(57)【要約】  プロテアーゼのプロ体をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入し、封入体として発現させるプロ体発現工程と、封入体状態のプロ体を変性させ、変性プロ体を得る変性工程と、カルシウムイオンを含み、かつ、ｐＨ５以上の溶液中で、変性プロ体をリフォールディングさせるリフォールディング工程と、リフォールディング後のプロ体をアルカリ条件下で成熟化させ、活性を有するプロテアーゼを得る成熟化工程とを包含するプロテアーゼの製造方法は、製造過程における自己分解を抑制し、プロ体から生成される成熟体を高効率で回収可能なプロテアーゼの製造方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼのプロ体をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入し、封入体として発現させるプロ体発現工程と、
封入体状態のプロ体を変性させ、変性プロ体を得る変性工程と、
カルシウムイオンを含み、かつ、ｐＨ５以上の溶液中で、変性プロ体をリフォールディングさせるリフォールディング工程と、
リフォールディング後のプロ体を成熟化させ、活性を有するプロテアーゼを得る成熟化工程と
を包含し、
前記成熟化工程に供したプロ体の５０％以上が活性を有するプロテアーゼとして回収されることを特徴とするプロテアーゼの製造方法。
【請求項２】
前記成熟化工程の後に、さらにｐＨ２〜６のプロテアーゼ溶液を調製するプロテアーゼ溶液調製工程を包含することを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記プロテアーゼ溶液が、０．１ｍｇ／ｍｌ以上のプロテアーゼ濃度を有する請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記リフォールディング工程の直後に、リフォールディング後のプロ体を含有し、ｐＨ２〜６の溶液を調製するプロ体含有溶液調製工程をさらに包含することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記プロテアーゼが、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
【請求項６】
前記プロテアーゼのプロ体が、以下の（ｅ）または（ｆ）に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるプロテアーゼを含有し、ｐＨが２〜６の範囲であることを特徴とするプロテアーゼ溶液。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
【請求項８】
プロテアーゼ濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ以上である請求項７に記載のプロテアーゼ溶液。
【請求項９】
以下の（ｅ）または（ｆ）に記載のアミノ酸配列からなるプロ体を含有し、ｐＨが２〜６の範囲であることを特徴とするプロテアーゼのプロ体溶液。
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるプロテアーゼを含有する洗剤。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
【請求項１１】
さらに、界面活性剤を含有する請求項１０に記載の洗剤。
【請求項１２】
医療器具洗浄用である請求項１０または１１に記載の洗剤。
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるプロテアーゼを含有する異常プリオンタンパク質分解剤。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
【請求項１４】
異常プリオンタンパク質が付着した被洗浄物と、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるプロテアーゼとを接触させる工程を包含する異常プリオンタンパク質の不活化方法。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
【請求項１５】
前記被洗浄物と前記プロテアーゼとをタンパク質変性条件下で接触させる請求項１４に記載の異常プリオンタンパク質の不活化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼの製造方法、並びに当該製造方法により製造されるプロテアーゼ溶液およびプロテアーゼのプロ体溶液に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素の総称であり、微生物、動物および植物に広く分布している。また、プロテアーゼは、洗剤、皮革加工、食品加工、機能性ペプチド生産において幅広く利用されている代表的な産業用酵素である。特に医療器具の二次感染予防の観点から、感染性タンパク質汚れのプロテアーゼによる分解は、代替の難しい技術となっている。産業用酵素としての実用面で一番重要視されるのは、酵素の安定性および利用条件下での活性の高さである。特に、物理的・化学的に高い熱安定性が要求される場合が多く、それゆえ、産業用プロテアーゼには耐熱性プロテアーゼが広く使用されている。現在、産業用に使用されている耐熱性プロテアーゼとして、Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  ＣａｒｌｓｂｅｒｇやＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫなどのサチライシンファミリープロテアーゼ（subtilisin family protease）が知られている。また、他にはアルカリフィルス・トランスバーレンシス由来のプロテアーゼ（特許文献１）、パイロコッカス・ホリコシ由来のプロテアーゼ（特許文献２）、ピロコッカス・フリオサス由来のプロテアーゼ（特許文献３）が知られている。【０００３】
特に医療器具の酵素洗浄剤として使用されるプロテアーゼは、強い洗浄力が求められるため高温域での安定性と活性の高さが必要となる。機械洗浄で使用される医療用洗浄剤は、洗浄と同時に滅菌できることが望まれており、滅菌処理温度の９３℃においても活性を保持するプロテアーゼが求められている。医療機器の洗浄において二次感染の防止は重要な問題であり、なかでもプリオン病といわれる感染症は、病原菌ではなく異常プリオンタンパク質が二次感染を引き起こすことが知られている。異常プリオンタンパク質は通常の医療洗浄では、感染性を不活化することができない。現在では、異常プリオンタンパク質に汚染された医療機器は、廃棄や洗浄後、過酷な物理的条件として例えば３％ＳＤＳ存在下、１００℃、５分の条件で処理することで感染性の不活化を行っている。また感染性の不活化までは担保できないが、異常プリオンタンパク質を分解除去できる酵素洗浄剤としてＰｒｉｏｎｚｙｍｅ（米国Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社）が開発されている。【０００４】
本発明者らは、超好熱菌の１つであるＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株由来のサチライシンファミリーに属するプロテアーゼ（以下「Ｔｋ−サチライシン」という）を見出し、当該Ｔｋ−サチライシンがｐＨ９．５、温度８０℃〜１００℃で最も高い活性を示すこと、公知のプロテアーゼのなかで最も高い熱安定性を有し、アルカリ条件下におけるタンパク質分解活性が最も高いことを報告している（非特許文献１および２参照）。したがって、Ｔｋ−サチライシンは、産業利用上有利な高い温度、高いｐＨ条件下での利用が可能であり、しかも公知のプロテアーゼより当該条件下における活性が顕著に高いため、従来プロテアーゼを用いることができなかった用途への適用が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−１４１２５９号公報
【特許文献２】特開２００６−１４９３０７号公報
【特許文献３】特許３５１６４５５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kannan, Y., Koga, Y., Inoue, Y., Haruki, M., Takagi, M., Imanaka, T. et al. Active subtilisin-like protease from a hyperthermophilic archaeon in a form with a putative prosequence. Appl. Environ. Microbiol. 67, 2445?2552. (2001).
【非特許文献２】Pulido, M., Saito, K., Tanaka, S., Koga, Y., Takano, K. & Kanaya, S. Ca2+-dependent maturation of Tksubtilisin from a hyperthermophilic archaeon: propeptide is a potent inhibitor of the mature domain but is not required for its folding. Appl. Environ. Microbiol. 72, 4154?4162. (2006).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
Ｔｋ−サチライシンを大量生産する場合、遺伝子組換え技術により、大腸菌を用いてそのプロ体を組換えタンパク質として発現させ、リフォールディングおよび成熟化を経て精製および回収する方法が一般的である（非特許文献２参照）。しかしながら、Ｔｋ−サチライシンは、活性が高いことに起因して、リフォールディングおよび成熟化の段階で自己分解が生じるため成熟体の回収効率が低く、リフォールディングしたプロ体の約２０％しかＴｋ−サチライシンを回収することができなかった。また、自己分解が生じずに構造の安定性を維持した状態で保存可能なＴｋ−サチライシン溶液は未だ実現できていなかった。さらに、Ｔｋ−サチライシンの濃縮を試みた場合、一定以上の濃度になると直ちに自己分解反応が生じ、高濃度のＴｋ−サチライシン溶液を調製することができなかった。このように、Ｔｋ−サチライシンは製造および保存に関する種々の問題点を有しており、産業用プロテアーゼとして利用するためにはこれらの課題を解決する必要があった。【０００８】
そこで、本発明は、製造過程における自己分解を抑制し、プロ体から生成される成熟体を高効率で回収可能なプロテアーゼの製造方法、並びに、自己分解が生じることなく高濃度で安定に保存可能なプロテアーゼ溶液およびプロテアーゼのプロ体溶液を提供することを目的とする。さらに、当該製造方法で得られるプロテアーゼ、特にＴｋ−サチライシンの新規な産業用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の発明を包含する。
［１］プロテアーゼのプロ体をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入し、封入体として発現させるプロ体発現工程と、封入体状態のプロ体を変性させ、変性プロ体を得る変性工程と、カルシウムイオンを含み、かつ、ｐＨ５以上の溶液中で、変性プロ体をリフォールディングさせるリフォールディング工程と、リフォールディング後のプロ体を成熟化させ、活性を有するプロテアーゼを得る成熟化工程とを包含し、前記成熟化工程に供したプロ体の５０％以上が活性を有するプロテアーゼとして回収されることを特徴とするプロテアーゼの製造方法。
［２］前記成熟化工程の後に、さらにｐＨ２〜６のプロテアーゼ溶液を調製するプロテアーゼ溶液調製工程を包含することを特徴とする前記［１］に記載の製造方法。
［３］前記プロテアーゼ溶液が、０．１ｍｇ／ｍｌ以上のプロテアーゼ濃度を有する前記［２］に記載の製造方法。
［４］前記リフォールディング工程の直後に、リフォールディング後のプロ体を含有し、ｐＨ２〜６の溶液を調製するプロ体含有溶液調製工程をさらに包含することを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］前記プロテアーゼが、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
［６］前記プロテアーゼのプロ体が、以下の（ｅ）または（ｆ）に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
［７］以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるプロテアーゼを含有し、ｐＨが２〜６の範囲であることを特徴とするプロテアーゼ溶液。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
