(57)【要約】  従来の２型糖尿病治療薬の有している副作用が少ない血糖低下剤であって、長期の服用や予防的な使用にも問題がほとんどなく、また飲食品中に添加して使用することにも適した血糖低下剤を提供することを課題にし、ガラクトース、ガラクトース誘導体又は単離されたガラクトースホモポリマーを有効成分として含有することを特徴とする血糖低下剤；その血糖低下剤を添加した糖尿病の予防又は症状改善のための飲食品；ガラクトース、ガラクトース誘導体又は単離されたガラクトースホモポリマーが血糖低下の有効成分として添加されてなることを特徴とする飲食品；により上記課題を解決した。
2010004916.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラクトース又はガラクトース誘導体を有効成分として含有することを特徴とする血糖低下剤。
【請求項２】
単離されたガラクトースホモポリマーを有効成分として含有することを特徴とする血糖低下剤。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の血糖低下剤を添加してなることを特徴とする糖尿病の予防又は症状改善のための飲食品。
【請求項４】
ガラクトース又はガラクトース誘導体が血糖低下の有効成分として添加されてなることを特徴とする飲食品。
【請求項５】
単離されたガラクトースホモポリマーが血糖低下の有効成分として添加されてなることを特徴とする飲食品。
【請求項６】
ガラクトース又はガラクトース誘導体を有効成分とする薬剤を投与することを特徴とする糖尿病の治療方法。
【請求項７】
単離されたガラクトースホモポリマーを有効成分とする薬剤を投与することを特徴とする糖尿病の治療方法。
【請求項８】
上記ガラクトース又はガラクトース誘導体が、少なくとも以下の工程（ａ）ないし（ｄ）を含む工程によって決定されたものである請求項１に記載の血糖低下剤。
（ａ）無脊椎動物に糖（Ａ）を摂取させることによって、該無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を上昇させる工程
（ｂ）上記工程（ａ）で得られた、脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度が上昇した無脊椎動物に、被検物質を投与する工程
（ｃ）上記被検物質が投与された無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を測定する工程
（ｄ）上記被検物質の中から、該無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を低下させる物質を選択する工程
【請求項９】
上記ガラクトース又はガラクトース誘導体が、少なくとも以下の工程（ａ）ないし（ｄ）を含む工程によって決定されたものである請求項４に記載の飲食品。
（ａ）無脊椎動物に糖（Ａ）を摂取させることによって、該無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を上昇させる工程
（ｂ）上記工程（ａ）で得られた、脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度が上昇した無脊椎動物に、被検物質を投与する工程
（ｃ）上記被検物質が投与された無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を測定する工程
（ｄ）上記被検物質の中から、該無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を低下させる物質を選択する工程
【請求項１０】
上記ガラクトース又はガラクトース誘導体が、少なくとも以下の工程（ａ）ないし（ｄ）を含む工程によって決定されたものである請求項６に記載の糖尿病の治療方法。
（ａ）無脊椎動物に糖（Ａ）を摂取させることによって、該無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を上昇させる工程
（ｂ）上記工程（ａ）で得られた、脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度が上昇した無脊椎動物に、被検物質を投与する工程
（ｃ）上記被検物質が投与された無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を測定する工程
（ｄ）上記被検物質の中から、該無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を低下させる物質を選択する工程
【請求項１１】
少なくとも以下の工程（ａ）ないし（ｄ）を含み、被検物質がガラクトース誘導体であることを特徴とする糖尿病の治療薬のスクリーニング方法。
（ａ）無脊椎動物に糖（Ａ）を摂取させることによって、該無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を上昇させる工程
（ｂ）上記工程（ａ）で得られた、脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度が上昇した無脊椎動物に、被検物質を投与する工程
（ｃ）上記被検物質が投与された無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を測定する工程
（ｄ）上記被検物質の中から、該無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を低下させる物質を選択する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血糖低下剤とそれを添加した糖尿病の予防又は症状改善のための飲食品に関する。また、糖尿病の治療方法及び糖尿病の治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジオウは古くからその増血作用により滋養強壮で知られる重要な漢方薬であり、他の漢方薬と組み合わせて血行不良によるしびれ、皮膚の乾燥やかゆみ、前立腺肥大等の薬として幅広く用いられている。また血糖低下効果も有することが知られており、糖尿病治療剤の構成成分としても検討されている（例えば、特許文献１）。また、ジオウの熱水抽出液のエタノール沈殿画分に血糖低下効果があることが報告されている（非特許文献１）。しかしながら現在に至るまでジオウの示す血糖低下効果の主体は明らかとなっておらず、その適切な用い方は確立されていない。【０００３】
糖尿病は慢性の高血糖状態の持続及び耐糖能の異常を示す疾患である。糖尿病は初期段階では自覚症状がほとんどなく、重篤な合併症である様々な臓器障害（腎症、末梢神経障害、網膜症等）に至ってしまうため、大幅な生活の質の低下をもたらし、治療にも多くの社会資源を必要とする等、多くの問題を発生させる疾患である。そして世界的にもその有病者が急激に増加していることから、国連でその撲滅が決議されるほどの大きな社会的問題となっている。【０００４】
糖尿病は、大きく１型と２型に分けられるが、社会的に問題視されているのは２型である。２型糖尿病は、遺伝的な背景による場合と肥満による場合がその原因の大半を占めており、インスリン分泌量の低下やインスリンに対する感受性の低下（インスリン抵抗性）を基礎とする疾患で、日本では糖尿病患者の９５％がこの２型とされている。２型糖尿病は生活習慣病の側面も強く、近年の肥満化高齢化に伴って更に増加傾向にある。【０００５】
２型糖尿病の治療としては一般に食事療法と運動療法が行われるが、良好な血糖コントロールが達成できない場合は、経口血糖低下薬の服用やインスリン注射が行われる。経口血糖低下薬は、その作用機序により、インスリン分泌促進薬、インスリン抵抗性改善薬、α−グルコシダーゼ阻害薬等がある。【０００６】
しかし、これらは何れも過度の投与や長期の使用により、肥満やインスリン抵抗性の増悪、重篤な低血糖症等の血糖値コントロールの不全等をもたらすことがあるとされている。そのため、新たな治療薬・予防薬、機能性食品等が強く求められ、その開発が進められている。それらの中には糖を構成単位に含んでいるものもあり、例えば、特許文献２にはグアガム等のガラクトマンナン分解物や、難消化性デキストリン等の食物繊維、及びポリフェノールを含有する糖尿病予防又は治療用組成物が示されており、特許文献３には、ヘパリンやヘパラン硫酸を有効成分とする血糖低下剤が開示されている。【０００７】
しかしながら、これら治療薬・予防薬、機能性食品等は、充分にその効果が確認されておらず、更に良好な血糖コントロールが達成できるものの開発が望まれていた。【０００８】
一方、本発明者は、哺乳類に代替し得る実験動物として、カイコに着目し、これまでヒト等に感染する菌やウイルスに対する治療薬開発のための評価系に用いることができることを報告した（特許文献４、特許文献５）。この評価系は、初めて無脊椎動物を用いたものであり、従来の実験動物に比してコストや倫理面での問題が少なく、また精度管理用の動物も置くことができるため、これまで実験動物を用いた検討に載せられることのなかった対象物を含め、より広範な対象物を評価でき、また正確な評価ができる等多くの利点を持つ方法である。【０００９】
そして更に、本発明者は、カイコを用いた上記評価系が、哺乳類の２型糖尿病治療薬の評価系として用いることができることを新たに見出して既に出願した。しかしながら、その評価系を用いて、良好な血糖コントロールができる新規の２型糖尿病治療薬・予防薬、機能性食品等は、具体的にはまだ見出せていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平０８−１９８７６８号公報
【特許文献２】特開２００６−０５２１９１号公報
【特許文献３】特開２００４−１６８７７１号公報
【特許文献４】特開２００７−３２７９６４号公報
【特許文献５】ＷＯ２００５／１１６２６９号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】J.Pharm.Soc.Jpn., T.Kihoet al., 112(6), 393-400 (1992)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、従来の２型糖尿病治療薬の有する重篤な低血糖症をもたらす等の副作用が少なく、長期の服用や予防的な使用にも問題がほとんどなく、また飲食品中に添加して使用することにも適した血糖低下剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、前記の課題を解決すべく、古くから滋養強壮効果、血糖低下効果、安全性等に定評のあるジオウについて、カイコガの幼虫（以下、「カイコ」と記す）による２型糖尿病治療薬の評価系を用いて鋭意検討を重ねた結果、ジオウの熱水抽出画分が高血糖カイコの血糖値を低下させることを確認した。【００１４】
また、この熱水抽出画分を単糖類にまで加水分解したところ、そこに含まれる主な構成糖がガラクトースであることを見出した。そして、高血糖カイコの血糖値を低下させる「ジオウの熱水抽出画分」中の成分がガラクトースホモポリマーであることを確認し、単離されたガラクトースホモポリマーが血糖値を低下させることを見出して本発明に至った。【００１５】
そして、更に驚くべきことに、ジオウ自体には含まれていない、単糖類であるガラクトースが、高血糖カイコ及び高血糖マウスの血糖値を低下させることを見出して本発明に至った。【００１６】
すなわち、本発明は、ガラクトース又はガラクトース誘導体を有効成分として含有することを特徴とする血糖低下剤を提供するものである。【００１７】
また、本発明は、単離されたガラクトースホモポリマーを有効成分として含有することを特徴とする血糖低下剤を提供するものである。【００１８】
また、本発明は、上記の血糖低下剤を添加してなることを特徴とする糖尿病の予防又は症状改善のための飲食品を提供するものであり、また、ガラクトース又はガラクトース誘導体が血糖低下の有効成分として添加されてなることを特徴とする飲食品を提供するものである。また、単離されたガラクトースホモポリマーが血糖低下の有効成分として添加されてなることを特徴とする飲食品を提供するものである。【００１９】
