(57)【要約】  本発明は、脳虚血により引き起こされる炎症反応から脳組織を有効に保護するための薬剤を提供することを目的とする。本発明に係る脳保護剤は、特定のカロテノイド化合物を有効成分として含有することを特徴とする。
2019131136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物を有効成分として含有することを特徴とする脳保護剤。
【化１】
2019131136.tif 000009
［式中、
Ｒ1〜Ｒ3は、独立して水素原子またはＣ1-18アルカノイル基を示し、
Ｒ4〜Ｒ17は、独立して水素原子またはＣ1-6アルキル基を示し、但し、ＲnとＲn+2（ｎは、４以上、１５以下の整数を示す）は、結合してエステル基を形成していてもよく、
Ｘは、−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−基または単結合を示す。］
【請求項２】
Ｒ1が水素原子である請求項１に記載の脳保護剤。
【請求項３】
Ｒ2が水素原子である請求項１または２に記載の脳保護剤。
【請求項４】
Ｒ3がアセチル基である請求項１〜３のいずれかに記載の脳保護剤。
【請求項５】
上記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物がペリジニンである請求項１〜４のいずれかに記載の脳保護剤。
【請求項６】
上記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物がフコキサンチンである請求項１〜４のいずれかに記載の脳保護剤。
【請求項７】
脳虚血後の炎症反応を抑制する請求項１〜６のいずれかに記載の脳保護剤。
【請求項８】
脳虚血から脳組織を保護するための、下記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物の使用。
【化２】
2019131136.tif 000010
［式中、
Ｒ1〜Ｒ3は、独立して水素原子またはＣ1-18アルカノイル基を示し、
Ｒ4〜Ｒ17は、独立して水素原子またはＣ1-6アルキル基を示し、但し、ＲnとＲn+2（ｎは、４以上、１５以下の整数を示す）は、結合してエステル基を形成していてもよく、
Ｘは、−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−基または単結合を示す。］
【請求項９】
Ｒ1が水素原子である請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
Ｒ2が水素原子である請求項８または９に記載の使用。
【請求項１１】
Ｒ3がアセチル基である請求項８〜１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
上記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物がペリジニンである請求項８〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
上記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物がフコキサンチンである請求項８〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
脳虚血後の炎症反応を抑制するための請求項８〜１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
脳虚血から脳組織を保護するための方法であって、下記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物を脳虚血患者に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【化３】
2019131136.tif 000011
［式中、
Ｒ1〜Ｒ3は、独立して水素原子またはＣ1-18アルカノイル基を示し、
Ｒ4〜Ｒ17は、独立して水素原子またはＣ1-6アルキル基を示し、但し、ＲnとＲn+2（ｎは、４以上、１５以下の整数を示す）は、結合してエステル基を形成していてもよく、
Ｘは、−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−基または単結合を示す。］
【請求項１６】
Ｒ1が水素原子である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ2が水素原子である請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｒ3がアセチル基である請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
