(57)【要約】本発明は、高輝度であり耐光性の高い、凝集ナノ粒子および蛍光標識材を提供することを目的とし、本発明の凝集ナノ粒子は凝集誘起発光性分子の凝集により形成された凝集ナノ粒子であって、粒子表面に親水基を有しており、粒径変動係数が３０％以下である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
凝集誘起発光性分子の凝集により形成された凝集ナノ粒子であって、
前記凝集ナノ粒子は、当該粒子表面に親水基を有し、
前記凝集ナノ粒子の粒径変動係数が３０％以下である、凝集ナノ粒子。
【請求項２】
前記凝集ナノ粒子が、前記親水基を当該粒子表面に１個／ｎｍ2以上有している、請求項１に記載の凝集ナノ粒子。
【請求項３】
前記凝集ナノ粒子の平均粒径が１ｎｍ以上１００ｎｍ以下である、請求項１または２に記載の凝集ナノ粒子。
【請求項４】
前記凝集誘起発光性分子が、環構造の形成に寄与しない炭素・炭素二重結合を有さないことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の凝集ナノ粒子。
【請求項５】
中心核を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の凝集ナノ粒子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の凝集ナノ粒子を含む蛍光標識材であって、前記凝集ナノ粒子表面に標的指向性リガンドを有する、蛍光標識材。
【請求項７】
前記標的指向性リガンドが、抗体、糖鎖と結合性を有するタンパク質、細胞小器官親和性物質、ペプチドからなる群から選択される１種または２種以上の分子である、請求項６に記載の蛍光標識材。
【請求項８】
請求項６または７に記載の蛍光標識材と、緩衝液とを含む蛍光標識材分散液。
【請求項９】
凝集誘起発光性分子の溶液に、貧溶媒を接触させ、前記凝集誘起発光性分子を凝集させる工程（Ａ）を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の凝集ナノ粒子の製造方法。
【請求項１０】
前記工程（Ａ）が、中心核存在下で、前記凝集誘起発光性分子の溶液に、貧溶媒を接触させ、前記凝集誘起発光性分子を凝集させる工程である、請求項９に記載の凝集ナノ粒子の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の凝集ナノ粒子に標的指向性リガンドを結合させる工程を含む、蛍光標識材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝集ナノ粒子および蛍光標識材に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、臨床分野や基礎研究において、分子イメージング技術が高い注目を集めている。分子イメージングは、これまで可視化できなかった生体内での分子の動きを可視化する技術であり、例えば、生体分子の分子レベルでの解析、疾病の原因となるウイルスや細菌の動態についての研究、薬物が生体に与える作用等の評価など、様々な目的について広く用いられている。特にその優れた検出感度や操作性等から、生体中の微量物質の検出には、蛍光物質を用いて行う蛍光イメージングが広く用いられる。【０００３】
蛍光イメージングを用いた診断や研究においては、蛍光性の物質を標識試薬として検出したい生体物質に結合させ、所定の励起光を照射することによって標識試薬の蛍光を高感度に検出する手法が提案されている。このような蛍光イメージングにより得られる蛍光シグナルにより、生体分子相互作用の定量化、長期間におよぶ生体分子の動態観察、超高感度観察などを行うため、「高輝度」および「高耐光性」の二つの特性をあわせもつ蛍光標識材が求められている。【０００４】
従来用いられてきた蛍光標識材としては、例えば市販の有機系蛍光色素等が挙げられるが、これらは量子収率は高くても標的分子に結合した1分子あたりの輝度は低く、また、使用の際に色素分子同士が凝集することで発光効率、発色性、光感受性や光増感性などの機能が著しく低下し、蛍光色素本来の特性を制限してしまうという欠点があった。【０００５】
さらに他の蛍光標識材としては、量子収率が高く、また耐光性が高いナノ粒子である量子ドットがある（特許文献１）。しかしながら、量子収率の比較的高い量子ドットの組成は生体毒性が高いＣｄを含む組成であることから生細胞や生体に対して用いることができないという問題がある。また、量子ドットは予測不可能な明滅現象を引き起こす等蛍光が安定せず、また比較的比重の大きい粒子であるため、標識した生体物質の動態や他の物質との相互作用へ干渉してしまうなど、生体分子の正確な観察や定量が難しいという欠点があった。【０００６】
これらの問題を解決するため、近年凝集誘起発光性分子を凝集させた凝集ナノ粒子が開発された（特許文献２）。この凝集ナノ粒子は従来の蛍光標識材よりも高輝度であり、さらに細胞毒性が低いという利点がある。凝集誘起発光性分子の高い輝度の発生は諸説あるが、凝集誘起発光性分子が高密度にパッキングされた微粒子となることで色素分子の部分構造の回転や振動や熱エネルギーへの変換等が抑制されて励起光エネルギーが効果的に発光パスに利用され量子収率が向上するメカニズム、また規則的な分子の積層状態がエキシマー発光しないような配置でパッキングされるために量子収率が向上するというメカニズムなどが考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１１−５３０１８７号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１３／０８９８８９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記特許文献２に記載の凝集ナノ粒子について、本発明者らが追試実験をしたところ染色時において輝度ムラが発生し、また一定期間保存後に使用した際の輝度および染色後の耐光性が低いという問題が判明した。この原因を解明するため、本発明者らがさらに追試したところ、上記凝集ナノ粒子を製造してからの時間経過とともに、粒子の凝集による粒度分布が広がり始め、１週間後には粒径変動係数が６０％を超えることが明らかになり、この凝集による粒度分布の増大が、耐光性の低下に相関していることもわかった。【０００９】
この原因について、発明者らは鋭意検討した結果、製造時の粒径変動係数が大きいほど、経時的な粒度分布の増大が顕著であることを突き止めた。さらに、当該凝集ナノ粒子は表面が疎水性であるために相互作用により２次凝集を引き起こしやすく、その結果、ナノ粒子の凝集体中心付近に位置する凝集誘起発光性分子の励起光吸収が不充分となることや、発光がナノ粒子凝集体の内部で多重散乱することで凝集誘起発光性分子が発した蛍光が検出されないことで、充分な輝度が得られないのではないかと考えた。また、ナノ粒子が２次凝集することで励起光の吸収に異方性が発現することで蛍光強度が均一でない（輝度ムラが発生する）こと、さらに凝集により隣接する粒子表面の凝集誘起発光性分子同士が相互作用を引き起こして再配置することでナノ粒子表面に空隙等が発生し、凝集誘起発光性分子の劣化因子となる酸素分子などが作用しやすくなってしまうことが、耐光性低下の原因となると考えた。【００１０】
本発明は、従来用いられてきた蛍光標識材よりも、より高輝度であり、より耐光性の高い凝集ナノ粒子に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、本発明者らは上記問題を解決すべく鋭意検討した結果、凝集誘起発光性分子をナノ粒子化した凝集ナノ粒子の表面を親水性にし、凝集ナノ粒子の粒子径変動係数を３０％以下とすることで、上記の課題を解決し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は例えば次のような凝集ナノ粒子および蛍光標識材を提供する。
[項１]
凝集誘起発光性分子の凝集により形成された凝集ナノ粒子であって、
前記凝集ナノ粒子は、当該粒子表面に親水基を有し、
前記凝集ナノ粒子の粒径変動係数が３０％以下である、凝集ナノ粒子。
[項２]
前記凝集ナノ粒子が、前記親水基を当該粒子表面に１個／ｎｍ2以上有している、項１に記載の凝集ナノ粒子。
[項３]
前記凝集ナノ粒子の平均粒径が１ｎｍ以上１００ｎｍ以下である、項１または２に記載の凝集ナノ粒子。
[項４]
前記凝集誘起発光性分子が、環構造の形成に寄与しない炭素・炭素二重結合を有さないことを特徴とする項１〜３のいずれか一項に記載の凝集ナノ粒子。
[項５]
中心核を有する、項１〜４のいずれか一項に記載の凝集ナノ粒子。
[項６]
項１〜５のいずれか一項に記載の凝集ナノ粒子を含む蛍光標識材であって、前記凝集ナノ粒子表面に標的指向性リガンドを有する、蛍光標識材。
[項７]
前記標的指向性リガンドが、抗体、糖鎖と結合性を有するタンパク質、細胞小器官親和性物質、ペプチドからなる群から選択される１種または２種以上の分子である、項６に記載の蛍光標識材。
[項８]
項６または７に記載の蛍光標識材と、緩衝液とを含む蛍光標識材分散液。
[項９]
凝集誘起発光性分子の溶液に、貧溶媒を接触させ、前記凝集誘起発光性分子を凝集させる工程（Ａ）を含む、項１〜４のいずれか一項に記載の凝集ナノ粒子の製造方法。
[項１０]
