(57)【要約】【課題】細胞・組織の遺伝子発現の相対定量を反復して行うためには、大量のスタンダードを供給することが必要とされる。【解決手段】本発明は、合成ＤＮＡプラスミドなどからなる、絶対定量したスタンダードを採用することで、長期にわたる反復遺伝子発現解析に対して均一なスタンダードを安定して供給する。また、本発明は、このようなスタンダードを用いることにより、反復遺伝子発現解析を再現性良く安定に実施することを可能とする。また、当該方法を用いて細胞や組織の品質を長期に亘って安定的に管理する方法、当該方法に用いるスタンダードを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶対定量したスタンダードを用いることを特徴とする、細胞または細胞を含む組織の遺伝子発現解析方法。
【請求項２】
リアルタイムＰＣＲを用いることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子発現解析方法。
【請求項３】
前記絶対定量したスタンダードは、合成ＤＮＡであることを特徴とする、請求項１または２に記載の遺伝子発現解析方法。
【請求項４】
前記合成ＤＮＡは、ＤＮＡプラスミドであることを特徴とする、請求項３に記載の遺伝子発現解析方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子発現解析方法を用いることにより、細胞または細胞を含む組織の品質を管理する方法。
【請求項６】
前記細胞が、哺乳動物細胞であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、体性幹細胞であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞または組織が、再生医療において使用されるものであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の遺伝子発現解析方法を用いることにより、細胞を含む再生医療製品の有効性または安全性を評価する方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法で用いるための、１または複数の絶対定量されたスタンダード。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞や組織の遺伝子発現解析において、絶対定量したスタンダード、例えば絶対定量したＤＮＡプラスミドからなるスタンダードを用いることで、遺伝子発現解析を安定的に行う方法、当該方法を用いて細胞や組織の品質を長期に亘って安定的に管理する方法、当該方法に用いるスタンダードを提供する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物等の培養細胞は、医薬、研究の分野等で広く用いられているが、細胞は培養・保存中に変質することがあり、培養・保管中に細胞が変質していないことを確認するために、リアルタイムＰＣＲを利用した遺伝子発現解析によって細胞の品質を管理・保証することが広く行われている（特許文献１）。【０００３】
このような遺伝子発現解析に用いられるリアルタイムＰＣＲ試験では、検量線法や比較Ｃｔ法を利用した相対定量が広く利用されている。検量線法では、内部標準遺伝子及び標的遺伝子をともに高発現する検体（細胞）から抽出したＲＮＡ又はそれから合成したｃＤＮＡを段階希釈したものをスタンダードとして用いている。相対定量の場合、遺伝子ごとに基準となるキャリブレータ検体と対象検体を比較する必要がある。【０００４】
特定の細胞について長期に亘る研究を行う際には、その全期間を通じて可能な限り正確な遺伝子発現の相対定量を反復して行うために、その研究初期段階でスタンダードまたはキャリブレータ検体を大量調製し、同一のｃＤＮＡ／ＲＮＡプールから分注保存したものを各遺伝子発現解析に使用するのが望ましい。しかし、開発から上市までの長期に亘るライフサイクルを通じて必要とされるのに十分な量の、スタンダードまたはキャリブレータを取得し、これを安定に保管・維持することは困難であり、現実的ではない。【０００５】
また、再生医療分野等において、特定の性質を有する細胞を大量に長期に亘って供給する必要性が増大しており、細胞の品質を管理するために遺伝子発現解析が利用されている（特許文献２）、これらの細胞の品質管理において用いられる遺伝子発現解析に必要な大量のスタンダードまたはキャリブレータを供給することは困難であり、より優れた方法が求められている。【０００６】
