(57)【要約】  本発明は、細胞凝集塊の大きさを機械学的／物理学的な手段に依らずに適切に制御するための手段を提供することを目的とし、具体的には、ＳＲＦ阻害剤を含む、細胞の浮遊培養に用いるための細胞凝集促進剤に関する。本発明はまた、ＳＲＦ阻害剤を含む培地中で細胞を浮遊培養する工程を含む、細胞凝集塊の製造方法に関する。
2019131942.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＲＦ阻害剤を含む、細胞の浮遊培養に用いるための細胞凝集促進剤。
【請求項２】
前記ＳＲＦ阻害剤の濃度が９．０μｇ／ｍＬ以上１０．０ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１に記載の細胞凝集促進剤。
【請求項３】
さらにＲＯＣＫ阻害剤を含む、請求項１又は２に記載の細胞凝集促進剤。
【請求項４】
前記ＳＲＦ阻害剤がＣＣＧ−１４２３である、請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞凝集促進剤。
【請求項５】
前記細胞が幹細胞である、請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞凝集促進剤。
【請求項６】
ＳＲＦ阻害剤を含む培地中で細胞を浮遊培養する工程を含む、細胞凝集塊の製造方法。
【請求項７】
前記培地中における前記ＳＲＦ阻害剤の濃度が４．５ｎｇ／ｍＬ以上４．６ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
さらに、前記培地中にＲＯＣＫ阻害剤を含む、請求項６又は７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記ＳＲＦ阻害剤がＣＣＧ−１４２３である、請求項６から８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記細胞が幹細胞である、請求項６から９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項６から１０のいずれか１項に記載の製造方法により得られた細胞凝集塊。
【請求項１２】
細胞と、培地と、ＳＲＦ阻害剤とを含む、細胞培養組成物。
【請求項１３】
前記ＳＲＦ阻害剤の濃度が４．５ｎｇ／ｍＬ以上４．６ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１２に記載の細胞培養組成物。
【請求項１４】
さらにＲＯＣＫ阻害剤を含む、請求項１２又は１３に記載の細胞培養組成物。
【請求項１５】
前記ＳＲＦ阻害剤がＣＣＧ−１４２３である、請求項１２から１４のいずれか１項に記載の細胞培養組成物。
【請求項１６】
前記細胞が幹細胞である、請求項１２から１５のいずれか１項に記載の細胞培養組成物。
【請求項１７】
前記細胞の形態が細胞凝集塊である、請求項１２から１６のいずれか１項に記載の細胞培養組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞凝集促進剤に関する。本発明はまた、細胞凝集塊の製造方法、及び、それにより製造された細胞凝集塊に関する。本発明はまた、細胞培養組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞等のヒト多能性幹細胞の近年の研究により、再生医療の実用化の可能性が高まっている。これらの細胞は、無限に増殖できる能力と、様々な細胞に分化する能力を有していることから、多能性幹細胞を用いた再生医療には、難治性疾患、生活習慣病等に対する治療法を根本的に変革することが期待されている。多能性幹細胞からは、神経細胞をはじめとして、心筋細胞、血液細胞、及び網膜細胞などさまざまな種類の細胞に試験管内で分化誘導することが既に可能になっている。【０００３】
多能性幹細胞を用いて各種臓器を再生する再生医療に関する実用化に向けた課題の一つに、臓器再生に必要な大量の細胞を如何に効率的に生産するかという課題がある。例えば肝臓の再生には約２×１０１１個の細胞が必要である。平坦な基板上での接着培養により前記個数の細胞を培養するには１０６ｃｍ２以上の基板が必要であり、これは一般的な１０ｃｍディッシュで約２０，０００枚分に相当する。基板表面上での接着培養では得られる細胞数が培養面積に依存するためスケールアップが困難であり、再生医療に必要な十分な量の細胞を供給することは困難である。【０００４】
そこで、培地中で細胞を浮遊させながら培養する浮遊培養はスケールアップが容易であることから、細胞の大量生産に適していると期待される。【０００５】
例えば、非特許文献１には、浮遊培養の細胞培養容器としてスピナーフラスコを用い、強い撹拌力により液体培地を撹拌しながらヒト多能性幹細胞の浮遊培養を行い均一な大きさのスフェロイドを製造する方法が開示されている。【０００６】
非特許文献２では微小なマイクロウェルが形成された基板を用い、各マイクロウェル中で均一な大きさのスフェロイドを作製する方法が開示されている。【０００７】
非特許文献３では培地として、粘性や比重の調製された培地を用い、多能性幹細胞の浮遊状態を保持するとともに細胞同士の衝突を抑制しながら培養を行う方法が開示されている。【０００８】
特許文献１には細胞を液体培地中で旋回培養しながら培養して、細胞の凝集塊を作製する技術が開示されている。【０００９】
特許文献２には多能性幹細胞を、細胞塊の平均直径が約２００μｍ以上３００μｍ以下となるまで浮遊培養する方法が開示されている。【００１０】
特許文献３には、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）等のリゾリン脂質を含む培地中で細胞を浮遊培養することにより、細胞の凝集を抑制する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００３−３０４８６６号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１３／０７７４２３号パンフレット
【特許文献３】国際公開ＷＯ２０１６／１２１７３７号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Olmer R. et al., Tissue Engineering: Part C, Volume 18 (10): 772-784 (2012)
【非特許文献２】Ungrin MD et al., PLoS ONE, 2008, 3(2), e1565
【非特許文献３】Otsuji GT et al., Stem Cell Reports, Volume 2: 734-745 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは、膜タンパク質や細胞膜の細胞間での非特異的な吸着、細胞表面のカドヘリンを介した細胞間の接着が多能性幹細胞等の接着性細胞を浮遊培養するうえで重要な機構であることを見出した。つまり、浮遊培養の技術に求められることは、細胞の膜タンパク質や細胞表面のカドヘリンなどの結合に障害を与えることなく、適度な大きさの細胞凝集塊を作製しなければならないという課題が存在する。しかしながら、非特許文献１〜３、特許文献１又は２に開示された浮遊培養の技術には、以下の問題があった。【００１４】
非特許文献１の方法では剪断応力により細胞死が生じやすいという問題がある。【００１５】
非特許文献２の方法は大規模化が困難であることや、培地の交換が困難である等の問題がある。【００１６】
非特許文献３の方法では培養時の培地の移動が少ないため酸素や栄養成分が細胞凝集塊に供給され難いという問題がある。【００１７】
特許文献１では細胞塊の大きさを適度な大きさに制御するための手段は開示されていない。【００１８】
特許文献２では細胞塊同士の接着を防ぐための手段として培地に水溶性高分子を添加して粘性を高めることが記載されている。このため非特許文献３と同様に、酸素や栄養成分が細胞凝集塊に供給され難いという問題がある。【００１９】
そこで本発明者らは、上記課題を解決するために、特許文献３においてリゾリン脂質を含む培地中で細胞を浮遊培養することにより、細胞の凝集を抑制し、適度な大きさの凝集塊を細胞に障害を与えることなく生産することが可能な浮遊培養の技術を開発した。【００２０】
ところで、特許文献３では細胞凝集を抑制する成分としてリゾリン脂質のみが開示されている。仮に、リゾリン脂質以外にも、浮遊培養において培地中に存在することにより細胞の凝集を抑制又は促進する成分が提供されれば、細胞凝集塊の大きさを、機械学的／物理学的な手段に依らずにより適切に制御することが可能になると本発明者らは考えた。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ＳＲＦ阻害剤が、浮遊培養において培地中に存在することにより細胞の凝集を促進する作用を奏することを見出し、以下の各発明を完成するに至った。
（１）ＳＲＦ阻害剤を含む、細胞の浮遊培養に用いるための細胞凝集促進剤。
（２）前記ＳＲＦ阻害剤の濃度が９．０μｇ／ｍＬ以上１０．０ｍｇ／ｍＬ以下である、（１）に記載の細胞凝集促進剤。
（３）さらにＲＯＣＫ阻害剤を含む、（１）又は（２）に記載の細胞凝集促進剤。
（４）前記ＳＲＦ阻害剤がＣＣＧ−１４２３である、（１）から（３）のいずれかに記載の細胞凝集促進剤。
（５）前記細胞が幹細胞である、（１）から（４）のいずれかに記載の細胞凝集促進剤。
（６）ＳＲＦ阻害剤を含む培地中で細胞を浮遊培養する工程を含む、細胞凝集塊の製造方法。
（７）前記培地中における前記ＳＲＦ阻害剤の濃度が４．５ｎｇ／ｍＬ以上４．６ｍｇ／ｍＬ以下である、（６）に記載の製造方法。
（８）さらに、前記培地中にＲＯＣＫ阻害剤を含む、（６）又は（７）に記載の製造方法。
（９）前記ＳＲＦ阻害剤がＣＣＧ−１４２３である、（６）から（８）のいずれかに記載の製造方法。
（１０）前記細胞が幹細胞である、（６）から（９）のいずれかに記載の製造方法。
（１１）（６）から（１０）のいずれかに記載の製造方法により得られた細胞凝集塊。
（１２）細胞と、培地と、ＳＲＦ阻害剤とを含む、細胞培養組成物。
（１３）前記ＳＲＦ阻害剤の濃度が４．５ｎｇ／ｍＬ以上４．６ｍｇ／ｍＬ以下である、（１２）に記載の細胞培養組成物。
（１４）さらにＲＯＣＫ阻害剤を含む、（１２）又は（１３）に記載の細胞培養組成物。
（１５）前記ＳＲＦ阻害剤がＣＣＧ−１４２３である、（１２）から（１４）のいずれかに記載の細胞培養組成物。
（１６）前記細胞が幹細胞である、（１２）から（１５）のいずれかに記載の細胞培養組成物。
（１７）前記細胞の形態が細胞凝集塊である、（１２）から（１６）のいずれかに記載の細胞培養組成物。
（１８）ＳＲＦ阻害剤を含む培地中で細胞を浮遊培養する工程を含む、細胞の凝集を促進する方法。
（１９）前記培地中における前記ＳＲＦ阻害剤の濃度が４．５ｎｇ／ｍＬ以上４．６ｍｇ／ｍＬ以下である、（１８）に記載の方法。
（２０）さらにＲＯＣＫ阻害剤を含む、（１８）又は（１９）に記載の方法。
（２１）前記ＳＲＦ阻害剤がＣＣＧ−１４２３である、（１８）から（２０）のいずれかに記載の方法。
（２２）前記細胞が幹細胞である、（１８）から（２１）のいずれかに記載の方法。
（２３）培地と、ＳＲＦ阻害剤とを含む、細胞培養培地。
（２４）前記ＳＲＦ阻害剤の濃度が４．５ｎｇ／ｍＬ以上４．６ｍｇ／ｍＬ以下である、（２３）に記載の細胞培養培地。
（２５）さらにＲＯＣＫ阻害剤を含む、（２３）又は（２４）に記載の細胞培養培地。
（２６）さらに増殖因子を含む、（２３）から（２５）のいずれかに記載の細胞培養培地。
（２７）幹細胞の培養に用いるための、（２３）から（２６）のいずれかに記載の細胞培養培地。
（２８）細胞凝集塊を作製するための、（２３）から（２７）のいずれかに記載の細胞培養培地。
（２９）細胞凝集塊の７０％以上（重量基準）において、最も幅の広い部分の寸法が５００μｍ以下、好ましくは３００μｍ以下である、（６）から（１０）のいずれかに記載の製造方法、（１１）に記載の細胞凝集塊、（１７）に記載の細胞培養組成物、又は（２８）に記載の細胞培養培地。
（３０）細胞凝集塊の７０％以上（重量基準）において、最も幅の広い部分の寸法が４０μｍ以上、好ましくは１００μｍ以上である、（６）から（１０）及び（２９）のいずれかに記載の製造方法、（１１）又は（２９）に記載の細胞凝集塊、（１７）又は（２９）に記載の細胞培養組成物、又は（２８）もしくは（２９）に記載の細胞培養培地。【００２２】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-254688号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の細胞凝集促進剤の一実施形態は、浮遊培養時の細胞の凝集を促進するために培地中に配合することができる。【００２４】
本発明の細胞凝集塊の製造方法の一実施形態によれば、細胞凝集塊を高収量で製造することができる。【００２５】
本発明の細胞凝集塊の一実施形態は適度な寸法を有し、生細胞率が高い。【００２６】
本発明の細胞培養組成物の一実施形態は、細胞凝集塊を高収量で製造するために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ヒトｉＰＳ細胞を、ＣＣＧ−１４２３を添加または未添加の培地中で浮遊培養したときの培養１日目の位相差顕微鏡による観察像を示す。
【図２】図２は、ヒトｉＰＳ細胞を、ＣＣＧ−１４２３を添加または未添加の培地中で浮遊培養したときの培養１日目の死細胞数の測定結果を示す。
【図３】図３は、ヒトｉＰＳ細胞を、ＣＣＧ−１４２３を添加または未添加の培地中で浮遊培養し、細胞凝集塊を作製した後、継続して浮遊培養したときの、培養１日目から５日目の位相差顕微鏡による観察像を示す。
【図４】図４は、ヒトｉＰＳ細胞を、ＣＣＧ−１４２３を添加または未添加の培地中で浮遊培養し、細胞凝集塊を作製した後、継続して浮遊培養したときの、培養１日目から５日目のグルコース消費量の測定結果を示す。
【図５】図５は、ヒトｉＰＳ細胞を、ＣＣＧ−１４２３を添加または未添加の培地中で浮遊培養し、細胞凝集塊を作製した後、継続して浮遊培養したときの、培養５日目の細胞収量の測定結果を示す。
【図６】図６は、ＣＣＧ−１４２３を添加して浮遊培養し、細胞凝集塊を作製した後、継続して浮遊培養したときの、培養５日目のヒトｉＰＳ細胞の、未分化マーカー（ＳＯＸ２、ＯＣＴ４およびＮａｎｏｇ）陽性率の測定結果を示す。
【図７】図７は、ヒトｉＰＳ細胞を、ＣＣＧ−１４２３を含む培地中で浮遊培養（培養１日目）して細胞凝集塊を作製した際の培養１日目の細胞凝集塊の直径の分布を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明を、好ましい実施形態を用いて詳細に説明する。
【００２９】
＜１．細胞＞
本発明において細胞凝集塊を形成する細胞は、接着性を有する細胞（接着性細胞）であることができる。接着性細胞は、動物由来細胞等であることができ、好ましくは哺乳類動物由来細胞等であることができ、より好ましくは生体組織由来細胞及び生体組織由来細胞から派生した細胞等であることができ、特に好ましくは上皮組織由来細胞及び上皮組織細胞から派生した細胞等、又は結合組織由来細胞及び結合組織由来細胞から派生した細胞等、又は筋組織由来細胞及び筋組織由来細胞から派生した細胞等、又は神経組織由来細胞及び神経組織由来細胞から派生した細胞等であることができ、さらに好ましくは動物由来幹細胞及び動物由来幹細胞から分化した細胞等であることができ、もっと好ましくは動物由来多能性幹細胞及び動物由来多能性幹細胞から分化した細胞等であることができ、よりさらに好ましくは哺乳類動物由来多能性幹細胞及び哺乳類動物由来多能性幹細胞から分化した細胞等であることができ、もっとも好ましくはヒト由来多能性幹細胞及びヒト由来多能性幹細胞から分化した細胞等であることができる。
【００３０】
