(57)【要約】  本発明の解決課題は、実用にかなう優れた氷結晶化阻害活性を有する氷結晶化阻害物質を、食品製造に利用できる安全な工程で、簡単に、効率よく、安価に提供することである。本発明に係る氷結晶化阻害物質を含む植物抽出物を製造するための第一方法は、氷結晶化阻害物質を含む植物を乾燥する工程；および、乾燥した植物から氷結晶化阻害物質を抽出する工程を含むことを特徴とする。また、本発明に係る氷結晶化阻害物質を含む植物抽出物を製造するための第二方法は、植物から氷結晶化阻害物質を抽出する工程；および、抽出物を吸着体で処理する工程を含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
氷結晶化阻害物質を含む植物抽出物を製造するための方法であって、
氷結晶化阻害物質を含む植物を乾燥する工程；および
乾燥した植物から氷結晶化阻害物質を抽出する工程；
を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項２】
凍結乾燥法または通風乾燥法により植物を乾燥する請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
さらに、抽出物を吸着体で処理する工程を含む請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
植物としてスプラウトを用いる請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
植物としてアブラナ科植物を用いる請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
植物としてＢｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａを用いる請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
水により氷結晶化阻害物質を抽出する請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
さらに、植物を乾燥する前に、低温馴化する工程を含む１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
０℃以上、２０℃以下で低温馴化を行う請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
低温馴化を３日間以上行う請求項８または９に記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法により得られる植物抽出物であって、氷結晶化阻害活性を有することを特徴とする植物抽出物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の植物抽出物であって、ショ糖を３０ｗ／ｖ％含む植物抽出物の溶液を−４０℃に冷却した後に−６℃まで温度を上げ、顕微鏡により観察した氷結晶の平均面積が、乾燥工程を経ない以外は同様の製造方法で得られる植物抽出物を同様に処理して測定される平均面積に比べて、５％以上低いことを特徴とする植物抽出物。
【請求項１３】
請求項１１もしくは１２に記載の植物抽出物、または請求項１１もしくは１２に記載の植物抽出物の乾燥物を含むことを特徴とする氷結晶化阻害物質含有組成物。
【請求項１４】
氷結晶化阻害物質を含む植物抽出物を製造するための方法であって
植物から氷結晶化阻害物質を抽出する工程；および
抽出物を吸着体で処理する工程；
を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項１５】
吸着体として、活性炭、アクリル系合成吸着体、アクリル酸系陽イオン交換樹脂、メタアクリル酸系陽イオン交換樹脂またはシリカゲルを用いる請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
抽出物に含まれるタンパク質１重量部あたり０．１重量部以上の吸着体を用いる請求項１４または１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
植物としてスプラウトを用いる請求項１４〜１６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１８】
植物としてアブラナ科植物を用いる請求項１４〜１７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１９】
植物としてＢｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａを用いる請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
水により氷結晶化阻害物質を抽出する請求項１４〜１９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２１】
さらに、植物を乾燥する前に、低温馴化する工程を含む１４〜２０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２２】
０℃以上、２０℃以下で低温馴化を行う請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２３】
低温馴化を３日間以上行う請求項２１または２２に記載の製造方法。
【請求項２４】
請求項１４〜２３のいずれかに記載の製造方法により得られる植物抽出物であって、氷結晶化阻害活性を有することを特徴とする植物抽出物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の植物抽出物、または請求項２４に記載の植物抽出物の乾燥物を含むことを特徴とする氷結晶化阻害物質含有組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、氷結晶化阻害物質を含む植物抽出物およびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体における低温時の防御物質として、植物、魚類、昆虫、菌類、細菌等が産生する氷結晶化阻害物質が発見されている。これらの氷結晶化阻害物質は、霜害防除剤、冷凍食品の品質向上、細胞や組織等の生体材料の保存、低温手術での利用等において有用であるとされている。【０００３】
