(57)【要約】  本発明は、ヘパリン親和性モチーフと生物活性を有するポリペプチドを含むキメラ蛋白質、およびこれを含む徐放性医薬組成物または持効性医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリン親和性モチーフと生物活性を有するポリペプチドを含むキメラ蛋白質。
【請求項２】
生物活性を有するポリペプチドがサイトカイン、ホルモン又はケモカインである請求項１に記載のキメラ蛋白質。
【請求項３】
生物活性を有するポリペプチドが造血因子である請求項２に記載のキメラ蛋白質。
【請求項４】
造血因子がヒトエリスロポエチンである請求項３に記載のキメラ蛋白質。
【請求項５】
ヘパリン親和性モチーフが、少なくとも当該ドメイン全体に少なくとも１つの下記(a)〜(d)から選ばれる塩基性アミノ酸配列を含む３〜１００個のアミノ酸残基からなり、ヘパリン又はヘパリン様物質の糖鎖に存在するスルホ基と結合するドメインである請求項１に記載のキメラ蛋白質。
(a)BBB
(b)BXBB
(c)BBXB
(d)BXBXB
（ここで、Bは、RまたはK；Xは、RまたはK以外のアミノ酸を表す）
【請求項６】
ヘパリン親和性モチーフがヘパリン結合性増殖因子由来のモチーフまたはその一部である請求項１に記載のキメラ蛋白質。
【請求項７】
ヘパリン結合性増殖因子が、PLGFである請求項６に記載のキメラ蛋白質。
【請求項８】
請求項１〜７に記載のキメラ蛋白質を含む徐放性医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜７に記載のキメラ蛋白質を含む持効性医薬組成物。
【請求項１０】
医薬活性化合物とヘパリン親和性モチーフを融合させることによる医薬活性化合物の徐放化方法。
【請求項１１】
医薬活性化合物とヘパリン親和性モチーフを融合させることによる医薬活性化合物の持効化方法。
【請求項１２】
医薬活性化合物にヘパリン親和性モチーフを融合させる工程を含む徐放化用医薬活性化合物の作製方法。
【請求項１３】
医薬活性化合物にヘパリン親和性モチーフを融合させる工程を含む持効化用医薬活性化合物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘパリン親和性モチーフと生物活性を有するポリペプチドを含むキメラ蛋白質に関する。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチン（以下においてEPOと記載することもある）は、赤血球系前駆細胞の分化、増殖を促進する酸性糖タンパク質ホルモンであり、主として腎臓から産生される。血液中に最も豊富に存在する赤血球は、一定期間機能した後に脾臓などで破壊される（ヒトでは平均寿命が約１２０日）が、骨髄から絶えず供給されることによって、正常な状態では末梢の全赤血球数は常に一定に保たれている。EPOはこのような生体の赤血球の恒常性維持において中心的な役割を担っている。臨床的にはEPOは貧血の治療や術前術後の管理に利用されている。【０００３】
EPOは造血因子としての働きの他に、神経系細胞、心筋細胞、腎尿細管上皮細胞などでアポトーシス抑制や組織保護の作用をすることが知られている（PNAS 100:4802-4806, 2003他）。EPOの有するこのような2つの作用は、EPOが2つの異なるシグナル伝達経路によって作用するためであると考えられている。EPOがEPO受容体のホモダイマーに作用すると、細胞内のJAK2シグナル伝達経路を通じて造血作用を及ぼす。一方、EPOがEPO受容体とcommonβ受容体（βcR）とのヘテロダイマーに作用すると、細胞内のERK1/2シグナル伝達経路を通じて抗アポトーシス作用を及ぼす（PNAS 101:14907-14912, 2004）。【０００４】
EPOの有する上記抗アポトーシス作用に基づき、EPO が血管新生促進作用を有し、虚血性疾患の治療剤として有用であることも報告されている（Christopher H et al., Blood 102(4);1340-1346, 2003、Ferdinand H B et al., Blood 103(3);921-926, 2004、Kyle J S et al., Cardiovascular Research 59; 538-548, 2003など）。【０００５】
EPOなどのヘパリン親和性を有さないサイトカインをヒトなどの哺乳類の組織内に投与した場合には、組織内に存在する血管から再吸収されやすく、そのために組織内濃度が低下することがある。たとえば、EPOを虚血性疾患の治療に用いるときには、血管新生を起こしたい目的臓器において、十分な血管が新生されるまでの１週間前後は局所において十分高い薬剤濃度が維持される必要がある。四肢の虚血の治療など体表から局所内に容易に薬剤を到達できる場合には連日投与などの方法が可能であるが、心筋虚血の治療など、体表からの頻回の投与に困難がある場合には、新しい製剤を開発することが求められている。【０００６】
生体内に存在する糖鎖を含むタンパク質にはグリコプロテインとプロテオグリカン（PG）がある。PGの持つ糖鎖には、コンドロイチン硫酸・ケラタン硫酸・ヘパリン・ヘパラン硫酸・デルマタン硫酸などのいわゆるヘパリン様物質があり、糖鎖のもつスルホ基（硫酸基）が他の物質・特に塩基性アミノ酸残基との間で相互作用を行う。これらヘパリン様物質は結合組織内に豊富に存在し、また各種細胞膜にはシンデカン等のPGが発現しており、細胞外マトリックスおよび細胞表面での生物反応の足場を形成している。特に血管内皮表面には各種のPGが発現し、各種血中物質に反応の場を提供している。【０００７】
サイトカイン・ケモカイン・およびその他の生物活性物質のうち、かなりのものがヘパリン親和性を有する。細胞から分泌されるこれらのヘパリン親和性物質は細胞周囲に存在する細胞外マトリックスに対する親和性を示すため、分泌細胞を山の頂点とする濃度勾配を形成し、生物活性物質の標的細胞に対して極性や運動の方向性に関する情報を提供する。またPGを発現する細胞表面、および特に血管内皮表面には、これら生物活性物質が強く集積する。【０００８】
