(57)【要約】本発明は、所望の粒径を有する脂質粒子の製造方法であって、該方法は、（Ａ）第１の混合領域内で、脂質およびアルコールを含む第１の溶液と、水を含む第２の溶液とを混合して一次希釈溶液を調製する工程と、（Ｂ）該一次希釈溶液を、送液管を通して該第１の混合領域から第２の混合領域へと所定の時間で送液する工程と、（Ｃ）該第２の混合領域内で、該一次希釈溶液と、水を含む第３の溶液とを混合して二次希釈溶液を調製する工程と、を含み、（Ａ）〜（Ｃ）の工程は連続的に実施され、脂質粒子の粒径が、該一次希釈溶液中の該アルコールの濃度、該脂質の濃度、該所定の時間、および該混合時の温度からなる群より選択される少なくとも１つの条件を調整することによって制御される、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の粒径を有する脂質粒子の製造方法であって、該方法は、
（Ａ）第１の混合領域内で、脂質およびアルコールを含む第１の溶液と、水を含む第２の溶液とを混合して一次希釈溶液を調製する工程と、
（Ｂ）該一次希釈溶液を、送液管を通して該第１の混合領域から第２の混合領域へと所定の時間で送液する工程と、
（Ｃ）該第２の混合領域内で、該一次希釈溶液と、水を含む第３の溶液とを混合して二次希釈溶液を調製する工程と、
を含み、
（Ａ）〜（Ｃ）の工程は連続的に実施され、
脂質粒子の粒径が、該一次希釈溶液中の該アルコールの濃度、該脂質の濃度、該所定の時間、および該混合時の温度からなる群より選択される少なくとも１つの条件を調整することによって制御される、
方法。
【請求項２】
前記脂質粒子が、リポソームまたはミセルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脂質粒子が、リポソームである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記脂質粒子がさらに薬物を担持する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、
（Ａ）の工程の前にさらに以下の工程；
（Ａ−１）該薬物、前記脂質および前記アルコールを含む溶液を希釈して該アルコールの濃度を変化させた場合に形成される脂質粒子の粒径を測定する工程と、
（Ａ−２）該アルコールの濃度が一定の条件下における該薬物を担持する脂質粒子の粒径の経時的変化を測定する工程と、
を含み、
（Ａ−１）および（Ａ−２）の工程により得られた情報に基づいて、前記該一次希釈溶液中の該アルコールの濃度、該脂質の濃度、前記所定の時間、および前記混合時の温度からなる群より選択される、前記所望の粒径を調整するのに必要な少なくとも１つの条件が決定される、
方法
【請求項５】
前記一次希釈溶液中のアルコール濃度が１８重量％以上に調整される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
（Ａ）〜（Ｃ）の工程が、閉鎖系において実施される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
（Ｃ）の工程の後に、さらなる粒径制御処理が実施されない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記所定の時間が、前記送液管の長さおよび流速の少なくとも１つによって調整される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記送液管中の圧力が、１ＭＰａ以上である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記二次希釈溶液を、さらに中空糸膜カラムに送液する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
所望の粒径を有する脂質粒子を製造するシステムであって、該システムは、
（Ａ）脂質およびアルコールを含む第１の溶液と、水を含む第２の溶液とを混合して一次希釈溶液を調製する第１の混合領域と、
（Ｂ）該一次希釈溶液と、水を含む第３の溶液とを混合して二次希釈溶液を調製する第２の混合領域と、
（Ｃ）該一次希釈溶液を、該第１の混合領域から該第２の混合領域へと所定の時間で送液する送液管と、
を含み、
脂質粒子の粒径が、該一次希釈溶液中の該アルコールの濃度、該脂質の濃度、該所定の時間および該混合時の温度からなる群より選択される少なくとも１つの条件を調整することによって制御される、
システム。
【請求項１２】
前記脂質粒子が、リポソームまたはミセルである、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記脂質粒子が、リポソームである、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記脂質粒子がさらに薬物を担持する、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のシステムであって、
（Ａ−１）該薬物、前記脂質および前記アルコールを含む溶液を希釈して該アルコールの濃度を変化させた場合に形成される脂質粒子の粒径を測定する工程と、
（Ａ−２）前記アルコールの濃度が一定の条件下における該薬物を担持する脂質粒子の粒径の経時的変化を測定する工程と、
を行う制御部をさらに含み、該制御部は、（Ａ−１）および（Ａ−２）の工程により得られた情報に基づいて、前記一次希釈溶液中の該アルコールの濃度、前記脂質の濃度、前記所定の時間および前記混合時の温度からなる群より選択される少なくとも１つの条件を決定する、システム。
【請求項１５】
前記一次希釈溶液中のアルコール濃度が１８重量％以上に調整される、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１６】
所望の粒径を有する脂質粒子を製造するシステムであって、該システムは、
（１）脂質粒子製造装置、および
（２）透析装置
を含み、
該脂質粒子製造装置は、
（１−Ａ）脂質およびアルコールを含む第１の溶液と、水を含む第２の溶液とを混合して一次希釈溶液を調製する第１の混合領域と、
（１−Ｂ）該一次希釈溶液と、水を含む第３の溶液とを混合して二次希釈溶液を調製する第２の混合領域と、
（１−Ｃ）該一次希釈溶液を、該第１の混合領域から該第２の混合領域へと所定の時間で送液する送液管と、
を含み、
ここで、脂質粒子の粒径は、該一次希釈溶液中の該アルコールの濃度、該脂質の濃度、該所定の時間および該混合時の温度からなる群より選択される少なくとも１つの条件を調整することによって制御され、
該透析装置は、
（２−Ａ）中空糸膜と、該中空糸膜の内側に被透析液を流すための第１流路を有する中空糸透析カラムと、
（２−Ｂ）該第１流路の入口に該被透析液を送る送液部と、
（２−Ｃ）該中空糸膜と接触する部分を有する第２流路と、
を含む、
システム。
【請求項１７】
前記脂質粒子が、リポソームまたはミセルである、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記脂質粒子が、リポソームである、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１９】
前記第２流路が、前記中空糸膜の外側に外液を流す流路である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２０】
前記第２流路が、前記中空糸膜のろ過液を流す流路である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２１】
前記被透析液に外液を加える第３流路を含む、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
溶液貯蔵容器を含み、ここで、該溶液貯蔵容器は前記脂質粒子製造装置および前記透析装置に接続されており、該溶液貯蔵容器は前記脂質粒子製造装置から流入した脂質粒子含有溶液を貯蔵する、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２３】
前記透析装置が、
（２−Ｄ）前記第１流路の出口から流出する時の前記被透析液の流速および／または圧力を変更可能とする流速／圧力可変部、
を含み、ここで、該流速可変部は、前記第１流路の出口よりも下流側に設けられ、該第１流路の出口から流出した該被透析液を、該第１流路の入口の送液部の流速よりも低い流速および／または低い圧力で下流に送る装置を含む、
請求項１６〜２２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２４】
前記流速可変部の装置が、
（１）前記第１流路の出口から流出した前記被透析液を所定の流速で下流に送るポンプ、または
（２）前記第１流路の出口から流出した前記被透析液の流路を狭くするバルブ
のいずれかを含む、
請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記一次希釈溶液中のアルコール濃度が１８重量％以上に調整される、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２６】
前記第１流路の出口から流出した前記被透析液が前記透析装置に再度流入するように構成される、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所望の粒径を有する脂質粒子を製造するための方法および装置に関する。より特定すると、脂質を含む溶液を段階的に希釈することで所望の粒径を有する脂質粒子を製造する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
無菌の脂質粒子を作製する技術として、閉鎖された細管内で連続的にリポソームを形成させる「インラインリポソーム製造技術」が注目を集めており、形成されたリポソームの濃度をインラインで調整する技術が開発されている（引用文献１）。しかし、リン脂質の組成や担持させる薬物が異なれば同じ粒径を得るために異なる条件を検討しなければならず、所望の構成のリン脂質で均一な粒子径の脂質粒子をインライン製造することは困難であった。【０００３】
従来の脂質粒子製造法の１つである「エタノールインジェクション法」は、リン脂質を溶解したエタノールを水系溶媒に注入または滴下し、水系溶媒中でのリン脂質の自己組織化による二重膜形成を利用した脂質粒子製造法である。この方法で製造される脂質粒子は、粒子径が不均一であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１６／０２４５１０号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、高濃度のアルコール存在下で脂質粒子が不安定化することに着目し、脂質を溶解したアルコール含有溶液を、脂質粒子が不安定化するアルコール濃度で１次希釈を行った後、さらに２次希釈を行うことで安定化した脂質粒子を得るが、ここで、１次希釈から２次希釈までの保持時間を調整することにより、均一な粒度分布を保ったまま脂質粒子の粒子径を制御することが可能であることを見出した。【０００６】
したがって、本発明は以下を提供する。
（項目Ｘ１）
所望の粒径を有する脂質粒子の製造方法であって、該方法は、
（Ａ）第１の混合領域内で、脂質およびアルコールを含む第１の溶液と、水を含む第２の溶液とを混合して一次希釈溶液を調製する工程と、
（Ｂ）該一次希釈溶液を、送液管を通して該第１の混合領域から第２の混合領域へと所定の時間で送液する工程と、
（Ｃ）該第２の混合領域内で、該一次希釈溶液と、水を含む第３の溶液とを混合して二次希釈溶液を調製する工程と、
を含み、
（Ａ）〜（Ｃ）の工程は連続的に実施され、
脂質粒子の粒径が、該一次希釈溶液中の該アルコールの濃度、該脂質の濃度、該所定の時間、および該混合時の温度からなる群より選択される少なくとも１つの条件を調整することによって制御される、
方法。
（項目Ｘ２）
前記脂質粒子が、リポソームまたはミセルである、項目Ｘ１に記載の方法。
（項目Ｘ３）
前記脂質粒子が、リポソームである、項目Ｘ１に記載の方法。
（項目Ｘ４）
前記脂質粒子がさらに薬物を担持する、項目Ｘ１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、
（Ａ）の工程の前にさらに以下の工程；
（Ａ−１）該薬物、前記脂質および前記アルコールを含む溶液を希釈して該アルコールの濃度を変化させた場合に形成される脂質粒子の粒径を測定する工程と、
（Ａ−２）該アルコールの濃度が一定の条件下における該薬物を担持する脂質粒子の粒径の経時的変化を測定する工程と、
を含み、
（Ａ−１）および（Ａ−２）の工程により得られた情報に基づいて、前記該一次希釈溶液中の該アルコールの濃度、該脂質の濃度、前記所定の時間、および前記混合時の温度からなる群より選択される、前記所望の粒径を調整するのに必要な少なくとも１つの条件が決定される、
方法
（項目Ｘ５）
前記一次希釈溶液中のアルコール濃度が１８重量％以上に調整される、項目Ｘ１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目Ｘ６）
（Ａ）〜（Ｃ）の工程が、閉鎖系において実施される、項目Ｘ１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目Ｘ７）
（Ｃ）の工程の後に、さらなる粒径制御処理が実施されない、項目Ｘ１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目Ｘ８）
前記所定の時間が、前記送液管の長さおよび流速の少なくとも１つによって調整される、項目Ｘ１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目Ｘ９）
前記送液管中の圧力が、１ＭＰａ以上である、項目Ｘ１〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目Ｘ１０）
前記二次希釈溶液を、さらに中空糸膜カラムに送液する、項目Ｘ１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目Ｘ１１）
所望の粒径を有する脂質粒子を製造するシステムであって、該システムは、
（Ａ）脂質およびアルコールを含む第１の溶液と、水を含む第２の溶液とを混合して一次希釈溶液を調製する第１の混合領域と、
（Ｂ）該一次希釈溶液と、水を含む第３の溶液とを混合して二次希釈溶液を調製する第２の混合領域と、
（Ｃ）該一次希釈溶液を、該第１の混合領域から該第２の混合領域へと所定の時間で送液する送液管と、
を含み、
脂質粒子の粒径が、該一次希釈溶液中の該アルコールの濃度、該脂質の濃度、該所定の時間および該混合時の温度からなる群より選択される少なくとも１つの条件を調整することによって制御される、
システム。
（項目Ｘ１２）
前記脂質粒子が、リポソームまたはミセルである、項目Ｘ１１に記載のシステム。
（項目Ｘ１３）
前記脂質粒子が、リポソームである、項目Ｘ１１に記載のシステム。
（項目Ｘ１４）
前記脂質粒子がさらに薬物を担持する、項目Ｘ１１〜１３のいずれか１項に記載のシステムであって、
（Ａ−１）該薬物、前記脂質および前記アルコールを含む溶液を希釈して該アルコールの濃度を変化させた場合に形成される脂質粒子の粒径を測定する工程と、
（Ａ−２）前記アルコールの濃度が一定の条件下における該薬物を担持する脂質粒子の粒径の経時的変化を測定する工程と、
を行う制御部をさらに含み、該制御部は、（Ａ−１）および（Ａ−２）の工程により得られた情報に基づいて、前記一次希釈溶液中の該アルコールの濃度、前記脂質の濃度、前記所定の時間および前記混合時の温度からなる群より選択される少なくとも１つの条件を決定する、システム。
（項目Ｘ１５）
前記一次希釈溶液中のアルコール濃度が１８重量％以上に調整される、項目Ｘ１１〜１４のいずれか１項に記載のシステム。
（項目Ｘ１６）
所望の粒径を有する脂質粒子を製造するシステムであって、該システムは、
（１）脂質粒子製造装置、および
（２）透析装置
を含み、
該脂質粒子製造装置は、
（１−Ａ）脂質およびアルコールを含む第１の溶液と、水を含む第２の溶液とを混合して一次希釈溶液を調製する第１の混合領域と、
（１−Ｂ）該一次希釈溶液と、水を含む第３の溶液とを混合して二次希釈溶液を調製する第２の混合領域と、
（１−Ｃ）該一次希釈溶液を、該第１の混合領域から該第２の混合領域へと所定の時間で送液する送液管と、
を含み、
ここで、脂質粒子の粒径は、該一次希釈溶液中の該アルコールの濃度、該脂質の濃度、該所定の時間および該混合時の温度からなる群より選択される少なくとも１つの条件を調整することによって制御され、