氷結晶化阻害物質を含む生物として、例えば、植物としてはイネ科の植物や（非特許文献１〜３）、ダイコン等のアブラナ科の植物（特許文献１〜３）が知られている。これらの植物由来の氷結晶化阻害物質は、その含量が少なく、実用化において製造方法に課題がある。また、魚類では、例えば、カジカ科等の魚類、昆虫類ではゴミムシダマシの幼虫に由来する氷結晶化阻害物質が知られている（非特許文献４〜６，特許文献４）。しかしながら、魚類又は昆虫類由来の氷結晶化阻害物質を工業的に生産することは困難である。それは、大量調製するために必要な多くの個体数を集めることが困難であり、また、硬い骨格等を持つため精製に高いコストを要することが大きな課題となっているからである。【０００４】
このように、これまでに報告されている氷結晶化阻害物質を含む植物、魚類、昆虫、菌類、細菌等は、生体内に氷結晶化阻害物質を微量しか含まず、その抽出効率が非常に悪かったり、多量に含むものであっても捕獲や培養が難しいといった問題がある。よって、これまでこれら生物から氷結晶化阻害物質を工業的に生産し、食品用途として利用することはできなかった。魚類又は昆虫類の氷結晶化阻害物質については、遺伝子組み換え技術を用いて生産性を高めている報告もある（特許文献５，６）。しかしながら、そのような組換え技術を利用しなくとも、より簡便な方法で効率よく、安価に氷結晶化阻害物質を提供し得る方法が求められている。【０００５】
氷結晶化阻害物質を含有する組成物から、不要物を除去して目的の氷結晶化物質を得る方法としては、例えば限外濾過による分画法（特許文献７，８）や、各種のクロマトグラフィーによる精製法（特許文献２，８）、有機溶媒を用いた分画法（特許文献２，９）についての報告がある。しかしながら、これらの工程には特別な設備や装置が必要であり高いコストを要することが課題であり、また、特に限外濾過やクロマトグラフィーを用いた分画は完了までに長時間を要するなどの問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−２４５６５９号公報
【特許文献２】特開２００３−２５０４７３号公報
【特許文献３】特開２００７−１６９２４６号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ９９／００４９３号パンフレット
【特許文献５】国際公開ＷＯ９２／１６６１８号パンフレット
【特許文献６】国際公開ＷＯ９７／２８２６０号パンフレット
【特許文献７】特開２００４−２７５００８号公報
【特許文献８】特開２００８−１２０７４５号公報
【特許文献９】特開２００６−２２５３１５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Plant Physiology，1994，104，971-980
【非特許文献２】Physiologia Plantarum，1997，100，327-332
【非特許文献３】Plant Physiology，1999，119，1361-1369
【非特許文献４】Can．J．Zool．，1988，66，403-408
【非特許文献５】The Journal of Biological Chemistry，1986，261，15690-15695
【非特許文献６】FEBS Letters，1997，402，17-20
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の解決課題は、実用にかなう優れた氷結晶化阻害活性を有する氷結晶化阻害物質を、食品製造に利用できる安全な工程で、簡単に、効率よく、安価に提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行なった。その結果、氷結晶化阻害物質を含む植物を乾燥処理することによりその植物が有する氷結晶化阻害活性を著しく向上させることができること、また、氷結晶化阻害物質を含んだ植物抽出液を吸着体で処理することにより抽出液中の不要分を選択的に除去し、氷結晶化阻害物質の精製度を著しく向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
本発明に係る氷結晶化阻害物質を含む植物抽出物を製造するための第一方法は、氷結晶化阻害物質を含む植物を乾燥する工程；および、乾燥した植物から氷結晶化阻害物質を抽出する工程を含むことを特徴とする。【００１１】
本発明に係る氷結晶化阻害物質を含む植物抽出物を製造するための第二方法は、植物から氷結晶化阻害物質を抽出する工程；および、抽出物を吸着体で処理する工程を含むことを特徴とする。【００１２】
本発明に係る植物抽出物は、上記の本発明に係る第一方法または第二方法により得られる植物抽出物であって、氷結晶化阻害活性を有することを特徴とする。【００１３】
また、本発明に係る氷結晶化阻害物質含有組成物は、上記植物抽出物、または上記植物抽出物の乾燥物を含むことを特徴とする。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明に係る氷結晶化阻害物質を含む植物抽出物を製造するための第一方法は、氷結晶化阻害物質を含む植物を乾燥する工程；および、乾燥した植物から氷結晶化阻害物質を抽出する工程を含むことを特徴とする。以下、当該方法を工程ごとに説明する。
【００１５】
（１）  乾燥工程
本発明における乾燥工程により、植物の有する氷結晶化阻害物質の活性を著しく向上させることができる。植物から氷結晶化阻害物質を抽出する前に乾燥することでより優れた氷結晶化阻害活性を有する植物抽出液が得られるということは、これまで全く報告の無かった新たな知見である。
【００１６】
本発明に係る氷結晶化阻害物質は、氷結晶の成長を阻害する機能を有する物質を意味するものであり、とくに限定されるものではないが、タンパク質を含む植物由来の抽出物であり、熱ヒステリシスの測定、氷結晶構造の観察、氷再結晶化阻害の測定など公知の方法により定義される氷結晶化阻害活性を有するものである。本発明に係る氷結晶化阻害物質は、単一の化合物であっても、複数の化合物の混合物であってもよい。
【００１７】
本発明方法で用いる植物は、氷結晶化阻害物質を含む植物であれば特に限定されるものではないが、例えば、アブラナ科、セリ科、ユリ科またはキク科に属する植物が挙げられる。アブラナ科に属する植物は、ハクサイ、ダイコン、ブロッコリー、チンゲンサイ、コマツナ、カブ、シロナ、野沢菜、広島菜、ミズナ、マスタード（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）等が挙げられる。セリ科に属する植物はニンジン等が、ユリ科に属する植物はネギ等が、キク科に属する植物は春菊等が挙げられる。これらの中では、アブラナ科植物が好ましく、特にＢｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａが好ましい。また、これらの植物の類縁品種および改良品種も適宜使用することができる。
【００１８】
