(57)【要約】  細胞凝集塊の大きさを機械学的／物理学的な手段に依らずに適切に制御するための手段を提供する。  本発明は、トロンビン受容体のアゴニストを含む、細胞の浮遊培養に用いるための細胞凝集抑制剤に関する。本発明はまた、トロンビン受容体のアゴニストを含む培地中で細胞を浮遊培養する工程を含む、細胞凝集塊の製造方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンビン受容体のアゴニストを含む、細胞の浮遊培養に用いるための細胞凝集抑制剤。
【請求項２】
前記トロンビン受容体のアゴニストの濃度が７．４μｇ／ｍＬ以上３．８ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１に記載の細胞凝集抑制剤。
【請求項３】
前記トロンビン受容体が、ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−３及びＰＡＲ−４からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１又は２に記載の細胞凝集抑制剤。
【請求項４】
前記トロンビン受容体のアゴニストが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのペプチドである、請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞凝集抑制剤；
（ａ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列において、１個又は２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｃ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項５】
前記細胞が幹細胞である、請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞凝集抑制剤。
【請求項６】
トロンビン受容体のアゴニストを含む培地中で細胞を浮遊培養する工程を含む、細胞凝集塊の製造方法。
【請求項７】
前記培地中における前記トロンビン受容体のアゴニストの濃度が３．７ｎｇ／ｍＬ以上３．８ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記トロンビン受容体が、ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−３及びＰＡＲ−４からなる群より選択される少なくとも一つである、請求項６又は７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記トロンビン受容体のアゴニストが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのペプチドである、請求項６から８のいずれか１項に記載の製造方法；
（ａ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列において、１個又は２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｃ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項１０】
前記細胞が幹細胞である、請求項６から９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項６から１０のいずれか１項に記載の製造方法により得られた細胞凝集塊。
【請求項１２】
細胞と、培地と、トロンビン受容体のアゴニストとを含む、細胞培養組成物。
【請求項１３】
前記トロンビン受容体のアゴニストの濃度が３．７ｎｇ／ｍＬ以上３．８ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１２に記載の細胞培養組成物。
【請求項１４】
前記トロンビン受容体が、ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−３及びＰＡＲ−４からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１２又は１３に記載の細胞培養組成物。
【請求項１５】
前記トロンビン受容体のアゴニストが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのペプチドである、請求項１２から１４のいずれか１項に記載の細胞培養組成物；
（ａ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列において、１個又は２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｃ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項１６】
前記細胞が幹細胞である、請求項１２から１５のいずれか１項に記載の細胞培養組成物。
【請求項１７】
前記細胞の形態が細胞凝集塊である、請求項１２から１６のいずれか１項に記載の細胞培養組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞凝集抑制剤及び細胞の凝集を抑制する方法に関する。本発明はまた、細胞凝集塊の製造方法、及びそれにより製造された細胞凝集塊に関する。本発明はまた、細胞培養組成物、及び細胞培養培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞等のヒト多能性幹細胞の近年の研究により、再生医療の実用化の可能性が高まっている。これらの細胞は、無限に増殖できる能力と、様々な細胞に分化する能力を有していることから、多能性幹細胞を用いた再生医療には、難治性疾患、生活習慣病等に対する治療法を根本的に変革することが期待されている。多能性幹細胞からは、神経細胞をはじめとして、心筋細胞、血液細胞、及び網膜細胞などさまざまな種類の細胞に試験管内で分化誘導することが既に可能になっている。【０００３】
多能性幹細胞を用いて各種臓器を再生する再生医療に関する実用化に向けた課題の一つに、臓器再生に必要な大量の細胞を如何に効率的に生産するかという課題がある。例えば肝臓の再生には約２×１０１１個の細胞が必要である。平坦な基板上での接着培養により前記個数の細胞を培養するには１０６ｃｍ２以上の基板が必要であり、これは一般的な１０ｃｍディッシュで約２０，０００枚分に相当する。基板表面上での接着培養では得られる細胞数が培養面積に依存するためスケールアップが困難であり、再生医療に必要な十分な量の細胞を供給することは困難である。【０００４】
そこで、培地中で細胞を浮遊させながら培養する浮遊培養はスケールアップが容易であることから、細胞の大量生産に適していると期待される。【０００５】
例えば、非特許文献１には、浮遊培養の細胞培養容器としてスピナーフラスコを用い、強い撹拌力により液体培地を撹拌しながらヒト多能性幹細胞の浮遊培養を行い均一な大きさのスフェロイドを製造する方法が開示されている。【０００６】
非特許文献２では微小なマイクロウェルが形成された基板を用い、各マイクロウェル中で均一な大きさのスフェロイドを作製する方法が開示されている。【０００７】
非特許文献３では培地として、粘性や比重の調製された培地を用い、多能性幹細胞の浮遊状態を保持するとともに細胞同士の衝突を抑制しながら培養を行う方法が開示されている。【０００８】
特許文献１には細胞を液体培地中で旋回培養しながら培養して、細胞の凝集塊を作製する技術が開示されている。【０００９】
特許文献２には多能性幹細胞を、細胞塊の平均直径が約２００から３００μｍとなるまで浮遊培養する方法が開示されている。【００１０】
特許文献３には、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）等のリゾリン脂質を含む培地中で細胞を浮遊培養することにより、細胞の凝集を抑制する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００３−３０４８６６号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１３／０７７４２３号パンフレット
【特許文献３】国際公開ＷＯ２０１６／１２１７３７号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Olmer R. et al., Tissue Engineering: Part C, Volume 18 (10): 772-784 (2012)
【非特許文献２】Ungrin MD et al., PLoS ONE, 2008, 3(2), e1565
【非特許文献３】Otsuji GT et al., Stem Cell Reports, Volume 2: 734-745 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは、膜タンパク質や細胞膜の細胞間での非特異的な吸着、細胞表面のカドヘリンを介した細胞間の接着が多能性幹細胞等の接着性細胞を浮遊培養するうえで重要な機構であることを見出した。つまり、浮遊培養の技術には、細胞の膜タンパクや細胞表面のカドヘリンなどの結合に障害を与えることなく、適度な大きさの細胞凝集塊を作製しなければならないという課題が存在する。しかしながら、非特許文献１から３、特許文献１又は２に開示された浮遊培養の技術には、以下の問題があった。【００１４】
非特許文献１の方法では剪断応力により細胞死が生じやすいという問題がある。【００１５】
非特許文献２の方法は大規模化が困難であることや、培地の交換が困難である等の問題がある。【００１６】
非特許文献３の方法では培養時の培地の移動が少ないため酸素や栄養成分が細胞凝集塊に供給され難いという問題がある。【００１７】
特許文献１では細胞塊の大きさを適度な大きさに制御するための手段は開示されていない。【００１８】
特許文献２では細胞塊同士の接着を防ぐための手段として培地に水溶性高分子を添加して粘性を高めることが記載されている。このため非特許文献３と同様に、酸素や栄養成分が細胞凝集塊に供給され難いという問題がある。【００１９】
そこで発明者らは、上記課題を解決するために、特許文献３においてリゾリン脂質を含む培地中で細胞を浮遊培養することにより、細胞の凝集を抑制し、適度な大きさの凝集塊を細胞に障害を与えることなく生産することが可能な浮遊培養の技術を開発した。【００２０】
ところで、特許文献３では細胞凝集を抑制する成分としてリゾリン脂質のみが開示されている。仮に、リゾリン脂質以外にも、浮遊培養において培地中に存在することにより細胞の凝集を抑制する成分が提供されれば、細胞凝集塊の大きさを、機械学的／物理学的な手段に依らずにより適切に制御することが可能になると本発明者らは考えた。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、鋭意研究の結果、トロンビン受容体のアゴニストが、浮遊培養において培地中に存在することにより細胞の凝集を抑制する作用を奏することを見出し、以下の各発明を完成するに至った。
（１）トロンビン受容体のアゴニストを含む、細胞の浮遊培養に用いるための細胞凝集抑制剤。
（２）前記トロンビン受容体のアゴニストの濃度が７．４μｇ／ｍＬ以上３．８ｍｇ／ｍＬ以下である、（１）に記載の細胞凝集抑制剤。
（３）前記トロンビン受容体が、ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−３及びＰＡＲ−４からなる群より選択される少なくとも１つである、（１）又は（２）に記載の細胞凝集抑制剤。
（４）前記トロンビン受容体のアゴニストが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのペプチドである、（１）から（３）のいずれかに記載の細胞凝集抑制剤；
（ａ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列において、１個又は２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｃ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
（５）前記トロンビン受容体のアゴニストが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのペプチドである、（１）から（３）のいずれかに記載の細胞凝集抑制剤；
（ａ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列において、１個又は２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｃ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド。
（６）前記細胞が幹細胞である、（１）から（５）のいずれかに記載の細胞凝集抑制剤。
（７）トロンビン受容体のアゴニストを含む培地中で細胞を浮遊培養する工程を含む、細胞凝集塊の製造方法。
（８）前記培地中における前記トロンビン受容体のアゴニストの濃度が３．７ｎｇ／ｍＬ以上３．８ｍｇ／ｍＬ以下である、（７）に記載の製造方法。
（９）前記トロンビン受容体が、ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−３及びＰＡＲ−４からなる群より選択される少なくとも一つである、（７）又は（８）に記載の製造方法。
（１０）前記トロンビン受容体のアゴニストが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのペプチドである、（７）から（９）のいずれかに記載の製造方法；
（ａ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列において、１個又は２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｃ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
（１１）前記トロンビン受容体のアゴニストが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのペプチドである、（７）から（９）のいずれかに記載の製造方法；
（ａ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列において、１個又は２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｃ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド。
（１２）前記細胞が幹細胞である、（７）から（１１）のいずれかに記載の製造方法。
（１３）（７）から（１２）のいずれかに記載の製造方法により得られた細胞凝集塊。
（１４）細胞と、培地と、トロンビン受容体のアゴニストとを含む、細胞培養組成物。
（１５）前記トロンビン受容体のアゴニストの濃度が３．７ｎｇ／ｍＬ以上３．８ｍｇ／ｍＬ以下である、（１４）に記載の細胞培養組成物。
（１６）前記トロンビン受容体が、ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−３及びＰＡＲ−４からなる群より選択される少なくとも１つである、（１４）又は（１５）に記載の細胞培養組成物。
（１７）前記トロンビン受容体のアゴニストが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのペプチドである、（１４）から（１６）のいずれかに記載の細胞培養組成物；
（ａ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列において、１個又は２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｃ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
（１８）前記トロンビン受容体のアゴニストが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのペプチドである、（１４）から（１６）のいずれかに記載の細胞培養組成物；
（ａ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列において、１個又は２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｃ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド。