本発明において「幹細胞」とは、別の細胞に分化することができ且つ自己複製能をもつ細胞である。「幹細胞」のなかでも特に、生体を構成する全ての種類の細胞に分化することができる多分化能（多能性）を有し、適切な条件下のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での培養において多能性を維持したまま無限に増殖を続けることができる細胞を「多能性幹細胞」という。多能性幹細胞の具体例としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞であるＥＧ細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．（１９９８）  ９５，  ｐ．１３７２６−１３７３１）、精巣由来の多能性幹細胞であるＧＳ細胞（Ｃｏｎｒａｄ  Ｓ．，  Ｎａｔｕｒｅ（２００８）  ４５６，  ｐ．３４４−３４９）、体細胞由来の人工多能性幹細胞であるｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明に用いる多能性幹細胞は、特に好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。ＥＳ細胞は、胚盤胞と呼ばれる初期胚に由来する多能性幹細胞である。ｉＰＳ細胞は、体細胞に初期化因子を導入することにより体細胞を未分化状態へと初期化し、多能性を付与した培養細胞である。初期化因子としては、例えばＯＣＴ３／４及びＫＬＦ４及びＳＯＸ２及びｃ−Ｍｙｃを用いることができ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，  eｔ ａｌ．  Ｃｅｌｌ．  ２００７；１３１：８６１-７２．）、例えばＯＣＴ３／４及びＳＯＸ２及びＬＩＮ２８及びＮａｎｏｇを用いることができる（Ｙｕ Ｊ,  ｅt  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００７；３１８：１９１７−２０．）。これらの因子の細胞への導入形態は特に限定されないが、例えば、プラスミドを用いた遺伝子導入、合成ＲＮＡの導入、タンパク質として直接導入などが挙げられる。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡやＲＮＡ、低分子化合物等を用いた方法で作製されたｉＰＳ細胞を用いてもよい。ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞を始めとする多能性幹細胞は、市販品又は分譲を受けた細胞を用いてもよいし、新たに作製したものを用いてもよい。ｉＰＳ細胞として、例えば２５３Ｇ１株、２０１Ｂ６株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１Ａ株、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−２Ａ株、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１２Ａ株、Ｎｉｐｓ−Ｂ２株、ＴｋＤＮ４−Ｍ株、ＴｋＤＡ３−１株、ＴｋＤＡ３−２株、ＴｋＤＡ３−４株、ＴｋＤＡ３−５株、ＴｋＤＡ３−９株、ＴｋＤＡ３−２０株、ｈｉＰＳＣ ３８−２株、ＭＳＣ−ｉＰＳＣ１株、ＢＪ−ｉＰＳＣ１株等を使用することができる。ＥＳ細胞として、例えばＫｈＥＳ−１株、ＫｈＥＳ−２株、ＫｈＥＳ―３株、ＫｈＥＳ−４株、ＫｈＥＳ−５株、ＳＥＥＳ−１株、ＳＥＥＳ−２株、ＳＥＥＳ−３株、ＳＥＥＳ−４株、ＳＥＥＳ−５株、ＳＥＥＳ−６株、ＳＥＥＳ−７株、ＨＵＥＳ８株、ＣｙＴ４９株、Ｈ１株、Ｈ９株、ＨＳ−１８１株、ＲＰＣｈｉＰＳ７７１−２株等を使用することができる。新たに作製された臨床グレードのｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞を用いてもよい。ｉＰＳ細胞を作製する際の細胞の由来は特に限定されないが、例えば、繊維芽細胞又はリンパ球等を���いることができる。
【００３１】
また、本発明における細胞の種類としては、細胞外マトリックスやカドヘリン等によってプラスチックや細胞などに接着することができる細胞であれば特に限定されないが、例えば、上述した多能性幹細胞（人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、精巣由来の多能性幹細胞であるＧＳ細胞、胎児の始原生殖細胞由来のＥＧ細胞、骨髄等に由来するＭｕｓｅ細胞等）、体性幹細胞（骨髄、脂肪組織、歯髄、胎盤、卵膜、臍帯血、羊膜、絨毛膜等に由来する間葉系幹細胞、神経幹細胞等）、神経細胞、心筋細胞、心筋前駆細胞、肝細胞、肝臓前駆細胞、α細胞、β細胞、繊維芽細胞、軟骨細胞、角膜細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、周細胞等が例示でき、前記細胞は遺伝子導入された形態やゲノム上の対象遺伝子などをノックダウンされた形態でもよい。
【００３２】
本発明で用いられる細胞は、任意の動物由来のものであってよく、例えば、マウス、ラット、ハムスター等のげっ歯類、ヒト、ゴリラ、チンパンジー等の霊長類、さらにイヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜又は愛玩動物等の哺乳動物由来のものであってよいが、ヒト由来の細胞が特に好ましい。
【００３３】
本発明では、接着又は浮遊させながら培養した後に単離された細胞を用いることができる。ここで「単離された細胞」とは、複数の細胞が集団として接着している細胞を剥離、分散した状態の前記細胞である。単離とは、培養容器や培養担体等に接着していた状態の細胞又は細胞同士が接着している状態の細胞集団を剥離、分散して単一の細胞にする工程である。単離する細胞集団は液体培地中に浮遊した状態であってもよい。単離の方法は特に限定されないが、剥離剤（トリプシン又はコラゲナーゼ等の細胞剥離酵素）又はＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）等のキレート剤又は剥離剤とキレート剤の混合物等を好適に使用することができる。剥離剤は特に限定されないが、トリプシン、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標登録）、ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ディスパーゼ（商標登録）、コラゲナーゼなどが挙げられる。単離後に凍結保存した前記細胞も本発明で好適に使用することができる。
【００３４】
＜２．細胞凝集塊＞
細胞凝集塊は、複数の細胞が三次元的に凝集して形成される塊状の細胞集団であって、スフェロイドとも呼ばれる。細胞凝集塊は、典型的には、概ね球状の形状を有する。
【００３５】
本明細書において「細胞凝集」とは、複数の細胞が三次元的に集合して、集塊を形成することをいう。異なる細胞による凝集と同一細胞による凝集があるが、本明細書ではいずれの凝集も包含する。同一細胞による凝集は、1つの細胞の増殖によって集塊が形成される場合も含む。細胞凝集の機構としては、限定はしないが、膜タンパク質や細胞膜の細胞間での非特異的な吸着、細胞表面のカドヘリンを介した細胞間の接着等が挙げられる。
【００３６】
本発明において、細胞凝集塊を構成する細胞は１種類以上の前記細胞であれば特に限定されない。例えば、ヒト多能性幹細胞又はヒト胚性幹細胞等の多能性幹細胞で構成された細胞凝集塊は、多能性幹細胞マーカーを発現している及び／または多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞を含む。多能性幹細胞マーカーとしては、例えば、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＴＲＡ−１−６０、ｃ−Ｍｙｃ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−１等が例示できる。
【００３７】
多能性幹細胞マーカーは、当該技術分野において任意の検出方法により検出することができる。発現マーカーを検出する方法としては、例えばフローサイトメトリーが挙げられるが、これらに限定されない。蛍光標識抗体を用いるフローサイトメトリーにおいて、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。フローサイトメトリーによって解析した蛍光標識抗体について陽性を呈する細胞の比率は、陽性率と記載されることがある。また、蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
細胞凝集塊を構成する細胞が多能性幹細胞である場合、多能性幹細胞マーカーを発現する及び／または多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞の割合（比率）は、例えば８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％以下とすることができる。多能性幹細胞マーカーを発現する及び／または多能性幹細胞マーカーが陽性を呈する細胞の割合が前記範囲内である細胞凝集塊は未分化性が高く、より均質な細胞集団である。なお、多能性幹細胞マーカーは未分化マーカーと同義であり、両者は置き換えて使用することができる。
【００３９】
本発明の一以上の実施形態により製造される細胞凝集塊の寸法（「サイズ」ともいう）は特に限定されないが、顕微鏡で観察したとき、観察像での最も幅の広い部分の寸法の上限は例えば１０００μｍ以下、９００μｍ以下、８００μｍ以下、７００μｍ以下、６００μｍ以下、５００μｍ以下、４００μｍ以下、３００μｍ以下、２００μｍ以下である。下限は例えば４０μｍ以上、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、９０μｍ以上、１００μｍ以上である。因みにヒトｉＰＳ細胞１個が約１０μｍの寸法である。このような寸法範囲の細胞凝集塊は、内部の細胞にも酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。
【００４０】
本発明の一以上の実施形態により製造される細胞凝集塊の集団は、該集団を構成する細胞凝集塊のうち重量基準で例えば１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上が上記の範囲の寸法を有することが好ましい。上記の範囲の寸法の細胞凝集塊を２０％以上含む細胞凝集塊の集団では、個々の細胞凝集塊において、内部の細胞にも酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。
【００４１】
本発明の一以上の実施形態により製造される細胞凝集塊の集団は、該集団を構成する細胞のうち生細胞の割合（生存率）が、例えば５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上であることが好ましい。上記の範囲の生存率の細胞凝集塊は、凝集状態を維持しやすく、細胞の増殖に好ましい状態である。
【００４２】
＜３．培地＞
本発明で用いる培地は、任意の動物細胞培養用培地を基礎培地とし、ＳＲＦ阻害剤若しくはＳＲＦ阻害剤とＲＯＣＫ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤若しくはＳＲＦ阻害剤とＲＯＣＫ阻害剤を含む細胞凝集促進剤、及び、必要に応じて他の成分を適宜添加することにより調製することができる。本発明で用いる培地は細胞の浮遊培養に適したものであることが好ましく、典型的には、液体培地である。
【００４３】
基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２  Ｈａｍ））等の培地を使用することができるが、特に限定されない。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地としては特に、ＤＭＥＭ培地とハムＦ１２培地とを好ましくは６０／４０以上４０／６０以下の重量比、より好ましくは５５／４５以上４５／５５以下の重量比、最も好ましくは等量（５０／５０の重量比）で混合した培地を用いる。
【００４４】
本発明で用いる培地は、好ましくは血清を含まない培地、すなわち無血清培地であるか又は血清代替品（Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を含む培地である。血清代替品の例としては、ＫｎｏｃｋＯｕｔＴＭ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｇｉｂｃｏ）を挙げることができる。
【００４５】
本発明で用いる培地は、より好ましくは、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムから選択される少なくとも１つを含み、より好ましくはこれらの全部を含む。Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムは、溶液、誘導体、塩又は混合試薬等の形態で培地に添加することができる。例えば、Ｌ−アスコルビン酸は、２−リン酸アスコルビン酸マグネシウムなどの誘導体の形態で培地に添加してもよい。セレンは亜セレン酸塩（亜セレン酸ナトリウムなど）の形態で培地に添加してもよい。インスリン及びトランスフェリンは、動物（好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ等）の組織又は血清等から分離した天然由来のものであってもよいし、遺伝子工学的に作製した組換えタンパク質であってもよい。インスリン、トランスフェリン、及びセレンは、試薬ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレン）の形態で培地に添加してもよい。ＩＴＳは、インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸ナトリウムを含む、細胞増殖促進用の添加剤である。
【００４６】
Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムから選択される少なくとも１つを含む市販の培地を使用することができる。インスリン及びトランスフェリンを添加した市販の培地としては、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｅＲＤＦ  Ｄｒｙ  Ｐｏｗｄｅｒｅｄ  Ｍｅｄｉａ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＤＯＭＡＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＣＨＯＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、ＵｌｔｒａＭＤＣＫＴＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）等を用いることができる。ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）  ｈＥＳＣ  ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＴｅＳＲ２（Ｖｅｒｉｔａｓ社）なども好適に用いることができる。その他、ヒトｉＰＳ細胞やヒトＥＳ細胞の培養に使用されている培地も好適に使用することができる。
【００４７】
本発明で用いる培地は好ましくは少なくとも１つの増殖因子を含む。増殖因子としては、限定するものではないが、ＦＧＦ２（Ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−２）、ＴＧＦ−β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β１）、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、ＩＧＦ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＰＡＩ、ＰＥＤＦ、ＩＧＦＢＰ−２、ＬＩＦ及びＩＧＦＢＰ−７からなる群から選択される１つ以上を含むことが好ましい。特に好ましい増殖因子は、ＦＧＦ２及び／又はＴＧＦ−β１である。