乾燥に供する植物の形態は、特に限定されるものではなく、植物体の全体でもよく、例えば芽、葉、葉柄等、その一部分であってもよい。また、必要に応じて粉砕や細断等の加工を施したものであってもよい。さらに、後述するように低温馴化など公知の方法によって植物中の氷結晶化阻害物質を適宜誘導した後にこれを乾燥に供してもよい。
【００１９】
本発明に係る植物は、特に限定されるものではないが、好ましくはスプラウトの状態で使用する。本明細書において「スプラウト」とは、植物の新芽を意味するものである。例えば、ラディッシュ、ブロッコリー、マスタード（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、クレス、レッドキャベツ、ケール等の新芽や、カイワレ大根やモヤシを好適に用いることができる。
【００２０】
本発明方法においては、乾燥工程の前に、植物を低温馴化する工程などにより植物中の氷結晶化物質を誘導してもよい。低温馴化の温度としては、特に限定されるものではないが、０℃以上、２０℃以下が好ましい。また低温馴化の期間としては、特に限定されるものではないが、１日以上、より好ましくは３日間以上行うことが好ましい。低温馴化期間の上限は特に制限されないが、長過ぎると製造効率を損なうため、３０日以下が好ましく、２０日以下がより好ましく、１５日以下がさらに好ましい。
【００２１】
乾燥処理の方法としては特に限定されるものではなく、凍結乾燥法、通風乾燥法、真空乾燥法を含む減圧乾燥法、蒸気乾燥法、高周波乾燥法、およびそれらを組合せた方法などを用いることができる。その中でも凍結乾燥法または通風乾燥法が好ましく、通風乾燥法としては特に温風乾燥または熱風乾燥が好ましい。
【００２２】
乾燥処理の温度は、特に限定されるものではないが、−８０℃以上、１６０℃以下の範囲で行うことが好ましい。具体的には、乾燥方法に応じて適宜調節することができる。例えば通風乾燥の温度条件としては、特に限定されるものではないが、植物中の氷結晶化物質の安定性や経済的な処理を実現する観点から、０℃以上が好ましく、４℃以上がより好ましく、１０℃以上がさらに好ましく、１５℃以上がさらに好ましく、最も好ましくは２０℃以上であり、また、１６０℃以下が好ましく、１５０℃以下がより好ましく、１４０℃以下がさらに好ましく、１３０℃以下がさらに好ましく、最も好ましくは１２０℃以下である。
【００２３】
乾燥時間は特に限定されず、用いる植物の種類や乾燥方法などに応じ、より一層優れた氷結晶化阻害活性を示す植物抽出物が得られる範囲で適宜調整すればよいが、通常、１５分間以上、７２時間以下とすることができ、３０分間以上、４８時間以下がより好ましく、１時間以上、２４時間以下がさらに好ましい。
【００２４】
本発明方法では、乾燥した植物をそのまま次の抽出工程に付してもよいが、乾燥後、粉砕や細断を行ってもよい。
【００２５】
（２）  抽出工程
次に、上記乾燥工程において植物内で活性が向上した氷結晶化阻害物質を抽出する。
【００２６】
乾燥処理後の植物から氷結晶化阻害物質を抽出する溶媒は特に限定されるものではないが、水、有機溶媒、超臨界二酸化炭素、亜臨界水などが好ましく例示される。有機溶媒としては、酢酸エチル、メタノール、エタノール、ヘキサン等が挙げられるが、食品加工に使用可能なものであることが好ましく、エタノール等が好ましい。これらの溶媒の中でも水またはエタノールが好ましく、水がより好ましい。また、水とエタノールとの混合溶媒など、水と有機溶媒を混合して用いることも可能である。なお、水には、酢酸ナトリウム緩衝液などの緩衝液が含まれるものとする。
【００２７】
水を用いる場合は、熱水を用いることが好ましく、有機溶媒を用いる場合は、加温した有機溶媒を用いることが好ましい。熱水又は加温した有機溶媒の温度として特に限定されないが、０℃以上、１６０℃以下が好ましく、２０℃以上、１２０℃以下がより好ましい。抽出溶媒の種類や量は、抽出に処する植物体の種類や量により適宜選択することができる。
【００２８】
抽出物の形態は、抽出溶媒などにより異なる。例えば超臨界二酸化炭素を用いて得られた抽出物は固体として得られ、水や有機溶媒などを用いて得られた抽出物は液体として得られる。抽出液は、減圧濃縮などにより溶媒を除去して固体としてもよい。
【００２９】
（３）  吸着体処理工程
以上の工程を経て得られた氷結晶化阻害物質を含む抽出物は、さらに吸着体で処理してもよい。その詳しい条件などは、後述する第二方法で説明する。
【００３０】
本発明に係る氷結晶化阻害物質を含む植物抽出物を製造するための第二方法は、植物から氷結晶化阻害物質を抽出する工程；および、抽出物を吸着体で処理する工程を含むことを特徴とする。
【００３１】
（１’）  抽出工程
本発明に係る第二方法では、植物から氷結晶化阻害物質を抽出する。その詳しい条件などは、第一方法の説明と同様のものとすることができる。また、抽出工程の前に、第一方法と同様に植物の乾燥工程を行ってもよいし、さらに乾燥工程前に低温馴化工程を行ってもよい。
【００３２】
（２’）  吸着体処理工程
本発明に係る第二方法では、抽出工程で得られた抽出物と吸着体を接触させることにより、氷結晶化阻害物質以外の不純物の量を低減する。かかる吸着体処理により植物抽出液中の不要分を選択的に除去し、所要の氷結晶化阻害物質の精製度を著しく向上させることができる。さらに、除去される不要分には多くの植物抽出物が有する色素成分や香気成分なども含まれることから、植物抽出物の脱色・脱臭の効果も併せて期待できる。
【００３３】
抽出物は、液体であればそのまま吸着体と接触させてもよいし、或いは事前に濃縮または希釈してもよい。抽出物が固体である場合には、水、有機溶媒、水と有機溶媒との混合溶媒などに適宜溶解または分散する。
【００３４】
使用する吸着体は、特に限定されるものではないが、例えば合成吸着体、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、架橋デキストラン誘導体、ポリビニル系樹脂、アガロース誘導体、セルロース誘導体等の有機吸着体；活性炭、シリカゲル、アルミナ、ゼオライト、セピオライト、珪藻土、白土（活性白土、酸性白土）等の無機吸着体；親油性合成樹脂；綿花セルロース；再生綿；珪砂；海砂等が挙げられる。
【００３５】
合成吸着体は、その材質により、芳香族系合成吸着体、置換芳香族系合成吸着体、アクリル系合成吸着体などに分類され、例えばセパビーズ（登録商標）ＳＰ８５０及びダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０（以上、三菱化学株式会社製）、アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−１６、ＸＡＤ−１１８０及びＸＡＤ−２０００（以上、株式会社オルガノ製）等の芳香族系合成吸着体や、セパビーズＳＰ２０５、ＳＰ２０６、ＳＰ２０７（以上、三菱化学株式会社製）等の置換芳香族系合成吸着体、ダイヤイオンＨＰ２ＭＧ（三菱化学株式会社製）やアンバーライトＸＡＤ−７（株式会社オルガノ製）等のアクリル系合成吸着体等が挙げられる。
