(57)【要約】  抗体を高純度に精製し、抗体の重合体（あるいは凝集体）を効果的に除去するとともに、抗体の回収率を向上させる精製法を提供する。抗体を含む溶液を、アミノ酸の存在下に、ミックスモードクロマトグラフィーで処理する工程を含む、抗体の精製方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を含む溶液を、アミノ酸の存在下に、ミックスモードクロマトグラフィーで処理する工程を含む、抗体の精製方法。
【請求項２】
ミックスモードクロマトグラフィー処理の前に、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー処理工程を行う、請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
さらに、イオン交換クロマトグラフィー処理工程を含む、請求項１又は２に記載の精製方法。
【請求項４】
イオン交換クロマトグラフィーが陽イオン交換クロマトグラフィーである、請求項３に記載の精製方法。
【請求項５】
アミノ酸が塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸、酸性アミノ酸またはシトルリンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項６】
アミノ酸がアルギニン、ヒスチジン、プロリン、グルタミン酸またはシトルリンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項７】
アミノ酸が塩基性アミノ酸である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項８】
塩基性アミノ酸がアルギニンである、請求項７に記載の精製方法。
【請求項９】
抗体が、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に対するヒト化モノクローナル抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に対する抗体であるＨｕＬ２Ｇ７の精製方法に関する。
（発明の背景）【０００２】
ＨＧＦは、間葉細胞によって産生されるヘテロ二量体型ポリペプチドであり、血管新生や、各種細胞の増殖・散乱を刺激する因子として知られている。ＨＧＦの多様な活性は、その受容体、プロトオンコジーンｃＭｅｔによってコードされる膜貫通チロシンキナーゼによって媒介される。ＨＧＦ／ｃＭｅｔは、腫瘍発生、侵襲、転移などの癌の進行、アポトーシスの制御及び血管新生の様々な側面において重要な役割を果たすと報告されている。したがって、ＨＧＦに対する効果的なアンタゴニスト分子を用いれば、このようなＨＧＦの生物活性を阻害することができると考えられる。
特許文献１には、マウスＬ２Ｇ７ｍＡｂを用いて、ＨＧＦに対するヒト化中和モノクローナル抗体を調製する方法が、記載されている。
しかし、特許文献１におけるような、組織培養上清から得られたモノクローナル抗体には、細胞培養液に由来する複雑な夾雑成分が含まれているのが普通であり、医薬品として使用するためには、これらの夾雑成分を除去して高度に精製された抗体を得ることが不可欠である。抗体の精製方法としてはさまざまな分離精製法が提案されているが、その中でも、クロマトグラフィーを用いた例が多く、クロマトグラフィーとしては、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーを用いる処理法が報告されている。
また、近年になって、プロテインＡ及びプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーが、高純度で簡便な方法として抗体の単離精製のために広く用いられ、特に工業的規模の抗体製造法として広く知られている。
さらに、ゲルろ過クロマトグラフィーによる会合凝集体を含む疎水性タンパク質等の処理時に、展開溶媒の水溶性緩衝液に適量のアルギニンを添加して、タンパク質と充填剤の間に発生する不必要な相互作用を弱め、会合凝集体や疎水性タンパク質、疎水性ペプチドをより定量的に回収する方法が報告されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２００７−１１５０４９
【特許文献２】特開２００６−２４２９５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のとおり、細胞培養上清から得られたモノクローナル抗体には、細胞培養液に由来する複雑な夾雑成分が含まれているのが普通であり、また、培養液由来の夾雑成分のほか、精製分離のためのいずれかの工程において、タンパク質の会合・重合・凝集が起こり、最終的に分離された抗体に夾雑する場合がある。一旦生成した重合体はその後の精製工程における操作性や貯蔵時の障害となりやすく、また、重合体は医薬品としての使用時の副作用の原因となる。
したがって、本発明が解決しようとする課題は、モノクローナル抗体を高純度に精製し、特に抗体の重合体（あるいは凝集体）を効果的に除去するとともに、抗体の回収率を向上させる精製法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで、本発明者らは、前記精製法について鋭意研究の結果、イオン交換基と疎水性官能基などを併せ持つミックスモード樹脂を用いて抗体を精製し、かつ添加剤としてアミノ酸を使用することで、上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００６】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
（１）抗体を含む溶液を、アミノ酸の存在下に、ミックスモードクロマトグラフィーで処理する工程を含む、抗体の精製方法。
（２）ミックスモードクロマトグラフィー処理の前に、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー処理工程を行う、前記（１）に記載の精製方法。
（３）さらに、イオン交換クロマトグラフィー処理工程を含む、前記（１）又は（２）に記載の精製方法。
（４）イオン交換クロマトグラフィーが陽イオン交換クロマトグラフィーである、前記（３）に記載の精製方法。
（５）アミノ酸が塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸、酸性アミノ酸またはシトルリンである、前記（１）〜（４）のいずれか１に記載の精製方法。
（６）アミノ酸がアルギニン、ヒスチジン、プロリン、グルタミン酸またはシトルリンである、前記（１）〜（４）のいずれか１に記載の精製方法。
（７）アミノ酸が塩基性アミノ酸である、前記（１）〜（４）のいずれか１に記載の精製方法。
（８）塩基性アミノ酸がアルギニンである、前記（７）に記載の精製方法。
（９）抗体が、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に対するヒト化モノクローナル抗体である、前記（１）〜（８）のいずれか１に記載の精製方法。
