(57)【要約】  本発明は、魚の誘引行動および策餌行動を誘発する物質としてアデノシンを、およびアデノシンの受容体として新規アデノシン受容体を提供する。
2018186487.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノシンを含む、Ａ２ｃ受容体を活性化させることに用いるための組成物。
【請求項２】
水中に添加して魚の行動を制御することに用いるための組成物であって、アデノシンを含む、組成物。
【請求項３】
魚の行動制御が、食欲を増進すること、魚を誘引すること、及び／又は、策餌行動を活発化させることである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
アデノシンまたは請求項１〜３に記載の組成物を含む、魚の飼料。
【請求項５】
無魚粉化飼料である、請求項４に記載の飼料。
【請求項６】
アデノシンまたは請求項１〜３に記載の組成物を含む、釣り針または疑似餌のコーティング剤。
【請求項７】
Ａ２ｃ受容体タンパク質。
【請求項８】
請求項７に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項９】
請求項７に記載のタンパク質を発現する細胞。
【請求項１０】
請求項７に記載のタンパク質を認識する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類の行動制御技術、特には魚の誘引行動および策餌行動を誘発する物質並びにこれに関与するアデノシン受容体に関する。
【背景技術】
【０００２】
魚において嗅覚は、重要な感覚器官であり、策餌行動、求愛行動、危険回避行動など様々な重要な行動制御に関与している。これまでに食料源から放出されるヌクレオチドが様々な種の魚に感知されることが明らかにされている（非特許文献１）。【０００３】
アデノシンは、神経伝達物質として神経細胞に発現するアデノシン受容体に結合し、神経細胞の信号伝達を制御する。アデノシン受容体としては、これまでのところＰ１受容体としてＡ１受容体、Ａ２ａ受容体、Ａ２ｂ受容体およびＡ３受容体が発見されている。また、ヌクレオチドの受容体としては、Ｐ２受容体として、Ｐ２Ｘ受容体ファミリーとＰ２Ｙ受容体ファミリーとが発見されている。しかし、いずれの受容体がヌクレオチドの検知に関与しているのかは不明であった。【０００４】
魚の餌に関して、養魚用飼料の主原料は魚粉である。近年では、世界的な養殖漁業の増加と、魚粉の減産の影響から、魚粉の供給が追いつかず、魚粉の国際的な取引価格は高値で推移し、この状況は当面変わらないと予想されている。一方で、飼料への魚粉の配合比率を減少させると養魚の飼育成績は低下する。このような状況で、魚粉を代替できる、あるいは魚粉の使用量を減らした飼料の開発が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Carr, W. E. S. (1988). The Molecular Nature of Chemical Stimuli in the Aquatic Environment. (New York: Springer), pp. 3-27.
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、魚の誘引行動および策餌行動を誘発する物質としてアデノシンを提供し、およびアデノシンの受容体として新規アデノシン受容体を提供する。
【０００７】
本発明者らは、アデノシンが魚の誘引行動および策餌行動を誘発することを見出した。本発明者らはまた、上記誘引行動および策餌行動の誘発には、新規のアデノシン受容体が関与していることを見出し、Ａ２ｃ受容体と命名した。本発明者らはさらに、Ａ２ｃ受容体は、魚類に広く保存され、両生類もＡ２ｃ受容体遺伝子を有することが確認できること、および、Ａ２ｃ受容体のアデノシンの推定結合部位は種間で広く保存されていることを見出した。本発明はこれらの知見に基づく発明である。
【０００８】
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）アデノシンを含む、Ａ２ｃ受容体を活性化させることに用いるための組成物。
