(57)【要約】  本発明の目的は、ヒトＣＤ４を認識する抗体を含むＨＩＶ複製抑制剤を提供することにある。該目的は、下記（１）の抗体を有効成分として含む、ヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤により解決される。（１）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列を含み；かつ、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列又は配列番号４に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列を含む、ヒトＣＤ４を認識する抗体
2010087131.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）の抗体を有効成分として含む、ヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤。
（１）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列を含み；かつ、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列又は配列番号４に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列を含む、ヒトＣＤ４を認識する抗体
【請求項２】
下記（１）の抗体をコードする塩基配列を含む核酸を有効成分として含む、ヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤。
（１）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列又は配列番号４に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列を含む、ヒトＣＤ４を認識する抗体
【請求項３】
抗体が、ヒトＣＤ４におけるｇｐ１２０への結合部位内にあるエピトープであって、Leu3a及び／又はRPA-T4が認識するエピトープと異なるエピトープを認識する、請求項１又は２に記載のヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤。
【請求項４】
抗体が、Ｆａｂ抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤。
【請求項５】
下記（２）の核酸を有効成分として含む、ヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤。
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号３に記載の塩基配列を含む核酸
【請求項６】
有効成分として含まれる核酸が、ベクターに挿入されている、請求項２〜５のいずれか１項に記載のヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤。
【請求項７】
ベクターが、プラスミドベクター又はウイルスベクターである、請求項６に記載のヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤。
【請求項８】
ヒト免疫不全ウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス１型である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤を有効成分として含む、後天性免疫不全症候群の予防及び／又は治療するための医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＣＤ４を認識する抗体又は該抗体をコードする塩基配列を含む核酸を有効成分として含むヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus；HIV）複製抑制剤に関する。さらに本発明は、該ＨＩＶ複製抑制剤を有効成分として含む後天性免疫不全症候群（Acquired Immune Deficiency Syndrome ；AIDS）の予防及び／又は治療するための医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
in vivoで自己認識抗体および自己寛容が生じる機序を理解することは、自己免疫疾患の分野のみならず、ＡＩＤＳワクチン開発の分野でも大きな関心事である。その理由の1つとして、ヒト免疫不全ウイルス1型（Human Immunodeficiency Virus type1；HIV−1）に対するいくつかの強力な中和抗体（2F5、4E10、b12、2G12など）は自己反応性を示すという点が挙げられる（非特許文献１及び２を参照）。【０００３】
広い中和活性を示すこれらの抗体がHIV-1感染者で検出されることはまれであり、免疫を行ってこれらの抗体の力価を高めることは成功していない。これは、強力なHIV-1中和抗体の自己抗原に対する交差反応性を一因とする。一方、自己反応性抗体は健康人においても検出される。健康人における自己認識抗体の産生および病態生理学的役割については、依然として不明な部分が多い。【０００４】
ヒトＣＤ４はT細胞のマーカーであり、HIV-1の受容体として機能することが知られている。HIV-1感染者（約13%）および血清反応陰性のHIV-1曝露者（34%）では自己ヒトＣＤ４反応性抗体が検出されること、及び一部の健康人（約0.6%）もヒト抗ＣＤ４抗体陽性を示すことがこれまでに報告されている（非特許文献３〜５を参照）。また、数種のマウス抗CD4モノクローナル抗体は、in vitroおよびin vivoでHIV-1の複製を阻害することが知られている（非特許文献6〜9を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Trkola, A., Purtscher, M., Muster, T., Ballaun, C., Buchacher, A., Sullivan, N., Srinivasan, K., Sodroski, J., Moore, J.P., and Katinger, H., (1996), J Virol 70:1100-1108.
【非特許文献２】Haynes, B.F., Fleming, J., St Clair, E.W., Katinger, H., Stiegler, G., Kunert, R., Robinson, J., Scearce, R.M., Plonk, K., Staats, H.F., et al., (2005), Science 308:1906-1908. Epub 2005 Apr 1928.
【非特許文献３】Henriksson, G., Manthorpe, R., and Bredberg, A., (2000), Rheumatology (Oxford) 39:142-147.
【非特許文献４】Lenert, P., Lenert, G., and Senecal, J.L., (1996), Hum Immunol 49:38-48.
【非特許文献５】Lopalco, L., Magnani, Z., Confetti, C., Brianza, M., Saracco, A., Ferraris, G., Lillo, F., Vegni, C., Lazzarin, A., Siccardi, A.G., et al., (1999), AIDS Res Hum Retroviruses 15:1079-1085.
【非特許文献６】Rieber, E.P., Federle, C., Reiter, C., Krauss, S., Gurtler, L., Eberle, J., Deinhardt, F., and Riethmuller, G., (1992), Proc Natl Acad Sci U S A 89:10792-10796.
【非特許文献７】Benkirane, M., Hirn, M., Carriere, D., and Devaux, C., (1995), J Virol 69:6898-6903.
【非特許文献８】Moir, S., Lapointe, R., Malaspina, A., Ostrowski, M., Cole, C.E., Chun, T.W., Adelsberger, J., Baseler, M., Hwu, P., and Fauci, A.S., (1999), J Virol 73:7972-7980.