また、本発明は、ガラクトース又はガラクトース誘導体を有効成分とする薬剤を投与することを特徴とする糖尿病の治療方法を提供するものであり、また、単離されたガラクトースホモポリマーを有効成分とする薬剤を投与することを特徴とする糖尿病の治療方法を提供するものである。【００２０】
また、本発明は、少なくとも以下の工程（ａ）ないし（ｄ）を含み、被検物質がガラクトース誘導体であることを特徴とする糖尿病の治療薬のスクリーニング方法を提供するものである。
（ａ）無脊椎動物に糖（Ａ）を摂取させることによって、該無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を上昇させる工程
（ｂ）上記工程（ａ）で得られた、脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度が上昇した無脊椎動物に、被検物質を投与する工程
（ｃ）上記被検物質が投与された無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を測定する工程
（ｄ）上記被検物質の中から、該無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を低下させる物質を選択する工程
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、上記問題点と課題を解決できたものであり、本発明の血糖低下剤は、高血糖状態の動物の血糖値を低下させる効果を有し、糖尿病による高血糖状態を極めて顕著に改善する効果を有する。すなわち、本発明の血糖低下剤は、特に、２型糖尿病治療薬・予防薬、機能性食品用途に極めて効果的である。【００２２】
また、本発明の血糖低下剤の必須有効成分であるガラクトース又はガラクトース誘導体は、生命活動の必須成分として用いられている非常に安全な物質であるため、本発明の血糖低下剤も極めて安全で副作用もないものである。また、単離されたガラクトースホモポリマーも加水分解されてガラクトースになるので、ガラクトース同様安全である。また、各種の剤形にすることも容易であり、甘味料として用いることも可能な程に飲食品に添加することも容易なので、安全な血糖低下剤や機能性食品として、極めて効果的に糖尿病の予防や症状の改善を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】５齢１日目のカイコに１５％（ｗ／ｗ）グルコースを含む餌を１日間及び３日間与えたカイコにおける、血糖値又は糖濃度を表すグラフである（評価実験例１）。（Ａ）：血液（ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ）中の血糖値    （Ｂ）：脂肪体中の糖濃度
【図２】グルコース３３％（ｗ／ｗ）を含む餌を摂取させたときの血糖値の経時的推移（ｔｉｍｅ  ｃｏｕｒｓｅ）を表すグラフである（評価実験例２）。上から、「３３％（ｗ／ｗ）グルコース添加飼料給餌群」、「通常飼料給餌群」、「絶食群」である。
【図３】餌に含有されるグルコース量を変化させたときの、給餌開始後６０分後の血糖値を示すグラフである（評価実験例３）。
【図４】インスリンによる高血糖状態のカイコの血糖値の低下作用を示すグラフである（評価実験例４）。左から、「通常飼料給餌群に生理食塩水を投与」、「１６％（ｗ／ｗ）グルコース添加飼料を与え６０分後に生理食塩水を投与」「１６％（ｗ／ｗ）グルコース添加飼料を与え６０分後にインスリンを投与」である。
【図５】メトホルミンによる高血糖状態のカイコの血糖値の低下作用を示すグラフである（評価実験例５）。左から、「通常飼料給餌群に生理食塩水を投与」、「１６％（ｗ／ｗ）グルコース添加飼料を与え６０分後に生理食塩水を投与」「１６％（ｗ／ｗ）グルコース添加飼料を与え６０分後にメトホルミンを投与」である。
【図６】インスリンのカイコの血糖値低下作用におけるＥＤ５０値の算出に用いたグラフである（評価実験例６）。
【図７】グルコース１５％（ｗ／ｗ）を含む餌を摂取させたときの血糖値及び血液中のグルコース濃度の経時的推移を表すグラフである（評価実験例７）。（ａ）：血糖値    （ｂ）：血液中のグルコース濃度
【図８】カイコにグルコース１２％（ｗ／ｗ）を含む餌を摂取させた後、絶食させたときのカイコの血糖値の経時的推移を表すグラフである（評価実験例７）。
【図９】餌に含有されるグルコース量を変化させたときの、給餌開始後１８０分後の血糖値を示すグラフである（評価実験例３）。
【図１０】カイコに、通常飼料又は５％、１０％、１５％、３０％（ｗ／ｗ）グルコース添加飼料をそれぞれ与え又は何も与えずに飼育後のカイコの体長、体重、血糖値を表すものである（評価実験例８）。（ａ）：カイコの状態を示す写真    （ｂ）：体重    （ｃ）：体長    （ｄ）：血糖値
【図１１】（ａ）カイコに、グルコース添加飼料及び「生理食塩水」又は「組み換え型ヒトインスリン」を投与後の血糖値の経時的推移を表すグラフである（評価実験例９）。  （ｂ）カイコに、グルコース添加飼料を与えた後に各量の組み換え型ヒトインスリンを投与したときの血糖値を表すグラフである（評価実験例９）。  （ｃ）抗Ａｋｔ抗体及び抗リン酸化Ａｋｔ抗体を用いてウエスタンブロットを行った結果を示すものである。  （ｄ）カイコから摘出した脂肪体のリン酸化Ａｋｔの量を表すグラフである（評価実験例９）。  （ｅ）カイコから摘出した脂肪体の糖取り込み量を表すグラフである（評価実験例９）。
【図１２】ＡＩＣＡＲ投与によるカイコの血糖値及びＡＭＰＫ活性の変化を示すグラフである（評価実験例１０）。（ａ）：血糖値    （ｂ）：ＡＭＰＫ活性
【図１３】組み換え型ヒトインスリン注射によるカイコの体重及び体長の変化を表すものである（評価実験例１１）。（ａ）：評価実験例概要    （ｂ）：カイコの状態を示す写真    （ｃ）：体重    （ｄ）：体長
【図１４】ジオウ熱水抽出物のエタノール沈殿画分を構成する糖の分析結果を示す図で、ＴＬＣ上の移動度をＤ−ガラクトース等の標準糖と比較した結果を示す図である（実施例１）。
【図１５】高血糖カイコモデルにジオウ熱水抽出物のエタノール沈殿画分を投与したときのカイコ体液中血糖値低下の効果を示す図である（実施例２）。
【図１６】高血糖カイコモデルにＤ−ガラクトースを投与したときのカイコ体液中グルコース濃度低下の効果を示す図である（実施例２）。
【図１７】高血糖マウスモデルにＤ−ガラクトースを投与したときのマウス血液中グルコース濃度低下の効果を示す図である（実施例３）。
【図１８】ジオウからジオウ熱水抽出物のエタノール沈殿画分を得る方法を示した図である（実施例１）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明について説明するが、本発明は以下の実施の形態に限定されるものではなく、任意に変形して実施することができる。
【００２５】
［ガラクトース又はガラクトース誘導体］
本発明における「ガラクトース又はガラクトース誘導体」とは、Ｄ−ガラクトース及びその誘導体のことをいう。また、α型とβ型を含む。すなわち、Ｄ−ガラクトースの場合、［α］Ｄ２０＝＋１４４°のα型、［α］Ｄ２０＝＋５２°のβ型を含む。本発明における「ガラクトース又はガラクトース誘導体」は単糖類であり、本発明における「ガラクトース誘導体」には、ガラクトースを構成成分とする２糖類、３糖類等の多糖類は含まれない。
【００２６】
ガラクトース誘導体としては、例えば、ガラクトースの環に置換基が結合したものも挙げられる。置換基としては、メチル基、エチル基、プロピル基等のアルキル基；フェニル基等のアリール基；ベンジル基等のアリールアルキル基；アセチル基（エタノイル基）等のアルカノイル基等が挙げられる。本発明における「ガラクトース又はガラクトース誘導体」（以下、「ガラクトース（誘導体）」と略記する場合がある）は、ピラノース型もフラノース型も含まれる。
【００２７】
また、ガラクトース誘導体は、ガラクトースと同様の代謝経路で利用されるものであれば、ガラクトースと同様の血糖低下効果があるものと考えられる。そのようなものとしては、例えば、ガラクトースの抱水体、アルデヒド体、Ｏ−メチル化体、Ｏ−硫酸化体、それらの薬理学的に許容し得る塩、ガラクトースの代謝中間体であるＵＤＰ（ウリジン二リン酸）ガラクトース等が挙げられる。つまり、本発明の根幹の１つは、従来それ単独で血糖低下効果のあることが予測できなかったガラクトースという単糖に血糖低下効果があることを見出したことでもあるので、ガラクトースと同様の代謝経路で利用される単糖のガラクトース誘導体であれば本発明の範囲内のものである。
【００２８】
ガラクトースが血糖低下作用を示すのは、ガラクトースが未同定の細胞に作用するからである。その細胞が何らかのメカニズムにより、血糖値を下げる作用をもたらしていると考えられる。ガラクトースのような生体物質が細胞に作用する場合には、細胞表面上の受容体（receptor)タンパク質と結合し、そのシグナルが細胞内に伝達される、ということが現代生物学における一般的理解である。従って、ガラクトースが作用する受容体に親和性のある物質であれば、ガラクトースでなくとも、ガラクトースと同様に血糖低下作用を示すものが存在すると考えられる。ガラクトースの誘導体の中にはそのような受容体への親和性を有するものがあるはずである。従って、かかるガラクトース誘導体も本発明の範囲である。そのようなガラクトース誘導体で、ガラクトースよりも有利な（例えば血液中での安定性がよい）物質があれば、血糖低下剤としては、ガラクトースよりも優れていると言える。すなわち、ガラクトースと同じ性能を有する、ガラクトースと同等、又はより利便性のあるガラクトース誘導体が存在し得ることは、論理的に自明である。
【００２９】
ガラクトースは、天然には、主にＤ−グルコースと結合して２糖類である乳糖の構成糖として、α−Ｄ−ガラクトースとして存在する。また、寒天を形成しているアガロースは、１→３結合β−Ｄ−ガラクトースと１→４結合３、６−アンヒドロ−α−Ｌ−ガラクトースとが交互に直鎖状に並んだ多糖類である。このようにガラクトースを構成成分とする多糖類は天然には極めて多く存在するが、単糖であるガラクトースは、天然には極めて稀にしか存在しておらず、従って通常の飲食品中には存在していない。
【００３０】
ガラクトースは、動物の生命活動に必要な基幹的な糖であり、一般に乳製品等を介して供給されているために、これまで高血糖状態の動物に対するガラクトースの血糖低下効果について検討されたことはなく、そのような効果があることを示唆されることもなかった。このような動物の生命活動に基幹的な役割を持つ糖に、高血糖状態の動物に対する血糖低下効果があることを見出したことは、これまでにない非常に安全な血糖低下剤を見出したことになる。また、ガラクトースには、ガラクトース血症のように糖代謝系に障害がある人を除き、特に問題となる毒性も報告されていない。
【００３１】
また、ガラクトースは、ショ糖の甘味度を１としたときの甘味度が０．３で、０．５のグルコース程の甘さはないが適度な甘さがあり、エネルギーともなるので、栄養性の甘味料と捉えて用いることもできる。ガラクトース（誘導体）は、甘味に関してショ糖の代替として用いることができることによっても、糖尿病の予防又は症状改善に効果的である。また、甘味度がさほど強くないことは、血糖低下剤としての添加量が多くなった場合でも、通常用いる甘味料を代替するものと考えれば味への影響が少ないという点で優れている。
【００３２】
［単離されたガラクトースホモポリマー］
本発明における「ガラクトースホモポリマー」とは、ガラクトースのみが２個以上結合した多糖類のことである。その分子量（結合数）に限定はないが、その結合数は好ましくは１０個以上、より好ましくは１００個以上、特に好ましくは１０００個以上である。ジオウから抽出された「単離されたガラクトースホモポリマー」を用いて、血糖値を低下させる効果を見出したが、「単離されたガラクトースホモポリマー」であれば、ジオウから抽出されたものでなくても当然その効果は同一であると考えられるので、本発明における「単離されたガラクトースホモポリマー」は、ジオウから抽出されたものには限定されない。また、「単離されたガラクトースホモポリマー」には、ガラクトースから人工的に合成されたものも含まれる。
