(57)【要約】【課題】癌細胞増殖抑制作用、癌細胞浸潤抑制作用、癌治癒力の増強作用が強く、しかも、汎用性が高く、さらに、癌細胞増殖抑制、癌細胞浸潤抑制、癌治癒力の増強などの抗癌作用があり、副作用がなく安全な医薬品並びに予防、改善のための医薬部外品の原料を提供する。【解決手段】ケフィア（Ｋｅｆｉｒ）粒から分離された微生物〔ラクトバシラス属（Lactobacillussp.）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ（原受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２００６２、新受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２９９）〕を、あるいは前記微生物を含む微生物群を、緑茶と緑茶以外のお茶及び／又はその有効成分との組み合わせで微生物培養して得られた微生物培養物であって、抗癌作用を有する微生物培養物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケフィア（Ｋｅｆｉｒ）粒から分離された微生物〔ラクトバシラス属（Lactobacillus
sp.）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ（原受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２００６２、新受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２９９）〕を、あるいは前記微生物〔ラクトバシラス属（Lactobacillus sp.）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ（原受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２００６２、新受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２９９）〕を含む微生物群を、緑茶と緑茶以外のお茶及び／又はその有効成分との組み合わせで微生物培養して得られた微生物培養物であって、抗癌作用を有することを特徴とする微生物培養物。
【請求項２】
緑茶と緑茶以外のお茶として、黒茶を組み合わせることで、抗癌作用を増強することを可能ならしめたことを特徴とする請求項１記載の微生物培養物。
【請求項３】
緑茶と緑茶以外のお茶として、黒茶と杜仲茶を組み合わせることで、治癒する癌の種類を拡大し、抗癌作用を増強することを可能ならしめたことを特徴とする請求項１記載の微生物培養物。
【請求項４】
前記抗癌作用が、癌細胞増殖、癌細胞浸潤などを抑制する作用並びに癌治癒力の増強作用である請求項１〜３のいずれかに記載の微生物培養物。
【請求項５】
前記癌は、神経芽腫、乳癌、子宮癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膵癌、膀胱・腎盂・尿管癌、大腸癌、皮膚癌（悪性黒色腫・基底細胞癌・有棘細胞癌）、咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌（乳頭癌、濾胞癌、髄様癌）、肺癌、食道癌、胃癌、胆道癌、十二指腸乳頭部癌、前立腺癌、卵巣癌および脳腫瘍（髄芽腫、胚細胞腫）、悪性中皮腫、胸腺腫、精巣腫瘍、子宮肉腫、骨軟部腫瘍、白血病、悪性リンパ腫を含むものである請求項１〜４のいずれかに記載の微生物培養物。
【請求項６】
請求項１記載の微生物培養物から菌体を除去したことを特徴とする微生物培養物。
【請求項７】
請求項１記載の微生物培養物が添加されていることを特徴とする、抗癌作用を有する抗癌剤、免疫賦活剤、治療薬などの医薬品並びに予防、改善のための医薬部外品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤、免疫賦活剤、治療薬などの医薬品並びに予防、改善のための医薬部外品の原料として、あるいは、これら製品又は原料に添加することにより、癌細胞増殖抑制、癌細胞浸潤抑制、癌治癒力の増強などの抗癌作用を有する微生物培養物に関する。さらに詳しくは、緑茶と緑茶以外のお茶及び／又はその有効成分との組み合わせで微生物培養した微生物培養物に関する。さらに、本発明はそれらを用いた抗癌剤、免疫賦活剤、治療薬などの医薬品並びに予防、改善のための医薬部外品に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の日本における死因として、悪性新生物（癌）は一貫して上昇し続け、昭和５６年以降死因順位第１位となり、平成１７年の全死亡者に占める割合は３０．１％で、全死亡者のおよそ３人に１人は悪性新生物（癌）で死亡していることになる。そのため、癌の抑制、予防は今日の医療における重要課題である。【０００３】
