(57)【要約】  新規の抗アルツハイマー病剤を提供することを課題とし、下記一般式１で表される化合物を有効成分とする抗アルツハイマー病剤を提供することにより解決する。【化１】2010087315.tif 000063  一般式１におけるＲ１乃至Ｒ３は、それぞれ独立に、水素原子又は適宜の置換基を表し、Ｚ１は複素環を、また、Ｚ２はＺ１と同じか異なる複素環又は芳香環を表し、それらの複素環及び芳香環は置換基を有していてもよい。ｏは０又は１、２のいずれかである整数を表し、ｐは、０又は１のいずれかである整数を表し、ｏが０又は２のとき、ｐは１であり、ｏが１のとき、ｐは０である。ｏが０の場合、Ｒ１、Ｒ２は存在せず、ｐが０の場合、Ｒ３は存在せず、Ｒ２が結合する炭素とＺ２とは一重結合となる。Ｘｌ−は適宜の対アニオンを表し、ｑは１又は２のいずれかである整数を表す。
2010087315.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式１で表される化合物を有効成分として含有する抗アルツハイマー病剤。
【化１】
2010087315.tif 000056
（一般式１におけるＲ１乃至Ｒ３は、それぞれ独立に、水素原子又は適宜の置換基を表し、Ｚ１は複素環を、また、Ｚ２はＺ１と同じか異なる複素環又は芳香環を表し、それらの複素環及び芳香環は置換基を有していてもよい。ｏは０又は１、２のいずれかである整数を表し、ｐは、０又は１のいずれかである整数を表し、ｏが０又は２のとき、ｐは１であり、ｏが１のとき、ｐは０である。ｏが０の場合、Ｒ１、Ｒ２は存在せず、ｐが０の場合、Ｒ３は存在せず、Ｒ２が結合する炭素とＺ２とは一重結合となる。Ｘｌ−は適宜の対アニオンを表し、ｑは１又は２のいずれかである整数を表す。）
【請求項２】
一般式１で表される化合物が、一般式２乃至５のいずれかで表される化合物である請求の範囲第１項記載の抗アルツハイマー病剤。
【化２】
2010087315.tif 000057
（一般式２において、Ｒ４乃至Ｒ６は互いに同じか異なる脂肪族炭化水素基を表す。Ｘ２−は適宜の対アニオンを表す。）
【化３】
2010087315.tif 000058
（一般式３において、Ｒ７乃至Ｒ９は互いに同じか異なる脂肪族炭化水素基を表す。Ｘ３−は適宜の対アニオンを表す。）
【化４】
2010087315.tif 000059
（一般式４において、Ｒ１０乃至Ｒ１２は互いに同じか異なる脂肪族炭化水素基を表す。Ｘ４−は適宜の対アニオンを表す。）
【化５】
2010087315.tif 000060
（一般式５において、Ｚ３は複素芳香環を表し、その複素芳香環は置換基を有していてもよい。Ｚ４は芳香環又は複素芳香環を表し、それらの複素芳香環及び芳香環は置換基を有していてもよい。Ｒ１３は脂肪族炭化水素基を表し、その脂肪族炭化水素基は置換基を有していてもよい。Ｒ１４は水素原子又は適宜の置換基を、また、Ｘ５−は適宜の対アニオンを表す。）
【請求項３】
一般式１乃至５のいずれかで表される化合物の対アニオンが、沃素イオン又は塩素イオンである請求の範囲第１項又は第２項記載の抗アルツハイマー病剤。
【請求項４】
一般式２で表される化合物が化学式２で表される化合物であり、一般式３で表される化合物が化学式３で表される化合物である請求の範囲第２項記載の抗アルツハイマー病剤。
【化６】
2010087315.tif 000061
【化７】
2010087315.tif 000062
【請求項５】
製剤学的に許容される１種又は２種以上の成分を含んでなる請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の抗アルツハイマー病剤。
【請求項６】
製剤学的に許容される成分が、水性媒体である請求の範囲第５項記載の抗アルツハイマー病剤。
【請求項７】
神経が小脳プルキンエ細胞である請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記載の抗アルツハイマー病剤。
【請求項８】
神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、脊髄小脳変性症、脳梗塞又は運動失調症である請求の範囲第１項乃至第７項のいずれかに記載の抗アルツハイマー病剤。
【請求項９】
抗アルツハイマー病剤が、神経細胞変性抑制剤、神経突起伸展促進剤、神経細胞保護剤、又は、神経細胞変性に伴う運動失調症改善剤である請求の範囲第１項乃至第８項のいずれかに記載の抗アルツハイマー病剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下記一般式１で表される化合物を有効成分とする抗アルツハイマー病剤に関するものである。【０００２】
【化１】
2010087315.tif 000003
【０００３】
一般式１におけるＲ１乃至Ｒ３は、それぞれ独立に、水素原子又は適宜の置換基を表し、Ｚ１は複素環を、また、Ｚ２はＺ１と同じか異なる複素環又は芳香環を表し、それらの複素環及び芳香環は置換基を有していてもよい。ｏは０又は１、２のいずれかである整数を表し、ｐは、０又は１のいずれかである整数を表し、ｏが０又は２のとき、ｐは１であり、ｏが１のとき、ｐは０である。ｏが０の場合、Ｒ１、Ｒ２は存在せず、ｐが０の場合、Ｒ３は存在せず、Ｒ２が結合する炭素とＺ２とは一重結合となる。Ｘｌ−は適宜の対アニオンを表し、ｑは１又は２のいずれかである整数を表す。
【背景技術】
【０００４】
アルツハイマー病は、アミロイドβペプチドなどにより引き起こされる系統的な神経細胞の変性、脱落に基づく神経回路網の破綻により引き起こされる病態であり、近年、急増する認知症の主因の一つとされている。【０００５】
アルツハイマー病をはじめとする神経変性疾患の原因である神経変性死のメカニズムには多くの分子群が複雑に関与し、それらの発現、機能異常が生じているものと予想される。しかしながら、その分子病態については解明されたものはほとんどなく、有効な神経変性の抑制方法も確立されていない。病因を取り除く治療に加えて重要なのが、神経回路網を再構築させることである。アルツハイマー病では、神経突起（軸索及び樹状突起）の萎縮とシナプスの減少が、神経機能が損なわれる引き金であり、逆に、その引き金が引かれた後でも、変性しきっていない神経細胞や変性を免れて生き残っている神経細胞を活性化して、神経突起を伸展させ、シナプスを回復できれば、神経機能を回復できるといわれている。しかしながら、損傷をうけた末梢神経系の軸索は再生するものの、中枢神経系では軸索は末梢神経を移植するなどの処置をしないと、再生は起こらないといわれている。【０００６】
神経成長因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、以下、「ＮＧＦ」と略記する場合がある。）などの神経栄養因子群に属する蛋白は、神経細胞の分化や生存、シナプスの制御等に関与することが知られているものの、高分子ゆえに血液脳関門を通過し難いなどの点からも、皮下や血管内などの全身投与では、中枢神経の変性に起因する神経変性疾患に対する治療効果があまり期待できない。効果を期待して脳内へ投与するためには、外科的処置が必要となり、患者には、大きな肉体的・精神的負担が伴う。【０００７】
アルツハイマー病の臨床症状とは、軽微なものから重篤なものまで様々であり、代表的なものとしては、認知症があり、症状が進行すれば、他の神経変性症と同様に、例えば、振戦、固縮、無動、寡動、動作緩慢、姿勢反射障害、自律神経障害、突進現象、歩行障害、うつ、記憶障害、筋萎縮、筋力低下、上肢機能障害、構音障害、嚥下障害、呼吸障害、しびれ又は麻痺等が現れることもあり、これらはいずれも日常生活を営む上で、大きな障害となっている。【０００８】
アルツハイマー病は、神経細胞に変性を来たす重大な疾患であり、これらの疾患やそれに伴う病態や神経機能障害を改善するために、種々の化合物を有効成分とする治療剤が提案されており（例えば、国際公開ＷＯ９７／０３０７０３号パンフレット、特開平１１−２２８４１７号公報、特開２００６−１４３７０８号公報、特開２００６−３２１７３７号公報を参照）、神経突起伸展促進剤なども提案されている（例えば特開２００２−２３４８４１号公報を参照）ものの、効果的な疾患の治療法はまだ見出されていない。【０００９】
医療現場では、患者にとって肉体的・精神的負担の少ない、皮下や血管内などの全身投与により、中枢神経系の神経細胞に作用し、神経細胞を活性化し、神経突起の萎縮を抑制、乃至、神経突起の伸展を促進させて神経変性を抑制し、それに伴う病態や臨床症状を治療することができる新規抗アルツハイマー病剤の開発が切望されている。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、新規な抗アルツハイマー病剤を提供することを課題とする。
【００１１】
本発明者等は、上記課題を解決するために、鋭意研究して検索した結果、下記一般式１で表される化合物が優れた神経細胞活性化作用を有し、神経突起伸展促進作用を有することを見出した。さらに、これらの化合物が、アミロイドβペプチドによる神経細胞死の抑制作用を有し、全身投与でも中枢神経系の神経細胞を活性化して、神経変性を抑制すると共に、アミロイドβペプチドによる細胞傷害に起因する症状や病態の発症を遅延乃至改善することを見出して、本発明を完成した。すなわち、本発明は、一般式１で表される分子内にカチオン部とアニオン部とをもつ化合物を有効成分とする抗アルツハイマー病剤を主な構成とする。
【００１２】
【化２】
2010087315.tif 000004
【００１３】
一般式１におけるＲ１乃至Ｒ３は、それぞれ独立に、水素原子又は適宜の置換基を表し、Ｚ１は複素環を、また、Ｚ２はＺ１と同じか異なる複素環又は芳香環を表し、それらの複素環及び芳香環は置換基を有していてもよい。ｏは０又は１、２のいずれかである整数を表し、ｐは、０又は１のいずれかである整数を表し、ｏが０又は２のとき、ｐは１であり、ｏが１のとき、ｐは０である。ｏが０の場合、Ｒ１、Ｒ２は存在せず、ｐが０の場合、Ｒ３は存在せず、Ｒ２が結合する炭素とＺ２とは一重結合となる。Ｘｌ−は適宜の対アニオンを表し、ｑは１又は２のいずれかである整数を表す。
【００１４】
本発明の抗アルツハイマー病剤は、非経口的に投与することにより、アミロイドβペプチドをはじめとする細胞傷害因子から細胞を保護し、神経細胞の活性化や神経突起の伸展を促進することで、これらの傷害因子により引き起こされる神経変性を抑制して、アルツハイマー病やそれに伴う認知症をはじめとする種々の病態や症状（例えば、振戦、固縮、無動、寡動、動作緩慢、姿勢反射障害、自律神経障害、突進現象、歩行障害、うつ、記憶障害、筋萎縮、筋力低下、上・下肢機能障害、構音障害、嚥下障害、呼吸障害、しびれ及び麻痺等を含む）を改善することができる。しかも、有効成分である一般式１で表される化合物の安全性は極めて高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明でいう神経突起とは、神経の細胞体から伸びる軸索及び樹状突起をいう。また、神経突起伸展促進作用とは、神経細胞を活性化して軸索及び／又は樹状突起を伸展させる作用をいい、神経突起の萎縮や減少の抑制作用、神経細胞間のシナプス形成の促進作用やシナプスの減少を抑制する作用を含む。【００１６】
本発明でいう神経変性とは、神経細胞、とりわけ、中枢神経系の神経細胞の機能低下、死滅、や減少（脱落）をいい、神経突起の萎縮や減少、シナプスの減少、グリア細胞の機能低下、死滅や減少を含む。【００１７】
本発明の抗アルツハイマー病剤は、上記一般式１で表される化合物を有効成分とする。【００１８】
【化３】
2010087315.tif 000005
【００１９】