（１０）抗体が、ATCC No.:PTA-5162で表示されるハイブリドーマから産生される肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に対するモノクローナル抗体Ｌ２Ｇ７のヒト化モノクローナル抗体である、前記（１）〜（８）のいずれか１に記載の精製方法。
（１１）抗体が、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）との結合に対して、ATCC No.:PTA-5162で表示されるハイブリドーマから産生される肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に対するモノクローナル抗体Ｌ２Ｇ７と競合するヒト化モノクローナル抗体である、前記（１）〜（８）のいずれか１に記載の精製方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、ＨＧＦモノクローナル抗体などの抗体の精製工程において、アミノ酸の存在下にミックスモード樹脂処理工程を採用した結果、細胞培養液に由来する夾雑成分のほか、他の精製工程のいずれかにおいて生成した重合体（あるいは凝集体）を効果的に除去することが可能となった。ミックスモード樹脂は、バッファーにアミノ酸を添加することにより、重合体と抗体との分離能力が向上し、それにより、他の樹脂、例えば疎水クロマト、ハイドロキシアパタイト、ゲルろ過に比べて、重合体除去のためのミックスモード樹脂の抗体処理量を多くすることが可能となった。さらに、溶出のテーリングがなく、シャープなピークとして抗体が回収され、優れた回収率を達成することができる。しかも少量の溶出液によって回収できることから、製造設備がコンパクトとなり、設備建設費用を削減でき、工業的規模の精製法として、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ゲルろ過ＨＰＬＣによるＨｕＬ２Ｇ７の分析：矢印は左から、それぞれ重合体０．２％、ＨｕＬ２Ｇ７  ９９．８％、サンプルバッファーを示す。条件の詳細は文中に記す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ヒト化中和抗ＨＧＦ抗体
ＨＧＦと結合するモノクローナル抗体（即ち抗ＨＧＦｍＡｂ）は、その結合が、ＨＧＦの１以上の生物活性を部分的又は完全に阻害する場合、ＨＧＦを中和する又は中和していると言われる。中和抗体が阻害し得るＨＧＦの生物学的特性の中では、例えば、自身のｃＭｅｔレセプターと結合する、マーディン−ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞などの特定の細胞系の散乱を引き起こす；肝細胞、Ｍｖ１Ｌｕミンク肺外皮細胞、及び様々なヒト腫瘍細胞を含む特定の細胞の増殖を刺激する；あるいは、例えば、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖もしくは血管形成の刺激により、又はニワトリ胚絨毛尿膜（ＣＡＭ）に適用した場合の血管の誘導により測定されるような、血管新生を刺激する、ＨＧＦの能力がある。ヒト化中和ｍＡｂは、好ましくはヒトＨＧＦ（即ちＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ９０３３４の配列によりコードされているタンパク質）と結合する。ヒト化抗体は、マウス抗体（ラット、ハムスター、又は他の類似種でもあり得る「ドナー抗体」）由来のＣＤＲをヒト抗体（「受容体抗体」）上に移植した、遺伝子組み換え（モノクローナル）抗体である。
【００１０】
例えば、０．０１、０．１、０．５、１、２、５、１０、２０又は５０μｇ／ｍｌの濃度のヒト化中和ｍＡｂは、ＨＧＦの生物学的機能（例、増殖又は散乱の刺激）を、少なくとも約５０％、しかし好ましくは７５％以上、より好ましくは９０％もしくは９５％又はさらに９９％以上、並びに最も好ましくは約１００％（本質的に完全に）阻害する。ＨＧＦに対する抗体のモル比が、０．１倍、０．５倍、１倍、２倍、３倍、５倍、又は１０倍である場合、好ましくは、少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％、もしくは９５％又は本質的に完全な阻害を達成する。最も好ましくは、ｍＡｂは、１つだけではなくいくつかの上記に記載した生物活性を中和し；ＨＧＦの全ての生物活性を中和する抗ＨＧＦｍＡｂは、「完全に中和している」と呼ばれ、そのようなｍＡｂが最も好ましい。ヒト化中和ｍＡｂは、ＨＧＦと好ましくは特異的に結合し、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などＨＧＦに関連するタンパク質とは結合しないか、又はとても低い程度で結合するにすぎない。
【００１１】
ヒト化中和ｍＡｂは、自身の四量体形態（２つのＬ鎖及び２つのＨ鎖）での抗ＨＧＦ抗体を含み、公知のアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥ並びにそれらのサブタイプ、即ちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のいずれかであり得、並びにκＬ鎖又はλＬ鎖を含み得る。ヒト化中和ｍＡｂとしてはまた、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２など抗体の断片；二官能性複合抗体、一本鎖抗体；及び変化した定常領域を伴う抗体が挙げられる。ｍＡｂのＣＤＲの源は、動物（例、マウス、ラット、ハムスター又はニワトリ）由来であり得、これらは遺伝子組み換えが行われ得る。げっ歯類のｍＡｂは、適切なアジュバント中のＨＧＦを腹腔内、静脈内、足底球中などに複数回免疫感作した後、脾臓又はリンパ節の細胞を抽出し、好適な不死化細胞系と融合させ、次いでＨＧＦに結合する抗体を産生するハイブリドーマを選抜することを含む、当技術分野で周知の標準的な方法で生成される。
【００１２】
Ｌ２Ｇ７ｍＡｂのヒト化形態は、ヒト可変領域フレームワーク（シングル、合成又はコンセンサス配列ヒトフレームワークを含む）中に、Ｌ２Ｇ７ｍＡｂのＨ鎖およびＬ鎖の配列由来のＣＤＲアミノ酸のほとんど又は全てを包含する。例えば、Ｌ２Ｇ７Ｈ鎖由来の３つの無傷のＣＤＲ及びＬ鎖由来の３つの無傷のＣＤＲを含むヒト化抗体もあれば、Ｌ２Ｇ７Ｈ鎖由来の少なくとも１つの無傷のＣＤＲ及びＬ２Ｇ７Ｌ鎖由来の少なくとも１つの無傷のＣＤＲを含むヒト化抗体もある。いくつかのヒト化抗体は、いくつかの残基がＬ２Ｇ７の対応するＣＤＲ由来であり、その他の残基がヒト抗体、好ましくは、ＣＤＲを包含する可変領域フレームワークを供給するのと同一のヒト抗体のＣＤＲ由来である少なくとも１つのＣＤＲを含む。
【００１３】
