(57)【要約】微生物の表面に発現するタンパク質全体に対する網羅的抗体の作製方法、及び該方法により得られた網羅的抗体の提供。  （ａ）微生物をタンパク質架橋固定試薬で処理することにより、前記微生物の表面に発現しているタンパク質を分子内架橋により固定し、（ｂ）該タンパク質架橋固定試薬で固定した前記微生物を免疫原として動物に投与し、（ｃ）動物から抗体を得ることを含む、微生物の表面に発現するタンパク質分子全体に対する抗体を含む網羅的抗体を作製する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）微生物をタンパク質架橋固定試薬で処理することにより、前記微生物の表面に発現しているタンパク質を分子内架橋により固定し、（ｂ）該タンパク質架橋固定試薬で固定した前記微生物を免疫原として動物に投与し、（ｃ）動物から抗体を得ることを含む、微生物の表面に発現するタンパク質分子全体に対する抗体を含む網羅的抗体を作製する方法。
【請求項２】
タンパク質架橋固定試薬が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドからなる群から選択される、請求項１記載の網羅的抗体を作製する方法。
【請求項３】
タンパク質架橋固定試薬が１〜３８％（ｖ／ｖ）ホルマリンである、請求項１記載の網羅的抗体を作製する方法。
【請求項４】
タンパク質架橋固定試薬による固定を１０分〜４８時間行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の網羅的抗体を作製する方法。
【請求項５】
免疫原を投与する動物がニワトリである請求項１〜４のいずれか１項に記載の網羅的抗体を作製する方法。
【請求項６】
免疫原を投与したニワトリが産生した鶏卵より抗体を得る、請求項５記載の網羅的抗体を作製する方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法で得られた、微生物の表面に発現するタンパク質分子全体に対する抗体を含む網羅的抗体。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法で得られた、微生物の表面に発現するタンパク質分子全体に対する抗体を含む網羅的抗体を含む微生物感染症の予防又は治療剤。
【請求項９】
請求項６記載の方法で鶏卵より得られた網羅的抗体を含む食品。
【請求項１０】
請求項６記載の方法で鶏卵より得られた網羅的抗体を含む飼料。
【請求項１１】
請求項６記載の方法で鶏卵より得られた網羅的抗体を含む水産動物感染症治療用組成物。
【請求項１２】
水産動物が生息する環境水中に適用するための請求項１１記載の水産動物感染症治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の作製方法に関し、微生物の表面に発現するタンパク質全体に対する網羅的抗体の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌菌体、ウイルス等の微生物には数々のタンパク質が発現している。従来はこれらの中から有用と思われる特定の抗原タンパク質分子を選択して、主にモノクローナル抗体を作製し、医療等に応用する試みが行われてきた。しかし、細菌等の表面に発現する単一の抗原分子を認識する抗体によって、細胞そのものを特異的に認識し、標的とすることには限界があった。
従来より、細菌、ウイルス等の感染症等の予防や治療には、主として抗生物質が用いられていた。また、弱毒化ウイルスを用いて作製したワクチンを投与して生体内でウイルスに対する抗体を産生させ、ウイルス感染症の予防又は治療に役立てることが行われていた。しかし、抗生物質は細菌により適切な抗生物質を選択する必要があり、また、耐性菌が生じるという問題があった。また、ワクチンはワクチンの安全性を考慮する必要性があり、適用できる感染症は限られていた。
さらに、腸管出血性大腸菌の菌体を抗原としてニワトリを免疫して得たベロ毒素に特異的な抗体を大腸菌の感染症の治療に利用することが報告されていた（特許文献１参照）。しかし、該方法は、菌体を抗原として用いているものの、腸管出血性大腸菌の分泌性のベロ毒素に対する抗体の産生を目的としており、細菌表面に発現しているタンパク質分子全体に対する網羅的抗体は得られていない。また、得られた抗体も分泌されたベロ毒素の中和のために用いられており、大腸菌そのものの排除はできない。
