(57)【要約】  ＴＲＥＣ及び／又はＫＲＥＣの量の評価をより高精度で行うためのコントロールＤＮＡ等として使用可能な新規な粒子、及びその利用を提供する。本発明の一態様は、シグナルジョイント部分を含むＴＲＥＣ（T-cell Receptor Excision Circles）の核酸断片、及び、シグナルジョイント部分を含むＫＲＥＣ（Kappa-deleting Receptor Excision Circles）の核酸断片の少なくとも一方が、細胞内又はリポソーム内に導入されている、粒子である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナルジョイント部分を含むＴＲＥＣ（T-cell Receptor Excision Circles）の核酸断片、及び、シグナルジョイント部分を含むＫＲＥＣ（Kappa-deleting Receptor Excision Circles）の核酸断片の少なくとも一方が、細胞内又はリポソーム内に導入されている、粒子。
【請求項２】
シグナルジョイント部分を含むＴＲＥＣの上記核酸断片、及び、シグナルジョイント部分を含むＫＲＥＣの上記核酸断片が導入されている、請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
上記核酸断片が何れも４００ｂｐ以上で６００ｂｐ以下の範囲内であり、当該核酸断片の両端部から上記シグナルジョイント部分まで少なくとも８０ｂｐ以上離れている、請求項１又は２に記載の粒子。
【請求項４】
上記核酸断片が上記細胞に導入されている、請求項１〜３の何れか一項に記載の粒子。
【請求項５】
上記細胞は、内在性のＴＲＥＣ及びＫＲＥＣを有していない、請求項４に記載の粒子。
【請求項６】
上記核酸断片が、所定の個数含まれている、請求項１〜５の何れか一項に記載の粒子。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか一項に記載の粒子を、所定の濃度（粒子の個数／液体の体積）で含んでいる液体であるか、当該液体を繊維体にしみこませてなる、試料。
【請求項８】
上記液体は、赤血球及び血漿の少なくとも一方を含んでなる、請求項７に記載の試料。
【請求項９】
上記液体を上記繊維体にしみこませてなるスポットを複数有し、当該スポット間で上記粒子の濃度が異なっている、請求項７又は８に記載の試料。
【請求項１０】
請求項１〜６の何れか一項に記載の粒子、又は、請求項７〜９の何れか一項に記載の試料を含んでなる、キット。
【請求項１１】
ＴＲＥＣの上記核酸断片を遺伝子増幅するためのプライマー、ＫＲＥＣの上記核酸断片を遺伝子増幅するためのプライマー、ＴＲＥＣの上記核酸断片に対するプローブ、及び、ＫＲＥＣの上記核酸断片に対するプローブからなる群より選択される少なくとも一つを含んでなる、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
血液検体に含まれるＴＲＥＣ及びＫＲＥＣの少なくとも一方の量を、遺伝子増幅法を用いて評価する方法であって、
請求項７〜９の何れか一項に記載の試料をコントロール試料又は検量線作成用の試料として用いる、方法。
【請求項１３】
上記血液検体が新生児のろ紙血検体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法でＴＲＥＣ及びＫＲＥＣの少なくとも一方の量を評価した結果に基づいて、上記新生児が重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）に罹患している可能性を評価する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
シグナルジョイント部分を含むＴＲＥＣの核酸断片、及び、シグナルジョイント部分を含むＫＲＥＣの核酸断片の少なくとも一方を含む、核酸構築物（ただし、ＴＲＥＣの全長、及び、ＫＲＥＣの全長は含まない）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＲＥＣ（T-cell Receptor Excision Circles）又はＫＲＥＣ（Kappa-deleting Receptor Excision Circles）の量を評価する方法、当該方法に用いる粒子、並びにこれらの利用に関する。より具体的には、本発明の一態様は、原発性重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）等の新生児スクリーニングに関する。
【背景技術】
【０００２】
原発性免疫不全症（primary immunodeficiency）と総称される疾患の中には、例えば、ＳＣＩＤに代表されるように、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞の新生に異常を来しているために、機能的なＴ細胞及び／又はＢ細胞の欠乏という症状を先天的に呈するものが存在する。【０００３】
例えば、ＳＣＩＤは、機能的なＴ細胞の欠乏を主症状として、機能的なＢ細胞及びＮＫ細胞の欠乏をも先天的に引き起こす。そして、これらリンパ球の異常によって、患者は、細菌、真菌、及びウイルスに対する易感染性を呈し、遅くとも１歳までに造血幹細胞移植等の根治的治療を行わないと、致命的な予後をたどるとされている。そのため、疾患の発症又は発症可能性を早期に判定可能な技術が切望されている。【０００４】
非特許文献１には、新生児のろ紙血から抽出したＤＮＡ検体に対して、定量ＰＣＲ法によってＴＲＥＣ及びＫＲＥＣの部分配列を増幅して絶対定量を行うことで、ＳＣＩＤ等の原発性免疫不全症患者の新生児スクリーニングを行う方法が記載されている。なお、ＴＲＥＣは、胸腺でＴ細胞が新生される際に出現し、細胞内に残存する環状ＤＮＡであり、Ｔ細胞新生の指標となる。同様に、ＫＲＥＣはＢ細胞が新生される際に出現し、細胞内に残存する環状ＤＮＡであり、Ｂ細胞新生の指標となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Stephan Borte, Ulika von Dobeln et. al.，Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR, BLOOD, 15 MARCH 2012 vol.119 no. 11 p.2552-2555
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献１に記載のような従来技術において、ＴＲＥＣ及び／又はＫＲＥＣの絶対定量を行うためには検量線の作製が必須である。例えば、非特許文献１に記載の従来技術では、１コピーのＴＲＥＣ−ＫＲＥＣ−ＴＲＡＣコンストラクトを含むプラスミド、及び１コピーのβ−アクチン配列を含むプラスミドを検量線作成用のコントロールＤＮＡとし、当該コントロールＤＮＡの希釈系列を作製した後に、これら希釈系列に対して定量ＰＣＲ法を適用して検量線を作成する。他の従来技術では、検量線作成用のコントロールＤＮＡとして、ＴＲＥＣ断片及び／又はＫＲＥＣ断片に相当するオリゴＤＮＡを用いる場合もある。【０００７】
しかし、検量線作成用のコントロールＤＮＡの正確な定量（分子量の決定）の困難さ、又は、希釈系列を作製する際の段階希釈時に生じる希釈誤差等に起因して、作成された検量線の正確性に問題がある場合がある。【０００８】
また、検体と検量線作成用のコントロールＤＮＡとで、定量ＰＣＲ法に供するＤＮＡの調製過程が異なる。すなわち、上記の通りコントロールＤＮＡでは、精製したプラスミド（又はオリゴＤＮＡ）を希釈することによって、定量ＰＣＲ法に供するＤＮＡが調製されるが、検体では、ろ紙血からＤＮＡを抽出することによって、定量ＰＣＲ法に供するＤＮＡが調製される。そのため、例えば、ろ紙血からのＤＮＡの抽出効率が変化した場合でも、上記のコントロールＤＮＡには影響を及ぼさないため、このコントロールＤＮＡを用いて作成した検量線との比較による絶対定量の結果は、ろ紙血からのＤＮＡの抽出効率の変動によって変化する可能性がある。【０００９】
加えて、検体と検量線作成用のコントロールＤＮＡとで、定量ＰＣＲ法に供するＤＮＡの調製過程が異なる事実は、測定をする施設が異なれば、同一検体についての値でもその一貫性が保てなくなりうる原因の一つとなっている。【００１０】
本発明の一態様は、ＴＲＥＣ及び／又はＫＲＥＣの量の評価をより高精度で行うためのコントロールＤＮＡ等として使用可能な新規な粒子、及びその利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、例えば、シグナルジョイント部分を含むＴＲＥＣ（T-cell Receptor Excision Circles）の核酸断片、及び、シグナルジョイント部分を含むＫＲＥＣ（Kappa-deleting Receptor Excision Circles）の核酸断片の少なくとも一方が、細胞内又はリポソーム内に導入されている、粒子を態様の一つとして包含している。
