(57)【要約】  新規なナノ粒子、これを含む磁気共鳴イメージング用造影剤及び当該ナノ粒子の製造に用いられるリガンド化合物を提供する。本発明は、酸化鉄を含有する金属粒子と、前記金属粒子表面の金属原子と結合した式（３）で表されるリガンドと、を含むナノ粒子に関する。【化１】2019004297.tif 000022  （式中、ｍは１から４の整数であり、破線は、金属粒子表面の金属原子との配位結合を表す。）
2019004297.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化鉄を含有する金属粒子と、
前記金属粒子表面の金属原子と結合した式（３）で表されるリガンドと、
を含むナノ粒子。
【化１】
2019004297.tif 000020
（式中、ｍは１から４の整数であり、破線は、金属粒子表面の金属原子との配位結合を表す。）
【請求項２】
請求項１に記載の前記金属粒子表面の金属原子と結合したリガンドが下式（１）で表されるリガンドである、請求項１に記載のナノ粒子。
【化２】
2019004297.tif 000021
（式中、破線は、金属粒子表面の金属原子との配位結合を表す）
【請求項３】
前記式（３）中、前記ｍが１、２又は４である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記酸化鉄を含有する金属粒子が、酸化鉄粒子である、請求項１〜３のいずれか1項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記金属粒子の平均粒子径が５ｎｍ以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記金属粒子の平均粒子径が４ｎｍ以下である、請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記金属粒子の平均粒子径が３ｎｍ以下である、請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のナノ粒子を含む、磁気共鳴イメージング用造影剤。
【請求項９】
陽性造影剤である、請求項８に記載の磁気共鳴イメージング用造影剤。
【請求項１０】
請求項２に記載のナノ粒子を製造するための、（３，４−ジヒドロキシフェニル）（ジメチル）（３−スルホナートプロピル）アンモニウムの使用。
【請求項１１】
（３，４−ジヒドロキシフェニル）（ジメチル）（３−スルホナートプロピル）アンモニウム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なナノ粒子、これを含む磁気共鳴イメージング用造影剤及び当該ナノ粒子の製造に用いられるリガンド化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁気共鳴イメージング（Magnetic resonance imaging、ＭＲＩ）は、臨床画像診断において重要な役割を果たしてきたが、近年は生物医学研究分野においても重要なツールとなっている。【０００３】
画像診断法及びこれに用いる造影剤は、生体の臓器及び組織等の検査に使用される技術である。このうち、ＭＲＩは原子の磁気的性質に基づき、強い磁場と高周波無線信号とを使用して生体内の組織及び臓器の精巧な断面画像及び三次元画像を作出する技術である。【０００４】
ＭＲＩは、水を含有している全ての組織及び臓器の２次元又は３次元画像を得るのに効果的な手法である。【０００５】
集束した電磁波パルスが対象の組織内の磁気によって整列した水素原子に入射されると、それらの水素原子はプロトン緩和の結果として信号を返す。様々な組織からの信号の僅かな差により、ＭＲＩで、臓器を識別し、良性の組織と悪性の組織とを潜在的に対照させることができる。ＭＲＩは腫瘍、出血、浮腫等を検出するのに有用である。【０００６】
ここでＭＲＩ用造影剤は、生体組織中の水の緩和時間（Ｔ１、Ｔ２）を主に短縮させることによって変化させ、異なる組織間のコントラストを増強することによって、病変部位の検出、又は血管内の血流あるいは各器官の機能等の調査を可能にする薬剤を指す。【０００７】
ＭＲＩ用造影剤は、投与後に迅速に造影効果が得られ、生体に悪影響を及ぼさず、且つ１００％排出される性質を有することが望まれる。ＭＲＩ用造影剤は、例えば静脈内投与により、血中及び細胞外液に分布し得る。そして、好ましくは２時間以内、より好ましくは１時間以内に経腎的に尿中に排泄される。細胞外液に分布する造影剤は、それ自体が直接ＭＲＩで画像化されるのではない。造影剤は分布した周辺の組織のプロトンの緩和を促進させる。これは主としてＴ１短縮効果と呼ばれる。この効果によって、造影剤はＴ１強調画像で造影効果を発揮する（信号が増強される）。造影剤はそれが占める組織の緩和時間を変化させる。【０００８】
造影剤濃度が一定濃度以上に高くなると、Ｔ２、Ｔ２＊短縮効果により信号は逆に減衰する。よって、信号強度を高めるための至適濃度は造影目的に応じて異なる。【０００９】
磁性体のＴ１及びＴ２緩和の短縮効果の大きさ、すなわち、プロトンの緩和時間を短縮する効率は、緩和率(relaxation rate)（Ｒ）として表される。ここで、緩和率Ｒ１及びＲ２は、それぞれＭＲＩの縦緩和時間Ｔ１及び横緩和時間Ｔ２の逆数で表される（Ｒ１＝１／Ｔ１、Ｒ２＝１／Ｔ２）。また単位濃度あたりの緩和率を緩和能(relaxivity)（ｒ）として表され、縦緩和能はｒ１、横緩和能はｒ２と表記される。Ｒ１／Ｒ２比及びｒ１／ｒ２比は、ＭＲＩ用造影剤の緩和能を評価するためのパラメータの１つとして用いられる。【００１０】
特にＴ１緩和を利用し、Ｔ１強調画像上での信号を増強する目的で使用されるものをＴ１短縮造影剤又は陽性造影剤（positive contrast agent）と呼ぶ。陽性造影剤は、当該
造影剤が占める組織に信号上昇をもたらす。また、Ｔ２緩和を利用し、Ｔ２強調画像上での信号を減衰する目的で使用される造影剤をＴ２短縮造影剤又は陰性造影剤（negative contrast agent）と呼ぶ。陰性造影剤は、当該造影剤が占める組織に信号減少をもたらす。
Ｔ１強調ＭＲＩは、Ｔ２強調ＭＲＩに比して人為的影響が小さく、高い空間分解能を示すことから、近年注目されている。高いコントラストを示すＴ１強調ＭＲ画像を得るためには、水プロトン緩和時間を変化させることによってＭＲＩのコントラストを増強する陽性造影剤の使用が不可欠である。【００１１】
特に、造影剤のｒ１／ｒ２比は、造影剤の評価にとって重要な値であり、陽性造影剤としての高いｒ１／ｒ２は、良好なＴ１強調ＭＲ画像をもたらす。【００１２】
ガドリニウム（Ｇｄ）ベースのキレート及び酸化ガドリニウムナノ粒子は、臨床での陽性造影剤として使用することができ、高いｒ１及び低いｒ２（すなわち高いｒ１／ｒ２）を有して優れたＴ１コントラストを示す。しかしながら、Ｇｄベースの化合物は、高齢者や腎機能不全患者に対して、毒性を示すことが知られている。【００１３】
一方、酸化鉄系はＧｄに比べると毒性は非常に低い。したがって、現在市場で主流となっているＧｄに代わる材料として、酸化鉄系のナノ粒子の研究開発が進められている（非特許文献１）。【００１４】
これまでに、診断用又は治療用等の医療用の用途に使用するためのナノ粒子が研究開発されてきた。金属材料からなるコア粒子表面にポリマー等の種々の分子を被覆させたナノ粒子は、生体に適用するためのナノ粒子の構成の１つとして知られている。例えば、４ｎｍ以下の酸化鉄粒子（ESIONs）の製造方法と、これをポリエチレングリコールホスフェート（PO-PEG）で被覆したナノ粒子を用いたＭＲＩ用陽性造影剤が報告されている（非特許文献２）。更に、酸化鉄ナノ粒子をコア粒子とし、双イオン性ドーパミンスルホネート（zwitterionic dopamine sulfonate、ＺＤＳ）を酸化鉄ナノ粒子表面に結合させた構造を有するナノ粒子が報告されている（非特許文献３及び特許文献１）。また、当該ナノ粒子（ZDS-SPIONs）を陽性造影剤として用いた場合の性能についても報告されている（特許文献２及び非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２０１３／０９０６０１号公報（２０１３年６月２０日公開）
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２０１６／０４４０６８号公報（２０１６年３月２４日公開）
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Corot et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 58, 1471-1504, 2006
【非特許文献２】Byung Hyo Kim et al., J Am. Chem. Sci., 133, 12624-12631, 2011
【非特許文献３】He Wei et al., Integr. Biol., 5, 108-114, 2013
【非特許文献４】He Wei et al.,Proc. Natr. Acad. Sci., 114(9), 2325-2330, 2017
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
