(57)【要約】  高密度な糸状菌ペレットを製造する方法の提供。  糸状菌の胞子を、カチオン性ポリマーを含有する培養液中で発芽させる工程を含む、糸状菌ペレットの製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌の胞子を、カチオン性ポリマーを含有する培養液中で発芽させる工程を含む、糸状菌ペレットの製造方法。
【請求項２】
培養液中のカチオン性ポリマーの含有量が０．０００１％（ｗ／ｖ）以上、２％（ｗ／ｖ）以下である請求項１記載の糸状菌ペレットの製造方法。
【請求項３】
カチオン性ポリマーの電荷密度が０．１ｍｅｑ／ｇ以上、１００ｍｅｑ／ｇ以下である請求項１又は２記載の糸状菌ペレットの製造方法。
【請求項４】
カチオン性ポリマーの重量平均分子量が１，０００以上、１，０００，０００以下である請求項１〜３のいずれか１項記載の糸状菌ペレットの製造方法。
【請求項５】
糸状菌の胞子を発芽させる工程の培養液とは異なる培養液中で糸状菌ペレットを増殖させる工程を更に含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の糸状菌ペレットの製造方法。
【請求項６】
糸状菌がリゾプス属菌又はトリコデルマ属菌である請求項１〜５のいずれか１項記載の糸状菌ペレットの製造方法。
【請求項７】
カチオン性ポリマーがポリアリルアミン又はその塩、メチルグルコールキトサン、ポリジアリルジアルキルアンモニウム塩、ポリエチレンイミン及びカチオン化ポリビニルアルコールから選ばれる１種以上である請求項１〜６のいずれか１項記載の糸状菌ペレットの製造方法。
【請求項８】
カチオン性ポリマーを含有する培養液の初発ｐＨが２以上、７以下である請求項１〜７のいずれか１項記載の糸状菌ペレットの製造方法。
【請求項９】
炭素源を含有する培養液にて請求項１〜８のいずれか１項記載の製造方法によって得られる糸状菌のペレットを用い、有機酸及びエタノールから選ばれる少なくとも１種を製造する方法。
【請求項１０】
有機酸がフマル酸、乳酸、イタコン酸、リンゴ酸及びピルビン酸から選ばれる１種以上である請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
密度が０．０４ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3以上、０．５ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3以下である糸状菌ペレット。
【請求項１２】
体積平均粒径が１５０μｍ以上、３０００μｍ以下である請求項１１記載の糸状菌ペレット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌ペレットの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌は、有機酸や酵素類等の有用物質の微生物学的生産に産業上欠かせられない有用微生物である。糸状菌を液体培養すると、胞子接種量、培養液のｐＨ、流動条件等によりその形態は繊維状、塊状又はペレット状等に変化する。糸状菌ペレットは発酵後の培地からの分離が容易等の利点を有する（例えば、特許文献１）。【０００３】
非特許文献１では、培養液に特定のノニオン界面活性剤を添加し、糸状菌ペレットを形成させることが報告されている。また、非特許文献２では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒの菌糸凝集体を形成させることが報告されている。【０００４】
（特許文献１）特開平６−２５３８７１号公報【０００５】
（非特許文献１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、４、１９８９年、ｐ．１５５−１６１
（非特許文献２）第４８回化学工学会ポスター、ＬＱ２６８
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、糸状菌の胞子を、カチオン性ポリマーを含有する培養液中で発芽させる工程を含む、糸状菌ペレットの製造方法、及び、菌糸密度の高い糸状菌ペレットを提供するものである。
【発明の詳細な説明】
【０００７】
本発明は、高密度な糸状菌ペレットを製造する方法を提供することに関する。
【０００８】
本発明者は、糸状菌のペレット化について検討した結果、カチオン性ポリマーを含む培養液中で糸状菌胞子を発芽させ、ペレットを形成させると、菌糸密度の高い糸状菌ペレットが得られることを見出した。
【０００９】
本発明によれば、高密度な糸状菌ペレットが得られる。
【００１０】
本発明の糸状菌ペレットの製造方法は、糸状菌の胞子を、カチオン性ポリマーを含有する培養液中で発芽させ、ペレットを形成させる工程を含む、製造方法である。
【００１１】
（糸状菌）
本発明に用いられる糸状菌としては、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に属する微生物等が挙げられる。
リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属菌としては、例えば、リゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ）、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）、リゾプス・キネンシス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、リゾプス・ニグリカンス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）、リゾプス・トンキネンシス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｔｏｎｋｉｎｅｎｓｉｓ）、リゾプス・トリチシ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｔｒｉｔｉｃｉ）等が挙げられる。
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌としては、例えば、トリコデルマ・アトロビリデ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｓｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）等が挙げられる。
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌としては、例えば、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）等が挙げられる。
ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属菌としては、ムコール・マンドシュリクス（Ｍｕｃｏｒ ｍａｎｄｓｈｕｒｉｃｕｓ）等が挙げられる。
これらの糸状菌は、単独で使用すればよいが、２種以上組み合わせて使用することもできる。
なかでも、有用物質の生産性、取扱性の観点から、リゾプス属菌又はトリコデルマ属菌が好ましく、リゾプス・デレマー、リゾプス・オリザエがより好ましい。本明細書における有用物質については後述する。
【００１２】
（糸状菌の胞子と胞子懸濁液の調整）
糸状菌の胞子は、糸状菌の胞子をポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地）等の培地に接種して静置培養を行い、培養物を液体に懸濁した胞子懸濁液として調製することができる。胞子懸濁液は、適宜希釈して所望の胞子数に調整することができる。
胞子懸濁液を調製するための静置培養の条件としては、胞子増殖の観点から、培養温度は、好ましくは１０℃以上、より好ましくは２５℃以上であり、また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３０℃以下である。培養日数は、好ましくは７日以上、１０日以下である。
胞子懸濁液中の胞子数は、後述するセルカウンターにて計測することができる。
【００１３】
（胞子の発芽とペレット化の工程）
胞子懸濁液を、培養液に接種して培養することで、胞子は発芽し、菌糸体へと成長して、ペレットを形成する。
ここで、本明細書において「ペレット」とは、液体培養により菌糸が自発的に形成した数百μｍ〜数ｍｍ程度の大きさの菌糸塊をいう。
培養液に接種する糸状菌の胞子数は、糸状菌ペレットの良好な生育の観点から、好ましくは１×１０1個−胞子／ｍＬ−培養液以上、より好ましくは１×１０2個−胞子／ｍＬ−培養液以上であり、また、上記と同様の観点から、好ましくは１×１０8個−胞子／ｍＬ−培養液以下であり、より好ましくは１×１０4個−胞子／ｍＬ−培養液以下である。