また、シグナルジョイント部分を含むＴＲＥＣの核酸断片、及び、シグナルジョイント部分を含むＫＲＥＣの核酸断片の少なくとも一方を含む、核酸構築物（ただし、ＴＲＥＣの全長、及び、ＫＲＥＣの全長は含まない）を一つの態様として包含している。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の一態様によれば、ＴＲＥＣ及び／又はＫＲＥＣの量の評価をより高精度で行うためのコントロールＤＮＡ等として使用可能な新規な粒子、及びその利用を提供することが出来るという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＴＲＥＣ５００の定量ＰＣＲ反応を行った結果から得られた検量線を示す。
【図２】ＫＲＥＣ５００の定量ＰＣＲ反応を行った結果から得られた検量線を示す。
【図３】ＴＲＥＣの定量ＰＣＲ反応で決定したＣｔ値を、図１の検量線にプロットした状態を示す。
【図４】実施例１による検量線及び参考例１による検量線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００１５】
なお、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」とは、Ａ及びＢと、Ａ又はＢとの両方を意図した表現である。
【００１６】
〔１．粒子〕
本実施形態における「粒子」とは、「粒子の母体」に、以下に説明する「核酸断片」が導入されているものをいう。なお、「核酸断片が導入されている」とは、粒子の母体外から内に導入するプロセスを少なくとも一度経ていればよい。粒子の母体が細胞である場合は、核酸断片が、細胞内に導入された後に増幅され、細胞の増殖に伴って生じた新生細胞に核酸断片（導入された核酸断片の複製物）が含まれている形態も、「粒子の母体内に導入されている」の概念に含まれる。
【００１７】
（粒子の母体）
核酸断片が導入される粒子の母体は、細胞又はリポソームである。リポソームとは、リン脂質二重膜で構成された人工膜小胞である。リポソームは、細胞と類似した挙動を示す上に、核酸断片を内包させる方法も確立されているので、核酸断片を格納する容器として、細胞と同等に取り扱うことができる。
【００１８】
ＴＲＥＣ等の量の評価を行うためのコントロールとして本発明の一態様にかかる粒子を用いる場合、粒子の母体は、内在性（intrinsic)のＴＲＥＣ及びＫＲＥＣを有していないことが好ましい。リポソームは元よりこの条件を満たしている。細胞も、Ｔ細胞へ分化する直前直後の細胞（新生したＴ細胞かその前駆細胞）、Ｂ細胞へ分化する直前直後の細胞（新生したＢ細胞かその前駆細胞）を除く大部分のものが、元よりこの条件を満たしている。
【００１９】
粒子の母体は、リポソームよりも細胞が好ましい場合がある。細胞は、一般的に、１）培養条件を整えれば増殖性を有する（細胞に含まれる核酸断片の個数を一定に維持したクローンを樹立し、これを大量増殖することで、均質な粒子を大量に得ることも容易）、２）内在性のリファレンス遺伝子（ＲＮａｓｅＰ等）を有する、及び、３）リポソームより一般に安定である、等の特性を有するからである。
【００２０】
ＴＲＥＣ及びＫＲＥＣの評価に血液検体を用いること、及び、新生直後のＴ細胞又はＢ細胞との細胞の類似性を考慮すると、粒子の母体として用いる細胞は、血液系の細胞であるか、免疫系の細胞であることが好ましい場合がある。血液系の細胞及び免疫系の細胞としては、例えば、Ｊｅｋｏ−1細胞、Ｒａｊｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞等のＢ細胞株；Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＭＯＬＴ−４細胞、ＴＧ４０細胞、Ｕ−９３７細胞等のＴ細胞株；ＫＵ８１２‐Ｆ細胞、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞等の好塩基球細胞株；ＨＭＣ−１細胞、Ｋｕ８１２細胞、ＲＢＬ細胞等の顆粒球細胞株；ＭＣＬ−５細胞、ＭＯＬＴ−４細胞等のリンパ芽球細胞株；ＮＢ−４細胞、ＴＨＰ−１細胞等の好中球様細胞株；４１６Ｂ細胞、ＭＯＬＭ−１４細胞、ＴＨＰ−１細胞等のマクロファージ細胞株；ＢＪＡＢ細胞、ＣＭＬ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞等の白血球細胞株；Ａ２０細胞、ＢＣ−３細胞、ＣＡ４６細胞、ＨＣＴ１１６細胞、ＳＴ−４８６細胞等のリンパ腫細胞株；ＥＳＢ細胞、ＴＣＬＢ細胞等のリンパ芽球腫細胞株；ＨＬ−６０細胞、Ｋ５６２細胞等の白血病細胞株；等が挙げられる。これらの中では、白血病細胞株、リンパ芽球腫細胞株、リンパ腫細胞株、及び、白血球細胞株がより好ましい場合があり、白血病細胞株、及び、白血球細胞株がさらに好ましい場合がある。
【００２１】
（核酸断片）
粒子の母体に導入される核酸断片は、シグナルジョイント部分を含むＴＲＥＣの核酸断片、及びシグナルジョイント部分を含むＫＲＥＣの核酸断片の少なくとも一方である。なお、環状のＴＲＥＣそのもの、環状のＫＲＥＣそのものは、核酸断片の範疇には含まれない。同一の粒子の母体に、これら核酸断片の両方が導入されている場合は、ＫＲＥＣ及びＴＲＥＣの評価の何れにも用いることが出来るという観点では好ましい。なお、ＴＲＥＣの核酸断片、及びＫＲＥＣの核酸断片は、別々の核酸構築物として粒子の母体に導入されてもよいし、両者が連結された一つの核酸構築物として粒子の母体に導入されてもよい。ここで核酸構築物とは、上述の核酸断片そのものか、当該核酸断片を部分として含む核酸からなる構造体（例えば、核酸断片が挿入されたプラスミド等）を指す。
【００２２】
なお、上記のシグナルジョイント部分とは、ＴＲＥＣ及びＫＲＥＣそれぞれにおける環の結合部を指す。ＴＲＥＣではδＲｅｃ−ΨＪαシグナルジョイントとも称され、ＫＲＥＣではイントロンＲＳＳ−κｄｅシグナルジョイントとも称される。
【００２３】
核酸断片の好ましい態様では、ＴＲＥＣの全長を含む断片、及びＫＲＥＣの全長を含む断片ではなく、シグナルジョイント部分を含んだＴＲＥＣの部分断片、及び／又は、シグナルジョイント部分を含んだＫＲＥＣの部分断片である。なお、好ましい態様では、シグナルジョイント部分は、核酸断片の両端に分断されて含まれるのではなく、ひとまとまりの連続する領域として含まれている。
【００２４】
核酸断片のサイズは特に限定されないが、後述する遺伝子増幅に必要充分なサイズを考慮すると、その下限は、２００ｂｐ以上であることが好ましく、３００ｂｐ以上であることがより好ましく、４００ｂｐ以上であることがさらに好ましい。核酸断片のサイズの上限は、６００ｂｐ以下であることが好ましく、５５０ｂｐ以下であることがより好ましく、５３０ｂｐ以下であることがさらに好ましい。一例では、核酸断片のサイズは、４００ｂｐ以上６００ｂｐ以下の範囲内、４５０ｂｐ以上５５０ｂｐ以下の範囲内、又は４７０ｂｐ以上５３０ｂｐ以下の範囲内である。
【００２５】
シグナルジョイント部分を含む領域を遺伝子増幅する場合、核酸断片に含まれるシグナルジョイント部分の位置は、当該核酸断片の比較的中央部であることが好ましい。例えば、核酸断片の両端部からシグナルジョイント部分まで好ましくは５０ｂｐ以上、より好ましくは８０ｂｐ以上、さらに好ましくは１００ｂｐ以上離れている。なお、核酸断片に含まれるシグナルジョイント部分の位置が、当該核酸断片の比較的中央部であって、当該核酸断片のサイズが上述の範囲内（特に４００ｂｐ以上６００ｂｐ以下の範囲内）にある場合は、実質的に全ての既存のＴＲＥＣ検出用／ＫＲＥＣ検出用のプライマー・プローブセットをそのまま用いて、当該核酸断片の遺伝子増幅及び検出を行うことが出来る。つまり、この核酸断片は、既存の測定系、及び、新規に設計される測定系の何れに対しても、その評価（例えば、プライマー・プローブセットを用いた増幅効率、増幅の特異性等の検討）、及び、後述する標準試料等として汎用できる。
【００２６】
なお、核酸断片に含まれるシグナルジョイント部分は、野生型では、塩基の挿入及び欠失等による遺伝的変異に由来する、個人間の相違がある領域を含んでいる。核酸断片の特に好ましい態様では、この個人間の相違がある領域が除去されたシグナルジョイント部分を有している（配列番号１及び２に相当）。これによって、統一した規格で核酸断片を調製できる上に、同じプライマーセットを用いてこの核酸断片を増幅した場合は、理論上は、常に同じ増幅断片が得られることとなり、既存の測定系に対しても、新規に設計される測定系に対しても、後述する標準試料等として特に好適に利用できる。
【００２７】
特に限定されないが、核酸断片の好ましい態様は、二本鎖ＤＮＡ断片である。核酸断片は、例えば、プラスミド等のベクターに挿入された状態の核酸構築物として、粒子の母体に導入されていてもよい。
【００２８】
