(57)【要約】この発明は、多能性幹細胞から、無血清培地中で骨細胞、軟骨細胞又は筋肉細胞を分化誘導する方法に関し、具体的には、哺乳動物由来の多能性幹細胞をＢＭＰ４含有無血清培地で培養してＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞を誘導し、骨細胞又は軟骨細胞へ分化する方法、並びに、多能性幹細胞をＢＭＰ４含有無血清培地で培養したのち、ＢＭＰ４非存在、ＬｉＣｌ存在下の無血清培地で培養しＰＤＧＦＲα陽性骨格筋前駆細胞へ分化誘導することを含む骨格筋細胞の形成方法に関する。
2010008100.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物由来の多能性幹細胞をＢＭＰ４含有無血清培地で培養してＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞を誘導し、該中胚葉前駆細胞を回収することを含む、ＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞の作製方法。
【請求項２】
多能性幹細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
培地中のＢＭＰ４濃度が、１〜１０ｎｇ／ｍｌ又はそれ以上である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
多能性幹細胞の細胞数が、１×１０５〜２×１０５である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
培養期間が４日〜７日の間である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞が、ＰＤＧＦＲα陰性ＥＣＤ陽性細胞と比べてＭｓｇｎ、Ｔｂｘ６及びＤｌｌ１遺伝子をより多く発現する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞が、ＶＥＧＦＲ２、ＥＣＤ、Ｔ及びＣａｄ１１遺伝子をさらに発現する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞が、骨芽細胞、骨細胞又は軟骨細胞へ分化する能力を有する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物がヒトである、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載の方法によって作製され得る、かつ、ＰＤＧＦＲα陰性ＥＣＤ陽性細胞と比べてＭｓｇｎ、Ｔｂｘ６及びＤｌｌ１遺伝子をより多く発現することを特徴とするＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞。
【請求項１１】
ＶＥＧＦＲ２、ＥＣＤ、Ｔ及びＣａｄ１１遺伝子をさらに発現する、請求項１０記載のＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞。
【請求項１２】
請求項１０又は１１記載のＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞から骨芽細胞、骨細胞又は軟骨細胞へ分化誘導することを含む、骨細胞又は軟骨細胞の形成方法。
【請求項１３】
請求項１０又は１１記載のＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞を含む、骨又は軟骨組織形成用組成物。
【請求項１４】
骨髄又は骨損傷部位への移植用である、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
哺乳動物由来の多能性幹細胞をＢＭＰ４含有無血清培地で培養したのち、該培地からＢＭＰ４を除去し、さらに、ＬｉＣｌを含有する無血清培地で培養し、これによって骨格筋前駆細胞へ分化誘導することを含む、骨格筋細胞の形成方法。
【請求項１６】
多能性幹細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ＬｉＣｌ含有無血清培地で培養後、生じた細胞群からＰＤＧＦＲα陽性骨格筋前駆細胞を選抜することをさらに含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ＰＤＧＦＲα陽性骨格筋前駆細胞を、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ及びＦＧＦを含む無血清培地で培養したのち、培地からＨＧＦとＦＧＦを取り除きＩＧＦ−１単独で培養し、その後、ＩＧＦ−１及びＨＧＦの存在下で培養し、これによって骨格筋細胞を誘導することをさらに含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ＰＤＧＦＲα陽性骨格筋前駆細胞が、Ｍｙｆ５陽性及びＭｙｏＤ陽性の細胞である、請求項１７又は１８記載の方法。
【請求項２０】
骨格筋細胞が、ミオゲニン陽性及びＭＲＦ４陽性である、請求項１５〜１９のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物由来の多能性幹細胞からＢＭＰ４含有無血清培地にてＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞を誘導し、この前駆細胞からさらに骨格筋細胞、或いは、骨細胞又は軟骨細胞へ分化させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹（ＥＳ）細胞、間葉系幹細胞などの多能性幹細胞の発見により、これらの多能性幹細胞を再生医療に利用するための研究が活発化している。特に、ヒトＥＳ細胞（Ｓｕｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，（２００６）；３４５，９２６−９３２）の樹立が可能になったために、この幹細胞からいくつかの細胞、例えば心筋細胞（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．（２００８），２２；４５３（７１９４）：５２４−５２８）、血管内皮細胞（Ｍｅｔａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．（２００８）；２６（２）：３７２−３８０）、神経細胞（Ｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．（２００６）；１０３（２５）：９５５４−９５５９）、膵島細胞（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．（２００７）；２５（８）：１９４０−１９５３）などに分化誘導することが報告されているが、実用化するには多くの問題が解決されねばならない。
その１つとして、これらの研究では、細胞の分化誘導に際して培地に牛胎仔血清が使用されることが多い。この場合、狂牛病などの感染、再現性などの問題が生じると予測される。さらに血清のロットの差による誘導効率の違いも大きく、再現性のある分化誘導が出来ない。また、別の問題として、ＥＳ細胞を含む多能性幹細胞の腫瘍（奇形腫）形成の問題も存在する。
このような状況において、多能性幹細胞から目的の細胞へ分化させるときに、血清を使用しない培養系が望ましいと考えられるし、また、腫瘍形成を起こさない安全性の高い分化細胞の構築が望ましいはずである。
本発明者らは、無血清培地を使用して多能性幹細胞から骨細胞、軟骨細胞の前駆細胞、及び骨格筋前駆細胞と骨格筋細胞を分化誘導する方法について検討してきた。
従来、骨髄中に存在する間葉系幹細胞が骨芽細胞へ分化する際にＢＭＰ（骨形成因子）などの因子の関与は指摘されてきたが（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００６）；９８（３）：５３８−５４）、このような内因性の間葉系幹細胞は骨髄などに非常に微量にしか存在しないため単離が難しいため、実用的な面で問題がある。また、ＥＳ細胞などの多能性幹細胞から、骨細胞、軟骨細胞、及び骨格筋細胞を分化誘導することに関しては、十分な知見がないようである。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、哺乳動物由来の多能性幹細胞から無血清条件下で骨細胞及び軟骨細胞の前駆細胞へ分化させる方法を提供することを目的とする。
本発明はまた、哺乳動物由来の多能性幹細胞から無血清条件下で骨格筋前駆細胞及び骨格筋細胞へ分化させる方法を提供することを目的とする。
本発明は、要約すると、以下の特徴を包含する。
本発明は、第１の態様において、哺乳動物由来の多能性幹細胞をＢＭＰ４含有無血清培地で培養してＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞を誘導し、該中胚葉前駆細胞を回収することを含む、ＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞の作製方法を提供する。
