(57)【要約】  検体中の被分析物質を検出する際の銀増感において、迅速かつ高検出強度での検出を実現しつつ黒色化を抑制する。本発明の一態様は、検体中の被分析物質の金属標識及び銀増感による検出において前記銀増感に用いられ、（ａ）銀含有化合物、（ｂ）銀イオン還元剤、及び（ｃ）反応速度制御剤を含む増感剤であって、（ｃ）反応速度制御剤が式（Ｉ）：2020045671.tif 000037（式中：Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は各々独立に、水素原子、若しくは置換基を有してもよい炭素数１〜３０の１価の脂肪族炭化水素基を表し、但しＲ１、Ｒ２、及びＲ３が全て水素原子になることはなく、又は、Ｒ１及びＲ２は５員環若しくは６員環を形成するとともにＲ３は水素原子、若しくは置換基を有してもよい炭素数１〜３０の１価の脂肪族炭化水素基を表し；Ｘは炭素数１〜３の２価の炭化水素基を表し；そしてｎは１〜３の整数である。）で表される化合物からなる群から選択される化合物である、増感剤を提供する。
2020045671.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の被分析物質の金属標識及び銀増感による検出において前記銀増感に用いられ、
（ａ）銀含有化合物、
（ｂ）銀イオン還元剤、及び
（ｃ）反応速度制御剤
を含む、増感剤であって、
前記（ｃ）反応速度制御剤が、
下記式（Ｉ）：
【化１】
2020045671.tif 000036
（式中：
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は各々独立に、水素原子、若しくは置換基を有してもよい炭素数
１〜３０の１価の脂肪族炭化水素基を表し、但しＲ１、Ｒ２、及びＲ３が全て水素原子に
なることはなく、又は、Ｒ１及びＲ２は５員環若しくは６員環を形成するとともにＲ３は
水素原子、若しくは置換基を有してもよい炭素数１〜３０の１価の脂肪族炭化水素基を表
し；
Ｘは炭素数１〜３の２価の炭化水素基を表し；そして
ｎは１〜３の整数である。）
で表される化合物からなる群から選択される化合物である、増感剤。
【請求項２】
前記金属標識が、金標識、銀標識、パラジウム標識又は白金標識である、請求項１に記載の増感剤。
【請求項３】
前記（ｂ）銀イオン還元剤の対標準水素電極電位が０．５Ｖ以下である、請求項１又は２に記載の増感剤。
【請求項４】
前記（ｂ）銀イオン還元剤が、フェノール類、含窒素複素環式化合物、及び含酸素複素環式化合物からなる群から選択される１又は２以上の化合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の増感剤。
【請求項５】
前記（ｃ）反応速度制御剤が、前記式（Ｉ）中のＲ１、Ｒ２、及びＲ３の合計炭素数１〜４である第１成分を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の増感剤。
【請求項６】
前記第１成分がトリメチルグリシンである、請求項５に記載の増感剤。
【請求項７】
前記（ｃ）反応速度制御剤は、前記式（Ｉ）中のＲ１、Ｒ２、及びＲ３の合計炭素数５〜６０である第２成分をさらに含む、請求項５又は６に記載の増感剤。
【請求項８】
前記第２成分が、脂肪酸アミドアルキルジアルキルアミノ酢酸ベタイン、及びアルキル−カルボキシアルキル−ヒドロキシアルキルイミダゾリニウムベタイン、からなる群から選択される１又は２以上の化合物である、請求項７に記載の増感剤。
【請求項９】
前記（ｃ）反応速度制御剤を、前記増感剤中の銀に対して０．１〜５０モル％の量で含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の増感剤。
【請求項１０】
（ｄ）ｐＨ調整剤を更に含み、
前記（ｄ）ｐＨ調整剤は、カルボン酸、リン酸及び硝酸からなる群から選択される１又は２以上の化合物であり、
前記増感剤のｐＨは、１．５〜３である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の増感剤。
【請求項１１】
検体中の被分析物質を金属標識及び銀増感によって検出する方法であって、
前記被分析物質と、金属標識を含む結合物質とを結合させること、及び
前記金属標識を、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の増感剤で銀増感すること、
を含む、方法。
【請求項１２】
前記金属標識が金属コロイドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記結合物質が、金属標識された抗体である、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
捕捉試薬を担持した担体上に前記被分析物質を供給することをさらに含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出を、フロースルー方式で行う、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出を、ラテラルフロー方式で行う、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
フロースルー検出キットを用いて検体中の被検出物質を検出する方法であって、
前記フロースルー検出キットが、
上側に試料導入口を有するケースと、
前記ケース内に収容された吸収体と、
前記ケース内に収容され、前記試料導入口に対向する第１の主面と前記吸収体に対向する第２の主面とを有する検出用メンブレンと、
任意に、前記試料導入口に着脱可能に嵌込まれた1つ又は複数の窓部を有するキャップと、
を有し、前記第１の主面が、前記試料導入口を介して外部から視認可能である検出領域を有し、
前記検出領域には、被検出物質と結合する検出用リガンドが固定されており、
前記方法が、
（１）前記キャップが装着された状態又は装着されていない状態で、検体と、前記検出用リガンドとは異なる金属標識されたリガンドとを前記第１の主面に適用する第１工程と、
（２）前記第１工程の後、前記キャップが装着されていない状態で、前記検出用メンブレンを前記第１の主面から洗浄液で洗浄する第２工程と、
（３）前記第２工程の後、前記キャップが装着されていない状態で、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の増感剤を前記第１の主面に適用し、次いで前記第１の主面上の被検出物質を検出する第３工程と、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記第３工程において、銀含有化合物と還元剤とを溶液状態で接触させてから前記第1の主面に適用する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２工程において、前記洗浄液を１〜２０μｌ／ｍｍ2の量で前記検出用メンブレンに適用する、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記洗浄液が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びポリオキシエチレンソルビタンモノカルボン酸エステルからなる群から選択される１種以上の界面活性剤を含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記洗浄液が、前記界面活性剤を０．１質量％〜２質量％含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の工程の前に、検体調製工程を更に含み、
前記検体調製工程において、細菌を含む試料の前記細菌を溶菌して、抗原を含む溶菌液を検体として回収する、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
検体中の被検出物質を検出する方法に用いるフロースルー検出キットであって、
上側に試料導入口を有するケースと、
前記ケース内に収容された低吸収性吸収体と、
前記ケース内に収容され、前記試料導入口に対向する第１の主面と前記低吸収性吸収体に対向する第２の主面とを有する検出用メンブレンと、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の増感剤と、
任意に、前記試料導入口に着脱可能に嵌込まれた1つ又は複数の窓部を有するキャップと、
を有し、前記第１の主面が、前記試料導入口を介して外部から視認可能である検出領域を有し、
前記検出領域には、被検出物質と結合する検出用リガンドが固定されている、
フロースルー検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の被分析物質を検出するための増感剤、及び検体中の被分析物質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、検体中の被分析物質を検出する方法としては、被分析物質、及びそれと特異的に結合する結合物質（例えば、金属標識と、被分析物質と特異的に結合するリガンドとを有するもの）を利用する種々の方法が用いられている。これら方法において、被分析物質は、結合物質と結合することで金属標識化されるため、金属標識の検出によってその存在が検出されることになる。【０００３】
例えば、特許文献１は、分析対象物及びそれと特異的に結合する抗体又は抗原による免疫反応を利用することにより、固定化された免疫複合体に由来する標識の信号を分析するイムノクロマトグラフ方法において、金属コロイド標識に金属イオン及び還元剤を接触させることにより起こる還元反応により生じた金属粒子を前記標識に沈着させ、前記固定化免疫複合体の前記沈着物を分析する方法について記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−２０２３０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１は、金属標識を用いた被分析物質の検出において、金属標識と、金属イオンの還元作用で生じる金属粒子の沈着（例えば銀増感）を組み合わせた、迅速、簡便かつ高感度なイムノクロマトグラフ法の提供に言及する。金属標識の銀増感は、金属標識（例えば金属コロイド）の存在下で銀イオンをヒドロキノン又はその誘導体などの還元剤で還元し、金属標識上に銀粒子を析出させることで実現される。金属標識と銀増感との組み合わせによれば、被分析物質の高検出強度での検出が可能になる。特許文献１では、銀増感液［Ｓｉｌｖｅｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃａｔ．ＳＥＫＢ２５０）；Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製］を用いており、増感反応に１０分を要している。発明者らも、同じ銀増感液を用いて金属標識と銀増感の組み合わせを評価したが、増感反応に数十分の時間を要した。被分析物質の検出は、検査の効率化の観点からはより迅速である方が好ましく、従って金属標識と銀増感反応も１分程度で終了することが好ましい。しかし銀増感においては、還元反応速度の制御が難しく、被検出物質の検出所要時間が過度に長くならないように還元反応（すなわち増感）を良好に進行させようとすると、還元反応速度が大きくなりすぎ、増感剤における非特異的な（すなわち金属標識非存在下における）過剰な銀粒子の析出によって黒色化が生じ、金属標識部分の検出が不可能となるという問題が生じていた。したがって、検体中の被分析物質を金属標識及び銀増感によって検出する方法においては、迅速かつ高検出強度での検出を実現しつつ増感剤の黒色化を抑制することが求められている。【０００６】
本発明は、上記の課題を解決し、検体中の被分析物質の金属標識及び銀増感による検出において銀増感に用いられる増感剤、及び検体中の被分析物質を金属標識及び銀増感によって検出する方法であって、迅速かつ高検出強度でありながら、銀増感時の黒色化抑制によって被分析物質の高精度での検出を可能にする、増感剤及び方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一側面は以下の態様を包含する。
［１］  検体中の被分析物質の金属標識及び銀増感による検出において前記銀増感に用いられ、
（ａ）銀含有化合物、
（ｂ）銀イオン還元剤、及び
（ｃ）反応速度制御剤
を含む、増感剤であって、
前記（ｃ）反応速度制御剤が、
下記式（Ｉ）：
【化１】
2020045671.tif 000003
（式中：
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は各々独立に、水素原子、若しくは置換基を有してもよい炭素数
１〜３０の１価の脂肪族炭化水素基を表し、但しＲ１、Ｒ２、及びＲ３が全て水素原子に
なることはなく、又は、Ｒ１及びＲ２は５員環若しくは６員環を形成するとともにＲ３は
水素原子、若しくは置換基を有してもよい炭素数１〜３０の１価の脂肪族炭化水素基を表
し；
Ｘは炭素数１〜３の２価の炭化水素基を表し；そして
ｎは１〜３の整数である。）
で表される化合物からなる群から選択される化合物である、増感剤。
［２］  前記金属標識が、金標識、銀標識、パラジウム標識又は白金標識である、上記態様１に記載の増感剤。
［３］  前記（ｂ）銀イオン還元剤の対標準水素電極電位が０．５Ｖ以下である、上記態様１又は２に記載の増感剤。
［４］  前記（ｂ）銀イオン還元剤が、フェノール類、含窒素複素環式化合物、及び含酸素複素環式化合物からなる群から選択される１又は２以上の化合物である、上記態様１〜３のいずれかに記載の増感剤。
［５］  前記（ｃ）反応速度制御剤が、前記式（Ｉ）中のＲ１、Ｒ２、及びＲ３の合計炭素数１〜４である第１成分を含む、上記態様１〜４のいずれかに記載の増感剤。
［６］  前記第１成分がトリメチルグリシンである、上記態様５に記載の増感剤。
［７］  前記（ｃ）反応速度制御剤は、前記式（Ｉ）中のＲ１、Ｒ２、及びＲ３の合計炭素数５〜６０である第２成分をさらに含む、上記態様５又は６に記載の増感剤。
［８］  前記第２成分が、脂肪酸アミドアルキルジアルキルアミノ酢酸ベタイン、及びアルキル−カルボキシアルキル−ヒドロキシアルキルイミダゾリニウムベタイン、からなる群から選択される１又は２以上の化合物である、上記態様７に記載の増感剤。
［９］  前記（ｃ）反応速度制御剤を、前記増感剤中の銀に対して０．１〜５０モル％の量で含む、上記態様１〜８のいずれかに記載の増感剤。
［１０］  （ｄ）ｐＨ調整剤を更に含み、
前記（ｄ）ｐＨ調整剤は、カルボン酸、リン酸及び硝酸からなる群から選択される１又は２以上の化合物であり、
前記増感剤のｐＨは、１．５〜３である、上記態様１〜９のいずれかに記載の増感剤。
［１１］  検体中の被分析物質を金属標識及び銀増感によって検出する方法であって、
前記被分析物質と、金属標識を含む結合物質とを結合させること、及び
前記金属標識を、上記態様１〜１０のいずれかに記載の増感剤で銀増感すること、
を含む、方法。
［１２］  前記金属標識が金属コロイドである、上記態様１１に記載の方法。
［１３］  前記結合物質が、金属標識された抗体である、上記態様１１又は１２に記載の方法。
［１４］  捕捉試薬を担持した担体上に前記被分析物質を供給することをさらに含む、上記態様１１〜１３のいずれかに記載の方法。
［１５］  前記検出を、フロースルー方式で行う、上記態様１１〜１４のいずれかに記載の方法。
［１６］  前記検出を、ラテラルフロー方式で行う、上記態様１１〜１５のいずれかに記載の方法。
［１７］  フロースルー検出キットを用いて検体中の被検出物質を検出する方法であって、
前記フロースルー検出キットが、
上側に試料導入口を有するケースと、
前記ケース内に収容された吸収体と、
前記ケース内に収容され、前記試料導入口に対向する第１の主面と前記吸収体に対向する第２の主面とを有する検出用メンブレンと、
任意に、前記試料導入口に着脱可能に嵌込まれた1つ又は複数の窓部を有するキャップと、
を有し、前記第１の主面が、前記試料導入口を介して外部から視認可能である検出領域を有し、
前記検出領域には、被検出物質と結合する検出用リガンドが固定されており、
前記方法が、
（１）前記キャップが装着された状態又は装着されていない状態で、検体と、前記検出用リガンドとは異なる金属標識されたリガンドとを前記第１の主面に適用する第１工程と、
（２）前記第１工程の後、前記キャップが装着されていない状態で、前記検出用メンブレンを前記第１の主面から洗浄液で洗浄する第２工程と、
（３）前記第２工程の後、前記キャップが装着されていない状態で、上記態様１〜１０のいずれかに記載の増感剤を前記第１の主面に適用し、次いで前記第１の主面上の被検出物質を検出する第３工程と、
を含む、方法。
［１８］  前記第３工程において、銀含有化合物と還元剤とを溶液状態で接触させてから前記第1の主面に適用する、上記態様１７に記載の方法。
［１９］  前記第２工程において、前記洗浄液を１〜２０μｌ／ｍｍ2の量で前記検出用メンブレンに適用する、上記態様１７又は１８に記載の方法。
［２０］  前記洗浄液が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びポリオキシエチレンソルビタンモノカルボン酸エステルからなる群から選択される１種以上の界面活性剤を含む、上記態様１７〜１９のいずれかに記載の方法。
［２１］  前記洗浄液が、前記界面活性剤を０．１質量％〜２質量％含む、上記態様１７〜２０のいずれかに記載の方法。
［２２］  前記第１の工程の前に、検体調製工程を更に含み、
前記検体調製工程において、細菌を含む試料の前記細菌を溶菌して、抗原を含む溶菌液を検体として回収する、上記態様１７〜２１のいずれかに記載の方法。
［２３］  検体中の被検出物質を検出する方法に用いるフロースルー検出キットであって、
上側に試料導入口を有するケースと、
前記ケース内に収容された低吸収性吸収体と、
前記ケース内に収容され、前記試料導入口に対向する第１の主面と前記低吸収性吸収体に対向する第２の主面とを有する検出用メンブレンと、
上記態様１〜１０のいずれかに記載の増感剤と、
任意に、前記試料導入口に着脱可能に嵌込まれた1つ又は複数の窓部を有するキャップと、
を有し、前記第１の主面が、前記試料導入口を介して外部から視認可能である検出領域を有し、
前記検出領域には、被検出物質と結合する検出用リガンドが固定されている、
フロースルー検出キット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、検体中の被分析物質の金属標識及び銀増感による検出において、迅速かつ高検出強度でありながら、銀増感時の黒色化抑制によって被分析物質の高精度での検出が実現され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ラテラルフロー方式による検出手順の例を示す図である。
【図２】図２は、ラテラルフロー方式による検出手順の別の例を示す図である。
【図３】図３は、フロースルー方式による検出手順の例を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明の一態様に係るフロースルー検出キットの例を示す斜視図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａに示すフロースルー検出キットの上面図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、図４ＢにおけるＣ−Ｃ断面を示す図である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、図４Ｃに示すフロースルー検出キットの分解図である。
【図５Ａ】図５Ａは、図４Ａ〜Ｄに示すフロースルー検出キット１００におけるキャップ１２の形状を示す斜視図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａに示すキャップ１２の上面図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、図５Ａに示すキャップ１２の側面図である。
【図５Ｄ】図５Ｄは、図５ＢにおけるＤ−Ｄ断面を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明の一態様に係るフロースルー検出キットの別の例を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図６ＡにおけるＢ−Ｂ断面を示す図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、図６Ａ及びＢに示すフロースルー検出キット２００におけるキャップ２２の形状を示す斜視図である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、図６Ａ及びＢに示すフロースルー検出キット２００におけるキャップ２２の形状を示す斜視図である。
【図７Ａ】図７Ａは、図４Ｃ及びＤに示す固定部品１５の形状を示す上面図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７ＡにおけるＢ−Ｂ断面を示す図である。
【図８Ａ】図８Ａは、図６Ａ及びＢに示すケース２１の上側部材２１ａを上側からみた斜視図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図６Ａ及びＢに示すケース２１の上側部材２１ａを下側からみた斜視図である。
【図９】図９は、図４Ａ〜８Ｂに示すフロースルー検出キットの検出用メンブレンにおける検出領域Ｄの上面図である。
【図１０】図１０は、ラテラルフロー方式による検出手順の一実施態様例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の例示の実施形態（以下、本実施形態ともいう。）について説明するが、本発明は以下の実施の形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。本開示において、各種特性値は、特記がない限り、実施例に記載される方法又はこれと同等であることが当業者に理解される方法に基づいて得られる値を意味する。なお、本明細書において引用される特許公報、特許出願公開公報、及び非特許公報を含む全ての文献は、その全体が援用により、あらゆる目的において本明細書に組み込まれる。
