(57)【要約】  【課題】  本発明は，肝線維症又は肝硬変を予防又は治療する抗ＧＧＴ抗体を含有する剤を提供することを目的とする。  【解決手段】  本発明は，抗ＧＧＴ抗体によって，肝線維症及び肝硬変モデル動物の肝線維症を改善することができるという知見に基づくものである。また，本発明は，抗ＧＧＴ抗体によって，肝機能マーカー（ＡＬＴ及びＡＳＴ）が回復するという知見に基づくものである。また，本発明は，抗ＧＧＴ抗体によって，ＴＮＦ−αの発現を抑制することができるという知見に基づくものである。  【選択図】図８
2010058550.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）抗体を有効成分として含有する肝線維症治療剤又は予防剤であって，
前記抗ＧＧＴ抗体は，
破骨細胞形成阻害作用を有する抗体である，
肝線維症治療剤又は予防剤。
【請求項２】
前記抗ＧＧＴ抗体は，
ＡＧＴ−３である，
請求項１に記載の肝線維症治療剤又は予防剤。
【請求項３】
抗ＧＧＴ抗体を有効成分として含有する肝硬変治療剤又は予防剤であって，
前記抗ＧＧＴ抗体は，
破骨細胞形成阻害作用を有する抗体である，
肝硬変治療剤又は予防剤。
【請求項４】
前記抗ＧＧＴ抗体は，
ＡＧＴ−３である，
請求項３に記載の肝硬変治療剤又は予防剤。
【請求項５】
抗ＧＧＴ抗体を有効成分として含有する慢性肝炎の治療剤又は予防剤であって，
前記抗ＧＧＴ抗体は，
破骨細胞形成阻害作用を有する抗体である，
慢性肝炎の治療剤又は予防剤。
【請求項６】
前記抗ＧＧＴ抗体は，
ＡＧＴ−３である，
請求項５に記載の慢性肝炎の治療剤又は予防剤。
【請求項７】
抗ＧＧＴ抗体を有効成分として含有する肝線維症又は肝硬変誘発性ＴＮＦ−α発現抑制剤であって，
前記抗ＧＧＴ抗体は，
破骨細胞形成阻害作用を有する抗体である，
肝線維症誘発性ＴＮＦ−α発現抑制剤又は肝硬変誘発性ＴＮＦ−α発現抑制剤。
【請求項８】
前記抗ＧＧＴ抗体は，
ＡＧＴ−３である，
請求項７に記載の肝線維症誘発性ＴＮＦ−α発現抑制剤又は肝硬変誘発性ＴＮＦ−α発現抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ヒトＧＧＴ抗体を有効成分として含有する肝疾患治療剤又は予防剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝線維化は，肝臓が損傷した場合におこる過程の一つである。このような損傷の原因として，例えば，ウイルス（例：慢性肝炎），化学物質（例：薬剤，アルコール），代謝性疾患（例：脂質代謝障害，グリコーゲン代謝障害，金属代謝障害），癌（原発性肝臓癌，転移性肝臓癌），細菌などによる感染があげられる。このような原因より生じる肝線維化が進行すると肝硬変を惹起し，最終的に肝不全が引き起こされため，肝の線維化を予防する又は治療する剤が望まれた。【０００３】
特開２００６−２２０８８号公報には，ビタミンＢ１２又はその類縁体を有効成分とする含む肝線維化抑制剤が開示されている。ビタミンＢ１２又はその類縁体は，多くの生体各組織で作用する。そのため，ビタミンＢ１２又はその類縁体を多く含む剤は，生体組織各所で副作用が起きる問題があった。そのため，肝線維化抑制作用を示すのに十分なビタミンＢ１２又はその類縁体量を接取することが難しく，新たな薬剤が望まれた。
【特許文献１】特開２００６−２２０８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は，肝線維症又は肝硬変を予防又は治療する抗ＧＧＴ抗体を含有する剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は，抗ＧＧＴ抗体によって，肝線維症及び肝硬変モデル動物の肝線維症を改善することができるという知見に基づくものである。また，本発明は，抗ＧＧＴ抗体によって，肝機能マーカー（ＡＬＴ及びＡＳＴ）が回復するという知見に基づくものである。また，本発明は，抗ＧＧＴ抗体によって，ＴＮＦ−αの発現を抑制することができるという知見に基づくものである。【０００６】
本発明の第１の側面は，抗γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）抗体を有効成分として含有する肝線維症治療剤又は予防剤に関する。前記抗ＧＧＴ抗体は，破骨細胞形成阻害作用を有する抗体である。本発明の抗ＧＧＴ抗体は，ＡＧＴ−３であることが好ましい。後述する実施例に示されたとおり，本発明の抗ＧＧＴ抗体は，肝組織の線維化を抑制することができる。よって，本発明の抗ＧＧＴ抗体は，肝線維症治療剤として又は予防剤として好適に用いることができる。【０００７】
本発明の第２の側面は，抗ＧＧＴ抗体を有効成分として含有する肝硬変治療剤又は予防剤に関する。前記抗ＧＧＴ抗体は，破骨細胞形成阻害作用を有する抗体である。本発明の抗ＧＧＴ抗体は，ＡＧＴ−３であることが好ましい。後述する実施例で示されたとおり，本発明の抗ＧＧＴ抗体は，肝硬変モデルマウスの肝機能を改善することができる。よって肝硬変治療剤として好適に用いることができる。さらに，後述する実施例で示されたとおり，本発明の抗ＧＧＴ抗体は，肝組織の線維化を抑制することができる。肝硬変は，肝組織の線維化が悪化することによって起こる。よって，本発明の抗ＧＧＴ抗体は，肝硬変の予防剤として好適に用いることができる。【０００８】
本発明の第３の側面は，抗ＧＧＴ抗体を有効成分として含有する慢性肝炎の治療剤又は予防剤に関する。前記抗ＧＧＴ抗体は，破骨細胞形成阻害作用を有する抗体である。本発明の抗ＧＧＴ抗体は，ＡＧＴ−３であることが好ましい。慢性肝炎では，肝臓の炎症が繰り返されることによって，肝組織の線維化が進行する。後述する実施例で示されたとおり，本発明の抗ＧＧＴ抗体は，肝組織の線維化を抑制することができる。そして，後述するとおり，肝疾患（肝障害）によって誘導されるＧＧＴは，炎症性サイトカインの産出を誘導する。本発明の抗ＧＧＴ抗体は，このＧＧＴの作用を阻害する。すなわち，本発明の抗ＧＧＴ抗体は，炎症性サイトカインの産出を抑制することができる。よって，本発明の抗ＧＧＴ抗体を用いれば，慢性肝炎で繰り返される肝臓の炎症反応を軽減させることができる。よって，本発明の抗ＧＧＴ抗体は，慢性肝炎の治療剤又は予防剤として好適に用いることができる。【０００９】
本発明の第４の側面は，抗ＧＧＴ抗体を有効成分として含有する肝線維症誘発性ＴＮＦ−α発現抑制剤又は肝硬変誘発性ＴＮＦ−α発現抑制剤に関する。前記抗ＧＧＴ抗体は，破骨細胞形成阻害作用を有する抗体である。本発明の抗ＧＧＴ抗体は，ＡＧＴ−３であることが好ましい。後述する実施例で示されたとおり，肝線維症及び肝硬変モデルマウスにおいて，本発明の抗ＧＧＴ抗体を投与することによって，ＴＮＦ−αの発現が抑制される。よって，本発明の抗ＧＧＴ抗体は，肝線維症誘発性ＴＮＦ−α発現抑制剤又は肝硬変誘発性ＴＮＦ−α発現抑制剤として好適に用いることができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば，肝線維症又は肝硬変を予防又は治療する抗ＧＧＴ抗体を含有する剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は，ヒト腎臓を用いたＡＧＴ−１の免疫染色結果を示す図面に替わる写真である。図１Ａは，ＡＧＴ−１抗体で免疫染色した結果を示す図面に替わる写真である。図１Ｂは，ＨＥ染色した結果を示す図面に替わる写真である。図１Ｃは，陽性コントロールであるＣＳＬＥＸ−１抗体で免疫染色した結果を示す図面に替わる写真である。図１Ｄは，染色を行っていない組織を示す図面に替わる写真である。
【図２】図２は，ヒト腎臓を用いたＡＧＴ−３の免疫染色結果を示す図面に替わる写真である。図２Ａは，ＡＧＴ−３抗体で免疫染色した結果を示す図面に替わる写真である。図２Ｂは，ＨＥ染色した結果を示す図面に替わる写真である。図２Ｃは，陽性コントロールであるＣＳＬＥＸ−１抗体で免疫染色した結果を示す図面に替わる写真である。図２Ｄは，染色を行っていない組織を示す図面に替わる写真である。
【図３】図３は，骨ミネラル密度の測定結果を示す図面に替わるグラフである。
【図４】図４は，ラット大腿骨のμＣＴ３Ｄ像を示す図面に替わる写真である。図４Ａは，胆管結紮していないラット大腿骨のμＣＴ３Ｄ像を示す図面に替わる写真である。図４Ｂは，胆管結紮していないラットの大腿骨の切断面を示す図面に替わる写真である。図４Ｃは，胆管結紮したラットの大腿骨のμＣＴ３Ｄ像を示す図面に替わる写真である。図４Ｄは，胆管結紮したラットの大腿骨の切断面を示す図面に替わる写真である。
【図５】図５は，大腿骨遠位骨幹部のＨＥ染色組織像，海綿骨量面積率，破骨細胞数を示す図面に替わる写真又はグラフである。図５Ａは，胆管結紮を行っていないラットの大腿骨遠位骨幹部のＨＥ染色組織を示す図面に替わる写真である。図５Ｂは，胆管結紮したラットの大腿骨遠位骨幹部のＨＥ染色組織を示す図面に替わる写真である。図５Ｃは，大腿骨遠位骨幹部の海綿骨梁面積率を示す図面に替わるグラフである。図５Ｄは，大腿骨遠位骨幹部の破骨細胞数を示す図面に替わるグラフである。
【図６】図６は，ラットの大腿骨遠位骨幹部のＣＴ撮影及び骨密度測定結果を示す図面に替わる写真およびグラフである。図６Ａ〜図６Ｃは，ラットの大腿骨遠位骨患部のμＣＴ像を示す。図６Ａは，胆管結札を行っていないラットの大腿骨遠位骨患部のμＣＴ像示す図面に替わる写真である。図６Ｂは，胆管結紮を行ったラットの大腿骨遠位骨患部のμＣＴ像示す図面に替わる写真である。図６Ｃは，胆管結札を行い，ＡＴＧ−３を投与したラットの大腿骨遠位骨患部のμＣＴ像示す図面に替わる写真である。図６Ｄは，骨密度の結果を示す図面に替わるグラフである。
