(57)【要約】真珠核及び外套膜ピースからなる群から選択される少なくとも１つが、１個以上のアミノ酸で分離されていてもよいＧＸＹトリプレットの繰り返し配列、及び１個以上のＲＧＤモチーフを含み、多分散度が２０未満であるタンパク質により被覆されている、真珠養殖用材料及び上記タンパク質を含むコーティング用組成物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真珠核及び外套膜ピースからなる群から選択される少なくとも１つが、１個以上のアミノ酸で分離されていてもよいＧＸＹトリプレットの繰り返し配列、及び１個以上のＲＧＤモチーフを含み、多分散度が２０未満であるタンパク質により被覆されている、真珠養殖用材料。
【請求項２】
ゲル浸透クロマトグラフィー法による前記タンパク質の重量平均分子量が、３０ｋＤａ〜２００ｋＤａである、請求項１に記載の真珠養殖用材料。
【請求項３】
前記タンパク質が、コラーゲンのアミノ酸配列の少なくとも一部を含む、請求項１又は請求項２に記載の真珠養殖用材料。
【請求項４】
前記コラーゲンのアミノ酸配列が、Ｉ型コラーゲンα１のアミノ酸配列である、請求項３に記載の真珠養殖用材料。
【請求項５】
１個以上のアミノ酸で分離されていてもよいＧＸＹトリプレットの繰り返し配列、及び１個以上のＲＧＤモチーフを含み、多分散度が２０未満であるタンパク質を含む、真珠核及び外套膜ピースから選択される少なくとも１つをコーティングするためのコーティング用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、真珠養殖用材料及びコーティング用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
真珠は、真珠を生産し得る母貝の体内に、外套膜の小片及び真珠核を挿入し、真珠核の表面に真珠質を分泌させることにより作製できる。高品質な真珠を得ることを目的として、様々な技術が提案されている。
例えば、比重２．３〜２．７でかつ溶出物の少ないプラスチックを主体とする球の表面を不溶化したコラーゲンを主体とする皮膜で被覆したことを特徴とする養殖真珠用母核が開示されている（例えば、実開昭５０−７５９９７号公報参照）。
また、真珠貝に無毒であり、且つカルシウム結晶よりも拒絶性の弱い細胞足場性有機物質で養殖用核の表面を被覆してなることを特徴とする真珠養殖用核が開示されている（例えば、特開平１−１４８１３５号公報参照）。
また、真珠養殖用母貝の外套膜切片の処理に使用される真珠養殖用細胞賦活剤であって、分子中にＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を有し、かつ細胞接着活性並びに細胞賦活活性を有する人工のポリペプチドを含有することを特徴とする真珠養殖用外套膜細胞賦活剤が開示されている（例えば、特開平５−２３６８４８号公報参照）。
また、挿入核に用いる外套膜切片を天然由来のビトロネクチンにより処理することを特徴とする真珠核の処理方法が開示されている（例えば、特開平７−１３２０３２号公報参照）。
また、表面が正電荷を帯びたことを特徴とする真珠核が開示されている（例えば、国際公開第２０１５／０３３９７２号参照）。
また、ピース貝の外とう膜から得られるピースと真珠核とを母貝に移殖して真珠を養殖する真珠の養殖方法において、ピースとして、外とう膜の上皮組織から上皮細胞を分離し、この分離した上皮細胞を生体外で人工培養したものを用いるようにしたことを特徴とする真珠の養殖方法が開示されている（例えば、特開２００６−３０４６２８号公報参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、実開昭５０−７５９９７号公報、特開平１−１４８１３５号公報、特開平５−２３６８４８号公報、特開平７−１３２０３２号公報、国際公開第２０１５／０３３９７２号及び特開２００６−３０４６２８号公報の存在にかかわらず、高品質な真珠の得率は十分に高いとはいえず、高品質な真珠の得率を向上させるという課題は依然として存在する。【０００４】
また、真珠を製造する際には、真珠を生産し得る母貝の体内に、外套膜ピース（外套膜の小片）及び真珠核を挿入（挿核）する必要があるが、実開昭５０−７５９９７号公報、特開平１−１４８１３５号公報、特開平５−２３６８４８号公報、特開平７−１３２０３２号公報及び国際公開第２０１５／０３３９７２号に記載されている真珠核又は外套膜ピースを被覆するタンパク質は、粘着性が高いため、母貝に挿核する際の操作性が悪く、挿核作業の効率を低下させるという問題がある。【０００５】
上記に鑑み、本発明の一実施形態が解決しようとする課題は、高品質な真珠の得率を向上させ、かつ、母貝への挿核の操作性に優れる真珠養殖用材料及び真珠養殖用材料を作製するためのコーティング用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するための具体的手段には、以下の態様が含まれる。
＜１＞  真珠核及び外套膜ピースからなる群から選択される少なくとも１つが、１個以上のアミノ酸で分離されていてもよいＧＸＹトリプレットの繰り返し配列、及び１個以上のＲＧＤモチーフを含み、多分散度が２０未満であるタンパク質により被覆されている、真珠養殖用材料。
＜２＞  ゲル浸透クロマトグラフィー法によるタンパク質の重量平均分子量が、３０ｋＤａ〜２００ｋＤａである、＜１＞に記載の真珠養殖用材料。
＜３＞  タンパク質が、コラーゲンのアミノ酸配列の少なくとも一部を含む、＜１＞又は＜２＞に記載の真珠養殖用材料。
＜４＞  コラーゲンのアミノ酸配列が、Ｉ型コラーゲンα１鎖のアミノ酸配列である、＜３＞に記載の真珠養殖用材料。
＜５＞  １個以上のアミノ酸で分離されていてもよいＧＸＹトリプレットの繰り返し配列、及び１個以上のＲＧＤモチーフを含み、多分散度が２０未満であるタンパク質を含む、真珠核及び外套膜ピースから選択される少なくとも１つをコーティングするためのコーティング用組成物。
【発明の効果】
【０００７】
