(57)【要約】  本発明は、タンパク質の電気泳動用試薬、前記試薬を含む電気泳動用ゲル／バッファー組成物、並びにそれらを用いたタンパク質の分離方法及び電気泳動用キットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
中性の電気泳動緩衝液中でタンパク質と結合して分子全体がマイナスに帯電した複合体を形成することができ、かつ、実質的に無色である少なくとも１種の化合物からなり、前記化合物が、下記式（Ｉ）
【化１】
2010064638.tif 000021
(式中、Ｒは、水素原子、ＳＯ３Ｈもしくはその塩、ハロゲン原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、メチレンジオキシ、ヒドロキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルコキシカルボニルアミノ、カルバモイル、モノ若しくはジアルキルカルバモイル、スルファモイル、モノ若しくはジアルキルスルファモイル、アルキルスルホニルアミノ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アリールオキシ、カルボキシルまたはＮＲ１Ｒ２を示す。
Ｒ’は、水素原子、ＳＯ３Ｈもしくはその塩、ハロゲン原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、メチレンジオキシ、ヒドロキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルコキシカルボニルアミノ、カルバモイル、モノ若しくはジアルキルカルバモイル、スルファモイル、モノ若しくはジアルキルスルファモイル、アルキルスルホニルアミノ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アリールオキシ、カルボキシルまたはＮＲ３Ｒ４を示す。
Ｒ”は、水素原子、ＳＯ３Ｈもしくはその塩、ハロゲン原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、メチレンジオキシ、ヒドロキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルコキシカルボニルアミノ、カルバモイル、モノ若しくはジアルキルカルバモイル、スルファモイル、モノ若しくはジアルキルスルファモイル、アルキルスルホニルアミノ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アリールオキシ、カルボキシルまたはＮＲ５Ｒ６を示す。
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６は、同一または異なって水素原子、アルキル、シクロアルキル、置換されていてもよいアリールまたは置換されていてもよいアラルキルを示し、
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃは、同一または異なって、ＳＯ３Ｈもしくはその塩、ハロゲン原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、メチレンジオキシ、ヒドロキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、カルバモイル、モノ若しくはジアルキルカルバモイル、スルファモイル、モノ若しくはジアルキルスルファモイル、アルキルスルホニルアミノ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アリールオキシ、アシルアミノまたはカルボキシルを意味し、
ｎ１，ｎ２、ｎ３は、同一または異なって０〜４の整数を示す。
Ｚは、水素原子、ハロゲン原子、ＯＨ、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アリールオキシ、ＳＨ、アルキルチオ、アルキル、アミノ（ＮＨ２）、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノまたはアシルアミノを示す。
ただし、式（Ｉ）の化合物は、１，２，３，４，５または６個のＳＯ３Ｈまたはその塩を有する。）
で表される、電気泳動用試薬。
【請求項２】
下記一般式（Ｉａ）で表される少なくとも１種の化合物を含有することを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用試薬。
【化２】
2010064638.tif 000022
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５は、同一又は異なって、水素原子、アルキル、シクロアルキル、置換されていてもよいアリールまたは置換されていてもよいアラルキルを示す。
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒ２ａ、Ｒ４ａ、Ｒ６ａ、は、同一または異なってＳＯ３Ｈもしくはその塩、ハロゲン原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、メチレンジオキシ、ヒドロキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、カルバモイル、モノ若しくはジアルキルカルバモイル、スルファモイル、モノ若しくはジアルキルスルファモイル、アルキルスルホニルアミノ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アリールオキシ、アシルアミノまたはカルボキシルを示す。
ｎ１，ｎ２、ｎ３は、同一または異なって０〜４の整数を示す。
ｍ１，ｍ２、ｍ３は、同一または異なって０〜５の整数を示す。
ただし、式（Ｉａ）の化合物は、１，２，３，４，５または６個のＳＯ３Ｈまたはその塩を有し、かつ、Ｒ１，Ｒ３，Ｒ５，
【化３】
2010064638.tif 000023
のうちの、１〜６個は、ＳＯ３Ｈもしくはその塩を置換基として有するアリールもしくはアラルキルを示す。）
【請求項３】
下記式(Ｉｂ)で表される少なくとも１種の化合物を含有することを特徴とする、請求項１または２に記載の電気泳動用試薬。
【化４】
2010064638.tif 000024
（式中、Ｒ１，Ｒ３，Ｒ５は、同一または異なって、水素原子、Ｃ１−４アルキル、置換されていてもよいフェニルまたは置換されていてもよいベンジルを示し、
Ｒａ、Ｒｃは、同一または異なって、水素原子もしくはメチルである。
Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃは、一方が水素原子であり、他方がＳＯ２ＮＲ９Ｒ１０、ＳＯ３Ｈまたはその塩を示す。
Ｒ４ｂ、Ｒ４ｃは、一方が水素原子であり、他方がアルコキシを示す。
Ｒ６ｂ、Ｒ６ｃは、一方が水素原子であり、他方がＳＯ２ＮＲ９Ｒ１０、ＳＯ３Ｈまたはその塩を示す。
Ｒ９，Ｒ１０は、水素又はアルキルを示す。
ただし、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、Ｒ６ｂ、Ｒ６ｃの１つ又は２つは、ＳＯ３Ｈまたはその塩を示す。）
【請求項４】
下記式(Ｉｃ)で表される少なくとも１種の化合物を含有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の電気泳動用試薬。
【化５】
2010064638.tif 000025
（式中、Ｒａ、Ｒｃは、同一または異なって、水素原子もしくはメチルである。
Ｒ２ｂ、Ｒ６ｂは、ＳＯ３Ｈまたはその塩を示す。）
【請求項５】
電気泳動用ゲルと請求項１〜４のいずれかに記載の電気泳動用試薬を含む電気泳動用ゲル組成物。
【請求項６】
電気泳動用バッファーと請求項１〜４のいずれかに記載の電気泳動用試薬を含む電気泳動用バッファー組成物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の電気泳動用試薬をタンパク質サンプルおよび/または電気泳動用バッファーに添加してタンパク質のClear Native電気泳動を行うことを特徴とするタンパク質の分離方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載の電気泳動用試薬、請求項５に記載の電気泳動用ゲル組成物、請求項６に記載の電気泳動用バッファー組成物からなる群から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とするタンパク質の電気泳動用キット。
【請求項９】
下記式(Ig)、(Ih)のいずれかで表される化合物。
【化６】
2010064638.tif 000026
(式中、Ｍは水素原子もしくは水溶性の塩を形成する金属あるいはＮ(Ｒ８)４（Ｒ８は同一または異なって水素原子、アルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいアリールまたは置換されていてもよいアラルキルを示す。)を示す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気泳動用試薬、電気泳動用組成物、電気泳動用キット及びタンパク質の分離方法に主に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、膜タンパク質及び超分子複合体の分子量や会合状態を、天然の状態や酵素活性を保ったままで調べる方法として、Blue-Native電気泳動法が多用されている。この方法は、Schaggerらにより開発され(非特許文献１参照）、負電荷を持つクマシーブリリアントブルー（Coomassie Brilliant Blue、以下「CBB」)G250が、タンパク質へ結合することを利用し、タンパク質のトータルの電荷をマイナスに偏らせ、細かな網目構造をもつアクリルアミドゲル中のタンパク質に電圧を掛け、分子の大きさによって分離する方法である。しかしながら、電気泳動用バッファーがCBB G250由来の青色を呈しているため、タンパク質試料をゲルへ添加する操作が不便である。また、泳動後のゲルはCBB G250由来の青色を呈しているため、GFP融合タンパク質をゲル中で泳動した場合、GFPを用いた蛍光検出することには適さなかった。【０００３】