さらに、品質を保証すべき細胞・組織を大量に維持するような場合には、物理的に離れた施設においてこれらを管理する必要が想定され、これら離れた施設において個別に細胞の品質管理を行う際に、スタンダードまたはキャリブレータを安定に移送することも問題となり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００５−５０８５０５号公報
【特許文献２】特開２０１４−２３０４９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
長期に亘る研究に使用する細胞・組織について、その全期間を通じて可能なかぎり正確に当該細胞・組織の遺伝子発現の相対定量を反復して行うためには、スタンダードまたはキャリブレータ検体が大量に必要とされ、そのように大量のスタンダードを供給することは困難である。【０００９】
特に、再生医療の分野では、使用する大量の細胞・組織を長期に亘って一定の性質に保つ品質管理が重要であり、細胞の遺伝子発現パターンに変化がないことを検査するために、長期に亘って遺伝子発現解析を一定期間ごとに行うことが必要である。そのような長期に亘る反復遺伝子発現解析をより安定に行うことを可能とする技術が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、合成ＤＮＡプラスミドなどからなる、絶対定量したスタンダードを採用することで、長期にわたる反復遺伝子発現解析に対して均一なスタンダードを安定して供給する。また、本発明は、このようなスタンダードを用いることにより、反復遺伝子発現解析を再現性良く安定に実施することを可能とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法を使用することにより、特定の性質を有する細胞の品質を、長期に亘って保証することが可能となり、再生医療分野等、特定の性質を有する細胞を大量、長期に亘って供給する必要がある分野において極めて有用である。【００１２】
また、本発明の方法は、再生医療製品の有効性または安全性を精度よく評価することを可能にする。さらに、当該絶対定量したスタンダードとして、合成ＤＮＡプラスミドを利用することにより、離れた施設において個別に細胞の品質管理を行う際に、それぞれの施設において当該スタンダードを調製することを可能としながら、安定的に長期にわたる反復遺伝子発現解析を行うことができる。【００１３】
また、絶対定量したスタンダードを採用することで、必ずしも比較の基準となる検体が必要ではなくなり、各々検量線で求めた、対象検体の標的遺伝子のコピー数を内部標準遺伝子のコピー数で除した標準化発現量で評価することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ドナーＡ〜Ｆから採取した組織から単離・培養した体性幹細胞と、市販の同一組織由来の線維芽細胞における、遺伝子Ａ〜Ｃの遺伝子発現解析結果を示す。各標的遺伝子の発現量を内部標準遺伝子の発現量で除することで標準化された標準化発現量がヒートマップによって示されている（発現量の低いものをより暗く、多いものをより明るく示す）。
【図２】比較細胞に対する各サンプルの標的遺伝子の相対発現量がヒートマップによって示されている。各サンプルの標的遺伝子の標準化発現量を、比較細胞の当該標的遺伝子の標準化発現量で除することで、比較細胞に対する相対発現量を算出した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、一つの態様において、絶対定量したスタンダードを用いることを特徴とする、細胞または細胞を含む組織の遺伝子発現解析方法である。
【００１６】
また、別の態様において、本発明は、リアルタイムＰＣＲを用いることを特徴とする、前記遺伝子発現解析方法である。
【００１７】
また、別の態様において、本発明は、合成ＤＮＡである絶対定量したスタンダードを用いることを特徴とする、前記遺伝子発現解析方法である。
【００１８】
また、別の態様において、本発明は、ＤＮＡプラスミドである絶対定量したスタンダードを用いることを特徴とする、前記遺伝子発現解析方法である。
【００１９】
また、別の態様において、本発明は、前記遺伝子発現解析方法を用いることにより、細胞または細胞を含む組織の品質を管理する方法である。
【００２０】
また、別の態様において、本発明は、細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする、細胞または細胞を含む組織の品質を管理する方法である。
