(57)【要約】  初代培養肝細胞に多くの点で類似する成熟した肝細胞の作製を目的として、多能性幹細胞から肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞を作製する方法であって、（１）多能性幹細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤を含む培地で培養する工程、（２）工程（１）で得られた細胞を、骨形成因子及び線維芽細胞成長因子を含む培地で培養する工程、（３）工程（２）で得られた細胞を、肝細胞増殖因子受容体の活性化剤及びオンコスタチンM受容体の活性化剤を含む培地で培養する工程、（４）工程（３）で得られた細胞を培養し、肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞を得る工程を含み、工程（２）、（３）、及び（４）の少なくとも一つの工程において細胞を高密度コラーゲンゲル膜上で培養することを特徴とする方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞から肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞を作製する方法であって、以下の工程（１）〜（４）を含み、工程（２）、（３）、及び（４）の少なくとも一つの工程において細胞を高密度コラーゲンゲル膜上で培養することを特徴とする方法、
（１）多能性幹細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤を含む培地で培養する工程、
（２）工程（１）で得られた細胞を、骨形成因子及び線維芽細胞成長因子を含む培地で培養する工程、
（３）工程（２）で得られた細胞を、肝細胞増殖因子受容体の活性化剤及びオンコスタチンM受容体の活性化剤を含む培地で培養する工程、
（４）工程（３）で得られた細胞を培養し、肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞を得る工程。
【請求項２】
工程（２）、（３）、及び（４）のすべての工程において細胞を高密度コラーゲンゲル膜上で培養することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤がアクチビンAであり、骨形成因子がBMP4であり、線維芽細胞成長因子がFGF10であり、肝細胞増殖因子受容体の活性化剤がHGFであり、オンコスタチンM受容体の活性化剤がオンコスタチンMであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
以下の工程（１）〜（４）を含み、工程（２）、（３）、及び（４）の少なくとも一つの工程において細胞を高密度コラーゲンゲル膜上で培養する方法によって作製されたことを特徴とする肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞、
（１）多能性幹細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤を含む培地で培養する工程、
（２）工程（１）で得られた細胞を、骨形成因子及び線維芽細胞成長因子を含む培地で培養する工程、
（３）工程（２）で得られた細胞を、肝細胞増殖因子受容体の活性化剤及びオンコスタチンM受容体の活性化剤を含む培地で培養する工程、
（４）工程（３）で得られた細胞を培養し、肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞を得る工程。
【請求項５】
工程（２）、（３）、及び（４）のすべての工程において細胞を高密度コラーゲンゲル膜上で培養することを特徴とする請求項４に記載の肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞。
【請求項６】
アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤がアクチビンAであり、骨形成因子がBMP4であり、線維芽細胞成長因子がFGF10であり、肝細胞増殖因子受容体の活性化剤がHGFであり、オンコスタチンM受容体の活性化剤がオンコスタチンMであることを特徴とする請求項４又は５に記載の肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞。
【請求項７】
多能性幹細胞から作製された肝細胞であって、CYP3A4の発現量が初代培養肝細胞のCYP3A4の発現量の2％以上であることを特徴とする肝細胞。
【請求項８】
以下の工程を含むことを特徴とする被験物質の特性を評価する方法、
（１）請求項４乃至６のいずれか一項に記載の肝細胞を、被験物質を含む培地中で培養し、肝細胞を被験物質と接触させる工程、
（２）特性に関する指標を測定し、被験物質の特性を評価する工程。
【請求項９】
特性が安全性であり、特性に関する指標が肝細胞の生存率であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞の作製方法、肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞、及び前記肝細胞を用いた被験物質の特性評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの薬剤は肝臓で代謝されることで、薬効が変わったり、毒性を示すようになったりする。このため、医薬品の開発にあたっては、医薬候補物質の肝臓に対する毒性を調べることが必要である。現在、肝毒性の評価は、マウスなどの実験動物を用いたin vivo試験やヒト初代培養肝細胞を用いたin vitro試験などが行われている。しかし、実験動物を用いた試験は、「種差の壁」があることから、ヒト肝細胞への正確な毒性評価は困難であり、動物愛護の観点からも好ましくない。一方、ヒト初代培養肝細胞は、供給が限られており、ロット差が大きいという問題や培養開始から短時間で薬剤代謝酵素の活性が低下するという問題がある。【０００３】
ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞は、肝細胞を含めた任意の体細胞へ分化する能力を持っている。ヒト由来の多能性幹細胞を成熟した肝細胞へ分化させ、これを用いて肝毒性試験を行うことができれば、上述した問題を解決することができる。このため、ヒト多能性幹細胞から成熟肝細胞を分化誘導する技術の開発が強く望まれている。
ヒト多能性幹細胞から成熟肝細胞へ分化誘導する技術については、以前から幾つか報告がある。例えば、本発明者は、ナノファイバーを足場材として用いた肝細胞の分化方法を報告している（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Yamazoe et al., 2013, J. Cell Sci. 126, 5391-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献１に記載されている方法によって得られる肝細胞は、ALBやSERPINA1などの分化マーカーを高いレベルで発現していたが、トランスポーターや代謝酵素の発現レベルは十分なものではなかった。【０００６】
本発明は、このような背景の下、初代培養肝細胞に多くの点で類似する成熟した肝細胞を作製する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、iPS細胞から誘導した内胚葉細胞を、コラーゲンビトリゲル（登録商標）膜上で培養することにより、成熟度の高い肝細胞を得られることを見出した。【０００８】
コラーゲンビトリゲルは、様々な細胞の培養に用いられており、肝臓に関する細胞に用いられていた例もある。例えば、コラーゲンビトリゲルを用いて、ヒト肝ガン由来の細胞であるHepG2を培養したという報告がある（Oshikata-Miyazaki and Takezawa, 2016, Cytotechnology 68, 1801-1811）。しかし、内胚葉細胞のような分化途中の細胞を培養したという報告はなく、また、そのような培養により、肝細胞の成熟度の高いものになるという報告もない。【０００９】
本発明は、以上の知見に基づいて完成されたものである。【００１０】
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔９〕を提供するものである。
〔１〕多能性幹細胞から肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞を作製する方法であって、以下の工程（１）〜（４）を含み、工程（２）、（３）、及び（４）の少なくとも一つの工程において細胞を高密度コラーゲンゲル膜上で培養することを特徴とする方法、
