(57)【要約】  本発明によれば、核酸の効果的なデリバリー系が提供される。具体的には、本発明は、カチオン性基を含む部分に異なる複数のアミン官能基を有する側鎖を有し、かつ該側鎖の一部に疎水性基が導入されたカチオン性ポリ（アミノ酸）、ならびに該ポリ（アミノ酸）とオリゴもしくはポリヌクレオチドとのポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表されるカチオン性のポリ（アミノ酸）：
【化１】
2010093036.tif 000005
式中、
Ｒ１は、ヒドロキシル基、炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキルオキシ基、炭素数２〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルケニルオキシ基、炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキニルオキシ基または炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキル置換イミノ基を表し、
Ｒ２は、水素原子、炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキル基または炭素数１〜２４の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキルカルボニル基を表し、
Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、相互に独立して、メチレン基またはエチレン基を表し、
Ｒ４ａおよびＲ４ｂは、相互に独立して、下記の基：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ１−〕ｒ１ＮＨ２（ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ２−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ２−ＮＨ２〕２    （ｉｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ３−Ｎ｛〔−（ＣＨ２）ｑ３−ＮＨ２〕〔−（ＣＨ２）ｑ４−ＮＨ〕ｒ２Ｈ｝ （ｉｉｉ）；および
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ４−Ｎ｛−（ＣＨ２）ｑ５−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ６−ＮＨ２〕２｝２  （ｉｖ）
よりなる群の同一もしくは異なる基から選ばれ、
ここで、ｐ１〜ｐ４、ｑ１〜６、およびｒ１〜２は、それぞれ相互に独立して、１〜５の整数であり、
Ｒ４ａおよびＲ４ｂの基は、その総数の５〜４０％の少なくとも１つのアミノ基の水素原子が、炭素数６〜２７の飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝状の脂肪族炭化水素残基を有するアシル基またはステロールオキシカルボニル基により置換されており、
ｎは、３０〜５、０００の整数であり、
ｙは、０〜５，０００の整数であり、
但し、Ｒ３ａおよびＲ３ｂがメチレン基の場合には、ｙはｎより小さい整数である。
【請求項２】
請求項１記載のカチオン性のポリ（アミノ酸）であって、式（１）における、Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、相互に独立して、メチレン基を表す、上記のポリ（アミノ酸）。
【請求項３】
請求項１記載のカチオン性のポリ（アミノ酸）であって、式（１）における、Ｒ３ａがエチレン基を表し、かつ、ｙが０である、上記のポリ（アミノ酸）。
【請求項４】
請求項１または２に記載のカチオン性のポリ（アミノ酸）であって、Ｒ４ａおよびＲ４ｂが、相互に独立して、下記の基：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ１−〕ｒ１ＮＨ２  （ｉ）；
を表し、ここで、ｐ１およびｑ１が相互に独立して２または３であり、そしてｒ１が１〜３の整数であり、
Ｒ４ａおよびＲ４ｂの基は、その総数の１０〜３０％のアミノ基の水素原子が、炭素数６〜２７の飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝状の脂肪族炭化水素残基を有するアシル基により置換されている、上記のポリ（アミノ酸）。
【請求項５】
請求項３に記載のカチオン性のポリ（アミノ酸）であって、Ｒ４ａが下記の基：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ１−〕ｒ１ＮＨ２  （ｉ）；
を表し、ここで、ｐ１およびｑ１が相互に独立して２または３であり、そしてｒ１が１〜３の整数であり、
Ｒ４ａの基は、その総数の１０〜３０％のアミノ基の水素原子が、炭素数６〜２７の飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝状の脂肪族炭化水素残基を有するアシル基により置換されている、上記のポリ（アミノ酸）。
【請求項６】
下記式（２）で表されるブロックコポリマー：
【化２】
2010093036.tif 000006
式中、Ｒ２、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、ｎおよびｙは、請求項１の上記式（１）
について定義したのと同義であり、
Ｌ１は−Ｓ−Ｓ−または原子価結合であり、
Ｌ２は−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｐ１−ＮＨ−、または−Ｌ２ａ−（ＣＨ２）ｑ１−Ｌ２ｂ−であり、ここで、ｐ１およびｑ１は、相互に独立して、１〜５の整数であり、Ｌ２ａはＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯであり、Ｌ２ｂはＮＨまたはＯであり、
Ｒ５は、水素原子、または未置換もしくは置換された炭素数１〜１２の直鎖もしくは分枝状のアルキル基であり、そして
ｍは、３０〜２０，０００の整数を表す。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかの１に記載のポリ（アミノ酸）と核酸のポリイオンコンプレックス。
【請求項８】
請求項６に記載ブロックコポリマーと核酸のポリイオンコンプレックス。
【請求項９】
核酸が、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アプタマーおよびリボザイムよりなる群から選ばれる、請求項７記載のポリイオンコンプレックス。
【請求項１０】