【非特許文献９】Kuritzkes, D.R., Jacobson, J., Powderly, W.G., Godofsky, E., DeJesus, E., Haas, F., Reimann, K.A., Larson, J.L., Yarbough, P.O., Curt, V., et al., (2004), J Infect Dis 189:286-291. Epub 2004 Jan 2008.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献６〜９に記載のマウス抗ＣＤ４モノクローナル抗体は、複数のクレードのHIV-1に対して広い交差反応性を示す可能性がある。ヒト抗CD4抗体がHIV-1感染やＡＩＤＳの進行からヒトを保護する何らかの役割を担い得ることが考えられる。しかし、HIV-1などのＨＩＶの感染や該感染によって引き起こされるＡＩＤＳの進行からヒトを保護し得るヒト抗CD4モノクローナル抗体は未だクローニングされておらず、このような抗体を有効成分として含むＨＩＶの複製を抑制し得る薬剤やＡＩＤＳを予防及び／又は治療するための医薬についても知られていない。【０００７】
そこで、本発明の目的は、ヒトＣＤ４を認識する抗体を含むＨＩＶ複製抑制剤を提供することにある。さらに本発明の目的は、該ＨＩＶ複製抑制剤を有効成分として含む、ＡＩＤＳを予防及び／又は治療するための医薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、健康成人ドナーの末梢血単核球からヒト抗CD4モノクローナル抗体をクローニングすることを試みたところ、ヒトＣＤ４を認識するIgM Fabの独立クローンを単離することに成功した。次いで本発明者らは、単離した抗体の可変領域の配列の解析により、可変領域遺伝子が選択的に使用されてヒトＣＤ４反応性抗体が生じることを明らかにした。すなわち、本発明者らによって単離された抗体は、健康人由来の自己ヒトＣＤ４反応性モノクローナル抗体であった。【０００９】
さらに本発明者らは、上記抗体のHIV-1の複製への影響について検討したところ、上記抗体がヒトＣＤ４の本来の機能を損なうことなくＨＩＶ−１の複製を抑制し得ることを明らかにした。本発明はこれらの知見に基づいて完成された発明である。【００１０】
したがって、本発明によれば、下記（１）の抗体を有効成分として含む、ヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤が提供される。
（１）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列を含み；かつ、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列又は配列番号４に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列を含む、ヒトＣＤ４を認識する抗体【００１１】
本発明の別の側面によれば、下記（１）の抗体をコードする塩基配列を含む核酸を有効成分として含む、ヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤が提供される。
（１）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列又は配列番号４に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列を含む、ヒトＣＤ４を認識する抗体【００１２】
本発明のヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤の好ましい態様は、抗体が、ヒトＣＤ４におけるｇｐ１２０への結合部位内にあるエピトープであって、Leu3a及び／又はRPA-T4が認識するエピトープと異なるエピトープを認識する。【００１３】
本発明のヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤の好ましい態様は、抗体が、Ｆａｂ抗体である。【００１４】
本発明の別の側面によれば、下記（２）の核酸を有効成分として含む、ヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤が提供される。
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号３に記載の塩基配列を含む核酸【００１５】
本発明のヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤の好ましい態様は、有効成分として含まれる核酸が、ベクターに挿入されている。【００１６】
本発明のヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤の好ましい態様は、ベクターが、プラスミドベクター又はウイルスベクターである。【００１７】
本発明のヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤の好ましい態様は、ヒト免疫不全ウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス１型である。【００１８】
本発明の別の側面によれば、本発明のヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤を有効成分として含む、後天性免疫不全症候群の予防及び／又は治療するための医薬が提供される。【００１９】
本発明の別の側面によれば、本発明のヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤又は本発明の医薬を製造するための、下記（１）の抗体、下記（１）の抗体をコードする塩基配列を含む核酸、又は下記（２）の核酸の使用が提供される。
（１）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列又は配列番号４に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列を含む、ヒトＣＤ４を認識する抗体
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号３に記載の塩基配列を含む核酸【００２０】
本発明の別の側面によれば、下記（１）の抗体、下記（１）の抗体をコードする塩基配列を含む核酸、下記（２）の核酸、又は本発明のヒト免疫不全ウイルス複製抑制剤を哺乳動物に投与することを含む、ヒト免疫不全ウイルスの複製を抑制する方法が提供される。
（１）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列を含み；軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列又は配列番号４に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列を含む、ヒトＣＤ４を認識する抗体
（２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号３に記載の塩基配列を含む核酸【００２１】
本発明の別の側面によれば、本発明の医薬を哺乳動物に投与することを含む、後天性免疫不全症候群の予防及び／又は治療する方法が提供される。
【発明の効果】
【００２２】