【特許文献１】特開平１０−２９８１０５号公報
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、微生物の表面に発現するタンパク質全体に対する網羅的抗体の作製方法、及び該方法により得られた網羅的抗体の提供を目的とする。
本発明者らは、ウイルス又は細菌等の微生物の菌体表面をホルムアルデヒドを用いて固定処理したものをそのまま抗原として用いて動物を免疫することにより、固定された抗原タンパク質分子全体に対して広く網羅的に抗体が作製できることを見出した。この網羅的な抗体を含有する抗体組成物は、従来の抗体作製法では得られなかった高い特異性及び感受性を有していた。本発明者らは、該抗体組成物が個々の細菌そのものを特異的に、なおかつ強く認識し、抗菌などの治療に効果的であることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  （ａ）微生物をタンパク質架橋固定試薬で処理することにより、前記微生物の表面に発現しているタンパク質を分子内架橋により固定し、（ｂ）該タンパク質架橋固定試薬で固定した前記微生物を免疫原として動物に投与し、（ｃ）動物から抗体を得ることを含む、微生物の表面に発現するタンパク質分子全体に対する抗体を含む網羅的抗体を作製する方法。
［２］  タンパク質架橋固定試薬が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドからなる群から選択される、［１］の網羅的抗体を作製する方法。
［３］  タンパク質架橋固定試薬が１〜３８％（ｖ／ｖ）ホルマリンである、［１］の網羅的抗体を作製する方法。
［４］  タンパク質架橋固定試薬による固定を１０分〜４８時間行う、［１］〜［３］のいずれかの網羅的抗体を作製する方法。
［５］  免疫原を投与する動物がニワトリである［１］〜［３］のいずれかの網羅的抗体を作製する方法。
［６］  免疫原を投与したニワトリが産生した鶏卵より抗体を得る、［５］の網羅的抗体を作製する方法。
［７］  ［１］〜［６］のいずれかの方法で得られた、微生物の表面に発現するタンパク質分子全体に対する抗体を含む網羅的抗体。
［８］  ［１］〜［６］のいずれかの方法で得られた、微生物の表面に発現するタンパク質分子全体に対する抗体を含む網羅的抗体を含む微生物感染症の予防又は治療剤。
［９］  ［６］の方法で鶏卵より得られた網羅的抗体を含む食品。
［１０］  ［６］の方法で鶏卵より得られた網羅的抗体を含む飼料。
［１１］  ［６］の方法で鶏卵より得られた網羅的抗体を含む水産動物感染症治療用組成物。
［１２］  水産動物が生息する環境水中に適用するための［１１］の水産動物感染症治療用組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００８−３２４２５７号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、網羅的抗体を用いたアユ冷水病の防止試験を行なった養殖池の概略を示す図である。
図２は、網羅的抗体を用いたアユ冷水病の防止試験１（鶏卵抗体による養殖池別冷水病試験成績  試験Ｎｏ１）の結果を示す図である。
図３は、網羅的抗体を用いたアユ冷水病の防止試験２（鶏卵抗体による養殖池別冷水病試験成績  試験Ｎｏ２）の結果を示す図である。
図４は、冷水菌に感染したアユの写真である。
図５は、網羅的抗体を含む鶏卵粉末（鶏卵抗体）を含む餌を与え、冷水菌への感染が回避されたアユの写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法により、微生物に対して網羅的に抗体を作製することができる。ここで、微生物に対して網羅的に抗体を作製するとは、微生物の表面に発現する多数の抗原タンパク質分子全体に対して一度に抗体を作製することをいい、得られた抗体を網羅的抗表面抗体と呼ぶ。網羅的抗表面抗体は微生物の表面に発現する多数の抗原タンパク質に対する個々の抗体を含むポリクローナル抗体である。本発明の方法によれば、固定した微生物を動物に投与するだけで、表面タンパク質分子の全体に対する抗体を含む網羅的抗表面抗体を得ることができる。ここで、表面タンパク質分子の全体に対する抗体とは、微生物の表面に発現している全てのタンパク質に対する抗体を含むことまでは要求されないが、表面タンパク質のうち、存在量が多いもののほとんどに対する抗体を含むことが望ましい。
