(57)【要約】イミン誘導体を立体選択的に還元する新規な酵素を単離精製し、該酵素をコードするポリヌクレオチドをクローニングした。イミン誘導体に、当該化合物を立体選択的に還元しうる能力を有する微生物の培養物、菌体またはその処理物及もしくはイミン還元酵素を作用させ、生成する光学活性なアミン誘導体を回収することにより、光学活性なアミン誘導体を製造する。本発明によって、たとえば下記式（ＩＶ）で示される光学活性な化合物を製造することができる。式（ＩＶ）【化１】2010024444.tif 000037（式中、Ｒ基は炭素数１〜３個のアルキル基を、ｎは、１〜４の整数を表す）
2010024444.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（１）−（５）に示す理化学的性状を有する、イミン還元酵素；
（１）作用：還元型ニコチナミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと略す）依存的に、２−メチル−１−ピロリンを還元し、（Ｒ）−２−メチルピロリジンを生成する；、および
（２）補酵素依存性：ＮＡＤＰＨを補酵素として利用する。
（３）至適ｐＨ：６．０−７．０
（４）至適温度：４０−５５℃
（５）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）が約３２，０００、ゲルろ過による分子量が６５，０００〜７０，０００。
【請求項２】
ストレプトマイセス属に属する微生物に由来する、請求項１に記載のイミン還元酵素。
【請求項３】
ストレプトマイセス属に属する微生物が、下記の群から選択されるいずれかの微生物であることを特徴とする、請求項２に記載のイミン還元酵素；
ストレプトマイセス・エスピー NITE  BP-594（Streptomyces sp. NITE  BP-594）、
ストレプトマイセス・エスピー NITE  BP-595（Streptomyces sp. NITE  BP-595）、
ストレプトマイセス・エスピー NITE  BP-596（Streptomyces sp. NITE  BP-596）、および
ストレプトマイセス・エスピー NITE  BP-597（Streptomyces sp. NITE  BP-597）。
【請求項４】
ストレプトマイセス属に属する微生物が、下記の群から選択されるいずれかの微生物であることを特徴とする請求項２に記載のイミン還元酵素；
ストレプトマイセス・グリセオルビギノサス (Streptomyces griseorubiginosus)、
ストレプトマイセス・マイクロフラバス(Streptomyces microflavus) 、および
ストレプトマイセス・アルボビリディス (Streptomyces alboviridis)。
【請求項５】
ストレプトマイセス・グリセオルビギノサス (Streptomyces griseorubiginosus)、
ストレプトマイセス・マイクロフラバス(Streptomyces microflavus) 、および
ストレプトマイセス・アルボビリディス (Streptomyces alboviridis)が、それぞれ以下の菌株である請求項４に記載のイミン還元酵素；
ストレプトマイセス・グリセオルビギノサス (Streptomyces griseorubiginosus) NBRC 13047、
ストレプトマイセス・マイクロフラバス (Streptomyces microflavus) NBRC 13062、および
ストレプトマイセス・アルボビリディス (Streptomyces alboviridis) NBRC 13013。
【請求項６】
請求項１の（１）および（２）に示す理化学的性状を有し、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる、イミン還元酵素。
（ａ）配列番号：５に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：５に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列と８０%以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１の（１）および（２）に示す理化学的性状を有し、かつ少なくとも８０％ｅｅ以上の（Ｒ）−２−メチルピロリジンを生成する機能を有するタンパク質であって、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含む、イミン還元酵素。
（ａ）配列番号：１６に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１６に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：１７に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