一般式１におけるＲ１乃至Ｒ３は、それぞれ独立に、水素原子又は適宜の置換基を表し、Ｚ１は複素環を、また、Ｚ２はＺ１と同じか異なる複素環又は芳香環を表し、それらの複素環及び芳香環は置換基を有していてもよい。ｏは０又は１、２のいずれかである整数を表し、ｐは、０又は１のいずれかである整数を表し、ｏが０又は２のとき、ｐは１であり、ｏが１のとき、ｐは０である。ｏが０の場合、Ｒ１、Ｒ２は存在せず、ｐが０の場合、Ｒ３は存在せず、Ｒ２が結合する炭素とＺ２とは一重結合となる。Ｘｌ−は適宜の対アニオンを表し、ｑは１又は２のいずれかである整数を表す。【００２０】
一般式１におけるＸｌ−は適宜の対アニオンを表し、通常、例えば、弗素イオン、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン、過塩素酸イオン、過沃素酸イオン、六弗化燐酸イオン、六弗化アンチモン酸イオン、六弗化錫酸イオン、燐酸イオン、硼弗化水素イオン、四弗硼素酸イオンなどの無機酸アニオンや、チオシアン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、ナフタレンスルホン酸イオン、ナフタレンジスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、アルキルスルホン酸イオン、ベンゼンカルボン酸イオン、アルキルカルボン酸イオン、トリハロアルキルカルボン酸イオン、アルキル硫酸イオン、トリハロアルキル硫酸イオン、ニコチン酸イオン、アスパラギン酸イオンなどの有機酸アニオンから選択される。【００２１】
一般式１で表される化合物としては、具体的には、一般式２乃至４のいずれかで表されるペンタメチン系シアニン色素及び一般式５で表されるジメチン系スチリル色素などの色素化合物（以下、単に「化合物」という場合がある。）を例示することができる。【００２２】
【化４】
2010087315.tif 000006
一般式２において、Ｒ４乃至Ｒ６は互いに同じか異なる脂肪族炭化水素基を表す。Ｘ２−は適宜の対アニオンを表し、ｍはカチオン部の電荷とバランスする電荷となる１又は２のいずれかである整数を表す。【００２３】
【化５】
2010087315.tif 000007
一般式３において、Ｒ７乃至Ｒ９は互いに同じか異なる脂肪族炭化水素基を表す。Ｘ３−は適宜の対アニオンを表し、ｍはカチオン部の電荷とバランスする電荷となる１又は２のいずれかである整数を表す。【００２４】
【化６】
2010087315.tif 000008
一般式４において、Ｒ１０乃至Ｒ１２は互いに同じか異なる脂肪族炭化水素基を表す。Ｘ４−は適宜の対アニオンを表し、ｍはカチオン部の電荷とバランスする電荷となる１又は２のいずれかである整数を表す。【００２５】
【化７】
2010087315.tif 000009
一般式５において、Ｚ３は複素芳香環を表し、その複素芳香環は置換基を有していてもよい。Ｚ４は芳香環又は複素芳香環を表し、それらの複素芳香環及び芳香環は置換基を有していてもよい。Ｒ１３は脂肪族炭化水素基を表し、その脂肪族炭化水素基は置換基を有していてもよい。Ｒ１４は水素原子又は適宜の置換基を、また、Ｘ５−は適宜の対アニオンを表す。【００２６】
一般式２乃至５におけるＲ４乃至Ｒ１３で表される脂肪族炭化水素基としては、通常、炭素数が１乃至１２であるものが選択され、２乃至１０のものが好ましく、２乃至９のものがより好ましい。なかでも、一般式２で表される化合物のＲ４乃至Ｒ６の脂肪族炭化水素の基の炭素数が２乃至１２、又は、一般式３で表される化合物のＲ７乃至Ｒ９の脂肪族炭化水素の基の炭素数が４乃至１０の化合物は、神経変性抑制作用が強いので、特に望ましい。個々の脂肪族炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、１−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、５−メチルヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基などが挙げられる。また、一般式２乃至５においてＸ２−乃至Ｘ５−で表される適宜の対アニオンは、通常、例えば、弗素イオン、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン、過塩素酸イオン、過沃素酸イオン、六弗化燐酸イオン、六弗化アンチモン酸イオン、六弗化錫酸イオン、燐酸イオン、硼弗化水素イオン、四弗硼素酸イオンなどの無機酸アニオンや、チアシアン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、ナフタレンスルホン酸イオン、ナフタレンジスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、アルキルスルホン酸イオン、ベンゼンカルボン酸イオン、アルキルカルボン酸イオン、トリハロアルキルカルボン酸イオン、アルキル硫酸イオン、トリハロアルキル硫酸イオン、ニコチン酸イオン、アスパラギン酸イオンなどの有機酸アニオンから選択される。【００２７】
一般式２で表される化合物としては、より具体的には、化学式１で表される化合物（以下、「ＮＫ−９６９４」という場合がある。）、化学式２で表される化合物（以下、「ＮＫ−４」という場合がある。）や一般式２の側鎖のアルキル基（Ｒ４乃至Ｒ６）の炭素数が３の化合物（以下、「ＮＫ−２３４」という場合がある。）を例示することができる。なお、本明細書中のＮＫ番号に対応する化合物の構造は、例えば、『感光色素表』、感光色素研究所発行（１９６９年）にも記載されている。【００２８】
【化８】
2010087315.tif 000010
【００２９】
【化９】
2010087315.tif 000011
【００３０】
一般式３で表される化合物としては、具体的には、例えば、化学式３で表される化合物（以下、「ＮＫ−１５０」という場合がある。）や化学式４で表される化合物（以下、「ＮＫ−１９」という場合がある。）を例示することができる。さらには、ＮＫ−１９の対アニオン（Ｉ−）をＣｌ−に替えた化学式５で表される化合物（以下、「ＮＫ−５３」という場合がある。）も、ＮＫ−１９と同様に有利に利用できる。【００３１】
【化１０】
2010087315.tif 000012
【００３２】
【化１１】
2010087315.tif 000013
【００３３】
【化１２】
2010087315.tif 000014
【００３４】
一般式４で表される化合物としては、具体的には、例えば、化学式６で表される化合物（以下、「ＮＫ−１００」という場合がある。）を例示することができる。【００３５】
【化１３】
2010087315.tif 000015
【００３６】
一般式５で表される化合物としては、化学式７乃至９で表される化合物（以下、それぞれ、「ＮＫ−５２８」、「ＮＫ−５５７」、「ＮＫ−１５１６」という場合がある。）を例示することができる。
【化１４】
2010087315.tif 000016
【００３７】
【化１５】
2010087315.tif 000017
【００３８】
【化１６】
2010087315.tif 000018
【００３９】
化学式１乃至９のいずれかで表される化合物やＮＫ−２３４は、いずれも、神経細胞活性化作用、神経突起伸展促進作用に加えて、飢餓、ラジカル、アミロイドβペプチドなどの細胞傷害因子から神経細胞を保護して細胞死や神経突起の萎縮を抑制する作用も有しているので、本発明の抗神経変性疾患剤の有効成分としてより望ましく、その作用効果の強さの点からは、ＮＫ−２６（化学式１で表される化合物）、ＮＫ−４（化学式２で表される化合物）、ＮＫ−２３４（一般式２の側鎖のアルキル基の炭素数が３の化合物）、ＮＫ−１５０（化学式３で表される化合物）が特に望ましい。アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）活性抑制作用の強さ、脳内への移行性、製剤化の容易性などを加味すると、ＮＫ−４やＮＫ−２３４が望ましく、ＮＫ−４が特に望ましい。【００４０】
本発明の抗アルツハイマー病剤の有効成分として使用する一般式１で表される化合物は、その由来や製法に制限はない。【００４１】
本発明の抗アルツハイマー病剤は、一般式１で表される化合物、望ましくは、一般式２乃至４のいずれかで表されるペンタメチン系シアニン色素及び／又は一般式５で表されるジメチン系スチリル色素を、１種又は２種以上含有してなる。【００４２】
本発明の抗アルツハイマー病剤は、必要に応じて、有効成分である一般式１で表される化合物に加えて、製剤学的に許容される食品分野、化粧品分野、医薬品分野、医薬部外品分野で使用される成分の１種又は２種以上を配合した製剤の形態で提供される。【００４３】
製剤学的に許容される成分としては、例えば、添加剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、安定化剤、界面活性剤、防腐剤（抗菌剤）、香料、増粘剤、抗酸化剤、キレート剤、ビタミン類、アミノ酸類、水性媒体、糖質、水溶性高分子、ｐＨ調整剤、発泡剤、医薬品・医薬部外品・化粧品・食品用の添加剤、医薬用・医薬部外品用の有効成分など例示することができ、これらの成分の１種又は２種以上を適宜組み合わせて配合し、目的とする剤型に応じて、常法により製造すればよい。【００４４】
また、本発明の抗アルツハイマー病剤は、一般式１で表される化合物以外の、アルツハイマー病、その病態や臨床症状に治療効果があるとされる神経突起伸展促進剤や、神経変性疾患やそれに起因する病態や神経機能障害の治療剤との併用も有利に実施できる。脳血管障害の治療薬、神経変性疾患の治療薬、筋萎縮性側索硬化症の治療薬、多発性硬化症の治療薬、ドーパミン受容体作動薬、ドーパミン遊離促進薬、ドーパミン取り込み阻害薬、ドーパミン作用薬、中枢性抗コリン薬、芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素阻害薬（ＤＣＩ）、モノアミン酸化酵素（ＭＡＯ−Ｂ）阻害薬、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害薬、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）補充薬、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬、神経栄養因子及びその他の脳機能賦活薬が挙げられる。中でも、ＮＧＦは、本発明で使用する一般式１で表される化合物の、神経突起伸展促進作用が効果的に増強されるので望ましい。【００４５】
本発明の抗アルツハイマー病剤は、通常、非経口用の注射用の製剤などの形態で提供される。また、非有効成分である一般式１で表される化合物は、対象とする注射用の製剤などの非経口用製剤の組成やその使用目的を勘案して、原料の段階から製品が完成するまでの工程で配合すればよい。その方法としては、例えば、混和、混捏、溶解、融解、分散、懸濁、乳化、逆ミセル化、浸透、晶出、散布、塗布、付着、噴霧、被覆（コーティング）、注入、浸漬、固化、担持などの公知の１種又は２種以上の方法が適宜に選ばれる。【００４６】
注射用製剤などの非経口用の製剤の場合、対象となる疾患や症状などに応じて、通常、パイロジェンを含まない水性媒体に溶解して、皮内、皮下、筋肉内、体腔内（胸腔内、腹腔内など）、血管内又は脳内（脊髄内を含む）へ投与されるので、製剤の形態としては、乾燥製剤であってもよく、液剤であってもよい。乾燥製剤の場合は、使用時に、注射用の精製水、生理食塩水、ブドウ糖液などの水性媒体に溶解して使用すればよい。液剤の場合は、そのまま投与してもよく、輸液や灌流液などに添加して使用してもよい。また、溶媒への溶解性や水性媒体への溶解性に問題のある場合や、徐放性の製剤を調製する場合には、両親媒性溶媒、油性基材や乳化剤等を使用して、有効成分の溶媒への溶解性を高めることも随意である。【００４７】