本発明においては、網羅的な抗体を作製しようとする、微生物をタンパク質分子内架橋固定試薬を用いて固定する。この場合、菌体等の微生物としては微生物体を用いればよい。タンパク質分子内架橋固定試薬としては、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなどのアルデヒドが挙げられる。好ましくは、ホルムアルデヒドの３５〜３８％、好ましくは３７％水溶液であるホルマリンを用いて行う。
これらのタンパク質分子内架橋固定試薬を固定試薬として用いた場合、試薬は微生物細胞中に浸透し、分子中のアルデヒド基が微生物表面のタンパク質のアミノ基（α−アミノ基やリジン残基のε−アミノ基）やＳＨ基に結合して分子間架橋を形成し、タンパク質は凝固変性する。架橋により、タンパク質の立体構造が損なわれ、酵素活性、輸送、分泌などの様々な生物活性が阻害される。タンパク質分子内架橋固定試薬の作用はタンパク質分子の架橋反応であるため、脂質などの物質に対しては固定作用は働かず、脂質等は流出してしまう。
市販の３５〜３８％ホルムアルデヒド水溶液であるホルマリンを用いる場合、固定化は１〜３８％（ｖ／ｖ）ホルマリン、好ましくは２〜２０％（ｖ／ｖ）ホルマリン、さらに好ましくは５〜１０％（ｖ／ｖ）ホルマリンを用いて行なえばよい。用いるホルマリンは、蒸留水、生理食塩水、緩衝液等を用いて調製すればよい。
菌体等の微生物をホモジナイズし、該のホモジナイズのペレット１ｇに対して、ホルマリンを５〜２０ｍｌ添加する。固定は、微生物ホモジナイズにホルマリンを添加した後、攪拌し、４〜３０℃で３０分〜４８時間以上静置することにより行う。生きた微生物は、短時間のホルマリン処理で不活化されるが、本発明の方法においては、微生物を不活化するのみでは足りず、微生物の表面に発現しているタンパク質分子が分子内架橋を生じる程度のホルマリン処理が必要である。
固定化した微生物ホモジナイズを必要に応じて生理食塩水や緩衝液で希釈、懸濁し公知のアジュバントと混合し、免疫原として動物に投与すればよい。用いる動物としては、マウス、ラット、ヌートリア、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ等の哺乳動物、ニワトリ、ダチョウ等の鳥類が挙げられる。この中でも、ＩｇＹ抗体を含有した鶏卵を得ることができるニワトリ等の鳥類が好ましい。
免疫原による動物の免疫は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、一般的方法として、免疫原を動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。免疫は１回でもよいが、２〜１０日毎に数回投与するのが望ましい。また、初回投与後５〜１０日毎に数回、追加免疫を行なってもよい。
例として細菌の免疫原調製方法を以下に挙げる。以下の方法は、一例であり、これらの方法に限定されない。
細菌の場合は、これらを遠心分離により集め、ペレット状にし、該ペレットをホルマリンに入れ、攪拌により分散させ、３０分間静置する。次いで、荒目の濾紙を用いて濾過し、残渣を除去する。濾液を回収し、遠心分離を行い、ペレットにリン酸バッファーを添加し、これを免疫原として用いる。
本発明の網羅的抗表面抗体組成物は免疫を行った動物の血清から得ることができる。また、免疫する動物がニワトリの場合、ニワトリが産む鶏卵より得ることができる。最終免疫後、約３カ月で高い抗体価の抗体を含有する鶏卵が得られる。鶏卵の卵黄にはＩｇＹが含まれ、卵白にはＩｇＡ及びＩｇＭが含まれる。抗体を全卵から回収した場合、網羅的抗体組成物中にはＩｇＹ、ＩｇＡ及びＩｇＭが含まれ、卵黄から回収した場合、ＩｇＹが含まれる。鶏卵を用いて本発明の抗体組成物を調製する場合、全卵を用いてもよいし、卵黄のみを用いてもよい。
得られた鶏卵は、割卵し、卵黄及び卵白を一緒に、あるいは卵黄のみを攪拌し、粉末化する。この際、抗体はタンパク質である為に熱に弱く７０℃を超えるとその活性を失うので、好ましくは６０℃以下で行う。好適には、凍結乾燥、スプレードライ又は温風乾燥により６０℃以下で乾燥し粉末化すればよい。粉末化した鶏卵は、必要ならば、さらに粉砕機にかけ細粒粉末とする。この方法で得られた粉末には卵黄の油成分が含まれているので、粉末は湿り気がある。超低温臨界法により完全脱脂することにより、脂分を除いてもよい。
