(57)【要約】  特定の塩基配列を有する核酸を簡便に且つ短時間で効率的に増幅させることができる、新規な原理に基づく核酸の増幅方法、及び該方法を利用した核酸の検出方法を提供することを目的とする。  (a)増幅対象の塩基配列を含む鋳型ＤＮＡと、前記塩基配列の３’末端側に隣接する領域に相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端が化学修飾されたプライマーを含むプライマー対とを用いてＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を行って、直鎖状ＤＮＡ断片を得ること；及び  (b)増幅対象の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡを鋳型とし、(a)により得られた直鎖状ＤＮＡ断片の３'末端を複製起点として、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を行うこと；を含むことを特徴とする、核酸の増幅方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)増幅対象の塩基配列を含む鋳型ＤＮＡと、前記塩基配列の３’末端側に隣接する領域に相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端が化学修飾されたプライマーを含むプライマー対とを用いてＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を行って、直鎖状ＤＮＡ断片を得ること；及び
(b)増幅対象の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡを鋳型とし、(a)により得られた直鎖状ＤＮＡ断片の３'末端を複製起点として、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を行うこと；
を含むことを特徴とする、核酸の増幅方法。
【請求項２】
化学修飾が、ＲＮＡ残基、ＬＮＡ残基若しくはＥＮＡ残基への変更又はイノシン残基への変更である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
プライマー対を構成する２種類のプライマーが共に化学修飾されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程(a)で使用するプライマー対を構成する各プライマーの５’末端側にそれぞれ設計された２種類のプライマーから構成される第二のプライマー対をさらに添加して工程(a)を行う、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
(a)と(b)とを同一温度条件下で行う、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
増幅対象の塩基配列を含む鋳型ＤＮＡが、ＲＮＡを鋳型とする逆転写によって得られたＤＮＡ鎖を含むものである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
(i)増幅対象の塩基配列の３’末端側に隣接する領域に相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端が化学修飾されたプライマーを含むプライマー対；
(ii)増幅対象の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ；
(iii)鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ；
(iv)ｄＮＴＰ；
を含む、核酸増幅用キット。
【請求項８】
２本鎖の標的核酸分子を検出する方法であって、
(a)標的核酸分子の標的塩基配列の３’末端側に隣接する領域に対して相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端が化学修飾されたプライマーを含むプライマー対；標的塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ；鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ；及びｄＮＴＰ；を、検出対象の試料に添加して、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが活性を有する温度にて酵素反応させること；
(b)酵素反応させた試料中で、核酸が増幅されたか否かを確認すること；及び
(c)核酸が増幅された場合に、検出対象の試料中に２本鎖の標的核酸分子が存在すると決定すること；
を含む前記方法。
【請求項９】
１本鎖の標的核酸分子を検出する方法であって、
(a)標的核酸分子の標的塩基配列の３’末端側に隣接する領域に対して相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端が化学修飾されたプライマー；標的核酸分子の前記標的塩基配列の領域と異なる領域の標的塩基配列の３’末端側に隣接する領域の塩基配列を有し、かつ、３’末端が化学修飾されたプライマー；前記標的塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ；鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ；及びｄＮＴＰ；を、検出対象の試料に添加して、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが活性を有する温度にて酵素反応させること；
(b)酵素反応させた試料中で、核酸が増幅されたか否かを確認すること；及び
(d)核酸が増幅された場合に、検出対象の試料中に１本鎖の標的核酸分子が存在すると決定すること；
を含む前記方法。
【請求項１０】
(i)２本鎖の標的核酸分子の標的塩基配列の３’末端側に隣接する領域に対して相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端が化学修飾されたプライマーを含むプライマー対；
(ii)標的塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ；
(iii)鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ；及び
(iv)ｄＮＴＰ；
を含む、２本鎖の標的核酸分子の検出用キット。