［８］プロテアーゼ濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ以上である前記［７］に記載のプロテアーゼ溶液。
［９］以下の（ｅ）または（ｆ）に記載のアミノ酸配列からなるプロ体を含有し、ｐＨが２〜６の範囲であることを特徴とするプロテアーゼのプロ体溶液。
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
［１０］以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるプロテアーゼを含有する洗剤。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
［１１］さらに、界面活性剤を含有する前記［１０］に記載の洗剤。
［１２］医療器具洗浄用である前記［１０］または［１１］に記載の洗剤。
［１３］以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるプロテアーゼを含有する異常プリオンタンパク質分解剤。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
［１４］異常プリオンタンパク質が付着した被洗浄物と、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるプロテアーゼとを接触させる工程を包含する異常プリオンタンパク質の不活化方法。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
［１５］前記被洗浄物と前記プロテアーゼとをタンパク質変性条件下で接触させる前記［１４］に記載の異常プリオンタンパク質の不活化方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、製造過程において自己分解を抑え、プロ体から生成される成熟体を従来と比較して顕著に高い効率で回収可能なプロテアーゼの製造方法を提供することができる。また、自己分解が生じることなく高濃度で安定に保存可能なプロテアーゼ溶液およびプロテアーゼのプロ体溶液を提供することができる。本発明の製造方法により製造されるプロテアーゼは、高温かつ高アルカリ条件下でも高い活性を有し、界面活性剤やタンパク質変性剤に対しても安定であるので、異常プリオンをはじめとする難分解性タンパク質を物理的に変性（感染性を不活化）させながら分解し除去することが可能であり、各種産業用洗剤として非常に有用である。さらに、本発明の製造方法により製造されるプロテアーゼは、異常プリオンタンパク質を分解することができるので、異常プリオンタンパク質分解剤として非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｔｋ−サチライシンの温度依存性を検討した結果を示すグラフである。
【図２】Ｔｋ−サチライシンのｐＨ依存性を検討した結果を示すグラフである。
【図３】Ｔｋ−サチライシンの構造安定性に及ぼすｐＨの影響を検討した結果を示すグラフである。
【図４】プロＴｋ−サチライシンの各ｐＨ条件下でのリフォールディング効率を比較・検討した結果を示すグラフである。
【図５】Ｔｋ−サチライシンの熱安定性を検討した結果を示すグラフである。
【図６】Ｔｋ−サチライシンのＴｒｉｔｏｎＸ−１００に対する安定性を検討した結果を示すグラフである。
【図７】Ｔｋ−サチライシンのＴｗｅｅｎ−２０に対する安定性を検討した結果を示すグラフである。
【図８】Ｔｋ−サチライシンのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に対する安定性を検討した結果を示すグラフである。
【図９】Ｔｋ−サチライシンの塩酸グアニジン（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ＨＣｌ）に対する安定性を検討した結果を示すグラフである。
【図１０】Ｔｋ−サチライシンの尿素（Ｕｒｅａ）に対する安定性を検討した結果を示すグラフである。
【図１１】本発明の製造方法および従来法における成熟体の回収効率を比較した図である。
【図１２】Ｔｋ−サチライシン溶液の濃縮に伴う自己分解の有無を調べた結果を示す図である。
【図１３】ネイティブ構造を有するプロＴｋ−サチライシン含有溶液の調製を試みた結果を示す図である。
【図１４】各種界面活性剤存在下において、１００℃、１０分間の反応条件でＴｋ−サチライシンのＢＳＡ分解活性を確認した結果を示す図である。
【図１５】各種界面活性剤存在下において、６５℃、１０分間の反応条件でＴｋ−サチライシンのＢＳＡ分解活性を確認した結果を示す図である。
【図１６】各種界面活性剤存在下において、３７℃、１０分間の反応条件でＴｋ−サチライシンのＢＳＡ分解活性を確認した結果を示す図である。
【図１７】各種界面活性剤存在下において、２５℃、１０分間の反応条件でＴｋ−サチライシンのＢＳＡ分解活性を確認した結果を示す図である。
【図１８】各種界面活性剤存在下において、１００℃、５分間の反応条件でＴｋ−サチライシンのＢＳＡ分解活性を確認した結果を示す図である。
【図１９】各種界面活性剤存在下において、１００℃、５分間の反応条件でＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫのＢＳＡ分解活性を確認した結果を示す図である。
【図２０】各種界面活性剤存在下において、１００℃、５分間の反応条件でＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎＡの分解活性を確認した結果を示す図である。
【図２１】３％ＳＤＳ存在下１００℃におけるＴｋ−サチライシンの残存活性を確認した結果を示す図である。
【図２２】１〜７％ＳＤＳ存在下において、１００℃、５分間の反応条件でＴｋ−サチライシンのＢＳＡ分解活性を確認した結果を示す図である。
【図２３】アルカリ性条件においてＴｋ−サチライシンによる異常プリオンタンパク質の分解を検討した結果を示す図である。
【図２４】中性付近の条件においてＴｋ−サチライシンによる異常プリオンタンパク質の分解を検討した結果を示す図である。
【図２５】Ｔｋ−サチライシンによる異常プリオンタンパク質の分解において、反応後のＴｋ−サチライシン不活化の影響を検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
〔プロテアーゼの製造方法〕
本発明のプロテアーゼの製造方法は、以下の（１）〜（４）の工程を包含し、成熟化工程に供したプロ体の５０％以上が活性を有するプロテアーゼとして回収されるものであればよい。
（１）プロテアーゼのプロ体をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入し、封入体として発現させるプロ体発現工程
（２）封入体状態のプロ体を変性させ、変性プロ体を得る変性工程
（３）カルシウムイオンを含み、かつ、ｐＨ５以上の溶液中で、変性プロ体をリフォールディングさせるリフォールディング工程
（４）リフォールディング後のプロ体をアルカリ条件下で成熟化させ、活性を有するプロテアーゼを得る成熟化工程
【００１３】
本発明のプロテアーゼの製造方法は、成熟化工程の後に、さらに（５）ｐＨ２〜６のプロテアーゼ溶液を調製するプロテアーゼ溶液調製工程、を設けることが好ましい。プロテアーゼ溶液調製工程を設けることにより、自己分解を起こすことなく安定に長期間保存できる高濃度のプロテアーゼ溶液を調製することができる。
また、本発明のプロテアーゼの製造方法は、リフォールディング工程の後、成熟化工程の前に、さらに（６）リフォールディング後のプロ体を含有し、ｐＨ２〜６の溶液を調製するプロ体含有溶液調製工程、を設けてもよい。プロ体含有溶液調製工程を設けることにより、正しくフォールディングしたネイティブ構造を有するプロ体と、自己切断により生じたプロ配列と成熟配列とが結合した構造を有する複合体と、成熟体を含有し、これらを安定に保存可能なプロ体含有溶液を調製することができる。
【００１４】
本発明の製造方法は、超好熱菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株（Morikawa M et al. Appl Environ Microbiol, 1994 Dec;60(12):4559-66、以下「ＫＯＤ１株」という）由来のＴｋ−サチライシンの製造に特に適した方法である。ただし、本発明により製造されるプロテアーゼはＴｋ−サチライシンに限定されるものではなく、Ｔｋ−サチライシンと生化学的特性（特に、カルシウムイオン、温度、ｐＨに関する生化学的特性）が類似したプロテアーゼであれば、本発明の製造方法により効率よく製造することができる。Ｔｋ−サチライシンは、上述のように本発明者らが見出したサチライシンファミリーに属するプロテアーゼであり（非特許文献１参照）、プレ配列、プロ配列および成熟配列を有する前駆体として発現され、分泌および成熟化を経て最終的にプレ配列およびプロ配列のない成熟体（プロテアーゼ活性を有するＴｋ−サチライシン）となる。プレ配列（シグナル配列とも称する）は、酵素の菌体外への分泌に必要な配列であり、プロ配列は酵素の活性型立体構造を形成する際に必要な配列であるとされている。Ｔｋ−サチライシン前駆体をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号６）および推定アミノ酸配列（配列番号５）はＤＤＢＪに登録されており、そのアクセッション番号はＡＢ０５６７０１である。
【００１５】
本発明の製造方法により製造されるプロテアーゼは、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるものであることが好ましい。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、Ｔｋ−サチライシン（成熟体）のアミノ酸配列であり、Ｔｋ−サチライシン前駆体のアミノ酸配列（配列番号５）の第９４位〜第４２２位に該当する。配列番号２に示されるアミノ酸配列は、Ｔｋ−サチライシン（成熟体）のアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から１３アミノ酸残基が欠失したものであり、Ｔｋ−サチライシン前駆体のアミノ酸配列（配列番号５）の第１０７位〜第４２２位に該当する。なお、Ｔｋ−サチライシン（成熟体）のアミノ酸配列（配列番号１）のＮ末端から１〜１２アミノ酸残基のいずれかが欠失し、かつ、プロテアーゼ活性を有するタンパク質も、本発明の製造方法により好適に製造することができる。
【００１６】
また、本発明の製造方法により、組換えタンパク質として発現されるプロ体は、以下の（ｅ）または（ｆ）に記載のアミノ酸配列からなるものであることが好ましい。なお、本明細書において「プロ体」とは、プレ配列がなくプロ配列および成熟配列を含むプロテアーゼ前駆体を意味する。
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
配列番号３に示されるアミノ酸配列は、Ｔｋ−サチライシンのプロ体（以下、「プロＴｋ−サチライシン」という）のアミノ酸配列であり、Ｔｋ−サチライシン前駆体のアミノ酸配列（配列番号５）の第２５位〜第４２２位に該当する。
【００１７】
「１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。このような変異タンパク質は、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質を単離精製したものであってもよい。タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００１８】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチド活性を変化させない。代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００１９】
本発明のプロテアーゼおよびプロテアーゼ前駆体は付加的なペプチドを含むものであってもよい。付加的なペプチドとしては、例えば、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）やＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ペプチドが挙げられる。
【００２０】
以下、本発明の製造方法によりＴｋ−サチライシンを製造する場合を例に挙げて、各工程を詳細に説明するが、本発明により製造されるプロテアーゼはＴｋ−サチライシンに限定されるものではなく、Ｔｋ−サチライシン以外のプロテアーゼについても以下の説明に準じて容易に製造することができる。
【００２１】
（１）プロ体発現工程
プロ体発現工程では、プロテアーゼのプロ体をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入し、封入体として発現させる。プロテアーゼのプロ体をコードするＤＮＡは、本発明の製造方法により製造しようとするプロテアーゼのプロ体をコードするＤＮＡであればよく、一般的な遺伝子工学的手法を用いることにより、容易に取得することができる。Ｔｋ−サチライシンを製造する場合、プロＴｋ−サチライシンをコードするＤＮＡとしては、以下の（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡを好適に用いることができる。
（Ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるプロＴｋ−サチライシンをコードするＤＮＡ
（Ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるプロＴｋ−サチライシンをコードするＤＮＡ
【００２２】
また、プロＴｋ−サチライシンをコードするＤＮＡとしては、以下の（Ｃ）または（Ｄ）のＤＮＡを用いることが好ましい。
（Ｃ）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｄ）配列番号４に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロＴｋ−サチライシンをコードするＤＮＡ
配列番号４に示される塩基配列はＴｋ−サチライシン前駆体をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号６）の第１３４位〜第１３２７位に該当する。
【００２３】
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高く（ハイブリダイズし難く）なり、より相同なＤＮＡを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００２４】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」とは、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。
【００２５】
プロＴｋ−サチライシンをコードするＤＮＡとしては、配列番号４に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるＤＮＡであって、プロＴｋ−サチライシンをコードするＤＮＡが好ましい。
任意の特定のＤＮＡが、配列番号４に示される塩基配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）を使用して決定することができる。
【００２６】
プロＴｋ−サチライシンをコードするＤＮＡを取得する方法としては、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、配列番号４に示される塩基配列の５’側および３’側の配列（またはその相補配列）に基づいてそれぞれプライマーを設計し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、プロＴｋ−サチライシンをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。
【００２７】
得られたＤＮＡの宿主細胞への導入は、例えば当該ＤＮＡを宿主細胞で発現させるための発現ベクターを構築し、これを宿主細胞に導入して形質転換体を得ることにより行うことができる。発現ベクターは特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択することができる。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実にプロＴｋ−サチライシンを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これとプロＴｋ−サチライシンをコードするＤＮＡを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００２８】
宿主細胞も特に限定されず、組換えタンパク質の発現に使用可能な従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。中でも低コストかつ高生産効率であり、工業的な大量生産が可能である点から、大腸菌を宿主細胞とすることが好ましい。発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００２９】
プロＴｋ−サチライシンをコードするＤＮＡを発現可能に組み込んだ発現ベクターで形質転換した大腸菌等の宿主細胞を培養することにより、プロＴｋ−サチライシンを封入体として発現させることができる。ここで、封入体とは、組換えタンパク質が宿主細胞内で凝集により不溶化した凝集体のことであり、インクルージョンボディ（Inclusion Body）とも称される。
宿主細胞として大腸菌を用いた場合、培養終了後集菌し、超音波処理等により細胞を破砕後、遠心分離して得られる沈殿画分に封入体を回収することができる。
【００３０】
（２）変性工程
変性工程では、封入体状態のプロ体を変性させ変性プロ体を得る。具体的には、上記プロ体発現工程で沈殿として回収した封入体状態のプロ体を変性バッファーで溶解することにより、封入体状態のプロ体を変性させ可溶化した変性プロ体を得ることができる。変性用バッファーに用いるタンパク質変性剤としては、例えば、尿素（例えば２Ｍ〜８Ｍ）、塩酸グアニジン（例えば２Ｍ〜６Ｍ）等を好適に用いることができる。また、ＳＤＳ等の界面活性剤を用いることもできる。また、Ｔｋ−サチライシンのようにジスルフィド結合を有する場合には、変性剤以外に還元剤を添加することが好ましい。還元剤としては、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、例えば１ｍＭ〜１０ｍＭ）、β−メルカプトエタノール（βＭＥ例えば１％〜２％）等を好適に用いることができる。
変性バッファーのベースとなるバッファーは特に限定されない。例えば、本発明者らは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、８Ｍ Ｕｒｅａを用いている。この変性バッファーを選択した理由は、等電点から離れたｐＨを維持し、イオン交換カラムクロマトグラフィーでの精製が容易になるからである。また、金属要求性の酵素（プロテアーゼ）の作用で溶液が変質するのを防ぐ目的でＥＤＴＡを添加している。
【００３１】
変性工程において、封入体に含まれる宿主由来の種々の分子（核酸、脂質、タンパク質等）を除去するために、変性状態のプロ体を精製することが好ましい。本発明者らは、陰イオン交換カラムを用いて変性状態のプロＴｋ−サチライシンを精製しているが、これに限定されず、公知のタンパク質精製方法から適宜選択して用いればよい。
【００３２】
（３）リフォールディング工程
リフォールディング工程では、カルシウムイオンを含み、かつ、ｐＨ５以上の溶液中で、変性プロ体をリフォールディングさせる。リフォールディングとは、変性剤などにより可溶化した封入体をネイティブな構造へ巻き戻すことをいう。リフォールディングは、変性プロ体をリフォールディングバッファーで希釈または透析し、変性剤を除去することにより行うことができる。
【００３３】
リフォールディングバッファーにはカルシウムイオンが含まれる。また、Ｔｋ−サチライシンはシステイン残基を２つ持つことから、異なる分子間での不適切なジスルフィド結合の形成を防ぐために、リフォールディングバッファーには還元剤（ＤＴＴ、βＭＥ等）が含まれる。従来の製造方法では、カルシウムイオンを含まないリフォールディングバッファーを用いてリフォールディングさせることで、一旦プロ配列を含む不活性な中間体を形成させ、その後成熟化を行っていたが、この方法では成熟化の過程で自己分解が起こり、回収可能なＴｋ−サチライシン（成熟体）量は非常に少なかった。そこで、本発明の製造方法では、リフォールディングバッファーにカルシウムイオンおよびＤＴＴを含ませることで、不活性な中間体を形成させることなくネイティブ構造のプロＴｋ−サチライシンを形成させ、これを成熟化に供することにより、成熟体の回収効率を顕著に向上させ、多量のＴｋ−サチライシン（成熟体）を回収することが可能となった。
リフォールディングバッファー中のカルシウムイオン濃度は、１ｍＭ〜５０ｍＭが好ましく、５ｍＭ〜１０ｍＭがより好ましい。１ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であれば、正しくフォールディングしたネイティブ構造を有するプロＴｋ−サチライシンを形成することができる。
【００３４】
また、リフォールディングバッファーはｐＨ５以上のものを使用する。これは、本発明者らが、プロＴｋ−サチライシンのリフォールディング効率は、リフォールディングバッファーのｐＨが５より低い場合に格段に悪くなることを新たに見出したことに基づく。
リフォールディングバッファーのベースとなるバッファーは特に限定されない。好適なリフォールディングバッファーとしては、例えば、１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ Ｃａ2+を含むｐＨ５．２以上のバッファー（溶質は問わない）が挙げられる。
【００３５】
（４）成熟化工程
成熟化工程では、リフォールディング後のプロ体を成熟化させ、活性を有するプロテアーゼを得る。成熟化とは、プロ体からプロ配列が自己切断により離れ、引き続き自己分解により消化されて成熟配列からなる成熟体（プロテアーゼ活性を有するタンパク質）が生成することをいう。
成熟化は、リフォールディング後のプロ体を、成熟体がプロテアーゼ活性を発現可能なｐＨの溶液環境に移すことにより進行させることができる。したがって、プロＴｋ−サチライシンを成熟化させる場合は、ｐＨ７以上の成熟化バッファーを用いることが好ましい。また、成熟体がより高いプロテアーゼ活性を発現可能なｐＨの成熟化バッファーを用いること（Ｔｋ−サチライシンの場合はｐＨ８以上）、リフォールディング後のプロ体ができるだけ低濃度になるように成熟化バッファーで希釈すること、成熟化バッファーを加熱すること、等により成熟化の効率を上げることができる。
【００３６】
成熟化バッファーのベースとなるバッファーは特に限定されない。例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨなどを好適に用いることができる。また、Ｔｋ−サチライシンに結合しているカルシウムイオンを維持するために成熟化バッファーにカルシウムイオンを添加することが好ましい。成熟化に供するプロ体の濃度は終濃度で３００ｎＭ以下であることが好ましい。３００ｎＭを超えると、自己分解が生じるからである。一例を挙げると、本発明者らは、５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ ｐＨ９．５、５ｍＭ ＣａＣｌ２を用いて、プロＴｋ−サチライシンを約３００ｎＭに希釈し、８０℃で１５分間熱処理することで成熟化を行っている。ただし、これに限定されるものではない。
【００３７】
上記（１）〜（４）の工程を包含する本発明の製造方法によれば、成熟化工程に供したプロ体の５０％以上が活性を有するプロテアーゼ（成熟体）として回収される。ここで、「成熟化工程に供したプロ体の５０％以上が活性を有するプロテアーゼ（成熟体）として回収される」とは、成熟化工程に供したプロ体のモル数と回収された成熟体のモル数の比が５０％以上であることを意味する。成熟化工程に供したプロ体の５０％以上が活性を有するプロテアーゼ（成熟体）として回収されたか否かは、簡便には、成熟化前後の成熟化バッファーの一定量をＳＤＳ-ＰＥＧＥに供し、プロ体のバンドの濃さと成熟体のバンドの濃さをデンシトメーター等で比較することにより行うことができる。また、正確には、成熟化前後の成熟化バッファーを用いて、波長２８０ｎｍの紫外光の吸光度を測定し、モル吸光係数を使って成熟化前後のタンパク質濃度を計算し、これを比較することにより確認することができる。
本発明の製造方法において、成熟化工程に供したプロ体に対する回収された成熟体の比率は、少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上である。
【００３８】
（５）プロテアーゼ溶液調製工程
本発明の製造方法において、成熟化工程の後にｐＨ２〜６のプロテアーゼ溶液を調製するプロテアーゼ溶液調製工程を設けることが好ましい。本発明者らは、ｐＨ６以下ではＴｋ−サチライシンの活性が顕著に低いこと、および、Ｔｋ−サチライシンはｐＨ２〜１２の範囲で構造が安定しているがｐＨが２より低いと構造を維持できないことを新たに見出し、この新規知見に基づいてｐＨ２〜６の溶液状態でＴｋ−サチライシンを安定に保存することに成功した。
【００３９】
プロテアーゼ溶液調製工程では、成熟化工程で得られたＴｋ−サチライシンをｐＨ２〜６のバッファーに移行させる。移行方法は特に限定されないが、例えば、Ｔｋ−サチライシンをｐＨ２〜６のバッファーで希釈する方法や透析する方法を用いることができる。