上記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物がペリジニンである請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
上記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物がフコキサンチンである請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
脳虚血後の炎症反応を抑制するための請求項１５〜２０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳虚血により引き起こされる炎症反応から脳組織を有効に保護するための薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
脳卒中（脳血管障害）は、主に脳梗塞と脳出血とくも膜下出血に分類される。脳梗塞とは、脳血管における動脈硬化や、脳以外における血管でできた血栓が脳に運搬されることなどを原因として、脳血管が閉塞したり細くなることによって、脳の血流が不足して血流障害組織が壊死に陥る疾病をいう。また、脳出血は高血圧や加齢などにより脳内で出血し、血液の塊が脳細胞を圧迫する。くも膜下出血は脳動脈にできたコブが破れ、くも膜下腔に出血が生じるものである。いずれにしても、壊死した脳組織は元通りにはならないと言われており、たとえ生命を取り留めた場合でも運動麻痺、感覚障害、言語障害のみならず痴呆症状が残る場合が多い。その一方で、近年、高血圧、心臓病、高脂血症、糖尿病などの生活習慣病といわれる疾病が増加しており、それに伴って脳卒中の危険性が増している。我が国において脳血管障害は癌や虚血性心疾患に次いで死因の第３位を占めており、このことは欧米先進諸国でも同様である。従って、効果的な脳卒中の処置手段が切望されている。【０００３】
ところが、これまでのところ脳卒中に対する真に有効な治療手段は未だ見出されていない。例えば、脳梗塞の原因となった血栓を溶解して血流を再開させるために、組織型プラスミノーゲンアクチベータなどの血栓溶解剤が使用されている。しかし、血流再開により生じるフリーラジカルを原因とする障害も脳虚血後の病態に深く関与しており、血栓溶解剤のみでは脳組織の壊死に対する根本的な解決方法とはならない。【０００４】
近年、脳虚血に続く再灌流時の海馬で増加する細胞外亜鉛イオンが、中枢神経系グリア細胞であるミクログリア内の亜鉛シグナルを活性化し、過剰な炎症応答を引き起こすことが明らかとなった。ミクログリアに由来する過剰な炎症反応は認知機能を障害することが知られており、特に認知機能に関与する大脳辺縁系の海馬は、炎症反応に対して脆弱な脳領域として知られている。しかし、亜鉛シグナルを標的とした薬剤は存在しておらず、かかる薬剤は新たなアプローチからの脳保護剤となる可能性がある。【０００５】
日本では、脳梗塞急性期に伴う機能障害などを改善するための薬剤として、ラジカルスカベンジャーであるエダラボンが唯一承認されている。しかし、エダラボンには肝機能障害や腎機能障害などの副作用が見られ、特に肝機能検査値異常など臨床検査値の異常変動は投与患者の実に２１．４％にも及ぶというデータもある。いかに致死的な疾患である脳梗塞に対する治療手段といえども、この様な高い副作用発生率には問題がある。【０００６】
ところで、本発明者らの研究グループは、天然の海洋カロテノイドであるペリジニンが遅延性アレルギーに対して優れた抑制効果を示すことを見出して、特許出願している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第６１８３７４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、脳卒中は近年益々問題になっているにもかかわらず、日本で承認されている薬剤はエダラボンのみである。その一方で、脳虚血に続く再灌流時に増加する亜鉛イオンに起因するミクログリアの過剰な炎症反応が脳卒中後遺症に重篤な影響を与えるなど、脳虚血から脳卒中後遺症に至るメカニズムの解明も進んでいる。
そこで本発明は、脳虚血により引き起こされる炎症反応から脳組織を有効に保護するための薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、特定のカロテノイド化合物が、脳虚血に続く再灌流後における炎症性サイトカインの過剰放出を抑制し、過度の炎症反応を低減できることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。【００１０】
［１］  下記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物を有効成分として含有することを特徴とする脳保護剤。
【化１】
2019131136.tif 000003
［式中、
Ｒ1〜Ｒ3は、独立して水素原子またはＣ1-18アルカノイル基を示し、
Ｒ4〜Ｒ17は、独立して水素原子またはＣ1-6アルキル基を示し、但し、ＲnとＲn+2（ｎは、４以上、１５以下の整数を示す）は、結合してエステル基を形成していてもよく、
Ｘは、−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−基または単結合を示す。］
［２］  Ｒ1が水素原子である上記［１］に記載の脳保護剤。
［３］  Ｒ2が水素原子である上記［１］または［２］に記載の脳保護剤。
［４］  Ｒ3がアセチル基である上記［１］〜［３］のいずれかに記載の脳保護剤。
［５］  上記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物がペリジニンである上記［１］〜［４］のいずれかに記載の脳保護剤。
［６］  上記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物がフコキサンチンである上記［１］〜［４］のいずれかに記載の脳保護剤。
［７］  脳虚血後の炎症反応を抑制する上記［１］〜［６］のいずれかに記載の脳保護剤。
［８］  脳虚血から脳組織を保護するための、上記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物の使用。
［９］  Ｒ1が水素原子である上記［８］に記載の使用。
［１０］  Ｒ2が水素原子である上記［８］または［９］に記載の使用。
［１１］  Ｒ3がアセチル基である上記［８］〜［１０］のいずれかに記載の使用。
［１２］  上記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物がペリジニンである上記［８］〜［１１］のいずれかに記載の使用。
［１３］  上記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物がフコキサンチンである上記［８］〜［１１］のいずれかに記載の使用。
［１４］  脳虚血後の炎症反応を抑制するための上記［８］〜［１３］のいずれかに記載の使用。
［１５］  脳虚血から脳組織を保護するための方法であって、上記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物を脳虚血患者に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
［１６］  Ｒ1が水素原子である上記［１５］に記載の方法。
［１７］  Ｒ2が水素原子である上記［１５］または［１６］に記載の方法。
［１８］  Ｒ3がアセチル基である上記［１５］〜［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］  上記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物がペリジニンである上記［１５］〜［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］  上記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物がフコキサンチンである上記［１５］〜［１８］のいずれかに記載の方法。
［２１］  脳虚血後の炎症反応を抑制するための上記［１５］〜［２０］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る脳保護剤は、脳虚血に続く再灌流後における炎症性サイトカインの過剰放出を抑制し、脳組織にダメージを与える過度の炎症反応を低減することにより、脳組織を保護できる。かかる作用機序は従来の脳保護剤には無いものである。また、承認薬ではあるがラジカルスカベンジャーであることから半減期が短く、また作用も激しく副作用が問題となるエダラボンに比べて、本発明に係る脳保護剤の有効成分はカロテノイド化合物であり、副作用が少なく安全性が高いといえる。よって本発明に係る脳保護剤は、脳卒中後の後遺症を軽減できるものとして非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、亜鉛イオンに起因するミクログリアによる炎症性サイトカインの過剰放出に対する本発明に係るペリジニンによる抑制効果を示すｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験結果のグラフである。