（１９）前記細胞が幹細胞である、（１４）から（１８）のいずれかに記載の細胞培養組成物。
（２０）前記細胞の形態が細胞凝集塊である、（１４）から（１９）のいずれかに記載の細胞培養組成物。
（２１）トロンビン受容体のアゴニストを含む培地中で細胞を浮遊培養する工程を含む、細胞の凝集を抑制する方法。
（２２）前記培地中における前記トロンビン受容体のアゴニストの濃度が３．７ｎｇ／ｍＬ以上３．８ｍｇ／ｍＬ以下である、（２１）に記載の方法。
（２３）前記トロンビン受容体が、ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−３及びＰＡＲ−４からなる群より選択される少なくとも１つである、（２１）又は（２２）に記載の方法。
（２４）前記トロンビン受容体のアゴニストが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのペプチドである、（２１）から（２３）のいずれかに記載の方法；
（ａ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列において、１個又は２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｃ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
（２５）前記トロンビン受容体のアゴニストが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのペプチドである、（２１）から（２３）のいずれかに記載の方法；
（ａ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列において、１個又は２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｃ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド。
（２６）前記細胞が幹細胞である、（２１）から（２５）のいずれかに記載の方法。
（２７）培地と、トロンビン受容体のアゴニストとを含む、細胞培養培地。
（２８）前記トロンビン受容体のアゴニストの濃度が３．７ｎｇ／ｍＬ以上３．８ｍｇ／ｍＬ以下である、（２７）に記載の細胞培養培地。
（２９）前記トロンビン受容体が、ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−３及びＰＡＲ−４からなる群より選択される少なくとも１つである、（２７）又は（２８）に記載の細胞培養培地。
（３０）前記トロンビン受容体のアゴニストが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのペプチドである、（２７）から（２９）のいずれかに記載の細胞培養培地；
（ａ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列において、１個又は２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｃ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
（３１）前記トロンビン受容体のアゴニストが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのペプチドである、（２７）から（２９）のいずれかに記載の細胞培養培地；
（ａ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列において、１個又は２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｃ）配列番号１、２、７又は８に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド。
（３２）さらに増殖因子を含む、（２７）から（３１）のいずれかに記載の細胞培養培地。
（３３）幹細胞の培養に用いるための、（２７）から（３２）のいずれかに記載の細胞培養培地。
（３４）細胞凝集塊を作製するための、（２７）から（３３）のいずれかに記載の細胞培養培地。
（３５）前記トロンビン受容体のアゴニストが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのペプチドである、（１）から（６）のいずれかに記載の細胞凝集抑制剤、（７）から（１２）のいずれかに記載の製造方法、（１３）に記載の細胞凝集塊、（１４）から（２０）のいずれかに記載の細胞培養組成物、（２１）から（２６）のいずれかに記載の方法、又は（２７）から（３４）のいずれかに記載の細胞培養培地；
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４に示すアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４に示すアミノ酸配列において、１個又は２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｃ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド。
（３６）前記トロンビン受容体のアゴニストが、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのペプチドである、（１）から（６）のいずれかに記載の細胞凝集抑制剤、（７）から（１２）のいずれかに記載の製造方法、（１３）に記載の細胞凝集塊、（１４）から（２０）のいずれかに記載の細胞培養組成物、（２１）から（２６）のいずれかに記載の方法、又は（２７）から（３４）のいずれかに記載の細胞培養培地；
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４に示すアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４に示すアミノ酸配列において、１個又は２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｃ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチド。
（３７）上記細胞凝集塊の７０％以上（重量基準）において、最も幅の広い部分の寸法が５００μｍ以下、好ましくは３００μｍ以下である、（７）から（１２）、（３５）、及び（３６）のいずれかに記載の製造方法、（１３）、（３５）、及び（３６）のいずれかに記載の細胞凝集塊、（２０）、（３５）、及び（３６）のいずれかに記載の細胞培養組成物、又は（３４）から（３６）のいずれかに記載の細胞培養培地。
（３８）上記細胞凝集塊の７０％以上（重量基準）において、最も幅の広い部分の寸法が４０μｍ以上、好ましくは１００μｍ以上である、（７）から（１２）、及び（３５）から（３７）のいずれかに記載の製造方法、（１３）及び（３５）から（３７）のいずれかに記載の細胞凝集塊、（（２０）及び（３５）から（３７）のいずれかに記載の細胞培養組成物、又は（３４）から（３７）のいずれかに記載の細胞培養培地。【００２２】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-253147号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の一実施形態の細胞凝集抑制剤は、浮遊培養時の細胞の凝集を抑制するために培地中に配合することができる。【００２４】
本発明の細胞の凝集の抑制方法の一実施形態によれば、浮遊培養時の細胞の凝集を抑制することができる。【００２５】
本発明の細胞凝集塊の製造方法の一実施形態によれば、細胞凝集塊を高収量で製造することができる。【００２６】
本発明の細胞凝集塊の一実施形態は適度な寸法を有し、生細胞率が高い。【００２７】
本発明の細胞培養組成物の一実施形態は、細胞凝集塊を高収量で製造するために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、ヒトｉＰＳ細胞を、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）の存在下、異なる濃度のＴＲＡＰ−６（０μＭ、２μＭ、１０μＭ、５０μＭ）を含む培地中で浮遊培養したときの培養１日目の位相差顕微鏡による観察像を示す。対照は、ヒトｉＰＳ細胞をＹ−２７６３２とＴＲＡＰ−６のいずれも含まない培地中で浮遊培養したときの培養１日目の位相差微鏡による観察像である。画像データ中のスケールバーは５００μｍである。
【図２】ヒトｉＰＳ細胞を５μＭのＴＲＡＰ−６を含む培地中で浮遊培養（培養１日目）して細胞凝集塊を作製し、その後ＴＲＡＰ−６を含まない培地で継続して浮遊培養（培養２から５日目）したときの、培養１から５日目の位相差顕微鏡による観察像を示す。対照は、ヒトｉＰＳ細胞を、ＴＲＡＰ−６を含まない培地中で培養したときの、培養１から５日目の位相差顕微鏡による観察像である。
【図３】ヒトｉＰＳ細胞を５μＭのＴＲＡＰ−６を含む培地中で浮遊培養（培養１日目）して細胞凝集塊を作製し、その後ＴＲＡＰ−６を含まない培地で継続して浮遊培養（培養２から５日目）したときの培養１から５日目のグルコース消費量の測定結果を示す。対照は、ヒトｉＰＳ細胞を、ＴＲＡＰ−６を含まない培地中で培養したときの、培養１から５日目のグルコース消費量である。
【図４】ヒトｉＰＳ細胞を５μＭのＴＲＡＰ−６を含む培地中で浮遊培養（培養１日目）して細胞凝集塊を作製し、その後ＴＲＡＰ−６を含まない培地で継続して浮遊培養（培養２から５日目）したときの培養５日目の細胞収量の測定結果を示す。対照は、ヒトｉＰＳ細胞を、ＴＲＡＰ−６を含まない培地中で培養したときの、培養５日目の細胞収量である。
【図５】ヒトｉＰＳ細胞を５μＭのＴＲＡＰ−６を含む培地中で浮遊培養（培養１日目）して細胞凝集塊を作製し、その後ＴＲＡＰ−６を含まない培地で継続して浮遊培養（培養２から５日目）したときの培養５日目の細胞の、未分化マーカー（ＳＯＸ２、ＯＣＴ４およびＮａｎｏｇ）陽性率の測定結果を示す。
【図６】ヒトｉＰＳ細胞を、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）の存在下、ＰＡＲ−1アゴニスト（３２．８μＭ）を含む培地中で浮遊培養したときの培養１日目の位相差顕微鏡による観察像を示す。陰性対照は、ヒトｉＰＳ細胞をＹ−２７６３２（１０μＭ）を含む培地中で浮遊培養したときの培養１日目の位相差微鏡による観察像を、陽性対照は、ヒトｉＰＳ細胞を、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）の存在下、Ｓ１Ｐ（０．８μｇ／ｍＬ）を含む培地中で浮遊培養したときの培養１日目の位相差顕微鏡による観察像を示す。画像データ中のスケールバーは５００μｍである。
【図７】ヒトｉＰＳ細胞（ＴｋＤＮ４Ｍ株）において、ＰＡＲ１およびＰＡＲ２の相対的遺伝子発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した結果を示す。陽性対照として、未分化マーカー遺伝子であるＳＯＸ２を用いた。
【図８】ヒトｉＰＳ細胞（ＴｋＤＮ４Ｍ株、２０１Ｂ７株、ＲＰＣｈｉＰＳ７７１−２（図中ＲＰＣ−１）株）において、ＰＡＲ１およびＰＡＲ２の相対的遺伝子発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した結果を示す。
【図９】ヒトｉＰＳ細胞を５μＭのＴＲＡＰ−６を含む培地中で浮遊培養（培養１日目）して細胞凝集塊を作製した際の培養１日目の細胞凝集塊の直径の分布を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明を、好ましい実施形態を用いて詳細に説明する。
【００３０】
＜１．細胞＞
本発明において細胞凝集塊を形成する細胞は、接着性を有する細胞（接着性細胞）であることができる。接着性細胞は、動物由来細胞等であることができ、好ましくは哺乳類動物由来細胞等であることができ、より好ましくは生体組織由来細胞及び生体組織由来細胞から派生した細胞等であることができ、特に好ましくは上皮組織由来細胞及び上皮組織細胞から派生した細胞等、又は結合組織由来細胞及び結合組織由来細胞から派生した細胞等、又は筋組織由来細胞及び筋組織由来細胞から派生した細胞等、又は神経組織由来細胞及び神経組織由来細胞から派生した細胞等であることができ、さらに好ましくは動物由来幹細胞及び動物由来幹細胞から分化した細胞等であることができ、もっと好ましくは動物由来多能性幹細胞及び動物由来多能性幹細胞から分化した細胞等であることができ、よりさらに好ましくは哺乳類動物由来多能性幹細胞及び哺乳類動物由来多能性幹細胞から分化した細胞等であることができ、もっとも好ましくはヒト由来多能性幹細胞及びヒト由来多能性幹細胞から分化した細胞等であることができる。
【００３１】
本発明において「幹細胞」とは、別の細胞に分化することができ且つ自己複製能をもつ細胞である。「幹細胞」のなかでも特に、生体を構成する全ての種類の細胞に分化することができる多分化能（多能性）を有し、適切な条件下のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での培養において多能性を維持したまま無限に増殖を続けることができる細胞を「多能性幹細胞」という。多能性幹細胞の具体例としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞であるＥＧ細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．（１９９８）  ９５，  ｐ．１３７２６−１３７３１）、精巣由来の多能性幹細胞であるＧＳ細胞（Ｃｏｎｒａｄ  Ｓ．，  Ｎａｔｕｒｅ（２００８）  ４５６，  ｐ．３４４−３４９）、体細胞由来の人工多能性幹細胞であるｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明に用いる多能性幹細胞は、特に好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。ＥＳ細胞は、初期胚に由来する多能性幹細胞である。ｉＰＳ細胞は、体細胞に初期化因子を導入することにより体細胞を未分化状態へと初期化し、多能性を付与した培養細胞である。初期化因子としては、例えばＯＣＴ３／４及びＫＬＦ４及びＳＯＸ２及びｃ−Ｍｙｃを用いることができ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，  eｔ ａｌ．  Ｃｅｌｌ．  ２００７；１３１：８６１-７２．）、例えばＯＣＴ３／４及びＳＯＸ２及びＬＩＮ２８及びＮａｎｏｇを用いることができる（Ｙｕ Ｊ,  ｅt  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００７；３１８：１９１７−２０．）。これらの因子の細胞への導入形態は特に限定されないが、例えば、プラスミドを用いた遺伝子導入、合成ＲＮＡの導入、タンパク質として直接導入などが挙げられる。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡやＲＮＡ、低分子化合物等を用いた方法で作製されたｉＰＳ細胞を用いてもよい。ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞を始めとする多能性幹細胞は、市販品又は分譲を受けた細胞を用いてもよいし、新たに作製したものを用いてもよい。ｉＰＳ細胞として、例えば２５３Ｇ１株、２０１Ｂ６株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１Ａ株、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−２Ａ株、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１２Ａ株、Ｎｉｐｓ−Ｂ２株、ＴｋＤＮ４−Ｍ株、ＴｋＤＡ３−１株、ＴｋＤＡ３−２株、ＴｋＤＡ３−４株、ＴｋＤＡ３−５株、ＴｋＤＡ３−９株、ＴｋＤＡ３−２０株、ｈｉＰＳＣ ３８−２株、ＭＳＣ−ｉＰＳＣ１株、ＢＪ−ｉＰＳＣ１株等を使用することができる。ＥＳ細胞として、例えばＫｈＥＳ−１株、ＫｈＥＳ−２株、ＫｈＥＳ―３株、ＫｈＥＳ−４株、ＫｈＥＳ−５株、ＳＥＥＳ−１株、ＳＥＥＳ−２株、ＳＥＥＳ−３株、ＳＥＥＳ−４株、ＳＥＥＳ−５株、ＳＥＥＳ−６株、ＳＥＥＳ−７株、ＨＵＥＳ８株、ＣｙＴ４９株、Ｈ１株、Ｈ９株、ＨＳ−１８１株、ＲＰＣｈｉＰＳ７７１−２株等を使用することができる。新たに作製された臨床グレードのｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞を用いてもよい。ｉＰＳ細胞を作製する際の細胞の由来は特に限定されないが、例えば、繊維芽細胞又はリンパ球等を用いることができる。
