(57)【要約】本発明は、ヒトＣＤ４４ｖ９に結合でき、癌細胞に対して特異的に抗体依存性細胞障害を誘導する新規な抗体を有効成分として含有する、現在治療困難な固形腫瘍をはじめとした各種悪性腫瘍の予防又は治療剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４４ｖ９を発現する細胞のＣＤ４４ｖ９に特異的に結合し、前記細胞に対する細胞障害活性を有する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
ＣＤ４４ｖ９を発現する細胞のＣＤ４４ｖ９に特異的に結合し、ＣＤ４４ｖ９とアミノ酸トランスポーターｘＣＴとの相互作用を阻害する活性を有する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
（ｉ）細胞内活性酸素種の低下を抑制するか、または
（ｉｉ）薬剤の細胞外排出を阻害する、
請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
ＣＤ４４ｖ９に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列、または
（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列中に１個または数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、または付加を有するアミノ酸配列、
に対して特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
配列番号１０のアミノ酸配列に特異的に結合する、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
配列番号１０のアミノ酸配列に特異的に結合しない、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
ＣＤ４４ｖ９を発現する細胞のＣＤ４４ｖ９に特異的に結合し、前記細胞に対する細胞障害活性を有する、請求項４〜６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
ＣＤ４４ｖ９を発現する細胞のＣＤ４４ｖ９に特異的に結合し、ＣＤ４４ｖ９とアミノ酸トランスポーターｘＣＴとの相互作用を阻害する活性を有する、請求項４〜６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗体またはその抗原結合断片が、
（１）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号１の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、
（２）（ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号２の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、
（３）（ｉ）配列番号：３のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号３の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、
（４）（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号４の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、
（５）（ｉ）配列番号：５のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号５の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、
（６）（ｉ）配列番号：６のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号６の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）、
（７）（ｉ）配列番号：７のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号７の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域１’（ＣＤＲＨ１’）、
（８）（ｉ）配列番号：８のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号８の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域２’（ＣＤＲＨ２’）、および
（９）（ｉ）配列番号：９のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号９の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域３’（ＣＤＲＨ３’）、
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記抗体またはその抗原結合断片が、
（１）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号１の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、
（２）（ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号２の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、および
（３）（ｉ）配列番号：３のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号３の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、
を含む少なくとも１つの軽鎖、ならびに
（４）（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号４の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、
（５）（ｉ）配列番号：５のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号５の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、および
（６）（ｉ）配列番号：６のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号６の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）、
を含む少なくとも１つの重鎖
を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記抗体またはその抗原結合断片が、
（１）（ｉ）配列番号：７のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号７の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域１’（ＣＤＲＨ１’）、
（２）（ｉ）配列番号：８のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号８の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域２’（ＣＤＲＨ２’）、および
（３）（ｉ）配列番号：９のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号９の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域３’（ＣＤＲＨ３’）、
を含む少なくとも１つの重鎖
を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
モノクローナル抗体である、請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
ラット、マウス、霊長類、またはヒト抗体である、請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
以下の（ｉ）または（ｉｉ）：
（ｉ）受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８２１で特定されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片、または
（ｉｉ）受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８２２で特定されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片、
のいずれかである、請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１６に記載の核酸分子を含む、ハイブリドーマ細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれかに記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞。
【請求項２０】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８２１または受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８２２で特定されるハイブリドーマ細胞。
【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれかに記載のハイブリドーマ細胞を培養し、得られる培養液からＣＤ４４ｖ９に特異的に結合する抗体を採取することを含む、ＣＤ４４ｖ９に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項２２】
請求項１９または２０に記載のハイブリドーマ細胞から抗ＣＤ４４ｖ９モノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して前記モノクローナル抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上清または宿主の分泌物からＣＤ４４ｖ９に特異的に結合するモノクローナル抗体を採取することを含む、ＣＤ４４ｖ９に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項２３】
前記宿主が、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、または哺乳動物である、請求項２２に記載の製造方法。
【請求項２４】
請求項１〜１５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含有する組成物であって、ＣＤ４４ｖ９を発現する細胞に適用して該細胞のアポトーシスを誘導するために使用する、組成物。
【請求項２５】
請求項１〜１５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含有する、腫瘍の予防または治療のための医薬。
【請求項２６】
前記腫瘍が、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、口腔癌、胆嚢癌、甲状腺癌、中皮腫、胸膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、平滑筋肉腫、およびウィルムス腫瘍からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２５に記載の医薬。
【請求項２７】
前記腫瘍が、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、膀胱癌、リンパ腫、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、または前立腺癌である、請求項２５に記載の医薬。
【請求項２８】
前記腫瘍が、トリプルネガティブ乳癌（ＨＥＲ２陰性、ＥＲ陰性、ＰＲ陰性）である、請求項２５に記載の医薬。
【請求項２９】
薬学的に許容し得る細胞増殖抑制剤と同時、個別、又は逐次投与するための、請求項２５〜２８のいずれかに記載の医薬。
【請求項３０】
前記細胞増殖抑制剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、分子標的薬、植物アルカロイド、抗癌性抗生物質、およびプラチナ製剤からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２９に記載の医薬。
【請求項３１】
前記アルキル化剤が、イホスファミド、シクロフォスファミド、ダカルバシン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、プロカルバジン、メルファラン、およびラニムスチンからなる群から選択され、
前記代謝拮抗剤が、エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリピン、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、テガフール、テガフールウラシル、ＴＳ−１、ドキシフルリジン、ネララビン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メルカプトプリン、およびメトトレキサートからなる群から選択され、
前記分子標的薬が、ゼヴァリン、イマチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、スニチニブ、セツキシマブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、トラスツズマブ、トレチノイン、パニツムマブ、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、およびリツキシマブからなる群から選択され、
植物アルカロイドが、イリノテカン、エトポシド、ソブゾキサン、ドセタキセル、ノギテカン、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビンブラスチンからなる群から選択され、
前記抗癌性抗生物質が、アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、スマンクス、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、およびドキシルからなる群から選択され、
前記プラチナ製剤が、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、およびネダプラチンからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項３０に記載の医薬。
【請求項３２】
以下の（１）〜（９）からなる群から選択される単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（１）配列番号：１のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、
（２）配列番号：２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、
