(57)【要約】  本発明は、検体中のマイコプラズマの有無を検査するための方法の提供を目的とする。検体中のマイコプラズマの有無を検査するための方法であって、（ａ）検体を培養するステップ、および（ｂ）培養した検体から核酸を抽出し、マイコプラズマ由来の核酸配列を増幅することができるプライマーを用いて核酸の増幅を行うステップ、を含み、検体は、バイオテクノロジー関連製品またはその一部である、前記方法により、上記課題が解決された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中のマイコプラズマの有無を検査するための方法であって、
（ａ）検体を培養するステップ、および
（ｂ）培養した検体から核酸を抽出し、マイコプラズマ由来の核酸配列を増幅することができるプライマーを用いて核酸の増幅を行うステップ、
を含み、検体は、バイオテクノロジー関連製品またはその一部である、前記方法。
【請求項２】
検体が、再生医療関連製品またはその一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核酸の増幅を行うステップが、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction；ポリメラーゼ連鎖反応）法により行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ｃ）ステップ（ｂ）により得られた増幅産物の電気泳動を行うステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）において、嫌気培養を行うことを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）において、２以上の検体をそれぞれ好気または嫌気で培養を行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）において培養される検体の量が、１０μＬ〜１０ｍＬである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）において、培養が３〜１４日間行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）において核酸を抽出する前に、夾雑物を除去することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
夾雑物を除去することが、検体をフィルター濾集することにより行われる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
フィルターの分画分子量が１０００ＫＤａ以下である、またはフィルターの孔径が０．２２μｍ以下である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
再生医療関連製品が、加工が施された細胞、加工に供される細胞、加工や検査の際に用いられる試薬、細胞を培養するための培地、細胞を洗浄するための細胞洗浄液、および再生医療等製品を保存するための保存液から選択される少なくとも一つを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
バイオテクノロジー関連製品の品質を管理する方法であって、
請求項１〜１２に記載の方法によって、検体中のマイコプラズマの有無を検査するステップを含む、前記方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法に用いるためのキットであって、マイコプラズマを培養するための培地およびマイコプラズマ由来の核酸配列を増幅することができるプライマーを含む、前記キット。
【請求項１５】
夾雑物を除去するためのフィルターをさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコプラズマの有無を検査する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコプラズマは、培養細胞の代表的汚染微生物としてよく知られている。マイコプラズマとは、一般的にMollicutes綱に属する微生物を指し、細胞に寄生しなくても自己複製可能な微生物の中では最小であり、多形性・濾過性を示す。また、細胞壁を持たないため、ペニシリン等のβ−ラクタム系抗生物質に耐性である。通常の顕微鏡観察で発見することは困難であり、また汚染を目視で判断することは難しく、汚染に気づかずに培養・継代が行われる場合が多い。マイコプラズマ汚染の影響としては、感染した培養細胞の代謝異常、サイトカインの誘導および染色体変異等がある。人体においては、マイコプラズマの細胞質膜表面タンパク質が抗原として働き、炎症性サイトカイン類を誘導する等、免疫系に影響を与えることが知られている。また、一部のマイコプラズマは肺炎、尿道炎、関節炎などの疾病を引き起す恐れもある。したがって、動物に由来する生体材料を用いて製造を行う、生きた細胞・組織を用いる再生医療、臓器や組織の再生を目的としない細胞治療（例えば、がん細胞免疫療法）、培養・活性化・分化誘導などの加工をする細胞・組織加工製品、細胞加工物、ワクチン及び抗体医薬などの分野において、マイコプラズマ否定試験は必要とされている。【０００３】
第十七改正日本薬局方には、マイコプラズマ否定試験として、Ａ．培養法、Ｂ．指標細胞を用いたＤＮＡ染色法、Ｃ．核酸増幅法（ＮＡＴ）法が記載されている。培養法は、１４日間の液体培地での培養に続く、１４日間の寒天培地での培養の合計２８日の長い培養期間が必要である。ＤＮＡ染色法は、試験に必要な期間は７日程度であるが、感度が低く、検体は１ｍＬ以上必要である。また核酸増幅法においては、試験に必要な期間は数日程度であるが、通常１〜１０ｍＬ程度の検体を必要とする。その他の方法として、培養法における１４日間の寒天培地での培養をＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction；ポリメラーゼ連鎖反応）による検出に置き換えた方法が報告されている（非特許文献１）。しかしながら、当該方法においても、１４日程度培養することが必要とされ、検体は１ｍＬ程度必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】「前培養とＰＣＲ法を組み合わせたマイコプラズマ生菌の検出」動薬検年報  第４４号１３−２０（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、マイコプラズマの有無を検査する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
再生医療等製品の製造においては、患者の自己の細胞を用いている場合など、製造可能な最終製品の量に限りがある場合がある。また、その製品の寿命は、一般的な医薬品と比較して、著しく短い。したがって、再生医療等製品においては、一般的な医薬品と異なり、品質試験に必要な検体の量が少量で、試験に必要な期間も短いことが望ましい。にもかかわらずマイコプラズマ否定試験においては、上述のとおり、培養法は試験期間に必要な期間が２８日と、製品の寿命に比して長い期間が求められ、ＤＮＡ染色法、核酸増幅法および改良された培養法は、１ｍＬ以上と多量の検体が必要であり、いずれの方法も再生医療の分野において好ましい方法ではなかった。【０００７】
本発明者らは、マイコプラズマの有無を検査する方法について研究する中で、核酸増幅法における核酸を増幅する工程の前にマイコプラズマを培養する工程を組み込むことにより、少量の検体からマイコプラズマの存在を検出することができることを見出し、再生医療等製品において有利に用い得る新たなマイコプラズマの検査方法を完成させた。かかる方法についてさらなる研究を進めたところ、培養法やＤＮＡ染色法では問題とならない製品及びまたは試験材料に含まれる生物由来材料等からのマイコプラズマ核酸断片の試験系への混入が、偽陽性を生じさせる場合があるという新たな課題に直面した。かかる課題に対し、本発明者らは、核酸を増幅する工程の前に夾雑物を除去する工程を組み込むことで、偽陽性を減らすことができるという新たな知見を得た。そしてかかる知見に基づいてさらに研究を続けた結果、本発明を完成させた。【０００８】
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］検体中のマイコプラズマの有無を検査するための方法であって、
（ａ）検体を培養するステップ、および
（ｂ）培養した検体から核酸を抽出し、マイコプラズマ由来の核酸配列を増幅することができるプライマーを用いて核酸の増幅を行うステップ、
を含み、検体は、バイオテクノロジー関連製品またはその一部である、前記方法。
［２］検体が、再生医療関連製品またはその一部である、［１］に記載の方法。
［３］核酸の増幅を行うステップが、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction；ポリメラーゼ連鎖反応）法により行われる、［１］または［２］に記載の方法。