ヘパリン親和性物質は、そのペプチド配列の中にヘパリン親和性モチーフを有する。リシン・アルギニンなどの塩基性アミノ酸は側鎖に余剰のアミノ基を有し、ヘパリン様物質の糖鎖に存在するスルホ基と強い親和性を示す。モチーフ内に複数の塩基性アミノ酸が連続または不連続に存在する場合、あるいは一次構造上は塩基性アミノ酸の集積がなくとも、蛋白が三次構造（立体構造）を形成したときに複数の塩基性アミノ酸が近接した場合には、当該構造がヘパリン親和性モチーフとして機能する。【０００９】
現在までに、ヘパリン結合性を利用してEPOを精製する方法が公知(WO97017366(特表平11-511483))となっている。【００１０】
しかしながら、ヘパリン親和性モチーフが結合されたEPOなどの生物活性を有するポリペプチドについては全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】WO97017366(特表平11-511483)
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】PNAS 100:4802-4806, 2003
【非特許文献２】PNAS 101:14907-14912, 2004
【非特許文献３】Blood 102(4);1340-1346, 2003
【非特許文献４】Blood 103(3);921-926, 2004
【非特許文献５】Cardiovascular Research 59; 538-548, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、ヘパリン親和性モチーフと生物活性を有するポリペプチドを含むキメラ蛋白質、およびこれを含む徐放性医薬組成物または持効性医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、EPOとヘパリン親和性モチーフをつなげたキメラ蛋白質であるヘパリン親和性エリスロポエチン（Heparinophilic erythropoietin: HEPO）を作製し、これが組織成分のヘパリン様物質に対する親和性を示し、かつEPOの生物活性を示したこと、並びにin vivoでの造血作用および血管新生阻害作用を有することを見出し、本発明を完成させた。【００１５】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
［１］ヘパリン親和性モチーフと生物活性を有するポリペプチドを含むキメラ蛋白質。
［２］生物活性を有するポリペプチドがサイトカイン、ホルモン又はケモカインである［１］に記載のキメラ蛋白質。
［３］生物活性を有するポリペプチドが造血因子である［２］に記載のキメラ蛋白質。
［４］造血因子がヒトエリスロポエチンである［３］に記載のキメラ蛋白質。
［５］ヘパリン親和性モチーフが、少なくとも当該ドメイン全体に少なくとも１つの下記(a)〜(d)から選ばれる塩基性アミノ酸配列を含む３〜１００個のアミノ酸残基からなり、ヘパリン又はヘパリン様物質の糖鎖に存在するスルホ基と結合するドメインである［１］に記載のキメラ蛋白質。
(a)BBB
(b)BXBB
(c)BBXB
(d)BXBXB
（ここで、Bは、RまたはK；Xは、RまたはK以外のアミノ酸を表す）
［６］ヘパリン親和性モチーフがヘパリン結合性増殖因子由来のモチーフまたはその一部である［１］に記載のキメラ蛋白質。
［７］ヘパリン結合性増殖因子が、PLGFである［６］に記載のキメラ蛋白質。
［８］［１］〜［７］に記載のキメラ蛋白質を含む徐放性医薬組成物。
［９］［１］〜［７］に記載のキメラ蛋白質を含む持効性医薬組成物。
［１０］医薬活性化合物とヘパリン親和性モチーフを融合させることによる医薬活性化合物の徐放化方法。
［１１］医薬活性化合物とヘパリン親和性モチーフを融合させることによる医薬活性化合物の持効化方法。
「１２］医薬活性化合物にヘパリン親和性モチーフを融合させる工程を含む徐放化用医薬活性化合物の作製方法。
［１３］医薬活性化合物にヘパリン親和性モチーフを融合させる工程を含む持効化用医薬活性化合物の作製方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明者らは、EPOとヘパリン親和性モチーフをつなげたキメラ蛋白質であるHEPOを作製し、これがin vitroおよびin vivoでヘパリン親和性をもつエリスロポエチンとして作用することを確認した。本願発明により、以下の有用な作用を期待することができる。
１．長期間作用する赤血球増血剤：腎性貧血等の治療にエリスロポエチン製剤が用いられているが、HEPOの１回投与量を増量し投与回数を減少させることで、患者の負担を軽減することができる。
２．EPOには血管内皮傷害治療作用があるが、この作用を得るためには多血症を誘発し心不全を来す程度の投与量が必要であり、現実的ではない。HEPOおよびその誘導体は血管内皮に対する選択的な親和性があるため、多血症を誘発しない量での血管内皮傷害治療作用が見込まれ、血栓性血小板減少性紫斑病、移植後・薬剤性および放射線障害による血栓性微少血管障害、腎炎・川崎病などの血管内皮傷害を伴う血管炎などの治療に応用しうる。
３．EPOには心臓・中枢神経・その他の臓器に対する保護作用があるが、HEPOおよびその誘導体はこれに代わる治療薬として応用しうる。
４．移植用臓器の保存剤に添加することで、移植臓器の劣化を防ぎ生着率を高めることができる。
５．血管新生阻害作用があるので、癌性血管の発育を阻害し、抗癌剤として応用できる。【００１７】
さらに、本発明によれば、任意のペプチド製剤あるいは非ペプチド製剤にヘパリン親和性を付与することで、以下の有用な性質を付加することができる：
１．組織親和性が生じることで、組織内における薬剤濃度を高い状態で維持できる。
２．組織内に投与した場合に、組織からゆっくり血中へ放出されるため、徐放性薬剤として使用できる。
３．ヘパリン親和性モチーフの構造を調整することで、任意の細胞への親和性を高めることができる。
４．特に血管内皮との親和性を高めることで、血管内皮に選択的に作用する薬剤を創製できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、rhHEPOのcDNA発現用に用いたpMIBベクターの構造を示す。
【図２】図２は、rhHEPOのペプチド配列を示す。
【図３】図３は、In vitroでの各EPOのヘパリン親和性の結果を示す位相差顕微鏡写真（パネルA)および細胞数のグラフ（パネルB)である。（（図中、１はEPO；２はAEPO；３はCEPO；４はHEPOである）。