【００３３】
［血糖低下効果の評価系及び血糖低下効果を有するガラクトース（誘導体）の決定方法］
本発明の血糖低下剤は、上記ガラクトース（誘導体）又は単離されたガラクトースホモポリマーが、少なくとも以下の工程（ａ’）ないし（ｄ’）を含む工程によって決定されたものであることが好ましい。
（ａ’）無脊椎動物に糖（Ａ）を摂取させることによって、該無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を上昇させる工程
（ｂ’）上記工程（ａ）で得られた、脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度が上昇した無脊椎動物に、被検物質を投与する工程
（ｃ’）上記被検物質が投与された無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を測定する工程
（ｄ’）上記被検物質の中から、該無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を低下させる物質を選択する工程
【００３４】
また、上記ガラクトース（誘導体）は、少なくとも、以下の工程（ａ）ないし（ｄ）を含む工程によって決定されたものであることが特に好ましい。
（ａ）無脊椎動物に糖を摂取させることによって、該無脊椎動物の脂肪体中又は血液中のグルコース濃度を上昇させる工程
（ｂ）上記工程（ａ）で得られた、脂肪体中又は血液中のグルコース濃度が上昇した無脊椎動物に、被検物質を投与する工程
（ｃ）上記被検物質が投与された無脊椎動物の脂肪体中又は血液中のグルコース濃度を測定する工程
（ｄ）上記被検物質の中から、該無脊椎動物の脂肪体中又は血液中のグルコース濃度を低下させる物質を選択する工程
【００３５】
以下の説明と実施例中の評価実験例で示すように、上記「工程（ａ’）ないし（ｄ’）を含む工程」、上記「工程（ａ）ないし（ｄ）を含む工程」を使用すれば、ヒト等に対する血糖低下剤が正確にスクリーニングできる。ガラクトースとガラクトースホモポリマーは、かかる工程によって見出されたので、確実にヒト等に対する血糖低下剤としての効果を有する。更に、上記「工程（ａ’）ないし（ｄ’）を含む工程」を用いれば、種々のガラクトース誘導体の中から、ヒト等に対して効果を有する血糖低下剤のスクリーニングができることは明らかである。
【００３６】
上記「工程（ａ’）ないし（ｄ’）を含む工程」によれば、高血糖状態の動物の血糖値を低下させる効果を有している薬剤のスクリーニングができるので、インスリン代替の薬剤のスクリーニングができることはもとより、インスリンが既に無脊椎動物中にあることもあり、またインスリンを別途無脊椎動物に投与しておけば、インスリン抵抗性改善薬（インスリン抵抗性を取り除く物質）のスクリーニングも可能である。
【００３７】
本発明の一態様は、少なくとも、上記「工程（ａ’）ないし（ｄ’）」、好ましくは、上記「工程（ａ）ないし（ｄ）」を含み、被検物質がガラクトース誘導体であることを特徴とする糖尿病の治療薬のスクリーニング方法である。
【００３８】
＜工程（ａ）＞
無脊椎動物としては、昆虫綱、甲殻綱、ムカデ綱、クモ綱等の節足動物門に属するものが好ましく、鱗翅目、甲虫目、双翅目、膜翅目、直翅目、網翅目等の昆虫綱に属するものがより好ましい。昆虫綱に属するものとしては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。取り扱いの便宜性から、昆虫綱に属するものの幼虫であることが特に好ましい。かかる幼虫としては特に限定はないが、具体的には、鱗翅目（ガ、チョウ等を含む）、甲虫目（カブトムシ等を含む）、双翅目（ハエを含む）、膜翅目（ゴキブリを含む）、直翅目（バッタを含む）、網翅目（ハチを含む）等に属するものの幼虫が好ましいものとして挙げられる。これらのうち、完全変態型昆虫の幼虫がより好ましく、完全変態型昆虫の実質的に無毛の幼虫が特に好ましい。完全変態型昆虫とは、卵、幼虫、蛹、成虫の成長過程を経る昆虫で、その多くが幼虫時は「いもむし」と呼ばれる栄養補給に特化した実質的に無毛で単純な形態をしており、その動きも緩慢であるため、完全変態型昆虫の幼虫は、薬剤等の注射が容易である点から特に適している。
【００３９】
更に、かかる幼虫としては、以下の点から、カイコが特に好ましい。
（１）入手が容易である。
（２）飼育する方法が既に確立されており、更に飼育に利便性がある。
（３）ヒト等の哺乳類の内臓・器官と類似する性質が、これまでの研究である程度分かっている。
（４）遺伝系統が確立されており、遺伝的均一性の維持ができている。
（５）比較的大型で、動きが緩慢であり、実質上無毛なので、定量的に注射できる等、薬物の投与が容易である。
（６）脂肪体を有しており、脂肪体を取り出して、含有する物質の定量が可能である。
（７）マウス、ラット等に比べると安価で、狭いスペースで多数の個体を飼育でき、倫理的な問題も少ない為、スクリーニング的な評価を行うことが容易である。
（８）被検物質が少量しかない場合でも評価を行うことができる。
（９）齢を揃える等、同じ状態の個体を揃えることが容易である。
（１０）体液を採取して、糖、脂質、酵素等の成分を解析することが可能である。
【００４０】
以上のうち、（５）以降は完全変態型昆虫の幼虫全般にいえる特色となっており、完全変態型昆虫の実質的に無毛の幼虫が実験動物として優れた特徴を持っている。上記幼虫は、糖（Ａ）の摂取させやすさ、被検物質の投与のしやすさ、血液や脂肪体の採取のしやすさ等の観点から、大型の幼虫であることが好ましい。ここで「大型の幼虫」とは、体長が１ｃｍ以上である幼虫であり、好ましくは、１．５ｃｍ以上１５ｃｍ以下であり、特に好ましくは、２ｃｍ以上５ｃｍ以下である。また、カイコ等の場合は、４齢〜５齢の幼虫が好ましく、５齢の幼虫が特に好ましい。
【００４１】
糖（Ａ）の摂取の方法としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、血液中への注射、飼料（餌）への添加等による経口摂取、腸内への注入等が挙げられ、簡便である点、及びヒトの臨床との対応という点で、腸管内部への注射、飼料（餌）への添加等による経口摂取が好ましい。
【００４２】
上記糖（Ａ）としては、その無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を上昇させるものであれば特に限定はないが、例えば、グルコース、ヘプトース、ヘキソース、ペントース、テトロース、トリオース等の単糖類；トレハロース、マルトース、ラクトース、スクロース、セロビオース、ニゲロース、ソホロース等の２糖類；フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖等のオリゴ糖；デンプン、グリコーゲン、セルロース、ペクチン、グルコマンナン等の多糖類；デオキシ糖；ウロン酸等の糖の酸化生成物；ソルビット、アラビット等の糖アルコール等が、糖（Ｂ）の濃度を上昇させる可能性があるものとして挙げられる。このうち、グルコース、スクロース、オリゴ糖、グリコーゲン又はでんぷんが、カイコの血液中のグルコース濃度及び／又はトレハロース濃度を上昇させる点、ヒト臨床との対応の点等から特に好ましい。これらは１種を用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
【００４３】
工程（ａ）においては、該無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）濃度を上昇させることが必須である。糖（Ｂ）としては、糖（Ａ）の摂取によって脂肪体中又は血液中の濃度が上昇し、被検物質が投与されたときに、その濃度の低下が測定できるものであれば特に限定はないが、例えば、グルコース、トレハロース等が挙げられる。また、糖（Ｂ）の定量方法によっては複数種類の糖の合計量が定量される場合があるが、その場合は、糖（Ｂ）は１種に限定されない。
【００４４】
糖（Ａ）と糖（Ｂ）は同一の場合も異なる場合もある。例えば、カイコの場合、糖（Ａ）としてスクロースを投与すると直ちにカイコの血液中のグルコース濃度とトレハロース濃度が上昇する。この場合の糖（Ｂ）はグルコースとトレハロースである。
【００４５】
糖（Ｂ）の定量方法は、全ての糖類の定量にはフェノール硫酸法、アンスロン硫酸法、カルバゾール硫酸法等が挙げられ；グルコースの定量にはグルコースオキシダーゼ法等が挙げられる。
【００４６】
工程（ａ）で得られた「脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度が上昇した無脊椎動物」における「糖（Ｂ）の濃度の上昇の程度」は、ガラクトース（誘導体）の効果が確認できる程度に大きければ特に限定はないが、糖（Ａ）を摂取させない通常のものに比較して、１．５倍〜１００倍が好ましく、１．５倍〜８倍がより好ましく、１．５倍〜３倍が特に好ましい。「糖（Ｂ）の濃度の上昇の程度」が低すぎる場合は、ガラクトース（誘導体）の効果が確認できない場合がある。一方、上限については、上記範囲より高くできなかったり、また、必要性がなかったりする場合がある。また、必要以上に高くしようとすると、血糖値上昇以外の個体の障害が生じ、著しい場合には個体が死亡してしまう場合がある。
【００４７】
具体的には、血液中の糖（Ｂ）の濃度の場合には、７ｍｇ／ｍＬ（μｇ／μＬ）〜２００ｍｇ／ｍＬ（μｇ／μＬ）が好ましく、８ｍｇ／ｍＬ〜１５０ｍｇ／ｍＬがより好ましく、１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬが特に好ましい。また、脂肪体中のグルコース濃度の場合には、１０ｎｇ／μｇ〜１００００００ｎｇ／μｇが好ましく、１００ｎｇ／μｇ〜１００００ｎｇ／μｇがより好ましく、１０００ｎｇ／μｇ〜２００００ｎｇ／μｇが特に好ましい。濃度の測定方法と表現方法は実施例の方法による。
【００４８】
＜工程（ｂ）＞
工程（ｂ）では、上記工程（ａ）で得られた「脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度が上昇した無脊椎動物」に対してガラクトース（誘導体）を投与する。
【００４９】
ガラクトース（誘導体）を投与する方法としては、特に制限はなく目的に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、血液中への注射、飼料（餌）への添加等による経口摂取、腸内への注入等が挙げられる。簡便である点、ヒトとの対応という点で、腸管内部への注射、経口摂取が好ましい。ガラクトース（誘導体）の投与量としては特に制限はなく、無脊椎動物の種類、投与方法等に応じて適宜選択することができる。また、生理食塩水、水等で希釈して投与させることも好ましい。
【００５０】
ガラクトース（誘導体）は水溶性の低分子量有機化合物であり、腸管から傍細胞経路と呼ばれる、トランスポーターを介さない経路により、すなわち、傍細胞輸送により、大量に血液内に取り込まれると考えられている。例えば、以下の文献（１）及び（２）には、ガラクトースが傍細胞輸送という経路で吸収されることが示されている。「傍細胞輸送」とは、腸管の細胞の間を栄養分が通過する輸送のことで、濃度が高くても効率的に輸送される。従って、ガラクトース（誘導体）は、腸管から極めて効率的に吸収されるため、投与方法として血液中への注射、腸管内部への注射及び経口摂取の何れか１つでガラクトース（誘導体）の効果が得られれば、その効果はその他の投与方法でも、同様に得られると合理的に考えられる。
【００５１】
文献（１）：
In vivo
increase of passive intestinal absorption by cotransporter activation in rat.
