(57)【要約】  本開示は、心筋細胞に対する分化指向性を有する多能性幹細胞を選別するための方法を提供することを目的とする。  （ａ）対象の多能性幹細胞におけるミトコンドリア関連遺伝子、ＷＮＴシグナル伝達調節因子、ＴＧＦβシグナル伝達調節因子、中胚葉関連遺伝子、心筋細胞関連遺伝子および未分化細胞関連遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量を計測すること、および（ｂ）（ａ）で測定した遺伝子の発現量を基準と比較すること、を含み、測定した発現量が基準より有意に高い場合、前記対象の多能性幹細胞を心筋細胞への分化指向性が高い細胞株であると決定する方法により、上記課題は解決された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞の特定の分化誘導細胞への分化指向性を評価するための分化指向性マーカーの決定方法であって、
（１）複数の多能性幹細胞株における遺伝子発現量を測定すること；
（２）前記複数の多能性幹細胞株におけるｍｉＲＮＡの発現量を測定すること；
（３）前記特定の分化誘導細胞への分化指向性の高い多能性幹細胞株と低い多能性幹細胞株との間に有意に発現量に差異のある遺伝子を抽出すること；
（４）前記特定の分化誘導細胞への分化指向性の高い多能性幹細胞株と低い多能性幹細胞株との間に有意に発現量に差異のあるｍｉＲＮＡを抽出すること；および
（５）（３）で抽出された遺伝子から（４）で抽出されたｍｉＲＮＡと関与する遺伝子を選択すること；
を含む、前記方法。
【請求項２】
多能性幹細胞株の分化指向性を指標化する方法であって、
（ａ）対象の多能性幹細胞における少なくとも１種の分化指向性マーカー遺伝子の発現量を計測すること
（ｂ）（ａ）で測定した遺伝子の発現量を基準と比較すること
を含む、前記方法。
【請求項３】
分化指向性マーカー遺伝子が、ＷＮＴシグナル伝達調節因子、ミトコンドリア関連遺伝子、ＴＧＦβシグナル伝達調節因子、中胚葉関連遺伝子、心筋細胞関連遺伝子および未分化細胞関連遺伝子からなる群から選択される遺伝子である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＷＮＴシグナル伝達調節因子が、ＰＦ４、ＴＭＥＭ６４、ＫＤＭ６Ａ、ＡＰＣ、βカテニン、Ａｘｉｎ、ＣＫ１、Ｄｓｈ、ＧＳＫ−３β、Ｄｋｋ、ＷＩＦ、ＦＲＰ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＴＣＦ、Ｋｒｎ、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ３、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
ミトコンドリア関連遺伝子が、ＣＨＣＨＤ２、ＳＦＸＮ３、ＣＲＥＢ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ、ＣＡＭＫ４、ＰＰＰ３ＣＡ、ＭＹＥＦ２、ＰＰＲＣ１、ＰＫＡ、ＮＲＦ１、ＧＡＢＰＡ、ＧＡＢＰＢ２、ＥＳＲＲＡ、ＴＦＢ２Ｍ、ＴＦＢ１Ｍ、ＴＦＡＭ、ＰＯＬＲＭＴおよびＭＴＥＲＦからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＴＧＦβシグナル伝達調節因子が、ＳＫＩＬ、ＴＨＢＳ１、ＣＤ３、ＴＬＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＭＡＤ９、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＲＯＣＫ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８Ｂ、ＢＭＰＲ１ＡおよびＢＭＰＲ１Ｂからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
中胚葉遺伝子が、ＦＬＫ１、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、ＰＤＧＦＲ−ａ、ＩＧＦ２、ＣＤ３４、ＣＬＬ１、ＨＨＥＸ，ＩＮＨＢＡ，ＬＥＦ１、ＳＲＦ、Ｔ、ＴＷＩＳＴ１、ＡＤＩＰＯＱ、ＭＭＥ、ＫＩＴ、ＩＴＧＡＬ、Ｔｂｘ１、Ｇａｔａ１、Ｋｌｆ１、Ｃｓｆ１ｒ、ＣＤ４５およびＴｅｒ１１９からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
心筋細胞関連遺伝子が、ＴＮＴ２、ＭＬ２、ＧＡＴＡ４、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、Ｎｋｘ２．５、ＳＣＮ５Ａ、ＲＹＲ２、ＰＰＡＲＧＣ１、ＭＹＬ２、ＨＣＮ４、ＣＡＣＮａ１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ２、Ａｃｔｃ１、Ｃｘ４３、ＴＥＦ−１およびＴｂｘ−５からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
未分化細胞関連遺伝子が、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、ＴＲＡ−１−６０、ＳＳＥＡ−４、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘ１、ＥＲａｓ、Ｆｇｆ４、Ｅｓｇ１、Ｒｅｘ１、Ｚｆｐ２９６、ＵＴＦ１、ＧＤＦ３、Ｓａｌｌ４、Ｔｂｘ３、Ｔｃｆ３、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ｂ、Ｔｒａ−１−８１、ｍｉＲ−２９０クラスターのｍｉＲＮＡおよびｍｉＲ−３０２クラスターのｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
分化指向性マーカー遺伝子が、ＰＦ４、ＣＨＣＨＤ２、ＡＭＭＥＣＲ１、ＡＰＩ５、ＢＣＯＲ、ＢＲＷＤ１、ＣＬＥＣ４Ｇ、ＧＬＩＰＲ１、ＨＥＬＢ、ＫＤＭ６Ａ、ＬＯＣ３８８７９６、ＮＫＴＲ、ＰＯＭＺＰ３、ＺＰ３、ＰＲＵＮＥ２、ＲＢＭＸ、ＲＣ３Ｈ１、ＳＫＩＬ、ＳＯＲＢＳ２およびＳＲＳＦ１１からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
測定した発現量が基準より有意に高い場合、対象の多能性幹細胞を心筋細胞への分化指向性が高い細胞株であると判断する、請求項１０に記載の方法
【請求項１２】
分化指向性マーカー遺伝子が、ＴＭＥＭ６４、ＡＣＴＮ３、ＬＯＣ２８４３７３、ＬＯＣ４４１６６６、ＰＬＣＢ１、ＳＹＮＰＲ、ＴＭＥＭ１６３、Ｕ２ＡＦ１Ｌ４、ＶＷＤＥ、ＺＮＦ２２９およびＺＮＦ３５４Ｃからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
測定した発現量が基準より有意に低い場合、対象の多能性幹細胞を心筋細胞への分化指向性が高い細胞株であると判断する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
多能性幹細胞の培養方法であって、ＰＦ４、ＣＨＣＨＤ２、ＡＭＭＥＣＲ１、ＡＰＩ５、ＢＣＯＲ、ＢＲＷＤ１、ＣＬＥＣ４Ｇ、ＧＬＩＰＲ１、ＨＥＬＢ、ＫＤＭ６Ａ、ＬＯＣ３８８７９６、ＮＫＴＲ、ＰＯＭＺＰ３、ＺＰ３、ＰＲＵＮＥ２、ＲＢＭＸ、ＲＣ３Ｈ１、ＳＫＩＬ、ＳＯＲＢＳ２およびＳＲＳＦ１１からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む培地で培養することを特徴とする、前記方法。
【請求項１５】
少なくとも１種のタンパク質が、ＰＦ４である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
培養が、多能性幹細胞から胚様体を形成するための培養である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
胚様体が、中胚葉性胚様体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法により培養された多能性幹細胞由来の分化誘導細胞を含む、医療用組成物。
【請求項１９】
薬剤スクリーニング用組成物である、請求項１８に記載の医療用組成物。
【請求項２０】
移植用組成物である、請求項１８に記載の医療用組成物。
【請求項２１】
シート状細胞培養物であることを特徴とする、請求項１９または２０に記載の医療用組成物。
【請求項２２】
多能性幹細胞から分化誘導された心筋細胞を含む医療用組成物の品質管理方法であって、多能性幹細胞を培養して得られる胚様体における中胚葉遺伝子、内胚葉遺伝子および／または外胚葉遺伝子の発現量を計測することを含む、前記方法。
【請求項２３】
中胚葉遺伝子が、ＦＬＫ１、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、ＰＤＧＦＲ−ａ、ＩＧＦ２、ＣＤ３４、ＣＬＬ１、ＨＨＥＸ，ＩＮＨＢＡ，ＬＥＦ１、ＳＲＦ、Ｔ、ＴＷＩＳＴ１、ＡＤＩＰＯＱ、ＭＭＥ、ＫＩＴ、ＩＴＧＡＬ、Ｔｂｘ１、Ｇａｔａ１、Ｋｌｆ１、Ｃｓｆ１ｒ、ＣＤ４５およびＴｅｒ１１９からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
内胚葉遺伝子が、ＡＭＮ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７およびＨＮＦ３からなる群から選択され、外胚葉遺伝子が、ＳＯＸ１、ＰＡＸ６およびＺＩＣ１からなる群から選択される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
さらに、多能性幹細胞や胚様体の形態的特徴を取得することを含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の分化誘導細胞、特に心筋細胞への分化指向性を有する多能性幹細胞、該多能性幹細胞から誘導される胚様体、該多能性幹細胞から誘導される分化誘導細胞を含む医療用組成物、該多能性幹細胞をスクリーニングする方法、前記医療用組成物を用いて対象を処置する方法、前記医療用組成物を用いて有効な薬剤をスクリーニングする方法、前記医療用組成物の製造における品質管理方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
成体の心筋細胞は自己複製能に乏しく、心筋組織が損傷を受けた場合、その修復は極めて困難である。近年、損傷した心筋組織の修復のために、細胞工学的手法により作製した心筋細胞を含む移植片を患部に移植する試みが行われている（特許文献１、非特許文献１）。かかる移植片の作製に用いる心筋細胞として最近注目されているのが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞から誘導した心筋細胞であり、このような多能性幹細胞由来の心筋細胞を含むシート状細胞培養物の作製や動物での治療実験が試みられている（非特許文献２〜３）。しかしながら、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含むシート状細胞培養物の開発は始まったばかりであり、その機能的特性や、それに影響する因子などについては依然不明な部分が多い。【０００３】
多能性幹細胞から分化誘導細胞を調製する場合、例えば心筋細胞を調製する場合であれば、まず多能性幹細胞から中胚葉への分化の方向性を与えつつ胚様体を形成し、かかる胚様体を心筋細胞に分化誘導し、これを単一の細胞に分散させることにより心筋細胞を回収する（例えば特許文献２など）。【０００４】