核酸が、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アプタマーおよびリボザイムよりなる群から選ばれる、請求項８記載のポリイオンコンプレックス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、側鎖の一部に疎水性基が導入されたカチオン性ポリ（アミノ酸）に関する。より具体的には、本発明はカチオン性基を含む部分に異なる複数のアミン官能基を有する側鎖を有し、かつ該側鎖の一部に疎水性基が導入されたカチオン性ポリ（アミノ酸）および該ポリ（アミノ酸）とオリゴもしくはポリヌクレオチドとのポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを特異的かつ効果的にノックダウンできることから、その医療応用に対する期待が高まっているが、ｓｉＲＮＡを医療に応用するには効果的なデリバリーシステムの開発が必要不可欠である。近年、臨床治験中であるｎａｋｅｄ  ｓｉＲＮＡの眼球内投与による加齢黄斑変性（ＣＮＶ）の治療効果が、ｓｉＲＮＡによる配列特異的な遺伝子ノックダウン効果によるものではなく、細胞表面のＴｏｌｌ様受容体−３（ＴＬＲ−３）による認識を介した配列非特異的な効果によることが明らかにされ、いかなるｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ応用においても、細胞外では安定であるが細胞内に的確にｓｉＲＮＡを送達できるキャリヤーの開発が重要であると考えられている。【０００３】
ＤＮＡとポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を形成して真核細胞に遺伝子を導入し、該遺伝子を発現するカチオン性ポリマーとして早くから知られていたポリ（Ｌ−リシン）やポリエチレンイミンは、遺伝子の発現効率があまり高くないか、また、細胞に対する毒性が高い等の問題があった。このような問題点を解決すべく多種多様のカチオン性ポリマーが提供されている。例えば、ポリ（Ｌ−リシン）のε−アミノ基を介して親水性基（例えば、ポリエチレングリコール）と疎水性基（例えば、パルミトイル）が導入されたポリ（Ｌ−リシン）誘導体は、水性媒体中においてコレステロールの存在下でベシクルを形成し、該ベシクルは遺伝子の組み込まれたプラスミドＤＮＡを凝集し、安定な複合体を形成することが知られている（特許文献１）。また、ポリ（Ｌ−リシン）−ポリ（エチレングリコール）のコポリマーであって、ポリ（Ｌ−リシン）のε−アミノ基をチオレート化することによりカチオン荷電とジスルフィド架橋密度を調節したコポリマー誘導体とプラスミドＤＮＡのＰＩＣは細胞外媒体中での高い安定性と細胞内コンパートメント内での効果的な該ＤＮＡの放出を示すことが知られている（本発明者らの一部を共著者とする非特許文献１）。また、本発明者等はこのような研究の一環として、側鎖にエチレンジアミン構造を有するポリ（Ｎ−［Ｎ−（２−アミノエチル）−２−アミノエチル］アスパルタミド（ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））および該ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）をブロックコポリマーの一ブロック成分として含むコポリマーを製造したところ、このようなポリマーは、低い細胞毒性を示し、しかも、プラスミドＤＮＡを高効率で細胞内に導入し、該ＤＮＡ中に組み込まれた遺伝子を効率よく発現することを確認した（非特許文献２、特許文献２、特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ  ９９／６１５１２
【特許文献２】ＷＯ  ２００６／０８５６６４  Ａ１
【特許文献３】ＷＯ  ２００７／０９９６６０  Ａ１
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋ．Ｍｉｈａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．    ２００４，１２６，２３５５−２３６１
【非特許文献２】Ｋ．Ｍｉｙａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．    ２００８，１３０，１６２８７−１６２９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記特許文献２および３に開示されたＰＡｓｐ（ＤＥＴ）およびそのブロックコポリマーは、核酸分子を送達しようとする標的細胞に対して低い毒性と高い遺伝子導入効率を示すものの、上述したように、医療応用に対する期待が高まっているｓｉＲＮＡのような小分子核酸と生理的条件下で必ずしも高い安定性を有するＰＩＣを形成できない場合がある。したがって、本発明の目的は、ｓｉＲＮＡのような小分子核酸と生理的条件下でより高い安定性を示し、かつ、核酸分子を送達しようとする標的細胞に対して低い毒性と高い遺伝子導入効率を示すキャリヤーとなりうる合成ポリマー材料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
今ここに、カチオン性基を含む部分に異なる複数のアミン官能基を有する側鎖を有し、かつ該側鎖の一部に疎水性基が導入されたカチオン性ポリ（アミノ酸）は、核酸分子を送達しようとする標的細胞に対して全く毒性を示さないかまたは殆ど毒性を示すことなく、ｓｉＲＮＡのような小分子核酸とも安定なＰＩＣを形成することができることが見出された。さらに、こうして形成するＰＩＣは、一定条件下、水性媒体中で平均直径百数ｎｍの比較的単分散の安定な会合体を形成し、しかも、標的細胞に高効率で取り込まれ、かつ、ｓｉＲＮＡが本来有している効果を奏することも見出された。【０００８】
したがって、本発明によれば、下記式（１）および式（２）で表されるポリ（アミノ酸）誘導体を提供することにより、上記課題が解決される。
【化１】
2010093036.tif 000002
式中、
Ｒ１は、ヒドロキシル基、炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキルオキシ基、炭素数２〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルケニルオキシ基、炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキニルオキシ基または炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキル置換イミノ基を表し、
Ｒ２は、水素原子、炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキル基または炭素数１〜２４の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキルカルボニル基を表し、
Ｒ３ａおよびＲ３ｂは、相互に独立して、メチレン基またはエチレン基を表し、
Ｒ４ａおよびＲ４ｂは、相互に独立して、下記の基：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ１−〕ｒ１ＮＨ２  （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ２−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ２−ＮＨ２〕２    （ｉｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ３−Ｎ｛〔−（ＣＨ２）ｑ３−ＮＨ２〕〔−（ＣＨ２）ｑ４−ＮＨ〕ｒ２Ｈ｝ （ｉｉｉ）；および