P&eacute;rez M,
Barber A, Ponz F., Rev Esp Fisiol. 1993 Dec;49(4):259-64.
文献（２）：
Galactose
transport inhibition by cytochalasin E in rat intestine in vitro.
D&iacute;ez-Sampedro
A, Urdaneta E, Lostao MP, Barber A., Can J Physiol Pharmacol. 1999
Feb;77(2):96-101.
【００５２】
ガラクトース（誘導体）の投与時期は特に限定はなく、工程（ａ）において糖（Ａ）を摂取させ終えた直後、該無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度がほぼ最大値に達した時点、血液中の糖（Ｂ）の濃度が正常値にまで回復してゆく時点等が挙げられるが、該無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度がほぼ最大値に達した時点が、実験結果の再現性を得るという点で好ましい。具体的には、「糖（Ａ）を摂取させ終えた直後」が特に好ましい。
【００５３】
＜工程（ｃ）＞
工程（ｃ）では、上記工程（ｂ）で、ガラクトース（誘導体）が投与された無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を測定する。測定試料の採取方法は脂肪体に関しては、解剖して採取することが好ましく、血液に関しては、切り傷を付けてそこから採取する方法が好ましい。
【００５４】
糖（Ｂ）の種類、糖（Ｂ）の濃度及びグルコースの濃度の測定方法としては、工程（ａ）の箇所で記載した方法と同様の方法が挙げられる。すなわち、糖（Ｂ）としては、糖（Ａ）の摂取によって脂肪体中又は血液中の濃度が上昇し、被検物質が投与されたときに、その濃度の低下が測定できるものであれば特に限定はないが、例えば、グルコース、トレハロース等が挙げられる。また、糖（Ｂ）は１種に限定されず、全ての糖（Ｂ）の合計量を測定してもよい。ただし、糖（Ｂ）にはガラクトース（誘導体）もガラクトースホモポリマーも含まれない。
【００５５】
例えば、カイコの場合、糖（Ａ）の摂取によって、カイコの血液中のグルコース濃度とトレハロース濃度が上昇する場合が多いので、糖（Ｂ）としては、グルコース又はトレハロースであることが好ましい。また、血液中に、工程（ｂ）で投与したガラクトース（誘導体）が検出される場合は、ガラクトース（誘導体）の量を除いた糖（Ｂ）のみの定量をすること、又は、糖（Ｂ）の中のグルコースのみの定量をすることが好ましい。
【００５６】
前記した通り、糖（Ｂ）の定量方法としては、全ての糖類の定量にはフェノール硫酸法、アンスロン硫酸法、カルバゾール硫酸法等が挙げられ；グルコースのみの定量方法としてはグルコースオキシダーゼ法等が挙げられる。
【００５７】
脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度の測定をする時期については特に限定はなく、工程（ｂ）においてガラクトース（誘導体）が投与された直後から、ガラクトース（誘導体）による糖（Ｂ）の濃度の減少の効果が見られなくなるまでの期間から選択すればよい。具体的には、例えば、被検物質が投与された時点から１分〜１日が好ましく、３０分〜１０時間が特に好ましい。
【００５８】
糖（Ｂ）の濃度の測定に際しては、ガラクトース（誘導体）を投与していない、「同様に脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を上昇させた無脊椎動物」を陰性対照として用いることが好ましい。陰性対照には、例えば、生理食塩水を同量だけを投与することが好ましい。陰性対照に比較して、ガラクトース（誘導体）を投与したもので、糖（Ｂ）の濃度がどれくらい減少していたかによって、そのガラクトース（誘導体）を評価する。
【００５９】
＜工程（ｄ）＞
工程（ｄ）において、上記工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）によって使用されたガラクトース（誘導体）の中から、該無脊椎動物の脂肪体中又は血液中の糖（Ｂ）の濃度を低下させる物質を選択する。
【００６０】
実施例で詳述するが、高血糖カイコを用いた場合、糖（Ｂ）の濃度は、インスリンで６０％にまで減少、メトホルミンで７０％にまで減少、5-Aminoimidazole-4-Carboxamide  Ribonucleoside（以下、「ＡＩＣＡＲ」と略記する）で８０％にまで減少した。これは、工程（ａ）〜（ｄ）を含む工程でスクリーニングされた物質、すなわち上記工程（ｄ）で選択された被検物質が、血糖低下剤としての効果を有しており、このスクリーニング方法が２型糖尿病治療薬・予防薬のスクリーニングに極めて有効であることを示している。従って、ガラクトース（誘導体）の血糖低下効果もこの方法で評価でき、血糖低下効果を有するものを決定できることは明らかである。
【００６１】
陰性対照に比較して、ガラクトース（誘導体）を投与したもので、グルコース濃度がどれくらいまでに減少した場合に有意差と判定してその被検物質を選択するかについては、評価実験例に示す、インスリン、メトホルミン及びＡＩＣＡＲの結果から導き出すに、陰性対照のグルコース濃度の９５％以下〜８０％以下にまで減少した場合である。
【００６２】
実施例で詳述するが、Ｄ−ガラクトースを高血糖カイコに摂取させた場合、グルコース濃度が、６０％以下〜７０％以下になった。このことは、Ｄ−ガラクトースが血糖低下剤として有効であり、２型糖尿病の予防又は症状改善のために効果的であることを示している。また、この事実は、ガラクトース（誘導体）の中で、血糖低下剤として有効なものを、工程（ａ）〜（ｄ）を含む工程でスクリーニングができることを示している。
【００６３】
[[評価系の作用・原理]]
工程（ａ）〜（ｄ）を含む工程で、ヒト等の血糖値を低下させる物質をスクリーニングできる作用・原理は明らかではないが、以下のことが考えられる。すなわち、カイコ等は血糖値の恒常性を維持する機構を有しており、筋肉及び人の肝臓に相当する脂肪体に糖を貯蔵でき、また、インスリン様ペプチドホルモンであるボンビキシンを有しており、ボンビキシンの下流には、ヒトの場合と同様なＭＡＰＫシグナル伝達経路を含むインスリンシグナル伝達経路が存在する。また、組み換え型ヒトインスリンがＰＩ３キナーゼの活性化を介して、カイコの脂肪体の糖の取り込みを亢進させる作用を有する。更に、インスリンシグナル伝達経路以外の経路であるＡＭＰキナーゼの活性化により、カイコの血糖値は低下する。すなわち、カイコにはヒトの血糖調節機構と同様な機構があるために、ヒト等の血糖値を低下させる物質をスクリーニングでき、血糖低下剤としてガラクトース及びガラクトースホモポリマーが発見できたと考えられる、また、そのために、ガラクトース（誘導体）の中から、血糖低下剤をスクリーニングできるものと考えられる。
【００６４】
［血糖低下剤］
本発明は、ガラクトース（誘導体）又は単離されたガラクトースホモポリマーを有効成分として含有することを特徴とする血糖低下剤である。ガラクトースホモポリマーは単離されたことが必須であって、植物体等の抽出液等のように、ガラクトースホモポリマーが単離されずに含有されている血糖低下剤は本発明には含まれない。
【００６５】
ガラクトース（誘導体）とガラクトースホモポリマーは安定な物質であって、吸湿性も強くないので、取り扱いに特に注意を要しない。従って、原末のまま用いる場合；液剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、丸剤等の各種の剤形に製剤化する場合；飲食品に添加する場合；等を問わず、あらゆる形態で用いることができる。
【００６６】
ガラクトース（誘導体）や単離されたガラクトースホモポリマーを製剤化する場合、賦形剤としては特に限定はないが、無機塩類、ステアリン酸マグネシウム等の有機酸塩類、タルク等のフィラー類、クエン酸等の有機酸類等を挙げることができる。ガラクトース（誘導体や単離されたガラクトースホモポリマーは、賦形剤等の通常製剤化に用いられる物質を用いなくても、それ自体で製剤化が可能なので、液剤を除き、１００質量％までの任意の含量を選択することができる。各製剤中のガラクトース（誘導体）や単離されたガラクトースホモポリマーの含量は、その製剤の適用対象；治療、改善、予防等の適用目的；他の剤との併用等の適用方法；等によって適宜調整すればよい。
【００６７】
［飲食品］
本発明の一態様は、ガラクトース（誘導体）又は単離されたガラクトースホモポリマーを有効成分として含有する血糖低下剤を添加してなることを特徴とする糖尿病の予防又は症状改善のための飲食品である。すなわち、ガラクトース又はガラクトース誘導体が血糖低下の有効成分として添加されてなることを特徴とする飲食品であり、また、単離されたガラクトースホモポリマーが血糖低下の有効成分として添加されてなることを特徴とする飲食品である。
【００６８】