本発明のＨＩＶ複製抑制剤は、有効成分として含まれる抗体又は有効成分として含まれる核酸がコードする抗体がヒトＣＤ４を認識して結合しヒトＣＤ４とＨＩＶ−１などのＨＩＶとの結合を妨げることにより、ＨＩＶの複製を抑制することができる。さらに上記抗体は、ヒトＣＤ４におけるヒトＣＤ４本来の機能を妨げない部位を認識して結合する可能性が高いことから、ヒトＣＤ４機能阻害による免疫障害の発生を防ぎつつ、ＨＩＶの複製を抑制することが期待できる。したがって、本発明の医薬は、上記ＨＩＶ複製抑制剤を有効成分として含むことにより、臨床的にＡＩＤＳを予防及び／又は治療することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ヒトモノクローナルCD4反応性Fab遺伝子をクローニングするための実験法の概略を示した実験フロー図である。
【図２】ELISAによるヒト抗ＣＤ４抗体の定量結果を示した図である。rhCD4（50 ng/ウェル）をプレコートしたマイクロタイタープレート中で、段階希釈したHO538-213（●）、HO702-001（■）、HO702-016（▲）をインキュベートして定量した結果を示す。
【図３】ヒトＣＤ４反応性FabフラグメントHO538-213、HO702-001、HO702-016のVHおよびVL遺伝子の推定アミノ酸配列をアライメントした図である。略号は、CDRは相補性決定領域を、FRはフレームワーク領域を示し、―は同一残基、・は欠失を表す。
【図４】ヒトＣＤ４反応性FabのHIV-1JR-FL複製に対する影響を調べたアッセイ結果を示す。FabクローンHO538-213（●）、HO702-001（■）、HO702-016（▲）を濃度0.1（A）、1.0（B）、2.5（C）μg/mlで試験した結果である。ヒトＣＤ４非反応性Fabクローン13-3（○）を陰性対照として用いた。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus；HIV）複製抑制剤は、ヒトＣＤ４を認識する抗体又は該抗体をコードする塩基配列を含む核酸を有効成分として含むことにより、ＨＩＶの複製を抑制することができる。ＨＩＶは、エンベロープを持つプラス鎖の一本鎖RNAウイルスであるレトロウイルス科レンチウイルス属に属し、HIV-1（Human Immunodeficiency Virus type1）とHIV-2（Human Immunodeficiency Virus type2）がこれまでに知られている。HIV-1とHIV-2の基本的な遺伝子の構造はほぼ同じであるが、塩基配列の相同性は低く約60%程度の相同性である。ＨＩＶ−１は、ＨＩＶ−２と比べて、感染力が強く、後天性免疫不全症候群（Acquired Immune Deficiency Syndrome ；AIDS）を発症するまでの潜伏期間が短いために、世界中で蔓延しているウイルスである。本発明のＨＩＶ複製抑制剤は、このＨＩＶ−１を好適な対象とする。以下に、本発明について順を追って説明する。
【００２５】
［１］ヒトＣＤ４
ヒトＣＤ４は、分子量が約59kDaの単鎖膜貫通型糖タンパクであり、MHCクラスII分子の非多型性領域に結合し、MHCクラスII拘束性の抗原刺激活性化におけるコ・レセプターとなり得る。ヒトＣＤ４は、末梢血リンパ球の特定のサブセット、例えば、ヘルパーT細胞や単球において発現することが知られている。ヒトＣＤ４陽性T細胞サブセットは、B細胞による免疫グロブリン合成を誘導・促進する活性を示す。ヒトＣＤ４は、ヒト免疫不全ウイルス１型（HIV-1）のエンベロープ糖タンパク質であるgp120のレセプター（受容体）として機能する。したがって、特定のタンパク質がヒトＣＤ４であるか否かは、ｇｐ１２０を用いたＥＬＩＳＡにより確認することができる。
【００２６】
ヒトＣＤ４を認識する抗体の取得や該抗体がヒトＣＤ４を認識することを確認するために利用できるヒトＣＤ４は、特に制限されるものではなく、その取得についても特に制限されないが、例えば、ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞の遺伝子情報やタンパク質情報を基に、通常知られる遺伝子工学的又は物理化学的な方法により作製されたヒトＣＤ４を利用することができる。具体的には、バキュロウイルス系由来の組換えヒトＣＤ４（rhCD4）がAmerican Research Products, Inc.社（カタログ番号：18-13001）から入手可能である。
【００２７】
［２］ヒトＣＤ４を認識する抗体
ヒトＣＤ４を認識する抗体は、ヒトＣＤ４に特異的に認識する抗体であり、具体的には、下記（１）の抗体である。
（１）重鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列を含み；かつ、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列として、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列又は配列番号４に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異を有するアミノ酸配列を含む、ヒトＣＤ４を認識する抗体
【００２８】
配列表の配列番号２及び４は、以下に示す通り、ヒトＣＤ４を認識する抗体の重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号２：ヒトＣＤ４を認識する抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号４：ヒトＣＤ４を認識する抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
【００２９】
通常の抗体は大小二種類のポリペプチドからなり、大きい方のサブユニットを「H鎖」（重鎖）、小さい方のサブユニットを「L鎖」（軽鎖）という。また、それぞれのペプチドはN末端側に存在して抗原結合部位を形成する「可変領域」と抗体のクラス別に一定の「定常領域」から構成される。可変領域はさらに特に抗原結合部位の形成に密接に関与している相補性決定領域「CDR」とその間に存在する「フレームワーク」に分けられる。CDRにはH鎖とL鎖のそれぞれについてN末端側から「CDR1」、「CDR2」、「CDR3」と呼ばれる3つの領域があることが知られている。
【００３０】
ヒトＣＤ４を認識する抗体は、通常生体内に存在する形の抗体の他に、1組のH鎖断片とL鎖断片からなるFab、2組のH鎖断片とL鎖断片からなるF(ab')2、H鎖断片とL鎖断片が同一ペプチドに直列に結合した一本鎖抗体なども含む。ヒトＣＤ４を認識する抗体は、全長Ｈ鎖と全長Ｌ鎖の2対の組み合わせから構成される、通常生体内に存在する形の全長抗体でもよい。
【００３１】
上記（１）の抗体において、「１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、逆位、付加及び挿入からなる群から選ばれる少なくとも１種の変異」における「１から複数個」の範囲は、上記（１）の抗体がヒトＣＤ４を特異的に認識し得る程度の範囲であれば特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落もしくは消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていること、「アミノ酸の逆位」とは隣り合う２以上のアミノ酸残基の位置が逆になっていること、「アミノ酸の付加」とはアミノ酸残基が付け加えられていること、「アミノ酸の挿入」とは配列中のアミノ酸残基の間に別のアミノ酸残基が挿し入れられていることをそれぞれ意味する。