【図７】図７は，血清中肝機能マーカーの生化学検査の結果を示す図面に替わるグラフである。図７ＡはＧＧＴ値，図７ＢはＡＬＴ値，図７ＣはＡＳＴ値の結果を示す図面に替わるグラフである。
【図８】図８は，肝組織切片をＨＥで染色した結果を示す図面に替わる写真である。図８Ａは，胆管結紮を行っていないラットの肝組織切片のＨＥ染色の結果を示す図面に替わる写真である。図８Ｂは，胆管結紮を行っていないラットの肝組織切片のＴＮＦ−α免疫染色の結果を示す図面に替わる写真である。図８Ｃ，図８Ｅ及び図８Ｆは，胆管結紮を行ったラットの肝組織切片のＨＥ染色の結果を示す図面に替わる写真である。図８Ｄは，胆管結紮を行ったラットの肝組織切片のＴＮＦ−α免疫染色の結果を示す図面に替わる写真である。図８Ｇ，図８Ｉ及び図８Ｊは，胆管結札を行い，かつＡＧＴ−３を投与したラットの肝組織切片のＨＥ染色の結果を示す図面に替わる写真である。図８Ｈは，胆管結札を行い，かつＡＧＴ−３を投与したラットの肝組織切片のＴＮＦ−α免疫染色の結果を示す図面に替わる写真である。
【図９】図９は，アザン・マロリー染色で線維組織のコラーゲン線維を染色した図面に替わる写真である。図９Ａ及び図９Ｂは，胆管結紮を行わなかった動物の肝組織を示す図面に替わる写真である。図９Ｃ及び図９Ｄは，胆管結紮して２週間飼育した動物の肝組織を示す図面に替わる写真である。図９Ｅ及び図９Ｆは，胆管結紮して更にＡＧＴ−３抗体を投与して２週間飼育した動物の肝組織を示す図面に替わる写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は，抗ＧＧＴ抗体を有効成分として含有する肝疾患の治療剤及び予防剤に関する。本明細書の肝疾患として，肝の線維化が関与する疾患があげられる。肝の線維化が関与する疾患として，肝線維症，肝硬変，又は慢性肝炎があげられる。【００１３】
本明細書において，“ＧＧＴ”とは，γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−グルタミルトランスフェラーゼ）を示す。ＧＧＴは，γ−グルタミル基をペプチドまたはアミノ酸に転移する反応を触媒する酵素である。また，ＧＧＴはグルタチオンなどのγ−グルタミル化合物を加水分解する活性を有する。また，ＧＧＴは腎臓，すい臓，肝臓などの細胞の細胞膜に存在し，細胞外アミノ酸の細胞内への取り込みに関与する酵素であり，肝機能診断マーカーとして知られている。【００１４】
抗体とは，生物体内に誘導されるタンパク質である。このような生物として，哺乳類，
鳥類などがあげられる。本発明の抗体としては，ヒト，マウス，ラットなど哺乳動物由来の抗ＧＧＴ抗体があげられる。本発明の抗体は，ヒト以外にも，イヌやネコなどの動物医薬として用いることもできる。投与後の副作用を避けるため，投与する生物由来の抗体とすることが好ましい。ヒトに投与する抗体のタイプとしては，マウス抗体，キメラ抗体，ヒト化抗体，（完全）ヒト抗体などがあげられる。【００１５】
抗ＧＧＴ抗体とは，ＧＧＴと結合しＧＧＴの機能を抑える抗体，ＧＧＴが結合するリガンドと結合しＧＧＴの機能を抑える抗体，ＧＧＴが結合するＧＧＴ受容体と結合しＧＧＴの機能を抑える抗体があげられる。本発明の抗体は，ＧＧＴと結合しＧＧＴ機能を抑える抗体であることが好ましい。【００１６】
このような抗体は，公知の方法で製造することができる（例えば，竹縄忠臣編，タンパク質実験ハンドブック，２００３，ｐ８６−ｐ１０５，（株）羊土社発行）。また，市販のものを用いてもよい（例えば，エーシーバイオテクノロジーズ社製ＡＧＴ−３）。抗体が結合する抗原であるタンパク質やペプチドを，抗体を産生する免疫動物に注射する。免疫動物は，マウス，ラット，ハムスター，ウサギ，ヤギなど免疫動物として利用される公知の動物を用いることができる。免疫動物への抗原の注入は，１回又は２回以上で定期的（例えば，２〜４週間ごと）に行う。抗原の注入後，一定期間ごと（例えば１〜２週間），採血を行い，目的とする抗体が産生されていることを確認する（抗体価を調べる）。抗体価を調べる方法は，公知の方法を用いることができる。たとえば，ウエスタンブロッティング，ＥＬＩＳＡなどがあげられる。このような方法を用いることで，免疫動物由来の抗体（マウスであれば，マウス抗体）を得ることができる。【００１７】
キメラ抗体とは，マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域に連結したもので，公知の方法（例えば，特開平７−１９４３８４号公報など）によって製造することができる。ヒト化抗体とは，マウス抗体の相補鎖決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）をヒト抗体の可変領域に移植した抗体であり，公知の方法（特許２８２８３４０号公報，特開平１１−４６９４号公報など）で製造することができる。ヒト抗体は，免疫動物が本来有している免疫グロブリンを破壊したノックアウト動物に，ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入し，産生させた抗体であり，公知の方法（特開平１０−１４６１９４号公報，特開平１０−１５５４９２号公報など）で，製造することができる。完全ヒト抗体とは，ヒトの細胞から産生される抗体であり，公知の方法（特開２００７−１４１号公報，特開２００５−０３４１５４号公報など）。当業者であれば，このような抗体の公知の作製方法を適宜採用して，本発明の抗体を製造することができる。【００１８】
［ポリクローナル抗体］
ポリクローナル抗体の作製方法の例を以下にあげるが，当業者にとって公知の方法を用いて適宜変更することができる。ポリクローナル抗体は，上記した免疫動物に抗原（免疫原）を注入することで作製することができる。免疫動物に注入する抗原（免疫原）としては，抗原発現細胞，(粗)精製タンパク質，組換えタンパク質，又は合成ペプチドなどを用いることができる。このような抗原として，例えば，配列番号１に記載のアミノ酸配列（ヒトＧＧＴ１全長ＯＲＦ（ＮＣＢI  Ｎｏ．ＣＲ４５６４９４））と同一，又は１〜１０個のアミノ酸残基が置換，欠失，付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドがあげられる。抗原は，好ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列と同一，又は１〜５個のアミノ酸残基が置換，欠失，付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましく，前記アミノ酸配列に置換，欠失，付加又は挿入されるアミノ酸残基の数は１〜２個がより好ましく，さらに好ましくは１個である。本発明の抗ＧＧＴ抗体は，ＧＧＴの機能を抑える抗体であることが好ましい。よって，このような抗体を製造する際に用いる抗原は，配列番号１に記載のアミノ酸配列よりも短いアミノ酸配列のペプチドを用いてもよい。このようなペプチドの長さは，当業者であれば適宜調整することができる。【００１９】
ポリクローナル抗体を作製する際，抗原は，アジュバンドと混合して免疫動物に注入する。ここで，アジュバンドとは，抗原に対する免疫応答を強化する目的で用いられる物質をさし，例えば，アルミニウムアジュバンド，完全（不完全）フロイントアジュバンド，百日咳菌アジュバンドなどである。免疫動物への抗原の注入は，２〜４週間ごとに行う。２回以上注入をした後，注入日後１〜２週間後に採血を行い，抗体価検定（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｉｔｅｒ  ｃｈｅｃｋ）を行う。免疫動物への注入量，注入回数（免疫回数）は，免疫動物の種類やその個体ごとに異なる。当業者であれば，抗体価検定の結果に応じて，適宜調整することができる。抗体価検定としては，公知の方法を用いることができ，たとえばＥＬＩＳＡやウエスタンブロッティングがあげられる。免疫終了後，全血を搾取し，遠心分離など公知の方法を用いて，血清を分離する。血清は，血清中に含まれる内在性の抗体などを取り除くため，精製を行う。精製方法は，たとえばアフィニティークロマトグラフィーなど公知の方法を用いることができる。このようにしてポリクローナル抗体を作製することができる。【００２０】
［抗原発現細胞］