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ４−Ｎ｛−（ＣＨ２）ｑ５−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ６−ＮＨ２〕２｝２  （ｉｖ）
よりなる群の同一もしくは異なる基から選ばれ、
ここで、ｐ１〜ｐ４、ｑ１〜６、およびｒ１〜２は、それぞれ相互に独立して、１〜５の整数であり、
Ｒ４ａおよびＲ４ｂの基は、その総数の５〜４０％の少なくとも１つのアミノ基の水素原子が、炭素数６〜２７の飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝状の脂肪族炭化水素残基を有するアシル基、またはステロールオキシカルボニル基により置換されており、
ｎは、３０〜５、０００の整数であり、
ｙは、０〜５，０００の整数であり、
但し、Ｒ３ａおよびＲ３ｂがメチレン基の場合には、ｙはｎより小さい整数である。
【化２】
2010093036.tif 000003
式中、Ｒ２、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、ｎおよびｙは、上記式（１）について定義したのと同義であり、
Ｌ１は−Ｓ−Ｓ−または原子価結合であり、
Ｌ２は−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｐ１−ＮＨ−、または−Ｌ２ａ−（ＣＨ２）ｑ１−Ｌ２ｂ−であり、ここで、ｐ１およびｑ１は、相互に独立して、１〜５の整数であり、Ｌ２ａはＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯであり、Ｌ２ｂはＮＨまたはＯであり、
Ｒ５は、水素原子、または未置換もしくは置換された炭素数１〜１２の直鎖もしくは分枝状のアルキル基であり、そして
ｍは、３０〜２０，０００の整数を表す。【０００９】
上記式（１）および式（２）中の基もしくは部分、またはそれらについて定義する基は、特記しない限り、記載された方向性において共有結合されているものと理解されねばならない。ただし、上記式（１）および式（２）中の繰り返し数がｎ−ｙである反復単位および繰り返し数がｙである反復単位の並び方は任意であり、ブロック、ランダム、交互等の任意の構造であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１（１）に係る方法で製造されたＰＡｓｐ（ＤＥＴ）（左図）およびＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴの構造式をそれぞれ表す図である。
【図２】実施例１（２）に係る方法で形成されたＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ１９％とｓｉＲＮＡのＰＩＣについて行ったポリアクリルアミドゲルの電気泳動の結果を表す図に代わる写真である。
【図３】実施例１（２）の上記ＰＩＣの粒径および多分散度を動的光散乱により評価した結果をグラフ表示した図である。Ｎ／Ｐ＝５．０において、ＳＴ１２％ミセルの平均サイズは１７１ｎｍ、多分酸度（ＰＤＩ）は０．１４４であり、一方、ＳＴ１９％ミセルの平均サイズは１５２ｎｍ、多分散度は０．１００である。
【図４】実施例２（１）の上記ＰＩＣによる内在性遺伝子Ｂｃｌ−２のノックダウン試験を行った結果をグラフ表示した図である。
【図５】実施例２（１）における上記ＰＩＣを用いたノックダウン試験における細胞毒性を評価した結果をグラフ表示した図である。
【図６】実施例２（２）の上記ＰＩＣによる内在性遺伝子ＶＥＧＦのノックダウン試験を行った結果（ＶＥＧＦの発現の評価）をグラフ表示した図である。
【図７】実施例２（２）の上記ＰＩＣによる内在性遺伝子ＶＥＧＦのノックダウン試験を行った結果（ＶＥＧＦのタンパク質レベルでの評価）をグラフ表示した図である。
【図８】実施例３（１）で合成したＰＥＧ−ＳＳ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴとｓｉＲＮＡとのポリマーミセル形成につての概念図である。
【図９】実施例３（３）のＰＥＧ−ＳＳ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴとｓｉＲＮＡとの複合体を用いるｓｉＲＮＡトランスフェクション試験の結果をグラフ表示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明をより具体的に説明する。
【００１２】
理論により拘束されるものでないが、本発明のカチオン性ポリ（アミノ酸）は、カチオン性基を含む部分に異なる複数のアミン官能基を有する側鎖を有することによりｐＫａが複数段階を示し、生理条件であるｐＨ７．４においては複数のアミン官能基は部分的にプロトン化状態にあり核酸と相互作用することによりポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を形成することができる。また、こうして形成されたＰＩＣはエンドソーム内（ｐＨ５．５）へ取り込まれてｐＨが下がるとカチオン性ポリアミノ酸のプロトン化がさらに進行し、バッファー効果（またはプロトンスポンジ効果）によりエンドソームエスケープを促進させることにより細胞に対するダメージを軽減するものと理解できる。一方で、カチオン性基を含む部分に一定の割合で疎水性基を導入すると、その導入が上記バッファー効果（またはプロトンスポンジ効果）に悪影響を及ぼすことなく、ＰＩＣが疎水性相互作用によって安定化され、こうして平均直径百数ｎｍの比較的単分散の安定な会合体を形成するものと理解される。また、本発明に従う、上記のようなカチオン性ポリ（アミノ酸）は、特許文献３のものと同様にＰＥＧセグメントとのブロックコポリマーとすることにより該カチオン性ポリ（アミノ酸）それ自体が有する上記の特性を少なくとも保持したまま、循環血液中における良好な滞留性を示すポリマーミセルを形成できる。
【００１３】
式（１）および式（２）におけるＲ１およびＲ２の定義で称する、炭素数１〜１２の直鎖もしくは分枝状のアルキル基またはアルキル置換イミノ基等の該アルキル部分としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、デシル基、およびウンデシル基等を挙げることができる。炭素数２〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルケニルオキシ基等または炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキニルオキシ基等における、アルケニルまたはアルキニル部分は、炭素数が２以上の上記に例示したアルキル基中に二重結合または三重結合を含むものを挙げることができる。
【００１４】