【請求項１１】
(i)１本鎖の標的核酸分子の標的塩基配列の３’末端側に隣接する領域に対して相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端が化学修飾されたプライマー
(ii)標的核酸分子の前記標的塩基配列の領域と異なる領域の３’末端側に隣接する領域の塩基配列を有し、かつ、３’末端が化学修飾されたプライマー；
(iii)標的塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ；
(iv)鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ；及び
(v)ｄＮＴＰ；
を含む、１本鎖の標的核酸分子の検出用キット。
【請求項１２】
(vi)逆転写酵素を更に含む、請求項１０又は１１に記載の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅方法、特には、化学修飾をしたプライマーと環状１本鎖ＤＮＡとの組合せを用いる核酸の増幅方法、前記方法を利用して標的遺伝子の存在の有無を検出する方法及び前記方法に使用する検出用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、研究機関、医療機関、検査機関その他様々な現場において、標的遺伝子の特異的な塩基配列に基づく分析・検出方法が数多く用いられている。例えば、ヒト・動物など生体由来の試料（体液や細胞片）や環境由来の試料に含まれる病原菌、カビ、ダニなどのアレルゲンといった病原性の微生物・微小動物、ウイルスや花粉などの存在を分析・検出する場合にも、それらの検出対象が有する標的遺伝子の特異的な塩基配列を検出する方法が用いられている。これら核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を検出する方法は、タンパク質を検出する方法と比較して、短時間且つ高感度で行うことができる。また、試料中に本来含まれる核酸の量が検出限界以下であっても、無細胞系を用いて比較的簡単に且つ特異的に増幅することができる。これらの利点から、核酸を増幅する方法を利用して、あるいは核酸を増幅する方法と組合せて、標的遺伝子の特異的な塩基配列を検出する方法が数多く開発されている。
現在、最も一般的に使用されている核酸の増幅手法としては、温度サイクルを利用して鋳型の変性、鋳型へのプライマーのアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応のサイクルを数十回行い、プライマー対によって挟まれる領域の核酸を増幅するＰＣＲ法が挙げられる。しかし、温度サイクルを利用して核酸を増幅する方法では、温度サイクルを制御するための機器（サーマルサイクラーなど）が高価であることや、核酸の増幅に最適な温度サイクルの検討・設定などが必要とされるなどの問題点があり、近年は、温度サイクルを利用せずに一定温度条件下でＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を進行させる核酸増幅方法が考えられてきた。その代表的なものとしてＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法（特許文献１）が挙げられるが、その他にも、コスト、検出方法の設計及び操作、検出感度といった点を克服するために、環状１本鎖ＤＮＡとの組合せを用いる核酸の増幅方法も開発されている（特許文献２）。
しかしながら、上記の方法によってもなお、試料中に含まれる検出対象の核酸が微量である場合には必ずしも検出感度が十分ではない場合も存在する。従って、増幅の効率及び検出感度のさらに向上した新たな核酸増幅方法及び検出方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０００／２８０８２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００８／０２６７１９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、特定の塩基配列を有する核酸を簡便に且つ短時間で効率的に増幅させることができる、新規な原理に基づく核酸の増幅方法、及び該方法を利用した核酸の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、特異的塩基配列を有する鋳型核酸分子に対して、前記塩基配列の３’末端側に隣接する領域に相補的な塩基配列を有し、かつ３’末端を化学修飾したプライマーと、前記特異的塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡとの組合せを用いてＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を連鎖的に行うことにより上記の課題を解決できることを見出し、本願発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
(a)増幅対象の塩基配列を含む鋳型ＤＮＡと、前記塩基配列の３’末端側に隣接する領域に相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端が化学修飾されたプライマーを含むプライマー対とを用いてＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を行って、直鎖状ＤＮＡ断片を得ること；及び
(b)増幅対象の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡを鋳型とし、(a)により得られた直鎖状ＤＮＡ断片の３'末端を複製起点として、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を行うこと；
を含むことを特徴とする、核酸の増幅方法を提供する。【０００６】
また、本発明は、
(i)増幅対象の塩基配列の３’末端側に隣接する領域に相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端が化学修飾されたプライマーを含むプライマー対；
(ii)増幅対象の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ；
(iii)鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ；
(iv)ｄＮＴＰ；
を含む、核酸増幅用キットを提供する。【０００７】
