(57)【要約】  本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかから選択されるポリヌクレオチドからなる遺伝子、当該遺伝子がコードする酵素の製造方法、及び当該酵素を用いたメチル化体の製造方法である；（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と６４％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを有し、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかから選択されるポリヌクレオチドからなることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド。（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と６４％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを有し、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかから選択されるポリペプチドをコードすることを特徴とする遺伝子。（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド。（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と６２％以上の相同性を有し、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかから選択されるポリペプチド。（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド。（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と６２％以上の相同性を有し、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
請求項１又は２記載の遺伝子を含有することを特徴とする組換え発現ベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換え発現ベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
【請求項６】
微生物であることを特徴とする請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
植物細胞、植物組織、又は植物体であることを特徴とする請求項５記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか記載の形質転換体を培養し、得られた培養物から、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドを精製することを特徴とするメチルトランスフェラーゼ酵素の製造方法。
【請求項９】
メチルトランスフェラーゼ酵素を用いて、化合物中の水酸基をメチル化する方法であり、前記メチルトランスフェラーゼ酵素が、請求項５〜７のいずれか記載の形質転換体を培養し、得られた培養物から精製された、下記（ａ）〜（ｃ’）のいずれかから選択されるポリペプチドであることを特徴とするメチル化体の製造方法。（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド。（ｃ’）配列番号２で表されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有し、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有する担子菌類由来のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項４記載の組換え発現ベクターを含む形質転換植物から、メチル化体を精製することを特徴とするメチル化体の精製方法。
【請求項１１】
請求項４記載の組換え発現ベクターを含む形質転換植物から精製されたことを特徴とするメチル化ポリフェノール含有組成物。
【請求項１２】
担子菌類から抽出されたメチルトランスフェラーゼ酵素を用いて、ポリフェノール中の水酸基をメチル化することを特徴とするメチル化ポリフェノールの製造方法。
【請求項１３】
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかから選択されるポリペプチドを、担子菌類から抽出し、精製することを特徴とする、メチルトランスフェラーゼ酵素の製造方法。（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド。（ｃ’）配列番号２で表されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有し、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを、エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）から抽出し、精製することを特徴とする、メチルトランスフェラーゼ酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規メチルトランスフェラーゼ酵素及びその製造方法に関するものである。さらには、当該酵素を用いて、化合物中の水酸基（ヒドロキシ基）をメチル化し、メチル化体を製造する方法に関するものである。
本願は、２００９年３月２日に、日本に出願された特願２００９−０４７９５３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本を含む先進国において、生活環境の変化や食生活の変化による様々な生活習慣病の患者が増加している。主要な生活習慣病として糖尿病、高血圧症、脂質異常症等が挙げられ、これらの疾患の発症者が増加している。また、重篤な症状に至らなくともその兆候を示す、いわゆる予備軍も増加の傾向を示している。その他、これらの生活習慣病以外にも、生活環境の変化によるアレルギー患者の増加、パソコン（パーソナルコンピュータ）等の普及による眼性疲労患者の増加も深刻な問題となっている。【０００３】
これらの症状を有する患者やその予備軍にとって、その改善を試みる手段の一つに、健康食品や特定保健用食品等の機能性食品の摂取が挙げられる。機能性食品中の有効成分には、様々な植物や微生物からの抽出物が用いられている。中でも、植物の果実や葉等から抽出されたポリフェノールを有効成分とするものが多く開発されている。【０００４】
ポリフェノールとしては、例えば、フラボン類、フラボノール類、フラバノン類、イソフラボン類、アントシアニン類、フラバノール類、エラジタンニン類、フェニルプロパノイド類、アントシアニジン類、プロアントシアニジン類、カルコン類、オーロン類、フェニルエタノイド類等が挙げられる。より具体的には、没食子酸、エラグ酸、ヒドロキシチロソール、エピガロカテキン３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）、カテキンガレート（ＣＧ）、ガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＧＣＧ）、エピカテキン（ＥＣ）、カテキン（Ｃ）、エピガロカテキン(ＥＧＣ)、ガロカテキン(ＧＣ)、クロマニン、デルフィニジン、デルフィニジン３−Ｏ−グルコシド、プロシアニジンＢ２（ＰＢ２）、カフェ酸、クロロゲン酸、ロスマリン酸、カフェ酸フェネチルエステル、ストリクチニン、ケルセチン、イソクエルシトリン、ルチン、ミリセチン、ブテイン、スルフレチン、ルテオリン、エリオジクチオール等が挙げられる。これらのポリフェノールは、その構造に複数のフェノール性水酸基を持つことを特徴とし、抗酸化活性、血圧上昇抑制、血糖値上昇抑制、内脂肪蓄積抑制、動脈硬化抑制、抗炎症作用、抗がん性、アレルギー抑制、抗う蝕作用、消臭作用、抗菌活性等の様々な機能性が研究、報告されている。また、これらのポリフェノール以外にも、植物由来の成分に関して、様々な機能性が研究、報告されている。【０００５】
植物から抽出・精製された多種多様なポリフェノールが、食品用素材として用いられており、その効果が期待されている。しかしながら、必ずしもポリフェノール自体の生体内への吸収性は良好とは言えない。ヒトへのポリフェノール摂取後の吸収性を比較した結果でも、最高血中濃度で数μｍｏｌ／ｌの濃度であることが報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。【０００６】
植物中には、水酸基にメチル基が修飾されたメチル化ポリフェノールが含まれている。例えば、茶品種“青心大ぱん”、“べにほまれ”、“べにふじ”、“べにふうき”等には、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート(ＥＧＣＧ３”Ｍｅ)やエピガロカテキン−３−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート（ＥＧＣＧ４”Ｍｅ)が含まれている。これらのメチル化カテキンをマウスへ経口投与した場合の、投与６０分後の血中メチル化カテキン濃度は、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）と比較して、遊離体で約９倍高い値を示した（例えば、非特許文献２参照。）。また、ＥＧＣＧ３”Ｍｅを含む“べにふうき”茶飲料を人に飲用させた後の血漿中ＥＧＣＧ濃度及びＥＧＣＧ３”Ｍｅ濃度を比較した結果、ＥＧＣＧ３”Ｍｅの方が良好な吸収性を示し、かつ血漿中からの代謝消失も穏やかであった（例えば、非特許文献３参照。）。【０００７】
メチル化ポリフェノールは、メチル基で修飾されていないポリフェノールに比べて、吸収性のみならず、機能性も優れているという報告が多くなされている。例えば、マウスマスト細胞を用いたヒスタミン遊離抑制試験に関しては、ＥＧＣＧ３”Ｍｅ、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレート、及びエピ（３−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレートは、ＥＧＣＧと比較して高い抗アレルギー作用を示し、かつメチル基の増加に伴ってその作用は強まる傾向を示した（例えば、特許文献１参照。）。また、７−ヒドロキシフラボン、７，４’−ジヒドロキシフラボン、クリシン、アピゲニン、及びこれらのメチル化体のヒトＣａｃｏ−２細胞への透過性を比較したところ、メチル化体の方が良好な透過性を示した（例えば、非特許文献４参照。）。同様に、ヒト肝臓細胞Ｓ９フラクションを用いた安定性試験においても、メチル化体の方が良好な結果を示した（例えば、非特許文献４参照。）。さらには、クリシン及びアピゲニンのメチル化体は、ヒトのＳＣＣガン細胞の増殖抑制効果が、非メチル化体と比較して約１０倍高い活性が得られた（例えば、非特許文献５参照。）。【０００８】
