(57)【要約】  本発明は、毒素Ａおよび毒素Ｂを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除するための組成物、および当該組成物をエビ類に投与するまたは摂取させることを含むエビ類毒素Ａおよび毒素Ｂを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除するための組成物であって、毒素Ａに対する抗体を含む、前記組成物。
【請求項２】
毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌が、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）、ビブリオ・オウェンジー（Vibrio owensii）、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、またはビブリオ・カンプベリイ（Vibrio campbellii）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
毒素Ａに対する抗体が、毒素Ａで免疫した鶏の卵より得られる鶏卵抗体である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
毒素Ａに対する抗体が、毒素Ａに対するＩｇＹ抗体である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
感染症が、エビ類の早期死亡症候群／急性肝すい臓壊死病（EMS／AHPND）である、請求項１または２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
組成物がエビ類餌料である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項７】
毒素Ａに対する抗体を含む全卵粉末を、組成物重量に対して０．１％〜２０％含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物をエビ類に投与する、または摂取させることを含む、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毒素Ａおよび毒素Ｂを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除するための組成物、および当該組成物をエビ類に投与するまたは摂取させることを含むエビ類毒素Ａおよび毒素Ｂを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＭＳまたはＡＨＰＮＤ（早期死亡症候群または急性肝すい臓壊死病；以下、本明細書においてＥＭＳ／ＡＨＰＮＤと表記することがある。）は、近年被害が拡大しているエビ類の感染症で、その原因菌は特殊タイプの腸炎ビブリオ（ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus））である。【０００３】
一般的に、海水中にはビブリオ・パラヘモリティカスが常在しているが、特殊タイプのビブリオ・パラヘモリティカスのみがエビ類に病原性を示すことが分かっており、この特殊タイプの腸炎ビブリオが産生する毒素Ａおよび毒素Ｂがエビへの致死因子として働く可能性が報告されている（非特許文献１、２）。また、毒素Ａまたは毒素Ｂの組換え体を用いた試験では、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方が存在する場合に、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤの病態が生じ、用量依存的に死亡率が上昇するが、毒素Ａまたは毒素Ｂいずれかが単独で存在する場合には死亡率は認められないことが報告されている（非特許文献３）。【０００４】
また、ビブリオ属の他の種である、ビブリオ・オウェンジー（Vibrio owensii）、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、またはビブリオ・カンプベリイ（Vibrio campbellii）も、毒素ＡおよびＢを発現し、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを引き起こすことが報告されている（非特許文献４〜６）。【０００５】
エビ類においては、抗体を介した特異的免疫機能が存在しないといわれており、エビ類の感染症にして能動免疫による感染防除効果は期待できない。エビ類における感染症に対する防除対策として抗生物質を用いる方法があるが、抗生物質の多用に伴い耐性菌の出現といった問題点もある。【０００６】
エビ類における感染症に対するその他の防除対策として、受動免疫が注目されている。受動免疫による感染症の防除方法は、病原体に対する抗体を対象に投与するまたは摂取させることにより、当該病原体による感染症を防除する手法である。エビ類について、病原体を抗原とした鶏卵由来ＩｇＹを経口投与することで感染症防除効果が得られたことが報告されている（特許文献１、非特許文献７）。ＩｇＹとは、鶏が持つ免疫グロブリンであり、主に卵黄に存在する。抗原を用いて鶏に免疫した際に、当該抗原に特異的なＩｇＹが作られた後、卵内の卵黄に移行することから、動物の命を犠牲にすることなく特異的抗体を大量かつ安価に生産できる手法として注目されている。【０００７】
