(57)【要約】トランスジェニック金魚の作製方法の提供、および当該方法によって得られるトランスジェニック金魚の提供。  対象遺伝子が組み込まれた遺伝子発現ベクターを金魚に導入する工程を含むことで、トランスジェニック金魚の作製方法を得た。また、当該方法によりトランスジェニック金魚を得た。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象遺伝子を導入してなるトランスジェニック金魚。
【請求項２】
対象遺伝子が遺伝子発現ベクターに組み込まれ、かつ、当該遺伝子発現ベクターが金魚の受精卵に導入された請求項１に記載のトランスジェニック金魚。
【請求項３】
遺伝子発現ベクターがｐＸＩ、ｐＺｅｘまたはｐＺＥＦ１をプロモーターとして含む請求項２に記載のトランスジェニック金魚。
【請求項４】
遺伝子発現ベクターがｐＸＩ、ｐＺｅｘおよびｐＺＥＦ１のいずれか２つ以上をプロモーターとして含む請求項２に記載のトランスジェニック金魚。
【請求項５】
ｐＸＩ、ｐＺｅｘおよびｐＺＥＦ１のいずれか２つ以上がタンデムに配列される請求項４に記載のトランスジェニック金魚。
【請求項６】
対象遺伝子が全身に発現された請求項１〜５のいずれかに記載のトランスジェニック金魚。
【請求項７】
金魚がリュウキン、ワキン、シュブンキン、コメット、トサキン、ジキン、チョウテンガン、ハナフサ、パールスケール、オオサカランチュウ、チョービ、パンダ、サクラニシキ、デメキン、キャリコ、ランチュウ、オランダシシガシラ、アズマニシキ、エドニシキ、ハマニシキ、タンチョウ、セイブンギョ、チャキン、ナンキンから選ばれるいずれかである請求項１〜６のいずれかに記載のトランスジェニック金魚。
【請求項８】
対象遺伝子を組み込んだ遺伝子発現ベクターを金魚の受精卵に導入する工程を含むトランスジェニック金魚の作製方法。
【請求項９】
遺伝子発現ベクターがｐＸＩ、ｐＺｅｘまたはｐＺＥＦ１をプロモーターとして含む請求項８に記載のトランスジェニック金魚の作製方法。
【請求項１０】
金魚がリュウキン、ワキン、シュブンキン、コメット、トサキン、ジキン、チョウテンガン、ハナフサ、パールスケール、オオサカランチュウ、チョービ、パンダ、サクラニシキ、デメキン、キャリコ、ランチュウ、オランダシシガシラ、アズマニシキ、エドニシキ、ハマニシキ、タンチョウ、セイブンギョ、チャキン、ナンキンから選ばれるいずれかである請求項８または９に記載のトランスジェニック金魚の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック金魚の作製方法および当該方法によって得られるトランスジェニック金魚に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ゼブラフィッシュ等に様々な遺伝子を導入して発現させたトランスジェニック魚類が作製されている（例えば、特許文献１参照）。これらのトランスジェニック魚類は、導入した遺伝子が魚類に与える影響を調べるためのモデル動物や、有用なタンパク質を製造させるための動物等として利用されている。
これらのトランスジェニック魚類の作製にあたり、主にゼブラフィッシュが対象魚として用いられてきた。ゼブラフィッシュは体長が約４ｃｍと小さく飼育がしやすい、また、採卵がしやすい等の多くの利点がある。一方で小さすぎることから、血液を採取する等が難しく、抗体を産生させた場合でも血清が得られない等の問題があった。【０００３】
そこで、ゼブラフィッシュに変わり得る魚類として、本発明者らは金魚に着目した。金魚はゼブラフィッシュと比較して体が大きく、血液の採取も容易である。