また、本発明は、２本鎖の標的核酸分子を検出する方法であって、
(a)標的核酸分子の標的塩基配列の３’末端側に隣接する領域に対して相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端が化学修飾されたプライマーを含むプライマー対；標的塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ；鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ；及びｄＮＴＰ；を、検出対象の試料に添加して、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが活性を有する温度にて酵素反応させること；
(b)酵素反応させた試料中で、核酸が増幅されたか否かを確認すること；及び
(c)核酸が増幅された場合に、検出対象の試料中に２本鎖の標的核酸分子が存在すると決定すること；
を含む前記方法を提供する。【０００８】
また、本発明は、１本鎖の標的核酸分子を検出する方法であって、
(a)標的核酸分子の標的塩基配列の３’末端側に隣接する領域に対して相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端が化学修飾されたプライマー；標的核酸分子の前記標的塩基配列の領域と異なる領域の標的塩基配列の３’末端側に隣接する領域の塩基配列を有し、かつ、３’末端が化学修飾されたプライマー；前記標的塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ；鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ；及びｄＮＴＰ；を、検出対象の試料に添加して、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが活性を有する温度にて酵素反応させること；
(b)酵素反応させた試料中で、核酸が増幅されたか否かを確認すること；及び
(d)核酸が増幅された場合に、検出対象の試料中に１本鎖の標的核酸分子が存在すると決定すること；
を含む前記方法を提供する。【０００９】
また、本発明は、
(i)２本鎖の標的核酸分子の標的塩基配列の３’末端側に隣接する領域に対して相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端が化学修飾されたプライマーを含むプライマー対；
(ii)標的塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ；
(iii)鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ；及び
(iv)ｄＮＴＰ；
を含む、２本鎖の標的核酸分子の検出用キットを提供する。【００１０】
また、本発明は、
(i)１本鎖の標的核酸分子の標的塩基配列の３’末端側に隣接する領域に対して相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端が化学修飾されたプライマー
(ii)標的核酸分子の前記標的塩基配列の領域と異なる領域の３’末端側に隣接する領域の塩基配列を有し、かつ、３’末端が化学修飾されたプライマー； 
(iii)標的塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡ；
(iv)鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ；及び
(v)ｄＮＴＰ；
を含む、１本鎖の標的核酸分子の検出用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、短時間かつ特異的に核酸の増幅が可能な核酸の増幅方法が得られ、該方法を利用することにより核酸の検出感度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の核酸増幅方法の原理（第一段階）を示す。
【図２】第一段階により生成される直鎖上１本鎖ＤＮＡと、環状１本鎖ＤＮＡとの対応を示す。
【図３】本発明の核酸増幅方法の原理（第二段階）を示す。
【図４】λＤＮＡを鋳型とした場合の、プライマーF-in、R-in、F-out、R-outの対応領域及び標的配列の領域Ａ及びＢを示す。
【図５】実験１〜実験３の結果を示す。
【図６】実験４〜実験６の結果を示す。
【図７】実験７〜実験９の結果を示す。
【図８】実験１０〜実験１３の結果を示す。
【図９】比較実験１〜比較実験４の結果を示す。
【図１０】実験１４〜実験１５の結果を示す。
【図１１】実験１６〜実験１７の結果を示す。
【図１２】実験１８〜実２１の結果を示す。
【図１３】実験２２〜実２５の結果を示す。
【図１４】表５の実験３のサンプルの電気泳動の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の核酸増幅方法においては、ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応によって、増幅対象とする塩基配列を１回又は複数回反復して含む多様な鎖長の増幅産物が得られ、これらの増幅産物が鋳型又は複製起点として役割を果たす更なるＤＮＡポリメラーゼ伸長反応が連鎖的に進行して、増幅対象とする塩基配列を効率的に増幅することができる。
本発明の増幅対象の塩基配列（本明細書中では「標的塩基配列」とも呼ぶ）を含む鋳型ＤＮＡは１本鎖又は２本鎖の直鎖状又は環状のＤＮＡであり、この鋳型ＤＮＡ中に含まれる増幅対象の塩基配列は、鋳型ＤＮＡ中において特異的な領域の塩基配列である。また、本発明の方法は、逆転写酵素を用いてＲＮＡ分子に相補的な塩基配列を合成したｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして行うこともできる。この場合には、本発明の増幅対象の塩基配列は、ＲＮＡ分子中ウラシル（Ｕ）であった塩基がチミン（Ｔ）に置き換わった塩基配列である。
【００１４】
本発明の増幅方法に用いるプライマー対は、鋳型ＤＮＡ中の増幅対象の標的塩基配列の３’末端側に隣接する領域に相補的な塩基配列を有するプライマーを含むものであり、鋳型ＤＮＡに基づいて、プライマー対に挟まれた領域を直鎖状ＤＮＡ断片として得ることができるものであればよい。よって、鋳型ＤＮＡが２本鎖のＤＮＡである場合には、プライマー対の各プライマーは、別々の鎖上の標的塩基配列を有する。鋳型ＤＮＡが１本鎖のＤＮＡである場合には、プライマー対のうち一方のプライマーは、鋳型ＤＮＡ鎖上に存在する増幅対象の塩基配列とは異なる領域の標的塩基配列を有する。