【図４】図４は、各濃度のEPOおよびHEPOのエリスロポエチン活性を示すグラフである。
【図５】図５は、HEPOの造血作用を示すグラフである。
【図６】図６は、HEPOの血管新生阻害作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
生物活性を有するポリペプチド
本発明に用いる生物活性を有するポリペプチドは特に限定されないが、ターゲットとなる組織内において当該活性を持続させることが好ましいポリペプチド、あるいは組織に結合後、組織から血中に徐々に放出させることが好ましいポリペプチドをいう。生物活性を有するポリペプチドは抗体、酵素、サイトカイン、ホルモンを含むがこれに限定されない。具体的には、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、トロンボポエチン等の造血因子、インターフェロン、IL-1やIL-6等のサイトカイン、ケモカイン、免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ヒト型化抗体、組織プラスミノーゲン活性化因子(ＴＰＡ)、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、レプチン、インシュリン、幹細胞成長因子(ＳＣＦ)などを含むが、これらに限定されない。特に、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯなどの造血因子が好ましく、ＥＰＯが最も好ましい。
【００２０】
本発明では、特に組織親和性の低いポリペプチドにヘパリン親和性モチーフを結合させることで、当該生物活性の持効性や徐放性を向上させることが可能となり有用である。
【００２１】
ヘパリン親和性モチーフ
本発明におけるヘパリン親和性モチーフとは、ヘパリン親和性物質中に含まれるヘパリン親和性の配列モチーフをいい、ペプチド配列の中に塩基性アミノ酸等の側鎖に余剰のアミノ基を有する配列であって、ヘパリン様物質の糖鎖に存在するスルホ基と強い親和性を示すペプチドであれば特に限定されない。塩基性アミノ酸は、モチーフ内に複数の塩基性アミノ酸が連続または不連続に存在していても良いし、一次構造上は塩基性アミノ酸の集積がなくとも、蛋白が三次構造（立体構造）を形成したときに複数の塩基性アミノ酸が近接し、当該構造がヘパリン親和性を有していてもよい。そのようなヘパリン親和性モチーフとしては、例えば、当該ドメイン全体内に下記(a)〜(d)に記載のいずれかの塩基性アミノ酸配列（ヘパリン結合配列）を少なくとも１つ、好ましくは２つ以上含む、全体として３〜１００個程度のアミノ酸残基からなり、好ましくは１０〜４０個のアミノ酸残基からなる。
(a)BBB
(b)BXBB
(c)BBXB
(d)BXBXB
（ここで、Bは、RまたはK；Xは、RまたはK以外のアミノ酸を表す）
ヘパリン親和性モチーフはヘパリン様物質の糖鎖に存在するスルホ基と結合するモチーフや、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)などのヘパリン結合性増殖因子由来のモチーフまたはその一部を用いることができる。そのようなモチーフとしては、例えば、下記に記載のヘパリン親和性ドメイン全体若しくは当該ドメイン中のヘパリン親和性モチーフ(下線部)またはその一部が挙げられる。
hBMP-2:
QAKHKQRKRLKSSCKRHP LYVDFSDVGW NDWIVAPPGY HAFYCHGECP FPLADHLNST NHAIVQTLVN SVNSKIPKAC CVPTELSAIS MLYLDENEKV VLKNYQDMVV EGCGCR (SEQ ID NO:1)
hFGF1:
KKNG SCKRGPRTHY GQK (SEQ ID NO:2)
hFGF2:
KRT GQYKLGSKTG PGQK (SEQ ID NO:3)
hPDGF-A:
RPRESG KKRKRKRLKP T (SEQ ID NO:4)
hVEGF:
ERRKHLFVQD PQTCKCSCKN TDSRCKARQL ELNERTCRCD KPRR (SEQ ID NO:5)
hPLGF:
RRRPKGRGKR RREKQRPTDC HLCGDAVPRR(SEQ ID NO:6)
が挙げられる。
【００２２】
ヘパリン結合性増殖因子
ヘパリン結合性増殖因子としては、例えば、PLGF（Placental growth factor: 胎盤増殖因子）、PDGF（Platelet derived growth factor: 血小板由来成長因子）、VEGF（Vascular endothelial growth factor: 血管内皮増殖因子）、IL-8（Interleukin-8: インターロイキン-8）、HGF（Hepatocyto growth factor: 肝細胞増殖因子）、SF（Scatter factor: 分散因子）、FGF-1（Fibroblast growth factor-1: 線維芽細胞増殖因子-1）、FGF-2、FGF-7、FGF-10等が挙げられる。特に組織特異的なヘパリン親和性モチーフまたはその一部を用いることで、組織選択的な薬剤とすることも可能である。
【００２３】
医薬活性化合物
本発明において用いられる医薬活性化合物は特に限定されず、ペプチド医薬でも非ペプチド医薬でもよく、活性も特に限定されない。例えば、エリスロポエチンに本発明を適用すれば、腎性貧血患者へのエリスロポエチンの投与回数を減少させることが可能となったり、組織選択的にエリスロポエチンの機能を作用させることが可能となる等の優れた効果を得ることができる。例えば抗癌剤などの非ペプチド性医薬活性化合物にリンカー等を用いてヘパリン結合性配列を結合させることで、投与局所内での濃度を持続させることが可能となる。また組織選択的なヘパリン結合性配列を結合させることで目的とする臓器へのターゲッティングを行うためのDDS (Drug Delivery System) として応用することも可能である。
【００２４】
エリスロポエチン（EPO）
本発明に用いるエリスロポエチンは、どのようなEPOでも用いることができるが、好ましくは高度に精製されたEPOであり、より具体的には、哺乳動物EPO、特にヒトEPOと実質的に同じ生物学的活性を有するものである。