その実施形態において、本発明で使用され得る多能性幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。
別の実施形態において、培地中のＢＭＰ４濃度が、１〜１０ｎｇ／ｍｌ又はそれ以上である。
別の実施形態において、多能性幹細胞の細胞数が、１×１０５〜２×１０５である。
別の実施形態において、培養期間が４日〜７日の間である。
別の実施形態において、ＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞は、ＰＤＧＦＲα陰性ＥＣＤ陽性細胞と比べてＭｓｇｎ、Ｔｂｘ６及びＤｌｌ１遺伝子をより多く発現する。
別の実施形態において、ＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞は、ＶＥＧＦＲ２、ＥＣＤ、Ｔ及びＣａｄ１１遺伝子をさらに発現する。
別の実施形態において、ＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞は、骨芽細胞、骨細胞又は軟骨細胞へ分化する能力を有する。
別の実施形態において、哺乳動物はヒトである。
本発明は更に、第２の態様において、上記定義の方法によって作製され得る、かつ、ＰＤＧＦＲα陰性ＥＣＤ陽性細胞と比べてＭｓｇｎ、Ｔｂｘ６及びＤｌｌ１遺伝子をより多く発現することを特徴とするＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞を提供する。
その実施形態において、ＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞は、ＶＥＧＦＲ２、ＥＣＤ、Ｔ及びＣａｄ１１遺伝子をさらに発現する。
本発明は更に、第３の態様において、上記定義のＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞から骨芽細胞、骨細胞又は軟骨細胞へ分化誘導することを含む、骨細胞又は軟骨細胞の形成方法を提供する。
本発明は更に、第４の態様において、上記定義のＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞を含む、骨又は軟骨組織形成用組成物を提供する。
その実施形態において、上記組成物は、骨髄又は骨損傷部位への移植用である。
本発明は更に、第５の態様において、哺乳動物由来の多能性幹細胞をＢＭＰ４含有無血清培地で培養したのち、該培地からＢＭＰ４を除去し、さらに、ＬｉＣｌを含有する無血清培地で培養し、これによって骨格筋前駆細胞へ分化誘導することを含む、骨格筋細胞の形成方法を提供する。
その実施形態において、多能性幹細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞である。
別の実施形態において、上記定義の方法が、ＬｉＣｌ含有無血清培地で培養後、生じた細胞群からＰＤＧＦＲα陽性骨格筋前駆細胞を選抜することをさらに含む。
別の実施形態において、上記定義の方法が、ＰＤＧＦＲα陽性骨格筋前駆細胞を、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ及びＦＧＦを含む無血清培地で培養したのち、培地からＨＧＦとＦＧＦを取り除きＩＧＦ−１単独で培養し、その後、ＩＧＦ−１及びＨＧＦの存在下で培養し、これによって骨格筋細胞を誘導することをさらに含む。
別の実施形態において、上記ＰＤＧＦＲα陽性骨格筋前駆細胞が、Ｍｙｆ５陽性及びＭｙｏＤ陽性の細胞である。
別の実施形態において、上記骨格筋細胞が、ミオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）陽性及びＭＲＦ４陽性である。
＜定義＞
本明細書で使用する用語は、以下の意味を包含する。
本明細書で使用する「多能性幹細胞」という用語は、種々の細胞に分化する能力と自己複製能力を有する未分化な細胞を指し、多分化能性幹細胞とも呼ばれる。このような幹細胞には、例えば胚性幹細胞（「ＥＳ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）」）、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ）」）、精子幹細胞（「ＧＳ細胞（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）」、人工多能性幹細胞（「ｉＰＳ細胞」）、核移植クローン胚由来胚性幹細胞（「ｎｔＥＳ細胞」）などが含まれる。
本明細書で使用する「ＢＭＰ４」という用語は、骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）４を指し、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属し、他の骨形成タンパク質と同様に、骨や軟骨の発達、特に歯や四肢の発達、骨折の修復に関与しているといわれている。
本明細書で使用する「ＰＤＧＦＲα」という用語は、血小板由来増殖因子受容体（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）αを指し、種々の間葉系細胞に発現している分子量約１８万の膜糖タンパク質でチロシンキナーゼ活性をもつＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）の１つである。
本明細書で使用する「中胚葉前駆細胞」という用語は、原腸胚を構成する３つの胚葉（外胚葉、中胚葉及び内胚葉）のうちの１つである中胚葉の中の沿軸中胚葉に由来の、骨細胞又は軟骨細胞又は骨格筋細胞に分化可能な前駆細胞を指す。
本明細書で使用する「陽性」又は「陰性」という用語は、細胞表面に発現する特定の遺伝子マーカーの存在又は不存在について使用される。遺伝子マーカーが存在するとき「陽性」、一方、遺伝子マーカーが存在しないとき「陰性」であるという。
本明細書で使用する「無血清培地」という用語は、血清を含まない動物細胞用の培養培地を意味する。血清の代わりに、成長因子などのホルモン類、結合タンパク質、細胞接着因子などを含み、これによって細胞の生存や増殖を良好にする培地である。
本明細書で使用する「哺乳動物」という用語は、ヒト、サル、チンパンジーなどの霊長類、イヌ、ネコなどのペット類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの家畜類、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどの他の動物などを非限定的に包含する。好ましい哺乳動物はヒトである。また、「患者」という用語は、ヒトを含む上記哺乳動物を指す。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００８−１８６３４８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、マウスＥＳ細胞からＰＤＧＦＲ−α陽性中胚葉前駆細胞を分化誘導するための条件の検討及び結果を示す。図１ａは、ＰＤＧＦＲ−α陽性中胚葉前駆細胞の生成割合に及ぼす、培地に添加するＢＭＰ４の濃度の影響を表す図である。図１ｂは、ＰＤＧＦＲ−α陽性中胚葉前駆細胞の生成割合に及ぼす、ＥＳ細胞の細胞数の濃度の影響を表す図である。図１ｃは、ＥＳ細胞の細胞数と増殖率との関係を示す図であり、白のバーは、培養初期の細胞数を表し、黒のバーは、培養終了時の細胞数を表す。図１ｄは、ＰＤＧＦＲ−α陽性中胚葉前駆細胞の生成割合に及ぼす、培養日数の影響を表す図（上）、及び細胞の形状を示す図（下）である。図１ｅは、中胚葉発生に関わる遺伝子発現の経日的変化を表す。１０％ｓｅｒｕｍは牛胎仔血清を表す。Ｔ，Ｍｓｇｎ，Ｔｂｘ６，Ｐａｘ３，Ｏｃｔ−３／４は、遺伝子マーカーであり、β−アクチン（Ａｃｔｉｎ）はコントロールである。図１ｆは、ＦＡＣＳによって分離したＰＤＧＦＲ−α陽性細胞分画（フラクション１，２，３，４）（上）及び遺伝子発現解析の結果（下）を示す図である。
図２は、ＢＭＰ４により誘導された中胚葉前駆細胞の骨、軟骨細胞への分化能を示す。（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの沿軸中胚葉前駆細胞（ｐａｒａｘｉａｌ  ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ；ＰＭＰｃ）と未分化、内胚葉系細胞（ＥＣＡＤ＋、ＰＤＧＦＲａ−）の骨形成能の比較である。骨誘導培地で誘導後２８日後にカルシウムを染色するＡｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄにて染色した。（ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの沿軸中胚葉前駆細胞（ＰＭＰｃ）と未分化、内胚葉系細胞（ＥＣＡＤ＋、ＰＤＧＦＲａ−）の軟骨形成能の比較である。軟骨誘導培地で誘導後２１日後にムコ多糖を染色するＡｌｃｉａｎ  Ｂｌｅｕにて染色した。どちらも中胚葉前駆細胞で高い形成能を示す。スケールバーは１００ｍｍを示す。（ｃ）ＣＣＥ／ｎＬａｃＺ  ＥＳ由来の中胚葉前駆細胞を免疫不全マウスの骨髄に移植し２８日後にＬａｃＺ染色を行い解析した。矢頭で示す青色の細胞がＥＳ細胞由来の細胞である。骨梁の辺縁に多く位置するのが分かる。また下段ではＬａｃＺ染色に加え、骨芽細胞を染めるＡＰ染色も行った。ＥＳ細胞由来の細胞が骨芽細胞にも分化しているのが分かる。（矢印）左パネルのスケールバーは１００ｍｍ、右パネルのスケールバーは１０ｍｍを示す。（ｄ）ＣＣＥ／ｎＬａｃＺ  ＥＳ由来の中胚葉前駆細胞を免疫不全マウスの挫滅させた骨格筋に移植し２８日後にＬａｃＺ染色を行い解析した。右パネルで緑に光る細胞がＥＳ細胞由来の細胞である。軟骨と骨に分化しているのが分かる。スケールバーは１００ｍｍを示す。