（２）水中に添加して魚の行動を制御するための組成物であって、アデノシンを含む、組成物。
（３）魚の行動制御が、食欲を増進すること、魚を誘引すること、及び／又は、策餌行動を活発化させることである、上記（２）に記載の組成物。
（４）アデノシンまたは上記（１）〜（３）に記載の組成物を含む、魚の飼料。
（５）無魚粉化飼料である、上記（４）記載の飼料。
（６）アデノシンまたは上記（１）〜（３）に記載の組成物を含む、釣り針または疑似餌のコーティング剤。
（７）Ａ２ｃ受容体タンパク質。
（８）上記（７）に記載のタンパク質をコードする核酸。
（９）上記（７）に記載のタンパク質を発現する細胞。
（１０）上記（７）に記載のタンパク質を認識する抗体。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、魚の誘引行動の評価系と魚がアデノシンに誘引することを示す。
【図２】図２は、魚がアデノシンに誘引することを示す。
【図３】図３は、新規アデノシン受容体として発見しＡ２ｃと命名した受容体の発現細胞がＡＴＰ刺激によりｃ−Ｆｏｓを発現する細胞と一致することを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、Ａ２ｃ受容体の特性解析のスキームを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ａ２ｃ受容体がアデノシン特異的に活性化し、ｃＡＭＰ産生を誘導することを示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、Ａ２ｃ受容体活性化によるｃＡＭＰ産生に対するアデノシンの効果とＡＴＰの効果との比較結果を示す。
【図５】図５は、Ａ２ｃ受容体遺伝子が存在する周辺のゲノム構造が種間で保存されていることを示す。
【図６】図６は、魚類２８種および両生類２種のＡ２ｃ受容体遺伝子の近隣接合法による系統樹を示す。
【発明の具体的な説明】
【００１０】
本明細書では、「魚類」には、いわゆる魚であり、特に軟骨魚類、および硬骨魚類（条鰭魚類）が含まれる。本明細書では、「ほ乳類」には、マウスやラットなどの齧歯類、サルやヒトなどの霊長類が含まれる。
【００１１】
本明細書では、アデノシンとは、アデニンとリボースとからなるヌクレオシドである。
【００１２】
本明細書では、アデノシン受容体とは、アデノシンに対するＧタンパク質共役型の受容体分子を意味する。アデノシン受容体は、Ｐ１受容体ともよばれ、ヒトではＡ１、Ａ２Ａ、Ａ２ＢおよびＡ３の４種類のサブタイプが知られている。なお、Ｐ２受容体は、細胞外ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＵＴＰ、ＵＤＰなど）をリガンドとする受容体であり、Ｐ２Ｘ受容体およびＰ２Ｙ受容体の２つのファミリーに大別され、上記アデノシン受容体とは異なる。
【００１３】
本明細書では、「有効量」とは、指定された用途に用いるために適した量を意味し、有効量の有効成分は、指定された用途で達成すべき目的を達成することができる。
【００１４】
本明細書では、「Ａ２ｃ受容体」とは、水生脊椎動物（魚類及び両生類）において広く発見されるアデノシン受容体のサブタイプであり、ｐａｒｐ１遺伝子の第４エキソンと第５エキソンとの間に存在するイントロンにｐａｒｐ１遺伝子の転写方向とは逆向きに存在する遺伝子である。ヤツメウナギ、サメおよび魚、さらには両生類にわたってＡ２ｃ受容体が見出されることから、魚類や両生類で共有されるアデノシン受容体であると考えられる。ゼブラフィッシュのＡ２ｃ受容体のｃＤＮＡの塩基配列は配列番号１に示され、アミノ酸配列は配列番号２に示されている。
【００１５】