該透析装置は、
（２−Ａ）中空糸膜と、該中空糸膜の内側に被透析液を流すための第１流路を有する中空糸透析カラムと、
（２−Ｂ）該第１流路の入口に該被透析液を送る送液部と、
（２−Ｃ）該中空糸膜と接触する部分を有する第２流路と、
を含む、
システム。
（項目Ｘ１７）
前記脂質粒子が、リポソームまたはミセルである、項目Ｘ１６に記載のシステム。
（項目Ｘ１８）
前記脂質粒子が、リポソームである、項目Ｘ１６に記載のシステム。
（項目Ｘ１９）
前記第２流路が、前記中空糸膜の外側に外液を流す流路である、項目Ｘ１６〜１８のいずれか１項に記載のシステム。
（項目Ｘ２０）
前記第２流路が、前記中空糸膜のろ過液を流す流路である、項目Ｘ１６〜１８のいずれか１項に記載のシステム。
（項目Ｘ２１）
前記被透析液に外液を加える第３流路を含む、項目Ｘ２０に記載のシステム。
（項目Ｘ２２）
溶液貯蔵容器を含み、ここで、該溶液貯蔵容器は前記脂質粒子製造装置および前記透析装置に接続されており、該溶液貯蔵容器は前記脂質粒子製造装置から流入した脂質粒子含有溶液を貯蔵する、項目Ｘ１６〜２１のいずれか１項に記載のシステム。
（項目Ｘ２３）
前記透析装置が、
（２−Ｄ）前記第１流路の出口から流出する時の前記被透析液の流速および／または圧力を変更可能とする流速／圧力可変部、
を含み、ここで、該流速可変部は、前記第１流路の出口よりも下流側に設けられ、該第１流路の出口から流出した該被透析液を、該第１流路の入口の送液部の流速よりも低い流速および／または低い圧力で下流に送る装置を含む、
項目Ｘ１６〜２２のいずれか１項に記載のシステム。
（項目Ｘ２４）
前記流速可変部の装置が、
（１）前記第１流路の出口から流出した前記被透析液を所定の流速で下流に送るポンプ、または
（２）前記第１流路の出口から流出した前記被透析液の流路を狭くするバルブ
のいずれかを含む、
項目Ｘ２３に記載のシステム。
（項目Ｘ２５）
前記一次希釈溶液中のアルコール濃度が１８重量％以上に調整される、項目Ｘ１６〜２４のいずれか１項に記載のシステム。
（項目Ｘ２６）
前記第１流路の出口から流出した前記被透析液が前記透析装置に再度流入するように構成される、項目Ｘ１６〜２５のいずれか１項に記載のシステム。
（項目Ｙ１）
所望の粒径を有するリポソームの製造方法であって、該方法は、
（Ａ）第１の混合領域内で、脂質およびアルコールを含む第１の溶液と、水を含む第２の溶液とを混合して一次希釈溶液を調製する工程と、
（Ｂ）該一次希釈溶液を、送液管を通して該第１の混合領域から第２の混合領域へと所定の時間で送液する工程と、
（Ｃ）該第２の混合領域内で、該一次希釈溶液と、水を含む第３の溶液とを混合して二次希釈溶液を調製する工程と、
を含み、
（Ａ）〜（Ｃ）の工程は連続的に実施され、
リポソームの粒径が、該一次希釈溶液中の該アルコールの濃度、該脂質の濃度、該所定の時間、および該混合時の温度からなる群より選択される少なくとも１つの条件を調整することによって制御される、
方法。
（項目Ｙ２）
前記リポソームがさらに薬物を担持する、項目Ｙ１に記載の方法であって、
（Ａ）の工程の前にさらに以下の工程；
（Ａ−１）該薬物、前記脂質および前記アルコールを含む溶液を希釈して該アルコールの濃度を変化させた場合に形成されるリポソームの粒径を測定する工程と、
（Ａ−２）該アルコールの濃度が一定の条件下における該薬物を担持するリポソームの粒径の経時的変化を測定する工程と、
を含み、
（Ａ−１）および（Ａ−２）の工程により得られた情報に基づいて、前記該一次希釈溶液中の該アルコールの濃度、該脂質の濃度、前記所定の時間、および前記混合時の温度からなる群より選択される、前記所望の粒径を調整するのに必要な少なくとも１つの条件が決定される、
方法
（項目Ｙ３）
前記一次希釈溶液中のアルコール濃度が１８重量％以上に調整される、項目Ｙ１または２に記載の方法。
（項目Ｙ４）
（Ａ）〜（Ｃ）の工程が、閉鎖系において実施される、項目Ｙ１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目Ｙ５）
（Ｃ）の工程の後に、さらなる粒径制御処理が実施されない、項目Ｙ１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目Ｙ６）
前記所定の時間が、前記送液管の長さおよび流速の少なくとも１つによって調整される、項目Ｙ１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目Ｙ７）
前記送液管中の圧力が、１ＭＰａ以上である、項目Ｙ１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目Ｙ８）
前記二次希釈溶液を、さらに中空糸膜カラムに送液する、項目Ｙ１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目Ｙ９）
所望の粒径を有するリポソームを製造するシステムであって、該システムは、
（Ａ）脂質およびアルコールを含む第１の溶液と、水を含む第２の溶液とを混合して一次希釈溶液を調製する第１の混合領域と、
（Ｂ）該一次希釈溶液と、水を含む第３の溶液とを混合して二次希釈溶液を調製する第２の混合領域と、
（Ｃ）該一次希釈溶液を、該第１の混合領域から該第２の混合領域へと所定の時間で送液する送液管と、
を含み、
リポソームの粒径が、該一次希釈溶液中の該アルコールの濃度、該脂質の濃度、該所定の時間および該混合時の温度からなる群より選択される少なくとも１つの条件を調整することによって制御される、
システム。
（項目Ｙ１０）
前記リポソームがさらに薬物を担持する、項目Ｙ９に記載のシステムであって、
（Ａ−１）該薬物、前記脂質および前記アルコールを含む溶液を希釈して該アルコールの濃度を変化させた場合に形成されるリポソームの粒径を測定する工程と、
（Ａ−２）前記アルコールの濃度が一定の条件下における該薬物を担持するリポソームの粒径の経時的変化を測定する工程と、
を行う制御部をさらに含み、該制御部は、（Ａ−１）および（Ａ−２）の工程により得られた情報に基づいて、前記一次希釈溶液中の該アルコールの濃度、前記脂質の濃度、前記所定の時間および前記混合時の温度からなる群より選択される少なくとも１つの条件を決定する、システム。
（項目Ｙ１１）
前記一次希釈溶液中のアルコール濃度が１８重量％以上に調整される、項目Ｙ１０または１１に記載のシステム。
（項目Ｙ１２）
所望の粒径を有するリポソームを製造するシステムであって、該システムは、
（１）リポソーム製造装置、および
（２）透析装置
を含み、
該リポソーム製造装置は、
（１−Ａ）脂質およびアルコールを含む第１の溶液と、水を含む第２の溶液とを混合して一次希釈溶液を調製する第１の混合領域と、
（１−Ｂ）該一次希釈溶液と、水を含む第３の溶液とを混合して二次希釈溶液を調製する第２の混合領域と、
（１−Ｃ）該一次希釈溶液を、該第１の混合領域から該第２の混合領域へと所定の時間で送液する送液管と、
を含み、
ここで、リポソームの粒径は、該一次希釈溶液中の該アルコールの濃度、該脂質の濃度、該所定の時間および該混合時の温度からなる群より選択される少なくとも１つの条件を調整することによって制御され、
該透析装置は、
（２−Ａ）中空糸膜と、該中空糸膜の内側に被透析液を流すための第１流路を有する中空糸透析カラムと、
（２−Ｂ）該第１流路の入口に該被透析液を送る送液部と、
（２−Ｃ）該中空糸膜と接触する部分を有する第２流路と、
を含む、
システム。
（項目Ｙ１３）
前記第２流路が、前記中空糸膜の外側に外液を流す流路である、項目Ｙ１２に記載のシステム。
（項目Ｙ１４）
前記第２流路が、前記中空糸膜のろ過液を流す流路である、項目Ｙ１２に記載のシステム。
（項目Ｙ１５）
前記被透析液に外液を加える第３流路を含む、項目Ｙ１４に記載のシステム。
（項目Ｙ１６）
溶液貯蔵容器を含み、ここで、該溶液貯蔵容器は前記リポソーム製造装置および前記透析装置に接続されており、該溶液貯蔵容器は前記リポソーム製造装置から流入したリポソーム含有溶液を貯蔵する、項目Ｙ１２〜１５のいずれか１項に記載のシステム。
（項目Ｙ１７）
前記透析装置が、
（２−Ｄ）前記第１流路の出口から流出する時の前記被透析液の流速および／または圧力を変更可能とする流速／圧力可変部、
を含み、ここで、該流速可変部は、前記第１流路の出口よりも下流側に設けられ、該第１流路の出口から流出した該被透析液を、該第１流路の入口の送液部の流速よりも低い流速および／または低い圧力で下流に送る装置を含む、
項目Ｙ１２〜１６のいずれか１項に記載のシステム。
（項目Ｙ１８）
前記流速可変部の装置が、
（１）前記第１流路の出口から流出した前記被透析液を所定の流速で下流に送るポンプ、または
（２）前記第１流路の出口から流出した前記被透析液の流路を狭くするバルブ
のいずれかを含む、
項目Ｙ１７に記載のシステム。
（項目Ｙ１９）
前記一次希釈溶液中のアルコール濃度が１８重量％以上に調整される、項目Ｙ１２〜１８のいずれか１項に記載のシステム。
（項目Ｙ２０）
前記第１流路の出口から流出した前記被透析液が前記透析装置に再度流入するように構成される、項目Ｙ１２〜１９のいずれか１項に記載のシステム。【０００７】
本発明において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明を用いると、種々の脂質組成および担持薬物で構成される脂質粒子を、所望の粒子径および粒径分布で提供することができることから、薬物動態の検討、有効成分の安定化、製剤設計等において有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ワンステップインライン閉鎖系脂質粒子製造システムの概略図である。
【図２】脂質粒子製造システムの概略図である。１ａおよび１ｂは、それぞれ第１および第２の混合領域である。２は、送液管である。３ａ、３ｂおよび３ｃは、それぞれポンプである。
【図３Ａ】本発明の一つの実施形態における脂質粒子の粒径の制御ユニットの構成を機能ごとに分けて示すブロック図である。
【図３Ｂ】本発明の一つの実施形態における脂質粒子の粒径の制御ユニットの構成を機能ごとに分けて示すブロック図である。条件Ａ１、条件Ａ２などは、薬物、脂質およびアルコールを含む溶液を希釈してアルコールの濃度を所定の値とする条件である。条件Ｂ１、条件Ｂ２などは、アルコールの濃度を一定の濃度に希釈した後に保持時間を所定の値だけ経過させる条件である。
【図４】透析装置の中空糸膜カラムの一例を示す図である。
【図５】被透析液の濃度制御装置の制御ユニットの構成を機能ごとに分けて示すブロック図である。
【図６】被透析液（脂質粒子液）の濃度をほとんど変えずに被透析液中の有機微粒子を除去する場合の制御を説明するための図である。
【図７】有機微粒子を除去しながら被透析液（脂質粒子液）を濃縮する場合の制御を説明するための図である。
【図８】本発明の実施形態に係る透析装置の流速可変部の変形例を示す図である。
【図９Ａ】本発明の脂質粒子製造装置と透析装置とを組み合わせた例示的実施形態を示す図である。
【図９Ｂ】本発明の脂質粒子製造装置と透析装置とを組み合わせた例示的実施形態を示す図である。
【図９Ｃ】本発明の脂質粒子製造装置と透析装置とを組み合わせた例示的実施形態を示す図である。
【図１０Ａ】脂質組成（モル比）として、ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ：ＭＰＥＧ２０００ＤＳＰＥ（５６：３９：５）を使用した場合の粒径分布の変化を示す図である。左は、エタノール濃度が１２％、１８％、２７％、３６％、３９％、４２％、４６％の場合の調製直後および調製の１時間後のリポソームの粒径分布を示す。右は、エタノール濃度が１５％、１８％、２１％、２４％、２７％、３０％の場合の調製直後および調製の１日後のリポソームの粒径分布を示す。
【図１０Ｂ】脂質組成（モル比）としてＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ：ＤＳＰＧ（２．０：１．０：０．８）を使用した場合の粒径分布の変化を示す図である。左は、エタノール濃度が１２％、１５％、１８％、２１％、２４％、２７％の場合の調製直後および調製の１時間後のリポソームの粒径分布を示す。右は、エタノール濃度が１５％、１８％、２１％、２４％、２７％、３０％の場合の調製直後および調製の１日後のリポソームの粒径分布を示す。
【図１０Ｃ】脂質組成（モル比）としてＤＯＰＣ：ＤＯＰＧ：ＤＰＰＣ：ＤＰＰＧ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（１：１：１：１：２．７）を使用した場合の調製直後および調製の１時間後のリポソームの粒径分布を示す図である。
【図１１Ａ】実施例２−１に記載されるＨＳＰＣ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＭＰＥＧ２０００ＤＳＰＥの組成を使用した場合の各２次希釈濃度で調製されたリポソームの調製直後、１時間後、１日後および２日後の粒径分布を示す図である。
【図１１Ｂ】実施例２−２に記載されるＨＳＰＣ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＭＰＥＧ２０００ＤＳＰＥの組成を使用した場合の各２次希釈濃度で調製されたリポソームの調製直後、１時間後および２日後の粒径分布を示す図である。
【図１２Ａ】脂質組成（モル比）として、ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ：ＭＰＥＧ２０００ＤＳＰＥ（５６：３９：５）を使用した場合の各脂質濃度で調製されたリポソームの１８％または３６％の希釈濃度における粒径分布を示す図である。
【図１２Ｂ】脂質組成（モル比）としてＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ：ＤＳＰＧ（２．０：１．０：０．８）を使用した場合の各脂質濃度で調製されたリポソームの１８％または３６％の希釈濃度における粒径分布を示す図である。
【図１２Ｃ】脂質組成（モル比）としてＤＯＰＣ：ＤＯＰＧ：ＤＰＰＣ：ＤＰＰＧ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（１：１：１：１：２．７）を使用した場合の各脂質濃度で調製されたリポソームの２５％の希釈濃度における粒径分布を示す図である。
【図１３】脂質組成（モル比）としてＤＯＰＣ：ＤＯＰＧ：ＤＰＰＣ：ＤＰＰＧ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（１：１：１：１：２．７）を使用した場合の各脂質濃度で調製されたリポソームの３６％の１次希釈濃度かつ１８％の２次希釈濃度における粒径分布を示す図である。
【図１４】流速および流路の長さを変更した場合のリポソームの粒径分布を示す図である。
【図１５Ａ】脂質組成（モル比）として、ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ：ＭＰＥＧ２０００ＤＳＰＥ（５６：３９：５）を使用した場合の各流速（保持時間）で調製されたリポソームの粒径分布を示す図である。
【図１５Ｂ】脂質組成（モル比）としてＤＯＰＣ：ＤＯＰＧ：ＤＰＰＣ：ＤＰＰＧ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（１：１：１：１：２．７）を使用した場合の各流速（保持時間）で調製されたリポソームの粒径分布を示す図である。
【図１６Ａ】実施例４−４に記載されるＤＯＰＣ、ＤＯＰＧ、ＤＰＰＣ、ＤＰＰＧ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌの組成を使用した場合の各保持時間で調製されたリポソームの調製直後、１時間後および２日後の粒径分布を示す図である。
【図１６Ｂ】実施例４−５に記載されるＨＳＰＣ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＤＳＰＧの組成を使用した場合の各保持時間で調製されたリポソームの調製直後、１時間後および２日後の粒径分布を示す図である。
【図１７】温度を変更した場合のリポソームの粒径分布を示す図である。
【図１８】背圧を変更した場合のリポソームの粒径分布を示す図である。
【図１９】各濃度の第１希釈液におけるリポソームの粒径分布を示す図である。