【図２】図２は、亜鉛イオンに起因する海馬における炎症性サイトカインの過剰放出に対する本発明に係るペリジニンによる抑制効果を示すｉｎ  ｖｉｖｏ実験結果のグラフである。
【図３】図３は、亜鉛イオンに起因するミクログリアにおける活性酸素の発生に対する本発明に係るペリジニンによる抑制効果を示すｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験結果の写真とグラフである。
【図４】図４は、脳虚血に続く再灌流後における海馬ミクログリアのＭ１型への活性化に対するペリジニンの抗炎症効果を示す写真とグラフである。
【図５】図５は、ペリジニンの事前投与が短期間空間認識記憶の欠失に対する保護効果を示すか否かを確認するためのＹ字迷路テストの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に係る脳保護剤は、上記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物（以下、「カロテノイド化合物（Ｉ）」と略記する場合がある）を有効成分として含有する。なお、上記式（Ｉ）と以下の化学構造式中の「＝・＝」は、「＝Ｃ＝」を意味する。
【００１４】
上記式（Ｉ）のＲ1〜Ｒ3である「Ｃ1-18アルカノイル基」は、ホルミルまたはＣ1-17アルキル−カルボニル基をいい、ここで「Ｃ1-17アルキル基」は、炭素数１以上、１７以下の直鎖状または分枝鎖状の一価飽和炭化水素基をいう。Ｃ1-18アルカノイル基としては、ホルミルに加え、例えば、アセチル、エチルカルボニル、ｎ−プロピルカルボニル、イソプロピルカルボニル、ｎ−ブチルカルボニル、ピバロイル、ｎ−ヘキシルカルボニル、ｎ−オクチルカルボニル、ｎ−ノニルカルボニル、６−メチルオクチルカルボニル、７−メチルオクチルカルボニル、ｎ−デシルカルボニル、８−メチルノニルカルボニル、ｎ−ウンデシルカルボニル、９−メチルデシルカルボニル、ｎ−ドデシルカルボニル、１０−メチルウンデシルカルボニル、ｎ−トリデシルカルボニル、１１−メチルドデシルカルボニル、ｎ−テトラデシルカルボニル、ｎ−ペンタデシルカルボニル、ｎ−ヘキサデシルカルボニル、ｎ−ヘプタデシルカルボニルなどが挙げられる。Ｃ1-18アルカノイル基としては、Ｃ1-8アルカノイル基またはＣ9-18アルカノイル基が好ましく、Ｃ1-6アルカノイル基がより好ましく、Ｃ1-4アルカノイル基がさらに好ましく、Ｃ1-2アルカノイル基がさらに好ましく、アセチルが特に好ましい。
【００１５】
上記式（Ｉ）のＲ4〜Ｒ17である「Ｃ1-6アルキル基」は、炭素数１以上、６以下の直鎖状または分枝鎖状の一価飽和炭化水素基をいう。例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等を挙げることができ、好ましくはＣ1-4アルキル基であり、より好ましくはＣ1-2アルキル基であり、最も好ましくはメチルである。
【００１６】
上記式（Ｉ）のＲ4〜Ｒ17において、ＲnとＲn+2（ｎは、４以上、１５以下の整数を示す）が結合して形成してもよいエステル基は、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−基であり、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基が好ましい。
【００１７】
カロテノイド化合物（Ｉ）としては、以下のカロテノイド化合物（ＩＩ）を挙げることができる。
【００１８】
【化２】
2019131136.tif 000004
［式中、Ｒ1〜Ｒ3は上記と同義を示す。］
【００１９】
カロテノイド化合物（Ｉ）のうちペリジニンは、Ｒ1とＲ2が水素原子、Ｒ3がアセチル、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ9およびＲ11〜Ｒ16が水素原子、Ｒ10とＲ17がメチル、Ｘが単結合である下記構造を有する。
【００２０】
【化３】
2019131136.tif 000005
【００２１】
渦鞭毛藻であるＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．ＯＴＣＬ２Ａ株などから単離される天然のカロテノイド化合物であるペリジニンは、以下の立体構造を有する。
【００２２】
【化４】
2019131136.tif 000006
【００２３】
カロテノイド化合物（Ｉ）のうちフコキサンチンは、Ｒ1とＲ2が水素原子、Ｒ3がアセチル、Ｒ4、Ｒ8、Ｒ13およびＲ17がメチル、Ｒ5〜Ｒ7、Ｒ9〜Ｒ12およびＲ14〜Ｒ16が水素原子、Ｘが−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−基である下記構造を有する。