【００１１】
＜増感剤＞
本発明の一態様は、検体中の被分析物質の金属標識及び銀増感による検出において銀増感に用いられる増感剤を提供する。増感剤は、（ａ）銀含有化合物、（ｂ）銀イオン還元剤、及び（ｃ）反応速度制御剤を含む。
【００１２】
増感剤は、検体中の被分析物質の金属標識及び銀増感による検出において銀増感に用いられる。一態様においては、被分析物質と金属標識を含む結合物質とを結合させることによって被分析物質を金属標識化すること、及び金属標識を銀増感すること、によって、被分析物質が検出（すなわち可視化）される。可視化手段としては、目視、顕微鏡（例えば、光学顕微鏡、又は電子顕微鏡）、リーダー装置（例えば、銀増感された金属標識に光照射し、当該銀増感された金属標識からの反射光を受け取ることで、シグナルを得る装置）等が挙げられる。
【００１３】
［検体］
検体は、被分析物質を含む任意の物質である。検体としては、食品、土壌や地下水などの環境から採取された検体、生体試料（例えば、全血、血清、血漿、尿、尿道分泌物、便、唾液、喀痰、膿、汗又は鼻、咽頭、鼻咽頭若しくは呼吸性の分泌物等、粘膜擦過物、皮膚擦過物）、等が挙げられる。検体は、検出に用いる装置、方法等に応じて、前処理なしで、又は前処理（例えば抽出等）を施してから使用してよい。例えば、抽出試薬、超音波等を用いて細菌を溶菌することによる被分析物質の抽出が好ましい。
【００１４】
[被分析物質]
被分析物質は、結合物質と結合し得る任意の物質である。被分析物質としては、特に限定されるものではないが、細菌（レジオネラ菌、肺炎球菌、大腸菌、Ｏ−１５７、等）、ウィルス（インフルエンザウィルス、アデノウィルス等）等に由来する物質（例えば、タンパク質、核酸、ペプチド等、糖鎖）、抗体（例えばＨＩＶ抗体、ＴＰ抗体等）、生体内タンパク質（例えば、ヘモグロビン、ホルモン等）等が挙げられる。
【００１５】
［結合物質］
結合物質は、金属標識を含む。典型的な態様において、結合物質は、被分析物質と結合し得る構造を有するリガンドと、金属標識とを有する。結合物質は、リガンドを金属標識化したもの、標識用金属とリガンドとの混合物、等であってよい。一態様において、結合物質は金属標識された抗体である（すなわちリガンドが抗体である）。金属標識された抗体は、例えば、抗体と標識用金属のコロイドとを結合させる方法で調製できる。この方法は従来公知であり、例えばＴｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．７，ｐｐ６９１−６９６，（１９８２））に準拠して行ってよい。
【００１６】
好ましい態様において、金属標識における金属としては、金、銀、白金、鉄、水酸化アルミニウムなどの金属や金属硫化物、及びこれらの組合せ等が挙げられ、好ましくは、金、銀、白金、パラジウム及びこれらの組合せが挙げられる。好ましい態様において、金属標識は金標識、銀標識又は白金標識である。典型的な態様において、金属は金属コロイドである。金属コロイドとしては、適当な粒径の観点から、金コロイド又は銀コロイド又は白金コロイドが好ましい。例えば金コロイドは赤色、銀コロイドは黄色、白金コロイドは黒色を示すことから、それぞれ視認度が高く好ましい。金属コロイドの平均粒径の下限は、良好なシグナル強度（したがって良好な検出強度）を得る観点から、約５ｎｍ以上が好ましく、２０ｎｍ以上がさらに好ましい。一方、金属コロイドの平均粒径の上限は、被分析物質と結合物質との良好な結合（したがって良好な検出精度）の実現の観点から、約１５０ｎｍ以下が好ましく、約８０ｎｍ以下がさらに好ましい。上記平均粒径は、透過型電子顕微鏡による１００個の粒子粒径計測結果の平均値である。
【００１７】
［被分析物質とリガンドとの組合せ］
被分析物質と結合物質のリガンドとの組合せは、当該リガンドが被分析物質と特異的に結合するような組合せであればよく、組合せは当業者の技術常識に従って適宜選択される。結合物質と被分析物質との結合の形式は問わない。ここで、「特異的」とは、主に被分析物質のみと反応する性質を意味する。被分析物質は一種類の物質でもよく、複数種類の物質でも良い。被分析物質−リガンドの組合せ例としては、抗原―抗体、抗体―抗原、特定分子−当該特定分子に対するアプタマー（例えば、タンパク質―配位子、受容体―配位子、核酸―相補性核酸等）等が挙げられる。典型的な態様において、被分析物質は抗原であり、リガンドは、当該抗原に対して特異性を有する抗体である。例えば、被分析物質が抗原である場合の当該抗原に対して特異性を有する抗体としては、特に限定されるものではないが、被分析物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、被分析物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、又はそれらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］を用いることができる。これらの抗体は、常法により調製できる。常法については、例えば国際公開第２０００／００６６０３号パンフレット等に記載されている。
【００１８】
［増感剤の構成成分］
増感剤は、金属標識の銀増感に用いられる。銀増感は、金属標識の存在下で銀イオンを還元剤で還元し、金属標識上に銀粒子を析出させることで実現される。一態様において、増感剤は、（ａ）銀含有化合物、（ｂ）銀イオン還元剤、及び（ｃ）反応速度制御剤を含む。以下、増感剤の構成成分の例示の態様について説明する。
【００１９】
（ａ）銀含有化合物
銀含有化合物の種類は限定されず、銀イオンを生成可能な任意の銀含有化合物を用いることができる。例としては、無機銀塩、有機銀塩、銀錯体等が挙げられる。銀含有化合物としては、銀イオンを生成し易くかつ還元剤以外の物質と反応し難い点で、硝酸銀、銀カルボン酸塩、ハロゲン化銀、塩素酸銀、過塩素酸銀、酢酸銀、硝酸銀、フッ化銀等が好ましく、硝酸銀がより好ましい。銀含有化合物は、溶媒中に溶解又は分散させた状態とするのが好ましい。溶媒の種類は、銀含有化合物中の銀がイオン状態で存在できるように適宜選択されればよく、例えば水や、リン酸、酢酸、シュウ酸等の水性緩衝液などを用いることができる。
【００２０】
増感剤全体に対する（ａ）銀含有化合物の含有率は、銀イオン基準での質量％で、良好な増感効果を得る観点から、好ましくは０．１％以上、より好ましくは１％以上、さらに好ましくは３％以上であり、黒色化を抑制して良好な検出感度を得る観点から、好ましくは５０％以下、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１５％以下である。
【００２１】
（ｂ）銀イオン還元剤
（ｂ）銀イオン還元剤（以下、還元剤ともいう。）は、（ａ）銀含有化合物に由来する銀（Ｉ）イオンを銀に還元する能力を有する物質である。（ｂ）還元剤は無機還元剤でも有機還元剤でもよい。無機還元剤としては、遷移金属（例えばＦｅ、Ｖ、Ｔｉ等）の塩等の還元性金属塩（還元性金属錯塩も包含する）を使用できる。有機還元剤としては、例えば銀を用いた現像において還元剤として使用できることが当業者に理解される種々の化合物を使用できる。このような化合物としては、例えば特開２００９−９８１３９公報等に記載されるような、ハロゲン化銀写真感光材料に用いられる現像主薬等が挙げられる。
【００２２】
銀イオンと還元剤との反応性が良好である（すなわち良好な還元能を有する）点で、（ｂ）還元剤の酸化還元電位（対標準水素電極電位）は、０．５Ｖ以下であることが好ましい。さらに、銀イオンとの酸化還元電位差が大きいために、銀イオンと還元剤との反応性が良好である（すなわち良好な還元能を有する）点で、（ｂ）還元剤は、好ましくは有機還元剤であり、より好ましくは、フェノール類、含窒素複素環式化合物、含酸素複素環式化合物等であり、さらに好ましくは、２価フェノール類、含窒素複素環式ケトン、含酸素複素環式ケトン等である。
【００２３】
好ましい態様において、（ｂ）還元剤が有機還元剤である場合、（ｂ）還元剤の酸化還元電位（対標準水素電極電位）は、通常−０．３〜０．５Ｖの範囲にある。一方、（ａ）銀含有化合物由来の銀イオンの酸化還元電位（対標準水素電極電位）は、通常０．８〜０．９Ｖの範囲にある。このような態様では、銀イオンと還元剤との酸化還元電位差が０．３〜１．２Ｖ程度と大きく、増感反応速度を高めやすく、好ましい。一方で、還元反応が急激に進行し易く、増感剤の黒色化が起こりやすい。（ｃ）反応速度制御剤は、例えば上記態様のような銀イオンと還元剤との間の大きい電位差を緩衝する（すなわち活性化エネルギーを増大させる）ことで、金属標識非存在下での銀イオン還元反応の急激な進行を抑制し、したがって増感剤の黒色化を抑制できると考えられる。本開示で、酸化還元電位は、ｐＨイオンメーター（例えばＴＯＡ−ＤＫＫ製ｐＨイオンメーターＨＭ−４２Ｘ）にＯＲＰ複合電極（例えば東亜ディーケーケー（株）製「ＰＳＴ−５８２１Ｃ」）を装着し、還元剤を溶解した２３℃の水溶液中に電極を浸漬し測定される値である。蒸留水中に還元剤のみを０．１Ｍ濃度で溶解した水溶液の測定結果を以下に示す。
【００２４】
【表１】
2020045671.tif 000004
【００２５】
フェノール類は、フェノール性水酸基を少なくとも１つ有する化合物である。フェノール類はフェノール性水酸基以外の官能基を１つ又は２つ以上有してもよい。好ましい一態様において、フェノール類は２価フェノール類（すなわち、フェノール性水酸基を２つ有する化合物）である。銀イオン還元能の点で、フェノール類としては、ヒドロキノン（ハイドロキノン）、レゾルシン、アミノフェノール、ピロガロール、カテコール、ベンゼントリオール、等（これらは、置換基として例えばメチル基、アミノ基、カルボキシル基、及び／又はニトロ基を更に有してもよい）が挙げられる。好ましい態様において、フェノール類は、ヒドロキノン、及びパラ-メチルアミノフェノール硫酸塩（メトール）である。
【００２６】
含窒素複素環式化合物及び含酸素複素環式化合物は、それぞれ、含窒素複素環を有する化合物全般及び含酸素複素環を有する化合物全般を意味する。含窒素複素環式化合物及び含酸素複素環式化合物としては、それぞれ、還元性の構造（例えばケトン構造等）を有しているものが好ましい。銀イオン還元能の点で好ましい含窒素複素環式化合物としては、含窒素複素環式ケトン等が挙げられ、銀イオン還元能の点で好ましい含酸素複素環式化合物としては、含酸素複素環式ケトン等が挙げられる。
【００２７】
含窒素複素環式化合物が有する含窒素複素環としては、ピラゾリン環、ピロール環、ピリジン環、イミダゾール環、イミダゾリン環、オキサゾール環、チアゾール環、ピラゾリドン環等が挙げられる。含窒素複素環式化合物の特に好ましい例は、ピラゾリドン環含有化合物である。ピラゾリドン環含有化合物としては、Ｎ−フェニル−３−ピラゾリドン（フェニドン）、等が挙げられ、銀イオン還元能の点で特に好ましい。
【００２８】
含酸素複素環式化合物が有する含酸素複素環としては、フラン環、オキシシクロヘプタトリエン環等が挙げられる。含酸素複素環式化合物の特に好ましい例は、銀イオン還元能の点で、フラン環含有化合物、特にアスコルビン酸又はその塩（例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等）である。
【００２９】
（ｂ）還元剤は、２種以上の化合物の組合せでもよい。例えば、ヒドロキノンとパラ−メチルアミノフェノール硫酸塩（メトール）との組合せ、ヒドロキノンとＮ−フェニル−３−ピラゾリドン（フェニドン）との組み合わせ、Ｎ−フェニル−３−ピラゾリドン（フェニドン）とアスコルビン酸との組み合わせなどが可能である。ヒドロキノンとパラ−メチルアミノフェノール硫酸塩（メトール）の組み合わせは、特に良好な銀イオン還元能を示す点で好ましい。
【００３０】
増感剤中の（ｂ）還元剤の含有率は、還元剤の対銀イオン濃度比率で、還元反応の良好な進行の観点から、好ましくは１モル％以上、より好ましくは５モル％以上、さらに好ましくは１０モル％以上であり、黒色化を良好に抑制する観点から、好ましくは５０モル％以下、より好ましくは４０モル％以下、さらに好ましくは３０モル％以下である。
【００３１】
（ｃ）反応速度制御剤
一態様において、（ｃ）反応速度制御剤は、下記式（Ｉ）：
【化２】
2020045671.tif 000005
（式中：
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は各々独立に、水素原子、若しくは置換基を有してもよい炭素数１〜３０の１価の脂肪族炭化水素基を表し、但しＲ１、Ｒ２、及びＲ３が全て水素原子になることはなく、又は、Ｒ１及びＲ２は５員環若しくは６員環を形成するとともに、Ｒ３は水素原子、若しくは置換基を有してもよい炭素数１〜３０の１価の脂肪族炭化水素基を表し；
Ｘは炭素数１〜３の２価の炭化水素基を表し；そして
ｎは１〜３の整数である。）
で表される化合物からなる群から選択される。
【００３２】
本開示の（ｃ）反応制御剤は、アンモニウムカチオン性基とカルボキシレートアニオン性基との両者を有し、かつ分子全体としての電荷が中性である分子（分子性塩、双性イオン化合物等といわれることもある。）である。（ｃ）反応速度制御剤は、銀イオン還元反応の適切な（すなわち遅過ぎない）速度での進行による高い増感強度（従って良好な検出強度）の実現と、黒色化抑制による被分析物質の高精度での検出の実現との両立に寄与する。理論に拘束されるものではないが、（ｃ）反応速度制御剤は、その電荷に起因して、例えばカルボン酸等と比べて銀に配位し易いと考えられ、（ｃ）反応速度制御剤が銀に配位すると、銀イオンと還元剤との反応が進行し難くなる（還元反応の活性化エネルギーが増大する）結果、還元反応の急激な進行に起因する黒色化を抑制できると考えられる。
【００３３】
式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は各々独立に、水素原子、又は置換基を有してもよい炭素数１〜３０の１価の脂肪族炭化水素基を表す（但しＲ１、Ｒ２、及びＲ３が全て水素原子になることはない）。なお本開示において、ある基について言及する「炭素数」は、当該基が置換基を有する場合には当該置換基の炭素数も含む数であることが意図される。「炭素数１〜３０の１価の脂肪族炭化水素基」は、直鎖状、分岐鎖状又は脂環式の基であり、飽和でも不飽和でもよい。当該脂肪族炭化水素基としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基等が挙げられる。アルキル基の例として、メチル基、エチル基、ラウリル基、ステアリル基、リグノセリル基、ミリシル基等が挙げられ、好ましくはアルキル基である。炭素数１〜３０の１価の脂肪族炭化水素基の炭素数は、良好な黒色化抑制の観点から、好ましくは１以上、より好ましくは２以上、さらに好ましくは３以上であり、還元反応の良好な進行の観点から、好ましくは３０以下、より好ましくは２５以下、さらに好ましくは２０以下である。
【００３４】
好適例において、式（Ｉ）で表される化合物は、黒色化抑制、良好な増感強度、及び副反応抑制の観点から、式（Ｉ）中のＲ１、Ｒ２及びＲ３が各々独立して、無置換又は置換の、炭素数１〜４、又は炭素数１〜３、又は炭素数１のアルキル基である化合物である。
【００３５】
別の好適例において、式（Ｉ）で表される化合物は、黒色化抑制、良好な増感強度、及び副反応抑制の観点から、式（Ｉ）中のＲ１が、直鎖又は分岐の、炭素数５〜３０、又は炭素数８〜２０、又は炭素数１０〜１８、又は炭素数１２〜１８の、無置換又は置換のアルキル基又はアルケニル基であり、Ｒ２及びＲ３が各々独立して、炭素数１〜３０、又は炭素数１〜７、又は炭素数１〜５、又は炭素数１〜３の、無置換又は置換の（好ましくは、ヒドロキシ基、アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選択される基で置換された）アルキル基である化合物である。この態様において、Ｒ１は、好ましくは、炭素数５〜３０のアルキル基又はアルケニル基であって、１又は複数のＲ４−ＣＯ−ＮＲ５−（式中、Ｒ４及びＲ５は、各々独立して、水素原子、並びに、置換又は無置換の、アルキル基、アルケニル基及びアルキニル基からなる群から選択され、但しＲ４及びＲ５の合計炭素数は１〜２０である）で示されるアミド基で置換されているものである。好ましくは、Ｒ４はアルキル基又はアルケニル基、Ｒ５は水素原子、アルキル基又はアルケニル基である。この態様において、式（Ｉ）で表される化合物は、好ましくは、脂肪酸アミドプロピルベタイン、例えば、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン、ラウリン酸アミドプロピルベタイン、イソステアリン酸アミドプロピルベタイン、リノレイン酸アミドプロピルベタイン、パーム核脂肪酸アミドプロピルベタイン等であり、より好ましくは、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン、及びラウリン酸アミドプロピルベタインである。
【００３６】
別の一態様においては、式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２が５員環又は６員環を形成するとともに、Ｒ３が水素原子、又は置換基を有してもよい炭素数１〜３０の１価の脂肪族炭化水素基である。Ｒ３の「炭素数１〜３０の１価の脂肪族炭化水素基」の好ましい態様は前述と同様である。５員環及び６員環は、それぞれ、飽和又は不飽和、炭素環又は複素環（例えば含窒素複素環）であることができる。５員環としては、ピロール環、イミダゾール環、ピラゾール環、オキサゾール環、チアゾール環、イミダゾリン環などが挙げられ、６員環としては、ピリジン環、ピリダジン環、ピリミジン環、ピラジン環、チアジン環などが挙げられ、合成が容易で比較的安価に入手できる観点から好ましい環は、イミダゾリン環である。
【００３７】
Ｒ１及びＲ２が５員環又は６員環を形成している場合の式（Ｉ）で表される化合物の好適例は、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、及びウンデシル−Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−カルボキシメチルイミダゾリニウムベタインである。
【００３８】
「炭素数１〜３０の１価の脂肪族炭化水素基」が置換されている場合の置換基としては、ハロ基、ヒドロキシ基、アルコキシ基（例えば炭素数１〜２０）、アミノ基、カルボキシ基、エステル基、アシル基（例えば炭素数１〜２０）、Ｒ４−ＣＯ−ＮＲ５−（式中、Ｒ４及びＲ５は、各々独立して、水素、並びに、置換若しくは無置換の、アルキル基、アルケニル基及びアルキニル基からなる群から選択され、但し、Ｒ４及びＲ５の合計炭素数は１〜２０である）で表されるアミド基、等が挙げられ、より典型的には、ヒドロキシ基、アミノ基及びカルボキシ基が挙げられる。
【００３９】
式（Ｉ）において、Ｘは炭素数１〜３の２価の炭化水素基を表す。「２価の炭化水素基」は、置換基を有していてもよく、また飽和又は不飽和であることができる。炭化水素基の例として、アルキレン基（例えばプロピレン基、エチレン基、メチレン基）が挙げられる。中でも、エチレン基、メチレン基等、特にメチレン基が、アンモニウムカチオン性基とカルボキシレートアニオン性基の距離が近くイオン化しやすくなり、銀への配位が促進され反応速度制御能が高まる観点から好ましい。２価の炭化水素基の炭素数は、良好な黒色化抑制と、還元反応の良好な進行の両立の観点から、好ましくは３以下、より好ましくは２以下、さらに好ましくは１である。
【００４０】
式（Ｉ）において、ｎは１〜３の整数である。ｎは、良好な黒色化抑制と還元反応の良好な進行の観点から、好ましくは３以下、より好ましくは２以下、さらに好ましくは１以下である。
【００４１】
（ｃ）反応速度制御剤は、黒色化抑制、良好な増感強度、及び副反応抑制の観点から、好ましくは、トリメチルグリシン、ラウリン酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン（ラウラミドプロピルベタイン、例えば、商品名：エナジコールＬ−３０Ｂ（ライオン(株）から入手可能）、ソフダゾリンＬＰＢ−Ｒ（川研ファインケミカル（株）から入手可能））、ヤシ脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン（コカミドプロピルベタイン、例えば、商品名：エナジコールＣ−３０Ｂ（ライオン(株）から入手可能）、ソフダゾリンＣＰＢ−Ｒ（川研ファインケミカル（株）から入手可能））、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン（例えば、商品名：エナジコールＣＮＳ（ライオン(株）から入手可能））からなる群から選択される１種又は複数種の組合せである。
【００４２】
分子量が比較的小さい反応速度制御剤は、銀に配位し易く、かつ銀イオンと還元剤との反応を阻害し難い傾向があることから、良好な増感強度を実現できる点で有利である。しかし、反応速度制御剤の分子量が比較的小さい場合、還元反応の急激な進行の抑制能が弱く、金属標識非存在下でも銀の析出が起こりやすいという傾向もある。一方、分子量が比較的大きい反応速度制御剤によれば、還元反応の急激な進行の抑制が可能であり、金属標識非存在下では銀の析出が起こりにくい点で有利である。
【００４３】
したがって、黒色化抑制、良好な増感強度の実現、及び副反応抑制を同時に満足するという点で、（ｃ）反応速度制御剤は、好ましくは、分子量が比較的小さい化合物と、分子量が比較的大きい化合物との組合せである。一態様において、（ｃ）反応速度制御剤は、分子量２００未満の低分子量成分と、分子量２００以上の高分子量成分とを含む。低分子量成分の分子量は、好ましくは８８以上２００未満、より好ましくは１０２〜１８０である。高分子量成分の分子量は、好ましくは２００〜１０００、より好ましくは２５０〜７００、さらに好ましくは３００〜５００である。この場合、低分子量成分／高分子量成分のモル比率は、黒色化抑制、良好な増感強度の実現、及び副反応抑制の観点から、好ましくは１／１〜２０００／１、より好ましくは３／１〜１００００／１、さらに好ましくは５／１〜５００／１である。
