】
2010087260.tif 000005
【図３】
2010087260.tif 000006
【図４】
2010087260.tif 000007
【図５】
2010087260.tif 000008
【図６】
2010087260.tif 000009
【図７】
2010087260.tif 000010
【図８】
2010087260.tif 000011
【図９】
2010087260.tif 000012
【図１０】
2010087260.tif 000013
【図１１】
2010087260.tif 000014
【図１２】
2010087260.tif 000015
【図１３】
2010087260.tif 000016
【図１４】
2010087260.tif 000017
【図１５】
2010087260.tif 000018
【図１６】
2010087260.tif 000019
【図１７】
2010087260.tif 000020
【図１８】
2010087260.tif 000021
【図１９】
2010087260.tif 000022
【図２０】
2010087260.tif 000023
【図２１】
2010087260.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成22年6月7日(2010.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジスルフィラムを有効成分として含有し、イソニアジド、リファンピシン、エタンブトール、レボフロキサシン、スパルフロキサシン、シプロフロキサシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、パラアミノサリチル酸、エチオナミド及びピラジナミドからなる群より選択される一以上の抗結核薬と併用投与されることを特徴とする、抗結核薬。
【請求項２】
イソニアジド、リファンピシン、エタンブトール、レボフロキサシン、スパルフロキサシン、シプロフロキサシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、パラアミノサリチル酸、エチオナミド及びピラジナミドからなる群より選択される一以上の抗結核薬に耐性の結核菌に対して抗菌活性を示すことを特徴とする、請求項１に記載の抗結核薬。
【請求項３】
多剤耐性結核菌に対して抗菌活性を示すことを特徴とする、請求項２に記載の抗結核薬。
【請求項４】
請求項１に記載の抗結核薬を対象に投与するステップを含む、結核の予防又は治療方法。
【請求項５】
前記対象が、イソニアジド、リファンピシン、エタンブトール、レボフロキサシン、スパルフロキサシン、シプロフロキサシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、パラアミノサリチル酸、エチオナミド及びピラジナミドからなる群より選択される一以上の抗結核薬に耐性の結核菌に感染していることを特徴とする、請求項４に記載の結核の予防又は治療方法。
【請求項６】
イソニアジド、リファンピシン、エタンブトール、レボフロキサシン、スパルフロキサシン、シプロフロキサシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、パラアミノサリチル酸、エチオナミド及びピラジナミドからなる群より選択される一以上の抗結核薬と併用投与される抗結核薬を製造するための、ジスルフィラムの使用。
【国際調査報告】
2010087260.tif 000025
2010087260.tif 000026
2010087260.tif 000027
2010087260.tif 000028
2010087260.tif 000029
2010087260.tif 000030