(57)【要約】  本発明は、ヒト毛乳頭細胞と毛嚢ケラチノサイト（毛嚢の主体をなす細胞。毛乳頭からのシグナルの受け手）を混合し、ヒト毛嚢構造をin vivoで再構成することを目的とする。本発明は、FGF系材料、BMP-2/BMP-4系材料及びWNT系材料の存在下で毛乳頭細胞を培養することを特徴とする、毛誘導能を維持した毛乳頭細胞の培養方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
FGF系材料、BMP-2/BMP-4系材料及びWNT系材料の存在下で毛乳頭細胞を培養することを特徴とする、毛誘導能を維持した毛乳頭細胞の培養方法。
【請求項２】
毛乳頭細胞を３次元的に培養することを特徴とする、請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
培養の継代数が３以下である、請求項１または２に記載の培養方法。
【請求項４】
毛乳頭細胞がヒト毛乳頭細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載の培養方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の培養方法で得られた毛乳頭細胞とケラチノサイトを共培養することを特徴とする毛嚢の再構成方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかの方法により得られた毛乳頭／毛乳頭細胞又は請求項５の方法により得られた毛嚢をヒトの頭皮に移植することを特徴とするヒト毛髪の再生方法。
【請求項７】
FGF系材料、BMP-2/BMP-4系材料及びWNT系材料を含む毛乳頭細胞を培養するための培地。
【請求項８】
FGF系材料、BMP-2/BMP-4系材料及びWNT系材料の存在下で毛乳頭細胞を培養して得られる毛髪再生用移植材料。
【請求項９】
毛乳頭細胞のPTX3の発現が抑制されている請求項８に記載の移植材料。
【請求項１０】
さらにケラチノサイトを含む、請求項８に記載の移植材料。
【請求項１１】
毛誘導能が低下もしくは消失した毛乳頭細胞を請求項７に記載の培地で培養することを特徴とする、毛乳頭細胞の毛誘導能を向上する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛乳頭細胞の培養方法、毛嚢の再構成方法、毛髪の再生方法に関し、詳しくは、毛嚢の発生、再生に重要な役割を果たすヒト毛乳頭細胞の毛誘導能を維持したまま培養する技術に関する。毛乳頭細胞は、平面的に培養されてもよく、３次元的ないし塊状に培養されて毛乳頭を再生させてもよい。
【背景技術】
【０００２】
脱毛性疾患が患者に与える苦痛は大きい。特に瘢痕性脱毛症と呼ばれる疾患群では毛嚢構造が完全に破壊されるため、毛嚢を再生医療の技術で再生し、移植する以外に治療法がない。ヒト毛嚢の構造を図１に示す。最下部の毛乳頭からのシグナルにより毛髪の伸長が決まるので、毛乳頭は毛嚢の司令塔であるといえる。【０００３】
毛嚢は毛幹（いわゆる毛髪）を中心にケラチノサイトと呼ばれる皮膚の角化細胞が多層の鞘を構成し、その底部（毛球部）に起源の異なる毛乳頭とよばれる細胞塊を有する構造をもつ（図１）。毛幹の伸長は毛乳頭からそれに接する毛母細胞と呼ばれるケラチノサイトに向けての成長因子、シグナルなどに依存し、また、毛嚢の発生にも毛乳頭が不可欠であることがすでに示されている。従って、毛嚢を再生するためには毛乳頭を再生することが非常に重要である。【０００４】
特にヒトの毛嚢の再生医療を考えると、スタートのマテリアル（ヒト毛嚢由来細胞）は可能な限り少なく、最終的に得られる再生組織は可能な限り多く得ることは大変重要である。そのためには、はじめに得られた毛嚢由来細胞を細胞培養操作により増やすステップが必須となる。毛乳頭細胞もその例外ではない。しかし、その反面、一般に培養という生体内とは全く異なるきわめて人工的な状況下では細胞の数は増やすことはできても、もともと生体内でその細胞が有していた生物学的特性を失う可能性が高いことが知られており、もともと細胞が持つ生物学的特性を維持しつつ培養し、培養された細胞を用いて組織を再構築することは再生医療における大きなテーマとなっている。【０００５】
以上を踏まえ、以下に毛乳頭細胞とその再生に関する従来技術を要約する。
(1) 長期培養した毛乳頭細胞は最も重要な毛誘導能を失ってしまう（マウス）(非特許文献１〜４)。
(2) 培養毛乳頭細胞の毛誘導能を反映する因子としてアルカリフォスファターゼなどいくつかのタンパクが知られている（ヒト、マウス）(非特許文献３，５〜１１)。
(3) 毛乳頭細胞をケラチノサイトにてコンディショニングした培養液あるいは外来因子（WNT、BMPなどのシグナル刺激因子）を添加した培養液で培養すると毛誘導能をある程度維持することができる（マウス）(非特許文献１〜３、１２)。
(4) ヒト毛乳頭細胞にWNT刺激因子を加えると毛誘導能を反映するいくつかの遺伝子の発現が上昇する。またこの毛乳頭細胞とケラチノサイトを組み合わせて培養すると毛嚢で発現するタンパクの発現を見る（特許文献１、非特許文献１，２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2008-29331
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kishimoto, J., Burgeson, R.E., and Morgan, B.A. 2000. Wnt signaling maintains the hair-inducing activity of the dermal papilla. Genes Dev 14:1181-1185.
【非特許文献２】Shimizu, H., and Morgan, B.A. 2004. Wnt signaling through the beta-catenin pathway is sufficient to maintain, but not restore, anagen-phase characteristics of dermal papilla cells. J Invest Dermatol 122:239-245.
【非特許文献３】Rendl, M., Polak, L., and Fuchs, E. 2008. BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties. Genes Dev 22:543-557.
【非特許文献４】Osada, A., Iwabuchi, T., Kishimoto, J., Hamazaki, T.S., and Okochi, H. 2007. Long-term culture of mouse vibrissal dermal papilla cells and de novo hair follicle induction. Tissue Eng13:975-982.
【非特許文献５】Limat, A., Hunziker, T., Waelti, E.R., Inaebnit, S.P., Wiesmann, U., and Braathen, L.R. 1993. Soluble factors from human hair papilla cells and dermal fibroblasts dramatically increase the clonal growth of outer root sheath cells. Arch Dermatol Res 285:205-210.
【非特許文献６】Handjiski, B.K., Eichmuller, S., Hofmann, U., Czarnetzki, B.M., and Paus, R. 1994. Alkaline phosphatase activity and localization during the murine hair cycle. Br J Dermatol131:303-310.
【非特許文献７】Yu, D.W., Yang, T., Sonoda, T., Gaffney, K., Jensen, P.J., Dooley, T., Ledbetter, S., Freedberg, I.M., Lavker, R., and Sun, T.T. 1995. Message of nexin 1, a serine protease inhibitor, is accumulated in the follicular papilla during anagen of the hair cycle. J Cell Sci 108 (Pt 12):3867-3874.
【非特許文献８】Kishimoto, J., Ehama, R., Wu, L., Jiang, S., Jiang, N., and Burgeson, R.E. 1999. Selective activation of the versican promoter by epithelial- mesenchymal interactions during hair follicle development. Proc Natl Acad Sci U S A 96:7336-7341.
【非特許文献９】Botchkarev, V.A., Botchkareva, N.V., Sharov, A.A., Funa, K., Huber, O., and Gilchrest, B.A. 2002. Modulation of BMP signaling by noggin is required for induction of the secondary (nontylotrich) hair follicles. J Invest Dermatol 118:3-10.
【非特許文献１０】Ito, M., Yang, Z., Andl, T., Cui, C., Kim, N., Millar, S.E., and Cotsarelis, G. 2007. Wnt-dependent de novo hair follicle regeneration in adult mouse skin after wounding. Nature 447:316-320.
【非特許文献１１】Iida, M., Ihara, S., and Matsuzaki, T. 2007. Hair cycle-dependent changes of alkaline phosphatase activity in the mesenchyme and epithelium in mouse vibrissal follicles. Dev Growth Differ49:185-195.
