(57)【要約】  本発明は、特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作されている多能性細胞を用いて体細胞キメラを作製する方法を提供する。本発明は、特に、多能性細胞が、体細胞キメラ動物において、脳や生殖腺に寄与することを防ぐ方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞キメラ動物を作製する方法であって、
多能性細胞を胚に導入して体細胞キメラ動物を得ること
を含み、
多能性細胞は、特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作されている、
方法。
【請求項２】
体細胞キメラ動物を作製することに用いるための組成物であって、多能性細胞を含み、多能性細胞は、特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作されている、組成物。
【請求項３】
特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が、生殖細胞に必須の遺伝子が破壊された細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が、生殖細胞に必須の遺伝子が破壊された細胞である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウト細胞、Ｏｔｘ２遺伝子のノックアウト細胞、またはＰｒｄｍ１４遺伝子とＯｔｘ２遺伝子のダブルノックアウト細胞である、請求項１または３に記載の方法。
【請求項６】
特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウト細胞、Ｏｔｘ２遺伝子のノックアウト細胞、またはＰｒｄｍ１４遺伝子とＯｔｘ２遺伝子のダブルノックアウト細胞である、請求項２または４に記載の組成物。
【請求項７】
体細胞キメラ動物および多能性細胞が、雌である、請求項３または５に記載の方法。
【請求項８】
体細胞キメラ動物および多能性細胞が、雄である、請求項３または５に記載の方法。
【請求項９】
体細胞キメラ動物の製造における多能性細胞の使用であって、多能性細胞は、特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作されている、使用。
【請求項１０】
体細胞キメラ非ヒト動物であって、特定の種類の細胞は宿主動物由来の細胞からなる、動物。
【請求項１１】
生殖細胞が宿主動物由来の細胞からなる、請求項１０に記載の体細胞キメラ非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分化ポテンシャルを改変した多能性幹細胞の動物の作製への応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子改変動物は、遺伝子の生体内での機能を解析するために多用されており、外来遺伝子を導入するトランスジェニック動物、および、内在性遺伝子を破壊するノックアウト動物が知られている。【０００３】
遺伝子改変動物の作製は、野生型の動物胚に目的の遺伝子改変を有する多能性細胞を導入すること、または動物胚に直接目的の遺伝子改変を導入することにより行われる。目的の遺伝子改変を有する多能性細胞を導入した動物胚を偽妊娠仮親の子宮に移植して発生させると動物胚から発生する個体は、細胞の一部は野生型の細胞からなり、他の部分は遺伝子改変を有する細胞からなるというキメラ状態となる。【０００４】
非特許文献１は、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウトマウスが生殖細胞を欠失することを開示する。Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウトマウスは、生殖細胞が欠失するので交配させることができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Yamaji, M. et al., Nature Genetics, 40(8):1016-1022, 2008
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、分化ポテンシャルを改変した多能性幹細胞の動物の作製への応用を提供する。
【０００７】
本発明者らは、本発明において分化ポテンシャルを改変した多能性細胞を動物胚に導入することにより、当該動物胚を成長させて得られる動物において、多能性細胞の体内分布を制御することを提案する。
本発明者らは、例えば、遺伝子操作細胞（例えば、ノックアウト細胞、ノックダウン細胞やトランスジェニック細胞）を胚に導入することによって、当該細胞を標的組織への分化を抑制または喪失させるものである（標的組織以外の組織には遺伝子操作細胞自体の本来的に有するキメラ形成能に従って分化を許してもよい）。
これにより、本発明者らは、例えば、標的組織は胚由来の細胞から本質的になるが、その他の組織は胚由来細胞と胚導入細胞由来細胞のキメラ状態である動物を創出させようとするものである。
【０００８】
本発明は、このような思想に基づく発明である。すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）体細胞キメラ動物を作製する方法であって、
多能性細胞を胚に導入して体細胞キメラ動物を得ること
を含み、
多能性細胞は、特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作されている、
方法。
（２）体細胞キメラ動物を作製することに用いるための組成物であって、多能性細胞を含み、多能性細胞は、特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作されている、組成物。
（３）特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が、生殖細胞に必須の遺伝子が破壊された細胞である、上記（１）に記載の方法。
（４）特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が、生殖細胞に必須の遺伝子が破壊された細胞である、上記（２）に記載の組成物。