近年ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞に関する研究が進んでおり、また多くの細胞株が樹立されていく中で、細胞株間で分化の特性に違いがあることがわかってきた。例えば特許文献２や非特許文献４には、神経系の細胞への分化指向性を有するｉＰＳ細胞について記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００７−５２８７５５号公報
【特許文献２】国際公開第２０１３／１８７４１６号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Shimizu et al., Circ Res. 2002 Feb 22;90(3):e40-e48
【非特許文献２】Matsuura et al., Biomaterials. 2011 Oct;32(30):7355-62
【非特許文献３】Kawamura et al., Circulation. 2012 Sep 11;126(11 Suppl 1):S29-37
【非特許文献４】Kojima et al., Cell Stem Cell 14, 107?120 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、心筋細胞に対する分化指向性を有する多能性幹細胞を選別するための方法などに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、多能性幹細胞由来の心筋細胞を用いたシート状細胞培養物の作製について研究する中で、同様の分化誘導法を用いても、最終調製物中の心筋細胞の割合が大きく異なるという課題に直面した。かかる課題を解決すべく鋭意研究を進めたところ、多能性幹細胞株によって心筋細胞に分化しやすい株と分化しにくい株が存在し、心筋細胞に分化しやすい多能性幹細胞株を用いると、最終調製物中の心筋細胞の割合が多くなることを見出した。そこで、これらの細胞株の際について研究を続けたところ、心筋細胞に分化しやすい細胞株において特徴的に発現している遺伝子の特定に成功し、さらに研究を進めた結果本発明を完成させるに至った。【０００９】
すなわち、本発明に下記に掲げるものに関する：
［１］多能性幹細胞の特定の分化誘導細胞への分化指向性を評価するための分化指向性マーカーの決定方法であって、
（１）複数の多能性幹細胞株における遺伝子発現量を測定すること；
（２）前記複数の多能性幹細胞株におけるｍｉＲＮＡの発現量を測定すること；
（３）前記特定の分化誘導細胞への分化指向性の高い多能性幹細胞株と低い多能性幹細胞株との間に有意に発現量に差異のある遺伝子を抽出すること；
（４）前記特定の分化誘導細胞への分化指向性の高い多能性幹細胞株と低い多能性幹細胞株との間に有意に発現量に差異のあるｍｉＲＮＡを抽出すること；および
（５）（３）で抽出された遺伝子から（４）で抽出されたｍｉＲＮＡと関与する遺伝子を選択すること；
を含む、前記方法。【００１０】
［２］多能性幹細胞株の分化指向性を指標化する方法であって、
（ａ）対象の多能性幹細胞における少なくとも１種の分化指向性マーカー遺伝子の発現量を計測すること
（ｂ）（ａ）で測定した遺伝子の発現量を基準と比較すること
を含む、前記方法。
［３］分化指向性マーカー遺伝子が、ＷＮＴシグナル伝達調節因子、ミトコンドリア関連遺伝子、ＴＧＦβシグナル伝達調節因子、中胚葉関連遺伝子、心筋細胞関連遺伝子および未分化細胞関連遺伝子からなる群から選択される遺伝子である、［２］の方法。【００１１】
［４］ＷＮＴシグナル伝達調節因子が、ＰＦ４、ＴＭＥＭ６４、ＫＤＭ６Ａ、ＡＰＣ、βカテニン、Ａｘｉｎ、ＣＫ１、Ｄｓｈ、ＧＳＫ−３β、Ｄｋｋ、ＷＩＦ、ＦＲＰ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＴＣＦ、Ｋｒｎ、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ３、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、［２］または［３］の方法。
［５］ミトコンドリア関連遺伝子が、ＣＨＣＨＤ２、ＳＦＸＮ３、ＣＲＥＢ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ、ＣＡＭＫ４、ＰＰＰ３ＣＡ、ＭＹＥＦ２、ＰＰＲＣ１、ＰＫＡ、ＮＲＦ１、ＧＡＢＰＡ、ＧＡＢＰＢ２、ＥＳＲＲＡ、ＴＦＢ２Ｍ、ＴＦＢ１Ｍ、ＴＦＡＭ、ＰＯＬＲＭＴおよびＭＴＥＲＦからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、［２］〜［４］の方法。【００１２】
［６］ＴＧＦβシグナル伝達調節因子が、ＳＫＩＬ、ＴＨＢＳ１、ＣＤ３、ＴＬＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＭＡＤ９、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＲＯＣＫ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８Ｂ、ＢＭＰＲ１ＡおよびＢＭＰＲ１Ｂからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、［２］〜［５］の方法。
［７］中胚葉遺伝子が、ＦＬＫ１、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、ＰＤＧＦＲ−ａ、ＩＧＦ２、ＣＤ３４、ＣＬＬ１、ＨＨＥＸ，ＩＮＨＢＡ，ＬＥＦ１、ＳＲＦ、Ｔ、ＴＷＩＳＴ１、ＡＤＩＰＯＱ、ＭＭＥ、ＫＩＴ、ＩＴＧＡＬ、Ｔｂｘ１、Ｇａｔａ１、Ｋｌｆ１、Ｃｓｆ１ｒ、ＣＤ４５およびＴｅｒ１１９からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、［２］〜［６］の方法。【００１３】
［８］心筋細胞関連遺伝子が、ＴＮＴ２、ＭＬ２、ＧＡＴＡ４、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、Ｎｋｘ２．５、ＳＣＮ５Ａ、ＲＹＲ２、ＰＰＡＲＧＣ１、ＭＹＬ２、ＨＣＮ４、ＣＡＣＮａ１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ２、Ａｃｔｃ１、Ｃｘ４３、ＴＥＦ−１およびＴｂｘ−５からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、［２］〜［７］の方法。
［９］未分化細胞関連遺伝子が、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、ＴＲＡ−１−６０、ＳＳＥＡ−４、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘ１、ＥＲａｓ、Ｆｇｆ４、Ｅｓｇ１、Ｒｅｘ１、Ｚｆｐ２９６、ＵＴＦ１、ＧＤＦ３、Ｓａｌｌ４、Ｔｂｘ３、Ｔｃｆ３、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ｂ、Ｔｒａ−１−８１、ｍｉＲ−２９０クラスターのｍｉＲＮＡおよびｍｉＲ−３０２クラスターのｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、［２］〜［８］の方法。【００１４】
［１０］分化指向性マーカー遺伝子が、ＰＦ４、ＣＨＣＨＤ２、ＡＭＭＥＣＲ１、ＡＰＩ５、ＢＣＯＲ、ＢＲＷＤ１、ＣＬＥＣ４Ｇ、ＧＬＩＰＲ１、ＨＥＬＢ、ＫＤＭ６Ａ、ＬＯＣ３８８７９６、ＮＫＴＲ、ＰＯＭＺＰ３、ＺＰ３、ＰＲＵＮＥ２、ＲＢＭＸ、ＲＣ３Ｈ１、ＳＫＩＬ、ＳＯＲＢＳ２およびＳＲＳＦ１１からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である、［２］の方法。
［１１］測定した発現量が基準より有意に高い場合、対象の多能性幹細胞を心筋細胞への分化指向性が高い細胞株であると判断する、［１０］の方法【００１５】
［１２］分化指向性マーカー遺伝子が、ＴＭＥＭ６４、ＡＣＴＮ３、ＬＯＣ２８４３７３、ＬＯＣ４４１６６６、ＰＬＣＢ１、ＳＹＮＰＲ、ＴＭＥＭ１６３、Ｕ２ＡＦ１Ｌ４、ＶＷＤＥ、ＺＮＦ２２９およびＺＮＦ３５４Ｃからなる群から選択される、［２］の方法。
［１３］測定した発現量が基準より有意に低い場合、対象の多能性幹細胞を心筋細胞への分化指向性が高い細胞株であると判断する、［１２］の方法。
［１４］多能性幹細胞の培養方法であって、ＰＦ４、ＣＨＣＨＤ２、ＡＭＭＥＣＲ１、ＡＰＩ５、ＢＣＯＲ、ＢＲＷＤ１、ＣＬＥＣ４Ｇ、ＧＬＩＰＲ１、ＨＥＬＢ、ＫＤＭ６Ａ、ＬＯＣ３８８７９６、ＮＫＴＲ、ＰＯＭＺＰ３、ＺＰ３、ＰＲＵＮＥ２、ＲＢＭＸ、ＲＣ３Ｈ１、ＳＫＩＬ、ＳＯＲＢＳ２およびＳＲＳＦ１１からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む培地で培養することを特徴とする、前記方法。【００１６】
［１５］少なくとも１種のタンパク質が、ＰＦ４である、［１４］の方法。
［１６］培養が、多能性幹細胞から胚様体を形成するための培養である、［１４］または［１５］の方法。
［１７］胚様体が、中胚葉性胚様体である、［１６］の方法。
［１８］［１４］〜［１７］の方法により培養された多能性幹細胞由来の分化誘導細胞を含む、医療用組成物。
［１９］薬剤スクリーニング用組成物である、［１８］の医療用組成物。
［２０］移植用組成物である、［１８］の医療用組成物。
［２１］シート状細胞培養物であることを特徴とする、［１９］または［２０］の医療用組成物。【００１７】
［２２］多能性幹細胞から分化誘導された心筋細胞を含む医療用組成物の品質管理方法であって、多能性幹細胞を培養して得られる胚様体における中胚葉遺伝子、内胚葉遺伝子および／または外胚葉遺伝子の発現量を計測することを含む、前記方法。
［２３］中胚葉遺伝子が、ＦＬＫ１、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、ＰＤＧＦＲ−ａ、ＩＧＦ２、ＣＤ３４、ＣＬＬ１、ＨＨＥＸ，ＩＮＨＢＡ，ＬＥＦ１、ＳＲＦ、Ｔ、ＴＷＩＳＴ１、ＡＤＩＰＯＱ、ＭＭＥ、ＫＩＴ、ＩＴＧＡＬ、Ｔｂｘ１、Ｇａｔａ１、Ｋｌｆ１、Ｃｓｆ１ｒ、ＣＤ４５およびＴｅｒ１１９からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子からなる群から選択される、［２２］の方法。
［２４］内胚葉遺伝子が、ＡＭＮ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７およびＨＮＦ３からなる群から選択され、外胚葉遺伝子が、ＳＯＸ１、ＰＡＸ６およびＺＩＣ１からなる群から選択される、［２２］または［２３］の方法。
［２５］さらに、多能性幹細胞や胚様体の形態的特徴を取得することを含む、［２２］〜［２４］の方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、特定の分化誘導細胞、例えば心筋細胞に対する分化指向性を有する多能性幹細胞株を容易に選抜し、得ることができるため、かかる多能性幹細胞株を用いることで、分化誘導による心筋細胞の調製を効率よく行うことができるようになる。また多能性幹細胞や胚様体など分化誘導の初期段階で、心筋細胞の割合が高い最終調製物を得られるか否かを判断できるため、効率よく高品質な医療用組成物を提供することができる。さらには、所望の分化誘導細胞、例えば心筋細胞に分化させる新規な培養方法を提供することで、所望の分化誘導細胞をより効率的に得ることを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、例１で用いたｉＰＳ細胞の培養中および胚葉体の写真図である。Ａは培養中の細胞の写真、Ｂは胚様体の写真図である。