ここで、非特許文献７は、ビブリオ・パラヘモリティカスの菌体そのものを抗原としたＩｇＹを用いることを記載している。しかし、その生存率は６０％程度（すなわち、ＩｇＹ摂取により致死率が４０％程度に抑制された）にとどまっている。【０００８】
エビ類におけるＥＭＳ／ＡＨＰＮＤについて、より高い生存率を達成するために有効な防除方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平５−２５５１１３
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Tinwongger, S., et al., J. Appl. Microbiol., 2016 Dec;121(6):1755-1765
【非特許文献２】Lee, C. T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2015 Aug 25; 112(34):10798-803
【非特許文献３】Sirikharin, R., et al., PLOS ONE, 2015 May 27; 10(5): e0126987
【非特許文献４】Liu, L., et al., Genome Announc., 2015 Dec 3; 3(6):e01395-15
【非特許文献５】Kondo, H., et al., Genome Announc., 2015 Sep 17; 3(5):e00978-15
【非特許文献６】Xiao J., et al., Sci. Rep., 2017 Feb 7; 7:42177
【非特許文献７】Gao, X., et al., Int. J. Mol. Sci., 2016 May; 17(5): 723
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、毒素Ａおよび毒素Ｂを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除するための組成物、および当該組成物をエビ類に投与するまたは摂取させることを含むエビ類毒素Ａおよび毒素Ｂを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除する方法を提供する。本明細書において、処置方法は、防除方法、治療方法および予防方法を包含する。防除方法は、治療方法および予防方法を包含する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
以上に鑑み、本件の発明者は、特殊タイプの腸炎ビブリオが産生する毒素Ａおよび毒素Ｂに注目し、研究を開始した。鋭意検討の結果、毒素Ａに対するＩｇＹが、エビ類のＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによる死亡率を劇的に低減することを見いだした。当該知見に基づいて、本発明は完成された。【００１３】
すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
［１］毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除するための組成物であって、毒素Ａに対する抗体を含む、前記組成物。
［２］毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌が、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）、ビブリオ・オウェンジー（Vibrio owensii）、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、またはビブリオ・カンプベリイ（Vibrio campbellii）である、上記［１］に記載の組成物。
［３］毒素Ａに対する抗体が、毒素Ａで免疫した鶏の卵より得られる鶏卵抗体である、上記［１］または［２］に記載の組成物。
［４］毒素Ａに対する抗体が、毒素Ａに対するＩｇＹ抗体である、上記［１］または［２］に記載の組成物。
［５］感染症が、エビ類の早期死亡症候群／急性肝すい臓壊死病（EMS／AHPND）である、上記［１］または［２］のいずれか１項に記載の組成物。
［６］組成物がエビ類餌料である、上記［１］または［２］に記載の組成物。
［７］毒素Ａに対する抗体を含む全卵粉末を、組成物重量に対して０．１％〜２０％含む、上記［６］に記載の組成物。
［８］上記［１］〜［８］のいずれか１項に記載の組成物をエビ類に投与する、または摂取させることを含む、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除する方法。
［９］上記［１］〜［８］のいずれか１項に記載の組成物をエビ類に投与する、または摂取させることを含む、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を処置する方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ビブリオ属細菌の毒素Ａに対する抗体を含む組成物が、有効に毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌による感染症を防除するために有効であることが示された。本発明の組成物は、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによるエビ類の死亡率を２０％以下にまで低減することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、感染実験の結果を示すグラフである。縦軸は累積死亡率を示し、横軸はＡＨＰＮＤ菌体を浸漬感染させた後の時間を示す。グラフ中、Controlは、免疫していないニワトリ由来の鶏卵粉末を給餌した区；Ａは、試験区Ａの全卵粉末を含む餌料を給餌した区；Ｂは、試験区Ｂの全卵粉末を含む餌料を給餌した区；ＡＢは、試験区ＡＢの全卵粉末を含む餌料を給餌した区；ＡＢｍｉｘは、試験区ＡＢｍｉｘの全卵粉末を含む餌料を給餌した区；を示す。