【非特許文献１２】Inamatsu, M., Matsuzaki, T., Iwanari, H., and Yoshizato, K. 1998. Establishment of rat dermal papilla cell lines that sustain the potency to induce hair follicles from afollicular skin. J Invest Dermatol111:767-775.
【非特許文献１３】大山  学、清水  篤、天谷雅行.  ヒト毛乳頭のmolecular signatureの解析-毛乳頭細胞の何が特別なのか?-  第14回分子皮膚科学フォーラム  松山、(2007.9)
【非特許文献１４】881 Ohyama M, Shimizu A, Kobayashi T and Amagai M.  Microarray analysis of freshly-microdissected intact human dermal papilla identified upregulation of genes that could contribute to biological distinctiveness.  International Investigative Deramtology 2008, Kyoto Japan   S147 881 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
毛嚢再生には再生に用いる細胞を培養することが重要であるが、齧歯類、ヒトを問わず毛乳頭細胞を培養すると、毛誘導能という毛嚢再生を考える上で最も重要な毛乳頭細胞の生物学的特性が失われる。従来技術により、それをある程度まで維持する培養条件が報告されているが、ヒト毛乳頭細胞に関しての検討は齧歯類と比較して大きく立ち遅れている。【０００９】
毛誘導能を維持する培養条件でのヒト毛乳頭細胞の培養とそれを用いたヒト毛乳頭の再生という観点から考えると、従来技術の最も大きな問題点は技術開発過程において、ヒト生体内（in vivo）の毛乳頭細胞を直接解析することなく、大きさ、ホルモン感受性などがヒト毛乳頭細胞とは異なる齧歯類の毛乳頭細胞またはヒトのその他の細胞（ＥＳ細胞）などで得られた知見をヒト毛乳頭細胞にあてはめていることがあげられる。たとえヒト毛乳頭細胞を解析対象にしていても、すでに培養したものを解析しており、生体内のヒト毛乳頭細胞を直接解析しているとは言い難い。さらに毛誘導能反映因子の発現を維持して培養したとの主張も、従来法で培養した毛乳頭細胞との比較であり、生体内の毛乳頭細胞と比較した場合のデータは示されていない。【００１０】
その理由は、毛乳頭は微細構造のため、生体内そのままの条件で毛乳頭細胞を分離・解析するには高度の技術を必要とするからである。また、従来技術では、毛誘導能を評価するin vivoの系がヒトでは確立されていないことから、主として既知の毛誘導能反映因子の発現の有無で毛誘導能を論じている点が問題である。【００１１】
本発明は、毛誘導能を有するヒト毛乳頭の再生法の確立を目的とする。具体的には、以下の(i)〜(iv)を目的とする。
(i) ヒト頭皮検体から得られたin vivo毛乳頭細胞の網羅的遺伝子発現プロファイルを得て、それを培養ヒト毛乳頭細胞の遺伝子発現プロファイルとし、また対照群として線維芽細胞の網羅的遺伝子発現プロファイルを検討し、培養操作により失われる因子を直接的に同定する。
(ii) 同定された因子を各種濃度、組合せにより補足した条件でヒト毛乳頭細胞を培養し、毛誘導能を最も維持すると考えられる培養条件を決定する。
(iii) 不足因子添加以外に培養ヒト毛乳頭細胞の毛誘導能に影響を与える要素があるか否かを検討する。特に「非特許文献４」におけるマウス毛乳頭細胞を用いた実験結果から考えれられるように、本来、生体内で細胞塊として３次元構造をとり存在する毛乳頭細胞は、２次元での培養条件よりも３次元の培養条件において毛誘導能を含めた生物学的特性を維持しやすい可能性がある。故に、３次元的に培養することでヒト毛乳頭の毛誘導能に良い影響を与えるか否かに重点をおき検討する。
(iv) 上記の検討の結果得られた最適な条件で培養・準備されたヒト毛乳頭細胞と毛嚢ケラチノサイト（毛嚢の主体をなす細胞。毛乳頭からのシグナルの受け手）を混合し、ヒト毛嚢構造をin vivoで再構成する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、以下の発明に関する。
項１．FGF系材料、BMP-2/BMP-4系材料及びWNT系材料の存在下で毛乳頭細胞を培養することを特徴とする、毛誘導能を維持した毛乳頭細胞の培養方法。
項２．毛乳頭細胞を３次元的に培養することを特徴とする、項１に記載の培養方法。
項３．培養の継代数が３以下である、項１または２に記載の培養方法。
項４．毛乳頭細胞がヒト毛乳頭細胞である、項１〜３のいずれかに記載の培養方法。
項５．項１〜４のいずれかに記載の培養方法で得られた毛乳頭細胞とケラチノサイトを共培養することを特徴とする毛嚢の再構成方法。
項６．項１〜４のいずれかの方法により得られた毛乳頭／毛乳頭細胞又は項５の方法により得られた毛嚢をヒトの頭皮に移植することを特徴とするヒト毛髪の再生方法。
項７．FGF系材料、BMP-2/BMP-4系材料及びWNT系材料を含む毛乳頭細胞を培養するための培地。
項８．FGF系材料、BMP-2/BMP-4系材料及びWNT系材料の存在下で毛乳頭細胞を培養して得られる毛髪再生用移植材料。
項９．毛乳頭細胞のPTX3の発現が抑制されている請求項８に記載の移植材料。
項１０．さらにケラチノサイトを含む、項８に記載の移植材料。
項１１．毛誘導能が低下もしくは消失した毛乳頭細胞を請求項７に記載の培地で培養することを特徴とする、毛乳頭細胞の毛誘導能を向上する方法。
【発明の効果】
【００１３】
毛嚢の発生、分化の司令塔ともいうべき毛乳頭の細胞、特にヒト毛乳頭細胞を直接解析し、その生体内の特性を維持しながら培養する技術を発明し、それが生体内における毛嚢構造の再生につながることを示したことから、ヒト毛嚢再生に向けての技術的礎を築くとともに、実用化を可能にした。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヒト毛嚢の構造。１：毛母細胞、２：毛乳頭。
【図２】既知の毛乳頭関連遺伝子の発現。新鮮ヒト毛乳頭(DP)、培養毛乳頭細胞(CulDP)、線維芽細胞(Fibro)。ALPL、VCAN、WIF1はマウスの実験において毛誘導能と密接に関連することが示されている。またVIMはFibroのマーカーである。それぞれの細胞分画からRNAの抽出に成功したことが示された。
【図３】一人の提供者から得られたDP、CulDP、Fibroのマイクロアレイの遺伝子発現パターンの相関（RはPearsonの相関係数。高いほど相関が強い。一個の点はある遺伝子の発現の強さを示す。点の分布範囲が線形で狭いほど両者のパターンが類似している。）。CulDPとFibroは高い相関を示しているが、DPとCulDP、Fibroの相関係数は低い。しかし、この提供者と他の提供者のDP(DP2)の相関係数は高い。つまりCulDPは培養によりFibroに近くなっていることが判る。
【図４】本発明により明らかとなったヒト新鮮分離毛乳頭細胞の培養操作により発現が失われる遺伝子群（代表例のみ示す）グループはそれぞれ異なるアルゴリズムで得られたことを示す。
【図５】ヒト、マウス新鮮分離毛乳頭細胞間で発現が高く保たれている遺伝子群。種を超えて発現が高く保たれているため毛乳頭細胞の生物学的特性を規定するために重要であると予想される。
【図６】ヒト新鮮分離毛乳頭で発現が上昇していたシグナル伝達系とそれらに関連する遺伝子群。
【図７】BMP2添加培養におけるヒト毛乳頭細胞の形態学的変化（培養４週後）
【図８】BIO添加培養におけるヒト毛乳頭細胞の形態学的変化（培養４週後）
【図９】FGF添加培養におけるヒト毛乳頭細胞の形態学的変化（培養４週後）
【図１０】各因子が培養ヒト毛乳頭細胞の毛誘導能関連遺伝子の発現に与える影響