【図２０】本発明の方法で調製されたミセルおよびリポソームの比較を示す図である。図２０Ａは、電子顕微鏡観察により測定した、それぞれの脂質粒子調製液における脂質粒子全体のうちミセルの割合（％）を示す。図２０Ｂは、リンタングステン酸染色したそれぞれの脂質粒子調製液における代表的な脂質粒子の観察像を示す（ｘ２００，０００倍）。図２０Ｃは、それぞれの脂質粒子調製液における粒径分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１１】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
【００１２】
（定義等）
本明細書において「脂質粒子」とは、疎水性基と親水性基とを有する脂質分子を含む、流体中で形成される粒子状の物質を指し、脂質粒子の内外の間または脂質粒子内には、脂質分子の疎水性基および親水性基の極性に基づいて局所的な親水的環境および疎水的環境が生じる。脂質粒子には、リポソームおよびミセルが含まれ得る。脂質粒子は、典型的には、平均粒径が１μｍ未満の脂質ナノ粒子であり得る。脂質粒子またはその脂質二重膜は、生体を構成する細胞膜と類似しているため、生体内環境に受け入れられ易い。また、脂質粒子は独立した局所的環境を提供するため、薬剤を担持することができる。そのため、脂質粒子はドラッグデリバリシステム（ＤＤＳ）に用いられることがある。例えば、脂質粒子に薬物を担持させ、生体の所定の部位まで薬物を輸送することができる。本発明の脂質粒子は医薬用途に特に適しているが、用途は限定されず、食品、化粧品、農業、撮像などの用途に用いてもよい。
【００１３】
本明細書において「リポソーム」とは、脂質分子を含む脂質二重層から形成される脂質小胞体を指し、具体的には、脂質分子の疎水性基と親水性基の極性に基づいて生じる脂質二重層により外界から隔てられた空間を有する小胞体を意味する。リポソームは、単一の脂質二重膜を有する単層リポソーム（ＳＵＶ：Small  Unilameller  Vesicle）であってもよいし、複数の層を有する多重層リポソーム（ＭＬＶ：Multilameller  Vesicle）であってもよい。二重膜は、疎水性の「尾」領域と、親水性の「頭」領域とを有する２つの単層の脂質膜から構成される。膜二重層の構造は、脂質単層の疎水性の（非極性）「尾」が二重層の中心を向き、他方、新水性の「頭」が水相を向くようになっている。
【００１４】
本明細書において「ミセル」とは、疎水性基と親水性基とを有する脂質分子を含み、この脂質分子の疎水性基および親水性基の極性に基づいてその内外にそれぞれ親水的環境および疎水的環境を生じる、粒子状の物質を指す。例えば、水性溶媒中に形成されたミセルでは、脂質分子の疎水性基を内側に、脂質分子の親水性基を外側に位置付けるように脂質分子が配向され得る。
【００１５】
本明細書において脂質粒子が薬物を「担持する」というとき、薬物は脂質粒子の内部および／または表面に保持されている。脂質粒子が薬物を「担持する」場合、薬物の少なくとも一部が、脂質粒子の内部または表面に保持されている。薬物はリポソーム内の水相、リポソーム膜の脂質相、ミセル内の脂質相、脂質粒子の相間の界面、脂質粒子と外部環境との間の界面およびそれらの組合せのいずれの場所に存在していてもよく、脂質粒子表層に静電的相互作用などで固定化された状態で存在していてもよく、脂質粒子のいずれかの相内に一部または全ての部分が含まれている状態であってもよい。
【００１６】
本明細書において「脂質粒子製剤」とは、脂質粒子そのもの、あるいは、脂質粒子を担体とし、これに薬物を担持させたものを指す。脂質粒子製剤は、脂質粒子が脂質粒子外液に分散あるいは懸濁された状態であってもよいし、凍結乾燥されている状態であってもよい。
【００１７】
本明細書において「脂質」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、長鎖脂肪酸あるいは炭化水素鎖などの疎水性の部分を有する物質を指す。例えば、脂質として、ホスファチジルコリン類(大豆レシチン、水添大豆レシチン、卵黄レシチン等)、ホスファチジルセリン類、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルイノシトール類、ホスファスフィンゴミエリン類、ホスファチジン酸類、長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類、ホスファチジルグリセロール類、コレステロール類等、トコフェロール、ステロイド、脂肪酸、およびグリセロールの脂肪酸エステルなどが挙げられる。
【００１８】
本明細書において「両親媒性脂質」とは、疎水性部分および親水性部分の両方を有する脂質を指す。親水性部分は、例えば、リン酸基、カルボン酸基、硫酸基、アミノ基、スルフヒドリル基、ニトロ基、ヒドロキシ基などの極性または電荷を有する基を含む部分であり得る。疎水性部分は、長鎖飽和または不飽和脂肪族炭化水素基、芳香族性基、脂環式または複素環式基などの無極性基を含む部分であり得る。両親媒性脂質の例として、リン脂質、アミノ脂質、スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質、ジアシルグリセロール、およびβ−アシルオキシ酸などが挙げられるがこれに限定されない。リン脂質は、一般的に、分子内に長鎖アルキル基より構成される疎水性基とリン酸基より構成される親水性基とを持つ両親媒性物質である。リン脂質の例として、ホスファチジルコリン（＝レシチン）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、スフィンゴリン脂質、ジホスファチジル系リン脂質、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、パルミトイルステアロイルホスファチジルグリセロール（ＰＳＰＧ）、ジリノレオイルホスファチジルコリン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１９】
本明細書において「アシル（基）」とは、当該分野において通常の意味で使用され、有機酸（カルボン酸；脂肪酸）からヒドロキシル基が除去されてつくられる基をいう。広義には、ホルミル基ＨＣＯ−、アセチル基ＣＨ３ＣＯ−、マロニル基−ＣＯＣＨ２ＣＯ−、ベンゾイル基Ｃ６Ｈ５ＣＯ−、シンナモイル基Ｃ６Ｈ５ＣＨ＝ＣＨＣＯ−、ケトン誘導体なども含まれる。リン脂質に含まれるアシル基は、好ましい実施形態では、脂肪酸を形成することから脂肪酸基とも称される。本明細書では、脂肪酸は、その炭素数と二重結合の数で表すことができ、例えば、アラキドン酸は（２０：４）と表され得る。二重結合の位置をさらに特定する場合は、ｃｉｓやｔｒａｎｓの表示、またはＥまたはＺの表示について、すべての位置を特定するか、またはω３系、ω６系等の系統で表示することができる。
【００２０】
脂質が脂肪酸またはそれに基づくアシル基を含む場合、脂肪酸またはアシル基は、任意の鎖長、任意の二重結合を有することができる。例えば、炭素数について言えば、１以上、代表的には１〜３０、通常は４〜３０の範囲のものが挙げられ、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個等を挙げることができるが、これらに限定されない。また二重結合の個数は０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個等炭素数に応じて許容し得る任意の数を採用することができる。二重結合の位置は、ω−３系、ω−６系、ω−９系等が代表的であり、このほか、ω−５系や、ω−７系なども確認されており、これらの任意の入手可能なものを利用することができる。脂肪酸には三重結合が含まれていてもよく、その個数は０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個等炭素数に応じて許容し得る任意の数を採用することができる。
【００２１】
本明細書において「アニオン性脂質」とは、生理学的ｐＨで負電荷を有する脂質を指す。このような脂質として、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−サクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、および中性脂質と結合したその他のアニオン性修飾基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書において「カチオン性脂質」とは、生理学的ｐＨで正電荷を有する脂質を指す。このような脂質として、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチル塩化アンモニウム（「ＤＯＤＡＣ」）、Ｎ−（２，３−オレイロキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（「ＤＯＴＭＡ」）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチル臭化アンモニウム（「ＤＤＡＢ」）、Ｎ−（２，３−オレオイロキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（「ＤＯＴＡＰ」）、３−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）、およびＮ（１，２−ジミリスチロキシプロプ−３−イル）Ｎ，Ｎ−ジメチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（「ＤＭＲＩＥ」）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
コレステロール類としては、例えばコレステロール、フィトステロール（シトステロール、スチグマステロール、フコステロール、スピナステロール、ブラシカステロール）、ラノステロール、エルゴステロール、これらの脂肪酸エステル等が挙げられる。
【００２４】
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではagentに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）であってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質（抗体等も含む）、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。
【００２５】
一般的に、本発明の組成物、医薬、剤（治療剤、予防剤等）等は、治療有効量の医薬または有効成分、および薬学的に許容しうるキャリアもしくは賦形剤を含む。本明細書において「薬学的に許容しうる」は、動物、そしてより詳細にはヒトにおける使用のため、政府の監督官庁に認可されたか、あるいは薬局方または他の一般的に認められる薬局方に列挙されていることを意味する。
【００２６】
本明細書において「薬物」（ｄｒｕｇ）とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、生物に投与したときに何らかの生理的な作用を及ぼすものを指し、例えば、タンパク質（酵素、抗体などを含む）、ペプチド、核酸（DNA、mRNA、siRNA、miRNA）、ベクター、ウイルス性粒子、プラスミド、毒素、糖類（オリゴ糖および多糖）、高分子化合物、抗がん剤、抗生物質、酵素剤、抗酸化剤、脂質取り込み阻害剤、ホルモン剤、抗炎症剤、ステロイド剤、血管拡張剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、ケミカルメディエーターの遊離阻害剤、血管内皮細胞の増殖促進または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗リウマチ薬、消炎酵素製剤、痛風治療薬、抗ヒスタミン薬、化学伝達物質遊離抑制薬、抗ウイルス剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、一酸化窒素合成阻害剤、AGFs（Advanced  glycation  endproducts）阻害剤、ヘモグロビン、ラジカルスカベンジャー、グリコサミノグリカンおよびその誘導体、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾンなどの副腎皮質ステロイドやその誘導体、アスピリン、インドメタシン、イブプロフェン、メフェナム酸、フェニルブタゾンなどの非ステロイド抗炎症剤、ヘパリン、低分子ヘパリンなどのメザンギウム細胞増殖阻害剤、シクロスポリンなどの免疫抑制剤、カプトプリルなどのACE（angiotensin  converting  enzyme）阻害剤、メチルグアニジンなどのAGE（advanced  glycation  endoproduct）阻害剤、バイグリカン、デコリンなどのTGF-β拮抗薬、PKC（protein  kinase  C）阻害剤、PGE1やPGI2などプロスタグランジン製剤、パパベリン系薬、ニコチン酸系薬、トコフェロ−ル系薬、およびCa拮抗薬などの末梢血管拡張薬、フォスホジエステラ−ゼ阻害剤、チクロピジン、アスピリンなどの抗血栓薬、ワ−ファリン、ヘパリン、抗トロンビン剤などの抗凝固剤、ウロキナ−ゼなどの血栓溶解薬、ケミカルメディエーター遊離抑制剤、抗生物質、抗酸化剤、酵素剤、脂質取込抑制剤、ホルモン剤、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ＳＯＤなどのラジカルスキャベンジャ−、メサンギウム細胞の増殖抑制作用を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。
【００２７】
本明細書において「粒径」または「粒子径」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられる通り、粒子の大きさを表すために使用される尺度であり、粒子を完全な球体と仮定した場合に、その直径に相当する便宜的な値である。脂質粒子の粒径は、当該技術分野で公知のいずれの方法によって測定してもよいが、例えば、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いた凍結割断法、およびＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ等の動的光散乱を利用する方法で測定してもよい。本明細書において「平均粒子径」とは、数平均粒径またはＺ−平均粒子径のいずれを指す場合にも使用され得るが、特に断らなければ、測定した粒子径から算出されるＺ−平均粒子径を指す。本明細書において「粒径分布」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、粒子の大きさの広がりを指す。粒径分布を表す尺度として多分散指数（ＰＤＩ）が使用される。
【００２８】
本明細書において「アルコール」とは、ヒドロキシ官能基（−ＯＨ）が飽和炭素原子に結合している任意の有機化合物を指す。アルコールは、一価であってもよいし、それより多くの価数であってもよい。アルコールは、１〜２０個の炭素原子を含む炭素鎖を有してもよく、この炭素鎖は環および／または二重結合を含んでいてもよく、この炭素鎖は直鎖状であっても分岐状であってもよい。アルコールとして、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、１−プロパノール、ブチルアルコールおよびペンタノールが挙げられる。
【００２９】
本明細書において「中空糸膜」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、管の壁に多数の孔を有する微小細管を指し、これを使用して透析を行うことができる。
【００３０】
本明細書中において「膜濾過」とは、透析膜を使用して液体流を分離するための機械的分離方法を指す。膜濾過として、逆浸透（ＲＯ）、ナノ濾過（ＮＦ）、限外濾過（ＵＦ）、および精密濾過（ＭＦ）が挙げられる。
【００３１】
本明細書において「流速」とは、溶液が管内を流れる速さを指し、本明細書では、（距離）／（時間）または（体積）／（時間）のいずれの次元で表されてもよい量である。
【００３２】
本明細書において「保持時間」とは、溶液がある領域から別の領域まで移動するのにかかる時間を指す。例えば、領域Ａが領域Ｂと送液管Ｃを介して連結されている場合、領域Ａから領域Ｂまでの保持時間は、（送液管の長さ）／（流速［ｃｍ／分］）で計算することができる。
【００３３】
