(57)【要約】  本発明は、検体として血液（全血）を用いてもＨＢｓＡｇを高感度に検出することができる、ＨＢｓＡｇの検出方法に関する。その表面にＢ型肝炎ウイルス表面抗原に特異的に結合できる結合物質（例えば抗体）が固定化された金属膜上に検体を提供して、前記検体に含まれるＢ型肝炎ウイルス表面抗原を前記結合物質に結合させる。また、前記Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を蛍光物質で標識する。前記金属膜で表面プラズモン共鳴が生じるように前記金属膜に励起光を照射したときに前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する。
2019044202.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属膜と、前記金属膜に固定化された、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に特異的に結合する結合物質とを含む検出チップを準備する工程と、
前記金属膜上に検体を提供して、前記検体に含まれるＢ型肝炎ウイルス表面抗原を前記結合物質に結合させる工程と、
前記結合物質に結合する前または結合した後の前記Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を蛍光物質で標識する工程と、
前記蛍光物質で標識された前記Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原が前記結合物質に結合している状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が生じるように前記金属膜に励起光を照射したときに前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する工程と、
を含む、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の検出方法。
【請求項２】
前記Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原は、前記蛍光物質で標識された、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に特異的に結合する結合物質を結合されることで、前記蛍光物質で標識される、請求項１に記載のＢ型肝炎ウイルス表面抗原の検出方法。
【請求項３】
前記金属膜に固定化された結合物質および前記蛍光物質で標識された結合物質は、いずれも抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原抗体である、請求項２に記載のＢ型肝炎ウイルス表面抗原の検出方法。
【請求項４】
前記金属膜に固定化された抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原抗体は、１種類または２種類以上の抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原モノクローナル抗体または抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原ポリクローナル抗体であり、
前記蛍光物質で標識された抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原抗体は、前記金属膜に固定化されているものとは異なる、１種類または２種類以上の抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原モノクローナル抗体または抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原ポリクローナル抗体である、
請求項３に記載のＢ型肝炎ウイルス表面抗原の検出方法。
【請求項５】
前記金属膜に固定化された抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原抗体、および前記蛍光物質で標識された抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原抗体は、いずれも、前記Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原のＳ領域に結合する抗体である、請求項３に記載のＢ型肝炎ウイルス表面抗原の検出方法。
【請求項６】
前記金属膜に固定化された抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原抗体、および前記蛍光物質で標識された抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原抗体は、いずれも、前記Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原のＳ領域に結合する抗体および前記Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原のＰｒｅ−Ｓ２領域に結合する抗体の両方を含む、請求項３に記載のＢ型肝炎ウイルス表面抗原の検出方法。