（５）特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウト細胞、Ｏｔｘ２遺伝子のノックアウト細胞、またはＰｒｄｍ１４遺伝子とＯｔｘ２遺伝子のダブルノックアウト細胞である、上記（１）または（３）に記載の方法。
（６）特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウト細胞、Ｏｔｘ２遺伝子のノックアウト細胞、またはＰｒｄｍ１４遺伝子とＯｔｘ２遺伝子のダブルノックアウト細胞である、上記（２）または（４）に記載の組成物。
（７）体細胞キメラ動物および多能性細胞が、雌である、上記（３）または（５）に記載の方法。
（８）体細胞キメラ動物および多能性細胞が、雄である、上記（３）または（５）に記載の方法。
（９）体細胞キメラ動物の製造における多能性細胞の使用であって、多能性細胞は、特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作されている、使用。
（１０）体細胞キメラ非ヒト動物であって、特定の種類の細胞は宿主動物由来の細胞からなる、動物。
（１１）生殖細胞が宿主動物由来の細胞からなる、上記（１０）に記載の体細胞キメラ非ヒト動物。
【０００９】
本発明によれば、キメラ状態が制御された体細胞キメラ動物を作製する際に有用である。このような体細胞キメラ動物の作製は、導入細胞と宿主動物との情報ネットワークの解析に有利に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、野生型または雄若しくは雌のＰｒｄｍ１４遺伝子ノックアウトＥＳ細胞を野生型胚に導入して得られた体細胞キメラ動物における、胚導入細胞のキメラ率を示す。
【図２】図２は、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによる破壊方法と破壊されたＰｒｄｍ１４遺伝子を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、細胞特異的な細胞死誘導システムの一例を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、細胞特異的な細胞死誘導システムの一例を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、細胞特異的な細胞死誘導システムの一例を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、細胞特異的な細胞死誘導システムの一例を示す。
【図４】図４は、Otx2ノックアウトES細胞の作製法を示す。
【図５】図５は。Otx2ノックアウトであるES細胞を野生型胚に導入して得られた個体における、全体的な移植細胞の分布および脳の組織切片の免疫化学染色の結果を示す。
【図６】図６は、Prdm14ノックアウト（Prdm14-/-）かつOtx2ノックアウト（Otx2-/-）であるGFP発現ES細胞を、Pdx1-/-胚に導入して得られた個体（#11）の膵臓のGFPの発現を示す。
【図７】図７は、耐糖能試験により#11個体の膵臓が正常な機能を有することを示す。また、#11個体と野生型マウスとの交雑試験の結果得られた産仔のPdx1遺伝子の遺伝子型を示す。
【発明の具体的な説明】
【００１１】
本明細書では、「生殖細胞」とは、生殖細胞を形成する特異な細胞集団として始原生殖細胞から分化して生じる細胞種であって、始原生殖細胞から精子および卵などの配偶子が形成されるまでの分化過程で生じるすべての生殖細胞系列の細胞種を指す。
【００１２】
本明細書では、「発生段階において自己の生殖細胞を欠損する動物」またはその胚とは、発生段階において自己の生殖細胞を生じない動物またはその胚を意味する。例えば、そのような動物としては、発生段階において自己の生殖細胞を欠損する細胞自律的（cell-autonomous）な異常を有する動物が挙げられる。
【００１３】
本明細書では、「分化ポテンシャル」とは、多能性細胞に対して用いられるとき、当該多能性細胞が胎児や成体に存在する各組織への分化の能力を意味する。
【００１４】
本明細書では、「細胞自律的な異常」とは、細胞が有する異常が当該細胞に対する影響しか質的にまたは量的に実質的に有しないことを意味する。「細胞自律的な異常」は、好ましくは他の細胞に働きかける機構の異常ではない。「細胞自律的な異常」は、例えば、その異常を有する細胞にのみ影響が生じる異常であるから、正常な細胞を導入すると、その細胞は、当該宿主からは異常の影響を受けない。「細胞自律的な異常」としては、例えば、組織特異的な細胞死を誘発する改変、および、組織分化に必要でかつ細胞自律的な因子を欠損した改変が挙げられる。
【００１５】
本明細書では、「動物」とは、哺乳動物および鳥類を意味する。動物としては、特に限定されないが、例えば、マウスおよびラットなどの齧歯類、ブタおよびウシなどの家畜動物、イヌおよびネコなどの愛玩動物、ニワトリなどの鳥類、並びにサルなどの霊長類が挙げられる。本明細書では、動物は非ヒト動物である。
【００１６】
本明細書では、「同種」とは、同種同系および同種異系を意味し、「異種」とは、動物分類学上の種が異なることを意味する。
【００１７】
本明細書では、「体細胞キメラ動物」とは、ある個体の細胞と別の個体の細胞（例えば、同種異系の細胞、または１以上の遺伝子操作が加えられた同種同系細胞若しくは同種異系細胞）とが細胞レベルで混在した組織または臓器を有する動物を言う。本発明では、体細胞キメラ動物は、胚（例えば、桑実胚や胚盤胞）に複数個（例えば、１０個程度）の多能性細胞を導入することにより得ることができる。より具体的には、胚としては、８細胞期の胚から胚盤胞期の胚まで様々な胚を用いることができ、また、このような動物胚に多能性細胞を導入する方法は当業者に周知である。胚盤胞期の胚に細胞を導入する場合には、例えば、卵割腔に細胞を導入することができる。桑実胚期までの初期胚であれば、細胞を接触させることにより集合させてもよい。多能性細胞としては、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞や内部細胞塊（ＩＣＭ）などの多能性細胞が挙げられ、本発明において胚に導入することができる。胚に導入する多能性幹細胞の数も、適宜決定することができ、特に限定されないが例えば、胚に導入する場合には３個〜１０個程度とすることができる。