本開示によれば、高品質な真珠の得率を向上させ、かつ、母貝への挿核の操作性に優れる真珠養殖用材料及び真珠養殖用材料を作製するためのコーティング用組成物を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本開示において、「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を意味する。本開示に段階的に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
【０００９】
本開示において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合は、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【００１０】
本開示において、「ペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合して形成される化合物の総称をいう。
本開示において、「ポリペプチド」とは、１０個以上のアミノ酸がペプチド結合して形成される化合物の総称をいう。アミノ酸が１０個以上である場合、「ペプチド」と「ポリペプチド」とは、同義的に使用することができる。
本開示において、「タンパク質」とは、分子量が５０００以上のポリペプチドをいう。分子量が５０００以上の場合、「タンパク質」と「ポリペプチド」とは、同義的に使用することができる。
本開示において、タンパク質の重量平均分子量（Ｍｗ）及び数平均分子量（Ｍｎ）は、Ｄａ（ダルトン）を単位として表される。
本開示において真珠核とは、外套膜ピースと共に真珠貝中に挿核されることにより、外套膜の上皮細胞から分泌された炭酸カルシウムを主成分とする真珠質による真珠層がその表面に形成される材料をいう。その大きさは目的とする真珠のサイズに応じて適宜選択すればよく、例えば４ｍｍ〜１０ｍｍの球状材料である。材質としては、典型的には、淡水二枚貝の貝殻物質であり、淡水二枚貝としてはガマノセガイ属（Genus Lamprotula）、ピッグトウ貝（Fusconaia flava）、ニガーヘッド貝（Fusconaia ebenus）などが挙げられる。
本開示において外套膜ピースとは、真珠核と共に真珠貝中に挿核されることにより、そこに含まれる外套膜の上皮細胞から炭酸カルシウムを主成分とする真珠質を分泌し、真珠層を真珠核の表面に形成する、貝の外套膜小片をいう。外套膜ピースを作製するために用いられる貝としては、アコヤ貝などが挙げられる。外套膜ピースの大きさは真珠核のサイズに応じて適宜選択すればよいが、例えば、２ｍｍ〜４ｍｍ角程度の大きさである。
【００１１】
本開示において、タンパク質の重量平均分子量及び数平均分子量は、東ソー株式会社製のＧＰＣ装置（ＨＬＣ−８２２０ＧＰＣ）を用いて下記の条件下でゲル浸透クロマトグラフィー法により測定し、プルラン換算分子量として求められる値である。測定対象タンパク質の水溶液を（凍結標品については解凍後）、４０℃で３０分加熱して完全に溶解させ、測定対象タンパク質の濃度が０．２質量％となるように１００ｍＭのリン酸緩衝液で希釈し、その後０．４５μｍフィルターで濾過して試料溶液を作成する。この試料溶液を上記ＧＰＣ装置を用いて測定して、重量平均分子量及び数平均分子量を得る。
［ＧＰＣ測定条件］
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＧＳ−６２０  ７Ｇ−ｐ  内径７．５ｍｍ  長さ５０ｃｍ（昭和電工株式会社製）
溶離液：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．９）
流速：サンプル：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、リファレンス：０．１ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度（設定）：４０℃
注入量：１００μＬ
検出器：ＲＩ／ＵＶ  （２１０ｎｍ）
分子量較正用のタンパク質：プルラン（昭和電工株式会社製  Ｓｈｏｄｅｘ  Ｐ−８２）
【００１２】
本開示において、「タック性」とは、真珠養殖用材料を挿核する際の作業性との関係で使用される「粘着性」又は「ベタつき」を意味する。
【００１３】
＜真珠養殖用材料＞
本開示の真珠養殖用材料は、真珠核及び外套膜ピースからなる群から選択される少なくとも１つが、１個以上のアミノ酸で分離されていてもよいＧＸＹトリプレットの繰り返し配列、及び１個以上のＲＧＤモチーフを含み、多分散度が２０未満であるタンパク質により被覆されている。
真珠は、真珠を生産し得る母貝の体内に、外套膜ピース及び真珠核を挿入し、核の表面に真珠質を分泌させることにより作製できる。高品質な真珠を得ることを目的として、様々な技術が提案されているが、高品質な真珠の得率は十分に高いとはいえない。
また、真珠を製造する際には、真珠を生産し得る母貝の体内に、外套膜ピース及び真珠核を挿入する必要がある。これに関連して、従来の技術では、特定のタンパク質又はポリペプチドで被覆された外套膜ピース又は真珠核が開示されているものの、これらの外套膜ピース又は真珠核を被覆しているタンパク質又はポリペプチドは粘着性が高いため、母貝に挿核する際の操作性に劣り、作業効率を低下させるという問題がある。
これに対し、本開示によれば、高品質な真珠の得率を向上させ、かつ、母貝への挿核の操作性に優れる真珠養殖用材料を提供することができる。その理由は明らかではないものの、以下のように推察される。すなわち、本開示の真珠核及び外套膜ピースからなる群から選択される少なくとも１つを被覆するタンパク質には、細胞接着に関与するＲＧＤモチーフが１個以上含まれることにより、挿核後における真珠核の表面への外套膜細胞の伸展が促進されることで、シミ等の少ない高品質な真珠が生成されると考えられる。また、本開示の真珠核及び外套膜ピースからなる群から選択される少なくとも１つを被覆するタンパク質は、１個以上のアミノ酸で分離されていてもよいＧＸＹトリプレットの繰り返し配列を含むことで生体親和性が高いコラーゲンタンパク質に類似した構造を有し、タンパク質により被覆される真珠核及び外套膜ピースからなる群から選択される少なくとも１つを挿核した場合に高品質な真珠の得率が向上することになると考えられる。更に、真珠核及び外套膜ピースからなる群から選択される少なくとも１つを被覆するタンパク質は、多分散度が２０未満であり、極めて単一性の高い高分子であるため、母貝中で真珠核と外套膜組織との間の生体組織レベルでの相互作用を均等にすることができ、これにより良質真珠の得率向上の効果を発現させることができると考えられる。また、真珠核及び外套膜ピースからなる群から選択される少なくとも１つを被覆するタンパク質は、多分散度が２０未満であり、極めて単一性の高い高分子であるため、タンパク質分子間における極性親水基同士の結合の方が、極性親水基と水分子との間の分子間相互作用による結合よりも優先的に形成され、これにより、タック性の主因である空気中の水分による吸湿（すなわち、水との分子間相互作用）が阻害され、挿核時の操作性が良好になると考えられる。