いくつかのヒト化抗体において、Ｈ２９、Ｈ３０、Ｈ４８、Ｈ６６、Ｈ６７、Ｈ７１、Ｈ９４、Ｌ３及びＬ６０の群より選ばれる、少なくとも１、３、５又は全ての位置は、マウスＬ２Ｇ７抗体においてＫａｂａｔの番号付けにより対応する位置に存在するアミノ酸が占める。後述のヒト受容体可変領域フレームワーク（ＡＡＣ１８３２３およびＢＡＣ０１７２６）において、これらの位置は全て、マウスＬ２Ｇ７抗体において対称する位置に存在するアミノ酸とは異なる、ヒト残基が占める。したがって、該群より選ばれる全て又はほとんどの位置を、置換することが望ましい。他のヒト可変領域フレームワークを使用する場合、それらの位置の中には、ヒト可変領域フレームワーク及びマウスＬ２Ｇ７抗体において同一のアミノ酸が占めるものがあり得る。したがって、置換は該位置において行われるのではなく、Ｑｕｅｅｎのルールに従って、ヒト可変領域フレームワークとマウスＬ２Ｇ７抗体との間で異なる他の位置において行われ得る。ヒト可変領域フレームワークの選択に関係なく、上記の群において指定されたアミノ酸に加えて、他のアミノ酸の置換もまた可能である。しかし、一般に、ヒト化抗体のＨ鎖可変領域フレームワーク及びＬ鎖可変領域フレームワークのどちらも、受容体ヒト可変領域フレームワーク（ヒトコンセンサス可変領域フレームワーク及び合成ヒト可変領域フレームワークを含む）に存在しない残基を生じる１０又は１２より多くの置換を含まない。
【００１４】
ヒト化抗体において存在する任意の定常領域は、ヒト又は本質的にヒトと同程度であり、天然ヒト定常領域に関連する、１０よりは少なく、好ましくは２以下の置換を有する。いくつかの置換は、抗体の半減期及びＦｃγＲｎに対するその親和性の増加において有利である。他の置換、通常保存的な置換は、事実上差し障りない。
【００１５】
Ｌ２Ｇ７のヒト化形態の一例は、ＷＯ２００７／１１５０４９の図２に記載される成熟Ｈ鎖及びＬ鎖可変領域を含む。ヒト化Ｌ２Ｇ７の他の好ましい形態は、これらの配列に対して少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％同一の配列を有する成熟Ｈ鎖及びＬ鎖可変領域を含み（Ｋａｂａｔの番号付けに従って整列させた場合）、さらに／あるいは少数の（典型的に５又は１０より少ないアミノ酸を含む）機能的に重要でない置換、欠失、及び／又は挿入によりこれらの配列とは異なる。例えば、Ｈ鎖の最初のアミノ酸はＧｌｕ又はＧｌｎのどちらかであり得る。置換は通常保存的である。即ち、1つのアミノ酸を化学的に類似するアミノ酸で置換する。アミノ酸置換を、保存的又は非保存的と分類する目的で、アミノ酸は以下のようにグループ分けされる：グループＩ（疎水性側鎖）：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；グループＶ（鎖配向に影響を及ぼす残基）：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及びグループＶＩ（芳香族側鎖）；Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。保存的置換は、同一のグループ内のアミノ酸の間での置換を伴うものである。マウスＬ２Ｇ７の可変領域に関連する置換は、Ｈ２９、Ｈ３０、Ｈ４８、Ｈ６６、Ｈ６７、Ｈ７１、Ｈ９４、Ｌ３及びＬ６０位を避けることが望ましい。これらの位置はＣＤＲと相互作用するので、マウスＬ２Ｇ７由来のアミノ酸が含まれる。置換は好ましくは可変領域フレームワーク位置において起こるが、ＣＤＲ領域においても起こり得る。ＣＤＲ領域を置換する場合、マウスアミノ酸を、ヒト抗体、好ましくは受容体可変領域フレームワークを提供する同一のヒト抗体の対応する位置（Ｋａｂａｔの番号付け）のアミノ酸で置換することが好ましい。
【００１６】
通常、ヒト化Ｌ２Ｇ７ｍＡｂは、κＬ鎖を伴うＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプである。完全なヒトγ−１及びκ定常領域と組み合わせられた、ＷＯ２００７／１１５０４９の図２に記載される可変領域を有するＩｇＧ１ｍＡｂを、ＨｕＬ２Ｇ７と命名する。
【００１７】
ＨｕＬ２Ｇ７と類似の結合特性を保有するＨｕＬ２Ｇ７の変異体は、突然変異形成の後の、ファージディスプレイ法を使用する集団選択により取得できる。変異体は、任意でＨｕＬ２Ｇ７又はマウスＬ２Ｇ７と競合させて、ＨＧＦとの特異的結合についてまず選択する。次いでｄＨｕＬ２Ｇ７やマウス２Ｇ７抗体と同一又は類似の結合特性を有する変異体を、機能面で試験することができる。
【００１８】
好ましいヒト化Ｌ２Ｇ７ｍＡｂは、上に定義するように、ＨＧＦに対して中和性又は完全に中和性である。好ましくは、測定されたＨＧＦの生物学的特性（例、Ｍｅｔとの結合、Ｍｖ１Ｌｕ又はＨＵＶＥＣ細胞の増殖の刺激）のいくつか、ほとんど又は全てに関して、ヒト化ｍＡｂの中和活性は、Ｌ２Ｇ７自身の中和活性の３倍以内、より好ましくは２倍又は１．５倍以内、最も好ましくはそれと同程度（即ち、実験誤差の範囲内）である。即ち、Ｌ２Ｇ７に対してせいぜい３倍、２倍、１．５倍又は同じ量のヒト化ｍＡｂが、同程度の生物学的特性の阻害（例えば、ＩＣ５０’ｓにより測定されたような）を得るために必要である。好ましくはヒト化ｍＡｂのＨＧＦに対する親和性はまた、Ｌ２Ｇ７のそれの３倍、２倍以内又は同程度である。同様に、異種移植片マウスモデル（例、Ｕ８７などのヒトグリオーマ細胞系を使用している）において、ヒト化ｍＡｂは、好ましくはマウスＬ２Ｇ７ｍＡｂの３倍、２倍以内又はそれと同程度で腫瘍の成長を阻害する。実際、好ましくは、わずか４０、２０又は１０μｇの用量のヒト化ｍＡｂの週２回投与ですら、Ｕ８７腫瘍異種移植片の増殖を完全に阻害する。
【００１９】
ヒト化ｍＡｂは、当業者公知の様々な方法により発現され得る。例えば、それらのＬ鎖及びＨ鎖の可変領域をコードする遺伝子を、重複オリゴヌクレオチドから又は事前に調製した目的遺伝子の変異体にＰＣＲ突然変異誘発を施すことにより、まず合成する。遺伝コードの縮重のため、様々なＤＮＡ配列が各抗体アミノ酸配列をコードする。どのように作製された場合でも、ヒト化ｍＡｂＬ鎖及びＨ鎖遺伝子をコードする遺伝子は、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ部位などの必要な調節領域を提供する発現ベクター（例、インビトロジェン社より市販の）内に定常領域と共に挿入される。ＣＭＶプロモーター−エンハンサーの使用が好ましい。定常領域に関する遺伝子は、現在広く利用可能であり、またヒト抗体産生細胞からのＰＣＲにより容易にクローニングされ得る。Ｌ鎖及びＨ鎖遺伝子は１つのベクターに共に、又は別々のベクターに挿入され得る。発現ベクターは、次いで、ＣＨＯ又は２９３、あるいはＳｐ２／０及びＮＳ０を含む非産生骨髄腫などの様々な哺乳動物細胞系内に、リポフェクション又はエレクトロポレーションなどの当業者に公知の様々な方法を使用してトランスフェクションされ得、適切な抗生物質選択により抗体を発現する細胞が選択される。より大量の抗体が、商業的に利用可能なバイオリアクター内で細胞を増殖させることにより生産される。
【００２０】
一度発現すると、ヒト化ｍＡｂは精密ろ過、限外ろ過、プロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー及び／又は有機染料などに基づいた他の形態のアフィニティークロマトグラフィーのなどの当業者に標準の手順に従って精製され得る。薬学的使用に関して、少なくとも約９０又は９５％の均一性を有する実質的に純粋な抗体が好ましく、９８％又は９９％以上の均一性が、最も好ましい。
【００２１】
ＨＧＦに対するモノクローナル抗体の製造方法は特に限定されないが、例えば次のような工程にて製造することができる。
