(57)【要約】  新規の神経突起伸展促進剤を提供することを課題とし、下記一般式１で表される化合物を有効成分とする神経突起伸展剤を提供することにより解決する。【化１】2010087313.tif 000067  一般式１におけるＲ１乃至Ｒ３は、それぞれ独立に、水素原子又は適宜の置換基を表し、Ｚ１は複素環を、また、Ｚ２はＺ１と同じか異なる複素環又は芳香環を表し、それらの複素環及び芳香環は置換基を有していてもよい。ｏは０又は１、２のいずれかである整数を表し、ｐは、０又は１のいずれかである整数を表し、ｏが０又は２のとき、ｐは１であり、ｏが１のとき、ｐは０である。ｏが０の場合、Ｒ１、Ｒ２は存在せず、ｐが０の場合、Ｒ３は存在せず、Ｒ２が結合する炭素とＺ２とは一重結合となる。Ｘｌ−は適宜の対アニオンを表し、ｑは１又は２のいずれかである整数を表す。
2010087313.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式１で表される化合物を有効成分として含有する神経突起伸展促進剤。
【化１】
2010087313.tif 000060
（一般式１におけるＲ１乃至Ｒ３は、それぞれ独立に、水素原子又は適宜の置換基を表し、Ｚ１は複素環を、また、Ｚ２はＺ１と同じか異なる複素環又は芳香環を表し、それらの複素環及び芳香環は置換基を有していてもよい。ｏは０又は１、２のいずれかである整数を表し、ｐは、０又は１のいずれかである整数を表し、ｏが０又は２のとき、ｐは１であり、ｏが１のとき、ｐは０である。ｏが０の場合、Ｒ１、Ｒ２は存在せず、ｐが０の場合、Ｒ３は存在せず、Ｒ２が結合する炭素とＺ２とは一重結合となる。Ｘｌ−は適宜の対アニオンを表し、ｑは１又は２のいずれかである整数を表す。）
【請求項２】
一般式１で表される化合物が、一般式２乃至５のいずれかで表される化合物である請求の範囲第１項記載の神経突起伸展促進剤。
【化２】
2010087313.tif 000061
（一般式２において、Ｒ４乃至Ｒ６は互いに同じか異なる脂肪族炭化水素基を表す。Ｘ２−は適宜の対アニオンを表す。）
【化３】
2010087313.tif 000062
（一般式３において、Ｒ７乃至Ｒ９は互いに同じか異なる脂肪族炭化水素基を表す。Ｘ３−は適宜の対アニオンを表す。）
【化４】
2010087313.tif 000063
（一般式４において、Ｒ１０乃至Ｒ１２は互いに同じか異なる脂肪族炭化水素基を表す。Ｘ４−は適宜の対アニオンを表す。）
【化５】
2010087313.tif 000064
（一般式５において、Ｚ３は複素芳香環を表し、その複素芳香環は置換基を有していてもよい。Ｚ４は芳香環又は複素芳香環を表し、それらの複素芳香環及び芳香環は置換基を有していてもよい。Ｒ１３は脂肪族炭化水素基を表し、その脂肪族炭化水素基は置換基を有していてもよい。Ｒ１４は水素原子又は適宜の置換基を、また、Ｘ５−は適宜の対アニオンを表す。）
【請求項３】
一般式１乃至５のいずれかで表される化合物の対アニオンが、沃素イオン又は塩素イオンである請求の範囲第１項又は第２項記載の神経突起伸展促進剤。
【請求項４】
一般式２で表される化合物が化学式１で表される化合物であり、一般式３で表される化合物が化学式３で表される化合物である請求の範囲第２項記載の神経突起伸展促進剤。
【化６】
2010087313.tif 000065
【化７】
2010087313.tif 000066
【請求項５】
製剤学的に許容される１種又は２種以上の成分を含んでなる請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の神経突起伸展促進剤。
【請求項６】
製剤学的に許容される成分が、水性媒体である請求の範囲第５項記載の神経突起伸展促進剤。
【請求項７】
神経が小脳プルキンエ細胞である請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記載の神経突起伸展促進剤。
【請求項８】
神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、脊髄小脳変性症、脳梗塞、又は運動失調症である請求の範囲第１項乃至第７項のいずれかに記載の神経突起伸展促進剤。
【請求項９】
神経突起伸展促進剤が、神経細胞変性抑制剤、神経突起伸展促進剤、神経細胞保護剤、又は、神経細胞変性に伴う運動失調症改善剤である請求の範囲第１項乃至第８項のいずれかに記載の神経突起伸展促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般式１で表される化合物を有効成分とする神経突起伸展促進剤に関するものである。【０００２】
【化１】
2010087313.tif 000003
【０００３】
一般式１におけるＲ１乃至Ｒ３は、それぞれ独立に、水素原子又は適宜の置換基を表し、Ｚ１は複素環を、また、Ｚ２はＺ１と同じか異なる複素環又は芳香環を表し、それらの複素環及び芳香環は置換基を有していてもよい。ｏは０又は１、２のいずれかである整数を表し、ｐは、０又は１のいずれかである整数を表し、ｏが０又は２のとき、ｐは１であり、ｏが１のとき、ｐは０である。ｏが０の場合、Ｒ１、Ｒ２は存在せず、ｐが０の場合、Ｒ３は存在せず、Ｒ２が結合する炭素とＺ２とは一重結合となる。Ｘｌ−は適宜の対アニオンを表し、ｑは１又は２のいずれかである整数を表す。
【背景技術】
【０００４】
神経変性疾患は系統的な神経細胞の変性、脱落に基づく神経回路網の破綻により引き起こされる病態であり、数多くの難病、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソン症候群、脳血管性認知症、前頭側頭葉型認知症、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、ハンチントン病、脊髄小脳変性症などが知られている。【０００５】
神経変性疾患の原因である神経変性死のメカニズムには多くの分子群が複雑に関与し、それらの発現、機能異常が生じているものと予想される。しかしながら、その分子病態については解明されたものはほとんどなく、有効な神経変性の抑制方法も確立されていない。病因を取り除く治療に加えて重要なのが、神経回路網を再構築させることである。例えば、アミロイドβペプチドの細胞毒性がその一因と考えられているアルツハイマー病では、神経突起（軸索及び樹状突起）の萎縮とシナプスの減少が、神経機能が損なわれる引き金であり、逆に、その引き金が引かれた後でも、変性しきっていない神経細胞や変性を免れて生き残っている神経細胞を活性化して、神経突起を伸展させて、シナプスを回復できれば、神経機能を回復できるといわれている。しかしながら、損傷をうけた末梢神経系の軸索は再生するものの、中枢神経系では軸索は末梢神経を移植するなどの処置をしないと、再生は起こらないといわれている。【０００６】
神経成長因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、以下、「ＮＧＦ」と略記する場合がある。）などの神経栄養因子群に属する蛋白は、神経細胞の分化や生存、シナプスの制御などに関与することが知られているものの、高分子ゆえに血液脳関門を通過し難いなどの点からも、皮下や血管内などの全身投与では、中枢神経の変性に起因する神経変性疾患に対する治療効果があまり期待できない。効果を期待して脳内へ投与するためには、外科的処置が必要となり、患者には、大きな肉体的・精神的負担が伴う。【０００７】
神経変性疾患の臨床症状としては、それぞれの病気により異なるが、軽微なものから重篤なものまで様々であり、代表的なものとしては、例えば、振戦、固縮、無動、寡動、動作緩慢、姿勢反射障害、自律神経障害、突進現象、歩行障害、うつ、記憶障害、筋萎縮、筋力低下、上肢機能障害、構音障害、嚥下障害、呼吸障害、しびれ又は麻痺などが挙げられ、これらはいずれも日常生活を営む上で、大きな障害となっている。【０００８】
アルツハイマー病やパーキンソン病などに代表される神経変性疾患は、神経細胞に変性を来たす重大な疾患であり、これらの疾患やそれに伴う病態や神経機能障害を改善するために、種々の化合物を有効成分とする治療剤が提案されており（例えば、国際公開ＷＯ９７／０３０７０３号パンフレット、特開平１１−２２８４１７号公報、特開２００６−１４３７０８号公報、特開２００６−３２１７３７号公報を参照）、神経突起伸展促進剤なども提案されている（例えば特開２００２−２３４８４１号公報を参照）ものの、効果的な疾患の治療法はまだ見出されていない。【０００９】
医療現場では、患者にとって肉体的・精神的負担の少ない、皮下や血管内などの全身投与により、中枢神経系の神経細胞に作用し、神経細胞体を活性化し、神経突起の萎縮を抑制、乃至、神経突起の伸展を促進させ神経変性に伴う神経機能低下乃至機能障害を改善することが可能な新規神経突起伸展促進剤の開発が切望されている。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、新規な神経突起伸展促進剤を提供することを課題とする。
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究して検索した結果、下記一般式１で表される化合物が優れた神経突起伸展促進作用を有することを見出して本発明を完成した。すなわち、本発明は、下記一般式１で表される化合物を有効成分とする神経突起伸展促進剤を主な構成とする。
【００１２】
【化２】
2010087313.tif 000004
【００１３】
一般式１におけるＲ１乃至Ｒ３は、それぞれ独立に、水素原子又は適宜の置換基を表し、Ｚ１は複素環を、また、Ｚ２はＺ１と同じか異なる複素環又は芳香環を表し、それらの複素環及び芳香環は置換基を有していてもよい。ｏは０又は１、２のいずれかである整数を表し、ｐは、０又は１のいずれかである整数を表し、ｏが０又は２のとき、ｐは１であり、ｏが１のとき、ｐは０である。ｏが０の場合、Ｒ１、Ｒ２は存在せず、ｐが０の場合、Ｒ３は存在せず、Ｒ２が結合する炭素とＺ２とは一重結合となる。Ｘｌ−は適宜の対アニオンを表し、ｑは１又は２のいずれかである整数を表す。
【００１４】
本発明の神経突起伸展促進剤は、経口投与及び非経口的投与の何れの投与経路でも、神経突起の伸展を促進して、神経機能を活性化し、神経の機能障害に伴う種々の症状（例えば、振戦、固縮、無動、寡動、動作緩慢、姿勢反射障害、自律神経障害、突進現象、歩行障害、うつ、記憶障害、筋萎縮、筋力低下、上・下肢機能障害、構音障害、嚥下障害、呼吸障害、しびれ及び麻痺など）を改善することができる。しかも、有効成分である一般式１で表される化合物の安全性は極めて高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明でいう神経突起とは、神経の細胞体から伸びる軸索及び樹状突起をいう。また、神経突起伸展促進作用とは、神経細胞を賦活して軸索及び／又は樹状突起を伸展させる作用をいい、神経突起の萎縮や減少の抑制作用、神経細胞間のシナプス形成の促進作用やシナプスの減少を抑制する作用を含む。【００１６】
本発明の神経突起伸展促進剤は、下記一般式１で表される化合物を有効成分とする。【００１７】
【化３】
2010087313.tif 000005
【００１８】
一般式１におけるＲ１乃至Ｒ３は、それぞれ独立に、水素原子又は適宜の置換基を表し、Ｚ１は複素環を、また、Ｚ２はＺ１と同じか異なる複素環又は芳香環を表し、それらの複素環及び芳香環は置換基を有していてもよい。ｏは０又は１、２のいずれかである整数を表し、ｐは、０又は１のいずれかである整数を表し、ｏが０又は２のとき、ｐは１であり、ｏが１のとき、ｐは０である。ｏが０の場合、Ｒ１、Ｒ２は存在せず、ｐが０の場合、Ｒ３は存在せず、Ｒ２が結合する炭素とＺ２とは一重結合となる。Ｘｌ−は適宜の対アニオンを表し、ｑは１又は２のいずれかである整数を表す。【００１９】
一般式１におけるＸｌ−は適宜の対アニオンを表し、通常、例えば、弗素イオン、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン、過塩素酸イオン、過沃素酸イオン、六弗化燐酸イオン、六弗化アンチモン酸イオン、六弗化錫酸イオン、燐酸イオン、硼弗化水素イオン、四弗硼素酸イオンなどの無機酸アニオンや、チオシアン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、ナフタレンスルホン酸イオン、ナフタレンジスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、アルキルスルホン酸イオン、ベンゼンカルボン酸イオン、アルキルカルボン酸イオン、トリハロアルキルカルボン酸イオン、アルキル硫酸イオン、トリハロアルキル硫酸イオン、ニコチン酸イオン、アスパラギン酸イオンなどの有機酸アニオンから選択される。【００２０】
一般式１で表される化合物としては、具体的には、一般式２乃至４のいずれかで表されるペンタメチン系シアニン色素及び一般式５で表されるジメチン系スチリル色素などの色素化合物
（以下、単に「化合物」という場合がある。）を例示することができる。【００２１】
【化４】
2010087313.tif 000006
一般式２において、Ｒ４乃至Ｒ６は互いに同じか異なる脂肪族炭化水素基を表す。Ｘ２−は適宜の対アニオンを表す。【００２２】
【化５】
2010087313.tif 000007
一般式３において、Ｒ７乃至Ｒ９は互いに同じか異なる脂肪族炭化水素基を表す。Ｘ３−は適宜の対アニオンを表す。【００２３】
【化６】
2010087313.tif 000008
一般式４において、Ｒ１０乃至Ｒ１２は互いに同じか異なる脂肪族炭化水素基を表す。Ｘ４−は適宜の対アニオンを表す。【００２４】
【化７】
2010087313.tif 000009
一般式５において、Ｚ３は複素芳香環を表し、その複素芳香環は置換基を有していてもよい。Ｚ４は芳香環又は複素芳香環を表し、それらの複素芳香環及び芳香環は置換基を有していてもよい。Ｒ１３は脂肪族炭化水素基を表し、その脂肪族炭化水素基は置換基を有していてもよい。Ｒ１４は水素原子又は適宜の置換基を、また、Ｘ５−は適宜の対アニオンを表す。【００２５】