【００１４】
培養液は、糸状菌を生育可能な液体培地であれば、合成培地、天然培地及び天然成分を合成培地に添加した半合成培地のいずれでもよい。例えば、ポテトデキストロース培地（ＰＤＢ培地）、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ培地）、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（ＮＢ培地）、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ培地（ＳＢ培）等を利用することができる。
培養液には、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要な栄養源等を含有することができる。
炭素源としては、糖類が挙げられる。糖類としては、グルコース、フルクトース、キシロース等の単糖類、スクロース、ラクトース、マルトース等の二糖類が挙げられる。糖類は無水物又は水和物であってもよい。これらは単独で又は２種以上組み合わせて使用することができる。なかでも、生産性の観点から、グルコースが好ましい。培養液中の当初の炭素源濃度は、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上、３０％（ｗ／ｖ）以下である。
窒素源としては、例えば、尿素、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム等の含窒素化合物が挙げられる。培養液中の当初の窒素源濃度は、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上、１％（ｗ／ｖ）以下である。
無機塩としては、硫酸塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等が挙げられる。
硫酸塩としては、例えば、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム等が挙げられる。培養液中の当初の硫酸塩濃度は、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上、１％（ｗ／ｖ）以下である。
マグネシウム塩としては、例えば、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。培養液中の当初のマグネシウム塩濃度は、好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）以上、０．５％（ｗ／ｖ）以下である。
亜鉛塩としては、例えば、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、塩化亜鉛等が挙げられる。培養液中の当初の亜鉛塩濃度は、好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）以上、０．５％（ｗ／ｖ）以下である。
【００１５】
（カチオン性ポリマー）
本発明では、胞子の発芽とペレット化は、カチオン性ポリマーを含有する培養液中で行われる。
本発明に用いられる「カチオン性ポリマー」とは、水と混合された場合、正に帯電するポリマーをいう。カチオン性ポリマーの具体的な事例は、カチオン性基を有するモノマー、あるいは水中でカチオン性を示すアミノ基を有するモノマーの重合体、及び、これらのモノマーと他のモノマーの共重合体又は縮重合体が好ましい。
カチオン性基としては、第４級アミノ基、ヒドラジノ基等が挙げられ、水中でカチオン性を示すアミノ基としては、例えば第１級アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基が挙げられる。
【００１６】
カチオン性ポリマーの電荷密度は、ペレットの密度を高める観点から、好ましくは０．１ｍｅｑ／ｇ以上であり、より好ましくは１ｍｅｑ／ｇ以上、更に好ましくは２ｍｅｑ／ｇ以上、更に好ましくは１０ｍｅｑ／ｇ以上である。また、上記と同様の観点から、好ましくは１００ｍｅｑ／ｇ以下であり、より好ましくは５０ｍｅｑ／ｇ以下であり、より好ましくは３０ｍｅｑ／ｇ以下である。
カチオン性ポリマーの電荷密度は、好ましくは０．１ｍｅｑ／ｇ〜１００ｍｅｑ／ｇであり、より好ましくは１ｍｅｑ／ｇ〜５０ｍｅｑ／ｇであり、より好ましくは２ｍｅｑ／ｇ〜３０ｍｅｑ／ｇであり、更に好ましくは１０ｍｅｑ／ｇ〜３０ｍｅｑ／ｇである。
ここで、カチオン電荷密度とは、ポリマー上の正電荷の数と該ポリマーの分子量（カチオン基の対イオンの重量は除く）の比を指す。カチオン電荷密度にポリマー分子量を乗じると、所与のポリマー鎖における正に荷電した部位の数が求められる。カチオン電荷密度は更に、ポリマーのグラム当たりの正電荷（カチオン性を有する窒素原子）のミリ当量の数（ｍｅｑ／ｇ）として定義される。
【００１７】
カチオン電荷密度の値は、たとえば、以下の式（１）に従い求めることができる。
カチオン電荷密度（ｍｅｑ／ｇ）＝１÷（カチオンポリマー中のカチオン性を有する窒素原子を１つ含む単位分子量）×１０００  ・・・  式（１）
【００１８】
カチオン性ポリマーの重量平均分子量（以下、単に分子量ともいう）は、糸状菌ペレットの良好な生育の観点から、好ましくは１，０００以上、より好ましくは１，６００以上であり、また、好ましくは１，０００，０００以下、より好ましくは５００，０００以下、より好ましくは３００，０００以下、更に好ましくは２００，０００以下である。カチオン性ポリマーの分子量は、好ましくは１，０００〜１，０００，０００、より好ましくは１，０００〜５００，０００、より好ましくは１，０００〜３００，０００、更に好ましくは１，６００〜２００，０００である。
また、カチオン性ポリマーの重量平均分子量は、培養時の操作性の観点から、好ましくは１，０００以上、より好ましくは２，０００以上、より好ましくは５，０００以上、より好ましくは１００，０００以上であり、また、好ましくは５００，０００以下である。
なお、平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）等の公知の測定方法により測定され、測定装置は拘らないが、例としては、東ソー製ＨＬＣ−８２２０シリーズ等が挙げられる。
【００１９】
カチオン性ポリマーは、水溶性ポリマーであることが好ましい。ここで、「水溶性ポリマー」とは、１０５℃で２時間乾燥させたポリマーを、２５℃の水１００ｇに溶解させたときに、その溶解量が１０ｇを超えるポリマーをいう。カチオン性ポリマーの水１００ｇへの溶解量は、好ましくは２０ｇ以上、より好ましくは１００ｇ以上である。
【００２０】
カチオン性ポリマーとしては、例えば、１級アミンを含むポリマー、２級アミンを含むポリマー、３級アミンを含むポリマー、４級アミンを含むポリマーが挙げられる。１級アミンを含むポリマーとして、ポリアリルアミン、アリルアミン塩重合体、アリルアミンアミド塩重合体が挙げられる。２級アミンを含むポリマーとして、ポリジアリルアミン、ジアリルアミン塩重合体、ジアリルアミン塩/アクリルアミド共重合体が挙げられる。３級アミンを含むポリマーとして、アルキルジアリルアミン塩重合体、アルキルジアリルアミンアミド塩重合体が挙げられる。４級アミンを含むポリマーとして、ジアリルジアルキルアンモニウム塩重合体、ジアリルジアルキルアンモニウムエチルサルフェイト重合体、ジアリルジアルキルアンモニウム塩/アクリルアミド共重合体が挙げられる。また、前記のポリマー以外にも、ポリエチレンイミン、メチルグリコールキトサン、アミン−エピクロルヒドリン共重合体、カチオン化ポリビニルアルコール、カチオン化セルロース、カチオン化澱粉、カチオン化グアーガム、ジシアンジアミド系高分子が挙げられる。上記のアルキル基としてはメチル基、エチル基、プロピル基が挙げられる。また、上記の塩としては硫酸塩、塩酸塩、酢酸塩が挙げられる。
アリルアミン塩重合体は、アリルアミン塩酸塩重合体が挙げられる。アリルアミンアミド塩重合体はアリルアミンアミド硫酸塩重合体が挙げられる。ジアリルアミン塩重合体は、ジアリルアミン塩酸塩重合体が挙げられる。アルキルジアリルアミン塩重合体はメチルジアリルアミン塩酸塩重合体、メチルジアリルアミン酢酸塩重合体が挙げられる。アルキルジアリルアミンアミド塩重合体として、メチルジアリルアミンアミド硫酸塩重合体が挙げられる。ジアリルジアルキルアンモニウム塩重合体として、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリジアリルメチルエチルアンモニウムクロライド、ポリアクリル酸−ｃｏ−ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリアクリルアミド−ｃｏ−ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリアクリルアミド−ｃｏ−アクリル酸−ｃｏ−ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリジアリルジメチルアンモニウムエチルサルフェイト、ポリジアリルメチルエチルアンモニウムエチルサルフェイトが挙げられる。