（１）多能性幹細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤を含む培地で培養する工程、
（２）工程（１）で得られた細胞を、骨形成因子及び線維芽細胞成長因子を含む培地で培養する工程、
（３）工程（２）で得られた細胞を、肝細胞増殖因子受容体の活性化剤及びオンコスタチンM受容体の活性化剤を含む培地で培養する工程、
（４）工程（３）で得られた細胞を培養し、肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞を得る工程。【００１１】
〔２〕工程（２）、（３）、及び（４）のすべての工程において細胞を高密度コラーゲンゲル膜上で培養することを特徴とする〔１〕に記載の方法。【００１２】
〔３〕アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤がアクチビンAであり、骨形成因子がBMP4であり、線維芽細胞成長因子がFGF10であり、肝細胞増殖因子受容体の活性化剤がHGFであり、オンコスタチンM受容体の活性化剤がオンコスタチンMであることを特徴とする〔１〕又は〔２〕に記載の方法。【００１３】
〔４〕以下の工程（１）〜（４）を含み、工程（２）、（３）、及び（４）の少なくとも一つの工程において細胞を高密度コラーゲンゲル膜上で培養する方法によって作製されたことを特徴とする肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞、
（１）多能性幹細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤を含む培地で培養する工程、
（２）工程（１）で得られた細胞を、骨形成因子及び線維芽細胞成長因子を含む培地で培養する工程、
（３）工程（２）で得られた細胞を、肝細胞増殖因子受容体の活性化剤及びオンコスタチンM受容体の活性化剤を含む培地で培養する工程、
（４）工程（３）で得られた細胞を培養し、肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞を得る工程。【００１４】
〔５〕工程（２）、（３）、及び（４）のすべての工程において細胞を高密度コラーゲンゲル膜上で培養することを特徴とする〔４〕に記載の肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞。【００１５】
〔６〕アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤がアクチビンAであり、骨形成因子がBMP4であり、線維芽細胞成長因子がFGF10であり、肝細胞増殖因子受容体の活性化剤がHGFであり、オンコスタチンM受容体の活性化剤がオンコスタチンMであることを特徴とする〔４〕又は〔５〕に記載の肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞。【００１６】
〔７〕多能性幹細胞から作製された肝細胞であって、CYP3A4の発現量が初代培養肝細胞のCYP3A4の発現量の2％以上であることを特徴とする肝細胞。【００１７】
〔８〕以下の工程を含むことを特徴とする被験物質の特性を評価する方法、
（１）〔４〕乃至〔６〕のいずれかに記載の肝細胞を、被験物質を含む培地中で培養し、肝細胞を被験物質と接触させる工程、
（２）特性に関する指標を測定し、被験物質の特性を評価する工程。【００１８】
〔９〕特性が安全性であり、特性に関する指標が肝細胞の生存率であることを特徴とする〔８〕に記載の方法。【００１９】
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2017-198201の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、成熟度の高い肝細胞及びそれを作製する方法を提供する。このような成熟度の高い肝細胞は、薬剤の安全性評価などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ヒトiPS細胞のコラーゲンビトリゲル膜上の肝細胞系統への分化。（A）ヒトiPS細胞の肝細胞への分化の概略図。未分化ヒトiPS細胞は、M15細胞上で内胚葉に分化した。3日目のヒトiPSC由来内胚葉細胞を解離させ、使用まで凍結させた。分化の際に、凍結された内胚葉を解凍し、コラーゲンビトリゲル（CV）膜カルチャーインサート（B）上に播種した。カルチャーインサートの上側のチャンバー中に培地200μLを供給し、下側のチャンバー中に培地500μLを供給した。分化の各段階に使用される培地が示される。ヒトiPS細胞由来肝細胞を、分化30日目（D30）〜47日目（D47）の発現プロファイル分析又は代謝活性試験に供した。スケールバー：100μm。 （C）ヒトiPS細胞由来内胚葉細胞の免疫化学的分析。緑色：OCT3/4（0.16±0.02％）;赤色：SOX17（92.8±0.14％）。（D）核対比染色（DAPI、青色）を伴うα-フェトプロテイン（AFP、緑色）及びアルブミン（ALB、赤色）についての分化15日目、20日目、25日目における分化したヒトiPS細胞の免疫化学分析。AFP単一陽性、ALB単一陽性及びAFP/ALB-二重陽性細胞のパーセンテージを表に示す。（E）分化27日目のCV膜上で分化したヒトiPS細胞由来肝細胞の代表的な位相差画像は、肝細胞に似た多角形の形態を示した。スケールバー：100μm。
【図２】コラーゲンビトリゲル膜、ナノファイバーマトリックス又は通常の細胞培養用プレートにSynthemax（登録商標）IIでコートしたプレート上で分化させたヒトiPS細胞における肝臓マーカーの発現。未分化ヒトiPS細胞（iPS）、又は通常の細胞培養用プレート（2D）、ナノファイバー（NF）、若しくはコラーゲンビトリゲル（CV）膜上で7日、15日、27日、30日、若しくは42日分化させたヒトiPS細胞における、リアルタイムPCRによって定量された様々な遺伝子転写物の発現レベル。初代培養肝細胞（PH）を基準値として使用した。分化させたヒトiPS細胞については、値は平均値±S.D（n=3）を表す。CV上で42日分化させたヒトiPS細胞の値を1とした相対値が示される。CV上での31日間培養とNF上での30日間培養、又はCV上での31日間培養とCV上での40日間培養との間に、スチューデントのt検定で有意差が認められた（有意水準は*p<0.05又は**p<0.01とした。）。
【図３】ビトリゲル、ナノファイバー、又は通常の細胞培養用プレート上で分化させたヒトiPS細胞におけるCYP代謝酵素遺伝子の発現。様々な代謝酵素の発現レベルを、未分化ヒトiPS細胞、又は通常の細胞培養用プレート（2D）、ナノファイバー（NF）、若しくはCV膜上で培養させたiPS細胞由来肝細胞において、リアルタイムPCRによって定量した。初代培養肝細胞（PH）を基準値として使用した。分化させたヒトiPS細胞については、値は平均値±S.D（n=3）を表す。CV上で42日分化させたヒトiPS細胞の値を1とした相対値が示される。CV上での31日間培養とNF上での30日間培養、又はCV上での31日間培養とCV上での40日間培養との間に、スチューデントのt検定で有意差が認められた（有意水準は*p<0.05又は**p<0.01とした。）。
【図４】未分化ヒトiPS細胞又はCV膜上で分化させたヒトiPS細胞における肝遺伝子発現。肝臓分化又は肝細胞の成熟機能に関連する様々な遺伝子の発現レベルを、未分化iPSC又はCV膜上で培養させたiPS細胞由来肝細胞において、リアルタイムPCRによって定量した。初代培養肝細胞（PH）を基準値として使用した。値は平均値±S.D（n=3）を表す。CV上で42日分化させたヒトiPS細胞の値を1とした相対値が示される。CV上での31日間培養と40日間培養との間に、スチューデントのt検定で有意差が認められた（有意水準は*p<0.05又は**p<0.01とした。）。
【図５】遺伝子発現の主成分分析（PCA）は、CVで培養させた後期ヒトiPS細胞由来肝細胞が、NF又は通常の2D環境で培養させたものとは異なることを示した。PCAは、ビトリゲル上で培養させたヒトiPS細胞由来肝細胞が、後期段階で、通常の細胞培養用プレート又はナノファイバー基質上で培養させたものとは異なる肝遺伝子発現プロファイルを示したという傾向を確認した。（A）遺伝子発現プロファイルのPCA。 PrimerArrayからの96個の遺伝子の発現データを分析した。各サンプルは、最大の分散を与えるために、PC1軸及びPC2軸について有意な遺伝子の発現レベルとともに2次元プロットにマッピングされた。分化7日目（三角）、15日目（菱形）、27日目〜47日目（丸）に、CV膜（黒色）、通常の細胞培養用プレート（白色）又はナノファイバー（灰色）上で培養させたヒトiPS細胞由来分化細胞から得られたデータを表示した。（B）各遺伝子は、PC1及びPC2軸のそれらの値に従ってプロットされている。