ＴＲＥＣ及びＫＲＥＣの正確な定量をより容易に行う観点では、核酸断片は、粒子の母体内での複製が制限されているものであることが好ましい。核酸断片が、プラスミド等のベクターに挿入された状態である場合は、プラスミドと、粒子の母体（宿主細胞）との組み合わせに応じて、当該プラスミドのコピー数を制限することができる。
【００２９】
ＴＲＥＣ及びＫＲＥＣの正確な定量をより容易に行う観点では、核酸断片は、粒子の母体内で所定の個数（例えば一コピーのみ）含まれていることが好ましい。加えて、上述の通り、核酸断片が、粒子の母体内での複製が制限されているものであれば、粒子の母体内に含まれる核酸断片の数が経時的に変化し難くなるためより好ましい。
【００３０】
ＴＲＥＣ及びＫＲＥＣの正確な定量をより容易に行う観点では、核酸断片は、粒子の母体内で転写が起こらないものであることが好ましい。核酸断片が、プラスミド等のベクターに挿入された状態である場合、例えば、当該核酸断片の発現制御にかかわるプロモーター又はエンハンサー等を設けなければ、核酸断片の転写を防止することが出来る。但し、このベクターは、転写及び翻訳がなされるように挿入された薬剤耐性遺伝子等を有していてもよい。
【００３１】
シグナルジョイント部分を含むＴＲＥＣの核酸断片の特に好ましい一例としては、１）配列番号１に塩基配列を示す核酸断片、２）配列番号１に塩基配列を示す核酸断片の部分であって４００ｂｐ以上、４５０ｂｐ以上、又は４７０ｂｐ以上のサイズを持つ核酸断片、３）前記した１）又は２）の核酸断片と塩基配列同一性が９０％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の核酸断片、等が挙げられる。
【００３２】
シグナルジョイント部分を含むＫＲＥＣの核酸断片の特に好ましい一例としては、１）配列番号２に塩基配列を示す核酸断片、２）配列番号２に塩基配列を示す核酸断片の部分であって４００ｂｐ以上、４５０ｂｐ以上、又は４７０ｂｐ以上のサイズを持つ核酸断片、３）前記した１）又は２）の核酸断片と塩基配列同一性が９０％以上、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の核酸断片、等が挙げられる。
【００３３】
既存の測定系では、ＴＲＥＣ及びＫＲＥＣとも、その増幅配列は報告毎に異なっている。使用する装置又は方法によっても、最適な増幅配列が異なっており、プライマー及びプローブ配列の設計にあたっては、全長配列を含むゲノムＤＮＡを用いて設計した増幅配列の増幅効率及び特異性を評価する必要があった。さらに、実際の判定では絶対定量が主流であるため、特定した増幅配列毎にオリゴＤＮＡ又はこれを組み込んだプラスミドＤＮＡ（コントロールＤＮＡ）を作製する必要があった。本発明の一実施形態にかかる核酸断片を用いることで、これら既存の測定系が抱えていた問題点を解決しうる。
【００３４】
（粒子の作製方法）
粒子の作製方法としては、例えば、上記の核酸断片（当該核酸断片を含んだ核酸構築物の形態であってもよい）を、粒子の母体に導入する。核酸断片を粒子の母体に導入する方法は、例えば、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、及びパーティクルガン法等の遺伝子導入法から適宜選択すればよいが、エレクトロポレーションがより好ましい。
【００３５】
粒子の母体に核酸断片を導入する操作を行った後、必要に応じて、核酸断片導入の成否の確認（例えば、核酸断片が挿入されたベクターが有する薬剤耐性遺伝子等を用いる）と、導入された核酸断片のコピー数の確認とを行ってもよい。
【００３６】
作製された粒子は、細胞又はリポソームの保存法に従って保存することが出来る。粒子は、例えば、粒子の種類に応じた適切な液体（生理的食塩水、液体培地等）中に懸濁された状態で、容器中で保存される。この粒子を長期間保存する場合には、例えば凍結乾燥等を行ってもよい。
【００３７】
〔２．粒子を用いた、ＴＲＥＣ及び／又はＫＲＥＣの量の評価〕
（標準試料）
上述の粒子は、例えば、血液検体中のＴＲＥＣ及び／又はＫＲＥＣの量を評価する際の基準となる試料（標準試料）として用いることができる。標準試料は、例えば、検量線作成用の試料、陰性コントロール用の試料、又は基準値（閾値）提示用の試料等として用いることが出来る。
【００３８】
上述の粒子は、核酸断片そのものとは異なり、例えば光学顕微鏡システム等を用いて計数もできる。従って、粒子に含まれる核酸断片の個数（粒子の母体がリポソームのときは、リポソームへの核酸断片の封入効率でもよい）と、系中に含まれる粒子の個数との関係に基づいて、系中に含まれる核酸断片の総数の制御がより容易となる。従って、プラスミド又はオリゴＤＮＡそのものをコントロールＤＮＡとすると生じる以下の問題１）及び２）を低減することができる。１）コントロールＤＮＡの正確な定量（分子量の決定）の困難さ、また２）希釈系列を作製する際の段階希釈時に生じる希釈誤差等に起因する検量線の正確性の問題等。
【００３９】
標準試料の一形態（液体試料）は、上述の粒子を、所定の濃度（粒子の個数／液体の体積）で含んでいる液体である。標準試料は、上述の粒子を、互いに異なる所定の濃度（粒子の個数／液体の体積）で含んでいる液体のセットであってもよい。標準試料の調製に用いる液体は特に限定されず、例えば、生理的食塩水、ＰＢＳ等であってもよいが、血液試料に疑似させる観点では、当該液体は、赤血球及び血漿の少なくとも一方を含んでいることが好ましく、両方を含んでいることがより好ましい。例えば、赤血球濃厚液と血漿とを混合して得られる赤血球液は、粒子を混合する液体として好ましい。なお、血液試料に疑似させる観点では、当該液体は、血液と同等の粘稠度（例えば、血液に対して０．８倍〜１．２倍程度、より好ましくは０．９倍〜１．１倍程度の粘稠度）に調整されていることが好ましい場合がある。
【００４０】
標準試料の他の形態は、上述の液体試料を、繊維体にしみこませてなるものである。繊維体は、液体がしみこむことが可能な繊維の集合体であれば特に限定されないが、例えば、ろ紙等の紙；織布；不織布；等が挙げられ、中でもろ紙が好ましく、ろ紙の中でも採血用ろ紙がより好ましい。液体試料を繊維体にしみこませる方法は特に限定されないが、この液体試料をピペット等で採取し、繊維体上にスポットする方法等が挙げられる。なお、液体試料をしみこませた繊維体は、乾燥して保存することも可能である。
【００４１】
標準試料の上記他の形態において、繊維体は、液体試料をしみこませてなるスポットを複数有していてもよい。複数のスポットは、粒子を同じ濃度で含む液体試料をしみこませたものであってもよいが、粒子を異なる濃度で含む液体試料をしみこませたものが含まれていることが好ましい。粒子を互いに異なる所定の濃度で含む液体試料を、繊維体にしみこませた複数のスポットを有する標準試料は、検量線作成用の試料として適している。
【００４２】
なお、標準試料の形態は、ＴＲＥＣ及び／又はＫＲＥＣの量の評価対象となる検体の形態に応じて最適なものを選択すればよい。例えば、検体が血液検体（繊維体にしみこませていないもの）である場合は、標準試料として液体試料を採用すればよい。検体が、血液を繊維体にしみこませてなるものである場合は、標準試料として、液体試料を繊維体（好ましくは検体の場合と同じ種類の繊維体）にしみこませてなるものを採用すればよい。検体が、血液をろ紙（好ましくは採血用ろ紙）にしみこませてなるものである場合は、標準試料として、液体試料をろ紙（好ましくは採血用ろ紙）にしみこませてなるものを採用すればよい。標準試料の形態と、検体の形態とが類似することによって、共通した手法に基づいて、ＤＮＡの抽出、及び抽出したＤＮＡの増幅を行うことが出来るため、得られた結果の比較が容易かつ正確となる。そのため、同一の施設で同一検体について複数回測定する場合はもちろん、異なる施設で同一検体について測定をする場合でも、値の一貫性が保てることとなる。
【００４３】
（検体とその調製方法）
ＴＲＥＣ及び／又はＫＲＥＣの量の評価対象となる検体は、ＴＲＥＣ及びＫＲＥＣの少なくとも一方を含む検体であれば特に限定されないが、血液検体であることが好ましく、血液を繊維体にしみこませてなる検体であることがより好ましく、中でもろ紙（特に、採血用ろ紙）血検体であることがさらに好ましい。検体の由来は、ヒト又はヒト以外の哺乳動物であり、ヒトであることが好ましく、新生児であることがより好ましい。なお、「新生児」とは生後３０日以内である児を指す。繊維体は、上記（標準試料）の欄で説明したものと同様のものを適宜利用可能である。ＴＲＥＣ及び／又はＫＲＥＣの量の評価が特に必要とされる新生児については、ろ紙（特に、採血用ろ紙）血検体を用いることが特に好ましい。
【００４４】
以下、検体の好ましい態様であるろ紙(採血用ろ紙）血検体を新生児から調製する方法について説明する。ろ紙血検体の調製方法としては、新生児から少量の採血をして、その血液をろ紙にスポットし、室温で乾燥させる方法が挙げられる。具体的には、新生児の踵に針などでわずかな傷をつけて、毛細血管から直接ろ紙に血液をしみこませる方法がある。