【００１８】
本明細書では、「宿主動物」とは、体細胞キメラ動物を作製する際に多能性細胞を導入する胚を意味する。
【００１９】
本明細書では、「胚導入細胞」とは、体細胞キメラ動物を作製する際に胚に導入する細胞を意味する。
【００２０】
本明細書では、「多能性細胞」（pluripotent cell）とは、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞、並びに、内部細胞塊（ＩＣＭ）などの多能性細胞を意味する。多能性細胞は、胎児または成体のあらゆる細胞に分化できることで知られる。
【００２１】
本明細書では、「遺伝子操作」とは、遺伝子発現の改変および遺伝子改変を意味する。
【００２２】
本明細書では、遺伝子発現の改変は、遺伝子発現の増強または減弱を生じる改変を意味する。遺伝子発現の増強は、内因性遺伝子を１以上の制御配列に作動可能に連結して細胞内で強く発現させることにより行われ得る。遺伝子発現の減弱は、内因性遺伝子に対するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡおよびその核酸誘導体（例えば、架橋核酸（ＢＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、異なる種類の核酸を含むハイブリッド核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）など）、並びにｓｈＲＮＡおよびその核酸誘導体などのノックダウン技術により行われ得る。
【００２３】
本明細書では、「遺伝子改変」とは、遺伝子が野生型と異なることを意味し、天然の改変および人工の改変が含まれる。遺伝子改変の代表的な例としては、トランスジェニックおよびノックアウトが挙げられる。
【００２４】
本明細書では、「交配」とは、次世代を得るために生物の二個体間で受精を行って当該二個体を親とする産仔を得ることを意味する。交配としては、人工授精により交配すること、および生殖を目的として雄と雌とを対合させることが挙げられる。
【００２５】
本発明によれば、体細胞キメラ動物の作製において、分化ポテンシャルを改変した多能性細胞を胚に導入することを含む、方法が提供される。
【００２６】
本発明のある態様では、分化ポテンシャルを改変した多能性細胞としては、例えば、特定の種類の細胞に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞が挙げられる。これにより、本発明では、当該特定の種類の細胞は、胚由来の細胞から本質的になり、それ以外の細胞は、胚導入細胞のキメラ形成能に応じて胚由来の細胞と胚導入細胞由来の細胞とからなる体細胞キメラ動物およびその作製方法が提供されることとなる。
【００２７】
本発明のある態様では、分化ポテンシャルを改変した多能性細胞としては、好ましくは細胞自律的な異常（cell autonomous defect）を有し得る。例えば、特定の種類の細胞に分化する際に誘導される遺伝子のエンハンサーおよび／またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子を有する多能性細胞は、特定種類の細胞に分化しようとすると自律的に死滅するため、細胞自律的な異常を有し、分化ポテンシャルを改変した多能性細胞として用いることができる。
【００２８】
本発明のある態様では、細胞自律的な細胞死を誘導することもできる。細胞死の誘導は、例えば、薬剤誘導性遺伝子発現システム（例えば、テトラサイクリン応答性発現誘導システム）と組み合わせることで、Ｃａｓｐａｓｅ−８、Ｃａｓｐａｓｅ−９、Ｂａｒｎａｓｅ、およびジフテリアトキシンなどの細胞障害性遺伝子を、胎内の薬物（例えば、ドキシサイクリン）濃度依存的に特定細胞（例えば、生殖細胞）で発現させることによって達成され得る。以下、細胞特異的に細胞傷害性を発生させる方法の例を図３Ａ〜Ｄを参照して説明する。
【００２９】
図３Ａは、細胞特異的プロモーターと薬剤誘導性遺伝子発現システムと組み合わせて細胞特異的に薬物濃度依存的な細胞死を誘導する系において、薬剤誘導性遺伝子発現システムがＴｅｔ−Ｏｎシステムである系を例示する。図３Ａでは、細胞特異的プロモーターに作動可能にリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）が連結されている。この系が組込まれた胎児は、細胞特異的にｒｔＴＡを発現している。ここで、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）などのテトラサイクリン系化合物により、ｒｔＴＡが発現する細胞でのみ、細胞傷害性遺伝子が誘導され、細胞特異的に細胞死を誘発させることができる。
【００３０】
同じ目的の他の方法としては、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰなどの遺伝子組換えシステムによって細胞特異的に細胞障害性遺伝子を発現させる方法が挙げられる。図３Ｂは、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰなどの組織特異的遺伝子組換えシステムを用いて細胞特異的に細胞死を誘導する系を例示する。図３Ｂでは、構成的活性化型プロモーターの下流に、生理学的に意味の無い遺伝子（ダミー遺伝子）と細胞傷害性遺伝子とを連結させている。この状態では、細胞が細胞死を誘発することがない。しかし、上記においてダミー遺伝子の上流と下流にＬｏｘＰ配列を配置されている。また、この細胞は、細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅを有する。この系では、細胞が特定細胞に分化すると、細胞特異的プロモーターにより駆動されるＣｒｅが細胞特異的に発現し、ＬｏｘＰ配列に作用してダミー遺伝子を除去し、これにより、構成的活性化型プロモーターに作動可能に細胞傷害性遺伝子を連結し、細胞特異的に細胞傷害性遺伝子を発現させ、結果として細胞特異的に細胞を誘発することができる。この系において、Ｃｒｅリコンビナーゼに代えて、４−水酸化タモキシフェンにより活性化されるＣｒｅＥＲを用いてもよいであろう。ＣｒｅＥＲは、Ｃｒｅリコンビナーゼとエストロゲン受容体のリガンド結合領域の変異体との融合タンパク質として知られ、４−水酸化タモキシフェンにより活性化される。
