(57)【要約】  本発明は、（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位とジビニルベンゼン由来のモノマー単位を有する共重合体の粒子を含む液体クロマトグラフィー用充填剤であって、前記（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位：前記ジビニルベンゼン由来のモノマー単位が７０〜９０質量％：３０〜１０質量％であり、前記粒子表面にスルホ基が結合してなり、スルホ基が結合した構造として式（１）2019004440.tif 000006（式中、Ｒは共重合体粒子の表面に由来する部分構造を表し、Ｘは酸素原子または硫黄原子を表し、ｎは２〜４の整数を表す。）で示される構造が含まれ、前記粒子中にスルホ基が４０μｍｏｌ／ｇ〜３００μｍｏｌ／ｇ含まれることを特徴とする液体クロマトグラフィー用充填剤及びその充填剤を用いたカラムに関する。前記カラムは、タンパク質やアミノ酸等の分析に好適に用いることができ、かつ効率的に生産可能である。
2019004440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位とジビニルベンゼン由来のモノマー単位を有する共重合体の粒子を含む液体クロマトグラフィー用充填剤であって、前記（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位：前記ジビニルベンゼン由来のモノマー単位が７０〜９０質量％：３０〜１０質量％であり、前記粒子表面にスルホ基が結合してなり、スルホ基が結合した構造として式（１）
【化１】
2019004440.tif 000005
（式中、Ｒは共重合体粒子の表面に由来する部分構造を表し、Ｘは酸素原子または硫黄原子を表し、ｎは２〜４の整数を表す。）で示される構造が含まれ、前記粒子中にスルホ基が４０μｍｏｌ／ｇ〜３００μｍｏｌ／ｇ含まれることを特徴とする液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項２】
前記（メタ）アクリル酸エステルがグリシジルメタクリレートを含む請求項１に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の充填剤の製造方法であって、（メタ）アクリル酸エステルとジビニルベンゼンとを含むモノマー混合物を懸濁重合により共重合し、共重合体粒子を得る工程、および塩基の存在下、第二級アルコールを含む溶媒中でスルホ化剤と反応させる工程を有する充填剤の製造方法。
【請求項４】
前記の共重合体粒子を得る工程の後、得られた粒子を別の化学反応に供することなく、前記のスルホ化剤と反応させる工程を実施する請求項３に記載の充填剤の製造方法。
【請求項５】
（メタ）アクリル酸エステルがグリシジルメタクリレートであり、スルホ化剤がプロパンスルトンであり、第二級アルコールが２−プロパノールである請求項３または４に記載の充填剤の製造方法。
【請求項６】
請求項１または２に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤を充填してなる糖化ヘモグロビン分析用の液体クロマトグラフィー用カラム。
【請求項７】
請求項１または２に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤を充填してなるカラムを用いた糖化ヘモグロビンの分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はスルホ基を有する液体クロマトグラフィー用充填剤及びこの充填剤を充填してなる液体クロマトグラフィー用カラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」ともいう）は、幅広いサンプルの分析方法として、様々な分野で用いられている。中でもスルホ基を有する充填剤を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質やアミノ酸等の分析に用いられる。【０００３】
陽イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質の分析では、充填剤に対するタンパク質の非特異吸着が起こる場合がある。タンパク質の非特異吸着が起こると、正確な分析結果が得られないだけでなく、カラムの劣化を早めるという問題が生じるため、この非特異吸着が起こらない充填剤を用いる必要がある。【０００４】