一般式２乃至５におけるＲ４乃至Ｒ１３で表される脂肪族炭化水素基としては、通常、炭素数が１乃至１２であるものが選択され、２乃至１０のものが好ましく、２乃至９のものがより好ましい。なかでも、一般式２で表される化合物のＲ４乃至Ｒ６の脂肪族炭化水素基の炭素数が２乃至１２、又は、一般式３で表される化合物のＲ７乃至Ｒ９の脂肪族炭化水素基の炭素数が４乃至１０の化合物は、神経突起伸展促進作用が強いので、特に望ましい。個々の脂肪族炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、１−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、５−メチルヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基などが挙げられる。また、一般式２乃至５においてＸ２−乃至Ｘ５−で表される適宜の対アニオンは、通常、例えば、弗素イオン、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン、過塩素酸イオン、過沃素酸イオン、六弗化燐酸イオン、六弗化アンチモン酸イオン、六弗化錫酸イオン、燐酸イオン、硼弗化水素イオン、四弗硼素酸イオンなどの無機酸アニオンや、チアシアン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、ナフタレンスルホン酸イオン、ナフタレンジスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、アルキルスルホン酸イオン、ベンゼンカルボン酸イオン、アルキルカルボン酸イオン、トリハロアルキルカルボン酸イオン、アルキル硫酸イオン、トリハロアルキル硫酸イオン、ニコチン酸イオン、アスパラギン酸イオンなどの有機酸アニオンから選択される。【００２６】
一般式２で表される化合物としては、より具体的には、例えば、化学式１で表される化合物（以下、「ＮＫ−９６９４」という場合がある。）、化学式２で表される化合物（以下、「ＮＫ−４」という場合がある。）、一般式２の側鎖のアルキル基（Ｒ４乃至Ｒ６）の炭素数が４の化合物（以下、「ＮＫ−２６」という場合がある。）や一般式２の側鎖のアルキル基（Ｒ４乃至Ｒ６）の炭素数が３の化合物（以下、「ＮＫ−２３４」という場合がある。）を例示することができる。なお、本明細書中のＮＫ番号に対応する化合物の構造は、例えば、『感光色素表』、感光色素研究所発行（１９６９年）にも記載されている。【００２７】
【化８】
2010087313.tif 000010
【００２８】
【化９】
2010087313.tif 000011
【００２９】
一般式３で表される化合物としては、具体的には、例えば、化学式３で表される化合物（以下、「ＮＫ−１５０」という場合がある。）や化学式４で表される化合物（以下、「ＮＫ−１９」という場合がある。）を例示することができる。さらには、ＮＫ−１９の対アニオン（Ｉ−）をＣｌ−に替えた化学式５で表される化合物（以下、「ＮＫ−５３」という場合がある。）も、ＮＫ−１９と同様に有利に利用できる。【００３０】
【化１０】
2010087313.tif 000012
一般式３においてＲ７乃至Ｒ９は炭素数が同一で、炭素数が７乃至９のアルキル基を表し、ｍＸ３−はＩ−又はＣｌ−を表す。【００３１】
【化１１】
2010087313.tif 000013
【００３２】
【化１２】
2010087313.tif 000014
【００３３】
一般式４で表される化合物としては、具体的には、例えば、化学式６で表される化合物（以下、「ＮＫ−１００」という場合がある。）を例示することができる。【００３４】
【化１３】
2010087313.tif 000015
【００３５】
一般式５で表される化合物としては、化学式７乃至９で表される化合物（以下、それぞれ、「ＮＫ−５２８」、「ＮＫ−５５７」、「ＮＫ−１５１６」という場合がある。）を例示することができる。
【化１４】
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【００３６】
【化１５】
2010087313.tif 000017
【００３７】
【化１６】
2010087313.tif 000018
【００３８】
化学式１乃至９のいずれかで表される化合物、ＮＫ−２３４、ＮＫ−２６は、いずれも神経活性化作用、神経突起伸展促進作用に加えて、飢餓、ラジカル、アミロイドβペプチドなどの細胞傷害因子から神経細胞を保護して細胞死や神経突起の萎縮を抑制する作用も有しているので、本発明の神経突起伸展促進剤の有効成分としてより望ましく、その作用効果の強さの点からは、ＮＫ−９６９４（化学式１で表される化合物）、ＮＫ−１５０（化学式３で表される化合物）が望ましい。また、脳梗塞、アルツハイマー病、血管性痴呆症糖などのモデル動物に対する認知障害や運動障害の改善効果の強さ、製剤化の容易さ、安全性などを考慮するとＮＫ−４、ＮＫ−２３４及びＮＫ−２６が望ましく、ＮＫ−４が特に望ましい。【００３９】
本発明の神経突起伸展促進剤の有効成分として使用する一般式１で表される化合物は、その由来や製法に制限はない。【００４０】
本発明の神経突起伸展促進剤は、一般式１で表される化合物、望ましくは、一般式２乃至４のいずれかで表されるペンタメチン系シアニン色素及び／又は一般式５で表されるジメチン系スチリル色素を、１種又は２種以上含有してなる。【００４１】
本発明の神経突起伸展促進剤は、必要に応じて、有効成分である一般式１で表される化合物に加えて、製剤学的に許容される食品分野、化粧品分野、医薬品分野、医薬部外品分野で使用される成分の１種又は２種以上を配合した製剤の形態で提供される。【００４２】
製剤学的に許容される成分としては、例えば、添加剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、安定化剤、界面活性剤、防腐剤（抗菌剤）、香料、増粘剤、抗酸化剤、キレート剤、ビタミン類、アミノ酸類、水性媒体、糖質、水溶性高分子、ｐＨ調整剤、発泡剤、医薬品・医薬部外品・化粧品・食品用の添加剤、医薬用・医薬部外品用の有効成分など例示することができ、これらの成分の１種又は２種以上を適宜組み合わせて配合し、目的とする剤型に応じて、常法により製造すればよい。【００４３】
また、一般式１で表される化合物以外を有効成分とする神経突起伸展促進剤や、神経変性疾患やそれに起因する病態や神経機能障害の治療剤との併用も有利に実施できる。具体的には、例えば、脳血管障害（例えば、脳卒中、脳梗塞（例えば、脳血栓、脳塞栓など）、一過性脳虚血発作、再灌流障害、脳出血（例えば、高血圧性脳内出血、クモ膜下出血など）など）・脳腫瘍（例えば、星状膠細胞腫、脳膿瘍など）・血液量減少性ショック・外傷性ショック・頭部損傷及び／又は脳脊髄外傷（例えば、脳挫傷・貫入・せん断・圧迫・裂傷、分娩時外傷、乳児むち打ち揺さぶり症候群など）に伴う神経機能障害の治療剤、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、パーキンソン症候群、線条体黒質変性症、ハンチントン病、舞踏病−無定位運動症、進行性核上麻痺、びまん性レビー小体病、大脳皮質基底核変性症、アルツハイマー病、老年性認知症、ピック病、前頭側頭葉型認知症、家族性認知症、脊髄小脳変性症（例えば、オリーブ橋小脳萎縮症、晩発性小脳皮質萎縮症、家族性脊髄小脳失調症（例えば、マッカードジョセフ病など）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、家族性痙性対麻痺、フリードライヒ病など）など）の治療剤、運動神経病（例えば、筋萎縮性側索硬化症、家族性筋萎縮性側索硬化症など）の治療剤、脱髄性疾患（例えば、多発性硬化症、汎発硬化症、急性散在性脳脊髄炎、急性小脳炎、横断性脊髄炎、ギラン・バレー症候群など）の治療剤、感染症に伴う脳脊髄疾患（例えば、髄膜炎、インフルエンザ脳症、クロイツフェルト−ヤコブ病、エイズ脳症による認知など）の治療剤、毒物（ヒ素、カドミウム、有機水銀、サリン、ソマン、タブン、ＶＸガスなど）・放射線などによる神経機能障害の治療剤、精神疾患（例えば、神経症、心身症、不安、統合失調症、躁うつ病など）の治療剤、てんかんの治療剤、メージ症候群の治療剤、ジストニアの治療剤、ダウン症の治療剤及び／又は睡眠障害（例えば、過眠、ナルコレプシー、睡眠時無呼吸症候群など）の治療剤、糖尿病の治療剤、糖尿病合併症の治療剤及び／又は高脂血症の治療剤、ドーパミン受容体作動薬（ドーパミン受容体刺激薬）、ドーパミン遊離促進薬（ドーパミン分泌促進薬あるいはドーパミン放出促進薬）、ドーパミン取り込み阻害薬、ドーパミン作用薬、中枢性抗コリン薬、芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素阻害薬（ＤＣＩ）、モノアミン酸化酵素（ＭＡＯ−Ｂ）阻害薬、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害薬、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）補充薬、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬、ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）受容体拮抗薬、ＡＭＰＡ（２−アミノ−３−（メチル−３−ヒドロキシイソオキサゾール−４−イル）プロパン酸）／カイニン酸受容体拮抗薬、ＧＡＢＡ受容体調節薬、アデノシンＡ２Ａ受容体遮断薬、ニコチン受容体調節薬、神経型一酸化窒素合成酵素（ｎ−ＮＯＳ）阻害薬、βアミロイドタンパクの産生、分泌、蓄積、凝集及び／又は沈着抑制薬（例えば、βセクレターゼ阻害薬、γセクレターゼ阻害作用薬、βアミロイドタンパク凝集抑制薬、βアミロイドタンパク分解酵素、βアミロイド用ワクチンなど）、アポトーシス阻害薬、神経分化・再生促進薬、神経栄養因子（例えば、ニューロトロフィン、ＴＧＦ−βスーパーファミリー、ニューロカインファミリー、ＮＧＦなどの増殖因子など）、その他の脳機能賦活薬（例えば、脳代謝賦活薬、脳循環改善薬など）、Ｒｈｏ−キナーゼ阻害薬、利尿薬（例えば、チアジド系利尿薬、ループ利尿薬、カリウム保持性利尿薬など）、β受容体遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬（カルシウム拮抗薬）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、ナトリウムチャネル遮断薬、カリウムチャネル開口薬、抗血小板薬、抗凝固薬、血栓溶解薬、トロンボキサンＡ２合成酵素阻害薬、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−２阻害薬、非ステロイド性抗炎症薬、ステロイド薬、抗酸化薬、ビタミン類、疾患修飾性抗リウマチ薬、サイトカイン、抗サイトカイン薬（例えば、ＴＮＦ阻害薬、ＭＡＰキナーゼ阻害薬など）、性ホルモン又はその誘導体（例えば、プロゲステロン、エストラジオール、安息香酸エストラジオールなど）、副甲状腺ホルモン（例えば、ＰＴＨなど）及びカルシウム受容体拮抗薬などを例示することができる。これらの薬剤は、本発明の有効成分と混合剤の形態で投与してもよいし、個々の製剤を別々に投与することもできる。【００４４】
本発明の抗神経変性疾患剤と併用される神経変性疾患やそれに起因する病態や神経機能障害の治療剤の中で、好ましくは、例えば、脳血管障害（例えば、脳卒中、脳梗塞（例えば、脳血栓、脳塞栓など）、一過性脳虚血発作、脳出血（例えば、高血圧性脳内出血、クモ膜下出血など）など）の治療剤、脳腫瘍の治療剤、脳脊髄外傷（例えば、脳挫傷など）に伴う神経機能障害の治療剤、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、パーキンソン症候群、ハンチントン病、アルツハイマー病、老年性認知症、脊髄小脳変性症など）の治療剤、運動神経病（例えば、筋萎縮性側索硬化症など）の治療剤、脱髄性疾患（例えば、多発性硬化症など）の治療剤、感染症に伴う脳脊髄疾患（例えば、髄膜炎、インフルエンザ脳症、クロイツフェルト−ヤコブ病、エイズ脳症による認知症など）の治療剤、精神疾患（例えば、神経症、心身症、不安、統合失調症、躁うつ病など）の治療剤、てんかんの治療剤、ジストニアの治療剤、糖尿病の治療剤、糖尿病合併症の治療剤及び／又は高脂血症の治療剤、ドーパミン受容体作動薬、ドーパミン遊離促進薬、ドーパミン取り込み阻害薬、ドーパミン作用薬、中枢性抗コリン薬、芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素阻害薬（ＤＣＩ）、モノアミン酸化酵素（ＭＡＯ−Ｂ）阻害薬、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害薬、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）補充薬、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬、ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）受容体拮抗薬、ＡＭＰＡ（２−アミノ−３−（メチル−３−ヒドロキシイソオキサゾール−４−イル）プロパン酸）／カイニン酸受容体拮抗薬、ＧＡＢＡＡ受容体調節薬（例えば、ＧＡＢＡＡ受容体作動薬など）、ＧＡＢＡＢ受容体調節薬、アデノシンＡ２Ａ受容体遮断薬、βセクレターゼ阻害薬、βアミロイドタンパク凝集抑制薬、アポトーシス阻害薬、神経分化・再生促進薬、神経栄養因子（例えば、ニューロトロフィン、ＴＧＦ−βスーパーファミリー、ニューロカインファミリー、増殖因子など）、その他の脳機能賦活薬（例えば、脳代謝賦活薬、脳循環改善薬など）、Ｒｈｏ−キナーゼ阻害薬、利尿薬（例えば、チアジド系利尿薬、ループ利尿薬、カリウム保持性利尿薬など）、β受容体遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬（カルシウム拮抗薬）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、ナトリウムチャネル遮断薬、カリウムチャネル開口薬、抗血小板薬、抗凝固薬、血栓溶解薬、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−２阻害薬、非ステロイド性抗炎症薬、ステロイド薬、抗酸化薬及びビタミン類が挙げられ、より好ましくは、例えば、脳血管障害（例えば、脳卒中、脳梗塞など）の治療剤、脳脊髄外傷（例えば、脳挫傷など）に伴う神経機能障害の治療剤、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、パーキンソン症候群、ハンチントン病、アルツハイマー病、老年性認知症など）の治療剤、筋萎縮性側索硬化症の治療剤、多発性硬化症の治療剤、精神疾患（例えば、神経症、心身症、不安、統合失調症、躁うつ病など）の治療剤、てんかんの治療剤及び／又はジストニアの治療剤、糖尿病の治療剤、糖尿病合併症の治療剤及び／又は高脂血症の治療剤、ドーパミン受容体作動薬、���ーパミン遊離促進薬、ドーパミン取り込み阻害薬、ドーパミン作用薬、中枢性抗コリン薬、芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素阻害薬（ＤＣＩ）、モノアミン酸化酵素（ＭＡＯ−Ｂ）阻害薬、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害薬、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）補充薬、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬、ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）受容体拮抗薬、βセクレターゼ阻害薬、βアミロイドタンパク凝集抑制薬、アポトーシス阻害薬、神経分化・再生促進薬、神経栄養因子（例えば、ＮＧＦなどのニューロトロフィン、ＴＧＦ−βスーパーファミリー、ニューロカインファミリー、増殖因子など）、その他の脳機能賦活薬（例えば、脳代謝賦活薬、脳循環改善薬など）、β受容体遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬（カルシウム拮抗薬）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、抗血小板薬、抗凝固薬及び血栓溶解薬が挙げられ、とりわけ好ましくは、例えば、脳血管障害（例えば、脳卒中、脳梗塞など）の治療剤、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、パーキンソン症候群、ハンチントン病、アルツハイマー病など）の治療剤、筋萎縮性側索硬化症の治療剤、多発性硬化症の治療剤、てんかんの治療剤及び／又は糖尿病合併症の治療剤、ドーパミン受容体作動薬、ドーパミン遊離促進薬、ドーパミン取り込み阻害薬、ドーパミン作用薬、中枢性抗コリン薬、芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素阻害薬（ＤＣＩ）、モノアミン酸化酵素（ＭＡＯ−Ｂ）阻害薬、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害薬、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）補充薬、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬、神経栄養因子及びその他の脳機能賦活薬が挙げられる。中でも、ＮＧＦは、本発明で使用する一般式１で表される化合物の、神経突起伸展促進作用が効果的に増強されるので望ましい。【００４５】
本発明の神経突起伸展促進剤は、通常、非経口用の注射用の製剤などの形態で提供される。また、非経口投与が困難な場合には、経口用の製剤の形態で使用する場合もある。有効成分である一般式１で表される化合物は、対象とする注射用の製剤や経口投与用の製剤の組成やその使用目的を勘案して、原料の段階から製品が完成するまでの工程で配合すればよい。その方法としては、例えば、混和、混捏、溶解、融解、分散、懸濁、乳化、逆ミセル化、浸透、晶出、散布、塗布、付着、噴霧、被覆（コーティング）、注入、浸漬、固化、担持などの１種又は２種以上の方法が適宜に選ばれる。【００４６】
本発明の神経突起伸展促進剤は、その形状を問わず、経口投与用の製剤の場合、対象となる疾患や症状などに応じて、例えば、溶液、シラップ、マスキット、ペースト、粉末、固状、顆粒、錠剤などの何れの形状であってもよく、そのままで、又は、必要に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤、カプセル剤など各種形状に成型して使用することも随意である。【００４７】
注射用製剤などの非経口用の製剤の場合、対象となる疾患や症状などに応じて、通常、パイロジェンを含まない水性媒体に溶解して、皮内、皮下、筋肉内、体腔内（胸腔内、腹腔内など）、血管内又は脳内（脊髄内を含む）へ投与されるので、製剤の形態としては、乾燥製剤であってもよく、液剤であってもよい。乾燥製剤の場合は、使用時に、注射用の精製水、生理食塩水、ブドウ糖液などの水性媒体に溶解して使用すればよい。液剤の場合は、そのまま投与してもよく、輸液や灌流液などに添加して使用してもよい。また、溶媒への溶解性や水性媒体への溶解性に問題のある場合や、徐放性の製剤を調製する場合には、両親媒性溶媒、油性基材や乳化剤などを使用して、有効成分の溶媒への溶解性を高めることも随意である。【００４８】
本発明でいう水性媒体とは、水を必須の要素とし、必要に応じて、これに、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノールなどのアルコール類、アセトンなどのケトン類、ジエチルエーテルなどのエーテル類、ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」と略記する場合がある。）などの含硫化合物をはじめとする親水性有機溶剤の１又は複数を配合してなる水性媒体一般を意味する。この発明による液剤における水性溶剤としては、注射用精製水、生理食塩、リンゲル液など、を単独で用いるか、あるいは、注射用精製水と、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ジエチルエーテル、ＤＭＳＯなどの生理学的に許容される親水性有機溶剤との混液を用いるのが望ましい。【００４９】
斯かる液剤の場合、使用する一般式１で表される化合物によっては、溶存酸素などにより不安定になる場合があるので、その場合は、例えば、該化合物溶液の溶存酸素濃度を低減させればよい。このような液状組成物は、通常、該化合物を水性媒体に溶解する工程と、該水性媒体をしてその常温常圧の大気環境下における酸素濃度を下回らせる工程とを経由する方法により調製することができる。これらの化合物を水性媒体に溶解するには、例えば、所定の量の化合物を適量の水性媒体へ添加し、必要に応じて、加熱・攪拌しながら溶解させた後、必要に応じて、化合物の濃度が所定のレベルになるまで水性媒体を追加すればよい。【００５０】
水性媒体の溶存酸素濃度を、常温常圧の大気環境下における濃度より低くするには、例えば、該化合物溶液を減圧下で調製し、保存するか、該化合物溶液に溶存する酸素を別の気体で置換するか、あるいは、該化合物溶液を脱酸素剤へ接触させる方法が好適である。液状組成物に溶解する酸素を別の気体で置換するには、液状組成物中で、例えば、窒素などの比較的不活性な気体か、あるいは、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノンなどの希ガスをバブリングさせればよい。脱酸素剤を用いて酸素濃度を下げるには、液状組成物へ、例えば、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ステアリン酸エステル、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、アルファチオグリセリン、エデト酸ナトリウム、塩酸システイン、クエン酸、大豆レシチン、チオグリコール酸ナトウム、チオリンゴ酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ブチルヒドロキシアニソールなどを適量添加すればよい。これらの方法は、化合物溶液に適用しても、化合物を溶解する前の水性媒体へ適用してもよい。この場合の水性媒体に溶存する酸素の濃度は、通常、０．４ｐｐｍ以下、望ましくは、０．１ｐｐｍ以下とすればよい。【００５１】
斯くして得られた一般式１で表される化合物の溶液は、酸素を遮断し得る、用途に応じた適宜の容器へ封入した状態で保存すればよい。容器の材質としては、原理上、液状組成物を保持することができ、かつ、酸素を実質的に遮断し得るものであるかぎり、特に制限がないが、褐色ビンや褐色のアンプルのような遮光性の容器が望ましい。用途にもよるけれども、通常、ガラスアンプル、バイアル瓶などの容器へ液状組成物を分注し、封止した後、高圧滅菌などにより滅菌する。【００５２】
また、本発明の神経突起伸展促進剤は、注射剤以外にも、経口剤、ハップ剤や吸飲噴霧剤などの形態で使用することもでき、皮下などの体内に埋め込む徐放製剤の形態で使用することもできる。また、神経変性疾患を発症したペットをはじめとするヒト以外の動物の治療や、神経変性症に伴う病態や神経機能障害の予防剤乃至治療剤として使用することも随意である。【００５３】
このようにして製造される本発明の神経突起伸展促進剤は、長期間連用しても、重篤な副作用もなく安全な製剤である。【００５４】
本発明の神経突起伸展促進剤の、一日当たりの投与量は、所期の作用・効果が得られる量であれば特に制限はなく、通常、皮下乃至腹腔内投与の場合、一般式１で表される化合物を合計で、０．０１ｍｇ／ｋｇ・体重／日以上が望ましく、０．１乃至２０ｍｇ／ｋｇ・体重／日がより望ましく、０．５乃至５ｍｇ／ｋｇ・体重／日が特に望ましい。５０ｍｇ／ｋｇ・体重／日以上投与しても、その投与量に見合うほどの効果の増強は認められない場合がある。なお、経口投与の場合には、本発明の神経突起伸展促進剤の有効成分である一般式１で表される化合物は、一般に消化管からの吸収率が低いことを勘案して、皮下投与の場合よりも高い投与量を設定する必要がある。【００５５】
本発明の神経突起伸展促進剤は、神経突起の伸展促進作用に加えて、脳や神経細胞を障害因子から保護して変性を抑制すると共に、神経細胞を活性化し、神経突起の萎縮の抑制、神経細胞の生存延長や変性を抑制することもできるので、神経変性疾患、とりわけ、中枢神経の変性に起因する疾患を治療することができる。神経変性疾患とは、神経細胞（中枢神経（例えば、脳神経、脊髄神経など）及び／又は末梢神経（例えば、自律神経系（例えば、交感神経、副交感神経など）、運動神経系、知覚神経系））の変性を伴う疾患全てを包含し、その病因によって限定されるものではない。具体的には、一般的に神経変性疾患とされている疾患であればよく、例えば、パーキンソン病、パーキンソン症候群、線条体黒質変性症、ハンチントン病、舞踏病−無定位運動症、進行性核上麻痺、びまん性レビー小体病、大脳皮質基底核変性症、アルツハイマー病、老年性認知症、ピック病、前頭側頭葉型認知症、家族性認知症、脊髄小脳変性症（例えば、オリーブ橋小脳萎縮症、晩発性小脳皮質萎縮症、家族性脊髄小脳失調症（例えば、マッカードジョセフ病など）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、家族性痙性対麻痺、フリードライヒ病など）、運動神経病（例えば、筋萎縮性側索硬化症、家族性筋萎縮性側索硬化症など）、脱髄性疾患（例えば、多発性硬化症、汎発硬化症、急性散在性脳脊髄炎、急性小脳炎、横断性脊髄炎、ギラン・バレー症候群など）、代謝性脳疾患、先天性及び遺伝性疾患（神経系リソソーム蓄積症など）などだけでなく、脳血管障害（例えば、脳卒中、脳梗塞（例えば、脳血栓、脳塞栓など）、一過性脳虚血発作、再灌流障害、脳出血（例えば、高血圧性脳内出血、クモ膜下出血など）など）・脳腫瘍（例えば、星状膠細胞腫、脳膿瘍など）・血液量減少性ショック・外傷性ショック・頭部損傷及び／又は脳脊髄外傷（例えば、脳挫傷・貫入・せん断・圧迫・裂傷、分娩時外傷、乳児むち打ち揺さぶり症候群など）に伴う神経機能障害、感染症に伴う脳脊髄疾患（例えば、髄膜炎、インフルエンザ脳症、クロイツフェルト−ヤコブ病、エイズ脳症による認知症など）、毒物（ヒ素、カドミウム、有機水銀、サリン、ソマン、タブン、ＶＸガスなど）・放射線などによる神経機能障害、精神疾患（例えば、神経症、心身症、不安、統合失調症、躁うつ病など）、てんかん、メージ症候群、ジストニア、ダウン症、睡眠障害（例えば、過眠、ナルコレプシー、睡眠時無呼吸症候群など）なども含まれる。【００５６】
本発明の神経突起伸展促進剤の対象として好ましい神経変性疾患としては、例えば、パーキンソン病、パーキンソン症候群、ハンチントン病、アルツハイマー病、老年性認知症、脊髄小脳変性症、筋萎縮性側索硬化症、脱髄性疾患（例えば、多発性硬化症など）、脳血管障害（例えば、脳卒中、脳梗塞（例えば、脳血栓、脳塞栓など）、一過性脳虚血発作、脳出血（例えば、高血圧性脳内出血、クモ膜下出血など）など）・脳腫瘍・外傷性ショック・頭部損傷及び／又は脳脊髄外傷（例えば、脳挫傷など）に伴う神経機能障害、感染症に伴う脳脊髄疾患（例えば、髄膜炎、インフルエンザ脳症、クロイツフェルト−ヤコブ病、エイズ脳症による認知症など）、てんかんなどの中枢神経系の神経変性に由来する疾患であり、より好ましくは、例えば、パーキンソン病、パーキンソン症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症に伴う神経機能障害、感染症に伴う脳脊髄疾患（例えば、髄膜炎、インフルエンザ脳症、クロイツフェルト−ヤコブ病、エイズ脳症による認知症など）、てんかんなどであり、特に好ましくは、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病に伴う神経機能障害などである。【００５７】
