(57)【要約】標的分子の検出方法であって、標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドプライマーと、一本鎖環状DNAとの複合体を形成させる工程、ローリングサークル増幅によって前記複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および増幅された核酸を検出する工程、を含み、  前記一本鎖環状DNAは、第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域と、好ましくはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含み、  前記プライマーは、標的分子に結合する第１のアプタマー配列と、その３’側に連結された、一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列とを含み  前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列と、その３'側に連結された前記標的分子に結合する第２のアプタマー配列とを含む、方法。
2018168895.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子の検出方法であって、
標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドプライマーと、一本鎖環状DNAとの複合体を形成させる工程、ローリングサークル増幅によって前記複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出する工程、
を含み、
前記一本鎖環状DNAは、第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域とを含み、
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、標的分子に結合する第１のアプタマー配列と、その３’側に連結された、一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列とを含み、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列と、その３'側に連結された前記標的分子に結合する第２のアプタマー配列とを含む、
方法。
【請求項２】
前記一本鎖環状DNAはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項１に記載の標的分子の検出方法。
【請求項３】
標的分子の検出方法であって、
標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、第１の一本鎖環状DNAとからなる第１の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第１の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、
当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２の一本鎖環状DNAと第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のプライマーと第２の一本鎖環状DNAとからなる第２の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第２の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出する工程、を含み、
前記第１の一本鎖環状DNAは、第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域と、第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、を含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的分子に結合する第１のアプタマー配列とその３’側に連結された、第１の一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列と、を含み、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、第１の一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列とその３'側に連結された標的分子に結合する第２のアプタマー配列と、を含み、
前記第２の一本鎖環状DNAは、第１の一本鎖環状DNAにおける第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列と同一の配列と、該配列の３’側に隣接した、第２のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列と、検出試薬結合配列に相補的な配列と、を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１の一本鎖環状DNAにおける第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列に相補的な配列とを含む、方法。
【請求項４】
前記検出試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列であり、前記検出用試薬がグアニン四重鎖結合試薬である、請求項２または３に記載の標的分子の検出方法。
【請求項５】
グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列がＣ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3配列を含む、請求項４に記載の標的分子の検出方法。
【請求項６】
グアニン四重鎖結合試薬が下記一般式（I）で表される化合物を含む、請求項４または５に記載の標的分子の検出方法。
【化１】
2018168895.tif 000012
Ｒ1は水素、またはＯ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでもよい炭化水素基を示し、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立して炭素数１〜５の炭化水素基を示し、
nは０〜５の整数を示し、
ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示す。
【請求項７】
標的分子がタンパク質、ペプチドまたは低分子化合物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の標的分子の検出方法。
【請求項８】
第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域とを含む一本鎖環状DNA、
標的分子に結合する第１のアプタマー配列と、その３’側に連結された、一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列とを含むオリゴヌクレオチドプライマー、及び
一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列と、その３'側に連結された前記標的分子に結合する第２のアプタマー配列とを含むキャプチャーオリゴヌクレオチド、
を含む標的分子の検出用試薬。
【請求項９】
一本鎖環状DNAは、さらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項８に記載の標的分子の検出用試薬。
【請求項１０】
検出試薬結合配列はグアニン四重鎖形成配列である、請求項９に記載の標的分子の検出用試薬。
【請求項１１】
さらにグアニン四重鎖結合試薬を含む、請求項１０に記載の標的分子の検出用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ローリングサークル増幅法を利用した標的分子の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、核酸の変異やバイオマーカーなどの生体関連分子を標的とした疾患やストレスなどの検出法の開発が注目されている。核酸変異検出法としてリアルタイムPCR法などが、タンパク質や代謝物などの生体分子の検出方法としてELISA法などが知られているが、クリニックでの簡易検査やセルフメディケーションに用いるには装置の価格や使用コストが高く、操作も煩雑である。【０００３】