【００１５】
ここで、本発明の上記プライマー対は、３’末端が化学修飾されたプライマーを含む。３’末端が化学修飾されたプライマーを基点してＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を行った場合、化学修飾された塩基残基を途中に含むＤＮＡ断片が生成される。前記ＤＮＡ断片を鋳型としてさらにＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を行うと、ＤＮＡポリメラーゼは前記化学修飾された塩基の部分で対応する塩基を追加することができず、従って、ＤＮＡの伸長は化学修飾された塩基の直前で停止する（図面を参照して後述する）。
本発明に使用できる化学修飾は、上記のように、それを含むＤＮＡ断片を鋳型としたＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を停止させるものであれば特に限定されず、当業者が適宜選択することができる。本発明においては、プライマー上の３’末端の塩基を、ＲＮＡ残基、ＬＮＡ（ロック核酸：Locked Nucleic Acid）残基若しくはＥＮＡ（2'-O, 4'-C-Ethylene Bridged Nucleic Acid）残基へ変更すること、又はイノシン残基へ変更することによって、上記の化学修飾を行うことができる。化学修飾する３’末端の塩基の数は特に制限はされず、３’末端から例えば１つ、２つ又は３つの塩基を化学修飾することができるが、通常は３’末端の最末端の１つの塩基のみが化学修飾されていれば本発明を実施することができる。
本発明に使用するプライマー対は、プライマー対を構成する２種類のプライマーの少なくとも一方が化学修飾されていればよいが、２種類のプライマーが共に化学修飾されていることが好ましい。
【００１６】
本発明の方法は、少なくとも１つのプライマー対を用いて行うことができ、複数のプライマー対を用いる場合、その数に上限はないが、例えば入れ子として設計して用いることもできる。例えば１〜５対、好ましくは１〜３対、より好ましくは２〜３対、特に好ましくは２対である。
各プライマーは、対をなすプライマーや他のプライマー対のプライマーと同一の配列や相補的な配列を有していない方が好ましい。
対をなすプライマーが結合する領域間の相対距離（塩基数）は、本発明の反応が進行するのであれば特に制限はないが、最も内側のプライマー対のプライマーが結合する領域間の相対距離はより少ない方が好ましく、その外側のプライマー対と隣接する内側のプライマー対とが結合する領域間の相対距離もより少ない方が好ましい。上記相対距離（塩基数）は、好ましくは５ｂ〜１ｋｂであり、より好ましくは１０〜１００ｂである。
本発明に使用するプライマーとしては、鋳型ＤＮＡと相補的な２重鎖を形成し得るのであれば特に制限はないが、８〜４０merのものが好ましく、より好ましくは１６〜２５merのものである。また、鋳型ＤＮＡ（標的塩基配列）又はプライマーのＧＣ含量、二次構造のとり易さ等、その他プライマー設計において一般的に考慮される性質についても、当業者の技術常識の範囲内のものである。このようなプライマーの設計及び合成は、本技術分野で通常用いられている設計プログラム等の手法を用いて行うことができる。
逆転写酵素を用いてＲＮＡ分子中の塩基配列を合成したｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いる場合も、同様に、該ＲＮＡ分子が２本鎖であるか１本鎖であるかに応じて、上述のようにプライマー対を設計することができる。
【００１７】
本発明の方法で使用する環状１本鎖ＤＮＡは、前記の増幅対象の塩基配列を含むものである。
環状１本鎖ＤＮＡは、前記の増幅対象の塩基配列（即ち標的塩基配列）が一定の間隔で反復して複数含まれるように設計されてもよく、またプライマー対の両方のプライマーが化学修飾されている場合には、それぞれの増幅対象の塩基配列が１回又は複数回反復して含まれていてもよい。
環状１本鎖ＤＮＡ中、標的配列以外の領域の塩基配列は、本発明が特異的に反応するのであれば特に制限はないが、少ない方が好ましい。また、３'→５'エキソヌクレア−ゼ活性を持たない鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合、プライマーと同一の塩基配列の５'側にチミン（Ｔ）を１塩基付加することが好ましい。
環状１本鎖ＤＮＡの鎖長は、本発明が特異的に反応するのであれば特に制限はないが、１６ｂ〜１００ｋｂのものが好ましく、より好ましくは２０〜１００ｂである。このような環状１本鎖ＤＮＡの設計及び合成は、本技術分野で通常用いられている設計プログラム等の手法を用いて行うことができる。また、環状１本鎖ＤＮＡは、国際公開第２００８／０２６７１９号パンフレットの図６に示される環状１本鎖ＤＮＡの製造方法により製造することも可能である。
本発明の方法で使用するＤＮＡポリメラーゼは鎖置換型５'-３'ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するものであり、塩基対の相補鎖を正しく合成するものが好ましい。また３'→５'エキソヌクレア−ゼ活性は持っていても良いが持っていないものが好ましく、５'→３'エキソヌクレア−ゼ活性は持たないものが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼの至適温度は、５０〜９０℃であるのが好ましく、より好ましくは６０〜７２℃である。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばBacillus stearothermophilus由来のBst DNA Polymerase large fragment、Pyrococcus属細菌由来のDeep VentR(R) (exo-) DNA polymerase、Thermococcus属細菌由来の9 degrees North DNA polymerase(New England Biolabs Incorporation製)、Herculase(R)II Fusion DNA polymerase（STRATAGENE社製）、Thermococcus属由来のVentR(R) (exo-) DNA Polymerase、TherminatorTM DNA Polymerase 、TherminatorTMII DNA Polymerase (New England Biolabs Incorporation製）、KOD Dash DNA polymerase (東洋紡社製)といったものが、単独で、あるいはキットの形態で入手可能である。互いの酵素活性を妨げない限りは、２種類以上のＤＮＡポリメラーゼを併用することもできる。