図３は、（ａ）骨格筋形成に関わる遺伝子の発現を表した図である。ＢＭＰ４を初期に加え、後期にＬｉＣｌを加えることで、Ｍｙｆ５，ＭｙｏＤといった骨格筋遺伝子が発現することが分かる。β−アクチン（Ａｃｔｉｎ）はコントロールである。（ｂ）骨格筋遺伝子発現により、最適な培養期間を解析した。この結果からＢＭＰ４を３日間、ＬｉＣｌを４日間加えたものが最適であると考える。（ｃ）骨格筋前駆細胞誘導によって得られたフラクション（上図、１，２，３）及びその遺伝子発現解析を示す（下図）。（ｄ）無血清誘導による骨格筋誘導のプロトコールを表した図である。（ｅ）ＩＧＦ−１，ＨＧＦ，ＦＧＦの組み合わせにより、ミオゲニン（Ｍｙｏｇｅｎｉｎ）、ＭＲＦ４といった骨格筋分化遺伝子の発現が増加することを示している。（ｆ）培養細胞中のミオゲニン（左図）および骨格筋アクチン（右図）陽性細胞の形態。スケールバーは５０ｍｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本発明について、以下でさらに詳細に説明する。
＜ＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞の作製＞
本発明は、哺乳動物由来の多能性幹細胞をＢＭＰ４含有無血清培地で培養してＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞を誘導し、該中胚葉前駆細胞を回収することを含む、ＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞の作製方法を提供する。
本発明の方法は、無血清培地を使用して、胚性幹（ＥＳ）細胞などの多能性幹細胞からいかにしてＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞を誘導することができるかという課題を解決する。これまで、Ｆｌｋ１陽性の血液系前駆細胞が、ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ及びＢＭＰ４を無血清培地に加えるか、或いは低い濃度のＢＭＰ４で誘導することによりＥＳ細胞から分化することが報告されている（Ｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２６（２）：４０１−４１１）が、沿軸中胚葉前駆細胞の無血清誘導系に関する知見はほとんどない。
本発明者らは、意外にもＢＭＰ４を含有する無血清培地において効率よくＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞を誘導できることを見出した。この誘導の効率には、以下に述べるように、ＢＭＰ４の濃度、出発細胞の培養密度などが大きく影響する。得られたＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞は、骨芽細胞、骨細胞及び軟骨細胞に分化する能力を有すること、並びに、該前駆細胞からさらに、骨格筋前駆細胞、さらに骨格筋細胞を形成することができることが今回判明した。
以下に、ＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞の作製について説明する。
多能性幹細胞
本発明方法では、多能性幹細胞が出発細胞として使用される。多能性幹細胞には、上記定義のとおり、胚性幹細胞（「ＥＳ細胞」）、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、精子幹細胞（「ＧＳ細胞」）、人工多能性幹細胞（「ｉＰＳ細胞」）、核移植クローン胚由来胚性幹細胞（「ｎｔＥＳ細胞」）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ヒト由来の多能性幹細胞、例えばヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞などである。
ＥＳ細胞は、極初期発生において主要な場を形成する肛盤胞の内部細胞塊に由来する幹細胞であり、生殖系列細胞を含むあらゆる成体を構成する細胞に分化する能力を内在している。もともとマウスＥＳ細胞が１９８１年に発見、樹立された（Ｍ．Ｊ．ＥｖａｎｓとＭ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６）が、その後、ヒト、サルなどの霊長類由来のＥＳ細胞株も樹立されたと言われている（Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９（９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：７８４４−７８４８；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５５：２５４−２５９；Ｊ．Ａ．ＴｈｏｍｓｏｎとＶ．Ｓ．Ｍａｒｓｈａｌｌ（１９９８），Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３８：１３３−１６５）。霊長類ＥＳ細胞は、マウスＥＳ細胞と同様に、アルカリフォスファターゼやＯＣＴ−３／４を発現する以外に、ヒト胚盤胞の内部細胞塊で発現するＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４などの抗原も発現することが示されている（Ｊ．Ｋ．Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌｓ，２０：３２９−３３７）。
ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、マウス胎仔線維芽細胞をフィーダーにして樹立し維持することができる。ヒトＥＳ細胞の樹立と維持の方法については、例えばＨ．Ｓｕｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３４５：９２６−９３２；Ｍ．Ｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：９５５４−９５５９などに記載されている。サルＥＳ細胞の樹立と維持の方法については、例えばＨ．Ｓｕｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２２２：２７３−２７９；Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１５８０−１５８５などに記載されている。
ヒトＥＳ細胞は、ヒト受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、マイトマイシンＣ処理マウス胎仔線維芽細胞（オリエンタル酵母（東京、日本）などから入手可能）のフィーダー層上で培養し樹立、維持することができる。培地として、例えば０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、２０％ＫＳＲ及び４ｎｇ／ｍｌ  β−ＦＧＦを補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を使用し、３７℃、２％ＣＯ２／９８％空気の湿潤雰囲気下でヒトＥＳ細胞を維持することができる（Ｏ．Ｆｕｍｉｔａｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：２１５−２２４）。また、ＥＳ細胞は、３〜４日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び２０％ＫＳＲを含有するＰＢＳ中の０．２５％トリプシン及び０．１ｍｇ／ｍｌ  コラゲナーゼＩＶを用いて行うことができる。
ＥＳ細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２などの遺伝子マーカーの発現を指標にしてＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法で行うことができる。特に、ヒトＥＳ細胞の選択では、ＯＣＴ−３／４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＥＣＡＤなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる（Ｅ．Ｋｒｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：４４３−４５２）。