【００２４】
【化５】
2019131136.tif 000007
【００２５】
主に褐藻などの不等毛藻渦鞭毛藻から単離される天然のカロテノイド化合物であるフコキサンチンは、以下の立体構造を有する。
【００２６】
【化６】
2019131136.tif 000008
【００２７】
本発明で用いるカロテノイド化合物（Ｉ）は、主に天然の海洋カロテノイドであることから藻類から単離精製することができる。例えば上記のペリジニンは、Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．ＯＴＣＬ２Ａ株などの渦鞭毛藻から単離精製することができる。以下、一例としてペリジニンの単離方法を説明するが、他のカロテノイド化合物（Ｉ）も藻類から同様の方法で単離することができる。
【００２８】
ペリジニンを産生する渦鞭毛藻の中でもＳｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．は、海産の無脊椎動物と共生関係を持つ共生性のものである。宿主である海産動物としては、有孔虫類、放散虫類、扁形動物の無腸類、クラゲ類、サンゴ類、二枚貝類などを挙げることができる。よって、ペリジニンを天然から単離するには、渦鞭毛藻Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．を上記海産動物から単離した上で培養し、培養した渦鞭毛藻をホモジナイズなどした後、抽出すればよい。また、ペリジニンを生産する渦鞭毛藻を含む海産動物から、ペリジニンを直接抽出することも可能である。海産動物を用いる場合においても、渦鞭毛藻を用いる場合と同様に、渦鞭毛藻を含む海産動物をホモジナイズなどした後に抽出すればよい。
【００２９】
抽出溶媒は、適宜選択すればよいが、例えば、メタノールやエタノールなどのアルコール系溶媒；アセトンやメチルエチルケトンなどのケトン系溶媒；ジクロロメタンやクロロホルムなどのハロゲン化炭化水素系溶媒；ベンゼンやトルエンなどの芳香族炭化水素系溶媒；酢酸メチルや酢酸エチルなどのエステル系溶媒；ジエチルエーテルやテトラヒドロフランなどのエーテル系溶媒；ジメチルホルムアミドやジメチルアセトアミドなどのアミド系溶媒；濃度６０ｖ／ｖ％以上の、これら有機溶媒のうち水混和性有機溶媒と水との混合溶媒を挙げることができる。
【００３０】
抽出条件は適宜調整すればよい。例えば、抽出は常温で行うことができるが、抽出効率を高めるために、気温によっては３０〜６０℃程度に加温してもよい。また、抽出効率を高めるために抽出時には撹拌することが好ましい。或いは、渦鞭毛藻に抽出溶媒を加えた後に、渦鞭毛藻を抽出溶媒中で粉砕してもよい。また、抽出時間は特に制限されないが、例えば、１時間以上、１０日以下程度にすることができる。
【００３１】
抽出操作後は、例えば後記の実施例と同様にして炎症性サイトカイン産生の作用を測定したり、既知化合物の物性データを参照するなどしつつ、薄層クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ、分取クロマトグラフィなどのクロマトグラフィにより活性成分を特定していけばよい。
【００３２】
以上のとおり、カロテノイド化合物（Ｉ）は、藻類から単離するか、或いは単離された化合物を誘導体化することにより製造すればよい。例えば、Ｒ1〜Ｒ3の何れか１以上がＣ1-18アルカノイル基であるカロテノイド化合物（Ｉ）は、所定の水酸基をエステル化することにより製造することができる。かかるエステル化は、Ｃ1-18アルカノイル基に対応する酸、またはその活性化エステル化合物や酸クロライド化合物、更には必要に応じて縮合剤を用い、当業者にとり公知の方法で行うことができる。但し、カロテノイド化合物（Ｉ）のうち天然化合物であるペリジニンやフコキサンチンのＲ3はアセチル基である。
【００３３】
本発明に係る脳保護剤は、脳虚血に続く再灌流後における亜鉛イオンを原因とする過剰な炎症反応を抑制し、脳を保護することができる。よって、脳虚血前に予防的に投与してもよいが、それが難しい場合には脳虚血後、更には再灌流処置と同時またはその後速やかに投与することが好ましい。本発明者らによる実験的知見によれば、本発明に係る脳保護剤は、脳虚血に続く再灌流時における活性酸素や、過剰な炎症反応の原因となるＭ１型ミクログリアを抑制することができる。なお、本発明に係る脳保護剤を投与すべき患者としては、ヒト、およびヒト以外の動物を挙げることができる。
【００３４】