抗原として用いる抗原発現細胞は，培養細胞などの細胞膜上に抗原となるタンパク質が発現した細胞が好ましい。このような抗原発現細胞は，公知の方法で作製することができる。具体的には，抗原となるタンパク質をコードするＤＮＡを培養細胞に導入し発現させればよい。抗原を発現させる培養細胞（以下，「宿主」ともよぶ）は，特に限定されず公知の細胞を用いればよい。たとえば，抗原提示細胞としてしられるＢ細胞や樹状細胞などがあげられる。このような細胞に抗原となるタンパク質を発現させる方法としては，抗原となるタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ抗原発現ベクターを作製し，抗原を発現させる細胞に導入する。発現ベクターに組み込むＤＮＡが細胞膜ドメイン配列を含まない場合には，発現ベクターを導入する宿主が有する細胞膜ドメインの配列を含ませておくことが好ましい。このような配列を含むことで，効率的に細胞膜上にタンパク質（抗原）を発現させることができる。このような細胞膜ドメイン配列は，当業者であれば，適宜取得し，発現ベクターに組み込むＤＮＡ配列に含ませることができる。このような発現ベクターとしては，プロモーター，エンハンサー，スプライシングシグナル，ポリＡ付加シグナル，選択マーカー，ＳＶ４０複製オリジンなどを含有しているものを用いることができる。宿主が動物細胞である場合，プロモーターとしては，例えば，ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどがあげられる。選択マーカーとしては，例えば，ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（メソトレキサート（ＭＴＸ）耐性），アンピシリン耐性遺伝子，ネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性），ハイドロマイシン耐性遺伝子，ブラストサイジン耐性遺伝子等があげられる。このような発現ベクターは，公知のものを使用すればよく，当業者であれば，宿主に応じて適宜選択することができる。抗原発現ベクターを導入する方法としては，リン酸カルシウム法，リポフェクション法，エレクトロポレーション法など公知の方法を用いることができる。細胞に抗原が発現していることを確認する方法は，免疫染色法など公知の方法を適宜用いればよい。このように抗原を発現させた細胞は，公知の方法で回収し，免疫動物に注入する抗原として用いることができる。【００２１】
［（粗）精製タンパク質］
抗原として用いる（粗）精製タンパク質は，培養細胞などが発現するタンパク質を精製したものである。このようなタンパク質は，細胞のシグナル伝達経路に作用したり，転写因子に作用したりする薬剤や因子で培養細胞などを刺激することによって発現させればよい。発現したタンパク質は，公知の方法で精製し，精製タンパク質として用いることができる。たとえば，分泌タンパク質であれば，培養上清を回収し，例えば塩析やカラムクロマトグラフィー，膜処理などで精製することができる。カラムクロマトグラフィーとしては，イオン交換クロマトグラフィー，ゲル濾過クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，疎水性クロマトグラフィーなどがあげられ，当業者であれば，タンパク質の性質に応じて適宜使用することができる。細胞外に分泌されないタンパク質であれば，培養細胞を回収し，超音波処理などで細胞を破砕し，タンパク質を回収することができる。そして，上記した方法でタンパク質を精製すればよい。このような精製タンパク質を取得する方法は，公知であり，当業者であればタンパク質の特性に合わせて適宜用いることができる。【００２２】
［組換えタンパク質］
抗原として用いる組換えタンパク質は，公知の方法で作製することができる。具体的には，抗原として用いる組換えタンパク質をコードするＤＮＡを公知の方法でベクターに挿入し，組換えタンパク質を発現させる宿主に導入する。ベクターは公知のものを用いればよく，当業者であれば導入する宿主に応じて選択することができる。このような宿主としては，細菌，昆虫細胞，植物細胞，動物細胞など公知の宿主を用いることができる。そして，宿主にベクターを導入する方法は，エレクトロポレーション法，リン酸カルシウム法，リポフェクション法など，宿主に応じて，適宜公知の方法を用いることができる。組換えタンパク質は，ＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ  Ｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ），ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）,又は（オリゴ）ヒツチジンなどのタグとの融合タンパク質としてもよい。このようなタグは，目的とする抗原をコードするＤＮＡのＮ末端側又はＣ末端側に結合させればよい。このようなタグを結合させた融合タンパク質とすることで，発現したタンパク質を簡単に精製することが可能になる。宿主に発現させたタンパク質は，例えば分泌タンパク質であれば培養上清を回収することによって，分泌タンパク質でなければ，超音波処理などで宿主細胞を破砕するなどして回収することができる。タンパク質の精製方法は，上記したように，たとえば，ＨＰＬＣやアフィニティーカラムなどを用いることができる。また，インビトロでのタンパク発現系や昆虫，動物,植物などの生体を用いて組換えタンパク質を得ることもできる。このような方法は，公知であり，当業者であれば，適宜変更を加えることができる。【００２３】
［合成ペプチド］
ペプチドを合成する方法として，固相法や液相法などがあげられる。ペプチド合成では，目的とするアミノ酸配列をＮ末端またはＣ末端から逐次結合させていくステップワイズ延長法，またはアミノ酸配列を適当なフラグメントに分け，それらのフラグメントを縮合させて目的のペプチドを合成するフラグメント縮合法があげられる。また，ペプチド合成法として不溶性の樹脂にアミノ酸を結合し，アミノ酸配列情報に基づいて，その樹脂上でアミノ酸を１個ずつ結合させていき鎖を伸長させていく固相法や，樹脂などの担体を用いない液相法があげられる。さらにそれらの方法を組み合わせて効率的に合成することも可能である。このような方法は公知であり，当業者であれば，目的のアミノ酸配列を合成するために，適宜用いることができる。また，合成したペプチドは，精製を行ってもよい。合成ペプチドの精製は，沈殿法，ＨＰＬＣ，イオン交換クロマトグラフィー，ゲル濾過クロマトグラフィーなど公知の方法を用いることができる。抗原として合成ペプチドを用いる場合は，そのままでは抗原性に乏しいので，ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）やＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリアに架橋剤（例えば，ＭＢＳ（ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｘｏｉｃ  ａｃｉｄ）エステル，ＤＭＳ(ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ)など）を用いて共有結合させて用いる方がよい。【００２４】
［モノクローナル抗体］
モノクローナル抗体は，公知の方法で製造することができる。具体的には，免疫動物（例えば，マウスなど）に上記した抗原を２〜４週間間隔で１〜６ヶ月間注入（免疫）し，ポリクローナル抗体の製造方法と同様に，抗体価検定を行う。検定により所望する抗体価が得られたら，免疫動物から脾臓を単離する。単離した脾臓は無血清培地（例えば，イスコフ培地（ＧＩＢＣＯ社製））で懸濁し，脾臓細胞懸濁液とする。脾臓細胞とミエローマ細胞（骨髄腫細胞）を混合し，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を加えて，細胞を融合させる。その後，ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）−アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎｅ）−チミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）（ＨＡＴ）選択培地で培養することで，ハイブリドーマ（脾臓細胞とミエローマ細胞が融合した細胞）のみを増殖させる。さらに，目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選択するために，目的とする抗体の有無の検定と同時に，検定陽性ハイブリドーマのクローニングを行う。この操作を数回繰り返すことによって，目的とする抗体を産生するクローン化ハイブリドーマを得ることができる。その後，クローン化ハイブリドーマを免疫動物の腹腔内に注射し，２〜４週間後に腹水を回収し，精製することでモノクローナル抗体を得ることができる。腹水を精製する方法は，公知の方法を用いればよく，たとえばアフィニティークロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィーなどがあげられる。【００２５】
［リコンビナント抗体の製造方法］
また，本発明の抗体は，リコンビナント抗体としてもよい。リコンビナント抗体とは，抗体産生工程でハイブリドーマを用いない組換え型モノクローナル抗体である。例として最小の抗原結合部位のみを有したもの、多価型の抗原結合部位を具有したもの、ＩｇＧとＩｇＡを組み合わせ分泌型にしたもの、異種動物間でのキメラやヒューマニゼーション（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）を施したものなどがあげられる。このようなリコンビナント抗体は，各アイソタイプの免疫グロブリン遺伝子を宿主で発現させることによって得ることができる。このような宿主を用いる産生系のとしては，大腸菌を用いる方法，培養細胞を用いる方法，植物に産生させる方法，トランスジェニックマウスに産生させる方法などがあげられる。【００２６】
このようなリコンビナント抗体の製造は公知の方法を用いればよい。具体的な例として，ファージディスプレイ法（例えば，Ｒｉｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）など）があげられる。ファージディスプレイ法は，大腸菌ウイルスの一種であるＭ１３などの繊維状ファージのコートタンパク質にファージの感染能を失わないように外来遺伝子を融合タンパクとして発現させるシステムである。ファージとは，細菌に感染するウイルスであり，そのＤＮＡに外来性遺伝子を組み込めば感染に際して宿主内に侵入し，増殖する能力を有する。【００２７】