特許文献１ではローリングサークル増幅法によってRNAを検出する方法が開示されているが、アナライトのRNAをプライマーに使用しているため、検出対象にできる配列が３'末端に制約される。また、増幅効率や検出効率の面でも十分ではない。
また、特許文献２および非特許文献１には、一本鎖環状DNA、プライマーおよびグアニン四重鎖結合試薬を用いたポリヌクレオチドの検出方法が開示されているが、タンパク質などの非核酸分子の検出法への応用は開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2012-080871号公報
【特許文献２】WO2016/152936
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Anal. Chem., 2016, 88 (14), pp 7137-7144
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、タンパク質などの標的分子を簡便な手法で効率よく検出するための方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、一本鎖環状DNA、キャプチャーDNAおよびプライマーを用いたローリングサークル増幅法において、キャプチャーDNAおよびプライマーの配列を標的の非核酸分子に結合するアプタマー配列とすることにより、非核酸分子を効率的に検出できることを見出し、本発明を完成させた。【０００８】
本発明の第一の態様によれば、
標的分子の検出方法であって、
標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドプライマーと、一本鎖環状DNAとの複合体を形成させる工程、ローリングサークル増幅によって前記複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出する工程、
を含み、
前記一本鎖環状DNAは、第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域とを含み、
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、標的分子に結合する第１のアプタマー配列と、その３’側に連結された、一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列とを含み
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列と、その３'側に連結された前記標的分子に結合する第２のアプタマー配列とを含む、
方法、が提供される。【０００９】
本発明の第二の態様によれば、
標的分子の検出方法であって、
標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、第１の一本鎖環状DNAとからなる第１の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第１の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、
当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２の一本鎖環状DNAと第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のオリゴヌクレオチドプライマーと第２の一本鎖環状DNAとからなる第２の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第２の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出する工程、を含み、
前記第１の一本鎖環状DNAは、第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域と、第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、を含み、
前記第１のプライマーは、標的分子に結合する第１のアプタマー配列とその３’側に連結された、第１の一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列と、を含み、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、第１の一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列とその３'側に連結された標的分子に結合する第２のアプタマー配列と、を含み、
前記第２の一本鎖環状DNAは、第１の一本鎖環状DNAにおける第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列と同一の配列と、該配列の３’側に隣接した、第２のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列と、検出試薬結合配列に相補的な配列と、を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１の一本鎖環状DNAにおける第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列に相補的な配列とを含む、方法が提供される。【００１０】
本発明の第三の態様によれば、
第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域とを含む一本鎖環状DNA、
標的分子に結合する第１のアプタマー配列と、その３’側に連結された、一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列とを含むオリゴヌクレオチドプライマー、及び
一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列と、その３'側に連結された前記標的分子に結合する第２のアプタマー配列とを含むキャプチャーオリゴヌクレオチド、
を含む、標的分子の検出用試薬、が提供される。【００１１】
なお、前記検出試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列であり、前記検出用試薬がグアニン四重鎖結合試薬であることが好ましく、グアニン四重鎖結合試薬は後述のThT誘導体であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、標的分子が存在すると、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドプライマーと、一本鎖環状DNAが複合体を形成して、そこから核酸増幅反応が起こり、幾つものグアニン四重鎖含有配列などの検出試薬結合配列が直列に繋がったDNA鎖が生成し、これをThT（誘導体）などの検出試薬を用いて検出することにより、標的分子を特異的に検出できる。昇温・降温などの温度サイクルを必要するPCR法ではなく、一定温度で反応が進行するRCA法を用いるため、簡易検出法への応用が可能である。本発明の方法は検査や診断等の用途に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の第一の態様にかかる標的分子検出方法の模式図。
【図２】本発明の第二の態様にかかる標的分子検出方法の模式図。
【図３】実施例１のトロンビン、キャプチャーオリゴヌクレオチド、第１の一本鎖環状DNA、およびオリゴヌクレオチドプライマー（検出プローブ）の複合体形成と、その伸長産物と第２の一本鎖環状DNA、および第２のプライマーの複合体形成を示す図。
【図４】実施例１−１におけるトロンビン検出結果を示す図（写真）。
【図５】実施例１−２におけるトロンビン検出結果を示す図（写真）。
【図６】実施例１−３におけるトロンビン検出結果を示す図（写真）。
【図７】実施例２のストレプトマイシン、キャプチャーオリゴヌクレオチド、第１の一本鎖環状DNA、およびオリゴヌクレオチドプライマー（検出プローブ）の複合体形成と、その伸長産物と第２の一本鎖環状DNA、および第２のプライマーの複合体形成を示す図。英大文字はDNAで、英小文字はRNAである。
【図８】実施例２−１におけるストレプトマイシン検出結果を示す図（写真）。