本発明に係る脳保護剤の剤形や投与形態は特に問わないが、脳虚血に対する緊急性を考慮すれば、注射剤として静脈内投与することが好ましい。その場合、溶媒としては、ｐＨを調整した生理食塩水やグルコース水溶液など、血漿の等張液を用いることができる。或いは、カロテノイド化合物（Ｉ）を塩類などと共に乾燥した場合には、最終的に溶液が血漿と等張または略等張になるならば、純水、蒸留水、滅菌水なども使用できる。その濃度も通常の注射剤のものとすればよく、例えば０．０５ｍｇ／ｍＬ以上、１０ｍｇ／ｍＬ程度とすることができる。
【００３５】
本発明の脳保護剤の投与量は特に制限されず、患者の年齢、性別、体重、症状、重篤度などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、ヒトまたは動物に対して１回あたり０．５ｍｇ／ｋｇ体重以上、１００ｍｇ／ｋｇ体重以下程度とすることができる。また、１回あたりの投与時間は１０分以上、２時間以下程度とすることができる。１日あたりの投与回数は０．５回以上、５回以下程度とすることができる。
【００３６】
本願は、２０１７年１２月２６日に出願された日本国特許出願第２０１７−２４８８４５号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１７年１２月２６日に出願された日本国特許出願第２０１７−２４８８４５号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。【００３８】
実施例１
（１）ペリジニンの単離
ヒメシャコガイ（Ｔｒｉｄａｃｎａ  ｃｒｏｃｅａ）から渦鞭毛藻Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．ＯＴＣＬ２Ａ株を単離し、培養した。１５６Ｌの培養液から得られた凍結細胞１００．２ｇを、７０％エタノール２００ｍＬ中、ホモジナイザー（「Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ２５」Ｊａｎｋｅ＆Ｋｕｎｋｅｌ社製）を用いてホモジナイズし、４℃で３日間静置した後、遠心分離した。上澄液を回収し、沈殿物に対して上記の操作を２回繰り返した。全ての上澄液を合わせ、減圧濃縮した。濃縮物に水１００ｍＬを加え、酢酸エチル１５０ｍＬで３回抽出した。抽出液を減圧濃縮し、酢酸エチルフラクション１０９４ｍｇを得た。得られた酢酸エチルフラクションのうち９５７．９ｍｇをシリカゲルクロマトグラフィに付した。シリカゲルクロマトグラフィでは、４０ｍＬのＳｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０（ナカライテスク社製）を用い、溶離液としてジクロロメタン：メタノール＝９９：１（８０ｍＬ）→９８：２（８０ｍＬ）→９６：４（１２０ｍＬ）→９２：８（８０ｍＬ）の混合溶媒を用いた。ジクロロメタン：メタノール＝９６：４の溶離液により溶出されたフラクション３１３．５ｍｇのうち２９４．９ｍｇを、ＯＤＳシリカゲル（「Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ７５Ｃ１８−ＯＰＮ」ナカライテスク社製）２０ｍＬ、８０％メタノール６０ｍＬ、続いて８５％メタノール１４０ｍＬを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィに付した。８５％メタノールにより溶出されたフラクション１６９．１ｍｇを、ＨＰＬＣ（カラム：「ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ18−ＡＲ−ＩＩ」ナカライテスク社製，２０ｍｍφ×２５０ｍｍ；溶離液：８０％アセトニトリル；流速：６．０ｍＬ／ｍｉｎ）に付し、ペリジニン３１．７ｍｇを得た。【００３９】
（２）ミクログリアに対するペリジニンの効果の確認試験
生後１日齢の新生児マウスＣ５７ＢＬ／６の脳内からミクログリアを単離し、細胞培養用培地（「イーグルＭＥＭ」日水製薬社製にウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を添加したもの）中、３７℃で２週間培養した。得られたミクログリア培養液を、細胞培養ウェルプレートに１ウェルあたり３００μＬ添加した（約６．４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。更に、ペリジニンの０．０３〜０．３μｇ／ｍＬ水溶液を１ウェルあたり５０μＬ添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、塩化亜鉛の６０μＭ水溶液を１ウェルあたり５０μＬ添加し、３７℃で２時間インキュベートした。培養液を除去し、更に付着したミクログリアを無血清培地で洗浄した後、新しい無血清培地を１ウェルあたり３５０μＬ添加した。