【図２】図２は、例１で用いたｉＰＳ細胞を心筋細胞に分化誘導した際の、トロポニンＴの陽性率を表す、青いバーと赤いバーはそれぞれ、アクチビンを６ｎｇ／ｍＬ加えた場合、１２ｎｇ／ｍＬ加えた場合の陽性率である。
【図３】図３は、例１で用いたｉＰＳ細胞を心筋細胞に分化誘導した際の、培養物の拍動率を表す。赤いバーと青いバーはそれぞれ培養８日目および１７日目の結果を示す。
【００２０】
【図４】図４は、各ｉＰＳ細胞を心筋細胞に分化誘導した際の、未分化細胞の残存率を表す。青いバーと赤いバーはそれぞれ、アクチビンを６ｎｇ／ｍＬ加えた場合、１２ｎｇ／ｍＬ加えた場合の結果である。
【図５】図５は、各ｉＰＳ細胞株から形成された胚様体における各胚葉の関連遺伝子の発現レベルを表す。
【図６】図６は、各ｉＰＳ細胞から分化誘導された細胞培養物における心筋細胞関連遺伝子発現のヒートマップである。
【００２１】
【図７】図７は、各ｉＰＳ細胞から分化誘導された細胞培養物における各心筋細胞関連遺伝子の発現量を表す。
【図８】図８は各ｉＰＳ細胞株におけるｍｉＲＮＡ発現解析の結果を表す図である。Ａは、分化指向性の高いｉＰＳ細胞株と分化指向性の低いｉＰＳ細胞株との間でのｍｉＲＮＡの発現量の変化をプロットしたグラフである。Ｂは、発現量が低減したｍｉＲＮＡとして特定された５種のｍｉＲＮＡの、高分化指向性株と低分化指向性株との間の発現量の違いを表すグラフである。Ｃは、解析した全ｍｉＲＮＡについて、高分化指向性株および低分化指向性株での発現量を縦軸および横軸としてプロットした分布図である。
【００２２】
【図９】図９は、特定されたｍｉＲＮＡのパスウェイ解析の結果と、特定された２遺伝子（ＰＦ４およびＴＭＥＭ６４）の発現についての試験結果を表す図である。Ａは分化指向性の高いｉＰＳ細胞株と分化指向性の低いｉＰＳ細胞株との間で有意に発現量が高い１０種のｍＲＮＡと、有意に発現量が低い１０種のｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。Ｂは、ｍｉＲＮＡ解析と遺伝子発現解析によって特定されたｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡが関与するシグナル伝達経路を列挙するグラフである。Ｃは、高分化指向性株と低分化指向性株とをそれぞれ心筋細胞へと分化誘導した場合の、得られた細胞集団におけるｃＴｎＴ発現量の違いを表すグラフである。Ｄは高分化指向性株および低分化指向性株における、ＰＦ４およびＴＭＥＭ６４の発現量をそれぞれ表すグラフである。Ｅは、各ｉＰＳ細胞株におけるＰＦ４およびＴＭＥＭ６４の発現量と、同ｉＰＳ細胞株を心筋細胞へと分化誘導した際のｃＴｎＴ発現量との相関関係を表すグラフである。
【図１０】図１０は、培地に種々の剤を添加して分化誘導した場合における、Ａ：ｃＴｎＴの発現量、ならびにＢ：ＰＦ４およびＴＭＥＭ６４の発現量を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
本開示において、特定の遺伝子名で表される塩基配列（ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡなどを含む）は、例えばGenBankなどの当該技術分野において公知のデータベースに登録された配列を意味する。当業者であれば、かかる遺伝子名から、いかなる配列を表しているか直ちに知ることができる。
【００２４】
本開示において、「多能性幹細胞」という語は、当該技術分野で周知の用語であり、三胚葉、すなわち内胚葉、中胚葉および外胚葉に属する全ての系列の細胞に分化することができる能力を有する細胞を意味する。多能性幹細胞の非限定例としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などが挙げられる。通常多能性幹細胞を特定の細胞に分化誘導する際には、まず多能性幹細胞を浮遊培養して、上記三胚葉のいずれかの細胞の凝集体を形成し、その後凝集体を形成する細胞を目的とする特定の細胞に分化誘導させる。または、多能性幹細胞を高密度で接着培養して、分化誘導させる。本開示において「胚様体」とは、かかる細胞の凝集体を意味する。本開示においては特に、内胚葉系の細胞に分化指向性を有する胚様体を「内胚葉性胚様体」、中胚葉系の細胞に分化指向性を有する胚様体を「中胚葉性胚様体」、外胚葉系の細胞に分化指向性を有する胚様体を「外胚葉性胚様体」と称する場合がある。
【００２５】
本開示において、「分化誘導細胞」は、多能性幹細胞から特定の種類の細胞に分化するように分化誘導処理された任意の細胞を意味する。分化誘導細胞は、心筋細胞や骨格筋芽細胞などの組織を構成する接着性の細胞および、血球細胞などの非接着性の細胞が含まれる。分化誘導細胞の非限定例は、心筋細胞、骨格筋芽細胞などの筋肉系の細胞、ニューロン細胞、オリゴデンドロサイト、ドーパミン産生細胞などの神経系の細胞、網膜色素上皮細胞などの網膜細胞、血球細胞、骨髄細胞などの造血系の細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞などの免疫関連の細胞、肝細胞、膵β細胞、腎細胞などの臓器を構成する細胞、軟骨細胞、生殖細胞などの他、これらの細胞に分化する前駆細胞や体性幹細胞などを含む。かかる前駆細胞や体性幹細胞の典型例としては、例えば心筋細胞における間葉系幹細胞、多分化性心臓前駆細胞、単能性心臓前駆細胞、神経系の細胞における神経幹細胞、造血系の細胞や免疫関連の細胞における造血幹細胞およびリンパ系幹細胞などが挙げられる。多能性幹細胞の分化誘導は、既知の任意の手法を用いて行うことができる。例えば、多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導は、Miki et al., Cell Stem Cell 16, 699-711, June 4, 2015やＷＯ２０１４／１８５３５８、Shugo Tohyama et al., Stem Cell Report, 9, 1?9, Nov 14, 2017に記載の手法に基づいて行うことができる。
【００２６】
本開示において、「分化指向性」は、多能性幹細胞が特定の分化誘導細胞に分化しやすい性質を意味し、特定の分化誘導細胞への分化指向性が高いほど、当該分化誘導細胞になりやすいことを意味する。したがって特定の細胞への分化指向性が高い多能性幹細胞株は、分化指向性が高くない多能性幹細胞株と比較して、当該特定の細胞への分化誘導方法により分化誘導を行った場合、同一の分化誘導方法であってもより多くの分化誘導細胞を得られることが期待される。
【００２７】
本開示において、「心筋細胞」とは、心筋細胞の特徴を有する細胞を意味する。心筋細胞の特徴としては、限定されずに、例えば、心筋細胞マーカーの発現、自律的拍動の存在などが挙げられる。心筋細胞マーカーの非限定例としては、例えば、ｃ−ＴＮＴ（cardiac troponin T）、ＣＤ１７２ａ（別名ＳＩＲＰＡまたはＳＨＰＳ−１）、ＫＤＲ（別名ＣＤ３０９、ＦＬＫ１またはＶＥＧＦＲ２）、ＰＤＧＦＲＡ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＶＣＡＭなどが挙げられる。一態様において、多能性幹細胞由来の心筋細胞は、ｃ−ＴＮＴ陽性かつ／またはＣＤ１７２ａ陽性である。
【００２８】
本開示の一側面は、特定の分化誘導細胞への分化指向性を評価するための分化指向性マーカーを決定する方法に関する。本開示において「分化指向性マーカー」または「分化指向性マーカー遺伝子」は、多能性幹細胞に発現しているマーカー（遺伝子）であって、発現量の多寡により該多能性幹細胞の分化指向性を評価することが可能なものを意味する。例えば本発明者らにより分化指向性マーカーであることが確認されたＰＦ４の場合、ある多能性幹細胞においてＰＦ４の発現量が標準的な多能性幹細胞より多い場合に、当該多能性幹細胞は心筋細胞への分化指向性が高いと評価される。本開示において「標準的な発現量」とは、これに限定するものではないが、例えば複数の多能性幹細胞株における遺伝子の発現量の平均値などが挙げられる。発現量の平均値としては、例えば無作為抽出された所定の個数（例えば５個、１０個、１５個など）の多能性幹細胞株における計測対象遺伝子の発現量の平均値などであってよい。
【００２９】
本開示の分化指向性マーカーの決定方法は、以下の工程を含む：
（１）複数の多能性幹細胞株における遺伝子発現量を測定すること；
（２）前記複数の多能性幹細胞株におけるｍｉＲＮＡの発現量を測定すること；
（３）特定の分化誘導細胞への分化指向性の高い多能性幹細胞株と低い多能性幹細胞株との間に有意に発現量に差異のある遺伝子を抽出すること；
（４）前記特定の分化誘導細胞への分化指向性の高い多能性幹細胞株と低い多能性幹細胞株との間に有意に発現量に差異のあるｍｉＲＮＡを抽出すること；および
（５）（３）で抽出された遺伝子から（４）で抽出されたｍｉＲＮＡと関与する遺伝子を選択すること。
【００３０】
工程（１）において、複数の多能性幹細胞株における遺伝子の発現量を、それぞれ定量的に測定する。かかる遺伝子発現量の測定は、網羅的に行われてよい。複数の多能性幹細胞株は、特定の分化誘導細胞への分化指向性が高いことが知られている少なくとも１種の多能性幹細胞株と前記特定の分化誘導細胞への分化指向性が低いことが知られている少なくとも１種の多能性幹細胞株とを含む。特定の分化誘導細胞への分化指向性は、当該技術分野において既知の方法や本開示に記載の方法などを用いて同定することができる。遺伝子の発現量の測定は、当該技術分野において既知の方法、例えばリアルタイムＰＣＲ法、マイクロアレイ法、ハイスループットシークエンシング法などを用いて行うことができる。
【００３１】
工程（２）において、複数の多能性幹細胞株におけるｍｉＲＮＡの発現量を、それぞれ定量的に測定する。かかる複数の多能性幹細胞株は、工程（１）において遺伝子の発現量を測定された複数の多能性幹細胞株と同一の多能性幹細胞株である。ｍｉＲＮＡの発現量の測定は、当該技術分野において既知の方法、例えばリアルタイムＰＣＲ法、マイクロアレイ法、ハイスループットシークエンシング法などを用いて行うことができる。
【００３２】
工程（３）において、特定の分化誘導細胞への分化指向性の高い多能性幹細胞株と低い多能性幹細胞株との間に有意に発現量に差異のある遺伝子を抽出する。例えば、分化指向性の高い多能性幹細胞株と分化指向性の低い多能性幹細胞株とを比較して、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、５倍以上、１０倍以上などの発現量の差がある遺伝子を抽出してよい。かかる発現量は、どちらの多能性幹細胞株で高くてもよく、例えば分化指向性の高い多能性幹細胞株において高発現していてもよいし、分化指向性の低い多能性幹細胞株において高発現していてもよい。好ましい一態様において、分化指向性の高い多能性幹細胞株において有意に高発現している遺伝子が抽出される。別の好ましい一態様において、分化指向性の低い多能性幹細胞株において有意に高発現している遺伝子が抽出される。
【００３３】
工程（４）において、特定の分化誘導細胞への分化指向性の高い多能性幹細胞株と低い多能性幹細胞株との間に有意に発現量に差異のあるｍｉＲＮＡを抽出する。例えば、分化指向性の高い多能性幹細胞株と分化指向性の低い多能性幹細胞株とを比較して、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、５倍以上、１０倍以上などの発現量の差があるｍｉＲＮＡを抽出してよい。かかる発現量は、どちらの多能性幹細胞株で高くてもよく、例えば分化指向性の高い多能性幹細胞株において高発現していてもよいし、分化指向性の低い多能性幹細胞株において高発現していてもよい。好ましい一態様において、分化指向性の高い多能性幹細胞株において有意に高発現しているｍｉＲＮＡが抽出される。別の好ましい一態様において、分化指向性の低い多能性幹細胞株において有意に高発現しているｍｉＲＮＡが抽出される。