【００３１】
同じ目的のさらに他の方法としては、細胞特異的に細胞障害性シグナルのレセプターを発現させたのちに任意のタイミングでリガンドを作用させて細胞特異的に細胞死を誘導する方法が挙げられる。この場合、細胞傷害性シグナルのレセプターを発現しない細胞は、リガンドに非感受性であることが好ましい。図３Ｃは、細胞特異的プロモーターに作動可能に細胞傷害性シグナルレセプターを連結した系を細胞に組込んでいる。細胞が特定細胞に分化すると、細胞表面に細胞傷害性シグナルレセプターが発現し、リガンド依存的に細胞死が誘発される。細胞傷害性シグナルレセプターとそのリガンドの例としては、ジフテリアトキシンレセプターとジフテリアトキシンが挙げられる。
【００３２】
同じ目的のさらに他の方法としては、化合物誘導性細胞障害システムが例示できる。他化合物誘導性細胞傷害システムの例としては、HSV-TK/GCVシステム(Moolten FL et al., Hum. Gene Ther. 1990; 1: 125-134) を用いる系や、inducible caspase-9 (Straathof KC et al., Blood 2005; 105: 4247-4254)を用いる系が挙げられる。
図３Ｄは、HSV-TK/GCVシステムを例示する。具体的には、ガンシクロビル（ＧＣＶ）は、非リン酸化形態では細胞傷害性が弱い。しかしながら、ヘルペスウイルス属が有するチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）を作用させると、ＧＣＶはリン酸化され、ＧＣＶ三リン酸に変換され、細胞傷害性を獲得する。従って、ＨＳＶ−ＴＫを細胞特異的プロモーターに作動可能に連結し、ＨＳＶ−ＴＫを細胞特異的に発現させることにより、細胞特異的に細胞死を誘発できる。また、inducible caspase-9は、caspase-9において、ＣＡＲＤがＦＫＢＰ１２により置き換えられたタンパク質であり、ＡＰ１９０３などのタクロリムス誘導体存在下でのみ二量体化することができ、活性化して細胞に細胞死を誘発させることができる。inducible caspase-9を細胞特異的プロモーターに作動可能に連結した系を導入した細胞が特定細胞に分化すると、タクロリムス誘導体により細胞特異的に細胞死が誘発される。
【００３３】
本発明においては、これらの方法をさらに組み合わせて用いてもよい。当業者であれば、本明細書の内容および技術常識に基づいて細胞特異的な細胞死の誘導を実現することができるであろう。
【００３４】
本発明のある態様では、例えば、細胞自律的な異常は、生殖細胞において発生させうる。例えば、生殖細胞特異的な発現を示す遺伝子、例えば、Ｐｒｄｍ１４、Ｎａｎｏｓ２、Ｎａｎｏｓ３、ＤＤＸ４、およびＳｏｘ１７などのエンハンサーおよび／またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子を有する多能性細胞は、生殖細胞に分化しようとすると自律的に死滅するため、体細胞キメラ動物において生殖細胞には寄与しない。本発明のある態様では、生殖細胞特異的な発現を示す遺伝子は、例えば、生殖細胞に一時期または長期に特異的に発現する遺伝子とすることができる。
【００３５】
本発明のある態様では、例えば、多能性細胞の大脳皮質への寄与を制限することができる。例えば、前脳（将来の大脳）特異的な発現を示す遺伝子、例えばＯｔｘ１やＯｔｘ２、のエンハンサーおよび／またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子を有する多能性細胞は、前脳に規定された細胞が死滅するため、体細胞キメラ動物において大脳皮質には寄与しない。本発明のある態様では、前脳特異的な発現を示す遺伝子は、例えば、前脳領域に一時期または長期に特異的に発現する遺伝子とすることができる。このようにすることで、胚導入細胞が脳に寄与することの不都合、例えば、脳の高次機能における障害の発生等を回避し得る。
【００３６】
また、ある態様では、精子特異的に発現するＩｚｕｍｏ遺伝子を欠損させると精子は形成されるものの、形成された精子は受精する機能を有さないことが知られているが、このような遺伝子欠損を用いて配偶子を機能不全にしてもよい。
【００３７】
また、ある態様では、Ｉｚｕｍｏのような精子特異的なプロモーター／エンハンサーに細胞傷害性遺伝子を組みあわせ、配偶子を除去してもよい。同様に、配偶子に特異的に発現する遺伝子、例えば精子に特異的に発現する遺伝子であるＴｐａｐ、Ａｃｒｏｓｉｎ、Ｔｒａ９８、卵に特異的に発現する遺伝子であるＧｄｆ９、Ｚｐ１、Ｚｐ３などのプロモーター／エンハンサーに細胞障害遺伝子を組み合わせることで、配偶子形成過程において配偶子を除去することもできる。
【００３８】
さらに別のある態様では、生殖細胞特異的に起る現象である減数分裂に関わる遺伝子、例えばＤａｚｌ、Ｓｔｒａ８、Ｔａｆ７ｌ、またはＳｙｃｐ３などのプロモーター／エンハンサーを利用して、生殖細胞の形成を避けることもできる。
【００３９】
また、本発明のある態様では、胚導入細胞としては、生殖細胞への分化に必須の遺伝子が破壊された細胞を用いることができる。
【００４０】
Ｐｒｄｍ１４は、ＰＲドメイン含有タンパク質１４（PR domain-containing protein 14）をコードする遺伝子である。Ｐｒｄｍ１４は、ＰＲドメインジンクフィンガータンパク質１４（RP domain zinc finger protein 14）とも呼ばれる。Ｐｒｄｍ１４タンパク質は、例えば、ＨＰＲＤ  ＩＤ：１１４５７で登録されたアミノ酸配列を有し、その遺伝子は、染色体上の８ｑ１３．３に位置することが知られている。また、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウトマウスでは、卵巣および精巣において生殖細胞が欠損することが知られている（Yamaji M. et al., Nature Genetics, 40: 1016-1022, 2008）。
