(57)【要約】  ヘモグロビン含有試料に、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を添加して過酸化水素を生成させ、生成した当該過酸化水素を消去した後、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を添加して過酸化水素を生成させ、生成した当該過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモグロビン含有試料に、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を添加して過酸化水素を生成させ、生成した当該過酸化水素を消去した後、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を添加して過酸化水素を生成させ、生成した当該過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
【請求項２】
以下の工程を含む、請求項１記載の方法。
（１）糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、当該ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドとを反応させて過酸化水素を生成させ、生成した当該過酸化水素を消去する工程；
（２）工程（１）の反応液に、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を添加し、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、糖化ヘモグロビンとを反応させて、過酸化水素を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（４）当該ヘモグロビン含有試料の代わりに、既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて、上記（１）〜（３）と同様の工程を行うことにより予め作成された糖化ヘモグロビン濃度と過酸化水素の測定値との関係を示す検量線と、工程（３）の測定値とを照らし合わせることにより、当該ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
【請求項３】
前記過酸化水素の消去が、カタラーゼにより行われる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記過酸化水素の測定が、カタラーゼ阻害剤の存在下に行われる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記カタラーゼ阻害剤が、アジ化物である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記過酸化水素の消去が、ペルオキシダーゼと酸化カップリング発色反応により使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方との組み合わせにより行われる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
前記過酸化水素の消去が、当該試料中の還元性物質により行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記過酸化水素の測定が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体により行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、カタラーゼとを含む第１試薬、及び、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、カタラーゼ阻害剤とを含む第２試薬を含む、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット。
【請求項１２】
前記カタラーゼ阻害剤がアジ化物である、請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体をそれぞれ、第１試薬及び第２試薬に別々に含むか、又は、第２試薬及び第１試薬に別々に含む、請求項１１又は１２記載のキット。
【請求項１４】
糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、及び、ペルオキシダーゼと、酸化カップリング発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方との組み合わせを含む第１試薬、及び、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、ロイコ型色原体とを含む第２試薬を含む、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット。
【請求項１５】
糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第１試薬、及び、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第２試薬を含み、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体をそれぞれ、第１試薬及び第２試薬に別々に含むか、又は、第２試薬及び第１試薬に別々に含む、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット。
【請求項１６】
前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１７】
前記フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、請求項１６記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法、及び、測定キットに関する。
本願は、２０１７年５月３０日に日本に出願された特願２０１７−１０７００２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
糖化タンパク質は、生体内の血液等の体液や毛髪等の生体試料中に含まれている。血液中に存在する糖化タンパク質の濃度は、血清中に溶解しているグルコース等の糖類の濃度に依存しており、臨床診断分野において、血液中の糖化タンパク質であるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）の濃度の測定が、糖尿病の診断やモニタリングに用いられている（非特許文献１参照）。ヘモグロビンは、α鎖及びβ鎖の２種類のサブユニットを各々２つ持つ、分子量６４，０００のヘムタンパク質である。ＨｂＡ１ｃは特にβ鎖のＮ末端バリン残基が糖化されたものと定義されている。このＨｂＡ１ｃを測定する方法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる機器分析的方法（非特許文献２参照）、抗原抗体反応を用いる免疫測定法（非特許文献３）等が知られていた。【０００３】
近年、汎用性のある自動分析装置への適用が可能であり、また、操作も簡便なＨｂＡ１ｃの酵素的測定法の開発が進んでおり、種々の方法が報告されている。ＨｂＡ１ｃの酵素的測定法として、プロテアーゼ、及び、フルクトシルペプチドオキシダーゼを用いる方法のみならず、プロテアーゼを用いることなく、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を用いて、検体中の糖化ヘモグロビンを測定する方法も報告されている（特許文献１〜３参照）。【０００４】
このようなＨｂＡ１ｃの酵素的測定法において、検体中の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドがしばしば測定に影響を与える。特に、輸液を受けている患者由来の検体においては、輸液に含まれるグルコースとアミノ酸又はペプチドとが反応して生成する糖化アミノ酸又は糖化ペプチドが多く含まれ、ＨｂＡ１ｃの測定に影響を与える。これまで、糖化アミノ酸及び糖化ペプチドの影響を抑制する検体中の糖化ヘモグロビンの測定方法が報告されている（特許文献４、５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１５／００５２５８号
【特許文献２】国際公開第２０１５／００５２５７号
【特許文献３】国際公開第２０１５／０６０４２９号
【特許文献４】特開２０１１−０４５３８９号公報
【特許文献５】国際公開第２００３／０３３７２９号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Clin Chem Lab Med，第36巻、p.299-308(1998).
【非特許文献２】Diabetes，第27巻、第2号、p.102-107(1978).
【非特許文献３】日本臨床検査自動化学会会誌、第18巻、第4号、p.620 (1993).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまで、プロテアーゼを用いることなく、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を用いる、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法において、ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの影響を受けて、正確な糖化ヘモグロビンの測定ができない、という課題があった。
従って、本発明の目的は、ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの影響を受けることなく、糖化ヘモグロビンを正確に測定する方法及びキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、本課題を解決すべく鋭意検討し、ヘモグロビン含有試料に、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を添加して過酸化水素を生成させ、生成した当該過酸化水素を消去した後、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を添加して過酸化水素を生成させ、生成した当該過酸化水素を測定することにより、ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの影響を受けることなく、糖化ヘモグロビンを正確に測定することができる、という知見を見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［１７］に関する。
［１］ヘモグロビン含有試料に、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を添加して過酸化水素を生成させ、生成した当該過酸化水素を消去した後、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を添加して過酸化水素を生成させ、生成した当該過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。【００１０】
［２］以下の工程を含む、［１］記載の方法。
（１）糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、当該ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドとを反応させて過酸化水素を生成させ、生成した当該過酸化水素を消去する工程；