【００３４】
工程（５）において、工程（３）で抽出された遺伝子の中から工程（４）で抽出されたｍｉＲＮＡと関与する遺伝子が選択される。あるｍｉＲＮＡと関与する遺伝子を同定する方法としては、当該技術分野において既知の方法を用いてよく、かかる方法としては、例えばパスウェイ解析法、ｍｉＲＮＡの標的遺伝子のデーターベース（TargetScan）などが挙げられる。本工程により、ｍｉＲＮＡの発現における有意差に起因して発現量に有意差が生じている遺伝子が選択されることになる。
【００３５】
本開示の別の一側面は、特定の分化誘導細胞への分化指向性を指標化する方法に関する。本開示の指標化方法は以下の工程を含む：
（ａ）対象の多能性幹細胞における少なくとも１種の分化指向性マーカー遺伝子、例えばミトコンドリア関連遺伝子、ＷＮＴシグナル伝達調節因子、ＴＧＦβシグナル伝達調節因子、各胚葉の関連遺伝子および未分化細胞関連遺伝子など、の発現量を計測すること
（ｂ）（ａ）で測定した分化指向性マーカー遺伝子の発現量を基準と比較すること。
【００３６】
「各胚葉の関連遺伝子」は、分化誘導細胞が由来する胚葉の関連遺伝子を意味し、例えば分化誘導細胞が心筋細胞であれば中胚葉関連遺伝子、神経系の細胞であれば外胚葉関連遺伝子、消化管の細胞であれば内胚葉関連遺伝子を意味する。
遺伝子の発現量を計測する工程においては、さらに特定の分化誘導細胞に関連する遺伝子の発現量を計測してもよい。例えば分化誘導細胞が心筋細胞であれば心筋細胞関連遺伝子をさらに計測してよい。
【００３７】
以下に分化誘導細胞が心筋細胞である場合を例として、本発明を詳述する。
＜１＞本開示の指標化方法
本開示の一側面は、特定の分化誘導細胞、特に心筋細胞への分化指向性を指標化する方法に関する。本開示の指標化方法は以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む：
（ａ）対象の多能性幹細胞におけるミトコンドリア関連遺伝子、ＷＮＴシグナル伝達調節因子、ＴＧＦβシグナル伝達調節因子、中胚葉関連遺伝子、心筋細胞関連遺伝子および未分化細胞関連遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の分化指向性マーカー遺伝子の発現量を計測すること
（ｂ）（ａ）で測定した遺伝子の発現量を基準と比較すること。
【００３８】
工程（ａ）において、多能性幹細胞における分化指向性マーカー遺伝子の発現量を計測する。遺伝子の発現量の計測は、当該技術分野において知られた通常の方法を用いて行うことができる。かかる方法としては、これに限定するものではないが、例えばリアルタイムＰＣＲ法、マイクロアレイ法、ハイスループットシークエンシング法などが挙げられる。
【００３９】
発現量が計測される分化指向性マーカー遺伝子は、ミトコンドリア関連遺伝子、ＷＮＴシグナル伝達調節因子、ＴＧＦβシグナル伝達調節因子、中胚葉関連遺伝子、心筋細胞関連遺伝子および未分化細胞関連遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である。
ミトコンドリア関連遺伝子としては、これに限定するものではないが、例えばＣＨＣＨＤ２、ＳＦＸＮ３、ＣＲＥＢ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ、ＣＡＭＫ４、ＰＰＰ３ＣＡ、ＭＹＥＦ２、ＰＰＲＣ１、ＰＫＡ、ＮＲＦ１、ＧＡＢＰＡ、ＧＡＢＰＢ２、ＥＳＲＲＡ、ＴＦＢ２Ｍ、ＴＦＢ１Ｍ、ＴＦＡＭ、ＰＯＬＲＭＴまたはＭＴＥＲＦなどが挙げられる。したがって一態様において、工程（ａ）において、ＣＨＣＨＤ２、ＳＦＸＮ３、ＣＲＥＢ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＰＰＡＲＧＣ１Ｂ、ＣＡＭＫ４、ＰＰＰ３ＣＡ、ＭＹＥＦ２、ＰＰＲＣ１、ＰＫＡ、ＮＲＦ１、ＧＡＢＰＡ、ＧＡＢＰＢ２、ＥＳＲＲＡ、ＴＦＢ２Ｍ、ＴＦＢ１Ｍ、ＴＦＡＭ、ＰＯＬＲＭＴおよびＭＴＥＲＦからなる群から選択される少なくとも１種のミトコンドリア関連遺伝子の発現量が計測される。好ましい一態様において、ミトコンドリア関連遺伝子として、ＣＨＣＨＤ２および／またはＳＦＸＮ３の発現量が計測される。
【００４０】
ＷＮＴシグナル伝達調節因子としては、これに限定するものではないが、例えば下表に記載のものなどが挙げられる。
【表１】
2019078342.tif 000002
特に好ましいＷＮＴシグナル伝達調節因子としては、ＰＦ４、ＴＭＥＭ６４、ＫＤＭ６Ａ、ＡＰＣ、βカテニン、Ａｘｉｎ、ＣＫ１、Ｄｓｈ、ＧＳＫ−３β、Ｄｋｋ、ＷＩＦ、ＦＲＰ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＴＣＦ、Ｋｒｎ、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ３、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６などが挙げられる。したがって一態様において、工程（ａ）において、ＰＦ４、ＴＭＥＭ６４、ＫＤＭ６Ａ、ＡＰＣ、βカテニン、Ａｘｉｎ、ＣＫ１、Ｄｓｈ、ＧＳＫ−３β、Ｄｋｋ、ＷＩＦ、ＦＲＰ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＴＣＦ、Ｋｒｎ、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ３、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６からなる群から選択される少なくとも１種のＷＮＴシグナル伝達調節因子の発現量が計測される。好ましい一態様において、ＷＮＴシグナル伝達調節因子としてＰＦ４またはＴＭＥＭ６４の発現量が、より好ましい一態様においてＰＦ４の発現量が計測される。
【００４１】
ＴＧＦβシグナル伝達調節因子としては、これに限定するものではないが、例えば下表に記載のものなどが挙げられる。
【表２】
2019078342.tif 000003
特に好ましいＴＧＦβシグナル伝達調節因子としては、ＳＫＩＬ、ＴＨＢＳ１、ＣＤ３、ＴＬＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＭＡＤ９、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＲＯＣＫ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８Ｂ、ＢＭＰＲ１ＡまたはＢＭＰＲ１Ｂなどが挙げられる。したがって一態様において、工程（ａ）において、ＳＫＩＬ、ＴＨＢＳ１、ＣＤ３、ＴＬＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＭＡＤ９、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＲＯＣＫ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８Ｂ、ＢＭＰＲ１ＡおよびＢＭＰＲ１Ｂからなる群から選択される少なくとも１種のＴＧＦβシグナル伝達調節因子の発現量が計測される。好ましい一態様において、ＴＧＦβシグナル伝達調節因子として、ＳＫＩＬの発現量が計測される。
【００４２】
中胚葉遺伝子としては、これに限定するものではないが、例えば、ＦＬＫ１、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、ＰＤＧＦＲ−ａ、ＩＧＦ２、ＣＤ３４、ＣＬＬ１、ＨＨＥＸ，ＩＮＨＢＡ，ＬＥＦ１、ＳＲＦ、Ｔ、ＴＷＩＳＴ１、ＡＤＩＰＯＱ、ＭＭＥ、ＫＩＴ、ＩＴＧＡＬ、Ｔｂｘ１、Ｇａｔａ１、Ｋｌｆ１、Ｃｓｆ１ｒ、ＣＤ４５またはＴｅｒ１１９などが挙げられる。したがって一態様において、工程（ａ）において、ＦＬＫ１、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、ＰＤＧＦＲ−ａ、ＩＧＦ２、ＣＤ３４、ＣＬＬ１、ＨＨＥＸ，ＩＮＨＢＡ，ＬＥＦ１、ＳＲＦ、Ｔ、ＴＷＩＳＴ１、ＡＤＩＰＯＱ、ＭＭＥ、ＫＩＴ、ＩＴＧＡＬ、Ｔｂｘ１、Ｇａｔａ１、Ｋｌｆ１、Ｃｓｆ１ｒ、ＣＤ４５およびＴｅｒ１１９からなる群から選択される少なくとも１種の中胚葉遺伝子の発現量が計測される。好ましい一態様において、中胚葉遺伝子として、ＦＬＫ１、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤおよび／またはＰＤＧＦＲ−ａの発現量が計測される。
【００４３】
心筋細胞関連遺伝子としては、これに限定するものではないが、例えば、ＴＮＴ２、ＭＹＬ２、ＧＡＴＡ４、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、Ｎｋｘ２．５、ＳＣＮ５Ａ、ＲＹＲ２、ＰＰＡＲＧＣ１、ＭＹＬ２、ＨＣＮ４、ＣＡＣＮａ１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ２、Ａｃｔｃ１、Ｃｘ４３、ＴＥＦ−１またはＴｂｘ−５などが挙げられる。したがって一態様において、工程（ａ）において、ＴＮＴ２、ＭＹＬ２、ＧＡＴＡ４、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、Ｎｋｘ２．５、ＳＣＮ５Ａ、ＲＹＲ２、ＰＰＡＲＧＣ１、ＭＹＬ２、ＨＣＮ４、ＣＡＣＮａ１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ２、Ａｃｔｃ１、Ｃｘ４３、ＴＥＦ−１およびＴｂｘ−５からなる群から選択される少なくとも１種の心筋細胞関連遺伝子の発現量が計測される。好ましい一態様において、心筋細胞関連遺伝子として、ＴＮＴ２、ＭＹＬ２、ＧＡＴＡ４、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、Ｎｋｘ２．５、ＳＣＮ５Ａ、ＲＹＲ２、ＰＰＡＲＧＣ１、ＭＹＬ２、ＨＣＮ４、ＣＡＣＮａ１Ｃおよび／またはＡＴＰ２Ａ２の発現量が計測される。
【００４４】
未分化細胞関連遺伝子としては、これに限定するものではないが、例えば、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、ＴＲＡ−１−６０、ＳＳＥＡ−４、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘ１、ＥＲａｓ、Ｆｇｆ４、Ｅｓｇ１、Ｒｅｘ１、Ｚｆｐ２９６、ＵＴＦ１、ＧＤＦ３、Ｓａｌｌ４、Ｔｂｘ３、Ｔｃｆ３、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ｂ、Ｔｒａ−１−８１またはｍｉＲ−２９０クラスターのｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−３０２クラスターのｍｉＲＮＡなどが挙げられる。したがって一態様において、工程（ａ）において、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、ＴＲＡ−１−６０、ＳＳＥＡ−４、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘ１、ＥＲａｓ、Ｆｇｆ４、Ｅｓｇ１、Ｒｅｘ１、Ｚｆｐ２９６、ＵＴＦ１、ＧＤＦ３、Ｓａｌｌ４、Ｔｂｘ３、Ｔｃｆ３、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３Ｂ、Ｔｒａ−１−８１、ｍｉＲ−２９０クラスターのｍｉＲＮＡおよびｍｉＲ−３０２クラスターのｍｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種の未分化細胞関連遺伝子の発現量が計測される。好ましい一態様において、未分化細胞関連遺伝子として、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇおよび／またはＬｉｎ２８の発現量が計測される。