【００１８】
ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応は、一般的な核酸増幅に使用されるバッファー（Tris-HCl、KCl、（NH4）2SO4、MgSO4などの塩類を含む）、例えば使用するＤＮＡポリメラーゼに付属の最適化された組成のものを用いてもよい。
上述するような適切なバッファーに、鋳型ＤＮＡ、本発明のプライマー対、本発明の環状１本鎖ＤＮＡ、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ及び基質となる４種のデオキシリボヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を添加し、この反応溶液を鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが該酵素活性を有する温度、例えば５０〜９０℃、好ましくは６０〜７２℃に保つことによって、温度サイクル制御なしに同一容器内で１回の操作にて核酸を効率的に増幅することができる。また、複数のプライマー対を用いる場合は、本発明の反応温度条件をさらに低い条件、例えば３０〜５０℃に設定することができる。ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応の温度条件は、用いる鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの活性を有する温度に依存する。使用する鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが該酵素活性を有する温度の範囲内であれば、必ずしも増幅反応全体を通して同一温度（等温）を保たなくてもよいが、増幅反応全体を通して同一温度（等温）に保つこと（同一温度条件下）が好ましい。
核酸の増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応で核酸が増幅される際に反応溶液中で生成するピロリン酸マグネシウムの沈殿によって確認することができる（国際公開第２００１／０８３８１７号パンフレット）。また、本技術分野で通常使用される核酸染色蛍光色素など、例えばエチジウムブロミドやSYBR Green I(Lonza社製)等を常法に従って用いて、蛍光の有無や強度により、核酸の増幅を確認することもできる。
【００１９】
次に、図面を用いて、本発明の核酸の増幅方法の態様を具体的に説明する。
まず、第一段階で、増幅対象の特異的な塩基配列を含む鋳型ＤＮＡとプライマー対とのＤＮＡポリメラーゼ伸長反応によって、直鎖状ＤＮＡ断片が得られる（図１）。
２本鎖の鋳型ＤＮＡ中の２つの特異的な塩基配列の領域Ａ、Ｂを増幅対象とする場合、各領域の一方の鎖上の配列をＡ１及びＢ１、他方の鎖上の配列をＡ２及びＢ２と規定する（図１、(i)）。プライマー対のうち、一方のプライマーＰ１はＡ１の３’末端側に隣接する領域と相補的な塩基配列を有するように設計し、他方のプライマーＰ２はＢ２の３’末端側に隣接する領域と相補的な塩基配列を有するように設計する。図１において、プライマーＰ１及びＰ２の３’末端が修飾されている様子を丸印で示す。
このプライマー対と前記鋳型ＤＮＡとを用いてＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を行う。以下、説明の簡略のため、領域Ａ１及びＢ１を含む鎖（図１の２本鎖の鋳型ＤＮＡの上側の鎖）上での反応にのみ着目して説明する。まず、プライマーＰ１が配列Ａ１の３末端側の領域に結合する（図１、(ii)）。その後、伸長反応によって、Ｐ１の配列に続いてＡ２と同一の塩基配列を合成し、その後間隔を空けてＢ２と同一の塩基配列を合成した断片Ｃ１が生成される（図１、(iii)）。生成された断片は、酵素の作用により、伸長反応条件下で自然に鋳型ＤＮＡから離れて２本鎖に解離することも可能であるが（例えば国際公開第２００８／０２６７１９号パンフレットの例１参照）、プライマーＰ１の外側（５’末端側）にさらなるプライマーＰ１−ｏｕｔを設計してアニーリングさせて同様に伸長させることにより、プライマーＰ１から合成されたＤＮＡ断片を鋳型ＤＮＡから剥がして効率的に１本鎖に解離させることができる（図１、(iv)）。
【００２０】
次に、上記のように増幅された断片Ｃ１を鋳型として、プライマーＰ２がアニーリングして逆向きのＤＮＡ伸長反応が行われる（図１、(v)）。ここで、鋳型となるＤＮＡ断片にはＡ２の配列の５’末端側に化学修飾を含むため、その部分の伸長は行われず、化学修飾を含む塩基の直前でＤＮＡの伸長が停止し（図１、(vi)）ＤＮＡ断片Ｃ２が生成する。図１の(iv)について述べた通り、生成されたＤＮＡ断片Ｃ２は伸長反応条件下で自然に鋳型ＤＮＡから離れて２本鎖に解離することも可能であるが、(iv)と同様に外側のプライマーＰ２−ｏｕｔを同時に反応に加えることにより、プライマーＰ２から合成されたＤＮＡ断片を鋳型ＤＮＡから剥がして効率的に１本鎖に解離させることができる（図１、(vii)）。
上記の反応によって、５’末端にプライマーＰ２の配列を有し、連続してＢ１と同一の配列を有し、その後間隔を空けてＡ１と同一の配列を有し、そこで伸長が中断した直鎖状ＤＮＡ断片が得られる。前述の通り、これは図１(i)の上側の鎖を鋳型とした場合について示したものであり、下側の鎖を鋳型とした場合についても同様にまずプライマーＰ２を鋳型として断片Ｄ１を生成し（図示せず）、該断片Ｄ１を鋳型として、途中でＤＮＡ伸長が停止して生成される直鎖状ＤＮＡ断片Ｄ２が得られる。鋳型の２本鎖ＤＮＡの両方の鎖から直鎖上ＤＮＡ断片Ｃ２及びＤ２が生成され、それが後述の第二段階において環状１本鎖ＤＮＡに結合する様子を図２に示す。この得られた直鎖状ＤＮＡ断片Ｃ２及びＤ２が、第二段階の増幅反応が開始される際の複製起点となる。
【００２１】