動物のペットにおいても、癌が犬や猫の死因の第１位となっている。【０００４】
癌の治療方法としては、手術、放射線治療が挙げられ、それらの進歩は目覚しいものがある。しかし、手術においては、癌の再発、転移などの際に問題があり、また、放射線治療においては、癌の種類により感受性の違いで効果がない場合がある。そのため、原発巣のような局所における癌には有効であるが、癌が再発、転移した場合においてはそれを完全に取り除くことは不可能に近い。【０００５】
また、癌の治療方法として、上記手術及び放射線治療を含む３大癌治療方法の１つとして、化学療法（抗癌剤治療）が挙げられる。この場合に用いられる抗癌剤の種類として、「細胞障害性抗癌剤」、「分子標的治療薬」があり、そのうち前者の「細胞障害性抗癌剤」には、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗癌性抗生物質、微小管阻害薬がある。【０００６】
しかし、全身療法としての「細胞障害性抗癌剤」の場合は、効果と薬物有害反応（副作用）が半々か、あるいは、効果よりも薬物有害反応の方が大きい場合がある。主な薬物有害反応としては、悪心（おしん）、嘔吐（おうと）、しびれ感、脱毛、白血球減少と発熱、血小板減少と出血、肝機能障害、腎機能障害等の症状が挙げられる。薬物有害反応を軽く済ませるための努力が注がれ、分子標的治療薬などが開発されて来ているが、薬物有害反応を完全に無くすことはまだ出来ていない。【０００７】
前記３大癌治療方法以外の治療方法として、さらに免疫細胞療法、遺伝子治療などが挙げられる。しかし、保険の適用がないなど費用の面で不利であるだけでなく、臨床試験段階であるという問題もある。【０００８】
一方、抗癌サプリメントにおいては、キノコ系サプリメントとして、アガリクス、メシマコブ、活性化多糖類関連化合物（ＡＨＣＣ）、マイタケエキス、ヤマブシタケがあり、植物系サプリメントとして、フコイダン、アラビノキシランなどがある。しかし、多量の摂取による障害、アレルギー性の疾患、発癌物質の含有などの問題があるものもある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来、抗癌剤には、副作用や取扱いに関する注意点が多かった。このようなことから、癌細胞増殖抑制作用、癌細胞浸潤抑制作用、癌治癒力の増強作用が強く、しかも、汎用性が高く、さらに、癌細胞増殖抑制、癌細胞浸潤抑制、癌治癒力の増強などの抗癌作用があり、副作用がなく安全な医薬品並びに予防、改善のための医薬部外品の原料開発が望まれていた。【００１０】
微生物培養物を利用した技術のうち、天然物の乳酸菌を利用した癌に関する治療薬として、腸内乳酸球菌のエンテロコッカス・フェカリス菌とドコサヘキサエン酸とを有効成分として含む制癌免疫療法剤（例えば、特許文献１参照）、ポリ−γ−グルタミン酸の免疫補強剤組成物と抗原性物質として、ペプチド、ポリペプチド、該ポリペプチドを発現する乳酸菌、抗原タンパク質、該抗原タンパク質を発現する乳酸菌等を含む癌疾患の予防用または治療用のワクチン用組成物（例えば、特許文献２参照）、癌の抑制、感染症のリスクを低下させるために、乳酸菌および少なくとも一種の酵母菌を選択的に加えて生成させる発酵大豆エキスを含む治療組成物（例えば、特許文献３参照）、癌などの自己免疫疾患におけるアポトーシス誘導、炎症抑制を低下させるアルギニン・デイミナーゼを高度に富む乳酸菌（例えば、特許文献４参照）、癌などを含む腫瘍の予防剤又は治療剤として、ハトムギの殻、薄皮及び渋皮から選ばれる少なくとも一種を、麹菌、乳酸菌及び酵母から選ばれる少なくとも一種の微生物により発酵することで得られる食品用又は医薬用組成物（例えば、特許文献５参照）などが提案されている。【００１１】
【特許文献１】特開平８−２７０１０号公報
【００１２】