【図１１】各因子の組合せ添加の培養条件が毛誘導能関連遺伝子発現に与える影響Cont(1)：10%FBS-DMEMで培養したヒト毛乳頭細胞;BIO 1(2)：BIO 1μM添加10%FBS-DMEMで培養したヒト毛乳頭細胞;BIO 1+ FGF(3)：BIO 1μM+FGF 10ng添加10%FBS-DMEMで培養したヒト毛乳頭細胞;BMP(4)：BMP2  100ng/ml添加10%FBS-DMEMで培養したヒト毛乳頭細胞;FGF+BIO+BMP(5)：BMP2  100ng/ml+BIO 1μM+FGF 10ng添加10%FBS-DMEMで培養したヒト毛乳頭細胞。
【図１２】３因子組合せのバリエイションが毛誘導能関連遺伝子の発現に与える影響。コントロールはCulDP(1)。条件特Ａ（５）では各遺伝子の発現が良好である。CulDP(1)：10%FBS-DMEMで培養されたヒト毛乳頭細胞。FGF10+ BIO1+BMP200(2)：BMP2  200ng/ml+BIO 1μM+FGF 10ng添加10%FBS-DMEMで培養されたヒト毛乳頭細胞。FGF10+ BIO1+BMP100(3)：BMP2  100ng/ml+BIO 1μM+FGF 10ng添加10%FBS-DMEMで培養されたヒト毛乳頭細胞。FGF20+ BIO1+BMP100(4)：BMP2  100ng/ml+BIO 1μM+FGF 20ng添加10%FBS-DMEMで培養されたヒト毛乳頭細胞。FGF20+ BIO1+BMP200(5)：BMP2  200ng/ml+BIO 1μM+FGF 20ng添加10%FBS-DMEMで培養されたヒト毛乳頭細胞。
【図１３】条件Ａ、条件特Ａで培養したヒト毛乳頭細胞の形態学的特徴。条件Aでは培養細胞が紡錘形でなく多角形で、かつ小型である。この傾向は条件特Ａにおいてより顕著である。
【図１４】培養毛乳頭細胞から作成した細胞塊。
【図１５（Ａ）】、
【図１５（Ｂ）】培養細胞からの細胞塊作成が毛誘導能関連遺伝子の発現に与える効果の検討。条件Aで培養し細胞塊を形成させたもの（Sphere GAS）では条件Aで培養しただけの細胞（CulDP GAS）と比較して各遺伝子（Ｘ軸）の発現がよりヒト新鮮分離毛乳頭（DP）に近い。DP(1)：ヒト新鮮分離毛乳頭細胞；  CulDP(2):  10%FBS-DMEMで培養したヒト毛乳頭細胞;CulDP GAS(3): 条件Aで培養したヒト毛乳頭細胞; Sphere cont(4): 10%FBS-DMEMで細胞凝集法で培養した対照ヒト毛乳頭細胞塊、Sphere GAS(5)：条件Ａで細胞凝集法で培養した本発明ヒト毛乳頭細胞塊。
【図１６】条件Aがヒト毛乳頭細胞の継代培養に与える影響。下の列が条件A。新鮮毛乳頭に近い毛誘導能関連因子の発現パターンを有する小型多角形の細胞は初代培養(P1)ではほとんどを占める。従来条件の紡錘形細胞が条件Aでも継代すると観察されるようになるが、継代３代目(P3)でもその割合は低い。
【図１７（Ａ）】、
【図１７（Ｂ）】条件Aがヒト毛乳頭細胞の継代培養下での生物学的特性維持に与える影響。バーのひとかたまりが一つの毛誘導能関連因子の遺伝子発現を示す。X軸左から右に向かって継代数が増加する。DP(1)はヒト新鮮分離毛乳頭細胞の遺伝子発現を示し、CulDP(2)、CulDP P2(4)、CulDP P3(6)、CulDP P4(8)、CulDP P5(10)は従来法（10%FBS-DMEM）で初代もしくは2〜5代継代培養したヒト毛乳頭細胞の遺伝子発現を示し、CulDP GAS(3)、CulDP GAS P2(5)、CulDP GAS P3(7)、CulDP GAS P4(9)、CulDP GAS P5(11)が条件Aで初代もしくは2〜5代継代培養したヒト毛乳頭細胞の遺伝子発現を示す。一番左、ALPLの発現を例にとると、従来条件（10%FBS-DMEM）では初代培養ですでに発現が大幅に低下しており、その後継代数を重ねるごとに発現が低下している。これに対し、条件Aでは継代３代目(CulDP GAS P3(7))までは発現が比較的良好に保たれている。
【図１８】条件Aで培養したヒト毛乳頭細胞とヒト毛嚢由来ケラチノサイト、ヒト線維芽細胞を混合し、免疫不全マウスに移植したところ毛嚢構造が再構成された（左）。しかし、ケラチノサイトと線維芽細胞のみではこのような所見は見られなかった（右）。
【図１９】ヒト毛乳頭の生物学的特性を維持する先行技術FGF+BIOに対する本発明の技術の優位性を毛誘導能関連遺伝子の発現強度（図１９のY軸）をもとに検討した結果。
【図２０（Ａ）】、
【図２０（Ｂ）】従来法で培養したヒト毛乳頭細胞を培養の途中で条件特Aに変更、あるいは継代培養２代目において従来法から条件特Aでの培養に変更し、毛乳頭細胞の生物学的特性が回復可能か否かを検討した結果を示す。図２０において、DP(1)：新鮮ヒト毛乳頭、CulDP(2)：10%FBS-DMEMで培養されたヒト毛乳頭細胞(遺伝子発現の基準)、sGAS(3)：条件特Ａで培養されたヒト毛乳頭細胞、sGAS (from cont)(4)：初代培養において途中まで10%FBS-DMEMで培養し途中で条件特Aに変更して培養したヒト毛乳頭細胞、CulDP P2(5)：10%FBS-DMEMで２代継代培養したヒト毛乳頭細胞、sGAS P2(6)：条件特Ａで２代継代培養したヒト毛乳頭細胞、sGAS P2(from P2)(7)：10%FBS-DMEMで培養した後、条件特Ａで継代培養したヒト毛乳頭細胞、CulDP P3(8)：10%FBS-DMEMで３代継代培養したヒト毛乳頭細胞、sGAS P3(from P2) (9)：10%FBS-DMEMで培養し、次いで条件特Ａで２代継代培養(合計３代継代培養)したヒト毛乳頭細胞、CulDP P4(10)：10%FBS-DMEMで４代継代培養したヒト毛乳頭細胞、sGAS P4(from P2) (11)：10%FBS-DMEMで培養し、次いで条件特Ａで３代継代培養(合計４代継代培養)したヒト毛乳頭細胞、sGAS P5(from P2) (12)：10%FBS-DMEMで培養し、次いで条件特Ａで４代継代培養(合計５代継代培養)したヒト毛乳頭細胞、をそれぞれ示す。
【図２１】培養後、細胞凝集塊を作成することにより、毛誘導能関連遺伝子の発現をさらに回復できることを示す。ＤＰ(1)：新鮮ヒト毛乳頭、Sphere control(2)：10%FBS-DMEMで細胞凝集法で培養した対照ヒト毛乳頭細胞、Sphere sGAS(3)：条件特Ａで細胞凝集法で培養した本発明ヒト毛乳頭細胞。
【図２２】本発明で得られたヒト毛乳頭細胞が生体内において実際に無毛部に毛を誘導する能力を持つことを示す。矢印は、誘導された毛嚢構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において、「Control」とは、10%FBS-DMEM培地で培養したヒト新鮮毛乳頭細胞を意味する。「DP」とは、新鮮毛乳頭細胞を意味する。
【００１６】
本明細書において、FGF系材料としては、FGFファミリーに属する蛋白質あるいはそれを毛乳頭細胞で誘導可能な物質を広く含む。FGFファミリーに属する蛋白質としては、bFGF(FGF2)、FGF7などが挙げられ、好ましくはbFGFが挙げられる。
【００１７】
本明細書において、BMP-2/BMP-4系材料としては、BMP-2、BMP-4もしくはその誘導体ないし類似体あるいはそれらを毛乳頭細胞で誘導可能な物質を広く含む。BMP-2またはBMP-4を誘導可能な物質としては、Nogginが挙げられる。
【００１８】
本明細書において、WNT系材料としては、WNTファミリーに属する蛋白質もしくはその誘導体ないし類似体あるいはそれを毛乳頭細胞で誘導可能な物質を広く含む。WNTファミリーに属する蛋白質としては、WNT5a、WNT3a、WNT10a、WNT10bなどが挙げられ、好ましくはWNT3aが挙げられる。WNTファミリーに属する蛋白質を誘導可能な物質としては、BIOを含むグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）の阻害活性を有するもの、またはSHHなどが挙げられる。
【００１９】