［４］（ｃ）ステップ（ｂ）により得られた増幅産物の電気泳動を行うステップをさらに含む、［１］〜［３］のいずれか一つに記載の方法。
［５］ステップ（ａ）において、嫌気培養を行うことを含む、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の方法。【０００９】
［６］ステップ（ａ）において、２以上の検体をそれぞれ好気または嫌気で培養を行う、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の方法。
［７］ステップ（ａ）において培養される検体の量が、１０μＬ〜１０ｍＬである、［１］〜［６］のいずれか一つに記載の方法。
［８］ステップ（ａ）において、培養が３〜１４日間行われる、［１］〜［７］のいずれか一つに記載の方法。
［９］ステップ（ｂ）において核酸を抽出する前に、夾雑物を除去することをさらに含む、［１］〜［８］のいずれか一つに記載の方法。
［１０］夾雑物を除去することが、検体をフィルター濾集することにより行われる、［１］〜［９］のいずれか一つに記載の方法。【００１０】
［１１］フィルターの分画分子量が１０００ＫＤａ以下である、またはフィルターの孔径が０．２２μｍ以下である、［１］〜［１０］のいずれか一つに記載の方法。
［１２］再生医療関連製品が、加工が施された細胞、加工に供される細胞、加工や検査の際に用いられる試薬、細胞を培養するための培地、細胞を洗浄するための細胞洗浄液、および再生医療等製品を保存するための保存液から選択される少なくとも一つを含む、［１］〜［１１］のいずれか一つに記載の方法。
［１３］バイオテクノロジー関連製品の品質を管理する方法であって、
［１］〜［１２］に記載の方法によって、検体中のマイコプラズマの有無を検査するステップを含む、前記方法。
［１４］［１］〜［１２］のいずれか一つに記載の方法に用いるためのキットであって、マイコプラズマを培養するための培地およびマイコプラズマ由来の核酸配列を増幅することができるプライマーを含む、前記キット。
［１５］夾雑物を除去するためのフィルターをさらに含む、［１４］に記載のキット。【００１１】
［Ｉ］検体中のマイコプラズマの有無を検査するための方法であって、
（ｉ）検体を含む組成物から夾雑物を除去するステップ、および
（ｉｉ）夾雑物が除去された検体を含む組成物から核酸を抽出し、マイコプラズマ由来の核酸配列を増幅することができるプライマーを用いて核酸の増幅を行うステップ、
を含む、前記方法。
［ＩＩ］核酸の増幅を行うステップが、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction；ポリメラーゼ連鎖反応）法により行われる、［Ｉ］に記載の方法。
［ＩＩＩ］（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）により得られた増幅産物の電気泳動を行うステップをさらに含む、［Ｉ］または［ＩＩ］に記載の方法。
［ＩＶ］ステップ（ｉ）において、夾雑物を除去するステップが、検体をフィルター濾集することにより行われる、［Ｉ］〜［ＩＩＩ］のいずれか一つに記載の方法。
［Ｖ］フィルターの分画分子量が１０００ＫＤａ以下である、またはフィルターの孔径が０．２２μｍ以下である、［Ｉ］〜［ＩＶ］のいずれか一つに記載の方法。【００１２】
［ＶＩ］ステップ（ｉｉ）の前に検体を培養することを含む、［Ｉ］〜［Ｖ］のいずれか一つに記載の方法。
［ＶＩＩ］ステップ（ｉ）の前に検体を培養することを含む、［Ｉ］〜［ＶＩ］のいずれか一つに記載の方法。
［ＶＩＩＩ］検体が、バイオテクノロジー関連製品またはその一部である、［Ｉ］〜［ＶＩＩ］のいずれか一つに記載の方法。
［ＩＸ］検体が、再生医療関連製品またはその一部である、［Ｉ］〜［ＶＩＩＩ］のいずれか一つに記載の方法。
［Ｘ］再生医療関連製品が、加工が施された細胞、加工に供される細胞、加工や検査の際に用いられる試薬、細胞を培養するための培地、細胞を洗浄するための細胞洗浄液、および再生医療等製品を保存するための保存液から選択される少なくとも一つを含む、［Ｉ］〜［ＩＸ］のいずれか一つに記載の方法。
［ＸＩ］バイオテクノロジー関連製品の品質を管理する方法であって、
［Ｉ］〜［Ｘ］に記載の方法によって、検体中のマイコプラズマの有無を検査するステップを含む、前記方法。
［ＸＩＩ］［Ｉ］〜［Ｘ］のいずれか一つに記載の方法に用いるためのキットであって、マイコプラズマ由来の核酸配列を増幅することができるプライマーおよび夾雑物を除去するためのフィルターを含む、前記キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、少量の検体からでも、短期間で、１０ｃｆｕ/ｍＬ以下の感度でマイコプラズマを検出することができる。試験に要する期間が短くてすみ、また試験に供する検体が少量ですむため、特に再生医療を含むバイオテクノロジーの分野において、本方法は極めて有用である。また、核酸を増幅する工程の前に夾雑物を除去する工程を組み込むことにより、偽陽性が減少した精度の高い試験を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＰＣＲ産物の電気泳動像である。（Ａ）において、Ｍは１００ｂｐラダーであり、レーン１はマイコプラズマを加えずにＰＣＲを行ったものであり、レーン２は、陽性対照（マイコプラズマ（Acholeplasma laidlawii）を加えてＰＣＲを行ったもの）である。（Ｂ）において、Ｍは１００ｂｐラダーであり、レーン１〜３はマイコプラズマを加えずに、フィルター濾集後にＰＣＲを行ったものであり、レーン４〜６は、陽性対照（マイコプラズマ（Acholeplasma laidlawii）を加え、フィルター濾集後にＰＣＲを行ったもの）である。
【図２】図２は、細胞検体におけるマイコプラズマの増殖性を表すグラフである。（Ａ）は好気培養した結果、（Ｂ）は嫌気培養した結果を表す。縦軸は、マイコプラズマの濃度（ｃｆｕ／ｍＬ、対数表示）を、横軸は、培養日数（日）を表す。
【図３】図３は、培地検体におけるマイコプラズマの増殖性を表すグラフである。（Ａ）は好気培養した結果、（Ｂ）は嫌気培養した結果を表す。縦軸は、マイコプラズマの濃度（ｃｆｕ／ｍＬ、対数表示）を、横軸は、培養日数（日）を表す。
【図４】図４は、洗浄液検体におけるマイコプラズマの増殖性を表すグラフである。（Ａ）は好気培養した結果、（Ｂ）は嫌気培養した結果を表す。縦軸は、マイコプラズマの濃度（ｃｆｕ／ｍＬ、対数表示）を、横軸は、培養日数（日）を表す。
【００１５】
【図５】図５は、細胞検体におけるマイコプラズマの増殖性と検出限界を表す。縦軸は、マイコプラズマの濃度（ｃｆｕ／ｍＬ、対数表示）を表す。図中、黒色は、７日間培養後のマイコプラズマの濃度を、灰色は、検出感度を表す。
【図６】図６は、培地検体におけるマイコプラズマの増殖性と検出限界を表す。縦軸は、マイコプラズマの濃度（ｃｆｕ／ｍＬ、対数表示）を表す。図中、黒色は、７日間培養後のマイコプラズマの濃度を、灰色は、検出感度を表す。
【図７】図７は、洗浄液検体におけるマイコプラズマの増殖性と検出限界を表す。縦軸は、マイコプラズマの濃度（ｃｆｕ／ｍＬ、対数表示）を表す。図中、黒色は、７日間培養後のマイコプラズマの濃度を、灰色は、検出感度を表す。
【図８】図８は、ＰＣＲ産物の電気泳動像である。Ｍは１００ｂｐラダーであり、レーン１は陰性対照（水に対してＰＣＲを行ったもの）であり、レーン２〜４は陰性対照（検体の代わりにＰＢＳを用いて好気培養し、ＰＣＲを行ったもの）であり、５〜７は検体を好気培養し、ＰＣＲを行ったものであり、レーン８〜１０は陽性対照（検体にマイコプラズマ希釈液（Mycoplasma orale）を加えて好気培養し、ＰＣＲを行ったもの）であり、レーン１１〜１３は陰性対照（検体の代わりにＰＢＳを用いて嫌気培養し、ＰＣＲを行ったもの）であり、レーン１４〜１６は検体を嫌気培養し、ＰＣＲを行ったものであり、レーン１７〜１９は陽性対照（検体にマイコプラズマ希釈液（Mycoplasma salivarium）を加えて嫌気培養し、ＰＣＲを行ったもの）である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
【００１７】
本発明は、検体中のマイコプラズマの有無を検査するための方法であって、検体から核酸を抽出し、マイコプラズマ由来の核酸配列を増幅することができるプライマーを用いて核酸の増幅を行うステップを含む、前記方法に関する。
【００１８】