本発明のある態様では、Ｐｒｄｍ１４遺伝子をノックアウトまたはノックダウンして生殖細胞に分化できない多能性細胞を胚導入細胞として用いてもよい。本発明のある態様では、Ｐｒｄｍ１４遺伝子のノックアウトは、例えば、遺伝子の一部若しくは全部の欠損、またはフレームシフトの導入等により行うことができる。本発明のある態様では、ノックアウトされたＰｒｄｍ１４遺伝子は、配列番号３または配列番号４の配列を有する。
【００４１】
このようにして、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞を胚導入細胞として胚に導入して体細胞キメラ動物を作製することによって、特定の種類の細胞以外は、胚導入細胞の固有のキメラ形成能に依存したキメラ状態となり、特定の種類の細胞は胚由来の細胞から本質的になる、体細胞キメラ動物を得ることができる。例えば、このようにして、本発明によれば、標的組織以外は、胚導入細胞の固有のキメラ形成能に依存したキメラ状態となり、標的組織は胚由来の細胞から本質的になる、体細胞キメラ動物を得ることもまたできる。
【００４２】
本発明によれば、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞としては、Ｐｒｄｍ１４ノックアウトかつＯｔｘ２ノックアウトである多能性細胞（例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞）を用い得る。このように、本発明は、脳および生殖腺に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞を、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞として用いる発明を提供する。
【００４３】
興味深いことに、生体では、胚導入細胞と宿主細胞とは、一方が分化し得ない組織に対しては他方が補完することができる高い柔軟性を有していることが後述する実施例から明らかとなっている。すなわち、胚導入細胞が分化しない細胞は、宿主胚の細胞が補完することかでき、結果として、胚導入細胞が分化できる細胞は、胚導入細胞と宿主胚の細胞のキメラ状態を形成し、胚導入細胞が分化しない細胞は、宿主胚由来の細胞からなることとなり、胚導入細胞の分化欠陥は宿主胚細胞により補われるため体細胞キメラ動物においては異常としては表れない。
また、臓器欠損動物の胚盤胞補完では、欠損臓器が胚導入細胞からなる臓器により補完されることが実証されている（例えば、引用することにより本願明細書の一部とされるWO2010/087459）。
【００４４】
従って、ある態様では、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞としては、Ｐｒｄｍ１４ノックアウトかつＯｔｘ２ノックアウトである多能性細胞（例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞）を用い得、かつ、胚としては、Pdx1-/-ノックアウト胚、またはPdx1-Hes1トランスジェニック胚を用いることができる。ある態様では、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞としては、Ｐｒｄｍ１４ノックアウトかつＯｔｘ２ノックアウトである多能性細胞（例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞）を用い得、かつ、胚としては、Sal1ノックアウト胚を用いることができる。
【００４５】
本発明によれば、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞としては、脳および生殖腺のいずれにも分化しないように遺伝子操作された多能性細胞を用いることができる。脳および生殖腺のいずれにも分化しないように遺伝子操作された多能性細胞は、上記の脳に分化させないための遺伝子操作と、生殖腺に分化させないための遺伝子操作によって作製され得る。
例えば、
生殖細胞特異的な発現を示す遺伝子、例えば、Ｐｒｄｍ１４、Ｎａｎｏｓ２、Ｎａｎｏｓ３、ＤＤＸ４、およびＳｏｘ１７などのエンハンサーおよび／またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子と、
前脳（将来の大脳）特異的な発現を示す遺伝子、例えばＯｔｘ１やＯｔｘ２のエンハンサーおよび／またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子と
の両方を有する多能性細胞は、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞として用い得る。
また、例えば、
配偶子に特異的に発現する遺伝子、例えば精子に特異的に発現する遺伝子である、Ｉｚｕｍｏ、Ｔｐａｐ、Ａｃｒｏｓｉｎ、もしくはＴｒａ９８、または、卵に特異的に発現する遺伝子であるＧｄｆ９、Ｚｐ１、もしくはＺｐ３などのプロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子と
前脳（将来の大脳）特異的な発現を示す遺伝子、例えばＯｔｘ１やＯｔｘ２、のエンハンサーおよび／またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子と
の両方を有する多能性細胞は、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞として用い得る。
また、例えば、
生殖細胞特異的に起る現象である減数分裂に関わる遺伝子、例えばＤａｚｌ、Ｓｔｒａ８、Ｔａｆ７ｌ、またはＳｙｃｐ３などのプロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子と、
前脳（将来の大脳）特異的な発現を示す遺伝子、例えばＯｔｘ１やＯｔｘ２、のエンハンサーおよび／またはプロモーターに作動可能に連結した細胞傷害性遺伝子と
の両方を有する多能性細胞は、特定の種類に分化しないように遺伝子操作された多能性細胞として用い得る。
【００４６】