【００４４】
黒色化抑制、良好な増感強度、及び副反応抑制の観点から、（ｃ）反応速度制御剤は、式（Ｉ）中のＲ１、Ｒ２、及びＲ３の合計炭素数が１〜４である化合物から選択される第１成分を含むことが好ましい。また同様の観点から、（ｃ）反応速度制御剤は、上記第１の成分と、式（Ｉ）中のＲ１、Ｒ２、及びＲ３の合計炭素数５〜６０である化合物から選択される第２成分と、を含むことが好ましい。この場合、第１成分／第２成分のモル比率は、黒色化抑制、良好な増感強度の実現、及び副反応抑制の観点から、好ましくは１／１〜２０００／１、より好ましくは３／１〜１００００／１、さらに好ましくは５／１〜５００／１である。
【００４５】
黒色化抑制、良好な増感強度、及び副反応抑制の観点から、（ｃ）反応速度制御剤は、より好ましくは、トリメチルグリシンである第１成分と、脂肪酸アミドアルキルジアルキルアミノ酢酸ベタイン及びアルキル−カルボキシアルキル−ヒドロキシアルキルイミダゾリニウムベタインからなる群から選択される１又は２以上の化合物である第２成分との組合せを含み、特に好ましくは当該組合せからなる。中でも、トリメチルグリシンと、ラウリン酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ヤシ脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン、及び２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、からなる群から選択される１種又は複数種、との組合せは好ましい。
【００４６】
増感剤中の（ｃ）反応速度制御剤の含有率は、還元剤の対銀イオン濃度比率で、良好な黒色化抑制効果を得る観点から、好ましくは０．１モル％以上、より好ましくは０．３モル％以上、さらに好ましくは０．７モル％以上であり、還元反応を良好に進行させる観点から、好ましくは５０モル％以下、より好ましくは４０モル％以下、さらに好ましくは３０モル％以下である。
【００４７】
（ｄ）ｐＨ調整剤
増感剤は、（ｄ）ｐＨ調整剤を含んでいてもよい。（ｄ）ｐＨ調整剤は、増感剤のｐＨを組成に応じて所望範囲に調整することで、（ｃ）反応速度制御剤の銀への配位の程度を良好に制御できる。ｐＨ調整剤としては、有機酸、有機塩基、無機酸及び無機塩基が挙げられ、これらを１種又は複数種の組合せで使用できる。化学的安定性の観点から、有機酸としては、クエン酸、酢酸、シュウ酸等のカルボン酸化合物、及びリン酸化合物が好ましく、無機酸としては、リン酸、硝酸、硫酸等の鉱酸が好ましく、有機塩基としては窒素原子を含むアミン或いは複素環式化合物が好ましく、無機塩基としては、水酸化ナトリウムが好ましい。ｐＨ調整剤は、安全性の観点から、カルボン酸化合物及び硝酸からなる群から選択される化合物である。
【００４８】
増感剤中の（ｄ）ｐＨ調整剤の含有率は、増感剤の目的のｐＨに応じて決定されるが、ｐＨを所望の範囲に容易に調整する観点から、増感剤中のモル濃度が好ましくは０．１〜３０００ｍＭ、より好ましくは１〜１０００ｍＭ、さらに好ましくは、５〜３００ｍＭである。
【００４９】
（ｅ）酸化防止剤
増感剤は、（ｂ）還元剤の自動酸化防止の観点から、さらに（ｅ）酸化防止剤を含んでいてもよい。（ｅ）酸化防止剤としては、抗酸化物質として知られるもの、例えばビタミンC（アスコルビン酸）、ビタミンＥ（トコフェロール）、ＢＨＴ（ジブチルヒドロキシトルエン）、ＢＨＡ（ブチルヒドロキシアニソール）、エリソルビン酸ナトリウム、没食子酸プロピル、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、二酸化硫黄、クロロゲン酸、カテキン、等を用いることができる。好ましくは、亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、及びアスコルビン酸からなる群から選択される化合物が用いられる。（ｅ）酸化防止剤は、水溶性と化学的安定性の観点から、亜硫酸塩及びチオ硫酸塩からなる群から選択される化合物である。
【００５０】
増感剤中の（ｅ）酸化防止剤の濃度は、良好な酸化防止効果を得る観点から、好ましくは０．０１ｍＭ以上、より好ましくは０．０５ｍＭ以上、さらに好ましくは０．１ｍＭ以上であり、銀イオンとの反応による析出物生成を抑制する観点から、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは５ｍＭ以下、さらに好ましくは２ｍＭ以下である。
【００５１】
本発明の一態様において、反応効率や操作性の観点から、ｐＨが特定範囲に調整された増感剤中で銀増感を行うことが好ましい。一態様において、増感剤は、（ａ）銀含有化合物、（ｂ）銀イオン還元剤、（ｃ）反応速度制御剤、及び（ｄ）ｐＨ調整剤を含む。
【００５２】
典型的な態様において、増感剤は溶媒を含む。溶媒は、銀含有化合物及び／又は還元剤を分散又は溶解させ得る任意の溶媒であってよく、好ましくは、水、エチレングリコール等である。
【００５３】
好適な態様において、増感剤のｐＨは、好ましくは１．５〜４、より好ましくは１．７〜３．５、さらに好ましくは２〜３の範囲である。ｐＨが上記範囲である場合、（ｃ）反応速度制御剤の銀に対する配位の程度を、黒色化抑制と良好な増加強度を良好な範囲に制御できる。
【００５４】
本発明の一態様において、増感剤中のハロゲン化物イオン濃度は、ハロゲン化銀が沈殿を生じるため、低い方が好ましい。ハロゲン化物イオンの中でも、特に塩化物イオンは各種試薬の不純物として含まれることが多い。増感剤中の塩化物イオンの含有率は、増感剤中の銀１００モル％に対して、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、さらに好ましくは０．１％以下であり、最も好ましくは０％である。塩化物イオンは、増感剤の構成成分中の不純物に由来する。増感剤中の塩化物イオンは、余剰の銀イオンとの副反応により沈殿の原因となると推定される。この副反応は、増感反応自体に影響を及ぼすものではなく、後述するラテラルフロー方式では問題とはならないが、フロースルー方式に適用した場合には、検出結果の視認性の点で不利になる傾向がある。したがって、塩化物イオンモル濃度を上記範囲とすることは、特にフロースルー方式において有利である。
【００５５】
一態様において、増感剤は、（ａ）銀含有化合物の水溶液である液Ａと、（ｂ）銀イオン還元剤、（ｃ）反応速度制御剤、及び（ｄ）ｐＨ調整剤を含む液である液Ｂとを混合することで調製してよい。液Ｂの酸化還元電位（対標準水素電極電位）は、増感強度と黒色化抑制効果を良好に得る観点で、好ましくは０．１〜０．６Ｖ、より好ましくは０．２〜０．５７Ｖ、更に好ましくは０．３〜０．５４Ｖの範囲にある。
【００５６】
＜検出方法＞
本発明の一態様は、
検体中の被分析物質を金属標識及び銀増感によって検出する方法であって、
被分析物質と、金属標識を含む結合物質とを結合させること、及び
金属標識を銀増感すること、を含み、
銀増感を、（ａ）銀含有化合物、（ｂ）銀イオン還元剤、及び、（ｃ）反応速度制御剤の存在下で行う、方法を提供する。
【００５７】
本実施形態の方法の銀増感においては、金属標識部分に銀含有化合物及び還元剤を接触させることによって、銀含有化合物の銀イオンの還元により生じた銀粒子を金属標識部分に付着させることができる。銀増感は、被分析物質の存在のより明瞭な検出に有利である。本実施形態の方法において、検体、被分析物質、結合物質、増感剤の組成等の好ましい態様は、＜増感剤＞の項で上述したのと同様であってよい。本実施形態の方法の一態様において、銀増感は、前述の＜増感剤＞の項で例示した増感剤を用いて行ってよい。
【００５８】
［銀増感］
一態様において、銀増感は、（ａ）銀含有化合物、（ｂ）銀イオン還元剤、及び、（ｃ）反応速度制御剤の存在下で行う。（ｃ）反応速度制御剤の存在は、銀含有化合物の銀イオン、及び還元剤を、金属標識部分と接触させ、金属部分上で銀イオンの還元反応を適切な速度で進行させるのに有利である。（ａ）銀含有化合物、（ｂ）銀イオン還元剤、及び、（ｃ）反応速度制御剤は、金属標識部分に対して、同時又は順次のいずれで供給されてもよい。また、（ａ）銀含有化合物、（ｂ）銀イオン還元剤、及び、（ｃ）反応速度制御剤の供給の順序は問わない。各成分は、溶液の状態で供給してもよく、又は、（ａ）銀含有化合物、（ｂ）銀イオン還元剤、及び、（ｃ）反応速度制御剤を含む混合物を浸潤状態又は乾燥状態で担体上に定着させ、当該混合物を担体上で金属標識と接触させてもよい。反応効率、操作性、及び増感反応の再現性の観点から、増感溶液の状態での供給が好ましい。
【００５９】
被分析物質と金属標識を含む結合物質との結合は、直接法、間接法、競合法、非競合法等の従来公知の手法によるものであってよい。結合によって、被分析物質と結合物質との複合体（以下、被分析物質−結合物質複合体ともいう。）が形成される。競合法としては、結合物質（金属標識化した抗原）及び被分析物質（抗原）を抗体に結合させて複合体を形成した後、当該複合体の金属標識を検出することによって被分析物質の存在を検出する方法を例示できる。非競合法としては、捕捉試薬（一態様において、検出用リガンド）、及び結合物質を、被分析物質と結合させて、捕捉試薬と被分析物質と結合物質との複合体（以下、捕捉試薬−被分析物質−結合物質複合体ともいう。）を形成し、当該複合体における金属標識を検出することによって、被分析物質の存在を検出する方法を例示できる。検査確度及び簡便性の観点から、非競合法が好ましい。被分析物質と結合物質との結合には、被分析物質及び結合物質の一方が抗原、他方が抗体である方法（すなわち、免疫学的方法）を用いることが好ましい。
【００６０】
非競合法において、捕捉試薬は、いわゆる生物学的プローブとして知られるもの、例えば被分析物質（抗原）に対する抗体、被分析物質（抗体）に対する抗原、被分析物質（タンパク質、低分子化合物等）に対するアプタマー等であってよく、好ましくは抗体又は抗原である。
【００６１】
非競合法において、結合物質と、捕捉試薬とは、同一の物質であっても、異なる物質であってもよい。結合物質と捕捉試薬とがいずれも被分析物質に特異的に結合する抗体である方法は、サンドイッチ法として知られており好ましい。結合物質は、捕捉試薬を介して被分析物質に結合してもよい。この態様における結合物質は、捕捉試薬に対して結合し得る物質であってよい。結合物質としては、ビオチン標識化抗体に結合する金属標識化ストレプトアビジン、未標識の抗体に結合する金属標識化プロテインＡ等が挙げられる。
【００６２】
捕捉試薬は担体に担持されていてもよい。典型的な態様において、担体は不溶性担体（すなわち、本実施形態の方法を通じて形態が保持されるように構成されている担体）である。好適な例においては、不溶性担体上の捕捉試薬に、被分析物質−結合物質複合体を結合させて、捕捉試薬−被分析物質−結合物質複合体を形成し、この捕捉試薬−被分析物質−結合物質複合体の金属標識を検出する。不溶性担体としては、例えば、免疫学的検出方法及び免疫学的装置に適していることが公知である種々の担体を使用できる。不溶性担体は、繊維ウェブ、多孔材、膜、ビーズ等であってよい。免疫学的方法においては、試料検体を毛細管現象によって吸収し流動させる不溶性担体を使用できる。不溶性担体の材質としては、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス、ポリオレフィン、セルロース、及びこれらの混合物が挙げられる。不溶性担体の好適例としては、上記で列挙した材質で構成された繊維ウェブ、多孔膜等が挙げられる。
【００６３】
（ａ）銀含有化合物、（ｂ）銀イオン還元剤、及び、（ｃ）反応速度制御剤の供給タイミングは、被分析物質と結合物質との、結合前、結合時、及び結合後のいずれでもよい。好ましい態様において、反応効率、操作性、及び増感反応の安定性の観点から、結合後の供給が好ましい。
【００６４】
本実施形態の方法は、フロースルー方式、又はラテラルフロー方式であってよい。フロースルー方式に好適な不溶性担体としては、任意の大きさの膜を例示できる。また、ラテラルフロー方式に好適な不溶性担体としては、ストリップ形状の膜を例示できる。いずれの方式においても、不溶性担体上に捕捉試薬を固定化することで、膜状の捕捉試薬を形成できる。
【００６５】
不溶性担体上への捕捉試薬の固定化は、例えば、吸着、化学的結合（例えば、アミノ基、カルボキシル基等の官能基を利用した化学的な結合）等、公知の方法で行うことができる。
【００６６】
［洗浄工程］
本実施形態の方法において不溶性担体を用いる場合、当該方法は、洗浄工程をさらに含むことが、検出精度向上の観点から好ましい。洗浄工程においては、結合物質のうち、捕捉試薬−被分析物質−結合物質複合体を形成していないものを除去する。洗浄工程のタイミングは、捕捉試薬と被分析物質−結合物質複合体との結合前、結合時、及び結合後のいずれでもよい。洗浄工程は、不溶性担体上に洗浄液を適用することにより行うことができる。洗浄液は、結合物質のうち、捕捉試薬−被分析物質−結合物質複合体を形成していないものを除去できるものであれば、制限されず、例えば、界面活性剤水溶液が好ましい。界面活性剤としては、抗原抗体反応により結合した金属コロイドは保持しながら、非特異吸着によってメンブレンに付着した金属コロイドを除去する観点から非イオン界面活性剤が好ましい。例えば、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノカルボン酸エステルなどを用いることができる。ポリオキシエチレンアルキルエーテルの好適例は、繰り返し数が１０〜３０、又は１５〜２５、又は１８〜２２のオキシエチレンユニットと、炭素数が６〜３０、又は１０〜２５、又は１４〜１７のアルキル鎖とを有する。ポリオキシエチレンソルビタンモノカルボン酸エステルの好適例は繰り返し数が１０〜３０、又は１５〜２５、又は１８〜２２のオキシエチレンユニットと、カルボン酸の炭素数が６〜５０、又は８〜２０、又は１０〜１３のアルキル鎖とを有する。洗浄液は、（ａ）銀含有化合物、（ｂ）銀イオン還元剤、及び／又は（ｃ）反応速度制御剤と別々又は同時に供給してよい。好ましい態様においては、洗浄液が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びポリオキシエチレンソルビタンモノカルボン酸エステルからなる群から選択される１種以上の界面活性剤を含む。また、好ましい態様においては、洗浄液が、界面活性剤（好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びポリオキシエチレンソルビタンモノカルボン酸エステルからなる群から選択される１種以上の界面活性剤）を、０．１質量％〜２質量％含む。
【００６７】
［定着工程］
本実施形態の方法において不溶性担体を用いる場合、当該方法は、増感後のシグナルを定着させるための定着工程をさらに含むことが、検出精度向上の観点から好ましい。定着工程は、増感剤供給後に実施してもよい。定着工程は、不溶性担体上に定着液を適用することにより行うことができる。定着液は、増感反応を停止させるものであれば、制限されず、例えば、１質量％硝酸等の酸性水溶液が好ましい。
【００６８】
以下、本実施形態の方法の例として、フロースルー方式に従った方法、及びラテラルフロー（イムノクロマトグラフィー）方式に従った方法を説明する。
【００６９】
フロースロー方式においては、リガンドが固定されたメンブレンの厚み方向に当該検体を通過させて生じさせた表示を検出する一方、ラテラルフロー方式においては、リガンドが固定されたメンブレンの面内方向に当該検体を展開して（すなわちクロマトグラフィー的手法で）生じさせた表示を検出する。
【００７０】
フロースルー方式で検体中の被検出物質を検出する際の典型的な手順は以下のとおりである。検出には、検体中の被検出物質と結合し得る、金属標識されたリガンド（例えば、当該被検出物質を抗原とする抗体を、金コロイド等で金属標識したもの）を用いる。フロースルー検出キットは、通常、検出用メンブレン（典型的には、被検出物質と結合し得る検出用リガンド（例えば捕捉用抗体）が固定されている検出用メンブレン）を有する。検体と金属標識されたリガンドとを検出用メンブレン上に適用して当該検出用メンブレン厚み方向に通過させる。被検出物質の存在は、当該被検出物質と結合している金属標識されたリガンドの金属によって可視化されたシグナル（スポット）として、検出用メンブレン上に示される。
【００７１】
ラテラルフロー方式は、検体及びリガンドをメンブレン内にクロマトグラフィー的に通すという構成を有し、キット構成が簡単であるのが利点であるが、メンブレン内に流せる流体の量に制限がある。一方、フロースルー方式にはこのようなクロマトグラフィー的な流量の制限がないため、多量の検体をメンブレンに流すことで高感度の検出（すなわち検体中に低濃度で存在する被検出物質の検出）が可能であるとともに、メンブレンの適切な洗浄操作を行うことで擬陽性を容易に回避して高精度の検出が可能であるという利点を有する。またフロースルー方式は、検体の流動性が比較的低い場合でも使用可能であるという利点も有する。更に、フロースルー方式では、メンブレンの厚み方向に流体が流れることによって流体抵抗が大きくなり、検体と検出用リガンドとの接触時間を長くできる。このことも高感度の検出に有利である。
【００７２】
本実施形態の方法においては、フロースルー方式が、試料検体の性状によらず良好な検出感度を得る観点から好ましい。なお、フロースルー方式では、検出用メンブレンの厚み方向に流体を流すため、ラテラルフロー方式とは異なり、検出用メンブレン上の検体供給位置と検出表示位置とが同位置となる。検出用メンブレンに供給された流体が検出用メンブレン上又は検出用メンブレン内に過剰に滞留すること、及び検出用メンブレン内への流体の浸透が不均一であることは、正確な検出を妨げる原因となる。したがって、高感度かつ高精度の検出というフロースルー方式の利点を有効に得るためには、検出用メンブレンにおける流体の流れを適量かつ均一にするように、検出用メンブレンにおける流体の流動挙動が高度に制御されていることが望ましい。
【００７３】
フロースルー方式及びラテラルフロー（イムノクロマトグラフィー）方式はいずれも公知であり、本開示で説明する事項以外の手順については当業者が技術常識に基づいて適宜設計できる。以下、図面を参照しながら検出手順の例示の態様について説明するが、これらは例に過ぎず、フロースルー方式又はラテラルフロー方式による方法の実施は例示の態様には何ら限定されない。
【００７４】
［ラテラルフロー方式による検出手順の例］
図１は、ラテラルフロー方式による検出手順の例を示す図である。ラテラルフロー方式の一例においては、図１に示すようなストリップ状の検出機構を用いることができる。検出機構１０においては、不溶性担体１上のストリップ長さ方向一端側（試料流れＢの上流側）に、ストリップ状のコンジュゲートパッド２（この上に結合物質が固定化されている）、及びサンプルパッド３が配置され、他端側（試料流れＢの下流側）に、吸収パッド４が配置されている。不溶性担体１上のストリップ長さ方向中央部には、捕捉試薬５、必要に応じて対照試薬６が固定化されている。対照試薬６は、被分析物質とは結合せず結合物質とは結合する試薬である。試料Ａをサンプルパッド上に適用すると、試料Ａは、コンジュゲートパッド２を通過して不溶性担体１１を試料流れＢの方向に流れる。試料Ａが捕捉試薬５固定部位を通過すると、被分析物質が捕捉試薬５と結合して、捕捉試薬−被分析物質−結合物質複合体が形成される。さらに、試料Ａが対照試薬６固定部位を通過すると、結合物質のうち被分析物質と結合していないものが対照試薬６と結合し、これによって検査の終了（すなわち試料Ａが捕捉試薬５を通過したこと）を確認できる。なお、コンジュゲートパッド２及びサンプルパッド３は、任意に省略することもできる（図２の検出機構２０参照）。本機構においてコンジュゲートパッドを有しない場合、試料Ａ及び結合試薬を、予め混合した状態又は別々の状態で、同時に又は順次に、不溶性担体１上の一端に適用することにより、上記の検査と同様の検査を行うことができる。
【００７５】
ラテラルフロー方式において、銀増感は、
（１）試料Ａ中に（ａ）銀含有化合物、（ｂ）銀イオン還元剤、及び（ｃ）反応速度制御剤を含む増感剤を予め含有させておく（すなわち、金属標識を予め銀増感しておく）方法、
（２）捕捉試薬５よりも試料流れの下流側（例えば、対照試薬６よりも下流側）において、増感剤を不溶性担体１上に固定化しておく（すなわち、試料Ａを不溶性担体１上の増感剤と接触させ、金属標識を銀増感することで、増感剤固定部位において被分析物質の存在を明瞭に可視化する）方法、
（３）試料Ａが吸収パッド４まで達した後に、（ａ）銀含有化合物、（ｂ）銀イオン還元剤、及び（ｃ）反応速度制御剤を含む増感剤中に、検出機構１０を吸収パッド４から浸漬して引き上げることで、捕捉試薬５固定部位に捕捉されている金属標識を銀増感して明瞭に可視化する方法、
等によって実施できる。
【００７６】
［フロースルー方式による検出手順の例］
図３は、フロースルー方式による検出手順の例を示す図である。フロースルー方式の一例においては、図３に示すような任意形状の検出機構３０を用いることができる。検出機構３０においては、検出用メンブレン１４が吸収体１３としての吸収用メンブレン上に積層されており、検出用メンブレン１４上には、捕捉試薬５が固定されている。被分析物質を含む検体を含む試料Ａを検出用メンブレン１４上の捕捉試薬５固定部位に適用すると、試料Ａは検出用メンブレン１４を厚み方向に通過して吸収体１３としての吸収用メンブレンに浸透する。試料が検出用メンブレン１４を通過する際に、検出用メンブレン１４上に固定化された捕捉試薬５に被分析物質が結合し、被分析物質−捕捉試薬複合体が形成される。次いで、検出用メンブレン１４上の、試料適用位置と同位置に、結合物質を供給すると、結合物質と被分析物質とが結合して、捕捉試薬−被分析物質−結合物質複合体が形成される。又は、被分析物質と結合物質とを混合して被分析物質−結合物質複合体を得た後、この複合体を、捕捉試薬が固定化された検出用メンブレン上に適用して、捕捉試薬−被分析物質−結合物質複合体を形成させてもよい。次いで、必要に応じて検出用メンブレン１４の洗浄を行う。次いで、検出用メンブレン１４上の、試料適用位置と同位置に、（ａ）銀含有化合物、（ｂ）銀イオン還元剤、及び（ｃ）反応速度制御剤を同時又は逐時に適用して金属標識の銀増感を行う。銀増感された金属標識によって、被分析物質の存在を検出できる。