【００１４】
（タンパク質）
本開示のタンパク質は、１個以上のアミノ酸で分離されていてもよいＧＸＹトリプレットの繰り返し配列、及び１個以上のＲＧＤモチーフを含み、多分散度が２０未満である。
【００１５】
本開示のタンパク質の重量平均分子量は、好ましくは３０ｋＤａ（キロダルトン）〜２００ｋＤａであり、より好ましくは３０ｋＤａ〜１００ｋＤａであり、更に好ましくは４０ｋＤａ〜７５ｋＤａであり、最も好ましくは５０ｋＤａ〜６０ｋＤａである。本開示のタンパク質の重量平均分子量が上記範囲内であると、タンパク質は水への良好な溶解性を有しながらも、過剰な吸湿による潮解が抑制される。
【００１６】
本開示のタンパク質の数平均分子量は、好ましくは１５ｋＤａ〜１００ｋＤａであり、より好ましくは２０ｋＤａ〜８０ｋＤａであり、更に好ましくは３０ｋＤａ〜６０ｋＤａであり、最も好ましくは４０ｋＤａ〜５０ｋＤａである。本開示のタンパク質の数平均分子量が上記範囲内であると、タンパク質は水への良好な溶解性を有しながらも、過剰な吸湿による潮解が抑制される。
【００１７】
−多分散度−
本開示において、タンパク質の多分散度とは、重量平均分子量（Ｍｗ）を数平均分子量（Ｍｎ）で割った値（Ｍｗ／Ｍｎ）である。
タンパク質は、多分散度が２０未満であり、好ましくは多分散度が１０未満であり、より好ましくは多分散度が５未満であり、更に好ましくは多分散度が２未満である。本開示のタンパク質の多分散度が上記範囲であることにより、母貝中で真珠核と外套膜組織との間の生体組織レベルでの相互作用を均等にすることができ、そのことにより良質真珠の得率向上の効果を発現させることができると考えられる。また、タンパク質分子間における極性親水基同士の結合の方が、極性親水基と水分子との間の分子間相互作用による結合よりも優先的に形成されることにより、タック性の主因である空気中の水分による吸湿を阻害し、挿核時の操作性に優れると考えられる。
【００１８】
−ＧＸＹトリプレット−
本開示において、「ＧＸＹトリプレット」とは、Ｎ末端側からＣ末端側にかけて「Ｇ（グリシン）」、「Ｘ（Ｇ以外の任意のアミノ酸）」、及び「Ｙ（Ｇ以外の任意のアミノ酸）」の３個のアミノ酸が存在するアミノ酸配列の単位をいい、ここで「Ｘ」及び「Ｙ」は、それぞれ独立に、Ｇ以外の任意のアミノ酸である。「Ｘ」もしくは「Ｙ」は、「Ｐ（プロリン）」あるいは「４−ヒドロキシプロリン」である傾向が高い。
本開示のタンパク質のアミノ酸配列全長に対して、ＧＸＹトリプレットが占める領域の割合（総割合）は、アミノ酸残基数基準で、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがいっそう好ましく、９０％以上であることがよりいっそう好ましく、９５％以上であることが特に好ましい。また、ＧＸＹトリプレットは本開示のタンパク質のアミノ酸配列全長にわたって繰り返されていてもよい。
ＧＸＹトリプレットが存在することで、本開示のタンパク質は、生体親和性が高いコラーゲンタンパク質に類似した構造を有する。このため、タンパク質により被覆される真珠核及び外套膜ピースからなる群から選択される少なくとも１つを挿核した場合に高品質な真珠の得率が向上することになると考えられる。
【００１９】
本開示において、「ＧＸＹトリプレット」同士は、ＧＸＹトリプレットの間にアミノ酸を含まずに直列的に連結していてもよく、ＧＸＹトリプレットの間に１個以上のアミノ酸（アミノ酸残基）が含まれていてもよい。好ましくは、「ＧＸＹトリプレット」同士は、ＧＸＹトリプレットの間にアミノ酸を含まずに直列的に連結している。
【００２０】
−ＲＧＤモチーフ−
本開示において、「ＲＧＤモチーフ」とは、Ｎ末端側からＣ末端側にかけて「Ｒ（アルギニン）」、「Ｇ（グリシン）」、及び「Ｄ（アスパラギン酸）」の３個のアミノ酸が存在するモチーフをいう。「ＲＧＤモチーフ」は、細胞接着に関与することから、本開示のタンパク質を真珠核又は外套膜ピースの表面に有する真珠養殖用材料を挿核することにより、真珠核の表面への外套膜細胞の伸展が促進され、シミ等の少ない高品質な真珠が生成されると考えられる。
なお、タンパク質との関係において使用される「モチーフ」とは、機能的又は構造的に特徴を有するアミノ酸配列をいう。
【００２１】
本開示のタンパク質において、「ＲＧＤモチーフ」は、１個〜１００個含まれてよく、好ましくは５個〜７５個含まれてよく、より好ましくは１０個〜５０個含まれてよく、更に好ましくは１０個〜２５個含まれてよい。
また、「ＲＧＤモチーフ」は、本開示のタンパク質の構成アミノ酸１０個〜１００個につき１個の割合で含まれていることが好ましく、本開示のタンパク質の構成アミノ酸２０個〜７５個につき１個の割合で含まれていることがより好ましく、本開示のタンパク質の構成アミノ酸３０個〜６０個につき１個の割合で含まれていることが更に好ましく、本開示のタンパク質の構成アミノ酸４５個〜５５個につき１個の割合で含まれていることが最も好ましい。
ＲＧＤモチーフが本開示のタンパク質に上記範囲で含まれることにより、細胞接着促進能が好ましい範囲となり、高品質な真珠の生成に寄与することができる。
【００２２】
「ＧＸＹトリプレット」と「ＲＧＤモチーフ」とは、重畳的に存在し得る。すなわち、ＧＸＹトリプレットの１番目のＧは、ＲＧＤモチーフの２番目のＧであってもよい。
【００２３】