【００２５】
本発明で用いるエリスロポエチンは、いかなる方法で製造されたものでもよく、例えば、ヒト由来の抽出物から精製して得られた天然のヒトEPO（特公平1-38800号公報、など）や、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、昆虫細胞、などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したヒトEPOなどを用いることができる。本発明において用いられるエリスロポエチンは、遺伝子工学的手法により製造されたEPOが好ましく、哺乳動物細胞（特にＣＨＯ細胞）を用いて製造されたEPOが好ましい（例えば、特公平1-44317号公報、Kenneth Jacobs et al., Nature, 313 806-810 (1985)など）。
【００２６】
遺伝子組換え法により得られるEPOには、天然由来のEPOとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列中の１または複数のアミノ酸を欠失、置換、付加等したもので、天然由来のEPOと同様の生物学的活性を有するもの等であってもよい。アミノ酸の欠失、置換、付加などは当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275；Zoller, M.J. and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500；Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456；Kramer, W. and Fritz, H.J. (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367；Kunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492；Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などを用いて、EPOのアミノ酸に適宜変異を導入することにより、EPOと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。一般的に、置換されるアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換されることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666；Zoller, M.J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500；Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433；Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413）。
【００２７】
又、本発明のエリスロポエチンとして、EPOと他のタンパク質との融合タンパク質を用いることも可能である。融合ポリペプチドを作製するには、例えば、EPOをコードするＤＮＡと他のタンパク質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。本発明のEPOとの融合に付される他のタンパク質は、特に限定されない。
【００２８】
又、本発明のエリスロポエチンとして、化学修飾したEPOを用いることも可能である。化学修飾したEPOの例として、例えば、ポリエチレングリコール等により化学修飾されたEPO（WO90/12874など）、糖鎖のついていないEPOをポリエチレングリコール等により化学修飾したもの、その他、ビタミンＢ１２等、無機あるいは有機化合物等の化合物を結合させたEPOなどを挙げることができる。
【００２９】
さらに、本発明のエリスロポエチンとしてEPO誘導体を用いることも可能である。EPO誘導体とは、EPO分子中のアミノ酸を修飾したEPO又はEPO分子中の糖鎖を修飾したEPOのことをいう。
【００３０】
EPO分子中の糖鎖の修飾としては、糖鎖の付加、置換、欠失などが含まれる。本発明において好ましい糖鎖の修飾としては、EPO分子中のシアル酸の欠失を挙げることができる。
【００３１】
通常、組換え動物細胞により生産したEPO、尿由来のEPOのいずれも、糖鎖構造の異なる多様なEPOを含むEPO組成物として得られる。EPO組成物中のEPO分子に付加しているシアル酸の数は、個々のEPO分子によって異なるが、通常、1つのEPO分子に１１個〜１５個のシアル酸が付加している。これらのシアル酸を除去することによりアシアロ化されたEPO（アシアロEPO）を作製することが可能である。アシアロ化の際に除去されるシアル酸の数は特に限定されず、全てのシアル酸を除去してもよいし、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、又は14個のシアル酸を除去してもよい。本発明において好ましいアシアロEPOは、EPO分子に付加しているシアル酸の数が１０個以下であり、さらに好ましくは５個以下であり、特に好ましくは２個以下である。なお、本発明において用いられるシアル酸の数は、EPO組成物に含まれているEPO分子の平均数を用いる。1分子あたりのシアル酸の平均は当業者に公知の方法によって測定することが可能である（ＥＰ0428267公報、など）。
【００３２】
シアル酸が除去されたEPO（アシアロEPO）は当業者に公知の方法で作製することができ、例えば、シアリダーゼなどの酵素でEPOを処理すること等により作製することが可能である。シアリダーゼは市販されているものを用いることが可能である。（特表2005-507426号、Nobuo Imai et al., Eur.J.Biochem, 194, 457-462 (1990)、など)
【００３３】
アシアロEPOは、血管新生治療において、多血症や高血圧などの副作用を伴わずに安全に投与することができ、さらに骨髄単核球移植（BMI）と併用した場合にも併用しない単独投与の場合にも顕著な血管新生効果をもたらすことが報告されている（特願2007-519063号（特許第4200509号））。したがって、アシアロEPOは好ましいEPO誘導体である。