【図２】図２は、感染実験の結果を示すグラフである。縦軸は累積死亡率を示し、横軸はＡＨＰＮＤ菌体を浸漬感染させた後の時間（日数）を示す。グラフ中、コントロール−１は、免疫していないニワトリ由来の全卵粉末を１重量％含む餌料を与えた区；コントロール−１０は、免疫していないニワトリ由来の全卵粉末を１０重量％含む餌料を与えた区；ｔｏｘｉｎＡ−１は、試験区Ａの全卵粉末を１重量％含む餌料を与えた区；ｔｏｘｉｎＡ−１０は、試験区Ａの全卵粉末を１０重量％含む餌料を与えた区；を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
【００１７】
定義
本明細書において「エビ類」とは、クルマエビ科（family Panaeidae）に属するエビをいう。クルマエビ科に属するエビは、例えばバナメイエビ、ブラックタイガー、クルマエビであってもよい。
【００１８】
本明細書において「毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌」とは、ビブリオ属細菌であって、毒素Ａおよび毒素Ｂを発現する細菌を意味する。そのような細菌には、ビブリオ・パラヘモリティカス、ビブリオ・オウェンジー、ビブリオ・ハーベイ、またはビブリオ・カンプベリイであって、毒素ＡおよびＢを発現する細菌が含まれる。好ましい態様において、「毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌」は、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ・パラヘモリティカスであってもよい。
【００１９】
本明細書において「毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症」とは、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌の感染により引き起こされるエビ類の疾病であれば特に限定されない。当該感染症にはエビ類のＥＭＳ／ＡＨＰＮＤが含まれる。「毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症」を、本明細書において単に「エビ類の感染症」と表記することがある。
【００２０】
本明細書において「毒素Ａ」とは、ビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ａ（アミノ酸配列は配列番号２に示され、それをコードする塩基配列は配列番号１に示される）、またはその変異体もしくはホモログである。ビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ａは、GenBankアクセッション番号AB972427.1に開示される塩基配列の１１１９〜１４５４番目のヌクレオチドによりコードされる。
【００２１】
本明細書において「毒素Ｂ」とは、ビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ａ（アミノ酸配列は配列番号４に示され、それをコードする塩基配列は配列番号３に示される）、またはその変異体もしくはホモログである。ビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ｂは、GenBankアクセッション番号AB972427.1に開示される塩基配列の１４６７〜２７８３番目のヌクレオチドによりコードされる。
【００２２】
本明細書において「変異体」とは、元となるタンパク質のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入もしくは付加された配列を有するタンパク質を意味してもよい。「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入もしくは付加された」とは、対象となるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸（例えば、アミノ酸配列の全長に対して３０％、好ましくは２５％、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％または１％のアミノ酸）が欠失しているか、他のアミノ酸に置換されているか、他のアミノ酸が挿入されているか、および／または他のアミノ酸が付加されていることを意味する。
【００２３】
