(57)【要約】  本発明は、TM4SF20タンパク質に結合する抗体、及び前記抗体を利用した癌の診断と治療に関する。すなわち、本発明は、抗TM4SF20抗体、及び前記抗体を有効成分とする医薬組成物（例えば、抗癌剤、癌診断薬）を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
TM4SF20タンパク質に結合する抗体。
【請求項２】
細胞傷害活性を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害活性（ADCC活性）である請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
細胞傷害活性が補体依存性細胞傷害活性（CDC活性）である請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
以下のいずれかに記載のTM4SF20タンパク質に結合する抗体。
（１）配列番号：79に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号：80に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号：81に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（２）配列番号：85に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号：86に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号：87に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（３）配列番号：91に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号：92に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号：93に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（４）配列番号：97に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号：98に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号：99に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（５）配列番号：103に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号：104に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号：105に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（６）配列番号：109に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号：110に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号：111に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（７）配列番号：82に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号：83に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号：84に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（８）配列番号：88に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号：89に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号：90に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（９）配列番号：94に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号：95に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号：96に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（１０）配列番号：100に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号：101に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号：102に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（１１）配列番号：106に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号：107に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号：108に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（１２）配列番号：112に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号：113に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号：114に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（１３）（１）の重鎖可変領域と（７）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（１４）（２）の重鎖可変領域と（８）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（１５）（３）の重鎖可変領域と（９）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（１６）（４）の重鎖可変領域と（１０）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（１７）（５）の重鎖可変領域と（１１）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（１８）（６）の重鎖可変領域と（１２）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（１９）（１）から（１８）のいずれかに記載の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入された抗体であって、（１）から（１８）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
（２０）（１）から（１８）のいずれかに記載の抗体が結合するTM4SF20タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
【請求項６】
配列番号：116の168-184番目のアミノ酸配列を含むTM4SF20タンパク質の第二ループをエピトープとして認識することを特徴とする請求項１〜５いずれかに記載の抗体。
【請求項７】
請求項１〜６いずれかに記載の抗体を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項８】
抗癌剤である請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
胃癌、肺腺癌、膵臓癌、及び大腸癌から選択される癌の治療に用いられる請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
以下の工程を含む癌の診断方法
(a)被験者から単離された試料を準備する工程、
(b)上記試料におけるTM4SF20タンパク質又はTM4SF20遺伝子の発現量を検出する工程。
【請求項１１】
胃癌、肺腺癌、膵臓癌、及び大腸癌から選択される癌を診断するためのものである、請求項１０に記載の診断方法。
【請求項１２】
請求項１〜６いずれかに記載の抗体を含む癌の診断薬。
【請求項１３】
胃癌、肺腺癌、膵臓癌、及び大腸癌から選択される癌を診断するためのものである、請求項１２に記載の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗TM4SF20抗体、及び前記抗体を利用した癌の診断と治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
Transmembrane  4  L6  family  member  20  (TM4SF20)は細胞膜上に発現する4回膜貫通タンパクであり、L6  tetraspanin  familyに属する。L6  tetraspanin  familyのメンバーとしてはTM4SF1  (L6)、TM4SF4  (ILTMP)、TM4SF5等が知られている。いずれも4回膜貫通タンパクであり、N末とC末に短い細胞内領域を有し、膜貫通領域1  (TM1)とTM2の間の細胞外領域は短く、TM3とTM4の間の細胞外領域は長い（非特許文献１）。TM4SF1は肺癌、大腸癌、乳癌及び卵巣癌に発現しており、抗TM4SF1抗体を用いた抗癌剤の臨床試験が行われている（非特許文献２）。また抗TM4SF1抗体は肺癌細胞の浸潤能を低下させることが知られている（非特許文献３）。TM4SF4は腸管上皮細胞の管腔側に発現することが報告されている（非特許文献４）。TM4SF5は膵癌で高発現する分子として見出されている（非特許文献５）。【０００３】
L6  tetraspanin  familyはtetraspanin  superfamilyに属しているが、Tetraspanin  superfamilyの多くはインテグリンと結合することが知られている（非特許文献６及び７）。TM4SF5もインテグリンα2と結合し、さらにfocal  adhesion  kinaseを介してシグナルを伝達し、EMT  (epithelial-mesenchymal  transistion)を誘導することが知られている（非特許文献８及び９）。【０００４】
TM4SF20については、Barrett's  esophagusにおける発現増強、サルモネラ菌を感染させたブタの小腸での発現増強、及びsevere  acute  respiratory  syndrome  (SARS)ウイルスタンパクを発現させたヒト肺癌細胞株A549での発現増強が知られている（非特許文献１０〜１２）。癌では、胃癌で発現が低下することが報告されている（特許文献１）。一方、TM4SF20をインスリン分泌誘導剤としての利用することを報告した特許出願もある（特許文献２）。しかしながら、TM4SF20に関する報告は少なく、その生理的機能や癌組織特異的な発現についてはこれまで報告がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許公開番号２００６／０１６０１８６Ａ１
【特許文献２】特開２００７−２０９２１４号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】The  L6  membrane  proteins--a  new  four-transmembrane  superfamily.  Protein  Sci  2000;9:1594
【非特許文献２】Phase  I  trial  of  chimeric  (human-mouse)  monoclonal  antibody  L6  in  patients  with  non-small-cell  lung,  colon,  and  breast  cancer.  Cancer  Immunol  Immunother  1993;36:267
【非特許文献３】Tumor-associated  antigen  L6  and  the  invasion  of  human  lung  cancer  cells.  Clin  Cancer  Res  2003;9:2807
【非特許文献４】A  tetraspan  membrane  glycoprotein  produced  in  the  human  intestinal  epithelium  and  liver  that  can  regulate  cell  density-dependent  proliferation.  J  Biol  Chem  1995;270:21907
【非特許文献５】Identification  of  a  new  tumour-associated  antigen  TM4SF5  and  its  expression  in  human  cancer.  Gene  1998;208:25
【非特許文献６】Tetraspanin  functions  and  associated  microdomains.  Nat  Rev  Mol  Cell  Biol  2005;6:801
【非特許文献７】Functional  implications  of  tetraspanin  proteins  in  cancer  biology.  Cancer  Sci  2007;98:1666
【非特許文献８】Focal  adhesion  and  actin  organization  by  a  cross-talk  of  TM4SF5  with  integrin  alpha2  are  regulated  by  serum  treatment.  Exp  Cell  Res  2006;312:2983
【非特許文献９】Tetraspanin  TM4SF5  mediates  loss  of  contact  inhibition  through  epithelial-mesenchymal  transition  in  human  hepatocarcinoma.  J  Clin  Invest  2008;118:1354
【非特許文献１０】Altered  expression  of  TFF-1  and  CES-2  in  Barrett's  Esophagus  and  associated  adenocarcinomas.  Neoplasia  2005;7:407
【非特許文献１１】The  early  transcriptional  response  of  pig  small  intestinal  mucosa  to  invasion  by  Salmonella  enterica  serovar  typhimurium  DT104.  Mol  Immunol  2007;44:1316
【非特許文献１２】The  severe  acute  respiratory  syndrome  coronavirus  3a  protein  up-regulates  expression  of  fibrinogen  in  lung  epithelial  cells.  J  Virol  2005;79:10083
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、生体内におけるTM4SF20の発現と機能を解明し、癌の治療及び診断における新たな分子標的としての利用可能性を検討することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析により、TM4SF20  mRNAが胃癌、肺腺癌、膵臓癌、大腸癌の組織で発現しているが、正常組織では小腸と胎児大腸以外ではほとんど発現していないことを見出した。また、免疫組織化学染色を用いた解析の結果、臨床胃癌検体(腺癌および印環細胞癌)の細胞膜上にTM4SF20タンパクが検出された。さらに、発明者らは、モノクローナル抗TM4SF20抗体を作製し、癌細胞に対するその活性を調べた。その結果、抗TM4SF20抗体はヒト肺腺癌細胞株A549に結合し、antibody-dependent  cellular  cytotoxicity  (ADCC)及びcomplement-dependent  cytotoxicity  (CDC)によりヒト肺腺癌細胞を殺傷することが確認された。以上の知見は、抗TM4SF20抗体は胃癌、肺腺癌、膵臓癌、大腸癌等のTM4SF20を発現する癌の治療及び診断に有用であることを示すものである。【０００９】
本発明は、これらの知見に基づいてなされたものであり、以下の[１]〜[２０]を提供する。
[１]  TM4SF20タンパク質に結合する抗体に関する。
[２]  細胞傷害活性を有することを特徴とする上記[１]に記載の抗体。
[３]  細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害活性（ADCC活性）である上記[２]に記載の抗体。
[４]  細胞傷害活性が補体依存性細胞傷害活性（CDC活性）である上記[２]に記載の抗体。
[５]  以下のいずれかに記載の抗体。
（１）配列番号：79に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号：80に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号：81に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体（B8）。
（２）配列番号：85に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号：86に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号：87に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体（B11）。
（３）配列番号：91に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号：92に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号：93に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体（B12）。
（４）配列番号：97に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号：98に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号：99に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体（B15）。
（５）配列番号：103に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号：104に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号：105に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体（C7）。
（６）配列番号：109に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号：110に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号：111に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体（C9）。
（７）配列番号：82に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号：83に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号：84に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体（B8）。
（８）配列番号：88に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号：89に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号：90に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体（B11）。
（９）配列番号：94に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号：95に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号：96に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体（B12）。
（１０）配列番号：100に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号：101に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号：102に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体（B15）。
（１１）配列番号：106に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号：107に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号：108に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体（C7）。
（１２）配列番号：112に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号：113に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号：114に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体（C9）。
（１３）（１）の重鎖可変領域と（７）の軽鎖可変領域を含む抗体（B8）。
（１４）（２）の重鎖可変領域と（８）の軽鎖可変領域を含む抗体（B11）。
（１５）（３）の重鎖可変領域と（９）の軽鎖可変領域を含む抗体（B12）。
（１６）（４）の重鎖可変領域と（１０）の軽鎖可変領域を含む抗体（B15）。
（１７）（５）の重鎖可変領域と（１１）の軽鎖可変領域を含む抗体（C7）。
（１８）（６）の重鎖可変領域と（１２）の軽鎖可変領域を含む抗体（C9）。
（１９）（１）から（１８）のいずれかに記載の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入された抗体であって、（１）から（１８）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
（２０）（１）から（１８）のいずれかに記載の抗体が結合するTM4SF20タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。【００１０】
[６]  配列番号：116の168-184番目のアミノ酸配列を含むTM4SF20タンパク質の第二ループを認識することを特徴とする、上記[１]〜[５]いずれかに記載の抗体。
[７]  上記[１]〜[５]いずれかに記載の抗体を有効成分として含む医薬組成物。
[８]  抗癌剤である上記［７］に記載の医薬組成物。