【特許文献２】特開２００６−２３２７９９号公報
【００１３】
【特許文献３】特開２００３−２６５８２号公報
【００１４】
【特許文献４】特表２００７−５２８８４８号公報
【００１５】
【特許文献５】国際公開第０２／０７２１２３号パンフレット
【００１６】
また、天然物のお茶を利用した技術のうち、癌細胞に対してアポトーシスを誘導する医薬品および健康補助食品として、茶葉から抽出されたポリフェノール誘導体（例えば、特許文献６参照）、ウーロン茶抽出物を有効成分とすることを特徴とする癌細胞転移抑制剤（例えば、特許文献７参照）、アスパラチンを有効成分として含有する癌細胞増殖抑制作用及び癌細胞浸潤抑制作用を有する、ルボイス茶より精製されたものであることを特徴する抗癌剤（例えば、特許文献８参照）などが提案されている。【００１７】
【特許文献６】特開２００５−７５７９０号公報
【００１８】
【特許文献７】特開２００１−３９８８１号公報
【００１９】
【特許文献８】特開２００７−１９７４０９号公報
【００２０】
一方、コーカサス地方が発祥の地と考えられている伝統的な乳酸菌と酵母の複合醗酵乳ケフィア（Ｋｅｆｉｒ）は、そのスターターであるケフィア粒を牛乳にて培養することにより製造される。
本発明者は、天然物であるこのケフィア粒を飲料、食品、化粧料又は飼料などに利用した場合、人、動物にとって安全であることを見出し、さらに、様々な利用方法について鋭意研究を重ねて来た。そして、ケフィア粒から分離された微生物〔ラクトバシラス属（Lactobacillus sp.）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ〕を、あるいは前記微生物を含む微生物群を培養することにより得られる微生物培養物並びにそれらを用いた製品を提案し、開発するに至った（例えば、特許文献９参照）。また、ケフィア粒から分離された微生物〔ラクトバシラス属（Lactobacillus sp.）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ〕を、あるいは前記微生物を含む微生物群を緑茶及び黒茶を主成分とする培地で得られる微生物培養物並びにそれを用いた製品を提案し、開発するに至った（例えば、特許文献１０参照）。また、ケフィア粒から分離された微生物〔ラクトバシラス属（Lactobacillus sp.）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ〕を、あるいは前記微生物を含む微生物群を緑茶、黒茶及びヨモギ抽出液を主成分とする培地で得られる微生物培養物並びにそれを用いた製品を提案し、開発するに至った（例えば、特許文献１１参照）。さらに、ケフィア粒から分離された微生物〔ラクトバシラス属（Lactobacillus sp.）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ〕を、あるいは前記微生物を含む微生物群を、緑茶の培養液で微生物培養して得られた培養物を、皮膚外用剤（軟膏）、皮膚疾患治療薬、化粧料、及び経口投与薬などの医薬品並びに予防、改善のための医薬部外品に添加することによって、皮膚炎発症抑制、皮膚創傷の治癒促進効果を有する微生物培養物並びにそれらを用いた製品を提案し、開発するに至った（例えば、特許文献１２参照）。【００２１】
【特許文献９】欧州特許第１６０７４７６号明細書
【００２２】
【特許文献１０】特開２００６−２７１２１９号公報
【００２３】
【特許文献１１】特開２００６−２７１２２０号公報
【００２４】
【特許文献１２】特開２００７−１３７８６４号公報
【００２５】
そして、本発明者はさらに研究を重ねた結果、緑茶と緑茶以外のお茶及び／又はその有効成分との組み合わせで微生物培養した微生物培養物であれば、天然物であって安全性が高く、しかも、それらを用いれば、癌細胞増殖抑制、癌細胞浸潤抑制、癌治癒力の増強などの抗癌作用を有する抗癌剤、免疫賦活剤、治療薬などの医薬品並びに予防、改善のための医薬部外品の原料が得られることを見出した。また、緑茶と緑茶以外のお茶との組み合わせを変えることにより、癌の種類ごとに効果が異なることも見出した。【００２６】