式（Ｉ）で示されるイミン誘導体に、当該化合物を立体選択的に還元する能力を有する微生物の培養物、菌体、およびその処理物からなる群から選択される、少なくとも一つの酵素活性物質を接触させる工程と、式（ＩＩ）で示される光学活性なＲ体のアミン誘導体を回収する工程を含む、光学活性なＲ体のアミン誘導体の製造方法。
式（Ｉ）
【化１】
2010024444.tif 000029
式（ＩＩ）
【化２】
2010024444.tif 000030
（式中、Ｒ１、Ｒ２基は炭素数１〜３個のアルキル基を、Ｒ３基は、炭素数１〜３個のアルキル基もしくは水素を表し、Ｒ１とＲ３は環を巻いていてもよい）
【請求項９】
式（Ｉ）の化合物が下記式（ＩＩＩ）で表されるイミン誘導体であり、式（ＩＩ）の化合物が式（ＩＶ）で表されるアミン誘導体である、請求項８に記載の方法。
式（ＩＩＩ）
【化３】
2010024444.tif 000031
式（ＩＶ）
【化４】
2010024444.tif 000032
（式中、Ｒ基は炭素数１〜３個のアルキル基を、ｎは、１〜４の整数を表す）
【請求項１０】
式（ＩＩＩ）の化合物が２−メチル−１−ピロリンであり、式（ＩＶ）で表される化合物が、２−メチルピロリジンである、請求項９に記載の光学活性なＲ体のアミン誘導体の製造方法。
【請求項１１】
微生物が、ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物であることを特徴とする、請求項８から１０のいずれか一項に記載の光学活性なＲ体のアミン誘導体の製造方法。
【請求項１２】
ストレプトマイセス属に属する微生物が、下記の群から選択されるいずれかの微生物であることを特徴とする、請求項１１に記載の光学活性なＲ体のアミン誘導体の製造方法；
ストレプトマイセス・エスピー NITE  BP-594（Streptomyces sp. NITE  BP-594）、
ストレプトマイセス・エスピー NITE  BP-595（Streptomyces sp. NITE  BP-595）、
ストレプトマイセス・エスピー NITE  BP-596（Streptomyces sp. NITE  BP-596）、および
ストレプトマイセス・エスピー NITE  BP-597（Streptomyces sp. NITE  BP-597）。
【請求項１３】
ストレプトマイセス属に属する微生物が、下記の群から選択されるいずれかの微生物であることを特徴とする、請求項１１に記載の光学活性なＲ体のアミン誘導体の製造方法；
ストレプトマイセス・グリセオルビギノサス (Streptomyces griseorubiginosus)、
ストレプトマイセス・マイクロフラバス(Streptomyces microflavus) 、および
ストレプトマイセス・アルボビリディス (Streptomyces alboviridis)。
【請求項１４】
ストレプトマイセス・グリセオルビギノサス (Streptomyces griseorubiginosus)、
ストレプトマイセス・マイクロフラバス(Streptomyces microflavus)、および
ストレプトマイセス・アルボビリディス (Streptomyces alboviridis)が、それぞれ以下の菌株である、請求項１３に記載の光学活性なＲ体のアミン誘導体の製造方法；
ストレプトマイセス・グリセオルビギノサス (Streptomyces griseorubiginosus) NBRC 13047、
ストレプトマイセス・マイクロフラバス (Streptomyces microflavus) NBRC 13062、および
ストレプトマイセス・アルボビリディス (Streptomyces alboviridis) NBRC 13013。
【請求項１５】
式（I）で示されるイミン誘導体に請求項１〜７のいずれかに記載のイミン還元酵素、当該イミン還元酵素を生産する微生物、およびその処理物からなる群から選択される、少なくとも一つの酵素活性物質を接触させる工程と、式（ＩＩ）で示される光学活性なＲ体のアミン誘導体を回収する工程を含む、光学活性なＲ体のアミン誘導体の製造方法。
式（Ｉ）
【化５】
2010024444.tif 000033
式（ＩＩ）
【化６】
2010024444.tif 000034
（式中、Ｒ１、Ｒ２基は炭素数１〜３個のアルキル基を、Ｒ３基は、炭素数１〜３個のアルキル基もしくは水素を表し、Ｒ１とＲ３は環を巻いていてもよい）
【請求項１６】
式（Ｉ）の化合物が下記式（ＩＩＩ）で表されるイミン誘導体であり、式（ＩＩ）の化合物が式（ＩＶ）で表されるアミン誘導体である請求項１５に記載の方法。
式（ＩＩＩ）
【化７】
2010024444.tif 000035
式（ＩＶ）
【化８】
2010024444.tif 000036
（式中、Ｒ基は炭素数１〜３個のアルキル基を、ｎは、１〜４の整数を表す）
【請求項１７】