【図９】実施例２−２におけるストレプトマイシン検出結果を示す図（写真）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜標的分子＞
本明細書において、標的分子は、第１のアプタマー配列と第２のアプタマー配列に結合できる分子であれば特に制限されないが、非核酸分子が好ましく、タンパク質やペプチド、低分子化合物などが挙げられ、糖、ビタミン、ホルモン、補酵素なども含まれる。
例えば、ホルモンとしては、アドレナリン、ノルアドレナリン、アンギオテンシン、アトリオペプチン、アルドステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、カルシトニン、カルシトリオール、カルシジオール、コルチコトロピン、コルチゾール、ドパミン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、エリトロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒスタミン、ヒト胎盤性ラクトゲン、インスリン、インスリン様増殖因子、成長ホルモン、インヒビン、レプチン、ロイコトリエン、リポトロピン、メラトニン、オレキシン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロゲステロン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔｇｌａｎｄｉｎ）、レニン、セロトニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、サイロキシン、トリヨードサイロニン、バソプレシンなどが例示される。
タンパク質としては、トロンビンなどの血液凝固因子、ウイルス由来タンパク質、サイトカインや増殖因子（上記ホルモンにも該当し得る）、腫瘍マーカーなどの疾患マーカータンパク質などが例示される。
【００１５】
標的分子は単離されたものでもよいし、生物種由来の試料に含まれるものでもよい。そのような標的分子を含む試料には、ウイルス、原核生物または真核生物を含む試料が挙げられる。例えば、脊椎動物（ヒトを含む）では、糞便、尿、または汗のような排泄物、血液、精液、唾液、胃液、または胆汁のような体液等が挙げられる。また、外科的に生体から取り出した組織、または体毛のように生体から脱落した組織であってもよい。さらに、食品等の加工物から調製した試料であってもよい。
【００１６】
＜検出方法〜第１の態様＞
本発明の第１の態様にかかる標的分子の検出方法は、
標的分子の検出方法であって、
標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドプライマーと、一本鎖環状DNAとの複合体を形成させる工程、ローリングサークル増幅によって前記複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出する工程、
を含む。
【００１７】
以下、第１の態様について説明する。
＜一本鎖環状DNA＞
一本鎖環状DNAは、第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域とを含み、好ましくは、さらにグアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列を含む。
【００１８】
図１を参照し、例を挙げて説明する。なお、一本鎖環状DNAでは、時計回りに５’→３’である。一本鎖環状DNA１０は第１の領域１０１（プライマー結合配列）とその３’側に連結した第２の領域１０２（キャプチャーオリゴポリヌクレオチド１１の第1の領域１１１に相補的な配列）と、グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列１０３を含む。配列１０１の長さは好ましくは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。配列１０２の長さは、通常、１０〜３０塩基であり、好ましくは１５〜２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。
【００１９】
グアニン四重鎖形成配列としては、Nat Rev Drug Discov. 2011 Apr; 10(4): 261-275.に記載されたような配列が挙げられ、Ｇ3Ｎ1-10Ｇ3Ｎ1-10Ｇ3Ｎ1-10Ｇ3で表されるが、具体的には、配列番号１〜６に記載の配列などが例示される。グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列としては、Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3が例示される。すなわち、連続する３つのＣが、１〜１０個（好ましくは１〜５個）の任意の塩基（Ｎ＝Ａ，Ｔ，ＧまたはＣ）からなる配列をスペーサーとして、４回繰り返される配列である。
22mer DNA（２２ＡＧ：5'-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3' （配列番号１）および
２２Ｋｉｔ：5'-AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG-3'（配列番号２））、
26mer DNA（２６Ｔｅｌ：5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTT-3'（配列番号３））、
27mer DNA（２７Ｍｙｃ：5'-TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGA AGG-3'（配列番号４））、
20mer DNA（２０Ｓｒｃ：5'-GGGCGGCGGGCTGGGCGGGG-3'（配列番号５））、
18mer RNA（１８Ｒａｓ：5'-GGGAGGGGCGGGUCUGGG-3'（配列番号６））。
【００２０】
グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列はその前後、すなわち、第１の領域１０１との間および第２の領域１０２との間に任意の配列を含んでもよい。一本鎖環状DNA１０全体の長さは、好ましくは３５〜１００塩基である。
【００２１】
なお、図１では、検出試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列である場合について説明したが、例えば、検出試薬結合配列をアプタマー配列もしくは分子ビーコン（FRETを生じさせる蛍光基（ドナー）と消光基（アクセプター）を有するヘアピン状のオリゴヌクレオチド）結合配列とし、検出試薬として、アプタマー結合性発色分子もしくは分子ビーコンを用いて検出することも可能である。また、検出試薬結合配列にハイブリダイズする標識プローブを用いて検出することも可能である。
【００２２】
一本鎖環状DNA１０は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。一本鎖ＤＮＡの環状化は、任意の手段によって行うことができるが、例えば、CircLigase（登録商標）、CircLigase II（登録商標）、ssDNA Ligase（Epicentre社）、ThermoPhage ligase（登録商標） single-stranded DNA（Prokzyme社）を用いて行うことができる。
【００２３】
＜オリゴヌクレオチドプライマー＞
オリゴヌクレオチドプライマーは、標的分子に結合する第１のアプタマー配列と、その３’側に連結された、一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列とを含む。オリゴヌクレオチドプライマーの配列はDNA配列であってもよいし、RNA配列であってもよいし、DNAとRNAの混合配列であってもよい。また、アプタマーの結合特性、ハイブリダイズ特性および伸長特性が維持される限り、さらに修飾核酸や核酸アナログを含む配列であってもよい。
図１では、オリゴヌクレオチドプライマー１２は、標的分子１４に結合する第１のアプタマー配列１２１と、その３’側に連結された、一本鎖環状DNAの第１の領域１０１に相補的な配列１２２とを含む。第１のアプタマー配列１２１の長さは通常、１０〜３０塩基であり、好ましくは１５〜２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０〜７０％であり、一本鎖環状DNAの第１の領域１０１に相補的な配列１２２の長さは好ましくは７〜８塩基である。