このような基または部分について、「置換された」場合の置換基としては、限定されるものでないが、Ｃ１−６アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールＣ１−３オキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、トリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基、シリルアミノ基を示すか、またはアセタール化ホルミル基、ホルミル基、ハロゲン、塩素もしくはフッ素を挙げることができる。ここで、例えば、Ｃ１−６のごとき表示は、炭素数１〜６を意味し、以下同様な意味を表すものとして使用する。さらに、炭素数１〜２４の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキルカルボニル基の内の炭素数１〜１２の未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝状のアルキル部分は上述した例示を参考にでき、炭素数１３以上のアルキル部分は、例えば、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ノナデシル基、ドコサニル基およびテトラコシル基等を挙げることができる。
【００１５】
Ｒ３ａおよびＲ３ｂの定義におけるメチレン基またはエチレン基が、Ｒ３ａおよびＲ３ｂの両者ともメチレン基を表す場合には、このような定義を伴う反復単位は、ポリ（アスパラギン酸）由来の単位を表し、これらの基をそれぞれ有する単位はランダムに存在するものと理解されている。一方、Ｒ３ａおよびＲ３ｂの両者がエチレン基を表す場合には、このような定義を伴う反復単位は、ポリ（グルタミン酸）由来の単位を表し、ここでは、ｙが整数０であるか、またはｎ−ｙが整数０であるポリマーを表すことになる。前者は、例えば、グルタミン酸γ−ベンジルエステルのＮ−カルボン酸無水物の重合により得られるポリ−α−グルタミン酸由来の単位を表し、一方後者は、例えば、納豆菌をはじめとする細菌バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株が生産するポリ−γ−グルタミン酸由来の単位を表す。
【００１６】
Ｒ４ａおよびＲ４ｂの基について定義する、
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ１−〕ｒ１ＮＨ２  （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ２−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ２−ＮＨ２〕２    （ｉｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ３−Ｎ｛〔−（ＣＨ２）ｑ３−ＮＨ２〕〔−（ＣＨ２）ｑ４−ＮＨ〕ｒ２Ｈ｝ （ｉｉｉ）；および
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ４−Ｎ｛−（ＣＨ２）ｑ５−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ６−ＮＨ２〕２｝２  （ｉｖ）
よりなる群から選ばれる基は同一の基であることが好ましく、また、ｐ１〜ｐ４およびｑ１〜６はそれぞれ相互に独立して２または３であることが好ましいが、より好ましくは２である。一方、ｒ１およびｒ２は、それぞれ相互に独立して、１〜３の整数であることが好ましい。
【００１７】
Ｒ４ａおよびＲ４ｂの基は、その総数、ｎまたはｙの５〜４０％、好ましくは１０〜３０％、より好ましくは１５〜２５％の基の少なくとも１のアミノ基の水素原子が炭素数６〜２７の飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分枝状の脂肪族炭化水素残基を有するアシル基またはステロールオキシカルボニル基により置換されている。脂肪族炭化水素残基が飽和である場合は、炭素数６〜２７のアルキル基に等価であり、上記アルキル基に加えてペンタコシル基、ヘキサコシル基、へプタコシル基等が例示される。不飽和の脂肪族炭化水素残基は、該アルキル基の鎖中の炭素−炭素単結合の１〜５個が炭素−炭素二重結合となっている基に該当する。このような残基（Ｒ）を有するアシル基（ＲＣＯ−）の例としては、限定されるものでないが、ラウリン酸（またはドデカン酸）、ミリスチン酸（またはテトラデカン酸）、パルミチン酸（またはヘキサデカン酸）、パルミトオレイン酸（または９−ヘキサデセン酸）、ステアリン酸（またはオクタデカン酸）、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エレオステアリン酸（または９，１１，１３−オクタデカトリエン酸）、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸等を挙げることができる。
【００１８】
本発明にいう、ステロールとは、シクロペンタノンヒドロフェナントレン環（Ｃ１７Ｈ２８）をベースとする天然、半合成または合成の化合物、さらにはそれらの誘導体を意味し、例えば、天然のステロールとしては、限定されるものではないが、コレステロール、コレスタノール、ジヒドロコレステロール、コール酸、カンペステロール、シストステロール等が挙げられ、その半合成または合成の化合物としては、これら天然物の例えば、合成前駆体（必要により、存在する場合には、一定の官能基、ヒドロキシ基の一部もしくは全部が当該技術分野で既知のヒドロキシ保護基により保護されているか、またはカルボキシル基がカルボキシル保護により保護されている化合物を包含する）であることができる。また、ステロール誘導体とは、本発明の目的に悪影響を及ぼさない範囲内で、シクロペンタノンヒドロフェナントレン環にＣ１−１２アルキル基、ハロゲン原子、例えば、塩素、臭素、フッ素、が導入されていてもよく、該環系は飽和、部分不飽和、であることができること等を意味する。ステロール誘導体の残基は、好ましくは、コレステロール、コレスタノール、ジヒドロキシコレステロールの３位ヒドロキシ基の水素原子が除去された基である。さらに好ましくは、コレステロール３位ヒドロキシ基の水素原子が除去された基である。ステロールオキシカルボニル基のステロールとしては、コレステロール、コレスタノール、ジヒドロコレステロール、コール酸、カンペステロール、シストステロール等の動植物油起源のものが挙げられる。
【００１９】
アミノ酸の反復単位の個数を表す、ｎは、３０〜５，０００であることができるが、合成上の便宜を考慮すると、３０〜３００、好ましくは６０〜１５０、さらに好ましくは６０〜１００であることができる。また、ｙは、０〜５，０００であることができるが、合成上の便宜を考慮すると、３０〜３００、好ましくは６０〜１５０、さらに好ましくは６０〜１００であることができる。
【００２０】
本発明によれば、さらに式（２）で表されるブロックコポリマーも提供できる。式（２）において、式中、Ｒ２、Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、ｎおよびｙは、上記式（１）について定義し、上述したのと同義である。
【００２１】
Ｌ１は−Ｓ−Ｓ−または原子価結合である。一方、Ｌ２は−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｐ１−ＮＨ−、または−Ｌ２ａ−（ＣＨ２）ｑ１−Ｌ２ｂ−であり、ここで、ｐ１およびｑ１は、相互に独立して、１〜５の整数であり、Ｌ２ａはＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨまたはＣＯＯであり、Ｌ２ｂはＮＨまたはＯである。上記定義において、Ｌ１およびＬ２は、一緒になって一つの連結基となり得るように組み合わされる必要がある。例えば、Ｌ２が−ＮＨ−である場合、Ｌ１は−Ｓ−Ｓ−でなく、原子価結合である。−Ｌ１−Ｌ２−で好ましいのは、Ｌ１は−Ｓ−Ｓ−である場合の連結基を形成するものである。