鶏卵から得られた網羅的抗表面抗体組成物を鶏卵抗体と呼ぶことがある。
得られた抗体の抗体価は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）、蛍光抗体法等を用いて測定することができる。抗体価は、動物から採取した血清を用いて測定すればよい。また、鶏卵を用いる場合、鶏卵より抗体を抽出して抽出物中の抗体価を測定すればよい。
本発明の微生物に対する網羅的抗体は、微生物の感染症の予防又は治療に用いることができる。本発明の網羅的抗体は、細菌やウイルス等の微生物の表面に発現するタンパク質分子全体に対する抗体を含むため、細菌やウイルス等の微生物に対する攻撃力が強く、細菌やウイルス等の微生物を死滅させ、排除・防除することができる。
微生物は、細菌、ウイルス、真菌、リケッチア、せん毛虫等の寄生虫等を含み、好ましくは動物に感染し、動物に対して病原性を有する病原微生物である。
以下に微生物の例を挙げる。以下の微生物は例示であり、これらに限定されない。
水産動物に感染する微生物
水産動物としては、魚類、甲殻類、軟体動物等が挙げられる。魚類としては、アユ、ウナギ、マス、サケ、マグロ、ハマチ、マダイ、ヒラメ等の養殖魚や金魚、コイ、熱帯魚等のアクアリウム魚や観賞用魚類が挙げられる。甲殻類としては、カニ、エビ等が挙げられる。軟体動物としては貝類等が挙げられる。
微生物としては、アユ冷水病の病原菌であるアユ冷水菌（フラボバクテリウム・サイクロフィラム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ））、尾腐れ病の病原菌であるフレキシバクター・コルムナリス（Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｕｍｎａｒｉｓ）、穴あき病の病原菌であるアエロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、エロモナス症の病原菌であるアエロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、ミズカビ症の病原真菌であるミズカビ、白点病の病原寄生虫である、ウオノカイセンチュウ（Ｉｃｈｆｈｙｏｐｈｆｈｉｒｉｕｓ  ｍｕｌｔｉｆｉｌｉｉｓ）やクリプトカリオン・イリタンス（Ｃｒｙｐｔｏｃａｒｙｏｎ  ｉｒｒｉｔａｎｓ）などのせん毛虫、コイヘルペスウイルス病の病原ウイルスであるコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）等が挙げられる。その他、魚類の病原菌であるエドワードシェラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ  ｔａｒｄａ）、エンテロコッカス・セリオリシダ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｅｒｉｏｌｉｃｉｄａ）、、フラボバクテリウム・ブランチオフィルム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ）、フレキシバクター・マリチムス（Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）、リストネラ・アンギラルム（Ｌｉｓｔｏｎｅｌｌａ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）、マイコバクテリウム・マリナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ）、ノカルジア・セリオラエ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｅｒｉｏｌａｅ）、パスツレラ・ピスシシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｐｉｓｃｉｃｉｄａ）、シュードモナス・アンギリセプチカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、レニバクテリウム・サルモニナルム（Ｒｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍ）、スタフィロコッカス・エピデルミジス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・イニアエ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｉａｅ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属微生物等が挙げられる。