ヒト化Ｌ２Ｇ７への最初の工程は、Ｌ２Ｇ７のＬ鎖及びＨ鎖遺伝子のクローニングである。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて１０６個のＬ２Ｇ７（ＩｇＧ２ａ、κ）ハイブリドーマ細胞から調製し、次いで、ストラタジーンのキットを使用しランダムプライマーを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（プロメガ社）によりｄＧ尾部を付加する。ｄＧ尾部にアニーリングするプライマーとＨ鎖用のＣγ２ａのＮ−末端領域にアニーリングするプライマー、及びＬ鎖用のＣκのＮ−末端領域にアニーリングするプライマーとで、高性能ポリメラーゼＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｐｆｘ（インビトロジェン社）を使用して、Ｈ鎖及びＬ鎖可変領域を、ｃＤＮＡからそれぞれ増幅する。適当なサイズのバンドをＰＣＲ産物よりゲル精製し、自動シークエンサーでジデオキシターミネーション法を使用して、直接配列決定するか又はクローニングした後、配列決定する。
【００２２】
Ｌ２Ｇ７のキメラ体を発現させ、その後ヒト化ｍＡｂを発現させるために、ヒトＣκ及びＣγ１遺伝子を包含するｐＶｋ及びｐＶｇ１ベクター（J.Immunol.148:1149,1992）に類似の発現ベクターを、市販の利用可能なベクター及びＤＮＡ断片から構築する。しかし、Ｌ鎖ベクターはｇｐｔの代わりにｈｙｇ選択可能マーカーを有し、Ｈ鎖ベクターはＤｈｆｒの代わりにｎｅｏ選択可能マーカーを有する。クローニングされたＶＬ及びＶＨ遺伝子を、これらのベクターの適当な部位内でサブクローニングし、キメラＬ２Ｇ７（ｃｈＬ２Ｇ７）ｍＡｂＬ鎖及びＨ鎖遺伝子の発現プラスミドを作製する。ｃｈＬ２Ｇ７ｍＡｂが産生され、Ｌ２Ｇ７と同程度に、ＨＧＦとよく結合することが分かり、正しいＬ鎖及びＨ鎖可変領域がクローニングされたことが証明される。
【００２３】
ヒト化Ｌ２Ｇ７ｍＡｂを設計するために、Ｑｕｅｅｎら(US 5,530,101およびUS 5,585,089)の方法に一般に従う。ヒト抗体配列のＮＣＢＩデータベースをスキャンし、ヒトＶＨ配列ＡＡＣ１８３２３及びＶκ配列ＢＡＣ０１７２６をそれぞれ選択し、Ｌ２Ｇ７ＶＨ及びＶＬのための受容体配列として用いる（なぜならヒトＶＨ配列ＡＡＣ１８３２３及びＶκ配列ＢＡＣ０１７２６はそれぞれＬ２Ｇ７ＶＨ及びＶＬ配列に対して高いフレームワーク同一性を有するため）。ウェブ上で利用可能なコンピュータープログラム、Ｄｅｅｐ  Ｖｉｅｗ  Ｓｗｉｓｓ−Ｐｄｂ  Ｖｉｅｗｅｒを使用して、ＣＤＲがそれらと相互作用し得るのに十分近傍である、Ｌ２Ｇ７フレームワーク中のアミノ酸の位置を決定するために使用される、Ｌ２Ｇ７可変ドメインの分子モデルを構築する。ヒト化Ｌ２Ｇ７Ｈ鎖及びＬ鎖可変領域を設計するために、マウスＬ２Ｇ７ｍＡｂ由来のＣＤＲを受容体フレームワーク領域内にまず概念的に移植する。コンピューターモデルが、ＣＤＲ構造の維持に必要となり得るＣＤＲとの重要な接触を示唆したフレームワーク位置において、オリジナルヒトフレームワークアミノ酸をマウス抗体由来のアミノ酸で置換する。ＨｕＬ２Ｇ７と命名したヒト化Ｌ２Ｇ７ｍＡｂに関して、この置換は、Ｋａｂａｔの番号付けを使用して、Ｈ鎖の２９、３０（Ｃｈｏｔｈｉａ  超可変ループＨ１内）４８、６６、６７、７１及び９４残基において、及びＬ鎖の３及び６０残基においてなされる。さらに、抗体タンパク質中で誘導体化を受ける可能性がＱ（Ｇｌｎ）より少ないために、Ｈ鎖のアミノ酸１を、Ｅ（Ｇｌｕ）で置換する。
【００２４】
実施例で用いる代表的なｍＡｂＨｕＬ２Ｇ７は、ヒトκ及びγ１定常領域を有し、したがって、ＩｇＧ１である。しかし、他のＩｇＧ１ｍＡｂ（ＩｇＧ１、κ）アロタイプも、ＨｕＬ２Ｇ７という表記に包含されると理解される。他のアイソタイプのヒト化ｍＡｂ（例、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）は、ＨｕＬ２Ｇ７可変領域と適当なヒト定常領域とを組み合わせることにより作製され得る。補体介在細胞毒性もしくはＡＤＣＣなどのエフェクター機能を減少又は増加し、又はヒトにおける半減期を延長するために、ＨｕＬ２Ｇ７定常領域において置換を行うことができる。特に、ＩｇＧ定常領域における２５０位のＧｌｎへの変異及び／又は４２８位のＬｅｕへの変異を有するＨｕＬ２Ｇ７が、実施態様として挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
ＨｕＬ２Ｇ７ｍＡｂを設計したら、即ち、そのＬ鎖及びＨ鎖可変領域のアミノ酸配列を選択したら、当該可変領域をコードするＤＮＡ配列（シグナルペプチドを含む）を、遺伝子コードにより通常どおり選択する。これらの配列はクローニングのための制限部位とＫｏｚａｋ翻訳開始シグナルとを提供するために、開始ＡＴＧコドンより前のＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣで始まる。これらの遺伝子はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により商業的に合成することのできる、つまり、ストランド上で交互に重複する２対のオリゴヌクレオチドを合成する（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＮＡシンセサイザーを適用）。これらは共に遺伝子全体を包含する。オリゴヌクレオチドは、１５塩基重複を伴う１１０から１４０塩基である。二重鎖ＤＮＡ断片を、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを使用して、オリゴの５’対及び３’対から別々に合成する。５’ＤＮＡ断片は、可変領域の５’末端及び真ん中を切断する制限酵素により切断する。３’ＤＮＡ断片は、可変領域の真ん中及び３’末端を切断する制限酵素により切断する。各切断断片は好適なクローニングベクターに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、多くの分離株由来のＤＮＡを配列決定し、完全に正しい配列を有する断片を見つける。次いで、各遺伝子に関して、３元のライゲーションを行い、正しい５’及び３’断片を適当な発現ベクターに挿入して、完全な遺伝子を形成させ、その配列を確認する。
【００２６】