上記のうち置換は、好ましくは保存的置換である。保存的置換とは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることであるが、もとの配列の構造に関する特徴を実質的に変化させなければいかなる置換であってもよく、例えば、置換アミノ酸が、もとの配列に存在するらせんを破壊したり、もとの配列を特徴付ける他の種類の二次構造を破壊したりしなければいかなる置換であってもよい。以下に、アミノ酸残基の保存的置換について置換可能な残基ごとに分類して例示するが、置換可能なアミノ酸残基は以下に記載されているものに限定されるものではない。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、メチオニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、
Ｅ群：セリン、スレオニン
Ｆ群：フェニルアラニン、チロシン
【００２４】
非保存的置換の場合は、上記種類のうち、ある１つのメンバーと他の種類のメンバーとを交換することができる。例えば、不用意な糖鎖修飾を排除するために上記のＢ、Ｄ、Ｅ群のアミノ酸をそれ以外の群のアミノ酸に置換してもよい。または、３次構造でタンパク質中に折りたたまれることを防ぐためにシステインを欠失させるか、他のアミノ酸に置換してもよい。あるいは、親水性／疎水性のバランスが保たれるように、または合成を容易にするために親水度を上げるように、アミノ酸に関する疎水性／親水性の指標であるアミノ酸のハイドロパシー指数（J. Kyte およびR. Doolittle, J. Mol. Biol., Vol.157, p.105-132, 1982）を考慮して、アミノ酸を置換してもよい。
【００２５】
あるいは、本明細書において「変異体」とは、元となるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を意味してもよい。好ましくは、「変異体」は、元となるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性％を決定することもできる。そのようなコンピュータープログラムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴおよびＣｌｕｓｔａｌＷ等があげられる。特に、ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、Altschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)に記載されたもので、ＮＣＢＩやDNA Data Bank of Japan（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから公的に入手することができる（ＢＬＡＳＴマニュアル、Altschulら NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894；Altschulら）。また、遺伝情報処理ソフトウエアGENETYX Ver.7（ゼネティックス）、DNASIS Pro（日立ソフト）、Vector NTI（Infomax）等のプログラムを用いて決定することもできる。
【００２６】
本明細書においてビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ａまたは毒素Ｂの「ホモログ」とは、他のビブリオ属細菌由来の毒素Ａまたは毒素Ｂであってもよい。好ましくは、ビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ａまたは毒素Ｂの「ホモログ」は、ビブリオ・オウェンジー、ビブリオ・ハーベイ、またはビブリオ・カンプベリイ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂであってもよい。
【００２７】
本明細書において「毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除する」とは、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌の感染を防ぎ、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症の発症を防ぐ作用を意味する。エビ類の感染症の防除効果は、エビ類の感染症による死亡率の低減効果により評価してもよい。エビ類はＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによりほぼ１００％死滅する。ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによる死亡率が、処置しない区と比較して低減した場合は、エビ類の感染症を防除したと判断することができる。好ましい態様において、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによる死亡率が５０％以下、４０％以下、３０％以下、２５％以下、または２０％以下に低減した場合に、エビ類の感染症を防除したと判断してもよい。
【００２８】
エビ類の感染症を防除するための組成物
本発明は、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除するための組成物であって、毒素Ａに対する抗体を含む、前記組成物に関する。当該組成物を、以下、本明細書において「本発明の組成物」と表記することがある。各構成についての範囲は、上記「定義」の項目において記載した通りである。
【００２９】
毒素Ａに対する抗体は、毒素Ａに対して特異的な抗体であれば特に限定されない。
【００３０】