最近になり、Wittigらにより、界面活性剤の１種であり負電荷を持つデオキシコール酸（DOC）を用いたClear Native電気泳動法が報告された(非特許文献２参照)。DOCは無色であるため、透明な状態でNative電気泳動を行うことはできる。しかし、ある種のタンパク質の場合には天然状態ではあり得ない多量体を形成してしまうなどの問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Anal. Biochem. 1991 Dec 199(2) 223-231
【非特許文献２】Mol. Cell Proteomics, 2007 Jul 6(7) 1215-1225
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、高次構造や複合体構造を維持したまま、全体的に負電荷を帯びた状態でタンパク質の泳動分離を行うことができ、かつ、透明な状態で電気泳動を行うことができる、タンパク質の電気泳動用試薬、電気泳動用組成物、並びにそれらを用いたタンパク質の分離方法及び電気泳動用キットを提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決することを主な目的として、鋭意検討を重ねた結果、特定の化合物が、可視光の波長領域に吸収がほとんどなく、かつ、Blue-Native-電気泳動法とほぼ同じ電気泳動パターンを得ることを可能にすることを見出し、更に鋭意検討を重ねて本発明を完成するに至った。【０００７】
即ち、本発明は、下記の事項に関する。
項１．  中性の電気泳動緩衝液中でタンパク質と結合して分子全体がマイナスに帯電した複合体を形成することができ、かつ、実質的に無色である少なくとも１種の化合物からなる電気泳動用試薬。
項２．  前記化合物が、少なくとも１つのアリールスルホン酸部分を有する、項１に記載の電気泳動用試薬。
項３．  中性の電気泳動緩衝液中でタンパク質と結合して分子全体がマイナスに帯電した複合体を形成することができ、かつ、実質的に無色である少なくとも１種の化合物からなり、前記化合物が、下記式（Ｉ）【０００８】
【化１】
2010064638.tif 000002
【０００９】
(式中、Ｒは、水素原子、ＳＯ３Ｈもしくはその塩、ハロゲン原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、メチレンジオキシ、ヒドロキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルコキシカルボニルアミノ、カルバモイル、モノ若しくはジアルキルカルバモイル、スルファモイル、モノ若しくはジアルキルスルファモイル、アルキルスルホニルアミノ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アリールオキシ、カルボキシルまたはＮＲ１Ｒ２を示す。【００１０】
Ｒ’は、水素原子、ＳＯ３Ｈもしくはその塩、ハロゲン原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、メチレンジオキシ、ヒドロキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルコキシカルボニルアミノ、カルバモイル、モノ若しくはジアルキルカルバモイル、スルファモイル、モノ若しくはジアルキルスルファモイル、アルキルスルホニルアミノ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アリールオキシ、カルボキシルまたはＮＲ３Ｒ４を示す。【００１１】
Ｒ”は、水素原子、ＳＯ３Ｈもしくはその塩、ハロゲン原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、メチレンジオキシ、ヒドロキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルコキシカルボニルアミノ、カルバモイル、モノ若しくはジアルキルカルバモイル、スルファモイル、モノ若しくはジアルキルスルファモイル、アルキルスルホニルアミノ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アリールオキシ、カルボキシルまたはＮＲ５Ｒ６を示す。【００１２】
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６は、同一または異なって水素原子、アルキル、シクロアルキル、置換されていてもよいアリールまたは置換されていてもよいアラルキルを示し、
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃは、同一または異なって、ＳＯ３Ｈもしくはその塩、ハロゲン原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、メチレンジオキシ、ヒドロキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、カルバモイル、モノ若しくはジアルキルカルバモイル、スルファモイル、モノ若しくはジアルキルスルファモイル、アルキルスルホニルアミノ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アリールオキシ、アシルアミノまたはカルボキシルを意味し、
ｎ１，ｎ２、ｎ３は、同一または異なって０〜４の整数を示す。【００１３】
Ｚは、水素原子、ハロゲン原子、ＯＨ、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アリールオキシ、ＳＨ、アルキルチオ、アルキル、アミノ（ＮＨ２）、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノまたはアシルアミノを示す。【００１４】
ただし、式（Ｉ）の化合物は、１，２，３，４，５または６個のＳＯ３Ｈまたはその塩を有する。）
で表される、項１又は項２に記載の電気泳動用試薬。
項４．  下記一般式（Ｉａ）で表される少なくとも１種の化合物を含有することを特徴とする項１〜３のいずれかに記載の電気泳動用試薬。【００１５】
【化２】
2010064638.tif 000003
【００１６】
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５は、同一又は異なって、水素原子、アルキル、シクロアルキル、置換されていてもよいアリールまたは置換されていてもよいアラルキルを示す。【００１７】
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒ２ａ、Ｒ４ａ、Ｒ６ａ、は、同一または異なってＳＯ３Ｈもしくはその塩、ハロゲン原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、メチレンジオキシ、ヒドロキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、カルバモイル、モノ若しくはジアルキルカルバモイル、スルファモイル、モノ若しくはジアルキルスルファモイル、アルキルスルホニルアミノ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アリールオキシ、アシルアミノまたはカルボキシルを示す。【００１８】
ｎ１，ｎ２、ｎ３は、同一または異なって０〜４の整数を示す。【００１９】
ｍ１，ｍ２、ｍ３は、同一または異なって０〜５の整数を示す。【００２０】
ただし、式（Ｉａ）の化合物は、１，２，３，４，５または６個のＳＯ３Ｈまたはその塩を有し、かつ、Ｒ１，Ｒ３，Ｒ５，【００２１】
【化３】
2010064638.tif 000004
【００２２】
のうちの、１〜６個は、ＳＯ３Ｈもしくはその塩を置換基として有するアリールもしくはアラルキルを示す。）
項５．  下記式(Ｉｂ)で表される少なくとも１種の化合物を含有することを特徴とする、項１〜４のいずれかに記載の電気泳動用試薬。【００２３】
【化４】
2010064638.tif 000005
【００２４】
（式中、Ｒ１，Ｒ３，Ｒ５は、同一または異なって、水素原子、Ｃ１−４アルキル、置換されていてもよいフェニルまたは置換されていてもよいベンジルを示し、
Ｒａ、Ｒｃは、同一または異なって、水素原子もしくはメチルである。【００２５】
Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃは、一方が水素原子であり、他方がＳＯ２ＮＲ９Ｒ１０、ＳＯ３Ｈまたはその塩を示す。【００２６】
Ｒ４ｂ、Ｒ４ｃは、一方が水素原子であり、他方がアルコキシを示す。【００２７】
Ｒ６ｂ、Ｒ６ｃは、一方が水素原子であり、他方がＳＯ２ＮＲ９Ｒ１０、ＳＯ３Ｈまたはその塩を示す。【００２８】
Ｒ９，Ｒ１０は、水素又はアルキルを示す。【００２９】
ただし、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、Ｒ６ｂ、Ｒ６ｃの１つ又は２つは、ＳＯ３Ｈまたはその塩を示す。）
項６．  下記式(Ｉｃ)で表される少なくとも１種の化合物を含有することを特徴とする、項１〜５のいずれかに記載の電気泳動用試薬。【００３０】
【化５】
2010064638.tif 000006
【００３１】
（式中、Ｒａ、Ｒｃは、同一または異なって、水素原子もしくはメチルである。【００３２】
Ｒ２ｂ、Ｒ６ｂは、ＳＯ３Ｈまたはその塩を示す。）
項７．  電気泳動用ゲルと項１〜６のいずれかに記載の電気泳動用試薬を含む電気泳動用ゲル組成物。
項８．  電気泳動用バッファーと項１〜６のいずれかに記載の電気泳動用試薬を含む電気泳動用バッファー組成物。
項９．  項１〜６のいずれかに記載の電気泳動用試薬をタンパク質サンプルおよび/または電気泳動用バッファーに添加してタンパク質のClear Native電気泳動を行うことを特徴とするタンパク質の分離方法。
項１０．  項１〜６のいずれかに記載の電気泳動用試薬、項７に記載の電気泳動用ゲル組成物、項８に記載の電気泳動用バッファー組成物からなる群から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とするタンパク質の電気泳動用キット。