（３）配列番号：３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、
（４）配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、
（５）配列番号：５のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、
（６）配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）、
（７）配列番号：７のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１’（ＣＤＲＨ１’）、
（８）配列番号：８のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２’（ＣＤＲＨ２’）、および
（９）配列番号：９のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３’（ＣＤＲＨ３’）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腫瘍学分野に属する。本発明は、ＣＤ４４遺伝子のエキソンｖ９によってコードされるエピトープに特異的に結合する抗体および前記抗体の誘導体に関する。本発明はまた、前記抗体蛋白質をコードする核酸分子を提供する。本発明はさらに、前記抗体蛋白質を製造する方法に関する。本発明はまた、前記抗体蛋白質を含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、癌治療用医薬の製造における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４４は細胞−細胞、細胞−細胞間基質（ＥＣＭ；  ｅｘｔｒａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）を接着させる接着分子のひとつである。また、ＣＤ４４はヒアルロン酸の受容体として、接着や遊走、Ｔリンパ球活性化などの細胞活動に重要な役割を果たしている。近年では、ＣＤ４４は血管新生や癌の浸潤転移にも関与していることが明らかとなってきている。ＣＤ４４はＩ型膜蛋白質であり、Ｎ末端細胞外、膜貫通領域、ならびに細胞質尾部Ｃ末端の３つのドメインからなる。細胞外領域はＮ末端に連結モジュールも有し、他のヒアルロン酸結合連結蛋白質と相同性を示す。２０のエキソンから構成されるが、その中のエキソン６〜１５は選択的スプライシングによって挿入されるバリアントエキソンである。これらの挿入パターンの多様性によって様々なアイソフォームが存在し、現在その数は数十発見されている。バリアントは、エキソン５のカルボキシ末端に挿入され、発現された際に細胞外に位置する。バリアントエキソンが１つも挿入されていない標準型のＣＤ４４はＣＤ４４ｓと表記され、血液細胞、消化管、筋肉、皮膚、神経系など最も広範に発現している。
一方、特定のＣＤ４４アイソフォームが腫瘍細胞特異的に発現していることが近年多数報告されている（特表２００８−５０８９０３号公報、Ｇｕｎｔｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。最初の報告は、エキソンｖ６を含んだアイソフォーム（ＣＤ４４ｖ６）が腫瘍細胞の転移能に関与していることを示した１９９１年の論文である（Ｇｕｎｔｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。ラット膵癌細胞で高転移能を獲得したサブクローンにおいて、ＣＤ４４ｖ６が発現していることが見出され、さらに低転移株にＣＤ４４ｖ６を発現させると高転移能を獲得することが証明された。ＣＤ４４ｖ６に関してはその後も癌組織において高発現しているとの報告が相次ぎ、また正常皮膚組織にもおいても発現亢進していることが示されてきたが、その生物学的意義は明らかとなっていない。ＣＤ４４ｖ６をターゲットとした抗体医薬品の開発も行われたが、臨床試験の中途段階で皮膚への重篤な副作用のために中止となっている。これは、抗ＣＤ４４ｖ６抗体単独では腫瘍細胞に対する増殖抑制効果や細胞障害誘導効果が見られなかったために該抗体に細胞毒を結合させて用いた結果、正常皮膚組織にも細胞死を誘導してしまったためと考えられる。
これらの事実から、より正常組織で発現が低くかつ腫瘍組織特異的に高発現しているＣＤ４４のバリアントを同定し癌細胞の細胞障害性を媒介する抗体組成物が単離された場合、有益な診断的および治療的手順が実現するものと考えられる。
ＣＤ４４ｖ９を含むＣＤ４４のアイソフォームのモノクローナル抗体を用いた、ヒトにおけるＣＤ４４アイソフォームの発現およびその調節の評価に関する報告がある（Ｍａｃｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １２４，Ｎｕｍｂｅｒｓ  １  ＆  ２，Ｊａｎｕａｒｙ  １９９４，ｐｐ．７１−８２）。
また、ヒト癌組織で最も高頻度に強発現しているアイソフォーム（ｖａｒｉａｎｔ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ）を明らかにする試みが報告されている（Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ＣＤ４４の全てのアイソフォームが増幅可能なプライマーを設定し、非小細胞肺癌およびその転移巣から抽出したｍＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを施行してアイソフォームの発現パターンを検討するという実験を行った。その結果、エキソンｖ８、ｖ９、ｖ１０を含むＣＤ４４ｖ８−１０アイソフォーム（ＣＤ４４Ｒ１とも呼ばれる）が最も高発現しているアイソフォームであり、免疫組織染色法によっても７５〜８０％の癌組織特異的な発現が確認された。大腸癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、甲状腺癌においても同様の結果が報告されており、大腸癌においては予後との正の相関があることが示唆されている。
【発明の開示】
【０００３】
このような状況下、正常組織での発現が低くかつ腫瘍組織特異的に高発現しているＣＤ４４のアイソフォームの同定が求められている。
本発明者らは、ＣＤ４４ｖ９に特異的に結合する抗体を作製し、これらの抗体の抗原への結合が腫瘍組織特異的であること、およびその結合が腫瘍細胞障害活性を誘導することを見出した。本発明の抗体は正常組織にはほとんど結合しないことから、それらは腫瘍治療の好適な候補となりうる。
また、本発明者らは、ＣＤ４４ｖ９を含むＣＤ４４Ｒ１アイソフォームと、グルタチオン（ＧＳＨ）の合成を促進することで活性酸素種（ＲＯＳ）の低下や薬剤排出を担う分子である、アミノ酸トランスポーターｘＣＴが共局在し、相互作用することでｘＣＴを細胞膜上に安定的に存在させていることを見出した。このことは、本発明の抗体を用いてこの相互作用を阻害しｘＣＴの機能を抑制することで、ＲＯＳの上昇を促し腫瘍細胞の細胞死への感受性を亢進しうることを示唆する。さらに、本発明の抗体と併用することにより、従来の抗癌剤の効果を増強しうることを示唆する。本発明者らは、本発明の抗体をクローニングし、配列決定し、抗体軽鎖および重鎖可変領域および相補性決定領域１、２および３の配列を決定した。さらに該抗体が単独で抗腫瘍効果を発揮することを確認した。
すなわち、本発明は、以下を提供する。
［１］ＣＤ４４ｖ９を発現する細胞のＣＤ４４ｖ９に特異的に結合し、上記細胞に対する細胞障害活性を有する抗体またはその抗原結合断片。
［２］ＣＤ４４ｖ９を発現する細胞のＣＤ４４ｖ９に特異的に結合し、ＣＤ４４ｖ９とアミノ酸トランスポーターｘＣＴとの相互作用を阻害する活性を有する抗体またはその抗原結合断片。
［３］（ｉ）細胞内活性酸素種の低下を抑制するか、または
（ｉｉ）薬剤の細胞外排出を阻害する、
上記［１］または［２］に記載の抗体またはその抗原結合断片。
［４］ＣＤ４４ｖ９に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列、または
（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列中に１個または数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、または付加を有するアミノ酸配列、
に対して特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
［５］配列番号１０のアミノ酸配列に特異的に結合する、上記［４］に記載の抗体またはその抗原結合断片。
［６］配列番号１０のアミノ酸配列に特異的に結合しない、上記［４］に記載の抗体またはその抗原結合断片。
［７］ＣＤ４４ｖ９を発現する細胞のＣＤ４４ｖ９に特異的に結合し、上記細胞に対する細胞障害活性を有する、上記［４］〜［６］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
［８］ＣＤ４４ｖ９を発現する細胞のＣＤ４４ｖ９に特異的に結合し、ＣＤ４４ｖ９とアミノ酸トランスポーターｘＣＴとの相互作用を阻害する活性を有する、上記［４］〜［６］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
［９］上記抗体またはその抗原結合断片が、
（１）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号１の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、
（２）（ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号２の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、
（３）（ｉ）配列番号：３のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号３の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、
（４）（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号４の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、
（５）（ｉ）配列番号：５のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号５の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、
（６）（ｉ）配列番号：６のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号６の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）、
（７）（ｉ）配列番号：７のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号７の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域１’（ＣＤＲＨ１’）、
（８）（ｉ）配列番号：８のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号８の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域２’（ＣＤＲＨ２’）、および
（９）（ｉ）配列番号：９のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号９の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域３’（ＣＤＲＨ３’）、
のうちの少なくとも１つを含む、上記［１］〜［８］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
［１０］上記抗体またはその抗原結合断片が、
（１）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号１の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、
（２）（ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号２の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、および
（３）（ｉ）配列番号：３のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号３の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、
を含む少なくとも１つの軽鎖、ならびに
（４）（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号４の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、
（５）（ｉ）配列番号：５のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号５の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、および
（６）（ｉ）配列番号：６のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号６の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）、
を含む少なくとも１つの重鎖
を含む、上記［１］〜［８］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
［１１］上記抗体またはその抗原結合断片が、
（１）（ｉ）配列番号：７のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号７の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域１’（ＣＤＲＨ１’）、
（２）（ｉ）配列番号：８のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号８の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域２’（ＣＤＲＨ２’）、および
（３）（ｉ）配列番号：９のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号９の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域３’（ＣＤＲＨ３’）、
を含む少なくとも１つの重鎖
を含む、上記［１］〜［８］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
［１２］モノクローナル抗体である、上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
［１３］ラット、マウス、霊長類、またはヒト抗体である、上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
［１４］キメラ抗体またはヒト化抗体である、上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
［１５］以下の（ｉ）または（ｉｉ）：