これらの知見に基づいて、本発明者は、ケフィア粒から分離された微生物〔ラクトバシラス属（Lactobacillus sp.）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ〕を、あるいは前記微生物を含む微生物群を、緑茶と緑茶以外のお茶及び／又はその有効成分との組み合わせで微生物培養して得られた微生物培養物を、抗癌剤、免疫賦活剤、治療薬などの医薬品並びに予防、改善のための医薬部外品の原料として用い得ること、さらに、これら製品又は原料に前記微生物培養物を添加することにより、癌細胞増殖抑制、癌細胞浸潤抑制、癌治癒力の増強などの抗癌作用を有することを見出した。また、緑茶と緑茶以外のお茶との組み合わせを変えることで、癌の種類ごとに効果が異なることも見出した。そして、本発明者は、それらを用いた抗癌剤、免疫賦活剤、治療薬などの医薬品並びに予防、改善のための医薬部外品に前記微生物培養物を添加することによって、癌細胞増殖抑制、癌細胞浸潤抑制、癌治癒力の増強などの抗癌作用を有する製品を開発するに至ったものである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明は、以下の構成からなる発明である。すなわち、
(1) ケフィア（Ｋｅｆｉｒ）粒から分離された微生物〔ラクトバシラス属（Lactobacillus sp.）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ（原受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２００６２、新受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２９９）〕を、あるいは前記微生物〔ラクトバシラス属（Lactobacillus sp.）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ（原受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２００６２、新受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２９９）〕を含む微生物群を、緑茶と緑茶以外のお茶及び／又はその有効成分との組み合わせで微生物培養して得られた微生物培養物であって、抗癌作用を有することを特徴とする微生物培養物である。
(2) 緑茶と緑茶以外のお茶として、黒茶を組み合わせることで、抗癌作用を増強することを可能ならしめたことを特徴とする前記(1)記載の微生物培養物である。
(3) 緑茶と緑茶以外のお茶として、黒茶と杜仲茶を組み合わせることで、治癒する癌の種類を拡大し、抗癌作用を増強することを可能ならしめたことを特徴とする前記(1)記載の微生物培養物である。
(4) 前記抗癌作用が、癌細胞増殖、癌細胞浸潤などを抑制する作用並びに癌治癒力の増強作用である、前記(1)〜(3)記載の微生物培養物である。
(5) 前記癌は、神経芽腫、乳癌、子宮癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膵癌、膀胱・腎盂・尿管癌、大腸癌、皮膚癌（悪性黒色腫・基底細胞癌・有棘細胞癌）、咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌（乳頭癌、濾胞癌、髄様癌）、肺癌、食道癌、胃癌、胆道癌、十二指腸乳頭部癌、前立腺癌、卵巣癌および脳腫瘍（髄芽腫、胚細胞腫）、悪性中皮腫、胸腺腫、精巣腫瘍、子宮肉腫、骨軟部腫瘍、白血病、悪性リンパ腫を含むものである、前記(1)〜(3)のいずれかに記載の微生物培養物である。
(6) 前記(1)記載の微生物培養物から菌体を除去した微生物培養物も、上述した場合と同様の効果、機能、すなわち、抗癌作用、機能を有するものである。
(7) 前記(1)記載の微生物培養物が添加されていることを特徴とする、抗癌作用を有する抗癌剤、免疫賦活剤、治療薬などの医薬品並びに予防、改善のための医薬部外品である。
【発明の効果】
【００２８】
請求項１記載の発明によれば、ケフィア（Ｋｅｆｉｒ）粒から分離された微生物〔ラクトバシラス属（Lactobacillus sp.）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ〕を、あるいは前記微生物を含む微生物群を、緑茶と緑茶以外のお茶及び／又はその有効成分との組み合わせで微生物培養して得られた微生物培養物であって、抗癌作用を有する微生物培養物を新規に提供できる効果がある。【００２９】