本発明において、「検体」とは、マイコプラズマの混入を検査したい任意の対象、もしくはマイコプラズマ汚染が懸念されるような対象、またはそれらの一部などであればとくに限定されない。非限定例としては、任意の生物由来の生体材料（例えば、組織、細胞、生物液体など）およびそれを原料として製造される製品（例えば、臓器の一部、融合細胞、生物由来の医薬品など）が挙げられる。具体的には、例えば、動物由来の生体材料およびそれを原料として製造される製品、動物由来の生体材料を用いて行われる試験または製造の用に供するものなどが挙げられる。動物由来の生体材料およびそれを原料として製造される製品としては、これに限定するものではないが、例えば、動物の細胞、組織、血液（全血、または全血の一部、例えば血清、血漿などを含む）、胎盤、尿、抗体、生物学的製剤（例えば、タンパク質、ポリペプチド、それらの誘導体およびそれらを構成成分とする医薬品、抗体医薬品、ワクチン、抗毒素、血液製剤など）、再生医療等製品、などが挙げられる。動物由来の生体材料を用いて行われる試験または製造の用に供するものとしては、これに限定するものではないが、例えば、動物由来の生体材料を用いて行われる試験または製造の用に供する器具（例えば細胞培養用容器など）、試薬、血清、抗体、培地、洗浄液などが挙げられる。
また、本発明の「検体」は、バイオテクノロジー関連製品とされるものや、再生医療関連製品とされるものであってもよい。
【００１９】
本発明において、「バイオテクノロジー関連製品」とは、生物学的製剤、再生医療等製品またはそれらの製造に使用する製品などを含む。
本発明において、「生物学的製剤」とは、例えば、タンパク質、ポリペプチド、それらの誘導体およびそれらを構成成分とする医薬品、抗体医薬品、ワクチン、抗毒素、血液製剤などを含む。
本発明において、生物学的製剤の製造に使用する製品とは、組み換えタンパク質またはポリペプチドを産生する細胞、血液（全血、または全血の一部、例えば血清、血漿などを含む）、胎盤、尿、細胞を培養するための培地、細胞を洗浄するための細胞洗浄液、生物学的製剤を保存するための保存液、加工や検査の際に用いられる試薬（例えば緩衝液、検出試薬、血清、成長因子、酵母抽出液など）などを含む。
組み換えタンパク質またはポリペプチドを産生する細胞としては、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、ハイブリドーマ、動物細胞（例えばＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞など）、ヒト細胞などが挙げられる。本発明において、生物学的製剤の製造に使用する製品とは、ワクチンを含むことができるが、しかし生物学的製剤の製造に使用する製品からワクチンを除外することもできる。
【００２０】
本発明において、「再生医療関連製品」とは、再生医療等製品またはその製造に使用する製品などを含む。
本発明において、「再生医療等製品」とは、（１）ヒト又は動物の細胞に培養等の加工を施したものであって、（イ）身体の構造・機能の再建・修復・形成するもの、もしくは（ロ）疾病の治療・予防を目的として使用するもの、または（２）遺伝子治療を目的として、ヒトの細胞に導入して使用するものである。「再生医療等製品」とは治療に用いられる細胞を本体として含み、例えば、加工が施された細胞や加工に供される細胞を含む。具体的には、非限定例として、造血幹細胞移植後の急性移植片対宿主病（急性ＧＶＨＤ）の治療に使用されるヒト（同種）骨髄由来間葉系幹細胞、重症心不全の治療において移植されるヒト（自己）骨格筋由来細胞シート、がん免疫療法に用いられる細胞（樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｔリンパ球など）などが挙げられる。
本発明において、再生医療等製品の製造に使用する製品とは、加工や検査の際に用いられる試薬（例えば緩衝液、検出試薬、血清、成長因子、酵母抽出液など）、細胞を培養するための培地、細胞を洗浄するための細胞洗浄液、再生医療等製品を保存するための保存液などを含む。
【００２１】
本発明において、加工が施された細胞および加工に供される細胞は、動物細胞、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト細胞である。
加工が施された細胞および加工に供される細胞の非限定例としては、例えば、体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、樹状細胞、リンパ球（ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球）など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳ（embryonic stem）細胞）、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）などを含む。体細胞は、幹細胞、特にｉＰＳ細胞から分化させたものであってもよく、具体的には、ｉＰＳ由来心筋細胞、ｉＰＳ由来樹状細胞、ｉＰＳ由来リンパ球（ＮＫ細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球）などが挙げられる。これらの細胞は遺伝子導入により修飾されていてもよく、そのような具体例としては、ＣＡＲ−Ｔ（キメラ抗原受容体−Ｔ細胞）やＴＣＲ−Ｔ（Ｔ細胞受容体−Ｔ細胞）などが挙げられる。
加工が施された細胞とは、何らかの加工を施された後に得られる細胞であり、加工に供される細胞とは何らかの加工を施す前に準備される細胞である。加工は細胞に対して加えられる何らかの操作であれば限定されず、例えば、疾患を処置するための加工であってよい。このような細胞としては、具体的には、液体中で培養された細胞、ゲル内等の環境で培養された細胞、培養されたのちに細胞接着を介して三次元的に構成された細胞培養物、シート状細胞培養物、細胞密度を調整された細胞懸濁液、培養して増殖させた細胞、増殖させて凍結に供する細胞、凍結状態から融解した細胞、細胞の数や密度を調製した細胞、投与のために投与デバイスにセットされる細胞などが挙げられる。
【００２２】
このような細胞により処置される疾患としては、限定されずに、例えば、心疾患、肺疾患、肝疾患、膵臓疾患、腎臓疾患、大腸疾患、小腸疾患、脊髄疾患、中枢神経系疾患、骨疾患、眼疾患、または皮膚疾患などが挙げられる。疾患には血液がんや固形がんなどのがん（悪性新生物）が含まれる。使用される細胞が筋芽細胞や（ｉＰＳ由来の）心筋細胞である場合には、疾患として心筋梗塞（心筋梗塞に伴う慢性心不全を含む）、拡張型心筋症、虚血性心筋症、収縮機能障害（例えば、左室収縮機能障害）を伴う心疾患（例えば、心不全、特に慢性心不全）などが挙げられる。
【００２３】
本発明の一態様において、再生医療関連製品は、加工が施された細胞、加工に供される細胞、加工や検査の際に用いられる試薬、細胞を培養するための培地、細胞を洗浄するための細胞洗浄液、および再生医療等製品を保存するための保存液から選択される少なくとも一つを含む。具体的には、シート状細胞培養物、シート状細胞培養物を製造するための細胞（例えば凍結保存細胞など）、シート調製培地、細胞洗浄液などが挙げられる。
本発明の一態様において、再生医療関連製品は、加工が施された細胞および加工に供される細胞から選択される少なくとも一つを含む。
本発明の一態様において、再生医療関連製品は、筋芽細胞およびｉＰＳ由来心筋細胞から選択される少なくとも一つを含む。
本発明の一態様において、再生医療関連製品は、間葉系幹細胞および線維芽細胞から選択される少なくとも一つを含む。
本発明の一態様において、再生医療関連製品は、樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＣＡＲ−ＴおよびＴＣＲ−Ｔから選択される少なくとも一つを含む。
【００２４】
本発明において、シート状細胞培養物とは、細胞が互いに連結してシート状になったものをいう。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介する細胞接着を含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、１の細胞層から構成されるもの（単層）であっても、２以上の細胞層から構成されるもの（積層体（多層）、例えば、２層、３層、４層、５層、６層など）であってもよい。
【００２５】
本発明において、シート状細胞培養物は、ヒト又は動物の治療に用いられるものであり、シート状細胞培養物を構成する細胞は、動物細胞、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト細胞である。
本発明において、シート状細胞培養物を構成する細胞は、シート状細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、接着細胞（付着性細胞）を含む。接着細胞は、例えば、接着性の体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）などを含む。体細胞は、幹細胞、特にｉＰＳ細胞から分化させたものであってもよい。
また、シート状細胞培養物を構成する細胞の非限定例としては、例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞など）、肝細胞（例えば、肝実質細胞など）、膵細胞（例えば、膵島細胞など）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等が挙げられる。シート状細胞培養物はこれらの細胞から構成され、具体的には、骨格筋芽細胞シートやｉＰＳ由来心筋細胞シート、間葉系幹細胞シート、線維芽細胞シートなどが挙げられる。