［ファージディスプレイ法］
ファージディスプレイ法によるモノクローナル抗体の作製方法の１例を以下にあげるが，本発明は以下の作製方法に限定されるものではなく，当業者は各工程を他の公知の方法を用いて，適宜変更することができる。また，当業者であれば，それぞれの工程において，温度，反応時間，使用溶液濃度，使用溶液量などのパラメータを適宜設定して，また変更を加えて実施することができる。ファージディスプレイ法では，まずファージ抗体ライブラリーの作製を行い，その後抗体産生ファージのスクリーニングを行うことで，モノクローナル抗体を作製する。【００２８】
ファージ抗体ライブラリーの作製
（１）Ｂ細胞からｍＲＮＡを抽出し，ＲＴ−ＰＣＲを行って，ｃＤＮＡライブラリーを作製する。
Ｂ細胞は，マウスやヒトなどから採取した細胞を用いればよい。Ｂ細胞のＲＮＡの抽出は，例えば，ＡＧＰＣ法（Ａｃｉｄ−Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）などを用いることができる。ＡＧＰＣ法では，まずＢ細胞にグア二仁チオシアネイト溶液を加えて，ホモジナイズする。その後，細胞のホモジネート溶液に酢酸ナトリウム，フェノール,クロロホルムを加えて混和し，遠心する。遠心後，溶液の水層を回収する。回収した水層にイソプロパノールを加え，混和後，遠心し，ＲＮＡを沈殿させる。沈殿物（ＲＮＡ）は再度グア二ジンチオシアネイト溶液に溶解後，酢酸ナトリウム，フェノール，クロロホルムを加えて振とうする。振とう後，遠心して再度水層を回収する。回収した水層に再度イソプロパノールを加えて遠心し，ＲＮＡを沈殿させる。沈殿させたＲＮＡに７０％エタノールを加え，懸濁し再度遠心して，ＲＮＡを沈殿させることで，トータルＲＮＡ（ｔｏｔａｌＲＮＡ）を得ることができる。次に，トータルＲＮＡからｍＲＮＡの抽出は，ｍＲＮＡのＣ末端側に存在するポリＡ配列に結合するプライマー（オリゴｄＴプライマー）を用いて，ＰＣＲにてｍＲＮＡを増幅させ，オリゴｄＴカラム（例えば，ＱＩＡＧＥＮ社製）などで抽出・精製することができる。また，オリゴｄＴがコーティングされた磁性ビーズ（例えば，ナカライテスク社製）を用いたアフィニティクロマトグラフィーなどで抽出・精製してもよい。精製したｍＲＮＡは，逆転写酵素を含む反応溶液中で，ＰＣＲによってｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。【００２９】
（２）Ｌ鎖（Ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）とＨ鎖（Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）の可変領域に特異的なプライマーを用いてそれぞれＰＣＲで増幅する。
抗体（免疫グロブリン（Ｉｇ）分子）のＨ鎖およびＬ鎖の可変領域であるＶＨ及びＶＬの配列は，たとえばＧｅｎＢａｎｋなどから入手することができる。たとえばＩｇＡ型のヒト抗体を得るには，ヒトのＩｇＡのＶＬ及びＶＨ配列を入手し，それら配列を増やすためのプライマー設計を行い，テンプレートとして上記ｃＤＮＡを用いて，ＰＣＲにて両配列を増幅させればよい。当業者であれば，どのような抗体を得るかによって，プライマー設計は適宜行うことができ，またＰＣＲ等の条件も適宜決めることができる。増幅させたＶＬとＶＨは，公知の方法で精製すればよい。【００３０】
（３）ライブラリーの構築
精製したＶＬとＶＨは，それぞれをリンカーでつなぎ，一本鎖とし，ファージミドベクターに挿入して，一本鎖Ｆｖ（可変領域断片）遺伝子ライブラリーを構築する。リンカーとは，各断片を接続する配列である。このようなリンカーとしては，リンカーとして公知の配列を用いればよい。ファージミドベクターとは，Ｍ１３ファージあるいはｆ１ファージの一本鎖ＤＮＡの生成に必要な複製起点（ＩＧ領域）を組み込んだプラスミドベクターである。ファージミドベクターは，プラスミドとしての特性と一本鎖ＤＮＡファージとしての特性を備えており，通常の二本鎖ＤＮＡプラスミドとして操作することが可能なだけでなく，プラスミドの一方のＤＮＡ鎖を含む線状ファージ粒子を産生させることができる。ファージミドベクターとしては，公知のものを用いればよい（例えば，ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製））。また，別の方法として，抗体Ｈ鎖Ｆｄ部分（ＶＨおよびＣＨ１領域）及びＬ鎖部分に特異的なプライマーを用いてＰＣＲにより抗体遺伝子断片を増幅し，これらの遺伝子断片をファージミドベクターに挿入することにより抗体Ｆａｂに対応する遺伝子ライブラリーを構築してもよい。【００３１】
抗体産生ファージのスクリーニング
（４）抗体提示ファージライブラリーの濃縮
ファージミドベクターを用いて構築した抗体遺伝子ライブラリーを大腸菌に導入し，ヘルパーファージ（Ｍ１３ＫＯ７，ＶＣＳＭ１３など）を感染させることにより，抗体提示ファージライブラリーを作製する。この抗体提示ファージライブラリーの濃縮方法としては，パニング法があげられる。この方法によって，精製した抗原（上記方法などにより精製した抗原）を用いて固相法によりファージライブラリーから目的とする抗体を提示するファージ集団を濃縮することができる。パニング法では，固相化抗原とファージライブラリーの反応，洗浄（固相化抗原と結合しないファージライブラリーの除去），抗原結合ファージの溶出，大腸菌への感染による増幅というステップを数回（例えば４〜５回）繰り返す。これにより抗原特異的ファージ（抗体産生ファージ）を濃縮することができる。【００３２】
（５）抗原特異的ファージクローンの選択及びモノクローナル抗体の取得
抗原特異的ファージクローンの選択法としては，例えばＥＬＩＳＡ法などを用いることができる。精製抗原をコートしたＥＬＩＳＡプレートに，抗体産生ファージを反応させ，精製抗原との反応性（結合性）を調べる。この工程を繰り返し，クローンを選別していくことで，モノクローナル抗体を産生するファージを得ることができる。そして，このようなファージを大腸菌で増殖させ，抗体を回収することでモノクローナル抗体を取得することができる。このような抗体は，たとえばアフィニティークロマトグラフィーなどの公知の精製方法を用いて精製することが可能である。【００３３】
［抗体の評価］
作製した抗体は，抗体価を調べることで評価することができる。抗体価は，公知の方法を用いて評価すればよい。たとえば，ＥＬＩＳＡやウエスタンブロッティングなどがあげられる。作製した抗体が破骨細胞形成阻害作用を有することは，抗ＧＧＴ抗体によるＧＧＴの破骨細胞形成活性阻害を調べることで評価することができる。たとえば，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌｕｍｅ２２，Ｎｕｍｂｅｒ１２，ｐ１９３３−１９４２，２００７」に記載の方法を適宜もちいることができる。また，当業者であれば，上記公知の方法に適宜変更を加えることができる。具体的には，初代軟骨細胞と骨髄造血細胞（ＢＭＨＣｓ）を同じ培養皿に播種し，７日間共培養する。その後，１）ＧＧＴ単独，２）ＧＧＴと抗ＧＧＴ抗体の併用，３）ＰＢＳ（コントロール）をそれぞれ添加し，２〜３日培養する。その後，パラホルムアルデヒドで細胞を培養皿に固定し，ＴＲＡＰ（酒石酸耐性酸性ホスファターゼ）染色（株式会社プライマリーセル社製など）を行う。ＴＲＡＰ染色後，破骨細胞数を計測する。細胞にＰＢＳ（コントロール）を添加したディッシュの破骨細胞数を「ＰＢＳ」，細胞にＧＧＴ単独を添加したディッシュの破骨細胞数「ＧＧＴ」，細胞にＧＧＴと抗ＧＧＴ抗体を併用したディッシュの破骨細胞数を「ＧＧＴ＋抗体」とすると，作製した抗体が破骨細胞の形成を阻害すると評価するためには，（「ＧＧＴ＋抗体」−「ＰＢＳ」）／（「ＧＧＴ」−「ＰＢＳ」）の値が，０．９以下であればよく，０．７以下が好ましく，０．５以下がより好ましい。このような評価に用いる初代軟骨細胞及び骨髄造血細胞は，作製した抗ＧＧＴ抗体が対象とする生物から公知の方法で採取すればよい。当業者であれば，これら細胞は，公知の培養培地（例えば，１０％ウシ血清含有αＭＥＭ培地）で適宜培養し，使用することができる。【００３４】
本発明の好ましい態様として，肝線維症の治療剤又は予防剤，肝硬変の治療剤又は予防剤，慢性肝炎の治療剤又は予防剤，肝線維症誘発性ＴＮＦ−α発現抑制剤又は肝硬変誘発性ＴＮＦ−α発現抑制剤を製造のために本発明の抗体を使用することがあげられる。すなわち，本発明は，肝線維症の治療剤又は予防剤を製造するための抗ＧＧＴ抗体の使用；肝硬変の治療剤又は予防剤を製造するための抗ＧＧＴ抗体の使用；慢性肝炎の治療剤又は予防剤を製造するための抗ＧＧＴ抗体の使用；肝線維症誘発性ＴＮＦ−α発現抑制剤又は肝硬変誘発性ＴＮＦ−α発現抑制剤を製造するための抗ＧＧＴ抗体の使用をも提供する。そして，抗ＧＧＴ抗体の使用において，先に説明したそれぞれのパターンを組み合わせて用いることができる。【００３５】
本発明の剤は，当業者に公知の方法で製造すればよい。本発明の剤は，経口用製剤および非経口用製剤として製造することができる。本発明の剤は，公知の製剤化技術を用いて行えばよい。非経口用製剤は，液剤（水性液剤，非水性液剤，懸濁性液剤，乳濁性液剤など）としてもよいし,固形剤（粉末充填製剤，凍結乾燥製剤など）としてもよい。また，本発明の剤は，徐放製剤としてもよい。固形剤を製造する方法は，凍結乾燥法，スプレードライ（噴霧乾燥）法，無菌再結晶法など，公知の方法を用いればよい。【００３６】