本発明でいう水性媒体とは、水を必須の要素とし、必要に応じて、これに、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノールなどのアルコール類、アセトンなどのケトン類、ジエチルエーテルなどのエーテル類、ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」と略記する場合がある。）などの含硫化合物をはじめとする親水性有機溶剤の１又は複数を配合してなる水性媒体一般を意味する。この発明による液剤における水性溶剤としては、注射用精製水、生理食塩、リンゲル液等、を単独で用いるか、あるいは、注射用精製水と、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ジエチルエーテル、ＤＭＳＯなどの生理学的に許容される親水性有機溶剤との混液を用いるのが望ましい。【００４８】
斯かる液剤の場合、一般式１で表される化合物によっては、溶存酸素などにより不安定になる場合があるので、その場合は、例えば、該化合物溶液の溶存酸素濃度を低減させればよい。このような液状組成物は、通常、該化合物を水性媒体に溶解する工程と、該水性媒体をしてその常温常圧の大気環境下における酸素濃度を下回らせる工程とを経由する方法により調製することができる。これらの化合物を水性媒体に溶解するには、例えば、所定の量の化合物を適量の水性媒体へ添加し、必要に応じて、加熱・攪拌しながら溶解させた後、必要に応じて、化合物の濃度が所定のレベルになるまで水性媒体を追加すればよい。【００４９】
水性媒体の溶存酸素濃度を、常温常圧の大気環境下における濃度より低くするには、例えば、一般式１で表される化合物の溶液を減圧下で調製し、保存するか、該化合物溶液に溶存する酸素を別の気体で置換するか、あるいは、該化合物溶液を脱酸素剤へ接触させる方法が好適である。液状組成物に溶解する酸素を別の気体で置換するには、液状組成物中で、例えば、窒素などの比較的不活性な気体か、あるいは、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノンなどの希ガスをバブリングさせればよい。脱酸素剤を用いて酸素濃度を下げるには、液状組成物へ、例えば、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ステアリン酸エステル、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、アルファチオグリセリン、エデト酸ナトリウム、塩酸システイン、クエン酸、大豆レシチン、チオグリコール酸ナトウム、チオリンゴ酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ブチルヒドロキシアニソールなどを適量添加すればよい。これらの方法は、化合物溶液に適用しても、化合物を溶解する前の水性媒体へ適用してもよい。この場合の水性媒体に溶存する酸素の濃度は、通常、０．４ｐｐｍ以下、望ましくは、０．１ｐｐｍ以下とすればよい。【００５０】
斯くして得られた一般式１で表される化合物の溶液は、酸素を遮断し得る、用途に応じた適宜の容器へ封入した状態で保存すればよい。容器の材質としては、原理上、液状組成物を保持することができ、かつ、酸素を実質的に遮断し得るものであるかぎり、特に制限がないが、褐色ビンや褐色のアンプルのような遮光性の容器が望ましい。用途にもよるけれども、通常、ガラスアンプル、バイアル瓶などの容器へ液状組成物を分注し、封止した後、高圧滅菌などにより滅菌する。【００５１】
また、本発明の抗アルツハイマー病剤は、注射剤以外にも、ハップ剤や経肺用の吸飲噴霧剤等の形態で使用することもでき、皮下等の体内に埋め込む徐放製剤の形態で使用することもできる。また、神経変性疾患を発症したペットをはじめとするヒト以外の動物の治療や、神経変性症に伴う病態や神経機能障害の予防剤乃至治療剤として使用することも随意である。【００５２】
このようにして製造される本発明の抗アルツハイマー病剤は、長期間連用しても、重篤な副作用もなく安全な製剤である。【００５３】
本発明の抗アルツハイマー病剤の、一日当たりの投与量は、所期の作用・効果が得られる量であれば特に制限はなく、通常、皮下乃至腹腔内投与の場合、一般式１で表される化合物を合計で、０．０１ｍｇ／ｋｇ・体重／日以上が望ましく、０．１乃至２０ｍｇ／ｋｇ・体重／日がより望ましく、０．５乃至５ｍｇ／ｋｇ・体重／日が特に望ましい。５０ｍｇ／ｋｇ・体重／日以上投与しても、その投与量に見合うほどの効果の増強は認められない場合がある。【００５４】
本発明の抗アルツハイマー病剤は、脳や神経細胞をアミロイドβペプチドなどの細胞傷害因子から保護して変性を抑制すると共に、神経細胞を活性化し、神経突起の伸展促進や萎縮の抑制、神経細胞の生存延長や変性を抑制し、アルツハイマー病に伴う神経機能障害を治療乃至予防することができる。なお、本発明でいうアルツハイマー病の治療とは、アルツハイマー病に伴う病態や機能障害を治癒の方向へ導く、いわゆる治療に加え、悪化を抑制し病態の進行をとどめる進展防止、さらには疾患の発症そのものの予防も含む。【００５５】
以下、実験により本発明をさらに詳細に説明する。【００５６】
＜実験１：神経細胞に対する傷害に及ぼすペンタメチン系シアニン色素の影響＞
神経細胞は、栄養飢餓や活性酸素による傷害に対して非常に脆弱なことが知られている。この神経細胞の特性は、アルツハイマー病をはじめとする神経変性疾患で認められる神経細胞死の原因と考えられている。そこで、細胞傷害因子の神経細胞に対する傷害性に及ぼすペンタメチン系シアニン色素の影響を調べる試験を以下のように実施した。【００５７】
＜試験標品＞
試験には、化学式２で表される化合物（株式会社林原生物化学研究所製造、「ＮＫ−４」）を試験標品として使用した。ＮＫ−４は水に難溶性のため、ＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ社販売、商品番号「Ｄ８４１８」）に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した後、膜濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社販売、商品名「Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＧ  ＳＬＬＧ０２５ＳＳ」、ＤＭＳＯ耐性膜使用）し、ダルベッコのＭＥＭ培地（日水製薬株式会社販売、以下、「Ｄ−ＭＥＭ培地」と略記する。）でさらに希釈して、試験に供した。なお、ＤＭＳＯに溶解した試験標品を、Ｄ−ＭＥＭ培地で、試験に使用する濃度に希釈した場合、それに含まれる濃度のＤＭＳＯは、以下の各試験系に影響しないことを予め確認した。【００５８】
＜細胞傷害抑制作用の測定方法＞
＜栄養飢餓による細胞傷害に及ぼすＮＫ−４の影響＞
ヒトの神経細胞変性研究用のモデルとし好適な、ラット副腎褐色細胞腫由来のＰＣ−１２細胞のＮＧＦ（神経増殖因子）高感受性株（以下、「ＰＣ−１２ＨＳ細胞」という。ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手）を使用した。栄養飢餓環境として血清除去培地による培養をおこなった。ＰＣ−１２ＨＳ細胞は、凍結保存した細胞を解凍して、１０容積％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）加Ｄ−ＭＥＭ培地を用いて培養して試験に供した。試験に用いる細胞は、常法により、０．２５質量％トリプシン溶液を用いて剥離し、１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈して、コラーゲンコートした９６ウエルプレート（ファルコン社販売、商品名「マイクロテストプレート・細胞培養用、平底」）に、５´１０３個／１００μｌ／ウエルになるように播種した。２４時間後に、培養上清を除去後、ＦＢＳを含まないＤ−ＭＥＭ培地で希釈し、表１に示す終濃度の２倍に調整したＮＫ−４のいずれかを１００μｌ／ウエル添加し、３日間培養した。３日目に培養上清を除去し、１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地で、１０質量／容積％に希釈したＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ（Ｔｒｅｋ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社販売）溶液を、２００μｌ／ウエル添加し、６時間培養し、蛍光プレートリーダー（日本モレキュラーディバイス株式会社販売、商品名「ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＨＹ」）で５４４−５９０ｎｍの蛍光強度を測定した。対照として、１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地（ＮＫ−４無添加）のみで細胞を培養し、同様に、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ（Ｔｒｅｋ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社販売）溶液を加えて培養後、各ウエルの蛍光強度を測定した。対照の蛍光強度を１００％とした時の相対値を求め、各ウエルの細胞の生存率（％）として表１に併せて示す。なお、本試験及び以下の試験では、ＰＣ−１２ＨＳ細胞は、３７℃、５容積％ＣＯ２の条件下で、インキュベーター内で培養した。【００５９】
＜過酸化水素による細胞傷害に及ぼすＮＫ−４の影響＞
上記と同様に培養したＰＣ１２−ＨＳ細胞を、１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈して、コラーゲンコートした９６ウエルプレートに、２´１０４個／１００μｌ／ウエルで播種して２４時間培養した。その後、８００μＭ過酸化水素水（和光純薬工業株式会社販売）を５０μｌ／ウエル（終濃度２００μＭ）と、表１に示す終濃度の４倍の濃度に１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈したＮＫ−４とを、各々５０μｌ／ウエル（ＮＫ−４の終濃度５ｎｇ乃至５０μｇ／ｍｌ）を同時に添加して、インキュベーター内で２時間培養後、２５容積％グルタルアルデヒド（和光純薬工業株式会社販売）を２０μｌ／ウエル（終濃度２０容積％）添加して細胞を固定した。０．０５質量％メチレンブルー（Ｗａｋｏ社販売）を１００μｌ／ウエル加えて、ダイアップテイク法で、常法により、各ウエルの吸光度を測定した。対照として過酸化水素及びＮＫ−４を添加しなかった以外は同様に培養を行い、メチレンブルーを加えて吸光度を測定した。対照の細胞数（吸光度）を１００（％）とした時の相対値を求めて各ウエルの細胞の生存率（％）として表１に併せて示す。【００６０】
＜アミロイドβフラグメントによる細胞傷害に及ぼすＮＫ−４の影響＞