また、プロテアーゼ溶液調製工程では、Ｔｋ−サチライシンをｐＨ２〜６のバッファーに移行させた後、濃縮を行ってもよい。濃縮することにより、高濃度のＴｋ−サチライシン溶液を調製することができる。濃縮の方法は特に限定されず、公知のタンパク質溶液の濃縮方法を用いればよい。例えば、限外ろ過が挙げられる。また、Ｔｋ−サチライシン溶液を一度凍結乾燥した後に、少容量のバッファーに再溶解してもよい。
【００４０】
得られたプロテアーゼ溶液のＴｋ−サチライシン濃度は０．１ｍｇ／ｍｌ以上であることが好ましい。従来の方法で製造したＴｋ−サチライシンを濃縮した場合、自己分解反応を起こして０．１ｍｇ／ｍｌ以上のＴｋ−サチライシン溶液を調製することができなかった。本発明の製造方法で得られるＴｋ−サチライシン溶液は、構造の安定性を維持しながら活性の発現を抑えることができるｐＨ２〜６のＴｋ−サチライシン溶液であるため、Ｔｋ−サチライシン濃度を０．１ｍｇ／ｍｌ以上としても自己分解を起こさず、安定に保存することが可能である。
【００４１】
（６）プロ体含有溶液調製工程
本発明の製造方法において、リフォールディング工程の直後に、リフォールディング後のプロ体を含有し、ｐＨ２〜６の溶液を調製するプロ体含有溶液調製工程を設けてもよい。本発明者らは、変性させたプロＴｋ−サチライシンはｐＨ５以上で正しいフォールディングを効率よくできること、ｐＨ６以下ではＴｋ−サチライシンの活性が顕著に低いこと、および、Ｔｋ−サチライシンはｐＨ２〜１２の範囲で構造が安定しているがｐＨが２より低いと構造を維持できないことを新たに見出した。そして、この新規知見に基づいて、正しくフォールディングしたネイティブ構造を有するプロ体を含有し、安定に保存可能な溶液の調製を試みたところ、ネイティブ構造を有するプロ体、当該プロ体の自己切断により生じたプロ配列と成熟配列とが結合した構造を有する複合体、およびＴｋ−サチライシン（成熟体）の３種類のタンパク質を含有する混合物が得られ、これらの成熟化の進行を抑えてｐＨ２〜６の溶液中で安定に保存することに成功した。
【００４２】
プロ体含有溶液調製工程では、リフォールディング工程で得られたネイティブ構造を有するプロ体を含有する混合物をｐＨ２〜６のバッファーに移行させる。さらに、引き続き濃縮を行ってもよい。ｐＨ２〜６のバッファーへの移行および濃縮には、上記プロテアーゼ溶液調製工程に記載の方法を用いることができる。得られたプロ体含有溶液中のプロ体と複合体の混合物を成熟化工程に供すれば、プロテアーゼ活性を有する成熟体（Ｔｋ−サチライシン）を得ることができる。
【００４３】
〔プロテアーゼ溶液〕
本発明のプロテアーゼ溶液は、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるプロテアーゼを含有し、ｐＨが２〜６の範囲であるプロテアーゼ溶液である。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
つまり、本発明のプロテアーゼ溶液は、上記本発明の製造方法のプロテアーゼ溶液調製工程で得られるＴｋ−サチライシン溶液である。このＴｋ−サチライシン溶液は、Ｔｋ−サチライシンが自己分解を起こすことなく、安定に長期間保存できる。また、従来実現できなかった０．１ｍｇ／ｍｌ以上の高濃度Ｔｋ−サチライシン溶液を提供することができる。
【００４４】
本発明のプロテアーゼ溶液は、高濃度のＴｋ−サチライシンを含有させることができるので、保存コストや輸送コストを低く抑えることが可能となり、流通の経済性を向上させることができる。また、使用時にプロテアーゼを添加して用いる用途において、用事調製用の溶液として利用できる。
【００４５】
〔プロ体含有溶液〕
本発明のプロ体溶液は、以下の（ｅ）または（ｆ）に記載のアミノ酸配列からなるプロ体を含有し、ｐＨが２〜６の範囲であるプロテアーゼのプロ体溶液である。
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
つまり、上記本発明の製造方法のプロ体含有溶液調製工程において調製されるプロＴｋ−サチライシン含有溶液である。このプロＴｋ−サチライシン含有溶液は、正しくフォールディングしたネイティブ構造を有するプロ体、当該プロ体の自己切断により生じたプロ配列と成熟配列とが結合した構造を有する複合体、およびＴｋ−サチライシン（成熟体）の３種類のタンパク質を含有する混合物溶液であり、これらの成熟化の進行を抑えて安定に保存することができきる。
【００４６】
本発明のプロ体含有溶液は、Ｔｋ−サチライシン製造における中間体を供給するものである。すなわち、Ｔｋ−サチライシン製造の中間体を流通させることができるため、Ｔｋ−サチライシンを含有する最終製品を製造する現場で、目的物であるＴｋ−サチライシンを製造することが可能となる。また、本発明のプロ体含有溶液は保存安定性が高い溶液であるが、溶液中のプロ体の量をチェックすることにより、自己分解が進んでいないことを容易に確認することができる。すなわち、流通過程や保存中の品質管理を容易に行うことができるという利点を有する。
【００４７】
〔Ｔｋ−サチライシンの用途〕
以下、本発明の製造方法により得られるプロテアーゼの代表例としてＴｋ−サチライシンの用途について説明するが、本発明の製造方法により得られるプロテアーゼはＴｋ−サチライシンに限定されるものではなく、本発明の製造方法により得られる他のプロテアーゼも同様の用途に使用できる。また、本発明の製造方法以外の方法により製造されたＴｋ−サチライシンも同様の用途に使用できることは言うまでもない。Ｔｋ−サチライシンは、既に実用化されているＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ＣａｒｌｓｂｅｒｇやＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫと比較して、高温域（７０℃〜１００℃）で顕著に高い活性を有し、それより低い温度域においても他のプロテアーゼより高い活性を有するプロテアーゼである。今回、本発明者らはＴｋ−サチライシンはｐＨ８〜１２で非常に高い活性を有すること、Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ＣａｒｌｓｂｅｒｇやＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫと比較して、顕著に高い熱安定性を有すること、および、界面活性剤やタンパク質変性剤に対する安定性が高いことを新たに見出した。それゆえ、Ｔｋ−サチライシンは、難分解産業廃棄物（羽毛、獣毛などケラチンを含むもの）の分解、生理活性ペプチド生産、繊維加工、羊毛加工、皮革加工、食品加工（魚油加工、食肉加工等）、飼料加工、核酸精製、コンタクトレンズ洗浄、配管洗浄等の用途に好適に利用することができる。また、Ｔｋ−サチライシンは、常温から高温の広い範囲で高い活性を示すことから、分解対象の材料、利用目的に最適な温度条件に合わせて用いることができる。さらに、反応性が高いので少量で既存品と同程度の効果が得られる。特に、高アルカリかつ高温条件（例えばｐＨ１２、８０℃など）を必要とするような、今まで酵素が利用できなかった分野での新しい活用（医療機器の洗浄、難分解物の高効率分解）に利用できる。したがって、Ｔｋ−サチライシンは、高温かつ高アルカリ条件で使用され、界面活性剤を含有する洗剤に配合して洗浄力の増強を図ることができる。特に、従来使用されている産業用プロテアーゼと比較して顕著に高い活性を有していることから、二次感染が問題となる医療器具の感染性タンパク質汚れを強力に分解・洗浄することが可能であり、医療器具用洗剤に高い有用性を有している。また、食器洗浄機用洗剤や洗濯用洗剤等の各種洗剤にも好適に用いることができる。
【００４８】
（１）洗剤
本発明は、Ｔｋ−サチライシンを含有する洗剤（洗浄用組成物）を提供する。洗剤中のＴｋ−サチライシンの含有量は特に限定されないが、他のプロテアーゼと比較して高い活性を有することから、少量の添加で高い洗浄力を発揮することができる。好ましい含有量として、例えば０．１〜１０重量％が挙げられる。含有量が少なすぎると十分な洗浄効果が得られず、また逆に多すぎる場合には含有量に比した洗浄効果の向上が得られないため、経済性の点で好ましくない。Ｔｋ−サチライシンは、公知の任意の洗剤に対して、その洗剤の組成を何ら変更することなく配合することができる。また、Ｔｋ−サチライシンを含有する洗剤の成分については特に限定はない。そのような洗剤の代表的例としては、洗剤重量当たり１０〜５０重量％の界面活性剤、０〜５０重量％のビルダー、１〜５０重量％のアルカリ剤あるいは無機電解質、０．１〜５重量％の再汚染防止剤、酵素、漂白剤、蛍光染料、ケーキング防止剤および酸化防止剤からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の配合成分からなる洗剤が挙げられる。
【００４９】
Ｔｋ−サチライシンを含有する洗剤は、さらに界面活性剤を含有することが好ましい。洗剤に含有される界面活性剤は特に限定されず、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤（例えば、エーテル型非イオン性界面活性剤、脂肪酸エステル型非イオン性界面活性剤、酸化エチレン付加脂肪アミンなど）、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤のいずれも好適に用いることができる。本発明者らは、少なくとも１９種類の界面活性剤の存在下においてＴｋ−サチライシンがプロテアーゼ活性を維持できることを確認しており（実施例５および表１参照）、Ｔｋ−サチライシンは、界面活性剤を含有する洗剤に配合して用いることに特に適していると言える。界面活性剤の含有量は特に限定されないが、被洗浄物に存在するタンパク質が変性する程度の量を含有することが好ましい。したがって、用いる界面活性剤に応じて、適切な含有量を選択して使用することが好ましい。例えば、約１〜５０重量％が好ましく、約１〜３０重量％がより好ましく、約３〜１０重量％がさらに好ましい。
【００５０】
既存のアルカリプロテアーゼであるアルカリフィルス・トランスバーレンシス由来のプロテアーゼ（特許文献１）は、高アルカリ活性、界面活性剤耐性、カルシウム非依存性の耐熱性などの特徴ある性質を有しているが、最適温度が７０℃であるため、より高温の洗浄には適していない。またパイロコッカス・ホリコシ由来のプロテアーゼ（特許文献２）は、至適温度約９８℃以上で、至適ｐＨ約５〜約６である特徴を有しているが、中性、アルカリ条件では活性が低く、界面活性剤への耐性について記載がない。一方、ピロコッカス・フリオサス由来のプロテアーゼ（特許文献３）は、アセトニトリル、尿素、ＳＤＳに対して耐性を有している。ＳＤＳに対する耐性については、終濃度１％ＳＤＳの存在下、９５℃、３時間の処理の後も処理前の約８０％の活性を有しているが、高温条件でＳＤＳ１％以上の濃度における分解活性の記載はなく、またＳＤＳ以外の界面活性剤に対する耐性の記載はない。
【００５１】
本発明の洗剤は、既存の洗剤と比較して洗浄力およびタンパク質分解力が格段に優れるので、上述のように、医療器具用洗剤として高い有用性がある。特に酵素洗浄剤では、これまで使用できなかった高温で界面活性剤を含有した状態で洗浄できるため、短時間で洗浄、滅菌の処理を行うことが可能となる。また異常プリオンタンパク質の不活化条件である、３％ＳＤＳ存在下、１００℃、３分においても８０％以上の活性を有しており、プリオン病の二次感染防止において異常プリオンタンパク質の分解除去と不活化が同時に行える洗剤を提供できる。同様に、ウォッシャーディスインフェクターを用いた噴射・加熱式洗浄などの用途にも高い有用性を発揮する。つまり、本発明の洗剤は、ウォッチャーディスインフェクターなどの既存設備をそのまま使うことが可能である点で、非常に有用である。高温条件で使用する場合、酵素量を少なくできることからプリオン不活化後のプロテアーゼの除去が容易になる。中性で利用できるため、既存のアルカリ洗剤に比べ作業者の安全性が高いほか、アルカリ洗浄に弱い内視鏡などの製品に対しても利用できる。プリオン汚染の可能性が高く、使い捨ても難しい内視鏡に対する、効果的なプリオン不活化法はまだないが、本洗浄剤によりそれが可能となる。さらに、コンタクトレンズ洗浄用洗剤としても有用性が高い。
【００５２】
（２）異常プリオンタンパク質分解剤
本発明者らは、Ｔｋ−サチライシンが異常プリオンタンパク質を分解することができることを見出した。したがって、本発明は、Ｔｋ−サチライシンを含有する異常プリオンタンパク質分解剤を提供する。本発明の異常プリオンタンパク質分解剤は、Ｔｋ−サチライシンを含有するものであればよく、これ以外の組成は特に限定されない。好ましくは界面活性剤を含有する。本発明の異常プリオンタンパク質分解剤は、上記本発明の洗剤に準じて製造することができる。また、後述する「異常プリオンタンパク質の不活化方法」に従って、使用することができる。
【００５３】
（３）異常プリオンタンパク質の不活化方法