【００３４】
さらに、本発明のエリスロポエチンは、糖鎖改変体EPOであってもよく、これにはEPOのＮ末端にシアル酸が付着した糖鎖改変体EPOであるNESP（Novel Erythropoietin Stimulating Protein : WO85/02610,WO91/05867, WO95/05465等に記載）などの糖鎖が改変されたEPO類似体が挙げられる。
【００３５】
EPO分子中のアミノ酸の修飾としては、カルバミル化、ビオチン化、アミジン化、アセチル化、グアニジン化、などを挙げることができるが、本発明において好ましいアミノ酸の修飾はカルバミル化である。
【００３６】
修飾されるアミノ酸残基は特に限定されず、例えば、リジン、アルギニン、グルタミン酸、トリプトファンなどを挙げることができるが、本発明において修飾される好ましいアミノ酸はリジンである。
【００３７】
従って、本発明においてアミノ酸が修飾されたEPOの特に好ましい態様として、リジンがカルバミル化されたEPOを挙げることができる（Marcel L et al. Derivatives of erythropoietin that are tissue protective but not erythropoietic. Science, 2004; 305: 239、 Fiordaliso E et al. A nonerythropoietic derivative of erythropoietin protects the myocardium from ischemia-reperfusion injury. PNAS, 2005; 102: 2046、など)。EPOのカルバミル化には、シアナートイオン等との反応によるカルバミル化、アルキル−イソシアナート等との反応によるアルキル−カルバミル化、アリール−イソシアナート等との反応によるアリール−カルバミル化などが含まれる。
【００３８】
キメラ蛋白質
本発明は、ヘパリン親和性モチーフと生物活性を有するポリペプチドを含むキメラ蛋白質を提供する。
【００３９】
ヘパリン親和性モチーフと生物活性を有するポリペプチドを含むキメラ蛋白質の作製は以下に述べる種々の態様で公知の方法により実施することができる。
【００４０】
生物活性を有するポリペプチドにヘパリン親和性モチーフを導入する場合には、当該ペプチドのN末端、あるいはC末端、あるいはペプチド配列の途中にヘパリン親和性モチーフ配列を挿入してもよい。または、一次構造ではなく三次立体構造で塩基性物質が近接するように用いてもよい。
【００４１】
非ペプチド製剤にヘパリン親和性を付与するためには、ヘパリン親和性モチーフをリンカー等を用いて結合させてもよい。または当該薬剤に直接、自由なアミノ基などの塩基性側鎖を導入してもよい。
【００４２】
具体的には、ヘパリン親和性モチーフの作成には以下の方法がある。
１．既知のヘパリン親和性物質、例えば血管内皮細胞増殖因子（VEGF）などのヘパリン親和性モチーフの全体もしくは一部をそのまま用いる。
２．リシン・アルギニン・その他の塩基性の自然型アミノ酸または合成アミノ酸が複数、一定の配列をとるように小ペプチドを作成する。
３．複数の塩基性アミノ酸が三次立体構造で近傍に配位されるように設計する。
４．塩基性アミノ酸の代わりに、アミノ基・その他の塩基性側鎖を直接または間接に導入して用いる。
【００４３】
一例を挙げると、後述する実施例に記載するように、生物活性を有するポリペプチドをコードするDNAとヘパリン親和性モチーフをコードするDNAを連結させ、これを発現ベクターに組み込むことによって、キメラ蛋白質を発現する組換えベクターが作製できる。該ベクターにより形質転換された組換え細胞を培養し、組み込まれたDNAを発現させることによって、培養中に生産される当該キメラ蛋白質を取得できる。
【００４４】
キメラ蛋白質を作製するための宿主と発現ベクターの多くの組み合わせが公知である。これらの発現系は、いずれも本発明に応用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が使用できる。具体的には、本発明に利用することができる動物細胞としては、次のような細胞を例示することができる。
（１）哺乳類細胞、：CHO、COS、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、Hela、Vero、HEK293、Ba/F3、HL-60、Jurkat、SK-HEP1など。
（２）両生類細胞：アフリカツメガエル卵母細胞など。
（３）昆虫細胞：sf9、sf21、Tn5、HiFiveなど。
【００４５】
あるいは植物細胞としては、ニコティアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）などのニコティアナ（Nicotiana）属由来の細胞による蛋白質遺伝子の発現系が公知である。植物細胞の形質転換には、カルス培養した細胞を利用することができる。
【００４６】
更に真菌細胞としては、次のような細胞を利用することができる。酵母：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）などのサッカロミセス（Saccharomyces）属、メタノール資化酵母（Pichia pastoris）などのPichia属糸状菌：アスペスギルス・ニガー（Aspergillus niger）などのアスペルギルス（Aspergillus）属。
【００４７】
あるいは原核細胞を利用した蛋白質遺伝子の発現系も公知である。たとえば、細菌細胞を用いる場合、大腸菌（E. coli）、枯草菌などの細菌細胞を本発明に利用することができる。
【００４８】
哺乳類細胞を用いる場合、常用される有用なプロモーター、発現させる蛋白質遺伝子、その3’側下流にポリAシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。
【００４９】
また、その他に、ウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等を、蛋白質発現のために使用することができる。プロモーター／エンハンサーを利用することができるウイルスとして、具体的には、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40（SV40）等を示すことができる。