依然として、優れた造影能を有しつつ、生体内で安定した挙動を示し、且つ、生体に対して毒性が低く、良好な保存安定性を有するという条件を十分に満たす、新規なナノ粒子及び当該ナノ粒子を被覆するためのリガンド化合物が望まれている。さらには、該ナノ粒子を用いた磁気共鳴イメージング用造影剤の開発が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記の課題を解決するために、本発明は、以下の何れかの一態様を包含する。
＜１＞酸化鉄を含有する金属粒子と、
前記金属粒子表面の金属原子と結合した式（３）で表されるリガンドと、
を含むナノ粒子。【００１９】
【化１】
2019004297.tif 000003
【００２０】
（式中、ｍは１から４の整数であり、破線は、金属粒子表面の金属原子との配位結合を表す。）
＜２＞（３，４−ジヒドロキシフェニル）（ジメチル）（３−スルホナートプロピル）アンモニウム。【００２１】
なお、（３，４−ジヒドロキシフェニル）（ジメチル）（３−スルホナートプロピル）アンモニウム（(3,4-dihydroxyphenyl)(dimethyl)(3-sulfonatopropyl)ammonium）の構造式を式（２）に示す。また、本願明細書中において、本化合物並びに本化合物が金属粒子表面の金属原子と結合した後記式（１）のリガンドをＤＤＳＡと略記する場合がある。【００２２】
【化２】
2019004297.tif 000004
【発明の効果】
【００２３】
本発明は、新規なナノ粒子及びこれを含む磁気共鳴イメージング用造影剤、殊に、良好な緩和能を有する陽性造影剤、並びに当該ナノ粒子の製造に用いられる新規リガンド化合物を提供するという効果を奏することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって観察した、本発明のナノ粒子（酸化鉄粒子（ＳＮＰ）−リガンド（ＤＤＳＡ））の画像である。
【図２】ＰＢＳ中の、直径１.８ｎｍの酸化鉄粒子をコアとするＳＮＰ−ＤＤＳＡの１テスラ（Ｔ）のＭＲＩを用いた緩和能の推定結果を示す図である。図２の（ａ）は、系列的に希釈されたＳＮＰ−ＤＤＳＡのＰＢＳの緩和時間の測定結果を示す。図２の（ｂ）は、緩和時間をＳＮＰ−ＤＤＳＡの鉄原子濃度に対してプロットした図である。図２の（ｃ）は図２の（ｂ）のプロットの傾きから決定された緩和能ｒ１、ｒ２及びｒ１／ｒ２の値を示す。
【図３】図３の（ａ）は実施例２のＳＮＰ−ＤＤＳＡを含有する造影剤を投与したマウスの膀胱における投与前（ｐｒｅ）、投与直後（ｐｏｓｔ）、投与後３０分（３０ｍｉｎ）、投与後３時間（３ｈ）の経時的なＭＲＩ測定結果の画像を示す。図３の（ｂ）は実施例２のＳＮＰ−ＤＤＳＡを含有する造影剤を投与したマウスの膀胱における投与前（ｐｒｅ）、投与直後（ｐｏｓｔ）、投与後１時間（１ｈ）、投与後２時間（２ｈ）の経時的なＭＲＩ測定結果の画像を示す。
【図４】図４の（ａ）は実施例２のＳＮＰ−ＤＤＳＡを含有する造影剤を投与したマウスの腎臓における投与前（ｐｒｅ）、投与直後（ｐｏｓｔ）、投与後３０分（３０ｍｉｎ）、投与後３時間（３ｈ）の経時的なＭＲＩ測定結果の画像を示す。図４の（ｂ）は実施例２のＳＮＰ−ＤＤＳＡを含有する造影剤を投与したマウスの腎臓における投与前（ｐｒｅ）、投与直後（ｐｏｓｔ）、投与後１時間（１ｈ）、投与後２時間（２ｈ）の経時的なＭＲＩ測定結果の画像を示す。
【図５】実施例２のＳＮＰ−ＤＤＳＡを含有する造影剤を投与したマウスの肝臓における経時的なＭＲＩ測定結果の画像を示す。
【図６】実施例２のＳＮＰ−ＤＤＳＡを含有する造影剤を投与したマウスの血管における経時的なＭＲ血管造影結果の画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００２６】
〔用語の定義〕
一般に「ナノ粒子」とは、ナノメートルスケールの粒子径を有する粒子を指し、通常、１μｍ未満の粒子径を有する粒子をいう。ここで粒子径の詳細については、以下の粒子径の項目において詳細に説明する。
【００２７】
「リガンド」又は「リガンド化合物」とは、金属粒子表面において金属原子と配位結合しうる基を有し、金属粒子を安定に水中に分散させるための粒子表面の修飾剤として用いられる化合物を意味する。本明細書において、「リガンド」又は「リガンド化合物」というときは、該化合物が、金属粒子表面に配位結合される前の化合物である場合又は配位結合された後の分子構造を有する場合のいずれか、あるいはその両方を意味する。
【００２８】
「被験体」とは、本発明のＭＲＩ用造影剤、ナノ粒子又はナノ粒子を含む組成物を、例えば、実験、診断、及び／又は治療目的のために投与され得る任意の生物を指す。一例としてはヒトである。
【００２９】
以下、本発明に係るナノ粒子、ＭＲＩ用造影剤及び化合物について説明する。
【００３０】
〔１．ナノ粒子〕
本発明に係るナノ粒子は、酸化鉄を含有する金属粒子と、前記金属粒子表面の金属原子と結合した下記式（３）で表されるリガンドと、を含むナノ粒子であり、好ましくは当該リガンドが下記式（１）で表されるリガンドである、ナノ粒子である。
【００３１】
【化３】
2019004297.tif 000005
【００３２】
（式中、ｍは１から４の整数であり、破線は、金属粒子表面の金属原子との配位結合を表す。）
【００３３】
【化４】
2019004297.tif 000006
【００３４】
（式中、破線は、金属粒子表面の金属原子との配位結合を表す）
また、本発明の別の態様のナノ粒子は、酸化鉄を含有する金属粒子と、前記金属粒子表面の金属原子と結合した上記式（３）で表されるリガンドと、を含むナノ粒子において、上記式（３）中、ｍが１、２又は４の整数であるナノ粒子である。
【００３５】
一実施形態において本発明のナノ粒子は、酸化鉄を含有する金属粒子と、前記金属粒子表面の金属原子と結合した上記式（３）で表されるリガンドと、を含むナノ粒子において、上記式（３）中、ｍが２又は４であり、より好ましくはｍが４である、ナノ粒子である。
【００３６】
つまり、本発明に係るナノ粒子は、その中心部（コア）に金属粒子を有しており、当該金属粒子の外表面にリガンド化合物が結合することによって、該リガンド化合物が当該金属粒子を被覆している、粒子である。
【００３７】
本発明のナノ粒子であれば、ナノ粒子同士が凝集することが抑止され、例えばナノ粒子を高濃度で含有する溶液中でも粒子性状が安定している。このようなナノ粒子であれば、低い飽和磁化を確保し、明瞭なＴ１強調画像を得ることができると共に、腎排泄が容易となるので良好な腎クリアランスを示すことが期待できる。
【００３８】
（金属粒子）
金属粒子は、酸化鉄を含有する。一実施形態では、金属粒子は、酸化鉄のみを含有する酸化鉄粒子である。
【００３９】
一実施形態において、金属粒子は酸化鉄と、少なくとも一種の酸化鉄以外の金属誘導体とを含んでいてもよい。また、金属粒子は少なくとも一種の鉄（Ｆｅ）以外の金属元素を含んでいてもよい。別の金属元素としては、必要に応じてガドリニウム（Ｇｄ）、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）及び亜鉛（Ｚｎ）の中からなる群から選択されるうちの少なくとも１つをさらに含むことができる。
【００４０】
さらに別の実施形態において、金属粒子は、酸化鉄のみからなるものであってもよく、酸化鉄から誘導されるフェライトを含んでいてもよい。フェライトは、式（Ｆｅ２＋，Ｍ）３Ｏ４の酸化物であり、ここで、Ｍは、好ましくはＺｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋及びＮｉ２＋から選択される遷移金属イオンである。
【００４１】
超常磁性酸化鉄製剤（Super Paramagnetic Iron Oxide ：ＳＰＩＯ）として知られる材料もまた、好適に用いられる。これらの材料は一般式［Ｆｅ２Ｏ３］ｘ［Ｆｅ２Ｏ３（Ｍ２＋Ｏ）］１−ｘで表される（式中ｘ＝０又は１）。Ｍ２＋は２価金属イオン、例えばＦｅ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｚｎ、マグネシウム（Ｍｇ）、銅（Ｃｕ）又はこれらの組合せとしてもよい。なお、金属イオン（Ｍ２＋）が第一鉄イオン（Ｆｅ２＋）及びｘ＝０の場合、材料は、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）であり、ｘ＝１である場合、材料はマグへマイト（γ−Ｆｅ２Ｏ３）である。
【００４２】
一実施形態において、酸化鉄は、磁性酸化鉄であり、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、マグヘマイト（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、又はこれらの混合物であり得る。このような磁性酸化鉄粒子は超常磁性ナノ粒子となる。
【００４３】
さらに別の実施形態において、酸化鉄粒子が少なくとも一種の鉄以外の金属元素の誘導体を含んでいる場合、金属元素の各誘導体同士は異なる種類の誘導体であってもよい。すなわち、酸化鉄粒子は、酸化物及び窒化物等を含み得る。別の実施形態では、コア粒子は、酸化鉄以外の鉄元素を有する酸化鉄以外の鉄誘導体（例えば、ＦｅＰｔ及びＦｅＢ）を含んでいてもよい。
【００４４】
一実施形態に係る金属粒子は、前出の特許文献１、非特許文献２、非特許文献３等に記載の方法等の公知の方法によって製造されたものであってもよく、市販のものであってもよい。例えば、共沈法又は還元法によって作製された酸化鉄粒子であり得る。
【００４５】
（金属粒子の粒子径）
本明細書において、粒子径という場合は、特に記載をしていない場合は平均粒子径を指す。