アルツハイマー病における神経細胞死の主要原因の一つと考えられているアミロイドβペプチド（ヒト由来）のアミノ末端から２３乃至３５番目に相当するアミノ酸配列を有するペプチドフラグメント（ＡｎａＳｐｅｃ社販売、以下、「アミロイドβフラグメント」という。）（配列表における配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈して２ｍＭの濃度に調整し、使用前に６時間、３７℃でエイジングさせ、フラグメントを凝集させて、細胞毒性を上昇させたものを使用した。上記と同様に培養したＰＣ１２−ＨＳ細胞を、１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈して、コラーゲンコートした９６ウエルプレートに、５´１０３個／１００μｌ／ウエルになるように播種し、２４時間培養後に上清を除去して、１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈したアミロイドβフラグメント溶液を５０μｌ／ウエル（アミロイドβフラグメントの終濃度５０μＭ）と、ＮＫ−４溶液を５０μｌ／ウエル（終濃度４０乃至５０００ｎｇ／ｍｌ）添加して３日間培養した。３日目に培養上清を除去し、１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地で、１０質量％濃度に希釈したＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ（Ｔｒｅｋ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社販売）溶液を、２００μｌ／ウエル添加し、６時間培養し、蛍光プレートリーダーで５４４−５９０ｎｍの蛍光強度を測定した。対照として、１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地のみで細胞を培養（アミロイドβフラグメント及びＮＫ−４の両方とも無添加）し、同様にＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ溶液を加えて、蛍光強度を測定した。対照の蛍光強度を１００％する相対値を求めて、各ウエルの細胞の生存率（％）として表１に併せて示す。また、別途、前記と同じ条件で培養した細胞の培養上清を除去後、ＰＢＳで希釈した１容積％グルタルアルデヒドを１００μｌ／ウエル添加して３０分間固定した後、１ｍＭヘキスト３３２５８色素（Ｓｉｇｍａ社販売）で５分間染色した後、位相差顕微鏡下及び蛍光顕微鏡下で、一視野に約１００個の細胞を含む倍率で細胞を観察し、細胞をカウントして、同一視野内の全細胞中に占めるアポトーシスを起こしている細胞の占有率（％）を計算した結果を、表１に併せて示す。なお、アポトーシスを起こしている細胞の判定は、細胞の核の断片化乃至核内のクロマチンの凝集を指標とした。【００６１】
【表１】
2010087315.tif 000019
【００６２】
表１から明らかなように、ＮＫ−４は、ＰＣ１２−ＨＳ細胞に対する栄養飢餓、過酸化水素傷害、アミロイドβフラグメントによる傷害のいずれに対しても、各々の細胞傷害因子に対する有効濃度に差はあるものの、神経細胞に対する保護作用を有することが明らかとなった。表１に示す３種類の細胞傷害因子に対する保護作用が発揮されるＮＫ−４の濃度を比較すると、アミロイドβフラグメントの傷害に対する保護作用は４０ｎｇ／ｍｌから発揮されているのに対して、栄養飢餓傷害では５００ｎｇ／ｍｌ、過酸化水素傷害では５，０００ｎｇ／ｍｌの濃度が各々必要であることが判明した。傷害の発生する速度を見ると、過酸化水素が最も早く、アポトーシス誘導を伴うアミロイドβフラグメントが最も遅いと考えられるので、これらの細胞傷害因子に対するＮＫ−４による細胞保護作用は、傷害の発生する速度が速い程、高い濃度を必要とすることを物語っている。なお、具体的なデータは示さないが、濃度が５０，０００ｎｇ／ｍｌ以下のＮＫ−４水溶液は過酸化水素に対する消去能は有していないので、ＮＫ−４はペルオキシラジカルやヒドロキシラジカルなどのフリーラジカルの消去能も有しているものの、この試験系における過酸化水素による細胞傷害に対する細胞保護作用は、直接過酸化水素を消去する作用によるものではなく、細胞側に作用して、細胞死を抑制していると判断した。また、ヘキスト染色像より算出したアポトーシスを起こした細胞の占有率は、アミロイドβフラグメントを添加した場合（ＮＫ−４濃度０ｎｇ／ｍｌ）７２％となってアポトーシスが促進されたのに対して、ＮＫ−４（２００ｎｇ／ｍｌ）を添加した場合の占有率は１３％となって、対照のアポトーシスを起こした細胞の占有率（５％）にほぼ近い値となり、ＮＫ−４が、アミロイドβフラグメントにより誘導されるアポトーシスを抑制することが確認された。また、具体的なデータは示さないが、位相差顕微鏡観察でもアミロイドβフラグメントの添加により、細胞の凝集及び細胞死が認められたのに対して、ＮＫ−４の添加により細胞の凝集や細胞死が抑制されていることが確認された。さらに、ヘキスト染色像でも、アミロイドβフラグメントの添加により認められるアポトーシスによるクロマチンの凝集及び核の断片化が、ＮＫ−４を添加することにより、抑制されることが確認された。以上の結果は、ＮＫ−４は、アミロイドβフラグメントを初めとする神経細胞傷害因子に対する神経細胞保護作用があることからアミロイドβペプチドをはじめとする細胞傷害因子により引き起こされるアルツハイマー病治療剤として利用できることを物語っている。【００６３】
＜実験２：ＮＫ−４以外の色素化合物の細胞傷害性因子に対する保護作用＞
実験１において、ＮＫ−４に、アミロイドβフラグメントなどの細胞傷害性因子に対する保護作用が確認されたので、ＮＫ−４以外の色素化合物（以下、単に「化合物」という場合がある。）についても、同様の作用があるかどうかを検討した。すなわち、表２に示す化学式２、化学式４乃至９で表される化合物に加えて、下記化学式１０乃至２４１で表わされる２３２種類（合計２３９種類）の化合物について、以下に示す細胞増殖促進活性（評価法Ａ）、神経突起伸展促進作用（評価法Ｂ）及びアミロイドβフラグメントによる細胞傷害に対する抑制作用（評価法Ｃ）により、ＰＣ１２−ＨＳ細胞に対する細胞増殖活性、神経突起伸展促進作用及びアミロイドβフラグメントによる細胞傷害に対する抑制作用の有無を調べた結果を表２に併せて示す。なお、下記試験において、各々の判定基準よりも低い効果しか認められなかった場合、表２は空欄とした。【００６４】
【化１７】
2010087315.tif 000020
【００６５】
【化１８】
2010087315.tif 000021
【００６６】
【化１９】
2010087315.tif 000022
【００６７】
【化２０】
2010087315.tif 000023
【００６８】
【化２１】
2010087315.tif 000024
【００６９】
【化２２】
2010087315.tif 000025
【００７０】
【化２３】
2010087315.tif 000026
【００７１】
【化２４】
2010087315.tif 000027
【００７２】
【化２５】
2010087315.tif 000028
【００７３】
【化２６】
2010087315.tif 000029
【００７４】
【化２７】
2010087315.tif 000030
【００７５】
【化２８】
2010087315.tif 000031
【００７６】
【化２９】
2010087315.tif 000032
【００７７】
【化３０】
2010087315.tif 000033
【００７８】
【化３１】
2010087315.tif 000034
【００７９】
【化３２】
2010087315.tif 000035
【００８０】
【化３３】
2010087315.tif 000036
【００８１】
【化３４】
2010087315.tif 000037
【００８２】
【化３５】
2010087315.tif 000038
【００８３】
【化３６】
2010087315.tif 000039
【００８４】
【化３７】
2010087315.tif 000040
【００８５】
【化３８】
2010087315.tif 000041
【００８６】
【化３９】
2010087315.tif 000042
【００８７】
＜試験試料＞
表２に示す２３９種類の化合物は、水に難溶性のものが多いため、ＮＫ−４の場合と同様に、ＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ社販売、カタログ番号「Ｄ８４１８」）に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した後、Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社販売、製品番号「ＬＬＧ０２５ＳＳ」、ＤＭＳＯ耐性）で膜ろ過し、遮光して２５℃で保存した。使用時には、１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地（日水製薬）で２００倍以上に希釈して試験試料を調製し、試験に供した（表中のＮＫ番号に対応する化合物の構造は、『感光色素表』、感光色素研究所発行（１９６９年）参照）。これらの化合物は、いずれも株式会社林原生物化学研究所で合成したものを使用した。【００８８】
＜評価法Ａ：神経細胞増殖促進作用の評価法＞
実験１と同じ方法で、ＰＣ１２−ＨＳ細胞を、予めコラーゲンコートした９６ウエルマイクロプレートに５×１０３個／ウエルになるように１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈し、１００μｌ／ウエルで播種した。２４時間後にＤ−ＭＥＭ（１０容積％ＦＢＳ）で希釈し、１００ｎｇ／ｍｌに調整した各試験試料を１００μｌ／ウエル添加し、３７℃、５容積％ＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。３日目に培養上清を除去し、１０質量％Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ（Ｔｒｅｋ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社販売）／１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地を２００μｌ／ウエルずつ添加し、６時間、３７℃、５容積％ＣＯ２インキュベーター中で培養し、蛍光プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社販売）で５４４−５９０ｎｍの蛍光強度を測定した。各試験サンプルの細胞増殖促進作用は、１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地を１００μｌ／ウエル添加した対照の値を１００とした時の相対値が１４０乃至１９９の場合をＮＫ−４と同等（○）、２００以上をＮＫ−４より強い作用（◎）と判定した。結果を表２に併せて示す。【００８９】
＜評価法Ｂ：神経突起伸展作用の評価法＞
細胞増殖促進活性の測定の場合と同様に、ＰＣ１２−ＨＳ細胞を、予めコラーゲンコートした９６ウエルマイクロプレートに５×１０３個／ウエルになるように１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈し、１００μｌ／ウエルで播種した。２４時間後に、Ｄ−ＭＥＭ（１０容積％ＦＢＳ）で希釈して４００ｎｇ／ｍｌに調整した各試験試料５０μｌ／ウエルと、２０ｎｇ／ｍｌＮＧＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社販売、マウス由来、終濃度５ｎｇ／ｍｌ）含有Ｄ−ＭＥＭ培地（１０容積％ＦＢＳ）５０μｌ／ウエルとを加えて、３日間培養した。培養３日目に１０容積％グルタルアルデヒドで室温２０分間固定した。対照として１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地のみで３日間培養したＰＣ１２−ＨＳ細胞をグルタルアルデヒドで固定した。固定した細胞を、顕微鏡下で観察し、神経突起伸展の有無を評価し、神経突起伸展率が３０％以上の場合をＮＫ−４と同等以上（○）と判定した。なお、神経突起伸展率（％）は、顕微鏡下で、一視野に約１００個の細胞を含む倍率で細胞を観察し、細胞体の２倍以上の神経突起を有する細胞数をカウントし、同一視野内にある全細胞数で除し、１００倍して求めた。また、この実験系にＮＧＦのみを添加（５ｎｇ／ｍｌ）したときの神経突起伸展率は５％程度であった。結果を表２に併せて示す。【００９０】