【００４５】
より好ましい一態様において、上述の遺伝子群から選択される少なくとも２種の遺伝子の発現量を計測する。すなわち、ＣＨＣＨＤ２、ＳＦＸＮ３、ＫＤＭ６Ａ、ＳＫＩＬ、ＦＬＫ１、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、ＰＤＧＦＲ−ａ、ＴＮＴ２、ＭＬ２、ＧＡＴＡ４、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、Ｎｋｘ２．５、ＳＣＮ５Ａ、ＲＹＲ２、ＰＰＡＲＧＣ１、ＭＹＬ２、ＨＣＮ４、ＣＡＣＮａ１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ２、Ｏｃｔ−４、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８から選択される少なくとも２種の遺伝子の発現量が計測される。
【００４６】
別の好ましい一態様において、分化指向性マーカー遺伝子として、ＰＦ４、ＣＨＣＨＤ２、ＡＭＭＥＣＲ１、ＡＰＩ５、ＢＣＯＲ、ＢＲＷＤ１、ＣＬＥＣ４Ｇ、ＧＬＩＰＲ１、ＨＥＬＢ、ＫＤＭ６Ａ、ＬＯＣ３８８７９６、ＮＫＴＲ、ＰＯＭＺＰ３、ＺＰ３、ＰＲＵＮＥ２、ＲＢＭＸ、ＲＣ３Ｈ１、ＳＫＩＬ、ＳＯＲＢＳ２およびＳＲＳＦ１１からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が計測される。
さらに別の好ましい一態様において、分化指向性マーカー遺伝子として、ＴＭＥＭ６４、ＡＣＴＮ３、ＬＯＣ２８４３７３、ＬＯＣ４４１６６６、ＰＬＣＢ１、ＳＹＮＰＲ、ＴＭＥＭ１６３、Ｕ２ＡＦ１Ｌ４、ＶＷＤＥ、ＺＮＦ２２９およびＺＮＦ３５４Ｃからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が計測される。
【００４７】
工程（ｂ）において、（ａ）で測定した遺伝子の発現量を基準と比較する。比較対象となる基準としては、これに限定するものではないが、例えば心筋細胞への分化指向性が低いことが既知の多能性幹細胞株における同一遺伝子の発現量、心筋細胞への分化指向性が低いことが既知の複数の多能性幹細胞株における同一遺伝子の発現量の平均値、心筋細胞への分化指向性が高いことが既知の多能性幹細胞株における同一遺伝子の発現量、心筋細胞への分化指向性が高いことが既知の複数の多能性幹細胞株における同一遺伝子の発現量の平均値、複数の多能性幹細胞株における同一遺伝子の発現量の平均値、中胚葉系列組織への分化指向性が低いことが既知の複数の多能性幹細胞株における同一遺伝子の発現量、中胚葉系列組織への分化指向性が高いことが既知の複数の多能性幹細胞株における同一遺伝子の発現量、内胚葉系列組織への分化指向性が低いことが既知の複数の多能性幹細胞株における同一遺伝子の発現量、内胚葉系列組織への分化指向性が高いことが既知の複数の多能性幹細胞株における同一遺伝子の発現量、外胚葉系列組織への分化指向性が高いことが既知の複数の多能性幹細胞株における同一遺伝子の発現量、外胚葉系列組織への分化指向性が低いことが既知の複数の多能性幹細胞株における同一遺伝子の発現量などが挙げられる。
【００４８】
これらの基準は、当該技術分野において既知の数値や予め測定および記録していた値を用いてもよいし、上記（ａ）の工程と併せて本開示の指標化方法を実施する時に測定してもよい。これらの基準と比較することにより対象多能性幹細胞株の分化指向性マーカーを指標化し、かかる指標に基づいて対象多能性幹細胞株が心筋細胞への分化指向性が高い株であるか否かを決定することができる。
（ａ）で測定した発現量と基準とを比較する場合、両値は同じ方法により測定された値であることが好ましいが、これに限定されない。異なる方法で測定された値である場合、直接的な比較が可能となるように値を変換してもよい。
【００４９】
本開示の一態様において、心筋細胞への分化指向性が低いことが既知の多能性幹細胞株における同一遺伝子の発現量または心筋細胞への分化指向性が低いことが既知の複数の多能性幹細胞株における同一遺伝子の発現量の平均値を基準として比較する。この場合、（ａ）で測定した発現量が基準値よりも有意に高い場合、対象の多能性幹細胞株が心筋細胞への分化指向性が高いと決定し得る。
【００５０】
本開示の別の一態様において、心筋細胞への分化指向性が高いことが既知の多能性幹細胞株における同一遺伝子の発現量または心筋細胞への分化指向性が高いことが既知の複数の多能性幹細胞株における同一遺伝子の発現量の平均値を基準として比較する。この場合、（ａ）で測定した発現量が基準値と同等であるか、またはそれよりも有意に高い場合、対象の多能性幹細胞株が心筋細胞への分化指向性が高いと決定し得る。本開示において「有意に」とは、統計学上意味のある差異であることを意味する。例えば、ある計測値がある統計量と比較して極端に乖離した数値を示す場合に「有意」であるとする。
【００５１】
本開示のさらに別の一態様において、複数の多能性幹細胞株における同一遺伝子の発現量の平均値を基準として比較する。この場合、（ａ）で測定した発現量が基準値よりも有意に高い場合、対象の多能性幹細胞株が心筋細胞への分化指向性が高いと決定し得る。
【００５２】
一態様において、分化指向性マーカー遺伝子として、ＰＦ４、ＣＨＣＨＤ２、ＡＭＭＥＣＲ１、ＡＰＩ５、ＢＣＯＲ、ＢＲＷＤ１、ＣＬＥＣ４Ｇ、ＧＬＩＰＲ１、ＨＥＬＢ、ＫＤＭ６Ａ、ＬＯＣ３８８７９６、ＮＫＴＲ、ＰＯＭＺＰ３、ＺＰ３、ＰＲＵＮＥ２、ＲＢＭＸ、ＲＣ３Ｈ１、ＳＫＩＬ、ＳＯＲＢＳ２およびＳＲＳＦ１１からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量を計測する。この場合、（ａ）で測定した発現量が基準値よりも有意に高い場合、対象の多能性幹細胞株が心筋細胞への分化指向性が高いと決定し得る。別の一態様において、分化指向性マーカー遺伝子として、ＴＭＥＭ６４、ＡＣＴＮ３、ＬＯＣ２８４３７３、ＬＯＣ４４１６６６、ＰＬＣＢ１、ＳＹＮＰＲ、ＴＭＥＭ１６３、Ｕ２ＡＦ１Ｌ４、ＶＷＤＥ、ＺＮＦ２２９およびＺＮＦ３５４Ｃからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量を計測する。この場合、（ａ）で測定した発現量が基準値よりも有意に低い場合、対象の多能性幹細胞株が心筋細胞への分化指向性が高いと決定し得る。
【００５３】
＜２＞本開示の多能性幹細胞
本発明者らにより、多能性幹細胞、とくに誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）において心筋細胞への分化指向性が高い細胞株が存在すること、およびかかる多能性幹細胞株の遺伝的特徴が初めて見いだされた。したがって本開示の一側面は、ミトコンドリア関連遺伝子、ＷＮＴシグナル伝達調節因子、ＴＧＦβシグナル伝達調節因子、中胚葉関連遺伝子、心筋細胞関連遺伝子および未分化細胞関連遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が高いことを特徴とする、心筋細胞への分化指向性が高い多能性幹細胞を包含する。
【００５４】
上述のとおり本発明者らは、心筋細胞への分化指向性の高い多能性幹細胞株において、ミトコンドリア関連遺伝子、ＷＮＴシグナル伝達調節因子、ＴＧＦβシグナル伝達調節因子、中胚葉関連遺伝子、心筋細胞関連遺伝子および未分化細胞関連遺伝子が高発現していることを見出した。
【００５５】
本開示において、「発現量が高い」または「高発現している」とは、ある遺伝子の発現量が所定の値よりも高いことを言う。かかる「所定の値」としては、典型的には、当該遺伝子の発現量の平均値などが挙げられる。発現量の平均値としては、例えば無作為抽出された所定の個数（例えば５個、１０個、１５個など）の多能性幹細胞株における計測対象遺伝子の発現量の平均値であってよい。
【００５６】
本開示の多能性幹細胞株において高発現している遺伝子としては、ミトコンドリア関連遺伝子、ＷＮＴシグナル伝達調節因子、ＴＧＦβシグナル伝達調節因子、中胚葉関連遺伝子、心筋細胞関連遺伝子および未分化細胞関連遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子の具体的な例としては、上記＜１＞において記載したものなどが挙げられる。
【００５７】
本開示の好ましい一態様において、多能性幹細胞がｉＰＳ細胞であり、より好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞は、ベースとする体細胞の由来やリプログラミング因子の種類および導入方法などにより、それぞれの細胞株の特性に違いが生じる可能性が指摘されており、したがって分化指向性も細胞株ごとに異なることが予測される。また、ｉＰＳ細胞を再生医療に用いる際のメリットとして、処置対象の自家細胞を用いて細胞株を樹立することが可能であることが挙げられる。したがって本発明によれば、対象の自家細胞から作製したｉＰＳ細胞から心筋細胞への分化指向性の高いものをスクリーニングして、新たな細胞株として樹立することも可能である。
【００５８】
多能性幹細胞から分化誘導細胞を調製する場合、未分化性が高いことが必要である。このことは、本開示の多能性幹細胞において未分化細胞関連遺伝子が高発現していることからも首肯される。すなわち、多能性幹細胞において未分化性が高いことは、所望の分化誘導細胞に分化させやすいと考えられる。本発明者らの試験により、心筋細胞への分化指向性そのものには、多能性幹細胞の未分化性は直接的には関係がないと考えられる結果が得られている。
【００５９】
＜３＞本開示の胚様体
本発明者らにより、心筋細胞への分化指向性が高い多能性幹細胞を培養して得られる胚様体もまた心筋細胞への分化指向性が高いことが見出された。したがって本開示の一側面は、少なくとも１種の中胚葉遺伝子の発現量が高く、少なくとも１種の内胚葉遺伝子および／または外胚葉遺伝子の発現量が低いことを特徴とする、心筋細胞への分化指向性が高い胚様体を包含する。
【００６０】
本開示の胚様体は、多能性幹細胞、好ましくは上記＜２＞に記載の多能性幹細胞を、当該技術分野において知られた方法で培養することにより得られる。具体的には例えば、ヒトｉＰＳ細胞をY27632（和光純薬）を含有するStemFit AK03培地（味の素）中で１日培養し、その後Y27632を含有しないStemFit AK03培地で２日間培養し、さらにその後ＢＭＰ４を含有する培養液中で培養することにより得られる。
【００６１】
本開示の胚様体は、少なくとも１種の中胚葉遺伝子を高発現している。中胚葉遺伝子の具体的な例としては、上記＜１＞において記載したものなどが挙げられる。本開示の胚様体はまた、少なくとも１種の内胚葉遺伝子および／または外胚葉遺伝子の発現量が低い。ここで、「発現量が低い」とは、上記「発現量が高い」と逆で、ある遺伝子の発現量が所定の値よりも低いことを言う。かかる「所定の値」としては、典型的には、当該遺伝子の発現量の平均値などが挙げられる。発現量の平均値としては、例えば無作為抽出された所定の個数（例えば５個、１０個、１５個など）の胚様体における計測対象遺伝子の発現量の平均値であってよい。
【００６２】
外胚葉遺伝子としては、これに限定するものではないが、例えば、ＳＯＸ１、ＰＡＸ６、またはＺＩＣ１などが挙げられる。内胚葉遺伝子としては、これに限定するものではないが、例えば、ＡＭＮ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ３またはＺＩＣ１などが挙げられる。