【００４５】
（ＴＲＥＣ及び／又はＫＲＥＣの定量方法）
＝検量線作成用の試料＝
検量線作成用の試料としては、上述の標準試料の中でも、例えば、１）粒子を、互いに異なる所定の濃度で含んでいる液体試料のセットか、２）粒子を、互いに異なる所定の濃度で含んでいる液体試料をしみこませた複数のスポットを有する繊維体が挙げられる。なお、「粒子を、互いに異なる所定の濃度で含んでいる液体試料」とは、例えば、検量線の作成に必要な濃度で粒子を含んでいる、所定倍の希釈系列に相当するものを指す。
【００４６】
＝陰性コントロール及び陽性コントロール＝
陽性コントロールは、粒子の作製に用いた粒子の母体（ＴＲＥＣの核酸断片、及びＫＲＥＣの核酸断片を導入していないもの）を一定濃度で含む液体であるか、当該液体を繊維体にしみこませてなるものである。「液体」及び「繊維体」については、上記（標準試料）の欄に説明した通りである。粒子の母体の濃度は、健康な０か月児の白血球数の下限と等しい、５０００個（粒子の母体）／μｌであることが好ましい。陽性コントロールでは、ＴＲＥＣ及びＫＲＥＣは検出されない。
【００４７】
陰性コントロールは、例えば、上述の陽性コントロールにおいて、粒子の母体の一部を、ＴＲＥＣの核酸断片及び／又はＫＲＥＣの核酸断片を含む粒子（本発明の粒子）に置き換えたものである。すなわち、陰性コントロールは、上述した標準試料の一形態に相当する。
【００４８】
なお、陽性コントロールの形態も、標準試料と同じく、ＴＲＥＣ及び／又はＫＲＥＣの量の評価対象となる検体の形態に応じて最適なものを選択すればよい。例えば、検体が血液検体（繊維体にしみこませていないもの）である場合は、陽性コントロールとして液体の形態を採用すればよい。検体が、血液を繊維体にしみこませてなるものである場合は、陽性コントロールとして、液体を繊維体（好ましくは検体の場合と同じ種類の繊維体）にしみこませてなるものを採用すればよい。検体が、血液をろ紙（好ましくは採血用ろ紙）にしみこませてなるものである場合は、陽性コントロールとして、液体をろ紙（好ましくは採血用ろ紙）にしみこませてなるものを採用すればよい。
【００４９】
なお、陰性コントロール及び陽性コントロールは同一の繊維体上に別々のスポットとしてしみこませた形態であってもよく、さらに、陰性コントロール及び陽性コントロール及び検量線作成用の試料を全て同一の繊維体上に別々のスポットとしてしみこませた形態であってもよい。
【００５０】
＝ＤＮＡの抽出と定量＝
ＤＮＡの抽出は、検量線作成用の試料、陽性コントロール、陰性コントロール、及び、検体の形態（液体の形態か、繊維体にしみこませた形態か）に応じた方法で行う。例えば、ろ紙のような繊維体にしみこませた形態の試料であれば、繊維体から一定の大きさのパンチで打ち出し、打ち出したパンチ片の洗浄と、ＤＮＡの抽出とを経て、ＤＮＡ溶出液を得る。パンチの径は３ミリ程度が好ましいが、これより大きくても小さくてもよい。なお、検量線作成用の試料、陽性コントロール、陰性コントロール、及び、検体それぞれの形態を同一とし、全試料を同じ手法に基づいてＤＮＡの抽出を行うことが、より正確な定量を行う上で好ましい。
【００５１】
次いで、得られたＤＮＡ溶出液中に含まれるＴＲＥＣ及びＫＲＥＣの少なくとも一方、好ましくは両方を、遺伝子増幅法によって増幅し、増幅断片の定量を行う。なお、遺伝子増幅法は、定量ＰＣＲ法であることが好ましい。
【００５２】
定量ＰＣＲ法を行う場合、プライマーセットは、粒子の母体に導入されたＴＲＥＣ及び／又はＫＲＥＣの核酸断片の配列に基づいて決定をすればよい。プライマーセットを構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの長さは、例えば、１５塩基長以上であり、好ましくは１５塩基長以上で５０塩基長以下の範囲内であり、より好ましくは１７塩基長以上で３５塩基長以下の範囲内であり、さらに好ましくは１７塩基長以上で３０塩基長以下の範囲内であり、特に好ましくは１７塩基長以上で２５塩基長以下の範囲内である。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、ＰＣＲの結果得られる増幅断片がシグナルジョイント部分を含み、サイズが凡そ８０ｂｐ〜５００ｂｐ程度、又は、８０ｂｐ〜２００ｂｐ程度、又は、１００ｂｐ〜１５０ｂｐ程度となるように設計することが好ましい場合がある。
【００５３】
プライマーセットに含まれるフォワードプライマーとリバースプライマーとの数量比(モル比と実質同義)は特に限定されないが、好ましくはフォワードプライマーの濃度がリバースプライマーの濃度の０．７倍〜１．３倍の範囲内であることが好ましく、０．９倍〜１．１倍の範囲内であることがより好ましい。
【００５４】
このプライマーセットは常法に従って合成することができる。また、このプライマーセットを用いたＰＣＲの反応条件は特に限定されない。変性ステップの温度は例えば９３℃〜９６℃の範囲内、好ましくは９４℃〜９５℃の範囲内に設定される。アニーリングステップの温度は例えば５８℃〜６９℃の範囲内、好ましくは５９℃〜６３℃の範囲内に設定される。伸長ステップの温度は例えば６０℃〜７９℃の範囲内、好ましくは６５℃〜７５℃の範囲内に設定される。変性ステップの反応時間は、例えば８秒〜２５秒の範囲内、好ましくは８秒〜２０秒の範囲内に設定される。アニーリングステップの反応時間は例えば２５秒〜１分の範囲内、好ましくは２８秒〜３５秒の範囲内に設定される。伸長ステップの反応時間は例えば１秒〜２０秒、好ましくは１秒〜１０秒の範囲内に設定される。また、サイクル数は例えば２０〜１００サイクルの範囲内、好ましくは３０〜８５サイクルの範囲内、より好ましくは３５〜６５サイクルの範囲内に設定される。
【００５５】
ＰＣＲ増幅断片の定量に用いるプローブ（通常、蛍光ラベル核酸プローブである）は、当該ＰＣＲ増幅断片にハイブリダイズ可能なように設計されればよいが、その核酸部分は１５塩基長以上であり、好ましくは１５塩基長以上で５０塩基長以下の範囲内であり、より好ましくは１７塩基長以上で３５塩基長以下の範囲内である。
【００５６】
また、上述の各プライマー及びプローブを構成するヌクレオチドには、ＤＮＡの他にＰＮＡ（ペプチド核酸）及び／又はＬＮＡ（locked nucleic acid）等の人工核酸が含まれていてもよい。
【００５７】
ＰＣＲ反応後のＴＲＥＣ及び／又はＫＲＥＣの定量は、一般的な定量ＰＣＲの方法に即して行えばよい。具体的な一例では、まず、陽性コントロール及び陰性コントロールから得たＰＣＲ反応の結果から、定量ＰＣＲ反応が適切に行われたことを確認する。その上で、検量線作成用の試料から得られた、ＰＣＲ反応のＣｔ値を、各細胞濃度を横軸にとった座標上にプロットして検量線を作成する。作成した検量線を基準として用いて、検体中に含まれるＴＲＥＣ及び／又はＫＲＥＣの総量（又は、血液中の濃度換算値）を決定することができる。
【００５８】
なお、上述をした絶対定量を行う態様の他、検体中に含まれるＴＲＥＣ及び／又はＫＲＥＣの量を相対定量する態様も本発明の範疇である。例えば、標準試料として、上述の粒子を、所定の濃度（粒子の個数／液体の体積）で含んでいる一種以上の試料を準備する。その上で、絶対定量の場合と同様に、標準試料と検体とからＤＮＡ溶出液を得て、定量ＰＣＲ法に基づいて遺伝子増幅を行い、得られた増幅断片の定量を行う。次いで、ＰＣＲ反応のＣｔ値同士（もしくはここから得た換算値同士）を比較して、検体中に含まれるＴＲＥＣ及び／又はＫＲＥＣの量が、標準試料中の量より多いか否かを決定する。すなわち、標準試料は、基準値（閾値）提示用の試料として用いられる。
【００５９】
（ＴＲＥＣ及び／又はＫＲＥＣの定量結果の利用）
検体中のＴＲＥＣ及び／又はＫＲＥＣの定量結果は、この検体の由来であるヒト又はヒト以外の哺乳動物において、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞の新生に異常を来している可能性が有るか否かの指標として利用することが出来る。例えば、濃度ベースの比較で、所定の基準値（閾値）と比較して、検体中のＴＲＥＣの定量結果の方が低ければ、Ｔ細胞の新生に異常を来している可能性が有ると判定する。同様に、濃度ベースの比較で、所定の基準値（閾値）と比較して、検体中のＫＲＥＣの定量結果の方が低ければ、Ｂ細胞の新生に異常を来している可能性が有ると判定する。ここで、所定の基準値（閾値）は、例えば、７０コピー（ＴＲＥＣ）／ｕｌ（血液）以下の値、５０コピー（ＴＲＥＣ）／ｕｌ（血液）以下の値、４０コピー（ＴＲＥＣ）／ｕｌ（血液）以下の値、又は、１０コピー（ＴＲＥＣ）／ｕｌ（血液）以下の値である。所定の基準値（閾値）は、例えば、７０コピー（ＫＲＥＣ）／ｕｌ（血液）以下の値、５０コピー（ＫＲＥＣ）／ｕｌ（血液）以下の値、４０コピー（ＫＲＥＣ）／ｕｌ（血液）以下の値、１０コピー（ＫＲＥＣ）／ｕｌ（血液）以下の値である。