【請求項７】
前記蛍光物質は、前記抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原抗体のアミノ基またはスルフヒドリル基を介して前記抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原抗体に結合している、請求項３〜６のいずれか一項に記載のＢ型肝炎ウイルス表面抗原の検出方法。
【請求項８】
前記検体は、血液である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＢ型肝炎ウイルス表面抗原の検出方法。
【請求項９】
前記金属膜は、プリズムの上に配置されており、
前記励起光は、プリズムを介して前記金属膜に照射される、
請求項１〜８のいずれか一項に記載のＢ型肝炎ウイルス表面抗原の検出方法。
【請求項１０】
前記金属膜は、回折格子を含み、
前記結合物質は、前記回折格子の上に固定化されており、
前記励起光は、前記回折格子に照射される、
請求項１〜８のいずれか一項に記載のＢ型肝炎ウイルス表面抗原の検出方法。
【請求項１１】
前記励起光は、出力が１５〜３０ｍＷのレーザー光源から出射されたレーザー光である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＢ型肝炎ウイルス表面抗原の検出方法。
【請求項１２】
金属膜と、前記金属膜に固定化された、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に特異的に結合する結合物質とを含む検出チップと、
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原を蛍光物質で標識するための標識試薬と、
を有する、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の検出キット。
【請求項１３】
前記標識試薬は、蛍光物質で標識された、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に特異的に結合する結合物質である、請求項１２に記載のＢ型肝炎ウイルス表面抗原の検出キット。
【請求項１４】
前記金属膜に固定化された結合物質および前記蛍光物質で標識された結合物質は、いずれも抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原抗体である、請求項１３に記載のＢ型肝炎ウイルス表面抗原の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の検出方法および検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウイルス（以下「ＨＢＶ」ともいう）に感染することで発症するウイルス性肝炎である。ＨＢＶの外皮抗原であるＢ型肝炎ウイルス表面抗原（以下「ＨＢｓＡｇ」ともいう）は、ＨＢＶが肝細胞内で増殖する際に血中に放出される。したがって、血液中のＨＢｓＡｇを検出することで、ＨＢＶの感染を検査することができる。ＨＢＶの一過性感染では、ＨＢｓＡｇは血液から一過性に検出され、持続性感染では、ＨＢｓＡｇは血液から持続的に検出される。【０００３】
ＨＢＶの感染を高精度に検査するためには、ＨＢｓＡｇを高感度に検出することが必要となる。たとえば、特許文献１には、ＨＢｓＡｇのＳ領域に結合する抗体、Ｐｒｅ−Ｓ１領域およびＰｒｅ−Ｓ２領域に結合する抗体を組み合わせて使用することで、血清中のＨＢｓＡｇを高感度に検出できることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−１３３４６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＨＢｓＡｇを高感度に検出するためには、特許文献１に記載の発明のように使用する試薬の処方を工夫してもよいが、原理的に検出感度が高い検出方法を採用することも考えられる。また、検査を簡便に行うためには、検体として血清や血漿ではなく血液（全血）をそのまま使える検出方法が好ましい。しかしながら、検体として血液（全血）を用いてＨＢｓＡｇを高感度に検出することができる検出方法は、現在までに提案されていない。【０００６】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、検体として血液（全血）を用いてもＨＢｓＡｇを高感度に検出することができる、ＨＢｓＡｇの検出方法および検出キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一実施形態に係るＨＢｓＡｇの検出方法は、金属膜と、前記金属膜に固定化された、ＨＢｓＡｇに特異的に結合する結合物質とを含む検出チップを準備する工程と、前記金属膜上に検体を提供して、前記検体に含まれるＨＢｓＡｇを前記結合物質に結合させる工程と、前記結合物質に結合する前または結合した後の前記ＨＢｓＡｇを蛍光物質で標識する工程と、前記蛍光物質で標識された前記ＨＢｓＡｇが前記結合物質に結合している状態で、前記金属膜で表面プラズモン共鳴が生じるように前記金属膜に励起光を照射したときに前記蛍光物質から放出される蛍光を検出する工程と、を含む。【０００８】