前記工程（Ａ）が、中心核存在下で、前記凝集誘起発光性分子の溶液に、貧溶媒を接触させ、前記凝集誘起発光性分子を凝集させる工程である、項９に記載の凝集ナノ粒子の製造方法。
[項１１]
項１〜５のいずれか一項に記載の凝集ナノ粒子に標的指向性リガンドを結合させる工程を含む、蛍光標識材の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の「凝集ナノ粒子」は、凝集誘起発光性分子を含む従来のナノ粒子よりも量子収率が高くまた高輝度であり、さらに上述した２次凝集による輝度の低下および凝集誘起発光性分子の再配置による劣化が抑制されることで、経時的耐光性が飛躍的に向上する。【００１４】
また本発明の凝集ナノ粒子を含む蛍光標識材を生体分子の標識に用いると、強くまた均一な蛍光シグナルを安定して得ることができるため、生体物質の定量化、長期間におよぶ動態観察、および超高感度観察を行うことが可能となる。さらに本発明の凝集ナノ粒子および蛍光標識材は粒径および比重が比較的小さいことから、標識した生体物質と他の物質との相互作用へ干渉しにくいため、生体物質間相互作用を定量的に評価することも可能になる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の「凝集ナノ粒子」は、凝集誘起発光性分子の凝集により形成された粒子であって、当該粒子表面には親水基を有しており、粒径変動係数が３０％以下であることを特徴とする。
＜凝集誘起発光性分子＞
本発明において用いられる凝集誘起発光性分子は、希薄溶液中で凝集することなく各分子が溶解あるいは分散している状態では量子収率が低いため蛍光を発さないか、蛍光の発光強度が弱い物質であるが、凝集して集合体を形成することで量子収率が上がり、強い蛍光を発する、または蛍光強度を増すという性質を有する蛍光物質である。凝集誘起発光性分子としては、公知の凝集誘起発光性分子等を特に制限なく用いることができるが、通常は炭化水素系芳香環およびヘテロ芳香環の少なくとも一方を有する分子が用いられる。具体的には、例えば、マレイミド系凝集誘起発光性分子、アミノベンゾピラノキサンテン（ABPX）系凝集誘起発光性分子、ベンゾフロ・オキサゾロ・カルバゾール系凝集誘起発光性分子、カルボラン系凝集誘起発光性分子、ローダミン系凝集誘起発光性分子、テトラフェニルエチレン系凝集誘起発光性分子、シロール系凝集誘起発光性分子、芳香環含有金属錯体系化合物、ＢＯＤＩＰＹ系ホウ素イミン錯体凝集誘起発光性分子、その他のヘテロ化合物などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
＜１．ベンゾフロ・オキサゾロ・カルバゾール系凝集誘起発光性分子＞
前記ベンゾフロ・オキサゾロ・カルバゾール系凝集誘起発光性分子とは、ベンゾフロ・オキサゾロ・カルバゾール骨格を有する凝集誘起発光性分子のことをいい、ベンゾフロ・オキサゾロ・カルバゾール骨格とは、下記式（１）で表される。すなわち、ベンゾフロ・オキサゾロ・カルバゾール系凝集誘起発光性分子は、分子内に下記式（１）で表される骨格を有する凝集誘起発光性分子である。ベンゾフロ・オキサゾロ・カルバゾール系凝集誘起発光性分子としては、例えば下記式（２）で表される化合物が挙げられる。
【００１６】
【化１】
2019088266.tif 000002
【００１７】
【化２】
2019088266.tif 000003
Ｒ1〜Ｒ3はそれぞれ独立に、水素原子、有機基または有機金属基である。
【００１８】
Ｒ1およびＲ2は、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、好ましくはアルキル基または置換アルキル基であり、置換アルキル基の置換基としては、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基、亜リン酸基、水酸基、アミノ基、イソシアネート基、シリル基およびハロゲン原子から選択される少なくとも１種の置換基であることが好ましい。
【００１９】
Ｒ3で表される置換基は、芳香族基、脂肪族基、または水素原子であることが好ましく、前記芳香族基は芳香族炭化水素基でも芳香族複素環基でもよく、好ましい例としては、フェニル基、ナフチル基、アントラニル基、フェナンスリル基、ピレニル基、ピリジル基、ピリミジル基、トリアジニル基等が挙げられる。脂肪族基としては、アルキル基、シクロアルキル基、不飽和脂肪族基等が挙げられ、芳香族基、脂肪族基は水素原子が置換基で置換されていてもよく、置換基としては、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基、亜リン酸基、水酸基、アミノ基、イソシアネート基、シリル基およびハロゲン原子から選択される少なくとも１種の置換基が好ましい。
【００２０】
また、Ｙは電子吸引性基を表し、具体的には、シアノ基、ニトロ基、メトキシ基、トシル基、メシル基、ハロゲン、フェニル基、アシル基、ケト基、カルボキシル基、アルデヒド基、エトキシカルボニル基、メトキシカルボニル基、ピリジル基、ピリミジル基、トリアジニル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、ジシアノメチル基、シアナミド基などが挙げられる。
【００２１】
前記ベンゾフロ・オキサゾロ・カルバゾール系凝集誘起発光性分子は、以下の式（３）‐１〜式（３）‐３であらわされる化合物であることが好ましい。
【００２２】
【化３】
2019088266.tif 000004
【００２３】
【化４】
2019088266.tif 000005
【００２４】
【化５】
2019088266.tif 000006
＜２．カルボラン系凝集誘起発光性分子＞
前記カルボラン系凝集誘起発光性分子としては、Ｃ2Ｂ10で構成されるカルボラン骨格を有する化合物、好ましくはortho-カルボラン骨格を有する化合物である。前記カルボラン系凝集誘起発光性分子としては、例えば下記式（４）で表される化合物が挙げられる。
【００２５】
【化６】
2019088266.tif 000007
なお、式（４）において、白抜きの丸は炭素原子を表し、黒い点はＢＨを表す。立体構造の観点から図示できないＢＨは省略されている。
【００２６】
式（４）においてＲ1およびＲ2はそれぞれ独立に、水素原子、有機基または有機金属基から選択することができる。Ｒ1およびＲ2で表される置換基は、同一であっても異なっていてもよく、互いに縮合して環状構造を形成してもよい。Ｒ1およびＲ2のうち１つが芳香族炭化水素基または芳香族複素環基であることが好ましく、その場合、他方は芳香族炭化水素基または芳香族複素環基であっても、脂肪族炭化水素基であっても、水素原子であってもよい。
【００２７】
前記芳香族炭化水素基は、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントラニル基、フェナンスリル基、ピレニル基等が挙げられ、前記芳香族複素環基はピリジル基、ピリミジル基、トリアジニル基、ピロール基、イミダゾール基、ピラゾール基、トリアゾール基、オキサジアゾール基、オキサゾール基、チアジアゾール基、チアゾール基等が挙げられる。前記脂肪族炭化水素基のうち飽和脂肪族炭化水素基としては、アルキル基、シクロアルキル基が挙げられ、不飽和脂肪族基としては、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルケニル基、シクロアルキニル基が挙げられる。また、前記脂肪族炭化水素基には、アラルキル基の水素原子の一つがアリール基で置換されたアラルキル基が含まれるものとする。
【００２８】
前記芳香族炭化水素基、芳香族複素環基、および脂肪族炭化水素基は任意のアルカリ金属基で置換されていてもよく、さらに親水性基および反応性官能基から選択される少なくとも１種の基で置換されていてもよい。前記親水性基および反応性官能基から選択される少なくとも１種の基としては、例えば、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基、亜リン酸基、水酸基、アミノ基、イソシアネート基、シリル基およびハロゲン原子等が挙げられる。
【００２９】
前記Ｒ1およびＲ2が同一のものである場合、Ｒ1およびＲ2は以下の式（４）‐１の中から選択されることが好ましい。
【００３０】
【化７】
2019088266.tif 000008
また、前記Ｒ1およびＲ2は、以下の式（４）‐２から選択される組み合わせであることも好ましい。
【００３１】
【化８】
2019088266.tif 000009
＜３．マレイミド系凝集誘起発光性分子＞
前記マレイミド系凝集誘起発光性分子とは、マレイミド骨格を有する化合物のことをいい、例えば下記式（５）‐１または（５）‐２で表される化合物が挙げられる。
【００３２】
【化９】
2019088266.tif 000010
前記式（５）‐１または（５）‐２においてＲ、Ｒ'、およびＲ''はそれぞれ独立に、水素原子、有機基または有機金属基から選択することができ、芳香族基であることが好ましく、フェニル基、ナフチル基、アントラニル基、ピリジル基、ピリミジル基、トリアジニル基であることがより好ましい。
【００３３】
置換基Ｒ'およびＲ''は、同一であっても異なっていてもよく、また互いに縮合して飽和環、不飽和環、芳香族環を形成してもよい。
【００３４】