トランスジェニックの対象魚の一つとして金魚を用いることは、示唆されてはいるものの（例えば、特許文献１参照）、具体的に記載されたものはなく、トランスジェニック金魚の具体的な作製方法および当該方法によって得られるトランスジェニック金魚の提供が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００５−５１１０５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
トランスジェニック金魚の作製方法の提供、および当該方法によって得られるトランスジェニック金魚の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、対象遺伝子が組み込まれた遺伝子発現ベクターを金魚に導入することで、対象遺伝子が発現されたトランスジェニック金魚が作製できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は次の（１）〜（１０）のトランスジェニック金魚、トランスジェニック金魚の作製方法等に関する。
（１）対象遺伝子を導入してなるトランスジェニック金魚。
（２）対象遺伝子が遺伝子発現ベクターに組み込まれ、かつ、当該遺伝子発現ベクターが金魚の受精卵に導入された上記（１）に記載のトランスジェニック金魚。
（３）遺伝子発現ベクターがｐＸＩ、ｐＺｅｘまたはｐＺＥＦ１をプロモーターとして含む上記（２）に記載のトランスジェニック金魚。
（４）遺伝子発現ベクターがｐＸＩ、ｐＺｅｘおよびｐＺＥＦ１のいずれか２つ以上をプロモーターとして含む上記（２）に記載のトランスジェニック金魚。
（５）ｐＸＩ、ｐＺｅｘおよびｐＺＥＦ１のいずれか２つ以上がタンデムに配列される上記（４）に記載のトランスジェニック金魚。
（６）対象遺伝子が全身に発現された上記（１）〜（５）のいずれかに記載のトランスジェニック金魚。
（７）金魚がリュウキン、ワキン、シュブンキン、コメット、トサキン、ジキン、チョウテンガン、ハナフサ、パールスケール、オオサカランチュウ、チョービ、パンダ、サクラニシキ、デメキン、キャリコ、ランチュウ、オランダシシガシラ、アズマニシキ、エドニシキ、ハマニシキ、タンチョウ、セイブンギョ、チャキン、ナンキンから選ばれるいずれかである上記（１）〜（６）のいずれかに記載のトランスジェニック金魚。
（８）対象遺伝子を組み込んだ遺伝子発現ベクターを金魚の受精卵に導入する工程を含むトランスジェニック金魚の作製方法。
（９）遺伝子発現ベクターがｐＸＩ、ｐＺｅｘまたはｐＺＥＦ１をプロモーターとして含む上記（８）に記載のトランスジェニック金魚の作製方法。
（１０）金魚がリュウキン、ワキン、シュブンキン、コメット、トサキン、ジキン、チョウテンガン、ハナフサ、パールスケール、オオサカランチュウ、チョービ、パンダ、サクラニシキ、デメキン、キャリコ、ランチュウ、オランダシシガシラ、アズマニシキ、エドニシキ、ハマニシキ、タンチョウ、セイブンギョ、チャキン、ナンキンから選ばれるいずれかである上記（８）または（９）に記載のトランスジェニック金魚の作製方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、トランスジェニック金魚の作製が可能となった。本発明のトランスジェニック金魚は、導入した遺伝子が金魚に与える影響を調べるためのモデル動物や、有用なタンパク質を製造させるための動物として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）ＳＫ−Ｂｇｌ／ＫＳ−Ｎｄｅを示した図である（実施例）。
【図２】ｐＸＩ−ＥｇｇＥ０７Ｆ０９（ＳｆｉＩ）を示した図である（実施例）。
【図３】ｐＺｅｘ−ＥｇｇＥ０７Ｆ０９（ＳｆｉＩ）を示した図である（実施例）。
【図４】ｐＸＩ−１０００ｐｒｏ−ＤｓＲｅｄ（ΔＢａｍＨＩ）を示した図である（実施例）。
【図５】ｐＺｅｘ−ＤｓＲｅｄ（ΔＢａｍＨＩ）／ｐＢＳＩＩＳＫ（−）ＳＫ−Ｂｇｌ／ＫＳ−Ｎｄｅを示した図である（実施例）。