ジアリルジアルキルアンモニウムエチルサルフェイト重合体としてジアリルメチルエチルアンモニウムエチルサルフェイトが挙げられる。また、ポリ２−（メタクリロイルオキシ）エチルトリメチルアンモニウムクロライドが挙げられる。
カチオン性ポリマーは、単独で又は２種以上を組み合わせて使用することもできる。
なかでも、ペレットの密度を高める観点から、好ましくはポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、アリルアミン塩重合体、ジアリルジアルキルアンモニウム塩重合体、ジアリルジアルキルアンモニウムエチルサルフェイト重合体、メチルグリコールキトサン、カチオン化ポリビニルアルコールであり、より好ましくはポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、アリルアミン塩重合体、ジアリルジアルキルアンモニウム塩重合体であり、より好ましくはポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ジアリルジアルキルアンモニウム塩重合体である。
【００２１】
培養液中のカチオン性ポリマーの含有量は、ペレットの密度を高める観点から、好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．００１５％（ｗ／ｖ）以上である。また、上記と同様の観点から、好ましくは２％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは１％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以下である。培養液中のカチオン性ポリマーの含有量は、好ましくは０．０００１〜２％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００１〜１％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．００１５〜０．５％（ｗ／ｖ）である。
【００２２】
（胞子の発芽とペレット化時の培養方法）
培養は、通常の手順にて行えばよい。培養は、通常、好気的条件で行われる。
培養温度は、好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上であり、また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３０℃以下である。
培地の初発ｐＨは、菌体の良好な生育の観点から、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、また、好ましくは７以下、より好ましくは５以下である。
培養期間は、糸状菌の胞子を培養液に植菌後、好ましくは３０分以上、より好ましくは０．５日以上であり、また、好ましくは７日以内、より好ましくは６日以内、更に好ましくは５日以内である。
培養に用いる培養槽は、従来公知のものを適宜採用することができる。例えば、フラスコ、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽等、及び流動床培養槽が挙げられる。撹拌条件は、好ましくは８０ｒ／ｍｉｎ以上、より好ましくは１００ｒ／ｍｉｎ以上であり、また、好ましくは２５０ｒ／ｍｉｎ以下、より好ましくは２００ｒ／ｍｉｎ以下である。
培養温度、培養期間、撹拌条件等を変更することにより、所望の大きさや外観のペレットを形成することができる。
糸状菌ペレットの体積平均粒径は、有用物質の高い生産性と触媒繰返し利用時の分離性の観点から、好ましくは１５０μｍ以上、より好ましくは２５０μｍ以上であり、また、好ましくは３０００μｍ以下、より好ましくは１５００μｍ以下である。
なお、体積平均粒径は後述する顕微鏡観察による画像解析で測定される。
【００２３】
（ペレットの増殖工程）
本発明では、有用物質の生産性向上の観点から、糸状菌ペレットをさらに培養して増殖させる工程を行ってもよい。
糸状菌ペレットの増殖に用いられる培養液は特に限定されないが、糸状菌の胞子を発芽させる工程の培養液とは異なる培養液を用いるのが好ましい。例えば、通常使用されるグルコースを含む無機培養液が挙げられる。具体的には、グルコースを７．５以上３０％以下（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウムを０．０５以上２％以下（ｗ／ｖ）、リン酸２水素カリウムを０．０３以上０．６％以下（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウムを０．０１以上０．１％以下（ｗ／ｖ）、及び硫酸亜鉛を０．００５以上０．０５％以下（ｗ／ｖ）含有する培地等が挙げられる。上記の塩は水和物であっても良い。
【００２４】
培養条件としては、培養温度が、好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上であり、また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３０℃以下である。
また、培地のｐＨは、菌体の生育や、有用物質の生産性の観点から、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、また、好ましくは７以下、より好ましくは５以下である。培養液のｐＨ制御は、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア等の塩基、硫酸、塩酸等の酸を用いて行うことができる。
培養期間は、好ましくは３０分以上、より好ましくは６時間以上、より好ましくは０．５日以上であり、また、好ましくは３日以下、より好ましくは２日以下、より好ましくは１日以下である。
また、培養に用いる培養槽は、従来公知のものを適宜採用することができる。具体的には、フラスコ、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽、及び流動床培養槽等が挙げられる。
【００２５】
培養後、糸状菌ペレットは、培養液と共に培養槽から抜き出して、ろ過、遠心分離等の簡便な操作により分離回収することができる。培養槽に糸状菌ペレットを残したまま、同一培養槽で糸状菌ペレットを物質生産に利用することも可能である。
【００２６】
かくして得られる糸状菌ペレットは、菌糸密度が高い。従って、当該糸状菌ペレットは、有用物質の発酵生産性向上に有用である。
糸状菌ペレットの密度は、有用物質の生産性の観点から、０．０４ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3以上、より好ましくは０．１ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3以上であり、また、０．５ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3以下、より好ましくは０．３ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3以下、より好ましくは０．２５ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3以下である。当該密度は、後述する実施例に記載の方法で求められる。
【００２７】
本明細書における有用物質は、糸状菌の培養の過程により炭素源から生産される化合物である。このような化合物としては、例えば、有機酸、酵素、油脂及びアルコールから選ばれる少なくとも１種が挙げられる。本発明の糸状菌ペレットを用いて生産することができる好適な有用物質は、有機酸、エタノール又は酵素である。有機酸としては、例えば、フマル酸、乳酸、イタコン酸、リンゴ酸、ピルビン酸等が挙げられる。なかでも、好ましくは、フマル酸、ピルビン酸、乳酸及びリンゴ酸から選ばれる少なくとも１種であり、更に好ましくはフマル酸、乳酸であり、更に好ましくはフマル酸である。酵素としては、例えば、プロテアーゼ、オキシゲナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、イソメラーゼが挙げられる。
【００２８】
（糸状菌ペレットを用いた有用物質の生産）
有用物質の生産時に用いられる培養液は、通常、炭素源を含む。培養液には、炭素源の他、窒素源、無機塩類、その他リン源、ビタミン等の必要な栄養源等を含有することができる。使用する炭素源に培養に適切な濃度の上記栄養源が含まれている場合には、炭素源のみを用いることも可能である。炭素源、窒素源、無機塩類としては、前記［００１４］段落記載の化合物が挙げられる。