【００６０】
本発明の一態様では、ヒト又はヒト以外の哺乳動物が、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞の新生に異常を来している可能性が有る場合、このヒト等は、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞の新生異常を伴う原発性免疫不全症に罹患しているか、罹患可能性があると判定することができる。なお、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞の新生異常を伴う原発性免疫不全症とは、例えば、アデノシンデアミネース欠損症、Ｘ連鎖型ＳＣＩＤ、ＪＡＫ３欠損症、ＲＡＧ欠損症等の重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）；Ｘ連鎖性無ガンマグロブリン血症等の抗体産生不全症；ディジョージ症候群等のその他の原発性免疫不全症；等が挙げられ、中でもＳＣＩＤは早期の治療を要する疾患であるため、新生児スクリーニングの対象として好ましい。
【００６１】
なお、上述の原発性免疫不全症を罹患しているか、罹患可能性があると判定された個体は、必要に応じて医師（個体がヒトの場合）又は獣医師（個体が哺乳動物の場合）の診断を受けた後に、原発性免疫不全症の種類に応じた治療を受けてもよい。例えば、ＳＣＩＤの場合は早期の（遅くとも１歳になる前の）造血幹細胞移植、Ｘ連鎖性無ガンマグロブリン血症の場合は免疫グロブリン製剤の投与等が、現時点での適切な治療方法である。
【００６２】
〔３．ＴＲＥＣ及び／又はＫＲＥＣの定量キット〕
本発明の一実施形態に係る定量キットは、１）上述した粒子、又は、２）上述した標準試料を含んでなる。この定量キットは、好ましくは、３）粒子に含まれるＴＲＥＣの核酸断片を遺伝子増幅するためのプライマー（特にＰＣＲプライマーセット）、４）粒子に含まれるＫＲＥＣの核酸断片を遺伝子増幅するためのプライマー（特にＰＣＲプライマーセット）、５）粒子に含まれるＴＲＥＣの核酸断片に対するプローブ、及び、６）粒子に含まれるＫＲＥＣの核酸断片に対するプローブからなる群より選択される少なくとも一つを含んでなる。５）及び６）は、それぞれ、３）及び４）を用いて得た増幅断片に対するプローブでもあり得る。従い、３）と５）とはセットで、４）と６）とはセットで、キットに含まれることが好ましい。
【００６３】
さらに、必要に応じて、７）血液をしみこませて採取するための繊維体、８）繊維体を打ち抜くパンチ、９）ＰＣＲ等の遺伝子増幅に用いる各種試薬及び器具（ポリメラーゼ、ＰＣＲバッファー、各ｄＮＴＰ、ピペット等）、１０）遺伝子増幅に供するＤＮＡを含有する試料を調製するための各種試薬及び器具（試験管、バッファー等）、１１）遺伝子増幅断片を解析するための各種試薬及び器具（電気泳動ゲル材料、ピペット等）、１２）キットの使用説明書、１３）上述した粒子の母体に含まれる内在性のリファレンス遺伝子を遺伝子増幅するためのプライマー、及び１４）リファレンス遺伝子に対するプローブ、等の少なくとも１つを備えていてもよい。
【００６４】
この定量キットは、検体中のＴＲＥＣ及び／又はＫＲＥＣの定量に用いる。この定量キットは、例えば、この検体の由来であるヒト又はヒト以外の哺乳動物が、Ｔ細胞及び／又はＢ細胞の新生異常を伴う原発性免疫不全症に罹患しているか、罹患可能性があるかの判定に用いる。この定量キットは、例えば、ヒト新生児がＳＣＩＤに罹患しているか、罹患可能性があるかの新生児スクリーニングに用いる。
〔４．まとめ〕
以上から明らかなように、本発明は例えば、以下を包含する。
１）シグナルジョイント部分を含むＴＲＥＣ（T-cell Receptor Excision Circles）の核酸断片、及び、シグナルジョイント部分を含むＫＲＥＣ（Kappa-deleting Receptor Excision Circles）の核酸断片の少なくとも一方が、細胞内又はリポソーム内に導入されている、粒子。
２）シグナルジョイント部分を含むＴＲＥＣの上記核酸断片、及び、シグナルジョイント部分を含むＫＲＥＣの上記核酸断片が導入されている、１）に記載の粒子。
３）上記核酸断片が何れも４００ｂｐ以上で６００ｂｐ以下の範囲内であり、当該核酸断片の両端部から上記シグナルジョイント部分まで少なくとも８０ｂｐ以上離れている、１）又は２）に記載の粒子。
４）上記核酸断片が上記細胞に導入されている、１）〜３）の何れかに記載の粒子。
５）上記細胞は、内在性のＴＲＥＣ及びＫＲＥＣを有していない、４）に記載の粒子。
６）上記核酸断片が、所定の個数含まれている、１）〜５）の何れかに記載の粒子。
７）上記１）〜６）の何れかに記載の粒子を、所定の濃度（粒子の個数／液体の体積）で含んでいる液体であるか、当該液体を繊維体にしみこませてなる、標準試料。
８）上記液体は、赤血球及び血漿の少なくとも一方を含んでなる、７）に記載の標準試料。
９）上記液体を上記繊維体にしみこませてなるスポットを複数有し、当該スポット間で上記粒子の濃度が異なっている、７）又は８）に記載の標準試料。
１０）上記１）〜６）の何れかに記載の粒子、又は、７）〜９）の何れかに記載の標準試料を含んでなる、キット。
１１）ＴＲＥＣの上記核酸断片を遺伝子増幅するためのプライマー、ＫＲＥＣの上記核酸断片を遺伝子増幅するためのプライマー、ＴＲＥＣの上記核酸断片に対するプローブ、及び、ＫＲＥＣの上記核酸断片に対するプローブからなる群より選択される少なくとも一つを含んでなる、１０）に記載のキット。
１２）血液検体に含まれるＴＲＥＣ及びＫＲＥＣの少なくとも一方の量を、遺伝子増幅法を用いて評価する方法であって、７）〜９）の何れかに記載の標準試料をコントロール試料又は検量線作成用の試料として用いる、方法。
１３）上記血液検体が新生児のろ紙血検体である、１２）に記載の方法。
１４）上記１３）に記載の方法でＴＲＥＣ及びＫＲＥＣの少なくとも一方の量を評価した結果に基づいて、上記新生児が重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）に罹患している可能性を評価する、１３）に記載の方法。
１５）シグナルジョイント部分を含むＴＲＥＣの核酸断片、及び、シグナルジョイント部分を含むＫＲＥＣの核酸断片の少なくとも一方を含む、核酸構築物（ただし、ＴＲＥＣの全長、及び、ＫＲＥＣの全長は含まない）。
【実施例】
【００６５】
本発明の一実施例について説明すれば以下のとおりである。【００６６】
〔実施例１〕
＜Ｋ５６２−ＴＲＥＣ、Ｋ５６２−ＫＲＥＣ、Ｋ５６２−ＴＲＥＣ−ＫＲＥＣの作製＞
１．配列の増幅とプラスミドの作製
１−１．ＴＲＥＣ５００とＫＲＥＣ５００の配列同定
６名のヒト（０歳〜成人）の血液からQIAGEN DNeasy blood and tissue kit又はQIAmp DNA Blood mini kitを用いてゲノム検体を抽出し、ＰＣＲ法を用いることによって、ＴＲＥＣ（T-cell Receptor Excision Circles）の結合部であるδＲｅｃ−ΨＪα及びその周辺部位を含んだＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を、ＤＮＡシーケンサーを用いて解析した。具体的には、データベース上より、δＲｅｃ−ΨＪαから約３００ｂｐ上流及び下流のプライマーを設計し、これらを使用して約５５０ｂｐを増幅し、サンガーシーケンスによって配列を確認した。ＡＴＧＣシーケンスアセンブリソフトウェア（ゼネティックス）を用いてこれらＤＮＡ断片の塩基配列同士を比較し、塩基の挿入・欠失による遺伝的変異に由来する、個人間の相違がある部分を取り除いた、結合部の共通配列を同定した。さらに、結合部の共通配列の真中より左右に約２５０ｂｐまでの計５００ｂｐ程度の塩基配列を同定し、ＴＲＥＣ５００配列とした。ＴＲＥＣ５００配列は、配列番号１に示す。以下、ＴＲＥＣ５００配列で示されるＤＮＡを、ＴＲＥＣ５００と称する場合がある。【００６７】
６名のヒト（０歳〜成人）の血液からQIAGEN DNeasy blood and tissue kit又はQIAmp DNA Blood mini kitを用いてゲノム検体を抽出し、ＰＣＲ法を用いることによって、ＫＲＥＣ（Kappa-deleting Receptor Excision Circles）の結合部であるintron RSS-κde signal joint及びその周辺部位を含んだＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を、ＤＮＡシーケンサーを用いて解析した。具体的には、データベース上より、intron RSS-κde signal jointから約３００ｂｐ上流及び下流のプライマーを設計し、これらを使用して約５５０ｂｐを増幅し、サンガーシーケンスによって配列を確認した。ＡＴＧＣシーケンスアセンブリソフトウェア（ゼネティックス）を用いてこれらＤＮＡ断片の塩基配列同士を比較し、塩基の挿入・欠失による遺伝的変異に由来する、個人間の相違がある部分を取り除いた、結合部の共通配列を同定した。さらに、結合部の共通配列の真中より左右に約２５０ｂｐまでの計５００ｂｐ程度の塩基配列を同定し、ＫＲＥＣ５００配列とした。ＫＲＥＣ５００配列の塩基配列情報は、配列番号２に示す。以下、ＫＲＥＣ５００配列で示されるＤＮＡを、ＫＲＥＣ５００と称する場合がある。【００６８】