また、マレイミド系凝集誘起発光性分子としては、前記式（５）‐１または（５）‐２で表される化合物の任意の位置の水素原子の一つまたは複数が、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基、亜リン酸基、水酸基、アミノ基、イソシアネート基、シリル基およびハロゲン原子から選択される少なくとも１種によって置換されていることが好ましい。
【００３５】
前記マレイミド系凝集誘起発光性分子として好適に用いられる化合物の一例として、具体的には以下の化合物が挙げられる。
【００３６】
【化１０】
2019088266.tif 000011
＜４．アミノベンゾピラノキサンテン系凝集誘起発光性分子＞
前記アミノベンゾピラノキサンテン系凝集誘起発光性分子とは、アミノベンゾピラノキサンテン骨格を有する凝集誘起発光性分子のことをいい、例えば下記式（６）で表される化合物が挙げられる。
【００３７】
【化１１】
2019088266.tif 000012
式（６）においてＲ1〜Ｒ4はそれぞれ独立に、水素原子、有機基または有機金属基から選択することができる。アルキル基および置換アルキル基であることが好ましく、置換アルキル基の置換基としては、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基、亜リン酸基、水酸基、アミノ基、イソシアネート基、シリル基およびハロゲン原子から選択される少なくとも一種であることがより好ましい。
【００３８】
さらに、Ｒ1とＲ2、Ｒ3とＲ4がそれぞれ結合して環を形成していてもよい。またアミノ基のカチオンにアニオンが配位することで塩を形成していてもよい。さらにＲ1とＲ2はそれぞれ独立に、Ｒ1とＲ2とが結合する窒素原子が結合する炭素原子を含む環が有する別の炭素原子と結合して環を形成してもよく、Ｒ3とＲ4はそれぞれ独立に、Ｒ3とＲ4とが結合する窒素原子が結合する炭素原子を含む環が有する別の炭素原子と結合して環を形成してもよい。
【００３９】
具体的には、前記アミノベンゾピラノキサンテン系凝集誘起発光性分子は、以下の化合物であることが好ましい。
【００４０】
【化１２】
2019088266.tif 000013
＜５．ローダミン系凝集誘起発光性分子＞
前記ローダミン系凝集誘起発光性分子とは、ローダミン骨格を有する凝集誘起発光性分子のことをいい、ローダミン骨格とは、下記式（７）で表される。ローダミン系凝集誘起発光性分子は、アミノベンゾピロキサンテン系色素が好ましく、下記式（７）‐１で表される化合物がより好ましい。式（７）‐１で表される化合物には、Ｒa〜Ｒg、およびｍが、それぞれ２つ存在するが、同様の符号で表されるものは、それぞれ同一でも異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。
【００４１】
【化１３】
2019088266.tif 000014
【００４２】
【化１４】
2019088266.tif 000015
式（７）‐１においてＲaおよびＲbは、それぞれ独立に水素原子または炭素数１〜２０の炭化水素基であり、好ましくは炭素数１〜１２の炭化水素基である。
【００４３】
前記ＲcおよびＲdはそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子または炭素数１〜２０の炭化水素基であり、好ましくは水素原子である。
【００４４】
前記Ｒeは独立に、アミノ基または−ＣＯＯＲhであり、該Ｒhは、水素原子または炭素数１〜２０の炭化水素基であり、好ましくは水素原子である。
【００４５】
前記Ｒfは独立に、水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、保護基を有していてもよいアミド結合含有基、または炭素数１〜２０の炭化水素基であり、好ましくは水素原子である。
【００４６】
前記Ｒgは独立に、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、カルボキシル基、アミノ基又は炭素数１〜２０の炭化水素基であり、好ましくは水素原子である。
【００４７】
ｍは、１〜４の整数であり、好ましくは１である。
【００４８】
前記Ｒa、Ｒb、Ｒc、Ｒd、Ｒf、ＲgおよびＲhにおける炭化水素基は、一部が窒素原子、酸素原子または硫黄原子で置換されていてもよい。
【００４９】
前記ＲaとＲcおよび／またはＲbとＲdは互いに結合することで、窒素原子を少なくとも１つ含む、構成原子数５または６の複素環基を形成してもよい。該複素環基としては、例えば、ピロリジン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピペリジン、ピリジン、ピペラジン、ピリダジン、ピリミジンおよびピラジンが挙げられる。これらの中では、ピペリジンが好ましい。
【００５０】
なお、該複素環基は、置換基Ｒjを有していてもよい。該Ｒjは独立に、炭素数１〜１２の炭化水素基または該炭化水素基の一部が窒素原子、酸素原子または硫黄原子で置換された基である。このような化合物としては、下記式（７）−２および（７）−３で表される化合物が挙げられる。このとき、ｎは独立に０〜３の整数であり、好ましくは０〜２の整数である。
【００５１】
【化１５】
2019088266.tif 000016
［式（７）‐２および（７）‐３中、Ｒa、Ｒc、Ｒe、Ｒf、Ｒgおよびｍはそれぞれ独立に、式（７）‐１中のＲa、Ｒc、Ｒe、Ｒf、Ｒgおよびｍと同義である。］
前記ＲeとＲfとは互いに結合することで、窒素原子を少なくとも１つ含む、構成原子数５または６の複素環基を形成してもよい。該複素環としては、例えば、γ−ブチロラクトン、β−ラクタム、γ−ラクタムが挙られ、特にγ−ブチロラクトンであることが好ましい。該複素環基は、置換基を有していてもよく、該置換基としては、例えば、窒素原子、酸素原子もしくは硫黄原子で置換されていてもよい炭素数１〜１２の炭化水素基、ヒドロキシル基、アミノ基、ピリジニル基、フリル基、またはチエニル基が挙げられる。このような化合物としては、例えば下記式（７）‐４で表される化合物が挙げられる。
【００５２】
【化１６】
2019088266.tif 000017
［式（７）‐４中、Ｒa〜Ｒd、Ｒgおよびｍはそれぞれ独立に、式（７）‐１中のＲa〜Ｒd、Ｒgおよびｍと同義である。］
なお、前記式（７）‐４で表される化合物には、下記式（３Ａ）のように共鳴構造を取るようなものや、下記式（３Ｂ）のようにイオン化したものも含まれる。
【００５３】
【化１７】
2019088266.tif 000018
＜６，テトラフェニルエチレン系凝集誘起発光性分子＞
前記テトラフェニルエチレン系凝集誘起発光性分子とは、テトラフェニルエチレン骨格を有する凝集誘起発光性分子のことをいい、例えば下記式（８）で表される化合物が挙げられる。
【００５４】
【化１８】
2019088266.tif 000019
前記式（８）中、ａ〜ｄはそれぞれ独立して、０〜５の整数である。ａ〜ｄ＝０、すなわち前記式（８）であらわされる化合物がテトラフェニルエチレンであることも好ましい。なお、ａ〜ｄが２以上の場合、複数のＲ1〜Ｒ4は同一であっても異なっていてもよく、複数のＲ1同士、Ｒ2同士、Ｒ3同士、またはＲ4同士が互いに結合して環を形成していてもよい。Ｒ1〜Ｒ4は、同一であっても異なっていてもよく、またＲ1とＲ2、Ｒ2とＲ4、Ｒ3とＲ4、Ｒ3とＲ1が縮合して飽和環、不飽和環、芳香族環を形成してもよい。
【００５５】
前記式（８）中、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ独立に、有機基、または有機金属基であり、好ましくは芳香環含有有機基であり、より好ましくは芳香族基であり、フェニル基、ナフチル基、アントラニル基、ピリジル基、ピリミジル基、トリアジニル基であることが特に好ましい。
【００５６】
前記式（８）で表される化合物の一例として、以下の化合物が挙げられる。
【００５７】
【化１９】
2019088266.tif 000020
また、テトラフェニルエチレン系凝集誘起発光性分子としては、式（８）で表される化合物において、分子中の任意の位置に、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基、亜リン酸基、水酸基、アミノ基、イソシアネート基、シリル基およびハロゲン原子を一つまたは複数個有する化合物を用いることも好ましい。
＜７．シロール系凝集誘起発光性分子＞
前記シロール系凝集誘起発光性分子とは、シロール環を有する凝集誘起発光性分子のことをいい、特に制限されないが、好ましくは下記式（２）で表される化合物である。なお、下記式（９）中の同じ符号で表される基は、それぞれ同一でも異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。
【００５８】
【化２０】
2019088266.tif 000021
前記ＲAは独立に、水素原子または炭素数１〜１２の炭化水素基であり、好ましくは水素原子または炭素数１〜６の炭化水素基であり、より好ましくは水素原子または炭素数１〜４の炭化水素基であり、さらに好ましくは水素原子である。
【００５９】
前記ａは独立に、１〜５の整数であり、好ましくは１または２である。
【００６０】