有用物質の生産時に用いられる培養液においては、炭素源として、糖類を含有する糖液を使用することもできる。例えば、でんぷんから得られる糖液、糖蜜、廃糖蜜、リグノセルロース系バイオマスから得られる糖液が挙げられる。これらは１種又は２種以上組み合わせて使用することができる。ここで、本明細書において「リグノセルロース系バイオマス」とは、セルロース、ヘミセルロース、及びリグニンを主成分とするバイオマスを意味する。リグノセルロース系バイオマスとしては、具体例には、イナワラ、籾殻、麦わら、バガス、ヤシ殻、コーンコブ、雑草、木材、及びそれらから製造されたパルプ及び紙等が挙げられる。また、でんぷんとしては、例えば、トウモロコシ等の雑穀類、大豆等の豆類の抽出物が挙げられ、糖蜜としては、例えば、サトウキビ、テンサイ等に由来するものが挙げられる。
培養液中の当初の炭素源濃度は、生産性の観点から、好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは２％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは３％（ｗ／ｖ）以上であって、また、好ましくは４０％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは３０％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは２０％（ｗ／ｖ）以下である。また、培養液中の当初の炭素源濃度は、好ましくは１〜４０（ｗ／ｖ）％、より好ましくは２〜３０（ｗ／ｖ）％、更に好ましくは３〜２０（ｗ／ｖ）％である。
【００２９】
また、培養液中の当初の窒素源濃度は、生産性の観点から、好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００２％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００４％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．３％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下である。
培養液中の当初の硫酸塩濃度は、生産性の観点から、好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．０８％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは０．０４％（ｗ／ｖ）以下である。
培養液中の当初のマグネシウム塩濃度は、生産性の観点から、好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００２％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．００３％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．２％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下である。
培養液中の当初の亜鉛塩濃度は、生産性の観点から、好ましくは０．００００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００００３％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．００００５％（ｗ／ｖ）以上、そして、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以下である。
【００３０】
有用物質の生産時の培養温度は、好ましくは２０℃以上、より好ましくは３０℃以上であり、また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３７℃以下である。
培養液のｐＨは、菌体の生育や、有用物質の生産性の観点から、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、また、好ましくは７以下、より好ましくは５以下である。ｐＨ制御は、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア等の塩基、硫酸、塩酸等の酸を用いて行うことができる。
培養に用いるガスは、空気や酸素富化されたガスを選択できる。通気条件は、好ましくは０．１ｖｖｍ以上、より好ましくは０．２ｖｖｍ以上であり、また、好ましくは２ｖｖｍ以下、より好ましくは１ｖｖｍ以下である。
また、培養に用いる培養槽は、従来公知のものを適宜採用することができるが、フマル酸の高い生産性の観点から、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽、及び流動床培養槽が好ましく使用される。
培養は、回分式、半回分式及び連続式のいずれで行ってもよい。例えば、半回分式で行う場合、菌体と発酵液とを分離し、分離回収した菌体に培地を加えて更に発酵を行うことができる。また、連続式で行う場合、一定量の培地を発酵槽内に一定速度で供給するとともに、同量の発酵液を抜き取るという方法を採用することができる。その場合、発酵槽内の液面高さを一定に保つように、液面高さを液面センサー等により制御してもよい。また、発酵時に炭素源のみを供給することも可能であり、炭素源の供給は、流速で制御しても、グルコース濃度で制御してもよい。
【００３１】
培養後の菌体と発酵液の分離は、発酵槽内でフィルターにより固液分離してもよいし、一度槽外に抜き出して液体サイクロンやろ過等の固液分離に供した後に菌体のみを発酵槽内に戻してもよい。
【００３２】
（有用物資の回収）
分離後に得られた発酵液はそのまま、或いは発酵液を濃縮した後、晶析法、イオン交換法、溶剤抽出法、あるいはアルカリ土類金属塩として析出させた後析出物を酸分解する方法等により、発酵液から生成物を分離し回収することができる。
【００３３】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の製造方法を開示する。
【００３４】
＜１＞糸状菌の胞子を、カチオン性ポリマーを含有する培養液中で発芽させる工程を含む、糸状菌ペレットの製造方法。
【００３５】
＜２＞糸状菌が、好ましくはリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属及びムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に属する微生物から選ばれる１種又は２種以上であり、より好ましくはリゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ）、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）、リゾプス・キネンシス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、リゾプス・ニグリカンス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）、リゾプス・トンキネンシス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｔｏｎｋｉｎｅｎｓｉｓ）、リゾプス・トリチシ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、トリコデルマ・アトロビリデ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｓｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）及びムコール・マンドシュリクス（Ｍｕｃｏｒ ｍａｎｄｓｈｕｒｉｃｕｓ）から選ばれる１種又は２種以上である＜１＞に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜３＞糸状菌が、好ましくはリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属菌又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌であり、より好ましくはリゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ）、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）又はトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｓｓｅｉ）である＜１＞に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜４＞糸状菌の胞子を、好ましくは１×１０1個−胞子／ｍＬ−培養液以上、より好ましくは１×１０2個−胞子／ｍＬ−培養液以上であり、また、好ましくは１×１０8個−胞子／ｍＬ−培養液以下、より好ましくは１×１０4個−胞子／ｍＬ−培養液以下の胞子数で、カチオン性ポリマーを含有する培養液に接種して胞子を発芽させる、＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜５＞培養液が、好ましくは炭素源、窒素源及び無機塩類を含有する＜１＞〜＜４＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜６＞培養液中の当初の窒素源濃度が、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上、１％（ｗ／ｖ）以下であり、当初の硫酸塩濃度が、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上、１％（ｗ／ｖ）以下であり、当初のマグネシウム塩濃度が、好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）以上、０．５％（ｗ／ｖ）以下であり、当初の亜鉛塩濃度が、好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）以上、０．５％（ｗ／ｖ）以下である＜５＞に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜７＞培養液中のカチオン性ポリマーの含有量が、好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．００１５％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは２％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは１％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以下であり、また、好ましくは０．０００１〜２％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．００１〜１％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．００１５〜０．５％（ｗ／ｖ）である＜１＞〜＜６＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜８＞カチオン性ポリマーの電荷密度が、好ましくは０．１ｍｅｑ／ｇ以上、より好ましくは１ｍｅｑ／ｇ以上、更に好ましくは２ｍｅｑ／ｇ以上、更に好ましくは１０ｍｅｑ／ｇ以上であり、また、好ましくは１００ｍｅｑ／ｇ以下、より好ましくは５０ｍｅｑ／ｇ以下、更に好ましくは３０ｍｅｑ／ｇ以下であり、また、好ましくは０．１ｍｅｑ／ｇ〜１００ｍｅｑ／ｇ、より好ましくは１ｍｅｑ／ｇ〜５０ｍｅｑ／ｇ、より好ましくは２ｍｅｑ／ｇ〜３０ｍｅｑ／ｇであり、更に好ましくは１０ｍｅｑ／ｇ〜３０ｍｅｑ／ｇである＜１＞〜＜７＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜９＞カチオン性ポリマーの重量平均分子量が、好ましくは１，０００以上、より好ましくは１，６００以上であり、また、好ましくは１，０００，０００以下、より好ましくは５００，０００以下、より好ましくは３００，０００以下、更に好ましくは２００，０００以下であり、また、好ましくは１，０００〜１，０００，０００、より好ましくは１，０００〜５００，０００、より好ましくは１，０００〜３００，０００、更に好ましくは１，６００〜２００，０００である＜１＞〜＜８＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜１０＞カチオン性ポリマーの重量平均分子量が、好ましくは１，０００以上、より好ましくは２，０００以上、より好ましくは５，０００以上、より好ましくは１００，０００以上であり、また、好ましくは５００，０００以下であり、また、好ましくは１，０００〜５００，０００、より好ましくは２，０００〜５００，０００、更に好ましくは５，０００〜５００，０００、更に好ましくは１００，０００〜５００，０００である＜１＞〜＜８＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜１１＞カチオン性ポリマーが、好ましくは水溶性カチオン性ポリマーである＜１＞〜＜１０＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜１２＞カチオン性ポリマーが、好ましくはポリジアリルジアルキルアンモニウム塩又はその共重合体、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン又はその塩、メチルグリコールキトサン、アミン−エピクロルヒドリン共重合体、カチオン化ポリビニルアルコール、カチオン化セルロース、カチオン化澱粉、カチオン化グアーガム、ジシアンジアミド系高分子、及びポリ２−（メタクリロイルオキシ）エチルトリメチルアンモニウムクロライドから選ばれる１種又は２種以上であり、より好ましくはポリアリルアミン又はその塩、メチルグリコールキトサン、ポリジアリルジアルキルアンモニウム塩又はその共重合体、ポリエチレンイミン及びカチオン化ポリビニルアルコールから選ばれる１種又は２種以上である＜１＞〜＜１１＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜１３＞ポリジアリルジアルキルアンモニウム塩又はその共重合体が、好ましくはポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリジアリルメチルエチルアンモニウムクロライド、ポリアクリル酸−ｃｏ−ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリアクリルアミド−ｃｏ−ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリアクリルアミド−ｃｏ−アクリル酸−ｃｏ−ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリジアリルジメチルアンモニウムエチルサルフェイト、及びポリジアリルメチルエチルアンモニウムエチルサルフェイトから選ばれる１種又は２種以上である＜１２＞に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜１４＞培養温度が、好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上であり、また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３０℃以下である＜１＞〜＜１３＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜１５＞カチオン性ポリマーを含有する培養液の初発ｐＨが、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、また、好ましくは７以下、より好ましくは５以下である＜１＞〜＜１４＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜１６＞培養期間が、好ましくは３０分以上、より好ましくは０．５日以上であり、また、好ましくは７日以内、より好ましくは６日以内、更に好ましくは５日以内である＜１＞〜＜１５＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜１７＞糸状菌ペレットの体積平均粒径が、好ましくは１５０μｍ以上、より好ましくは２５０μｍ以上であり、また、好ましくは３０００μｍ以下、より好ましくは１５００μｍ以下である＜１＞〜＜１６＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜１８＞糸状菌の胞子を発芽させる工程の培養液とは異なる培養液中で糸状菌ペレットを増殖させる工程を更に含む、＜１＞〜＜１７＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜１９＞糸状菌ペレットの増殖に用いられる培養液が、好ましくはグルコースを７．５〜３０％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウムを０．