【図６】分化32日目及び47日目におけるヒトiPS細胞由来肝細胞におけるCYP活性。分化開始から32日後（灰色の棒グラフ）又は47日後（黒色の棒グラフ）のヒトiPS細胞由来の肝細胞培養物におけるCYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4活性をLC/MSで測定した。測定値は、2時間で得られた値を用いて、ウェル及び分あたりのタンパク質含量に対して標準化した。4時間前培養（pre-4h）又は48時間前培養（pre-48h）した凍結保存初代培養肝細胞（白抜きの棒グラフ）を基準値として使用する。値は平均値±S.D（n=3）を表す。差異の有意性を§P<0.05又は§§P<0.01として示す。ポストホックダネットの検定を用いた一元配置ANOVAにより、初代培養肝細胞（pre-4h又はpre-48h）で得られたデータグループとヒトiPS細胞由来肝細胞で得られたデータグループを比較した。
【図７】PrimerArrayにおいて使用されたプライマーリストを示す（Well ID 1〜50）。
【図８】PrimerArrayにおいて使用されたプライマーリストを示す（Well ID 51〜96）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ａ）肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞の作製方法
本発明の肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞の作製方法は、多能性幹細胞から肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞を作製する方法であって、（１）多能性幹細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤を含む培地で培養する工程、（２）工程（１）で得られた細胞を、骨形成因子及び線維芽細胞成長因子を含む培地で培養する工程、（３）工程（２）で得られた細胞を、肝細胞増殖因子受容体の活性化剤及びオンコスタチンM受容体の活性化剤を含む培地で培養する工程、及び（４）工程（３）で得られた細胞を培養し、肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞を得る工程を含み、工程（２）、（３）、及び（４）の少なくとも一つの工程において細胞を高密度コラーゲンゲル膜上で培養することを特徴とする方法である。
【００２３】
「多能性幹細胞」とは、自己複製能を有し、in vitroにおいて培養することが可能で、かつ、個体を構成する細胞に分化しうる多分化能を有する細胞をいう。具体的には、胚性幹細胞（ES細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（GS細胞）、体細胞由来の人工多能性幹細胞（iPS細胞）、体性幹細胞等を挙げることができるが、本発明で好ましく用いられるのはiPS細胞又はES細胞であり、特に好ましくは、ヒトiPS細胞及びヒトES細胞である。
【００２４】
ES細胞は、哺乳類動物由来のES細胞であればよく、その種類や取得方法などは特に限定されない。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル又はヒト等を挙げることができ、好ましくは、マウス又はヒトであり、さらに好ましくはヒトである。
【００２５】
ES細胞は、一般的には、胚盤胞期の受精卵をフィーダー細胞と一緒に培養し、増殖した内部細胞塊由来の細胞をばらばらにして、さらに、植え継ぐ操作を繰り返し、最終的に細胞株として樹立することができる。
【００２６】
また、iPS細胞（人工多能性幹細胞）とは、分化多能性を獲得した細胞のことで、体細胞（例えば、線維芽細胞など）へ分化多能性を付与する数種類の転写因子（分化多能性因子）遺伝子を導入することにより、ES細胞と同等の分化多能性を獲得した細胞のことである。「分化多能性因子」としては、多くの因子が報告されており、特に限定しないが、例えば、Octファミリー（例えば、Oct3/4）、Soxファミリー（例えば、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15及びSox17など）、Klfファミリー（例えば、Klf4、Klf2など）、Mycファミリー（例えば、c-Myc、N-Myc、L-Mycなど）、Nanog、LIN28などを挙げることができる。iPS細胞の樹立方法については、多くの報告がなされており、それらを参考にすることができる（例えば、Takahashi et al., Cell, 2006, 126:663-676；Okita et al., Nature, 2007, 448:313-317：Wernig et al., Nature, 2007, 448:318-324；Maherali et al., Cell Stem Cell, 2007, 1:55-70；Park et al., Nature, 2007, 451:141-146；Nakagawa et al., Nat Biotechnol 2008, 26:101-106；Wernig et al., Cell Stem Cell, 2008, 10:10-12；Yu et al., Science, 2007, 318:1917-1920；Takahashi et al., Cell, 2007, 131:861-872；Stadtfeld et al., Science, 2008, 322:945-949など）。
【００２７】
多能性幹細胞は、当該分野で通常用いられている方法にて培養及び維持できる。哺乳動物由来のES細胞の培養方法は常法により行うことができる。例えば、フィーダー細胞としてマウス胎児線維芽細胞（MEF細胞）を用い、白血病阻害因子、KSR（ノックアウト血清代替物）、ウシ胎仔血清（FBS）、非必須アミノ酸、L-グルタミン、ピルビン酸、ペニシリン、ストレプトマイシン、β-メルカプトエタノールを加えた培地、例えばDMEM培地を用いて維持することができる。iPSＳ細胞の培養も定法により行うことができる。例えば、フィーダー細胞としてMEF細胞を用いて、bFGF、KSR（ノックアウト血清代替物）、非必須アミノ酸、L-グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、β-メルカプトエタノールを加えた培地、例えばDMEM/F12培地を用いて維持することができる。
【００２８】
「肝細胞に分化可能な細胞」は、肝細胞に分化できるものでればどのようなものでもよく、例えば、肝前駆細胞、肝芽細胞などを挙げることができる。ここで「肝前駆細胞」及び「肝芽細胞」という用語は、当業者に通常理解される意味で用いられるが、例えば、「肝前駆細胞」をα-フェトプロテインが陽性でアルブミンが陰性である細胞、「肝芽細胞」をα-フェトプロテイン及びアルブミンの両方が陽性である細胞と定義することも可能である。
【００２９】
「高密度コラーゲンゲル」とは、生体内の結合組織に匹敵する高密度コラーゲン線維より構成されるコラーゲンゲルであり、強度と透明性に優れている。高密度コラーゲンゲルとしては、コラーゲンビトリゲル（国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構による登録商標）を挙げることができる（竹澤俊明: 生物工学学会誌. 91: 214-217, 2013、WO2012/026531、特開2012-115262）。高密度コラーゲンゲルは、例えば、コラーゲンのゾルをゲル化し、そのコラーゲンゲルを乾燥させて、ガラス化し、その後、再水和することにより作製することができる。高密度コラーゲンゲルにおけるコラーゲン繊維密度は、21〜45(W/V)％が好ましく、 26〜40(W/V)％がより好ましく、31〜35(W/V)％がさらに好ましい。
【００３０】
高密度コラーゲンゲル膜上での培養はどのような方法で行ってもよいが、筒状の枠体の底面部分に高密度コラーゲンゲル膜を設け、この膜上で細胞を培養することが好ましい。
【００３１】
本発明の肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞の作製方法は、以下に説明する工程（１）〜（４）を含むものである。
【００３２】
工程（１）では、多能性幹細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤を含む培地で培養する。この培養により、多能性幹細胞は内胚葉細胞に分化する。多能性幹細胞が内胚葉細胞に分化したことの確認は、内胚葉細胞特異的に発現するタンパク質や遺伝子（内胚葉マーカー）の発現変動を評価することによって行うことができる。内胚葉マーカーの発現変動の評価は、例えば、抗原抗体反応を利用したタンパク質の発現評価方法、定量RT-PCRを利用した遺伝子発現評価方法等によって行うことができる。内胚葉マーカーの例としては、SOX17、FOXA2を挙げることができる。