（ｉ）受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８２１で特定されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片、または
（ｉｉ）受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８２２で特定されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片、
のいずれかである、上記［１］〜［１４］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
［１６］上記［１］〜［１５］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子。
［１７］上記［１６］に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
［１８］上記［１６］に記載の核酸分子を含む、ハイブリドーマ細胞。
［１９］上記［１］〜［１５］のいずれかに記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞。
［２０］受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８２１または受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８２２で特定されるハイブリドーマ細胞。
［２１］上記［１８］〜［２０］のいずれかに記載のハイブリドーマ細胞を培養し、得られる培養液からＣＤ４４ｖ９に特異的に結合する抗体を採取することを含む、ＣＤ４４ｖ９に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
［２２］上記［１９］または［２０］に記載のハイブリドーマ細胞から抗ＣＤ４４ｖ９モノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して上記モノクローナル抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上清または宿主の分泌物からＣＤ４４ｖ９に特異的に結合するモノクローナル抗体を採取することを含む、ＣＤ４４ｖ９に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
［２３］上記宿主が、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、または哺乳動物である、上記［２２］に記載の製造方法。
［２４］上記［１］〜［１５］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含有する組成物であって、ＣＤ４４ｖ９を発現する細胞に適用して該細胞のアポトーシスを誘導するために使用する、組成物。
［２５］上記［１］〜［１５］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含有する、腫瘍の予防または治療のための医薬。
［２６］上記腫瘍が、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、口腔癌、胆嚢癌、甲状腺癌、中皮腫、胸膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、平滑筋肉腫、およびウィルムス腫瘍からなる群から選択される少なくとも１つである、上記［２５］に記載の医薬。
［２７］上記腫瘍が、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、膀胱癌、リンパ腫、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、または前立腺癌である、上記［２５］に記載の医薬。
［２８］上記腫瘍が、トリプルネガティブ乳癌（ＨＥＲ２陰性、ＥＲ陰性、ＰＲ陰性）である、上記［２５］に記載の医薬。
［２９］薬学的に許容し得る細胞増殖抑制剤と同時、個別、又は逐次投与するための、上記［２５］〜［２８］のいずれかに記載の医薬。
［３０］上記細胞増殖抑制剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、分子標的薬、植物アルカロイド、抗癌性抗生物質、およびプラチナ製剤からなる群から選択される少なくとも１つである、上記［２９］に記載の医薬。
［３１］上記アルキル化剤が、イホスファミド、シクロフォスファミド、ダカルバシン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、プロカルバジン、メルファラン、およびラニムスチンからなる群から選択され、
上記代謝拮抗剤が、エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリピン、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、テガフール、テガフールウラシル、ＴＳ−１、ドキシフルリジン、ネララビン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メルカプトプリン、およびメトトレキサートからなる群から選択され、
上記分子標的薬が、ゼヴァリン、イマチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、スニチニブ、セツキシマブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、トラスツズマブ、トレチノイン、パニツムマブ、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、およびリツキシマブからなる群から選択され、
植物アルカロイドが、イリノテカン、エトポシド、ソブゾキサン、ドセタキセル、ノギテカン、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビンブラスチンからなる群から選択され、
上記抗癌性抗生物質が、アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、スマンクス、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、およびドキシルからなる群から選択され、
上記プラチナ製剤が、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、およびネダプラチンからなる群から選択される少なくとも１つである、上記［３０］に記載の医薬。
［３２］以下の（１）〜（９）からなる群から選択される単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（１）配列番号：１のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、
（２）配列番号：２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、
（３）配列番号：３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、
（４）配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、
（５）配列番号：５のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、
（６）配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）、
（７）配列番号：７のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１’（ＣＤＲＨ１’）、
（８）配列番号：８のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２’（ＣＤＲＨ２’）、および
（９）配列番号：９のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３’（ＣＤＲＨ３’）。
［発明の効果］
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、腫瘍細胞を特異的に死滅させるために使用することができる点で顕著な効果を奏する。
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、腫瘍特異的に発現し、正常細胞にはほとんど発現しない抗原（すなわち、ＣＤ４４ｖ９）に対して特異的に結合し、ＣＤ４４ｖ９発現細胞に対して細胞障害作用を奏するため、副作用の少ない抗癌剤、または腫瘍の予防または治療のための医薬として特に有用である。
本発明者らは、ＣＤ４４Ｒ１がｘＣＴと共局在し、相互作用することでｘＣＴを細胞膜上に安定的に存在させていることを新たに見出した。アミノ酸トランスポーターの一つであるｘＣＴは、細胞内からグルタミン酸を放出し、細胞外からシスチンを取り込んでシステインに還元して、ペプチドの一種であるＧＳＨを生成させる。細胞内ＧＳＨの役割は２つあり、１つは細胞内のＲＯＳを還元することで、細胞死から回避させることである。もう１つは、グルタチオン抱合により薬剤を細胞外に排出することである。ＣＤ４４Ｒ１はｘＣＴを安定化させることによって、生体内の主要な抗酸化物質のひとつであるＧＳＨの合成を促進し、細胞内のＲＯＳを還元するのに貢献していることが判明した。ＣＤ４４Ｒ１は癌細胞内のＲＯＳ濃度を低下させることによって細胞死を回避させ、癌細胞の増殖に寄与していると考えられる。抗ＣＤ４４ｖ９抗体と抗癌剤の併用により、抗腫瘍効果の増強が確認された。このことから、抗ＣＤ４４ｖ９抗体が、ＣＤ４４Ｒ１のｘＣＴ安定化機能を阻害し細胞内ＲＯＳ濃度を上昇させることで、抗癌剤による細胞死誘導を促進することが示された。また、ＧＳＨはグルタチオン抱合による薬剤排出にも関与していることから、ＣＤ４４Ｒ１を阻害することで細胞内に抗癌剤が貯留しやすくなり、薬剤の効果が増強することも示唆された。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＣＤ４４  Ｒ１強制発現細胞のＦＡＣＳ解析による（Ａ）ＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体、（Ｂ）ＬＧａｄｈ０１−０２モノクローナル抗体の特異性を示す図である。ＣｏｎｔｒｏｌとしてＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ９を含まないＣＤ４４ｓ強制発現系を使用した。横軸：強制発現させた遺伝子のＧＦＰによる発現量、縦軸：モノクローナル抗体の反応性。
図２は、ＥＬＩＳＡ解析によるＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体のＣＤ４４における結合部位を示す図である。抗原としてＣＤ４４Ｒ１、ＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ８−１０、ＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ８−９、ＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ８、ＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ９−１０、ＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ９の組換え蛋白質を使用した。Ｃｏｎｔｒｏｌは抗体を含まないときの値を示す。縦軸：４５０ｎｍにおける吸光度。
図３は、ＦＡＣＳ解析による（Ａ）ＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体、（Ｂ）ＬＧａｄｈ０１−０２モノクローナル抗体のＣＤ４４における結合部位を示す図である。ＦＡＣＳにはＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ８、ＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ９、ＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ１０、ＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ８−１０、ＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ９−１０をＨＥＫ２９３細胞の細胞膜表面に強制発現させたサンプルを使用した。横軸はモノクローナル抗体の反応性で値は抗体反応時のＭＦＩ（ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）からＣｏｎｔｒｏｌとして抗体を含まないときのＭＦＩを引いた値を示す。
図４は、ヒト乳癌組織アレイから得られた乳癌組織に対するＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体による典型的な免疫組織染色像を示す。青色はヘマトキシリン３Ｇによる染色された核、茶褐色はＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体が結合したＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔの発現を示す。
図５は、（Ａ）ヒト乳癌細胞株２０種および正常細胞２種、（Ｂ）ヒト癌細胞株６種（大腸癌、肺癌、膵臓癌、皮膚癌、子宮頸癌、舌癌）におけるＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ９の発現量を示す図である。値は抗体反応時のＭＦＩからＣｏｎｔｒｏｌとして抗体を含まないときのＭＦＩを引いた値を示す。
図６は、ＣＤ４４ｖ９を含むＣＤ４４アイソフォームとｘＣＴが、細胞膜上で共発現し、ＣＤ４４アイソフォームがｘＣＴの膜上での安定化に関与していることを示す図である。蛍光顕微鏡画像で示される緑色はｘＣＴのシグナル、赤色はＣＤ４４アイソフォームのシグナル、青色は核を示している。
図７は、ＣＤ４４Ｒ１とｘＣＴとの相互作用を示す図である。図の上段のＩｎｐｕｔは蛋白質の抽出液を示し、Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体および抗ｘＣＴ抗体は免疫沈降に用いた抗体を示す。右側には検出されたバンドの蛋白質名、およびＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔに用いた抗体を示す。
図８は、ＣＤ４４アイソフォームのノックダウンによる細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）抵抗性への影響を示す図である。値はＤＣＦ蛍光強度を示す。＊はｐ＜０．０５を示す。
図９は、（Ａ）乳癌細胞株、（Ｂ）肺癌細胞株、（Ｃ）大腸癌細胞株、（Ｄ）膵癌細胞株、および（Ｅ）子宮癌細胞株についての、ＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体と従来の細胞増殖抑制剤の併用効果を示す図である。値は抗体または薬剤処理群の未処理群に対する割合（％ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ（ｎｏｎｔｒｅａｔ））。コントロール抗体およびＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体の処理濃度はすべてのサンプルにおいて１０μｇ／ｍｌであり、各細胞増殖抑制剤の処理濃度はグラフ中の薬剤名の下に示す。棒グラフの青棒（左）はコントロール抗体（ラットＩｇＧ）と各細胞増殖抑制剤で処理した結果、紫棒（右）はＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体と各細胞増殖抑制剤で処理した結果を示す。＊はｐ＜０．０５を示す。