なお、プライマーは担体に固定化するなどして固相化されてもよい。これにより固相での検出も可能となる。固相化法としては、ビオチンなどでプライマーを標識し、アビジン等との相互作用により固相化する方法などが挙げられる。
【００２４】
アプタマー配列は、上記のような標的分子と結合する配列である。アプタマーは標的分子のアプタマー配列として公知の配列（例えば、Nucleic Acids Res (2004) 32 (suppl_1): D95-D100.に記載のアプタマーデータベースに記載の配列）を使用してもよいし、ＳＥＬＥＸ（Stoltenburg, R.ら、(2007), Biomolecular Engineering 24、381〜403頁；Tuerk, C.ら、Science 249、505〜510頁；Bock, L. C.ら、(1992)、Nature 355、564〜566頁）または非ＳＥＬＥＸ（Berezovski, M.ら(2006)、Journal of the American Chemical Society 128、1410〜1411頁）を用いて選択された配列を使用してもよい。
標的分子に結合する2種類のアプタマー配列を第1および第2のアプタマー配列として使用すればよい。
【００２５】
また、第1および第2のアプタマー配列は2種類別々に選択されてもよいが、ステムループ構造やバルジループ構造などを形成して2ヵ所で標的分子に結合するアプタマー配列をループ部分で切断して得られるスプリットアプタマーを第１および第２のアプタマーとして使用してもよい。
【００２６】
＜キャプチャーオリゴヌクレオチド＞
キャプチャーオリゴヌクレオチドは、一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列と、
その３'側に連結された前記標的分子に結合する第２のアプタマー配列とを含む。キャプチャーオリゴヌクレオチドの配列はDNA配列であってもよいし、RNA配列であってもよいし、DNAとRNAの混合配列であってもよい。また、ハイブリダイズ特性やアプタマーの結合特性が維持される限り、さらに修飾核酸や核酸アナログを含む配列であってもよい。
図１で説明すると、キャプチャーオリゴヌクレオチド１１は、一本鎖環状DNA１０の第２の領域１０２に相補的な配列１１１と、その３'側に連結された前記標的タンパク質に結合する第２のアプタマー配列１１２とを含む。
配列１１１および配列１１２の長さは、通常、１０〜３０塩基であり、好ましくは１５〜２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。
なお、第２のアプタマー配列１１２から非特異的な伸長反応が進行しないようにするために第２のアプタマー配列１１２の３’末端はリン酸基などで修飾されていることが好ましい。
【００２７】
＜増幅方法＞
標的分子１４が存在すると、標的分子１４と、キャプチャーオリゴヌクレオチド１１と、一本鎖環状DNA１０と、オリゴヌクレオチドプライマー１２との４者複合体が形成され、その結果、ローリングサークル増幅（RCA）法によって核酸増幅反応が行われる。
【００２８】
４者複合体を形成させる条件は、標的分子と一本鎖環状DNAとキャプチャーオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを検討し、適宜設定できる。
ただし、検出部分にアプタマーを用いるため、1価のアルカリ金属イオンや2価のアルカリ土類金属イオンを含有した反応液を用いることが望ましく、これら1種または2種以上の塩濃度は適宜設定できる。ただし、高塩濃度になるとローリングサークルアンプリフィケーション(RCA)の反応を阻害するため、これらの金属イオンの塩濃度は0から20mMまでが望ましい。
【００２９】
RCA法はLizardi et al., Nature Genet. 19: 225-232 (1998);米国特許第５，８５４，０３３号及び同第６，１４３，４９５号；ＰＣＴ出願ＷＯ９７／１９１９３などに記載されている。RCA法は、例えば、phi29 polymerase、Klenow DNA Polymerase (5'-3', 3'-5'exo minus) 、Sequenase（登録商標）Version 2.0 T7 DNA Polymerase (USB社)、Bsu DNA Polymerase, Large Fragment (NEB社)などの中温性の鎖置換型ＤＮＡ合成酵素や、Bst DNA Polymerase (Large Fragment) 、Bsm DNA Polymerase, Large Fragment (Fermentas社)、BcaBEST DNA polymerase (TakaraBio社)、Vent DNA polymerase (NEB社)、Deep Vent DNA polymerase (NEB社)、DisplaceAce (登録商標) DNA Polymerase (Epicentre社)等の耐熱性の鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いることで行うことができる。
【００３０】
RCAによるＤＮＡの伸長反応は、サーマルサイクラーを用いる必要はなく、例えば、２５℃〜６５℃の範囲の一定の温度において実施される。反応温度は、酵素の至適温度とプライマー鎖長に基づく変性温度（プライマーが鋳型ＤＮＡに結合（アニール）／解離する温度帯）に基づいて通常の手順により適宜設定される。さらに、一定の比較的低温においても実施される。例えば、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素としてphi29ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合は、好ましくは２５℃〜４２℃、より好ましくは約３０〜３７℃で反応する。RCAによって、標的分子１４依存的に、プライマー１２から一本鎖環状DNA１０に沿ってグアニン四重鎖形成配列（配列１０３に対応）を含む核酸（増幅産物１３）が増幅される。増幅産物１３はグアニン四重鎖を含む配列１３１を含んでおり、グアニン四重鎖検出試薬１５によって検出される。したがって、本発明の検出方法により、標的分子の検出及び定量ができる。
【００３１】
＜検出方法〜第２の態様＞
本発明の第２の態様にかかる遺伝子変異検出方法は、
標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、第１の一本鎖環状DNAとからなる第１の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第１の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、
当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２の一本鎖環状DNAと第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のオリゴヌクレオチドプライマーと第２の一本鎖環状DNAとからなる第２の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第２の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出する工程、を含む。
【００３２】
以下、第２の態様について説明する。
第２の態様におけるキャプチャーオリゴヌクレオチドおよび第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、第一の態様で説明したのと同様である。
【００３３】
＜第１の一本鎖環状DNA＞
第１の一本鎖環状DNAは、第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域と、第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列を含む。
【００３４】
図２を参照して説明する。
第１の一本鎖環状DNA２０は、第１の領域２０１（プライマー結合配列）と、第２の領域２０２（キャプチャーオリゴヌクレオチド２１の第1の領域２１１に相補的な配列）と、第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列２０３を含む。