【００３３】
また、本発明における細胞の種類としては、細胞外マトリックスやカドヘリン等によってプラスチックや細胞などに接着することができる細胞であれば特に限定されないが、例えば、上述した多能性幹細胞（人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、精巣由来の多能性幹細胞であるＧＳ細胞、胎児の始原生殖細胞由来のＥＧ細胞、骨髄等に由来するＭｕｓｅ細胞等）、体性幹細胞（骨髄、脂肪組織、歯髄、胎盤、卵膜、臍帯血、羊膜、絨毛膜等に由来する間葉系幹細胞、神経幹細胞等）、神経細胞、心筋細胞、心筋前駆細胞、肝細胞、肝臓前駆細胞、α細胞、β細胞、繊維芽細胞、軟骨細胞、角膜細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、周細胞等が例示でき、前記細胞は遺伝子導入された形態やゲノム上の対象遺伝子などをノックダウンされた形態でもよい。
【００３４】
本発明で用いられる細胞は、任意の動物由来のものであってよく、例えば、マウス、ラット、ハムスター等のげっ歯類、ヒト、ゴリラ、チンパンジー等の霊長類、さらにイヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜又は愛玩動物等の哺乳動物由来のものであってよいが、ヒト由来の細胞が特に好ましい。
【００３５】
本発明では、接着又は浮遊させながら培養した後に単離された細胞を用いることができる。ここで「単離された細胞」とは、複数の細胞が集団として接着している細胞を剥離、分散した状態の前記細胞である。単離とは、培養容器や培養担体等に接着していた状態の細胞又は細胞同士が接着している状態の細胞集団を剥離、分散して単一の細胞にする工程である。単離する細胞集団は液体培地中に浮遊した状態であってもよい。単離の方法は特に限定されないが、剥離剤（トリプシン又はコラゲナーゼ等の細胞剥離酵素）又はＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）等のキレート剤又は剥離剤とキレート剤の混合物等を好適に使用することができる。剥離剤は特に限定されないが、トリプシン、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標登録）、ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ディスパーゼ（商標登録）、コラゲナーゼなどが挙げられる。単離後に凍結保存した前記細胞も本発明で好適に使用することができる。
【００３６】
＜２．細胞凝集塊＞
細胞凝集塊は、複数の細胞が三次元的に凝集して形成される塊状の細胞集団であって、スフェロイドとも呼ばれる。細胞凝集塊は、典型的には、概ね球状の形状を有する。
【００３７】
本発明において、細胞凝集塊を構成する細胞は１種類以上の前記細胞であれば特に限定されない。例えば、ヒト多能性幹細胞又はヒト胚性幹細胞等の多能性幹細胞で構成された細胞凝集塊は、多能性幹細胞マーカーを発現している及び／又は多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞を含む。多能性幹細胞マーカーとしては、例えば、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＴＲＡ−１−６０、ｃ−Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−１等が例示できる。
【００３８】
多能性幹細胞マーカーは、当該技術分野において任意の検出方法により検出することができる。発現マーカーを検出する方法としては、例えばフローサイトメトリーが挙げられるが、これらに限定されない。蛍光標識抗体を用いるフローサイトメトリーにおいて、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。フローサイトメトリーによって解析した蛍光標識抗体について陽性を呈する細胞の比率は、陽性率と記載されることがある。また、蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
細胞凝集塊を構成する細胞が多能性幹細胞である場合、多能性幹細胞マーカーを発現する及び／又は多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞の割合（比率）は、例えば８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％以下とすることができる。多能性幹細胞マーカーを発現する及び／又は多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞の割合が前記範囲内である細胞凝集塊は未分化性が高く、より均質な細胞集団である。なお、多能性幹細胞マーカーは未分化マーカーと同義であり、両者は互換的に使用することができる。
【００４０】
本発明の一以上の実施形態により製造される細胞凝集塊の寸法は特に限定されないが、顕微鏡で観察したとき、観察像での最も幅の広い部分の寸法の上限は例えば１０００μｍ以下、９００μｍ以下、８００μｍ以下、７００μｍ以下、６００μｍ以下、５００μｍ以下、４００μｍ以下であり、３００μｍ以下、又は２００μｍ以下である。下限は例えば５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、９０μｍ以上、又は１００μｍ以上である。このような寸法範囲の細胞凝集塊は、内部の細胞にも酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。
【００４１】
本発明の一以上の実施形態により製造される細胞凝集塊の集団は、該集団を構成する細胞凝集塊のうち重量基準で、例えば１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上が上記の範囲の寸法を有することができる。上記の範囲の寸法の細胞凝集塊を２０％以上含む細胞凝集塊の集団では、個々の細胞凝集塊において、内部の細胞にも酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。
【００４２】
本発明の一以上の実施形態により製造される細胞凝集塊の集団は、該集団を構成する細胞のうち生細胞の割合（生存率）が、例えば５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上であることが好ましい。上記の範囲の生存率の細胞凝集塊は、凝集状態を維持しやすく、細胞の増殖に好ましい状態である。
【００４３】
＜３．培地＞
本発明で用いる培地は、任意の動物細胞培養用培地を基礎培地とし、トロンビン受容体のアゴニスト又はトロンビン受容体のアゴニストを含む細胞凝集抑制剤、及び、必要に応じて他の成分を適宜添加することにより調製することができる。本発明で用いる培地は細胞の浮遊培養に適したものであることが好ましく、典型的には、液体培地である。
【００４４】
基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２  Ｈａｍ））等の培地を使用することができるが、特に限定されない。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地としては特に、ＤＭＥＭ培地とハムＦ１２培地とを例えば６０／４０以上４０／６０以下の重量比、５５／４５以上４５／５５以下の重量比、又は等量（５０／５０の重量比）で混合した培地を用いる。
【００４５】
本発明で用いる培地は、好ましくは血清を含まない培地、すなわち無血清培地である。本発明で用いる培地は、より好ましくは、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムから選択される少なくとも１つを含み、より好ましくはこれらの全部を含む。Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムは、溶液、誘導体、塩又は混合試薬等の形態で培地に添加することができる。例えば、Ｌ−アスコルビン酸は、２−リン酸アスコルビン酸マグネシウムなどの誘導体の形態で培地に添加してもよい。セレンは亜セレン酸塩（亜セレン酸ナトリウムなど）の形態で培地に添加してもよい。インスリン及びトランスフェリンは、動物（好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ等）の組織又は血清等から分離した天然由来のものであってもよいし、遺伝子工学的に作製した組換えタンパク質であってもよい。インスリン、トランスフェリン、及びセレンは、試薬ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレン）の形態で培地に添加してもよい。ＩＴＳは、インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウムを含む、細胞増殖促進用の添加剤である。
【００４６】
Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムから選択される少なくとも１つを含む市販の培地を使用することができる。インスリン及びトランスフェリンを添加した市販の培地としては、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｅＲＤＦ  Ｄｒｙ  Ｐｏｗｄｅｒｅｄ  Ｍｅｄｉａ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＤＯＭＡＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＣＨＯＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＭＤＣＫＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）等を用いることができる。ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）  ｈＥＳＣ  ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＴｅＳＲ２（Ｖｅｒｉｔａｓ社）なども好適に用いることができる。その他、ヒトｉＰＳ細胞やヒトＥＳ細胞の培養に使用されている培地も好適に使用することができる。
【００４７】
本発明で用いる培地は好ましくは少なくとも１つの増殖因子を含む。増殖因子としては、限定するものではないが、ＦＧＦ２（Ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−２）、ＴＧＦ−β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β１）、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、ＩＧＦ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＰＡＩ、ＰＥＤＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＬＩＦ及びＩＧＦＢＰ−７からなる群から選択される１つ以上を含むことが好ましい。特に好ましい増殖因子は、ＦＧＦ２及び／又はＴＧＦ−β１である。
【００４８】
本発明で用いる培地として最も好ましいものは、後述するトロンビン受容体のアゴニスト以外の成分として、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウム、並びに、少なくとも１つの増殖因子を含む無血清培地であり、特に好ましくは、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウム、並びに、少なくとも１つの増殖因子（好ましくはＦＧＦ２及びＴＧＦ−β１）を含み、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である。このような培地としては、トロンビン受容体のアゴニストを添加した、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８ＴＭ培地（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が好適に使用できる。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８ＴＭ培地は、ライフテクノロジーズジャパン株式会社から市販されている、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地であるＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ＨＡＭ）１：１と、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８ＴＭサプリメント（Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、炭酸水素ナトリウム、ＦＧＦ２及びＴＧＦ−β１を含む）とを混合して調製することができる。
【００４９】
本発明で用いる培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生剤、リン酸化酵素阻害剤等のさらなる成分を含有してもよい。
【００５０】
抗生剤としては、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ等を使用することができる。
【００５１】
リン酸化酵素阻害剤としては、ＲＯＣＫ阻害剤を添加することができる。ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏ−キナーゼ（ＲＯＣＫ，Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）のキナーゼ活性を阻害する物質として定義され、例えば、Ｙ−２７６３２（４−［（１Ｒ）−１−アミノエチル］−Ｎ−ピリジン−４−イルシクロヘキサン−１−カルボキサミド又はその塩（例えば２塩酸塩））（例えば、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照）、Ｈ−１１５２（（Ｓ）−（＋）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］−ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−ジアゼピン又はその塩（例えば２塩酸塩））（例えば、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７(１−(５−イソキノリンスルホニル)ホモピペラジン又はその塩（例えば２塩酸塩））（例えば、Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)参照）、Ｗｆ−５３６（（＋）−（Ｒ）−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）ベンズアミド１塩酸塩）（例えば、Nakajima et al., CancerChemother. Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）及びそれらの誘導体、並びにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の低分子化合物も知られており、本発明においてはこのような化合物又はそれらの誘導体もＲＯＣＫ阻害剤として使用できる（例えば、米国特許出願公開第2005/0209261号、同第2005/0192304号、同第2004/0014755号、同第2004/0002508号、同第2004/0002507号、同第2003/0125344号、同第2003/0087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。ＲＯＣＫ阻害剤としては、１種又は２種以上のＲＯＣＫ阻害剤を使用することができる。