本明細書において、「測定」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、ある対象について、量がどれほどか測って求めることをいう。本明細書において「検出」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、物質や成分等を検査して見つけだすことをいい、「同定」とは、ある対象について、そのものにかかわる既存の分類のなかからそれの帰属先をさがす行為をいい、化学分野において使用される場合、対象となる物質の化学物質としての同一性を決定する（例えば、化学構造を決定する）ことをいい、「定量」とは、対象となる物質の存在する量を決定することをいう。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、体液試料中の分析物の「量」は、一般には、試料の体積中で検出し得る分析物の質量を反映する絶対値を指す。しかし、量は、別の分析物量と比較した相対量も企図する。例えば、試料中の分析物の量は、試料中に通常存在する分析物の対照レベルまたは正常レベルより大きい量であってもよい。
【００３５】
用語「約」は、イオンの質量の測定を含まない定量的測定に関連して本明細書で使用されるとき、示された値プラスまたはマイナス１０％を指す。なお、「約」と明示的に示されない場合でも「約」があると同義で解釈されうる。質量分析機器は、所与の分析物の質量の決定においてわずかに異なり得る。イオンの質量またはイオンの質量／電荷比との関連において用語「約」は、＋／−０．５原子質量単位を指す。
【００３６】
（好ましい実施形態）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本発明の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
【００３７】
（脂質粒子作製方法）
１つの局面において、本発明は、所望の粒径を有する脂質粒子（例えば、リポソーム、ミセル）を製造する方法を提供する。この方法は、Ａ）第１の混合領域内で、脂質およびアルコールを含む第１の溶液と、水を含む第２の溶液とを混合して一次希釈溶液を調製する工程；Ｂ）該一次希釈溶液を、送液管を通して該第１の混合領域から第２の混合領域へと所定の時間で送液する工程；およびＣ）該第２の混合領域内で、該一次希釈溶液と、水を含む第３の溶液とを混合して二次希釈溶液を調製する工程を包含し、ここで、脂質粒子の粒径は、該一次希釈溶液中の該アルコールの濃度、該脂質の濃度、該所定の時間、および該混合時の温度からなる群より選択される少なくとも１つの条件を調整することによって制御される。１つの実施形態では、（Ｃ）の工程の後に、さらなる粒径制御処理が実施されない。１つの実施形態では、（Ｃ）の工程の後に、二次希釈溶液を、送液管を通して第２の混合領域から第３の混合領域へと所定の時間で送液する工程；および第３の混合領域内で、二次希釈溶液と、水を含む第４の溶液（第１、第２および第３の溶液のいずれかと同様に定義され得る）とを混合して三次希釈溶液を調製する工程がさらに実施されてもよい。１つの実施形態では、脂質およびアルコールを含む溶液の調製において、脂質（および／または薬物）をアルコールに溶解する工程が含まれ得る。溶解の際には加温してもよい。
【００３８】
一次希釈溶液中のアルコールの濃度、脂質の濃度、送液の所定の時間、および混合時の温度の少なくとも１つを調整することで、脂質粒子（例えば、リポソーム、ミセル）の粒径を調節できることが本発明で一つの重要な点である。特に、理論に束縛されることを望まないが、アルコールの濃度を段階的に調節することで、脂質粒子（例えば、リポソーム、ミセル）の粒径を微細に調節することができる点は本発明において一つの重要な点である。また、アルコールの濃度を段階的に調節し、その上で、送液の所定の時間することで、所望の粒径を有する脂質粒子（例えば、リポソーム、ミセル）を製造できること、およびその際、その粒径の粒度分布が製薬レベルとしても通用する程度に狭いものであることが達成され得ることもまた、本発明において重要な点の一つである。さらに、混合時の温度を調節することで、脂質粒子（例えば、リポソーム、ミセル）の粒径をさらに詳細に調整することができる。
【００３９】
１つの実施形態では、本発明は、薬物を担持し、所望の粒径を有する脂質粒子（例えば、リポソーム、ミセル）を製造する方法を提供し、ここで、該方法は、薬物、脂質およびアルコールを含む溶液を希釈してアルコールの濃度を変化させた場合に形成される脂質粒子の粒径を測定する工程と、該アルコールの濃度が一定の条件下における該薬物を含む脂質粒子の粒径の経時的変化を測定する工程と、をさらに含み、このように得られた情報に基づいて、該所望の粒径を得るための、該一次希釈溶液中の該アルコールの濃度、該脂質の濃度、該所定の時間、および該混合時の温度からなる群より選択される、前記所望の粒径を調整するのに必要な少なくとも１つの条件が決定される。このような条件で測定された該一次希釈溶液中の該アルコールの濃度、該脂質の濃度、該所定の時間、および該混合時の温度からなる群より選択される少なくとも１つの条件は、以降、所望の粒径の脂質粒子（例えば、リポソーム、ミセル）を製造するために用いることができる。
【００４０】
第１の溶液に含まれる脂質は、任意の脂質の組み合わせであり得、それぞれの脂質成分の比率は任意に設定され得る。１つの実施形態では、脂質は、薬物を脂質粒子（例えば、リポソーム、ミセル）の内部に担持するように選択される。１つの実施形態では、脂質は、薬物を脂質粒子（例えば、リポソーム、ミセル）の表面に担持するように選択される。１つの実施形態では、脂質は、薬物をリポソームの脂質二重膜上に担持するように選択される。１つの実施形態では、第１の溶液に含まれる脂質は、生体内温度（３５〜３７℃）より高い相転移温度を有する。このような脂質を用いることにより、保存時に、または、血液などの生体環境中で、脂質粒子（例えば、リポソーム、ミセル）に担持された薬物が脂質粒子から外部へ漏出されにくくなり得る。
【００４１】
１つの実施形態では、第１の溶液に含まれるアルコールは、１〜６個の炭素原子を含む一価または二価のアルコールを含む。あるいは、第１の溶液に含まれるアルコールは、一価または二価のアルコールを含む。別の実施形態では、第１の溶液に含まれるアルコールは、一価のアルコールを含む。特定の実施形態では、第１の溶液に含まれるアルコールは、１〜３個の炭素原子を含む一価のアルコールを含む。具体的な実施形態では、第１の溶液に含まれるアルコールは、メタノール、エタノールまたはイソプロピルアルコール、あるいはそれらの組合せを含む。
【００４２】
１つの実施形態では、第２の溶液および／または第３の溶液は、第１の溶液に含まれるアルコールを第１の溶液より低濃度で含んでもよい。
【００４３】
第１の溶液、第２の溶液および第３の溶液を含め、本発明の脂質粒子製造法において使用する溶液には、水およびアルコール以外の溶媒が含まれていてもよい。このような溶媒の例として、例えば、エーテル類、エステル類、ケトン類、アセタール類、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどの水と混和性の溶媒、ならびにヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロホルム、酢酸エチル、塩化メチレンなどの水と非混和性の溶媒が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
１つの実施形態では、第１の溶液、第２の溶液および第３の溶液のうちのいずれかは、脂質粒子に担持させる目的の薬物を含む。１つの実施形態では、第１の溶液および第２の溶液のうちのいずれかは、脂質粒子に担持させる目的の薬物を含む。１つの実施形態では、第１の溶液、第２の溶液および第３の溶液のいずれでもない溶液が、脂質粒子に担持させる目的の薬物を含んでいてもよい。目的の薬物は、任意の薬物であり得る。目的の薬物は、治療目的の薬物でなくてもよく、例えば、殺虫剤、除草剤、美容用薬剤、香料、食品添加物、着香料、撮像剤、染料、蛍光マーカー、発毛剤、保湿剤、色素類、美白剤、顔料、Ｘ線造影剤、超音波診断薬、放射性同位元素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬などであってもよい。
【００４５】
第１の溶液、第２の溶液および第３の溶液を含め、本発明の脂質粒子製造法において使用される任意の溶液には、必要に応じて、浸透圧調整剤、安定化剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤などの添加剤が含まれていてもよい。
【００４６】
浸透圧調整剤としては、特に限定されないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムのような無機塩類、グリセロール、マンニトール、ソルビトールのようなポリオール類、グルコース、フルクトース、ラクトース、またはスクロースのような糖類が挙げられる。
【００４７】
安定化剤としては、特に限定されないが、例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、またはスクロースのような糖類、コレステロールなどのステロールが挙げられる。
【００４８】
酸化防止剤としては、特に限定されないが、例えば、アスコルビン酸、尿酸、トコフェロール同族体（例えば、ビタミンＥ）が挙げられる。なお、トコフェロールには、α、β、γ、δの４個の異性体が存在するが本発明においてはいずれも使用できる。
【００４９】
ｐＨ調整剤としては、任意の塩基性または酸性化合物、例えば、水酸化ナトリウム、クエン酸、酢酸、トリエタノールアミン、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどが挙げられる。
【００５０】
その他の添加剤の例として、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＰＢＳ、生体内分解性ポリマー、無血清培地、医薬添加物として許容される界面活性剤、生理的ｐＨの緩衝液などが挙げられる。
【００５１】
発明者らは、一次希釈溶液中のアルコール濃度（重量％）が特定の値（本明細書において「流動性変動点」とも呼ぶ）以上に調整されている場合、脂質粒子の粒径は経時的に変化する状態になり、逆に流動性変動点未満のアルコール濃度では脂質粒子の粒径がほとんど変化しないことを見出した。１つの実施形態では、流動性変動点は、脂質粒子の組成、温度および圧力によって変動し得る。１つの実施形態では、流動性変動点は、一次希釈溶液中のアルコールの種類によって変動し得る。１つの実施形態では、流動性変動点は、脂質粒子の組成、温度および圧力によって変動し得る。１つの実施形態では、流動性変動点は、一次希釈溶液中のアルコールの種類が同じであれば、脂質粒子の組成および／または脂質粒子に担持させる薬物の有無で変動しない。なお、本明細書で開示されたこれらおよび他の箇所で記載された条件は、脂質粒子であれば、リポソーム、ミセルの両方に適用可能でありうる。
【００５２】
１つの実施形態では、一次希釈溶液中のアルコール濃度は、約１０〜約５０重量％であり得、例えば、約１０重量％、約１５重量％、約１８重量％、約２０重量％、約２５重量％、約３０重量％、約３５重量％、約４０重量％、約４５重量％または約５０重量％であり得る。
【００５３】
１つの実施形態では、二次希釈溶液中のアルコール濃度は、流動性変動点未満以下または流動性変動点未満であり、そのような濃度に調整することで一次希釈溶液中で制御された脂質粒子の粒径分布が変化しないように固定される。１つの実施形態では、アルコールがエタノールである場合の流動性変動点は、約１８重量であり得る。１つの実施形態では、二次希釈溶液中のアルコール濃度は、約０〜約３０重量％であり得、例えば、約０重量％、約５重量％以下、約１０重量％以下、約１５重量％以下、約１８重量％以下、約２０重量％以下、約２５重量％以下または約３０重量％以下であり得る。二次希釈溶液は、追加の溶液と混合してさらに希釈してもよい。
【００５４】
脂質粒子の粒子径を制御するためには、一次希釈溶液中のアルコール濃度範囲および二次希釈溶液中のアルコール濃度範囲の特定の組み合わせを使用することが好ましく、例えば、このような組み合わせは、一次希釈溶液中のアルコール濃度約１０〜約５０重量％および二次希釈溶液中のアルコール濃度約０〜約３０重量％、一次希釈溶液中のアルコール濃度約１５〜約５０重量％および二次希釈溶液中のアルコール濃度約０〜約２５重量％、一次希釈溶液中のアルコール濃度約２０〜約５０重量％および二次希釈溶液中のアルコール濃度約０〜約２０重量％などである。また、第１の溶液に含まれる溶媒の種類に応じてこの範囲は変動する可能性があり、例えば、第１の溶液がエタノールを含む場合、一次希釈溶液中のエタノール濃度約１０〜約５０重量％および二次希釈溶液中のエタノール濃度約０〜約２５重量％、好ましくは一次希釈溶液中のエタノール濃度約１５〜約５０重量％および二次希釈溶液中のエタノール濃度約０〜約２０重量％、より好ましくは一次希釈溶液中のエタノール濃度約２０〜約５０重量％および二次希釈溶液中のエタノール濃度約０〜約１８重量％の組み合わせであり得る。１つの実施形態では、一次希釈溶液中のアルコール濃度はリポソーム膜が十分に安定化しない範囲が好ましく、二次希釈溶液中のアルコール濃度はリポソーム膜を安定化する範囲が好ましい。
【００５５】
１つの実施形態では、溶液は、混合領域において乱流を生じさせることで混合される。１つの実施形態では、溶液は、混合領域において混合要素（例えば、ミキサー）によって混合される。
【００５６】
１つの実施形態では、一次希釈溶液が第１の混合領域から第２の混合領域に到達するまでの所定の時間（保持時間）（ある場合には、二次希釈溶液が第２の混合領域から第３の混合領域に到達するまでの所定の時間）を調整することでリポソームの粒子径が制御され得る。１つの実施形態では、この所定の時間（保持時間）は、約０．１〜約６０分であり得、例えば、約０．１分、約０．２分、約０．５分、約１分、約２分、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約４５分または約６０分であり得るが、それ以上であってもよい。一次希釈溶液が第１の混合領域から第２の混合領域に送液されるまでの間に追加の溶液と混合されてもよい。一次希釈溶液中で脂質粒子またはその膜が不安定化し、相転移温度以上の加温で脂質の流動性が高まるため、ブラウン運動等により互いに接触した際に融合を起こす頻度が高まる。そのため、時間経過とともに生成した脂質粒子同士の融合が均一に進み、一定の粒度分布を維持したまま粒子径が大きくなると考えられる。二次希釈溶液が第２の混合領域から第３の混合領域に到達するまでの所定の時間の制御も同様である。
【００５７】
１つの実施形態では、一次希釈溶液が第１の混合領域から第２の混合領域に到達するまでに送液管内に保持される所定の時間（ある場合には、二次希釈溶液が第２の混合領域から第３の混合領域に到達するまに送液管内に保持される時間）は、混合領域間の流路の長さおよび流速の少なくとも１つによって制御される。１つの実施形態では、一次希釈溶液が第１の混合領域から第２の混合領域に到達するまでに送液管内に保持される時間は、第１の混合領域と第２の混合領域との間の流速によって制御される。１つの実施形態では、一次希釈溶液が第１の混合領域から第２の混合領域に到達するまでに送液管内に保持される所定の時間は、第１の混合領域と第２の混合領域との間の流路の長さによって制御される。１つの実施形態では、第１の混合領域から第２の混合領域までの流路の長さは、例えば、０．１〜５００ｍ、１〜１００ｍまたは５〜５０ｍの範囲であり得、例えば、０．１ｍ、０．５ｍ、１ｍ、５ｍ、１０ｍ、２０ｍ、３０ｍ、４０ｍ、５０ｍ、７０ｍ、１００ｍ、１５０ｍ、２００ｍ、５００ｍなどであり得る。１つの実施形態では、第１の混合領域と第２の混合領域との間の流速は、例えば、０．１〜５００ｍ／分、１〜１００ｍ／分または５〜５０ｍ／分の範囲であり得、例えば、０．１ｍ／分、０．２ｍ／分、０．５ｍ／分、１ｍ／分、５ｍ／分、１０ｍ／分、２０ｍ／分、３０ｍ／分、４０ｍ／分、５０ｍ／分、７０ｍ／分、１００ｍ／分、１５０ｍ／分、２００ｍ／分、５００ｍ／分などであり得、０．１〜５００ｍＬ／分、１〜１００ｍＬ／分または５〜５０ｍＬ／分の範囲であり得、例えば、０．１ｍＬ／分、０．２ｍＬ／分、０．５ｍＬ／分、１ｍＬ／分、５ｍＬ／分、１０ｍＬ／分、２０ｍＬ／分、３０ｍＬ／分、４０ｍＬ／分、５０ｍＬ／分、７０ｍＬ／分、１００ｍＬ／分、１５０ｍＬ／分、２００ｍＬ／分、５００ｍＬ／分などであり得る。一次希釈溶液が第１の混合領域から第２の混合領域に到達するまでに送液管内に保持される所定の時間（保持時間）が一定に保たれる場合、流路の長さおよび流速の個々の要素が脂質粒子の粒子径に与える影響は少ない。そのため、使用する保持時間が決定されたときには、脂質粒子製造装置の各部位における溶液間の混合割合、圧力およびレイノルズ数などのその他の要素を考慮して適当な流路の長さおよび流速の組み合わせを選択することができる。二次希釈溶液が第２の混合領域から第３の混合領域に到達するまでの所定の時間の制御も同様である。