Ｏｃｔ−３／４は、胚細胞と生殖細胞で特異的に発現する転写因子である（Ｈ．Ｎｉｗａ（２００１），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃ．２６：１３７−１４８；Ｍ．ＰｅｓｃｅとＨ．Ｒ．Ｓｃｈｏｌｅｒ（２００１），Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，１９：２７１−２７８）。Ｎａｎｏｇは、桑実胚の中央部で発現し始め、その後、胚盤胞の内部細胞塊で最大の発現を示し、分化細胞では発現が認められない。Ｓｏｘ２は、転写因子の１つであり、受精卵、内部細胞塊、生殖細胞で発現が認められている。胚性幹細胞の転写因子群については、山中伸弥，生化学，７８：２７−３３（２００６）（日本）などに記載されている。
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞である。この細胞は、ＥＳ細胞と同様に、Ｎａｎｏｇなどの遺伝子を発現し、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、マウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ（Ｋ．Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｃｅｌｌ，１１９：１００１−１０１２）。
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ＥＳ細胞と同様な多能性をもつ細胞である（Ｙ．Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｃｅｌｌ，７０：８４１−８４７；Ｊ．Ｌ．Ｒｅｓｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ，３５９：５５０−５５１）。
人工多能性幹細胞は、特定の再プログラミング因子（例えば、ＯＣＴ３／４，ＳＯＸ２，ＫＬＦ４，Ｃ−ＭＹＣの組合わせ；ＯＣＴ３／４，ＳＯＸ２，ＫＬＦ４の組合わせ；ＯＣＴ３／４，ＳＯＸ２，ＮＡＮＯＧ，ＬＩＮ２８の組合わせなど）を、ＤＮＡ又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ＥＳ細胞と同様の分化多能性と増殖能を有する人工幹細胞である（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）Ｃｅｌｌ，１２６：６６３−６７６；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２；Ｊ．Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７−１９２０；国際公開ＷＯ  ２００７／０６９６６６）。
ｎｔ  ＥＳ細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のＥＳ細胞であり、受精卵由来のＥＳ細胞とほぼ同じ特性を有している（Ｔ．Ｗａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：７４０−７４３；Ｊ．Ｂｙｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｎａｔｕｒｅ，４５０：４９７−５０２）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚の内部細胞塊から樹立されたＥＳ細胞がｎｔ  ＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＥＳ）細胞である。ｎｔ  ＥＳ細胞の作製のためには、核移植技術（Ｊ．Ｂ．Ｃｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：６４２−６４６）とＥＳ細胞作製技術（上記）の組み合わせが利用される。
ＢＭＰ４含有無血清培地
本発明の方法では、無血清培地を使用すること、培地にＢＭＰ４を添加することを特徴とする。
ＢＭＰ４（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４）は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質であり、他の骨形成タンパク質と同様に、骨や軟骨の発達、特に歯や四肢の発達、骨折の修復に関与しているといわれている。ＢＭＰ４はまた、筋肉の発達、骨の鉱物化にも関与しているといわれる。ヒト胚の発生の際に、ＢＭＰ４は胚の初期分化に必要な重要なシグナル伝達分子であり、また外胚葉組織の分化を刺激する。ＢＭＰ４のクローニングや特性については、例えばＪＭ  Ｗｏｚｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１５２８−１５３４；Ｓ．Ｏｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），ＤＮＡ  Ｓｅｑ．５（５）：２７３−２７５；ＢＬ  Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（１７）：７６３２−７６３６等に記載されている。
本発明で使用し得るＢＭＰ４は、哺乳動物由来のＢＭＰ４、その変異体、及びその化学修飾誘導体のいずれかである。本明細書で単に「ＢＭＰ４」と記載する場合は、特別の断りがない限り、哺乳動物由来のＢＭＰ４、その変異体、及びその化学修飾誘導体のいずれをも指すものとする。
哺乳動物由来のＢＭＰ４の塩基配列及びアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ（米国）のｗｅｂサイトにアクセスすることによって入手し得る。例えばヒト由来ＢＭＰ４の登録番号は、ＮＭ＿００１２０１、ＮＭ＿１３０８５０、ＮＭ＿１３０８５１などであり、マウス由来のＢＭＰ４の登録番号は、ＮＭ＿００７５５４などである。上記変異体は、多能性幹細胞からＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞を誘導する能力を有し、かつ、天然型ＢＭＰ４のアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、好ましくは９０％以上、９５％以上、９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。ここで、％同一性は、２つのアミノ酸配列のアラインメントにおいて、ギャップを導入するか或いはギャップを導入しないで各配列を整列させたときに、総アミノ酸数（ギャップ数も含む）に対する同−アミノ酸数の百分率（％）を意味する。％同一性は、例えばＢＬＡＳＴアルゴリズム（ＮＣＢＩ）を利用して決定することができるし、また同アルゴリズムを利用すると、遺伝子バンク（ＮＣＢＩなど）から同一性のあるホモログ配列を検索することができる。ＢＭＰ４の変異体（天然の突然変異体、遺伝子多型由来の変異体、選択的スプライス変異体、人工変異体などを含む）は、１若しくは複数の（好ましくは、１若しくは数個の）アミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含み、例えば置換として、電気的性質（酸性、塩基性）、極性／疎水性、構造的性質（分枝の有無、芳香族性）などの性質が類似したアミノ酸間の置換が含まれる。変異体は、天然型ＢＭＰ４と同様に、ＤＮＡクローニング、遺伝子組換え技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、部位特異的突然変異導入法、ＰＣＲ利用の部位特異的突然変異導入法などの公知の技術を利用して作製することができる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００２など）。ＢＭＰ４の化学修飾誘導体は、糖修飾体、水溶性ポリマー（例えばポリエチレングリコール）修飾体、リン酸又は硫酸修飾体、アルキル化修飾体、アシル化修飾体などを含むことができる。ＢＭＰ４タンパク質は、以下に限定されないが、例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から入手可能である。