前記ＲBは独立に芳香環含有有機基等の有機基であり、該芳香環としては、ベンゼン環、ナフタレン環、ピロール環、イミダゾール環、イミダゾリン環、ピラゾール環、ピリジン環、ピラジン環、フラン環、チオフェン環、オキサゾール環、チアゾール環等が挙げられる。
【００６１】
前記ＲBは、少なくとも１つのベンゼン環を含むことが好ましく、フェニル基であることがより好ましい。
【００６２】
前記ＲCは、独立に有機基であり、好ましくは芳香環含有有機基または炭素数１〜２０の炭化水素基である。
【００６３】
該炭素数１〜２０の炭化水素基としては、炭素数１〜１２の炭化水素基が好ましい。
【００６４】
前記ＲCは、炭素数１〜１２の炭化水素基が好ましく、フェニル基または炭素数１〜１２のアルキル基であることがより好ましい。
【００６５】
前記ＲBおよびＲCにおける有機基は、炭素原子と水素原子のみからなる基であってもよく、窒素原子、酸素原子、硫黄原子またはケイ素原子などのヘテロ原子を含む基であってもよい。具体的には、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基、亜リン酸基、水酸基、アミノ基、イソシアネート基、シリル基およびハロゲン原子から選択される少なくとも一種を有していてもよい。
【００６６】
また、前記ＲBおよびＲCはそれぞれ結合して環を形成していてもよい。ＲBおよびＲCが環を形成した化合物としては例えば下記の化合物が挙げられる。
【００６７】
【化２１】
2019088266.tif 000022
【００６８】
【化２２】
2019088266.tif 000023
また、前記ＲA、ＲBおよびＲCの組み合わせとしては好ましい例としては以下のものが挙げられる。
【００６９】
【表１】
2019088266.tif 000024
前記シロール系凝集誘起発光性分子として好適に用いられる化合物の一例として、具体的には以下の化合物が挙げられる。
【００７０】
【化２３】
2019088266.tif 000025
前記式（９）で表される化合物は、シロール環にベンゼン環が２つ結合し、さらに、芳香環含有有機基を少なくとも２つ有する構造等であるため、凝集することにより、分子内回転が抑制され、発光が生じると考えられる。すなわち、前記式（９）で表される化合物は、シロール環にベンゼン環が２つ結合し、さらに、好ましくは芳香環含有有機基を少なくとも２つ有していれば特に制限されず、所望の用途に応じて、様々な基を導入することができる。例えば、分子中の任意の位置に、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基、亜リン酸基、水酸基、アミノ基、イソシアネート基、シリル基およびハロゲン原子から選択される少なくとも一種を、一つまたは複数個有することが好ましい。
【００７１】
前記式（９）で表される化合物はイオン化した構造をとるものも含む。例えば、前記ＲCが−Ｃ6Ｈ4−ＣＨ2−Ｎ（Ｃ2Ｈ5）2で表される基である場合、前記式（９）で表される化合物には、該部分が、−Ｃ6Ｈ4−ＣＨ2−Ｎ+（Ｃ2Ｈ5）2であるものも含まれる。
【００７２】
＜８．芳香環含有金属錯体系分子＞
前記芳香環含有金属錯体系分子とは、芳香環および金属錯体部を有する凝集誘起発光性分子である。金属錯体部を構成する金属原子としては、特に限定されないが、例えばＰｔ、Ｐｄ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｍｏ、Ｚｒ、Ｃｒ、Ｒｅ、Ｍｎ、Ｒｈ、Ｖ、Ｗ、Ｔｉ、Ｔａ、Ｎｂ、Ｉｒなどが挙げられる。
【００７３】
前記芳香環含有金属錯体系分子は、特に制限されないが、例えば下記の様なものを挙げることができる。
【００７４】
【化２４】
2019088266.tif 000026
＜９．ＢＯＤＩＰＹ系ホウ素イミン錯体凝集誘起発光性分子＞
前記ＢＯＤＩＰＹ系ホウ素イミン錯体凝集誘起発光性分子とは、ホウ素原子とイミン構造とを有する凝集誘起発光性分子のことをいい、特に制限されないが、下記式（１０）で表される化合物であることが好ましく、下記式（１０）−１および（１０）−２で表される化合物であることがさらに好ましい。
【００７５】
【化２５】
2019088266.tif 000027
【００７６】
【化２６】
2019088266.tif 000028
前記式（１０）、式（１０）−１、および（１０）−２中、Ｙは電子吸引性基または電子供与性基を表し、この置換基により、凝集誘起発光性分子の発光波長や強度といった蛍光特性が大きく変化する。前記式（１０）中、ＸはＳ、Ｏ、またはＮである。なお、式中Ｘ＝ＯまたはＳのとき、Ｒ4は存在しないことを留意する。
【００７７】
前記電子供与性基としては、例えば、メトキシ基、アルコキシ基、アミノ基アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアミノ基、アルキル基、メトキシ基部位を有する芳香族基が挙げられる。
【００７８】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立に水素原子、有機基または有機金属を表し、それぞれ同一であっても異なっても良く、互いに縮合して環構造を取っても良い。
【００７９】
前記ＢＯＤＩＰＹ系ホウ素イミン錯体凝集誘起発光性分子として好適に用いられる化合物の一例として、具体的には以下の化合物が挙げられる。
【００８０】
【化２７】
2019088266.tif 000029
前記凝集誘起発光性分子は、耐光性の観点から、環構造の形成に寄与しない炭素・炭素二重結合を有さないことが好ましい。言い換えると前記凝集誘起発光性分子は、耐光性の観点から、炭素・炭素二重結合は全て環構造の一部を形成していることが好ましい。
【００８１】
前記凝集誘起発光性分子は、市販品を用いてもよく、従来公知の方法、例えば、米国特許出願公開第２０１２／２９９４７４号明細書、米国特許出願公開第２０１３／１７７９９１号明細書、米国特許出願公開第２０１３／８９８８９号明細書、S. Kamino, et. Al., Chem. Commun., 2010, 46, 9013-9015に記載の方法で合成した化合物を用いてもよい。
【００８２】
前記凝集誘起発光性分子は発光波長や輝度などの蛍光特性を調整できるさらにメカノクロミック特性を有していてもよい。
【００８３】
凝集ナノ粒子の作製に用いられる凝集誘起発光性分子は、撮影される蛍光画像において所望の波長（色）の蛍光を発するものを選択することができる。蛍光標識の対象とする標的物質が２種類以上である場合は、それぞれに対応した異なる波長の蛍光を発する凝集誘起発光性分子の組み合わせを選択して凝集ナノ粒子を作製すればよい。そのような２種類以上の凝集誘起発光性分子を用いる場合は、発光波長のピークが互いに１００ｎｍ以上離れているものを選択することが好ましい。
【００８４】
＜凝集ナノ粒子＞
本発明の凝集ナノ粒子は、前記凝集誘起発光性分子の凝集により形成される粒子であり、粒子表面に親水基を有し、粒径変動係数が３０％以下である。
【００８５】
本発明の凝集ナノ粒子がその表面に有する親水基の種類は特に限定されないが、例えば−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）ＮＨ2、−Ｓ（＝Ｏ）2ＮＨ2、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）3、−Ｐ（＝Ｏ）Ｒ（ＯＨ）2、−Ｐ（＝Ｏ）Ｒ2（ＯＨ）、−Ｐ（ＯＨ）3、−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＨ2）3、−Ｐ（＝Ｏ）Ｒ（ＮＨ2）2、−Ｐ（＝Ｏ）Ｒ2（ＮＨ2）、−Ｐ（ＮＨ2）3、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＨＣＯＮＨ2、−ＮＨＣＯＮＨＲ、−ＮＨＣＯＯＨ、−Ｓｉ（ＯＨ）3、−Ｓｉ（Ｒ）（ＯＨ）2、−Ｓｉ（Ｒ）2ＯＨ、−Ｇｅ（ＯＨ）3、−Ｇｅ（Ｒ）（ＯＨ）2、−Ｇｅ（Ｒ）2ＯＨ、−Ｔｉ（ＯＨ）3、−Ｔｉ（Ｒ）（ＯＨ）2、−Ｔｉ（Ｒ）2ＯＨ、−Ｓｉ（ＮＨ2）3、−Ｓｉ（Ｒ）（ＮＨ2）2、−Ｂ（ＯＨ）2、−Ｏ−Ｂ（ＯＨ）2、−Ｂ（ＮＨ2）2、−ＮＨＢ（ＯＨ）2等が挙げられる。なお、前記Ｒはそれぞれ独立に水素または炭素数１〜１２のアルキル基を示す。
【００８６】
本発明の凝集ナノ粒子の製造方法としては特に制限は無いが、例えば任意の位置に事前に親水基が導入された凝集誘起発光性分子を任意の方法で凝集させてナノ粒子化することにより、表面に親水基を有する凝集ナノ粒子を作製することができる。また、親水基が導入されていない凝集誘起発光性分子を疎水性相互作用により凝集させてナノ粒子化させた後に化学合成法、分子間相互作用または錯形成によって粒子表面に親水基を導入する方法を用いてもよい。凝集ナノ粒子表面に親水基を導入する方法は特に限定はされないが、具体例としては、凝集誘起発光性分子を硫酸または、硝酸等の酸で処理する方法が挙げられる。
【００８７】
本発明の凝集ナノ粒子は、親水基を当該粒子表面に１個／ｎｍ2以上有することが好ましく、１．５個／ｎｍ2以上有することがより好ましい。また、親水基を当該粒子表面に６．０個／ｎｍ2以下有することが好ましく、４．５個／ｎｍ2以下有することがより好ましい。なお、前記親水基の数は、凝集ナノ粒子の表面積１ｎｍ2あたりの親水基の個数である。
【００８８】