ここで「飲食品」には、ヒトが摂取する全ての飲み物や食品が含まれる。また、本発明の飲食品には、家畜、家禽類、ペット等が摂取するための飼料も含まれる。「添加」とは、飲食品を製造する際に、物質を外部から加えることをいい、既に製造された飲食品中で経時と共に化学反応等で物質が生成して、結果としてその飲食品中に含有されることになった場合は含まれない。すなわち、例えば、乳糖等が飲食品中で分解して、結果として、Ｄ−ガラクトースがその飲食品中に含有されることになった場合は、本発明には含まれない。また、本発明は、ガラクトースホモポリマーが単離された形で添加された飲食品であり、「植物体等の抽出液そのもの」のように、最初からガラクトースホモポリマーが種々の多成分中の１成分として含有されている飲食品は本発明には含まれず、最初からガラクトースホモポリマーが種々の多成分中の１成分として含有されている「植物体等からの抽出液」を、そのまま添加した飲食品も本発明には含まれない。
【００６９】
本発明の一態様は、ガラクトース（誘導体）又は単離されたガラクトースホモポリマーが血糖低下の有効成分として添加されてなることを特徴とする飲食品である。「血糖低下の有効成分」とは、血糖値を低下させ、糖尿病の予防又は症状改善に効果的な成分である。「添加」の定義は上記と同様である。また、飲食品に該ガラクトース（誘導体）又は単離されたガラクトースホモポリマーが血糖低下の有効成分として含まれていることをたとえ標榜していなくても本発明に含まれる。また、明確に全く異なる目的のみで添加させている場合を除き、該ガラクトース（誘導体）又は単離されたガラクトースホモポリマーの添加が血糖低下をもたらすことを認識していなくても本発明に含まれる。
【００７０】
飼料を含む飲食品にガラクトース（誘導体）又は単離されたガラクトースホモポリマーを添加して用いる場合には、味、摂取カロリー量、コスト等を勘案して添加量を決定すればよく、ガラクトース（誘導体）等の性状による添加量の制限は特にない。上記したように、他の甘味料を代替する形式であれば、血糖低下剤として添加した場合でも比較的多い添加量を選択することもできる。
【実施例】
【００７１】
以下、本発明について、実施例により具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限りこれらの実施例に限定されるものではない。【００７２】
本発明の完成には、カイコ等の無脊椎動物を用いた血糖低下剤の評価系の存在が重要であり、かかる評価系を発明者が有していたことにより、従来、哺乳動物の高血糖動物モデルを用いた段階の検討まで行われることがなかったガラクトースという生命活動に基幹的な役割を有する単糖が、単独でも血糖低下効果を有する血糖低下剤の有効成分として用いることができるという本発明の根幹を想到することができたものである。そのため、カイコを用いた血糖低下剤の評価系について、まず、評価例及び評価実験例１〜１１で詳述する。【００７３】
下記する評価例及び評価実験例１〜１１は、この評価系が血糖低下の有効成分をスクリーニングする上で正しいものであることを示すのと同時に、ガラクトース（誘導体）の中から、血糖低下を示すものを正確にスクリーニングできることをも示す。また、実施例で用いたガラクトースが、人、家畜、家禽類、ペット等において血糖値を低下させる効果が確実にあることを示すものである。【００７４】
［評価例］
＜カイコの種類、飼育条件＞
カイコの受精卵（交雑種Ｈｕ・Ｙｏ  ｘ  Ｔｕｋｕｂａ・Ｎｅ）は、愛媛蚕種株式会社から購入した。孵化した幼虫は室温で人工飼料シルクメイト２Ｓ（日本農産工業株式会社製）を与えて５齢幼虫まで育てた。飼育容器は卵から２齢幼虫までを角型２号シャーレ（栄研器材製）、それ以降をディスポーザブルのプラスチック製フードパック（フードパックＦＤ  大深、中央化学株式会社製）を用いた。飼育温度は２７℃とした。【００７５】
以下の評価実験例で用いる通常飼料給餌に用いる飼料は、人工飼料シルクメイト２Ｓ（日本農産工業株式会社製）であり、グルコース添加飼料給餌に用いる飼料は、人工飼料シルクメイト２Ｓ（日本農産工業株式会社製）に所定の質量比でＤ−グルコースを混合して調製したものである。本評価実験例において、「絶食群（以下、適宜「Ｓｔ」と記載することもある）」とは、所定期間中全く餌を給餌しなかったカイコ群であり、「通常飼料給餌群（以下、適宜「ＮＤ」と記載することもある）」とは、人工飼料シルクメイト２Ｓを所定期間給餌したカイコ群であり、「グルコース添加飼料給餌群（以下、適宜「ＧＤ」と記載することもある）」とは、所定の質量比でグルコースを混合した飼料を所定期間給餌したカイコ群のことである。【００７６】
＜試薬＞
以下の評価実験例で用いる「組み換え型インスリン」は、インスリン（Ｓｉｇｍａ社製）を０．１％の酢酸を含む生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に溶解して用いた。メトホルミン（１，１−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｉｇｕａｎｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、和光純薬社製）は、生理食塩水に溶解して用いた。ワートマニン（ｗｏｒｔｍａｎｉｎ）はＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭより購入したものをＤＭＳＯに溶解して用いた。【００７７】
＜血液中の糖濃度の測定方法＞
カイコの血液中の糖濃度（以下、「血糖値」と略記する）の測定方法は以下の通りである。カイコの血液は、第一腹肢に切り傷をつけた所から、約１００μＬ採取し、タンパク質を沈殿させるために、９倍量の０．６Ｎ（規定）過塩素酸と混合した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、体液抽出液（ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ  ｅｘｔｒａｃｔ）（上清）を得た。【００７８】
血糖値はフェノール硫酸法（Ｈｏｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ）により定量した。上記体液抽出液を蒸留水で１０倍希釈したもの１００μＬと、５％（ｗ／ｖ）フェノール水溶液１００μＬとを混合し、濃硫酸５００μＬを加えて激しく撹拌した。室温で２０分間静置した後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。グルコース水溶液を標準糖溶液として血糖値を算出した。単位「ｍｇ／ｍＬ」の分母はカイコの血液の体積である。【００７９】
＜血液中のグルコース濃度の測定方法＞
カイコの血液中のグルコース濃度は、通常のグルコースオキシダーゼ法に従い定量した。上記の血液中の糖濃度の測定と同様にして、体液抽出液（ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ  ｅｘｔｒａｃｔ）（上清）を得た後、蒸留水で適当な濃度に希釈したもの２０μＬに、酵素反応液（０．１２Ｍ  Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）、４ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ、３ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、９ｍＭ  ｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ）４００μＬとを混合し、室温で４０分放置した。その後、７０％濃硫酸１００μＬを加えて激しく撹拌し、５３０ｎｍにおける吸光度を測定した。グルコース水溶液を標準糖溶液として、グルコース濃度を算出した。単位「ｍｇ／ｍＬ」の分母は、カイコの体液抽出液の体積である。【００８０】
＜脂肪体中の糖濃度の測定方法＞
カイコの脂肪体中の糖濃度の測定方法は、以下の通りである。カイコの脂肪体は、ハサミで体腔を開いてピンセットにより取り出し、生理食塩水中で洗った後、終濃度３０％（ｗ／ｖ）となるように水酸化カリウム（ＫＯＨ）を加え、１００℃にて５分間熱処理した。更にエチルアルコールを終濃度６０％（ｖ／ｖ）となるまで加え、煮沸して糖を沈殿させ、４℃で一晩静置した後、遠心（３０００ｒｐｍ、１５分）により集め、定量した。糖濃度の測定方法は、上記血液中の糖濃度の測定方法と同様である。単位「μｇ／ｍｇ」（又は「ｍｇ／ｇ」）の分母はカイコの脂肪体の質量である。【００８１】
＜脂肪体の糖取り込み量の測定方法＞
絶食させた５齢２日目のカイコを背側から解剖し、脂肪体を摘出した。摘出した脂肪体はＩｎｓｅｃｔ  ｓａｌｉｎｅ（１３０ｍＭＮａＣｌ／５ｍＭ  ＫＣｌ／１ｍＭ  ＣａＣｌ２）で洗浄した後、質量を測定し、ペニシリン、ストレプトマイシン及びグルコースを添加したＧｒａｃｅ’ｓ  ｉｎｓｅｃｔ  ｍｅｄｉｕｍ２００μＬ中で２７℃において馴染ませた。ワートマニン（ｗｏｒｔｍａｎｉｎ）を用いた実験においては、同時に培地中にワートマニンを加えた。３０分間の前培養の後、培地にインスリン（３ｍｇ／ｍＬ）５０μＬを添加し、２７℃で引き続き培養を続けた。培養後、上記方法で脂肪体抽出液を調製し、脂肪体中の糖濃度の測定を行い、脂肪体の質量当たりの糖取り込み量を算出した。単位「μｇ／ｍｇ」の分母はカイコの脂肪体の質量である。【００８２】