【図６】ｐＸＩ−ＥｇｇＥ０７Ｆ０９（ＳｆｉＩ）−ｐＺｅｘ−ＤｓＲｅｄを示した図である（実施例）。
【図７】ｐＸＩ−ＥＧＦＰ（ＳｆｉＩ）−ｐＺｅｘ−ＤｓＲｅｄを示した図である（実施例）。
【図８】ｐｚＨｅ１−１０００ｐｒｏ−ＥＧＦＰ（Ｓｆｉ１ＣＢ）（ｉ）を示した図である（実施例）。
【図９】ＺＥＦ１−ＥＧＦＰベクターを示した図である（実施例）。
【図１０】導入遺伝子の発現を確認した図である（実施例）。
【図１１】導入遺伝子の発現を確認した図である（実施例）。
【図１２】導入遺伝子の発現を確認した図である（実施例）。
【図１３】導入遺伝子の発現を確認した図である（実施例）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の「トランスジェニック金魚」とは、対象遺伝子を導入して得られるトランスジェニック金魚であればいずれの金魚も含まれる。対象遺伝子が体の一部の領域に発現されたトランスジェニック金魚でもよく、対象遺伝子が全身に発現されたトランスジェニック金魚であってもよい。
ここで、「対象遺伝子」とは、発現の目的とする遺伝子をいう。例えば、特定の遺伝子を導入することにより、その遺伝子が与える影響を調べることを目的とする場合には、その特定の遺伝子が「対象遺伝子」とされることになる。また、特定のタンパク質を製造することを目的とする場合には、そのタンパク質をコードする遺伝子が「対象遺伝子」とされることになる。具体的には、金魚以外を由来とする外来遺伝子等が挙げられ、これらの遺伝子は、遺伝子の発現を確認するためのＥＧＦＰやＤｓＲｅｄ等の蛍光物質をコードする遺伝子等と組み合わせて「対象遺伝子」とすることもできる。
【００１１】
本発明の「トランスジェニック金魚」は、対象遺伝子を組み込んだ遺伝子発現ベクターを金魚の受精卵、未受精卵や成魚体細胞等に導入することによって作製することができる。
対象遺伝子を組み込む「遺伝子発現ベクター」は、対象遺伝子が発現できるものであればいずれのものであってもよいが、例えば、アフリカツメガエルｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １−ａｌｐｈａプロモーターであるｐＸＩ、ゼブラフィッシュｈａｔｃｈｉｎｇ−ｇｒａｎｄ−ｅｎｚｙｍｅプロモーターであるｐＺｅｘ（いずれも参考文献１参照）や、本発明者らが独自に作成した、ゼブラフィッシュｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １−ａｌｐｈａプロモーターであるｐＺＥＦ１をプロモーターとして含む遺伝子発現ベクター等が挙げられる。
【００１２】
本発明の「遺伝子発現ベクター」は、対象遺伝子を発現させるためのプロモーターを１つ以上含んでいればよく、複数含んでいてもよい。また、対象遺伝子が発現できるプロモーターであれば、そのプロモーターの一部であってもよい。例えば、配列表配列番号４に示したｐＺｅｘの一部等が挙げられる。本発明においては、これらのプロモーターの一部も、「プロモーター」として表す。
プロモーターを複数含む場合、対象遺伝子が発現できればプロモーターはどのように配列されていてもよく、例えば、プロモーターがタンデムに配列された遺伝子発現ベクターを用いることもできる。
参考文献１：特開２００７−１４３４９７号公報
【００１３】
遺伝子発現ベクターを導入する金魚の受精卵は、自然に得られたものや、金魚の雌から搾出した未受精卵と雄から搾出した精子とを予め混合しておき、そこに飼育水を加えて受精を促す乾導法（参考文献２）等の方法で人工授精することによって調製したものを用いることができる。