タンパク質の非特異吸着は、充填剤とタンパク質間の疎水的相互作用が主な原因である。このため、これを抑制する手段として、充填剤に親水性の高い粒子が用いられている。例えば、充填剤として（メタ）アクリル酸エステル系重合体を利用した粒子が広く知られている。【０００５】
特許文献１にはメタクリル酸エステル系重合体からなる粒子に、スルホ基を導入したイオン交換体を利用するグルコヘモグロビンの分析方法が開示されている。
特許文献２ではジビニルベンゼン系疎水性粒子の表面にメタクリル酸などの親水性重合体層を形成し得られた充填剤が開示されている。
非特許文献１にはアセトニトリル中の重合反応により、発生させたジビニルベンゼンの重合体のコアの表面にメタクリル酸エステルの層を形成し粒子を取得し、さらに、該粒子にエピクロロヒドリンを反応させたうえ、スルホ基を導入した充填剤を用いたタンパク質の分析例が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平３−２５５３６０号公報
【特許文献２】特開平３−０７３８４８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｈｕｈｏｎｇ  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ、９６５  （２００２）  ８３−９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
タンパク質を分析するカラムでは、粒子の親水性を高める必要がある。広く使われている（メタ）アクリル酸エステル系共重合体からなる粒子を充填剤として用いる場合、その原料として親水性のモノマーが選択され、使用されている。このときに架橋のために使われる架橋性（メタ）アクリル酸エステルは、比較的に疎水性が高いという特徴があり、このため、タンパク質の分析用途の充填剤においては、架橋性（メタ）アクリル酸エステル単量体の割合を上げられない。その結果、充填剤の架橋度を上げられず、十分な強度を持たない。分析能を上げるためには充填剤の粒径を小さくすることが考えられるものの、充填剤の強度が高くない状態で小粒径にすると、カラムにした場合の圧力に耐えらずに変形してしまい、良好な分析はできないことになる。そのため、高い親水性を有し、小粒径で使用できる強度の高い充填剤が求められている。
また、特許文献２のように、疎水性粒子の表面に親水性重合体層を形成する方法では、親水性層を形成する必要性から作業工程が増え、生産性が低下するという問題がある。【０００９】
したがって、本発明の課題は、タンパク質やアミノ酸等の分析に好適に用いることができ、かつ効率的に生産可能な、液体クロマトグラフィー用充填剤及び液体クロマトグラフィー用カラムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下の液体クロマトグラフィー用充填剤及びその充填剤を充填してなるカラムを提供する。
［１］（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位とジビニルベンゼン由来のモノマー単位を有する共重合体の粒子を含む液体クロマトグラフィー用充填剤であって、前記（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位：前記ジビニルベンゼン由来のモノマー単位が７０〜９０質量％：３０〜１０質量％であり、前記粒子表面にスルホ基が結合してなり、スルホ基が結合した構造として式（１）
【化１】
2019004440.tif 000003
（式中、Ｒは共重合体粒子の表面に由来する部分構造を表し、Ｘは酸素原子または硫黄原子を表し、ｎは２〜４の整数を表す。）で示される構造が含まれ、前記粒子中にスルホ基が４０μｍｏｌ／ｇ〜３００μｍｏｌ／ｇ含まれることを特徴とする液体クロマトグラフィー用充填剤。
［２］前記（メタ）アクリル酸エステルがグリシジルメタクリレートを含む前記１に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤。
［３］前記１または２に記載の充填剤の製造方法であって、（メタ）アクリル酸エステルとジビニルベンゼンとを含むモノマー混合物を懸濁重合により共重合し、共重合体粒子を得る工程、および塩基の存在下、第二級アルコールを含む溶媒中でスルホ化剤と反応させる工程を有する充填剤の製造方法。
［４］前記の共重合体粒子を得る工程の後、得られた粒子を別の化学反応に供することなく、前記のスルホ化剤と反応させる工程を実施する前記３に記載の充填剤の製造方法。