一方で、化合物の水酸基をメチル化する方法としては、化学合成・修飾法によるものがある。例えば、ポリフェノールの一種であるＥＧＣＧをメチル化する方法が、特許文献２又は３に開示されている。また、化学合成法以外の方法として、酵素法を用いたメチル化体の製造方法がある。例えばラット、豚や牛の肝臓から抽出したカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼが試薬品として市販されており、これらの酵素を用いてメチル化体を製造することができる。その他、植物体由来のメチルトランスフェラーゼを用いた酵素変換方法の報告もある（例えば、特許文献４参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００８−１８９６２８号公報
【特許文献２】特開昭６１−１４５１７７号公報
【特許文献３】特開２００２−２５５８１０号公報
【特許文献４】特開２００６−１４１２４２号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】マナック（Manach）、外４名、ジ・アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（The American journal of clinical nutrition）、２００５年、第８１巻、第２３０Ｓ〜２４２Ｓページ、レビュー。
【非特許文献２】佐野満昭、外３名、フレグランス・ジャーナル（FRAGRANCE JOURNAL）、２００４年、第４６〜５２ページ。
【非特許文献３】山本（前田）万里、外２名、サイトテクノロジー（Cytotechnology）、２００７年、第５５巻、第１３５〜１４２ページ。
【非特許文献４】ウェン（Wen）、外１名、ドラッグ・メタボリズム・アンド・ディスポジション（Drug Metabolism and Disposition）、２００６年、第３４巻第１０号、第１７８６〜１７９２ページ。
【非特許文献５】ウェイル（Walle）、外５名、バイオケミカル・ファーマコロジー（Biochemical pharmacology）、２００７年、第７３巻第９号、第１２８８〜１２９６ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、化学合成で製造した化学物質を飲食品として用いることは、コストや安全性の点から現状では困難である。また、酵素を用いたメチル化体の製造方法においても、動物や植物から酵素を大量に抽出・精製することは困難である、という問題がある。さらに飲食品への展開を考えた場合、動物由来の酵素を用いることは、感染症等の問題が懸念され、好ましくない。一方で、植物体由来のメチルトランスフェラーゼは、植物細胞を培養し、培養物から酵素を抽出、精製して得ることもできるが、植物細胞を培養する場合、特別な培養施設が必要となり、更には非常に長時間の培養日数が必要となる。また、得られる酵素活性が低いことも多々有り、工業生産を考えた場合は、生産コストが非常に高価となってしまう。【００１２】
本発明は、上記課題を鑑みてなされたものであって、飲食品への使用が可能であり、消費者が受け入れやすく、かつ工業生産を考えた場合の大量製造可能なメチルトランスフェラーゼ酵素、及び当該酵素を用いたメチル化体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、食経験があり、大量製造が可能であり、かつ消費者にとって認知度のある担子菌類のエノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）の培養菌糸体中に、各種ポリフェノール等の水酸基構造を有する各種化合物を基質とし、水酸基をメチル化する新規メチルトランスフェラーゼ酵素が存在していることを見出し、この新規酵素を単離・同定することにより、本発明を完成させた。【００１４】
すなわち、本発明は、（１）  下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかから選択されるポリヌクレオチドからなることを特徴とする遺伝子；（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と６４％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを有し、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（２）  下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかから選択されるポリペプチドをコードすることを特徴とする遺伝子；（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド、（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と６２％以上の相同性を有し、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド、（３）  下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかから選択されるポリペプチド；（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド、（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と６２％以上の相同性を有し、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド、【００１５】
（４）  前記（１）又は（２）記載の遺伝子を含有することを特徴とする組換え発現ベクター、（５）  前記（４）記載の組換え発現ベクターを含むことを特徴とする形質転換体、（６）  微生物であることを特徴とする前記（５）記載の形質転換体、（７）  植物細胞、植物組織、又は植物体であることを特徴とする前記（５）記載の形質転換体、【００１６】
（８）  前記（５）〜（７）のいずれか記載の形質転換体を培養し、得られた培養物から、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドを精製することを特徴とするメチルトランスフェラーゼ酵素の製造方法、（９）  メチルトランスフェラーゼ酵素を用いて、化合物中の水酸基をメチル化する方法であり、前記メチルトランスフェラーゼ酵素が、前記（５）〜（７）のいずれか記載の形質転換体を培養し、得られた培養物から精製された、下記（ａ）〜（ｃ’）のいずれかから選択されるポリペプチドであることを特徴とするメチル化体の製造方法；（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド、（ｃ’）配列番号２で表されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有し、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有する担子菌類由来のポリペプチド、（１０）  前記（４）記載の組換え発現ベクターを含む形質転換植物から、メチル化体を精製することを特徴とするメチル化体の精製方法、（１１）  前記（４）記載の組換え発現ベクターを含む形質転換植物から精製されたことを特徴とするメチル化ポリフェノール含有組成物、（１２）  担子菌類から抽出されたメチルトランスフェラーゼ酵素を用いて、ポリフェノール中の水酸基をメチル化することを特徴とするメチル化ポリフェノールの製造方法、（１３）  下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかから選択されるポリペプチドを、担子菌類から抽出し、精製することを特徴とする、メチルトランスフェラーゼ酵素の製造方法；（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド、（ｃ’）配列番号２で表されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有し、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド、（１４）  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを、エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）から抽出し、精製することを特徴とする、メチルトランスフェラーゼ酵素の製造方法、を提供するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の遺伝子がコードするポリペプチドは、飲食品に応用でき、かつ工業生産に有利な新規メチルトランスフェラーゼ酵素である。本発明の遺伝子及びポリペプチドを用いることにより、各種ポリフェノールを初めとする水酸基構造をもつ化合物のメチル化体を効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示した図である。
【図２Ａ】配列番号２で表されるアミノ酸配列と、上記２種類の担子菌の遺伝子と、相同性検索の結果相同性が高かった上位４遺伝子とのアミノ酸配列を比較した結果である。
【図２Ｂ】図２Ａ中の１〜４に示す領域から、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素のコンセンサス配列であると推定された配列を表す図である。
【図３】実施例１において、エノキタケ菌糸培養物から分画されたメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有する活性画分の二次元電気泳動像である。
【図４】実施例２において、ＩＰＴＧ処理前の大腸菌のライセート（レーン１）、ＩＰＴＧ処理後の大腸菌のライセート（レーン２）、ＩＰＴＧ処理後の大腸菌のライセートからヒスチジンタグを用いて得られた精製物（レーン３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像である。
【図５Ａ】実施例５において、各反応時間後に分取した天然型酵素反応液中のＥＧＣＧメチル化体濃度を示した図である。
【図５Ｂ】実施例５において、各反応時間後に分取した組換え酵素反応液中のＥＧＣＧメチル化体濃度を示した図である。
【図６】実施例６において、各ｐＨの酵素反応液中のＥＧＣＧメチル化体濃度を示した図である。
【図７】実施例７において、各温度の酵素反応液中のＥＧＣＧメチル化体濃度を示した図である。
【図８】実施例８において、天然型酵素処理したものとブランクの、緑茶カテキン類の組成を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明において、メチルトランスフェラーゼ酵素活性とは、水酸基構造を有する化合物を基質とし、基質中の水酸基をメチル化する反応を触媒する酵素活性を意味する。メチル化される水酸基は、特に限定されるものではないが、フェノール性水酸基であることが好ましい。また、基質としては、水酸基構造を有する化合物であれば特に限定されるものではないが、フェノール性水酸基を有する化合物であることが好ましく、ポリフェノールであることがより好ましい。
【００２０】
本発明の遺伝子は、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチド（以下、「本発明の酵素」ということがある。）をコードする担子菌類由来の遺伝子である。担子菌類は、植物よりも培養（栽培）が簡便であり、このため、植物や動物の組織から酵素を抽出・精製するよりも、担子菌類から酵素を抽出・精製することにより、大量の酵素を簡便かつ安定的に、低コストで得ることができる。すなわち、本発明の遺伝子がコードするメチルトランスフェラーゼ酵素は、工業生産に非常に有利である。