（２）工程（１）の反応液に、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を添加し、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、糖化ヘモグロビンとを反応させて、過酸化水素を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（４）当該ヘモグロビン含有試料の代わりに、既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて、上記（１）〜（３）と同様の工程を行うことにより予め作成された糖化ヘモグロビン濃度と過酸化水素の測定値との関係を示す検量線と、工程（３）の測定値とを照らし合わせることにより、当該ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
［３］前記過酸化水素の消去が、カタラーゼにより行われる、［１］又は［２］記載の方法。
［４］前記過酸化水素の測定が、カタラーゼ阻害剤の存在下に行われる、［３］記載の方法。
［５］前記カタラーゼ阻害剤が、アジ化物である、［４］記載の方法。
［６］前記過酸化水素の消去が、ペルオキシダーゼと酸化カップリング発色反応により使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方との組み合わせにより行われる、［１］又は［２］記載の方法。
［７］前記過酸化水素の消去が、当該試料中の還元性物質により行われる、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記過酸化水素の測定が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体により行われる、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、［８］記載の方法。
［１０］前記フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、［９］記載の方法。【００１１】
［１１］糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、カタラーゼとを含む第１試薬、及び、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、カタラーゼ阻害剤とを含む第２試薬を含む、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット。
［１２］前記カタラーゼ阻害剤がアジ化物である、［１１］記載のキット。
［１３］さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体をそれぞれ、第１試薬及び第２試薬に別々に含むか、又は、第２試薬及び第１試薬に別々に含む、［１１］又は［１２］記載のキット。【００１２】
［１４］糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、及び、ペルオキシダーゼと、酸化カップリング発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方との組み合わせを含む第１試薬、及び、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、ロイコ型色原体とを含む第２試薬を含む、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット。【００１３】
［１５］糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第１試薬、及び、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第２試薬を含み、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体をそれぞれ、第１試薬及び第２試薬に別々に含むか、又は、第２試薬及び第１試薬に別々に含む、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット。
［１６］前記ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である、［１３］〜［１５］のいずれかに記載のキット。
［１７］前記フェノチアジン系色原体が、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩である、［１６］記載のキット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの影響を受けることなく、糖化ヘモグロビンを正確に測定する方法及びキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＦＰＯＸ−４７Δ３を第２試薬に含むキットＡを用いる、ヘモグロビン含有試料中のＨｂＡ１ｃの測定における、ＨｂＡ１ｃ濃度と吸光度差ΔＥとの関係を示すグラフである。縦軸は吸光度差ΔＥ（Ａｂｓ×１００００）を、横軸はＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法
本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料に、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を添加して過酸化水素を生成させ、生成した当該過酸化水素を消去した後、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を添加して過酸化水素を生成させ、生成した当該過酸化水素を測定することを特徴とする方法である。
【００１７】
具体的には、以下の工程を含む方法である。
（１）糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、当該ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドとを反応させて過酸化水素を生成させ、生成した当該過酸化水素を消去する工程；
（２）工程（１）の反応液に、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を添加し、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、糖化ヘモグロビンとを反応させて、過酸化水素を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（４）当該ヘモグロビン含有試料の代わりに、既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて、上記（１）〜（３）と同様の工程を行うことにより予め作成された糖化ヘモグロビン濃度と過酸化水素の測定値との関係を示す検量線と、工程（３）の測定値とを照らし合わせることにより、当該ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
【００１８】
また、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度の、総ヘモグロビン濃度（すなわち、ヘモグロビン濃度と糖化ヘモグロビン濃度とを合わせた総濃度）に対する割合を算出する方法も包含する。この場合、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、具体的には、以下の工程を含む測定方法である。
（１）ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン濃度を測定する工程；
（２）糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、当該ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドとを反応させて過酸化水素を生成させ、生成した当該過酸化水素を消去する工程；
（３）工程（２）の反応液に、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を添加し、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、糖化ヘモグロビンとを反応させて、過酸化水素を生成させる工程；
（４）工程（３）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（５）当該ヘモグロビン含有試料の代わりに、既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて、上記（２）〜（４）と同様の工程を行うことにより予め作成された糖化ヘモグロビン濃度と過酸化水素の測定値との関係を示す検量線と、工程（４）の測定値とを照らし合わせることにより、当該ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
（６）工程（１）で測定した総ヘモグロビン濃度と、工程（５）で決定した糖化ヘモグロビン濃度とから、当該ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン濃度に対する糖化ヘモグロビン濃度の割合を算出する工程。
総ヘモグロビン濃度は、シアンメトヘモグロビン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ−ヘモグロビン法等の公知の方法を用いて測定することができる。
【００１９】
本発明の測定方法におけるヘモグロビン含有試料は、ヘモグロビンを含有し、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法が適用可能な試料であれば特に制限はなく、例えば全血、血球、血球に血漿が混在した試料、これらの試料を溶血処理した試料等が挙げられる。溶血処理としては、全血、血球、血球に血漿が混在した試料を溶血させる処理であれば特に制限はなく、例えば物理的方法、化学的方法、生物学的方法等が挙げられる。物理的方法としては、例えば蒸留水等の低張液を用いる方法、超音波を用いる方法等が挙げられる。化学的方法としては、例えばメタノール、エタノール、アセトン等の有機溶媒を用いる方法、ポリオキシエチレン系界面活性剤を用いる方法等が挙げられる。生物学的方法としては、例えば抗体や補体を用いる方法等が挙げられる。
【００２０】
本発明における糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンにグルコース等の糖が結合して生成したものであり、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ＨｂＡ１ｃ等が挙げられ、ＨｂＡ１ｃが好ましい。
本発明における糖化アミノ酸は、ヘモグロビン含有試料中に存在し、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を用いる糖化ヘモグロビンの測定に影響を及ぼし得るものであり、例えば糖化バリン、糖化リジン等が挙げられる。糖化バリンとしては、例えばフルクトシルバリン等が挙げられる。糖化リジンとしては、例えばフルクトシルリジン等が挙げられる。
【００２１】
本発明における糖化ペプチドは、ヘモグロビン含有試料中に存在し、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を用いる糖化ヘモグロビンの測定に影響を及ぼし得るものであり、糖化ジペプチド、糖化トリペプチド等が挙げられる。糖化ジペプチドとしては、例えば糖化バリルヒスチジン等が挙げられる。糖化バリルヒスチジンとしては、例えばフルクトシルバリルヒスチジン等が挙げられる。また、糖化トリペプチドとしては、例えば糖化バリルヒスチジルロイシン等が挙げられる。糖化バリルヒスチジルロイシンとしては、例えばフルクトシルバリルヒスチジルロイシン等が挙げられる。
【００２２】
糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素としては、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンには作用せず、ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドに作用して、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドから過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素であれば特に制限はなく、例えば例えば糸状菌由来、酵母由来、放線菌由来、バクテリア由来、古細菌由来のフルクトシルペプチド酸化酵素等が挙げられる。本発明においては、市販のフルクトシルペプチド酸化酵素も使用することができ、市販品としては例えばＦＰＯＸ−ＣＥ（キッコーマン社製）、ＦＰＯＸ−ＥＥ（キッコーマン社製）、ＦＰＯＸ−ＣＥＴ（キッコーマン社製）等が挙げられる。
【００２３】
ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドと、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応は、水性媒体中で行うことが好ましい。水性媒体としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。
【００２４】
水性媒体のpHは、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とするpHであれば特に制限はなく、例えばpH4〜10である。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するpHに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
【００２５】
グッドの緩衝剤としては、例えば2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)、ビス（2-ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン(Bis-Tris)、N-（2-アセトアミド）イミノ二酢酸(ADA)、ピペラジン-N,N’-ビス（2-エタンスルホン酸）(PIPES)、N-（2-アセトアミド）-2-アミノエタンスルホン酸(ACES)、3-モルホリノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）-2-アミノエタンスルホン酸(BES)、3-モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、N-〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕-2-アミノエタンスルホン酸(TES)、2-〔4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPES)、3-〔N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）アミノ〕-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、N-〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕-2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPSO)、ピペラジン-N,N’-ビス（2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）(POPSO)、3-〔4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル〕-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(HEPPSO)、3-〔4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔(H)EPPS〕、N-〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン(Tricine)、N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）グリシン(Bicine)、N-トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸(CHES)、N-シクロヘキシル-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO)、N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸(CAPS)等が挙げられる。緩衝液の濃度は、通常0.001〜2.0 mol/Lであり、0.005〜1.0 mol/Lが好ましい。
【００２６】
ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドと、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応における反応温度は、当該反応を可能とする反応温度であれば特に制限はなく、通常10〜50℃であり、20〜40℃が好ましい。また、当該反応における反応時間は、当該反応を可能とする反応時間であれば特に制限はなく、通常1分間〜3時間であり、2.5分間〜1時間が好ましい。糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の反応液中の濃度としては、ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドと、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応が進行する濃度であれば特に制限はなく、通常0.1〜30 kU/Lであり、好ましくは0.2〜15 kU/Lである。
【００２７】
本発明において、ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドと、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応で生成する過酸化水素の消去とは、ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドと、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応で生成する過酸化水素を、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定に影響を及ぼさない物質に変換することを意味する。ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドと、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応で生成する過酸化水素の消去は、例えばカタラーゼや、ペルオキシダーゼと酸化カップリング発色反応により使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方との組み合わせ、当該ヘモグロビン含有試料中の還元性物質等により行うことができる。酸化カップリング型色原体としては、例えば後述の酸化カップリング型色原体等が挙げられる。ヘモグロビン含有試料中の還元性物質としては、例えばアスコルビン酸、ヘモグロビン等が挙げられる。
【００２８】
ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドと、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応で生成する過酸化水素を、カタラーゼにより消去する場合、カタラーゼの反応液中の濃度は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.001〜5,000 kU/Lであり、0.01〜1,000 kU/Lが好ましい。
【００２９】
ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドと、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応で生成する過酸化水素を、ペルオキシダーゼと酸化カップリング発色反応により使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方との組み合わせにより消去する場合、ペルオキシダーゼの反応液中の濃度は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.01〜500 kU/Lであり、0.1〜100 kU/Lが好ましく、酸化カップリング発色反応により使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方の反応液中の濃度は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.01〜10 g/Lであり、0.05〜5 g/Lが好ましい。
【００３０】
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応における反応温度は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする反応温度であれば特に制限はなく、通常10〜50℃であり、20〜40℃が好ましい。また、当該反応における反応時間は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする反応時間であれば特に制限はなく、通常1分間〜3時間であり、2.5分間〜1時間が好ましい。糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の反応液中の濃度としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.1〜30 kU/Lであり、0.2〜15 kU/Lが好ましい。
【００３１】
また、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応は、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応を可能とするように、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの構造を変化させる、糖化ヘモグロビン変性剤の存在下で行うことが好ましい。糖化ヘモグロビン変性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、例えばアルキルグルコシド、脂肪酸ソルビタンエステル、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、アルキルモノグリセリルエーテル等が挙げられる。カチオン性界面活性剤としては、例えば第四級アンモニウム塩、ピリジニウム塩、ホスホニウム塩、イミダゾリウム塩、イソキノニウム塩等が挙げられる。アニオン性界面活性剤としては、例えばN-アシルタウリン、アルキルスルホ酢酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸、N-アシルアミノ酸、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルリン酸、アルキルリン酸、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩等が挙げられる。両性界面活性剤としては、例えばアルキルカルボキシベタイン、アルキルジメチルアミンオキシド等が挙げられる。
【００３２】
ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドと、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応で生成する過酸化水素を、カタラーゼにより消去する場合には、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応は、カタラーゼ阻害剤の存在下で行うことが好ましい。カタラーゼ阻害剤としては、例えばアジ化物等が挙げられる。アジ化物としては、例えばアジ化リチウム、アジ化ナトリウム、アジ化カリウム等が挙げられる。カタラーゼ阻害剤の反応液中の濃度は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.5〜60 mmol/Lであり、1〜30 mmol/Lが好ましい。