【００４８】
本発明で用いる培地として最も好ましいものは、後述するＳＲＦ阻害剤とＲＯＣＫ阻害剤以外の成分として、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウム、並びに、少なくとも１つの増殖因子を含む無血清培地であり、特に好ましくは、Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウム、並びに、少なくとも１つの増殖因子（好ましくはＦＧＦ２及びＴＧＦ−β１）を含み、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である。このような培地としては、ＳＲＦ阻害剤又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を添加した、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８ＴＭ培地（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が好適に使用できる。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８ＴＭ培地は、ライフテクノロジーズジャパン株式会社から市販されている、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地であるＤＭＥＭ／Ｆ−１２（ＨＡＭ）１：１と、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８ＴＭサプリメント（Ｌ−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、炭酸水素ナトリウム、ＦＧＦ２及びＴＧＦ−β１を含む）とを混合して調製することができる。
【００４９】
本発明で用いる培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生剤等の更なる成分を含有してもよい。
【００５０】
抗生剤としては、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ等を使用することができる。
【００５１】
＜４．ＳＲＦ阻害剤＞
ＳＲＦ阻害剤は、ＭＡＤＳ（ＭＣＭ１, Ａｇａｍｏｕｓ, Ｄｅｆｉｃｉｅｎｓ, ａｎｄ ＳＲＦ）ボックススーパーファミリーに属する転写因子である血清応答因子（ＳＲＦ、ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ）の活性を阻害する物質として定義され、例えば、ＣＣＧ−１４２３（Ｎ−［２−［４（４−クロロフェニル）アミノ］−１−メチル−２−オキソエトキシ］−３，５−ビス（トリフルオロメチル）−ベンズアミド）、ＣＣＧ−１４２３アナログであるＣＣＧ−１００６０２（１−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）ベンゾイル］−Ｎ−（４−クロロフェニル）−３−ピペリジンカルボキサミド）、ＣＣＧ−２０３９７１（６−ａｍｉｎｏ−１，４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−［４−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−ｐｙｒａｎｏ［２，３−ｃ］ｐｙｒａｚｏｌｅ−５−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）、ＣＣＧ−２２２７４０（参考文献：Ｙｕ−Ｗａｉ−Ｍａｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｏｃａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ＭＲＴＦ／ＳＲＦ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｓｃａｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ２０１７  Ｍａｒ  ３１；７（１）：５１８）及びそれらの誘導体、並びにＳＲＦに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。
【００５２】
ＳＲＦ阻害剤としては、１種又は２種以上のＳＲＦ阻害剤を使用することができる。
【００５３】
上記の、Ｎ−［２−［４（４−クロロフェニル）アミノ］−１−メチル−２−オキソエトキシ］−３，５−ビス（トリフルオロメチル）−ベンズアミドの構造式は以下の通りである。
【００５４】
【化１】
2019131942.tif 000003
【００５５】
ＳＲＦ阻害剤は、特に好ましくは、ＣＣＧ−１４２３及びＣＣＧ−１００６０２及びＣＣＧ−２０３９７１及びＣＣＧ−２２２７４０から選択される１以上であり、最も好ましくは、ＣＣＧ−１４２３である。
【００５６】
＜５．ＲＯＣＫ阻害剤＞
ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏ−キナーゼ（ＲＯＣＫ，Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）のキナーゼ活性を阻害する物質として定義され、例えば、Ｙ−２７６３２（４−［（１Ｒ）−１−アミノエチル］−Ｎ−ピリジン−４−イルシクロヘキサン−１−カルボキサミド又はその塩（例えば２塩酸塩））（例えば、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照）、Ｈ−１１５２（（Ｓ）−（＋）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］−ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−ジアゼピン又はその塩（例えば２塩酸塩））（例えば、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７(１−(５−イソキノリンスルホニル)ホモピペラジン又はその塩（例えば２塩酸塩））（例えば、Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)参照）、Ｗｆ−５３６（（＋）−（Ｒ）−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）ベンズアミド１塩酸塩）（例えば、Nakajima et al., CancerChemother. Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）、Ｙ３９９８３（４−［（１Ｒ）−１−Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ］−Ｎ−１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｏ［２、３−ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ−４-ｙｌｂｅｎｚａｍｉｄｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＳＬｘ−２１１９（２−［３−［４−（１Ｈ−ｉｎｄａｚｏｌ−５−ｙｌａｍｉｎｏ）−２−ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｙｌ］ｐｈｅｎｏｘｙ］−Ｎ−（１-ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）−ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、Ａｚａｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ−ａｍｉｎｏｆｕｒａｚａｎｓ、ＤＥ−１０４、ＸＤ−４０００、ＨＭＮ−１１５２、４−（１−ａｍｉｎｏａｌｋｙｌ）−Ｎ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｓ、Ｒｈｏｓｔａｔｉｎ、ＢＡ−２１０、ＢＡ−２０７, ＢＡ−２１５, ＢＡ−２８５, ＢＡ−１０３７、Ｋｉ−２３０９５、ＶＡＳ−０１２（例えば、James K. Liao et al., J Cardiovasc Pharmacol. 2007 Jul;50(1):17-24.）及びそれらの誘導体、並びにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の低分子化合物も知られており、本発明においてはこのような化合物又はそれらの誘導体もＲＯＣＫ阻害剤として使用できる（例えば、米国特許出願公開第20050209261号、同第20050192304号、同第20040014755号、同第20040002508号、同第20040002507号、同第20030125344号、同第20030087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。ＲＯＣＫ阻害剤としては、１種又は２種以上のＲＯＣＫ阻害剤を使用することができる。
【００５７】
上記の、４−［（１Ｒ）−１−アミノエチル］−Ｎ−ピリジン−４−イルシクロヘキサン−１−カルボキサミドの構造式は以下の通りである。
【００５８】
【化２】
2019131942.tif 000004
【００５９】
また、上記の（Ｓ）−（＋）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］−ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−ジアゼピンの構造式は以下の通りである。
【００６０】
【化３】
2019131942.tif 000005
【００６１】
ＲＯＣＫ阻害剤は、特に好ましくは、Ｙ−２７６３２及びＨ−１１５２から選択される１以上であり、最も好ましくは、Ｙ−２７６３２である。Ｙ−２７６３２及びＨ−１１５２は、それぞれ、水和物の形態で用いられてもよい。
【００６２】
＜６．細胞の凝集を促進する方法＞
本発明の一態様は、ＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で細胞を浮遊培養する工程（浮遊培養工程）を含む、細胞の凝集を促進する方法である。
【００６３】
本明細書において「細胞（の）凝集（を）促進（する）」とは、細胞凝集作用を促進し、それにより細胞凝集塊の形成又は増大を促進することをいう。本明細書において「細胞凝集促進剤」とは、細胞凝集を促進する効果を有する薬剤をいう。
【００６４】
本態様の方法は、浮遊培養工程を必須の工程として、維持培養工程並びに回収工程を選択工程として含む。以下、それぞれの工程について、説明をする。
【００６５】
（浮遊培養工程）
ＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で細胞を浮遊培養する工程（浮遊培養工程）の具体的な実施形態について説明する。
【００６６】
ＳＲＦ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、培地及び細胞の具体的な実施形態は既述の通りである。
【００６７】
浮遊培養工程での培地中のＳＲＦ阻害剤の濃度は、細胞の凝集を促進することができるように、細胞の種類、細胞数、培地の種類等の諸条件に応じて適宜調整することができる。浮遊培養工程での培地中のＳＲＦ阻害剤の濃度は、例えばＳＲＦ阻害剤がＣＣＧ−１４２３（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＣＡＳ  Ｎｏ．２８５９８６−８８１、Ｃ１８Ｈ１４ＣｌＦ６Ｎ２Ｏ３、分子量＝４５４．８）の場合、前記阻害剤の濃度の下限としては、細胞凝集促進効果を奏すれば特に限定されないが、好ましくは、４．５ｎｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは４５ｎｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは４５０ｎｇ／ｍＬ以上、最も好ましくは１．１μｇ／ｍＬ以上、２μｇ／ｍＬ以上、３μｇ／ｍＬ以上、４μｇ／ｍＬ以上、５μｇ／ｍＬ以上、６μｇ／ｍＬ以上、７μｇ／ｍＬ以上、８μｇ／ｍＬ以上、９μｇ／ｍＬ以上、１０μｇ／ｍＬ以上、１１μｇ／ｍＬ以上、１２μｇ／ｍＬ以上、１３μｇ／ｍＬ以上、１４μｇ／ｍＬ以上、１５μｇ／ｍＬ以上、１６μｇ／ｍＬ以上、１７μｇ／ｍＬ以上、１８μｇ／ｍＬ以上である。一方、上限としては、細胞が死滅しない濃度であれば特に限定されないが、好ましくは４．６ｍｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは４６０μｇ／ｍＬ以下、特に好ましくは４６μｇ／ｍＬ以下、最も好ましくは１９μｇ／ｍＬ以下である。また、前記阻害剤の濃度は、好ましくは４．５ｎｇ／ｍＬ以上４．６ｍｇ／ｍＬ以下である。浮遊培養工程での培地中のＳＲＦ阻害剤の濃度はまた、１０ｎＭ以上、１０ｍＭ以下の範囲であることが特に好ましい。前記濃度の下限としては、１０ｎＭ以上が好ましく、より好ましくは１００ｎＭ以上、特に好ましくは１μＭ以上、最も好ましくは２．５μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、６μＭ以上、７μＭ以上、８μＭ以上、９μＭ以上、１０μＭ以上、１１μＭ以上、１２μＭ以上、１３μＭ以上、１４μＭ以上、１５μＭ以上、１６μＭ以上、１７μＭ以上、１８μＭ以上、１９μＭ以上、２０μＭ以上、２１μＭ以上、２２μＭ以上、２３μＭ以上、２４μＭ以上、２５μＭ以上、２６μＭ以上、２７μＭ以上、２８μＭ以上、２９μＭ以上、３０μＭ以上、３１μＭ以上、３２μＭ以上、３３μＭ以上、３４μＭ以上、３５μＭ以上、３６μＭ以上、３７μＭ以上、３８μＭ以上、３９μＭ以上である。一方、上限としては好ましくは１０ｍＭ以下であり、より好ましくは１ｍＭ以下、特に好ましくは１００μＭ以下、最も好ましくは４０μＭ以下である。
【００６８】