図１０は、ＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体を用いたヒト乳癌細胞ＢＴ２０に対するＡＤＣＣ活性を示す図である。値は細胞障害率（％）を示す。（Ａ）異なるエフェクター／ターゲット比での細胞障害活性、（Ｂ）異なる抗体濃度での細胞障害活性。
図１１は、ＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体によるヒト舌癌細胞ＨＳＣ−３のＸｅｎｏｇｒａｆｔに対する抗腫瘍効果を示す図である。縦軸：ハイブリドーマ投与後と投与前の腫瘍容量の比の平均値。ＣｏｎｔｒｏｌはＨＳＣ−３に結合しないことを確認している抗マウスＣＤ４４抗体を産生するハイブリドーマ投与群を示す。
図１２は、ＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体によるヒト大腸癌細胞ＨＴ２９のＸｅｎｏｇｒａｆｔに対する抗腫瘍効果を示す図である。縦軸：腫瘍体積（長径×短径２／２）。横軸：投与開始からの日数。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
１．ＣＤ４４ｖ９を特異的に認識する抗体
本発明は、１つの実施形態において、ＣＤ４４ｖ９に特異的に結合する抗体（本明細書中、「抗ＣＤ４４ｖ９抗体」と呼ぶこともある。）およびその抗原結合断片を提供する。典型的には、上記抗体またはその抗原結合断片は、
（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列、または
（ｉｉ）（ｉ）のアミノ酸配列中に１個または数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、または付加を有するアミノ酸配列、
に対して特異的に結合する。
すなわち、本発明は、上記（ｉ）または（ｉｉ）のアミノ酸配列をエピトープとする抗体およびその抗原結合断片を提供する。上記（ｉｉ）のアミノ酸配列の具体例としては、配列番号１０のアミノ酸配列が挙げられるが、これに限定されない。
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１２のアミノ酸配列に特異的に結合し、かつ配列番号１０のアミノ酸配列に特異的に結合する。別の好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１２のアミノ酸配列に特異的に結合するが、配列番号１０のアミノ酸配列には結合しない。
さらなる実施形態において、本発明の抗体およびその抗原結合断片は、典型的には、ＣＤ４４ｖ９を発現する細胞（本明細書中、「ＣＤ４４ｖ９発現細胞」と呼ぶことがある。）（例：腫瘍細胞）に発現しているＣＤ４４ｖ９に結合し、ＣＤ４４ｖ９の活性を阻害するかまたは細胞障害性因子を誘導して、その細胞を細胞死（アポトーシス）に至らしめることができる。
「ＣＤ４４」は、細胞膜を１回貫通し、Ｎ末端が細胞外、Ｃ末端が細胞内にあるＩ型膜糖蛋白質である。現在、ＣＤ４４遺伝子には２０個のエキソンが存在することが確認されている。選択的スプライシングを受けて、エキソン６〜１５（バリアントエキソン：ｖ１〜ｖ１０）が種々な組合せで挿入されることにより、これまでに約６０種類のアイソフォームが確認されている。
本明細書中、「ＣＤ４４ｖ９」または「ＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ９」は、３１アミノ酸残基からなるｖ９エキソンが挿入されているＣＤ４４のバリアントアイソフォームである。ｖ９エキソンのアミノ酸配列、ｍＲＮＡ配列等の情報は、それぞれＮＭ＿００１００１３９０、ＮＰ＿００１００１３９０等のアクセッション番号でＧｅｎＢａｎｋ等の公にアクセス可能なデータベースから入手することができる。また、マウスや他の哺乳動物（例えば、ラット、ウシなど）のＣＤ４４ｖ９も同様に、公にアクセス可能なデータベースから入手することが出来る。
本明細書中、単に「ＣＤ４４ｖ９」または「ＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ９」という場合、ＣＤ４４ｖ９のことを指すものとし、特に、ＣＤ４４ｖ９蛋白質のことを指すものとする。場合によっては、ＣＤ４４ｖ９蛋白質をコードする遺伝子（または単にＣＤ４４ｖ９遺伝子）を単にＣＤ４４ｖ９と呼ぶ場合もありうるが、その場合には当業者にとっては文脈からＣＤ４４ｖ９遺伝子を指すことが明らかであろう。本明細書中、ＣＤ４４ｖ９は、典型的には、ヒトＣＤ４４ｖ９であるが、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウシなど）のＣＤ４４ｖ９であってもよい。
さらなる実施形態において、本発明の抗体およびその抗原結合断片は、典型的には、ＣＤ４４ｖ９発現細胞に発現しているＣＤ４４ｖ９に特異的に結合し、アミノ酸トランスポーターｘＣＴとの相互作用を阻害する機能（または活性）を有する。
シスチン・グルタミン酸交換輸送系である「ヒトｘＣＴ（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，  ｙ＋  ｓｙｓｔｅｍ）」は、５０１アミノ酸残基からなる１２回膜貫通型の膜タンパク質である。ヒトｘＣＴのアミノ酸配列、ｍＲＮＡ配列等の情報は、それぞれＡＡＧ３５５９２、ＡＣ１１０８０４、ＡＦ２００７０８等のアクセッション番号でＧｅｎＢａｎｋ等の公にアクセス可能なデータベースから入手することができる。また、マウスや他の哺乳動物（例えば、ラット、ウシなど）のｘＣＴも同様に、公にアクセス可能なデータベースから入手することができる。
本明細書中、単に「ｘＣＴ」という場合、ｘＣＴタンパク質のことを指すものとする。場合によっては、ｘＣＴタンパク質をコードする遺伝子（または単にｘＣＴ遺伝子）を単にｘＣＴと呼ぶ場合もありうるが、その場合には当業者にとっては文脈からｘＣＴ遺伝子を指すことが明らかであろう。本明細書中、ｘＣＴは、典型的には、ヒトｘＣＴであるが、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウシなど）のｘＣＴであってもよい。
アミノ酸トランスポーターの一つであるｘＣＴは、細胞内からグルタミン酸を放出し、細胞外からシスチンを取り込んでシステインに還元して、ペプチドの一種であるＧＳＨを生成させる。細胞内ＧＳＨの役割は２つあり、１つは細胞内のＲＯＳを還元することで、細胞死から回避させることである。もう１つは、グルタチオン抱合により薬剤を細胞外に排出することである。本発明者らは、ＣＤ４４ｖ９を含むＣＤ４４Ｒ１はｘＣＴを安定化させることによって、生体内の主要な抗酸化物質のひとつであるＧＳＨの合成を促進し、細胞内のＲＯＳを還元するのに貢献しているという新たな知見を得た。したがって、ＣＤ４４ｖ９とｘＣＴとの相互作用を阻害することができる抗体およびその抗原結合断片は、（ｉ）細胞内活性酸素種の低下を抑制するか、または（ｉｉ）薬剤の細胞外排出を阻害することができると考えられる。このような抑制または阻害を受けた細胞は、細胞死へと導かれうる。
本明細書中、抗体またはその抗原結合断片が、ＣＤ４４ｖ９に「特異的に結合する」とは、その抗体または抗原結合断片が他のアミノ酸配列に対するその親和性よりも、この蛋白質の特定のアミノ酸配列に対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、所望の測定装置によって、その特定のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能なほどに高い親和性を意味し、典型的には、結合定数（Ｋａ）が少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは、１０９Ｍ−１、さらにより好ましくは、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１またはそれより高い、例えば、最高で１０１３Ｍ−１またはそれより高いものであるような結合親和性を意味する。
本明細書中、「抗体」は、インタクトな免疫グロブリンの全てのクラスおよびサブクラスを含むものとする。好ましくは、本発明の抗体は、ＩｇＧサブクラスのものであり、より好ましくは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。「抗体」は、特に、モノクローナル抗体を含む。
本明細書中、「抗原結合断片」は、インタクトな、および／またはヒト化された、および／またはキメラな抗体の抗原結合領域または可変領域を有するフラグメント、たとえば、上記抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖフラグメントを含む。従来、こうしたフラグメントは、インタクトな抗体の蛋白質分解によって、たとえばパパイン分解によって（たとえば、国際公開ＷＯ９４／２９３４８を参照）作製されているが、遺伝子組換えによる形質転換宿主細胞から直接産生させることもできる。ＳｃＦｖの作製については、Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６に記載の方法が使用できる。さらに、抗体フラグメントは、下記のさまざまな遺伝子工学技術を用いて作製することができる。
Ｆｖフラグメントは、その２つの鎖の相互作用エネルギーがＦａｂフラグメントより低いと思われる。ＶＨおよびＶＬドメインの結合を安定化するために、これらのドメインは、ペプチド（Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，４２３−４２６、Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ，８５，５８７９−５８８３）、ジスルフィド架橋（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら、（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９，１３６２−１３６７）、および「ｋｎｏｂ  ｉｎ  ｈｏｌｅ」変異（Ｚｈｕら、（１９９７），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，６，７８１−７８８）によって連結されている。ＳｃＦｖフラグメントは、当業者によく知られている方法によって作製することができる（Ｗｈｉｔｌｏｗら、（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，２，９７−１０５およびＨｕｓｔｏｎら、（１９９３）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０，１９５−２１７を参照）。ＳｃＦｖは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞内で産生させることができるが、真核細胞内で産生させる方が好ましい。ＳｃＦｖの不利な点は、産物が一価であること、そのために多価結合による結合力の増加が不可能になること、ならびに半減期が短いことである。こうした問題を克服するための試みには、二価（ＳｃＦｖ’）２があるが、これは、追加のＣ末端システインを含有するＳｃＦｖから、化学的カップリングによって（Ａｄａｍｓら、（１９９３）Ｃａｎ．Ｒｅｓ  ５３，４０２６−４０３４、およびＭｃＣａｒｔｎｅｙら、（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８，３０１−３１４）、または不対Ｃ末端システイン残基を含有するＳｃＦｖの、自然発生的な部位特異的二量体化によって（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、（１９９５）Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２６，１８７−２０４を参照）作製される。あるいはまた、ペプチドリンカーを３〜１２残基に短縮して「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」を形成することによって、ＳｃＦｖに多量体を形成させることができる。Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、ＰＮＡＳ（１９９３），９０，６４４４−６４４８を参照。リンカーをさらに小さくすることで、ＳｃＦｖ三量体（「トリアボディ」、Ｋｏｒｔｔら、（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，１０，４２３−４３３を参照）および四量体（「テトラボディ」、Ｌｅ  Ｇａｌｌら、（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，４５３，１６４−１６８を参照）をもたらすことができる。二価ＳｃＦｖ分子の構築は、「ミニ抗体（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）」（Ｐａｃｋら、（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１，１５７９−１５８４を参照）および「ミニボディ」（Ｈｕら、（１９９６），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６，３０５５−３０６１を参照）を形成することができる蛋白質二量体化モチーフとの遺伝子融合によっても、達成することができる。ＳｃＦｖ−ＳｃＦｖタンデム（（ＳｃＦｖ）２）は、第３のペプチドリンカーによって２つのＳｃＦｖ単位を連結することによって作製することもできる（Ｋｕｒｕｃｚら、（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｏｌ．１５４，４５７６−４５８２を参照）。二重特異性ダイアボディは、ある抗体のＶＬドメインに短いリンカーで連結された、別の抗体由来のＶＨドメイン���らなる、２つの一本鎖融合産物の非共有結合によって作製することができる（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、（１９９８），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ  ７７，７６３−７７２を参照）。このような二重特異性ダイアボディの安定性は、ジスルフィド架橋、もしくは上記の「ｋｎｏｂ  ｉｎ  ｈｏｌｅ」変異を導入することによって、または２つのハイブリッドＳｃＦｖフラグメントがペプチドリンカーを介して連結される、一本鎖ダイアボディ（ＳｃＤｂ）を形成することによって、高めることができる（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎら、（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２６  １７９−１８８を参照）。四価の二重特異性分子は、たとえば、ＳｃＦｖフラグメントを、ＩｇＧ分子のＣＨ３ドメインに、またはヒンジ領域を介してＦａｂフラグメントに、融合することによって得られる（Ｃｏｌｏｍａら、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，１５９−１６３を参照）。あるいはまた、四価の二重特異性分子は、二重特異性一本鎖ダイアボディの融合によって作製されている（Ａｌｔら、（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４５４，９０−９４を参照）。より小さい四価の二重特異性分子は、ヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフ含有リンカーによるＳｃＦｖ−ＳｃＦｖタンデムの二量体化（ＤｉＢｉミニ抗体、Ｍｕｌｌｅｒら、（１９９８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４３２，４５−４９を参照）、または分子内対合を妨げる配向で４つの抗体可変領域（ＶＨおよびＶＬ）を含む一本鎖分子の二量体化（タンデムダイアボディ、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３，４１−５６を参照）のいずれかによって、作製することもできる。二重特異性Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、Ｆａｂ’フラグメントの化学的カップリングによって、またはロイシンジッパーによるヘテロ二量体化によって作製することができる（Ｓｈａｌａｂｙら、（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５，２１７−２２５、およびＫｏｓｔｅｌｎｙら、（１９９２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３を参照）。また、単離されたＶＨおよびＶＬドメイン（Ｄｏｍａｎｔｉｓ  ｐｌｃ）も利用できる。