【００２６】
本発明において、マイコプラズマとは、Mollicutes網に分類される細菌であれば特に限定されない。具体的には、とくに限定されないが、例えば、Mycoplasmataceae科のMycoplasma属、Acholeplasmataceae科のAcholeplasma属、Spiroplasmataceae科のSpiroplasma属などの細菌などが挙げられる。より具体的には、Mycoplasma arginini、Mycoplasma salivarium、Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma fermentans、Mycoplasma orale、Mycoplasma hyorhinis、Mycoplasma synoviae、Acholeplasma laidlawii、Spiroplasma citriなどが挙げられる。本明細書において、Mycoplasma argininiをＭａ、Mycoplasma salivariumをＭｓ、Mycoplasma pneumoniaeをＭｐ、Mycoplasma fermentansをＭｆ、Mycoplasma oraleをＭｏ、Mycoplasma hyorhinisをＭｈ、Acholeplasma laidlawiiをＡｌとも称する。
【００２７】
本発明において、検体の量は、マイコプラズマが、本方法の検出感度を超える量に増殖するのに必要な量であればよく、当該技術分野において通常の知識を有するものであれば、最適な量を設定することができる。非限定例としては、１０μＬ、１５μＬ、２０μＬ、２５μＬ、３０μＬ、３５μＬ、４０μＬ、４５μＬ、５０μＬ、５５μＬ、６０μＬ、６５μＬ、７０μＬ、７５μＬ、８０μＬ、８５μＬ、９０μＬ、９５μＬ、１００μＬ、１１０μＬ、１２０μＬ、１３０μＬ、１４０μＬ、１５０μＬ、１６０μＬ、１７０μＬ、１８０μＬ、１９０μＬ、２００μＬ、２５０μＬ、３００μＬ、３５０μＬ、４００μＬ、４５０μＬ、５００μＬ、５５０μＬ、６００μＬ、６５０μＬ、７００μＬ、７５０μＬ、８００μＬ、８５０μＬ、９００μＬ、９５０μＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、７ｍＬ、８ｍＬ、９ｍＬ、１０ｍＬなどが挙げられる。
【００２８】
本発明において、検体の量の下限値は、マイコプラズマが、本方法の検出感度を超える量に増殖するのに必要な量であれば特に限定されない。非限定例としては、１０μＬ以上、１５μＬ以上、２０μＬ以上、２５μＬ以上、３０μＬ以上、３５μＬ以上、４０μＬ以上、４５μＬ以上、５０μＬ以上、５５μＬ以上、６０μＬ以上、６５μＬ以上、７０μＬ以上、７５μＬ以上、８０μＬ以上、８５μＬ以上、９０μＬ以上、９５μＬ以上、１００μＬ以上などが挙げられる。好ましくは、１００μＬである。
【００２９】
本発明において、検体の量の上限値は、特に限定されないが、本発明の方法を再生医療関連製品に用いる場合は、本方法の検出感度を達成することができる量の中でなるべく少ない量が好ましい。非限定例としては、１０ｍＬ以下、９ｍＬ以下、８ｍＬ以下、７ｍＬ以下、６ｍＬ以下、５ｍＬ以下、４ｍＬ以下、３ｍＬ以下、２ｍＬ以下、１ｍＬ以下、９５０μＬ以下、９００μＬ以下、８５０μＬ以下、８００μＬ以下、７５０μＬ以下、７００μＬ以下、６５０μＬ以下、６００μＬ以下、５５０μＬ以下、５００μＬ以下、４５０μＬ以下、４００μＬ以下、３５０μＬ以下、３００μＬ以下、２５０μＬ以下、２００μＬ以下、１５０μＬ以下、１００μＬ以下などが挙げられる。
【００３０】
本発明において、検体の量の範囲は、上記例示した上限値および下限値の任意の組み合わせなどが挙げられる。すなわち、例えば、１０μＬ〜１０ｍＬ、１０μＬ〜９ｍＬ、１０μＬ〜８ｍＬ、１０μＬ〜７ｍＬ、１０μＬ〜６ｍＬ、１０μＬ〜５ｍＬ、１０μＬ〜４ｍＬ、１０μＬ〜３ｍＬ、１０μＬ〜２ｍＬ、１０μＬ〜１ｍＬ、１０〜９００μＬ、１０〜８００μＬ、１０〜７００μＬ、１０〜６００μＬ、１０〜５００μＬ、１０〜４００μＬ、１０〜３００μＬ、１０〜２００μＬ、１０〜１００μＬ、１００μＬ〜１０ｍＬ、１００μＬ〜９ｍＬ、１００μＬ〜８ｍＬ、１００μＬ〜７ｍＬ、１００μＬ〜６ｍＬ、１００μＬ〜５ｍＬ、１００μＬ〜４ｍＬ、１００μＬ〜３ｍＬ、１００μＬ〜２ｍＬ、１００μＬ〜１ｍＬ、１００〜９００μＬ、１００〜８００μＬ、１００〜７００μＬ、１００〜６００μＬ、１００〜５００μＬ、１００〜４００μＬ、１００〜３００μＬ、１００〜２００μＬなどが挙げられる。とくに好ましくは、１００〜１０００μＬであり、さらに好ましくは１００〜５００μＬである。
【００３１】
本発明において、核酸とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、好ましくはＤＮＡである。
本発明において、検体から核酸を抽出する方法としては、マイコプラズマの核酸を抽出することができるものであればとくに限定されず、当業者であれば適宜最適な手法を選択することができる。例えば、フェノール・クロロホルム抽出や、担体を用いて抽出する方法などであってもよい。市販されている核酸抽出のためのキットを用いて行ってもよい。
【００３２】
本発明において、核酸を増幅する方法は、マイコプラズマ由来の核酸配列を増幅することができるものであればとくに限定されず、当業者であれば適宜最適な手法を選択することができる。
本発明において、核酸を増幅する方法としては、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction；ポリメラーゼ連鎖反応）法、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification；ループ介在等温増幅）法などが挙げられる。
本発明の一態様において、核酸の増幅を行うステップは、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction；ポリメラーゼ連鎖反応）法により行われる。ＰＣＲ法において、マイコプラズマ由来の核酸配列を増幅することができるプライマー、ポリメラーゼ、バッファ、ＰＣＲ条件（温度、時間、サイクル数等）などは、適宜選択することができる。
本発明において、ＰＣＲは、例えば、通常のＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲなどであってもよい。好ましくは通常のＰＣＲである。
【００３３】
上述のとおり、本発明においてプライマーは、マイコプラズマ由来の核酸配列を増幅することができるものであればいかなるものを用いてもよい。マイコプラズマ由来の核酸配列を増幅することができるプライマーの非限定例は、以下の配列：
Forward：5’ -GGCGAATGGGTGAGTAACACG- 3’
Reverse：5’ -CGGATAACGCTTGCGACCTATG- 3’
を含む。
【００３４】
本発明の一側面は、検体中のマイコプラズマの有無を検査するための方法であって、
（ａ）検体を培養するステップ、および
（ｂ）培養した検体から核酸を抽出し、マイコプラズマ由来の核酸配列を増幅することができるプライマーを用いて核酸の増幅を行うステップを含み、検体は、バイオテクノロジー関連製品またはその一部である、前記方法に関する。
【００３５】
本発明の一態様において、検体は、再生医療関連製品またはその一部である。
本発明の一態様において、再生医療関連製品は、加工が施された細胞、加工に供される細胞、加工や検査の際に用いられる試薬、細胞を培養するための培地、細胞を洗浄するための細胞洗浄液、および再生医療等製品を保存するための保存液から選択される少なくとも一つを含む。具体的には、シート状細胞培養物、シート状細胞培養物を製造するための細胞（例えば凍結保存細胞など）、シート調製培地、細胞洗浄液などが挙げられる。
【００３６】
本発明の一態様において、本方法は、（ｃ）ステップ（ｂ）により得られたＰＣＲ産物の電気泳動を行うステップをさらに含む。
本発明において、増幅産物の電気泳動は、増幅された核酸を検出することができる方法であればとくに限定されず、当業者であれば適宜最適な手法を選択することができる。例えば、アガロースゲルなどのゲルの調製方法、バッファの選択、バンドの確認方法は、当業者であれば適宜最適な手法を選択することができる。バンドを確認する方法としては、例えば、エチジウムブロマイドやSYBR（登録商標）Greenなどによる核酸の染色や、サザンブロッティング法などが挙げられる。
【００３７】
本発明において、培養の条件は、マイコプラズマを増殖させることができる方法であればとくに限定されず、当業者であれば適宜最適な手法を選択することができる。例えば、培地の種類や組成、培養温度、雰囲気、ＣＯ２濃度なども適宜選択することができる。