［５］（メタ）アクリル酸エステルがグリシジルメタクリレートであり、スルホ化剤がプロパンスルトンであり、第二級アルコールが２−プロパノールである前記３または４に記載の充填剤の製造方法。
［６］前記１または２に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤を充填してなる糖化ヘモグロビン分析用の液体クロマトグラフィー用カラム。
［７］前記１または２に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤を充填してなるカラムを用いた糖化ヘモグロビンの分析方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の一実施態様における液体クロマトグラフィー用充填剤及び液体クロマトグラフィー用カラムは、タンパク質やアミノ酸等の分析に好適に用いることができる。特に充填剤はアクリル系重合体を基剤とするにもかかわらず、親水性を高くしたまま強度を高めることができるため粒径を小さくすることができ、そのため分析能が向上する。
また、前記充填剤及びカラムは効率的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】分析例１により得られたクロマトグラムである。
【図２】分析例２により得られたクロマトグラムである。
【図３】分析例３により得られたクロマトグラムである。
【図４】分析例４により得られたクロマトグラムである。
【図５】実施例１で得られた充填剤粒子のＳＥＭ写真（倍率２００００倍）である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の一実施態様における液体クロマトグラフィー用充填剤は、（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位とジビニルベンゼン由来のモノマー単位を含む共重合体の粒子を基材として用いる。なお、（メタ）アクリル酸エステルとは、アクリル酸エステルまたはメタクリル酸エステルを意味する。
【００１４】
本発明の一実施態様における共重合体は、架橋性単量体としてジビニルベンゼンを用いる。架橋性単量体としてジビニルベンゼンを使用することにより、非架橋性単量体の割合を高めても、得られる共重合体は高い機械的強度を有するようになる。そのため、この共重合体の粒子は粒径を小さくしても強度が高く、この粒子をカラムの充填剤として使用した場合にも粒子の小粒径化に伴う分析時の圧力の上昇にも耐えることが可能である。これにより、カラムの分離性能を高めることができる。
単量体としてのジビニルベンゼンは、メタ及びパラ位の異性体混合物であっても良い。
【００１５】
共重合体の単量体である（メタ）アクリル酸エステルとしては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート等が挙げられ、これらは単独でまたは二種以上組み合わせて用いることができる。
【００１６】
基材の親水性を高めるためや、スルホ基を導入するために、（メタ）アクリル酸エステルは水酸基やグリシジル基を有するものが一定量以上含まれていることが好ましい。その量は一概にいえないが、（メタ）アクリル酸エステル全体の例えば７０質量％以上が好ましい。水酸基やグリシジル基を有する（メタ）アクリル酸エステルとしては、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート等が挙げられる。この中で、グリシジル（メタ）クリレートは、スルホ基構造の導入に好適に利用できるうえに、開環反応により水酸基を持つ構造に変換できるため、より好ましい。入手が容易さから、グリシジルメタクリレートが最も好ましい。
【００１７】
（メタ）アクリル酸エステルには、疎水性の強いエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ヘキシル（メタ）アクリレートを併用することもできる。その使用量は、共重合体の親水性に大きな影響を与えない範囲であればよく、具体的には（メタ）アクリル酸エステルの全量に対して１０質量％以下である。
【００１８】
本発明の一実施態様における共重合体において、（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位とジビニルベンゼン由来のモノマー単位との比は、（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位（複数種を用いるときはそれらの合計量）：前記ジビニルベンゼン由来のモノマー単位が、７０〜９０質量％：３０〜１０質量％であり、７５〜８５質量％：２５〜１５質量％がより好ましい。