【００５８】
１つの実施形態では、希釈溶液は、混合領域間の送液管中を層流状態で流れる。１つの実施形態では、混合領域間の送液管中を流れる希釈溶液におけるレイノルズ数（Ｎre）を調整することで脂質粒子の粒子径が制御され得る。１つの実施形態では、混合領域間の送液管中を流れる一次希釈溶液におけるレイノルズ数（Ｎre）は、２０００未満、１０００未満、５００未満、３００未満、２００未満、１００未満、５０未満であり得る。
【００５９】
１つの実施形態では、本発明の脂質粒子製造法の各工程において温度を制御することで脂質粒子の粒子径が制御され得る。１つの実施形態では、脂質が溶解状態を維持する温度が使用され得る。１つの実施形態では、第１の混合領域内および／または送液管内の温度を、３０℃以上９５℃以下、より好ましくは５０℃以上９０℃以下、さらに好ましくは７０℃以上８５℃以下の範囲に維持するように温度が調整される。１つの実施形態では、第１の混合領域内の温度を、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、１００℃などに維持するように温度が調整される。１つの実施形態では、第１の混合領域内および／または送液管内の温度は、一次希釈液中の脂質と脂質粒子に担持させる目的の薬物とが完全に溶解する温度以上の範囲に維持するように調整され、そのように温度が調整される場合、温度は、厳密に管理しなくても、例えば、標的温度の±５℃の範囲内等で保てばよい。１つの実施形態では、２次希釈溶液および／またはそれ以降の工程における溶液が、例えば０℃以上５０℃以下、より好ましくは５℃以上３０℃以下、さらに好ましくは１５℃以上２５℃以下の範囲を維持するように温度が調整される。溶液の温度は、熱媒体を使用して調整することができる。熱媒体は任意の物質であってよく、液体（例えば水）であってもよいし、気体であってもよいし、固体（例えば、アルミブロック）であってもよい。
【００６０】
１つの実施形態では、一次希釈溶液に含まれる脂質濃度を調整することで脂質粒子の粒子径が制御され得る。脂質濃度が増加するほど、脂質粒子の粒径が増加し得る。１つの実施形態では、一次希釈溶液に含まれる脂質濃度は、０．５〜１０００ｍｇ／ｍＬ、５〜５００ｍｇ／ｍＬまたは１０〜２００ｍｇ／ｍＬの範囲であり得、例えば、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、５００ｍｇ／ｍＬ、７００ｍｇ／ｍＬ、１０００ｍｇ／ｍＬなどであり得るが、使用する脂質の組成によって適切な濃度は変動し得る。脂質濃度が高くなるほど、単位体積当たりに生成される脂質粒子数が増大し、ブラウン運動等により脂質粒子同士の接触の機会が増加するため、脂質粒子同士の融合が加速され粒子径が大きくなり得る。
【００６１】
１つの実施形態では、本発明の脂質粒子製造法の各工程において圧力を制御することで脂質粒子の粒子径が制御され得る。１つの実施形態では、圧力は背圧によって制御される。１つの実施形態では、第１の混合領域（ある場合には、第２の混合領域）内および／または送液管内の圧力は、０．０１〜１００ＭＰａ、０．１〜２０ＭＰａまたは１〜１０ＭＰａの範囲であり得、例えば、０．０１ＭＰａ、０．０５ＭＰａ、０．１ＭＰａ、０．５ＭＰａ、１ＭＰａ、５ＭＰａ、１０ＭＰａ、５０ＭＰａ、１００ＭＰなどであり得る。１つの実施形態では、混合領域間の配管中の圧力は、０．５ＭＰａ以上、０．８ＭＰａ以上、１ＭＰａ以上、１．５ＭＰａ以上、２ＭＰａ以上、３ＭＰａ以上、４ＭＰａ以上、５ＭＰａ以上、８ＭＰａ以上または１０ＭＰａ以上であり得る。ある値以上の圧力をかけることで、脂質粒子の粒径分布（ＰＤＩ）が狭い範囲に維持され得る。
【００６２】
１つの実施形態では、本発明の脂質粒子製造法は、脂質粒子を作製した後に溶液の組成を調整する工程を含む。１つの実施形態では、本発明の脂質粒子製造法は、脂質粒子を作製した後に脂質粒子濃度を調整する工程を含む。溶液の組成を調整する工程と、リポソーム濃度を調整する工程とは、同時に実施されてもよいし、別々に実施されてもよい。例えば、国際公開第２０１６／０２４５１０号に開示されるように中空糸膜カラムを使用することで溶液の組成を調整する工程および脂質粒子濃度を調整する工程を同時に実施することができる。作製された脂質粒子を含む溶液中の脂質粒子濃度および溶液組成を調整する手段として、限外濾過および透析などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６３】
１つの実施形態では、本発明の脂質粒子製造法は連続的に実施される。１つの実施形態では、本発明の脂質粒子製造法は無菌環境で実施される。１つの実施形態では、本発明の脂質粒子製造法は閉鎖系で実施される。閉鎖系でも、所望の粒径の脂質粒子を製造することができる点は本発明の1つの有利な点であり、さらに粒径分布も所望の範囲に
収めることができる点も１つの有利な点である。
【００６４】
１つの実施形態では、本発明の方法で製造された脂質粒子の平均粒子径は、１０〜１０００ｎｍであり得、例えば、１０ｎｍ〜５００ｎｍであり得、具体的には、２０ｎｍ〜３００ｎｍであり得、より具体的には３０ｎｍ〜２００ｎｍであり得る。１つの実施形態では、本発明の方法で製造されたリポソームの平均粒子径は、少なくとも１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍまたは２５０ｎｍかつ最大１０００ｎｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２５０ｎｍまたは２００ｎｍであり得、例えば、２０ｎｍ〜１０００ｎｍ、３０ｎｍ〜７００ｎｍ、４０ｎｍ〜１０００ｎｍ、４０ｎｍ〜７００ｎｍ、４０ｎｍ〜５００ｎｍ、４０ｎｍ〜４００ｎｍ、２０ｎｍ〜３００ｎｍ、３０ｎｍ〜３００ｎｍ、５０ｎｍ〜２５０ｎｍ、６０ｎｍ〜２００ｎｍまたは１００ｎｍ〜２００ｎｍであり得、代表的には、４０ｎｍ〜３００ｎｍであり得る。１つの実施形態では、本発明の方法で製造されたミセルの平均粒子径は、少なくとも５ｎｍ、７ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍまたは１００ｎｍかつ最大５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１２０ｎｍ、１００ｎｍ、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍまたは５０ｎｍであり得、例えば、５ｎｍ〜５００ｎｍ、７ｎｍ〜３００ｎｍ、１０ｎｍ〜１５０ｎｍ、１５ｎｍ〜１００ｎｍ、１５ｎｍ〜３００ｎｍ、１５ｎｍ〜１５０ｎｍ、５ｎｍ〜９０ｎｍ、１０ｎｍ〜９０ｎｍ、２０ｎｍ〜８０ｎｍまたは３０ｎｍ〜７０ｎｍであり得、代表的には、１５ｎｍ〜９０ｎｍであり得る。脂質粒子の粒子径が１０〜１０００ｎｍ程度であれば体内の多くの血管を通過できるサイズであるため血管からの全身投与が可能となり、全身の各種組織へ移行できるといった効果が発揮され得る。
【００６５】
１つの実施形態では、本発明の方法で製造された脂質粒子の平均粒子径と、所望の粒子径との間の誤差は、±５０ｎｍ以内、±４０ｎｍ以内、±３０ｎｍ以内、±２０ｎｍ以内、±１０ｎｍ以内、±５ｎｍ以内、±４ｎｍ以内、±３ｎｍ以内、±２ｎｍ以内、±１ｎｍ以内、±０．７ｎｍ以内、±０．５ｎｍ以内、±０．２ｎｍ以内、±０．１ｎｍ以内であり得る。本発明の方法によれば、高い精度で脂質粒子の平均粒子径が制御され得る。
【００６６】
１つの実施形態では、本発明の方法で製造された脂質粒子の粒径分布は、多分散指数で０．５未満であり得、例えば、０．２未満であり得、具体的には、０．１未満であり得、より具体的には０．０５未満であり得、さらには０．０１未満であり得る。
【００６７】
１つの実施形態では、脂質粒子の表面は、修飾剤で修飾されていてもよい。修飾剤として、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタアクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアスパルトアミド、合成ポリアミノ酸およびこれらの誘導体などが挙げられるがこれらに限定されない。脂質粒子は、ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体で修飾されることで、血中に長時間滞留し易くなり得る。また、特定の組織と親和性である標的化分子（例えば、抗体）で脂質粒子を修飾することにより、脂質粒子が標的組織に到達され易くなり得る。
【００６８】
本発明の方法によって作製されたリポソームは任意の用途に使用することができ、例えば、医薬用途、食品、化粧品、農業、撮像などの用途に用いることができる。
【００６９】
（システム）
本発明は、また、所望の粒径を有する脂質粒子（例えば、リポソーム、ミセル）を製造するためのシステムを提供する。システムは、上記の脂質粒子製造方法を実施するための任意の適切な手段を備えることができる。
【００７０】
一つの局面において、本発明は、所望の粒径を有する脂質粒子を製造するシステムであって、該システムは、（Ａ）脂質およびアルコールを含む第１の溶液と、水を含む第２の溶液とを混合して一次希釈溶液を調製する第１の混合領域と、（Ｂ）該一次希釈溶液と、水を含む第３の溶液とを混合して二次希釈溶液を調製する第２の混合領域と、（Ｃ）該一次希釈溶液を、該第１の混合領域から該第２の混合領域へと所定の時間で送液する送液管と、を含み、脂質粒子の粒径が、該一次希釈溶液中の該アルコールの濃度、該脂質の濃度および該混合時の温度を調整することによって制御される、システムを提供する。１つの実施形態では、システムは、水を含む第４の溶液（第１、第２および第３の溶液のいずれかと同様に定義され得る）とを混合して三次希釈溶液を調製する第３の混合領域と、二次希釈溶液を第２の混合領域から第３の混合領域へと所定の時間で送液する送液管とを含んでもよく、脂質粒子の粒径は、さらに、二次希釈溶液中のアルコールの濃度、脂質の濃度および混合時の温度を調整することによって制御されてもよい。
【００７１】
一つの局面において、システムは、薬物、脂質およびアルコールを含む溶液を希釈してアルコールの濃度を変化させた場合に形成される脂質粒子の粒径を測定する工程と、アルコールの濃度が一定の条件下における薬物を担持する脂質粒子の粒径の経時的変化を測定する工程と、を行う制御部をさらに含み、制御部は、これらの工程により得られた情報に基づいて、一次希釈溶液中のアルコールの濃度、および所定の時間を決定する。
【００７２】
本発明のシステムにおいて、送液のために任意の管を使用することができるが、管の材料は、例えば、断熱性（熱伝導率）、耐熱性、耐薬品性、または密閉性等を考慮して決定することができる。送液管の材料として、例えば、熱可塑性プラスチック（例えば、可塑剤を含むポリ塩化ビニル）、熱可塑性プラスチックエラストマー（例えば、可塑剤を含まないポリ塩化ビニル、スチレン−エチレン−ブチレンとシリコーンオイルとの共重合体、又はＵＳＰ石油を含むポリプロピレン系プラスチック）、熱硬化性ゴム（例えば、非結晶シリカを含むシロキサンポリマー）、又は熱凝固性フッ素ゴムが挙げられるが、これらに限定されない。送液管として、例えば、サンゴバン株式会社製「ファーメッドＢＰＴ」および「ファーマピュア」等を使用することができる。送液管は、任意の内径を有してよく、例えば約０．８ｍｍであり得る。
【００７３】
本発明のシステムの混合領域はミキサーを備えてもよい。ミキサーは、溶液の組成、流速および圧力などの要因を考慮して適切なものが選択され得るが、例えば、圧力の関係から低流速を使用する場合、低流速でも混合効率が高いマイクロ流路を利用したミキサー（Deneb  Helix型）およびマイクロスワールミキサーなどを利用することができる。
【００７４】
本発明のシステムにおいて、各溶液を収容するために任意の容器を使用することができるが、容器の材質は、断熱性（熱伝導率）、耐熱性、耐薬品性、及び密閉性等を考慮して決定することができる。一つの実施形態において、容器は開閉式の蓋を有する。一つの実施形態において、容器は密閉可能な容器である。一つの実施形態において、容器は密閉状態を維持したまま本発明のシステムに接続され得る。
【００７５】
本発明のシステムにおいて、任意の箇所にポンプ（流速可変部）を取り付けることができる。ポンプは、例えばシリンジポンプ、プランジャポンプ、ピストンポンプ、又はローラーポンプであり得る。ポンプによって、流速および圧力などが調整され得る。
【００７６】
本発明の脂質粒子製造システムは、図３Ａに示すような制御ユニット３０を有し得る。制御ユニット３０は、制御部３１と、検出部３２とを有する。制御部３１と検出部３２とは相互に通信可能に接続されている。ハードウェア（例えば、専用回路）だけで上記制御を実行可能にしてもよいし、ＣＰＵにプログラムを実行させることで上記制御を実行してもよい。
【００７７】
一つの局面において、本発明の脂質粒子製造システムは、図３Ｂに示すような制御ユニット３０を有し得る。制御ユニット３０は、制御部３１と、検出部３２と、記録部３３と、計算部３４とを有する。制御部３１、検出部３２、記録部３３および計算部３４は相互に通信可能に接続されている。ハードウェア（例えば、専用回路）だけで上記制御を実行可能にしてもよいし、ＣＰＵにプログラムを実行させることで上記制御を実行してもよい。
【００７８】
粒子径検出器４５ａは、薬物、脂質およびアルコールを含む溶液を希釈してアルコールの濃度を所定の値とする種々の条件（条件Ａ１、条件Ａ２など）について、作製される脂質粒子の粒子径を検出する。粒子径検出器４５ｂは、アルコールの濃度を一定の濃度に希釈した後に保持時間を所定の値だけ経過させる種々の条件（条件Ｂ１、条件Ｂ２など）について、作製される脂質粒子の粒子径を検出する。粒子径検出器４５ａおよび粒子径検出器４５ｂは同一のものを使用してもよいし、異なるものを使用してもよい。
【００７９】
粒子径検出器４５ａおよび粒子径検出器４５ｂで取得されたデータは、検出部３２に送信され、記録部３３に蓄積される。計算部３４は、記録部３３に蓄積された情報（必要に応じて入力部４１からの入力と合わせて）に基づいて、所望の粒径の脂質粒子の作製に適した希釈溶液中のアルコールの濃度、および希釈溶液が混合領域から次の混合領域に到達するまでの所定の時間（保持時間）を算出する。
【００８０】
制御部３１は、ＣＰＵ（Central  Processing  Unit）と、ＲＯＭ（Read  Only  Memory）と、ＲＡＭ（Random  Access  Memory）と、脂質粒子製造装置に含まれる各種アクチュエータの駆動回路とから構成される。ＲＯＭ５２には、ＢＩＯＳ（Basic  Input/Output  System）、ＯＳ（Operating  System）、各種ドライバー、及び各種アプリケーションなど、各種プログラムが格納されている。検出部３２は、脂質粒子製造装置に含まれる各種センサ（例えば、温度センサ、圧力センサおよび粒子径検出器）の検出回路から構成される。
【００８１】
制御ユニット３０は、入力部４１と、表示部４２と、記憶部４３と、インターフェイス４４とそれぞれ通信可能に接続されている。インターフェイス４４は、制御ユニット３０と外部の装置との間でのデータの送受信を可能にする。制御ユニット３０は、インターフェイス４４を介して、例えば汎用コンピューター（いわゆるパーソナルコンピューター）に接続される。
【００８２】
入力部４１は、ユーザーからの入力を受け付ける。入力部４１は、例えばキーボード、マウス、又はタッチパネルから構成される。表示部４２は、例えばＬＣＤ（Liquid  Crystal  Display）又はＥＬＤ（Electro  Luminescence  Display）のようなディスプレーから構成される。なお、入力部４１及び表示部４２がタッチパネルから構成される場合には、入力部４１と表示部４２とは一体化していることになる。
【００８３】
記憶部４３は、例えばハードディスクのような不揮発性メモリーから構成される。記憶部４３には、各種制御に係るプログラム及びデータ（例えば、入力部４１から制御ユニット３０に入力されたデータ）等が格納される。
