(57)【要約】  本発明の課題は、優れたライソゾーム病処置剤を提供することである。本発明によれば、複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種類の複数個の細胞とを含み、複数個の上記細胞の隙間に、少なくとも１個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体を含む、ライソゾーム病処置剤が提供される。
2019004446.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種類の複数個の細胞とを含み、複数個の前記細胞の隙間に、少なくとも１個の前記高分子ブロックが配置されている細胞構造体を含む、ライソゾーム病処置剤。
【請求項２】
前記細胞が、少なくとも間葉系幹細胞または線維芽細胞を含む、請求項１に記載の処置剤。
【請求項３】
前記細胞構造体が、細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、請求項１または２に記載の処置剤。
【請求項４】
前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが１０μｍ以上３００μｍ以下である、請求項１から３の何れか一項に記載の処置剤。
【請求項５】
前記細胞構造体の厚さ又は直径が１００μｍ以上３ｃｍ以下である、請求項１から４の何れか一項に記載の処置剤。
【請求項６】
前記生体親和性高分子ブロックがリコンビナントペプチドからなる、請求項１から５の何れか一項に記載の処置剤。
【請求項７】
前記リコンビナントペプチドが、下記式で示される、請求項６に記載の処置剤。
式：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【請求項８】
前記リコンビナントペプチドが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、請求項６または７に記載の処置剤。
【請求項９】
前記生体親和性高分子ブロックにおいて、前記生体親和性高分子が熱、紫外線又は酵素により架橋されている、請求項１から８の何れか一項に記載の処置剤。
【請求項１０】
前記生体親和性高分子ブロックが、生体親和性高分子の多孔質体を粉砕することにより得られる顆粒の形態にある、請求項１から９の何れか一項に記載の処置剤。
【請求項１１】
ライソゾーム病がファブリ病である、請求項１から１０の何れか一項に記載の処置剤。
【請求項１２】
生体内においてα−ガラクトシダーゼＡを分泌することにより、生体内におけるグロボトリアオシルスフィンゴシンを低減させる、請求項１１に記載の処置剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数個の細胞の隙間に複数個の高分子ブロックが配置されている細胞構造体を含む、ライソゾーム病処置剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ライソゾーム病は、遺伝子異常によりライソゾームにある一以上の酵素の活性が欠損するために細胞内小器官であるライソゾーム内に分解されない物質が蓄積するか、あるいはライソゾームにある膜蛋白の機能障害のためにライソゾームに物質が蓄積することにより発症する病気の総称である。ライソゾーム病は、個々に異常のある酵素または遺伝子によって複数種類に分類されており、６０種類以上が存在する難病である。【０００３】
一般的には、ライソゾーム病では、体外から酵素を人工的に補填する酵素補填療法が行われている。例えばファブリ病に対する酵素補填療法が行なわれているが、酵素製剤の体内滞留時間が著しく短いことから、二週間に一度の頻度で一生涯にわたって酵素製剤を投与し続けなければならず、患者にとって負担が大きくＱＯＬ（Quality of Life）は低い。また、酵素製剤が存在しないライソゾーム病もあり、その場合には有効な治療手段が存在しない。【０００４】
また、ライソゾーム病の治療に必要な酵素の遺伝子を過剰に発現させた細胞を治療に用いる技術も開発されている。例えば、特許文献１には、ヒトα−ｇａｌ Ａを過剰発現し、かつ分泌するように遺伝的に修飾されたヒト細胞である、α−ガラクトシダーゼＡ欠損症治療用細胞が記載されている。また、特許文献２には、遺伝子導入をしていない多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）などの幹細胞をライソゾーム病に用いることが記載されている。【０００５】
一方、特許文献３には、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４３１３３８１号公報
【特許文献２】米国特許第７，９２７，５８７号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２０１１／１０８５１７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に記載されているような遺伝子を過剰発現させた細胞を用いることは、生体にとっての有害性および危険性の観点からも望ましいことではない。また、特許文献２に記載されているような多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）などの幹細胞を単独で使用した場合には、その効果が持続せず、治療に供することができない。本発明は、優れたライソゾーム病処置剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体が、ライソゾーム病の処置に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞  複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種類の複数個の細胞とを含み、複数個の上記細胞の隙間に、少なくとも１個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体を含む、ライソゾーム病処置剤。
＜２＞  上記細胞が、少なくとも間葉系幹細胞または線維芽細胞を含む、＜１＞に記載の処置剤。
＜３＞  上記細胞構造体が、細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、＜１＞または＜２＞に記載の処置剤。
＜４＞  上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが１０μｍ以上３００μｍ以下である、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の処置剤。
＜５＞  上記細胞構造体の厚さ又は直径が１００μｍ以上３ｃｍ以下である、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の処置剤。
＜６＞  上記生体親和性高分子ブロックがリコンビナントペプチドからなる、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の処置剤。【００１０】
＜７＞  上記リコンビナントペプチドが、下記式で示される、＜６＞に記載の処置剤。
式：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
＜８＞  上記リコンビナントペプチドが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、＜６＞または＜７＞に記載の処置剤。【００１１】
＜９＞  上記生体親和性高分子ブロックにおいて、上記生体親和性高分子が熱、紫外線又は酵素により架橋されている、＜１＞から＜８＞の何れか一に記載の処置剤。
＜１０＞  上記生体親和性高分子ブロックが、生体親和性高分子の多孔質体を粉砕することにより得られる顆粒の形態にある、＜１＞から＜９＞の何れか一に記載の処置剤。
＜１１＞  ライソゾーム病がファブリ病である、＜１＞から＜１０＞の何れか一に記載の処置剤。
＜１２＞  生体内においてα−ガラクトシダーゼＡを分泌することにより、生体内におけるグロボトリアオシルスフィンゴシンを低減させる、＜１１＞に記載の処置剤。【００１２】
さらに本発明によれば、以下の発明が提供される。
（Ａ）  複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種類の複数個の細胞とを含み、複数個の上記細胞の隙間に、少なくとも１個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体を、ライソゾーム病の処置を必要とする対象者に移植する工程を含む、ライソゾーム病の処置方法。
（Ｂ）  ライソゾーム病の処置において使用するための、複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種類の複数個の細胞とを含み、複数個の上記細胞の隙間に、少なくとも１個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体。
（Ｃ）  ライソゾーム病処置剤の製造のための、複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種類の複数個の細胞とを含み、複数個の上記細胞の隙間に、少なくとも１個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体の使用。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の処置剤はライソゾーム病処置剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、条件Ａに記載した実験の液温プロファイリングを示す。
【図２】図２は、条件Ｂに記載した実験の液温プロファイリングを示す。
【図３】図３は、条件Ｃに記載した実験の液温プロファイリングを示す。
【図４】図４は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）におけるライソゾーム病関連酵素の発現量を示す。
【図５】図５は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）におけるライソゾーム病関連酵素の発現量を示す。
【図６】図６は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）、ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）およびヒト歯髄由来幹細胞（ｈＤＰＳＣ）におけるライソゾーム病関連酵素の発現量を示す。ＮＥＵ１、ＣＴＳＡ、ＧＬＢ１およびＨＥＸＡは、酵素製剤が未開発であり、かつ患者数が多いもの上位６種に該当する。ＩＤＳは患者数が最も多いもの１種である。