【００１９】
（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位が７０質量％未満であると、共重合体の疎水性が高くなってしまい、タンパク質の非特異吸着が起こりやすくなる。また、（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位にスルホ基を導入する場合、スルホ基を効率的に導入することが難しくなる。一方、（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位が９０質量％を超えると、共重合体粒子の強度が低くなり、それをカラムの充填剤に用いた場合は、粒子が変形しカラムの劣化を招き易くなる。
【００２０】
重合体には、（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位やジビニルベンゼン由来のモノマー単位以外にも、他のモノマー単位を含むことができる。他のモノマー単位の量は、共重合体の親水性に大きな影響を与えない範囲であればよく、例えば共重合体の１０質量％以下の量である。好ましくは５質量％以下の量であり、さらに好ましくは３質量％以下の量である。他のモノマー単位のモノマーとしては、スチレン、エチルスチレン、メチルスチレン、プロピルスチレン、メトキシスチレン、α−メチルスチレン、ブタジエン、酢酸ビニルなどが挙げられる。
【００２１】
共重合体の粒子の大きさは、液体クロマトグラフィーのカラム用充填剤として使用できる範囲であれば特に制限はないが、カラムへの充填と分離性能を考慮すると、平均粒子径が１μｍ〜１０μｍであることが好ましい。平均粒子径が１０μｍ以下であれば、化合物の分離能力が高く、良好な分析結果を得ることができる。一方で１μｍ以下ではカラムの圧力が高くなり、充填が困難になり易い。分離能力が高いカラムを得るためには、粒子の平均粒子径は２μｍ〜７μｍがより好ましく、２μｍ〜３μｍが最も好ましい。
【００２２】
本明細書における平均粒子径は、体積平均粒子径であり、次のようにして測定することができる。まず、粒子を粒度分布測定装置で２０００個以上になるように撮像し、得られた二次元の粒子像（静止画像が好ましい）から、各粒子の円相当径（粒子像の投影面積と同じ面積を持つ円の直径）を得る。その円相当径から各粒子の体積を算出して、算出された体積を基準に、平均化して得た粒子径である。このとき、各粒子は、上記の円相当径と同一の直径を有する球体とみなす。粒度分布測定装置としては、ＦＰＩＡ−３０００（シスメックス社製）などが使用できる。
【００２３】
共重合体の粒子は、その表面に微細な細孔をほとんど有しないことが好ましい。具体的には、ガス吸着法によって測定される全細孔容積が粒子の質量に対して０．０５ｃｍ3／ｇ以下であることが好ましく、０．０２ｃｍ3／ｇ以下であることがさらに好ましい。微細な細孔がほとんどない粒子は、強度が向上する。また、この粒子を基材とした充填剤を用いてＨＰＬＣ分析を行う場合、試料に含まれるたんぱく質などの化合物が、細孔内を拡散することがないので、迅速な分析が可能になる。
全細孔容積は、装置としてカンタクローム社製Ａｕｔｏｓｏｒｂ（登録商標）  ｉＱを用いて測定することができる。
【００２４】
本発明の一実施態様における液体クロマトグラフィー用充填剤は、（メタ）アクリル酸エステル由来のモノマー単位とジビニルベンゼン由来のモノマー単位を有する共重合体の粒子を得た後、粒子表面にスルホ基を導入することにより製造することができる。
【００２５】
上記共重合には、公知の油溶性ラジカル重合開始剤を用いることができる。重合開始剤としては、例えば２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（以下ＡＩＢＮともいう）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（以下Ｖ−６５ともいう）、２，２’−アゾビスイソ酪酸ジメチル、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル等が挙げられる。
重合開始剤の使用量はモノマーの種類や量によって適切に定めれば良いが、通常、モノマーの合計量１００質量部に対して０．１〜５質量部である。
【００２６】