【００３３】
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応で生成する過酸化水素の測定としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする測定であれば特に制限はなく、例えば過酸化水素電極による測定、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体による測定、ペルオキシダーゼと化学発光物質による測定、ペルオキシダーゼと蛍光物質による測定等が挙げられるが、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体による測定が好ましい。
【００３４】
また、ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドと、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応で生成する過酸化水素の消去に、酸化カップリング発色反応により使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方を用いる場合は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応で生成する過酸化水素の測定は、前記ぺルオキシダーゼと酸化カップリング発色反応により使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方と共に、酸化カップリング発色反応により使用される２つの酸化カップリング型色原体のもう一方を用いて行うこともできる。
【００３５】
ロイコ型色原体としては、例えば後述のロイコ型色原体等が挙げられる。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。蛍光物質としては、例えば4-ヒドロキシフェニル酢酸、3-（4-ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等が挙げられる。
【００３６】
ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応で生成する過酸化水素の測定を、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体により行う場合、ペルオキシダーゼの反応液中の濃度は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.01〜500 kU/Lであり、0.1〜100 kU/Lが好ましく、ロイコ型色原体の反応液中の濃度は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.001〜10 g/Lであり、0.005〜5 g/Lが好ましい。
また、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素との反応で生成する過酸化水素の測定を、ペルオキシダーゼ、及び、酸化カップリング発色反応により使用される２つの酸化カップリング型色原体により行う場合、ペルオキシダーゼの反応液中の濃度は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.01〜500 kU/Lであり、0.1〜100 kU/Lが好ましく、２つの酸化カップリング型色原体の一方（例えば、後述のカプラー）の反応液中の濃度は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.001〜10 g/Lであり、0.005〜5 g/Lが好ましく、２つの酸化カップリング型色原体のもう一方（例えば、後述のフェノール類又はアニリン類）の反応液中の濃度は、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常0.001〜10 g/Lであり、0.005〜5 g/Lが好ましい。
【００３７】
本発明において、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の酵素活性(U)は、例えば以下の方法により算出することができる。
＜酵素活性測定用試薬＞
第１試薬
リン酸緩衝液(pH8.0)            0.1 mmol/L
N-エチル-N-（3-メチルフェニル）-N’-サクシニルエチレンジアミン(EMSE)
0.3 g/L
ペルオキシダーゼ              3 kU/L
4-アミノアンチピリン          0.1 g/L
第２試薬
フルクトシルバリン水溶液        1.7 mmol/L
なお、上記フルクトシルバリン水溶液は、J. Agric. Food Chem., 第24巻、第1号、p.70-73 (1976) に記載された方法等により調製する。
【００３８】
＜検体希釈液＞
リン酸緩衝液(pH8.0)            10 mmol/L
牛血清アルブミン              0.15%
＜サンプル＞
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するＦＰＯＸ−４７Δ３を上記の検体希釈液で希釈したものを用いる。
【００３９】
＜測定＞
反応セルへ、上記サンプル(2μL)と上記酵素活性測定用試薬の第１試薬(150μL)とを添加し、37℃で3分間反応（第１反応）させた後、上記酵素活性測定用試薬の第２試薬(20μL)を添加し、当該第２試薬を添加3分後の反応液の吸光度［AbS酵素（3分後）］、及び、当該第２試薬を添加5分後の反応液の吸光度［Abs酵素（5分後）］を、共に主波長546 nm、副波長700 nmで測定し、Abs酵素（5分後）からAbs酵素（3分後）を差し引き、吸光度差ΔAbs’酵素を算出し、さらに算出した吸光度差ΔAbs’酵素を2（分）で除して、1分間当たりの吸光度変化量ΔAbs’酵素／分を算出する。
【００４０】
上記サンプルの代わりに上記検体希釈液を用いる以外は、同様の方法により、吸光度差ΔAbs’ブランク／分を算出する。
算出したΔAbs’酵素／分からΔAbs’ブランク／分を差し引き、当該酵素に対する吸光度差ΔAbs酵素／分を決定する。
【００４１】
＜酵素活性＞
上記で決定したΔAbs酵素／分を基に、以下の式（Ｉ）により酵素活性を算出する。
【００４２】
【数１】
2018221446.tif 000002
【００４３】
上記式（Ｉ）において、33.8は、反応により生成されるキノイミン色素のミリモル吸光係数［(mmol/L)-1・cm-1］である。
上記式(I)において、0.5は、1 molの過酸化水素による生成されるキノイミン色素のmol数である。
【００４４】
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素としては、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに作用し、糖化ヘモグロビンから過酸化水素を生成させる酵素であれば特に制限はなく、例えば国際公開第２０１５／００５２５８号に記載の酵素、国際公開第２０１５／０６０４２９号に記載のアマドリア一ゼ等が挙げられる。具体的には、国際公開公報第２０１５／００５２５８号に記載されたＦＰＯＸ−１８Ａ、ＦＰＯＸ−１８Ｂ、ＦＰＯＸ−１８Ｃ、ＦＰＯＸ−１８Ｄ、ＦＰＯＸ−１９〜４６、及び当該酵素の改変体等が挙げられる。当該酵素の改変体の具体例としては、例えば、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するＦＰＯＸ−４７Δ３等が挙げられる。
【００４５】
本発明において、ロイコ型色原体とは、過酸化水素および過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質をいう。過酸化活性物質としては、例えばペルオキシダーゼ等が挙げられる。
【００４６】
ロイコ型色原体としては、例えばフェノチアジン系色原体、トリフェニルメタン系色原体、ジフェニルアミン系色原体、o-フェニレンジアミン、ヒドロキシプロピオン酸、ジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン等が挙げられ、フェノチアジン系色原体が好ましい。
【００４７】
フェノチアジン系色原体としては、例えば10-N-カルボキシメチルカルバモイル-3,7-ビス（ジメチルアミノ）-10H-フェノチアジン(CCAP)、10-N-メチルカルバモイル-3,7-ビス（ジメチルアミノ）-10H-フェノチアジン(MCDP)、10-N-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-3,7-ビス（ジメチルアミノ）-10H-フェノチアジン ナトリウム塩(DA-67)等が挙げられる。フェノチアジン系色原体の中でも、10-N-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-3,7-ビス（ジメチルアミノ）-10H-フェノチアジン ナトリウム塩(DA-67)が特に好ましい。
【００４８】
トリフェニルメタン系色原体としては、例えばN,N,N’,N’,N’’,N’’-ヘキサ（3-スルホプロピル）-4,4’,4’’-トリアミノトリフェニルメタン(TPM-PS)等が挙げられる。ジフェニルアミン系色原体としては、例えばN-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-4,4’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩(DA-64)、4,4’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔3-ビス（4-クロロフェニル）メチル-4-ジメチルアミノフェニル〕アミン(BCMA)等が挙げられる。
【００４９】
本発明において、酸化カップリング型色原体とは、過酸化水素及び過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質をいう。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。
カプラーとしては、例えば4-アミノアンチピリン(4-AA)、3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。
【００５０】
アニリン類としては、N-（3-スルホプロピル）アニリン、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3-メチルアニリン(TOOS)、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3,5-ジメチルアニリン(MAOS)、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン(DAOS)、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）-3-メチルアニリン(TOPS)、N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン(HDAOS)、N,N-ジメチル-3-メチルアニリン、N,N-ビス（3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）-3-メトキシアニリン、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）アニリン、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン、N-（3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）-3,5-ジメチルアニリン、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3-メトキシアニリン、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）アニリン、N-エチル-N-（3-メチルフェニル）-N’-サクシニルエチレンジアミン(EMSE)、N-エチル-N-（3-メチルフェニル）-N’-アセチルエチレンジアミン、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-4-フルオロ-3,5-ジメトキシアニリン(F-DAOS)等があげられる。