【００５０】
SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277, 108）を利用することができる。また、HEF1αプロモーター／エンハンサーはMizushimaらの方法（Nucleic Acids Res.（1990）18, 5322）により、容易に目的とする遺伝子発現に利用することができる。
【００５１】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、蛋白質分泌のためのシグナル配列および発現させる蛋白質遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子が発現できる。プロモーターとしては、例えばlacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1989）341, 544-546 ; FASEBJ.（1992）6, 2422-2427）を利用することができる。あるいはaraBプロモーターはBetterらの方法（Science（1988）240, 1041-1043）により、目的とする遺伝子の発現に利用することができる。
【００５２】
医薬組成物
本発明はさらに、ヘパリン親和性モチーフと生物活性を有するポリペプチドを含むキメラ蛋白質を含む医薬組成物を提供する。
【００５３】
本発明の医薬組成物には、必要に応じて、懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を適宜添加することができる。
【００５４】
懸濁剤の例としては、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができる。
【００５５】
溶液補助剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができる。
【００５６】
安定化剤としては、デキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることができる。
【００５７】
また、安定化剤としてある種のアミノ酸を添加することも可能である（例えば、特開平10-182481号公報など）。安定化剤として添加されるアミノ酸には、遊離のアミノ酸、そのナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩などの塩などが含まれる。アミノ酸は1種又は２種以上を組み合わせて添加することができる。安定化剤として添加されるアミノ酸は特に限定されないが、好ましいアミノ酸としては、ロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジンを挙げることができる。
【００５８】
等張化剤としては例えば、Ｄ−マンニトール、ソルビート等を挙げることができる。
【００５９】
保存剤としては例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができる。
【００６０】
吸着防止剤としては例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。
【００６１】
界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチエレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のＨＬＢ６〜１８を有するもの；陰イオン界面活性剤、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０〜１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２〜４でアルキル基の炭素原子数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８〜１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数１２〜１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。本発明の医薬組成物には、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。好ましい界面活性剤は、ポリソルベート２０，４０，６０又は８０などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソルベート２０及び８０が特に好ましい。また、ポロキサマー（プルロニックＦ−６８（登録商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好ましい。
【００６２】
含硫還元剤としては例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。
【００６３】
酸化防止剤としては例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。
【００６４】
さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含んでいてもよい。
【００６５】
本発明を徐放性製剤として行う場合、徐放性製剤は公知の方法、例えば基剤としてポリマーを用いる方法などにより調製することが可能である。基剤として用いるポリマーは生体内で分解されるポリマーを用いることが好ましい。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、使用する生物活性を有するポリペプチドまたは医薬活性化合物および／またはキメラ蛋白質の種類や治療する疾患によって異なる。本発明の一例であるEPOのC末端に胎盤増殖因子（PLGF）のヘパリン結合性ドメインを結合したキメラ蛋白であるHEPO（Heparinophilic erythropoietin）の場合には、通常、0.001μg/kg/day〜1000μg/kg/day、好ましくは0.01μg/kg/day〜100μg/kg/day、より好ましくは0.1μg/kg/day〜30μg/kg/dayの投与量で投与する。本発明の医薬組成物の個々の患者に対する投与量は患者の年齢、体重、症状、投与経路などを考慮して医師により決定される。