その他の動物に感染する微生物
その他の動物としては、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類が挙げられる。
微生物としては、グラム陰性細菌、グラム陽性が挙げられる。例えば、グラム陰性細菌としては、緑膿菌、コレラ菌、病原性大腸菌等が、グラム陽性細菌としては、黄色ブドウ球菌等が挙げられる。また、水虫や爪水虫等の病原真菌となる白癬菌、副鼻腔炎等の原因となる緑濃菌、腸内感染症の病原菌となる病原性大腸菌、サルモネラ属細菌、クロストリジウム属細菌、カンピロバクター属細菌等が等が挙げられる。その他、食中毒の病原菌となるウェルシュ属細菌、日和見感染症を引き起こすセラチア属細菌、エンテロバクター属細菌、アルカリゲネス属細菌等が挙げられる。
また、ウイルスとしては、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、バクロウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、レトロウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、レオウイルス、コロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、タバコモザイクウイルス、ポチウイルス、コモウイルス、カウリモウイルス等が挙げられる。
微生物感染症の予防又は治療用抗体組成物は、例えば、動物に投与して用いる。該抗体組成物は、経口ルート、鼻腔ルート、並びに静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内の注射又は非経腸的ルートで投与することができる。鼻腔炎等の治療のためには、公知の浸透剤と混合した液体状態又はエアロゾル状態で時に軟膏で投与することができる。また、皮膚の感染症等の治療のためには、軟膏等の塗布剤の形態で皮膚の患部に塗布又は液剤の噴霧により局所投与され得る。該軟膏は、キャリアとして、脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、パラフィン、プラスティベース、蝋、硬膏剤、樹脂、プラスチック、グルコール類、高級アルコール、グリセリン、水若しくは乳化剤、懸濁化剤を含む。本発明の医薬組成物の投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常、経口投与では、成人に対して、１日約０．０１ｍｇ〜１００００ｍｇであり、これらを１回、又は数回に分けて投与することができる。
微生物感染症の予防又は治療用抗体組成物は、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含んでいてもよい。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。
さらに、本発明の微生物に対する網羅的抗体を動物の飼料に混合し、動物に投与することにより、動物における微生物感染症を予防又は治療することができる。
また、水産動物の感染症の場合、水産動物が生息している水槽、養殖池、養殖用生簀等の環境水（飼育水）中に本発明の微生物に対する抗体組成物を添加してもよい。この場合、水産動物が経口的に体内に治療用抗体を取り込んで体内で効果を発揮することができ、さらに、環境水中に存在する微生物に結合し、微生物を不活性化する。また、微生物と結合して、抗体と微生物の水不溶性の凝集体が形成され、沈殿し、養殖池の排水溝から除かれること等により、環境水中から除去される。
以下に、養殖魚類や甲殻類の感染症の治療法の具体例を挙げる。養殖魚類の感染症としては、アユ等のフラボバクテリウム（冷水菌）を原因菌とする冷水病、シュウドモナスを原因菌とする穴あき等があるが、これらには限定されない。魚類の感染症の予防又は治療のためには、原因菌の菌体の表面に発現するタンパク質を固定し、免疫原を作製し、ニワトリを免疫し、鶏卵抗体を得る。得られた鶏卵抗体を、魚類の餌に混合し、給餌すればよい。また、得られた鶏卵抗体を養殖魚類が生息する環境水中に添加してもよい。