前記親水基の導入量は、リファレンス試料と評価対象となる凝集誘起発光性分子に係るＳＴＥＭ−ＥＥＬＳＥ（走査透過型電子顕微鏡を用いた電子エネルギー損失分光法）によりそれぞれの電子エネルギー損失値を測定し、ランベルト・ベールの法則に基づいて算出することができる。
【００８９】
＜平均粒径および粒径変動係数＞
前記凝集ナノ粒子の粒径は、粒径が小さくなるほど比表面積が大きくなることで標的物質との結合力が高まること、粒子に含まれる全ての凝集誘起発光性分子を励起させることが可能となるという観点と、粒径と輝度とは相関するという観点から、平均粒径は１ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることが好ましく、１０ｎｍ以上７０ｎｍ以下であることが特に好ましい。凝集ナノ粒子の平均粒径は、その製造方法における条件を調節することにより、所望の範囲に収まるようにすることができる。
【００９０】
凝集ナノ粒子の粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて粒子の画像を撮影することで測定することができる。充分な数（例えば１００個）の集団に含まれる凝集ナノ粒子のそれぞれの粒径を測定し、その算術平均として平均粒径を算出する。
【００９１】
前記凝集ナノ粒子の粒径変動係数は、式：１００×粒径の標準偏差／平均粒径により算出される。粒径変動係数は小さいほど染色に用いた際の輝度ムラが抑えられ、染色結果における定量性が向上する。本発明に係る凝集ナノ粒子における粒径変動係数は３０％以下であることが好ましく、１５％以下であることがさらに好ましい。粒径変動係数の下限としては特に限定は無いが、通常は４％以上である。凝集ナノ粒子の平均粒径、粒径変動係数は、例えば製造方法に応じた製造条件を適宜調節することによって、所定の範囲に収めることができる。例えば、高希釈高回転数の貧溶媒の中に凝集誘起発光性分子の分散液を滴下する方法や、マイクロミキサーを用いて貧溶媒と凝集誘起発光性分子の分散液とを高速接触させる方法、記載の比較的粗大な凝集誘起発光性分子の結晶を貧溶媒中に分散させた分散液に対してレーザーアブレーションを行う方法（特開２００５−２３８３４２号公報）等で、粒径変動係数の小さい凝集ナノ粒子を製造することができる。
【００９２】
前記レーザーアブレーションを行う場合、レーザーとしては公知の各種レーザーを用いることができ、ＹＡＧレーザー、エキシマーレーザー、チタン−サファイヤレーザーなどが好ましく用いられる。照射レーザーとしては、パルス波を当てるのがよい。またより粒度分布のそろった凝集ナノ粒子を調製するためには、レーザーアプレーションを行う前の分散液の濃度を、０．１ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌに調整しておくことが好ましい。照射するパワー、パルス幅、波長、照射時間は、対象の凝集誘起発光性分子の結晶の種類や大きさ、貧溶媒との混合比により適宜調整することができ、より粒度分布のそろった凝集ナノ粒子を調製するためには、例えば、パワーは０．５〜５００ｍＪ／ｃｍ2、パルス幅は１〜１００フェムト秒、パルス幅は０．０１〜５００Ｈｚ、照射時間は０．５分〜５時間、の範囲で選択してレーザーを照射することが好ましい。
【００９３】
前記貧溶媒としては水、メタノール、エタノールなどのアルコール系溶媒、ペンタン、ヘキサン、ヘプタンなどの脂肪族系溶媒、ベンゼン、トルエンなどの芳香族系溶媒、またはこれら２種以上の混合溶媒を使用することができるが、これらには限定されない。前記レーザーアブレーション法は例えば、The Review of Laser Engineering, 33, 41-46に記載の方法でセットアップした装置で行うことができる。
【００９４】
前記凝集ナノ粒子は、その構成成分として凝集誘起発光性分子の他に、中心核を有していてもよい。中心核とは、後述するように凝集誘起発光性分子から前記凝集ナノ粒子を作製する際において、凝集誘起発光性分子が凝集して成長するための核となる物質である。
【００９５】
中心核として用いられる物質は、特に限定されず、例えばポリスチレン、ラテックス等の有機分子や、シリカ等の無機分子からなる微粒子が好適に用いられる。中心核の性質および大きさは、所望の凝集ナノ粒子の粒径や作製に用いられる凝集誘起発光性分子の性質にしたがって選択することができる。中心核としては、平均粒径が１ｎｍ以上２０ｎｍ以下であり、粒径変動係数が、５％以下のものが好ましい。中心核の平均粒径および粒径変動係数が前記範囲内であると、得られる凝集ナノ粒子の平均粒径および粒径変動係数を前述の範囲とすることが容易であるため好ましい。
【００９６】
前記凝集ナノ粒子は、その表面に非特異吸着防止分子を有していてもよい。凝集ナノ粒子と非特異吸着防止分子の結合様式は特に限定されないが、例えば、凝集ナノ粒子表面の親水性基を介して共有結合や静電相互作用で結合することができる。非特異吸着防止分子は特に限定されないが、例えば、ポリエチレングリコール等のポリマーであることが好ましい。
【００９７】
本発明の凝集ナノ粒子の形態、例えば、製造時、保存時、流通時の形態としては、特に限定されないが、例えばＰＢＳ等の公知の緩衝液を分散媒とする分散液の形態であることが好ましい。
【００９８】
＜蛍光標識材＞
本発明の一実施形態に係る蛍光標識材は、凝集ナノ粒子を含み、粒子表面に標的指向性リガンドを有する。凝集ナノ粒子と標的指向性リガンドとは、直接結合させてもよいし、リンカー等を介して結合させてもよい。また、凝集ナノ粒子の表面に公知の方法で結合基を導入することで標的指向性リガンドを結合させることもできる。前記結合基としては、例えば上述の凝集ナノ粒子が有する親水基を利用してもよい。
【００９９】
蛍光標識材の形態、例えば、製造時、保存時、流通時の形態としては、特に限定されないが、例えばＰＢＳ等の公知の緩衝液を分散媒とする分散液の形態であることが好ましい。本発明の一態様は、分散液の形態、すなわち、蛍光標識材分散液であり、該蛍光標識材分散液は、蛍光標識材と、緩衝液とを含む。
【０１００】
＜標的指向性リガンド＞
本発明において用いられる標的指向性リガンドは、標的物質を特異的に認識して結合する物質であり、例えば動物等から採取した組織や細胞に含まれる生体物質である目的生体物質を標的物質として、特異的に認識して結合する物質であることが好ましい。前記目的生体物質は特に限定されないが、例えばタンパク質、核酸、糖鎖、脂質等が挙げられる。目的生体物質は任意の疾患に関連している生体物質であることが好ましい。具体的には、例えばがん細胞特異的に発現するマーカータンパク質(例えば、がん特異的タンパク質、血管内皮細胞特異的タンパク質、リン酸化タンパク質など）、炎症誘発性タンパク質等、免疫関連タンパク質が挙げられる。
【０１０１】
例えば、目的生体物質が腫瘍組織やがん細胞において特異的に発現するタンパク質である場合、標的指向性リガンドとしてはこれらに対する抗体が好ましく選択される。目的生体物質が糖タンパク質の場合には、標的指向性分子としては、糖鎖と結合性を有するタンパク質（例えば、レクチン）などが好ましく選択される。
【０１０２】
その他の標的指向性分子としては、例えば、細胞小器官親和性物質、ペプチドなどが挙げられる。
【０１０３】
上記標的指向性リガンドとして抗体を選択する場合、通常はＩｇＧまたはＩｇＭであり、ＩｇＧが好ましく用いられる。抗体は、目的タンパク質または低次抗体を特異的に認識して結合する能力を有する限り、完全長のＩｇＧのような天然型の抗体であってもよいし、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')2、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体断片、あるいはそれらの抗体断片を用いて多機能化（多価化または多重特異性化）された人工抗体のような、非天然型の抗体であってもよい。抗原にユニークなエピトープを認識して結合する一次抗体が好ましく用いられる。標的指向性リガンドとして、一次抗体にユニークなエピトープを認識して結合する抗体である二次抗体を用いる場合にはあらかじめ目的生体物質に一次抗体を結合させたものを標的物質として用いる。
【０１０４】
標的指向性リガンドおよび凝集ナノ粒子表面との結合様式は特に限定されず、例えば共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着および化学吸着等を介して結合することができる。特に、凝集ナノ粒子表面に存在する前記親水基と、標的指向性リガンドの有する官能基とが共有結合することによって結合していることが好ましい。この場合において、凝集ナノ粒子表面の親水基は標的指向性リガンドとの結合によって失われるが、標的指向性リガンドの有する親水基によって補完されるため、本発明の蛍光標識材の表面は親水性であることに留意する。
【０１０５】
また、前記凝集ナノ粒子がその表面に非特異吸着分子を有するとき、標的指向性リガンドと結合するためのリンカーとして該非特異吸着防止分子を用いてもよい。このような目的で用いられる非特異吸着防止分子としては、ＭＰＣポリマー、およびＮＨＳもしくはマレイミド等の各種末端基を有するポリエチレングリコール誘導体等が挙げられる。
【０１０６】
＜凝集ナノ粒子の製造方法＞