また、浮遊培養工程での培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、細胞の凝集を促進することができるように、細胞の種類、細胞数、培地の種類等の諸条件に応じて適宜調整することができる。浮遊培養工程での培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、例えばＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２（和光純薬工業株式会社、ＣＡＳ  Ｎｏ．３３１７５２−４７−７、Ｃ１４Ｈ２１Ｎ３Ｏ・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、分子量＝３３８．２７）の場合、３．３ｎｇ／ｍＬ以上３．４ｍｇ／ｍＬ以下の範囲であることが特に好ましい。前記濃度の下限としては、細胞凝集促進効果を奏すれば特に限定されないが、好ましくは３．３ｎｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは３３ｎｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは３３０ｎｇ／ｍＬ以上、最も好ましくは８００ｎｇ／ｍＬ以上、１μｇ／ｍＬ以上、２μｇ／ｍＬ以上、３μｇ／ｍＬ以上、４μｇ／ｍＬ以上、５μｇ／ｍＬ以上、６μｇ／ｍＬ以上、７μｇ／ｍＬ以上、８μｇ／ｍＬ以上、９μｇ／ｍＬ以上、１０μｇ／ｍＬ以上、１１μｇ／ｍＬ以上、１２μｇ／ｍＬ以上、１３μｇ／ｍＬ以上、１４μｇ／ｍＬ以上である。一方、上限としては、細胞が死滅しない濃度であれば特に限定されないが、好ましくは３．４ｍｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは３４０μｇ／ｍＬ以下、特に好ましくは３４μｇ／ｍＬ以下、最も好ましくは１４μｇ／ｍＬ以下である。浮遊培養工程での培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度はまた、１０ｎＭ以上、１０ｍＭ以下の範囲であることが特に好ましい。前記濃度の下限は、好ましくは１０ｎＭ以上であり、より好ましくは１００ｎＭ以上、特に好ましくは１μＭ以上、最も好ましくは２．５μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、６μＭ以上、７μＭ以上、８μＭ以上、９μＭ以上、１０μＭ以上、１１μＭ以上、１２μＭ以上、１３μＭ以上、１４μＭ以上、１５μＭ以上、１６μＭ以上、１７μＭ以上、１８μＭ以上、１９μＭ以上、２０μＭ以上、２１μＭ以上、２２μＭ以上、２３μＭ以上、２４μＭ以上、２５μＭ以上、２６μＭ以上、２７μＭ以上、２８μＭ以上、２９μＭ以上、３０μＭ以上、３１μＭ以上、３２μＭ以上、３３μＭ以上、３４μＭ以上、３５μＭ以上、３６μＭ以上、３７μＭ以上、３８μＭ以上、３９μＭ以上である。上限としては、好ましくは１０ｍＭ以下であり、より好ましくは１ｍＭ以下、特に好ましくは１００μＭ以下、最も好ましくは４０μＭ以下である。
【００６９】
浮遊培養工程は、仮に本発明のＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤が培地中に存在しない場合には、細胞が、細胞凝集塊を形成することとなる条件下において浮遊培養を行う工程であることが好ましい。
【００７０】
浮遊培養工程に用いる培養容器は、好ましくは容器内面への細胞の接着性が低い容器が好ましい。このような容器内面への細胞の接着性が低い容器としては、例えば生体適合性がある物質で親水性表面処理されているようなプレートが挙げられる。例えば、ＮｕｎｃｌｏｎＴＭＳｐｈｅｒａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を培養容器として使用できるが特に限定はされない。
【００７１】
培養容器の形状は特に限定されないが、例えば、ディッシュ状、フラスコ状、ウェル状、バッグ状、スピナーフラスコ状等の形状の培養容器が挙げられる。
【００７２】
浮遊培養は静置培養であってもよいし、培地が流動する条件での培養（流動培養）であってもよいが、好ましくは流動培養である。流動培養としては、細胞の凝集を促進するように培地が流動する条件での培養が好ましい。細胞の凝集を促進するように培地が流動する条件での培養としては、例えば、旋回流、揺動流等の流れによる応力（遠心力、求心力）により細胞が一点に集まるように培地が流動する条件での培養や、直線的な往復運動により培地が流動する条件での培養が挙げられ、旋回培養法又は揺動培養法が特に好ましい。
【００７３】
「旋回培養法」（振盪培養法を含む）とは、旋回流による応力（遠心力、求心力）により細胞が一点に集まるように培地が流動する条件で培養する方法をいう。具体的には、細胞を含む培地を収容した培養容器を概ね水平面に沿って円、楕円、扁平した円、扁平した楕円等の閉じた軌道を描くように旋回させたり、培養容器は静置させたままでスターラ―バーや撹拌翼のような撹拌子を用いて容器内の培地を旋回させたりすることにより行う。後者は、例えば、撹拌翼の付いたスピナーフラスコ状の培養容器を用いることで達成し得る。そのような培養容器は市販されており、それらを利用することもできる。その場合、培地や培養液の量等は培養容器メーカー推奨の量で使用すればよい。
【００７４】
旋回培養法における旋回速度は特に限定されないが、上限は、好ましくは２００ｒｐｍ以下、より好ましくは１５０ｒｐｍ以下、さらに好ましくは１２０ｒｐｍ以下、より好ましくは１１５ｒｐｍ以下、より好ましくは１１０ｒｐｍ以下、より好ましくは１０５ｒｐｍ以下、もっと好ましくは１００ｒｐｍ以下、より好ましくは９５ｒｐｍ以下、特に好ましくは９０ｒｐｍ以下とすることができる。下限は好ましくは１ｒｐｍ以上、より好ましくは１０ｒｐｍ以上、さらに好ましくは５０ｒｐｍ以上、より好ましくは６０ｒｐｍ以上、より好ましくは７０ｒｐｍ以上、さらに好ましくは８０ｒｐｍ以上、もっと好ましくは９０ｒｐｍ以上とすることができる。旋回培養の際の旋回幅は特に限定されないが、下限は、例えば１ｍｍ以上、好ましくは１０ｍｍ以上、より好ましくは２０ｍｍ以上、最も好ましくは２５ｍｍ以上とすることができる。旋回幅の上限は、例えば２００ｍｍ以下、好ましくは１００ｍｍ以下、好ましくは５０ｍｍ以下、より好ましくは３０ｍｍ以下、最も好ましくは２５ｍｍ以下とすることができる。旋回培養の際の回転半径もまた特に限定されないが、好ましくは旋回幅が前記の範囲となるように設定される。回転半径の下限は例えば５ｍｍ以上、好ましくは１０ｍｍ以上であり、上限は例えば１００ｍｍ以下、好ましくは５０ｍｍ以下とすることができる。旋回培養の条件をこの範囲とすることで、適切な寸法の細胞凝集塊を製造することが容易となるため好ましい。
【００７５】
「揺動培養法」とは、揺動（ロッキング）撹拌のような直線的な往復運動により培地に揺動流を付与する条件で培養する方法をいう。具体的には、細胞を含む培地を収容した培養容器を概ね水平面に垂直な平面内で揺動させることにより行う。揺動速度は特に限定されないが、例えば１往復を１回とした場合、下限は１分間に２回以上、４回以上、６回以上、８回以上、又は１０回以上、一方、上限は１分間に１５回以下、２０回以下、２５回以下、又は５０回以下で揺動すればよい。揺動の際、垂直面に対して若干の角度、すなわち揺動角度を培養容器につけることが好ましい。揺動角度は特に限定されないが、例えば、下限は０°以上、１°以上、２°以上、４°以上、６°以上、又は８°以上、一方、上限は１０°以下、１２°以下、１５°以下、１８°以下又は２０°以下とすることができる。揺動培養の条件をこの範囲とすることで、適切な寸法の細胞凝集塊を製造することが可能となるため好ましい。
【００７６】
更に、上記のような旋回と揺動とを組み合わせた運動により撹拌しながら培養することもできる。
【００７７】
スピナーフラスコ状の培養容器を用いた培養は、培養容器の中に攪拌翼を使用して、液体培地を攪拌しながら行う培養である。回転数や培地量は特に限定されない。市販のスピナーフラスコ状の培養容器であれば、細胞培養組成物の量として、メーカー推奨の量を好適に使用することができる。回転数は例えば１０ｒｐｍ以上、１００ｒｐｍ以下とすることができるが、特に限定されない。
【００７８】
浮遊培養における細胞の培地中での播種密度（浮遊培養の開始時の細胞密度）は適宜調整することができるが、下限として、例えば０．０１×１０５個細胞／ｍＬ以上、より好ましくは０．１×１０５個細胞／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０５個細胞／ｍＬ以上である。播種密度の上限としては、例えば２０×１０５個細胞／ｍＬ以下、より好ましくは１０×１０５個細胞／ｍＬ以下である。播種密度がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成され易い。例えば、０．１×１０５個細胞／ｍＬ、０．２×１０５個細胞／ｍＬ、０．３×１０５個細胞／ｍＬ、０．４×１０５個細胞／ｍＬ、０．５×１０５個細胞／ｍＬ、０．６×１０５個細胞／ｍＬ、０．７×１０５個細胞／ｍＬ、０．８×１０５個細胞／ｍＬ、０．９×１０５個細胞／ｍＬ、１×１０５個細胞／ｍＬ、１．５×１０５個細胞／ｍＬ、２×１０５個細胞／ｍＬ、３×１０５個細胞／ｍＬ、４×１０５個細胞／ｍＬ、５×１０５個細胞／ｍＬ、６×１０５個細胞／ｍＬ、７×１０５個細胞／ｍＬ、８×１０５個細胞／ｍＬ、９×１０５個細胞／ｍＬ、１０×１０５個細胞／ｍＬでも良い。
【００７９】
浮遊培養の際の細胞培養組成物の量は使用する培養容器によって適宜調整することができるが、例えば１２ウェルプレート（１ウェルあたりの平面視でのウェル底面の面積が３．５ｃｍ２）を使用する場合は０．５ｍＬ／ウェル以上、１．５ｍＬ／ウェル以下とすることができ、より好ましくは１．３ｍＬ／ウェルとすることができる。例えば６ウェルプレート（１ウェルあたりの平面視でのウェル底面の面積が９．６ｃｍ２）を使用する場合は、１．５ｍＬ／ウェル以上、好ましくは２ｍＬ／ウェル以上、より好ましくは３ｍＬ／ウェル以上とすることができ、６．０ｍＬ／ウェル以下、好ましくは５ｍＬ／ウェル以下、より好ましくは４ｍＬ／ウェル以下とすることができる。例えば１２５ｍＬ三角フラスコ（容量が１２５ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、１０ｍＬ／容器以上、好ましくは１５ｍＬ／容器以上、より好ましくは２０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２５ｍＬ／容器以上、より好ましくは２０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２５ｍＬ／容器以上、より好ましくは３０ｍＬ／容器以上とすることができ、５０ｍＬ／容器以下、より好ましくは４５ｍＬ／容器以下、より好ましくは４０ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば５００ｍＬ三角フラスコ（容量が５００ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、１００ｍＬ／容器以上、好ましくは１０５ｍＬ／容器以上、より好ましくは１１０ｍＬ／容器以上、より好ましくは１１５ｍＬ／容器以上、より好ましくは１２０ｍＬ／容器以上とすることができ、１５０ｍＬ／容器以下、より好ましくは１４５ｍＬ／容器以下、より好ましくは１４０ｍＬ／容器以下、より好ましくは１３５ｍＬ／容器以下、より好ましくは１３０ｍＬ／容器以下、より好ましくは１２５ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば１０００ｍＬ三角フラスコ（容量が１０００ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、２５０ｍＬ／容器以上、好ましくは２６０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２７０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２８０ｍＬ／容器以上、より好ましくは２９０ｍＬ／容器以上とすることができ、３５０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３４０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３３０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３２０ｍＬ／容器以下、より好ましくは３１０ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば２０００ｍＬ三角フラスコ（容量が２０００ｍＬの三角フラスコ）の場合は、５００ｍＬ／容器以上、より好ましくは５５０ｍＬ／容器以上、より好ましくは６００ｍＬ／容器以上とすることができ、１０００ｍＬ／容器以下、より好ましくは９００ｍＬ／容器以下、より好ましくは８００ｍＬ／容器以下、より好ましくは７００ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば３０００ｍＬ三角フラスコ（容量が３０００ｍＬの三角フラスコ）の場合は、１０００ｍＬ／容器以上、好ましくは１１００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１２００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１３００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１４００ｍＬ／容器以上、より好ましくは１５００ｍＬ／容器以上とすることができ、２０００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１９００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１８００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１７００ｍＬ／容器以下、より好ましくは１６００ｍＬ／容器以下とすることができる。例えば２Ｌ培養バッグ（容量が２Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは２００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは３００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは４００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは５００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは６００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは７００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは８００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは９００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは１０００ｍＬ／バッグ以上とすることができ、２０００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１９００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１８００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１７００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１６００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１５００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１４００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１３００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１２００ｍＬ／バッグ以下、より好ましくは１１００ｍＬ／バッグ以下とすることができる。例えば１０Ｌ培養バッグ（容量が１０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、５００ｍＬ／バッグ以上、より好ましくは１Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２Ｌ／バッグ以上、より好ましくは３Ｌ／バッグ以上、より好ましくは４Ｌ／バッグ以上、より好ましくは５Ｌ／バッグ以上とすることができ、１０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは９Ｌ／バッグ以下、より好ましくは８Ｌ／バッグ以下、より好ましくは７Ｌ／バッグ以下、より好ましくは６Ｌ／バッグ以下とすることができる。