【００３２】
上記（１）の抗体を取得する方法は特に制限されるものではなく、例えば、配列表の配列番号２や４のアミノ酸配列の記載を参照して物理化学的に合成してもよいし、上記（１）の抗体を発現する細胞から突然変異を誘発させるなどの方法を講じて取得してもよいし、配列表の配列番号１及び３の情報を基に遺伝子工学的に上記（１）の抗体をコードする塩基配列を含む核酸から作成してもよいし、その他の通常知られる手段を用いた各種スクリーニングにより取得してもよい。
【００３３】
上記（１）の抗体は、ヒトＣＤ４におけるｇｐ１２０への結合部位内にあるエピトープであって、Leu3a及び／又はRPA-T4が認識するエピトープと異なるエピトープを認識する抗体であることがより好ましい。この抗体は、ヒトＣＤ４に結合する場合、ヒトＣＤ４の本来の機能を損なうことなく、ヒトＣＤ４とＨＩＶとの結合を阻害することが期待できる。Leu3a及びRPA-T4などのヒトＣＤ４中和抗体はヒトＣＤ４が生理機能に必要な他のリガンドと結合するのを阻止する抗体である。従ってヒトＣＤ４中和抗体はヒトＣＤ４の生理機能を阻害する可能性がある。逆にヒトＣＤ４中和抗体と拮抗しなければヒトＣＤ４中和抗体能が無いことを意味し、ヒトＣＤ４に結合してもヒトＣＤ４の生理機能を阻害しないと考えられる。
【００３４】
上記（１）の抗体の好ましい態様は、Ｆａｂ抗体である。上記（１）のＦａｂ抗体は、ヒト抗ＣＤ４抗体を産生する健康成人由来の末梢血単核球由来の細胞、例えば、Ｂリンパ芽球様細胞株（Ｂ−ＬＣＬともいう）から得たＲＮＡの情報を基に作製した細菌Ｆａｂ発現ライブラリーを利用したスクリーニングにより得ることができる。さらにスクリーニングして得られたヒトＣＤ４反応性Ｆａｂ発現クローンがＨＩＶの複製を抑制することができることについては、後述する実施例に示すように、ＨＩＶプロウイルスＤＮＡで形質転換した２９３Ｔ細胞などの適当な細胞の培養上清にヒトＣＤ４反応性Ｆａｂ発現クローンを加えてインキュベートし、次いでインキュベート後の培養上清におけるｐ２４などのＨＩＶのマーカータンパク質を検出することにより確認することができる。以下に、具体的なスクリーニング方法及び確認方法について、実施例の記載に沿って説明する。
【００３５】
まず、健康成人から末梢血単核球を採取し、この中のＢリンパ芽球様細胞株（Ｂ−ＬＣＬ）にEBV（Epstein-Barr Virus）を感染させて、Ｂ−ＬＣＬを癌化させた状態で培養する。この培養により得た上清を用いてヒトＣＤ４を認識する抗体を産生する細胞株を選抜する。この選抜は、ヒトCD4を抗原として用いて、当業者によく知られる方法、例えば、免疫染色法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法（米国特許第４，３７６，１１０号）、モノクローナルポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ法（Ｗｉｄｅら、Ｋｉｒｋｈａｍ及びＨｕｎｔｅｒ編集、「ラジオイムノアッセイ法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」、Ｅ．  ａｎｄ  Ｓ．  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、エジンバラ、（１９７０））、免疫沈降法などにより実施することができるが、感度が高くかつ汎用されていることから、ＥＬＩＳＡにより実施することが好ましい。
【００３６】
ＥＬＩＳＡには、直接吸着法、サンドイッチ法、競合法などがある。直接吸着法の一具体例について説明する。まず、ＥＬＩＳＡプレートのウェル中に抗原としてrhCD4を含む溶液を添加する。rhCD4を除去した後、ウェルの洗浄やブロッキングなどを適宜実施する。次いでrhCD4に対する抗rhCD4抗体を含む可能性のある被験試料をウェル中に添加する。該被験試料を除いた後、該抗rhCD4抗体を認識する標識化２次抗体をウェル中に加える。該標識化２次抗体を除去した後に、該標識を利用してrhCD4-抗rhCD4抗体−２次抗体の複合体を検出する。
【００３７】
次いで、ヒト抗ＣＤ４抗体産生が陽性のオリゴクローナルな細胞を選抜した後、これらの細胞の全ＲＮＡを単離する。細胞の全ＲＮＡの単離方法は特に制限されないが、例えば、キアジェン社のRNeasy Mini Kitを使用することができる。単離したＲＮＡをヒトイムノグロブリンの各鎖、例えば、Ｉｇμ、γ、λ、κ鎖に対する遺伝子特異的プライマー（配列表の配列番号５〜１４）を用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりｃＤＮＡを合成及び増幅する。
【００３８】
配列表の配列番号５；VH1a ；H鎖用５’プライマー（γ鎖μ鎖共通）
配列表の配列番号６；VH1b ；H鎖用５’プライマー（γ鎖μ鎖共通）
配列表の配列番号７；VH2a ；H鎖用５’プライマー（γ鎖μ鎖共通）
配列表の配列番号８；VH3 ；H鎖用５’プライマー（γ鎖μ鎖共通）
配列表の配列番号９；VH4c ；H鎖用５’プライマー（γ鎖μ鎖共通）
配列表の配列番号１０；FDG1；γ鎖用３’プライマー
配列表の配列番号１１；FDG2；γ鎖用３’プライマー
配列表の配列番号１２；FDG3；γ鎖用３’プライマー
配列表の配列番号１３；FDG4；γ鎖用３’プライマー
配列表の配列番号１４；FDM；μ鎖用３’プライマー
配列表の配列番号１５；VK1；κ鎖用５’プライマー
配列表の配列番号１６；VK2a；κ鎖用５’プライマー
配列表の配列番号１７；VK3a；κ鎖用５’プライマー
配列表の配列番号１８；VK4；κ鎖用５’プライマー
配列表の配列番号１９；VKC；κ鎖用３’プライマー
配列表の配列番号２０；VL1a；λ鎖用５’プライマー
配列表の配列番号２１；VL1b；λ鎖用５’プライマー
配列表の配列番号２２；VL2a；λ鎖用５’プライマー
配列表の配列番号２３；VL2b；λ鎖用５’プライマー
配列表の配列番号２４；VL3a；λ鎖用５’プライマー
配列表の配列番号２５；VL3b；λ鎖用５’プライマー
配列表の配列番号２６；VLC；λ鎖用３’プライマー
【００３９】
このＰＣＲには、タッチダウンＰＣＲを用いることが好ましい。タッチダウンＰＣＲは、ユニバーサルプライマーの融解温度（Ｔｍ）よりも若干高い融解温度（Ｔｍ）を持つ遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）を使用し、ＰＣＲの初めの数サイクル中、アニール温度をＧＳＰのＴｍに設定する。その結果、ＧＳＰによりプライミングされる遺伝子特異的合成のみが生じることになり、ＰＣＲの初期段階では目的遺伝子のみが鋳型ｃＤＮＡ中から濃縮される。以降のサイクルでは、アニーリング温度をユニバーサルプライマーのＴｍに下げて、目的遺伝子の特異的増幅を行なう。タッチダウンＰＣＲによれば、ポリＡ＋  ＲＮＡ、トータルＲＮＡのいずれからでも稀少転写産物（例えば、約５０ｎｇのトータルＲＮＡからの転写産物）を増幅可能である。
【００４０】
次いで、得られた増幅産物を適当なベクターにクローニングしてＦａｂ発現ライブラリーを作製する。ベクターは、通常発現させるべき宿主に対応するものを用い、例えば、大腸菌に発現させる場合には、pFab1-His2ベクターなどを用いることができる。
【００４１】