また、本発明の一実施形態に係るＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の検出キットは、金属膜と、前記金属膜に固定化された、ＨＢｓＡｇに特異的に結合する結合物質とを含む検出チップと、ＨＢｓＡｇを蛍光物質で標識するための標識試薬と、を有する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、検体として血液（全血）を用いてもＨＢｓＡｇを高感度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本実施の形態に係るＨＢｓＡｇの検出方法の一例を示すフローチャートである。
【図２】図２Ａは、ＰＣ−ＳＰＦＳ用の検出チップの構成を説明するための断面模式図であり、図２Ｂは、ＧＣ−ＳＰＦＳ用の検出チップの構成を説明するための断面模式図である。
【図３】図３は、ＰＣ−ＳＰＦＳ用の検出チップの一例を示す断面模式図である。
【図４】図４は、希釈直線性の試験結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本実施の形態に係る検出方法の検出結果と他の検出方法の検出結果の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００１２】
［ＨＢｓＡｇの検出方法］
本実施の形態に係るＨＢｓＡｇの検出方法では、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy、以下「ＳＰＦＳ」ともいう）を利用してＨＢｓＡｇを検出する。ＳＰＦＳは、表面プラズモン共鳴（以下「ＳＰＲ」ともいう）により増強された電場により蛍光物質を励起して蛍光を放出させるため、一般的な蛍光免疫測定法よりもターゲット（本実施の形態ではＨＢｓＡｇ）を高感度に検出することができる。また、ＳＰＦＳは、検体として全血も使用することができる。
【００１３】
本実施の形態に係るＨＢｓＡｇの検出方法について、具体的に説明する。図１は、本実施の形態に係るＨＢｓＡｇの検出方法の一例を示すフローチャートである。
【００１４】
（検出チップの準備）
まず、金属膜と、ＨＢｓＡｇに特異的に結合する結合物質とを含む検出チップを準備する（工程Ｓ１０）。ＳＰＦＳでは、金属膜に光（本実施の形態では励起光）を照射したときに生じるエバネッセント波と表面プラズモンとを結合させてＳＰＲを生じさせる。ＳＰＲを生じさせる手法としては、金属膜の一方の面上にプリズムを配置する手法（Kretschmann配置）や、金属膜に回折格子を形成する手法などが知られている。前者の手法を採用したＳＰＦＳは、プリズムカップリング（ＰＣ）−ＳＰＦＳと称され、後者の手法を採用したＳＰＦＳは、格子カップリング（ＧＣ）−ＳＰＦＳと称される。本実施の形態に係るＨＢｓＡｇの検出方法は、ＰＣ−ＳＰＦＳおよびＧＣ−ＳＰＦＳのどちらを採用してもよい。
【００１５】
上述のとおり、金属膜は、励起光を照射されたときにＳＰＲを生じさせる。金属膜を構成する金属の種類は、ＳＰＲを生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜を構成する金属の例には、金、銀、銅、アルミニウムおよびこれらの合金が含まれる。
【００１６】
結合物質は、ＨＢｓＡｇに特異的に結合することができ、検体中のＨＢｓＡｇを捕捉するために金属膜上に固定化されている。通常、結合物質は、金属膜上の所定の領域（反応場）に均一に固定化されている。金属膜に固定化される結合物質の種類は、ＨＢｓＡｇに特異的に結合することができれば特に限定されない。結合物質の例には、ＨＢｓＡｇに特異的に結合できる抗体（抗ＨＢｓＡｇ抗体）、ＨＢｓＡｇに特異的に結合できる核酸、ＨＢｓＡｇに特異的に結合できる脂質、およびＨＢｓＡｇに特異的に結合できる抗体以外のタンパク質が含まれる。結合物質が抗ＨＢｓＡｇ抗体である場合、抗ＨＢｓＡｇ抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよいし、抗体の断片であってもよい。また、金属膜に固定化される結合物質の種類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。たとえば、金属膜に固定化される抗ＨＢｓＡｇ抗体は、１種類または２種類以上の抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原モノクローナル抗体または抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原ポリクローナル抗体である。