＜評価法Ｃ：アミロイドβフラグメントによる細胞傷害に対する抑制作用＞
評価法Ａで細胞増殖促進作用の認められた試験試料について、実験１と同じ方法で、アミロイドβフラグメントによる細胞傷害に対する細胞保護効果があるかどうかを検討した。試験試料無添加の場合に比して、アミロイドβフラグメントによる細胞傷害を有意に抑制した場合を抑制効果あり（○）と判定した。結果を表２に併せて示す。【００９１】
【表２】
2010087315.tif 000043
【００９２】
表２の結果に示すように、試験した２３９種の化合物は、細胞増殖促進作用（評価法Ａ）、神経突起伸展促進作用（評価法Ｂ）或いはアミロイドβ傷害抑制作用（評価法Ｃ）を有するものがあることが判明した。とりわけ、ＮＫ−１９（化学式４で表される化合物）、ＮＫ−５３（化学式５で表される化合物）、ＮＫ−１００（化学式６で表される化合物）、ＮＫ−５２８（化学式７で表される化合物）、ＮＫ−５５７（化学式８で表される化合物）、ＮＫ−１５１６（化学式９で表される化合物）は、ＮＫ−４と同等以上の細胞増殖促進作用と、神経突起伸展促進作用を示した。また、細胞増殖促進活性をもつ化合物について、アミロイドβフラグメントによる細胞傷害に対する抑制作用（評価法Ｃ）があると評価した化合物は、いずれも、アミロイドβフラグメントによる細胞傷害に対する抑制作用が認められた。以上の結果、及び、実験１、実験２の結果から、表６に示す細胞増殖促進作用や神経突起伸展促進作用を有する化合物は、いずれも、神経細胞を活性化しているので、ヒトの抗アルツハイマー病剤として利用できることを物語っている。なかでも、ＮＫ−１９（化学式４で表される化合物）、ＮＫ−５３（化学式５で表される化合物）、ＮＫ−１００（化学式６で表される化合物）、ＮＫ−５２８（化学式７で表わされる化合物）、ＮＫ−５５７（化学式８で表される化合物）、ＮＫ−１５１６（化学式９で表される化合物）は、細胞増殖促進作用や神経突起伸展促進作用が強いので、特にヒトの抗アルツハイマー病剤として有用であることを物語っている。さらに、これらの化合物、とりわけ、ＮＫ−４、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００、ＮＫ−５２８、ＮＫ−５５７、ＮＫ−１５１６は、アルツハイマー病に伴う病態や神経機能障害の治療剤としても利用できることを物語っている。【００９３】
＜実験３：各化合物の濃度がアミロイドβフラグメントによる細胞傷害に及ぼす影響＞
実験２において、ＮＫ−４と同様にアミロイドβフラグメントによる細胞傷害を抑制する作用を持つことが確認された化合物の中からＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００、ＮＫ−５２８、ＮＫ−５５７及びＮＫ−１５１６について、その濃度が、アミロイドβフラグメントによる細胞傷害に及ぼす影響を調べた。すなわち、前記６種の化合物及びＮＫ−４を試験標品として使用し、各化合物が表３に示す終濃度となるように、ＰＣ１２−ＨＳ細胞を播種したウエルに添加した以外は、実験３の評価法Ｃと同一の条件で、これらの化合物のアミロイドβフラグメントによる細胞傷害に対する抑制効果を評価した。結果を細胞生存率（％）として表３に示す。【００９４】
【表３】
2010087315.tif 000044
【００９５】
表３から明らかなように、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００はＮＫ−４よりも低濃度で、アミロイドβフラグメントによる細胞傷害に対して、高い抑制活性を示した。このうち、最も低濃度で高い抑制活性を示したのは、ＮＫ−５３で、１２．５ｎｇ／ｍｌの濃度でほぼ完全にアミロイドβフラグメントによる細胞傷害を抑制した（細胞生存率１１５±１６％）。ＮＫ−１９、ＮＫ−１００、ＮＫ−５５７では、５０ｎｇ／ｍｌの濃度で傷害抑制率が最高となり、それぞれ１０２±２７％、８８±１２％、１１４±９％となった。この効果は全て、５０μｇ／ｍｌのＮＫ−４を添加した場合に得られた細胞傷害抑制率（６９±７％）よりも高かった。ＮＫ−５３は、濃度が５０ｎｇ／ｍｌでも傷害抑制率が１１１±９％と高い抑制活性が認められた。一方、ＮＫ−４は２００ｎｇ／ｍｌの濃度で、傷害抑制率が１２２±３２％と最高になったのに対して、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００、ＮＫ−５５７では細胞保護効果の低下が認められ、これらの化合物の細胞傷害抑制作用には至適濃度が存在することが確認され、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００、ＮＫ−５５７の至適濃度は、ＮＫ−４より低いことが判明した。ＮＫ−５２８及びＮＫ−１５１６では、ＮＫ−４より高い細胞傷害抑制効果は認められなかった。以上の結果から、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００、ＮＫ−５５７は、抗アルツハイマー病剤としてＮＫ−４より低濃度で、優れた効果を発揮する可能性が示唆された。また、ＮＫ−４よりも低濃度で、高い細胞傷害抑制活性の認められたＮＫ−１９及びＮＫ−１００は、他のものより分子量が大きく、ＮＫ１９やＮＫ−５３ではチアゾール環の窒素に結合した側鎖のアルキル基の炭素数が７（他は炭素数２）と多いことから、脂溶性が高く、細胞膜透過性が高いため、強い活性が発現されたと判断した。【００９６】
＜実験４：アミロイドβペプチドの凝集に及ぼす影響＞
実験２及び３において、アミロイドβフラグメントの細胞傷害性に対する保護作用が認められた化合物のなかから、神経突起伸展促進作用も確認されたＮＫ−４、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００及びＮＫ−５５７を試験試料に使用してアミロイドβペプチドの凝集に及ぼす影響を調べる試験を以下のように実施した。すなわち、各試験試料をＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ社販売、カタログ番号「Ｄ８４１８」）に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した後、Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社販売、製品番号「ＬＬＧ０２５ＳＳ」、ＤＭＳＯ耐性）で膜ろ過し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用して、濃度の２００ｎＭの濃度に調製して試験試料溶液とした。【００９７】
＜アミロイドβペプチド凝集の測定法＞
アミロイドβペプチドの凝集はチオフラビンＴを用いた方法で測定した（例えば、Ｈｉｌａｌ  Ａ．Ｌａｓｈｕｅｌら、『Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ』、第２７７巻、第４５号、第４２８８１−４２８９０頁（２００２年）参照）。チオフラビン−Ｔは、凝集したアミロイドβペプチドのβ−シート構造に結合し、蛍光を発する。この蛍光量を蛍光プレートリーダーで検出しアミロイドβペプチド凝集の指標とした。試験試料がアミロイドβペプチド凝集を抑制した場合、チオフラビン−Ｔの蛍光が減少する。この方法で試験試料のアミロイドβペプチド凝集に及ぼす影響を調べた。すなわち、配列表における配列番号２で表される４０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するヒトアミロイドβペプチドＡｎａ  Ｓｐｅｃ社販売）を、４００μＭの濃度に滅菌蒸留水に溶解して使用した。試験試料溶液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液にて希釈した。反応用の容器に１００ｍＭ  アミロイドβペプチド１５μｌおよび試験試料溶液（２００ｎＭ）４５μｌを入れて、混合し、３７℃で６日間反応させた。反応後の溶液を５０μｌとり、の１０μＭチオフラビンＴ４５０μｌと混合し、３０分後に、蛍光度計で測定した（励起波長４５０ｎｍ、吸収波長４８２ｎｍ）。チオフラビンＴのみの蛍光度を０％、１００ｍＭ  アミロイドβペプチド１５μｌおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液４５μｌを入れ、混合し、３７℃で６日間反応させたときの蛍光度を１００％とし、各試験試料溶液を加えて反応させたときの蛍光強度の相対値を求め１００％から減じてアミロイドβペプチド凝集抑制効果（％）として表４に示す。【００９８】
【表４】
2010087315.tif 000045
【００９９】
表４から明らかなように、試験に使用したＮＫ−４、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００及びＮＫ−５５７はいずれも、アミロイドβペプチドの凝集を抑制し、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００及びＮＫ−５５７はいずれも、ＮＫ−４よりも強い抑制活性を示した。なかでも、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００及びＮＫ−５５７は、アミロイドβペプチドの凝集を９５％以上抑制し、ＮＫ−１００では９９％とほぼ完全に凝集を抑制した。この結果は、ＮＫ−４、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００及びＮＫ−５５７などの、アミロイドβフラグメントによる細胞傷害を抑制する作用を有する化合物は、アミロイドβペプチドの凝集を抑制する作用も有することから、アルツハイマー病の治療剤としてだけでなく、予防剤としても有用であることを物語っている。【０１００】
＜実験５：色素化合物のアセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）活性に及ぼす影響＞