【００２２】
Ｒ５は、水素原子、または未置換もしくは置換された炭素数１〜１２の直鎖もしくは分枝状のアルキル基であり、これらの例示は、上記Ｒ１について説明したものが適用される。エチレングリコール（またはオキシエチレン）の反復単位の数を表すｍは、３０〜２０，０００、好ましくは２００〜２０００、より好ましくは、５００〜１０００の整数を表す。
【００２３】
式（１）で表されるポリ（アミノ酸）は、例えば、それ自体公知のアスパラギン酸エステルまたはグルタミン酸エステル由来のＮ−カルボン酸無水物の重合により製造したポリアミノ酸エステルを、Ｒ４ａおよびＲ４ｂの基のポリアミン残基に対応するポリアミンを用いてアミノリシスを行うことによりポリ（アミノ酸）の側鎖にポリアミン残基を導入し、こうして導入したポリアミン部分のアミノ基と、上記脂肪族炭化水素残基を有するアシル基に対応するカルボン酸のカルボキシル基を必要により活性化した後、上記アミノ基に対してかような活性化カルボン酸の適量を反応させることにより、製造することができる。式（２）のブロックコポリマーは、上記のように製造したポリ（アミノ酸）と、それ自体公知のポリエチレンセグメントの連結方法に従い製造するか、または非特許文献３に記載の方法に従い、上記ポリアミン残基に疎水性基が導入されていないブロックコポリマーを製造した後、活性化カルボン酸の反応を行うことにより製造できる。上記アシル基以外の疎水性基の導入も、当該技術分野に公知のアミノ基と該疎水性基を担持する活性炭酸エステル化物を反応させることにより、実施できる。
【００２４】
以上のようにして提供できる式（１）および式（２）のポリマーは、上述した複数段階のｐＫａを示すので、生理的条件下で、アニオン荷電性化合物とポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を形成できる。アニオン荷電性化合物はタンパク質、脂質、ペプチド、核酸であることができるが、核酸と都合よくＰＩＣを形成するので、以下、説明を簡略化する目的で、核酸と本発明のカチオン性のポリ（アミノ酸）またはそのブロックコポリマーとのＰＩＣについて説明する。
【００２５】
上述したとおり、本発明のカチオン性のポリ（アミノ酸）は、側鎖に疎水性基を有することにより、小分子量の核酸とのＰＩＣであっても生理的条件下で安定なベシクルまたは会合体を提供できる。上記式（１）のカチオン性のポリ（アミノ酸）または式（２）のブロックコポリマーを用いる本発明に従いＰＩＣを提供できる核酸は、プリンまたはピリミジン塩基、ペントース、リン酸からなるヌクレオチドを基本単位とするポリもしくはオリゴヌクレオチドを意味し、オリゴもしくはポリ二本鎖ＲＮＡ、オリゴもしくはポリ二本鎖ＤＮＡ、オリゴもしくはポリ一本鎖ＤＮＡおよびオリゴもしくはポリ一本鎖ＲＮＡを挙げることができ、また同一の鎖にＲＮＡとＤＮＡが混在したオリゴもしくはポリ２本鎖核酸、オリゴもしくはポリ１本鎖核酸も含まれる。また核酸に含有されるヌクレオチドは天然型であっても、化学修飾された非天然型のものであっても良く、またアミノ基、チオール基、蛍光化合物などの分子が付加されたものであっても良い。限定されるものでないが、該核酸は、４〜２０，０００塩基、好ましくは１０〜１０，０００塩基、さらに好ましくは１８〜３０塩基からなるものであることができる。また、機能もしくは作用を考慮すると、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アプタマーおよびリボザイムを挙げることができる。
【００２６】
例えば、ｓｉＲＮＡは標的とする遺伝子またはポリヌクレオチドに対し、公知の方法で設計されたすべてのものを用いることができる。ｓｉＲＮＡの鎖長は、二重鎖を構成する部分の長さが好ましくは１５〜５０塩基、より好ましくは１８〜３０塩基であることができ、当該技術分野で公知の化合物、また、それらと同様な作用または機能を有するすべてのヌクレオチドを包含する。限定されるものでないが、ｓｉＲＮＡの具体例は、遺伝子療法の対象となりうる遺伝子を参照して設計することができる。このような遺伝子としては、限定されるものでないが、非小細胞肺癌等に関係のあるＰＫＣα、悪性黒色腫等に関係のあるＢＣＬ−２、クローン病に関係のあるＩＣＡＭ−１、Ｃ型肝炎に関係のあるＨＣＶ、関節リュウマチもしくは乾癬に関係のあるＴＮＦα、喘息に関係のあるアデノシンＡＩ受容体、卵巣癌等に関係のあるｃ−ｒａｆ  ｋｉｎａｓｅ、膵臓癌等に関係のあるＨ−ｒａｓ、冠動脈疾患に関係のあるｃ−ｍｙｃ、大腸癌に関係のあるＰＫＡ  Ｒｉａ、エイズに関係のあるＨＩＶ、固形癌に関係のあるＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、癌に関係のあるＶＥＧＦ受容体、腎臓癌に関係のあるリボヌクレオチド還元酵素、ＣＭＶ性網膜炎に関係のあるＣＭＶ  ＩＥ２、前立腺癌に関係のあるＭＭＰ−９、悪性グリオーマに関係のあるＴＧＦβ２、多発性硬化症に関係のあるＣＤ４９ｄ、糖尿病に関係のあるＰＴＰ−１Ｂ、癌に関係のあるｃ−ｍｙｂ、乳癌等に関係のあるＥＧＦＲ、癌に関係のあるｍｄｒ１、ａｕｔｏｔａｘｉｎ及びＧＬＵＴ−１の遺伝子を挙げることができる。アンチセンス核酸も当該術分野で公知ものまたはそれらと同様の機能または作用を有するすべてのものを本発明に従いＰＩＣを形成する対象とすることができる。
【００２７】
したがって、別の態様の本発明として、上記のような核酸と式（１）または式（２）で表される化合物のＰＩＣが提供される。このような式（１）または式（２）の化合物と、例えば、ｓｉＲＮＡのＰＩＣは、Ｎ／Ｐ比が２〜６０であるとき一般に、生理的条件下で安定であることができる。
【００２８】
なお、Ｎ／Ｐ比＝〔側鎖のポリカチオン部分のアミノ基と置換アミノ基の総数〕／〔核酸中のリン酸基の総数〕と定義できる。
【００２９】
式（１）の化合物においては、総アミノ基中に占める疎水性基の割合に至適のＮ／Ｐ比が変動するので特定できないが、一般に、Ｎ／Ｐ比が５以上、好ましくは７以上になるようにｓｉＲＮＡとのＰＩＣを形成すると、循環血液中等の生理的条件下で平均粒径サイズが約百数十ｎｍにある安定な会合体が提供できる。このようなＰＩＣは必要により緩衝化された水溶液中で式（１）の化合物とｓｉＲＮＡを上記のＮ／Ｐ比となるように混合することにより調製できる。式（２）のブロックコポリマーを用い、特に、疎水性基の割合いが高くなると、かようなコポリマーのみでも水溶液中で自立的に会合して高分子ミセルを形成する傾向があるので、式（１）の化合物を用いる場合より、より広範なＮ／Ｐ比の下で安定なＰＩＣを形成できる。
【００３０】
以下、具体例を挙げて本発明をさらに説明するが、これらは例示の目的のためにのみ提供する。
【製造例１】
【００３１】
Ｎ−スクシイミジルオクタデカノエートの合成