次いで、作製したＦａｂ発現ライブラリーを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体の中からヒトＣＤ４反応性Fab発現クローンをスクリーニングする。このスクリーニングには、例えば、上記と同様に、ELISAなどを用いることができる。クローンからFabフラグメントを精製する方法としては、透析、限外ろ過、レジンカラム、ゲルろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、塩沈澱、硫安沈殿、アルコール沈殿及びその他の溶媒沈澱のような溶解性の差を利用する方法、ＤＥＡＥ−トヨパール樹脂などを用いるイオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーのような特異的親和性を利用する方法、ブチルトヨパール樹脂などを用いる疎水クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、吸着クロマトグラフィーのような物理化学的な吸着性の差を利用する方法、等電点電気泳動及び等電点クロマトグラフィーなどのような等電点の差を利用する方法などの通常知られる方法を単独または組み合わせて供することができる。
【００４２】
ヒトＣＤ４を認識する抗体がＨＩＶの複製を抑制することができるか否かについては、例えば、実施例に記載の方法に準じて確認することができる。該方法において、まず初代培養単核球を、HIV-1プロウイルスDNAを導入されたことによりJR-FL分子クローンの感染性ビリオンを産生する293T細胞の培養上清と共に37℃で30分間インキュベートする。３０分後の培養上清において、HIV-1は、ｐ２４をマーカーとして約0.9〜2 ng含まれていることが好ましい。次いで培養上清からp24抗原をELISAなどの通常知られる方法により測定する。ＥＬＩＳＡにより測定する場合は、RETRO-TEK HIV-1 p24 Antigen ELISA Kit（ZeptoMetrix）を用いて、メーカーのプロトコールに従って行うことができる。
【００４３】
［３］ヒトＣＤ４を認識する抗体をコードする塩基配列を含む核酸
ヒトＣＤ４を認識する抗体をコードする塩基配列を含む核酸は、上記（１）の抗体をコードする塩基配列を含む核酸であり、より具体的には、配列表の配列番号１に記載の塩基配列、及び配列表の配列番号３に記載の塩基配列を含む核酸である。
【００４４】
配列表の配列番号１及び３は、以下に示す通り、ヒトＣＤ４を認識する抗体の重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域のアミノ酸配列に対応する塩基配列を示す。
配列番号１：ヒトＣＤ４を認識する抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列に対応する塩基配列
配列番号３：ヒトＣＤ４を認識する抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列に対応する塩基配列
【００４５】
ヒトＣＤ４を認識する抗体をコードする塩基配列を含む核酸を取得する方法は特に制限されるものではなく、例えば、配列表の配列番号２や４のアミノ酸配列の記載を参照して物理化学的に合成してもよいし、上記（１）の抗体を発現する細胞から突然変異を誘発させるなどの方法を講じて取得してもよいし、配列表の配列番号１及び３の情報を基に遺伝子工学的に作成してもよいし、その他の通常知られる手段を用いた各種スクリーニングにより取得してもよい。
【００４６】
ヒトＣＤ４を認識する抗体をコードする塩基配列を含む核酸としては、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列及び配列表の配列番号３に記載の塩基配列を含む核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を挙げることができる。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られる核酸を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションに限らず本明細書における遺伝子工学的及び分子生物学的な手法は、Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)などに記載されている通常知られている方法に準じて行うことができる。
【００４７】
ヒトＣＤ４を認識する抗体をコードする塩基配列を含む核酸の好ましい態様は、自律増殖可能なベクターに挿入されてなる組換えＤＮＡである。ベクターとしては、ヒト細胞内で自立的に増殖可能なベクターであれば特に制限されないが、例えば、ｐＧＬ４．１２などの発現ベクターやウイルスベクターなどを挙げることができ、好ましくはウイルスベクターである。ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを挙げることができる。ヒトＣＤ４を認識する抗体をコードする塩基配列を含む核酸をベクターに挿入する方法は、上記のMolecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)などに記載されている通常知られている方法を制限なく利用することができる。
【００４８】
［４］ＨＩＶ複製抑制剤
本発明のＨＩＶ複製抑制剤は、上記したヒトＣＤ４を認識する抗体やヒトＣＤ４を認識する抗体をコードする塩基配列を含む核酸を有効成分として含むことにより、ＨＩＶの複製を抑制することができる。
【００４９】
本発明の発現抑制剤に含まれるヒトＣＤ４を認識する抗体やヒトＣＤ４を認識する抗体をコードする塩基配列を含む核酸の質量比（抗体又は核酸／複製抑制剤）は、本発明のＨＩＶ複製抑制剤をＨＩＶが存在する哺乳動物の体液や細胞などの部位（以下、ＨＩＶ存在部位ともいう）に接触させた場合に、有効成分である上記抗体又は上記核酸がコードする抗体がＨＩＶ存在部位におけるＨＩＶの複製を抑制できる程度の割合であれば特に制限されないが、例えば、０．５〜０．９９が好ましく、０．８〜０．９９がより好ましく、０．９〜０．９９がさらに好ましい。本発明のＨＩＶ複製抑制剤は、実質的に上記抗体又は核酸を１００％含んだものであってもよい。
【００５０】
本発明のＨＩＶ複製抑制剤は、ヒトＣＤ４を認識する抗体又はヒトＣＤ４を認識する抗体をコードする塩基配列を含む核酸の有効量を含めば、固体又は液体のいずれの形態でも利用することができるが、これに薬学上許容される担体または添加剤を配合して、固体又は液体状の医薬として調製することもできる。本発明のＨＩＶ複製抑制剤は、上記抗体又は核酸とその他の成分を通常知られる方法で混合することにより製造することができる。
【００５１】
本発明のＨＩＶ複製抑制剤の使用において、本発明のＨＩＶ複製抑制剤をＨＩＶ存在部位に接触させる方法としては、有効成分であるヒトＣＤ４を認識する抗体又はヒトＣＤ４を認識する抗体をコードする塩基配列を含む核酸がＨＩＶ存在部位におけるＨＩＶと接触できれば特に制限されるものではなく、例えば、エレクトロポレーションなどのこれまでに知られている方法によりＨＩＶ存在部位に本発明のＨＩＶ複製抑制剤を直接導入する方法や、ＨＩＶ存在部位に本発明のＨＩＶ複製抑制剤をリポソームなどの細胞に取り込まれやすい形態で添加する方法などを用いることができる。
【００５２】
［５］AIDSの予防及び／又は治療するための医薬
本発明には、本発明のＨＩＶ複製抑制剤を有効成分として含む、ＡＩＤＳを予防及び／又は治療するための医薬が包含される。
【００５３】