【００３６】
陽イオン交換樹脂からなる吸着体としては、例えばスルホン酸イオンをイオン交換基とする樹脂である、アンバーライトＣＧ−４０００、ＣＧ−５０００、ＣＧ−６０００、ＣＧ−８０００、ＩＲ−１１６、ＩＲ−１１８、ＩＲ−１２０Ｂ、ＩＲ−１２２、ＩＲ−１２４、ＸＴ−１００７、ＸＴ−１００９、ＸＴ−１００２（以上、株式会社オルガノ製）や、アクリル酸系又はメタアクリル酸系の樹脂である、ダイヤイオンＷＫ１０、ＷＫ２０（以上、三菱化学株式会社製）などが挙げられる。
【００３７】
陰イオン交換樹脂からなる吸着体としては、例えば２〜３級アミノ基又は第４級アンモニウム基をイオン交換基とする樹脂であるダイヤイオンＷＡ１０、ＷＡ２０、ＷＡ３０、ＷＡ２１Ｊ、ＳＡ２０Ａ（以上、三菱化学株式会社製）などが挙げられる。
【００３８】
架橋デキストラン誘導体からなる吸着体としては、例えばセファデックス（登録商標）ＬＨ２０、ＬＨ６０（以上、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）などが挙げられる。
【００３９】
ポリビニル系樹脂からなる吸着体としては、例えばトヨパール（登録商標）ＨＷ−４０、５０（東ソー株式会社製）などが挙げられる。
【００４０】
アガロース誘導体からなる吸着体としては、例えばセファロース（登録商標）ＣＬ、４Ｂ、６Ｂ（以上ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）などが挙げられる。
【００４１】
セルロース誘導体からなる吸着体としては、例えばセルロファイン（登録商標）ＣＬ−９０、ＧＣＬ−３００、ＧＣＬ−１０００（以上、生化学工業株式会社製）などが挙げられる。
【００４２】
活性炭は、その形状から、粉末状活性炭、粒状活性炭、破砕状炭、球形炭、繊維状活性炭等に分類される。その由来原料としては、例えばオガコ、木炭、椰子殻等の植物原料、石炭等の化石原料、フェノール樹脂、ポリエステル樹脂等の合成樹脂原料などが挙げられ、これらの原料を炭化、賦活して各種の活性炭が製造される。賦活には例えば水蒸気や塩化水素、一酸化炭素、二酸化炭素、酸素等を用いるガス賦活；アルカリ、酸又は塩による薬品賦活等が挙げられる。本発明に用いられる活性炭としては、例えば、粉末状活性炭である太閤Ｓ、太閤ＦＣ、太閤Ｋ（以上、二村化学工業株式会社製）や、活性炭素粉末（和光純薬工業製）等を用いることができる。
【００４３】
シリカゲルとしては、公知のもの及び通常市販されているものをいずれも使用できる。形状も種々知られているが、とくに制限はない。例えばワコーゲルＣ−１００、Ｃ−２００、Ｃ−３００（以上、和光純薬工業株式会社製）等を用いることができる。
【００４４】
ゼオライトは結晶中に微細孔を持つアルミノ珪酸塩の総称であり、例えばＸ型ゼオライト、Ｙ型ゼオライト、モルデナイト等の天然ゼオライトや、Ａ型ゼオライト、ホージャサイト型ゼオライト、ソーダライト型ゼオライトなどの合成ゼオライトが挙げられる。ゼオライトとしては、公知のもの及び通常市販されているものをいずれも使用できる。
【００４５】
セピオライトは含水マグネシウム珪酸塩を主成分とする鎖状粘土鉱物であり、その結晶中にトンネルを持つ特異な鎖状結晶構造により吸着及び脱臭能を有する。セピオライトとしては、公知のもの及び通常市販されているものをいずれも使用できる。
【００４６】
珪藻土は藻類の一種である珪藻の化石よりなる堆積物であり、二酸化ケイ素を主成分とする多孔体である。珪藻土としては、公知のもの及び通常市販されているものをいずれも使用できる。
【００４７】
活性白土や酸性白土などの白土は、シリカ層、アルミナ層、シリカ層の三層からなる結晶構造体であり、陽イオン交換能や吸着能を有している。白土としては、公知のもの及び通常市販されているものをいずれも使用できる。
【００４８】
親油性合成樹脂としては、例えばポリエチレンやポリプロピレン、ポリエステル、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリル、ポリカーボネート等、公知のもの及び通常市販されているものをいずれも使用できる。
【００４９】
綿花セルロース、再生綿、珪砂、海砂は、いずれも公知のもの及び通常市販されているものをいずれも使用できる。
【００５０】
上記の吸着体は、抽出液中の氷結晶化阻害物質との親和性が低く、且つ抽出液中の他の成分との吸着性が高いという性質を有することが好ましい。そのような吸着体としては、例えば、活性炭が好ましい。抽出液との混合等、操作性の観点から、粉末状活性炭が特に好ましい。
【００５１】
吸着体の添加量は、植物抽出液に含まれる固形分量、タンパク量、溶媒の種類、吸着体の種類等に応じて適宜設定すればよい。特に限定されるものではないが、例えば、抽出物中のタンパク質１重量部に対して０．００１重量部以上が好ましく、０．０１重量部以上がより好ましく、０．１重量部以上がさらに好ましく、また、１００重量部以下が好ましく、８０重量部以下がより好ましく、５０重量部以下がさらに好ましい。上記割合が０．００１重量部よりも少ないと不要分の除去が不充分である可能性があり、１００重量部を超えると処理後の溶液の回収率が悪くなるという問題が生じ得るため、好ましくない。
【００５２】
抽出物と吸着体との接触は、いかなる方法で行ってもよい。例えば、吸着体を抽出物に加え、一定時間後に吸着体を除去するバッチ法や、吸着体をカラムに充填し、これに抽出物を通過させるカラム法などが挙げられる。なお、上述したように、抽出物が液体であればそのまま吸着体と接触させればよいし、固体であれば溶液または分散液とした上で接触させればよい。
【００５３】
抽出物と吸着体との接触時間や吸着処理の回数などは、抽出物に含まれるタンパク質や抽出物の氷結晶化阻害活性などに応じて適宜調節すればよい。
【００５４】
以上で説明した本発明に係る方法により製造された植物抽出物は、氷結晶化阻害活性を有する。
【００５５】
本発明に係る氷結晶化阻害活性を有する植物抽出物は、水が氷結晶化することで障害が生じる様々な分野において、この障害を抑制する目的で利用可能である。例えば、食品分野、機械分野、土木分野、化粧品分野、生体材料を用いる医療分野等で利用可能である。
【００５６】
食品分野では、食品に含まれる水の氷結晶化を抑制することで、当該食品の味の劣化等を防ぐことができる。例えば、澱粉老化を防止したり、また、食品中の水が氷結晶化して、タンパク質や油脂成分等を物理的に圧迫して、その構造を変化させることによる味や品質等の劣化を抑制したりすることができる。
【００５７】