一態様において、毒素Ａに対する抗体は、毒素Ａで免疫した鶏の卵より得られる鶏卵抗体である。「鶏卵抗体」とは、鶏の卵に含まれる抗体である。鶏を抗原で免疫することにより、当該抗原に特異的な抗体が作られ、卵内の卵黄に移行することが知られている。また、鶏卵抗体には、主にＩｇＹ（免疫グロブリン・クラスＹ）が含まれることが知られている。好ましい態様において、本発明の組成物に含まれる毒素Ａに対する抗体は毒素Ａに対するＩｇＹ抗体である。
【００３１】
毒素Ａに対する抗体は、例えば、鶏を毒素Ａで免疫し、免疫した鶏から得られた卵の全卵または卵黄より得ることができる。ここで、毒素Ａで鶏を免疫する際には、接種源に含まれる抗原は毒素Ａのみとする。複数の抗原で鶏を免疫する場合は、他の抗原は、毒素Ａを接種した部位とは異なる部位に接種する。鶏を毒素Ａで免疫する際の接種回数および接種量は、鶏の卵において毒素Ａに対する抗体が生じる条件であれば特に限定されない。例えば、鶏は毒素Ａで複数回、例えば、３回、５回、７回、または１０回接種することが、鶏卵における抗体価を上げるために好ましい。また、１回あたりの接種量は、０．１〜５．０ｍｇ／ｍＬ、０．３〜３．０ｍｇ／ｍＬ、０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬ、または０．７ｍｇ／ｍＬであることができる。
【００３２】
毒素Ａで免疫した鶏から得られた卵の全卵または卵黄を粉末化したものを、毒素Ａに対する抗体を含む材料として使用してもよい。毒素Ａに対する抗体を含む全卵粉末を用いることが好ましい。全卵粉末を用いることにより、卵を卵白と卵黄とに分離する、ＩｇＹ抗体を分離する等の工程を減らすことができ、組成物の製造コストの低減を図ることができる。
【００３３】
一態様において、本発明の組成物は、エビ類餌料である（以下、「本発明のエビ類餌料」と記載することがある）。エビ類餌料は、毒素Ａに対する抗体と公知のエビ類用の餌料（例えば、市販のエビ類用の餌料）と混合することにより得てもよい。例えば、毒素Ａに対する抗体を含む全卵粉末と公知のエビ類用の餌料を混合することにより、エビ類餌料を得てもよい。毒素Ａに対する抗体を含む全卵粉末を用いる場合、組成物重量に対して全卵粉末を０．１重量％以上、０．５重量％以上、１．０重量％以上、５．０重量％以上、１０重量％以上含むように調整してもよい。組成物重量に対する全卵粉末の含有量の上限に特に制限はなく、当業者が適宜設定することができる。組成物の製造コストを考慮する場合、組成物重量に対する全卵粉末の含有量は２０重量％以下とすることが好ましい。
【００３４】
エビ類の感染症を防除するための方法
本発明は、本発明の組成物をエビ類に投与する、または摂取させることを含む、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類感染症を防除する方法に関する。以下、本明細書において「本発明のエビ類の感染症を防除するための方法」と表記することがある。各構成についての範囲は、上記「定義」の項目において記載した通りである。また、「本発明の組成物」については上記「エビ類の感染症を防除するための組成物」の項目において説明した通りである。
【００３５】
本発明の組成物をエビ類に投与する、または摂取させることを開始する時期は、エビ類の養殖期間内であって、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌への感染が確認されない段階であればいかなる時期であってもよい。好ましくは孵化直後または養殖開始直後より本発明の組成物のエビ類への投与・摂取を開始する。また、本発明の組成物をエビ類に投与する、または摂取させる期間は、エビ類の養殖期間の全範囲に渡っていてもよい。
【００３６】
一態様において、本発明のエビ類の感染症を防除するための方法は、本発明のエビ類餌料をエビ類に摂取させることを含む方法であってもよい。本発明のエビ類餌料については上述の通りである。その際、餌量は、一日あたりエビ類体重の３〜１０重量％、３〜７重量％、４〜６重量％、または５重量％を、一日に数回に分けて摂取させてもよい。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３８】
実施例１：ＩｇＹの調製
ビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ａおよび毒素Ｂの組換えタンパク質を、大腸菌を用いて調製した。【００３９】
ニワトリに６週間ごとに組換えタンパク質（毒素Ａおよび／または毒素Ｂ）を１ｍＬ（０．７ｍｇ／ｍＬ）注射した。注射は計５回行った。１回の注射につき、１ｍＬをニワトリの胸と足の２箇所に分けて注射した。ＩｇＹは、免疫したニワトリにおいて作られた後、当該ニワトリの卵内の卵黄に移行する。以下の４つの試験区に分けて、ＩｇＹを調製した。【００４０】
試験区Ａ：毒素Ａの組換えタンパク質を注射した。【００４１】
試験区Ｂ：毒素Ｂの組換えタンパク質を注射した。【００４２】
試験区ＡＢ：毒素Ａの組換えタンパク質を１箇所に注射し、毒素Ｂの組換えタンパク質を別の箇所に注射した。【００４３】
試験区ＡＢｍｉｘ：毒素Ａと毒素Ｂの組換えタンパク質を混合したものを注射した。【００４４】
実施例２：ＩｇＹ含有餌料の調製
実施例１において免疫したニワトリから得られた卵の全卵を粉末化し、全卵粉末を得た。また、対照区として何も免疫されていない鶏から得られた全卵粉末も用意した。餌料は市販のエビ用餌料と混ぜて作成し、最終的な餌の重量に対し全卵粉末の含有率Ｘ重量％（Ｘは数値）という形で表した。成型には、市販のエビ用餌料と全卵粉末を滅菌蒸留水と混ぜ合わせ、シリンジを用いてトレーに餌の形に整形し、６０℃のオーブンで約２時間乾燥させ、４℃で保存した。対照区、試験区合わせて５種類のＩｇＹ含有餌料を得た。【００４５】