【図７】図７は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）、ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）およびヒト歯髄由来幹細胞（ｈＤＰＳＣ）におけるライソゾーム病関連酵素の発現量を示す。ＰＰＴＩとＧＮＰＴＡＢは、酵素製剤が未開発であり、かつ患者数が多いもの上位６種に該当する。
【図８】図８は、細胞または細胞構造体から分泌されるαＧａｌＡ酵素量を測定した結果を示す。
【図９】図９は、細胞構造体を各種投与経路から投与してから４週間後の肝臓中のグロボトリアオシルスフィンゴシン（ＬｙｓｏＧｂ３）量を定量した結果を示す。
【図１０】図１０は、細胞構造体を各種投与経路から投与してから４週間後の腎臓中のＬｙｓｏＧｂ３量を定量した結果を示す。
【図１１】図１１は、細胞構造体を各種投与経路から投与してから４週間後の心臓中のＬｙｓｏＧｂ３量を定量した結果を示す。
【図１２】図１２は、細胞または細胞構造体を門脈内投与または尾静脈内投与してから４週間後の肝臓中のＬｙｓｏＧｂ３量を定量した結果を示す。
【図１３】図１３は、細胞構造体を腎被膜下に移植してから４週間後の肝臓中のＬｙｓｏＧｂ３量を定量する試験の流れを示す。
【図１４】図１４は、細胞構造体を腎被膜下に移植してから４週間後の肝臓中のＬｙｓｏＧｂ３量を定量した結果を示す。
【図１５】図１５は、細胞構造体を腎被膜下に移植してから４週間後における腎被膜下の細胞構造体のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための形態を、詳細に説明する。
本発明において使用する細胞構造体は、本明細書中において、モザイク細胞塊（モザイク状になっている細胞塊）と称する場合もある。また本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
【００１６】
本発明は、複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種類の複数個の細胞とを含み、複数個の上記細胞の隙間に、少なくとも１個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体を含む、ライソゾーム病処置剤に関する。本発明のライソゾーム病処置剤によれば、持続的に処置効果を維持することができる。
【００１７】
後記する実施例に示す通り、ファブリ病マウスに細胞構造体を投与した群では肝臓中のＬｙｓｏＧｂ３が、細胞構造体を投与していない群および細胞のみを投与した群と比べて有意に減少することが分かった。実施例に示す結果から、細胞構造体として細胞を投与した場合にはファブリ病マウスに高い有効性を示すことが明らかになり、これは全く予想外な効果である。
【００１８】
（１）生体親和性高分子ブロック
（１−１）生体親和性高分子
生体親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン、およびＭＰＣ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）などが挙げられる。生分解性材料としては、具体的には、天然由来のペプチド、リコンビナントペプチドまたは化学合成ペプチドなどのポリペプチド（例えば、以下に説明するゼラチン等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、およびキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、「基材表面に対する細胞接着基質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）や細胞接着配列（アミノ酸一文字表記で表される、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列）ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、または「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。
【００１９】
リコンビナントペプチドまたは化学合成ペプチドを含むポリペプチドの種類は生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン（登録商標）が好ましく、最も好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンである。本発明で用いるためのゼラチンとしては、好ましくは、天然ゼラチン、リコンビナントゼラチンまたは化学合成ゼラチンであり、さらに好ましくはリコンビナントゼラチンである。ここでいう天然ゼラチンとは天然由来のコラーゲンより作られたゼラチンを意味する。
【００２０】
化学合成ペプチドまたは化学合成ゼラチンとは、人工的に合成したペプチドまたはゼラチンを意味する。ゼラチン等のペプチドの合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ペプチドの固相合成は当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護としてＦｍｏｃ基（Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基）を使用するＦｍｏｃ基合成法、並びにアミノ基の保護としてＢｏｃ基（tert-Butyl Oxy Carbonyl基）を使用するＢｏｃ基合成法などが挙げられる。なお、化学合成ゼラチンの好ましい態様は、本明細書中後記するリコンビナントゼラチンに記載した内容を当てはめることができる。
【００２１】
本発明で用いる生体親和性高分子の親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ４）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図−基礎と応用−」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
【００２２】
本発明で用いる高分子の「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明にかかる細胞構造体（モザイク細胞塊）における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
【００２３】
本発明で用いる生体親和性高分子がポリペプチドである場合は、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標において、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』および『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
【００２４】
本発明で用いる高分子のＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明にかかる細胞構造体（モザイク細胞塊）における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
【００２５】
（１−２）架橋
本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、培地中で培養する際および生体に移植した際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、およびイオン性相互作用などが知られており、本発明においても上記の架橋方法を使用することができる。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、または酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
【００２６】
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼまたはラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として販売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、並びにヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
【００２７】
架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは、−１００℃〜５００℃であり、より好ましくは０℃〜３００℃であり、更に好ましくは５０℃〜３００℃であり、特に好ましくは１００℃〜２５０℃であり、最も好ましくは１２０℃〜２００℃である。
【００２８】
（１−３）リコンビナントゼラチン
本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列（ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばＥＰ１０１４１７６、米国特許６９９２１７２号、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
【００２９】
リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然ゼラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度および分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
【００３０】
リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ（キロダルトン）以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。
【００３１】
リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、ＸおよびＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。ＸおよびＹで表されるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し構造である。
【００３２】