請求項２記載の発明によれば、緑茶と緑茶以外のお茶として、黒茶を組み合わせることで、抗癌作用を増強することが可能となり、癌の種類、提供価格に応じて、微生物培養物を新規に提供できる効果がある。【００３０】
請求項３記載の発明によれば、緑茶と緑茶以外のお茶として、黒茶と杜仲茶を組み合わせることで、治癒する癌の種類を拡大し、抗癌作用を増強することが可能となり、癌の種類、提供価格に応じて、微生物培養物を新規に提供できる効果がある。【００３１】
請求項４記載の発明によれば、癌細胞増殖、癌細胞浸潤などを抑制する作用並びに癌治癒力の増強作用などの抗癌作用を有する微生物培養物を新規に提供できる効果がある。【００３２】
請求項５記載の発明によれば、体表や臓器などに関わる癌、腫瘍に対して、抗癌作用を有する微生物培養物を新規に提供できる効果がある。【００３３】
請求項６記載の発明によれば、請求項１記載の培養物から菌体を除去した微生物培養物であって、抗癌作用を有する微生物培養物を新規に提供できる効果がある。【００３４】
請求項７記載によれば、前記微生物培養物は毒性や副作用が無く安全であり、当該微生物培養物が添加されている、抗癌作用を有する抗癌剤、免疫賦活剤、治療薬などの医薬品並びに予防、改善のための医薬部外品を新規に提供できる効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明の好ましい実施の形態について、詳細に説明する。
ケフィア粒から分離された微生物〔ラクトバシラス属（Lactobacillus
sp.）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ〕を、緑茶と緑茶以外のお茶との組み合わせで微生物培養して得られた微生物培養物が、癌細胞増殖抑制作用、機能を有するか、以下の評価試験を行った。その結果、緑茶と緑茶以外のお茶との組み合わせを変え、微生物培養して得られた微生物培養物が、癌細胞増殖抑制作用、機能を有することを確認することができた。さらに、本発明では、微生物〔ラクトバシラス属（Lactobacillus sp.）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ〕と安全性が確認できている微生物を共生し同様な作用を示すものや、緑茶と緑茶以外のお茶及び／又はその有効成分との組み合わせで調製すれば、いずれも使用できる。
なお、微生物〔ラクトバシラス属（Lactobacillus sp.）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ（ＦＥＲＭ
ＡＰ−２００６２）〕は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、さらに、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２９９として同センターに国際寄託するに至っている。【００３６】
代表例として、微生物〔ラクトバシラス属（Lactobacillus sp.）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ〕を、５：５の割合の緑茶と黒茶を組み合わせた２種混合茶と、３：４：３の割合の緑茶と黒茶と杜仲茶とを組み合わせた３種混合茶の２種類を各々微生物培養し、得られた２種類の微生物培養物を用いて癌細胞増殖抑制評価試験を次のように実施した。【００３７】
ヒト乳癌細胞ＨＳ-５３８Ｔ、ヒト子宮癌細胞ＨｅＬａ、ヒト肝細胞癌細胞ＨｅｐＧ２、ヒト腎細胞癌細胞Ｃａｋｉ-１及びＫＵ１９-２０、ヒト膵癌細胞ＭｉａＰａＣａ-２、ヒト膀胱癌細胞ＲＹＯＪＩ-ＸＡ、ハムスター膵臓β細胞ＨＩＴ−Ｔ１５及びアデノウィルスで形質転換したヒト胚性腎細胞ＨＥＫ２９３の計９種類の癌細胞を、１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＳｉｇｍａＤ６４２１）に１０％ＦＢＳ、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加し、５％ＣＯ２ 環境下で３７℃培養し、増殖期の細胞をトリプシン処理後、前記培地に懸濁し、コラーゲンコート９６ウェルプレートに約２０％コンフルエントになるように撒いた。【００３８】