０５〜２％（ｗ／ｖ）、リン酸２水素カリウムを０．０３〜０．６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水和物を０．０１〜０．１％（ｗ／ｖ）、及び硫酸亜鉛・７水和物を０．００５〜０．０５％（ｗ／ｖ）を含有する培養液である＜１８＞に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜２０＞糸状菌ペレットを増殖させる工程における培養温度が、好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上であり、また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３０℃以下である＜１８＞又は＜１９＞に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜２１＞糸状菌ペレットを増殖させる工程における培養液のｐＨが、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、また、好ましくは７以下、より好ましくは５以下である＜１８＞〜＜２０＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜２２＞糸状菌ペレットを増殖させる工程における培養期間が、好ましくは３０分以上、より好ましくは６時間以上、より好ましくは０．５日以上であり、また、好ましくは３日以下、より好ましくは２日以下、より好ましくは１日以下である＜１８＞〜＜２１＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜２３＞糸状菌ペレットの密度が、好ましくは０．０４ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3以上、より好ましくは０．１ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3以上であり、また、好ましくは０．５ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3以下、より好ましくは０．３ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3以下、より好ましくは０．２５ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3以下である＜１＞〜＜２２＞のいずれか１に記載の糸状菌ペレットの製造方法。
＜２４＞炭素源を含有する培養液にて＜１＞〜＜２３＞のいずれか１に記載の製造方法によって得られる糸状菌ペレットを用い有機酸及びエタノールから選ばれる少なくとも１種を製造する方法。
＜２５＞有機酸が、好ましくはフマル酸、乳酸、イタコン酸、リンゴ酸、及びピルビン酸から選ばれる少なくとも１種であり、より好ましくは、フマル酸、ピルビン酸、乳酸及びリンゴ酸から選ばれる少なくとも１種であり、更に好ましくはフマル酸、乳酸であり、更に好ましくはフマル酸である＜２４＞に記載の方法。
＜２６＞培養液中の当初の炭素源濃度が、好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは２％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは３％（ｗ／ｖ）以上であって、また、好ましくは４０％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは３０％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは２０％（ｗ／ｖ）以下であり、また、好ましくは１〜４０（ｗ／ｖ）％、より好ましくは２〜３０（ｗ／ｖ）％、更に好ましくは３〜２０（ｗ／ｖ）％である＜２４＞又は＜２５＞に記載の方法。
＜２７＞培養液が、好ましくは窒素源及び無機塩類を含有する＜２４＞〜＜２６＞のいずれか１に記載の方法。
＜２８＞培養液中の当初の窒素源濃度が、好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００２％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００４％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．３％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下であり、当初の硫酸塩濃度が、好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．０８％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは０．０４％（ｗ／ｖ）以下であり、当初のマグネシウム塩濃度が、好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００２％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．００３％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．２％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下であり、当初の亜鉛塩濃度が、好ましくは０．００００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．００００３％（ｗ／ｖ）以上、更に好ましくは０．００００５％（ｗ／ｖ）以上、また、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以下、更に好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以下である＜２７＞に記載の方法。
＜２９＞有機酸及びエタノールから選ばれる少なくとも１種を製造する時の培養温度が、好ましくは２０℃以上、より好ましくは３０℃以上であり、また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３７℃以下である＜２４＞〜＜２８＞のいずれか１に記載の方法。
＜３０＞培養液のｐＨが、好ましくは２以上、より好ましくは３以上であり、また、好ましくは７以下、より好ましくは５以下である＜２４＞〜＜２９＞のいずれか１に記載の方法。
＜３１＞密度が、好ましくは０．０４ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3以上、より好ましくは０．１ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3以上であり、また、好ましくは０．５ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3以下、より好ましくは０．３ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3以下、より好ましくは０．２５ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3以下である糸状菌ペレット。
＜３２＞体積平均粒径が、好ましくは１５０μｍ以上、より好ましくは２５０μｍ以上であり、また、好ましくは３０００μｍ以下、より好ましくは１５００μｍ以下である＜３１＞記載の糸状菌ペレット。
【実施例】
【００３６】
[カチオン性ポリマー]
実施例１〜１６にて次の高分子を使用した。
・ポリエチレンイミン(PEI、分子量10,000、電荷密度23.2meq/g、Alfa Asesar製)
・ポリアリルアミン(PAA-01、分子量1,600、電荷密度17.5meq/g、ニットーボーメディカル製)
・ポリアリルアミン(PAA-05、分子量5,000、電荷密度17.5meq/g、ニットーボーメディカル製)
・ポリアリルアミン(PAA-15c、分子量15,000、電荷密度17.5meq/g、ニットーボーメディカル製)
・ポリアリルアミン(PAA-25、分子量25,000、電荷密度17.5meq/g、ニットーボーメディカル製)
・ポリアリルアミン塩酸塩(PAA-HCl-01、分子量1,600、電荷密度10.7meq/g、ニットーボーメディカル製)
・ポリアリルアミン塩酸塩(PAA-HCl-05、分子量5,000、電荷密度10.7meq/g、ニットーボーメディカル製)
・ポリアリルアミン塩酸塩(PAA-HCl-3L、分子量30,000、電荷密度10.7meq/g、ニットーボーメディカル製)