【００１７】
また、ＨＢｓＡｇの検出感度を向上させる観点から、金属膜に固定化する結合物質として、ＨＢｓＡｇの特定の領域に特異的に結合する抗体を採用してもよい。たとえば、金属膜に固定化する抗ＨＢｓＡｇ抗体は、ＨＢｓＡｇのＳ領域に結合する抗体であってもよいし、ＨＢｓＡｇのＳ領域に結合する抗体とＨＢｓＡｇのＰｒｅ−Ｓ２領域に結合する抗体との組み合わせであってもよい。
【００１８】
結合物質の固定化方法は、特に限定されない。たとえば、金属膜上に、結合物質（例えば抗ＨＢｓＡｇ抗体）を結合させた自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」という）または高分子膜を形成すればよい。ＳＡＭの例には、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１１−ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびＭＰＣポリマーが含まれる。また、結合物質（例えば抗ＨＢｓＡｇ抗体）に結合可能な反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有する高分子を金属膜に固定化し、この高分子に結合物質（例えば抗ＨＢｓＡｇ抗体）を結合させてもよい。
【００１９】
検出チップは、好ましくは各片の長さが数ｍｍ〜数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。
【００２０】
図２Ａは、ＰＣ−ＳＰＦＳ用の検出チップの構成を説明するための断面模式図であり、図２Ｂは、ＧＣ−ＳＰＦＳ用の検出チップの構成を説明するための断面模式図である。説明の便宜上、これらの図において、各構成要素の大きさおよび形状は、正確ではない。また、これらの図では、結合物質として抗ＨＢｓＡｇ抗体を使用する例を示している。
【００２１】
図２Ａに示されるように、ＰＣ−ＳＰＦＳ用の検出チップ１００は、プリズム１１０、金属膜１２０および抗ＨＢｓＡｇ抗体１３０（の層）を有する。プリズム１１０は、励起光Ｌ１に対して透明な誘電体からなり、励起光Ｌ１が入射する入射面１１１と、励起光Ｌ１が反射する成膜面１１２と、反射光Ｌ２が出射する出射面１１３とを有する。プリズム１１０の形状は、特に限定されない。図２Ａに示される例では、プリズム１１０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面１１２であり、一方の脚に対応する面が入射面１１１であり、他方の脚に対応する面が出射面１１３である。プリズム１１０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム１１０の材料は、好ましくは、励起光に対する屈折率が１.４〜１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。金属膜１２０は、プリズム１１０の成膜面１１２上に配置されている。金属膜１２０の形成方法は、特に限定されない。金属膜１２０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、めっきが含まれる。金属膜１２０の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内であることが好ましい。
【００２２】
図２Ａに示されるように、金属膜１２０においてＳＰＲが生じるようにプリズム１１０を介して金属膜１２０に励起光Ｌ１を照射すると、ＳＰＲにより増強された電場が金属膜１２０近傍に生じる。このとき、金属膜１２０上の抗ＨＢｓＡｇ抗体１３０に蛍光物質１５０で標識されたＨＢｓＡｇ１４０が結合していると、蛍光物質１５０が増強電場により励起され、蛍光Ｌ３を放出する。
【００２３】
図２Ｂに示されるように、ＧＣ−ＳＰＦＳ用の検出チップ２００は、回折格子２１１を形成された金属膜２１０および抗ＨＢｓＡｇ抗体１３０（の層）を有する。金属膜２１０の形成方法は、特に限定されない。金属膜２１０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、めっきが含まれる。金属膜２１０の厚みは、特に限定されないが、３０〜５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。回折格子２１１の形状は、エバネッセント波を生じさせることができれば特に限定されない。たとえば、回折格子２１１は、１次元回折格子であってもよいし、２次元回折格子であってもよい。たとえば、１次元回折格子では、金属膜２１０の表面に、互いに平行な複数の凸条が所定の間隔で形成されている。２次元回折格子では、金属膜２１０の表面に、所定形状の凸部が周期的に配置されている。凸部の配列の例には、正方格子、三角（六方）格子などが含まれる。回折格子２１１の断面形状の例には、矩形波形状、正弦波形状、鋸歯形状などが含まれる。回折格子２１１の形成方法は、特に限定されない。たとえば、平板状の基板（不図示）の上に金属膜２１０を形成した後、金属膜２１０に凹凸形状を付与してもよい。また、予め凹凸形状を付与された基板（不図示）の上に、金属膜２１０を形成してもよい。いずれの方法であっても、回折格子２１１を含む金属膜２１０を形成することができる。