【００２１】
本発明の遺伝子は、担子菌類由来の遺伝子であれば、特に限定されるものではなく、食用として市販されている担子菌類由来の遺伝子であってもよく、オオキツネタケ（Ｌａｃｃａｒｉａ ｂｉｃｏｌｏｒ）やＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ（以下、モデルキノコ）、カイメンタケ、ヤケイロタケ、コレラタケ等の担子菌類由来の遺伝子であってもよい。本発明の遺伝子としては、食用に供される化合物のメチル化体の製造にも好適であることから、食用に適した担子菌類由来の遺伝子であることが好ましい。食用に適した担子菌類として、例えば、シイタケ、シメジ、マイタケ、エノキタケ、ブナシメジ、ヒラタケ、ナラタケ、タモギタケ、エリンギ、アワビタケ等が挙げられる。本発明の遺伝子としては、エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）由来の遺伝子であることが特に好ましい。
【００２２】
本発明の遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子（以下、「エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子」ということがある。）であることが好ましい。エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子は、後記実施例１の方法により、本発明者らによりエノキタケから単離・同定された新規遺伝子である。当該遺伝子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、「エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素」ということがある。）をコードする遺伝子であり、配列番号１で表される塩基配列の４５位〜７３４位がコーディング領域である。図１に、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示す。
【００２３】
なお、配列番号１で表される塩基配列及び配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、公開されているＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のデータベースを用いてホモロジー検索を行った結果、最も相同性の高い遺伝子はオオキツネタケ由来遺伝子Ｓ２３８Ｎ−Ｈ８２（アクセッション番号：ＸＭ＿００１８７８８０３）であり、塩基配列で６３．６％、アミノ酸配列で６１．６％程度の相同性であった。
【００２４】
また、全ゲノム配列が判明している担子菌類であるモデルキノコのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／Ｐｈｃｈｒ１／Ｐｈｃｈｒ１．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）を用いて、同様にホモロジー検索を行った結果、最も相同性の高い遺伝子はＯ-メチルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ：１２７１１５）であり、塩基配列で６３．９％、アミノ酸配列で５６．８％程度の相同性であった。
【００２５】
図２Ａは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と、上記２種類の担子菌の遺伝子と、相同性検索の結果相同性が高かった上位４遺伝子とのアミノ酸配列を比較した結果である。図２Ａ中、「Ｆ．ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ」は配列番号２で表されるアミノ酸配列を表す。また、「Ｌ．ｂｉｃｏｌｏｒ  Ｓ２３８Ｎ−Ｈ８２」はオオキツネタケ由来遺伝子Ｓ２３８Ｎ−Ｈ８２、「Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ」はモデルキノコ由来Ｏ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子、「Ｂ．ｉｎｄｅｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．」はＢｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ ｉｎｄｉｃａ ｓｕｂｓｐ．由来Ｏ−メチルトランスフェラーゼ  ファミリータンパク質遺伝子（アクセッション番号：ＹＰ＿００１８３２７９７）、「Ｂ．ａｍｂｉｆａｒｉａ  ＡＭＭＤ」はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ａｍｂｉｆａｒｉａ ＡＭＭＤ由来Ｏ−メチルトランスフェラーゼ  ファミリータンパク質遺伝子（アクセッション番号：ＹＰ＿７７７３１０）、「Ｂ．ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ」はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ  ＭＳＭＢ４３由来Ｏ−メチルトランスフェラーゼ  ファミリータンパク質遺伝子（アクセッション番号：ＺＰ＿０２４６６６０９）、及び「Ｅ．ｓａｋａｚａｋｉｉ」はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ  ＡＴＣＣ ＢＡＡ−８９４由来遺伝子（アクセッション番号：ＹＰ＿００１４３７７８５）の推定アミノ酸配列をそれぞれ表す。
【００２６】
本発明者らは、このアラインメントから、図２Ａ中、１〜４に示す領域が、全７種類の遺伝子において保存性の高い領域であることを見出した。なお、配列番号２で表されるアミノ酸配列中、領域１は７０〜８８番目の領域であり、領域２は１３９〜１４８番目の領域であり、領域３は１７１〜１７５番目の領域であり、領域４は２１５〜２２３番目の領域である。さらに本発明者らは、これらの４領域のアミノ酸配列から、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素のコンセンサス配列を推定した。図２Ｂは、図２Ａ中の１〜４に示す領域から、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素のコンセンサス配列であると推定された配列を表す。なお、図２Ｂ中、「ｘ」はいずれのアミノ酸残基であってもよいことを意味し、「（／）」は、括弧内のいずれかのアミノ酸残基であることを意味する。
【００２７】
さらに、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、ＮＣＢＩデータベースを用いて植物由来のメチルトランスフェラーゼ酵素とのホモロジー検索を行った結果、ダイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）由来遺伝子（アクセッション番号：ＡＹ２７９００４）と、塩基配列で５３．９％、アミノ酸配列で３０．４％の相同性であった。同様に、イネ（Ｏｌｙｚａ ｓａｔｉｖａ）由来遺伝子（アクセッション番号：ＡＹ２７９００４）と５０．７％（塩基配列）及び３０．０％（アミノ酸配列）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来遺伝子（アクセッション番号：ＭＮ＿１１６０６５）５２．３％（塩基配列）及び３０．８％（アミノ酸配列）程度の相同性であった。さらに、特許文献４に記載の、茶から単離されたＥＧＣＧをメチル化可能なメチルトランスフェラーゼ酵素と比較した結果、塩基配列で５３．９％、アミノ酸配列では３０．４％程度の相同性であった。
【００２８】
本発明の遺伝子を部分的に少数の塩基を改変した場合であっても、当該遺伝子が有するメチルトランスフェラーゼ酵素活性が維持されうることは周知の事実である。また、このような改変は、例えば部分特異的変異導入方法等の周知の技術を利用して行うことができる。したがって、本発明の遺伝子は、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有する遺伝子をコードする限り、配列番号１で表される塩基配列の１又は複数の塩基が、置換、欠失、付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドからなってもよい。例えば、公知の遺伝子組換え技術を用いることにより、配列番号１で表される塩基配列に、１又は複数の塩基を人為的に挿入、欠失、置換を行う事により、メチルトランスフェラーゼ酵素活性が損なわれていない変異遺伝子、又は当該酵素活性が改善された変異遺伝子とすることが可能である。
【００２９】
具体的には、本発明の遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる遺伝子であってもよい。
【００３０】
なお、本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。例えば、２×ＳＳＣ、１０重量％硫酸デキストラン、及び５０％ホルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、４０〜６５℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。なお、２０×ＳＳＣ溶液は、３Ｍ  塩化ナトリウム及び０．３Ｍ  クエン酸溶液（ｐＨ７．０）である。
【００３１】
また、本発明の遺伝子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。例えば、配列番号１で表される塩基配列のコーディング領域以外の領域の塩基が欠失・置換・付加等された遺伝子であってもよく、配列番号１で表される塩基配列のコーディング領域中の１若しくは数個の塩基が置換されている遺伝子（サイレント変異が生じている遺伝子）であってもよい。
【００３２】
さらに、本発明の遺伝子としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。このような遺伝子であっても、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子と同様に機能するためである。
【００３３】
本発明の遺伝子は、他の担子菌類におけるエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子のホモログ遺伝子であってもよい。このようなホモログ遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列や配列番号２で表されるアミノ酸配列等の情報を用いて、公知の遺伝子解析方法、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されている方法を用いて行うことができる。具体的には、例えば、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有する担子菌類からｔｏｔａｌ−ＲＮＡを抽出し、ディジェネレートプライマー等を用いたＲＴ−ＰＣＲ法により、目的のホモログ遺伝子又はその断片を取得する。得られた遺伝子断片を、ｐＵＣ系ベクターやｐＧＥＭ系ベクター等の塩基配列決定が可能なベクターにクローニングして塩基配列を決定し、決定された配列を基にＲＡＣＥ−ＰＣＲ法等を行うことにより、ホモログ遺伝子の全長を取得することができる。このとき、例えば、図２Ｂに示すコンセンサス配列に対するディジェネレートプライマーを設計し、これを用いることにより、より効率よくホモログ遺伝子断片を取得することができる。なお、同様の手法により、担子菌類以外の生物、例えば、微生物や植物等からも、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子のホモログ遺伝子を取得することができる。