本発明の神経突起伸展促進剤は、神経細胞を活性化し、神経突起を伸展させ、シナプスの形成を促進するなどにより、神経機能障害をも治療することができる。対象となる神経機能障害とは、神経機能の障害であればどのようなものであってもよいが、例えば、認知機能障害、意識障害、両側性四肢麻痺、反対側片麻痺、交代性片麻痺、感覚障害、一過性失明（例えば、一過性黒内障など）、同名性半盲、めまい、眼振、複視、失語、耳鳴、昏睡などが挙げられる。特に好ましくは、前記神経変性疾患に伴うこれらの神経機能障害などが対象となる。前記の神経変性疾患に伴う神経機能障害、例えば、脳梗塞に伴う神経機能障害は、血管閉塞部位により様々であり、また障害されるレベルによっても症状が異なるが、主に上記の神経機能障害が見られる。また、脳梗塞における神経機能障害は、神経機能障害を検出する当技術分野で公知の様々な診断試験によってその有無を判断してもよい。該診断試験の具体的な例としては、例えば、アルツハイマー病などによる記憶や認知機能障害の評価に使用されている認知機能スコア（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｓｃａｌｅ−ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｐａｒｔ；ＡＤＡＳ−ｃｏｇ）、臨床症状改善スコア（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈａｎｇｅ；ＡＤＣＳ−ＣＧＩＣ）、ミニ精神状態試験（Ｍｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｅ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ；ＭＭＳＥ）、長谷川式評価法などをあげることができ、さらには、グラスゴーアウトカムスケール（Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  Ｓｃａｌｅ：ＧＯＳ）、グラスゴーコーマスケール（Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｃｏｍａ  Ｓｃａｌｅ：ＧＣＳ）、ランキンスケール（Ｒａｎｋｉｎ  Ｓｃａｌｅ：ＲＳ）、改変ランキンスケール（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｒａｎｋｉｎ  Ｓｃａｌｅ：ｍＲＳ）、能力障害関連スケール（Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ：ＤＲＳ）、及び、ＮＩＨ卒中スケール（ＮＩＨ  Ｓｔｒｏｋｅ  Ｓｃａｌｅ：ＮＩＨＳＳ）などの公知の方法を用いて行うことができる。これらの神経機能障害を検出する診断試験は、物理的な脳の異常を検出する試験方法、例えば、ＣＴスキャンや頭蓋内圧の測定などと適宜組み合わせておこなってもよい。【００５８】
したがって、本発明の神経突起伸展促進剤は、神経細胞保護剤、神経細胞活性化剤、プルキンエ細胞変性・脱落抑制剤、神経変性疾患やそれに伴う病態の治療剤、神経機能障害治療剤などとして有利に使用することができる。本発明でいう神経変性疾患や神経機能障害の治療とは、神経変性に起因する病態や機能障害を治癒の方向へ導く、いわゆる治療に加え、悪化を抑制し病態の進行をとどめる進展防止、さらには疾患の発症そのものの予防も含む。【００５９】
以下、実験により本発明をさらに詳細に説明する。【００６０】
＜実験１：神経突起に及ぼすペンタメチン系シアニン色素及びジメチン系スチリル色素の影響＞
ペンタメチン系シアニン色素及びジメチン系スチリル色素を用いて、これらの色素に神経突起伸展作用があるかどうかを検討した。すなわち、表１に示す化学式２、化学式４乃至９で表される化合物に加えて、下記化学式１０乃至２４１で表される２３２種類（合計２３９種類）の化合物について、以下に示す評価方法により、神経突起伸展促進作用の有無を調べた結果を表１に示す。なお、下記試験において、各々の判定基準よりも低い効果しか認められなかった場合、表１では空欄とした。【００６１】
【化１７】
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【００６２】
【化１８】
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【００６３】
【化１９】
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【００６４】
【化２０】
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【００６５】
【化２１】
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【００６６】
【化２２】
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【００６７】
【化２３】
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【００６８】
【化２４】
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【００６９】
【化１５】
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【００７０】
【化２６】
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【００７１】
【化２７】
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【００７２】
【化２８】
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【００７３】
【化２９】
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【００７４】
【化３０】
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【００７５】
【化３１】
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【００７６】
【化３２】
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【００７７】
【化３３】
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【００７８】
【化３４】
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【００７９】
【化３５】
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【００８０】
【化３６】
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【００８１】
【化３７】
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【００８２】
【化３８】
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【００８３】
【化３９】
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【００８４】
＜試験試料＞
表１に示す２３９種類の化合物は、水に難溶性のものが多いため、ＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ社販売、カタログ番号「Ｄ８４１８」）に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した後、Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社販売、製品番号「ＬＬＧ０２５ＳＳ」、ＤＭＳＯ耐性）で膜ろ過し、遮光して２５℃で保存した。使用時には、１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地（日水製薬）で２００倍以上に希釈して試験試料を調製し、試験に供した（表中のＮＫ番号に対応する化合物の構造は、『感光色素表』、感光色素研究所発行（１９６９年）参照）。これらの化合物は、いずれも株式会社林原生物化学研究所で合成したものを使用した。【００８５】
＜神経突起伸展促進作用の評価法＞
ヒトの神経突起伸展促進作用を検討するために好適なモデルとされているラット副腎褐色細胞腫由来のＰＣ−１２細胞のＮＧＦ（神経増殖因子）高感受性株（以下、「ＰＣ−１２ＨＳ細胞」という。ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手）を、予めコラーゲンコートした９６ウエルマイクロプレートに５×１０３個／ウエルになるように１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈し、１００μｌ／ウエルで播種した。２４時間後に、Ｄ−ＭＥＭ（１０容積％ＦＢＳ）で希釈して４００ｎｇ／ｍｌに調整した各試験試料５０μｌ／ウエルと、２０ｎｇ／ｍｌＮＧＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社販売、マウス由来、終濃度５ｎｇ／ｍｌ）含有Ｄ−ＭＥＭ培地（１０容積％ＦＢＳ）５０μｌ／ウエルとを加えて、３日間培養した。培養３日目に１０容積％グルタルアルデヒドで室温２０分間固定した。対照として１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地のみで３日間培養したＰＣ１２−ＨＳ細胞をグルタルアルデヒドで固定した。固定した細胞を、顕微鏡下で観察し、神経突起伸展の有無を評価し、神経突起伸展の見られた細胞の割合が３０％以上の場合を強い神経突起伸展促進作用ありと判定して、表１に○を付した。なお、神経突起伸展の見られた細胞の割合（％）は、顕微鏡下で、一視野に約１００個の細胞を含む倍率で細胞を観察し、細胞体の長径の２倍以上の神経突起を有する細胞数をカウントし、同一視野内にある全細胞数で除し、１００倍して求めた。また、この実験系にＮＧＦのみを添加（５ｎｇ／ｍｌ）したときの神経突起伸展の見られた細胞の割合は５％程度であった。【００８６】
【表１】
2010087313.tif 000042
【００８７】
表１の結果から明らかなように、試験した２３９種の化合物のうち、５６種類の化合物で、神経突起伸展の見られた細胞の割合が３０％以上となったので、これらの化合物には強い神経突起伸展促進作用があると判断した。以上の結果は、表１に示す強い神経突起伸展促進作用を有する化合物は、いずれも、神経突起伸展促進剤として有用であり、ヒトの神経変性疾患及びそれに伴う病態や神経機能障害の治療剤として利用できることを物語っている。【００８８】
＜実験２：色素化合物の濃度の神経突起伸展に及ぼす影響＞
実験１で、強い神経突起伸展促進作用があると判定した化合物のうちＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００、及び、ＮＫ−５５７について、その濃度が、ＰＣ１２−ＨＳ細胞の神経突起伸展に及ぼす影響を、実験１と同じ方法を用いて調べた。すなわち、培地中の化合物の終濃度が、表２に示す濃度となるように、ＮＫ−４、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００、ＮＫ−５５７のいずれかを加えて培養を継続し、細胞をグルタルアルデヒドで固定した。一視野に約１００個の細胞を含む倍率で顕微鏡観察し、全細胞数に対する神経突起伸展の見られた細胞の割合（％）を求めた結果を表２に示す。【００８９】
【表２】
2010087313.tif 000043
【００９０】
表２の結果から明らかなように、各化合物の濃度依存的に神経突起の伸展の見られる細胞の割合が増加した。この結果は、これらの化合物に、濃度依存的な神経突起伸展促進作用があること
を物語っている。また、試験に使用した５種類の化合物の中で、ＮＫ−１００を使用した場合は、神経突起の伸展の認められた細胞の割合が、濃度が２００ｎｇ／ｍｌのとき３６±２％、１６００ｎｇ／ｍｌのとき８９±６％となって、他の４種類の化合物を使用した場合よりも、低濃度から高濃度まで、強い神経突起伸展促進作用を示した。【００９１】
＜実験３：ＮＫ−１９類縁体の神経突起伸展促進作用＞
上記実験で、神経突起伸展促進作用が確認されたＮＫ−１９について、その類縁体にも同様の作用があることを確認する試験をおこなった。すなわち、下記一般式３で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が１乃至１２である化合物を合成（株式会社林原生物化学研究所合成）し、実験１と同様に、ＰＣ−１２ＨＳ細胞に対する神経突起伸展促進作用の強さを、伸展突起伸展の認められる細胞の割合を指標にして調べた。表３に示すＮＫ−１９を含む、ＮＫ−１９の類縁体１２種類の化合物を合成し、各々ＤＭＳＯに５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。この溶液を１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈して、化合物の濃度が、２μｇ／ｍｌに希釈して試験試料溶液を調製した。また、ＮＫ−２４及びＮＫ−１９については、その対アニオンをＩ−からＣｌ−に替えた化合物（ＮＫ−５６及びＮＫ−５３）も、ＤＭＳＯに５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。これらの溶液を１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈して、化合物の濃度を、各々２μｇ／ｍｌに希釈して試験試料溶液を調製した。【００９２】