共重合の方法としては、例えば、懸濁重合法、乳化重合法、沈殿重合法などが利用できる。モノマーは溶解するが重合物は溶解しない適当な有機溶媒中で重合反応を行う沈殿重合では、粒径の揃った粒子を得ることができる。しかし、沈殿重合では、重合中に粒子の凝集が起きることがあり、単分散な粒子を収率よく合成することが困難な場合がある。粒子の凝集が起こりにくい点で、懸濁重合法または乳化重合法が好ましく、懸濁重合法がより好ましい。懸濁重合法の中でも、細孔径が制御されたシラス多孔質ガラス（ＳＰＧ）膜と内圧式マイクロキットＭＮ−２０（ＳＧＰテクノ株式会社製）を用いたＳＰＧ膜懸濁重合法、マイクロチャネル懸濁装置（株式会社イーピーテック製）を用いたマイクロチャネル懸濁重合法などが、粒径の揃った粒子を得ることができるのでより好ましい。
【００２７】
このような重合方法においては、重合反応は、例えば、６０〜８０℃で６〜２０時間加熱することで行うことができる。
【００２８】
重合後は、篩や分級装置（例えば、半自由渦式分級機エアロファインクラシファイアＡＣ，日清エンジニアリング株式会社製）を使用して分級を行うことにより、平均粒子径、均一性及び微細粒子の含有量などを調節することができる。
【００２９】
共重合体の粒子の表面に微細な細孔をほとんど設けないようにするためには、例えば、重合時に希釈剤を添加しないことにより行うことができる。
【００３０】
得られた共重合体粒子の表面にスルホ基を導入ためには、例えば、スルホ化剤を用いることができる。スルホ化剤としては、２−ヒドロキシエタンスルホン酸ナトリウム、３−ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、３−メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム、２−ブロモプロパンスルホン酸ナトリウム、３−ブロモプロパンスルホン酸ナトリウム等のスルホン酸塩、１，３−プロパンスルトン、１，３−ブタンスルトン、１，４−ブタンスルトン、２，４−ブタンスルトン等のスルトン化合物等が挙げられる。これらの中では、反応の容易さから３−メルカプトプロパンンスルホン酸ナトリウム及び１，３−プロパンスルトンが好ましく、１，３−プロパンスルトンがより好ましい。
【００３１】
これらのスルホ化剤は、共重合体粒子の表面に存在する反応性官能基との反応を利用して、スルホ基として結合する。反応性官能基としては、水酸基やエポキシ基が好ましく、エポキシ基がより好ましい。
スルホ化剤は、粒子表面に存在する共重合体由来の反応性官能基に直接反応させるほか、前記反応性官能基にスペーサーを反応させたり、前記反応性官能基がエポキシ基である場合にエポキシ基を開環反応させた後に、スルホ化剤と反応させることもできる。好ましくは、直接反応させるものであり、それにより得られる充填剤を用いたカラムの分離性能が向上するほか、製造効率にも優れる。特に、糖化ヘモグロビンの分析においては、共重合体粒子の表面に存在するエポキシ基の開環反応を行った後にスルホ化するよりも、エポキシ基を直接スルホ化する方が、目的とするたんぱく質の分離が良好になる。
このように、得られた共重合体粒子を、エポキシ基の開環反応も含め、他の反応に供することなく、スルホ基化剤との反応に用いることが好ましい。
【００３２】
共重合体粒子とスルホ化剤の反応は、スルホ化剤の種類に応じた適切な方法で行うことができる。例えば、グリシジルメタクリレート由来のモノマー単位に、スルホ剤としてスルトン化合物を用いてスルホ基を導入する場合には、塩基を用いて行うことができる。塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等の無機塩基や、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン等のアミン類、ナトリウムメトキシド、カリウムメトキシド、カリウムｔ−ブトキシド、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン等の有機塩基が挙げられる。上記塩基の中で、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、カリウムｔ−ブトキシドが好ましく、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムがより好ましい。無機塩基は適当な濃度の水溶液で使用される。
スルホ剤としてスルホン酸塩を用いてスルホ基を導入する場合にも、同様に塩基を用いて行うことができる。ハロゲン基を有するスルホン酸塩を用いる場合、反応中に共重合体粒子上に生じる水酸基によるハロゲン置換反応によりスルホ基が導入され、水酸基あるいはメルカプト基を有するスルホン酸塩を用いる場合、共重合体粒子上のエポキシ基の開環を伴う求核反応によりスルホ基を導入される。
【００３３】