未受精卵および精子は、搾出後のすぐのものを人工授精させて用いることもできるが、親金魚の飼育条件下でそれぞれを保存することにより、保存後時間が経過したものでも用いることができる。例えば、親金魚の飼育条件下（約１５〜２６℃）や生存可能水温（０〜４０℃）で保存後６時間以上経過したもの等でも人工授精させて用いることができる。
従来使用されてきたゼブラフィッシュにおいても、金魚と同様に、成熟した雌雄親魚からお腹を圧迫して絞り出す搾出法によって未受精卵および精子を得て、乾導法（参考文献２）によって人工授精を行うことができる。しかし、ゼブラフィッシュから搾出した未受精卵および精子の受精可能時間が数分間と短いため、金魚のように、それぞれを保存して使用することができない。また、魚体が小さいために搾出時に魚体へのダメージが大きく、熟練した手技を持ってしても親魚を殺してしまうことがよくある。そのため、繰り返し採卵・採精できず、受精卵の生産性が自然産卵に比べて極めて悪かった。
さらに、ゼブラフィッシュの受精卵は分離性沈下卵であるため、付着性沈下卵である金魚の受精卵とは異なり、植物、石、プラスティックなどの物質に粘着する生物学的な特性を有しておらず、対象遺伝子を導入しにくいという問題もあった。
参考文献２：緑書房「水産養殖学講座」４  水族繁殖学，隆島史夫，羽生功  編（ＩＳＢＮ４−８９５３１−４３４−０）  「媒精方法」ｐ１８２−１８３
【００１４】
本発明の「トランスジェニック金魚」において、対象遺伝子を導入する金魚は遺伝学的にフナから派生したコイ目コイ科の魚類で、体色および／または体型がフナと異なる外見的特徴を有する魚類であればいずれであってもよい。例えば、赤、紅白、三色、黒、茶、青文、桜、オーロラ、アルビノ、透明鱗、丹頂などの体色を有し、フナ型、リュウキン型、オランダ獅子頭型、らんちゅう型などの体型を有し、その他の外見的特徴として肉瘤、出目、頂天眼、花房、パール鱗、蝶尾、孔雀尾、などを有する金魚であって、これらの特徴を単独または複数同時に発現している金魚等が挙げられる。
このような金魚としては、例えば、リュウキン、ワキン、シュブンキン、コメット、トサキン、ジキン、チョウテンガン、ハナフサ、パールスケール、オオサカランチュウ、チョービ、パンダ、サクラニシキ、デメキン、キャリコ、ランチュウ、オランダシシガシラ、アズマニシキ、エドニシキ、ハマニシキ、タンチョウ、セイブンギョ、チャキン、ナンキン等が挙げられ、また、これらを交配、突然変異、選抜育種して新たに作出したキンギョ等も含まれる。
【００１５】
本発明の「トランスジェニック魚類の作製方法」は、対象遺伝子を組み込んだ遺伝子発現ベクターを金魚の受精卵に導入する工程を含む作製方法であれば、いずれの作製方法であってもよい。さらに導入した対象遺伝子の発現を確認する工程等を含んでいてもよい。
「対象遺伝子を組み込んだ遺伝子発現ベクターを金魚の受精卵に導入する工程」において、該遺伝子発現ベクターは、マイクロインジェクション等の従来知られている方法を用いて受精卵に導入することができる。
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００１６】
１．金魚受精卵の調製
受精卵は金魚（リュウキン）の雌雄成魚から調製した受精卵を用いた。
２歳齢リュウキンの雌雄からそれぞれ搾出した未受精卵および精子を、乾導法にて人工授精させた後、付着性沈下卵である金魚受精卵の粘着性を利用して、直径９０ｍｍのプラスティックシャーレに付着させ飼育水と共に収容した。また、透明な金魚（リュウキン）の１歳齢の雌雄からそれぞれ搾出した未受精卵および精子についても同様に人工受精して、得られた受精卵を収容した。【００１７】
２．遺伝子発現ベクターの作製
３種類の遺伝子発現ベクターを作製した。【００１８】
Ａ．ｐＸＩ−ＥＧＦＰ−ｐＺｅｘ−ＤｓＲｅｄベクター