アルツハイマー型認知症にはドネぺジルをはじめとするＡｃｈＥ阻害薬が臨床応用されている。ＡｃｈＥ阻害薬は中枢コリン神経系を賦活化し、虚血性認知症においても認知機能を改善することが報告されている。そこで、実験７で脳虚血を起こしたラットの脳梗塞及びそれに伴う神経機能障害を改善する効果が確認された、ＮＫ−４、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００及びＮＫ−５５７に、ＡｃｈＥ阻害作用があるかどうかを確認する試験を行った。すなわち、ＤＭＳＯに溶解したＮＫ−４、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００及びＮＫ−５５７を、各々リン酸緩衝液で希釈し、濃度が表１３に示す濃度の１０倍濃度の化合物を含む溶液を調製して、試験試料溶液とした。実験１と同様に培養したＰＣ１２−ＨＳ細胞を回収し、その５倍量（容積）の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．２）を加えて、常法により均一にホモジナイズした後、４℃にて３０分間遠心分離（１０，０００ｇ）し、その上清を回収してアセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）含有溶液とした。９６ウエルプレート（住友ベークライト社販売、商品名「μテストプレート、細胞培養用、平底」）に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）３０μｌ、試験試料溶液１０μｌ、ＡｃｈＥ含有溶液１０μｌを入れ、さらに、反応基質液として０．５ｍＭヨウ化アセチルチオコリン（和光純薬工業株式会社販売）と１ｍＭ  ２−ニトロ安息香酸（Ｗａｋｏ社販売）を含むリン酸緩衝液５０μｌを加えた。３７℃のインキュベーターで３０分間酵素反応を行った後、プレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度（ＡＲ）を測定した。また、ＡｃｈＥ含有溶液の代わりにリン酸緩衝液１０μｌを用いて、上記と同様に、３７℃のインキュベーターで３０分間酵素反応を行って吸光度（ＡＵ）を測定した。対照におけるＡｃｈＥ含有液に代えてリン酸緩衝液１０μｌを用いて３７℃のインキュベーターで３０分間酵素反応を行い、吸光度（ＢＲ）を測定した。さらに、対照の対照として、対照の反応液のＡｃｈＥ含有液に代えてリン酸緩衝液１０μｌを用いて反応を行い、吸光度（ＢＵ）を測定した。ＡｃｈＥ活性残存率（％）（＝｛（ＡＲ−Ａｕ）÷（ＢＲ−ＢＵ）｝×１００）を求め、ＡｃｈＥ活性を５０％阻害するときの化合物の濃度（ＩＣ５０）を求めた。結果を表５に示す。【０１０１】
【表５】
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【０１０２】
表５から明らかなように、低濃度域ではＮＫ−１００に最も高いＡｃｈＥ阻害が認められ、ＮＫ−１００の濃度が０．７８μｇ／ｍｌ以上で有意なＡｃｈＥ阻害作用を示した。また、ＮＫ−１００と構造の類似しているＮＫ−４でも３．１３μｇ／ｍｌ以上の濃度で有意な阻害が認められた。これらの化合物のＩＣ５０は、ＮＫ−４は３．３μｇ／ｍｌ、ＮＫ−１００は１１．８μｇ／ｍｌであった。これに対し、ＮＫ−１９及びＮＫ−５３のＡｃｈＥ阻害活性は弱く、ＮＫ−１９及びＮＫ−５３では２５μｇ／ｍｌの濃度でのみで有意な活性の低下が認められた。一方、ＮＫ−５５７では２５μｇ／ｍｌまでの濃度でほとんどＡｃｈＥ阻害活性を示さなかった。この結果は、ＮＫ−４、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００の４種の化合物では、ＡｃｈＥの阻害作用によっても、コリン作動性神経系を賦活化し、アルツハイマー型認知症を改善する可能性が示唆された。【０１０３】
なお、アルツハイマー病の治療薬として臨床利用されているガランタミンは、ＮＫ−４に比較して低い濃度で同程度のＡｃｈＥ阻害効果を示す（その時のＩＣ５０は、４４２μｇ／ｍｌ）。最近、これらの化合物では、ＮＫ−４と同様のＰＩ３Ｋ−Ａｋｔカスケードを介した細胞死の抑制も報告されているが、ＮＫ−４では３．３ｇ／ｍｌで効果が得られるのに対し、ガランタミでは同等の効果を得るのに約１００倍濃度を要する。また、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアミロイドβフラグメント傷害モデルでの細胞保護効果についても同様の濃度のオーダーが異なっているので、これらのことを考慮すると、ＮＫ−４（ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１００、ＮＫ−５５７を含む）は既存のアルツハイマー病治療薬とは異なる作用機作を有する抗アルツハイマー病剤として利用できることを物語っている。【０１０４】
＜実験６：ＮＫ−１９類縁体の神経栄養因子様活性＞
上記実験で、強い神経変性抑制作用が確認されたＮＫ−１９について、その類縁体にも同様の作用があることを確認する試験をおこなった。すなわち、一般式３で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が１乃至１２である化合物を合成（株式会社林原生物化学研究所合成）し、実験２と同様に、ＰＣ−１２ＨＳ細胞に対する細胞増殖促進作用及び神経突起伸展促進作用の強さを調べた。表６に示すＮＫ−１９を含む、ＮＫ−１９の類縁体１２種類の化合物を合成し、各々ＤＭＳＯに５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。この溶液を１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈して、化合物の濃度が、各々１００ｎｇ／ｍｌ又は２μｇ／ｍｌにとなるように試験試料溶液を調製した。また、ＮＫ−２４及びＮＫ−１９については、その対アニオンをＩ−からＣｌ−に替えた化合物（ＮＫ−５６及びＮＫ−５３）も、ＤＭＳＯに５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。これらの溶液を１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈して、化合物の濃度を、各々１００ｎｇ／ｍｌ又は２μｇ／ｍｌに希釈して試験試料溶液を調製した。【０１０５】
＜細胞増殖促進作用の評価＞
実験２の評価法Ａと同様に、コラーゲンコートした９６ウエルプレートに５Ｘ１０３個／ウエルになるように１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈し、１００μｌ／ウエルで播種した。２４時間後に１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈し、化合物の濃度を１００ｎｇ／ｍｌに調整した各試験試料溶液を１００μｌ／ウエル添加し、３７℃、５容積％ＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。培養３日目に培養上清を除去し、１０質量％Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ（Ｔｒｅｋ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）／１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地を２００μｌ／ウエルずつ添加し、６時間、３７℃、５容積％ＣＯ２インキュベーター中で培養し、蛍光プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で５４４−５９０ｎｍの蛍光強度を測定した。各試験試料溶液を添加した場合の細胞増殖促進作用は、１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地を１００μｌ／ウエル添加した対照の値を１００とした時の相対値として求めた。結果を表６に示す。なお、試験は、各試験試料溶液につき、トリプレットで２回実施し、その平均を求めた。【０１０６】
＜神経突起伸展促進作用の評価＞
実験２の評価Ｂと同様に、ＰＣ１２−ＨＳ細胞を、予めコラーゲンコートした９６ウエルマイクロプレートに５´１０３個／ウエルになるように１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地で希釈し、１００μｌ／ウエルで播種した。２４時間後に、化合物の濃度を２μｇ／ｍｌに調整した各試験試料溶液５０μｌ／ウエルとＮＧＦ（終濃度５ｎｇ／ｍｌ）５０μｌ／ウエルとを添加し、培養３日目に１０容積％グルタルアルデヒドで室温２０分間固定した。対照として１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地のみで３日間培養し、細胞をグルタルアルデヒドで固定した。固定した細胞を、顕微鏡下で観察し、実験３の場合と同じ方法で神経突起伸展の有無を評価した。結果を表６に併せて示す。なお、試験は、ＮＫ−５６及びＮＫ−５３を除く各試験試料溶液につき、トリプレットで２回実施し、その平均を求めた。また、この実験系にＮＧＦのみを添加（５ｎｇ／ｍｌ）したときの神経突起伸展率は５％程度であった。【０１０７】
【化４０】
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一般式３においてＲ７乃至Ｒ９は炭素数が同一で、炭素数が１乃至１２のアルキル基を表し、Ｘ３−はＩ−又はＣｌ−で、ｍは２を表す。【０１０８】
【表６】
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【０１０９】
表６から明らかなように、側鎖のアルキル基の炭素数が３乃至１２で、細胞増殖及び神経突起伸展の促進作用が認められ、３乃至１０でその作用は強くなり、細胞増殖促進作用は４乃至９のものが最も強い活性を示し、神経突起伸展作用は５乃至１０のものが最も強い活性を示した。また、ＮＫ−２４とＮＫ−５６、或いは、ＮＫ−１９とＮＫ−５３とを比較すると、いずれの場合にも、神経突起伸展促進作用の程度に差は認められないことから、ＮＫ−１９類縁体の持つ神経栄養因子様活性には、対アニオンの種類による差異はないと判断した。【０１１０】
以上の実験結果は、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１５０などの一般式３で表される化合物は、神経栄養因子様作用、神経変性抑制作用などの生理機能を持っているので、これらの化合物は抗アルツハイマー病剤として有用であることを物語っている。【０１１１】
＜実験７：ＮＫ−４類縁体の神経栄養因子様活性＞
実験６と同様に、ＮＫ−４の類縁体に同様の作用効果があることを確認するために、下記一般式２で表される化合物において、側鎖のアルキル基（Ｒ４乃至Ｒ６）の炭素数が２乃至８で、対アニオンがＩ−である７種類の化合物を合成し、実験３と同様に、ＰＣ１２−ＨＳ細胞に対する細胞増殖促進作用、及び、神経突起伸展促進作用の強さを調べた。すなわち、ＮＫ−４に加えて、表７に示すＮＫ−２３４、ＮＫ−２６、ＮＫ−９８１５、ＮＫ−９６９４、ＮＫ−２８及びＮＫ−１４７の７種類の化合物を、各々ＤＭＳＯに５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。この溶液をそれぞれ化合物の終濃度が表７又は８に示す濃度となるように、１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭで希釈し試験試料溶液を調製した。また、ＮＫ−１９の類縁体ＮＫ−１３、ＮＫ−３９２、ＮＫ−１９及びＮＫ−１５０をＤＭＳＯに５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、化合物の濃度が表７又は８に示す濃度となるように１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭで希釈し、試験試料溶液を調製した。なお、試験は、いずれも、各試験試料溶液につきトリプレットで２回実施し、その平均を求めた。細胞増殖促進作用の結果を表７に、神経突起伸展促進作用の結果を表８にそれぞれ併せて示す。【０１１２】
【化４１】
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一般式２においてＲ４乃至Ｒ６は炭素数が同一で、炭素数が６乃至８のアルキル基を表し、Ｘ２はＩ−で、ｍは２を表す。【０１１３】
【表７】
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【０１１４】