本明細書中、「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（または抗体断片）を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。概して異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性の他に、ハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンによる混入がないという点で、モノクローナル抗体は有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示すものであって、ある特定の方法による抗体の産生を必要とすることを意味するためのものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋ▲ｏ▼ｈｌｅｒ等，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５［１９７５］に最初に記載されたハイブリドーマ法によって作成してもよいし、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作成してもよい。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ等，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８［１９９１］およびＭａｒｋｓ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を用いて、ファージ抗体ライブラリから単離した抗体断片（Ｆｖクローン）を含む抗原認識および結合部位のクローンを含む。
「モノクローナル抗体」は、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、それは、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種から誘導されたまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りの部分は他の種から誘導されたまたは他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限りにおいて、それらの抗体の断片の対応する配列と同一または相同である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５［１９８４］）。
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合性配列）である。大部分において、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、そのレシピエントＣＤＲ由来の残基が、マウス、ラット、ウサギ、霊長類（例えば、サル）などのヒト以外の種のＣＤＲ（ドナー抗体）に由来する所望の特異性、親和性および容量を持つ残基で置換されている。ある場合は、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移植されるＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに精密かつ最適化するために施される。一般にヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質上全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質上全てがヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含有しうる。また、最適なヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含有しうる。
本明細書中、「細胞障害活性」とは、細胞に対して細胞障害を引き起こす能力を意味し、本発明の場合、ＣＤ４４ｖ９発現細胞に本発明の抗体またはその抗原結合断片が特異的に結合して、該細胞に細胞障害性因子を誘導して、該細胞を細胞死またはアポトーシスに至らしめる能力をいうものとする。細胞障害活性は、例えば、本発明の実施例２に記載される方法で測定し、細胞障害率として評価することができる。
本明細書中、「細胞死」は「アポトーシス」を意味する。「アポトーシス」は、個体発生のプログラム、デス因子刺激、放射線などによる染色体ＤＮＡの重度の損傷、異常蛋白質の蓄積などによる重度の処方体ストレスなどさまざまな生理的、病理的要因により誘導される機能的、能動的な細胞死の典型であり、細胞体や核の膨潤を伴う壊死（ネクローシス）とは逆に、細胞体や核の収縮や断片化が起こる。
「ＣＤ４４ｖ９とｘＣＴとの相互作用を阻害する機能（または阻害活性）」は、例えば、後述の実施例に示される方法で、当業者が容易に測定することが可能である。そのような方法としては、例えば、免疫沈降法などを挙げることができる。
本発明の抗体またはその抗原結合断片の例としては、
（１）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号１の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、
（２）（ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号２の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、
（３）（ｉ）配列番号：３のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号３の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、
（４）（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号４の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、
（５）（ｉ）配列番号：５のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号５の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、
（６）（ｉ）配列番号：６のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号６の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）、
（７）（ｉ）配列番号：７のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号７の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域１’（ＣＤＲＨ１’）、
（８）（ｉ）配列番号：８のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号８の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域２’（ＣＤＲＨ２’）、および
（９）（ｉ）配列番号：９のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号９の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域３’（ＣＤＲＨ３’）、
のうちの少なくとも１つを含む、抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
本明細書中、「１個または数個のアミノ酸残基の変異」とは、元となるアミノ酸配列中の１個または数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入、または付加されていることを意味する。本明細書中、そのような変異を元となるアミノ酸配列中の対応する位置に有するアミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合断片は、元となるアミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合断片と同等の生物学的活性を有する。ここで、「同等の生物学的活性」としては、（ｉ）元となるアミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合断片が特異的に結合する抗原に対して特異性をもって結合する能力、（ｉｉ）ＣＤ４４ｖ９発現細胞上のＣＤ４４ｖ９に結合した場合における細胞障害活性、または（ｉｉｉ）これらの両方が挙げられる。最も好ましくは、「同等の生物学的活性」とは、上記（ｉｉｉ）を意味する。また、上記の「１個または数個のアミノ酸残基の変異」における変異したアミノ酸残基の数の上限は、このような同等の特異性を保持することができるか否かという基準（ｃｒｉｔｅｒｉａ）によって制限される。
本発明の抗体またはその抗原結合断片のより好ましい例としては、
（１）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号１の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、
（２）（ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号２の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、および
（３）（ｉ）配列番号：３のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号３の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、
を含む少なくとも１つの軽鎖、ならびに
（４）（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号４の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、
（５）（ｉ）配列番号：５のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号５の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、および
（６）（ｉ）配列番号：６のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号６の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）、
を含む少なくとも１つの重鎖
を含む、抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
本発明の抗体またはその抗原結合断片の別のより好ましい例としては、
（１）（ｉ）配列番号：７のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号７の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域１’（ＣＤＲＨ１’）、
（２）（ｉ）配列番号：８のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号８の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域２’（ＣＤＲＨ２’）、および
（３）（ｉ）配列番号：９のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号９の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域３’（ＣＤＲＨ３’）、
を含む少なくとも１つの重鎖
を含む、抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
本発明の抗体またはその抗原結合断片の最も好ましい例としては、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに２００９年６月２３日付で寄託された、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８２１で特定されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。
本発明の抗体またはその抗原結合断片の別の最も好ましい例としては、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに２００９年６月２３日付で寄託された、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８２２で特定されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。
２．本発明の抗体をコードする核酸
本発明は、別の実施形態において、ＣＤ４４ｖ９に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子を提供する。核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。本発明の核酸分子は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を作製するために使用することができる。
したがって、これに関連する本発明の別の実施形態では、本発明のハイブリドーマ細胞から抗ＣＤ４４ｖ９モノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して前記モノクローナル抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上清または宿主の分泌物からＣＤ４４ｖ９に特異的に結合するモノクローナル抗体を採取することを含む、ＣＤ４４ｖ９に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法が提供される。