＜神経突起伸展促進作用の評価＞
実験１と同様に、ＰＣ１２−ＨＳ細胞を、予めコラーゲンコートした９６ウエルマイクロプレートに５´１０３個／ウエルになるように１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈し、１００μｌ／ウエルで播種した。２４時間後に、化合物の濃度を２μｇ／ｍｌに調整した各試験試料溶液５０μｌ／ウエルとＮＧＦ（終濃度５ｎｇ／ｍｌ）５０μｌ／ウエルとを添加し、培養３日目に１０容積％グルタルアルデヒドで室温２０分間固定した。対照として、ＰＣ１２−ＨＳ細胞を１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地のみで３日間培養し、細胞をグルタルアルデヒドで固定した。固定した細胞を、顕微鏡下で観察し、実験１の場合と同じ方法で細胞をカウントして、神経突起伸展の見られた細胞の割合（％）を求めた。結果を表３に併せて示す。なお、試験は、各試験試料溶液につき、トリプレットで２回実施し、その平均を求めた。また、この実験系にＮＧＦのみを添加（５ｎｇ／ｍｌ）したときの神経突起伸展の見られた細胞の割合は５％程度であった。【００９３】
【化４０】
2010087313.tif 000044
一般式３においてＲ７乃至Ｒ９は炭素数が同一で、炭素数が７乃至９のアルキル基を表し、ｍＸ３−はＩ−又はＣｌ−を表す。【００９４】
【表３】
2010087313.tif 000045
【００９５】
表３から明らかなように、側鎖のアルキル基の炭素数が３乃至１２を添加した場合には、ＮＧＦを単独で添加した場合に比して、神経突起伸展の見られた細胞の割合が増加し、３乃至１０のものではさらに増加し、５乃至１０のもので、最も増加した。また、ＮＫ−２４とＮＫ−５６、或いは、ＮＫ−１９とＮＫ−５３とを比較すると、何れの場合にも、神経突起伸展の見られた細胞の割合は、ほぼ同じなのであった。【００９６】
以上の実験結果は、ＮＫ−１９類縁体では、その側鎖のアルキル基の炭素数が３乃至１２の化合物が神経突起伸展促進作用を有し、３乃至１０でその作用は強くなり、５乃至１０のもので、最も強くなることから、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１５０などの一般式３で表される構造を有し、側鎖のアルキル基の炭素数が３乃至１０個の化合物は、神経突起伸展促進剤として有用であり、アルツハイマー病や小脳失調症をはじめとする神経変性疾患治療剤として利用できることを物語っている。また、ＮＫ−１９類縁体の持つ神経突起伸展促進作用は、対アニオンの種類による差はないと判断した。【００９７】
＜実験４：ＮＫ−４類縁体の神経突起伸展促進作用＞
実験３と同様に、ＮＫ−４の類縁体に同様の作用効果があることを確認するために、下記一般式２で表される化合物において、側鎖のアルキル基（Ｒ４乃至Ｒ６）の炭素数が２乃至８で、対アニオンがＩ−である７種類の化合物を合成し、実験３と同様に、ＰＣ１２−ＨＳ細胞に対する細胞増殖促進作用、及び、神経突起伸展促進作用の強さを調べた。すなわち、ＮＫ−４に加えて、表４に示すＮＫ−２３４、ＮＫ−２６、ＮＫ−９８１５、ＮＫ−９６９４、ＮＫ−２８及びＮＫ−１４７の７種類の化合物を、各々ＤＭＳＯに５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。この溶液をそれぞれ化合物の終濃度が表４又は５に示す濃度となるように、１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭで希釈し試験試料溶液を調製した。また、ＮＫ−１９の類縁体ＮＫ−１３、ＮＫ−３９２、ＮＫ−１９及びＮＫ−１５０をＤＭＳＯに５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、化合物の濃度が表４又は５に示す濃度となるように１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭで希釈し、試験試料溶液を調製した。なお、試験は、いずれも、各試験試料溶液につきトリプレットで２回実施し、その平均を求めた。細胞増殖促進作用の結果を表４に、神経突起伸展促進作用の結果を表５にそれぞれ併せて示す。【００９８】
【化４１】
2010087313.tif 000046
一般式２においてＲ４乃至Ｒ６は炭素数が同一で、炭素数が１乃至１２のアルキル基を表し、Ｘ２はＩ−で、ｍは２を表す。【００９９】
【表４】
2010087313.tif 000047
【０１００】
【表５】
2010087313.tif 000048
【０１０１】
表４及び５の結果から明らかなように、一般式２で表されるＮＫ−４類縁体は、側鎖のアルキル基の炭素数が３乃至８化合物で、ＮＫ−４と同など乃至高い細胞増殖及び神経突起伸展の促進作用が認められ、化合物の濃度８０ｎｇ／ｍｌで比較すると、細胞増殖促進作用は側鎖のアルキル基の炭素数が４乃至６の化合物で特に強い作用が認められた。神経突起進展促進作用は側鎖のアルキル基の炭素数が４及び５の化合物で強い活性の発現が認められた。また、一般式３で表される構造を有し、側鎖のアルキル基の炭素数が２乃至８のである化合物、とりわけ、一般式３で表され側鎖のアルキル基の炭素数が６乃至８であるＮＫ−１９類縁体化合物は強い細胞増殖及び神経突起伸展の促進活性を示すことが明らかになった。【０１０２】
実験１乃至４の結果は、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１５０などの一般式３で表される構造を有し、側鎖のアルキル基の炭素数が３乃至１０の化合物と同様に、ＮＫ−２６、ＮＫ−９８１５、ＮＫ−９６９４をはじめとする一般式２で表される構造を有し、側鎖のアルキル基の炭素数が２乃至８個の化合物は、神経突起伸展促進剤として有用であり、これらは、アルツハイマー病、小脳失調症、脳梗塞はじめとする神経変性症の治療剤として有用であることを物語っている。【０１０３】
＜実験５：小脳変性運動失調症ハムスターの行動及び脳組織に及ぼすＮＫ−４投与の影響＞
実験１乃至４で、ＮＫ−４やその類縁体が、神経突起伸展促進剤として利用でき、神経変性疾患治療剤として利用できることが確認されたので、ヒトの神経変性疾患（脊髄小脳変性症など）のモデル動物として好適な小脳変性運動失調症（以下、「小脳失調症」という。）ハムスター（以下、「小脳失調症ハムスター」という）を使用して、その行動及び脳組織に及ぼすＮＫ−４投与の影響を調べた。すなわち、生後３週齢以降に小脳のプルキンエ細胞の脱落が認められ、それに引き続いて、７週齢以降に運動失調と、小脳失調症を自然発症することが知られている自然発症遺伝子突然変異（Ｎｎａ１抑制）ハムスター（Ａｋｉｔａ  Ｋ．など、『Ｊ．Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ』、第２１巻、第１乃至１１頁（２００７年）参照）、株式会社林原生物化学研究所で飼育）２５匹を、表６に示す試験群１乃至５に、各群５匹を無作為に割り付けた。試験群１のハムスターには、小脳失調症発症前（３週齢）から、ＰＢＳを１０ｍｌ／ｋｇ／日投与した。試験群２乃至４のハムスターには、小脳失調症発症前（３週齢）から、ＮＫ−４を、２０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ又は５００μｇ／ｋｇ／日投与した。試験群５のハムスターには、神経細胞栄養因子として知られるインスリン様栄養因子−１（Ａｓｓａｙｐｒｏ社販売、商品名「ＩＧＦ−１、ｈｕｍａｎ」、ヒト由来、以下、「ＩＧＦ−１」と略記する。）を２５μｇ／ｋｇ／日投与した。これらの投与成分は、１日１回１０週齢まで、毎日腹腔内に投与した。小脳失調症の症状の程度と、ＮＫ−４によるその症状の改善効果を、後述するロタロッド試験、斜面耐久試験を週１回行って、ハムスターの運動協調性の改善を指標に評価した。さらに、１０週齢で、ハムスターの転倒する回数を測定後、脳を摘出し、組織学的評価を行い、併せて、血中及び脳脊髄液（ＣＳＦ）中のグルタミン酸濃度を測定した。試験群６として、試験群１乃至５で使用した小脳失調症ハムスターと同一週齢の正常ハムスター５匹に、小脳失調症発症前（３週齢）から、ＰＢＳを１０ｍｌ／ｋｇ／日を、１日１回１０週齢まで、毎日腹腔内投与して、小脳失調症ハムスターと同じ試験を行った。【０１０４】
＜ロタロッド試験＞
ハムスターが、ロタロッドの回転にあわせて歩行運動し、ロタロッド上に留まるために行う運動の継続時間を運動協調性の指標とし使用した。すなわち、ハムスターを一定速度（６ｒｐｍ）で回転するロタロッド装置（株式会社林原生物化学研究所製造、ロタロッドの直径６０ｍｍ）に乗せ、ロタロッドから落下するまでの時間を測定した（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚなど、『Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ』、第９５号、第１２５３乃至１２５８頁（１９９８年）参照）。試験は、１匹のハムスターについて６回行い、最初から５回は、回転運動に馴化させるための予備運動試験とし、６回目の試験で、ロタロッドから落下するまでの時間（以下、「落下時間」という）を計測して、各群５匹の平均を求めた。結果を表６に示す。なお、落下時間は１８０秒まで計測した。さらに、この結果に基づき、小脳失調症ハムスターにＰＢＳを投与した場合（試験群１）の週齢と落下時間の関係を示すグラフを作成し、小脳失調症ハムスターにＮＫ−４（試験群２乃至４）又はＩＧＦ−１（試験群５）を投与した時の、５週齢以降（ＮＫ−４又はＩＧＦ−１投与２週間以降）について、各試験群の各週齢のハムスターの落下時間が、試験群１のハムスターの何週齢の落下時間と同じになるかをグラフから求め、試験群２乃至５のハムスターの小脳失調症の進行が遅延された日数を求めた（＝試験群２乃至５の週齢×７（日）−計算から求めた試験群２乃至５の週齢と同じ落下時間を示す試験群１の週齢×７（日））。結果を表７に示す。なお、表７に示すように、正常ハムスターでは、試験した何れの週齢においても、１８０秒間では、ロッドから落下したハムスターは認められなかったので、１８０秒以内に落下した場合には、ハムスターが小脳失調症を発症して運動協調性が低下したと判断した。【０１０５】
＜斜面耐久試験＞
ハムスターの頭部を上にして、傾斜角度の変えられる板の上に乗せ、５秒間静止できる角度を判定して、斜面耐久傾斜角度（Ｒｉｖｌｉｎなど、『Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．』、第４７巻、第５７７−５８１頁（１９９７年）参照）とした。傾斜角度は２５度から開始し、５度ずつ上昇させた。静止が５秒未満で落下した場合には、その傾斜角度から、１度間隔で角度を減じて、５秒間静止できる角度を判定して、斜面耐久傾斜角度を測定して、各群５匹の平均を求めた。結果を表８に示す。【０１０６】
＜ハムスターの転倒する回数＞
１０週齢のハムスターを１匹ずつ飼育ケージに入れ、１分間に転倒する回数を肉眼観察により計測して、各群５匹の平均を求めた。結果を表９に示す。なお、この試験で使用した小脳失調症ハムスターは、９週齢以降に転倒頻度が増加することが知られている。【０１０７】
＜組織学的評価＞
転倒回数を確認などの運動協調性に関する試験終了後の１０週齢のハムスターにペントバルビタールを５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与し、麻酔下で、後大静脈より放血、致死せしめ、大脳及び小脳を摘出し、１０％ホルマリン溶液で固定後、上部より大脳及び小脳を、デジタルカメラで、一定の高さから撮影し、それぞれの矢状方向及び水平方向の直径を計測した。矢状方向長２×水平方向長×０．５を計算して、それぞれ大脳体積及び小脳体積として、各群５匹の平均を求めた。結果を表９に示す。さらに、この試験で使用した小脳失調症ハムスターは、抑制性神経細胞のプルキンエ細胞に加えて、興奮性神経細胞である顆粒細胞も細胞密度が減少することが知られている。そこで、矢状方向に切り出した小脳切片を、常法によりヘマトキシリン・エオシン染色し、検鏡してプルキンエ細胞層（小葉Ｉ乃至Ｘ）にある全プルキンエ細胞数及び単位面積当たりの顆粒細胞数を計測すると共に、小脳白質に脱髄が認められる個体数を確認した。結果を表９に併せて示す。なお、大脳体積は、各試験群間で有意の差が認められなかったので、表９には小脳体積の計算結果のみを示す。
【表６】
2010087313.tif 000049
【０１０８】
【表７】
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【０１０９】
【表８】
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【０１１０】
【表９】
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【０１１１】
表６から明らかなよう、４週齢の正常ハムスター（試験群６）の落下時間は１８０秒以上だったのに対して、同じ４週齢の小脳失調症ハムスターを使用した試験群１（ＰＢＳ投与群）の落下時間は１０８±１０秒で、すでに、正常ハムスターに比較して有意な落下時間の短縮が認められ、以後、加齢と共に、さらに短縮した。１０週齢では、ロタロッドに留まることはできず、すぐに落下（０秒）した。これに対して、ＮＫ−４を投与したハムスターでは、投与開始後１週目（４週齢）から、用量依存的に、落下時間短縮の抑制が認められ、試験群３（１００μｇ／ｋｇ・体重）、及び、試験群４（５００μｇ／ｋｇ・体重）では、試験群１に比較して有意な落下時間短縮の抑制効果が認められた。この抑制効果は、試験終了の１０週齢（投与７週間）まで持続した。試験群２（２０μｇ／ｋｇ・体重）でもＮＫ−４投与開始後２週目（５週齢）以降に、試験群１よりも落下時間の短縮の抑制効果は認められたが、試験群３及び試験群４に比較してその効果は弱かった。また、運動神経変性疾患の治療に効果があるとされているＩＧＦ−１を投与した場合（試験群５）には、落下時間短縮の抑制効果はほとんど認められなかった。同様に、落下時間短縮の遅延日数を示す表７からも明らかなように、１０週齢（ＮＫ−４投与期間４９日）時点でも、試験群２乃至４では、各々、３２、３６、及び、３５日の、落下時間短縮の遅延が認められた。この試験期間を通して、試験群３及び４で最も高い落下時間短縮の抑制効果が認められ、小脳失調症の発症遅延効果が認められた。しかし、ＩＧＦ−１を投与した試験群５ではほとんど症状発症遅延効果は認められず、１０週齢時点では、落下時間に試験群１との差は認められなかった。この結果は、ＮＫ−４が、ヒトの神経変性症及びその病態や症状の治療剤として利用できることを物語っている。【０１１２】