【００７７】
＜フロースルー検出方法及びフロースルー検出キット＞
本発明の一態様は、フロースルー方式でありながら、金属標識と銀増感との組合せを用いることができ、それにより被検出物質の高感度かつ高精度な検出が可能である、フロースルー検出方法及びフロースルー検出キット、及び、フロースルー検出に有用な検体の調製方法も提供する。本発明の一態様は、
上側に試料導入口を有するケースと、
該ケース内に収容された吸収体と、
該ケース内に収容され、該試料導入口に対向する第１の主面と該吸収体に対向する第２の主面とを有する検出用メンブレンと、
任意に、該試料導入口に着脱可能に嵌込まれた1つ又は複数の窓部を有するキャップと、
を有し、該第１の主面が、該試料導入口を介して外部から視認可能である検出領域を有し、
該検出領域には、被検出物質と結合する検出用リガンドが固定されている、
フロースルー検出キットを用いて検体中の被検出物質を検出する、フロースルー検出方法、及び、当該フロースルー検出キットを提供する。
【００７８】
本実施形態のフロースルー検出方法及びフロースルー検出キットは、食品、土壌又は地下水等の環境から採取された検体、或いは、全血、血清、血漿、尿、尿道分泌物、便、唾液、喀痰、膿、汗又は鼻、咽頭、鼻咽頭若しくは呼吸性の分泌物等、粘膜擦過物、皮膚擦過物の生体由来物質等の検体中の被検出物質を検出する目的で使用できる。例示の態様において、検体中の被検出物質は、限定されないが抗原又は抗体である。例えば、細菌が有するタンパク質又は多糖（抗原抗体反応の抗原になり得るもの）、生体内に存在する抗体等である。検体は、被検出物質と結合し得る、金属標識されたリガンドとともにフロースルー検出キットに適用される。検体中に当該被検出物質が存在する場合、リガンドと被検出物質とが結合して複合体が形成され、この複合体を検出用メンブレン上の検出用リガンド（上記の金属標識されたリガンドとは異なるリガンド）と更に結合させることで被検出物質の存在を確認できる。
【００７９】
本実施形態の方法では、金属標識及び銀増感のそれぞれによって可視化された被検出物質の検出表示を、フロースルー検出キットの上側から視認する。すなわち、フロースルー方式において、検出表示の視認方向と流体の流通方向とが略同一である。本発明者らは、フロースルー方式において検出表示の視認性を向上させるためには、銀増感を確実に行うこと、そのために、検出用メンブレン上に増感剤を所望の時間確実に存在させることが有意であることを見出した。特に、本発明者らは、フロースルー方式において、検出用メンブレンに、還元剤、次いで銀含有化合物を適用すると、銀含有化合物の適用前に還元剤がメンブレンを既に通過してしまい、増感反応時に良好な増感強度が得られない場合があることに着目した。本実施形態の方法によれば、銀含有化合物及び還元剤を含む増感剤（すなわち、銀含有化合物と還元剤とを含む混合物）を検出用メンブレンに適用するため、このような問題が回避されて、増感反応時に還元剤が良好に機能し、高感度かつ高精度の標識が可能になる。このように、本実施形態によれば、フロースルー方式であっても金属標識と銀増感とを有効に組合せることができるため、検体中の被検出物質を低濃度から高濃度まで幅広い範囲で検出できる。
【００８０】
［フロースルー検出キットの構成］
図４Ａは、本発明の一態様に係るフロースルー検出キットの例を示す斜視図であり、図４Ｂは、図４Ａに示すフロースルー検出キットの上面図であり、図４Ｃは、図４ＢにおけるＣ−Ｃ断面を示す図であり、図４Ｄは、図４Ｃに示すフロースルー検出キットの分解図である。
図４Ａ〜Ｄを参照し、一態様において、フロースルー検出キット１００は、
上側に試料導入口Ｉを有するケース１１と、
任意に、試料導入口Ｉに着脱可能に嵌込まれた、1つ又は複数の窓部Ｗを有するキャップ１２と、
ケース１１内に収容された吸収体１３と、
ケース１１内に収容され、試料導入口Ｉに対向する第１の主面Ｓ１と吸収体１３に対向する第２の主面Ｓ２とを有する検出用メンブレン１４と、
を有する。第１の主面Ｓ１は、試料導入口Ｉを介して外部から視認可能である検出領域Ｄを有する。
【００８１】
（ケース）
ケースは、検出用メンブレン及び吸収体を収容できる任意の形状を有してよい。一態様において、ケース１１は、互いに篏合可能な上側部材１１ａ及び下側部材１１ｂで構成されてよい。
【００８２】
（キャップ）
フロースルー検出キット１００がキャップ１２を有する場合、当該キャップは、フロースルー検出キットに装着された状態において第１の主面Ｓ１との接触部Ｃを有することが好ましい。このような構成によれば、キャップ１２が検出用メンブレン１４の浮き上がり防止に寄与する。検出用メンブレン１４の浮き上がりが防止されることで、検出用メンブレン１４の第１の主面Ｓ１上に流体導入方向Ａにて適用された流体は、第１の主面Ｓ１から第２の主面Ｓ２に向かって、予め設計されたとおりの流動挙動で、検出用メンブレン１４内を厚み方向に通過できる。すなわち、接触部Ｃの寄与により、検出用メンブレン１４における流体の流れが適量かつ均一になる。
【００８３】
図５Ａは、図４Ａ〜Ｄに示すフロースルー検出キット１００におけるキャップ１２の形状を示す斜視図であり、図５Ｂは、図５Ａに示すキャップ１２の上面図であり、図５Ｃは、図５Ａに示すキャップ１２の側面図であり、図５Ｄは、図５ＢにおけるＤ−Ｄ断面を示す図である。
【００８４】
図５Ａ〜Ｄを参照し、キャップ１２は、ケース１１の試料導入口Ｉ上に着脱可能である形状を有し、検体収容部Ｖ（下面に窓部Ｗを有する）、及び検出用メンブレンとの接触部Ｃを有する。接触部Ｃは、検出用メンブレンに接触するような任意の形状を有してよく、好ましくは、検出用メンブレンを吸収体に向かって押圧するような形状を有する。接触部Ｃによって、検出用メンブレンの浮き上がりが良好に防止される。接触部が検出用メンブレンを押圧する場合の押圧力の例としては、圧力測定フィルム（例えば富士フィルム社製「プレスケール」ＬＬＬＷ，ＬＬＷ，ＬＷ（厚み約１８０μｍ））を吸収体の上に挿入し、液流調整メンブレンや検出用メンブレンなど他の部材を配置せずにフロースルー検出キットを組み、キャップを嵌めた際の接触部Ｃ下部のプレスケールの色調を観察することにより凡その圧力を測定したとき、０．１〜１０ＭＰａであることが挙げられる。
【００８５】
好ましい態様において、キャップの、検出用メンブレンの第１の主面との接触部の算術平均粗さＲａは、検出用メンブレンの良好な固定の観点から、好ましくは０．０１μｍ以上、より好ましくは０．０３μｍ以上であり、検出用メンブレンを損傷なく固定する観点から、好ましくは１μｍ以下、より好ましくは０．３μｍ以下である。
【００８６】
図６Ａは、本発明の一態様に係るフロースルー検出キットの別の例を示す図であり、図６Ｂは、図６ＡにおけるＢ−Ｂ断面を示す図であり、図６Ｃは、図６Ａ及びＢに示すフロースルー検出キットにおけるキャップの形状を示す斜視図であり、図６Ｄは、図６Ａ及びＢに示すフロースルー検出キットにおけるキャップの形状を示す斜視図である。
【００８７】
図６Ａ〜Ｄを参照し、一態様において、キャップ２２の検体収容部Ｖは、多量の検体を収容できるような大容量を有してよい。一態様において、キャップの検体収容部の容量は、検体中に低濃度で存在する被検出物質を良好に検出する観点で、キャップ窓部Ｗ開口部の面積に対し、好ましくは３０μｌ／ｍｍ2以上、より好ましくは６０μｌ／ｍｍ2以上である。上記容量は、より正確な検出の観点から、試料導入口の面積に対し、好ましくは３０００μｌ／ｍｍ2以下、より好ましくは１５００μｌ／ｍｍ2以下であってよい。
【００８８】
キャップが有する１つ又は複数の窓部は、検体及びリガンドを検出領域に適度な流量で適用する観点で、丸孔（例えば図５Ａ〜Ｄ及び図６Ａ〜Ｄにおけるキャップ１２，２２の３つの窓部Ｗのように）であることが好ましい。丸孔の直径は、好ましくは０．１〜５ｍｍ、より好ましくは０．５〜２ｍｍである。窓部の個数の好適例は、１〜３個、又は１〜２個である。窓部が複数個あれば、同時に複数の被分析物質を検出することが可能になる。
【００８９】
（固定機構）
好ましい態様において、検出用メンブレンは、ケースに対して直接、又は間接的に（すなわち他の部材を介して）固定されている。固定の手段としては、押圧固定、接着等を用いることができる。一態様において、検出用メンブレンは、検出領域以外の領域の一部においてケースに直接又は間接的に固定されている。一態様において、検出用メンブレンは、検出領域以外の領域の実質的に全部においてケースに直接又は間接的に固定されている。
【００９０】
好ましい態様において、フロースルー検出キットは、固定機構を有する。一態様において、固定機構は、検出用メンブレンの第１の主面の検出領域以外の領域の少なくとも一部を固定する検出用メンブレン固定面を有する。一態様において、検出用メンブレン固定面は、検出用メンブレンを吸収体に向かって押圧することで固定する検出用メンブレン押圧面である。
【００９１】
図７Ａは、図４Ｃ及びＤに示す固定部品１５の形状を示す上面図であり、図７Ｂは、図７ＡにおけるＢ−Ｂ断面を示す図である。
図７Ａ及びＢを参照し、一態様において、固定機構は、ケース１１に嵌合された固定部品１５である。固定部品１５は、開口Ｏを有する平板状であってよく、検出用メンブレン１４を検出領域Ｄ以外の領域の少なくとも一部において固定する。固定部品１５自体が押圧固定で検出用メンブレン１４を固定してもよいし、固定部品１５と検出用メンブレン１４とが接着剤１６を介して互いに接着されていてもよいし、これらの組合せであってもよい。一態様において、固定部品１５は、検出用メンブレン固定面Ｆにて、検出用メンブレン１４を固定（好ましくは押圧固定）する。この際、キャップ１２，２２の接触部Ｃは、固定部品１５の検出用メンブレン固定面Ｆよりも下側に位置することが好ましい。これにより、検出用メンブレン１４は、検出領域Ｄにおいては接触部Ｃによって比較的強く固定され、検出領域Ｄ以外では検出用メンブレン固定面Ｆによって比較的弱く固定されることになり、検出用メンブレンの損傷防止と高精度の検出とが良好に両立される。
【００９２】
図８Ａは、図６Ａ及びＢに示すケース２１の上側部材２１ａを上側からみた斜視図であり、図８Ｂは、図６Ａ及びＢに示すケース２１の上側部材２１ａを下側からみた斜視図である。好ましい態様において、固定機構は、ケース２１（具体的には上側部材２１ａ）の一部である検出用メンブレン固定面Ｆである。
【００９３】
（検出用メンブレン）
検出用メンブレンは、フロースルー検出キットの上記のような典型的な使用態様に適した特性を有することが望ましい。具体的には、検出用メンブレンは、検体、リガンド、洗浄液、増感剤等の流体を厚み方向に適切な流速で通過させることが好ましい。ここで、適切な流速とは、例えば、
−検体について、被検出物質が検出用メンブレン上の検出用リガンドと十分反応する程度には遅いが検出用メンブレンの第１の主面上又は内部に過剰に滞留しない程度には速い、
−洗浄液について、検出用メンブレンから未反応の検体及びリガンドを十分除去する程度には遅いが検出用メンブレンの第１の主面上又は内部に過剰に滞留しない程度には速い、
−増感剤について、還元反応及び金属標識への銀の付着を十分進行させる程度には遅いが検出用メンブレンの第１の主面上又は内部に過剰に滞留しない程度には速い、
流速である。
【００９４】
検出用メンブレンは、流体を厚み方向に適切な流速で通過させる観点から、好ましくは、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、及びポリフッ化ビニリデン膜から成る群から選択される多孔膜である。例えば検出用リガンドとして抗体を用いる場合、抗体付着量を高めると共に、抗原及び標識用リガンドの非特異吸着を抑え、高いＳ／Ｎ比を実現する観点からは、ニトロセルロース膜が特に好ましい。
【００９５】
検出用メンブレンの厚みは、浮き上がりが生じ難い点で、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは５０μｍ以上、更に好ましくは１００μｍ以上であり、ポジスポットを明瞭にでき、キット製造時に容易にハンドリングできる程度の力学強度を有する点で、好ましくは１０００μｍ以下、より好ましくは６００μｍ以下、更に好ましくは３００μｍ以下である。
【００９６】
検出用メンブレンの平均孔径は、検体等による検出用メンブレンの孔の閉塞、流体の過剰な滞留等によって、擬陽性の表示が生じることを防止する観点から、好ましくは０．１μｍ以上、より好ましくは０．３μｍ以上、更に好ましくは０．５μｍ以上であり、検出用メンブレンを流体が通過する時間が短すぎないようにして良好な検出強度を得る観点から、好ましくは１０μｍ以下、より好ましくは５μｍ以下、更に好ましくは３μｍ以下である。
【００９７】
好ましい態様において、検出用メンブレンは、第１の主面の総面積のうち１〜９８面積％において他の部材（例えば、ケース、及び存在する場合の固定部品）と接触している。
【００９８】
（吸収体）
吸収体は、検出用メンブレンを通過した流体を吸収するものであればよい。好ましい態様においては、吸収体と検出用メンブレンとの特定の組合せによって、良好に制御された流速で流体が検出用メンブレンを通過する。例えば、検出用メンブレンを低吸水性吸収体と組合せると、検出用メンブレンを流体が通過する時間を、検出用メンブレン単独の場合と比べて長くすることができる。なお本開示で、「低吸収性吸収体」とは、２３℃において、吸収体の表面（１０ｍｍ×１０ｍｍ以上の面積）に対し０．０１質量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液を１００μｌ、マイクロピペットを用いて滴下した後に、その液滴が吸収体表面に１秒間以上残存する吸収体を意味する。低吸収性吸収体であることができる好ましい吸収体としては、ポリビニルアルコール多孔体、ウレタン多孔体、セルロース多孔体、プラスチック粒子（例えば直径０．５〜５０μｍの微細プラスチック粒子）凝集体であるプラスチック多孔体等が挙げられる。低吸水性吸収体は、比較的平均孔径が大きい（例えば平均孔径０．７〜５μｍの）（したがって流体の通過時間が短い）検出用メンブレンと好適に組合される。一方、高吸水性吸収体（すなわち、上記「低吸収性吸収体」よりも吸水速度が大きいもの）としては、ガラス繊維ろ紙、コットンリンター製ろ紙、紙製のろ紙等が挙げられる。高吸水性吸収体は、比較的平均孔径が小さい（例えば平均孔径０．３〜０．７μｍの）検出用メンブレンと好適に組合される。
【００９９】
吸収体の厚みは、良好な吸液性能を得る観点から、好ましくは０．２ｍｍ以上、より好ましくは０．５ｍｍ以上、更に好ましくは１ｍｍ以上であり、良好な吸液性能を得つつキットを小型化する観点から、好ましくは５０ｍｍ以下、より好ましくは３０ｍｍ以下、更に好ましくは１０ｍｍ以下である。
【０１００】
吸収体の吸水速度は、吸収体のメンブレンと接触する面（１０ｍｍ×１０ｍｍ以上の面積）に対し、２３℃で、０．０１質量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液を１００μｌ、マイクロピペットを用いて滴下した後に、その液滴が吸収体表面に残存する時間を測定したときに、好ましくは０〜６００秒、より好ましくは１秒〜４００秒、更に好ましくは２秒〜２００秒である。
【０１０１】
吸収体の最大吸水量は、平板上に吸収体のみを載せ、２３℃で、０．５質量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液を滴下していき、水溶液が吸収体から漏れ出す量を測定したときに、好ましくは５００μｌ〜１０ｍｌ、より好ましくは１ｍｌ〜７ｍｌ、更に好ましくは１．５ｍｌ〜４ｍｌである。
【０１０２】
特に、検出用メンブレンの平均孔径が上記で例示した範囲であり、かつ、吸収体の吸水速度及び／又は最大吸水量が上記範囲である場合、被検出物質と結合していない金属標識されたリガンドが検出用メンブレン上に残存して生じる偽陽性を良好に防止できるという利点が得られる。この利点は、銀増感を更に行う場合において特に顕著である。
【０１０３】
（液流調整メンブレン）
図４Ａ〜Ｄを再び参照し、好ましい態様において、フロースルー検出キット１００は、検出用メンブレン１４と吸収体１３との間に液流調整メンブレン１７を更に有する。液流調整メンブレン１７は、検出用メンブレン１４の第２の主面Ｓ２から流出して液流調整メンブレン１７に達した流体が液流調整メンブレン１７の厚み方向及び面方向の両者に拡散できる材質で構成される。検出用メンブレン１４に試料導入口Ｉから導入された流体は、主として厚み方向に浸透し、面方向には通常僅かしか拡散しないことから、検出用メンブレン１４の第２の主面Ｓ２に達する流体は、検出領域Ｄのほぼ直下の領域に多く分布している。液流調整メンブレン１７は、第２の主面Ｓ２から受入れた流体を、厚み方向に加えて面方向にも拡散させることで、液流調整メンブレン１７を通過した流体を吸収体１３がより大面積で受入れることを可能にする。これにより、吸収体１３のより多くの領域を流体吸収に寄与させることができるため、検出領域Ｄの直下の領域での流体の滞留が良好に回避され、検出領域Ｄにおける検出結果のより明瞭な表示が可能になる。
【０１０４】
液流調整メンブレンの面方向の流体拡散性能は、当該メンブレンの吸水速度及び最大吸収量、検出用メンブレンとの密着性、平坦性等に左右される。
【０１０５】
好ましい態様において、液流調整メンブレンの吸水速度は、２３℃で、０．５質量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液に、幅２４ｍｍ、長さ３０ｍｍの液流調整メンブレンを長さ方向に２ｍｍだけ垂直に挿入し保持し、水溶液が液流調整メンブレンの最上部に到達する時間を測定したときに、１０秒〜１８０秒である。
【０１０６】
好ましい態様において、液流調整メンブレンの最大吸収量は、平面上に置いた幅２４ｍｍ、長さ３０ｍｍの単独の液流調整メンブレンに、２３℃で、０．５質量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液を滴下していき、水溶液が液流調整メンブレンから漏れ出す量を測定したときに、２０μｌ〜２００μｌである。
【０１０７】
好ましい態様において、液流調整メンブレンの両主面は比較的平坦であり、例えば、直径６ｍｍの先端が平坦な測定子を用いた厚さ測定を２４ｍｍ×３０ｍｍの範囲内で９点測定した際の厚みＣＶ値が０．１〜１０％である。
【０１０８】
液流調整メンブレンは、吸水速度、最大吸収量、平坦性をいずれも良好にできる点で、好ましくは、再生セルロース繊維ウェブ、ナイロン不織布、ポリプロピレン不織布、ポリエステル不織布等から選択される。
【０１０９】
液流調整メンブレンの厚みは、良好な液流調整性能を得る観点から、好ましくは１０μｍ以上、更に好ましくは４０μｍ以上であり、良好な液流調整性能を得つつキットを小型化する観点から、好ましくは８００μｍ以下、より好ましくは３００μｍ以下、更に好ましくは１００μｍ以下である。
【０１１０】
（リガンド）
好ましい態様において、フロースルー検出キットは、検出領域に固定されている検出用リガンドを更に有する。検出用リガンドとしては、被検出物質を抗原とする抗体、核酸、レクチン、アプタマー等が挙げられ、好ましくは、被検出物質を抗原とする抗体（好ましくは断片化抗体）である。
【０１１１】
別の態様において、フロースルー検出キットは検出用リガンドを有さないことができる。この場合、フロースルー検出キットの使用時に、検体の適用に先立って、上記で例示したような検出用リガンドを検出用メンブレン上に適用してよい。
【０１１２】
好ましい態様において、フロースルー検出キットは、結合物質として、検出用リガンドとは異なる金属標識されたリガンドを更に有する。金属標識されたリガンドとしては、被検出物質を抗原とする抗体が金属標識（例えば金コロイドで標識）されたもの等が挙げられる。リガンドは、好ましくは、被検出物質を抗原とする抗体（好ましくは断片化抗体）である。
【０１１３】
一態様においては、検出用リガンドと、金属標識されたリガンドとの一方又は両方が、断片化抗体である。一態様においては、検出用リガンドと、金属標識されたリガンドとの一方又は両方が、細胞内抗原に結合する抗体である。一態様において、細胞内抗原は、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原である。
【０１１４】
一態様においては、フロースルー検出キットは、複数種類の検出用リガンド、及び／又は金属標識された複数種類のリガンドを有する。この場合、複数の異なる被検出物質を同時に検出することが可能となる。
【０１１５】
また、一態様においては、フロースルー検出キットは複数の検出領域を備え、複数の検出領域にそれぞれ異なる検出用リガンドが配置されている。この場合、複数の検出領域において、それぞれ異なる被検出物質を独立かつ同時に検出することが可能になる。一態様においては、検出用メンブレン上に、菌種同定用リガンドと耐性因子同定用リガンドとが固定化されていることによって、薬剤耐性菌の菌種及び耐性因子を同時かつ高感度に同定できる。このような同時かつ高感度の同定という利点は、フロースルー方式で顕著に得られるものであるが、菌種同定用リガンドと耐性因子同定用リガンドとの組合せによる菌種及び耐性因子の同時同定という利点は、例えばラテラルフロー方式においても得ることが可能である。
【０１１６】
好ましい態様において、検出領域は、検出用リガンドが配置されている陽性判定領域と、検出用リガンドが配置されていない擬陽性判定領域とを有する。この場合、擬陽性を容易に判別できるため、より正確な検査が可能になる。
【０１１７】
（複数種類の検出用リガンドの例）