本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードするＤＮＡは、常法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に分離されて、配列決定される。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。一旦分離されると、組換え宿主細胞でモノクローナル抗体を合成するために、このＤＮＡを発現ベクターへ挿入し、それをこの状況以外では抗体蛋白質を産生しない大腸菌細胞、ヒトＨＥＫ２９３胎児腎由来細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞へトランスフェクトしうる。例えば、相同的なマウス配列をヒト重鎖および軽鎖定常ドメインの配列で置換することによって（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．ｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１：６８５１［１９８４］）、または免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部を共有結合させることによって、このＤＮＡを修飾しうる。本発明の抗ＣＤ４４ｖ９モノクローナル抗体の結合特異性を有するように、「キメラ」または「ハイブリッド」抗体は調製される。
３．本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞
本発明はさらに別の実施形態において、ＣＤ４４ｖ９に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片を産生するハイブリドーマ細胞を提供する。本発明はまた、ＣＤ４４ｖ９に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片をコードする核酸分子を含有するハイブリドーマを提供する。最も好ましい本発明のハイブリドーマ細胞としては、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに２００９年６月２３日付で寄託された、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８２１で特定されるハイブリドーマ細胞が挙げられる。別の最も好ましい本発明のハイブリドーマ細胞としては、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに２００９年６月２３日付で寄託された、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８２２で特定されるハイブリドーマ細胞が挙げられる。
本発明のハイブリドーマ細胞の調製（樹立）は、具体的には、以下のように行うことができるが、この方法に限定されるわけではない。
（１）抗原の調製
抗ＣＤ４４ｖ９モノクローナル抗体を作製するために必要な抗原としては、ＣＤ４４ｖ９を産生する細胞あるいはその細胞画分、またはＣＤ４４ｖ９をコードするＤＮＡにより形質転換された宿主細胞、すなわち、大腸菌などの原核性宿主細胞および昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核性宿主細胞中に、ＣＤ４４ｖ９をコードするｃＤＮＡの全長または部分断片を公知の方法を用いて組み込み、そのままあるいは融合蛋白として発現、精製された蛋白質、さらには、ペプチド合成機を用いて合成されたＣＤ４４ｖ９の部分ペプチド等を用いることができる。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
３〜２０週令のマウスまたはラットに、（１）に示した方法で作製された抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、抗原を投与することにより行う。抗原の投与は、１回目の投与の後２〜３週間おきに３〜７回行う。各投与後５〜１０日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊  １９７６年〕などで調べる。免疫に用いた抗原細胞に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源として供する。脾細胞を骨髄腫細胞との融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後３〜４日目に、免疫したマウスまたはラットより脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。脾臓を血清無添加の基礎培地（以下洗浄用培地という。）中で細断し、遠心分離して細胞を回収後、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ  ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球の除去を行い、洗浄用培地で洗浄した後に融合用脾細胞として提供する。
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、８  −  アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）〔カレント・トピックス・イン・ミクロバイオロジィ・アンド・イムノロジィ−１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−１）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジィ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）６，５１１−５１９（１９７６）〕、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２７６，２６９−２７０（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）〔ジャーナル・オブ・イムノロジィ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）１２３，１５４８−１５５０（１９７９）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２５６，４９５−４９７（１９７５）〕などが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）を１０％加えた培地（以下、正常培地という。）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合
（２）で免疫した抗体産生細胞と（３）で得られた骨髄腫細胞を洗浄用培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合させる。細胞回収後、細胞をよくほぐし、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１，５００（ＰＥＧ−１，５００）２ｇ、洗浄用培地２ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液０．２〜１ｍｌ／１０８抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎に洗浄用培地１〜２ｍｌを数回加え、全量が５０ｍｌになるまで洗浄する。細胞回収後、ゆるやかに細胞をほぐしながら、ＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−４Ｍ）、チミジン（１．５×１０−５Ｍ）およびアミノプテリン（４×１０−７Ｍ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり、例えば（５）に述べる酵素免疫測定法あるいはＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇの略）などを用いて、ＣＤ４４ｖ９蛋白質に特異的に反応する抗体を選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを抗ＣＤ４４ｖ９モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
したがって、これに関連する本発明の別の実施形態では、ハイブリドーマ細胞を培養し、得られる培養物からＣＤ４４ｖ９に特異的に結合する抗体を採取することを含む、ＣＤ４４ｖ９に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法が提供される。
４．本発明の腫瘍の予防または治療のための医薬
本発明はまた、さらに別の実施形態において、上記の本発明の抗体またはその抗原結合断片を含有する、腫瘍の予防または治療のための医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、さらに薬学的に許容し得る担体を含有する。
後述の実施例に示されるように、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ４４ｖ９を発現する細胞（例：腫瘍細胞）のＣＤ４４ｖ９に特異的に結合して、ＣＤ４４ｖ９の活性を阻害するか、または細胞障害因子を誘導し、該細胞を細胞死に至らしめることができる。あるいは、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ４４ｖ９を発現する細胞のＣＤ４４ｖ９に特異的に結合し、ＣＤ４４ｖ９とアミノ酸トランスポーターであるｘＣＴとの相互作用を阻害し、その結果として、該細胞を細胞死に至らしめることができる。
したがって、本発明の抗体またはその抗原結合断片を含有する医薬組成物は、ＣＤ４４ｖ９を細胞表面に発現する腫瘍細胞を死滅させるため、またはそのような細胞で特徴付けられる腫瘍および、同様の機序により生ずる疾患の予防または治療のために使用することができる。
上記「腫瘍」の例としては、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、口腔癌、胆嚢癌、甲状腺癌、中皮腫、胸膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、平滑筋肉腫、およびウィルムス腫瘍等が挙げられるが、これらに限定されない。より好ましくは、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、膀胱癌、リンパ腫、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、および前立腺癌が挙げられる。さらに乳癌においては、トリプルネガティブ乳癌（ＨＥＲ２陰性、ＥＲ陰性、ＰＲ陰性）が挙げられる。
本発明の抗体またはその抗原結合断片を医薬として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＡ化し分泌成分を結合した後、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該抗体またはその抗原結合断片を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
また、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、他の細胞増殖抑制剤とともに使用され得る。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、抗癌剤としての治療効果をより高めるために、薬学的に許容し得る細胞増殖抑制剤と同時に、逐次的に、または個別に、治療を必要とする対象または患者に投与されることができる。
本発明において使用され得る「細胞増殖抑制剤」の例としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、分子標的薬、植物アルカロイド、抗癌性抗生物質、プラチナ製剤等が挙げられるが、これらに限定されない。
アルキル化剤の例としては、イホスファミド、シクロフォスファミド、ダカルバシン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、プロカルバジン、メルファラン、ラニムスチン等が挙げられるが、これらに限定されない。
代謝拮抗剤の例としては、エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリピン、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、テガフール、テガフールウラシル、ＴＳ−１、ドキシフルリジン、ネララビン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メルカプトプリン、メトトレキサート等が挙げられるが、これらに限定されない。
分子標的薬の例としては、ゼヴァリン、イマチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、スニチニブ、セツキシマブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、トラスツズマブ、トレチノイン、パニツムマブ、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、リツキシマブ等が挙げられるが、これらに限定されない。
植物アルカロイドの例としては、イリノテカン、エトポシド、ソブゾキサン、ドセタキセル、ノギテカン、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン等が挙げられるが、これらに限定されない。
抗癌性抗生物質の例としては、アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、スマンクス、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ドキシル等が挙げられるが、これらに限定されない。
プラチナ製剤の例としては、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン等が挙げられるが、これらに限定されない。
「薬学的に許容し得る」という用語は、正常な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比を有し、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、またはその他の問題もしくは合併症を示すことのない、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために、本明細書において利用される。
本発明の腫瘍の予防または治療のための医薬組成物の投与経路は、周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、皮下、筋肉内、眼内、動脈内、脳内脊髄、または病巣内経路での注射または注入、または徐放系による。またさらに、該抗体またはその抗原結合断片を直接腫瘍部位へ投与する手段として、カテーテル等による投与等も可能である。