Ａ２ｃ受容体は、配列番号１の塩基配列または配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、およびそのオーソログを含む。本明細書では、Ａ２ｃ受容体のオーソログとは、ゼブラフィッシュの配列番号１の塩基配列によりコードされる配列番号２のアミノ酸配列を有するＡ２ｃ受容体に対応する他の種のＡ２ｃ受容体を意味する。Ａ２ｃ受容体は、アデノシンとの結合に重要と考えられるＹ８２からＩ３５０の領域（この領域はヒトＡ１受容体のＹ１２からＩ２７４に対応する：配列番号３に示されるアミノ酸配列部分）において種を超えて広くアミノ酸配列が保存されている。従って、Ａ２ｃ受容体は、ゼブラフィッシュのＡ２ｃ受容体の塩基配列またはアミノ酸配列との相同性を元に特定することができる。また、Ａ２ｃ受容体は、ｐａｒｐ１遺伝子の第４エキソンと第５エキソンとの間に存在するイントロンにｐａｒｐ１遺伝子の転写方向とは逆向きに存在し、このシンテニーは種を超えて保存されていた。従って、Ａ２ｃ受容体は、ｐａｒｐ１遺伝子の第４エキソンと第５エキソンとの間に存在するイントロンを他のＡ２ｃ受容体との相同性に基づいて検索することで特定され得る。例えば、ｐａｒｐ１遺伝子の第４エキソンと第５エキソンとの間に存在するイントロンについて、例えば、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、例えば８０％以上、例えば９０％以上、または例えば９５％以上の配列類似性を有するアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子を検索することで特定され得る。類似性は、比較する２つの配列をアラインメントして決定される。アラインメントは、当業者に周知の方法、例えばＣｌａｓｔａｌ  Ｗを用いて行うことができる。Ｃｌａｓｔａｌ  Ｗでは、アライメントした２つの配列の類似性も決定することができる。
【００１６】
本発明によれば、Ａ２ｃ受容体タンパク質が提供される。Ａ２ｃ受容体タンパク質は水生脊椎動物において共通して見出される受容体である。また、Ａ２ｃ受容体は、アデノシンとの結合に重要と考えられるＹ８２からＩ３５０の領域（この領域はヒトＡ１受容体のＹ１２からＩ２７４に対応する）において種を超えて広くアミノ酸配列が保存されていることから、いずれの種のＡ２ｃ受容体もアデノシンと結合し、当該生物種の誘引行動を惹起するものと考えられる。本発明では、Ａ２ｃ受容体タンパク質の断片（例えば、細胞外領域）が提供される。Ａ２ｃ受容体タンパク質の細胞外領域は、膜貫通領域を有しないため、分泌型タンパク質であり得る。このようなＡ２ｃ受容体タンパク質の細胞外ドメインは、例えば、動物への免疫等に用いることができる。
【００１７】
本発明によれば、Ａ２ｃ受容体タンパク質またはその断片をコードする核酸が提供される。核酸としては、ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられ、ＤＮＡとしてはゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡが挙げられる。ＲＮＡとしては、メッセンジャーＲＮＡが挙げられる。
【００１８】
本発明によれば、Ａ２ｃ受容体タンパク質をコードする外来核酸が導入された脊椎動物細胞、特に魚類細胞、鳥類細胞、またはほ乳類細胞が提供される。細胞は、嗅覚神経細胞であってもよいし、非嗅覚神経細胞であってもよい。
【００１９】
本発明によれば、Ａ２ｃ受容体タンパク質を発現した細胞が提供される。Ａ２ｃ受容体タンパク質を発現した細胞は、嗅覚上皮組織からタンパク質分解酵素処理および／またはキレート剤処理により細胞を単離し、細胞表面に発現したＡ２ｃ受容体に対する抗体を用いて、例えばセルソーターを用いて単離することができる。Ａ２ｃ受容体タンパク質を発現した細胞としては、その他には、Ａ２ｃ受容体タンパク質を発現した同種細胞、異種脊椎動物細胞、異種魚類細胞、鳥類細胞、またはほ乳類細胞が挙げられる。ここで、「異種」とは、Ａ２ｃ受容体と細胞の種が異なることを意味する。また、「同種」とは、Ａ２ｃ受容体と細胞の種が一致することを意味する。細胞は、嗅覚神経細胞であってもよいし、非嗅覚神経細胞であってもよい。これらの細胞は、例えば、Ａ２ｃ受容体の機能を調べるために、または、Ａ２ｃ受容体に対する抗体の免疫原として用いることができる。
【００２０】