ＨｕＬ２Ｇ７ｍＡｂを産生するために、ヒト腎臓上皮２９３−Ｆ細胞（インビトロジェン社）をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地（ＦＳ培地；インビトロジェン社）中で培養し、１０６細胞／２ｍｌ／マイクロウェルにＦＤ培地で再懸濁する。ＨｕＬ２Ｇ７Ｌ鎖及びＨ鎖発現ベクターＤＮＡ（各１μｇ）を３μｌのＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）と共に１００μｌのＦＳ培地中で、室温で３０分間インキュベートし、次いで混合物を細胞に添加する。４８時間のインキュベーション後、トランスフェクトした細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８存在下で培養してネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞を選抜し、次いで９６穴組織培養プレート（１００μｌ／ｗｅｌｌ）内に展開する。約２週間後、生存細胞を含むウェルがコンフルエントになった時、ＨｕＬ２Ｇ７の存在及び量に関してこれらのウェルからの培養上清をＥＬＩＳＡで試験する。トランスフェクトした細胞は、Ｌ鎖及びＨ鎖を不均衡に分泌するかもしれないので、完全なＨｕＬ２Ｇ７のみが測定されることを保障すべく、このＥＬＩＳＡは、捕捉剤としてヤギ抗−ヒトＦｃ及び検出薬としてビオチン化抗ヒトκを使用する。ｃｈＬ２Ｇ７ｍＡｂも同様に発現させ得る。比較的高レベルのＣｈＬ２Ｇ７及びＨｕＬ２Ｇ７を発現する細胞のクローンを、それぞれＦＳ培地中で拡張し増殖させる。抗体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して培養上清から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を解析する。
より具体的には、ＨｕＬ２Ｇ７ｍＡｂとしては、後述する実施例１などで用いられるATCC No.:PTA-5162で表示されるハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体Ｌ２Ｇ７のヒト化モノクローナル抗体が好ましく用いられる。さらには、ＨＧＦとの結合に対して、ATCC No.:PTA-5162で表示されるハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体と競合するヒト化モノクローナル抗体も好ましく用いられる。ＨｕＬ２Ｇ７ｍＡｂは、例えばＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６５３８５（ＷＯ２００７／１１５０４９）に記載の方法を用いて製造することができる。
【００２７】
本発明の精製方法は、上記したＨＧＦに対するヒト化モノクローナル抗体をはじめとする抗体（例、ＨＧＦなどの抗原に対するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体など）を含有する培養上清を、精製工程のいずれかの段階で、塩基性アミノ酸の存在下に、ミックスモード樹脂で処理する工程を行うことによって、さらに精製し、高純度の抗体を得る。
ミックスモード樹脂処理の前後において、さらに、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー等の各種精製手段を採用することができる。特に、ミックスモード樹脂処理の前工程において、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー処理を行うことが好ましい。
また、各精製工程を経て得られた抗体含有液は、必要に応じて、濃縮のためのメンブランフィルターを通過させることができる。
各クロマトグラフィーの取扱い、処理方法自体は、公知の方法がいずれも採用できる。
【００２８】
本発明で用いるミックスモードの樹脂は、１以上の陰イオンあるいは陽イオン交換基と、１以上の芳香族又は複素芳香族環系とを含むマルチモーダルリガンドが固定化された担体からなるクロマトグラフィー樹脂であり、例えば、Capto adhere（GE Healthcare社）、Capto MMC（GE Healthcare社）、MEP HyperCel （PALL社）として市販されている。
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーとしては、MabSelect SuRe（GE Healthcare社）、ProSep Ultra Plus（Millipore社）が例示される。
イオン交換樹脂としては、陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィーのいずれでもよいが、陽イオンクロマトグラフィーが好ましく、Capto S（GE Healthcare社）、UNOsphere S（Bio-Rad Laboratories社）、Fractogel SE Hicap (M)（Merck KGaA社）、Q及びCM Ceramic HyperD（PALL社）が例示される。
ミックスモード樹脂処理工程において存在させるアミノ酸としては、例えば、塩基性アミノ酸（例、アルギニン、ヒスチジン、リジン）、疎水性アミノ酸（例、プロリン）、酸性アミノ酸（例、グルタミン酸、アスパラギン酸）、シトルリン、及び／又はその誘導体でも良い。なかでも、アルギニン、リジン、ヒスチジンなどの塩基性アミノ酸が好ましく、さらに好ましくは、アルギニンであり、及び／又はその誘導体でも良い。
アミノ酸は、ミックスモード樹脂へアプライする抗体の溶液中に存在させてもよく、また、展開溶媒中に含有させてもよい。
アミノ酸の含有量は、抗体溶液中に１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜５００ｍＭ、展開溶媒中に１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜５００ｍＭである。
アミノ酸は、ミックスモード樹脂処理工程のほかの精製工程において存在していてもよい。その場合の含有量、濃度は、前記と同様である。
添加する際のアミノ酸は、水溶性の塩であってもよい。
展開溶媒としては、クエン酸バッファー、酢酸バッファー、炭酸バッファー、リン酸バッファーなどが挙げられる。好ましくはクエン酸バッファーである。
展開溶媒中のアミノ酸濃度（特に、アルギニン濃度）としては１０ｍＭ〜５００ｍＭが好ましく、５０ｍＭ〜３５０ｍＭがより好ましい。
【００２９】
治療方法
好ましい実施形態において、ヒト化抗体は自身を含む医薬製剤を提供する。抗体の医薬製剤は生理学的に好適な担体中に、任意で賦形剤又は安定剤と共に、凍結乾燥又は水溶液の形態で、ｍＡｂを包含する。好ましい担体、賦形剤又は安定剤は、使用した用量及び濃度においてレシピエントに対して無毒性であり、典型的にｐＨ５．０〜８．０、ほとんどの場合、ｐＨ６．０〜７．０のリン酸、クエン酸、又は酢酸などのバッファー；等張にするために塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩；抗オキシダント、保存料、低分子量ポリペプチド、タンパク質、ポリソルベート８０などの親水性ポリマー、アミノ酸、炭水化物、キレート剤、糖、及び当業者に公知の他の標準成分を含む。ｍＡｂは、１〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば１０ｍｇ／ｍｌ濃度で典型的に存在する。
【００３０】