【００５１】
フェノール類としては、フェノール、4-クロロフェノール、3-メチルフェノール、3-ヒドロキシ-2,4,6-トリヨード安息香酸(HTIB)等があげられる。
【００５２】
２．ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット
本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キットは、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法に用いられる。
本発明の測定キットとしては、例えば２試薬系のキット、３試薬系のキット等が挙げられ、２試薬系キットが好ましい。
本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キットは、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、カタラーゼとを含む第１試薬、及び、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、カタラーゼ阻害剤とを含む第２試薬を含むキットであり、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法に用いられる。当該キットにおいて、さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体をそれぞれ、第１試薬及び第２試薬に別々に含んでいても、第２試薬及び第１試薬に別々に含んでいてもよい。
【００５３】
また、本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キットは、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、及び、ペルオキシダーゼと、酸化カップリング発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方との組み合わせを含む第１試薬、及び、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、ロイコ型色原体とを含む第２試薬を含むキットであり、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法に用いられる。
【００５４】
さらに、本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キットは、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第１試薬、及び、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を含む第２試薬を含み、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体をそれぞれ、第１試薬及び第２試薬に別々に含むか、又は、第２試薬及び第１試薬に別々に含むキットであり、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法に用いられる。
【００５５】
本発明の糖化ヘモグロビン測定キットにおける、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、及び、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素としては、例えば前述の糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、及び、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素等がそれぞれ挙げられる。本発明の糖化ヘモグロビン測定キットにおける、カタラーゼ阻害剤、酸化カップリング型色原体、及び、ロイコ型色原体としては、例えば前述のカタラーゼ阻害剤、酸化カップリング型色原体、及び、ロイコ型色原体等がそれぞれ挙げられる。
【００５６】
本発明の糖化ヘモグロビン測定キットを用いてヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定する場合、前述の本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法に従い、反応セルに、ヘモグロビン含有試料と第１試薬とを添加し、一定時間、一定温度で反応を行った後、第２試薬を添加し、生成した過酸化水素を測定することにより、糖化ヘモグロビンを測定することができる。
【００５７】
本発明の糖化ヘモグロビン測定キットの具体的態様を以下に記す。
・キット１
糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、カタラーゼとを含む第１試薬；及び、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、及び、カタラーゼ阻害剤を含む第２試薬
を含む糖化ヘモグロビン測定キット。
【００５８】
・キット２
糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、ペルオキシダーゼ、及び、カタラーゼを含む第１試薬；及び、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、カタラーゼ阻害剤、及び、ロイコ型色原体を含む第２試薬
を含む糖化ヘモグロビン測定キット。
【００５９】
・キット３
糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、ロイコ型色原体、及び、カタラーゼを含む第１試薬；及び、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、カタラーゼ阻害剤、及び、ペルオキシダーゼを含む第２試薬
を含む糖化ヘモグロビン測定キット。
【００６０】
・キット４
糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、ペルオキシダーゼ、及び、酸化カップリング発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方を含む第１試薬；及び、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、及び、ロイコ型色原体を含む第２試薬
を含む糖化ヘモグロビン測定キット。
【００６１】
・キット５
糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、ペルオキシダーゼ、及び、酸化カップリング発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方を含む第１試薬；及び、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、及び、酸化カップリング発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体のもう一方を含む第２試薬
を含む糖化ヘモグロビン測定キット。
【００６２】
・キット６
糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、及び、ペルオキシダーゼを含む第１試薬；及び、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、及び、ロイコ型色原体を含む第２試薬
を含む糖化ヘモグロビン測定キット。
【００６３】
・キット７
糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、及び、ロイコ型色原体を含む第１試薬；及び、
糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素、及び、ペルオキシダーゼを含む第２試薬
を含む糖化ヘモグロビン測定キット。
【００６４】
本発明の糖化ヘモグロビン測定キットを構成する第１試薬及び／又は第２試薬は、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。凍結乾燥された状態の第１試薬及び／又は第２試薬を含むキットを用いてヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定する場合には、凍結乾燥された状態の第１試薬及び／又は第２試薬は水性媒体に溶解して使用される。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。
【００６５】
本発明の測定キットを構成する第１試薬における、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.1〜60 kU/Lとなる含量であり、0.2〜30 kU/Lとなる含量が好ましい。
【００６６】
本発明の測定キットを構成する第２試薬における、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.1〜120 kU/Lとなる含量であり、0.2〜60 kU/Lとなる含量が好ましい。
【００６７】
本発明の測定キットを構成する第１試薬におけるカタラーゼの含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.002〜10,000 kU/Lとなる含量であり、0.02〜2,000 kU/Lとなる含量が好ましい。
【００６８】
本発明の測定キットを構成する第２試薬におけるカタラーゼ阻害剤の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が2〜240 mmol/Lとなる含量であり、4〜120 mmol/Lとなる含量が好ましい。
【００６９】
本発明の測定キットを構成する第１試薬におけるペルオキシダーゼの含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.02〜1,000 kU/Lとなる含量であり、0.2〜200 kU/Lとなる含量が好ましい。
【００７０】
本発明の測定キットを構成する第１試薬における酸化カップリング発色反応により使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.02〜20 g/Lとなる含量であり、0.1〜10 g/Lとなる含量が好ましい。
【００７１】
本発明の測定キットを構成する第２試薬におけるロイコ型色原体の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.004〜40 g/Lとなる含量であり、0.02〜20 g/Lとなる含量が好ましい。
【００７２】
本発明の測定キットを構成する第２試薬におけるペルオキシダーゼの含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.04〜2,000 kU/Lとなる含量であり、0.4〜400 kU/Lとなる含量が好ましい。
【００７３】
本発明の測定キットを構成する第１試薬におけるロイコ型色原体の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.002〜20 g/Lとなる含量であり、0.01〜10 g/Lとなる含量が好ましい。