また、本発明の腫瘍の予防または治療のための医薬は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、ヒトを含む哺乳動物に対して投与することができる。該抗体またはその抗原結合断片またはその塩の投与量は、投与対象、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、子宮内膜症患者または子宮腺筋症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば６０ｋｇの患者に対して、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与することができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に記載するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【０００６】
［実施例１］
（１）免疫原の調製
抗ＣＤ４４ｖ９モノクローナル抗体を作製するために必要な抗原として、ＧＦＰ融合ＣＤ４４Ｒ１発現ラット肝癌細胞株ＲＨ７７７７細胞株を作製（樹立）した。ＣＤ４４Ｒ１をコードするｃＤＮＡの全長を公知の方法を用いて組み込み融合蛋白として発現させ、発現が強いものを薬剤選択性および限界希釈法にて単一クローン化し安定発現株とした。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
ラット（Ｆ３４４／Ｎ、雌）３匹に、（１）に示した方法で作製された抗原を免疫して、その脾臓より抗体産生細胞を採取した。免疫は、ラットの皮下に抗原としてＧＦＰ−ＣＤ４４Ｒ１発現ＲＨ７７７７細胞３×１０６個を投与することにより行った。抗原の投与は、１回目の投与の３週間後および６週間後に２回行った。脾細胞を骨髄腫細胞との融合に供するにあたって、抗原の最終投与後３日後に、免疫したラットより脾臓を摘出し脾細胞を採取した。脾臓を血清無添加の基礎培地（以下洗浄用培地という。）中で細断し、遠心分離して細胞を回収後、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で３〜５分間処理し赤血球の除去を行い、洗浄用培地で洗浄した後に融合用脾細胞として用いた。
（３）ハイブリドーマの作製
実施例１（２）で得られたマウス脾細胞とマウス骨髄腫細胞株Ｘ６３とを４：１の比率で混合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１５００（ＰＥＧ−１５００）２ｇ、ＤＭＥＭ培地２ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液を０．２〜１ｍｌ／１０８個マウス脾細胞の割合で加え、さらに１〜２分間毎にＤＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回加えた後、ＤＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるようにした。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分）後、上清を捨てＨＡＴ培地１００ｍｌ中に細胞をゆるやかに懸濁した。この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。
（４）抗体スクリーニング
ＧＦＰ融合ＣＤ４４Ｒ１発現ベクター（ＧＦＰ−ｓＣＤ４４Ｒ１）をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞の培養上清に含まれる、１μｇ／ｍｌのＣＤ４４Ｒ１細胞外領域断片蛋白質をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（住友ベークライト）に４０μｌ加え、４℃にて一晩インキュベートした。３％脱脂粉乳溶液を１００μｌ加えて３７℃で１時間ブロッキングしたのち、実施例１（３）で得られたハイブリドーマ培養上清を４０μｌ加え３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳで１回、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（Ｔ−ＰＢＳ）で５回、さらにＰＢＳで１回洗浄後、ＨＲＰ標識抗体（Ｄａｋｏ）を８００〜３０００倍希釈し４０μｌずつ加え、３７℃で４５分間反応させた。ＰＢＳで１回、０．０５％Ｔ−ＰＢＳで５回、さらにＰＢＳで１回洗浄後、基質溶液Ｓｕｒｅ  ＢｌｕｅＴＭ  ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＫＰＬ）を各穴に５０μｌ加えて発色させた。適度に発色した時点で０．５Ｎ硫酸を７０ｍｌずつ加えて反応を停止し、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ５５０（ＢＩＯ−ＲＡＤ）にて各穴の吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。吸光度が０．３以上の陽性反応を示したハイブリドーマを１次スクリーニングとして選択した。
得られたハイブリドーマ培養上清をＧＦＰ−ＣＤ４４Ｒ１トランスフェクタントと反応させ、ＦＡＣＳ解析を行うことによりＣＤ４４Ｒ１特異的抗体を産生しているかの２次スクリーニングを行った。ＦＡＣＳの反応は９６ウェルプレートにて行った。トランスフェクタントを２．５×１０５〜３×１０６個／ウェルになるように５０μｌずつチューブに分注した。この細胞浮遊液にハイブリドーマの培養上清５０μｌを加え、氷冷化で６０分反応させた。チューブに０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳ  ２００〜５００μｌを加え、１９０ｇ、４℃で５分間遠心し上清を捨てる操作を３回繰り返して洗浄した後、２次抗体としてＦＩＴＣ標識抗ラット抗体を添加し遮光氷冷下で４５分間反応させた。ウェルを遠心し洗浄した後０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳ  ５００μｌに懸濁し、４０μｍのナイロンメッシュを通した。死細胞を除くために測定直前にＤＡＰＩを１ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう添加し、ＢＤＬＳＲ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて蛍光強度を測定した。図１に示すように、ＧＦＰ−ＣＤ４４Ｒ１トランスフェクタントに陽性反応を示すクローンを選別し、抗ＣＤ４４Ｒ１抗体産生ハイブリドーマ株を樹立した。
得られた抗体の認識部位を同定するために、大腸菌により発現させたＧＳＴ融合ＣＤ４４ｖ８−１０、ＣＤ４４ｖ８−９、ＣＤ４４ｖ８およびＨｉｓ融合ＣＤ４４ｖ９−１０、ＣＤ４４ｖ９の精製蛋白質を固相化抗原として用いたＥＬＩＳＡを行った。図２に示すように、ＬＧａｄｈ０１−０１およびＬＧａｄｈ０１−０２はＣＤ４４ｖ８以外の全ての断片蛋白質と反応したことから、ＣＤ４４ｖ９特異的に結合する抗体であると結論付けられた。
（５）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雄マウス（ＫＳＮ）に実施例１（４）で得られたハイブリドーマ株を１×１０７細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから腹水を採取し、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分、４℃）した後５０％飽和硫酸アンモニウムにて塩析し、沈渣を溶かして１００００ｇ、４℃で１０分間遠心した。プレフィルター、メンブランフィルター（０．２２μｍ）を通過させた後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて液体クロマトグラフィーシステム▲Ａ▼ＫＴＡにより精製し、抗ＣＤ４４ｖ９モノクローナル抗体とした。
［実施例２］
（１）ＦＡＣＳによるモノクローナル抗体の結合部位の確認
細胞をＰＢＳにて２．５×１０５〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように調整し、５０μＬずつチューブに分注した。この細胞浮遊液にハイブリドーマ上清または濃度調整した精製抗体５０μＬを加え、氷冷下で６０分反応させた。０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳ  ２００〜５００μＬを加え、９，１００ｇ、４℃でフラッシュする洗浄を３回行い、細胞ペレットにＦＩＴＣ標識またはＰＥ標識の二次抗体（１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２００倍希釈）を５０μＬ加え、遮光氷冷下４５分間反応させた。遠心洗浄後、０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳ  ５００μＬにサスペンドし、４０  μｍのナイロンメッシュ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  ＃３５−２３４０）を通した後、死細胞を除くため測定直前にＤＡＰＩを０．５μｇ／ｍＬの濃度になるように添加し、ＢＤ−ＬＳＲ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて測定した。図３のヒストグラムにて矢印で示すように、ＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体及びＬＧａｄｈ０１−０２モノクローナル抗体がＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ９に特異的に結合することが認められた。
（２）ファージディスプレイによるモノクローナル抗体の認識エピトープ解析
１０μｇ／ｍＬに調整した精製抗体を５０μｌ／ｗｅｌｌでＥＬＩＳＡプレート（ＭＳ−７２９６Ｆ）に固相化した。ＢｉｏＬａｂｓのＰｈ．Ｄ−７ランダムペプチドライブラリーを用い、結合ファージを得た。このバイオパニング操作を３回繰り返し、回収ファージの塩基配列をＤＮＡシーケンスで解読、アミノ酸配列に変換した。ＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体が最も頻度高く結合した配列としてＴＰＬＥＥＤＫ（配列番号１０）が得られ、ヒトＣＤ４４ｖａｒｉａｎｔ９領域と比較したところ、ＬＥＥＤＫ（配列番号１１）が共通であった。配列番号１０のアミノ酸配列の両端にヒトＣＤ４４ｖａｒｉａｎｔ９の２アミノ酸を加えた合成ペプチドＥＧＬＥＥＤＫＤＨ（配列番号１２）との反応をＥＬＩＳＡで調べた結果、ＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体及びＬＧａｄｈ０１−０２モノクローナル抗体が結合することが認められた。ただし、ＬＧａｄｈ０１−０２モノクローナル抗体は配列番号１０をもつファージと反応しなかったため、ＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体とＬＧａｄｈ０１−０２モノクローナル抗体のエピトープは異なることが認められた。
（３）免疫組織染色法によるヒト乳癌組織におけるＣＤ４４ｖ９の発現量の検討
ホルマリン固定後パラフィン包埋された検体組織切片のアレイスライドを、６０℃で１時間加熱した後、コプリンジャー内でキシレンに３０分間浸し、さらに新しいキシレンで２回洗浄することで脱パラフィン化した。一連の段階的濃度（１００％〜７５％）のエタノールで処理した後、切片を純水で再水和した。スライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に浸し、続いて電子レンジ（７００Ｗ）に７分間かけ、３０分間室温で放冷した。スライドをＴＢＳＴ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４，１３０ｍＭＮａＣｌ，２．５ｍＭＫＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５分間３回洗浄した後、メタノールで３％に希釈した過酸化水素水に１５分間浸した。ＴＢＳＴで５分間３回洗浄した後、ＴＢＳＴで１０％に希釈した正常ウサギ血清とともにインキュベートした。正常ウサギ血清を除いた後、ＴＢＳＴで１．５％に希釈した正常ウサギ血清を用い０．２μｇ／ｍＬになるよう希釈したＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体をスライドに滴下し、室温で１時間インキュベートした。スライドをＴＢＳＴで５分間３回洗浄した後、二次抗体として、ＴＢＳＴで１．５％に希釈した正常ウサギ血清で２００倍に希釈したビオチン標識抗ラットイムノグロブリン・ウサギポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ  ＃Ｅ０４６８）とともに室温で１時間インキュベートした。スライドをＴＢＳＴで５分間３回洗浄した後、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｋｉｔ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ  ＃  ＰＫ−６１００）を用いて添付のプロトコルに従い作成したアビジンＤＨとビオチン標識ペルオキシダーゼＨの混合液とともに３０分間室温でインキュベートした。スライドをＴＢＳＴで５分間３回洗浄した後、Ｍｅｔａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＤＡＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ  ＃３４０６５）を用いて添付のプロトコルに従い発色基質溶液を作成し、スライドに滴下することで呈色反応を生じさせた。スライドをＴＢＳＴに浸すことで呈色反応を停止させた後、対比染色としてヘマトキシリン３Ｇ（サクラファインテック＃８６５６）を用いて核を染色した。段階的濃度のエタノール（７５％〜１００％）によって脱水し、キシレンによって透徹させた。封入のためにマウントクイック（大道産業＃ＤＭ−０１）を用いて、スライドにカバースリップを乗せた。ＢＸ５１−３４−ＦＬ−１（オリンパス）を用い、スライドの検鏡を行った。図４に示すように、乳癌組織中の癌細胞の細胞膜にＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体の結合が認められた。表１は乳癌組織アレイＨｕｍａｎ，Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ−ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ｎｏｒｍａｌ（Ｓｕｐｅｒ  Ｂｉｏ  Ｃｈｉｐ  ＃ＣＢＡ３）のＬＧａｄｈ０１−０１抗体染色をまとめたものである。各組織のシグナル強度を比較し、シグナルなしを０、シグナルありの場合、その強度を１＋、２＋、３＋の３段階でスコア化した。全体的に３５人の患者の原発巣の約５４％がＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ９抗原に対し陽性であった。悪性度の高いサブタイプ（ｓｕｂｔｙｐｅ）であるトリプルネガティブ（Ｔｒｉｐｌｅ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ；ＴＮ）乳癌（ＨＥＲ２陰性、ＥＲ陰性、ＰＲ陰性）の患者では、１３人���うち９人が陽性であった。また、リンパ節転移巣においては１０人の患者のうち７人が陽性であった。
【表１】
2011007853.tif 000002
（４）癌細胞株におけるＣＤ４４ｖ９の発現量の検討