本ベクターはプロモーターとしてｐＸＩおよびｐＺｅｘを組み込んだ遺伝子発現ベクターである。ｐＸＩ（配列表配列番号１）の下流にＥＧＦＰ（配列表配列番号２）を組み込んだｐＸＩ−ＥＧＦＰベクターと、ｐＺｅｘ（配列表配列番号４）の下流にＤｓＲｅｄ（配列表配列番号５）を組み込んだｐＺｅｘ−ＤｓＲｅｄベクターを、タンデムに連結して遺伝子発現ベクターを作製した。【００１９】
本発明のｐＸＩ−ＥＧＦＰ−ｐＺｅｘ−ＤｓＲｅｄベクターは次のように作製した。
１）ｐＢＳＩＩＳＫ（−）ＳＫ−Ｂｇｌ／ＫＳ−Ｎｄｅ（図１）を作製した。
ｐＢＳＩＩＳＫ（−）ＳＫ−Ｂｇｌ／ＳＫ−Ｎｄｅは，タンデムベクター作製用に構築したサブクローニング用のベクターである。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）のＮｏｔＩとＸｂａＩの間にＢｇｌＩＩを挿入し，さらに，ＸｈｏＩとＫｐｎＩの間にＮｄｅＩを挿入する事により作製した。【００２０】
２）ｐＸＩ−ＥｇｇＥ０７Ｆ０９（ＳｆｉＩ）（図２）を作製した。
ｐＸＩ−ＥｇｇＥ０７Ｆ０９（ＳｆｉＩ）は，研究用ベクターｐＸＩ−ＧＦＰ（参考文献３）のβ−ｇｌｏｂｉｎイントロンの下流に、２個のＳｆｉＩサイトを挿入したベクターであり、２個のＳｆｉＩサイトを設けることで目的遺伝子の組換え作業がより簡便になることを期待したものである。ｐＸＩ−ＥｇｇＥ０７Ｆ０９（ＳｆｉＩ）の作製は次のように行った。
ａ．ｐＢＳＩＩ（ＳＫ−）−ＥｇｇＥ０７Ｆ０９を作製した。
クローニング用ベクターｐＴｒｉｐｌｅＥｘ２（タカラバイオ）のマルチクローニングサイトにゼブラフィッシュｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ３５（ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＮＰ７７５３４０）のｃＤＮＡをクローニングしたｐＴｒｉｐｌＥｘ２−ＥｇｇＥ０７Ｆ０９から制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩでＥｇｇＥ０７Ｆ０９  ｃＤＮＡ領域を切り出した。これを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）へＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩサイトを介して組み換えてｐＢＳＩＩ（ＳＫ−）−ＥｇｇＥ０７Ｆ０９を作製した。
ｂ．ｐＺｅｘ−ＥＧＦＰ−Ｈｉｓ（Ｂ）を作製した。
ゼブラフィッシュｚＨｅ１プロモーター約１０００ｂｐ（以下、ｚＨｅ１−１０００ｂｐとする、配列表配列番号３）をＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩを介してｐＸＩ−ＥＧＦＰ（参考文献３）のプロモーターと組み換え，さらにＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで処理後Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ）によって末端を平滑化しセルフライゲーションする事によりプロモーター領域を約３００ｂｐに削除したｐＺｅｘ（配列表配列番号４）を調製した。さらに，ＥＧＦＰのアミノ酸配列のＣ末端へＨｉｓ  ｔａｇを付加してｐＺｅｘ−ＥＧＦＰ−Ｈｉｓ（Ｂ）を作製した。
ｃ．ｐＺｅｘ−ＥｇｇＥ０７Ｆ０９（ＳｆｉＩ）（図３）を作製した。
ｐＢＳＩＩ（ＳＫ−）−ＥｇｇＥ０７Ｆ０９からＢａｍＨＩ／ＳａｌＩでＥｇｇＥ０７Ｆ０９を含む領域を切り出した。これをｐＺｅｘ−ＥＧＦＰ−Ｈｉｓ（Ｂ）へＢａｍＨＩ／ＳａｌＩを介して組み換えてｐＺｅｘ−ＥｇｇＥ０７Ｆ０９（ＳｆｉＩ）を作製した。
ｄ．ｐＸＩ−ＥｇｇＥ０７Ｆ０９（ＳｆｉＩ）を作製した。