[９]  胃癌、肺腺癌、膵臓癌、及び大腸癌から選択される癌の治療に用いられる上記［８］に記載の医薬組成物。
[１０]  以下の工程を含む癌の診断方法。
(a)被験者から単離された試料を準備する工程、
(b)上記試料におけるTM4SF20タンパク質又はTM4SF20遺伝子の発現量を検出する工程。
[１１]  胃癌、肺腺癌、膵臓癌、及び大腸癌から選択される癌を診断する為の上記［１０］に記載の診断方法。
[１２]  上記[１]〜[６]のいずれかに記載の抗体を含む癌の診断薬。
[１３]  胃癌、肺腺癌、膵臓癌、及び大腸癌から選択される癌を診断するためのものである、上記[１２]に記載の診断薬。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、癌、とくに胃癌、肺腺癌、膵臓癌、及び大腸癌の、治療と診断のための新規な手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Human  Exon  1.0  ST  Arrayを用いた正常組織(A)及び癌(B)におけるTM4SF20  mRNAの発現プロファイルを示す図である。
【図２】(A)はHuman  Genome  U133  Setを用いたTM4SF20  mRNAの発現プロファイルを示す図である。(B)はHuman  Genome  U133  Plus  2.0  Arrayを用いた臨床膵臓癌組織におけるTM4SF20  mRNAの発現プロファイルを示す図である。
【図３】抗HA抗体のTM4SF20_CHO  (実線)、mTM4SF20_CHO  (点線)及びDG44細胞(灰色で塗りつぶした線)への結合を評価したフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図４】抗TM4SF20抗体のTM4SF20_CHO、mTM4SF20_CHO及びDG44細胞への結合を評価したフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図５】抗HA抗体のキメラTM4SF20  ver.1_CHO  (実線)、キメラTM4SF20  ver.2_CHO  (点線)及びDG44細胞(灰色で塗りつぶした線)への結合を評価したフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図６】抗TM4SF20抗体のキメラTM4SF20  ver.1_CHO、キメラTM4SF20  ver.2_CHO及びDG44細胞への結合を評価したフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図７】抗GST抗体及び抗His抗体を用いたウェスタンブロットの結果を示す図である。サンプルにはGST_TM4SF20_N1、GST_TM4SF20_N2、GST_TM4SF20_N3、GST_TM4SF20_C1、GST_TM4SF20_C2、GST_TM4SF20_C3を発現させた大腸菌のwhole  cell  lysateを用いた。図中にはそれぞれ、N1、N2、N3、C1、C2、C3と表記した。
【図８】抗TM4SF20抗体を用いたウェスタンブロットの結果を示す図である。サンプルにはGST_TM4SF20_N1、GST_TM4SF20_N2、GST_TM4SF20_N3、GST_TM4SF20_C1、GST_TM4SF20_C2、GST_TM4SF20_C3を発現させた大腸菌のwhole  cell  lysateを用いた。図中にはそれぞれ、N1、N2、N3、C1、C2、C3と表記した。
【図９】抗TM4SF20抗体の肺腺癌細胞株A549への結合を評価したフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図１０】抗TM4SF20抗体の肺腺癌細胞株A549に対するADCC活性(A)及びCDC活性(B)を評価した結果を示す図である。
【図１１】臨床胃癌検体におけるTM4SF20タンパクの発現を評価した免疫組織化学染色の結果を示す図である。胃腺癌(A，B)及び胃における印環細胞癌(C)を用いた。
【００１３】
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００８−３３０４８７号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．TM4SF20
本願発明にかかるTransmembrane  4  L6  family  member  20  (TM4SF20)は、細胞膜上に発現する4回膜貫通タンパクであり、L6  tetraspanin  familyに属する。L6  tetraspanin  familyにはTM4SF1  (L6)、TM4SF4  (ILTMP)、TM4SF5等がある。いずれも4回膜貫通タンパクであり、N末とC末に短い細胞内領域を有し、膜貫通領域1  (TM1)とTM2の間の細胞外領域は短く、TM3とTM4の間の細胞外領域は長い。
【００１５】
本発明で用いられるTM4SF20タンパク質の由来は特に限定されず、公知のTM4SF20タンパク質のいずれを用いることも可能である。好ましくは、TM4SF20タンパク質はヒトTM4SF20である。ヒトTM4SF20のアミノ酸配列とこれをコードする塩基配列は当該分野において公知であり、公共のデータベースであるGenBankやUnigene等に、例えば、GenBank  Accession  No:NM_024795（塩基配列＝配列番号：115、アミノ酸配列＝配列番号：116）、UniProtKB;  Q53R12として登録されている。
【００１６】
発明者らは、マイクロアレイを用いた発現解析の結果、TM4SF20  mRNAが胃癌、肺腺癌、膵臓癌、大腸癌の組織で発現しているが、正常組織では小腸と胎児大腸以外ではほとんど発現していないことを見出した。また、免疫組織化学的解析の結果、臨床胃癌検体(腺癌および印環細胞癌)の細胞膜上にTM4SF20タンパクが存在することを確認した。
【００１７】
２．抗TM4SF20抗体
本発明で用いられる抗TM4SF20抗体は、TM4SF20タンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状などは特に限定されない。具体的には、非ヒト動物の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体が使用できる。本発明において使用される抗TM4SF20抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。抗体のTM4SF20タンパク質への結合は特異性の高いものであることが好ましく、特にヒトTM4SF20に特異的であることがより好ましい。
【００１８】
本発明で使用される抗TM4SF20抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として取得できる。本発明で使用される抗TM4SF20抗体としては、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、及び遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるもの等を含む。
【００１９】
本発明の抗TM4SF20抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子で修飾してもよい。また、後述するように、細胞傷害活性を有する化学療法剤や放射性化学物質等で修飾してもよい。
【００２０】
本発明で用いられるTM4SF20を認識する抗体の例として、例えば以下の抗体を挙げることができる。
（１）配列番号：79に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号：80に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号：81に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体（B8）。
（２）配列番号：85に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号：86に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号：87に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体（B11）。
（３）配列番号：91に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号：92に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号：93に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体（B12）。
（４）配列番号：97に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号：98に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号：99に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体（B15）。
（５）配列番号：103に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号：104に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号：105に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体（C7）。
（６）配列番号：109に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号：110に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号：111に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体（C9）。
（７）配列番号：82に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号：83に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、配列番号：84に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体（B8）。
（８）配列番号：88に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号：89に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、配列番号：90に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体（B11）。
（９）配列番号：94に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号：95に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、配列番号：96に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体（B12）。
（１０）配列番号：100に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号：101に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、配列番号：102に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体（B15）。
（１１）配列番号：106に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号：107に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、配列番号：108に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体（C7）。
（１２）配列番号：112に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号：113に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、配列番号：114に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体（C9）。
（１３）（１）の重鎖可変領域と（７）の軽鎖可変領域を含む抗体（B8）。
（１４）（２）の重鎖可変領域と（８）の軽鎖可変領域を含む抗体（B11）。
（１５）（３）の重鎖可変領域と（９）の軽鎖可変領域を含む抗体（B12）。
（１６）（４）の重鎖可変領域と（１０）の軽鎖可変領域を含む抗体（B15）。
（１７）（５）の重鎖可変領域と（１１）の軽鎖可変領域を含む抗体（C7）。
（１８）（６）の重鎖可変領域と（１２）の軽鎖可変領域を含む抗体（C9）。
（１９）（１）から（１８）のいずれかに記載の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入された抗体であって、（１）から（１８）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
（２０）（１）から（１８）のいずれかに記載の抗体が結合するTM4SF20タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
【００２１】
本発明において、本発明の抗体と同等の活性を有するとは、TM4SF20への結合活性及び／又はTM4SF20を発現する細胞への細胞傷害活性（ADCC活性、CDC活性など）が同等であることをいう。本発明において、結合活性が同等、細胞傷害活性が同等とは、必ずしも活性が同一であることは要求されず、例えば上述の（１）〜（１８）のいずれかの活性と比較して50%以上、好ましくは70%以上、さらに好ましくは90%以上の活性を有していればよい。活性の上限は特に限定されず、例えば1000%以下、500%以下、300%以下、150%以下、100%以下などの例をあげることができる。
【００２２】
本発明において、本発明の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入された抗体は、人為的に作製されたものでも、自然的に生じたものであってもよい。ポリペプチドに変異を導入する方法は、あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法の一つである。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh,  T.  et  al.  (1995)  Gene  152,  271-275、Zoller,  MJ,  and  Smith,  M.(1983)  Methods  Enzymol.  100,  468-500、Kramer,  W.  et  al.  (1984)  Nucleic  Acids  Res.  12,  9441-9456、Kramer  W,  and  Fritz  HJ(1987)  Methods.  Enzymol.  154,  350-367、Kunkel,TA(1985)  Proc  Natl  Acad  Sci  USA.  82,  488-492、Kunkel  (1988)  Methods  Enzymol.  85,  2763-2766）などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発明の抗体のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該抗体と機能的に同等な抗体もまた本発明の抗体に含まれる。
【００２３】
このような変異体において、変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内）である。
【００２４】
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質に基づいて、次のような分類が確立している。
疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、
親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、
脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、
水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、
硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、
カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、
塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）
（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）
【００２５】
あるアミノ酸配列に対する１又は数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが、その生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark,  D.  F.  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  (1984)  81,  5662-5666、Zoller,  M.  J.  and  Smith,  M.,  Nucleic  Acids  Research  (1982)  10,  6487-6500、Wang,  A.  et  al.,  Science  224,  1431-1433、Dalbadie-McFarland,  G.  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  (1982)  79,  6409-6413）。すなわち、一般に、あるポリペプチドを構成するアミノ酸配列中、各群に分類されたアミノ酸は、相互に置換したときに、当該ポリペプチドの活性が維持される可能性が高いといわれている。本発明において、上記アミノ酸群の群内のアミノ酸間の置換を保存的置換と言う。
【００２６】
また本発明は、上述の（１）〜（１８）いずれかの抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体もまた提供する。上述の（１）〜（１８）の抗体の具体的な例として、本願実施例に記載されたB8、B11、B12、B15、C7、C9の抗体を挙げることができる。すなわち本発明は、B8、B11、B12、B15、C7、C9が認識するエピトープと同一のエピトープを認識する抗体も提供する。このような抗体は、例えば、以下の方法により得ることができる。
【００２７】
被験抗体が、ある抗体とエピトープを共有することは、両者の同じエピトープに対する競合によって確認することができる。抗体間の競合は、交叉ブロッキングアッセイなどによって検出される。例えば競合ELISAアッセイは、好ましい交叉ブロッキングアッセイである。
【００２８】
具体的には、交叉ブロッキングアッセイにおいては、マイクロタイタープレートのウェル上にコートしたTM4SF20タンパク質を、候補の競合抗体の存在下、又は非存在下でプレインキュベートした後に、本発明の抗TM4SF20抗体が添加される。ウェル中のTM4SF20タンパク質に結合した本発明の抗TM4SF20抗体の量は、同じエピトープへの結合に対して競合する候補競合抗体（被験抗体）の結合能に間接的に相関している。すなわち同一エピトープに対する被験抗体の親和性が大きくなればなる程、本発明の抗TM4SF20抗体のTM4SF20タンパク質をコートしたウェルへの結合量は低下し、一方、被験抗体のTM4SF20タンパク質をコートしたウェルへの結合量は増加する。
【００２９】
ウェルに結合した抗体量は、予め抗体を標識しておくことによって、容易に測定することができる。たとえば、ビオチン標識された抗体は、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な基質を使用することにより測定できる。ペルオキシダーゼなどの酵素標識を利用した交叉ブロッキングアッセイを、特に競合ELISAアッセイと言う。抗体は、検出あるいは測定が可能な他の標識物質で標識することができる。具体的には、放射標識あるいは蛍光標識などが公知である。
【００３０】
さらに被験抗体が本発明の抗TM4SF20抗体と異なる種に由来する定常領域を有する場合には、ウェルに結合したいずれかの抗体を、いずれかの定常領域を認識する標識抗体によって測定することもできる。あるいは同種由来の抗体であっても、クラスが相違する場合には、各クラスを識別する抗体によって、ウェルに結合した抗体を測定することができる。
【００３１】
候補の競合抗体の非存在下で実施されるコントロール試験において得られる結合活性と比較して、候補抗体が、少なくとも20％、好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも50％、抗TM4SF20抗体の結合をブロックできるならば、該候補競合抗体は本発明の抗TM4SF20抗体と実質的に同じエピトープに結合するか、又は同じエピトープへの結合に対して競合する抗体である。
なお、エピトープを測定する際には、本発明の抗TM4SF20抗体の定常領域を被検抗体の定常領域と同一の定常領域に置換してもよい。
【００３２】
また、本発明の抗体の好ましい態様として、TM4SF20の第二ループを認識する抗体を挙げることができる。TM4SF20の第二ループは配列番号：116（TM4SF20）のアミノ酸配列において、105番目のアミノ酸から185番目のアミノ酸までの領域をいう。
さらに、本発明の抗体の好ましい他の態様として、配列番号：116（TM4SF20）のアミノ酸配列において168番目のアミノ酸から184番目のアミノ酸までの領域を認識する抗体を挙げることができる。
【００３３】
このような抗体は高い細胞傷害活性を有していることから、医薬品、特に抗癌剤として有用である。抗体がヒトに投与される場合、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体とすることができる。遺伝子組換え型抗体とは、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体などを含む。これらの改変抗体は、公知の方法を用いて製造することができる。
【００３４】
（１）キメラ抗体
キメラ抗体とは、互いに由来の異なる可変領域と定常領域を連結した抗体をいう。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体は、マウス−ヒト−異種キメラ抗体である。マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結させ、これを発現ベクターに組み込むことによって、キメラ抗体を発現する組換えベクターが作製できる。該ベクターにより形質転換された組換え細胞を培養し、組み込まれたDNAを発現させることによって、培養中に生産される当該キメラ抗体を取得できる。キメラ抗体及びヒト化抗体のC領域には、ヒト抗体のものが使用される。
【００３５】