項１１．  下記式(Ig)、(Ih)のいずれかで表される化合物。【００３３】
【化６】
2010064638.tif 000007
【００３４】
(式中、Ｍは水素原子もしくは水溶性の塩を形成する金属あるいはＮ(Ｒ８)４（Ｒ８は同一または異なって水素原子、アルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいアリールまたは置換されていてもよいアラルキルを示す。)を示す。）
【発明の効果】
【００３５】
本発明の電気泳動用試薬及び組成物によれば、透明な状態で電気泳動を行うことができ、かつ、高次構造や複合体構造を維持したまま、全体的に負電荷を帯びた状態でタンパク質の泳動分離を行うことができる。【００３６】
本発明の電気泳動用試薬は、実質的に無色であるので、電気泳動後に脱色をする必要がなく、直接銀染色などによりタンパク質を非常に高感度に検出することができ、Blue-Native電気泳動法よりもはるかに高感度である特徴を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】化合物(Ig) 及びCBB G250の可視吸収スペクトルの測定結果を示す。縦軸は吸光度（absorbance）、横軸は波長（単位nm）を示す。図１の実線は0.0167mg/ml CBB G250溶液の測定結果を示す。図１の点線は、1mg/ml化合物(Ig)溶液の測定結果を示す。
【図２】種々のタンパク質について、Blue Native PAGE(以下、「BN-PAGE」)及びClear Native PAGE(以下、「CN-PAGE」)を行い、電気泳動パターンを対比した結果を示す。図２左は、BN-PAGEにおけるパターンを示す。図２右はCN-PAGEにおけるパターンを示す。図２横軸の数値は、タンパク質の種類によって付したレーン番号であり、１：チログロブリン（Thyroglobulin: 669kDa）、2：フェリチン（Ferritin: 440kDa）、３：アルドラーゼ（Aldolase: 158kDa）、４：コンアルブミン（Conalbumin: 75kDa）、５：オボアルブミン（Ovalbumin: 43kDa）、６：カーボニックアンヒドラーゼ（Carbonic Anhydrase: 29kDa）、7：リボヌクレアーゼ A（RNase A: 13.7kDa）、８：一酸化窒素還元酵素（NOR: 68.5kDa）、９：バンド３（Band3: 55kDa(110kDa))）、10：アデノシン受容体A2a（A2a: 33kDa）を示す。  １〜７は、可溶性蛋白質(Soluble proteins)であり、８〜１０は、膜蛋白質(Membrane proteins)である。
【図３】タンパク質試料とEGFPとの融合体におけるCN-PAGE後の蛍光検出及びCBB染色の結果を示す。図3左（In-gel fluorescence）は、CN-PAGE後のゲルについて蛍光撮影を行って検出した結果を示す。図3右は、CN-PAGE後のゲルについてCBB染色により検出した結果を示す。レーン1は、マーカー、レーン２はEGFP、レーン３はドデシルマルトシド（DDM）で可溶化した膜タンパク質−EGFP融合体発現膜画分の結果を示す。
【図４】β-ガラクトシダーゼを用いてBN-PAGE又はCN-PAGEを行い、泳動後のゲル中で酵素活性を検出した結果を示す。図４左はBN-PAGEの結果を示す。図４右はCN-PAGEの結果を示す。
【図５】膜タンパク質（NOR）及び水溶性タンパク質（BSA）をタンパク質試料として、CN-PAGE後、銀染色を行った結果を示す。図５(A)はNOR試料の結果を示す。図５(B)はBSA試料の結果を示す。図5縦軸は、分子量（kDa）を示す。図5横軸は、電気泳動させたタンパク質の量に応じて付したレーンの番号を示す。左から、M：マーカー、１：1000ng, 2：500ng, 3：100ng, 4：50ng, 5：10ng, 6：5ng, 7：1ng, 8：0.5ng, 9：0.1ngである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明で使用する電気泳動用試薬は、実質的に無色の化合物を含み、この化合物は、タンパク質の疎水性部分と結合するアリール部分(aryl moiety)と、中性の水溶液中でアニオンを形成するＳＯ３Ｈまたはその塩を有する。水溶液中で該化合物をタンパク質と共存させると全体としてアニオン性の複合体を形成する。
【００３９】
好ましい実施形態において、電気泳動用試薬に含まれる化合物は、少なくとも１つのアリールスルホン酸部分(aryl sulfonate moiety)を有する。該化合物は、さらに少なくとも１つのアリールアミノ部分(aryl amino moiety)を有することができる。
【００４０】
【化７】
2010064638.tif 000008
【００４１】
(式中、Ｒｄ、Ｒｅは同一または異なって、ＳＯ３Ｈもしくはその塩、ハロゲン原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、メチレンジオキシ、ヒドロキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、カルバモイル、モノ若しくはジアルキルカルバモイル、スルファモイル、モノ若しくはジアルキルスルファモイル、アルキルスルホニルアミノ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アリールオキシ、アシルアミノまたはカルボキシルを示す。
【００４２】
Ｒ７は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、置換されていてもよいアリールまたは置換されていてもよいアラルキルを示す。
【００４３】
ｎ４は０〜４の整数を示す。ｎ５は０〜５の整数を示す。
【００４４】
Ｍは水素原子もしくは水溶性の塩を形成する金属、特にＮａ，Ｋ，Ｌｉ，Ｃｓなどのアルカリ金属、あるいはＮ(Ｒ８)４（Ｒ８は同一または異なって水素原子、アルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいアリールまたは置換されていてもよいアラルキルを示す。）で表される４級アンモニウムを示す。）
【００４５】
なお、上記は、アリールがフェニルであるアリールスルホン酸部分(aryl sulfonate moiety)、アリールアミノ部分(aryl amino moiety)を例示しているが、アリールがナフチル、フルオレニル、アントリル、ビフェニリル、テトラヒドロナフチル、クロマニル、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニル、インダニル、フルオレニル及びフェナントリルなどのフェニル以外の基であるアリールスルホン酸部分(aryl sulfonate moiety)、アリールアミノ部分(aryl amino moiety)も当然に本発明に含まれる。
【００４６】
メチレンジオキシ(-Ｏ-ＣＨ２-Ｏ-）は、隣接する２つの置換基が一緒になって形成される。
【００４７】
より好ましい実施形態において、該化合物は、式（Ｉ）で表される。
【００４８】
【化８】
2010064638.tif 000009
【００４９】
(式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ”、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、ｎ１，ｎ２、ｎ３及びＺは、前記に定義されるとおりである。)
【００５０】
さらに好ましい実施形態において、該化合物は、式（Ｉ’）で表される。
【００５１】
【化９】
2010064638.tif 000010
【００５２】
(式中、Ｒ、Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、ｎ１，ｎ２、ｎ３及びＺは、前記に定義されるとおりである。)
【００５３】
本明細書において、「ハロゲン原子」とは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を意味し、フッ素、塩素、臭素が好ましい。
【００５４】
「アルキル」としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル及びデシルなどの直鎖状、分枝鎖状又は環状のＣ１−１０アルキル、好ましくはＣ１−６アルキル、より好ましくはＣ１−４アルキルが挙げられる。特に好ましいアルキルはメチルまたはエチルである。
【００５５】
「シクロアルキル」としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル及びシクロヘプチルなどのＣ３−７シクロアルキルが挙げられる。
【００５６】
「ヒドロキシアルキル」としては、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシｎ−プロピル、ヒドロキシイソプロピル、ヒドロキシｎ−ブチル、ヒドロキシイソブチル、ヒドロキシtert−ブチルなどのＯＨを１個有するＣ１−４アルキルが挙げられる。
【００５７】
「アルコキシアルキル」としては、例えば、メトキシメチル、メトキシエチル、エトキシメチル、エトキシエチルなどのＣ１−４アルコキシＣ１−４アルキルが挙げられる。
【００５８】
「アリール」としては、５又は６員の芳香族炭化水素環からなる単環又は多環系を意味し、具体例としては、フェニル、ナフチル、フルオレニル、アントリル、ビフェニリル、テトラヒドロナフチル、クロマニル、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニル、インダニル、フルオレニル及びフェナントリルが挙げられる。
【００５９】
「アラルキル」としては、上記のアリールで置換された直鎖状、分枝鎖状又は環状のＣ１−４アルキルを意味し、具体的にはベンジル、１−フェニルエチル、２−フェニルエチル、１-フェニルプロピル、２-フェニルプロピル、３-フェニルプロピル、ナフチルメチルなどが挙げられる。
【００６０】