液剤を製造する方法は，公知の方法で製造することができる。例えば，抗体を薬学的に許容された溶剤に溶解し，滅菌された液剤用の容器に充填することで製造することができる。薬学的に許容された溶剤としては，たとえば，注射用水，蒸留水，生理食塩水，電解質溶液剤などがあげられ，滅菌された溶剤を用いることが好ましい。滅菌された液剤用の容器としては，アンプル，バイアル，バッグ、などがあげられる。これら容器は，ガラス製やプラスチック製など公知の容器を用いることができる。具体的には，プラスチック製容器としては，ポリ塩化ビニル，ポリエチレン，ポリプロピレン，エチレン・酢酸ビニル・コポリマーなどの材質を用いたものがあげられる。これら容器や溶剤の滅菌法は，加熱法（火炎法，乾燥法，高温蒸気法，流通蒸気法，煮沸法など），濾過法，照射法（放射線法，紫外線法，高周波法など），ガス法，薬液法などがあげられる。このような滅菌法は，容器の材質，溶剤の性質に応じて，当業者であれば適宜選択して用いることができる。【００３７】
また，本発明は，本発明の抗ＧＧＴ抗体を含む剤と医療用具を組み合わせたキット製品として提供することも可能である。例えば，本発明の抗ＧＧＴ抗体を含む剤を注射筒等の医療用具にあらかじめ充填したもの，１つのソフトバックに離壁を介して一方に固形剤を，他方に溶剤を充填し，使用時に離壁を開通して混合できるようにしたものなどがあげられる。このようにすることで，使用時に医療従事者が調製する負担を軽減できるだけでなく，細菌汚染や異物混入などを防止することができ，好適に使用することができる。このような注射筒やソフトバックは公知であるので，医療従事者であれば適宜使用することができる。【００３８】
本発明の抗ＧＧＴ抗体を含む剤は，静脈内投与，動脈内投与,筋肉内投与，皮下投与，腹腔内投与，鼻腔内投与などの公知の投与方法を用いて投与することができる。好ましくは,注射による投与であり，点滴によって注入することも可能である。また、本発明の剤は,外科手術により患部を開口し，直接患部に投与してもよい。本発明の剤は，経口用製剤および非経口用製剤として調整することができ，好ましくは非経口用製剤である。このような非経口用製剤は，液剤（水性液剤，非水性液剤，懸濁性液剤，乳濁性液剤など）としてもよいし,固形剤（粉末充填製剤，凍結乾燥製剤など）としてもよい。固形剤は，投与する際に，薬学的に許容された溶剤で所望濃度に用時溶解または懸濁化して用いる。このような非経口用製剤は，注射や点滴などの投与方法で用いることができる。【００３９】
本発明の抗ＧＧＴ抗体を含む剤を製剤化する場合，薬学的に許容される担体又は媒体などと適宜組み合わせて製剤化することもできる。さらに，薬剤を含ませてもよい。また，本発明の抗ＧＧＴ抗体を含む剤は，アルブミン，リポタンパク質，グロブリンなどの本発明の抗体の作用を阻害しないタンパク質を含ませてもよい。このようにタンパク質を含ませることで，液剤中に含まれる抗体の安定性向上させることができる。このようなタンパク質は，液剤として本発明の剤を製剤化する場合は，液剤中に含ませればよい。固形剤として，製剤化する場合は，本発明の抗ＧＧＴ抗体を固形化するときに上記タンパク質を含ませてもよいし，固形剤を溶解する溶剤に上記タンパク質を含ませてもよい。このようなタンパク質の含量は，投与時の液量を１００重量部としたときに，０．０１重量部〜５重量部があげられ，当業者であれば，投与する抗体の量やその他に含まれる物質に応じて適宜調整することができる。【００４０】
［薬学的に許容される担体又は媒体］
薬学的に許容される担体又は媒体は，例えば，賦形剤，安定化剤，溶解補助剤，乳化剤，懸濁化剤，緩衝剤，等張化剤，抗酸化剤，又は保存剤など薬学的に許容される物質があげられる。また，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子材料やシクロデキストリン等の抱合化防物を使用することもできる。以下，具体例をあげるが，本発明はそれらに限定されるものではなく，公知のものを使用することができる。賦形剤としては，デンプンや乳糖などそれ自体が薬理作用を有さないものが好ましい。安定化剤としては，アルブミン,ゼラチン，ソルビトール，マンニトール，乳糖，ショ糖，トレハロース，マルトース，グルコースなどがあげられる。これらのうちでは，ショ糖又はトレハロースが好ましい。溶解補助剤としては，エタノール，グリセリン，プロピレングリコール，ポリエチレングリコールなどがあげられる。乳化剤としては，レシチン，ステアリン酸アルミニウム，またはセスキオレイン酸ソルビタンなどがあげられる。懸濁化剤としては，マクロゴール，ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），またはカルメロース（ＣＭＣ）などがあげられる。等張化剤としては，塩化ナトリウム，グルコースなどがあげられる。緩衝剤としては，クエン酸塩，酢酸塩，ホウ酸，またはリン酸塩などがあげられる。抗酸化剤としては，アスコルビン酸，亜硫酸水素ナトリウム，ピロ亜硫酸ナトリウムなどがあげられる。保存剤としては，フェノール，チメロサール，塩化ベンザルコニウムなどがあげられる。【００４１】
本発明の抗体と組み合わせる薬剤として，抗炎症剤，鎮痛剤，抗生物質，肝炎治療薬，または肝疾患に用いられる公知の薬剤があげられる。また，本発明の抗ＧＧＴ抗体を含む剤を注射などによって投与する際，注射による疼痛が起こりうるので，無痛化剤を含ませてもよい。このような薬剤は１種または２種以上組み合せてもよい。【００４２】
抗炎症剤として，ステロイド性抗炎症剤や非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ）などがあげられる。ステロイド性抗炎症剤は，たとえば，デキサメタゾン，コルチゾン，ヒドロコルチゾン，プレドニゾロン，メチルプレドニゾロン，ベタメタゾン，トリアムシノロン，トリアムシノロンアセトニド，フルオシノロンアセトニド，フルオシノニド，ベクロメタゾン，エテンザミドなどがあげられる。非ステロイド性抗炎症剤として，たとえば，アスピリン，イブプロフェン，ナプロキセン，ジクロフェナク，インドメタシン，ナブトメン，フェニルブタゾン，ロフェコキシブ，セレコキシブ，オキシカム，ピロキシカム，ピラゾロン，アザプロパゾンなどがあげられる。【００４３】
鎮痛剤として，鎮痛作用を有するＮＳＡＩＤｓやオピオイド系鎮痛剤などがあげられる。ＮＳＡＩＤｓとしては，アスピリン，イブプロフェン，ナプロキセン，ジクロフェナク，インドメタシン，ナブトメン，フェニルブタゾン，ロフェコキシブ，セレコキシブ，オキシカム，ピロキシカム，ピラゾロン，アザプロパゾンなどがあげられる。オピオイド系鎮痛剤としては，たとえば，エンドルフィン，ダイノルフィン，エンケファリン，コデイン，ジヒドロコデイン，デキストロプロポキシフェンなどがあげられる。【００４４】
抗生物質として，ペニシリン系抗生物質，セフェム系抗生物質,アミノグリコシド系抗生物質，マクロライド系抗生物質，テトラサイクリン系抗生物質，ペプチド系抗生物質などの抗生物質があげられる。ペニシリン系抗生物質としては，ベンジルペニシリン，フェノキシメチルペニシリン，メチシリン，フルクロキサシリン，アモキシシリン，アンピシリン，ピペラシリン，アズロシリン，チカルシリンなどがあげられる。セフェム系抗生物質としては，セファゾリン，セフロキシム，セファマンドール，セフォタキシム，セフォペラゾン，セフピラミド，セファレキシン，セファクロール，セフィキシム，セフテラムなどがあげられる。アミノグリコシド系抗生物質としては，ゲンタマイシン，ネチルマイシン，トブラマイシン，ストレプトマイシン，ネオマイシン，カナマイシン，アミカシンなどがあげられる。マクロライド系抗生物質としては，エリスロマイシン，クラリスロマイシン，ロキシスロマイシン，ロキタマイシン，クリンダマイシン，アジスロマイシンなどがあげられる。テトラサイクリン系抗生物質として，テトラサイクリン，ミノサイクリン，土岐氏再クリンなどがあげられる。この他に，β−ラクタム系抗生物質として，ラタモキセフ，フロモキセフ，アズスレオナム，イミペネム，パニペネムがあげられる。また，この他にバンコマイシン，リファンピシン，クロラムフェニコールなどがあげられる。【００４５】
肝炎治療薬としては，インターフェロン，インターロイキン，ステロイド，強力ミノファーゲン，ウルソ，リバビリン，ラミブジンなどがあげられる。【００４６】
上記のように製造された本発明の抗ＧＧＴ抗体を有効成分として含む剤は，肝線維症，肝硬変もしくは慢性肝炎の患者に有効量投与する治療方法又は予防方法として利用することができる。また，本発明の抗ＧＧＴ抗体を有効成分として含む剤は，肝線維症誘発性ＴＮＦ−α発現又は肝硬変誘発性ＴＮＦ−α発現を抑制するために，患者に有効量を投与する治療方法または予防方法として利用することができる。すなわち，本発明は，対象に有効量の抗ＧＧＴ抗体を投与する肝線維症治療方法又は予防方法；対象に有効量の抗ＧＧＴ抗体を投与する肝硬変治療方法又は予防方法；対象に有効量の抗ＧＧＴ抗体を投与する慢性肝炎の治療方法又は予防方法；対象に有効量の抗ＧＧＴ抗体を投与する肝線維症誘発性ＴＮＦ−α発現抑制方法又は肝硬変誘発性ＴＮＦ−α発現抑制方法をも提供する。そして，この抗ＧＧＴ抗体の使用において，先に説明したそれぞれのパターンを組み合わせて用いることができる。【００４７】