＜脂肪体のリン酸化Ａｋｔ量の測定方法＞
カイコから摘出した脂肪体を、Ｉｎｓｅｃｔ  ｓａｌｉｎｅ（１３０ｍＭＮａＣｌ／５ｍＭ  ＫＣｌ／１ｍＭ  ＣａＣｌ２）で洗浄した後、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したＧｒａｃｅ’ｓ  ｉｎｓｅｃｔ  ｍｅｄｉｕｍ２００μＬ中で２７℃において馴染ませた。ワートマニン（ｗｏｒｔｍａｎｉｎ）を用いた実験においては、同時に培地中にワートマニンを加えた。３０分間の前培養の後、培地にインスリン（３ｍｇ／ｍＬ）を５０μＬ添加し、２７℃で１時間培養した。脂肪体をＩｎｓｅｃｔ  ｓａｌｉｎｅ（１３０ｍＭＮａＣｌ／５ｍＭＫＣｌ／１ｍＭＣａＣｌ２）で洗浄した後、ＮＰ−４０  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、１％ＮＰ−４０、１０ｍＭＮａＦ、１ｍＭＮａ３ＶＯ４）２５０μＬの溶液と混合し、２０秒間、超音波処理した。その後、ＴＣＡ沈殿を行い、タンパク質をＳＤＳ電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレンに移行させた。抗Ａｋｔ抗体及び抗リン酸化Ａｋｔ抗体を用いてウエスタンブロットを行い、脂肪体のリン酸化Ａｋt量（リン酸化Ａｋｔ量／全Ａｋｔ量）を測定した。【００８３】
＜被検物質の投与の方法＞
評価実験例４、評価実験例５及び評価実験例９において、５齢１日目のカイコの第５体節の模様部に、被検物質をそれぞれ所定量含む０．０５ｍＬの生理食塩水を注射した。また、対照としては、それぞれ同量である０．０５ｍＬの生理食塩水のみを注射した。注射筒（１ｍＬ）と注射針（２７Ｇｘ３／４）はテルモ株式会社製を使用した。【００８４】
評価実験例１
カイコに糖を含む餌を摂取させることにより、カイコの血糖値が上昇するか否かを検討した。５齢１日目のカイコを、「絶食群」、「通常飼料給餌群」、「１５％（ｗ／ｗ）グルコース添加飼料給餌群」に分け、それぞれ１０匹に対し、２７℃で、１５％（ｗ／ｗ）のグルコースを含む餌を１日間及び３日間与えた。その後、血糖値（ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ  ｓｕｇａｒ）（ｍｇ／ｍＬ）及び脂肪体中の糖濃度（μｇ／ｍｇ）を測定した。その結果を、それぞれ図１（Ａ）及び図１（Ｂ）に示す。【００８５】
図１（Ａ）から分かるように、給餌開始後１日目及び３日目のカイコの何れにおいても、グルコース添加飼料給餌群では、通常飼料給餌群と比べて約３倍高い血糖値を示した。なお、絶食群の血糖値は、通常飼料給餌群の約１／２であった。【００８６】
また、図１（Ｂ）から分かるように、給餌開始後１日目のカイコの脂肪体中の糖濃度において、グルコース添加飼料給餌群では、通常飼料給餌群と比べて約２倍高い値を示した。なお、絶食群の糖濃度は、通常飼料給餌群の１／１０以下であった。【００８７】
従って、以上から、グルコース添加飼料をカイコに与えることにより、カイコの血糖値及び脂肪体の糖濃度が上昇することが分かった。これらの結果より、カイコにおいても、ヒトと同様に、血糖値の増加により、脂肪体中に糖が取り込まれて貯蔵されることが示唆された。【００８８】
評価実験例２
５齢１日目のカイコに対し、それぞれ、３匹ずつに、グルコース３３％（ｗ／ｗ）を含む餌（３３％Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｄｉｅｔ）を摂取させたときの血糖値の経時的推移を調べた。すなわち、給餌開始前、給餌開始３０分後、６０分後、１８０分後のカイコの血糖値をそれぞれ同様にして測定した。結果を図２に示す。【００８９】
図２から分かるように、給餌開始３０分後では、給餌開始前の約２倍、給餌開始６０分後及び１８０分後では何れも、給餌開始前の約３倍に血糖値が上昇していた。以上の結果は、カイコにおいても、哺乳類と同様に、糖の経口摂取により血糖値が速やかに上昇することを示している。なお、この範囲の時間経過では、通常飼料給餌群（Ｎｏｒｍａｌ  Ｄｉｅｔ）と絶食群（Ｓｔａｖａｔｉｏｎ）では、血糖値の変化はみられなかった。【００９０】
評価実験例３
餌に含まれる糖の含有割合を変化させて、カイコの血糖値の変動を調べた。すなわち、５齢1日目のカイコを、「通常飼料給餌群」、「８％（ｗ／ｗ）グルコース添加飼料給餌群」、「１６％（ｗ／ｗ）グルコース添加飼料給餌群」、「３３％（ｗ／ｗ）グルコース添加飼料給餌群」に分けて、それぞれ３匹ずつを２７℃で飼育し、給餌開始後６０分後に血糖値を測定した。結果を図３に示す。同様にして給餌開始後１８０分後の血糖値を測定した。結果を図９に示す。【００９１】
図３、図９から分かるように、各群の平均血糖値は、グルコース含量を３３％としても飽和せずに餌のグルコースの含量割合に依存して上昇した。【００９２】
評価実験例４
評価実験例１〜３及び評価実験例７〜９で、カイコを高血糖状態にする条件が見出された。次に、臨床において用いられる血糖低下薬が、高血糖状態のカイコの血糖値を低下させるか否かを検討した。５齢１日目のカイコ（体重１±０．１ｇ）に、１６％（ｗ／ｗ）グルコース添加飼料を与え、２７℃で６０分間飼育後、それぞれ３匹ずつ、血液中に「生理食塩水０．０５ｍＬを投与」及び「組み換え型ヒトインスリン０．３６ｍｇを含有する０．０５ｍＬの生理食塩水溶液を投与」し、投与から６時間後に血液を採取し、糖濃度の定量を行った。結果を図４に示す。【００９３】
図４から分かるように、インスリン投与群の血糖値は、生理食塩水投与群の血糖値と比べて、約６割まで低下していた。このことから、組み換え型ヒトインスリンは、カイコの血糖値を低下させる作用を有することが示された。【００９４】
評価実験例５
臨床において用いられる、ヒトの血糖低下薬であるメトホルミンが、高血糖状態のカイコの血糖値を低下させるか否かを検討した。メトホルミンは、解糖の促進を作用機序とするビグアナイド系の血糖低下薬として知られているものである。すなわち、評価実験例４において、「組み換え型ヒトインスリン０．３６ｍｇ／生理食塩水０．０５ｍＬ」の代わりに、「メトホルミン０．１ｍｇ／生理食塩水０．０５ｍＬ」を投与した以外は、評価実験例４と同様の操作をし、その後、糖濃度の定量を行った。結果を図５に示す。【００９５】
図５から分かるように、メトホルミン投与群の血糖値は、生理食塩水投与群の血糖値と比べて、約７割まで低下していた。このことから、メトホルミンはカイコの血糖値を低下させる作用を有することが示された。【００９６】
なお、投与したメトホルミン量（１００ｍｇ／ｇ）は、ヒトの１日最高投与量（１２．５ｍｇ／ｇ）の約１０倍の量であった。メトホルミンはインスリンとは異なる作用機構により血糖値を下げる薬剤である。従って、カイコを用いた方法は、１型糖尿病ばかりでなく、インスリン分泌低下によらない２型糖尿病に有効な治療薬の評価、スクリーニング、製造にも有効であることが分かった。【００９７】
評価実験例６
次に、インスリンのカイコの血糖値低下作用のＥＤ５０値の算出を試みた。５齢１日目のカイコに９％（ｗ／ｗ）グルコース添加飼料を与え、２７℃で６０分間飼育後、生理食塩水、及び組み換え型ヒトインスリン（０．００５ｍｇ〜０．５ｍｇ）を投与し、６時間後に血液を採取し、血中の糖濃度を定量した。３％（ｗ／ｗ）グルコース添加飼料群の血糖値まで低下したときを１００％とした相対的な血糖値低下率のグラフを図６に示す。【００９８】
図６から分かるように、インスリンによるカイコの血糖低下作用のＥＤ５０値は、０．０１５ｍｇ／ｇであった。臨床において、１日にヒトに投与されるインスリン量は、０．１４〜３．５３ｍｇである。算出されたＥＤ５０値は、体重６０ｋｇのヒトに対する１日投与量の１０００倍程度であった。【００９９】
評価実験例７
５齢１日目のカイコに対し、それぞれ、３匹ずつに、グルコース１５％（ｗ／ｗ）を含む餌を摂取させたときの血糖値及びカイコの血液中のグルコース濃度の経時的推移を調べた。すなわち、給餌開始前、給餌開始３０分後、６０分後、１８０分後のカイコの血糖値及びカイコの血液中のグルコース濃度をそれぞれ同様にして測定した。結果を図７に示す。次に、カイコに２７℃で６０分間グルコース１２％（ｗ／ｗ）を含む餌を摂取させた後、絶食させたときのカイコの血糖値の経時的推移を調べた。すなわち、給餌前、給餌開始１時間後（絶食開始０時間後）、絶食開始２時間後、５時間後、８時間後のカイコの血糖値をそれぞれ同様にして測定した。結果を図８に示す。【０１００】
図７（ａ）から分かるように、給餌開始３０分後では、給餌開始前の約２倍、給餌開始６０分後及び１８０分後では、給餌開始前の約３倍以上、約６倍以上に血糖値が上昇していた。１５％グルコース添加飼料給餌群においても同様に、速やかに血液中のグルコース濃度が上昇していた（図７（ｂ））。以上の結果は、カイコにおいても、哺乳類と同様に、糖の経口摂取により血糖値及び血液中のグルコース濃度が速やかに上昇することを示している。なお、この範囲の時間経過では、通常飼料給餌群（Ｎｏｒｍａｌ  Ｄｉｅｔ）と絶食群（Ｓｔａｖａｔｉｏｎ）では、血糖値及び血液中のグルコース濃度の変化はみられなかった。また、図８から分かるように、絶食開始２時間後からカイコの血糖値が低下し始めた。これの結果は、カイコが哺乳類と同様に糖の過剰摂取により血糖値が上昇し、時間の経過に伴い減少することを示唆している。【０１０１】
