(57)【要約】【課題】  環境中における微生物の密度を推定することを可能とする。【解決手段】  以下のａ及びｂのプローブを用い、プローブが検査対象微生物由来のポリヌクレオチドとハイブリダイズした程度を示すシグナル値を測定し、この値と閾値にもとづきパターン１〜３を判定して微生物の密度を推定する方法とする。ａ：ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする塩基配列からなり、密度αの場合に閾値以上のシグナル値を示すプローブ  ｂ：ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする塩基配列からなり、密度αよりも小さい密度βの場合に閾値以上のシグナル値を示す１つ以上のプローブ  パターン１：ａ及びｂにおけるシグナル値が両方閾値以上の場合  密度はα以上  パターン２：ａにおけるシグナル値が閾値未満でｂにおけるシグナル値が閾値以上の場合  密度は密度β以上α未満  パターン３：ａ及びｂにおけるシグナル値が両方閾値未満の場合  密度はβ未満【選択図】  図１
2019044126.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査対象の微生物が試料中に存在する密度を推定する微生物密度の推定方法であって、
検査対象の微生物の遺伝子における分析対象領域のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする、以下の（ａ）及び（ｂ）に規定するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、これらのプローブが前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズした程度を示すシグナル値を測定し、前記シグナル値と所定の閾値にもとづいてパターン（１）〜（３）を判定することにより、前記微生物密度を推定することを特徴とする微生物密度の推定方法。
プローブ（ａ）：前記ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする塩基配列からなり、試料中に存在する該微生物の密度が特定の微生物密度（α）の場合に前記所定の閾値以上の前記シグナル値を示すものとして予め対応付けられたプローブ
プローブ（ｂ）：前記ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする塩基配列からなり、試料中に存在する該微生物の密度が前記微生物密度（α）よりも小さい特定の微生物密度（β）の場合に前記所定の閾値以上の前記シグナル値を示すものとして予め対応付けられた１つ以上のプローブ
パターン（１）：前記プローブ（ａ）及び前記プローブ（ｂ）におけるシグナル値が、両方ともに前記所定の閾値以上の場合
微生物密度は、前記微生物密度（α）以上
パターン（２）：前記プローブ（ａ）におけるシグナル値が、前記所定の閾値未満であり、かつ、前記プローブ（ｂ）におけるシグナル値が、前記所定の閾値以上の場合
微生物密度は、前記微生物密度（β）以上、前記微生物密度（α）未満
パターン（３）：前記プローブ（ａ）及び前記プローブ（ｂ）におけるシグナル値が、両方ともに前記所定の閾値未満の場合
微生物密度は、前記微生物密度（β）未満
【請求項２】
前記プローブ（ｂ）の塩基配列が、前記プローブ（ａ）の塩基配列と少なくとも１塩基以上の共通配列を含み、かつ、５’末端若しくは３’末端、又はその両端に合計で３〜２５塩基付加されたことを特徴とする請求項１に記載の微生物密度の推定方法。
【請求項３】
前記プローブ（ｂ）が複数存在し、かつ、前記微生物密度（β）が複数存在する場合、前記パターンにおいて、最小の微生物密度（β）を使用することを特徴とする請求項１又は２記載の微生物密度の推定方法。
【請求項４】
環境中から採取された微生物の遺伝子を前記検査対象の微生物の遺伝子として使用し、該遺伝子をＰＣＲ法によって増幅して、前記分析対象領域のポリヌクレオチドを得ることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の微生物密度の推定方法。
【請求項５】
前記シグナル値がＳＮ比値であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の微生物密度の推定方法。
【請求項６】
請求項１〜５に記載の微生物密度の推定方法に用いるための微生物密度推定用マイクロアレイであって、
前記プローブ（ａ）として、配列番号１に示す塩基配列からなるプローブが配置され、
前記プローブ（ｂ）として、配列番号２に示す塩基配列からなるプローブ及び／又は配列番号３に示す塩基配列からなるプローブが配置された
ことを特徴とする微生物密度推定用マイクロアレイ。
【請求項７】
請求項１〜５に記載の微生物密度の推定方法に用いるための微生物密度推定用マイクロアレイであって、
前記プローブ（ａ）として、配列番号４に示す塩基配列からなるプローブが配置され、
前記プローブ（ｂ）として、配列番号５に示す塩基配列からなるプローブ及び／又は配列番号６に示す塩基配列からなるプローブが配置された
ことを特徴とする微生物密度推定用マイクロアレイ。
【請求項８】
請求項１〜５に記載の微生物密度の推定方法に用いるための微生物密度推定用マイクロアレイであって、
前記プローブ（ａ）として、配列番号７に示す塩基配列からなるプローブが配置され、
前記プローブ（ｂ）として、配列番号８に示す塩基配列からなるプローブ及び／又は配列番号９に示す塩基配列からなるプローブが配置された