本明細書において、毛乳頭細胞を３次元的に培養するとは、例えば毛乳頭細胞を毛乳頭に類似した形状のプラスチック、ガラスなどの非生物由来の材料、あるいはコラーゲン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ゼラチンなどの生体適合性の適当な材料のフィルム、３次元ゲル、多孔質のスポンジなどの適当な３次元形状の容器ないし足場構造体の中で培養することを意味する。この培養物は、毛乳頭細胞とともにケラチノサイトを共培養してもよい。３次元に培養する利点としては、前述のごとく、本来、生体内で細胞塊として３次元構造をとり存在する毛乳頭細胞は、２次元での培養条件よりも３次元の培養条件において毛誘導能を含めた生物学的特性を維持しやすい可能性があるからである。
【００２０】
本明細書において、FGF、BMP-2/BMP-4、WNTなどの蛋白質は、ヒトの毛乳頭細胞に作用して毛誘導能を維持しながら継代培養できる限り特に限定されない。これらは、ヒト由来のものが好ましく使用できるが、ヒト以外の脊椎動物、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコなどのヒト以外の哺乳類、鶏、アヒルなどの鳥類由来のものも広く使用できる。
【００２１】
毛乳頭細胞とケラチノサイトは、毛嚢を再構成してヒトの頭皮に移植したときに、ヒトの毛髪を再生できるものが好ましく、ヒト由来の毛乳頭細胞とケラチノサイトが好適に使用できるが、ウシ、ウマ、ブタ、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコなどのヒト以外の哺乳類由来のものを用いることも可能である。
【００２２】
本発明者が実施例で使用した毛乳頭を含むサンプルは、すべて得られた直後の新鮮ヒトサンプルのみを用いているのが大きな特徴である。なお、ヒト検体の使用については慶應義塾大学医学部倫理委員会の承認のもと提供者の同意に基づいてのみ行われた。
本発明を完成するまでの技術的手段のポイントを以下に示す。
１．新鮮ヒト頭皮標本からのヒト毛乳頭の直接分離（分離検体を以下ヒト新鮮分離毛乳頭と記す）および分離検体からの従来法によるヒト培養毛乳頭細胞の作成。比較対照群としてのヒト頭皮真皮由来培養線維芽細胞の準備。
２．上記各細胞群からのRNAの抽出とそれを用いたマイクロアレイ（一度に約１万５千の遺伝子の発現の様式を検出するデバイス）の作成。
３．ヒト新鮮分離毛乳頭とヒト培養毛乳頭細胞、線維芽細胞との間でのマイクロアレイデータの比較検討。
４．マイクロアレイデータ解析の結論から導きだされるヒト新鮮分離毛乳頭の培養条件下に補足すべき因子（複数）の決定。
５．項目４で決定した各因子が培養ヒト毛乳頭細胞の生物学的特性（毛誘導能）に与える影響の検討（主として濃度条件の検討）。
６.上記各因子の組合せが培養ヒト毛乳頭細胞の毛誘導能に与える影響の検討。
７．添加因子以外に毛乳頭細胞の毛誘導能に影響を与える要素があるか否かの検討。
８．継代培養において不足因子添加下の培養条件がヒト毛乳頭細胞の毛誘導能にいかなる影響を与えるかについての検討。
９．上記検討の結果最適化した培養・準備条件で培養したヒト毛乳頭細胞とヒト毛嚢由来ケラチノサイトの混合移植によるヒト毛嚢再構成。
１０．先行条件（FGF+BIO）に対する本発明の優位性。
１１．本発明が、培養操作により一度失われたヒト毛乳頭細胞の生物学的特性を回復するかについての検討。
１２．本発明の条件で培養した後、再度細胞凝集して作成した再生ヒト毛乳頭と新鮮ヒト毛乳頭における誘導能関連遺伝子の発現の検討。
１３．本発明により生物学的特性を回復させたヒト毛乳頭細胞塊が生体内において実際に無毛部に毛を誘導する能力を有するか否かの検討。
【００２３】
以下に各ポイントについての詳細を記す。
１．ヒト新鮮分離毛乳頭の採取。および分離検体からの従来法によるヒト培養毛乳頭細胞の作成。比較対照群としてのヒト頭皮真皮由来培養線維芽細胞の準備
図１に示したように、マイクロダイセクション法（顕微鏡下操作）によりヒト頭皮標本からヒト新鮮分離毛乳頭を採取した。またこれを従来法により培養した。比較対照としてヒト頭皮組織より線維芽細胞を分離培養した。
【００２４】
２．各細胞群からのRNAの抽出とそれを用いたマイクロアレイの作成
ヒト新鮮分離毛乳頭、培養毛乳頭細胞、線維芽細胞からそれぞれ遺伝子の発現を反映するRNAを抽出した。マイクロダイセクションによって得られたヒト新鮮分離毛乳頭からはきわめて微量のRNAのみ抽出可能である。確実に毛乳頭からRNAが抽出されたことを確認するため、抽出されたRNAについて既知の毛乳頭関連遺伝子の発現を定量的PCR法を用いて検討したところ、線維芽細胞(Fibro)で上昇していることが知られるVIMを除いて、毛乳頭関連遺伝子はヒト新鮮分離毛乳頭（DP）で上昇しており微量サンプルからのRNAの抽出に成功したことが示された（図４）。また、これらの遺伝子発現は従来の培養条件で４週間培養後のヒト毛乳頭細胞(CulDP)では低下しており、改めて従来の培養条件では毛乳頭細胞の生物学的特徴が維持困難であることが示された。
【００２５】
４名の異なる提供者からDP、CulDP、FibroのRNAを同様の方法で採取し、それを増幅、ラベルしマイクロアレイとハイブリダイズさせた。マイクロアレイはAffymetrix社のHU133 2.0Aを用いた。一枚のマイクロアレイで解析対象の細胞について約１万５千の既知の遺伝子発現の様式を網羅的に知ることが可能である。つまり、それぞれの提供者についてDPのマイクロアレイとCulDP、Fibroのマイクロアレイを比較し、ある遺伝子がすべての提供者のＤＰのマイクロアレイでのみ発現が高ければ、それは培養によって失われてしまうヒト毛乳頭特異的な遺伝子である可能性が高いことになる。
【００２６】
実際に作成されたマイクロアレイのデータを解析したところ、CulDPとFibroの遺伝子発現のパターンの相関係数は0.98ときわめて高く、培養操作を加えることによりDPに特有の遺伝子発現パターンが失われ、Fibroに近い遺伝子発現パターンになっていくことが明らかとなり、従来の培養条件の欠点が浮き彫りとなった（図３）。
【００２７】
３．ヒト新鮮分離毛乳頭とヒト培養毛乳頭細胞、線維芽細胞との間でのマイクロアレイの比較検討
次に得られた４組のDP、CulDP、FibroのマイクロアレイをAffymetrix社のGeneChip Operation Software Ver1.4を用いて統計学的に解析し、DPで発現が高い遺伝子の同定を試みた。本研究においては３つの異なるアルゴリズムを用いることにより培養によりヒト新鮮毛乳頭細胞から失われる125個の遺伝子を同定した。ヒト新鮮分離毛乳頭に関する同様の解析は、我々の知る限りはじめての報告である。図４にその代表的な遺伝子を示す。この中には従来のマウス、ヒト毛乳頭細胞の研究では発現が知られていなかった遺伝子が多く含まれていた。
【００２８】
マイクロアレイの解析により培養操作により失われる遺伝子群は明らかになったが、そのうちのどの遺伝子が重要なのかについて知るためにはさらなる検討の工夫が必要である。マウスではすでに新鮮分離毛乳頭で発現の高い遺伝子群が明らかとなっている。種を超えて高い発現が保存されている遺伝子群は毛乳頭の生物学的特性を規定する重要な役割を果たしている可能性が高い。そこで過去に報告されているマウス毛乳頭関連遺伝子群と本発明により得られた遺伝子群でオーバーラップするものを調べたところ、図５に示す遺伝子群が同定された。
【００２９】
また、もう一つの解析のアプローチとして、個体の発生、分化に重要な役割を果たすシグナル経路ごとに同定された125個の遺伝子を分類したところ図６に示すようにＷＮＴ，SHHシグナル経路などいくつかのシグナル経路に関与する遺伝子が複数含まれることが明らかとなった。
【００３０】
４．マイクロアレイデータ解析の結論から導きだされるヒト新鮮分離毛乳頭の培養条件下に補足すべき因子（複数）の決定