例えばH鎖においては、Cγ１、Cγ２、Cγ３、Cγ４、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、及びCεをC領域として利用することができる。またL鎖においてはCκ、及びCλをC領域として使用できる。これらのC領域のアミノ酸配列、ならびにそれをコードする塩基配列は公知である。また、抗体そのもの、あるいは抗体の産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域中の１又は数個のアミノ酸を置換、欠失、付加及び／又は挿入することができる。
【００３６】
マウス以外の動物の抗体としてラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、サル等の抗体が使用できる。これらの配列は公知である。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、C領域を修飾することができる。
【００３７】
（２）ヒト化抗体
一般にキメラ抗体が、ヒト以外の動物由来抗体のV領域とヒト抗体由来のC領域とから構成されるのに対して、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来抗体の相補性決定領域（CDR；complementarity  determining  region）と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（FR；framework  region）及びヒト抗体由来のC領域とから構成される。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
【００３８】
抗体の可変領域は、通常、４つのFRにはさまれた３つのCDRで構成されている。CDRは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列は多様性に富む。一方FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い相同性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるといわれている。
【００３９】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。
【００４０】
具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばOverlap  Extension  PCRが公知である。Overlap  Extension  PCRにおいては、ヒト抗体のFRを合成するためのプライマーに、移植すべきマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付加される。プライマーは４つのFRのそれぞれについて用意される。一般に、マウスCDRのヒトFRへの移植においては、マウスのFRと相同性の高いヒトFRを選択するのが、CDRの機能の維持において有利であるといわれている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに隣接しているFRのアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用するのが好ましい。
【００４１】
また連結される塩基配列は、互いにインフレームで接続されるようにデザインされる。それぞれのプライマーによってヒトFRが個別に合成される。その結果、各FRにマウスCDRをコードするDNAが付加された産物が得られる。各産物のマウスCDRをコードする塩基配列は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、ヒト抗体遺伝子を鋳型として合成された産物のオーバーラップしたCDR部分を互いにアニールさせて相補鎖合成反応が行われる。この反応によって、ヒトFRがマウスCDRの配列を介して連結される。
【００４２】
最終的に３つのCDRと４つのFRが連結されたV領域遺伝子は、その5'末端と3'末端にアニールし適当な制限酵素認識配列を付加されたプライマーによってその全長が増幅される。上記のように得られたDNAとヒト抗体C領域をコードするDNAとをインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト化抗体発現用ベクターが作成できる。このベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、組換え細胞を培養し、ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、ヒト化抗体が培養細胞の培養物中に産生される（欧州特許公開EP  239400  、国際公開WO  96/02576参照）。
【００４３】
上記のように作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、評価することによって、CDRを介して連結されたときに該CDRが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト抗体のFRが好適に選択できる。必要に応じ、ヒト化抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入することができる。具体的には、FRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたFRには、塩基配列の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を上記の方法で測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択できる（Sato,  K.et  al.,  Cancer  Res,  1993,  53,  851-856）。
【００４４】
（３）低分子化抗体
本発明の抗体には、TM4SF20タンパク質に結合する限り、IgG（IgG1、IgG2、IgG4など）に代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはIgMに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、又は、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。本発明の抗体は、抗体の全長分子に限られず、TM4SF20タンパク質に結合する限り、低分子化抗体又はその修飾物であってもよい。
【００４５】
低分子化抗体は、全長抗体（whole  antibody、例えばwhole  IgG等）の一部分が欠損している抗体断片を含む。TM4SF20抗原への結合能を有する限り、抗体分子の部分的な欠損は許容される。本発明における抗体断片は、重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域（VL）のいずれか、又は両方を含んでいることが好ましい。また、本発明における抗体断片はCDRを含んでいることが好ましい。本発明の抗体断片に含まれるCDRの数は特に限定されないが、重鎖CDR1、CDR2、CDR3、軽鎖CDR1、CDR2、CDR3の６つを少なくとも含んでいることが好ましい。
【００４６】
VH又はVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入を含むことができる。さらにTM4SF20抗原への結合能を有する限り、VH及びVLのいずれか、又は両方の一部を欠損させることもできる。また、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single  chain  Fv）、ダイアボディー、sc(Fv)2（single  chain  (Fv)2）、scFv-Fcなどを挙げることができる。これら抗体の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の低分子化抗体に含まれる。
【００４７】
抗体の断片は、抗体を酵素で処理して抗体断片を生成させることによって得ることができる。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知である。あるいは、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることができる（例えば、Co,  M.S.  et  al.,  J.  Immunol.（1994）152,  2968-2976、Better,  M.  &  Horwitz,  A.  H.  Methods  in  Enzymology（1989）178,  476-496、Plueckthun,  A.  &  Skerra,  A.  Methods  in  Enzymology（1989）178,  476-496、Lamoyi,  E.,  Methods  in  Enzymology（1989）121,  652-663、Rousseaux,  J.  et  al.,  Methods  in  Enzymology（1989）121,  663-669、Bird,  R.  E.  et  al.,  TIBTECH（1991）9,  132-137参照）。
【００４８】
消化酵素は、抗体断片の特定の位置を切断し、次のような特定の構造の抗体断片を与える。このような酵素的に得られた抗体断片に対して、遺伝子工学的手法を利用すると、抗体の任意の部分を欠失させることができる。
パパイン消化：F(ab)2又はFab
ペプシン消化：F(ab')2又はFab'
【００４９】
したがって、本発明における低分子化抗体は、TM4SF20に対する結合親和性を有する限り、任意の領域を欠失した抗体断片であることができる。
【００５０】
ダイアボディーは、遺伝子融合により構築された二価（bivalent）の抗体断片を指す（Holliger  P  et  al.,  Proc.Natl.Acad.Sci.USA  90:  6444-6448  (1993)、EP404,097号、WO93/11161号等）。ダイアボディーは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーである。通常、ダイマーを構成するポリペプチド鎖は、各々、同じ鎖中でVL及びVHがリンカーにより結合されている。ダイアボディーにおけるリンカーは、一般に、VLとVHが互いに結合できない位に短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、例えば、5残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHとは、単鎖可変領域フラグメントを形成できず、別の単鎖可変領域フラグメントと二量体を形成する。その結果、ダイアボディーは2つの抗原結合部位を有することとなる。
【００５１】
scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域とを連結することにより得られる。scFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Huston,  J.  S.  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A,  1988,  85,  5879-5883）。scFvにおけるH鎖V領域及びL鎖V領域は、本明細書に記載されたいずれの抗体由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば３から25残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。具体的には、たとえば後述のペプチドリンカー等を用いることができる。
【００５２】
両鎖のV領域は、たとえば上記のようなPCR法によって連結することができる。PCR法によるV領域の連結のために、まず次のDNAのうち、全部あるいは所望の部分アミノ酸配列をコードするDNAが鋳型として利用される。
抗体のH鎖又はH鎖V領域をコードするDNA配列、及び
抗体のL鎖又はL鎖V領域をコードするDNA配列
【００５３】
増幅すべきDNAの両端の配列に対応する配列を有するプライマーの一対を用いたPCR法によって、H鎖とL鎖のV領域をコードするDNAがそれぞれ増幅される。次いで、ペプチドリンカー部分をコードするDNAを用意する。ペプチドリンカーをコードするDNAもPCRを利用して合成することができる。このとき利用するプライマーの5'側に、別に合成された各V領域の増幅産物と連結できる塩基配列を付加しておく。次いで、［H鎖V領域DNA］−［ペプチドリンカーDNA］−［L鎖V領域DNA］の各DNAと、アセンブリーPCR用のプライマーを利用してPCR反応を行う。
【００５４】
アセンブリーPCR用のプライマーは、［H鎖V領域DNA］の5'側にアニールするプライマーと、［L鎖V領域DNA］の3'側にアニールするプライマーとの組み合わせからなる。すなわちアセンブリーPCR用プライマーとは、合成すべきscFvの全長配列をコードするDNAを増幅することができるプライマーセットである。一方［ペプチドリンカーDNA］には各V領域DNAと連結できる塩基配列が付加されている。その結果、これらのDNAが連結され、さらにアセンブリーPCR用のプライマーによって、最終的にscFvの全長が増幅産物として生成される。一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された組換え細胞が常法に従って取得できる。また、その結果得られる組換え細胞を培養して該scFvをコードするDNAを発現させることにより、該scFvが取得できる。
【００５５】
scFv-FcはscFvにFc領域を融合させた低分子化抗体である（Cellular  &  Molecular  Immunology  2006；  3：  439-443）。scFv-Fcに用いられるscFvの由来は特に限定されないが、例えばIgM由来のscFvを用いることができる。また、Fcの由来は特に限定されないが、例えばヒトIgG（ヒトIgG1など）を用いることができる。従って、scFv-Fcの好ましい態様の例として、IgM抗体のscFv断片と、ヒトIgG1のCH2(たとえば、Cγ2)とCH3（たとえば、Cγ3)をヒトIgG1のヒンジ領域（Hγ)で連結させたscFv-Fcを挙げることができる。
【００５６】
sc(Fv)2は、2つのVH及び2つのVLをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Hudson  et  al、J  Immunol.  Methods  1999；231：177-189）。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。
【００５７】
また２つのVH及び２つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましい。
【００５８】
2つのVHと2つのVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置も挙げることができる。
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］
【００５９】
抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー（例えば、Protein  Engineering,  9(3),  299-305,  1996参照）に開示されるリンカー等を用いることができる。本発明においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。通常、ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基は、1から100アミノ酸、好ましくは3から50アミノ酸、さらに好ましくは5から30アミノ酸、特に好ましくは12から18アミノ酸（例えば、15アミノ酸）である。
【００６０】
ペプチドリンカーを構成するアミノ酸配列は、scFvの結合作用を阻害しない限り、任意の配列とすることができる。例えば、ペプチドリンカーの場合次のようなアミノ酸配列を利用することができる。
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：117）
Ser・Gly・Gly・Gly（配列番号：118）
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：119）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：120）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号：121)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：122）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：123）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：124）
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：119）)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：120）)n
［nは１以上の整数である］
【００６１】
ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。たとえば上記のペプチドリンカーの長さを決定するnは、通常１〜５、好ましくは１〜３、より好ましくは１又は２である。
【００６２】
よって本発明において特に好ましいsc(Fv)2の態様としては、例えば、以下のsc(Fv)2を挙げることができる。
［VH］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VL］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VH］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VL］
【００６３】
あるいは、合成化学物リンカー（化学架橋剤）を利用してV領域を連結することもできる。ペプチド化合物などの架橋に通常用いられている架橋剤を本発明に利用することができる。例えば次のような化学架橋剤が公知である。これらの架橋剤は市販されている。
N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、
ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、
ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、
ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、
ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、
エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、
エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−EGS）、
ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−DST）、
ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、及び
ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）など
【００６４】
4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、3つのリンカーが必要となる。複数のリンカーは、同じでもよいし、異なるリンカーを用いることもできる。本発明において好ましい低分子化抗体はダイアボディー又はsc(Fv)2である。このような低分子化抗体を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し、抗体断片を生成させるか、又はこれら抗体断片をコードするDNAを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co,  M.  S.  et  al.,  J.  Immunol.  (1994)  152,  2968-2976  ;  Better,  M.  and  Horwitz,  A.  H.,  Methods  Enzymol.  (1989)  178,  476-496  ;  Pluckthun,  A.  and  Skerra,  A.,  Methods  Enzymol.  (1989)  178,  497-515  ;  Lamoyi,  E.,  Methods  Enzymol.  (1986)  121,  652-663  ;  Rousseaux,  J.  et  al.,  Methods  Enzymol.  (1986)  121,  663-669  ;  Bird,  R.  E.  and  Walker,  B.  W.,  Trends  Biotechnol.  (1991)  9,  132-137参照）。
【００６５】
３．抗TM4SF20抗体の活性
癌などの細胞増殖性疾患の治療においては、抗体は、そのエフェクター活性を維持していることが望ましい。すなわち、本発明における好ましい抗体は、TM4SF20に対する結合親和とエフェクター機能の両方を有する。抗体のエフェクター機能には、ADCC活性及びCDC活性が含まれる。本発明における治療用の抗体は、特に好ましくは、ADCC活性及びCDC活性のいずれか、又は両方をエフェクター機能として備える。
【００６６】
３．１  細胞傷害活性
本発明の抗体が治療目的で用いられる場合、抗体は好ましくは細胞傷害活性を有する抗体である。
【００６７】
本発明における細胞傷害活性としては、例えば抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent  cell-mediated  cytotoxicity：ADCC）活性、補体依存性細胞傷害（complement-dependent  cytotoxicity：CDC）活性などを挙げることができる。本発明において、CDC活性とは補体系による細胞傷害活性を意味する。一方ADCC活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのFc部分にFcγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がFcγ受容体を介して結合し、標的細胞に傷害を与える活性を意味する。
【００６８】
抗TM4SF20抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Current  protocols  in  Immunology,  Chapter7.  Immunologic  studies  in  humans,  Editor,  John  E,  Coligan  et  al.,  John  Wiley  &  Sons,  Inc.,(1993)等）。
【００６９】
具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞の調製が実施される。