第１の領域２０１の長さは、好ましくは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。第２の領域２０２の長さは通常、１０〜３０塩基であり、好ましくは１５〜２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列２０３の長さは、通常、１０〜３０塩基であり、好ましくは１５〜２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。第１の一本鎖環状DNA２０全体の長さは、好ましくは３５〜１００塩基である。第１の一本鎖環状DNA２０は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。
【００３５】
＜第２の一本鎖環状DNA＞
第２の一本鎖環状DNA２４は、第１の一本鎖環状DNA２０の第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列２０３と同一の配列２４１と、
該配列の３’側に隣接した、第２のプライマー結合配列２４２と、
グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列２４３と、
を含む。
配列２０３の長さは、通常、１０〜３０塩基であり、好ましくは１５〜２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。配列２４２の長さは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列２４３については、第一の態様で説明したのと同様である。第２一本鎖環状DNA２４全体の長さは、好ましくは３５〜１００塩基である。第２の一本鎖環状DNA２４は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。
【００３６】
なお、図２では、検出試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列である場合について説明したが、検出試薬結合配列をアプタマー配列もしくは分子ビーコン（FRETを生じさせる蛍光基（ドナー）と消光基（アクセプター）を有するヘアピン状のオリゴヌクレオチド）結合配列とし、検出試薬として、アプタマー結合性発色分子もしくは分子ビーコンを用いて検出することも可能である（ChemBioChem 2007, 8, 1795-1803；J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 7430-7433）。
【００３７】
＜第２のオリゴヌクレオチドプライマー＞
第２のオリゴヌクレオチドプライマー２５は、第１の一本鎖環状DNA２０の第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列２０３の５’側に隣接した領域２０４と同一の配列２５１（好ましくは８〜１５塩基の配列）と、該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列２４２に相補的な配列２５２（好ましくは７〜８塩基の配列）と、を含む。第２のオリゴヌクレオチドプライマーの配列はDNA配列であってもよいし、RNA配列であってもよいし、DNAとRNAの混合配列であってもよい。また、ハイブリダイズ特性および伸長特性が維持される限り、さらに修飾核酸や核酸アナログを含む配列であってもよい。
【００３８】
＜増幅方法＞
図２に示されるように、
標的分子２７が存在すると、標的分子２７と、キャプチャーオリゴヌクレオチド２１と、一本鎖環状DNA２０と、プライマー２２との４者複合体が形成され、その結果、ローリングサークル増幅（RCA）法によって核酸増幅反応が行われる。反応条件等は第一の態様と同様である。RCAによって、標的分子２７依存的に、プライマー２２から第１の一本鎖環状DNA２０に沿って第１増幅産物２３が増幅される。
【００３９】
増幅産物２３は、第１の一本鎖環状DNA２０の第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列２０３に相補的な配列２３１を含むため、この配列２０３と同一の配列２４１を含む第２の一本鎖環状DNA２４は、第１の増幅産物２３の配列２３１に、配列２４１を介してハイブリダイズする。
このようにしてできた、第１の増幅産物２３と、第２の一本鎖環状DNAの複合体に、第２のオリゴヌクレオチドプライマー２５がハイブリダイズして三者の複合体ができる。
【００４０】
すなわち、第２のオリゴヌクレオチドプライマー２５は、第１の一本鎖環状DNA２０の第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列２０３の５’側に隣接した領域２０４と同一の配列２５１を有するので、第１の増幅産物２３の、第１の一本鎖環状DNA２０の領域２０４に相補的な領域２３２に、配列２５１を介してハイブリダイズする。
また、第２のオリゴヌクレオチドプライマー２５は、配列２５１の３’側に、第２の一本鎖環状DNA２４の第２のプライマー結合配列２４２に相補的な配列２５２を有するので、第２の一本鎖環状DNA２４にも配列２５２を介してハイブリダイズする。
【００４１】
この第１の増幅産物２３と、第２の一本鎖環状DNA２４と、第２のオリゴヌクレオチドプライマー２５との三者複合体から、RCAにより、第２の増幅産物２６（伸長鎖）が増幅される。第２の増幅産物２６はグアニン四重鎖を含む配列２６１を含んでおり、グアニン四重鎖検出試薬２８によって検出される。第二の態様では、第１の増幅産物２３に含まれる領域２３１のそれぞれに第２の一本鎖環状DNA２４がハイブリダイズしてRCA反応が起こるので、検出感度の著しい向上が達せられる。
【００４２】
標的分子が存在すると、標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、一本鎖環状DNAと、オリゴヌクレオチドプライマーとの４者複合体が形成され、その結果、増幅反応が起こり、増幅産物が検出されるが、標的分子が存在しないときは増幅反応が起こらず、増幅産物が検出されない。したがって、本発明の検出方法により、標的分子が検出及び定量できる。
【００４３】
＜検出試薬＞
上記の通り、検出試薬結合配列と検出試薬の組み合わせは任意に決定でき、アプタマー配列とアプタマー結合性発色分子の組み合わせ、分子ビーコン結合配列と分子ビーコンの組み合わせ、特異的配列とそれにハイブリダイズする標識プローブの組み合わせなどを用いてることもできるが、好ましくはグアニン四重鎖とグアニン四重鎖結合試薬の組み合わせである。グアニン四重鎖結合試薬としては、以下のような試薬が挙げられる。
［１］チオフラビンT（ThT）またはその誘導体
【化１】
2018168895.tif 000003
［２］H-aggregate 『 Yan, J. W.; Ye, W. J.; Chen, S. B.; Wu, W. B.; Hou, J. Q.; Ou, T. M.; Tan, J. H.; Li, D.; Gu, L. Q.; Huang, Z. S. Anal. Chem. 2012, 84, 6288-6292.』
【化２】
2018168895.tif 000004
［３］TMPyP4 『Yaku, H.; Fujimoto, T.; Murashima, T.; Miyoshi, D.; Sugimoto, N. Chem. Commun. 2012, 48, 6203-6216.』
【化３】
2018168895.tif 000005
［４］ PPIX 『Li, T.; Wang, E.; Dong, S. Anal. Chem. 2010, 82, 7576-7580.』
【化４】
2018168895.tif 000006
［５］BPBC『Jin, B.; Zhang, X.; Zheng, W.; Liu, X.; Qi, C.; Wang, F.; Shangguan,D. Anal. Chem. 2014, 86, 943-952.』
［６］APD『Nikan, M.; Di Antonio, M.; Abecassis, K.; McLuckie, K.; Balasubramanian, S. Angew. Chem., Int. Ed. 2013, 52, 1428-1431.』
【化５】
2018168895.tif 000007
［７］チアゾールオレンジ（TO）
『Nakayama S.;Kelsey I.; Wang J.; Roelofs K.; Stefane B.; Luo Y.;Lee V  .T.;Sintim H.O. J.Am.Chem.Soc. 2011,133,4856-4864.』
【００４４】
好ましくは、以下の一般式（I）で示されるＴｈＴ誘導体が使用できる（Anal. Chem. 2014, 86, 12078-12084）。特開2016-079132。