項目３において得られた図５、６を比較検討すると、図４で示した培養操作によりヒト新鮮分離毛乳頭（ＤＰ）から発現が失われる遺伝子のうち、種を超えて毛乳頭に発現しており、かつ重要な生物学的シグナル経路に含まれる遺伝子はBMPシグナル系、WNTシグナル系、FGFシグナル系、NOTCHシグナル系のものが多いことが明らかとなった。マウスなどでの検討など過去の報告から、NOTCHシグナル系は毛乳頭細胞でも重要であるが、むしろ毛母細胞で重要であることを考慮し、ヒト毛乳頭細胞を新鮮分離の状態に維持しつつ培養するにはBMP、WNT、FGFのシグナル系を刺激する因子を外から加えることが必要ではないかとの結論に至った。
【００３１】
５．項目４で決定した各因子が培養ヒト毛乳頭細胞の生物学的特性（毛誘導能）に与える影響の検討（主として濃度条件の検討）
まず、ＢＭＰ、WNT、ＦＧＦシグナル系の刺激因子をそれぞれヒト毛乳頭培養培地に添加しそれぞれが培養細胞に与える条件を検討した。
【００３２】
ＢＭＰは元来、骨の成長因子として同定されたタンパクであり数多くのファミリー分子が存在する。本発明においては、ヒト新鮮分離毛乳頭から培養により失われ、かつ生体内で毛乳頭を取り囲む毛母細胞からも分泌されているBMP2というタンパクに注目した。ヒト新鮮分離毛乳頭細胞に従来の毛乳頭細胞培養条件（10%FBS-DMEM）にBMP2を様々な濃度で添加し培養を試みた。その結果、100ng/mlの濃度では従来の培養条件（コントロール）と比較して目立った変化は見られなかったが、200ng/mlの濃度では増殖速度が低下するかわりに細胞の形態が多角形様に変化し、何らかの生物学的特性がコントロールの培養条件と異なっている可能性が示唆された（図７）。しかし、さらに高濃度の400ng/mlの濃度ではほどんど毛乳頭細胞は増殖しなかった(図７)。
【００３３】
BMP-2は、100 ng/ml超、かつ、400ng/ml未満、好ましくは125〜375ng/ml、より好ましくは150〜350ng/ml、さらに好ましくは175〜325ng/ml、特に好ましくは200〜300ng/mlである。なお、BMP-2/BMP-4の誘導体ないし類似体、BMP-2/BMP-4の誘導物質などは、BMP-2の使用量を参考にして当業者であれば容易に決定できる。BMP-2/BMP-4は毛乳頭細胞の増殖を遅らせることになるが、その分だけFGFなどの増殖促進因子を多く使用すればBMP-2/BMP-4系材料が2μg/mlであっても毛乳頭細胞を増殖させることができる。従って、BMP-2/BMP-4系材料の使用量は、FGF、BIOなどの共存させる他の物質の量にも影響される。
【００３４】
次いでWNTシグナル系を刺激する化合物としてビスーインドロ（インジルビン）化合物BIOを使用した。BIOはWNTシグナルを刺激する化合物として広く用いられている。BIOの添加により細胞の増殖は著しく抑制され、1μM添加の条件で明らかなように毛乳頭細胞の形態はコントロールの紡錘形から多角形に変化している（図８）。また、濃度を2μM、4μMと上げるとほとんど増殖しないことも判明した。BIOの添加により培養ヒト毛乳頭細胞に何らかの変化が起きていることが考えられるが、高濃度のBIOの添加は実用性が低いことも明らかとなった。
【００３５】
BIOの好ましい添加量は、0.1〜2μg/ml、好ましくは0.2〜1.8μg/ml、より好ましくは0.4〜1.6μg/ml、さらに好ましくは0.6〜1.4μng/ml、特に好ましくは0.8〜1.2μng/mlである。なお、BIOのようなWNTの誘導物質あるいはWNTの誘導体ないし類似体は、BIOの使用量を参考にして当業者であれば容易に決定できる。また、WNTもしくはその誘導体ないし類似体もしくはその誘導物質(BIOなど)は毛乳頭細胞の増殖を遅らせることになるが、その分だけFGFなどの増殖促進因子を多く使用すればBIOが2μg/ml以上であっても毛乳頭細胞を増殖させることができる。従って、BIOなどのWNT系材料の使用量は、FGF、BIOなどの共存させる他の物質の量にも影響される。
【００３６】
FGFシグナル系の刺激因子としてはこれも神経系幹細胞の研究などに広く用いられているbasic-FGF(以下FGF)を使用した。FGFは線維芽細胞系の成長因子であり、特殊な線維芽細胞とも考えられる毛乳頭細胞の培養への添加により培養細胞の成長促進が期待される。実際にヒト新鮮分離毛乳頭細胞培養に様々な濃度のFGFを添加したところ10ng/mlから20ng/mlの濃度では毛乳頭細胞の増殖が促進されるが、40ng/mlの濃度では逆に抑制されることが明らかとなった（図９）。FGF系材料の好ましい使用量は、1ng/ml以上40ng/ml未満、好ましくは3〜35ng/ml程度、より好ましくは5〜30ng/ml程度、好ましくは7〜25ng/ml程度、特に好ましくは10〜20ng/ml程度である。FGF以外のFGF系材料については、FGFの使用量を参考にして当業者であれば適宜設定できる。FGF系材料の使用量は、WNT系材料、BMP2系材料の使用量、あるいはその他の条件によっても変動し得るので、これらの使用量は例示にすぎず、例示された範囲以外で使用してもよい。これは、WNT系材料、BMP2系材料についても当てはまる。
【００３７】
次いでこうした培養条件がマウスなどの実験で既知の毛誘導能と相関される遺伝子（ALPL、WNT5A、LEF1、HEY1、NOG、BMP4）の発現にいかなる影響を与えるかについて定量的PCR法にて検討した。比較対象としては、従来の培養条件で培養したヒト毛乳頭細胞(CulDP)のみならず、本発明の重要な特徴である、ヒト新鮮分離毛乳頭(DP)を用いた（図１０）。
【００３８】
BIOは特に2μMの濃度で各遺伝子の発現を維持し、ALPL、WNT5Aの発現はDPよりも添加培養後の方がむしろ高いほどであった。しかし、FGFはWNT5A、BMP2はNOGの発現をそれぞれ良好に維持することも判った（図１０）。これらの所見から、各添加因子はそれぞれ培養毛乳頭細胞に対して異なる作用を有し、その毛誘導能を最大限に維持するにはこれらの因子を組合せヒト毛乳頭細胞に作用させることが必要であると発想するに至った。
【００３９】
６．上記各因子の組合せが培養ヒト毛乳頭細胞の毛誘導能に与える影響の検討
次に項目５で検討した各添加因子を組み合わせた効果を検討した。まず、２つの因子を組み合わせた場合と項目５で検討した３つの因子すべてを組み合わせた場合に違いがあるかどうか既知の毛誘導能関連遺伝子であるHEY1、LEF1、WIF1に本発明の項目３までの検討で新たに発見した遺伝子であるRGS2、とこれも新たに発見した負の関連遺伝子（発現が低い程よい）PTX3の発現に与える影響について検討した(図１１)。  本発明とは異なり、生物学的な意味の解釈はないが、単なる成長因子として特許文献１においてFGFがBIOと組合せてヒト毛乳頭培養に使用されていることから、特許文献１に類似のBIO+FGFの組合せ（図１１の(3)）と、本発明によるBMP2+BIO+FGFの添加培養（図１１の(5)）により前述の毛誘導能関連遺伝子の発現が従来の培養条件で培養したヒト毛乳頭細胞（図１１の(1)）と比較してどのように変化するか定量的PCR法を用いて検討した。
【００４０】
図１１から明らかなように、本発明で提案する条件である３因子組合せの条件（５）において培養ヒト毛乳頭細胞における正の毛誘導能関連遺伝子であるHEY1、LEF1、WIF１の発現を良好に維持していることが明らかである。さらに重要なのは、ヒト新鮮分離毛乳頭においてほとんど発現していないPTX3の発現が本発明の３因子組み合わせ添加培養条件下では良好に抑制されていることである。本発明の培養条件がヒト毛乳頭細胞の本来の生物学的特性を失うことなく細胞培養を可能にしていることを強く示唆する所見である。
【００４１】
本発明においては図１１に用いた３因子の組合せ、BMP2  100ng/ml+BIO1μM+FGF10ng添加10%FBS-DMEM(5)の培養条件をヒト新鮮毛乳頭細胞の生物学的特性を維持しながら培養する基準条件と設定し、以下、“条件Ａ”と記載する。
【００４２】