図９は、図４Ａ〜８Ｂに示すフロースルー検出キットの検出用メンブレンにおける検出領域Ｄの上面図である。図９を参照し、例えば、菌種同定用リガンドと耐性因子同定用リガンドとの組合せを用いる態様においては、菌種同定用リガンドＤ１１及び耐性因子同定用リガンドＤ１２が、図５Ａ〜Ｄに示すキャップ１２の窓部Ｗに対応する位置に固定化されることによって、検出領域が外部から視認されてよい。なお検出用メンブレンの検出領域は、菌種同定用リガンドＤ１１及び耐性因子同定用リガンドＤ１２が配置されている陽性判定領域Ｄ１と、これらリガンドが配置されていない擬陽性判定領域Ｄ２とを有してもよい。この場合、擬陽性を容易に判別できるため、より正確な検査が可能になる。検出用メンブレンに固定化されている菌種同定用リガンド及び耐性因子同定用リガンドは、それぞれ１種でも２種以上であってもよい。後者の場合、１種の細菌について２種以上の耐性因子の同定、あるいは２種以上の細菌についての菌種及び／又は耐性因子の同定が可能である。また、菌種同定用リガンド及び耐性因子同定用リガンドは、それぞれ、１種当たり、検出用メンブレン上の１か所又は２か所以上に固定化されてよい。
【０１１８】
一態様においては、検出キットが、上側に試料導入口を有するケースと、ケース内に収容された吸収体と、ケース内に収容され、試料導入口を介して外部から視認可能である検出領域を有する検出用多孔膜とを有するフロースルー方式の検出キットであり、検出用多孔膜の検出領域に、菌種同定用リガンドが固定化されている１つ以上の菌種同定用リガンド固定化領域と耐性因子同定用リガンドが固定化されている１つ以上の耐性因子同定用リガンド固定化領域とが、互いの固定化領域の中心がずれるように配置されており、検出キットが、任意に、試料導入口に着脱可能に嵌込まれた、菌種同定用リガンド固定化領域及び耐性因子同定用リガンド固定化領域の位置にそれぞれ対応する複数の窓部を有するキャップを有する。
【０１１９】
細菌の菌種とその耐性因子との関係としては、これらに限定されないが例えば以下を例示できる：
−耐性因子がペプチドグリカン合成酵素である耐性菌として、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）（耐性因子は新規ＰＢＰ（ペニシリン結合タンパク））等；
−耐性因子がβ-ラクタム環加水分解酵素である耐性菌として、β-ラクタマーゼ産生菌（たとえば基質拡張型βラクタマーゼ産生菌（ＥＳＢＬ）及びカルバペネマーゼ産生腸内細菌科菌群（ＣＰＥ））（耐性因子はβ−ラクタマーゼ）等；
−耐性因子がメチラーゼである耐性菌として、アミノグリコシド耐性腸内細菌科（耐性因子は１６ｓリボソーマルＲＮＡメチラーゼ）等。
【０１２０】
菌種同定用リガンドは、細菌固有の被分析物質と特異的に結合するような物質であればよい。被分析物質と菌種同定用リガンドとの結合の形式は問わない。なお本開示で、「特異的に結合」とは、主に対象物のみと結合する性質を意味する。例えば、被分析物質−菌種同定用リガンドの組合せとしては、抗原−抗体、抗体−抗原、特定分子−当該特定分子に対するアプタマー（例えば、タンパク質−配位子、受容体−配位子、核酸−相補性核酸等）等を例示できる。
【０１２１】
耐性因子同定用リガンドは、耐性因子と特異的に結合するような物質であればよい。耐性因子と耐性因子同定用リガンドとの結合の形式は問わない。例えば、耐性因子−耐性因子同定用リガンドの組合せとしては、抗原−抗体、抗体−抗原、特定分子−当該特定分子に対するアプタマー（例えば、タンパク質−配位子、受容体−配位子、核酸−相補性核酸等）等を例示できる。
【０１２２】
典型的な態様においては、菌種同定用リガンドが細菌の表面抗原又は細胞内抗原に対する抗体であり、耐性因子同定用リガンドが耐性因子を抗原とする抗体であり、より典型的には、菌種同定用リガンドが、細菌固有の被分析物質としてのリボソームタンパク（例えばＬ７／Ｌ１２タンパク）を抗原とする抗体であり、耐性因子同定リガンドが、耐性因子としての酵素（例えば、ペプチドグリカン合成酵素又はβ-ラクタム環加水分解酵素）を抗原とする抗体である。菌種同定用リガンド及び耐性因子同定用リガンドがそれぞれ抗体である場合の当該抗体としては、それぞれの抗原で免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、それぞれの抗原で免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、又はそれらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］を用いることができる。これらの抗体は、常法により調製できる。常法については、例えば国際公開第２０００／００６６０３号パンフレット等に記載されている。
【０１２３】
一態様においては、菌種同定用リガンドが、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の被分析物質であるＬ７／Ｌ１２タンパクを抗原とする抗体であり、耐性因子同定用リガンドが、耐性因子であるペニシリン結合タンパクＰＢＰ２aを抗原とする抗体である。
【０１２４】
一態様においては、菌種同定用リガンドが、基質拡張型βラクタマーゼ産生菌及び／又はカルバペネマーゼ産生腸内細菌科細菌の被分析物質であるＬ７／Ｌ１２タンパクを抗原とする抗体であり、耐性因子同定用リガンドが、耐性因子であるβラクタマーゼを抗原とする抗体である。
【０１２５】
なお、本開示の検出キットの構成は本開示で例示したものに限定されず、本開示の目的を達成し得る任意の構成であってよい。例えば、検出キットは、菌種同定用リガンドが固定化された第１の検出用メンブレンと、耐性因子同定用リガンドが固定化された第２の検出用メンブレンとを備えてもよい。
【０１２６】
（複数種類の結合物質）
検出用リガンドが菌種同定用リガンドと耐性因子同定用リガンドとの組合せである場合、結合物質は、細菌結合物質及び耐性因子結合物質を含むことが好ましい。一態様において、細菌結合物質は、細菌固有の被分析物質に特異的に結合するリガンドと金属標識とを含む。また一態様において、耐性因子結合物質は、耐性因子に特異的に結合するリガンドと金属標識とを含む。細菌結合物質及び耐性因子結合物質は、それぞれ、リガンドを標識化したもの、金属標識とリガンドとの混合物、等であってよい。一態様において、細菌結合物質のリガンドは細菌の被分析物質を抗原とする抗体であり、一態様において、耐性因子結合物質のリガンドは耐性因子を抗原とする抗体である。細菌結合物質に含まれるリガンドは、細菌固有の被分析物質と菌種同定用リガンドとの結合を損なわず、かつ当該被分析物質と良好に結合できるものが好ましい。また耐性因子結合物質に含まれるリガンドは、耐性因子と耐性因子同定用リガンドとの結合を損なわず、かつ耐性因子と良好に結合できるものが好ましい。なお、別の態様において、菌種同定用リガンド及び耐性因子同定リガンドの各々に対して結合し得る物質を結合物質として用いてもよい。そのような結合物質としては、ビオチン標識化抗体に結合する金属標識化ストレプトアビジン、未標識の抗体に結合する金属標識化プロテインＡ等が知られており、これらを好適に利用できる。
【０１２７】
細菌結合物質及び耐性因子結合物質の各々の一形態としての金属標識された抗体は、例えば、抗体と標識用金属のコロイドとを結合させる方法で調製できる。この方法は従来公知であり、例えばＴｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．７，ｐｐ６９１−６９６，（１９８２））に準拠して行ってよい。
【０１２８】
銀増感は、細菌結合物質及び耐性因子結合物質の両者に対して適用してよいが、一態様においては、銀増感が、細菌結合物質及び耐性因子結合物質のうち一方のみに適用されてもよい。例えば、上記両者に対して銀増感を適用した際に視認されるシグナル強度が両者の間で大きく異なる場合には、シグナル強度が大きい方に銀増感を行わない（すなわち金属標識のみによるシグナルを検出する）ようにすることで、両者のシグナル強度のバランスを向上させて視認性をより良好にすることができる。一態様においては、耐性因子結合物質を銀増感し、細菌結合物質を銀増感しないことができる。
【０１２９】
［フロースルー検出システムの構成］
本実施形態の方法は、
（１）本実施形態のフロースルー検出キット、並びに、
（２）金属標識用物質と、銀含有化合物及び還元剤を含む増感剤とを含む検査試薬セット、
を含むフロースルー検出システムを用いて好ましく実施できる。したがって、本実施形態は、当該フロースルー検出システムも提供する。
【０１３０】
（金属標識用物質）
金属標識用物質は、金属コロイド（好ましくは金コロイド）と、被検出物質と結合し得るリガンド（例えば、被検出物質が抗原である場合、当該抗原と抗原抗体反応し得る抗体）とを有する。
【０１３１】
（銀含有化合物）
銀含有化合物としては、無機銀塩、有機銀塩、銀錯体等が挙げられる。銀含有化合物としては、銀イオンを生成し易くかつ還元剤以外の物質と反応し難い点で、硝酸銀、銀カルボン酸塩、ハロゲン化銀、塩素酸銀、過塩素酸銀、酢酸銀、フッ化銀等が好ましく、硝酸銀がより好ましい。
【０１３２】
増感剤全体に対する銀含有化合物の含有率は、銀イオン基準での質量％で、良好な増感効果を得る観点から、好ましくは０．１％以上、より好ましくは１％以上、さらに好ましくは３％以上であり、良好な検出感度を得る観点から、好ましくは５０％以下、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１５％以下である。
【０１３３】
（還元剤）
還元剤は、銀含有化合物に由来する銀（Ｉ）イオンを銀に還元する能力を有する物質である。還元剤は無機還元剤でも有機還元剤でもよい。無機還元剤としては、遷移金属（例えばＦｅ、Ｖ、Ｔｉ等）の塩等の還元性金属塩（還元性金属錯塩も包含する）を使用できる。有機還元剤としては、例えば銀を用いた現像において還元剤として使用できることが当業者に理解される種々の化合物を使用できる。有機還元剤としては、フェノール類、含窒素複素環式化合物、含酸素複素環式化合物等が挙げられ、好ましくは、２価フェノール類、含窒素複素環式ケトン、含酸素複素環式ケトン等である。
【０１３４】
還元剤は、２種以上の化合物の組合せでもよい。例えば、ヒドロキノンとパラ−メチルアミノフェノール硫酸塩（メトール）との組合せ、ヒドロキノンとＮ−フェニル−３−ピラゾリドン（フェニドン）との組み合わせ、Ｎ−フェニル−３−ピラゾリドン（フェニドン）とアスコルビン酸との組み合わせなどが可能である。ヒドロキノンとパラ−メチルアミノフェノール硫酸塩（メトール）の組み合わせは、特に良好な銀イオン還元能を示す点で好ましい。
【０１３５】
増感剤中の還元剤の含有率は、増感剤の対銀イオン濃度比率で、還元反応の良好な進行の観点から、好ましくは１モル％以上、より好ましくは５モル％以上、さらに好ましくは１０モル％以上であり、良好な検出感度を得る観点から、好ましくは５０モル％以下、より好ましくは４０モル％以下、さらに好ましくは３０モル％以下である。
【０１３６】
好ましい態様においては、銀含有化合物が銀塩であり、還元剤が有機系還元剤である。
【０１３７】
増感剤は、界面活性剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤等の添加剤を更に含んでもよい。
【０１３８】
増感剤は、銀含有化合物、還元剤、及び任意の添加剤を、予めチューブ内等で混合して調製してよい。
【０１３９】
一態様において、増感剤の好適例としては、本開示の＜増感剤＞の項で説明したものを例示できる。
【０１４０】
以下、本実施形態の方法の各工程について説明する。
【０１４１】
（１）第１工程
第１工程においては、キャップが装着された又は装着されていない状態で（窓部を有するキャップが装着されている場合には当該窓部を介して）、検体と、検出用リガンドとは異なる金属標識されたリガンドとを、別個に、又はあらかじめこれらの混合物の状態で、第１の主面に適用する。あらかじめ混合物を形成する場合、被検出物質とリガンドとを溶液中反応によって良好に結合させることができる。したがって、混合物中では、検体中の被検出物質とリガンドとの複合体が形成されており、被検出物質は金属標識された状態にある。
【０１４２】
また、キャップは、検体を検出用メンブレン上の検出領域上に集中的に分布させることに寄与する。典型的な態様においては、被検出物質と結合し得る検出用リガンドが第１の主面の検出領域（好ましくは陽性判定領域）に固定されており、混合物が検出用メンブレンに適用されると、被検出物質と検出用リガンドとが反応することで、検出領域上に金属標識のシグナル（ポジスポット）が現れる。
【０１４３】
一態様においては、検体の量が多量（好ましくは、前記試料導入口のうち検体導入時に検出用メンブレンが露出している部分の面積に対し、３０μｌ／ｍｍ2以上、より好ましくは７０μｌ／ｍｍ2以上、さらに好ましくは１００μｌ／ｍｍ2以上）であることができる。
【０１４４】
検体と金属標識されたリガンドとを予め接触させた状態で第１の主面に適用する場合の、当該接触から適用までの時間は、良好な検出精度を維持する観点から、好ましくは１５分以下、より好ましくは１０分以下である。
【０１４５】
（２）第２工程
第２工程は、第１工程の後、検出用メンブレンを第１の主面から洗浄液で洗浄する工程である。検出用メンブレンに多量の洗浄液を供給できるようにする観点から、キャップが装着されていない状態で、試料導入口に洗浄液を適用して検出用メンブレンを洗浄することが好ましい。フロースルー方式では、メンブレンの厚み方向に洗浄液を流すことから洗浄効率が高い。洗浄は、検出用メンブレンが完全に乾燥する前に行うのが望ましい。
【０１４６】
洗浄液としては、界面活性剤（例えば前述で例示したような）の水溶液等を使用できる。界面活性剤としては、抗原抗体反応により結合した金属コロイドは保持しながら、非特異吸着によってメンブレンに付着した金属コロイドを除去する観点から非イオン界面活性剤が好ましく、例えば、オクチルフェノールエトキシレート、ポリソルベート等が好適である。
【０１４７】
第２工程においては、良好な洗浄効果を得る観点から、洗浄液を、試料導入口の面積に対し好ましくは１．０〜２０μｌ／ｍｍ2、より好ましくは１．５〜１５μｌ／ｍｍ2、さらに好ましくは１．５〜１０μｌ／ｍｍ2、特に好ましくは２．０〜１０μｌ／ｍｍ2の流量で検出用メンブレンに適用する。洗浄液量が少ない場合、増感検査後の検出用リガンドを塗布していない部分の黒色化度が高くなる傾向がある。これは、検出用リガンドを塗布していない部分にも金属コロイドが残留し、これが増感される結果と考えられる。増感検査後の、検出用リガンドを塗布していない部分の黒色化度が高い場合、検出用リガンドを塗布した部分のシグナルにも非特異的な成分が多く含まれると考えられる。したがって、洗浄液量は上記下限以上であることが好ましい。一方、洗浄液量が多いと、シグナル値が低くなる傾向がある。これは、検出用リガンド塗布部の特異的吸着した金属コロイドも洗浄で一部除去されてしまうためと考えられる。また、洗浄液量が多いと、その分液流れ時間が長くかかるため、検査所要時間が長くなり検査効率は低くなる傾向がある。したがって、洗浄液量は上記上限以下であることが好ましい。
【０１４８】
第２工程において、例えば洗浄液の量が一定である場合、洗浄回数は少ない方が良好な洗浄効果が得られる傾向にある。上記観点から、洗浄は好ましくは２回以下行う。
【０１４９】
（３）第３工程
第３工程では、第２工程の後、銀含有化合物と還元剤とを、これらを予め溶液状態で接触させてから第１の主面に適用する。次いで第１の主面上の被検出物質を検出する。当該適用は、増感を良好に進行させる観点、及び銀増感の視認性を良好にして高感度での検出を可能にする観点から、キャップが装着されていない状態で行うことが好ましい。当該適用後、所定時間おいて、銀の還元反応及び金属標識への銀の付着を十分に進行させる。
【０１５０】
第３工程において、銀含有化合物と還元剤とが増感前に反応する不都合を回避する観点から、銀含有化合物と還元剤との接触から検出用メンブレン上への適用までの時間は、短いほど好ましく、例えば、１０分以下、５分以下、又は３分以下、又は１分以下が好適である。
【０１５１】
第３工程において、銀含有化合物と還元剤とが検出用メンブレンを通過する時間は、増感効果を良好に得る観点から比較的長いことが好ましく、具体的には、好ましくは１０秒間以上、又は１５秒間以上、又は２０秒間以上であり、金属標識以外の部位への銀の付着によって検出結果が不正確になることを回避する観点から、好ましくは１２０秒間以下、又は９０秒間以下、更に好ましくは６０秒間以下である。
【０１５２】
第３工程において、銀含有化合物と還元剤とを検出用メンブレンに適用してから検出までの時間は、明瞭な検出結果を得る観点から、好ましくは５秒間以上、より好ましくは１５秒間以上、更に好ましくは３０秒間以上であり、金属標識以外の部位への銀の付着によって検出結果が不正確になることを回避する観点から、好ましくは１８０秒間以下、より好ましくは１２０秒間以下、更に好ましくは９０秒間以下である。
【０１５３】
（４）検体調製工程
本実施形態のフロースルー検出方法は、第１工程の前に検体調製工程を更に含むことが好ましい。一態様に係る検体調製工程においては、細菌を含む試料の該細菌を溶菌して、抗原（被検出物質として）を含む溶菌液を検体として回収することが好ましい。
【０１５４】
＜検体の調製方法＞
なお一態様において、流体試料が粒状物（例えば、乳（牛乳等）中の乳脂肪球等の懸濁物質等）を含む場合、検体は、細菌と粒状物とを含む流体試料から、細菌由来の抗原を含むが粒状物の含有率が流体試料よりも低減された（好ましくは粒状物を含まない）検体を調製する方法によって得られる。流体試料の一例は、細菌を含み、かつ平均粒径０．１〜２０μｍの乳脂肪球を含み、被検出物質が該細菌に由来する抗原であるものである。なお本開示で、平均粒径は、レーザー回折／散乱式粒子径分布測定装置で測定される値である。一態様においては、このような検体の調製方法を、前述のフロースルー検出方法における第１工程の前に行う。
【０１５５】
細菌と同程度以上のサイズを有する粒状物を含む流体試料はキットの検出用メンブレンを閉塞しやすい。したがって、所望の検出結果を得るためには、検出用メンブレンを閉塞させる成分をあらかじめ除去することが望ましい。例えば、検体中の被検出物質（例えば細菌由来の抗原）を抽出剤（例えば溶菌剤）で抽出し、更にフィルターで濾過すること等によって、検出用メンブレンを閉塞させる成分を除去することが可能であるが、このような方法では、検体が希釈されること、フィルターの閉塞によって検体液量が僅かしか回収できないこと等に起因して、検体中の被検出物質(すなわち、細菌が有するタンパク質）の濃度が低下し、所望の感度及び精度での検査結果が得られない場合がある。流体試料をデプスフィルターで濾過することによって、被検出物質を含む細菌を一定の割合で残渣として捕捉したのち、この残渣を洗浄、次いで溶菌すると、被検出物質を高濃度で含む溶菌液を回収できる。更に、好ましくは、この溶菌液を濾過用メンブレンで濾過する。以上の手順によって、検出用メンブレンを閉塞させる成分が効果的に除去されているとともに目的の被検出物質が棄損されずに（したがって高濃度で）保持されている検体を得ることができる。このような検体はフロースルー検出用の検体として好適である。
典型的な態様においては、液体試料が乳（牛乳等）であり、粒状物が乳脂肪球である。
【０１５６】
例示の態様において、本開示の流体試料としての乳脂肪球を含む流体試料に含まれる乳脂肪球の平均粒径は、例えば０．１μｍ以上、又は０．２μｍ以上、又は０．３μｍ以上であり、例えば２０μｍ以下、又は１０μｍ以下、又は５μｍ以下、又は３μｍ以下、又は２μｍ以下、又は１μｍ以下である。
【０１５７】
例示の態様において、乳脂肪球を含む流体試料中の乳脂肪球の含有比率は、例えば０．１質量％以上、又は５質量％以上、又は１０質量％以上であり、例えば５０質量％以下、又は４０質量％以下、又は３０質量％以下である。
【０１５８】
例示の態様において、流体試料の濁度は、例えば５０ＦＡＵ以上、又は１００ＦＡＵ以上、又は３００ＦＡＵ以上であり、また例えば試料を１００倍希釈した後の濁度で、３０００ＦＡＵ以下、又は２０００ＦＡＵ以下、又は１０００ＦＡＵ以下である。なお本開示の濁度は、ＩＳＯ  ７０２７に準拠して測定し、ホルマジン濁度標準液を用いて作成した検量線から求める値である。
【０１５９】
検体の調製方法としては、下記を例示できる。
デプスフィルターで、細菌と乳脂肪球とを含む流体試料を濾過して、一定割合の細菌と乳脂肪球とを含む固体画分をデプスフィルター上に得る固体画分回収工程と、
任意に、該固体画分を洗浄液で洗浄する洗浄工程と、
該デプスフィルター上の固体画分に溶菌剤を適用することによって、固体画分を、第１の量の乳脂肪球を含む残渣と、細菌由来の抗原及び第２の量（第１の量と同量でも、第１の量よりも多い又は少ない量であってもよい）の乳脂肪球を含む溶菌液とに分離する溶菌工程と、
任意に、該溶菌液を更に濾過する工程と、
を含む方法（方法１）。
【０１６０】
デプスフィルターで、細菌と乳脂肪球とを含む流体試料の量［単位：ｍｌ］Ｆ１とデプスフィルターの面積［単位：ｍｍ2］Ｓとの比Ｆ１／Ｓが０．００２以上０．４以下となる液量にて該流体試料を濾過して、デプスフィルター上に固体画分を得る固体画分回収工程と、
任意に、該固体画分を洗浄液で洗浄する洗浄工程と、
デプスフィルター上の固体画分に、該流体試料の体積量よりも少ない体積量の溶菌剤を適用して、抗原を含む溶菌液を得る溶菌工程と、
任意に、溶菌液を更に濾過する濾過工程と、
を含む方法（方法２）。
ここで、デプスフィルターの上記面積Ｓは、該流体試料が通過するエリアの面積から計算で（すなわち、平膜状のデプスフィルターの主面において、該流体試料が接触・通過する領域の面積として、又はデプスフィルターがひだ状になっている場合は、フィルターを展開した後、該流体試料が接触・通過する領域の合計面積として）求められる値である。
【０１６１】
（デプスフィルター）
デプスフィルターの材質としては、グラスファイバー、ポリプロピレン不織布、ポリエーテルスルホン、セルロースファイバー等を例示できる。デプスフィルターの平均最小孔径は、良好な濾過効率を得る観点から、好ましくは０．６μｍ以上、より好ましくは０．７μｍ以上、更に好ましくは０．８μｍ以上であり、良好な濾過性能を得る観点から、好ましくは２５μｍ以下、より好ましくは１０μｍ以下、更に好ましくは５μｍ以下である。
【０１６２】
デプスフィルターの厚みは、良好な濾過性能を得る観点から、好ましくは２００μｍ以上、より好ましくは５００μｍ以上であり、良好な濾過効率を得る観点から、好ましくは５０００μｍ以下、より好ましくは３０００μｍ以下、更に好ましくは２０００μｍ以下である。デプスフィルタは所望の厚みを得るために複数のフィルタの積層物であっても良い。その際、組み合わせるフィルタの平均最小孔径は異なっても良く、デプスフィルタ全体で上記値を有するように構成されて良い。