表８の結果から明らかなように、試験群６（正常ハムスター）の斜面耐久傾斜角度は、試験期間を通して４６度から５２度の範囲内であったが、小脳失調症ハムスターを使用した試験群１（ＰＢＳ投与群）では、試験開始時には、すでに、４１０．６±０．３度と有意に低く、加齢に伴い、減少して、８週齢以降はさらに低下し、１０週齢では３５．８±１．０度となった。試験群５（ＩＧＦ−１投与）では、４週齢で４４．４±０．２度となって、試験群１の４０．６±０．３度に比較して有意な斜面耐久傾斜角度の低下抑制効果が認められたものの、それ以降は試験群１と同様に斜面耐久傾斜角度が低下し、５週齢以降は有意な低下抑制効果は認められなかった。これに対して、試験群２乃至４（ＮＫ−４投与）では、試験に使用した何れの投与量でも、試験期間を通して耐久傾斜角度低下は認められず、高い斜面耐久傾斜角度低下抑制効果が認められた。１０週齢での試験群２乃至４（ＮＫ−４投与）の斜面耐久傾斜角度は、各々、４５．８±０．６、５１．６±０．６、５１．８±０．４度となり、いずれも試験群１（ＰＢＳ投与）や試験群５（ＩＧＦ−１投与）に比較して有意に高かった。【０１１３】
表９の結果から明らかなように、１０週齢の正常ハムスター（試験群６）では、転倒は認められないのに対して、試験群１（ＰＢＳ投与）では、１２．８±０．５回／分の転倒が認められた。これに対して、試験群５（ＩＧＦ−１投与）では、１１．４±０．４回／分と試験群１と比較して、やや減少傾向にあったが、有意な転倒減少効果は認められなかった。これに対して、試験群２乃至４（ＮＫ−４投与）では、各々、４．０±１．０、１．６±０．９、１．２±０．８回／分と、いずれの群でも有意な転倒回数の減少が認められた。また、試験群１（ＰＢＳ投与）の小脳体積は、１０週齢で６４．６±９．４ｍｍ３と、同一週齢の正常ハムスター（試験群６）の９４．７±１１．４ｍｍ３に比較して有意な萎縮が認められた。これに対し、試験群５（ＩＧＦ−１投与）では、７７．６±６．１（ｍｍ３）と、試験群１に比して有意な小脳の萎縮抑制効果が認められた。また、ＮＫ−４投与群でも用量依存的な小脳萎縮抑制効果が認められ、２０、１００、５００μｇ／ｋｇ投与群で、それぞれ、７６．０±８．２、７７．０±２．８、８０．５±１０．８ｍｍ３となった（全てＰ＜０．０５で有意）。一方、何れの群においても大脳体積に有意の差は認められなかった（データ未掲載）。以上の結果から、ＮＫ−４は、小脳失調症ハムスターの運動協調性を改善するとともに、小脳萎縮を効果的に抑制すること、及び、その効果はＩＧＦ−１よりも優れていることが判明した。【０１１４】
また、表９の結果から明らかなように、小脳皮質の顆粒細胞層にある顆粒細胞密度は、１０週齢の正常ハムスター（試験群６）が、４８０±６個／２００００μｍ２であるのに対し、小脳失調症ハムスターにＰＢＳを投与した場合（試験群１）は３８０±４個／２００００μｍ２にまで、有意に減少した。試験群５（ＩＧＦ−１投与）の顆粒細胞密度は、３７１±１１個／２００００μｍ２と、試験群１と差は認められなかった。試験群２乃至４（ＮＫ−４投与）では、各々、４０８±８、４１９±６、４３６±７個／２００００μｍ２となり、ＮＫ−４の投与量に依存した顆粒細胞密度減少抑制効果が認められた。また、具体的なデータは示さないが、小脳実質組織の顕微鏡観察では、試験群１や５では顆粒細胞の萎縮や変性が顕著であったのに対して、試験群２乃至４では、顆粒細胞の萎縮や変性が抑制されていることが確認された。さらに、小脳失調症ハムスターにＰＢＳを投与した場合（試験群１）では、小脳白質の脱髄が全個体（５匹中５匹）に認められたが、ＮＫ−４投与群では試験群２乃至４（ＮＫ−４投与）では、各々、５匹中４匹、５匹中１匹、５匹中０匹に脱髄が認められたのみであり、これらのＮＫ−４投与群では、プルキンエ細胞の持つ神経突起（樹状突起）の萎縮の抑制も確認された。この結果は、ＮＫ−４を神経突起伸展促進剤として有用であることを物語っている。また、ＮＫ−４は、小脳白質の脱髄の抑制、則ち、プルキンエ細胞の変性や脱落の抑制剤としても有用であることを物語っている。【０１１５】
以上のように、ＮＫ−４を投与した小脳失調症ハムスターでは、ロタロッド試験、斜面耐久試験、転倒回数の全ての試験項目で症状改善が認められ、その効果は、ＮＫ−４の投与量に依存し、投与量が１００及び５００μｇ／ｋｇ・体重／日で、特に高い効果が得られた。また、小脳失調症ハムスターの症状発症の原因となる小脳プルキンエ細胞では、神経突起の萎縮の抑制が確認された。この結果は、腹腔内に投与したＮＫ−４は、脳神経細胞に作用して、その神経突起伸展作用（萎縮抑制を含む）により、神経機能低下を抑制し小脳失調症を抑制したことを示している。これらの結果は、ＮＫ−４が、神経突起伸展促進剤として、ヒトの神経変性症やそれに伴う種々の病態や臨床症状に対する全身投与可能な治療剤として有用であることを物語っている。なお、小脳失調ハムスターの体重を試験終了（１０週齢）まで毎週１回計測して、各群の平均を求めたところ、何れの週齢においても、ＰＢＳ、ＮＫ−４、ＩＧＦ−１投与群間に有意な差は認められなかったことから、ＮＫ−４は、生体へ投与しても安全性は高い化合物と判断した。なお、的に具体的なデータは示さないが、ＮＫ−４を経口摂取させ、本実験と同じ系でその効果を調べたところ、ＮＫ−４を腹腔内投与した場合と同じ効果を得るためには、腹腔内投と比較して約１００倍量のＮＫ−４の摂取が必要であった。【０１１６】
＜実験６：各色素化合物の脳虚血モデルラットに及ぼす影響＞
実験１乃至５で、ＮＫ−４や、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００、及び、ＮＫ−５５７に神経変性症に対する治療効果が確認されたので、これらの化合物の投与が、ヒトの脳梗塞の好適なモデルとされている脳虚血モデルラットに及ぼす影響を、行動学的指標及び脳梗塞部位の体積を指標として調べた。【０１１７】
＜脳虚血ラット＞
ＳＤラット（雄性、７乃至８週齢、体重２８０乃至３３０ｇ、日本チャールスリバー株式会社販売）を、無作為に７群各５乃至７匹を割り付けた。予め、アトロピン（扶桑薬品、０．３ｍｇ／ｋｇ・体重）を皮下に投与した、ウレタン（シグマ社販売６００ｍｇ／ｋｇ・体重）及びα−クロラロース（シグマ社販売、６０ｍｇ／ｋｇ・体重）を腹腔内に投与して、麻酔を施し、自然呼吸のまま、固定器に固定した。頚部正中切開を加え、迷走神経の保存に留意しつつ、右頚動脈分岐部に達した。右頚動脈分岐部を中心に、総頚動脈及び外頚動脈を周囲結合織より剥離し、それぞれ６−０ナイロン糸（アルフレッサーファーマ株式会社販売、商品名「ネスコスーチャー」）にて結紮した。次に、内頚動脈に６−０ナイロン糸をかけ、塞栓挿入後の固定に備えた。次いで、総頚動脈を切開し、同部より先端をシリコンコートした４−０ナイロン糸で作成した塞栓（Ｄｏｃｃｏｌ）を内頚動脈に向けて約１６ｍｍ挿入し、総頚動脈にクリップで固定した。（例えば、小泉ら、「脳卒中」、第８巻、第１号、第１乃至８頁（１９８６年）参照）。なお、この方法により、塞栓のシリコンコートした先端部分は、中大脳動脈分岐部を越えて、前大脳動脈内に２ｍｍ程度入り、中大脳動脈入口を閉塞する。この状態のまま３７℃の保温パッド上で２時間中大脳動脈を閉塞した後、挿入した塞栓を抜き去り、血流を再開通（再灌流）させ、その後、総頚動脈切開部からの出血を防ぐため、内頚動脈を頚動脈分岐部近傍で結紮した。このモデルでの血流再開は、右総頚動脈が結紮されているため、左内径動脈及び、椎骨動脈、脳底動脈より、前・後交通動脈を介して行われる。【０１１８】
＜色素化合物の投与＞
試験に使用したＮＫ−４、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００及びＮＫ−５５７は、各々ＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ社販売、商品番号「Ｄ８４１８」）に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した後、膜濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社販売、商品名「Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＧ  ＳＬＬＧ０２５ＳＳ」、ＤＭＳＯ耐性膜使用）した。各化合物を、使用時に、各々ＰＢＳに２５ｎｇ／ｍｌとなるように溶解して、そのいずれかを、５群各５匹又は７匹のラットに、中大脳動脈閉塞１時間後及び血液の再灌流時に尾静脈内に投与した（４ｍｌ／ｋｇ・体重、化合物の投与量１００μｇ／ｋｇ・体重）（試験群１乃至５）。血流再開２４時間後に、行動学的及び組織学的評価を行った。残りの２群各５匹の内の１群６匹には、対照群１として、化合物を含まないＰＢＳを４ｍｌ／ｋｇ・体重、中大脳動脈閉塞１時間後及び血液の再灌流時に尾静脈内投与した。また、残りの１群５匹には、対照群２として、総頚、外頚、内頚動脈の結紮した後、塞栓を中大脳動脈付近に挿入せずに、血流を再開させた偽手術（Ｓｈａｍ手術）を行った。対照群２にも、化合物を含まないＰＢＳを４ｍｌ／ｋｇ・体重、総頚、外頚、内頚動脈の結紮１時間後及び血液の再灌流時に尾静脈内投与した。【０１１９】
＜効果の評価方法＞
＜行動学的及び組織学的評価＞
＜行動学的評価＞
表１０に示す基準に基づいて、各評価項目の症状の程度をスコア化し、個体ごとに積算して、行動学的スコアを求めた（Ｐｅｔｕｌｌｏ  Ｄ．など、『Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ』、第６４巻、第１３号、第１０９９乃至１１０８頁（１９９９年）参照）（最大スコア６）。結果を表１１に示す。【０１２０】
＜組織学的評価＞
試験終了後、各々のラットをエーテル麻酔下で、左心室からの生理食塩水を灌流させながら後大静脈を切断して脱血した。死後３分以内に脳を摘出し、スライサー（株式会社林原生物化学研究所製造）を使用して、冠状方向に、２ｍｍの厚さにスライスにした後、脳梗塞部位を、特異的に染色する２，３，５−ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＴＴＣ）を２質量／容積％含有するＰＢＳ中で３７℃、３０分間インキュベートし、１０％ホルマリン溶液中で１時間固定した（Ｂｅｎｄｅｒｓｏｎ  Ｊ．Ｂ．など，  『Ｓｔｒｏｋｅ』、第１７巻、第１３０４乃至１３０８頁（１９８６年）参照）。ＴＴＣで染色された脳梗塞部位の面積を、画像解析フリーソフト（Ｓｃｉｏｎ社販売、商品名「Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ」）を用いて解析し、梗塞部位と脳全体の体積を算出した。梗塞部位の体積を、脳の全体積で除し、１００倍して、脳全体に占める梗塞部位の割合（％）を計算した。さらに、対照群１のラットの脳梗塞部位の脳全体に占める割合を１００％としたときの、実験群１乃至５のラットの脳梗塞部位の脳全体に占める割合の相対値を計算して、脳梗塞部位の抑制率（％）とした。結果を表１１に併せて示す。【０１２１】
【表１０】
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【０１２２】
【表１１】
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【０１２３】
表１１から明らかなように、偽手術を行ったラット（対照群２）の脳には梗塞部位は認められず、行動も全て正常であった。脳虚血を起こしたラット（対照群１）は、行動学的スコアが、５．８±０．１となって、評価した全ての項においてその運動能の殆どを喪失した。これに対して、ＮＫ−４、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００及びＮＫ−５５７のいずれかを投与したラット（試験群１乃至５）では、何れの場合にも、対照群１に比較して、運動能の喪失が有意に抑制された。脳梗塞の起こった部位の体積で見ても、脳虚血を起こしたラット（対照群１）と比較して、ＮＫ−４、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００及びＮＫ−５５７のいずれかを投与したラット（試験群１乃至５）では、何れの場合にも、脳梗塞を起こした部位が小さく、ＮＫ−４、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３投与（試験群１乃至３）では、有意な脳梗塞部位の縮小が認められた。効果の強さを比較すると、ＮＫ−１９を投与した場合に、行動学的スコア及び脳梗塞部位の抑制率共に、最も強い改善が認められた。この結果は、ＮＫ−４、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００及びＮＫ−５５７は、虚血が原因で引き起こされる神経突起の萎縮をはじめとする神経変性及びそれに伴う神経機能障害に対する治療効果を有することを物語っている。【０１２４】
＜実験７：ＮＫ−４類縁体又はＮＫ−１９類縁体の脳梗塞モデルラットに及ぼす影響＞