【００３４】
このようなホモログ遺伝子としては、具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列と４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは５５％以上、さらに好ましくは６２％以上の相同性を有し、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。
【００３５】
このようなホモログ遺伝子としては、例えば、配列番号１で表される塩基配列と６４％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを有し、かつ、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる遺伝子であってもよい。
【００３６】
塩基配列とアミノ酸配列の相同性検索をする場合には、一般的に、最初にＧＡＰを考慮せずホモロジーの核となる部分を探し、そこからアライメント処理を行う方法（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｓｅａｒｃｈ）と、置き換えや欠損を考慮しながら、塩基（アミノ酸）配列間で一致する塩基（アミノ酸残基）対が最大になるように並べ替える方法（Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｍａｔｃｈｉｎｇ）とがある。本発明及び本願明細書における「相同性」の値は、Ｍａｘｉｍｕｍ Ｍａｔｃｈｉｎｇを用いて解析し、得られる値を示す。なお、Ｍａｘｉｍｕｍ Ｍａｔｃｈｉｎｇによる相同性検索は、ＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１．０（ＧＥＮＥＴＹＸ社製）等の汎用されている解析ソフトウェアを用いて行うことができる。
【００３７】
本発明の酵素は、本発明の遺伝子を含む生物体から抽出し、精製することにより、得ることができる。生物体からの精製方法は、特に限定されるものではなく、一般的に行われる公知の精製方法の中から、適宜選択して行うことができる。また、メチルトランスフェラーゼ酵素活性が発揮される状態まで精製すればよく、精製度は特に限定されず、粗精製であってもよい。
【００３８】
具体的には、本発明の遺伝子を含む担子菌類の子実体又は菌糸体を、適当な緩衝液中で超音波処理等により破砕した後、回収された上清を、本発明の酵素の粗酵素とすることができる。その他、担子菌類の子実体又は菌糸体を、適当な緩衝液中でホモジナイズした後、上清を回収してもよい。粗酵素を得るための緩衝液としては、例えば、ｐＨ６．５〜８．５のトリス緩衝液やリン酸緩衝液等を用いることができる。
【００３９】
また、酵素を抽出する担子菌類は、採取直後のものであってもよく、市販等されているものであってもよく、培養物であってもよい。なお、担子菌類の菌糸体の培養は、常法により行うことができる。
【００４０】
このようにして得られた粗酵素は、そのまま酵素反応に用いることができる。さらには、遠心分離、限外ろ過膜、塩析、各種クロマトグラフィーを組み合わせることにより、粗酵素から精製物を得ることもできる。
【００４１】
精製された本発明の酵素を、水酸基をメチル化したい化合物を基質とし、当該化合物と接触させて反応させることによりメチル化体を製造することができる。基質としては、水酸基構造を有する化合物であれば特に限定されるものではないが、フェノール性水酸基を有する化合物であることが好ましい。フェノール性水酸基を有する化合物の中でも、本発明の酵素の基質としては、ポリフェノールであることが好ましい。基質となるポリフェノールとしては、例えば、フラボン類、フラボノール類、フラバノン類、イソフラボン類、アントシアニン類、フラバノール類、エラジタンニン類、フェニルプロパノイド類、アントシアニジン類、プロアントシアニジン類、カルコン類、オーロン類、フェニルエタノイド類等が挙げられる。より具体的には、没食子酸、エラグ酸、ヒドロキシチロソール、エピガロカテキン３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）、カテキンガレート（ＣＧ）、ガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＧＣＧ）、エピカテキン（ＥＣ）、カテキン（Ｃ）、エピガロカテキン(ＥＧＣ)、ガロカテキン(ＧＣ)、クロマニン、デルフィニジン、デルフィニジン３−Ｏ−グルコシド、プロシアニジンＢ２（ＰＢ２）、カフェ酸、クロロゲン酸、ロスマリン酸、カフェ酸フェネチルエステル、ストリクチニン、ケルセチン、イソクエルシトリン、ルチン、ミリセチン、ブテイン、スルフレチン、ルテオリン、エリオジクチオール等が挙げられる。
【００４２】
具体的には、精製された本発明の酵素を、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９、より好ましくはｐＨ６．５〜８．５の緩衝液に懸濁し、さらに基質となる化合物とメチル基の供与体とを加えて、０〜６０℃、好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは３０〜４２℃で反応させることにより、酵素反応液中にメチル化体を得ることができる。なお、メチル基の供与体としては、Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ (ＳＡＭ)等の、一般的に水酸基のメチル化の際に用いられる物質の中から、適宜選択して用いることができる。
【００４３】
酵素反応により得られたメチル化体は、酵素反応液から、メチル化体化合物を抽出することが可能な溶媒等を用いることにより抽出することができる。なお、酵素反応液は、濃縮した後に抽出に用いてもよい。その他、酵素反応液を、合成吸着剤を充填したカラムに供して、メチル化体を当該合成吸着剤に吸着させ、さらに洗浄した後、適当な溶媒を用いて溶出させることによっても、メチル化体を得ることが可能である。得られたメチル化体は、さらにＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて精製することができる。
【００４４】
特に、本発明の酵素が、エノキタケ等の食用担子菌類から回収されたメチルトランスフェラーゼ酵素である場合には、当該酵素は、安全性が高いため、食用に供される化合物のメチル化体の製造に非常に好適である。また、前述したように、担子菌類は、簡便に大量培養（栽培）することができるため、エノキタケ等の食用担子菌類から回収された本発明の酵素は、飲食品や医薬品、化粧品等の十分な安全性が要求される製品の工業生産に適している。
【００４５】
本発明の酵素は、遺伝子組換え技術を用いて製造されたものであってもよい。具体的には、本発明の遺伝子を発現ベクターに組み込み、組換え発現ベクターを作製し、この組換え発現ベクターを、本発明の酵素を発現させる生物体（宿主）に導入し、当該組換え発現ベクターを含む形質転換体を製造する。
【００４６】
組換え発現ベクターを導入する宿主としては、特に限定されるものではなく、微生物、植物細胞、植物組織、植物体、昆虫由来や哺乳類由来の培養細胞等のいずれであってもよい。微生物としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）、乳酸菌(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉｕｓ属)、又はカビ等が挙げられる。また、植物組織としては、植物体から採取された組織自体であってもよく、脱分化処理等を施して得られたカルスであってもよい。その他、培養細胞としては、哺乳類から確立された培養細胞株であってもよく、ＳＦ９細胞等の昆虫由来培養細胞であってもよい。
【００４７】
本発明の遺伝子を組み込む発現ベクターは、本発明の遺伝子がコードする本発明の酵素を、当該ベクターが導入された宿主生物中で発現可能なように組み込むことができる発現ベクターであれば、特に限定されるものではなく、宿主の生物種に導入可能な公知の発現ベクターの中から、適宜選択して用いることができる。例えば、大腸菌等の微生物へ導入する発現ベクターとしては、ｐＥＴ系ベクターやｐＱＥ系ベクター等を用いることができる。酵母へ導入する発現ベクターとしては、ｐＹＥ系ベクターやｐＹＣＰ系ベクター等を用いることができる。乳酸菌へ導入するベクターとしては、その乳酸菌の宿主に応じた市販のベクター等を用いることができる。また、植物細胞や植物組織、植物体に導入する発現ベクターとしては、アグロバクテリウム法において汎用されているバイナリーベクターを用いてもよい。また、培養細胞へ導入する発現ベクターとしては、真核細胞発現用ベクターとして市販されている発現ベクターを用いることができる。なお、アデノウィルス発現系やレトロウィルス発現系、バキュロウィルス発現系等の発現系に用いられる市販されている発現ベクター等を用いてもよい。なお、これらの発現ベクターへ本発明の遺伝子を組み込んだ組換え発現ベクターは、常法により作製することができる。
【００４８】
作製された組換え発現ベクターは、宿主の生物種に応じて、公知の種々の方法を用いて宿主へ導入することができる。例えば、大腸菌等の微生物が宿主の場合には、エレクトロポレーション法、ヒートショック法、リン酸カルシウム法等を用いて組換え発現ベクターを導入し、形質転換体を得ることができる。酵母が宿主の場合には、リチウム法やエレクトロポレーション法等を用いることができる。宿主が乳酸菌の場合には、エレクトロポレーション法や接合法等を用いることができる。植物細胞等の場合には、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法等を用いることができる。また、培養細胞の場合には、リポフェクション法等や、各種ウィルス感染を利用して形質転換体を得ることができる。
【００４９】
このようにして得られた形質転換体をそれぞれの生物体の最適な条件で培養することにより、当該形質転換体内に本発明の酵素を生成することができる。本発明の酵素を製造するための生物体の培養方法としては、液体培養、固体培養又は育種であっても良く、その生物体に適した培養条件、培養方法であればよい。例えば、形質転換体に導入された発現ベクターがイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導されるタイプのものであれば、培養時に培地中にＩＰＴＧを添加することにより、目的酵素タンパク質を生成させることができる。
【００５０】
本発明の酵素は、形質転換体の培養物から抽出し、精製することにより、得ることができる。生物体からの精製方法は、特に限定されるものではなく、本発明の遺伝子を含む担子菌類の子実体又は菌糸体からと同様にして、抽出・精製することができる。