評価実験例８
５齢１日目のカイコ、それぞれ３匹ずつに、通常飼料又は５％、１０％、１５％、３０％（ｗ／ｗ）グルコース添加飼料をそれぞれ与え、２７℃で３日間飼育後のカイコの体長、体重、血糖値を測定した。また、５齢１日目のカイコに同条件下、何も飼料を与えないで飼育後、同様にして体長、体重、血糖値を測定した。結果を図１０に示す。【０１０２】
図１０より、各グルコース添加飼料給餌群（５％、１０％、１５％、３０％ＧＤ）は、通常飼料給餌群（Ｎｏｒｍａｌ  Ｄｉｅｔ；ＮＤ）より何れも体長が短く、体重が軽かった（図１０（ａ）〜（ｃ））。このときの血糖値は、グルコースの添加量により上昇していた（図１０（ｄ））。また、カイコにグルコース溶液を注射することによっても、同様の成長阻害が起こることがわかった（データ示さず）。これらの結果より、カイコは血糖値の上昇により、成長が阻害されることを示唆している。【０１０３】
評価実験例９
５齢１日目のカイコ（体重１±０．１ｇ）に、１２％（ｗ／ｗ）グルコース添加飼料を与え、２７℃で６０分間飼育後、それぞれ３匹ずつ、血液中に「生理食塩水０．０５ｍＬを投与」又は「組み換え型ヒトインスリン０．３６ｍｇを含有する０．０５ｍＬの生理食塩水溶液を投与」し、投与から１時間後、３時間後、６時間後に血液を採取し、血糖値を測定した。更に、５齢１日目のカイコに、１２％（ｗ／ｗ）グルコース添加飼料を与え、２７℃で６０分間飼育後、それぞれ３匹ずつ、血液中に「組み換え型ヒトインスリン（０．００５ｍｇ〜０．５ｍｇ）を含有する０．０５ｍＬの生理食塩水溶液を投与」し、６時間後に血液を採取し、血糖値を測定した。図１１（ｂ）における単位「μｇ／ｇ」の分母はカイコの体重である。結果を図１１に示す。【０１０４】
次に、５齢１日目のカイコ、それぞれ３匹ずつから脂肪体を摘出し、１質量％グルコースを添加したＧｒａｃｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍに生理食塩水又は組み換え型ヒトインスリン０．７ｍｇを投与し、２７℃３時間培養後、摘出した脂肪体のリン酸化Ａｋｔ量及び糖取り込み量を測定した。また、５齢１日目のカイコから摘出した脂肪体をワートマニン（ｗｏｒｔｍａｎｉｎ）処理したものも同様にしてグルコースを添加し、組み換え型ヒトインスリンを投与して培養し、脂肪体のリン酸化Ａｋｔ量及び脂肪体質量当たりの糖取り込み量を測定した。更に、脂肪体のリン酸化Ａｋｔ量を定性的に確認するため、抗Ａｋｔ抗体、及び抗リン酸化Ａｋｔ抗体を用いてそれぞれのサンプルについて測定を行った。結果を図１１に示す。【０１０５】
図１１（ａ）及び（ｂ）から分かるように、インスリン投与群の血糖値は生理食塩水投与群と比べて、約６割まで低下することが判明した（図１１（ａ））。また、ヒトインスリンの投与量に依存してカイコの血糖値は低下した（図１１（ｂ））。これらの結果は、組み換え型ヒトインスリンがカイコの血糖値を低下させる作用を有することを示唆している。【０１０６】
図１１（ｃ）及び（ｄ）から分かるように、摘出した脂肪体を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの組織培養液に組み換え型ヒトインスリンを添加することにより、脂肪体のリン酸化Ａｋｔ量が増加した。また、組み換え型ヒトインスリンの添加により、脂肪体質量当たりの糖取り込み量も増加した（図１１（ｅ））。更に、この組み換え型ヒトインスリンによるＡｋｔのリン酸化及び脂肪体の糖取り込み量の増加は、ＰＩ３キナーゼの阻害剤であるｗｏｒｔｍａｎｉｎ処理により抑圧されることが分かった（図１１（ｃ）〜（ｅ））。これらの結果より、組み換え型ヒトインスリンがＰＩ３キナーゼの活性化を介して、カイコの脂肪体の糖の取り込みを亢進させる作用を有することを示唆している。したがって、組み換え型ヒトインスリンによるカイコの血糖低下作用は、ヒトにおける作用と同様のメカニズムであると考えられる。【０１０７】
評価実験例１０
５齢１日目のカイコ、それぞれ３匹ずつに、１２％（ｗ／ｗ）グルコース添加飼料を与え、２７℃６０分間飼育後、「生理食塩水１ｍＬのみ」又は「ＡＩＣＡＲ４ｍｇ／生理食塩水１ｍＬ」を投与し、６時間後に血液を採取し、血糖値を測定した。また、５齢１日目のカイコの脂肪体を摘出し、５００μＭのＡＩＣＡＲを５０μＬ加え、６時間処理後、脂肪体中のＡＭＰＫ活性を、ＡＭＰＫの人工基質であるＳＡＭＳペプチドにγ３２Ｐ−ＡＴＰのリン酸を付加する反応を用いて測定した。結果を図１２に示す。【０１０８】
図１２（ａ）から分かるように、ＡＩＣＡＲ投与群のカイコの血糖値は、生理食塩水のみ投与群と比較して低下していた（図１２（ａ））。この結果より、ＡＭＰキナーゼの活性化剤であるＡＩＣＡＲがカイコに対して血糖低下作用を示すことが分かった。また、摘出した脂肪体をＡＩＣＡＲで処理することにより、ＡＭＰＫ活性が増強することがわかった（図１２（ｂ））。以上より、投与したＡＩＣＡＲは、ヒトと同様のメカニズムでカイコの脂肪体に作用し、ＡＭＰＫ活性を促進させることを示唆している。【０１０９】
一方、グリベンクラミドの注射では、カイコの血糖値の低下は見られなかった（データ示さず）。ＳＵ剤の一種であるグリベンクラミドは、膵臓のβ細胞のＳＵレセプターと結合して、インスリンの放出を促進する薬剤である。カイコにおいては、膵臓と同様の機能をする臓器が確認されていない。グリベンクラミドの投与によりカイコの血糖値が低下しなかったことは、カイコには、哺乳類の膵臓のβ細胞様の細胞が存在しないことが原因の一つであると考えられる。したがって、カイコを用いた場合には、グリベンクラミドのようなインスリン放出促進作用を有する薬剤の評価は行えないと考えられる。【０１１０】
評価実験例１１
５齢１日目のカイコ、それぞれ３匹ずつに、通常飼料（Ｎｏｒｍａｌ  Ｄｉｅｔ；ＮＤ）、１２％（ｗ／ｗ）グルコース添加飼料（Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｄｉｅｔ；ＧＤ）及び１２％（ｗ／ｗ）グルコース添加飼料（Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｄｉｅｔ；ＧＤ）と、組み換え型ヒトインスリン３．５ｍｇ／ｍＬを５０μＬ、１２時間ごとに５回注射し、２７℃４日間飼育後、カイコの体長、体重を測定した。結果を図１３に示す。【０１１１】
１２％グルコース添加飼料（ＧＤ）を４日間給餌したカイコは、通常飼料（ＮＤ）給餌群のカイコより、体長が小さく、体重が減少しており、成長の阻害が観察された（図１３（ｂ）〜（ｄ））。１２％グルコース添加飼料（ＧＤ）及び組み換え型ヒトインスリンを１２時間ごとに５回注射した場合は、組み換え型ヒトインスリンを注射しないものより、体長の増大と、体重の増加が認められた（図１３（ａ）〜（ｄ））。この結果は、高血糖状態によるカイコの成長阻害が組み換え型ヒトインスリンによる血糖値の低下により回復することを示唆している。【０１１２】
評価実験例１〜評価実験例１１によって、カイコの血糖値は飼料に添加した糖（Ａ）の濃度及び給餌時間に依存して上昇すること、及び高血糖状態のカイコに血糖低下薬であるインスリン、メトホルミン、ＡＩＣＡＲを投与することにより、カイコの血糖値が低下することが明らかになった。任意に選んだ「ヒトに効果がある上記３物質」で、特定状態のカイコの血糖値が低下することが明らかになったことにより、本発明の方法は、少なくともヒトの血糖値を低下させる可能性がある全ての薬剤の評価・スクリーニング方法として、充分に確立しているものである。【０１１３】
血糖値の上昇により引き起こされたカイコの成長阻害が、ヒトインスリンの血糖低下作用により回復した。糖尿病マウスモデルでは、長期間の飼育により尿毒症や足の麻痺がおこることが知られているが、高血糖によるカイコの成長阻害は、数日で観察可能であり、このことからも、ヒト等の血糖値を低下させる物質を、簡便、正確に評価・スクリーニングする方法である。【０１１４】
臨床では、食後の血糖値が健常人の２倍以上であると高血糖状態であると判断される。餌に含まれる糖濃度、及び給餌時間の調節により、カイコを高血糖状態（通常の餌を給餌した場合の２倍の血糖値）にする条件を見出した（評価実験例２（図２）、評価実験例３（図３））。臨床において、血糖低下剤として用いられる組み換え型ヒトインスリン又はメトホルミン、ＡＩＣＡＲの投与（注射）により、高血糖状態のカイコの血糖値が低下すること、及びインスリンによる血糖低下作用は、カイコとヒトで同程度であることから、カイコを用いて、ヒトの血糖低下剤の評価、スクリーニングができる。このカイコを用いた血糖低下剤の評価方法やスクリーニング方法を用い、カイコの血糖低下活性を指標に、ヒトに対する血糖低下剤の探索や決定が可能である。【０１１５】
培養細胞系を用いて血糖低下剤の候補となる化合物をスクリーニングする方法が糖尿病治療薬の開発手法として一般的に行われている。しかしながら、一般に培養細胞系で効果を示すほとんどの化合物は、動物個体では血糖低下作用を示さない。その理由は、培養細胞系では、個体における薬物動態を反映できないためである。そのため、動物個体を用いた評価系の利用は必須である。【０１１６】