【００６７】
本発明の医薬組成物においては、キメラ蛋白質が体表あるいは経カテーテル的に直接投与できる場合には、局所投与することで高い組織内濃度を維持することができる。局所投与される部位は特に限定されず、たとえば血管新生促進や血流増加を起こしたい部位（組織、器官など）や虚血状態になっている部位などに投与することができる。具体的な局所投与部位の例としては、下肢骨格筋、上肢骨格筋、心臓（心筋）などを挙げることができる。
【００６８】
局所投与は、全身に大きな影響を及ぼすことなく患部局所に効率的にキメラ蛋白質を投与できる方法であれば特に限定されず、通常の注射器、ニードル、局所針、カテーテルなどを用いて局所投与することが可能である。
【００６９】
さらに、本発明の医薬組成物は、局所投与に限定されず、血管内投与とすることもできる。心筋虚血の治療など体表からの頻回の投与に困難がある場合には、本発明のキメラ蛋白質を血管内投与することにより、キメラ蛋白質の一部は血管内皮に発現しているへパラン硫酸プロテオグリカンなどのヘパリン用物質に結合することから、血管内皮に特異的に吸着され、組織内での濃度を高く維持することができる。
【００７０】
したがって、本発明の医薬組成物は徐放性医薬組成物または持効性医薬組成物とすることができる。
【００７１】
本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
【００７２】
なお、以下の実施例における統計的解析は、全てのデータを平均値±SDで表す。群間の比較をANOVA、次いでボン=フェローニの確率検定により行った。顕著な違いをp<0.05で定義した。
【実施例】
【００７３】
実施例1：HEPOの調製
（１．１）rhHEPOのベクターの作成
シグナル配列を含まないヒトEPOのcDNAを以下のPrimerを用いたPCR法によりrhHEPOのcDNAを作成した。作成したcDNAの構築は以下のとおりである：
5’ - (Sph-I切断配列) - (シグナル配列を含まないヒトEPOのcDNA全長) - (ヒトPLGFのヘパリン親和性モチーフのcDNA) - (終始コドン) - (EcoRI切断配列) - 3’。【００７４】
使用したプライマーおよび得られたポリペプチド
１）hEPO-cDNAの5'末端にSph-Iサイトを付加
5’primer: ttaatggcatgctagccccaccacgcctcatctgtgac (SEQ ID NO:7)
２）hEPOの3'末端にPLGFのcDNAヘパリン結合モチーフおよびEcoRIサイトを付加して伸張
3’primer-1: ttctcttccccctgcccttgggtctcctccttctgtcccctgtcctgcaggcctc 
(SEQ ID NO:8)
3’primer-2: ggcagtctgtgggtctctgcttctctctcctcctcttccccctgcccttgggtc 
(SEQ ID NO:9)
3’primer-3: gagaattcctacctccggggaacagcatcgccgcacaggtggcagtctgtgggtctctgcttct 
(SEQ ID NO:10)
PCRバンドを切り出し、塩基配列を確認したのち、pMIB Baculovirus Vector（Invitrigen社）に制限酵素 (5’:SphI, 3’:EcoRI) を用いてrhHEPOのcDNAを挿入し（図１）、公知の方法により大腸菌 JM109株（Takaraバイオ）に導入し、複数のクローンを得、塩基配列の確認により正しい向きに正しい配列で挿入されたクローンを得た。この大腸菌クローンを公知の方法により増殖させ、Quantum Prep, Plasmid Maxiprep Kit (BIO-RAD社) を用いてベクターを精製し、キットを用いてミラクリン処理を行い (Mira CLEAN, Endotoxin Removal Kit, Mirus社)、OD260でDNA濃度を測定し、-80℃で保存した。【００７５】
（１．２）rhHEPOの発現系と精製
発現細胞は昆虫細胞株HighFive (Invitrogen社) を用い、培養液は無血清培養液ExpressFive (Invitrogen社) を用い、BioCoat, Collagen-Iボトル（BD社）による付着細胞系でRoom Air, 28℃の条件で培養した。融解した保存ベクターをFuGENE HD (Invitrogen社) を用いて昆虫細胞に導入し、培養上清を収穫した。上清からMILLEX-HA, 0.45μm (Millipore社) を用いて粒子を除去したのち、濃縮フィルター Amicon Ultra-15, Ultracel- 10k (Millipore社) を用いて10kD以下の分子を取り除く濃縮を行った。【００７６】
rhHEPOの精製にはHeparin-Sepharose gel, pre-packed カラム (HiTrap Heparin, GE Amersham社) を用いた。カラムを 1 M Tris buffer, pH7.5で置換したのち、濃縮培養上清を注入し、十分量の1 M Tris bufferでカラムを洗ったのち、1M NaCl + 0.3% BSA in 1M Tris buffer, pH 7.5 でrhHEPOを回収した。回収した部分精製液をUltracel- 10kを用いて濃縮し、hEPO ELISA kit (R&D社) で濃度を測定し、10 μg/mlのrhHEPO溶液を得た。rhHEPOのcDNAを組み込まないベクターを同じ方法で細胞に発現させ、回収した培養上清を同じ方法で濃縮精製したものをコントロールとして用いた（Mock）。【００７７】
得られたrhHEPOの構造は、図２に示すように、ヒトEPOの165アミノ酸とヒトPLGFのヘパリン親和性モチーフの30アミノ酸からなるキメラ蛋白質である。キメラ蛋白質rhHEPOをコードするcDNAの配列は(SEQ ID NO:11)であり、アミノ酸配列は(SEQ ID NO:12)である。【００７８】