第二段階で鋳型となる環状１本鎖ＤＮＡは、標的塩基配列Ａ２及び/又はＢ１を含むように設計する（図３、(i)）。このような環状１本鎖ＤＮＡを使用すると、第一段階で得られた直鎖上ＤＮＡ断片Ｃ２及びＤ２は共に環状ＤＮＡにアニーリングし（図２参照）、環状１本鎖ＤＮＡを起点とした連鎖増幅反応をすることができる。以下、説明の簡略のため、直鎖上ＤＮＡ断片Ｃ２を複製基点とする場合についてのみ説明する。図３では、Ａ２、Ｂ１及びＰ２の各々と同一の塩基配列を含む環状１本鎖ＤＮＡを示している。上述するように、第一段階で得られる直鎖状ＤＮＡ断片Ｃ２は各々３'末端に標的配列と相補的な塩基配列（Ａ１）を有するため、その直鎖状ＤＮＡ断片の３'末端領域（Ａ１）が、環状１本鎖ＤＮＡ中の３’末端部分の塩基配列（Ａ２）領域に対してアニールして複製起点となり、環状１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼ伸長反応が起こる（図３、(i)）。合成されたＤＮＡ鎖は、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによって剥されながらローリングサークル様に伸長する（図３、(ii)）。その剥されて伸長するＤＮＡ鎖に対して、反応溶液中に存在するプライマーＰ２がアニールして複製起点となってＤＮＡポリメラーゼ伸長反応が起こり、前記プライマーを複製起点として合成し剥されたＤＮＡ鎖は、反応溶液中に存在するプライマー又は環状１本鎖ＤＮＡに対してアニールしてＤＮＡポリメラーゼ伸長反応が起こる（図３、(iii)）。
上で説明する第一段階の過程と第二段階の過程は、一旦、第二段階を開始する引き金となる直鎖状ＤＮＡ断片が合成された後は並列して同時進行する。また、このように連鎖的な増幅反応が進行し、結果として、増幅対象の特異的な塩基配列を１回又は複数回反復して含む、多様な鎖長のＤＮＡ鎖が合成される。
【００２２】
本発明の別の態様は、上述の核酸増幅方法の原理を利用する、標的遺伝子の検出方法である。本検出方法は、検出目的、検出対象の試料の由来、標的遺伝子などに応じて、多様な産業において様々な場面で行うことができる。
標的遺伝子が検出される試料としては、例えば、ヒトその他動物由来の体液や組織片から調製したものであってもよく、環境由来の土壌や海水、植物から調製したものであってもよく、工場で製造・加工された飲料や食料品、医薬品などであってもよい。これらは、直接、あるいは必要に応じて、適当な操作を用いて核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）抽出液として調製して、検出対象の試料として本発明の検出方法に用いることができる。このような試料の調製は、一般的な核酸検出方法に使用される通常の手法に従って行うことができる。
標的遺伝子は、微生物（細菌、カビなど）、アレルゲン（例えばダニ、花粉など）、ウイルスに特異的なものでもよく、またヒトその他動物のゲノム中の野生型又は変異型の遺伝子であってもよい。
【００２３】
本検出方法は、上述の核酸増幅方法の「鋳型ＤＮＡ」及び「増幅対象の塩基配列」を、それぞれ本検出方法の「標的核酸分子（すなわち標的遺伝子）」及び「標的遺伝子中の標的塩基配列」と置き換え、試料中に標的核酸分子（すなわち標的遺伝子）が存在する場合には、上述の核酸増幅方法と同様の原理によって、標的遺伝子中の標的塩基配列の核酸が増幅されることを利用したものである。
【００２４】
標的核酸分子がＲＮＡの場合には、本発明の検出方法の工程(a)の酵素反応の工程において、更に逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）を試料に添加して酵素反応させることにより、上述の核酸増幅方法と同様、試料中のＲＮＡ分子に対して合成されるｃＤＮＡ鎖を鋳型として核酸が増幅されるか否かを確認し、核酸が増幅された場合には標的ＲＮＡ分子が存在すると決定することによって、標的ＲＮＡ分子の存在を検出することができる。
核酸の増幅は、上述と同様に、ピロリン酸マグネシウムの沈殿や、本技術分野で通常使用される核酸染色蛍光色素などを用いて、沈殿や蛍光の有無を指標として確認することができる。また、ピロリン酸マグネシウムの生成量や蛍光の強度を指標として、検出対象の試料中に存在する標的遺伝子の核酸量の多少について比較することもできる。
このようにして、本検出方法を用いることにより、試料中に存在する標的遺伝子の核酸がごく微量であっても、同一の反応容器内で１回の操作にて、標的遺伝子中の特異的塩基配列を効率的に増幅して検出することができる。本検出方法は、例えばマイクロチューブ、マイクロウェルプレート、マイクロチップなどの反応容器内で行ってもよく、またＨＴＳ（High-Throughput Screening）などの技術を用いてもよい。
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、薬品名後に会社名を記していないものは、和光純薬工業社製である。また、特別に記さない限り、溶媒は水である。
ＴＥバッファー
４ｍmol/l  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス-ヒドロキシメチル-アミノメタン）塩酸
１ｍmol/l  エチレンジアミン四酢酸２ナトリウム２水和物（ＥＤＴＡ）
ｐＨ８．０に調整
１．５％  ＴＡＥ電気泳動用ゲル
１．５％  アガロース
４ｍmol/l  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
１ｍmol/l  ＥＤＴＡ
１ｍmol/l  酢酸
ＬＢ培地
Peptone  １．０％
Yeast Extract  ０．５％
塩化ナトリウム  １．０％
溶解後ｐＨを７．０に調整【００２６】
［環状１本鎖ＤＮＡの合成］
下記に示す酵素製品、Kit製品は、特別に記さない限り取扱説明書に従った。
環状１本鎖ＤＮＡの合成に用いたプライマーを下記表１及び２に記す。【００２７】
【表１】
2011007889.tif 000002
*Ｃ６０には５’末端に、Ｂｉｎｄには３’末端にリン酸化修飾を行っており、共にＨＰＬＣ精製を行っている。【００２８】
【表２】
2011007889.tif 000003
*６０Ｃには５’末端に、Ｂｉｎｄには３’末端にリン酸化修飾を行っており、共にＨＰＬＣ精製を行っている。【００２９】
上記表１に記載のプライマー配列は、本発明の実施例に用いる環状１本鎖ＤＮＡを合成するためのものであり、本明細書の実施例に用いるものである。また、上記表２に記載のプライマー配列は、従来法、即ち国際公開第２００８／０２６７１９号パンフレットに記載された発明の実施に用いる環状１本鎖ＤＮＡを合成するためのものであり、本明細書の比較例に用いるものである。【００３０】
表１及び表２のそれぞれについて、各表に示す２種類のプライマー（各1.0μmol/l）と９°Ｎ DNA Ligase（New England biolabs社）を混合し、下記に示した温度で反応を行った。
９８℃、１分間                        −(1)
９８℃、３０秒間                      −(2)