本発明の剤は，経口用，または非経口用製剤として用いられる。非経口用製剤の投与方法は，公知の方法を用いればよく，特に限定されない。例えば，静脈注射，動脈注射，皮下注射，筋肉注射，点滴等があげられる。当業者であれば，適宜，患者に適した投与方法を選択することができる。本発明の剤の主成分である抗ＧＧＴ抗体は，本発明の剤に有効量含まれていればよい。本発明の剤に含まれる抗ＧＧＴ抗体の割合は，全重量を１００重量部としたときに，１×１０−３〜１×１０重量部であればよく，１×１０−２〜１×１０−１重量部が好ましく，５×１０−２〜５×１０−１重量部がより好ましい。投与量は，投与する対象，年齢，症状などによって変化する。一般的には，１日の投与量は，抗体の有効成分で個体あたり１×１０−３〜１×１０３ｍｇがあげられ，好ましくは５×１０−１〜５×１０２ｍｇであり，より好ましくは１×１００〜１×１０２ｍｇである。または，体重１ｋｇ当たり１．５×１０−４〜１．５×１０２ｍｇがあげられ，好ましくは１×１０−２〜１×１０ｍｇであり，より好ましくは１×１０−１〜５×１００ｍｇである。好ましくは，１日分の投与量を２〜５回に分けて投与することが好ましい。また，本発明の剤を徐放製剤として，１日当たりの投与回数を減らすことも可能である。このような徐放製剤とするには，公知の方法を利用すればよい。分けて投与したり，徐放製剤としたりすることで，生体内の薬剤濃度を一定に保ちやすくなるので，持続した薬効が得やすくなり，さらに副作用が軽減されうるので，患者への負担を減らすことができる。
【実施例１】
【００４８】
抗ＧＧＴ抗体作製
組換えヒトＧＧＴ（ｒｈ−ＧＧＴ）（Ｉｋｅｄａ  Ｙ  ｅt  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９２，ｐ１２６−１３０，１９９５）をマウスに感作して，そのリンパ球を細胞融合し，新規ハイブリドーマを作製した。【００４９】
抗体作製法
１．感作
Ｂａｌｂ／ｃ雌６週齢マウス（日本チャールズリバー社）を２５℃飼育室にて，１２時間ごとのライトコントロール下，餌，水を与えて飼育した。１週間の慣らし買いの後に免疫を開始した。感作スケジュールは初回から３回まで５０μｇ／１００μＬアジュバンド（液性アジュバンド）を２週間おきに腹腔内投与，最終回のみ３日後にブーストとして５０μｇ／５０μＬ  ＰＢＳを尾静脈注射した。【００５０】
２．細胞融合
最終免疫より３日後に感作済みのマウスより，ジエチルエーテル麻酔下に外科的摘出された脾臓を無菌的に分散し脾臓細胞を調整した。融合は基本的にケラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２５６，ｐ４９５，１９７５）に従って行った。はじめに取り出した脾臓を７０％アルコールに軽く通して除菌し，滅菌済みの外科用先鋭刀と先曲ピンセットを用いて６０ｍｍ  ｄｉｓｈ中に用意した５ｍＬ無血清培地中で脾臓を分散した。よく分散したら無菌ガーゼを通して線維質のみを取り除き，ファルコン１５ｍＬ遠心管（Ｆａｌｃｏｎ  ２０９６）に集めた。更に無血清培地５ｍＬを加えてよく分散し，遠心分離（１０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ  ＲＴ）した。これを計３回行って最後に１０ｍＬに分散した。この分散液１００μＬを取って９００μＬのギムザ染色液と混合し，細胞計測盤にて有核リンパ球数を数えた。別に培養準備した骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）も同様に遠心操作を行って洗浄し，最後に分散液１００μＬを取って９００μＬのトリパンブルー染色液と混合し細胞数と生存率（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を測定した。結果より融合割合を決定し，１本の別チューブに２種分散液の必要量を入れる。融合比率は脾臓細胞数１×１０８個に対して骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）５×１０７個で，５：１であった。遠心操作を行って細胞を集めたら，１ｍＬ  ＰＥＧ（ポリエチレングリコール：ＰＥＧ６０００）［メルク社］液を用いて脾細胞と骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を融合させた。ＰＥＧは１滴ずつ壁に滴下してムラがないようにし，ＰＥＧを加えたら１分後に無血清培地を加えて細胞を洗浄した。はじめに１滴／秒で１０ｍＬ，次に１ｍＬ／１回で１０ｍＬ，最後に１０ｍＬを１回で加えることでＴｏｔａｌ  ３０ｍＬにした。遠心分離（１０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ  ＲＴ）によって上清を捨て，融合細胞は１０％ＦＢＳ［ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社］α−ＭＥＭ［ＧＩＢＣＯ社］ＨＡＴ［ＧＩＢＣＯ社］培地１０ｍＬに分散し，数と融合状態を観察した。必要細胞量をとり，９６ウェルマイクロタイターカルチャープレート［Ｆａｌｃｏｎ社］１枚に対して１０ｍＬの計算で必要液量にあわせる。先太ピペットにてプレートへ細胞液を分注して３７℃，５％ＣＯ２条件にて培養した。その後，途中３日，６日，１０日後に培地を加えた。【００５１】
３．スクリーニング１
約２週間後にコロニーの生育を確認してスクリーニングを実施した。スクリーニングの実施法を以下に述べる。スクリーニング用プレートを作製するために精製したｒｈ−ＧＧＴを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に溶解し，０．５μｇ／１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルプレート［Ｎｕｎｃ製］に分注した。９６ウェルプレートを４℃で２晩静置した後に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄し，非特異的反応を抑えるために１．５％ＢＳＡ溶液を２００μＬ分注して，更に４℃で１晩静置した。完成したプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄した後に培養上清１００μＬを反応させ，更に洗浄を行った後に２次抗体であるＨＲＰ標識抗マウスイムノグロブリン抗体［ＤＡＫＯ社製］を加えて反応させた。洗浄後にＨＲＰの発色基質である３ｍｇ／ｍＬＯＰＤ［和光純薬製］を加えて一定時間後にＯＤ４９０（吸光度）を測定した。上記のようにして陽性になったクローンは限界希釈法によって再クローニングすることで上清を再度チェックした。【００５２】
４．スクリーニング２
上記ｒｈ−ＧＧＴ抗原プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む緩衝液で３回洗浄した後に培養上清１００μＬを室温で１時間反応させ，更に洗浄を行った後にＧＧＴの酵素活性を測定した。目的はｒｈ−ＧＧＴに結合するが，ＧＧＴ酵素活性を阻害しないモノクローナル抗体の作製であり，ｒｈ−ＧＧＴに抗体を結合させた状態で酵素活性を有するクローンを選択した。ＧＧＴの酵素活性測定法は，市販の活性測定キット（デタミナーＬ）［協和メディックス社製］の反応試薬を各ウェルに５０μＬ添加して，５分後にＯＤ４１０（吸光度）を測定した。吸光度が０．１以下のクローンを陰性と判断して除外した。【００５３】
５．抗体の確認
本実験では，合計１５００ウェルのスクリーニングから８４クローン（６％）を確立し，目的とする特異性を有する抗体は１８クローン（１．２％）であった。しかしその内４クローンは陰性コントロールのＢＳＡプレートとも反応する非特異抗体であった。結果としてｒｈ−ＧＧＴと反応する抗原特異的抗体は１５クローン（０．９％）であった。結果より１５種類のクローンの抗体をモノクローナル抗体タイピングキット［アマシャム社製］にて検定した結果，表１のような結果であった。それぞれクローンをＩｇＧタイプの４クローンをＡＧＴ−１，ＡＧＴ−２，ＡＧＴ−３，ＡＧＴ−４とし，ＩｇＭタイプの１１クローンを番号順にＡＧＴｍ−１からＡＧＴｍ−１１と命名した。
【表１】
2010058550.tif 000003
【００５４】
６．抗体の調製
ハイブリドーマを血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地等で増殖させ，無血清のＲＰＭＩ−１６４０培地やＡＳＦ１０４培地で抗体を産生させ，その培養上清からモノクローナル抗体を精製する。また，大量の抗体を得るには，Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内にハイブリドーマを移植して，増殖させ腹水化させる。この腹水から抗体を回収することもできる。この際，移植前にプリスタン等の鉱油を腹腔内に投与しておくと抗体産生能が上がる。
培養上清や腹水中の抗体は，公知の方法，例えば硫酸アンモニウム沈殿や限外濾過して抗体濃度をあげた後，ＩｇＧであれば，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦカラム［アマシャムバイオサイエンス社製］を用いた．ＩｇＭであれば，ＨｉＴｒａｐ  ＩｇＭ  ＨＰカラム［アマシャムバイオサイエンス社製］を用いたクロマトグラフィーで精製した。
【実施例２】
【００５５】
抗ｒｈ−ＧＧＴモノクローナル抗体を用いた免疫学的実験
