(57)【要約】  本発明の課題は、細胞膜透過性に優れた新規な環状ペプチド化合物、その製造方法、スクリーニング用組成物、並びに標的物質に結合する環状ペプチド化合物の選択方法を提供することである。本発明によれば、下記式（１）で表わされるペプチド化合物またはその塩が提供される。式中、各記号は、本明細書に記載した意味を有する。2018174078.tif 000339
2018174078.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表わされるペプチド化合物またはその塩。
【化１】
2018174078.tif 000329
式中、
Ｘは、Ｓ、ＮＨ、またはＯを示し、
Ａは、単結合、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基、またはＢが結合している炭素原子と一緒になって＊−ＣＲ0＝Ｃ（Ｂ）−で表わされる２価の基を示し、Ｒ0は水素原子または置換基を示し、＊はＸと結合する位置を示し、
Ｂは、単結合または置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示し、ただし、ＡおよびＢは同時に単結合ではなく、
Ｚは、ヒドロキシル基またはアミノ基を示し、
ｐ個のＲは、同一または異なっていても良く、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、または置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基を示し、
ＧはＧが結合している炭素がＡと一緒になって＊−ＣＲ0＝Ｃ（Ｂ）−で表わされる２価の基を示さない場合は、水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｔ1個のＷ1は、同一または異なっていても良く、単結合、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5ＮＨ）−、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示し、
ｔ2個のＷ2は、同一または異なっていても良く、単結合、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＣＯ−、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、−（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示し、
Ｊは水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、ｎ個のＸａａはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基または任意のアミノ酸類縁体残基を示し、
ｍ個のＸｂｂはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基または任意のアミノ酸類縁体残基を示し、
ｐは、０〜４の整数を示し、
ｔ1は、０〜６の整数を示し、
ｔ2は、０〜６の整数を示し、
ｍは０〜２０の整数を示し、
ｎは１〜２０の整数を示す。
【請求項２】
前記式（１）で表わされるペプチド化合物が、下記式（１Ａ）で表わされるペプチド化合物である、請求項１記載のペプチド化合物またはその塩。
【化２】
2018174078.tif 000330
式中、
Ａ1は、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基、またはＮが結合している炭素原子と一緒になって＊−ＣＨ＝Ｃ（Ｎ）−で表わされる２価の基を示し、＊はＳと結合する位置を示し、
ｐ1個のＲ1は、同一または異なっていても良く、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、または置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基を示し、
ｔ11個のＷ11は、同一または異なっていても良く、単結合、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5ＮＨ）−、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示し、
ｔ21個のＷ21は、同一または異なっていても良く、単結合、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＣＯ−、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、−（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示し、
Ｇ1はＧ1が結合している炭素がＡ1と一緒になって＊−ＣＨ＝Ｃ（Ｎ）−で表わされる２価の基を示さない場合は、水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
Ｊ1は水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｐ1は、０〜４の整数を示し、
ｔ11は、０〜６の整数を示し、
ｔ21は、０〜６の整数を示し、
Ｚ、Ｘａａ、Ｘｂｂ、ｍ、およびｎは、請求項１における定義と同様の意味を示す。
【請求項３】
前記式（１）で表わされるペプチド化合物が、下記式（１Ｂ）で表わされるペプチド化合物である、請求項１記載のペプチド化合物またはその塩。
【化３】
2018174078.tif 000331
式中、
Ａ2は、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基、またはＮが結合している炭素原子と一緒になって＊−ＣＨ＝Ｃ（Ｎ）−で表わされる２価の基を示し、＊はＳと結合する位置を示し、
Ｇ2はＧ2が結合している炭素がＡ2と一緒になって＊−ＣＨ＝Ｃ（Ｎ）−で表わされる２価の基を示さない場合は、水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
Ｊ2は水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｐ2個のＲ2は、同一または異なっていても良く、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、または置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基を示し、
ｐ2は０〜４の整数を示し、
ｑ2は、０〜６の整数を示し、
ただし、ｐ2とｑ2が同時に０になることはない。
Ｚ、Ｘａａ、Ｘｂｂ、ｍ、およびｎは、請求項１における定義と同様の意味を示す。
【請求項４】
前記Ｒ、Ｒ1またはＲ2が、置換基を有していてもよいベンゾチアゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾイミダゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾチオフェニレン基、置換基を有していてもよいベンゾフラニレン基、置換基を有していてもよいイソベンゾフラニレン基、置換基を有していてもよいインドリレン基、置換基を有していてもよいキノリニレン基、置換基を有していてもよいイソキノリニレン基、置換基を有していてもよいキナゾリレン基、置換基を有していてもよいシンノリレン基、置換基を有していてもよいインダゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾチアジアゾリレン基、置換基を有していてもよいピリジニレン基、置換基を有していてもよいピリダジニレン基、置換基を有していてもよいピリミジニレン基、置換基を有していてもよいピラジニレン基、置換基を有していてもよいチアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサジアゾリレン基、置換基を有していてもよいチアジアゾリレン基、置換基を有していてもよいピラゾリレン基、置換基を有していてもよいイソキサゾリレン基、置換基を有していてもよいトリアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾチアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリダジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリミジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピラジニレン基、置換基を有していてもよいピラゾロピリミジニレン基、置換基を有していてもよいピロロピリジニレン基、置換基を有していてもよいチオフェニレン基、置換基を有していてもよいフラニレン基、置換基を有していてもよいピローレン基、置換基を有していてもよいフェニレン基、および置換基を有していてもよいナフチレン基から選ばれる少なくとも１つの構造である、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド化合物またはその塩。
【請求項５】
前記ＲまたはＲ1またはＲ2が、置換基を有していてもよいベンゾチオフェニレン基、置換基を有していてもよいインドリレン基、置換基を有していてもよいキノリニレン基、置換基を有していてもよいインダゾリレン基、置換基を有していてもよいピロロピリジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピラジニレン基、置換基を有していてもよいピリジニレン基、置換基を有していてもよいピリダジニレン基、置換基を有していてもよいピラジニレン基、置換基を有していてもよいチアゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいトリアゾリレン基、置換基を有していてもよいチオフェニレン基、および置換基を有していてもよいフェニレン基から選ばれる少なくとも１つの構造である、請求項１から４のいずれか一項に記載のペプチド化合物またはその塩。
【請求項６】
前記ペプチド化合物の環状部を構成するアミノ酸残基およびアミノ酸類縁体残基の総数が３〜２０である、請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチド化合物またはその塩。
【請求項７】
前記ペプチド化合物を構成するアミノ酸残基およびアミノ酸類縁体残基の総数が３〜２０である、請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチド化合物またはその塩。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載のペプチド化合物またはその塩を含むスクリーニング用組成物。
【請求項９】
請求項１から７のいずれか一項に記載のペプチド化合物またはその塩を含むペプチドライブラリーと標的物質とを接触させ、前記標的物質に結合するペプチド化合物またはその塩を選択することを含む、標的物質に結合するペプチド化合物またはその塩の選択方法。
【請求項１０】
シアノ基を側鎖に有するアミノ酸残基またはアミノ酸類縁体残基をペプチド鎖中またはＣ末端に有し、下記式（２）の構造をＮ末端に有するペプチド鎖を製造する工程；および、
前記のシアノ基と、下記式（２）の構造とを反応させて、下記式（３）で表わされる結合を有する環状部を形成させる工程を含む、
ペプチド化合物またはその塩の製造方法。
【化４】
2018174078.tif 000332
式中、Ｘは、Ｓ、ＮＨ、または、Ｏを示し、
Ａは、単結合、または、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示し、
Ｂは、単結合、または、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示し、
Ｇは、水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
＊は、ペプチド鎖との結合部位を示し、
ＡおよびＢは同時に単結合ではない：
【化５】
2018174078.tif 000333
式中、Ｘ、Ａ、ＧおよびＢは、式（２）における定義と同義である。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法により環状部を有するペプチド化合物を製造する工程；および
前記ペプチド化合物またはその塩を含むペプチドライブラリーと標的物質とを接触させ、前記標的物質に結合するペプチド化合物またはその塩を選択する工程を含む、標的物質に結合するペプチド化合物の選択方法。
【請求項１２】
次の工程を含む、請求項１１に記載の選択方法。
（i）核酸ライブラリーを調製し、非天然アミノ酸でアシル化された伸長用ｔＲＮＡを含む無細胞翻訳系によって翻訳し、非天然アミノ酸がペプチド配列にランダムに導入されたペプチド化合物を含むライブラリーを調製する工程；
（ii）ペプチドライブラリーを標的物質に接触させる工程；
（iii）標的物質に結合するペプチド化合物を選択する工程、
前記（i）の工程において、ライブラリーを構成する各ペプチド化合物がライブラリーを構成する各ペプチド化合物をコードする核酸配列から翻訳され、核酸配列とその翻訳産物であるペプチドが連結されて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイライブラリーが構築され、
前記（iii）の工程が、標的物質に結合するペプチド化合物をコードする核酸配列を決定し、核酸配列からペプチド配列を決定し、ペプチド化合物を選択することを含む。
【請求項１３】
前記シアノ基を側鎖に有する前記アミノ酸残基および／または前記アミノ酸類縁体残基が下記式（４）で表わされる構造である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【化６】
2018174078.tif 000334
式中、
ｍ1個のＱ1は、同一または異なってもよく、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基、および置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基の少なくとも１種を示し、
Ｔ1は水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｎ1は、０から６の整数を示し、ｍ1は、１から４の整数を示し、
＊は、ペプチド鎖を構成するアミノ酸残基および／またはアミノ酸類縁体残基との結合位置を示す。
【請求項１４】
前記シアノ基を側鎖に有する前記アミノ酸残基および／または前記アミノ酸類縁体残基が下記式（５）で表わされる構造である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【化７】
2018174078.tif 000335
式中、
ｌ2個のＱ2は、同一または異なっていても良く、単結合、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5ＮＨ）−、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示し、
ｎ2個のＱ3は、同一または異なっても良く、単結合、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＣＯ−、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、−（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示し、
ｍ2個のＱ4は、同一または異なっても良く、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基、および置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基の少なくとも１種を示し、
Ｔ2は水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｌ2は、０〜６の整数を示し、
ｎ2は、０〜６の整数を示し、
ｍ2は、１〜４の整数を示し、
＊は、ペプチド鎖を構成するアミノ酸残基および／またはアミノ酸類縁体残基との結合位置を示す。
【請求項１５】
前記Ｑ1またはＱ4が、置換基を有していてもよいベンゾチアゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾイミダゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾチオフェニレン基、置換基を有していてもよいベンゾフラニレン基、置換基を有していてもよいイソベンゾフラニレン基、置換基を有していてもよいインドリレン基、置換基を有していてもよいキノリニレン基、置換基を有していてもよいイソキノリニレン基、置換基を有していてもよいキナゾリレン基、置換基を有していてもよいシンノリレン基、置換基を有していてもよいインダゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾチアジアゾリレン基、置換基を有していてもよいピリジニレン基、置換基を有していてもよいピリダジニレン基、置換基を有していてもよいピリミジニレン基、置換基を有していてもよいピラジニレン基、置換基を有していてもよいチアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサジアゾリレン基、置換基を有していてもよいチアジアゾリレン基、置換基を有していてもよいピラゾリレン基、置換基を有していてもよいイソキサゾリレン基、置換基を有していてもよいトリアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾチアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリダジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリミジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピラジニレン基、置換基を有していてもよいピラゾロピリミジニレン基、置換基を有していてもよいピロロピリジニレン基、置換基を有していてもよいチオフェニレン基、置換基を有していてもよいフラニレン基、置換基を有していてもよいピローレン基、置換基を有していてもよいフェニレン基、および置換基を有していてもよいナフチレン基から選ばれる少なくとも１つの構造である、
請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｑ1またはＱ4が、置換基を有していてもよいベンゾチオフェニレン基、置換基を有していてもよいインドリレン基、置換基を有していてもよいキノリニレン基、置換基を有していてもよいインダゾリレン基、置換基を有していてもよいピロロピリジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピラジニレン基、置換基を有していてもよいピリジニレン基、置換基を有していてもよいピリダジニレン基、置換基を有していてもよいピラジニレン基、置換基を有していてもよいチアゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいトリアゾリレン基、置換基を有していてもよいチオフェニレン基、および置換基を有していてもよいフェニレン基から選ばれる少なくとも１つの構造である、請求項１３から１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記式（２）が下記式（２Ａ）で表わされる構造である、請求項１０から１６のいずれか一項に記載の方法。
【化８】
2018174078.tif 000336
式中、Ａ1は、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示す。Ｇは水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示す。
【請求項１８】
前記式（２）が下記式から選ばれる少なくとも１つの構造である、請求項１０から１７のいずれか一項に記載の方法。
【化９】
2018174078.tif 000337
【請求項１９】
前記シアノ基と、前記式（２）の構造とを反応させて、前記式（３）で表わされる結合を形成させる工程の反応溶媒が水である、請求項１０から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記シアノ基と、前記式（２）の構造とを反応させて、前記式（３）で表わされる結合を形成させる工程の反応液のｐＨが６．０〜８．５である、請求項１０から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記環状部を有するペプチド化合物の環状部を構成するアミノ酸残基およびアミノ酸類縁体残基の総数が３〜２０である、請求項１０から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記環状部を有するペプチド化合物を構成するアミノ酸残基およびアミノ酸類縁体残基の総数が３〜２０である、請求項１０から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記シアノ基を有するヘテロアリーレン基、シアノ基を有するアリーレン基またはシアノ基を有するアルキレン基を側鎖に有するアミノ酸残基またはアミノ酸類縁体残基が、天然アミノ酸の翻訳において割り当てられているコドンに対して天然アミノ酸を除外することによって空になるコドン、終止コドン、または四塩基コドンを用いて、ペプチド鎖中に導入される、請求項１０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
環状部を有するペプチド化合物またはその塩であり、
前記環状部は下記式（６）で表わされる構造を有するペプチド化合物またはその塩を含有するスクリーニング用組成物。
【化１０】
2018174078.tif 000338
式中、
Ｘは、Ｓ、ＮＨ、またはＯを示し、
Ａは、単結合、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基、またはＢが結合している炭素原子と一緒になって＊−ＣＲ0＝Ｃ（Ｂ）−で表わされる２価の基を示し、Ｒ0は水素原子または置換基を示し、＊はＸと結合する位置を示し、
Ｂは、単結合または置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示し、ただし、ＡおよびＢは同時に単結合ではなく、
ｐ個のＲは、同一または異なっていても良く、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、または置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基を示し、
ＧはＧが結合している炭素がＡと一緒になって＊−ＣＲ0＝Ｃ（Ｂ）−で表わされる２価の基を示さない場合は、水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｐは、０〜４の整数を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド化合物、その製造方法、およびスクリーニング用組成物に関する。本発明はさらに、標的物質に結合するペプチド化合物の選択方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環状構造や非天然アミノ酸を含むペプチドは、膜透過性、標的結合能力および生体内安定性に優れているため、新しい創薬シーズとして注目されている。例えば、特許文献１および非特許文献１には、チオエーテル環化方法またはトリアゾール環化方法を含む環状ペプチド化合物の製造方法、並びに上記環状ペプチド化合物を用いた薬剤探索方法が記載されている。【０００３】
薬剤探索方法は、翻訳されたペプチドとそのペプチドの由来となる遺伝子が連結した複合体を形成させ、標的物質に結合したペプチド複合体の遺伝子を解読することでペプチド構造を判断することに基づいている。その複合体を形成させる方法として、特許文献２には、ペプチドアクセプターにＲＮＡ（リボ核酸）分子にクロスリンクさせる段階；ＲＮＡを翻訳してペプチド産物を生成する段階；およびＲＮＡを逆転写によってＤＮＡ（デオキシリボ核酸）・ペプチド複合体を生成する段階を含むＤＮＡ・ペプチド複合体を生成する方法が記載されている。また、特許文献３には、ＲＮＡ分子を提供する段階；およびペプチドアクセプターをＲＮＡ分子の３’末端に共有結合を形成するように化学的に連結する段階を含む、ＲＮＡ・ペプチド複合体を生成する方法が記載されている。【０００４】
一方、環状化合物を合成する方法としてはいくつかの方法が知られている。例えば、特許文献４には、ジスルフィドの還元およびアミド結合の加水分解を伴う、チアゾリン環を形成する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−０５８０９２号公報
【特許文献２】国際公開第２０００／０３２８２３号パンフレット
【特許文献３】特開２０１０−２８４１７２号公報
【特許文献４】米国特許第２０１５／００５６１３７号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】特殊環状ペプチドの翻訳合成と医薬品探索への展開、生化学  第８２巻  第６号、ｐｐ５０５−５１４、２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、細胞膜透過性に優れた新規なペプチド化合物、その製造方法およびスクリーニング用組成物を提供することである。本発明の別の課題は、標的物質に結合するペプチド化合物の選択方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に対し鋭意検討を重ねた結果、本明細書に記載する一般式（１）で表される化合物、またはその塩が、優れた細胞膜透過性を有することを見出した。更に、本発明者らは、一般式（１）で表される化合物またはその塩が、環状ペプチドライブラリーとして有用な化合物であることを見出した。また、本発明者らは、無細胞翻訳系において、シアノ基を有するアミノ酸と一般式（２）で表されるアミノ酸（システイン等の反応性基を有するアミノ酸）とを反応させ、環状ペプチドを製造できることを見出した。更に、本発明者らは、シアノ基を有するアミノ酸および一般式（２）で表されるアミノ酸との反応による環状ペプチドの製造方法が、環状ペプチドライブラリーを構築するうえで、有用であることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。【０００９】
＜１＞  下記式（１）で表わされるペプチド化合物またはその塩。
【化１】
2018174078.tif 000003
式中、
Ｘは、Ｓ、ＮＨ、またはＯを示し、
Ａは、単結合、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基、またはＢが結合している炭素原子と一緒になって＊−ＣＲ0＝Ｃ（Ｂ）−で表わされる２価の基を示し、Ｒ0は水素原子または置換基を示し、＊はＸと結合する位置を示し、
Ｂは、単結合または置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示し、ただし、ＡおよびＢは同時に単結合ではなく、
Ｚは、ヒドロキシル基またはアミノ基を示し、
ｐ個のＲは、同一または異なっていても良く、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、または置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基を示し、
ＧはＧが結合している炭素がＡと一緒になって＊−ＣＲ0＝Ｃ（Ｂ）−で表わされる２価の基を示さない場合は、水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｔ1個のＷ1は、同一または異なっていても良く、単結合、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5ＮＨ）−、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示し、
ｔ2個のＷ2は、同一または異なっていても良く、単結合、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＣＯ−、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、−（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示し、
Ｊは水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｎ個のＸａａはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基または任意のアミノ酸類縁体残基を示し、
ｍ個のＸｂｂはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基または任意のアミノ酸類縁体残基を示し、
ｐは、０〜４の整数を示し、
ｔ1は、０〜６の整数を示し、
ｔ2は、０〜６の整数を示し、
ｍは０〜２０の整数を示し、
ｎは１〜２０の整数を示す。【００１０】
＜２＞  上記式（１）で表わされるペプチド化合物が、下記式（１Ａ）で表わされるペプチド化合物である、＜１＞記載のペプチド化合物またはその塩。
【化２】
2018174078.tif 000004
式中、
Ａ1は、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基、またはＮが結合している炭素原子と一緒になって＊−ＣＨ＝Ｃ（Ｎ）−で表わされる２価の基を示し、＊はＳと結合する位置を示し、
ｐ1個のＲ1は、同一または異なっていても良く、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、または置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基を示し、
ｔ11個のＷ11は、同一または異なっていても良く、単結合、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5ＮＨ）−、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示し、
ｔ21個のＷ21は、同一または異なっていても良く、単結合、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＣＯ−、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、−（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示し、
Ｇ1はＧ1が結合している炭素がＡ1と一緒になって＊−ＣＨ＝Ｃ（Ｎ）−で表わされる２価の基を示さない場合は、水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
Ｊ1は水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｐ1は、０〜４の整数を示し、
ｔ11は、０〜６の整数を示し、
ｔ21は、０〜６の整数を示し、
Ｚ、Ｘａａ、Ｘｂｂ、ｍ、およびｎは、＜１＞における定義と同様の意味を示す。【００１１】
＜３＞  上記式（１）で表わされるペプチド化合物が、下記式（１Ｂ）で表わされるペプチド化合物である、＜１＞記載のペプチド化合物またはその塩。
【化３】
2018174078.tif 000005
式中、
Ａ2は、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基、またはＮが結合している炭素原子と一緒になって＊−ＣＨ＝Ｃ（Ｎ）−で表わされる２価の基を示し、＊はＳと結合する位置を示し、
Ｇ2はＧ2が結合している炭素がＡ2と一緒になって＊−ＣＨ＝Ｃ（Ｎ）−で表わされる２価の基を示さない場合は、水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｐ2個のＲ2は、同一または異なっていても良く、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、または置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基を示し、
Ｊ2は水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｐ2は０〜４の整数を示し、
ｑ2は、０〜６の整数を示し、
ただし、ｐ2とｑ2が同時に０になることはない。
Ｚ、Ｘａａ、Ｘｂｂ、ｍ、およびｎは、＜１＞における定義と同様の意味を示す。【００１２】
＜４＞  上記Ｒ、Ｒ1またはＲ2が、置換基を有していてもよいベンゾチアゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾイミダゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾチオフェニレン基、置換基を有していてもよいベンゾフラニレン基、置換基を有していてもよいイソベンゾフラニレン基、置換基を有していてもよいインドリレン基、置換基を有していてもよいキノリニレン基、置換基を有していてもよいイソキノリニレン基、置換基を有していてもよいキナゾリレン基、置換基を有していてもよいシンノリレン基、置換基を有していてもよいインダゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾチアジアゾリレン基、置換基を有していてもよいピリジニレン基、置換基を有していてもよいピリダジニレン基、置換基を有していてもよいピリミジニレン基、置換基を有していてもよいピラジニレン基、置換基を有していてもよいチアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサジアゾリレン基、置換基を有していてもよいチアジアゾリレン基、置換基を有していてもよいピラゾリレン基、置換基を有していてもよいイソキサゾリレン基、置換基を有していてもよいトリアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾチアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリダジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリミジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピラジニレン基、置換基を有していてもよいピラゾロピリミジニレン基、置換基を有していてもよいピロロピリジニレン基、置換基を有していてもよいチオフェニレン基、置換基を有していてもよいフラニレン基、置換基を有していてもよいピローレン基、置換基を有していてもよいフェニレン基、および置換基を有していてもよいナフチレン基から選ばれる少なくとも１つの構造である、＜１＞から＜３＞のいずれか一に記載のペプチド化合物またはその塩。
＜５＞  上記ＲまたはＲ1またはＲ2が、置換基を有していてもよいベンゾチオフェニレン基、置換基を有していてもよいインドリレン基、置換基を有していてもよいキノリニレン基、置換基を有していてもよいインダゾリレン基、置換基を有していてもよいピロロピリジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピラジニレン基、置換基を有していてもよいピリジニレン基、置換基を有していてもよいピリダジニレン基、置換基を有していてもよいピラジニレン基、置換基を有していてもよいチアゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいトリアゾリレン基、置換基を有していてもよいチオフェニレン基、および置換基を有していてもよいフェニレン基から選ばれる少なくとも１つの構造である、＜１＞から＜４＞のいずれか一に記載のペプチド化合物またはその塩。
＜６＞  上記ペプチド化合物の環状部を構成するアミノ酸残基およびアミノ酸類縁体残基の総数が３〜２０である、＜１＞から＜５＞のいずれか一に記載のペプチド化合物またはその塩。
＜７＞  上記ペプチド化合物を構成するアミノ酸残基およびアミノ酸類縁体残基の総数が３〜２０である、＜１＞から＜６＞のいずれか一に記載のペプチド化合物またはその塩。【００１３】
＜８＞  ＜１＞から＜７＞のいずれか一に記載のペプチド化合物またはその塩を含むスクリーニング用組成物。
＜９＞  ＜１＞から＜７＞のいずれか一に記載のペプチド化合物またはその塩を含むペプチドライブラリーと標的物質とを接触させ、上記標的物質に結合するペプチド化合物またはその塩を選択することを含む、標的物質に結合するペプチド化合物またはその塩の選択方法。
＜１０＞  シアノ基を側鎖に有するアミノ酸残基またはアミノ酸類縁体残基をペプチド鎖中またはＣ末端に有し、下記式（２）の構造をＮ末端に有するペプチド鎖を製造する工程；および、
上記のシアノ基と、下記式（２）の構造とを反応させて、下記式（３）で表わされる結合を有する環状部を形成させる工程を含む、
ペプチド化合物またはその塩の製造方法。
【化４】
2018174078.tif 000006
式中、Ｘは、Ｓ、ＮＨ、または、Ｏを示し、
Ａは、単結合、または、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示し、
Ｂは、単結合、または、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示し、
Ｇは、水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
＊は、ペプチド鎖との結合部位を示し、
ＡおよびＢは同時に単結合ではない：
【化５】
2018174078.tif 000007
式中、Ｘ、Ａ、ＧおよびＢは、式（２）における定義と同義である。
＜１１＞  ＜１０＞に記載の方法により環状部を有するペプチド化合物を製造する工程；および
上記ペプチド化合物またはその塩を含むペプチドライブラリーと標的物質とを接触させ、上記標的物質に結合するペプチド化合物またはその塩を選択する工程を含む、標的物質に結合するペプチド化合物の選択方法。
＜１２＞  次の工程を含む、＜１１＞に記載の選択方法。
（i）核酸ライブラリーを調製し、非天然アミノ酸でアシル化された伸長用ｔＲＮＡを含む無細胞翻訳系によって翻訳し、非天然アミノ酸がペプチド配列にランダムに導入されたペプチド化合物を含むライブラリーを調製する工程；
（ii）ペプチドライブラリーを標的物質に接触させる工程；
（iii）標的物質に結合するペプチド化合物を選択する工程、
上記（i）の工程において、ライブラリーを構成する各ペプチド化合物がライブラリーを構成する各ペプチド化合物をコードする核酸配列から翻訳され、核酸配列とその翻訳産物であるペプチドが連結されて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイライブラリーが構築され、
上記（iii）の工程が、標的物質に結合するペプチド化合物をコードする核酸配列を決定し、核酸配列からペプチド配列を決定し、ペプチド化合物を選択することを含む。【００１４】
＜１３＞  上記シアノ基を側鎖に有する上記アミノ酸残基および／または上記アミノ酸類縁体残基が下記式（４）で表わされる構造である、＜１０＞から＜１２＞のいずれか一に記載の方法。
【化６】
2018174078.tif 000008
式中、
ｍ1個のＱ1は、同一または異なってもよく、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基、および置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基の少なくとも１種を示し、
Ｔ1は水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｎ1は、０〜６の整数を示し、ｍ1は、１から４の整数を示し、
＊は、ペプチド鎖を構成するアミノ酸残基および／またはアミノ酸類縁体残基との結合位置を示す。
＜１４＞  上記シアノ基を側鎖に有する上記アミノ酸残基および／または上記アミノ酸類縁体残基が下記式（５）で表わされる構造である、＜１０＞から＜１２＞のいずれか一に記載の方法。
【化７】
2018174078.tif 000009
式中、
ｌ2個のＱ2は、同一または異なっていても良く、単結合、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5ＮＨ）−、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示し、
ｎ2個のＱ3は、同一または異なっても良く、単結合、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＣＯ−、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、−（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示し、
ｍ2個のＱ4は、同一または異なっても良く、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基、および置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基の少なくとも１種を示し、
Ｔ2は水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｌ2は、０〜６の整数を示し、
ｎ2は、０〜６の整数を示し、
ｍ2は、１〜４の整数を示し、
＊は、ペプチド鎖を構成するアミノ酸残基および／またはアミノ酸類縁体残基との結合位置を示す。【００１５】
＜１５＞  上記Ｑ1またはＱ4が、置換基を有していてもよいベンゾチアゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾイミダゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾチオフェニレン基、置換基を有していてもよいベンゾフラニレン基、置換基を有していてもよいイソベンゾフラニレン基、置換基を有していてもよいインドリレン基、置換基を有していてもよいキノリニレン基、置換基を有していてもよいイソキノリニレン基、置換基を有していてもよいキナゾリレン基、置換基を有していてもよいシンノリレン基、置換基を有していてもよいインダゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾチアジアゾリレン基、置換基を有していてもよいピリジニレン基、置換基を有していてもよいピリダジニレン基、置換基を有していてもよいピリミジニレン基、置換基を有していてもよいピラジニレン基、置換基を有していてもよいチアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサジアゾリレン基、置換基を有していてもよいチアジアゾリレン基、置換基を有していてもよいピラゾリレン基、置換基を有していてもよいイソキサゾリレン基、置換基を有していてもよいトリアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾチアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリダジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリミジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピラジニレン基、置換基を有していてもよいピラゾロピリミジニレン基、置換基を有していてもよいピロロピリジニレン基、置換基を有していてもよいチオフェニレン基、置換基を有していてもよいフラニレン基、置換基を有していてもよいピローレン基、置換基を有していてもよいフェニレン基、および置換基を有していてもよいナフチレン基から選ばれる少なくとも１つの構造である、
＜１３＞または＜１４＞に記載の方法。
＜１６＞  上記Ｑ1またはＱ4が、置換基を有していてもよいベンゾチオフェニレン基、置換基を有していてもよいインドリレン基、置換基を有していてもよいキノリニレン基、置換基を有していてもよいインダゾリレン基、置換基を有していてもよいピロロピリジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピラジニレン基、置換基を有していてもよいピリジニレン基、置換基を有していてもよいピリダジニレン基、置換基を有していてもよいピラジニレン基、置換基を有していてもよいチアゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいトリアゾリレン基、置換基を有していてもよいチオフェニレン基、および置換基を有していてもよいフェニレン基から選ばれる少なくとも１つの構造である、＜１３＞から＜１５＞の何れか一に記載の方法。【００１６】
＜１７＞  上記式（２）が下記式（２Ａ）で表わされる構造である、＜１０＞から＜１６＞のいずれか一に記載の方法。
【化８】
2018174078.tif 000010
式中、Ａ1は、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示す。Ｇは水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示す。
＜１８＞  上記式（２）が下記式から選ばれる少なくとも１つの構造である、＜１０＞から＜１７＞のいずれか一に記載の方法。
【化９】
2018174078.tif 000011
＜１９＞  上記シアノ基と、上記式（２）の構造とを反応させて、上記式（３）で表わされる結合を形成させる工程の反応溶媒が水である、＜１０＞から＜１８＞のいずれか一に記載の方法。
＜２０＞  上記シアノ基と、上記式（２）の構造とを反応させて、上記式（３）で表わされる結合を形成させる工程の反応液のｐＨが６．０〜８．５である、＜１０＞から＜１９＞のいずれか一に記載の方法。
＜２１＞  上記環状部を有するペプチド化合物の環状部を構成するアミノ酸残基およびアミノ酸類縁体残基の総数が３〜２０である、＜１０＞から＜２０＞のいずれか一に記載の方法。
＜２２＞  上記環状部を有するペプチド化合物を構成するアミノ酸残基およびアミノ酸類縁体残基の総数が３〜２０である、＜１０＞から＜２１＞のいずれか一に記載の方法。
＜２３＞  上記シアノ基を有するヘテロアリーレン基、シアノ基を有するアリーレン基またはシアノ基を有するアルキレン基を側鎖に有するアミノ酸残基またはアミノ酸類縁体残基が、天然アミノ酸の翻訳において割り当てられているコドンに対して天然アミノ酸を除外することによって空になるコドン、終止コドン、または四塩基コドンを用いて、ペプチド鎖中に導入される、＜１０＞から＜２２＞のいずれか一に記載の方法。【００１７】
＜２４＞  環状部を有するペプチド化合物またはその塩であり、
上記環状部は下記式（６）で表わされる構造を有するペプチド化合物またはその塩を含有するスクリーニング用組成物。
【化１０】
2018174078.tif 000012
式中、
Ｘは、Ｓ、ＮＨ、またはＯを示し、
Ａは、単結合、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基、またはＢが結合している炭素原子と一緒になって＊−ＣＲ0＝Ｃ（Ｂ）−で表わされる２価の基を示し、Ｒ0は水素原子または置換基を示し、＊はＸと結合する位置を示し、
Ｂは、単結合または置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示し、ただし、ＡおよびＢは同時に単結合ではなく、
ｐ個のＲは、同一または異なっていても良く、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、または置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基を示し、
ＧはＧが結合している炭素がＡと一緒になって＊−ＣＲ0＝Ｃ（Ｂ）−で表わされる２価の基を示さない場合は、水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｐは、０〜４の整数を示す。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のペプチド化合物は、細胞膜透過性に優れている。本発明のペプチド化合物の製造方法によれば、細胞膜透過性に優れた環状ペプチド化合物を製造することができる。本発明のペプチド化合物およびスクリーニング用組成物は、標的物質に結合する環状ペプチド化合物の選択方法において有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、特に断らない限り、％は質量％である。
本発明において、特に断らない限り、各用語は、次の意味を有する。
本発明において、「〜」とは、その前後に記載される数値を下限値および上限値として含む意味で使用される。
【００２０】
ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を意味する。
Ｃ1-6アルキル基とは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、２−メチルブチル、２−ペンチル、３−ペンチルおよびヘキシル基などの直鎖状または分枝鎖状のＣ1-6アルキル基を意味する。
Ｃ3-8シクロアルキル基とは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロヘプチル基などのＣ3-8シクロアルキル基を意味する。
Ｃ1-6アルコキシＣ1-6アルキル基とは、メトキシメチルおよび１−エトキシエチル基などのＣ1-6アルキルオキシＣ1-6アルキル基を意味する。
Ｃ6-20アリールＣ1-6アルキル基とは、ベンジル、ジフェニルメチル、トリチル、フェネチル、２−フェニルプロピル、３−フェニルプロピルおよびナフチルメチル基などのＣ6-20アリールＣ1-6アルキル基（アルキル部分がＣ1-6アルキルであるアラルキル基）を意味する。
【００２１】
Ｃ1-6アルコキシ基とは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、シクロプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、シクロブトキシ、ペンチルオキシおよびヘキシルオキシ基などの直鎖状、環状または分枝鎖状のＣ1-6アルキルオキシ基を意味する。
Ｃ6-20アリールオキシ基とは、フェノキシおよびナフチルオキシ基などのＣ6-20アリールオキシ基を意味する。
【００２２】
Ｃ1-6アルキルチオ基とは、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、ｓｅｃ−ブチルチオ、イソブチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、ペンチルチオ、イソペンチルチオ、２−メチルブチルチオ、２−ペンチルチオ、３−ペンチルチオおよびヘキシルチオ基などの直鎖状または分枝鎖状Ｃ1-6アルキルチオ基を意味する。
Ｃ6-20アリールチオ基とは、フェニルチオおよび２−ナフチルチオ基などのＣ6-20アリールチオ基を意味する。
【００２３】
Ｃ1-6アルキルアミノ基とは、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ブチルアミノ、ｓｅｃ−ブチルアミノ、ｔｅｒｔ−ブチルアミノ、ペンチルアミノおよびヘキシルアミノ基などの直鎖状または分枝鎖状のＣ1-6アルキルアミノ基を意味する。
Ｃ6-20アリールアミノ基とは、フェニルアミノ、ｐ−トリルアミノおよび２−ナフチルアミノ基などのＣ6-20アリールアミノ基を意味する。
【００２４】
Ｃ2-6アルケニル基とは、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、１，３−ブタジエニル、ペンテニルおよびヘキセニル基などの直鎖状または分枝鎖状のＣ2-6アルケニル基を意味する。
Ｃ3-8シクロアルケニル基とは、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル基などのＣ3-8シクロアルケニル基を意味する。
Ｃ2-6アルキニル基とは、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニルおよびヘキシニル基などの直鎖状または分枝鎖状のＣ2-6アルキニル基を意味する。
【００２５】
Ｃ1-6アルキルカルボニル基とは、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリルおよびピバロイル基などのＣ1-6アルキルカルボニル基を意味する。
Ｃ1-30アルキルカルボニル基とは、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ピバロイルおよびパルミトイル基などのＣ1-30アルキルカルボニル基を意味する。
Ｃ6-20アリールカルボニル基とは、ベンゾイルなどの炭素数６〜２０のアリールカルボニル基を意味する。
複素環式カルボニル基とは、ニコチノイル、テノイル、ピロリジノカルボニルまたはフロイル基などの複素環式カルボニル基を意味する。
【００２６】
Ｃ1-6アルキルスルホニル基とは、メチルスルホニル、エチルスルホニルおよびプロピルスルホニル基などのＣ1-6アルキルスルホニル基を意味する。
Ｃ6-20アリールスルホニル基とは、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニルまたはナフタレンスルホニル基などのＣ6-20アリールスルホニル基を意味する。
Ｃ1-6アルキルスルフィニル基とは、メチルスルフィニル、エチルスルフィニルおよびプロピルスルフィニル基などのＣ1-6アルキルスルフィニル基を意味する。
Ｃ6-20アリールスルフィニル基とは、ベンゼンスルフィニル、ｐ−トルエンスルフィニルまたはナフタレンスルフィニル基などのＣ6-20アリールスルフィニル基を意味する。
【００２７】
Ｃ6-20アリール基とは、フェニルまたはナフチル基などの炭素数６〜２０のアリール基を意味する。
【００２８】