本発明の凝集ナノ粒子は、凝集誘起発光性分子の溶液に、貧溶媒を接触させ、凝集誘起発光性分子を凝集させる工程（Ａ）を含むことが好ましく、前記工程（Ａ）が、中心核存在下で、凝集誘起発光性分子の溶液に、貧溶媒を接触させ、凝集誘起発光性分子を凝集させる工程であってもよい。前記工程（Ａ）以外の工程としては特に限定は無く、例えば凝集誘起発光性分子に親水基を導入する工程や、凝集ナノ粒子表面に親水基を導入する工程等が適宜行われる。中心核存在下で工程（Ａ）を行うことにより、凝集ナノ粒子の粒径変動係数や平均粒径をコントロールすることが容易になるため好ましい。中心核は、凝集誘起発光性分子の溶液中に予め混合されていてもよく、貧溶媒中に予め混合されていてもよい。
【０１０７】
本発明における凝集ナノ粒子は、凝集誘起発光性分子を溶解させることができる溶媒（良溶媒）を用い、凝集誘起発光性分子の溶液を調製した後に、凝集誘起発光性分子の溶液に、凝集誘起発光性分子の貧溶媒と混合することで凝集ナノ粒子を析出させる再沈殿法により調製することができる。このような再沈殿法を利用することで、凝集誘起発光性分子がより高密度に充填された粒子を作製することができる。具体的には、例えば、マイクロミキサーと呼ばれる内径の小さなミキサーを用いた再沈殿法であって、マイクロミキサーに凝集誘起発光性分子の良溶媒と貧溶媒とをポンプで送り込み、両者を急速かつ均一に混合することにより、微粒子を析出させる方法（流通法）が挙げられる。
【０１０８】
好適に用いることができるマイクロミキサーとしては、凝集誘起発光性分子の分溶液と貧溶媒とを混合する混合部の流路の内径（流路の断面が円形でない場合は、当該流路の断面積と同じ面積をもつ円の直径）が２ｍｍ以下であることが好ましく、溶液と貧溶媒をより急速に混合するためには、流路の内径が１ｍｍ以下であることが好ましい。また、微粒子による流路の閉塞を防止するため、および流路内部での圧力損失を低減するためには、流路の内径が０．０５ｍｍ以上であることが好ましい。
【０１０９】
本発明の良溶媒としては、凝集誘起発光性分子に対して良好な溶解性を示すものであれば特に限定されず、後述の貧溶媒との混合性がよいものを選択することが好ましい。具体的には、例えば、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン系溶媒、１−メチル−２−ピロリジノン、１，３−ジメチルイミダゾリノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどのアミド系溶媒、ジメチルスルホキシドなどの含硫黄系溶媒、またはこれら２種以上の混合溶媒を好適に使用することができる。また、凝集誘起発光性分子の再分散を防ぐという観点から、貧溶媒の沸点よりも低い沸点を有する良溶媒を使用することが好ましい。また、必要に応じて無機化合物や分散剤などを溶解させてもよい。
【０１１０】
本発明の貧溶媒としては、凝集誘起発光性分子に対して比較的溶解性が低いものであれば特に限定されず、前述の良溶媒との混合性がよいものを選択することが好ましい。例えば、水または水溶液が好ましく、メタノール、エタノールなどのアルコール系溶媒、ペンタン、ヘキサン、ヘプタンなどの脂肪族系溶媒、ベンゼン、トルエンなどの芳香族系溶媒、またはこれら２種以上の混合溶媒を使用することができるが、これらには限定されない。除去を容易にする観点から、沸点が良溶媒と比較的低い（例えば４０℃〜１２０℃）ものが好ましい。また、必要に応じて無機化合物などを溶解させてもよい。
【０１１１】
反応時間、反応温度の反応条件は、上述した条件を満たす凝集ナノ粒子が製造されるような条件であれば特に限定されないが、凝集誘起発光性を効率よくナノ粒子化するためには短時間内に急速に混合することが好ましく、例えば、レイノルズ数が４，０００以上であるような乱流条件であることが好ましい。
【０１１２】
＜蛍光標識材の製造方法＞
本発明の一実施形態としては、凝集ナノ粒子に標的指向性リガンドを結合させる工程を含む、蛍光標識材の製造方法が挙げられる。凝集ナノ粒子に標的指向性リガンドの結合方法は特に限定されず、したがって上記製造方法においては、凝集ナノ粒子と標的指向性リガンドとを直接反応させてもよいし、凝集ナノ粒子と標的指向性リガンドとを反応させる前に凝集ナノ粒子に任意の結合基を導入する工程を含んでいてもよい。また、凝集ナノ粒子に標的指向性リガンドを結合させる前に、凝集粒子表面に非特異吸着防止分子を結合させる、非特異吸着防止処理を行う工程を含んでいてもよい。
【実施例】
【０１１３】
以下、実施例に基づいて本発明の好適な態様をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
[作製例１]【０１１４】
＜凝集誘起性発光性分子の作製＞
親水基を持たない1,1,2,3,4,5-Hexaphenyl-1H-silole（以下、ＡＩＥ０と称する）０．１モルに対し、濃硝酸５ｍＬ、濃硫酸５ｍＬを加え１時間攪拌することでＡＩＥ０の有する芳香環にニトロ基を導入した。続いて、トルエン／水で分液精製した後、カラムクロマトグラフィーを用いて一分子中に、ニトロ基が１つ導入されたＡＩＥ０、２つ導入されたＡＩＥ０をそれぞれ分離し、分取した。【０１１５】
１０．１ｇのニトロ基が１つ導入されたＡＩＥ０に対し、スズ粉末０．１ｇおよび濃塩酸１０ｍＬを加えて１時間攪拌した。続いて、１規定水酸化ナトリウム水溶液５０ｍＬを加え、１０分間攪拌した。続いて、水／酢酸エチルで分液精製し、減圧乾燥させることで一分子中に１つのアミノ基を有するシロール系凝集誘起発光性分子（以下ＡＩＥ１と称する）を得た。【０１１６】
同様にニトロ基２つ導入されたＡＩＥ０から一分子中に２つのアミノ基を有するシロール系凝集誘起発光性分子（以下ＡＩＥ２と称する）を合成した。【０１１７】
また、1,2,3,4,5-Hexaphenyl-1H-siloleの代わりに tetraphenyletheneを用いて、ＡＩＥ１合成と同様の製造法によりアミノ基を１つ導入したtetraphenylethene（以下ＡＩＥ３と称する）を得た。なお、ＡＩＥ３は炭素―炭素２重結合に芳香環が結合したオレフィン骨格を有する。【０１１８】
Dalton Trans, 2013, 42, 3646-3652に記載の合成法により、シロール系凝集誘起発光性分子を作製した（以下、ＡＩＥ４と称する）。【０１１９】
Macromolecules 2009, 42, 1418-1420に記載の合成法によりカルボラン系凝集誘起発光性分子を作製した（以下、ＡＩＥ５と称する）。【０１２０】
New J. Chem., 2007, 31, 2076-2082に記載の合成法によりベンゾフロ・オキサゾロ・カルバゾール系凝集誘起発光性分子を作製した（以下、ＡＩＥ６と称する）。【０１２１】
Chem.Lett.2012, 41, 1445-1447に記載の合成法によりマレイミド系凝集誘起発光性分子を作製した（以下、ＡＩＥ７と称する）。【０１２２】
Organometallics, 2016, 35 (14), pp 2327-2332に記載の合成法によりシロール系凝集誘起発光性分子を作製した（以下、ＡＩＥ８と称する）。【０１２３】
Chem. Eur. J, 2013, 19, 4506-4512に記載の合成法によりＢＯＤＩＰＹ系ホウ素イミン錯体凝集誘起発光性分子を作製した（以下、ＡＩＥ９と称する）。【０１２４】
前記ＡＩＥ１〜ＡＩＥ９はそれぞれ以下の構造を有する。【０１２５】
【化２８】
2019088266.tif 000030
[作製例２]
＜ビオチン修飾した２次抗体＞
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）に抗ウサギＩｇＧ抗体１００μｇを溶解した。該溶液に最終濃度が３ｍＭとなるようにＤＴＴ（Dithiothretol）溶液を混合した。その後、該溶液を３７℃で３０分間反応させ、脱塩カラムを用いて還元型２次抗体を精製した。精製した溶液全量のうち２００μＬを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）に溶解して抗体溶液を得た。その一方で、スペーサーの長さが３０Åであるリンカー試薬「(+)-Biotin-PEG6-NH-Mal」（ＰｕｒｅＰＥＧ社、製品番号2461006-250）をＤＭＳＯを用いて０．４ｍＭとなるように調製した。この溶液８．５μＬを前記抗体溶液に添加し、混和して３７℃で３０分間反応させた。【０１２６】
この反応溶液を脱塩カラム（Zaba Spin Desalt Spin Columuns」（サーモサイエンティフィック社、89882）を用いて精製した。脱塩した反応溶液の波長３００ｎｍの吸収を分光光度計（日立社「F-7000」）により計測することで反応溶液に含まれるたんぱく質の量を算出した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ溶液により反応溶液を２５０μｇ／ｍＬに調整してビオチン修飾２次抗体の溶液とした。
［実施例１］
＜凝集ナノ粒子１＞
作製例１で作製した、ＡＩＥ１を１ｍＭになるようにテトラヒドロフランに溶解したものを調整した。内径０．１５ｍｍの流路を備えるステンレス製Ｔ字型マイクロミキサー（ＭＴ１ＸＣＳ６、Ｖａｌｃｏ社製）に、ポンプ（ＰＵ−１５８０、日本分光株式会社）を用いて流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで前記溶液を送液し、さらに別のポンプ（ＮＳ−ＫＸ−５００、日本精密科学株式会社）を用いて、流速７４．０ｍＬ／ｍｉｎで超純水を送液することで、マイクロミキサー内で両液を混合してＡＩＥ１の粒子を析出させた。混合時の圧力は４〜５ＭＰａであり、ＡＩＥ１の粒子による流路の閉塞は生じなかった。混合時のレイノルズ数は、約１２，０００と計算された。【０１２７】