このようにすることで、得られる個体中の特定種類の細胞のみを胚導入細胞由来とすることもできるし、得られる個体中の特定種類の細胞のみを宿主胚細胞由来とすることもできる。従って、本発明は、特定組織のみを遺伝子操作細胞からなるものとすること、特定組織のみを野生型細胞からなるものとすること、またはキメラ状態にすることを自在に制御する技術、およびこれらを相互に比較して特定組織における操作遺伝子の機能を解析する技術を提供する。そうすると、本発明により、体細胞キメラ動物のキメラ状態制御技術は、これまでのキメラ状態制御技術に新しい選択肢を与えるものでもある。
従って、本発明のある態様では、体細胞キメラ動物を作製する方法であって、多能性細胞を胚に導入して体細胞キメラ動物を得ることを含み、多能性細胞は、特定種類の細胞に分化しないように遺伝子操作されており、胚は、多能性細胞とは別の特定種類の細胞を欠損するように遺伝子操作されている、方法が提供される。このような胚の遺伝子操作としては、Pdx1遺伝子のノックアウト、またはPdx1-Hes1トランスジェニックによる膵臓の欠損、および、Sal1遺伝子のノックアウトによる腎臓の欠損等が挙げられる。
本発明のある態様では、胚において特定種類の細胞を欠損する遺伝子操作としては、特定種類の細胞に特異的なプロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結した細胞障害性遺伝子を搭載させることが挙げられる。いくつかの態様では、特定細胞または組織が欠損するとしられている遺伝子改変（例えば、ノックアウトまたはトランスジェニック）によって、胚を遺伝子操作してもよい。従って、本発明のある態様では、胚は、特定種類の細胞に特異的なプロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結した細胞障害性遺伝子を有するか、または、特定細胞または組織が欠損するように遺伝子が改変されていてもよい。
【００４７】
本発明のある態様では、細胞を導入する胚としては、脊椎動物由来の胚、例えば、非ヒト哺乳動物由来の胚、例えば、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、サル、マーモセットおよびボノボなどの非ヒト霊長類由来の胚；ブタ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマおよびイヌなどの非ヒト哺乳動物由来の胚（例えば、食肉類、偶蹄類、奇蹄類およびげっ歯類の胚）；並びに、ニワトリなどの鳥類の胚が挙げられる。
【００４８】
本発明のある態様では、胚導入細胞としては、特に限定されないが、ヒトおよびサルなどの霊長類の多能性細胞、並びに、ブタ、ウシ、ヒツジおよびヤギなどの哺乳類の多能性細胞などを挙げることができる。本発明のある態様では、胚導入細胞は、ヒト多能性細胞である（例えば、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞）。
【００４９】
本発明では、胚と、胚に導入される細胞の種は、同種の関係であってもよいし、異種の関係であってもよい（例えば、引用することにより本願明細書の一部とされるWO2010/087459）。本発明では、胚と胚導入細胞の種の組み合わせとしては、マウスとラットとの組み合わせが挙げられ、マウスとラット間では胚盤胞補完によるキメラ動物の作製にも成功している（引用することにより本願明細書の一部とされるWO2010/021390およびWO2010/087459）。マウス−ラット間の遺伝的な距離は、ヒト−ブタ間の遺伝的距離に相当する。従って、マウス−ラット間での異種間キメラ動物の作製が成功するということは、それよりも遺伝的な距離の近い種間であれば十分に異種間キメラ動物を作製することができることを意味する。WO2014119627では、ヒトとマウス間、またはマーモセットとマウス間で体細胞キメラ動物が得られている。従って、仮にげっ歯類と霊長類との組合せであったとしてもキメラ動物を形成させることは可能である。そして、げっ歯類と霊長類との相違と比べて小さな相違を有すると考えられる種間では異種間でキメラ動物を作製することができる。これらのことから、本発明で用いられ得る胚と胚導入細胞の異種間の組み合わせとしては、マウス−ラット以外では、例えば、非ヒト哺乳動物同士の組み合わせ、鳥類同士の組み合わせ、ヒトと非ヒト霊長類動物との組み合わせ、ヒトとニワトリの組み合わせ、ヒトとブタとの組み合わせ、ヒトとウシとの組み合わせ、ヒトとヤギとの組み合わせ、ヒトとヒツジとの組み合わせ、非ヒト霊長類動物同士の組み合わせ、非ヒト霊長類動物とブタ、ウシまたはヒツジとの組み合わせ、ウシとブタ、ヒツジ、ヤギ若しくはウマとの組み合わせ、または、ブタとヒツジ、ヤギ若しくはウマとの組み合わせなどを挙げることができる。また、ヒトと、食肉類、偶蹄類または奇蹄類のいずれかに属する動物との組み合わせとしてもよいし、同じ属、類または科に属する動物同士の組み合わせとしてもよいであろう。マウスとラットは染色体数が異なるが、マウス−ラット間ではキメラ動物の作製が可能であることから、染色体数が異なっていたとしても、キメラ動物の作製の可能性が否定されるものではない。
【００５０】
多能性細胞のキメラ形成能は、細胞毎に異なると考えられる（例えば、図１の「野生型」パネル参照）。従って、特定の種類の細胞以外では、所望のキメラ状態が得られる多能性細胞を選択して用いることができる。キメラ状態は、多能性細胞のキメラ形成能に依存し、キメラ形成能が高い場合には多能性細胞由来の細胞の割合が増え、キメラ形成能が弱い場合には、多能性細胞由来の細胞の割合が減る。キメラ形成能は、胚導入細胞および／または胚を標識し、体細胞キメラ動物を作製して、得られた体細胞キメラ動物中の標識を有する細胞の割合を指標として決定することができる。
従って、本発明は、ある態様では、所望のキメラ形成能を有する多能性細胞を選択することと、得られた多能性幹細胞の分化ポテンシャルを改変することとを含んでいてもよい。キメラ形成能の指標としては、キメラ形成能の強さ、または組織毎のキメラ形成能の強弱のバランスが挙げられ、これらを指標として所望のキメラ形成能を有する多能性細胞を選択すればよい。
【００５１】
体細胞キメラ動物は、胚に胚導入細胞を導入した後は、偽妊娠の雌仮親の子宮に着床させ、胎児に成長させることができる。体細胞キメラ動物は、胎児として、産仔として、または成体として得てもよい。