機械分野、土木分野では、機械の可動部、道路、地盤等の凍結防止剤として利用できる。
【００５８】
化粧品分野では、化粧品の品質の劣化等を防ぐための添加剤として利用できる。例えば、油脂成分を含む化粧品を凍結保存のため凍結させると、当該化粧品に含まれる水が氷結晶化して、当該油脂成分を物理的に圧迫してその構造を壊すことがあり、品質及び使用感が劣化するため、従来、化粧品の凍結保存は困難であった。しかし本発明に係る植物抽出物を用いれば、水の氷結晶化を防ぐことで油脂成分の構造が保持されるため、品質の劣化等を抑制することができる。
【００５９】
医療分野では、生体材料を凍結保存する際の保護剤として用いることができる。例えば、細胞、血液、臓器等の組織等の生体材料を従来公知の保存液に入れて凍結保存すると、保存液中の水分が凍結して氷結晶を生じ、当該氷結晶により生体材料が損傷することがある。しかし、本発明に係る植物抽出物を添加すれば、氷結晶の発生、成長を抑制することができるので、生体材料を氷結晶による損傷から保護することができる。
【００６０】
本発明の植物抽出物はそのまま用いることができるが、必要に応じて、さらに精製を行ってもよい。例えば、デカンテーション、濾過、遠心分離等により夾雑成分を除去してもよい。また例えば、塩析や有機溶媒による沈殿や、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過等による精製、透析や限外濾過等による濃縮等を行ってもよい。さらに必要により、粉末状または顆粒状など任意の形態に固形化してもよい。固形化の方法はとくに限定されないが、例えば、上記の抽出物を噴霧乾燥や凍結乾燥等の常法に従って粉末化する方法や、抽出物を賦形剤に吸着、担持させて粉末または顆粒状に固形化する方法などを挙げることができる。これらの操作は当業者に公知のものであり、用途に応じて適宜選択して用いることができる。
【００６１】
本発明の植物抽出物は、そのまま用いてもよいし、或いは、植物抽出物または植物抽出物の乾燥物を含む氷結晶化阻害物質含有組成物として用いてもよい。その形態は、用途に応じて様々であり、例えば、溶液、濃縮液、懸濁液、凍結乾燥物、粉末、顆粒、錠剤などであってもよい。
【００６２】
次に、本発明に係る植物抽出物の氷結晶化阻害活性の測定方法、及びタンパク質量の測定方法について説明する。
【００６３】
本発明の抽出物の氷結晶化阻害活性の測定方法は、植物の種類などに応じて適宜適したものを用いる。例えば、熱ヒステリシスの測定、氷結晶構造の観察、氷再結晶化阻害の測定などの公知の方法にて行うことができ、何れかの方法で氷結晶化阻害活性の向上が認められる場合は、本発明範囲に含まれるものとする。氷結晶化阻害活性の測定は、例えば、ショ糖を３０ｗ／ｖ％含む植物抽出物溶液を−４０℃に冷却した後に−６℃まで温度を上げ、顕微鏡により観察した氷結晶の平均面積を測定することにより行うことができる。氷結晶化阻害活性が強いほどこの氷結晶の平均面積は小さくなることから、この数値を指標として、植物抽出物の氷結晶化阻害活性を定量的に評価することができる。なお、ここで測定できる「植物抽出物の氷結晶化阻害活性」とは、植物抽出物から溶媒を除去した固形分に水とショ糖を加えて３０ｗ／ｖ％のショ糖を含む溶液とした場合における氷結晶化阻害活性をいうものとする。
【００６４】
本発明に係る第一方法により得られた植物抽出物の氷結晶化阻害活性は、例えば、上記方法で測定された氷結晶の平均面積を、乾燥工程を経ない以外は同様の製造方法で得られる植物抽出物を同様に処理して測定される平均面積に比べることにより測定することができる。本発明に係る第一方法により得られた植物抽出物としては、上記方法で測定された氷結晶の平均面積が、乾燥工程を経ない以外は同様の製造方法で得られる植物抽出物を同様に処理して測定される平均面積に比べて５％以上低いものが好ましい。
【００６５】
本発明の抽出物のタンパク質量の測定方法は、特に限定されるものではないが、例えばＬｏｗｒｙ法やビシンコニン酸（ＢＣＡ）法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ法）などの公知の方法にて行うことができる。標準タンパク質としては、特に限定されないが、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を好適に用いることができる。
【実施例】
【００６６】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された特許文献及び非特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。【００６７】
実施例１  乾燥後抽出による抽出物の製造
市販のマスタードスプラウト（村上農園製，４０ｇ）を−８０℃の冷凍庫内で一晩凍結した後に、凍結乾燥機（東京理化機器製，品番：ＦＤ−５Ｎ）で乾燥し、乾燥物（２．０ｇ）を得た。この乾燥物に水（８０ｍＬ）を加え、１０５℃、０．１２ＭＰａで２０分間加圧抽出した。濾紙（アドバンテック社製，保留粒子径：５μｍ）を用いて濾過した後、回収した濾液を減圧濃縮装置（東京理化機器製ロータリーエバポレーター，品番：Ｎ−１０００−Ｓ−Ｗ）で減圧乾燥し、抽出物（８２０ｍｇ）を得た。さらにこの抽出物を濃度が１００ｍｇ／ｍＬとなるように水に溶解した。この溶液のタンパク質濃度を、ピアース社製のＢＣＡキットを用い、ＢＣＡ法によって測定したところ、２７．８ｍｇ／ｍＬであった。【００６８】
実施例２  乾燥後抽出による抽出物の製造
実施例１に記載のマスタードスプラウト（４０ｇ）を金属製トレーにとり、温度４０℃の恒温乾燥機内にて温風乾燥し、乾燥物（１．８ｇ）を得た。実施例１に記載の方法と同様に、この乾燥物を熱水抽出した後に濾液を濃縮し、得られた抽出物（９２０ｍｇ）を濃度が１００ｍｇ／ｍＬとなるように水に溶解した。この溶液のタンパク質濃度をＢＣＡ法によって測定したところ、２５．４ｍｇ／ｍＬであった。【００６９】
比較例１
実施例１に記載のマスタードスプラウト（４０ｇ）を乾燥せず、そのまま水（８０ｍＬ）を加えた以外は実施例１と同様にして、１０５℃、０．１２ＭＰａで２０分間加圧抽出し、抽出物（８６０ｍｇ）を得た。この抽出物を濃度が１００ｍｇ／ｍＬとなるよう水に溶解し、溶液のタンパク質濃度をＢＣＡ法で測定したところ、３０．１ｍｇ／ｍＬであった。【００７０】
実施例３  氷結晶化阻害活性の測定