本発明において、培養は、好気培養で行っても嫌気培養で行ってもよく、検査したいマイコプラズマの種類に応じて適宜選択することができる。例えば、Mycoplasma arginini、Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma fermentans、Mycoplasma orale、Acholeplasma laidlawiiの５種については、好気的条件下、嫌気的条件下のいずれにおいても増殖することができるが、Mycoplasma salivariumは嫌気的条件下でのみ増殖することができ、Mycoplasma hyorhinisについては好気的条件下でのみ増殖することができるため、Mycoplasma salivarium以外の６種については好気的条件下で培養し、Mycoplasma salivariumについては嫌気的条件下で培養してもよい。７種全てについて検査を行うために、２以上の検体をそれぞれ好気または嫌気で培養を行うことができる。
本発明の一態様において、本方法は、ステップ（ａ）において、嫌気培養を行うことを含む。
本発明の一態様において、本方法は、ステップ（ａ）において、２以上の検体をそれぞれ好気または嫌気で培養を行う。
【００３８】
本発明の一態様において、ステップ（ａ）において培養される検体の量は、１０μＬ〜１０ｍＬである。
本発明の一態様において、ステップ（ａ）において培養される検体の量は、１００μＬ〜１ｍＬである。
本発明の一態様において、ステップ（ａ）において培養される検体の量は、１００μＬ〜５００μＬである。
【００３９】
本発明において、培養する期間は、マイコプラズマが、本方法により得られる検出感度を超える量に増殖するのに十分な期間であればよく、任意に設定することができる。培養する期間は、非限定例としては、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日である。培養する期間の範囲は、非限定例としては、１日〜１４日、１日〜７日、３〜１４日、３日〜７日、６〜１０日である。好ましくは３〜１４日、より好ましくは６〜１０日である。
本発明の一態様において、培養は６〜１０日間行われる。
また、本発明の一態様において、培養は３〜７日間行われる。
【００４０】
本発明の一態様において、本方法は、ステップ（ｂ）において核酸を抽出する前に、夾雑物を除去することをさらに含む。
本発明において、夾雑物とは、例えば、マイコプラズマの菌体以外の物質であり、具体的には、核酸、タンパク質などであり、好ましくは、マイコプラズマの核酸断片である。
本発明において、夾雑物を除去することは、除去前と比較して、夾雑物が減少している方法であればよい。夾雑物を除去する方法としては、例えば、検体をフィルターにより濾過または濾集する方法や、遠心分離により集菌する方法などが挙げられる。
本発明において、夾雑物はフィルターを通過して除去されても、フィルターを通過せずにフィルター上に残ることで除去されてもよい。好ましくは、夾雑物はフィルターを通過して除去される。
本発明の一態様において、夾雑物を除去することは、検体をフィルター濾集することにより行われる。
【００４１】
濾集のためのフィルターには、市販のフィルターを用いることができる。フィルターの孔径は、例えば、０．２２μｍ、０．１μｍ、０．０１μｍ、０．００５μｍである。例えば、孔径が０．１μｍであるフィルターであれば、０．１μｍ程度の物質、例えばウイルスなどを捕捉することができる。フィルターは特定の分子量の夾雑物を排除するように設計されているフィルターであってもよく、例えば、フィルターの分画分子量（ＭＷＣＯ）は、１０００ＫＤａ、１００ＫＤａ、５０ＫＤａである。例えば、分画分子量が１００ＫＤａであるフィルターは、１００ＫＤａ程度の物質を捕捉することができるフィルターである。本発明において、フィルターの分画分子量は、５０〜１０００ＫＤａであり、好ましくは、５０〜１００ＫＤａである。
本発明において、夾雑物は、フィルターの分画分子量より小さく、フィルターを通過して除去されてもよく、またフィルターの分画分子量より大きく、フィルターを通過せずにフィルター上に残ることで除去されてもよい。好ましくは、夾雑物は、フィルターの分画分子量より小さく、フィルターを通過する。
本発明の一態様において、フィルターの分画分子量は１０００ＫＤａ以下である、またはフィルターの孔径は０.２２μｍ以下である。
本発明の一態様において、フィルターの分画分子量は１００ＫＤａ以下である。
【００４２】
本発明の一側面は、バイオテクノロジー関連製品の品質を管理する方法であって、本発明の方法によって、検体中のマイコプラズマの有無を検査するステップを含む、前記方法に関する。
本発明の一側面は、再生医療関連製品の品質を管理する方法であって、本発明の方法によって、検体中のマイコプラズマの有無を検査するステップを含む、前記方法に関する。
【００４３】
本発明の一側面は、検体中のマイコプラズマの有無を検査するための方法であって、
（ｉ）検体を含む組成物から夾雑物を除去するステップ、および
（ｉｉ）夾雑物が除去された検体から核酸を抽出し、マイコプラズマ由来の核酸配列を増幅することができるプライマーを用いて核酸の増幅を行うステップ、
を含む、前記方法に関する。
【００４４】
本発明において、検体を含む組成物とは、例えば、検体に加えて、マイコプラズマの有無を検査するために用いられる培地、試薬などを含む組成物である。
本発明において、夾雑物とは、例えば、マイコプラズマの菌体以外の物質であり、具体的には、核酸やタンパク質などであり、好ましくは、マイコプラズマの核酸断片である。
本発明において、夾雑物を除去することは、除去前と比較して、夾雑物が減少している方法であればよい。夾雑物を除去する方法としては、例えば、検体をフィルターにより濾過または濾集する方法や、遠心分離により集菌する方法などが挙げられる。
本発明において、夾雑物はフィルターを通過して除去されても、フィルターを通過せずにフィルター上に残ることで除去されてもよい。好ましくは、夾雑物はフィルターを通過して除去される。
本発明の一態様において、ステップ（ｉ）において、夾雑物を除去するステップは、検体をフィルター濾集することにより行われる。
【００４５】
濾集のためのフィルターには、市販のフィルターを用いることができる。フィルターの孔径は、例えば、０．２２μｍ、０．１μｍ、０．０１μｍ、０．００５μｍである。例えば、孔径が０．１μｍであるフィルターであれば、０．１μｍ程度の物質、例えばウイルスなどを捕捉することができる。フィルターは特定の分子量の夾雑物を排除するように設計されているフィルターであってもよく、例えば、フィルターの分画分子量（ＭＷＣＯ）は、１０００ＫＤａ、１００ＫＤａ、５０ＫＤａである。例えば、分画分子量が１００ＫＤａであるフィルターは、１００ＫＤａ程度の物質を捕捉することができるフィルターである。本発明において、フィルターの分画分子量は、５０〜１０００ＫＤａであり、好ましくは、５０〜１００ＫＤａである。
本発明において、夾雑物は、フィルターの分画分子量より小さく、フィルターを通過して除去されてもよく、またフィルターの分画分子量より大きく、フィルターを通過せずにフィルター上に残ることで除去されてもよい。好ましくは、夾雑物は、フィルターの分画分子量より小さく、フィルターを通過する。
本発明の一態様において、フィルターの分画分子量は１０００ＫＤａ以下である、またはフィルターの孔径は０.２２μｍ以下である。
本発明の一態様において、フィルターの分画分子量は１００ＫＤａ以下である。
【００４６】
本発明の一態様において、本方法は、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）により得られた増幅産物の電気泳動を行うステップをさらに含む。
本発明において、増幅産物の電気泳動は、増幅された核酸を検出することができる方法であればとくに限定されず、当業者であれば適宜最適な手法を選択することができる。例えば、アガロースゲルなどのゲルの調製方法、バッファの選択、バンドの確認方法は、当業者であれば適宜最適な手法を選択することができる。バンドを確認する方法としては、例えば、エチジウムブロマイドやSYBR（登録商標）Greenなどによる核酸の染色や、サザンブロッティング法などが挙げられる。
【００４７】
本発明において、培養の条件は、マイコプラズマを増殖させることができる方法であればとくに限定されず、当業者であれば適宜最適な手法を選択することができる。例えば、培地の種類や組成、培養温度、雰囲気、ＣＯ２濃度なども適宜選択することができる。
本発明において、培養は、好気培養で行っても嫌気培養で行ってもよく、検査したいマイコプラズマの種類に応じて適宜選択することができる。
例えば、Mycoplasma arginini、Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma fermentans、Mycoplasma orale、Acholeplasma laidlawiiの５種については、好気的条件下、嫌気的条件下のいずれにおいても増殖することができるが、Mycoplasma salivariumは嫌気的条件下でのみ増殖することができ、Mycoplasma hyorhinisについては好気的条件下でのみ増殖することができるため、Mycoplasma salivarium以外の６種については好気的条件下で培養し、Mycoplasma salivariumについては嫌気的条件下で培養してもよい。７種全てについて検査を行うために、２以上の検体をそれぞれ好気または嫌気で培養を行うことができる。