BIOの濃度については図１１で判るように1μM以上に増加させた場合、増殖抑制効果が予想され、1μMが現実的な濃度であると考えられる。しかし、条件ＡのBMP2やFGFの濃度をさらに上げることでより良好な生物学的特性維持効果を期待できる。これを確認するために、条件AをもとにBMP2またはFGFの濃度を倍にした培養条件でヒト毛乳頭細胞を培養した。今まで同様、毛誘導能関連遺伝子の発現を定量的PCR法にて検討した（図１２）ところ、条件A（２）と比較してBMP2  200ng/ml+BIO1μM+FGF20ngの条件（５）がより良好に毛誘導関連遺伝子の発現を高めることが明らかとなった。
【００４３】
以下、BMP2  200ng/ml+BIO1μM+FGF20ng添加10%FBS-DMEMの添加条件を“条件特Ａ”と記載する。
【００４４】
条件Ａ、条件特Ａとも従来の条件と比較した場合に若干ヒト毛乳頭細胞の増殖速度には遅れが出るものの、十分実用に耐えうる増殖の程度である（図１３）。注目すべきは培養細胞の形態であり従来条件と比較して条件Ａでは細胞はほとんど紡錘形の形態をとらず、小型で多角形の形態を示し、その特徴は条件特Aにおいてより顕著であった（図１３）。      
【００４５】
この所見からも条件A、条件特Aが従来のヒト毛乳頭細胞培養条件とは異なる作用を有していることが伺える。
【００４６】
また、本発明方法ないし培地、特に条件Ａもしくは条件特Ａに関する方法ないし培地を用いれば、培養操作中に毛誘導能が低下又は消失したヒト毛乳頭細胞において、ヒト毛乳頭細胞に特有の生物学的特性を回復させることができる。
【００４７】
７．添加因子以外に毛乳頭細胞の毛誘導能に影響を与える要素があるか否かの検討
外来添加因子の多くは生体内のヒト毛乳頭およびそれを取り囲む毛母細胞から分泌されている因子であったことから考えると、ヒト毛乳頭細胞の生物学的特性を維持する条件とは、いわば生体内での毛乳頭細胞の状態をシミュレートした状態だともいえる。生体内における毛乳頭細胞の一番の特徴は細胞同士が凝集し３次元構造をもつ細胞塊を形成することである。そこで、培養した毛乳頭細胞から細胞塊を作成し（図14）、それが毛乳頭細胞の毛誘導能関連因子の発現に影響を与えるか否かについて検討した。細胞凝集塊の作成には細胞が付着しにくい丸底の細胞培養皿に培養ヒト毛乳頭細胞を入れ皿ごと遠心した。
【００４８】
次に条件Aにて培養したヒト毛乳頭細胞と、その細胞を用いて作成した細胞塊について毛誘導能関連因子の発現をヒト新鮮分離毛乳頭細胞と定量PCR法を用いて比較検討した（図15）。条件Aで培養したヒト毛乳頭細胞（CulDP GAS）と比較して、それを細胞塊にしたもの（Sphere GAS）における各遺伝子の発現はヒト新鮮分離毛乳頭（DP）にかなり近づいている。つまり、項目４?６までで検討された不足因子の添加による培養に毛乳頭細胞を凝集させるという物理的手法と組み合わせることによりヒト新鮮分離毛乳頭に近い遺伝子発現プロファイル＝生物学的特性を有する細胞塊（再生ヒト毛乳頭類似構造）を作成し得ることが示された。
【００４９】
８．継代培養において不足因子添加下の培養条件がヒト毛乳頭細胞の毛誘導能にいかなる影響を与えるかについての検討
一般に細胞の数を十分に確保するため、また、細胞の密度を適切に保ち、良好な増殖能力を維持するために培養器具内で培養細胞が過密になる前に細胞を回収し、数を調整した後新しく培養するという操作が必要になる。これを培養細胞の継代という。この継代操作は前述したような利点がある反面、操作を繰り返すことにより培養細胞の生物学的特性が失われていくという欠点もある。事実、マウス毛乳頭細胞の培養では継代を繰り返すと毛誘導能関連因子の発現が低下し、in vivoでの毛嚢再構成ができなくなることが示されている。
【００５０】
特にヒト組織の再生を考えた場合、スターティングマテリアルが限られている可能性が高く、継代操作を繰り返し十分な細胞数を確保する必要が生じる可能性が高い。従って、継代操作を経ても、もともとその細胞がもつ生物学的特性を維持可能な培養条件を定義することが非常に重要である。
【００５１】
そこで本発明においても、この視点から本発明で決定した条件Aがヒト毛乳頭細胞の継代培養において、本来の生物学的特性の維持にいかなる作用を有するか検討した。
【００５２】
その結果、条件Aで培養すると、継代を進めても初代培養の細胞形態を維持しうることが明らかとなった（図16）。
【００５３】
次に、この形態学的変化が実際の毛誘導能関連因子の発現様式に反映されているか否かを検討するため、いままでと同様に定量的PCR法により検討した（図17）。その結果、従来法（10%FBS-DMEM）で培養したヒト毛乳頭細胞（CulDP(2)、CulDP P2(4)、CulDP P3(6)、CulDP P4(8)、CulDP P5(10)）継代を重ねるたびに毛誘導能関連因子の発現が失われていくが、条件Aで継代した場合では（CulDP GAS(3)、CulDP GAS  P2(5)、CulDP GAS  P3(7)、CulDP GAS  P4(9)、CulDP GAS  P5(11)）徐々に発現が低下してはいくものの、ある程度、ヒト新鮮毛乳頭細胞の遺伝子発現のレベルと比較可能な発現レベルが維持されていることが判った（図17）。つまり本発明の培養条件の継代培養における毛乳頭細胞の生物学的特性維持作用も示された。
【００５４】
９．上記検討の結果最適化した培養・準備条件で培養したヒト毛乳頭細胞とヒト毛嚢由来ケラチノサイトの混合移植によるヒト毛嚢再構成
いままでの検討では、毛誘導能関連因子の遺伝子発現パターンがヒト新鮮分離毛乳頭のそれにいかに近づけることができるかで培養条件の最適化をはかってきた。しかし、最終的には、こうして作成された毛乳頭がin vivoの条件下で実際に毛嚢を再構成できるか否かを検討することが必要である。前述のごとく、齧歯類では毛嚢由来ケラチノサイト（角化細胞）と毛乳頭細胞を免疫不全マウスに混合移植することより毛嚢を再構成することが可能である。しかし、ヒト、特に毛嚢再生による治療の対象となる瘢痕性脱毛症の患者はそのほとんどが成人であるが、成人ヒトの細胞を利用した安定した毛嚢再構成系は未だ確立していないのが現状である。確立が困難な理由の一つとして、毛嚢再構成の場として使用するは免疫不全マウスの体内であり、ヒト細胞にとって異種の環境である可能性が考えられる。そこで本発明においては、従来のヒト毛嚢由来ケラチノサイトに単に培養毛乳頭細胞を加えるのではなく、新たにヒト由来線維芽細胞を追加混合し免疫不全マウスに移植する系を工夫した。  ヒト毛嚢由来ケラチノサイトと条件Aで培養したヒト毛嚢由来毛乳頭細胞、およびヒト線維芽細胞を混合し免疫不全マウスの皮下に移植したところ皮下に嚢腫様構造を形成し、嚢腫様構造の中に毛嚢構造を認めた（図18）。しかし、ヒトケラチノサイトと線維芽細胞のみ混合した場合には同様の所見は得られなかった。以上より、条件Aで培養したヒト毛乳頭細胞はin vivoの条件下で毛嚢構造を再生しうることが示され、毛嚢誘導因子の遺伝子発現量をリードアウトとする本発明の理論的根拠が支持された。
【００５５】
１０．先行条件（FGF+BIO）に対する本発明の優位性
ヒト毛乳頭の生物学的特性を維持する先行条件（FGF+BIO）に対する本発明の技術(sGAS)の優位性を毛誘導能関連遺伝子の発現強度（図１９の縦軸）をもとに検討した。それぞれのパネルはそれぞれ一つの毛誘導能関連遺伝子の各種条件による違いを示す。
NOGはその発現が失われると毛嚢形成が起きなくなることが示されている毛誘導に非常に重要な遺伝子である。NOGのパネルを見て明らかなように、先行条件ではヒト毛乳頭細胞の特性を失わせる従来の培養方法と比較して同等程度しか発現が得られていない。これに対して、条件特Aでは新鮮ヒト毛乳頭（DP）と比較すれば劣るものの、従来法(CulDP)や先行技術の条件（FGF+BMP、FGF+BIO）と比較して良好なNOGの発現が得られている。NOGほど明らかではないものの、この傾向は他の毛誘導能関連遺伝子であるLEF1あるいはBAMBIでも同様であり、条件特Aの優位性が見て取れる。ALPLでは先行条件下での遺伝子発現が条件特Aより強くなっているが、新鮮ヒト毛乳頭の発現レベルを超えている。発現を良好に保つというより過剰な発現を誘導している。新鮮毛乳頭との発現レベルの強さの違い幅に関して言えば条件特Aの方が少ない。また先行条件とは異なる新しい条件であるFGF+BMPについてはNOGの発現こそ良好であるものの毛誘導能に関与するもう一つの重要な因子であるALPLの発現が先行条件、条件特Aと比較して極めて低く、適切とは言い難い。