【化６】
2018168895.tif 000008
ここで、Ｒ1は水素、またはＯ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでもよい炭素数１〜１０（好ましくは１〜５）の炭化水素基を示す。炭化水素基は直鎖でも分岐鎖でもよいし、飽和でも不飽和でもよく、アルキル基などの脂肪族炭化水素基でもよいし、アリール基やアリールアルキル基などの芳香族炭化水素基でもよい。「Ｏ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでいてもよい」とは、炭化水素基が、アミノ基（−ＮＲ2）（Ｒは独立して水素または炭素数１〜５のアルキル基）、ニトロ基（−ＮＯ2）、シアノ基（−ＣＮ）、イソシアネート基（−ＮＣＯ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、アルデヒド基（−ＣＨＯ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、メルカプト基（−ＳＨ）、スルホン酸基（−ＳＯ3Ｈ）等の窒素原子、酸素原子、硫黄原子等を含む官能基を含んでいてもよいことを意味するほか、エーテル基（−Ｏ−）、イミノ基（−ＮＨ−）、チオエーテル基（−Ｓ−）、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、エステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、チオエステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−）等の窒素原子、酸素原子、硫黄原子等を含む連結基が炭化水素基の炭素骨格の内部又は末端に含まれていてもよいことを意味する。
【００４５】
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立して炭素数１〜５の（脂肪族）炭化水素基を示し、より好ましくは炭素数１〜３の炭化水素基を示し、メチル基が特に好ましい。炭素数１〜５の炭化水素基は直鎖でも分岐鎖でもよいし、飽和でも不飽和でもよい。
【００４６】
ｎは０〜５の整数を示し、より好ましくは０〜３の整数を示し、特に好ましくは１である。
ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示し、より好ましくはＯである。
【００４７】
具体的には以下のような化合物が例示される。
【化７】
2018168895.tif 000009
【化８】
2018168895.tif 000010
【００４８】
検出は、例えば、一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と、RCA産物を含む試料を接触させ、グアニン四重鎖構造に結合した化合物を、化合物が発する蛍光に基づいて検出することにより、被検ＤＮＡ中のグアニン四重鎖構造を検出することができる。検出操作自体は、一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を用いる点を除けば、公知の方法と同様であり、化合物を緩衝液中に溶解した溶液を、被検ＤＮＡを含む試料と接触させ、インキュベーション後、洗浄し、洗浄後に被検ＤＮＡと結合している蛍光色素の蛍光を検出することにより行うことができる。
【００４９】
本発明の標的分子検出試薬は、
上述したような、
第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域とを含む一本鎖環状DNA、
標的分子に結合する第１のアプタマー配列と、その３’側に連結された、一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列とを含むオリゴヌクレオチドプライマー、及び
一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列と、その３'側に連結された前記標的分子に結合する第２のアプタマー配列とを含むキャプチャーオリゴヌクレオチド、
を含む。
一本鎖環状DNAは、さらにグアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列を含んでもよい。
本発明の標的分子検出試薬は、さらに、上記第２の一本鎖環状DNAや第２のオリゴヌクレオチドプライマー、さらには、グアニン四重鎖結合試薬などの検出試薬を含んでもよい。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例の態様には限定されない。【００５１】
＜実施例１−１＞
スプリットアプタマーを用いたトロンビン検出法
図４ a1〜a5の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nM Positive control Primer 2μL (最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、0〜1000mM KCl溶液1μL(最終濃度0〜50mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水4μLを混合した(計20μL)。【００５２】
図４ b1〜b5の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、0〜1000mM KCl溶液1μL(最終濃度0〜50mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水2μLを混合した(計20μL)。【００５３】
図４ c1〜c5の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、0〜1000mM KCl溶液1μL(最終濃度0〜50mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、1μMトロンビン溶液2μL (最終濃度100nM)を混合した(計20μL)。【００５４】
＜実施例１−２＞
スプリットアプタマーを用いたトロンビン検出法(他分子での未反応の確認)【００５５】
図５ a1〜a2の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMトロンビン(Thr)2μLを混合した(計20μL)。【００５６】
図５ b1〜b2の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMリゾチーム(Lys)2μLを混合した(計20μL)。【００５７】
図５ c1〜c2の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMレクチン(Lec)2μLを混合した(計20μL)。【００５８】
図５ d1〜d2の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMストレプトアビジン(SA)2μLを混合した(計20μL)。【００５９】
図５ e1〜e2の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水2μLを混合した(計20μL)。【００６０】
＜実施例１−３＞
スプリットアプタマーを用いたトロンビン検出法(タンパク混合溶液での反応進行確認)
図６ a1〜a4の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、ターゲット溶液(トロンビン/リゾチームLys、トロンビン/レクチンLec、トロンビン/ストレプトアビジンSAの2種類混合物、または、トロンビン/Lys,Lec,SAの四種混合物のいずれか)2μLを混合した(計20μL)。【００６１】
図６ b1〜b4の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMターゲット溶液(リゾチームLys、レクチンLec、ストレプトアビジンSA、または、Lys,Lec,SAの三種混合物のいずれか)2μLを混合した(計20μL)。【００６２】
＜実施例２−１＞
スプリットアプタマーを用いたストレプトマイシン検出法
図８ a1〜a2の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[2] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[2] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水2μLを混合した(計20μL)。【００６３】