１５時間培養後、培地を吸引し、それぞれの濃度が０％、１％、２％、４％、８％及び１６％になるように、微生物〔ラクトバシラス属（Lactobacillus sp.）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ〕と前記割合の緑茶と黒茶を組み合わせた２種混合茶の４８時間培養物（以下、Ｂ２溶液（ａ）という）とを加えた血清添加１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を、ウェルあたり１００μＬ入れ、５％ＣＯ２ 環境下で３７℃にて４０時間培養した。各処理は４ウェルずつ実験を行った。【００３９】
また、前記の場合と同様に、１５時間培養後、培地を吸引し、それぞれの濃度が０％、１％、２％、４％、８％及び１６％になるように、微生物〔ラクトバシラス属（Lactobacillus sp.）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ〕と前記割合の緑茶と黒茶と杜仲茶とを組み合わせた３種混合茶の４８時間培養物（以下、Ｂ１１溶液（ｂ）という）とを加えた血清添加１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を、ウェルあたり１００μＬ入れ、５％ＣＯ２ 環境下で３７℃にて４０時間培養した。前記の場合と同様に、各処理は４ウェルずつ実験を行った。【００４０】
前記培養後、培地を吸引し、癌細胞増殖率を定量するため、ＡｌａｒｍａＢｌｕｅ（ＢＩＯＳＯＵＣＥ社）を１０％添加した血清添加１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を１００μＬ入れ、５％ＣＯ２ 環境下で３７℃にて４時間培養した。培地の吸光度（５７０ｎｍ、５９５ｎｍ）を測定し、以下の計算式(1)により、ＡｌａｒｍａＢｌｕｅ還元率を計算した。培養物上清０％の値を１００％としたときの相対値で各癌細胞に対しての増殖抑制を求めた。
その結果を、各癌細胞に対する相対値のグラフについて図１〜図９に示す。（縦軸は癌細胞増殖率、横軸は培養物上清濃度を示す。）【００４１】
【数１】
2010023716.tif 000002
【００４２】
ヒト乳癌細胞ＨＳ−５３８Ｔ、ヒト子宮癌細胞ＨｅＬａ、ヒト肝細胞癌細胞ＨｅｐＧ２、ヒト腎細胞癌細胞Ｃａｋｉ−１及びＫＵ１９−２０、ヒト膵癌細胞ＭｉａＰａＣａ−２、ヒト膀胱癌細胞ＲＹＯＪＩ−ＸＡ、ハムスター膵臓β細胞ＨＩＴ−Ｔ１５及びアデノウィルスで形質転換したヒト胚性腎細胞ＨＥＫ２９３の計９種類の癌細胞に対して、ハムスター膵臓β細胞ＨＩＴ−Ｔ１５は、有意な差が得られなかったものの、残りの８種類の癌細胞に対しては、培養物上清の濃度依存的に癌細胞増殖の抑制が認められた。【００４３】
また、Ｂ２溶液（ａ）よりもＢ１１溶液（ｂ）の方が上記８種類の癌細胞に対して、有意に高いことが認められた。【００４４】
さらに、Ｂ２溶液（ａ）又はＢ１１溶液（ｂ）を１０倍希釈で添加した場合の増殖抑制効果を、ヒト子宮癌細胞ＨｅＬａ、ヒト膵癌細胞ＭｉａＰａＣａ−２、ヒト膀胱癌細胞ＲＹＯＪＩ−ＸＡに対して実施し、５日目の増殖抑制状態を位相差顕微鏡で観察した。前記３種類の癌細胞の増殖抑制状態を撮影した写真を図１０〜図１２に示す。各図の左側がＢ２溶液（ａ）を１０倍希釈で添加した場合を、各図の右側がＢ１１溶液（ｂ）を１０倍希釈で添加した場合を示す。Ｂ２溶液（ａ）又はＢ１１溶液（ｂ）を添加しない場合は、癌細胞はディシュ全体に広がって増殖した。【００４５】
これらのことから、ケフィア（Ｋｅｆｉｒ）粒から分離された微生物〔ラクトバシラス属（Lactobacillus
sp.）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ〕を、あるいは、前記微生物を含む微生物群を、緑茶と緑茶以外のお茶及び／又はその有効成分との組み合わせで微生物培養して得られた本発明に係る微生物培養物に、  癌細胞増殖抑制作用があることが示唆され、さらに、緑茶と緑茶以外のお茶との組み合わせを変えることで、癌の種類ごとに細胞増殖抑制作用を増強することが可能となることが示唆された。【００４６】