一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンおよびアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０〜４０％であり、好ましくは２０〜３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満、好ましくは５％以上１０％未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
【００３３】
一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列およびＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。細胞接着シグナルを有するリコンビナントゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。
【００３４】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０〜１００の間で均一でないことが好ましく、ＲＧＤ間のアミノ酸数が２５〜６０の間で均一でないことがより好ましい。
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中に好ましくは３〜５０個であり、さらに好ましくは４〜３０個であり、特に好ましくは５〜２０個であり、最も好ましくは１２個である。
【００３５】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、より好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に一層好ましくは少なくとも１．０％であり、特に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも６、更に好ましくは少なくとも８、特に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、好ましくは少なくとも４つのＲＧＤモチーフを含み、より好ましくは少なくとも６つのＲＧＤモチーフを含み、さらに好ましくは少なくとも８つのＲＧＤモチーフを含み、特に好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
【００３６】
リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００３７】
好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、式１：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍは好ましくは２〜１０の整数を示し、より好ましくは３〜５の整数を示す。ｎは３〜１００の整数が好ましく、１５〜７０の整数がさらに好ましく、５０〜６５の整数が最も好ましい。Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【００３８】
より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）６３］３−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。
【００３９】
繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、またはＶ型コラーゲンである。より好ましくは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウスまたはラットであり、より好ましくはヒトである。
【００４０】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、さらに好ましくは７〜９．５である。リコンビナントゼラチンの等電点の測定は、等電点電気泳動法（Ｍａｘｅｙ，Ｃ．Ｒ．（１９７６；Ｐｈｉｔｏｇｒ．Ｇｅｌａｔｉｎ ２，Ｅｄｉｔｏｒ Ｃｏｘ，Ｐ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌ．参照）に記載されたように、１質量％ゼラチン溶液をカチオンおよびアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのｐＨを測定することで実施することができる。
【００４１】
好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
【００４２】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである
【００４３】
本発明における配列同一性は、以下の式で計算される値を指す。
％配列同一性＝［（同一残基数）／（アラインメント長）］×１００
２つのアミノ酸配列における配列同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができ、ＢＬＡＳＴ（(Basic Local Alignment Search Tool)）プログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）等を使用して決定することができる。
【００４４】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００４５】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。
【００４６】
（１−４）生体親和性高分子ブロック
本発明では、上記した生体親和性高分子からなるブロック（塊）を使用する。
本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではない。例えば、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状、多孔質状、繊維状、紡錘状、扁平状およびシート状であり、好ましくは、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状および多孔質状である。不定形とは、表面形状が均一でないもののことを示し、例えば、岩のような凹凸を有する物を示す。なお、上記の形状の例示はそれぞれ別個のものではなく、例えば、粒子状（顆粒）の下位概念の一例として不定形となる場合もある。
【００４７】
本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は上記の通り特に限定されるものではないが、タップ密度が、好ましくは１０ｍｇ／ｃｍ３以上５００ｍｇ／ｃｍ３以下であり、より好ましくは２０ｍｇ／ｃｍ３以上４００ｍｇ／ｃｍ３以下であり、さらに好ましくは４０ｍｇ／ｃｍ３以上２２０ｍｇ／ｃｍ３以下であり、特に好ましくは５０ｍｇ／ｃｍ３以上１５０ｍｇ／ｃｍ３以下である。
【００４８】
タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であることが分かる。生体親和性高分子ブロックのタップ密度とは、生体親和性高分子ブロックの表面構造の複雑性、および生体親和性高分子ブロックを集合体として集めた場合に形成される空隙の量を表していると考えられる。タップ密度が小さい程、生体親和性高分子ブロック間の空隙が多くなり、細胞の生着領域が多くなる。また、小さ過ぎないことで、細胞同士の間に適度に生体親和性高分子ブロックが存在でき、細胞構造体とした場合に同構造体内部への栄養分送達を可能とすることから、上記の範囲に収まることが好適であると考えられる。
【００４９】
本明細書でいうタップ密度は、特に限定されないが、以下のように測定できる。測定のために（直径６ｍｍ、長さ２１．８ｍｍの円筒状：容量０．６１６ｃｍ３）の容器（以下、キャップと記載する）を用意する。まず、キャップのみの質量を測定する。その後、キャップにロートを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込む。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を２００回机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにする。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定する。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めることができる。
【００５０】
本発明における生体親和性高分子ブロックの架橋度は、特に限定されないが、好ましくは２以上であり、さらに好ましくは２以上３０以下であり、さらに好ましくは４以上２５以下であり、特に好ましくは４以上２２以下である。
【００５１】
生体親和性高分子ブロックの架橋度（１分子当たりの架橋数）の測定方法は、特に限定されないが、生体親和性高分子がＣＢＥ３の場合には、例えば、後記実施例に記載のＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）法で測定することができる。具体的には、生体親和性高分子ブロック、ＮａＨＣＯ３水溶液およびＴＮＢＳ水溶液を混合して３７℃で３時間反応させた後に反応停止したサンプルと、生体親和性高分子ブロック、ＮａＨＣＯ３水溶液およびＴＮＢＳ水溶液を混合した直後に反応停止させたブランクとをそれぞれ調製し、純水で希釈したサンプルおよびブランクの吸光度（３４５ｎｍ）を測定し、以下の（式２）、および（式３）から架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出することができる。
【００５２】
（式２）  （Ａｓ−Ａｂ）／１４６００×Ｖ／ｗ  
（式２）は、生体親和性高分子ブロック１ｇ当たりのリジン量（モル等量）を示す。
（式中、Ａｓはサンプル吸光度、Ａｂはブランク吸光度、Ｖは反応液量（ｇ）、ｗは生体親和性高分子ブロック質量（ｍｇ）を示す。）
【００５３】
（式３）  １−（サンプル（式２）/未架橋の高分子（式２））×３４
（式３）は、１分子あたりの架橋数を示す。
【００５４】
本発明における生体親和性高分子ブロックの吸水率は、特に限定されないが、好ましくは３００％以上、より好ましくは４００％以上、さらに好ましくは５００％以上、特に好ましくは６００％以上、最も好ましくは７００％以上である。なお吸水率の上限は特に限定されないが、一般的には４０００％以下、または２０００％以下である。
【００５５】