「アルケニル」としては、二重結合を少なくとも１個有するものを意味し、例えばビニル、アリル、１−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、イソプロペニル、１−、２−若しくは３−ブテニル、２−、３−若しくは４−ペンテニル、２−メチル−２−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、５−ヘキセニル、１−シクロペンテニル、１−シクロヘキセニル、３−メチル−３−ブテニルなどの直鎖状、分枝鎖状又は環状のＣ２−１０アルケニル、好ましくはＣ２−６アルケニル、より好ましくはＣ２−４アルケニルが挙げられる。
【００６１】
「アルキニル」としては、三重結合を少なくとも１個有するものを意味し、例えばエチニル、１−若しくは２−プロピニル、１−、２−若しくは３−ブチニル、１−メチル−２−プロピニルなどの直鎖状、分枝鎖状又は環状のＣ２−１０アルキニル、好ましくはＣ２−６アルキニル、より好ましくはＣ２−４アルキニルが挙げられる。
【００６２】
「アルコキシ」としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、tert−ブトキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ及びヘキシルオキシなどの直鎖状、分枝鎖状又は環状のＣ１−６アルコキシが挙げられる。
【００６３】
「モノアルキルアミノ」としては、例えばメチルアミノ、エチルアミノ、ｎ−プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、イソブチルアミノ、tert−ブチルアミノ、ｎ−ペンチルアミノ、イソペンチルアミノ、ヘキシルアミノなどの直鎖状、分枝鎖状又は環状のモノＣ１−６アルキルアミノが挙げられる。
【００６４】
「ジアルキルアミノ」としては、例えばジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジｎ−プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジｎ−ブチルアミノ、ジイソブチルアミノ、ジtert−ブチルアミノ、ジｎ−ペンチルアミノ、ジイソペンチルアミノ、ジヘキシルアミノなどの直鎖状、分枝鎖状又は環状のジＣ１−６アルキルアミノが挙げられる。
【００６５】
「アルコキシカルボニルアミノ」としては、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、プロポキシカルボニルアミノ、イソプロポキシカルボニルアミノ、ブトキシカルボニルアミノ、イソブトキシカルボニルアミノ、tert−ブトキシカルボニルアミノ、ペンチルオキシカルボニルアミノ、イソペンチルオキシカルボニルアミノ及びヘキシルオキシカルボニルアミノなどの直鎖状、分枝鎖状又は環状のＣ１−６アルコキシカルボニルアミノが挙げられる。
【００６６】
「モノアルキルカルバモイル」としては、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ｎ−プロピルカルバモイル、イソプロピルカルバモイル、ｎ−ブチルカルバモイル、イソブチルカルバモイル、tert−ブチルカルバモイル、ｎ−ペンチルカルバモイル、イソペンチルカルバモイル、ヘキシルカルバモイルなどのＣ１−６アルキルモノカルバモイルが挙げられる。
【００６７】
「ジアルキルカルバモイル」としては、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、ジｎ−プロピルカルバモイル、ジイソプロピルカルバモイル、ジｎ−ブチルカルバモイル、ジイソブチルカルバモイル、ジtert−ブチルカルバモイル、ジｎ−ペンチルカルバモイル、ジイソペンチルカルバモイル、ジヘキシルカルバモイルなどのジＣ１−６アルキルカルバモイルが挙げられる。
【００６８】
「モノアルキルスルファモイル」としては、メチルスルファモイル、エチルスルファモイル、ｎ−プロピルスルファモイル、イソプロピルスルファモイル、ｎ−ブチルスルファモイル、イソブチルスルファモイル、tert−ブチルスルファモイル、ｎ−ペンチルスルファモイル、イソペンチルスルファモイル、ヘキシルスルファモイルなどのＣ１−６アルキルモノスルファモイルが挙げられる。
【００６９】
「ジアルキルスルファモイル」としては、ジメチルスルファモイル、ジエチルスルファモイル、ジｎ−プロピルスルファモイル、ジイソプロピルスルファモイル、ジｎ−ブチルスルファモイル、ジイソブチルスルファモイル、ジtert−ブチルスルファモイル、ジｎ−ペンチルスルファモイル、ジイソペンチルスルファモイル、ジヘキシルスルファモイルなどのジＣ１−６アルキルスルファモイルが挙げられる。
【００７０】
「アルキルスルホニルアミノ」としては、メチルスルホニルアミノ、エチルスルホニルアミノ、ｎ−プロピルスルホニルアミノ、イソプロピルスルホニルアミノ、ｎ−ブチルスルホニルアミノ、イソブチルスルホニルアミノ、tert−ブチルスルホニルアミノ、ｎ−ペンチルスルホニルアミノ、イソペンチルスルホニルアミノ、ヘキシルスルホニルアミノなどの直鎖状、分枝鎖状又は環状のＣ１−６アルキルスルホニルアミノが挙げられる。
【００７１】
「アルコキシカルボニル」としては、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、tert−ブトキシカルボニル、ペンチルオキシカルボニル、イソペンチルオキシカルボニル及びヘキシルオキシカルボニルなどの直鎖状、分枝鎖状又は環状のＣ１−６アルコキシカルボニルが挙げられる。
【００７２】
「モノアリールアミノ」としては、フェニルアミノ、ナフチルアミノ、フルオレニルアミノ、アントリルアミノ、ビフェニリルアミノ、テトラヒドロナフチルアミノ、クロマニルアミノ、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニルアミノ、インダニルアミノ、フルオレニルアミノ及びフェナントリルアミノが挙げられる。
【００７３】
「ジアリールアミノ」としては、ジフェニルアミノ、ジナフチルアミノ、ジフルオレニルアミノ、ジアントリルアミノ、ジビフェニリルアミノ、ジテトラヒドロナフチルアミノ、ジクロマニルアミノ、ジ（２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニル）アミノ、ジインダニルアミノ、ジフルオレニルアミノ及びジフェナントリルアミノが挙げられる。
【００７４】
「モノアラルキルアミノ」としては、ベンジルアミノ、１−フェニルエチルアミノ、２−フェニルエチルアミノ、１-フェニルプロピルアミノ、２-フェニルプロピルアミノ、３-フェニルプロピルアミノ、ナフチルメチルアミノが挙げられる。
【００７５】
「ジアラルキルアミノ」としては、ジベンジルアミノ、ジフェネチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジナフチルメチルアミノが挙げられる。
【００７６】
「アルキルカルボニルオキシ」としては、メチルカルボニルオキシ、エチルカルボニルオキシ、ｎ−プロピルカルボニルオキシ、イソプロピルカルボニルオキシ、ｎ−ブチルカルボニルオキシ、イソブチルカルボニルオキシ、tert−ブチルカルボニルオキシ、ｎ−ペンチルカルボニルオキシ、イソペンチルカルボニルオキシ、ヘキシルカルボニルオキシなどの直鎖状、分枝鎖状又は環状のＣ１−６アルキルカルボニルオキシが挙げられる。
【００７７】
「アリールカルボニルオキシ」としては、フェニルカルボニルオキシ、ナフチルカルボニルオキシ、フルオレニルカルボニルオキシ、アントリルカルボニルオキシ、ビフェニリルカルボニルオキシ、テトラヒドロナフチルカルボニルオキシ、クロマニルカルボニルオキシ、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニルカルボニルオキシ、インダニルカルボニルオキシ、フルオレニルカルボニルオキシ及びフェナントリルカルボニルオキシが挙げられる。
【００７８】
「アリールオキシ」としては、フェニルオキシ、ナフチルオキシ、フルオレニルオキシ、アントリルオキシ、ビフェニリルオキシ、テトラヒドロナフチルオキシ、クロマニルオキシ、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニルオキシ、インダニルオキシ、フルオレニルオキシ及びフェナントリルオキシが挙げられる。
【００７９】
「アシルアミノ」としては、ホルミルアミノ、アセチルアミノ、プロピオニルアミノ、ブチリルアミノなどのＣ１−６アルカノイルアミノ、ベンゾイルアミノなどのアリールカルボニルアミノが挙げられる。
【００８０】
アルキルカルボニルオキシの具体例としては、メチルカルボニルオキシ、エチルカルボニルオキシ、ｎ−プロピルカルボニルオキシ、イソプロピルカルボニルオキシ、ｎ−ブチルカルボニルオキシ、イソブチルカルボニルオキシ、tert−ブチルカルボニルオキシ、ｎ−ペンチルカルボニルオキシ、イソペンチルカルボニルオキシ、ヘキシルカルボニルオキシなどのＣ１−６アルキルカルボニルオキシが挙げられる。
【００８１】
アリールカルボニルオキシの具体例としては、フェニルカルボニルオキシ、ナフチルカルボニルオキシ、フルオレニルカルボニルオキシ、アントリルカルボニルオキシ、ビフェニリルカルボニルオキシ、テトラヒドロナフチルカルボニルオキシ、クロマニルカルボニルオキシ、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニルカルボニルオキシ、インダニルカルボニルオキシ、フルオレニルカルボニルオキシ及びフェナントリルカルボニルオキシが挙げられる。
【００８２】
アルキルチオとしては、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、イソブチルチオ、tert−ブチルチオ、ｎ−ペンチルチオ、イソペンチルチオ、ヘキシルチオなどの直鎖状、分枝鎖状又は環状のＣ１−６アルキルチオが挙げられる。
【００８３】