本発明によれば、Ａ２ｃ受容体タンパク質に結合する抗体が提供される。Ａ２ｃ受容体タンパク質に結合する抗体は、例えば、Ａ２ｃ受容体タンパク質を可溶化して動物に免疫することにより得ることができる。あるいは、Ａ２ｃ受容体タンパク質に結合する抗体は、Ａ２ｃ受容体タンパク質を強制発現させた細胞を動物に免疫して得てもよい。Ａ２ｃ受容体で免疫された動物からは、脾臓細胞を入手して、Ａ２ｃ受容体タンパク質に結合する抗体を産生するハイブリドーマや、Ａ２ｃ受容体タンパク質に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。従って、本発明では、Ａ２ｃ受容体タンパク質に結合するポリクローナル抗体、Ａ２ｃ受容体タンパク質に結合するモノクローナル抗体、Ａ２ｃ受容体タンパク質に結合する抗体を産生するハイブリドーマ、およびＡ２ｃ受容体タンパク質で免疫した哺乳動物または鳥類（例えば、ニワトリ）が提供される。抗体は、常法により、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体として得てもよい。
【００２１】
Ａ２ｃ受容体タンパク質に結合する抗体は、ある態様では、他のアデノシン受容体に対するよりも強い親和性（例えば、１０倍以上、１００倍以上、１０００倍以上）でＡ２ｃ受容体タンパク質に結合する。Ａ２ｃ受容体タンパク質に結合する抗体は、ある態様では、他のアデノシン受容体には実質的に結合しない。このようなＡ２ｃ受容体タンパク質に結合する抗体は、Ａ２ｃ受容体と他のアデノシン受容体との親和性に基づいて、当業者に周知の技術を用いて容易に得ることができる。Ａ２ｃ受容体タンパク質に結合する抗体は、ある態様では、Ａ２ｃ受容体の細胞外領域に結合する。これらの抗体は、例えば、Ａ２ｃ受容体のアフィニティー精製、Ａ２ｃ受容体の発現解析、Ａ２ｃ受容体の染色、Ａ２ｃ受容体のウェスタンブロット等の様々な用途に用いることができる。
【００２２】
本発明によれば、アデノシンを含む、Ａ２ｃ受容体を活性化させることに用いるための組成物が提供される。
【００２３】
Ａ２ｃ受容体を活性化させるとは、Ａ２ｃ受容体と反応して、Ａ２ｃ受容体シグナルを活性化することを意味する。Ａ２ｃ受容体シグナルの活性化は、Ａ２ｃ受容体発現細胞においてｃ−ｆｏｓの発現の増加またはｃＡＭＰの産生の増加により確認することができる。
【００２４】
本発明によれば、アデノシンを含む、魚の食欲を増進すること、魚を誘引すること、及び／又は、魚の策餌行動を活発化させることに用いるための組成物が提供される。アデノシンは、魚を誘引するだけでなく、泡のような餌としての機能を果たし得ないものへの求餌行動を誘発した。従って、アデノシンは、魚の食欲増進や策餌行動の活性化（活発化）に用いることができる。
【００２５】
また、このアデノシンの特性を利用して、アデノシンを魚のための飼料に混ぜることにより、魚が好む飼料となる。従って、本発明では、アデノシンを含む、魚の飼料、特には無魚粉化飼料（すなわち、魚粉を含まない飼料）が提供される。本発明ではまた、アデノシンを含む、釣り針または疑似餌のコーティング剤が提供される。上述の通り、アデノシンは、魚の食欲増進や策餌行動の活性化（活発化）に用いることができるが、水中では早くに拡散される特徴を有することから、当該コーティング剤としては、アデノシンを徐放する組成物を含むコーティング剤が好ましい。アデノシンを徐放する組成物としては、例えば、製剤として利用される徐放性材料にアデノシンを含有した組成物が挙げられる。当該徐放性材料としては、一般に徐放性製剤に用いられる製剤材料を利用することができる。本発明ではさらに、アデノシンを塗布した釣り針または疑似餌が提供される。本発明ではさらにまた、アデノシンを含むコーティングを有する釣り針または疑似餌が提供される。
【００２６】
本発明によれば、水生脊椎動物（例えば、魚類）においてアデノシン受容体を活性化させる方法であって、前記水生脊椎動物とアデノシンとを接触させることを含む、方法が提供される。本発明によれば、水生脊椎動物（例えば、魚類）の行動を制御する方法であって、前記水生脊椎動物とアデノシンとを接触させることを含む、方法が提供される。本発明によれば、水生脊椎動物（例えば、魚類）の食欲を増進する、魚を誘引する、及び／又は、策餌行動を活発化させる方法であって、前記水生脊椎動物とアデノシンとを接触させることを含む、方法が提供される。