本発明の一態様において、本方法は、ステップ（ｉｉ）の前に検体を培養することを含む。
本発明の一態様において、本方法は、ステップ（ｉ）の前に検体を培養することを含む。
【００４８】
本発明において、培養する期間は、マイコプラズマが、本方法により得られる検出感度を超える量に増殖するのに十分な期間であればよく、任意に設定することができる。培養する期間は、非限定例としては、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日である。培養する期間の範囲は、非限定例としては、１日〜１４日、１日〜７日、３〜１４日、３日〜７日、６〜１０日である。好ましくは３〜１４日、より好ましくは６〜１０日である。
【００４９】
本発明の一態様において、検体は、バイオテクノロジー関連製品またはその一部である。
本発明の一態様において、検体は、再生医療関連製品またはその一部である。
本発明の一態様において、再生医療関連製品は、加工が施された細胞、加工に供される細胞、加工や検査の際に用いられる試薬、細胞を培養するための培地、細胞を洗浄するための細胞洗浄液、および再生医療等製品を保存するための保存液から選択される少なくとも一つを含む。具体的には、シート状細胞培養物、シート状細胞培養物を製造するための細胞（例えば凍結保存細胞など）、シート調製培地、細胞洗浄液などが挙げられる。
【００５０】
本発明の一側面は、バイオテクノロジー関連製品の品質を管理する方法であって、本発明の方法によって、検体中のマイコプラズマの有無を検査するステップを含む、前記方法に関する。
本発明の一側面は、再生医療関連製品の品質を管理する方法であって、本発明の方法によって、検体中のマイコプラズマの有無を検査するステップを含む、前記方法に関する。
【００５１】
本発明の一側面において、マイコプラズマの有無を検査する方法に用いるためのキットであって、マイコプラズマ由来の核酸配列を増幅することができるプライマーを含む、キットに関する。
本発明のキットは、マイコプラズマ由来の核酸配列を増幅することができるプライマーに加え、マイコプラズマを培養するための培地、および／または夾雑物を除去するためのフィルターを含む。
本発明のキットは、例えば、マイコプラズマを培養するための器具、核酸の抽出に用いる試薬または器具、核酸の増幅に用いる試薬、その他の器具類、使用方法に関する指示をさらに含んでいてもよい。
【００５２】
マイコプラズマを培養するための器具としては、例えば、プレート、チューブなどが挙げられる。核酸の抽出に用いる器具または試薬としては、例えば、フェノール、クロロホルム、イソプロパノール、エタノール、ＰＥＧなどを含む試薬や、シリカビーズ、シリカメンブレンが充填されたカラム、陰イオン交換カラムなどが挙げられる。核酸の増幅に用いる試薬としては、例えば、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、バッファなどが挙げられる。その他の器具類としては、例えば、ピペット、スポイト、ピンセット、チューブなどが挙げられる。使用方法に関する指示としては、例えば、使用説明書、製造方法や使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリーなどが挙げられる。
【００５３】
本発明の一態様において、本発明のキットは、マイコプラズマを培養するための培地およびマイコプラズマ由来の核酸配列を増幅することができるプライマーを含む。
本発明の一態様において、本発明のキットは、マイコプラズマ由来の核酸配列を増幅することができるプライマーおよび夾雑物を除去するためのフィルターを含む。
本発明の一態様において、本発明のキットは、マイコプラズマを培養するための培地、マイコプラズマ由来の核酸配列を増幅することができるプライマー、および夾雑物を除去するためのフィルターを含む。
【実施例】
【００５４】
本発明を以下の例を参照してより詳細に説明するが、これらは本発明の特定の具体例を示すものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５５】
Ｉ．材料
１．マイコプラズマ株
第１７改正日本薬局方参考情報に基づき、以下の７種類のマイコプラズマを用いた。なお、いずれも公的な保管機関より入手後、５継代以内のものを用いた。
Mycoplasma arginini  ATCC23838
Mycoplasma salivarium  NBRC14478
Mycoplasma pneumoniae  NBRC14401
Mycoplasma fermentans  NBRC14854
Mycoplasma orale  NBRC14477
Mycoplasma hyorhinis  NBRC14858
Acholeplasma laidlawii  NBRC14400【００５６】
２．マイコプラズマ否定試験用液体培地
終濃度で、Heart Infusion Broth  １８．７５ｇ／Ｌ、ブドウ糖３．０ｇ／Ｌ、塩酸アルギニン３．０ｇ／Ｌ、フェノールレッド０．０２５ｇ／Ｌとなるよう混合した後、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌を行った。これに、終濃度でウマ血清１５％、酵母抽出液１０％、ペニシリンＧカリウム２５万単位／Ｌとなるよう添加した。【００５７】
３．マイコプラズマ増殖用寒天培地
終濃度で、Heart Infusion Broth  １７．５ｇ／Ｌ、カンテン１０ｇ／Ｌとなるよう混合した後、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌を行った。これに、終濃度でウマ血清２０％、酵母抽出液１０％となるよう添加した。【００５８】
４.検体
検体には、凍結保存細胞、シート調製培地、および細胞洗浄液を用いた。凍結保存細胞は、骨格筋芽細胞を３．０×１０７個／ｍＬの濃度で凍結保存液に懸濁させ、凍結したものである。以下の実験においては、３７．０℃設定の水浴中で穏やかに振り混ぜ、融解したものを試験に供した。シート調製培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地と２０％（ｖ／ｖ）量のヒト由来血清を混合したものである。細胞洗浄液は、Hanks's平衡塩液（ＨＢＳＳ（−））と０．５％（ｖ／ｖ）量のヒト血清アルブミンを混合したものである。以後、「凍結保存細胞」を単に「細胞」、「シート調製培地」を単に「培地」、および「細胞洗浄液」を単に「洗浄液」とも称する。【００５９】
ＩＩ．方法および結果
１．夾雑物除去工程の設定
マイコプラズマ否定試験用液体培地２ｍＬに、陰性対照としてマイコプラズマ生菌の混入がないことが確認された細胞１００μＬを加え、３６℃、５％ＣＯ２条件下で７日間好気培養した。また、陽性対照として、マイコプラズマ否定試験用液体培地２ｍＬに、細胞１００μＬと７５００ｃｆｕ／μＬのAcholeplasma laidlawiiを含むマイコプラズマ希釈液を１０μＬ加えたものを好気培養した。【００６０】
MagNA Pure LC DNA Isolation Kit-Large Volume（Roche）を用いてＤＮＡ抽出を行い、最終的に２００μＬのＤＮＡ抽出液とした。ＤＮＡ抽出液１０μＬに、ＰＣＲ反応液（Takara Ex taq）９０μＬ加え、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、４０℃５分を１サイクル、９４℃１０分を１サイクル、９４℃３０秒、７０℃３０秒、７２℃４５秒のサイクルを２０サイクル（７０℃の部分が２サイクル毎に１℃ずつ低下。６１℃まで）、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃４５秒のサイクルを２５サイクル、７２℃４分を１サイクルでＰＣＲを実施した。プライマーには、以下の配列を用いた。
プライマー配列：
Forward：5’ -GGCGAATGGGTGAGTAACACG- 3’
Reverse：5’ -CGGATAACGCTTGCGACCTATG- 3’
ＰＣＲ後の反応液をアガロースゲルにて電気泳動後、ＤＮＡバンドの有無を確認した。【００６１】
結果を図１（Ａ）に示す。Ｍは１００ｂｐラダーであり、レーン１はマイコプラズマを加えずにＰＣＲを行ったものであり、レーン２は、陽性対照（マイコプラズマを加えてＰＣＲを行ったもの）である。マイコプラズマを加えていないもの（レーン１）においても、マイコプラズマを加えた場合（陽性対照、レーン２）と同じサイズのバンドが現れた。検体には、マイコプラズマ生菌の混入がないことが確認された細胞を用いていることから、この試験系においてマイコプラズマの核酸断片が混入していると考えられた。【００６２】
試験系からマイコプラズマの核酸断片を除去するために、遠心式限外濾過フィルターによるマイコプラズマの捕集を検討した。