i）エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地（Invitrogen社製）中で脾臓細胞が分離される。10％ウシ胎児血清（FBS、HyClone社製）を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を5×106/mlに調製することによって、エフェクター細胞が調製できる。
【００７０】
ii）補体溶液の調製
Baby  Rabbit  Complement（CEDARLANE社製）を10％  FBS含有培地（Invitrogen社製）にて10倍希釈し、補体溶液が調製できる。
【００７１】
iii）標的細胞の調製
TM4SF20タンパク質を発現する細胞を0.2  mCiの51Cr-クロム酸ナトリウム（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）とともに、10％  FBS含有DMEM培地中で37℃にて1時間培養することにより該標的細胞を放射性標識できる。TM4SF20タンパク質を発現する細胞としては、TM4SF20タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、胃癌細胞、肺腺癌細胞、膵臓癌細胞、大腸癌細胞等を利用することができる。放射性標識後、細胞を10％  FBS含有RPMI1640培地にて３回洗浄し、細胞濃度を2×105/mlに調製することによって、該標的細胞が調製できる。
【００７２】
ADCC活性、又はCDC活性は下記に述べる方法により測定できる。ADCC活性の測定の場合は、96ウェルＵ底プレート（Becton  Dickinson社製）に、標的細胞と、抗TM4SF20抗体を50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。その後、エフェクター細胞100μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で4時間培養する。抗体の終濃度は0又は10μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンター（COBRAII  AUTO-GAMMA、MODEL  D5005、Packard  Instrument  Company社製）で放射活性を測定する。細胞傷害活性（%）は得られた値を使用して(A-C)  /  (B-C)  x  100の計算式に基づいて計算できる。Aは各試料における放射活性（cpm）、Bは1％  NP-40（nacalai  tesque社製)を加えた試料における放射活性（cpm）、Cは標的細胞のみを含む試料の放射活性（cpm）を示す。
【００７３】
一方、CDC活性の測定の場合は、96ウェル平底プレート（Becton  Dickinson社製）に、標的細胞と、抗TM4SF20抗体を50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。その後、補体溶液100μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で4時間培養する。抗体の終濃度は0又は3μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞傷害活性はADCC活性の測定と同様にして計算できる。
【００７４】
一方、抗体コンジュゲートによる細胞傷害活性の測定の場合は、96ウェル平底プレート（Becton  Dickinson社製）に、標的細胞と、抗TM4SF20抗体コンジュゲートを50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。炭酸ガスインキュベーター内で1から4時間培養する。抗体の終濃度は0又は3μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞傷害活性はADCC活性の測定と同様にして計算できる。
【００７５】
（１）細胞傷害性物質による修飾
抗体に化学療法剤、毒性ペプチド或いは放射性化学物質などの細胞傷害性物質を結合することも可能である。このような抗体修飾物（以下、抗体コンジュゲートと称する。）は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
【００７６】
抗TM4SF20抗体に結合させて細胞傷害活性を機能させる化学療法剤としては、たとえば次のような化学療法剤が例示できる：アザリビン（azaribine）、アナストロゾール（anastrozole）、アザシチジン（azacytidine）、ブレオマイシン（bleomycin）、ボルテゾミブ（bortezomib）、ブリオスタチン-1（bryostatin-1）、ブスルファン（busulfan）、カンプトテシン（camptothecin）、10-ヒドロキシカンプトテシン（10-hydroxycamptothecin）、カルムスチン（carmustine）、セレブレックス（celebrex）、クロラムブシル（chlorambucil）、シスプラチン（cisplatin）、イリノテカン（irinotecan）、カルボプラチン（carboplatin）、クラドリビン（cladribine）、シクロホスファミド（cyclophosphamide）、シタラビン（cytarabine）、ダカルバジン（dacarbazine）、ドセタキセル（docetaxel）、ダクチノマイシン（dactinomycin）、ダウノマイシングルクロニド（daunomycin  glucuronide）、ダウノルビシン（daunorubicin）、デキサメタゾン（dexamethasone）、ジエチルスチルベストロール（diethylstilbestrol）、ドキソルビシン（doxorubicin）、ドキソルビシンブルクロニド（doxorubicin  glucuronide）、エピルビシン（epirubicin）、エチニルエストラジオール（ethinyl  estradiol）、エストラムスチン（estramustine）、エトポシド（etoposide）、エトポシドグルクロニド（etoposide  glucuronide）、フロキシウリジン（floxuridine）、フルダラビン（fludarabine）、フルタミド（flutamide）、フルオロウラシル（fluorouracil）、フルオキシメステロン（fluoxymesterone）、ゲムシタビン（gemcitabine）、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート（hydroxyprogesterone  caproate）、ヒドロキシウレア（hydroxyurea）、イダルビシン（idarubicin）、イフォスファミド（ifosfamide）、ロイコボリン（leucovorin）、ロムスチン（lomustine）、メクロレタミン（mechlorethamine）、メドロキシプロゲステロンアセテート（medroxyprogesterone  acetate）、メゲストロールアセテート（megestrol  acetate）、メルファラン（melphalan）、メルカプトプリン（mercaptopurine）、メトトレキセート（methotrexate）、ミトキサントロン（mitoxantrone）、ミトラマイシン（mithramycin）、ミトマイシン（mitomycin）、ミトタン（mitotane）、フェニルブチレート（phenylbutyrate）、プレドニゾン（prednisone）、プロカルバジン（procarbazine）、パクリタキセル（paclitaxel）、ペントスタチン（pentostatin）、セムスチン（semustine）、ストレプトゾシン（streptozocin）、タモキシフェン（tamoxifen）、タキサン類（taxanes）、タキソール（taxol）、テストステロンプロピオネート（testosterone  propionate）、サリドマイド（thalidomide）、チオグアニン（thioguanine）、チオテパ（thiotepa）、テニポシド（teniposide）、トポテカン（topotecan）、ウラシルマスタード（uracil  mustard）、ビンブラスチン（vinblastine）、ビノレルビン（vinorelbine）、ビンクリスチン（vincristine）。
【００７７】
好ましい化学療法剤は、低分子の化学療法剤である。低分子の化学療法剤は、抗体への結合の後も、抗体の機能に干渉する可能性が低い。本発明において、低分子の化学療法剤は、通常100〜2000、好ましくは200〜1000の分子量を有する。ここに例示した化学療法剤は、いずれも低分子の化学療法剤である。これらの本発明における化学療法剤は、生体内で活性な化学療法剤に変換されるプロドラッグを含む。プロドラッグの活性化は酵素的な変換であっても、非酵素的な変換であっても良い。
【００７８】
また、抗体を毒性ペプチドで修飾することもできる。毒性ペプチドの例としては、例えば、次のものを挙げることができる。ジフテリアトキシンＡ鎖(Diphtheria  toxin  A  Chain)(Langone  J.J.,et  al.,Methods  in  Enzymology,93,307-308,1983)、シュードモナスエキソトキシン(Pseudomonas  Exotoxin)(Nature  Medicine,2,350-353,1996)、リシン鎖(Ricin  A  Chain)(Fulton  R.J.,et  al.,J.Biol.Chem.,261,5314-5319,1986;Sivam  G.,et  al.,Cancer  Res.,47,3169-3173,1987;Cumber  A.J.et  al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;Wawrzynczak  E.J.,et  al.,Cancer  Res.,50,7519-7562,1990;Gheeite  V.,et  al.,J.Immunol.Methods,142,223-230,1991);無糖鎖リシンＡ鎖(Deglicosylated  Ricin  A  Chain)(Thorpe  P.E.,et  al.,Cancer  Res.,47,5924-5931,1987);アブリンＡ鎖(Abrin  A  Chain)(Wawrzynczak  E.J.,et  al.,Br.J.Cancer,66,361-366,1992;Wawrzynczak  E.J.,et  al.,Cancer  Res.,50,7519-7562,1990;Sivam  G.,et  al.,Cancer  Res.,47,3169-3173,1987;Thorpe  P.E.,et  al.,Cancer  Res.,47,5924-5931,1987);ゲロニン(Gelonin)(Sivam  G.,et  al.,Cancer  Res.,47,3169-3173,1987;Cumber  A.J.et  al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;WawrzynczakE.J.,et  al.,Cancer  Res.,50,7519-7562,1990;Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ポークウイード抗ウィルス蛋白（PAP-s;Pokeweed  anti-viral  protein  fromseeds)(Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ブリオジン(Briodin)(Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);サポリン(Saporin)(Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);モモルジン(Momordin)(Cumber  A.J.,et  al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;Wawrzynczak  E.J.,et  al.,Cancer  Res.,50,7519-7562,1990;Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);モモルコキン(Momorcochin)(Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ジアンシン３２(Dianthin  32)(Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ジアンシン３０(Dianthin  30)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);モデッシン(Modeccin)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);ビスカミン(Viscumin)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);ボルケシン(Volkesin)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);ドデカンドリン(Dodecandrin)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);トリチン(Tritin)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);ルフィン(Luffin)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);トリコキリン(Trichokirin)(Casellas  P.,et  al.,Eur.J.Biochem.176,581-588,1988;Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992)。
【００７９】
本発明において放射性化学物質とは、放射性同位体を含む化学物質のことをいう。放射性同位体は特に限定されず、如何なる放射性同位体を用いてもよいが、例えば、32P、14C、125I、3H、131I、186Re、188Reなどを用いることが可能である。
また別の態様では、一又は二以上の低分子化学療法剤と毒性ペプチドをそれぞれ組み合わせて抗体の修飾に使用できる。抗TM4SF20抗体と上記の低分子化学療法剤との結合は共有結合又は非共有結合が利用できる。これら化学療法剤を結合した抗体の作製方法は公知である。
【００８０】
タンパク質性の薬剤や毒素は、遺伝子工学的な手法によって抗体と結合することができる。具体的には、たとえば上記毒性ペプチドをコードするDNAと抗TM4SF20抗体をコードするDNAをインフレームで融合させて発現ベクター中に組み込んだ組換えベクターが構築できる。該ベクターを適切な宿主細胞に導入することにより得られる形質転換細胞を培養し、組み込んだDNAを発現させて、毒性ペプチドを結合した抗TM4SF20抗体を融合タンパク質として得ることができる。抗体との融合タンパク質を得る場合、一般に、抗体のC末端側にタンパク質性の薬剤や毒素を配置される。抗体と、タンパク質性の薬剤や毒素の間には、ペプチドリンカーを介在させることもできる。
【００８１】
（２）二重特異性抗体
さらに、本発明の抗体は二重特異性抗体（bispecific  antibody）であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体を言う。本発明において、二重特異性抗体はTM4SF20分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有することができる。このような二重特異性抗体は、１分子のTM4SF20に対して２分子の抗体分子が結合できる。その結果、より強力な細胞傷害作用を期待できる。
【００８２】
あるいは、一方の抗原結合部位がTM4SF20を認識し、他方の抗原結合部位が細胞傷害性物質を認識する二重特異性抗体とすることもできる。細胞傷害性物質には、具体的には、化学療法剤、毒性ペプチド或いは放射性化学物質等が含まれる。このような二重特異性抗体は、TM4SF20を発現している細胞に結合する一方で、細胞傷害性物質を捕捉する。その結果、細胞傷害性物質をTM4SF20発現細胞に直接作用させることができる。すなわち細胞傷害性物質を認識する二重特異性抗体によって、腫瘍細胞を特異的に傷害し、腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。
【００８３】
また本発明においては、TM4SF20以外の抗原を認識する二重特異性抗体を組み合わせることもできる。たとえば、TM4SF20と同様に標的とする癌細胞の細胞表面に特異的に発現する抗原であって、TM4SF20とは異なる抗原を認識するような二重特異性抗体を組み合わせることができる。
【００８４】
二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる２種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる抗体は、それぞれがH鎖とL鎖を有する１／２分子であっても良いし、H鎖のみからなる１／４分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体が作製できる。
【００８５】
抗体の抗原結合活性（Antibodies  A  Laboratory  Manual.  Ed  Harlow,  David  Lane,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  1988）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。
【００８６】
（３）糖鎖の改変
本発明の抗体は糖鎖が改変された抗体であってもよい。抗体の糖鎖を改変することにより抗体の細胞傷害活性を増強できることが知られている。糖鎖が改変された抗体としては、例えば、次のような抗体が公知である。
糖鎖が修飾された抗体（WO99/54342など）、
糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体（WO00/61739、WO02/31140など）、
バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体（WO02/79255など）など
【００８７】
３．２  インターナライズ活性
また、本発明の抗体はインターナライズ活性を有していてもよい。本発明において「インターナライズ活性を有する抗体」とは、TM4SF20に結合した際に細胞内（細胞質内、小胞内、他の小器官内など）に輸送される抗体を意味する。
【００８８】
抗体がインターナライズ活性を有するか否かは当業者に公知の方法を用いて確認することができ、例えば、標識物質を結合した抗TM4SF20抗体をTM4SF20を発現する細胞に接触させ該標識物質が細胞内に取り込まれたか否かを確認する方法、細胞傷害性物質を結合した抗TM4SF20抗体をTM4SF20を発現する細胞に接触させ該TM4SF20発現細胞に細胞死が誘導されたか否かを確認する方法、などにより確認することができる。
【００８９】
インターナライズ活性を有する抗体は例えば上述の細胞傷害性物質を結合することにより、後述する抗癌剤などの医薬組成物として用いることができる。
【００９０】
４．  抗TM4SF20抗体の作製
４．１  モノクローナル抗体産生ハイブリドーマによる抗TM4SF20抗体の作製
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、公知技術にしたがい、以下のようにして作製できる。まず、TM4SF20タンパク質、あるいは後述するその部分ペプチドを感作抗原として使用し、通常の免疫方法にしたがって動物を免疫する。得られた免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させてハイブリドーマを得る。さらにこのハイブリドーマから、通常のスクリーニング法により、目的とする抗体を産生する細胞をスクリーニングすることによって抗TM4SF20抗体を産生するハイブリドーマを選択する。選択したハイブリドーマから所望の抗TM4SF20モノクローナル抗体を得る。具体的には、以下のようにして行う。
【００９１】
（１）TM4SF20タンパク質の調製
まず、TM4SF20遺伝子を発現させることによって、抗体取得の感作抗原として使用されるTM4SF20タンパク質が取得できる。すなわち、TM4SF20をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は培養上清中から、目的のヒトTM4SF20タンパク質が公知の方法で精製する。精製した天然のTM4SF20タンパク質、あるいは、TM4SF20タンパク質の所望の部分ポリペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質を免疫原として利用することもできる。免疫原とする融合タンパク質を製造するために、例えば、抗体のFc断片やペプチドタグなどを利用することができる。融合タンパク質を発現するベクターは、所望の二種類又はそれ以上のポリペプチド断片をコードする遺伝子をインフレームで融合させ、当該融合遺伝子を発現ベクターに挿入することにより作製することができる。融合タンパク質の作製方法はMolecular  Cloning  2nd  ed.（Sambrook,J  et  al.,  Molecular  Cloning  2nd  ed.,  9.47-9.58,  Cold  Spring  Harbor  Lab.  press,  1989）に記載されている。
【００９２】
このようにして精製されたTM4SF20タンパク質を、哺乳動物に対する免疫に使用する感作抗原として使用できる。TM4SF20の部分ペプチドもまた感作抗原として使用できる。たとえば、次のようなペプチドを感作抗原とすることができる。
・ヒトTM4SF20のアミノ酸配列に基づいて化学合成によって取得されたペプチド。
・TM4SF20遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによって取得されたペプチド。
・TM4SF20タンパク質をタンパク質分解酵素により分解することによって取得されたペプチド。
【００９３】
部分ペプチドとして用いるTM4SF20の領域及び大きさは限定されない。感作抗原とするペプチドを構成するアミノの数は、少なくとも３以上、たとえば、５以上、あるいは６以上であることが好ましい。より具体的には、８〜５０、好ましくは１０〜３０残基のペプチドを感作抗原とすることができる。
【００９４】
（２）TM4SF20タンパク質による免疫
TM4SF20タンパク質あるいはその部分ペプチドを感作抗原として、哺乳動物を免疫する。免疫される哺乳動物は、特に限定されないが、モノクローナル抗体を細胞融合法によって得るためには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して免疫動物を選択するのが好ましい。一般的には、げっ歯類の動物が免疫動物として好ましい。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギを免疫動物とすることができる。その他、サル等を免疫動物とすることもできる。
【００９５】
上記の動物は、公知の方法にしたがい、感作抗原により免疫できる。例えば、一般的方法として、感作抗原を腹腔内又は皮下に注射することにより哺乳動物を免疫することができる。具体的には、該感作抗原が哺乳動物に4から21日毎に数回投与される。感作抗原は、PBS（Phosphate-Buffered  Saline）や生理食塩水等で適当な希釈倍率で希釈して免疫に使用される。さらに、感作抗原をアジュバントとともに投与してもよい。例えばフロイント完全アジュバントと混合し、乳化して、感作抗原とすることができる。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用できる。特に分子量の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、該感作抗原ペプチドをアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