【０１６３】
（濾過用メンブレン）
濾過用メンブレンは、溶菌液中の、検出用メンブレンの閉塞を招来する成分（粒子等）を除去する。濾過用メンブレンとしては、セルロース多孔膜、ＰＶＤＦ多孔膜、グラスファイバー膜等を例示できる。セルロース多孔膜の材質としては、混合セルロース、セルロースアセテート、再生セルロース、ニトロセルロース等が挙げられる。濾過用メンブレンの平均孔径は、良好な濾過効率を得る観点から、好ましくは０．１μｍ以上、より好ましくは０．２μｍ以上、更に好ましくは０．３μｍ以上であり、良好な濾過性能を得る観点から、好ましくは２μｍ以下、より好ましくは１μｍ以下、更に好ましくは０．８μｍ以下である。
【０１６４】
濾過用メンブレンは1枚で使用しても、複数枚を合わせて使用しても良い。濾過用メンブレンの合計厚みは、良好な濾過性能と力学強度を得る観点から、好ましくは５０μｍ以上、より好ましくは１００μｍ以上、更に好ましくは１３０μｍ以上であり、良好な濾過効率を得る観点から、好ましくは１５００μｍ以下、より好ましくは１０００μｍ以下、更に好ましくは７００μｍ以下である。
【０１６５】
（洗浄液）
洗浄液としては、界面活性剤の水溶液等を使用できる。界面活性剤としては、デプスフィルターに捕捉した細菌と微量の検体由来成分との性状への影響を最小限にする観点から非イオン界面活性剤が好ましく、例えば、オクチルフェノールエトキシレート、ポリソルベート等が好適である。洗浄液中の界面活性剤の濃度は０．０５〜５質量％であることが好ましい。
【０１６６】
(溶菌剤）
対象となる菌種によるが、溶菌剤は、溶菌酵素を含むことが多い。溶菌酵素は細菌溶菌効果が当業者に知られている公知の酵素、例えばリゾチーム、リゾスタフィン、ラビアーゼ等であってよい。一態様において、溶菌剤は、溶菌酵素、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤及び電解質を含む。
【０１６７】
以下、上記（方法１）及び（方法２）のより具体的な手順を例示する。
【０１６８】
（方法１）
（方法１）においては、デプスフィルターで流体試料を、例えば吸引濾過等で濾過して、一定割合の細菌と乳脂肪球とを含む固体画分をデプスフィルター上に得る。次いで、任意に、該固体画分を洗浄液で洗浄する。洗浄液は連続式又は回分式に添加してよく、残渣が十分洗浄される程度まで洗浄を行う。次いで、溶菌工程において、該デプスフィルター上の固体画分に溶菌剤を適用することによって、固体画分を、第１の量の乳脂肪球を含む残渣と、細菌由来の抗原及び第２の量（第１の量と同量でも、第１の量よりも多い又は少ない量であってもよい）の乳脂肪球を含む溶菌液とに分離する。溶菌工程は、１５℃〜５０℃の温度範囲、ｐＨ５〜８の範囲で行うことが好ましい。
【０１６９】
溶菌剤によって細菌から溶出した抗原は溶菌液中に回収される。乳脂肪球は、主としてデプスフィルター上に残るが、一部の（すなわち第２の量の）乳脂肪球はデプスフィルターを通過して溶菌液中に移行する。（第１の量）／（第２の量）の質量比は、典型的には１／１５〜１５／１、より典型的には１／７〜７／１である。したがって、好ましい態様においては、溶菌液を更に濾過することで、溶菌液から乳脂肪球を取り除く。濾過には、濾過用メンブレン、又は、デプスフィルターと濾過用メンブレンとの組合せを用いる。好ましい態様においては、デプスフィルターと濾過用メンブレンとを重ねて配置し、溶菌液をデプスフィルター、濾過用メンブレンの順に通して検体を回収する。
【０１７０】
（方法２）
（方法２）においては、まず、固体画分回収工程において、デプスフィルターで、乳脂肪球を含む流体試料の量［単位：ｍｌ］Ｆ１とデプスフィルターの表面積［単位：ｍｍ2］Ｓとの比Ｆ１／Ｓが０．００２以上０．４以下となる液量にて乳脂肪球を含む流体試料を濾過して、デプスフィルター上に固体画分を得る。比Ｆ１／Ｓは、検体の調製効率の点で、好ましくは０．００４以上、より好ましくは０．００６以上、更に好ましくは０．００８以上であり、デプスフィルターへの乳脂肪球の閉塞を防ぎ、より再現性の高い処理を実現する点で、好ましくは０．２以下、より好ましくは０．１２以下、更に好ましくは０．０４以下である。
【０１７１】
次いで、任意に、該固体画分を洗浄液で洗浄する。洗浄液は連続式又は回分式に添加してよく、残渣が十分洗浄される程度まで洗浄を行う。
【０１７２】
次いで、溶菌工程において、デプスフィルター上の固体画分に、乳脂肪球を含む流体試料の体積量よりも少ない体積量の溶菌剤を適用して、抗原を含む溶菌液を得る。溶菌剤の量をこのように少量にすることで、目的の抗原を高濃度で含む溶菌液を得ることができる。乳脂肪球を含む流体試料の体積量に対する溶菌剤の体積量の比率は、溶菌を良好に進行させる点で、好ましくは０．００２以上、より好ましくは０．００３以上、更に好ましくは０．０１以上であり、抗原を高濃度で含む溶菌液を得る点で、好ましくは０．５以下、より好ましくは０．３以下、更に好ましくは０．１以下である。溶菌工程は、１５℃〜５０℃の温度範囲、ｐＨ５〜８の範囲で行うことが好ましい。
【０１７３】
次いで、任意に、溶菌液を更に濾過する。濾過には、前述したような濾過用メンブレンを単独、又はデプスフィルターとの組合せで使用でき、（方法１）と同様に実施できる。
【０１７４】
上記（方法２）で洗浄工程を行う場合、好ましい態様において、洗浄液の量［単位：ｍｌ］Ｆ２と、デプスフィルターの表面積［単位：ｍｍ２］Ｓとの比Ｆ２／Ｓが０．００２以上０．１以下である量の洗浄液をデプスフィルターに適用する。洗浄工程を更に設けることは、乳脂肪球をより良好に除去する点で有利である。比Ｆ２／Ｓは、良好な洗浄効果を得る観点から、好ましくは０．００５以上、より好ましくは０．０１以上、更に好ましくは０．０２以上であり、良好な洗浄効果を得つつ洗浄コストの過度な上昇を回避する観点から、比Ｆ２／Ｓは、好ましくは０．１以下、より好ましくは０．０８以下、更に好ましくは０．０６以下である。
【実施例】
【０１７５】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに例示するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【０１７６】
≪実施例Ａ≫
＜ラテラルフロー方式＞
[ラテラルフロー方式デバイスの作製]
図１に示す検出機構を備えるラテラルフローデバイスを作製した。【０１７７】
［抗体］
金コロイド標識する抗体には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２モノクローナル抗体を使用した。国際公開ＷＯ００／０６６０３号パンフレットの実施例５に記載の方法を参照し、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＬ７／Ｌ１２リボゾームタンパク質を取得し、同タンパク質を用いてモノクローナル抗体を作製した。当該モノクローナル抗体は、上記Ｌ７／Ｌ１２リボゾームタンパク質の別のサイトに同時に結合しうる２種（ＥＣ−１及びＥＣ−２）の組合せを選択した。【０１７８】
［抗原］
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２５９２２）を液体培地にて３７℃６時間振盪培養した後、遠心し、上清を生理食塩水に置換した後、懸濁し、超音波振盪機にて菌体破砕したものを用いた。超音波振盪を行う前の懸濁液について生理食塩水で希釈系列を作製し、標準寒天培地に塗抹し、３７℃好気条件下で１０時間培養し、コロニー数をカウントすることで、検体液中の菌濃度を値付けした。【０１７９】
［金コロイド標識抗体含浸部材］
田中貴金属社製金コロイド溶液（粒径６０ｎｍ）１．５ｍＬに０．１Ｍ  リン酸カリウム  ｐＨ６．４を混合し、金コロイド標識するモノクローナル抗体ＥＣ−２  １００μｇ／ｍＬを加え室温で３０分間静置し、この抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が０．２質量％となるようにカゼインナトリウム５質量％水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をカゼインでブロッキングして、金コロイド標識したモノクローナル抗体ＥＣ−２（以下、「金コロイド標識抗体」と記す）溶液を調製した。この溶液を遠心分離（４５００×ｒｐｍ、３０分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を０．２５質量％カゼインナトリウム、２．５質量％スクロース、４０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。１０ｍｍ×１５０ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液０．９ｍＬを含浸させ、これを室温で減圧乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材とした。【０１８０】
［捕捉抗体塗布］
モノクローナル抗体  ＥＣ−１  １．５ｍｇ／ｍＬとトレハロース３質量％とを含有する０．０５Ｍ  ＴＡＰＳバッファーｐＨ８．０の水溶液を、メンブレン（不溶性担体）の展開開始点側（すなわち試料流れの上流側）の末端から２０ｍｍの位置に１μＬ／ｃｍでライン状に塗布して、これを５０℃で３０分間乾燥し、その後一晩室温で乾燥させた。【０１８１】
［ラテラルフローデバイス組み立て］
図２に示す機構を備えるラテラルフローデバイスを作製した。上記メンブレンと吸収パッドとを基材（厚さ２５４μｍ、ポリスチレン製で部材を貼り合わせるための粘着材がついたもの）に貼り合せた後、５ｍｍ幅に切断した。【０１８２】
（シグナル計測方法）
免疫検査或いは増感検査終了後のキットを、リング照明（名称：HPR-100FC-STK、メーカー：CCS）照射下で、不溶性担体の主面に対し鉛直方向の直上から工業用カメラ（名称：Stingray f125C、メーカー：AVT(Allied Vision Technologies)により撮影してRGB 8ビット出力した際の、不溶性担体上の所定位置のG値を読み取った。【０１８３】
［免疫検査］
□抗原と標識抗体の反応
抗原を反応液に１：１００（質量比）の割合で添加・混合した混合液９００μｌを、あらかじめ金コロイド標識抗体含浸部材５ｍｍ×１０ｍｍの入ったチューブに導入、混合し、１０分間静置した。
反応液の組成を以下に示す。
０．１Ｍ  ＭＯＰＳＯ    ｐＨ７．４
１．８質量％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
０．２Ｍ  ＮａＣｌ水溶液【０１８４】
□抗原−抗体サンドイッチ形成反応
上記にて１０分間静置したあとの液２００μｌを９６穴プレートのウェルに導入し、ラテラルフローデバイスの展開開始点側をウェルに挿入し、１５分静置した（図１０）。【０１８５】
□シグナル計測
デバイスを９６穴プレートから取り出して上述のシグナル計測方法により、捕捉抗体塗布部の濃度（Ｇ値）をシグナル値として記録した。【０１８６】
［増感検査］
□増感
免疫検査にて、１５分静置が終了したラテラルフローデバイスを、結合物質のうち、捕捉抗体−抗原−金属コロイド標識抗体を形成していないものを除去するため、０．５質量％Tween20水溶液に1分間浸漬したのち取り出し、次に容量２ｍｌのチューブ内で液Ａと液Ｂとを混合し、増感剤を調製したのち、不溶性担体の捕捉抗体塗布部が増感剤に浸るように、デバイスをチューブに挿入した。増感剤の調製方法及び組成は各実施例において後述する。
増感剤の性状の観察
透明チューブ内にて液Ａと液Ｂを混合後、照明に透かし、内部に析出物が見られない場合は透明、わずかに浮遊物が認められる場合は「わずかに濁り」、浮遊物が多く、チューブ内を透視不可能な場合は「白濁」とした。【０１８７】
□シグナル計測
デバイス挿入から１分程度静置後、デバイスを取り出し、上述のシグナル計測方法により、捕捉抗体塗布部の濃度（Ｇ値）をシグナル値として記録した。【０１８８】
＜フロースルー方式＞
［フロースルー方式デバイスの作製］
図３に示す検出機構を備えるフロースルーデバイスを射出成型により作製した。デバイスは、ケース内に吸収材、液流れ均一化材及びメンブレンが重なって収容され、さらにケース上部には試料導入口を備えるキャップが装着されるように構成した。キャップは、メンブレンに接触して当該メンブレンを吸収材側に押さえ付けることができる形状とした。【０１８９】
［メンブレン（不溶性担体）］
アドバンテック東洋株式会社製ニトロセルロース膜Ａ１００Ａ（孔径１．０μｍ  厚み１００μｍ）を２５ｍｍ×３０ｍｍのサイズに裁断し使用した。
［吸収材］
アイオン社ＰＶＡスポンジＤ（Ａ）厚み６ｍｍを２５ｍｍ×３０ｍｍのサイズに裁断し使用した。
［液流れ均一化材］
旭化成株式会社製ベンコットＰＳ−２（厚み１００μｍ）を２５ｍｍ×３０ｍｍのサイズに裁断し使用した。【０１９０】
［抗体］
上記ラテラルフローデバイスにおいて作製したものと同じものを用いた。
［抗原］
上記ラテラルフローデバイスにおいて作製したものと同じものを用いた。【０１９１】
［金コロイド標識抗体含浸部材］
金コロイド標識抗体溶液は、上記ラテラルフロー方式デバイスにおいて作製したものと同じものを用いた。１０ｍｍ×１５０ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液０．９ｍＬを含浸させ、これを室温で減圧乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材とした。【０１９２】
［フロースルーデバイス組み立て］
フロースルーデバイスのケース内に、吸収材、液流れ均一化材、メンブレンの順に積層・収納し、フタ部を閉めた。【０１９３】
［捕捉抗体塗布］
モノクローナル抗体  ＥＣ−１  １．５ｍｇ／ｍＬとトレハロース３質量％とを含有する０．０５Ｍ  ＴＡＰＳバッファーｐＨ８．０の水溶液２μＬを、フロースルーキットのメンブレン上の、試料導入口部分３か所のうち２か所にドット状に塗布して、これを５０℃で３０分間乾燥し、その後一晩室温で乾燥させた。【０１９４】
［キャップ装着］
フタ部の開口部に、試料導入口を備えるキャップを押し込み、フロースルーデバイスを完成させた。
（シグナル計測方法）
免疫検査或いは増感検査終了後のキットを、リング照明（名称：HPR-100FC-STK、メーカー：CCS）照射下で、不溶性担体の主面に対し鉛直方向の直上から工業用カメラ（名称：Stingray f125C、メーカー：AVT(Allied Vision Technologies)により撮影してRGB 8ビット出力した際の、不溶性担体上の所定位置のG値を読み取った。【０１９５】
［免疫検査］
□抗原と標識抗体の反応
１Ｅ５ｃｆｕ／ｍｌ濃度の抗原を反応液に１：１００（質量比）の割合で添加・混合した混合液９００μｌを、あらかじめ金コロイド標識抗体含浸部材５ｍｍ×１０ｍｍをいれてあるチューブに導入・混合し、１０分間静置した。
反応液組成：
０．１Ｍ  ＭＯＰＳＯ    ｐＨ７．４
１．８質量％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
０．２Ｍ  ＮａＣｌ水溶液
□抗原−抗体サンドイッチ形成反応
上記にて１０分間静置したあとの液４００μｌを、上記フロースルーデバイスのキャップにある試料導入口部分に導入し、液流れ時間（液が吸収されきる時間）を計測・記録した。
□洗浄
デバイスからキャップを取り外し、試料導入口部分に０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液５００μｌを滴下した。
□シグナル計測
上述のシグナル計測方法により、試料導入口部分のうち捕捉抗体ＥＣ−１を塗布した２か所のスポット濃度（Ｇ値）の平均値から、試料導入口部分のうち捕捉抗体ＥＣ−１を塗布していない１か所のスポット濃度を減算し、シグナル値として記録した。【０１９６】
［増感検査］
□増感
液Ａと液Ｂとを混合し、増感剤を調製したのち、増感剤４００μｌを速やかに、免疫検査において洗浄が終了したフロースルーデバイスに滴下した。増感剤の調製方法及び組成は各実施例において後述する。【０１９７】
□シグナル計測
増感滴下から１分程度静置後、上述のシグナル計測方法により、試料導入口部分のうち捕捉抗体ＥＣ−１を塗布した２か所のスポット濃度（Ｇ値）の平均値から、試料導入口部分のうち捕捉抗体ＥＣ−１を塗布していない１か所のスポット濃度を減算し、シグナル値として記録した。【０１９８】
［評価］
以下の手順により検出し、評価を行った。
増感剤の性状の観察
透明チューブ内にて液Ａと液Ｂを混合後、照明に透かし、内部に析出物が見られない場合は透明、わずかに浮遊物が認められる場合は「わずかに濁り」、浮遊物が多く、チューブ内を透視不可能な場合は「白濁」とした。【０１９９】
増感剤の黒色化時間の計測
透明チューブ内にて液Ａと液Ｂを混合後、白色背景に透かし、内部の液が黒くなるまでの時間を計測した。
評価基準
黒色化抑制：
Ａ＝増感剤調製後５分経過後での黒色化が抑制されている
Ｂ＝増感剤調製後１分経過後での黒色化が抑制されており、且つ増感剤調製後５分経過後で黒色化している
Ｃ＝増感剤調製後３０秒経過後での黒色化が抑制されており、且つ増感剤調製後１分経過後での黒色化している
Ｄ＝増感剤調製後３０秒経過後で黒色化している【０２００】
増感剤中の塩化物イオン濃度の計測
増感剤中の塩化物イオン濃度は、液Ａと混合する前の液Ｂの塩化物イオン濃度をイオンクロマトグラフ法により定量し、増感剤の（すなわち液Ａと液Ｂとを混合したあとの）塩化物イオン濃度に換算することで求めた。このように算出した増感剤中の塩化物イオンモル濃度を、増感剤中の銀イオンモル濃度で割ることで、増感剤中の銀１００モル％に対しての塩化物イオン濃度を算出した。【０２０１】
増感剤のｐＨ測定
液Ａと液Ｂとを混合後、少量をｐＨ試験紙Ｍｅｒｃｋ  Ａｃｉｌｉｔ  ｐＨ０−６に滴下し、色見本を参照することでｐＨを測定した。【０２０２】
増感強度
下記基準で評価した。
上述のシグナル計測方法において、増感後の捕捉抗体塗布部の色が、日本塗料工業会2017年J版塗料標準色
色見本番号  ＪＮ−９５  より薄い場合はＤ
色見本番号  ＪＮ−９５  と同等又はこれより濃く、ＪＮ−９０  より薄い場合はＣ
色見本番号  ＪＮ−９０  と同等又はこれより濃く、ＪＮ−８０  より薄い場合はＢ
色見本番号  ＪＮ−８０  と同等又はこれより濃い場合はＡ【０２０３】
＜反応速度制御剤の種類の検討＞
［実施例Ａ１］
増感剤の調製
下記の液Ａ  ９８０μｌと液Ｂ  ４２０μｌを混合し、増感剤を調製した。液Ａ及び液Ｂの組成は以下のとおりである。
液Ａ  ：０．６Ｍ  硝酸銀水溶液
液Ｂ  ：０．１Ｍメトール，  ０．２Ｍヒドロキノン，  ０．１Ｍクエン酸，  ０．４Ｍトリメチルグリシン（（ｃ）反応速度制御剤として）
液Ｂの塩化物イオン濃度をイオンクロマトグラフ法により定量したところ、０．９７ｍｇ／Ｌであった。
調製直後の増感剤１４００μｌに、免疫検査が終了したラテラルフローデバイスを挿入した。【０２０４】
［実施例Ａ２〜４、比較例Ａ１〜５］
（ｃ）反応速度制御剤の種類及び量を表２に示すとおりに変更した他は実施例Ａ１と同様にして、増感剤を調製した。【０２０５】
各増感剤につき、それぞれ上記ラテラルフロー方式に従って免疫検査及び増感検査を行った。結果を表３に示す。【０２０６】
【表２】
2020045671.tif 000006
【０２０７】
【表３】
2020045671.tif 000007
【０２０８】
表３に示すように、（ｃ）反応速度制御剤を還元剤と共存させた実施例Ａ１〜４においては、黒色化の抑制及び良好な増感強度を達成することができた。一方、反応制御速度制御剤を用いない比較例Ａ１、並びに、比較化合物を共存させた比較例Ａ２〜５では、黒色化の抑制（時間）が十分でなかった。なお、実施例Ａ２〜４及び後述の実施例Ａ１０〜１３、１８、３１、３２においては、沈殿物の生成により増感剤中に濁りが観察されたが、測定自体に影響を及ぼすものではなかった。【０２０９】
＜還元剤種類の検討＞
［実施例Ａ５〜９］
還元剤の種類及び量、反応速度制御剤の種類及び量、ｐＨ調整剤の種類及び量を表４に示すように変えた他は実施例Ａ1と同様に（実施例Ａ５〜９）増感剤を調製した。各増感剤につき、それぞれ上記（ラテラルフロー方式（実施例Ａ５及び６について）、又はフロースルー方式（実施例Ａ７〜９））に従って免疫検査及び増感検査を行った。結果を表５に示す。【０２１０】
【表４】
2020045671.tif 000008
【０２１１】
【表５】
2020045671.tif 000009
表５に示すように、（ｃ）反応速度制御剤を還元剤と共存させることにより、ラテラルフロー方式及びフロースルー方式のいずれの場合も、各種還元剤の複数の組合せにおいて黒色化の抑制及び良好な増感強度を得ることができた。【０２１２】
＜反応速度制御剤の成分及び含有濃度の検討＞
［実施例Ａ１０〜１７］
反応速度制御剤の種類及び量を表６に示すように変えた他は、実施例Ａ１と同様に増感剤を調製した。各増感剤につき、それぞれ上記（ラテラルフロー方式）の方法により免疫検査及び増感検査を行った。結果を表７に示す。【０２１３】
【表６】
2020045671.tif 000010
【０２１４】
【表７】
2020045671.tif 000011
【０２１５】
表７に示すように、いずれの実施例でも、黒色化の抑制及び良好な増感強度を達成することができた。特に、実施例Ａ１３〜１５においては、増感剤調製後の黒色化の抑制が５分間以上保たれた。このことは、（ｃ）反応速度制御剤の幅広い濃度範囲で黒色化抑制が達成できることを示すとともに、低分子量のベタインと、高分子量のベタイン系化合物とを組合せることにより黒色化抑制効果を高められることを示している。【０２１６】
＜塩化物イオン濃度の検討＞
［実施例Ａ１８〜２０］
反応速度制御剤の種類及び量を表８に示すように変えた他は、実施例Ａ１と同様に増感剤を調製した。各増感剤につき、それぞれ上記（ラテラルフロー方式）の方法により免疫検査及び増感検査を行った。結果を表９に示す。【０２１７】
【表８】
2020045671.tif 000012