別の好ましい実施形態において、医薬製剤の形に調製されたｍＡｂは、任意の好適な投与法、特に非経口的に、静脈内注入又はボーラス注射、筋肉内又は皮下により、患者に投与され得、医薬製剤の形でヒト化Ｌ２Ｇ７（例、ＨｕＬ２Ｇ７）などのヒト化抗ＨＧＦｍＡｂを使用して、疾病を持つ患者の治療方法を提供する。静脈内注入は、最低１５分以上、しかし非常にしばしば３０分、又は１、２又はさらに３時間を越えて与えられ得る。ｍＡｂはまた、疾患部位へ直接注入され得、又はリポソームなどの運搬剤中に封入され得る。与えられる用量は治療されるべき疾患を和らげるために十分であり（治療有効用量）、例えば、１、２、３又は４ｍｇ／ｋｇなど、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重の傾向にあるが、１０ｍｇ／ｋｇ又はさらに１５又は２０ｍｇ／ｋｇの多さでもあり得る。固定のユニット用量はまた、与えられ得、例えば、５０、１００、２００、５００又は１０００ｍｇであり、用量は例えば１００ｍｇ／ｍ２など、患者の表面積に基づき得る。通常１〜８（例、１、２、３、４、５、６、７又は８）回の投与が、癌を治療するためになされるが、１０回、２０回又はそれ以上投与してもよい。該ｍＡｂは、例えばｍＡｂの半減期に依存して、毎日、週に２回、週に１回、１週間おき、月に１回又は他のある間隔で、１週間、２週間、４週間、８週間、３〜６ヶ月又はそれ以上投与され得る。長期投与のように治療コースを繰り返し行うことも可能である。
【００３１】
例えば、ＨｕＬ２Ｇ７などのヒト化抗ＨＧＦｍＡｂによる治療に特に感受性を示す疾病は、血管新生を必要とする、または、ＨＧＦレベル上昇に関連すると考えられている固形腫瘍、例えば、卵巣癌、乳癌、肺癌（小細胞又は非小細胞）、結腸癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、頭頸部腫瘍、子供又は大人のメラノーマ及び肉腫、並びに脳腫瘍などを含む。実際、ｍＡｂによる癌の治療方法、特にヒト化Ｌ２Ｇ７ｍＡｂによる全身性治療は、髄膜腫を含む脳腫瘍；上衣腫、乏突起膠腫及び星細胞腫の全ての型を含むグリオーマ（低いグレード、未分化及び膠芽細胞腫多形又は単なる膠芽細胞腫）；髄芽腫、神経節膠腫、神経鞘腫、脊索腫；及び原始神経害胚葉性腫瘍を含む主に子供の脳腫瘍の治療に特に適用できる。初期脳腫瘍及び二次又は転移脳腫瘍の両方が、該方法により治療され得る。該方法による治療に適する他の疾病は、糖尿病性網膜症、加齢による筋肉退化、リウマチ関節炎及び乾癬など望まれない血管新生に関連する。
【００３２】
特に好ましい実施形態において、ヒト化抗ＨＧＦｍＡｂ（例、ＨｕＬ２Ｇ７）は、他の抗癌治療と共に（即ち、抗癌治療前、抗癌治療中又は抗癌治療後に）投与される。例えば、該ｍＡｂは、腫瘍学の当業者に公知の１以上の化学療法剤、例えば、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、カルボプラチン、オキシプラチン、プロカルバジン、及びシクロホスファミドなどのアルキル化剤；フルオロウラシル、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキサート及びヒドロキシウレアなどの代謝拮抗剤；植物アルカノイド及びブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、エトポシド、マイトマイシン、ミトキサントロン、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどの抗生物質及びタキソール（パクリタキセル）又はタキソテール（登録商標）などの関連化合物を含む天然物；テモゾロミド及びカルムスチンを含有するグリアデル（登録商標）ウェーファを含む脳腫瘍のために特異的に認可された剤；及びイリノテカン及びグリベック（登録商標）を含む他の剤並びに全ての認可された実験抗癌剤と共に投与され得る。ヒト化抗ＨＧＦｍＡｂと共に投与される他の剤は、ＨＥＲ２抗原に対するヘルセプチン（商標）、ＶＥＧＦに対するアバスチン（商標）、又はＥＧＦレセプターに対する抗体を含むモノクローナル抗体、並びに小分子抗血管新生剤又はＥＧＦレセプター拮抗剤などの生物製剤を含み投与され得る。さらに、ヒト化抗ＨＧＦｍＡｂは、放射線治療又は外科手術と共に使用され得る。
【００３３】
ヒト化抗ＨＧＦｍＡｂ抗体（例、ＨｕＬ２Ｇ７）を含む治療（例、標準化学療法）は、これらの腫瘍（例、卵巣、乳房、肺、膵臓、脳及び結腸、特に再発又は難治性の場合）の患者の無増悪生存期間中央値及び全体の生存時間を、同一治療（例、化学療法）だが、抗ＨＧＦｍＡｂを用いないものと比較すると、少なくとも３０％又は４０％しかし好ましくは５０％、６０％から７０％又はさらに１００％増加させ得る。さらに／あるいは、抗ＨＧＦｍＡｂを含む治療（例、標準化学療法）は、これらの腫瘍（例、卵巣、乳房、肺、膵臓、脳及び結腸、特に再発又は難治性の場合）の患者の完全寛解率、部分寛解率、又は客観的寛解率（全体的＋部分的）を、同一治療（例、化学療法）だが、抗ＨＧＦｍＡｂを用いないものと比較すると、少なくとも３０％又は４０％しかし好ましくは５０％、６０％から７０％又はさらに１００％増加させ得る。膠芽細胞腫などの脳腫瘍に関して、単独もしくは他の剤と組み合わせてヒト化抗ＨＧＦｍＡｂを用いる治療は、少なくとも５％又は１０％、より好ましくは２０％又は２５％又は３０％、並びに最も好ましくは４０％、５０％又はそれ以上の部分的、完全又は客観的寛解率を好ましくは提供する。
【００３４】
臨床試験において、ヒト化抗ＨＧＦｍＡｂ（例、ＨｕＬ２Ｇ７）を加えた標準療法で治療した患者の、前述の無増悪生存期間中央値及び／又は反応速度における増加は、標準療法（又はプラセボを添加）だけを受けている患者の対照群と比較して、例えば、ｐ＝０．０５又は０．０１又はさらに０．００１レベルでさえも、統計的に有意である。完全及び部分的寛解率は、例えば、国立癌研究所及び／又は食品医薬品局により記載又は許容されているような、癌に対する臨床試験において一般に使用される客観的基準により測定される。
【００３５】
他の方法
ヒト化抗ＨＧＦｍＡｂはまた、診断法、予後診断法及び実験室的な方法に使用することができる。これらは、腫瘍中又は腫瘍を有する患者の血液循環中のＨＧＦレベルの測定に使用され得、したがって、腫瘍の治療を追跡し、指針を与えるのに使用され得る。例えば、高レベルＨＧＦに関連する腫瘍は、ヒト化抗ＨＧＦｍＡｂでの治療に対して特に感受性であるだろう。具体的な実施形態において、該ｍＡｂは、例えば、腫瘍生検標本中又は血清中又は細胞培養におけるＨＧＦ分泌細胞の培養上清中のＨＧＦのレベルを測定するためにＥＬＩＳＡ又は放射免疫測定において使用され得る。様々なアッセイに関して、抗ＨＧＦｍＡｂは、蛍光分子、スピン標識分子、酵素又は放射性同位体により標識され得、ＨＧＦアッセイを行うために必要な試薬を全て備えたキットの形で提供され得る。他用途において、抗ＨＧＦｍＡｂは、例えばアフィニティークロマトグラフィーによるＨＧＦ精製に使用される。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００３６】
［実施例１］
ＨｕＬ２Ｇ７の精製
１．細胞培養液の調製
肝細胞増殖因子に対する抗体をコードする遺伝子（ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６５３８５；ＷＯ２００７／１１５０４９）を組み込んだ発現ベクターをチャイニーズハムスター卵巣細胞にトランスフェクションして肝細胞増殖因子に対する抗体であるＨｕＬ２Ｇ７を生産する細胞株を取得した。この生産細胞株をＣＤ−ＣＨＯ（インビトロジェン社）改変培地で培養して細胞培養液約１０Ｌを取得した。【００３７】