図８ b1〜b2の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[2] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[2] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、1mMストレプトマイシン2μL(最終濃度100μM)を混合した(計20μL)。【００６４】
図８ c1〜c2の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[2] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[2] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、1mMアンピシリン2μL(最終濃度100μM)を混合した(計20μL)。【００６５】
図８ d1〜d2の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDetection Probe[2] 2μL(最終濃度12nM)、水または120nMのCapture Probe[2] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、200mM KCl溶液1μL(最終濃度10mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、1mMカナマイシン2μL(最終濃度100μM)を混合した(計20μL)。【００６６】
＜実施例２−２＞
スプリットアプタマーを用いたストレプトマイシンの検出法（塩濃度の検討）
図９ a1〜a5の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nM Positive control Primer 2μL (最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、0〜1000mM KCl溶液1μL(最終濃度0〜50mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水4μLを混合した(計20μL)。【００６７】
図９ b1〜b5の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、0〜1000mM KCl溶液1μL(最終濃度0〜50mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水2μLを混合した(計20μL)。【００６８】
図９ c1〜c5の調製
100nMのDNAテンプレート[2] 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート[1] 2μL(最終濃度40nM)、120nMのCapture Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、120nMのDetection Probe[1] 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー[1] 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、20×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、0〜1000mM KCl溶液1μL(最終濃度0〜50mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、1mMストレプトマイシン 2μL (最終濃度100μM)を混合した(計20μL)。【００６９】
【表１】
2018168895.tif 000011
注１：英大文字はDNA、英小文字はRNA
注２：2本鎖DNAはそれぞれ相補鎖をアニーリングしたものを使用した【００７０】
用いた試薬
ThT(チオフラビンT)誘導体
5×PBS153NM
50 mM HPO42-, 730 mM Cl-, 765 mM Na+, 13.5 mM K+, 12.5 mM Mg2+pH 7.4
1×PBS153NM
10 mM HPO42-, 146 mM Cl-, 153 mM Na+, 2.7 mM K+, 2.5 mM Mg2+pH 7.4【００７１】
ポリメラーゼ反応
上記で調製した溶液を37℃で2時間インキュベートさせた。【００７２】
検出
ポリメラーゼ反応後の溶液 8μLに5×PBS153NMバッファーを2μL加えた。
混合溶液10μLと蛍光色素(1×PBS153NMバッファーに溶けた30μM ThT誘導体溶液、最終濃度(5μM))を2μL混合させて25℃で30分インキュベートさせた。
調製した溶液に410nmのUVランプを照射してカットフィルター(460nmより短波長をカットする)を装着したカメラで撮影した。【００７３】
＜結果＞
実施例１．スプリットアプタマーを用いたトロンビン検出法
本法は、生体内に存在するタンパク質を検出する方法である。
今実験は、トロンビンをターゲットとした。また、トロンビンを検出する部分は、スプリットアプタマーを用いた。設計は、図３のようになっている。
アプタマーが高次構造を取ってトロンビンと結合するようになるため、塩濃度の検討を行った。塩濃度が低すぎると、アプタマーの高次構造が取ることができず、また、高塩濃度の場合は、RCAの反応が阻害される。
図４ a1〜a5においてRCA反応の進行を検討した。結果は、塩濃度10mMまでは反応の進行に影響はなくそれ以上になると阻害されることが分かった。
また、図４ c1に示す様に塩濃度が0mMであるとき反応はしなかったが、図４ c2で示す、10mMの時は反応が進行した。また、それ以上の塩濃度(図４ c3〜5)では反応の進行は確認できなかった。
図５の結果から、トロンビン以外のタンパク質では反応が進行せず、トロンビンのみに特異性があることが分かった。また、図６の結果から、多種のタンパク質が夾雑する場合でもトロンビンが存在すれば反応が進行することが分かった。【００７４】
実施例２．スプリットアプタマーを用いたストレプトマイシン検出法
本法は、小分子を検出する方法である。
今実験では、抗生物質であるストレプトマイシンをターゲットとした。ストレプトマイシンを検出する部分は、スプリットアプタマーを用いた。設計は図７のようになる。
本実験では、ストレプトマイシンの他、アンピシリンとカナマイシンを特異的に検出できるか検討した。
結果は、ストレプトマイシンのみ特異的に検出できることが分かった(図８ b1)。
次に、反応における塩濃度の検討を行った。アプタマーが高次構造を取ってストレプトマイシンと結合するようになるため、塩濃度が低すぎると、アプタマーの高次構造が取ることができず、また、高塩濃度の場合は、RCAの反応が阻害されることが考えられる。
図９ a1〜a5においてRCA反応の進行を検討した。その結果、塩濃度10mMまでは反応の進行に影響はなくそれ以上になると阻害されることが分かった。また、図９ c1に示す様に塩濃度が0mMであるとき反応はしなかったが、図９ c2で示す、10mMの時は反応が進行した。また、それ以上の塩濃度(図９ c3〜5)では反応の進行は確認できなかった。
【符号の説明】
【００７５】
１０・・・一本鎖環状DNA、１１・・・キャプチャーオリゴヌクレオチド、１２・・・オリゴヌクレオチドプライマー、１３・・・増幅産物（伸長鎖）、１４・・・標的分子、１５・・・グアニン四重鎖検出試薬、１０１・・・第１の領域（プライマー結合配列）、１０２・・・第２の領域、１０３・・・グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列、１１１・・・第２の領域に相補的な配列、１１２・・・第２のアプタマー配列、１２１・・・第１のアプタマー配列、１２２・・・第１の領域に相補的な配列、１３１・・・グアニン四重鎖を含む配列【００７６】