ことを特徴とする微生物密度推定用マイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の検査技術に関し、特に環境中に存在する微生物の密度の推定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食品製造現場や臨床現場、農業現場、文化財保護環境等において、真菌や細菌などの微生物が存在するか否かを検査して安全性、健全性を確認するとともに、その繁殖を防止することが重要となっている。
このような微生物の検査において、遺伝子を用いた同定法が行われている。すなわち、環境中から採取した微生物からＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法などにより標的領域を増幅し、その増幅産物を解析することで、環境中の微生物を同定することが行われている。増幅産物を解析する方法としては、電気泳動によって増幅産物のサイズを分析する方法や、増幅産物と相補的に結合するプローブを配置したマイクロアレイを用いる方法などが提案されている（特許文献１、２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第５６７０６２３号公報
【特許文献２】特許第５１９６８４８号公報
【特許文献３】特許第４２９１１４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、環境中の微生物を同定すると共に、その環境中における微生物の密度を把握できれば有益である。
例えば、農薬を散布して土壌消毒を行うような場合、農作物に病気が生じる程に病原性微生物が土壌に存在していない場合であっても、安心感を得るために、農薬が散布されることがある。しかしながら、このような農薬の散布は本来無駄であり、また環境に悪影響を与えるという問題もある。
具体的には、アブラナ科野菜の根こぶ病などでは、根こぶ病菌（Plasmodiophora brassicae）が所定の土壌条件下において一定の密度以下しか存在しない場合には、農薬を散布する必要がないことが知られている。このため、環境中における微生物の密度が簡単に推定できれば、有益である。【０００５】
ここで、環境中における微生物の密度の推定に使用できそうな候補として、上述したマイクロアレイを用いる方法における、ハイブリダイゼーションの程度を示すシグナル値であるＳＮ比値を挙げることができる。
ところが、ＳＮ比値自体にもとづいて、環境中における微生物の密度を推定することは困難であった。その理由は、ＳＮ比値には、ばらつきが生じ易いという特性があるためである。【０００６】
すなわち、検査対象の微生物からＤＮＡを抽出してＰＣＲを行う場合、ＤＮＡの増幅に伴って、プライマーの反応性や酵素の反応性の相違、ＤＮＡ抽出効率の相違が増幅され、ＳＮ比値が大きくなると、大きなばらつきが生じるため、ＳＮ比値にもとづき環境中における微生物の密度を推定することは難しかった。
なお、ＳＮ比値が小さくなればなる程、そのばらつきが小さくなることから、微生物の存否を判定に用いられる閾値の近辺においては、ＳＮ比値のばらつきは比較的小さいと考えられる。【０００７】
そこで、本発明者らは鋭意研究して、感度の異なる２種類のプローブを使用することにより、ＳＮ比値を用いて微生物密度の推定を可能にする手法を開発した。
感度の異なる２種類のプローブを使用することについて記載された技術先行文献としては、特許文献３に記載のプローブを挙げることができる。
すなわち、この特許文献３に記載のプローブによれば、感度の異なる２種類のプローブで計測されたシグナル値を合算することによって、検出感度を向上させることが可能になっている。
しかしながら、この技術は、環境中における微生物の密度を推定するために適用可能なものではなかった。【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、環境中における微生物の密度を推定可能な微生物密度の推定方法、及びこれに用いるための微生物密度推定用マイクロアレイの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明の微生物密度の推定方法は、検査対象の微生物が試料中に存在する密度を推定する微生物密度の推定方法であって、
検査対象の微生物の遺伝子における分析対象領域のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする、以下の（ａ）及び（ｂ）に規定するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、これらのプローブが前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズした程度を示すシグナル値を測定し、前記シグナル値と所定の閾値にもとづいてパターン（１）〜（３）を判定することにより、前記微生物密度を推定することを特徴とする微生物密度の推定方法。
プローブ（ａ）：前記ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする塩基配列からなり、試料中に存在する該微生物の密度が特定の微生物密度（α）の場合に前記所定の閾値以上の前記シグナル値を示すものとして予め対応付けられたプローブ
プローブ（ｂ）：前記ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする塩基配列からなり、試料中に存在する該微生物の密度が前記微生物密度（α）よりも小さい特定の微生物密度（β）の場合に前記所定の閾値以上の前記シグナル値を示すものとして予め対応付けられた１つ以上のプローブ