得られた粒子０．１ｇと硝酸１０ｍＬを混合し、５０℃で１時間攪拌して粒子表面の親水化処理を行い、続いて遠心分離機を用いて１００００ｒｐｍで３０分処理して上澄みを除去して洗浄することで凝集ナノ粒子１を得た。【０１２８】
得られた凝集ナノ粒子１について、ＴＥＭで任意の１００個の粒子を観察し、平均粒径を求め、式；100×(粒子の標準偏差/平均粒子径)に基づいて粒径変動係数（ＣＶ）を算出した。【０１２９】
得られた凝集ナノ粒子１について、以下の方法で粒子表面への親水基の導入量［個／ｎｍ2］を算出した。【０１３０】
表面に３個／ｎｍ2の親水基を有するリファレンス試料溶液（１００μＭ、１００μＬ）を、φ３ｍｍのＴＥＭ用グリッド内に滴下し、均一に乾燥させてＳＴＥＭ−ＥＥＬＳＥ測定により損失値を測定した。このときの親水基またはリガンドに吸収に由来する波長におけるＳＴＥＭ−ＥＥＬＳＥ測定の損失値を、リファレンス値とした。【０１３１】
凝集ナノ粒子１についてＳＴＥＭ−ＥＥＬＳＥ測定により、粒子表面の１ｎｍ2の領域を指定し、損失値を測定した。ランベルト・ベール則より、凝集誘起発光性分子１ｎｍ2の損失値とリファレンスの損失値をもとに、親水基の導入量［個／ｎｍ2］を算出した。【０１３２】
各実施例および比較例で得られた凝集ナノ粒子１〜２１についても同様の方法で粒径変動係数および親水基の導入量を算出した。
＜蛍光標識材１＞
凝集ナノ粒子１を、ＥＤＴＡを２ｍＭ含むＰＢＳを用いて３ｎＭに調整した分散液に、最終濃度が１０ｍＭとなるようにＳＭ（ＰＥＧ）１２（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｏｄｅｃａｎｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ；サーモサイエンティフィック社）を混合し、５℃で１時間反応させた。【０１３３】
この分散液について、１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離処理を行った後に上澄みを除去した後にＥＤＴＡを２ｍＭ含有したリン酸バッファに加えて沈殿物を分散させて、再度遠心分離を行った。同様の操作を３回行うことで、マレイミド基で修飾された凝集ナノ粒子１を得た。【０１３４】
１ｍｇ／ｍＬに調整したストレプトアビジン４０μＬを２１０μＬのボレートバッファに加えた後、６４ｍｇ／ｍＬに調整した２−イミノチオラン塩酸塩（シグマアルドリッチ社製）７０μＬを加え、室温で１時間反応させることで、ストレプトアビジンのアミノ基にチオール基を導入した。このストレプトアビジン溶液をゲルろ過カラム（Zaba Spin Desalting Columuns、フナコシ社）により脱塩することで、表面にアミノ化を有する凝集ナノ粒子１に結合可能なストレプトアビジンを作製した。【０１３５】
このストレプトアビジン０．０４ｍｇとＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを用いて、上記０．６７ｎＭに調整した表面にアミノ化を有する凝集ナノ粒子１、７４０μＬと混合し、室温で１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムで未反応のストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジン結合凝集ナノ粒子である蛍光標識材１を得た。【０１３６】
［実施例２］
＜凝集ナノ粒子２＞
ＡＩＥ１をＡＩＥ２に変更する以外は凝集ナノ粒子１と同様の手法で、凝集ナノ粒子２を得た。
＜蛍光標識材２＞
凝集ナノ粒子１を凝集ナノ粒子２に変更する以外は、蛍光標識材１と同様の手法で、蛍光標識材２を得た。【０１３７】
［実施例３］
＜凝集ナノ粒子３＞
１０ｗ％に調整した凝集ナノ粒子２の水分散液１ｍLと硫酸１０ｍＬを混合し、５０℃で１時間攪拌して粒子表面の親水化処理を行い、続いて遠心分離機を用いて１００００ｒｐｍで３０分処理して上澄みを除去して洗浄することで凝集ナノ粒子３を得た。
＜蛍光標識材３＞
凝集ナノ粒子１を凝集ナノ粒子３に変更する以外は、蛍光標識材１と同様の手法で、蛍光標識材３を得た。【０１３８】
［実施例４］
＜凝集ナノ粒子４＞
硫酸での処理時間を３時間にする以外は凝集ナノ粒子３と同様の手法で、凝集ナノ粒子４を得た。
＜蛍光標識材４＞
凝集ナノ粒子１を凝集ナノ粒子４に変更する以外は、蛍光標識材１と同様の手法で、蛍光標識材４を得た。【０１３９】
［実施例５］
＜凝集ナノ粒子５＞
超純水をマイクロミキサーの流路内に送液する際の流速を４０．０ｍＬ／ｍｉｎに変更する以外は凝集ナノ粒子３と同様の手法で、凝集ナノ粒子５を得た。
＜蛍光標識材５＞
凝集ナノ粒子１を凝集ナノ粒子５に変更する以外は、蛍光標識材１と同様の手法で、蛍光標識材５を得た。【０１４０】
［実施例６］
＜凝集ナノ粒子６＞
マイクロミキサーの流路内に送液するＡＩＥ２のテトラヒドロフラン溶液濃度を０．１ｍＭに変更する以外は凝集ナノ粒子３と同様の手法で、凝集ナノ粒子６を得た。
＜蛍光標識材６＞
凝集ナノ粒子１を凝集ナノ粒子６に変更する以外は、蛍光標識材１と同様の手法で、蛍光標識材６を得た。【０１４１】
［実施例７］
＜凝集ナノ粒子７＞
マイクロミキサーの流路内に送液するＡＩＥ２のテトラヒドロフラン溶液濃度を３ｍＭに変更する以外は凝集ナノ粒子３と同様の手法で、凝集ナノ粒子７を得た。
＜蛍光標識材７＞
凝集ナノ粒子１を凝集ナノ粒子７に変更する以外は、蛍光標識材１と同様の手法で、蛍光標識材７を得た。【０１４２】
［実施例８］
＜凝集ナノ粒子８＞
マイクロミキサーの流路内に送液するＡＩＥ２のテトラヒドロフラン溶液濃度を０．０７ｍＭに変更する以外は凝集ナノ粒子３と同様の手法で、凝集ナノ粒子８を得た。
＜蛍光標識材８＞
凝集ナノ粒子１を凝集ナノ粒子８に変更する以外は、蛍光標識材１と同様の手法で、蛍光標識材８を得た。【０１４３】
［実施例９］
＜凝集ナノ粒子９＞
マイクロミキサーの流路内に送液するＡＩＥ２のテトラヒドロフラン溶液濃度を６ｍＭに変更する以外は凝集ナノ粒子３と同様の手法で、凝集ナノ粒子９を得た。
＜蛍光標識材９＞
凝集ナノ粒子１を凝集ナノ粒子９に変更する以外は、蛍光標識材１と同様の手法で、蛍光標識材９を得た。【０１４４】
［実施例１０］
＜凝集ナノ粒子１０＞
ＡＩＥ２を０．１ｍＭになるようにテトラヒドロフランに溶解したものを調整した。続いて調整したＡＩＥ２溶液を、高速撹拌造粒機（ＳＰＧ−２５ＴＧ、ＤＡＬＴＯＮ社製）を用いて、１０００ｒｐｍで撹拌させている貧溶媒の水１０００ｍＬに１分間に１ｍＬのペースで５０ｍＬ滴下させ、さらに１０００ｒｐｍでの撹拌を３０分継続することにより凝集ナノ粒子１０を得た。
＜蛍光標識材１０＞
凝集ナノ粒子１を凝集ナノ粒子１０に変更する以外は、蛍光標識材１と同様の手法で、蛍光標識材１０を得た。【０１４５】
［実施例１１］
＜凝集ナノ粒子１１＞
マイクロミキサーを用いて１ｍＭに調整したＡＩＥ２のテトラヒドロフラン溶液と水とを混合する際に、中心核として平均粒径３ｎｍの酸化ジルコニア粒子分散液（ＳＺＲ−Ｍ、堺化学工業株式会社）２ｍＬを加える以外は凝集ナノ粒子３と同様の手法で、凝集ナノ粒子１１を得た。
＜蛍光標識材１１＞
凝集ナノ粒子１を凝集ナノ粒子１１に変更する以外は、蛍光標識材１と同様の手法で、蛍光標識材１１を得た。【０１４６】
［実施例１２］
＜凝集ナノ粒子１２＞
ＡＩＥ１をＡＩＥ３に変更する以外は凝集ナノ粒子３と同様の手法で、凝集ナノ粒子１２を得た。
＜蛍光標識材１２＞
凝集ナノ粒子１を凝集ナノ粒子１２に変更する以外は、蛍光標識材１と同様の手法で、蛍光標識材１２を得た。【０１４７】
［比較例１］
＜凝集ナノ粒子１３＞
米国特許出願公開第２０１３／０８９８８９号明細書に記載のとおり、メタノール：ＴＨＦ＝１：１溶媒にＡＩＥ２を１００ｍｇ、完全に溶解させた後、冷暗所にて３日間再結晶させることにより凝集ナノ粒子１３を得た。
＜蛍光標識材１３＞
凝集ナノ粒子１を凝集ナノ粒子１３に変更する以外は、蛍光標識材１と同様の手法で、蛍光標識材１３を得た。【０１４８】
［比較例２］
＜凝集ナノ粒子１４＞
ＡＩＥ１をＡＩＥ０に変更し、さらに粒子表面の親水化処理を行わない以外は凝集ナノ粒子３と同様の手法で、凝集ナノ粒子１４を得た。
＜蛍光標識材１４＞
凝集ナノ粒子１を凝集ナノ粒子１４に変更する以外は、蛍光標識材１と同様の手法で、蛍光標識材１４を得た。【０１４９】
［実施例１３］
＜凝集ナノ粒子１５＞
ＡＩＥ１をＡＩＥ４に変更する以外は凝集ナノ粒子３と同様の手法で、凝集ナノ粒子１５を得た。
＜蛍光標識材１５＞
ナトリウムアミドによる芳香族スルホ著酸塩のアミノ化反応（日本化学会誌1974，（8），P・1522, 奈良ら）を参考に、凝集ナノ粒子１５を１００ｍｇ、ナトリウムアミドを３０ｍｇ、２８ｗ％アンモニア水を０．５ｍL、水を５ｍL加え、６０℃で４時間反応させることで、粒子表面のスルホン酸基をアミノ基に置換した。続いて純水を用いてYM-1００（ミリポア社製）で限外ろ過で精製を行った。精製後の凝集ナノ粒子１５を用いて、蛍光標識材１と同様の手法でストレプトアビジンを導入し、蛍光標識材１５を得た。【０１５０】