２．細胞培養液上清の調製
上記１で取得したＨｕＬ２Ｇ７を含む細胞培養液上清をデプスフィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＨＣ  ｍｉｎｉ、Millipore社）でろ過し、ろ液を０．２μｍメンブレンフィルター（Ｓａｒｔｏｌａｂ  Ｐ  ｐｌｕｓ、Sartorius stedim社）でさらにろ過した。【００３８】
３．プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー
バッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  トリス塩酸バッファー、ｐＨ７．５）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（３０ｍｍＩＤ×２００ｍｍＬ、GE Healthcare社）に、上記２で得られたろ液１００８ｍＬ（ＨｕＬ２Ｇ７：３，９５６ｍｇ）をアプライし、同じバッファーで洗浄した後、５０ｍＭ  クエン酸バッファー（ｐＨ３．２）で溶出し、ＨｕＬ２Ｇ７を含む画分をプールした（プール液量：２７９ｍＬ、ＨｕＬ２Ｇ７：３，８１４ｍｇ、単量体純度：８２．４％、重合体：１７．６％）。【００３９】
４．ウイルス不活化
上記３で得られたプロテインＡカラム溶出画分を０．１Ｎ  塩酸でｐＨ３．５に調製し、室温で１時間撹拌した。その後１Ｍ  トリスでｐＨ５．０に調製し、０．２μｍメンブレンフィルター（Ｓａｒｔｏｌａｂ  Ｐ  ｐｌｕｓ、Sartorius stedim社）によりろ過した。【００４０】
５．クロスフローろ過によるバッファー交換
上記４で得られたろ液をＳａｌｔｏｃｏｎ  ｓｌｉｃｅ  ２００メンブレン（分子排除限界３０ｋＤａ、Sartorius stedim社）を用いてバッファー（２０ｍＭ  クエン酸、８７．５ｍＭ  Ｌ（＋）−アルギニン、ｐＨ６．２）に置換した後、０．２μｍメンブレンフィルター（Ｓａｒｔｏｌａｂ  Ｐ  ｐｌｕｓ、Sartorius stedim社）によりろ過した。【００４１】
６．ミックスモードクロマトグラフィー
バッファー（２０ｍＭ  クエン酸、８７．５ｍＭ  Ｌ（＋）−アルギニン、ｐＨ６．２）で平衡化したＣａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅカラム（１０ｍｍＩＤ×２００ｍｍＬ、GE Healthcare社）に上記５でバッファー置換したＨｕＬ２Ｇ７溶液を４７．６ｍＬ（ＨｕＬ２Ｇ７：７８５ｍｇ）アプライし、バッファー（２０ｍＭ  クエン酸、８７．５ｍＭ  Ｌ（＋）−アルギニン、ｐＨ６．２）を通液して、素通り画分をプールした（プール液量：１８２ｍＬ、ＨｕＬ２Ｇ７：６３９ｍｇ、単量体純度：９６．２％、重合体：３．８％）。【００４２】
７．クロスフローろ過によるバッファー交換
上記５と同様の方法で、上記６で得られたＨｕＬ２Ｇ７溶液をバッファー（２０ｍＭ  クエン酸、１４ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）に置換し、０．２μｍメンブレンフィルター（Ｓａｒｔｏｌａｂ  Ｐ  ｐｌｕｓ、Sartorius stedim社）によりろ過した。【００４３】
８．陽イオン交換クロマトグラフィー
バッファー（２０ｍＭ  クエン酸、１４ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｃａｐｔｏ  Ｓカラム（７ｍｍＩＤ×２５ｍｍＬ、GE Healthcare社）に上記７で得られたＨｕＬ２Ｇ７溶液１８．８ｍＬ（ＨｕＬ２Ｇ７：７０ｍｇ）をアプライし、同じバッファーで洗浄した後、８５ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）で溶出し、ＨｕＬ２Ｇ７を含む画分をプールした（プール液量：１９ｍＬ、ＨｕＬ２Ｇ７：６１．９ｍｇ、単量体純度：９９．８％、重合体：０．２％）。
精製プロセス全体のＨｕＬ２Ｇ７回収率は６９．４％であった。【００４４】
分析方法
１．ＨＰＬＣによるＨｕＬ２Ｇ７濃度定量
ろ液中のＨｕＬ２Ｇ７濃度をＰＡ  ＩＤセンサーカートリッジ（２．１ｍｍＩＤ×３０ｍｍＬ、Applied Biosystems社）を用いて定量した。【００４５】
２．ゲルろ過ＨＰＬＣによるＨｕＬ２Ｇ７単量体分析
１５０ｍＭ  ＫＣｌを含む２００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．９）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬカラム（７．８ｍｍＩＤ×３００ｍｍＬ、東ソー（株））に上記８で取得したサンプル１２．３μＬのＨｕＬ２Ｇ７（ＨｕＬ２Ｇ７  Ｃａｐｔｏ  Ｓ溶出画分  ４０μｇ）をアプライし、同バッファーで流速１ｍＬ／分で２０分間通液し、２８０ｎｍの吸光度をモニターすることで、重合体と単量体の含量を分析した。【００４６】
［実施例２］
ＨｕＬ２Ｇ７の精製【００４７】
１．細胞培養液の調製
肝細胞増殖因子に対する抗体をコードする遺伝子（ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６５３８５；ＷＯ２００７／１１５０４９）を組み込んだ発現ベクターをチャイニーズハムスター卵巣細胞にトランスフェクションして肝細胞増殖因子に対する抗体であるＨｕＬ２Ｇ７を生産する細胞株を取得した。この生産細胞株をＣＤ−ＣＨＯ（インビトロジェン社）改変培地で培養して細胞培養液約１０Ｌを取得した。【００４８】
２．細胞培養液上清の調製
上記１で取得したＨｕＬ２Ｇ７を含む細胞培養液上清をデプスフィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＨＣ、Millipore社）でろ過し、ろ液を０．２μｍメンブレンフィルター付属のディスポーザブルバッグ（Flexboy １０Ｌ、Sartorius stedim社）へ移送した。【００４９】
３．プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー
バッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  トリス塩酸バッファー、ｐＨ７．５）で平衡化したMabSelect SuReカラム（１００ｍｍＩＤ×２００ｍｍＬ、GE Healthcare社）に、上記２で得られたろ液７，７４９Ｌ（ＨｕＬ２Ｇ７：４３，２７８ｍｇ）をアプライし、同じバッファーで洗浄した後、５０ｍＭ  クエン酸バッファー（ｐＨ３．２）で溶出し、ＨｕＬ２Ｇ７を含む画分をプールした（プール液量：１８５０Ｌ、ＨｕＬ２Ｇ７：３８，５４６ｍｇ、単量体純度：９３％）。【００５０】
４．ウイルス不活化
上記３で得られたプロテインＡカラム溶出画分を０．１Ｎ  塩酸でｐＨ３．５に調整し、室温で１時間撹拌した。その後１Ｍ  トリスでｐＨ５．０に調整し、０．２μｍメンブレンフィルター（ザルトポア２、Sartorius stedim社）でろ過した。２日後さらに０．６５μｍデプスフィルター（ザルトピュアＧＦ、Sartorius stedim社）、０．２μｍメンブレンフィルター（ザルトポア２、Sartorius stedim社）でろ過した。【００５１】