例えば、２０Ｌ培養バッグ（容量が２０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２Ｌ／バッグ以上、より好ましくは３Ｌ／バッグ以上、より好ましくは４Ｌ／バッグ以上、より好ましくは５Ｌ／バッグ以上、より好ましくは６Ｌ／バッグ以上、より好ましくは７Ｌ／バッグ以上、より好ましくは８Ｌ／バッグ以上、より好ましくは９Ｌ／バッグ以上、より好ましくは１０Ｌ／バッグ以上とすることができ、２０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１９Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１８Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１７Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１６Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１５Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１４Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１３Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１２Ｌ／バッグ以下、より好ましくは１１Ｌ／バッグ以下とすることができる。例えば５０Ｌ培養バッグ（容量が５０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、１Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２Ｌ／バッグ以上、より好ましくは５Ｌ／バッグ以上、より好ましくは１０Ｌ／バッグ以上、より好ましくは１５Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２０Ｌ／バッグ以上、より好ましくは２５Ｌ／バッグ以上とすることができ、５０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは４５Ｌ／バッグ以下、より好ましくは４０Ｌ／バッグ以下、より好ましくは３５Ｌ／バッグ以下、より好ましくは３０Ｌ／バッグ以下とすることができる。細胞培養組成物の量がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成され易い。
【００８０】
使用する培養容器の容量は適宜選択することができ特に限定されないが、液体培地を収容する部分の底面を平面視したときの面積として、下限が、例えば０．３２ｃｍ２以上、好ましくは０．６５ｃｍ２以上、より好ましくは０．６５ｃｍ２以上、さらに好ましくは１．９ｃｍ２以上、もっと好ましくは３．０ｃｍ２以上、３．５ｃｍ２以上、９．０ｃｍ２以上、又は９．６ｃｍ２以上の培養容器を用いることができ、上限としては、例えば１０００ｃｍ２以下、好ましくは５００ｃｍ２以下、より好ましくは３００ｃｍ２以下、より好ましくは１５０ｃｍ２以下、より好ましくは７５ｃｍ２以下、もっと好ましくは５５ｃｍ２以下、さらに好ましくは２５ｃｍ２以下、さらにより好ましくは２１ｃｍ２以下、さらにもっと好ましくは９．６ｃｍ２以下、又は３．５ｃｍ２以下の培養容器を用いることができる。
【００８１】
前記ＳＲＦ阻害剤又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤の存在下での細胞の浮遊培養の温度、時間、ＣＯ２濃度等の条件は特に限定されない。培養温度は好ましくは２０℃以上、より好ましくは３５℃以上、好ましくは４５℃以下、より好ましくは４０℃以下、最も好ましくは３７℃である。培養時間は好ましくは０．５時間以上、より好ましくは１２時間以上、好ましくは７日間以下、より好ましくは７２時間以下、より好ましくは４８時間以下、最も好ましくは２４時間以下である。培養時のＣＯ２濃度としては、好ましくは４％以上、より好ましくは４．５％以上、好ましくは１０％以下、より好ましくは５．５％以下、最も好ましくは５％である。また、本発明の細胞の凝集を促進する方法においては、浮遊培養工程中で継代操作を伴ってもよい。培養条件がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成され易い。また、適当な頻度で培地交換を行うことができる。培地交換の頻度は培養する細胞種によって異なるが、例えば、５日に１回以上、４日に１回以上、３日に１回以上、２日に１回以上、１日に１回以上で行えばよい。培地交換は、後述する回収工程と同様の方法で細胞を回収した後、新鮮な培地を添加し、穏やかに細胞凝集塊を分散させた後、再度培養すればよい。
【００８２】
浮遊培養工程で細胞の数をどこまで増やすか、また細胞の状態をどこに合わせるかについては、培養する細胞の種類、細胞凝集の目的、培地の種類や培養条件に応じて適宜定めればよい。
【００８３】
浮遊培養工程に用いる細胞は、予め維持培養工程により培養され、回収工程により回収され、必要に応じて単細胞化された細胞であることが好ましい。維持培養工程、回収工程、単細胞化については、後述する通りである。
【００８４】
浮遊培養工程後は、常法により培養液を廃棄し、細胞を回収する。この時、細胞は、剥離又は分散処理によって単一の細胞として回収することが好ましい。具体的な方法については、後述の回収工程で詳述する。回収した細胞は、そのまま、又は必要に応じてバッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生食、又は培地（次の工程で使用する培地か基礎培地が好ましい）で洗浄後、次の工程に供すればよい。
【００８５】
（維持培養工程）
「維持培養工程」は、浮遊培養工程前の細胞集団、又は浮遊培養工程後、若しくはその後の回収工程後に得られる細胞凝集塊を、未分化性を維持した状態で細胞を増殖させるために培養する工程である。維持培養は、細胞を容器、担体等培養基材に接着させながら培養する接着培養であってもよいし、細胞を培地中で浮遊させながら培養する浮遊培養であってもよい。
【００８６】
維持培養工程では、当該分野で既知の動物細胞培養法により、対象となる細胞を培養すればよい。接着培養又は浮遊培養を問わない。
【００８７】
維持培養工程で使用する培地、細胞の具体的な実施形態は既述の通りである。
【００８８】
維持培養工程で使用する培養容器、細胞の播種密度、培養条件は、浮遊培養工程に関して既述の通りである。
【００８９】
維持培養工程における、培地の流動状態は問わない。静置培養でもよいし、流動培養でもよい。
【００９０】
「静置培養」とは、培養容器内で培地を静置した状態で培養することをいう。接着培養では、通常、この静置培養が採用される。
【００９１】
「流動培養」とは、培地を流動させる条件下で培養することをいう。流動培養の具体的な実施形態は、浮遊培養工程に関して既述の通りである。
【００９２】
維持培養工程で細胞の数をどこまで増やすか、また細胞の状態をどこに合わせるかについては、培養する細胞の種類、細胞凝集の目的、培地の種類や培養条件に応じて適宜定めればよい。
【００９３】
維持培養工程の好適な一態様は、ＳＲＦ阻害剤又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤の存在下での浮遊培養工程により形成された細胞凝集塊を更に培養する維持培養工程である。この態様の維持培養工程での培養方法は特に限定されないが、例えばＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地中で細胞凝集塊を浮遊培養する工程が挙げられる。この維持培養に用いる培地としては、ＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含まない以外は上記と同様の培地を用いることができ、培養の条件としては浮遊培養工程と同様の条件を用いることができる。この態様の維持培養工程では、適当な頻度で培地交換を行うことが好ましい。培地交換の頻度は細胞種により異なるが、好ましくは５日に一回以上、より好ましくは４日に一回以上、さらに好ましくは３日に一回以上、もっと好ましくは２日に一回以上、最も好ましくは１日に一回以上の頻度で培地交換作業を含むことができる。この頻度の培地交換は、幹細胞の細胞凝集塊を培養する際に特に好適である。培地交換の方法は特に限定されないが、好ましくは細胞凝集塊を含む細胞培養組成物を遠沈管に全量回収し、遠心分離又は静置状態５分程度置き、沈降した細胞凝集塊を残して上清を除去し、その後、新鮮な培地を添加し、穏やかに細胞凝集塊を分散させた後、再度プレート等の培養容器に細胞凝集塊分散培地を戻すことで細胞凝集塊を継続して培養することができる。この態様の維持培養工程の培養期間は特に限定されないが、３日以上７日以下が好ましい。細胞凝集塊をＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地中で上記の条件において更に浮遊培養することにより、適切な寸法の細胞凝集塊を得ることができる。
【００９４】
維持培養工程後は、常法により培養液を廃棄し、細胞を回収する。この時、細胞は、剥離又は分散処理によって単一の細胞として回収することが好ましい。具体的な方法については、後述の回収工程で詳述する。回収した細胞は、そのまま、又は必要に応じてバッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生食、又は培地（次の工程で使用する培地か基礎培地が好ましい）で洗浄後、次の工程に供すればよい。
【００９５】
（回収工程）
「回収工程」は、維持培養工程又は浮遊培養工程後の培養液から培養した細胞を回収する工程で、本発明の方法における選択工程である。
【００９６】
本明細書において「（細胞の）回収」とは、培養液と細胞とを分離して細胞を取得することをいう。細胞の回収方法は、当該分野の細胞培養法で使用される常法に従えばよく、特に限定はしない。細胞培養方法は、一般に浮遊培養方法と接着培養方法に大別できる。以下、それぞれの培養方法後の細胞の回収方法について説明をする。
【００９７】
（浮遊培養方法後の回収方法）
細胞を浮遊培養法で培養した場合、細胞は培養液中に浮遊した状態で存在する。したがって、細胞の回収は、静置状態又は遠心分離により上清の液体成分を除去することで達成できる。また、細胞の回収方法としてはフィルターや中空糸分離膜等を選択することもできる。
【００９８】
静置状態で液体成分を除去する場合、培養液の入った容器を静置状態５分程度置き、沈降した細胞や細胞凝集塊を残して上清を除去すればよい。また遠心分離は、遠心力によって細胞がダメージを受けない回転速度と処理時間で行えばよい。例えば、回転速度の下限は、細胞を沈降できれば特に限定はされないが、例えば５００ｒｐｍ以上、８００ｒｐｍ以上、又は１０００ｒｐｍ以上であればよい。一方、上限は細胞が遠心力によるダメージを受けない、又は受けにくい速度であればよく、例えば１４００ｒｐｍ以下、１５００ｒｐｍ以下、又は１６００ｒｐｍ以下であればよい。また処理時間の下限は、上記回転速度により細胞を沈降できる時間であれば特に限定はされないが、例えば３０秒以上、１分以上、３分以上、又は５分以上であればよい。また、上限は、上記回転により細胞がダメージを受けない、又は受けにくい時間であればよく、例えば３０秒以下、６分以下、８分以下、又は１０分以下であればよい。回収した細胞は、必要に応じて洗浄することができる。洗浄方法は、限定しない。例えば前述の維持培養工程における工程後の洗浄方法と同様に行えばよい。洗浄液には、バッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生食、又は培地（基礎培地が好ましい）を使用すればよい。
【００９９】
（接着培養後の回収方法）
接着培養法で細胞を培養した場合、培養後、多くの細胞は培養容器や培養担体等の外部マトリクスに接着した状態で存在する。したがって、培養容器から培養液を除去するには、培養後の容器を静かに傾けて液体成分を流し出せばよい。外部マトリクスに接着した細胞が培養容器内に残るため、培養液と細胞を容易に分離することができる。
【０１００】
その後、必要に応じて外部マトリクスに接着した細胞表面を洗浄することもできる。洗浄液には、バッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生食、又は培地（基礎培地が好ましい）を使用すればよい。ただし、これらに限定はされない。洗浄後の洗浄液は、培養液と同様の操作で除去すればよい。この洗浄ステップは、複数回繰り返してもよい。
【０１０１】
続いて、外部マトリクスに接着した細胞集団を外部マトリクスから剥離する。剥離方法は、当該分野で公知の方法で行えばよい。通常は、スクレ―ピング、タンパク質分解酵素を有効成分とする剥離剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、又は剥離剤とキレート剤の混合物等が使用される。
【０１０２】
スクレ―ピングは、スクレーパー等を用いて外部マトリクスに付着した細胞を機械的手段によって剥ぎ取る方法である。ただし機械的操作により細胞が損傷を受けやすいため、回収後の細胞をさらなる培養に供する場合には、外部マトリクスに固着している細胞の足場部分を化学的に破壊又は分解し、外部マトリクスとの接着を解除する剥離方法が好ましい。
【０１０３】
剥離方法では、剥離剤及び／又はキレート剤を使用する。剥離剤は限定しないが、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼの他、市販のＡｃｃｕｔａｓｅ（商標登録）、ＴｒｙｐＬＥＴＭＥｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ディスパーゼ（商標登録）等を利用することができる。各剥離剤の濃度及び処理時間は、細胞の剥離又は分散で用いられる常法の範囲で使用すればよい。例えば、トリプシンの場合、溶液中の濃度の下限は、細胞を剥離できる濃度であれば特に限定はされないが、例えば０．０１％以上、０．０２％以上、０．０３％以上、０．０４％以上、０．０５％以上、０．０８％以上、又は０．１０％以上であればよい。一方、溶液中の濃度の上限は、トリプシンの作用によって細胞そのものが溶解される等の影響を受けない濃度であれば特に限定はされないが、例えば０．１５％以下、０．２０％以下、０．２５％以下、又は０．３０％以下であればよい。また処理時間は、トリプシンの濃度によって左右されるものの、その下限はトリプシンの作用によって外部マトリクスから細胞が十分に剥離される時間であれば特に限定はされず、例えば１分以上、２分以上、３分以上、４分以上又は５分以上であればよい。一方、処理時間の上限は、トリプシンの作用によって細胞そのものが溶解される等の影響を受けない時間であれば特に限定はされず、例えば８分以下、１０分以下、１２分以下、１５分以下、１８分以下、又は２０分以下であればよい。他の剥離剤又はキレート剤の場合も、概ね同様に行えばよい。なお、市販の剥離剤を使用する場合には、添付のプロトコルに記載の濃度及び処理時間で行うことができる。
【０１０４】
外部マトリクスから剥離した細胞は、遠心分離により剥離剤を含む上清を除去する。遠心条件は、上記「浮遊培養方法後の回収方法」と同様でよい。回収した細胞は、必要に応じて洗浄することができる。洗浄方法も上記「浮遊培養方法後の回収方法」と同様に行えばよい。
【０１０５】
本工程後に得られた細胞は、単層細胞片や細胞凝集塊等の細胞集合体を一部に包含し得る。一方、回収した細胞は、必要に応じて単一細胞化することもできる。
【０１０６】
（単一細胞化）
本明細書において「単一細胞化」とは、単層細胞片や細胞凝集塊等のように複数の細胞が互いに接着又は凝集した細胞集合体を分散させて、単一の遊離した細胞状態にすることをいう。