【００２４】
図２Ｂに示されるように、金属膜２１０（回折格子２１１）においてＳＰＲが生じるように金属膜２１０（回折格子２１１）に励起光Ｌ１を照射すると、ＳＰＲにより増強された電場が金属膜２１０（回折格子２１１）近傍に生じる。このとき、金属膜２１０（回折格子２１１）上の抗ＨＢｓＡｇ抗体１３０に蛍光物質１５０で標識されたＨＢｓＡｇ１４０が結合していると、蛍光物質１５０が増強電場により励起され、蛍光Ｌ３を放出する。
【００２５】
図３は、ＰＣ−ＳＰＦＳ用の検出チップの一例を示す断面模式図である。図３に示されるように、検出チップ３００は、入射面１１１、成膜面１１２および出射面１１３を有するプリズム１１０と、プリズム１１０の成膜面１１２に形成された金属膜１２０と、プリズム１１０の成膜面１１２または金属膜１２０上に配置された流路蓋３１０とを有する。図３において、入射面１１１および出射面１１３は、紙面の手前および奥にそれぞれ存在している。検出チップ３００は、さらに、流路３２０と、流路３２０の一端に接続された液体注入部３３０と、流路３２０の他端に接続された貯留部３４０も有する。本実施の形態では、流路蓋３１０は、両面テープなどの接着層３５０を介して金属膜１２０（またはプリズム１１０）に接着されており、接着層３５０は流路３２０の側面形状を規定する役割も担っている。図３では省略しているが、流路３２０内に露出している金属膜１２０の一部の領域（反応場）には、抗ＨＢｓＡｇ抗体１３０が固定化されている。液体注入部３３０は、液体注入部被覆フィルム３３１により塞がれ、貯留部３４０は、貯留部被覆フィルム３４１により塞がれている。貯留部被覆フィルム３４１には、通気孔３４２が設けられている。
【００２６】
流路蓋３１０は、蛍光Ｌ３に対して透明な材料で形成されている。ただし、蛍光Ｌ３の取り出しの妨げにならない限り、流路蓋３１０の一部は蛍光Ｌ３に対して不透明な材料で形成されていてもよい。蛍光Ｌ３に対して透明な材料の例には、樹脂が含まれる。流路蓋３１０は、接着層３５０を用いずに、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより、金属膜１２０（またはプリズム１１０）に接合されていてもよい。この場合は、流路３２０の側面形状は、流路蓋３１０により規定される。
【００２７】
液体注入部３３０には、ピペットチップが挿入される。このとき、液体注入部３３０の開口部（液体注入部被覆フィルム３３１に設けられた貫通孔）はピペットチップの外周に隙間なく接触する。このため、ピペットチップから液体注入部３３０内に液体を注入することで流路３２０内に液体を導入することができ、液体注入部３３０内の液体をピペットチップに吸引することで流路３２０内の液体を除去することができる。また、液体の注入および吸引を交互に行うことで、流路３２０内において液体を往復送液することもできる。
【００２８】
液体注入部３３０から流路３２０内に流路３２０の容積を超える量の液体が導入された場合、貯留部３４０には流路３２０から液体が流入する。また、流路３２０内において液体を往復送液するときにも、貯留部３４０には液体が流入する。貯留部３４０に流入した液体は、貯留部３４０内で攪拌される。貯留部３４０内で液体が攪拌されると、流路３２０を通過する液体（検体や洗浄液など）の成分（例えばＨＢｓＡｇや洗浄成分など）の濃度が均一になり、流路３２０内で各種反応が生じやすくなったり、洗浄効果が高まったりする。
【００２９】
（１次反応）
次に、検出チップの金属膜上に検体を提供して、検体に含まれるＨＢｓＡｇを結合物質に結合させる（１次反応；工程Ｓ２０）。検体を提供する方法は、特に限定されない。たとえば、ピペットチップを先端に装着したピペットを用いて金属膜上に検体を提供すればよい。通常は、１次反応を終えた後、金属膜の表面を緩衝液などで洗浄して、結合物質に結合していない成分を除去する。
【００３０】
検体の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液、血清、血漿およびこれらの希釈液が含まれる。本実施の形態に係るＨＢｓＡｇの検出方法では、ＳＰＦＳを利用してＨＢｓＡｇを検出するため、検体として全血も使用することができる。
【００３１】
（２次反応）