【００２１】
また、別の態様において、本発明は、細胞が、体性幹細胞であることを特徴とする、細胞または細胞を含む組織の品質を管理する方法である。
【００２２】
また、別の態様において、本発明は、細胞または組織が、再生医療において使用されるものであることを特徴とする、細胞または細胞を含む組織の品質を管理する方法である。
【００２３】
また、別の態様において、本発明は、前記遺伝子発現解析方法を用いることにより、細胞を含む再生医療製品の有効性または安全性を評価する方法である。
【００２４】
また、別の態様において、本発明は、前記遺伝子発現解析方法、細胞または細胞を含む組織の品質を管理する方法、または再生医療製品の有効性または安全性を評価する方法で用いられる、１または複数の絶対定量されたスタンダードである。
【００２５】
（定義）
本発明において、「遺伝子発現分析」とは、細胞または組織サンプルに由来するものの集団を作成して分析することにより、どの遺伝子がサンプル中で発現されているかを調べることを包含する。典型的には、サンプルにおける各遺伝子由来のｍＲＮＡの存在を調べることにより、当該遺伝子の発現を評価する。
【００２６】
「定量的遺伝子発現分析」とは、遺伝子の発現量についての相対的または絶対的な値を求める分析を意味する。例えば、サンプル中のｍＲＮＡ量に基づいて、遺伝子の発現量を求める分析を包含する。
【００２７】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」とは、過剰の非特異的ＤＮＡの存在下でも、インビトロで選択されたＤＮＡの特定の小片を複製するための技術を意味する。プライマーを選択されたＤＮＡに添加すると、プライマーはヌクレオチドおよびポリメラーゼなどを用いて選択ＤＮＡのコピーを開始する。温度を循環させることにより、選択ＤＮＡは変性およびコピーを繰り返す。いくつかの例においては、線状増幅法をＰＣＲの代替として用いることができる。
【００２８】
「リアルタイムＰＣＲ」という用語は、ＰＣＲにおける増幅を、反応完了後ではなく、反応の間に測定する種々のＰＣＲの適用例を意味する。リアルタイムＰＣＲを用いた遺伝子発現分析では、サンプル中のｍＲＮＡの存在量を算出し、遺伝子発現量を求める。この際ＲＮＡ自体をＰＣＲの鋳型にしてもよく、ＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡをＰＣＲの鋳型に用いてもよい。ＲＮＡを鋳型とする場合、ＰＣＲ反応液に逆転写酵素を加えたＲＴ−ＰＣＲ反応液を調製し、ＰＣＲ反応の温度サイクルに掛ける前に逆転写反応によりＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡを合成し、その後ＰＣＲ反応によりこのｃＤＮＡを鋳型として対象配
列を増幅することができる（１ステップＲＴ−ＰＣＲ）。また、逆転写反応とＣＲ反応を別々に行うこともできる（２ステップＲＴ−ＰＣＲ）。当該リアルタイムＰＣＲ法としては、特に限定されないが、例えば、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ、例えば、Taq DNA ポリメラーゼの5'-エキソヌクレアーゼ活性を利用した加水分解プローブ等のプローブを用いる方法、サイバーグリーン等のインターカレーターを用いる方法等を用いることができる。
【００２９】
「標的遺伝子」とは、リアルタイムＰＣＲにおいて、対応するｍＲＮＡの存在量を測定する対象とされる遺伝子を意味する。
【００３０】
「内部標準遺伝子」とは、リアルタイムＰＣＲにおいて実験間の発現量の補正のためにその発現量が測定される遺伝子を意味する。典型的には、多くの組織や細胞中に共通して一定量発現する遺伝子であって、常に発現され，細胞の維持，増殖に不可欠な遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）が用いられる。
【００３１】
「スタンダード」とは、リアルタイムＰＣＲにおいてＣｔ値（増幅曲線が一定のシグナル強度に達したときのサイクル数）と遺伝子の試料中のコピー数の関係を示す検量線を得るために用いられる検体を意味し、希釈系列から構成される。典型的には、内部標準遺伝子及び標的遺伝子をともに高発現する検体（細胞）から抽出したＲＮＡ又はそれから逆転写により合成したｃＤＮＡを含み、また、新規に合成されたＲＮＡまたはＤＮＡも含む。
【００３２】