【０２１８】
【表９】
2020045671.tif 000013
【０２１９】
表９に示すように、塩化物イオン濃度を低くすることで、増感剤における沈殿物の生成を抑制できた。なお実施例Ａ１８においては、沈殿物の生成により増感剤中に僅かに濁りが観察されたが、測定自体に影響を及ぼすものではなかった。【０２２０】
＜増感剤のｐＨ値の検討＞
［実施例Ａ２１〜２８］
混合時の液量を液Ａ４００μｌ、液Ｂ１００μｌとし、ｐＨ調整剤の種類及び量、銀含有化合物の種類及び量、還元剤の種類及び量、反応速度制御剤の種類及び量、酸化防止剤の種類及び量を表１０に示すように変えた他は実施例Ａ１と同様に（実施例Ａ２１〜２５について）、また、ｐＨ調整剤の種類及び量、並びに反応速度制御剤を表１０に示す種類及び量とした他は実施例Ａ１と同様に（実施例Ａ２６〜２８について）増感剤を調製した。各増感剤につき、それぞれ上記（フロースルー方式（実施例Ａ２１〜２５について）、又はラテラルフロー方式（実施例Ａ２６〜２８について））に従って免疫検査及び増感検査を行った。結果を表１１に示す。【０２２１】
【表１０】
2020045671.tif 000014
【０２２２】
【表１１】
2020045671.tif 000015
【０２２３】
表１１に示すように、実施例Ａ２３、２４では５分以上の増感剤の黒色化抑制と優れた増感強度が得られた。一方、増感剤中のｐＨ調整剤として高濃度の酸を加えた実施例Ａ２１、２２については、５分以上の増感剤の黒色化抑制効果が得られたが増感強度は実施例Ａ２３、２４と比べて低かった。増感剤中のｐＨ調整剤として高濃度のアルカリを加えた実施例Ａ２５については、増感剤の黒色化抑制効果が得られたが、抑制時間は５分未満で実施例Ａ２３、２４と比べると短く、増感強度も実施例Ａ２３、２４と比べると顕著に低かった。ラテラルフロー方式において増感剤中にｐＨ調整剤として酸を表１０に示す濃度で加えた実施例Ａ２６、２７、２８ではいずれも１分以上、５分未満の増感剤の黒色化抑制効果と良好な増感強度が得られた。【０２２４】
＜酸化防止剤＞
［実施例Ａ２９〜３２］
酸化防止剤の種類及び量とｐＨ調整剤の種類と量を表１２に示すとおりとした他は実施例Ａ２１と同様に増感剤を調製した。各増感剤につき、それぞれ上記（フロースルー方式）の方法により免疫検査及び増感検査を行った。結果を表１３に示す。【０２２５】
【表１２】
2020045671.tif 000016
【０２２６】
【表１３】
2020045671.tif 000017
【０２２７】
亜硫酸ナトリウムを添加した場合と添加しない場合のいずれも黒色化の抑制及び良好な増感強度を得ることができた。なお、実施例Ａ２９の増感剤は、４℃で２０日間保存後に還元剤の分解が観察されたのに対し、実施例Ａ３０〜３２では同条件での保存後に分解が観察されず保存安定性が良好であった。【０２２８】
【表１４】
2020045671.tif 000018
【０２２９】
≪実施例Ｂ≫
＜測定方法＞
下記測定方法を用いた。
（検出用メンブレン及び濾過用メンブレンの平均孔径）
ＪＩＳ  Ｋ  ３８３２に述べられている方法（バブルポイント）で測定した。
（厚み）
厚み計（ミツトヨ製  ５４３−３９０ＢＳに直径６．３ｍｍの平坦測定子を装着）により測定した。
（厚みＣＶ値）
直径６．３ｍｍの先端が平坦な測定子を用いた厚さ測定を２５ｍｍ×３０ｍｍの範囲内で９点（互いに重ならないように縦３点×横３点を正方格子状に等間隔に選択）測定した際のＣＶ値
（吸水速度）
吸収体：
吸収体のメンブレンと接触する面（１０ｍｍ×１０ｍｍ以上の面積）に対し、２３℃で、０．０１質量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液を１００μｌ、マイクロピペットを用いて滴下した後に、その液滴が吸収体表面に残存する時間
液流調整メンブレン：
２３℃で、０．５質量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液に、幅２４ｍｍ、長さ３０ｍｍの液流調整メンブレンを長さ方向に２ｍｍだけ垂直に挿入し保持し、水溶液が液流調整メンブレンの最上部に到達する時間
（最大吸水量）
単独の各吸収体に、２３℃で、０．５質量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液を１００〜１０００μｌずつ滴下したときに、水溶液が吸収体から漏れ出す量
（スポット濃度）
免疫検査又は増感検査終了後のキットを、リング照明（名称：ＨＰＲ−１００ＦＣ−ＳＴＫ、メーカー：ＣＣＳ）照射下で、検出用メンブレンの主面に対し鉛直方向の直上から工業用カメラ（名称：Ｓｔｉｎｇｒａｙ  ｆ１２５Ｃ、メーカー：ＡＶＴ（Ａｌｌｉｅｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により撮影してＲＧＢ  ８ビット出力した際の、検出用メンブレン上の所定位置のＧ値をスポット濃度とした。【０２３０】
＜検体及び試薬＞
用いた検体及び試薬は以下のとおりである。【０２３１】
（検体）
・大腸菌菌液
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２５９２２）を液体培地にて３７℃６時間振盪培養したのち遠心し、上清を生理食塩水に置換した後懸濁し、超音波振盪機にて菌体破砕したものを用いた。超音波振盪を行う前の懸濁液について生理食塩水で希釈系列を作製し、標準寒天培地に塗抹し、３７℃好気条件下で１０時間培養し、コロニー数をカウントすることで、検体液中の菌濃度を値付けした。【０２３２】
・黄色ブドウ球菌菌液
メチシリン感受性のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ  ２５９２３）  メチシリンを含む薬剤に感受性を示すこと、ｍｅｃＡ遺伝子を保有していないことが文献：Complete Genome Sequence of the Quality Control Strain Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 25923  Genome Announc. 2014 Nov-Dec; 2(6)で報告されている）をポアメディア羊血液寒天培地（栄研）にて３７℃で４４〜４８時間培養したのち、コロニーを回収し生理食塩水に懸濁した。得られた液５０μｌに、ブドウ球菌キットＭＲＳＡ−ＬＡ「生研」（デンカ）の抽出試薬１を２００μｌ加えた。その後、同ブドウ球菌キットの抽出試薬２を５０μｌ混合して、アルカリ溶菌液を得た。このアルカリ溶菌液に、１０μｇ／ｍｌ  リゾスタフィン及び０．３Ｍ  ＮａＣｌを含有する０．０８Ｍ  ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ７．４）を混合し、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、１５０００ｒｐｍで２０分遠心し、上清（可溶性画分）を黄色ブドウ球菌菌液とした。生理食塩水に懸濁した液について生理食塩水で希釈系列を作製し、羊血液寒天培地に塗抹し、３７℃好気条件下で２０時間培養し、コロニー数をカウントすることで、検体液中の菌濃度を値付けした。【０２３３】
・メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）菌液
Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎａｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−８１１））をポアメディア羊血液寒天培地（栄研）にて３７℃で４４〜４８時間培養したのち、コロニーを回収し生理食塩水に懸濁した。得られた液５０μｌにブドウ球菌キットＭＲＳＡ−ＬＡ「生研」（デンカ）の抽出試薬１を２００μｌ加えた。その後、同ブドウ球菌キットの抽出試薬２を５０μｌ混合した。このアルカリ溶菌液に１０μｇ／ｍｌ  リゾスタフィン及び０．３Ｍ  ＮａＣｌを含有する０．０８Ｍ  ＭＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ  ７．４）を混合し、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、１５０００ｒｐｍで２０分遠心し、上清（可溶性画分）を黄色ブドウ球菌菌液とした。生理食塩水に懸濁した液について生理食塩水で希釈系列を作製し、羊血液寒天培地に塗抹し、３７℃好気条件下で２０時間培養し、コロニー数をカウントすることで、検体液中の菌濃度を値付けした。【０２３４】
検体１：陰性検体
後述の反応液３を検体１（陰性検体）として用いた。【０２３５】
検体２：黄色ブドウ球菌含有検体
検体１に対し、黄色ブドウ球菌菌液を９９：１の質量割合で混合し、黄色ブドウ球菌が６×１０５ｃｆｕ／ｍｌ含まれる検体２を調製した。【０２３６】
検体３：黄色ブドウ球菌含有検体
検体１に対し、黄色ブドウ球菌菌液を９９：１の質量割合で混合し、黄色ブドウ球菌が３×１０６ｃｆｕ／ｍｌ含まれる検体３を調製した。【０２３７】
検体４：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌含有検体
検体１に対し、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌菌液を９９：１の質量割合で混合し、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌が６×１０５ｃｆｕ／ｍｌ含まれる検体４を調製した。【０２３８】
検体５：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌含有検体
検体１に対し、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌菌液を９９：１の質量割合で混合し、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌が３×１０６ｃｆｕ／ｍｌ含まれる検体５を調製した。【０２３９】
（反応液）
・反応液１
下記組成の水溶液を反応液１として用いた。
０．１Ｍ  ＭＯＰＳＯ（ｐＨ７．４）
１．８質量％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
０．２Ｍ  ＮａＣｌ
・反応液２
下記組成の水溶液を反応液２として用いた。
０．１Ｍ  ＭＯＰＳＯ（ｐＨ７．４）
０．５質量％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
０．１Ｍ  ＮａＣｌ
・反応液３
下記組成の水溶液を反応液３として用いた。
０．１Ｍ  ＭＯＰＳＯ（ｐＨ７．４）
０．５質量％  Ｔｗｅｅｎ２０
０．１Ｍ  ＮａＣｌ
０．２５質量％  カゼインナトリウム【０２４０】
（金属標識されたリガンド及び検出用リガンド)
・大腸菌Ｌ７／Ｌ１２リボゾームタンパク質検出用抗体
国際公開ＷＯ２０００／０６６０３号パンフレットの実施例５に記載の方法に準じて、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＬ７／Ｌ１２リボゾームタンパク質を取得し、同タンパク質を用いてモノクローナル抗体を作製した。当該モノクローナル抗体は、上記Ｌ７／Ｌ１２リボゾームタンパク質に同時に結合しうる２種（ＥＣ−１及びＥＣ−２）の組合せを選択した。
・黄色ブドウ球菌Ｌ７／Ｌ１２リボゾームタンパク質検出用抗体
国際公開ＷＯ２０００／０６６０３号パンフレットの実施例５に記載の方法に準じて、黄色ブドウ球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのＬ７／Ｌ１２リボゾームタンパク質を取得し、同タンパク質を用いてモノクローナル抗体を作製した。当該モノクローナル抗体は、上記Ｌ７／Ｌ１２リボゾームタンパク質に同時に結合しうる２種（ＳＡ−１及びＳＡ−２）の組合せを選択した。
・ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａタンパク質検出用抗体
Ａｂｎｏｖａ社のMethicillin-resistant Staphylococcus aureus PBP2a monoclonal antibody, clone 6G10（カタログ番号ＭＡＢ１７０２（以下、ＰＢＰ２ａ−１）、Methicillin-resistant Staphylococcus aureus PBP2a monoclonal antibody, clone 9C6 （カタログ番号ＭＡＢ１７０７（以下、ＰＢＰ２ａ−２）を使用した。【０２４１】
モノクローナル抗体  ＥＣ−１  １．５ｍｇ／ｍＬとトレハロース３質量％とを含有する０．０５Ｍ  ＴＡＰＳバッファーｐＨ８．０の水溶液を、ＥＣ検出用リガンド溶液として用いた。【０２４２】
上記モノクローナル抗体  ＥＣ−２  １００μｇ／ｍＬ溶液を用い、以下の手順で、金属標識されたリガンドの溶液を調製した。
田中貴金属社製金コロイド溶液（粒径６０ｎｍ）１．５ｍＬに０．１Ｍ  リン酸カリウムを混合してｐＨを６．４とし、これに、上記で得たモノクローナル抗体  ＥＣ−２  １００μｇ／ｍＬ溶液を１００μＬ加えて室温で３０分間静置した。これにより抗体を金コロイド粒子表面に結合させた。これに、最終濃度が０．２質量％となるようにカゼインナトリウム５質量％水溶液を加えることで、金コロイド粒子の残余の表面をカゼインでブロッキングした。これにより、金コロイド標識されたモノクローナル抗体ＥＣ−２（金属標識されたリガンドとして）の溶液を調製した。この溶液を遠心分離（４５００ｒｐｍ×３０分間）して金コロイド標識抗体を沈殿させ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を０．２５質量％カゼインナトリウム、２．５質量％スクロース、及び４０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁して、金コロイド標識抗体溶液を得た。１０ｍｍ×１５０ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液０．９ｍＬを含浸させ、これを室温で一晩減圧乾燥させ、金コロイド標識抗体含浸部材を得た。【０２４３】
モノクローナル抗体  ＳＡ−１  １．５ｍｇ／ｍＬとスクロース１質量％とを含有する０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７．０の水溶液を、ＳＡ検出用リガンド溶液として用いた。【０２４４】
上記モノクローナル抗体  ＳＡ−２  １００μｇ／ｍＬ溶液を用い、以下の手順で、金属標識されたリガンドの溶液を調製した。
田中貴金属社製金コロイド溶液（粒径６０ｎｍ）１．５ｍＬに０．１Ｍ  リン酸カリウムを混合してｐＨを６．４とし、これに、上記で得たモノクローナル抗体  ＳＡ−２  １００μｇ／ｍＬ溶液を１００μＬ加えて室温で３０分間静置した。これにより抗体を金コロイド粒子表面に結合させた。これに、最終濃度が０．２質量％となるようにカゼインナトリウム５質量％水溶液を加えることで、金コロイド粒子の残余の表面をカゼインでブロッキングした。これにより、金コロイド標識されたモノクローナル抗体ＳＡ−２（金属標識されたリガンドとして）の溶液を調製した。この溶液を遠心分離（４５００ｒｐｍ×３０分間）して金コロイド標識抗体を沈殿させ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を０．２５質量％カゼインナトリウム、２．５質量％スクロース、及び４０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁して、金コロイド標識抗体溶液を得た。１０ｍｍ×１５０ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液０．９ｍＬを含浸させ、これを室温で一晩減圧乾燥させ、金コロイド標識ＳＡ抗体含浸部材を得た。【０２４５】
モノクローナル抗体  ＰＢＰ２ａ−１  １．０ｍｇ／ｍＬとスクロース１質量％とを含有する０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７．０の水溶液を、ＰＢＰ２ａ検出用リガンド溶液として用いた。【０２４６】
上記モノクローナル抗体  ＰＢＰ２ａ−２  １００μｇ／ｍＬ溶液を用い、以下の手順で、金属標識されたリガンドの溶液を調製した。
田中貴金属社製金コロイド溶液（粒径６０ｎｍ）１．５ｍＬに０．１Ｍ  リン酸カリウムを混合してｐＨを６．４とし、これに、上記で得たモノクローナル抗体  ＰＢＰ２ａ−２  １００μｇ／ｍＬ溶液を１００μＬ加えて室温で３０分間静置した。これにより抗体を金コロイド粒子表面に結合させた。これに、最終濃度が０．２質量％となるようにカゼインナトリウム５質量％水溶液を加えることで、金コロイド粒子の残余の表面をカゼインでブロッキングした。これにより、金コロイド標識されたモノクローナル抗体ＰＢＰ２ａ−２（金属標識されたリガンドとして）の溶液を調製した。この溶液を遠心分離（４５００ｒｐｍ×３０分間）して金コロイド標識抗体を沈殿させ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を０．２５質量％カゼインナトリウム、２．５質量％スクロース、及び４０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁して、金コロイド標識抗体溶液を得た。１０ｍｍ×１５０ｍｍの帯状のグラスファイバーパットに、金コロイド標識抗体溶液０．９ｍＬを含浸させ、これを室温で一晩減圧乾燥させ、金コロイド標識ＰＢＰ２ａ抗体含浸部材を得た。【０２４７】
（洗浄液）
０．５質量％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液を用いた。【０２４８】
（増感剤）
下記組成の液Ａ  ４００μｌと、下記組成の液Ｂ  １００μｌとを混合して得た、下記組成を有するｐＨ＝２．５の増感剤を用いた。
液Ａ：
２０ｗ／ｖ％  硝酸銀（銀含有化合物として）水溶液
液Ｂ：
０．２Ｍ  メトール（還元剤として），０．４Ｍ  ヒドロキノン（還元剤として），０．２Ｍ  クエン酸，４８ｍＭ  ベタイン，１．４ｍＭ  ヤシ脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン，１．５ｍＭ  亜硫酸Ｎａ  水溶液
液Ｂの塩化物イオン濃度をイオンクロマトグラム法で測定したところ０．２５ｍＭ（８．９ｍｇ／Ｌ）であった。
増感剤組成：
９４０ｍＭ  硝酸銀，４０ｍＭ  メトール，８０ｍＭ  ヒドロキノン，４０ｍＭ  クエン酸，ベタイン  ９．６ｍＭ，０．２８ｍＭ  ヤシ脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン，０．２９ｍＭ  亜硫酸Ｎａ
増感剤中の塩化物イオン濃度は、増感剤中の銀１００モル％に対して０．００５％であった。【０２４９】
＜キット作製＞
［キット作製例１］
図４Ａ〜Ｄに示すキットを作製した。【０２５０】
（キャップ及び固定機構）
キャップ１２は、窓部Ｗとして直径１．１ｍｍの丸孔を３個有し、接触部Ｃが平面となるように形成した。接触部Ｃは、ケース１１の上側部材１１ａ及び固定部品１５の検出用メンブレン固定面Ｆよりも１５０μｍ下側に位置するようにした。接触部Ｃの算術平均粗さＲａは、０．０４μｍであった。【０２５１】
（検出用メンブレン）
アドバンテック東洋株式会社製ニトロセルロース膜Ａ１００Ａ（平均孔径１．０μｍ、厚み１００μｍ）を、２４ｍｍ×３０ｍｍのサイズに裁断し使用した。【０２５２】
（液流調整メンブレン）
旭化成株式会社製ベンコットＰＳ−２（厚み１００μｍ）を２４ｍｍ×３０ｍｍのサイズに裁断し使用した。この液流調整メンブレンは、吸水速度３０秒、最大吸水量７０μｌ、厚みＣＶ値４％を有する。【０２５３】
（吸収体）
アイオン社製ＰＶＡスポンジＤ（Ａ）（厚み６ｍｍ）を２４ｍｍ×３０ｍｍのサイズに裁断し使用した。この吸収体は、吸水速度１２０秒、最大吸水量３．６ｍｌを有する。【０２５４】
上記で調製したモノクローナル抗体  ＥＣ−１  １．５ｍｇ／ｍＬ溶液を、検出用リガンド溶液として用いた。
図４Ａ〜Ｄに示すキットのケース１１の下側部材１１ｂ内に、吸収体１３、液流調整メンブレン１７、検出用メンブレン１４の順に積層収納し、ケースの上側部材１１ａを下側部材１１ｂに篏合させた。接触部Ｃが検出用メンブレンを押圧する押圧力は０．１〜２．５ＭＰａの範囲であった。次いで、上記で調製したモノクローナル抗体  ＥＣ−１を用いたＥＣ検出用リガンド溶液２μＬを、検出用メンブレン１４上の窓部Ｗに対応する領域３か所のうち２か所それぞれにドット状に塗布した後、５０℃で３０分間乾燥し、更に一晩室温で乾燥させた。次いで、ケース１１の上側部材１１ａの試料導入口Ｉ（直径８．７ｍｍの円形）にキャップ１２を押し込み、キット１を完成させた。キット１において、第１の主面Ｓ１のうち他の部材と接触している部分の面積比率は、９２面積％であった。【０２５５】
［キット作製例２］
接触部Ｃが検出用メンブレン固定面Ｆよりも５０μｍ下側に位置するようにキャップ１２を形成した他は作製例１と同様にして、キット２を作製した。接触部が検出用メンブレンを押圧する押圧力は０．１〜２．５ＭＰａの範囲であった。キット２において、第１の主面Ｓ１のうち他の部材と接触している部分の面積比率は、９２面積％であった。【０２５６】
［キット作製例３］
接触部Ｃが検出用メンブレン固定面Ｆよりも５０μｍ上側に位置するようにキャップ１２を形成した他は作製例１と同様にして、キット３を作製した。接触部が検出用メンブレンを押圧する押圧力は０．１〜０．５ＭＰａの範囲であった。キット３において、第１の主面Ｓ１のうち他の部材と接触している部分の面積比率は、９２面積％であった。【０２５７】
［キット作製例４］
検出用メンブレン１４として、アドバンテック東洋株式会社製ニトロセルロース膜Ａ０４５Ａ（厚み１４５μｍ、平均孔径０．４５μｍ）を用いた他は作製例１と同様にして、キット４を作製した。キット４において、第１の主面Ｓ１のうち他の部材と接触している部分の面積比率は、９２面積％であった。【０２５８】
［キット作製例５］