・ポリアリルアミン塩酸塩(PAA-HCl-10L、分子量150,000、電荷密度10.7meq/g、ニットーボーメディカル製)
・ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド(PAS-H、分子量200,000、電荷密度6.19meq/g、ニットーボーメディカル製)
・ポリジアリルメチルエチルアンモニウムエチルサルフェイト(PAS-24、分子量37,000、電荷密度3.32meq/g、ニットーボーメディカル製)
・メチルグリコールキトサン(MGch、分子量150,080、電荷密度2.67meq/g、和光純薬製)
・ポリアリルアミン塩酸塩(PAH、分子量120,000〜200,000、電荷密度10.7meq/g、Alfa Asesar製)
・ポリアリルアミン(PAAm、分子量15,000、電荷密度17.5meq/g、Polysciences,Inc.製)
・カチオン化ポリビニルアルコール(ゴーセネックス Ｋ−４３４、C-PVA、分子量 78,000〜86,000 、電荷密度 8.23meq/g、日本合成化学工業製)【００３７】
[界面活性剤]
比較例１および６にて次の界面活性剤を使用した。
(非イオン性界面活性剤)
・ソルビタンモノラウレート:レオドールSP-L10、分子量346.46、花王(株)製【００３８】
[ポリマー]
比較例３〜４にて次のポリマーを使用した。
(非イオン性ポリマー)
・ポリビニルアルコール（ＰＶＡ、分子量100,000、Polysciences,Inc.製）
(アニオン性ポリマー)
・ポリアクリル酸ナトリウム（ＳＰＡ、分子量2,821,200〜3,761,600、和光純薬製）【００３９】
［実施例１］
＜糸状菌ペレットの調製＞
〔胞子懸濁液の調製〕
菌株は独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）より入手した糸状菌Ｒ．ｄｅｌｅｍａｒ  ＪＣＭ５５５７を使用した。糸状菌は、シャーレ内に調製したＰＤＡ培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）上に菌体を画線／塗布し、３０℃にて静置培養し、定期的に継代を行った。菌体使用時にはシャーレから胞子を回収し、４０ｍＬの胞子回収液（ＮａＣｌ  ０．８５％、Ｔｗｅｅｎ８０  ０．０５％）に胞子を懸濁させた。その後、無菌の胞子回収液（ＮａＣｌ  ０．８５％、Ｔｗｅｅｎ８０  ０．０５％）で希釈することで１×１０7個−胞子／ｍＬに調整したものを胞子懸濁液とした。胞子の濃度は全自動セルカウンター（ＴＣ２０TM、バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（株）製）にて測定した。【００４０】
〔糸状菌の発芽及びペレット化〕
熱滅菌済みのＰＤＢ培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｂｒｏｔｈ、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を２００ｍＬ仕込んだ５００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコに、熱滅菌済みのポリエチレンイミンを０．００１５％（ｗ／ｖ）になるように含ませた。ＰＤＢ培地に胞子懸濁液を２×１０3個−胞子／ｍＬとなるように植菌して、振とう機（ＰＲＥＣＩ社、ＰＲＸＹｇ−９８Ｒ）にて２７℃、１７０ｒ／ｍｉｎの振盪条件で３日間培養を行い、糸状菌を発芽させ、糸状菌ペレットを得た。【００４１】
＜糸状菌ペレット１個当たりの密度の測定＞
培養終了後、菌体を含む培養液を重量測定用に１００ｍＬサンプリングし、ナイロンメンブレンフィルター（目開き１８０μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を用いて糸状菌ペレットをろ過分離した。次いで、分離した糸状菌ペレットを、蒸留水２００ｍＬに浸漬し、振とう機（ＰＲＸＹｇ−９８Ｒ、プリス社製）を用いて１７０ｒ／ｍｉｎ−２７℃の条件で１５分撹拌し、さらに前記ナイロンメンブレンフィルターでろ過分離した。この洗浄操作を３回行った。
洗浄後の糸状菌ペレットを、再びナイロンメンブレンフィルターでろ過し、１０５℃の乾燥器にて１日間静置し乾燥菌体を得た。乾燥菌体の重量を測定し、菌体乾燥重量濃度［ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌ］を求めた。
ペレット粒子数濃度［個／Ｌ］は、洗浄後、１ｍＬあたりに存在するペレットの個数を目視によりカウントし求めた。
１個当りのペレット体積［ｃｍ3／個］は、洗浄後、糸状菌ペレットを画像解析（ＫＥＹＥＮＣＥ  ＶＨＸ−１０００）により観察し、ペレット１００個分の体積平均粒径を求め、１個当りのペレット体積［ｃｍ3／個］を算出した。【００４２】
糸状菌ペレット１個当たりの密度を以下の式（１）より算出した。
糸状菌ペレット密度［ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3］
＝菌体乾燥重量濃度［ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／Ｌ］／ペレット粒子数濃度［個／Ｌ］／糸状菌ペレット１個当たりの体積［ｃｍ3／個］          （１）【００４３】
［実施例２］〜［実施例１２］
表１に示すカチオンポリマーを使用した以外は実施例１と同様の手法で糸状菌ペレットを得た。【００４４】
［実施例１３］
カチオンポリマーとしてポリアリルアミン塩酸塩（分子量１２０，０００〜２００，０００、電荷密度１０．７、Ａｌｆａ  Ａｓｅｓａｒ製）を使用し、添加濃度を０．５％（ｗ／ｖ）にした以外は実施例１と同様の手法で糸状菌ペレットを得た。【００４５】
［実施例１４］〜［実施例１５］
ポリアリルアミン塩酸塩の添加濃度を０．１％（ｗ／ｖ）又は０．０１％（ｗ／ｖ）にした以外は実施例１３と同様の手法で糸状菌ペレットを得た。【００４６】
［実施例１６］
＜糸状菌ペレットの調製＞
〔胞子回収および冷凍ストックの作製〕
菌株は糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｓｓｅｉを使用した。糸状菌は、シャーレ内に調製したＰＤＡ培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）上に菌体を画線／塗布し、３０℃にて７日間静置培養し、胞子を十分に形成させた。静置培養の後、シャーレから胞子を回収し、胞子回収液（ＮａＣｌ  ０．９％、Ｔｗｅｅｎ８０  ０．０３％）に胞子を懸濁させた。胞子の濃度は全自動セルカウンター（ＴＣ２０TM、バイオ・ラッド・ラボラトリーズ（株）製）にて測定した。胞子懸濁液を調製した後、懸濁液とグリセロール水溶液(４０ｖｏｌ％)を体積比３：１で混合し、その混合液を超低温フリーザ(三洋電機製（株）)にて−８０℃で保存し、冷凍ストックとした。【００４７】
〔糸状菌の発芽及びペレット化〕
ＰＤＢ培地５０ｍＬおよび０．００４５％（ｗ/ｖ）のカチオン化ポリビニルアルコールを５００ｍＬ容三角フラスコに入れた。三角フラスコを熱滅菌した後に、冷凍しておいた胞子懸濁液を解凍した後に、１×１０4個−胞子／ｍＬとなるように培地に植菌して、振とう機（ＰＲＥＣＩ社、ＰＲＸＹｇ−９８Ｒ）にて２８℃、２２０ｒ／ｍｉｎの振盪条件にて２日間培養を行い、糸状菌ペレットを得た。【００４８】
＜糸状菌ペレット１個当たりの密度の測定＞
培養終了後、得られた菌体を含む培養液５０ｍＬについて上記実施例１と同様の手法により洗浄を行った後、糸状菌ペレット密度［ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3］を算出した。【００４９】
［比較例１］
＜糸状菌ペレットの調製＞
〔胞子懸濁液の調製〕
上記実施例１と同様の手法により、胞子懸濁液を調製した。【００５０】
〔糸状菌のペレット化〕
ＰＤＢ培地２００ｍＬおよび０．５％（ｗ／ｖ）のソルビタンモノラウレートを５００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコに入れた。三角フラスコを熱滅菌した後に、胞子懸濁液を２×１０3個−胞子／ｍＬとなるように培地に植菌して、振とう機（ＰＲＥＣＩ社、ＰＲＸＹｇ−９８Ｒ）にて２７℃、１７０ｒ／ｍｉｎの振盪条件にて３日間培養を行い、糸状菌ペレットを得た。【００５１】
＜糸状菌ペレット１個当たりの密度の測定＞
培養終了後、上記実施例１と同様の手法により洗浄を行った後、糸状菌ペレット密度［ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3］を算出した。【００５２】
[比較例２]
添加剤を用いずに比較例１と同様の手法で培養を行った。【００５３】
[比較例３]