そのまま餌と共に給餌されることで魚体の消化管に取り込まれると共に一部は魚体に取り込まれることなく魚を飼育している飼育水中に溶解し又はけん濁した状態で存在する。溶け込んだ飼育水中の抗体は、飼育水中に浮遊する細菌と反応し、菌体に結合し、菌体を死滅させる。
本発明は、鶏卵より得られた網羅的抗体を含む食品又は飼料を包含する。さらに、本発明は鶏卵より得られた網羅的抗体を含む水産動物感染症治療用組成物を包含する。該水産動物感染症治療用組成物は、餌として水産動物に供給してもよいし、環境水中に添加して適用してもよい。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
細菌を抗原とする網羅的抗体作製
抗原として、アユ冷水菌の菌体を用いた。
アユ冷水菌（フラボバクテリウム・サイクロフィラム：Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ）をサイトファーガー培地（またはＴＹＥＳ培地［トリプトン０．０４％，酵母エキス０．００５％，ＭｇＳＯ４，７Ｈ２Ｏ  ０．００５％，ＣａＣｌ２／２Ｈ２Ｏ  ０．００５％，ｐＨ７．２］）にて１８℃で培養し、寒天平板培地に１８℃で５日間培養することにより、不規則な波上の縁を持つ黄色のコロニーを形成することを確認した後（写真）、培養液を遠心して菌体をペレットとし、このペレットを抗原として使用するまで冷凍保存した。
容量１５ｍｌの栓付試験管に解凍したアユ冷水菌のペレット約３ｍｇを入れ、そこに５％（ｖ／ｖ）ホルマリン溶液を５ｍｌ加えて密封した。
試験管ミキサーで数回（約１０分）撹拌し、均等に拡散溶解するまで、５％（ｖ／ｖ）ホルマリン溶液（純生薬品（株）製：ホルムアルデヒド３５．０〜３８．０％、メタノールを５〜１３％含有を水で希釈）にペレットを完全に溶解させて、１５分インキュベーションし黄色ブドウ球菌の表面抗原を固定化した。インキュベーション終了後３０分間放置した。
若干の注射用蒸留水で、湿らせておいた荒目の濾紙で濾過し、残渣を除去した。この際、作製量が少ない場合は重力を利用した自然濾過を行い、作製量が多い場合は吸引濾過を行った。細菌の菌体を含む濾液を回収したのち、高速にて遠心分離した（回転数１５０００ｒｐｍ以上、３０分以上）。
上清を捨てて約３ｍｇのペレットに約１．５ｍｌのリン酸バッファーを添加し、ペレットを分散させ、これを投与抗原として用いた。
投与抗原組成物は、エマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）ポンプに抗原１ｍｌとホワイトオイル（日本新薬社）１ｍｌを徐々に混和し、エマルジョン（乳化液）を作製することにより作製した。
作成した抗原組成物エマルジョン０．５ｍｌを、５週齢の雌のニワトリの鼡径部皮下に投与した。この際、ニワトリへの侵襲を少なくする為に、投与抗原組成物をニワトリの体温である３７℃に加温しておいた。
固定後の遠心分離によるホルマリンの分離が不十分であった場合は、抗原投与後およそ３日位は、ニワトリは疼痛のためにうずくまり、吸水のみで食餌行動は無いことがあり、その間に死亡する個体もあった。抗原投与部位は固く硬結した状態となった。
初回投与後５日毎に、２回抗原組成物を投与し、追加免疫を行い、計３回の免疫を行った。抗体は免疫を行ったニワトリが産む鶏卵より得ることができた。最終免疫後、約３カ月で高い抗体価の抗体を含有する鶏卵が得られた。ヤマト科学製スプレードライヤーＧＡ２２型、温風乾燥機及び粉砕機を用いて乾燥した鶏卵粉末を製造した。
【実施例２】
【０００７】
網羅的抗表面抗体を用いたアユ冷水病の防止
実施例１で作製したアユ冷水菌に対する抗体を含む鶏卵粉末を用いた。ここで、抗体を含む鶏卵粉末を鶏卵抗体と呼ぶ。
３つの地域（地域１：日本国滋賀県長浜市、地域２：日本国滋賀県滋賀町及び地域３：日本国滋賀県知内川水系）のアユの流水式養殖池を利用した。
養殖池は、約１００ｍ２のものを用い、地域１及び地域２においては２面の養殖池を利用し、地域３においては１面の養殖池を利用した。また、各地域において、コントロール用の約１００ｍ２の養殖池を準備し、鶏卵抗体を供給せずに、従来用いられているアユ冷水病防止用水産用医薬品、イスランソーダ（一般名：スルフィソゾールナトリウム）、およびビブリオ病防止用水産用医薬品、ノボビオシンを投与してアユの飼育を行った。