【００５２】
上記の、４−［（１Ｒ）−１−アミノエチル］−Ｎ−ピリジン−４−イルシクロヘキサン−１−カルボキサミドの構造式は以下の通りである。
【００５３】
【化１】
2019131941.tif 000003
【００５４】
ＲＯＣＫ阻害剤は、特に好ましくは、Ｙ−２７６３２及びＨ−１１５２から選択される１以上であり、最も好ましくは、Ｙ−２７６３２である。Ｙ−２７６３２及びＨ−１１５２は、それぞれ、水和物の形態で用いられてもよい。
【００５５】
液体培地におけるＹ−２７６３２等のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は特に限定されないが、例えば、３．３ｎｇ／ｍＬ以上、３．４ｍｇ／ｍＬ以下の範囲であることが特に好ましい。前記濃度の下限は、効果を奏する濃度であれば特に限定されないが、例えば３３ｎｇ／ｍＬ以上、３３０ｎｇ／ｍＬ以上、８００ｎｇ／ｍＬ以上であり、例えば１μｇ／ｍＬ以上、２μｇ／ｍＬ以上、３μｇ／ｍＬ以上、４μｇ／ｍＬ以上、５μｇ／ｍＬ以上、６μｇ／ｍＬ以上、７μｇ／ｍＬ以上、８μｇ／ｍＬ以上、９μｇ／ｍＬ以上、１０μｇ／ｍＬ以上、１１μｇ／ｍＬ以上、１２μｇ／ｍＬ以上、１３μｇ／ｍＬ以上である。前記濃度の上限としては、細胞が死滅しない濃度であれば特に限定されないが、例えば３４０μｇ／ｍＬ以下であり、３００μｇ／ｍＬ以下、２００μｇ／ｍＬ以下、１００μｇ／ｍＬ以下、９０μｇ／ｍＬ以下、８０μｇ／ｍＬ以下、７０μｇ／ｍＬ以下、６０μｇ／ｍＬ以下、５０μｇ／ｍＬ以下、４０μｇ／ｍＬ以下、３４μｇ／ｍＬ以下、３０μｇ／ｍＬ以下、２５μｇ／ｍＬ以下、２０μｇ／ｍＬ以下、１９μｇ／ｍＬ以下、１８μｇ／ｍＬ以下、１７μｇ／ｍＬ以下、１６μｇ／ｍＬ以下、１５μｇ／ｍＬ以下、又は１４μｇ／ｍＬ以下である。前記培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度はまた、１０ｎＭ以上、１０ｍＭ以下の範囲であることが特に好ましい。前記濃度は、例えば１００ｎＭ以上、１μＭ以上、２．５μＭ以上であり、例えば３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、６μＭ以上、７μＭ以上、８μＭ以上、９μＭ以上、１０μＭ以上、１１μＭ以上、１２μＭ以上、１３μＭ以上、１４μＭ以上、１５μＭ以上、１６μＭ以上、１７μＭ以上、１８μＭ以上、１９μＭ以上、２０μＭ以上、２１μＭ以上、２２μＭ以上、２３μＭ以上、２４μＭ以上、２５μＭ以上、２６μＭ以上、２７μＭ以上、２８μＭ以上、２９μＭ以上、３０μＭ以上、３１μＭ以上、３２μＭ以上、３３μＭ以上、３４μＭ以上、３５μＭ以上、３６μＭ以上、３７μＭ以上、３８μＭ以上、３９μＭ以上、４０μＭ以上等でも良い。上限としては、例えば１ｍＭ以下、９００μＭ以下、８００μＭ以下、７００μＭ以下、６００μＭ以下、５００μＭ以下、４００μＭ以下、３００μＭ以下、２００μＭ以下、１００μＭ以下、９０μＭ以下、８０μＭ以下、７０μＭ以下、６０μＭ以下、５０μＭ以下、又は４０μＭ以下である。
【００５６】
＜４．トロンビン受容体のアゴニスト＞
本明細書において、「トロンビン受容体」とは、トロンビンによって活性化されるレセプター、すなわちＰＡＲ−１（ｐｒｏｔｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１）、ＰＡＲ−３（ｐｒｏｔｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−３）、又はＰＡＲ−４（ｐｒｏｔｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−４）を指し、さらに好ましくはＰＡＲ−１又はＰＡＲ−４、最も好ましくはＰＡＲ−１を指す。ＰＡＲファミリーメンバーとして知られているＰＡＲ−２はトロンビンの受容体ではないが、トリプシンやトリプターゼ、血液凝固因子等により活性化される膜貫通型受容体であり、活性化されると他のＰＡＲファミリーメンバー（ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−３、ＰＡＲ−４）と同様に細胞内へとシグナルが伝達されることから、ＰＡＲ−２アゴニストにおいてもトロンビン受容体アゴニストと同様の効果が得られると当業者であれば容易に想到できる。したがって、本明細書における「トロンビン受容体」には、上記ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−３、ＰＡＲ−４に加えて、ＰＡＲ−２も含まれる。本明細書において、「トロンビン受容体のアゴニスト」は、トロンビン受容体を活性化させる物質として定義され、内因性アゴニストと外因性のアゴニストの両方を含む。限定するものではないが、トロンビン受容体のアゴニストとしては、セリンプロテアーゼ、例えばトロンビン（ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−３、及びＰＡＲ−４）、トリプシン、血液凝固第Ｘａ因子、及びプラスミン（ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、及びＰＡＲ−４）、活性化プロテインＣ（ＰＡＲ−１）、トリプターゼ及びマトリプターゼ（ＰＡＲ−２）、並びにカテプシンＧ（ＰＡＲ−４）が挙げられる（例えば、Ｔｅｊｍｉｎｄｅｒ  Ｓ．  Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２０１４，  １５，  ６１６９−６１８３参照）。これらのセリンプロテアーゼに加えて、トロンビン受容体がセリンプロテアーゼによる切断を受けた後に生じるアミノ酸配列を含むペプチドも、トロンビン受容体のアゴニストに含まれる。そのようなペプチドは、対象となる動物種におけるトロンビン受容体のアミノ酸配列、及びプロテアーゼによる切断部位に基づいて、当業者であれば容易に特定することができる。例えば、アミノ酸配列ＳＦＬＬＲ（配列番号１）及びＳＦＦＬＲ（配列番号２）を含むペプチドは、それぞれヒトＰＡＲ−１及びマウスＰＡＲ−１のアゴニストとして使用することができ、アミノ酸配列ＴＦＲＧＡＰ（配列番号３）及びＳＦＧＢＧＧＰ（配列番号４）を含むペプチドは、それぞれヒトＰＡＲ−３及びマウスＰＡＲ−３のアゴニストとして使用することができ、アミノ酸配列ＧＹＰＧＱＶ（配列番号５）及びＧＹＰＧＦＫ（配列番号６）を含むペプチドは、それぞれヒトＰＡＲ−４及びマウスＰＡＲ−４のアゴニストとして使用することができる（例えば、関口富美子、薬学雑誌，２００５，１２５（６），４９１−４９８参照）。アミノ酸配列ＳＦＬＬＲＮ（配列番号７）を含むペプチド、及びアミノ酸配列ＴＦＬＬＲＮ（配列番号８）を含むペプチドは、ＰＡＲ−１のアゴニストとして使用することができる。特に好ましいアゴニストの例として、ＰＡＲ−１アゴニストとして作用する、アミノ��配列ＳＦＬＬＲＮ（配列番号７）からなるペプチドであるＴＲＡＰ−６（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ６）、及びアミノ酸配列ＴＦＬＬＲＮ（配列番号８）からなるペプチドが挙げられる。
【００５７】
アミノ酸配列ＴＦＬＬＲＮＰＮＤＫ（配列番号９）、アミノ酸配列ＦＳＬＬＲＮ（配列番号１０）、及びアミノ酸配列ＦＬＬＲＮ（配列番号１１）を含むペプチドは、ＰＡＲ−１のアゴニストとして使用することができる。アミノ酸配列ＳＬＩＧＫＶ（配列番号１２）、及びアミノ酸配列ＳＬＩＧＲＬ（配列番号１３）を含むペプチドは、ＰＡＲ−２のアゴニストとして使用することができる。アミノ酸配列ＡＹＰＧＫＦ（配列番号１４）を含むペプチドは、ＰＡＲ−４のアゴニストとして使用することができる。
【００５８】
トロンビン受容体のアゴニストのさらなる例として、配列番号１から８で示されるアミノ酸配列を含むペプチドにおいて、１個又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。ここで「複数個のアミノ酸」とは、配列番号１から８で示すアミノ酸配列を含むペプチドのようにトロンビン受容体を活性化させることができる限り、その個数は特に限定されない。
【００５９】
また、トロンビン受容体のアゴニストのさらなる例として、配列番号１から８で示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、１個又は２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。トロンビン受容体のアゴニストは、上記アミノ酸配列のいずれかからなるペプチドであってもよい。
【００６０】
また、上記ペプチドのC末端アミド化物等の誘導体も、トロンビン受容体のアゴニストに含まれる。トロンビン受容体のアゴニストのさらなる例として、アゴニスト抗体、上記ペプチド又はアゴニスト抗体の発現ベクター、及び低分子化合物等が挙げられる。トロンビン受容体のアゴニストとしては、１種又は２種以上のアゴニストを使用することができる。
【００６１】
また、配列番号１から１４において共通して保存されているアミノ酸配列として、Ｘ−Ｐｈｅ−Ｘ−Ｌｅｕ−Ａｒｇの骨格を有しており、この骨格によりトロンビンのアゴニストとして機能を発揮することができる。なお、Ｘについては任意のアミノ酸を適宜選択することができる。
【００６２】
トロンビン受容体のアゴニストのさらなる例として、配列番号９から１４で示されるアミノ酸配列を含むペプチドにおいて、１個又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。ここで「複数個のアミノ酸」とは、配列番号１から８で示すアミノ酸配列を含むペプチドのようにトロンビン受容体を活性化させることができる限り、その個数は特に限定されない。
【００６３】
また、トロンビン受容体のアゴニストのさらなる例として、配列番号９から１４で示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、１個又は２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。トロンビン受容体のアゴニストは、上記アミノ酸配列のいずれかからなるペプチドであってもよい。
【００６４】
トロンビン受容体のアゴニストは、上記アミノ酸配列（配列番号１から１４で示されるアミノ酸配列からなるペプチド）のいずれかとの配列同一性が６０％以上であり、トロンビン受容体を活性化できるペプチドであってもよい。上記配列同一性は６６％以上であってもよいし、７５％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい。
【００６５】
例えば、トロンビン受容体のアゴニストには、配列番号７又は配列番号８に示すアミノ酸配列からなるペプチドのほか、配列番号７又は配列番号８に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドが含まれる。上記配列同一性は８０％以上であってもよいし、８３％以上、８５％、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％であってもよい。
【００６６】
アミノ酸の配列同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムのblastpプログラムやＦＡＳＴＡアルゴリズムのfastaプログラムが挙げられる。ここでのアミノ酸配列の配列同一性は、例えば配列番号７又は８に示すアミノ酸配列に対して評価対象のアミノ酸配列を比較し、同一部位に同一のアミノ酸が出現する頻度を％で表示した値である。
【００６７】
例えば、配列番号８と配列番号２の配列同一性を配列解析ソフトウェア「GENETYXネットワークTM版Ver. 13.0.2」（株式会社ゼネティックス）を使用して解析した場合、６０％と算出される。
【００６８】
例えば、配列番号８と配列番号１の配列同一性を配列解析ソフトウェア「GENETYXネットワークTM版Ver. 13.0.2」（株式会社ゼネティックス）を使用して解析した場合、８０％と算出される。
【００６９】
例えば、配列番号７と配列番号８の配列同一性を配列解析ソフトウェア「GENETYXネットワークTM版Ver. 13.0.2」（株式会社ゼネティックス）を使用して解析した場合、８３％と算出される。
【００７０】
例えば、配列番号７と配列番号１の配列同一性を配列解析ソフトウェア「GENETYXネットワークTM版Ver. 13.0.2」（株式会社ゼネティックス）を使用して解析した場合、１００％と算出される。
【００７１】
例えば、トロンビン受容体のアゴニストには、配列番号１２又は配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるペプチドのほか、配列番号１２又は配列番号１３に示すアミノ酸配列と６６％以上の配列同一性を有するアミノ酸からなるペプチドが含まれる。上記配列同一性は７５％以上であってもよいし、８０％以上、８３％以上、８５％、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％であってもよい。
【００７２】
アミノ酸の配列同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムのblastpプログラムやＦＡＳＴＡアルゴリズムのfastaプログラムが挙げられる。ここでのアミノ酸配列の配列同一性は、例えば配列番号１２又は１３に示すアミノ酸配列に対して評価対象のアミノ酸配列を比較し、同一部位に同一のアミノ酸が出現する頻度を％で表示した値である。
【００７３】
例えば、配列番号１２と配列番号１３の配列同一性を配列解析ソフトウェア「GENETYXネットワークTM版Ver. 13.0.2」（株式会社ゼネティックス）を使用して解析した場合、６６％と算出される。
【００７４】
例えば、トロンビン受容体のアゴニストには、配列番号５、配列番号６又は配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるペプチドのほか、配列番号５又は配列番号６に示すアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸からなるペプチドが含まれる。上記配列同一性は７５％以上であってもよいし、８０％以上、８３％以上、８５％、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％であってもよい。
【００７５】
アミノ酸の配列同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムのblastpプログラムやＦＡＳＴＡアルゴリズムのfastaプログラムが挙げられる。ここでのアミノ酸配列の配列同一性は、例えば配列番号５又は６に示すアミノ酸配列に対して評価対象のアミノ酸配列を比較し、同一部位に同一のアミノ酸が出現する頻度を％で表示した値である。
【００７６】
例えば、配列番号５と配列番号１４の配列同一性を配列解析ソフトウェア「GENETYXネットワークTM版Ver. 13.0.2」（株式会社ゼネティックス）を使用して解析した場合、６０％と算出される。
【００７７】
例えば、配列番号６と配列番号１４の配列同一性を配列解析ソフトウェア「GENETYXネットワークTM版Ver. 13.0.2」（株式会社ゼネティックス）を使用して解析した場合、７５％と算出される。
【００７８】
例えば、配列番号５と配列番号６の配列同一性を配列解析ソフトウェア「GENETYXネットワークTM版Ver. 13.0.2」（株式会社ゼネティックス）を使用して解析した場合、１００％と算出される。
【００７９】
＜５．細胞の凝集を抑制する方法＞
本発明の一態様は、トロンビン受容体のアゴニストを含む培地中で細胞を浮遊培養する工程（浮遊培養工程）を含む、細胞の凝集を抑制する方法である。また、本発明の方法は、選択工程として、回収工程を含んでもよい。
【００８０】
本明細書において「細胞（の）凝集（を）抑制（する）」とは、細胞凝集作用を抑制し、それにより細胞凝集塊の形成又は増大を抑制することをいう。本明細書において「細胞凝集抑制剤」とは、細胞凝集を抑制する効果を有する薬剤をいう。
【００８１】
本態様の方法は、浮遊培養工程を必須の工程として、維持培養工程並びに回収工程を選択工程として含む。以下、それぞれの工程について、説明をする。
【００８２】
（浮遊培養工程）
トロンビン受容体のアゴニストを含む培地中で細胞を浮遊培養する工程（浮遊培養工程）の具体的な実施形態について説明する。
【００８３】
トロンビン受容体のアゴニスト、培地及び細胞の具体的な実施形態は既述の通りである。
【００８４】