実施例２：HEPOの生物学的活性の検討
HEPOのin vitroでの性質を調べた。比較対象として自然型ヒトリコンビナントエリスロポエチン（EPO）、同アシアロエリスロポエチン（AEPO）・同カルバミルエリスロポエチン（CEPO）を用いた。なお、AEPOの調製はCHO細胞を用いて遺伝子組換え法で作製したEPO（中外製薬株式会社製）から、文献（Imai N. Higuchi M. Kawamura A. Tomonoh K. Oh-Eda M. Fujiwara M. Shimonaka Y. Ochi N. Physicochemical and biological characterization of asialoerythropoietin. Suppressive effects of sialic acid in the expression of biological activity of human erythropoietin in vitro. European Journal of Biochemistry. 194(2):457-62, 1990 Dec 12.）記載の方法により、またCEPOの調製はJin Zeng (Methods in Enzymology 205: 433-437, 1991)に記載の方法に従い、EPOをシアナートイオンと反応させ、リジンをカルバミル化させることにより行った。【００７９】
（２．１）ヘパリン親和性
実験方法
４種のEPO液（80 ng/ml） にヘパリンアガロースゲルを加え、一夜静置した。翌朝、ゲルを緩衝液で数回洗浄した。EPO依存性白血病細胞株AS-E2（1 x 105/ml） にゲルを加え、５日後に細胞数を測定した（n = 3）。
結果
得られたヘパリン親和性の結果を図３に示す（図中、１はEPO；２はAEPO；３はCEPO；４はHEPOである）。パネルAは位相差顕微鏡写真であり、写真の大きい粒子はゲル、小さい粒子は細胞である。また、パネルBは細胞数（x 106/ml）を示す。この結果から、HEPOのみがヘパリンアガロースゲルに吸着し、洗浄によって遊離しないことが明らかになった。また、HEPOはヘパリンアガロースゲルに吸着した状態でもEPOとしての生物活性を失わないことが明らかになった。【００８０】
（２．２）エリスロポエチン活性
実験方法
各濃度のEPOおよびHEPOをAS-E2細胞（2 x 104/ml）に添加し、４日間の培養ののちに細胞数を計測した（n = 3）。
結果
得られたエリスロポエチン活性の結果を図４に示す（図中、○はEPO；●はHEPOである）。EPOおよびHEPOは3■10 ng/mlで最大の活性を示した。なお、低濃度のHEPOで活性の低下が見られるが、これは昆虫細胞に発現した蛋白がプラスチック容器表面に吸着されやすいためであり、HEPOの本来の性質ではないと考えられる。この結果から、HEPOの生物活性の力価はEPOとほぼ等しいことが明らかになった。【００８１】
実施例３：HEPOの造血作用
HEPOの造血作用を以下の方法により検討した。
実験方法
ICRマウスに2 μg/kg体重のEPOまたはHEPOまたはEPOsを含まない溶液を３回筋肉内投与した（days 0, 2, 4）。７日目および14日目に採血し、ヘモグロビン濃度（Hb）を測定した。
結果
得られたヘモグロビン濃度（Hb）の結果を図５に示す。投与されたEPOは半減期が短いため14日目にはすでにHbが低下傾向を示したが、HEPOは結合組織から徐々に血中へ放出されるため、14日目でもHbが上昇傾向を示した（Day 0: n = 8, Day 7: null: n = 6, EPO: n = 6, HEPO: n = 6, Day 14: null: n = 6, EPO: n = 4, HEPO: n = 6）。【００８２】
実施例４：HEPOの血管新生阻害作用
HEPOの血管新生阻害作用を以下の方法により検討した。
実験方法
C57BLマウスに次の方法で下肢虚血を作成した。すべての実験手順は Guide for the Care and Use of Laboratory Animals （NIH publication No.86 - 23; National Institute of Health, Bethesda, MD）に基づき無菌的に行われた。マウスをケタミン（60 mg/kg BW）およびキシラジン（6 mg/kg BW）の腹腔内投与により麻酔した。Isnerの方法に準じ左下肢の中間部に皮膚切開を加え、血管を露出した（Couffinhal T, Silver M, Zheng LP, Kearney M, Witzenbichler B, Isner JM: Mouse model of angiogenesis. Am J Pathol 152: 1667 - 1679, 1998）。大腿動脈起始部を結紮ののちその末梢の伏在動脈を結紮し、その他の側枝を剥離して本管とともに切除した。なお、全てのマウスには通常の食事及び飲み水を与えた。【００８３】
下肢虚血を作成したマウスの虚血筋肉内に2 μg/kg体重のEPOまたはHEPOまたはEPOsを含まない溶液を２回（days 0, 3）または３回（days 0, 2, 4）投与し、７日目の血流回復をレーザードップラー法で測定した（x2: null: n = 9, EPO: n = 9, HEPO: n = 6, x3: null: n = 6, EPO: 6, HEPO: n = 7）。比較のために虚血作成１日後の値も示す（n = 5）。なお、C57BLマウスは虚血から自然回復する性質のマウスである。
結果
得られた血管新生阻害作用の結果を図５示す。図から明らかなように、HEPOには血流の自然回復を阻害する作用が観察された。２回筋注より３回筋注のほうが血管新生促進作用が強いが、これは所謂「針治療効果」であり、null群とEPO群で差はなかった。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図３】
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【配列表】
2010071190000001.app
【国際調査報告】
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