交通事故患者の同意を得て，摘出されたヒト腎臓（出血による赤血球などの浸潤以外に異常は認められない）をパラフィン包埋後，切片を作製して抗ｒｈ−ＧＧＴモノクローナル抗体（ＡＧＴ−１，ＡＧＴ−３）（以下，「抗ＧＧＴ中和抗体」，「抗ＧＧＴ抗体」ともよぶ）を用いた免疫染色とＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色を行った。陽性コントロールにはＣＳＬＥＸ−１抗体（抗Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｘモノクローナル抗体）で免疫染色を行った。その結果を図１，図２に示した。【００５６】
図１及び図２は，ヒト腎臓を用いたＡＧＴ−１（図１）及びＡＧＴ−３（図２）の免疫染色結果を示す。図１Ａは，ＡＧＴ−１抗体で免疫染色した結果を示す。図１Ｂは，ＨＥ染色した結果を示す。図１Ｃは，陽性コントロールであるＣＳＬＥＸ−１抗体で免疫染色した結果を示す。図１Ｄは，染色を行っていない組織を示す。図２Ａは，ＡＧＴ−３抗体で免疫染色した結果を示す。図２Ｂは，ＨＥ染色した結果を示す。図２Ｃは，陽性コントロールであるＣＳＬＥＸ−１抗体で免疫染色した結果を示す。図２Ｄは，染色を行っていない組織を示す。陽性コントロールであるＣＳＬＥＸ−１とＧＧＴは近位尿細管に存在する。図１Ｃ及び図２Ｃで示されたとおり，ＣＳＬＥＸ−１が特異的に染色された。そして，図１Ａ及び図２Ａで示されたとおり，ＡＧＴ−１及びＡＧＴ−３はバックがあるものの，ＧＳＬＥＸ−１と同様に管上皮細胞に陽性であった。このことから，ＡＧＴ−１及びＡＧＴ−３は天然の膜結合型ＧＧＴを認識していることがしめされた。
【実施例３】
【００５７】
抗ｒｈ−ＧＧＴモノクローナル抗体による破骨細胞形成阻害
１．マウス骨髄細胞の調製
６〜１２週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（日本エスエルシー社）の大腿骨及び頚骨を無菌的に摘出し，それらの骨端を切除してから両端から１回ずつ２６Ｇの針を突き刺して１ｍＬの培地（α−ＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，１００Ｕ／ｍＬペニシリン，１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含む。）で骨髄細胞を押し出して，細胞塊をピペッティングした。その後，メッシュ（セルストレーナー：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で組織残渣を除いてから細胞数（２×１０６個細胞／ｍＬ）を調整してマウス骨髄細胞とした。【００５８】
２．破骨細胞誘導阻害系
前記マウス骨髄細胞を９６ウェルプレートに１ウェル／１８０μＬ添加し，それに１０μＬのｒｈ−ＧＧＴ（６２５ｎｇ）と抗体（ＡＧＴ−１とＡＧＴ−３及びコントロールＩｇＧ抗体）を同時に添加して培養を開始した。３日目に培地の３／４を交換して，前記サンプルも同量を添加し，更に４日間培養した。【００５９】
３．ＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ）染色
ＴＲＡＰ染色は，破骨細胞の同定法の１つであり，破骨細胞のマーカーであるＴＲＡＰを基質で染色する方法である。上記破骨細胞誘導系（プレート）の細胞をアセトン−クエン酸で固定し，酒石酸存在下で，基質（Ｎａｐｈｔｈｏｌ  ＡＳ−ＭＸ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と色素（Ｐａｓt  ｒｅｄ  ｖｉｏｌｅｔ  ＬＢ  ｓａｌｔ）を３７℃で３０分間反応させて染色した。この反応はＰＢＳで反応液を洗い流して乾燥させることによって停止させた（Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ１２２，ｐ１３７３，１９８８）。その結果，破骨細胞培養系でｒｈ−ＧＧＴはＲＡＮＫＬを発現誘導することでＴＲＡＰ陽性細胞（破骨細胞）の形成を促進させた（データ未掲載）。コントロールＩｇＧ抗体では，ＴＲＡＰ陽性細胞数に変化はないが，ＡＧＴ−３の添加では，用量依存的にＴＲＡＰ陽性細胞数は減少した（データ未掲載）。このことから，ＡＧＴ−３によって，破骨細胞の誘導（形成）が阻害されることが示された。一方，ＡＧＴ−１添加では，破骨細胞の形成が促進され，ＡＧＴ−３添加とは逆の結果となった（データ未掲載）。
【実施例４】
【００６０】
大腿骨遠位骨幹部の骨形成阻害
１．胆汁うっ滞性肝疾患ラットモデルの作成
実験には，７週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラットを各群１０匹，合計２群２０匹用いた。抱水クロナール（４４．８ｍｇ／１００ｇ  Ｂ．Ｗ．）を用いて全身麻酔下にて腹部の毛を剃り，７０％アルコールで消毒後，開腹を行った。コントロール群（Ｓｈａｍ  ｏｒｅ）はその後，即座に閉腹した。肝線維症及び肝硬変モデルである胆管結紮ラット群（ＢＤＬ）は，開腹後,総胆管を剖出し５−０絹糸にて２箇所結紮した後，閉腹した。【００６１】
閉腹直後（０Ｗ），１週間後（１Ｗ），２週間後（２Ｗ）の骨ミネラル密度の測定を測定した（図３）。また，閉腹２週間後，ＣＴ撮影装置を用いて大腿骨のμＣＴ３Ｄ像を撮影した（図４）。さらに，閉復２週間後の大腿骨遠位骨幹部をＨＥ染色し，界面骨梁面積率，破骨細胞数を測定した（図５）。図３〜図５中，「Ｓｈａｍ  ｏｐｅ」は胆管結紮を行わず開腹のみをしたコントロールのラットを示す。図３〜図５中「ＢＤＬ」は，胆管結紮したラットを示す。【００６２】
図３は，骨ミネラル密度の測定結果を示す。図３中，縦軸は骨ミネラル密度［ｇ／ｃｍ２］を示し，横軸は胆管結紮直後（０Ｗ），１週間後（１Ｗ），２週間後（２Ｗ）を示す。図３中，Ｐは棄却率を示す。図３では，縦軸の値が高いほど，骨ミネラル密度が高い，すなわち骨形成が進んでいることを示す。この結果，胆管結札を行っていないラット（Ｓｈａｍ  ｏｐｅ）は，手術後，骨ミネラル密度が高くなることが示された。それに対して，胆管結紮したラット（ＢＤＬ）は，手術後，骨ミネラル密度が高くならないことが示された。このことから，胆管結紮することによって，骨形成が阻害されることが示された。【００６３】
図４は，ラット大腿骨のμＣＴ３Ｄ像を示す。図４Ａは，胆管結紮していないラットの大腿骨を示す。図４Ｂは，胆管結紮していないラットの大腿骨の切断面を示す。図４Ｃは，胆管結紮したラットの大腿骨を示す。図４Ｄは，胆管結紮したラットの大腿骨の切断面を示す。この結果，胆管結紮したラット（ＢＤＬ）の大腿骨（図４Ｄ）は，胆管結紮していないラット（Ｓｈａｍ  ｏｐｅ）（図４Ｂ）と比較して骨密度が低いことがわかる。このことからも胆管結紮することによって，骨形成が阻害されることが示された。【００６４】
図５Ａ及び図５Ｂは，大腿骨遠位骨幹部のＨＥ染色組織を示す。図５Ｃは，大腿骨遠位骨幹部の海綿骨梁面積率を示す。図５Ｃ中，縦軸は骨量（％）を示す。図５Ｄは，大腿骨遠位骨幹部の破骨細胞数を示す。図５Ｄ中，縦軸は１ｍｍ２あたりの破骨細胞数を示す。図中，Ｐは棄却率を示す。この結果，胆管結紮したラット（ＢＤＬ）は，胆管結紮していないラット（Ｓｈａｍ  ｏｐｅ）と比較して，骨量が低いことが示された（図５Ｃ）。そして，胆管結紮したラット（ＢＤＬ）は，胆管結紮していないラット（Ｓｈａｍ  ｏｐｅ）と比較して，破骨細胞数が多いことが示された（図５Ｄ）。【００６５】
図３〜図５の結果より，肝線維症及び肝硬変モデルである胆管結紮ラットでは，破骨細胞数が増大し，骨量が低下することが示された。
【実施例５】
【００６６】
胆汁うっ滞性肝疾患に伴う高ＧＧＴ血症が骨組織に及ぼす影響及び抗ＧＧＴ血症に伴う骨量減少に及ぼす抗ＧＧＴ中和抗体投与の影響
１−ａ．胆汁うっ滞性肝疾患ラットモデルの作成
実験には，７週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラットを各群１０匹，合計２群２０匹用いた。抱水クロナール（４４．８ｍｇ／１００ｇ  Ｂ．Ｗ．）を用いて全身麻酔下にて腹部の毛を剃り，７０％アルコールで消毒後，開腹を行った。コントロール（Ｓｈａｍ  ｏｐｅ）群はその後，即座に閉腹した。肝線維症及び肝硬変モデルである胆管結紮ラット群は，開腹後,総胆管を剖出し５−０絹糸にて２箇所結紮した後，閉腹した。【００６７】
１−ｂ．抗ｒｈ−ＧＧＴ中和抗体（ＡＧＴ−１またはＡＧＴ−３）投与
７週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット１０匹を用いた。抱水クロナール（４４．８ｍｇ／１００ｇＢ．Ｗ．）を用いて全身麻酔下にて腹部の毛を剃り，７０％アルコールで消毒後，開腹して総胆管を剖出し５−０絹糸にて２箇所結紮した後，閉復した。抗ｒｈ−ＧＧＴ中和抗体（ＡＧＴ−１，ＡＧＴ−３（０．１ｍｇ／２００ｇ／ｄａｙ））は，結紮前２日前から実験期間中（２週間）毎日腹腔内に投与した。なお，抗ｒｈ−ＧＧＴ中和抗体ＡＧＴ−１及びＡＧＴ−３は，株式会社エーシーバイオテクノロジーズ社製のものを用いた。ＢＤＬラットは，通常１ヶ月で死亡する。しかし，ＡＧＴ−３を投与したＢＤＬラットは，死亡しないことが明らかとなった。一方，ＡＧＴ−１を投与したＢＤＬラットは，２週間で死亡することが明らかとなった。【００６８】
２．抗ｒｈ−ＧＧＴ中和抗体投与による骨形成への影響
実験開始２週間後に，ラットの大腿骨遠位骨幹部のＣＴ撮影及び骨密度測定を行った。図６にその結果を示した。図６Ａ〜図６Ｃは，ラットの大腿骨遠位骨患部のμＣＴ像を示す。図６Ａは，胆管結札を行っていないコントロールのラット（Ｓｈａｍ  ｏｐｅ）の結果を示す。図６Ｂは，胆管結紮を行ったラット（ＢＤＬ）の結果を示す。図６Ｃは，胆管結札を行い，抗ｒｈ−ＧＧＴ中和抗体（ＡＧＴ−３）を投与したラット（ＢＤＬ＆ＡＧＴ−３）の結果を示す。図６Ｄは，骨密度の結果を示す。【００６９】