浮遊培養工程での培地中のトロンビン受容体のアゴニストの濃度は、細胞の凝集を抑制することができるように、細胞の種類、細胞数、培地の種類等の諸条件に応じて適宜調整することができる。浮遊培養工程での培地中のトロンビン受容体のアゴニストの濃度は、３．７ｎｇ／ｍＬ以上３．８ｍｇ／ｍＬ以下の範囲であることが特に好ましい。前記濃度の下限は、効果を奏する濃度であれば特に限定されないが、例えば３７ｎｇ／ｍＬ以上、４０ｎｇ／ｍＬ以上、５０ｎｇ／ｍＬ以上、６０ｎｇ／ｍＬ以上、７０ｎｇ／ｍＬ以上、８０ｎｇ／ｍＬ以上、９０ｎｇ／ｍＬ以上、１００ｎｇ／ｍＬ以上、１５０ｎｇ／ｍＬ以上、２００ｎｇ／ｍＬ以上、２５０ｎｇ／ｍＬ以上、３００ｎｇ／ｍＬ以上、３５０ｎｇ／ｍＬ以上、３７０ｎｇ／ｍＬ以上、４００ｎｇ／ｍＬ以上、５００ｎｇ／ｍＬ以上、６００ｎｇ／ｍＬ以上、７００ｎｇ／ｍＬ以上、８００ｎｇ／ｍＬ以上、９００ｎｇ／ｍＬ以上、又は９２５ｎｇ／ｍＬ以上である。一方、上限は細胞が死滅しない濃度であれば特に限定されないが、３ｍｇ／ｍＬ以下、２ｍｇ／ｍＬ以下、１ｍｇ／ｍＬ以下、９００μｇ／ｍＬ以下、８００μｇ／ｍＬ以下、７００μｇ／ｍＬ以下、６００μｇ／ｍＬ以下、５００μｇ／ｍＬ以下、４００μｇ／ｍＬ以下、３８０μｇ／ｍＬ以下、３５０μｇ／ｍＬ以下、３００μｇ／ｍＬ以下、２５０μｇ／ｍＬ以下、２００μｇ／ｍＬ以下、１５０μｇ／ｍＬ以下、１００μｇ／ｍＬ以下、５０μｇ／ｍＬ以下、３８μｇ／ｍＬ以下、３５μｇ／ｍＬ以下、３０μｇ／ｍＬ以下、２５μｇ／ｍＬ以下、２０μｇ／ｍＬ以下、又は１５．２μｇ／ｍＬ以下である。浮遊培養工程での培地中のトロンビン受容体のアゴニストの濃度はまた、５ｎＭ以上、５ｍＭ以下の範囲であることが特に好ましい。前記濃度は、例えば５０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、２００ｎＭ以上、３００ｎＭ以上、４００ｎＭ以上、５００ｎＭ以上、６００ｎＭ以上、７００ｎＭ以上、８００ｎＭ以上、９００ｎＭ以上、１μＭ以上、１．２５μＭ以上、２μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、６μＭ以上、７μＭ以上、８μＭ以上、９μＭ以上、１０μＭ以上であり、５００μＭ以下、４００μＭ以下、３００μＭ以下、２００μＭ以下、１００μＭ以下、５０μＭ以下、４０μＭ以下、３０μＭ以下、又は２０μＭ以下である。培地中のトロンビン受容体のアゴニストの濃度が前記範囲のとき、特に多能性幹細胞の未分化性や生存率等への影響が少なく、かつ、細胞の凝集抑制に作用し、細胞凝集塊の大きさを制御できる。
【００８５】
浮遊培養工程は、仮に本発明のトロンビン受容体のアゴニストが培地中に存在しない場合には、細胞の凝集が過剰となる条件下において浮遊培養を行う工程であることが好ましい。細胞の凝集が過剰となる条件は特に限定しないが、例えば細胞の凝集により、一部の細胞への栄養及び／又は酸素の供給が不十分となり、細胞の死滅及び／又は増殖の低下が生じる様な条件が挙げられる。
【００８６】
浮遊培養工程に用いる培養容器は、好ましくは容器内面への細胞の接着性が低い容器が好ましい。このような容器内面への細胞の接着性が低い容器としては、例えば生体適合性がある物質で親水性表面処理されているようなプレートが挙げられる。例えば、ＮｕｎｃｌｏｎＴＭＳｐｈｅｒａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を培養容器として使用できるが特に限定はされない。
【００８７】
培養容器の形状は特に限定されないが、例えば、ディッシュ状、フラスコ状、ウェル状、バッグ状、スピナーフラスコ状等の形状の培養容器が挙げられる。
【００８８】
浮遊培養は静置培養であってもよいし、培地が流動する条件での培養（流動培養）であってもよいが、好ましくは流動培養である。流動培養としては、細胞の凝集を抑制するように培地が流動する条件での培養が好ましい。細胞の凝集を抑制するように培地が流動する条件での培養としては、例えば、旋回流、揺動流等の流れによる応力（遠心力、求心力）により細胞が一点に集まるように培地が流動する条件での培養や、直線的な往復運動により培地が流動する条件での培養が挙げられ、旋回培養法又は揺動培養法が特に好ましい。
【００８９】
「旋回培養法」（振盪培養法を含む）とは、旋回流による応力（遠心力、求心力）により細胞が一点に集まるように培地が流動する条件で培養する方法をいう。具体的には、細胞を含む培地を収容した培養容器を概ね水平面に沿って円、楕円、扁平した円、扁平した楕円等の閉じた軌道を描くように旋回させたり、培養容器は静置させたままでスターラ―バーや撹拌翼のような撹拌子を用いて容器内の培地を旋回させたりすることにより行う。後者は、例えば、撹拌翼の付いたスピナーフラスコ状の培養容器を用いることで達成し得る。そのような培養容器は市販されており、それらを利用することもできる。その場合、培地や培養液の量等は培養容器メーカー推奨の量で使用すればよい。
【００９０】
旋回培養法における旋回速度は特に限定されないが、上限は、例えば２００ｒｐｍ以下、１５０ｒｐｍ以下、１２０ｒｐｍ以下、１１５ｒｐｍ以下、１１０ｒｐｍ以下、１０５ｒｐｍ以下、１００ｒｐｍ以下、９５ｒｐｍ以下、又は９０ｒｐｍ以下とすることができる。下限は例えば１ｒｐｍ以上、１０ｒｐｍ以上、５０ｒｐｍ以上、６０ｒｐｍ以上、７０ｒｐｍ以上、８０ｒｐｍ以上又は９０ｒｐｍ以上とすることができる。旋回培養の際の旋回幅は特に限定されないが、下限は、例えば１ｍｍ以上、１０ｍｍ以上、２０ｍｍ以上、２５ｍｍ以上とすることができる。旋回幅の上限は、例えば２００ｍｍ以下、１００ｍｍ以下、５０ｍｍ以下、３０ｍｍ以下、２５ｍｍ以下とすることができる。旋回培養の際の回転半径もまた特に限定されないが、旋回幅が前記の範囲となるように設定される。回転半径の下限は例えば５ｍｍ以上、１０ｍｍ以上であり、上限は例えば１００ｍｍ以上、５０ｍｍ以上とすることができる。旋回培養の条件をこの範囲とすることで、適切な寸法の細胞凝集塊を製造することが容易となるため好ましい。
【００９１】
「揺動培養法」とは、揺動（ロッキング）撹拌のような直線的な往復運動により培地に揺動流を付与する条件で培養する方法をいう。具体的には、細胞を含む培地を収容した培養容器を概ね水平面に垂直な平面内で揺動させることにより行う。揺動速度は特に限定されないが、例えば１往復を１回とした場合、下限は１分間に２回以上、４回以上、６回以上、８回以上、又は１０回以上、一方、上限は１分間に１５回以下、２０回以下、２５回以下、又は５０回以下で揺動すればよい。揺動の際、垂直面に対して若干の角度、すなわち誘導角度を培養容器につけることが好ましい。揺動角度は特に限定されないが、例えば、下限は０°以上、１°以上、２°以上、４°以上、６°以上、又は８°以上、一方、上限は１０°以下、１２°以下、１５°以下、１８°以下又は２０°以下とすることができる。揺動培養の条件をこの範囲とすることで、適切な寸法の細胞凝集塊を製造することが可能となるため好ましい。
【００９２】
さらに、上記のような旋回と揺動とを組み合わせた運動により撹拌しながら培養することもできる。
【００９３】
スピナーフラスコ状の培養容器を用いた培養は、培養容器の中に攪拌翼を使用して、液体培地を攪拌しながら行う培養である。回転数や培地量は特に限定されない。市販のスピナーフラスコ状の培養容器であれば、細胞培養組成物の量として、メーカー推奨の量を好適に使用することができる。回転数は例えば１０ｒｐｍ以上、１００ｒｐｍ以下とすることができるが、特に限定されない。
【００９４】
浮遊培養における細胞の培地中での播種密度（浮遊培養の開始時の細胞密度）は適宜調整することができるが、下限として、例えば０．０１×１０５個細胞／ｍＬ以上、０．１×１０５個細胞／ｍＬ以上、１×１０５個細胞／ｍＬ以上である。播種密度の上限としては、例えば１０×１０６個細胞／ｍＬ以下、２０×１０５個細胞／ｍＬ以下、又は１０×１０５個細胞／ｍＬ以下である。播種密度がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成され易い。例えば、０．１×１０５個細胞／ｍＬ、０．２×１０５個細胞／ｍＬ、０．３×１０５個細胞／ｍＬ、０．４×１０５個細胞／ｍＬ、０．５×１０５個細胞／ｍＬ、０．６×１０５個細胞／ｍＬ、０．７×１０５個細胞／ｍＬ、０．８×１０５個細胞／ｍＬ、０．９×１０５個細胞／ｍＬ、１×１０５個細胞／ｍＬ、１．５×１０５個細胞／ｍＬ、２×１０５個細胞／ｍＬ、３×１０５個細胞／ｍＬ、４×１０５個細胞／ｍＬ、５×１０５個細胞／ｍＬ、６×１０５個細胞／ｍＬ、７×１０５個細胞／ｍＬ、８×１０５個細胞／ｍＬ、９×１０５個細胞／ｍＬ、１０×１０６個細胞／ｍＬでも良い。
【００９５】
浮遊培養の際の細胞培養組成物の量は使用する培養容器によって適宜調整することができるが、例えば１２ウェルプレート（１ウェルあたりの平面視でのウェル底面の面積が３．５ｃｍ２）を使用する場合は０．５ｍＬ／ウェル以上、１．５ｍＬ／ウェル以下とすることができ、例えば１．３ｍＬ／ウェルとすることができる。例えば６ウェルプレート（１ウェルあたりの平面視でのウェル底面の面積が９．６ｃｍ２）を使用する場合は、１．５ｍＬ／ウェル以上、例えば２ｍＬ／ウェル以上、３ｍＬ／ウェル以上とすることができ、６．０ｍＬ／ウェル以下、５ｍＬ／ウェル以下、４ｍＬ／ウェル以下とすることができる。例えば１２５ｍＬ三角フラスコ（容量が１２５ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、１０ｍＬ／容器以上、１５ｍＬ／容器以上、２０ｍＬ／容器以上、２５ｍＬ／容器以上、２０ｍＬ／容器以上、２５ｍＬ／容器以上、３０ｍＬ／容器以上とすることができ、５０ｍＬ／容器以下、４５ｍＬ／容器以下、４０ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば５００ｍＬ三角フラスコ（容量が５００ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、１００ｍＬ／容器以上１０５ｍＬ／容器以上、１１０ｍＬ／容器以上、１１５ｍＬ／容器以上、１２０ｍＬ／容器以上とすることができ、１５０ｍＬ／容器以下、１４５ｍＬ／容器以下、１４０ｍＬ／容器以下、１３５ｍＬ／容器以下、１３０ｍＬ／容器以下、１２５ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば１０００ｍＬ三角フラスコ（容量が１０００ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、２５０ｍＬ／容器以上、例えば２６０ｍＬ／容器以上、２７０ｍＬ／容器以上、２８０ｍＬ／容器以上、２９０ｍＬ／容器以上とすることができ、３５０ｍＬ／容器以下、３４０ｍＬ／容器以下、３３０ｍＬ／容器以下、３２０ｍＬ／容器以下、３１０ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば２０００ｍＬ三角フラスコ（容量が２０００ｍＬの三角フラスコ）の場合は、５００ｍＬ／容器以上、５５０ｍＬ／容器以上、６００ｍＬ／容器以上とすることができ、１０００ｍＬ／容器以下、９００ｍＬ／容器以下、８００ｍＬ／容器以下、７００ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば３０００ｍＬ三角フラスコ（容量が３０００ｍＬの三角フラスコ）の場合は、１０００ｍＬ／容器以上、好ましくは１１００ｍＬ／容器以上、１２００ｍＬ／容器以上、１３００ｍＬ／容器以上、１４００ｍＬ／容器以上、１５００ｍＬ／容器以上とすることができ、２０００ｍＬ／容器以下、１９００ｍＬ／容器以下、１８００ｍＬ／容器以下、１７００ｍＬ／容器以下、１６００ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば２Ｌ培養バッグ（容量が２Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１００ｍＬ／バッグ以上、２００ｍＬ／バッグ以上、３００ｍＬ／バッグ以上、４００ｍＬ／バッグ以上、５００ｍＬ／バッグ以上、６００ｍＬ／バッグ以上、７００ｍＬ／バッグ以上、８００ｍＬ／バッグ以上、９００ｍＬ／バッグ以上、１０００ｍＬ／バッグ以上とすることができ、２０００ｍＬ／バッグ以下、１９００ｍＬ／バッグ以下、１８００ｍＬ／バッグ以下、１７００ｍＬ／バッグ以下、１６００ｍＬ／バッグ以下、１５００ｍＬ／バッグ以下、１４００ｍＬ／バッグ以下、１３００ｍＬ／バッグ以下、１２００ｍＬ／バッグ以下、１１００ｍＬ／バッグ以下とすることができる。例えば１０Ｌ培養バッグ（容量が１０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、５００ｍＬ／バッグ以上、１Ｌ／バッグ以上、２Ｌ／バッグ以上、３Ｌ／バッグ以上、４Ｌ／バッグ以上、５Ｌ／バッグ以上とすることができ、１０Ｌ／バッグ以下、９Ｌ／バッグ以下、８Ｌ／バッグ以下、７Ｌ／バッグ以下、６Ｌ／バッグ以下とすることができる。例えば、２０Ｌ培養バッグ（容量が２０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１Ｌ／バッグ以上、２Ｌ／バッグ以上、３Ｌ／バッグ以上、４Ｌ／バッグ以上、５Ｌ／バッグ以上、６Ｌ／バッグ以上、７Ｌ／バッグ以上、８Ｌ／バッグ以上、９Ｌ／バッグ以上、１０Ｌ／バッグ以上とすることができ、２０Ｌ／バッグ以下、１９Ｌ／バッグ以下、１８Ｌ／バッグ以下、１７Ｌ／バッグ以下、１６Ｌ／バッグ以下、１５Ｌ／バッグ以下、１４Ｌ／バッグ以下、１３Ｌ／バッグ以下、１２Ｌ／バッグ以下、１１Ｌ／バッグ以下とすることができる。例えば５０Ｌ培養バッグ（容量が５０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１Ｌ／バッグ以上、２Ｌ／バッグ以上、５Ｌ／バッグ以上、１０Ｌ／バッグ以上、１５Ｌ／バッグ以上、２０Ｌ／バッグ以上、２５Ｌ／バッグ以上とすることができ、５０Ｌ／バッグ以下、４５Ｌ／バッグ以下、４０Ｌ／バッグ以下、３５Ｌ／バッグ以下、３０Ｌ／バッグ以下とすることができる。細胞培養組成物の量がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成され易い。
【００９６】
使用する培養容器の容量は適宜選択することができ特に限定されないが、液体培地を収容する部分の底面を平面視したときの面積として、下限が、例えば０．３２ｃｍ２以上、０．６５ｃｍ２以上、０．６５ｃｍ２以上、１．９ｃｍ２以上、３．０ｃｍ２以上、３．５ｃｍ２以上、９．０ｃｍ２以上又は９．６ｃｍ２以上の培養容器を用いることができ、上限としては、例えば１０００ｃｍ２以下、５００ｃｍ２以下、３００ｃｍ２以下、１５０ｃｍ２以下、７５ｃｍ２以下、５５ｃｍ２以下、２５ｃｍ２以下、２１ｃｍ２以下、９．６ｃｍ２以下、又は３．５ｃｍ２以下の培養容器を用いることができる。
【００９７】
前記トロンビン受容体のアゴニストの存在下での細胞の浮遊培養の温度、時間、ＣＯ２濃度等の条件は特に限定されない。培養温度は２０℃以上、３５℃以上、４５℃以下、４０℃以下、又は３７℃である。培養時間は０．５時間以上、１２時間以上、７日間以下、７２時間以下、４８時間以下、又は２４時間以下である。培養時のＣＯ２濃度としては、４％以上、４．５％以上、１０％以下、５．５％以下、又は５％である。また、本発明の細胞の凝集を抑制する方法においては、浮遊培養工程中で継代操作を伴ってもよい。培養条件がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成され易い。また、適当な頻度で培地交換を行うことができる。培地交換の頻度は培養する細胞種によって異なるが、例えば、５日に１回以上、４日に１回以上、３日に１回以上、２日に１回以上、１日に１回以上で行えばよい。培地交換は、後述する回収工程と同様の方法で細胞を回収した後、新鮮な培地を添加し、穏やかに細胞凝集塊を分散させた後、再度培養すればよい。
【００９８】
浮遊培養工程で細胞の数をどこまで増やすか、また細胞の状態をどこに合わせるかについては、培養する細胞の種類、細胞凝集の目的、培地の種類や培養条件に応じて適宜定めればよい。浮遊培養工程に用いる細胞は、予め培養工程により培養され、回収工程により回収され、必要に応じて単細胞化された細胞であることが好ましい。維持培養工程、回収工程、単細胞化については、後述する通りである。浮遊培養工程後は、常法により培養液を廃棄し、細胞を回収する。この時、細胞は、剥離又は分散処理によって単一の細胞として回収することが好ましい。具体的な方法については、後述の回収工程で詳述する。回収した細胞は、そのまま、又は必要に応じてバッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生食、又は培地（次の工程で使用する培地か基礎培地が好ましい）で洗浄後、次の工程に供すればよい。