Ｎ−スクシンイミジルオクタデカノエートの合成は、以下の論文［Ｎ．Ｍ．Ｈｏｗａｒｔｈ，Ｗ．Ｅ．Ｌｉｎｄｓｅｌｌ，Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｐ．Ｎ．Ｐｒｅｓｏｎ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ６１（２００５）８８７５−８８８７．］に従って行った。ステアリン酸（１．８７ｇ，６．５６ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．７６ｇ，６．５６ｍｍｏｌ）を８０ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸（ＷＳＣ）（１．２５ｇ，６．５６ｍｍｏｌ）と４８時間反応させた。その後、水で洗浄し、ＤＣＭで２回抽出、ＭｇＳＯ２で乾燥することによって白色の粉末を得た（収量１．４ｇ，収率５６％）。ステアリン酸のカルボキシル基の転換率は、１Ｈ−ＮＭＲによって算出したところ９６％であった。
【実施例１】
【００３２】
（１）ステアロイル基導入ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）（ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ）の合成
ｎ−ブチルアミンを開始剤として、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）を開裂重合することによって、ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（ＰＢＬＡ）（重合度１１０）を合成した。次に、ＰＢＬＡ（５１３ｍｇ）をベンゼン凍結乾燥後、２５ｍＬのＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）に溶解し、ＰＢＬＡ側鎖に対して５０倍当量のジエチレントリアミン（ＤＥＴ）を１３．５ｍＬのＮＭＰと混合した後、１０℃、アルゴン下で、ＤＥＴ溶液をＰＢＬＡ溶液に加え、１時間反応させた。その後、冷却した０．０１Ｎ  ＨＣｌ水溶液に加え、０．０１Ｎ  ＨＣｌに対して２回透析を行い、４℃で水に対して透析を行った後、凍結乾燥によって回収した。このようにして合成されたＰＡｓｐ（ＤＥＴ）（図１左）は、高いバッファー能を有する一方で、低ｐＨ環境に応答した細胞膜傷害活性を有しており、プラスミドＤＮＡを効率的に細胞質内に輸送できることが確認されている（非特許文献２参照）。次に、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）（１００ｍｇ，Ａｓｐ（ＤＥＴ）ユニットのモル数として０．３６６ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（６３８ｍｌ，３．６６ｍｍｏｌ）を６ｍＬのメタノールに溶解し、６ｍＬのＤＣＭに溶解したＮ−スクシンイミジルオクタデカノエート（２７．８ｍｇ，０．０７３ｍｍｏｌ）と４℃で２４時間反応させた。反応後、ジエチルエテール中で再沈し、濾過したサンプルをメタノール／水（１：１  ｖ／ｖ）に溶解した後、４℃で０．０１Ｍ  ＨＣｌ水溶液に対して３回、蒸留水に対して１回透析を行った。その後、凍結乾燥によって回収することによって、側鎖にステアロイル基が導入されたＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴを合成した（図１右）。ポリマーの収率は９０％以上であった。【００３３】
（２）ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴとｓｉＲＮＡのコンプレックス形成
ステアロイル基の導入率が０，１２，１９％のＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴを１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）もしくは５０％エタノール溶液（エタノール／１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液，１：１  ｖ／ｖ）に溶解し、異なるＮ／Ｐ比でｓｉＲＮＡ（２０μＭ，１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．３））と混合した。コンプレックスの形成の確認は、ポリアクリルアミド電気泳動によって行った（図２にＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ１９％とｓｉＲＮＡのコンプレックスの電気泳動の結果を示す）。その結果、どのポリマーを用いた場合にも一定のＮ／Ｐ比以上（ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ１９％の場合は、Ｎ／Ｐ比が２．５以上）でフリーのｓｉＲＮＡのバンドが観察されなくなり、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）もしくはＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴによるｓｉＲＮＡのコンプレックス化が起こっていることが示唆された。次に、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ／ｓｉＲＮＡの粒径および多分散度（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ，ＰＤＩ）を動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，Ｕ．Ｋ．））によって評価した（図３）。その結果、比較的低いＮ／Ｐ比（ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の場合はＮ／Ｐ比が１．４−２．５、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴの場合はＮ／Ｐ比が２．０−３．５）では２００ｎｍ以上の大きな凝集体が形成され、Ｎ／Ｐ比が３．５−４．０以上ではＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴの場合においてのみ１５０−１７０ｎｍの比較的単分散な会合体が形成された。一方、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の場合には、散乱光強度が弱く会合体の形成が確認されなかった。【００３４】
以上の結果より、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の側鎖に疎水性基としてステアロイル基を導入することによって、コンプレックスが疎水性相互作用によって安定化され、ナノ粒子が形成されたものと考えられる。
【実施例２】
【００３５】
（１）ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ／ｓｉＲＮＡコンプレックスによる内在性遺伝子Ｂｃｌ−２のノックダウン