ケフィア（Ｋｅｆｉｒ）粒から分離された微生物〔ラクトバシラス属（Lactobacillus sp.）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ〕を、あるいは、前記微生物を含む微生物群を、緑茶と緑茶以外のお茶及び／又はその有効成分との組み合わせで微生物培養して得られた微生物培養物は、様々な種類の癌細胞増殖抑制、癌細胞浸潤抑制、癌治癒力の増強などの抗癌作用が期待できる。【００４７】
そして、前記微生物培養物を抗癌剤、免疫賦活剤、治療薬などの医薬品並びに予防、改善のための医薬部外品の原料として用いることができ、さらに、これら製品又は原料に前記微生物培養物を添加することにより、癌細胞増殖抑制、癌細胞浸潤抑制、癌治癒力の増強などの抗癌作用が期待できる。【００４８】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託後、ＳＩＩＤ１７１９−６ｂの種の再同定を行うために、欧州特許第１６０７４７６号明細書（前記特許文献９）記載の塩基配列を用いて、細菌基準株データベースに対して相同性検索を行い、得られた１６Ｓ
ｒＤＮＡの塩基配列から検体と近縁と考えられる種の相同性検索を行い、上位５株を決定した。
相同性検索結果を、表１に示す。【００４９】
【表１】
2010023716.tif 000003
【００５０】
これまで得られた情報をもとに１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列とこれに近縁と考えられる菌群の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を用いて分子系統樹を構築した。なお、分子系統樹の推定には近隣結合法を用い、樹型の妥当性を示すブートストラップは１０００回発生させた。解析にはＭＥＧＡ
ｖｅｒ３．１を使用した。
分子系統解析結果を、図１３に示す。【００５１】
１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列解析で最も近縁な菌種Lactobacillus satsumensisと、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成試験を行い、種の異同を決定した。
方法として、培地ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ（Ｏｘｏｉｄ,  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，  ＵＫ）で、培養温度３０℃、培養時間４８時間の嫌気培養を行い、各検体の培養菌体から河村らの方法（「日本細菌学雑誌」，日本細菌学会，２０００年８月，
第５５巻，第３号，ｐ．５４５−５８４）によりＤＮＡを抽出・精製した。ＤＮＡ-ＤＮＡハイブリッド形成試験の主な手法は河村らの方法および成書（鈴木健一朗、平石  明、横田  明編，「微生物の分類・同定実験法」，分子遺伝学・分子生物学的手法を中心に，シュプリンガー・ジャパン，２００１年９月１６日，ｐ．３４−４７）により、マイクロプレート法を用いて行った。蛍光強度の測定には蛍光プレートリーダー（ジェニオス，
ＴＥＣＡＮ (和光純薬工業株式会社製， 大阪)）を使用した。【００５２】
ＳＩＩＤ１７１９−６ｂとLactobacillus
satsumensisの３回の試験による相同値の平均は７０％以上の値を示した。現在、細菌の種はＤＮＡ-ＤＮＡ相同値の比較の結果、７０％以上の相同値を示す菌株同士を同種とすると定義されている。このことから、ＳＩＩＤ１７１９−６ｂとLactobacillus satsumensisは互いに同種であると判断された。
従って、ＳＩＩＤ１７１９−６ｂは、Lactobacillus
satsumensisと同定された。【００５３】
ＳＩＩＤ１７１９−６ｂの１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列の塩基配列を、表２に示す。【００５４】
【表２】
2010023716.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ヒト乳癌細胞ＨＳ−５３８Ｔに対する癌細胞増殖抑制作用の相対値を示すグラフである。
【図２】ヒト子宮癌細胞ＨｅＬａに対する癌細胞増殖抑制作用の相対値を示すグラフである。
【図３】ヒト肝細胞癌細胞ＨｅｐＧ２に対する癌細胞増殖抑制作用の相対値を示すグラフである。
【図４】ヒト腎細胞癌細胞Ｃａｋｉ−１に対する癌細胞増殖抑制作用の相対値を示すグラフである。