図６の結果より，胆管結紮によって骨密度が減少する（図６Ｂ）。しかし，ＡＧＴ−３を投与することによって骨密度が回復することが示された（図６Ｃ）。図５で示したとおり，胆管結紮したラットは，破骨細胞数が増大し，骨量が低下する。すなわち，胆管結紮したラットの骨密度現象は，破骨細胞によるものと考えられる。よって，胆管結紮したラットにＡＧＴ−３を投与することによって骨密度が回復することから，ＡＧＴ−３は破骨細胞形成を阻害することによって骨密度を回復させると考えられる。よって，ＡＧＴ−３は，破骨細胞形成阻害作用を有するといえる。一方，胆管結紮したラットにＡＧＴ−１を投与すると，骨密度は減少し，破骨細胞形成が促進されることが示された（データ未記載）。よって，ＡＧＴ−１は，破骨細胞形成促進作用を有するといえる。なお，ＡＧＴ−２及びＡＧＴ−４を用いて同様の実験を行ったところ，ＡＧＴ−２及びＡＧＴ−４は，破骨細胞形成に作用しないことが分かった。【００７０】
３．血清中肝機能マーカーの生化学検査
実験開始２週間後に，断頭により堵殺し血液を採取した。採取した血液を１０分間遠心分離機（２．５×１０３ＲＰＭ）にかけ，血清を採取し，総ビリルビン，ＡＳＴ（，ＡＬＴ，γＧＴＰ（ＧＧＴ），ＡＬＰを測定した。【００７１】
図７にその結果を示した。図７ＡはＧＧＴ値，図７ＢはＡＬＴ値，図７ＣはＡＳＴ値の結果を示す。図７中「２Ｗ」は，胆管結札後２週間を示す。図７中，「Ｓｈａｍ  ｏｐｅ」は胆管結紮を行わず開腹のみをしたコントロールのラットを示す。図７中「ＢＤＬ」は，胆管結紮したラットを示す。図７中「ＢＤＬ＋ＡＧＴ−３」は，胆管結紮したラットに抗ＧＧＴ抗体（ＡＧＴ−３）を投与したラットを示す。その結果，図７Ａ〜図７Ｃともに，胆管結紮することによって値が上昇した。胆管結紮により，肝機能マーカーであるＡＳＴ及びＡＬＴがともに上昇していることから，ラットが肝機能障害を起こしていることがわかる。しかし，図７Ａ〜図７Ｃともに，抗ＧＧＴ抗体ＡＧＴ−３を投与することで，各値が低下（回復）した。このことから，抗ＧＧＴ抗体ＡＧＴ−３投与により肝機能障害が抑制されることが分かった。よって，本発明の抗ＧＧＴ抗体は，肝機能障害の治療薬として好適に用いることができる。上記したとおり，胆管結紮したラットは，肝線維症及び肝硬変モデルとして広く用いられている。本発明の抗ＧＧＴ抗体は，このようなモデル動物の肝機能障害を改善することから，肝線維症及び肝硬変の治療剤としても用いることができると考えられる。【００７２】
４．組織学的観察
堵殺後に肝臓，大腿骨，上顎骨を摘出し，ＰＬＰ固定液に１日間浸漬した。肝臓はその後通法に従って，パラフィン切片を作成し，ヘマトキシリン・エオジン染色，ＴＮＦ−α免疫染色，アザン・マロリー（Ａｚａｎ−Ｍａｌｌｏｒｙ）染色を施した。染色後，光学顕微鏡にてそれぞれの組織学的特徴変化を観察した。その結果を図８（ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色），ＴＮＦ−α免疫染色），及び図９（アザン・マロリー染色）に示した。【００７３】
図８は，肝組織切片をＨＥで染色した結果を示す。図８Ａ〜図８Ｂは，胆管結紮を行っていないラット（Ｓｈａｍ  ｏｐｅ）の肝組織切片を示す。図８Ａは，ＨＥ染色の結果を示す。図８Ｂは，ＴＮＦ−α免疫染色の結果を示す。図８Ｃ〜図８Ｆは，胆管結紮を行ったラット（ＢＤＬ２Ｗ）の肝組織切片を示す。図８Ｃ，図８Ｅ及び図８Ｆは，ＨＥ染色の結果を示す。図８Ｄは，ＴＮＦ−α免疫染色の結果を示す。図８Ｇ〜図８Ｊは，胆管結札を行い，かつＡＧＴ−３を投与したラット（ＡＧＴ−３  ２Ｗ）の肝組織切片を示す。図８Ｇ，図８Ｉ及び図８Ｊは，ＨＥ染色の結果を示す。図８Ｈは，ＴＮＦ−α免疫染色の結果を示す。【００７４】
図８Ａ及び図８Ｂより，Ｓｈａｍ  ｏｐｅのラットの肝組織には変化が見られなかった。そして，ＴＮＦ−αの発現は少なく，ＴＮＦ−α陽性マクロファージ量は非常に少なかった。それに対して，図８Ｃ，図８Ｅ及び図８Ｆより，胆管結紮を行ったラット（ＢＤＬ２Ｗ）では，門脈領域の線維化及び中心静脈の膨張が顕著であった。また，肝細胞の顕著なネクローシス及び胆管の増殖がはっきりと認められた。そして，炎症細胞が湿潤している肉芽組織も認められた。さらに，微小膿瘍巣も観察された。図８Ｄでは，線維組織が増大して，線維組織にＴＮＦ−αの発現が認められた。そして，線維性結合組織中には，ＴＮＦ−α陽性マクロファージが点在していた。胆管結紮を行ったラット（ＢＤＬ２Ｗ）と比較して，胆管結紮後ＡＧＴ−３を投与したラット（ＡＧＴ−３  ２Ｗ）では，胆管結紮によって引き起こされる様々な組織応答（線維組織の増大，ＴＮＦ−αの発現など）が減少していた（図８Ｇ〜図８Ｊ）。【００７５】
図８より，ＡＧＴ−３によって門脈領域の線維化，中心静脈の膨張，肝細胞のネクローシス，胆管の増殖，炎症細胞が湿潤している肉芽組織，微小膿瘍巣，及びＴＮＦ−αの発現が抑制されることが示された。これらの現象は，肝疾患で認められる病態，又は様々な肝疾患を引き起こす病因でもある。このことから，ＡＴＧ−３は，肝疾患の治療剤及び予防剤として有効に用いることができる。【００７６】
図９は，アザン・マロリー染色で線維組織のコラーゲン線維を染色した写真である。アザン・マロリー染色では，コラーゲン量に応じて青く染まる。すなわち，青くなるほど線維組織が多い（線維化が進行した）ことを示す。図９Ａ及び図９Ｂは，胆管結紮を行わなかったラットの肝組織を示す。図９Ｃ及び図９Ｄは，胆管結紮して２週間飼育したラットの肝組織を示す。図９Ｅ及び図９Ｆは，胆管結紮して更にＡＧＴ−３抗体を投与して２週間飼育したラットの肝組織を示す。図９Ｂ，図９Ｄ，図９Ｆは，それぞれ図９Ａ，図９Ｃ，図９Ｅを拡大して撮影した写真である。【００７７】
図８及び図９の結果から，ＡＧＴ−３によって肝組織の線維化が抑制されることが示された。一方，同様の実験をＡＧＴ−１で行ったところ，ＡＧＴ−１を投与したラットでは，肝組織の線維化が促進された（データ未記載）。実験の結果からこのことから，破骨細胞形成阻害作用を有するＡＧＴ−３は，肝線維化を抑制することが示された。一方，破骨細胞形成促進作用を有するＡＧＴ−１では，肝線維症を促進し，死期を早めることが明らかになった（データ未記載）。なお，破骨細胞形成に影響を及ぼさない抗ＧＧＴ抗体（ＡＧＴ−２，ＡＧＴ−４）は，肝線維症に影響を及ぼさなかった。【００７８】
上記のとおり，ＡＧＴ−１とＡＧＴ−３は，抗ＧＧＴ抗体である。しかし，ＡＧＴ−１が破骨細胞形成を促進するのに対し，ＡＧＴ−３は破骨細胞形成を阻害する。このように，両抗体は逆の作用を有する。そして，破骨細胞形成に影響を及ぼさない抗ＧＧＴ抗体（ＡＧＴ−２，ＡＧＴ−４）は，肝線維症に影響を及ぼさない。以上より，破骨細胞形成と肝線維化との関係は明らかではないが，破骨細胞形成阻害作用を有する抗ＧＧＴ抗体は，肝線維化抑制作用を有するといえる。よって，破骨細胞形成阻害作用を有する抗ＧＧＴ抗体は，肝線維症治療剤又は予防剤として用いることができると考えられる。【００７９】
上記のとおり，抗ＧＧＴ抗体であるＡＧＴ−１とＡＧＴ−３は，反対の作用を有する。よって，ＡＧＴ−１とＡＧＴ−３を組み合わせることで，たとえば一方の抗体の薬効を他方の抗体の作用で調製するような新たな医薬用組成物を得ることが可能になる。【００８０】
本発明の抗ＧＧＴ抗体は，破骨細胞形成阻害作用を有し，ＧＧＴと結合してＧＧＴの機能を阻害する抗体である。肝組織が障害をうける（肝疾患をわずらう）と，ＧＧＴが誘導され，ＧＧＴ量が増大する。このＧＧＴは，ＳＴ−２細胞（骨芽細胞様ストローマ細胞（繊維芽細胞））やＲＡＷ細胞（マクロファージ様細胞）にあるＧＧＴ受容体に結合し，サイトカインの産出を誘導する。このサイトカインには炎症性サイトカイン（ＩＬ−１，ＩＬ−６，ＭＩＰ−１など）が含まれる。そのため，肝疾患によってＧＧＴが増大すると，炎症症状が惹起されうる。このようなＧＧＴによる効果は，ＧＧＴと生体内結合タンパク質とが複合体を形成し，その複合体が細胞膜上の受容体に結合することで引き起こされると考えられる。本発明の抗ＧＧＴ抗体は，ＧＧＴと結合タンパク質の複合体に結合することで，その複合体が複合体の受容体に結合することを阻害すると考えられる。このように，本発明の抗ＧＧＴ抗体は，受容体を介するシグナル伝達を阻害することでＧＧＴによって惹起される症状を抑えることができると考えられる。よって，本発明の抗ＧＧＴ抗体を用いれば，肝疾患によって惹起される炎症症状などを予防することもできる。【００８１】
さらに今回の実験で，ＧＧＴは，ＴＮＦ−αを介してアポトーシスを誘導することが明らかになった。そして，ＡＧＴ−１はアポトーシスを促進し，ＡＧＴ−３はアポトーシスを抑制することが明らかとなった。この抗ＧＧＴ抗体によるアポトーシス促進作用又はアポトーシス抑制作用には，ＴＮＦ−αが関与していることも明らかとなった。このことから，ＡＧＴ−１又はＡＧＴ−３のいずれか又は両方を組み合わせて用いることで，アポトーシスが関連する肝疾患，又はＴＮＦ−αが関連する肝疾患などに対して，薬効を調整できる医薬組成物を提供できると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明は，医薬産業で使用されうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2010058550.tif 000014
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