試験は、１年３ヶ月をかけて行い、その間に４ヶ月の測定期間を２回設けた。それぞれ、試験１及び試験２とする。
試験には、エリ漁（エリと呼ぶ定置網を用いた漁法）で捕獲した日本国滋賀県琵琶湖産稚魚を用い、海産アユ、アユの人工種苗は用いなかった。
養殖池のアユの数は、試験１では５３２３００〜８３３３００匹（総重量３１５〜４５０ｋｇ）、試験２では６０３７７３〜８８２３５２匹（総重量３２０〜４５０ｋｇ）であった。
給餌する餌に対して重量比３％で鶏卵抗体粉末を混合し、各養殖池において、総魚体重量に対して重量比２〜５％で鶏卵抗体を含む餌を給餌した。給餌は１日５〜６回行った。総給餌量は統一が困難なため統一しなかった。
試験実施中の養殖池においては、抗生物質の投与、温水療法等、従来より行われていたアユ冷水病予防法は適用しなかった。
試験期間中、毎日午後５時に斃死魚を集め、さらに、斃死の原因を、病死か自然死かを鑑別した。また、病死の斃死魚は、冷水病によるものか他の病気（エロモナス菌、シュードモナス等の細菌感染症による斃死、寄生虫による斃死）によるものかを鑑別した。冷水病は、鰓蓋や内臓の貧血、鰓蓋下部の出血、体表面の退色、体表面の潰瘍形成による穴あき症状、肛門拡張、胆のう肥大、下顎欠損、尾へい部欠損などの症状により鑑別することができる。
鶏卵抗体は、そのまま餌と共に給餌されることで魚体の消化管に取り込まれると共に一部は魚体に取り込まれることなく池水中に溶け込んだ。池水に溶け込んだ抗体は、池水中に浮遊する冷水菌と反応し、菌体に取り付く。また、池水中に溶け込んだ抗体は、アユが鰓呼吸する際に鰓蓋に取り込まれ、鰓蓋内に存在する冷水菌や魚体表面の冷水菌がアユの病巣部に感染している冷水菌に対し、その表面抗原に強力に結合することにより症状の改善を達成した。この様に水中に存在する冷水菌は、ことごとく抗体の反応対照となり、抗体が付着した菌体は、池の底に沈殿し中央にある排水溝より養殖池外へ排出された。
図１に養殖池略図を示す。図１中には、抗体及び冷水菌並びに抗体と冷水菌の存在の様式をも示してある。
図２に試験１における結果、図３に試験２における結果を示す。
図２及び図３においては、３地域の養殖池をそれぞれＡ−１及びＡ−２池、Ｂ−１池及びＢ−２池、並びにＣ−１池とし、３地域においてコントロールとして利用した養殖池を、それぞれＡコントロール（ＡＣ）、Ｂコントロール（ＢＣ）、Ｃコントロール（ＣＣ）と呼んだ。
試験１、試験２ともに４ヶ月間行なった。図２及び図３には月ごとの冷水病で斃死した魚及びその他の原因で斃死した魚の個体数を示した。養殖は、前年の１２月下旬から開始した。
図中、残存率は各池への入荷稚魚の総重量と出荷時の総重量を各十匹の平均体重で除し算出した。
試験１における、１月の１００匹平均魚体重はＡ−１池（０．５８ｇ）、Ａ−２池（０．５５ｇ）、ＡＣ（０．５７ｇ）、Ｂ−１池（０．５１ｇ）、Ｂ−２池（０．５９ｇ）、ＢＣ（０．５５ｇ）、Ｃ−１池（０．４９ｇ）、ＣＣ（０．５４ｇ）であり、４月末の１００匹平均魚体重はＡ−１池（２５．４ｇ）、Ａ−２池（２６．４ｇ）、ＡＣ（２４．８ｇ）、Ｂ−１池（２７．７ｇ）、Ｂ−２池（２６．９ｇ）、ＢＣ（２５．７ｇ）、Ｃ−１池（２６．３ｇ）、ＣＣ（２６．１ｇ）であった。
試験２における、１月の１００匹平均魚体重はＡ−１池（０．５４ｇ）、Ａ−２池（０．５２ｇ）、ＡＣ（０．５３ｇ）、Ｂ−１池（０．５３ｇ）、Ｂ−２池（０．５５ｇ）、ＢＣ（０．５３ｇ）、Ｃ−１池（０．５２ｇ）、ＣＣ（０．５１ｇ）であり、４月末の１００匹平均魚体重はＡ−１池（２４．８ｇ）、Ａ−２池（２５．３ｇ）、ＡＣ（２６．９ｇ）、Ｂ−１池（２５．１ｇ）、Ｂ−２池（２４．７ｇ）、ＢＣ（２６．２ｇ）、Ｃ−１池（２５．３ｇ）、ＣＣ（２６．８ｇ）であった。
図２及び３に示すように、３地域のいずれにおいても、鶏卵抗体を含む餌を給餌した池での残存率がコントロール池に比べ著しく上昇した。
図４に冷水菌に感染したアユの写真を示す。冷水菌に感染したアユは、内臓が溶けており、えらや心臓は貧血状態となって白くなっていた。図５に鶏卵抗体を含む餌を給餌したアユの写真を示す。内臓の色彩、形態ともに正常であり、えらも酸素飽和度の高い血液で満たされており、赤色を呈していた。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明の方法により、微生物の表面に発現しているタンパク質をタンパク質分子内架橋試薬を用いて分子内架橋により固定して動物に投与した場合、微生物の表面に発現しているタンパク質全体に対する抗体を含む網羅的抗体を得ることができる。