【図５】ヒト膵癌細胞ＭｉａＰａＣａ−２に対する癌細胞増殖抑制作用の相対値を示すグラフである。
【図６】ヒト膀胱癌細胞ＲＹＯＪＩ−ＸＡに対する癌細胞増殖抑制作用の相対値を示すグラフである。
【図７】ハムスター膵臓β細胞ＨＩＴ−Ｔ１５に対する癌細胞増殖抑制作用の相対値を示すグラフである。
【図８】ヒト腎細胞癌細胞ＫＵ１９−２０に対する癌細胞増殖抑制作用の相対値を示すグラフである。
【図９】アデノウィルスで形質転換したヒト胚性腎細胞ＨＥＫ２９３に対する癌細胞増殖抑制作用の相対値を示すグラフである。
【図１０】ヒト子宮癌細胞ＨｅＬａに対する５日目の増殖抑制状態を示す写真で、左がＢ２溶液（ａ）の場合を、右側がＢ１１溶液（ｂ）の場合を示す。
【図１１】ヒト膵癌細胞ＭｉａＰａＣａ−２に対する５日目の増殖抑制状態を示す写真で、左側がＢ２溶液（ａ）の場合を、右側がＢ１１溶液（ｂ）の場合を示す。
【図１２】ヒト膀胱癌細胞ＲＹＯＪＩ−ＸＡに対する５日目の増殖抑制状態を示す写真で、左側がＢ２溶液（ａ）の場合を、右側がＢ１１溶液（ｂ）の場合を示す。
【図１３】分子系統解析結果を示す系統樹である。
【図１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年11月7日(2008.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケフィア（Ｋｅｆｉｒ）粒から分離された微生物〔ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ（原受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２００６２、新受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２９９）〕を、あるいは前記微生物〔ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＳＩＩＤ１７１９−６ｂ（原受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２００６２、新受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２９９）〕を含む微生物群を、緑茶と緑茶以外のお茶及び／又は前記お茶から抽出される成分との組み合わせで微生物培養して得られた微生物培養物であって、癌細胞増殖、癌細胞浸潤などを抑制する作用並びに癌治癒力の増強作用を有することを特徴とする微生物培養物。
【請求項２】
緑茶と緑茶以外のお茶として黒茶を、５：５の割合で組み合わせることで、癌細胞増殖、癌細胞浸潤などを抑制する作用並びに癌治癒力の増強作用を増強することを可能ならしめたことを特徴とする請求項１記載の微生物培養物。
【請求項３】
緑茶と緑茶以外のお茶として黒茶と杜仲茶を、３：４：３の割合で組み合わせることで、治癒する癌の種類を拡大し、癌細胞増殖、癌細胞浸潤などを抑制する作用並びに癌治癒力の増強作用を増強することを可能ならしめたことを特徴とする請求項１記載の微生物培養物。
【請求項４】
前記癌は、神経芽腫、乳癌、子宮癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膵癌、膀胱・腎盂・尿管癌、大腸癌、皮膚癌（悪性黒色腫・基底細胞癌・有棘細胞癌）、咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌（乳頭癌、濾胞癌、髄様癌）、肺癌、食道癌、胃癌、胆道癌、十二指腸乳頭部癌、前立腺癌、卵巣癌および脳腫瘍（髄芽腫、胚細胞腫）、悪性中皮腫、胸腺腫、精巣腫瘍、子宮肉腫、骨軟部腫瘍、白血病、悪性リンパ腫を含むものである請求項１〜３のいずれかに記載の微生物培養物。
【請求項５】
請求項１記載の微生物培養物から菌体を除去したことを特徴とする微生物培養物。
【請求項６】
請求項１記載の微生物培養物が添加されていることを特徴とする、癌細胞増殖、癌細胞浸潤などを抑制する作用並びに癌治癒力の増強作用を有する抗癌剤、免疫賦活剤、治療薬などの医薬品並びに予防、改善のための医薬部外品。
【請求項７】
（削除）
【国際調査報告】
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