【００７４】
本発明の測定キットを構成する第２試薬における酸化カップリング発色反応により使用される２つの酸化カップリング型色原体のもう一方の含量は、通常、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.04〜40g/Lとなる含量であり、0.2〜20 g/Lとなる含量が好ましい。
【００７５】
本発明の糖化ヘモグロビン測定キットには、必要に応じて、前述の水性媒体、及び、前述の糖化ヘモグロビン変性剤以外に、安定化剤、防腐剤、塩類、干渉物質消去剤、有機溶媒等が含有されてもよい。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、シュークロース、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硝酸カルシウム、フェロシアン化カリウム、牛血清アルブミン(BSA)、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等のポリオキシエチレン系界面活性剤等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等があげられる。塩類としては、例えば塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウム、炭酸カリウム、ギ酸カリウム、酢酸カリウム等が挙げられる。干渉物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。有機溶媒としては、例えばロイコ型色原体の水性媒体への溶解補助剤としてのジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキサイド(DMSO)、ジオキサン、アセトン、メタノール、エタノール等が挙げられる。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例、比較例及び試験例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
Bis-Tris（同仁化学研究所社製）、ＦＰＯＸ−ＣＥＴ（糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素；キッコーマン社製）、DA-67（和光純薬工業社製）、4-アミノアンチピリン（埼京化成社製）、EMSE（同仁化学研究所社製）、ペルオキシダーゼ（東洋紡社製）、カタラーゼ（東洋紡社製）、NIKKOL LMT［N-アシルタウリン塩（N-ラウロイル-N-メチルタウリンナトリウム）；日光ケミカルズ社製］、アジ化ナトリウム（和光純薬工業社製）、フルクトシルバリン（J. Agric. Food Chem., 第24巻、第1号、p.70-73 (1976) に記載された方法により調製）。
なお、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素であるＦＰＯＸ−４７Δ３は、後述の参考例１の方法により調製した。また、ＦＰＯＸ−４７Δ３の酵素活性は、前述の式（Ｉ）に基づいて算出した。【００７７】
［実施例１］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第１試薬
Bis-Tris(pH7.0)           50 mmol/L
NIKKOL LMT                1.5 g/L
FPOX-CET                  1 kU/L
DA-67                     40μmol/L
カタラーゼ                100 kU/L
第２試薬
Bis-Tris(pH7.0)           50 mmol/L
FPOX-47Δ3                1.5kU/L
ペルオキシダーゼ          200 kU/L
アジ化ナトリウム          0.1 g/L【００７８】
［実施例２］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第１試薬
Bis-Tris(pH7.0)           50 mmol/L
NIKKOL LMT                1.5 g/L
FPOX-CET                  1 kU/L
ペルオキシダーゼ          40 kU/L
カタラーゼ                100 kU/L
第２試薬
Bis-Tris(pH7.0)           50 mmol/L
FPOX-47Δ3                1.5kU/L
DA-67                     120μmol/L
アジ化ナトリウム          0.1 g/L【００７９】
［実施例３］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。本キットは、第１試薬中にカタラーゼが含まれていない点を除いては、実施例１のキットと同じである。
第１試薬
Bis-Tris(pH7.0)           50 mmol/L
NIKKOL LMT                1.5 g/L
FPOX-CET                  1 kU/L
DA-67                     40μmol/L
第２試薬
Bis-Tris(pH7.0)           50 mmol/L
FPOX-47Δ3                1.5kU/L
ペルオキシダーゼ          200 kU/L
アジ化ナトリウム          0.1 g/L【００８０】
［実施例４］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。本キットは、第１試薬中にカタラーゼが含まれていない点を除いては、実施例２のキットと同じである。
第１試薬
Bis-Tris(pH7.0)           50 mmol/L
NIKKOL LMT                1.5 g/L
FPOX-CET                  1 kU/L
ペルオキシダーゼ          40 kU/L
第２試薬
Bis-Tris(pH7.0)           50 mmol/L
FPOX-47Δ3                1.5kU/L
DA-67                     120μmol/L
アジ化ナトリウム          0.1 g/L【００８１】
［実施例５］
ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、実施例１のキットを用い、ヘモグロビン含有試料として、ＨＰＬＣ法であるＫＯ５００法によって、ＨｂＡ１ｃ濃度がそれぞれ5.14％、5.64％、6.87％、7.60％及び10.51％と値付けされている、5濃度の全血を用いて、以下の手順により、各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度の総ヘモグロビン濃度に対する割合［ＨｂＡ１ｃ（％）］を決定した。【００８２】
（１）総ヘモグロビン濃度決定のための検量線の作成
総ヘモグロビン測定用キットであるヘモグロビンＢ−テストワコー（SLS-ヘモグロビン法）（和光純薬工業社製）及びヘモグロビンＢ−テストワコーに付属の標準品（総ヘモグロビン濃度：15.3 mg/mL）を用いて、以下の手順に従って測定を行い、当該標準品に対する吸光度を測定した。
反応セルへ、当該標準品（10μL）とヘモグロビンＢ−テストワコー（250μL）とを添加し、37℃で10分間反応させ、反応液の吸光度（Ｅ）を主波長546nm、副波長660nmで測定し、当該標準品に対する吸光度とした。当該標準品の代わりに生理食塩水を用いる以外は同様の方法により測定し、生理食塩水に対する吸光度とした。当該標準品に対する吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該標準品に対するブランク補正吸光度とした。当該標準品に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度（0 Abs）とから、総ヘモグロビン濃度（μmol/L）と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。【００８３】
（２）ＨｂＡ１ｃ濃度決定のための検量線の作成
ＫＯ５００法によりＨｂＡ１ｃ濃度が3.64μmol/L、9.18μmol/Lと値付けされている2つの血球画分について、実施例１のＨｂＡ１ｃ測定用キットを用いて、以下の手順に従って測定し、各血球画分に対する吸光度を測定した。
反応セルへ、上記の各血球画分（10μL）と実施例１のキットの第１試薬（100μL）とを添加し、37℃で5分間反応（第１反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長660nm、副波長800nmで測定し、次いで、この反応液に実施例１のキットの第２試薬（40μL）を添加し、さらに37℃で5分間反応（第２反応）させ、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長660nm、副波長800nmで測定した。Ｅ２からＥ１を差し引き、吸光度差ΔＥ’１Ａを算出し、各血球画分に対する吸光度とした。上記の各血球画分の代わりに生理食塩水を用いる以外は同様の方法により、吸光度差ΔＥ’生理食塩水を算出し、生理食塩水に対する吸光度とした。当該血球画分の代わりに生理食塩水を用いて、生理食塩水に対する吸光度を測定した。当該血球画分に対するそれぞれの吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該血球画分に対するブランク補正吸光度とした。当該血球画分に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度(0 Abs)とから、ＨｂＡ１ｃ濃度(μmol/L)と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。【００８４】
（３）各血球画分における総ヘモグロビン濃度の決定
前記の5濃度の全血試料に対して、25℃、2,200rpm（800×G）で5分間遠心分離を行い、血球画分を得た。各血球画分について、ヘモグロビンＢ−テストワコーを用いて（１）と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と（１）の検量線とから、各血球画分中の総ヘモグロビン濃度(μmol/L)を決定した。【００８５】
（４）各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度の決定
上記（３）で得られた各血球画分について、本発明の実施例１のキットを用いて（２）と同様の方法により測定を行い、得られた測定値と（２）の検量線とから、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ濃度(μmol/L)を決定した。【００８６】
（５）ＨｂＡ１ｃ(%)（ＨｂＡ１ｃ濃度の総ヘモグロビン濃度に対する割合）の決定
上記（３）で決定した各血球画分における総ヘモグロビン濃度(μmol/L)と、上記（４）で決定した各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度(μmol/L)とから、以下の式（II）により、ＨｂＡ１ｃ(%)をNGSP値（国際標準値）として算出した。【００８７】
【数２】
2018221446.tif 000003
【００８８】
（６）同一血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）のＫＯ５００法での決定
上記（５）でのＨｂＡ１ｃ(%)の決定に使用した血球画分と同一の血球画分を用いて、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ(%)を、ＨＰＬＣを用いるＫＯ５００法により決定した。【００８９】
（７）本発明の測定方法とＫＯ５００法との相関