【００９９】
（維持培養工程）
「維持培養工程」は、浮遊培養工程前の細胞集団、又は浮遊培養工程後、若しくはその後の回収工程後に得られる細胞凝集塊を、未分化性を維持した状態で細胞を増殖させるために培養する工程である。維持培養は、細胞を容器、担体等培養基材に接着させながら培養する接着培養であってもよいし、細胞を培地中で浮遊させながら培養する浮遊培養であってもよい。
【０１００】
維持培養工程では、当該分野で既知の動物細胞培養法により、対象となる細胞を培養すればよい。接着培養又は浮遊培養を問わない。
【０１０１】
維持培養工程で使用する培地、細胞の具体的な実施形態は既述の通りである。
【０１０２】
維持培養工程で使用する培養容器、細胞の播種密度、培養条件は、浮遊培養工程に関して既述の通りである。
【０１０３】
維持培養工程における、培地の流動状態は問わない。静置培養でもよいし、流動培養でもよい。
【０１０４】
「静置培養」とは、培養容器内で培地を静置した状態で培養することをいう。接着培養では、通常、この静置培養が採用される。
【０１０５】
「流動培養」とは、培地を流動させる条件下で培養することをいう。流動培養の具体的な実施形態は、浮遊培養工程に関して既述の通りである。
【０１０６】
維持培養工程で細胞の数をどこまで増やすか、また細胞の状態をどこに合わせるかについては、培養する細胞の種類、細胞凝集の目的、培地の種類や培養条件に応じて適宜定めればよい。
【０１０７】
維持培養工程の好適な一態様は、トロンビン受容体のアゴニストの存在下での浮遊培養工程により形成された細胞凝集塊を更に培養する維持培養工程である。この態様の維持培養工程での培養方法は特に限定されないが、例えばトロンビン受容体のアゴニストを含まない培地中で細胞凝集塊を浮遊培養する工程が挙げられる。この維持培養に用いる培地としては、トロンビン受容体のアゴニストを含まない以外は上記と同様の培地を用いることができ、培養の条件としては浮遊培養工程と同様の条件を用いることができる。この態様の維持培養工程では、適当な頻度で培地交換を行うことが好ましい。培地交換の頻度は細胞種により異なるが、例えば５日に一回以上、４日に一回以上、３日に一回以上、２日に一回以上、又は１日に一回以上の頻度で培地交換作業を含むことができる。この頻度の培地交換は、幹細胞の細胞凝集塊を培養する際に特に好適である。培地交換の方法は特に限定されないが、好ましくは細胞凝集塊を含む細胞培養組成物を遠沈管に全量回収し、遠心分離又は静置状態５分程度置き、沈降した細胞凝集塊を残して上清を除去し、その後、新鮮な培地を添加し、穏やかに細胞凝集塊を分散させた後、再度プレート等の培養容器に細胞凝集塊分散培地を戻すことで細胞凝集塊を継続して培養することができる。この態様の維持培養工程の培養期間は特に限定されないが、３日以上７日以下が好ましい。細胞凝集塊をトロンビン受容体のアゴニストを含まない培地中で上記の条件において更に浮遊培養することにより、適切な寸法の細胞凝集塊を得ることができる。
【０１０８】
維持培養工程後は、常法により培養液を廃棄し、細胞を回収する。この時、細胞は、剥離又は分散処理によって単一の細胞として回収することが好ましい。具体的な方法については、後述の回収工程で詳述する。回収した細胞は、そのまま、又は必要に応じてバッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生食、又は培地（次の工程で使用する培地か基礎培地が好ましい）で洗浄後、次の工程に供すればよい。
【０１０９】
（回収工程）
「回収工程」は、浮遊培養工程後、及び／又は維持培養工程後の培養液から培養した細胞を回収する工程で、本発明の方法における選択工程である。
【０１１０】
本明細書において「（細胞の）回収」とは、培養液と細胞とを分離して細胞を取得することをいう。細胞の回収方法は、当該分野の細胞培養法で使用される常法に従えばよく、特に限定はしない。細胞培養方法は、一般に浮遊培養法と接着培養法に大別できる。以下、それぞれの培養方法後の細胞の回収方法について説明をする。
【０１１１】
（浮遊培養方法後の回収方法）
浮遊培養法で培養した場合、細胞は培養液中に浮遊した状態で存在する。したがって、細胞の回収は、静置状態又は遠心分離により上清の液体成分を除去することで達成できる。また、細胞の回収方法としてはフィルターや中空糸分離膜等を選択することもできる。静置状態で液体成分を除去する場合、培養液の入った容器を静置状態５分程度置き、沈降した細胞や細胞凝集塊を残して上清を除去すればよい。また遠心分離は、遠心力によって細胞がダメージを受けない回転速度と処理時間で行えばよい。例えば、回転速度の下限は、細胞を沈降できれば特に限定はされないが、例えば５００ｒｐｍ以上、８００ｒｐｍ以上、又は１０００ｒｐｍ以上であればよい。一方、上限は細胞が遠心力によるダメージを受けない、又は受けにくい速度であればよく、例えば１４００ｒｐｍ以下、１５００ｒｐｍ以下、又は１６００ｒｐｍ以下であればよい。また処理時間の下限は、上記回転速度により細胞を沈降できる時間であれば特に限定はされないが、例えば３０秒、１分、３分、又は５分であればよい。また、上限は、上記回転により細胞がダメージを受けない、又は受けにくい時間であればよく、例えば３０秒、６分、８分、又は１０分であればよい。回収した細胞は、必要に応じて洗浄することができる。洗浄方法は、限定しない。例えば前述の維持培養工程における「工程後処理」に記載の洗浄方法と同様に行えばよい。洗浄液には、バッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生食、又は培地（基礎培地が好ましい）を使用すればよい。
【０１１２】
（接着培養方法後の回収方法）
接着培養法で培養した場合、培養後、多くの細胞は培養容器や培養担体等の外部マトリクスに接着した状態で存在する。したがって、培養容器から培養液を除去するには、培養後の容器を静かに傾けて液体成分を流し出せばよい。外部マトリクスに接着した細胞が培養容器内に残るため、培養液と細胞を容易に分離することができる。
【０１１３】
その後、必要に応じて外部マトリクスに接着した細胞表面を洗浄することもできる。洗浄液には、バッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生食、又は培地（基礎培地が好ましい）を使用すればよい。ただし、これらに限定はされない。洗浄後の洗浄液は、培養液と同様の操作で除去すればよい。この洗浄ステップは、複数回繰り返してもよい。
【０１１４】
続いて、外部マトリクスに接着した細胞集団を外部マトリクスから剥離する。剥離方法は、当該分野で公知の方法で行えばよい。通常は、スクレーピング、タンパク質分解酵素を有効成分とする剥離剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、又は剥離剤とキレート剤の混合物等が使用される。
【０１１５】
スクレーピングは、スクレーパー等を用いて外部マトリクスに付着した細胞を機械的手段によって剥ぎ取る方法である。ただし機械的操作により細胞が損傷を受けやすいため、回収後の細胞をさらなる培養に供する場合には、外部マトリクスに固着している細胞の足場部分を化学的に破壊又は分解し、外部マトリクスとの接着を解除する剥離方法が好ましい。
【０１１６】
剥離方法では、剥離剤及び／又はキレート剤を使用する。剥離剤は限定しないが、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼの他、市販のＡｃｃｕｔａｓｅ（商標登録）、ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ディスパーゼ（商標登録）等を利用することができる。各剥離剤の濃度及び処理時間は、細胞の剥離又は分散で用いられる常法の範囲で使用すればよい。例えば、トリプシンの場合、溶液中の濃度の下限は、細胞を剥離できる濃度であれば特に限定はされないが、例えば０．０１％以上、０．０２％以上、０．０３％以上、０．０４％以上、０．０５％以上、０．０８％以上、又は０．１０％以上であればよい。一方、溶液中の濃度の上限は、トリプシンの作用によって細胞そのものが溶解される等の影響を受けない濃度であれば特に限定はされないが、例えば０．１５％以下、０．２０％以下、０．２５％以下、又は０．３０％以下であればよい。また処理時間は、トリプシンの濃度によって左右されるものの、その下限はトリプシンの作用によって外部マトリクスから細胞が十分に剥離される時間であれば特に限定はされず、例えば１分以上、２分以上、３分以上、４分又は５分以上であればよい。一方、処理時間の上限は、トリプシンの作用によって細胞そのものが溶解される等の影響を受けない時間であれば特に限定はされず、例えば８分以下、１０分以下、１２分以下、１５分以下、１８分以下、又は２０分以下であればよい。他の剥離剤又はキレート剤の場合も、概ね同様に行えばよい。なお、市販の剥離剤を使用する場合には、添付のプロトコルに記載の濃度及び処理時間で行うことができる。
【０１１７】
外部マトリクスから剥離した細胞は、遠心分離により剥離剤を含む上清を除去する。遠心条件は、上記「浮遊培養方法後の回収方法」と同様でよい。回収した細胞は、必要に応じて洗浄することができる。洗浄方法も上記「浮遊培養方法後の回収方法」と同様に行えばよい。
【０１１８】
本工程後に得られた細胞は、単層細胞片や細胞凝集塊等の細胞集合体を一部に包含し得る。一方、回収した細胞は、必要に応じて単一細胞化することもできる。
【０１１９】
（単一細胞化）
本明細書において「単一細胞化」とは、単層細胞片や細胞凝集塊等のように複数の細胞が互いに接着又は凝集した細胞集合体を分散させて、単一の遊離した細胞状態にすることをいう。
【０１２０】
単一細胞化は、上記の剥離方法で使用する剥離剤及び／又はキレート剤の濃度を高めにする、及び／又は剥離剤及び／又はキレート剤での処理時間を長くすればよい。例えば、トリプシンの場合、溶液中の濃度の下限は、細胞集合体を分散できる濃度であれば特に限定はされないが、例えば０．１５％以上、０．１８％以上、０．２０％以上、又は０．２４％以上であればよい。一方、溶液中の濃度の上限は、細胞そのものが溶解される等の影響を受けない濃度であれば特に限定はされないが、０．２５％以下、０．２８％以下、又は０．３０％以下であればよい。また処理時間は、トリプシンの濃度によって左右されるものの、その下限は、トリプシンの作用によって細胞集合体が十分に分散される時間であれば特に限定はされず、例えば５分以上、８分以上、１０分以上、１２分以上、又は１５分以上であればよい。一方、処理時間の上限は、トリプシンの作用によって細胞そのものが溶解される等の影響を受けない時間であれば特に限定はされず、例えば１８分以下、２０分以下、２２分以下、２５分以下、２８分以下、又は３０分以下であればよい。なお、市販の剥離剤を使用する場合には、添付のプロトコルに記載の、細胞を分散させて単一状態にできる濃度で使用すればよい。前記剥離剤及び／又はキレート剤による処理後に物理的に軽く処理することで、単一細胞化を促進できる。この物理的処理は限定しないが、例えば、細胞を溶液ごと複数回ピペッティングする方法が挙げられる。さらに、必要に応じて、細胞をストレーナーやメッシュに通過させてもよい。
【０１２１】
単一細胞化した細胞は、静置又は遠心分離により剥離剤を含む上清を除去して回収することができる。回収した細胞は、必要に応じて洗浄してもよい。遠心分離の条件や洗浄方法については上記「浮遊培養方法後の回収方法」と同様に行えばよい。
【０１２２】
＜６．細胞凝集抑制剤＞
本発明の他の一態様は、トロンビン受容体のアゴニストを含む、細胞の浮遊培養に用いるための細胞凝集抑制剤である。
【０１２３】
本発明の細胞凝集抑制剤は、浮遊培養において細胞の凝集を適度に抑制し、略均一な大きさの細胞凝集塊を形成するために用いることができる。また、本発明の細胞凝集抑制剤を用いた幹細胞の浮遊培養では、幹細胞の未分化性を維持することができる。
【０１２４】
本発明における細胞凝集抑制剤の形態は特に限定されず、トロンビン受容体のアゴニスト自体であってもよいし、トロンビン受容体のアゴニストと他の成分とを組み合わせた組成物であってもよい。前記組成物の形態は特に限定されない。前記組成物は例えば浮遊培養に用いる培地の形態であってもよいし、培地の調製時に配合される添加用組成物の形態であってもよい。
【０１２５】
本発明における細胞凝集抑制剤の好ましい実施形態は、トロンビン受容体のアゴニストを含有する培地又はリン酸緩衝液等の緩衝液である。培地中のトロンビン受容体のアゴニストの濃度としては、＜５．細胞の凝集を抑制する方法＞の欄にて浮遊培養に関して記載の培地中のトロンビン受容体のアゴニストの濃度が例示できる。
【０１２６】
本発明における細胞凝集抑制剤の別の好ましい実施形態は、トロンビン受容体のアゴニストを液状又は固形状媒体中に含有する液状又は固形状組成物である。前記液状又は固形状組成物は、浮遊培養用の培地を調製する際に添加される添加物である。この実施形態の細胞凝集抑制剤は、調製される培地中でのトロンビン受容体のアゴニストの最終濃度が、＜５．細胞の凝集を抑制する方法＞の欄にて浮遊培養に関して記載の培地中のトロンビン受容体のアゴニストの濃度となるように調製されていることが好ましい。細胞凝集抑制剤が組成物の場合、細胞凝集抑制剤に含まれるトロンビン受容体のアゴニストの濃度の下限は細胞凝集抑制剤としての効果を奏すれば特に限定されないが、例えば、トロンビン受容体のアゴニストの、浮遊培養時の培地中での好ましい濃度として挙げた前記濃度の１倍以上、２倍以上、１０倍以上、１００倍以上、１０００倍以上、１００００倍以上であり、具体的には、７．４μｇ／ｍＬ以上、３８ｍｇ／ｍＬ以下の範囲であり、下限としては、１０μｇ／ｍＬ以上、２０μｇ／ｍＬ以上、３０μｇ／ｍＬ以上、３８μｇ／ｍＬ以上、５０μｇ／ｍＬ以上、１００μｇ／ｍＬ以上、１５０μｇ／ｍＬ以上、２００μｇ／ｍＬ以上、２５０μｇ／ｍＬ以上、３００μｇ／ｍＬ以上、３５０μｇ／ｍＬ以上、３８０μｇ／ｍＬ以上であればよい。また上限としては、細胞が死滅しない濃度で、かつ溶媒に溶解可能であれば特に限定されないが、例えば、３８ｍｇ／ｍＬ以下、３０ｍｇ／ｍＬ以下、２０ｍｇ／ｍＬ以下、１０ｍｇ／ｍＬ以下、９ｍｇ／ｍＬ以下、８ｍｇ／ｍＬ以下、７ｍｇ／ｍＬ以下、６ｍｇ／ｍＬ以下、５ｍｇ／ｍＬ以下、４ｍｇ／ｍＬ以下、３．８ｍｇ／ｍＬ以下が例示できる。或いは、トロンビン受容体のアゴニストの濃度としてはまた、１０μＭ以上、５０ｍＭ以下が例示できる。前記濃度の下限としては、例えば、１０μＭ以上、２０μＭ以上、３０μＭ以上、４０μＭ以上、５０μＭ以上、１００μＭ以上、２００μＭ以上、３００μＭ以上、４００μＭ以上、５００μＭ以上、６００μＭ以上、７００μＭ以上、８００μＭ以上、９００μＭ以上、１ｍＭ以上、２ｍＭ以上、３ｍＭ以上、４ｍＭ以上、５ｍＭ以上であり、上限としては、５０ｍＭ以下、４５ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３５ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２５ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１５ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、５ｍＭ以下でも良い。トロンビン受容体のアゴニストを前記範囲の濃度で含む組成物は、他の培地成分と混合して、＜５．細胞の凝集を抑制する方法＞の欄にて浮遊培養に関して記載のトロンビン受容体のアゴニストの適切な濃度範囲の培地を調製することが容易である。
【０１２７】