本開示のタンパク質は、好ましくは、コラーゲンのアミノ酸配列の少なくとも一部を含む。より好ましくは、本開示のタンパク質は、コラーゲンのコラーゲンドメイン（すなわち、三本鎖へリックスを形成するドメイン）のアミノ酸配列を含む。ここで、コラーゲンドメインには、１個以上のアミノ酸で分離されていてもよいＧＸＹトリプレットの繰り返し配列、及び１個以上のＲＧＤモチーフが含まれる。
本開示のタンパク質のアミノ酸配列全長に対して、コラーゲンのアミノ酸配列（たとえば配列番号１のアミノ酸配列）由来の領域が占める領域の割合（総割合）は、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがいっそう好ましく、９０％以上であることがよりいっそう好ましく、９５％以上であることが特に好ましい。
コラーゲンは、任意の生物種由来であってよい。コラーゲンは、ウシ、ブタ、又はヒト由来であることが好ましく、ヒトに由来することがより好ましい。
【００２４】
コラーゲンは、任意の型のコラーゲンであってよい。例えば、コラーゲンとしては、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、ＶＩＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン、ＸＩＩ型コラーゲン、ＸＩＩＩ型コラーゲン、ＸＩＶ型コラーゲン、ＸＶ型コラーゲン、ＸＶＩ型コラーゲン、ＸＶＩＩ型コラーゲン、ＸＶＩＩＩ型コラーゲン、ＸＩＸ型コラーゲン、ＸＸ型コラーゲン、ＸＸＩ型コラーゲン、ＸＸＩＩ型コラーゲン、ＸＸＩＩＩ型コラーゲン、ＸＸＩＶ型コラーゲン、ＸＸＶ型コラーゲン、ＸＸＶＩ型コラーゲン、ＸＸＶＩＩ型コラーゲン、又はＸＸＶＩＩＩ型コラーゲンなどが挙げられる。
上記コラーゲンのアミノ酸配列は、存在する場合、そのコラーゲンを構成する複数種のポリペプチドのうちの任意の亜型のアミノ酸配列であってよい。例えば、Ｉ型コラーゲンの場合、Ｉ型コラーゲンα１鎖のアミノ酸配列又はＩ型コラーゲンα２鎖のアミノ酸配列であってよく、Ｖ型コラーゲンの場合、Ｖ型コラーゲンα１鎖のアミノ酸配列、Ｖ型コラーゲンα２鎖のアミノ酸配列又はＶ型コラーゲンα３鎖のアミノ酸配列であってよい。
本開示において、コラーゲンのアミノ酸配列は、Ｉ型コラーゲンのアミノ酸配列であることが好ましく、Ｉ型コラーゲンα１鎖のアミノ酸配列であることがより好ましい。
【００２５】
タンパク質は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列から構成されるポリペプチドである。
【００２６】
真珠核及び外套膜ピースからなる群から選択される少なくとも１つを被覆するタンパク質は、１種のポリペプチドであってよく、２種以上のポリペプチドの組み合わせであってもよい。
【００２７】
コラーゲンは牛皮、ブタ皮又は魚皮などに含まれているが、水などの一般に使用される溶媒には不溶性である。このため、コラーゲンを抽出しようとした場合、タンパク質加水分解酵素を使用したり、加熱によりゼラチン化させることになり、幅広い分子量のタンパク質分子が生じる。例えば、通常、市販ゼラチンは、数万〜数百万の分子量分布を有している。このため、天然のコラーゲンを一般的な方法で抽出しても、多分散度が２０未満とはならない。
【００２８】
ある実施形態においては、本開示のタンパク質は、牛皮、ブタ皮、又は魚皮といった天然のコラーゲン源から抽出したコラーゲンを、サイズ排除クロマトグラフィーなどの分画方法を使用して、特定の分子量範囲にあるタンパク質分子のみを分離精製することにより得ることができる。別の実施形態においては、本開示のタンパク質は、ＧＸＹトリプレットの繰り返し配列を含み、１個以上のＲＧＤモチーフを含むタンパク質の遺伝子を導入した組換え細胞により生産させることで得ることができる。この場合、タンパク質の遺伝子を導入する宿主細胞としては大腸菌などの細菌の細胞、Ｓ．Ｃｅｒｖｉｓｉａｅなどの酵母の細胞、又はカイコなどの昆虫の細胞を用いることができる。発現ベクターは宿主と導入するタンパク質のサイズに応じて適切なベクターを公知のベクターから選択して用いればよい。組換え細胞により生産させた場合には、分子量の均一性の高いタンパク質を得ることができる。
【００２９】
なお、配列番号２で示すヒトＩ型コラーゲンα１鎖のアミノ酸配列は１４６４アミノ酸の全長中ＲＧＤ配列は２箇所（７４５位〜７４７位及び１０９３位〜１０９５位）しか含んでいない。ヒトＩ型コラーゲンα１鎖のアミノ酸配列を元に作成したタンパク質を本開示のタンパク質として用いる場合、ＲＧＤ配列の個数を上記で述べた好ましい範囲に変更することで、より好ましい細胞接着促進能を有するタンパク質が得られる。また、分子の両端に存在し、コラーゲン分子間の会合に寄与するテロペプチドを除去することにより、分子間の会合が抑制され、挿核時の作業性がいっそう向上すると考えられる。以上の点を考慮して、本開示のタンパク質は、例えば、配列番号２のアミノ酸における、７４５位のＡｒｇ〜７４７位のＡｓｐを含む２０アミノ酸長〜６０アミノ酸長の領域を複数（好ましくは４〜２０個、より好ましくは６〜１６個）含むものであってもよい。この場合、複数の領域の各々は同じであっても異なって（つまり７４５位〜７４７位のＲＧＤ周辺の領域では重複するが境界点は異なる）いてもよく、直接接していても間に１つ以上の他のアミノ酸残基が挟まっていてもよい。各々の領域は、それぞれ独立に、７２２位のＧｌｙ〜７５５位のＧｌｙの領域を含む３４アミノ酸長〜５０アミノ酸長の領域であることが好ましい。また、組換え細胞内での発現効率、水への溶解性、及び潮解の抑制の点から、全アミノ酸長は２００アミノ酸〜８００アミノ酸であることが好ましく、３００〜６００アミノ酸であることがより好ましい。
【００３０】
より具体的には、本開示のタンパク質は、配列番号１で表されるタンパク質であってもよい。このタンパク質は、配列番号２における７４５位のＡｒｇ〜７４７位のＡｓｐを含む数十アミノ酸程度の領域を１２個含む５７１アミノ酸長のタンパク質である。あるいは、本開示のタンパク質は、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質若しくは配列番号３で表されるアミノ酸配列を複数回（例えば２回、３回、４回、５回又は６回）繰り返したアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。また、これらのアミノ酸配列にのうちいずれかに対して、９０％以上（あるいは９５％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよく、この場合、元々のアミノ酸配列中の各ＲＧＤモチーフは維持されていることが好ましい。配列番号３のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列の４位のアミノ酸〜１９２位のアミノ酸の領域に対応する。