【００６３】
本開示の胚様体は、上述のとおり、少なくとも１種の中胚葉遺伝子の発現量が高く、少なくとも１種の内胚葉遺伝子および／または外胚葉遺伝子の発現量が低いという特徴を有し、これにより中胚葉由来の体細胞、特に心筋細胞に高い分化指向性を有するものである。かかる特徴は、心筋細胞に対して高い分化指向性を有する本開示の多能性幹細胞から作製される胚様体において、特に顕著に表れる。したがって好ましい一態様において、本開示の胚様体は、上記＜２＞に記載の本開示の多能性幹細胞から作製される。
【００６４】
＜４＞本開示の分化誘導方法
本発明者らは、心筋細胞への分化指向性が高い多能性幹細胞の遺伝的特徴を見出し、かかる特徴を有する多能性幹細胞を用いて心筋細胞を分化誘導することにより、高効率で心筋細胞を得ることができることを見出した。したがって、本開示は一側面において、多能性幹細胞から高効率で心筋細胞を分化誘導する方法を包含する。
【００６５】
本開示の分化誘導方法は、好ましい一態様において、本開示の多能性幹細胞または胚様体を用いる。かかる態様においては、分化誘導手法自体は当該技術分野において知られたいかなる手法を用いてもよい。多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する手法としては、様々なものが知られている（例えば、Burridge et al., Cell Stem Cell. 2012 Jan 6;10(1):16-28）が、いずれの方法においても、中胚葉誘導因子（例えば、アクチビンＡ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦなど）、心臓特異化（cardiac specification）因子（例えば、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、Ｗｎｔシグナルインヒビター（例えば、ＩＷＲ−１、ＩＷＰ−２、ＩＷＰ−３、ＩＷＰ−４等）、ＢＭＰシグナルインヒビター（例えば、ＮＯＧＧＩＮ等）、ＴＧＦβ／アクチビン／ＮＯＤＡＬシグナルインヒビター（例えば、SB431542等）、レチノイン酸シグナルインヒビターなど）および心臓分化因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＤＫＫ１など）を、順次作用させることにより誘導効率を高めることができる。一態様において、多能性幹細胞からの心筋細胞誘導処理は、ＢＭＰ４を作用させて形成した胚様体に、（１）ＢＭＰ４とｂＦＧＦとアクチビンＡとの組み合わせ、（２）ＶＥＧＦとＩＷＰ−３、および、（３）ＶＥＧＦとｂＦＧＦとの組み合わせを順次作用させることを含む。
【００６６】
ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞を得る公知の方法としては、例えば、以下のステップ：
（１）ヒトｉＰＳ細胞を、フィーダー細胞を含まない培養液で維持培養するステップ（フィーダーフリー法）、
（２）得られたｉＰＳ細胞から胚様体を形成するステップ、
（３）得られた胚様体をアクチビンＡ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）４および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有する培養液中で培養するステップ、
（４）得られた胚様体をＷｎｔ阻害剤、ＢＭＰ４阻害剤およびＴＧＦβ阻害剤を含む培養液中で培養するステップ、および
（５）得られた胚様体をＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む培養液中で培養するステップ
を含む方法が挙げられる。
【００６７】
（１）のステップにおいて、例えばＷＯ２０１７０３８５６２に記載のように、StemFit AK03（味の素）を培地として用い、iMatrix511（ニッピ）上でｉＰＳ細胞を培養して適応させ、維持培養を行うことができる。また、例えばNakagawa M.,et al.A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells.Sci Rep.2014;4:3594に記載のように、ｉＰＳ細胞を、７〜８日毎に、TrypLE（登録商標）Select（Thermo Fisher Scientific）を使用してシングルセルとして継代を行うことができる。上記（１）〜（５）のステップのあとに、任意で、（６）得られた心筋細胞を精製するステップを選択的に行ってもよい。心筋細胞の精製としては、グルコースフリー培地を用いて心筋細胞以外を減少させる方法やＷＯ２０１７／０３８５６２に記載のように熱処理を用いて未分化細胞を減少させる方法などが挙げられる。
【００６８】
本開示の一態様において、上記（１）のステップの前および／または後に、上記＜１＞に記載の本開示の指標化方法を実施するステップを含んでよい。また、（２）のステップの後に、得られた胚様体の遺伝子発現量を計測するステップを含んでもよい。さらに、計測した遺伝子発現量を基準値と比較するステップ、およびかかる比較の結果上記＜３＞に記載の胚様体であると判断された胚様体以外の胚様体を除外するステップを含んでもよい。かかる基準値としては、例えば上記＜２＞において「所定の値」として記載されたものなどが挙げられる。
【００６９】
上述のとおり、本発明者らにより、心筋細胞への分化指向性を有する多能性幹細胞においては、ミトコンドリア関連遺伝子、ＷＮＴシグナル伝達調節因子、ＴＧＦβシグナル伝達調節因子、中胚葉関連遺伝子、心筋細胞関連遺伝子および未分化細胞関連遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現量が、心筋細胞への分化指向性を有しない多能性幹細胞と比較して有意に差異があることが見出された。したがって上記（１）〜（５）の各ステップにおいて、これらの遺伝子の発現が亢進または低減するような処置を施すことにより、心筋細胞への分化を誘導し得る。このような処置の非限定的な例としては、例えばＷＮＴシグナル阻害剤、ＴＧＦβシグナル阻害剤の添加など、ＴＧＦβシグナルやＷＮＴシグナルの調節、MitoBlockの添加などによるミトコンドリアの活動の調節などが挙げられる。
【００７０】
したがって本開示の一側面において、分化指向性マーカーの発現量を亢進または低減するか、あるいは分化指向性マーカー遺伝子の発現産物であるタンパク質の作用を増強または低減させることを含む、多能性幹細胞の分化誘導方法にも関する。
【００７１】
分化指向性マーカーの発現量を亢進する方法としては、例えば分化指向性マーカー遺伝子のリプレッサーの阻害、分化指向性マーカー遺伝子のエンハンサーの添加などが挙げられる。分化指向性マーカーの発現量を低減させる方法としては、例えばリプレッサーの添加、ｓｉＲＮＡなどのアンチセンス核酸の導入などが挙げられる。
【００７２】
分化指向性マーカー遺伝子の発現産物であるタンパク質の作用を増強する方法としては、例えば当該発現産物タンパク質の培地への添加などが挙げられる。分化指向性マーカー遺伝子の発現産物であるタンパク質の作用を低減する方法としては、例えば当該タンパク質に対する阻害剤や阻害性抗体などの培地への添加などが挙げられる。
【００７３】
例えば心筋細胞への分化誘導の場合、有意に発現が増大している分化指向性マーカー発現産物、例えばＰＦ４、ＣＨＣＨＤ２、ＡＭＭＥＣＲ１、ＡＰＩ５、ＢＣＯＲ、ＢＲＷＤ１、ＣＬＥＣ４Ｇ、ＧＬＩＰＲ１、ＨＥＬＢ、ＫＤＭ６Ａ、ＬＯＣ３８８７９６、ＮＫＴＲ、ＰＯＭＺＰ３、ＺＰ３、ＰＲＵＮＥ２、ＲＢＭＸ、ＲＣ３Ｈ１、ＳＫＩＬ、ＳＯＲＢＳ２およびＳＲＳＦ１１などのタンパク質を含む培地で培養することにより、心筋細胞への分化誘導が促進されることが期待される。したがって本開示の分化誘導方法には、上述の有意に発現が増大している分化指向性マーカー発現産物、例えばＰＦ４、ＣＨＣＨＤ２、ＡＭＭＥＣＲ１、ＡＰＩ５、ＢＣＯＲ、ＢＲＷＤ１、ＣＬＥＣ４Ｇ、ＧＬＩＰＲ１、ＨＥＬＢ、ＫＤＭ６Ａ、ＬＯＣ３８８７９６、ＮＫＴＲ、ＰＯＭＺＰ３、ＺＰ３、ＰＲＵＮＥ２、ＲＢＭＸ、ＲＣ３Ｈ１、ＳＫＩＬ、ＳＯＲＢＳ２およびＳＲＳＦ１１などのタンパク質を含む培地を用いることを特徴とする、多能性幹細胞の培養方法も包含される。かかる培養方法は、特に多能性幹細胞を胚様体（特に中胚葉性胚様体）に分化させる段階における培養において用いることが好ましい。
【００７４】
本開示の分化誘導方法によれば、効率よく心筋細胞を得ることができる。本開示の分化誘導方法により得られる心筋細胞含有組成物中の心筋細胞含有率（純度）は、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約８６％超、約８７％超、約８８％超、約８９％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超などであり得る。一態様において、本開示における多能性幹細胞由来の心筋細胞は、心筋細胞の純度が９０％超の心筋細胞集団である。また別の一態様において、心筋細胞含有率は、例えば５０〜９９％であり。好ましくは５０％〜７０％であり、または７５〜９９％である。別の一態様において、本開示の誘導方法により得られる心筋細胞含有組成物は、未分化細胞の残存率が低いことを特徴とする。未分化細胞の残存率としては、例えば０．０１％〜５％、０．０１％〜４％、０．０１％〜３％、０．０１％〜２％、０．０１％〜１％、０．０１％〜１％などであり得る。
【００７５】
＜５＞本開示の医療用組成物
本開示の別の側面は、上記＜４＞に記載の方法により誘導された分化誘導細胞、例えば心筋細胞を含む医療用組成物を包含する。
本開示において「医療用組成物」とは、医療目的に用いられる組成物を意味し、これに限定するものではないが、例えば医薬用組成物、治療用組成物、移植用組成物などの、直接対象の処置に用いる組成物のほか、例えば薬剤スクリーニング用組成物など、薬剤開発などにおいて用いられる組成物も包含する。
【００７６】
本開示の分化誘導方法により誘導される心筋細胞を含む組成物は、心筋細胞含有率が高い組成物であり、医療上非常に有用であるといえる。例えば、本開示の分化誘導方法により誘導される心筋細胞を含む組成物を用いて移植用組成物を調製する場合、心筋細胞含有率が高いため、含有される心筋細胞量が多くなり、心臓への移植に好適な移植用組成物を調製することができる。したがって一態様において、本開示の医療用組成物は、移植用組成物である。かかる態様において、心筋細胞の含有率は、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約８６％超、約８７％超、約８８％超、約８９％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超などであってよい。一態様において、本開示における多能性幹細胞由来の心筋細胞は、心筋細胞の純度が９０％超の心筋細胞集団である。また別の一態様において、心筋細胞含有率は、例えば５０〜９９％であり、好ましくは５０％〜７０％であり、または７５〜９９％である。
【００７７】
近年重症心不全患者に対する心機能回復には細胞移植法が有用とされ、既に自己骨格筋芽細胞やｉＰＳ細胞由来心筋細胞による臨床応用・研究が開始されている。その一例として、組織工学を応用した温度応答性培養皿を用いることによって、成体の心筋以外の部分に由来する細胞を含む心臓に適用可能な三次元に構成された細胞培養物が開発されている。本開示の医療用組成物、特に移植用組成物もまた、かかる細胞培養物とすることができる。したがって好ましい一態様において、本開示の医療用組成物はシート状細胞培養物である。
【００７８】