本発明の異常プリオンタンパク質の不活化方法は、異常プリオンタンパク質が付着した被洗浄物と、Ｔｋ−サチライシンとを接触させる工程を包含するものであればよい。「接触」は特に限定されず、Ｔｋ−サチライシンを含有する溶液に被洗浄物を浸漬してもよく、被洗浄物にＴｋ−サチライシンを含有する溶液を塗布、噴射、噴霧等してもよい。なお、上記接触させる工程の後に、水等で被洗浄物十分にすすぐ工程を行い、被洗浄物にＴｋ−サチライシンが残留していない状態にすることが好ましい。また、界面活性剤を含有するＴｋ−サチライシン溶液を用いることにより、被洗浄物の異常プリオンタンパク質の不活化と、被洗浄物の洗浄を同時に行うことができる。また、Ｔｋ−サチライシンは、１００℃で３％ＳＤＳ界面活性剤の存在下、５分の条件で異常プリオンタンパク質を効果的に分解できるため、異常プリオンタンパク質の分解除去と不活化が同時にできる。この点は、市販の異常プリオンタンパク質の汚染除去剤である「プリオザイム（登録商標）」が、被洗浄物の洗浄後、プリオザイムを溶解した溶液に被洗浄物を浸漬することが必須であることと比較して、極めて利便性が高い。
【００５４】
また、プリオザイムはアルカリ性溶液に６０℃で１時間、被洗浄物を浸漬する必要があるが、本発明に用いるＴｋ−サチライシンは中性付近のｐＨでも十分異常プリオンタンパク質を不活化（分解）することができる。Ｔk−サチライシンは、２５℃〜１００℃で高い活性を有することから、低温域から高温域の広い範囲で異常プリオンタンパク質分解剤として利用できる。従って高温域での使用は分解活性が高くなることから短時間で異常プリオンタンパク質を分解除去することが可能である。プリオザイムは、異常プリオンタンパク質の分解除去は可能であるが、感染性の除去すなわち不活化までは担保されていない。一方でＴｋ−サチライシンは、異常プリオンタンパク質を感染除去できる不活化条件（３％ＳＤＳ、１００℃、３分）で分解活性を有するため、プリオザイムでは不可能な、異常プリオンタンパク質の分解除去および不活化が可能となる点で、本発明の異常プリオンタンパク質の不活化方法は極めて優れている。
【００５５】
本発明の異常プリオンタンパク質の不活化方法において、被洗浄物とＴｋ−サチライシンとをタンパク質変性条件下で接触させることが好ましい。例えば、異常プリオンタンパク質は３％ＳＤＳ溶液で１００℃、３分間処理すると完全に感染性が消滅することが知られている（参考文献：厚生労働省、厚生労働省遅発性ウイルス感染調査研究班、「クロイツフェルト・ヤコブ病診療マニュアル 改訂版」、４８−４９頁、２００２年）。その他、異常プリオンタンパク質の感染性を消滅させるタンパク質変性条件としては、例えば、７Ｍ塩酸グアニジン２時間処理、３Ｍグアニジンチオシアネート２時間処理、３Ｍトリクロロアセテート２時間処理、５０％以上のフェノール２時間処理などが挙げられる。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００５７】
〔実施例１：Ｔｋ−サチライシンの生化学的特性〕
（１）プロＴｋ−サチライシンの発現および精製
Ｔｋ−サチライシン前駆体をコードする塩基配列（ACCESSION：AB056701、配列番号６）に基づいて、プロＴｋ−サチライシンをコードする部分配列を増幅するためのプライマーペアを設計した。すなわち、ＮｄｅＩサイトを含むフォワードプライマー（5'-AGTCCCTGCACATATGGGAGAGCAGAATACAATA-3'（配列番号７））と、ＢａｍＨＩサイトを含むリバースプライマー（5'-AGTGGATCCAATCAGCCCAGGGC-3'（配列番号８））である。Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーペアを用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、このＤＮＡ断片をｐＥＴ２５ｂ（Novagen社製）のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩサイトに挿入した。このプラスミドを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓを形質転換した。【００５８】
得られた菌株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＮＺＣＹＭ培地を用いて３７℃で培養した。ＯＤ660が０．５に達した段階で、終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに４時間培養を続けることで、プロＴｋ−サチライシンを封入体として大量発現させた。集菌し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離（15,000×g、30min）により沈殿画分を回収した。この沈澱を変性バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、８Ｍ Ｕｒｅａ）に溶解し、遠心分離（15,000×g、30min）を行って上清を得、陰イオン交換カラムＨｉｔｒａｐ Ｑ（GE Healthcare社）にかけて変性状態のプロＴｋ−サチライシンの精製を行った。精製度の確認はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色を用いて行った。【００５９】
（２）プロＴｋ−サチライシンのリフォールディングおよびＴｋ−サチライシン（成熟体）の調製
Ｈｉｔｒａｐ Ｑによる精製後、変性状態のプロＴｋ−サチライシン（1.0mg/ml、10ml）を１Ｌのリフォールディングバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ９．０）で２回透析（１回目;２時間、２回目;１２時間）し、Ｕｒｅａを抜くことでリフォールディングを行った。その後、終濃度３００ｎＭ（約0.0124mg/ml）となるように、１３μｌのリフォールディング後のプロＴｋ−サチライシンを９８７μｌの成熟化バッファー（５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ ｐＨ９．５、５ｍＭ ＣａＣｌ２）で希釈し、８０℃で１５分間熱処理することにより、プロペプチドの自己切断（Autoprocessing）およびプロペプチドの分解（Degradation）を経てＴｋ−サチライシン（成熟体）を得た。【００６０】
（３）活性測定方法
(3-1) アゾカゼインを基質とする場合
３０μｌのＴｋ−サチライシン（１００ｎＭ）を２７０μｌの反応バッファー（５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ ｐＨ９．５、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２％ アゾカゼイン）に添加し、各温度条件下、２０分間インキュベーションした。２００μｌの１５％ＴＣＡを添加し、氷中１５分間静置することで酵素反応を停止した。１５，０００×ｇ、１５分間遠心分離を行い、得られた８０μｌの上清液に２０μｌの２Ｍ ＮａＯＨを添加し、４４０ｎｍの吸光度を測定した。このとき、０．３ｍｌの反応液の４４０ｎｍの吸光度を１分間に１上昇させるのに必要な酵素量を、「１単位」として定義した。また、比較対照のＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ＣａｒｌｓｂｅｒｇおよびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫについては、反応バッファーとして５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ ｐＨ８．０、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２％アゾカゼインを用いた。【００６１】
(3-2) 合成基質Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡを用いる場合
３００ｎＭのＴｋ−サチライシンを、終濃度６ｎＭとなるように酵素活性測定用バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）で５０倍希釈し、２０℃で４分間インキュベーションした。１０μｌの１００％酢酸を添加して酵素反応を停止させ、波長４１０ｎｍでの吸光度変化を測定した。この測定系において、Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡから生成されるパラニトロアニリン（p-nitroaniline）の量を８９００Ｍ-1ｃｍ-1の吸光係数を用いて決定し、１分間に１μｍｏｌのパラニトロアニリンを生成する酵素量を、「１単位」として定義した。また、比較対照のＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ＣａｒｌｓｂｅｒｇおよびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫについても同じ反応バッファーを用いた。【００６２】
（４）活性の温度依存性
上記(3-1)の活性測定方法に従い、２０℃から１００℃までの各温度におけるＴｋ−サチライシンの酵素活性を測定した。また、比較対照としてＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ（Sigma）およびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（Wako）を用いて同様の実験を行った。
結果を図１に示した。図１から明らかなように、Ｔｋ−サチライシンは９０℃で最も高い活性を示し、１００℃においても顕著に高い活性を有していた。一方、比較対照のＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇは６０℃、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫは６５℃で最も活性が高かったが、これらの温度においてもＴｋ−サチライシンのほうが２〜３倍高い活性を示した。【００６３】
（５）活性のｐＨ依存性
上記(3-2)の活性測定方法に従い、各ｐＨ条件での酵素活性を測定した。用いたバッファーは以下のとおりである。
ｐＨ４．０〜５．６：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ
ｐＨ５．５〜７．０：５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ
ｐＨ７．０〜７．５：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ
ｐＨ７．０〜９．０：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ８．５〜１０．０：５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ
ｐＨ９．０〜１１．５：５０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ
結果を図２に示した。図２からわかるように、Ｔｋ−サチライシンの至適ｐＨ範囲はｐＨ８〜１２であり、高アルカリ環境での利用に適した酵素であることが明らかとなった。【００６４】
（６）構造安定性に及ぼすｐＨの影響
３００ｎＭのＴｋ−サチライシンを、各ｐＨ条件のバッファー内にて３０℃で一晩インキュベーションし、上記(3-2)の活性測定方法に従い残存活性を測定した。用いたバッファーは以下のとおりである。
ｐＨ１．０〜１．５：５０ｍＭ ＫＣｌ−ＨＣｌ
ｐＨ２．０〜３．０：５０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ
ｐＨ４．０〜５．０：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ
ｐＨ６．０        ：５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ
ｐＨ７．０        ：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ
ｐＨ８．０〜９．０：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ１０．０〜１１．０：５０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ
ｐＨ１２．０〜１３．０：５０ｍＭ ＫＣｌ−ＮａＯＨ
結果を図３に示した。図３から明らかなように、ＴＫ−サチライシンはｐＨ２〜１２の範囲で構造安定性を有していることが示された。【００６５】
（７）各ｐＨ条件下でのリフォールディング効率の比較
４Ｍ塩酸グアニジン存在下で変性させたプロＴｋ−サチライシン（２．０ｍｇ/ｍｌ）を、各ｐＨ条件のバッファー（１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴを含む）で１００倍希釈することでリフォールディングさせ、その効率を円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル測定により解析した。用いたバッファーは以下のとおりである。