１−２．プラスミドの作製
ＴＲＥＣ５００配列とＫＲＥＣ５００配列のオリゴＤＮＡを、ＤＮＡ合成機を用いて合成した。ＴＡクローニングによって各オリゴＤＮＡを異なるｐＣＲ２．１ベクター（インビトロジェン）に組み込み、得られたプラスミドをそれぞれｐＣＲ−ＴＲＥＣ５００とｐＣＲ−ＫＲＥＣ５００とした。次に、これらのプラスミドから制限酵素ＥｃｏＲＩにより、ＴＲＥＣ５００を含むＤＮＡ断片とＫＲＥＣ５００を含むＤＮＡ断片とを切り出し、異なるｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（インビトロジェン）のマルチクローニングサイト（multiple cloning site）のＥｃｏＲＩ認識部位に挿入した。さらに、挿入したＤＮＡ断片の転写が起こらないように、ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドのＣＭＶプロモーター配列をＢｇｌ ＩＩとＢａｍＨＩで削除し、得られたそれぞれのプラスミドをｐＴＲＥＣ５００とｐＫＲＥＣ５００とした。【００６９】
さらに、ｐＴＲＥＣ５００において、ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドのマルチクローニングサイトのＮｏｔＩ認識部位に、ＫＲＥＣ５００を含むＤＮＡ断片を組み込むことで、ＴＲＥＣ５００とＫＲＥＣ５００との両方を含むプラスミドｐＴＲＥＣ−ＫＲＥＣを作製した。なお、ＫＲＥＣ５００を含むＤＮＡ断片は、制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔＩを用いてｐＣＲ−ＫＲＥＣ５００から切り出すことによって調製した。【００７０】
２．遺伝子導入細胞の作製
２−１．遺伝子導入
脊髄性白血病由来の細胞株Ｋ５６２に対して、ｐＴＲＥＣ５００、ｐＫＲＥＣ５００、及びｐＴＲＥＣ−ＫＲＥＣをそれぞれエレクトロポレーション（Biorad Gene pulsar）により遺伝子導入を行った。【００７１】
遺伝子導入より３日後、それぞれの細胞群に対してネオマイシンによるセレクションを行った。次いで、ネオマシン耐性の細胞群に対して、シングルセルクローニングを行い、ＦＩＳＨ法（fluorescent in situ hybridization）によってＴＲＥＣ５００、及び／又は、ＫＲＥＣ５００が１コピーであるクローンを選んだ。【００７２】
２−２．コピー数の確認
細胞群からそれぞれ選び出したクローンについて、DNA blood and Tissue kit(ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ＴＲＥＣ５００、及び、ＫＲＥＣ５００のコピー数を確認するために、１細胞に対して２コピー含有されるＲＮａｓｅＰ及びＲＰＰ３０（Ribonuclease P/MRP Subunit P30）に対するプライマーとプローブとを用いてドロップレットデジタルＰＣＲを行った。ドロップレットデジタルＰＣＲの結果から、選び出されたクローンにおいて、ＴＲＥＣ５００／ＲＰＰ３０の比率、及び、ＫＲＥＣ５００／ＲＰＰ３０の比率が共に０．５であり、ＲＮａｓｅＰ／ＲＰＰ３０の比率が１であることが確認された。【００７３】
以上のようにして作製した、細胞株Ｋ５６２に対してＴＲＥＣ５００を１コピー含む細胞をＫ５６２−ＴＲＥＣ５００と称する。同様に、細胞株Ｋ５６２に対してＫＲＥＣ５００を１コピー含む細胞をＫ５６２−ＫＲＥＣ５００と称し、細胞株Ｋ５６２に対してＴＲＥＣ５００及びＫＲＥＣ５００をそれぞれ１コピー含む細胞をＫ５６２−ＴＲＥＣ−ＫＲＥＣと称する。【００７４】
＜ろ紙血の作製＞
１．検量線作成用ろ紙血の作製
赤血球濃厚液に新鮮凍結血漿を混合し、ヘマトクリット値６２％となる赤血球液を調製した。次に、Ｋ５６２−ＴＲＥＣ５００、Ｋ５６２−ＫＲＥＣ５００、及びＫ５６２−ＴＲＥＣ−ＫＲＥＣを、別々の赤血球液に、所定の細胞濃度（０、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、及び１００００個／μｌの９種類）となるように混合し、赤血球−細胞混合液を得た。赤血球−細胞混合液を５０μｌずつろ紙（型番：09800010・アドバンテック東洋株式会社）にスポットし、室温で乾燥した。この９種類の細胞濃度で各細胞を含む全９個のスポットを１セットとして、各細胞に対する検量線作成用ろ紙血とした。【００７５】
２．コントロールろ紙血の作製
０か月児の白血球数の下限は５０００個／μｌであることを鑑み、次の（Ａ）及び（Ｂ）に示す赤血球−細胞混合液を調製した。なお、細胞を混合する前の赤血球液は、上記「１．検量線作成用ろ紙血の作製」で説明したものと同じ方法で調製した。【００７６】
（Ａ）  陽性コントロール
赤血球以外の細胞として細胞株Ｋ５６２のみを５０００個／μｌの細胞濃度で含む赤血球−細胞混合液（ＴＲＥＣ及びＫＲＥＣは検出されない）。【００７７】
（Ｂ）  陰性コントロール
細胞株Ｋ５６２と当該細胞株に由来する細胞との総数が５０００個／μｌの細胞濃度である、以下に示す３種類の赤血球−細胞混合液を調製した。
・赤血球以外の細胞として、Ｋ５６２−ＴＲＥＣ５００を２００個／μｌと細胞株Ｋ５６２を４８００個／μｌとを含む赤血球−細胞混合液（陰性コントロール１）、
・赤血球以外の細胞として、Ｋ５６２−ＫＲＥＣ５００を２００個／μｌと細胞株Ｋ５６２を４８００個／μｌとを含む赤血球−細胞混合液（陰性コントロール２）、
・赤血球以外の細胞として、Ｋ５６２−ＴＲＥＣ−ＫＲＥＣを２００個／μｌと細胞株Ｋ５６２を４８００個／μｌとを含む赤血球−細胞混合液（陰性コントロール３）。【００７８】
次いで、調製した赤血球−細胞混合液を５０μｌずつろ紙（型番：09800010・アドバンテック東洋株式会社）にスポットし、室温で乾燥した。陽性コントロールのスポットと陰性コントロール１〜３の何れかのスポットとを１セットとして、各細胞（Ｋ５６２−ＴＲＥＣ５００、Ｋ５６２−ＫＲＥＣ５００又はＫ５６２−ＴＲＥＣ−ＫＲＥＣ）に対するコントロールろ紙血とした。【００７９】
３．新生児ろ紙血の作製
早産児及び未熟児を除く、国立成育医療研究センター研究所にて出生した新生児２２名について、文書により代諾者の同意を得た上で、踵に針などでわずかな傷をつけて、毛細血管から直接ろ紙（型番：09800010・東洋アドバンテック株式会社）に血液を染み込ませて採血した。室温で乾燥させて、各新生児に対する新生児ろ紙血とした。一般に、１つのスポットには５０μＬ程度の血液が含まれる。【００８０】
＜Ｃｔ値の測定とＴＲＥＣ及びＫＲＥＣ濃度の算出＞
１セットの検量線作成用ろ紙血、１セットのコントロールろ紙血、及び新生児ろ紙血について、３．２ｍｍのパンチを用いて、それぞれ１つのスポットあたり１つパンチ片を打ち出し、９６ウェルプレートの各ウェルに１つずつ入れた。なお、検量線作成用ろ紙血及びコントロールろ紙血のセットは、各プレートごとに用意した。【００８１】
１．洗浄
各ウェルにpurification solution（ＱＩＡＧＥＮ社）を８０μｌ添加し、ウェルプレートを２１２５×ｇで３０秒間遠心した。このウェルプレートを、室温で１０分間静置し、２５℃、３５００ｒｐｍで５分間遠心した後に、上清を可能な限り捨てた。各ウェルにpurification solutionを８０μｌ添加し、ウェルプレートを、２５℃、３５００ｒｐｍで３０秒間遠心した。このウェルプレートを、室温で１０分間静置し、２５℃、３５００ｒｐｍで５分間遠心した後に、上清を可能な限り捨てた。各ウェルにMili Q waterを８０μｌ添加し、ウェルプレートを、２５℃、３５００ｒｐｍで３０秒間遠心した後に、上清を可能な限り捨てた。【００８２】
２．溶出
上述した洗浄の工程を経たウェルプレートの各ウェルに、yeast  tRNA（invitrogen社）を１０μｇ／ｍｌ濃度で添加したelution solution（ＱＩＡＧＥＮ社）を２０μｌ加えた。このウェルプレートにシールを施し、サーマルサイクラ―を用いて９９℃で３０分間、溶出操作を行った。ウェルプレートを室温まで冷却し、ボルテックスミキサーで撹拌したのち、２５℃、３５００ｒｐｍで３０秒間遠心を行った。各ウェル中に得られたＤＮＡ溶出液（２０μｌ）を別々にチューブに移した。【００８３】
３．定量ＰＣＲ反応