ＰＣ−１２ＨＳ細胞に対する細胞増殖促進作用及び神経突起促進作用が確認されたＮＫ−４、ＮＫ−２６、ＮＫ−１５が脳梗塞に及ぼす影響をヒトの脳梗塞モデルラットを用いて調べた。すなわち、実験６に準じて、ＳＤラット（日本チャールスリバー社販売、オス、８週齢、体重２８０乃至３３０ｇ）に中大脳動脈に塞栓を行った。ＮＫ−１５０、ＮＫ−２６及びＮＫ−４を、それぞれＤＭＳＯに５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解後、ポワサイズ０．４５μｍの膜フィルターで膜濾過し、さらにＤＭＳＯで２．５乃至０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したものを遮光し保存した。これらの化合物溶液を、使用時に生食で２５０倍希釈し、塞栓したラットに、閉塞１時間後および再開通時の２回、尾静脈より投与した（液量：５ｍｌ／ｋｇ・体重）。ＮＫ−４は１０ｍｇ／ｍｌの溶液を調製し、２５０乃至１６７倍希釈し、尾静脈より投与した（液量：５ｍｌ／ｋｇ・体重）。ＮＫ−４と同じ投与スケジュールで、陰性対照として生理食塩水を投与し、陽性対照として既存薬エダラボン（田辺三菱製薬社製、商品名「ラジカット」）をＤＭＳＯにより希釈し静脈内投与した。実験６と同じ方法により行動学的スコアを求め神経症状を評価した。また、脳梗塞部位の体積（ｍｍ３）は、梗塞に伴う脳の浮腫の影響を排除するため、予め腫脹率（＝虚血側大脳半球の体積÷健常側大脳半球の体積）を求め、梗塞体積の実測値を腫脹率で除して求めた。その結果と群構成を表１２に示した。【０１２５】
【表１２】
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【０１２６】
表１２から明らかなように、ＮＫ−４、ＮＫ−２６及びＮＫ−１５０を投与したラットでは、至適投与量に差はあるものの、いずれも脳梗塞に伴う行動学的スコアの有意な改善と、脳梗塞部位の体積増加の有意な抑制が認められた。エダラボンの投与では行動学的スコアの改善は認められたものの、脳梗塞部位の体積増加の有意な抑制が認められなかった。この結果は、ＮＫ−４、ＮＫ−２６、ＮＫ−１５０は、虚血が原因で引き起こされる神経突起の萎縮をはじめとする神経変性及びそれに伴う神経機能障害に対する治療効果を有することを物語っている。【０１２７】
＜実験８：ＮＫ−４類縁体及びＮＫ−１９類縁体のヒトアルツハイマー型認知症のモデルマウスに及ぼす影響＞
既述の実験からＮＫ−４がアルツハイマー型認知症治療剤として利用できる可能性が示唆されたので、本実験ではＮＫ−４類縁体及びＮＫ−１９類縁体のヒトアルツハイマー型認知症のモデルマウスに及ぼす影響を検証した。【０１２８】
＜被験試料＞
被験試料としてＮＫ−４、ＮＫ−２３４、ＮＫ−２６、ＮＫ−１９及びＮＫ−１５０を用いた。対照１として生理食塩水（２００μｌ／匹）を投与した。対照２としてドネペジル塩酸塩を用いた。各被験試料はＤＭＳＯにより５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、生理食塩水に希釈し投与した。【０１２９】
＜実験方法＞
ＩＣＲマウス（日本チャールスリバー社販売、オス、５週齢、体重２５乃至３０ｇ）１００匹を無作為に１０群各１０匹に群分けし、試験終了まで単独飼育した。抱水クロラール（シグマ社販売、３５０ｍｇ／ｋｇ・体重、腹腔内投与）麻酔を施したマウスを、背面固定し、頭部正中切開を加え、骨縫合を確認した後、ブレグマの左側方１．０ｍｍ、後方０．５ｍｍに刺入点を定め、３ｍｍ刺入しアミロイドβフラグメント（β−Ａｍｙｌｏｉｄ２５−３５：Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔのアミノ酸配列を有するペプチド）：溶液９ｎｍｏｌ／６μｌ／匹を脳室内に投与した（投与法は、『Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ』、第７０６巻、１８１−１９３頁（１９９６年）参照。）。投与には２８ゲージステンレス針（３ｍｍ）を装着したマイクロシリンジを用いた。刺入部位は、予めアミロイドβフラグメント溶液の代わりにエバンスブルー溶液（０．３μｇ／０．３μｌ）を投与し、左右前額断面の側脳室、背側第三脳室、腹側第三脳室などに着色が認められることを確認し決定した。投与後、頭皮を縫合し、翌日より化合物のいずれかを腹腔内に１日１回１３日間投与し、以下に示す方法により行動学的評価をおこなった。その結果と群構成を表１３に示した。【０１３０】
【表１３】
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【０１３１】
＜評価法＞
＜新奇物体認識試験＞
新奇物体認識試験は、マウスの新奇性を好むとい特性を利用したもので、他の多くの学習評価系と異なり人為的な強化因子を用いない。試験は、順化、訓練試行、保持試行の３部門で構成され、アミロイドβフラグメントを脳室内に投与して後６乃至８日目に実施した。床にウッドチップを敷き詰めたオープンフィールドの実験装置（縦４０ｃｍ、横３０ｃｍ、高さ３０ｃｍ）を、約１，０００ルックス（ｌｕｘ）の照明下、雑音のない場所に設置した。まず６日目に、マウスを探索物体の入っていない実験装置中央に入れ、１０分間自由に探索させた（順化）。その２４時間後（７日目）、実験装置内に２種類の物体（ＡとＢ）をそれぞれ側面から１０ｃｍの位置に設置し、マウスを実験装置中央に入れ、１０分間自由に探索させた（訓練試行）。さらにその２４時間後（８日目）、実験装置内に前日探索させた物体Ａを前日の物体Ａ（一度記憶した対象物）と同じ位置に、前日の物体Ｂと異なる物体Ｃ（新しい対象物）を物体Ｂと同じ位置に設置し、マウスを装置の中央に入れ１０分間自由に探索させた（保持試行）。この時、マウスが鼻先を物体に向け、鼻先から物体までの距離が２ｃｍ以内にある時、又はマウスの鼻先が物体に接触している時を物体探索中とみなし、その時間をストップウオッチで計測した。物体識別指数（＝（新しい対象物の探索に費やした時間−一度記憶した対象物の探索に費やした時間）／（新しい対象物の探索に費やした時間＋一度記憶した対象物の探索に費やした時間））を求めた。この場合、物体識別指数は、新規対象物の探索により多く割かれた時間の全探索時間に対する割合であり、一度探索した対象物を動物が記憶していれば物体識別指数の値が大きくなり、記憶していなければ値が小さくなる。【０１３２】
＜受動的回避試験＞
動物が一度経験した嫌悪刺激（電気刺激）に対して示す回避行動を記憶の指標とするもので、マウスが暗室を好む性質を利用したステップスルー型を採用した。明室と暗室が扉でつながった装置の明室側にマウスを入れた時の暗室側への移動時間を記憶の指標とした。受動的回避試験はアミロイドβフラグメントを脳室内に投与して後９乃至１２日目に実施した。９日目に明室（１，０００ルクス、縦３０ｃｍ、横３０ｃｍ、高さ１５ｃｍ）に１分間、暗室（縦３０ｃｍ、横３０ｃｍ、高さ１５ｃｍ）に２分間入れ順化させた。１０日目も同様に順化を行った。１１日目の訓練試行で、まず明室の中央にマウスを入れ、マウスが暗室内に移動すると同時に明室と暗室のとの間の扉を閉め、電気刺激を与えた（０．８ｍＡ、１秒）。２４時間後（１２日目）、前日と同様に再び明室の中央にマウスを入れ、暗室への移動時間（秒）を受動的回避的反応として測定した。通電による嫌悪刺激を記憶していれば受動的回避的反応が長くなる。【０１３３】
表１３から明らかなように、ＮＫ−４を５００μｇ／ｋｇ・体重、ＮＫ−２３４を５００μｇ／ｋｇ・体重、ＮＫ−２６を５０μｇ／ｋｇ・体重、ＮＫ−１９を５００μｇ／ｋｇ・体重及びＮＫ−１５０を５００μｇ／ｋｇ・体重投与マウスでは、アミロイドβフラグメントのみ投与マウスに比べて、新奇物体認識試験で有意の改善が認められた。また、ＮＫ−４を５０μｇ／ｋｇ・体重、ＮＫ−４を５００μｇ／ｋｇ・体重、ＮＫ−２３４を５００μｇ／ｋｇ・体重、ＮＫ−２６を５０μｇ／ｋｇ・体重、ＮＫ−２６を５００μｇ／ｋｇ・体重、及び、ＮＫ−１９を５００μｇ／ｋｇ・体重投与マウスでは、アミロイドβフラグメントのみを投与マウスに比べて、受動的回避試験で有意の改善が認められた。なかでも、ＮＫ−４を５００μｇ／ｋｇ・体重投与した群では、新奇物体認識試験及び受動的回避試験の両方で、ドネペジル塩酸塩１，０００μｇ／ｋｇ・体重投与した群（対照２）よりも著明な改善が認められた。なお、試験中ＮＫ−４、ＮＫ−２３４、ＮＫ−２６、ＮＫ−１９或いはＮＫ−１５０の投与に起因すると思われる副作用は認められなかった。【０１３４】
この結果は、ＮＫ−４、ＮＫ−２３４、ＮＫ−２６、ＮＫ−１９及びＮＫ−１５０は、いずれもアミロイドβペプチドに起因する神経突起の萎縮をはじめとする神経変性及びそれに伴う神経機能障害に対する治療効果を有することを物語っている。【０１３５】
＜実験９：ＮＫ−４のＡＰＰトランスジェニックマウスに及ぼす影響＞
実験１４で、アミロイドβフラグメント投与したマウスの認知障害改善作用の最も強かったＮＫ−４につき、スウェーデン型アルツハイマー病の原因遺伝子変異を導入した市販のＡＰＰトランスジェニックマウス（ＡＰＰ  Ｔｇマウス）に及ぼす影響を調べた。すなわち、ＡＰＰ  Ｔｇマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ社販売、メス、１０週齢、体重１５乃至２３ｇ）４５匹を１０日間予備飼育した後、体重が均などになるように、４群に分け、単独飼育とし、ＮＫ−４を腹腔内に週５回、１２週間投与した。対照１として遺伝子変異を導入していないマウス（野生型、メス、１０週齢、体重１５乃至２３ｇ）１０匹を１０日間予備飼育後、単独飼育とし、生理食塩水を腹腔内に週５回、１２週間投与した。対照２としてＡＰＰ  Ｔｇマウスに生理食塩水（２００μｌ／匹）を週５回、１２週間投与した。対照３としてＡＰＰ  Ｔｇマウスにドネペジル塩酸塩を週５回、１２週間投与した。ＮＫ−４、生理食塩水或いはドネペジル塩酸塩投与１２週目に、実験１５と同じ方法で、最初に新奇物体認識試験、次に受動的回避試験を行い、引き続き下記方法による水迷路試験を行った。その結果と群構成を表１４に示す。【０１３６】
【表１４】
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【０１３７】
＜水迷路試験法＞
直径１３０ｃｍの円形プールに、白色インクで着色した水を深さ２０ｃｍまで満たし、水槽用ヒーターで水温を２３±１℃に維持した。プールを４分割し一画の中央に、プールの側面から１０ｃｍの位置に避難用のプラットホームを水面下２ｃｍになるように設置した。このプラットホームの位置は、試験終了まで一定の場所とした。受動的回避試験終了の翌日よりマウスをプールの側面に向けて水面上に放ち、水面下に隠れたプラットホームに到着するまでの時間を計測した。スタート位置は、プールを４分割したいずれかの画分の中央部、壁面より１０ｃｍ離れた場所とし、試行毎にランダムに変更した。２分間自由にプラットホームを探索させた後、マウスが２分以内にプラットホームに到着できなかった場合は、プラットホームへ誘導し、３０秒間プラットホームに留まらせた後、ペーパータオルを敷いたケージに移した。２回目の試験は、１回目の試験終了１分後に開始した。この試験を４日間連続で行ない、２回の試行の平均値を１日の値とした。【０１３８】
表１４から明らかなように、ＮＫ−４を投与したマウスは、物体識別指数、受動的回避反応、水迷路試験の何れにおいても、ＡＰＰ  Ｔｇマウスの認知障害を顕著に改善した。また、その改善作用は、市販のアルツハイマー型認知症治療剤ドネペジル塩酸塩より有意に強かった。なお、試験中ＮＫ−４の投与に起因すると思われる副作用は認められなかった。【０１３９】
＜実験１０：脳血管性認知症モデルマウスに及ぼすＮＫ−４の影響＞
既述の実験により、ＮＫ−４が脳梗塞に由来する運動障害やアルツハイマー型認知障害の改善に有効であることが確認できたので、本実験では脳血管性認知障害に対するＮＫ−４の影響を調べた。すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本クレア社販売、雄、１２週齢）３１匹を１週間予備飼育後、２１匹にアトロピン（０．３ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）を前投与した後、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し麻酔し右総頸動脈の永久結紮手術を行った（手術法については特開２００８−１９３９４１号公報参照）。手術して後全てのマウスを単独飼育とし、自由飲食、飲水で飼育した。結紮手術を施した２１匹のうち１０匹はそのまま飼育（結紮群）し、残りの１１匹はＮＫ−４を投与した（投与群）。また手術を行っていない１０匹を対照（無手術群）とした。手術後２日目より、無手術群および結紮群には生理食塩水を、ＮＫ−４投与群にはＮＫ−４（１００μｇ／ｋｇ）を連日（週５日間）腹腔内投与した。手術３週目、４週目に、実験１５と同じ方法により新奇物体認識試験を実施した。その結果を表１５に示す。【０１４０】
【表１５】
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【０１４１】
表１５から明らかなように、ＮＫ−４投与群の物体識別指数は、無手術群と差が無く、右総頸動脈結紮による脳血管性認知障害をほぼ完全に回復させた。なお、試験中ＮＫ−４の投与に起因すると思われる副作用は認められなかった。この結果は、ＮＫ−４は、虚血が原因で引き起こされる神経突起の萎縮をはじめとする神経変性及びそれに伴う神経機能障害に対する治療効果を有することを物語っている。【０１４２】
以上の結果は、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１５０などの一般式３で表される構造を有し、側鎖のアルキル基の炭素数が３乃至１０の化合物と同様に、一般式２で表される構造を有し、側鎖のアルキル基の炭素数が２乃至８である化合物は神経突起伸展促進剤として有用であることを物語っている。また、これらの化合物はいずれも、脳梗塞や血管障害による虚血、アルツハイマー症、小脳失調症、パーキンソン氏病などにみられる神経突起の萎縮を改善し、神経突起の萎縮や減少による、認知障害や各種臨床症状を改善できることを物語っている。なかでも、モデル動物での実験結果、製剤化の容易さ、安全性なども考慮すると、一般式２で表される化合物が望ましく、側鎖のアルキル基の炭素数が２乃至４であるＮＫ−４、ＮＫ−２３４、ＮＫ−２６が望ましく、ＮＫ−４が特に望ましいことが示唆された。【０１４３】