【００５１】
例えば、形質転換体を作製するにあたり、宿主として、本発明の酵素を菌体外に放出するタイプの微生物を用いた場合には、得られた形質転換体を培養した後、培養液から菌体を遠心分離等により除去することにより目的の粗酵素を得ることができる。一方、宿主として、本発明の酵素を菌体内に産生するタイプの微生物を用いた場合には、菌体を超音波や溶菌酵素等で処理し菌体を破砕することにより目的粗酵素を得ることができる。得られた粗酵素はそのままでもメチル化反応に用いることができるが、分子量分画等必要に応じてさらに精製することも可能である。
【００５２】
その他、本発明の酵素を、ヒスチジンタグや、Ｍｙｃタグ等の、発現させたタンパク質の精製に一般的に用いられるタグを付けて宿主中で発現させた場合には、これらのタグを用いて、本発明の酵素を簡便に精製することができる。
【００５３】
また、精製された酵素は、本発明の遺伝子を含む担子菌類の子実体又は菌糸体から精製された酵素と同様に、化合物のメチル化体の製造に用いることができる。
具体的には、宿主として大腸菌を用いて、ヒスチジンタグを付けて発現させた場合には、形質転換体の培養物からヒスチジンタグを用いて精製された本発明の酵素を、ｐＨ５〜１２、好ましくはｐＨ６〜９の緩衝液に懸濁し、さらに基質となる化合物と、ＳＡＭ等のメチル基の供与体とを加えて、０〜８０℃、好ましくは０〜６０℃で反応させることにより、酵素反応液中にメチル化体を得ることができる。
【００５４】
本発明の遺伝子を含有する組換え発現ベクターが導入される宿主として、本発明の酵素の基質である水酸基を有する化合物が比較的豊富に含まれている生物を用いた場合には、得られた形質転換体を培養後、当該形質転換体から直接、メチル化体を抽出し、精製することができる。例えば、宿主として、茶等のポリフェノール含有量の多い植物を用いた場合には、得られた形質転換植物からポリフェノールを抽出し、精製した場合には、得られたポリフェノール組成物には、非形質転換植物から回収されたポリフェノール組成物よりも、メチル化ポリフェノールが多く含まれている。
【００５５】
なお、形質転換体からのメチル化体の抽出・精製方法は、一般的に、宿主となる生物種から非メチル化体を抽出・精製する場合に用いられる方法によっても行うことができる。例えば、茶に本発明の遺伝子を含有する組換え発現ベクターを導入して得られた形質転換植物から、一般的に茶からポリフェノールを抽出する方法を用いて、メチル化ポリフェノールが多く含まれているメチル化ポリフェノール含有組成物を製造することができる。
【００５６】
本発明の酵素を用いて製造されたメチル化体は、様々な飲食品、医薬品、医薬用部外品及び化粧品に用いることができる。当該メチル化体が原料として添加される飲食品としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ギョーザの皮、シュウマイの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、キャンディー、ガム、チョコレート、錠果、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ちくわ、ハム、ソーセージ等の水酸・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂加工食品；ソース、タレ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物；その他種々の形態の健康食品、栄養補助食品、特定保健用食品等を挙げることができる。
【００５７】
当該メチル化体が原料として添加される医薬品及び医薬部外品の剤型としては、錠剤、液剤、カプセル剤、ドリンク剤、トローチ等が挙げられる。
また、化粧品としては、洗顔クリーム、化粧水、パック、美容液等の基礎化粧品類；ファンデーション、口紅、アイカラー等のメイクアップ化粧品類；ネイルエナメル、石鹸、入浴剤、サンスクリーン剤、デオドラントスプレー等のボディ化粧品類；シャンプー、リンス、ヘアートリートメント、ヘアームース等の頭髪用化粧品類；育毛剤、養毛剤、ヘアトニック等の頭髪用化粧品類；香水、オーデコロン等の芳香用化粧品類を挙げることが出来る。
【００５８】
これらを製造するにあたり、当該メチル化体は、通常用いられている補助的な原料や添加物と共に添加することができる。このような原料及び添加物としては、例えば、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＣ、ビタミンＢ群、ビタミンＥ、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、界面活性剤、色素、香料、保存料等が挙げられる。
【実施例】
【００５９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６０】
［実施例１］
エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子の単離・同定を行った。
＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞
食用として市販されている日本産のシイタケ、シメジ、マイタケ、エノキタケ、ブナシメジ、ヒラタケ、ナラタケ、タモギタケ、エリンギ、アワビタケをスクリーニングに用いた。
まず、これらの子実体の柄の部分をカットし、０．５％次亜塩素酸に浸した後、滅菌水で洗浄した。柄の内部から５ｍｍ程度を切り出し、Ｄｉｆｃｏ Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇｅｒ培地上で、２５℃にて培養し、菌糸体を単離した。得られた菌糸体を、菌糸体培養用液体培地（０．０２％  ｇｌｕｃｏｓｅ、０．０１％  ｐｅｐｔｏｎｅ、０．００２％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．００２％  ＫＨ２ＰＯ４、０．００１％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）に接種し、２８℃で旋回培養した。
得られた菌糸体培養液をろ過して菌糸体を回収し、粗酵素溶解液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加えて超音波破砕した後、遠心分離して上清を回収した。この上清を粗酵素液として酵素活性測定に用いた。
酵素活性測定は、基質としてＥＧＣＧを用い、そのメチル化体の生成量を指標とした。酵素反応液の組成は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ  ＥＧＣＧ、０．５ｍＭ  ＳＡＭ、及び５０％  粗酵素液とし、全量３ｍｌを３７℃、１６時間反応させた。
反応後、酵素反応液３ｍｌに、１Ｎ  ＨＣｌ  ７０μl及び酢酸エチル５ｍｌを加えて攪拌し、遠心分離して有機層を回収した。有機層を窒素で乾固した後、１％アスコルビン酸含有３０％メタノール水溶液に溶解し、ＨＰＬＣを用いて測定した。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
カラム：Ｗａｋｏｐａｋ Ｎａｖｉ Ｃ１８−５（４．６×１５０ｍｍ）及びＣ１８−５（４．６×１０ｍｍ）（和光純薬社製）
移動相Ａ：蒸留水、アセトニトリル、リン酸を４００：１０：１(ｖ／ｖ)で混合した溶液
移動相Ｂ：移動相Ａとメタノールを２：１(ｖ／ｖ)で混合した溶液
グラジエント条件：２０％Ｂ液(２分間)→８０％Ｂ液(２５分間)→８０％Ｂ液(１０分間)、直線濃度勾配
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２８０ｎｍ【００６１】
その結果、エノキタケ培養菌糸体から抽出した粗酵素を用いた場合に、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３，４−Ｏ−ジメチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３,５−Ｏ−ジメチル）ガレート、エピ（４−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレートの生成が確認された。なお、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３，４−Ｏ−ジメチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレート、エピ（４−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレートに関しては、それらのピークを分取し、ＴＯＦ−ＭＳ、ＮＭＲを用いて構造を確認した。また、粗酵素液を煮沸した後に酵素反応液に添加した場合や、酵素反応液にＥＧＣＧやＳＡＭを添加しなかった場合には、これらのメチル化体の生成は認められなかった。
以上の結果から、エノキタケ培養菌糸体から抽出した粗酵素がメチルトランスフェラーゼ酵素活性を有することが確認された。【００６２】
＜各種エノキタケ酵素活性の確認＞
エノキタケの採取地の違い等によるメチルトランスフェラーゼ酵素活性の有無を確認した。エノキタケの菌糸は、農業生物資源ジーンバンクより購入したものを使用し、Ｄｉｆｃｏ Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇｅｒ培地上で２５℃にて培養した。菌糸体の液体培養及び酵素活性測定は、上記＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様にして行った。試験には、ＭＡＦＦ番号４３０２０４、４３０２０５、４３０２０６、４３０２０７、４３０２０９、４３５２１０、４３０２１２、４３０２１４、４３０２２４、４３５０８５、４３０２１１、４３０２１３、４３５１２１、４４０１１０、４４０１１１、及び４４０１１８を用いた。その結果、それぞれの菌糸によって酵素活性の強弱はあるものの、全ての菌糸において、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を確認した。【００６３】
＜エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼの同定＞
上記と同様にしてエノキタケ菌糸体を液体培養し、得られた菌糸体培養液をろ過して菌糸体を回収し、凍結乾燥した。凍結乾燥物約１２ｇを乳鉢で破砕した後、粗酵素溶解液６００ｍｌに懸濁した。この懸濁物を超音波破砕した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ、４℃）し、回収した上清を再度遠心分離（３０，０００ｒｐｍ×３０ｍｉｎ、４℃）して上清を回収した。この上清に、６０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、攪拌、遠心分離して上清を回収した。さらに、この回収した上清に、８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、攪拌、遠心分離して沈殿物を得た。得られた沈殿物を、粗酵素溶解液４０ｍｌに溶解した後、ＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて脱塩した。脱塩したサンプルは、トリス緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＤＴＴ）で平衡化した陰イオン交換カラム（ＨｉＰｒｅｐ １６／１０ ＤＥＡＥ ＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させ、上記トリス緩衝液で調整した０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液の直線濃度勾配を用いて溶出し、メチルトランスフェラーゼ酵素活性が確認されたフラクションを、活性画分として分取した。なお、メチルトランスフェラーゼ酵素活性の確認は、＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様にして行った。