生体親和性高分子ブロックの吸水率の測定方法は、特に限定されないが、例えば、後記実施例に記載の方法により測定することができる。具体的には、２５℃において３ｃｍ×３ｃｍのナイロンメッシュ製の袋の中に、生体親和性高分子ブロック約１５ｍｇを充填し、２時間イオン交換水中で膨潤させた後、１０分風乾させ、それぞれの段階において質量を測定し、（式４）に従って吸水率を求めることができる。
【００５６】
（式４）
吸水率＝（ｗ２−ｗ１−ｗ０）／ｗ０
（式中、ｗ０は、吸水前の材料の質量、ｗ１は吸水後の空袋の質量、ｗ２は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。）
【００５７】
本発明における生体親和性高分子ブロック一つの大きさは、特に限定されないが、好ましくは２０μｍ以上２００μｍ以下であり、より好ましくは２０μｍ以上１５０μｍ以下であり、さらに好ましくは５０μｍ以上１２０μｍ以下であり、特に好ましくは５３μｍ以上１０６μｍ以下である。
生体親和性高分子ブロック一つの大きさを上記の範囲内にすることにより、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を良好にすることができる。なお、生体親和性高分子ブロック一つの大きさとは、複数個の生体親和性高分子ブロックの大きさの平均値が上記範囲にあることを意味するものではなく、複数個の生体親和性高分子ブロックを篩にかけて得られる、一つ一つの生体親和性高分子ブロックのサイズを意味するものである。
【００５８】
ブロック一つの大きさは、ブロックを分ける際に用いたふるいの大きさで定義することができる。例えば、１８０μｍのふるいにかけ、通過したブロックを１０６μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、１０６〜１８０μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、１０６μｍのふるいにかけ、通過したブロックを５３μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、５３〜１０６μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、５３μｍのふるいにかけ、通過したブロックを２５μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、２５〜５３μｍの大きさのブロックとすることができる。
【００５９】
（１−５）生体親和性高分子ブロックの製造方法
生体親和性高分子ブロックの製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子を含有する固形物（生体親和性高分子の多孔質体など）を、粉砕機（ニューパワーミルなど）を用いて粉砕することにより、生体親和性高分子ブロックを得ることができる。生体親和性高分子を含有する固形物（多孔質体など）は、例えば、生体親和性高分子を含有する水溶液を凍結乾燥して得ることができる。
【００６０】
上記の通り、生体親和性高分子を含有する固形物を粉砕することにより、表面形状が均一でない不定形の生体親和性高分子ブロックを製造することができる。
【００６１】
生体親和性高分子の多孔質体を製造する方法としては、特に限定されないが、生体親和性高分子を含む水溶液を凍結乾燥させることによっても得ることができる。例えば、溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が、未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以下となる凍結工程を含めることによって、形成される氷は球状とすることができる。この工程を経て、氷が乾燥されることで、球状の等方的な空孔（球孔）を持つ多孔質体が得られる。溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が、未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以上となる凍結工程を含まずに、凍結されることで、形成される氷は柱／平板状とすることができる。この工程を経て、氷が乾燥されると、一軸あるいは二軸上に長い、柱状あるいは平板状の空孔（柱／平板孔）を持つ多孔質体が得られる。生体親和性高分子の多孔質体を、粉砕し、生体親和性高分子ブロックを製造する場合には、粉砕前の多孔質体の空孔が、得られる生体親和性高分子ブロックの形状に影響を与えるため、上記の通り、凍結乾燥の条件を調整することにより、得られる生体親和性高分子ブロックの形状を調整することができる。
【００６２】
生体親和性高分子の多孔質体の製造方法の一例としては、
（ａ）溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程
を含む方法を挙げることができるが、上記方法に限定されるわけではない。
【００６３】
生体親和性高分子の溶液を未凍結状態に冷却する際に、最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下（好ましくは２．３℃以下、より好ましくは２．１℃以下）、つまり温度の差を小さくすることによって、得られる多孔質のポアの大きさのばらつきが少なくなる。なお最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差の下限は特に限定されず、０℃以上であればよく、例えば０．１℃以上、０．５℃以上、０．８℃以上、または０．９℃以上でもよい。これにより、製造された多孔質体を用いて製造した生体親和性高分子ブロックを用いた細胞構造体は、高い細胞数を示すという効果が達成される。
【００６４】
工程（ａ）の冷却は、例えば、水よりも熱伝導率の低い素材（好ましくは、テフロン（登録商標））を介して冷却することが好ましく、溶液内で最も液温の高い部分は、冷却側から最も遠い部分と擬制することができ、溶液内で最も液温の低い部分は、冷却面の液温と擬制することができる。
【００６５】
好ましくは、工程（ａ）において、凝固熱発生直前の、溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、より好ましくは２．３℃以下であり、さらに好ましくは２．１℃以下である。ここで「凝固熱発生直前の温度差」とは、凝固熱発生時の１秒前〜１０秒前の間で最も温度差が大きくなるときの温度差を意味する。
【００６６】
好ましくは、工程（ａ）において、溶液内で最も液温の低い部分の温度は、溶媒融点−５℃以下であり、より好ましくは溶媒融点−５℃以下かつ溶媒融点−２０℃以上であり、更に好ましくは溶媒融点−６℃以下かつ溶媒融点−１６℃以上である。なお、溶媒融点の溶媒とは、生体親和性高分子の溶液の溶媒である。
【００６７】
工程（ｂ）においては、工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する。工程（ｂ）にて凍結するための冷却温度は、特に制限されるものではなく、冷却する機器にもよるが、好ましくは、溶液内で最も液温の低い部分の温度より、３℃から３０℃低い温度であり、より好ましくは、５℃から２５℃低い温度であり、更に好ましくは、１０℃から２０℃低い温度である。
【００６８】
工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する。凍結乾燥は、常法により行うことができ、例えば、溶媒の融点より低い温度で真空乾燥を行い、さらに室温（２０℃）で真空乾燥を行うことにより凍結乾燥を行うことができる。
【００６９】
本発明では好ましくは、上記工程（ｃ）で得られた多孔質体を粉砕することによって、生体親和性高分子ブロックを製造することができる。
【００７０】
（２）細胞
本発明で使用する細胞は、その種類は特に限定されるものではなく、本発明の目的であるライソゾーム病を処置する機能を有する細胞を好適に用いることができ、実際の治療目的に応じて、任意の細胞を使用することができる。また、使用する細胞は１種でもよいし、複数種の細胞を組合せて用いてもよい。使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）の種類は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞、または成熟細胞の何れでもよく、特に好ましくは体性幹細胞である。
【００７１】
万能細胞としては、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、生殖幹（ＧＳ）細胞、または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を使用することができる。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞（例えば、骨髄由来間ＭＳＣ等）、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、または神経幹細胞を使用することができる。前駆細胞および成熟細胞としては、例えば、皮膚、真皮、表皮、筋肉、心筋、神経、骨、軟骨、内皮、脳、上皮、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、口腔内、角膜、骨髄、臍帯血、羊膜、または毛に由来する細胞を使用することができる。ヒト由来細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＭＳＣ、軟骨細胞、骨芽細胞、骨芽前駆細胞、間充織細胞、筋芽細胞、心筋細胞、心筋芽細胞、神経細胞、肝細胞、ベータ細胞、線維芽細胞、角膜内皮細胞、血管内皮細胞、角膜上皮細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、または造血幹細胞を使用することができる。また、細胞の由来は、自家細胞または他家細胞の何れでも構わない。また、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から分化誘導した間質細胞、間葉系幹細胞であっても構わない。上記の中でも、細胞としては、少なくとも間葉系幹細胞または線維芽細胞を使用することが好ましい。間葉系幹細胞としては、脂肪由来間葉系幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞が好ましい。間葉系幹細胞の由来としては、ヒト由来または犬由来が好ましい。
【００７２】
本発明で用いる細胞が、ライソゾーム病の治療に必要な遺伝子の導入によって上記遺伝子を過剰発現させていない細胞であることが好ましい。
【００７３】
（３）細胞構造体