本発明の医薬の適用対象となる疾患は、ＡＩＤＳである。ＡＩＤＳは、通常知られている意味でのＡＩＤＳとして解釈されるものであり、例えば、ＨＩＶがヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞に感染し、次いでＨＩＶによってヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞が破壊されることにより引き起こされる免疫不全症のことをいうことができる。本発明の医薬は、ヒトＣＤ４とＨＩＶとの結合を妨げることにより、ＨＩＶのヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞への感染を防ぎ、ＡＩＤＳを予防及び／又は治療することができる。
【００５４】
例えば、ＡＩＤＳを発症した患者のうち、症状が軽度な患者は本発明の医薬を投与することにより症状の進行や悪化を防ぐことが可能であり、症状が重篤な患者に対しても治療効果を期待できる場合がある。また、ＡＩＤＳを引き起こすＨＩＶは母子感染性のウイルスであることから、ＨＩＶ感染者を親に持つ子供に本発明の医薬を投与することにより、ＡＩＤＳの発症を予防することができる。
【００５５】
本発明の医薬としては、本発明のＨＩＶ複製抑制剤をそのまま用いてもよいが、通常は有効成分である本発明のＨＩＶ複製抑制剤と１又は２種以上の製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態に調製して用いることが望ましい。
【００５６】
ＡＩＤＳの予防及び／又は治療の際には、本発明の医薬だけでなく、免疫力を高めるためのサイトカインなどを併用することや、未分化リンパ球などを移植することも望ましい。
【００５７】
経口投与に適する医薬組成物の態様としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、及びシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物の態様としては、例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、点眼剤、点鼻剤、軟膏剤、クリーム剤、貼付剤、経皮吸収剤、又は経粘膜吸収剤等を挙げることができる。上記の医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物としては、例えば、乳糖やオリゴ糖などの賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、抗酸化剤、矯味剤、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、保存剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、等張化剤、噴射剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、キャリアー、薬学的アジュバント及び粘着剤等を挙げることができるが、これらは医薬組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することができ、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５８】
本発明の医薬の好ましい形態として、注射剤を挙げることができる。注射剤としては、通常、非水溶媒（または水溶性有機溶媒）を実質的に含まず、媒体が実質的に水である溶媒で溶解または希釈可能である。注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、注射剤は、生理食塩水、ＰＢＳなどの緩衝液、滅菌水等の溶剤に溶解した後、フィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプル等）に充填することにより調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアーを含めてもよい。また、非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法を用いてもよい。本発明で用いることができるキャリアーとしては、中性緩衝化生理食塩水、又は血清アルブミンを含む生理食塩水等が挙げられる。
【００５９】
さらに、本発明の医薬の好ましい形態として、凍結乾燥製剤（凍結乾燥した注射剤）を挙げることができる。このような凍結乾燥製剤であっても、注射用水（注射用蒸留水）、電解質液（生理食塩水など）などを含む輸液、栄養輸液などから選択された少なくとも１つの液体または溶媒により溶解可能であり容易に注射液を調製でき、その容器もガラス容器およびプラスチック容器が使用できる。注射剤内容物の１００重量部に対して本発明の発現抑制剤を０．０１重量部以上、好ましくは０．１〜１０重量部含有することができる。
【００６０】
本発明の医薬の投与量及び投与回数などは特に限定されず、患者の年齢、体重、及び性別などの条件、並びに疾患の種類や重篤度、予防又は治療の目的などに応じて適宜選択可能である。通常は、非経口投与による場合には有効成分量として成人一日あたり０．５μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌが好ましく、１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌがより好ましく、１０μｇ／ｍｌ〜０．５ｍｇ／ｍｌがさらに好ましいが、このような投与量を一日数回に分けて投与してもよい。本発明の医薬の投与頻度は、例えば、一日一回〜数ヶ月に１回であればよく、一ヶ月に１回の投与が好ましい。
【００６１】
本発明のＨＩＶ複製抑制剤又は医薬は、上記のような医薬品の形態としてだけでなく、医薬部外品、化粧品、機能性食品、栄養補助剤、飲食物などとして使用することができる。医薬部外品または化粧品として使用する場合、必要に応じて、医薬部外品または化粧品などの技術分野で通常用いられている種々の補助剤とともに使用され得る。あるいは、機能性食品、栄養補助剤、または飲食物として使用する場合、必要に応じて、例えば、甘味料、香辛料、調味料、防腐剤、保存料、殺菌剤、酸化防止剤などの食品に通常用いられる添加剤とともに使用してもよい。また、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状などの所望の形状で、あるいは必要に応じて成形して使用してもよい。これらに含まれる割合は、特に限定されず、使用目的、使用形態、および使用量に応じて適宜選択することができる。
【００６２】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００６３】
１．材料と方法
（１）抗体重鎖・軽鎖遺伝子の機能的クローニング
抗体産生細胞の樹立、可変領域をコードする免疫グロブリン遺伝子のクローニング、ELISA、大腸菌からのFabフラグメントの精製は既報に従って行った（Takekoshi, M., Maeda, F., Tachibana, H., Inoko, H., Kato, S., Takakura, I., Kenjyo, T., Hiraga, S., Ogawa, Y., Horiki, T., et al., (1998), J Virol Methods 74:89-98.；Takekoshi, M., Maeda, F., Nagatsuka, Y., Aotsuka, S., Ono, Y., and Ihara, S., (2001), J Biochem 130:299-303.）。以下に概要を示す。末梢血単核球にEBV（Epstein-Barr Virus）のB95-8株を感染させ、マルチウェルプレート中で増殖させた。上清を、バキュロウイルス系由来のrhCD4（50 ng/ウェル、INTRACEL）を抗原として用い、ELISAで分析した。【００６４】