本発明の測定方法を用いて、上記（５）で決定したＨｂＡ１ｃ(%)と、ＫＯ５００法を用いて、上記（６）で決定したＨｂＡ１ｃ(%)とから、本発明の測定方法とＫＯ５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果、両測定法間の相関係数が1.000となり、両測定法間に良好な相関関係が認められた。従って、実施例１のキットを用いる本発明の測定方法により、試料中のＨｂＡ１ｃを正確に測定できることが明らかとなった。【００９０】
［実施例６］
実施例１のキットの代わりに、実施例２のキットを用いる以外は実施例５と同様の手順により、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ(%)を決定し、実施例２のキットを用いる測定方法とＫＯ５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果、両測定法間の相関係数が0.999となり、両測定法間に良好な相関関係が認められた。従って、実施例２のキットを用いる本発明の測定方法により、試料中のＨｂＡ１ｃを正確に測定できることが明らかとなった。【００９１】
［実施例７］
実施例１のキットの代わりに、実施例３のキットを用いる以外は実施例５と同様の手順により、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ(%)を決定し、実施例３のキットを用いる測定方法とＫＯ５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果、両測定法間の相関係数が0.999となり、両測定法間に良好な相関関係が認められた。従って、第１試薬にカタラーゼを含有しない、実施例３のキットを用いる本発明の測定方法においても、全血中の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドがＦＰＯＸ−ＣＥＴと反応して生成した過酸化水素が、全血中のヘモグロビンやアスコルビン酸等の還元性物質により消去され、試料中のＨｂＡ１ｃを正確に測定できることが明らかとなった。【００９２】
［実施例８］
実施例１のキットの代わりに、実施例４のキットを用いる以外は実施例５と同様の手順により、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ(%)を決定し、実施例４のキットを用いる測定方法とＫＯ５００法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。その結果、両測定法間の相関係数が0.999となり、両測定法間に良好な相関関係が認められた。従って、第１試薬にカタラーゼを含有しない、実施例４のキットを用いる本発明の測定方法においても、全血中の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドがＦＰＯＸ−ＣＥＴと反応して生成した過酸化水素が、全血中のヘモグロビンやアスコルビン酸等の還元性物質により消去され、試料中のＨｂＡ１ｃを正確に測定できることが明らかとなった。【００９３】
［比較例１］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。本キットは、第１試薬中にＦＰＯＸ−ＣＥＴが含まれていない点を除いては、実施例１のキットと同じである。【００９４】
第１試薬
Bis-Tris(pH7.0)           50 mmol/L
NIKKOL LMT                1.5 g/L
DA-67                     40μmol/L
カタラーゼ                100 kU/L
第２試薬
Bis-Tris(pH7.0)           50 mmol/L
FPOX-47Δ3                1.5kU/L
ペルオキシダーゼ          200 kU/L
アジ化ナトリウム          0.1 g/L【００９５】
［比較例２］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。本キットは、第１試薬中にＦＰＯＸ−ＣＥＴが含まれていない点を除いては、実施例２のキットと同じである。【００９６】
第１試薬
Bis-Tris(pH7.0)           50 mmol/L
NIKKOL LMT                1.5 g/L
ペルオキシダーゼ          40 kU/L
カタラーゼ                100 kU/L
第２試薬
Bis-Tris(pH7.0)           50 mmol/L
FPOX-47Δ3                1.5kU/L
DA-67                     120μmol/L
アジ化ナトリウム          0.1 g/L【００９７】
［比較例３］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。本キットは、第１試薬中にＦＰＯＸ−ＣＥＴが含まれていない点を除いては、実施例３のキットと同じである。【００９８】
第１試薬
Bis-Tris(pH7.0)           50 mmol/L
NIKKOL LMT                1.5 g/L
DA-67                     40μmol/L
第２試薬
Bis-Tris(pH7.0)           50 mmol/L
FPOX-47Δ3                1.5kU/L
ペルオキシダーゼ          200 kU/L
アジ化ナトリウム          0.1 g/L【００９９】
［比較例４］
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。本キットは、第１試薬中にＦＰＯＸ−ＣＥＴが含まれていない点を除いては、実施例４のキットと同じである。【０１００】
第１試薬
Bis-Tris(pH7.0)           50 mmol/L
NIKKOL LMT                1.5 g/L
ペルオキシダーゼ          40 kU/L
第２試薬
Bis-Tris(pH7.0)           50 mmol/L
FPOX-47Δ3                1.5kU/L
DA-67                     120μmol/L
アジ化ナトリウム          0.1 g/L【０１０１】
［試験例１］
ヘモグロビン含有試料として、実施例５で用いた、ＨＰＬＣ法であるＫＯ５００法によってＨｂＡ１ｃ濃度が5.14％と値付けされている全血に、フルクトシルバリンを添加して調製した、4μmol/Lのフルクトシルバリンを含む全血を用いて、また、キットとして、実施例１〜４及び比較例１〜４の各キットを用いて、実施例５と同様の方法により、当該ヘモグロビン含有試料中のＨｂＡ１ｃ濃度(%)［以下、ＨｂＡ１ｃ濃度Ａ(%)と記す］を算出した。同様に、ヘモグロビン含有試料として、実施例５で用いた、ＨＰＬＣ法であるＫＯ５００法によってＨｂＡ１ｃ濃度が5.14％と値付けされている全血を用いて、また、キットとして、実施例１〜４及び比較例１〜４の各キットを用いて、実施例５と同様の方法により、当該ヘモグロビン含有試料中のＨｂＡ１ｃ濃度(%)［以下、ＨｂＡ１ｃ濃度Ｂ(%)と記す］を算出した。前記ＨｂＡ１ｃ濃度Ａ(%)から、前記ＨｂＡ１ｃ濃度Ｂ(%)を差し引いた値［以下、ΔＨｂＡ１ｃ濃度(%)と記す］を第１表に示す。なお、表１において、酵素１とは、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を示し、酵素２とは、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素を示す。【０１０２】
【表１】
2018221446.tif 000004
【０１０３】
第１表から明らかな通り、第１試薬に、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素であるＦＰＯＸ−ＣＥＴを含まない比較例１〜４のキットを用いた場合には、ヘモグロビン含有試料中のフルクトシルバリンは、第２試薬中のＦＰＯＸ−４７Δ３と反応し、生成した過酸化水素に起因する発色が認められ、結果として、フルクトシルバリンに起因する発色が認められたのに対して、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素であるＦＰＯＸ−ＣＥＴを含む実施例１〜４のキットを用いた場合には、ヘモグロビン含有試料中のフルクトシルバリンは、第１試薬中のＦＰＯＸ−ＣＥＴと反応し、生成した過酸化水素は、カタラーゼ及び／又は全血中のヘモグロビンやアスコルビン酸等の還元性物質により消去され、結果として、フルクトシルバリンに起因する発色は認められなかった。【０１０４】
従って、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、カタラーゼと、ロイコ型色原体とを含む第１試薬、及び、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、ペルオキシダーゼとを含む第２試薬を含む、本発明の糖化ヘモグロビン測定キットを用いることにより、ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの影響を受けることなく、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを正確に測定できることが判明した。【０１０５】
また、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、カタラーゼと、ペルオキシダーゼとを含む第１試薬、及び、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、ロイコ型色原体とを含む第２試薬を含む、本発明の糖化ヘモグロビン測定キットを用いることにより、ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの影響を受けることなく、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを正確に測定できることが判明した。【０１０６】
また、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、ロイコ型色原体とを含む第１試薬、及び、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、ペルオキシダーゼとを含む第２試薬を含む、本発明の糖化ヘモグロビン測定キットを用いることにより、ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの影響を受けることなく、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを正確に測定できることが判明した。【０１０７】
さらに、糖化ヘモグロビンを酸化せず、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、ペルオキシダーゼとを含む第１試薬、及び、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素と、ロイコ型色原体とを含む第２試薬を含む、本発明の糖化ヘモグロビン測定キットを用いることにより、ヘモグロビン含有試料中の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの影響を受けることなく、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを正確に測定できることが判明した。【０１０８】
［参考例１］ＦＰＯＸ−４７Δ３の造成（１）ＦＰＯＸ−４７発現ベクターpTrc-FPOX-47の造成