ヒト膵がんＰａｎｃ−１細胞を６ウェルプレートに播種した（１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。１晩培養した後、Ｂｃｌ−２を標的とするｓｉＲＮＡを上述のようにＰＡｓｐ（ＤＥＴ）およびＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴとコンプレックス化し、細胞と４８時間培養した（ｓｉＲＮＡ濃度：１００ｎＭ）。その後、細胞をトリプシン処理によって回収し、Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを回収した。次に、ＴＡＫＡＲＡ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔを用いてｃＤＮＡを調製し、Ｂｃｌ−２およびＧＡＤＰＨ（内部標準としてのハウスキーピング遺伝子）のｍＲＮＡ量をＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたＲｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（ＡＢＩ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ））によって評価した。ここで、Ｂｃｌ−２を標的とするｓｉＲＮＡとして、以下の配列を使用した（５’−ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＣＵＣ  ＧＣＣ  ＧＣＵ  ＧＣＡ  ＧＡＣ−３’；３’−ＣＧＧ  ＵＣＣ  ＵＧＧ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＧＡＣ  ＧＵＣ  ＵＧ−５’）（参考文献１）。その結果、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ１２％はＮ／Ｐ比が７．５以上、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ１９％はどのＮ／Ｐ比においても内在性遺伝子でありアポトーシス抑制性のＢｃｌ−２のｍＲＮＡをノックダウンできることが明らかとなった（図４）。また、上記のｓｉＲＮＡトランスフェクション（４０時間培養）に伴うＰａｎｃ−１細胞に対する非特異的な細胞毒性をＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて評価したところ、いずれのステアロイル基の導入率、Ｎ／Ｐ比においても細胞毒性が認められなかった（図５）。【００３６】
（２）ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ／ｓｉＲＮＡコンプレックスによる内在性遺伝子ＶＥＧＦのノックダウン
ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ１９％とｓｉＲＮＡを異なるＮ／Ｐ比で混合し、調製したコンプレックスをヒト子宮頸がんＨｅＬａ細胞と４８時間培養し、上記と同様に、Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲによって血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のｍＲＮＡ量を定量した（内部標準としてはＡｃｔｉｎを使用）（図６）。ここで、使用したＶＥＧＦ標的ｓｉＲＮＡの配列は以下の通りである（ＧＧＡ  ＧＵＡ  ＣＣＣ  ＵＧＡ  ＵＧＡ  ＧＡＵ  ＣｄＴｄＴ；ＧＡＵ  ＣＵＣ  ＡＵＣ  ＡＧＧ  ＧＵＡ  ＣＵＣ  ＣｄＴｄＴ）。その結果、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ１９％はどのＮ／Ｐ比においてもＶＥＧＦの発現を有意にノックダウンし、その活性はポジティブコントロールとして使用したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と同程度であった（図６）。一方、ＰＥＩ（ＥｘＧｅｎ）では有意な遺伝子ノックダウン効果は得られなかった（図６）。次に、ＶＥＧＦのタンパク質レベルでの発現量をＥＬＩＳＡ（ｓａｎｄｗｉｃｈ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＤＶＥ００，Ｑｕａｎｔｋｉｎｅ(R)  ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））によって評価した。その結果、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ１９％は、タンパク質レベルでも配列特異的にＶＥＧＦの発現量を抑制することが明らかとなった（図７）。
【実施例３】
【００３７】
（１）ＰＥＧ−ＳＳ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴの合成
参考文献２に従って、生体内で開裂するジスルフィド（ＳＳ）結合でポリエリレングリコール（ＰＥＧ）とＰＡｓｐ（ＤＥＴ）が連結されたＰＥＧ−ＳＳ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を合成した。具体的には、ＰＥＧ−ＳＳ−ＮＨ２を開始剤として、塩化メチレン中でＢＬＡ−ＮＣＡを開環重合することによって、ＰＢＬＡの重合度が５９および９８のＰＥＧ−ＳＳ−ＰＢＬＡを得た。次に、ＰＥＧ−ＳＳ−ＰＢＬＡをＮＭＰに溶解し、５℃でＤＥＴと４０分間反応させた。その後、反応物は２５％の酢酸水溶液で中和し、０．０１ＮのＨＣｌに対して４℃で透析、さらに凍結乾燥を行うことによって０．２７ｇ．のＰＥＧ−ＳＳ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を合成した。【００３８】
次に、ＰＥＧ−ＳＳ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）のＰＡｓｐ（ＤＥＴ）側鎖へのステアロイル基の導入反応を行った。ステアロイル基の導入反応は、実施例１と同様にＮ−スクシンイミジルオクタデカノエートを反応させることによって行った。ここでは、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の重合度が５９および９８のＰＥＧ−ＳＳ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）について側鎖１級アミノ基に対する２０％に相当するＮ−スクシンイミジルオクタデカノエートを反応させたところ、それぞれ１７％および１９％の側鎖にステアロイル基が導入されたＰＥＧ−ＳＳ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴが合成された。これらのポリマーは、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）に溶解し、Ｎ／Ｐ＝５．０になるようにｓｉＲＮＡと混合することによってコンプレックスを形成させた。このようにして形成されたコンプレックスは、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ／ｓｉＲＮＡのコンプレックスが生体適合性のＰＥＧの外殻で覆われたポリマーミセル構造をとるものと考えられ、さらに生体内ではＰＥＧが徐々に脱離することによって、全身投与によるｓｉＲＮＡデリバリーにおいて血中での高い安定性と標的組織での効率的なｓｉＲＮＡの導入が両立できるものと考えられる（図８）。【００３９】