【００３１】
本開示の真珠養殖用材料は、本開示のタンパク質により被覆されている真珠核若しくは本開示のタンパク質により被覆されている外套膜ピースを含むか、又はそれらの両方を含む。このため、例えば、本開示のタンパク質により被覆されている真珠核を被覆されていない外套膜ピースと共に用いる実施形態、本開示のタンパク質により被覆されている外套膜ピースを被覆されていない真珠核と共に用いることも、本開示の範囲に含まれる。
【００３２】
真珠核が本開示のタンパク質で被覆される場合、真珠核の表面の少なくとも一部が被覆されていればよい。本開示のタンパク質で被覆された真珠核の表面において、本開示のタンパク質で被覆されている領域の、真珠核の全表面積に対する割合は、好ましくは２０％以上であり、より好ましくは３０％以上であり、さらに好ましくは４０％以上であり、いっそう好ましくは５０％以上であり、よりいっそう好ましくは６０％以上であり、特に好ましくは６５％以上である。真珠核の表面全体が本開示のタンパク質で被覆されていてもよい。真珠核表面上における本開示のタンパク質による被覆量は特に制限されないが、例えば０．００１ｇ／ｍ２〜１００ｇ／ｍ２、より具体的には０．０５ｇ／ｍ２〜３０ｇ／ｍ２としてもよい。
同様に、外套膜ピースが本開示のタンパク質で被覆される場合、外套膜ピースの表面の少なくとも一部が被覆されていればよい。本開示のタンパク質で被覆された外套膜ピースの表面において、本開示のタンパク質で被覆されている領域の、外套膜ピースの全表面積に対する割合は、好ましくは２０％以上であり、より好ましくは３０％以上であり、さらに好ましくは４０％以上であり、いっそう好ましくは５０％以上であり、よりいっそう好ましくは６０％以上であり、特に好ましくは６５％以上である。外套膜ピースの表面全体が本開示のタンパク質で被覆されていてもよい。外套膜ピース表面上における本開示のタンパク質による被覆量は特に制限されないが、例えば０．００１ｇ／ｍ２〜１００ｇ／ｍ２、より具体的には０．０５ｇ／ｍ２〜３０ｇ／ｍ２としてもよい。
【００３３】
真珠核を本開示のタンパク質で被覆するには、本開示のタンパク質を水に加えて攪拌してコーティング液を作製し、当業界で知られたコーティング方法を用いて真珠核にコーティングすればよい。例えば、真珠核をコーティング液中に浸漬する、真珠核上にコーティング液をスプレーする、真珠核上にコーティング液をブラシによりコーティングするなどの方法が挙げられる。コーティング液中における本開示のタンパク質の濃度は、例えば０．０００１質量％〜１質量％であり、０．０００５質量％〜０．５質量％であってもよい。
【００３４】
コーティング液にはＮａＣｌなどの塩や、ＨＥＰＥＳ又はＰＢＳなどの緩衝剤が共存していてもよいが、真珠貝に対する悪影響を避ける観点からは有機溶剤など生体にとって有害な物質を含まないことが好ましい。コーティング液は、後述のコーティング用組成物のうち液状であるコーティング用組成物そのものであってもよく、あるいは固体状であるコーティング用組成物あるいは後述の凍結乾燥体を後述の溶解液に溶解して作製した液体であってもよい。
【００３５】
外套膜ピースを本開示のタンパク質で被覆するには、本開示のタンパク質を水に加えて攪拌してコーティング液を作製し、当業界で知られたコーティング方法を用いて外套膜ピースにコーティングすればよい。あるいは、コーティング液を外套膜にコーティングして、これを切断して外套膜ピースを作製してもよい。例えば、外套膜ピース又は外套膜をコーティング液中に浸漬する、外套膜ピース又は外套膜上にコーティング液をスプレーする、外套膜ピース又は外套膜上にコーティング液をブラシによりコーティングするなどの方法が挙げられる。コーティング液中における本開示のタンパク質の濃度は、例えば０．０００１質量％〜１質量％であり、０．０００５質量％〜０．５質量％であってもよい。
【００３６】
外套膜ピースのコーティングに際しても、コーティング液にはＮａＣｌなどの塩や、ＨＥＰＥＳ又はＰＢＳなどの緩衝剤が共存していてもよいが、真珠貝に対する悪影響を避ける観点からは有機溶剤など生体にとって有害な物質を含まないことが好ましい。コーティング液は、後述のコーティング用組成物のうち液状であるコーティング用組成物そのものであってもよく、あるいは固体状であるコーティング用組成物あるいは後述の凍結乾燥体を後述の溶解液に溶解して作製した液体であってもよい。
【００３７】
＜コーティング用組成物＞
上述に従い、本開示によれば真珠核及び外套膜ピースから選択される少なくとも１つをコーティングするためのコーティング用組成物も提供される。コーティング用組成物は、本開示のタンパク質を含む。コーティング用組成物はさらに、母貝に悪影響を及ぼさない適切な賦形剤及び担体等から選択される少なくとも１つを含むことが好ましい。コーティング用組成物は、液状であってもよく、固体状であってもよい。適切な液状担体としては水、アルコール類、大豆油、若しくはオリーブ油などの動植物油、ミネラル油、及び合成油などが挙げられる。適切な固体担体としては、マルトース若しくはスクロースなどの糖類、アミノ酸類、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、及びステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩などが挙げられる。ゲル状物質などを担体として用いることも可能である。