本開示において、「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいう。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、１の細胞層から構成されるもの（単層）であっても、２以上の細胞層から構成されるもの（積層（多層）体、例えば、２層、３層、４層、５層、６層など）であってもよい。
【００７９】
シート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、シート状細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本開示におけるシート状細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができるものであってもよい。また、シート状細胞培養物は、好ましくは、細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。
【００８０】
シート状細胞培養物を構成する細胞は、シート状細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどが含まれる。一態様において、シート状細胞培養物を構成する細胞はヒト細胞である。
【００８１】
シート状細胞培養物を形成する細胞は、異種由来細胞であっても同種由来細胞であってもよい。ここで「異種由来細胞」は、シート状細胞培養物が移植に用いられる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、サルやブタに由来する細胞などが異種由来細胞に該当する。また、「同種由来細胞」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト細胞が同種由来細胞に該当する。同種由来細胞は、自己由来細胞（自己細胞または自家細胞ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する細胞と、同種非自己由来細胞（他家細胞ともいう）を含む。自己由来細胞は、移植しても拒絶反応が生じないため、本開示においては好ましい。しかしながら、異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用する場合は、拒絶反応を抑制するため、免疫抑制処置が必要となることがある。なお、本明細書中で、自己由来細胞以外の細胞、すなわち、異種由来細胞と同種非自己由来細胞を非自己由来細胞と総称することもある。本開示の一態様において、細胞は自家細胞または他家細胞である。本開示の一態様において、細胞は自家細胞である。本開示の別の態様において、細胞は他家細胞である。
【００８２】
自家または他家多能性幹細胞は、限定されずに、例えば、採取した自家または他家体細胞（例えば、皮膚細胞（線維芽細胞、ケラチノサイト等）や血球（末梢血単核球等）など）に、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣ等の遺伝子を導入するなどして自家または他家ｉＰＳ細胞を誘導することにより得ることができる。体細胞からｉＰＳ細胞を誘導する方法は当該技術分野において周知である（例えば、Bayart and Cohen-Haguenauer, Curr Gene Ther. 2013 Apr;13(2):73-92など参照）。
【００８３】
本開示の医療用組成物やシート状細胞培養物は、上述のとおり心筋細胞を高度に含有しているため、かかる組成物やシート状細胞培養物を用いることにより、心筋細胞に対して作用する薬剤の効果を効果的に試験することができる。したがって本開示の別の一態様において、本開示の医療用組成物は、薬剤スクリーニング用組成物である。とくに本開示の組成物は、特定の対象由来の心筋細胞を調製することが可能であるため、かかる特定の対象に対して有効に作用する薬剤をスクリーニングすることが可能となる。
【００８４】
＜６＞本開示の品質管理方法
本開示の医療用組成物の調製において、効率よく高純度の心筋細胞含有組成物を得ることは、医療用組成物の品質を高めることにつながるものである。しかしながら通常は、多能性幹細胞から最終的に心筋細胞まで分化誘導して見なければどの程度の心筋細胞が含有されているか予測することは困難である。
【００８５】
しかしながら本開示の多能性幹細胞または胚様体を用いて分化誘導することにより、心筋細胞含有率の高い組成物を容易に得ることができる。すなわち多能性幹細胞から胚様体を形成するまで培養した段階で、胚様体における中胚葉遺伝子、内胚葉遺伝子および／または外胚葉遺伝子の発現量を計測することにより、かかる胚様体が心筋細胞に対して分化指向性を有するものであるかを試験することが可能である。したがって本開示の一側面は、多能性幹細胞を培養して得られる胚様体における中胚葉遺伝子、内胚葉遺伝子および／または外胚葉遺伝子の発現量を計測することを含む、多能性幹細胞から分化誘導された心筋細胞を含む医療用組成物の品質管理方法、およびかかる品質管理方法を工程として含む医療用組成物の製造方法も包含する。
【００８６】
本方法における中胚葉遺伝子、内胚葉遺伝子および外胚葉遺伝子の具体的な例としては、上記＜３＞において記載したものなどが挙げられる。これらの遺伝子の発現量の測定には、当該技術分野において公知の任意の方法を用いることができる。
一態様において、本側面の方法は、さらに、計測した遺伝子発現量を基準値と比較すること、およびかかる比較の結果上記＜３＞に記載の胚様体であると判断された胚様体以外の胚様体を除外することを含んでもよい。基準値としては、典型的には、当該遺伝子の発現量の平均値、などが挙げられる。発現量の平均値としては、例えば無作為抽出された所定の個数（例えば５個、１０個、１５個など）の胚様体における計測対象遺伝子の発現量の平均値であってよい。
【００８７】
また、胚様体形成の段階で、その後の分化効率の高い胚様体を選抜してもよい。例えば形成された胚様体の大きさ、凝集の仕方など、胚様体の形態的特徴に基づいて分化効率の高い胚様体を選抜してもよい。
【００８８】
本開示の医療用組成物の製造方法は、以下の工程を含む：
（Ａ）多能性幹細胞を分化誘導および培養して、胚様体を形成する工程、
（Ｂ）得られた胚様体における中胚葉遺伝子、内胚葉遺伝子および／または外胚葉遺伝子の発現量を計測し、かかる計測値と基準値とを比較することを含む、心筋細胞への分化指向性の高い胚様体を選抜する工程、
（Ｃ）選抜された胚様体を分化誘導および培養して、心筋細胞を含む細胞集団を得る工程。
【００８９】
工程（Ａ）において、多能性幹細胞から胚様体を形成する。胚様体形成には、当該技術分野において知られた手法を用いることができ、具体的には例えば上記＜３＞において記載された手法を用いることができる。用い得る多能性幹細胞は、特に限定されないが、医療用組成物による処置対象（例えばヒト）と同種細胞であることが好ましい。また医療用組成物を移植などに用いる場合は、自家ｉＰＳ細胞など、自家細胞から調製された多能性幹細胞が好ましい。また工程（Ａ）の前に、用いる多能性幹細胞を、本開示の方法によりスクリーニングする工程をさらに含んでもよい。
【００９０】
工程（Ｂ）において、心筋細胞への分化指向性の高い胚様体が選抜される。心筋細胞への分化指向性の高い胚様体の例は、上記＜３＞において記載されたとおりである。本工程においては、特に中胚葉遺伝子の発現量が高く、外胚葉遺伝子および／または内胚葉遺伝子の発現量が低い胚様体が選抜される。外胚葉遺伝子、内胚葉遺伝子、中胚葉遺伝子の具体例および基準値については、＜３＞において記載したものであってよい。
【００９１】
工程（Ｃ）において、工程（Ｂ）で選抜された胚様体を分化誘導して心筋細胞を含む医療用組成物を得る。胚様体からの分化誘導には、当該技術分野において公知の方法を用いることができ、具体的には例えば上記＜４＞において記載した方法などを用いてよい。
【００９２】
工程（Ｃ）の後に、任意に医療用組成物を改変する工程をさらに含んでよい。かかる工程としては、例えばシート状細胞培養物を形成するためのシート化工程、医療用組成物を凍結保存する工程などが挙げられる。
【実施例】
【００９３】
本開示を以下の例を参照してより詳細に説明するが、これらは本開示の特定の具体例を示すものであり、本開示はこれらに限定されるものではない。【００９４】
例１．心筋細胞への分化指向性の高いｉＰＳ細胞株の特定
心筋細胞への分化指向性の高いｉＰＳ細胞の遺伝的特徴を調べるため、まずは心筋細胞への分化指向性の高いｉＰＳ細胞株の特定を試みた。
（１）分化誘導
ｉＰＳ細胞株として表５に記載の１０種の細胞を用いた。２０１Ｂ７、２５３Ｇ１、４０９Ｂ２、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１Ａ、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−２ＡおよびＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１２Ａは理研バイオリソースセンターより入手した。ＡＴＣＣ−ＤＹＲ０１００およびＡＴＣＣ−ＨＹＲ０１０３はATCCより入手した。ｍｃ−ｉＰＳはSystem Biosciencesより入手した。Ｔｉｃは医薬基盤研究所より入手した。分化誘導直前のヒトｉＰＳ細胞株のＴｏｔａｌ  ＲＮＡはmiRNeasy Mini Kit（QIAGEN）を用いて、プロコールに従い抽出した。ＲＴ−ＰＣＲにはSuperScriptＴＭ VILO（Invitrogen）を用い、ｃＤＮＡを合成した。表４に記載したSYBR Green用PCRプライマーおよびSYBR Green PCRマスターミックス（Applied Biosystems）またはTaqman probeとTaqman Gene Expression Master Mix（Applied Biosystems）を用いて、ViiA 7 Real-Time PCR System（Applied Biosystems）でＰＣＲを実施した。遺伝子発現の解析にはハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨを用いた。ViiA 7 Sysytemを用いて遺伝子発現解析を行った。TaqMan Gene Expression Assaysでは温度サイクリング条件としてホールド：９５℃で２０秒、サイクル：９５℃で１秒、６０℃で２０秒、で行った。SYBR Greenの温度サイクリング条件はホールド：９５℃で２０秒、サイクル：９５℃で１秒、６０℃で２０秒を４０サイクル、および９５℃で１５秒、６０℃で１分、９５℃で１５秒で行った。
【表３】
2019078342.tif 000004
【表４】
2019078342.tif 000005
【表５】
2019078342.tif 000006