パターン（１）：前記プローブ（ａ）及び前記プローブ（ｂ）におけるシグナル値が、両方ともに前記所定の閾値以上の場合
微生物密度は、前記微生物密度（α）以上
パターン（２）：前記プローブ（ａ）におけるシグナル値が、前記所定の閾値未満であり、かつ、前記プローブ（ｂ）におけるシグナル値が、前記所定の閾値以上の場合
微生物密度は、前記微生物密度（β）以上、前記微生物密度（α）未満
パターン（３）：前記プローブ（ａ）及び前記プローブ（ｂ）におけるシグナル値が、両方ともに前記所定の閾値未満の場合
微生物密度は、前記微生物密度（β）未満【００１０】
また、本発明の微生物密度推定用マイクロアレイは、上記の微生物密度の推定方法に用いるための微生物密度推定用マイクロアレイであって、前記（ａ）のプローブとして、配列番号１に示す塩基配列からなるプローブが配置され、前記（ｂ）のプローブとして、配列番号２に示す塩基配列からなるプローブ及び／又は配列番号３に示す塩基配列からなるプローブが配置されたものとしてある。【００１１】
また、本発明の微生物密度推定用マイクロアレイは、上記の微生物密度の推定方法に用いるための微生物密度推定用マイクロアレイであって、前記（ａ）のプローブとして、配列番号４に示す塩基配列からなるプローブが配置され、前記（ｂ）のプローブとして、配列番号５に示す塩基配列からなるプローブ及び／又は配列番号６に示す塩基配列からなるプローブが配置されたものとしてある。【００１２】
また、本発明の微生物密度推定用マイクロアレイは、上記の微生物密度の推定方法に用いるための微生物密度推定用マイクロアレイであって、前記（ａ）のプローブとして、配列番号７に示す塩基配列からなるプローブが配置され、前記（ｂ）のプローブとして、配列番号８に示す塩基配列からなるプローブ及び／又は配列番号９に示す塩基配列からなるプローブが配置されたものとしてある。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、環境中における微生物の密度を推定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施形態に係る微生物密度の推定方法の検出パターンを示す説明図である。
【図２】本発明の実施形態に係る微生物密度の推定方法に関する実験において使用したオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列を示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係る微生物密度の推定方法に関する実験において使用したオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列を示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係る微生物密度の推定方法に関する実験１において使用したオリゴヌクレオチドプローブ毎の、様々な微生物密度についてのＳＮ比値を示す図である。
【図５】本発明の実施形態に係る微生物密度の推定方法に関する実験２において使用したオリゴヌクレオチドプローブ毎の、様々な微生物密度についてのＳＮ比値を示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係る微生物密度の推定方法に関する実験３において使用したオリゴヌクレオチドプローブ毎の、様々な微生物密度についてのＳＮ比値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の微生物密度の推定方法の一実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の本実施形態及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
【００１６】
本実施形態の微生物密度の推定方法は、検査対象の微生物が試料中に存在する密度を推定する微生物密度の推定方法であって、検査対象の微生物の遺伝子における分析対象領域のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする、以下の（ａ）及び（ｂ）に規定するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、これらのプローブがポリヌクレオチドとハイブリダイズした程度を示すシグナル値を測定し、シグナル値と所定の閾値にもとづいてパターン（１）〜（３）を判定することにより、微生物密度を推定することを特徴とする。
プローブ（ａ）：ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする塩基配列からなり、試料中に存在する該微生物の密度が特定の微生物密度（α）の場合に所定の閾値以上のシグナル値を示すものとして予め対応付けられたプローブ
プローブ（ｂ）：ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする塩基配列からなり、試料中に存在する該微生物の密度が微生物密度（α）よりも小さい特定の微生物密度（β）の場合に所定の閾値以上のシグナル値を示すものとして予め対応付けられた１つ以上のプローブ
パターン（１）：プローブ（ａ）及びプローブ（ｂ）におけるシグナル値が、両方ともに所定の閾値以上の場合
微生物密度は、微生物密度（α）以上
パターン（２）：プローブ（ａ）におけるシグナル値が、所定の閾値未満であり、かつ、プローブ（ｂ）におけるシグナル値が、所定の閾値以上の場合