ELISAは下記の通りに実施した。
ELISAプレートにrhCD4を50mM炭酸バッファーpH9.6の溶液に2μg/mLの濃度になるように溶解し50μLずつウエルに分注し4度で1晩放置した。PBS-T(PBS-0.05% Tween )で1回ウエルを洗浄した。PBS-T-SM (PBS-T-1% skim milk)を300μL加えて1時間室温でブロックした。PBS-T-SMを除去して、PBS-T-SMで希釈した抗体試料50μLを加えて1時間室温で放置した。試料を除去し、PBS-T-SMで3回洗浄した。PO結合抗ヒトIgG-Fab抗体をPBS-T-SMで1:2000に希釈して50μLを加えて1時間室温で放置した。2次抗体を除去し、PBS-T-SMで3回洗浄した。TMB試薬50μLを加えて発色させた。発色をOD６５０ｎｍで測定した。【００６５】
ヒト抗ＣＤ４抗体産生が陽性のオリゴクローナルな細胞集団から、細胞の全RNAを単離した（RNeasy Mini Kit、Qiagen）。ヒトIg μ、γ、λ、κ鎖に対する特異的プライマー（配列表の配列番号５〜２６）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によりcDNAを合成し増幅した。特異的プライマーは、いずれも最終濃度は10pmol/μLとし、複数を含む場合は等量まぜて最終濃度に調製した。上記文献に記載に従い「タッチダウン」PCRのプロトコールを用いた（Invitrogen 社、One-step RT-PCR with Platinum Taq、カタログ番号；10928-042）。ＰＣＲは、下記表１のプログラムで実施した。
【表１】
2010087131.tif 000003
【００６６】
増幅したμ、γ、λ、κ鎖をpFab1-His2ベクターのNhe I/Asc IおよびSfi I/Not I部位に組み込み、細菌Fab発現ライブラリーを作製した（Maeda, F., Nagatsuka, Y., Ihara, S., Aotsuka, S., Ono, Y., Inoko, H., and Takekoshi, M., (1999), J Med Virol 58:338-345.）。pFabライブラリーを用いて大腸菌JM109株の形質転換を行い、ヒトＣＤ４反応性Fab発現クローンをELISAでスクリーニングした。Fabフラグメントは抗Fab抗体アフィニティーカラムを用いて精製した。溶出したFabをPBSに対して透析し、遠心濃縮した（VIVASPIN遠心濃縮チューブ、Vivascience AG）。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により分析したFabフラグメントの純度は95%を上回っていた。【００６７】
（２）細胞
B-LCLおよび293T細胞は、10% FBS（ジャパン・バイオシーラム）、ペニシリン、ストレプトマイシン（Invitrogen）を添加したRPMI 1640（Sigma）中で維持した。初代培養単核球は、10% FBS、ペニシリン、ストレプトマイシン、5 μg/ml Plasmocin（InvivoGen）、5 μg/ml抗CD3モノクローナル抗体（OKT3、ヤンセンファーマ）、70 U/ml組み換えヒトインターロイキン2（rhIL-2、塩野義製薬）、GlutaMax-I（Invitrogen）、インシュリン-トランスフェリン-セレニウム-A（Invitrogen）、10mM HEPES（Invitrogen）を添加したRPMI 1640中で維持した。細胞は37℃、5% CO2の加湿条件下で培養した。【００６８】
（３）ＨＩＶ−１複製のモニタリング
アッセイは既報の手順で行った（Shimizu, S., Urano, E., Futahashi, Y., Miyauchi, K., Isogai, M., Matsuda, Z., Nohtomi, K., Onogi, T., Takebe, Y., Yamamoto, N., et al., (2007), AIDS 21:575-582.）。以下に概要を示す。初代培養単核球（1×105細胞）を、HIV-1プロウイルスDNAを導入されたことによりJR-FL分子クローンの感染性ビリオンを産生する293T細胞の培養上清（HIV-1［約0.9〜2 ng p24］が含まれる）と共に37℃で30分インキュベートした。培養上清をELISAで測定し、p24抗原を検出した。ELISAには、RETRO-TEK HIV-1 p24 Antigen ELISA Kit（ZeptoMetrix）をメーカーのプロトコールに従って用いた。【００６９】
２．結果
末梢血単核球は健康成人志願者1名から採取した。Bリンパ芽球様細胞株（B-LCL）は細胞にEpstein-Barrウイルス（EBV）を感染させることにより樹立した（図1）。EBVで形質転換したB-LCLはオリゴクローナルに増殖させた。培養上清の組み換えヒトCD4（rhCD4）に対する反応性はELISAにより検討した。rhCD4反応性が陽性の細胞集団2個（HO538、HO702）を同定した。これらの細胞集団はスクリーニングした他の抗原とは反応しなかったため、rhCD4に対する反応性は特異的であった。陽性ウェルの細胞を増殖させ、細胞のRNAを抽出した。抗体のFabフラグメントをコードする遺伝子をRT-PCRにより増幅させ、挿入されたVHおよびVL遺伝子のセットのFabフラグメントを産生する細菌発現ベクターpFab1-His2にクローニングした。一部のクローンでは当初のB-LCL細胞集団中に存在したヒトＣＤ４反応性Fabが再構成されると予想された。ELISAによるスクリーニングの後、HO538細胞集団から1クローン（HO538-213）、HO702細胞集団から独立した2クローン（HO702-001、HO702-016）のヒトＣＤ４反応性IgM Fabクローンを単離した。以下、HO538-213に関する記載を実施例として、HO702-001及びHO702-016に関する記載を比較例として記す。【００７０】
これらのクローンは、塩基配列解析の結果、IgM Fabであった。ヒトＣＤ４反応性抗体を産生する末梢B細胞の割合は、末梢B細胞の約0.0013%と推定された。精製した3クローンのIgM FabのrhCD4に対する結合をELISAにより検証した（図2）。OD 650 nmの吸光度が約0.7〜0.8（最大結合の50%が観察される値）となる希釈倍率から、抗体量はHO702-001およびHO702-016が約1 μg/ml、HO538-213が約8 μg/mlと推定された。HO538-213のrhCD4に対する親和性は、他のクローンの1/8であった。【００７１】
Fab配列の解析は、上記１（１）に記載した通りに、GenBankのKabatデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）を用いて行った。各遺伝子の免疫グロブリン（Ig）遺伝子ファミリーおよび最も相同性の高い胚細胞遺伝子を表２に示す。
【表２】
2010087131.tif 000004
【００７２】