スルホ化反応に使用される溶媒としては、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、アルコール等が挙げられる。これらの中ではアルコールが好ましく、反応効率及び反応性の観点から第二級アルコールがより好ましい。第二級アルコールとしては、２−プロパノール、２−ブタノール、３−メチル―２−ブタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノールなどが挙げられ、経済的観点からは２−プロパノールが好ましい。スルホ化剤としてスルトン化合物を用いる場合は、反応効率性の観点からも特に第二級アルコールが好ましい。
共重合体粒子とスルホ化剤の反応に酸性触媒を用いた場合には反応性が十分ではない。特に、ルイス酸を用いた場合には、得られた充填剤の親水性が低く、水溶液に分散しないため、カラムに充填できないなど、タンパク質分離用充填剤としての機能を発揮しない。
【００３４】
共重合体粒子に結合するスルホ基の量は、好ましくは２０μｍｏｌ／ｇ〜３００μｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは４０μｍｏｌ／ｇ〜３００μｍｏｌ／ｇである。結合するスルホ基の量が４０μｍｏｌ／ｇ未満では、ＨＰＬＣなどの液体クロマトグラフィー分析における保持時間が短くなり、良好な分離が行えない。４０μｍｏｌ／ｇ以上であると、充填剤の水分散性が良好であり、タンパク質の分析に良好なカラムを得ることができる。また、結合するスルホ基の量が３００μｍｏｌ／ｇを超える場合は、試料の保持が強くなり過ぎ、分析時間が長くなる傾向にあり好ましくない。
【００３５】
前記のスルホ基の量は以下の方法によって測定することができる。すなわち、真空乾燥させた粒子（試料）１ｇに０．５Ｍ塩酸１０ｍＬを加えて分散させ、濾過した後に水で洗浄する。これにより、スルホ基が酸型になり、洗浄された状態の粒子を得る。次に、前記粒子に０．５Ｍ水酸化ナトリウム１０ｍＬを加え、濾液を集めるための容器を設置した状態でそれを濾過し、次いで粒子を水１０ｍＬで洗浄する。濾液と洗浄液の混合液を０．１Ｍ塩酸で滴定する。このときに要した塩酸のモル数を求め、水酸化ナトリウムのモル数（上記の場合、５ｍＭ）から引いた値を、スルホ基の量とする。
【００３６】
本発明の一実施態様における共重合体粒子の表面には、スルホ基が導入された下記式（１）
【化２】
2019004440.tif 000004
（式中、Ｒは共重合体粒子の表面に由来する部分構造を表し、Ｘは酸素原子または硫黄原子を表し、ｎは２〜４の整数を表す。）
で示される構造を有することが望ましい。
【００３７】
この構造は、例えば（メタ）アクリル酸エステルの少なくとも一種としてグリシジル（メタ）アクリレートを用いて共重合を行い、その後、スルホ剤によりエポキシ基を開環させるとともにスルホ基として結合させるか、エポキシ基を開環させてジオールまたはモノオールモノチオールとした後にスルホ剤にてスルホ基を結合させることにより形成される。また、（メタ）アクリル酸エステルの少なくとも一種としてジオール構造含有エステルまたはモノオールモノチオール含有エステルを用いて共重合を行い、その後、スルホ剤にてスルホ基を結合させることにより形成してもよい。
【００３８】
本願明細書において、粒子の表面とは、固体の共重合体粒子が反応溶媒中で試薬と接することのできる部分のことを意味し、通常、固体内部は含まない。但し、個体内部にスルホ基が結合していても良い。
【００３９】
本発明の一実施態様における液体クロマトグラフィー用充填剤は、上記の共重合体粒子の表面にスルホ基を有する特定の構造が結合してなるものである。
本発明の一実施態様における液体クロマトグラフィー用カラムは、上記充填剤を有してなる。カラムは上記充填剤をスラリー法等の公知の充填法によってカラムに充填することによって得られる。充填用のカラムは、筐体の材質としてＰＥＥＫ製またはＳＵＳ製のものが使用できるが、ＳＵＳ製の場合はタンパク質が吸着するおそれもあるため、タンパク質を含む試料を分析する場合はＰＥＥＫ製が好ましい。カラム内には充填剤粒子が流出しないためのフリットが設置されるが、そのフリットも吸着を抑制するためにＰＥＥＫ製のものを使用することが好ましい。
【００４０】
本発明の一実施態様における液体クロマトグラフィー用カラムはイオン交換クロマトグラフィー用カラムとして用いることにより、種々のタンパク質やアミノ酸等を分析することができる。この場合、溶離液として、例えばリン酸等の緩衝液が好ましく利用できる。
【実施例】
【００４１】