【００５２】
本発明によれば、生殖細胞に分化しないように遺伝子操作されている多能性細胞を胚に導入すると、生殖細胞は宿主側の細胞から本質的になることとなる。すると、宿主動物と胚導入細胞との遺伝子型が異なる場合には、得られる体細胞キメラ動物の生殖細胞が宿主動物の遺伝子型を有することとなり、体細胞キメラ動物を交配させて得られる胎児または産仔は、宿主動物の遺伝子型を有することとなる。このようにすると、体細胞キメラ動物を交配させて得られる胎児または産仔の遺伝子型を宿主動物の遺伝子型と一致させることができる（または、少なくともその確率が高まる）点で有利である。
【実施例】
【００５３】
実施例１：Ｐｒｄｍ１４遺伝子ノックアウト多能性細胞の作製
本実施例では、Ｐｒｄｍ１４遺伝子を破壊したノックアウト多能性細胞を作製した。【００５４】
キメラ率の測定のため、多能性細胞としてはＥＧＦＰを発現させた胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いた。多能性細胞は、雄と雌の細胞をそれぞれ用意した。具体的には、ＥＧＦＰトランスジェニックマウスの雄とＣ５７ＢＬ６／Ｎ（すべて日本ＳＬＣから購入）の雌を交配させ得られた雄および雌の胚からそれぞれ雄性ES細胞株（SGE2）と雌性ES細胞株（SGE-F13）を樹立した。本実施例では、これらのＥＳ細胞を野生型ＥＳ細胞と呼ぶこととする。【００５５】
次に、野生型ＥＳ細胞からＰｒｄｍ１４遺伝子を破壊したＥＳ細胞を作製した。具体的には、雄のＰｒｄｍ１４遺伝子を破壊したＥＳ細胞（Prdm14-/- ESC-M）は、Prdm14 gRNAを組込んだgRNA cloningベクター（Addgene, Plasmid #41824）をCas9発現ベクター（Addgene, Plasmid #41815）と共にＳＧＥ２細胞にトランスフェクションして作製した。雌のＰｒｄｍ１４遺伝子を破壊したＥＳ細胞（Prdm14-/- ESC-F）は、SGE2細胞を用いる代わりにＳＧＥ−Ｆ１３細胞を用いる以外はPrdm14-/- ESC-Mと同様に作製した。【００５６】
実施例２：キメラマウスの作製
本実施例では、実施例1で作製したPrdm14遺伝子破壊多能性細胞と野生型多能性細胞とをそれぞれ用いてキメラマウスを作製した。【００５７】
ICRマウス(日本SLCより購入)を交配し、2.5日目に胚（桑実胚）を採取した。顕微鏡下でマイクロマニピュレーターを用いて１個の胚に対して10細胞の割合で、Prdm14遺伝子破壊多能性細胞の雄若しくは雌または野生型多能性細胞を胚の腔へ注入した。その後、KSOM-AA（Millipore）で１日培養し胚盤胞にした受精卵を交配後２．５日目の偽妊娠ＩＣＲ系統マウスの子宮へと移植し、移植後１２日目（胎齢１４．５日目）に帝王切開し胎仔を取り出した。得られた胎仔を蛍光顕微鏡下で観察し、EGFPの蛍光を指標としてキメラ形成の判定を行った。【００５８】
蛍光が確認された個体（n=4）について、臓器別にキメラ率の測定を行った。具体的には、蛍光が確認されたＥ１４．５のキメラマウスそれぞれについて、表皮（ＭＥＦ）、肝臓、脳および生殖堤を回収した。ＭＥＦ、生殖堤、および脳はハサミで細切後０．０２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（invitrogen）で１０分間、３７℃で処理して細胞懸濁液とした。肝臓はピペッティングにより崩し細胞懸濁液とした。【００５９】
肝臓の懸濁液にマウスＣＤ４５−ＡＰＣ（ｅＢｉｏ）を０．５μｌ加え、生殖堤の細胞懸濁液にＳＳＥＡ１−ＡＰＣ（ｅＢｉｏ）抗体を０．５μｌ加え、遮光した氷上で３０分間静置した。肝臓、ＭＥＦ、生殖堤、および脳それぞれをリン酸緩衝食塩水（ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ；ＳＭ）で洗浄後、１μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含んだリン酸緩衝食塩水で再懸濁し、FACSAria II（BD Biosciences）と解析ソフトウェアFlow-joを使用し解析した。キメラ率は、全細胞に対するGFP陽性細胞の割合により測定した。結果は図１に示される通りであった。【００６０】
図１に示されるように、野生型多能性細胞を胚に導入した場合には、胚から得られる個体では、脳、線維芽細胞、血液（肝臓）および生殖細胞のいずれにおいても、GFP陽性細胞が一定の割合で観察された。これに対して、Prdm14遺伝子破壊多能性細胞の雄を用いた場合およびPrdm14遺伝子破壊多能性細胞の雌を用いた場合には、生殖細胞においてはGFP陽性細胞が観察されなかった。このことから、Prdm14遺伝子破壊多能性細胞は雄の生殖細胞にも雌の生殖細胞にも寄与しないことが明らかとなった。【００６１】
実施例３：Otx2遺伝子破壊多能性細胞を用いたキメラ形成
本実施例では、Otx2遺伝子を破壊した多能性幹細胞を胚に導入した。【００６２】
GFPを発現するマウスES細胞のＯｔｘ２遺伝子座をＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９を用いて広範囲に破壊した。具体的には図４に示すｇＲＮＡ１、およびｇＲＮＡ２配列をそれぞれ含むｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの複合体、ＣＡＳ９タンパク質（全てＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＡｌｔ−Ｒ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを利用）をエレクトロポレーションにより導入し、クローニングした株のうち、exon3からexon4にかけて広範囲の配列欠損が両アレルについて起こっている細胞株を０ｔｘ２-／-ES細胞とした。なお、ES細胞は黒毛色を呈するB6系統マウスとBDF1系統マウスの交配によって得られた胚(B6xBDF1)から樹立されているため、メラニンを合成できる。この細胞を白毛色である正常なマウス（ICR系統）の胚に導入したところ、GFPの発現から移植細胞は全身に分布していると考えられたにも関わらず、網膜にメラニンの蓄積が認められなかった（図５の明視野および全身GFP像）。このことから、０ｔｘ２-／-ES細胞は、全身への高いキメラ寄与能を有していたと考えられるが、前脳由来の網膜色素上皮には０ｔｘ２-／-ES細胞が寄与しなかったことが明らかとなった。また、将来大脳を形成する前脳領域の組織切片を作製し、神経上皮細胞のマーカーであるb3tublinに対する抗体（Abcam, ab18207）と抗GFP抗体（Abcam, Ab13970）で免疫染色を行った。その結果、図５に示されるように、GFPを発現する０ｔｘ２-／-ES細胞由来細胞はその他の組織には高い割合で存在するにも関わらず、前脳神経上皮（βIIIチューブリン陽性）には全く寄与が認められなかった。【００６３】