制御部３１は、計算部３４から出力された情報に基づいて、送液管、ポンプ３ａ、３ｂおよび３ｃを制御する。
【００８４】
制御部３１は、入力部４１から制御ユニット３０に入力されたデータ、検出部３２に入力された温度センサおよび圧力センサの各出力信号、および計算部３４から出力された情報の少なくとも１つに基づいて、恒温槽、送液管、ポンプ３ａ、３ｂおよび３ｃのうちの少なくとも１つを制御する。送液管は、例えば、流路を切り替えるなどしてその長さが制御され得る。
【００８５】
本発明のシステムにおいて、流速を変更とする任意の流速可変部を使用することができる。一つの実施形態では、流速可変部は、図８に示すような流路面積可変装置１６ｂ（例えば、絞り部）であり、ここで、流路幅Ｄ１６（ひいては、流路面積）は変更可能であり得る。流路幅Ｄ１６（流路面積）を変更する場合には、例えば流路の側壁を内側又は外側に変位させる。例えば流路幅Ｄ１６（ひいては、流路面積）を小さくすることで、流速可変部を通過した後の流速を小さくすることができる。一つの実施形態では、制御ユニット３０により流路面積可変装置１６ｂ（例えば、流路幅Ｄ１６）が制御される。
【００８６】
本発明の脂質粒子製造システムは、さらに、溶液中の脂質粒子濃度を調整する装置および／または溶媒を置換する装置と接続することができる。そのような装置として、例えば、国際公開第２０１６／０２４５１０号に記載されるような透析装置を使用することができる。これらの装置を接続することで、脂質粒子の製造、濃度調整および溶媒置換を１つの閉鎖系で行い、最終的な製品とすることが可能であり、容易に無菌を達成できる。脂質粒子製造システムは、溶液中の脂質粒子濃度を調整する装置および／または溶媒を置換する装置と直接的に管によって接続してもよいし、間に溶液を貯蔵する容器等の管以外の構成要素を設けて間接的に接続してもよい。
【００８７】
図４は、透析装置における中空糸膜カラム２０の一例（ダイアライザー）を示す。中空糸透析カラム２０は、ハウジング内に多数の中空糸膜２０１ａの集合体を有する。中空糸膜２０１ａ（詳しくは、糸の側面）には、多数の孔２０１ｂが形成されている。中空糸透析カラム２０は、中空糸膜２０１ａの内側に脂質粒子液１１ｂ（被透析液）を流すための第１流路２０１と、中空糸膜２０１ａの外側に外液２１ａ（透析液）を流すための第２流路２０２とを有する。第１流路２０１の上流端には入口２０ａが設けられ、第１流路２０１の下流端には出口２０ｂが設けられている。第２流路２０２の上流端には入口２０ｃが設けられ、第２流路２０２の下流端には出口２０ｄが設けられている。第２流路２０２の入口２０ｃは第１流路２０１の出口２０ｂ近傍に配置され、第２流路２０２の出口２０ｄは第１流路２０１の入口２０ａ近傍に配置されている。
【００８８】
中空糸透析カラム２０における中空糸膜２０１ａのＭＷＣＯ（Molecular  Weight  Cut
Off）は、例えば３ｋＤ以上７５０ｋＤ以下であり得る。第１流路２０１の入口２０ａ
から出口２０ｂまでの長さＤ１１は、例えば１０ｃｍ以上３００ｃｍ以下であり得る。複数本の中空糸透析カラムを長手方向に（直列に）つなげることで、実質的に長い中空糸透析カラム２０を形成してもよい。中空糸膜２０１ａの内径（糸の内径）Ｄ１３は、例えば０．３ｍｍ以上２．０ｍｍ以下であり得る。また、孔２０１ｂは、例えば脂質粒子１０１の平均粒子径Ｄ１２よりも小さい直径Ｄ１４を有し得る。孔２０１ｂの直径Ｄ１４は、例えば２ｎｍ以上７５ｎｍ以下であり得る。中空糸膜２０１ａの素材の例としては、ｍＰＥＳ（修飾ポリエーテルスルホン）、ＭＥ（混合セルロースエステル）、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、又はＰＳ（ポリスルホン）が挙げられるが、これらに限定されない。中空糸膜カラム２０としては、例えばスペクトラム・ラボラトリーズ株式会社製の「ＭｉｄｉＫｒｏｓ（登録商標）モジュール」を用いることができる。
【００８９】
一つの実施形態では、図４に示すように、脂質粒子液１１ｂを透析する場合には、ポンプ２２ａを作動させて、中空糸膜２０１ａの外側に外液２１ａを流す。外液２１ａは、例えば最終生成物と同じ溶媒であり得る。一つの実施形態では、脂質粒子液を透析する場合に、中空糸膜２０１ａの外側に外液２１ａを流さなくてもよい。一つの実施形態では、透析装置は、脂質粒子液を中空糸膜２０１ａに通すことで生成されるろ液を流す流路を有し得る。一つの実施形態では、脂質粒子液の透析は、脂質粒子液を流す向きに直交する方向に廃液が流れるタンジェンシャルフロー・フィルトレーション（ＴＦＦ）であり得る。
【００９０】
ポンプ２２ａは、容器２１内の外液２１ａを中空糸透析カラム２０に向けて圧送（送液）する。ポンプ２２ａが作動することで、外液２１ａは、管２２内を中空糸透析カラム２０（第２流路２０２の入口２０ｃ）に向かって流れて、第２流路２０２において中空糸膜２０１ａの外側を中空糸膜２０１ａに沿って流れる。外液２１ａは、第２流路２０２の入口２０ｃから出口２０ｄまで流れて、管２３を通り、廃液容器２４内に回収される。
【００９１】
脂質粒子液１１ｂを流す向きは、外液２１ａの流れに対向する向き（逆向き）であることが好ましい。脂質粒子液１１ｂと外液２１ａとを互いに逆向きに流すことで、透析効率を向上させることができる。
【００９２】
図４に示すように、脂質粒子液１１ｂ中の脂質粒子１０１は、孔２０１ｂよりも大きいため、孔２０１ｂを通過できない。一方、有機微粒子１０３は、孔２０１ｂよりも小さいため、孔２０１ｂを通過できる。このため、脂質粒子液１１ｂに含まれる有機微粒子１０３は、中空糸膜２０１ａの外側へ除去される。脂質粒子液１１ｂ中の分散媒１０２も、中空糸膜２０１ａの内側（第１流路２０１）から外側（第２流路２０２）へ移動する。他方、外液２１ａは、中空糸膜２０１ａの外側（第２流路２０２）から内側（第１流路２０１）へ移動する。
【００９３】
中空糸膜カラム２０の第１流路２０１に被透析液を流すとともに第２流路２０２に外液２１ａを流して、被透析液を透析しながら、第１流路２０１へ入る脂質粒子液１１ｂ（被透析液）の量と第１流路２０１から出る脂質粒子液１１ｂ（被透析液）の量とを制御することで、中空糸透析カラム２０における分散媒１０２の移動量（第１流路２０１から第２流路２０２へ移動する液量）と外液２１ａの移動量（第２流路２０２から第１流路２０１へ移動する液量）との差分（ひいては、被透析液の濃度）を制御され得る。透析後の脂質粒子液１１ｂは、管１６内を通って回収部１７に流入する。
【００９４】
透析装置は、図５に示すような制御ユニット３０を有し得る。制御ユニット３０は、制御部３１と、検出部３２とを有する。制御部３１と検出部３２とは相互に通信可能に接続されている。透析装置用の制御ユニットは、脂質粒子製造装置用の制御ユニットと一体となっていてもよいし、独立していてもよい。透析装置は、図３Ａおよび３Ｂに示す脂質粒子製造装置用の制御ユニットと同様の制御ユニットを有し得る。
【００９５】
透析装置では、制御ユニット３０が、第１流路２０１の入口２０ａにおける被透析液（透析前の脂質粒子液１１ｂ）の流速（以下、第１流速と記載する）と第１流路２０１の出口２０ｂにおける被透析液（透析後の脂質粒子液１１ｂ）の流速（以下、第２流速と記載する）との差分に基づいて、第１流路２０１の出口２０ｂから流出する被透析液（透析後の脂質粒子液１１ｂ）の濃度を制御する。
【００９６】
例えば透析前後の流速比率を１．０（第１流速＝第２流速）にすることで、図６に示すように、脂質粒子液１１ｂの濃度をほとんど変えずに脂質粒子液１１ｂ中の有機微粒子１０３（図４）を除去することができる。脂質粒子液１１ｂが第１流路２０１を流れる間に、第１流路２０１から第２流路２０２へ移動する分散媒１０２の量は、第２流路２０２から第１流路２０１へ移動する分散媒１０２の量と略同じになる。
【００９７】
また、例えば透析前後の流速比率を１．０よりも小さく（第１流速＞第２流速）することで、図７に示すように、脂質粒子液１１ｂ中の有機微粒子１０３（図４）を除去しながら脂質粒子液１１ｂを濃縮することができる。逆に、透析前後の流速比率を１．０よりも大きくすることで、脂質粒子液１１ｂ中の有機微粒子１０３を除去しながら脂質粒子液１１ｂを希釈することができる。
【００９８】
透析装置（精製部１５等）は、制御ユニット３０によりポンプ１６ａを制御することで、中空糸透析カラム２０から流出する被透析液の濃度を簡易に制御することができる。その結果、高い精度で所望の濃度を有する被透析液を得ることが可能になる。
【００９９】
図９は、脂質粒子製造システムと、脂質粒子濃度調整および／または溶媒置換のための装置との間に溶液を貯蔵する容器を設けてこれらを間接的に接続した例示的実施形態を示す。この例では、脂質粒子製造システムからの脂質粒子含有溶液は、まず一次容器に流入する。システム内の構成要素同士をつなぐ管には、必要に応じて流量および／または圧力を監視および／または制御する構成要素を設けることができる。一次容器内の圧力、温度および／または液体量は、それを検出する手段（例えば、秤量計）などによって監視し、制御してもよい。次に、一次容器に貯蔵された溶液は脂質粒子濃度調整および／または溶媒置換のための装置に送られる。脂質粒子濃度調整および／または溶媒置換のための装置を通して濃度調整および／または溶媒置換された脂質粒子含有溶液は、そのまま取り出されてもよいし（図９Ａ）、一次容器または別の容器に流入させて再度システム内を循環させてもよい（図９Ｂ、９Ｃ）。一つの実施形態では、所望の脂質粒子濃度および／または溶液組成となった一次容器内の溶液が取り出される。一つの実施形態では、脂質粒子濃度調整および／または溶媒置換のための装置からの脂質粒子を含まない溶液（透過液、または廃液）の圧力、温度、液体量および／または液体組成を監視して、得られた情報に基づいて所望の脂質粒子濃度および／または溶液組成としてもよい。一つの実施形態では、透過液または廃液は、廃棄してもよいし、必要に応じて処理した後に、再度利用してもよい。一つの実施形態では、システムに透析液（外液）を加える流路を設けてもよく、この流路は、例えば、被透析液に透析液（外液）を加えるように構成され得る。一つの実施形態では、一次容器に透析液（外液）を流入させる管を接続してもよい（図９Ｃ）。一つの実施形態では、脂質粒子濃度調整および／または溶媒置換のための装置に透析液（外液）を流入させる管を接続してもよい（図９Ａ、９Ｂ）。一つの実施形態では、透過液と同量の透析液を供給することでシステム内の液量を一定に保ったまま脂質粒子濃度調整および／または溶媒置換を実施することができる。脂質粒子濃度調整および／または溶媒置換は、脂質粒子製造システムからの脂質粒子含有溶液を一次容器に貯蔵した後に実施してもよいし、貯蔵するのと並行して実施してもよい。脂質粒子濃度調整および溶媒置換は、複数の工程で実施してもよいし、一つの工程で実施してもよい。
【０１００】
一つの実施形態では、透析装置（精製部１５等）は、第１流路２０１内の脂質粒子液１１ｂ（被透析液）が、第２流路２０２内の外液２１ａの流れに対向する向きに流れる。こうした構成を有する透析装置では、透析効率を向上させることができる。
【０１０１】
製造される脂質粒子液の濃度が高過ぎると、脂質粒子液の保存安定性が悪くなることがある。上記透析装置によれば、所望の濃度の脂質粒子液を容易に得ることが可能になる。脂質粒子液の濃度を調整する場合において、透析前後の流速比率は０．２以上５．０以下であることが好ましく、０．５以上２．０以下であることがより好ましい。透析前後の流速比率を０．２以上５．０以下（より好ましくは、０．５以上２．０以下）にすることで、高い精度で被透析液の濃度を調整することが可能になる。
【０１０２】
中空糸膜２０１ａの内径（糸の内径）Ｄ１３（図４）を太くしたり、複数の中空糸膜カラムを並列につなげたりすることで、一度に処理する溶液の量を増やすことができる。また、第１流路２０１の入口２０ａにおける被透析液の流速を大きくして処理量を増やしてもよい。こうした方法では、流速の調整のみで簡単に処理量を増やすことができる。
【０１０３】
一つの局面において、本発明のシステムは、所与の薬物について、所望の平均粒径（および必要に応じて多分散指数）を有するように、所与の薬物を担持する脂質粒子を作製する条件を決定する。条件は、一次希釈液のアルコール濃度と脂質粒子の粒径との関係を表す関数、所与の時間（保持時間）と脂質粒子の粒径との関係を表す関数、混合領域（第２または第３）および／または混合領域間の送液管の温度と脂質粒子の粒径との関係を表す関数、一次または二次希釈液の脂質濃度と脂質粒子の粒径との関係を表す関数、混合領域間の送液管におけるレイノルズ数と脂質粒子の粒径との関係を表す関数、混合領域間の送液管における圧力と脂質粒子の粒径との関係を表す関数の少なくとも１つの関数を使用して決定される。
【０１０４】
一つの実施形態において、一次希釈液のアルコール濃度と脂質粒子の粒径との関係を表す関数は、以下の手順で得られ得る。所与の薬物、所与の脂質および特定のアルコールを含む第１の溶液を、水を含む第２の溶液と混合してアルコールが所定の濃度に希釈された混合物を調製する。ここで、所定の濃度は、少なくとも２点設定される。それぞれの混合物について、調製後一定の時間が経過した時点（調製直後であってもよい）で、脂質粒子の粒子径を測定する。この測定結果に基づいて、脂質粒子の平均粒子径（および必要に応じて多分散指数）と、希釈濃度との関係を表す関数を作成することができる。二次希釈溶液のアルコール濃度と脂質粒子リポソームの粒径との関係を表す関数も同様に得られ得る。
【０１０５】
一つの実施形態において、所与の時間（保持時間）と脂質粒子の粒径との関係を表す関数は、以下の手順で得られ得る。所与の薬物、所与の脂質および特定のアルコールを含む第１の溶液を、水を含む第２の溶液と混合してアルコールが一定濃度に希釈された混合物を調製する。混合物を調製した後、所定の時間が経過した時点で、脂質粒子の粒子径を測定する。ここで、所定の時間は、少なくとも２点設定される。測定結果に基づいて、脂質粒子の平均粒子径（および必要に応じて多分散指数）と、調製後の時間経過との関係を表す関数を作成することができる。上記は第１の混合領域から第２の混合領域に到達するまでの保持時間に関する記載であるが、第２の混合領域から第３の混合領域に到達するまでの保持時間と脂質粒子の粒径との関係を表す関数も同様に得られ得る。
【０１０６】
例えば、疎水性薬剤（リポソーム膜に埋め込まれる、またはミセル内部に担持される）の場合、一般に、薬剤が入ることで脂質粒子の平均粒径は大きくなる。そのため、脂質組成が決まっている場合、目標とする最終製剤の粒子径よりも２０％〜３０％小さい平均粒子径をもつ薬剤非担持脂質粒子ができる条件を予想することが本発明では通例である。ドキシルのような親水性薬剤の場合、薬剤非担持脂質粒子として製造することができることから、さらに予測可能である。
【０１０７】
（一般技術）
本明細書において用いられる分析学的手法、化学的手法、製剤学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、（Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ著、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ:Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｐｒｅｐａｒ
ａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １２，  ２００６  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ９７８０８４９３８８２１７）などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１０８】
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上
」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。
【０１０９】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１１０】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１１１】
以下に実施例を記載する。【０１１２】
試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Sigma−Aldrich、和光純薬、ナカライ、R&D  Systems、USCN  Life  Science  INC等）の同等品でも代用可能である。【０１１３】