ｐＨ３．０        ：５０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ
ｐＨ４．０〜５．６：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ
ｐＨ５．５〜６．０：５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ
ｐＨ７．０        ：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ
ｐＨ８．０〜９．０：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
結果を図４に示した。図４から明らかなように、プロＴｋ−サチライシンはｐＨ５を超えるｐＨ条件で効率よくリフォールディングを行うことが示された。【００６６】
（８）熱安定性
３００ｎＭのＴｋ−サチライシンを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１ｍＭ ＣａＣｌ2、のバッファー条件下にて、２０℃から１１０℃までの各温度で１０分間熱処理を行い、上記(3-2)の活性測定方法に従い残存活性を測定した。また、比較対照としてＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ（Sigma）およびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（Wako）を用いて同様の実験を行った。
結果を図５に示した。図５から明らかなように、Ｔｋ−サチライシンは１１０℃、１０分間の熱処理によっても活性の低下が認められなかった。一方、比較対象のＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇは７０℃、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫは８０℃で失活した。この結果から、Ｔｋ−サチライシンは熱安定性が極めて高い酵素である事が明らかになった。【００６７】
（９）界面活性剤およびタンパク質変性剤に対する安定性
３００ｎＭのＴｋ−サチライシンを、様々な濃度の界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））およびタンパク質変性剤（塩酸グアニジン（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ＨＣｌ）、尿素（Ｕｒｅａ））存在下、５５℃でインキュベーションし、上記(3-2)の活性測定方法に従い、時間間隔ごとに残存活性を測定した。また、比較対照としてＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ（Sigma）およびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（Wako）を用いて同様の実験を行った。【００６８】
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の結果を図６に示した。図６中（ａ）はＴｋ−サチライシン、（ｂ）はＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、（ｃ）はＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫの結果である。図６から明らかなように、いずれの酵素も１０％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で６０分間処理しても活性の低下は認められなかった。
Ｔｗｅｅｎ−２０の結果を図７に示した。図７中（ａ）はＴｋ−サチライシン、（ｂ）はＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、（ｃ）はＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫの結果である。図７から明らかなように、Ｔｋ−サチライシンは１０％のＴｗｅｅｎ−２０で６０分間処理しても活性の低下は認められなかった。一方、Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ＣａｒｌｓｂｅｒｇおよびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫは活性の低下が認められた。
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の結果を図８に示した。図８中（ａ）はＴｋ−サチライシン、（ｂ）はＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、（ｃ）はＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫの結果である。図８から明らかなように、Ｔｋ−サチライシンは５％のＳＤＳで６０分間処理しても活性の低下は認められなかった。一方、Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ＣａｒｌｓｂｅｒｇおよびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫは活性の低下が認められた。
塩酸グアニジン（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ＨＣｌ）の結果を図９に示した。図９中（ａ）はＴｋ−サチライシン、（ｂ）はＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、（ｃ）はＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫの結果である。図９から明らかなように、Ｔｋ−サチライシンは６Ｍの塩酸グアニジンで６０分間処理しても活性の低下は認められなかった。一方、Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ＣａｒｌｓｂｅｒｇおよびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫは活性の低下が認められた。
尿素（Ｕｒｅａ）の結果を図１０に示した。図１０中（ａ）はＴｋ−サチライシン、（ｂ）はＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、（ｃ）はＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫの結果である。図１０から明らかなように、Ｔｋ−サチライシンは８％の尿素で６０分間処理しても活性の低下は認められなかった。一方、Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ＣａｒｌｓｂｅｒｇおよびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫは活性の低下が認められた。
以上の結果から、Ｔｋ−サチライシンは各種の界面活性剤およびタンパク質変性剤に対して高い安定性を有していることが明らかとなった。【００６９】
〔実施例２：Ｔｋ−サチライシン（成熟体）の高効率製造方法〕
実施例１（１）および（２）の方法によりＴｋ−サチライシン（成熟体）を調製する方法（従来法）で得られるＴｋ−サチライシン（成熟体）量は、成熟化に供したプロＴｋ−サチライシン量の約２０％であり、成熟体の回収効率が非常に低かった。そこで、成熟体の回収効率を向上させるための試みを行った。【００７０】
上記実施例１の（１）と同様にして、８Ｍ Ｕｒｅａにより変性させたプロＴｋ−サチライシンを精製した。用いたリフォールディングバッファーは、実施例１と異なり、ＤＴＴおよびカルシウムイオンを添加したものを使用した。すなわち、変性状態のプロＴｋ−サチライシン（1.0mg/ml、10ml）を、１Ｌのリフォールディングバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．０、１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２）で２回透析（１回目;２時間、２回目;１２時間）し、Ｕｒｅａを抜くことでリフォールディングを行った。その後、終濃度３００ｎＭ（約0.0124mg/ml）となるように、１３μｌのリフォールディング後のプロＴｋ−サチライシンを９８７μlの成熟化バッファー（５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ ｐＨ９．５、５ｍＭ ＣａＣｌ２）で希釈し、８０℃で１５分間熱処理することにより、プロペプチドの自己切断（Autoprocessing）およびプロペプチドの分解（Degradation）を経てＴｋ−サチライシン（成熟体）を得た。【００７１】
プロＴｋ−サチライシンを含有する上記加熱前の成熟化バッファー、および加熱後（成熟化後）の成熟化バッファーからサンプルを採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。また、比較対照として、実施例１の方法（従来法）で行った場合のサンプルも、同時にＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
結果を図１１に示した。レーン１は従来法による加熱前サンプル、レーン２は従来法による加熱後サンプル、レーン３は本発明の製造方法による加熱前サンプル、レーン４は本発明の製造方法による加熱後サンプルである。レーン３および４より明らかなように、本発明の製造方法によれば加熱前のプロＴｋ−サチライシン量の約９０％がＴｋ−サチライシン（成熟体）として回収できた（成熟体回収効率約９０％）。一方、レーン１および２より従来法では、成熟体回収効率は約２０％であった。この結果から、本発明の方法によれば、成熟体の回収効率が格段に向上することが明らかとなった。【００７２】
〔実施例３：Ｔｋ−サチライシン（成熟体）の濃縮および保存〕
上記実施例１（１）および（２）の方法（従来法）で調製したＴｋ−サチライシン（成熟体）について、セントリプラス（Millipore社製）を用いて濃縮を試みた場合、０．１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度条件になると直ちに自己分解反応を起こした。したがって、これまで高濃度のＴｋ−サチライシン（成熟体）溶液を調製することができなかった。そこで、上記実施例１（５）および（６）により得られた新規知見、すなわち、ｐＨ６以下ではＴｋ−サチライシンの活性が顕著に低いこと（図２参照）、および、Ｔｋ−サチライシンは、ｐＨ２以上で構造が安定していること（図３参照）を利用して、ｐＨ２〜６の条件でＴｋ−サチライシンを濃縮し、保存することを試みた。【００７３】
上記実施例２の方法で製造されたＴｋ−サチライシン（成熟体）をバッファー（５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ４．６）、１０ｍＭ Ｃａ（ＯＡｃ）２）で透析し、サンプルＡを得た（濃度：0.0115 mg/ml）。このサンプルＡをセントリプラス（Millipore社製）を用いて１０倍濃縮し、サンプルＢ（0.115 mg/ml）を調製した。同様にサンプルＡを１００倍濃縮し、サンプルＣ（1.15mg/ml）を調製した。得られたサンプルＡ，ＢおよびＣを、それぞれ４℃で一夜放置した。サンプルＢおよびサンプルＣに上記バッファー（５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ４．６）、１０ｍＭ Ｃａ（ＯＡｃ）２）を加えて、それぞれ１０倍および１００倍に希釈し、サンプルＡ並びに、希釈後のサンプルＢおよびＣをそれぞれ１．０ｍｌ取り、１１２μｌの１００％ＴＣＡを添加してタンパク質を沈殿として回収し、得られた沈殿を２０μｌのＳＤＳサンプルバッファーに溶解した。この１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、Ｔｋ−サチライシンの濃縮に伴う自己分解の有無を調べた。【００７４】
結果を図１２に示した。図１２からわかるように、濃縮に伴う自己分解は無く、タンパク質量の変化は無いことが明らかとなった。
なお、濃縮・保存に用いるバッファーは、酸性ｐＨ（２．０〜６．０）に調整可能なものであればよく、上記Ｓｏｄｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅに限定されない。例えば、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌなどを好適に用いることができる。濃縮には、上記セントリプラスに代表される遠心式限外ろ過ユニットを好適に用いることができる。またＴｋ−サチライシン（成熟体）の等電点が４．４２であることから、ｐＨ４．０以下のバッファーで透析した後であれば陽イオン交換カラムＨｉｔｒａｐ ＳＰ（GE Healthcare社）等に結合させ、ｐＨ５．０以上のバッファーで透析した後であれば陰イオン交換カラムＨｉｔｒａｐ Ｑ（GE Healthcare社）等に結合させ、いずれも食塩による溶出により濃縮することが可能である。【００７５】