本発明で好ましく使用可能な無血清培地は、タンパク質成分としてインスリン及びトランスフェリンのみからなる無血清基本培地に、最終濃度で０．２％牛アルブミン、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｎｇ／ｍｌ又はそれ以上のＢＭＰ４を添加して調製される培地である。無血清基本培地としては、例えばＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ））、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２などの動物細胞培養用培地を、必要に応じて改変し、単独で又は任意に組み合わせて使用することができる。培地には、上記タンパク質成分の他に亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミンなどを含有させることができる。好適な培地の具体例は、Ｓ−Ｃｌｏｎｅ  ＳＦ−０３培地（三光純薬、東京、日本）であり、ＲＰＭＩ１６４０（僅かに改変）、ＤＭＥＭ及びＦ−１２の混合培地からなる。この基本培地は、マウス造血幹細胞の培養用として開発されたものであり、本発明における分化の誘導に際して他のホルモン、成長因子などの余分なタンパク質による影響を回避することができるという利点を有する。しかし、必要であれば、成長因子などのホルモン類を適宜、培地に添加することができる。
培養
本発明の方法では、無血清培地中のＢＭＰ４濃度、ＥＳ細胞などの多能性幹細胞の細胞数、並びに培養期間が重要である。
培地中のＢＭＰ４濃度は、１ｎｇ／ｍｌ又はそれ以上、好ましくは１〜１０ｎｇ／ｍｌ又はそれ以上である。この至適範囲である１〜１０ｎｇ／ｍｌでは、ＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞への分化率が３４％〜５０％に向上する。
ＥＳ細胞などの多能性幹細胞の至適な細胞数は、１×１０５〜２×１０５である。ＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞への分化率は、細胞数１×１０５の場合５１％であり、細胞数２×１０５の場合３４％であり、細胞数４×１０５の場合５％と激減する。
培養期間は、４日〜７日又はそれ以上、好ましくは５日〜７日、より好ましくは５日である。
ＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞の特徴づけ
上記の培養によってＥＳ細胞などの多能性幹細胞から得られるＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞は、骨芽細胞、骨細胞又は軟骨細胞へ分化する能力を有している。この特性により、該前駆細胞は、骨又は軟骨の再生のために使用することができる。
ＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞をさらに、発現遺伝子マーカーについて特徴付けると、この前駆細胞は、ＰＤＧＦＲα陰性ＥＣＤ陽性細胞と比べてＭｓｇｎ１（ＮＭ  ００１１０５５６９．１）、Ｔｂｘ６（ＮＭ＿００５４４２など）及びＤｅｌｔａ  ｌｉｋｅ  １（ＤＬＬ１；ＮＭ  ００５６１８．３）遺伝子をより多く発現するという特徴を有している（図１ｆ）。また、上記３つのマーカーの他に、前駆細胞は、ＶＥＧＦＲ２（ＮＭ＿００２２５３など）、ＥＣＤ（ＮＭ＿０１４２３７など）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ；ＮＭ＿００９３０９）及びＣａｄ１１（ＮＭ＿００１７９７など）遺伝子をさらに発現している（図１ｆ）。一方、ＰＤＧＦＲα陰性ＥＣＤ陽性細胞は、Ｍｓｇｎ、Ｔｂｘ６及びＤｌｌ１遺伝子をほとんど又は全く発現しないし、かつ、骨細胞又は軟骨細胞への分化能を有していないことから、Ｍｓｇｎ、Ｔｂｘ６及びＤｌｌ１遺伝子の発現をマーカーとすることによって骨細胞又は軟骨細胞へ分化するかどうかを判定することができる。
ＰＤＧＦＲα陰性ＥＣＤ陰性細胞についても発現遺伝子マーカーを調べると、Ｍｓｇｎ、Ｔｂｘ６及びＤｌｌ１遺伝子が弱く発現していることから、沿軸中胚葉前駆細胞が含まれていると考えられる（図１ｆ）。この点では、骨細胞や軟骨細胞に分化する沿軸中胚葉前駆細胞について、ＰＤＧＦＲαは必ずしも陽性である必要はないかもしれない。
したがって、本発明は、上記定義の方法によって作製され得る、かつ、ＰＤＧＦＲα陰性ＥＣＤ陽性細胞と比べてＭｓｇｎ、Ｔｂｘ６及びＤｌｌ１遺伝子をより多く発現することを特徴とするＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞を提供する。
この前駆細胞は、ＶＥＧＦＲ２、ＥＣＤ、Ｔ及びＣａｄ１１遺伝子をさらに発現することを特徴としている。
＜骨細胞又は軟骨細胞の形成＞
本発明は、上記ＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞から骨芽細胞、骨細胞又は軟骨細胞へ分化誘導することを含む、骨細胞又は軟骨細胞の形成方法を提供する。
本発明のＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞を患者の骨髄又は骨損傷部位に移植すると、該前駆細胞は、骨細胞、特に骨芽細胞、又は軟骨細胞に分化し、非常に強い骨、軟骨組織形成能をもつ（図２ｃ及び図２ｄ）。しかしながら、この前駆細胞は、骨格筋細胞への分化能を有していなかった。
近年、幹細胞を用いた再生医療に対する要望が増大しており、この分野の研究も活発化している。胚性幹細胞や、骨髄又は臍帯血から単離された内在性多分化能性前駆細胞、から誘導される組織特異的幹細胞（造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、血管内皮幹細胞など）は、対応する種々の細胞に分化する能力を有している。例えば、間葉系幹細胞は、軟骨細胞、骨細胞（骨芽細胞）、筋肉細胞、心筋細胞、脂肪細胞、線維芽細胞などに分化するといわれている。骨髄中の間葉系幹細胞は、全骨髄細胞の０．００１〜０．０１％と非常少ないため、幹細胞の単離には過度の負担を要すると思われる。
これに対して、本発明の方法は、例えばＥＳ細胞などの多能性幹細胞から容易な操作で、骨細胞、軟骨細胞に分化する能力をもつＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞を得ることができるという利点を提供する。
＜骨格筋細胞の形成＞
上で説明したＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞は、骨細胞及び軟骨細胞への分化能を有しているが筋肉細胞への分化能をもたない。そこで、多能性幹細胞から筋肉細胞への分化を誘導する方法を研究した結果、該前駆細胞をＢＭＰ４非存在下、ＬｉＣｌ（塩化リチウム）を含有させた無血清培地で培養することによって骨格筋細胞へ分化誘導することが見出された。
したがって、本発明はさらに、哺乳動物由来の多能性幹細胞をＢＭＰ４含有無血清培地で培養したのち、該培地からＢＭＰ４を除去し、さらに、ＬｉＣｌを含有する無血清培地で培養し、これによって骨格筋細胞へ分化誘導することを含む、骨格筋細胞の形成方法を提供する。
培養は、初め、上記「ＢＭＰ４含有無血清培地」の項で記載したような培地中で培養し、その後、ＢＭＰ４を除去し、ＬｉＣｌを含有する無血清培地中で培養を継続する。具体的には、ＢＭＰ４存在下でのＥＳ細胞などの多能性幹細胞の培養後、３〜５日目でＢＭＰ４を除去し、かつ好適には約２．５ｍＭ〜約５ｍＭ  ＬｉＣｌを添加した以外には上記と同様の無血清培地にてさらに１〜４日間培養をさらに継続する。このとき、より好適には、ＢＭＰ４を３日目で取り除き、２．５ｍＭ  ＬｉＣｌを４日間添加する。これによって、全細胞の約７５％がＰＤＧＦＲα陽性骨格筋前駆細胞に分化誘導される（図３ｂ）。
この方法は、ＬｉＣｌ含有無血清培地で培養後、生じた細胞群からＰＤＧＦＲα陽性骨格筋前駆細胞を選抜することをさらに含むことができる。ＰＤＧＦＲα陽性骨格筋前駆細胞が、Ｍｙｆ５陽性及びＭｙｏＤ陽性の細胞であるので、これらの遺伝子マーカーの発現を指標にして上記前駆細胞の選抜を行うことができる。また、このとき、細胞移植後の患者での腫瘍形成を回避するために、未分化細胞を、例えばセルソーターを使用して分離除去することが重要である。
次に、上記のようにして得られたＰＤＧＦＲα陽性骨格筋前駆細胞から骨格筋細胞を誘導する。そのための好適実施形態によれば、ＰＤＧＦＲα陽性骨格筋前駆細胞を４ｘ１０４／ｃｍ２の細胞密度で、コラーゲンタイプＩコートディッシュ上でＩＧＦ−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−１）２〜１０ｎｇ／ｍｌ、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）５〜２０ｎｇ／ｍｌ及びＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）１〜５ｎｇ／ｍｌを含む無血清培地（インスリン及びトランスフェリンのみからなる無血清基本培地（例えばＳＦ−０３）に、最終濃度で０．２％牛アルブミン、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを加えたもの）で培養（例えば３日）したのち、培地からＨＧＦとＦＧＦを取り除きＩＧＦ−１単独で培養し（例えば４日）し、さらにＩＧＦ−１及びＨＧＦの存在下で培養（例えば７日）する。図３ｄには、この方法の手順が経時的に例示されている。