【００２７】
本発明によれば、水生脊椎動物（例えば、魚類）を誘引する方法であって、水中に存在する水生脊椎動物に対して、誘引したい方向からアデノシンまたはアデノシンを含有する組成物を接触させることを含む方法が提供される。本発明によれば、水生脊椎動物（例えば、魚類および両生類）の策餌行動を活発化させる方法であって、水中に存在する水生脊椎動物にアデノシンまたはアデノシンを含有する組成物を与えることを含む方法が提供される。
【００２８】
本発明によれば、水生脊椎動物（例えば、魚類）の捕獲方法または漁業方法であって、水生脊椎動物を集めたい箇所にアデノシンまたはアデノシンを含有する組成物を添加することと、その後、当該箇所に集まった水生脊椎動物を捕獲することとを含む、方法が提供される。
【００２９】
本発明によれば、害魚（例えば、サメ、特定外来種など）を駆除または忌避する方法であって、対象とする害魚を目的の箇所に移動させるために、少なくとも当該目的の箇所にアデノシンまたはアデノシンを含有する組成物を放出することを含む方法が提供される。
【実施例】
【００３０】
実施例１：アデノシンによる魚の誘引行動
本実施例では、誘引物質として知られるアラニンを比較対象として、アデノシン、およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の誘引物質としての性質を検証した。【００３１】
５〜１５ヶ月齢の雄のゼブラフィッシュ１匹ずつを、０．０３％の合成海塩（TetraMarin Salt Pro, Tetra）を添加した６００ｍＬの逆浸透水中で少なくとも１時間以上順応させた。順応後、ＡＴＰアデノシンまたはアラニンを様々な濃度（１０−７〜１０−４Ｍ）で含む６００μＬの水を水槽に添加して、ゼブラフィッシュの行動を観察した。【００３２】
まず、試験毎に９〜１１回の反復実験を行い、平均移動度を求めた。平均移動度は、タンクの全長に対する添加前と添加後のゼブラフィッシュの移動距離の割合（％）として求めた。結果は図１に示される通りであった。【００３３】
図１に示されるように、統計学的に有意なゼブラフィッシュの誘引行動を引き起こすアラニン濃度は１００μＭであったのに対して、アデノシンでは１μＭで十分であった。ＡＴＰでは、高濃度（１００μＭ）で誘引行動が消失したのに対して、アデノシンではこの濃度でも誘引行動が維持された。【００３４】
次に、以下の誘引指数を指標としてゼブラフィッシュの誘引行動を観察した。
誘引指数＝｛（匂い物質側での滞在時間ｔ１）−（対照側での滞在時間ｔ２）｝／観察時間｛ここで、観察時間は、ｔ１＋ｔ２である。｝【００３５】
結果は、図２に示される通りであった。図２に示されるように、統計学的に有意なゼブラフィッシュの誘引行動を引き起こすアラニン濃度は１００μＭであったのに対して、アデノシンでは１μＭで十分であった。ＡＴＰでは、高濃度（１００μＭ）で誘引行動が消失したのに対して、アデノシンではこの濃度でも誘引行動が維持された。【００３６】
このことから、アデノシンに対してゼブラフィッシュは誘引行動を示すことが明らかとなった。【００３７】
また、ゼブラフィッシュの行動をより詳細に観察すると、アデノシンを添加した水槽ではゼブラフィッシュは水中の泡を食べようとして、泡を追いかけては口に入れようとする様子が観察された。このことから、アデノシンは、ゼブラフィッシュの誘引行動を引き起こすと共に、策餌行動を誘発することが明らかとなった。【００３８】
実施例２：アデノシン受容体の同定
上記誘引行動は、ゼブラフィッシュの嗅覚に基づくものであると考え、本実施例では、いずれのアデノシン受容体の活性化がアデノシンの上記誘引行動と関係するかを調べた。【００３９】
免疫組織化学染色