「キャリブレーション検体」とは、複数の検体における標的遺伝子の相対的存在量を測定する際に、基準として任意に選択される検体を意味する。
【００３３】
「発現プロファイル」とは、複数の細胞成分の存在比の測定結果を意味する。例えば、複数のＲＮＡ又はタンパク質の存在量またはこれらの組み合わせを意味する。発現プロファイルは、例えば、転写状態や翻訳状態の測定結果であってもよい。
【００３４】
「品質管理」とは、細胞や組織が一定の性質を維持していることを確認すること、また、当該性質を失った細胞や組織を除去することなどで、一定の性質を有する細胞や組織を維持することを含む。当該一定の性質が維持されているか否かは、典型的には当該細胞や組織の遺伝子の発現プロファイルの同一性に基づいて判断される。
【００３５】
「細胞」とは、1以上の核、細胞質、および種々の細胞小器官から構成され、全てが半透性の細胞膜もしくは細胞壁で囲まれた、独立して機能し得る生物の最小構造単位、または単細胞生物を意味する。細胞は原核生物であっても、真核生物であっても、また古細菌であっても良い。哺乳動物細胞、特にヒトの細胞が好ましい。細胞は、天然のものであっても、例えば遺伝的操作もしくは継代培養によって所望の性質を達成するように改変されたものであっても良い。
【００３６】
絶対定量されたスタンダード
本発明の絶対定量されたスタンダードは、リアルタイムＰＣＲに用いられるスタンダードの希釈系列の各検体において、それぞれに含まれるＰＣＲ反応の鋳型となるＲＮＡもしくはＤＮＡまたはこれらの類似体の含量（分子数）があらかじめ決定されているスタンダードを意味する。
【００３７】
当該ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはこれらの類似体として、一本鎖、二本鎖、直鎖、環状等様々な形態のものを使用することができ、好ましくは、環状プラスミドＤＮＡを使用することができる。さらに、これらＲＮＡもしくはＤＮＡまたはこれらの類似体は、非天然塩基対を含んでもよい。
【００３８】
当該スタンダードに用いられるＲＮＡまたはＤＮＡは、標的遺伝子の配列および／または内部標準遺伝子の配列を有することができる。このような配列の選択は、既知の方法に基づいて当業者が適宜おこなうことができる。例えば、当業者が実験により、または、公開塩基配列データベース（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ等）の配列データなどを用いて決定したプライマー等を用いて合成し、所望の配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡをＰＣＲで増幅したり、新規に合成することができる。
【００３９】
また、ＲＮＡまたはＤＮＡ含量の決定には、特に限定されず公知の方法を使用することができ、例えば分光光度計を用いて核酸の特異的吸収波長の吸光度を測定する方法、特定標的分子と結合した際に発する蛍光を測定する方法（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＱｕｂｉｔフルオロメーター）、アガロースゲル電気泳動した核酸を染色してその濃度を測定する方法、マイクロチップ型電気泳動（例えばＢｉｏ−Ｒａｄ社のＥｘｐｅｒｉｏｎ  ＤＮＡ分析キット）などの方法を使用することができる。特にマイクロチップ型電気泳動の使用が好ましい。
【００４０】
これら公知の方法によるスタンダードの定量は、高精度で反復実行することができ、例えば新たに絶対定量されたスタンダードを合成して用いた場合も、以前に使用していたスタンダードを用いて行われた解析の結果と比較することができる。
【００４１】
標的遺伝子の発現量の算出
本発明の絶対定量されたスタンダードを使用して標的遺伝子の発現量を算出する際には、スタンダードを用いて作成した検量線に、含量未知の試料から得られたＣｔ値を当てはめることにより、試料中の標的遺伝子の発現量（コピー数）を算出することができる。
【００４２】
検量線を作成する際には、任意の既知の方法を使用することができ、例えば、スタンダードの希釈系列のリアルタイムＰＣＲの結果から、サイクル数と増幅ＤＮＡの量の関係を示す増幅曲線を取得し、これを用いて検量線を作成することができる。
【００４３】
さらに、標的遺伝子の発現量を得た各サンプルについて、同様の方法で内部標準遺伝子の発現量を取得し、各サンプルにおける標的遺伝子の発現量を標準遺伝子の発現量で標準化することで、各サンプル間のばらつきを補正した標的遺伝子の標準化発現量を得ることができる。