【０１０７】
単一細胞化は、上記の剥離方法で使用する剥離剤及び／又はキレート剤の濃度を高めにする、及び／又は剥離剤及び／又はキレート剤での処理時間を長くすればよい。例えば、トリプシンの場合、溶液中の濃度の下限は、細胞集合体を分散できる濃度であれば特に限定はされないが、例えば０．１５％以上、０．１８％以上、０．２０％以上、又は０．２４％以上であればよい。一方、溶液中の濃度の上限は、細胞そのものが溶解される等の影響を受けない濃度であれば特に限定はされないが、０．２５％以下、０．２８％以下、又は０．３０％以下であればよい。また処理時間は、トリプシンの濃度によって左右されるものの、その下限は、トリプシンの作用によって細胞集合体が十分に分散される時間であれば特に限定はされず、例えば５分以上、８分以上、１０分以上、１２分以上、又は１５分以上であればよい。一方、処理時間の上限は、トリプシンの作用によって細胞そのものが溶解される等の影響を受けない時間であれば特に限定はされず、例えば１８分以下、２０分以下、２２分以下、２５分以下、２８分以下、又は３０分以下であればよい。なお、市販の剥離剤を使用する場合には、添付のプロトコルに記載の、細胞を分散させて単一状態にできる濃度で使用すればよい。前記剥離剤及び／又はキレート剤による処理後に物理的に軽く処理することで、単一細胞化を促進できる。この物理的処理は限定しないが、例えば、細胞を溶液ごと複数回ピペッティングする方法が挙げられる。さらに、必要に応じて、細胞をストレーナーやメッシュに通過させてもよい。
【０１０８】
単一細胞化した細胞は、静置又は遠心分離により剥離剤を含む上清を除去して回収することができる。回収した細胞は、必要に応じて洗浄してもよい。遠心分離の条件や洗浄方法については上記「浮遊培養方法後の回収方法」と同様に行えばよい。
【０１０９】
＜７．細胞凝集促進剤＞
本発明の他の一態様は、ＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含む、細胞の浮遊培養に用いるための細胞凝集促進剤である。
【０１１０】
本発明の細胞凝集促進剤は、浮遊培養系において細胞の凝集を適度に促進し、略均一な大きさの細胞凝集塊を形成するために用いることができる。本発明の細胞凝集促進剤を用いた幹細胞の浮遊培養では、幹細胞の未分化性を維持することができる。
【０１１１】
本発明における細胞凝集促進剤の形態は特に限定されず、ＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤自体であってもよいし、ＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤と他の成分とを組み合わせた組成物であってもよい。前記組成物の形態は特に限定されない。前記組成物は例えば浮遊培養に用いる培地の形態であってもよいし、培地の調製時に配合される添加用組成物の形態であってもよい。
【０１１２】
本発明における細胞凝集促進剤の好ましい実施形態は、ＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地又はリン酸緩衝液等の緩衝液である。培地中のＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤の濃度としては、＜６．細胞の凝集を促進する方法＞の欄にて浮遊培養に関して記載の培地中のＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤の濃度が例示できる。
【０１１３】
本発明における細胞凝集促進剤の別の好ましい実施形態は、ＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を液状又は固形状媒体中に含有する液状又は固形状組成物である。前記液状又は固形状組成物は、浮遊培養用の培地を調製する際に添加される添加物である。この実施形態の細胞凝集促進剤は、調製される培地中でのＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤の最終濃度が、＜６．細胞の凝集を促進する方法＞の欄にて浮遊培養に関して記載の培地中のＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤の濃度となるように調製されていることが好ましい。この実施形態の細胞凝集促進剤中でのＳＲＦ阻害剤の濃度は特に限定されないが、好ましくは、ＳＲＦ阻害剤の、浮遊培養時の培地中での好ましい濃度として挙げた前記濃度の１倍以上、より好ましくは２倍以上、より好ましくは１０倍以上、より好ましくは１００倍以上、より好ましくは１０００倍以上、より好ましくは１００００倍以上であり、具体的には、例えばＳＲＦ阻害剤がＣＣＧ−１４２３（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＣＡＳ  Ｎｏ．２８５９８６−８８１、Ｃ１８Ｈ１４ＣｌＦ６Ｎ２Ｏ３、分子量＝４５４．８）の場合、９．０μｇ／ｍＬ以上１０.０ｍｇ／ｍＬ以下の範囲であることが特に好ましい。前記濃度の下限としては、細胞凝集促進効果を奏すれば特に限定されないが、好ましくは９．０μｇ／ｍＬ以上、１０．０μｇ／ｍＬ以上、２０．０μｇ／ｍＬ以上、３０．０μｇ／ｍＬ以上、４０．０μｇ／ｍＬ以上、５０．０μｇ／ｍＬ以上、６０．０μｇ／ｍＬ以上、７０．０μｇ／ｍＬ以上、８０．０μｇ／ｍＬ以上、９０．０μｇ／ｍＬ以上、１００．０μｇ／ｍＬ以上である。一方、上限としては、細胞が死滅しない濃度であれば特に限定されないが、好ましくは１０.０ｍｇ／ｍＬ以下、９．０ｍｇ／ｍＬ以下、８．０ｍｇ／ｍＬ以下、７．０ｍｇ／ｍＬ以下、６．０ｍｇ／ｍＬ以下、５．０ｍｇ／ｍＬ以下、４．０ｍｇ／ｍＬ以下、３．０ｍｇ／ｍＬ以下、２．０ｍｇ／ｍＬ以下、１．０ｍｇ／ｍＬ以下、９００.０μｇ／ｍＬ以下、８００.０μｇ／ｍＬ以下、７００.０μｇ／ｍＬ以下、６００.０μｇ／ｍＬ以下、５００.０μｇ／ｍＬ以下である。また、ＳＲＦ阻害剤の濃度は、２０μＭ以上２０ｍＭ以下の範囲であることが特に好ましい。前記ＳＲＦ阻害剤の濃度の下限としては、例えば、２０μＭ以上、２００μＭ以上、０．０５ｍＭ以上、０．１ｍＭ以上、０．２ｍＭ以上、０．３ｍＭ以上、０．４ｍＭ以上、０．５ｍＭ以上、０．６ｍＭ以上、０．７ｍＭ以上、０．８ｍＭ以上、０．９ｍＭ以上、１ｍＭ以上、２ｍＭ以上、３ｍＭ以上、４ｍＭ以上、５ｍＭ以上、６ｍＭ以上、７ｍＭ以上、８ｍＭ以上、９ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、１１ｍＭ以上、１２ｍＭ以上、１３ｍＭ以上、１４ｍＭ以上、１５ｍＭ以上である。一方、上限としては、例えば２０ｍＭ以下である。また、この実施形態の細胞凝集促進剤中でのＲＯＣＫ阻害剤の濃度は特に限定されないが、好ましくは、ＲＯＣＫ阻害剤の、浮遊培養時の培地中での好ましい濃度として挙げた前記濃度の１倍以上、より好ましくは２倍以上、より好ましくは１０倍以上、より好ましくは１００倍以上、より好ましくは１０００倍以上、より好ましくは１００００倍以上であり、具体的には、例えばＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２（和光純薬工業株式会社、ＣＡＳ  Ｎｏ．３３１７５２−４７−７、Ｃ１４Ｈ２１Ｎ３Ｏ・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、分子量＝３３８．２７）の場合、６．７μｇ／ｍＬ以上１４.０ｍｇ／ｍＬ以下の範囲であることが特に好ましい。例えば、６．７ｍｇ／ｍＬでも良い。前記濃度の下限としては、細胞凝集促進効果を奏すれば特に限定されないが、好ましくは６．７μｇ／ｍＬ以上、７．０μｇ／ｍＬ以上、８．０μｇ／ｍＬ以上、９．０μｇ／ｍＬ以上、１０．０μｇ／ｍＬ以上、２０．０μｇ／ｍＬ以上、３０．０μｇ／ｍＬ以上、４０．０μｇ／ｍＬ以上、５０．０μｇ／ｍＬ以上、６０．０μｇ／ｍＬ以上、７０．０μｇ／ｍＬ以上、８０．０μｇ／ｍＬ以上、９０．０μｇ／ｍＬ以上、１００．０μｇ／ｍＬ以上である。一方、上限としては、細胞が死滅しない濃度であれば特に限定されないが、好ましくは１４.０ｍｇ／ｍＬ以下、１３.０ｍｇ／ｍＬ以下、１２.０ｍｇ／ｍＬ以下、１１.０ｍｇ／ｍＬ以下、１０.０ｍｇ／ｍＬ以下、９.０ｍｇ／ｍＬ以下、８.０ｍｇ／ｍＬ以下、７.０ｍｇ／ｍＬ以下、６.０ｍｇ／ｍＬ以下、５.０ｍｇ／ｍＬ以下、４.０ｍｇ／ｍＬ以下、３.０ｍｇ／ｍＬ以下、２.０ｍｇ／ｍＬ以下、１.０ｍｇ／ｍＬ以下、９００.０μｇ／ｍＬ以下、８００.０μｇ／ｍＬ以下、７００.０μｇ／ｍＬ以下、６００.０μｇ／ｍＬ以下、５００.０μｇ／ｍＬ以下である。また、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、２０μＭ以上４０ｍＭ以下の範囲であることが特に好ましい。前記ＲＯＣＫ阻害剤の濃度の下限としては、例えば２０μＭ以上、２００μＭ以上、０．５ｍＭ以上、０．６ｍＭ以上、０．７ｍＭ以上、０．８ｍＭ以上、０．９ｍＭ以上、１ｍＭ以上、２ｍＭ以上、３ｍＭ以上、４ｍＭ以上、５ｍＭ以上、６ｍＭ以上、７ｍＭ以上、８ｍＭ以上、９ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、１１ｍＭ以上、１２ｍＭ以上、１３ｍＭ以上、１４ｍＭ以上、１５ｍＭ以上、１６ｍＭ以上、１７ｍＭ以上、１８ｍＭ以上、１９ｍＭ以上、２０ｍＭ以上である。一方、上限としては、例えば４０ｍＭ以下、３０ｍＭ以下である。
【０１１４】
細胞凝集促進剤は、ＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤に加えて、溶媒及び／又は賦形剤等を含有してもよい。溶媒としては、水、バッファ（ＰＢＳを含む）、生食、有機溶媒（ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、キシレン、低級アルコール）等が挙げられる。賦形剤としては、抗生剤、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定化剤、界面活性剤、乳化剤、防腐剤、保存剤、抗酸化剤等が挙げられる。抗生剤は特に限定されないが、例えばペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ等を使用することができる。緩衝剤としては、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン緩衝液などが挙げられる。増粘剤としては、ゼラチン、多糖類などが挙げられる。着色剤としては、フェノールレッドなどが挙げられる。安定化剤としては、アルブミン、デキストラン、メチルセルロース、ゼラチンなどが挙げられる。界面活性剤としては、コレステロール、アルキルグリコシド、アルキルポリグルコシド、アルキルモノグリセリルエーテル、グルコシド、マルトシド、ネオペンチルグリコール系、ポリオキシエチレングリコール系、チオグルコシド、チオマルトシド、ペプチド、サポニン、リン脂質、脂肪酸ソルビタンエステル、脂肪酸ジエタノールアミドなどが挙げられる。乳化剤としては、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなどが挙がられる。防腐剤としては、アミノエチルスルホン酸、安息香酸、安息香酸ナトリウム、エタノール、エデト酸ナトリウム、カンテン、dl−カンフル、クエン酸、クエン酸ナトリウム、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸フェニル、ジブチルヒドロキシトルエン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、窒素、デヒドロ酢酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、2−ナフトール、白糖、ハチミツ、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル、l−メントール、ユーカリ油などが挙げられる。保存剤としては、安息香酸、安息香酸ナトリウム、エタノール、エデト酸ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グリセリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン、Ｄ−ソルビトール、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル、プロピレングリコール、リン酸などが挙げられる。抗酸化剤としては、クエン酸、クエン酸誘導体、ビタミンＣおよびその誘導体、リコペン、ビタミンＡ、カロテノイド類、ビタミンＢおよびその誘導体、フラボノイド類、ポリフェノール類、グルタチオン、セレン、チオ硫酸ナトリウム、ビタミンＥおよびその誘導体、αリポ酸およびその誘導体、ピクノジェノール、フラバンジェノール、スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、グルタチオン還元酵素、カタラーゼ、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ、およびこれらの混合物などが挙げられる。
【０１１５】
細胞凝集促進剤は、増殖因子を含有してもよく、好ましくはＦＧＦ２及びＴＧＦ−β１の１種以上の増殖因子を含有していることが好ましい。
【０１１６】
＜８．細胞凝集塊の製造方法、及び、それにより製造された細胞凝集塊＞
本発明の他の一態様は、ＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で細胞を浮遊培養する工程を含む、細胞凝集塊の製造方法である。
【０１１７】
この方法によれば、適度な寸法の細胞凝集塊を、高収量で製造することができる。特に、細胞が幹細胞である場合、幹細胞の未分化性の維持された、適度な寸法の細胞凝集塊を、高収量で製造することができる。
【０１１８】
ＳＲＦ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、培地及び細胞の具体的な実施形態は既述の通りである。
【０１１９】
前記工程での培地中のＳＲＦ阻害剤の濃度は、例えばＳＲＦ阻害剤がＣＣＧ−１４２３（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＣＡＳ  Ｎｏ．２８５９８６−８８１、Ｃ１８Ｈ１４ＣｌＦ６Ｎ２Ｏ３、分子量＝４５４．８）の場合、前記阻害剤の濃度の下限としては、細胞凝集促進効果を奏すれば特に限定されないが、好ましくは４．５ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは４５ｎｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは４５０ｎｇ／ｍＬ以上、最も好ましくは１．１μｇ／ｍＬ以上、２μｇ／ｍＬ以上、３μｇ／ｍＬ以上、４μｇ／ｍＬ以上、５μｇ／ｍＬ以上、６μｇ／ｍＬ以上、７μｇ／ｍＬ以上、８μｇ／ｍＬ以上、９μｇ／ｍＬ以上、１０μｇ／ｍＬ以上、１１μｇ／ｍＬ以上、１２μｇ／ｍＬ以上、１３μｇ／ｍＬ以上、１４μｇ／ｍＬ以上、１５μｇ／ｍＬ以上、１６μｇ／ｍＬ以上、１７μｇ／ｍＬ以上、１８μｇ／ｍＬ以上、１９μｇ／ｍＬ以上である。一方、上限としては、細胞が死滅しない濃度であれば特に限定されないが、好ましくは４．６ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは４６０μｇ／ｍＬ以下、特に好ましくは４６μｇ／ｍＬ以下、４０μｇ／ｍＬ以下、３０μｇ／ｍＬ以下、２０μｇ／ｍＬ以下である。また、前記阻害剤の濃度は、好ましくは４．５ｎｇ／ｍＬ以上４．６ｍｇ／ｍＬ以下である。前記工程での培地中のＳＲＦ阻害剤の濃度はまた、１０ｎＭ以上、１０ｍＭ以下の範囲であることが特に好ましい。前記濃度の下限としては、好ましくは１０ｎＭ以上、より好ましくは１００ｎＭ以上、特に好ましくは１μＭ以上、最も好ましくは２．５μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、６μＭ以上、７μＭ以上、８μＭ以上、９μＭ以上、１０μＭ以上、１１μＭ以上、１２μＭ以上、１３μＭ以上、１４μＭ以上、１５μＭ以上、１６μＭ以上、１７μＭ以上、１８μＭ以上、１９μＭ以上、２０μＭ以上、２１μＭ以上、２２μＭ以上、２３μＭ以上、２４μＭ以上、２５μＭ以上、２６μＭ以上、２７μＭ以上、２８μＭ以上、２９μＭ以上、３０μＭ以上、３１μＭ以上、３２μＭ以上、３３μＭ以上、３４μＭ以上、３５μＭ以上、３６μＭ以上、３７μＭ以上、３８μＭ以上、３９μＭ以上である。一方、上限としては、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下、特に好ましくは１００μＭ以下、最も好ましくは４０μＭ以下である。