次に、検出チップの金属膜上に標識試薬を提供して、結合物質に結合したＨＢｓＡｇを蛍光物質で標識する（２次反応；工程Ｓ３０）。標識試薬を提供する方法は、特に限定されない。たとえば、ピペットチップを先端に装着したピペットを用いて金属膜上に標識試薬を提供すればよい。通常は、２次反応を終えた後、金属膜の表面を緩衝液などで洗浄して、ＨＢｓＡｇを標識していない蛍光物質を除去する。
【００３２】
標識試薬の種類は、結合物質に結合したＨＢｓＡｇを蛍光物質で標識することができれば特に限定されない。たとえば、標識試薬は、蛍光物質で標識された、ＨＢｓＡｇに特異的に結合する結合物質である。標識試薬に含まれる結合物質の種類は、ＨＢｓＡｇに特異的に結合することができれば特に限定されない。結合物質の例には、ＨＢｓＡｇに特異的に結合できる抗体（抗ＨＢｓＡｇ抗体）、ＨＢｓＡｇに特異的に結合できる核酸、ＨＢｓＡｇに特異的に結合できる脂質、およびＨＢｓＡｇに特異的に結合できる抗体以外のタンパク質が含まれる。標識試薬に含まれる結合物質の種類は、金属膜に固定化される結合物質の種類と同一であってもよいし、異なっていてもよい。結合物質が抗ＨＢｓＡｇ抗体である場合、抗ＨＢｓＡｇ抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよいし、抗体の断片であってもよい。また、金属膜に固定化される結合物質の種類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。たとえば、蛍光物質で標識された抗ＨＢｓＡｇ抗体は、１種類または２種類以上の抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体または抗ＨＢｓＡｇポリクローナル抗体である。この場合、蛍光物質で標識された抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体および抗ＨＢｓＡｇポリクローナル抗体は、金属膜に固定化されている１種類または２種類以上の抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体とは異なるものであることが好ましい。
【００３３】
また、ＨＢｓＡｇの検出感度を向上させる観点から、蛍光物質で標識された抗ＨＢｓＡｇ抗体として、ＨＢｓＡｇの特定の領域に結合する抗体を採用してもよい。たとえば、蛍光物質で標識された抗ＨＢｓＡｇ抗体は、ＨＢｓＡｇのＳ領域に結合する抗体であってもよいし、ＨＢｓＡｇのＳ領域に結合する抗体とＨＢｓＡｇのＰｒｅ−Ｓ２領域に結合する抗体との組み合わせであってもよい。
【００３４】
蛍光物質の種類は、ＳＰＦＳで使用可能なものであれば特に限定されない。蛍光物質の例には、シアニン系色素、Thermo Scientific社のAlexa Fluor（登録商標）色素、およびBiotium社のＣＦ色素が含まれる。Alexa Fluor色素およびＣＦ色素は、市販されている蛍光色素の中では、ＳＰＦＳで使用する励起光の波長についての量子効率が高い。また、ＣＦ色素は、蛍光検出時における退色があまり生じないため、安定して蛍光検出を行うことができる。結合物質を蛍光物質で標識する方法は、特に限定されず、公知の方法から適宜選択されうる。たとえば、結合物質（例えば抗ＨＢｓＡｇ抗体）のアミノ基またはスルフヒドリル基に蛍光物質を結合させればよい。
【００３５】
なお、上記の説明では、金属膜に固定化された結合物質にＨＢｓＡｇを結合させてからＨＢｓＡｇを蛍光物質で標識したが、金属膜に固定化された結合物質にＨＢｓＡｇを結合させる前にＨＢｓＡｇを蛍光物質で標識してもよい。この場合は、検体を金属膜上に提供する前に、検体と標識試薬を混合すればよい。また、金属膜に固定化された結合物質にＨＢｓＡｇを結合させる工程とＨＢｓＡｇを蛍光物質で標識する工程を同時に行ってもよい。この場合は、検体と標識試薬を金属膜上に同時に提供すればよい。
【００３６】
（蛍光検出）
次に、ＳＰＦＳによりＨＢｓＡｇの存在または量を示す蛍光を検出する（工程Ｓ４０）。具体的には、蛍光物質で標識されたＨＢｓＡｇが金属膜に固定化された結合物質に結合している状態で、金属膜でＳＰＲが生じるように金属膜に励起光を照射し、これにより蛍光物質から放出される蛍光を検出する。通常は、測定された蛍光値から、予め測定された光学ブランク値を引いて、ＨＢｓＡｇの量に相関するシグナル値を算出する。必要に応じて、予め作成しておいた検量線などにより、シグナル値をＨＢｓＡｇの量や濃度などに換算してもよい。
【００３７】
図２Ａに示されるように、ＰＣ−ＳＰＦＳ用の検出チップ１００を用いる場合は、励起光Ｌ１は、プリズム１１０を介して金属膜１２０に照射される。これにより、金属膜１２０においてＳＰＲが生じ、金属膜１２０近傍に存在する蛍光物質１５０は、増強電場により励起され、蛍光Ｌ３を放出する。金属膜１２０に対する励起光Ｌ１の入射角は、金属膜１２０でＳＰＲが生じるように設定されるが、共鳴角または増強角であることが好ましい。ここで「共鳴角」とは、金属膜１２０に対する励起光Ｌ１の入射角を走査した場合に、反射光Ｌ２の光量が最小となるときの入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜１２０に対する励起光Ｌ１の入射角を走査した場合に、金属膜１２０の上方（プリズム１１０の反対側）に放出される励起光Ｌ１と同一波長の散乱光（プラズモン散乱光）の光量が最大となるときの入射角を意味する。