上記の方法によって、多能性幹細胞から、成熟した骨格筋細胞を誘導することができる。骨格筋細胞は、ミオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）陽性及びＭＲＦ４陽性であるので、これらの遺伝子マーカーの発現を指標にし、ＲＴ−ＰＣＲ法で確認することができる。
＜用途＞
本発明の方法で作製された上記のＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞は、患部において骨又は軟骨組織を修復、形成するために使用することができる。この方法は、例えば骨粗鬆症、骨折、関節リウマチを含む関節炎、先天性骨形成不全症、軟骨低形成症などの治療のために使用することができる。
同様に、本発明の方法で作製された上記の骨格筋細胞は、患部において筋肉組織を修復、形成するために使用することができる。この方法は、例えばＤｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィー、福山型筋ジストロフィー、廃用症候群などの治療のために使用することができる。
いずれの場合にも、患者の骨、軟骨、又は筋肉の損傷部位、欠損部位、炎症部位などに上記細胞を移植することによって組織の患部を修復するために使用できる。例えば、ＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞を、骨髄又は骨損傷部位もしくは軟骨損傷部位へ移植することができる。
ＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞又は骨格筋細胞は、培養物からトリプシンで細胞を回収し、生体適合性の液体に浮遊させ、患部又は骨髄に直接注入することができる。移植に要するこれら細胞の細胞数は、１×１０５〜１×１０７程度であるが、この範囲に限定されない。
あるいは、骨又は軟骨前駆細胞であるＰＤＧＦＲα陽性中胚葉前駆細胞は、三次元的組織構造を形成するための足場となるようなハイドロゲル（例えばアルギネート）、ハイドロキシアパタイトなどと組み合わせた組成物形態となして、それを患部に充填してもよい。
【実施例】
【０００６】
本発明を以下の実施例で、マウスＥＳ細胞を例示しながらさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの具体例によって限定されないものとする。
方法
細胞培養とＥＳ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化
ＣＣＥ  ＥＳ細胞とｔＬａｃＺ遺伝子を発現している（ＣＣＥ／ｎＬａｃＺ）ＥＳ細胞は西川伸一博士（神戸理研再生研、兵庫、日本）より分与される。筋肉、骨、軟骨のもととなる沿軸（軸傍）中胚葉（Ｐａｒａｘｉａｌ  ｍｅｓｏｄｅｒｍ）に分化させるため、ＥＳ細胞をタイプ４コラーゲン（新田ゼラチン社、大阪、日本）でコートした１０ｃｍシャーレで培養し、ＳＦ−０３培地（三光純薬（東京、日本）；ＳＦ−０３は、タンパク成分として、インスリン、トランスフェリンのみからなる無血清基本培地であり、京都大学医学部分子遺伝学西川伸一研究室（京都、日本）（現：理化学研究所発生科学研究センター幹細胞研究グループ（兵庫、日本））におけるマウス造血前駆細胞を対象とした研究成果に基づいて開発されたもの）に最終濃度０．２％牛アルブミン、０．１ｍＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４（遺伝子組み換えＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社）を加えて培養した。４〜７日後骨、軟骨前駆細胞がＰＤＧＦＲ−α陽性細胞として現れ、これをセルソーターで分離してさらに培養した。筋肉前駆細胞への分化は３日間上記ＢＭＰ４を含む培地で培養後、培地を変えて、２．５ｍＭ  ＬｉＣｌを含むＳＦ−０３培地でさらに４日間培養した。さらに筋肉細胞に分化させるため、細胞をセルソーターで分離し、タイプ１コラーゲンでコートした２４穴プレートで２ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）と１０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）と２ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を加えたＳＦ−０３培地で培養した。そして３日後さらに培地を２ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１を含むＳＦ−０３培地に変換し、５日後２ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１と１０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦを含むＳＦ−０３培地で７日間培養した。骨形成および軟骨形成培養については、Ｓａｋｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．（２００６）；２４（３）：５７５−８６を参照して行うことができる。
抗体、細胞染色、ＦＡＣＳ解析
ＡＰＡ５（ａｎｔｉ−ＰＤＧＦＲ−α）とＥＣＣＤ２（ａｎｔｉ−ＥＣＤ）は西川伸一研究室（上記）より分与、ビオチン化ＡＰＡ５はフィコエリトリン−ストレプトアビジン（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。モノクローナルＥＣＣＤ２抗体はアロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ））と結合させた。培養細胞は０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡで分離させ、染色後ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで解析し、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ−ＨＧ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で細胞分離を行った。免疫染色は２０００倍希釈ウサギ抗β−ガラクトシダーゼ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）、２００倍希釈ウサギ抗ミオゲニン（Ｍｙｏｇｅｎｉｎ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、１００倍希釈ウサギ抗骨格筋アクチン（ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  Ａｃｔｉｎ）（Ａｂｃａｍ）で１次抗体染色後、β−ガラクトシダーゼはＡｌｅｘａ４８８結合抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、ＭｙｏｇｅｎｉｎとＡｃｔｉｎはＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）でそれぞれ二次抗体染色した。
分化ＥＳ細胞のマウスへの移植
本発明者らはマウスの実験を名古屋大学（愛知、日本）実験動物指針に従って行った。ＰＤＧＦＲ−α＋ＥＣＤ−（図１ｆ，１）とＰＤＧＦＲ−α−ＥＣＤ＋（図１ｅ，３及び４）の分画を５ｘ１０５細胞以上の細胞数でセルソーターを用いて分離し、最終濃度２．５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／μｌにαＭＥＭ（１０％Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）＋１００μＭ  ２−ＭＥ）で浮遊させ、ＫＳＮヌードマウス（Ｎｉｈｏｎ  ＳＬＣ）の骨格筋（大腿四頭筋）を挫滅させ、筋肉内に注射した。また骨芽細胞への分化を行うため、膝関節から脛骨の骨髄に２１Ｇ注射針で移入した。
ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲは常法に従って行った。使用したプライマーは表１に示す。ＲＴ−ＰＣＲの条件は、変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）９４℃３０秒、アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）６２℃３０秒、伸長（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）７２℃１分を１サイクルとし、３０から３５サイクルのＰＣＲを行った。
【表１】
2010008100.tif 000003
2010008100.tif 000004
結果
ＢＭＰ４がＰＤＧＦＲ−α陽性中胚葉前駆細胞をＥＳ細胞から効率的に誘導する