細胞凝集抑制剤は、トロンビン受容体のアゴニストに加えて、添加剤として、抗生剤、リン酸化酵素阻害剤緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定化剤、界面活性剤、乳化剤、防腐剤、保存剤、抗酸化剤等も含有していても良い。抗生剤は特に限定されないが、例えばペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ等を使用することができる。リン酸化酵素阻害剤は特に限定されないが、好ましくはＲＯＣＫ阻害剤である。ＲＯＣＫ阻害剤は特に限定されないが、好ましくは前記Ｙ−２７６３２である。Ｙ−２７６３２が含まれる場合、細胞凝集抑制剤中のＹ−２７６３２の濃度は、調製される培地中でのＹ−２７６３２の最終濃度が、＜５．細胞の凝集を抑制する方法＞の欄にて浮遊培養に関して記載の培地中のＹ−２７６３２の濃度となるように調製されていることが好ましい。細胞凝集抑制剤中でのＹ−２７６３２の濃度は特に限定されないが、例えば、Ｙ−２７６３２の、浮遊培養時の培地中での好ましい濃度として挙げた前記濃度の１倍以上、２倍以上、１０倍以上、１００倍以上、１０００倍以上、１００００倍以上であり、具体的には、６．７μｇ／ｍＬ以上、１４.０ｍｇ／ｍＬ以下が例示できる。前記細胞凝集抑制剤中のＹ−２７６３２の濃度の下限は、効果を奏すれば特に限定されないが、例えば、６．７μｇ／ｍＬ以上、６７μｇ／ｍＬ以上、６７０μｇ／ｍＬ以上、１ｍｇ／ｍＬ以上、２ｍｇ／ｍＬ以上、３ｍｇ／ｍＬ以上、４ｍｇ／ｍＬ以上、５ｍｇ／ｍＬ以上、６ｍｇ／ｍＬ以上である。一方、上限は細胞が死滅しない濃度で、かつ溶媒に溶解可能であれば特に限定されないが、例えば１４.０ｍｇ／ｍＬ以下、１０ｍｇ／ｍＬ以下である。また、６．７ｍｇ／ｍＬでも良い。或いは、Ｙ−２７６３２の濃度として２０μＭ以上、４０ｍＭ以下が例示できる。前記濃度の下限は、効果を奏すれば特に限定されないが、例えば２０μＭ以上、０．２ｍＭ以上、０．３ｍＭ以上、０．４ｍＭ以上、０．５ｍＭ以上、０．６ｍＭ以上、０．７ｍＭ以上、０．８ｍＭ以上、０．９ｍＭ以上、１ｍＭ以上、２ｍＭ以上、３ｍＭ以上、４ｍＭ以上、５ｍＭ以上、６ｍＭ以上、７ｍＭ以上、８ｍＭ以上、９ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、１１ｍＭ以上、１２ｍＭ以上、１３ｍＭ以上、１４ｍＭ以上、１５ｍＭ以上、１６ｍＭ以上、１７ｍＭ以上、１８ｍＭ以上、１９ｍＭ以上、２０ｍＭ以上である。一方、上限は、例えば４０ｍＭ以下、３０ｍＭ以下である。緩衝剤としては、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン緩衝液などが挙げられる。増粘剤としては、ゼラチン、多糖類などが挙げられる。着色剤としては、フェノールレッドなどが挙げられる。安定化剤としては、アルブミン、デキストラン、メチルセルロース、ゼラチンなどが挙げられる。界面活性剤としては、コレステロール、アルキルグリコシド、アルキルポリグルコシド、アルキルモノグリセリルエーテル、グルコシド、マルトシド、ネオペンチルグリコール系、ポリオキシエチレングリコール系、チオグルコシド、チオマルトシド、ペプチド、サポニン、リン脂質、脂肪酸ソルビタンエステル、脂肪酸ジエタノールアミドなどが挙げられる。乳化剤としては、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、���ョ糖脂肪酸エステルなどが挙げられる。防腐剤としては、アミノエチルスルホン酸、安息香酸、安息香酸ナトリウム、エタノール、エデト酸ナトリウム、カンテン、dl−カンフル、クエン酸、クエン酸ナトリウム、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸フェニル、ジブチルヒドロキシトルエン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、窒素、デヒドロ酢酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、2−ナフトール、白糖、ハチミツ、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル、l−メントール、ユーカリ油などが挙げられる。保存剤としては、安息香酸、安息香酸ナトリウム、エタノール、エデト酸ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グリセリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン、Ｄ−ソルビトール、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル、プロピレングリコール、リン酸などが挙げられる。抗酸化剤としては、クエン酸、クエン酸誘導体、ビタミンＣおよびその誘導体、リコペン、ビタミンＡ、カロテノイド類、ビタミンＢおよびその誘導体、フラボノイド類、ポリフェノール類、グルタチオン、セレン、チオ硫酸ナトリウム、ビタミンＥおよびその誘導体、αリポ酸およびその誘導体、ピクノジェノール、フラバンジェノール、スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、グルタチオン還元酵素、カタラーゼ、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ、およびこれらの混合物などが挙げられる。
【０１２８】
細胞凝集抑制剤は、増殖因子を含有してもよく、好ましくはＦＧＦ２及びＴＧＦ−β１の１種以上の増殖因子を含有していることが好ましい。
【０１２９】
＜７．細胞凝集塊の製造方法、及び、それにより製造された細胞凝集塊＞
本発明の他の一態様は、３．７ｎｇ／ｍＬ以上、３．８ｍｇ／ｍＬ以下の濃度、或いは、５ｎＭ以上、５ｍＭ以下の濃度のトロンビン受容体のアゴニストを含む培地中で細胞を浮遊培養する工程を含む、細胞凝集塊の製造方法である。
【０１３０】
この方法によれば、適度な寸法の細胞凝集塊を、高収量で製造することができる。特に、細胞が幹細胞である場合、幹細胞の未分化性の維持された、適度な寸法の細胞凝集塊を、高収量で製造することができる。
【０１３１】
トロンビン受容体のアゴニスト、培地及び細胞の具体的な実施形態は既述の通りである。
【０１３２】
前記工程での培地中のトロンビン受容体のアゴニストの濃度の下限は、細胞凝集抑制剤としての効果を奏すれば特に限定されないが、例えば、３．７ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、１５ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上、２５ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、３５ｎｇ／ｍＬ以上、３７ｎｇ／ｍＬ以上、５０ｎｇ／ｍＬ以上、１００ｎｇ／ｍＬ以上、１５０ｎｇ／ｍＬ以上、２００ｎｇ／ｍＬ以上、２５０ｎｇ／ｍＬ以上、３００ｎｇ／ｍＬ以上、３５０ｎｇ／ｍＬ以上、３７０ｎｇ／ｍＬ以上、４００ｎｇ／ｍＬ以上、５００ｎｇ／ｍＬ以上、６００ｎｇ／ｍＬ以上、７００ｎｇ／ｍＬ以上、８００ｎｇ／ｍＬ以上、９００ｎｇ／ｍＬ以上、又は９２５ｎｇ／ｍＬ以上である。一方、上限は、細胞が死滅しない濃度であれば特に限定されないが、例えば３．８ｍｇ／ｍＬ以下、３ｍｇ／ｍＬ以下、２ｍｇ／ｍＬ以下、１ｍｇ／ｍＬ以下、９００μｇ／ｍＬ以下、８００μｇ／ｍＬ以下、７００μｇ／ｍＬ以下、６００μｇ／ｍＬ以下、５００μｇ／ｍＬ以下、４００μｇ／ｍＬ以下、３８０μｇ／ｍＬ以下、３００μｇ／ｍＬ以下、２００μｇ／ｍＬ以下、１００μｇ／ｍＬ以下、５０μｇ／ｍＬ以下、３８μｇ／ｍＬ以下、１５．２μｇ／ｍＬ以下である。前記工程での培地中のトロンビン受容体のアゴニストの濃度の下限は、例えば５ｎＭ以上、５０ｎＭ以上、０．１μＭ以上、０．５μＭ以上、０．６μＭ以上、０．７μＭ以上、０．８μＭ以上、０．９μＭ以上、１μＭ以上、１．２５μＭ以上、２μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、６μＭ以上、７μＭ以上、８μＭ以上、９μＭ以上、１０μＭ以上、１１μＭ以上、１２μＭ以上、１３μＭ以上、１４μＭ以上、１５μＭ以上、１６μＭ以上、１７μＭ以上、１８μＭ以上、１９μＭ以上、２０μＭ以上である。一方、上限は、例えば５ｎＭ以下、５００μＭ以下、５０μＭ以下、又は２０μＭ以下である。培地中のトロンビン受容体のアゴニストの濃度が前記範囲のとき、未分化性等に影響なく、細胞の凝集抑制作用があり、細胞凝集塊の大きさを制御することができる。
【０１３３】
前記工程の具体的な実施形態は、＜５．細胞の凝集を抑制する方法＞の欄で説明した、細胞の凝集を抑制する方法における「トロンビン受容体のアゴニストを含む培地中で細胞を浮遊培養する工程」の具体的な実施形態と同様である。
【０１３４】
本発明の他の一態様は、前記の細胞凝集塊の製造方法により製造された細胞凝集塊である。
【０１３５】
本発明のこの態様に係る細胞凝集塊は適度な寸法を有し、細胞凝集塊を構成する細胞の生細胞率が高い。また、細胞が幹細胞である場合、細胞凝集塊を構成する細胞が未分化性を維持している。
【０１３６】
本発明のこの態様に係る細胞凝集塊は、好ましくは、＜２．細胞凝集塊＞の欄に記載の特徴を備える。
【０１３７】
また、本発明の細胞凝集塊を製造する方法は、トロンビン受容体のアゴニストを含む培地中で細胞を浮遊培養する浮遊培養工程の他に、適宜任意の工程を含むことができる。前記任意の工程としては、例えば維持培養工程、細胞凝集塊の回収工程が挙げられる。さらに、前記浮遊培養は継代操作を含んでいてもよい。維持培養工程及び回収工程の好適な実施形態は、＜５．細胞の凝集を促進する方法＞の欄で説明した維持培養工程及び回収工程と同様である。
【０１３８】
＜８．細胞培養組成物＞
本発明の他の一態様は、細胞と、培地と、３．７ｎｇ／ｍＬ以上３．８ｍｇ／ｍＬ以下の濃度、或いは５ｎＭ以上５ｍＭ以下の濃度のトロンビン受容体のアゴニストとを含む、細胞培養組成物である。
【０１３９】
本発明のこの態様に係る細胞培養組成物は、細胞凝集塊を高収量で製造するために用いることができる。特に、細胞が幹細胞である場合、幹細胞の未分化性の維持された、適度な寸法の細胞凝集塊を、高収量で製造するために用いることができる。
【０１４０】
トロンビン受容体のアゴニスト、培地及び細胞の具体的な実施形態は既述の通りである。
【０１４１】
本発明のこの態様に係る細胞培養組成物中のトロンビン受容体のアゴニストの濃度の下限は、細胞凝集抑制剤としての効果を奏すれば特に限定されないが、例えば３．７ｎｇ／ｍＬ以上であり、３．７ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、１５ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上、２５ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、３５ｎｇ／ｍＬ以上、３７ｎｇ／ｍＬ以上、５０ｎｇ／ｍＬ以上、１００ｎｇ／ｍＬ以上、１５０ｎｇ／ｍＬ以上、２００ｎｇ／ｍＬ以上、２５０ｎｇ／ｍＬ以上、３００ｎｇ／ｍＬ以上、３５０ｎｇ／ｍＬ以上、３７０ｎｇ／ｍＬ以上、４００ｎｇ／ｍＬ以上、５００ｎｇ／ｍＬ以上、６００ｎｇ／ｍＬ以上、７００ｎｇ／ｍＬ以上、８００ｎｇ／ｍＬ以上、９００ｎｇ／ｍＬ以上、９２５ｎｇ／ｍＬ以上である。一方、上限は細胞が死滅しない濃度であれば特に限定されないが、例えば３．８ｍｇ／ｍＬ以下、３ｍｇ／ｍＬ以下、２ｍｇ／ｍＬ以下、１ｍｇ／ｍＬ以下、９００μｇ／ｍＬ以下、８００μｇ／ｍＬ以下、７００μｇ／ｍＬ以下、６００μｇ／ｍＬ以下、５００μｇ／ｍＬ以下、４００μｇ／ｍＬ以下、３８０μｇ／ｍＬ以下、３００μｇ／ｍＬ以下、２００μｇ／ｍＬ以下、１００μｇ／ｍＬ以下、５０μｇ／ｍＬ以下、３８μｇ／ｍＬ以下、１５．２μｇ／ｍＬ以下である。本発明のこの態様に係る細胞培養組成物中のトロンビン受容体のアゴニストの濃度の下限は、例えば、５ｎＭ以上であり、５０ｎＭ以上、０．１μＭ以上、０．５μＭ以上、０．６μＭ以上、０．７μＭ以上、０．８μＭ以上、０．９μＭ以上、１μＭ以上、１．２５μＭ以上、２μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、６μＭ以上、７μＭ以上、８μＭ以上、９μＭ以上、１０μＭ以上、１１μＭ以上、１２μＭ以上、１３μＭ以上、１４μＭ以上、１５μＭ以上、１６μＭ以上、１７μＭ以上、１８μＭ以上、１９μＭ以上、２０μＭ以上である。一方上限は、例えば５ｍＭ以下であり、５００μＭ以下、５０μＭ以下、又は２０μＭ以下である。トロンビン受容体のアゴニストの濃度が前記範囲の細胞培養組成物は、適度な寸法の細胞凝集塊を高収量で製造するために特に適している。
【０１４２】
前記細胞培養組成物から細胞凝集塊を製造する工程としては、前記細胞培養組成物中で細胞を浮遊培養する工程が挙げられる。この工程の具体的な実施形態は、＜５．細胞の凝集を抑制する方法＞の欄で説明した、細胞の凝集を抑制する方法における「トロンビン受容体のアゴニストを含む培地中で細胞を浮遊培養する工程」の具体的な実施形態と同様である。
【０１４３】
前記細胞培養組成物は、トロンビン受容体のアゴニストを培地に添加した後に細胞を添加することにより調製してもよいし、細胞を培地に混合した後にトロンビン受容体のアゴニストを添加することにより調製してもよいが、好ましくはトロンビン受容体のアゴニストを培地に添加した後に細胞を添加することにより調製する。トロンビン受容体のアゴニストを培地に添加する際、安定化剤を添加することもできる。前記安定化剤は、トロンビン受容体のアゴニストの液体培地中での安定化、活性維持、培養容器等への吸着防止等に寄与する物質であれば特に限定されないが、アルブミン等のタンパク質、乳化剤、界面活性剤、両親媒性物質、或いは、ヘパリン等の多糖類等を使用することができる。
【０１４４】
前記細胞培養組成物は、トロンビン受容体のアゴニストを含む培地（前記安定化剤をさらに含んでいても良い）を凍結して保存し、その後に解凍してから細胞を添加することにより調製してもよい。
【０１４５】
＜９．細胞培養培地＞
本発明の他の一態様は、培地と、３．７ｎｇ／ｍＬ以上３．８ｍｇ／ｍＬ以下の濃度、或いは５ｎＭ以上５ｍＭ以下の濃度のトロンビン受容体のアゴニストとを含む、細胞培養培地である。
【０１４６】
本発明のこの態様に係る細胞培養培地は、浮遊培養により細胞から細胞凝集塊を高収量で製造するための培地として用いることができる。特に、細胞が幹細胞である場合、幹細胞の未分化性の維持された、適度な寸法の細胞凝集塊を、高収量で製造するために用いることができる。
【０１４７】
トロンビン受容体のアゴニスト、培地及び細胞の具体的な実施形態は既述の通りである。
【０１４８】
本発明のこの態様に係る細胞培養培地中のトロンビン受容体のアゴニストの濃度は、例えば３．７ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、１５ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上、２５ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、３５ｎｇ／ｍＬ以上、３７ｎｇ／ｍＬ以上、５０ｎｇ／ｍＬ以上、１００ｎｇ／ｍＬ以上、１５０ｎｇ／ｍＬ以上、２００ｎｇ／ｍＬ以上、２５０ｎｇ／ｍＬ以上、３００ｎｇ／ｍＬ以上、３５０ｎｇ／ｍＬ以上、３７０ｎｇ／ｍＬ以上、４００ｎｇ／ｍＬ以上、５００ｎｇ／ｍＬ以上、６００ｎｇ／ｍＬ以上、７００ｎｇ／ｍＬ以上、８００ｎｇ／ｍＬ以上、９００ｎｇ／ｍＬ以上、９２５ｎｇ／ｍＬ以上である。一方、上限は細胞が死滅しない濃度であれば特に限定されないが、例えば３．８ｍｇ／ｍＬ以下、３ｍｇ／ｍＬ以下、２ｍｇ／ｍＬ以下、１ｍｇ／ｍＬ以下、９００μｇ／ｍＬ以下、８００μｇ／ｍＬ以下、７００μｇ／ｍＬ以下、６００μｇ／ｍＬ以下、５００μｇ／ｍＬ以下、４００μｇ／ｍＬ以下、３８０μｇ／ｍＬ以下、３００μｇ／ｍＬ以下、２００μｇ／ｍＬ以下、１００μｇ／ｍＬ以下、５０μｇ／ｍＬ以下、３８μｇ／ｍＬ以下、１５．２μｇ／ｍＬ以下、９．５μｇ／ｍＬ以下である。本発明のこの態様に係る細胞培養組成物中のトロンビン受容体のアゴニストの濃度はまた、５ｎＭ以上、５０ｎＭ以上、０．１μＭ以上、０．５μＭ以上、０．６μＭ以上、０．７μＭ以上、０．８μＭ以上、０．９μＭ以上、１μＭ以上、１．２５μＭ以上、２μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、６μＭ以上、７μＭ以上、８μＭ以上、９μＭ以上、１０μＭ以上、１１μＭ以上、１２μＭ以上、１３μＭ以上、１４μＭ以上、１５μＭ以上、１６μＭ以上、１７μＭ以上、１８μＭ以上、１９μＭ以上、２０μＭ以上である。一方上限は、例えば５ｍＭ以下、５００μＭ以下、５０μＭ以下、２０μＭ以下である。トロンビン受容体のアゴニストの濃度が前記範囲の細胞培養組成物は、適度な寸法の細胞凝集塊を高収量で製造するために特に適している。
【０１４９】
前記細胞培養培地から細胞凝集塊を製造する工程としては、前記細胞培養培地中で細胞を浮遊培養する工程が挙げられる。この工程の具体的な実施形態は、＜５．細胞の凝集を抑制する方法＞の欄で説明した、細胞の凝集を抑制する方法における「トロンビン受容体のアゴニストを含む培地中で細胞を浮遊培養する工程」の具体的な実施形態と同様である。
【０１５０】
前記細胞培養培地は、使用前まで凍結して保存し、使用時に解凍して使用することができる。
【実施例】
【０１５１】
＜実施例１．ヒトｉＰＳ細胞の維持培養＞