【００９６】
（３）DNA免疫
モノクローナル抗体は、DNA免疫（DNA  Immunization）によっても得ることができる。DNA免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコードする遺伝子が発現できるような態様で構築されたベクターDNAを当該免疫動物に投与し、免疫抗原を免疫動物の生体内で発現させることによって、免疫刺激を与える方法である。蛋白質抗原を投与する一般的な免疫方法と比べて、DNA免疫には、次のような優位性を期待できる。
−TM4SF20のような膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激を与えることができる
−免疫抗原を精製する必要が無い
【００９７】
DNA免疫によって本発明のモノクローナル抗体を得るには、まず、TM4SF20タンパク質を発現するDNAを免疫動物に投与する。TM4SF20をコードするDNAは、PCRなどの公知の方法によって合成することができる。得られたDNAを適当な発現ベクターに挿入し、免疫動物に投与する。発現ベクターとしては、たとえばpcDNA3.1などの市販の発現ベクターを利用することができる。ベクターを生体に投与する方法も、一般に用いられている方法を利用することができる。たとえば、発現ベクターを吸着させた金粒子を、遺伝子銃（gene  gun）で細胞内に打ち込むことによってＤＮＡ免疫を行うことができる。
【００９８】
（４）ハイブリドーマの作製
上述のように哺乳動物が免疫され、血清中における所望の抗体量の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用できる。
【００９９】
上記の免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（以下HGPRT欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下TK欠損と省略する）などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性（以下HAT感受性と省略する）を有する。HAT感受性の細胞はHAT選択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖するようになる。
【０１００】
HGPRT欠損やTK欠損の細胞は、それぞれ6チオグアニン、8アザグアニン（以下8AGと省略する）、あるいは5'ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択することができる。正常な細胞はこれらのピリミジンアナログをDNA中に取り込んでしまうので死滅するが、これらの酵素を欠損した細胞は、これらのピリミジンアナログを取り込めないので選択培地の中で生存することができる。この他、G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2-デオキシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。例えば、以下のようなミエローマ細胞を、本発明におけるモノクローナル抗体の製造に利用することができる。
P3（P3x63Ag8.653）（J.  Immunol.（1979）123,  1548-1550）
P3x63Ag8U.1（Current  Topics  in  Microbiology  and  Immunology（1978）81,  1-7）
NS-1（Kohler.  G.  and  Milstein,  C.  Eur.  J.  Immunol.（1976）6,  511-519）
MPC-11（Margulies.  D.H.  et  al.,  Cell（1976）8,  405-415）
SP2/0（Shulman,  M.  et  al.,  Nature（1978）276,  269-270）
FO（de  St.  Groth,  S.  F.  etal.,  J.  Immunol.  Methods（1980）35,  1-21）
S194（Trowbridge,  I.  S.  J.  Exp.  Med.（1978）148,  313-323）
R210（Galfre,  G.  et  al.,  Nature（1979）277,  131-133）等
【０１０１】
基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler.  G.  and  Milstein,  C.、Methods  Enzymol.（1981）73,  3-46）等に準じて、免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合が行われる。
【０１０２】
より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、細胞融合が実施できる。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等を使用することができる。さらに融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を加えることもできる。
【０１０３】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定できる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。細胞融合に用いる培養液としては、例えば、ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液を利用することができる。さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を培養液に添加することができる。
【０１０４】
細胞融合は、免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液を混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。細胞融合法においては、例えば平均分子量1000から6000程度のPEGを、通常30から60％（w/v）の濃度で添加することができる。続いて、上記に挙げた適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去される。
【０１０５】
このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられたミエローマが有する選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって選択することができる。例えばHGPRTやTKの欠損を有する細胞は、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養することにより選択できる。すなわち、HAT感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞を選択的に増殖させることができる。目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週間の培養によって、目的とするハイブリドーマを選択することができる。ついで、通常の限界希釈法を実施することによって、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングが実施できる。
【０１０６】
目的とする抗体のスクリーニング及び単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法によって好適に実施できる。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の96ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させる。次いで担体を洗浄した後に酵素で標識した二次抗体等を反応させる。もしも培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれる場合、二次抗体はこの抗体を介して担体に結合する。最終的に担体に結合する二次抗体を検出することによって、目的とする抗体が培養上清中に存在しているかどうかが決定できる。抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることが可能となる。この際、抗原としては免疫に用いたものを始め、実質的に同質なTM4SF20タンパク質が好適に使用できる。たとえばTM4SF20を発現する細胞株、可溶型TM4SF20などを抗原として利用することができる。
【０１０７】
ヒトTM4SF20に対する抗体の産生には、国際公開WO03/104453に記載された方法を利用することもできる。
【０１０８】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫することによって上記ハイブリドーマを得る方法以外に、ヒトリンパ球を抗原感作して目的とする抗体を得ることもできる。具体的には、まずインビトロにおいてヒトリンパ球をTM4SF20タンパク質で感作する。次いで免疫感作されたリンパ球を適当な融合パートナーと融合させる。融合パートナーには、たとえばヒト由来であって永久分裂能を有するミエローマ細胞を利用することができる（特公平1-59878号公報参照）。
【０１０９】
さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に対して抗原となるTM4SF20タンパク質を投与するか、又はTM4SF20を当該動物中において発現するように構築されたDNAによって免疫することによって、抗TM4SF20ヒト抗体を得ることもできる。免疫動物の抗体産生細胞は、適当な融合パートナーとの細胞融合やエプスタインバーウイルスの感染などの処理によって不死化させることができる。このようにして得られた不死化細胞から、TM4SF20タンパク質に対するヒト抗体を単離することができる（国際公開WO  94/25585、WO  93/12227、WO  92/03918、WO  94/02602参照）。さらに不死化された細胞をクローニングすることにより、目的の反応特異性を有する抗体を産生する細胞をクローニングすることもできる。トランスジェニック動物を免疫動物とするときには、当該動物の免疫システムは、ヒトTM4SF20を異物と認識する。したがって、ヒトTM4SF20に対するヒト抗体を容易に得ることができる。
【０１１０】
（５）ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の取得
以上のようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することができる。また、該ハイブリドーマを液体窒素中で長期にわたって保存することもできる。
【０１１１】
目的とするモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から得ることができる。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水としてモノクローナル抗体を得ることもできる。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適している。
【０１１２】
４．２  遺伝子工学的手法による抗TM4SF20抗体の作製
（１）  抗体遺伝子のクローニング
抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子を利用することにより、遺伝子工学的手法を用いて、抗体を作製することもできる。クローニングした抗体遺伝子は、適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって抗体として発現させることができる。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されている（例えば、Vandamme,  A.  M.  et  al.,  Eur.J.  Biochem.（1990）192,  767-775参照）。
【０１１３】
たとえば、抗TM4SF20抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、抗TM4SF20抗体の可変領域（V領域）をコードするcDNAを得ることができる。そのためには、通常、まずハイブリドーマから全RNAが抽出される。細胞からmRNAを抽出するための方法として、たとえば次のような方法を利用することができる。
・グアニジン超遠心法（Chirgwin,  J.  M.  et  al.,  Biochemistry（1979）18,  5294-5299）
・AGPC法（Chomczynski,  P.et  al.,  Anal.  Biochem.（1987）162,  156-159）
【０１１４】
抽出されたmRNAは、mRNA  Purification  Kit  （GEヘルスケアバイオサイエンス製）等を使用して精製することができる。あるいは、QuickPrep  mRNA  Purification  Kit  （GEヘルスケアバイオサイエンス製）などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマから全mRNAを得ることもできる。得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域をコードするcDNAを合成することができる。その際、抗体遺伝子に共通な配列より選び出した任意の15-30塩基の配列をプライマーとして用いることができる。cDNAは、AMV  Reverse  Transcriptase  First-strand  cDNA  Synthesis  Kit（生化学工業社製）等によって合成することができる。また、cDNAの合成及び増幅のために、5'-Ampli  FINDER  RACE  Kit（Clontech製）及びPCRを用いた5'-RACE法（Frohman,  M.  A.  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA（1988）85,  8998-9002、Belyavsky,  A.et  al.,  Nucleic  Acids  Res.（1989）17,  2919-2932）を利用することができる。さらにこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に後述する適切な制限酵素サイトが導入できる。
【０１１５】
得られたPCR産物から目的とするcDNA断片が精製され、次いでベクターDNAと連結される。このように組換えベクターが作製され、大腸菌等に導入されコロニーが選択された後に、該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターが調製できる。そして、cDNAの塩基配列を、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認することができる。
【０１１６】
また、抗体の可変領域をコードする遺伝子を得るために、cDNAライブラリーを利用することもできる。まず抗体産生細胞から抽出されたmRNAを鋳型としてcDNAを合成し、cDNAライブラリーを得る。cDNAライブラリーの合成には市販のキットを用いるのが便利である。実際には、少数の細胞のみから得られるmRNAは極めて微量なので、それを直接精製すると収率が低い。したがって通常は、抗体遺伝子を含まないことが明らかなキャリアRNAを添加した後に精製される。あるいは一定量のRNAを抽出できる場合には、抗体産生細胞のRNAのみでも効率よく抽出することができる。たとえば10以上、あるいは30以上、好ましくは50以上の抗体産生細胞からのRNA抽出には、キャリアRNAの添加は必要でない場合がある。
【０１１７】
得られたcDNAライブラリーを鋳型として、PCR法によって抗体遺伝子が増幅される。抗体遺伝子をPCR法によって増幅するためのプライマーが公知である。たとえば、論文（J.  Mol.  Biol.  (1991)  222,  581-597）などの開示に基づいて、ヒト抗体遺伝子増幅用のプライマーをデザインすることができる。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列となる。したがって、サブクラスが不明のcDNAライブラリーを鋳型とするときには、あらゆる可能性を考慮してPCR法が行われる。
【０１１８】
具体的には、たとえばヒトIgGをコードする遺伝子の取得を目的とするときには、重鎖としてγ１〜γ５、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能なプライマーを利用することができる。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3'側のプライマーにはヒンジ領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用される。一方5'側のプライマーには、各サブクラスに応じたプライマーを用いることができる。
【０１１９】
重鎖と軽鎖の各サブクラスの遺伝子増幅用プライマーによるPCR産物は、それぞれ独立したライブラリーとする。こうして合成されたライブラリーを利用して、重鎖と軽鎖の組み合せからなるイムノグロブリンを再構成することができる。再構成されたイムノグロブリンの、TM4SF20に対する結合活性を指標として、目的とする抗体をスクリーニングすることができる。
【０１２０】
（２）宿主細胞への抗体遺伝子の導入
抗TM4SF20抗体を製造するために、クローニングされた抗体遺伝子を、発現制御領域の制御下で発現するように発現ベクターに組み込む。抗体を発現するための発現制御領域とは、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。次いで、この発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換することによって、抗TM4SF20抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞を得ることができる。
【０１２１】
抗体遺伝子の発現にあたり、抗体重鎖（H鎖）及び軽鎖（L鎖）をコードするDNAは、それぞれ別の発現ベクターに組み込むことができる。H鎖とL鎖が組み込まれたベクターを、同じ宿主細胞に同時に形質転換（co-transfect）することによって、H鎖とL鎖を備えた抗体分子を発現させることができる。あるいはH鎖及びL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（国際公開WO  94/11523参照）。
【０１２２】
単離した抗体遺伝子を適当な宿主に導入して抗体を作製するための宿主と発現ベクターの多くの組み合わせが公知である。これらの発現系は、いずれも本発明に応用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が使用できる。具体的には、本発明に利用することができる動物細胞としては、次のような細胞を例示することができる。
i)  哺乳類細胞、：CHO、COS、ミエローマ、BHK（baby  hamster  kidney）、Hela、Vero、HEK293、Ba/F3、HL-60、Jurkat、SK-HEP1など
ii)  両生類細胞：アフリカツメガエル卵母細胞など
iii)  昆虫細胞：sf9、sf21、Tn5など
【０１２３】
植物細胞としては、ニコティアナ・タバカム（Nicotiana  tabacum）などのニコティアナ（Nicotiana）属由来の細胞による抗体遺伝子の発現系が公知である。植物細胞の形質転換には、カルス培養した細胞を利用することができる。
さらに真菌細胞としては、次のような細胞を利用することができる：
酵母：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces  serevisiae）などのサッカロミセス（Saccharomyces）属、メタノール資化酵母（Pichia  pastoris）などのPichia属糸状菌：アスペスギルス・ニガー（Aspergillus  niger）などのアスペルギルス（Aspergillus）属。
【０１２４】
あるいは原核細胞を利用した抗体遺伝子の発現系も公知である。たとえば、細菌細胞を用いる場合、大腸菌（E.  coli）、枯草菌などの細菌細胞を本発明に利用することができる。
【０１２５】
哺乳類細胞を用いる場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その3'側下流にポリAシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（human  cytomegalovirus  immediate  early  promoter/enhancer）を挙げることができる。
【０１２６】
また、その他に、ウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等を、抗体発現のために使用することができる。プロモーター／エンハンサーを利用することができるウイルスとして、具体的には、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40（SV40）等を示すことができる。
【０１２７】
SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277,  108）を利用することができる。また、HEF1αプロモーター／エンハンサーはMizushimaらの方法（Nucleic  Acids  Res.（1990）18,  5322）により、容易に目的とする遺伝子発現に利用することができる。
【０１２８】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子が発現できる。プロモーターとしては、例えばlacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1989）341,  544-546  ;  FASEBJ.（1992）6,  2422-2427）を利用することができる。あるいはaraBプロモーターはBetterらの方法（Science（1988）240,  1041-1043）により、目的とする遺伝子の発現に利用することができる。
【０１２９】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei,  S.  P.  et  al.,  J.  Bacteriol.（1987）169,  4379）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、尿素やグアニジン塩酸塩の様なタンパク質変性剤を使用することによって所望の結合活性を有するように、抗体の構造が組み直される（refolded）。
【０１３０】
動物細胞を用いて抗体を産生させる場合に、細胞外への分泌のために必要とされるシグナル配列としては抗体の重鎖遺伝子又は軽鎖遺伝子のシグナル配列を用いることが望ましい。また、IL-3やIL-6などの分泌タンパク質が有するシグナル配列を用いることも可能である。