単環の含窒素複素環式基とは、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピロリニル、ピロリル、ピペリジル、テトラヒドロピリジル、ジヒドロピリジル、ピリジル、ホモピペリジニル、オクタヒドロアゾシニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピペラジニル、ジアゼパニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ホモピペラジニル、トリアゾリルおよびテトラゾリル基などの上記環を形成する異項原子を含み、単環の含窒素ヘテロアリールも含む単環の含窒素複素環式基を意味する。
単環の含酸素複素環式基とは、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、フラニル、テトラヒドロピラニル、ピラニル、１，３−ジオキサニルおよび１，４−ジオキサニル基などの上記環を形成する異項原子として酸素原子のみを含む単環の含酸素複素環式基を意味する。
【００２９】
単環の含硫黄複素環式基とは、チエニル、テトラヒドロチオピラニル、１，１−ジオキシドテトラヒドロチオピラニルなどを意味する。
単環の含窒素・酸素複素環式基とは、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、モルホリニルおよびオキサゼパニル基などの上記環を形成する異項原子として窒素原子および酸素原子のみを含む単環の含窒素・酸素複素環式基を意味する。
単環の含窒素・硫黄複素環式基とは、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、チオモルホリニル、１−オキシドチオモルホリニルおよび１，１−ジオキシドチオモルホリニル基などの上記環を形成する異項原子として窒素原子および硫黄原子のみを含む単環の含窒素・硫黄複素環式基を意味する。
単環の複素環式基とは、単環の含窒素複素環式基、単環の含酸素複素環式基、単環の含硫黄複素環式基、単環の含窒素・酸素複素環式基または単環の含窒素・硫黄複素環式基を意味する。
【００３０】
二環式の含窒素複素環式基とは、インドリニル、インドリル、イソインドリニル、イソインドリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ピラゾロピリジニル、キノリル、テトラヒドロキノリニル、キノリル、テトラヒドロイソキノリニル、イソキノリニル、キノリジニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、ジヒドロキノキサリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、プリニル、プテリジニルおよびキヌクリジニル基などの上記環を形成する異項原子として窒素原子のみを含む二環式の含窒素複素環式基を意味する。
二環式の含酸素複素環式基とは、２，３−ジヒドロベンゾフラニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、クロマニル、クロメニル、イソクロマニル、１，３−ベンゾジオキソリル、１，３−ベンゾジオキサニルおよび１，４−ベンゾジオキサニル基などの上記環を形成する異項原子として酸素原子のみを含む二環式の含酸素複素環式基を意味する。
【００３１】
二環式の含硫黄複素環式基とは、２，３−ジヒドロベンゾチエニルおよびベンゾチエニル基などの上記環を形成する異項原子として硫黄原子のみを含む二環式の含硫黄複素環式基を意味する。
二環式の含窒素・酸素複素環式基とは、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾモルホリニル、ジヒドロピラノピリジル、ジオキソロピリジル、フロピリジニル、ジヒドロジオキシノピリジルおよびジヒドロピリドオキサジニル基などの上記環を形成する異項原子として窒素原子および酸素原子のみを含む二環式の含窒素・酸素複素環式基を意味する。
【００３２】
二環式の含窒素・硫黄複素環式基とは、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリルおよびベンゾチアジアゾリル基などの上記環を形成する異項原子として窒素原子および硫黄原子を含む二環式の含窒素・硫黄複素環式基を意味する。
二環式の複素環式基とは、二環式の含窒素複素環式基、二環式の含酸素複素環式基、二環式の含硫黄複素環式基、二環式の含窒素・酸素複素環式基または二環式の含窒素・硫黄複素環式基を意味する。
【００３３】
スピロ式複素環式基とは、２，６−ジアザスピロ［３．３］ヘプチル、２，７−ジアザスピロ［３．５］ノニル、２−オキサ−６−アザスピロ［３．３］ヘプチル、１，４−ジオキサスピロ［４．５］デシル、１−オキサ−８−アザスピロ［４．５］デシルおよび１−チア−８−アザスピロ［４．５］デシル基などの上記環を形成する異項原子として一つ以上の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を含むスピロ式複素環式基を意味する。
架橋式複素環式基とは、３−オキサ−８−アザビシクロ［３．２．１］オクチル、８−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクチルおよびキヌクリジニル基などの上記環を形成する異項原子として一つ以上の窒素原子を含み、更に、一つ以上の酸素原子または硫黄原子を含んでもよい架橋式複素環式基を意味する。
【００３４】
複素環式基とは、単環の複素環式基、二環式の複素環式基、スピロ式複素環基および架橋式複素環基を意味する。
【００３５】
炭素数１〜６のアルキレン基とは、メチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ｎ−ブチレン、ｎ−ペンチレン、ｎ−ヘキシレン基、およびシクロへキシレンなどの直鎖状または環状のＣ1-6アルキレン基を意味する。
炭素数６〜１０のアリーレン基とは、フェニレンまたはナフチレン基などの炭素数６〜２０のアリーレン基を意味する。
ここで、炭素数１〜６のアルキレン基、炭素数６〜１０のアリーレン基の炭素数は、置換基の炭素数は含まない。  ヘテロアリーレン基とは、２価の複素環式基を意味する。
【００３６】
ペプチド化合物は、アミノ酸またはアミノ酸類縁体がアミド結合またはエステル結合して形成される化合物の総称である。また、環状部を有するペプチド化合物（環状ペプチド化合物ともいう）は、ペプチド化合物が同一分子内で共有結合を介して環化された化合物の総称である。上記化合物をさらに化学修飾して得られる化合物も、本発明のペプチド化合物に含まれる。本発明のペプチド化合物は直鎖部を有していてもよい。
【００３７】
ペプチド化合物を構成するアミノ酸およびアミノ酸類縁体は、それぞれアミノ酸残基およびアミノ酸類縁体残基ということがある。アミノ酸残基およびアミノ酸類縁体残基とは、アミノ酸およびアミノ酸類縁体残基に由来する１価または２価の基を意味する。
【００３８】
本発明におけるアミノ酸とはα、βおよびγ−アミノ酸であり、天然アミノ酸（天然アミノ酸とはタンパク質に含まれる２０種類のアミノ酸を指す。具体的にはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏを指す）に限定されず、非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸は、上記天然アミノ酸以外のアミノ酸を指す。タンパク質に含まれる２０種類のアミノ酸以外の自然界に存在する天然アミノ酸は非天然アミノ酸とする。α−アミノ酸の場合、Ｌ型アミノ酸でもＤ型アミノ酸でもよく、α，α−ジアルキルアミノ酸でもよい。アミノ酸側鎖は、水素原子の他にも例えば、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、置換基を有していてもよいＣ3-8シクロアルキル基、置換基を有していてもよいＣ2-6アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ2-6アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ6-20アリール基、置換基を有していてもよい複素環式基、置換基を有していてもよいＣ6-20アリールＣ1-6アルキル基などから選択される基で置換されていてもよい。
【００３９】
アミノ酸類縁体とは、好ましくはα−ヒドロキシカルボン酸、および、α-メルカプトカルボン酸である。α―ヒドロキシカルボン酸、および、α-メルカプトカルボン酸の側鎖は、アミノ酸と同様水素原子以外にも様々な置換基を有していてもよい（自由な置換基を有していてもよい）。α−ヒドロキシカルボン酸、および、α-メルカプトカルボン酸の立体構造はアミノ酸のＬ型またはＤ型の何れに対応するものでもよく、側鎖は、例えば、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、置換基を有していてもよいＣ3-8シクロアルキル基、置換基を有していてもよいＣ2-6アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ2-6アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ6-20アリール基、置換基を有していてもよい複素環式基、置換基を有していてもよいＣ6-20アリールＣ1-6アルキル基などから選択される基で置換されていてもよい。置換基の数は１つに限定されず、２つ以上有していてもよい。例えば、Ｓ原子を有し、さらにアミノ基やハロゲン原子などの官能基を有していてもよい。
【００４０】
＜本発明のペプチド化合物またはその塩＞
本発明のペプチド化合物またはその塩は、下記式（１）で表わされるペプチド化合物またはその塩である。本発明のペプチド化合物またはその塩は、細胞膜透過性に優れており、好ましくは代謝安定性にも優れている。
【化１１】
2018174078.tif 000013
【００４１】
Ｘは、Ｓ、ＮＨ、またはＯを示す。Ｘは、好ましくはＳを示す。
【００４２】
Ａは、単結合、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基、またはＢが結合している炭素原子と一緒になって＊−ＣＲ0＝Ｃ（Ｂ）−で表わされる２価の基を示し、Ｒ0は水素原子または置換基を示し、＊はＸと結合する位置を示す。
Ａは、好ましくは、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基、または、Ｂが結合している炭素原子と一緒になって＊−ＣＲ0＝Ｃ（Ｂ）−で表わされる２価の基を示し、Ｒ0は水素原子または置換基を示す。
Ａは、より好ましくは、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示す。
Ａは、さらに好ましくは、エチレン基、または置換基を有していてもよいメチレン基を示す。
Ａは、特に好ましくは、メチレン基を示す。
Ｒ0は、好ましくは、水素原子を示す。
【００４３】
Ｂは、単結合または置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示し、ただし、ＡおよびＢは同時に単結合ではない。
Ｂは、好ましくは単結合を示す。
【００４４】
ＡおよびＢの定義において、「置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基」における置換基としては、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、Ｃ6-20アリール基、複素環式基、Ｃ6-20アリールＣ1-6アルキル基を挙げることができる。
Ｒ0の定義における置換基としては、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、Ｃ6-20アリール基、複素環式基、Ｃ6-20アリールＣ1-6アルキル基を挙げることができる。
【００４５】
Ｇは、Ｇが結合している炭素がＡと一緒になって＊−ＣＲ0＝Ｃ（Ｂ）−で表わされる２価の基を示さない場合は、水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示す。
Ｇは、好ましくはメチル基、エチル基、または水素原子であり、より好ましくは水素原子である。
Ｚは、ヒドロキシル基またはアミノ基を示す。Ｚは、好ましくはアミノ基を示す。
【００４６】
Ｒは、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、または置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基を示す。
Ｒである置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基としては、置換基を有していてもよいフェニレン基、置換基を有していてもよいナフチレン基が好ましく、置換基を有していてもよいフェニレン基がより好ましい。
Ｒの好ましい例としては、置換基を有していてもよいベンゾチアゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾイミダゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾチオフェニレン基、置換基を有していてもよいベンゾフラニレン基、置換基を有していてもよいイソベンゾフラニレン基、置換基を有していてもよいインドリレン基、置換基を有していてもよいキノリニレン基、置換基を有していてもよいイソキノリニレン基、置換基を有していてもよいキナゾリレン基、置換基を有していてもよいシンノリレン基、置換基を有していてもよいインダゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾチアジアゾリレン基、置換基を有していてもよいピリジニレン基、置換基を有していてもよいピリダジニレン基、置換基を有していてもよいピリミジニレン基、置換基を有していてもよいピラジニレン基、置換基を有していてもよいチアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサジアゾリレン基、置換基を有していてもよいチアジアゾリレン基、置換基を有していてもよいピラゾリレン基、置換基を有していてもよいイソキサゾリレン基、置換基を有していてもよいトリアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾチアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリダジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリミジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピラジニレン基、置換基を有していてもよいピラゾロピリミジニレン基、置換基を有していてもよいピロロピリジニレン基、置換基を有していてもよいチオフェニレン基、置換基を有していてもよいフラニレン基、置換基を有していてもよいピローレン基、置換基を有していてもよいフェニレン基、および置換基を有していてもよいナフチレン基から選ばれる少なくとも１つの構造が挙げられる。
【００４７】
Ｒのより好ましい例としては、置換基を有していてもよいベンゾチオフェニレン基、置換基を有していてもよいインドリレン基、置換基を有していてもよいキノリニレン基、置換基を有していてもよいインダゾリレン基、置換基を有していてもよいピロロピリジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピラジニレン基、置換基を有していてもよいピリジニレン基、置換基を有していてもよいピリダジニレン基、置換基を有していてもよいピラジニレン基、置換基を有していてもよいチアゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいトリアゾリレン基、置換基を有していてもよいチオフェニレン基、および置換基を有していてもよいフェニレン基から選ばれる少なくとも１つの構造が挙げられる。
【００４８】
Ｗ1は、同一または異なっていても良く、単結合、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5ＮＨ）−、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示す。好ましくは、単結合、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5ＮＨ）−、または−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5Ｏ）−を示す。
Ｗ2は、同一または異なっていても良く、単結合、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＣＯ−、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、−（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示す。好ましくは、単結合、−ＮＨＣＯ−、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基を示す。
Ｒ、Ｗ1およびＷ2の定義における置換基、並びにＲの好ましい例およびＲのより好ましい例として例示した構造における置換基としては、置換基群Ａ1に記載した置換基を挙げることができる。
【００４９】
置換基群Ａ1：
ハロゲン原子、
シアノ基、
ニトロ基、
ホルミル基、
カルボキシル基、
スルホ基、
ヒドロキシル基、
アミノ基、
メルカプト基、
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ1-6アルキル基、
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ3-8シクロアルキル基、
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ1-6アルコキシＣ1-6アルキル基、
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ6-20アリールＣ1-6アルキル基、
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ1-6アルコキシ基、
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ6-20アリールオキシ基、
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ1-6アルキルアミノ基、
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ6-20アリールアミノ基、
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ1-6アルキルチオ基、
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ6-20アリールチオ基、
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ2-6アルケニル基、
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ3-8シクロアルケニル基、
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ2-6アルキニル基、
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ6-20アリール基、
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよい複素環式基、
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ1-30アルキルカルボニル基、
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ6-20アリールカルボニル基、
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ1-6アルキルスルホニル基、
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ6-20アリールスルホニル基、
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ1-6アルキルスルフィニル基、および
置換基群Ａ2から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ6-20アリールスルフィニル基
【００５０】
置換基群Ａ2：
ハロゲン原子、
ヒドロキシル基、
シアノ基、
置換基群Ａ3から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ1-6アルキル基、
置換基群Ａ3から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ3-8シクロアルキル基、
置換基群Ａ3から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ1-6アルコキシ基、
置換基群Ａ3から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ1-6アルコキシＣ1-6アルキル基、
置換基群Ａ3から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ1-6アルキルカルボニル基、
置換基群Ａ3から選択される一つ以上の置換基を有してもよいＣ1-6アルキルスルホニル基、
置換基群Ａ3から選択される一つ以上の置換基を有してもよい複素環式基、
ＮＲ12Ｒ13（Ｒ12およびＲ13は、それぞれ独立に水素原子、Ｃ1-6アルキル基）、
置換基群Ａ3から選択される一つ以上の置換基を有してもよい複素環式カルボニル基。
【００５１】
置換基群Ａ3：
ハロゲン原子、
ヒドロキシル基、
シアノ基
Ｃ1-6アルキル基、
Ｃ1-6アルコキシ基、
【００５２】
Ｊは水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
好ましくはメチル基または水素原子であり、より好ましくは水素原子である。
【００５３】
ｎ個のＸａａはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基または任意のアミノ酸類縁体残基を示す。
ｍ個のＸｂｂはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基または任意のアミノ酸類縁体残基を示す。
【００５４】
ｐは０〜４の整数を示し、好ましくは０〜２を示し、より好ましくは０〜１を示す。
ｔ1は、０〜６の整数を示し、好ましくは０〜２の整数を示す。
ｔ2は、０〜６の整数を示し、好ましくは０〜２の整数を示す。
【００５５】
ｍは０〜２０の整数を示す。ｍは、好ましくは、０〜１０、より好ましくは、０〜５の整数を示す。
ｎは１〜２０の整数を示す。ｎは、好ましくは、１〜１８、より好ましくは、３〜１３の整数を示す。
ペプチド化合物の環状部を構成するアミノ酸残基およびアミノ酸類縁体残基の総数は、３〜２０であることが好ましく、５〜１５であることがより好ましい。
ペプチド化合物を構成するアミノ酸残基およびアミノ酸類縁体残基の総数は３〜２０であることが好ましく、５〜２０であることがより好ましい。
【００５６】
好ましくは、式（１）で表わされるペプチド化合物は、下記式（１Ａ）で表わされるペプチド化合物である。
【化１２】
2018174078.tif 000014
【００５７】
Ａ1は、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示し、またはＮが結合している炭素原子と一緒になって＊−ＣＨ＝Ｃ（Ｎ）−で表わされる２価の基を示し、＊はＳと結合する位置を示す。
Ａ1は、好ましくは、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示す。
Ａ1は、より好ましくは、エチレン基、または置換基を有していてもよいメチレン基を示す。
Ａ1は、さらに好ましくは、メチレン基を示す。
Ａ1の定義における置換基は、式（１）のＡの定義について上記したものと同様である。
Ｇ1はＧ1が結合している炭素がＡ1と一緒になって＊−ＣＨ＝Ｃ（Ｎ）−で表わされる２価の基を示さない場合は、水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示す。Ｇ1は、好ましくは、エチル基、メチル基、または水素原子を示し、さらに好ましくは水素原子を示す。
【００５８】
Ｒ1は、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、または置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基を示す。
Ｒ1は、好ましくは、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、または置換基を有していてもよいフェニレン基を示す。
Ｒ1の好ましい例、およびＲ1のより好ましい例は、Ｒの好ましい例、およびＲのより好ましい例と同様である。
Ｒ1の定義における置換基は、式（１）のＲの定義について上記したものと同様である。
【００５９】
Ｗ11は、単結合、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5ＮＨ）−、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示す。好ましくは、単結合、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5ＮＨ）−、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5Ｏ）−を示す。
Ｗ21は、単結合、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＣＯ−、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、−（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示す。好ましくは、単結合、−ＮＨＣＯ−、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基を示す。
【００６０】
Ｊ1は水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
好ましくはメチル基、水素原子である。
【００６１】
ｐ1は、０〜４の整数を示し、好ましくは０または１を示す。
ｔ11は、０〜６の整数を示し、好ましくは０〜２の整数を示す。
ｔ21は、０〜６の整数を示し、好ましくは０〜２の整数を示す。
Ｚ、Ｘａａ、Ｘｂｂ、ｍ、およびｎは、（１）における定義と同様の意味を示す。
【００６２】
好ましくは式（１）で表わされるペプチド化合物が、下記式（１Ｂ）で表わされるペプチド化合物である。
【化１３】
2018174078.tif 000015
【００６３】
Ａ2は、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基、またはＮが結合している炭素原子と一緒になって＊−ＣＨ＝Ｃ（Ｎ）−で表わされる２価の基を示し、＊はＳと結合する位置を示す。
Ａ2は、好ましくは、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示す。
Ａ2は、より好ましくは、エチレン基、または置換基を有していてもよいメチレン基を示す。
Ａ2は、さらに好ましくは、メチレン基を示す。
Ａ2の定義における置換基は、式（１）のＡの定義について上記したものと同様である。
【００６４】
Ｇ2はＧ2が結合している炭素がＡ2と一緒になって＊−ＣＨ＝Ｃ（Ｎ）−で表わされる２価の基を示さない場合は、水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示す。Ｇ2は、好ましくは、エチル基、メチル基、水素原子を示す。
【００６５】
Ｒ2は、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、または置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基を示す。
Ｒ2は、好ましくは、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、または置換基を有していてもよいフェニレン基を示す。
Ｒ2の好ましい例、およびＲ2のより好ましい例は、Ｒの好ましい例、およびＲのより好ましい例と同様である。
Ｒ2の定義における置換基は、式（１）のＲの定義について上記したものと同様である。
【００６６】
Ｊ2は水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
好ましくはメチル基、水素原子である。
【００６７】
ｐ2は０〜４の整数を示し、好ましくは０〜２の整数を示し、より好ましくは０または１を示す。
ｑ2は０〜６の整数を示し、好ましくは０〜４の整数を示し、より好ましくは０〜２の整数を示し、特に好ましくは０または１を示す。
ただし、ｐ2とｑ2が同時に０になることはない。
Ｚ、Ｘａａ、Ｘｂｂ、ｍ、およびｎは、（１）における定義と同様の意味を示す。
【００６８】
ペプチド化合物またはその塩としては、通常知られているアミノ基などの塩基性基、カルボキシル基などの酸性基、およびヒドロキシル基における塩を挙げることができる。
なお、本明細書において単にペプチド化合物という場合、ペプチド化合物の塩も包含される。
【００６９】
塩基性基における塩としては、たとえば、塩酸、臭化水素酸、硝酸および硫酸などの鉱酸との塩；ギ酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、アスパラギン酸、トリクロロ酢酸およびトリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸との塩；ならびにメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸およびナフタレンスルホン酸などのスルホン酸との塩が挙げられる。
【００７０】
酸性基における塩としては、たとえば、ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウムおよびマグネシウムなどの第二族金属との塩；アンモニウム塩；ならびにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジル−β−フェネチルアミン、１−エフェナミンおよびＮ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩などが挙げられる。
【００７１】
ペプチド化合物またはその塩において、異性体（たとえば、光学異性体および幾何異性体など）が存在する場合、本発明は、それらの異性体を包含し、また、溶媒和物、水和物および種々の形状の結晶を包含する。
【００７２】
＜スクリーニング用組成物＞
本発明によれば、上記した本発明のペプチド化合物またはその塩を含むスクリーニング用組成物が提供される。
本発明によればさらに、環状部を有するペプチド化合物またはその塩であり、上記環状部は下記式（６）で表わされる構造を有するペプチド化合物またはその塩を含有するスクリーニング用組成物が提供される。
【化１４】
2018174078.tif 000016
式中、
Ｘは、Ｓ、ＮＨ、またはＯを示し、
Ａは、単結合、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基、またはＢが結合している炭素原子と一緒になって＊−ＣＲ0＝Ｃ（Ｂ）−で表わされる２価の基を示し、Ｒ0は水素原子または置換基を示し、＊はＸと結合する位置を示し、
Ｂは、単結合または置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示し、ただし、ＡおよびＢは同時に単結合ではなく、
ｐ個のＲは、同一または異なっていても良く、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、または置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基を示し、
ＧはＧが結合している炭素がＡと一緒になって＊−ＣＲ0＝Ｃ（Ｂ）−で表わされる２価の基を示さない場合は、水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｐは、０〜４の整数を示す。
【００７３】
式（６）における記号の意味、好ましい範囲は、式（１）について上記したものと同様である。
スクリーニングの標的物質およびスクリーニングについては、本明細書中において後記する。
【００７４】
＜ペプチド化合物の製造方法＞
本発明のペプチド化合物の製造方法は特に限定されず、無細胞翻訳系を使用する方法で製造してもよいし、ペプチドの化学合成により製造してもよい。
【００７５】
例えば、シアノ基を側鎖に有するアミノ酸残基またはアミノ酸類縁体残基をペプチド鎖中またはＣ末端に有し、下記式（２）の構造をＮ末端に有するペプチド鎖（鎖状ペプチド）を製造し、シアノ基と式（２）の構造とを反応させて下記式（３）で表わされる結合を有する環状部を形成させることによって、天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含む非環状のペプチド化合物から環状部を有するペプチド化合物を製造することができる。
【００７６】
本発明のペプチド化合物は化学合成により製造することもできる。ペプチド化合物の合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ペプチド化合物の固相合成は、当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護としてＦｍｏｃ基（Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基）を使用するＦｍｏｃ基合成法、並びにアミノ基の保護としてＢｏｃ基（tert-Butyl Oxy Carbonyl基）を使用するＢｏｃ基合成法などが挙げられる。ペプチド化合物の化学合成は、一般的には自動ペプチド合成装置により行うことができる。
【００７７】
【化１５】
2018174078.tif 000017
式（２）中、Ｘは、Ｓ、ＮＨ、または、Ｏを示す。Ｘは、好ましくはＳを示す。
Ａは、単結合、または、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示す。
Ａは、好ましくは、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示す。
Ａは、より好ましくは、エチレン基、または置換基を有していてもよいメチレン基を示す。
Ａは、さらに好ましくは、メチレン基を示す。
【００７８】
Ｂは、単結合、または、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示す。ただし、ＡおよびＢは同時に単結合ではない。
Ｂは、好ましくは単結合を示す。
Ｇは、水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示す。Ｇは、好ましくは水素原子を示す。
＊は、ペプチド鎖との結合部位を示し、
【００７９】
【化１６】
2018174078.tif 000018
式中、Ｘ、Ａ、ＧおよびＢは、式（２）における定義と同義である。
【００８０】
ＡおよびＢの定義において、「置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基」における置換基としては、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、Ｃ6-20アリール基、複素環式基、Ｃ6-20アリールＣ1-6アルキル基を挙げることができる。
【００８１】
シアノ基を側鎖に有するアミノ酸残基またはアミノ酸類縁体残基は、好ましくは、下記式（４）で表わされる構造である。
【化１７】
2018174078.tif 000019
式（４）中、ｍ1個のＱ1は、同一または異なってもよく、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基、および置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基の少なくとも１種を示す。
Ｑ1は、好ましくは、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、または置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基を示す。
Ｑ1は、より好ましくは、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、または置換基を有していてもよいフェニレン基を示す。
【００８２】
Ｔ1は水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
好ましくはメチル基、水素原子である。
【００８３】
ｎ1は、０〜６の整数を示し、好ましくは０〜３の整数を示し、より好ましくは１または２を示す、さらに好ましくは１を示す。
ｍ1は、１〜４の整数を示し。好ましくは１または２を示し、より好ましくは１を示す。
＊は、ペプチド鎖を構成するアミノ酸残基および／またはアミノ酸類縁体残基との結合位置を示す。
【００８４】
シアノ基を側鎖に有するアミノ酸残基またはアミノ酸類縁体残基は、好ましくは、下記式（５）で表わされる構造である。
【化１８】
2018174078.tif 000020
【００８５】
式（５）中、Ｑ2は、単結合、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5ＮＨ）−、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示す。Ｑ2は、好ましくは、単結合、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5ＮＨ）−、−ＣＨ2（Ｃ6Ｈ5Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基を示す。
【００８６】
Ｑ3は、単結合、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＣＯ−、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、−（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示す。Ｑ3は、好ましくは、単結合、−ＮＨＣＯ−、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基を示す。
【００８７】
Ｑ4は、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基、および置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基の少なくとも１種を示す。Ｑ4は、好ましくは、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基を示す。
【００８８】
Ｔ2は水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
好ましくはメチル基、水素原子である。
【００８９】
ｌ2は、０〜６の整数を示し、好ましくは０〜２の整数を示す。
ｎ2は、０〜６の整数を示し、好ましくは０〜２の整数を示す。
ｍ2は、１〜４の整数を示し、好ましくは１または２を示す。
＊は、ペプチド鎖を構成するアミノ酸残基および／またはアミノ酸類縁体残基との結合位置を示す。
【００９０】
Ｑ1およびＱ4の好ましい例としては、置換基を有していてもよいベンゾチアゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾイミダゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾチオフェニレン基、置換基を有していてもよいベンゾフラニレン基、置換基を有していてもよいイソベンゾフラニレン基、置換基を有していてもよいインドリレン基、置換基を有していてもよいキノリニレン基、置換基を有していてもよいイソキノリニレン基、置換基を有していてもよいキナゾリレン基、置換基を有していてもよいシンノリレン基、置換基を有していてもよいインダゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾチアジアゾリレン基、置換基を有していてもよいピリジニレン基、置換基を有していてもよいピリダジニレン基、置換基を有していてもよいピリミジニレン基、置換基を有していてもよいピラジニレン基、置換基を有していてもよいチアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサジアゾリレン基、置換基を有していてもよいチアジアゾリレン基、置換基を有していてもよいピラゾリレン基、置換基を有していてもよいイソキサゾリレン基、置換基を有していてもよいトリアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾチアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリダジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリミジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピラジニレン基、置換基を有していてもよいピラゾロピリミジニレン基、置換基を有していてもよいピロロピリジニレン基、置換基を有していてもよいチオフェニレン基、置換基を有していてもよいフラニレン基、置換基を有していてもよいピローレン基、置換基を有していてもよいフェニレン基、および置換基を有していてもよいナフチレン基から選ばれる少なくとも１つの構造が挙げられる。
【００９１】
Ｑ1およびＱ4のより好ましい例としては、置換基を有していてもよいベンゾチオフェニレン基、置換基を有していてもよいインドリレン基、置換基を有していてもよいキノリニレン基、置換基を有していてもよいインダゾリレン基、置換基を有していてもよいピロロピリジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピラジニレン基、置換基を有していてもよいピリジニレン基、置換基を有していてもよいピリダジニレン基、置換基を有していてもよいピラジニレン基、置換基を有していてもよいチアゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいトリアゾリレン基、置換基を有していてもよいチオフェニレン基、および置換基を有していてもよいフェニレン基から選ばれる少なくとも１つの構造が挙げられる。
【００９２】
式（２）で表わされる構造は、好ましくは下記式（２Ａ）で表わされる構造である。
【化１９】
2018174078.tif 000021
式（２Ａ）中、Ａ1は、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示す。Ａ1は、好ましくは、エチレン基、または置換基を有していてもよいメチレン基を示す。Ａ1は、より好ましくは、メチレン基を示す。
Ｇは水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示す。Ｇは、好ましくはエチル基、メチル基、または水素原子を示す。
【００９３】
式（２）は、より好ましくは、下記式から選ばれる少なくとも１つの構造である。
【化２０】
2018174078.tif 000022
【００９４】
好ましくは、シアノ基と、式（２）の構造とを反応させて、式（３）で表わされる結合を形成させる工程の反応溶媒は水または有機溶媒である。非環状ペプチド並びに環状ペプチドの製造方法として無細胞翻訳系による合成を利用する場合、反応溶媒としては水が好ましい。
水としては、純粋な蒸留水、緩衝液および塩（ＮａＣｌ等）の水溶液、または上記蒸留水または上記水溶液においてさらに有機溶媒および／または界面活性剤を含むものでもよい。無細胞翻訳系により合成する場合には、このように反応溶媒として水を使用することが好ましい。緩衝液としてはＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸）バッファー、リン酸緩衝液等の緩衝能を有する適当な緩衝液を挙げることができる。有機溶媒としては、水または緩衝液と混合できる有機溶媒が好ましく、例えば、メタノール、ジメチルスルホキシド、またはポリエチレングリコール等が挙げられる。界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（商品名）、Ｂｒｉｊ（商品名）、Ｔｗｅｅｎ（商品名）等を挙げることができる。好ましい有機溶媒含率の範囲は、２０％以下であり、より好ましい範囲は、１５％以下であり、更に好ましい範囲は、１０％以下である。有機溶媒が含まれる場合には有機溶媒含率は０％より大きくなる。
また、非環状ペプチド並びに環状ペプチドの製造方法として化学合成を利用する場合、反応溶媒としては有機溶媒が好ましい。有機溶媒としては、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリルが挙げられる。この場合、水と混合して使用してもよい。有機溶媒と水を混合して使用する場合には、有機溶媒を２０％以上含有することが好ましく、より好ましくは２０％以上７０％以下であり、更に好ましくは３０％以上６０％以下である。
【００９５】
好ましくは、シアノ基と、式（２）の構造とを反応させて、式（３）で表わされる結合を形成させる工程のｐＨは６．０〜８．５である。ｐＨを上記の範囲内に調整することによって、収率良く環状ペプチドを得ることができる。
【００９６】
シアノ基を側鎖に有するアミノ酸残基および／またはアミノ酸類縁体残基をペプチド鎖中またはＣ末端に有し、式（２）の構造をＮ末端に有するペプチド鎖を製造する工程は、好ましくは、無保護の非環状ペプチドを合成する工程である。無保護の非環状ペプチドを合成することによって、その後の工程（環状ペプチドの合成工程）で目的物である環状ペプチドの精製を簡素化することができる。また、合成したペプチドをペプチドライブラリーとして使用する際には、合成後脱保護工程を挟まずにそのまま評価可能となる。シアノ基を側鎖に有するアミノ酸残基および／またはアミノ酸類縁体残基としては、シアノ基を有するヘテロアリーレン基、シアノ基を有するアリーレン基またはシアノ基を有するアルキレン基を側鎖に有するアミノ酸残基および／またはアミノ酸類縁体残基が好ましい。
【００９７】
シアノ基と、記式（２）の構造とを反応させて、式（３）で表わされる結合を形成させる工程は、好ましくは、無触媒下で行われる工程である。上記工程を無触媒下で行うことができることは、簡便性の観点から好ましい。
【００９８】
標的に対する結合性（薬理活性）と膜透過性の両立の観点から、環状部を有するペプチド化合物の環状部を構成するアミノ酸残基およびアミノ酸類縁体残基の総数は、好ましくは、３〜２０であり、より好ましくは、５〜１５である。
好ましくは、環状部を有するペプチド化合物を構成するアミノ酸残基およびアミノ酸類縁体残基の総数は３〜２０であり、より好ましくは、５〜２０である。
【００９９】
無細胞翻訳系でペプチドを合成する場合、シアノ基側鎖に有するアミノ酸残基またはアミノ酸類縁体残基は、終止コドン、四塩基コドン、天然アミノ酸の翻訳において割り当てられているコドンに対して天然アミノ酸を除外することによって空になるコドンを利用して導入することができる。好ましくは、終止コドン、四塩基コドンを用いて導入することである。
【０１００】
＜ペプチド化合物の選択方法＞
本発明によれば、本発明のペプチド化合物またはその塩を含むペプチドライブラリーと標的物質とを接触させ、標的物質に結合するペプチド化合物またはその塩を選択することを含む、標的物質に結合するペプチド化合物の選択方法が提供される。
本発明によればさらに、上記した本発明の方法により環状部を有するペプチド化合物を製造する工程；および上記ペプチド化合物またはその塩を含むペプチドライブラリーと標的物質とを接触させ、標的物質に結合するペプチド化合物またはその塩を選択する工程を含む、標的物質に結合するペプチド化合物の選択方法が提供される。
【０１０１】
ペプチドライブラリーとは、多種類のペプチドで構成された集合体である。選択とは、集合体から目的とする機能を備えたペプチドを選択する行為であり、スクリーニングと称される場合もある。
【０１０２】
ペプチドライブラリーは、本発明のペプチド化合物に対して、天然アミノ酸から構成される非環状のペプチド化合物を含むものでもよいし、天然アミノ酸から構成される環状のペプチド化合物を含むものでもよい。
本発明のペプチド化合物に対して、天然アミノ酸から構成される非環状ペプチド化合物または天然アミノ酸から構成される環状のペプチド化合物を含むものが好ましい。
【０１０３】
本発明による、標的物質に結合するペプチド化合物の選択方法は、好ましくは、次の工程を含む。
（i）核酸ライブラリーを調製し、非天然アミノ酸でアシル化された伸長用ｔＲＮＡを含む無細胞翻訳系によって翻訳し、非天然アミノ酸がペプチド配列にランダムに導入されたペプチドを含むライブラリーを調製する工程；
（ii）ペプチドライブラリーを標的物質に接触させる工程；
（iii）標的物質に結合するペプチドを選択する工程。
【０１０４】
（i）の工程においては、ライブラリーを構成する各ペプチドがペプチドをコードする核酸配列から翻訳され、核酸配列とその翻訳産物であるペプチドが連結されて、ｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイライブラリーが構築されるものでもよい。
核酸配列において、ペプチドをコードする領域は、異なる複数のトリプレットの繰り返しからなるランダム配列を含むものでもよく、ランダム配列中のトリプレットの少なくとも一部が非天然アミノ酸を指定するコドンに対応する配列であり、非天然アミノ酸でアシル化された伸長用ｔＲＮＡのアンチコドンと非天然アミノ酸を指定するコドンの対合により非天然アミノ酸がペプチド配列に導入されていてもよい。
（iii）の工程は、標的物質に結合するペプチドをコードする核酸配列を決定し、核酸配列からペプチド配列を決定し、ペプチド化合物を選択することを含むものでもよい。
【０１０５】
本発明における「核酸」には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）あるいは、人工塩基を有するヌクレオチド誘導体を含むこともできる。また、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むこともできる。本発明における核酸は、目的とする遺伝情報が保持される限り、これらの核酸のいずれか、あるいは混成とすることもできる。すなわち、ＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリッドヌクレオチドやＤＮＡとＲＮＡのような異なる核酸が１本鎖に連結されたキメラ核酸も本発明における核酸に含まれる。
本発明においては、これら核酸を鋳型として含む、ディスプレイライブラリーなどの核酸ライブラリーを好適に用いることができる。
【０１０６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイとは、無細胞翻訳系（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系ともいう）を用いて合成されたペプチドが遺伝情報と対応付けて提示されたものであり、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、ＤＮＡディスプレイ等が公知である。いずれのディスプレイも、ｍＲＮＡもしくはＤＮＡに記録された遺伝情報と、その遺伝情報によってコードされるペプチドを連結することにより、［遺伝情報］−［翻訳産物］の複合体として対応付けるメカニズムを有する。リボソームディスプレイにおいては、ｍＲＮＡ−リボソーム−ペプチドの複合体を形成する。ｍＲＮＡディスプレイにおいては、ｍＲＮＡ−ペプチドの複合体が形成される。ＤＮＡディスプレイにおいては、ＤＮＡ−ペプチドの複合体が形成される。本発明においては任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイライブラリーの利用が可能である。
【０１０７】
所望の固定した標的にライブラリーを接触させ、標的に結合しない分子を洗い流すことで結合するペプチドの濃縮が可能である(パニング法)。このような過程を経て選択されたペプチドに対応付けられている遺伝子情報を解析することで標的に結合したタンパク質の配列を明らかにすることができる。例えば、アミノアシルｔＲＮＡのアナログである抗生物質ピューロマイシンがリボソームによるｍＲＮＡ翻訳伸長中の蛋白質に非特異的に連結されることを利用する方法がmRNA display(Proc Natl Acad Sci USA. 1997;94:12297-302. RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins. Roberts RW, Szostak JW.)ないしはin vitro virus(FEBS Lett. 1997;414:405-8. In vitro virus: bonding of mRNA bearing puromycin at the 3'-terminal end to the C-terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro. Nemoto N, Miyamoto-Sato E, Husimi Y, Yanagawa H.)として報告されている。
【０１０８】
Ｔ７プロモーターなどのプロモーターを含むＤＮＡライブラリーから転写にて得たｍＲＮＡのライブラリーの３'端にピューロマイシンなどのスペーサーを結合しておき、無細胞翻訳系でｍＲＮＡをタンパク質に翻訳させるとピューロマイシンがリボソームによってアミノ酸と間違ってタンパク質に取り込まれ、ｍＲＮＡとこれにコードされる蛋白質が連結され、ｍＲＮＡとその産物が対応付けられたライブラリーになる。この過程では大腸菌などの形質転換を含まないため高い効率が実現され、大規模なディスプレイライブラリー(１０9〜１０14種類）を構築することができる。パニングで濃縮、選択された分子についている遺伝子情報を含むタグであるｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅し、塩基配列を解析することで結合した蛋白の配列を明らかにすることができる。ライブラリーの鋳型となるＤＮＡライブラリーのアミノ酸残基を固定しない箇所は塩基を混ぜて合成することによって得ることができる。Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの４塩基の混合（Ｎ）の３の倍数個の繰り返し、もしくはコドンの一文字目二文字目はＮ、三文字目はＷ、Ｍ、Ｋ、Ｓなどの２塩基の混合として合成する、さらに導入するアミノ酸の種類を１６以下に抑えるのであれば、三文字目を１種類の塩基にする方法もある。また、コドンの３文字に相当するコドンユニットを用意し、これを任意の割合で混合して合成に用いることによってアミノ酸残基の出現頻度を自由に調整できる。