９０−４５℃、４０分間  段階的に冷却  −(3)    (2)〜(5)を１５サイクル
５０℃、１０分間                      −(4)
６５℃、１０分間                      −(5)
４℃、∞                              −(6)【００３１】
反応終了後、Genとるくん（タカラバイオ社）を添加し、エタノール沈殿を行った。その後、７５％エタノールで２回、９９．５％エタノールで１回洗浄し、８５℃で乾燥させた後に、超純水で１.０μmol/lになるように溶解した。
溶解後、RecJf（New England biolabs社）専用バッファーを添加し、９８℃、１分間加熱後、氷冷した。その後、RecJf（New England biolabs社）を添加し、３７℃、２時間反応させた後、Genとるくんを添加し、エタノール沈殿を行った。その後、７５％エタノールで２回、９９．５％エタノールで１回洗浄し、８５℃で乾燥させた後に、ＴＥバッファーで１.０μmol/lになるように溶解し、環状１本鎖ＤＮＡ調整液とした。また、表１のプライマーセットを用いた場合を環状１本鎖ＤＮＡ調整液(1)、表２のプライマーセットを用いた場合を環状１本鎖ＤＮＡ調整液(2)とし、後述の実験において使用した。【００３２】
［特異的遺伝子増幅］
遺伝子検出に用いたプライマーを表３に記す。すべてHPLC精製を行っている。また、[]で囲った塩基は化学修飾をされた塩基を表し、実施例で使用する化学修飾に応じて、ＲＮＡ（グライナー社製）、ＬＮＡ（グライナー社製）またはＥＮＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を示す。【００３３】
【表３】
2011007889.tif 000004
【００３４】
上記の４つのプライマーの、鋳型として利用するλＤＮＡ上の関係を図４に示す。図４には、λＤＮＡの第24217-24412位の塩基配列を示している（番号付けはＮＣＢＩデータベースの登録番号NC_001416に従う）。また、図４の領域Ａ及びＢは、増幅対象となる標的塩基配列を含む領域を示し、これらの配列は、表１に示した環状１本鎖ＤＮＡのＣ６０にこの配列が存在する（Ｃ６０の第11-25位の塩基がＡに対応し、第２６−４０位の塩基がＢの相補配列に対応する）。
また、比較用の従来法の実験に使用する６０Ｃの配列については、６０Ｃの第１１−３０位の塩基がプライマーF-inの配列と同一であり、第３１−５０位の塩基がプライマーR-inの相補配列と同一である。これは、従来法ではF-in及びR-inの全体を含めた領域で直鎖ＤＮＡ断片が生成されるため、各断片の３’末端（即ち、複製の基点）に対応する配列を含むように環状ＤＮＡを設計したものである。【００３５】
また、化学修飾としてイノシン塩基を用いた場合については、上記表３のF-in及びR-inの代わりに以下のプライマーFI-in及びRI-inを使用し（F-out及びR-outは同じ）、以下の表４の通りのプライマーを使用した。【００３６】
【表４】
2011007889.tif 000005
*Ｉはイノシン塩基（グライナー社製）を示す。【００３７】
遺伝子検出反応には、下記を使用した。
酵素：４U/２５μl Bst DNA ポリメラーゼ（New England Biolabs Incorporation）
鋳型：λゲノム（タカラバイオ社）  １．０μl/２０μl
枯草菌は、Bacillus subtilisをＬＢ培地で培養後、ゲノム抽出装置（プレシジョンシステムサイエンス社製１２ＰＬＵＳ）を用いて取得した。【００３８】
反応バッファー
１/１０量            Bst DNA ポリメラーゼ付属のバッファー
０．４Ｍ              ベタイン
１．５μmol/l        表３のプライマー（F-in、R-in）
０．５μmol/l        表３のプライマー（F-out、R-out）
６００μmol/l each    ｄＮＴＰ
０．１μg/ml         環状１本鎖DNA調整液(1)または(2)【００３９】
各試薬を表３の条件で混合し、９８℃・１分加熱、氷冷後、酵素を添加し、６３℃・６０分インキュベーションした。【００４０】
［DNA増幅の確認］
核酸染色試薬SYBR GreenＩ（タカラバイオ社）を１/１０に希釈し、サンプル２０μlに対して１μlを混合し、３０２nmの波長を当て高感度フィルターで観察した。【００４１】
Ａ．化学修飾としてＲＮＡを用いた場合
ＤＮＡの増幅結果を以下の表５、及び図５、６に示す。【００４２】
【表５】
2011007889.tif 000006
【００４３】
以上の結果から、酵素＋鋳型を含むもの（実験３および６）は迅速な核酸の増幅が確認され、酵素は存在するが鋳型を含まないもの（実験２および５）は、核酸の増幅は確認されなかった。また、標的配列以外のDNA含んでいても核酸の増幅は確認されなかった（実験５）ことから配列を特異的に認識していることが確認された。また、酵素を含んでいないもの（実験１および４）は核酸の増幅は行っていない。
本発明により核酸配列を特異的に認識し、かつ迅速な核酸増幅が可能である。【００４４】
Ｂ．化学修飾としてＬＮＡを用いた場合
ＤＮＡの増幅結果を表６及び図７に示す。【００４５】
【表６】
2011007889.tif 000007
【００４６】
以上の結果から、表５の実験１〜３及び表６の実験７〜９では、同様な反応が起きていることが確認された。本発明によりＲＮＡだけでなくＬＮＡを用いた場合でも優れた効果が得られる。【００４７】
Ｃ．ＬＮＡにより化学修飾した場合と、化学修飾を行わない従来法との比較
実験１０〜１４は、上記Ｂの実験と同様に３’末端をＬＮＡにより修飾したF-in及びR-inのプライマーを用い、表１のＣ６０が環状化した環状１本鎖ＤＮＡ（環状１本鎖ＤＮＡ調整液(１)）を鋳型として、ＤＮＡを増幅した実験である。また、比較実験１〜４は、３’末端を化学修飾していないプライマーを使用し、表２の６０Ｃが環状化した環状１本鎖ＤＮＡ（環状１本鎖ＤＮＡ調整液(２)）を鋳型として、ＤＮＡを増幅した実験である。
ＤＮＡの増幅結果を表７及び図８，９に示す。【００４８】
【表７】
2011007889.tif 000008
【００４９】
以上の結果から、従来の方法では検出感度は１０6であった（比較実験４）が、１０5まで検出感度が上昇していることを確認した（実験１２、１３）。１０4は両方法とも検出されていない（実験１１、比較実験２）。また、鋳型が含まないもの（実験１０および比較実験１）は核酸の増幅は行っていない。