【０１２０】
また、前記工程での培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、例えばＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２（和光純薬工業株式会社、ＣＡＳ  Ｎｏ．３３１７５２−４７−７、Ｃ１４Ｈ２１Ｎ３Ｏ・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、分子量＝３３８．２７）の場合、３．３ｎｇ／ｍＬ以上３．４ｍｇ／ｍＬ以下の範囲であることが特に好ましい。前記濃度の下限としては、細胞凝集促進効果を奏すれば特に限定されないが、好ましくは３．３ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは３３ｎｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは３３０ｎｇ／ｍＬ以上、最も好ましくは８００ｎｇ／ｍＬ以上、１μｇ／ｍＬ以上、２μｇ／ｍＬ以上、３μｇ／ｍＬ以上、４μｇ／ｍＬ以上、５μｇ／ｍＬ以上、６μｇ／ｍＬ以上、７μｇ／ｍＬ以上、８μｇ／ｍＬ以上、９μｇ／ｍＬ以上、１０μｇ／ｍＬ以上、１１μｇ／ｍＬ以上、１２μｇ／ｍＬ以上、１３μｇ／ｍＬ以上、１４μｇ／ｍＬ以上である。一方、上限としては、細胞が死滅しない濃度であれば特に限定されないが、好ましくは３．４ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは３４０μｇ／ｍＬ以下、特に好ましくは３４μｇ／ｍＬ以下、最も好ましくは１４μｇ／ｍＬ以下である。前記工程での培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度はまた、１０ｎＭ以上、１０ｍＭ以下の範囲であることが特に好ましい。前記濃度の下限は、好ましくは１０ｎＭ以上、より好ましくは１００ｎＭ以上、特に好ましくは１μＭ以上、最も好ましくは２．５μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、６μＭ以上、７μＭ以上、８μＭ以上、９μＭ以上、１０μＭ以上、１１μＭ以上、１２μＭ以上、１３μＭ以上、１４μＭ以上、１５μＭ以上、１６μＭ以上、１７μＭ以上、１８μＭ以上、１９μＭ以上、２０μＭ以上、２１μＭ以上、２２μＭ以上、２３μＭ以上、２４μＭ以上、２５μＭ以上，２６μＭ以上、２７μＭ以上、２８μＭ以上、２９μＭ以上、３０μＭ以上、３１μＭ以上、３２μＭ以上、３３μＭ以上、３４μＭ以上、３５μＭ以上、３６μＭ以上、３７μＭ以上、３８μＭ以上、３９μＭ以上である。上限としては、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下、特に好ましくは１００μＭ以下、最も好ましくは４０μＭ以下である。
【０１２１】
前記工程の具体的な実施形態は、＜６．細胞の凝集を促進する方法＞の欄で説明した、細胞の凝集を促進する方法における「ＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で細胞を浮遊培養する工程」の具体的な実施形態と同様である。
【０１２２】
本発明の他の一態様は、前記の細胞凝集塊の製造方法により得られた細胞凝集塊である。
【０１２３】
本発明のこの態様に係る細胞凝集塊は適度な寸法を有し、生細胞率が高い。また、細胞が幹細胞である場合、細胞凝集塊を構成する細胞が未分化性を維持している。
【０１２４】
本発明のこの態様に係る細胞凝集塊は、好ましくは、＜２．細胞凝集塊＞の欄に記載の特徴を備える。
【０１２５】
また、本発明の細胞凝集塊を製造する方法は、ＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で細胞を浮遊培養する浮遊培養工程の他に、適宜任意の工程を含むことができる。前記任意の工程としては、例えば維持培養工程、細胞凝集塊の回収工程である。さらに、前記浮遊培養は継代操作を含んでいてもよい。維持培養工程及び回収工程の好適な実施形態は、＜６．細胞の凝集を促進する方法＞の欄で説明した維持培養工程及び回収工程と同様である。
【０１２６】
＜９．細胞培養組成物＞
本発明の他の一態様は、細胞と、培地と、ＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤とを含む、細胞培養組成物である。
【０１２７】
本発明のこの態様に係る細胞培養組成物は、細胞凝集塊を高収量で製造するために用いることができる。特に、細胞が幹細胞である場合、幹細胞の未分化性の維持された、適度な寸法の細胞凝集塊を、高収量で製造するために用いることができる。
【０１２８】
また、本発明のこの態様に係る細胞培養組成物は、細胞を細胞凝集塊の形態で含んでもよい。
【０１２９】
ＳＲＦ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、培地、細胞及び細胞凝集塊の具体的な実施形態は既述の通りである。
【０１３０】
本発明のこの態様に係る細胞培養組成物中のＳＲＦ阻害剤の濃度は、例えばＳＲＦ阻害剤がＣＣＧ−１４２３（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＣＡＳ  Ｎｏ．２８５９８６−８８１、Ｃ１８Ｈ１４ＣｌＦ６Ｎ２Ｏ３、分子量＝４５４．８）の場合、前記阻害剤の濃度の下限としては、細胞凝集促進効果を奏すれば特に限定されないが、好ましくは４．５ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは４５ｎｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは４５０ｎｇ／ｍＬ以上、最も好ましくは１．１μｇ／ｍＬ以上、２μｇ／ｍＬ以上、３μｇ／ｍＬ以上、４μｇ／ｍＬ以上、５μｇ／ｍＬ以上、６μｇ／ｍＬ以上、７μｇ／ｍＬ以上、８μｇ／ｍＬ以上、９μｇ／ｍＬ以上、１０μｇ／ｍＬ以上、１１μｇ／ｍＬ以上、１２μｇ／ｍＬ以上、１３μｇ／ｍＬ以上、１４μｇ／ｍＬ以上、１５μｇ／ｍＬ以上、１６μｇ／ｍＬ以上、１７μｇ／ｍＬ以上、１８μｇ／ｍＬ以上である。一方、上限としては、細胞が死滅しない濃度であれば特に限定されないが、好ましくは４．６ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは４６０μｇ／ｍＬ以下、特に好ましくは４６μｇ／ｍＬ以下、最も好ましくは１９μｇ／ｍＬ以下である。また、前記阻害剤の濃度は、好ましくは４．５ｎｇ／ｍＬ以上４．６ｍｇ／ｍＬ以下である。本発明のこの態様に係る細胞培養組成物中のＳＲＦ阻害剤の濃度はまた、１０ｎＭ以上、１０ｍＭ以下の範囲であることが特に好ましい。前記濃度の下限としては、好ましくは１０ｎＭ以上、より好ましくは１００ｎＭ以上、特に好ましくは１μＭ以上、最も好ましくは２．５μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、６μＭ以上、７μＭ以上、８μＭ以上、９μＭ以上、１０μＭ以上、１１μＭ以上、１２μＭ以上、１３μＭ以上、１４μＭ以上、１５μＭ以上、１６μＭ以上、１７μＭ以上、１８μＭ以上、１９μＭ以上、２０μＭ以上、２１μＭ以上、２２μＭ以上、２３μＭ以上、２４μＭ以上、２５μＭ以上，２６μＭ以上、２７μＭ以上、２８μＭ以上、２９μＭ以上、３０μＭ以上、３１μＭ以上、３２μＭ以上、３３μＭ以上、３４μＭ以上、３５μＭ以上、３６μＭ以上、３７μＭ以上、３８μＭ以上、３９μＭ以上である。一方、上限としては、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下、特に好ましくは１００μＭ以下、最も好ましくは４０μＭ以下である。
【０１３１】
また、本発明のこの態様に係る細胞培養組成物中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、例えばＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２（和光純薬工業株式会社、ＣＡＳ  Ｎｏ．３３１７５２−４７−７、Ｃ１４Ｈ２１Ｎ３Ｏ・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、分子量＝３３８．２７）の場合、３．３ｎｇ／ｍＬ以上３．４ｍｇ／ｍＬ以下の範囲であることが特に好ましい。前記濃度の下限としては、細胞凝集促進効果を奏すれば特に限定されないが、好ましくは３．３ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは３３ｎｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは３３０ｎｇ／ｍＬ以上、最も好ましくは８００ｎｇ／ｍＬ以上、１μｇ／ｍＬ以上、２μｇ／ｍＬ以上、３μｇ／ｍＬ以上、４μｇ／ｍＬ以上、５μｇ／ｍＬ以上、６μｇ／ｍＬ以上、７μｇ／ｍＬ以上、８μｇ／ｍＬ以上、９μｇ／ｍＬ以上、１０μｇ／ｍＬ以上、１１μｇ／ｍＬ以上、１２μｇ／ｍＬ以上、１３μｇ／ｍＬ以上、１４μｇ／ｍＬ以上である。一方、上限としては、細胞が死滅しない濃度であれば特に限定されないが、好ましくは３．４ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは３４０μｇ／ｍＬ以下、特に好ましくは３４μｇ／ｍＬ以下、最も好ましくは１４μｇ／ｍＬ以下である。本発明のこの態様に係る細胞培養組成物中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度はまた、１０ｎＭ以上、１０ｍＭ以下の範囲であることが特に好ましい。前記濃度の下限は、好ましくは１０ｎＭ以上、より好ましくは１００ｎＭ以上、特に好ましくは１μＭ以上、最も好ましくは２．５μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、６μＭ以上、７μＭ以上、８μＭ以上、９μＭ以上、１０μＭ以上、１１μＭ以上、１２μＭ以上、１３μＭ以上、１４μＭ以上、１５μＭ以上、１６μＭ以上、１７μＭ以上、１８μＭ以上、１９μＭ以上、２０μＭ以上、２１μＭ以上、２２μＭ以上、２３μＭ以上、２４μＭ以上、２５μＭ以上，２６μＭ以上、２７μＭ以上、２８μＭ以上、２９μＭ以上、３０μＭ以上、３１μＭ以上、３２μＭ以上、３３μＭ以上、３４μＭ以上、３５μＭ以上、３６μＭ以上、３７μＭ以上、３８μＭ以上、３９μＭ以上である。上限としては、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下、特に好ましくは１００μＭ以下、最も好ましくは４０μＭ以下である。
【０１３２】
前記細胞培養組成物から細胞凝集塊を製造する工程としては、前記細胞培養組成物中で細胞を浮遊培養する工程が挙げられる。この工程の具体的な実施形態は、＜６．細胞の凝集を促進する方法＞の欄で説明した、細胞の凝集を促進する方法における「ＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で細胞を浮遊培養する工程」の具体的な実施形態と同様である。
【０１３３】
前記細胞培養組成物は、ＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を培地に添加した後に細胞を添加することにより調製してもよいし、細胞を培地に混合した後にＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を添加することにより調製してもよいが、好ましくはＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を培地に添加した後に細胞を添加することにより調製する。ＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を培地に添加する際、安定化剤を添加することもできる。前記安定化剤は、ＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤の液体培地中での安定化、活性維持、培養容器等への吸着防止等に寄与する物質であれば特に限定されないが、アルブミン等のタンパク質、乳化剤、界面活性剤、両親媒性物質、或いは、ヘパリン等の多糖類等を使用することができる。
【０１３４】
前記細胞培養組成物は、ＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含む培地（前記安定化剤を更に含んでいても良い）を凍結して保存し、その後に解凍してから細胞を添加することにより調製してもよい。
【０１３５】
＜１０．細胞培養培地＞
本発明の他の一態様は、培地と、ＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤とを含む、細胞培養培地である。
【０１３６】
本発明のこの態様に係る細胞培養培地は、浮遊培養により細胞から細胞凝集塊を高収量で製造するための培地として用いることができる。特に、細胞が幹細胞である場合、幹細胞の未分化性の維持された、適度な寸法の細胞凝集塊を、高収量で製造するために用いることができる。
【０１３７】
ＳＲＦ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、培地及び細胞の具体的な実施形態は既述の通りである。
【０１３８】
本発明のこの態様に係る細胞培養培地中のＳＲＦ阻害剤の濃度は、例えばＳＲＦ阻害剤がＣＣＧ−１４２３（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＣＡＳ  Ｎｏ．２８５９８６−８８１、Ｃ１８Ｈ１４ＣｌＦ６Ｎ２Ｏ３、分子量＝４５４．８）の場合、前記阻害剤の濃度の下限としては、細胞凝集促進効果を奏すれば特に限定されないが、好ましくは４．５ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは４５ｎｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは４５０ｎｇ／ｍＬ以上、最も好ましくは１．１μｇ／ｍＬ以上、２μｇ／ｍＬ以上、３μｇ／ｍＬ以上、４μｇ／ｍＬ以上、５μｇ／ｍＬ以上、６μｇ／ｍＬ以上、７μｇ／ｍＬ以上、８μｇ／ｍＬ以上、９μｇ／ｍＬ以上、１０μｇ／ｍＬ以上、１１μｇ／ｍＬ以上、１２μｇ／ｍＬ以上、１３μｇ／ｍＬ以上、１４μｇ／ｍＬ以上、１５μｇ／ｍＬ以上、１６μｇ／ｍＬ以上、１７μｇ／ｍＬ以上、１８μｇ／ｍＬ以上である。一方、上限としては、細胞が死滅しない濃度であれば特に限定されないが、好ましくは４．６ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは４６０μｇ／ｍＬ以下、特に好ましくは４６μｇ／ｍＬ以下、最も好ましくは１９μｇ／ｍＬ以下である。また、前記阻害剤の濃度は、好ましくは４．５ｎｇ／ｍＬ以上４．６ｍｇ／ｍＬ以下である。本発明のこの態様に係る細胞培養培地中のＳＲＦ阻害剤の濃度はまた、１０ｎＭ以上、１０ｍＭ以下の範囲であることが特に好ましい。前記濃度の下限としては、好ましくは１０ｎＭ以上、より好ましくは１００ｎＭ以上、特に好ましくは１μＭ以上、最も好ましくは２．５μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、６μＭ以上、７μＭ以上、８μＭ以上、９μＭ以上、１０μＭ以上、１１μＭ以上、１２μＭ以上、１３μＭ以上、１４μＭ以上、１５μＭ以上、１６μＭ以上、１７μＭ以上、１８μＭ以上、１９μＭ以上、２０μＭ以上、２１μＭ以上、２２μＭ以上、２３μＭ以上、２４μＭ以上、２５μＭ以上，２６μＭ以上、２７μＭ以上、２８μＭ以上、２９μＭ以上、３０μＭ以上、３１μＭ以上、３２μＭ以上、３３μＭ以上、３４μＭ以上、３５μＭ以上、３６μＭ以上、３７μＭ以上、３８μＭ以上、３９μＭ以上である。一方、上限としては、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下、特に好ましくは１００μＭ以下、最も好ましくは４０μＭ以下である。