【０１０９】
無細胞翻訳系を利用したディスプレイライブラリーには、ｍＲＮＡディスプレイの他に、ペプチドとピューロマイシンの複合体が結合しているペプチドをコードするｃＤＮＡからなるライブラリーであるｃＤＮＡディスプレイ(Nucleic Acids Res. 2009;37(16):e108.cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions.Yamaguchi J, Naimuddin M, Biyani M, Sasaki T, Machida M, Kubo T, Funatsu T, Husimi Y, Nemoto N.)、ｍＲＮＡ翻訳中にリボソームと翻訳産物が比較的安定な複合体であることを利用したリボソームディスプレイ(Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91:9022-6. An in vitro polysome display system for identifying ligands from very large peptide libraries. Mattheakis LC, Bhatt RR, Dower WJ.)、bacteriophage endonuclease P2AがＤＮＡと共有結合を形成することを利用したcovalentディスプレイ(Nucleic Acids Res. 2005;33:e10.Covalent antibody display-an in vitro antibody-DNA library selection system.Reiersen H, Lobersli I, Loset GA, Hvattum E, Simonsen B, Stacy JE, McGregor D, Fitzgerald K, Welschof M, Brekke OH, Marvik OJ.)、微生物のプラスミドの複製開始蛋白ＲｅｐＡが複製開始点ｏｒｉに結合することを利用したＣＩＳディスプレイ(Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101:2806-10. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Odegrip R, Coomber D, Eldridge B, Hederer R, Kuhlman PA, Ullman C, FitzGerald K, McGregor D.)が知られている。また、ＤＮＡライブラリーを構成するＤＮＡの１分子毎に転写翻訳系をｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌエマルジョンやリポソームに封入し、翻訳反応を行うｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ(Nat Biotechnol. 1998;16:652-6. Man-made cell-like compartments for molecular evolution. Tawfik DS, Griffiths AD.)も知られている。適宜、公知の方法を用いて上記方法を使用することができる。
【０１１０】
本発明では、以下に記載の無細胞翻訳系を用いてこれら核酸ライブラリーを翻訳することができる。無細胞翻訳系を使用する場合、目的の核酸の下流にスペーサーをコードする配列を含むことが好ましい。スペーサー配列としては、グリシンやセリンを含む配列が挙げられるがこれに限定しない。またピューロマイシン、その誘導体などリボソームによる翻訳時にペプチドに取り込まれる化合物と核酸ライブラリーの間には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ヘキサエチレングリコール（ｓｐｃ１８）のポリマー（例えば５つのポリマー）などで形成されるリンカーを含むことが好ましい。
【０１１１】
無細胞翻訳系
本発明のペプチド化合物の製造方法では、無細胞翻訳系などのタンパク質製造システムを使用することが好ましい。無細胞翻訳系とは、細胞より抽出したリボソームの他、翻訳に関与する蛋白因子群、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）などのエネルギー源、その再生系を組み合わせたものでｍＲＮＡを蛋白に翻訳することが出来る。本発明の無細胞翻訳系には、これら以外にも、開始因子、伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼなどを含むことができる。これらの因子は、種々の細胞の抽出液から精製することによって得ることができる。因子を精製するための細胞は、例えば原核細胞、または真核細胞を挙げることができる。原核細胞としては、大腸菌細胞、高度好熱菌細胞、または枯草菌細胞を挙げることができる。真核細胞としては、酵母細胞、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、植物細胞、昆虫細胞、または動物細胞を材料にしたものが知られている。
【０１１２】
無細胞翻訳系は材料の細胞を破砕し、遠心分離、透析などによって調製した抽出液にｔＲＮＡ、アミノ酸、ＡＴＰなどを加えたものである。例えば、大腸菌(Methods Enzymol.  1983;101:674-90. Prokaryotic coupled transcription-translation. Chen HZ, Zubay G.)、酵母(J. Biol. Chem. 1979 254: 3965-3969. The preparation and characterization of  a cell-free system from Saccharomyces cerevisiae that translates natural messenger  ribonucleic acid. E Gasior, F Herrera, I Sadnik, C S McLaughlin, and K Moldave)、小麦胚芽(Methods Enzymol. 1983;96:38-50. Cell-free translation of messenger RNA  in a wheat germ system. Erickson AH, Blobel G.)、ウサギ網状赤血球(Methods Enzymol.  1983;96:50-74. Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates  for the translation of eukaryotic messenger RNA. Jackson RJ, Hunt T.)、Hela細胞（Methods Enzymol. 1996;275:35-57.Assays for poliovirus polymerase, 3D(Pol), and  authentic RNA replication in HeLa S10 extracts. Barton DJ, Morasco BJ, Flanegan  JB.）、昆虫細胞(Comp Biochem Physiol B. 1989;93:803-6. Cell-free translation in  lysates from Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) cells. Swerdel MR,  Fallon AM.)を材料にしたものを用いることができる。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼを加えることでＤＮＡからの転写、翻訳を共役させることができる。一方、ＰＵＲＥｆｒｅｘ（登録商標）は大腸菌の翻訳に必要な蛋白因子類、エネルギー再生系酵素、リボソームそれぞれを抽出、精製し、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）などと混合した再構成無細胞翻訳系である。不純物の含有量が少ないだけでなく、再構成系であるため排除したい蛋白因子、アミノ酸を含まない系を容易に作製することができる((i)Nat Biotechnol. 2001;19:751-5. Cell-free  translation reconstituted with purified components. Shimizu Y, Inoue A, Tomari Y,  Suzuki T, Yokogawa T, Nishikawa K, Ueda T.(ii)Methods Mol Biol. 2010;607:11-21.PURE  technology.Shimizu Y, Ueda T.)。本発明のおいては、適宜、公知の方法を用いて上記方法を使用することができる。
【０１１３】
リボソーム、ｔＲＮＡ等、無細胞翻訳系に含まれる種々の因子は大腸菌細胞や酵母細胞から当業者に周知の方法によって精製することができる。またｔＲＮＡやアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は天然に存在するものに加え、人工ｔＲＮＡや非天然アミノ酸を認識する人工アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いることもできる。人工ｔＲＮＡや人工アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いることにより部位特異的に非天然アミノ酸を導入したペプチドを合成することができる。
【０１１４】
非天然アミノ酸のペプチドへの翻訳導入には、直交性を有し効率よくリボソームに取り込まれるｔＲＮＡ（(i)Biochemistry. 2003;42:9598-608.Adaptation of an orthogonal  archaeal leucyl-tRNA and synthetase pair for four-base, amber, and opal suppression.  Anderson JC, Schultz PG., (ii)Chem Biol. 2003;10:1077-84.Using a solid-phase  ribozyme aminoacylation system to reprogram the genetic code.Murakami H, Kourouklis  D, Suga H. （iii）特許第4917044号）のアミノアシル化が必要である。ｔＲＮＡをアミノアシル化する方法として以下の５つの方法を用いることができる。
【０１１５】
（１）細胞内ではｔＲＮＡのアミノアシル化の過程でｔＲＮＡと結合するアミノ酸別にアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が用意されている。ある種のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素がＮ−Ｍｅ  Ｈｉｓなど非天然アミノ酸を許容することを利用する方法、すなわち非天然アミノ酸を許容する変異アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用意し、これを利用する方法である（(i)Proc Natl Acad Sci U S A.  2002;99:9715-20. An engineered Escherichia coli tyrosyl-tRNA synthetase for  site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in eukaryotic  translation and its application in a wheat germ cell-free system.Kiga D, Sakamoto  K, Kodama K, Kigawa T, Matsuda T, Yabuki T, Shirouzu M, Harada Y, Nakayama H, Takio  K, Hasegawa Y, Endo Y, Hirao I, Yokoyama S.(ii)Science. 2003;301:964-7.An expanded  eukaryotic genetic code.Chin JW, Cropp TA, Anderson JC, Mukherji M, Zhang Z, Schultz  PG. Chin,JW.(iii) Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103:4356-61.Enzymatic  aminoacylation of tRNA with unnatural amino acids.Hartman MC, Josephson K, Szostak  JW.）。
【０１１６】
（２）試験管内でｔＲＮＡをアミノアシル化しその後アミノ酸を化学修飾する方法も用いることができる（J Am Chem Soc. 2008;130:6131-6.Ribosomal synthesis of N-methyl  peptides.Subtelny AO, Hartman MC, Szostak JW.）。
【０１１７】
（３）ｔＲＮＡの３’末端のＣＣＡ配列からＣＡを除いたものと別途調製したアミノアシ
ル化したｐｄＣｐＡ（デオキシシチジンとアデノシンから構成されるジヌクレオチド）とをＲＮＡリガーゼで結合させることでアミノアシルｔＲＮＡを得ることができる(Biochemistry. 1984;23:1468-73.T4 RNA  ligase mediated preparation of novel "chemically misacylated" tRNAPheS.Heckler TG,  Chang LH, Zama Y, Naka T, Chorghade MS, Hecht SM.)。
【０１１８】
（４）種々の非天然アミノ酸の活性エステルをｔＲＮＡに担持させるリボザイムであるフレキシザイムによるアミノアシル化もある（J Am Chem Soc. 2002;124:6834-5.Aminoacyl-tRNA synthesis by a resin-immobilized  ribozyme.Murakami H, Bonzagni NJ, Suga H.)。ｔＲＮＡとアミノ酸活性エステルとをカチオン性ミセル中で超音波混合する方法も用いることができる(Chem Commun (Camb).  2005;(34):4321-3.Simple and quick chemical aminoacylation of tRNA in cationic  micellar solution under ultrasonic agitation. Hashimoto N, Ninomiya K, Endo T,  Sisido  M.)。
（５）ｔＲＮＡの３’末端付近に相補的なＰＮＡにアミノ酸活性エステルを結合したもの
をｔＲＮＡに加えることによってもアミノアシル化が可能である（J Am Chem Soc.  2004;126:15984-9.In situ chemical aminoacylation with amino acid thioesters linked  to a peptide nucleic acid.Ninomiya K, Minohata T, Nishimura M, Sisido  M.）。
【０１１９】
非天然アミノ酸を導入するコドンとして終止コドンを利用する方法が多く報告されているが、ＰＵＲＥｆｒｅｘ（登録商標）を用いることで天然アミノ酸、ＡＲＳを除いた合成系を構築できるため、アミノ酸をコードするコドンについて、除外した天然アミノ酸の代わりに非天然アミノ酸を導入すること、すなわち天然アミノ酸の翻訳において割り当てられているコドンに対して天然アミノ酸を除外することによって空になるコドンを利用して非天然アミノ酸を導入することができる(J Am Chem Soc. 2005;127:11727-35.Ribosomal synthesis  of unnatural peptides. Josephson K, Hartman MC, Szostak JW.)。さらに、コドンの縮重を解くことおよび四塩基コドンによるコドンの拡張により天然アミノ酸を除外することなく非天然アミノ酸を加えることができる（Kwon I,et al. Breaking the degeneracy of the genetic code. J Am Chem Soc. 2003,  125, 7512-3. T, Hohsaka et al . J Am Chem Soc. 1996, 118, 9778.）。即ち、シアノ基を有するヘテロアリーレン基、シアノ基を有するアリーレン基またはシアノ基を有するアルキレン基を側鎖に有するアミノ酸残基またはアミノ酸類縁体残基としては、天然アミノ酸の翻訳において割り当てられているコドンに対して天然アミノ酸を除外することによって空になるコドン、終止コドン、または四塩基コドンの何れを用いてもよい。
【０１２０】
天然の翻訳では、以下に示す普遍遺伝暗号表に従って、６４種類のコドンそれぞれに、２０種類のタンパク質性アミノ酸および翻訳の終止（停止）が割り当てられている。
【０１２１】
【表１】
2018174078.tif 000023
【０１２２】
本発明では、ペプチド鎖伸長反応で使用されるコドンに加えて、開始コドンも書き換えることができる。開始コドンは、翻訳の開始を指定するコドンであり、ｍＲＮＡ上でペプチドのＮ末端となる開始アミノ酸をコードする。ｍＲＮＡの翻訳の開始には、開始ｔＲＮＡと呼ばれる特定のｔＲＮＡが必要である。翻訳が始まるには、アミノアシル化された開始ｔＲＮＡが、開始因子（ＩＦ）とともにリボソームの小サブユニットに結合し、リボソームの小サブユニットがｍＲＮＡ上の開始コドンに結合する。開始ｔＲＮＡは開始コドンに対応するアンチコドンを有し、開始コドンを認識する。普遍暗号表においては、開始コドンとしては一般的にはメチオニンのコドンであるＡＵＧが用いられるため、開始ｔＲＮＡはメチオニンに対応するアンチコドンを有し、開始ｔＲＮＡは必ずメチオニン（原核細胞ではホルミルメチオニン）を運ぶ。
【０１２３】
イニシエーションリードスルー（開始コドンの読み飛ばし）を利用することによって、上記のメチオニン以外のアミノ酸、アミノ酸類縁体またはＮ末端カルボン酸類縁体のＮ末端導入による末端が多様なペプチド化合物またはペプチド化合物ライブラリーの合成法での複数種類アミノアシル翻訳開始ｔＲＮＡの用意の必要がない方法がある。イニシエーションリードスルー（Initiation read through）とは、一般的にはタンパクやペプチドはＡＵＧコドンとしてコードされる翻訳開始アミノ酸であるメチオニンから翻訳されるが、無細胞翻訳系において翻訳開始メチオニルｔＲＮＡが含まれない場合や翻訳効率の低い非天然アミノ酸が翻訳開始ｔＲＮＡに付加されたものからの翻訳を開始させようとした際に２番目以降のコドンにコードされるアミノ酸からの翻訳産物が生じる現象を意味する。
【０１２４】
イニシエーションリードスルーを利用する方法としては、ペプチドをコードするｍＲＮＡの開始コドンの次の２番目のコドンにメチオニン以外の任意の天然アミノ酸をコードさせ、メチオニンもしくは翻訳開始メチオニンｔＲＮＡを含まない翻訳系にて翻訳させることによってＮ末端をメチオニン以外の任意の天然アミノ酸とするペプチドまたはペプチドライブラリーを作成する方法が使用できる。別報として、酵素、例えば、peptide deformylase（ペプチド  デフォルミラーゼ）とMethionine aminopeptidase（メチオニン  アミノペプチダーゼ）を作用させることによってペプチドのN末端のメチオニンを削り取る方法が知られている（Meinnel, T., et al. Biochimie (1993) 75, 1061-1075, Methionine as translation start signal: A review of the enzymes of the pathway in Escherichia  coli.）。
【０１２５】
また、他の所望のアミノ酸をアミノアシル化した翻訳開始ｔＲＮＡを用いて翻訳させることによってＮ末端を所望のアミノ酸として翻訳させる方法を使用することもできる。非天然アミノ酸のＮ末端導入ではアミノ酸の許容度が伸長時よりも高く、天然型アミノ酸と大きく構造の異なるアミノ酸、アミノ酸類縁体を利用することが知られている（J Am Chem Soc. 2009  Apr 15;131(14):5040-1.Translation initiation with initiator tRNA charged with exotic  peptides.Goto Y, Suga H.）。
【０１２６】
（ペプチドの環状化）
本発明においては、翻訳合成された非環状のペプチドの分子内特異的反応を利用して、ペプチドを環状化することができる。
ペプチドの環状化は、以下の工程（i）および（ii）により実施される。
（i）結合形成反応が可能な一組の官能基である官能基１および官能基２を分子内に有する非環状ペプチド化合物を翻訳合成によって合成する工程；および
（ii）上記官能基１および官能基２の結合形成反応によって上記非環状ペプチド化合物を環状化する工程。
【０１２７】
結合形成反応が可能な一組の官能基とは、一組の官能基間、すなわち官能基１と官能基２との間で結合形成反応が可能であり、そして、その反応の結果として、非環状ペプチド化合物を環状ペプチド化合物とする官能基の組のことである。
本発明においては、上記した一組の官能基として、シアノ基と、上記式（２）の構造との組み合わせを使用する。
即ち、本発明においては、シアノ基を側鎖に有するアミノ酸残基またはアミノ酸類縁体残基をペプチド鎖中またはＣ末端に有し、上記式（２）の構造をＮ末端に有するペプチド鎖を製造し、上記シアノ基と、上記式（２）の構造とを反応させて、本明細書に記載した式（３）で表わされる結合を形成させることにより、環状ペプチド化合物を製造することができる。
【０１２８】
非環状ペプチド化合物に存在する、上記した一組の官能基間での結合形成によって環が形成されるため、非環状ペプチド化合物を構成する要素（典型的には、アミノ酸）を一つの単位として、そのような一組の官能基は、異なった構成要素の単位上に存在することが必要である。そのような構成要素をアミノ酸化合物、構成要素の単位をアミノ酸化合物単位と称する。すなわち、非環状ペプチド化合物は、一組の官能基を異なったアミノ酸化合物単位上に有する化合物である。非環状ペプチド化合物において、一方の官能基を有するアミノ酸化合物単位と他方の官能基を有するアミノ酸化合物単位との間に１〜１８のアミノ酸化合物単位が存在することが好ましく、１〜１５のアミノ酸化合物単位が存在することがより好ましく、３〜１３のアミノ酸化合物単位が存在することが更に好ましい。
【０１２９】
官能基２を有するアミノ酸は、例えば、天然アミノ酸としては、システイン、セリン、およびスレオニンを挙げることができる。非天然アミノ酸としては、−ＳＨ基を有する非天然アミノ酸（例えば、ペニシラミン、ホモシステイン、メルカプトノルバリン等）、−ＮＨ2基を有する非天然アミノ酸（例えば、α，β−ジアミノプロピオン酸、α，γ−ジアミノ酪酸等）、またはＯＨ基を有する非天然アミノ酸（例えば、ホモセリン等）を使用することもできる。
官能基２を有するアミノ酸としては、システイン、a-メチル-システイン、ペニシラミン、ホモシステインが好ましい。官能基２を有するアミノ酸は、このアミノ酸および対応するｔＲＮＡを少なくとも含む再構成型の翻訳系でぺプチド鎖伸長反応において導入される。
【０１３０】
上記のようにして合成された非環状ペプチド化合物を環状化することによって環状ペプチド化合物が合成される。官能基１および官能基２の結合形成反応の条件は官能基の種類に応じて、設定される。
【０１３１】
非環状ペプチド化合物の環状化は、非環状ペプチド化合物を単離した後、適切な反応条件にさらすことによって行うことができる。または、非環状ペプチド化合物を単離することなく、無細胞翻訳系を適切な反応条件に調整することによって環状化を行うことができる。また、一組の官能基の種類によっては、非環状ペプチド化合物を合成するための無細胞翻訳系の条件下において環状化することがあり、この場合は、特段の反応条件の調整を行うことなく、環状ペプチド化合物を得ることができる。
【０１３２】
非環状ペプチド化合物の環状化のための好ましい反応条件については、本明細書中において上記した通りである。
【０１３３】
（ペプチドをコードする鋳型核酸）
本発明においては、無細胞翻訳系において、ペプチドをコードする領域にランダム配列を持つ鋳型核酸（ｍＲＮＡもしくは対応するＤＮＡ）から翻訳合成を行うことにより、ランダムなアミノ酸配列を持つペプチドライブラリーを合成してもよい。さらに、翻訳系をｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ技術と組み合わせることにより、ライブラリーを構成するペプチドが、ペプチドをコードする核酸配列を伴った状態でスクリーニングを行うことができる。この場合、遺伝情報が、その翻訳産物であるペプチドとして提示（ディスプレイ）されているディスプレイライブラリーから、ペプチドアプタマーの選択を行うことになる。これにより、ライブラリー中のそれぞれのランダムペプチド分子に、分子生物学的手法により増幅および読み取りが可能なタグが付加されていることになる。
【０１３４】
本発明においては、ペプチドのアミノ酸配列に対応する鋳型であるＲＮＡもしくはＤＮＡの配列を、ペプチドのランダムなライブラリーをコードするように設計してもよい。具体的には、塩基配列においてペプチドをコードする領域が、異なる複数のトリプレットの繰り返しからなるランダム配列を含み、ランダム配列中のトリプレットの少なくとも一部が非天然アミノ酸を指定するコドンに対応する配列となる。
また、ペプチドをコードする領域において、ランダム配列中の四塩基（カルテット）コドンの少なくとも一部が非天然アミノ酸を指定するコドンに対応する配列でもよい。
【０１３５】
本発明においては、ＲＮＡもしくはＤＮＡの配列が、環状ペプチドをコードするように設計してもよい。具体的には、塩基配列においてペプチドをコードする領域が、ｍＲＮＡ配列の５’から３’の向きに沿って、次の（ａ）から（ｃ）に対応するような塩基配列を順に含む：
（ａ）官能基１を持つアミノ酸を指定するコドン；
（ｂ）異なる複数のトリプレットの繰り返しからなるランダム配列、および
（ｃ）官能基２を持つアミノ酸を指定するコドン。
【０１３６】
ランダムなｍＲＮＡ配列は、その翻訳産物であるランダムなアミノ酸配列中に非天然アミノ酸が一定の確率で現れるように設計される。すなわち、上記（ｂ）のランダム配列中のトリプレットの少なくとも一部が非天然アミノ酸を指定するコドンとなることにより、翻訳産物であるランダムペプチドのアミノ酸配列の一部に非天然アミノ酸が導入される。非天然アミノ酸の導入は、リボソーム上のペプチド鎖伸長反応において、非天然アミノ酸を連結した伸長反応用ｔＲＮＡのアンチコドンと、非天然アミノ酸を指定するコドンが対合することにより達成される。さらに、結合形成反応が可能な一組の官能基である官能基１および官能基２の間の結合形成反応によって、翻訳産物であるペプチドが環状化される。上述したように、非天然アミノ酸の導入のために使用されるｔＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応で調製された人工ｔＲＮＡであることが好ましい。
【０１３７】
本発明では、目的に合わせて最適化された成分からなる無細胞翻訳系に、翻訳の鋳型となる塩基配列に対応するＤＮＡまたはＲＮＡ分子を加えて利用する。核酸配列には、生細胞を利用したタンパク質発現系と同様に、目的のアミノ酸配列をコードする領域に加えて、使用する翻訳系に合わせて、翻訳に有利な塩基配列を付加的に含むことができる。例えば、大腸菌由来のリボソームを利用する系の場合は、開始コドンの上流にＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列やイプシロン配列などを含むことにより翻訳反応の効率が上昇する。
【０１３８】
ペプチドをコードする領域のＮ末端には、開始コドンが配置される。開始コドンは通常はトリプレット配列ＡＵＧである。
【０１３９】
Ｃ末端側には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ用に、核酸分子とその翻訳産物であるペプチドを連結するための配列が含まれる。例えば、ピューロマイシンリンカーを用いたｍＲＮＡディスプレイ法を利用する場合、ｍＲＮＡライブラリーにピューロマイシンリンカーが予め連結されたものを翻訳系に加えることにより、ｍＲＮＡ−ペプチドの複合体ライブラリーが形成される。ピューロマイシンをリボソームのＡサイトに効率良く取り込ませるために、通常、ｍＲＮＡの３’末端側とピューロマイシンの間にリンカーが挿入される。ピューロマイシンはリボソーム上でペプチド転移反応の基質（アミノアシルｔＲＮＡ類似体）として機能し、伸長ペプチドのＣ末端に結合することにより、ｍＲＮＡとペプチドを連結する。ｍＲＮＡディスプレイ法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系でｍＲＮＡとペプチドを適当なリンカーを介して連結することにより遺伝子型と表現型を一体化させる技術であり、このような目的が達成される限り、ピューロマイシンに代えて他の同様の機能を有する物質を含むリンカーも利用可能であることは当業者の認識の範囲内である。
【０１４０】
ランダム配列は、任意の配列のトリプレットからなるコドンの繰り返しで構成され、一部がシアノ基を側鎖に有するアミノ酸のような非天然アミノ酸を指定するコドンとなるように設計される。また、ランダム配列中に四塩基（カルテット）コドンを含んでいても良く、その四塩基コドンにシアノ基を側鎖に有するアミノ酸のような非天然アミノ酸を指定してもよい。
【０１４１】
ランダム配列を構成するトリプレットをＮ1Ｎ2Ｎ3コドンで表して、可能な配列について説明する。Ｎ1とＮ2は、それぞれ独立して、Ａ、Ｕ、ＣまたはＧのいずれか１つであることができる。さらに、Ｎ3もＡ、Ｕ、ＣまたはＧのいずれか１つであることができる。あるいは、Ｎ3は、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧの４種の塩基のうちの任意の３種から選択されるいずれか１つであることができる。あるいは、Ｎ3は、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧの４種の塩基のうちの任意の２種から選択されるいずれか１つであることができる。あるいは、Ｎ3を、Ａ、Ｕ、ＣまたはＧの１つに定めることができる。
【０１４２】
例えば、ランダム配列を構成するｍＲＮＡ配列上のトリプレットの例として、ＮＮＵコドンまたはＮＮＫコドン｛Ｎは、Ａ、Ｕ、ＣまたはＧのいずれかのリボヌクレオチドであり、Ｋは、ＣまたはＧのいずれかのリボヌクレオチドである｝が挙げられる。
【０１４３】
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択（セレクション））
本発明において、無細胞翻訳系で構築されるペプチドライブラリーは、ｍＲＮＡディスプレイを始めとするｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ技術と完全に適合可能であるため、１０9種類以上の高い多様性からなるペプチドライブラリーから、標的に結合するペプチド分子の創出が可能である。
【０１４４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ技術は、進化分子工学のツールとして利用される。進化分子工学では、所望の機能や性質を持つタンパク質やペプチドを創製することを目的として、可能性のある遺伝子を大規模に準備し、その中から狙った表現型を有するクローンを選択する。基本的には、最初にＤＮＡ集団（ＤＮＡライブラリー）を調製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写産物としてＲＮＡ集団（ＲＮＡライブラリー）を得て、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳産物としてペプチド集団（ペプチドライブラリー）を得る。このペプチドライブラリーから、所望の機能や性質を持つものを何らかのスクリーニング系で選択することになる。例えば、特定のタンパク質に結合するペプチド分子を得たい場合は、標的タンパク質を固相化したカラムにペプチド集団を流し込み、カラムに結合したペプチド分子の混合物を回収することができる。このとき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ技術により、各ペプチド分子には、その鋳型である核酸分子がタグのように付加されている。ｍＲＮＡディスプレイライブラリーであれば、各ペプチド分子にはｍＲＮＡが付加されている。そこで、回収したペプチド−ｍＲＮＡ複合体の集団から逆転写酵素でＤＮＡに戻し、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）で増幅して狙った表現型を有するクローンが多く含まれるバイアスのかかったライブラリーを得た後に、再度同じような選択実験を行う。あるいは、ＲＮＡアプタマーを回収してしまう可能性を回避するため、核酸部分を２本鎖（ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）にする目的で、選択前に逆転写反応を行うことも可能である。この操作を繰り返すことで、世代の経過とともに所望の表現型を有するクローンが集団中で濃縮されていく。
【０１４５】
ペプチドアプタマーを同定する場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイライブラリーと標的物質を混合し、標的物質に結合したペプチドを提示する対応付け分子（活性種）を選択し、選択された対応付け分子の核酸部分からＰＣＲにより核酸ライブラリーを調製する工程を繰り返すことで、標的物質に結合するペプチドアプタマーの遺伝子をクローニングできる。
【０１４６】
標的物質としては、一般的には、タンパク質、核酸、複合脂質を含む脂質、糖鎖を含む糖、その他の生体分子など、更には金属や顔料などが挙げられる。
標的物質としては、疾患治療の生体内分子、特に、従来の分子量５００未満の低分子化合物が専有できる空間を有していない分子、あるいは抗体等の高分子化合物がアクセスすることのできない細胞内タンパク質、核酸、膜タンパク質の細胞内領域または膜タンパク質の膜貫通ドメイン等が好ましい。
【０１４７】
標的物質としては、例えば、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＧＰＣＲ）、核内受容体、プロテインキナーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、イオンチャネル、代謝酵素、Ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄタンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、脂肪酸、リン脂質、ステロールなどが挙げられる。
【０１４８】
標的物質の具体例としては、
ｃ−Ｍｙｃ、ＳＴＡＴ、ＡＰ１、ＣＲＥＢ、ＳＲＥＢＰなどの転写因子、ＧＰＲ１４３、ＧＲＭ１、ＡＤＯＲＡ１、ムスカリン性アセチルコリン受容体、カンナビノイド受容体、ＧＬＰ−１受容体、ＰＴＨ受容体などのＧタンパク質共役型受容体（Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＧＰＣＲ）、ＴＮＦ、ＴＮＦＲ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ等のサイトカインやそのレセプター、Ｐ２Ｘ受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体などのイオンチャネル型受容体、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲなどのチロシンキナーゼ型受容体、ｐ５３、ＸＩＡＰ、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−２、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＢＲＤ４、ＵＳＰ７、ＹＡＰなどの細胞質タンパク質ｍｉＲ−２１，  ｍｉＲ２０６などのｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｃｆＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡなどのＤＮＡ類が挙げられる。
また、金、銀、銅、白金、パラジウムなどの金属、あるいは、その金属塩が標的物質となってもよく、酸化チタン、硫酸バリウム、カーボンブラック、シリカ、酸化鉄、アゾ色素、フタロシアニン、アントラキノン等の顔料が標的物質となってもよい。
【０１４９】
活性種を選択するためには、［遺伝情報］−［ペプチド］複合体を標的物質と接触させ、標的物質に結合したペプチドを提示する複合体を、標的物質に結合していない他の多数の複合体から適当な方法で分離して回収する必要がある。このような回収の方法としては多くの技術が公知である。
【０１５０】
例えば、標的物質に、固相への結合により回収可能な修飾を施しておくと便利である。例えば、標的物質をビオチン修飾しておき、固相化されたビオチン結合タンパク質への特異的な結合を利用して回収してもよい。このような特異的な結合としては、ビオチン結合タンパク質（アビジン、ストレプトアビジンなど）／ビオチンの組み合わせの他にも、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／金属イオン（ニッケル、コバルトなど）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原（エピトープ）などが利用可能であるが、これらに限定されるものではない。
【０１５１】
本発明は、ペプチドライブラリーを標的物質と接触させ、標的物質に結合したぺプチドを提示する活性種を選択し、選択された活性種の核酸配列を増幅し、増幅された核酸配列を鋳型として無細胞翻訳系で再び合成されたペプチドのライブラリーから活性種を選択するというｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクションを繰り返すことにより、標的物質に結合するペプチドを創製することを含む。
【０１５２】
標的物質に結合するペプチド化合物の創製は、標的物質に結合したぺプチドを提示する活性種を回収して核酸配列を解析し、核酸配列からペプチド配列を決定し、得られたペプチド配列に基づき適当なペプチドを選択することにより、標的物質に結合するペプチドのアミノ酸配列および核酸配列を得ることを含む。さらに、得られた配列情報に基づき、任意の方法を用いて、ペプチドを合成、精製および単離することが可能である。得られたペプチドを用いて、標的タンパク質の結合評価や阻害活性の確認を行い、活性の高いペプチドを得ることができる。
【実施例】
【０１５３】
以下の実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
特に記載のない場合、カラムクロマトグラフィーによる精製は、自動精製装置ＩＳＯＬＥＲＡ（Ｂｉｏｔａｇｅ社）または中圧液体クロマトグラフＹＦＬＣ  Ｗ−ｐｒｅｐ  ２ＸＹ（山善株式会社）を使用した。
特に記載のない場合、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにおける担体は、ＳＮＡＰ  ＫＰ−Ｓｉｌ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｂｉｏｔａｇｅ社）、ハイフラッシュカラムＷ００１、Ｗ００２、Ｗ００３、Ｗ００４またはＷ００５（山善株式会社）を使用した。
ＮＨシリカは、ＳＮＡＰ  ＫＰ−ＮＨ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｂｉｏｔａｇｅ社）を使用した。【０１５４】
溶離液における混合比は、容量比である。
たとえば、「クロロホルム／メタノール＝９０／１０→５０／５０」は、「クロロホルム／メタノール＝９０／１０」の溶離液を「クロロホルム／メタノール＝５０／５０」の溶離液へ変化させたことを意味する。【０１５５】
質量スペクトル（ＭＳ）は、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＳＱＤ  ＬＣ／ＭＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ社、イオン化法：ＥＳＩ（ＥｌｅｃｔｒｏＳｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、エレクトロスプレーイオン化）法またはＬＣＭＳ−２０１０ＥＶ（島津製作所、イオン化法：ＥＳＩおよびＡＰＣＩ（Ａｔｏｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、大気圧化学イオン化）を同時に行うイオン化法を用いて測定した。
特に記載のない場合、表中のＭＳは、ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：（Ｍ＋Ｈ）を意味する。【０１５６】
マイクロウェーブ反応装置は、ＩｎｉｔｉａｔｏｒＴＭ（Ｂｉｏｔａｇｅ社）を使用した。フロー式水素化反応装置は、Ｈ−Ｃｕｂｅ（ＴｈａｌｅｓＮａｎｏ社）を使用した。【０１５７】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、内部基準としてテトラメチルシランを用い、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ３００（Ｂｒｕｋｅｒ社）を用いて測定し、全δ値をｐｐｍで示した。【０１５８】
保持時間（ＲＴ）は、ＳＱＤ（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて測定し、分（ｍｉｎ）で示した。
カラム：Ｗａｔｅｒｓ社製ＢＥＨＣ  １８  １．７μｍ，  ２．１ｘ３０  ｍｍ
溶媒：Ａ液：０．１％ギ酸−水
Ｂ液：０．１％ギ酸−アセトニトリル
グラジエントサイクル：  ０．００ｍｉｎ（Ａ液／Ｂ液＝９５／５）、２．００ｍｉｎ（Ａ液／Ｂ液＝５／９５）、３．００ｍｉｎ（Ａ液／Ｂ液＝５／９５）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：２５４ｎｍ【０１５９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization- time of flight mass spectrum）は、ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）を使用した。マトリックスは、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を使用した。【０１６０】
４−ブロモ−２−シアノチアゾールの合成
【化２１】
2018174078.tif 000024
【０１６１】
４−ブロモ−１，３−チアゾール−２−カルボアルデヒド（５００ｍｇ）のメタノール（ＭｅＯＨ）溶液５ｍＬにＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）４３０μＬおよびヒドロキシルアミン塩酸塩（２００ｍｇ）を加え、室温で１２時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、蒸留水、酢酸エチルを加え、抽出操作を行った。有機層を蒸留水および飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた残渣にジクロロメタン１０ｍＬおよび１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）４３０ｍｇを加え、室温で２時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→１０／９０）にて精製し、黄色固体の標題化合物（４５０ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：  １９０．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：  １．０６【０１６２】
４−ブロモ−２−シアノフランの合成
【化２２】
2018174078.tif 000025
４−ブロモ−２−シアノチアゾールの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：１７２．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１８【０１６３】
３−ブロモ−４−ニトロベンゾニトリルの合成
【化２３】
2018174078.tif 000026
（１）３−ブロモ−４−ニトロベンズアミドの合成
３−ブロモ−４−ニトロ安息香酸（２．３５ｇ）のアセトニトリル溶液（２０ｍＬ）に４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）（３．９５ｇ）、およびアンモニアのメタノール溶液（７ｍｏｌ／Ｌ、８ｍＬ）を加え、室温で３．５時間撹拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、淡黄色固体の標題化合物（２．２６ｇ）得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２４６．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：０．９６【０１６４】
（２）３−ブロモ−４−ニトロベンゾニトリルの合成
３−ブロモ−４−ニトロベンズアミド２．０ｇにテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１０ｍＬおよびトリエチルアミン（ＴＥＡ）４ｍＬを加えた。氷浴下でトリフルオロ酢酸無水物（ＴＦＡＡ）１．８ｍＬを滴下し、２時間撹拌した。溶媒を留去した後、得られた残渣に蒸留水、酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→１５／８５）にて精製し、淡黄色固体の標題化合物１．４５ｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２２８．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．３１【０１６５】
６−ブロモベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボニトリルの合成
【化２４】
2018174078.tif 000027
６−ブロモベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボン酸を出発原料とし、３−ブロモ−４−ニトロベンゾニトリルの合成と同様に実施した。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ：８．０３（１Ｈ，ｓ），７．８６（１Ｈ，ｓ），７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．５９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６，２．０Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２３９．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．６９【０１６６】
６−ブロモベンゾフラン−２−カルボニトリルの合成
【化２５】
2018174078.tif 000028
【０１６７】
（１）２−（５−ブロモ−２−ホルミルフェノキシ）アセトニトリルの合成
４−ブロモ−２−ヒドロキシベンズアルデヒド（１．１ｇ）にN,N-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５ｍＬ）、炭酸カリウム（１．２ｇ）およびブロモアセトニトリル（４６０μＬ）を加え、室温で１５時間撹拌した。反応溶液に蒸留水、酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→１０／９０→３０／７０）にて精製し、淡黄色オイル状の標題化合物（１．１ｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２４１．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．２５【０１６８】
（２）６−ブロモベンゾフラン−２−カルボニトリルの合成
２−（５−ブロモ−２−ホルミルフェノキシ）アセトニトリル（１．１ｇ）にＤＭＦ（１０ｍＬ）および炭酸カリウム（０．９５ｇ）を加え、１００℃で１時間撹拌した。反応溶液に蒸留水、酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→１０／９０）にて精製し、淡黄色固体の標題化合物（１．１ｇ）を得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ：７．７６（１Ｈ，ｓ），７．５９−７．４７（２Ｈ，ｍ），７．４４（１Ｈ，ｓ）．
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２２３．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．６４【０１６９】
４−ブロモ−１−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボニトリルの合成
【化２６】
2018174078.tif 000029
４−ブロモ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボニトリル（１．０６ｇ）のＴＨＦ溶液（１４ｍＬ）に３，４−ジヒドロピラン（０．９８ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（４７μＬ）を加え、６０℃で１８時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をジクロロメタンに溶解した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→１３／８７→２５／７５）にて精製し、白色固体の標題化合物（１．３０ｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２５６．８（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．４４【０１７０】
ｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−ヨードプロパノアートの合成
【化２７】
2018174078.tif 000030
トリフェニルホスフィン（ＰＰｈ3）（７．３５ｇ）およびイミダゾール（１．９６ｇ）のジクロロメタン溶液（５０ｍＬ）にヨウ素（７．２９ｇ）を氷浴下で添加した後、溶液の温度を室温まで昇温し、１時間撹拌した。その後、ｔｅｒｔ−ブチル  （ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−セリナート（Ｂｏｃ−Ｓｅｒ−ＯｔＢｕ）（５．０ｇ）のジクロロメタン溶液（１０ｍＬ）を氷浴下で滴下した。Ｂｏｃはtert-ブトキシカルボニル基を示し、ｔＢｕはｔ−ブチルを示す。滴下終了後、溶液の温度を室温まで昇温し、１６時間撹拌した。不溶物をろ別後、溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→５／９５）にて精製し、淡黄色固体の標題化合物（５．３５ｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３７２．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．８３【０１７１】
ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノキノリン−６−イル）プロパノアートの合成
【化２８】
2018174078.tif 000031
【０１７２】
亜鉛粉末（１１６ｍｇ）にＤＭＦ（２ｍＬ）およびヨウ素（２５ｍｇ）を加え、窒素雰囲気下で５分撹拌した。その後、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−ヨードプロパノアート（２２６ｍｇ）およびヨウ素（２５ｍｇ）を加え、窒素雰囲気下でさらに３０分室温で撹拌した。その溶液に６−ブロモキノリン−２−カルボニトリル（１８５ｍｇ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（Ｐｄ2（ｄｂａ）3とも記す）（１３ｍｇ）および２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２′，６′−ジメトキシビフェニル（Ｓｐｈｏｓ）（１２ｍｇ）を添加し、６０℃窒素雰囲気下で４時間撹拌した。不溶物をセライトろ過で除去し、ろ液の溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→１５／８５）にて精製し、淡黄色油状の標題化合物（９０ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３９８．２（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．７２【０１７３】
下記の表２に示す化合物の合成は、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノキノリン−６−イル）プロパノアートの合成と同様に実施した。【０１７４】
【表２−１】
2018174078.tif 000032
【表２−２】
2018174078.tif 000033
【表２−３】
2018174078.tif 000034
【０１７５】
ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル）プロパノアートの合成
【化２９】
2018174078.tif 000035
【０１７６】
（１）ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−ニトロフェニル）プロパノアートの合成
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸（Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（ｐＮＯ2）−ＯＨ）（３１８ｍｇ）をトルエン（１０ｍＬ）に溶解し、８０℃に加熱した。その溶液にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルアセタール（１．０ｍＬ）を滴下した。滴下後、８０℃で１時間撹拌した。原料の消失を液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により確認し、室温まで冷却した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→１５／８５）にて精製し、透明液体の標題化合物を３４９ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３６７．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．７５【０１７７】
（２）ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−アミノフェニル）プロパノアートの合成
還元鉄１．０ｇおよび塩化アンモニウム（３００ｍｇ）をエタノール（ＥｔＯＨ）（１５ｍＬ）および蒸留水（１５ｍＬ）に溶解し、８０℃で２０分加熱した。その溶液にｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−ニトロフェニル）プロパノアート（３４９ｍｇ）のエタノール溶液（５ｍＬ）を添加し、８０℃で１．５時間撹拌した。セライトろ過により不溶物を除去し、ろ液を減圧留去した。得られた残渣に蒸留水、酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を飽和食塩水により洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥し、溶媒を減圧留去し、茶色油状の標題化合物を３２７ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３３７．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．２０【０１７８】
（３）ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−アミノ−３−ブロモフェニル）プロパノアートの合成
ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−アミノフェニル）プロパノアート（３００ｍｇ）のＤＭＦ溶液（１０ｍＬ）にＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）１７３ｍｇを加え、室温で１時間撹拌した。反応溶液に蒸留水、酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→１５／８５→２０／８０）にて精製し、透明液体の標題化合物（２８０ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４１６．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．７２【０１７９】
（４）ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ、Ｅ）−３−（３−ブロモ−４−（（４−クロロ−５Ｈ−１，２，３−ジチアゾール−５−イリデン）アミノ）フェニル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパノアートの合成
ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−アミノ−３−ブロモフェニル）プロパノアート（２８０ｍｇ）のジクロロメタン溶液（１０ｍＬ）にＡｐｐｅｌ’ｓ  ｓａｌｔ（４，５−Ｄｉｃｈｌｏｒｏ−１,２,３−ｄｉｔｈｉａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）１７０ｍｇを添加し、室温で３．５時間撹拌した。その溶液にピリジン（Ｐｙ）１１０μＬを添加し、さらに室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→１０／９０→１５／８５）にて精製し、黄色油状の標題化合物を２８０ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：５５１．７（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：２．０９【０１８０】
（５）ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル）プロパノアートの合成
ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ、Ｅ）−３−（３−ブロモ−４−（（４−クロロ−５Ｈ−１，２，３−ジチアゾール−５−イリデン）アミノ）フェニル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパノアート（２８０ｍｇ）のピリジン溶液（５ｍＬ）にヨウ化銅（Ｉ）１１０ｍｇを添加し、マイクロ波を照射（ＩｎｉｔｉａｔｏｒＴＭ、１００℃、１．０時間、２．４５ＧＨｚ、０−２４０Ｗ）した。反応溶液に蒸留水、酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→１５／８５）にて精製し、淡黄色油状の標題化合物を１５９ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４０３．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．８２【０１８１】
ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノ−６−メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール−５−イル）プロパノアートの合成
【化３０】
2018174078.tif 000036
【０１８２】
（１）ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−３−（５−アミノ−４−ブロモ−２−メトキシフェニル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパノアートの合成
ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−アミノ−３−ブロモフェニル）プロパノアートの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４４６．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．７３【０１８３】
（２）ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ，Ｚ）−３−（４−ブロモ−５−（（４−クロロ−５Ｈ−１，２，３−ジチアゾール−５−イリデン）アミノ）−２−メトキシフェニル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパノアートの合成
ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ，Ｅ）−３−（３−ブロモ−４−（（４−クロロ−５Ｈ−１，２，３−ジチアゾール−５−イリデン）アミノ）フェニル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパノアートの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：５８１．８（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：２．１３【０１８４】
（３）ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノ−６−メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール−５−イル）プロパノアートの合成
ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル）プロパノアートの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４３４．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．８４【０１８５】
ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノ−１−メチル−１Ｈ−インドール−５−イル）プロパノアートの合成
【化３１】
2018174078.tif 000037
ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノ−１Ｈ−インドール−５−イル）プロパノアート１７９ｍｇにＤＭＦ５ｍＬ、炭酸カリウム（１８０ｍｇ）およびメタンスルホン酸メチル（ＭｅＯＭｓ）（５０μＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応溶液に蒸留水、酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→２０／８０）にて精製し、無色油状の標題化合物（１６３ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４００．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．８５【０１８６】
ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノ−１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−６−イル）プロパノアートおよびｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノ−１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−イル）プロパノアートの混合物の合成
【化３２】
2018174078.tif 000038
【０１８７】
（１）ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（３，４−ジアミノフェニル）プロパノアートの合成
還元鉄１１０ｍｇおよび塩化アンモニウム２１０ｍｇにエタノール１０ｍＬおよび蒸留水１０ｍＬを加え、２０分間加熱還流を行った。その後、ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−３−（４−アミノ−３−ニトロフェニル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパノアート１５０ｍｇのエタノール溶液（５ｍＬ）を加え、２時間加熱還流を行った。反応溶液を室温まで冷却し、セライトろ過を行い、得られたろ液を減圧留去した。得られた残渣に蒸留水、酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を飽和食塩水により洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥し、溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→３０／７０→６０／４０）にて精製し、茶色油状の標題化合物を８１．２ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３５２．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１０【０１８８】
（２）ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−６−イル）プロパノアートの合成
ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（３，４−ジアミノフェニル）プロパノアート８１ｍｇにピリジン５ｍＬおよびＡｐｐｅｌ’ｓ  ｓａｌｔ５８ｍｇを添加し、室温で３０分間撹拌、引き続きマイクロ波を照射（ＩｎｉｔｉａｔｏｒＴＭ、１５０℃、３０分、２．４５ＧＨｚ、０−２４０Ｗ）した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→３０／７０→６０／４０）にて精製し、茶色油状の標題化合物を２５．２ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３８７．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５１【０１８９】
（３）ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノ−１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−６−イル）プロパノアートおよびｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノ−１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−イル）プロパノアートの混合物の合成
ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノ−１−メチル−１Ｈ−インドール−５−イル）プロパノアートの合成と同様に実施した。
位置異性体混合物のまま次工程に進んだ。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：  ４０１．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：  １．６２【０１９０】
ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノベンゾ［ｄ］オキサゾール−６−イル）プロパノアートの合成
【化３３】
2018174078.tif 000039
【０１９１】
（１）ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−３−（４−アミノ−３−ヒドロキシフェニル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパノアートの合成
ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（３，４−ジアミノフェニル）プロパノアートの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３５３．３（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１１【０１９２】
（２）ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ，Ｚ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（（４−クロロ−５Ｈ−１，２，３−ジチアゾール−５−イリデン）アミノ）−３−ヒドロキシフェニル）プロパノアートの合成
ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ，Ｅ）−３−（３−ブロモ−４−（（４−クロロ−５Ｈ−１，２，３−ジチアゾール−５−イリデン）アミノ）フェニル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパノアートの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４８８．３（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．９７【０１９３】
（３）ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノベンゾ［ｄ］オキサゾール−６−イル）プロパノアートの合成
ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ，Ｚ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（（４−クロロ−５Ｈ−１，２，３−ジチアゾール−５−イリデン）アミノ）−３−ヒドロキシフェニル）プロパノアート５１ｍｇにトルエン４ｍＬおよびピリジン０．５ｍＬを加え、マイクロ波を照射（ＩｎｉｔｉａｔｏｒＴＭ、１５０℃、３０分、２．４５ＧＨｚ、０−２４０Ｗ）した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→５／９５→１０／９０）にて精製し、黄色油状の標題化合物２２．２ｍｇを得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３８８．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１８【０１９４】
ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（６−シアノ−１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）プロパノアートおよびｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（５−シアノ−１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）プロパノアートの混合物の合成
【化３４】
2018174078.tif 000040
【０１９５】
（１）ｔｅｒｔ−ブチル  Ｎ4−（２−アミノ−５−シアノフェニル）−Ｎ2−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アスパラギナートの合成
（Ｓ）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−オキソブタン酸３００ｍｇにＤＭＦ５ｍＬおよびＮ−メチルモルホリン１２０μＬを加えた。氷浴下でクロロギ酸イソブチルを１３５μＬ加え、３０分間撹拌した。その後、３，４−ジアミノベンゾニトリル１３８ｍｇを加え、室温で１８時間撹拌した。反応溶液に蒸留水、酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→５０／５０）にて精製し、茶色油状の標題化合物を３２１ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４０５．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．３９【０１９６】
（２）ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（６−シアノ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）プロパノアートの合成
ｔｅｒｔ−ブチル  Ｎ4−（２−アミノ−５−シアノフェニル）−Ｎ2−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アスパラギナート３２１ｍｇに酢酸（ＡｃＯＨ）５ｍＬを加え、６０℃で２４時間撹拌した。反応溶液に蒸留水、酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→３５／６５）にて精製し、赤色油状の標題化合物を３２１ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３８７．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．３６【０１９７】
（３）ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（６−シアノ−１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）プロパノアートおよびｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（５−シアノ−１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）プロパノアートの混合物の合成
ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノ−１−メチル−１Ｈ−インドール−５−イル）プロパノアートの合成と同様に実施した。茶色油状の標題化合物を得た。
位置異性体の混合物のまま次工程に進んだ。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４０１．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．４９【０１９８】
シアノメチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノキノリン−６−イル）プロパノアートの合成
【化３５】
2018174078.tif 000041
ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノキノリン−６−イル）プロパノアート（９０ｍｇ）のジクロロメタン溶液（１ｍＬ）にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）５ｍＬを加え、室温で４時間撹拌した。溶媒を留去し、ＤＭＦを５ｍＬ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）２ｍＬ、およびジ−ｔｅｒｔ−ブチル  ジカルボナート（Ｂｏｃ2Ｏ）を８０μＬ添加し、室温で２時間撹拌した。原料の消失を確認した後、ブロモアセトニトリル３０μＬを添加し、さらに室温で５時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→２０／８０→４０／６０）にて精製し、白色アモルファス状の標題化合物を２０．４ｍｇ得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：８．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），８．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．７７−７．６３（３Ｈ，ｍ），５．０４−４．９３（１Ｈ，ｍ），  ４．８９−４．６４（３Ｈ，ｍ），３．４７−３．２１（２Ｈ，ｍ），１．４１（９Ｈ，ｓ）．
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３８１．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．４１【０１９９】
下記の表３に示す化合物の合成は、シアノメチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノキノリン−６−イル）プロパノアートの合成と同様に実施した。
【０２００】
【表３−１】
2018174078.tif 000042
【表３−２】
2018174078.tif 000043
【表３−３】
2018174078.tif 000044
【表３−４】
2018174078.tif 000045
【表３−５】
2018174078.tif 000046
【表３−６】
2018174078.tif 000047
【表３−７】
2018174078.tif 000048
【表３−８】
2018174078.tif 000049
【表３−９】
2018174078.tif 000050
【０２０１】
シアノメチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−シアノフェニル）プロパノアートの合成
【化３６】
2018174078.tif 000051
Ｂｏｃ−４−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン（Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＣＮ）−ＯＨ）０．５ｇのＤＭＦ溶液（１０ｍＬ）に、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン０．９ｍＬおよびブロモアセトニトリル０．１８ｍＬを加え、室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→４０／６０）にて精製し、白色固体を５９９ｍｇ得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．６３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．３０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），４．９９−４．８９（１Ｈ，ｍ），４．８９−４．６１（３Ｈ，ｍ），  ３．２４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．９，５．９Ｈｚ），３．１３−３．０８（１Ｈ，ｍ），１．４２（９Ｈ，ｓ）．
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３３０．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．３９【０２０２】
シアノメチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−シアノプロパノアートの合成
【化３７】
2018174078.tif 000052
シアノメチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−シアノフェニル）プロパノアートの合成と同様に実施した。【０２０３】
【表４】
2018174078.tif 000053
【０２０４】
ｔｅｒｔ−ブチル  （ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アスパラギナートの合成
【化３８】
2018174078.tif 000054
Ｌ−アスパラギン−ｔ−ブチルエステル１．０ｇの酢酸エチル溶液（２０ｍＬ）にトリエチルアミン８１５μＬおよびジ−ｔｅｒｔ−ブチル  ジカルボナート（Ｂｏｃ2Ｏ）  １．３４ｍＬを添加し、室温で１５時間撹拌した。有機層を蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、白色固体の標題化合物を１．４１ｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２８９．０
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１０【０２０５】
（Ｓ）−４−アミノ−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−チオキソブタン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化３９】
2018174078.tif 000055
ｔｅｒｔ−ブチル（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アスパラギナート（１．４１ｇ）のＴＨＦ溶液２０ｍＬに、ローソン試薬（２，４−ビス（４−メトキシフェニル）−１，３−ジチア−２，４−ジホスフェタン  ２，４−ジスルフィド）を１．０３ｇ添加し、室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→３０／７０→４０／６０）にて精製し、白色固体の標題化合物を１．３９ｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３０５．０
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．３１【０２０６】
（Ｓ）−２−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−オキソプロピル）チアゾール−４−カルボン酸エチルの合成
【化４０】
2018174078.tif 000056
（Ｓ）−４−アミノ−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−チオキソブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１．３９ｇ）のエタノール溶液（２０ｍＬ）に、ピリジン１．１ｍＬおよびブロモピルビン酸エチル６３５μＬを加え、３．５時間加熱還流した。ブロモピルビン酸をさらに３１０μＬ加え、２時間加熱還流した。溶媒を減圧留去し、残渣に蒸留水、酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→２０／８０）にて精製し、茶色油状の標題化合物（６８０ｍｇ）得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４０１．０
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．６２【０２０７】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−カルバモイルチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化４１】
2018174078.tif 000057
（Ｓ）−２−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−オキソプロピル）チアゾール−４−カルボン酸エチル（６８０ｍｇ）のメタノール溶液（５ｍＬ）に２５％アンモニア水を６．５ｍＬ添加し、室温で２４時間撹拌した。反応溶液に蒸留水、酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝３０／７０→４０／６０→８０／２０）にて精製し、透明油状の標題化合物４７３ｍｇを得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３７２．０
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．３０【０２０８】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−シアノチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化４２】
2018174078.tif 000058
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−カルバモイルチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３１２ｍｇ）のジクロロメタン溶液（５ｍＬ）に、トリエチルアミン２４０μＬを加えた。氷浴上でトリフルオロ酢酸無水物１３０μＬを滴下し、室温で１４時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→１０／９０→２０／８０）にて精製し、透明油状の標題化合物を１９３ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３５４．０
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５８【０２０９】
４−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボニトリルの合成
【化４３】
2018174078.tif 000059
１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボニトリル６０５ｍｇのＤＭＦ溶液（５ｍＬ）にＮＢＳ１．０２ｇを加え、５時間撹拌した。反応溶液に、蒸留水、酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→５／９５）にて精製し、白色固体の標題化合物を４０５ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：１８６．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．２６【０２１０】
メチル（４−ブロモベンゾイル）−Ｌ−セリナートの合成
【化４４】
2018174078.tif 000060
メチル−Ｌ−セリナート塩酸塩０．８４ｇにジクロロメタン２０ｍＬ、トリエチルアミン１．５１ｍＬを加えた。氷浴下で４−ブロモベンゾイルクロリド１．１９ｇ滴下した。滴下後室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣に蒸留水、酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝５０／５０→１００／０）にて精製し、無色オイル状の標題化合物を１．４９ｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３０３．８（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：０．９８【０２１１】
２−（４−ブロモフェニル）オキサゾール−４−カルボン酸メチルの合成
【化４５】
2018174078.tif 000061
メチル（４−ブロモベンゾイル）−Ｌ−セリナートにＴＨＦ１５ｍＬ、Ｂｕｒｇｅｓｓ試薬（Ｎ−（トリエチルアンモニオスルホニル）カルバミン酸メチル）１．４１ｇを加え、８０℃で２時間撹拌した。その後、溶媒を減圧留去し、残渣に蒸留水、酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、ジクロロメタン１５ｍＬ、ブロモトリクロロメタン１．５１ｍＬ、ジアザビシクロウンデセン２．２９ｍＬを加え、室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣に酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→１０／９０→３０／７０）にて精製し、白色固体の標題化合物を７７５ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２８３．８（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．４５【０２１２】
１−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸エチルの合成
【化４６】
2018174078.tif 000062
１Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸エチル１．２ｇのアセトニトリル１５ｍＬの溶液に１−フルオロ−４−ニトロベンゼン１．３ｇ、炭酸カリウム１．５ｇを加え、６０℃で１７時間撹拌した。残渣に蒸留水、酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、酢酸エチル５ｍＬ、ヘキサン３０ｍＬを加え、固体をろ別した。得られた固体をヘキサンで洗浄し、白色固体の標題化合物を９７７ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２６２．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１０【０２１３】
１−（４−アミノフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸エチルの合成
【化４７】
2018174078.tif 000063
還元鉄１．０５ｇおよび塩化アンモニウム２００ｍｇにエタノール１８ｍＬおよび蒸留水２ｍＬを加え、２０分間加熱還流を行った。その後、１−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸エチル９７０ｍｇを加え、１時間加熱還流を行った。反応溶液を室温まで冷却し、セライトろ過を行い、得られたろ液を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／メタノール＝１００／０→９５／５）にて精製し、黄色油状の標題化合物を８１９ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２３２．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：０．７２【０２１４】
１−（４−ブロモフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸エチルの合成
【化４８】
2018174078.tif 000064
１−（４−アミノフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸エチル８１９ｍｇにアセトニトリル１０ｍＬ、臭化銅８７５ｍｇを加えた。その溶液に亜硝酸ｔ−ブチル１．１ｍＬを室温で滴下し、滴下後室温で４時間撹拌した。反応溶液に、蒸留水、酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、酢酸エチル５ｍＬ、ヘキサン３０ｍＬを加え、固体をろ別した。得られた固体をヘキサンで洗浄し、黄色固体の標題化合物を７４６ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２９６．８（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．２９【０２１５】
６−ブロモイミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン−２−カルボン酸エチルの合成
【化４９】
2018174078.tif 000065
２−アミノ−５−ブロモピリミジン２．０ｇにエタノール３０ｍＬ、３−ブロモピルビン酸エチル２．９ｍＬを加え、６時間加熱還流を行った。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→１５／８５→３０／７０）にて精製し、黄色固体の標題化合物を８０４ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２７１．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．０６【０２１６】
６−ブロモイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−カルボン酸エチルの合成
【化５０】
2018174078.tif 000066
６−ブロモイミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン−２−カルボン酸エチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２７１．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：０．９２【０２１７】
６−ブロモイミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−２−カルボン酸エチルの合成
【化５１】
2018174078.tif 000067
６−ブロモイミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン−２−カルボン酸エチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２７１．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．０９【０２１８】
５−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボニトリルの合成
【化５２】
2018174078.tif 000068
ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノ−１−メチル−１Ｈ−インドール−５−イル）プロパノアートの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２３７．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．４８【０２１９】
４−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボニトリルの合成
【化５３】
2018174078.tif 000069
ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノ−１−メチル−１Ｈ−インドール−５−イル）プロパノアートの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：１８７．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１０【０２２０】
６−（３−ブロモフェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−カルボン酸エチルの合成
【化５４】
2018174078.tif 000070
６−ブロモピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−カルボン酸エチル６００ｍｇに（３−ブロモフェニル）ボロン酸４９５ｍｇ、ＴＨＦ２０ｍＬ、炭酸ナトリウム水溶液（１．０ｍｏｌ／Ｌ）５．９ｍＬを加え、窒素置換を行った。その溶液にテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）８１．４ｍｇ加え、８０℃で９時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣に酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０→３０／７０）にて精製し、黄色固体の標題化合物を６２２ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３４７．８（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５７【０２２１】
６−（３−ブロモフェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−カルボキサミドの合成
【化５５】
2018174078.tif 000071
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−カルバモイルチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３１８．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１７【０２２２】
６−（３−ブロモフェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−カルボニトリルの合成
【化５６】
2018174078.tif 000072
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−シアノチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３００．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５５【０２２３】
下記の表５に示す化合物の合成は、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−ヨードプロパノアートを原料に用い、ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（５−シアノチオフェン−３−イル）プロパノアートの合成と同様に実施した。【０２２４】
【表５−１】
2018174078.tif 000073
【表５−２】
2018174078.tif 000074
【０２２５】
下記の表６に示す化合物の合成は、シアノメチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノキノリン−６−イル）プロパノアートの合成の合成と同様に実施した。【０２２６】
【表６−１】
2018174078.tif 000075
【表６−２】
2018174078.tif 000076
【表６−３】
2018174078.tif 000077
【０２２７】
６−（２−ブロモアセチル）ピコリン酸エチルの合成
【化５７】
2018174078.tif 000078
６−アセチルピコリン酸エチル９９０ｍｇに臭化水素（３０％酢酸溶液）３．１ｍＬを加えた。その後、臭素３００μＬを滴下し、室温で９時間撹拌した。反応溶液に蒸留水および酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→２０／８０）にて精製し、無色オイル状の標題化合物を１．４９ｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２７３．８（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．２９【０２２８】
２−（２−ブロモアセチル）チアゾール−４−カルボン酸メチルの合成
【化５８】
2018174078.tif 000079
６−（２−ブロモアセチル）ピコリン酸エチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２６５．８（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．０８【０２２９】
２−（２−ブロモアセチル）ニコチン酸エチルの合成
【化５９】
2018174078.tif 000080
６−（２−ブロモアセチル）ピコリン酸エチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２７３．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．２４【０２３０】
６−アセチルニコチン酸メチルの合成
【化６０】
2018174078.tif 000081
６−クロロニコチン酸メチル１．５ｇにトルエン２０ｍＬを加え、窒素置換を行った。その溶液にトリブチル（１−エトキシビニル）すず３．６５ｍＬ、ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）３０８ｍｇを加え、窒素雰囲気下１０５℃で５時間４０分撹拌した。溶媒を減圧留去し、メタノール１０ｍＬ、濃塩酸５ｍＬを加え、室温で１６時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣に蒸留水５ｍＬ加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和処理を行った。酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→４０／６０）にて精製し、白色固体の標題化合物を９２７ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：１８０．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：０．９７【０２３１】
６−（２−ブロモアセチル）ニコチン酸メチルの合成
【化６１】
2018174078.tif 000082
６−（２−ブロモアセチル）ピコリン酸エチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２５９．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．２６【０２３２】
６−アセチルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−カルボン酸エチルの合成
【化６２】
2018174078.tif 000083
６−アセチルニコチン酸メチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２３４．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：０．９５【０２３３】
６−（２−ブロモアセチル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−カルボン酸エチルの合成
【化６３】
2018174078.tif 000084
６−（２−ブロモアセチル）ピコリン酸エチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３１３．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１３【０２３４】
３−ブロモ−２，２−ジメトキシプロパン酸の合成
【化６４】
2018174078.tif 000085
３−ブロモピルビン酸５．０ｇにオルトギ酸トリメチル１０ｍＬ、硫酸４００μＬを加え、室温で９時間撹拌した。反応溶液にジクロロメタン１００ｍＬを加え、１０％塩酸水溶液１００ｍＬで洗浄した。水層に酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、白色固体の標題化合物を３．４３ｇ得た。
1Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ3）  δ：  ３．６２  （２Ｈ，  ｓ），  ３．３８  （６Ｈ，  ｓ）．【０２３５】
メチル  Ｏ−ベンジル−Ｎ−（３−ブロモ−２，２−ジメトキシプロパノイル）−Ｌ−セリナートの合成
【化６５】
2018174078.tif 000086
３−ブロモ−２，２−ジメトキシプロパン酸３．４３ｇにジクロロメタン５０ｍＬ、ジイソプロピルエチルアミン１７ｍＬ、ＨＡＴＵ（１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム  ３−酸化物  ヘキサフルオロリン酸塩）７．３５ｇ、Ｏ−メチル  Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリナート  塩酸塩４，３５ｇを加え、室温で７時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣に塩酸水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）、酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を塩酸水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→４０／６０）にて精製し、無色オイル状の標題化合物を５．７７ｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４０５．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．４６【０２３６】
メチル  （３−ブロモ−２，２−ジメトキシプロパノイル）−Ｌ−セリナートの合成
【化６６】
2018174078.tif 000087
メチル  Ｏ−ベンジル−Ｎ−（３−ブロモ−２，２−ジメトキシプロパノイル）−Ｌ−セリナート５．７７ｇにメタノール３０ｍＬを加え、フロー式水素化反応装置（Ｈ−Ｃｕｂｅ（ＴｈａｌｅｓＮａｎｏ社））により反応を実施した（１０％水酸化パラジウム／カーボン、４０ｂａｒ、６０℃、２．０ｍＬ／ｍＬ）。反応後、溶媒を減圧留去し、黄色オイル状の標題化合物を４．４１ｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３１５．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：０．７５【０２３７】
２−（２−ブロモ−１，１−ジメトキシエチル）オキサゾール−４−カルボン酸メチルの合成
【化６７】
2018174078.tif 000088
メチル  （３−ブロモ−２，２−ジメトキシプロパノイル）−Ｌ−セリナート４．４１ｇにジクロロメタン５０ｍＬを加え、−７８℃に冷却した。その溶液に（ジエチルアミノ）硫黄  三フッ化物２．０５ｍＬを滴下し、−７８℃で１時間撹拌した。その後、炭酸カリウム３．７５ｇを加え、−７８度で１時間、室温で２時間撹拌した。不溶物をろ別後、ろ液を減圧留去し、ジクロロメタン５０ｍＬ、ジアザビシクロウンデセン４．２ｍＬを加えた。氷浴上でブロモトリクロロメタン３．７２ｍＬを滴下し、滴下後室温で４時間３０分撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣に蒸留水および酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を塩酸水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝１２／８８→１００／０）にて精製し、黄色オイル状の標題化合物を２．５７ｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２９５．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．０５【０２３８】
２−（２−ブロモアセチル）オキサゾール−４−カルボン酸メチルの合成
【化６８】
2018174078.tif 000089