ｐＺｅｘ−ＥｇｇＥ０７Ｆ０９（ＳｆｉＩ）のＥｇｇＥ０７Ｆ０９および＋ＳＶ４０由来のｐｏｌｙＡ付加シグナル領域をＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩで切り出した。これをＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩを介してｐＸＩ−ＥＧＦＰへ組み換えてｐＸＩ−ＥｇｇＥ０７Ｆ０９（ＳｆｉＩ）を作製した。【００２１】
３）ｐＸＩ−１０００ｐｒｏ−ＤｓＲｅｄ（ΔＢａｍＨＩ）（図４）を作製した。
ｐＸＩ−１０００ｐｒｏ−ＤｓＲｅｄ（ΔＢａｍＨＩ）は，ゼブラフィッシュｚＨｅ１プロモーター約１０００ｂｐをｐＸＩ−ＥＧＦＰのプロモーターとＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩを介して組み換え，さらにＥＧＦＰをｐＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＤｓＲｅｄ−ＭｏｎｏｍｅｒとＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩを組み換えたベクターである。さらにＢａｍＨＩで処理後Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ）によって末端を平滑化しセルフライゲーションする事により，ベクターのＢａｍＨＩ認識配列を消去した。【００２２】
４）ｐＺｅｘ−ＤｓＲｅｄ（ΔＢａｍＨＩ）／ｐＢＳＩＩＳＫ（−）ＳＫ−Ｂｇｌ／ＫＳ−Ｎｄｅ（図５）を作製した。
ｐＺｅｘ−ＤｓＲｅｄ（ΔＢａｍＨＩ）／ｐＢＳＩＩＳＫ（−）ＳＫ−Ｂｇｌ／ＫＳ−Ｎｄｅは，上記３）で作製したｐＸＩ−１０００ｐｒｏ−ＤｓＲｅｄ（ΔＢａｍＨＩ）を上記１）で作製したｐＢＳＩＩＳＫ（−）ＳＫ−Ｂｇｌ／ＳＫ−ＮｄｅへＥｃｏＲＩ／ＮｄｅＩを介して組み換えたベクターであった。【００２３】
５）ｐＸＩ−ＥｇｇＥ０７Ｆ０９（ＳｆｉＩ）−ｐＺｅｘ−ＤｓＲｅｄ（図６）を作製した。
ｐＸＩ−ＥｇｇＥ０７Ｆ０９（ＳｆｉＩ）−ｐＺｅｘ−ＤｓＲｅｄは，上記２）で作製したｐＸＩ−ＥｇｇＥ０７Ｆ０９（ＳｆｉＩ）のＢｇｌＩＩ／ＮｄｅＩ断片と上記４）で作製したｐＺｅｘ−ＤｓＲｅｄ（ΔＢａｍＨＩ）／ｐＢＳＩＩＳＫ（−）ＳＫ−Ｂｇｌ／ＫＳ−ＮｄｅのＢａｍＨＩ／ＮｄｅｌＩ断片を繋いで作製した。【００２４】
６）ｐＸＩ−ＥＧＦＰ（ＳｆｉＩ）−ｐＺｅｘ−ＤｓＲｅｄ（図７）を作製した。
上記５）で作製したＰＸＩ−ＥｇｇＥ０７Ｆ０９（ＳｆｉＩ）−ｐＺｅｘ−ＤｓＲｅｄのＥｇｇＥ０７Ｆ０４を，ＳｆｉＩを介してＥＧＦＰと組換えたプラスミドであった。【００２５】
Ｂ．ｐＺｅｘ−ＥＧＦＰベクター
ｐＺｅｘ（配列表配列番号４）の下流にＥＧＦＰ（配列表配列番号２）を組み込んだ発現ベクターを作製した。
すなわち、ｚＨｅ１−１０００ｂｐ（配列表配列番号３）をＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩを介してｐＸＩ−ＥＧＦＰ（参考文献３）のプロモーターと組み換え，さらにＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで処理後Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ）によって末端を平滑化しセルフライゲーションする事によりプロモーター領域を約３００ｂｐに削除したｐＺｅｘ（配列表配列番号４）を有するｐＺｅｘ−ＥＧＦＰを調製した。【００２６】
Ｃ．ｐＺＥＦ１−ＥＧＦＰベクター
本ベクターはプロモーターとしてｐＺＥＦ１（配列表配列番号６）を、ｐＸＩ−ＥＧＦＰベクターのプロモーター領域（ｐＸＩ、配列表配列番号１）に置換してＥＧＦＰ（配列表配列番号２）の上流に組み込んだ遺伝子発現ベクターであった。【００２７】