免疫組織化学染色のために嗅覚上皮（ＯＥ）の薄層切片を作製した。嗅覚上皮を常法によりパラホルムアルデヒドと１５％飽和ピクリン酸水溶液を含むリン酸緩衝液で４℃で一晩固定し、３０％スクロースを含むリン酸緩衝液で凍結保護して、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（Sakura, 4583）に包埋した。１０μｍ圧の切片をHistoVT One （Nacalai Tesque, 06380-05）で処理し、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と５〜１０％のヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水でブロッキングした。その後、ウサギ抗ｐＥＲＫ１／２モノクローナル抗体（1:500, Cell Signaling Technology, 4370）、およびラット抗ＧＦＰモノクローナル抗体（1:1000, Nacalai Tesque, 04404）で一晩インキュベートした。洗浄後、Ｃｙ３−標識ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（1:300, Jackson ImmunoResearch, 711-165-152）およびＡｌｅｘａ４８８−標識ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（1:300, Molecular Probes, A11006）で２〜４時間インキュベートした。その後、正立共焦点レーザー走査顕微鏡（FV1000, Olympus）で切片を観察した。【００４０】
In situハイブリダイゼーション
１３８種のＯＲ（Niimura, Y., and Nei, M. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 6039-6044）、６種のＶ１Ｒ（Saraiva, L. R., and Korsching, S. I. (2007) Genome Res. 17, 1448-1457）、１種のＶ２Ｒ（Alioto, T. S., and Ngai, J. (2006) BMC Genomics. 7, 309）、８５種のＴＡＡＲ（Hussain, A., Saraiva, L. R., and Korsching, S. I. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 4313-4318）、９種のＰ２Ｘ（Appelbaum, L. et al. (2007) Brain Res. 1174, 66-75）、１５種のＰ２Ｙ（下記登録番号）、９種のアデノシン受容体（Boehmler, W. et al. (2009） Gene Expr. Patterns 9, 144-151)、２９種のエクト−ヌクレオチダーゼ（Rosemberg, D. B. et al. (2010) Mol. Biol. 155, 230-240およびYang, Y. et al. (2012) Front. Immunol. 3, 314）、Ｇｏｌｆ（Ｇｎａｌ）およびＡＣＩＩＩ（Ａｄｃｙ３ｂ）のコード領域（それぞれ０．５〜１．５ｋｂ）について、ゼブラフィッシュのゲノムＤＮＡ、嗅覚上皮ｃＤＮＡ、または脳ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ベクターにクローニングした。ｃＲＮＡプローブは、Yabuki, Y. et al. (2016) Nat. Neurosci. 19, 897-904に記載の通り調製した。また、アンチセンスｃＲＮＡプローブは、ジゴキシゲニン標識ＵＴＰまたはフルオレセイン標識ＵＴＰを用いてＴ７またはＳＰ６ポリメラーゼを用いて合成した。なお、遺伝子とそのＧｅｎｂａｎｋ登録番号との関係は以下の通りであった：p2ry1 (XM_001343319)、p2ry1-like (XM_692784)、p2ry2.1 (XM_695238)、p2ry2.2 (XM_001340029)、p2ry2.3 (XM_017352075)、p2ry4(XM_005173268)、p2ry5.1 (BC056587)、p2ry5.2 (BC162776)、p2ry6 (ENSDARG00000042595)、p2ry8 (ENSDARG00000055560)、p2ry10 (NM_001089527)、p2ry11 (NM_001204454)、p2ry12 (NM_001308557)、pp2ry13 (XM_002664517)、p2ry14 (ENSDARG00000078833)、enpp1(NM_001030168)、enpp2 (NM_200603)、enpp4 (NM_001017887)、enpp5 (NM_001030176)、enpp6 (NM_001013527)、enpp7.1 (NM_001256805)、enpp7.2 (NM_001328040)、zgc:153896-001 (NM_001045194)、CD73 (NM_200932)、acp1 (NM_001014302)、acp2 (NM_001013337)、acp5a (NM_214773)、acp5b (NM_001002452)、acp6 (NM_001110380)、papl (NM_001099250)。【００４１】
二重蛍光in situハイブリダイゼーション
アデノシンに応答したゼブラフィッシュの嗅覚上皮の１０μｍ厚の組織切片を作製し、ジゴキシゲニン標識またはフルオレセイン標識ｃＲＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせた。フルオレセインは、ビオチン化抗フルオレセイン抗体（1:500, Vector, BA-0601）とＡｌｅｘａ４８８標識ストレプトアビジン（1:300, Molecular Probes, S11223）で検出し、ジゴキシゲニンは、アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（1:500, Roche, 11093274910）と反応させた後にHNPP/Fast Red substrate (HNPP Fluorescent Detection Set, Roche, 11758888001)で染色して検出した。【００４２】
その結果、いずれの既知の嗅覚受容体シグナルも、アデノシンで活性化されたｃ−ｆｏｓ陽性細胞と共染色されることは無かった。また、８種のアデノシン受容体全てを同様に観察したところ、いずれもｃ−ｆｏｓ陽性細胞と共染色されることは無かった。このことから、アデノシンは、確認した全ての嗅覚受容体およびアデノシン受容体を活性化するものではないことが明らかになった。【００４３】
実施例３：新規アデノシン受容体のクローニング
次に、ゼブラフィッシュゲノム上で既知のアデノシン受容体と一定の類似性を有する配列を調べていたところ、Ａ２ａａ、Ａ２ａｂおよびＡ２ｂと類似性を有する、新しい遺伝子を発見した。発見された遺伝子は、データベース上ではアノテーションされていない未知の遺伝子であり、本発明者らはこの新規遺伝子を「Ａ２ｃ」と命名した。ゼブラフィッシュのＡ２ｃ遺伝子のｃＤＮＡ配列は、配列番号１に示される。【００４４】
Ａ２ｃの発現を調べたところ、ゼブラフィッシュの嗅覚上皮で発現が観察された。特にＡ２ｃのｍＲＮＡは、嗅覚上皮の正中縫線の周辺の最表層の嗅覚神経の一部に発現を認め、この発現は、図３に示されるように、ＡＴＰ刺激により誘導されたｃ−ｆｏｓシグナルと顕著に共局在を示した。また、Ａ２ｃの発現細胞は、ＧｏｌｆおよびアデニリルシクラーゼＩＩＩ（ＡＣＩＩＩ）陽性であった。【００４５】
これらの結果から、新規アデノシン受容体として発見され、命名されたＡ２ｃ受容体がアデノシンに対するゼブラフィッシュの誘引行動の媒介する受容体であると考えられた。【００４６】
Ａ２ｃ受容体遺伝子をゼブラフィッシュ以外の魚類、両生類、は虫類、鳥類およびほ乳類で検索した。Ａ２ｃ受容体遺伝子は、図５に示されるように、ゼブラフィッシュでは、他の遺伝子ｐａｒｐ１遺伝子のイントロン中（第４エキソンと第５エキソンとの間）に逆向きに存在していた。そこで、メダカその他の魚類のゲノムを検索したところ、他の魚類および両生類においても、ｐａｒｐ１遺伝子のイントロン中にゼブラフィッシュのＡ２ｃ受容体遺伝子と相同性の高い配列が見出され、シンテニーが共通していることが明らかになった。このことから、ｐａｒｐ１遺伝子のイントロン中（第４エキソンと第５エキソンとの間）に存在し、ゼブラフィッシュのＡ２ｃ受容体遺伝子と相同性を有する、逆向きに配置された遺伝子がＡ２ｃ遺伝子であることが明らかとなった。【００４７】