微生物密度は、微生物密度（β）以上、微生物密度（α）未満
パターン（３）：プローブ（ａ）及びプローブ（ｂ）におけるシグナル値が、両方ともに所定の閾値未満の場合
微生物密度は、微生物密度（β）未満
【００１７】
本実施形態の微生物密度の推定方法において、検査対象とする微生物は、真菌や細菌などとすることができるが、この「微生物」は、これらに限定されず、環境中におけるその密度を推定することに有益性が認められるその他のものを含めることができる。例えば、ダニなどの極小型の動物やウイルス等を含めることができる。
また、環境中とは、例えば食品製造現場や臨床現場、農業現場、文化財保護環境等の各種検査対象となり得る場所を意味し、これらの場所から採取された試料を環境と見なすことができる。
【００１８】
微生物密度とは、環境中、すなわち試料内に存在する微生物の密度を意味する。これを意味するものであればその単位は特に限定されないが、例えば微生物をカビの胞子とする場合、「個／ｇ乾土」によって表すことができる。
【００１９】
本実施形態の微生物密度の推定方法において使用するオリゴヌクレオチドプローブは、検査対象の微生物の遺伝子における分析対象領域のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするものであれば特に限定されないが、微生物毎に、相対的に低感度のオリゴヌクレオチドプローブ１種類と、相対的に高感度のオリゴヌクレオチドプローブ１種類とからなる２種類のプローブのセットから構成される。すなわち、次の（ａ）及び（ｂ）のプローブのセットから構成される。
プローブ（ａ）：ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする塩基配列からなり、試料中に存在する該微生物の密度が特定の微生物密度（α）の場合に所定の閾値（ＳＮ比値を用いる場合は３）以上のシグナル値を示すものとして予め対応付けられたプローブ（以下、プローブ（ａ）を単に低感度プローブと称する場合がある。）
プローブ（ｂ）：ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする塩基配列からなり、試料中に存在する該微生物の密度が微生物密度（α）よりも小さい特定の微生物密度（β）の場合に所定の閾値以上のシグナル値を示すものとして予め対応付けられた１つ以上のプローブ（以下、プローブ（ｂ）を単に高感度プローブと称する場合がある。）
【００２０】
すなわち、低感度プローブは、試料中に存在する該微生物の密度が特定の微生物密度（α）の場合に、陽性を示すことが事前に確認されたプローブである。このとき、微生物密度（α）は、低感度プローブを用いた場合に陽性となる最小の密度が選択される。例えば、後述する実験１で示されるように、低感度プローブにより密度が1800000、180000、及び18000で陽性が示される場合、微生物密度（α）として最小の18000が選択される。
【００２１】
また、高感度プローブは、試料中に存在する該微生物の密度が微生物密度（α）よりも小さい特定の微生物密度（β）の場合に、陽性を示すことが事前に確認されたプローブである。このとき、微生物密度（β）は、高感度プローブを用いた場合に陽性となる最小の密度が選択される。例えば、後述する実験１で示されるように、高感度プローブにより密度が1800000、180000、18000、及び1800で陽性が示される場合、微生物密度（β）として1800が選択される。
【００２２】
さらに、高感度プローブが複数存在し、かつ、微生物密度（β）が複数存在する場合には、最小の微生物密度（β）を推定に使用する。
例えば、実験１において、仮に高感度プローブ２により密度が180で陽性が示される場合には、微生物密度（β）として、最小の180が選択される。
【００２３】
高感度プローブの塩基配列は、低感度プローブの塩基配列と少なくとも１塩基以上の共通配列を含み、かつ、５’末端若しくは３’末端、又はその両端に合計で３〜２５塩基が付加されたものとすることが好ましく、５〜２２塩基が付加されたものとすることがより好ましく、７〜２０塩基が付加されたものとすることがさらに好ましく、７〜１０塩基が付加されたものとすることが特に好ましい。なお、低感度プローブの塩基配列長は、例えば２０〜４０塩基とすることができる。
【００２４】
高感度プローブの塩基配列長は、低感度プローブの塩基配列長よりも長いため、同一のポリヌクレオチドに対する水素結合力が低感度プローブよりも強い。このため、特にＳＮ比値が閾値に近い値を示す微生物密度の範囲において、高感度プローブは、低感度プローブに比較して高いＳＮ比値を示す。
このＳＮ比値が閾値に近い値を示す微生物密度の範囲としては、高感度プローブによるＳＮ比値が閾値となる密度からその１０倍程度とすることができる。
【００２５】
また、高感度プローブをＧＣ配列のみからなるもの、又はＧＣ配列を低感度プローブよりも多く含むものとすることによって、同一のポリヌクレオチドに対する水素結合力を低感度プローブよりも強いものとすることも可能である。
【００２６】
本実施形態の微生物密度の推定方法において、オリゴヌクレオチドプローブとして、後述する実施例で用いた図２に示すプローブを使用することができるが、本発明の技術的思想の特徴上、これらに限定されるものではないことは言うまでもない。
すなわち、具体的な例として、本実施形態の微生物密度の推定方法において使用するオリゴヌクレオチドプローブとして、配列番号１〜９によりそれぞれ特定される塩基配列からなる核酸断片を用いることができる。
【００２７】