コーティング用組成物が固体状である場合は、適切な溶解液に溶解させてから真珠核及び外套膜ピースから選択される少なくとも１つをコーティングするために用いられてもよい。溶解液としては、例えば、生理食塩液、各種緩衝液、グルコース、イノシトール、マンニトール、若しくはラクトースなどの糖類の溶液、及びエチレングリコール若しくはポリエチレングリコールなどのグリコール類が好ましい。また、コーティング用組成物は、本開示のタンパク質を、イノシトール、マンニトール、ラクトース、スクロース若しくはトレハロースなどの糖類又はフェニルアラニンなどのアミノ酸などの賦活剤と共に凍結乾燥した凍結乾燥体であってもよく、凍結乾燥体を使用時に適当な溶解液、例えば滅菌水、生理食塩液、ブドウ糖液、電解質溶液、又はアミノ酸溶液などの液体、に溶解させてコーティングに用いることもできる。
コーティング用組成物はさらにＮａＣｌなどの塩、ＨＥＰＥＳ又はＰＢＳなどの緩衝剤、増粘剤、ｐＨ調整剤、安定剤、光吸収剤等から選ばれる１つ以上を含んでいてもよい。また、コーティング用組成物はペニシリン系、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、又はニューキノロン系などの抗生物質を含んでいてもよい。コーティング用組成物は着色剤、例えばフェノールレッド、エオシンを含んでいてもよい。コーティング用組成物中における本開示のタンパク質の濃度は、例えば０．０００１質量％〜１質量％であり、０．０００５質量％〜０．５質量％であってもよい。
本開示のコーティング用組成物を用いることにより、高品質な真珠の得率を向上させ、かつ、母貝への挿核の操作性に優れる、真珠核及び外套膜ピースから選択される少なくとも１つを作製することができる。
【実施例】
【００３８】
以下、本開示を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその主旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「部」及び「％」は質量基準である。【００３９】
＜実施例１〜実施例３＞
（ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法による重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）及び多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）の測定）
ｃｅｌｌｎｅｓｔ ヒトＩ型コラーゲン様リコンビナントペプチド（富士フイルム株式会社製）の重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）、多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）、及び粘度の測定を、以下の方法に従って行った。
ここで、ｃｅｌｌｎｅｓｔ ヒトＩ型コラーゲン様リコンビナントペプチドは、ヒトＩ型コラーゲンα１鎖から、細胞接着性の高いＲＧＤ配列を含む部位を４パターンのフラグメントに切り出して連結させたものをさらに３つ連結した構造を有し、より具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、ＧＸＹトリプレットが繰り返される５７１個のアミノ酸から構成され、１２個のＲＧＤモチーフを含む。【００４０】
ｃｅｌｌｎｅｓｔ ヒトＩ型コラーゲン様リコンビナントペプチド（富士フイルム株式会社製）を、東ソー株式会社製のＧＰＣ装置（ＨＬＣ−８２２０ＧＰＣ）を用いて下記の条件下で測定し、プルラン換算分子量として求めた。測定対象タンパク質の水溶液を（凍結標品については解凍後）、４０℃で３０分加熱して完全に溶解させ、測定対象タンパク質の濃度が０．２質量％となるように１００ｍＭのリン酸緩衝液で希釈し、その後０．４５μｍフィルター濾過して試料溶液を作成した。この試料溶液を上記ＧＰＣ装置を用いて測定して重量平均分子量及び数平均分子量を求め、得られた重量平均分子量及び数平均分子量からさらに多分散度を算出した。
［ＧＰＣ測定条件］
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＧＳ−６２０  ７Ｇ−ｐ  内径７．５ｍｍ  長さ５０ｃｍ（昭和電工株式会社製）
溶離液：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．９）
流速：サンプル：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、リファレンス：０．１ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度（設定）：４０℃
注入量：１００μＬ
検出器：ＲＩ／ＵＶ  （２１０ｎｍ）
分子量較正用のタンパク質：プルラン（昭和電工株式会社製  Ｓｈｏｄｅｘ  Ｐ−８２）【００４１】
上記により求められたｃｅｌｌｎｅｓｔ ヒトＩ型コラーゲン様リコンビナントペプチドの重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）及び多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）を表１に示す。【００４２】
（コーティング核１の作製）
ｃｅｌｌｎｅｓｔ ヒトＩ型コラーゲン様リコンビナントペプチド  １００ｍｇ（富士フイルム株式会社製、凍結乾燥体）に注射用水（光製薬株式会社製）を加え、３００ｍｌ三角フラスコ（ＡＧＣテクノグラス株式会社製）を用いて混合することにより、０．１％のコーティング水溶液１を作製した。なお、ｃｅｌｌｎｅｓｔ ヒトＩ型コラーゲン様リコンビナントペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。【００４３】
調製したコーティング水溶液１に、洗浄及び滅菌処理した直径２．３分（約７ｍｍ）サイズの無処理核（真珠核）を完全に浸し、３７℃で２時間振盪撹拌を行った。ついで、金属製ザル（１６メッシュ）で濾過した後、温度２５℃、湿度５５％の雰囲気下、２４時間乾燥させることにより、コーティング核１を作製した。【００４４】
（コーティング外套膜ピース１の作製）
上記により調製したコーティング水溶液１に、無処理の、一般的な真珠形成用外套膜ピースを２５℃で１時間完全に浸して取り出すことにより、コーティング外套膜ピース１を作製した。【００４５】
（真珠養殖実験）