【表８】
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【０１１５】
表７及び８の結果から明らかなように、一般式２で表されるＮＫ−４類縁体は、側鎖のアルキル基の炭素数が３乃至８化合物で、ＮＫ−４と同等乃至高い細胞増殖及び神経突起伸展の促進作用が認められ、化合物の濃度８０ｎｇ／ｍｌで比較すると、細胞増殖促進作用は側鎖のアルキル基の炭素数が４乃至６の化合物で特に強い作用が認められた。神経突起進展促進作用は側鎖のアルキル基の炭素数が４及び５の化合物で強い活性の発現が認められた。また、一般式３で表され側鎖のアルキル基の炭素数が２乃至８である化合物、とりわけ、一般式３で表され側鎖のアルキル基の炭素数が６乃至８であるＮＫ−１９類縁体化合物は強い細胞増殖及び神経突起伸展の促進活性を示すことが明らかになった。【０１１６】
なお、具体的なデータは示さないが、ＰＣ−１２ＨＳ細胞に替えて、ラット胎児大脳皮質から調製した初代神経細胞（ニューロン、アストロサイト及びミクログリア細胞）を用い、アミロイドβフラグメント障害及び過酸化水素障害に対するＮＫ−４、ＮＫ−２６、ＮＫ−２３４、ＮＫ−１９及びＮＫ−１５０の影響を調べたところ、これらの化合物は初代神経細胞に対するアミロイドβフラグメント障害及び過酸化水素障害を抑制する活性を有することが判明した。また、これらの化合物は、ＬＰＳ存在下においてミクログリア細胞が産生するＮＯの産生を抑制することが判明した。
＜実験８：ＮＫ−４類縁体のＡｃｈＥ活性阻害作用の比較＞
既述のごとく、ＡｃｈＥ活性抑制剤はアルツハイマー型認知症治療剤として用いられている。そこで、ＮＫ−４類縁体をアルツハイマー症に適用することを想定しＮＫ−４類縁体のＡｃｈｅ活性阻害作用の強さを比較した。すなわち、実験１１で用いた一般式２で表される化合物の側鎖のアルキル基の炭素数が２乃至５の４種のＮＫ−４類縁体を用い、実験８と同じ方法でＡｃｈＥ活性残存率（％）を測定した。併せて、ＮＫ−１９類縁体のＮＫ−１５０を用いてＡｃｈＥ活性残存率（％）を測定した。その結果及斯かる活性残存率に基づき計算したＩＣ５０値（実験で用いたＡｃｈｅ活性を５０％抑制する化合物濃度）を表９に併せて示す。【０１１７】
【表９】
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【０１１８】
表９から明らかなように、ＮＫ−４類縁体は側鎖のアルキル基の炭素数が増えるにつれてＡｃｈＥ活性の残存率が高くなる傾向を示した。ＮＫ−４及びＮＫ−２３４、とりわけＮＫ−４はＡｃｈＥ活性を強く抑制した。また、ＮＫ−１９類縁体のＮＫ−１５０は、ＮＫ−４類縁体と比較しＡｃｈｅ抑制作用が低いことが判明した。【０１１９】
この結果は、ＮＫ−４及びＮＫ−２３４、とりわけＮＫ−４はアルツハイマー型認知症治療剤として有用であることを物語っている。また、Ａｃｈｅ活性抑制剤としてアルツハイマー型認知症治療用に市販されているドネペジル塩酸塩（商品名『アリセプト』）のＡｃｈＥ活性残存率（％）を同じ実験系で測定したところＩＣ５０は０．９μｇ／ｍｌとなったことから、ＮＫ−４はドネペジル塩酸塩とほぼ同等のＡｃｈＥ活性抑制活性を有することを物語っている。【０１２０】
＜実験９：ＮＫ−４類縁体及びＮＫ−１９類縁体のヒトアルツハイマー型認知症のモデルマウスに及ぼす影響＞
既述の実験からＮＫ−４がアルツハイマー型認知症治療剤として利用できる可能性が示唆されたので、本実験ではＮＫ−４類縁体及びＮＫ−１９類縁体のヒトアルツハイマー型認知症のモデルマウスに及ぼす影響を検証した。【０１２１】
＜被験試料＞
被験試料としてＮＫ−４、ＮＫ−２３４、ＮＫ−２６、ＮＫ−１９及びＮＫ−１５０を用いた。対照１として生理食塩水（２００μｌ／匹）を投与した。対照２としてドネペジル塩酸塩を用いた。各被験試料はＤＭＳＯにより５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、生理食塩水に希釈し投与した。【０１２２】
＜実験方法＞
ＩＣＲマウス（日本チャールスリバー社販売、オス、５週齢、体重２５乃至３０ｇ）１００匹を無作為に１０群各１０匹に群分けし、試験終了まで単独飼育した。抱水クロラール（シグマ社販売、３５０ｍｇ／ｋｇ・体重、腹腔内投与）麻酔を施したマウスを、背面固定し、頭部正中切開を加え、骨縫合を確認した後、ブレグマの左側方１．０ｍｍ、後方０．５ｍｍに刺入点を定め、３ｍｍ刺入し、配列表における配列番号１で示すアミノ酸配列を有するアミロイドβフラグメント（β−Ａｍｙｌｏｉｄ２５−３５）溶液９ｎｍｏｌ／６μｌ／匹を脳室内に投与した（投与法は、『Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ』、第７０６巻、１８１−１９３頁（１９９６年）参照。）。投与には２８ゲージステンレス針（３ｍｍ）を装着したマイクロシリンジを用いた。刺入部位は、予めアミロイドβフラグメント溶液の代わりにエバンスブルー溶液（０．３μｇ／０．３μｌ）を投与し、左右前額断面の側脳室、背側第三脳室、腹側第三脳室などに着色が認められることを確認し決定した。投与後、頭皮を縫合し、翌日より化合物のいずれかを腹腔内に１日１回１３日間投与し、以下に示す方法により行動学的評価をおこなった。その結果と群構成を表１０に示した。【０１２３】
【表１０】
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【０１２４】
＜評価法＞
＜新奇物体認識試験＞
新奇物体認識試験は、マウスの新奇性を好むとい特性を利用したもので、他の多くの学習評価系と異なり人為的な強化因子を用いない。試験は、順化、訓練試行、保持試行の３部門で構成され、アミロイドβフラグメントを脳室内に投与して後６乃至８日目に実施した。床にウッドチップを敷き詰めたオープンフィールドの実験装置（縦４０ｃｍ、横３０ｃｍ、高さ３０ｃｍ）を、約１，０００ルックス（ｌｕｘ）の照明下、雑音のない場所に設置した。まず６日目に、マウスを探索物体の入っていない実験装置中央に入れ、１０分間自由に探索させた（順化）。その２４時間後（７日目）、実験装置内に２種類の物体（ＡとＢ）をそれぞれ側面から１０ｃｍの位置に設置し、マウスを実験装置中央に入れ、１０分間自由に探索させた（訓練試行）。さらにその２４時間後（８日目）、実験装置内に前日探索させた物体Ａを前日の物体Ａ（一度記憶した対象物）と同じ位置に、前日の物体Ｂと異なる物体Ｃ（新しい対象物）を物体Ｂと同じ位置に設置し、マウスを装置の中央に入れ１０分間自由に探索させた（保持試行）。この時、マウスが鼻先を物体に向け、鼻先から物体までの距離が２ｃｍ以内にある時、又はマウスの鼻先が物体に接触している時を物体探索中とみなし、その時間をストップウオッチで計測した。物体識別指数（＝（新しい対象物の探索に費やした時間−一度記憶した対象物の探索に費やした時間）／（新しい対象物の探索に費やした時間＋一度記憶した対象物の探索に費やした時間））を求めた。この場合、物体識別指数は、新規対象物の探索により多く割かれた時間の全探索時間に対する割合であり、一度探索した対象物を動物が記憶していれば物体識別指数の値が大きくなり、記憶していなければ値が小さくなる。【０１２５】
＜受動的回避試験＞
動物が一度経験した嫌悪刺激（電気刺激）に対して示す回避行動を記憶の指標とするもので、マウスが暗室を好む性質を利用したステップスルー型を採用した。明室と暗室が扉でつながった装置の明室側にマウスを入れた時の暗室側への移動時間を記憶の指標とした。受動的回避試験はアミロイドβフラグメントを脳室内に投与して後９乃至１２日目に実施した。９日目に明室（１，０００ルックス、縦３０ｃｍ、横３０ｃｍ、高さ１５ｃｍ）に１分間、暗室（縦３０ｃｍ、横３０ｃｍ、高さ１５ｃｍ）に２分間入れ順化させた。１０日目も同様に順化を行った。１１日目の訓練試行で、まず明室の中央にマウスを入れ、マウスが暗室内に移動すると同時に明室と暗室のとの間の扉を閉め、電気刺激を与えた（０．８ｍＡ、１秒）。２４時間後（１２日目）、前日と同様に再び明室の中央にマウスを入れ、暗室への移動時間（秒）を受動的回避的反応として測定した。通電による嫌悪刺激を記憶していれば受動的回避的反応が長くなる。【０１２６】
表１０から明らかなように、ＮＫ−４を５００μｇ／ｋｇ・体重、ＮＫ−２３４を５００μｇ／ｋｇ・体重、ＮＫ−２６を５０μｇ／ｋｇ・体重、ＮＫ−１９を５００μｇ／ｋｇ・体重及びＮＫ−１５０を５００μｇ／ｋｇ・体重投与マウスでは、アミロイドβフラグメントのみ投与マウスに比べて、新奇物体認識試験で有意の改善が認められた。また、ＮＫ−４を５０μｇ／ｋｇ・体重、ＮＫ−４を５００μｇ／ｋｇ・体重、ＮＫ−２３４を５００μｇ／ｋｇ・体重、ＮＫ−２６を５０μｇ／ｋｇ・体重、ＮＫ−２６を５００μｇ／ｋｇ・体重、及び、ＮＫ−１９を５００μｇ／ｋｇ・体重投与マウスでは、アミロイドβフラグメントのみを投与マウスに比べて、受動的回避試験で有意の改善が認められた。なかでも、ＮＫ−４を５００μｇ／ｋｇ・体重投与した群では、新奇物体認識試験及び受動的回避試験の両方で、ドネペジル塩酸塩１，０００μｇ／ｋｇ・体重投与した群（対照２）よりも著明な改善が認められた。なお、試験中ＮＫ−４、ＮＫ−２３４、ＮＫ−２６、ＮＫ−１９或いはＮＫ−１５０の投与に起因すると思われる副作用は認められなかった。【０１２７】
この結果は、ＮＫ−４、ＮＫ−２３４、ＮＫ−２６、ＮＫ−１９及びＮＫ−１５０は、いずれもアミロイドβペプチドに起因する認知障害を改善する作用を有し、この実験条件において、試験に用いた４種類の化合物の中ではＮＫ−４が最も強い認知障害改善作用を有していることを物語っている。【０１２８】
＜実験１０：ＮＫ−４のＡＰＰトランスジェニックマウスに及ぼす影響＞
実験９でアミロイドβフラグメントを投与したマウスの認知障害改善作用の最も強かったＮＫ−４につき、スウェーデン型アルツハイマー病の原因遺伝子変異を導入した市販のＡＰＰトランスジェニックマウス（ＡＰＰ  Ｔｇマウス）に及ぼす影響を調べた。すなわち、ＡＰＰ  Ｔｇマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ社販売、メス、１０週齢、体重１５乃至２３ｇ）４５匹を１０日間予備飼育した後、体重が均等になるように、４群に分け、単独飼育とし、ＮＫ−４を腹腔内に週５回、１２週間投与した。対照１として遺伝子変異を導入していないマウス（野生型、メス、１０週齢、体重１５乃至２３ｇ）１０匹を１０日間予備飼育後、単独飼育とし、生理食塩水を腹腔内に週５回、１２週間投与した。対照２としてＡＰＰ  Ｔｇマウスに生理食塩水（２００μｌ／匹）を週５回、１２週間投与した。対照３としてＡＰＰ  Ｔｇマウスにドネペジル塩酸塩を週５回、１２週間投与した。ＮＫ−４、生理食塩水或いはドネペジル塩酸塩投与１２週目に、実験１５と同じ方法で、最初に新奇物体認識試験、次に受動的回避試験を行い、引き続き下記方法による水迷路試験を行った。その結果と群構成を表１１に示す。【０１２９】
【表１１】
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【０１３０】
＜水迷路試験法＞
直径１３０ｃｍの円形プールに、白色インクで着色した水を深さ２０ｃｍまで満たし、水槽用ヒーターで水温を２３±１℃に維持した。プールを４分割し一画の中央に、プールの側面から１０ｃｍの位置に避難用のプラットホームを水面下２ｃｍになるように設置した。このプラットホームの位置は、試験終了まで一定の場所とした。受動的回避試験終了の翌日よりマウスをプールの側面に向けて水面上に放ち、水面下に隠れたプラットホームに到着するまでの時間を計測した。スタート位置は、プールを４分割したいずれかの画分の中央部、壁面より１０ｃｍ離れた場所とし、試行毎にランダムに変更した。２分間自由にプラットホームを探索させた後、マウスが２分以内にプラットホームに到着できなかった場合は、プラットホームへ誘導し、３０秒間プラットホームに留まらせた後、ペーパータオルを敷いたケージに移した。２回目の試験は、１回目の試験終了１分後に開始した。この試験を４日間連続で行ない、２回の試行の平均値を１日の値とした。【０１３１】