すなわち、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）を検出するための配列番号１〜３に示す塩基配列からなるプローブのセットを用いることができる。
また、アルタナリア・アルタナータ（Alternaria alternata）を検出するための配列番号４〜６に示す塩基配列からなるプローブのセットを用いることができる。
さらに、バーティシリウム・ダーリエ（Verticillium dahliae）を検出するための配列番号７〜９に示す塩基配列からなるプローブのセットを用いることができる。
なお、これらのプローブは、それぞれの微生物のｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域から選択されたものである。
【００２８】
本実施形態の微生物密度の推定方法において、プローブがポリヌクレオチドとハイブリダイズした程度を示すシグナル値としては、例えばＳＮ比値（Signal  to  Noise  ratio）を用いることができる。Ｓ／Ｎ比値にもとづいて、環境中における検査対象の微生物の存否（測定結果が陽性であるか陰性であるか）を精度高く判定することができるためであり、一般にＳ／Ｎ比値が３以上の場合に、陽性と判定することができる。本明細書中に記載のＳ／Ｎ比値は、（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値にて算出される。なお、このシグナル値はＳＮ比値に限定されず、その他の指標を用いることもできる。
【００２９】
本実施形態の微生物密度の推定方法において、パターン（１）〜（３）の判定は、次のように行われる。
パターン（１）：プローブ（ａ）及びプローブ（ｂ）におけるシグナル値が、両方ともに所定の閾値以上の場合
微生物密度は、密度（α）以上
パターン（２）：プローブ（ａ）におけるシグナル値が所定の閾値未満であり、かつ、プローブ（ｂ）におけるシグナル値が所定の閾値以上の場合
微生物密度は、密度（β）以上、密度（α）未満
パターン（３）：プローブ（ａ）及びプローブ（ｂ）におけるシグナル値が、両方ともに所定の閾値未満の場合
微生物密度は、密度（β）未満
【００３０】
すなわち、図１に示すように、低感度プローブ及び高感度プローブが陽性を示す場合、推定される微生物密度は密度（α）以上であると判定する。
また、低感度プローブが陰性を示し、高感度プローブが陽性を示す場合、推定される微生物密度は密度（β）以上、密度（α）未満であると判定する。
また、低感度プローブ及び高感度プローブが陰性を示す場合、推定される微生物密度は密度（β）未満である判定する。
これにより、本実施形態の微生物密度の推定方法によれば、感度の異なる２種類のプローブを用いることにより、環境中に存在する微生物の密度の大凡の範囲を、比較的簡易に推定することが可能になっている。
【００３１】
本実施形態の微生物密度の推定方法において使用されるオリゴヌクレオチドプローブは、一般的なＤＮＡ合成装置により合成できる。後述する実施例で用いた配列番号１〜９に示す塩基配列からなるプローブは、いずれもＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。なお、実施例でＰＣＲに用いた配列番号１０〜１３に示す塩基配列からなるプライマーも、ＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。
【００３２】
また、本実施形態の微生物密度の推定方法において、オリゴヌクレオチドプローブをマイクロアレイ上に配置して、使用可能にすることも好ましい。
このような微生物密度推定用マイクロアレイは、例えば、配列番号１〜９に示す塩基配列を有するプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができる。
【００３３】
具体的には、このマイクロアレイとして、貼り付け型のＤＮＡチップを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
【００３４】
また、この微生物密度推定用マイクロアレイには、例えば配列番号１〜９に示す塩基配列を有するプローブの全部を配置しても良く、微生物毎のプローブのセットのみをそれぞれ配置したものとすることもできる。
【００３５】
本実施形態の微生物密度の推定方法は、例えば以下の事前準備を含めて好適に行うことができる。
まず、微生物を含む検体を環境中から採取する。このとき、必要に応じて、乾燥、破砕、ふるいがけ、及び濃縮等を行う。
【００３６】
次に、採取された微生物からＤＮＡを抽出する。そして、抽出したゲノムＤＮＡにおける標的領域を、例えばＰＣＲ法により増幅させる。
そして、得られた増幅産物を微生物密度推定用マイクロアレイに滴下して、これに配置されたプローブにハイブリダイズした増幅産物の標識を検出する。この標識として蛍光強度などを用いて、ハイブリダイズした程度を示すシグナル値としてＳＮ比値等を算出する。
【００３７】
本実施形態の微生物密度の推定方法では、環境中における微生物の密度の大凡の範囲を推定することを可能としている。特に、微生物密度が中程度であるのか、又は小さいのかを簡易に判別し得るため、例えば病原菌が一定の密度以下しか存在しないことを明らかにして、薬剤の散布などを抑制できる場合がある点で有益である。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明の実施形態に係る微生物密度の推定方法の適用事例を示す実験について、具体的に説明する。
［実験１］