（略号）
本明細書において説明した略称の他、以下の略称も用いる。【０１１４】
ＤＯＰＣ：２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＯＰＧ：２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール
ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＧ：１，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール
ＨＳＰＣ：水素添加大豆ホスファチジルコリン
ＤＳＰＧ：ジステアロイルホスファチジルグリセロール
ＤＭＰＧ：ジミリストイルホスファチジルグリセロール
ＭＰＥＧ２０００ＤＳＰＥ：Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩
ＰＤＩ：多分散指数
脂質粒子の平均粒子径および多分散指数は、動的光散乱法によって測定した。【０１１５】
（実施例１）アルコール濃度と粒子径との関係
（１−１）
以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：ＨＳＰＣ  ９５．８ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ３１．９ｍｇ、ＭＰＥＧ２０００ＤＳＰＥ  ３１．９ｍｇを６ｍｌのエタノールに溶解
溶液Ｂ：マルトースを終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）で１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）に溶解
溶液Ａおよび溶液Ｂを、それぞれ、８５℃の温浴中で、エタノール濃度（Ｖ／Ｖ）が１２％、１８％、２７％、３６％、３９％、４２％および４６％となるように混合した後、静置した。混合直後、混合３時間後、混合３日後の各時点で平均粒子径および多分散指数を観察した。結果を以下の表および図１０Ａの左に示す。
【表１】
2019088193.tif 000002
【０１１６】
また、溶液Ａを、溶液Ａ：ＨＳＰＣ  ９５．８ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ３１．９ｍｇ、ＭＰＥＧ２０００ＤＳＰＥ  ３１．９ｍｇ、α−Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ  ５０ｍｇ  を６ｍｌのエタノールに溶解したエタノール溶液に代えて、同様に、エタノール濃度（Ｖ／Ｖ）が１５％、１８％、２１％、２４％、２７％および３０％となるように混合した後、静置した。混合直後および混合１日後の各時点で平均粒子径および多分散指数を観察した。結果を以下の表および図１０Ａの右に示す。
【表２】
2019088193.tif 000003
【０１１７】
（１−２）
以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：ＨＳＰＣ  １７０．４ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ４１．６ｍｇ、ＤＳＰＧ
６７．２ｍｇを１８ｍｌのエタノールに溶解
溶液Ｂ：マルトースを終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）で１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）に溶解
溶液Ａおよび溶液Ｂを、（１−１）と同様に、それぞれ、エタノール濃度（Ｖ／Ｖ）が１２％、１５％、１８％、２１％、２４％、および２７％となるように混合した後、静置した。混合直後、混合１時間後、混合２日後の各時点で平均粒子径および多分散指数を観察した。結果を以下の表および図１０Ｂの左に示す。
【表３】
2019088193.tif 000004
【０１１８】
また、溶液Ａを、溶液Ａ：ＨＳＰＣ  １７０．４ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ４１．６ｍｇ、ＤＳＰＧ  ６７．２ｍｇ、α−Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ  ５０ｍｇを１８ｍｌのエタノールに溶解したエタノール溶液に代えて、同様に、エタノール濃度（Ｖ／Ｖ）が１５％、１８％、２１％、２４％、２７％および３０％となるように混合した後、静置した。混合直後および混合１日後の各時点で平均粒子径および多分散指数を観察した。結果を以下の表および図１０Ｂの右に示す。
【表４】
2019088193.tif 000005
【０１１９】
（１−３）
以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：ＤＯＰＣ  ９６ｍｇ、ＤＯＰＧ  ９７ｍｇ、ＤＰＰＣ  ９０ｍｇ、ＤＰＰＧ  ９１ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  １２６ｍｇを４ｍｌのエタノールに溶解
溶液Ｂ：マルトースを終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）で１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）に溶解
溶液Ａおよび溶液Ｂを、（１−１）と同様に、それぞれ、エタノール濃度（Ｖ／Ｖ）が１７％、１８％、２５％、３３％、および３５％となるように混合した後、静置した。混合直後、混合１時間後の各時点で平均粒子径および多分散指数を観察した。結果を以下の表および図１０Ｃに示す。
【表５】
2019088193.tif 000006
これらの実験から、エタノール希釈濃度によって脂質粒子の粒径が変化することが分かった。また、脂質粒子の調製後、平均粒子径が時間と共に増大することが示された。【０１２０】
（実施例２）２段階目のアルコール希釈濃度と粒子径との関係
（２−１）
以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：ＨＳＰＣ  ９５．８ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ３１．９ｍｇ、ＭＰＥＧ２０００ＤＳＰＥ  ３１．９ｍｇを６ｍｌのエタノールに溶解  
溶液Ｂ：マルトースを終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）で１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）に溶解
６ｍＬの溶液Ａおよび１０．７ｍＬの溶液Ｂをエタノール濃度が３６％（Ｖ／Ｖ）となるように混合し、８５℃の温浴で３０秒間撹拌し、その後、さらに溶液Ｂを添加してエタノール濃度（Ｖ／Ｖ）がそれぞれ１２％、１５％、１８％、２１％、２４％および２７％となるように２次希釈液を調製した後、室温または４℃で静置した。２次希釈液調製直後、１時間後、３時間後、１日後、２日後の各時点で平均粒子径および多分散指数を観察した。結果を以下の表および図１１Ａに示す。
【表６】
2019088193.tif 000007
【０１２１】
（２−２）
以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：ＨＳＰＣ  １７０．４ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ４１．６ｍｇ、ＤＳＰＧ
６７．２ｍｇを１８ｍｌのエタノールに溶解
溶液Ｂ：マルトースを終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）で１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）に溶解
１８ｍＬの溶液Ａおよび３２ｍＬの溶液Ｂをエタノール濃度が３６％（Ｖ／Ｖ）となるように混合し、８５℃の温浴で３０秒間撹拌し、その後、さらに溶液Ｂを添加してエタノール濃度（Ｖ／Ｖ）がそれぞれ１２％、１５％、１８％、２１％、２４％および２７％となるように２次希釈液を調製した後、静置した。２次希釈液調製直後、１時間後、１日後、２日後の各時点で平均粒子径および多分散指数を観察した。結果を以下の表および図１１Ｂに示す。
【表７】
2019088193.tif 000008
【０１２２】
これらの実験から、エタノールの２次希釈濃度がある濃度（およそ１８％）以下である場合に、脂質粒子が安定化し、逆にそれ以上の濃度では脂質粒子が不安定化することが示された。このことから、脂質粒子が不安定化するアルコール濃度において、所望の粒径が得られるような操作を行い、その後、脂質粒子が安定化するアルコール濃度に調整することで安定的に所望の粒径分布を有する脂質粒子を提供可能であることが予測された。また、脂質粒子組成および脂質粒子に担持させる薬物の有無によらず、脂質粒子が不安定化し始めるアルコール濃度（流動性変動点）は変化しない可能性があることが示された。【０１２３】
（実施例３）アルコール中の脂質濃度と粒子径との関係
（３−１）
以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：ＨＳＰＣ  ９５．８ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ３１．９ｍｇ、ＭＰＥＧ２０００ＤＳＰＥ  ３１．９ｍｇを、１、２、３、４、６ｍｌのエタノールに溶解
溶液Ｂ：マルトースを終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）で１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）に溶解
溶液Ａおよび溶液Ｂを、それぞれ、８５℃の温浴中で、エタノール濃度（Ｖ／Ｖ）がそれぞれ１８％、３６％となるように混合した後、静置した。混合直後、混合1時間後、混
合１日後または２日後の各時点で平均粒子径および多分散指数を観察した。結果を以下の表および図１２Ａに示す。
【表８】
2019088193.tif 000009
【表９】
2019088193.tif 000010
【０１２４】
（３−２）
以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：ＨＳＰＣ  ４７．３ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  １１．６ｍｇ、ＤＳＰＧ  １８．７ｍｇを、１、２、３、４、５ｍｌのエタノールに溶解
溶液Ｂ：マルトースを終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）で１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）に溶解
溶液Ａおよび溶液Ｂを、（３−１）と同様に、エタノール濃度（Ｖ／Ｖ）がそれぞれ１８％、３６％となるように混合した後、静置した。混合直後、混合１時間後の各時点で平均粒子径および多分散指数を観察した。結果を以下の表および図１２Ｂに示す。
【表１０】
2019088193.tif 000011
【表１１】
2019088193.tif 000012
【０１２５】
（３−３）
以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：ＤＯＰＣ  ９６ｍｇ、ＤＯＰＧ  ９７ｍｇ、ＤＰＰＣ  ９０ｍｇ、ＤＰＰＧ  ９１ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  １２６ｍｇを３、３．５、４、５ｍｌのエタノールに溶解
溶液Ｂ：マルトースを終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）で１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）に溶解
溶液Ａおよび溶液Ｂを、（３−１）と同様に、それぞれ、エタノール濃度が２５％（Ｖ／Ｖ）となるように混合した後、静置した。混合直後、混合１時間、１．５時間後の各時点で平均粒子径および多分散指数を観察した。結果を以下の表および図１２Ｃに示す。
【表１２】
2019088193.tif 000013
【０１２６】
（３−４）
以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：ＤＯＰＣ  ９６ｍｇ、ＤＯＰＧ  ９７ｍｇ、ＤＰＰＣ  ９０ｍｇ、ＤＰＰＧ  ９１ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  １２６ｍｇを４、５、６ｍｌのエタノールに溶解
溶液Ｂ：マルトースを終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）で１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）に溶解
溶液Ａおよび溶液Ｂを、（３−１）と同様に、エタノール濃度が３６％（Ｖ／Ｖ）となるように混合した後、さらに溶液Ｂを添加して、エタノールが１８％（Ｖ／Ｖ）となるように２次希釈液を調製した後、静置した。２次希釈液調製後の各時点で平均粒子径および多分散指数を観察した。結果を以下の表および図１３に示す。
【表１３】
2019088193.tif 000014
これらの実験から、脂質濃度を増大させるほど脂質粒子の粒径が大きくなる傾向がみられること、脂質濃度に関わらず流動性変動点が一定であることが見出された。【０１２７】
（実施例４）アルコール第１希釈後の時間経過と粒子径との関係
（４−１）
以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：ＤＯＰＣ  ９６ｍｇ、ＤＯＰＧ  ９７ｍｇ、ＤＰＰＣ  ９０ｍｇ、ＤＰＰＧ  ９１ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  １２６ｍｇを４ｍｌのエタノールに溶解
溶液Ｂ：マルトースを終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）で１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）に溶解
溶液Ａおよび溶液Ｂをそれぞれ別の流路に流し、これらの溶液を第１のミキサーで混合して第１希釈液とし、第１希釈液を送液管に流し、第２のミキサーにおいて第１希釈液および溶液Ｂを混合し第２希釈液を調製するように、脂質粒子作製装置を構成した。ここで、第１希釈液のエタノール濃度は３６％（Ｖ／Ｖ）、第２希釈液のエタノール濃度は１８％（Ｖ／Ｖ）となるように流量を調整した。【０１２８】
流速および送液管の長さを変更して、平均粒子径および多分散指数を観察した。結果を以下の表および図１４に示す。
【表１４】
2019088193.tif 000015
異なる流速・流路長でも保持時間（二次希釈までの時間）が同じであれば同様の粒子径の脂質粒子が形成されることが示された。【０１２９】
（４−２）
以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：ＨＳＰＣ  ９５．８ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ３１．９ｍｇ、ＭＰＥＧ２０００ＤＳＰＥ  ３１．９ｍｇを３ｍｌのエタノールに溶解
溶液Ｂ：マルトースを終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）で１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）に溶解
脂質粒子作製装置を（４−１）と同様に構成した。ここで、第１希釈液のエタノール濃度は３６％（Ｖ／Ｖ）、第２希釈液のエタノール濃度は１８％（Ｖ／Ｖ）となるように流量を調整した。第１のミキサーにおける混合から２次希釈液の調製まで８５℃の加温条件で行った。【０１３０】
流速を変更して、平均粒子径および多分散指数を観察した。結果を以下の表および図１５Ａに示す。
【表１５】
2019088193.tif 000016
【０１３１】
（４−３）
以下の溶液を調製した。