【０１３１】
発現ベクターに挿入される複製起源としては、SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（BPV）等の由来のものを用いることができる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクター中に、選択マーカーを挿入することができる。具体的には、次のような選択マーカーを利用することができる。
アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）遺伝子
チミジンキナーゼ（TK）遺伝子
大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子
ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等
【０１３２】
（３）宿主細胞からの抗体の取得
これらの発現ベクターを宿主細胞に導入し、次に、形質転換された宿主細胞をインビトロ又はインビボで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。
【０１３３】
上述のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法を単独で使用することによって又は適宜組み合わせることによって精製できる。例えば、プロテインAカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies  A  Laboratory  Manual.  Ed  Harlow,  David  Lane,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  1988）。
【０１３４】
４．３  トランスジェニック動物による抗体産生
組換え型抗体の産生には、上記宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物を利用することもできる。すなわち目的とする抗体をコードする遺伝子を導入された動物から、目的とする抗体を得ることができる。例えば、抗体遺伝子は、乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の内部にインフレームで挿入することによって融合遺伝子として構築できる。乳汁中に分泌されるタンパク質として、たとえば、ヤギβカゼインなどを利用することができる。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片はヤギの胚へ注入され、該注入胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ（又はその子孫）が産生する乳汁からは、所望の抗体を乳汁タンパク質との融合タンパク質として取得できる。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに適宜使用できる（Ebert,  K.M.  et  al.,  Bio/Technology（1994）12,  699-702）。
【０１３５】
５．医薬組成物
TM4SF20は胃癌、肺腺癌、膵臓癌、大腸癌等の癌組織で特異的に高発現し、抗TM4SF20抗体は、癌細胞特異的な細胞傷害作用を有する。したがって、抗TM4SF20抗体は、これらのTM4SF20を発現する癌の治療に有用である。
【０１３６】
すなわち、本発明は、TM4SF20タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。ある実施形態において、前記医薬組成物は細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤である。本発明の細胞増殖抑制剤及び抗癌剤は、癌を罹患している対象又は罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。
【０１３７】
本発明の医薬組成物（例えば、抗癌剤）において用いられる抗TM4SF20抗体は特に限定されず、例えば上述した任意の抗TM4SF20抗体を用いることができる。
【０１３８】
本発明において、「TM4SF20に結合する抗体を有効成分として含有する」とは、抗TM4SF20抗体を主要な活性成分として含むという意味であり、抗TM4SF20抗体の含有率を制限するものではない。
【０１３９】
本発明の医薬組成物は、３．１（１）に記載したように、細胞傷害性物質が結合した抗TM4SF20抗体を有効成分としてもよい。前記医薬組成物は、例えば、細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤として利用できる。本発明の細胞増殖抑制剤及び抗癌剤は、癌を罹患している対象又は罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。
【０１４０】
本発明において、「細胞傷害性物質が結合した抗TM4SF20抗体を有効成分として含有する」とは、細胞傷害性物質が結合した抗TM4SF20抗体を主要な活性成分として含むという意味であり、細胞傷害性物質が結合した抗TM4SF20抗体の含有率を制限するものではない。
【０１４１】
本発明の医薬組成物が対象とする疾患が癌の場合、対象となる癌は特に限定されないが、胃癌、肺腺癌、膵臓癌、大腸癌であることが好ましい。癌は原発巣及び転移層のいずれであってもよい。
【０１４２】
本発明の医薬組成物は、経口、非経口投与のいずれかによって患者に投与することができる。好ましくは非経口投与である。係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物が全身又は局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1  kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000  mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
【０１４３】
本発明の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's  Pharmaceutical  Science,  latest  edition,  Mark  Publishing  Company,  Easton,  U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられる。さらにこれらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を担体として挙げることができる。
【０１４４】
本発明の抗TM4SF20抗体は、TM4SF20発現細胞と接触させることによりTM4SF20発現細胞に傷害を引き起こす又は細胞の増殖を抑制することができる。こうした利用方法も、本発明の範囲である。用いられる抗体は、特に限定されず、例えば上述した任意の抗体を用いることが可能である。抗TM4SF20抗体が結合する細胞はTM4SF20が発現している細胞であれば特に限定されない。本発明における好ましいTM4SF20発現細胞は癌細胞である。より好ましくは、胃癌細胞、肺腺癌細胞、膵臓癌細胞、大腸癌細胞である。上記方法は、これらの癌の、原発巣及び転移層のいずれに対しても適用することができる。
【０１４５】
本発明において「接触」は、例えば、試験管内で培養しているTM4SF20発現細胞の培養液に抗体を添加することにより行われる。また本発明において「接触」はさらに、TM4SF20発現細胞を体内に移植した非ヒト動物や内在的にTM4SF20を発現する癌細胞を有する動物に投与することによっても行われる。
【０１４６】
抗TM4SF20抗体の接触によってTM4SF20発現細胞に引き起こされた細胞傷害を評価又は測定する方法として、以下の方法が好適に使用される。試験管内において該細胞傷害活性を評価又は測定する方法としては、上記の抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent  cell-mediated  cytotoxicity：ADCC）活性、補体依存性細胞傷害（complement-dependent  cytotoxicity：CDC）活性などの測定法を挙げることができる。抗TM4SF20抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Current  protocols  in  Immunology,  Chapter  7.  Immunologic  studies  in  humans,  Editor,  John  E,  Coligan  et  al.,  John  Wiley  &  Sons,  Inc.,(1993)等）。活性の測定に際しては、対照抗体として抗TM4SF20抗体と同一のアイソタイプを有する抗体で該細胞傷害活性を有しない結合抗体を、抗TM4SF20抗体と同様に使用して、抗TM4SF20抗体が対照抗体よりも強い細胞傷害活性を示すことにより活性を判定することができる。
【０１４７】
抗体のアイソタイプは、その抗体のアミノ酸配列のH鎖定常領域の配列で規定される。生体内においては、抗体産生Ｂ細胞の成熟化の際に起こる染色体上の遺伝子組み換えにより生じるクラススイッチによって抗体のアイソタイプが最終的に決定される。アイソタイプの相違が抗体の生理的・病理的機能の相違に反映される。具体的には、例えば、細胞傷害活性の強度は抗原の発現量と共に、抗体のアイソタイプによっても影響されることが知られている。従って、上記記載の細胞傷害活性の測定に際しては、対照として用いられる抗体は被験抗体と同一のアイソタイプを用いることが好ましい。
【０１４８】
また、生体内で細胞傷害活性を評価、あるいは測定するために、例えばTM4SF20発現癌細胞を非ヒト被検動物の皮内又は皮下に移植後、当日又は翌日から毎日又は数日間隔で被験抗体を静脈又は腹腔内に投与する。腫瘍の大きさを経日的に測定することにより細胞傷害活性を判定することができる。試験管内での評価と同様に同一のアイソタイプを有する対照抗体を投与し、抗TM4SF20抗体投与群における腫瘍の大きさが対照抗体投与群における腫瘍の大きさよりも有意に小さいことにより細胞傷害活性を有すると判定することができる。非ヒト被検動物としてマウスを用いる場合には、胸腺を遺伝的に欠損してそのＴリンパ球の機能を欠失したヌード（nu/nu）マウスを好適に用いることができる。当該マウスを使用することにより、投与された抗体による細胞傷害活性の評価・測定に当たって被検動物中のTリンパ球の関与を除くことができる。
【０１４９】
６．診断薬（診断方法）
また、本発明はTM4SF20タンパク質又はTM4SF20タンパク質をコードする遺伝子を検出することを特徴とする癌の診断方法を提供する。TM4SF20は種々の癌組織あるいは癌細胞株において顕著な発現亢進が確認されている。したがって、TM4SF20は、癌を特異的に検出するためのマーカーとして有用である。
【０１５０】
６．１  TM4SF20タンパク質の検出
本発明の方法の1つの態様においては、試料中のTM4SF20タンパク質を検出することにより癌の診断が行われる。TM4SF20タンパク質の検出はTM4SF20タンパク質を認識する抗体を用いて行われることが好ましい。
本発明の診断方法の具体例の一つとして、以下の工程を含む癌の診断方法を挙げることができる。
(a)被験者から単離された試料を準備する工程、
(b)上記試料におけるTM4SF20タンパク質又はTM4SF20遺伝子の発現量を検出する工程。
また、本発明の診断方法においては、上述の(a)および(b)の工程にさらに、(c)上記TM4SF20タンパク質又はTM4SF20遺伝子の発現量に基づいて被験者が癌である可能性を評価する工程、を含んでもよい。
【０１５１】
本発明において検出とは、定量的又は定性的な検出を含む。例えば、定性的な検出としては、次のような測定を挙げることができる。
・単にTM4SF20タンパク質が存在するか否かの測定
・TM4SF20タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定
・TM4SF20タンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定など
【０１５２】
一方、定量的な検出とは、TM4SF20タンパク質の濃度の測定、TM4SF20タンパク質の量の測定などを挙げることができる。
【０１５３】
本発明における被検試料は、TM4SF20タンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されない。具体的には、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましい。さらに好ましい試料は、ヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿、組織などが例示できる。好ましい試料は、生物の体から採取された組織若しくは細胞が固定化された標本又は細胞の培養液などの被検試料から得られる試料である。
【０１５４】
本発明によって診断される癌は、特に制限されることはなく如何なる癌でもよい。具体的には、胃癌、肺腺癌、膵臓癌、大腸癌などを挙げることができる。本発明においては、これらの癌の原発病巣、及び転移病巣のいずれをも診断することができる。
【０１５５】
本発明においては、被検試料中にタンパク質が検出された場合に、そのレベルを指標として癌が診断される。具体的には、陰性コントロール又は健常者と比較して被検試料中に検出されるTM4SF20タンパク質の量が多い場合に、被検者が癌である、又は将来癌を羅患する可能性が高いことが示される。すなわち本発明は、次の工程を含む癌の診断方法に関する。
(1)  被検者から採取された生体試料中のTM4SF20発現レベルを検出する工程、及び
(2)  (1)で検出されたTM4SF20の発現レベルが、対照と比較して高い場合に被検者が癌を有することが示される工程。
【０１５６】
本発明において、対照とは、比較の基準となる試料をいい、陰性コントロールや健常者の生体試料が含まれる。陰性コントロールは、健常者の生体試料を採取し、必要に応じて混合することによって得ることができる。対照のTM4SF20の発現レベルは、被検者の生体試料におけるTM4SF20の発現レベルと平行して検出することができる。あるいは、予め、多数の健常者の生体試料におけるTM4SF20の発現レベルを検出し、健常者における標準的な発現レベルを統計学的に決定することができる。具体的には、たとえば、平均値±２×標準偏差(S.D.)、あるいは平均値±３×標準偏差(S.D.)を標準値として用いることもできる。統計学的に、平均値±２×標準偏差(S.D.)は80％の、また平均値±３×標準偏差(S.D.)は90％の健常者の値を含む。
【０１５７】
あるいは、対照におけるTM4SF20の発現レベルを、ROC曲線を利用して設定することができる。ROC曲線(receiver  operating  characteristic  curve；受信者操作特性曲線）は、縦軸に検出感度を、横軸に擬陽性率（すなわち"１−特異度"）を示すグラフである。本発明においては、生体試料中のTM4SF20の発現レベルを判定するための基準値を連続的に変化させたときの、感度と擬陽性率の変化をプロットすることによって、ROC曲線を得ることができる。
【０１５８】
なおROC曲線を得るための「基準値」は、統計学的な解析のために一時的に利用される数値である。ROC曲線を得るための「基準値」は、一般的には、選択しうる全ての基準値をカバーできる範囲内で、連続的に変化させられる。たとえば、解析される集団のTM4SF20の測定値の最小値と最大値の間で、基準値を変化させることができる。
【０１５９】
得られたROC曲線に基づいて、所望の検出感度、並びに精度を期待できる標準値を選択することができる。ROC曲線などによって統計学的に設定された標準値は、カットオフ値(cut-off  value)とも呼ばれる。カットオフ値に基づく癌の検出方法においては、上記工程(2)において、(1)で検出されたTM4SF20の発現レベルが、カットオフ値と比較される。そして、カットオフ値よりも(1)で検出されたTM4SF20の発現レベルが高いときに、被検者の癌が検出される。
【０１６０】
本発明において、TM4SF20の発現レベルは、任意の方法によって決定することができる。具体的には、TM4SF20のmRNAの量、TM4SF20タンパク質の量、そしてTM4SF20タンパク質の生物学的な活性を評価することによって、TM4SF20の発現レベルを知ることができる。TM4SF20のmRNAやタンパク質の量は、本明細書に記載したような方法によって決定することができる。
【０１６１】
本発明においては、特に好適な被検者はヒトである。なおヒト以外の動物を被験者とするときは、当該動物種のTM4SF20タンパク質が検出される。
【０１６２】
被検試料に含まれるTM4SF20タンパク質の検出方法は、特に限定されないが、抗TM4SF20抗体を用いた、以下に例示されるような免疫学的方法により検出することが好ましい。
酵素結合免疫吸着法（ELISA）、
ラジオイムノアッセイ（RIA）、
エンザイムイムノアッセイ（EIA）、
蛍光イムノアッセイ（FIA）、
発光イムノアッセイ（LIA）、
免疫沈降法（IP）、
免疫比濁法（TIA）、
ウエスタンブロット（WB）、
免疫組織化学（IHC）法、
免疫拡散法（SRID）、
ドットブロット法、
スロットブロット法。
【０１６３】
これらの手法の中で、免疫組織化学（IHC）法は、癌に羅患した患者から取得した組織若しくは細胞を固定化した切片上でTM4SF20タンパク質を検出する工程を含み、癌の診断方法として好ましい免疫学的アッセイ法の一つである。免疫組織化学（IHC）法などの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法である。
【０１６４】
TM4SF20は、癌細胞において特異的に発現が増強している膜タンパク質であることから、抗TM4SF20抗体によって、癌細胞、あるいは癌組織を検出することができる。上記の免疫組織学的な解析によって、生体から採取された細胞や組織に含まれる癌細胞が検出される。
【０１６５】
別な好ましい態様では、生体内の癌組織を抗TM4SF20抗体によって検出することもできる。この方法は、具体的には、(1)放射性同位元素等の標識物質で標識されたTM4SF20タンパク質に結合する抗体を被検者に投与する工程と、(2)該標識物質の集積を検出する工程を含む。生体内に投与した抗体を追跡するために、抗体は、検出可能に標識することができる。たとえば蛍光物質や発光物質、あるいは放射性同位元素で標識された抗体の生体における挙動を追跡することができる。蛍光物質や発光物質で標識された抗体は、内視鏡や腹腔鏡を利用して観察することができる。放射性同位元素は、その放射活性を追跡することによって、抗体の局在を画像化することができる。本発明において、生体内における抗TM4SF20抗体の局在は、癌細胞の存在を表している。
【０１６６】
生体内の癌を検出するために抗体を標識する放射性同位元素として、陽電子放出核種を利用することができる。たとえば18F、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr、及び124Iのような陽電子放出核種で抗体を標識することができる。これらの陽電子放出核種による抗TM4SF20抗体の標識には、公知の方法（Acta  Oncol.  32,  825-830,  1993）を利用することができる。
【０１６７】
陽電子放出核種で標識された抗TM4SF20抗体がヒトや動物に投与された後に、PET（ポジトロン断層撮影装置）により、その放射性核種が放射する放射線が体外から計測され、コンピュータートモグラフィーの手法で画像に変換される。PETは、薬物の体内挙動などに関するデータを非侵襲的に得るための装置である。PETによって、放射強度をシグナル強度として定量的に画像化することができる。上記のようにPETを使用することによって、患者から試料を採取することなく特定の癌で高発現する抗原分子が検出できる。抗TM4SF20抗体は、上記の核種の他に11C、13N、15O、18F、45Ti等の陽電子放出核種を用いた短寿命核種によって放射標識することもできる。
【０１６８】
医療用サイクロトロンによる上記核種を用いた短寿命核種の生産、短寿命放射標識化合物の製造技術等に関する研究開発が進められている。これらの技術により抗TM4SF20抗体を種々の放射性同位元素によって標識することができる。患者に投与された抗TM4SF20抗体は、各部位の病理組織に対する抗TM4SF20抗体の特異性に従って原発巣及び転移巣に集積する。抗TM4SF20抗体が陽電子放出核種で標識されていれば、その放射活性を検出することにより該原発巣及び転移巣の存在が放射活性の局在によって検出される。該診断用途に用いる場合には25-4000  keVのガンマ粒子又は陽電子放射量の活性値が適切に使用できる。また、適切な核種を選択して、さらに大量に投与すれば治療効果も期待できる。放射線による抗癌作用を得るためには、70-700  keVのガンマ粒子又は陽電子放射量値を与える核種を使用できる。
【０１６９】
６．２  TM4SF20遺伝子の検出
本発明の方法の別の態様においては、TM4SF20の遺伝子の発現を検出する。本発明において検出される遺伝子は特に限定されないが、mRNAが好ましい。本発明において検出とは、定量的又は定性的な検出を含む。例えば、定性的な検出として、次のような測定操作を挙げることができる。
・単にTM4SF20のmRNAが存在するか否かの測定、
・TM4SF20のmRNAが一定の量以上存在するか否かの測定、
・TM4SF20のmRNAの量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定など
【０１７０】
一方、定量的な検出とは、TM4SF20のmRNAの濃度の測定、TM4SF20のmRNAの量の測定などを挙げることができる。
【０１７１】
本発明における被検試料としては、TM4SF20のmRNAが含まれる可能性のある任意の試料を利用することができる。哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿、組織などが例示できる。好ましい試料は生物の体から採取された組織若しくは細胞が固定化された標本又は細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。
【０１７２】
生物の体から採取された組織、若しくは細胞が固定化された標本、又は細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料を用いる場合にはインシトゥーハイブリダイゼーション法が好適に用いられる。インシトゥーハイブリダイゼーション法は、細胞や組織内の特定のDNAやRNAの有無若しくは分布及びその発現の強弱を確認する手法として発展してきた。原理としては細胞内の特定の核酸配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸が特異的に複合体を形成する性質を利用したものである。当該プローブに予め放射性同位元素（RI）や抗原物質（ハプテン）等を標識しておくことにより、当該標識の検出を通じてハイブリダイゼーションした箇所が識別可能となることから、インシトゥーハイブリダイゼーション法は細胞内DNAやRNAなどの検出等に用いられている。プローブの標識としては好適にはRIによる標識を用いることができる。さらに好適な例としては、非放射性物質のビオチンやジゴキシゲニン等のハプテン等を利用した蛍光標識を用いることができる。特に好適な例としてはFISHと呼ばれる蛍光インシトゥーハイブリダイゼーション（fluorescence  in  situ  hibridization）による検出法が用いられる。