検出対象の微生物として、独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（NITE  Biological  Resource  Center）から入手した菌株のものを使用した。具体的には、次の３種類のカビを使用した。
（１）フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）（NBRC 31629）
（２）アルタナリア・アルタナータ（Alternaria alternata）（NBRC 106339）
（３）バーティシリウム・ダーリエ（Verticillium dahliae）（NBRC 9435）【００３９】
また、これらのカビを検出して、その密度を推定可能にするための微生物密度推定用マイクロアレイを作成した。具体的には、ジーンシリコン（Ｒ）（東洋鋼鈑株式会社製）を用い、これに図２に示す配列番号１〜９のプローブを配置したものを使用した。各プローブは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成したものを使用した。また、各プローブの基板への固定化は、マイクロアレイヤーにより行った。【００４０】
実験１では、微生物密度推定用マイクロアレイにおける、フザリウム・オキシスポラムを検出するための配列番号１〜３に示す塩基配列からなるプローブを微生物密度の推定に使用した。
すなわち、配列番号１に示す塩基配列からなるプローブは、フザリウム・オキシスポラムの密度を推定するための低感度プローブであり、配列番号２に示す塩基配列からなるプローブと配列番号３に示す塩基配列からなるプローブは、フザリウム・オキシスポラムの密度を推定するための高感度プローブである。
高感度プローブにおける低感度プローブと相違する配列部分を図２において太字二重下線で示している。図２におけるその他のカビを検出するためのプローブについても同様である。【００４１】
また、フザリウム・オキシスポラムを、ＰＤＡ培地を配置した培養プレート上で、２５℃の暗所で７日間培養して胞子を形成させた。
次に、胞子が形成された培養プレート上に0.05%Tween80生食水を10 mL注ぎ、コンラージ棒で胞子を軽く撫でてそぎ落とし、水溶液中に分散させた。次いで、胞子を分散させた水溶液をピペットで回収し、滅菌ガーゼでろ過して菌糸を取り除いた後、ろ液を3,000gで10分間遠心して上清を取り除いた。沈殿した胞子に水溶液を100 μL加えて懸濁したものを胞子液とした。そして、胞子液をトーマ血球計算盤で計数することによって、10^8から10^0の胞子を含む１０倍段階希釈系列胞子液を作成した。【００４２】
次に、得られた胞子液を土壌と混和させて土壌サンプルを作成し、土壌サンプルを用いてＤＮＡの抽出を行った。具体的には、乾燥させた市販土壌0.2 g（ニッピ園芸培土1号）と直径1 mmのガラスビーズ 0.2 gを添加したチューブに、10^6〜10^0 胞子/g乾土のカビ胞子密度となるよう胞子液を添加することで土壌サンプルを調製した。
各土壌サンプルを、0.2 g/mLスキムミルク 80 μL、100 mM Tris-HCl,40 mM EDTA バッファー 250 μL、10%SDS 50 μL、塩化ベンジル 150 μLと共に、ビードビーターを使用して、4,200 rpmで1分間破砕した。【００４３】
そして、60℃、15 分間加熱した破砕サンプルに3M sodium acetate 150 μLを添加した後、15分間氷冷して、市販ＤＮＡキット（FAVORGEN Plant Genomic DNA Extraction Mini Kit）を使用してＤＮＡを抽出し、精製ＤＮＡを得た。
得られた精製ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法により、フザリウム・オキシスポラムのＩＴＳ領域を増幅した。このとき、既存のプロトコルをそのまま用いたため、ＰＣＲ用の反応液として、図３に示すＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号１０に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１１に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットと、βチューブリン遺伝子を増幅させるための配列番号１２に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１３に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットが含まれるものを使用したが、使用したプローブに対応する増幅対象領域は、ＩＴＳ領域のみである。これらのプライマーは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社により合成した。【００４４】
ＰＣＲ用反応液としては、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、菌株毎に、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．Ampdirect(G/Crich)  4.0μl
２．Ampdirect(addition-4)  4.0μl
３．dNTPmix  1.0μl
４．Cy-5dCTP  0.2μl
５．ITS領域フォワードプライマー(2.5μM)  1.0μl
６．ITS領域リバースプライマー(2.5μM)  1.0μl