以下に実施例及び比較例を挙げて本発明を具体的に説明する。
実施例及び比較例にて測定した平均粒子径は、体積平均粒子径であり、発明を実施する形態の欄に記載した方法により測定した。【００４２】
実施例１
［重合工程］
グリシジルメタクリレート（日油株式会社製）及びジビニルベンゼン（新日鉄住金化学株式会社製，純度９９％）（グリシジルメタクリレート：ジビニルベンゼン＝８２：１７（質量比））からなる単量体混合物５０ｇに、重合開始剤としての過酸化ラウロイル（ナカライテスク株式会社製）０．５ｇ（前記単量体混合物の１質量％に相当する量）を添加し、混合物を得た。得られた混合物を、１％アルキルジフェニルエーテルスルホン酸ナトリウム水溶液５００ｇを水相として、マイクロチャネル懸濁装置（株式会社イーピーテック製）により油滴とし、さらに重合反応を行い、共重合体粒子を得た。
得られた粒子の平均粒子径は２．６μｍであった。【００４３】
［修飾工程］
上記共重合体粒子３ｇに２−プロパノール２４ｇ及び１，３−プロパンスルトン（東京化成工業株式会社製）３ｇを加え、５０℃に加熱した。これに８Ｍ水酸化カリウム水溶液１．２ｇを加え、６時間撹拌した後に濾過し、０．５Ｍ塩酸、水、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、水で順次洗浄することで充填剤粒子１を得た。
真空乾燥させた充填剤粒子１の１．０ｇを、０．５Ｍ塩酸１０ｍＬを加えて分散させ、濾過した後に水で洗浄し、スルホ基が酸型になった粒子を得た。前記粒子に０．５Ｍ水酸化ナトリウム１０ｍＬを加え、濾液を集めるための容器を設置した状態でそれを濾過し、次いで粒子を水１０ｍＬで洗浄した。設置した容器に採取された濾液と洗浄液の混合液を０．１Ｍ塩酸で滴定した。初めに使用した水酸化ナトリウムのモル数（５ｍＭ）と、滴定に要した塩酸のモル数の差から、スルホ基の量を求めた。その結果、粒子の質量に対するスルホ基量は２００μｍｏｌ／ｇであった。
充填剤粒子１をＳＥＭ観察した。細孔は確認されなかった。観察結果を図５に示す。ガス吸着による細孔測定（使用装置としてカンタクローム社製Ａｕｔｏｓｏｒｂ（登録商標）ｉＱを用いた。）の結果、細孔容積は０．０１ｃｍ3／ｇと非常に小さい値であった。
得られた充填剤粒子１を、内径４．６ｍｍ×長さ１０ｍｍのＰＥＥＫ製カラムにスラリー法で充填し、カラム１を得た。【００４４】
分析例１
実施例１にて製造したカラム１を液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ，アジレント・テクノロジー株式会社製）に装着し、下記の分析条件にて糖化ヘモグロビンコントロールサンプル（アークレイ株式会社製）の分析を行った。
溶離液：リン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
流速：１．７ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：ＵＶ−Ｖｉｓ検出器（波長：４１５ｎｍ）
温度：３５℃
得られたクロマトグラムを図１に示す。この際の安定型糖化ヘモグロビンピークの理論段高さは３３μｍであった。【００４５】
分析例２
実施例１にて製造したカラム１を液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ，アジレント・テクノロジー株式会社製）に装着し、下記の分析条件にてタンパク質の分析を行った。
溶離液：（Ａ）２０ｍＭ  ２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ５．６）
（Ｂ）（Ａ）＋０．５Ｍ  Ｎａ2ＳＯ4
リニアグラジエント  ０ｍｉｎから２ｍｉｎ、（Ａ）から（Ｂ）
流速：１．７ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：ＵＶ−Ｖｉｓ検出器（波長：２８０ｎｍ）
温度：室温
サンプル：１．オボアルブミン、２．トリプシノーゲン、３．リボヌクレアーゼＡ、４．シトクロムＣ、５．リゾチーム（シグマアルドリッチ社製）
得られたクロマトグラムを図２に示す。１．５分という短時間で５種類のタンパク質が良好に分離されていることがわかる。【００４６】
比較例１