【００４６】
本明細書において「粒子径」は、粒子を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した場合の、粒子の二次元形状に対する最大内接円の直径が意図される。例えば、粒子の二次元形状が実質的に円形状である場合はその円の直径が意図される。また、実質的に楕円形状である場合はその楕円の短径が意図される。また、実質的に正方形状である場合はその正方形の辺の長さが意図され、実質的に長方形状である場合はその長方形の短辺の長さが意図される。
【００４７】
平均粒子径が所定の範囲の値を有することを確認する方法としては、例えば、１００個の粒子を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察して、各粒子の上記粒子径を測定し、１００個の粒子の上記粒子径の平均値を求めることによって行うことができる。
【００４８】
一実施形態に係る酸化鉄粒子は、５ｎｍ以下の直径を有していることが好ましく、４ｎｍ以下の直径を有していることがより好ましく、３ｎｍ以下の直径を有していることがより好ましく、２ｎｍ以下の直径を有していることがさらにより好ましく、１ｎｍ以下の粒子径を有していることが最も好ましい。２ｎｍ以下の粒子径であれば、３テスラ（Ｔ）以上の高磁場ＭＲＩ用の陽性造影剤としてより有用性が高い。また、２ｎｍ以下、好ましくは１ｎｍ以下の粒子径であれば、７Ｔ以上の高磁場ＭＲＩでの利用において、より高い信号ノイズ比が得られるため、より高い空間分解能及び短時間における測定を実現できる可能性がある。
【００４９】
本発明の酸化鉄粒子の平均粒子径は、５ｎｍ以下であることが好ましく、４ｎｍ以下であることがより好ましく、３ｎｍ以下であることがより好ましく、２ｎｍ以下であることがさらに好ましい。一例の平均粒子径は１．８ｎｍである。酸化鉄粒子の平均粒子径は、小さければ小さいほど好ましいが、一例として、０．５ｎｍ以上又は０.６ｎｍ以上である。
【００５０】
一実施形態において、ＭＲＩ用造影剤に含まれるナノ粒子の集団は、各粒子の特性が可能な限り均一であることが好ましい。そのため、ナノ粒子のコアである金属粒子は、均一なサイズ及び形状を有していることが好ましい。一例としては、金属粒子はその平均粒子径±１ｎｍの範囲内の均一性を有する。別の一例としては、平均粒子径±０．５ｎｍの範囲内の均一性を有する。別の実施形態において、ＭＲＩ用造影剤に含まれるナノ粒子としては、コアとなる金属粒子として小さな粒子が多く含まれるほど好ましい。一例としては、金属粒子は、５ｎｍ以上の粒子が個数比で、全体の３０％以下、好ましくは全体の１０％以下、より好ましくは全体の５％以下である。別の一例としては、４ｎｍ以上の粒子が個数比で全体の３０％以下、好ましくは全体の１０％以下、より好ましくは全体の５％以下である。更に別の例としては、３ｎｍ以上の粒子が個数比で、全体の３０％以下、又は好ましくは全体の１０％以下、より好ましくは全体の５％以下である。
【００５１】
（ナノ粒子の粒子径）
ナノ粒子の粒径は上記金属粒子に被膜されたリガンドの厚さの分大きくなるが、測定は難しい。通常、ナノ粒子を溶液とした場合の流体力学的直径（hydrodynamic diameter、ＨＤ）がその大きさの指標とされる。一例としては、ナノ粒子の平均ＨＤは３０ｎｍ以下、好ましくは、１０ｎｍ以下である。更に別の一例としては、ナノ粒子の平均ＨＤは７ｎｍ以下、好ましくは６ｎｍ以下、好ましくは５ｎｍ以下、好ましくは４ｎｍ以下、更に好ましくは３ｎｍ以下である。
【００５２】
なお、ＭＲＩ用造影剤の造影能は、コアである金属粒子の粒子径に影響されることが確認されている。
【００５３】
（リガンド）
本発明に係るリガンド化合物は、下記式（４）で示される化合物である。
【００５４】
【化５】
2019004297.tif 000007
（式中、ｎは１〜４の整数である。）
ある態様としては、下記式（２）で示される（３，４−ジヒドロキシフェニル）（ジメチル）（３−スルホナートプロピル）アンモニウム（ＤＤＳＡ）である。後記するリガンド置換反応において、本化合物の２つの水酸基から水素イオンが脱離し、残る酸素原子と金属粒子表面の金属原子とが配位結合し、本発明のナノ粒子を形成する。金属粒子表面の金属原子と配位結合しているリガンドは、前記式（１）で表される構造を有している。
【００５５】
【化６】
2019004297.tif 000008
【００５６】
なお、本発明のリガンドの酸素原子が配位結合する金属原子は、コアの金属粒子表面に位置する原子であって、例えば鉄原子である。
【００５７】
本発明のリガンドは、アンモニウム基が直接ベンゼン環に結合する構造を有し、従来公知のリガンドに比して分子鎖が短く、リガンド層がより薄くなり得る。且つ、金属粒子側にプラス電荷、コア粒子外表面にマイナス電荷を有することを特徴とし、これにより、本発明のナノ粒子は、体液中でコア粒子同士が凝集しにくくなり高い安定性を示すことが期待される。また、リガンド層が薄いため金属原子との距離が近くなり、コア粒子から影響を受ける水分子数の増加等に起因する優れた造影能を発揮することが期待される。
【００５８】
金属粒子表面に配位させるリガンドの分子数（リガンドの個数）は、金属粒子のサイズ及び表面積等に応じて変化するが、例えば、粒子径１．８ｎｍの粒子の場合、金属粒子１つ当たり５〜２００個であることが好ましく、１０〜５０個であることがより好ましい。
【００５９】
（リガンドの製造方法）
リガンドの製造方法は特に限定されず、当業者に周知の反応を用いて公知原料化合物から容易に製造することができる。例えば、Wei H. et al., Nano Lett. 12, 22-25, 2012に記載の方法を参考にすることができる。
【００６０】
一例では実施例に記載の合成方法が好適に用いられる。
【００６１】
（リガンド以外の金属粒子に結合する化合物）
本発明のナノ粒子は、本発明のリガンド以外を含んでいてもよく、一実施形態においてナノ粒子は、コア粒子そのものが蛍光特性を持つか、コア粒子の表面に結合された蛍光分子又は色素分子等の分子をさらに含んでいてもよい。コア粒子そのものが蛍光特性を持つか、蛍光分子又は色素分子をナノ粒子に導入することによって、ナノ粒子は、ＭＲＩ用の造影剤としてのみならず、同時に、光学画像造影剤としても使用することができる。別の一実施形態として、本発明のリガンドに共有結合により結合された蛍光分子又は色素分子を有していてもよく、酸化鉄粒子とはリガンドを介し連結されている。体内にナノ粒子が注入された後にも、蛍光分子は酸化鉄粒子の表面に存在することによって、顕微鏡イメージングならびにナノ粒子の局在化を調べるのに利用することができる。蛍光分子及び色素分子としては、ローダミン、フルオレセイン、ニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）、シアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クマリン及びこれらの誘導体が挙げられる。
【００６２】
また、別の実施形態において、金属粒子の表面に結合している少なくとも１種の物質を有していてもよく、限定はされないが、ペプチド、核酸又は小分子等であり得る。
【００６３】
また、本発明以外の他のリガンドがナノ粒子の表面に結合されていてもよい。例えば、腫瘍に特異的に集積する性質を有するリガンドを本発明のナノ粒子に結合させることにより、腫瘍選択的な結合性を付与することも可能である。
【００６４】
このような組織特異性を造影剤に付与することは、ＭＲＩ測定の対象とする部位における信号を強くし、特定の病態等の情報を得るために好ましい。造影剤の生体内における分布は、粒径、電荷、表面化学、投与経路及び排出経路に依存する。
【００６５】
また、本発明のナノ粒子は、生体への毒性が非常に低い。そのため、安全性に優れ、種々の利用に対する制限が少ない。
【００６６】
〔２．ナノ粒子の製造方法〕
次に、ナノ粒子の製造方法について説明する。ナノ粒子の製造方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
【００６７】
例えば、Kim et al., J Am. Chem.Sci.2011, 133,12624-12631、Kim et al., J Am. Chem. Sci.2013, 135,2407-2410、及びHyeon et al., J. Am. Chem. Soc., 133, 12624, 2011に記載の方法を参考に行うことができる。
【００６８】
一実施形態におけるナノ粒子の製造方法は、（ａ）金属塩と、炭素数１８のカルボン酸のアルカリ金属塩とを反応させて、金属カルボン酸錯体を形成する工程と、（ｂ）当該錯体を加熱し表面が疎水性リガンドで被覆されたナノ粒子のコアとなる金属粒子を合成する工程と、（ｃ）当該コアとなる金属粒子の表面の疎水性リガンドを、カルボキシル基を有する親水性リガンドに変換し、高極性溶媒への分散を可能な粒子にする工程と、（ｄ）当該親水性リガンドで被覆された金属粒子と本発明のリガンド化合物とを反応させて、金属粒子表面の親水性リガンドを本発明のリガンドに置換する工程と、を含む。以下、各工程について詳細に説明する。
【００６９】
（工程（ａ））
工程（ａ）は金属塩と、炭素数１８のカルボン酸のアルカリ金属塩とを反応させて、金属カルボン酸錯体を形成する工程である。
【００７０】