実施例１、２および比較例１で得た抽出物の水溶液を、６０ｗ／ｖ％のショ糖溶液と１：１（ｖ／ｖ）の割合で混合した。当該混合物（１μＬ）をカバーガラスで挟み込んだ。加熱冷却載物台（ＬＩＮＫＡＭ社製，ＬＫ‐６００ＰＭ）を備えた光学顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社製，ＢＸ５０）のガラスシャーレを２０℃に保ち、その上に上記カバーガラスを載せて、１００℃／ｍｉｎの速度で−４０℃まで冷却した。次に、１００℃／ｍｉｎの速度で−６℃まで温度を上げた。−６℃になった時を０分として、その後、光学顕微鏡をそのままの状態に保ち、３０分後の画像を取り込んだ。得られた画像中に存在する氷結晶の平均面積を算出し、これを氷結晶化阻害活性の指標とした。この結果を表１に示す。表１は、それぞれの水溶液について測定して得られた画像中の氷結晶の平均面積を、比較例１の平均面積に対する比として数値化した結果である。【００７１】
【表１】
2010093014.tif 000002
【００７２】
表１に示すように、マスタードスプラウトを乾燥した後に抽出して得られた実施例１及び実施例２の抽出物の水溶液について氷結晶化阻害活性を測定した結果、氷結晶の平均面積は比較例１の抽出物の水溶液よりも小さい値であった。氷結晶の平均面積が小さいほど、氷結晶化阻害活性が強いことを示している。この結果から、凍結乾燥および４０℃の温風乾燥によりマスタードスプラウトから抽出される氷結晶化阻害物質の氷結晶化阻害活性が向上することは明らかである。【００７３】
実施例４  低温馴化と乾燥後の抽出による抽出物の製造
市販のマスタードスプラウトを１５℃にて低温馴化し、氷結晶化阻害物質を誘導した。馴化１０日目のマスタードスプラウト（２５ｇ）を実施例１に記載の方法と同様にして凍結乾燥し、乾燥物（１．３ｇ）を得た。この乾燥物に水（５０ｍＬ）を加え、１０５℃、０．１２ＭＰａで２０分間加圧抽出した後に濾液を乾燥し、抽出物（３３０ｍｇ）を得た。この抽出物を濃度が１００ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、溶液のタンパク質濃度をＢＣＡ法によって測定したところ、２６．６ｍｇ／ｍＬであった。【００７４】
実施例５  低温馴化と乾燥後の抽出による抽出物の製造
実施例４で低温馴化したマスタードスプラウト（２５ｇ）を金属製トレーに取り、実施例２に記載の方法と同様にして４０℃で温風乾燥し、乾燥物（１．２ｇ）を得た。この乾燥物に水（５０ｍＬ）を加え、１０５℃、０．１２ＭＰａで２０分間加圧抽出した後に濾液を乾燥し、抽出物（２４０ｍｇ）を得た。この抽出物を濃度が１００ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、溶液のタンパク質濃度をＢＣＡ法によって測定したところ、３０．１ｍｇ／ｍＬであった。【００７５】
実施例６  低温馴化と乾燥後の抽出による抽出物の製造
実施例４で低温馴化したマスタードスプラウト（２５ｇ）を金属製トレーに取り、温度９０℃の恒温乾燥機内にて熱風乾燥し、乾燥物（２．３ｇ）を得た。この乾燥物に水（５０ｍＬ）を加え、１０５℃、０．１２ＭＰａで２０分間加圧抽出した後に濾液を乾燥し、抽出物（３００ｍｇ）を得た。この抽出物を濃度が１００ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、溶液のタンパク質濃度をＢＣＡ法によって測定したところ、２２．５ｍｇ／ｍＬであった。【００７６】
比較例２
実施例４で低温馴化したマスタードスプラウト（２５ｇ）を乾燥せず、そのまま水（５０ｍＬ）を加え、１０５℃、０．１２ＭＰａで２０分間加圧抽出し、抽出物（３５０ｍｇ）を得た。この抽出物を濃度が１００ｍｇ／ｍＬとなるように水に溶解し、溶液のタンパク質濃度をＢＣＡ法で測定したところ、２４．６ｍｇ／ｍＬであった。【００７７】
実施例７  氷結晶化阻害活性の測定
実施例４、５、６および比較例２で得た抽出物の水溶液について、それぞれ実施例３に記載の方法と同様に氷結晶化阻害活性を測定した。得られた画像中の氷結晶の平均面積を比較例２の抽出物の水溶液について得られた氷結晶の平均面積に対する比として数値化した。この結果を表２に示す。【００７８】
【表２】
2010093014.tif 000003
【００７９】
表２に示すように、マスタードスプラウトを低温馴化した後に乾燥した場合においても、乾燥後に抽出して得られる抽出液の水溶液の氷結晶の平均面積（実施例４ないし６）は、乾燥処理を施していない比較例２の抽出物の水溶液の氷結晶の平均面積よりも小さくなっていた。この結果から、低温馴化により氷結晶化阻害活性を誘導した後に、これを凍結乾燥、温風乾燥、または、熱風乾燥することにより、マスタードスプラウト中の氷結晶化物質の氷結晶化阻害活性が向上することは明らかである。【００８０】
実施例８  低温馴化と乾燥後の抽出による抽出物の製造
市販のマスタードスプラウトを１５℃にて低温馴化し、氷結晶化阻害物質を誘導した。馴化１０日目のマスタードスプラウト（５０ｇ）を金属製トレーに取り、実施例２に記載の方法と同様にして４０℃で温風乾燥し、乾燥物（４．１ｇ）を得た。この乾燥物に水（１００ｍＬ）を加え、５０℃で２時間加熱抽出した後に濾液を乾燥し、抽出物（８００ｍｇ）を得た。この抽出物のタンパク質濃度がＢＣＡ法により１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、抽出液（２２ｍＬ）を得た。【００８１】
比較例３
実施例８で低温馴化したマスタードスプラウト（５０ｇ）を乾燥せず、そのまま水（１００ｍＬ）を加え、５０℃で２時間加熱抽出し、抽出物（８８０ｍｇ）を得た。この抽出物のタンパク質濃度がＢＣＡ法で１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、抽出液（２６ｍＬ）を得た。【００８２】
実施例９  氷結晶化阻害活性の測定
実施例８および比較例３で得た抽出液について、それぞれ実施例３に記載の方法と同様に氷結晶化阻害活性を測定した。得られた画像中の氷結晶の平均面積を比較例３の抽出物の水溶液について得られた氷結晶の平均面積に対する比として数値化した結果、その値は０．８８であり、乾燥後に抽出して得られる抽出液の水溶液の氷結晶の平均面積（実施例８）は、乾燥処理を施していない比較例３の抽出物の水溶液の氷結晶の平均面積よりも小さくなっていた。この結果からも、低温馴化による氷結晶化阻害活性の誘導後にこれを乾燥することによって、マスタードスプラウト中の氷結晶化物質の氷結晶化阻害活性が向上すること
は明らかである。【００８３】
実施例１０  低温馴化と乾燥後に抽出し、さらに吸着処理した抽出物の製造
実施例８で得られたタンパク質濃度１０ｍｇ／ｍＬの抽出液（２２ｍＬ）に活性炭（二村化学工業社製，太閤ＦＣ，２２０ｍｇ）を添加し、１５０ｒｐｍにて３０分間振とうしてこれを混合した。遠心分離機（日立ハイテクノロジーズ社製、品番：ＣＲ２２Ｇ）により１０，０００×ｇで３０分間遠心分離して活性炭を除去し、上清（１９ｍＬ）を得た。【００８４】
実施例１１  タンパク質濃度および氷結晶化阻害活性の測定