得られた活性画分を、限外ろ過カラムで脱塩、濃縮した後、上記トリス緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラム（ＨｉＬｏａｄ ２６／１０ Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させ、上記トリス緩衝液で調整した０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液の直線濃度勾配を用いて溶出し、活性画分を分取した。得られた活性画分を、限外ろ過カラムにて脱塩、濃縮し、再度同じ陰イオン交換カラムに吸着させ、分取画分を前条件より詳細にして活性画分を分取し、同様に限外ろ過カラムにて脱塩、濃縮を行った。【００６４】
得られた濃縮画分を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むトリス緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で平衡化したゲルろ過カラム（ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて分画した。分取した各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、得られたタンパク質染色像と、各画分のメチルトランスフェラーゼ酵素活性とを比較したところ、酵素活性と相関したバンドが、約２４〜２５ｋＤａの位置に確認された。酵素活性が確認された画分を、さらに、上記トリス緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ ＢＩＯＡＳＳＩＳＴ Ｑ、東ソー社製）に吸着させ、上記トリス緩衝液で調整した０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ溶液の直線濃度勾配を用いて溶出し、活性画分を分取した。活性画分を、再度ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた結果、約２４〜２５ｋＤａの位置に再度特異的なバンドを確認した。この酵素タンパク質の内部配列を明らかにするために上記陰イオン交換カラム（ＨｉＬｏａｄ ２６／１０ Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で精製したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、バンドをゲルから回収した。
回収したバンドは、常法に従ってゲル内トリプシン消化処理を行い、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いてタンパク質の内部配列を解析した。さらに、同じ活性画分を二次元電気泳動で電気泳動し（一次元目：ｐＨ３〜１０の等電点分離、二次元目：４〜２０％グラジエントのポリアクリルアミドゲル）、分子量約２４〜２５ｋＤａ、ｐＨ５付近のスポットをゲルから回収した。図３は、二次元電気泳動像である。図中、丸で囲んだスポットを、目的の酵素タンパク質として回収した。
この回収したスポットに対して常法に従ってゲル内トリプシン消化処理を行い、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて、スポットに存在しているタンパク質の内部配列の確認を行った。その結果、内部配列ＲＶＬＥＶＧＴＬＧＧＹＳＴＴＷＬＡＲＡ（配列番号３）及びＴＧＧＩＩＩＶＤＮＶＶＲ（配列番号４）を得た。このアミノ酸配列をもとに、ＮＣＢＩのデータベースによるホモロジー検索を行った結果、既知のＯ−メチルトランスフェラーゼの内部配列と高い相同性を有していた。【００６５】
＜エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子の単離・同定＞
上記内部配列の配列情報に基づいてディジェネレートプライマーを設計し、エノキタケから回収したｔｏｔａｌ−ＲＮＡから、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子を単離・同定した。
具体的には、まず、エノキタケ培養菌糸体約１ｇを、乳鉢を用いて液体窒素下で破砕したものから、ＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ（シグマ社製）を用いてｔｏｔａｌ−ＲＮＡを回収した。得られたｔｏｔａｌ−ＲＮＡ約４μｇから、サーモスクリプトＲＴ−ＰＣＲシステム（インビトロジェン社製）を用いて、５５℃、５０分間反応させることによりｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型とし、上記内部配列の配列情報に基づいて設計されたディジェネレートプライマー（ＦＶＯＭＴ−Ｆ及びＦＶＯＭＴ−Ｒ）を用いてＰＣＲを行い、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子の単離を行った。設計されたディジェネレートプライマーの塩基配列及びＰＣＲ条件を下記に記す。なお、塩基配列中、Ｓはグアニン又はシトシンを、Ｍはアデニン又はシトシンを、Ｙはチミン又はシトシンを、Ｄはアデニン、グアニン、又はチミンを、Ｋはグアニン又はチミンを、Ｖはアデニン、グアニン、又はシトシンを、Ｒはグアニン又はアデニンを、それぞれ示す。ＦＶＯＭＴ−Ｆ：ＧＡＧＧＴＳＧＧＭＡＣＹＹＴＤＧＧＭＧＧＳＴＡＦＶＯＭＴ−Ｒ：ＧＣＫＳＡＣＶＡＣＲＴＴＲＴＣＭＡＣ ＰＣＲ条件：９４℃，５ｍｉｎ→（９４℃，１ｍｉｎ→５５℃，１ｍｉｎ→７２℃，１ｍｉｎ）×４０ｃｙｃｌｅｓ→７２℃，７ｍｉｎ【００６６】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけた結果、約４００ｂｐの増幅バンドが確認された。アガロースゲルから当該バンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＰＣＲ産物を回収し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター(プロメガ社製)へクローニングした後、大腸菌ＪＭ−１０９株（タカラ社製）へ形質転換した。得られた形質転換体を、ＬＢ培地にて３７℃で終夜振とう培養し、得られた培養物からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出した。抽出されたプラスミドのインサートの塩基配列を、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）及びＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００−ＡＶＡＮＴ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）により確認した。【００６７】
確認された遺伝子の部分塩基配列をもとに、特異的プライマー（ＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ１、ＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ２、ＦＶＯＭＴ−３’ＧＳＰ１、ＦＶＯＭＴ−３’ＧＳＰ２）を設計し、５’側と３’側の全長を取得するためにＲＡＣＥ−ＰＣＲ法を行った。設計した特異的プライマーの塩基配列を下記に示す。ＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ１：ＡＧＣＣＴＣＴＴＡＧＣＣＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＡＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ２：ＴＣＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＧＧＴＧＡＴＦＶＯＭＴ−３’ＧＳＰ１：ＡＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＧＡＦＶＯＭＴ−３’ＧＳＰ２：ＴＡＣＴＴＴＧＴＴＧＡＧＧＣＴＡＡＧＡＧＧＣＴ【００６８】
５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲは、まず、単離したｔｏｔａｌ−ＲＮＡ２．５μｇから、ＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ１プライマーを用い、サーモスクリプトＲＴ−ＰＣＲシステム（インビトロジェン社製）を用いて、５５℃、５０分間反応させてｃＤＮＡを合成した。次いで、得られたｃＤＮＡから、５’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（インビトロジェン社製）を用い、ＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ１プライマー及びＦＶＯＭＴ−５’ＧＳＰ２プライマーを用いて５’側の単離を行い、塩基配列を確認した。
同様に、３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲは、サーモスクリプトＲＴ−ＰＣＲシステム（インビトロジェン社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、３’ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（インビトロジェン社製）を用いて、得られたｃＤＮＡからＦＶＯＭＴ−３’ＧＳＰ１プライマー及びＦＶＯＭＴ−３’ＧＳＰ２プライマーを用いて３’側の単離を行い、塩基配列を確認した。
確認された５’末端及び３’末端の塩基配列に基づき、下記に示すＦＶＯＭＴ−５’ＮｄｅＩプライマー及びＦＶＯＭＴ−３’ＢａｍＨＩプライマーを設計し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、増幅バンドを回収した。回収したＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔベクターへクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換後、インサートの塩基配列を確認した。その結果、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の全遺伝子を単離するにいたった。同定されたエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列であり、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしている。ＦＶＯＭＴ−５’ＮｄｅＩ：ＴＡＣＡＴＡＴＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＴＡＣＴＦＶＯＭＴ−３’ＢａｍＨＩ：ＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＴＴＴＧＡＴＡＧＣＧＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣ【００６９】