〔実施例４：Ｔｋ−サチライシンのプロ体含有溶液の製造〕
上記実施例１（５）および（７）により、変性させたプロＴｋ−サチライシンは、ｐＨ５．２〜６．０の範囲では正しくリフォールディングできるが（図４参照）、当該ｐＨ範囲ではＴｋ−サチライシンの活性が顕著に低かった（図２参照）。これらの結果から、ｐＨ５．２〜６．０の範囲でリフォールディングさせれば、得られたプロ体が成熟化しても当該ｐＨ環境下ではＴｋ−サチライシンの活性が抑えられ、自己分解が起こらないものと考えられた。そこで、これを確認するために、以下の実験を行った。【００７６】
４Ｍ塩酸グアニジン存在下で変性させたプロＴｋ−サチライシン（１．２４ｍｇ/ｍｌ）を、各ｐＨ条件のバッファー（１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴを含む）で１００倍希釈することでリフォールディングさせ、４℃または室温で１２時間放置した後のプロペプチドの切断（オートプロセシング）効率を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。用いたバッファーは以下のとおりである。
ｐＨ４．０〜５．６：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ
ｐＨ６．０        ：５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ
ｐＨ７．０        ：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ
ｐＨ８．０        ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ【００７７】
結果を図１３に示した。図１３中、各レーンの上部の数字は用いたバッファーのｐＨを表し、Ｃはカルシウムイオンを含まないバッファーを用いたコントロールを表し、ＬＭＷは分子量マーカーを表す。図１３から明らかなように、リフォールディングバッファー中で１２時間放置後においては、ネイティブ構造を有するプロ体と、当該プロ体の自己切断により生じたプロ配列と成熟配列とが結合した構造を有する複合体と、Ｔｋ−サチライシン（成熟体）の３種類のタンパク質が存在していた。また、プロ体と複合体と成熟体の割合は、いずれのｐＨでも変化がなかった。この結果は、Ｔｋ−サチライシンの活性が顕著に低いｐＨ６以下でも自己切断が進行することを示したものであり、大変予想外な結果であった。なお、上記のプロ体と複合体と成熟体との３種類のタンパク質が存在する溶液（プロ体含有溶液）のｐＨを２〜６とすることにより、Ｔｋ−サチライシンの活性が抑えられ、成熟化がほとんど進まず、安定に保存可能であった。また、使用の際には、プロ体含有溶液中のタンパク質の終濃度が３００ｎＭとなるようにアルカリｐＨ条件のバッファーで希釈し、８０℃以上（ボイルでも可）で、１０分間熱処理を行うことにより、約３００ｎＭのＴｋ−サチライシン（成熟体）を調製することができる。【００７８】
〔実施例５：界面活性剤存在下におけるＴｋ−サチライシンのＢＳＡ分解活性〕
上記実施例２および３の方法で製造および調製したＴｋ−サチライシン（成熟体）溶液を本実施例に供した。また、界面活性剤は、表１に示す１９種類を用いた。各製品中の界面活性剤の含有量に応じて、それぞれ１％界面活性剤溶液を調製した。溶媒には１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＣａＣｌ2溶液を用いた。ネオぺレックスＧＳには６Ｍ ＮａＯＨを１／５０量添加してｐＨを中性付近に調整した。レオドールＳＰ−０１０Ｖ、エマノーン３２９９Ｖおよびアセタミン８６は水溶性でないため、水を５０％エタノールに変えて調製した。エマノーン３２９９Ｖは、固体を８０℃で融解し、エタノールに懸濁した後、調製した。【００７９】
【表１】
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【００８０】
（１）反応温度によるＢＳＡ分解活性の確認
１．５ｍｌチューブに、１％界面活性剤溶液４４μｌと５０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ溶液５μｌとを加えた。コントロールとしてバッファーのみ４４μｌと５０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ溶液５μｌとを加えたチューブを２本用意した。コントロールの１本には水を１μｌ加え、これ以外のチューブにはＴｋ−サチライシン溶液（２５ｍｇ／ｍｌ）を１μｌ加えてふたをし、直ちに、１００℃、６５℃、３７℃または２５℃で１０分間インキュベーションした。１０分後、０．５Ｍ ＥＤＴＡを１μｌ加えて反応を停止した。反応液に４×ＳＤＳサンプルバッファー１６μｌと１×ＳＤＳサンプルバッファー６６μｌを加えて５分間ボイリングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミドゲルを使用）に供した。【００８１】
反応温度１００℃の結果を図１４に示した。反応温度６５℃の結果を図１５に示した。反応温度３７℃の結果を図１６に示した。反応温度２５℃の結果を図１７に示した。図１４〜１７中Ｍａｒｋｅｒは分子量マーカーを、Ｃ１はコントロール１（界面活性剤なし、Ｔｋ−サチライシンあり）を、Ｃ２はコントロール２（界面活性剤あり、Ｔｋ−サチライシンなし）を、各レーンの数字は表１のレーン番号に対応する界面活性剤をそれぞれ表す。【００８２】
反応温度１００℃では、レーン３（ドデシルベンゼンスルホン酸）を除き１０分間でほぼ完全にＢＳＡが分解された（図１４参照）。反応温度６５℃では、反応速度に差があるものの、用いたすべての界面活性剤はＴｋ−サチライシンのＢＳＡ分解活性を阻害しないことが示された（図１５参照）。反応温度３７℃および２５℃の場合も同様に、反応速度に差があるものの、用いたすべての界面活性剤はＴｋ−サチライシンのＢＳＡ分解活性を阻害しないことが示された（図１６および図１７参照）。
これらの結果から、Ｔｋ−サチライシンは界面活性剤の存在下においても室温から高温（１００℃）に至るまで活性を維持できることが示された。また、高温の方が反応速度が速いことが明らかとなった。【００８３】
（２）１００℃、５分間の反応条件におけるＢＳＡ分解活性（他のプロテアーゼとの比較）
１．５ｍｌチューブに、１％界面活性剤溶液８８μｌと５０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ溶液１０μｌとを加えた。コントロールとしてバッファーのみ８８μｌと５０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ溶液１０μｌとを加えたチューブを２本用意した。１００℃のヒートブロックで５分間プレインキュベーションした。コントロールの１本には水を２μｌ加え、これ以外のチューブにはＴｋ−サチライシン溶液（２５ｍｇ／ｍｌ）を２μｌ加えてふたをし、直ちに、１００℃で１０分間インキュベーションした。１０分後、０．５Ｍ ＥＤＴＡを２μｌと２×ＳＤＳサンプルバッファー９８μｌとの混和物１００μｌを加えて５分間ボイリングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミドゲルを使用）に供した。
Ｔｋ−サチライシンに変えて、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（Wako）またはＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎＡ（Sigma）の２５ｍｇ／ｍｌ水溶液を用いて同様の実験を行った。【００８４】
Ｔｋ−サチライシンの結果を図１８に、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫの結果を図１９に、ＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎＡの結果を図２０にそれぞれ示した。図１８〜２０中Ｍａｒｋｅｒは分子量マーカーを、Ｃ１はコントロール１（界面活性剤なし、プロテアーゼあり）を、Ｃ２はコントロール２（界面活性剤あり、プロテアーゼなし）を、各レーンの数字は表１のレーン番号に対応する界面活性剤をそれぞれ表す。【００８５】
Ｔｋ−サチライシンはレーン３（ドデシルベンゼンスルホン酸）、レーン４（半硬化牛脂脂肪酸カリ石鹸）を除き１００℃、５分間でほぼ完全にＢＳＡを分解した（図１８参照）。一方、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫではレーン５（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）のみＢＳＡを分解したがこれ以外はＢＳＡを分解しなかった（図１９参照）。また、ＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎＡではレーン８（ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオレエート）、レーン１０（ポリオキシエチレン（40）ソルビトールテトラオレエート）およびレーン１４（塩化セチルトリメチルアンモニウム）において、多少ＢＳＡの部分的分解が認められたが、これら以外はＢＳＡを分解しなかった（図２０参照）。
これらの結果から、Ｔｋ−サチライシンは他のプロテアーゼと比較して、界面活性剤存在下において高温での活性が極めて高いことが明らかとなった。【００８６】
（３）３％ＳＤＳ存在下１００℃におけるＴｋ−サチライシンの残存活性の確認
バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＣａＣｌ2）を用いて３％ＳＤＳを調製した。これを１．５ｍｌチューブ６本に４９μｌずつ分注した。別途、バッファーのみ（０％ＳＤＳ）を１．５ｍｌチューブ３本に４９μｌずつ分注した。３％ＳＤＳ群には、さらにプレインキュベーションあり群（３本）とプレインキュベーションなし群（３本）を設けた。各群３本のチューブはそれぞれ反応時間０分用、５分用、１０分用とした。プレインキュベーションあり群の５分用および１０分用チューブは、１００℃で２分間プレインキュベーションした。
Ｔｋ−サチライシン溶液を、終濃度０．５ｍｇ／ｍｌとなるように２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＣａＣｌ2に希釈し、各チューブに１μｌ添加した。０分用のチューブはそのまま置き、５分用および１０分用はそれぞれ５分間および１０分間１００℃で加熱した後、氷上に３０秒間置いた。
酵素活性測定用溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）９９μｌに各反応液を１μｌ加え、３０℃で２０分間インキュベーションした。５μｌの酢酸を加えて反応を止め、波長４１０ｎｍで吸光度を測定した。ブランクとして酵素活性測定用溶液の吸光度を測定した。【００８７】
結果を図２１に示した。図２１から明らかなように、通常、タンパク質が変性すると考えられる３％ＳＤＳ存在下１００℃、１０分間という過酷な条件においても、Ｔｋ−サチライシンは約３５％〜約５０％の残存活性を有することが示された。【００８８】
（４）タンパク質変性条件下でのＴｋ−サチライシンのＢＳＡ分解活性の確認
１．５ｍｌチューブにバッファー（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５％２−メルカプトエタノール、１〜７％ ＳＤＳ）と２４０μｇのＢＳＡを液量３９μｌとなるように加え、１００℃で５分間加熱したのち、１．４ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼ溶液（Ｔｋ−サチライシン、Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ、またはバッファーのみ）を１μｌ加えた。１００℃で５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミドゲル使用）に供した。【００８９】
結果を図２２に示した。図２２から明らかなように、Ｔｋ−サチライシンは７％ＳＤＳ存在下であっても、１００℃５分間でＢＳＡを分解できることが示された。この結果から、Ｔｋ−サチライシンは、タンパク質変性条件下でのタンパク質分解に有効であることが明らかとなった。【００９０】
〔実施例６：Ｔｋ−サチライシンによる異常プリオンタンパク質の分解〕