【００３３】
アクチビン受容体様キナーゼ(ALK)-4,7の活性化剤は、ALK-4及び／又はALK-7に対し活性化作用を有する物質から選択される。使用されるアクチビン受容体様キナーゼ−4,7の活性化剤の例としては、アクチビン、Nodal、Myostatinが挙げられ、好ましくはアクチビンである。アクチビンは、アクチビンA、B、C、D及びABが知られているが、そのいずれのアクチビンも用いることができる。用いるアクチビンとしては、特に好ましくはアクチビンAである。また、用いるアクチビンとしては、ヒト、マウス等いずれの哺乳動物由来のアクチビンをも使用することができるが、分化に用いる幹細胞と同一の動物種由来のアクチビンを用いることが好ましく、例えばヒト由来の多能性幹細胞を出発原料とする場合、ヒト由来のアクチビン、特にはヒト由来のアクチビンAを用いることが好ましい。これらのアクチビンは商業的に入手可能である。
【００３４】
工程（１）の培地としては、基礎培地にアクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤が添加されている培地を使用することができる。このような培地の具体例としては、実施例に記載したM1培地を挙げることができる。培地中のアクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤の濃度は、用いる種類によって適宜設定されるが、ヒトアクチビンAを使用する場合は、通常、3〜500ng/mLであり、好ましくは、5〜200ng/mLである。
【００３５】
基礎培地としては、例えば、BME培地、BGjB培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM培地、IMDM培地、Medium  199培地、Eagles MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、William’s E培地、及びこれらの混合培地等を挙げることができるが、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。これらの培地は市販されており、入手可能である。
【００３６】
工程（１）の培地は、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン）、B-27サプリメント、E5サプリメン、E6サプリメン、N2サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント（KSR）、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロール、又はこれらの均等物が挙げられる。これらの血清代替物は、市販されている。好ましくは、ゼノフリーB-27サプリメント又はゼノフリーノックアウトシーラムリプレースメント（KSR）を挙げることができ、例えば、0.01〜10重量％、好ましくは0.1〜2.0重量％の濃度にて、培地中に添加できる。また、工程（１）の培地は、他の添加物、例えば、脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生物質（例えばペニシリンやストレプトマイシン）又は抗菌剤（例えばアンホテリシンB）等を含有してもよい。
【００３７】
工程（１）の培養は、M15フィーダー細胞上で行うことが好ましい。これにより、多能性幹細胞を効率的に内胚葉細胞に誘導することができる（Shiraki et al., 2008, Stem Cells 26, 874-85）。また、この工程の培養は、高密度コラーゲンゲル膜上で行う必要はない。
【００３８】
工程（１）の培養は、細胞の培養に適した培養温度（通常30〜40℃、好ましくは37℃程度）で、通常、CO2インキュベーター内で行われる。培養期間は、通常、1日〜5日であり、好ましくは、3日〜4日である。
【００３９】
工程（２）では、工程（１）で得られた細胞を、骨形成因子及び線維芽細胞成長因子を含む培地で培養する。
【００４０】
骨形成因子（BMP）の例としては、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7等をあげることができ、好ましくは、BMP2、BMP4であり、さらに好ましくはBMP4である。これらは、天然型であってもよいし、また組換タンパク質であってもよい。
【００４１】
線維芽細胞成長因子（FGF）の例としては、FGF1、FGF2（bFGF）、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23等をあげることができ、好ましくは、FGF2（bFGF）、FGF5、FGF7、FGF10であり、さらに好ましくはFGF10である。これらは、天然型であってもよいし、また組換タンパク質であってもよい。
【００４２】
工程（２）の培地としては、基礎培地に骨形成因子及び線維芽細胞成長因子が添加されている培地を使用することができる。このような培地の具体例としては、実施例に記載したM2培地を挙げることができる。培地中の骨形成因子の濃度は、用いる種類によって適宜設定されるが、BMP4を使用する場合は、通常、2〜200ng/mLであり、好ましくは、5〜50ng/mLである。線維芽細胞成長因子の濃度も、用いる種類によって適宜設定されるが、FGF10を使用する場合は、通常、2〜100ng/mLであり、好ましくは、5〜50ng/mLである。基礎培地は、工程（１）の培地と同様のものを使用することができる。また、工程（２）の培地は、工程（１）の培地と同様に、血清代替物や他の添加物を含んでいてもよい。
【００４３】
工程（２）の培養は、高密度コラーゲンゲル膜上で行うことが好ましい。
【００４４】
工程（２）の培養は、細胞の培養に適した培養温度（通常30〜40℃、好ましくは37℃程度）で、通常、CO2インキュベーター内で行われる。培養期間は、通常、2〜6日であり、好ましくは、2日〜4日である。
【００４５】
工程（３）では、工程（２）で得られた細胞を、肝細胞増殖因子受容体の活性化剤及びオンコスタチンM受容体の活性化剤を含む培地で培養する。
【００４６】
肝細胞増殖因子（HGF）受容体（Met）の活性化剤の例としては、HGFをあげることができる。
【００４７】
オンコスタチンM受容体の活性化剤の例としては、オンコスタチンMをあげることができる。
【００４８】
工程（３）の培地としては、基礎培地に肝細胞増殖因子受容体の活性化剤及びオンコスタチンM受容体の活性化剤が添加されている培地を使用することができる。このような培地の具体例としては、実施例に記載したM3培地を挙げることができる。培地中の肝細胞増殖因子受容体の活性化剤の濃度は、用いる種類によって適宜設定されるが、HGFを使用する場合は、通常、10〜250ng/mLであり、好ましくは、10〜150ng/mLである。培地中のオンコスタチンM受容体の活性化剤の濃度も、用いる種類によって適宜設定されるが、オンコスタチンMを使用する場合は、通常、5〜200ng/mLであり、好ましくは、10〜60ng/mLである。基礎培地は、工程（１）の培地と同様のものを使用することができる。また、工程（３）の培地は、工程（１）の培地と同様に、血清代替物や他の添加物を含んでいてもよい。
【００４９】
工程（３）の培養は、高密度コラーゲンゲル膜上で行うことが好ましい。
【００５０】
工程（３）の培養は、細胞の培養に適した培養温度（通常30〜40℃、好ましくは37℃程度）で、通常、CO2インキュベーター内で行われる。培養期間は、通常、4〜12日であり、好ましくは、4日〜10日である。
【００５１】
工程（４）では、工程（３）で得られた細胞を培養し、肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞を得る。
【００５２】
工程（４）の培地としては、例えば、Cellartis（登録商標）Hepatocyte Maintenance Mediumを含む培地を使用することができる。このような培地の具体例としては、実施例に記載したM4培地を挙げることができる。
【００５３】
工程（４）の培養は、高密度コラーゲンゲル膜上で行うことが好ましい。
【００５４】
工程（４）の培養は、細胞の培養に適した培養温度（通常30〜40℃、好ましくは37℃程度）で、通常、CO2インキュベーター内で行われる。培養期間は、通常、7日以上であり、好ましくは、7日〜40日である。
上述したように、高密度コラーゲンゲル膜上での培養は、工程（２）、（３）、及び（４）の少なくとも一つの工程において行えばよいが、好ましくは、工程（２）、（３）、及び（４）のすべての工程（即ち、内胚葉細胞から肝細胞までの工程、又は内胚葉細胞から肝細胞に分化可能な細胞までの工程）において行う。但し、工程（３）及び（４）においてのみ、又は工程（４）においてのみ、高密度コラーゲンゲル膜上での培養を行ってもよい。