（２）ＰＥＧ−ＳＳ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ／ｓｉＲＮＡコンプレックスの細胞内取り込みの評価
ＰＥＧ−ＳＳ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ／ｓｉＲＮＡコンプレックス（Ｎ／Ｐ＝５．０）は、表面がＰＥＧの外殻で覆われた二層構造を有するものと考えられ、カチオン性の表面を有するＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ／ｓｉＲＮＡコンプレックスとは異なる細胞内取り込みを示す可能性がある。そこで、蛍光色素Ｃｙ５で標識されたｓｉＲＮＡを用いてコンプレックスを形成し、その細胞内取り込み量を評価した。ＨｅＬａ細胞（１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を６ウェルマルチプレート上で培養し、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ／ｓｉＲＮＡおよびＰＥＧ−ＳＳ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ／ｓｉＲＮＡコンプレックスと３時間培養した。その後、トリプシン処理を行い、細胞に取り込まれたＣｙ３の平均の蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤTM  ＬＳＲ  ＩＩ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）により評価した。結果を表１に示す。
【表１】
2010093036.tif 000004
【００４０】
その結果、ｓｉＲＮＡ濃度が１００ｎＭの場合には、ＰＥＧ−ＳＳ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ／ｓｉＲＮＡコンプレックスの細胞内取り込み量は、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ／ｓｉＲＮＡのそれよりも低かったが、コンプレックスの濃度を高めることによってＰＥＧ−ＳＳ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ／ｓｉＲＮＡコンプレックスは、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ／ｓｉＲＮＡと同程度まで細胞内に取り込まれることが明らかとなった。【００４１】
（３）ＰＥＧ−ＳＳ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ／ｓｉＲＮＡコンプレックスによるｓｉＲＮＡトランスフェクション
ヒト肝がんＨｕｈ−７細胞を２４マイクロウェルプレートに播種し（２０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、１晩培養した後、Ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅとＲｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現するプラスミドＤＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて遺伝子導入した。その４時間後、Ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  に対するｓｉＲＮＡを搭載したＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ１９％、ＰＥＧ−ＳＳ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）（５９）−ＳＴ１７％およびＰＥＧ−ＳＳ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）（９８）−ＳＴ１９％より形成されたｓｉＲＮＡコンプレックスをそれぞれ培地中に加え、４８時間培養した。その後、ｓｉＲＮＡによる遺伝子ノックダウン効率は、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｓｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅに対するＦｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの発現量より算出した。その結果、１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡでは、ＰＥＧ−ＳＳ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）−ＳＴ／ｓｉＲＮＡコンプレックスは、有意な遺伝子ノックダウン効果を示さなかったが、３００および５００ｎＭ  ｓｉＲＮＡではコンプレックス濃度依存的な遺伝子ノックダウン活性を示した（図９）。この結果は、表１の細胞内取り込みの結果によく対応しており、ポリマーミセル構造を有するコンプレックスは細胞内に取り込まれた後、効率的にエンドソームから脱出し、細胞質内で効率的にｓｉＲＮＡを機能発現させることができるものと考えられる。【００４２】
（参考文献１）
Ｍ．Ｏｃｋｅｒ，Ｄ．Ｎｅｕｒｅｉｔｅｒ，Ｍ．Ｌｕｅｄｅｒｓ，Ｓ．Ｚｏｐｆ，Ｍ．Ｇａｎｓｌｍａｙｅｒ，Ｅ．Ｇ．Ｈａｈｎ，Ｃ．Ｈｅｒｏｌｄ，Ｄ．Ｓｃｈｕｐｐａｎ，Ｇｕｔ  ５４：１２９８−１３０８（２００５）
（参考文献２）
Ｓ．Ｔａｋａｅ，Ｙ．Ａｋｉｙａｍａ，Ｙ．Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｙ．Ｎａｇａｓａｋｉ，Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ，Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ａｕ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ａｎａｌｙｔｅｓ  ｂｙ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１８（４）：１２４１−１２４５（２００７）
【図１】
2010093036.tif 000007
【図２】
2010093036.tif 000008
【図３】
2010093036.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2010093036.tif 000015
【配列表】
2010093036000001.app
【国際調査報告】
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2010093036.tif 000017
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