本発明のｐＺＥＦ１−ＥＧＦＰベクターは次のように作製した。
１）ゼブラフィッシュゲノムＤＮＡの調製
参考文献４に従い、ゼブラフィッシュゲノムＤＮＡを調製した。即ち、孵化後（４８ｈｐｆ以降）のゼブラフィッシュ（ゴールデンタイプ）の稚魚（１４ｄｐｆ）１００匹程度およびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（Ｗａｋｏ  １６０−１４００１）０．２μｇ／ｍｌ（ＳＥＴ  バッファー（１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５，５ｍＭ−ＥＤＴＡ，１％ＳＤＳ）に溶解したもの）を用意した。このうち、稚魚５０匹を２の０．２μｇ  Ｐｒｏｔｅｎａｓｅ  Ｋ溶液１ｍｌに懸濁し、３７℃で２時間保温した後、マイルドシェーカーで振とうしながら室温で一晩保温した。
上記で調製されたゼブラフィッシュ酵素分解サンプル（５００μｌ）に対して同量のＰＣＩ（クロロホルム：イソミルアルコールの混合物＝２５：２４：１）を加えてマイルドシェーカーで混合した。これを室温，２００００ｘｇで２０分間遠心し、３００μｌの上清を広口のチップを用いて回収した。これに３０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと８２５μｌの１００％エタノールを加えて混合し、−８０℃で３０分間静置した後、４℃，２００００ｘｇで４０分間遠心した。得られたペレットを冷却７０％エタノールで２回洗浄した後、１００μｌの０．１ｘＴＥに溶解してゼブラフィッシュゲノムＤＮＡを調製した。
参考文献４：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０３．４０３−４１２（１９８８）【００２８】
２）プロモーター配列の調製
上記１）で調製したゼブラフィッシュゲノムＤＮＡより、ＰＣＲによってｐＺＥＦ１の塩基配列を単離した。ＴＡＫＡＲＡ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲを用い、配列表配列番号７及び配列番号８のプライマーを用いて表１に記載の条件でＰＣＲを行った。
増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー（ベックマン製）を用いて決定した。これによって単離された配列表配列番号６に記載の塩基配列が、ＥＦ１ａ遺伝子の約１ｋｂ上流のプロモーター領域（ｐＺＥＦ１）であった。
ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片の両端は平滑末端となり、さらに配列表配列番号９に記載のプライマーはＳｓｅ８３８７１（タカラバイオ製）サイトを有する。このＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片の５’末端は平滑末端となり、３’末端はＳｓｅ８３８７１認識サイトに調製できる。したがって、その両端をＰｍｅＩの平滑末端およびＳｓｅ８３８７１サイトに調製したベクターに組み込むことができる。【００２９】
【表１】
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【００３０】
３）ベクターの作製
研究用ベクターｐｚＨｅ１−１０００ｐｒｏ−ＥＧＦＰ（ＳｆｉＩＣＢ）（ｉ）（図８）はｐＸＩ−ＥＧＦＰをベースにして構築した。