以下、本発明の神経突起伸展促進剤について、実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【０１４４】
＜注射用の液剤＞
注射用精製水３７０ｇに注射用精製マルトース（株式会社林原製造）６０ｇを溶解した溶液と、注射用精製水１７０ｇに、有効成分として、ＮＫ−４（化学式２で表される化合物）、ＮＫ−９６９４（化学式１で表される化合物）、ＮＫ−２８（一般式２で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が７である化合物）、ＮＫ−１４７（一般式２で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が８である化合物）、ＮＫ−１９（化学式４で表される化合物）、ＮＫ−５３（化学式５で表される化合物）、ＮＫ−１５０（化学式３で表される化合物）、ＮＫ−３９３（一般式３で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が８である化合物）、ＮＫ−１００（化学式６で表される化合物）ＮＫ−５２８（化学式７で表される化合物）、ＮＫ−５５７（化学式８で表される化合物）、及び、ＮＫ−１５１６（化学式９で表される化合物）（いずれも株式会社林原生物化学研究所製造）のいずれか１種を、各々１２ｍｇ溶解した溶液とを混合し、溶存する酸素の濃度が約０．１ｐｐｍになるまで窒素ガスをバブリングして、褐色アンプルに１ｍｌずつ分注し、窒素気流下でアンプルを封止した後、濾過滅菌又は高圧滅菌した。本品は、いずれもパイロジェンフリーであり、神経突起伸展促進剤として利用できる。また、本品は、神経変性抑制剤、神経細胞保護剤や、神経変性に伴う病態や神経機能障害の治療剤としても利用できる。【０１４５】
これらの製剤を使用して、小脳失調症ハムスターの運動協調性低下に対する治療効果を確認した。
＜小脳失調症ハムスターの運動協調性低下に対する効果＞
実験５と同様に、同一週に生まれた３週齢の小脳失調症ハムスター１３０匹を、無作為に、１３群各１０匹に分けた。そのうちの１２群各１０匹には、表１６に示すように、実施例１で調製した１２種類の化合物のいずれかを有効成分として含有する製剤のいずれか１種を、３週齢から１０週齢まで、５６日間、１日１回、毎日、０．５ｍｌ／匹で腹腔内投与した（試験群１乃至１２）。残りの１群１０匹には、滅菌したマルトースの１０％水溶液（パイロジェンフリー）を、３週齢から１０週齢まで、５６日間、１日１回、毎日、０．５ｍｌ／匹で腹腔内投与した（対照群）。投与期間終了の翌日、実験５と同様に、各ハムスターの体重を測定し、ロタロッド試験、斜面耐久試験及び転倒回数の測定を行った。各群に投与した製剤の有効成分である化合物の種類と、測定結果とを表１６に示す。なお、対照群のハムスターの３週齢の平均体重は３５．４ｇ、１０週齢の平均体重は１２２．９ｇで、実施例１で調製した製剤を投与した試験群１乃至１２の何れの群においても、その平均体重に対照群と有意の差は認められなかったので、表１６には、ロタロッド試験、斜面耐久試験及び転倒回数の測定結果のみを示す。また、試験終了後、実験４と同様の方法でハムスターの小脳組織標本を作製し、顕微鏡観察により、対照群と比較して小脳プルキンエ細胞の樹状突起の萎縮が抑制されているかどうかを判定して、その結果を表１６に併せて示す。【０１４６】
【表１６】
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【０１４７】
表１６から明らかなように、実施例１で調製した１２種類の製剤は、いずれも、１０週齢の小脳失調症ハムスターの、小脳プルキンエ細胞の神経突起（樹状突起）の萎縮を抑制し、ロッドからの落下時間低下、斜面耐久傾斜角度の低下及び転倒回数の増加を、顕著に改善した。１２種類の製剤を投与した場合の効果の強さを比較すると、何れの試験においても、ジメチン系スチリル色素化合物（ＮＫ−５２３、ＮＫ−５５７、及び、ＮＫ−１５１６）を含有する製剤を投与した場合（試験群１０乃至１２）よりも、ペンタメチン系シアニン色素化合物（ＮＫ−４、ＮＫ−９６９４、ＮＫ−２８、ＮＫ−１４７、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１５０、ＮＫ−３９３、Ｋ−１００、Ｋ−５２８、Ｋ−５５７、及び、ＮＫ−１５１６）を投与した場合（試験験群１乃至９）の方が、強い運動協調性の改善効果が認められた。ペンタメチン系シアニン色素化合物間で、効果の強さを改善すると、ＮＫ−４、ＮＫ−２６、ＮＫ−９６９４、ＭＫ−１５０及びＮＫ−３９３で特に強い運動協調性の改善効果が認められた。この結果は、製造した製剤は、いずれも、神経変性疾患の治療剤としても有用であることを物語っている。また、これらの製剤は、５６日間投与しても、ハムスターの体重は、対照群と有意な差が認められなかったので、いずれも、安全性は高いと判断した。
【実施例２】
【０１４８】
＜注射用の液剤＞
注射用精製水３７０ｇに注射用精製マルトース（株式会社林原製造）６０ｇを溶解した溶液と、注射用精製水１７０ｇに、レシチン２ｇと有効成分として、ＮＫ−４（化学式２で表される化合物）、ＮＫ−２３４（一般式２で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が３である化合物）、ＮＫ−２６（一般式２で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が４である化合物）、ＮＫ−９６９４（化学式１で表される化合物）、ＮＫ−２８（一般式２で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が７である化合物）、ＮＫ−１４７（一般式２で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が８である化合物）、ＮＫ−１９（化学式４で表される化合物）、ＮＫ−５３（化学式５で表される化合物）、ＮＫ−１５０（化学式３で表される化合物）、ＮＫ−３９３（一般式３で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が８である化合物）、ＮＫ−１００（化学式６で表される化合物）ＮＫ−５２８（化学式７で表される化合物）、ＮＫ−５５７（化学式８で表される化合物）、及び、ＮＫ−１５１６（化学式９で表される化合物）（いずれも株式会社林原生物化学研究所製造）のいずれか１種を、各々１２０ｍｇ溶解した溶液とを混合し、溶存する酸素の濃度が約０．０５ｐｐｍになるまで窒素ガスをバブリングして、褐色アンプルに１ｍｌずつ分注し、窒素気流下でアンプルを封止した後、濾過滅菌又は高圧滅菌した。本品は、いずれもパイロジェンフリーであり、神経突起伸展促進剤として利用できる。【０１４９】
実施例２で調製した１４種類の神経突起伸展促進剤を、各々、１０匹のｄｄｙマウス（平均体重２５．６ｇ）に、０．３ｍｌ／匹単回投与して、投与後１週間、毎日体重を測定しながら、経過を観察したところ、対照として１０匹のｄｄｙマウス（平均体重２６．３ｇ）に、０．２％のレシチンを含む１０％マルトース溶液を投与して、経過を観察した場合に比して、体重に優位な変化は認められず、他に外観的な変化も認められなかった。この結果は、実施例２で調製した１２種類の神経突起伸展促進剤の有効成分として配合した化合物のＬＤ５０は、いずれも８．６ｍｇ／ｋｇ・体重以上となるので、これらの製剤がヒトに投与しても安全な製剤であることを物語っている。
【実施例３】
【０１５０】
＜注射用の粉末剤＞
注射用精製水３７０ｇに注射用精製マルトース（株式会社林原製造）６０ｇを溶解した溶液と、注射用精製水１７０ｇに、ポリソルベイト８０（日本油脂株式会社販売）３ｇと、有効成分として、ＮＫ−４（化学式２で表される化合物）、ＮＫ−２３４（一般式２で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が３である化合物）、ＮＫ−２６（一般式２で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が４である化合物）、ＮＫ−９６９４（化学式１で表される化合物）、ＮＫ−２８（一般式２で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が７である化合物）、ＮＫ−１４７（一般式２で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が８である化合物）、ＮＫ−１９（化学式４で表される化合物）、ＮＫ−５３（化学式５で表される化合物）、ＮＫ−１５０（化学式３で表される化合物）、ＮＫ−３９３（一般式３で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が８である化合物）、ＮＫ−１００（化学式６で表される化合物）ＮＫ−５２８（化学式７で表される化合物）、ＮＫ−５５７（化学式８で表される化合物）、及び、ＮＫ−１５１６（化学式９で表される化合物）（いずれも株式会社林原生物化学研究所製造）のいずれか１種を（いずれも株式会社林原生物化学研究所製造）のいずれか１種を、各々６０ｍｇ溶解した溶液とを混合して濾過滅菌後、褐色アンプルに１０ｍｌずつ分注し、常法により凍結乾燥後、窒素気流下でアンプルを封止した。本品は、いずれもパイロジェンフリーであり、用時に、アンプルに注射用精製水乃至生理食塩水２乃至１０ｍｌを加えて溶解し、点滴静注、皮下投与、腹腔内投与などの方法で使用する。本品は、神経突起伸展促進剤として利用できる。
【実施例４】
【０１５１】
＜カプセル剤＞
１錠あたり、下記量の成分を含有するカプセル剤を調製した。
＜成分Ａ＞
実施例１で使用した１２種の色素化合物の
いずれか１種                                  ３０ｍｇ
乳糖                                            ３５ｍｇ
とうもろこし澱粉                                ５３ｍｇ
不溶性ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ
ジャパン株式会社販売、商品名「コ
リドンＣＬ」）                                ２ｍｇ
＜成分Ｂ＞
ポリビニルピロリドンＫ−９０                      ５ｍｇ
結晶セルロース（旭化成株式会社販売、
商品名「アビセルＰＨ３０２」）              １８ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                          ２ｍｇ
上記成分Ａの混合物をポリビニルピロリドンＫ−９０の８％水溶液で練合し、６０℃で乾燥後、粉砕し、成分Ｂと混合して、１カプセル当たり１５０ｍｇをカプセルに充填し、常法により、カプセル剤を得た。本品は、神経突起伸展促進剤として利用できる。また、本品は、神経変性抑制剤、神経細胞保護剤、神経変性に伴う病態や神経機能障害の治療剤としても利用できる。
【実施例５】
【０１５２】
＜カプセル剤＞
１錠あたり、下記量の成分を含有するカプセル剤を調製した。
＜成分Ａ＞
ＮＫ−１５０（株式会社林原生物化学研究所
製造）                                      １０ｍｇ
実施例１で使用した、ＮＫ−１５０を除く
１１種の化合物のいずれか１種                  ２０ｍｇ
乳糖                                            ３５ｍｇ
とうもろこし澱粉                                ５３ｍｇ
不溶性ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ
ジャパン株式会社販売、商品名「コ
リドンＣＬ」）                                ２ｍｇ
＜成分Ｂ＞
ポリビニルピロリドンＫ−９０                      ５ｍｇ
結晶セルロース（旭化成株式会社販売、
商品名「アビセルＰＨ３０２」）              １８ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                          ２ｍｇ
上記成分Ａの混合物をポリビニルピロリドンＫ−９０の８％水溶液で練合し、６０℃で乾燥後、粉砕し、成分Ｂと混合して、１カプセル当たり１５０ｍｇをカプセルに充填し、常法により、カプセル剤を得た。本品は、神経突起伸展促進剤として利用できる。また、本品は、神経変性抑制剤、神経細胞保護剤、神経変性に伴う病態や神経機能障害の治療剤としても利用できる。
【産業上の利用可能性】
【０１５３】
本発明の神経突起伸展促進剤は、神経細胞の神経変性に起因するパーキンソン病、パーキンソン症候群、アルツハイマー病、認知症、又は、脳卒中などの予防、治療及び／又は進展抑制、又は神経変性からの神経細胞保護に有用である。また、神経変性疾患に伴う種々の病態や神経機能障害（例えば、振戦、固縮、無動、寡動、動作緩慢、姿勢反射障害、自律神経障害、突進現象、歩行障害、うつ、記憶障害、筋萎縮、筋力低下、上肢機能障害、構音障害、嚥下障害、呼吸障害、しびれ及び麻痺など）の改善にも有用である。しかも、本発明の神経突起伸展促進剤は、長期間投与しても、副作用がないので、安全性が高く、安心して利用することができる。本発明は、斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に多大の貢献をする、誠に意義のある発明である。
【国際調査報告】
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