マイコプラズマ否定試験用液体培地２ｍＬに、陰性対照としてマイコプラズマ生菌の混入がないことが確認された細胞１００μＬを加え、３６℃、５％ＣＯ２条件下で７日間好気培養した。また、陽性対照として、マイコプラズマ否定試験用液体培地２ｍＬに、細胞１００μＬと７５００ｃｆｕ／μＬのAcholeplasma laidlawiiを含むマイコプラズマ希釈液を１０μＬ加えたものを好気培養した。
４℃、４００×ｇ、５分間遠心した上清５００μＬを分画分子量１００ＫＤａの遠心式限外濾過フィルター（Merck Millipore、Amicon Ultra 100KDa）に移し、４℃、１４，０００×ｇ、１０分間遠心した。ＰＢＳ  ５００μＬを加え、４℃、１４，０００×ｇ、１０分間遠心した後、さらにＰＢＳ  ５００μＬを加え、激しくピペッティングを行い、溶液を回収した。ＰＣＲ後の反応液をアガロースゲルにて電気泳動後、ＤＮＡバンドの有無を確認した。【００６３】
結果を図１（Ｂ）に示す。Ｍは１００ｂｐラダーであり、レーン１〜３はマイコプラズマを加えずにフィルター濾集後にＰＣＲを行ったものであり、レーン４〜６は、陽性対照（マイコプラズマを加え、フィルター濾集後にＰＣＲを行ったもの）である。陰性対照としたもの（レーン１〜３）においては、バンドが現れず、マイコプラズマを加えた場合（陽性対照、レーン４〜６）にのみ、バンドが現れた。以上より、遠心式限外濾過フィルターによって、試験系からマイコプラズマのＤＮＡ断片の除去が可能であることが示された。【００６４】
２．フィルターの選定
マイコプラズマを捕集するための遠心式限外濾過フィルターの検討を行った。遠心式限外濾過フィルターは分画分子量１００ＫＤａ（Merck Millipore、Amicon Ultra 100KDa）、孔径０．１μｍ（Merck Millipore、Ultrafree 0.1μm）、孔径０．２２μｍ（Merck Millipore、Ultrafree 0.22μm）の３種類を用い、マイコプラズマにはMycoplasma pneumoniaeとAcholeplasma laidlawiiを用いた。検体として、細胞、培地および洗浄液を用いた。検体が細胞の場合は、マイコプラズマ否定試験用液体培地を２０００μＬ、検体を１００μＬ、２００００ｃｆｕ／ｍＬのマイコプラズマ希釈液を１００μＬ加えた。４℃、４００×ｇ、５分間遠心した上清５００μＬをフィルターに移し、４℃、１４，０００×ｇ、１０分間遠心した。検体が培地または洗浄液の場合は、マイコプラズマ否定試験用液体培地を２０００μＬ、検体を５００μＬ、２００００ｃｆｕ／ｍＬのマイコプラズマ希釈液を１００μＬ加えた。５００μＬをフィルターに移し、４℃、１４，０００×ｇ、１０分間遠心した。ＰＢＳ  ５００μＬを加え、４℃、１４，０００×ｇ、１０分間遠心した後、さらにＰＢＳ  ５００μＬを加え、激しくピペッティングを行い、フィルターにトラップされたマイコプラズマを回収した。陰性対照として、マイコプラズマ希釈液を加えない条件で同様の操作を行った。【００６５】
フィルター回収液から、MagNA Pure LC DNA Isolation Kit-Large Volume（Roche）を用いてＤＮＡを抽出し、最終的に２００μＬのＤＮＡ抽出液とした。
ＰＣＲ反応液（Takara Ex taq）９０μＬにＤＮＡ抽出液１０μＬ加え、４０℃５分を１サイクル、９４℃１０分を１サイクル、９４℃３０秒、７０℃３０秒、７２℃４５秒のサイクルを２０サイクル（７０℃の部分が２サイクル毎に１℃ずつ低下。６１℃まで）、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃４５秒のサイクルを２５サイクル、７２℃４分を１サイクルで実施した。プライマーには、以下の配列を用いた。
プライマー配列：
Forward：5’ -GGCGAATGGGTGAGTAACACG- 3’
Reverse：5’ -CGGATAACGCTTGCGACCTATG- 3’
ＰＣＲ後の反応液をアガロースゲルにて電気泳動後、ＤＮＡバンドの有無を確認した。フィルター回収液においてマイコプラズマのＤＮＡバンドが確認できたものについて、捕集可能であると判断した。結果を表１に示す。Mycoplasma pneumoniaeについては、いずれの検体においても０．２２μｍのフィルターで、捕集が可能であった。Acholeplasma laidlawiiについては、洗浄液検体においては０．２２μｍのフィルターで、培地検体においては、０．１μｍのフィルターで、細胞検体においては、１００ＫＤａのフィルターで捕集が可能であった。すべての検体において２種類のマイコプラズマを捕集可能であったのは、１００ＫＤａのフィルターのみであった。【００６６】
【表１】
2019112028.tif 000002
【００６７】
３．マイコプラズマの増殖性の確認
細胞、培地、洗浄液の各検体に１０ｃｆｕ／ｍＬ以下となるようマイコプラズマを加え培養したときに、どの程度マイコプラズマが増殖するか、７種類のマイコプラズマについて確認した。【００６８】
検体が凍結保存細胞の場合において、ウェルに、マイコプラズマ否定試験用液体培地２ｍＬ、検体１００μＬ、所望のマイコプラズマを含むように調製されたマイコプラズマ希釈液１０μＬを加えた。マイコプラズマは、ウェルあたり、Mycoplasma argininiについて試験する場合０．８０ｃｆｕ、Mycoplasma salivariumについて試験する場合０．５４ｃｆｕ、Mycoplasma pneumoniaeについて試験する場合０．６８ｃｆｕ、Mycoplasma fermentansについて試験する場合０．６０ｃｆｕ、Mycoplasma oraleについて試験する場合０．６０ｃｆｕ、Mycoplasma hyorhinisについて試験する場合０．７４ｃｆｕ、Acholeplasma laidlawiiについて試験する場合０．８４ｃｆｕ含むように加えた。すなわち、マイコプラズマは、検体１００μＬ当たり、Mycoplasma argininiについて試験する場合０．８０ｃｆｕ／１００μＬ（８．０ｃｆｕ／ｍＬ）、Mycoplasma salivariumについて試験する場合０．５４ｃｆｕ／１００μＬ（５．４ｃｆｕ／ｍＬ）、Mycoplasma pneumoniaeについて試験する場合０．６８ｃｆｕ／１００μＬ（６．８ｃｆｕ／ｍＬ）、Mycoplasma fermentansについて試験する場合０．６０ｃｆｕ／１００μＬ（６．０ｃｆｕ／ｍＬ）、Mycoplasma oraleについて試験する場合０．６０ｃｆｕ／１００μＬ（６．０ｃｆｕ／ｍＬ）、Mycoplasma hyorhinisについて試験する場合０．７４ｃｆｕ／１００μＬ（７．４ｃｆｕ／ｍＬ）、Acholeplasma laidlawiiについて試験する場合０．８４ｃｆｕ／１００μＬ（８．４ｃｆｕ／ｍＬ）となるように加えた。【００６９】
検体がシート調製培地または細胞洗浄液である場合において、ウェルに、マイコプラズマ否定試験用液体培地２ｍＬ、検体５００μＬ、所望のマイコプラズマを含むように調製されたマイコプラズマ希釈液５０μＬを加えた。マイコプラズマは、ウェルあたり、Mycoplasma argininiについて試験する場合４．０ｃｆｕ、Mycoplasma salivariumについて試験する場合２．７ｃｆｕ、Mycoplasma pneumoniaeについて試験する場合３．４ｃｆｕ、Mycoplasma fermentansについて試験する場合３．０ｃｆｕ、Mycoplasma oraleについて試験する場合３．０ｃｆｕ、Mycoplasma hyorhinisについて試験する場合３．７ｃｆｕ、Acholeplasma laidlawiiについて試験する場合４．２ｃｆｕ含むように加えた。すなわち、検体５００μＬ当たり、マイコプラズマは、Mycoplasma argininiについて試験する場合４．０ｃｆｕ／５００μＬ（８．０ｃｆｕ／ｍＬ）、Mycoplasma salivariumについて試験する場合２．７ｃｆｕ／５００μＬ（５．４ｃｆｕ／ｍＬ）、Mycoplasma pneumoniaeについて試験する場合３．４ｃｆｕ／５００μＬ（６．８ｃｆｕ／ｍＬ）、Mycoplasma fermentansについて試験する場合３．０ｃｆｕ／５００μＬ（６．０ｃｆｕ／ｍＬ）、Mycoplasma oraleについて試験する場合３．０ｃｆｕ／５００μＬ（６．０ｃｆｕ／ｍＬ）、Mycoplasma hyorhinisについて試験する場合３．７ｃｆｕ／５００μＬ（７．４ｃｆｕ／ｍＬ）、Acholeplasma laidlawiiについて試験する場合４．２ｃｆｕ／５００μＬ（８．４ｃｆｕ／ｍＬ）となるように加えた。【００７０】
Mycoplasma salivariumを除く６種類のマイコプラズマについては３６℃、５％ＣＯ２条件下で好気培養し、Mycoplasma salivariumを３６℃条件下で嫌気培養した。培養の３日後、７日後に各ウェルから培養液を抜き取り、菌数測定を行った。
結果を図２〜４に示す。７日間培養後のマイコプラズマの量は、菌種により異なるが１５００〜１０９ｃｆｕ／ｍＬに増殖しており、この前培養工程において、少量のマイコプラズマから十分な量に増殖することが確認された。【００７１】