溶液ＡをＤＯＰＣ  ９６ｍｇ、ＤＯＰＧ  ９７ｍｇ、ＤＰＰＣ  ９０ｍｇ、ＤＰＰＧ  ９１ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  １２６ｍｇを４ｍｌのエタノールに溶解したエタノール溶液に変更して（４−２）と同様の実験を行った。結果を以下の表および図１５Ｂに示す。
【表１６】
2019088193.tif 000017
【０１３２】
（４−４）
以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：ＤＯＰＣ  ９６ｍｇ、ＤＯＰＧ  ９７ｍｇ、ＤＰＰＣ  ９０ｍｇ、ＤＰＰＧ  ９１ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  １２６ｍｇを４ｍｌのエタノールに溶解
溶液Ｂ：マルトースを終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）で１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）に溶解
脂質粒子作製装置を（４−１）と同様に構成した。ここで、第１希釈液のエタノール濃度は３６％（Ｖ／Ｖ）、第２希釈液のエタノール濃度は１８％（Ｖ／Ｖ）となるように流量を調整した。【０１３３】
以下の表に示すような保持時間となるように流速および送液管の長さを調整して、平均粒子径および多分散指数を観察した。結果を以下の表および図１６Ａに示す。
【表１７】
2019088193.tif 000018
【０１３４】
（４−５）
以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：ＨＳＰＣ  ４７．３ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  １１．６ｍｇ、ＤＳＰＧ  １８．７ｍｇを、１８ｍｌのエタノールに溶解
溶液Ｂ：マルトースを終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）で１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）に溶解
脂質粒子作製装置を（４−１）と同様に構成した。ここで、第１希釈液のエタノール濃度は３６％（Ｖ／Ｖ）、第２希釈液のエタノール濃度は１８％（Ｖ／Ｖ）となるように流量を調整した。【０１３５】
以下の表に示すような保持時間となるように流速および送液管の長さを調整して、平均粒子径および多分散指数を観察した。結果を以下の表および図１６Ｂに示す。
【表１８】
2019088193.tif 000019
これらの実験から、保持時間を長くすることで脂質粒子の粒径を増大させることが可能であることが示された。また、粒径の増大に伴うＰｄＩの増加は少なかった。【０１３６】
（実施例５）温度と粒子径との関係
以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：ＨＳＰＣ  ９５．８ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ３１．９ｍｇ、ＭＰＥＧ２０００ＤＳＰＥ  ３１．９ｍｇを６ｍｌのエタノールに溶解
溶液Ｂ：マルトースを終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）で１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）に溶解
溶液Ａおよび溶液Ｂをそれぞれ別の流路に流し、これらの溶液を第１のミキサーで混合して第１希釈液とし、第１希釈液を送液管に流し、第２のミキサーにおいて第１希釈液および溶液Ｂを混合し第２希釈液を調製するように、脂質粒子作製装置を構成した。ここで、溶液Ａ（６ｍＬ／分）および溶液Ｂ（１０．７ｍＬ／分）を第１のミキサーで混合してエタノール濃度３６％（Ｖ／Ｖ）の第１希釈液とし、さらに溶液Ｂ（１６．７ｍＬ／分）を加えて第２のミキサーで混合してエタノール濃度１８％（Ｖ／Ｖ）の第２希釈液を調整した。【０１３７】
第１のミキサーにおける混合から２次希釈液の調製までに５０℃または８５℃の加温条件を使用して、平均粒子径および多分散指数を観察した。結果を以下の表および図１７に示す。
【表１９】
2019088193.tif 000020
温度を調整することで脂質粒子の粒径を制御可能であることが示された。【０１３８】
（実施例６）背圧と粒子径との関係
(６−１)
以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：ＤＯＰＣ  ９６ｍｇ、ＤＯＰＧ  ９７ｍｇ、ＤＰＰＣ  ９０ｍｇ、ＤＰＰＧ  ９１ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  １２６ｍｇを４ｍｌのエタノールに溶解
溶液Ｂ：マルトースを終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）で１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）に溶解
溶液Ａおよび溶液Ｂをそれぞれ別の流路に流し、これらの溶液を第１のミキサーで混合して第１希釈液とし、第１希釈液を送液管に流し、第２のミキサーにおいて第１希釈液および溶液Ｂを混合し第２希釈液を調製するように、脂質粒子作製装置を構成した。ここで、溶液Ａ（４ｍＬ／分）および溶液Ｂ（９．３ｍＬ／分）を第１のミキサーで混合してエタノール濃度３０％（Ｖ／Ｖ）の第１希釈液とし、さらに溶液Ｂ（８．９ｍＬ／分）を加えて第２のミキサーで混合してエタノール濃度１８％（Ｖ／Ｖ）の第２希釈液を調整した。【０１３９】
第１のミキサーと第２のミキサーとの間の流路における背圧を０．３ＭＰａ、１．０ＭＰａまたは２．０ＭＰａになるように調整して、平均粒子径および多分散指数を観察した。結果を以下の表および図１８左に示す。
【表２０】
2019088193.tif 000021
【０１４０】
(６−２)
以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：ＤＯＰＣ  １４４ｍｇ、ＤＭＰＧ  １４４ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ９６ｍｇを３ｍｌのエタノールに溶解
溶液Ｂ：マルトースを終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）で１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）に溶解
溶液Ａおよび溶液Ｂをそれぞれ別の流路に流し、これらの溶液を第１のミキサーで混合して第１希釈液とし、第１希釈液を送液管に流し、第２のミキサーにおいて第１希釈液および溶液Ｂを混合し第２希釈液を調製するように、脂質粒子作製装置を構成した。ここで、溶液Ａ（３．０６ｍＬ／分）および溶液Ｂ（１３．５ｍＬ／分）を第１のミキサーで混合してエタノール濃度１８．５％（Ｖ／Ｖ）の第１希釈液とし、さらに溶液Ｂ（０．５ｍＬ／分）を加えて第２のミキサーで混合してエタノール濃度１８％（Ｖ／Ｖ）の第２希釈液を調整した。【０１４１】
第１のミキサーと第２のミキサーとの間の流路における背圧を０．３ＭＰａ、１．０ＭＰａまたは２．０ＭＰａになるように調整して、平均粒子径および多分散指数を観察した。結果を以下の表および図１８右に示す。
【表２１】
2019088193.tif 000022
これらの実験から、背圧が１．０ＭＰａ以上の場合、脂質粒子の粒径およびＰｄＩ値は低く維持され、粒子径の均一性が高いことが示される。【０１４２】
背圧を調整することで脂質粒子の粒径分布を制御可能であることが示された。【０１４３】
（実施例７）要素の組み合わせによる粒子径の制御
以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：ＨＳＰＣ  ９５．８ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ３１．９ｍｇ、ＭＰＥＧ２０００ＤＳＰＥ  ３１．９ｍｇを６ｍｌのエタノールに溶解
溶液Ｂ：マルトースを終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）で１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）に溶解
溶液Ａおよび溶液Ｂをそれぞれ別の流路に流し、これらの溶液を第１のミキサーで混合して第１希釈液とし、以下の表に示すような保持時間となるように第１希釈液を送液管に流し、第２のミキサーにおいて第１希釈液および溶液Ｂを混合し第２希釈液を調製するように、脂質粒子作製装置を構成した。ここで、第１希釈液のエタノール濃度（Ｖ／Ｖ）が、それぞれ、２７％、３６％、３９％および４５％、第２希釈液のエタノール濃度は１８％（Ｖ／Ｖ）となるように流量を調整した。【０１４４】
平均粒子径および多分散指数を観察した。結果を以下の表および図１９に示す。
【表２２】
2019088193.tif 000023
【表２３】
2019088193.tif 000024
【表２４】
2019088193.tif 000025
【表２５】
2019088193.tif 000026
１次希釈のエタノール濃度および保持時間を調整することで、粒度分布を保ったまま広い範囲（７０〜１８０ｎｍ）にわたって脂質粒子の粒径を制御することができた。【０１４５】
（実施例８：所望の粒径を有するミセルの調製）
同様に、ミセルも調製することができる。以下のようにミセルを多く含む脂質粒子を調製した。
以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：ＤＯＰＣ  ９６ｍｇ、ＤＯＰＧ  ９７ｍｇ、ＤＰＰＣ  ９０ｍｇ、ＤＰＰＧ  ９１ｍｇ、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  １２６ｍｇを４ｍｌのエタノールに溶解
溶液Ｂ：マルトースを終濃度１０％（Ｗ／Ｖ）で１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）に溶解
溶液Ａおよび溶液Ｂをそれぞれ別の流路に流し、これらの溶液を第１のミキサーで混合して第１希釈液とし、第１希釈液を送液管に流し、以下の表に示すような保持時間となるように第２のミキサーにおいて第１希釈液および溶液Ｂを混合し第２希釈液を調製するように、脂質粒子作製装置を構成した。ここで、第１希釈液のエタノール濃度（Ｖ／Ｖ）が、それぞれ、２５％および３６％、第２希釈液のエタノール濃度は１８％（Ｖ／Ｖ）となるように流量を調整した。ここで、第１希釈液の混合から第２希釈液の混合までの保持時間は、エタノール濃度２５％の第１希釈液を使用した場合は１５秒、エタノール濃度３６％の第１希釈液を使用した場合は２分５０秒となるように調整した。これらの脂質粒子について、平均粒子径および多分散指数を観察した。結果を図２０Ｃに示す。脂質粒子調製物の平均粒子径は、それぞれ、３６ｎｍ（第１希釈液：２５％）および１１０ｎｍ（第１希釈液：３６％）であった。
【表２６】
2019088193.tif 000027
【０１４６】
リンタングステン酸染色により脂質二重膜構造を染色し、透過型電子顕微鏡（Ｈ−７６００、日立製作所、東京）で観察した（図２０Ａ、２０Ｂ）。観察結果から、平均粒子径３６ｎｍの調製物の約７０％が脂質二重膜構造を示さず、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）構造であることが示唆された。このＬＮＰは、コレステロールをコアにしたミセル構造だと予想される。【０１４７】
このように本発明は、ミセルも提供することができる。また、ミセルも所望の粒径および／または多分散指数に制御可能であり得る。【０１４８】
実施例１〜７と同様に、１段階目のアルコール希釈濃度、２段階目のアルコール希釈濃度、１段階目のアルコール希釈後の時間経過、温度および背圧のそれぞれの条件について、ミセルの粒径との相関を分析する。この分析結果に基づき、所望の平均粒子径および多分散指数のミセルを調製する。また、ミセルの形成には１段階目のアルコール濃度を低くすることが有利であり得、ミセルの粒径制御のためには、ミセル同士の融合を促進するために２段階目のアルコール濃度を逆に高くすることが有利であり得る。第３のミキサーを追加することで、第２希釈液をさらに希釈してアルコール濃度を１８％（Ｖ／Ｖ）以下に調整することで、安定化させてもよい。例えば、このような方法において、リポソームと同様にミセルも、保持時間（例えば、第２ミキサーと第３ミキサーとの間の保持時間）の制御により粒径制御が可能であり得る。【０１４９】
（実施例９：薬物を担持した所望の粒径を有する脂質粒子を調製する条件の決定）
所与の薬物Ａについて、平均粒径Ｘｎｍ（および必要に応じて多分散指数Ｙ）を有するように薬物Ａを担持する脂質粒子（リポソームまたはミセル）を作製する条件を決定する。
手順１）薬物Ａ、所与の脂質および特定のアルコールを含む溶液を、水を含む別の溶液と混合してアルコールが所定の濃度に希釈された混合物を調製する。ここで、所定の濃度は、２０重量％〜５０重量％の範囲内で少なくとも２点設定する。それぞれの混合物について、調製後一定の時間が経過した時点（調製直後であってもよい）で、脂質粒子の粒子径を測定する。この測定結果に基づいて、脂質粒子の平均粒子径（および必要に応じて多分散指数）と、希釈濃度との関係を表す関数を作成する。
手順２）手順２は、手順１の後または手順１と並行して行う。薬物Ａ、所与の脂質および特定のアルコールを含む溶液を、水を含む別の溶液と混合してアルコールが一定濃度に希釈された混合物を調製する。混合物を調製した後、所定の時間が経過した時点で、脂質粒子の粒子径を測定する。ここで、所定の時間は、調製後０分〜１時間の範囲内で少なくとも２点設定する。測定結果に基づいて、脂質粒子の平均粒子径（および必要に応じて多分散指数）と、調製後の時間経過との関係を表す関数を作成する。【０１５０】
手順１および手順２で作成された関数を使用して、脂質粒子が所望の平均粒子径（および必要に応じて多分散指数）となるような、アルコール希釈濃度および希釈後の所定の時間（保持時間）を決定するか、またはアルコール希釈濃度および希釈後の所定の時間（保持時間）の範囲を画定し、その中の適切な点を選択する。【０１５１】
（注記）
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１５２】
本発明は、薬物の製剤化に利用可能である。
【図１】
2019088193.tif 000028
【図２】
2019088193.tif 000029
【図３Ａ】
2019088193.tif 000030
【図３Ｂ】
2019088193.tif 000031
【図４】
2019088193.tif 000032
【図５】
2019088193.tif 000033
【図６】
2019088193.tif 000034
【図７】
2019088193.tif 000035
【図８】
2019088193.tif 000036
【図９Ａ】
2019088193.tif 000037
【図９Ｂ】
2019088193.tif 000038
【図９Ｃ】
2019088193.tif 000039
【図１０Ａ】
2019088193.tif 000040
【図１０Ｂ】
2019088193.tif 000041
【図１０Ｃ】
2019088193.tif 000042
【図１１Ａ】
2019088193.tif 000043
【図１１Ｂ】
2019088193.tif 000044
【図１２Ａ】
2019088193.tif 000045
【図１２Ｂ】
2019088193.tif 000046
【図１２Ｃ】
2019088193.tif 000047
【図１３】
2019088193.tif 000048
【図１４】
2019088193.tif 000049
【図１５Ａ】
2019088193.tif 000050
【図１５Ｂ】
2019088193.tif 000051
【図１６Ａ】
2019088193.tif 000052
【図１６Ｂ】
2019088193.tif 000053
【図１７】
2019088193.tif 000054
【図１８】
2019088193.tif 000055
【図１９】
2019088193.tif 000056
【図２０】
2019088193.tif 000057
【国際調査報告】
2019088193.tif 000058
2019088193.tif 000059
2019088193.tif 000060
2019088193.tif 000061