［実施例１４］
＜凝集ナノ粒子１６＞
ＡＩＥ１をＡＩＥ５に変更する以外は凝集ナノ粒子３と同様の手法で、凝集ナノ粒子１６を得た。
＜蛍光標識材１６＞
凝集ナノ粒子１を凝集ナノ粒子１６に変更する以外は蛍光標識材１と同様の手法で蛍光標識材１６を得た。【０１５１】
［実施例１５］
＜凝集ナノ粒子１７＞
ＡＩＥ１をＡＩＥ６に変更する以外は凝集ナノ粒子３と同様の手法で、凝集ナノ粒子１７を得た。
＜蛍光標識材１７＞
凝集ナノ粒子１５を凝集ナノ粒子１７に変更する以外は蛍光標識材１５と同様の手法で蛍光標識材１７を得た。【０１５２】
［実施例１６］
＜凝集ナノ粒子１８＞
ＡＩＥ１をＡＩＥ７に変更する以外は凝集ナノ粒子３と同様の手法で、凝集ナノ粒子１８を得た。
＜蛍光標識材１８＞
凝集ナノ粒子１５を凝集ナノ粒子１８に変更する以外は蛍光標識材１５と同様の手法で蛍光標識材１８を得た。【０１５３】
［実施例１７］
＜凝集ナノ粒子１９＞
ＡＩＥ１をＡＩＥ８に変更する以外は凝集ナノ粒子３と同様の手法で、凝集ナノ粒子１９を得た。
＜蛍光標識材１９＞
凝集ナノ粒子１５を凝集ナノ粒子１９に変更する以外は蛍光標識材１５と同様の手法で蛍光標識材１９を得た。【０１５４】
［実施例１８］
＜凝集ナノ粒子２０＞
ＡＩＥ１をＡＩＥ９に変更する以外は凝集ナノ粒子３と同様の手法で、凝集ナノ粒子２０を得た。
＜蛍光標識材２０＞
凝集ナノ粒子１５を凝集ナノ粒子２０に変更する以外は蛍光標識材１５と同様の手法で蛍光標識材２０を得た。【０１５５】
［実施例１９］
＜凝集ナノ粒子２１＞
凝集ナノ粒子３を実施例１９においては凝集ナノ粒子２１とした。
＜蛍光標識材２１＞
抗ＰＤ−Ｌ１ウサギモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社；Ｎｏ．Ｅ１Ｌ３Ｎ）１００μｇをＰＢＳ１００μＬに溶解させた。この抗体溶液に１Ｍの２−メルカプトエタノールを０．００２ｍＬ（０．２×１０-5モル）添加して、ｐＨ８．５、室温で３０分間反応させた反応液をゲル濾過カラムに通し、過剰の２−メルカプトエタノールを除去することで、チオール化した抗ＰＤ−Ｌ１ウサギモノクローナル抗体の溶液を得た。【０１５６】
凝集ナノ粒子１を凝集ナノ粒子２１に換えた以外は、実施例１と同様の手法で、マレイミド基で修飾された凝集ナノ粒子２１を得た。マレイミド基で修飾された凝集ナノ粒子１をマレイミド基で修飾された凝集ナノ粒子２１に換えて、さらにストレプトアビジンに換えて、チオール化した抗ＰＤ−Ｌ１ウサギモノクローナル抗体を用いる以外は実施例１と同様の手法で、抗ＰＤ−Ｌ１ウサギモノクローナル抗体結合凝集ナノ粒子である蛍光標識材２１を得た。【０１５７】
［実施例２０］
＜凝集ナノ粒子２２＞
ＡＩＥ２を１００ｍｇ／Ｌとなるようにメタノールで調製し、超音波処理を３分行うことでＡＩＥ２の分散液を得た。続いて、分散液を透明な石英容器に入れ、チタンサファイアレーザー（ＴｉＦ−１００、東京インスツルメンツ社製）を用いて、１００ｍＪ／ｃｍ2、パルス幅１００フェムト秒、照射時間２０分間の条件で、分散液にレーザー照射を行い、凝集ナノ粒子２２を得た。
＜蛍光標識材２１＞
凝集ナノ粒子１を凝集ナノ粒子２２に変更する以外は、蛍光標識材１と同様の手法で、蛍光標識材２１を得た。【０１５８】
[評価１]
（継時的輝度変化）
凝集ナノ粒子１〜２０を、粒子モル濃度が０．０１ｍｍｏｌ／ＬになるようにＰＢＳ中に分散させた分散液をそれぞれ調製した。蛍光光度計（日立ハイテクノロジーズ社；Ｆ−７０００）を用いて、調整直後の分散液および室温で７日間保管した後の分散液輝度を励起波長４５０ｎｍ、蛍光極大波長６３０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。以下の基準で経時的輝度の変化の評価を行った。
ＡＡ：「室温で７日間保管後の輝度」/「分散液調整直後の輝度」が、９５％以上
ＢＢ：「室温で７日間保管後の輝度」/「分散液調整直後の輝度」が、８０％以上、９５％未満
ＣＣ：「室温で７日間保管後の輝度」/「分散液調整直後の輝度」が、７０％以上、８０％未満
ＤＤ：「室温で７日間保管後の輝度」 / 「分散液作製後すぐの輝度」が、７０％未満【０１５９】
［実験例］
（前処理）
上記実施例および比較例で作製した蛍光標識材１〜２１について評価を行うため組織アレイスライド（コスモバイオ社；ＣＢ−Ａ７１２）を用いた蛍光染色を行った。脱パラフィン処理した組織アレイスライドを水で洗浄し、１０ｍＭクエン酸バッファ液中（ｐH６．０）１２１℃で１５分間オートクレーブ処理することで、賦活化処理を行った。賦活化処理後の組織アレイスライドをリン酸バッファにより洗浄し、ＢＳＡを１％含んだリン酸バッファを用いて１時間ブロッキング処理を行った。【０１６０】
（染色：蛍光標識材１〜２０）
ＢＳＡを１％含んだＰＢＳを用いて抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（ベンタナ社製；４Ｂ５を０．０５ｎＭに調整し、上記ブロッキング処理した組織アレイスライドに対して４℃で１晩反応させた。反応後の組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した後、ＢＳＡを１％含んだＰＢＳを用いて６μｇ／ｍLに希釈した、作製例２で作製したビオチン修飾した２次抗体と室温３０分間反応させた。２次抗体と反応後の組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した後、ＢＳＡを１％含んだＰＢＳを用いて０．０２ｎＭに希釈した蛍光標識材１〜２０とそれぞれ中性環境（ｐＨ６．９〜７．４）室温条件下で３時間反応させた。反応後の各組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した。【０１６１】
（染色：蛍光標識材２１）
ＢＳＡを１％含んだＰＢＳを用いて０．０２ｎＭに希釈した蛍光標識材１５と上記ブロッキング処理した組織アレイスライドとを、中性環境（ｐＨ６．９〜７．４）室温条件下で３時間反応させた。反応後の各組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した。【０１６２】
（後処理・輝度観察）
上記染色後の各組織アレイスライドに対し、純エタノールに５分間浸漬する操作を４回繰り返し、洗浄・脱水を行った。続いてキシレンに５分間浸漬する操作を４回行い、透徹を行った。最後に封入剤（メルク社製、エンテランニュー）を用いて封入処理を行うことで、観察用の組織アレイスライドとした。【０１６３】
封入処理を終えた各組織アレイスライドに対し、蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＤＰ７３）により励起光の照射、蛍光の発光の観察および撮像を行った。この際、励起光の波長は、蛍光顕微鏡が備える励起光用光学フィルターを用いて５７５〜６００ｎｍに設定し、観察する蛍光の波長は、蛍光用光学フィルターを用いて６１２〜６９２ｎｍに設定した。【０１６４】
蛍光顕微鏡による観察および画像撮影時の励起光の強度は、視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ2となるようにした。画像撮影時の露光時間は、画像の輝度が飽和しないような範囲で調節し、例えば４０００μ秒に設定した。【０１６５】
撮影は４００倍で行い、得られた画像は画像処理ソフトウェア「ＩｍａｇｅＪ」（オープンソース）を用いて画像処理を行った。ImageJの処理メニューであるＦｉｎｄ  Ｍａｘｉｍａ（極大点の検出）により１００細胞の輝点数を計測し、その平均値を算出した。【０１６６】
輝度は、取得した画像において１粒子領域を指定して計算した。さらに１００個の粒子の輝点について、平均値および標準偏差を算出した。【０１６７】
[評価２]
（耐光性）
実験例で作製した観察用組織アレイスライドに、３６５ｎｍ、８ＷのＵＶランプを１時間照射し、照射前後における１輝点あたりの輝度平均値を求め、照射前の輝度平均値に対する照射後の輝度平均値の低下率を算出し、以下の基準で耐光性の評価を行った。
ＡＡ：UVランプ照射後の輝度平均値低下が、５％未満
ＢＢ：UVランプ照射後の粒子の輝度平均値低下が、５％以上、１０％未満
ＣＣ：UVランプ照射後の粒子の輝度平均値低下が、１０％以上、１５％未満
ＤＤ：UVランプ照射後の粒子の輝度平均値低下が、１５％以上【０１６８】
[評価３]
（輝度ムラ）
実験例で作製した観察用組織アレイスライドについて取得した画像において、１００個の粒子の輝点について標準偏差を求め以下の基準で評価することで、輝度ムラを評価した。
ＡＡ：１００個の輝点輝度の標準偏差が、１０％未満
ＢＢ：１００個の輝点輝度の標準偏差が、１０％以上、２０％未満
ＣＣ：１００個の輝点輝度の標準偏差が、２０％以上、３０％未満
ＤＤ：１００個の輝点輝度の標準偏差が、３０％以上
各凝集ナノ粒子および蛍光標識体について、下記表２に示す。【０１６９】
【表２】
2019088266.tif 000031
【国際調査報告】
2019088266.tif 000032
2019088266.tif 000033
2019088266.tif 000034
2019088266.tif 000035