置換されていてもよいアリールもしくは置換されていてもよいアラルキルの置換基としては、ハロゲン原子、アルキル、アルコキシ、ＳＯ３Ｈまたはその塩、ヒドロキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、カルバモイル、モノ若しくはジアルキルカルバモイル、スルファモイル、モノ若しくはジアルキルスルファモイル、アルキルスルホニルアミノ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アリールオキシ、アシルアミノまたはカルボキシルが挙げられ、これらの置換基を1〜４個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１個もしくは２個有していてもよい。
【００８４】
ｎ１,ｎ２、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３は、同一または異なって０〜４、好ましくは０〜３、より好ましくは０、１または２の整数を示す。
【００８５】
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６のうち、１〜６個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、特に１〜２個は、ＳＯ３Ｈもしくはその塩を置換基として有するアリールもしくはアラルキルを示す。
【００８６】
ＳＯ３Ｈの塩としては、ＳＯ３Ｈの水溶性塩であれば特に限定されないが、例えばＳＯ３Ｍ(Ｍは水素原子もしくは水溶性の塩を形成する金属、特にＮａ，Ｋ，Ｌｉ，Ｃｓなどのアルカリ金属、あるいはＮ(Ｒ８)４（Ｒ８は同一または異なって水素原子、アルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいアリールまたは置換されていてもよいアラルキルを示す。)で表されるアンモニウムである）で表されるスルホン酸塩が挙げられる。
【００８７】
本発明の化合物は、少なくとも１個のＳＯ３Ｈ（スルホ基）またはその塩を置換基として有する。これは、スルホ基により本発明の化合物がタンパク質と結合して全体の電荷を陰性にして電気泳動するためである。従来のBlue-Native電気泳動法で用いられているCBB G250、CBB R250などの色素は、スルホ基を２個有するが、アンモニウムカチオンを分子内に有するため分子全体として1価の負電荷を有する。本発明の化合物は分子全体として少なくとも１価の負電荷を有する。本発明の化合物が分子内にアンモニウムイオンなどのカチオンを有しない場合、ＳＯ３Ｈまたはその塩（１〜６個）は２個以上であってもよいが、１個でも十分である。CBB G250、CBB R250を還元して製造される、本発明の化合物(Ig)、(Ih)は、２個のＳＯ３Ｈまたはその塩を有し、水溶液中で２価のアニオンとして存在する。このように、２価または多価のアニオンとして存在する場合、強い負電荷のためにタンパク質の種類または電気泳動の条件によってはサブユニットの解離や三次構造の部分的な破壊が起こり得る。このため、少なくとも１つのスルホ基を電荷を有しない官能基、例えば水素原子、水酸基（ＯＨ）、スルファモイル（−ＳＯ２ＮＨ２）、モノ若しくはジアルキルスルファモイルなどに変えることで負電荷を１価とし、タンパク質に対する作用をマイルドにしてタンパク質の構造を保持するようにしてもよい。本発明の好ましい化合物は、(Ig)、(Ih)の他に化合物(Ii)、(Ij)、(Ik)、(Il)が挙げられる。
【００８８】
【化１０】
2010064638.tif 000011
【００８９】
(式中、Ｒ９，Ｒ１０は同一又は異なって、水素原子又はアルキルを示す。)
【００９０】
ＣＢＢなどの複数のスルホ基を有する色素化合物を還元して無色の本発明の化合物に変換する場合、例えば１個のスルホ基を置換されていてもよいスルホンアミドなどの電荷を有さず水溶性／極性を有する他の基に置換することで、もとの色素化合物と同様なタンパク質との結合性、水溶性などを保持しつつ、色素化合物と同様な電荷を有する無色化合物に導くことができる。
【００９１】
上記一般式（１）で表される化合物は、一般的な化学合成技術を利用して合成することができる。具体的な合成法を以下のスキーム１に例示する。
＜スキーム１＞
【００９２】
【化１１】
2010064638.tif 000012
【００９３】
【化１２】
2010064638.tif 000013
【００９４】
(式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、ｎ１，ｎ２、ｎ３及びＺは、前記に定義されるとおりである。)
【００９５】
本発明の化合物（Ｉ）は、スキーム１（ａ１）に示されるように、アルデヒド（１）と化合物（２）、化合物（３）を反応させることにより、１段階で合成することができる。
【００９６】
反応は、化合物（１）１モルに対し、化合物（２）と化合物（３）を各々１モル程度、硫酸を触媒量から過剰量使用し、溶媒の存在下、６０〜１５０℃で５〜９６時間反応させることにより有利に進行する。化合物（２）と化合物(３)は、同一であるのが好ましい。化合物（２）と化合物（３）が相違する場合、アルデヒド（１）に対し化合物（２）が２分子反応した化合物、化合物（３）が２分子反応した化合物、化合物（２）と化合物（３）が１分子ずつ反応した化合物が生じ得、これらをカラムクロマトグラフィー、再結晶、溶媒抽出、分取ＨＰＬＣ等の通常の分離手段により分離することにより式（Ｉ）の化合物が各々得られる。溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアルコール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン、ジグライムなどのエーテルなどが挙げられる。
【００９７】
本発明のＺ＝Ｈの化合物(Ｉ”)は、スキーム１（ａ２）に示されるように、アルデヒド（１ａ）と化合物（２）、化合物（３）を反応させることにより、１段階で合成することができ、この化合物に、1）ハロゲン化(Halogenation)及び必要に応じて2)ハロゲン原子の他の官能基への置換反応(Substitution)により水素原子以外のＺを導入することにより、式（Ｉ）の化合物を得ることができる。ハロゲン化は、Ｆ２，Ｃｌ２，Ｂｒ２，Ｉ２などのハロゲン分子、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−クロロスクシンイミドなどのハロゲン化剤と反応させることにより実施される。Ｚ=ハロゲン原子の化合物と、水酸化ナトリウムなどのアルカリ金属水酸化物、（アルキル）-ＯＨ、（アルキル）−ＣＯＯＨ、（アリール）−ＣＯＯＨ、（アリール）−ＯＨ、（アルキル）−ＳＨ、アンモニア、（アルキル）−ＮＨ２、（アルキル）２−ＮＨなどの化合物と必要に応じてトリエチルアミン、ピリジンなどの塩基の存在下に反応させることにより、Ｚ＝ＯＨ、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アリールオキシ、ＳＨ、アルキルチオ、アルキル、アミノ（ＮＨ２）、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノの化合物を得ることができる。Ｚ＝アミノ基の化合物とアシルクロリドなどの酸無水物を反応させることにより、Ｚ＝アシルアミノの化合物を得ることができる。
【００９８】
本発明の化合物（Ｉｄ）は、スキーム１（ｂ）に示されるように、アルデヒド（１ｂ）と化合物（２ｂ）、化合物（３ｂ）を溶媒及び硫酸の存在下に反応させることにより、同様に１段階で合成することができる。反応は、アルデヒド（１ｂ）１モルに対し、化合物（２ｂ）と化合物（３ｂ）を各々１モル程度、硫酸を触媒量から過剰量使用し、溶媒の存在下、６０〜１５０℃で５〜９６時間反応させることにより有利に進行する。
【００９９】
次に、化合物（Ｉｄ）は、濃硫酸、発煙硫酸などのスルホン化剤の存在下に室温から４０℃程度の温度で１〜４８時間反応させることによりスルホン酸化合物（Ｉｅ）に導くことができる。次に、酢酸、ＨＣｌの存在下にＭｎＯ２で化合物（Ｉｅ）を酸化することにより、化合物（ＩＩａ）とし、これをＨＮＲ１Ｒ２と反応させて、式（ＩＩｂ）の化合物にする。化合物（ＩＩｂ）を更にＮａＣＮＢＨ３などの還元剤で還元することにより、化合物（Ｉｆ）を得ることができる。
【０１００】
化合物（Ｉｆ）は上記と同様にしてＺ基を導入することにより化合物（Ｉｆ’）に変換することができる。化合物（Ｉｅ）は、酢酸、ＨＣｌを溶媒として用い、当量から過剰量のＭｎＯ２と室温程度の温度で１から２４時間反応させることにより、化合物（ＩＩａ）を得ることができる。化合物（ＩＩａ）１モルをメタノール等のアルコール、塩化メチレン等の塩素化炭化水素などの溶媒中、１モルから過剰量のＨＮＲ１Ｒ２と反応させることにより化合物（ＩＩｂ）を得ることができる。化合物（ＩＩｂ）１モルに対し、メタノールなどのアルコール中、１当量から過剰量のＮａＣＮＢＨ３などの還元剤で還元することにより、化合物（Ｉｆ）を得ることができる。
【０１０１】
あるいは、化合物（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）や、ＣＢＢ系の染料を含む下記の部分構造
【０１０２】
【化１３】
2010064638.tif 000014
【０１０３】
（式中、Ａｒは、同一または異なって置換されていてもよいアリール基を示す。Ｒ５，Ｒ６は前記に定義されるとおりである。Ｒｆは、同一または異なってＳＯ３Ｈもしくはその塩、ハロゲン原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、メチレンジオキシ、ヒドロキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、カルバモイル、モノ若しくはジアルキルカルバモイル、スルファモイル、モノ若しくはジアルキルスルファモイル、アルキルスルホニルアミノ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アリールオキシ、アシルアミノまたはカルボキシルを示す。ｎ４は、０〜４の整数を示す。Ａｒ、Ｒ５，Ｒ６，Ｒｆは全体として１〜６個のＳＯ３Ｈまたはその塩を有することが好ましい。）
を有する酸性染料(スルホ基またはその塩を１〜６個有する染料)を原料とし、これを必要に応じて誘導体化し、ＮａＣＮＢＨ３などの還元剤で還元することにより、実質的に無色の以下の部分構造