本発明の細胞構造体は、上記した本発明にかかる複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも１種類の複数個の細胞とを含み、複数個の上記細胞の隙間に、少なくとも１個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体である。本発明においては、上記した生体親和性高分子ブロックと上記した細胞とを用いて、複数個の細胞の隙間に複数個の高分子ブロックをモザイク状に３次元的に配置させることによって、生体親和性高分子ブロックと細胞とがモザイク状に３次元配置されることにより、構造体中で細胞が均一に存在する細胞３次元構造体が形成され、前述したように、物質透過能を有することとなる。
【００７４】
本発明の細胞構造体は、複数個の細胞の隙間に複数個の高分子ブロックが配置されているが、ここで、「細胞の隙間」とは、構成される細胞により、閉じられた空間である必要はなく、細胞により挟まれていればよい。なお、すべての細胞に隙間がある必要はなく、細胞同士が接触している箇所があってもよい。高分子ブロックを介した細胞の隙間の距離、即ち、ある細胞とその細胞から最短距離に存在する細胞を選択した際の隙間距離は特に制限されるものではないが、高分子ブロックの大きさであることが好ましく、好適な距離も高分子ブロックの好適な大きさの範囲である。
【００７５】
また、本発明にかかる高分子ブロックは、細胞により挟まれた構成となるが、すべての高分子ブロック間に細胞がある必要はなく、高分子ブロック同士が接触している箇所があってもよい。細胞を介した高分子ブロック間の距離、即ち、高分子ブロックとその高分子ブロックから最短距離に存在する高分子ブロックを選択した際の距離は特に制限されるものではないが、使用される細胞が１〜数個集まった際の細胞の塊の大きさであることが好ましく、例えば、１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、好ましくは１０μｍ以上１００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上５０μｍ以下である。
【００７６】
なお、本明細書中、「構造体中で細胞が均一に存在する細胞３次元構造体」等、「均一に存在する」との表現を使用しているが、完全な均一を意味するものではない。
【００７７】
本発明の細胞構造体の厚さまたは直径は、所望の厚さとすることができるが、下限としては、１００μｍ以上であることが好ましく、２１５μｍ以上であることがより好ましく、４００μｍ以上がさらに好ましく、７３０μｍ以上であることが最も好ましい。厚さまたは直径の上限は特に限定されないが、使用上の一般的な範囲としては３ｃｍ以下が好ましく、２ｃｍ以下がより好ましく、１ｃｍ以下であることが更に好ましい。また、細胞構造体の厚さまたは直径の範囲として、好ましくは１００μｍ以上３ｃｍ以下、より好ましくは４００μｍ以上３ｃｍ以下、より一層好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。
【００７８】
本発明の細胞構造体は、好ましくは、高分子ブロックからなる領域と細胞からなる領域がモザイク状に配置されている。尚、本明細書中における「細胞構造体の厚さまたは直径」とは、以下のことを示すものとする。細胞構造体中のある一点Ａを選択した際に、その点Ａを通る直線の内で、細胞構造体外界からの距離が最短になるように細胞構造体を分断する線分の長さを線分Ａとする。細胞構造体中でその線分Ａが最長となる点Ａを選択し、その際の線分Ａの長さのことを「細胞構造体の厚さまたは直径」とする。
【００７９】
本発明の細胞構造体においては、細胞と高分子ブロックの比率は特に限定されないが、好ましくは細胞1個当りの高分子ブロックの質量が０．００００００１μｇ以上１μｇ以下であることが好ましく、より好ましくは０．０００００１μｇ以上０．１μｇ以下、さらに好ましくは０．００００１μｇ以上０．０１μｇ以下、最も好ましくは０．００００２μｇ以上０．００６μｇ以下である。上記範囲とすることにより、より細胞を均一に存在させることができる。また、下限を上記範囲とすることにより、上記用途に使用した際に細胞の効果を発揮することができ、上限を上記範囲とすることにより、任意で存在する高分子ブロック中の成分を細胞に供給できる。ここで、高分子ブロック中の成分は特に制限されないが、後記する培地に含まれる成分が挙げられる。
【００８０】
（４）細胞構造体の製造方法
本発明で用いる細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することによって製造することができる。より具体的には、本発明の細胞構造体は、生体親和性高分子ブロック（生体親和性高分子からなる塊）と、細胞とを交互に配置することにより製造できる。なお、交互とは、完全な交互を意味するものではなく、例えば、生体親和性高分子ブロックと細胞とが混合された状態を意味する。製造方法は特に限定されないが、好ましくは高分子ブロックを形成したのち、細胞を播種する方法である。具体的には、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートすることによって、細胞構造体を製造することができる。例えば、容器中、容器に保持される液体中で、細胞と、予め作製した生体親和性高分子ブロックをモザイク状に配置する。配置の手段としては、自然凝集、自然落下、遠心、攪拌を用いることで、細胞と生体親和性高分子ブロックからなるモザイク状の配列形成を、促進、制御することが好ましい。
【００８１】
用いられる容器としては、細胞低接着性材料、細胞非接着性材料からなる容器が好ましく、より好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートからなる容器である。容器底面の形状は平底型、Ｕ字型、Ｖ字型であることが好ましい。
【００８２】
上記の方法で得られたモザイク状細胞構造体は、例えば、（ａ）別々に調製したモザイク状細胞塊同士を融合させる、または（ｂ）分化培地または増殖培地下でボリュームアップさせる、などの方法により所望の大きさの細胞構造体を製造することができる。融合の方法、ボリュームアップの方法は特に限定されない。
【００８３】
例えば、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、培地を分化培地または増殖培地に交換することによって、細胞構造体をボリュームアップさせることができる。好ましくは、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体であって、細胞構造体中に細胞が均一に存在する細胞構造体を製造することができる。
【００８４】
上記別々に調製したモザイク状細胞塊同士を融合させる方法とは、具体的には、複数個の生体親和性高分子ブロックと、複数個の細胞とを含み、上記複数の細胞により形成される複数個の隙間の一部または全部に、一または複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を複数個融合させる工程を含む、細胞構造体の製造方法である。
【００８５】
本発明で用いる細胞構造体の製造方法における「生体親和性高分子ブロック（種類、大きさ等）」、「細胞」、「複数個の細胞の隙間」、「得られる細胞構造体（大きさ等）」、「細胞と高分子ブロックの比率」等の好適な範囲は、本明細書中上記と同様である。
【００８６】
（５）ライソゾーム病処置剤
ライソゾーム病とは、遺伝子異常によりライソゾームにある酵素の活性がひとつあるいは複数欠損するために、細胞内小器官であるライソゾーム内に分解されない物質が蓄積する、あるいはライソゾームにある膜蛋白の機能障害のために、ライソゾームに物質が蓄積して発症する病気の総称である。
【００８７】
ライソゾーム病は、個々に異常のある酵素・遺伝子によって複数種類に分類されており、６０種類以上が存在する。
ライソゾーム病としては、ファブリ病、ゴーシェ病、シアリドーシス、ニーマンピック病Ａ，Ｂ型、ガラクトシアリドーシス、ニーマンピック病Ｃ型、Ｉ−ｃｅｌｌ病、ムコリピドーシスIII型、ＧＭ１ガングリオシドーシス、βガラクトシダーゼ欠損症、α−マンノシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、β−マンノシドーシス、クラッベ、フコシドーシス、異染性脳白質ジストロフィー、アスパルチルグルコサミン尿症、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｕｌｆａｔａｓｅ欠損症、シンドラー／神崎病、ファーバー病、ポンペ病、ハーラー／シャイエ症候群、ウォルマン病、ハンター症候群、ダノン病、サンフィリッポ症候群、遊離シアル酸蓄積症、モルキオ症候群、セロイドリポフスチノーシス、マルトラミー症候群、スライ病、βグルコロニダーゼ活性低下症、サンドホフ病およびコレステロールエステル蓄積症が挙げられる。上記の中でも、ファブリ病が好ましい。
【００８８】
本発明の処置剤は、生体内においてα−ガラクトシダーゼＡを分泌することにより、生体内におけるグロボトリアオシルスフィンゴシンを低減させることができ、これによりファブリ病を処置することができる。
【００８９】
それぞれのライソゾーム病には原因遺伝子／蛋白質が同定されているものが多い。その具体例を後記する表１に示す。
【００９０】
処置とは、各種疾患に対する予防または治療などを意味する。
予防とは、対象となる疾患に特有な症状の進行を予め抑制することを意味し、発症の阻害、発症リスクの低減または発症の遅延などが含まれる。進行の抑制の程度は何ら限定されず、程度がごくわずかであっても進行が抑制され得る限り、予防に含まれる。
治療とは、対象となる疾患または状態の改善または進行の抑制などを意味する。
処置剤とは、処置の目的で供せられる物質を意味する。
【００９１】
本発明のライソゾーム病処置剤は、生体に移植して使用することができる。移植方法としては、切開、注射、内視鏡といったものが使用可能である。本発明のライソゾーム病処置剤は、細胞シートといった細胞移植物とは異なり、構造体のサイズを小さくすることができるため、注射による移植といった低侵襲の移植方法が可能となる。
【００９２】
本発明のライソゾーム病処置剤を移植する際の量は、移植対象（ヒト、動物）の状態などに応じて適宜選択することができるが、移植する細胞数としては、１．０×１０5 cells/kg以上２．０×１０9cells/kg以下が好ましく、１．０×１０6 cells/kg以上２．０×１０８cells/kg以下がより好ましい。
本発明のライソゾーム病処置剤の移植回数は、１回だけ移植してもよいし、必要に応じ２回以上の移植を行うこともできる。
【００９３】
（６）各種の用途
本発明によれば、本発明で規定する細胞構造体を、ライソゾーム病の処置を必要とする対象者に移植する工程を含む、ライソゾーム病の処置方法が提供される。上記のライソゾーム病の処置方法において、細胞構造体の好ましい範囲は、前述と同様である。