【００５５】
（Ｂ）肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞
本発明の肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞は、（１）多能性幹細胞を、アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤を含む培地で培養する工程、（２）工程（１）で得られた細胞を、骨形成因子及び線維芽細胞成長因子を含む培地で培養する工程、（３）工程（２）で得られた細胞を、肝細胞増殖因子受容体の活性化剤及びオンコスタチンM受容体の活性化剤を含む培地で培養する工程、及び（４）工程（３）で得られた細胞を培養し、肝細胞又は肝細胞に分化可能な細胞を得る工程を含み、工程（２）、（３）、及び（４）の少なくとも一つの工程において細胞を高密度コラーゲンゲル膜上で培養する方法によって作製されたことを特徴とするものである。
【００５６】
本発明の肝細胞は、以前から知られている多能性幹細胞由来の肝細胞（例えば、Yamazoe et al., 2013, J. Cell Sci. 126, 5391-9における多能性幹細胞由来の肝細胞）には見られなかった高い成熟度を示す新規な肝細胞である。
【００５７】
なお、上述のように、本明細書においては、「肝細胞」や「肝細胞に分化可能な細胞」という「物」を構造や特性ではなく、製造方法によって特定しているが、これは、細胞が生体の一部であることから、その構造や特性は極めて複雑であり、それらを特定する作業を行うことは、著しく過大な経済的支出や時間を必要とするからである。
【００５８】
本発明の肝細胞には、多能性幹細胞から作製された肝細胞であって、CYP3A4の発現量が初代培養肝細胞のCYP3A4の発現量の2％以上であることを特徴とする肝細胞も含まれる。
【００５９】
比較対象とする初代培養肝細胞は特に限定されず、市販のもの、例えば、実施例で使用したBioreclamation IVT社製の細胞を使用することができる。なお、初代培養肝細胞は前培養の期間が長くなるとCYP3A4の発現量が低下するので、比較対象とする初代培養肝細胞は前培養を行わないものを使用する。
【００６０】
CYP3A4の発現量は、公知の方法、例えば、RT-PCRなどによって測定することができる。
【００６１】
CYP3A4の発現量は、初代培養肝細胞のCYP3A4の発現量の2％以上であればよいが、好ましくは、3%以上であり、より好ましくは4%以上であり、更に好ましくは5%以上である。
【００６２】
（Ｃ）評価方法
本発明の被験物質の特性を評価する方法は、上記肝細胞を、被験物質を含む培地中で培養し、肝細胞を被験物質と接触させる工程、及び特性に関する指標を測定し、被験物質の特性を評価する工程を含むことを特徴とするものである。
【００６３】
評価対象とする特性としては、被験物質の安全性（より具体的には、肝毒性）を挙げることができる。この場合、測定対象とする指標としては、肝細胞の生存率を挙げることができる。肝細胞の生存率は、公知の方法に従って測定することができる。具体的には、以下の(a)〜(g)を挙げることができる。
(a)LDH、AST、ALTなどを測定する方法。
(b)Trypan Blueなどで肝細胞を染色し、染まっている細胞（死細胞）を計数する方法。
(c)細胞の呼吸活性を測定する方法、具体的には、MTT、WSTなど呼吸活性に応じて発色する物質を使用し、生成する発色物から細胞の呼吸活性を測定する方法。
(d)細胞の持っているエネルギー源であるATPを測定する方法、具体的には、細胞を溶解し、その溶解物中に含まれるATP量を測定する方法。
(e)ミトコンドリア毒性を測定する方法。
(f)酸化ストレスを測定する方法。
(g)Apoptosis(細胞死)に関する生成物（Caspaseなど）を測定する方法。
【００６４】
評価対象とする特性は、安全性に限定されず、例えば、被験物質の薬効や薬物動態も評価対象とすることができる。
【００６５】
被験物質の薬効を評価対象とする場合、測定対象とする指標は、薬効の疾患に応じて適宜選択できるが、例えば、糖尿病に対する薬効を評価対象とするのであれば、肝細胞における糖の代謝を測定すればよい。
【００６６】
被験物質の薬物動態を評価対象とする場合、薬物代謝酵素活性やトランスポーター機能などを測定対象とすることができる。
【００６７】
また、本発明の評価方法は、胆汁酸のうっ滞や脂肪肝誘導なども評価対象とすることができる。
【実施例】
【００６８】
以下に、実施例により本発明をさらに詳細に述べるが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。【００６９】
（Ａ）材料と方法
（１）ヒトiPS細胞株
未分化のヒトiPS細胞株ChiPS18細胞（Asplund et al., 2015, Stem Cell Rev. Reports）を、Synthemax （登録商標）IIで予めコートした細胞培養皿（Invitrogen）上のAK02 StemFit培地（Ajinomoto）で維持した。メチオニンを欠乏させるために、ChiPS18細胞を、StemFit培地（Ajinomoto）完全又はメチオニン欠乏KA01培地（Ajinomoto）で培養した。【００７０】
（２）コラーゲンビトリゲル膜チャンバーの調製
コラーゲンキセロゲル膜は、関東化学株式会社（Tokyo、Japan）によって製造されている。簡単に説明すると、コラーゲンビトリゲル膜は、以前に報告されているように（Oshikata-Miyazaki and Takezawa, 2016, Cytotechnology 68, 1801-1811；Yamaguchi et al., 2013, Toxicol. Sci. 135, 347-355；Yamaguchi et al., 2016, J. Appl. Toxicol. 36, 1025-1037）以下の３工程によって調製された：1）0.2mLの0.25％I型コラーゲンゾルから、直径35mmの培養皿に不透明な軟質ゲルを形成させたゲル化工程；2）十分な乾燥によってゲルが硬質材料となったガラス化工程；3）水分を補給することによってガラス化材料をゲル強度が増強された薄い透明なゲル膜に変換する再水和工程。続いて、分離可能なシート上にコラーゲンビトリゲル膜を再ガラス化することによって、遊離水を含まない乾燥コラーゲンビトリゲル膜として定義されるコラーゲンキセロゲル膜を調製した。コラーゲンキセロゲル膜を、内外径11〜13mm、長さ15mmのプラスチックシリンダーの底端に貼り付け、シリンダーの上端に2本のハンガーを接続した。これにより、以前報告したように（Oshikata-Miyazaki and Takezawa, 2016, Cytotechnology 68, 1801-1811；Yamaguchi et al., 2013, Toxicol. Sci. 135, 347-355；Yamaguchi et al., 2016, J. Appl. Toxicol. 36, 1025-1037）、培養培地で再水和することによって容易にコラーゲンビトリゲル膜チャンバーに変換可能なコラーゲンキセロゲル膜チャンバーを作製できた。【００７１】
（３）iPS細胞の肝臓系統への分化
分化していないChiPS18細胞を、まずM15細胞を用いて内胚葉に分化させた。簡潔には、直径100mmのプレートに、マイトマイシンで処理した凍結M15フィーダー細胞を、5×106細胞/皿の密度でプレコートした。内胚葉分化のために、未分化ChiPS18細胞をM15細胞被覆100mm直径プレート上に5×105細胞/皿の密度で播種し、3μM CHIR99021を補充した内胚葉分化培地であるM1培地で1日間培養し、次にM1培地（CHIR99021を含まない）に変更し、さらに2日間培養した。M1培地は、DMEM、4,500mg/Lグルコース、NEAA、L-Gln、ペニシリン、ストレプトマイシン、0.1mM β-ME無血清B27サプリメント100ng/mL組換えヒトアクチビンAからなる。3日目（D3）に、ChiPS18由来内胚葉細胞を集め、Bambanker hRM（NIPPON Genetics Co Ltd、CS-07-001）で2.0×106細胞/mLで凍結し、その後の使用まで液体窒素中に貯蔵した。【００７２】