得られた各ＤＮＡ溶出液２０μｌのうち２μｌ（表１中のTemplate ＤＮＡに相当）を使用し、LightCycler（登録商標）480  II（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて定量ＰＣＲ反応を行った。定量ＰＣＲ反応の反応液の組成（１ウェルあたり）は表１に示す通りであり、定量ＰＣＲ反応は２重反復試験（duplicate)で行った。プライマー及びプローブの配列は、以下のとおりである。【００８４】
＝ＴＲＥＣプライマー及びプローブの配列＝
・ＴＲＥＣ  Ｆｗプライマー：ＣＣＡＴＧＣＴＧＡＣＡＣＣＴＣＴＧＧＴＴ（配列番号３）
・ＴＲＥＣ  Ｒｖプライマー：ＴＣＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＴＧＡＡＴＧＡＡＧ（配列番号４）
・ＴＲＥＣプローブ：５’−ＦＡＭ−ＣＡＣＧＧＴＧＡＴＧＣＡＴＡＧＧＣＡＣＣＴＧＣ−ＭＧＢ−３’（配列番号５）
＝ＫＲＥＣプライマー及びプローブの配列＝
・ＫＲＥＣ  Ｆｗプライマー：ＴＣＡＧＣＧＣＣＣＡＴＴＡＣＧＴＴＣＴ（配列番号６）・ＫＲＥＣ  Ｒｖプライマー：ＧＴＧＡＧＧＧＡＣＡＣＧＣＡＧＣＣ（配列番号７）
・ＫＲＥＣプローブ：５’−ＦＡＭ−ＣＣＡＧＣＴＣＴＴＡＣＣＣＴＡＧＡＧ−ＭＧＢ−３’（配列番号８）【００８５】
【表１】
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定量ＰＣＲ反応は、はじめに、初期変性反応を９５℃、５分で１サイクル行った。続いて、変性反応（９５℃、１０秒）、アニーリング反応（６０℃、３０秒）及び、伸長反応（７２℃、１秒）を順に繰り返し４５サイクル行った。得られた増幅曲線から、各ＤＮＡ溶出液のＣｔ値を算出した。なお、コントロールろ紙血から得たＤＮＡ溶出液を用いた定量ＰＣＲ反応の結果から、定量ＰＣＲ反応が適切に行われていることも確認した。【００８６】
４．ＴＲＥＣ及びＫＲＥＣ濃度の算出
ＴＲＥＣ及びＫＲＥＣそれぞれについて、検量線作成用ろ紙血の各細胞濃度が１０から１０００個／μｌまでのものに対応するＣｔ値を座標上にプロットし、検量線を作成した。それぞれの検量線を図１、図２に示す。なお、図１は、Ｋ５６２−ＴＲＥＣ５００を含むろ紙血、及び、Ｋ５６２−ＴＲＥＣ−ＫＲＥＣを含むろ紙血から得たＤＮＡ溶出液について、ＴＲＥＣ５００の定量ＰＣＲ反応を行った結果から得られた検量線を示すものであり、図２は、Ｋ５６２−ＫＲＥＣ５００を含むろ紙血、及び、Ｋ５６２−ＴＲＥＣ−ＫＲＥＣを含むろ紙血から得たＤＮＡ溶出液について、ＫＲＥＣ５００の定量ＰＣＲ反応を行った結果から得られた検量線を示すものである。図１及び図２において、縦軸はＣｔ値であり、横軸は、検量線作成用ろ紙血の作製に用いた赤血球‐細胞混合液の細胞濃度（個／ｕｌ）であり、当該混合液中のＴＲＥＣ濃度又はＫＲＥＣ濃度（コピー数／ｕｌ）と同義である。横軸は対数目盛で示している。図１の検量線の式は、ｙ＝−１．２３８ｌｎ（Ｘ）＋４１．８５で表され、図２の検量線の式は、ｙ＝−１．２１１ｌｎ（Ｘ）＋３７．１８６で表される。図１、２より、本実施例において作成された検量線は、安定した直線形であることが分かった。【００８７】
図３は、２２名分の新生児ろ紙血（検体）から得たＤＮＡ溶出液について、ＴＲＥＣの定量ＰＣＲ反応で決定したＣｔ値を、図１の検量線上にプロットした状態を示す。縦軸及び横軸の定義は図１と同じである。図３より、２２名のうち１８名のスクリーニング陰性（ＴＲＥＣ検出）検体のプロットは、三角形で示されているが、いずれも検量線上に並び、ここから検量線の安定性が窺えた。このとき、４名の検体はスクリーニング陽性（ＴＲＥＣ未検出）で、ＰＣＲによる増幅がなかったためＣｔ値が得られず、プロットは図示されていない。また、図中のスクリーニング陰性検体のうち、Ｃｔ値が極端に低いプロット（黒塗りの三角形で示した）は、一過性リンパ球減少症に罹患している患者の検体である。【００８８】
さらに、コントロールろ紙血から得たＤＮＡ溶出液の定量ＰＣＲ反応で決定したＣｔ値より、新生児ろ紙血のＴＲＥＣ濃度及びＫＲＥＣ濃度を、以下の計算式によって算出した。ろ紙血の３．２ｍｍのパンチ片には凡そ３μｌの血液が含まれ、この血液から２０μｌのＤＮＡ溶出液を得ていることから、以下の計算式（１）となる。
・新生児ろ紙血のＴＲＥＣ濃度（コピー／μｌ)
＝決定したＣｔ値に検量線上で対応するＴＲＥＣ濃度（コピー／μｌ)×２０／３・新生児ろ紙血のＫＲＥＣ濃度（コピー／μｌ)
＝決定したＣｔ値に検量線上で対応するＫＲＥＣ濃度（コピー／μｌ)×２０／３
〔参考例１〕
１．新生児検体からのＤＮＡ溶出液の調製
実施例１の＜ろ紙血の作製＞欄における「３．新生児ろ紙血の作製」の記載に従って、早期産児及び未熟児を除いた、国立成育医療研究センター病院にて出生した新生児１０３名から各人の新生児ろ紙血を作製した。次いで、実施例１の＜Ｃｔ値の測定とＴＲＥＣ及びＫＲＥＣ濃度の算出＞欄における「１．洗浄」及び「２．溶出」の記載に従って、ウェルプレートの各ウェル中に得られたＤＮＡ溶出液（２０μｌ）を別々にチューブに移した。【００８９】
２．検量線用スタンダード希釈系列の作製
ＴＲＥＣに対する検量線用プラスミドとして、健常人ゲノムＤＮＡから、実施例１で用いたＴＲＥＣプライマーにより増幅した配列をｐＣＲ２．１に挿入して作成したプラスミド（ＴＲＥＣプラスミド）を用いた。また、ＡＣＴＢ（βアクチン）に対する検量線用プラスミドとしてＡＣＴＢプライマー（後述する）により増幅した配列をｐＣＲ２．１に挿入して作成したプラスミド（ＡＣＴＢプラスミド）を用いた。それぞれの検量線用プラスミドの濃度が２２ｎｇ／μｌ（５×１０９コピー／μｌ）になるように、検量線用プラスミドの原液を調製した。次いで、EASY  dilution（タカラバイオ社）を溶媒として用いて、ＡＣＴＢ用は５×１００コピー／μｌまでの１０倍希釈系列を作製し、ＴＲＥＣ用は５×１０２コピー／μｌまでの１０倍希釈系列を、さらに５×１０２コピー／μｌから７．８２コピー／μｌまでの２倍希釈系列を作製した。【００９０】
３．定量ＰＣＲ反応
ＴＲＥＣに対する定量ＰＣＲ反応の反応液の組成（１ウェルあたり）は実施例１中の表１に示す通りであり、ＡＣＴＢに対する定量ＰＣＲ反応の反応液の組成（１ウェルあたり）は以下の表２に示す通りである。表１〜２中のTemplate ＤＮＡとして、上記１．で得たＤＮＡ溶出液（同じＤＮＡ溶出液からＴＲＥＣ検出用２μｌとＡＣＴＢ検出用２μｌとを取得）、上記２．で得たＴＲＥＣ用の検量線用スタンダード希釈系列、及び、ＡＣＴＢ用の検量線用スタンダード希釈系列を用いた。ＡＣＴＢ用の検量線用スタンダード希釈系列は、５×１０５、５×１０４、５×１０３、５×１０２、５×１０１、５×１００コピー／μｌの６濃度を用いた。ＴＲＥＣ用の検量線用スタンダード希釈系列は、５×１０５、５×１０４、５×１０３、５×１０２コピー／μｌの１０倍希釈系列と、５×１０２コピー／μｌから７．８２コピー／μｌまでの２倍希釈系列との合計１０濃度を用いた。さらに、テンプレート無しネガティブコントロール（Non-template control(NTC))として、表１及び表２中のTemplate ＤＮＡをEASY  dilutionで置き換えたものを用いた。定量ＰＣＲ反応は２重反復試験（duplicate)で行った。【００９１】
＝ＡＣＴＢプライマー及びプローブの配列＝
・ＡＣＴＢ  Ｆｗプライマー：ＡＴＴＴＣＣＣＴＣＴＣＡＧＧＣＡＴＧＧＡ（配列番号９）
・ＡＣＴＢ  Ｒｖプライマー：ＣＧＴＣＡＣＡＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧ（配列番号１０）
・ＡＣＴＢプローブ：５’−ＨＥＸ−ＧＴＧＧＣＡＴＣＣＡＣＧＡＡＡＣＴＡ−ＭＧＢ−３’（配列番号１１）【００９２】
【表２】
2019044952.tif 000003
定量ＰＣＲ反応のその他の反応条件は、実施例１の＜Ｃｔ値の測定とＴＲＥＣ及びＫＲＥＣ濃度の算出＞欄の「３．定量ＰＣＲ反応」に記載の通りである。【００９３】
４．ＴＲＥＣ濃度の算出
溶出コントロールであるＡＣＴＢについて、検量線用スタンダード希釈系列の各コピー数及びＣｔ値から検量線を作成した。作成した検量線より、各ＤＮＡ溶出液におけるＡＣＴＢのコピー数を算出した。コピー数が５０００コピー／μｌ以上であることを条件として、ＤＮＡ溶出不良が起こっていないことを確認した。【００９４】
その上で、ＴＲＥＣについて、検量線用スタンダードの各コピー数及びＣｔ値から検量線を作成し、各ＤＮＡ溶出液について、検量線上でのＴＲＥＣ濃度（コピー／μｌ)を算出した。また、実施例１の計算式（１）に従い、新生児ろ紙血のＴＲＥＣ濃度（コピー／μｌ)も算出した。【００９５】
〔参考例２〕
１．新生児検体からのＤＮＡ溶出液の調製
参考例１の「１．新生児検体からのＤＮＡ溶出液の調製」欄の記載と同様にして、新生児ろ紙血からＤＮＡ溶出液（２０μｌ）を得た。なお、参考例１と参考例２とは同一の新生児検体を用いている。【００９６】
２．検量線用スタンダード希釈系列の作製