２０・・・一本鎖環状DNA、２１・・・キャプチャーオリゴヌクレオチド、２２・・・第１のオリゴヌクレオチドプライマー、２３・・・第１の増幅産物（伸長鎖）、２４・・・第２の一本鎖環状DNA、２５・・・第２のオリゴヌクレオチドプライマー、２６・・・第２の増幅産物（伸長鎖）、２７・・・標的分子、２８・・・グアニン四重鎖検出試薬、２０１・・・第１の領域（プライマー結合配列）、２０２・・・第２の領域、２０３・・・第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列、２０４・・・２０３の５’側に隣接した領域、２１１・・・第２の領域に相補的な配列、２１２・・・第２のアプタマー配列、２２１・・・第１のアプタマー配列、２２２・・・第１の領域に相補的な配列、２３１・・・２０３の相補領域、２３２・・・領域２０４に相補的な領域、２４１・・・第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列２０３と同一の配列、２４２・・・第２のプライマー結合配列、２４３・・・グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列、２５１・・・領域２０４と同一の配列、２５２・・・第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列２４２に相補的な配列、２６１・・・グアニン四重鎖を含む配列
【図１】
2018168895.tif 000013
【図２】
2018168895.tif 000014
【図３】
2018168895.tif 000015
【図４】
2018168895.tif 000016
【図５】
2018168895.tif 000017
【図６】
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【図７】
2018168895.tif 000019
【図８】
2018168895.tif 000020
【図９】
2018168895.tif 000021
【配列表】
2018168895000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月12日(2018.9.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子の検出方法であって、
標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドプライマーと、一本鎖環状ＤＮＡとの複合体を形成させる工程、ローリングサークル増幅によって前記複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出する工程、
を含み、
前記一本鎖環状ＤＮＡは、第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域とを含み、
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、標的分子に結合する１５〜２５塩基の第１のアプタマー配列と、その３’側に連結された、一本鎖環状ＤＮＡの第１の領域に相補的な７〜８塩基の配列とを含み、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、一本鎖環状ＤＮＡの第２の領域に相補的な配列と、その３’側に連結された前記標的分子に結合する１５〜２５塩基の第２のアプタマー配列とを含む、
方法。
【請求項２】
前記一本鎖環状ＤＮＡはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項１に記載の標的分子の検出方法。
【請求項３】
標的分子の検出方法であって、
標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、第１の一本鎖環状ＤＮＡとからなる第１の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第１の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、
当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２の一本鎖環状ＤＮＡと第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のプライマーと第２の一本鎖環状ＤＮＡとからなる第２の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第２の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出する工程、を含み、
前記第１の一本鎖環状ＤＮＡは、第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域と、
第２の一本鎖環状ＤＮＡ結合配列の相補配列と、を含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的分子に結合する１５〜２５塩基の第１のアプタマー配列とその３’側に連結された、第１の一本鎖環状ＤＮＡの第１の領域に相補的な７〜８塩基の配列と、を含み、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、第１の一本鎖環状ＤＮＡの第２の領域に相補的な配列とその３’側に連結された標的分子に結合する１５〜２５塩基の第２のアプタマー配列と、を含み、
前記第２の一本鎖環状ＤＮＡは、第１の一本鎖環状ＤＮＡにおける第２の一本鎖環状ＤＮＡ結合配列相補配列と同一の配列と、該配列の３’側に隣接した、第２のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列と、検出試薬結合配列に相補的な配列と、を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１の一本鎖環状ＤＮＡにおける第２の一本鎖環状ＤＮＡ結合配列相補配列の５’側に隣接した領域と同一の８〜１５塩基の配列と、該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状ＤＮＡの第２のプライマー結合配列に相補的な７〜８塩基の配列とを含む、方法。
【請求項４】
前記検出試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列であり、前記検出用試薬がグアニン四重鎖結合試薬である、請求項２または３に記載の標的分子の検出方法。
【請求項５】
グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列がＣ３Ｎ１−１０Ｃ３Ｎ１−１０Ｃ３Ｎ１−１０Ｃ３配列を含む、請求項４に記載の標的分子の検出方法。
【請求項６】
グアニン四重鎖結合試薬が下記一般式（Ｉ）で表される化合物を含む、請求項４または５に記載の標的分子の検出方法。
【化１】
2018168895.tif 000022
Ｒ１は水素、またはＯ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでもよい炭化水素基を示し、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ独立して炭素数１〜５の炭化水素基を示し、
ｎは０〜５の整数を示し、
ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示す。
【請求項７】
標的分子がタンパク質、ペプチドまたは低分子化合物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の標的分子の検出方法。
【請求項８】
第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域とを含む一本鎖環状ＤＮＡ、
標的分子に結合する１５〜２５塩基の第１のアプタマー配列と、その３’側に連結された、一本鎖環状ＤＮＡの第１の領域に相補的な７〜８塩基の配列とを含むオリゴヌクレオチドプライマー、及び
一本鎖環状ＤＮＡの第２の領域に相補的な配列と、その３’側に連結された前記標的分子に結合する１５〜２５塩基の第２のアプタマー配列とを含むキャプチャーオリゴヌクレオチド、
を含む標的分子の検出用試薬。
【請求項９】
一本鎖環状ＤＮＡは、さらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項８に記載の標的分子の検出用試薬。
【請求項１０】
検出試薬結合配列はグアニン四重鎖形成配列である、請求項９に記載の標的分子の検出用試薬。
【請求項１１】
さらにグアニン四重鎖結合試薬を含む、請求項１０に記載の標的分子の検出用試薬。
【国際調査報告】
2018168895.tif 000023
2018168895.tif 000024
2018168895.tif 000025
2018168895.tif 000026