【０１０４】
【化１４】
2010064638.tif 000015
【０１０５】
（式中、Ａｒ、Ｒ５，Ｒ６，Ｒｆ，ｎ４は前記に定義されるとおりである。）
を有する本発明の化合物を得ることができる。
【０１０６】
あるいは、下記の化合物
【０１０７】
【化１５】
2010064638.tif 000016
【０１０８】
(式中、Ｒａ、Ｒｂ、ｎ１，ｎ２は、前記に定義されるとおりである。Ｒｆ、Ｒｇは、一方が水素原子で他方が置換されていてもよいアリールスルホン酸を示すか、あるいは、ＲｆとＲｇが一緒になってスルホ基を有する芳香族もしくはヘテロ芳香族基を示す。)を本発明の電気泳動用試薬として使用することもできる。置換されていてもよいアリールスルホン酸としては、置換されていてもよいベンゼンスルホン酸、置換されていてもよいナフタレンスルホン酸、置換されていてもよいアントラセンスルホン酸、置換されていてもよいフェナントレンスルホン酸、置換されていてもよいフルオレンスルホン酸、置換されていてもよいインダンスルホン酸、置換されていてもよいインデンスルホン酸、置換されていてもよいテトラリンスルホン酸、置換されていてもよいアセナフテンスルホン酸が挙げられる。スルホ基を有する置換されていてもよい芳香族基としては、スルホ基を有する置換されていてもよい（インデン、インダン、テトラリン、フルオレン）が挙げられる。スルホ基を有する置換されていてもよいヘテロ芳香族基としては、スルホ基を有する置換されていてもよい（ベンゾフラン、ベンゾピラン、キサンテン、クロメン、イソベンゾフラノン、インドリン、イソインドリン）が挙げられる。具体的な化合物を以下に示す。
【０１０９】
【化１６】
2010064638.tif 000017
【０１１０】
(式中、Ｒａ、Ｒｂ、ｎ１，ｎ２，Ｍは、前記に定義されるとおりである。Ｒｈ、Ｒｉは、同一または異なってスルホ基（ＳＯ３Ｈ）もしくはその塩、ハロゲン原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、メチレンジオキシ、ヒドロキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、カルバモイル、モノ若しくはジアルキルカルバモイル、スルファモイル、モノ若しくはジアルキルスルファモイル、アルキルスルホニルアミノ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アリールオキシ、アシルアミノまたはカルボキシルを示す。ｎ５、ｎ６は、各々０〜４の整数を示す。)
【０１１１】
還元により本発明の化合物が得られる酸性染料としては、CBB R150, CBB G250, CBB R250, CBB R350が好ましい。 
【０１１２】
例えば、式(Ig)、(Ih)で表される化合物は、市販のCBB G250又はCBB R250を、常法に従って還元することにより、得ることができる。式(Ia)で表される化合物は、CBB G250又はCBB R250と同様な合成法により、CBB化合物（IIc）を合成し、これを還元剤で還元することにより、容易に得ることができる(スキーム２参照)。
＜スキーム２＞
【０１１３】
【化１７】
2010064638.tif 000018
【０１１４】
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒ２ａ、Ｒ４ａ、Ｒ６ａ、ｎ１，ｎ２、ｎ３、ｍ１，ｍ２、ｍ３は、前記に定義されるとおりである。）
【０１１５】
還元は、溶媒中、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、ＬｉＡｌＨ４などの還元剤の存在下で行うことができる。溶媒としては、メタノール、エタノールなどのアルコールが挙げられる。還元反応は、式（IIc）の化合物１モルに対し、還元剤を１モルから過剰量使用し、０℃から溶媒の沸騰する温度で30分〜２４時間反応させることにより、有利に進行する。
【０１１６】
本発明の好ましい化合物の構造を以下に示す。
【０１１７】
【化１８】
2010064638.tif 000019
【０１１８】
(式中、Ｍは水素原子もしくは水溶性の塩を示す。)
【０１１９】
本発明の化合物（Ｉ）は、タンパク質結合能を有する。一方で、化合物（Ｉ） は、可視光の吸収をほとんど示さないため、ほぼ無色である。これらの性質から、塩基性の等電点を持つタンパク質や膜タンパク質等のタンパク質においても可視光吸収を付加することなく負電荷を付与することが可能である。
【０１２０】
また、化合物（Ｉ）は水への溶解度が高く、取り扱いが容易である。
【０１２１】
さらに、SDSなどのタンパク質変成作用の強い界面活性剤と異なり、タンパク質の分子表面に比較的弱く結合するため、タンパク質の高次構造や多量体タンパク質の会合状態を変化させることがない。
【０１２２】
このような特性から、化合物（Ｉ）は、タンパク質を天然の状態で電気泳動することができ、かつ、電気泳動後のゲルを無色透明とする電気泳動用試薬(Clear Native電気泳動用試薬)として使用できる。
【０１２３】
本発明の電気泳動用試薬は、少なくとも１種の化合物（Ｉ）からなってもよいし、化合物（Ｉ）を電気泳動用ゲルに配合した電気泳動用ゲル組成物、電気泳動用バッファー（カソードバッファー、アノードバッファー）、ゲル作製用バッファー、サンプルバッファーなどに化合物（Ｉ）を配合した電気泳動用バッファー組成物であってもよい。
【０１２４】
電気泳動用ゲルとしては、例えば、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル、デキストランゲル等を挙げることができる。特に、本発明は、電気泳動用ゲルがポリアクリルアミドゲルであるポリアクリルアミドゲル電気泳動法に好適に用いられる。
【０１２５】
ゲルは、一定濃度ゲルであってもよく、濃度勾配ゲルであってもよい。
【０１２６】
例えば、ポリアクリルアミドゲルの場合、4-16%の濃度勾配ゲルや5-20%濃度勾配ゲル、あるいは8%の一定濃度ゲルや12%の一定濃度ゲルを用いることができる。一般には一定濃度ゲルよりは濃度勾配ゲルの方が、バンドがシャープである。  
【０１２７】
なお、本明細書において、「%」は、特に断わらない限り、「w/v（%）」を意味する。
【０１２８】
電気泳動用バッファー（サンプルバッファー）としては、公知のBlue-Native電気泳動におけるサンプルバッファーと同様のものを用いることができるが、通常、pHが６〜８程度で、塩濃度が0.3M以下程度のものが用いられる。例えば、100mMイミダゾール pH7.0, 100mM NaCl, 1%ドデシルマルトシド, 20%グリセロール，1%化合物（Ｉ）の組成のもの、或いは、20mM Hepes pH7.5，150mMNaCl, 0.1%ドデシルマルトシド，20%グリセロール，0.1%化合物（Ｉ）の組成のものなどを用いることができる。電気泳動用バッファー（カソードバッファー、アノードバッファー）、ゲル作製用バッファーも同様に、公知のBlue-Native電気泳動に使用するバッファーがそのまま使用できる。例えば陰極バッファーとしては50mM Tricine, 7.5mM イミダゾール(pH 7.0)、0.02%化合物（Ｉ）、陽極バッファーとしては、25mM イミダゾール(pH 7.0)などが挙げられる。
【０１２９】
本発明の試薬には、タンパク質の溶解性の向上や安定化など、目的に応じて、他の成分を添加することもできる。
【０１３０】
他の成分としては、例えば、可溶化剤やジスルフィド結合還元試薬等が挙げられる。可溶化剤としては、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド(ＤＤＭ)、ジギトニン等が挙げられる。これらの可溶化剤は、化合物（Ｉ）とタンパク質との結合を阻害することなく溶解性を上げることができる。また、ジスルフィド結合還元試薬としては、ジチオトレイトールや2-メルカプトエタノール等が挙げられる。
【０１３１】
本発明のタンパク質の分離方法は、上記電気泳動用試薬又は電気泳動用組成物を用いて、電気泳動することにより、タンパク質を分離する方法である。
【０１３２】
本発明の電気泳動用試薬又は組成物に含まれる化合物（Ｉ）が、複合体やタンパク質の高次構造を壊すことなくタンパク質に結合して、分子全体をマイナスに帯電し、タンパク質を天然の構造を維持した状態で陽極方向へ泳動し、タンパク質を分離することが可能になる。
【０１３３】
本発明の分離方法において、対象となるタンパク質の試料（検体）は、解析可能であれば特に限定されないが、例えば、タンパク質の種類としては、酵素、膜タンパク質、抗体等が挙げられる。複合体を形成したタンパク質であってもよい。
【０１３４】
またタンパク質の分子量も、解析可能であれば特に限定されないが、通常20,000〜1,500,000ダルトン程度、特に、50,000〜1,000,000ダルトン程度である。
【０１３５】
また、試料は、タンパク質の精製溶液であってもよく、また細胞破砕液、細胞膜可溶化液などであってもよい。
【０１３６】
また、試料は、１種のタンパク質を含むものであってもよく、２種以上のタンパク質を含むものであってもよい。例えば、相互作用するであろうと考えられる２種類以上のタンパク質を含有する溶液を試料とすることもできる。
【０１３７】
また、試料は電気泳動する前に、前処理を行っても良い。前処理としては、遠心操作やフィルター濾過により、大きな凝集体を取り除く操作や、SYPRO Orangeなどのタンパク質蛍光標識化処理などがあげられる。
【０１３８】
上記試料を、本発明の電気泳動用試薬又は組成物を用いて、電気泳動用サンプルに調製する。
【０１３９】
サンプルの調製は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、化合物（Ｉ）とサンプルバッファーを含むバッファー組成物に、前記タンパク質試料を混合して、サンプルを調製してもよい。また、タンパク質試料を可溶化させたバッファーに、化合物（Ｉ） からなる電気泳動用試薬を添加し、更に必要に応じてグリセロール等の他の成分を添加して、サンプルを調製してもよい。
【０１４０】