上記の結果より、本発明を用いることにより、従来の方法と比較して検出感度が約１０倍以上上昇したことが確認された。【００５０】
Ｄ．化学修飾としてＥＮＡ及びイノシン塩基を用いた場合
化学修飾としてイノシン塩基を用いた場合の反応バッファーは下記に示す。【００５１】
反応バッファー
１/１０量            Bst DNA ポリメラーゼ付属のバッファー
０．４Ｍ              ベタイン
１．５μmol/l        表３のプライマー
（ＥＮＡの場合：F-in、R-in、イノシン残基の場合：FI-in、RI-in）０．５μmol/l        表３のプライマー（F-out、R-out）
６００μmol/l each    ｄＮＴＰ
０．１μg/ml         環状１本鎖DNA調整液(1)【００５２】
実験１４、１５はＥＮＡ、実験１６、１７はイノシン塩基を用いた化学修飾を行った。
ＤＮＡの増幅結果を表８及び図１０、１１に示す。【００５３】
【表８】
2011007889.tif 000009
【００５４】
以上の結果から、ＥＮＡを用いた場合（実験１４、１５）とイノシン塩基を用いた場合（実験１６，１７）でも、表５、６と同様に効率的なＤＮＡ増幅反応が起きていることが確認された。【００５５】
Ｅ．環状１本鎖ＤＮＡに結合する配列が１種類の場合
直鎖上ＤＮＡ断片に結合する配列を１種類のみ含む環状１本鎖ＤＮＡを作製し、ＤＮＡの増幅の程度を確認した。Bindのプライマーを利用し、プライマー６０Ｆ及び６０Ｒをそれぞれ環状化した。なお、６０Ｆ及び６０Ｒには５’末端に、Ｂｉｎｄには３’末端にリン酸化修飾を行っており、共にＨＰＬＣ精製を行っている。【００５６】
【表９】
2011007889.tif 000010
【００５７】
６０Ｆの第１１−２５位の塩基が、図４の領域Ａの配列に対応し、６０Ｒの第２６−４０位の塩基が領域Ｂの相補配列に対応する。既述の方法と同様に環状ＤＮＡを合成し、既述の反応条件を用いて、反応の有無を確認した。
実験２２及び２３は６０Ｆの環状化ＤＮＡを鋳型としたＤＮＡ増幅を行い、実験２４−２５は６０Ｒの環状化ＤＮＡを鋳型としたＤＮＡ増幅を行った。
ＤＮＡの増幅結果を表１０及び図１２に示す。【００５８】
【表１０】
2011007889.tif 000011
【００５９】
以上の結果から、表９の６０Ｆを用いた場合（実験１８，１９）と６０Ｒを用いた場合（実験２０，２１）でも、表５、６と同様に効率的なＤＮＡ増幅が起きていることが確認された。
本発明の方法により、環状ＤＮＡへ結合する箇所は少なくとも１種類以上存在すれば、効率的なＤＮＡ増幅が可能であることが確認された。【００６０】
Ｆ．9 degrees North DNA polymeraseとＬＮＡを用いた高感度の条件
〔表１１〕
環状１本鎖ＤＮＡの合成に用いたプライマー配列
2011007889.tif 000012
*Ｃ６５には５’末端に、Ｂｉｎｄ−２には３’末端にリン酸化修飾を行っており、共にＨＰＬＣ精製を行っている。また、Ｂｉｎｄ−２の３’末端のＬＮＡ修飾を行っている。
環状一本鎖ＤＮＡの合成方法は上記と同様に行った。
〔表１２〕
遺伝子検出に用いたプライマー配列
2011007889.tif 000013
反応に用いた全てのプライマーの３’末端にＬＮＡ修飾を行っている。【００６１】
反応バッファー
１/１０量            9 degrees North DNA polymerase付属のバッファー
０．４Ｍ             ベタイン
１．６μmol/l        表１２のプライマー（F-in）
１．０μmol/l        表１２のプライマー（R-in）
０．５μmol/l        表１２のプライマー（F-out、R-out）
６００μmol/l each   ｄＮＴＰ
０．１μg/ml         環状１本鎖DNA調整液(1)
０．２Ｕ             9 degrees North DNA polymerase【００６２】
各試薬を表３の条件で混合し、下記の条件で反応した。
９８℃、１分間                        −(1)
９８℃、３０秒間                      −(2)
６５℃、１分間                        −(3)    (2)〜(3)を１０サイクル
９８℃、３０秒間                      −(4)
６５℃、４０分間                      −(5)
４℃、∞                              −(6)【００６３】
上記の実験結果は、実験２２〜２５に示す。
ＤＮＡの増幅結果を表１３及び図１３に示す。
【表１３】
2011007889.tif 000014
【００６４】
以上の結果から、表１１、１２の環状ＤＮＡとプライマー、9 degrees North DNA polymeraseを用い、サーマルサイクラーで温度を変化させながら反応を行うと、実験２３の結果より、１０2以上で核酸の増幅が認められることから、感度が１０2まで上昇することが確認された。
本発明の方法により、温度のサイクルを変化させることにより、感度の向上が確認された。【００６５】
Ｇ．電気泳動法によるＤＮＡ増幅の確認
表５の実験３のサンプルを１．５％ＴＡＥ電気泳動用ゲルを使用し、電気泳動漕であるMupid-ex（アドバンス社）を用いて電気泳動（１００Ｖ、５０分）を行った。
その後、核酸染色試薬SYBR GreenＩで染色後、写真撮影した（図１４）。
【図１】
2011007889.tif 000015
【図２】
2011007889.tif 000016
【図３】
2011007889.tif 000017
【図４】
2011007889.tif 000018
【図５】
2011007889.tif 000019
【図６】
2011007889.tif 000020
【図７】
2011007889.tif 000021
【図８】
2011007889.tif 000022
【図９】
2011007889.tif 000023
【図１０】
2011007889.tif 000024
【図１１】
2011007889.tif 000025
【図１２】
2011007889.tif 000026
【図１３】
2011007889.tif 000027
【図１４】
2011007889.tif 000028
【配列表】
2011007889000001.app
【国際調査報告】
2011007889.tif 000029
2011007889.tif 000030
2011007889.tif 000031
2011007889.tif 000032