【００３８】
図２Ｂに示されるように、ＧＣ−ＳＰＦＳ用の検出チップ２００を用いる場合は、励起光Ｌ１は、直接金属膜２１０（回折格子２１１）に照射される。これにより、金属膜２１０（回折格子２１１）においてＳＰＲが生じ、金属膜２１０（回折格子２１１）近傍に存在する蛍光物質１５０は、増強電場により励起され、蛍光Ｌ３を放出する。金属膜２１０に対する励起光Ｌ１の入射角は、金属膜２１０でＳＰＲが生じるように設定されるが、ＳＰＲにより形成される増強電場の強度が最も強くなる角度が好ましい。励起光Ｌ１の最適な入射角は、回折格子２１１のピッチや励起光Ｌ１の波長、金属膜２１０を構成する金属の種類などに応じて適宜設定される。
【００３９】
励起光の種類は、特に限定されないが、通常はレーザー光である。たとえば、励起光は、出力が１５〜３０ｍＷのレーザー光源から出射されたレーザー光である。出力を１５ｍＷ以上とすることで、蛍光強度を高めて蛍光を適切に検出することができる。また、出力を３０ｍＷ以下とすることで、金属膜に固定化されている結合物質などへの悪影響を抑制することができる。励起光の波長は、使用する蛍光物質の励起波長に応じて適宜設定される。
【００４０】
蛍光の検出器は、検出チップに対して蛍光の強度が最も高い方向に設置されることが好ましい。たとえば、図２Ａに示されるように、ＰＣ−ＳＰＦＳ用の検出チップ１００を用いる場合は、蛍光Ｌ３の強度が最も高い方向は金属膜１２０の法線方向であるので、検出器は、検出チップの直上に設置される。一方、図２Ｂに示されるように、ＧＣ−ＳＰＦＳ用の検出チップ２００を用いる場合は、蛍光Ｌ３の強度が最も高い方向は金属膜１２０の法線に対してある程度傾斜した方向であるので、検出器は、検出チップの直上ではない位置設置される。検出器は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。
【００４１】
以上の手順により、検体に含まれるＨＢｓＡｇの存在または量を検出することができる。
【００４２】
［ＨＢｓＡｇの検出キット］
本実施の形態に係るＨＢｓＡｇの検出キットは、上記の検出チップと上記の標識試薬とをセットにしたものである。このように上記の検出チップと上記の標識試薬とを予めセットとしておくことで、ユーザー（医療従事者など）が上記のＨＢｓＡｇの検出方法をより簡便に行うことが可能となる。
【００４３】
［効果］
以上のように、本実施の形態に係るＨＢｓＡｇの検出方法または検出キットによれば、ＳＰＦＳを利用するため、検体として血液（全血）を用いてもＨＢｓＡｇを高感度かつ短時間で検出することができる。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。【００４５】
実験１：全血の測定値と血漿の測定値の比較
図３に示される構成の検出チップ３００を準備した。流路３２０内に露出している金属膜１２０（金薄膜）の特定の領域（反応部）に、マウス抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体（株式会社特殊免疫研究所）を固定化した。【００４６】
ボランティアの健常者４名から血液を得た。４例の血液のそれぞれについて、血液（全血）１９９０μＬに精製ＨＢｓＡｇ（株式会社特殊免疫研究所）１０μＬを添加した。得られた抗原添加血液を二分し、一方はそのまま全血サンプルとし、他方は遠心分離して血漿サンプルとした。全血サンプルおよび血漿サンプルは、いずれも３倍に希釈して使用した。希釈後の各サンプルにおけるＨＢｓＡｇの濃度は、０.４０ＩＵ／ｍＬ（Ｌｏｗ）または４０.００ＩＵ／ｍＬ（Ｍｉｄ）である。【００４７】
ピペットチップにより、液体注入部３３０から流路３２０内にサンプルを導入し、往復送液させた（１次反応）。液体注入部３３０から流路３２０内のサンプルを除去した後、流路３２０内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、標識試薬（アミノ基を介してＣＦ色素（Biotium社）で標識されたマウス抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体（株式会社特殊免疫研究所））を液体注入部３３０から流路３２０内に導入し、往復送液させた（２次反応）。液体注入部３３０から流路３２０内の標識試薬を除去した後、流路３２０内を洗浄液で３回洗浄した。次いで、液体注入部３３０から流路３２０内に測定液を導入した。この状態で、ＳＰＦＳにより蛍光値を測定した。すなわち、金属膜１２０に対する励起光の入射角が増強角となるようにプリズム１１０側から金属膜１２０に励起光（レーザー光）を照射し、そのときに放出される蛍光を検出した。得られた蛍光値から予め測定した光学ブランク値を引き、ＨＢｓＡｇの量に相関するシグナル値を算出した。また、事前に作成した検量線を用いて、シグナル値からＨＢｓＡｇの濃度（ＩＵ／ｍＬ）（定量値）を算出した。全血サンプルにおけるＨＢｓＡｇの濃度は、ミクロヘマトクリット法で測定されたヘマトクリット値により補正した。【００４８】