まず、金属塩及び、炭素数１８のカルボン酸のアルカリ金属塩を溶媒に分散させる。ここで、金属カルボン酸錯体を作製するために用いられる上記金属塩は、塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物［ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ］が挙げられる。また、炭素数１８のカルボン酸のアルカリ金属塩は、オレイン酸ナトリウムが挙げられる。溶媒としてはエタノール、水、ヘキサン、及びこれらの混合物が挙げられる。一例としては、塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物及びオレイン酸ナトリウムをエタノール、水及びヘキサンの混合物に分散させる。続いて、加温下、好ましくは７０℃で、１〜１０時間、好ましくは４時間撹拌し、有機層を回収し、該有機層の水による洗浄を１〜複数回、より好ましくは３〜４回繰り返す。所望により得られた有機層を乾燥する。
【００７１】
（工程（ｂ））
工程（ｂ）は上記工程（ａ）で得られた錯体に疎水性リガンドを反応させて、コアとなる金属粒子の表面が疎水性リガンドで被覆されたナノ粒子を合成する工程である。
【００７２】
例えばアルゴン（Ａｒ）及び窒素から選択される気体の雰囲気下で、上記工程（ａ）で得られた錯体に、炭素数１８の脂肪酸、炭素数１８の脂肪族アルコール及び炭素数１８の脂肪族アミンからなる群から選択される少なくとも１つの界面活性剤、及びジフェニルエーテル及びフェニルオクチルエーテルから選択される溶媒を添加する。一例として、界面活性剤がオレイルアルコール、溶媒がジフェニルエーテルであり得る。次に、この混合物を室温から１８０〜３００℃まで昇温し、所望により、そのまま１０分から数時間撹拌する。一例として、３０℃から２５０℃まで１０℃／ｍｉｎで昇温し、２５０℃で３０分間撹拌する。別の一例として、３０℃から２００℃まで１０℃／ｍｉｎで昇温し、２００℃で３０分間撹拌する。
【００７３】
反応溶液の温度を室温まで下げた後、アセトンを添加し上清を遠心除去する。この操作を２〜３回、好ましくは４〜５回繰り返す。所望により、得られた溶液を乾燥させてもよい。一例として、アセトンを添加し上清を遠心除去する操作を３回繰り返す。
【００７４】
（工程（ｃ））
工程（ｃ）は、上記工程（ｂ）において得られたナノ粒子の表面にコーティングされた疎水性リガンドを、カルボキシル基を有する親水性リガンドで置換し、高極性溶媒への分散を可能な粒子にする工程である。
【００７５】
例えば、Ａｒ及び窒素から選択される気体の雰囲気下で、疎水性リガンドで被覆されたナノ粒子を溶媒に分散させた後に、カルボキシル基を有する親水性リガンドを添加することによって行われる。カルボキシル基を有する親水性リガンドとしては、２−メトキシエトキシエトキシ酢酸（2-[2-(2-methoxyethoxy)ethoxy]acetic acid；ＭＥＥＡ）が挙げられる。溶媒としてはメタノールが好適である。
【００７６】
反応は、室温もしくは加温下、好ましくは２５〜８０℃で、１〜１５時間程度、好ましくは５〜１０時間攪拌することによって行われ、一例として、５０℃で７時間攪拌することによって行われ、一例として、７０℃で１０時間攪拌することによって行われ、更に別の一例として、７０℃で５時間撹拌することによって行われる。
【００７７】
反応溶液の温度を室温まで下げた後に、アセトン及びヘキサンから選択される溶媒を添加し、遠心し、上清を除去する。この操作を、２〜３回、好ましくは４〜５回繰り返してもよい。得られた溶液を乾燥させてもよい。一例として、前記操作を３回繰り返す。
【００７８】
（工程（ｄ））
工程（ｄ）は上記工程（ｃ）で得られた親水性リガンドで被覆された金属粒子と本発明のリガンド化合物とを反応させて、金属粒子表面に本発明のリガンド化合物が被覆したナノ粒子を得る工程である。
【００７９】
ここで、親水性リガンドで被覆された金属粒子と本発明のリガンド化合物との反応は、Ａｒ及び窒素から選択される気体の雰囲気下で、室温もしくは加温下で１〜数十時間撹拌することにより行われる。一例としてＡｒ雰囲気下で行われる。反応温度は一例として２５〜８０℃であり、別の一例として５０〜７０℃である。撹拌時間は、一例として５〜７時間、別の一例として２４時間である。一例として、７０℃で１２時間撹拌する。続いて、反応溶液の温度を室温まで低下させ、溶媒を添加して遠心し、上清を除去する。溶媒は特に限定されないが、アセトン、ヘキサン等から選択される。一例としてアセトンを用いる。またこの溶媒添加、遠心及び上清除去の操作は複数回繰り返してもよく、例えば４〜５回繰り返してもよい。一例としてこの操作を３回繰り返す。続いて得られた本発明のリガンド化合物が被覆したナノ粒子を含む溶液は遠心式限外ろ過フィルター等の濃縮カラム等を用いて濃縮してもよい。この濃縮操作は複数回繰り返してもよく、途中でＰＢＳ等の溶液を添加して濃縮操作を繰り返してもよい。
【００８０】
ある態様として、酸化鉄粒子をコアとするナノ粒子の別の製造方法を以下に示す。
【００８１】
オレイン酸で被覆された酸化鉄粒子（ＳＮＰ−ＯＡ）をヘキサン溶液中に懸濁させ、１.７％テトラメチルアンモニウムヒドロキシド（ＴＭＡ（ＯＨ））水溶液と混合して激しく振盪する。得られた溶液から遠心分離によって水層を分離し、アセトンを加え、８０００〜１２０００ｒｐｍで５〜１０分間遠心し、上澄みを取り除く。得られた沈殿に対し０.１％ＴＭＡ（ＯＨ）溶液２ｍＬを加え分散させ、再び１０ｍＬのアセトンを加えて沈殿させる。この操作を複数回繰り返してもよく、好ましくは３〜４回繰り返す。得られた溶液を、０.１％ＴＭＡ（ＯＨ）溶液に分散させて保存する。
【００８２】
上記の手順で作成した０.１％ＴＭＡ（ＯＨ）溶液に０.１％〜２％のＴＭＡ（ＯＨ）溶液を用いてｐＨ８〜１２程度に調製したリガンド化合物の溶液を加える。得られた溶液を室温で６〜２４時間撹拌し、アセトンを加えて沈殿させ８０００〜１２０００ｒｐｍで３〜１０分間遠心し、上澄みを取り除く。この沈殿をリン酸緩衝液に分散させ、濃縮カラムを用い７０００〜１２０００ｒｐｍで遠心することにより溶液量を減少させる。そこにリン酸緩衝液を加え再び７０００〜１２０００ｒｐｍで１０〜２０分遠心し濃縮する。この操作を複数回繰り返してもよく、好ましくは３〜４回、より好ましくは５〜１０回繰り返す。得られたリガンドで被覆された酸化鉄粒子の溶液を、ＰＢＳで希釈し、保存してもよい。
【００８３】
〔３．磁気共鳴イメージング用造影剤（ＭＲＩ用造影剤）〕
本発明は、上述のナノ粒子を含む、磁気共鳴イメージング用造影剤も提供する。
【００８４】
以下、ＭＲＩ用造影剤について詳細に説明する。
【００８５】
（ＭＲＩ用造影剤に含まれる各種成分）
＝ナノ粒子＝
一実施形態において、本発明のＭＲＩ用造影剤は、上述したナノ粒子を、少なくとも１種類含んでいることを特徴とする。別の実施形態において、本発明のＭＲＩ用造影剤は、上述したナノ粒子の２種類以上の組み合わせを含んでいてもよい。
【００８６】
また、ＭＲＩ用造影剤には、ナノ粒子の他に、さらに必要に応じて、溶媒や薬理学的に許容され得る添加剤を含めることができる。本発明のＭＲＩ用造影剤の一実施形態として、好適な溶媒、及び/又は、担体、ビヒクル、錯体等の添加剤から選択される少なくとも１つをさらに含んでいてもよい。
【００８７】
＝溶媒＝
ＭＲＩ用造影剤に含まれる溶媒としては、水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液としては、さらに、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、リンガー溶液等が挙げられる。剤型が注射剤である場合の好ましい溶媒は、例えば水、リンガー溶液、生理食塩水等である。
【００８８】
すなわち、本発明に係るＭＲＩ用造影剤は、本発明に係るナノ粒子を、所望の組成を有する溶液中に懸濁させた溶液であり得る。具体的には、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液中にナノ粒子を懸濁させた形態であってもよい。
【００８９】
＝添加剤＝
ＭＲＩ用造影剤に含まれる担体、錯体、ビヒクル等の添加剤としては、医薬分野及び生命工学分野において一般的に使用される担体、ビヒクル等が挙げられる。担体の例としては、ポリエチレングリコール等のポリマー、金属微粒子等が挙げられ、錯体の例としては、ジエチレントリアミン5酢酸（ＤＴＰＡ）、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、等が挙げられ、ビヒクルの例としては、石灰、ソーダ灰、ケイ酸ソーダ、デンプン、膠、ゼラチン、タンニン及びケブラチョが挙げられる。
【００９０】
また、本発明によるＭＲＩ用造影剤は、さらに、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、ｐＨ調整剤、浸透圧調整剤等を含んでいてもよい。
【００９１】
（剤型）
本発明のＭＲＩ用造影剤の剤型は特に限定されず、液体、固体又は半固体若しくは半液体とすることができる。これらの剤型は、当業者に公知の方法に基づき、容易に製造することができる。剤型が液体の場合は例えば水性の溶媒に本発明に係るナノ粒子を分散、懸濁又は溶解して含有させた形態であり得る。また凍結乾燥剤の形態として、使用する際に分散、懸濁又は溶解して用いるものであってもよい。
【００９２】
（ナノ粒子の濃度）
ＭＲＩ用造影剤中のナノ粒子の濃度は目的及び造影対象組織等に応じて適宜決定される。例えば、適当な造影能を有し、且つ生体への影響が許容できる範囲の濃度が選択される。