この網羅的抗体は、微生物の表面全体に結合し、微生物を不活化し、又は死滅させることができる。特に微生物の感染症の予防や治療に用いることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年10月18日(2010.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  微生物をホモジナイズし、該ホモジナイズしたペレットに対して、５〜３８％（ｖ／ｖ）ホルマリンをタンパク質架橋固定試薬として５〜２０ｍｌ添加し処理することにより、前記微生物の表面に発現しているタンパク質を分子内架橋により固定し、（ｂ）  該タンパク質架橋固定試薬で固定した前記微生物を免疫原として動物に投与し、（ｃ）  動物から抗体を得ることを含む、微生物の表面に発現するタンパク質分子全体に対する抗体を含む網羅的抗体を作製する方法。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
タンパク質架橋固定試薬による固定を１０分〜４８時間行う、請求項１記載の網羅的抗体を作製する方法。
【請求項５】
免疫原を投与する動物がニワトリである請求項１又は４に記載の網羅的抗体を作製する方法。
【請求項６】
免疫原を投与したニワトリが産生した鶏卵より抗体を得る、請求項５記載の網羅的抗体を作製する方法。
【請求項７】
請求項１及び４〜６のいずれか１項に記載の方法で得られた、微生物の表面に発現するタンパク質分子全体に対する抗体を含む網羅的抗体。
【請求項８】
請求項１及び４〜６のいずれか１項に記載の方法で得られた、微生物の表面に発現するタンパク質分子全体に対する抗体を含む網羅的抗体を含む微生物感染症の予防又は治療剤。
【請求項９】
請求項６記載の方法で鶏卵より得られた網羅的抗体を含む食品。
【請求項１０】
請求項６記載の方法で鶏卵より得られた網羅的抗体を含む飼料。
【請求項１１】
請求項６記載の方法で鶏卵より得られた網羅的抗体を含む水産動物感染症治療用組成物。
【請求項１２】
水産動物が生息する環境水中に適用するための請求項１１記載の水産動物感染症治療用組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成23年6月10日(2011.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)  微生物をホモジナイズし、該ホモジナイズしたペレットに対して、５〜３８％(v/v)ホルマリンをタンパク質架橋固定試薬として５〜２０ml添加し処理することにより、前記微生物の表面に発現しているタンパク質を分子内架橋により固定し、(b)  該タンパク質架橋固定試薬で固定した前記微生物を免疫原として動物に投与し、(c)  動物から抗体を得ることを含む、微生物の表面に発現するタンパク質分子全体に対する抗体を含む網羅的抗体を作製する方法。
【請求項２】
タンパク質架橋固定試薬による固定を１０分〜４８時間行う、請求項１記載の網羅的抗体を作製する方法。
【請求項３】
免疫原を投与する動物がニワトリである請求項１又は２に記載の網羅的抗体を作製する方法。
【請求項４】
免疫原を投与したニワトリが産生した鶏卵より抗体を得る、請求項３記載の網羅的抗体を作製する方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法で得られた、微生物の表面に発現するタンパク質分子全体に対する抗体を含む網羅的抗体。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法で得られた、微生物の表面に発現するタンパク質分子全体に対する抗体を含む網羅的抗体を含む微生物感染症の予防又は治療剤。
【請求項７】
請求項４記載の方法で鶏卵より得られた網羅的抗体を含む食品。
【請求項８】
請求項４記載の方法で鶏卵より得られた網羅的抗体を含む飼料。
【請求項９】
請求項４記載の方法で鶏卵より得られた網羅的抗体を含む水産動物感染症治療用組成物。
【請求項１０】
水産動物が生息する環境水中に適用するための請求項９記載の水産動物感染症治療用組成物。
【国際調査報告】
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