各サンプルの測定結果を表１に示す。
【表１】
2019044202.tif 000003
【００４９】
表１から、検体として全血を用いても血漿を用いた場合と同様にＨＢｓＡｇの濃度を測定できることがわかる。なお、Ｎｏ.３またはＮｏ.４の血液の測定値が、サンプル中のＨＢｓＡｇの添加濃度よりやや小さい値となっているのは、サンプル調製時のブレや検体特性などに起因するものと考えられる。【００５０】
実験２：日間再現性の確認
実験１と同様に検出チップ３００を準備した。また、検体として、市販のＨＢｓＡｇ陽性の血漿（ProMedEx社）４例を準備した。実験１と同様の手順で、各検体について、１日２回、３日間、シグナル値を測定し、ＨＢｓＡｇの濃度（ＩＵ／ｍＬ）（定量値）を算出した。【００５１】
各検体の測定結果を表２に示す。
【表２】
2019044202.tif 000004
【００５２】
表２から、変動係数ＣＶが７.８％以下と低く、本実施の形態に係るＨＢｓＡｇの検出方法は、日間再現性が高いことがわかる。【００５３】
実験３：希釈直線性の確認
実験１と同様に検出チップ３００を準備した。また、検体として、市販のＨＢｓＡｇ陽性の血漿（ProMedEx社）３例を準備した。各血漿を、１倍、４倍、１６倍、６４倍、２５６倍、１０２４倍、４０９６倍、１６３８４倍に希釈して、希釈サンプルを準備した。実験１と同様の手順で、各希釈サンプルについて、シグナル値を測定し、ＨＢｓＡｇの濃度（ＩＵ／ｍＬ）（定量値）を算出した。【００５４】
各検体の測定結果を図４に示す。図４から、希釈直線性がよく、本実施の形態に係るＨＢｓＡｇの検出方法は、任意の希釈倍率で検出できることがわかる。【００５５】
実験４：他の検出方法との比較
実験１と同様に検出チップ３００を準備した。また、検体として、市販のＨＢｓＡｇ陽性の血漿（ProMedEx社）１９例を準備した。実験１と同様の手順で、各検体について、シグナル値を測定し、ＨＢｓＡｇの濃度（ＩＵ／ｍＬ）（定量値）を算出した。【００５６】
また、同じ１９例の検体について、市販の全自動化学発光免疫測定装置（ADVIA Centaur；Siemens社）を用いて、ＨＢｓＡｇを検出した。【００５７】
各検体の測定結果を図５に示す。図５のグラフの横軸は、市販の装置の測定結果（Index）であり、縦軸は本実施の形態に係るＨＢｓＡｇの検出方法の測定結果（ＩＵ／ｍＬ）である。図５から、本実施の形態に係るＨＢｓＡｇの検出方法は、他の測定方法の測定結果と相関性が高く、測定結果が信頼できることがわかる。また、本実施の形態に係る検出方法では、ＨＢｓＡｇ陽性の判定のカットオフ値が０.００５（ＩＵ／ｍＬ）であり、市販の装置の測定方法では、ＨＢｓＡｇ陽性の判定のカットオフ値が１.０（Index）であるところ、両者において陽性の判定結果が一致した。【００５８】
本出願は、２０１７年８月３１日出願の特願２０１７−１６７６１８に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本実施の形態に係るＨＢｓＡｇの検出方法または検出キットを用いることで、ＨＢＶの感染を高精度かつ短時間で検査することができる。したがって、本発明に係るＨＢｓＡｇの検出方法および検出キットは、例えば臨床検査などに有用である。
【符号の説明】
【００６０】
１００、２００、３００  検出チップ
１１０  プリズム
１１１  入射面
１１２  成膜面
１１３  出射面
１２０  金属膜
１３０  抗Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）抗体
１４０  Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）
１５０  蛍光物質
２１０  金属膜
２１１  回折格子
３１０  流路蓋
３２０  流路
３３０  液体注入部
３３１  液体注入部被覆フィルム
３４０  貯留部
３４１  貯留部被覆フィルム
３４２  通気孔
３５０  接着層
Ｌ１  励起光
Ｌ２  反射光
Ｌ３  蛍光
【図１】
2019044202.tif 000005
【図２】
2019044202.tif 000006
【図３】
2019044202.tif 000007
【図４】
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【図５】
2019044202.tif 000009
【国際調査報告】
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