検出用メンブレン１４として、アドバンテック東洋株式会社製ニトロセルロース膜Ａ０６５Ａ（厚み１５０μｍ、平均孔径０．６５μｍ）を用いた他は作製例１と同様にして、キット５を作製した。キット５において、第１の主面Ｓ１のうち他の部材と接触している部分の面積比率は、９２面積％であった。【０２５９】
［キット作製例６］
検出用メンブレン１４として、アドバンテック東洋株式会社製ニトロセルロース膜Ａ０８０Ａ（厚み１５０μｍ、平均孔径０．８μｍ）を用いた他は作製例１と同様にして、キット６を作製した。キット６において、第１の主面Ｓ１のうち他の部材と接触している部分の面積比率は、９２面積％であった。【０２６０】
［キット作製例７］
検出用メンブレン１４として、バイオラッド社製ニトロセルロース膜（厚み１５０μｍ、平均孔径０．４５μｍ）を用いた他は作製例１と同様にして、キット７を作製した。キット７において、第１の主面Ｓ１のうち他の部材と接触している部分の面積比率は、９２面積％であった。【０２６１】
［キット作製例８］
図６Ａ〜Ｄに示すフロースルー検出キット２００をキット８として作製した。キット８において、ケース及びキャップを図６Ａ〜Ｄに示すものとしたこと、及び吸収体としてアイオン社製ＰＶＡスポンジＤ（Ａ）（厚み１５ｍｍ）を２４ｍｍ×３０ｍｍのサイズに裁断したものを使用したこと、及び上記で調製した検出用リガンド溶液２μＬを、検出用メンブレン１４上の窓部Ｗに対応する領域２か所それぞれにドット状に塗布したこと以外はキット１と同様とした。キット８において、第１の主面Ｓ１のうち他の部材と接触している部分の面積比率は、３９面積％、接触部Ｃの算術平均粗さＲａは、０．０６μｍであった。試料導入口Ｉは直径８．７ｍｍの円形であった。【０２６２】
［キット作製例９］
検出用リガンド溶液として、上記で調製したモノクローナル抗体  ＳＡ−１を用いたＳＡ検出用リガンド溶液を使用したほかは作製例１と同様にして、キット９を作製した。【０２６３】
［キット作製例１０］
検出用メンブレン１４上の窓部Ｗに対応する領域３か所のうち１か所に上述のＳＡ−１を用いたＳＡ検出用リガンド溶液を、もう１か所に上記で調製したモノクローナル抗体  ＰＢＰ２ａ−１を用いたＰＢＰ２ａ検出用リガンド溶液を使用し、残りの１か所についてはリガンド溶液を使用しない（したがってこの領域は擬陽性判定領域となる）他は作製例１と同様にして、キット１０を作製した。【０２６４】
＜アッセイ再現性に対する接触部形状の効果＞
［実施例Ｂ１〜Ｂ４］
上記キット１、４、５、６を用い、下記手順でフロースルー検出を行った。【０２６５】
（免疫検査）
最終的に表中の抗原濃度となるように、上記検体液を希釈したのち、上記反応液１と質量比１：９９で混合して、表中の抗原濃度の混合液を得た。上記で得た金コロイド標識抗体含浸部材を、５ｍｍ×１０ｍｍに切り出してチューブに導入し、更にチューブ内に上記混合液９００μｌを添加して混合し、１０分間静置して、試料液を得た。上記試料液４００μｌを、フロースルー検出キット１００の試料導入口Ｉにキャップ１２を介して導入し、検出用メンブレン１４を通過させた。【０２６６】
フロースルー検出キット１００からキャップ１２を取り外し、試料導入口Ｉに上記洗浄液５００μｌを滴下して検出用メンブレン１４を洗浄した。【０２６７】
上述の方法でスポット濃度を測定した。検出用リガンドを塗布した２か所のスポット濃度（Ｇ値）の平均値から、検出用リガンドを塗布していない１か所のスポット濃度を差し引き、免疫検査シグナル値（ａ．ｕ．）として記録した。【０２６８】
（増感検査）
免疫検査を実施した検出用メンブレン１４に上記増感剤４００μｌを、調製（すなわち液Ａと液Ｂとの混合）直後に、試料導入口Ｉに滴下した。増感剤を検出用メンブレン１４上に適用してから、当該増感剤が検出用メンブレン１４上から流れ落ち切るまでの時間を増感剤液流れ時間として計測した。増感剤滴下から１分程度静置後、上述の方法でスポット濃度を測定した。検出用リガンドを塗布した２か所のスポット濃度（Ｇ値）の平均値から、検出用リガンドを塗布していない１か所のスポット濃度を差し引き、増感検査シグナル値（ａ．ｕ．）として記録した。
増感検査シグナル値
シグナル値  ２５以上        ・・・Ａ＋
シグナル値  １５以上２５未満・・・Ａ
シグナル値  ６以上１５未満  ・・・Ｂ
シグナル値  ４以上６未満    ・・・Ｃ
シグナル値  ４未満          ・・・Ｄ【０２６９】
なお免疫検査及び増感検査におけるシグナル値の測定は、それぞれｎ＝２で行い、その平均値をシグナル値とした。【０２７０】
＜増感検査シグナル値に対する検出用メンブレン平均孔径の効果＞
増感検査シグナル値について、陽性又は陰性を上記基準で評価した（以下同様）。【０２７１】
【表１５】
2020045671.tif 000019
【０２７２】
表１５に示す結果から、検出用メンブレン平均孔径が小さい方が、増感検査シグナル値が高いが偽陽性を示しやすい傾向がみられた。これは孔径が小さいと金コロイドによる検出用メンブレンの閉塞が生じやすいためと推測される。検出用メンブレン平均孔径０．６５μｍ以上が、増感検査シグナル値及び偽陽性防止の点で好適であった。【０２７３】
＜免疫検査シグナル値に対する検体液量の効果＞
［実施例Ｂ５〜Ｂ７］
キット７を用い、検体と反応液１とを１：９９（質量比）で混合した混合液を用いることで抗原濃度を２００００ｃｆｕ／ｍｌとした試料液を表１６に示す量で試料導入口Ｉに導入した他は実施例Ｂ１と同様にして、免疫検査シグナル値を得た。結果を表１６に示す。検体液量は、液量（μｌ）と、液量を試料導入口のうち検体導入時に検出用メンブレンが露出している部分の面積（すなわちキャップの窓部の総面積）で割った値（μｌ／ｍｍ2）を記載した。【０２７４】
【表１６】
2020045671.tif 000020
【０２７５】
表１６に示すように、検体量を増大させると免疫検査シグナル値を増大させることができた。【０２７６】
＜シグナル値に対する増感の効果＞
［実施例Ｂ８］
キット１を用いた。試料液として、検体と反応液１とを１：９９（質量比）で混合した混合液を用いることで抗原濃度を４００ｃｆｕ／ｍｌとした試料液を用いた他は実施例Ｂ１と同様にして、増感検査シグナル値を得た。
［参考例ＢＡ］
増感検査を行わない他は実施例Ｂ８と同様にして、免疫検査シグナル値を得た。
結果を表１７に示す。【０２７７】
【表１７】
2020045671.tif 000021
【０２７８】
表１７に示す結果から、フロースルー検出において、金属標識単独と比べて金属標識と増感との組合せでは被検出物質のより明瞭な検出が可能であることが確認された。【０２７９】
＜増感検査シグナル値に対する銀含有化合物添加タイミングの効果＞
［実施例Ｂ９］
増感検査において液Ａ４００μｌを滴下し、２秒後に液Ｂ１００μｌを滴下した他は実施例Ｂ１と同様にして、増感検査シグナル値を得た。【０２８０】
【表１８】
2020045671.tif 000022
【０２８１】
表１８に示すように、銀含有化合物添加タイミングはどちらの場合においても抗原濃度増加に応じたシグナル値増加が見られた。特に、銀含有化合物と還元剤とを検出用メンブレンに同時に適用することで、偽陽性の発生が抑制されると同時に陽性シグナルが得られ、良好な増感効果が得られた。銀含有化合物を還元剤より前に添加すると、検出用メンブレンを増感剤が通過する間、刻々と増感剤の液組成（銀含有化合物と還元剤の組成比、ｐＨなど）が変わることになるため、銀析出反応制御が難しく、非特異的な銀結晶の析出が起こりやすくなり、偽陽性が発生しやすくなると推測される。【０２８２】
＜偽陽性防止に対する洗浄の効果＞
［実施例Ｂ１０］
免疫検査工程にて洗浄を行わない他は実施例Ｂ１と同様にして、増感検査シグナル値を得た。結果を表１９に示す。【０２８３】
【表１９】
2020045671.tif 000023
【０２８４】
表１９に示す結果から、増感を行う場合には、増感前に洗浄を行うことが、増感後の偽陽性を防止する点で望ましいことが確認された。【０２８５】
＜洗浄条件：洗浄液量＞
[実施例Ｂ１１〜Ｂ１３］
洗浄における洗浄液量を５００μｌに代えて５０μｌ、１００μｌ、２００μｌとした他は実施例Ｂ１と同様にして、増感検査シグナル値を得た。洗浄液量は、液量（μｌ）と、液量を試料導入口Ｉの面積で割った値（μｌ／ｍｍ2）を記載した。
また、増感検査における検出用リガンドを塗布していない部分の黒色化度を、検出用リガンドを塗布していない部分のスポット濃度（Ｇ値）の、増感検査前後の差分を用い、下記基準で評価した。
差分が３５以上・・・Ｄ（黒色化度大）
差分が２５以上３５未満・・・Ｂ（黒色化度中）
差分が２５未満・・・Ａ（黒色化度小）【０２８６】
【表２０】
2020045671.tif 000024
【０２８７】
表２０に示す結果から、洗浄液量が少ない（実施例Ｂ１１）と、増感検査後の検出用リガンドを塗布していない部分の黒色化度が高いことが分かる。これは、検出用リガンドを塗布していない部分にも、金コロイドが多く残っており、これが増感された結果と考えられる。増感検査後の検出用リガンドを塗布していない部分の黒色化度が高い場合、検出用リガンドを塗布した部分のシグナルにも非特異的な成分が多く含まれると考えられる。洗浄液量が多い（実施例Ｂ１２〜Ｂ１４）場合、黒色化度は低かった。一方、洗浄液量が多いと、シグナル値が低下することが分かる（実施例Ｂ１）。これは、検出用リガンド塗布部の特異的吸着した金コロイドも洗浄で一部除去されてしまうためと考えられる。また、洗浄液量が多いと、その分液流れ時間が長くかかるため、検査所要時間が長くなり検査効率は低い傾向となる。【０２８８】
＜洗浄条件：洗浄回数＞
［実施例Ｂ１４〜Ｂ１６］
キット１を用いた。合計洗浄液量を５００μｌに代えて２００μｌとし、かつ洗浄回数を１回、２回、４回とした他は実施例Ｂ１と同様にして、増感検査シグナル値を得た。また、増感検査において、検出用リガンドを塗布していない部分のスポット濃度（Ｇ値）を前述の基準で評価した。【０２８９】
【表２１】
2020045671.tif 000025
【０２９０】
表２１に示す結果から、同じ総洗浄液量の場合、少ない回数で洗浄した方が、増感検査後の検出用リガンドを塗布していない部分の黒色化度が抑えられ、シグナル値も高い傾向が見られた。【０２９１】
［実施例Ｂ１７〜Ｂ２７］
反応液として反応液２を用い、洗浄液に用いる界面活性剤として、以下の界面活性剤を濃度０．５質量％で使用した他は、実施例Ｂ１と同様にして増感検査シグナル値を得た。増感検査シグナル値の大きさは、以下の基準で分類し記載した。
シグナル値  ３５以上・・・Ａ
シグナル値  １０以上３５未満  ・・・Ｂ
シグナル値  ５以上１０未満    ・・・Ｃ
シグナル値  ５未満    ・・・Ｄ【０２９２】
【表２２】
2020045671.tif 000026
【０２９３】
［実施例Ｂ２８〜Ｂ３８］
洗浄液に用いる界面活性剤として、以下の界面活性剤を濃度０．５質量％で使用し、キット９を使用し、抗原として黄色ブドウ球菌菌液を用い、金コロイド標識ＳＡ抗体含浸部材を使用したほかは、実施例Ｂ１７〜Ｂ２７と同様にして増感検査シグナル値を得た。【０２９４】
【表２３】
2020045671.tif 000027
【０２９５】
表２２及び２３に示す結果から、Ｔｗｅｅｎ２０及びＢｒｉｊ５８及びエマール２０Ｃが、特にＴｗｅｅｎ２０及びＢｒｉｊ５８が、陽性シグナル値を維持したまま、陰性検体の偽陽性を効果的に低減する点で特に有利であることが分かる。【０２９６】
［実施例Ｂ３９〜Ｂ４３］
洗浄液中の界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０を使用し、その含有量を表２４に示すように調製し、その他は実施例Ｂ２１と同様に増感検査シグナル値を得た。【０２９７】
【表２４】
2020045671.tif 000028
【０２９８】
［実施例Ｂ４４〜Ｂ４８］
洗浄液中の界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０を使用し、その含有量を表２５に示すように調製し、その他は実施例Ｂ３２と同様に増感検査シグナル値を得た。【０２９９】
【表２５】
2020045671.tif 000029
【０３００】
表２４及び２５に示す結果から、界面活性剤濃度は０．０２質量％以上で陰性検体の偽陽性低減効果を特に発揮し、その効果は濃度０．１質量％以上でさらに大きくなることが分かる。一方、界面活性剤濃度が５質量％になると、陽性検体のシグナルが低下する傾向がみられる。【０３０１】
＜偽陽性防止に対するキャップ離脱の効果＞
［実施例Ｂ４９］
キット１を用いた。試料液として、検体を含まない液、及び、検体と反応液１とを１：９９（質量比）で混合した混合液を用いることで抗原濃度を２０００ｃｆｕ／ｍｌとした試料液を用い、キャップ、洗浄液及び増感液を表２６に示す条件で用いた他は実施例Ｂ１と同様にして、増感検査シグナル値を得た。キャップ離脱有無で検出用メンブレンの露出量が変わるため、洗浄液量及び増感液量を調整し、洗浄液及び増感液の液流れ時間が凡そ同等となるようにした。洗浄液及び増感剤の液流れ時間も計測した。【０３０２】
［実施例Ｂ５０］
洗浄時及び増感検査時にキャップ１２を離脱しなかった他は実施例Ｂ４９と同様にした。【０３０３】
【表２６】
2020045671.tif 000030
【０３０４】
表２６に示す結果から、キャップ離脱する場合としない場合どちらも、抗原濃度増加に応じてシグナル値増加が見られた。キャップ離脱せずに洗浄及び増感した場合と比べて、キャップを離脱して洗浄及び増感した場合には、偽陽性の発生が抑制される傾向が見られた。キャップ離脱する場合は、メンブレンに対して垂直な液流となり効果的に非特異吸着した標識が洗浄されるのに対し、キャップ離脱しない場合はメンブレンに対して水平方向の液流も生じ、洗浄効果が低減すると推測される。
なお、さらに増感剤液量を減らすと、液の容器壁面への付着等により定量的な液のハンドリングが難しくなる傾向がある。以上から、洗浄及び増感時にキャップを離脱することが有利であることが分かる。【０３０５】
＜増感検査シグナル値に対する増感剤量及び液流れ時間の効果＞
［実施例Ｂ５１〜Ｂ５３］【０３０６】
キット１を用いた。シグナル値の測定時点を増感剤の適用から１分程度とし、増感剤量を表２７に示すとおりとした他は実施例Ｂ１と同様にして、増感検査シグナル値を得た。また、増感剤の液流れ時間も計測した。【０３０７】
【表２７】
2020045671.tif 000031
【０３０８】
表２７に示す結果から、増感剤の量を増加させるとスポット濃度が高くなる傾向があり、増感剤液量が３μｌ／ｍｍ2以上であると良好なスポット濃度が得られ好適であることが分かる。【０３０９】
＜増感検査シグナル値に対する、増感剤の調製から適用までの時間の効果＞
［実施例Ｂ５４〜Ｂ５６］
キット１を用いた。銀含有化合物と還元剤（すなわち液Ａと液Ｂ）とを接触させて増感剤を調製してから、これを検出用メンブレンに適用するまでの時間を表２８に示すように変えた他は実施例Ｂ１と同様にして、増感検査シグナル値を計測した。結果を表２８に示す。【０３１０】
【表２８】
2020045671.tif 000032
【０３１１】
表２８に示す結果から、増感剤の調製から適用までの時間を短くすると、抗原存在有無それぞれの場合の増感検査シグナル値の差を増大させることができることが分かる。【０３１２】
＜増感検査シグナル値に対する、増感剤の滴下から検出までの時間の効果＞
［実施例Ｂ５７〜Ｂ５９］
キット１を用いた。抗原濃度、及び増感剤の滴下から検出までの時間を表２９に示すように変えた他は実施例Ｂ１と同様にして、増感検査シグナル値を計測した。結果を表２９に示す。【０３１３】
【表２９】
2020045671.tif 000033
【０３１４】
表２９に示す結果から、増感剤の適用から検出までの時間（すなわち増感時間）を長くすると、増感検査シグナル値を増大できることが分かる。【０３１５】
［実施例Ｂ６０〜Ｂ６３、対照例］
キット１０を用い、反応液として反応液３を用い、抗原として表３０に示すような抗原濃度になるように黄色ブドウ球菌菌液、及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌菌液を用いて混合液（検体２〜５として）を調製し（各実施例について）、又は混合液に代えて反応液３のみ（検体１として）を用い（対照例について）、コロイド標識ＰＢＰ２ａ抗体含浸部材を用いたこと、洗浄液として０．５質量％Ｔｗｅｅｎ２０水溶液を用いたこと、及び、シグナル値を、ＳＡ検出用リガンド及びＰＢＰ２ａ検出用リガンドをそれぞれ塗布した各１か所のスポット濃度から、リガンドを塗布していない１か所のスポット濃度を減算して求め、下記基準で評価した以外は実施例Ｂ１と同様にして、増感検査シグナル値を得た。
（増感検査シグナル値）
シグナル値  １５以上        ・・・陽性（Ａ）
シグナル値  ６以上１５未満  ・・・陽性（Ｂ）
シグナル値  ４以上６未満    ・・・陽性（Ｃ）
シグナル値  ４未満          ・・・陰性（Ｄ）【０３１６】
【表３０】
2020045671.tif 000034
【０３１７】
表３０に示すように、６×１０5ｃｆｕ／ｍｌレベルという低濃度のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌であっても、ＳＡ検出、ＰＢＰ２ａ検出とも陽性となり、菌種及び耐性因子をともに同定できた。【０３１８】
＜検出用メンブレン閉塞防止に対する前処理の効果＞
［実施例Ｂ６４〜Ｂ６８］
キット１を用いた。下記流体試料に下記前処理を行った上で金コロイド標識抗体と混合して得た検体（実施例Ｂ６４〜Ｂ６６）、又は下記流体試料をそのまま金コロイド標識抗体と混合して得た検体（実施例Ｂ６７、Ｂ６８）を用いた他は、実施例Ｂ１と同様にして、免疫検査を行った。【０３１９】
流体試料：
大腸菌を表３１に示す濃度含む牛乳
前処理：
（デプスフィルター）
メルクミリポア  ＡＰ１５（グラスファイバーフィルター  平均孔径１．０μｍ  厚み７９０μｍ）  直径４７ｍｍ  ２枚を重ねて使用
（洗浄液）
０．１質量％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液
（溶菌剤）
０．１Ｍ  ＭＯＰＳＯ    ｐＨ７．４
１．８質量％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
０．２Ｍ  ＮａＣｌ
８ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム  水溶液【０３２０】
（濾過用メンブレン）
アドバンテック東洋株式会社製  混合セルロース膜  平均孔径０．３μｍ  直径５ｍｍ【０３２１】
（前処理手順）
下記手順で前処理を行った。
・デプスフィルターを吸引濾過器にセット
・流体試料６０ｍｌをデプスフィルターで吸引圧力５０ｋＰａでおよそ１分かけて吸引濾過
・次いで、デプスフィルターを、洗浄液６０ｍｌで２回吸引濾過して洗浄
・次いで、溶菌剤２ｍｌをデプスフィルターに滴下・含浸し３０分静置
・次いで、溶菌液を吸引し回収
・次いで、溶菌液９００μｌを上述の金コロイド標識抗体含浸部材５ｍｍ×１０ｍｍと混合し１０分間静置
・次いで、溶菌液を濾過用メンブレンで濾過して、濾液４００μｌを金属標識された検体として回収【０３２２】
【表３１】
2020045671.tif 000035
【０３２３】
実施例Ｂ６４〜Ｂ６６では、免疫検査を問題なく行うことができた一方、実施例Ｂ６７及びＢ６８では、検出用メンブレンが閉塞し、検体液がフロースルーキットに吸収されず、免疫検査が成立しなかった。
【産業上の利用可能性】
【０３２４】
本発明は、食品、土壌又は地下水などの環境から採取された検体、或いは全血、血清、血漿、唾液、尿、尿道分泌物、膿、喀痰、汗、粘膜擦過物、皮膚擦過物などの生体由来物質等に含まれる特定物質の検出に好適に適用され得る。
【符号の説明】
【０３２５】
１０，２０，３０    検出機構
１    不溶性担体
２    コンジュゲートパッド
３    サンプルパッド
４    吸収パッド
５    捕捉試薬
６    対照試薬
１００，２００    フロースルー検出キット
１１，２１    ケース
１１ａ，２１ａ    上側部材
１１ｂ，２１ｂ    下側部材
１２，２２    キャップ
１３    吸収体
１４    検出用メンブレン
１５    固定部品
１６    接着剤
１７    液流調整メンブレン
Ａ    流体導入方向
Ｃ    接触部
Ｄ    検出領域
Ｄ１    陽性判定領域
Ｄ１１  菌種同定用リガンド
Ｄ１２    耐性因子同定用リガンド
Ｄ２    擬陽性判定領域
Ｆ    検出用メンブレン固定面
Ｉ    試料導入口
Ｓ１    第１の主面
Ｓ２    第２の主面
Ｖ    検体収容部
Ｗ    窓部
【図１】
2020045671.tif 000038
【図２】
2020045671.tif 000039
【図３】
2020045671.tif 000040
【図４Ａ】
2020045671.tif 000041
【図４Ｂ】
2020045671.tif 000042
【図４Ｃ】
2020045671.tif 000043
【図４Ｄ】
2020045671.tif 000044
【図５Ａ】
2020045671.tif 000045
【図５Ｂ】
2020045671.tif 000046
【図５Ｃ】
2020045671.tif 000047
【図５Ｄ】
2020045671.tif 000048
【図６Ａ】
2020045671.tif 000049
【図６Ｂ】
2020045671.tif 000050
【図６Ｃ】
2020045671.tif 000051
【図６Ｄ】
2020045671.tif 000052
【図７Ａ】
2020045671.tif 000053
【図７Ｂ】
2020045671.tif 000054
【図８Ａ】
2020045671.tif 000055
【図８Ｂ】
2020045671.tif 000056
【図９】
2020045671.tif 000057
【図１０】
2020045671.tif 000058
【国際調査報告】
2020045671.tif 000059
2020045671.tif 000060
2020045671.tif 000061
2020045671.tif 000062