図５に示されるように、Otx2ホモノックアウトES細胞には将来的に大脳皮質を形成する細胞を含む前脳領域の神経上皮細胞に分化する能力が失われていることがわかった。【００６４】
次に、GFPを発現するPrdm14ノックアウトかつOtx2ノックアウトであるES細胞をPdx1-/-ノックアウト胚に導入して、ES細胞由来の膵臓が形成できるかを検証した。Ｏｔｘ２遺伝子の直接のターゲットにはWntアンタゴニストであるDkk1が含まれ、Wntシグナルを調節していることが知られている（Kimura et al., Developmental Cell 2005）ことから、Ｏｔｘ２がノックアウトされた細胞が正常に臓器形成できるか、また正常な機能を有する臓器となるかが不明だったためである。結果は、図６に示される通りであった。図６に示されるように、Pdx1-/-ノックアウト胚とPrdm14ノックアウトかつOtx2ノックアウトであるGFP発現ES細胞のキメラ個体（#11）において、移植したES細胞由来の膵臓（GFP陽性）が形成されていた。この膵臓の切片を作製し、抗GFP抗体（Abcam, Ab13970）と抗インスリン抗体（Abcam, Ab7842）を用いて免疫染色を行ったところ、インスリン産生細胞を含む組織標本上の全ての膵島が移植細胞由来であることが確認できた。＃１１は解析時点で生後１０週であったことから、移植細胞由来の膵臓が出生後に長期に渡って正常に機能していたことが裏付けられる。なお、＃１１の個体では、膵臓以外の組織においては、ほとんどGFP陽性の細胞が存在しなかった。＃１１に導入したES細胞のキメラ形成能が弱かったことがその理由であると考えられる。【００６５】
開腹しての解析に先立ち、生後８週の段階で＃１１および対照としてその同腹仔（＃８，＃９）について耐糖能試験を行った結果を図７に示す。耐糖能試験では150mg/mlのグルコース/生理食塩水溶液をマウスの体重１gあたり10μLを腹腔内注射し、時間経過に伴う血糖値の変化を測定した。耐糖能試験の結果、図７に示されるように、Pdx1-/-ノックアウト胚の体内で形成されたPrdm14ノックアウトかつOtx2ノックアウトであるES細胞由来の膵臓は、正常な血糖低下能を有し、機能的な膵臓であることが明らかであった。【００６６】
＃11のマウス（雌）を野生型のマウスと交配させてF1個体を得た。F1個体（n=8）においてPdx1の遺伝子型を決定した。その結果、図７に示されるように、いずれのF1個体の遺伝子型も、Pdx1+/-であった。このことは、生殖細胞に寄与した細胞は、全てPdx-/-の遺伝子型を有していたことを意味し、すなわち、Prdm14ノックアウトかつOtx2ノックアウトであるES細胞（Pdx+/+）が生殖細胞に寄与しなかったことを示す。なお、ここで用いたPdx1ノックアウトマウスのPdx1遺伝子座には、LacZ遺伝子等が挿入されている(Offield et al., Development 1996)ため、野生型(405bp)よりも大きな遺伝子増幅のバンドが検出される。【００６７】
このようにして、Prdm14遺伝子破壊多能性細胞を胚導入細胞として用いて体細胞キメラ動物を作製することにより、当該多能性幹細胞の生殖細胞への寄与を低減させる、または消失させることができる。また、Ｏｔｘ２遺伝子破壊多能性細胞を胚導入細胞として用いて体細胞キメラ動物を作製することにより、当該多能性幹細胞の大脳皮質への寄与を低減させる、または消失させることができる。【００６８】
配列表
配列番号１：gRNAのPrdm14遺伝子標的化配列（GAACCTCGCCACCACCGAGG）
配列番号２：gRNAのPrdm14遺伝子標的化配列（GTATGGAGCCATCGCTAGTC）
配列番号３：破壊されたPrdm14遺伝子配列の一例（CTCGCCACCACCG GTCCGGAGCACCCAACCG）
配列番号４：破壊されたPrdm14遺伝子配列の一例（CTCGCCACCACCG CAGTATTAAAACATGGATGTA）
配列番号５：gRNA1のOtx2遺伝子標的化配列（GAGTCTGACCACTTCGGGTA）
配列番号６：gRNA2のOtx2遺伝子標的化配列（GTATGGAGCCATCGCTAGTC）
配列番号７：Pdx1の増幅用フォワードプライマー(ATTGAGATGAGAACCGGCATG)
配列番号８：Pdx1野生型の増幅用リバーズプライマー（TTCATGCGACGGTTTTGGAAC）
配列番号９：Pdx1変異型の増幅用リバーズプライマー（TGTGAGCGAGTAACAACC）
【図１】
2019073960.tif 000002
【図２】
2019073960.tif 000003
【図３Ａ】
2019073960.tif 000004
【図３Ｂ】
2019073960.tif 000005
【図３Ｃ】
2019073960.tif 000006
【図３Ｄ】
2019073960.tif 000007
【図４】
2019073960.tif 000008
【図５】
2019073960.tif 000009
【図６】
2019073960.tif 000010
【図７】
2019073960.tif 000011
【配列表】
2019073960000001.app
【国際調査報告】
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2019073960.tif 000013
2019073960.tif 000014
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