【００５６】
先行条件やFGF+BMPと比較して本発明では生体内におけるヒト毛乳頭の生物学的特性が良好に保たれることが明らかとなった。
【００５７】
１１．本発明が、培養操作により一度失われたヒト毛乳頭細胞の生物学的特性を回復するかについての検討。
ヒト毛乳頭細胞の培養における最大の問題点は従来法で培養した場合、細胞の増殖は良好に保たれるものの、その生物学的特性が失われてしまうことにあった。ところが、先行条件などの生物学的特性を維持する条件では培養細胞の増殖速度が著しく障害されてしまう欠点があった。もし、本発明の条件Aあるいは特Aが、一度培養操作で失われた特性を回復させることが出来れば、まず、従来条件で増殖させたヒト毛乳頭細胞の生物学的特性を改めて回復させることにより大量の特性を維持した毛乳頭細胞を得ることが可能となる。そこで、まず従来法で培養したヒト毛乳頭細胞を培養の途中で条件特Aに変更、あるいは継代培養２代目において従来法から条件特Aでの培養に変更し、毛乳頭細胞の生物学的特性が回復可能か否かを検討した。
【００５８】
図２０に検討結果を示す。基準（Y軸のゼロ、Cul DP(2)）は従来法（10%FBS-DMEMで培養したヒト毛乳頭細胞）における各遺伝子の発現を示す。DP(1)は新鮮ヒト毛乳頭、sGAS(3)が条件特Aで初代から培養した場合の初代培養終了時の遺伝子発現。sGAS (from cont)(4)が初代培養において途中まで従来法で培養し途中で条件特Aに変更した場合、sGAS P2(from P2)(7)、sGAS P3(from P2) (9)、sGAS P4(from P2) (11)、sGAS P5(from P2) (12)は、初代が10%FBS-DMEMで培養し、次いで条件特Ａで継代培養したヒト毛乳頭細胞を各々示す。CulDP P2(5)、CulDP P3(8)、CulDP P4(10)は、10%FBS-DMEMで初代から継代培養したヒト毛乳頭細胞をそれぞれ示す。バーのひとかたまりが一つの遺伝子を示す。例として毛誘導とその発現がはっきりと相関することが実験的に示されているNOGで実験結果を説明する。まず、DP(1)で示される新鮮分離ヒト毛乳頭と比較して、Cul DP(2)、CulDP P2(5)、CulDP P3(8)、CulDP P4(10)で示される従来法による初代培養とその継代培養でのNOGの発現は極めて低いことが判る。つまりヒト毛乳頭細胞の特性の一つが長期にわたる従来法での培養で失われていく様子が見て取れる。しかし、初代から条件特Aで培養した場合（３，５）、途中で従来法から条件特Aに変更した場合（４）、継代２代目から条件特Aに変更した場合（７，９，１１，１２）のいずれにおいてもNOGの発現が新鮮毛乳頭のそれと比較して良好に保たれていることが判る。また、この傾向は多少の差異こそあるものの、他の遺伝子においても同様であった。図２０により、従来法で培養を続け、その生物学的特性が失われていても、途中から条件特Aに変更することにより失われた生物学的な特性を回復可能であることが示された。これは特性を維持した毛乳頭の大量供給を可能にする知見であり、本発明の大変重要な技術的特徴である。
【００５９】
１２．本発明の条件で培養した後、再度細胞凝集して作成した再生ヒト毛乳頭と新鮮ヒト毛乳頭における誘導能関連遺伝子の発現の検討
本来、生体内において細胞塊を形成している毛乳頭細胞は、培養の後でも凝集させることにより生物学的特性をある程度回復させることが可能である。そこで、条件特Aにおいて培養後、細胞凝集塊を作成することにより、新鮮毛乳頭と比較してどの程度毛誘導能関連遺伝子の発現を回復させることができるのか新たに検討した。細胞凝集法としては細胞を接着しない特殊加工を施した丸底プレート(low-cell binding plate)に培養毛乳頭細胞を培養液ごと入れ、プレートごと軽く遠心する方法を採用した。結果を図２１に示す。
【００６０】
図２１中、ＤＰ（１）は新鮮毛乳頭細胞、Sphere control (２)は、培地として10%FBS-DMEMを用いて丸底プレートにより細胞凝集法で培養したヒト毛乳頭細胞を示し、Sphere sGAS (３)は、条件特Ａを用いて丸底プレートにより細胞凝集法で培養したヒト毛乳頭細胞を示す。
【００６１】
図２１においてＹ軸の基準は従来法で培養し、同様に細胞凝集塊を作成した場合のX軸に示された各遺伝子の発現レベルである。条件特Aで培養後、細胞凝集して作成したSphere sGAS (３)において、多くの毛誘導能関連遺伝子の発現レベルが新鮮ヒト毛乳頭ＤＰ（１）と比較した場合、遜色ない、あるいは場合により優れていることが明らかとなった。
【００６２】
１３．本発明により生物学的特性を回復させたヒト毛乳頭細胞塊は生体内において実際に無毛部に毛を誘導する能力を持つ
条件特Aと細胞凝集により遺伝子発現の観点からは生物学的特性を維持した再生ヒト毛乳頭を作成可能なことが明らかとなったが、作成された再生毛乳頭が実際に生体内で毛誘導能を有するか否かを評価する必要がある。そこで、マウスの無毛部（足底皮膚）を採取し、再生ヒト毛乳頭を表皮・真皮境界部に移植し、その組織を免疫不全マウスに移植した。無毛部に毛嚢構造を認めれば、それは移植した再生毛乳頭によるものであると考えられる。
【００６３】
実際、２-３週後、移植片を採取したところ、図２２の右図に示すように従来法にて培養し細胞凝集したヒト毛乳頭細胞塊では毛嚢様構造はみられなかったが、左図に示すように、条件特Aで培養後、細胞凝集して得られた再生ヒト毛乳頭の移植部では表皮が陥入し毛嚢様構造を認めた。この所見から本発明の技術を用いて生体内のヒト毛乳頭と同様の生物学的特性を有する再生ヒト毛乳頭を本発明の技術により作成可能であることが示された。
【００６４】
以上まとめると、本発明の技術的手段と作用は
１） 従来されていなかった、直接ヒト新鮮分離毛乳の網羅的遺伝子発現解析を行う。
２） １）で得られた発現プロファイルを培養ヒト毛乳頭細胞、線維芽細胞と比較検討し従来の培養操作で失われる因子を明らかにした。
３） 因子を様々な濃度、組合せでヒト毛乳頭細胞培養に添加し、毛誘導関連遺伝子の発現解析から生物学的特性をもっとも維持する培養条件を最適化。
４） 最適化された条件で培養した毛乳頭細胞からヒト毛乳頭類似の細胞塊を作成し、細胞塊を作成すること自体が毛乳頭細胞の生物学的特性維持に寄与することを示した。
５） 最適化された条件を用いて一度従来法による培養操作にて失われたヒト毛乳頭細胞の生物学的特性を回復させることが可能である。
６） 最適化された条件で培養したヒト毛乳頭細胞を細胞凝集させて作成した再生ヒト毛乳頭が生体内で実際に無毛部に毛嚢構造を誘導した。
ということである。
参考文献／先行技術
１）毛乳頭細胞の分離・培養技術  文献(1)
２）毛乳頭の毛誘導能因子とそれを確認するための毛嚢再構成などのアッセイ  文献(2-4,5,7,8)
３）毛誘導能を維持するための試み  文献(3,5,6)
４）毛乳頭細胞塊の作成技術  (6,9)
５）ヒト毛嚢由来細胞を用いた毛嚢再構成実験  文献(10)
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(10) Ehama, R., Ishimatsu-Tsuji, Y., Iriyama, S., Ideta, R., Soma, T., Yano, K., Kawasaki, C., Suzuki, S., Shirakata, Y., Hashimoto, K., et al. 2007. Hair follicle regeneration using grafted rodent and human cells. J Invest Dermatol 127:2106-2115.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５（Ａ）】
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【図１５（Ｂ）】