【００９４】
本発明によれば、ライソゾーム病の処置において使用するための、本発明で規定する細胞構造体が提供される。上記の細胞構造体において、細胞構造体の好ましい範囲は、前述と同様である。
【００９５】
本発明によれば、ライソゾーム病処置剤の製造のための、本発明で規定する細胞構造体の使用が提供される。上記の使用において、細胞構造体の好ましい範囲は、前述と同様である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００９６】
［参考例１］リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）
リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）として以下のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：
分子量：５１．６ｋＤ
構造：  ＧＡＰ［（ＧＸＹ）６３］３Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：−０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)３G【００９７】
［参考例２］  リコンビナントペプチド多孔質体の作製
［ＰＴＦＥ厚・円筒形容器］
底面厚さ３ｍｍ、直径５１ｍｍ、側面厚さ８ｍｍ、高さ２５ｍｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は８ｍｍのＰＴＦＥで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も３ｍｍのＰＴＦＥで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップの内径は４３ｍｍになっている。以後、この容器のことをＰＴＦＥ厚・円筒形容器と呼称する。【００９８】
［アルミ硝子板・円筒形容器］
厚さ１ｍｍ、直径４７ｍｍのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は１ｍｍのアルミで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も１ｍｍのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚１ｍｍのテフロン（登録商標）を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は４５ｍｍになっている。また、この容器の底面にはアルミの外に２．２ｍｍの硝子板を接合した状態にしておく。以後、この容器のことをアルミ硝子・円筒形容器と呼称する。【００９９】
［温度差の小さい凍結工程、及び乾燥工程］
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器またはアルミ硝子板・円筒形容器にＣＢＥ３水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機（ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。この際の容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。【０１００】
条件Ａ：
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０５Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。【０１０１】
条件Ｂ：
アルミ・硝子板・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。  棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０５Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。【０１０２】
条件Ｃ：
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量１０ｍＬ。棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０５Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。【０１０３】
［各凍結工程での温度測定］
条件Ａ〜条件Ｃのそれぞれについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温（非冷却面液温）として容器内の円中心部の水表面液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温（冷却面液温）として容器内の底部の液温を測定した。
その結果、それぞれの温度とその温度差のプロファイルは図１〜図３の通りとなった。【０１０４】
図１、図２、図３から条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃでは棚板温度−１０℃設定区間（−２０℃に下げる前）において液温が融点である０℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない（未凍結・過冷却）状態であることがわかる。また、この状態で、冷却面液温と非冷却面液温の温度差が２．５℃以下となっていた。なお、本明細書において、「温度差」とは、「非冷却面液温」−「冷却面液温」を意味する。その後、棚板温度を−２０℃へ更に下げていくことによって、液温が０℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かる。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認できた。その後、温度は０℃付近を一定時間経過していく。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後０℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっている。従って、測定している温度は氷内部の固体温度となり、つまり液温ではなくなる。【０１０５】
以下に、条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃについて、非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差、棚板温度を−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差と、凝固熱発生直前の温度差を記載する。なお、本発明で言う「直前の温度差」とは、イベント（凝固熱発生等）の１秒前〜２０秒前までの間で検知可能な温度差の内、最も高い温度のことを表している。【０１０６】
条件Ａ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．１℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：０．２℃
凝固熱発生直前の温度差：１．１℃【０１０７】
条件Ｂ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．０℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：０．１℃
凝固熱発生直前の温度差：０．９℃【０１０８】
条件Ｃ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．８℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：１．１℃
凝固熱発生直前の温度差：２．１℃【０１０９】
［参考例３］生体親和性高分子ブロックの作製（多孔質体の粉砕と架橋）
参考例２で得られた条件Ａおよび条件ＢのＣＢＥ３多孔質体をニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ、１０６〜１８０μｍの未架橋ブロックを得た。その後、減圧下１６０℃で熱架橋（架橋時間は８時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間の６種類を実施した）を施して、生体親和性高分子ブロック（ＣＢＥ３ブロック）を得た。【０１１０】
以下、４８時間架橋を施した条件Ａの多孔質体由来ブロックをＥ、４８時間架橋を施した条件Ｂの多孔質体由来ブロックをＦと称する。ＥおよびＦは温度差の小さい凍結工程により製造した多孔質体から作られた温度差小ブロックである。なお、架橋時間の違いは本実施例の評価においては性能に影響が見られなかったため、以後、４８時間架橋したものを代表として使用した。また、ＥおよびＦでは性能に差が見られなかった。以下の参考例、実施例及び比較例では、条件Ａ、サイズ５３〜１０６μｍ、架橋時間４８時間で作製した生体親和性高分子ブロックを使用した。【０１１１】
［参考例４］  生体親和性高分子ブロックのタップ密度測定
タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であると言える。タップ密度は、以下のように測定した。まず、ロートの先にキャップ（直径６ｍｍ、長さ２１．８ｍｍの円筒状：容量０．６１６ｃｍ３）が付いたものを用意し、キャップのみの質量を測定した。その後、ロートにキャップを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込んだ。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を２００回、机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにした。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定した。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めた。
その結果、参考例３の生体親和性高分子ブロックのタップ密度は９８ｍｇ／ｃｍ３であった。【０１１２】
［参考例５］  生体親和性高分子ブロックの架橋度測定
参考例３で架橋したブロックの架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出した。測定はＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）法を用いた。