実施例１０で得た抽出液について、タンパク質濃度をＢＣＡ法で測定した。また、実施例３に記載の方法と同様に氷結晶化阻害活性を測定した。この結果を実施例８の活性炭処理前の抽出液と比較して表３に示す。表３の氷結晶化阻害活性の数値は、それぞれの溶液を測定して得られた画像中の氷結晶の平均面積を、水を試料として同様に測定したときの氷結晶の平均面積に対する比として数値化した相対値である。この数値が小さいほど氷結晶化阻害活性が強いことを示している。【００８５】
【表３】
2010093014.tif 000004
【００８６】
表３に示すように、マスタードスプラウトを乾燥した後に抽出して得られた抽出液を、さらに活性炭で処理すると、溶液中のタンパク質の約８６％が除去された。一方で、氷結晶の平均面積は殆ど変化しておらず、溶液の氷結晶化阻害活性は維持されていた。この結果から、低温馴化による氷結晶化阻害活性誘導後のマスタードスプラウトを、乾燥処理した後に抽出し、さらにこれを活性炭で処理することによって、氷結晶化阻害物質の精製度が著しく向上した抽出物を得ることができることは明らかである。【００８７】
実施例１２  低温馴化と乾燥後の抽出による抽出物の製造
市販のレッドキャベツスプラウトを４℃にて低温馴化し、氷結晶化阻害物質を誘導した。馴化４日目のスプラウト（２０ｇ）を金属製トレーに取り、実施例２に記載の方法と同様にして４０℃で温風乾燥し、乾燥物（０．８ｇ）を得た。この乾燥物に水（８０ｍＬ）を加え、５０℃で２時間加熱抽出した後に濾液を乾燥し、抽出物（３８９ｍｇ）を得た。この抽出物を、その濃度が１００ｍｇ／ｍＬとなるよう水に溶解し、抽出液を得た。【００８８】
比較例４
実施例１２で低温馴化したレッドキャベツスプラウト（２０ｇ）を乾燥せず、そのまま水（８０ｍＬ）を加え、５０℃で２時間加熱抽出し、抽出物（３９０ｍｇ）を得た。この抽出物を、その質濃度が１００ｍｇ／ｍＬとなるように水に溶解し、抽出液を得た。【００８９】
実施例１３  低温馴化と乾燥後の抽出による抽出物の製造
市販のケールスプラウトを４℃にて低温馴化し、氷結晶化阻害物質を誘導した。馴化４日目のスプラウト（２０ｇ）を金属製トレーに取り、実施例２に記載の方法と同様にして４０℃で温風乾燥し、乾燥物（１．２ｇ）を得た。この乾燥物に水（８０ｍＬ）を加え、５０℃で２時間加熱抽出した後に濾液を乾燥し、抽出物（５７７ｍｇ）を得た。この抽出物を、その濃度が１００ｍｇ／ｍＬとなるように水に溶解し、抽出液を得た。【００９０】
比較例５
実施例１３で低温馴化したケールスプラウト（２０ｇ）を乾燥せず、そのまま水（８０ｍＬ）を加え、５０℃で２時間加熱抽出し、抽出物（５５９ｍｇ）を得た。この抽出物を、その質濃度が１００ｍｇ／ｍＬとなるように水に溶解し、抽出液を得た。【００９１】
実施例１４  氷結晶化阻害活性の測定
実施例１２、１３および比較例４、５で得た抽出物の水溶液について、それぞれ実施例３に記載の方法と同様に氷結晶化阻害活性を測定した。実施例１２、１３の抽出液で得られた画像中の氷結晶の平均面積を、それぞれ比較例４、５の抽出物の抽出液について得られた氷結晶の平均面積に対する比として数値化した。この結果を表４に示す。【００９２】
【表４】
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【００９３】
表４に示すように、乾燥後に抽出して得られる抽出物の水溶液（実施例１２、１３）の氷結晶の平均面積は、乾燥処理を施していない比較例４、５の抽出物の水溶液の氷結晶の平均面積よりも小さくなっていた。この結果からも、低温馴化による氷結晶化阻害活性の誘導後に乾燥することによって、スプラウト中の氷結晶化阻害物質の活性が向上することは明らかである。【００９４】
実施例１５  低温馴化後に抽出し、さらに吸着処理した抽出物の製造
（１）  低温馴化後の抽出
市販のマスタードスプラウト（村上農園製）を１５℃にて低温馴化し、氷結晶化阻害活性を誘導した。馴化１０日目のマスタードスプラウト（５０ｇ）に水（１００ｍＬ）を加え、１０５℃、０．１２ＭＰａで２０分間加圧抽出した。濾紙（アドバンテック社製，保留粒子径：５μｍ）を用いて濾過した後、回収した濾液を減圧濃縮装置（東京理化機器製ロータリーエバポレーター，品番：Ｎ−１０００−Ｓ−Ｗ）で減圧濃縮した。さらに、得られた濃縮液を遠心分離機（日立ハイテクノロジーズ社製，品番：ＣＲ２２Ｇ）により１８，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清（８０ｍＬ）を得た。この抽出液のタンパク質濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製のＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  キットを用いたＢｒａｄｆｏｒｄ法で測定したところ、１．０４ｍｇ／ｍＬであった。【００９５】
（２）  吸着処理
上記抽出液（１．０ｍＬ）を１．５ｍＬチューブに取り、粉末状活性炭（二村化学工業株式会社製，太閤ＦＣ）を、１２．５ｍｇ、２５．０ｍｇまたは５０．０ｍｇ加えて攪拌・混合した。また、対照として、上記抽出液に活性炭を加えずに同様に攪拌・混合した。それぞれ遠心分離機（日立ハイテクノロジーズ社製，品番：ＣＲ２２Ｇ）により１０，０００×ｇで３０分間遠心分離して活性炭を除去した上清を回収した。得られた上清をメンブレンフィルター（アドバンテック社製，ｃｅｌｌｕｒｏｓｅ  ａｃｅｔａｔｅ，径：０．４５μｍ）に通して得られた活性炭処理溶液を、以下のタンパク濃度測定及び氷結晶化阻害活性測定に供した。【００９６】
実施例１６  タンパク濃度及び氷結晶化阻害活性の測定
実施例１５で得たそれぞれの活性炭処理溶液および対照の溶液について、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法で測定した。【００９７】
また、氷結晶化阻害活性の測定を以下の方法で行った。実施例１５で得たそれぞれの溶液を、６０ｗ／ｖ％のショ糖溶液と１：１（ｖ／ｖ）の割合で混合した。得られた混合液（１μＬ）をカバーガラスで挟み込んだ。加熱冷却載物台（ＬＩＮＫＡＭ社製，ＬＫ‐６００ＰＭ）を備えた光学顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社製，ＢＸ５０）のガラスシャーレを２０℃に保ち、その上に上記カバーガラスを載せて、１００℃／ｍｉｎの速度で−４０℃まで冷却した。次に、１００℃／ｍｉｎの速度で−６℃まで温度を上げた。−６℃になった時を０分として、その後、光学顕微鏡をそのままの状態に保ち、３０分後の画像を取り込んだ。得られた画像中に存在する氷結晶の平均面積を算出し、これを氷結晶化阻害活性の指標とした。この結果を表５に示す。表５中の氷結晶化阻害活性の値は、それぞれの溶液を測定して得られた画像中の氷結晶の平均面積を、３０ｗ／ｖ％のショ糖溶液を用いて同様に測定したときの氷結晶の平均面積に対する比として数値化した相対値を算出し、さらにその逆数を活性値として、これをタンパク質濃度で除した数値を、対照の活性値に対する比として数値化したものである。この数値が大きいほど氷結晶化阻害物質の比活性が強いことを示している【００９８】