２−（２−ブロモ−１，１−ジメトキシエチル）オキサゾール−４−カルボン酸メチル２．５７ｇにギ酸１５ｍＬを加え、６０℃で３時間３０分撹拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→２０／８０→４０／６０）にて精製し、白色固体の標題化合物を１．４６ｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２４９．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：０．９３【０２３９】
メチル  Ｎ−（２−（ベンジルオキシ）プロパノイル）−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチル）−Ｌ−アロトレオニナートの合成
【化６９】
2018174078.tif 000090
メチル  Ｏ−ベンジル−Ｎ−（３−ブロモ−２，２−ジメトキシプロパノイル）−Ｌ−セリナートの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３５２．２（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．６６【０２４０】
メチル（２−（ベンジルオキシ）プロパノイル）−Ｌ−アロトレオニナートの合成
【化７０】
2018174078.tif 000091
メチル  Ｎ−（２−（ベンジルオキシ）プロパノイル）−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチル）−Ｌ−アロトレオニナート３．９１ｇにＴＦＡ１０ｍＬ加え、室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝５０／５０→１００／０）にて精製し、無色オイル状の標題化合物を２．３０ｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２９６．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．０６【０２４１】
（２Ｓ）−２−（２−（ベンジルオキシ）プロパンアミド）−３−オキソブタン酸メチルの合成
【化７１】
2018174078.tif 000092
メチル  （２−（ベンジルオキシ）プロパノイル）−Ｌ−アロトレオニナート２．３０ｇにジクロロメタン１５ｍＬを加えた。氷浴上でデス−マーチンペルヨージナン４．２９ｇを加えた後、室温で１時間撹拌した。不溶物をろ別後、溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→２０／８０→４０／６０）にて精製し、無色オイル状の標題化合物を２．１８ｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２９４．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．２６【０２４２】
２−（１−（ベンジルオキシ）エチル）−５−メチルオキサゾール−４−カルボン酸メチルの合成（ＤＬ０１７２１−０４０）
【化７２】
2018174078.tif 000093
（２Ｓ）−２−（２−（ベンジルオキシ）プロパンアミド）−３−オキソブタン酸メチル２．１８ｇにジクロロメタン２０ｍＬ、トリエチルアミン４．１４ｍＬ加えた。氷浴上でトリフェニルホスフィン３．９ｇ、ヨウ素３．７７ｇ加えた後、室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣に蒸留水および酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水、チオ硫酸ナトリウム水溶液（１０％）および飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→１０／９０→２０／８０）にて精製し、黄色オイル状の標題化合物を１．５５ｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２７６．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．４２【０２４３】
２−（１−（ベンジルオキシ）エチル）−５−メチルオキサゾール−４−カルボキサミドの合成
【化７３】
2018174078.tif 000094
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−カルバモイルチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２６１．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．２１【０２４４】
２−（１−（ベンジルオキシ）エチル）−５−メチルオキサゾール−４−カルボチオアミドの合成
【化７４】
2018174078.tif 000095
（Ｓ）−４−アミノ−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−チオキソブタン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２７７．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．４９【０２４５】
２−（２−（１−（ベンジルオキシ）エチル）−５−メチルオキサゾール−４−イル）チアゾール−４−カルボン酸エチルの合成
【化７５】
2018174078.tif 000096
２−（１−（ベンジルオキシ）エチル）−５−メチルオキサゾール−４−カルボチオアミドにエタノール１０ｍＬ、ブロモピルビン酸エチル３３５μＬ加え、２時間加熱還流を行った。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→１５／８５）にて精製し、茶色オイル状の標題化合物を６５０ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３７３．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．７９【０２４６】
２−（２−（１−ヒドロキシエチル）−５−メチルオキサゾール−４−イル）チアゾール−４−カルボン酸エチルの合成
【化７６】
2018174078.tif 000097
２−（２−（１−（ベンジルオキシ）エチル）−５−メチルオキサゾール−４−イル）チアゾール−４−カルボン酸エチル６５０ｍｇにジクロロメタンを５ｍＬ加えた。−７８℃で三臭化ホウ素のジクロロメタン溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）１．６５ｍＬを滴下し、−７８℃で１時間撹拌した。その後、三臭化ホウ素のジクロロメタン溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）１．６５ｍＬを追加滴下し、−７８℃で１時間撹拌した。氷浴上で蒸留水を加え、ジクロロメタンにより抽出操作を行った。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→２５／７５→５０／５０）にて精製し、淡黄色固体の標題化合物を３７２ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２８３．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．０９【０２４７】
２−（２−アセチル−５−メチルオキサゾール−４−イル）チアゾール−４−カルボン酸エチルの合成
【化７７】
2018174078.tif 000098
（２Ｓ）−２−（２−（ベンジルオキシ）プロパンアミド）−３−オキソブタン酸メチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２８１．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．３２【０２４８】
２−（２−（２−ブロモアセチル）−５−メチルオキサゾール−４−イル）チアゾール−４−カルボン酸エチルの合成
【化７８】
2018174078.tif 000099
６−（２−ブロモアセチル）ピコリン酸エチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３６０．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５０【０２４９】
２−（１−ヒドロキシエチル）−５−メチルオキサゾール−４−カルボン酸メチルの合成
【化７９】
2018174078.tif 000100
２−（２−（１−ヒドロキシエチル）−５−メチルオキサゾール−４−イル）チアゾール−４−カルボン酸エチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：１８６．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：０．６９【０２５０】
２−アセチル−５−メチルオキサゾール−４−カルボン酸メチルの合成
【化８０】
2018174078.tif 000101
（２Ｓ）−２−（２−（ベンジルオキシ）プロパンアミド）−３−オキソブタン酸メチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：１８４．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：０．８１【０２５１】
２−（２−ブロモアセチル）−５−メチルオキサゾール−４−カルボン酸メチルの合成
【化８１】
2018174078.tif 000102
６−（２−ブロモアセチル）ピコリン酸エチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２６３．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．０８【０２５２】
６−クロロピリジン−３−カルボチオアミドの合成
【化８２】
2018174078.tif 000103
（Ｓ）−４−アミノ−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−チオキソブタン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：１７３．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：０．８５【０２５３】
２−（６−クロロピリジン−３−イル）チアゾール−４−カルボン酸エチルの合成
【化８３】
2018174078.tif 000104
２−（２−（１−（ベンジルオキシ）エチル）−５−メチルオキサゾール−４−イル）チアゾール−４−カルボン酸エチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２６９．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．３１【０２５４】
２−（６−アセチルピリジン−３−イル）チアゾール−４−カルボン酸エチルの合成
【化８４】
2018174078.tif 000105
６−アセチルニコチン酸メチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２７７．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．２３【０２５５】
２−（６−（２−ブロモアセチル）ピリジン−３−イル）チアゾール−４−カルボン酸エチルの合成
【化８５】
2018174078.tif 000106
６−（２−ブロモアセチル）ピコリン酸エチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３５６．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．４５【０２５６】
６−クロロピリジン−２−カルボチオアミドの合成
【化８６】
2018174078.tif 000107
（Ｓ）−４−アミノ−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−チオキソブタン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：１７３．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．０８【０２５７】
２−（６−クロロピリジン−２−イル）チアゾール−４−カルボン酸エチルの合成
【化８７】
2018174078.tif 000108
２−（２−（１−（ベンジルオキシ）エチル）−５−メチルオキサゾール−４−イル）チアゾール−４−カルボン酸エチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２６９．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５１【０２５８】
２−（６−アセチルピリジン−２−イル）チアゾール−４−カルボン酸エチルの合成
【化８８】
2018174078.tif 000109
６−アセチルニコチン酸メチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２７７．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．４１【０２５９】
２−（６−（２−ブロモアセチル）ピリジン−２−イル）チアゾール−４−カルボン酸エチルの合成
【化８９】
2018174078.tif 000110
６−（２−ブロモアセチル）ピコリン酸エチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３５６．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５４【０２６０】
（Ｓ）−２’−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
）アミノ）−３−オキソプロピル）−［２，４’−ビチアゾール］−４−カルボン酸メチ
ルの合成
【化９０】
2018174078.tif 000111
（Ｓ）−４−アミノ−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−チオキソブタン酸ｔｅｒｔ−ブチル３９５ｍｇにエタノール１０ｍＬ、２−（２−ブロモアセチル）チアゾール−４−カルボン酸メチル３４２ｍｇを加え、１時間加熱還流を行った。溶媒を減圧留去し、ジメチルホルムアミド１０ｍＬ、ジイソプロピルエチルアミン１ｍＬ、Ｂｏｃ2Ｏ３６０μＬ加え、室温で５時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→２０／８０→４０／６０）にて精製し、淡黄色オイル状の標題化合物を４８９ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４７０．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．６６【０２６１】
下記の表７に示す化合物の合成は、（Ｓ）−２’−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２
−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−オキソプロピル）−［２，４’−
ビチアゾール］−４−カルボン酸メチルの合成と同様に実施した。【０２６２】
【表７−１】
2018174078.tif 000112
【表７−２】
2018174078.tif 000113
【０２６３】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−カルバモチオイルチアゾール−２−イル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化９１】
2018174078.tif 000114
（Ｓ）−４−アミノ−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−チオキソブタン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３８８．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５２【０２６４】
下記の表８に示す化合物の合成は、原料として（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−カルバモチオイルチアゾール−２−イル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルを用い、（Ｓ）−２’−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−（（ｔｅ
ｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−オキソプロピル）−［２，４’−ビチアゾー
ル］−４−カルボン酸メチルの合成と同様に実施した。【０２６５】
【表８】
2018174078.tif 000115
【０２６６】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−カルバモイル−［２，４’−ビチアゾール］−２’−イル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化９２】
2018174078.tif 000116
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−カルバモイルチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４５５．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．４６【０２６７】
下記の表９に示す化合物の合成は、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−カルバモイルチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。【０２６８】
【表９−１】
2018174078.tif 000117
【表９−２】
2018174078.tif 000118
【表９−３】
2018174078.tif 000119
【０２６９】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（２−シアノピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−イル）チアゾール−２−イル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化９３】
2018174078.tif 000120
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−シアノチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４７１．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．７４【０２７０】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（２−シアノピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−６−イル）チアゾール−２−イル）プロパン酸シアノメチルの合成
【化９４】
2018174078.tif 000121
シアノメチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノキノリン−６−イル）プロパノアートの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４５４．２（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．４４
1Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ3）  δ：  ９．２１  （１Ｈ，  ｓ），  ９．０５  （１Ｈ，  ｓ），  ７．６３  （１Ｈ，  ｓ），  ７．１６  （１Ｈ，  ｓ），  ５．５９  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ），  ４．９７−４．６８  （３Ｈ，  ｍ），  ３．７８−３．５７  （２Ｈ，  ｍ），  １．４６  （９Ｈ，  ｓ）．【０２７１】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−カルバモチオイル−［２，４’−ビチアゾール］−２’−イル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化９５】
2018174078.tif 000122
（Ｓ）−４−アミノ−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−チオキソブタン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４７１．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．６８【０２７２】
（Ｓ）−２’’’−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボ
ニル）アミノ）−３−オキソプロピル）−［２，４’：２’，４’’：２’’，４’’’
−クアテルチアゾール］−４−カルボン酸メチルの合成
【化９６】
2018174078.tif 000123
（Ｓ）−２’−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
）アミノ）−３−オキソプロピル）−［２，４’−ビチアゾール］−４−カルボン酸メチ
ルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：６３６．７（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．９９【０２７３】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（４−カルバモチオイルオキサゾール−２−イル）チアゾール−２−イル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化９７】
2018174078.tif 000124
（Ｓ）−４−アミノ−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−チオキソブタン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４５５．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５２【０２７４】
（Ｓ）−２−（２−（２−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−オキソプロピル）チアゾール−４−イル）オキサゾール−４−イル）チアゾール−４−カルボン酸エチルの合成
【化９８】
2018174078.tif 000125
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（４−カルバモチオイルオキサゾール−２−イル）チアゾール−２−イル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチル７６ｍｇにエタノール１０ｍＬ、ブロモピルビン酸エチルを２５μＬを加え、加熱還流下４時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、ＴＨＦ１０ｍＬ、Ｂｏｃ2Ｏ４０μＬ、ジイソプロピルエチルアミン１ｍＬ加え、室温で１８時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→２０／８０→４０／６０）にて精製し、淡黄色オイル状の標題化合物を４３．８ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：５５１．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．７５【０２７５】
（Ｓ）−２−（２−（２−（２−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−オキソプロピル）チアゾール−４−イル）オキサゾール−４−イル）チアゾール−４−イル）オキサゾール−４−カルボン酸メチルの合成
【化９９】
2018174078.tif 000126
（Ｓ）−２’−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
）アミノ）−３−オキソプロピル）−［２，４’−ビチアゾール］−４−カルボン酸メチ
ルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：６０４．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．６９【０２７６】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（４−（４−カルバモイルチアゾール−２−イル）オキサゾール−２−イル）チアゾール−２−イル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化１００】
2018174078.tif 000127
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−カルバモイルチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：５２２．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．４７【０２７７】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−カルバモイル−［２，４’：２’，４’’：２’’，４’’’−クアテルチアゾール］−２’’’−イル
）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化１０１】
2018174078.tif 000128
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−カルバモイルチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：６２１．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．７６【０２７８】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（４−（４−（４−カルバモイルオキサゾール−２−イル）チアゾール−２−イル）オキサゾール−２−イル）チアゾール−２−イル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化１０２】
2018174078.tif 000129
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−カルバモイルチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：５８９．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．４９【０２７９】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−カルバモイル−［２，４’−ビチアゾール］−２’−イル）プロパン酸シアノメチルの合成
【化１０３】
2018174078.tif 000130
シアノメチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノキノリン−６−イル）プロパノアートの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４３８．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．２１【０２８０】
下記の表１０に示す化合物の合成は、シアノメチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノキノリン−６−イル）プロパノアートの合成と同様に実施した。【０２８１】
【表１０−１】
2018174078.tif 000131
【表１０−２】
2018174078.tif 000132
【表１０−３】
2018174078.tif 000133
【０２８２】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−シアノ−［２，４’−ビチアゾール］−２’−イル）プロパン酸シアノメチルの合成
【化１０４】
2018174078.tif 000134
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−シアノチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４２０．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５１
1Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ3）  δ：  ８．０１  （１Ｈ，  ｓ），  ７．９９  （１Ｈ，  ｓ），  ５．５９−５．４８  （１Ｈ，  ｍ），  ４．９３−４．７５  （３Ｈ，  ｍ），  ３．７２−３．５５  （２Ｈ，  ｍ），  １．４５  （９Ｈ，  ｓ）．【０２８３】
下記の表１１に示す化合物の合成は、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−シアノチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。【０２８４】
【表１１−１】
2018174078.tif 000135
【表１１−２】
2018174078.tif 000136
【表１１−３】
2018174078.tif 000137
【表１１−４】
2018174078.tif 000138
【表１１−５】
2018174078.tif 000139
【表１１−６】
2018174078.tif 000140
【０２８５】
（Ｓ）−３−（４−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセトアミド）フェニル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化１０５】
2018174078.tif 000141
ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−アミノフェニル）プロパノアート１００ｍｇにＤＭＦ５ｍＬ、（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）グリシン９７．３ｍｇ、ジイソプロピルエチルアミン１００μＬ、ＨＡＴＵ（１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム  ３−酸化物  ヘキサフルオロリン酸塩）１７０ｍｇを加え、室温で２時間撹拌した。反応溶液に蒸留水および酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水および飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→３０／７０→６０／４０）にて精製し、淡黄色オイル状の標題化合物を１８３ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：６１６．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．９１【０２８６】
下記の表１２に示す化合物の合成は、（Ｓ）−３−（４−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセトアミド）フェニル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。【０２８７】
【表１２】
2018174078.tif 000142
【０２８８】
（Ｓ）−３−（４−（２−アミノアセトアミド）フェニル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化１０６】
2018174078.tif 000143
（Ｓ）−３−（４−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）アセトアミド）フェニル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチル１８３ｍｇにジクロロメタン６ｍＬ、ピペリジン１．２ｍＬを加え、室温で１時間３０分撹拌した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（ＮＨシリカゲル、メタノール／酢酸エチル／ヘキサン／＝０／５０／５０→０／１００／０→２０／８０／０）にて精製し、淡黄色オイル状の標題化合物を１１７ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３９４．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．０８【０２８９】
下記の表１３に示す化合物の合成は、（Ｓ）−３−（４−（２−アミノアセトアミド）フェニル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。【０２９０】
【表１３】
2018174078.tif 000144
【０２９１】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（２−（５−シアノチオフェン−２−カルボキサミド）アセトアミド）フェニル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化１０７】
2018174078.tif 000145
（Ｓ）−３−（４−（２−アミノアセトアミド）フェニル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチル１１７ｍｇにＤＭＦ５ｍＬ、ジイソプロピルエチルアミン３００μＬ、５−シアノチオフェン−２−カルボン酸５０ｍｇ、ＨＡＴＵ（１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム  ３−酸化物  ヘキサフルオロリン酸塩）１７０ｍｇを加え、室温で１２時間撹拌した。反応溶液に蒸留水および酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水および飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→３０／７０→６０／４０）にて精製し、淡黄色オイル状の標題化合物を１２０ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：５２９．２（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５８【０２９２】
下記の表１４に示す化合物の合成は、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（２−（５−シアノチオフェン−２−カルボキサミド）アセトアミド）フェニル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。【０２９３】
【表１４】
2018174078.tif 000146
【０２９４】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（２−（５−シアノチオフェン−２−カルボキサミド）アセトアミド）フェニル）プロパン酸シアノメチルの合成
【化１０８】
2018174078.tif 000147
シアノメチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノキノリン−６−イル）プロパノアートの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：５１２．２（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．３４
1Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−Ｄ6）  δ：  １０．１０  （１Ｈ，  ｓ），  ９．３９−９．２９  （１Ｈ，  ｍ），  ８．０２  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ４．０  Ｈｚ），  ７．９３  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ４．０  Ｈｚ），  ７．５４−７．４４  （３Ｈ，  ｍ），  ７．１８  （２Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ），  ５．００  （２Ｈ，  ｓ），  ４．２７−４．１５  （１Ｈ，  ｍ），  ４．１５−４．０２  （２Ｈ，  ｍ），  ３．０２−２．７８  （２Ｈ，  ｍ），  １．３３  （９Ｈ，  ｓ）．【０２９５】
下記の表１５に示す化合物の合成は、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（２−（５−シアノチオフェン−２−カルボキサミド）アセトアミド）フェニル）プロパン酸シアノメチルの合成と同様に実施した。【０２９６】
【表１５】
2018174078.tif 000148
【０２９７】
５−シアノ−Ｎ−（２−（２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ）エチル）チオフェン−２−カルボキサミドの合成
【化１０９】
2018174078.tif 000149
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（２−（５−シアノチオフェン−２−カルボキサミド）アセトアミド）フェニル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２８５．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：０．７８【０２９８】
５−シアノ−Ｎ−（２−（２−（２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）チオフェン−２−カルボキサミドの合成
【化１１０】
2018174078.tif 000150
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（２−（５−シアノチオフェン−２−カルボキサミド）アセトアミド）フェニル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３２９．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：０．８２【０２９９】
５−シアノ−Ｎ−（１２−ヒドロキシドデシル）チオフェン−２−カルボキサミドの合成
【化１１１】
2018174078.tif 000151
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（２−（５−シアノチオフェン−２−カルボキサミド）アセトアミド）フェニル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３３７．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５４【０３００】
４−メチルベンゼンスルホン酸  １２−（５−シアノチオフェン−２−カルボキサミド）ドデシルの合成
【化１１２】
2018174078.tif 000152
５−シアノ−Ｎ−（１２−ヒドロキシドデシル）チオフェン−２−カルボキサミド２３０ｍｇのクロロホルム溶液（１０ｍＬ）にトリエチルアミン３８０μＬを加えた。氷浴上で塩化パラトルエンスルホニル１９５ｍｇ加え、氷浴下２時間撹拌した。トリエチルアミン３８０μＬ、塩化パラトルエンスルホニル１９５ｍｇを追加添加し、氷浴下３時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５→１５／８５→３０／７０）にて精製し、黄色オイル状の標題化合物を２６７ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４９１．２（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：２．０１【０３０１】
４−メチルベンゼンスルホン酸  ２−（２−（２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチルの合成
【化１１３】
2018174078.tif 000153
２，２’−（（オキシビス（エタン−２，１−ジイル））ビス（オキシ））ビス（エタン
−１−オール）１１ｇにＴＨＦ５ｍＬ、水酸化ナトリウム１．９２ｇの水溶液（５ｍＬ）を加えた。氷浴上で塩化パラトルエンスルホニル４．３２ｇのＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）を滴下した。滴下後室温で２時間撹拌した。反応溶液に蒸留水および酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水および飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝５０／５０→１００／０）にて精製し、無色オイル状の標題化合物を１．３０ｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３４９．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．０８【０３０２】
５−（２−（２−（２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）ピコリノニトリルの合成
【化１１４】
2018174078.tif 000154
４−メチルベンゼンスルホン酸  ２−（２−（２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル２３１ｍｇにアセトニトリル１０ｍＬ、炭酸セシウム３７１ｍｇ、５−ヒドロキシピコリノニトリル８２ｍｇを加え、６０℃で５時間、９０℃で３時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（ＮＨシリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝６０／４０→１００／０）にて精製し、無色オイル状の標題化合物を１１６ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２９７．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：０．８０【０３０３】
Ｎ−（２−（２−（２−ブロモエトキシ）エトキシ）エチル）−５−シアノチオフェン−２−カルボキサミドの合成
【化１１５】
2018174078.tif 000155
５−シアノ−Ｎ−（２−（２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ）エチル）チオフェン−２−カルボキサミド２３３ｍｇのジクロロメタン溶液（１０ｍＬ）に、氷浴上でトリフェニルホスフィン３１２ｍｇ、四臭化炭素３９６ｍｇ加えた。その後、室温で２４時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝３５／６５→７０／３０）にて精製し、無色オイル状の標題化合物を１４１ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３４８．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１４【０３０４】
下記の表１６に示す化合物は、Ｎ−（２−（２−（２−ブロモエトキシ）エトキシ）エチル）−５−シアノチオフェン−２−カルボキサミドの合成と同様に実施した。【０３０５】
【表１６】
2018174078.tif 000156
【０３０６】
ｔｅｒｔ−ブチル  （ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−チロシナートの合成
【化１１６】
2018174078.tif 000157
ｔｅｒｔ−ブチル  Ｌ−チロシナート５．１９ｇにジクロロメタン５０ｍＬ、トリエチルアミン６．２ｍＬ、Ｂｏｃ2Ｏ６．１ｍＬ加え、室温で１時間３０分撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣に塩酸水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）および酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を塩酸水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→３０／７０）にて精製し、無色オイル状の標題化合物を６．５２ｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３３８．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５１【０３０７】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（２−（２−（２−（５−シアノチオフェン−２−カルボキサミド）エトキシ）エトキシ）エトキシ）フェニル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化１１７】
2018174078.tif 000158
ｔｅｒｔ−ブチル  （ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−チロシナート１２３ｍｇにＤＭＦ１０ｍＬ、炭酸カリウム１５１ｍｇ、Ｎ−（２−（２−（２−ブロモエトキシ）エトキシ）エチル）−５−シアノチオフェン−２−カルボキサミド１４１ｍｇを加え、室温で２４時間撹拌した。反応溶液に蒸留水および酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を蒸留水および飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝３０／７０→６０／４０）にて精製し、無色オイル状の標題化合物を１７８ｍｇ得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：６０４．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．７２【０３０８】
下記の表１７に示す化合物は、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（２−（２−（２−（５−シアノチオフェン−２−カルボキサミド）エトキシ）エトキシ）エトキシ）フェニル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様にして実施した。【０３０９】
【表１７】
2018174078.tif 000159
【０３１０】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（２−（２−（２−（５−シアノチオフェン−２−カルボキサミド）エトキシ）エトキシ）エトキシ）フェニル）プロパン酸シアノメチルの合成
【化１１８】
2018174078.tif 000160
シアノメチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノキノリン−６−イル）プロパノアートの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：５８７．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．４７
１Ｈ−ＮＭＲ：  （ＣＤＣｌ3）  δ：  ７．４６−７．４２  （２Ｈ，  ｍ），  ７．０６  （２Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ），  ６．８２  （２Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ），  ４．９８−４．５４  （４Ｈ，  ｍ），  ４．１３−４．０８  （２Ｈ，  ｍ），  ３．８９−３．８４  （２Ｈ，  ｍ），  ３．７６−３．６１  （９Ｈ，  ｍ），  ３．０６  （２Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ５．９  Ｈｚ），  １．４３  （９Ｈ，  ｓ）．【０３１１】
下記の表１８に示す化合物は、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（２−（２−（２−（５−シアノチオフェン−２−カルボキサミド）エトキシ）エトキシ）エトキシ）フェニル）プロパン酸シアノメチルの合成と同様にして実施した。【０３１２】
【表１８−１】
2018174078.tif 000161
【表１８−２】
2018174078.tif 000162
【０３１３】
ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｒ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−ヨードプロパノアートの合成
【化１１９】
2018174078.tif 000163
ｔｅｒｔ−ブチル（Ｒ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−ヨードプロパノアートの合成と同様に実施した。本明細書中、Ｆｍｏｃは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基を示す。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４９４．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：２．０２【０３１４】
アリル２−（６−ヨードピリジン−２−イル）チアゾール−４−カルボキシラートの合成
（１）アリル（Ｒ）−２−（６−ヨードピリジン−２−イル）−４，５−ジヒドロチアゾール−４−カルボキシラートの合成
【化１２０】
2018174078.tif 000164
２−シアノ−６−ブロモピリジン（５．０ｇ）にヨウ化ナトリウム（１２．３ｇ）、トリメチルシリルクロリド（ＴＭＳＣｌ）（３．５ｍＬ）およびプロピオニトリル（３０ｍＬ）を加え、９０℃で２時間撹拌した。反応溶液に水酸化ナトリウム水溶液、酢酸エチルを加え、抽出操作を行った。有機層をチオ硫酸ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣にＬ−システイン３．６３ｇ、メタノール（２０ｍＬ）および蒸留水（１０ｍＬ）を加え、８０℃で３．５時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣にメタノール／酢酸エチル混合溶媒を添加し、固体をろ別した。得られた固体に、ＴＨＦ（１００ｍＬ）および塩化オキサリル（２．４ｍＬ）を添加し、４５分間撹拌した。その後、反応溶液にアリルアルコールを（３．４ｍＬ）添加し、４時間撹拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、酢酸エチルを加え、抽出操作を行った。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去し、黄色固体の標題化合物（３．２ｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３３５．８（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５６【０３１５】
（２）アリル２−（６−ヨードピリジン−２−イル）チアゾール−４−カルボキシラートの合成
【化１２１】
2018174078.tif 000165
アリル（Ｒ）−２−（６−ヨードピリジン−２−イル）−４，５−ジヒドロチアゾール−４−カルボキシラート（０．５ｇ）にブロモトリクロロメタン（５ｍＬ）、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）（０．３ｍＬ）を添加し、室温で１０分間撹拌した。反応溶液にクエン酸水溶液、酢酸エチルを加え、抽出操作を行った。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去し、白色固体の標題化合物（０．３１ｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３７２．４（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．６７【０３１６】
ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（５−シアノチオフェン−３−イル）プロパノアートの合成
【化１２２】
2018174078.tif 000166