［実施例２］＜組換えエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の製造＞
実施例１で単離されたエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子を組み込んだ組換え発現ベクターを作製し、この組換え発現ベクターを大腸菌に導入して、大腸菌内で発現させたエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素を回収した。
具体的には、まず、実施例１で作製したエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子含有ｐＧＥＭ−Ｔベクターから、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断し、アガロース電気泳動により、インサートを回収した。このインサートを、ｐＥＴ２８ａ(＋)ベクター（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩサイトへクローニングすることにより、組換え発現ベクターを作製した。この組換え発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)株（ストラタジーン社製）へ導入することにより、当該組換え発現ベクターを含む形質転換体を得た。
得られた形質転換体をＬＢ培地にて３７℃で終夜振とう培養した後、その一部を再度新しいＬＢ培地へ添加して培養した。Ｏ．Ｄ．６００＝０．６付近となるように培養した後、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように添加し、さらに２８℃で振とう培養して、ヒスチジンタグ付酵素タンパク質の発現誘導を行った。発現誘導した大腸菌を遠心分離し、沈殿物を上記トリス緩衝液に懸濁した。この大腸菌懸濁液を超音波破砕し、再度遠心分離した。得られた上清（ライセート）を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動した結果、ＩＰＴＧ誘導前の大腸菌を同様に処理して電気泳動した場合と比較して、約２９ｋＤａ付近に、ＩＰＴＧ処理により発現が誘導されたタンパク質のバンドを確認した。
図４は、ＩＰＴＧ処理前の大腸菌のライセート（レーン１）、ＩＰＴＧ処理後の大腸菌のライセート（レーン２）、ＩＰＴＧ処理後の大腸菌のライセートからヒスチジンタグを用いて得られた精製物（レーン３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像である。図中、「Ｍ」は分子量マーカーを流したレーンである。図中の矢印の位置のバンド（約２９ｋＤａ）を画像解析し、タンパク質量を数値化して比較した。画像解析には、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（アドビシステムズ社製）及びＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）ソフトウェアを使用した。その結果、この約２９ｋＤａのタンパク質量は、ＩＰＴＧ処理前を０％とした場合、ＩＰＴＧ処理後で８．４％、処理後の精製物で２５．１％であり、当該タンパク質が、ＩＰＴＧ処理により発現が誘導されたヒスチジンタグを有するタンパク質であることが確認された。
ｐＥＴ２８ａ(＋)ベクターのＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩサイトへクローニングした場合、約５ｋＤａのベクター由来発現タンパク質（ヒスチジンタグを含む）が付加される。また、配列番号２のアミノ酸配列から算出された本酵素タンパク質の理論分子量は、２４．７ｋＤａである。つまり、図４の矢印で示した約２９ｋＤａのタンパク質は、組換え発現ベクターにより導入したアミノ酸配列から得られる推定分子量と一致し、ヒスチジンタグ付きエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素であることが分かった。【００７０】
［実施例３］＜組換えエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性＞
実施例２で得られたＩＰＴＧ処理後の大腸菌のライセートを、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の組換え酵素の粗酵素液とし、この粗酵素液のメチルトランスフェラーゼ酵素活性を調べた。
具体的には、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ  ＥＧＣＧ、０．５ｍＭ  ＳＡＭ、及び５０％  粗酵素液となるように、酵素反応液３ｍｌを調製し、この酵素反応液を３７℃、１６時間インキュベートし、反応させた。反応後の酵素反応液を、実施例１の＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様に処理して分析した結果、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３，４−Ｏ−ジメチル）ガレート、エピガロカテキン−３−Ｏ−（３,５−Ｏ−ジメチル）ガレート、エピ（４−Ｏ−メチル）ガロカテキン−３−Ｏ−（３，５−Ｏ−ジメチル）ガレートの生成が確認できた。
これらの結果から、実施例２において大腸菌内で発現させた組換え酵素が、メチルトランスフェラーゼ酵素活性を有していることが確認された。【００７１】
［実施例４］＜菌糸体抽出粗酵素液を用いたメチル化体の製造＞
実施例１と同様にして、エノキタケ菌糸体培養液の菌糸体から抽出し、得られた抽出物の６０％〜８０％硫酸アンモニウム画分を脱塩処理したものを、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の天然型酵素の粗酵素液とした。
具体的には、まず、エノキタケ菌糸体培養液をろ過して菌糸体を回収し、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を乳鉢にて破砕した後、上記粗酵素溶解液に懸濁して、超音波破砕し、遠心分離して上清を回収した。この上清に、６０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、攪拌、遠心分離して上清を回収した。さらに、この回収した上清に、８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、攪拌、遠心分離して沈殿物を得た。得られた沈殿物を、粗酵素溶解液に溶解した後、ＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて脱塩した。この脱塩サンプルを、エノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の天然型酵素の粗酵素液とした。
得られた粗酵素液の各種基質に対するメチルトランスフェラーゼ活性を確認した。酵素反応液の組成は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭ  基質、０．５ｍＭ  ＳＡＭ、０．０４％  アスコルビン酸、及び粗酵素液（全量３ｍｌに対して０．２５ｍｌ）とし、全量３ｍｌを３７℃、６時間反応させた。基質には、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）、カテキンガレート（ＣＧ）、ガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＧＣＧ）、カフェ酸、クロロゲン酸、エラグ酸、ブテイン、スルフレチン、ルテオリン、ミリセチン、又はロスマリン酸を、それぞれ用いた。
反応後の酵素反応液を、実施例１＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様に処理して、当該酵素反応液中のメチル化体を、下記の条件でＬＣ−ＭＳを用いて分析した。標品と比較分析が可能なものについては同定も行った。ＨＰＬＣ条件及びＭＳ条件を以下に示す。
・ＨＰＬＣ条件
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３、２．１×１５０ｍｍ（ＧＬサイエンス社製）
移動相Ａ：０．１(ｖ／ｖ)％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１(ｖ／ｖ)％ギ酸を含むアセトニトリル
グラジエント条件（ｉ）：８％Ｂ液（２０分間)→２５％Ｂ液（８８分間)
グラジエント条件（ｉｉ）：８％Ｂ液（１０分間)→５０％Ｂ液（３１分間)
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
・ＭＳ条件
検出器：ＡＰＩ３０００（アプライドバイオシステムズ社製）
イオン源：ＥＳＩ（ネガティブ）
カーテンガス：１０
ネブライザーガス：１４
ターボガス：６ｌ／ｍｉｎ
イオンスプレー電圧：−４０００Ｖ
イオンスプレー温度：５００度
コーン電圧：−４１Ｖ【００７２】
ＬＣ−ＭＳ分析の結果を表１に示す。この結果、用いた全ての基質に対して、メチル化体の生成が確認された。これらの結果から、本発明の酵素は、水酸基を有する各種化合物を基質とし、メチル基を修飾することが可能であることが明らかとなった。
また、ＥＣＧのように、化合物中に複数の水酸基を有する化合物の中には、複数種類のメチル化体の生成が確認され、かつ、ジメチル化体も確認された。この結果から、本発明の酵素は、基質の化合物中の複数の水酸基のそれぞれを独立にメチル化可能であることも確認された。【００７３】
【表１】
2010100831.tif 000002
【００７４】
［実施例５］＜反応時間の検討＞
実施例４で用いたエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素の天然型酵素の粗酵素液（以下、天然型酵素）と、実施例２で用いたエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素のヒスチジンタグ精製した組換え酵素液（以下、組換え酵素）とを用いて、酵素反応の反応時間を検討した。
酵素反応液の組成は、２０ｍＭ  リン酸緩衝液(ｐＨ７．０)、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭ  ＥＧＣＧ、０．５ｍＭ  ＳＡＭ、０．０４％  アスコルビン酸、及び各粗酵素液（全量３０ｍｌに対して２．５ｍｌ）とし、全量３０ｍｌを３７℃で反応させた。反応開始から５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、２時間、 ４時間、６時間、８時間、２４時間後に、酵素反応液を１ｍｌずつ分取した。これらの酵素反応液を、実施例１＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様に処理して、当該酵素反応液中のメチル化体を、下記のＨＰＬＣ条件で分析した。