４．検出限界の算出
細胞、培地、洗浄液の各検体において、７種類のマイコプラズマの検出限界を算出した。【００７２】
検体が凍結保存細胞である場合において、マイクロチューブに、マイコプラズマ否定試験用液体培地８５２μＬ、検体４８μＬを加え、所望のマイコプラズマを含むように調製されたマイコプラズマ希釈液１００μＬを加えた。マイコプラズマは、マイクロチューブあたり、１０００ｃｆｕ、５００ｃｆｕ、１００ｃｆｕ、５０ｃｆｕとなるように加えた。すなわち、マイクロチューブ中の全容量に対して、１０００ｃｆｕ／ｍＬ、５００ｃｆｕ／ｍＬ、１００ｃｆｕ／ｍＬ、５０ｃｆｕ／ｍＬとなるように加えた。【００７３】
検体がシート調製培地または細胞洗浄液である場合において、マイクロチューブに、マイコプラズマ否定試験用液体培地５２５μＬ、検体１５０μＬ、所望のマイコプラズマを含むように調製されたマイコプラズマ希釈液７５μＬを加えた。マイコプラズマは、マイクロチューブあたり、７５０ｃｆｕ、３７５ｃｆｕ、７５ｃｆｕ、３７．５ｃｆｕとなるように加えた。すなわち、マイクロチューブ中の全容量に対して、１０００ｃｆｕ／ｍＬ、５００ｃｆｕ／ｍＬ、１００ｃｆｕ／ｍＬ、５０ｃｆｕ／ｍＬとなるように加えた。【００７４】
検体が凍結保存細胞である場合において、４℃、４００×ｇで５分間遠心分離した上清５００μＬを分画分子量１００ｋＤａの遠心式限外濾過フィルター（Merck Millipore）に移し、４℃、１４，０００×ｇ、１０分間遠心した。
検体が培地または洗浄液である場合において、５００μＬを分画分子量１００ｋＤａの遠心式限外濾過フィルター（Merck Millipore）に移し、４℃、１４，０００×ｇ、１０分間遠心した。ＰＢＳ  ５００μＬを加え、４℃、１４，０００×ｇ、１０分間遠心した後、さらにＰＢＳ  ５００μＬを加え、激しくピペッティングを行い、フィルターにトラップされたマイコプラズマを回収した。【００７５】
MagNA Pure LC DNA Isolation Kit-Large Volume（Roche）を用いて、夾雑物除去後の回収液全量からＤＮＡを抽出し、最終的に２００μＬのＤＮＡ抽出液とした。【００７６】
ＰＣＲ反応液（Takara Ex taq）９０μＬにＤＮＡ抽出液１０μＬ加え、４０℃５分を１サイクル、９４℃１０分を１サイクル、９４℃３０秒、７０℃３０秒、７２℃４５秒のサイクルを２０サイクル（７０℃の部分が２サイクル毎に１℃ずつ低下。６１℃まで）、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃４５秒のサイクルを２５サイクル、７２℃４分を１サイクルでＰＣＲを実施した。プライマーには、以下の配列を用いた。
プライマー配列：
Forward：5’ -GGCGAATGGGTGAGTAACACG- 3’
Reverse：5’ -CGGATAACGCTTGCGACCTATG- 3’
ＰＣＲ後の反応液をアガロースゲルにて電気泳動後、ＤＮＡバンドの有無を確認した。【００７７】
１０００ｃｆｕ／ｍＬ、５００ｃｆｕ／ｍＬ、１００ｃｆｕ／ｍＬ、５０ｃｆｕ／ｍＬの各マイコプラズマ濃度について２４回行い、マイコプラズマ濃度と陽性数（マイコプラズマに特異的なＤＮＡバンドが確認された数）の割合から、国立感染症研究所統計解析支援ソフトBioassay Assistを用い、プロビット解析を行い、９５％検出感度を算出した。結果を表２に示す。各マイコプラズマの検出限界は、９２〜５６４７ｃｆｕ／ｍＬであった。【００７８】
【表２】
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【００７９】
５．マイコプラズマの検出性
細胞、培地、洗浄液の各検体において、前培養において増殖したマイコプラズマの量と本方法における検出感度を比較し、最終的な試験方法としてマイコプラズマ汚染を高感度に検出可能であるか検証した。前培養において増殖したマイコプラズマの量と本方法における検出感度を表３および図５〜７に示す。７種のマイコプラズマ全てにおいて、３．で算出した前培養において増殖したマイコプラズマの量は、４．で算出した検出感度を超えるものであった。したがって、７種のマイコプラズマ全てにおいて、細胞検体については、1ｃｆｕ以下のマイコプラズマを含む１００μＬの検体から、培地および洗浄液検体については、５ｃｆｕ以下のマイコプラズマを含む５００μＬの検体から、１０ｃｆｕ/ｍＬ以下の感度でマイコプラズマを検出することが可能であることが検証された。【００８０】
【表３】
2019112028.tif 000004
【００８１】
６．マイコプラズマ否定試験
６．１．前培養
マイコプラズマ否定試験用液体培地２ｍＬに、検体として洗浄液５００μＬを加え、３６℃、５％ＣＯ２条件下で７日間好気培養した。同様に、マイコプラズマ否定試験用液体培地２ｍＬに、検体として洗浄液５００μＬを加えた後、３６℃条件下で７日間嫌気培養した。陰性対照は、検体の代わりにＰＢＳを加え、同様の操作を行った。また、陽性対照として、１５００ｃｆｕ／μＬのMycoplasma oraleを含むマイコプラズマ希釈液を５０μＬ加えたものを好気培養し、また、１５００ｃｆｕ／μＬのMycoplasma salivariumを含むマイコプラズマ希釈液を５０μＬ加えたものを、嫌気培養した。
６．２．夾雑物除去
培養液５００μＬを分画分子量１００ｋＤａの遠心式限外濾過フィルター（Merck Millipore）に移し、４℃、１４，０００×ｇ、１０分間遠心した。ＰＢＳ  ５００μＬを加え、４℃、１４，０００×ｇ、１０分間遠心した後、さらにＰＢＳ  ５００μＬを加え、激しくピペッティングを行い、フィルターにトラップされたマイコプラズマを回収した。【００８２】
６．３．ＤＮＡ抽出
MagNA Pure LC DNA Isolation Kit-Large Volume（Roche）を用いて、夾雑物除去後の回収液全量からＤＮＡを抽出し、最終的に２００μＬのＤＮＡ抽出液とした。
６．４．ＰＣＲと電気泳動
ＰＣＲ反応液（Takara Ex taq）９０μＬにＤＮＡ抽出液１０μＬ加え、４０℃５分を１サイクル、９４℃１０分を１サイクル、９４℃３０秒、７０℃３０秒、７２℃４５秒のサイクルを２０サイクル（７０℃の部分が２サイクル毎に１℃ずつ低下。６１℃まで）、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃４５秒のサイクルを２５サイクル、７２℃４分を１サイクルでＰＣＲを実施した。プライマーには、以下の配列を用いた。
プライマー配列：
Forward：5’ -GGCGAATGGGTGAGTAACACG- 3’
Reverse：5’ -CGGATAACGCTTGCGACCTATG- 3’
ＰＣＲ後の反応液をアガロースゲルにて電気泳動後、ＤＮＡバンドの有無を確認した。
６．５．結果
結果を図８に示す。Ｍは１００ｂｐラダーであり、レーン１は陰性対照（水に対してＰＣＲを行ったもの）であり、レーン２〜４は陰性対照（検体の代わりにＰＢＳを用いて好気培養し、ＰＣＲを行ったもの）であり、５〜７は検体を好気培養し、ＰＣＲを行ったもの、レーン８〜１０は陽性対照（検体にマイコプラズマ希釈液（Mycoplasma orale）を加えて好気培養し、ＰＣＲを行ったもの）であり、レーン１１〜１３は陰性対照（検体の代わりにＰＢＳを用いて嫌気培養し、ＰＣＲを行ったもの）であり、レーン１４〜１６は検体を嫌気培養し、ＰＣＲを行ったものであり、レーン１７〜１９は陽性対照（検体にマイコプラズマ希釈液（Mycoplasma salivarium）を加えて嫌気培養し、ＰＣＲを行ったもの）である。陽性対照であるレーン８〜１０および１７〜１９にバンドが現れ、陰性対照であるレーン２〜４および１１〜１３にはバンドが現れなかった。検体を流したレーン５〜７および１４〜１６においてもバンドが現れなかったことから、検体中にはマイコプラズマが存在していないことが確認された。【００８３】
本明細書に記載された本発明の種々の特徴は様々に組み合わせることができ、そのような組み合わせにより得られる態様は、本明細書に具体的に記載されていない組み合わせも含め、全て本発明の範囲内である。また、当業者は、本発明の精神から逸脱しない多数の様々な改変が可能であることを理解しており、かかる改変を含む均等物も本発明の範囲に含まれる。したがって、本明細書に記載された態様は例示にすぎず、これらが本発明の範囲を制限する意図をもって記載されたものではないことを理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2019112028.tif 000009
【図６】
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【図７】
2019112028.tif 000011
【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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