肝臓分化のために、凍結した内胚葉細胞を凍結融解し、1×105細胞/ウェルの濃度で再水和したビトリゲル（CV）メンブレン24ウェルインサート（ad-MED VitrigelTM 2、KANTO KAGAKU、培養面積：0.33cm2/インサート）上に播種した。培地の量は、トランスウェルの上層については200μL、下層については500μLであった。分化に使用した培地は、3〜7日目がM2培地、7〜15日目がM3培地、15〜30日又は15〜40日目がM4培地であった。M2培地は、NEAA、L-Gln、PS、0.1mM β-ME、無血清B27サプリメント、10ng/mL組換えヒトFGF10及び10ng/mL組換えヒトBMP4を添加したKnockout DMEM/F12からなる。M3培地は、50ng/mLヒト組換えHGF及び20ng/mL Oncostatin Mを添加したHCM SingleQuot KitTMからなる。M4培地は、Cellartis（登録商標）Hepatocyte Maintenance Mediumを含む培地である。上層及び下層の両方の培地を、新鮮な培地及び増殖因子で2日ごとに交換した。【００７３】
（４）免疫細胞化学
細胞を、4％パラホルムアルデヒドを含むPBS中で固定し、0.1％Triton X-100で透過処理し、次いで20％Blocking One（Nacalai Tesque、Japan）を含むPBST（0.1％Tween-20を含むPBS）でブロッキングした。抗体を、20％Blocking One（Nacalai Tesque、Japan）を含むPBST（0.1％Tween-20を含むPBS）で希釈した。細胞を6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で対比染色した。【００７４】
抗体は以下のものを使用した：ウサギ抗AFP抗体（Dako、Glostrup、Denmark）、ヤギ抗ALB抗体（Bethyl）、マウス抗OCT3/4抗体（Santa Cruz）、ウサギ抗OCT3/4抗体（Cell Signaling）、ヤギ抗SOX17抗体（R＆D Systems）、及びAlexa 568結合及びAlexa 488結合抗体（Invitrogen）。全細胞（DAPI陽性細胞）に対する陽性細胞を、ImageXpress Micro cellular imaging system (Molecular Devices)を用いて定量した。【００７５】
（５）RT-PCR分析
RNeasy micro-kit又はQiaxol（Qiagen、Germany）を用いてiPS細胞からRNAを抽出し、次いでDNase（Qiagen）で処理した。逆転写反応のために、PrimeScriptTM RT Master Mixを用いて2.5μgのRNAを逆転写した。リアルタイムPCR分析のために、mRNA発現をStepOne Plus（Applied Biosystems、Foster City、CA）を用い、SyberGreenで定量した。PCR条件は以下の通りであった：95℃での30秒間の初期変性、続いて95℃での5秒間の変性、60℃での30秒間のアニーリング及び伸長を1サイクルとし、これを40サイクル繰り返した。標的mRNAレベルを任意単位として表し、ΔΔCT法を用いて決定した。肝臓分化に関連する88個の遺伝子及び8個のハウスキーピング遺伝子のリアルタイムRT-PCR分析に最適化されたプライマー対を含むPrimerArray Hepatic Differentiation（ヒト）（TaKaRa PH017）を使用した。プライマーの詳細は図７及び図８に記載されている。【００７６】
（６）ヒト初代培養肝細胞
市販の凍結保存初代培養肝細胞（PH）を用いた（Bioreclamation IVT、Cat. No. M00995-P、Lot no. FOS、>5.0×106細胞/バイアル）。 PrimerArray Hepatic Differentiationを用いたリアルタイムPCR分析のために、RNAを、予備培養なしで凍結保存された初代培養肝細胞から抽出した。CYP活性については、凍結保存された初代培養肝細胞を解凍し、製造業者の説明書（BioreclamationIVT）に従い、TorpedoTMAntibiotic Mixと混合したInVitroGROTM CP培地中に、7.0×105生存細胞/mLの濃度で再懸濁し、BioCoatTM collagen I 24-well microplates（Corning）に、3.5×105細胞/ウェルになるように播種した。培地は、4〜6時間後（h）及び次の日に、CM4000（フェノールレッドなし; Life technologies）を含むWilliam's E培地に交換した。CYP活性アッセイは、播種後4時間（pre-4h）又は48時間（pre-48h）に開始した。【００７７】
（７）CYP活性アッセイ
分化開始から32日目及び47日目にヒトiPS細胞由来肝細胞におけるCYP 1A2、2C9、2C19、2D6及び3A4活性を評価した。4時間又は48時間前培養した初代培養肝細胞を基準値として使用した。ヒトiPS細胞由来肝細胞又は初代培養肝細胞の培養物を、PSを添加した暖かいWillim's E培地で洗浄した。以下に示す化学薬品の混合物のカクテルを含む培地を添加することによりアッセイを開始した：50μMフェナセチン、10μMブフラロール塩酸塩（Sumika Chemical Analysis Service, Ltd.）、5μMジクロフェナク、100μM S-メフェニトイン（Sumika Chemical Analysis Service, Ltd.）、5μMミダゾラム及び50μMテストステロン。添加された培地の量は、初代培養肝細胞に500μl、トランスウェルCV膜の上部チャンバーに300μl、下部チャンバーに600μlであった。1時間、2時間、6時間及び24時間後に、上部及び下部チャンバーのそれぞれから100μl又は300μlの上清を集め、-80℃で凍結保存した。上清を解凍し、代謝産物であるアセトアミノフェン、1'-OHブフラロール、4'-OHジクロフェナク、4-OHメフェニトイン、1-OHミダゾラム又は6b-OHテストステロンのLC/MS分析を行った。ヒトiPS細胞由来肝細胞については、化学薬品を上部及び下部チャンバーの両方に添加し、上清を採取し、両方のチャンバーから得た上清を合わせた。 Pierce BCAタンパク質アッセイキット（ThrmoFisher、Rockford、IL）を製造元の指示に従って使用して、1ウェルあたりのタンパク質量を定量した。代謝産物濃度をタンパク質量で正規化した。【００７８】
（８）統計
データは、平均値±S.D.（n = 3）として表した。グループ間の差は、スチューデントのt検定又はポストホックダネットの検定を用いた一元配置ANOVAによって分析した。各図の説明には、それぞれの統計分析とP値が記載されている。スチューデントのt検定による*p<0.05又は**p<0.01；ポストホックダネットの検定を用いた一元配置ANOVAによる§P<0.05又は§§P<0.01が有意であるとみなされる。【００７９】
（９）主成分分析
結果を可視化し、コラーゲンビトリゲル（CV）、ナノファイバー（NF）、又は通常の細胞培養用プレート（2D）上で分化させたヒトiPS細胞由来肝細胞間の8個のハウスキーピング遺伝子及び88個の肝臓分化遺伝子の発現プロファイルをマッピングするために、主成分分析（Principal Component Analysis、PCA）を行った。PCAはJMPソフトウェア（SAS Institute Japan）を用いて行った。【００８０】
（Ｂ）結果
（１）コラーゲンビトリゲル膜上でのヒトiPS細胞の肝臓分化
本発明者は、以前、NFマトリックスが多能性幹細胞のin vitroでの肝臓分化を促進することを示した。本発明者は、肝臓分化を増強する可能性のある他のマトリックスを探索するために、ヒトiPS細胞の肝細胞への分化の増強におけるコラーゲンビトリゲル（CV）膜の効果を、NFマトリックスと比較して、試験した。
今回の研究では、肝細胞分化効率が良好であると報告されているヒトiPS細胞系であるChiPS18（Asplund et al., 2015, Stem Cell Rev. Reports）を用いた。本発明者は、未分化ヒトiPS細胞に対する自分達の培養手順を、「材料と方法」の欄に記載したように適合させた。まず、M15フィーダー上でChiPS18を3日間培養し、ヒトiPS細胞由来内胚葉細胞を調製し、3日目（D3）にヒトiPS細胞由来内胚葉細胞を採取した（図1A、B）。ヒトiPS細胞由来内胚葉細胞を凍結細胞として保存し、凍結融解時に92.8±0.14％SOX17及び0.16±0.02％OCT3/4陽性を示すことを確認し、一晩培養した（図1C）。【００８１】
肝臓分化を行うために、ヒトiPS細胞由来内胚葉細胞を凍結融解し、CVメンブレン、NFマトリックス、又は通常の細胞培養用2Dプレート（2D）上に播種し、連続的に培地を交換する培養によって肝臓の運命に分化させた。具体的には、分化開始から3-7日目にM2培地で培養し、5-15日目にM3培地で培養し、15-30日目又は47日目までM4培地で培養した。ヒトiPS細胞由来の分化細胞の免疫細胞化学的分析により、15日目に、ヒトiPS細胞由来の細胞は、α-フェトプロテイン単一陽性（AFP+）肝前駆細胞（69.6％）、及びAFP/アルブミン（ALB）二重陽性肝芽細胞（28.3％）となっていたことが明らかになった。20日目に、AFP発現は36.1％に減少し、ALB単一陽性細胞は23.7％に増加した。25日目に、ALB単一陽性細胞は54.3％であったのに対し（図1D）、AFP単一陽性細胞は約6.2％であった。CV膜上で培養させたヒトiPS細胞由来細胞の多角形形態は、これらの細胞が肝細胞であることを示唆した（図1E）。【００８２】