亜鉛粉末（２．４  ｇ）のＤＭＦ（２．６ｍＬ）溶液に、ヨウ素（４６ｍｇ）を加え窒素雰囲気下、室温で５分攪拌した。反応混合物にｔｅｒｔ−ブチル  （Ｒ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−ヨードプロパノアート（６００ｍｇ）のＤＭＦ（１．４ｍＬ）溶液およびヨウ素（４６ｍｇ）を室温下加えて、２時間４０分攪拌した。反応混合物に４−ブロモ−２−シアノチオフェン（２９８ｍｇ）、２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，４’，６’−トリイソプロピル−１，１’−ビフェニル（２９ｍｇ）およびトリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（２８ｍｇ）を室温下加え、窒素雰囲気下、室温で３時間攪拌した後、混合物をセライトろ過した。ろ液に酢酸エチルを加えて、チオ硫酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧濃縮した。得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝９０：１０→３０：７０）で精製し、ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（５−シアノチオフェン−３−イル）プロパノアート（１２７ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４７５．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．９５【０３１７】
下記の表１９に示す化合物の合成は、ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（５−シアノチオフェン−３−イル）プロパノアートの合成と同様に実施した。【０３１８】
【表１９−１】
2018174078.tif 000167
【表１９−２】
2018174078.tif 000168
【表１９−３】
2018174078.tif 000169
【表１９−４】
2018174078.tif 000170
【０３１９】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（５−シアノチオフェン−３−イル）プロパン酸の合成
【化１２３】
2018174078.tif 000171
ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（５−シアノチオフェン−３−イル）プロパノアート（１２７ｍｇ）にＴＦＡ（１．０ｍＬ）を加え、室温で３０分撹拌した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝７０：３０→０：１００）で精製し、白色固体の標題化合物６３ｍｇを得た。
1Ｈ−ＮＭＲ （ＭｅＯＤ） δ： ７．７８ （２Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ）， ７．５９ （２Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ）， ７．５３−７．２４ （６Ｈ，  ｍ）， ４．５３−４．４３ （１Ｈ， ｍ）， ４．３６−４．１１ （３Ｈ， ｍ）， ３．２５−２．９３ （２Ｈ， ｍ）．
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４１９．０
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５５【０３２０】
下記の表２０に示す化合物の合成は、（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（５−シアノチオフェン−３−イル）プロパン酸の合成と同様に実施した。【０３２１】
【表２０−１】
2018174078.tif 000172
【表２０−２】
2018174078.tif 000173
【表２０−３】
2018174078.tif 000174
【表２０−４】
2018174078.tif 000175
【表２０−５】
2018174078.tif 000176
【表２０−６】
2018174078.tif 000177
【表２０−７】
2018174078.tif 000178
【表２０−８】
2018174078.tif 000179
【０３２２】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−シアノチアゾール−２−イル）プロパン酸の合成
【化１２４】
2018174078.tif 000180
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−シアノチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１９３ｍｇ）のジクロロメタン溶液（２ｍＬ）にＴＦＡ１０ｍＬを加え、室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、ＤＭＦを１０ｍＬ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．４８ｍＬ、９−フルオレニルメチルＮ−スクシンイミジルカルボナート（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）２０４ｍｇを添加し、室温で１５時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝３０／７０→１００／０）にて精製し、淡黄色アモルファス状の標題化合物を１２１ｍｇ得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．７８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．６８−７．６３（１Ｈ，ｍ），７．６０−７．４９（２Ｈ，ｍ），７．４５−７．２８（４Ｈ，ｍ），  ５．３４−５．２４（１Ｈ，ｍ），４．８０−４．６７（１Ｈ，ｍ），４．５５−４．３５（２Ｈ，ｍ），４．１８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），３．４２−３．２１（２Ｈ，ｍ）．
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４５４．９
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．６２【０３２３】
ｔｅｒｔ−ブチル  （（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｌ−ホモセリナートの合成
【化１２５】
2018174078.tif 000181
（Ｓ）−３−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−４−オキソブタン酸（５．０２ｇ）のＴＨＦ溶液（３０ｍＬ）にトリエチルアミン（２．８０ｍＬ）を加え、氷浴上でクロロギ酸エチル（１．４３ｍＬ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）を滴下し、室温で３５分間撹拌した。不溶物をろ別し、ろ液に水素化ホウ素ナトリウム１．３６ｇを少量づつ添加し、室温で１時間撹拌した。反応溶液に蒸留水を５ｍＬ加えた後、塩酸水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）、酢酸エチルを加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、無色油状の標題化合物（１．６２ｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３９８．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．６１【０３２４】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−ヨードブタン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化１２６】
2018174078.tif 000182
ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｒ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−ヨードプロパノアートの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：５０７．８（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．９９【０３２５】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−シアノ−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）プロピオン酸の合成
【化１２７】
2018174078.tif 000183
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−アジドプロパン酸（ ２３０ｍｇ）の水／アセトニトリル混合溶媒 (＝５／２、７ｍＬ) に２-クロロアクリロニトリル（０．１１ｍＬ）を室温で加え、８０℃で２１時間撹拌した。反応溶液に酢酸エチル、飽和食塩水を加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣にヘキサン/アセトン混合溶媒 (１５：１) を加え５０℃で再結晶を行うことで、白色固体の標題化合物（１４５ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：  ４０３．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：  １．４１
1Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ3）  δ：  ７．８７−７．７８  （２Ｈ，  ｍ），  ７．６５−７．５５  （２Ｈ，  ｍ），  ７．４９−７．４１  （３Ｈ，  ｍ），  ７．４０−７．３１  （２Ｈ，  ｍ），  ５．４４−５．３８  （１Ｈ，  ｍ），  ５．０３−４．６２  （３Ｈ，  ｍ），  ４．５６−４．５０  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２３−４．１９  （２Ｈ，  ｍ）.【０３２６】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化１２８】
2018174078.tif 000184
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸（２．５ｇ）のＴＨＦ溶液（１００ｍＬ）に室温で２，２，２−トリクロロアセトイミド酸  ｔｅｒｔ−ブチル４．５ｍＬ加え、７０℃で２４時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→１０／９０→２０／８０）にて精製し、黄色オイル状の標題化合物（３．６５ｇ）得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４８９．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．９６【０３２７】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ペンタ−４−イン酸 ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化１２９】
2018174078.tif 000185
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ペンタ−４−イン酸（１．５ｇ）の酢酸エチル溶液（５．０ｍＬ）にｔｅｒｔ−ブチル２，２，２−トリクロロアセトイミダート（４．６ｇ）を滴下し、室温で２２時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→３０／７０）にて精製し、無色油状の標題化合物（１．６６ｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：  ２７０．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：  １．５９【０３２８】
（Ｓ）−５−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−オキソプロピル）イソオキサゾール−３−カルボン酸エチルの合成
【化１３０】
2018174078.tif 000186
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ペンタ−４−イン酸  ｔｅｒｔ−ブチル（１６６０ｍｇ）および２−クロロ−２−（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル（２．８ｇ）のＤＭＦ溶液（２１ｍＬ）に９０℃でトリエチルアミン（６４０μＬ）を加え１５分撹拌した。反応溶液に９０℃でトリエチルアミン（６４０μＬ）を加え１５分撹拌した。９０℃でトリエチルアミン（１２７８μＬ）を加え３０分撹拌した。反応溶液に酢酸エチル、飽和食塩水を加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→２５／７５）にて精製し、黄色油状の標題化合物（８１８ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：  （Ｍ＋Ｈ）３８５．０
ＲＴ（ｍｉｎ）：  １．３６【０３２９】
５−ブロモ−１−メチル−１Ｈ−ピロロ［２、３−ｂ］ピリジン−６−カルボニトリルの合成
【化１３１】
2018174078.tif 000187
５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２、３−ｂ］ピリジン−６−カルボニトリル（２５０ｍｇ）のＴＨＦ／アセトニトリル溶液（＝２／１、６ｍＬ）に炭酸セシウム（９１９ｍｇ）、メタンスルホン酸メチル（１１５μＬ）を加え、室温で１６時間撹拌した。反応溶液に酢酸エチル、塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルにより抽出操作を行った。有機層を硫酸マグネシウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→５０／５０）にて精製し、白色固体の標題化合物（１５１ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：  ２３５．６（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：  １．５８【０３３０】
６−（３−ブロモフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン−２−カルボン酸エチルの合成
【化１３２】
2018174078.tif 000188
６−（３−ブロモフェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−カルボン酸エチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３４７．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．４５【０３３１】
下記の表２１に示す化合物は６−（３−ブロモフェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−カルボン酸エチルの合成と同様に実施した。【０３３２】
【表２１】
2018174078.tif 000189
【０３３３】
１−（４−ブロモフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボキサミドの合成
【化１３３】
2018174078.tif 000190
１−（４−ブロモフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸エチル（７４６ｍｇ）にアンモニアのメタノール溶液（７ｍｏｌ／Ｌ、１０ｍＬ）を加え、マイクロ波を照射（ＩｎｉｔｉａｔｏｒＴＭ、１１０℃、１．０時間、２．４５ＧＨｚ、０−２４０Ｗ）した。さらに反応溶液にマイクロ波を照射（ＩｎｉｔｉａｔｏｒＴＭ、１２０℃、４．０時間、２．４５ＧＨｚ、０−２４０Ｗ）した。溶媒を減圧留去し白色固体の標題化合物（６６０ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：２６８．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：０．９８【０３３４】
６−（３−ブロモフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン−２−カルボキサミドの合成
【化１３４】
2018174078.tif 000191
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−カルバモイルチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３１８．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．００【０３３５】
下記の表２２に示す化合物は（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−カルバモイルチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。【０３３６】
【表２２】
2018174078.tif 000192
【０３３７】
６−（３−ブロモフェニル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン−２−カルボニトリルの合成
【化１３５】
2018174078.tif 000193
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−シアノチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：３００．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．２４【０３３８】
下記の表２３に示す化合物は（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−シアノチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。【０３３９】
【表２３】
2018174078.tif 000194
【０３４０】
下記の表２４に示す化合物はｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（５−シアノチオフェン−３−イル）プロパノアートの合成と同様に実施した。【０３４１】
【表２４−１】
2018174078.tif 000195
【表２４−２】
2018174078.tif 000196
【０３４２】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−アミノフェニル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化１３６】
2018174078.tif 000197
ｔｅｒｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（３，４−ジアミノフェニル）プロパノアートの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４５９．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５５【０３４３】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（（（アリルオキシ）カルボニル）アミノ）フェニル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化１３７】
2018174078.tif 000198
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−アミノフェニル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチル（２．８３ｇ）のジクロロメタン溶液（５０ｍＬ）に、ジイソプロピルエチルアミン（３ｍＬ）、クロロギ酸アリル（７２２μＬ）加え、室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→２０／８０）にて精製し、黄色油状の標題化合物（２．５２ｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：５４３．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．９３【０３４４】
下記の表２５に示す化合物は（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（５−シアノチオフェン−３−イル）プロパン酸の合成と同様に実施した。【０３４５】
【表２５−１】
2018174078.tif 000199
【表２５−２】
2018174078.tif 000200
【表２５−３】
2018174078.tif 000201
【表２５−４】
2018174078.tif 000202
【表２５−５】
2018174078.tif 000203
【表２５−６】
2018174078.tif 000204
【０３４６】
（Ｓ）−５−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−３−オキソプロピル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−２−カルボン酸エチルの合成
【化１３８】
2018174078.tif 000205
６−ブロモイミダゾ［１，２−ａ］ピリミジン−２−カルボン酸エチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：５５６．４（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．７０【０３４７】
（Ｓ）−５−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−オキソプロピル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−２−カルボン酸エチルの合成
【化１３９】
2018174078.tif 000206
（Ｓ）−５−（２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−３−オキソプロピル）イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−２−カルボン酸エチル（３５７ｍｇ）にＤＭＦ（１０ｍＬ）、ピペリジン（６３５μＬ）加え、室温で１時間撹拌した。原料の消失を確認した後、ジイソプロピルエチルアミン（４ｍＬ）、Ｂｏｃ2Ｏ（３ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００→５０／５０→１００／０）にて精製し、褐色油状の標題化合物（１７６ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４３４．４（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．４１【０３４８】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−カルバモイルイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−５−イル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化１４０】
2018174078.tif 000207
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−カルバモイルチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４０５．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１９【０３４９】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−シアノ−［２，４’−ビチアゾール］−２’−イル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチルの合成
【化１４１】
2018174078.tif 000208
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−シアノチアゾール−２−イル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：４３７．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．７４【０３５０】
下記の表２６に示す化合物は（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−シアノ−［２，４’−ビチアゾール］−２’−イル）プロパン酸  ｔｅｒ
ｔ−ブチルの合成と同様に実施した。【０３５１】
【表２６】
2018174078.tif 000209
【０３５２】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（（１−（５−シアノチオフェン−２−イル）−１−オキソ−５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）オキシ）フェニル）プロパン酸の合成
【化１４２】
2018174078.tif 000210
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（４−（（１−（５−シアノチオフェン−２−イル）−１−オキソ−５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）オキシ）フェニル）プロパン酸  ｔｅｒｔ−ブチル（８９１ｍｇ）のジクロロメタン溶液（５ｍＬ）にトリフルオロ酢酸（２５ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣にジクロロメタン（１０ｍＬ）、ジイソプロピルエチルアミン（３ｍＬ）、Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニルオキシ］スクシンイミド（４６４ｍｇ）を加え、室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、メタノール／酢酸エチル＝０／１００→３０／７０）にて精製し、淡黄色油状の標題化合物（９２１ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：７１４．４（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５３【０３５３】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（２−（２−（２−（２−（（６−シアノピリジン−３−イル）オキシ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）フェニル）プロパン酸の合成
【化１４３】
2018174078.tif 000211
以下表に示す化合物は（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（（１−（５−シアノチオフェン−２−イル）−１−オキソ−５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）オキシ）フェニル）プロパン酸の合成と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：６８２．２（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５８【０３５４】
下記の表２７に示す化合物は（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（（１−（５−シアノチオフェン−２−イル）−１−オキソ−５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）オキシ）フェニル）プロパン酸の合成と同様に実施した。【０３５５】
【表２７−１】
2018174078.tif 000212
【表２７−２】
2018174078.tif 000213
【表２７−３】
2018174078.tif 000214
【表２７−４】
2018174078.tif 000215
【表２７−５】
2018174078.tif 000216
【０３５６】
ｐｄＣｐＡアミノ酸−１の合成
【化１４４】
2018174078.tif 000217
シアノメチル（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（２−シアノベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル）プロパノアート（１．１５ｍｇ）にｐｄＣｐＡ（Ｇｅｎｅ  Ａｃｔ社製）（デオキシシチジンとアデノシンから構成されるジヌクレオチド）のＤＭＦ溶液（１．０ＯＤ／μＬ）１３．７μＬを加え、ボルテックスで１時間振とうした。ＯＤは光学濃度を示す。反応後、０．３８％ギ酸水溶液／アセトニトリル（１／１）溶液で希釈し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社製１２６０ＩｎｆｉｎｉｔｙバイナリＬＣシステム、カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ社製ＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ｃ１８（９．４ｘ５０ｍｍ）、カラム温度：４０℃、グラジエント条件：Ｈ2Ｏ（０．１％ＴＦＡ）／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）＝９０／１０→０／１００、流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長：２５４ｎｍ）により精製した。得られた目的物溶液の溶媒を減圧留去し、得られた残渣にＴＦＡを１００μＬ加えた。室温で１時間振とうした後、溶媒を減圧留去し、ｐｄＣｐＡアミノ酸−１を得た。同定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製、ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳ、マトリックス：α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）により行った。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ｍ／ｚ）：８６４．５（Ｍ−Ｈ）【０３５７】
下記の表２８に示すｐｄＣｐＡアミノ酸−２〜２９の合成はｐｄＣｐＡアミノ酸−１の合成と同様の操作で合成を行った。【０３５８】
【表２８−１】
2018174078.tif 000218
【表２８−２】
2018174078.tif 000219
【表２８−３】
2018174078.tif 000220
【表２８−４】
2018174078.tif 000221
【表２８−５】
2018174078.tif 000222
【表２８−６】
2018174078.tif 000223
【表２８−７】
2018174078.tif 000224
【表２８−８】
2018174078.tif 000225
【表２８−９】
2018174078.tif 000226
【０３５９】
下記の表２９に示すｐｄＣｐＡアミノ酸の合成はｐｄＣｐＡアミノ酸−１の合成と同様の操作で合成を行った。【０３６０】
【表２９−１】
2018174078.tif 000227
【表２９−２】
2018174078.tif 000228
【表２９−３】
2018174078.tif 000229
【表２９−４】
2018174078.tif 000230
【表２９−５】
2018174078.tif 000231
【表２９−６】
2018174078.tif 000232
【表２９−７】
2018174078.tif 000233
【表２９−８】
2018174078.tif 000234
【表２９−９】
2018174078.tif 000235
【表２９−１０】
2018174078.tif 000236
【表２９−１１】
2018174078.tif 000237
【表２９−１２】
2018174078.tif 000238
【表２９−１３】
2018174078.tif 000239
【表２９−１４】
2018174078.tif 000240
【０３６１】
以降のＤＮＡおよびＲＮＡを使用した実験において使用した水は全て、ＱＩＡＧＥＮ社製Ｎｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒである。【０３６２】
ｍＲＮＡの合成
無細胞翻訳合成に使用したｍＲＮＡ−１〜ｍＲＮＡ−１３は全て以下の方法に従って合成した。
オープンリーディングフレームの上流にＴ７プロモーター、リボソームが結合する塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ｍＲＮＡの鋳型ＤＮＡ遺伝子を作製した（鋳型ＤＮＡ−１〜１３、下記表）。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。【０３６３】
次に、ｍＲＮＡを転写反応により合成した。下記溶液組成１の溶液を調製し、３７℃で６時間反応させた。５Ｍ酢酸アンモニウム１００μＬを加え、軽く混合し、氷上で２０分置いた。混合物を１３２００ｒｐｍ、４℃で２０分遠心した後、上清を除き、１ｘＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））２００μＬで沈殿を溶解させた。なお、Ｔｒｉｓはトリスヒドロキシメチルアミノメタンを示し、ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸を示す。等量のフェノール／クロロホルム＝１／１（１ｘＴＥで飽和させたもの）を加え攪拌し、遠心した。上層を回収し、等量のクロロホルムを加え、攪拌、遠心した。上層を回収し、３ｍｏｌ／Ｌ酢酸カリウム  ｐＨ４．５  ２０μＬ、エタノール６００μＬを加え、軽く混合し、−８０℃で３０分置いた。１３２００ｒｐｍ、４℃で３０分遠心した後、上清を除き、−３０℃で保存してある７０％冷エタノール２００μＬを加え、１３２００ｒｐｍ、４℃で５秒遠心した。上清を除き、減圧乾燥した。分光光度計で濃度を決定し、１６μｍｏｌ／Ｌになるように水に溶解させた。【０３６４】
・溶液組成１
１０ｘＢｕｆｆｅｒ（４００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，８０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ2，５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール））：１０μＬ
２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＴＰｓ（ヌクレオシド三リン酸混合物）：１６μＬ
１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ：２μＬ
０．１％  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）：１μＬ
ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０ｕｎｉｔ／μＬ、タカラバイオ社製）：１μＬ
ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（０．５ｕｎｉｔ／μＬ、シグマアルドリッチ社製）：１μＬ
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５０ｕｎｉｔ／μＬ；東洋紡社製）：４μＬ
ｍＲＮＡの鋳型ＤＮＡ遺伝子（１００ｎｇ／μＬ）：２０μＬ
水：４５μＬ【０３６５】
「配列表」
【表３０】
2018174078.tif 000241
表８【０３６６】
鋳型ＤＮＡ−１〜鋳型ＤＮＡ−１３の全配列はそれぞれ、「配列表」の配列番号１〜１３に記載する。
鋳型ＤＮＡ−１から合成されたｍＲＮＡをｍＲＮＡ−１とし、以降ｍＲＮＡ−２〜１３は同様に規定した。【０３６７】
アンバーサプレッサーｔＲＮＡ（−ＣＡ）の合成
国際公開ＷＯ０７／０５５４２９に記載のマイコプラズマ・カプリコラム由来トリプトファンｔＲＮＡ変異体で３’末端のＣＡジヌクレオチドを欠落させたｔＲＮＡをＰＣＲで増幅し、ｔＲＮＡ（−ＣＡ）遺伝子を作製し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
次に、ｔＲＮＡ（−ＣＡ）を転写反応により合成した。下記溶液組成２の溶液を調製し、３７℃で１２時間反応させた。ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）によりｔＲＮＡ（−ＣＡ）を精製し、２００μｍｏｌ／Ｌになるように水に溶解させた。【０３６８】
・溶液組成２
１０ｘＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（４００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ2，５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ）：１０μＬ
２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＴＰｓ：１６μＬ
１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＧＭＰ：２０μＬ
１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ：２μＬ
０．１％  ＢＳＡ：１μＬ
ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０ｕｎｉｔ／μＬ、タカラバイオ社製）：１  μＬ
ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（０．５ｕｎｉｔ／μＬ、シグマアルドリッチ社製）：１μＬ
Ｔ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５０ｕｎｉｔ／μＬ；  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）：８μＬ
ｔＲＮＡ（−ＣＡ）遺伝子（１００ｎｇ／μＬ）：４１μＬ【０３６９】
アミノアシルｔＲＮＡ−１の合成（ＲＮＡ部分の塩基配列は、「配列表」の配列番号１４に示す）
【化１４５】
2018174078.tif 000242
【０３７０】
１．５ｍＬサンプルチューブに下記溶液組成３の溶液を調製し、４℃で２時間静置した。その後、反応溶液に０．６ｍｏｌ／Ｌ酢酸カリウム水溶液（ｐＨ４．５）を２６．７μＬ、エタノールを１６０μＬ加え、−８０℃で３０分間静置した。その後、遠心分離（４℃、１３２００ｒｐｍ）を３０分間行い、上澄みを除去した。７０％エタノール水溶液２００μＬを静かに加え、遠心分離（４℃、１３２００ｒｐｍ）を１分間行った。上澄みを再除去し、減圧乾燥を行い、アミノアシルｔＲＮＡ−１を得た。得られたアミノアシルｔＲＮＡは翻訳混合物に添加する直前に１ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸カリウム水溶液に溶解した。【０３７１】
・溶液組成３
水：１４μＬ
５ｘＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２７５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−Ｎａ  ｐＨ７．５，７５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ2，１６．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ，５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ）：５．３４μＬ
０．１％ＢＳＡ：０．５４μＬ
ｐｄＣｐＡアミノ酸−１のＤＭＳＯ溶液（０．７３ｍｍｏｌ／Ｌ）：２．６６μＬ
アンバーサプレッサーｔＲＮＡ（−ＣＡ）水溶液（２００μｍｏｌ／Ｌ）：３．３４μＬ
Ｔ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ溶液（タカラバイオ社製、４０Ｕ／μＬ）：０．８０μＬ
なお、ＨＥＰＥＳは、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸を示し、ＤＭＳＯは、ジメチルスルホキシドを示す。【０３７２】
下記の表３１と３２に示すアミノアシルｔＲＮＡ−2〜68はアミノアシルｔＲＮＡ−１の合成と同様にして実施した。【０３７３】
【表３１−１】
2018174078.tif 000243
【表３１−２】
2018174078.tif 000244
【表３１−３】
2018174078.tif 000245
【０３７４】
【表３２−１】
2018174078.tif 000246
【表３２−２】
2018174078.tif 000247
【表３２−３】
2018174078.tif 000248
【表３２−４】
2018174078.tif 000249
【０３７５】
非天然アミノ酸の導入された鎖状ペプチドの無細胞翻訳合成および式（１）で表される環状ペプチドの合成
本項のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳは、ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）を使用した。マトリックスは、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を使用した。【０３７６】
環状ペプチド１−１の合成
【化１４６】
2018174078.tif 000250
【０３７７】
１．５ｍＬサンプルチューブに下記溶液組成４の溶液を調製し、３７℃で１．５時間インキュベートした。反応溶液にｗａｓｈバッファー（組成：２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール）を３１μＬ、磁気ビーズ溶液（ＭＢＬライフサイエンス社製、Ａｎｔｉ−ＤＤＤＤＫ−ｔａｇ  ｍＡｂ−Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｇａｒｏｓｅ）１０μＬを添加し、３０分間室温でボルテックスを使用して振とうした。その後、遠心分離を行い、上澄み溶液を除去した。得られた磁気ビーズの洗浄操作（ｗａｓｈバッファーを２００μＬ添加→ボルテックスによる振とう→遠心分離→上澄みの除去）を３回繰り返した。得られた磁気ビーズに２％ギ酸水溶液を１０μＬ添加し、１時間室温でボルテックスを使用して振とうした。その後、遠心分離により磁気ビーズを沈降させ、上澄みを回収し、環状ペプチド１−１を得た。得られたペプチドの同定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより行った。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ｍ／ｚ）：２３８２．０（Ｍ＋Ｈ）【０３７８】
・溶液組成４
水：２μＬ
ｍＲＮＡ−１水溶液（０．０２ＯＤ／μＬ）：１μＬ
アミノアシルｔＲＮＡ−１水溶液（０．２ＯＤ／μＬ）：１μＬ
アミノ酸水溶液（Ｍｅｔ以外の１９アミノ酸、各０．３ｍｍｏｌ／Ｌの混合物）：１．５μＬ
ＰＵＲＥｆｒｅｘ（登録商標）カスタムｖｅｒ２（ジーンフロンティア社製、ＰＦＣ−Ｚ１８０２）
ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ    ：４μＬ
ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩ  ：０．５μＬ
ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩ：１μＬ【０３７９】
下記の表３３に示す環状ペプチド１−２〜２７の合成は、表３３に示すｍＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡの組み合わせを使用し、環状ペプチド１−１の合成と同様の操作で実施した。【０３８０】
【表３３−１】
2018174078.tif 000251
【表３３−２】
2018174078.tif 000252
【表３３−３】
2018174078.tif 000253
【０３８１】
下記の表３４に示す環状ペプチドの合成は、表３４に示すｍＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡの組み合わせを使用し、環状ペプチド１−１の合成と同様の操作で実施した。【０３８２】
【表３４−１】
2018174078.tif 000254
【表３４−２】
2018174078.tif 000255
【表３４−３】
2018174078.tif 000256
【表３４−４】
2018174078.tif 000257
【表３４−５】
2018174078.tif 000258
【表３４−６】
2018174078.tif 000259
【０３８３】
環状ペプチド１−２８の合成
【化１４７】
2018174078.tif 000260
【０３８４】
１．５ｍＬサンプルチューブに上記溶液組成４の溶液を調製し、３７℃で３０分インキュベートした。反応溶液に０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ６．４）７０μＬを添加し、３７℃で４時間インキュベートした。反応溶液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液２０μＬ、磁気ビーズ溶液（ＭＢＬライフサイエンス社製、Ａｎｔｉ−ＤＤＤＤＫ−ｔａｇ  ｍＡｂ−Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｇａｒｏｓｅ）１０μＬを添加し、３０分間室温でボルテックスを使用して振とうした。その後、遠心分離を行い、上澄み溶液を除去した。得られた磁気ビーズの洗浄操作（ｗａｓｈバッファーを２００μＬ添加→ボルテックスによる振とう→遠心分離→上澄みの除去）を３回繰り返した。得られた磁気ビーズに２％ギ酸水溶液を１０μＬ添加し、１時間室温でボルテックスを使用して振とうした。その後、遠心分離により磁気ビーズを沈降させ、上澄みを回収し、環状ペプチド１−２８を得た。得られたペプチドの同定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより行った。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ｍ／ｚ）：２３２５．１（Ｍ＋Ｈ）【０３８５】
環状ペプチド１−２９の合成
環状ペプチド１−２８の合成におけるアミノアシルｔＲＮＡ−２８をアミノアシルｔＲＮＡ−２９に変更し、バッファー添加後のインキュベート時間を２４時間とすることで、表３５に示す環状ペプチド−２９を得た。【０３８６】
【表３５】
2018174078.tif 000261
【０３８７】
環状ペプチド１−３０〜３８の合成
下記の表３６に示す環状ペプチド１−３０〜３８の合成は、表３６に示すｍＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡの組み合わせを使用し、環状ペプチド１−１の合成と同様の操作で実施した。【０３８８】
【表３６−１】
2018174078.tif 000262
【表３６−２】
2018174078.tif 000263
【０３８９】
環状ペプチド１−３９〜４７の合成
下記の表３７に示す環状ペプチド１−３９〜４７の合成は、表３７に示すｍＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡの組み合わせを使用し、環状ペプチド１−１の合成と同様の操作で実施した。【０３９０】
【表３７−１】
2018174078.tif 000264
【表３７−２】
2018174078.tif 000265
【０３９１】
環状ペプチド１−４８の合成
【化１４８】
2018174078.tif 000266
環状ペプチド１−４８の合成は、ｍＲＮＡ−４およびアミノアシルｔＲＮＡ−１０の組み合わせを使用し、環状ペプチド１−１の合成と同様の操作で実施した。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ｍ／ｚ）：２１５９．９（Ｍ＋Ｈ）【０３９２】
環状ペプチド１−４９の合成
【化１４９】
2018174078.tif 000267
環状ペプチド１−４９の合成は、ｍＲＮＡ−５およびアミノアシルｔＲＮＡ−１０の組み合わせを使用し、環状ペプチド１−１の合成と同様の操作で実施した。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ｍ／ｚ）：２２１７．６（Ｍ＋Ｈ）【０３９３】
環状ペプチド１−５０の合成
【化１５０】
2018174078.tif 000268
環状ペプチド１−５０の合成は、ｍＲＮＡ−６およびアミノアシルｔＲＮＡ−１０の組み合わせを使用し、環状ペプチド１−１の合成と同様の操作で実施した。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ｍ／ｚ）：２０８８．９（Ｍ＋Ｈ）【０３９４】
環状ペプチド１−５１の合成
【化１５１】
2018174078.tif 000269
環状ペプチド１−５１の合成は、ｍＲＮＡ−７およびアミノアシルｔＲＮＡ−１０の組み合わせを使用し、環状ペプチド１−１の合成と同様の操作で実施した。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ｍ／ｚ）：２００１．８（Ｍ＋Ｈ）【０３９５】
環状ペプチド１−５２の合成
【化１５２】
2018174078.tif 000270
環状ペプチド１−５２の合成は、ｍＲＮＡ−８およびアミノアシルｔＲＮＡ−１０の組み合わせを使用し、環状ペプチド１−１の合成と同様の操作で実施した。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ｍ／ｚ）：１８４５．７（Ｍ＋Ｈ）【０３９６】
環状ペプチド１−５３の合成
【化１５３】
2018174078.tif 000271
環状ペプチド１−５３の合成は、ｍＲＮＡ−９およびアミノアシルｔＲＮＡ−１０の組み合わせを使用し、環状ペプチド１−１の合成と同様の操作で実施した。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ｍ／ｚ）：１７４８．７（Ｍ＋Ｈ）【０３９７】
環状ペプチド１−５４の合成
【化１５４】
2018174078.tif 000272
環状ペプチド１−５４の合成は、ｍＲＮＡ−１０およびアミノアシルｔＲＮＡ−１０の組み合わせを使用し、環状ペプチド１−１の合成と同様の操作で実施した。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ｍ／ｚ）：３００１．３（Ｍ＋Ｈ）【０３９８】
環状ペプチド１−５５の合成
【化１５５】
2018174078.tif 000273
環状ペプチド１−５５の合成は、ｍＲＮＡ−１１およびアミノアシルｔＲＮＡ−１０の組み合わせを使用し、環状ペプチド１−１の合成と同様の操作で実施した。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ｍ／ｚ）：３６１４．６（Ｍ＋Ｈ）【０３９９】
環状ペプチド１−５６の合成
【化１５６】
2018174078.tif 000274
環状ペプチド１−５６の合成は、ｍＲＮＡ−１２およびアミノアシルｔＲＮＡ−１０の組み合わせを使用し、環状ペプチド１−１の合成と同様の操作で実施した。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ｍ／ｚ）：  ２３２７．０（Ｍ＋Ｈ）【０４００】
環状ペプチド１−５７の合成
【化１５７】
2018174078.tif 000275
環状ペプチド１−５７の合成は、ｍＲＮＡ−１３およびアミノアシルｔＲＮＡ−１０の組み合わせを使用し、環状ペプチド１−１の合成と同様の操作で実施した。
ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ｍ／ｚ）：２０９０．９（Ｍ＋Ｈ）【０４０１】
ペプチド自動合成装置によるペプチド固相合成の一般法
ペプチド自動合成装置（ｂｉｏｔａｇｅ社製  ＳｙｒｏＩ）を用いてペプチド固相合成を行なった。合成装置にＲｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）（バイオタージ社製）、Ｆｍｏｃアミノ酸（０．５ｍｏｌ／Ｌ）のＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）溶液、シアノ―ヒドロキシイミノ―酢酸エチルエステル（１．０ｍｏｌ／Ｌ）およびジイロプロピルエチルアミン（０．１ｍｏｌ／Ｌ）のＮＭＰ溶液、ジイソプロピルカルボジイミド（１．０ｍｏｌ／Ｌ）のＮＭＰ溶液、ピペリジン（２０％ｖ／ｖ）のＮＭＰ溶液、および無水酢酸（２０％ｖ／ｖ）のＮＭＰ溶液をセットし、マニュアルに従い合成を行った。Ｆｍｏｃ脱保護（２０分）、ＮＭＰによる洗浄、Ｆｍｏｃアミノ酸の縮合（１時間）、ＮＭＰによる洗浄を１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことで、ペプチド鎖を伸長させた。本項のＨＰＬＣは、１２６０ＩｎｆｉｎｉｔｙバイナリＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）もしくはＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ社製）を使用した。