サンプル中のタンパク質濃度は、電気泳動後の染色方法や検出方法によって異なり一義的に設定できないが、CBB染色により検出する場合、通常0.5〜20μg/well程度、特に、1〜10μg/well程度である。また蛍光タンパク質融合体を作製して、タンパク質の蛍光を検出する場合、通常0.05μg〜1μg/well、特に0.1〜0.5μg/well程度である。また、銀染色を行って検出する場合、通常0.5〜100ng/well、特に5〜50ng/well程度である。なお、これらの濃度は１wellあたりの容量を20μL程度として表している。
【０１４１】
サンプル中の化合物（Ｉ）の濃度も、検出方法等に応じて適宜設定されるが、通常0.02〜0.5%程度、特に0.05〜0.25%程度である。
【０１４２】
上記のように調製した電気泳動用サンプルを、汎用の電気泳動用装置を用いてゲルにアプライし、電気泳動させることにより、タンパク質の分離を行うことができる。
【０１４３】
電気泳動装置としては、タンパク質の電気泳動用として公知のものを適宜用いることができ、例えば、電気泳動槽、電気泳動用ガラス板、バッファー槽、スペーサー、コーム、クリップ、パワーサプライ、ペリスタポンプ等よりなる一般的なものを使用することができる。
【０１４４】
電気泳動用バッファーは、公知のBlue-Native電気泳動による電気泳動で用いられているバッファーと同様のものを用いることができる。
【０１４５】
例えば、電気泳動用バッファーとしては、トリス-グリシンバッファー、イミダゾール-トリシンバッファー、ビストリス-トリシンバッファー等を用いることができる。陽極側と陰極側では異なる組成のものを用いる。
【０１４６】
具体的に、トリス-グリシンバッファーとしては、
カソードバッファー: 25mM トリスベース, 192mM グリシン, pH 8.5
アノードバッファー: 25mM トリスベース, 192mM グリシン, pH 8.5
の組成のものが挙げられる。
【０１４７】
イミダゾール-トリシンバッファーとしては、
カソードバッファー: 7.5mM イミダゾール, 50mM トリシン, pH7.0
アノードバッファー: 25mM イミダゾール, pH 7.0
の組成のものが挙げられる。
【０１４８】
ビストリス-トリシンバッファーとしては、
カソードバッファー: 50mM ビス-トリス, 50mM トリシン, pH 6.8
アノードバッファー: 50mM ビス-トリス, 50mM トリシン，pH 6.8
の組成のものが挙げられる。
【０１４９】
それぞれのカソードバッファー中には、化合物（Ｉ）を、通常0.002〜0.02%程度、特に0.004〜0.01%程度含有させる。
【０１５０】
上記以外の電気泳動条件も、タンパク質が天然の状態を保ったままで電気泳動し得る条件であれば特に限定されず、試料の種類や解析の目的等に応じて適宜設定することができる。
【０１５１】
温度もタンパク質の種類等に応じて適宜設定し得るが、一般的に低い温度でタンパク質はより安定になることから、通常は4℃程度で電気泳動を行う。
【０１５２】
電気泳動により、サンプル中のタンパク質は、天然の状態を保ったまま、陽極へ引かれ、分子の大きさに従って、タンパク質の分離が行われる。
【０１５３】
電気泳動後は、タンパク質バンドを固定化して可視化し、タンパク質の天然状態における大きさや純度、相互作用等の解析を行うことができる。
【０１５４】
電気泳動後の染色法としては、通常のCBB染色に加えて、銀染色やウエスタンブロッティングも用いることができる。これにより、数ナノグラムレベルの微量な試料においても、タンパク質の大きさあるいは会合状態などを高い精度で知ることができる。本発明のClear Native電気泳動は非常に高感度である特徴を有する。
【０１５５】
更に、化合物（Ｉ）を用いた電気泳動後のゲルは透明であるため、化合物（Ｉ）の洗浄を行うことなく、銀染色を行うことができる。
【０１５６】
また、化合物（Ｉ）を用いた電気泳動後のゲルは透明であることから、電気泳動直後にタンパク質に由来する発色あるいは蛍光を検出することができる。例えば、GFPなどの蛍光タンパク質と研究対象となるタンパク質との融合タンパク質を適切な発現宿主により発現させ、キメラ蛍光タンパク質を含む細胞破砕粗抽出液を電気泳動し、精製することなく、発現量、会合状態を調べることができる。更に、そのまま発色を伴う酵素活性測定を行うこともできる。発色を伴う酵素活性測定としては、例えば、ATP加水分解反応、ペルオキシダーゼ反応、ガラクトシダーゼ反応、脱水素酵素反応などがあげられる。
【０１５７】
また、本発明の化合物（Ｉ）を用いた電気泳動法と、SDS-PAGE等の他の電気泳動分離と組み合わせた2次元電気泳動も可能である。例えば、一次元目では、本発明の化合物（Ｉ）を行って複合体を形成した状態で電気泳動を行い、二次元目はSDS-PAGEを行って解離した状態で電気泳動を行い、複合体の高次構造とポリペプチド鎖に関する分析を行うことができる。
【０１５８】
本発明の電気泳動用試薬及び組成物を、必要に応じて各種試薬や電気泳動用装置と組み合わせることにより、電気泳動用キットとすることもできる。
【０１５９】
例えば、キットには、上記本発明の電気泳動用試薬、電気泳動用バッファー組成物、電気泳動用ゲル組成物以外に、分子量マーカー、呈色試薬、ブロッティングバッファー、ブロッティング膜等の1種または2種以上を含めることができる。
【０１６０】
また、キットには、電気泳動槽、電気泳動用ガラス板、バッファー槽、スペーサー、コーム、クリップ、パワーサプライ、又はペリスタポンプ等の一般的な電気泳動用装置又は部品を1種または2種以上備えさせることもできる。
【０１６１】
本発明の電気泳動用試薬及び組成物、並びに、タンパク質の分離方法及び電気泳動用キットには、タンパク質の電気泳動、特に、Native電気泳動に関する公知の技術を必要に応じて付加し得るものである。
【０１６２】
本発明によれば、電気泳動後のゲルが無色透明であるため、ゲル中に含まれる有色試薬の洗浄を行うことなく、銀染色やウエスタンブロッティングによる検出が可能である。
【０１６３】
また、電気泳動直後のゲルが透明であるため、タンパク質に由来する発色や蛍光の検出をそのまま行うことができる。これにより、クルードな試料中の微量なタンパク質であっても、高い精度で解析を行うことができる。例えば、対象となるタンパク質をGFPとの融合体とし、GFPの蛍光を観察することにより、電気泳動直後にその会合状態や分子量を高い精度で解析することができる。更に、活性を維持した状態で電気泳動されたタンパク質の酵素活性を、電気泳動直後に呈色反応により測定することもできる。
【０１６４】
更に、カソードバッファーを無色透明のものとすることができるため、サンプルウェルへタンパク質試料がきちんとロードされているかを容易に確認でき、サンプルの取り扱いや電気泳動の操作も簡便となる。
【０１６５】
このように、本発明は、天然の状態や酵素活性を保ったままの状態のタンパク質を、簡便に、かつ、高い精度で解析する手法を提供するものであり、重要性の高まる膜タンパク質や超分子複合体等の解析乃至その応用技術の発展に大きく寄与するものである。
【実施例】
【０１６６】
以下、本発明を実施例により、更に詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。【０１６７】
以下の実施例において、Blue Native PAGEを「BN-PAGE」と略し、Clear Native PAGEを「CN-PAGE」と略す。【０１６８】
また、以下では、ポリアクリルアミド電気泳動(PAGE)の結果を示すが、ポリアクリルアミド以外の電気泳動に対し本発明が有効であることはいうまでもない。
【実施例１】
【０１６９】
１．一般式（Ig）で表される化合物の製造
0 ℃で、ベンゼンメタンアミニウム, N-[4-[[4-[(4-エトキシフェニル)アミノ]フェニル][4-[エチル[(3-サルフォフェニル)メチル]アミノ]フェニル]メチレン]-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン]-N-エチル-3-サルフォ-,ヒドロキサイド, インナーソルト, モノソディウムソルト
（Benzenemethanaminium,N-[4-[[4-[(4-ethoxyphenyl)amino]phenyl][4-[ethyl[(3-sulfophenyl)methyl]amino]phenyl]methylene]-2,5-cyclohexadien-1-ylidene]-N-ethyl-3-sulfo-, hydroxide, inner salt, monosodium salt）(CBB G250) 12.0 g（14.1 mmol) に、メタノール (60 mL)、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（sodium cyanoborohydride）2.65 g（42.3 mmol) を加え、室温で 1.5 時間攪拌した。【０１７０】
反応液を減圧下濃縮した後、ジエチルエーテルとメタノールの混合溶液から再結晶することによりソディウム 3,3’-(4,4’-((4-(4-エトキシフェニルアミノ)フェニル)メチレン)ビス(3-メチル-4,1-フェニレン))ビス(エチルアザンジイル)ビス(メチレン)ジベンゼンサルフォネート（sodium3,3’-(4,4’-((4-(4-ethoxyphenylamino)phenyl)methylene)bis(3-methyl-4,1-phenylene))bis(ethylazanediyl)bis(methylene)dibenzenesulfonate
(以下、化合物Ig) 8.95 g（収率73%）を得た。【０１７１】
得られた化合物(Ig)のNMRによる分析結果を以下に示す。
1H NMR (270 MHz, CD3OD) : δ7.65 -7.85 (m, 4H), 7.37 (brs, 4H), 7.00 (d, J = 9.2Hz, 2H) 6.70 -6.90 (m, 6H), 6.35 -6.57 (m, 6H), 5.36 (s,1H), 4.50 (s,4H), 3.97 (q,J = 6.6 Hz,2H), 3.43 (q,J= 6.6 Hz,4H), 2.03 (s,6H), 1.34 (t,J= 6.6 Hz,3H), 1.15 (t,J = 6.6 Hz,6H).