実施例３：感染実験（１）
方法
感染試験には、ＡＨＰＮＤ  ＴＵＭＳＡＴ株（発明者が分離したビブリオ・パラヘモリティカスの株であって、毒素Ａおよび毒素Ｂを発現することが確認された株）を用いてバナメイエビを感染させ、実施例２で調製したＩｇＹ含有餌料（全卵粉末の含有率２０％）を与えて死亡率を確認することにより防除効果を調べた。【００４６】
感染試験を行った際の水槽における条件は、塩分濃度３０ｐｐｔ、水温約２４℃、水量１０Ｌ、餌量は一日にエビ体重の５％を一日に３〜４回で行った（ｎ＝２５）。また、感染実験を行う上で水槽内にバナメイエビを入れ、２日間給餌したのち、浸漬感染させた。給餌は浸漬感染後も６日間継続して行い、死亡率を確認した。【００４７】
結果
結果を図１に示す。免疫していないニワトリ由来の鶏卵粉末を給餌した区の死亡率は１００％であった（対照区（control））。試験区Ａの全卵粉末を含む餌料を給餌した区の死亡率は１３％、試験区Ｂの全卵粉末を含む餌料を給餌した区の死亡率は８６％、試験区ＡＢｍｉｘの全卵粉末を含む餌料を給餌した区の死亡率は８２％、そして試験区ＡＢの全卵粉末を含む餌料を給餌した区の死亡率は１７％であった。【００４８】
これらの結果から、鶏卵卵黄抗体を用いた経口受動免疫によりＡＨＰＮＤの防除が可能となることが示された。また、特に試験区Ａおよび試験区ＡＢの全卵粉末を含む餌料を給餌した区の死亡率は２０％以下に低減されていることから、毒素Ａに対して特異的なＩｇＹを含む餌料が、ＡＨＰＮＤに対する防除に特に有効であることが示された。【００４９】
実施例４：感染実験（２）
方法
感染試験には、別途調製したＡＨＰＮＤ  ＴＵＭＳＡＴ株（実施例３で使用した物と同じ株）を用いてバナメイエビを感染させ、実施例２で調製したＩｇＹ含有全卵粉末を含む餌料として、全卵粉末の含有率１重量％（ｔｏｘｉｎＡ−１）および１０重量％（ｔｏｘｉｎＡ−１０）の餌料を与えて死亡率を確認することにより防除効果を調べた。対照として、免疫していないニワトリ由来の全卵粉末を１重量％含む餌料（コントロール−１）を与えた区、および免疫していないニワトリ由来の全卵粉末を１０重量％含む餌料（コントロール−１０）を与えた区を設定した。【００５０】
感染試験を行った際の水槽における条件は、塩分濃度３０ｐｐｔ、水温約２６℃、水量１０Ｌ、餌量は一日にエビ体重の５％を一日に３〜４回で行った（ｎ＝２５）。また、感染実験を行う上で水槽内にバナメイエビを入れ、２日間給餌したのち、浸漬感染させた。給餌は浸漬感染後も７日間継続して行い、死亡率を確認した。【００５１】
結果
結果を図２に示す。免疫していないニワトリ由来の鶏卵粉末含む餌料（コントロール−１、およびコントロール−１０）を与えた区の死亡率はそれぞれ５２％および３２％であった。ｔｏｘｉｎＡ−１を給餌した区の死亡率は４％、ｔｏｘｉｎＡ−１０を給餌した区の死亡率は０％であった。【００５２】
これらの結果からも、鶏卵卵黄抗体を用いた経口受動免疫によりＡＨＰＮＤの防除が可能となることが示された。特に、毒素Ａに対して特異的なＩｇＹを含む全卵粉末を１重量％含有する餌料を使用しても、ＡＨＰＮＤに対する防除に特に有効であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明により、ビブリオ属細菌の毒素Ａに対する抗体を含む組成物が、有効に毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌による感染症を防除するために有効であり、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによるエビ類の死亡率を２０％以下にまで低減できることが示された。エビ類のＥＭＳ／ＡＨＰＮＤへの感染は致死率が高く、エビ類の養殖業において甚大な被害を与えるものであるが、本発明はエビ類のＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによる死亡率を低減し、エビ類の養殖を安定的に行うために有用である。
【図１】
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【図２】
2018221716.tif 000003
【配列表】
2018221716000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月9日(2019.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
エビ類においては、抗体を介した特異的免疫機能が存在しないといわれており、エビ類の感染症に対して能動免疫による感染防除効果は期待できない。エビ類における感染症に対する防除対策として抗生物質を用いる方法があるが、抗生物質の多用に伴い耐性菌の出現といった問題点もある。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
［１］毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除するための組成物であって、毒素Ａに対する抗体を含む、前記組成物。