ジエチレングリコールジメタクリレート（日油株式会社製）３０ｇ、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化成工業株式会社製）１０ｇ（ジエチレングリコールジメタクリレート：２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸＝７５：２５（質量比））からなる単量体混合物に、重合開始剤としての過酸化ベンゾイル０．１ｇ（前記単量体混合物の０．２５質量％に相当する量）を溶解させ混合物を得た。得られた混合物を、５％ポリビニルアルコール（クラレポバールＰＶＡ２２４，株式会社クラレ製）水溶液に加え、懸濁重合法により８０℃にて２４時間重合させた。得られた粒子を分級し、平均粒子径６．５μｍの充填剤粒子２を得た。
得られた充填剤粒子２をスラリー法にて内径４．６ｍｍ×長さ２０ｍｍのＳＵＳ製カラムに充填し、カラム２を得た。【００４７】
分析例３
比較例１にて得られたカラム２を用いて、分析例１と同じ条件で分析を行った。得られたクロマトグラムを図３に示す。この際の糖化ヘモグロビンピークの理論段高さは８１μｍであった。
平均粒子径を小さくできないので、分析例１と比べ、理論段高さが大きい。さらに、十分な分離が得られないためカラム長さが必要になり、分析例１に比べ、分析に要する時間が約１．３倍となった。【００４８】
比較例２
［重合工程］
グリシジルメタクリレート５６ｇとエチレングリコールジメタクリレート２４ｇ（グリシジルメタクリレート：エチレングリコールジメタクリレート＝７０：３０（質量比））からなる単量体混合物に、重合開始剤としてのＶ−６５  １．５ｇ（前記単量体混合物の１．８８質量％に相当する量）を溶解させ混合物を得た。水４００ｇにポリビニルアルコール４ｇと塩化ナトリウム４ｇを溶解させた水溶液に、得られた混合物を加え、懸濁重合法により６０℃で１０時間重合させた。得られた粒子を分級し、平均粒子径２．５μｍの共重合体粒子を得た。【００４９】
［修飾工程］
上記重合体粒子を実施例１と同様に修飾し、充填剤粒子３を得た。この充填剤粒子３を実施例１と同様にカラムに充填したところ、充填途中で充填剤粒子の変形により圧力が上昇し、送液が停止してしまいカラムに充填できなかった。【００５０】
比較例３
実施例１で得られた共重合体粒子３ｇにテトラヒドロフラン２４ｇを加え分散させた。これに１，３−プロパンスルトン３ｇと三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体０．１ｇを加え５０℃で６時間反応させた。反応液を濾過し、テトラヒドロフラン、水、０．５Ｍ塩酸、水、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、水の順に洗浄することで粒子を得た。
得られた粒子１．０ｇに、２−プロパノール１ｍｌと０．５Ｍ塩酸１０ｍＬを加えて分散させ、濾過した後に水で洗浄し、スルホ基が酸型になった粒子を得た。前記粒子に０．５Ｍ水酸化ナトリウム１０ｍＬを加え、濾液を集めるための容器を設置した状態でそれを濾過し、次いで粒子を水１０ｍＬで洗浄した。設置した容器に採取された濾液と洗浄液の混合液に純水７０ｍＬを加え、０．１Ｍ塩酸で滴定した。計算の結果、粒子の質量に対するスルホ基量は３８．２ｍｍｏｌ／ｇであった。
得られた粒子は、水に分散しない性質を有していた。
水に分散しない理由としては、酸性条件では、プロパンスルトンの反応による導入されるスルホ基量が少ないからではないかと推測される。水に分散しないため、タンパク質の分析に適したカラムは得られなかった。【００５１】
実施例２
実施例１で得た共重合体粒子３ｇを８ｍＬの水に分散させ、０．５Ｍ硫酸８ｍＬを加えて７０℃で６時間反応させて、エポキシ環を開環させた。エポキシ環が硫酸との反応により開環したことは、ＦＴ−ＩＲでエポキシ基由来のピークが焼失したことにより確認した。得られた粒子に対し、実施例１と同様な操作によって１，３−プロパンスルトンとの修飾工程を行い、充填剤粒子４を３ｇ得た。粒子の質量に対するスルホ基量は１８０μｍｏｌ／ｇであった。
得られた充填剤粒子４を、内径４．６ｍｍ×長さ１０ｍｍのＰＥＥＫ製カラムにスラリー法で充填し、カラム４を得た。【００５２】
分析例４
カラム４を用いて、溶離液条件として０ｍｉｎから０．５ｍｉｎは（Ａ）リン酸緩衝液（ｐＨ５．３）、０．５ｍｉｎから１．０ｍｉｎは（Ｂ）リン酸緩衝液（ｐＨ８．５）であるステップグラジエントとした以外は分析例１と同様に測定を行った。得られたクロマトグラムを図４に示す。図１と同様に、糖化ヘモグロビンが短時間で良好に分離した。比較した場合、糖化ヘモグロビンと不安定型糖化ヘモグロビンの分離に関しては、図１のクロマトグラムが、やや勝っていた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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