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３、２．１×１５０ｍｍ（ＧＬサイエンス社製）
移動相Ａ：０．１(ｖ／ｖ)％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１(ｖ／ｖ)％ギ酸を含むアセトニトリル
グラジエント条件：１０％Ｂ液（１０分間)→１６％Ｂ液（５０分間)
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
各反応時間後に分取した酵素反応液中のＥＧＣＧメチル化体濃度を図５Ａ及び図５Ｂに示す。図５Ａが天然型酵素の結果であり、図５Ｂが組換え酵素の結果である。この結果、天然型酵素では反応開始８時間後で、組換え酵素では２０分後で、ＥＧＣＧメチル化体の生成が最も高い値を示した。【００７５】
［実施例６］＜最適ｐＨの検討＞
実施例５において用いた天然型酵素及び組換え酵素の酵素反応における最適ｐＨを調べた。
酵素反応液の組成は、２０ｍＭの各種緩衝液に、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭ  ＥＧＣＧ、０．５ｍＭ  ＳＡＭ、０．０４％  アスコルビン酸、及び各粗酵素液（全量３ｍｌに対して０．２５ｍｌ）となるように添加して調製した。用いた緩衝液は、酢酸緩衝液（ｐＨ３．０〜５．５)、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜７．０）、及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５〜１０)である。調製した酵素反応溶液の全量３ｍｌを、３７℃で反応させた。反応時間は、天然型酵素で６時間、組換え酵素で１０分間とした。これらの酵素反応液を、実施例１＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様に処理して、当該酵素反応液中のメチル化体を分析した。
各ｐＨの酵素反応液中のＥＧＣＧメチル化体濃度を図６に示す。この結果、天然型酵素ではｐＨ６．５〜８．５で、組換え酵素ではｐＨ６以上で、ＥＧＣＧメチル化体の生成が確認された。【００７６】
［実施例７］＜最適温度の検討＞
実施例５で用いた天然型酵素及び組換え酵素の酵素反応における最適温度を調べた。
酵素反応液の組成は、２０ｍＭ  リン酸緩衝液(ｐＨ７．０)、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭ  ＥＧＣＧ、０．５ｍＭ  ＳＡＭ、０．０４％  アスコルビン酸、及び各粗酵素液（全量３ｍｌに対して０．２５ｍｌ）とし、全量３ｍｌを、４、１０、２０、３０、３７、４２、５０、又は６０℃で、それぞれ反応させた。反応時間は、天然型酵素で６時間、組換え酵素で１０分間とした。これらの酵素反応液を、実施例１＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様に処理して、当該酵素反応液中のメチル化体を分析した。
各温度における酵素反応液中のＥＧＣＧメチル化体濃度を図７に示す。この結果、天然型酵素では１０〜５０℃において、組換え酵素では行った全ての温度において、ＥＧＣＧメチル化体の合成が確認された。中でも、３０〜４２℃で、両酵素のいずれにおいても良好な酵素活性が確認された。【００７７】
［実施例８］＜天然型酵素（菌糸体抽出粗酵素液）を用いたメチル化体含有緑茶の製造＞
実施例５で用いた天然型酵素を用いて、緑茶抽出物に対するメチルトランスフェラーゼ活性を確認した。
酵素反応液の組成は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％  緑茶抽出物、０．５ｍＭ  ＳＡＭ、０．０４％  アスコルビン酸、及び各粗酵素液（全量３ｍｌに対して０．２５ｍｌ）とし、全量３ｍｌを、３７℃で６時間反応させた。なお、緑茶抽出物は、緑茶エキス粉末（上海宇維生物科技発展有限公司）を５０％ジメチルスルホキシド水溶液に溶解したものを用いた。これらの酵素反応液を、実施例１＜メチルトランスフェラーゼ酵素活性のスクリーニング＞と同様に処理して、当該酵素反応液から抽出された酢酸エチル抽出物に含まれる緑茶カテキン類の組成を分析した。ブランクとして、粗酵素液に代えて水を添加した反応液を同様に処理し、緑茶カテキン類の組成を分析した。
図８は、天然型酵素処理したものとブランクの、緑茶カテキン類の組成を示した図である。なお、ＥＧＣはエピガロカテキンの略である。この結果、ブランクにはほとんど含まれていないＥＧＣＧ３”Ｍｅ及びＥＣＧ３”Ｍｅの組成比が増大しており、本発明の酵素により、緑茶抽出物中のメチル化カテキン含量を増やすことが可能であることが明らかとなった。
［実施例９］
＜組換えエノキタケ由来メチルトランスフェラーゼ酵素を用いたメチル化体の製造＞
実施例２において製造した組換え酵素を用いて、各種基質に対するメチルトランスフェラーゼ活性を確認した。
酵素反応液の組成は、２０ｍＭ  リン酸緩衝液(ｐＨ６．５)、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭ  基質、０．５ｍＭ  ＳＡＭ、０．０４％  アスコルビン酸、及び酵素液（全量３ｍｌに対して０．１ｍｌ）とし、全量３ｍｌを３７℃で、３０分間反応させた。基質には、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）、カテキンガレート（ＣＧ）、ガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＧＣＧ）、エピカテキン（ＥＣ）、カテキン（Ｃ）、エピガロカテキン(ＥＧＣ)、ガロカテキン(ＧＣ)、クロマニン、デルフィニジン、デルフィニジン３−Ｏ−グルコシド、プロシアニジンＢ２（ＰＢ２）、カフェ酸、クロロゲン酸、ロスマリン酸、カフェ酸フェネチルエステル、没食子酸、エラグ酸、ストリクチニン、ケルセチン、イソクエルシトリン、ルチン、ミリセチン、ブテイン、スルフレチン、ルテオリン、エリオジクチオールを用いた。
反応後、酵素反応液３ｍｌに、１Ｎ  ＨＣｌ  ７０μl及び酢酸エチル５ｍｌを加えて攪拌し、遠心分離して酵素を含む中間層を除き、有機層、又は水層を回収した。有機層は窒素で乾固した後、１％アスコルビン酸含有５０％ＤＭＳＯ水溶液に、水層は凍結乾燥した後、１％アスコルビン酸水溶液に溶解し、下記の条件でＬＣ−ＭＳを用いて分析した。ＨＰＬＣ条件及びＭＳ条件を以下に示す。
・ＨＰＬＣ条件
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３、２．１×１５０ｍｍ（ＧＬサイエンス社製）
移動相Ａ：０．１(ｖ／ｖ)％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１(ｖ／ｖ)％ギ酸を含むアセトニトリル
グラジエント条件（ｉ）：
８％Ｂ液（１０分間)→５０％Ｂ液（２１分間)→５０％Ｂ液（３０分間）
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
・ＭＳ条件
検出器：ＱＳＴＡＲ  ＥＬＩＴＥ（アプライドバイオシステムズ社製）
イオン源：ＥＳＩ  ネガティブ（※アントシアニンのみポジティブで測定）
カーテンガス：３０
イオンソースガス１：５０
イオンソースガス２：５０
イオンスプレー電圧：−４５００Ｖ（＋５５００Ｖ）
イオンスプレー温度：４５０℃
デクラスタリングポテンシャル：−３０Ｖ（＋３０Ｖ）
フォーカスポテンシャル：−２５０（２５０Ｖ）
デクラスタリングポテンシャル：−１５Ｖ（＋１５Ｖ）【００７８】
ＬＣ−ＭＳ分析の結果を表２に示す。用いた全ての基質に対して、メチル化体の生成が確認された。これらの結果から、本発明の組換え酵素は水酸基を有する各種化合物を基質とし、メチル基を修飾することが可能であることが明らかとなった。
また、ＥＣＧのように複数の水酸基を有する化合物では、トリメチル化体を含む複数種類のメチル化体の生成が確認された。これらの結果から、本発明の酵素は、化合物中の複数の水酸基をそれぞれ独立にメチル化可能であることも確認された。【００７９】
【表２】
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【００８０】
実施例１〜９において使用した試薬の購入先は、以下の通りである。
Ｄｉｆｃｏ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇｅｒ：日本ベクトン・ディッキンソン
ｐｅｐｔｏｎｅ: 日本ベクトン・ディッキンソン
Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ：日本ベクトン・ディッキンソン
ＥＧＣＧ：テアビゴ、ＤＳＭニュートリションジャパン【００８１】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ：サーモフィッシャーサイエンティフィック【００８２】
エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣＧ）：フナコシ
カテキンガレート（ＣＧ）：フナコシ
ガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＧＣＧ）：フナコシ
カフェ酸：シグマ
クロロゲン酸：フナコシ
エラグ酸：フナコシ
ブテイン：フナコシ
スルフレチン：フナコシ
ルテオリン：フナコシ
ミリセチン：フナコシ
ロスマリン酸：フナコシ【００８３】
エピカテキン（ＥＣ）：フナコシ
カテキン（Ｃ）：フナコシ
エピガロカテキン(ＥＧＣ) ：フナコシ
ガロカテキン(ＧＣ) ：フナコシ
クロマニン：フナコシ
デルフィニジン：フナコシ
デルフィニジン３−Ｏ−グルコシド：フナコシ
プロシアニジンＢ２（ＰＢ２）：フナコシ
カフェ酸フェネチルエステル：フナコシ
没食子酸：フナコシ
ストリクチニン：フナコシ
ケルセチン：フナコシ
イソクエルシトリン：フナコシ
ルチン：フナコシ
エリオジクチオール：フナコシ
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の遺伝子がコードするポリペプチドは、各種ポリフェノールを初めとする水酸基構造を有する化合物を基質とし、飲食品に応用でき、かつ工業生産に有利な新規メチルトランスフェラーゼ酵素である。メチル化された各種化合物、特にメチル化ポリフェノールは、その非メチル化体と比較して生体内への良好な吸収性、安定性を発揮することができ、かつ、非メチル化体が持つ様々な機能性を格段に向上させることができる。このため、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドは、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等の様々な商品の製造分野において利用が可能である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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