上記実施例２および３の方法で製造および調製したＴｋ−サチライシン（成熟体）溶液を本実施例に供し、バッファーＡ［１０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５．０）、１０ｍＭ ＣａＣｌ２］を用いて使用濃度に調製した。
異常プリオンタンパク質試料は、異常プリオンタンパク質（マウスアダプトスクレイピーＣｈａｎｄｌｅｒ株）を感染させたマウスから脳を採取し、脳のホモジネートをＰＢＳで希釈して調製した。タンパク質濃度は、ＤＣプロテインアッセイ（バイオラッド社製）を用いて測定した。なお、本実施例ではＣｈａｎｄｌｅｒ株についての結果のみを示すが、本発明者らはＯｂｉｈｉｒｏ株についても同様の結果を得ている。【００９１】
ウエスタンブロッティングは以下の方法で実施した。
ブロッティング：電圧５０Ｖ、電流１４０ｍＡに設定し、９０分間ブロッティングした。
ブロッキング：５％スキムミルク（ｉｎ ＰＢＳ−Ｔ）で４℃一晩ブロッキングした。
１次抗体処理：ＳＡＦ８３（ＩｇＧ）を０．５％スキムミルクで１０００倍希釈し（総量４ｍｌ）、室温で１時間処理した。
Ｗａｓｈ：ＰＢＳ−Ｔで１０分間のＷａｓｈを３回行った。
２次抗体処理：α−ｍｏｕｓｅ−ＨＲＰを０．５％スキムミルクで１００００倍希釈し（総量４ｍｌ）、室温で１時間処理した。
Ｗａｓｈ：ＰＢＳ−Ｔで１０分間のＷａｓｈを３回行った。
感光：ＥＣＬキットを用いてＨＲＰ酵素反応を行い、Ｆｉｌｍに感光させた。【００９２】
（１）実験１
チューブに０．５Ｍ ＫＣｌ−ＮａＯＨ（ｐＨ１２．０）を２０μｌ、マウス脳ホモジネート（８ｍｇ／ｍｌ）７．５μｌ、水１７．５μｌを加えて混合し、６５℃で５分間加温した。これに水またはＴｋ−サチライシン溶液（３５．６ｍｇ／ｍｌ）を５μｌ添加し（終濃度３．５６ｍｇ／ｍｌ）、６５℃で３０分間加温した。０．５Ｍ ＥＤＴＡを５μＬ添加して反応を停止させ、氷中に移した。
各サンプルを等量ずつ分注し、「ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理をするサンプル」または「ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理をしないサンプル」に分け、「ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理をするサンプル」に関しては、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ溶液（２００μｇ／ｍｌ）をサンプル量の１０分の１量を加え、３７℃で１時間加温した。各サンプルに４×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、１００℃で５分間ボイリングを行った後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％アクリルアミドゲルを使用）に供し、電気泳動後、上記の方法でウエスタンブロッティングを行った。【００９３】
結果を図２３に示した。ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫは異常プリオンタンパク質を分解することができないので、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理のみを行ったサンプルのレーンには異常プリオンタンパク質のバンドが残っている。一方、Ｔｋ−サチライシン処理を行ったサンプルは、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理の有無に関わらず、異常プリオンタンパク質を含む全てのタンパク質が分解されていた。すなわち、Ｔｋ−サチライシンは異常プリオンタンパク質を分解できることが明らかとなった。なお、本実験１の反応条件は、文献（Proteolytic inactivation of the bovine spongiform encephalopathy agent, Biochem Biophys Res Commun., 2004 May 14;317(4):1165-70.）を参考にして、先行研究と比較しやすいように設定したものである。【００９４】
（２）実験２
反応液のｐＨを８．０に変更して実験を行った。すなわち、４本のチューブに０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を２０μｌ、マウス脳ホモジネート（８ｍｇ／ｍｌ）７．５μｌ、水１７．５μｌを加えて混合し、６５℃で５分間加温した。これにバッファーＡまたはＴｋ−サチライシン溶液（２０．０ｍｇ／ｍｌ）を５μｌずつ各２本のチューブに添加し（終濃度２ｍｇ／ｍｌ）、６５℃で３０分間加温した。０．５Ｍ ＥＤＴＡを５μＬ添加して反応を停止させ、氷中に移した。Ｔｋ−サチライシンを添加したサンプルおよび添加していないサンプルの各１本ずつにＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ溶液（２００μｇ／ｍｌ）をサンプル量の１０分の１量を加え、残りの各１本ずつにはＰＢＳを同量加え、３７℃で１時間加温した。各サンプルに４×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、１００℃で５分間ボイリングを行った後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％アクリルアミドゲルを使用）に供し、電気泳動後、上記の方法でウエスタンブロッティングを行った。【００９５】
結果を図２４に示した。実験１と同様に、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理のみを行ったサンプルには異常プリオンタンパク質のバンドが残ったが（レーン２）、Ｔｋ−サチライシン処理を行ったサンプルは、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理の有無に関わらず、異常プリオンタンパク質を含む全てのタンパク質が分解された（レーン３および４）。すなわち、Ｔｋ−サチライシンは、ｐＨが中性付近でも十分に異常プリオンタンパク質を分解することができることが明らかとなった。したがって、Ｔｋ−サチライシンを含有する異常プリオン分解剤は、アルカリ性溶液中に浸漬することが必須であるプリオザイム（登録商標、異常プリオンタンパク質汚染除去剤）に比べて、取扱いや廃棄の点で利便性が高いことが示された。【００９６】
（３）実験３
４本のチューブに０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を２０μｌ、マウス脳ホモジネート（８ｍｇ／ｍｌ）７．５μｌ、水１７．５μｌを加えて混合し、６５℃で５分間加温した。これにバッファーＡまたはＴｋ−サチライシン溶液（２０．０ｍｇ／ｍｌ）を５μｌずつ各２本のチューブに添加し（終濃度２ｍｇ／ｍｌ）、６５℃で３０分間加温した。０．５Ｍ ＥＤＴＡを５μＬ添加して反応を停止させ、氷中に移した。Ｔｋ−サチライシンを添加したサンプルおよび添加していないサンプルの各１本ずつに０．５Ｍ ＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロリン酸）を５μｌ加え、室温で１５分間処理した。残りの各１本ずつには、コントロールとして溶媒である２−プロパノールを５μｌ加えた。各サンプルに４×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、１００℃で５分間ボイリングを行った後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％アクリルアミドゲルを使用）に供し、電気泳動後、上記の方法でウエスタンブロッティングを行った。このとき、サンプル中のＳＤＳの終濃度はプリオンが不活化しやすいといわれる３％になるように調整した。【００９７】
結果を図２５に示した。図２４から明らかなように、レーン３（Ｔｋ−サチライシン、ＤＦＰ処理なし）では異常プリオンタンパク質を含む全てのタンパク質が分解されたが、レーン４（Ｔｋ−サチライシン、ＤＦＰ処理あり）では一部のタンパク質が分解されていなかった。この結果は、Ｔｋ−サチライシンの６５℃、３０分の処理ではすべてのタンパク質が完全に分解しておらず、その後ＳＤＳサンプルバッファーを加えて１００℃で５分間処理することで、完全にタンパク質が分解されることを示すものである。すなわち、Ｔｋ−サチライシンは、３％ＳＤＳ存在下、１００℃というプリオンが変性する過酷な条件下でプロテアーゼ活性を示し、異常プリオンを完全に分解することができることが明らかになった。【００９８】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年4月19日(2010.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼのプロ体をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入し、封入体として発現させるプロ体発現工程と、
封入体状態のプロ体を変性させ、変性プロ体を得る変性工程と、カルシウムイオンを含み、かつ、ｐＨ５以上の溶液中で、変性プロ体をリフォールディングさせるリフォールディング工程と、
リフォールディング後のプロ体を成熟化させ、活性を有するプロテアーゼを得る成熟化工程と
を包含し、
前記成熟化工程に供したプロ体の５０％以上が活性を有するプロテアーゼとして回収されることを特徴とするプロテアーゼの製造方法。
【請求項２】
前記成熟化工程の後に、さらにｐＨ２〜６のプロテアーゼ溶液を調製するプロテアーゼ溶液調製工程を包含することを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記プロテアーゼ溶液が、０．１ｍｇ／ｍｌ以上のプロテアーゼ濃度を有する請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記リフォールディング工程の直後に、リフォールディング後のプロ体を含有し、ｐＨ２〜６の溶液を調製するプロ体含有溶液調製工程をさらに包含することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記プロテアーゼが、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
【請求項６】
前記プロテアーゼのプロ体が、以下の（ｅ）または（ｆ）に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるプロテアーゼを含有し、ｐＨが２〜６の範囲であることを特徴とするプロテアーゼ溶液。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
【請求項８】
プロテアーゼ濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ以上である請求項７に記載のプロテアーゼ溶液。
【請求項９】
以下の（ｅ）または（ｆ）に記載のアミノ酸配列からなるプロ体を含有し、ｐＨが２〜６の範囲であることを特徴とするプロテアーゼのプロ体溶液。
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるプロテアーゼを含有する洗剤。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
【請求項１１】
さらに、界面活性剤を含有する請求項１０に記載の洗剤。
【請求項１２】
医療器具洗浄用である請求項１０または１１に記載の洗剤。
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるプロテアーゼを含有する異常プリオンタンパク質分解剤。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
【請求項１４】
異常プリオンタンパク質が付着した被洗浄物と、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるプロテアーゼとを接触させる工程を包含する異常プリオンタンパク質の不活化方法。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
【請求項１５】
前記被洗浄物と前記プロテアーゼとを異常プリオンタンパク質の感染性を消滅させる条件下で接触させる請求項１４に記載の異常プリオンタンパク質の不活化方法。
【請求項１６】
異常プリオンタンパク質の感染性を消滅させる条件が、３％ＳＤＳ存在下１００℃である請求項１５に記載の異常プリオンタンパク質の不活化方法。
【国際調査報告】
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2010021375.tif 000029
2010021375.tif 000030
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