【００９３】
本発明のナノ粒子は、高濃度にしても凝集されにくく、安定性を保持することができる。そのため、公知のナノ粒子と比較して、より高いＭＲＩ造影能を長期的に安定して保つことができる。
【００９４】
例えば、ＭＲＩ用造影剤が水溶液の液剤である場合、液剤中のナノ粒子の濃度は、例えば、一般的な注射剤として用いられる場合、０．１〜１０００ｍＭ Ｆｅ／ｍＬ、好ましくは１．０〜５００ｍＭ Ｆｅ／ｍＬ、更に好ましくは５．０〜１００ｍＭ Ｆｅ／ｍＬ、ある態様としては１０〜５００ｍＭ Ｆｅ／ｍＬ、別の態様としては５．０〜５０ｍＭ Ｆｅ／ｍＬとなる濃度等にすることができる。
【００９５】
（投与対象）
本発明に係る造影剤の投与の対象としては任意のヒト以外の生物又はヒトが挙げられる。ヒト以外の生物としては、哺乳類（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及びブタ等）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫及び植物を含むが、これらに限定されない。ある態様において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物又はクローン生物であり得る。また、生体以外の投与対象としては、組織試料又は細胞を含む生物学的材料であり得る。
【００９６】
（ＭＲＩ用造影剤の適用される用途）
ＭＲＩ用造影剤には、前記の通り陽性造影剤及び陰性造影剤の２種類が存在している。
【００９７】
一実施形態において、本発明のＭＲＩ用造影剤は、陽性造影剤である。別の実施形態としては陰性造影剤である。
【００９８】
本発明のＭＲＩ用造影剤は、例えば、ＭＲＩ装置を用いた病変及び腫瘍の有無等の診断に使用される。一例としては、腎機能の検査、肝腫瘍の検出、肝血管造影等に好適に用いることができる。ここで、ＭＲＩ装置は任意の装置であってよく、公知のものを使用することが可能である。また、印加される磁場は、例えば１Ｔ、１.５Ｔ、３Ｔ及び７Ｔのものが利用される。本発明の造影剤を使用した診断方法の一例は、生きているヒト等の被験体に、陽性造影剤をインビボ又はインビトロで投与する工程及び、続いてＭＲＩ装置を用いて被験体の画像形成を行う工程を包含している。
【００９９】
従来公知のＭＲＩ用造影剤は、常磁性化合物が陽性造影剤として、超常磁性ナノ粒子が陰性造影剤として使用されている。本発明のナノ粒子は超常磁性であるが、陽性造影剤としても使用できる。超常磁性は、不対スピンの結晶含有領域が、磁区といわれる熱力学的に独立した単一のドメイン粒子とみなすことができる程度に十分に大きいときに生じる。かかる磁区は、その個々の不対電子の和より大きい正味の磁気双極子である。磁場が印加されていないときは、すべての磁区がランダムに配向されていて正味の磁化はない。外部磁場が印加されると、すべての磁区の双極子モーメントが再配向される。その結果、正味の磁気モーメントが生じる。Ｔ１、Ｔ２及びＴ２＊緩和プロセスは磁性粒子により短縮される。一実施形態において、本発明に係る造影剤の造影能は、室温及び１Ｔの磁場で、ｒ２緩和能が１５〜１９ｍＭ−１ｓ−１であり、ｒ１緩和能は９〜１２ｍＭ−１ｓ−１の範囲である。別の実施形態において、本発明に係る造影剤の造影能は、室温及び１Ｔの磁場で、ｒ２緩和能が５〜７ｍＭ−１ｓ−１であり、ｒ１緩和能は３〜５ｍＭ−１ｓ−１の範囲である。
【０１００】
緩和能は、ＭＲＩ用造影剤ナノ粒子中の金属粒子の粒子径、組成物、粒子表面の電荷又は性状、粒子安定性、及び生体における凝集性や組織との結合性等のような様々な要因に依存する。緩和能の比であるｒ１／ｒ２は、一般に、ＭＲＩで生じたコントラストの型を定量化するのに使用され、造影剤の性能の指標となり得る。
【０１０１】
本発明のＭＲＩ用陽性造影剤は、外部から印加する磁場が１Ｔである場合のｒ１／ｒ２の値は大きいほど好ましく、磁場が１Ｔである場合のｒ１／ｒ２の値は、例えば、０.５以上が好ましく、０.６以上がより好ましく、０．７以上がさらにより好ましい。ｒ１／ｒ２値が０.５以上のとき、Ｔ１（陽性）効果は優れており、より高磁場のＭＲＩ測定においても高分解能で高い造影効果を有する。造影効果を著しく高めて、より少量のＭＲＩ用陽性造影剤を投与する観点では、０．７以上あることが好ましい。
【０１０２】
本発明のナノ粒子は、リガンドの分子鎖長が従来のリガンドと比較して短く、コアを被覆するリガンドシェルがより薄い。リガンドシェルが薄いことにより、コアの金属粒子と外部の水分子との距離が短くなり、緩和能を効率よく引き出すことができる。
【０１０３】
本発明のＭＲＩ用造影剤は金属粒子の粒子径を２ｎｍ以下、一例では１ｎｍ以下とすることが可能であり、７Ｔ以上のＭＲＩ装置で陽性造影剤としての利用が可能である。一例として、７Ｔ以下のＭＲＩ装置で使用するためのＭＲＩ用陽性造影剤を包含する。一例としては３Ｔ以下のＭＲＩ装置で使用するためのＭＲＩ用陽性造影剤を包含する。
【０１０４】
（毒性及び安定性）
本発明のＭＲＩ用造影剤は、ナノ粒子の安定性が高く、後記実施例４に示すように、溶液中において、室温又は４℃で長期間凝集することなく保存可能であることが確認されている。また、生物に対して毒性が低く、長期的かつ連続的な生体への適用も可能である。
【０１０５】
〔４．リガンド化合物〕
本発明は、前記式（２）で示される（３，４−ジヒドロキシフェニル）（ジメチル）（３−スルホナートプロピル）アンモニウム、及びそのナノ粒子製造のための使用にも関する。
【０１０６】
本化合物は本発明のナノ粒子を製造するためのリガンドとして使用できる。具体的には、本化合物を、親水性リガンド等で被膜された金属粒子と反応させ、リガンド置換反応を行うことによって、下記式（１）で表される構造を有する本発明リガンドが金属粒子を被膜したナノ粒子を得ることができる。
【０１０７】
【化７】
2019004297.tif 000009
【０１０８】
（式中、破線は、金属粒子表面の金属原子との配位結合を表す）
一実施形態において本発明に係る化合物は、Ｆｅ、Ｇｄ及びＭｎから選択される金属及びその金属誘導体ならびにそれらの組み合わせを材料とするナノ粒子における、コアとなる金属粒子と結合するリガンドとして用いることができる。金属誘導体としては、酸化物、窒化物、炭化物及び硫化物が挙げられる。例えば、金属粒子と、化合物とは、該金属粒子表面の金属原子と、酸素原子とで配位結合によって結合する。
【０１０９】
また、本発明のリガンド化合物の別の態様としては、下記式（４）で表される化合物である。前記するリガンド置換反応において、本化合物の２つの水酸基から水素イオンが脱離し、残る酸素原子と金属粒子表面の金属原子とが配位結合し、本発明の別の態様のナノ粒子を形成する。
【０１１０】
【化８】
2019004297.tif 000010
【０１１１】
（式中、ｎは１〜４の整数である。）
本発明の別の態様の化合物としては、上記式（４）で表される化合物において、ｎが１、２又は４である、好ましくはｎが２又は４である、さらに好ましくはｎが４である、化合物である。
【０１１２】
上記式（４）で表される化合物は、酸化鉄を含有する金属粒子と、前記金属粒子表面の金属原子と結合した前記式（３）で表されるリガンドと、を含む本発明の別の態様のナノ粒子を製造するための材料として好適に用いられる。
【０１１３】
〔５．本発明に係る具体的な態様の例示〕
上記の課題を解決するために、本発明は、以下の何れかの一態様を包含する。
＜１＞酸化鉄を含有する金属粒子と、上記金属粒子表面の金属原子と結合した式（３）で表されるリガンドと、を含むナノ粒子。
【０１１４】
【化９】
2019004297.tif 000011
【０１１５】
（式中、ｍは１から４の整数であり、破線は、金属粒子表面の金属原子との配位結合を表す。）
＜２＞  上記＜１＞に記載の金属粒子表面の金属原子と結合したリガンドが下記式（１）で表されるリガンドである、上記＜１＞に記載のナノ粒子。
【０１１６】
【化１０】
2019004297.tif 000012
【０１１７】
（式中、破線は、金属粒子表面の金属原子との配位結合を表す）
＜３＞  上記式（３）中、上記ｍが１、２又は４である、上記＜１＞に記載のナノ粒子。
＜４＞上記酸化鉄を含有する金属粒子が、酸化鉄粒子である、上記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のナノ粒子。
＜５＞上記金属粒子の平均粒子径が５ｎｍ以下である、上記＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載のナノ粒子。
＜６＞上記金属粒子の平均粒子径が４ｎｍ以下である、上記＜５＞に記載のナノ粒子。
＜７＞上記金属粒子の平均粒子径が３ｎｍ以下である、上記＜５＞に記載のナノ粒子。
＜８＞上記＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載のナノ粒子を含む、磁気共鳴イメージング用造影剤。
＜９＞陽性造影剤である、上記＜８＞に記載の磁気共鳴イメージング用造影剤。
＜１０＞上記＜２＞に記載のナノ粒子を製造するための、（３，４−ジヒドロキシフェニル）（ジメチル）（３−スルホナートプロピル）アンモニウムの使用。
＜１１＞（３，４−ジヒドロキシフェニル）（ジメチル）（３−スルホナートプロピル）アンモニウム。
【０１１８】
また、本発明の別の態様として以下の態様を包含する。
＜１２＞酸化鉄を含有する金属粒子と、
上記金属粒子表面の金属原子と結合した式（１）で表されるリガンドと、