（２）ビトリゲル上で培養させたヒトiPS細胞由来肝細胞は、ナノファイバーマトリックス上で培養させたものよりも、より成熟した発現プロファイルを示した。
ヒトiPS細胞由来肝細胞の特徴を明らかにするために、本発明者は、肝臓分化に関連する88個の既知遺伝子及び8個のハウスキーピング遺伝子からなるプライマーセットを用いて肝臓の分子マーカーの発現を調べるリアルタイムRT-PCRを行った（図2;マーカーの完全なリストについては、図７及び図８参照）。このリアルタイムRT-PCRでは、CV膜上で培養させたヒトiPS細胞由来肝細胞と、以前に肝臓分化を支持するための強力なマトリックスであると報告したNFマトリックス上で培養させたものとを比較した。コントロールとして前培養せずに凍結保存された初代培養肝細胞（PH）から直接抽出されたRNAを使用した。初代培養肝細胞（PH）でほとんど消失したAFPやApolipoprotein A-IV（APOA4）のような未成熟マーカーの発現は、CVで培養させたヒトiPS細胞由来肝細胞において観察されたが、そのレベルは、NF上で培養させたものや通常の2D環境（2D）で培養させたものと比較して、はるかに低いレベルであった。成熟マーカーの発現を促進することが知られているprospero homeobox 1（PROX1）、hematopoietically expressed homeobox (HHEX)、又はnuclear receptor subfamily 1H4（NR1H4; ファルネソイドX受容体（FRX）をコードする）などの転写因子は、NFマトリックス上で培養させたiPS細胞由来肝細胞と比較して、CV上で培養させたiPS細胞由来肝細胞においてアップレギュレートされていた。SERPINA1（α1-アンチトリプシン（AAT）をコードする）やasialoglycoprotein receptor 1(ASGR1) (Peters et al., 2016, Development 143, 1475-1481)などの初代培養肝細胞で高発現する成熟マーカーは、NFマトリックス又は通常の細胞培養用プレート上で培養させたヒトiPS細胞由来肝細胞と比較して、CV上で培養させたヒトiPS細胞由来肝細胞において高発現していたことが見出された。ALBの発現量は初代培養肝細胞における発現量の約1/6倍、ASGR1ALBの発現量は初代培養肝細胞における発現量の約1/3倍であった。以上をまとめると、これらの転写プロファイルは、CV上で培養させたヒトiPS細胞由来肝細胞は、NFマトリックス上で培養させたものよりも、より成熟した肝細胞であることを示唆している。【００８３】
UGT1A1（UDP glucuronosyltransferase 1 alpha 1)などの第2相代謝酵素、ATP-binding cassette, sub-family C3（ABCC3又はMRP3）などの排出トランスポーター、及びsolute carrier organic anion transporter1B1（SLCO1B1又はOATP1B1）やSLC22A1（又はOCT1; organic cation transporter1）などの取り込みトランスポーターは、CVで培養させたヒトiPS細胞由来肝細胞において、NFマトリックスで培養させたものよりも高いレベルで発現した（図2）。これらの転写プロファイルは、ヒトiPS細胞由来肝細胞のより成熟した特徴が、CV膜上で培養することによって得られた可能性を示唆している。【００８４】
次に代謝酵素の発現プロファイルを解析した。シトクロムP450（CYP）1A1、1A2、2D6、3A4及び3A7のような代謝酵素は、NF上で培養させたものと比較して、CVで培養させたヒトiPS細胞由来肝細胞においてより高いレベルで発現した（図3）。 CYP2A6、2C8、2E1及び7A1（コレステロール代謝に関与する）などの他のCYP酵素は、CV及びNF上で培養させたヒトiPS細胞由来肝細胞間で類似の発現レベルを示した。胎児性CYP酵素であるCYP3A7は、CV上で培養させたヒトiPS細胞由来肝細胞において高レベルで発現した。CYP1A1の発現は初代培養肝細胞よりも高く、CYP3A4は初代培養肝細胞の約1/50倍であることは注目に値する。また、CYP酵素の発現の多くは、31日目から41日目の間に実質的なレベルで観察され、細胞の機能が10日間以上維持することができたことも注目に値する。【００８５】
他の肝臓マーカー、例えば、keratin 18（KRT18）及びT-box 3（TBX3）は、より早期のヒトiPS細胞由来の細胞で発現されたが、分化の日数が増加すると減少した（図4）。transferrin（TF）又はnuclear receptor 1I3（NR1I3;又はconstitutive androstane nuclear receptor、CAR）の発現もまた検出された。尿素サイクル酵素であるornithine carbamoyltransferase（OTC）、argininosuccinate lyase（ASL）、arginase（ARG1）、及びトリプトファン代謝に関与する酵素であるtryptophan 2,3-dioxygenase（TDO2）などの他の成熟肝臓マーカーも発現した。 ヒトiPS細胞由来肝細胞において、取り込みトランスポーターであるsolute carrier family 10A1（sodium/bile acid cotransporter family; SLC10A1又はNTCP）、SLCO2B1（OATP2B1）、排出トランスポーターであるABCB4（MDR3）、ABCG2（BCRP）が発現していた。【００８６】
肝細胞の成熟マーカーの多くは、NFマトリックスよりもCVで培養したヒトiPS細胞由来肝細胞においてアップレギュレートされている。重要なことに、成熟マーカー発現の多くは、ヒトiPS細胞由来肝細胞において47日目に実質的なレベルで観察されることができ、それによってヒトiPS細胞由来肝細胞が機能的であり、10日間以上維持され得ることを示唆する。【００８７】
（３）iPS由来細胞の主成分解析
ヒトiPSC由来分化細胞の発現プロファイルの洞察を得るために、PrimerArray遺伝子発現の主成分分析（PCA）を行った。最も高い分散を有するPCAは、以下の特徴を明らかにした：通常の2D、NF又はCV上で培養させた7日目及び15日目及び27日目以降のヒトiPS細胞由来分化細胞は、3つの異なるクラスターに分類された。これらのクラスターの中では、27日目以降のヒトiPS細胞は、CV又は2D上で培養されたヒトiPS細胞から離れてマップされた（図5A）。【００８８】
PC1軸又はPC2軸とコーディネートする遺伝子を図5Bに示す。例えば、7日目の細胞クラスターにコーディネートする遺伝子は、内胚葉分化に関連するFOXA2、TBX3、NODAL、LAMB1などの遺伝子である。15日目の細胞クラスターにコーディネートする遺伝子は、初期の肝臓分化に関連するAFP、KRT18、CYP7A1、APOA4などの遺伝子である。肝細胞の成熟に関連するSERPINA1、SLC22A1、NR1H4、CYP1A2のような遺伝子は、27日目以降の細胞クラスターにコーディネートする。【００８９】
結果は、CV膜上で培養したヒトiPS細胞由来肝細胞は成熟肝細胞に似ており、NF又は2D環境で培養したものとは異なる遺伝子発現プロファイルを示すことを示唆している。【００９０】
（４）ヒトiPS細胞由来肝細胞の代謝酵素活性の機能解析
CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6及びCYP3A4は、肝臓の薬物代謝に関与する主なシトクロムP450酵素であるため、iPS細胞由来肝細胞における酵素活性を調べた。代謝酵素の機能を評価するために、フェナセチン、ブフラロール塩酸塩、ジクロフェナク、S-メフェニトイン及びミダゾラムを混合物として添加して試験し、代謝産物であるアセトアミノフェン、1'-OHブフラロール、4'-OHジクロフェナク、4-OHメフェニトイン、及び1-OHミダゾラムをそれぞれLC / MSにより分析した。この一連の実験では、陽性対照として、4時間（pre-4h）及び48時間（pre-48h）予備培養した初代培養肝細胞を使用した。【００９１】