５．ゲルろ過クロマトグラフィーカラムによるバッファー交換
上記４で得られたろ液のうち５ｍＬをSephadex G-25ゲルろ過カラム（PD-10 Desalting column、GE Healthcare社）により、３５０ｍＭのプロリンを含む２０ｍＭ  クエン酸バッファー（ｐＨ６．０）へバッファー置換し、０．２μｍメンブレンフィルター（Millex GVフィルターユニット、Millipore社）でろ過した。【００５２】
６．ミックスモードクロマトグラフィーによる精製
プロリンを３５０ｍＭ含む２０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）で平衡化したCapto adhereカラム（HiTrap Capto adhere １ｍＬ、GE Healthcare社）に上記５にて３５０ｍＭプロリンを含むバッファーへ置換したＨｕＬ２Ｇ７溶液を４．４ｍＬ（ＨｕＬ２Ｇ７：５０ｍｇ）アプライし、平衡化に使用したバッファーを通液して素通り画分をプールした（プール液量：１１．５ｍＬ、ＨｕＬ２Ｇ７：４３ｍｇ、単量体純度：９８％）。【００５３】
７．ゲルろ過クロマトグラフィーカラムによるバッファー交換
上記６にて得られたＨｕＬ２Ｇ７溶液を遠心式フィルター（Amicon Ultra-0.5、Ultracel-30、３０ｋＤａ、Millipore社）を用いて５ｍＬまで濃縮した後、上記５と同様の方法で、２０ｍＭ  クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）に置換し、０．２μｍメンブレンフィルター（Millex GVフィルターユニット、Millipore社）でろ過した。【００５４】
８．陽イオン交換クロマトグラフィー
２０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したCapto Sカラム（HiTrap Capto S １ｍＬ、GE Healthcare社）に上記７にてバッファー置換したＨｕＬ２Ｇ７溶液を６．４ｍＬ（ＨｕＬ２Ｇ７：３２ｍｇ）アプライし、平衡化に使用したバッファーを通液して素通り画分をプールした（プール液量：１８．２ｍＬ、ＨｕＬ２Ｇ７：２６．３４ｍｇ、単量体純度：１００％）。【００５５】
［実施例３］
ＨｕＬ２Ｇ７の精製【００５６】
１．細胞培養液の調製
肝細胞増殖因子に対する抗体をコードする遺伝子（ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６５３８５；ＷＯ２００７／１１５０４９）を組み込んだ発現ベクターをチャイニーズハムスター卵巣細胞にトランスフェクションして肝細胞増殖因子に対する抗体であるＨｕＬ２Ｇ７を生産する細胞株を取得した。この生産細胞株をＣＤ−ＣＨＯ（インビトロジェン社）改変培地で培養して細胞培養液約１０Ｌを取得した。【００５７】
２．細胞培養液上清の調製
上記１で取得したＨｕＬ２Ｇ７を含む細胞培養液上清をデプスフィルター（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＨＣ、Millipore社）でろ過し、ろ液を０．２μｍメンブレンフィルター付属のディスポーザブルバッグ（Flexboy １０Ｌ、Sartorius stedim社）へ移送した。【００５８】
３．プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー
バッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  トリス塩酸バッファー、ｐＨ７．５）で平衡化したMabSelect SuReカラム（１００ｍｍＩＤ×２００ｍｍＬ、GE Healthcare社）に、上記２で得られたろ液７，７４９Ｌ（ＨｕＬ２Ｇ７：４３，２７８ｍｇ）をアプライし、同じバッファーで洗浄した後、５０ｍＭ  クエン酸バッファー（ｐＨ３．２）で溶出し、ＨｕＬ２Ｇ７を含む画分をプールした（プール液量：１８５０Ｌ、ＨｕＬ２Ｇ７：３８，５４６ｍｇ、単量体純度：９３％）。【００５９】
４．ウイルス不活化
上記３で得られたプロテインＡカラム溶出画分を０．１Ｎ  塩酸でｐＨ３．５に調整し、室温で１時間撹拌した。その後１Ｍ  トリスでｐＨ５．０に調整し、０．２μｍメンブレンフィルター（ザルトポア２、Sartorius stedim社）でろ過し５℃で保存した。２日後０．６５μｍデプスフィルター（ザルトピュアＧＦ、Sartorius stedim社）、０．２μｍメンブレンフィルター（ザルトポア２、Sartorius stedim社）でろ過した。【００６０】
５．ゲルろ過クロマトグラフィーカラムによるバッファー交換
上記４で得られたろ液のうち０．５ｍＬをSephadex G-25ゲルろ過カラム（PD MiniTrap G-25、GE Healthcare社）により、グリシン（Ｇｌｙ、中性アミノ酸）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、塩基性アミノ酸）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、酸性アミノ酸）、プロリン（Ｐｒｏ、疎水性アミノ酸）それぞれを３７５ｍＭ含む四種類の２０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）へそれぞれ置換した。バッファー置換した各溶液を５ｍｇ／ｍＬとなるようそれぞれのバッファーで希釈し、０．２μｍメンブレンフィルター（Millex GVフィルターユニット、Millipore社）でろ過した。【００６１】
６．ミックスモードクロマトグラフィーによる精製
96well PreDictor Capto adhere  ２μＬ（GE Healthcare社）を上記５に示した各アミノ酸を含む四種類の２０ｍＭ  クエン酸バッファー（ｐＨ６．０）でそれぞれ１ウェルずつ平衡化した後、上記５で得られたＨｕＬ２Ｇ７溶液を２００μＬ（ＨｕＬ２Ｇ７：１ｍｇ）アプライし、平衡化と同じバッファーを通液して素通り画分をプールした。アミノ酸を含まないバッファーの場合、回収率は４３％、単量体純度は９６％であった。３７５ｍＭ  グリシンを含む２０ｍＭ  クエン酸バッファーの場合、回収率は５５％、単量体純度は９６％であった。３７５ｍＭ  ヒスチジンを含むクエン酸バッファーの場合、回収率は９７％、単量体純度は９５％であった。３７５ｍＭ  グルタミン酸を含む場合、回収率は９３％、単量体純度は９５％であった。３７５ｍＭ  プロリンを含む場合回収率は８４％、単量体純度は９６％であった。【００６２】
本出願は、日本で出願された特願２００８−３２４２０２（出願日：２００８年１２月１９日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2010071208.tif 000002
【国際調査報告】
2010071208.tif 000003
2010071208.tif 000004
2010071208.tif 000005
2010071208.tif 000006