カラム：Ｗａｔｅｒｓ社製  Ｘ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＣＳＨ１３０  Ｃ１８  （１０ｘ２５０ｍｍ）もしくはＷａｔｅｒｓ社製  Ｘ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＣＳＨ１３０  Ｃ１８  （１９ｘ２５０ｍｍ）
カラム温度：４０℃
流速：
流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）、２０ｍＬ／ｍｉｎ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
検出波長：２２０ｎｍ、２５４ｎｍ【０４０２】
環状ペプチド２−１の合成
【化１５８】
2018174078.tif 000276
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（０．５ｍｍｏｌ／ｇ，  ４０ｍｇ）を出発原料として用いて、ペプチド固相合成を行った。（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（２−シアノベンゾ［ｂ］チオフェン−４−イル）プロピオン酸、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｎ−ω−（２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル）−Ｌ−アルギニン（Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ），Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−１−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−トリプトファン（Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ）、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−β−シクロヘキシル−Ｄ−アラニン（Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｈａ−ＯＨ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ）、Ｎ−α−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン（Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）の順に縮合を行った。伸長終了後、レジンをジクロロメタンで洗浄したのち、減圧下溶媒を留去した。ＴＦＡ：トリイソプロピルシラン：水（＝９５：２．５：２．５、２．０ｍＬ）を加え、ペプチドの切り出しと脱保護を行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ−ヘキサン：メチル−ｔ−ブチルエーテル（＝１：１、１２ｍＬ）を加え、固体を生じさせた。遠心分離を行い固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル−ｔ−ブチルエーテルで固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。得られた固体にＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３，  ２．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）を加え、２時間反応を行った。Ｓｅｐ−ｐａｋ  Ｃ１８（ｗａｔｅｒｓ）を用いて、ペプチドを担体に吸着させた後、水で洗浄、アセトニトリルおよびメタノールで溶出を行い、塩類を除去した。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製した後、炭酸水素トリエチルアンモニウム溶液（１．０ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８．５）を加え中和し、溶媒を減圧留去することで、白色固体の環状ペプチド２−１（０．９１ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：９２３．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１９【０４０３】
環状ペプチド２−１と同様にして、下記の表３８に示す化合物を得た。【０４０４】
【表３８−１】
2018174078.tif 000277
【表３８−２】
2018174078.tif 000278
【表３８−３】
2018174078.tif 000279
【０４０５】
環状ペプチド３−１の合成
【化１５９】
2018174078.tif 000280
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（０．５ｍｍｏｌ／ｇ）１００ｍｇを出発原料として用いて、ペプチド固相合成を行った。（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（６−シアノピリジン−３−イル）プロピオン酸、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ，  Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ，  Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｈａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨの順に縮合を行った。伸長終了後、レジンをジクロロメタンで洗浄したのち、減圧下溶媒を留去した。ＴＦＡ：トリイソプロピルシラン：水（＝９５：２．５：２．５、  ３．０ｍＬ）を加え、ペプチドの切り出しと脱保護を行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ−ヘキサン：メチル−ｔ−ブチルエーテル（＝１：１、１２ｍＬ）を加え、固体を生じさせた。遠心分離を行い、固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル−ｔ−ブチルエーテルで固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。得られた固体に、リン酸緩衝液（ｐＨ６．４，５．０ｍＬ）、アセトニトリル（１．０ｍＬ）を加え、２時間反応を行った。Ｓｅｐ−ｐａｋ  Ｃ１８（ｗａｔｅｒｓ）を用いて、ペプチドを担体に吸着させた後、水で洗浄、アセトニトリルおよびメタノールで溶出を行い、塩類を除去した。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製した後、炭酸水素トリエチルアンモニウム溶液（１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ８．５）を加え中和し、溶媒を減圧留去することで、無色油状の環状ペプチド３−１（０．９３ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：８６９．２（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．０９【０４０６】
環状ペプチド３−１と同様にして、下記の表３９に示す化合物を得た。【０４０７】
【表３９】
2018174078.tif 000281
【０４０８】
環状ペプチド４−１の合成
【化１６０】
2018174078.tif 000282
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（０．５ｍｍｏｌ／ｇ）１００ｍｇを出発原料として用いて、ペプチド固相合成を行った。（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（６−シアノピリジン−２−イル）プロピオン酸、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｄ−フェニルアラニン（Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨ）、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）グリシン（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｏ−（ｔ−ブチル）−Ｄ−チロシン（Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ）、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨの順に縮合を行った。伸長終了後、レジンをジクロロメタンで洗浄したのち、減圧下溶媒を留去した。反応溶液にＴＦＡ：トリイソプロピルシラン：水（＝９５：２．５：２．５、３．０ｍＬ）を加え、ペプチドの切り出しと脱保護を行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ−ヘキサン：メチル−ｔ−ブチルエーテル（＝１：１、１２ｍＬ）を加え、固体を生じさせた。遠心分離を行い、固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル−ｔ−ブチルエーテルで固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。得られた固体にＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３，５．０ｍＬ）、アセトニトリル（１．０ｍＬ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（０．５ｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍＬ）水溶液を加え、室温下２時間撹拌した後、１３時間静置した。溶液を減圧濃縮し、得られた残渣をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸水溶液：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製した後、炭酸水素トリエチルアンモニウム溶液（１．０Ｍ、ｐＨ８．５）を加え中和し、減圧下溶媒を留去することで、無色油状の環状ペプチド４−１（２．６１ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：７０１．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：０．９７【０４０９】
環状ペプチド４−１と同様の方法で、以下の表４０、４１、および４２に示す環状ペプチド４−２〜７と、環状ヘ゜フ゜チト゛４−８および環状ペプチド４−９を得た。【０４１０】
【表４０】
2018174078.tif 000283
【０４１１】
【表４１】
2018174078.tif 000284
【０４１２】
【表４２】
2018174078.tif 000285
【０４１３】
環状ペプチド４−８
【化１６１】
2018174078.tif 000286
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：１１３５．２
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１５【０４１４】
環状ペプチド４−９
【化１６２】
2018174078.tif 000287
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：１１５１．２
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１２【０４１５】
環状ペプチド５−１の合成
【化１６３】
2018174078.tif 000288
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（０．５ｍｍｏｌ／ｇ）５０ｍｇを出発原料として用いて、ペプチド固相合成を行った。Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−３−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＣＮ）−ＯＨ）、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｄ−グルタミン酸  γ−ｔ−ブチル  エステル（Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ）、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｄ−トリプトファン（Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＯＨ）、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシン（Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ）、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｄ−バリン（Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｖａｌ−ＯＨ）、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨの順に縮合を行った。伸長終了後、レジンをジクロロメタンで洗浄した後、減圧下溶媒を留去した。反応溶液にＴＦＡ：トリイソプロピルシラン：水（＝９５：２．５：２．５、３．０ｍＬ）を加え、ペプチドの切り出しと脱保護を行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ−ヘキサン：メチル−ｔ−ブチルエーテル（＝１：１、１２ｍＬ）を加え、固体を生じさせた。遠心分離を行い、固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル−ｔ−ブチルエーテルで固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。得られた固体にリン酸バッファー（ｐＨ６．４，  ２．５ｍＬ）、メタノール（１．０ｍＬ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（０．５ｍｏｌ／Ｌ、０．０２５ｍＬ）水溶液を加え、室温下４２時間撹拌した。Ｓｅｐ−ｐａｋ  Ｃ１８（ｗａｔｅｒｓ）を用いて、ペプチドを担体に吸着させた後、水で洗浄、アセトニトリルおよびメタノールで溶出を行い、塩類を除去した。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸水溶液：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製した後、炭酸水素トリエチルアンモニウム溶液（１．０Ｍ、ｐＨ８．５）を加え中和し、減圧下溶媒を留去することで、無色油状の環状ペプチド５−１（０．６７ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：８０２．９（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．２１【０４１６】
環状ペプチド６−１の合成
【化１６４】
2018174078.tif 000289
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（０．５ｍｍｏｌ／ｇ）５０ｍｇを出発原料として用いて、ペプチド固相合成を行った。（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（６−（４−（（アリルオキシ）カルボニル）チアゾール−２−イル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｈａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨの順に縮合を行った。ペプチド伸長後、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)（Ｐｄ（ＰＰｈ3）4）（２９ｍｇ）、クロロホルム：酢酸：Ｎ−メチルモルホリン（＝３７／２／１，  １．５ｍＬ）を加え１時間反応させ、アリル基を除去した。ピペリジン（２０％ｖ／ｖ）のＮＭＰ溶液を加え、２０分反応させることで、Ｆｍｏｃ基の除去を行った後、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（１９ｍｇ）、ジイロプロピルエチルアミン（１７μＬ）、１―メチル―２―ピロリドン（１．５ｍＬ）を加え２時間反応させることで、ペプチドを環化させた。レジンをジクロロメタンで洗浄したのち、減圧下溶媒を留去した。反応溶液にＴＦＡ：トリイソプロピルシラン：水（＝９２．５：２．５：２．５、２．０ｍＬ）を加え、ペプチドの切り出しと脱保護を行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ−ヘキサン：メチル−ｔ−ブチルエーテル（＝１：１、１２ｍＬ）を加え、固体を生じさせた。遠心分離を行い、固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル−ｔ−ブチルエーテルで固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製することで、白色固体の環状ペプチド６−１（０．９１ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：８６７．０
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１１【０４１７】
環状ペプチドａ―１−１の合成
【化１６５】
2018174078.tif 000290
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（０．４８ｍｍｏｌ／ｇ）１０４ｍｇを出発原料として用いて、ペプチド固相合成を行った。（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（５−シアノチオフェン−３−イル）プロパン酸、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ，  Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ，  Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｈａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｎ−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｓ−（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル）−Ｌ−システインの順に縮合を行った。伸長終了後、ピペリジン（２０％ｖ／ｖ）のＮＭＰ溶液を加え、２０分反応させることで、Ｆｍｏｃ基の除去を行った。レジンをジクロロメタンで洗浄したのち、減圧下溶媒を留去した。ＴＦＡ：３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール：トリイソプロピルシラン：水（＝９２．５：２．５：２．５：２．５、３．０ｍＬ）を加え、ペプチドの切り出しと脱保護を行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ−ヘキサン：メチル−ｔ−ブチルエーテル（＝１：１、１２ｍＬ）を加え、固体を生じさせた。遠心分離を行い、固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル−ｔ−ブチルエーテルで固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。得られた固体に、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０，５．０ｍＬ）、メタノール（５．０ｍＬ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（０．５ｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍＬ）を加え、１時間撹拌した。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製した後、炭酸水素トリエチルアンモニウム溶液（１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ８．５）を加え中和し、減圧下溶媒を留去することで、白色固体の環状ペプチドａ−１−１（２．６３ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：８８８．２（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１２【０４１８】
環状ペプチドa―１−１の合成と同様の方法で、以下の表４３に示す環状ペプチドa―１−２〜１８を得た。【０４１９】
【表４３−１】
2018174078.tif 000291
【表４３−２】
2018174078.tif 000292
【表４３−３】
2018174078.tif 000293
【０４２０】
環状ペプチドａ−１−１９
【化１６６】
2018174078.tif 000294
環状ペプチドａ−１−１９の合成は環状ペプチドａ−１−１と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：８５４．１（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１４【０４２１】
環状ペプチドa−２−１の合成
【化１６７】
2018174078.tif 000295
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（０．５４ｍｍｏｌ／ｇ，  １０４ｍｇ）を出発原料として用いて、ペプチド固相合成を行った。（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（４−（（アリルオキシ）カルボニル）アミノ）フェニル）プロパン酸、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｈａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨの順に縮合を行った。ペプチド伸長後、Ｐｄ（ＰＰｈ3）4（５８ｍｇ）、クロロホルム：酢酸：Ｎ−メチルモルホリン（＝３７：２：１，  ２．０ｍＬ）を加え１時間撹拌し、Ａｌｌｏｃ基を除去した。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＣＮ）−ＯＨの順に縮合を行った。ピペリジン（２０％ｖ／ｖ）のＮＭＰ溶液を加え、２０分反応させることで、Ｆｍｏｃ基の脱保護を行い、無水酢酸（２０％  ｖ／ｖ）のＮＭＰ溶液を加え１０分反応させることで、Ｎ末端のアミノ基をアセチル化した。レジンをジクロロメタンで洗浄したのち、減圧下溶媒を留去した。ＴＦＡ：トリイソプロピルシラン：水（＝９５：２．５：２．５、３．０ｍＬ）を加え、ペプチドの切り出しと脱保護を行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ−ヘキサン：メチル−ｔ−ブチルエーテル（＝１：１、１２ｍＬ）を加え、固体を生じさせた。遠心分離を行い固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル−ｔ−ブチルエーテルで固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。得られた固体にリン酸バッファー（ｐＨ７．０，  ５ｍＬ）、メタノール（５ｍＬ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（０．５ｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍＬ）水溶液を加え、３０時間反応を行った。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製した後、炭酸水素トリエチルアンモニウム溶液（１．０ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８．５）を加え中和し、減圧下溶媒を留去することで、白色固体の環状ペプチドａ−２−１（７．９６ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：１１８４．２（Ｍ−Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１１【０４２２】
環状ペプチドａ−２−２
【化１６８】
2018174078.tif 000296
環状ペプチドａ−２−２の合成は環状ペプチドａ−２−１と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：１１０７．３（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１７【０４２３】
環状ペプチドａ―３―１
【化１６９】
2018174078.tif 000297
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（０．５４ｍｍｏｌ／ｇ，  １０４ｍｇ）を出発原料として用いて、ペプチド固相合成を行った。Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＣＮ）−ＯＨ、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシン（Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−アラニン（Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ）、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）―ＯＨの順に縮合を行った。レジンをジクロロメタンで洗浄したのち、減圧下溶媒を留去した。ＴＦＡ：３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール：トリイソプロピルシラン：水（＝９２．５：２．５：２．５：２．５、３．０ｍＬ）を加え、ペプチドの切り出しと脱保護を行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ−ヘキサン：メチル−ｔ−ブチルエーテル（＝１：１、１２ｍＬ）を加え、固体を生じさせた。遠心分離を行い固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル−ｔ−ブチルエーテルで固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。得られた固体にリン酸バッファー（ｐＨ７．０，  １４ｍＬ）、メタノール（１５ｍＬ）、アセトニトリル（４ｍＬ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（０．５ｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍＬ）水溶液を加え、３８時間反応を行った。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製した後、炭酸水素トリエチルアンモニウム溶液（１．０ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８．５）を加え中和し、減圧下溶媒を留去することで、白色固体の環状ペプチドａ−３−１（８．０５ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：１６６４．６（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５３【０４２４】
環状ペプチドａ−３−２。
【化１７０】
2018174078.tif 000298
環状ペプチドａ−３−１と同様に環状ペプチドａ−３−２を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：１１２９．５（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．２１【０４２５】
環状ペプチドａ−４−１
【化１７１】
2018174078.tif 000299
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（０．５４ｍｍｏｌ／ｇ，  １０４ｍｇ）を出発原料として用いて、ペプチド固相合成を行った。Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（３−ＣＮ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、N-α-（9-フルオレニルメトキシカルボニル）-N-ε-アリルオキシカルボニル-L-リジンの順に縮合を行った。ピペリジン（２０％ｖ／ｖ）のＮＭＰ溶液を加え、２０分反応させることで、Ｆｍｏｃ基の脱保護を行い、無水酢酸（２０％  ｖ／ｖ）のＮＭＰ溶液を加え１０分反応させることで、Ｎ末端のアミノ基をアセチル化した。Ｐｄ（ＰＰｈ3）4（５８ｍｇ）、クロロホルム：酢酸：Ｎ−メチルモルホリン（＝３７：２：１，  ２．０ｍＬ）を加え１時間撹拌し、Ａｌｌｏｃ基を除去した。Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを縮合した後、レジンをジクロロメタンで洗浄し、減圧下溶媒を留去した。ＴＦＡ：３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール：トリイソプロピルシラン：水（＝９２．５：２．５：２．５：２．５、３．０ｍＬ）を加え、ペプチドの切り出しと脱保護を行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ−ヘキサン：メチル−ｔ−ブチルエーテル（＝１：１、１２ｍＬ）を加え、固体を生じさせた。遠心分離を行い固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル−ｔ−ブチルエーテルで固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。得られた固体にリン酸バッファー（ｐＨ７．０，  ５ｍＬ）、メタノール（５ｍＬ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（０．５ｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍＬ）水溶液を加え、３０時間反応を行った。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製した後、炭酸水素トリエチルアンモニウム溶液（１．０ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８．５）を加え中和し、減圧下溶媒を留去することで、白色固体の環状ペプチドａ−４−１（０．２４ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：１０１１．５（Ｍ―Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：０．９８【０４２６】
環状ペプチド７−１
【化１７２】
2018174078.tif 000300
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（０．５ｍｍｏｌ／ｇ）１００ｍｇを出発原料として用いて、ペプチド固相合成を行った。Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン（Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｈａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨの順に縮合を行い、ペプチド伸長後、Ｆｍｏｃ基の脱保護を行い、クロロ酢酸をアミノ酸と同様の方法で縮合させた。レジンをジクロロメタンで洗浄したのち、減圧下溶媒を留去した。反応溶液にＴＦＡ：トリイソプロピルシラン：水（＝９５：２．５：２．５、３．０ｍＬ）を加え、ペプチドの切り出しと脱保護を行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ−ヘキサン：メチル−ｔ−ブチルエーテル（＝１：１、１２ｍＬ）を加え、固体を生じさせた。遠心分離を行い、固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル−ｔ−ブチルエーテルで固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。得られた固体にＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３、５．０ｍＬ）、アセトニトリル（１．０ｍＬ）を加え、室温下で４時間撹拌した。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ水溶液：０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液）にて精製し、白色固体の環状ペプチド７−１（１．４ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：８２４．４（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．０９【０４２７】
環状ペプチド７−１の合成と同様の方法で、下記の表４４に示す環状ペプチドを得た。【０４２８】
【表４４−１】
2018174078.tif 000301
【表４４−２】
2018174078.tif 000302
【０４２９】
環状ペプチド８−１
【化１７３】
2018174078.tif 000303
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（０．５ｍｍｏｌ／ｇ）１００ｍｇを出発原料として用いて、ペプチド固相合成を行った。Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−グルタミン酸  γ−アリルエステル（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＡｌ）−ＯＨ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｈａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨの順に縮合を行った。ペプチド伸長後、Ｐｄ（ＰＰｈ3）4（５８ｍｇ）、クロロホルム：酢酸：Ｎ−メチルモルホリン（＝３７：２：１，  ２．０ｍＬ）を加え１時間撹拌し、側鎖のアリル基を除去した。ピペリジン（２０％  ｖ／ｖ）のＮＭＰ溶液を加え、２０分反応させることで、Ｆｍｏｃ基の除去を行った。Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（５７ｍｇ）、ジイロプロピルエチルアミン（５２μＬ）、ＮＭＰ（３．０ｍＬ）を加え室温下で２時間反応させることで、ペプチドを環化させた。レジンをジクロロメタンで洗浄したのち、減圧下溶媒を留去した。反応溶液にＴＦＡ：トリイソプロピルシラン：水（＝９５：２．５：２．５、３．０ｍＬ）を室温下で加え、ペプチドの切り出しと脱保護を行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ−ヘキサン：メチル−ｔ−ブチルエーテル（＝１：１、１２ｍＬ）を加え、固体を生じさせた。遠心分離を行い、固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル−ｔ−ブチルエーテルで固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液）にて精製し、白色固体の環状ペプチド８−１（７．１ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：７９２．４（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．０２【０４３０】
環状ペプチド８−１の合成と同様の方法で、下記の表４５に示す環状ペプチドを得た。【０４３１】
【表４５】
2018174078.tif 000304
【０４３２】
環状ペプチド９−１
【化１７４】
2018174078.tif 000305
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（０．５ｍｍｏｌ／ｇ）１００ｍｇを出発原料として用いて、ペプチド固相合成を行った。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｈａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨの順に、ペプチド鎖を伸長後、ピペリジン（２０％ｖ／ｖ）のＮＭＰ溶液を加え、２０分反応させることで、Ｆｍｏｃ基の脱保護を行い、無水酢酸（２０％  ｖ／ｖ）のＮＭＰ溶液を加え１０分反応させることで、Ｎ末端のアミノ基をアセチル化した。レジンをジクロロメタンで洗浄したのち、減圧下溶媒を留去した。反応溶液にＴＦＡ：３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール：トリイソプロピルシラン：水（＝９２．５：２．５：２．５：２．５、３．０ｍＬ）を加え、ペプチドの切り出しと脱保護を行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にメチル−ｔ−ブチルエーテル（１２ｍＬ）を加え、固体を生じさせた。遠心分離を行い、固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル−ｔ−ブチルエーテルで固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。アセトニトリル（２０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）を加えたのち、炭酸水素トリエチルアンモニウム溶液（１．０  ｍｏｌ／Ｌ，  ｐＨ８．５）を少量ずつ加え、ｐＨを８．０に調整した。続いて、ヨウ素（０．１ｍｏｌ／Ｌ）のアセトニトリル溶液を、室温下ヨウ素の色が消えなくなるまで加え、ジスルフィド結合の形成を行った。３０分後、アスコルビン酸ナトリウムをヨウ素の色が消えるまで加え、減圧下溶媒を留去した。残渣をＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ水溶液／０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液）にて精製し、白色固体の環状ペプチド９−１（７．０ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：８５６．４（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１５【０４３３】
環状ペプチド９−１の合成と同様の方法で、下記の表４６に示す環状ペプチドを得た。【０４３４】
【表４６】
2018174078.tif 000306
【０４３５】
環状ペプチド１０−１
【化１７５】
2018174078.tif 000307
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（０．５ｍｍｏｌ／ｇ）８０ｍｇを出発原料として用いて、ペプチド固相合成を行った。Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−プロパルギルグリシン（Ｆｍｏｃ−Ｐｒａ−ＯＨ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｈａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨの順に、ペプチド伸長後、ピペリジン（２０％ｖ／ｖ）のＮＭＰ溶液を加え、２０分反応させることで、Ｎ末端のＦｍｏｃ基の脱保護を行った。アジド酢酸をアミノ酸と同様の方法で縮合させた。ヨウ化銅（７．６ｍｇ）、ジイソプロピルエチルアミン（３４．４μＬ）、トリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（６．４ｍｇ）、ＮＭＰ（２．０ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌することでペプチドを環化させた。レジンをジクロロメタンで洗浄したのち、減圧下溶媒を留去した。反応溶液にＴＦＡ：トリイソプロピルシラン：水（＝９５：２．５：２．５、  ２．４ｍＬ）を加え、ペプチドの切り出しと脱保護を行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ−ヘキサン：メチル−ｔ−ブチルエーテル（＝１：１、１２ｍＬ）を加え、固体を生じさせた。遠心分離を行い、固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル−ｔ−ブチルエーテルで固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣をＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ水溶液：０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液）で精製することで、白色固体の環状ペプチド１０−１（１．２６ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：８５９．０（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．０５【０４３６】
環状ペプチド１０−１の合成と同様の方法で下記の表４７に示す環状ペプチドを得た。【０４３７】
【表４７】
2018174078.tif 000308
【０４３８】
合成した環状ペプチドのＰＡＭＰＡ法による膜透過性評価
合成した環状ペプチドの膜透過性を比較検討するために、ＰＡＭＰＡ（ＰａｒａｌｌｅｌＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＭｅｍｂｒａｎｅＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙ）を実施した。
Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ．ＭＡＩＰＮ４５５０）に、Ｌ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（Ａｖａｎｔｉ，Ｃａｔ．８４００５１Ｐ，１．６７％）、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ（Ａｖａｎｔｉ，  Ｃａｔ．８４００３５Ｐ，  ０．３３％）、ｎ−ドデカン特級（ＷＡＫＯ，０４７−２１６１２）／１−オクタノール試薬特級（Ｋａｎｔｏ  ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃａｔ．３１０１３−０８）＝１０：１からなる、リン脂質有機溶媒溶液を５μＬ添加することで、人工リン脂質膜を作製した。【０４３９】
測定方法―Ａ
化合物を２０μｍｏｌ／Ｌの濃度で含むＤＭＳＯ溶液２５μＬに５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＰＢ（カリウムリン酸緩衝液、ｐＨ７．４あるいはｐＨ６．５）を４７５μＬ加えて最終濃度１μｍｏｌ／Ｌまで希釈した。その化合物溶液をＰＡＭＰＡ９６ウェルプレート（Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ．ＭＡＩＰＮ４５５０））の人工リン脂質膜を挟んで下側（ドナー側）に３００μＬずつ添加した。人工リン脂質膜を挟んで上側（アクセプター側）に２００μＬずつ５％ＤＭＳＯ  ＫＰＢ（ｐＨ７．４）を添加した。人工リン脂質膜を介した透過試験を２５℃、４時間行った。ドナープレートおよびアクセプタープレートにおける溶液中化合物濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより測定し、下記式より化合物の膜透過速度（Ｐe）を算出した。
但し、Ｃ0をドナー液中の化合物初期濃度、ｔを試験時間、Ａをメンブレンフィルター面積＝０．３  ｃｍ2、ＶDをドナー液量＝３００μＬ、ＶAをアクセプター液量＝２００μＬ、ＣD（ｔ）を時間ｔにおけるドナー液中化合物濃度、ＣA（ｔ）を時間ｔにおけるアクセプター液中化合物濃度、Ｃequilibrium ＝  ［ＣD（ｔ）＊ＶD＋ＣA（ｔ）＊ＶA］／ＶD＋ＶA）とする。【０４４０】
測定方法−Ｂ
化合物を２００μｍｏｌ／Ｌの濃度で含むＤＭＳＯ溶液２５μＬに５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＰＢ（カリウムリン酸緩衝液、ｐＨ７．４あるいはｐＨ６．５）を４７５μＬ加えて最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌまで希釈した。その化合物溶液をＰＡＭＰＡ９６ウェルプレート（Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ．ＭＡＩＰＮ４５５０））の人工リン脂質膜を挟んで下側（ドナー側）に３００μＬずつ添加した。人工リン脂質膜を挟んで上側（アクセプター側）に２００μＬずつ５％ＤＭＳＯ  ＫＰＢ（ｐＨ７．４）を添加した。人工リン脂質膜を介した透過試験を２５℃、４時間行った。ドナープレートおよびアクセプタープレートにおける溶液中化合物濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより測定し、下記式より化合物の膜透過速度（Ｐe）を算出した。
但し、Ｃ0をドナー液中の化合物初期濃度、ｔを試験時間、Ａをメンブレンフィルター面積＝０．３  ｃｍ2、ＶDをドナー液量＝３００μＬ、ＶAをアクセプター液量＝２００μＬ、ＣD（ｔ）を時間ｔにおけるドナー液中化合物濃度、ＣA（ｔ）を時間ｔにおけるアクセプター液中化合物濃度、Ｃequilibrium ＝  ［ＣD（ｔ）＊ＶD＋ＣA（ｔ）＊ＶA］／ＶD＋ＶA）とする。【０４４１】
【数１】
2018174078.tif 000309
【０４４２】
本手法により得られた膜透過性（Ｐｅ（１０-6ｃｍ／ｓ））を以下の表に記載した。
評価基準は以下の通りである。
＋＋＋    ０．５＜Ｐｅ（１０-6ｃｍ／ｓ）
＋＋      ０．２＜Ｐｅ（１０-6ｃｍ／ｓ）≦０．５
＋        ０．０１＜Ｐｅ（１０-6ｃｍ／ｓ）≦０．２
−        ０．０１≦Ｐｅ（１０-6ｃｍ／ｓ）【０４４３】
【表４８−１】
2018174078.tif 000310
【表４８−２】
2018174078.tif 000311
【表４８−３】
2018174078.tif 000312
【０４４４】
環状ペプチドを構成するアミノ酸配列は環化部分以外について同一に揃え、本発明の環状ペプチドの製造法、チオエーテル環化法、および、トリアゾール環化法、および、ジスルフィド環化法の各製法を用いて環状ペプチドを合成した。各ペプチドについてＰＡＭＰＡ法によって細胞膜透過性を評価、比較した。
その結果、本発明によって合成された環状ペプチドは、その他の製法によって合成された環状ペプチドと比較して細胞膜透過性が優れていることを示すことが出来た。【０４４５】
環状ペプチドのヒト肝ミクロソーム中代謝安定性試験
合成した環状ペプチドの代謝安定性を比較検討する目的でヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）を用いた実験を実施した。
１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、終濃度０．５ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬになるよう調製したヒト肝ミクロソーム（ＢＤ  Ｃａｔ  ＃４５２１１７）中にて、終濃度１μｍｏｌ／Ｌの化合物を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）およびウリジン５’−二リン酸−α−Ｄ−グルクロン酸（ＵＤＰＧＡ）の存在下、３７℃下で２０分間インキュベーションさせた。アセトニトリルによる除タンパク処理を施し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて残存する未変化体量を定量し、２０分における残存率（％）を算出した。本手法により得られたＨＬＭ残存率（％）を以下表に記載した。
評価基準は以下の通りである。
＋＋＋    ６０％＜ＨＬＭ残存率（％）
＋＋      ４０％＜ＨＬＭ残存率（％）≦６０％
＋        ＨＬＭ残存率（％）≦４０％【０４４６】
【表４９】
2018174078.tif 000313
【０４４７】
環状ペプチドを構成するアミノ酸配列は環化部分以外について同一に揃え、本発明の環状ペプチドの製造法、チオエーテル環化法を用いて環状ペプチドを合成した。各ペプチドをヒト肝ミクロソーム中代謝安定性試験によって代謝安定性を評価、比較した。
その結果、本発明によって合成された環状ペプチドは、その他の製法によって合成された環状ペプチドと比較して代謝安定性が優れていることを示すことが出来た。【０４４８】
＜cDNA display＞
ディスプレイライブラリーに用いるＤＮＡライブラリーの調製
合成オリゴＤＮＡ（配列番号１５）と合成オリゴＤＮＡ（配列番号１６）を用いて、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）により伸長反応を行った。９４℃で３分間変性した後、５５℃で１分、７２℃で２分のサイクルを５回繰り返した。続いて、この伸長反応産物を鋳型に合成オリゴＤＮＡ（配列番号１６）と合成オリゴＤＮＡ（配列番号１７）を用いて、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）によりＰＣＲを行った。９４℃で２分間変性した後、９４℃で１分、５０℃で１分、６８℃で１分のサイクルを５回繰り返し、ＤＮＡライブラリー（配列番号１８）を構築した。
配列中にＮと示した箇所は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃがランダムに出現することを、Ｋと示した箇所には、Ｔ、Ｇがランダムに出現することを意味する。【０４４９】
配列番号１５
AAGAAGGAGATATACATATGTGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTAGGGCGGTTCTGGCGGTAGC【０４５０】
配列番号１６
ATACTCAAGCTTATTTATTTACCCCCCGCCGCCCCCCGTCCTGCTACCGCCAGAACCGCC【０４５１】
配列番号１７
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG【０４５２】
配列番号１８
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTAGGGCGGTTCTGGCGGTAGCAGGACGGGGGGCGGCGGGGGGTAAATAAATAAGCTTGAGTAT【０４５３】
ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体調製
ＰＣＲにより調製したＤＮＡライブラリー（配列番号１８） を鋳型に、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔ７  ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いてｍＲＮＡ（配列番号１９）を調製し、エタノール沈殿により精製した。２．８μｍｏｌ／ＬのｍＲＮＡに、５μｍｏｌ／Ｌの下記ピューロマイシンリンカーＡ（つくばオリゴサービス社製）、 ＴＢＳ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ、５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を加え、９０℃で１分間反応させた後、１分毎に０．５℃ずつ２５℃まで低下させた。続いて、３６５ｎｍのＵＶを３０分間照射した後、エタノール沈殿により精製し、ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体とした。【０４５４】
配列中にＮと示した箇所は、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃがランダムに出現することを、Ｋと示した箇所には、Ｕ、Ｇがランダムに出現することを意味する。【０４５５】
配列番号１９
GGGAGACCACAACGGUUUCCCUCUAGAAAUAAUUUUGUUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKUAGGGCGGUUCUGGCGGUAGCAGGACGGGGGGCGGCGGGGGGUAAAUAAAUAAGCUUGAGUAU【０４５６】
【化１７６】
2018174078.tif 000314
上記のものがピューロマイシンリンカーＡ（つくばオリゴサービス社製）である。【０４５７】
【化１７７】
2018174078.tif 000315
上記のものが（Ｓｐ１８）を示す。【０４５８】
標的タンパク質の調製