ヒトｉＰＳ細胞として、ＴｋＤＮ４−Ｍ株（東京大学医科学研究所）を使用した。Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）をコートした細胞培養用ディッシュ上にヒトｉＰＳ細胞を播種し、培地はＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８ＴＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用して維持培養した。継代時の細胞剥離剤としては、Ａｃｃｕｔａｓｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いた。また、細胞播種時のみ、Ｙ−２７６３２（和光純薬工業株式会社）を１０μＭの濃度になるように培地に添加した。培地交換は毎日実施した。実験には継代数５０回までのヒトｉＰＳ細胞を使用した。【０１５２】
＜実施例２．細胞凝集アッセイによる凝集抑制効果の確認＞
トロンビン受容体のアゴニスト添加による細胞の凝集抑制効果について検討した。【０１５３】
（方法）
実施例１の手順で培養したヒトｉＰＳ細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで３から５分間処理して剥離し、単細胞まで分散した。この細胞を最終濃度５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（和光純薬工業株式会社）及び１０μＭのＹ−２７６３２（和光純薬工業株式会社）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８ＴＭ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して細胞数を調べた。１ｍＬあたり２×１０５個の細胞を含むように調製した。別途トロンビン受容体のアゴニスト（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ６；ＴＲＡＰ−６、ＡＮＡＳＰＥＣ、ＡＳ−２４１９１）を最終濃度３．７４ｍｇ／ｍＬ（１０ｍＭ）になるように細胞凝集抑制剤を調整し、前記調整した細胞凝集抑制剤を前記細胞懸濁液にトロンビン受容体のアゴニストの最終濃度が２μＭ、１０μＭ、又は５０μＭとなるように添加した上で、浮遊培養用１２ウェルプレート（住友ベークライト株式会社）に１．３ｍＬ／ウェルの割合で播種した。細胞を播種したプレートは、ロータリーシェーカー（株式会社オプティマ）上で９０ｒｐｍのスピードで水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回培養し、５％ＣＯ２、３７℃の環境下で浮遊培養を行った。培養を開始して翌日（培養１日目）に位相差顕微鏡にて画像を取得した。コントロール試験として、Ｙ−２７６３２及びＴＲＡＰ−６を添加していない以外は上記と同様に調製した細胞懸濁液を用いた条件での試験を行った。【０１５４】
（結果）
上記浮遊培養後（培養１日目）の顕微鏡観察像を図１に示す。観察の結果、コントロール試験（０μＭ  Ｙ−２７６３２、０μＭ  ＴＲＡＰ−６）では凝集塊が形成されず、単一細胞のままであったが、Ｙ−２７６３２を加えた場合には凝集塊が形成された。一方、Ｙ−２７６３２及びＴＲＡＰ−６（最終濃度２μＭ又は１０μＭ又は５０μＭ）を添加した条件では凝集塊が形成されたが、Ｙ−２７６３２のみを加えた場合に比べて、凝集が抑制され、より小さな凝集塊が形成された。【０１５５】
＜実施例３．ＴＲＡＰ−６存在条件での凝集塊形成後の細胞増殖能、未分化能への影響＞
ヒトｉＰＳ細胞の浮遊培養を行いグルコース消費量、細胞収量、未分化マーカーの陽性率を測定し、ＴＲＡＰ−６が与える細胞への影響を解析した。【０１５６】
（方法）
実施例２と同様に細胞懸濁液を調製し、別途ＴＲＡＰ−６（同上）を最終濃度３．７４ｍｇ／ｍＬ（１０ｍＭ）になるように細胞凝集抑制剤を調整し、前記調整した細胞凝集抑制剤を前記細胞懸濁液にトロンビン受容体のアゴニストの最終濃度が５μＭとなるように添加した上で、浮遊培養用６ウェルプレート（住友ベークライト株式会社）に４ｍＬ／ウェルの割合で播種した。細胞を播種したプレートは、ロータリーシェーカー（株式会社オプティマ）上で７５ｒｐｍのスピードで水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回培養し、５％ＣＯ２、３７℃の環境下で浮遊培養を行った。培養翌日（培養１日目）以降、毎日新鮮な培地（最終濃度５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（和光純薬工業株式会社）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８ＴＭ培地）に培地交換し、培養５日目まで培養を続けた。コントロール試験として、ＴＲＡＰ−６を添加していない以外は上記と同様に調製した細胞懸濁液を用いた条件での試験を行った。培養中、毎日位相差顕微鏡により画像を取得とした。培地交換時に回収した培養上清に含まれるグルコースの濃度を、バイオセンサーＢＦ−５ｉＤ（王子計測機器株式会社）で測定し、グルコース消費量を計算した。【０１５７】
また、培養５日目に細胞凝集塊を回収し、Ａｃｃｕｔａｓｅにより分散後、５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８ＴＭ培地で懸濁した。この細胞懸濁液の一部をトリパンブルー染色して細胞数を調べた。上記細胞懸濁液を３００ｇで３分間遠心分離後、上清を取り除き、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で細胞を洗浄した。その後、４％パラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社）により室温で２０分間固定後、ＰＢＳで３回洗浄し、３００μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁後、ボルテックスで攪拌しながら冷メタノール３ｍＬを添加し、−２０℃で一晩以上透過処理を行った。３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳで３回洗浄後、３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳにより細胞を再懸濁して室温で３０分から１時間ブロッキングした。その後、蛍光標識抗ＳＯＸ２抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．６５６１１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）及び蛍光標識抗ＯＣＴ４抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．６５３７０３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）及び蛍光標識抗Ｎａｎｏｇ抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．６７４０１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）により４℃で３０分から１時間染色した。３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳで１回洗浄後、セルストレーナーに通過させた細胞をＦＡＣＳＶｅｒｓｅにて解析した。コントロール試験として、上記３種の抗体（蛍光標識済抗ＳＯＸ２抗体、蛍光標識抗ＯＣＴ４抗体、蛍光標識抗Ｎａｎｏｇ抗体）の代わりに上記３種の各抗体に対応した３種の蛍光標識済アイソタイプコントロール抗体（Ｃａｔ.Ｎｏ.４００１２９、Ｃａｔ.Ｎｏ.４００３１４、Ｃａｔ.Ｎｏ.４００１３６；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を反応させた以外は同様に処理した細胞を用いた。【０１５８】
また、培養５日目に細胞収量を測定した。細胞収量の測定は次の手順で行った。すなわち、形成した細胞凝集塊をＡｃｃｕｔａｓｅで５から１０分処理し、ブルーチップでのピペッティングによって細胞を単分散させ、トリパンブルー染色した後、血球計算盤を用いて細胞数を係数し、細胞収量を測定した。【０１５９】
（結果）
図２は培養１から５日目に観察した顕微鏡写真である。播種後から培養１日目にかけて細胞凝集塊が形成されており、ＴＲＡＰ−６を添加するとより小さな凝集塊が形成された。培養を継続することで徐々に細胞が増殖し、細胞凝集塊が大きくなった。【０１６０】
グルコース消費量を図３に、培養５日目の細胞収量を図４にそれぞれ示す。グルコース消費量はＴＲＡＰ−６を添加した条件ではＴＲＡＰ−６を添加していない条件に比べて消費量がより多く、細胞が増殖していることが示唆され、培養５日目には播種細胞数（８×１０５個／ウェル）の８．５倍に増殖していることが明らかになった。【０１６１】
未分化マーカーの陽性率の測定結果を図５示す。ＴＲＡＰ−６を含む培地で細胞凝集塊を作製し、その後も浮遊培養にて増殖した細胞において、マーカーであるＳＯＸ２陽性細胞が９９％以上、ＯＣＴ４陽性細胞が９８％以上、Ｎａｎｏｇ陽性細胞が９９％以上であり、Ｙ−２７６３２及びＴＲＡＰ−６添加によって形成されたヒトｉＰＳ細胞の凝集塊は未分化性を維持していることが確認された。【０１６２】
＜実施例４．細胞凝集アッセイによる凝集抑制効果の確認２＞
（方法）
実施例１の手順で培養したヒトｉＰＳ細胞を用いて実施例２と同様に細胞懸濁液を調製し、ＴＲＡＰ−６の代わりに最終濃度３２．８μＭとなるようにＰＡＲ−１アゴニスト（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１；ＰＡＲ−１アゴニスト、ＡＮＡＳＰＥＣ、ＡＳ−６２９３７、ＴＦＬＬＲＮ（配列番号８）に示すアミノ酸配列からなり、Ｃ末端がアミド化されたペプチド）又は最終濃度０．８μｇ／ｍＬとなるようにＳ１Ｐ（Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−1−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｃａｙｍａｎ、６２５７０）（陽性対照）を添加し、実施例２と同様に浮遊培養及び画像取得を行った。【０１６３】
（結果）
上記浮遊培養後（培養１日目）の顕微鏡観察像を図６に示す。観察の結果、コントロール試験（０μＭ  Ｙ−２７６３２、０μＭ  ＰＡＲ−１アゴニスト）では凝集塊が形成されず、単一細胞のままであったが（データ示さず）、Ｙ−２７６３２を加えた場合には凝集塊が形成された（図６、陰性対照）。一方、Ｙ−２７６３２に加えてＰＡＲ−１  アゴニスト（最終濃度３２．８μＭ）又はＳ１Ｐ（０．８μｇ／ｍＬ、陽性対照）を添加した条件でも凝集塊が形成されたが、Ｙ−２７６３２のみを加えた場合に比べて、凝集が抑制され、より小さな凝集塊が形成された。【０１６４】
＜実施例５．定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析＞
ヒトｉＰＳ細胞（ＴｋＤＮ４−Ｍ株、２０１Ｂ７株、ＲＰＣｈｉＰＳ７７１−２株）におけるＰＡＲ遺伝子（ＰＡＲ１およびＰＡＲ２）の発現を調べた。【０１６５】
（方法）
ヒトｉＰＳ細胞として、ＴｋＤＮ４−Ｍ株（東京大学医科学研究所）、２０１Ｂ７株（京都大学）、又はＲＰＣｈｉＰＳ７７１−２株（株式会社リプロセル）を使用した。これらのヒトｉＰＳ細胞を実施例１に記載の方法で培養した。その後、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）およびＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）により単離・精製し、ＲｅｖｅｒＴｒａ  ＡｃｅＴＭ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡株式会社）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＫＯＤ  ＳＹＢＲＴＭ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（東洋紡株式会社）を使い、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ７  Ｆｌｅｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）により定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した。検出はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎによるインターカレーション法で、遺伝子発現量の比較にはハウスキーピング遺伝子（β−Ａｃｔｉｎ）を内部標準としたΔＣｔ値の比較による相対定量法で行った。多能性幹細胞の未分化マーカー遺伝子であるＳＯＸ２を遺伝子発現の陽性対照として使用した。【０１６６】
定量的ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーの塩基配列は次のとおりである。
β-Actin-F: CCTCATGAAGATCCTCACCGA（配列番号１５）
β-Actin-R: TTGCCAATGGTGATGACCTGG（配列番号１６）
PAR1-F: GAAGTCCCGGGCTTTGTTCC（配列番号１７）
PAR1-R: TGGCACTCAGAGGAAGCGTAA（配列番号１８）
PAR2-F: GGCCCTCAGAGATGATCAGTC（配列番号１９）
PAR2-R: GTCTCGAACTCCTGACCTCAAG（配列番号２０）
SOX2-F: CACCAATCCCATCCACACTCAC（配列番号２１）
SOX2-R: GCAAAGCTCCTACCGTACCAC（配列番号２２）【０１６７】
（結果）
上記の定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を図７および図８に示す。ヒトｉＰＳ細胞（ＴｋＤＮ４Ｍ株）において、ＰＡＲ１およびＰＡＲ２は、未分化マーカー遺伝子であるＳＯＸ２と同様のレベルで発現していた（図７）。また、用いた３つのヒトｉＰＳ細胞の全てにおいて、ＰＡＲ１およびＰＡＲ２が発現していることが明らかになった（図８）。【０１６８】
＜実施例６．細胞凝集塊のサイズ分布＞
（方法）
実施例３に従ってＴＲＡＰ−６存在で浮遊培養した細胞について、培養１日目に取得した画像中の２１０個の細胞凝集塊を観察し、顕微鏡写真のスケールと比較して各細胞凝集塊の最も広い部分の幅（「φ」とする）を求め、その分布を調べ、平均値±標準偏差を算出した。【０１６９】
（結果）
図９は、培養１日目の細胞凝集塊サイズ（直径）の分布図である。また以下の表１に、培養１日目のサイズ別の細胞凝集塊の個数およびその割合を示す。【０１７０】
培養１日目の細胞凝集塊のサイズ（直径）の平均値±標準偏差を算出した結果、１６７．８±３５．３μｍであった。【０１７１】
また、細胞凝集塊全個数に対する、細胞凝集塊サイズ（直径）が４０μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は１００％であった。また、前記細胞凝集塊サイズ（直径）が６０μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は１００％であった。また、前記細胞凝集塊のサイズ（直径）が８０μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は９８．０％であった。また、前記細胞凝集塊のサイズ（直径）が１００μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は９７．０％であった。
【表１】
2019131941.tif 000004
【０１７２】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2019131941.tif 000005
【図２】
2019131941.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
2019131941.tif 000009
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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