上記したカイコを用いたあらゆる結果については、前記した「完全変態型昆虫の幼虫」、「体内に脂肪体を有している幼虫」、「昆虫綱に属する動物」等の無脊椎動物全般においても、同様の又は類似の結果が得られると考えることは常識であるから、単に「カイコ」には限定されないことは明らかである。【０１１７】
以下、上記評価系を用いた実施例で、ガラクトースや単離されたガラクトースホモポリマーが血糖低下剤として有効であることを示す。
実施例１
［ジオウの血糖低下効果の主体となる成分の検討］
[[ジオウ熱水抽出物のエタノール沈殿画分の調製]]
ジオウ（ウチダ和漢薬社製）２３８ｇを、１００％エタノール５００ｍＬで抽出処理し、この抽出残渣を粉砕後に沸騰水浴中７０％含水エタノール５００ｍＬで８時間２回抽出処理を行った。この抽出残渣を沸騰水浴中の水５００ｍＬで８時間３回熱水抽出した。この抽出液の１／４を以降の操作に供した。先の熱水抽出液を蒸留水中で透析し、濃縮した後に３倍容の１００％エタノールを攪拌しながら加えて４℃で２４時間放置した。その沈殿画分を遠心分離によって集め凍結乾燥品として１ｇのジオウ熱水抽出物のエタノール沈殿画分を得た。調製操作の流れを図１８に示した。【０１１８】
[[ジオウ熱水抽出物のエタノール沈殿画分に含まれる構成糖の分析]]
上記で調製したジオウ熱水抽出物のエタノール沈殿画分をトリフルオロ酢酸で加水分解後にＴＬＣで展開し、硫酸により検出した。その結果、Ｄ−ガラクトースと同じ移動度を示すほぼ単一のスポットが検出された（図１４）。この結果から、ジオウ熱水抽出画分に含まれる構成糖は主にＤ−ガラクトースであると考えられた。【０１１９】
また、分子量等を測定した結果、ジオウ熱水抽出物のエタノール沈殿画分中の有効成分が、１０００分子以上のＤ−ガラクトースが結合したＤ−ガラクトースホモポリマーであることが分かった。【０１２０】
実施例２
［ジオウ熱水抽出物エタノール沈殿画分とＤ−ガラクトースの血糖低下効果検討］
[[高血糖カイコモデルを用いた検討]]
高血糖カイコモデルは、５齢１日目のカイコに１２質量％グルコース添加飼料を与え、２７℃で６０分間飼育し、それを以下の検討に用いた。【０１２１】
陰性対照として、０．９％生理食塩水を用い、陽性対照として、組み換え型ヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ社）を、０．１％酢酸を含む生理食塩水に溶解させ、３．５ｍｇ／ｍＬ溶液として用いた。【０１２２】
［被検体１］
上記の「ジオウ熱水抽出物のエタノール沈殿画分」の凍結乾燥品を０．９％生理食塩水に溶解し、１ｍｇ／ｍＬ溶液とした。
［被検体２］
Ｄ−ガラクトース（ＷＡＫＯ（和光純薬）社）を、０．９％生理食塩水に溶解し、１ｍｇ／ｍＬ溶液とした。【０１２３】
［体液抽出液］
カイコ体液２０μＬは第一腹肢につけた傷口から採取し、９倍量の０．６Ｎ（規定）過塩素酸と混合してタンパク質を沈殿させた。３０００ｒｐｍ１０分間、遠心分離し体液抽出液を得た。【０１２４】
［糖濃度（血糖値）の測定］
体液中の全ての種類の糖（Ｂ）を合算した糖濃度（血糖値）を評価する方法としてフェノール硫酸法（Hodge et al.）を使用した。体液抽出液を蒸留水で適当な濃度で希釈したもの１００μＬと５％（ｗ／ｖ）フェノール水溶液１００μＬを混合し、濃硫酸５００μＬを加えて激しく攪拌した。室温で２０分間静置した後に４９０ｎｍでの吸光度を測定した。グルコース標準溶液の値から糖濃度（血糖値）を算出した。【０１２５】
［グルコース濃度の測定］
単糖としてのＤ−ガラクトースを投与する場合、フェノール硫酸法ではＤ−ガラクトースの影響がでる可能性があるため、グルコース濃度を評価できるグルコースオキシダーゼ法を使用した。蒸留水で適当な濃度に希釈した検体２０μＬと酵素反応液（０．１２モルＮａ−リン酸緩衝液ｐＨ７．４、グルコースオキシダーゼ４ユニット／ｍＬ、ペルオキシダーゼ３ユニット／ｍＬ、ｏ−ジアニシジン９ｍＭ）４００μＬを混合し、室温で４０分間放置した。その後７０％硫酸１００μＬを加えて激しく攪拌し、５３０ｎｍにおける吸光度を測定した。グルコース標準液の値からグルコース濃度を算出した。【０１２６】
［高血糖カイコへの被検体投与と体液中の糖濃度（血糖値）とグルコース濃度の測定］
生理食塩水、ヒトインスリン及び被検体１（ジオウ熱水抽出物のエタノール沈殿画分）を各々０．０５ｍＬ高血糖カイコに投与し、６時間後に体液を採取して体液中の糖濃度（血糖値）を測定した。それぞれの測定は１群６〜１０頭のカイコを用いて行った。得られた結果を図１５に示す。【０１２７】
また、同様にして、生理食塩水、ヒトインスリン、被検体２（Ｄ−ガラクトース）を各々０．０５ｍＬ高血糖カイコに投与し、体液中のグルコース濃度を測定した。得られた結果を図１６に示す。【０１２８】
＜結果＞
ジオウ熱水抽出物のエタノール沈殿画分を投与した高血糖カイコの血糖濃度は明確に低下した（図１５）。また、ジオウ熱水抽出物のエタノール沈殿画分の主たる構成糖であるＤ−ガラクトースを投与した高血糖カイコのグルコース濃度も明確に低下した（図１６）。これより、Ｄ−ガラクトースホモポリマー及びＤ−ガラクトースが、血糖低下剤として有効であることが分かった。【０１２９】
実施例３
［Ｄ−ガラクトースの血糖低下効果の検討］
[[高血糖マウスモデルを用いた検討]]
ストレプトゾトシン処理された高血糖マウスを使用した。高血糖マウスは、８週齢、雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｊｃｌマウスであり、日本クレア社より購入し、血糖値が２３０ｍｇ／ｍＬ以上であることを確認後に検討に使用した。【０１３０】
陰性対照として、０．９％生理食塩水を用い、被検体は、Ｄ−ガラクトース（ＷＡＫＯ（和光純薬）社）を、０．９％生理食塩水に溶解し２．５ｍｇ／ｍＬ溶液とした。グルコース濃度の測定は、上記と同様に行った。【０１３１】
生理食塩水、被検体（Ｄ−ガラクトース）を各々０．５ｍＬ投与し、６時間後にマウス尻尾にはさみでつけた切り口から血液を採取した。血液２０μＬを用いて血液中のグルコース濃度を測定した。それぞれの測定は１群３匹のマウスを用いて行った。得られた結果を図１７に示す。【０１３２】
＜結果＞
ストレプトゾトシン処理によって高血糖となったマウスにＤ−ガラクトースを投与した場合には、陰性対照に対し血中グルコース濃度が明確に低下していた。このことから、Ｄ−ガラクトースには哺乳動物である高血糖マウスの血糖値を低下させる効果のあることが確認された。【０１３３】
なお、ガラクトース（誘導体）は、前記した通り、傍細胞経路と呼ばれるトランスポーターを介さない経路により傍細胞輸送され、大量に血液内に取り込まれることが知られている（前記文献（１）、（２）参照）。従って、血液中への注射、腸管内部への注射及び経口摂取の何れか１つの投与方法で効果が得られれば、その効果はその他の投与方法でも同様に得られると考えられる。従って、実施例３の結果より、Ｄ−ガラクトースは、高血糖マウスの血糖値を、経口摂取によって低下させると考えられる。【０１３４】
本発明により初めて、Ｄ−ガラクトース及び単離されたＤ−ガラクトースホモポリマーが血糖値を低下させる効果があることが明らかになり、新規糖尿病治療薬を提供できた。Ｄ−ガラクトースという生命活動に必須な糖を有効成分とする点で、従来報告されてきた血糖低下剤とは性格が明らかに異なるものである。その血糖低下効果のメカニズムはまだ明らかとなっていないが、今後更にＤ−ガラクトースによる血糖低下効果の機構を解析することにより、Ｄ−ガラクトース（誘導体）やＤ−ガラクトースホモポリマーの糖尿病治療や予防等における更なる有効利用が計られるものと考えられる。【０１３５】
また、ガラクトースのような生体物質が細胞に作用する場合には、それが細胞表面上の受容体（receptor)タンパク質と結合し、そのシグナルが細胞内に伝達されるからである。従って、ガラクトースが作用する受容体に親和性のある物質であれば、ガラクトースでなくともガラクトース誘導体であれば、ガラクトースと同様に血糖低下作用を示すものが存在し得ることは自明である。【０１３６】
上記したように、ガラクトース誘導体の中から、少なくとも前記工程（ａ’）ないし（ｄ’）を含む工程によって、血糖低下剤がスクリーニング可能であるが、更に、既に血糖低下効果が期待されるガラクトース誘導体にスクリーニング対象が絞られているので、極めて効率的に血糖低下剤がスクリーニングできる。
【産業上の利用可能性】
【０１３７】
本発明の血糖低下剤は安全であり、製剤化、飲食品への添加等に適した性状を有しており、また従来の血糖低下剤と異なる用い方が期待できるため、新たな血糖低下剤として広く利用できるものである。また、飲食品に添加することが容易なので、糖尿病の予防、改善用の機能性食品として広く利用することができる。【０１３８】
本願は、２００８年７月８日に出願した日本の特許出願である特願２００８−１７８４５０に基づくものであり、それらの出願の全ての内容はここに引用し、本発明の明細書の開示として取り込まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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