ヒトiPS細胞由来肝細胞においてCYP1A2、2C19、2D6及びCYP3A4活性の結果として高レベルの代謝物が検出された。CYP1A2又はCYP3A4活性によって生成された代謝産物は、47日目のヒトiPS細胞由来肝細胞においてそれぞれ約0.2又は0.5nmol / mgタンパク質/分であり、pre-4hの初代培養肝細胞及びpre-48hの初代培養肝細胞より有意に高かった。32日目におけるCYP2C19活性は、pre-48の初代培養肝細胞よりも有意に高く、47日目のヒトiPS細胞由来肝細胞は、pre-4hの初代培養肝細胞とほぼ同等であり、pre-48hの初代培養肝細胞より高かった。32日目又は47日目のヒトiPS細胞由来肝細胞におけるCYP2D6活性は、pre-48hの初代培養肝細胞とほぼ同等であった。 CYP2C9活性も、pre-48hの初代培養肝細胞よりも低いレベルであったが、検出された（図6）。【００９２】
重要なことに、本発明者らの結果はまた、CV上で培養させたヒトiPS細胞由来肝細胞におけるCYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6及びCYP3A4の代謝酵素活性が、培養において2週間以上維持され得ることを示す。【００９３】
（Ｃ）考察
現在の研究では、ヒトiPS細胞由来内胚葉細胞をCV膜上で培養することにより、成熟肝細胞の特徴を示すヒトiPS細胞由来肝細胞の生成を実証した。CV膜上で培養されたヒトiPS細胞内胚葉細胞は、未成熟マーカーであるAFP又はAPOA4の発現を徐々にダウンレギュレートし、次いで、PROX1、HHEXのような成熟肝細胞転写因子及びNR1H4及びNR1I3のような核内受容体をアップレギュレートした。肝臓の分化及び成熟に重要な多くの標的遺伝子が核内受容体によって調節される点で、核内受容体のアップレギュレーションは重要である。NR1H4は、胆汁酸合成、解毒及び輸送を調節する重要な転写因子であり、CYP3A4、CYP7A1、SLCO1B1（Calkin and Tontonoz, 2012, Nat Rev Mol Cell Biol 13, 213-224）の転写調節にも関与している。NR1I3は、広範囲の代謝第I相CYP酵素、及び第II相薬物代謝に関与する酵素ならびにトランスポータータンパク質の発現に影響を及ぼすことが知られている（Godoy et al., 2013, cell signaling and ADME）。これらの特徴は、ヒトiPS細胞分化の後期段階で、成熟肝細胞マーカーALB、ASGR1及びSERPINA1のアップレギュレーションをもたらした。薬物取り込みトランスポーターSLCO1B1、SLC22A1、第II相酵素UGT1A1、排出トランスポーターABCC3及び多くのCYP酵素がヒトiPS細胞由来肝細胞で発現される。肝臓中の薬物のかなりの部分の代謝に関与するCYP1A1,1A2,2A6,2C8,2D2,2E1及び3A4のようなCYP酵素（Terada and Hira, 2015, J. Gastroenterol. 50, 508-519）は、CV膜上で培養したヒトiPS細胞由来肝細胞において実質的なレベルで発現される。ヒトiPS細胞由来肝細胞は、初代培養肝細胞（前培養なし）の約1/50倍のCYP3A4を発現した。特に、CYP1A2、2D6、2C9、2C19、3A4の代謝酵素活性が観察されたことは重要である。その中でも、ヒトiPS細胞由来肝細胞のCYP1A2、CYP3A4活性は初代培養肝細胞（前培養4時間）よりも高く、CYP2C19活性は前培養48時間の初代培養肝細胞よりも高く、CYP2D6の活性は前培養48時間の初代培養肝細胞と同等であったことは重要である。培養32日から47日までのヒトiPS細胞由来肝細胞において酵素活性が観察され、これにより代謝酵素活性が少なくとも2週間維持されたことが示唆された。【００９４】
本発明者は、インテグリンベータ1の活性化によるES細胞又はiPS細胞の分化増強における基底膜基質の重要性を以前に報告した。ES細胞又はiPS細胞は細胞外シグナルを感知して伝達し、ヘパリン硫酸プロテオグリカン（HSPG）を分泌する。これは、誘導因子シグナルを媒介する成長因子受容体を有する細胞の近傍で作用する（Higuchi et al., 2010, J. Cell Sci.；Shiraki et al., 2011, PLoS One 6, 1-10）。2D細胞培養において肝細胞の脱分化及び肝機能の低下が起きること、肝臓中の細胞が機械的感受性であること、ならびにマトリックスの剛性が重要であることが以前に報告されている（Godoy et al., 2009, Hepatology 49, 2031-2043；Wells, 2008, Hepatology 47, 1394-1400）。細胞外マトリックスを模倣する3D微小環境を提供するマトリックスは、ES細胞又はiPS細胞の分化を支持し得る（Gieseck et al., 2014, PLoS One 9；Yamazoe et al., 2013, J. Cell Sci. 126, 5391-9）。CV膜は、3-D構造形成を支持し、適切な剛性を提供することが報告されており、iPS細胞由来肝細胞の成熟増強のための重要な鍵となる可能性がある。本発明者はまた、ヒトiPS細胞由来内胚葉細胞の細胞接着をCV膜上で増強したことを観察した。これは、ヒトiPS細胞由来内胚葉細胞の再プレーティング時の細胞生存率の増加をもたらした。CV膜の透過性はまたヒトiPS細胞由来肝細胞の成熟を促進するための重要な因子であり得る。まとめると、CV膜は、in vivoを模倣した適切な環境を提供し、ヒトiPS細胞由来肝細胞の分化及び成熟を増強する。【００９５】
現在のプロトコールで指摘されている別のポイントは、凍結されたiPS細胞由来内胚葉細胞株の使用である。M15はES細胞又はiPS細胞から効率的に内胚葉細胞を誘導することが示された（Shiraki et al., 2008, Stem Cells 26, 874-85）。M15システムを用いることにより、多数のヒトiPS細胞由来内胚葉細胞を効率的に得ることができ、ヒトiPS細胞由来肝細胞の迅速な分化が可能になった。一般に、5x105の未分化ヒトiPS細胞から出発して、100mm直径のプレート上のM15フィーダーの1バッチから4x107 のヒトiPS細胞由来内胚葉細胞を得ることができた。【００９６】
肝分化能はヒトES細胞又はiPS細胞株によって異なることが報告されている（Kajiwara et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 14716；Takayama et al., 2014, Biomaterials 34, 1781-1789）。したがって、成熟肝細胞に分化することができる有能なiPS細胞株を選択することが重要である。ここでは、以前に成熟機能性肝細胞に分化することが報告されているChiPS18細胞株を使用した（Asplund et al., 2015, Stem Cell Rev. Reports）。本発明者は現在、他の細胞株を使用しており、CV膜が異なるヒトiPS細胞株に適用可能であるかどうかを試験している。【００９７】
要約すると、本発明者は、CV膜がヒトiPS細胞の肝細胞への分化及び成熟を支持する適切な基質であることを見出した。 CV膜上に成長した本発明者らの現在のヒトiPS細胞由来肝細胞は、初代培養肝細胞に似た多くの特徴を示す。ヒトiPS細胞由来肝細胞が、初代培養肝細胞（前培養4時間又は前培養48時間）に匹敵する高い代謝CYP酵素活性を示したことは注目に値する。ヒトiPS細胞由来肝細胞は、高レベルで多くの成熟肝細胞マーカーを発現した。まとめると、本発明者の結果は、作製されたヒトiPS細胞由来肝細胞が肝細胞に似ており、in vitro肝毒性研究及び疾患モデリングのための優れたモデルを提供することを示唆している。【００９８】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明は、肝細胞に関するものなので、この細胞を使用する産業分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月28日(2020.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
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【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
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【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
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【国際調査報告】
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