７．βチューブリン遺伝子フォワードプライマー(10μM)  1.0μl
８．βチューブリン遺伝子リバースプライマー(10μM)  1.0μl
９．NovaTaq  HotStart  DNA  polymerase  0.2μl
１０．Template  DNA 4.0μl
１１．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）【００４５】
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（Ｒ）  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  タカラバイオ株式会社製）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃  １０分
（b）９５℃  ３０秒
（c）５６℃  ３０秒
（d）７２℃  ６０秒（（b）〜（d）を４０サイクル）
（e）７２℃  １０分【００４６】
次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、９４℃で５分間加温し、上記の微生物密度推定用マイクロアレイに滴下した。このマイクロアレイを４５℃で１時間静置し、上記の緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物を洗い流した。
そして、標識検出装置（ＢＩＯＳＨＯＴ（Ｒ），東洋鋼鈑株式会社製）を用いて、微生物密度推定用マイクロアレイに配置された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定して、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値（（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）を取得した。その結果を図４に示す。【００４７】
なお、微生物密度推定用マイクロアレイには、各プローブをスポッティングしたスポットを１個ずつ配置した。そして、上記操作を３反復行うことで取得した各スポットにおけるＳＮ比値の平均値を図４におけるＳＮ比値とした。以下においても同様である。なお、ＳＮ比値の判定方法として、各スポットにおける平均値を用いることなく、３反復全てのＳＮ比値が３以上の場合に陽性とすることも可能である。【００４８】
図４を参照すると、低感度プローブと高感度プローブにおけるＳＮ比値が、両方ともに陽性（３以上）となっているのは、試料３であり、これは図１におけるパターン（１）に相当する。
したがって、低感度プローブと高感度プローブが、当該パターンを示す場合、試料中におけるフザリウム・オキシスポラムの密度は、微生物密度（α）に対応する18000（個／ｇ乾土）以上であると推定される。【００４９】
また、低感度プローブにおけるＳＮ比値が陰性（３未満）であり、高感度プローブにおけるＳＮ比値が陽性となっているのは、試料４であり、これは図１におけるパターン（２）に相当する。
したがって、低感度プローブと高感度プローブが、当該パターンを示す場合、試料中におけるフザリウム・オキシスポラムの密度は、微生物密度（β）に対応する1800（個／ｇ乾土）以上、18000（個／ｇ乾土）未満であると推定される。【００５０】
さらに、低感度プローブと高感度プローブにおけるＳＮ比値が、両方ともに陰性となっているのは、試料５であり、これは図１におけるパターン（３）に相当する。
したがって、低感度プローブと高感度プローブが、当該パターンを示す場合、試料中におけるフザリウム・オキシスポラムの密度は、1800（個／ｇ乾土）未満であると推定される。【００５１】
ここで、現実の各種環境下からサンプルを採取して、微生物密度を推定する場合、各試料における微生物密度は不明である。
そして、本実施形態の微生物密度の推定方法により、低感度プローブと高感度プローブにおけるＳＮ比値にもとづき上記のパターンを判別することによって、同様に、その微生物密度が、18000（個／ｇ乾土）以上であるのか、1800（個／ｇ乾土）以上、18000（個／ｇ乾土）未満であるのか、又は、1800（個／ｇ乾土）未満であるのかということを大凡把握することが可能になっている。これは、以下の実験においても同様である。【００５２】
また、図４において、仮に、高感度プローブ２における試料５のＳＮ比値が３以上であった場合、微生物密度の推定パターン（２）及び（３）において、最小の微生物密度（β）（この場合、180（個／ｇ乾土））が用いられる。
すなわち、この場合、低感度プローブとこの高感度プローブ２が微生物密度の推定に使用されて、微生物密度が、18000（個／ｇ乾土）以上であるのか、180（個／ｇ乾土）以上、18000（個／ｇ乾土）未満であるのか、又は、180（個／ｇ乾土）未満であるのかということを判定することが可能である。【００５３】
なお、本実験では、微生物密度（α）として18000（個／ｇ乾土）を用い、微生物密度（β）として1800（個／ｇ乾土）を用いたが、例えば、横軸を微生物密度、縦軸をＳＮ比値として、低感度プローブ及び高感度プローブにおけるＳＮ比値の実測データをプロットして、それぞれのグラフを作成し、低感度プローブのグラフとＳＮ比値＝３との交点を微生物密度（α）、高感度プローブのグラフとＳＮ比値＝３との交点を微生物密度（β）として算出して決定することもできる。
微生物密度（α）及び微生物密度（β）をこのように決定すれば、微生物密度の推定精度をより向上させることが可能となる。【００５４】
［実験２］