【００４４】
また、各種細胞間における各標的遺伝子の発現量の差異を検討する際には、解析対象細胞の標準化発現量を比較細胞の値で除し、比較細胞に対する相対発現量を算出することができる。
【００４５】
細胞、組織の品質管理への適用
細胞や組織を長期に亘って培養、保存する際には、一定の期間ごとに各細胞、組織を特徴付ける遺伝子発現プロファイルを構成する複数の遺伝子の発現量を上記方法により取得し、その継時的変化が無いまたは微少であることを確認することで、細胞や組織が変質していないことを確認、保証することが可能となる。
【００４６】
その際、各細胞、組織を特徴付ける遺伝子発現プロファイルを構成する複数の遺伝子の種類およびその数は、公知の情報に基づいて、当業者が任意に選択することが可能である。
【００４７】
そのような細胞には、任意の細胞が選択され得る。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞であり、特にヒトの細胞である。また、当該細胞は、体性幹細胞であることが好ましく、あるいは、その他再生医療において使用される細胞であることが好ましい。
【００４８】
このような品質管理において、合成ＤＮＡを絶対定量されたスタンダードとして用いることにより、細胞または組織を異なる施設で管理する際にも、統一された基準により細胞の品質を管理することが可能となる。
【００４９】
再生医療製品の有効性または安全性の評価への適用
細胞を含む再生医療製品では、目的の治療効果を奏するために、細胞が一定の性質を維持していなければならない。本発明の絶対定量されたスタンダードを用いる遺伝子発現解析方法を用いて、再生医療製品に含まれる細胞の発現プロファイルの継時的変化がないまたは微小であることを確認することにより、細胞が当該一定の性質を維持しているか否かを評価すること、すなわち、当該細胞を含む再生医療製品の有効性を評価することができる。その際、たとえば、特定の遺伝子（群）の相対または絶対的発現量の変化量に基づいて評価する場合、その変化量の基準は、２００％、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％などに設定できるが、これらに限定されない。
【００５０】
また、変質した細胞の適用は、再生医療製品の安全性を失う恐れが高い。本発明の絶対定量されたスタンダードを用いる遺伝子発現解析方法を用いることにより、当該変質した細胞を検出し、再生医療製品の安全性を評価することができる。
【００５１】
絶対定量されたスタンダードおよびこれを含むキット
特定の細胞、組織の品質管理のために選択された絶対定量されたスタンダードのセットは、当該細胞、組織の品質管理に利用するものとして、スタンダードのセットとしてまたは、単一のスタンダードとして提供される。
【００５２】
スタンダードのセットとしてまたは、単一のスタンダードとして提供する際には、保存剤等、通常用いられる添加剤を併用することができ、液体、乾燥粉末等、任意の形態で提供することができる。
【００５３】
以下の実施例において、本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００５４】
体性幹細胞の調製：
ドナーＡ〜Ｆから採取した組織から単離した各体性幹細胞について、培養条件（条件１〜３）や継代数（Ｐ３・Ｐ４・Ｐ７）の異なる細胞から各々検体を調製した。【００５５】
調製したＤＮＡ検体について、下記の手順でリアルタイムＰＣＲにより遺伝子Ａ〜Ｃの発現を解析した。また、市販の同一組織由来の線維芽細胞（比較細胞Ｐ３）を培養し、比較細胞として同様に解析した。【００５６】
ＲＮＡ抽出：
８０％コンフルエントの細胞培養フラスコから、以下の手順でＲＮＡを抽出した。フラスコの培地を除去し、ＤＰＢＳ（−）  で２回洗浄した後、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ（ＱＩＡＧＥＮ）  ９００μＬを添加し、セルスクレーパーを用いて細胞を剥がし、１．５ｍＬチューブに細胞溶解液を回収した。この細胞溶解液について、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＮＡを抽出し（ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲノムＤＮＡを除去）、最終的にＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ  ３０  μＬで溶出した。【００５７】