また上記反応式を下記に示す。【０１７２】
【化１９】
2010064638.tif 000020
【０１７３】
上記で得られた化合物Igを、以下で、Clear Native電気泳動用試薬として用いた。【０１７４】
２．化合物（Ig） の吸光スペクトル
上記で得られた化合物（Ig）及び市販のCBB G250（ナカライテスク株式会社）を水に溶解し、分光光度計（Hitachi UV-2810）を用いて、可視吸収スペクトルを測定した。【０１７５】
結果を図１に示す。【０１７６】
図１に示すように、化合物（Ig）は、582nm光の吸収（CBB G250の吸収極大）が、CBB G250に比べ1,000倍減少した。また、化合物（Ig）の1mg/ml水溶液は目視においてほとんど色を示さなかった。【０１７７】
３．化合物（Ig）を用いたCN-PAGE
ゲル濾過分子量マーカー（GEヘルスケア）と3種類の膜タンパク質を対象とし、化合物（Ig）とCBB G250を用いたNative PAGEのパターンの比較を行った。【０１７８】
電気泳動条件を以下に示す：
（１）電気泳動システム
Xcell SureLock mini cell及びPowerEase 500 power supply（Invitrogen社）  
（２）カソード溶液
（BN-PAGE）
50mM トリシン, 7.5mM イミダゾール、及び0.02%(W/V) CBB G250（pH7.0）
（CN-PAGE）
50mM トリシン, 7.5mM イミダゾール、及び0.02%(W/V) 化合物（Ig）（pH7.0）
（３）アノード溶液
25mM イミダゾール（pH 7.0）
サンプルは、BN-PAGEの場合は、タンパク質試料（20μg）を、50mM イミダゾール, 50mM NaCl, 0.5%ドデシルマルトシド, 及び0.5% CBB G250を含む溶液に溶解して調製した。CN-PAGEの場合は、CBB G250に代えて化合物（Ig）を用いる以外は前記と同様にしてサンプルを調製した。【０１７９】
また、ゲルは、ポリアクリルアミドゲル（Native PAGE TM 4-16% ビストリスゲル, 1.0mm, 10ウェル、Invitrogen社）を用いた。【０１８０】
以下では、CBB G250を用いたNative電気泳動をBlue Native PAGE(又はBN-PAGE)とも称する。また化合物（Ig）を用いたNative電気泳動をClear Native PAGE(又はCN-PAGE)とも称する。【０１８１】
サンプルをウェルにロードし、150Vで1時間、さらに250Vで1時間電圧を印加して、電気泳動を行った。電気泳動後、BN-PAGEの場合は30%(V/V)メタノール-10%(V/V)酢酸水溶液で脱色した。またCN-PAGEの場合はImperial Stain(Pierce)により染色した。【０１８２】
タンパク質試料は、水溶性タンパク質（Soluble protein）として、チログロブリン（Thyroglobulin、分子量669kDa）、フェリチン（Ferritin、分子量440ｋDa）、アルドラーゼ（Aldolase、分子量158kDa）、コンアルブミン（Conalbumin、分子量75kDa）、オボアルブミン（Ovalbumin、分子量43kDa）、カーボニックアンヒドラーゼ（Carbonic Anhydrase、分子量29kDa）、リボヌクレアーゼ A（RNase A、分子量13.7kDa）を用いた。【０１８３】
また、膜タンパク質(Membrane protein)として、一酸化窒素還元酵素（NOR、分子量68.5kDa）、バンド３（Band3、分子量55kDa（110kDa））、アデノシン受容体A2a（A2a、分子量33kDa）を用いた。【０１８４】
結果を図２に示す。【０１８５】
図２に示されるとおり、CN-PAGEは、水溶性タンパク質、膜タンパク質ともにBN-PAGEとほぼ同等のパターンを示した。【０１８６】
このことから、化合物（Ig）はCBB G250と同様にタンパク質に結合し、電気泳動に用いることができることが解った。【０１８７】
また、BN-PAGEでは、カソードバッファーが濃い青色を呈するため、試料をウェルへロードする際に、きちんとロードされているかどうか、ウェルからの漏れがないか等の判断が困難であったのに対し、CN-PAGEでは、カソードバッファーが透明なため、そのようなことがなく、試料のゲルへのアプライが非常に簡単であった。【０１８８】
４．In-Gel蛍光検出
蛍光タンパク質と膜タンパク質の融合タンパク質を形成して、化合物（Ig）を用いたCN-PAGEを行った後、蛍光検出を行った。【０１８９】
蛍光タンパク質としてはEGFPを用いた。EGFPは、出芽酵母を宿主とし、EGFP発現プラスミドを用いて発現させ、Ni-NTA super flow(キアゲン社製)を用いて精製して調製した。【０１９０】
また、融合タンパク質は、アデノシン受容体A2aとEGFPとの融合タンパク質（以下、膜タンパク質−EGFP融合体）を用いた。膜タンパク質−EGFP融合体は、出芽酵母を宿主とし、A2a-EGFP融合体をコードするプラスミドDNAを用いて発現させ、菌体回収後、ガラスビーズにより菌体を破砕し、超遠心により膜画分を回収して調製した。【０１９１】
上記調製したEGFP（75ng）及び膜タンパク質-EGFP融合体（約50ng）を含む出芽酵母の膜画分を1%ドデシルマルトシドで可溶化したものを化合物（Ig）で電気泳動し、電気泳動後のゲルをそのままLAS-1000 plus（富士フィルム(株)社製）を用いて、励起光470nm LED、515nmローパス蛍光フィルター撮影を行った。電気泳動条件は上記３に記載の方法と同一とした。その結果を図３に示す。【０１９２】
図３に示されるように、CBB染色では精製EGFPはうっすらと検出できる程度であるが、蛍光撮影では明瞭に検出することができた。膜タンパク質-GFP融合体についても、CBB染 色では、他の大量に存在する共雑タンパク質に隠れてバンドを同定することができないが、蛍光撮影では分子量及び会合状態をはっきりと検出することができた。通常、タンパク質の発現量やその会合状態を調べるためには、ウエスタンブロッティングや精製、ゲル濾過などによる煩雑な分析操作が必要であるが、本方法を用いることで、非常に簡単に短時間で分析することが可能になることがわかった。【０１９３】
５．In-Gel酵素活性検出
大腸菌由来β-ガラクトシダーゼを用いて、BN-PAGE及びCN-PAGEを行い、ゲル中での酵素活性の検出を行った。【０１９４】
電気泳動は上記３の条件と同一とした。また電気泳動後、ゲルを0.01%ニトロブルーテトラゾリウム, 0.05% X-gal in PBS, pH7.0で20分インキュベートすることで着色させた。【０１９５】
結果を図４に示す。図４左はBN-PAGE後のゲルを示す。図４右はCN-PAGE後のゲルを示す。アプライしたβガラクトシダーゼの量は、両ゲルで同一であり、右のレーンから10μg, 5μg, 2.5μg, 1.25μg, 1μg, 0.5μg, 0.25μg, 0.125μgである。【０１９６】
図４に示されるように、どちらの方法でも酵素活性を維持していることが解る。しかし、BN-PAGEではCBB G250が残るため、着色バンドがはっきりとは目視できないが、CN-PAGEでは明瞭にバンドを見ることができる。【０１９７】
６．銀染色
膜タンパク質及び水溶性タンパク質をタンパク質試料として、CN-PAGEを行い、電気泳動後、銀染色を行った。【０１９８】
膜タンパク質としては、緑膿菌由来の一酸化窒素還元酵素(以下「NOR」、分子量68.5kDa)を用いた。NORは、緑膿菌を培養し、集菌後、超音波破砕により膜画分を回収し、界面活性剤による可溶化後、クロマトグラフィーにより精製して調製した。【０１９９】
水溶性タンパク質としては、牛由来血清アルブミン（BSA、分子量66kDa、 Sigma社製）を用いた。【０２００】
電気泳動条件は、サンプルバッファー中のドデシルマルトシドを0.02%、及び化合物（Ig）を0.05%とし、カソードバッファー中の化合物（Ig）を0.002%としたこと以外は上記３に記載の条件と同一とした。電気泳動後の銀染色は、銀染色IIキットワコー（和光純薬工業社製）を用いた。【０２０１】
結果を図５に示す。図５(A)はNOR試料の結果を示す。図５(B)はBSA試料の結果を示す。横軸のMはマーカーを示す。また、電気泳動に供したタンパク質の量は、マーカーの次のレーンから始まり、左から1000ng, 500ng, 100ng, 50ng, 10ng, 5ng, 1ng, 0.5ng, 0.1ngである。【０２０２】
図5（A)及び（B）に示されるように、どちらにおいても0.5ng程度のタンパク質量まで、バンドの検出が可能であった。これから、CN-PAGEは電気泳動直後の銀染色も可能であり、少ないタンパク質試料でも分析を行うことができることがわかった。【０２０３】
更に、図5（B）においては、BSA単量体（BSA monomer)のバンドだけでなく、BSA分子間の相互作用に起因するいくつかの会合状態からなるバンドも検出された。【０２０４】
以上の結果より、化合物（Ｉ）を用いたClear Native電気泳動法は、従来のBlue Native電気泳動法より、取り扱いの簡便さ及び検出感度に優れていることがわかった。また、蛍光物質や銀染色を用いた高感度検出が可能であるため、微量なタンパク質 試料においてもタンパク質の大きさや発現量等を明瞭に検出することができ、更にタンパク質間相互作用等の解析も可能であることがわかった。
【図１】
2010064638.tif 000027
【図２】
2010064638.tif 000028
【図３】
2010064638.tif 000029
【図４】
2010064638.tif 000030
【図５】
2010064638.tif 000031
【国際調査報告】
2010064638.tif 000032
2010064638.tif 000033