【表５】
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【００９９】
表１に示すように、マスタードスプラウト抽出液のタンパク質濃度は活性炭添加量に応じて著しく減少するが、氷結晶化阻害物質の比活性は著しく増大した。この結果から、マスタードスプラウト抽出液を活性炭で処理することにより、その氷結晶化阻害活性を損なうことなく溶液中の不要分を除去し、氷結晶化阻害物質の精製度を著しく向上できることは明らかである。【０１００】
実施例１７  低温馴化後に抽出し、さらに吸着処理した抽出物の製造
（１）  低温馴化後の抽出
市販のマスタードスプラウトを１５℃にて低温馴化し、氷結晶化阻害物質を誘導した。馴化１０日目のマスタードスプラウト（５０ｇ）に水（１００ｍＬ）を加え、実施例１に記載の方法と同様にして、１０５℃、０．１２ＭＰａで２０分間加圧抽出した。得られた抽出液を減圧濃縮装置で濃縮し、水を除去してこれを固形化することにより抽出物（８８０ｍｇ）を得た。この固形の抽出物を、そのタンパク質濃度がＢＣＡ法により１０ｍｇ／ｍＬとなるように水に再度溶解し、抽出液（２６ｍＬ）を得た。【０１０１】
（２）  吸着処理
上記抽出液（１．０ｍＬ）を１．５ｍＬチューブに取り、これに活性炭（二村化学工業株式会社製，太閤ＦＣ）を、２．５ｍｇ、５．０ｍｇまたは１０．０ｍｇ加え、攪拌・混合した。また、対照として、上記抽出液に活性炭を加えずに同様に攪拌・混合した。それぞれ１０，０００×ｇで３０分間遠心分離して活性炭を除去した上清を回収した。【０１０２】
実施例１８  タンパク質濃度及び氷結晶化阻害活性の測定
実施例１７で得たそれぞれの上清について、タンパク質濃度をＢＣＡ法で測定した。また、実施例１６に記載の方法と同様に氷結晶化阻害活性を測定した。この結果を表６に示す。表６のタンパク質濃度の数値は、対照の溶液について得られたタンパク質濃度に対する比として数値化した。また表６の氷結晶化阻害活性の数値は、それぞれの溶液を測定して得られた画像中の氷結晶の平均面積を、３０ｗ／ｖ％のショ糖溶液を用いて同様に測定したときの氷結晶の平均面積に対する比として数値化した相対値を算出し、さらにその逆数を活性値として、これをタンパク質濃度で除した数値を、対照の活性値に対する比として数値化したものである。この数値が大きいほど氷結晶化阻害物質の比活性が強いことを示している。【０１０３】
【表６】
2010093014.tif 000007
【０１０４】
表６に示すように、マスタードスプラウト抽出液のタンパク質濃度は活性炭添加量に応じて大きく減少するが、氷結晶化阻害物質の比活性は増大した。この結果から、マスタードスプラウト抽出液を活性炭で処理することにより、その氷結晶化阻害物質の精製度を向上できることは明らかである。【０１０５】
実施例１９  低温馴化後に抽出し、さらに吸着処理した抽出物の製造
上記実施例１７（１）で得た抽出液（１．０ｍＬ）を１．５ｍＬチューブに取り、これにシリカゲル（和光純薬工業社製，ワコーゲルＣ−２００，２００ｍｇ）を加えて攪拌・混合した。遠心分離によりシリカゲルを除去した上清を回収した。【０１０６】
実施例２０  低温馴化後に抽出し、さらに吸着処理した抽出物の製造
上記実施例１７（１）で得た抽出液（１．０ｍＬ）を１．５ｍＬチューブに取り、これにアクリル系合成吸着体であるダイヤイオンＨＰ２ＭＧ（三菱化学株式会社製，２００ｍｇ）を加えて攪拌・混合した。遠心分離により吸着体を除去した上清を回収した。【０１０７】
実施例２１  低温馴化後に抽出し、さらに吸着処理した抽出物の製造
上記実施例１７（１）で得た抽出液（１．０ｍＬ）を１．５ｍＬチューブに取り、これに陽イオン交換樹脂であるダイヤイオンＷＫ２０（三菱化学株式会社製，２００ｍｇ）を加えて攪拌・混合した。遠心分離により吸着体を除去した上清を回収した。【０１０８】
比較例６
上記実施例１７（１）で得た抽出液（１．０ｍＬ）を１．５ｍＬチューブに取り、実施例１９〜２１と同様にしてこれを遠心分離し、上清を回収した。【０１０９】
実施例２２  タンパク質濃度及び氷結晶化阻害活性の測定
実施例１９〜２１および比較例６で得たそれぞれの上清について、タンパク質濃度をＢＣＡ法で測定した。また、実施例１６に記載の方法と同様に氷結晶化阻害活性を測定した。この結果を表７に示す。表７のタンパク質濃度の数値は、比較例６の溶液について得られたタンパク質濃度に対する比として数値化した。また表７の氷結晶化阻害活性の数値は、それぞれの溶液を測定して得られた画像中の氷結晶の平均面積を、３０ｗ／ｖ％のショ糖溶液を用いて同様に測定したときの氷結晶の平均面積に対する比として数値化した相対値を算出し、さらにその逆数を活性値として、これをタンパク質濃度で除した数値を、比較例６の活性値に対する比として数値化したものである。この数値が大きいほど氷結晶化阻害物質の比活性が強いことを示している。【０１１０】
【表７】
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【０１１１】
表７に示すように、マスタードスプラウト抽出液のタンパク質濃度は実施例１９〜２１の各吸着体による処理で大きく減少するが、氷結晶化阻害物質の比活性はいずれの吸着体処理においても増大した。この結果から、マスタードスプラウト抽出液をこれらの吸着体で処理することにより、その氷結晶化阻害物質の精製度を向上できることは明らかである。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明に係る氷結晶化阻害物質を含む植物抽出物の第一の製造方法によれば、より一層優れた氷結晶化阻害活性を示す植物抽出物を効率良く製造できるので、優れた氷結晶化阻害活性を有する組成物を提供できるという効果を奏する。また、本発明に係る氷結晶化阻害物質を含む植物抽出物の第二の製造方法によれば、氷結晶化阻害物質の精製度を著しく向上させることができるので、優れた氷結晶化阻害活性を有する組成物を提供できるという効果を奏する。よって、本発明の製造方法を用いることにより、実用にかなう優れた氷結晶化阻害活性を有する氷結晶化阻害物質を、食品製造に利用できる安全な工程で、簡単に、効率よく、安価に提供することが可能になる。
【国際調査報告】
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