を含むナノ粒子。
【０１１９】
【化１１】
2019004297.tif 000013
【０１２０】
（式中、破線は、金属粒子表面の金属原子との配位結合を表す）
＜１３＞上記酸化鉄を含有する金属粒子が、酸化鉄粒子である、上記＜１２＞に記載のナノ粒子。
＜１４＞上記金属粒子の平均粒子径が５ｎｍ以下である、上記＜１２＞又は＜１３＞に記載のナノ粒子。
＜１５＞上記＜１２＞〜＜１４＞のいずれかに記載のナノ粒子を含む、磁気共鳴イメージング用造影剤。
＜１６＞陽性造影剤である、上記＜１５＞に記載の磁気共鳴イメージング用造影剤。
＜１７＞上記＜１２＞〜＜１４＞のいずれかに記載のナノ粒子を製造するための（３，４−ジヒドロキシフェニル）（ジメチル）（３−スルホナートプロピル）アンモニウムの使用。
＜１８＞（３，４−ジヒドロキシフェニル）（ジメチル）（３−スルホナートプロピル）アンモニウム。
【０１２１】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。
【実施例】
【０１２２】
以下に実施例を示し、本発明についてさらに詳しく説明する。【０１２３】
〔実施例１．リガンド化合物の合成１〕
以下のスキーム１に沿って、本発明のリガンド化合物である（３，４−ジヒドロキシフェニル）（ジメチル）（３−スルホナートプロピル）アンモニウム（ＤＤＳＡ；スキーム１の化合物３）を合成した。【０１２４】
【化１２】
2019004297.tif 000014
【０１２５】
各工程について、詳細に説明する。【０１２６】
３，４−ジメトキシアニリン（５.００ｇ、３２.６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１００ｍＬ）溶液に、１，３−プロパンスルトン（５.９８ｇ、４９.０ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で４８時間撹拌した。反応混合物をろ別し、アセトニトリルで洗浄した後乾燥させ、３−（３，４−ジメトキシアニリノ）プロパン−１−スルホン酸（化合物１）を灰色粉末として得た（４.９７ｇ、収率５５％）。【０１２７】
得られた化合物１（２.００ｇ、７.２６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２.０１ｇ、１４.５ｍｍｏｌ）、ヨードメタン（８.２５ｇ、５８.１ｍｍｏｌ）をメタノール（５０ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下で１２時間加熱還流した。反応混合物を濃縮し、逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）で精製して（３，４−ジメトキシフェニル）（ジメチル）（３−スルホナートプロピル）アンモニウム（化合物２）を得た（２.１６ｇ、収率９８％）。【０１２８】
得られた化合物２（１.３４ｇ、４.４２ｍｍｏｌ）をヨウ化水素酸（１０ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下で１２時間加熱還流した。反応混合物を加熱真空乾燥した後、水（１０ｍＬ）を加え、再び加熱真空乾燥させた。再び残渣を水（５ｍＬ）に溶解させ、アセトン（３００ｍＬ）を加えて沈殿させた後、ろ別して、（３，４−ジヒドロキシフェニル）（ジメチル）（３−スルホナートプロピル）アンモニウム（ＤＤＳＡ、化合物３）を白色粉末として得た（４２０ｍｇ、収率３５％）。【０１２９】
〔実施例２．ナノ粒子の製造１〕
下記のスキーム２に記載の手順で、平均粒径１.８ｎｍの酸化鉄ナノ粒子（ＳＮＰ）をコア粒子とするＤＤＳＡで被覆されたナノ粒子（ＳＮＰ−ＤＤＳＡ）を製造した。【０１３０】
【化１３】
2019004297.tif 000015
【０１３１】
以下に、上記スキーム２中の各工程（ａ）〜（ｄ）について、詳細に説明する。【０１３２】
＜工程（ａ）＞
塩化鉄（ＩＩＩ）にオレイン酸（ＯＡ）を添加してオレイン酸と鉄イオンとからなる錯体（ＦｅＯＡ３）を製造する工程である。【０１３３】
１００ｍＬのフラスコに、塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物（２.１６ｇ、８ｍｍｏｌ）、オレイン酸ナトリウム（７.３ｇ、２４ｍｍｏｌ）、１６ｍＬのエタノール、１２ｍＬの水及び２８ｍＬのヘキサンを混合し、７０℃で４時間撹拌した。有機層を回収して分液漏斗に移し、３０ｍＬの水を加えて激しく振盪し、有機層を回収した。この操作を３回繰り返した。得られた有機層を乾燥し、オレイン酸と鉄イオンとからなる錯体（ＦｅＯＡ３）を得た。【０１３４】
＜工程（ｂ）＞
ＦｅＯＡ３にオレイルアルコールを反応させて表面がオレイン酸で被覆された酸化鉄粒子（ＳＮＰ−ＯＡ）を製造する工程である。【０１３５】
上記工程（ａ）で得られたＦｅＯＡ３（１.８ｇ、２ｍｍｏｌ）に、オレイルアルコール（３.２２ｇ、１２ｍｍｏｌ）及びジフェニルエーテル１０ｇを、Ａｒ雰囲気下で加え、撹拌しながら９０℃で脱気し、その後２００℃まで１０℃／ｍｉｎで昇温し、２００℃で３０分間撹拌を続けた。その後室温まで下げた後にアセトンを５０ｍＬ加え、８０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上澄みを除去した。得られた沈殿が完全に分散するまでクロロホルムを加え（約０.５ｍＬ）、さらにアセトンを１０ｍＬ加えた後、８０００ｒｐｍで２０分間遠心し上澄みを除去した。この操作を３回繰り返し、得られた沈殿を乾燥させた。【０１３６】
＜工程（ｃ）＞
上記工程（ｂ）において得られたＳＮＰ−ＯＡの表面に被覆されたオレイル酸を２−メトキシエトキシエトキシ酢酸（ＭＥＥＡ）で置換し、親水性リガンドで被覆されたナノ粒子（ＳＮＰ−ＭＥＥＡ）を製造する工程である。【０１３７】
Ａｒ雰囲気下で１０ｍｇのＳＮＰ−ＯＡをメタノール０.９ｍＬに分散させ、ＭＥＥＡ０.１ｍＬを加え、７０℃で４時間撹拌した。この溶液の温度を室温に下げたあと、アセトン８ｍＬ及びヘキサン２ｍＬを加え、５８００ｒｐｍで３分間遠心し上澄みを取り除いた。この操作を３回繰り返し、得られた沈殿を乾燥させ、ＳＮＰ−ＭＥＥＡを得た。また、ＳＮＰ−ＭＥＥＡに水３００μＬとＤＭＦ６００μＬを加え溶液とし、以下これをＳＮＰ−ＭＥＥＡ溶液と呼ぶ。
＜工程（ｄ）＞
上記工程（ｃ）で得られたＳＮＰ−ＭＥＥＡと、（３，４−ジヒドロキシフェニル）（ジメチル）（３−スルホナートプロピル）アンモニウム（ＤＤＳＡ）を反応させ、酸化鉄粒子がＤＤＳＡで被覆されたナノ粒子（ＳＮＰ−ＤＤＳＡ）を製造する工程である。なお、ナノ粒子（ＳＮＰ−ＤＤＳＡ）において、酸化鉄粒子表面に被覆したＤＤＳＡリガンドは以下の式（１）の構造を有している。【０１３８】
【化１４】
2019004297.tif 000016
【０１３９】
（式中、破線は、酸化鉄粒子表面の鉄原子と、酸素原子との配位結合を表す）
ＳＮＰ−ＭＥＥＡ溶液１ｍＬに、リガンド化合物としてＤＤＳＡ ８５ｍｇをＡｒ雰囲気下で加え、５０℃で１２時間撹拌した。その後、室温まで温度を下げたあと、２０ｍＬのアセトンを加え、５８００ｒｐｍで３分間遠心し、上澄みを除去した。得られた沈殿をリン酸緩衝液（phosphate buffered saline、ＰＢＳ）２ｍＬ中に分散させた。得られた溶液をAmicon Ultra centrifuge 3K filter（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、以下3K filterと略記する）を用い、８０００ｒｐｍで３０分ほど遠心し、体積を１／５ぐらいになるまで減らした。そこにまた溶液体積が全量で約２ｍＬになるようにＰＢＳを加え、遠心をした。この操作をＦｉｌｔｅｒから落ちてくる溶液の色が完全に消えるまで、５〜８回程度繰り返して行った。得られた溶液を、１〜１.５ｍＬになるようにＰＢＳで希釈し、ＳＮＰ−ＤＤＳＡ溶液とした。【０１４０】
上記工程（ｄ）で得られたＳＮＰ−ＤＤＳＡ溶液を、４℃で保存した。また、ＳＮＰ−ＤＤＳＡ溶液中の鉄の濃度を、ＩＣＰ発光分光分析法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）を用いて決定した。また、図１に透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって観察したＳＮＰ−ＤＤＳＡの画像を示す。ＴＥＭによる観察結果、１００個の粒子のコア直径の平均値から、得られたＳＮＰ−ＤＤＳＡはコアである酸化鉄粒子の直径が平均１.８ｎｍであると見積もられた。【０１４１】
〔実施例３．ナノ粒子のＭＲ緩和能の評価測定〕
上記実施例２で得られた、直径１.８ｎｍの酸化鉄粒子をコアとするナノ粒子、ＳＮＰ−ＤＤＳＡを以下の実験に用いた。【０１４２】
まず、ＰＢＳ中でＳＮＰ−ＤＤＳＡの濃度を系列的に希釈し、試験試料とした。各試料について、１ＴのＭＲＩを用い、緩和能の推定を行った。【０１４３】
まず、１Ｔ−ＭＲＩにおいてＴ１強調画像を取得した。Ｔ１及びＴ２の測定条件を以下に示す。【０１４４】
＜１Ｔ−ＭＲＩ＞
Ｔ１強調画像
Pulse Sequence : MSME, TR = 400 msec, TE = 10 msec, Slice Thickness = 2 mm, Number of Slice = 1, Matrix Size = 256 × 256, FOV = 38.4 × 38.4 mm2, scan time = 1min 42 sec.