【０１７３】
診断される癌は、特に制限されない。具体的には、胃癌、肺腺癌、膵臓癌、大腸癌などを挙げることができる。本発明においては、これらの癌の原発病巣、及び転移病巣のいずれをも診断することができる。
【０１７４】
本発明においてはTM4SF20遺伝子を発現する任意の動物種を被験者とすることができる。特に好適な被検者はヒトである。なおヒト以外の動物種を被験者とするときには、当該動物種のTM4SF20の遺伝子が検出される。
【０１７５】
以下に検出方法の具体的な態様を記載する。まず、被検者から試料を調製する。次いで、該試料に含まれるTM4SF20のmRNAを検出する。本発明においては、mRNAから合成したcDNAを検出することもできる。本発明においては、被検試料中にTM4SF20のmRNAやTM4SF20をコードするcDNAが検出された場合、癌の可能性があると判定される。たとえば、陰性コントロール又は健常者と比較して、被検試料中に検出されるTM4SF20のmRNAやTM4SF20をコードするcDNAの量が多い場合に、被検者が癌である、又は将来癌を羅患する可能性が高いことが示される。
【０１７６】
mRNAを検出する方法は、公知である。具体的には、例えば遺伝子チップ、cDNAアレイ、及びメンブレンフィルターから選ばれる固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法等を本発明に利用することができる。
【０１７７】
上記した本発明の検出方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもできる。自動化することによって、短時間に多数の試料を検査することができる。
【０１７８】
６．３  診断薬、試薬、キット
本発明は、被検試料中のTM4SF20タンパク質を検出するための試薬を含む、癌の診断のための診断薬又はキットも提供する。本発明の診断薬は、少なくとも抗TM4SF20抗体を含む。
【０１７９】
本発明の癌の診断用試薬と、TM4SF20の検出に用いられるその他の要素を組み合わせることによって、癌の診断のためのキットとすることができる。すなわち本発明は、TM4SF20に結合する抗体と、該抗体とTM4SF20との結合を検出する試薬を含み、さらにTM4SF20を含む生体試料からなる対照試料を含んでいてもよい、癌の診断のためのキットに関する。本発明のキットには、さらに測定操作を説明するための指示書をキットに添付することもできる。
【０１８０】
以下、実施例により、本発明について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１８１】
TM4SF20  mRNAの発現解析  Human  Exon  1.0  ST  Array、Human  Genome  U133  Set及びHuman  Genome  U133  Plus  2.0  Array  (いずれもAffymetrix)を用いてTM4SF20  mRNAの臨床癌、癌細胞株及び正常組織における発現を解析した。Human  Exon  1.0  ST  Arrayを用いた発現解析は、図1に示した各サンプルのtotal  RNA  1μgを用い、GeneChip  Whole  Transcript  (WT)  Sense  Target  Labeling  Assay  Manual  (Affymetrix)に準じて実施した。データの数値化にはExACT  (Exon  Array  Computational  Tool)ソフトウェア  (Affymetrix)を用いた。Human  Genome  U133  Set及びHuman  Genome  U133  Plus  2.0  Arrayを用いた発現解析は、図2に示した各サンプルのtotal  RNA  10μgを用い、Expression  Analysis  Technical  Manual  (Affymetrix)に準じて実施した。正常組織由来のtotal  RNAはClontech、Ambion、Stratagene、Cell  Applications、Panomics、Chemicon及びBiochain  Instituteから購入した。臨床癌検体(インフォームドコンセント取得済み)の腫瘍部や正常部、癌細胞株については、Trizol  (Invitrogen)又はIsogen  (ニッポンジーン)を用いて製品添付の方法に従ってtotal  RNAを精製した。【０１８２】
Human  Exon  1.0  ST  Arrayについては、コーディング領域に設定されているコアプローブセット(プローブセットID;  2602308,  2602309,  2602310,  2602312,  2602315)の数値の平均値を発現データとした。正常組織、癌細胞株、臨床胃癌及び臨床肺腺癌の発現データを図1に示した。なお臨床胃癌検体は腸型(検体番号;  stomach  102t,  106t,  107t,  109t,  111t,  27t)、スキルス型(stomach  103t,  108t,  112t,  113t,  52t,  78t,  87t,  167t)及びその他のタイプ(stomach  105t,  101t)を含む。【０１８３】
Human  Genome  U133  Set及びHuman  Genome  U133  Plus  2.0  Arrayについては、TM4SF20に対するプローブ(プローブID;  220639_at)の数値を発現データとした。正常組織、癌細胞株、臨床大腸癌、臨床膵臓癌の発現データを図2に示した。【０１８４】
これらの発現解析の結果、TM4SF20は正常組織では小腸及び胎児大腸以外ではほとんど発現していないのに対し、癌では膵臓癌細胞株AsPC-1、肺腺癌細胞株A549、臨床胃癌(腸型及びスキルス型を含む)、臨床肺腺癌、臨床大腸癌及び臨床膵臓癌で発現が認められた。従ってTM4SF20が胃癌、肺腺癌、膵臓癌及び大腸癌の治療標的分子もしくは診断マーカーとなることが示された。
【実施例２】
【０１８５】
TM4SF20に対する抗体の作製
１．TM4SF20のクローニング
癌細胞株A549  (JCRB)からTrizol  (Invitrogen)を用いてtotal  RNAを抽出し、さらにSuperScript  III  Reverse  Transcriptase  (Invitrogen)を用いて製品添付の方法に従ってcDNAを作製した。このcDNAをテンプレートとして、配列番号：1で表されるプライマー(NotI認識配列-Kozak配列-TM4SF20の5'末端配列)、配列番号：2で表されるプライマー(XbaI認識配列-TM4SF20の3'末端配列)を用いてPCR増幅を行い、増幅産物をpGEM-T  Easy  Vector  Systems  (Promega)を用いてpGEM-T  Easyベクターにクローニングした(pGEM-T_TM4SF20)。PCR増幅にはKOD  Plus  Ver.2  (東洋紡)を用い、5μLの10×KOD  Plus  Ver.2  buffer、5μLのdNTP  mixture、3μLの25  mM  MgSO4、1.5μLの配列番号：1のプライマー  (10μM)、1.5μLの配列番号：2のプライマー  (10μM)、2.5μLのA549  cDNA、1μLのKOD  Plus  Polymerase、30.5μLのヌクレアーゼフリー水を含む溶液を調製し、94℃  2分、(98℃  10秒、72℃  30秒、68℃  2分)×5サイクル、(98℃  10秒、70℃  30秒、68℃  2分)×5サイクル、(98℃  10秒、68℃  2分)×25サイクル、72℃  7分で増幅を行った。pGEM-T_TM4SF20の配列をシークエンスし、RefSeq  Accession  No.  NM_024795.3と同じであることを確認した。【０１８６】
２．DNA免疫用発現ベクターの作製
TM4SF20  cDNAを哺乳動物細胞用発現ベクター(pMC及びpCOS2)にクローニングした。pMCはマウスCMVプロモーター(GenBank  Accession  No.  U68299)による制御下で発現誘導が可能なベクターである。pCOS2はヒトEEF1A1プロモーター(GenBank  Accession  No.  NM_001402)による制御下で発現誘導が可能で、かつネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれたベクターである。pGEM-T_TM4SF20をNotI、XbaIで消化し、pMC及びpCOS2のNotI、XbaIサイトにクローニングした(pMC_TM4SF20及びpCOS2_TM4SF20)。【０１８７】
３．TM4SF20発現Ba/F3細胞株の作製
TM4SF20  cDNAを哺乳動物細胞用発現ベクター(pMCDN2_ntHA)にクローニングした。pMCDN2_ntHAはマウスCMVプロモーターによる制御下で発現誘導が可能で、かつネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれたベクターである。また、挿入した目的遺伝子の5'側にHAタグ配列が付加される。HAタグ配列とはインフルエンザのヘマグルチニンタンパク質由来のHAエピトープ配列  (YPYDVPDYA)であり、HA特異的抗体により認識される。配列番号：3で表されるプライマー(NheI認識配列-TM4SF20の開始コドンを除く5'末端配列)及び配列番号：4で表されるプライマー(NotI認識配列-TM4SF20のストップコドンを除く3'末端配列)を用い、pGEM-T_TM4SF20をテンプレートとしてPCR増幅を行った。増幅断片をNheI、NotIで消化し、pMCDN2_ntHAのNheI、NotIサイトにクローニングした(pMCDN2_TM4SF20_ntHA)。pMCDN2_TM4SF20_ntHAの開始コドンからストップコドンまでの塩基配列を配列番号：5に、アミノ酸配列を配列番号：6に示す。【０１８８】
pMCDN2_TM4SF20_ntHAをPvuI消化したものをエレクトロポレーション法によりマウスB細胞株Ba/F3  (理研)に導入した。500μg/mL  Geneticin  (Invitrogen)により細胞株を選抜することにより、N末端HAタグ付加TM4SF20定常発現Ba/F3細胞株(TM4SF20_Ba/F3)を樹立した。培養には500μg/mL  Geneticin、1  ng/mL  mouse  IL-3  (R&D  Systems)、10%  fetal  bovine  serum  (FBS,  Invitrogen)、penicillin/streptomycin  (Invitrogen)を含むRPMI1640培地(Invitrogen)を用いた。【０１８９】
４．抗TM4SF20抗体の作製
MRL/MpJUmmCrj-lpr/lprマウス(オス、6週令、日本チャールス・リバー)に対し、Helios  Gene  Gun  (Bio-Rad)を用いて製品添付の方法により1週間に2回、合計10回のDNA免疫を行った(day0-day32)。DNA免疫にはpMC_TM4SF20及びpCOS2_TM4SF20発現ベクターを同時に用いた。DNA免疫に引き続きTM4SF20_Ba/F3細胞5×106個を尾静脈内に投与した(day35)。その後、1匹はday42に再度TM4SF20_Ba/F3細胞を尾静脈内に投与し、その4日後に脾臓細胞を摘出した。別の1匹はday63に再度TM4SF20_Ba/F3細胞を尾静脈内に投与し、その3日後に脾臓細胞を摘出した。いずれも脾臓細胞とマウスミエローマ細胞株P3-X63Ag8U1  (P3U1、ATCC)を3:1〜4:1になるよう混合し、PEG1500  (Roche  Diagnostics)を徐々に加えハイブリドーマを作製した。RPMI1640培地を加え遠心後、上清を除去することによりPEG1500を除去した。次にHAT培地(10%  FBS、penicillin-streptomycin、1×HAT  media  supplement  (Sigma)、0.5×BM-Condimed  H1  Hybridoma  Cloning  Supplement  (Roche  Diagnostics)を含むRPMI1640培地)に懸濁し、96ウェルプレート8枚にP3U1細胞が1×105個/ウェルになるように播種した。これを37℃、5%  CO2インキュベーターにて7日間培養後、培養上清を用いてスクリーニングを行った。スクリーニングは、培養上清に含まれる抗体のTM4SF20_Ba/F3細胞及び親株Ba/F3細胞に対する結合をフローサイトメーター(FACS  Calibur、Becton  Dickinson)を用いて測定することにより行った。TM4SF20_Ba/F3細胞に特異的に結合したウェルのハイブリドーマの培養を継続し、同様な方法で再度スクリーニングを行った後、限界希釈法によりモノクローン化を行った。以上により、TM4SF20に特異的に結合する抗体としてクローンB8、B11、B12、B15、C7、C9を樹立した。【０１９０】
これらのハイブリドーマをFBSの代わりにUltra  Low  IgG  FBS  (Invitrogen)を含むHAT培地にて培養し、その培養上清からHiTrap  ProteinG  HPカラム(GE  Healthcare)を用いて抗体を精製した。精製抗体についてIsostrip  (Roche  Diagnostics)を用いてアイソタイピングを行ったところ、B11、B12、C7、C9はマウスIgG1κ、B15はマウスIgG2aκ、B8はマウスIgG2bκであった。抗体濃度はDC  Protein  Assay  Kit  I  (Bio-Rad)を用いて測定した。スタンダードには添付のウシγグロブリンを用いた。上述の抗体精製、アイソタイピング及び抗体濃度測定は製品添付の方法に従って実施した。
【実施例３】
【０１９１】
抗TM4SF20抗体のマウスTM4SF20への結合の評価
１．マウスTM4SF20  (mTM4SF20)のクローニング
Mouse  Normal  Tissue  Small  Intestine  cDNA  (Cosmo  Bio)をテンプレートとして、配列番号：7で表されるプライマー(mTM4SF20の5'末端配列)、配列番号：8で表されるプライマー(mTM4SF20の3'末端配列)を用いてPCR増幅を行い、増幅産物をpGEM-T  Easy  Vector  Systems  (Promega)を用いてpGEM-T  Easyベクターにクローニングした(pGEM-T_mTM4SF20)。PCR増幅にはKOD  Plus  Ver.2  (東洋紡)を用い、5μLの10×KOD  Plus  Ver.2  buffer、5μLのdNTP  mixture、3μLの25  mM  MgSO4、1.5μLの配列番号：7のプライマー  (10μM)、1.5μLの配列番号：8のプライマー  (10μM)、2μLのmouse  small  intestine  cDNA、1μLのKOD  Plus  Polymerase、31μLのヌクレアーゼフリー水を含む溶液を調製し、94℃  2分、(98℃  10秒、57℃  30秒、68℃  1分)×27サイクルで増幅を行った。pGEM-T_mTM4SF20の配列をシークエンスしたところ、GenBankに登録さている配列(RefSeq  Accession  No.  NM_025453.3)と比べて、塩基配列では4塩基、アミノ酸配列では2アミノ酸、異なっていた。クローニングしたmTM4SF20の塩基配列を配列番号：9に、アミノ酸配列を配列番号：10に示す。【０１９２】
２．mTM4SF20発現CHO細胞株の作製
mTM4SF20  cDNAをpMCDN2_ntHAにクローニングした。配列番号：11で表されるプライマー(NheI認識配列-mTM4SF20の開始コドンを除く5'末端配列)及び配列番号：12で表されるプライマー(NotI認識配列-mTM4SF20のストップコドンを除く3'末端配列)を用い、pGEM-T_mTM4SF20をテンプレートとしてPCR増幅を行った。増幅断片をNheI、NotIで消化し、pMCDN2_ntHAのNheI、NotIサイトにクローニングした(pMCDN2_mTM4SF20_ntHA)。【０１９３】
続いてmTM4SF20_ntHA  cDNAをpCOS2にクローニングした。配列番号：13で表されるプライマー(NotI認識配列-mTM4SF20_ntHAの5'末端配列)及び配列番号：14で表されるプライマー(BamHI認識配列-mTM4SF20_ntHAのNotI認識配列を除く3'末端配列)を用い、pMCDN2_mTM4SF20_ntHAをテンプレートとしてPCR増幅を行った。増幅断片をNotI、BamHIで消化し、pCOS2のNotI、BamHIサイトにクローニングした(pCOS2_mTM4SF20_ntHA)。pCOS2_mTM4SF20_ntHAの開始コドンからストップコドンまでの塩基配列を配列番号：15に、アミノ酸配列を配列番号：16に示す。【０１９４】
pCOS2_mTM4SF20_ntHAをPvuI消化したものをエレクトロポレーション法によりCHO細胞株DG44に導入した。Geneticin  (500μg/mL)により細胞株を選抜することにより、N末端HAタグ付加mTM4SF20定常発現CHO細胞株(mTM4SF20_CHO)を樹立した。培養には500μg/mL  Geneticin、HT  supplement  (Invitrogen)、penicillin/streptomycin  (Invitrogen)を含むCHO-S-SFM  II培地(Invitrogen)  (以下CHO培地と称する)を用いた。【０１９５】
３．TM4SF20発現CHO細胞株の作製
TM4SF20  cDNAを哺乳動物細胞用発現ベクター(pCOS2_ctHA)にクローニングした。pCOS2_ctHAはマウスCMVプロモーターによる制御下で発現誘導が可能で、かつネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれたベクターである。挿入した目的遺伝子の3'側にHAタグ配列が付加される。配列番号：1で表されるプライマー(NotI認識配列-Kozak配列-TM4SF20の5'末端配列)及び配列番号：17で表されるプライマー(BamHI認識配列-TM4SF20のストップコドンを除く3'末端配列)を用い、pMC_TM4SF20をテンプレートとしてPCR増幅を行った。増幅断片をNotI、BamHIで消化し、pCOS2_ctHAのNotI、BamHIサイトにクローニングした(pCOS2_TM4SF20_ctHA)。pCOS2_TM4SF20_ctHAの開始コドンからストップコドンまでの塩基配列を配列番号：18に、アミノ酸配列を配列番号：19に示す。【０１９６】
pCOS2_TM4SF20_ctHAをPvuI消化したものをエレクトロポレーション法によりDG44細胞に導入した。Geneticin  (500μg/mL)により細胞株を選抜することにより、C末端HAタグ付加TM4SF20定常発現CHO細胞株(TM4SF20_CHO)を樹立した。培養にはCHO培地を用いた。【０１９７】
４．抗TM4SF20抗体のmTM4SF20への結合の評価
実施例2で作製した抗TM4SF20抗体のmTM4SF20に対する結合をフローサイトメトリーにて評価した。細胞にはmTM4SF20_CHO、陽性対照としてTM4SF20_CHO、陰性対照としてDG44細胞を用いた。【０１９８】
まず、各細胞におけるmTM4SF20あるいはTM4SF20の発現を、抗HA抗体を用いたフローサイトメトリーにて確認した。mTM4SF20及びTM4SF20は4回膜貫通タンパクであり、N末端、C末端ともに細胞内に存在する。従ってHAタグも細胞内に存在する。抗HA抗体を細胞内に到達させるため、Intrastain  (Dako)  を用いて製品添付の方法に従って細胞を処理し、細胞膜を透過性にした。Intrastain処理した細胞(5×104個/ウェル、96ウェルU底プレート)に対し、3μg/mLとなるようにFITC標識抗HA抗体(Sigma)を添加した。室温で15分間反応後、0.5%ウシ血清アルブミン及び0.1%  NaN3を含むPBS  (FACS  buffer)を用いて細胞を洗浄した。細胞をFACS  bufferに懸濁し、フローサイトメーター(FACS  Calibur,  Becton  Dickinson)にて測定した。測定データはCELLQuestソフトウェア(Becton  Dickinson)を用いて解析した。その結果、mTM4SF20_CHO及びTM4SF20_CHOは同程度に抗原を発現していることが確認された(図3)。【０１９９】
次に、FACS  bufferに懸濁した5×104個の細胞を96ウェルU底プレートに分注し、10μg/mLとなるように抗TM4SF20抗体(ハイブリドーマの培養上清)、もしくは陰性対照としてHAT培地を添加した。氷上で1時間反応後、FACS  bufferにより細胞を洗浄した。次に2次抗体としてFITC標識抗マウス抗体(Goat  F(ab')2  Fragment  Anti-mouse  IgG  (H+L)-FITC,  Beckman  Coulter)を加え、氷上で1時間反応させた。FACS  bufferにより細胞を洗浄後、propidium  iodide  (PI,  Sigma)  10μg/mLを加えたFACS  bufferに細胞を懸濁し、フローサイトメーターにて測定した。測定データはCELLQuestソフトウェアを用い、PI陰性である細胞集団について解析した。その結果、いずれのクローンもTM4SF20_CHO  には結合し、mTM4SF20_CHO及びDG44細胞には結合しなかった(図4)。
【実施例４】
【０２００】
フローサイトメトリーによる抗TM4SF20抗体のエピトープの解析
実施例２で作製した抗TM4SF20抗体のエピトープを解析するため、TM4SF20の2つの細胞外ループのうち、第一ループ(36-44番目のアミノ酸)もしくは第二ループ(105-185番目のアミノ酸、いずれもUniProt  accession  number  Q53R12より)の配列を、それぞれmTM4SF20の配列に置換した(キメラTM4SF20)。これをCHO細胞に発現させ、抗TM4SF20抗体の結合をフローサイトメトリーにて解析した。【０２０１】
１．キメラTM4SF20  version  1発現CHO細胞株の作製
第一ループをmTM4SF20に置換したキメラTM4SF20  (キメラTM4SF20  version  1)のcDNAをpMCDN2_ntHAにクローニングした。配列番号：3で表されるプライマー(NheI認識配列-TM4SF20の開始コドンを除く5'末端配列)及び配列番号：20で表されるプライマー(第一ループをmTM4SF20に置換したTM4SF20の配列)を用い、pGEM-T_TM4SF20をテンプレートとしてPCR増幅を行った。同様に配列番号：21で表されるプライマー(第一ループをmTM4SF20に置換したTM4SF20の配列)及び配列番号：4で表されるプライマー(NotI認識配列-TM4SF20のストップコドンを除く3'末端配列)を用い、pGEM-T_TM4SF20をテンプレートとしてPCR増幅を行った。これら二つの増幅断片をテンプレートとして、配列番号：3で表されるプライマー及び配列番号：4で表されるプライマーを用いてPCR増幅を行った。増幅断片をNheI、NotIで消化し、pMCDN2_ntHAのNheI、NotIサイトにクローニングした(pMCDN2_キメラTM4SF20  ver.1_ntHA)。【０２０２】