１群２００個のアコヤ貝母貝（天然貝 ２才）を用意し、上記により作製したコーティング核１及びコーティングされていない外套膜ピース（実施例１）、又はコーティング外套膜１及びコーティングされていない真珠核（実施例２）、並びにコーティング核１及びコーティング外套膜ピース１（実施例３）を用い、挿核養殖を行った。挿核時の操作性、及び８ヶ月後に貝より核を抜き出した後の良質真珠得率及び挿核時の操作性を以下のように評価した。【００４６】
−良質真珠得率−
珠表面のシミの有無及びシミの面積は、真珠の価値に大きく影響を及ぼす。
良質真珠得率は、珠表面のシミ面積が０％以上５％未満（シミ無し、僅かなシミが見られるレベル）である割合を評価指標とした。ここでシミとは、核と真珠層との間、又は真珠層と真珠層との間に存在する異常沈着のタンパク質の総称である。シミ面積として、茶色〜黒色の着色域の珠総表面積に対する割合を評価した。具体的には、真珠を上下左右の４方向からデジタルカメラで写真撮影し、シミ面積を計算した。
この評価指標に従って、良質真珠得率を下記評価基準で判定した。なお、Ａ及びＢが、実用上許容し得るレベルである。
−−評価基準−−
Ａ：シミの面積が０％以上５％未満である割合が４０％以上である。
Ｂ：シミの面積が０％以上５％未満である割合が３５％以上４０％未満である。
Ｃ：シミの面積が０％以上５％未満である割合が３０％以上３５％未満である。
Ｄ：シミの面積が０％以上５％未満である割合が２５％以上３０％未満である。
Ｅ：シミの面積が０％以上５％未満である割合が２５％未満である。【００４７】
−挿核時の操作性−
挿核時の挿入器での核の挿核作業の効率は、真珠養殖の生産性に大きく影響を及ぼす。
挿核時の操作性は、挿核作業の熟練作業者により、挿核時の核のタック性（ベタつき）による挿入器の操作性の良否を評価した。
この評価指標に従って、挿核時の操作性を下記評価基準で判定した。なお、Ａが、実用上許容し得るレベルである。
−−評価基準−−
Ａ：無処理核同等の操作性である。
Ｂ：無処理核よりも多少ベタつきを感じ、操作性が悪い。
Ｃ：無処理核よりも明確にベタつきを感じ、操作性が極めて悪い。
評価結果を表１に示す。【００４８】
＜比較例１＞
コーティングされていない真珠核及び外套膜ピースを用いた以外は「実施例１〜実施例３」と同様にして、良質真珠得率及び挿核時の操作性を評価した。
評価結果を表１に示す。【００４９】
＜比較例２〜比較例４＞
ｃｅｌｌｎｅｓｔ ヒトＩ型コラーゲン様リコンビナントペプチドをブタ皮由来Ｉ型コラーゲン−ＰＳＩＬＫ（日本ハム株式会社製、ブタ皮膚製コラーゲンＩ溶液）に代えた以外は「実施例１〜実施例３」と同様にして、重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）及び多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）を測定し、良質真珠得率及び挿核時の操作性を評価した。
評価結果を表１に示す。【００５０】
＜比較例５〜比較例７＞
ｃｅｌｌｎｅｓｔ ヒトＩ型コラーゲン様リコンビナントペプチドをハイグレードゼラチン−ＡＰＡＴ（株式会社ニッピ製）に代えた以外は「実施例１〜実施例３」と同様にして、重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）及び多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）を測定し、良質真珠得率及び挿核時の操作性を評価した。
評価結果を表１に示す。【００５１】
＜比較例８〜比較例１０＞
ｃｅｌｌｎｅｓｔ ヒトＩ型コラーゲン様リコンビナントペプチドをブタ由来コラーゲン（新田ゼラチン株式会社製）に代えた以外は「実施例１〜実施例３」と同様にして、重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）及び多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）を測定し、良質真珠得率及び挿核時の操作性を評価した。
評価結果を表１に示す。【００５２】
＜比較例１１〜比較例１３＞
ｃｅｌｌｎｅｓｔ ヒトＩ型コラーゲン様リコンビナントペプチドをブタ由来ゼラチン（新田ゼラチン株式会社製）に代えた以外は「実施例１〜実施例３」と同様にして、重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）及び多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）を測定し、良質真珠得率及び挿核時の操作性を評価した。
評価結果を表１に示す。【００５３】
＜比較例１４〜比較例１６＞
ｃｅｌｌｎｅｓｔ ヒトＩ型コラーゲン様リコンビナントペプチドをウシ由来ゼラチン（新田ゼラチン株式会社製）に代えた以外は「実施例１〜実施例３」と同様にして、重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）及び多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）を測定し、良質真珠得率及び挿核時の操作性を評価した。
評価結果を表１に示す。【００５４】
【表１】
2019087650.tif 000002
【００５５】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、ＧＸＹトリプレットが繰り返される５７１個のアミノ酸から構成され、１２個のＲＧＤモチーフを含み、多分散度が１．１６であるｃｅｌｌｎｅｓｔ ヒトＩ型コラーゲン様リコンビナントペプチドを真珠核、外套膜ピース、又は真珠核及び外套膜ピースの両方にコーティングした場合（実施例１〜３）、良質真珠得率及び挿核時の操作性に優れることが示された。
これに対し、比較例１〜１６では、良質真珠得率及び挿核時の操作性の少なくとも一方が実用上許容できない評価レベルであったことが示された。【００５６】
２０１７年１１月６日に出願された日本国特許出願２０１７−２１４１８０号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本開示の真珠養殖用材料は、良質な真珠の作製に好ましく利用できる。