ＡＣＴＢ（βアクチン）に対する検量線用プラスミドとして健常人ゲノムＤＮＡからＡＣＴＢプライマー（後述する）により増幅した配列をｐＣＲ２．１に挿入して作成したプラスミド（ＡＣＴＢプラスミド）を用いた。検量線用プラスミドの濃度が２２ｎｇ／μｌ（５×１０９コピー／μｌ）になるように、検量線用プラスミドの原液を調製した。次いで、EASY  dilution（タカラバイオ社）を溶媒として用いて１０倍希釈系列作製した。【００９７】
また、ＴＲＥＣに対する検量線を作成するために、LightMix（登録商標）Modular  Kit
TREC（Ｒｏｃｈｅ社）に付属するPositive  Control（２００コピー／μｌ）を用い、その２倍希釈系列を６濃度（２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５コピー／μｌ）作製した。【００９８】
３．定量ＰＣＲ反応
ＴＲＥＣに対する定量ＰＣＲ反応の反応液の組成（１ウェルあたり）は表３に示す通りであり、ＡＣＴＢに対する定量ＰＣＲ反応の反応液の組成（１ウェルあたり）は以下の表４に示す通りである。表３〜４中のテンプレートＤＮＡとして、上記１．で得たＤＮＡ溶出液（同じＤＮＡ溶出液からＴＲＥＣ検出用１μｌとＡＣＴＢ検出用１μｌとを取得）、上記２．で得たＴＲＥＣ用の検量線用スタンダード希釈系列、及び、ＡＣＴＢ用の検量線用スタンダード希釈系列を用いた。ＴＲＥＣ用の検量線用スタンダード希釈系列は、２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５コピー／μｌの６濃度を用いた。ＡＣＴＢ用の検量線用スタンダード希釈系列は、５×１０５、５×１０４、５×１０３、５×１０２、５×１０１、５×１００、５×１０−１コピー／μｌの７濃度を用いた。さらに、テンプレート無しネガティブコントロール（NTC)として、表３及び表４中のTemplate ＤＮＡをEASY  dilutionで置き換えたものを用いた。定量ＰＣＲ反応は２重反復試験（duplicate)で行った。【００９９】
＝ＴＲＥＣプライマー及びプローブの配列＝
LightMix（登録商標）Modular  Kit  TRECに備え付けのものを用いた。【０１００】
＝ＡＣＴＢプライマー及びプローブの配列＝
参考例１と同じＡＣＴＢ  Ｆｗプライマー、ＡＣＴＢ  Ｒｖプライマー、及びＡＣＴＢプローブの組合せを用いた。【０１０１】
【表３】
2019044952.tif 000004
【０１０２】
【表４】
2019044952.tif 000005
【０１０３】
そして、ＡＢＩ７５００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて定量ＰＣＲ反応を行った。はじめに、逆転写反応を６３℃で１サイクル、初期変性反応を９５℃で１サイクル行った。続いて、変性反応（９５℃）、アニーリング反応（６０℃）及び、伸長反応（７２℃）を順に繰り返し４５サイクル行った。得られた増幅曲線から各反応溶液のＣｔ値を算出した。【０１０４】
４．ＴＲＥＣ濃度の算出
参考例１の「４．ＴＲＥＣ濃度の算出」に記載の方法に従い、本参考例に関する検量線を得て、新生児ろ紙血のＴＲＥＣ濃度（コピー／μｌ)を算出した。【０１０５】
５．参考例１と参考例２との結果の比較
同一検体について異なる方法でＴＲＥＣ値の測定を行った結果、同一検体を用いても換算値（新生児ろ紙血のＴＲＥＣ濃度（コピー／μｌ)）は大きく異なっていた。具体的には、参考例２の換算値が参考例１の換算値よりも明らかに小さくなる傾向が見られた。一方、この換算値を求めるのに用いたＣｔ値を比較すると、参考例２のＣｔ値が参考例１のＣｔ値よりも明らかに小さくなるという、一見矛盾する傾向が見られた。ここから、二つの方法において検量線の違いが換算値の違いを生んでいること、より具体的には、参考例１及び２で得られた検量線を同じ座標上にプロットすると、参考例２の検量線が参考例１と比較して原点より近くに位置する可能性、すなわち、参考例２で得られた増幅曲線の立ち上がりが、参考例１と比較して早い可能性が示唆された。【０１０６】
６．実施例１と参考例１との結果の比較
実施例１による検量線と参考例１による検量線を比較した。結果を図４に示す。黒塗り丸印が実施例１の結果であり、白抜き四角形が参考例１の結果である。なお、図中の人工ろ紙血のグラフは、図１の検量線と同じものであるが、参考例１の結果と比較するため、横軸の細胞濃度（ＴＲＥＣ濃度）を以下の式によって、赤血球‐細胞混合液あたりの値（図１の値）から、人工ろ紙血あたりの値（図４の値。但しｌｏｇ値で示す）に換算してある。【０１０７】
人工ろ紙血中の濃度（／μｌ）＝赤血球‐細胞混合液の濃度（／μｌ）×３／２０
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明は、新生児が重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）に罹患している可能性の評価に利用することができる。
【図１】
2019044952.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月26日(2020.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナルジョイント部分を含むＴＲＥＣ（T-cell Receptor Excision Circles）の核酸断片、及び、シグナルジョイント部分を含むＫＲＥＣ（Kappa-deleting Receptor Excision Circles）の核酸断片の少なくとも一方が、細胞内又はリポソーム内に導入されており、
上記核酸断片は、プラスミドに挿入されたものであり、
上記細胞は、血液系または免疫系の細胞である、粒子。
【請求項２】
シグナルジョイント部分を含むＴＲＥＣの上記核酸断片、及び、シグナルジョイント部分を含むＫＲＥＣの上記核酸断片が導入されている、請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
上記核酸断片が何れも４００ｂｐ以上で６００ｂｐ以下の範囲内であり、当該核酸断片の両端部から上記シグナルジョイント部分まで少なくとも８０ｂｐ以上離れている、請求項１又は２に記載の粒子。
【請求項４】
上記核酸断片が上記細胞に導入されている、請求項１〜３の何れか一項に記載の粒子。
【請求項５】
上記細胞は、内在性のＴＲＥＣ及びＫＲＥＣを有していない、請求項４に記載の粒子。
【請求項６】
上記核酸断片が、所定の個数含まれている、請求項１〜５の何れか一項に記載の粒子。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか一項に記載の粒子を、所定の濃度（粒子の個数／液体の体積）で含んでいる液体を繊維体にしみこませてなる、試料。
【請求項８】
上記液体を上記繊維体にしみこませてなるスポットを複数有し、当該スポット間で上記粒子の濃度が異なっている、請求項７に記載の試料。
【請求項９】
請求項１〜６の何れか一項に記載の粒子を、所定の濃度（粒子の個数／液体の体積）で含んでいる液体である、試料。
【請求項１０】
上記液体は、赤血球及び血漿の少なくとも一方を含んでなる、請求項７〜９の何れか一項に記載の試料。
【請求項１１】
請求項１〜６の何れか一項に記載の粒子、又は、請求項７〜１０の何れか一項に記載の試料を含んでなる、キット。
【請求項１２】
ＴＲＥＣの上記核酸断片を遺伝子増幅するためのプライマー、ＫＲＥＣの上記核酸断片を遺伝子増幅するためのプライマー、ＴＲＥＣの上記核酸断片に対するプローブ、及び、ＫＲＥＣの上記核酸断片に対するプローブからなる群より選択される少なくとも一つを含んでなる、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
血液検体に含まれるＴＲＥＣ及びＫＲＥＣの少なくとも一方の量を、遺伝子増幅法を用いて評価する方法であって、
請求項７〜１０の何れか一項に記載の試料をコントロール試料又は検量線作成用の試料として用いる、方法。
【請求項１４】
上記血液検体が新生児のろ紙血検体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法でＴＲＥＣ及びＫＲＥＣの少なくとも一方の量を評価した結果に基づいて、上記新生児が重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）に罹患している可能性を評価する、請求項１４に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
【表３】
2019044952.tif 000010
【国際調査報告】
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2019044952.tif 000012
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