表１１から明らかなように、ＮＫ−４を投与したマウスは、物体識別指数、受動的回避反応、水迷路試験のいずれにおいても、ＡＰＰ  Ｔｇマウスの認知障害を顕著に改善した。また、その改善作用は、市販のアルツハイマー型認知症治療剤ドネペジル塩酸塩より有意に強かった。この結果は、ＮＫ−４がアルツハイマー型認知障害の治療剤として利用できることを強く示唆している。なお、試験中ＮＫ−４の投与に起因すると思われる副作用は認められなかった。【０１３２】
以上の実験１乃至１１の結果から、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１５０などの一般式３で表され、側鎖のアルキル基の炭素数が３乃至１０の化合物と同様に、一般式２で表され、側鎖のアルキル基の炭素数が２乃至８個の化合物は、神経栄養因子様作用、神経変性抑制作用などの生理機能を持ち、アミロイドβフラグメントによる細胞傷害を抑制する活性も有しているので、これらの化合物はいずれも抗アルツハイマー病治療剤として有用であることを物語っている。また、これらの化合物の中では、一般式２で表され側鎖のアルキル基の炭素数が２乃至４である化合物であるＮＫ−４、ＮＫ−２３４、ＮＫ−２６、とりわけＮＫ−４が特に強いアルツハイマー型認知障害の改善効果を有していることを物語っている。【０１３３】
以下、本発明の抗アルツハイマー病剤について、実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【０１３４】
＜注射用の液剤＞
注射用精製水３７０ｇに注射用精製マルトース（株式会社林原製造）６０ｇを溶解した溶液と、注射用精製水１７０ｇに、有効成分として、ＮＫ−４（化学式２で表される化合物）、ＮＫ−９６９４（化学式１で表される化合物）、ＮＫ−２８（一般式２で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が７である化合物）、ＮＫ−１４７（一般式２で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が８である化合物）、ＮＫ−１９（化学式４で表される化合物）、ＮＫ−５３（化学式５で表される化合物）、ＮＫ−１５０（化学式３で表される化合物）、ＮＫ−３９３（一般式３で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が８である化合物）、ＮＫ−１００（化学式６で表される化合物）ＮＫ−５２８（化学式７で表される化合物）、ＮＫ−５５７（化学式８で表される化合物）、及び、ＮＫ−１５１６（化学式９で表される化合物）（いずれも株式会社林原生物化学研究所製造）のいずれか１種を、各々１２ｍｇ溶解した溶液とを混合し、溶存する酸素の濃度が約０．１ｐｐｍになるまで窒素ガスをバブリングして、褐色アンプルに１ｍｌずつ分注し、窒素気流下でアンプルを封止した後、濾過滅菌又は高圧滅菌した。本品は、いずれもパイロジェンフリーであり、抗アルツハイマー病剤として利用できる。【０１３５】
これらの製剤を使用して、アミロイドβフラグメント投与マウス（アルツハイマー病モデル）に対する治療効果を確認した。【０１３６】
＜アミロイドβフラグメント投与マウス（アルツハイマー病モデル）に対する効果＞
ＩＣＲマウス（日本チャールスリバー社販売）６５匹を無作為に５匹ずつ、１３群に分けた。実験２で使用した配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するアミロイドβフラグメントを、３７℃で４日間エイジングさせて、６５匹のマウス全ての脳室内に５μｇ／匹投与した。アミロイドβフラグメント投与後１日目から表１２に示すように、１２群各５匹（試験群１乃至１２）には、実施例１で調製した１２種類の化合物のいずれかを有効成分として含有する製剤のいずれか１種を、１日１回９日目まで毎日、０．３ｍｌ／匹、腹腔内投与した（試験群１乃至１２）。残りの１群５匹には、滅菌したマルトースの１０％水溶液（パイロジェンフリー）を、１日１回９日目まで毎日、０．３ｍｌ／匹、腹腔内投与した（対照群）。アミロイドβフラグメント投与６日目から１０日目まで、マウスの行動を観察して、その期間中に何らかの行動異常が認められた個体数の割合（％）を表１２に併せて示す。また、投与１０日目に、マウスを解剖して脳を採取し、常法により脳の組織標本を作製し、アミロイドβフラグメントの沈着（凝集）の有無を確認するためにコンゴーレッド染色及びチオフラビンＴ染色を行った。染色した標本を蛍光顕微鏡で観察し、対照を投与した場合に比して、組織の蛍光強度が明らかに弱い（２）、蛍光強度が少し弱い（１）、差がない（０）、蛍光強度が少し強い（−１）、蛍光強度が明らかに強い（−２）の５段階で評価してスコア化し、各試験群５匹のマウスの平均を求めて、アミロイドβフラグメントの蓄積の程度として表１２に併せて示す。【０１３７】
【表１２】
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【０１３８】
表１２から明らかなように、実施例１で調製した１２種類の製剤は、いずれも、アミロイドβフラグメント投与マウスの異常行動の発現を抑制すると共に、脳内へのアミロイドβフラグメントの蓄積を抑制した。１２種類の製剤を投与した場合の効果の強さを比較すると、いずれの試験においても、ジメチン系スチリル色素化合物（ＮＫ−５２３、ＮＫ−５５７、及び、ＮＫ−１５１６）を含有する製剤を投与した場合（実験群１０乃至１２）よりも、ペンタメチン系シアニン色素化合物（ＮＫ−４、ＮＫ−９６９４、ＮＫ−２８、ＮＫ−１４７、ＮＫ−１９、ＮＫ−５３、ＮＫ−１５０、ＮＫ−３９３、Ｋ−１００、Ｋ−５２８、Ｋ−５５７、及び、ＮＫ−１５１６）を投与した場合（実験群１乃至９）の方が、アミロイドβフラグメント投与による行動異常やフラグメントの脳内蓄積に対して強い改善効果が認められた。
【実施例２】
【０１３９】
＜注射用の液剤＞
注射用精製水３７０ｇに注射用精製マルトース（株式会社林原製造）６０ｇを溶解した溶液と、注射用精製水１６８ｇに、レシチン２ｇと有効成分として、ＮＫ−４（化学式２で表される化合物）、ＮＫ−２３４（一般式２で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が３である化合物）、ＮＫ−２６（化学式１で表される化合物）、ＮＫ−２８（一般式２で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が７である化合物）、ＮＫ−１４７（一般式２で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が８である化合物）、ＮＫ−１９（化学式４で表される化合物）、ＮＫ−５３（化学式５で表される化合物）、ＮＫ−１５０（化学式３で表される化合物）、ＮＫ−３９３（一般式３で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が８である化合物）、ＮＫ−１００（化学式６で表される化合物）ＮＫ−５２８（化学式７で表される化合物）、ＮＫ−５５７（化学式８で表される化合物）、及び、ＮＫ−１５１６（化学式９で表される化合物）（いずれも株式会社林原生物化学研究所製造）のいずれか１種を、各々１２０ｍｇ溶解した溶液とを混合し、溶存する酸素の濃度が約０．０５ｐｐｍになるまで窒素ガスをバブリングして、褐色アンプルに１ｍｌずつ分注し、窒素気流下でアンプルを封止した後、濾過滅菌又は高圧滅菌した。本品は、いずれもパイロジェンフリーであり、抗アルツハイマー病剤として利用できる。【０１４０】
実施例２で調製した１３種類の抗神経変性疾患剤を、各々、１０匹のｄｄｙマウス（平均体重２５．６ｇ）に、０．３ｍｌ／匹単回投与して、投与後１週間、毎日体重を測定しながら、経過を観察したところ、対照として１０匹のｄｄｙマウス（平均体重２６．３ｇ）に、０．２％のレシチンを含む１０％マルトース溶液を投与して、経過を観察した場合に比して、体重に優位な変化は認められず、他に外観的な変化も認められなかった。この結果は、実施例２で調製した１３種類の抗アルツハイマー病剤の有効成分として配合した化合物のＬＤ５０は、いずれも８．６ｍｇ／ｋｇ・体重以上となるので、これらの製剤がヒトに投与しても安全な製剤であることを物語っている。
【実施例３】
【０１４１】
＜注射用の粉末剤＞
注射用精製水３７０ｇに注射用精製マルトース（株式会社林原製造）６０ｇを溶解した溶液と、注射用精製水１７０ｇに、ポリソルベイト８０（日本油脂株式会社販売）３ｇと、有効成分として、ＮＫ−４（化学式２で表される化合物）、ＮＫ−２３４（一般式２で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が３である化合物）、ＮＫ−２６（化学式１で表される化合物）、ＮＫ−２８（一般式２で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が７である化合物）、ＮＫ−１４７（一般式２で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が８である化合物）、ＮＫ−１９（化学式４で表される化合物）、ＮＫ−５３（化学式５で表される化合物）、ＮＫ−１５０（化学式３で表される化合物）、ＮＫ−３９３（一般式３で表される化合物の側鎖のアルキル基（Ｒ）の炭素数が８である化合物）、ＮＫ−１００（化学式６で表される化合物）ＮＫ−５２８（化学式７で表される化合物）、ＮＫ−５５７（化学式８で表される化合物）、及び、ＮＫ−１５１６（化学式９で表される化合物）（いずれも株式会社林原生物化学研究所製造）のいずれか１種を、各々６０ｍｇ溶解した溶液とを混合して濾過滅菌後、褐色アンプルに１０ｍｌずつ分注し、常法により凍結乾燥後、窒素気流下でアンプルを封止した。本品は、いずれもパイロジェンフリーであり、用時に、アンプルに注射用精製水乃至生理食塩水２乃至１０ｍｌを加えて溶解し、点滴静注、皮下投与、腹腔内投与などの方法で使用する。本品は、いずれもパイロジェンフリーであり、抗アルツハイマー病剤として利用できる。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
本発明の抗アルツハイマー病剤は、アルツハイマー病の予防、治療及び／又は進展抑制、又は、アミロイドβペプチドなどのアルツハイマー病の原因となる神経細胞傷害因子からの神経細胞保護に有用である。また、アルツハイマー病に伴う認知障害や種々の病態や神経機能障害（例えば、振戦、固縮、無動、寡動、動作緩慢、姿勢反射障害、自律神経障害、突進現象、歩行障害、うつ、記憶障害、筋萎縮、筋力低下、上肢機能障害、構音障害、嚥下障害、呼吸障害、しびれ及び麻痺等）の改善にも有用である。しかも、本発明の抗アルツハイマー病剤は、長期間投与しても、副作用がないので、安全性が高く、安心して利用することができる。本発明は、斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に多大の貢献をする、誠に意義のある発明である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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