リポ多糖の１ｎｇ／ｍＬ水溶液を１ウェルあたり５０μＬ添加し、３７℃で２２時間インキュベートすることにより、ミクログリアをＭ１型に活性化させた。培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡにより炎症性サイトカインであるＩＬ−１β、ＴＮＦαおよびＩＬ−６の濃度を測定した。また、比較のために、亜鉛もリポ多糖も添加しない場合（コントロール）、ペリジニンを添加せず亜鉛のみ添加する場合、ペリジニンのみ添加する場合、ペリジニンを添加せずリポ多糖のみ添加する場合、ペリジニンを添加しない場合についても、同様に測定を行った。測定はそれぞれ４回ずつ行い、平均値を算出した。結果を図１に示す。【００４０】
（３）実験結果の考察
図１に示す結果の通り、リポ多糖によりＭ１型に活性化したミクログリアからは炎症性サイトカインが放出され、亜鉛を添加した場合にはその濃度は明らかに高まった。しかしペリジニンを添加していた場合には、炎症性サイトカインの濃度は有意に低減され、ペリジニンの濃度によっては亜鉛を添加しない場合とほぼ同等まで低減された。
かかる結果より、ペリジニンは脳卒中患者の脳で起こる亜鉛シグナルによる過剰な炎症反応を抑制できることが証明された。【００４１】
実施例２
体重約３５ｇ、１２週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの脳室内へ、ペリジニンの１０〜１００μｇ／ｍＬ水溶液またはキレート剤であるＣａＥＤＴＡの０．１ｍＭ水溶液２μＬを投与した。投与から１０分以内に、両側総頚動脈を２０分間閉塞することにより脳虚血状態とした後、再灌流した。脳虚血処理から３日後、各マウスの海馬よりｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ法により炎症性サイトカインＴＮＦα、ＩＬ−６およびＩＬ−１βの遺伝子発現量を測定した。測定はそれぞれ３回ずつ行い、平均値を算出した。比較のために、脳虚血処理を行わない場合と、ペリジニンまたはＣａＥＤＴＡを投与しない場合でも同様に測定を行った。脳虚血処理を行わない場合の各炎症性サイトカインの濃度を１とする相対比率を図２に示す。
図２に示す結果の通り、ペリジニンの投与により、脳卒中後における炎症性サイトカイン産生をキレート剤であるＣａＥＤＴＡと同等またはそれ以上に抑制することができ、脳虚血処理を行わなかった場合と同等レベルまで抑制できた実験例もあった。
この様に、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験でも、ペリジニンは脳卒中後における過剰な炎症反応を抑制し、脳組織を保護できることが実証された。【００４２】
実施例３
ペリジニンが、ミクログリアにおいて亜鉛により引き起こされる活性酸素（ＲＯＳ：Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｐｅｃｉｅｓ）の発生を抑制できるか否か、試験した。
ミクログリアを、１μＭのジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）と、３００ｎｇ／ｍＬのペリジニンを含むか或いは含まない培地中で３０分間前培養した後、６０μＭのＺｎＣｌ2の存在下で２時間培養した。ＤＨＥは、スーパーオキシドアニオンラジカルの量を示唆するものであり、活性酸素の検出に用いられる。ミクログリア細胞をオールインワン蛍光顕微鏡（「ＢＺ−９０００」キーエンス社製）で拡大観察し、ＤＨＥに染色された細胞を検出した。結果を図３Ａと図３Ｂに示す。なお、図３Ｂの結果は、４例の平均値である。図３Ｂ中、「＊」はコントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＃」はＺｎＣｌ2のみの処理群に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図３Ａおよび図３Ｂに示される結果の通り、亜鉛で処理されたミクログリアにおいてＤＨＥ染色は明らかに増加していたが、かかるＤＨＥ染色はペリジニンにより顕著に低減された。
また、亜鉛を用いなかった以外は同様にして、ミクログリアの活性酸素レベルに対するペリジニンの影響につき試験した。結果を図３Ｃと図３Ｄに示す。なお、図３Ｄの結果は、４例の平均値である。図３Ｄ中、「＊」はコントロールに対してｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＃」はＺｎＣｌ2のみの処理群に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図３Ｃおよび図３Ｄに示される結果の通り、ペリジニンのみで処理したミクログリアでは、ＤＨＥ陽性の細胞はコントロールに対して有意に増えることはなかった。【００４３】