これらのｉＰＳ細胞株を、Matsuura, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 425 (2012) 321?327、Miki K. Cell Stem Cell (2015)、ＷＯ２０１４／１８５３５８Ａ１およびＷＯ２０１７／０３８５６２などに記載の方法を参考に、心筋細胞まで分化誘導した。具体的には、Primate ES培地（ReproCell）に５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したものを未分化維持培地として用い、フィーダー細胞であるマイトマイシンＣ処理済みのMEF（ReproCell）上で未分化ヒトｉＰＳ細胞を培養して、３−４日に１回継代を行った。分化誘導はヒトｉＰＳ細胞をDissociation solution（ReproCell）およびAccumax（イノベーションセルテクノロジーズ）で解離して、０．５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−４と１０μＭのY27632（Ｒｏｃｋ阻害剤）を添加したStemPro34（ライフテクノロジーズ）で懸濁し、EZSPHERE（IWAKI）で１日培養して集塊を形成させた。得られた胚様体をアクチビンＡ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）４および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有する培養液中で培養し、さらにＷｎｔ阻害剤（ＩＷＲ１）を含む培養液中で培養し、その後ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む培養液中で培養を行った。図１は培養中のｉＰＳ細胞の写真図である。【００９５】
（２）分化誘導指向性の順位付け
各ｉＰＳ細胞株から分化誘導された心筋細胞含有胚様体におけるトロポニン陽性率および拍動率、心筋細胞関連遺伝子発現量を計測し、各ｉＰＳ細胞株の心筋細胞への分化指向性の順位付けを行った。
トロポニン陽性率は、胚様体をTrypLE Selectを用いて分散後、分散した細胞をBD Cytofix/Cytoperm（登録商標）Fixation/Permeabilization Solution Kit（BD Bioscience)を用いて固定、透過処理した後、抗ヒトトロポニン抗体（Thermo Fisher Scientific）、標識２次抗体（Thermo Fisher Scientific）を順次反応させた後、フローサイトメーターにより測定を行って算出した。【００９６】
拍動率は、各ｉＰＳ細胞株から心筋細胞へ分化誘導後の胚葉体をセルモーションイメージング（Sony）で動画撮影して、観察されたすべての胚葉体のうち、拍動している胚葉体をカウントして算出した。【００９７】
結果を図２および図３に示す。２０１Ｂ７、２５３Ｇ１および４０９Ｂ２の３細胞株において特に高いトロポニン陽性率および拍動率が算出された。したがって、これら３種の細胞株を、心筋細胞への分化指向性が高い細胞株であると特定した。【００９８】
（３）未分化細胞の残存率
上記（２）で心筋細胞への分化指向性が高い細胞株であると特定された３細胞株から調製された心筋細胞培養物における未分化細胞の残存率を、未分化細胞マーカーであるＬｉｎ２８を発現する細胞数の割合として、定量ＰＣＲで測定した。
結果を図４に示す。心筋細胞への分化指向性が高いと特定された３細胞株においては、他の細胞株に比べて顕著に未分化細胞の残存率が低くなる傾向があった。【００９９】
例２．胚様体における遺伝子発現
次に上記例１における培養４日目の時点の各胚様体における、ＳＯＸ２、ＰＡＸ６、ＺＩＣ１、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＦＬＫ１、ＰＤＧＦＲ−ａ、ＧＯＯＳＥＣＯＩＤ、ＨＮＦ３、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＡＭＮの１１種類の遺伝子の発現を計測した。【０１００】
結果を図５に示す。心筋細胞への分化指向性の高い細胞株である２０１Ｂ７、２５３Ｇ１および４０９Ｂ２の３細胞株ではいずれも中胚葉遺伝子が多く発現しており、内胚葉遺伝子および外胚葉遺伝子の発現量は低かった。各遺伝子に対して、発現量と各細胞株の分化誘導後のトロポニンＴ陽性率とのピアソンの相関係数を算出したところ、下表のとおりとなった。
【表６】
2019078342.tif 000007
【０１０１】
例３．各細胞株における主成分解析
ｉＰＳ細胞株をそれぞれを、RNeasy Kit（QIAGEN）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。各ＲＮＡの品質評価はAgilent RNA 6000 Nano Assay（Agilent Technologies）を用いて、２８Ｓと１８ＳのｒＲＮＡ比率を算出することにより純度を確認した。抽出したＲＮＡサンプルは−８０℃で冷凍保存した。ＲＮＡサンプルのビオチンラベル化ｃＲＮＡ合成は、GeneChip 3’ IVT Express kit（Affymetrix）を用いて、製品プロトコールに従い行った。【０１０２】
まず、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡからＴ７プロモーター配列を含む２本鎖ｃＤＮＡ合成を行い、in vitro逆転写反応によりｃＤＮＡを鋳型としたビオチンラベルされたａＲＮＡを合成した。次いでハンマーヘッド反応を利用したカルシウムランダム分解により、〜１００−１２０ｎｔのａＲＮＡ断片を作製した。GeneChip Hybridization Oven（Affymetrix）を用いて、Genechip アレイ Human Genome U133 Plus 2.0 Array（Affymetrix）に作製したビオチンラベル化ａＲＮＡをハイブリダイズさせた。ハイブリダイズ後、GeneChip Wash and Stain Kit（Affymetrix）とGeneChip Fluidics Station 450（Affymetrix）を用いて洗浄とフィコエリスリン染色を行った。その後、GeneChip Scanner 3000 7G（Affymetrix）を用いてGenechipアレイの蛍光画像をスキャンし、イメージ画像を取得した。得られた蛍光強度のデータはExpression Console Ver.1.1（Affymetrix）を用いて解析した。シグナルのノーマライズはMAS5アルゴリズム、およびMSKファイル（Affymetrix）を用いて行った。【０１０３】
心筋細胞への分化指向性の高い細胞株として２０１Ｂ７、２５３Ｇ１および４０９Ｂ２を用い、心筋細胞への分化指向性の低い細胞株としてＲＩＫＥＮ−１Ａ、ＲＩＫＥＮ−２Ａ、ＲＩＫＥＮ−１２Ａを用いて、心筋細胞への分化指向性の高い細胞株において特徴的に発現する遺伝子を解析した。【０１０４】
（１）心筋関連遺伝子発現比較
各細胞株を例１と同様に心筋細胞まで分化させ、心筋関連遺伝子の発現量を比較した。結果を図６および図７に示す。
心筋細胞への分化指向性の高い３細胞株から分化誘導された細胞培養物においては、いずれも高い心筋関連遺伝子の発現が確認された。また、トロポニン陽性率についても心筋細胞への分化指向性の高い３細胞株の方が有意に高かった。【０１０５】
（２）マイクロアレイ解析
次に心筋細胞への分化指向性の高い３細胞株と、低い３細胞株との間での遺伝子発現量の違いを、Affymetrix GeneChip(R) Arraysを用いたマイクロアレイ解析を行った。
Affymetrix GeneChip(R) Arraysで解析可能な３３００遺伝子のうち、分化指向性の高い群と分化指向性の低い群とで比較して、分化指向性の高い群において２倍以上の発現量を示した８４遺伝子を特定し、その遺伝子群がどのシグナル伝達経路に関連する遺伝子であるかを解析した。結果を下表に示す。
【表７】
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【０１０６】
（３）マーカー候補遺伝子の絞り込み
上記８４遺伝子の中でも特に顕著な発現量の差を示した遺伝子について、バイオマーカー候補遺伝子として特定した。これによりミトコンドリア関連遺伝子ＣＨＣＨＤ２およびＳＦＸＮ３、ＷＮＴシグナル調節因子ＫＤＭ６Ａ、ＴＧＦ−βシグナル関連因子ＳＫＩＬなどがバイオマーカー遺伝子候補として特定された。また、逆に心筋細胞への分化指向性の低い細胞株において顕著に高い発現を示した遺伝子として、ｍｉＲＮＡ−１３９およびｍｉＲＮＡ−２０４が特定された。【０１０７】
例４：ｍｉＲＮＡ発現解析
（１）ｍｉＲＮＡマイクロアレイ
各ｉＰＳ細胞株それぞれから、miRNeasy mini kit（QIAGEN）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。低分子量ＲＮＡを含むＴｏｔａｌ  ＲＮＡからFlashTag Biotin HSR RNA labelling kit (Affymetrix）を用いて、製品プロトコールに従い、ビオチンラベル化ＲＮＡの作製を行った。GeneChip Hybridization Oven（Affymetrix）を用いて、miRNA 3.0 array（Affymetrix）に作製したビオチンラベル化ＲＮＡをハイブリダイズさせた。ハイブリダイズ後、GeneChip Fluidics Station 450（Affymetrix）を用いて洗浄とフィコエリスリン染色を行った。その後、GeneChip Scanner 3000 7G（Affymetrix）を用いてGenechipアレイの蛍光画像をスキャンし、イメージ画像を取得した。得られた蛍光強度のデータはExpression Console Ver.1.1（Affymetrix）を用いて解析した。シグナルのノーマライズはthe miRNA array RMA+DABG分析およびExpression Console software (Affymetrix)を用いて行った。
心筋細胞への分化指向性の高い細胞株として２０１Ｂ７、２５３Ｇ１および４０９Ｂ２を用い、心筋細胞への分化指向性の低い細胞株としてＲＩＫＥＮ−１Ａ、ＲＩＫＥＮ−２Ａ、ＲＩＫＥＮ−１２Ａを用いて、心筋細胞への分化指向性の高い細胞株において特徴的に発現する遺伝子を解析した。
上記例１で用いた各種ｉＰＳ細胞株におけるｍｉＲＮＡの発現を、ｍｉＲＮＡマイクロアレイを用いて解析した。
解析可能な５３４種のｍｉＲＮＡのうち、分化指向性の高い群と分化指向性の低い群とで比較して、分化指向性の高い群において半分以下の発現量を示した５種のｍｉＲＮＡ（ＡＣＡ２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９−ｓｔａｒ、ｍｍｉ−ｍｉＲ−２０４、ＡＣＡ６１およびｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−５ｐ）を特定した。結果を図８に示す。
特定されたｍｉＲＮＡがどのシグナル伝達経路に関連するｍｉＲＮＡであるかを解析し、上記例３（３）で解析された結果を参照し、関連の強い遺伝子を絞り込んだ。結果を図９に示す。心筋細胞への分化指向性の強いｉＰＳ細胞株において有意に発現量が高い遺伝子としてＰＦ４が、有意に発現量が低い遺伝子としてＴＭＥＭ６４が見出された。【０１０８】
（２）心筋細胞への分化指向性への関与の確認
上記遺伝子の分化指向性マーカー遺伝子としての有効性を確認するため、ＤＭＳＯ、ＩＷＲ−１および２、ＣＨＩＲ９９０２１またはＭｉｔｏＢｌｏｃｋ６をそれぞれ加えた培地を用いてｉＰＳ細胞を心筋細胞に分化誘導し、得られた細胞集団におけるｃＴｎＴ陽性率、ＰＦ４の発現量およびＴＭＥＭ６４の発現量を計測した。
結果を図１０に示す。特にＣＨＩＲ９９０２１を添加した培地を用いた場合において、ｃＴｎＴ陽性率およびＰＦ４の発現量において有意な低減が確認された。またＭｉｔｏＢｌｏｃｋ−６を添加した培地においてもｃＴｎＴが有意に低減しており、この場合にはＰＦ４では低減傾向が確認され、ＴＭＥＭ６４では増加傾向が確認された。したがって、ＰＦ４は心筋細胞の分化誘導において正に相関し、ＴＭＥＭ６４は負に相関する可能性が示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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