配列番号１で表される塩基配列からなるDNAを含む発現プラスミドpTrc-FPOX-42をテンプレートDNAとして用い、配列番号２で表される塩基配列からなるFPOX-42 F342V-F及び配列番号３で表される塩基配列からなるFPOX-42 F342V-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ用いて、以下の試薬組成及びPCR条件により、PCRを行い、PCR産物を得た。pTrc-FPOX-42は、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素であるFPOX-42をコードするDNAを含む発現プラスミドであり、国際公開第２０１５／００５２５８号に開示されている方法に従って造成することができる。PCRは、東洋紡社製のPCRキット、DNA polymerase「KOD-Plus-」のプロトコールに基づいて実施した。【０１０９】
（試薬組成）
・KOD-Plus-バッファー
・テンプレートDNA（pTrc-FPOX-42）  1〜2 ng/μL
・フォワードプライマー（FPOX-42 F342V-F）  0.3μmol/L
・リバースプライマー（FPOX-42 F342V-R）  0.3 μmol/L
・dNTP 混合液  各0.2 mmol/L
・MgSO4  1 mmol/L
・DNA ポリメラーゼ（KOD-Plus-）  0.02 U/μL
・滅菌水添加により、50 μLとした。【０１１０】
（PCR条件）
1. 94℃  2分間
2. 98℃  15秒間
3. 60℃  30秒間
4. 68℃  6分間
5. 2〜4の繰り返し（全30サイクル）
6. 68℃  10分間【０１１１】
得られたPCR産物50 μLにニューイングランドバイオラボ社製「制限酵素Dpn I」1μ Lを添加し、37℃、1時間インキュベーションすることでテンプレートDNAを分解した。制限酵素処理したPCR産物をPromega社製「Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System」を用いて、当該キットのプロトコールに従って精製し、PCR産物の精製試料を得た。
次いで、得られたPCR産物の精製試料を用いて東洋紡社製の大腸菌コンピテントセル「Competent high DH5α」に形質転換した。50 mg/L アンピシリンを含有したLB寒天培地上に生育したコロニーを選択し、Promega社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification」を使用して、当該キットのプロトコールに従い、プラスミドを抽出した。【０１１２】
抽出したプラスミドをDNAシークエンサーで配列解析することにより、ＦＰＯＸ−４７をコードする、配列番号４で表される塩基配列を有するDNAを含むプラスミド、pTrc-FPOX-47が造成されていることを確認した。配列解析には、pTrc99aベクター（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）のマルチクローニングサイト直前、直後の塩基配列を反映した配列番号５で表される塩基配列からなるpTrc-F及び配列番号６で表される塩基配列からなるpTrc-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ使用した。【０１１３】
（２）ＦＰＯＸ−４７Δ３発現ベクターpTrc-FPOX-47Δ3の造成
プラスミドpTrc-FPOX-47に含まれるＦＰＯＸ−４７をコードする塩基配列の3’末端側の終止コドンの直前に位置する９塩基を除き、終止コドンおよびBam HI制限酵素認識サイトを付加した、配列番号７で表される塩基配列からなるFPOX-47Δ3-R、及び、pTrc99aベクターのマルチクローニングサイト直前の塩基配列を反映した配列番号5で表される塩基配列からなる pTrc-Fを設計し、化学合成した。【０１１４】
pTrc-F及びFPOX-47Δ3-Rをプライマーとして用い、pTrc-FPOX-47をテンプレートとして、以下の試薬組成及びPCR条件によりPCRを行い、ＦＰＯＸ−４７のＣ末端の３つのアミノ酸を欠失した欠失体ＦＰＯＸ−４７Δ３の塩基配列を含むDNA断片を含んだPCR産物を得た。PCRは、東洋紡社製のPCRキット、DNA polymerase「KOD-Plus-」のプロトコールに基づいて実施した。【０１１５】
（試薬組成）
・KOD-Plus-バッファー
・テンプレートDNA（pTrc-FPOX-47）  0.2〜0.5 ng/μL
・フォワードプライマー（pTrc-F）  0.3 μmol/L
・リバースプライマー（FPOX-47Δ3-R）  0.3 μmol/L
・dNTP 混合液  各0.2 mmol/L
・MgSO4  1 mmol/L
・DNA  ポリメラーゼ（KOD-Plus-）  0.02 U/μL
・滅菌水添加により、50 μLとした。【０１１６】
（PCR条件）
1. 94℃  2分間
2. 98℃  15秒間
3. 60℃  30秒間
4. 68℃  2分間
5. 2〜4の繰り返し（全30サイクル）
6. 68℃  5分間【０１１７】
得られたPCR産物の一部を用いて1%アガロースTAEゲルで電気泳動し、想定したサイズのDNA断片が得られていることを確認した。
得られたPCR産物を、Promega社製「Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system」を用いて、当該キットのプロトコールに従って精製し、ＦＰＯＸ−４７Δ３をコードするDNAを含むDNA断片を得た。得られた当該DNA断片を２種類の制限酵素Nco I及びBam HI（共に、タカラバイオ社製）により37℃で1時間処理し、得られた反応混合物をPromega社製「Wizard SV Gel andPCR Clean-Up system」を用いて、当該キットのプロトコールに従い精製し、制限酵素処理断片を得た。【０１１８】
また、国際公開第２０１０／０４１７１５号に記載されているフルクトシルヘキサペプチドを酸化する活性のないＦＰＯＸ−１５を発現させるpTrc-FPOX-15を同じ制限酵素で同様に処理し、1% アガロースTAEゲルで電気泳動し、ベクターに相当するDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up systemを用いてDNA断片を精製し、ＦＰＯＸ−１５をコードするDNAが除去されたプラスミド断片を得た。
得られた制限酵素処理断片と、ＦＰＯＸ−１５をコードするDNAが除去されたプラスミド断片とを混合し、DNA Ligation Kit（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションした後、ライゲーション産物を東洋紡社製の大腸菌コンピテントセル「Competent high DH5α」に導入した。【０１１９】
ライゲーション産物が導入された大腸菌を50 mg/L アンピシリンを含むLB寒天培地に植菌し、37℃で14時間培養し、出現したコロニーを選択した。選択したコロニーを、50 mg/L アンピシリンを含むLB液体培地で、37℃で14時間培養し、Promega社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification」を使用して、当該キットのプロトコールに従い、プラスミドを調製した。配列番号5で表される塩基配列からなるpTrc-F及び配列番号6で表される塩基配列からなるpTrc-Rをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ用いてPCRを行い、調製したプラスミドの塩基配列を確認し、当該プラスミド上に、FPOX-47の塩基配列の、終止コドンを除いた3’側９塩基が欠失した配列番号８で表される塩基配列が含まれることを確認した。同プラスミドをpTrc-FPOX-47Δ3と称する。【０１２０】
（３）ＦＰＯＸ−４７Δ３の取得
上記（２）で得られたpTrc-FPOX-47Δ3を含む大腸菌を、アンピシリン50 mg/Lを含むLB培地で、37℃、14時間振盪培養した。得られた培養液を用いて、国際公開第２０１０／０４１７１５号に記載されている糖化ペプチドオキシダーゼＦＰＯＸ−９及びＦＰＯＸ−１５の精製方法に従って精製し、精製ＦＰＯＸ−４７Δ３の溶液を得た。ＦＰＯＸ−４７のアミノ酸配列を配列番号９に、ＦＰＯＸ−４７Δ３のアミノ酸配列を配列番号１０にそれぞれ示す。【０１２１】
（４）ＦＰＯＸ−４７Δ３の糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する酵素活性（以下、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性と称する）の確認
上記（３）で得られた精製ＦＰＯＸ−４７Δ３の溶液を用いて、以下の測定キット及び測定手順により、ＦＰＯＸ−４７Δ３のＨｂＡ１ｃに対する糖化ヘモグロビンオキシダーゼ活性を確認した。
＜測定キットＡ＞
第１試薬
Bis-Tris(pH7.0)          50 mmol/L
DA-67                    40μmol/L
NIKKOL LMT               1 g/L
第２試薬
リン酸緩衝液(pH6.5)      10 mmol/L
FPOX-47Δ3               1.5 kU/L
ペルオキシダーゼ         200 kU/L【０１２２】
＜測定キットａ＞
第１試薬
Bis-Tris(pH6.5)          50 mmol/L
DA-67                    40μmol/L
第２試薬
リン酸緩衝液(pH6.5)      10 mmol/L
FPOX-47Δ3               1.5 kU/L
ペルオキシダーゼ         200 kU/L【０１２３】
測定キットａは、第１試薬中にNIKKOL LMTが含まれていないこと以外は、測定キットＡと同じである。
＜サンプル＞
ヒトの血液を遠心分離して得られる血球を脱イオン水で希釈して溶血させて調製され、ＨｂＡ１ｃ測定の基準法であるＫＯ５００法と、総ヘモグロビン測定法の1つであるSLS-ヘモグロビン法とから、ＨｂＡ１ｃ濃度が2.6μmol/L、4.5μmol/L、6.4μmol/L、8.4μmol/Lと値付けされている溶血試料をサンプルとして用いた。【０１２４】
＜測定手順＞
反応セルへ、上記の各サンプル(10μL)と上記測定キットＡの第１試薬(100μL)とを添加し、37℃で5分間反応（第１反応）させ、反応液の吸光度(E1)を主波長660nm、副波長800nmで測定し、次いで、この反応液に上記測定キットＡの第２試薬(40μL)を添加し、さらに37℃で5分間反応(第２反応)させ、反応液の吸光度(E2)を主波長660nm、副波長800nmで測定した。E2からE1を差し引き、吸光度差ΔE’Ａを算出した。【０１２５】
反応セルへ、上記の各サンプル(10μL)と上記測定キットａの第１試薬(100μL)とを添加し、37℃で5分間反応（第１反応）させ、反応液の吸光度(E3)を主波長660nm、副波長800nmで測定し、次いで、この反応液に上記測定キットａの第２試薬(40μL)を添加し、さらに37℃で5分間反応（第２反応）させ、反応液の吸光度(E4)を主波長660nm、副波長800nmで測定した。E4からE3を差し引き、吸光度差ΔE’ａを算出した。【０１２６】
ΔE’ＡからΔE’ａを差し引き、各サンプルに対する吸光度差ΔEとした。各サンプルにおけるＨｂＡ１ｃ濃度とΔEとの関係を図１に示す。
第１図から明らかな様に、アニオン性界面活性剤であるN-アシルタウリンを含む本発明のキット（キットＡ）を用いた測定において、ＨｂＡ１ｃ濃度と吸光度との間に定量関係が認められた。従って、ＦＰＯＸ−４７Δ３が、糖化ヘモグロビンを酸化して過酸化水素を生成させる反応を触媒する活性を有する酵素であることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明により、糖尿病等の診断に有用なヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定する方法及びキットが提供される。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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