実施例４
脳虚血に続く再灌流後における海馬ミクログリアのＭ１型への活性化に対するペリジニンの抗炎症効果を確認するために、ミクログリアマーカーであるＩｂａ１を用いた二重免疫染色により、代表的なＭ１マーカーであるＣＤ１６／３２の発現につき試験した。結果を図４Ａと図４Ｂに示す。なお、図４Ｂの結果は、６例の平均値である。図４Ｂ中、「＊」は溶媒処置擬似手術マウス群に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＃」および「＃＃」は溶媒処置脳虚血手術マウス群に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
図４に示す結果の通り、擬似手術マウスと比較すると、脳虚血を伴う溶媒処置マウスには、脳虚血処理から３日後の海馬におけるＩｂａ１陽性細胞中のＣＤ１６／３２免疫反応が明らかに増加していた。一方、ペリジニンを投与したマウスでは、海馬におけるＩｂａ１陽性細胞中、ＣＤ１６／３２免疫反応は用量依存的に低レベルまで低減された。
この様に、ペリジニンは、脳虚血に続く再灌流後における海馬ミクログリアのＭ１型への活性化を抑制し、過剰な炎症反応を低減できることが明らかとなった。【００４４】
実施例５
ペリジニンの事前投与が短期間空間認識記憶の欠失に対する保護効果を示すか否かを確認するために、脳虚血誘導から５日後にＹ字迷路テストを行った。
具体的には、グレイウッドを使って、４０×２×３ｃｍの同一の３本のアームを６０°間隔で有するＹ字型の迷路を形成した。マウスをいずれかのアームの端部に置き、１０分間自由に移動させ、各アームへの進入をデジタルビデオカメラで記録した。マウスが前回および前々回に進入した２つのアームとは異なるアームに侵入した場合を「交替反応」と定義し、マウスが前回および前々回に侵入した２つのアームのいずれかへ再び進入した場合を「エラー」と定義した。交替反応のパーセンテージを、下記式により計算した。結果を図５に示す。なお、図５の結果は、６例の平均値である。図５中、「＊」は溶媒処置擬似手術マウス群に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
［交替反応の回数／（アームへの総進入回数−２）］×１００
図５に示される結果の通り、脳虚血を伴う溶媒処置マウスには、擬似手術マウスに比べ、自発的な交替反応の有意な減少が認められた。
一方、ペリジニンを事前投与したマウスでは、脳虚血により誘導された自発的な交替反応の減少は、明確に妨げられていた。
【図１】
2019131136.tif 000012
【図２】
2019131136.tif 000013
【図３】
2019131136.tif 000014
【図４】
2019131136.tif 000015
【図５】
2019131136.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月8日(2020.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物を有効成分として含有することを特徴とする脳保護剤。
【化１】
2019131136.tif 000017
［式中、
Ｒ1〜Ｒ3は、独立して水素原子またはＣ1-18アルカノイル基を示し、
Ｒ4〜Ｒ17は、独立して水素原子またはＣ1-6アルキル基を示し、但し、ＲnとＲn+2（ｎは、４以上、１５以下の整数を示す）は、結合してエステル基を形成していてもよく、
Ｘは、−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−基または単結合を示す。］
【請求項２】
Ｒ1が水素原子である請求項１に記載の脳保護剤。
【請求項３】
Ｒ2が水素原子である請求項１または２に記載の脳保護剤。
【請求項４】
Ｒ3がアセチル基である請求項１〜３のいずれかに記載の脳保護剤。
【請求項５】
上記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物がペリジニンである請求項１〜４のいずれかに記載の脳保護剤。
【請求項６】
上記式（Ｉ）で表されるカロテノイド化合物がフコキサンチンである請求項１〜４のいずれかに記載の脳保護剤。
【請求項７】
脳虚血後の炎症反応を抑制する請求項１〜６のいずれかに記載の脳保護剤。
【国際調査報告】
2019131136.tif 000018
2019131136.tif 000019
2019131136.tif 000020
2019131136.tif 000021