Ｔ２測定（マルチエコー・スピンエコー法）
Pulse Sequence : MSME, TR = 15,000 msec, TE = 20 msecを256回繰り返した（maoパルス使用）, Slice Thickness = 2 mm, Number of Slice = 1, FOV = 38.4 × 38.4 mm2, Matrix Size = 64 × 64, Scan Time = 16 min 00 sec.
Ｔ１測定（反転回復法）
Pulse : SE-RARE, TR = 20,000 sec, TE = 17 msec, NEX = 1, RARE Factor = 4, Numberof slice = 1, slice thickness = 2 mm, FOV = 38.4 × 38.4 mm2, Matrix Size = 64 × 64, 1スキャンにつきScan Time = 21 min 20 sec, Inversion Time = 45, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200, 6400, 8000, 10000, 12000 の11点測定
結果を図２に示す。図２の（ａ）は、系列的に希釈された、ＳＮＰ−ＤＤＳＡのＰＢＳ溶液中の緩和時間の測定結果を示す。図２の（ｂ）は、緩和時間をＳＮＰ−ＤＤＳＡの鉄原子濃度に対してプロットした図である。図２の（ｂ）から、Ｔ１及びＴ２がＳＮＰ濃度に線形に比例することを確認した。図２の（ｃ）は図２の（ｂ）のプロットの傾きから決定された緩和能ｒ１、ｒ２及びｒ１／ｒ２の値を示す。【０１４５】
以上の結果から、１Ｔでは、ｒ１／ｒ２の値が０.７１であり、この値は、これまでに報告されてきた酸化鉄粒子をコアとするＳＮＰの中で磁場強度の影響を補正すると最も大きいものであった。よって、陽性造影剤として適用するために有望であることを示している。【０１４６】
〔実施例４．安定性評価試験〕
ナノ粒子を用いた造影剤が期待された性能を発揮するためには、それらが溶液中に安定に分散している必要があり、長い期間、高濃度な状態でも分散性を維持していることが望ましい。【０１４７】
一般に、ナノ粒子の分散安定性は、サイズ排除クロマトグラフィー（Size Exclusion Chromatography、ＳＥＣ）や動的光散乱法（Dynamic light scattering、ＤＬＳ）によって評価される。【０１４８】
ＳＥＣは、細孔を持つ担体を充填したカラムに試料を流し、それが流出するまでの時間で試料の大きさを見積もる分析手法である。大きな凝集体は担体の細孔に入らないため早く流出し、小さなナノ粒子は担体の細孔を通るため流出するまでの経路が長くなり、遅く流出するため、流出時間の変化から凝集挙動を調べることができる。【０１４９】
ＤＬＳは、溶液中の物体が散乱する光の強度、方向の時間変化の速さから溶液中の物体の流体力学半径を見積もる方法であり、この測定によって得られる流体力学半径の分布及び平均値から凝集挙動を調べることができる。【０１５０】
ナノ粒子の安定性を調べるため、上記実施例２で得られたＳＮＰ−ＤＤＳＡを凍結乾燥した後、ＰＢＳ中にＦｅイオン濃度が１００ｍＭとなるように分散させ、試験試料とした。【０１５１】
この試料を、４℃及び室温（２０℃）に静置し、１、７、２８日後にＳＥＣ及びＤＬＳに付して、その凝集の度合いを確認した。ＳＥＣ及びＤＬＳの測定条件を以下に示す。
＜ＳＥＣ条件＞
流速：０.３ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液：ＰＢＳ
カラム：Shodex KW403-4F
検出器：UV 280nm、PDA 200-650nm
＜ＤＬＳ条件＞
装置：Malvern Zetasizer nano
溶液をＦｅイオン濃度が１ｍＭ程度となるように希釈して測定
２８日間にわたってＳＥＣ及びＤＬＳで観察した結果、４℃及び室温のいずれにおいても、ＳＥＣでの測定において新しいピークの出現やピークのシフトは起こらず、ＤＬＳでの測定においても流体力学半径の分布や平均値にほとんど変化がなかったことから、ＳＮＰ−ＤＤＳＡの凝集は確認されず、優れた安定性が確認された。【０１５２】
〔実施例５．マウスを用いたＭＲＩ測定〕
実施例２で作製したＳＮＰ−ＤＤＳＡ（直径１.８ｎｍの酸化鉄粒子をコアとするナノ粒子）を含有する造影剤をラットに投与し、１テスラのＭＲＩ装置においてＴ１強調画像を取得した。測定時の条件を以下に示す。
動物：Ｃ５７ＢＬ／６ｊ  ｊｍｓ  ｍｏｕｓｅ  雄、体重２７．８ｇ
投与ナノ粒子濃度：４０ｍＭ
投与量：２００μＬ
磁場強度:１Ｔ
撮影モード：Ｔ１強調（図３〜図５）、ＭＲ  ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ（血管造影）（図６）
使用装置：１テスラ  ＭＲＩ装置（Bruker Biospin社製 ICON, solenoidコイル）
＜１Ｔ−ＭＲＩ＞
Ｔ１強調画像
Pulse sequence : MSME (Mulch Slice Mulch Echo), Slice Orient = Axial, TE/TR = 10.464 / 400 msec, Field of view = 40 × 40 mm2, matrix size = 256 × 256, Number of Slice = 15, Slice thickness = 1 mm, Slice Gap = 2 mm, Number of averages = 8, Scan Time = 13 min 39 sec
＜MR血管造影＞
Pulse sequence : FLASH (Fast Low Angle Shot), Slice Orient = Axial, TE/TR = 5.954 / 15 msec, Field of view = 28.8 × 28.8 mm2, matrix size = 192 × 192, Number of Slice = 1, Slice thickness = 1 mm, Number of averages = 32, Scan Time = 1 min32 sec
なお、画像は１スライス（Slice）を、３箇所に分けて撮像した（一度に撮像すると、血液の信号が低下するため。）。【０１５３】
造影剤投与前の撮影後、ＳＮＰ−ＤＤＳＡの４０ｍＭ溶液２００μＬを静脈内投与後、各時点で撮像し、３時間まで経過を追った。【０１５４】
結果を図３〜６に示す。
図３の（ａ）は、実施例２のＳＮＰ−ＤＤＳＡを含有する造影剤を投与したマウスの膀胱における投与前（ｐｒｅ）、投与直後（ｐｏｓｔ）、投与後３０分（３０ｍｉｎ）、投与後３時間（３ｈ）の経時的なＭＲＩ測定結果の画像を、図３の（ｂ）は、実施例２のＳＮＰ−ＤＤＳＡを含有する造影剤を投与したマウスの膀胱における投与前（ｐｒｅ）、投与直後（ｐｏｓｔ）、投与後１時間（１ｈ）、投与後２時間（２ｈ）の経時的なＭＲＩ測定結果の画像を、それぞれ示す。投与直後から造影剤を含む尿が溜まっていくのが観察されたことから、本造影剤は、腎臓から尿排泄されていることが示された。【０１５５】
図４の（ａ）は、実施例２のＳＮＰ−ＤＤＳＡを含有する造影剤を投与したマウスの腎臓における投与前（ｐｒｅ）、投与直後（ｐｏｓｔ）、投与後３０分（３０ｍｉｎ）、投与後３時間（３ｈ）の経時的なＭＲＩ測定結果の画像を、図４の（ｂ）は、実施例２のＳＮＰ−ＤＤＳＡを含有する造影剤を投与したマウスの腎臓における投与前（ｐｒｅ）、投与直後（ｐｏｓｔ）、投与後１時間（１ｈ）、投与後２時間（２ｈ）の経時的なＭＲＩ測定結果の画像を、それぞれ示す。投与直後、腎盂及び腎皮質の両方で信号が上昇したことから、本造影剤は、腎臓を介して尿排泄されていることが示された。また、その信号変化を追うことで、本造影剤は、腎機能検査に利用できる可能性が示唆された。【０１５６】
また、図５は、実施例２のＳＮＰ−ＤＤＳＡを含有する造影剤を投与したマウスの肝臓における経時的なＭＲＩ測定結果の画像を示す。肝臓においては、投与直後から徐々に信号低下が生じた（白く撮像された部分が投与後から徐々に黒く落ちていった）。これは肝臓の網内系において造影剤が濃縮及び凝集され、Ｔ２緩和時間の短縮を生じた結果、信号低下となったと考えられる。この現象は、肝がんでは生じないため、肝腫瘍の検出に有用である事が示唆された。【０１５７】
また、肝血管の多くが信号上昇を生じ、高いコントラストでの肝血管造影が可能である事が示唆された。【０１５８】