ＢＭＰ４によるＥＳ細胞の中胚葉分化をＰＤＧＦＲ−αの発現を指標にして調べた。その結果、６日間培養で、ＢＭＰ４なしでは３％であったが１ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４で３４％分化し、その後緩やかに増加した。このあとは１ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４に固定して実験を行った（図１ａ）。細胞密度がＰＤＧＦＲ−α陽性細胞分化に与える影響を調べた。１ｘ１０５細胞を１０ｃｍシャーレで培養した場合ＰＤＧＦＲ−α陽性細胞が５１％に増加した。２ｘ１０５細胞では３４％、それ以上ではＰＤＧＦＲ−α陽性細胞の割合が減少した（図１ｂ）。そして、どの割合が最も細胞数が増加するか調べたところ２ｘ１０５細胞で最も効率よく５日間培養で１５倍に増加した（図１ｃ）。それで２ｘ１０５細胞を培養して、何日後に最も多くのＰＤＧＦＲ−α陽性細胞が現れるかを調べたところ、培養４日にＰＤＧＦＲ−α陽性細胞が現れ、５日に４５％とピークに達した（図１ｄ，上）。形態もＥＳ細胞の丸い形からｃｏｂｂｌｅ  ｓｔｏｎｅ様に変化した（図１ｄ，下）。
中胚葉発生に関わる遺伝子発現を経時的に解析すると、胎児の発生と同じような順序で遺伝子発現が移り変わっていくことが確認された（図１ｅ）。最も初期の中胚葉マーカーであるＴが分化３日目から発現しており、その後は分化が進むほど発現が減少する。代わって沿軸中胚葉から原節（Ｓｏｍｉｔｅ）形成に関わる分子であるＭｓｇｎ、Ｔｂｘ６の発現が分化４日目から強く認められ、分化６日目には減少する。さらに原節（Ｓｏｍｉｔｅ）から皮筋板（Ｄｅｒｍｏｍｙｏｔｏｍｅ）が形成されるための重要な分子Ｐａｘ３が分化５日目から強く現れ、分化７日目には減少する。また未分化マーカーであるＯｃｔ３／４は分化が進むにつれて徐々に発現が減少してゆく。これらの変化から考えると、このＢＭＰ４を添加した培養システムは実際の胎児発生を忠実に再現したモデルであると考えられる。さらにこの効率よく誘導されたＰＤＧＦＲ−α陽性細胞が、確かに沿軸中胚葉の前駆細胞であるのかを確認するため、各フラクションをＦＡＣＳにて分離し遺伝子発現を解析した（図１ｆ）。ＰＤＧＦＲ−α陽性分画であるフラクション１は予想通りＴｂｘ６，Ｍｓｇｎ，Ｄｌｌ１などの沿軸中胚葉マーカーを強く発現していた。また間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）のマーカーであるＣａｄ１１（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）もこのフラクション１に強く発現している。一方未分化マーカーであるＯｃｔ３／４とＮａｎｏｇはＰＤＧＦＲ−α陰性ＥＣＤ陽性及び強陽性の分画（フラクション３及び４）に強く発現しており、また内胚葉マーカーであるＦｏｘａ２もこの分画で強く発現していた。このことからＥＣＤという未分化及び内胚葉マーカーで分離されたＰＤＧＦＲ−α陰性ＥＣＤ陽性及び強陽性の分画は、やはり未分化な細胞と内胚葉の前駆細胞を多く含む細胞群であり、沿軸中胚葉マーカーであるＰＤＧＦＲ−αによって分離されたＰＤＧＦＲ−α陽性分画は沿軸中胚葉の前駆細胞であることがわかった。さらにＰＤＧＦＲ−α陰性ＥＣＤ陰性であるフラクション２はＴｂｘ６，Ｍｓｇｎ，Ｄｌｌ１などの沿軸中胚葉マーカーを弱く発現しており、この分画にも沿軸中胚葉の前駆細胞が存在すると考えられる。このフラクション２をフラクション１と合わせて沿軸中胚葉の前駆細胞と考えると、ＢＭＰ４添加の誘導において分化６日目では沿軸中胚葉前駆細胞は実に８０％もの高い効率で誘導されると考えられる（図１ｆ）。次に示す骨、軟骨細胞への分化能を評価する実験では、このフラクション１とフラクション２を合わせた細胞群を沿軸中胚葉前駆細胞（ｐａｒａｘｉａｌ  ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ（ＰＭＰｃ））として扱っている。
ＢＭＰ４で誘導した沿軸中胚葉前駆細胞は軟骨と骨に分化する
次に、本発明者らは、ＢＭＰ４により誘導された沿軸中胚葉前駆細胞が、沿軸中胚葉由来組織である骨、軟骨へと分化する能力を有するかどうかをｉｎ  ｖｉｔｒｏ，ｉｎ  ｖｉｖｏ両方で解析した。分化６日目の沿軸中胚葉前駆細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏの骨細胞誘導において、Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ陽性の十分なカルシウムマトリックスを均一に形成する骨細胞へと分化した（図２ａ）。一方で未分化な細胞を多く含むＰＤＧＦＲ−α陰性ＥＣＤ陽性細胞は一部のコロニーでのみＡｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ陽性のカルシウム沈着を認めた。これは未分化な細胞の一部が骨細胞誘導に反応してカルシウム陽性になったと考えられる。しかしながら沿軸中胚葉前駆細胞はウェル全体に均一にカルシウムマトリックスを形成しており、沿軸中胚葉前駆細胞の多くが骨誘導に反応する比較的均一な細胞群であると考えられる。
次に、軟骨細胞誘導においては、沿軸中胚葉前駆細胞は微小集積培養（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ）によって形成された高細胞密度のコロニーの中心に、Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ陽性の軟骨細胞の形成を認めた（図２ｂ）。一方、ＰＤＧＦＲ−α陰性ＥＣＤ陽性細胞は同じ高細胞密度のコロニーを形成するもののＡｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅは陰性であり、軟骨細胞の形成は認められなかった（ｎ＝４）。以上の結果から、ＢＭＰ４により誘導された沿軸中胚葉前駆細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて骨細胞及び軟骨細胞への高い分化能を有することが明らかとなった。
次に、ＢＭＰ４により誘導された沿軸中胚葉前駆細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの骨細胞への分化能を解析するため、免疫不全マウスの骨髄に直接分化６日目の細胞を移植した。移植後４週に脛骨の組織を観察するとＬａｃＺ陽性のＥＳ細胞由来の細胞が骨梁を中心に認められた（図２ｃ，上）。一部は骨基質の中にも存在したが、特に骨梁の辺縁の部分に多く認められた（図２ｃ，矢頭）。この局在は骨芽細胞の存在する位置と非常に近いと考えられ、また沿軸中胚葉前駆細胞は骨芽細胞のマーカーでもあるｃａｄｈｅｒｉｎ  １１を特異的に発現しているため（図１ｆ）、ＡＰ染色を行い骨芽細胞へ分化しているかどうかを解析した（図２ｃ，下）。予想通り骨梁の辺縁にＡＰ陽性の領域が多く認められたが、この中の一部にはＬａｃＺ陽性の核を持つものも存在した（図２ｃ，矢印）。以上により、ＢＭＰ４により誘導された沿軸中胚葉前駆細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて骨細胞特に骨芽細胞への分化能を有することが明らかとなった。
さらに、この沿軸中胚葉前駆細胞は、骨や軟骨形成を促進しない環境でも細胞自律的（ｃｅｌｌ  ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ）に骨や軟骨へと分化する能力を有している（図２ｄ）。挫滅させた免疫不全マウスの大腿四頭筋に分化６日目の沿軸中胚葉前駆細胞を直接移植し、４週間後に組織を解析した。その結果、再生中の骨格筋組織の中に異所性軟骨および骨組織の形成を認めた（図２ｄ，左）（ｎ＝３）。この異所性軟骨及び骨組織は皮膜で覆われており、他の組織成分は含まれておらず、奇形腫ではなかった。またこれらの異所性軟骨はＬａｃＺ陽性であり、移植された細胞由来であることが確認された（図２ｄ，右）。これらの結果により、ＢＭＰ４により誘導された沿軸中胚葉前駆細胞は非常に強い骨、軟骨組織形成能を持つと考えられた。
しかしながら挫滅した骨格筋に移植したにもかかわらず、ＢＭＰ４により誘導された沿軸中胚葉前駆細胞は骨格筋細胞へ分化していなかった（データ示さず，ｎ＝８）。ＢＭＰはマウスの骨格筋発生において、Ｍｙｆ５やＭｙｏＤといった筋原性調節遺伝子（ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｇｅｎｅ）の発現を抑制することが知られている（Ｒｅｓｈｅｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．（１９９８）；１２（３）：２９０−３０３）。また筋原性調節遺伝子の発現促進にはＷｎｔシグナルが深く関わっていることも知られている（Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．（２００３）；４（７）：４９７−５０７）。そこで次に、骨格筋細胞誘導のためＢＭＰ４を取り除き、Ｗｎｔシグナルを代用して、β−ｃａｔｅｎｉｎを核内へ移行させる作用を持つＬｉＣｌを培地に加える実験を行った。