＜サンプル調製＞
ガラスバイアルに、サンプル（約１０ｍｇ）、４質量％ＮａＨＣＯ３水溶液（１ｍＬ）および１質量％のＴＮＢＳ水溶液（２ｍＬ）を添加し、混合物を３７℃で３時間振とうさせた。その後、３７質量％塩酸（１０ｍＬ）および純水（５ｍＬ）を加えた後、混合物を３７℃で１６時間以上静置し、サンプルとした。【０１１３】
＜ブランク調整＞
ガラスバイアルに、サンプル（約１０ｍｇ）、４質量％ＮａＨＣＯ３水溶液（１ｍＬ）および１質量％ＴＮＢＳ水溶液（２ｍＬ）を添加し、直後に３７質量％塩酸（３ｍＬ）を加え、混合物を３７℃で３時間振とうした。その後、３７質量％塩酸（７ｍＬ）および純水（５ｍＬ）を加えた後、混合物を３７℃で１６時間以上静置し、ブランクとした。
純水で１０倍希釈したサンプル、および、ブランクの吸光度（３４５ｎｍ）を測定し、以下の（式２）、及び（式３）から架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出した。【０１１４】
（式２）  （Ａｓ−Ａｂ）／１４６００×Ｖ／ｗ  
（式２）は、リコンビナントペプチド１ｇ当たりのリジン量（モル等量）を示す。
（式中、Ａｓはサンプル吸光度、Ａｂはブランク吸光度、Ｖは反応液量（ｇ）、ｗはリコンビナントペプチド質量（ｍｇ）を示す。）【０１１５】
（式３）  １−（サンプル（式２）／未架橋リコンビナントペプチド（式２））×３４
（式３）は、１分子あたりの架橋数を示す。【０１１６】
その結果、参考例３の生体親和性高分子ブロックの架橋度は、４．２であった。【０１１７】
［参考例６］  生体親和性高分子ブロックの吸水率測定
参考例３で作製した生体親和性高分子ブロックの吸水率を算出した。
２５℃において、３ｃｍ×３ｃｍのナイロンメッシュ製の袋の中に、生体親和性高分子ブロック約１５ｍｇを充填し、２時間イオン交換水中で膨潤させた後、１０分風乾させた。それぞれの段階において質量を測定し、（式４）に従って、吸水率を求めた。【０１１８】
（式４）
吸水率＝（ｗ２−ｗ１−ｗ０）／ｗ０
（式中、ｗ０は、吸水前の材料の質量、ｗ１は吸水後の空袋の質量、ｗ２は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。）【０１１９】
その結果、参考例３のブロックの吸水率は、７８６％であった。  【０１２０】
［参考例７］細胞のライソゾーム病関連酵素の発現確認試験
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）、ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）、ヒト歯髄由来幹細胞（ｈＤＰＳＣ）について、細胞のｍＲＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で検出することにより、ライソゾーム病関連酵素の発現有無を評価した。その結果、図４〜図７に示す通り、ｈＢＭＳＣ、ｈＡＤＳＣおよびｈＤＰＳＣは、下記表に示す５０種類の関連酵素の遺伝子を発現していることが分かった。図４〜図７において、ｈＢＭＳＣ、ｈＡＤＳＣおよびｈＤＰＳＣはそれぞれＢＭＳＣ、ＡＤＳＣおよびＤＰＳＣと表記し、Ｐ５とは、継代５回目を示す。【０１２１】
【表１】
2019004446.tif 000003
2019004446.tif 000004
2019004446.tif 000005
【０１２２】
［実施例１］  細胞構造体（モザイク細胞塊）からのライソゾーム病関連酵素の分泌試験
細胞構造体の準備：
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）をＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：ダルベッコ改変イーグル培地）＋１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ウシ胎児血清）培地にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、参考例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３−１０６μｍ）を０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍの球状の、生体親和性高分子ブロックとｈＭＳＣ細胞からなるモザイク細胞塊を作製した（細胞１個当たり０．００１μｇのブロック）。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は球状であった。【０１２３】
ライソゾーム病関連酵素の分泌量測定：
上記のようにして得られた細胞構造体について、４８時間培養後の上清中に含まれる、ライソゾーム病原因酵素であるαＧａｌＡを酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）（ＧＬＡ／ＡＬＰＨＡ  Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ。ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ。ＬＳ−Ｆ−１０７６５−１）で測定した。尚、比較として、細胞構造体を形成させないで同じ細胞数で平面培養した場合の上清についても測定した。その結果、図８に示すように、１細胞数当たりのαＧａｌＡ（別名ＧＬＡ）酵素分泌量は、平面培養時（細胞のみ）では１．５×１０−６ｎｇ／ｃｅｌｌであるのに対して細胞構造体中では３．６×１０−５ｎｇ／ｃｅｌｌであり、予想外にも細胞構造体からのαＧａｌＡ酵素分泌量は飛躍的（２４倍程度）に多くなることが分かった。【０１２４】
［実施例２］  細胞構造体（モザイク細胞塊）の作製
マウス脂肪由来幹細胞（ｍＡＤＳＣ）を１０％ＦＢＳ含有のＤ−ＭＥＭ培地に懸濁し、そこに参考例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３−１０６μｍ）を加えて、最終的にｍＡＤＳＣ（１．２×１０８ｃｅｌｌｓ）と生体親和性高分子ブロック（０．２５ｍｇ）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるＥＺＳＰＨＥＲＥ（登録商標）ディッシュＴｙｐｅ９０３（スフェロイドウェル口径８００μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数〜約１，２００ウェル。底面が窪み部を有する培養面であり、培養面の周縁に立設される側外壁部を有する。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。ＣＯ２インキュベーターで３７℃で４８時間静置することで、約１，２００個の均一な細胞構造体を取得した。【０１２５】
[実施例３]ファブリ病マウスでの有効性試験
ファブリ病マウスはＢ６；１２９−Ｇｌａｗｂｌｏ／ＧｒｓｒＪ（日本チャールス・リバー）の６週令を用いた。上記マウスでは肝臓中に病因物質としてＬｙｓｏＧｂ３が蓄積していくことが知られており、これがファブリ病の原因である。有効性試験としては被験物質を投与して、４週間後の肝臓中のＬｙｓｏＧｂ３量が減っているかを測定することで評価した。なお、ＬｙｓｏＧｂ３の定量はＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry）で行い総蛋白質量で規格化することで評価した。具体的には、以下の通りである。【０１２６】
実施例２で作製したｍＡＤＳＣの細胞構造体を門脈経由、または皮下投与、または尾静脈内投与により投与した。投与量は一匹あたり、細胞構造体が４００個（細胞４．０  ｘ１０５ｃｅｌｌｓ＋高分子ブロック０．０８ｍｇ）となるようにして細胞構造体として投与した。投与から４週間後の肝臓中のＬｙｓｏＧｂ３量を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで定量することにより、投与していないファブリ病マウスと比較してＬｙｓｏＧｂ３が減少しているかを評価した。【０１２７】
以下にＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定条件を示す。
試薬
内部標準物質としてＮ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅを使用した。Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３およびＮ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅは、Ｍａｔｒｅｙａ社（Ｐｌｅａｓａｎｔ Ｇａｐ，ＰＡ）から購入した。【０１２８】
サンプル調製及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳに用いたメタノール（ＭｅＯＨ、ＬＣ−ＭＳグレード）、並びに、ギ酸（ＦＡ、ＬＣ−ＭＳグレード）は、和光純薬株式会社から購入した。【０１２９】
タンパク質定量にはＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用した。【０１３０】
サンプル調製
マウス臓器は、健常マウス、ｍＡＤＳＣの細胞構造体を投与したファブリ病マウス、ならびに、ｍＡＤＳＣの細胞構造体を投与していないファブリ病マウスから採取し、液体窒素中で急速凍結した。凍結臓器はマルチビーズショッカー（安井器械株式会社）を使用して粉砕し、組織重量の１０倍のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加して臓器懸濁液とした。まず、Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅを終濃度０．５ｎｇ／ｍＬになるようにメタノールで希釈し、ＩＳ溶液（内部標準溶液）を作製した。次に、標準サンプルを作製した。具体的には、健常マウスの臓器懸濁液２０μＬに、内部標準物質のメタノール溶液を１００μＬ添加し、更に、０、２、４、２０、４０及び２００ｎｍｏｌ／Ｌの終濃度になるようにＬｙｓｏ−Ｇｂ３溶液５μＬを添加して標準サンプルを作製した。これを混合後に遠心し、タンパク質を除去した。一方、ｍＡＤＳＣの細胞構造体を投与したファブリ病マウス、及び投与していないファブリ病マウスの臓器も同様に臓器懸濁液を作製し、この臓器懸濁液２０μＬに対して、内部標準物質のメタノール溶液を１００μＬ添加し、メタノール５μＬを添加して混合後に遠心し、タンパク質を除去した。遠心後、得られた混合液の上清８０μＬに０．１％ギ酸水溶液８０μＬを添加し混合した。この混合液を遠心後、上清を０．１％ギ酸水溶液／５０％メタノールで４倍希釈し、得られたサンプルをＵＰＬＣ（ultra performance liquid chromatography）−ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。【０１３１】