配列解析の結果、3クローンはいずれもVLがκ鎖のIgMであった。重鎖を胚細胞遺伝子と比較したところ、HO538-213およびHO702-001のμ鎖は胚細胞遺伝子VH 3-33とそれぞれ95%および97%、HO702-016のμ鎖は胚細胞遺伝子VH 4-4と96%の相同性を示していた（Matsuda, F., Ishii, K., Bourvagnet, P., Kuma, K., Hayashida, H., Miyata, T., and Honjo, T., (1998), J Exp Med 188:2151-2162.）。軽鎖については、HO538-213のκ鎖Vκ3は胚細胞遺伝子L6と97%（Huber, C., Schable, K.F., Huber, E., Klein, R., Meindl, A., Thiebe, R., Lamm, R., and Zachau, H.G., (1993), Eur J Immunol 23:2868-2875.；Pech, M., and Zachau, H.G., (1984), Nucleic Acids Res 12:9229-9236.）、HO702-001およびHO702-016のκ鎖Vκ1はいずれも胚細胞遺伝子L12と97%（Pech, M., and Zachau, H.G., (1984), Nucleic Acids Res 12:9229-9236.；Bentley, D.L., and Rabbits, T.H., (1980), Nature 288:730-733.）の相同性を示していた。以上のデータから、これらのIgM可変領域遺伝子に体細胞高頻度変異（sHM）が生じたことが示唆される。また、ゲノムにコードされているVHおよびVL遺伝子の数を考慮すると、VHおよびVL遺伝子が見かけ上選択的に使用されてヒトＣＤ４反応性抗体が生じることも示唆される。【００７３】
VHおよびVLの推定アミノ酸配列を図3に示す。クローンHO702-001とHO702-016の軽鎖は同一であった。HO538-213とHO702-001はいずれも胚細胞遺伝子VH 3-33由来であるがVHのアミノ酸配列が異なり、sHMによる親和性成熟が生じたことが示唆される。【００７４】
これらのヒトＣＤ４反応性Fab抗体がHIV-1の複製に影響を及ぼすかについて検討した。ウイルス複製は、初代培養単核球が培養上清中に放出するp24CAウイルス抗原を測定することによりモニタリングした。3クローンのIgM Fabのうち、HO538-213は1μg/mlおよび2.5 μg/mlの濃度でHIV-1JR-FLの複製を抑制したが、0.2 μg/mlでは影響は認められなかった（図4）。ヒトＣＤ４のエピトープを調べるため、HIV-1を中和する抗CD4マウスモノクローナル抗体Leu-3aおよびRPA-T4（非特許文献７及び８、並びにSattentau, Q.J., Dalgleish, A.G., Weiss, R.A., and Beverley, P.C., (1986), Science 234:1120-1123.23を参照）とHO538-213の競合アッセイを行った。HO538-213はヒトＣＤ４とLeu-3aまたはRPA-T4の結合をいずれも阻害しなかった。このことから、HO538-213により認識されるエピトープは、HIV-1を中和する2種類のモノクローナル抗体により認識されるエピトープとは異なることが示唆された。Leu-3aはヒトＣＤ４+ T細胞の免疫調整機能を阻害することが示されているが、HO538-213はヒトＣＤ４の本来の機能を阻害しない強力なHIV-1ブロッカーであることが期待できる。【００７５】
３．考察
上記結果は、健康成人末梢血のB細胞が、sHMを有しヒトＣＤ４との交差反応性を示すIgMをコードすることを示した。IgMは病原体に対して多反応性を示し、感染性病原体に対する自然抵抗力をもたらす。上記結果は、ヒトＣＤ４反応性IgMが健康人に存在し、ヒトＣＤ４+ T細胞の機能調節の異常をもたらさずに、HIV-1感染やＡＩＤＳの進行に対する自然抵抗力に寄与し得ることを示す。これは、「未遭遇の」病原体（ここではHIV-1）に対するIgMの先天的機能をクローンレベルで明確に示すものである。【００７６】
乳児にはIgM+IgD+CD27+ B細胞により生じるIgMを介した液性自然免疫が認められ、未遭遇の病原体に対するsHMが蓄積している。上記結果は、成人末梢血の成熟B細胞集団もsHMを伴う先天性のIgMを産生することを示すものである。これらのIgM産生B細胞は正・負の選択を受けていることを考慮すると、その本来の標的はヒトＣＤ４ではないかもしれない。IgM Fab遺伝子にsHMが蓄積し、末梢でのB細胞成熟後にヒトＣＤ４に対する交差反応性が生じた可能性がある。ヒトＣＤ４交差反応性IgMがin vivoで少量産生され、これらのクローンのサブセットがHIV-1感染に対する先天的防御として機能できることが考えられる。B-1細胞はこのようなIgMを産生し、自己抗原に対して交差反応性を示すことが多い。これらのIgMがヒトＣＤ４+ T細胞の機能調節異常を引き起こした場合は、抗体産生B細胞においてCD5の発現が誘導され、未知の機序により自己反応性抗体の産生が自己制御される。【００７７】
上記結果は、VHおよびVL遺伝子が選択的に使用されてヒトＣＤ４反応性IgM Fabが生じることを明らかにするものである。これは他の自己認識抗体にも当てはまると考えられ、自己抗原に対する交差反応性を有し、広い中和活性を示す強力な抗HIV-1抗体もそれに含まれる可能性がある。抗体型ＡＩＤＳワクチンの開発に関する知見を得るためには、HIV-1を中和するヒトモノクローナル抗体をさらに単離し、その可変領域の配列や自己抗原に対する交差反応性を分析しなければならない。上記実験手法は、これらの問題に取り組むのに役立つ可能性がある。【００７８】
自己認識抗体を治療薬として用いる際には、安全性が常に問題となる。HO538-213として単離したヒトＣＤ４反応性IgM Fabを単離したドナーは、単離後20年以上健康を維持していることから、in vivoではヒトＣＤ４+ T細胞の機能に深刻な阻害は生じていないことが示唆される。健康人由来のヒトＣＤ４反応性抗体は、HIV-1感染の治療に役立つ可能性が高い。クローン化ヒトＣＤ４反応性抗体が免疫調整機能を有するのであれば、臓器移植患者や他の免疫疾患患者の治療にも利用できることが期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
国連合同ＡＩＤＳ計画（UNAIDS）の報告によれば、2007年末における世界のＨＩＶ感染者数（子どもを含む）は3,300万人（成人感染率0.8％）と推計されている。ＨＩＶは、感染者の血液・精液・膣分泌液に大量に含まれており、性的感染、血液感染、母子感染などにより容易に非感染者に感染し得る感染力の強いウイルスである。さらにＨＩＶに感染すると、ＡＩＤＳを発症し死に至る可能性が高いことが知られている。これらの事情から、ＨＩＶ感染は日本だけでなく世界的な社会問題として取り上げられている。本発明のＨＩＶ複製抑制剤や本発明の医薬は、適用すべき対象（ＨＩＶ感染者やＡＩＤＳ罹患者）が多いことにより産業的に有効性の高い発明であり、さらにＨＩＶの世界的蔓延を防ぐことができる社会的に価値の高い発明である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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