ｐＥＴ２８ａのプラスミドに、ＭＣＬ−１のアミノ酸１−１７２部分を含む遺伝子を導入し、Ｎ末端側にＨｉｓ６タグ、ＭＢＰ、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ認識配列、３×ＦＬＡＧタグが付与されたコンストラクトのプラスミドを用意した。このプラスミドをＢＬ２１ （ＤＥ３） ＲＩＰＬ株に形質転換し、３０℃で培養した。Ｏ．Ｄ．が０．８に達したところで、ＩＰＴＧ ０．５μｍｏｌ／Ｌを添加し、大量発現を誘導した後、１６℃オーバーナイトで培養した。回収した菌体をＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）、３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ）で懸濁した後、超音波で破砕した。１５ ｋｒｐｍ, １５分、遠心分離を行い、遠心後の上清をＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に吸着させたサンプルは、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ入りのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂでｗａｓｈ後に、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ入りのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂで溶出させた。サンプルにＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ （ＧＥ ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ社製） を添加し、Ｈｉｓ６タグ、ＭＢＰ部分を切断すると同時に、透析によりＤｉａｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ （２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ （ｐＨ ７．５）, １５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ） にオーバーナイトで置換した。タグの切断を確認後、Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒで置換したアミロースレジン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）に添加し、Ｆｌｏｗ Ｔｈｒｏｕｇｈ画分を分取した。得られたサンプルをＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濃縮後、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ （ＧＥ ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ社製）にて精製した。得られたサンプルをＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａで濃縮後、−８０℃で保存した。【０４５９】
タンパク質固定化ビーズの作製
１００μＬのＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ（ｓｉｇｍａ社製）をＴＢＳ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄し、３３μｇの標的タンパク質を加えて１０分間回転混和し、タンパク質をビーズに結合させた。ビーズを回収してＴＢＳで洗浄し、標的タンパク質固定化ビーズを得た。【０４６０】
アンバーサプレッサーｔＲＮＡ（−ＣＡ）の合成
上述の方法と同様にアンバーサプレッサーｔＲＮＡを合成した。【０４６１】
アミノアシルｔＲＮＡ−１５（表３１）の合成
上述の方法と同様にアミノアシルｔＲＮＡ−１５を得た。【０４６２】
パニングに使用する翻訳液
ＰＵＲＥｆｒｅｘ（登録商標）カスタムｖｅｒ２（ジーンフロンティア社製、ＰＦＣ−Ｚ１８０２）を使用し、１０μＬの反応液に対し下記を添加した。
ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体：終濃度０．６μｍｏｌ／Ｌ
アミノアシルｔＲＮＡ−１５水溶液（０．２ＯＤ／μＬ）：１μＬ
アミノ酸水溶液（Ｍｅｔ以外の１９アミノ酸、各０．３ｍｍｏｌ／Ｌの混合物）：１．５
μＬ【０４６３】
ラウンド１のパニングを行うための翻訳、逆転写反応、パニング、ＰＣＲ
前述の翻訳液を調製し、３７℃で３０分間反応させた。この翻訳液４μＬに対して、２μＬの６０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ溶液を加え、室温で数分間放置した。続いてこの溶液に、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡社製）、５×ＲＴ ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰｓを加え３０℃で１０分、４２℃で３０分保温し、逆転写反応を行い、１０μＬのペプチド−ｍＲＮＡ複合体溶液を得た。【０４６４】
上記の溶液に対して、１０μＬの標的タンパク質固定化ビーズおよびＴＢＳを加え、室温、４５分間回転混和を行った。上清を取り除き、ＴＢＳ＋０．０５％  ｔｗｅｅｎ−２０で４回、ＴＢＳで１回、純水で１回洗浄した。【０４６５】
１μｍｏｌ／Ｌ  プライマー（配列番号２０）、１μｍｏｌ／Ｌ  プライマー（配列番号２１）、およびＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を含むＰＣＲ溶液に上記のビーズ１μＬを加え、ＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）によりＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡを鋳型に、０．３μｍｏｌ／Ｌ  プライマー（配列番号２２）、０．３μｍｏｌ／Ｌ  プライマー（配列番号２３）、およびＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を用いて再度ＰＣＲを行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）によりＤＮＡを精製した。【０４６６】
配列番号２０
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTC【０４６７】
配列番号２１
ATACTCAAGCTTATTTATTTACCCCCCGCCGCCCCCCGTCC【０４６８】
配列番号２２
GAAATTAATACGACTCACTA【０４６９】
配列番号２３
ATACTCAAGCTTATTTATTT【０４７０】
ラウンド２のパニングを行うための転写、ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体調製、翻訳、逆転写反応、パニング、ＰＣＲ
ラウンド１で増幅したｃＤＮＡから、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔ７  ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いてｍＲＮＡを合成し、エタノール沈殿により精製した。次にｍＲＮＡにピューロマイシンリンカーＡ（構造を上記の化１７６に示す）を加え、９０℃で一分間反応させた後、一分毎に０．５℃ずつ２５℃まで低下させた。続いて、３６５ｎｍのＵＶを３０分間照射した後、エタノール沈殿により精製し、ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体とした。０．６μｍｏｌ／Ｌ  ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体を含む前述の４μＬ翻訳液を調製し、３７℃で３０分間保温後、２μＬの６０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ溶液を加え、室温で数分間放置した。続いてこの溶液に、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡社製）、５×ＲＴ ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰｓを加え３０℃で１０分、４２℃で３０分保温し、逆転写反応を行い、１０μＬのペプチド−ｍＲＮＡ複合体溶液を得た。【０４７１】
上記の溶液に対して、１０μＬの標的タンパク質固定化ビーズおよびＴＢＳを加え、室温、４５分間回転混和を行った。上清を取り除き、ＴＢＳ＋０．０５％  ｔｗｅｅｎ−２０で４回、ＴＢＳで１回、純水で１回洗浄した。【０４７２】
１μｍｏｌ／Ｌプライマー（配列番号２０）、１μｍｏｌ／Ｌプライマー（配列番号２１）、およびＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を含むＰＣＲ溶液に上記のビーズ１μＬを加え、ＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）によりＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡを鋳型に、０．３μｍｏｌ／Ｌプライマー（配列番号２２）、０．３μｍｏｌ／Ｌプライマー（配列番号２３）、およびＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を用いて再度ＰＣＲを行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）によりＤＮＡを精製した。
ラウンド３においても、ラウンド２と同じ操作を繰り返すことで標的タンパク質特異的な結合を示すｃＤＮＡの濃縮を行った。濃縮されたＤＮＡプールの塩基配列解析を行い、濃縮されたペプチド配列を同定した。【０４７３】
濃縮されたペプチド配列の化学合成環状ペプチドａ−５−１の合成
【化１７８】
2018174078.tif 000316
【０４７４】
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（０．５ｍｍｏｌ／ｇ）１００ｍｇを出発原料として用いて、ペプチド固相合成を行った。（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（６−シアノピリジン−２−イル）プロピオン酸、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｏ−（ｔ−ブチル）−Ｌ−チロシン（Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン（Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリン（Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨの順に縮合を行った。伸長終了後、ピペリジン（２０％ｖ／ｖ）のＮＭＰ溶液を加え、２０分反応させることで、Ｆｍｏｃ基の脱保護を行った。レジンをジクロロメタンで洗浄した後、減圧下溶媒を留去した。反応溶液にＴＦＡ：３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール：トリイソプロピルシラン：水（＝９２．５：２．５：２．５：２．５、３．０ｍＬ）を加え、ペプチドの切り出しと脱保護を行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ−ヘキサン：メチル−ｔ−ブチルエーテル（＝１：１、１２ｍＬ）を加え、固体を生じさせた。遠心分離を行い、固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル−ｔ−ブチルエーテルで固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。得られた固体にリン酸バッファー（ｐＨ７．０，  ２．５ｍＬ）、メタノール（２．５ｍＬ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（０．５ｍｏｌ／Ｌ、０．０２５ｍＬ）水溶液を加え、４５℃で４０分間撹拌した。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸水溶液：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製した後、炭酸水素トリエチルアンモニウム溶液（１．０Ｍ、ｐＨ８．５）を加え中和し、減圧下溶媒を留去することで、無色油状の環状ペプチドａ−５−１（２１．７ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：１９５７．６（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．４０【０４７５】
環状ペプチドａ−５−２の合成
【化１７９】
2018174078.tif 000317
【０４７６】
環状ペプチドａ−５−１と同様に実施した。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：１９７９．４（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．６７【０４７７】
環状ペプチドａ−５−３の合成
【化１８０】
2018174078.tif 000318
【０４７８】
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（０．５ｍｍｏｌ／ｇ）１００ｍｇを出発原料として用いて、ペプチド固相合成を行った。（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（６−シアノピリジン−２−イル）プロピオン酸、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｎ５−トリチル−Ｌ−グルタミン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨの順に縮合を行った。伸長終了後、レジンをジクロロメタンで洗浄した後、減圧下溶媒を留去した。反応溶液に反応溶液にＴＦＡ：３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール：トリイソプロピルシラン：水（＝９２．５：２．５：２．５：２．５、３．０ｍＬ）を加え、ペプチドの切り出しと脱保護を行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ−ヘキサン：メチル−ｔ−ブチルエーテル（＝１：１、１２ｍＬ）を加え、固体を生じさせた。遠心分離を行い、固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル−ｔ−ブチルエーテルで固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。得られた固体にリン酸バッファー（ｐＨ７．０，  ２．５ｍＬ）、メタノール（２．５ｍＬ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（０．５ｍｏｌ／Ｌ、０．０２５ｍＬ）水溶液を加え、室温下２時間撹拌した。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸水溶液：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製した後、炭酸水素トリエチルアンモニウム溶液（１．０Ｍ、ｐＨ８．５）を加え中和し、減圧下溶媒を留去することで、無色油状の環状ペプチドａ−５−３（１３．４ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：１８２１．３（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．５６【０４７９】
環状ペプチドａ−５−３と同様の方法で、下記の表５０に示す化合物を得た。【０４８０】
【表５０−１】
2018174078.tif 000319
【表５０−２】
2018174078.tif 000320
【０４８１】
標的タンパク質の調製
ｐＥＴ２８ａのプラスミドに、ＭＣＬ−１のアミノ酸１−１７２部分を含む遺伝子を導入し、Ｎ末端側にＨｉｓ６タグ、ＭＢＰ、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列が付与されたコンストラクトのプラスミドを用意した。このプラスミドをＢＬ２１ （ＤＥ３） ＲＩＰＬ株に形質転換し、３０℃で培養した。Ｏ．Ｄ．が０．８に達したところで、ＩＰＴＧ ０．５ｍｍｏｌ／Ｌを添加し、大量発現を誘導した後、１６℃オーバーナイトで培養した。回収した菌体をＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ａ （２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ （ｐＨ ７．５）, １５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ）で懸濁した後、超音波で破砕した。１５ ｋｒｐｍ、１５分、遠心分離を行い、遠心後の上清をＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に吸着させたサンプルは、１５ｍｍｏｌ／Ｌ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ入りのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ａでｗａｓｈ後に、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ入りのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ａで溶出させた。サンプルは透析によりＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒに置換後、−８０℃で保存した。【０４８２】
Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ （ＳＰＲ） を利用した合成ペプチドの標的タンパク質への結合評価
合成ペプチドとＭｃｌ−１との相互作用解析のＳＰＲ実験はＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、２５℃にて実施した。固定化したタンパク質に対して、合成ペプチドを添加し、相互作用を評価した。
ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を終濃度１ｖｏｌ％となるように添加したものを用いた。Ａｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、ビアコア用センサーチップ Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製） 上にＭｃｌ−１を固定化させた。解離定数（ＫＤ）を測定するため、各合成ペプチドを複数の濃度で添加し、固定化Ｍｃｌ−１に対する結合のセンサーグラムを得た。【０４８３】
得られたセンサーグラムの解析は、Ｔ２００ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ （ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて行った。ＤＭＦまたはＤＭＳＯに対する溶媒補正を行い、次にＭｃｌ−１が固定化されていないフローセルへのセンサーグラムを差し引いたセンサーグラムを用いて、平衡値解析によりＫＤを決定した。以上のように解析して得られた結果を以下の表に示す。
ＫＤが５０μｍｏｌ／Ｌ未満であったものをＡ、５０μｍｏｌ／Ｌ以上であったものをＢと表記する。【０４８４】
【表５１】
2018174078.tif 000321
【０４８５】
ｍＲＮＡ  ｄｉｓｐｌａｙ
ディスプレイライブラリーに用いるＤＮＡライブラリーの調製
上述の方法と同様にＤＮＡライブラリーを調製した。【０４８６】
ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体調製
ＰＣＲにより調製したＤＮＡライブラリー（配列番号１８） を鋳型に、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔ７  ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いてｍＲＮＡ（配列番号１９）を調製し、エタノール沈殿により精製した。２．８μｍｏｌ／ＬのｍＲＮＡに、５μｍｏｌ／ＬのピューロマイシンリンカーＢ（つくばオリゴサービス社製）（構造を下記の化１８１に示す）、 ＴＢＳ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ、５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を加え、９０℃で五分間反応させた後、２５℃まで低下させた。続いて、３６５ｎｍのＵＶを２分間照射した後、エタノール沈殿により精製し、ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体とした。【０４８７】
【化１８１】
2018174078.tif 000322
上記の物がピューロマイシンＢ（つくばオリゴサービス社製）である
【化１８２】
2018174078.tif 000323
【０４８８】
標的タンパク質の調製
上述の方法と同様に標的タンパク質を調製した。【０４８９】
タンパク質固定化ビーズの作製
上述の方法と同様にタンパク質固定化ビーズを作製した。【０４９０】
アンバーサプレッサーｔＲＮＡ（−ＣＡ）の合成
上述の方法と同様にアンバーサプレッサーｔＲＮＡを合成した。【０４９１】
アミノアシルｔＲＮＡ−１０（表３１）の合成
上述の方法と同様にアミノアシルｔＲＮＡ−１０を得た。【０４９２】
パニングに使用する翻訳液
ＰＵＲＥｆｒｅｘ（登録商標）カスタムｖｅｒ２（ジーンフロンティア社製、ＰＦＣ−Ｚ１８０２）を使用し、１０μＬの反応液に対し下記を添加した。
ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体：終濃度０．６μｍｏｌ／Ｌ
アミノアシルｔＲＮＡ−１０水溶液（０．２ＯＤ／μＬ）：１μＬ
アミノ酸水溶液（Ｍｅｔ以外の１９アミノ酸、各０．３ｍｍｏｌ／Ｌの混合物）：１．５μＬ【０４９３】
ラウンド１のパニングを行うための翻訳、パニング、逆転写反応、ＰＣＲ
前述の翻訳液を調製し、３７℃で３０分間反応させた。この翻訳液４μＬに対して、１０μＬの標的タンパク質固定化ビーズおよびＴＢＳ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を加え、室温、４５分間回転混和を行った。上清を取り除き、ＴＢＳ＋０．０５％  ｔｗｅｅｎ−２０で４回、ＴＢＳで１回、純水で１回洗浄した。続いてビーズ溶液に、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡社製）、５×ＲＴ ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰｓを加え３０℃で１０分、４２℃で３０分保温し、逆転写反応を行い、１２μＬのペプチド−ｍＲＮＡ複合体溶液を得た。【０４９４】
１μｍｏｌ／Ｌ  プライマー（配列番号２０）、１μｍｏｌ／Ｌ  プライマー（配列番号２４）、およびＫＯＤ−Ｍｕｌｔｉ＆Ｅｐｉ−（東洋紡社製）を含むＰＣＲ溶液に上記のビーズ１μＬを加え、ＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）によりＤＮＡを精製した。【０４９５】
配列番号２４
ATACTCAAGCTTATTTATTTACCCCCCGCCGCCCCCCGTCCTGCTACCGCCAGAACCGCCCTA【０４９６】
ラウンド２のパニングを行うための転写、ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体調製、翻訳、パニング、逆転写反応、ＰＣＲ
ラウンド１で増幅したｃＤＮＡから、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔ７  ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いてｍＲＮＡを合成し、ＲＮｅａｄｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製した。次にｍＲＮＡにピューロマイシンリンカーＢ（構造を上記の化１８１に示す）を加え、９０℃で５分間反応させた後、２５℃まで低下させた。続いて、３６５ｎｍのＵＶを２分間照射した後、エタノール沈殿により精製し、ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体とした。０．６μｍｏｌ／Ｌ  ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー複合体を含む前述の４μＬ翻訳液を調製し、３７℃で３０分間保温した。この溶液に対して、１０μＬのＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ（ｓｉｇｍａ社製）およびＴＢＳを加え、室温、１０分間転倒混和を行い、上清を回収することを３回繰り返した。上清に対して１０μＬの標的タンパク質固定化ビーズおよびＴＢＳを加え、室温、４５分間回転混和を行った。上清を取り除き、ＴＢＳ＋０．０５％  ｔｗｅｅｎ−２０で４回、ＴＢＳで１回、純水で１回洗浄した。続いてビーズ溶液に、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡社製）、５×ＲＴ ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰｓを加え３０℃で１０分、４２℃で３０分保温し、逆転写反応を行い、１２μＬのペプチド−ｍＲＮＡ複合体溶液を得た。【０４９７】
１μｍｏｌ／Ｌ  プライマー（配列番号２０）、１μｍｏｌ／Ｌ  プライマー（配列番号２４）、およびＫＯＤ−Ｍｕｌｔｉ＆Ｅｐｉ−（東洋紡社製）を含むＰＣＲ溶液に上記のビーズ１μＬを加え、ＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）によりＤＮＡを精製した。
ラウンド３およびラウンド４においても、ラウンド２と同じ操作を繰り返すことで標的タンパク質特異的な結合を示すｃＤＮＡの濃縮を行った。濃縮されたＤＮＡプールの塩基配列解析を行い、濃縮されたペプチド配列を同定した。【０４９８】
濃縮されたペプチド配列の化学合成
環状ペプチドａ−６−１の合成
【化１８３】
2018174078.tif 000324
【０４９９】
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（０．４８ｍｍｏｌ／ｇ，１０４ｍｇ）を出発原料として用いて、ペプチド固相合成を行った。2-（（（（9H-フルオレン-9-イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）-3-（5-シアノチオフェン-3-イル）プロパン酸、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｎ―α―（９―フルオレニルメトキシカルボニル)―Ｏ―（ｔ−ブチル）−Ｌ−トレオニン(Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ)、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−アスパラギンサン  β−ｔ−ブチル  エステル（Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−グルタミンサン  γ−ｔ−ブチル  エステル（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−ＯＨ）、、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨの順に縮合を行った。レジンをジクロロメタンで洗浄したのち、減圧下溶媒を留去した。反応溶液にＴＦＡ：３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール：トリイソプロピルシラン：水（＝９２．５：２．５：２．５：２．５、３．０ｍＬ）を加え、ペプチドの切り出しと脱保護を行った。２時間後、レジンをろ別し、ろ液にｎ−ヘキサン：メチル−ｔ−ブチルエーテル（＝１：１、１２ｍＬ）を加え、固体を生じさせた。遠心分離を行い、固体を沈殿させた後、上澄みを除去した。メチル−ｔ−ブチルエーテルで固体を洗浄後、減圧下溶媒を留去した。得られた固体にリン酸バッファー（ｐＨ７．０，  ５ｍＬ）、メタノール（５ｍＬ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（０．５ｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍＬ）水溶液を加え、４８時間反応を行った。減圧下溶媒を留去し、得られた残渣をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製した後、炭酸水素トリエチルアンモニウム溶液（１．０ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８．５）を加えｐＨを中性に調整した後、減圧下溶媒を留去することで、白色固体の環状ペプチドａ−６−１（７．６ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ）：１９９３．３（Ｍ＋Ｈ）
ＲＴ（ｍｉｎ）：１．１０【０５００】
環状ペプチドａ−６−１と同様にして下記の表５２に示す環状ペプチドを得た。【０５０１】
【表５２−１】
2018174078.tif 000325
【表５２−２】
2018174078.tif 000326
【０５０２】
ａ−６−７の環化部位の同定
【化１８４】
2018174078.tif 000327
【０５０３】
ａ−６−７は環化部位である2-（（（（9H-フルオレン-9-イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）-3-（5-シアノチオフェン-3-イル）プロパン酸を２か所に含むため、構造決定のためトリプシン消化を行った。ａ−６−７のＤＭＳＯ溶液（２０ｍＭ、５μＬ）にトリプシン（０．０１ｍｇ）（和光純薬工業社製）の炭酸水素トリエチルアンモニウム（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８．５、９５μＬ）溶液を加え、３７℃で２時間静置した。反応液をＬＣ/ＭＳで分析を行い、１０１５．１と７３６．１の２種類のＭＳが観測されたことから、環化部位はＮ末端から５残基目のアミノ酸である事を確認した。【０５０４】
標的タンパク質の調製
上述の方法と同様に標的タンパク質を調製した。【０５０５】
Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ （ＳＰＲ） を利用した合成ペプチドの標的タンパク質への結合評価
上述の方法と同様に合成ペプチドの標的タンパク質への結合を評価した。得られたＫＤを以下の表に示す。
ＫＤが５０μｍｏｌ／Ｌ未満であったものをＡ、５０μｍｏｌ／Ｌ以上であったものをＢと表記する。【０５０６】
【表５３】
2018174078.tif 000328
【産業上の利用可能性】
【０５０７】
本発明の製造法、および、選択方法によって得られる環状ペプチドは、医薬品、農薬、生化学用実験試薬、細胞培養用の添加剤、化粧品、機能性食品の有効成分として利用され、また、フィルターやカラムクロマトグラフィーに用いられる吸着材・分離剤としても利用できる。本発明の製造法、および、選択方法によって得られる環状ペプチドはさらに、合成反応を促進する触媒、顔料やナノ粒子の微小固体の分散剤、水溶液のゲル化剤としても利用することができる。
【配列表】
2018174078000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月6日(2018.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表わされるペプチド化合物またはその塩。
【化１】
2018174078.tif 000340
式中、
Ｘは、Ｓ、ＮＨ、またはＯを示し、
Ａは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示し、
Ｂは、単結合または置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示し、ただし、ＡおよびＢは同時に単結合ではなく、
Ｚは、ヒドロキシル基またはアミノ基を示し、
ｐ個のＲは、同一または異なっていても良く、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、または置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基を示し、
Ｇは、水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｔ１個のＷ１は、同一または異なっていても良く、単結合、−ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５ＮＨ）−、−ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示し、
ｔ２個のＷ２は、同一または異なっていても良く、単結合、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＣＯ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示し、
Ｊは水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、ｎ個のＸａａはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基または任意のアミノ酸類縁体残基を示し、
ｍ個のＸｂｂはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基または任意のアミノ酸類縁体残基を示し、
ｐは、０〜４の整数を示し、
ｔ１は、０〜６の整数を示し、
ｔ２は、０〜６の整数を示し、
ｍは０〜２０の整数を示し、
ｎは１〜２０の整数を示す。
【請求項２】
下記式（１Ａ）で表わされるペプチド化合物またはその塩。
【化２】
2018174078.tif 000341
式中、
Ａ１は、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示し、
ｐ１個のＲ１は、同一または異なっていても良く、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、または置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基を示し、
ｔ１１個のＷ１１は、同一または異なっていても良く、単結合、−ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５ＮＨ）−、−ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示し、
ｔ２１個のＷ２１は、同一または異なっていても良く、単結合、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＣＯ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示し、
Ｇ１はＧ１が結合している炭素がＡ１と一緒になって＊−ＣＨ＝Ｃ（Ｎ）−で表わされる２価の基を示さない場合は、水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
Ｊ１は水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｐ１は、０〜４の整数を示し、
ｔ１１は、０〜６の整数を示し、
ｔ２１は、０〜６の整数を示し、
Ｚ、Ｘａａ、Ｘｂｂ、ｍ、およびｎは、請求項１における定義と同様の意味を示す。
【請求項３】
式（１Ｂ）で表わされるペプチド化合物またはその塩。
【化３】
2018174078.tif 000342
式中、
Ａ２は、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基、またはＮが結合している炭素原子と一緒になって＊−ＣＨ＝Ｃ（Ｎ）−で表わされる２価の基を示し、＊はＳと結合する位置を示し、
Ｇ２はＧ２が結合している炭素がＡ２と一緒になって＊−ＣＨ＝Ｃ（Ｎ）−で表わされる２価の基を示さない場合は、水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
Ｊ２は水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｐ２個のＲ２は、同一または異なっていても良く、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、または置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基を示し、
ｐ２は０〜４の整数を示し、
ｑ２は、０〜６の整数を示し、
ただし、ｐ２とｑ２が同時に０になることはない。
Ｚ、Ｘａａ、Ｘｂｂ、ｍ、およびｎは、請求項１における定義と同様の意味を示す。
【請求項４】
前記Ｒ、Ｒ１またはＲ２が、置換基を有していてもよいベンゾチアゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾイミダゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾチオフェニレン基、置換基を有していてもよいベンゾフラニレン基、置換基を有していてもよいイソベンゾフラニレン基、置換基を有していてもよいインドリレン基、置換基を有していてもよいキノリニレン基、置換基を有していてもよいイソキノリニレン基、置換基を有していてもよいキナゾリレン基、置換基を有していてもよいシンノリレン基、置換基を有していてもよいインダゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾチアジアゾリレン基、置換基を有していてもよいピリジニレン基、置換基を有していてもよいピリダジニレン基、置換基を有していてもよいピリミジニレン基、置換基を有していてもよいピラジニレン基、置換基を有していてもよいチアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサジアゾリレン基、置換基を有していてもよいチアジアゾリレン基、置換基を有していてもよいピラゾリレン基、置換基を有していてもよいイソキサゾリレン基、置換基を有していてもよいトリアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾチアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリダジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリミジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピラジニレン基、置換基を有していてもよいピラゾロピリミジニレン基、置換基を有していてもよいピロロピリジニレン基、置換基を有していてもよいチオフェニレン基、置換基を有していてもよいフラニレン基、置換基を有していてもよいピローレン基、置換基を有していてもよいフェニレン基、および置換基を有していてもよいナフチレン基から選ばれる少なくとも１つの構造である、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド化合物またはその塩。
【請求項５】
前記ＲまたはＲ１またはＲ２が、置換基を有していてもよいベンゾチオフェニレン基、置換基を有していてもよいインドリレン基、置換基を有していてもよいキノリニレン基、置換基を有していてもよいインダゾリレン基、置換基を有していてもよいピロロピリジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピラジニレン基、置換基を有していてもよいピリジニレン基、置換基を有していてもよいピリダジニレン基、置換基を有していてもよいピラジニレン基、置換基を有していてもよいチアゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいトリアゾリレン基、置換基を有していてもよいチオフェニレン基、および置換基を有していてもよいフェニレン基から選ばれる少なくとも１つの構造である、請求項１から４のいずれか一項に記載のペプチド化合物またはその塩。
【請求項６】
前記ペプチド化合物の環状部を構成するアミノ酸残基およびアミノ酸類縁体残基の総数が３〜２０である、請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチド化合物またはその塩。
【請求項７】
前記ペプチド化合物を構成するアミノ酸残基およびアミノ酸類縁体残基の総数が３〜２０である、請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチド化合物またはその塩。
【請求項８】
Ｘａａが、α−アミノ酸残基である、請求項１から７のいずれか一項に記載のペプチド化合物またはその塩。
【請求項９】
Ｘａａが、天然アミノ酸残基を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のペプチド化合物またはその塩。
【請求項１０】
ｐ、ｐ１またはｐ２が、１である、請求項１から９のいずれか一項に記載のペプチド化合物またはその塩。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のペプチド化合物またはその塩を含むスクリーニング用組成物。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のペプチド化合物またはその塩を含むペプチドライブラリーと標的物質とを接触させ、前記標的物質に結合するペプチド化合物またはその塩を選択することを含む、標的物質に結合するペプチド化合物またはその塩の選択方法。
【請求項１３】
シアノ基を側鎖に有するアミノ酸残基またはアミノ酸類縁体残基をペプチド鎖中またはＣ末端に有し、下記式（２）の構造をＮ末端に有するペプチド鎖を製造する工程；および、
前記のシアノ基と、下記式（２）の構造とを反応させて、下記式（３）で表わされる結合を有する環状部を形成させる工程を含む、
ペプチド化合物またはその塩の製造方法。
【化４】
2018174078.tif 000343
式中、Ｘは、Ｓ、ＮＨ、または、Ｏを示し、
Ａは、単結合、または、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示し、
Ｂは、単結合、または、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示し、
Ｇは、水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
＊は、ペプチド鎖との結合部位を示し、
ＡおよびＢは同時に単結合ではない：
【化５】
2018174078.tif 000344
式中、Ｘ、Ａ、ＧおよびＢは、式（２）における定義と同義である。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法により環状部を有するペプチド化合物を製造する工程；および
前記ペプチド化合物またはその塩を含むペプチドライブラリーと標的物質とを接触させ、前記標的物質に結合するペプチド化合物またはその塩を選択する工程を含む、標的物質に結合するペプチド化合物の選択方法。
【請求項１５】
次の工程を含む、請求項１４に記載の選択方法。
（ｉ）核酸ライブラリーを調製し、非天然アミノ酸でアシル化された伸長用ｔＲＮＡを含む無細胞翻訳系によって翻訳し、非天然アミノ酸がペプチド配列にランダムに導入されたペプチド化合物を含むライブラリーを調製する工程；
（ｉｉ）ペプチドライブラリーを標的物質に接触させる工程；
（ｉｉｉ）標的物質に結合するペプチド化合物を選択する工程、
前記（ｉ）の工程において、ライブラリーを構成する各ペプチド化合物がライブラリーを構成する各ペプチド化合物をコードする核酸配列から翻訳され、核酸配列とその翻訳産物であるペプチドが連結されて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイライブラリーが構築され、
前記（ｉｉｉ）の工程が、標的物質に結合するペプチド化合物をコードする核酸配列を決定し、核酸配列からペプチド配列を決定し、ペプチド化合物を選択することを含む。
【請求項１６】
前記シアノ基を側鎖に有する前記アミノ酸残基および／または前記アミノ酸類縁体残基が下記式（４）で表わされる構造である、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【化６】
2018174078.tif 000345
式中、
ｍ１個のＱ１は、同一または異なってもよく、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基、および置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基の少なくとも１種を示し、
Ｔ１は水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｎ１は、０から６の整数を示し、ｍ１は、１から４の整数を示し、
＊は、ペプチド鎖を構成するアミノ酸残基および／またはアミノ酸類縁体残基との結合位置を示す。
【請求項１７】
前記シアノ基を側鎖に有する前記アミノ酸残基および／または前記アミノ酸類縁体残基が下記式（５）で表わされる構造である、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【化７】
2018174078.tif 000346
式中、
ｌ２個のＱ２は、同一または異なっていても良く、単結合、−ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５ＮＨ）−、−ＣＨ２（Ｃ６Ｈ５Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示し、
ｎ２個のＱ３は、同一または異なっても良く、単結合、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＣＯ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−、置換基を有していてもよいアミノ酸残基、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリーレン基、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基を示し、
ｍ２個のＱ４は、同一または異なっても良く、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基、および置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基の少なくとも１種を示し、
Ｔ２は水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｌ２は、０〜６の整数を示し、
ｎ２は、０〜６の整数を示し、
ｍ２は、１〜４の整数を示し、
＊は、ペプチド鎖を構成するアミノ酸残基および／またはアミノ酸類縁体残基との結合位置を示す。
【請求項１８】
前記Ｑ１またはＱ４が、置換基を有していてもよいベンゾチアゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾイミダゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾチオフェニレン基、置換基を有していてもよいベンゾフラニレン基、置換基を有していてもよいイソベンゾフラニレン基、置換基を有していてもよいインドリレン基、置換基を有していてもよいキノリニレン基、置換基を有していてもよいイソキノリニレン基、置換基を有していてもよいキナゾリレン基、置換基を有していてもよいシンノリレン基、置換基を有していてもよいインダゾリレン基、置換基を有していてもよいベンゾチアジアゾリレン基、置換基を有していてもよいピリジニレン基、置換基を有していてもよいピリダジニレン基、置換基を有していてもよいピリミジニレン基、置換基を有していてもよいピラジニレン基、置換基を有していてもよいチアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサジアゾリレン基、置換基を有していてもよいチアジアゾリレン基、置換基を有していてもよいピラゾリレン基、置換基を有していてもよいイソキサゾリレン基、置換基を有していてもよいトリアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾチアゾリレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリダジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピリミジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピラジニレン基、置換基を有していてもよいピラゾロピリミジニレン基、置換基を有していてもよいピロロピリジニレン基、置換基を有していてもよいチオフェニレン基、置換基を有していてもよいフラニレン基、置換基を有していてもよいピローレン基、置換基を有していてもよいフェニレン基、および置換基を有していてもよいナフチレン基から選ばれる少なくとも１つの構造である、
請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｑ１またはＱ４が、置換基を有していてもよいベンゾチオフェニレン基、置換基を有していてもよいインドリレン基、置換基を有していてもよいキノリニレン基、置換基を有していてもよいインダゾリレン基、置換基を有していてもよいピロロピリジニレン基、置換基を有していてもよいイミダゾピラジニレン基、置換基を有していてもよいピリジニレン基、置換基を有していてもよいピリダジニレン基、置換基を有していてもよいピラジニレン基、置換基を有していてもよいチアゾリレン基、置換基を有していてもよいオキサゾリレン基、置換基を有していてもよいトリアゾリレン基、置換基を有していてもよいチオフェニレン基、および置換基を有していてもよいフェニレン基から選ばれる少なくとも１つの構造である、請求項１６から１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記式（２）が下記式（２Ａ）で表わされる構造である、請求項１３から１９のいずれか一項に記載の方法。
【化８】
2018174078.tif 000347
式中、Ａ１は、置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示す。Ｇは水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示す。
【請求項２１】
前記式（２）が下記式から選ばれる少なくとも１つの構造である、請求項１３から２０のいずれか一項に記載の方法。
【化９】
2018174078.tif 000348
【請求項２２】
前記シアノ基と、前記式（２）の構造とを反応させて、前記式（３）で表わされる結合を形成させる工程の反応溶媒が水である、請求項１３から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記シアノ基と、前記式（２）の構造とを反応させて、前記式（３）で表わされる結合を形成させる工程の反応液のｐＨが６．０〜８．５である、請求項１３から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記環状部を有するペプチド化合物の環状部を構成するアミノ酸残基およびアミノ酸類縁体残基の総数が３〜２０である、請求項１３から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記環状部を有するペプチド化合物を構成するアミノ酸残基およびアミノ酸類縁体残基の総数が３〜２０である、請求項１３から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記シアノ基を有するヘテロアリーレン基、シアノ基を有するアリーレン基またはシアノ基を有するアルキレン基を側鎖に有するアミノ酸残基またはアミノ酸類縁体残基が、天然アミノ酸の翻訳において割り当てられているコドンに対して天然アミノ酸を除外することによって空になるコドン、終止コドン、または四塩基コドンを用いて、ペプチド鎖中に導入される、請求項１３から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
環状部を有するペプチド化合物またはその塩であり、
前記環状部は下記式（６）で表わされる構造を有するペプチド化合物またはその塩を含有するスクリーニング用組成物。
【化１０】
2018174078.tif 000349
式中、
Ｘは、Ｓ、ＮＨ、またはＯを示し、
Ａは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示し、
Ｂは、単結合または置換基を有していてもよい炭素数１もしくは２の直鎖のアルキレン基を示し、ただし、ＡおよびＢは同時に単結合ではなく、
ｐ個のＲは、同一または異なっていても良く、置換基を有していてもよいヘテロアリーレン基、または置換基を有していてもよい炭素数６〜１０のアリーレン基を示し、
ＧはＧが結合している炭素がＡと一緒になって＊−ＣＲ０＝Ｃ（Ｂ）−で表わされる２価の基を示さない場合は、水素原子、または、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｐは、０〜４の整数を示す。
【国際調査報告】
2018174078.tif 000350
2018174078.tif 000351