添加剤としてポリビニルアルコール（０．５％（ｗ/ｖ））を使用した以外は比較例２と同様の手法で糸状菌ペレットを得た。【００５４】
[比較例４]
添加剤としてポリアクリル酸ナトリウム（０．５％（ｗ/ｖ））を使用した以外は比較３と同様の手法で糸状菌ペレットを得た。【００５５】
[比較例５]
添加剤を用いずに実施例１６と同様の手法で培養を行った。【００５６】
実施例１〜１６及び比較例１〜５の結果を表１及び表２に示す。【００５７】
【表１】
2018221482.tif 000002
【００５８】
【表２】
2018221482.tif 000003
【００５９】
表１及び表２より明らかなように、実施例１〜１６で調製した糸状菌ペレットは、比較例１〜５の糸状菌ペレットと比較して高い菌糸密度を有していた。【００６０】
［実施例１７］
＜糸状菌ペレットの調製＞
〔胞子懸濁液の調製〕
上記実施例１と同様の手法により、胞子懸濁液を調製した。【００６１】
〔糸状菌のペレット化〕
糸状菌ペレットの調製は以下の２段階の培養にて行った。１段目の培養が胞子の発芽とペレット化の工程であり、２段目の培養がペレットの増殖工程である。
１段目の培養は、ペレット形成培地であるＰＤＢ培地を３０Ｌ容通気撹拌槽（（株）三ツワフロンテック製）に仕込み、熱滅菌を行った後に、滅菌済みのポリアリルアミン（分子量１５，０００、電荷密度１７．５、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．製）を０．００１５％（ｗ／ｖ）になるように含ませ、胞子懸濁液を１×１０4個−胞子／ｍＬとなるように植菌した。培地液量は滅菌水を加え１５Ｌに調整し、液温２７℃、撹拌速度３００ｒ／ｍｉｎ、槽内圧力０．０４０ＭＰａ、空気を供給しＤＯを１．０ｐｐｍに制御した条件で３日間培養を行った。また、消泡センサーを用いて発泡時には消泡剤（１％  ＫＭ−７２Ｆ（信越化学製））が添加されるように制御を行った。【００６２】
２段目の培養は、まず槽内を加圧した状態で、培養液の上清を槽内に設置した２５０μｍ目開きの金属フィルターを介して、３０Ｌ容通気撹拌槽から抜液した。その後、滅菌済みの増殖培地を槽内に仕込んだ後に、滅菌済みの蒸留水を槽内液量が１５Ｌへとなるように添加し、培地濃度を下記となるよう各化合物を添加した。培地濃度は、グルコース（和光純薬工業社製）  ６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物  ０．０２５％（ｗ／ｖ）、硫酸亜鉛七水和物  ０．００９％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウム  ０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素一カリウム  ０．０６％（ｗ／ｖ）である。培養は２７℃，撹拌速度３００ｒ／ｍｉｎ、槽内圧力０．０４０ＭＰａ、空気を供給しＤＯを２ｐｐｍに制御した条件で１２時間培養を行った。培養中のｐＨは７Ｎ水酸化ナトリウムを適宜添加して、４を維持した。また、１段目の培養と同様に発泡時には消泡剤（１％  ＫＭ−７２Ｆ）が添加されるように制御を行った。【００６３】
〔ペレットの回収〕
上記の操作で得られた糸状菌ペレット培養液を、ナイロンメッシュフィルターにてろ液のドリップが落ち着くまで数十秒ろ過し、ウエット状態の糸状菌ペレットを得た。２段目で得られたペレットは速やかに発酵性の評価に供した。一部は、上記実施例１と同様の手法により洗浄を行った後、糸状菌ペレット密度［ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3］を算出した。【００６４】
＜フマル酸及びエタノール生産性の評価＞
〔培養方法〕
滅菌済みの１Ｌ容通気撹拌槽に滅菌済みの培地と調製した糸状菌ペレット（ウエット状態）を添加した後に、滅菌済みの蒸留水を加え、液量を５００ｍＬに調整した。この際の培地組成は、グルコース（和光純薬工業社製）１０％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物  ０．０２５％（ｗ／ｖ）、硫酸亜鉛七水和物  ０．００９％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウム  ０．１％（ｗ／ｖ）、残りは水、であり、培地に対する糸状菌ペレットの占有体積が３６ｖｏｌ％になるようにした。その直後に培養０時間目のサンプリングを行った後、３５℃、撹拌速度５００ｒ／ｍｉｎ、通気速度０．３〜１．０ｖｖｍで高濃度酸素（＞９０％）を供給した条件にて培養を行った。その後経時的にサンプリングを行いながら、５時間培養を行った。ｐＨは７Ｎ水酸化ナトリウム溶液を適宜添加して、ｐＨ（３５℃）４を維持した。【００６５】
〔高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）による各種成分の測定〕
サンプリングした発酵液を孔径が０．２０μｍのセルロースアセテート製メンブレンフィルタ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて濾過した後、０．００８５Ｎ硫酸水溶液で適宜希釈し、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。ＨＰＬＣの分析条件は、次の通りである。
・カラム    ：ＩＣＳｅｐ  ＩＣＥ−ＩＯＮ−３００
・溶離液    ：０．００８５規定硫酸、０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・検出法    ：ＲＩ（ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｌ−２４９０）
・カラム温度：４０℃
・注入液量  ：２０μＬ
・保持時間  ：４０ｍｉｎ【００６６】
この分析系における各成分の保持時間は、次の通りである。
・グルコース：１６ｍｉｎ
・フマル酸  ：２６ｍｉｎ
・エタノール：３４ｍｉｎ【００６７】
〔生産速度の算出〕
発酵液の分析値から、（１）糖の消費速度（Ｐ［ｇ／Ｌ／ｈ］）、（２）フマル酸生産速度（Ｑ［ｇ／Ｌ／ｈ］）及び（３）エタノール生産速度（Ｒ［ｇ／Ｌ／ｈ］）の３項目を評価軸とした。ＨＰＬＣ分析結果より各成分の濃度［ｇ／Ｌ］を求めて、以下の式（１）〜（３）により速度を算出した。【００６８】
糖の消費速度
Ｐ［ｇ／Ｌ／ｈ］＝（Ｇ0−Ｇ）／  Ｔ                  （１）
フマル酸生産速度
Ｑ［ｇ／Ｌ／ｈ］＝（Ｆ−Ｆ0）／  Ｔ                  （２）
エタノール生産速度
Ｒ［ｇ／Ｌ／ｈ］＝（Ｅ−Ｅ0）／  Ｔ                  （３）
（式中、Ｇ0、Ｆ0及びＥ0は、培養０時間のグルコース濃度、フマル酸濃度、エタノール濃度を示し、Ｇ、Ｆ及びＥは、培養後のグルコース濃度、フマル酸濃度、エタノール濃度を示し、Ｔは発酵時間（ｈ）を示す。）【００６９】
［比較例６］
＜糸状菌ペレットの調製＞
〔胞子懸濁液の調製〕
上記実施例１と同様の手法により、胞子懸濁液を調製した。【００７０】
〔糸状菌のペレット化〕
糸状菌ペレットの調製は以下の２段階の培養にて行った。
１段目の培養は、ソルビタンモノラウレート０．５％（ｗ／ｖ）およびＰＤＢ培地および０．５％（ｗ／ｖ）のソルビタンモノラウレートを３０Ｌ容通気撹拌槽（（株）三ツワフロンテック製）に仕込み、熱滅菌を行った後に、胞子懸濁液を１×１０4個−胞子／ｍＬとなるように植菌した。培地液量は滅菌水を加え１５Ｌに調整し、液温２７℃、撹拌速度３００ｒ／ｍｉｎ、槽内圧力０．０４０ＭＰａ、空気を供給しＤＯを１．０ｐｐｍに制御した条件で３日間培養を行った。また、消泡センサーを用いて発泡時には消泡剤（１％  ＫＭ−７２Ｆ（信越化学製））が添加されるように制御を行った。【００７１】
２段目の培養は、実施例１７と同様の手法で行った。【００７２】
〔ペレットの回収〕
培養終了後、上記実施例１７と同様の手法によりウエット状態の糸状菌ペレットを得、速やかに発酵性の評価に供した。一部は、糸状菌ペレット密度［ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌ／ｃｍ3］を算出した。【００７３】
＜フマル酸及びエタノール生産性の評価＞
上記実施例１７と同様の手法で行った。【００７４】
実施例１７及び比較例６の評価結果を表３に示す。なお、結果は培養開始から培養終了５時間までの速度を採用した。【００７５】
【表３】
2018221482.tif 000004
【００７６】
表３より明らかなように、本発明の菌糸密度の高い糸状菌ペレットを利用することにより、フマル酸及びエタノールの生産速度が向上することが確認された。
【国際調査報告】
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