［２］毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌が、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）、ビブリオ・オウェンジー（Vibrio owensii）、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、またはビブリオ・カンプベリイ（Vibrio campbellii）である、上記［１］に記載の組成物。
［３］毒素Ａに対する抗体が、毒素Ａで免疫した鶏の卵より得られる鶏卵抗体である、上記［１］または［２］に記載の組成物。
［４］毒素Ａに対する抗体が、毒素Ａに対するＩｇＹ抗体である、上記［１］または［２］に記載の組成物。
［５］感染症が、エビ類の早期死亡症候群／急性肝すい臓壊死病（EMS／AHPND）である、上記［１］または［２］のいずれか１項に記載の組成物。
［６］組成物がエビ類餌料である、上記［１］または［２］に記載の組成物。
［７］毒素Ａに対する抗体を含む全卵粉末を、組成物重量に対して０．１％〜２０％含む、上記［６］に記載の組成物。
［８］上記［１］〜［７］のいずれか１項に記載の組成物をエビ類に投与する、または摂取させることを含む、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を防除する方法。
［９］上記［１］〜［８］のいずれか１項に記載の組成物をエビ類に投与する、または摂取させることを含む、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌によるエビ類の感染症を処置する方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明により、ビブリオ属細菌の毒素Ａに対する抗体を含む組成物が、毒素ＡおよびＢを発現するビブリオ属細菌による感染症を防除するために有効であることが示された。本発明の組成物は、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤによるエビ類の死亡率を２０％以下にまで低減することが可能である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
【図１】図１は、感染実験の結果を示すグラフである。縦軸は累積死亡率を示し、横軸はＡＨＰＮＤ菌体を浸漬感染させた後の時間を示す。グラフ中、Controlは、免疫していないニワトリ由来の鶏卵粉末を給餌した区；Ａは、試験区Ａの全卵粉末を含む餌料を給餌した区；Ｂは、試験区Ｂの全卵粉末を含む餌料を給餌した区；ＡＢは、試験区ＡＢの全卵粉末を含む餌料を給餌した区；を示す。
【図２】図２は、感染実験の結果を示すグラフである。縦軸は累積死亡率を示し、横軸はＡＨＰＮＤ菌体を浸漬感染させた後の時間（日数）を示す。グラフ中、コントロール−１は、免疫していないニワトリ由来の全卵粉末を１重量％含む餌料を与えた区；コントロール−１０は、免疫していないニワトリ由来の全卵粉末を１０重量％含む餌料を与えた区；ｔｏｘｉｎＡ−１は、試験区Ａの全卵粉末を１重量％含む餌料を与えた区；ｔｏｘｉｎＡ−１０は、試験区Ａの全卵粉末を１０重量％含む餌料を与えた区；を示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本明細書において「毒素Ｂ」とは、ビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ｂ（アミノ酸配列は配列番号４に示され、それをコードする塩基配列は配列番号３に示される）、またはその変異体もしくはホモログである。ビブリオ・パラヘモリティカス由来の毒素Ｂは、GenBankアクセッション番号AB972427.1に開示される塩基配列の１４６７〜２７８３番目のヌクレオチドによりコードされる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
あるいは、本明細書において「変異体」とは、元となるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を意味してもよい。好ましくは、「変異体」は、元となるタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性％を決定することもできる。そのようなコンピュータープログラムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴおよびＣｌｕｓｔａｌＷ等があげられる。特に、ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、Altschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)に記載されたもので、ＮＣＢＩやDNA Data Bank of Japan（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから公的に入手することができる（ＢＬＡＳＴマニュアル、Altschulら NCBI/NLM/NIH Bethesda, MD 20894；Altschulら）。また、遺伝情報処理ソフトウエアGENETYX Ver.7（ゼネティックス）、DNASIS Pro（日立ソフト）、Vector NTI（Infomax）等のプログラムを用いて決定することもできる。
【国際調査報告】
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