実験２では、実験１と同じ微生物密度推定用マイクロアレイにおける、アルタナリア・アルタナータを検出するための配列番号４〜６に示す塩基配列からなるプローブを微生物密度の推定に使用した。
すなわち、配列番号４に示す塩基配列からなるプローブは、アルタナリア・アルタナータの密度を推定するための低感度プローブであり、配列番号５に示す塩基配列からなるプローブと配列番号６に示す塩基配列からなるプローブは、アルタナリア・アルタナータの密度を推定するための高感度プローブである。【００５５】
また、アルタナリア・アルタナータを、実験１と同様に培養して胞子を形成させ、１０倍段階希釈系列胞子液を作成した。また、得られた胞子液を土壌と混和させて土壌サンプルを作成し、土壌サンプルを用いてＤＮＡの抽出を行った。
次に、得られた精製ＤＮＡを用いて、実験１と同様に、ＰＣＲ法により、当該カビのＩＴＳ領域を増幅した。
そして、ＰＣＲ増幅産物と、上記の微生物密度推定用マイクロアレイを使用して、実験１と同様に各プローブにおけるＳ／Ｎ比値を取得した。その結果を図５に示す。【００５６】
図５を参照すると、低感度プローブと高感度プローブにおけるＳＮ比値が、両方ともに陽性となっているのは、試料６であり、これは図１におけるパターン（１）に相当する。
したがって、低感度プローブと高感度プローブが、当該パターンを示す場合、試料中におけるアルタナリア・アルタナータの密度は、微生物密度（α）に対応する1500000（個／ｇ乾土）以上であると推定される。【００５７】
また、低感度プローブにおけるＳＮ比値が陰性であり、高感度プローブにおけるＳＮ比値が陽性となっているのは、試料７であり、これは図１におけるパターン（２）に相当する。
したがって、低感度プローブと高感度プローブが、当該パターンを示す場合、試料中におけるアルタナリア・アルタナータの密度は、微生物密度（β）に対応する150000（個／ｇ乾土）以上、1500000（個／ｇ乾土）未満であると推定される。【００５８】
さらに、低感度プローブと高感度プローブにおけるＳＮ比値が、両方ともに陰性となっているのは、試料８であり、これは図１におけるパターン（３）に相当する。
したがって、低感度プローブと高感度プローブが、当該パターンを示す場合、試料中におけるアルタナリア・アルタナータの密度は、150000（個／ｇ乾土）未満であると推定される。【００５９】
［実験３］
実験３では、実験１と同じ微生物密度推定用マイクロアレイにおける、バーティシリウム・ダーリエを検出するための配列番号７〜９に示す塩基配列からなるプローブを微生物密度の推定に使用した。
すなわち、配列番号７に示す塩基配列からなるプローブは、バーティシリウム・ダーリエの密度を推定するための低感度プローブであり、配列番号８に示す塩基配列からなるプローブと配列番号９に示す塩基配列からなるプローブは、バーティシリウム・ダーリエの密度を推定するための高感度プローブである。【００６０】
また、バーティシリウム・ダーリエを、実験１と同様にして培養して胞子を形成させ、１０倍段階希釈系列胞子液を作成した。また、得られた胞子液を土壌と混和させて土壌サンプルを作成し、土壌サンプルを用いてＤＮＡの抽出を行った。
次に、得られた精製ＤＮＡを用いて、実験１と同様に、ＰＣＲ法により、当該カビのＩＴＳ領域を増幅した。
そして、ＰＣＲ増幅産物と、上記の微生物密度推定用マイクロアレイを使用して、実験１と同様に各プローブにおけるＳ／Ｎ比値を取得した。その結果を図６に示す。【００６１】
図６を参照すると、低感度プローブと高感度プローブにおけるＳＮ比値が、両方ともに陽性となっているのは、試料１３であり、これは図１におけるパターン（１）に相当する。
したがって、低感度プローブと高感度プローブが、当該パターンを示す場合、試料中におけるバーティシリウム・ダーリエの密度は、微生物密度（α）に対応する75000（個／ｇ乾土）以上であると推定される。【００６２】
また、低感度プローブにおけるＳＮ比値が陰性であり、高感度プローブにおけるＳＮ比値が陽性となっているのは、試料１４であり、これは図１におけるパターン（２）に相当する。
したがって、低感度プローブと高感度プローブが、当該パターンを示す場合、試料中におけるバーティシリウム・ダーリエの密度は、微生物密度（β）に対応する7500（個／ｇ乾土）以上、75000（個／ｇ乾土）未満であると推定される。【００６３】
さらに、低感度プローブと高感度プローブにおけるＳＮ比値が、両方ともに陰性となっているのは、試料１５であり、これは図１におけるパターン（３）に相当する。
したがって、低感度プローブと高感度プローブが、当該パターンを示す場合、試料中におけるバーティシリウム・ダーリエの密度は、7500（個／ｇ乾土）未満であると推定される。【００６４】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、本実施形態の微生物密度の推定方法で使用するオリゴヌクレオチドプローブは、実施例に示したもののみならず、その他のプローブを用いても良く、適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は、環境検査、食品検査、疫学的環境検査、臨床試験、家畜衛生、植物病害診断等において、環境中に存在する微生物の密度の大凡の範囲を簡易に推定する場合に好適に利用することが可能である。【００６６】
この明細書に記載の文献及び本願のパリ優先の基礎となる日本出願明細書の内容を全てここに援用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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