【配列表】
2019087650000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月14日(2019.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真珠核及び外套膜ピースからなる群から選択される少なくとも１つが、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、多分散度が２０未満であるタンパク質により被覆されている、真珠養殖用材料。
【請求項２】
ゲル浸透クロマトグラフィー法による前記タンパク質の重量平均分子量が、３０ｋＤａ〜２００ｋＤａである、請求項１に記載の真珠養殖用材料。
【請求項３】
前記タンパク質が、コラーゲンのアミノ酸配列の少なくとも一部を含む、請求項１又は請求項２に記載の真珠養殖用材料。
【請求項４】
前記コラーゲンのアミノ酸配列が、Ｉ型コラーゲンα１のアミノ酸配列である、請求項３に記載の真珠養殖用材料。
【請求項５】
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、多分散度が２０未満であるタンパク質を含む、真珠核及び外套膜ピースから選択される少なくとも１つをコーティングするためのコーティング用組成物。
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月1日(2020.5.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真珠核及び外套膜ピースからなる群から選択される少なくとも１つが、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、多分散度が２０未満であるタンパク質により被覆されている、真珠養殖用材料。
【請求項２】
ゲル浸透クロマトグラフィー法による前記タンパク質の重量平均分子量が、３０ｋＤａ〜２００ｋＤａである、請求項１に記載の真珠養殖用材料。
【請求項３】
前記タンパク質が、コラーゲンのアミノ酸配列の少なくとも一部を含む、請求項１又は請求項２に記載の真珠養殖用材料。
【請求項４】
前記コラーゲンのアミノ酸配列が、Ｉ型コラーゲンα１鎖のアミノ酸配列である、請求項３に記載の真珠養殖用材料。
【請求項５】
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、多分散度が２０未満であるタンパク質を含む、真珠核及び外套膜ピースから選択される少なくとも１つをコーティングするためのコーティング用組成物。
【請求項６】
ゲル浸透クロマトグラフィー法による前記タンパク質の重量平均分子量が、３０ｋＤａ〜２００ｋＤａである、請求項５に記載のコーティング用組成物。
【請求項７】
前記タンパク質が、コラーゲンのアミノ酸配列の少なくとも一部を含む、請求項５又は請求項６に記載のコーティング用組成物。
【請求項８】
前記コラーゲンのアミノ酸配列が、Ｉ型コラーゲンα１鎖のアミノ酸配列である、請求項７に記載のコーティング用組成物。
【請求項９】
さらに、賦形剤及び担体からなる群より選択される少なくとの１つを含む、請求項５〜請求項８のいずれか１項に記載のコーティング用組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
ある実施形態においては、本開示のタンパク質は、牛皮、ブタ皮、又は魚皮といった天然のコラーゲン源から抽出したコラーゲンを、サイズ排除クロマトグラフィーなどの分画方法を使用して、特定の分子量範囲にあるタンパク質分子のみを分離精製することにより得ることができる。別の実施形態においては、本開示のタンパク質は、ＧＸＹトリプレットの繰り返し配列を含み、１個以上のＲＧＤモチーフを含むタンパク質の遺伝子を導入した組換え細胞により生産させることで得ることができる。この場合、タンパク質の遺伝子を導入する宿主細胞としては大腸菌などの細菌の細胞、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母の細胞、又はカイコなどの昆虫の細胞を用いることができる。発現ベクターは宿主と導入するタンパク質のサイズに応じて適切なベクターを公知のベクターから選択して用いればよい。組換え細胞により生産させた場合には、分子量の均一性の高いタンパク質を得ることができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
なお、配列番号２で示すヒトＩ型コラーゲンα１鎖のアミノ酸配列は１４６４アミノ酸の全長中ＲＧＤ配列は２箇所（７４５位〜７４７位及び１０９３位〜１０９５位）しか含んでいない。ヒトＩ型コラーゲンα１鎖のアミノ酸配列を元に作成したタンパク質を本開示のタンパク質として用いる場合、ＲＧＤ配列の個数を上記で述べた好ましい範囲に変更することで、より好ましい細胞接着促進能を有するタンパク質が得られる。また、分子の両端に存在し、コラーゲン分子間の会合に寄与するテロペプチドを除去することにより、分子間の会合が抑制され、挿核時の作業性がいっそう向上すると考えられる。以上の点を考慮して、本開示のタンパク質は、例えば、配列番号２のアミノ酸配列における、７４５位のＡｒｇ〜７４７位のＡｓｐを含む２０アミノ酸長〜６０アミノ酸長の領域を複数（好ましくは４〜２０個、より好ましくは６〜１６個）含むものであってもよい。この場合、複数の領域の各々は同じであっても異なって（つまり７４５位〜７４７位のＲＧＤ周辺の領域では重複するが境界点は異なる）いてもよく、直接接していても間に１つ以上の他のアミノ酸残基が挟まっていてもよい。各々の領域は、それぞれ独立に、７２２位のＧｌｙ〜７５５位のＧｌｙの領域を含む３４アミノ酸長〜５０アミノ酸長の領域であることが好ましい。また、組換え細胞内での発現効率、水への溶解性、及び潮解の抑制の点から、全アミノ酸長は２００アミノ酸〜８００アミノ酸であることが好ましく、３００〜６００アミノ酸であることがより好ましい。
【国際調査報告】
2019087650.tif 000003
2019087650.tif 000004
2019087650.tif 000005
2019087650.tif 000006