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【図１６】
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【図１７（Ａ）】
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【図１７（Ｂ）】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０（Ａ）】
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【図２０（Ｂ）】
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【図２１】
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【図２２】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年12月16日(2009.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ系材料、ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−４系材料及びＷＮＴ系材料の存在下で毛乳頭細胞を培養することを特徴とし、前記ＦＧＦ系材料がｂＦＧＦであり、ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−４系材料がＢＭＰ−２／ＢＭＰ−４であり、ＷＮＴ系材料がＢＩＯであり、培養液中のｂＦＧＦの濃度が５〜３０ｎｇ／ｍｌ、ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−４の濃度が１５０〜３５０ｎｇ／ｍｌであり、ＢＩＯの濃度が０．１〜２μｇ／ｍｌである、毛誘導能を維持した毛乳頭細胞の培養方法。
【請求項２】
培養液中のｂＦＧＦの濃度が１０〜２０ｎｇ／ｍｌ、ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−４の濃度が２００〜３００ｎｇ／ｍｌ、ＢＩＯの濃度が０．８〜１．２μｇ／ｍｌである、請求項１に記載の毛乳頭細胞の培養方法。
【請求項３】
培養液中のｂＦＧＦの濃度が２０ｎｇ／ｍｌ、ＢＭＰ−２の濃度が２００ｎｇ／ｍｌ、ＢＩＯの濃度が１μｇ／ｍｌである、請求項１又は２に記載の毛乳頭細胞の培養方法。
【請求項４】
毛乳頭細胞を３次元的に培養することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の培養方法。
【請求項５】
培養の継代数が３以下である、請求項１〜４のいずれかに記載の培養方法。
【請求項６】
毛乳頭細胞がヒト毛乳頭細胞である、請求項１〜５のいずれかに記載の培養方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の培養方法で得られた毛乳頭細胞とケラチノサイトを共培養することを特徴とする毛嚢の再構成方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかの方法により得られた毛乳頭／毛乳頭細胞又は請求項７の方法により得られた毛嚢をヒトの頭皮に移植することを特徴とするヒト毛髪の再生方法。
【請求項９】
ＦＧＦ系材料、ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−４系材料及びＷＮＴ系材料を含み、前記ＦＧＦ系材料がｂＦＧＦであり、ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−４系材料がＢＭＰ−２／ＢＭＰ−４であり、ＷＮＴ系材料がＢＩＯであり、培養液中のｂＦＧＦの濃度が５〜３０ｎｇ／ｍｌ、ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−４の濃度が１５０〜３５０ｎｇ／ｍｌであり、ＢＩＯの濃度が０．１〜２μｇ／ｍｌである、毛乳頭細胞を培養するための培地。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載の培養方法で得られた毛乳頭細胞とケラチノサイトを含む、毛髪再生用移植材料。
【請求項１１】
毛誘導能が低下もしくは消失した毛乳頭細胞を請求項９に記載の培地で培養することを特徴とする、毛乳頭細胞の毛誘導能を向上する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
［００３３］
ＢＭＰ−２は、１００ｎｇ／ｍｌ超、かつ、４００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１２５〜３７５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１５０〜３５０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１７５〜３２５ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは２００〜３００ｎｇ／ｍｌである。なお、ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−４の誘導体ないし類似体、ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−４の誘導物質などは、ＢＭＰ−２の使用量を参考にして当業者であれば容易に決定できる。ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−４は毛乳頭細胞の増殖を遅らせることになるが、その分だけＦＧＦなどの増殖促進因子を多く使用すればＢＭＰ−２／ＢＭＰ−４系材料が２μｇ／ｍｌであっても毛乳頭細胞を増殖させることができる。従って、ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−４系材料の使用量は、ＦＧＦ、ＢＩＯなどの共存させる他の物質の量にも影響される。
［００３４］
次いでＷＮＴシグナル系を刺激する化合物としてビス−インドロ（インジルビン）化合物ＢＩＯを使用した。ＢＩＯはＷＮＴシグナルを刺激する化合物として広く用いられている。ＢＩＯの添加により細胞の増殖は著しく抑制され、１μＭ添加の条件で明らかなように毛乳頭細胞の形態はコントロールの紡錘形から多角形に変化している（図８）。また、濃度を２μＭ、４μＭと上げるとほとんど増殖しないことも判明した。ＢＩＯの添加により培養ヒト毛乳頭細胞に何らかの変化が起きていることが考えられるが、高濃度のＢＩＯの添加は実用性が低いことも明らかとなった。
［００３５］
ＢＩＯの好ましい添加量は、０．１〜２μｇ／ｍｌ、好ましくは０．２〜１．８μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．４〜１．６μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．６〜１．４μｇ／ｍｌ、特に好ましくは０．８〜１．２μｇ／ｍｌである。なお、ＢＩＯのようなＷＮＴの誘導物質あるいはＷＮＴの誘導体ないし類似体は、ＢＩＯの使用量を参考にして当業者であれば容易に決定できる。また、ＷＮＴもしくはその誘導体ないし類似体もしくはその誘導物質（ＢＩＯなど）は毛乳頭細胞の増殖を遅らせることになるが、その分だけＦＧＦなどの増殖促進因子を多く使用すればＢＩＯが２μｇ／ｍｌ以上であっても毛乳頭細胞を増殖させることができる。従って、ＢＩＯなどのＷＮＴ系材料の使用量は、ＦＧＦ、ＢＩＯなどの共存させる他の物質の量にも影響される。
［００３６］
ＦＧＦシグナル系の刺激因子としてはこれも神経系幹細胞の研究などに広く用いられているｂａｓｉｃ−ＦＧＦ（以下ＦＧＦ）を使用した。ＦＧＦは線維芽細胞系の成長因子であり、特殊な線維芽細胞とも考えられる毛乳頭細胞の培養への添加により
【国際調査報告】
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