ＦＡＣＳ法によりＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体を用いてヒト乳癌細胞株７種および非癌細胞２種におけるＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ９の発現量を測定した。図５に示すように、ＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ９は非癌細胞に比べ、乳癌細胞で優位に高発現していることが認められた。また、大腸癌、肺癌、膵癌、皮膚癌、子宮頸癌、舌癌細胞においても高発現が認められ、ＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ９が癌細胞で特異的に発現していることが示唆された。
（５）ＣＤ４４アイソフォームとｘＣＴの細胞膜上での共局在
ＣＤ４４アイソフォームの機能としてＲＯＳの抵抗性への関与が示された。ＲＯＳの制御においては、生体内の主要な抗酸化物質のひとつであるＧＳＨの合成を促進し細胞内の活性酸素種の還元へ関与しているｘＣＴが知られていることから、ＣＤ４４アイソフォームとｘＣＴの相互作用について検討を行った。
ヒト大腸癌細胞ＨＣＴ１１６に対して、ＣＤ４４  ｓｉＲＮＡ（ＣＤ４４ｖ９を含むＣＤ４４アイソフォームを標的とするｓｉＲＮＡ）あるいはコントロールとしてヒトの配列に相同性を持たないｓｉＲＮＡ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ由来）を、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションした。３７℃で３日間培養後、４％パラフォルムアルデヒドにより固定した。抗ＣＤ４４ラットモノクローナル抗体（ＣＤ４４ｖ９を含むＣＤ４４アイソフォームに結合する抗体）あるいは抗ｘＣＴラットモノクローナル抗体を室温で６０分間反応させ、その後ＰＢＳで３回洗浄した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）あるいはＴｅｘａｓ  ｒｅｄ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、室温で６０分間反応させ、その後ＰＢＳで３回洗浄した。さらに対比染色として、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により核染色を行い、Ｂｉｏｒｅｖｏ  ＢＺ−９０００蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いて、観察を行った。
図６上段に示すように、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡで処理した細胞の染色結果から、ＣＤ４４ｖ９を含むＣＤ４４アイソフォームとｘＣＴが細胞膜上で共発現していることが認められた。さらに下段に示すように、ＣＤ４４  ｓｉＲＮＡで処理した細胞においては、ＣＤ４４アイソフォームのノックダウンにより、ｘＣＴの膜上の発現の減衰が認められた。以上のことから、ＣＤ４４アイソフォームとｘＣＴは膜上で共発現し、ＣＤ４４アイソフォームがｘＣＴの膜上での安定化に関与していることが示唆された。
さらに、免疫沈降法によるＣＤ４４アイソフォームとｘＣＴの相互作用の検討を行った。ＣＤ４４Ｒ１を発現するｐＲｃ−ＣＭＶベクター、ＣＤ４４ｓを発現するｐＲｃ−ＣＭＶベクター、および空のベクターをＦｕＧｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてトランスフェクションした。３７℃で２４時間培養後、プロテアーゼ阻害剤入りのＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒで溶解し、蛋白質抽出液を取得した。抗ｘＣＴラットモノクローナル抗体を加え、氷上で１時間作用させた。その後Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｂｅａｄｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加え、１時間反応させた。遠心後上清を除去し、ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒにより３回洗浄を行った。その後、抗ＣＤ４４ウサギポリクローナル抗体および抗ｘＣＴウサギポリクローナル抗体によるＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法で、ＣＤ４４とｘＣＴの複合体形成状態を解析した。検出はＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて行った。図７に示すように、ＣＤ４４Ｒ１を発現するｐＲｃ−ＣＭＶベクター、ＣＤ４４ｓを発現するｐＲｃ−ＣＭＶベクターをトランスフェクションした細胞において、それぞれ標的蛋白質が強制発現されていることを確認された。それらの細胞に対し、抗ｘＣＴ抗体を用いて免疫沈降した結果、ＣＤ４４Ｒ１を強制発現させた細胞において、バンドが検出されたことから、ｘＣＴはＣＤ４４Ｒ１と複合体を形成していることが認められ、一方ＣＤ４４ｓを強制発現させた細胞においては、バンドが検出されず、ｘＣＴとの相互作用はＣＤ４４Ｒ１特異的な現象であることが示唆された。
（６）ＣＤ４４アイソフォームの活性酸素種（ＲＯＳ）への抵抗性効果の検討
ヒト大腸癌細胞ＨＣＴ１１６に対して、ＣＤ４４  ｓｉＲＮＡ（ＣＤ４４ｖ９を含むＣＤ４４アイソフォームを標的とするｓｉＲＮＡ）あるいはコントロールとしてヒトの配列に相同性を持たないｓｉＲＮＡ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ由来）を、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションした。３７℃で３日間培養後、０．５ｍＭ過酸化水素水（Ｈ２Ｏ２）を２０分作用させ、その後１０μＭ  ＤＣＦＨ−ＤＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）試薬を３７℃で１５分間作用させた。ＦＡＣＳを用いてＤＣＦの蛍光を測定し、細胞内のＲＯＳ蓄積量を解析した。図８に示すように、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ処理群に過酸化水素水を加えてもＤＣＦ蛍光値は低くＲＯＳは蓄積していないのに対し、ＣＤ４４  ｓｉＲＮＡ処理によりＣＤ４４アイソフォームをノックダウンした細胞に過酸化水素水を加えるとＲＯＳが蓄積していることが確認され、ＣＤ４４アイソフォームがＲＯＳ抵抗性へ関与していることが認められた。
（７）モノクローナル抗体と従来の細胞増殖抑制剤の併用効果の検討
５種の臓器の癌細胞株を標的抗原とし、乳癌細胞株、肺癌細胞株、大腸癌細胞株、膵臓癌細胞株、および子宮頸癌細胞株を、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種した。３７℃で２４時間培養後、培地を取り除き、ＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体１０μｇ／ｍｌおよび本発明において好ましい各細胞増殖抑制剤（代謝拮抗剤の５ＦＵおよびゲムシタビン、微小管脱重合阻害薬のタキソテール、アルキル化剤のオキサリプラチン、トポイソメラーゼ阻害薬のドキソルビシン）を０〜３００μＭの範囲の用量で調整した培地を１５０μｌ／ｗｅｌｌで加えた。３７℃で３日間培養後、培地を取り除き、アラマーブルー試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１０倍に希釈した培地を１５０μｌ／ｗｅｌｌで加えた。３７℃で２時間培養後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いて５９０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。図９に示すように細胞増殖抑制剤の単剤の効果に比べ、ＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体の併用による抗腫瘍効果の強化が検出された。評価に使用したいずれの細胞増殖抑制剤においても増強効果が見られ、ＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体の作用により、ｘＣＴの薬剤排出能が抑えられたことが示唆された。
（８）モノクローナル抗体の抗体依存性細胞障害活性の検討
ベノジェクトＩＩ真空採血管（テルモ＃ＶＰ−Ｈ１００Ｋ）に採血したヒト末梢血６ｍＬを、リンフォセパールＩ（ＩＢＬ＃２３０１０）４ｍＬに対し静かに重層し、１８００ｒｐｍで３０分遠心して分離した単核球の層を回収した。ＰＢＳで倍量に希釈し、２００ｇで１０分間遠心した。ペレットにＰＢＳを加え、２００ｇで１０分間遠心する洗浄し、適切な細胞密度になるよう培地で懸濁した細胞をエフェクター細胞とした。一方、標的細胞としてＢＴ２０細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培地で調整した。丸底９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに予めＬＧａｄｈ０１−０１ヒトキメラ抗体５０μＬずつ分注し、標的細胞液を５０μＬ加えた。４℃で１５分インキュベート後、１５００ｒｐｍで３分遠心して、上清を捨てる。エフェクター細胞液１００μＬを加え、１２００ｒｐｍで１分遠心して３７℃で４時間インキュベートした。インキュベート後、１２００ｒｐｍで３分遠心し、上清５０μＬを平底９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに移した。Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｍｉｘ（Ｃｙｔｏｔｏｘ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｇ１７８０））を５０μＬ／ｗｅｌｌで加え、３０分静置した。Ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを５０μｌ／ｗｅｌｌ加え、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いて４９０ｎｍにおける吸光度を測定し、次の式で細胞障害率を算出した。細胞障害率（％）＝（ｓａｍｐｌｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  −  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｌｅａｓｅ）／（ｔｏｔａｌ  ｒｅｌｅａｓｅ  −  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｌｅａｓｅ）×１００。図１０に示すようにＬＧａｄｈ０１−０１モノクローナル抗体のＡＤＣＣ活性が検出された。エフェクター／ターゲット比依存的な活性および抗体濃度依存的な活性が認められた。
（９）モノクローナル抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果の検討
ヒト舌癌細胞ＨＳＣ−３をＫＳＮヌードマウスに皮下投与し、腫瘍を形成させた。腹腔内にプリスタン５００ｕｌ／匹を投与後、マウスを１６匹と１５匹の群に分けた。１６匹の群の腹腔内にハイブリドーマＬＧａｄｈ０１−０１を投与し、１５匹の群の腹腔内に陰性コントロールとして、ＨＳＣ−３に結合しない抗マウスＣＤ４４抗体を産生するハイブリドーマを投与し、腹水が貯留した時点で各マウスの腫瘍容量を測定した。図１１に示すように、陰性コントロール群に比べ、ハイブリドーマＬＧａｄｈ０１−０１投与群で腫瘍の増殖抑制が認められた。
４×１０６ｃｅｌｌｓのヒト大腸癌細胞ＨＴ２９を１００μＬのＭａｔｒｉｇｅｌで懸濁し、Ｂａｌｂ／ｃヌード雌マウスに皮下投与した。その４日後にＬＧａｄｈ０１−０１ラットモノクローナル抗体の投与を開始し、抗体は１ｍｇ／ｍｏｕｓｅで週２回投与を２週間続け、投与毎に腫瘍容量を測定した。図１２に示すように、陰性コントロールのＰＢＳ投与群に比べ、ＬＧａｄｈ０１−０１投与群で腫瘍の増殖抑制が認められた。
（配列表中の配列の説明）
配列番号：１  ＬＧａｄｈ０１−０１軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）
配列番号：２  ＬＧａｄｈ０１−０１軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）
配列番号：３  ＬＧａｄｈ０１−０１軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）
配列番号：４  ＬＧａｄｈ０１−０１重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）
配列番号：５  ＬＧａｄｈ０１−０１重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）
配列番号：６  ＬＧａｄｈ０１−０１重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）
配列番号：７  ＬＧａｄｈ０１−０２重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）
配列番号：８  ＬＧａｄｈ０１−０２重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）
配列番号：９  ＬＧａｄｈ０１−０２重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）
配列番号：１０  ＬＧａｄｈ０１−０１が特異的に結合するアミノ酸配列
配列番号：１１  配列番号１０のアミノ酸配列と配列番号１２のアミノ酸配列とに共通するアミノ酸配列
配列番号：１２  ＬＧａｄｈ０１−０１およびＬＧａｄｈ０１−０２が特異的に結合するアミノ酸配列
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、腫瘍特異的に発現し、正常細胞にはほとんど発現しない抗原（すなわち、ＣＤ４４ｖ９）に対して特異的に結合し、ＣＤ４４ｖ９発現細胞に対して細胞障害作用を奏するため、副作用の少ない抗癌剤、または腫瘍の予防または治療のための医薬等として特に有用である。
［配列表］
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【図３】
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【図８】
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【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９（Ａ）】
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【図９（Ｂ）】
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【図９（Ｃ）】
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【図９（Ｄ）】
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【図９（Ｅ）】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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