【０１３９】
また、本発明のこの態様に係る細胞培養培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、例えばＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２（和光純薬工業株式会社、ＣＡＳ  Ｎｏ．３３１７５２−４７−７、Ｃ１４Ｈ２１Ｎ３Ｏ・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、分子量＝３３８．２７）の場合、３．３ｎｇ／ｍＬ以上３．４ｍｇ／ｍＬ以下の範囲であることが特に好ましい。前記濃度の下限としては、細胞凝集促進効果を奏すれば特に限定されないが、好ましくは３．３ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは３３ｎｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは３３０ｎｇ／ｍＬ以上、最も好ましくは８００ｎｇ／ｍＬ以上、１μｇ／ｍＬ以上、２μｇ／ｍＬ以上、３μｇ／ｍＬ以上、４μｇ／ｍＬ以上、５μｇ／ｍＬ以上、６μｇ／ｍＬ以上、７μｇ／ｍＬ以上、８μｇ／ｍＬ以上、９μｇ／ｍＬ以上、１０μｇ／ｍＬ以上、１１μｇ／ｍＬ以上、１２μｇ／ｍＬ以上、１３μｇ／ｍＬ以上、１４μｇ／ｍＬ以上である。一方、上限としては、細胞が死滅しない濃度であれば特に限定されないが、好ましくは３．４ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは３４０μｇ／ｍＬ以下、特に好ましくは３４μｇ／ｍＬ以下、最も好ましくは１４μｇ／ｍＬ以下である。本発明のこの態様に係る細胞培養培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度はまた、１０ｎＭ以上、１０ｍＭ以下の範囲であることが特に好ましい。前記濃度の下限は、好ましくは１０ｎＭ以上、より好ましくは１００ｎＭ以上、特に好ましくは１μＭ以上、最も好ましくは２．５μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、６μＭ以上、７μＭ以上、８μＭ以上、９μＭ以上、１０μＭ以上、１１μＭ以上、１２μＭ以上、１３μＭ以上、１４μＭ以上、１５μＭ以上、１６μＭ以上、１７μＭ以上、１８μＭ以上、１９μＭ以上、２０μＭ以上、２１μＭ以上、２２μＭ以上、２３μＭ以上、２４μＭ以上、２５μＭ以上，２６μＭ以上、２７μＭ以上、２８μＭ以上、２９μＭ以上、３０μＭ以上、３１μＭ以上、３２μＭ以上、３３μＭ以上、３４μＭ以上、３５μＭ以上、３６μＭ以上、３７μＭ以上、３８μＭ以上、３９μＭ以上である。上限としては、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下、特に好ましくは１００μＭ以下、最も好ましくは４０μＭ以下である。
【０１４０】
前記細胞培養培地から細胞凝集塊を製造する工程としては、前記細胞培養培地中で細胞を浮遊培養する工程が挙げられる。この工程の具体的な実施形態は、＜６．細胞の凝集を促進する方法＞の欄で説明した、細胞の凝集を促進する方法における「ＳＲＦ阻害剤、又はＳＲＦ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含む培地中で細胞を浮遊培養する工程」の具体的な実施形態と同様である。
【０１４１】
前記細胞培養培地は、使用前まで凍結して保存し、使用時に解凍して使用することができる。
【実施例】
【０１４２】
＜実施例１．ヒトｉＰＳ細胞の維持培養＞
ヒトｉＰＳ細胞として、ＴｋＤＮ４−Ｍ株（東京大学医科学研究所）を使用した。Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）をコートした細胞培養用ディッシュ上にヒトｉＰＳ細胞を播種し、培地はＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８ＴＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用して維持培養した。継代時の細胞剥離剤としては、Ａｃｃｕｔａｓｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いた。また、細胞播種時のみ、Ｙ−２７６３２（和光純薬工業株式会社）を１０μＭの濃度になるように培地に添加した。培地交換は毎日実施した。実験には継代数５０回までのヒトｉＰＳ細胞を使用した。【０１４３】
＜実施例２．細胞凝集アッセイによる凝集促進効果の確認＞
ＳＲＦ阻害剤添加による細胞の凝集促進効果について検討した。【０１４４】
（方法）
実施例１の手順で培養したヒトｉＰＳ細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで３分間から５分間処理して剥離し、単細胞まで分散した。この細胞を最終濃度５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（和光純薬工業株式会社）および最終濃度２．５μＭのＹ−２７６３２（和光純薬工業株式会社）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８ＴＭ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して細胞数を調べた。１ｍＬあたり２×１０５個の細胞を含むように調製した。別途ＣＣＧ−１４２３（Ｃａｙｍａｎ、１００１０３５０）を最終濃度４・５５ｍｇ／ｍＬ（１０ｍＭ）になるように細胞凝集促進剤を調整し、前記調整した細胞凝集促進剤を前記細胞懸濁液にＣＣＧ−１４２３の最終濃度が１０μＭとなるように添加した上で、浮遊培養用１２ウェルプレート（住友ベークライト株式会社）に１．３ｍＬ／ウェルの割合で播種した。細胞を播種したプレートは、ロータリーシェーカー（株式会社オプティマ）上で９０ ｒｐｍのスピードで水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回培養し、５％ＣＯ２、３７℃の環境下で浮遊培養を行った。コントロール試験として、ＣＣＧ−１４２３を添加していない以外は上記と同様に調製した細胞懸濁液を用いた条件での試験を行った。【０１４５】
培養を開始して翌日（培養１日目）に位相差顕微鏡にて画像を取得した。
また、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ＬＤＨ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ−ＷＳＴ（株式会社同仁化学研究所）を用いて、死細胞数を算出した。【０１４６】
（結果）
上記浮遊培養後（培養１日目）の顕微鏡観察像を図１に示す。観察の結果、コントロール試験（０μＭ  ＣＣＧ−１４２３）に比べて、ＣＣＧ−１４２３を添加した条件では比較的大きな凝集塊を形成しており、凝集が促進されていた。死細胞数を調べた結果、コントロール試験（０μＭ  ＣＣＧ−１４２３）に比べて、ＣＣＧ−１４２３を添加した条件では死細胞数が減少していた（図２）。【０１４７】
＜実施例３．ＣＣＧ−１４２３存在条件での凝集塊形成後の細胞増殖能、未分化能への影響＞
ヒトｉＰＳ細胞の浮遊培養を行いグルコース消費量、細胞収量、未分化マーカーの陽性率を測定し、ＣＣＧ−１４２３が与える細胞への影響を解析した。【０１４８】
（方法）
実施例２と同様に細胞懸濁液を調製し、別途ＣＣＧ−１４２３（同上）を最終濃度４・５５ｍｇ／ｍＬ（１０ｍＭ）になるように細胞凝集促進剤を調整し、前記調整した細胞凝集促進剤を前記細胞懸濁液にＣＣＧ−１４２３の最終濃度が１０μＭとなるように添加した上で、浮遊培養用６ウェルプレート（住友ベークライト株式会社）に４ｍＬ／ウェルの割合で播種した。細胞を播種したプレートは、ロータリーシェーカー（株式会社オプティマ）上で９０ ｒｐｍのスピードで水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回培養し、５％ＣＯ２、３７℃の環境下で浮遊培養を行った。培養翌日（培養１日目）以降、毎日新鮮な培地（最終濃度５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（和光純薬工業株式会社）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８ＴＭ培地）に培地交換し、培養５日後まで培養を続けた。コントロール試験として、ＣＣＧ−１４２３およびＹ−２７６３２を含まない培地で同様に培養した。培養中、毎日位相差顕微鏡により画像を取得とした。培養１日目に取得した画像中の２０８個の細胞凝集塊を観察し、顕微鏡写真のスケールと比較して各細胞凝集塊の最も広い部分の幅（「φ」とする）を求め、その分布を調べ、平均値±標準偏差を算出した。培地交換時に回収した培養上清に含まれるグルコースの濃度を、バイオセンサーＢＦ−５ｉＤ（王子計測機器株式会社）で測定し、グルコース消費量を計算した。【０１４９】
また、培養５日目に細胞凝集塊を回収し、Ａｃｃｕｔａｓｅにより分散後、５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８ＴＭ培地で懸濁した。この細胞懸濁液の一部をトリパンブルー染色して細胞数を調べた。上記細胞懸濁液を３００ｇで３分間遠心分離後、上清を取り除き、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で細胞を洗浄した。その後、４％パラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社）により室温で２０分間固定後、ＰＢＳで３回洗浄し、３００μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁後、ボルテックスで攪拌しながら冷メタノール３ｍＬを添加し、−２０℃で一晩以上透過処理を行った。３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳで３回洗浄後、３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳにより細胞を再懸濁して室温で３０分から１時間ブロッキングした。その後、蛍光標識抗ＳＯＸ２抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．６５６１１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）及び蛍光標識抗ＯＣＴ４抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．６５３７０３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）及び蛍光標識抗Ｎａｎｏｇ抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．６７４０１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）により４℃で３０分から１時間染色した。３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳで１回洗浄後、セルストレーナーに通過させた細胞をＦＡＣＳＶｅｒｓｅにて解析した。コントロール試験として、上記３種の抗体（蛍光標識済抗ＳＯＸ２抗体、蛍光標識抗ＯＣＴ４抗体、蛍光標識抗Ｎａｎｏｇ抗体）の代わりに上記３種の各抗体に対応した３種の蛍光標識済アイソタイプコントロール抗体（Ｃａｔ.Ｎｏ.４００１２９、Ｃａｔ.Ｎｏ.４００３１４、Ｃａｔ.Ｎｏ.４００１３６；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を反応させた以外は同様に処理した細胞を用いた。【０１５０】
また、培養５日目に細胞収量を測定した。細胞収量の測定は次の手順で行った。すなわち、形成した細胞凝集塊をＡｃｃｕｔａｓｅで５分から１０分処理し、ブルーチップでのピペッティングによって細胞を単分散させ、トリパンブルー染色した後、血球計算盤を用いて細胞数を係数し、細胞収量を測定した。【０１５１】
（結果）
図３は培養１日目から５日目に観察した顕微鏡写真である。ＣＣＧ−１４２３を添加した条件では播種後から培養１日目にかけて細胞凝集塊が形成されており、培養を継続することで徐々に細胞が増殖し、細胞凝集塊が大きくなった。【０１５２】
図７はＣＣＧ−１４２３を添加した条件下での培養１日目の細胞凝集塊サイズ（直径）の分布図である。また、以下の表１にはＣＣＧ−１４２３を添加した条件下での培養１日目のある一定サイズ別の細胞凝集塊の個数およびその割合を示す。【０１５３】
ＣＣＧ−１４２３を添加した条件下での培養１日目の細胞凝集塊サイズ（直径）の平均値±標準偏差を算出した結果、１７１．３±２２．８μｍであった。【０１５４】
また、ＣＣＧ−１４２３を添加した条件下での培養１日目において、細胞凝集塊全個数に対する、細胞凝集塊サイズ（直径）が４０μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は１００％であった。そのうち、前記細胞凝集塊サイズ（直径）が６０μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は９９．５％であり、前記細胞凝集塊サイズ（直径）が８０μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は９８．５％であり、前記細胞凝集塊サイズ（直径）が１００μｍ以上３００μｍ以下となる細胞凝集塊の割合は９８．５％であった。
【表１】
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【０１５５】
グルコース消費量を図４に、培養５日目の細胞収量を図５にそれぞれ示す。ＣＣＧ−１４２３を添加した条件では、グルコース消費量は日々増加し、細胞が増殖していることが示唆され、培養５日目には播種細胞数（８×１０５個／ウェル）のおよそ８．５倍に増殖していることが明らかになった。【０１５６】
未分化マーカーの陽性率の測定結果を図６に示す。ＣＣＧ−１４２３を含む培地で細胞凝集塊を作製し、その後も浮遊培養にて増殖した細胞において、マーカーであるＳＯＸ２陽性細胞が９９％以上、ＯＣＴ４陽性細胞が９７％以上、Ｎａｎｏｇ陽性細胞が９９％以上であり、ＣＣＧ−１４２３添加によって形成されたヒトｉＰＳ細胞の凝集塊は未分化性を維持していることが確認された。【０１５７】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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