続いてキメラTM4SF20  ver.1_ntHA  cDNAをpCOS2にクローニングした。配列番号：13で表されるプライマー(NotI認識配列-キメラTM4SF20  ver.1_ntHAの5'末端配列)及び配列番号：22で表されるプライマー(BamHI認識配列-キメラTM4SF20  ver.1_ntHAのNotI認識配列を除く3'末端配列)を用い、pMCDN2_キメラTM4SF20  ver.1_ntHAをテンプレートとしてPCR増幅を行った。増幅断片をNotI、BamHIで消化し、pCOS2のNotI、BamHIサイトにクローニングした(pCOS2_キメラTM4SF20  ver.1_ntHA)。pCOS2_キメラTM4SF20  ver.1_ntHAの開始コドンからストップコドンまでの塩基配列を配列番号：23に、アミノ酸配列を配列番号：24に示す。【０２０３】
pCOS2_キメラTM4SF20  ver.1_ntHAをPvuI消化したものをエレクトロポレーション法によりDG44細胞に導入した。Geneticin  (500μg/mL)により細胞株を選抜することにより、N末端HAタグ付加キメラTM4SF20  ver.1定常発現CHO細胞株(キメラTM4SF20  ver.1_CHO)を樹立した。培養にはCHO培地を用いた。【０２０４】
２．キメラTM4SF20  version  2発現CHO細胞株の作製
第二ループをmTM4SF20に置換したキメラTM4SF20  (キメラTM4SF20  version  2)のcDNAをpMCDN2_ntHAにクローニングした。配列番号：25で表されるプライマー(TM4SF20の第二ループ直前の配列-mTM4SF20第二ループの5'末端配列)及び配列番号：26で表されるプライマー(TM4SF20の第二ループ直後の配列-mTM4SF20第二ループの3'末端配列)を用い、pGEM-T_mTM4SF20をテンプレートとしてPCR増幅を行った。また、配列番号：3で表されるプライマー(NheI認識配列-TM4SF20の開始コドンを除く5'末端配列)及び配列番号：27で表されるプライマー(mTM4SF20第二ループの5'末端配列-TM4SF20の第二ループ直前の配列)を用い、pGEM-T_TM4SF20をテンプレートとしてPCR増幅を行った。同様に配列番号：28で表されるプライマー(mTM4SF20第二ループの3'末端配列-TM4SF20の第二ループ直後の配列)及び配列番号：4で表されるプライマー(NotI認識配列-TM4SF20のストップコドンを除く3'末端配列)を用い、pGEM-T_TM4SF20をテンプレートとしてPCR増幅を行った。これら三つの増幅断片をテンプレートとして、配列番号：3で表されるプライマー及び配列番号：4で表されるプライマーを用いてPCR増幅を行った。増幅断片をNheI、NotIで消化し、pMCDN2_ntHAのNheI、NotIサイトにクローニングした(pMCDN2_キメラTM4SF20  ver.2_ntHA)。【０２０５】
続いてキメラTM4SF20  ver.2_ntHA  cDNAをpCOS2にクローニングした。配列番号：13で表されるプライマー(NotI認識配列-キメラTM4SF20  ver.2_ntHAの5'末端配列)及び配列番号：22で表されるプライマー(BamHI認識配列-キメラTM4SF20  ver.2_ntHAのNotI認識配列を除く3'末端配列)を用い、pMCDN2_キメラTM4SF20  ver.2_ntHAをテンプレートとしてPCR増幅を行った。増幅断片をNotI、BamHIで消化し、pCOS2のNotI、BamHIサイトにクローニングした(pCOS2_キメラTM4SF20  ver.2_ntHA)。pCOS2_キメラTM4SF20  ver.2_ntHAの開始コドンからストップコドンまでの塩基配列を配列番号：29に、アミノ酸配列を配列番号：30に示す。【０２０６】
pCOS2_キメラTM4SF20  ver.2_ntHAをPvuI消化したものをエレクトロポレーション法によりDG44細胞に導入した。Geneticin  (500μg/mL)により細胞株を選抜することにより、N末端HAタグ付加キメラTM4SF20  ver.2定常発現CHO細胞株(キメラTM4SF20  ver.2_CHO)を樹立した。培養にはCHO培地を用いた。【０２０７】
３．抗TM4SF20抗体のキメラTM4SF20への結合の評価
実施例２で作製した抗TM4SF20抗体のキメラTM4SF20に対する結合をフローサイトメトリーにて評価した。細胞にはキメラTM4SF20  ver.1_CHO、キメラTM4SF20  ver.2_CHO、陰性対照としてDG44細胞を用いた。【０２０８】
まず、各細胞におけるキメラTM4SF20の発現を抗HA抗体を用いたフローサイトメトリーにて確認した。フローサイトメトリーは実施例3と同様に行った。その結果、キメラTM4SF20  ver.1_CHOとキメラTM4SF20  ver.2_CHOは同程度に抗原を発現していることが確認された(図5)。【０２０９】
次に、抗TM4SF20抗体(ハイブリドーマの培養上清)の結合を実施例3と同様にフローサイトメトリーにて確認した。その結果、いずれのクローンもキメラTM4SF20  ver.1_CHO  には結合し、キメラTM4SF20  ver.2_CHO及びDG44細胞には結合しなかった(図6)。以上の結果から、これらの抗体はTM4SF20の第二ループを認識することが示された。
【実施例５】
【０２１０】
ウェスタンブロットによる抗TM4SF20抗体のエピトープの解析
エピトープをより詳細に解析するため、TM4SF20の第二ループを含む100アミノ酸(101-200番目のアミノ酸)をベースとし、そこから種々のアミノ酸配列を欠失させたペプチドを作製した。これらのペプチドを大腸菌で発現させ、抗TM4SF20抗体の結合をウェスタンブロットにて評価した。【０２１１】
下表に示した6つのペプチドを作製した。いずれも5'末端にglutathione  S-transferase(GST)タグ、3'末端にHisタグ(6個の連続したヒスチジン残基)を結合させた。作製に用いたフォワードプライマー(BamHI認識配列-TM4SF20の配列)及びリバースプライマー(NotI認識配列-ストップコドン-Hisタグ配列-TM4SF20の配列)についても下表に示した。【０２１２】
【表１】
2010073694.tif 000002
【０２１３】
各フォワードプライマー及びリバースプライマーを用い、pGEM-T_TM4SF20をテンプレートとしてPCR増幅を行った。増幅産物をBamHI、NotIで消化し、GST融合タンパク発現ベクター(pGEX-6P-1、GE  Healthcare)のBamHI、NotIサイトにクローニングした。作製したコンストラクトのBamHI認識配列からストップコドンまでの塩基配列及びアミノ酸配列を下表に示す。【０２１４】
【表２】
2010073694.tif 000003
【０２１５】
BL21  (DE3)  Competent  Cells  (Takara  Bio)を用いて各コンストラクトを発現させ、whole  cell  lysateをSDS-PAGE電気泳動後、PVDFメンブレン(Immobilon-P、Millipore)にトランスファーし、ウェスタンブロットを行った。抗TM4SF20抗体(精製抗体)は5μg/mL、二次抗体(HRP-anti  mIgG、GE  Healthcare)は3000倍希釈で用い、ECL  Western  Blotting  Detection  Reagents  (GE  Healthcare)を用いて検出した。なお、各コンストラクトの発現を確認するために、抗GST抗体(GE  Healthcare)及び抗His抗体(Santa  Cruz  Biotechnology)を用いた。二次抗体にはそれぞれHRP標識抗ヤギ抗体(Invitrogen)及びHRP標識抗ウサギ抗体(GE  Healthcare)を用いた。【０２１６】
抗GST抗体及び抗His抗体を用いたウェスタンブロットの結果、いずれのコンストラクトも大腸菌で発現していることが確認された(図7)。抗TM4SF20抗体はいずれのクローンもGST_TM4SF20_C2及びGST_TM4SF20_C3には結合しなかった(図8)。以上の結果から、いずれのクローンもTM4SF20の168-184番目のアミノ酸配列がエピトープであることが示された。
【実施例６】
【０２１７】
ヒト癌細胞株におけるTM4SF20の発現と抗TM4SF20抗体のantibody-dependent  cellular  cytotoxicity  (ADCC)活性及びcomplement-dependent  cytotoxicity  (CDC)活性の評価
１．ヒト癌細胞株におけるTM4SF20の発現の評価
実施例２で作製した抗TM4SF20抗体を用いて、ヒト癌細胞株の細胞膜上におけるTM4SF20の発現をフローサイトメトリーを用いて評価した。一次抗体には抗TM4SF20抗体(精製抗体)又は陰性対照抗体(mIgG2a、BD  Biosciences  Pharmingen)、細胞にはマイクロアレイ解析(実施例１)でTM4SF20  mRNAの発現が高かった肺腺癌細胞株A549  (JCRB)を用いた。フローサイトメトリーは実施例３と同様に行い、一次抗体は10μg/mLの濃度で用いた。その結果、A549細胞で細胞膜上にTM4SF20の発現が確認された(図9)。【０２１８】
２．抗TM4SF20抗体のADCC活性の評価
実施例２で作製した抗TM4SF20抗体のADCC活性を測定した。標的細胞にはA549細胞を用いた。A549細胞を培地(10%FBSを添加したMEM培地(Invitrogen))にて2×105個/mLに調製し、96ウェル平底プレートに50μL/ウェル加えた。37℃、5%  CO2インキュベーターにて一晩培養することにより細胞をプレートに付着させた後、Chromium-51  (GE  Healthcare)を加えさらに1時間培養した。細胞を剥がさないように慎重に培地で洗浄後、培地を50μL/ウェル加えた。次に培地で40μg/mLに調製した抗TM4SF20抗体(精製抗体)もしくはmIgG2aを50μL/ウェル加えた。室温にて15分間静置後、培地で4×106個/mLに調製したエフェクター細胞を100μL/ウェル加えた。エフェクター細胞にはマウスFcγreceptor  III  (RefSeq  Accession  No.  NM_010188)の細胞外領域及びヒトFcεreceptor  I-gamma  (RefSeq  Accession  No.  NM_004106)の膜貫通領域と細胞内領域を含むキメラタンパク質をNK-92細胞(ATCC)に定常発現させた細胞(特願2007-20155、WO2008/093688)を用いた。プレートを37℃、5%  CO2インキュベーターにて4時間培養後、100μL/ウェルの培養上清を回収しガンマカウンター(1480  WIZARD  3''、Wallac)を用いて放射活性(cpm)を測定し、以下の式を用いて特異的クロム遊離率(%)を求めた。
特異的クロム遊離率(%)  =  (A-C)×100/(B-C)【０２１９】
ここで、Aは各ウェルにおける放射活性、Bは終濃度1%  Nonidet  P-40で細胞を溶解させたウェルの放射活性の平均値、Cは標的細胞のみを添加したウェルの放射活性の平均値である。実験はtriplicateで行い、特異的クロム遊離率の平均値と標準偏差を算出した。その結果、抗TM4SF20抗体B8、B12、B15、C7、C9がADCC活性を有することが示された(図10A)。【０２２０】
３．抗TM4SF20抗体のCDC活性の評価
同様にして抗TM4SF20抗体のCDC活性を測定した。CDC活性の測定では、エフェクター細胞の代わりに培地で50%に希釈したウサギ血清(Baby  Rabbit  Complement、Cedarlane)を100μL/ウェル加えた後、プレートを37℃、5%  CO2インキュベーターにて1.5時間培養した。その結果、抗TM4SF20抗体B8、B15がCDC活性を有することが明らかとなった(図10B)。
【実施例７】
【０２２１】
免疫組織化学染色による胃癌におけるTM4SF20の発現解析
TM4SF20  mRNAが胃癌で発現していたことから(実施例1)、胃癌におけるTM4SF20タンパクの発現を免疫組織化学染色により解析した。臨床胃癌検体より4%  paraformaldehyde固定AMeX包埋パラフィンブロックを作製し、5μmの薄切切片を作製した。これらの切片についてVentana  HX  Discovery  System  (Ventana  Medical  Systems)を用いて下記のように免疫組織化学的に染色した。各切片を脱パラフィン後に洗浄し、内因性peroxidaseの除去のため3.0%  hydrogen  peroxide  solution  (Inhibitor  D、Ventana  Medical  Systems)を用いて37℃にて4分間反応させた。洗浄後、非特異的反応の除去のためProtein  Block  (Dako)を加え、室温にて30分間反応させた。洗浄後、一次抗体として25μg/mLの抗TM4SF20抗体クローンB11を加え室温にて2時間反応させた。洗浄後、二次抗体(Ventana  Universal  Secondary  Antibody、Ventana  Medical  Systems)を加え、室温にて30分間反応させた。洗浄後、非特異的反応の除去のためBlocker  D  (Ventana  Medical  Systems)にて室温にて2分間反応させ、続いてstreptavidin  horseradish  peroxidase  (Ventana  Medical  Systems)を加え、37℃にて16分間反応させた。洗浄後、diaminobenzidine  (DAB  map  solution、Ventana  Medical  Systems)とhydrogen  peroxide  solution  (DAB  map  solution、Ventana  Medical  Systems)を混和して加え、基質の発色のため42℃にて8分間反応させた。さらにCopper  sulfate  solution  (Ventana  Medical  Systems)にて発色の増感を行った。洗浄後、ヘマトキシリンにて核染を行い、脱水、透徹、封入を行った。【０２２２】
胃腺癌(adenocarcinoma  of  the  stomach)では、9例中5例で細胞膜に、7例で細胞質に陽性反応が観察された。胃における印環細胞癌(signet  ring  cell  adenocarcinoma)では、4例中3例で細胞膜に、全例で細胞質に陽性反応が観察された。代表的な染色像を図11に示した。以上の結果から、胃癌(腺癌および印環細胞癌)においてTM4SF20が細胞膜に発現し、抗体医薬の標的分子として有望であると考えられた。
【実施例８】
【０２２３】
抗TM4SF20抗体の可変領域遺伝子配列の決定
実施例２にて作製した抗TM4SF20抗体の可変領域の塩基配列を決定した。それぞれの抗体を産生するハイブリドーマ細胞1×106個からTrizol  (Invitrogen)を用いてtotal  RNAを精製した。Total  RNA  1μgを使用し、SMART  RACE  cDNA  Amplification  Kit  (Clontech)、マウスIgG1定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG1  (配列番号：51)、マウスIgG2a定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMHC-G2a  (配列番号：52)、マウスIgG2b定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMHC-G2b  (配列番号：53)又はマウスκ鎖定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMLC-kappa  (配列番号：54)を用い、抗体のH鎖、L鎖cDNAの上述オリゴヌクレオチド配列に相当する位置から5'-cDNA末端までの配列をPCR増幅した。増幅産物をpGEM-T  Easy  Vector  Systems  (Promega)を用いてpGEM-T  Easyベクターにクローニングし、cDNA配列を決定した。各抗体の可変領域配列を下表にまとめた。【０２２４】
【表３】
2010073694.tif 000004
またこれらの可変領域のCDRのアミノ酸配列を下表にまとめた。【０２２５】
【表４】
2010073694.tif 000005
【０２２６】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０２２７】
本発明の抗TM4SF20抗体は、胃癌、肺腺癌、膵臓癌、及び大腸癌をはじめとする増殖性疾患の治療及び診断において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０２２８】
配列番号：1−プライマーhSF20FNot2
配列番号：2−プライマーhSF20RXba
配列番号：3−プライマーhSF20FNhe
配列番号：4−プライマーhSF20RNot
配列番号：5−プラスミドpMCDN2_TM4SF20_ntHA（開始コドン−終止コドン）
配列番号：6−プラスミドpMCDN2_TM4SF20_ntHA（開始コドン−終止コドン）
配列番号：7−プライマーmSF-F
配列番号：8−プライマーmSF-R
配列番号：9−プラスミドpGEM-T_mTM4SF20（開始コドン−終止コドン）
配列番号：10−プラスミドpGEM-T_mTM4SF20（開始コドン−終止コドン）
配列番号：11−プライマーmSF20FNhe
配列番号：12−プライマーmSF20RNot
配列番号：13−プライマーh.mTM20FHANot
配列番号：14−プライマーmTM20RHABam
配列番号：15−プラスミドpCOS2_mTM4SF20_ntHA（開始コドン−終止コドン）
配列番号：16−プラスミドpCOS2_mTM4SF20_ntHA（開始コドン−終止コドン）
配列番号：17−プライマーhSF20RBamH
配列番号：18−プラスミドpCOS2_TM4SF20_ctHA（開始コドン−終止コドン）
配列番号：19−プラスミドpCOS2_TM4SF20_ctHA（開始コドン−終止コドン）
配列番号：20−プライマーhmTM4SF20ver1R1
配列番号：21−プライマーhmTM4SF20ver1F1
配列番号：22−プライマーhTM20RHABam
配列番号：23−プラスミドpCOS2_chimeraTM4SF20  ver.1_ntHA（開始コドン−終止コドン）
配列番号：24−プラスミドpCOS2_chimeraTM4SF20  ver.1_ntHA（開始コドン−終止コドン）
配列番号：25−プライマーhmTM4SF20-2-F1
配列番号：26−プライマーhmTM4SF20-2-R1
配列番号：27−プライマーhmTM4SF20-2-R2
配列番号：28−プライマーhmTM4SF20-2-F3
配列番号：29−プラスミドpCOS2_chimeraTM4SF20  ver.2_ntHA（開始コドン−終止コドン）
配列番号：30−プラスミドpCOS2_chimeraTM4SF20  ver.2_ntHA（開始コドン−終止コドン）
配列番号：31−プライマーF2
配列番号：32−プライマーR1
配列番号：33−プライマーF3
配列番号：34−プライマーF4
配列番号：35−プライマーF1
配列番号：36−プライマーR2
配列番号：37−プライマーR3
配列番号：38−プライマーR4
配列番号：39−コンストラクトGST_TM4SF20_N1
配列番号：40−コンストラクトGST_TM4SF20_N1
配列番号：41−コンストラクトGST_TM4SF20_N2
配列番号：42−コンストラクトGST_TM4SF20_N2
配列番号：43−コンストラクトGST_TM4SF20_N3
配列番号：44−コンストラクトGST_TM4SF20_N3
配列番号：45−コンストラクトGST_TM4SF20_C1
配列番号：46−コンストラクトGST_TM4SF20_C1
配列番号：47−コンストラクトGST_TM4SF20_C2
配列番号：48−コンストラクトGST_TM4SF20_C2
配列番号：49−コンストラクトGST_TM4SF20_C3
配列番号：50−コンストラクトGST_TM4SF20_C3
配列番号：51−合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG1
配列番号：52−合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG2a
配列番号：53−合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG2b
配列番号：54−合成オリゴヌクレオチドMLC-kappa
配列番号：55−B8  H  V
配列番号：56−B8  H  V
配列番号：57−B8  L  V
配列番号：58−B8  L  V
配列番号：59−B11  H  V
配列番号：60−B11  H  V
配列番号：61−B11  L  V
配列番号：62−B11  L  V
配列番号：63−B12  H  V
配列番号：64−B12  H  V
配列番号：65−B12  L  V
配列番号：66−B12  L  V
配列番号：67−B15  H  V
配列番号：68−B15  H  V
配列番号：69−B15  L  V
配列番号：70−B15  L  V
配列番号：71−C7  H  V
配列番号：72−C7  H  V
配列番号：73−C7  L  V
配列番号：74−C7  L  V
配列番号：75−C9  H  V
配列番号：76−C9  H  V
配列番号：77−C9  L  V
配列番号：78−C9  L  V
配列番号：79−B8  H  CDR1
配列番号：80−B8  H  CDR2
配列番号：81−B8  H  CDR3
配列番号：82−B8  L  CDR1
配列番号：83−B8  L  CDR2
配列番号：84−B8  L  CDR3
配列番号：85−B11  H  CDR1
配列番号：86−B11  H  CDR2
配列番号：87−B11  H  CDR3
配列番号：88−B11  L  CDR1
配列番号：89−B11  L  CDR2
配列番号：90−B11  L  CDR3
配列番号：91−B12  H  CDR1
配列番号：92−B12  H  CDR2
配列番号：93−B12  H  CDR3
配列番号：94−B12  L  CDR1
配列番号：95−B12  L  CDR2
配列番号：96−B12  L  CDR3
配列番号：97−B15  H  CDR1
配列番号：98−B15  H  CDR2
配列番号：99−B15  H  CDR3
配列番号：100−B15  L  CDR1
配列番号：101−B15  L  CDR2
配列番号：102−B15  L  CDR3
配列番号：103−C7  H  CDR1
配列番号：104−C7  H  CDR2
配列番号：105−C7  H  CDR3
配列番号：106−C7  L  CDR1
配列番号：107−C7  L  CDR2
配列番号：108−C7  L  CDR3
配列番号：109−C9  H  CDR1
配列番号：110−C9  H  CDR2
配列番号：111−C9  H  CDR3
配列番号：112−C9  L  CDR1
配列番号：113−C9  L  CDR2
配列番号：114−C9  L  CDR3
配列番号：115−human  TM4SF20  (GenBank  Accession  No:NM_024795)
配列番号：116−human  TM4SF20  (GenBank  Accession  No:NM_024795)
配列番号：117−リンカー
配列番号：118−リンカー
配列番号：119−リンカー
配列番号：120−リンカー
配列番号：121−リンカー
配列番号：122−リンカー
配列番号：123−リンカー
配列番号：124−リンカー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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