ｐｚＨｅ１−１０００ｐｒｏ−ＥＧＦＰ（ＳｆｉＩＣＢ）（ｉ）の塩基配列１１１位のＮｏｔＩサイトから塩基配列２３６２位のＡｓｉＳＩサイト間の塩基配列はｐＸＩ−ＥＧＦＰと同じであった。ｐｚＨｅ１−１０００ｐｒｏ−ＥＧＦＰ（ＳｆｉＩＣＢ）（ｉ）の塩基配列２３６２位のＡｓｉＳＩサイトから塩基配列１１１位のＮｏｔＩサイトまで間にはｚＨｅ１−１０００ｂｐ（配列表配列番号３）、ＥＧＦＰ（配列表配列番号２）およびＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ  ｓｉｇｎａｌ（配列表配列番号９）をこの順に配置し、２１４６ｂｐの領域（配列表配列番号１０）を構成した。なお、ｚＨｅ１−１０００ｂｐ、ＥＧＦＰおよびＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ  ｓｉｇｎａｌの上流および下流には、それぞれＰｍｅＩサイトおよびＳｓｅ８３８７１サイト、ＳｆｉＩサイトおよびＳｆｉＩサイト、ＣｌａＩサイトおよびＸｂａＩサイトが存在した。
そして、このベクターのＰｍｅＩ−Ｓｓｅ８３８７１サイトに連結されていたプロモーター配列（ゼブラフィッシュｚＨｅ１のプロモーター、配列表配列番号３）を取り除き、上記１）で増幅したプロモーター配列を組み込むことで、ＺＥＦ１−ＥＧＦＰベクター（図９）を作製した。【００３１】
上記で作製されたＡ〜Ｃの３種のベクターはゼブラフィッシュ初期胚において発現することが確認されている。【００３２】
３．遺伝子導入
マイクロインジェクション法により、これらの遺伝子発現ベクターを導入することで、遺伝子導入を行った。すなわち、上記ＡおよびＢの遺伝子発現ベクターをいずれも１００ｎｇ／ｕｌに調製して、ガラス製マイクロインジェクションキャピラリーに充填し、受精直後の受精卵に微量注入した。【００３３】
４．遺伝子発現の確認
マイクロインジェクション後の受精卵を、２０℃下で培養し、適宜、蛍光顕微鏡を用いて蛍光タンパク質の発現を観察した。
その結果、Ａ．の遺伝子発現ベクター（ｐＸＩ−ＥＧＦＰ−ｐＺｅｘ−ＤｓＲｅｄベクター）を導入したものは、図１０に示したように、受精７２時間後の導入初期胚において、全身にＥＧＦＰがユビキタスに発現すること、および、孵化腺特異的にＤｓＲｅｄが発現することが確認された。また、透明な金魚由来の受精卵に、Ａ．の遺伝子発現ベクター（ｐＸＩ−ＥＧＦＰ−ｐＺｅｘ−ＤｓＲｅｄベクター）を導入したものも、図１１に示したように、受精７２時間後の導入初期胚において、全身にＥＧＦＰがユビキタスに発現すること、および、孵化腺特異的にＤｓＲｅｄが発現することが確認された。
また、Ｂ．の遺伝子発現ベクター（ｐＺｅｘ−ＥＧＦＰベクター）を導入したものは、図１２に示したように、受精２４時間後の導入初期胚において、全身にＥＧＦＰがユビキタスに発現し、受精後７２時間になると孵化腺特異的に発現することが確認された。さらに、受精９６時間後になると孵化腺でのＥＧＦＰの発現が減衰することが確認された。
さらに、Ｃ．の遺伝子発現ベクター（ｐＺＥＦ１−ＥＧＦＰベクター）を導入したものは、図１３に示したように、受精４８時間後の導入初期胚において、全身にＥＧＦＰがユビキタスに発現することが確認された。
以上の結果より、本発明の作製方法により、トランスジェニック金魚が作製できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明のトランスジェニック金魚の作製方法により、様々な遺伝子を導入したトランスジェニック金魚の作製が可能となった。特定の遺伝子を導入することによって、その遺伝子が金魚に与える影響を調べたり、有用なタンパク質を製造したりすることができる。本発明のトランスジェニック金魚が製造するタンパク質は、血清から容易に抽出できるため、従来のトランスジェニック魚類を用いた場合と比較して容易かつ多量に得ることができる。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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