機器及び定量方法
ＵＰＬＣシステムとして、ＬＣはＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、  ＭＡ、ＵＳＡ）を使用した。サンプル注入量は５μＬ、カラムはＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｐｈｅｎｙｌ  Ｃｏｌｕｍｎ，１３０Å（オングストーム），  １．７μｍ，２．１ｍｍ×５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用した。溶媒Ａは０．１％ギ酸水溶液、溶媒Ｂは０．１％ギ酸メタノール溶液を用い、４．５分間のグラジエントを使用した（０分、５０％溶媒Ｂ；０．５分、７０％溶媒Ｂ；１分、９０％溶媒Ｂ；２．５分、１００％溶媒Ｂ；３．５分、１００％溶媒Ｂ；３．５１分、５０％溶媒Ｂ；４．５分、５０％溶媒Ｂ）。流速は０．４μＬ／分とした。ＭＳはＴｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄ５５００（ＡＢＳＣＩＥＸＦｒａｍｉｎｇｈａｍ、  ＭＡ、ＵＳ）を使用した。Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の定量はＭＲＭ（多重反応モニタリング）モードで実施した。ターゲットとした質量は、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３に対してｍ／ｚ７８６．３３６、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３−ＩＳに対してｍ／ｚ３２８．１９０とした。定量のためにはスフィンゴシン由来のもっとも強度が強いピークを使用した。Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３に対してｍ／ｚ２８２．４００、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３−ＩＳに対してｍ／ｚ１１０．０００とした。【０１３２】
タンパク質定量方法
タンパク質定量として、検量線用ＢＳＡはキットに添付のＡｌｂｕｍｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ａｍｐｕｌｅｓ、２ｍｇ／ｍＬを用い、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに注入したサンプルと同一組成の溶媒で、終濃度２０００、１５００、１０００、７５０、５００、２５０、１２５、２５及び０μg／ｍＬになるよう希釈して作製した。検出にはＴＥＣＡＮ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００を使用し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。【０１３３】
上述したＬＣ  ＭＳ／ＭＳシステムによる分析の結果及びＢＣＡ  Ａｓｓａｙによるタンパク質定量結果に基づいて、健常マウス、ｍＡＤＳＣの細胞構造体を投与したファブリ病マウス、ならびに、ｍＡＤＳＣの細胞構造体を投与していないファブリ病マウスの臓器における、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の濃度を算出した。すなわち、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＬｙｓｏ−Ｇｂ３量をｘ（ｎｍｏｌ／ｍＬ）とし、ＢＣＡ  Ａｓｓａｙによるタンパク質量をｙ（ｍｇ／ｍＬ）とし、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３量はｘ／ｙ（ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であらわした。【０１３４】
その結果、表２および図９に示す通り、細胞構造体を門脈内投与した群では投与後１週で肝臓中のＬｙｓｏＧｂ３が投与していない個体（６９  ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に比べて有意に減少し（５２ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、投与後４週ではさらに有意に減少する（３０ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ことが分かった。
本明細書中において、ファブリマウスとは、ファブリ病マウスを意味する。【０１３５】
【表２】
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【０１３６】
また、尾静脈内投与した個体についても、投与後１週で有意な減少を示し（２４ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、４週でも有意な減少（２７ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を示すことが分かった。その結果は皮下投与でも同様な傾向であった。【０１３７】
表３および図１０には腎臓中の、表４および図１１には心臓中のＬｙｓｏ−Ｇｂ３量を示した。表４および図１１の心臓中のＬｙｓｏ−Ｇｂ３量については、肝臓と同様、細胞構造体を投与した群において、投与していない群に比べて有意にＬｙｓｏ−Ｇｂ３量が減少していることが分かった。【０１３８】
【表３】
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【０１３９】
【表４】
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【０１４０】
さらに、比較のためにｍＡＤＳＣのみを同じ細胞数（４．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／匹）で門脈内投与または尾静脈内投与した場合、投与４週の肝臓中ＬｙｓｏＧｂ３（門脈投与：５３ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、尾静脈内投与：３６ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に比べて、細胞構造体を投与した４週後（門脈投与：３０ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、尾静脈内投与：２７ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の減少は有意に高いことも併せて確認された。図１２に結果を示した。【０１４１】
【表５】
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【０１４２】
これらのことから、細胞構造体として細胞を投与した場合、想定外にファブリ病マウスへ高い有効性を示すことが明らかになった。【０１４３】
［実施例４］  細胞構造体（モザイク細胞塊）の作製
マウス胎児由来線維芽細胞（ＭＥＦ）を１０％ＦＢＳ含有のＤ−ＭＥＭ培地に懸濁し、１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、参考例３で作製した生体親和性高分子ブロック５３−１０６μｍを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍの球状の、生体親和性高分子ブロックとｈＡＤＳＣ細胞からなるモザイク細胞塊を作製した（細胞１個当たり０．００１μｇのブロック）。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本細胞構造体は球状であった。【０１４４】
その後、１００ｗｅｌｌ分の内容物を全てピペットで、商品名３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（エイブル社ＢＷＶ−Ｓ０３Ａ）（撹拌手段を備えた第二の培養容器）に移し、培地３０ｍＬ中で７日間、撹拌培養を実施し、細胞構造体を取得した。結果的に細胞構造体は１００個である。【０１４５】
［実施例５］ファブリ病マウスでの有効性試験
実施例３と同様にファブリ病マウスへの投与により肝臓中のＬｙｓｏＧｂ３が減少するかを評価した。実施例４で作製したＭＥＦの細胞構造体を腎被膜下に２０個、あるいは４０個移植した。尚、２０個移植では１匹あたり細胞数が４．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓで高分子ブロックが０．４ｍｇを投与されたことになり、４０個移植では１匹あたり細胞数が８．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓで高分子ブロックが０．８ｍｇを投与されたことになる。試験の流れを図１３に示した。【０１４６】
その結果、表６および図１４に示す通り、細胞構造体を腎被膜下に移植した群（２０個移植群も４０個移植群も）では投与後４週で肝臓中のＬｙｓｏＧｂ３が、投与していない個体（５６ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に比べて有意に減少していた。かつ、２０個移植群（４３ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）よりも４０個移植群（３９ｎｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の方がその減少は強く認められていた。【０１４７】
【表６】
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【０１４８】
また、移植４週後の移植部位の組織切片を作製し、組織学的な評価を実施したところ、図１５に示す通り、移植４週後にも細胞と高分子ブロックが確認され、細胞構造体内部に血管が誘導されていることも確認された。細胞構造体内の細胞に血管から、栄養や酸素が供給されるため、このことから本効果はこの後も持続していくことが見込まれた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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