逆転写反応：
ＲＮＡ溶液を用いてＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて逆転写しｃＤＮＡを調製した。逆転写反応は反応容量４０  μＬでｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２  μｇを用いた。【００５８】
絶対定量されたＤＮＡスタンダードの調製：
内部標準遺伝子を含む、各遺伝子の標的配列をクローニングしたプラスミドを直鎖化・精製し、マイクロチップ型電気泳道装置（Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  ＤＮＡ分析キット、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で定量し、分子量に基づき得られた濃度（ｎｇ／μＬ）をコピー数に換算した。【００５９】
検量線法による遺伝子発現解析：
凍結保存されたＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（標的遺伝子Ａ〜Ｃ）及び内部標準遺伝子のプライマー・プローブミックス（自社設計）を氷上で解凍し、ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて遺伝子ごとにＰＣＲ反応マスターミックスを氷上で調製した。ＰＣＲチューブの各ウェルにマスターミックスを１５  μＬずつ分注し、予め希釈調製した逆転写反応液（Ｎｋｘ２．５：逆転写反応液の原液、ＧＡＴＡ４、Ｔｂｘ５、Ｍｅｆ２Ｃ：２０倍希釈、ＡＣＴＢ：１００倍希釈；各ｎ＝２）又はスタンダード溶液（１０１〜１０５  ｃｏｐｉｅｓ／μＬ；各ｎ＝１）を各ウェルに５  μＬずつ添加した。調製したＰＣＲチューブをＡＢＩ７５００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にセットし、リアルタイムＰＣＲ解析を行った。
常法に従い、遺伝子ごとに作成した検量線に基づき、反応液中の各標的遺伝子および内部標準遺伝子のコピー数を算出した。得られた各標的遺伝子のコピー数を内部標準遺伝子のコピー数で除することにより標準化し、各標的遺伝子の標準化発現量を算出した。【００６０】
遺伝子発現プロファイルの評価：
各ドナー由来の体性幹細胞サンプルについて、各標的遺伝子について検量線法による遺伝子発現解析を行い、各標的遺伝子の標準化発現量を算出した。【００６１】
同様に、比較として上記体性幹細胞と同一の組織由来の線維芽細胞（比較細胞Ｐ３）についても、各標的遺伝子について検量線法による遺伝子発現解析を行い、各標的遺伝子の標準化発現量を算出した。【００６２】
各標的遺伝子について、体性幹細胞サンプルにおける標準化発現量を比較細胞における標準化発現量で除することで標準化し、比較細胞に対する相対発現量を算出した。【００６３】
結果：
各検量線の決定係数Ｒ２が０．９８以上であれば、試験有効とした。【００６４】
図１に標準化発現量をヒートマップによって示す（発現量の低いものをより暗く、多いものをより明るく示す）。各ドナー、サンプル調製条件に応じて、異なる遺伝子発現プロファイルが得られた。【００６５】
図２に比較細胞における標的遺伝子に対する相対発現量をヒートマップによって示す。各標的遺伝子について、各ドナー、サンプル調製条件に応じた発現プロファイルの相違が明確に示されている。【００６６】
本発明の絶対定量されたスタンダードを用いる遺伝子発現解析方法では、必ずしも比較細胞との相対発現量を求めなくとも、標準化発現量で各サンプル細胞の状態を評価することが可能となる。【００６７】
本明細書における本発明の説明および実施例の記述は、本発明の様々な例示的な実施態様の詳細な説明を目的するものであり、当業者は本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示された実施態様に様々な改良および変更を行うことができる。したがって、本明細書の記載は本発明の範囲を何ら制限するものではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ決定される。
【図１】
2019066044.tif 000003
【図２】
2019066044.tif 000004
【国際調査報告】
2019066044.tif 000005
2019066044.tif 000006
2019066044.tif 000007
2019066044.tif 000008