図６は、実施例２のＳＮＰ−ＤＤＳＡを含有する造影剤を投与したマウスの血管における経時的なＭＲ血管造影の結果の画像を示す。【０１５９】
血管造影法において、図６に示す断面では、投与直後に静脈の信号上昇が生じ、この信号上昇した状態が３０分以上持続した。【０１６０】
〔実施例６．リガンド化合物の合成２〕
以下のスキーム３に沿って、前記式（４）のnが４である本発明の別の態様のリガンド化合物である（３，４−ジヒドロキシフェニル）（ジメチル）（４−スルホナートブチル）アンモニウム（Ｃ４−ＤＤＳＡ；化合物６）を合成した。【０１６１】
【化１５】
2019004297.tif 000017
【０１６２】
各工程について、詳細に説明する。【０１６３】
３，４−ジメトキシアニリン（２．００ｇ）とアセトニトリル（５０ｍＬ）の混合物に、１，４−ブタンスルトン（１．６０ｍＬ）を加え、１１５℃で攪拌した。途中で１，４−ブタンスルトン（１．３３ｍＬ）を２回追加し、合計２４時間攪拌した。室温まで放冷後、固体をろ取し、アセトニトリルで洗浄後、５０℃で減圧下乾燥し、４−（３，４−ジメトキシアニリノ）ブタン−１−スルホン酸（２．９７ｇ）を得た。
MASS（ESI＋）：290【０１６４】
得られた化合物４（２．９７ｇ）、炭酸カリウム（３．４０ｇ）及びメタノール（４５ｍＬ）の混合物に、ヨードメタン（５．７６ｍＬ）を加え、５０℃で３晩攪拌した。室温まで放冷後、濃縮した。得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アセトニトリル／水）で精製し、（３，４−ジメトキシフェニル）（ジメチル）（４−スルホナートブチル）アンモニウム（３．１２ｇ）を得た。
MASS（ESI＋）：318【０１６５】
得られた化合物５（３．１２ｇ）と５７％ヨウ化水素酸（１３ｍＬ）との混合物を、１１０℃で攪拌した。途中で５７％ヨウ化水素酸（１３ｍＬ）を追加し、合計１６時間攪拌した。室温まで放冷後、水（２０ｍＬ）を加え、濃縮した。再度水（２０ｍＬ）を加え、濃縮した。得られた残渣に水（２ｍＬ）及びアセトン（３５ｍＬ）を加え、氷冷下３０分間攪拌し、上澄液を廃棄した。さらにこの残渣に水（２ｍＬ）及びアセトン（２５ｍＬ）を加え、氷冷下３０分間攪拌し、上澄液を廃棄した。この操作をあと１回繰り返し、５０℃で減圧下乾燥し、（３，４−ジヒドロキシフェニル）（ジメチル）（４−スルホナートブチル）アンモニウム（Ｃ４−ＤＤＳＡ、化合物６）（２．５０ｇ）を得た。
MASS（ESI＋）：290
1H NMR (DMSO-d6) δ ppm 1.36 - 1.57 (4 H, m) 2.32 - 2.41 (2 H, m) 3.41 - 3.48 (6 H, m) 3.69 - 3.86 (2 H, m) 6.86 (1 H, d, J=8.8 Hz) 7.07 (1 H, dd, J=8.8, 3.1 Hz) 7.23 (1 H, d, J=3.1 Hz) 9.57 (1 H, br s) 9.80 (1 H, br s)【０１６６】
〔実施例７．ナノ粒子の製造２〕
下記スキーム４に記載の手順で、酸化鉄ナノ粒子（ＳＮＰ）をコア粒子とするＣ４−ＤＤＳＡで被覆されたナノ粒子（ＳＮＰ−Ｃ４−ＤＤＳＡ）を製造した。【０１６７】
【化１６】
2019004297.tif 000018
【０１６８】
以下に、上記スキーム４中の各工程（ａ）〜（ｄ）について、詳細に説明する。【０１６９】
＜工程（ａ）＞
塩化鉄（ＩＩＩ）にオレイン酸（ＯＡ）を添加してオレイン酸と鉄イオンとからなる錯体（ＦｅＯＡ３）を製造する工程である。当該工程は前記スキーム２中の工程（ａ）に従い行うことができる。【０１７０】
＜工程（ｂ）＞
ＦｅＯＡ３にオレイルアルコールを反応させてＳＮＰ−ＯＡを製造する工程である。【０１７１】
ＦｅＯＡ３（６．００ｇ）、オレイルアルコール（１０．７ｇ）及びジフェニルエーテル（３３．５ｇ）を加え、攪拌しながら９０℃で２時間減圧下脱気し、その後アルゴンで常圧にもどし、２３０℃まで１６分かけて昇温し、２３０℃で３７分間（内温２２０℃を超えてから３０分間）攪拌した。その後室温まで下げた後にヘキサン（５ｍＬ）及びアセトン（１５０ｍＬ）を加え、８０００ｒｐｍ、１０℃で１０分間遠心し、上澄みを除去した。ヘキサン（２４ｍＬ）及びアセトン（１５０ｍＬ）を加え、同条件で遠心し、上澄みを除去した。この操作をもう１回繰り返し、ＳＮＰ−ＯＡ（１．０２ｇ）を得た。【０１７２】
＜工程（ｃ）＞
上記工程（ｂ）において得られたＳＮＰ−ＯＡの表面に被覆されたオレイル酸をＭＥＥＡで置換し、ＳＮＰ−ＭＥＥＡを製造する工程である。【０１７３】
Ａｒ雰囲気下、ＳＮＰ−ＯＡ（２０ｍｇ）、ＭＥＥＡ（５００ｕＬ）及びメタノール（１．５ｍＬ）の混合物を、７０℃で６時間攪拌した。室温まで放冷後、アセトン（４ｍＬ）及びヘキサン（１６ｍＬ）を加え、７８００ｒｐｍ、１０℃で１０分間遠心し上澄みを取り除いた。この操作をアセトン（１ｍＬ）及びヘキサン（４ｍＬ）を用いて３回繰り返し、ＳＮＰ−ＭＥＥＡを得た。
＜工程（ｄ）＞
上記工程（ｃ）で得られたＳＮＰ−ＭＥＥＡと、Ｃ４−ＤＤＳＡを反応させ、酸化鉄粒子がＣ４−ＤＤＳＡで被覆されたナノ粒子（ＳＮＰ−Ｃ４−ＤＤＳＡ）を製造する工程である。なお、ナノ粒子（ＳＮＰ−Ｃ４−ＤＤＳＡ）において、酸化鉄粒子表面に被覆したＤＤＳＡリガンドは以下の式（５）の構造を有している。【０１７４】
【化１７】
2019004297.tif 000019
【０１７５】
（式中、破線は、酸化鉄粒子表面の鉄原子と、酸素原子との配位結合を表す）
Ｃ４−ＤＤＳＡ（２５０ｍｇ）を加熱しながら水（３．３ｍＬ）に溶解し、炭酸水素ナトリウム（５０ｍｇ）を加えた。この溶液を上記工程（ｃ）で得られたＳＮＰ−ＭＥＥＡに加え、更に、ＤＭＦ（６．７ｍＬ）を加え、５０℃で終夜攪拌した。室温まで放冷後、水（１．５ｍＬ）及びアセトン（６０ｍＬ）を加え、２つに分け、それぞれ７８００ｒｐｍ、１０℃で１０分間遠心し上澄みを取り除いた。得られた沈殿をＰＢＳに分散させ、Amicon Ultra centrifuge 100K filter（Merck Millipore）を用い、５８００ｒｐｍ、１０℃で３０分間遠心した。これに更にＰＢＳを加え、遠心した。この操作を後３回行った。得られた濾液をAmicon Ultra centrifuge 10K filter（Merck Millipore、以下10K filterと略記する）を用い、５８００ｒｐｍ、１０℃で３０分間遠心した。これに更に水を加え、遠心した。この操作を後３回行った。濃縮液をYMC Duo-Filter（XQ DUO 15, ポアサイズ０．２μｍ）で濾過し、凍結乾燥して、ＳＮＰ−Ｃ４−ＤＤＳＡ（１０Ｋ）を得た（１．９ｍｇ）。10K filterの濾液を、3K filterを用い、５８００ｒｐｍ、１０℃で１時間遠心した。これに更に水を加え、遠心した。この操作を後８回行った。濃縮液をYMC Duo-Filterで濾過し、凍結乾燥して、ＳＮＰ−Ｃ４−ＤＤＳＡ（３Ｋ）を得た（０．５ｍｇ）。なお、ＳＮＰ−Ｃ４−ＤＤＳＡの後ろの（１０Ｋ）及び（３Ｋ）は最後に用いたフィルターの種類を示す。【０１７６】
リガンドとして、上記式（４）のnが１である（３，４−ジヒドロキシフェニル）（ジメチル）（１−スルホナートメチル）アンモニウム（Ｃ１−ＤＤＳＡ）又はｎが２である（３，４−ジヒドロキシフェニル）（ジメチル）（２−スルホナートエチル）アンモニウム（Ｃ２−ＤＤＳＡ）を用いて、上記スキーム２又は４の工程もしくは同等の手法又は公知の手法を組み合わせることにより、酸化鉄ナノ粒子（ＳＮＰ）をコア粒子とするＣ１−ＤＤＳＡで被覆されたナノ粒子（ＳＮＰ−Ｃ１−ＤＤＳＡ）又はＣ２−ＤＤＳＡで被覆されたナノ粒子（ＳＮＰ−Ｃ２−ＤＤＳＡ）をそれぞれ製造することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１７７】
本発明のＭＲＩ用造影剤は、医療分野において、ＭＲＩの造影剤として好適に使用することができる。また、本発明のナノ粒子及び化合物は、ＭＲＩの造影剤を含む種々の医薬組成物等に応用可能であり、各種診断法や検査試薬をはじめとして、医薬及び生命工学分野等において広く利用することが可能である。
【図１】
2019004297.tif 000023
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2019004297.tif 000031