ＬｉＣｌは筋肉細胞をＥＳから誘導する
マウスＥＳ細胞を骨格筋細胞へと分化させるため、これまでのＢＭＰ４添加での誘導と比べ、ＢＭＰ４を３日目で取り除いたもの及びＢＭＰ４を３日目で取り除くと同時にＬｉＣｌを１〜１０ｍＭの範囲で添加した条件での分化を試みた。合計７日間培養した後ＲＴ−ＰＣＲにて遺伝子発現を解析した（図３ａ）。ＢＭＰ４単独で誘導した細胞は分化７日目で皮筋板（Ｄｅｒｍｏｍｙｏｔｏｍｅ）のマーカーであるＰａｘ３の発現は認めるものの、筋原性調節因子（Ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）であるＭｙｆ５，ＭｙｏＤの発現は認められなかった。しかしながら分化３日目でＢＭＰ４を除いた培養系では非常にわずかではあるがＭｙｆ５の発現が認められた。さらにＬｉＣｌを添加した培養系では全てでＭｙｆ５の発現を認め、２．５ｍＭ及び５ｍＭの濃度ではＭｙｏＤの発現も強く確認された。これらの結果から、ＢＭＰ４を分化の初期に取り除くことにより、筋原性因子（ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）の発現が誘導され、さらにＬｉＣｌ添加によるＷｎｔシグナルにより筋原性因子の発現が亢進することが明らかとなった。以降の実験ではＬｉＣｌの濃度は２．５ｍＭを至適濃度として実験している。一方ＢＭＰ４を用いずに最初からＬｉＣＬのみで誘導した場合には、Ｍｙｆ５，ＭｙｏＤのみならずＰａｘ３の発現もほとんど認められなかった。血液細胞分化の研究においてもＢＭＰ４が初期のｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｓｔｒｅａｋ  ｔｙｐｅの中胚葉誘導を促進するという報告もあり（Ｐｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（２００７）；２５（９）：２２０６−１４）、これらの結果はＥＳ細胞分化系において初期のＢＭＰ４刺激が中胚葉形成には必要であることを示唆している。
次にＢＭＰ４を除きＬｉＣｌを添加する最も適切な期間を解析した（図３ｂ，上）。この結果ＭｙｏＤの発現が最も強く見られたのはＢＭＰ４を３日目で取り除きＬｉＣｌを４日間添加したものと、ＢＭＰ４を４日目で取り除きＬｉＣｌを３日間添加した培養条件であった。ＢＭＰ４の刺激期間が長いほどＭｙｆ５の発現が減少し、ＬｉＣｌ誘導の期間が長いほどＭｙｏＤの発現が増加した。この結果から、至適な誘導条件はＢＭＰ４を３日目で取り除きＬｉＣｌを４日間添加する培養条件として、以降の実験を行った。ＢＭＰ４を３日目で取り除き２．５ｍＭのＬｉＣｌを添加した場合のＰＤＧＦＲ−αの経時的な発現経過をＦＡＣＳにて解析した（図３ｂ，下）。ＰＤＧＦＲ−αは時間とともに発現が増加する傾向を示し、ＬｉＣｌ添加４日目には７４％もの細胞がＰＤＧＦＲ−α陽性であった。ＢＭＰ４単独で分化誘導した場合と比較してＰＤＧＦＲ−α陰性ＥＣＤ陰性分画が２１％と半分程度であり、ＰＤＧＦＲ−α陰性ＥＣＤ陽性分画はわずか５％と極めて少なくなっていた（図３ｃ）。これらの分画の遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲにて解析すると、予想通りＰＤＧＦＲ−α陽性分画がＰａｘ３，Ｐａｘ７陽性の中胚葉分画であり、Ｍｙｆ５，ＭｙｏＤも特異的に発現していた。ＰＤＧＦＲ−α陰性ＥＣＤ陽性においてもＰａｘ７の発現が認められたが、神経細胞のマーカーであるＳｏｘ１がこの分画で特異的に発現しており、Ｐａｘ７は神経系の細胞にも発現していることから、このＰａｘ７の発現は神経細胞への分化を現していると考えられる。未分化マーカーであるＯｃｔ３／４およびＮａｎｏｇと内胚葉マーカーであるＦｏｘａ２はＰＤＧＦＲ−α陰性ＥＣＤ陽性分画に強く発現しており、ＢＭＰ４単独誘導と同様の結果であった。しかしながらＰＤＧＦＲ−α陰性ＥＣＤ陰性分画の遺伝子発現はＢＭＰ４単独誘導とは異なり、中胚葉マーカーの発現はなく、未分化マーカー及び内胚葉マーカーが弱く発現しているのみであった（図３ｃ）。以上の結果からＢＭ４を３日目で取り除きＬｉＣｌを４日間添加した骨格筋細胞の分化誘導系においては、ＰＤＧＦＲ−α陽性分画が骨格筋前駆細胞を含むＰｏｐｕｌａｔｉｏｎであることが分かった。
次に、得られたＰＤＧＦＲ−α陽性細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟した骨格筋へと分化する方法を試みた（図３ｄ）。マウスの生体において骨格筋の幹細胞である衛星細胞（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｃｅｌｌ）が骨格筋へと分化する際に、ＩＧＦ，ＨＧＦ，ＦＧＦが重要な役割を果たす事が知られている（Ｃｈａｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ．（２００４）；８４（１）：２０９−３８）。図３ｄは、Ｍｙｆ５，ＭｙｏＤ陽性の筋芽細胞（Ｍｙｏｂｌａｓｔ）がミオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ），ＭＲＦ４陽性の筋線維（Ｍｙｏｆｉｂｅｒ）へと融合する際の成長因子をｉｎ  ｖｉｔｒｏで再現した培養方法である。ＢＭＰ４を３日目で取り除きＬｉＣｌを４日間添加する培養により誘導されたＭｙｆ５，ＭｙｏＤ陽性細胞をＰＤＧＦＲ−αをマーカーに分離し、これをＣｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉディッシュ上に再培養し、初期にはＩＧＦ−１，ＨＧＦ，ｂＦＧＦを全て加える。筋芽細胞が増殖する際にはこれらの因子は全て促進的に働くが、増殖した筋芽細胞がミオゲニン，ＭＲＦ４陽性となり、融合する際にはＨＧＦ，ｂＦＧＦは抑制的に働く（Ｃｈａｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ．（２００４）；８４（１）：２０９−３８）。そのため一定期間でＨＧＦ，ｂＦＧＦを取り除き、ＩＧＦ−１単独で培養することでミオゲニン，ＭＲＦ４陽性細胞が誘導されるかどうかを解析した（図３ｅ）。初めからＩＧＦ−１単独で誘導した細胞でもミオゲニンは陽性となるが、ＭＲＦ４も発現するのは初めの３日間はＨＧＦおよびｂＦＧＦを添加した誘導方法であった。この初めの３日間はＩＧＦ−１に加えＨＧＦおよびｂＦＧＦを添加し、その後４日間はＩＧＦ−１単独で再培養した細胞のミオゲニンの発現を蛋白レベルでも確認した（図３ｆ，左）。核がミオゲニン陽性となっている紡錘形の細胞がいくつか確認された。多核になっているものも認められた。またこのミオゲニン陽性細胞を成熟した骨格筋細胞へと分化させるため、さらにＩＧＦ−１とＨＧＦで誘導を試みた。７日後に骨格筋アクチン陽性の骨格筋細胞がいくつか認められた（図３ｆ，右）。以上の結果から、本発明者らは、無血清培養系でＥＳ細胞から成熟した骨格筋細胞へと誘導する方法を確立した。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明によって、無血清培養系で中胚葉前駆細胞を誘導し、さらに骨細胞又は軟骨細胞へ分化させること、或いは骨格筋前駆細胞から骨格筋細胞へ分化させることが可能になった。形成された細胞を患者の骨や筋肉の損傷部位に移植することによって、損傷部位を修復することが可能になる。特に、多能性幹細胞として患者由来の細胞を使用するときには、免疫学的拒絶反応を誘発しない上記分化細胞を作製することができるという格別な利益が提供される。
本発明により、骨、軟骨又は筋肉組織の損傷、欠損又は炎症部位の修復と治療を可能とするので、細胞を利用した再生医療のために有用である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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2010008100.tif 000007
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2010008100.tif 000014
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【図１ａ−ｄ】
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【図１ｅ−ｆ】
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【図２】
2010008100.tif 000018
【図３ａ−ｃ】
2010008100.tif 000019
【図３ｄ−ｆ】
2010008100.tif 000020
【国際調査報告】
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2010008100.tif 000022
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