また、Ａ２ｃ受容体遺伝子は、魚類および両生類には存在する一方で、は虫類、鳥類およびほ乳類のいずれの種にも存在しなかった。このことから、Ａ２ｃ受容体は、水生脊椎動物特有の受容体であり、生物が陸に上がる過程で消失したものと考えられた。【００４８】
なお、アデノシン受容体に関しては、アデノシンＡ１受容体とアデノシンとの複合体の構造が明らかとなっている（Gluknhova A. et al. (2017) Cell 168: 657-877）。この構造解析結果によると、Ａ１受容体のＹ１２、Ｌ８８、Ｆ１７１、Ｍ１７７、Ｗ２４７、Ｌ２５０、Ｌ２５３、Ｎ２５４、Ｙ２７１、およびＩ２７４がアデノシンとの結合に関与していることが明らかとなっており、Ａ２Ａ受容体でもこれらのアミノ酸は保存されていることが示されている。これらの保存されているアミノ酸について、ゼブラフィッシュＡ２ｃ受容体を確認したところ、高度に保存されていた。また、他の魚類および両生類においてもこれらのアミノ酸配列は高度に保存されていた。これらのことから、新しく発見されたＡ２ｃ受容体は、種を超えて保存され、アデノシンに応答する受容体であると考えられた。【００４９】
実施例４：Ａ２ｃ受容体の特性解析
本実施例では、新しく発見されたＡ２ｃ受容体の特性解析を行った。【００５０】
図４Ａに示されるように、ゼブラフィッシュのＡ２ｃ受容体のｃＤＮＡをクローニングし、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に強制発現させ、２４時間後にアデノシン、ＡＭＰ、ＡＤＰまたはＡＴＰにより刺激し、３０分後に細胞を回収した。細胞を超音波破砕して遠心分離した上清を回収し、精製されたｃＡＭＰ濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。陰性対照としては、溶媒、リボース、アデニン、グアノシン、シチジン、ウリジンまたはチミジンで刺激した細胞を用いた。結果は図４Ｂに示される通りであった。【００５１】
図４Ｂに示されるように、アデノシンで刺激した場合のみｃＡＭＰの産生が生じ、ＡＭＰ、ＡＤＰおよびＡＴＰでは全くｃＡＭＰ産生が見られなかった。【００５２】
また、図４Ｃでは、アデノシンとＡＴＰとを濃度をそれぞれ変えてより詳細に解析した結果を示す。図４Ｃに示されるように、アデノシンは、３．１５×１０−５ＭのＥＣ５０を有していたが、ＡＴＰは測定した濃度域では受容体を活性化することがなかった。【００５３】
このことから、Ａ２ｃ受容体は、アデノシンに選択的に反応して下流シグナルを活性化させる受容体であることが明らかとなった。【００５４】
図１および２によれば、ゼブラフィッシュは、ＡＴＰに対しても誘引行動を示す。ＡＴＰそのものはＡ２ｃ受容体を活性化しないため、ＡＴＰが分解されて生じるアデノシンが誘引行動の原因になっていると考えられた。【００５５】
上記実施例から魚および両生類がＡ２ｃ受容体を共通して有することが明らかになり、また、Ａ２ｃ受容体は、アデノシンによる魚の誘引行動の原因となっていることが明らかとなった。このことから魚および両生類では広くＡ２ｃ受容体を介してアデノシンへの誘引行動が生じることが明らかになった。【００５６】
実施例５：アデノシンによる魚の誘引行動
本実施例では、魚としてブリを用いてアデノシンへの誘引行動が生じることを確認した。【００５７】
生後５ヶ月程度、体長２０ｃｍ程度のぶりを直径１．５ｍの水槽で飼育した。水槽には、排泄物等が溜まらないように、一方向に流れる水流を設けた。ブリが水流の方向に沿って遊泳している際に、約１ｇのアデノシンを水槽に添加した。その結果、ブリは水流に逆らってアデノシン添加箇所に集まった。このように、アデノシンは魚に誘引行動を引き起こすことが確認された。
なお、実施例３で明らかとなった魚類および両生類のＡ２ｃ受容体の一部についての近隣接合法による系統樹を図６に示す。Ａ２ｃ受容体のアミノ酸配列は種を超えて高度に保存されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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