請求項１の（１）および（２）に示す理化学的性状を有するイミン還元酵素をコードする、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：５に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：５に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１の（１）および（２）に示す理化学的性状を有し、かつ少なくとも８０％ｅｅ以上の（Ｒ）−２−メチルピロリジンを生成する機能を有するイミン還元酵素をコードする、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１６に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１６に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：１７に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載されたポリヌクレオチドが挿入された組換えベクター。
【請求項２０】
更に、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を補酵素とする酸化還元反応を触媒することができる脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入された、請求項１９に記載された組換えベクター。
【請求項２１】
脱水素酵素がグルコース脱水素酵素である、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
グルコース脱水素酵素がバシラス・サブチルス（Bacillus subtilis）に由来する、請求項２１に記載の組換えベクター。
【請求項２３】
請求項１７または１８に記載されたポリヌクレオチド、または請求項１９に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換体。
【請求項２４】
請求項２３に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、請求項１７または１８に記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イミン誘導体を立体選択的に還元することによって、医薬品などの原料あるいは合成中間体として利用されている光学活性なアミン誘導体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１−ピロリン−２−カルボン酸や１−ピロリン−５−カルボン酸などアミノ酸代謝に関与する酵素やジヒドロ葉酸還元酵素など特殊な構造並びに機能を有するイミン誘導体を還元する酵素は知られていた。しかし２−メチル−１−ピロリンのような単純なイミン化合物を立体選択的に還元し、光学活性アミン誘導体を生成する酵素、微生物は、次のような報告を除いてほとんど知られていない。【０００３】
−非特許文献1；Tetrahedron, 60, 753-758, 2004−
アセトバクテリウム・ウッディーによるＮ−ベンジリデンベンジルアミンの還元
−非特許文献2；Tetrahedron Asymmetry, 19, 93-96 (2008)−
キャンディダ・パラプシロシスによるＮ−（（Ｅ）−Ｎ−（１−フェニルエチリデン）アニリン誘導体の還元【０００４】
ただし、これらの公知技術においては、Ｎ−ベンジリデンベンジルアミンの還元生成物がキラルな構造ではないため、反応の立体選択性は不明である。また、Ｎ−（（Ｅ）−Ｎ−（１−フェニルエチリデン）アニリン誘導体のキャンディダ・パラプシロシスによる還元反応は極めて弱いため、工業的な利用には適さない。また、該イミン還元反応を行う酵素の実態は全く不明である。
また、２−メチルピロリジンの製法としては、次のような方法が知られている。【０００５】
−非特許文献３；Acta. Pharm. Suec., 15, 255-263, 1978−
２−メチル−１−ピロリンを水素化ホウ素ナトリウムによって還元し、ラセミ２−メチルピロリジンとした後、酒石酸を用いた光学分割により、キラル−２−メチルピロリジンを得る方法
−非特許文献４；J. Org. Chem., 54, 209-216, 1989−
Ｌ−プロリンから誘導されるＬ−プロリノールの水酸基を塩化チオニルでクロロ基に変換し、窒素原子をベンジルオキシカルボニル基により保護した後、水素化トリブチル錫を用いてラジカル的に還元することにより、（Ｒ）−１−ベンジルオキシカルボニル−２−メチルピロリジンを製造し、さらに脱保護する方法
−特許文献１；ＷＯ２００５／０７３３８８号公報−
光学活性（Ｓ）−１，４−ペンダンジオールをジスルホナートとした後、ベンジルアミンと反応させて環化し、（Ｒ）−１−ベンジル−２−メチル−１−ピロリンジンを合成し、更に、脱ベンジルして（Ｒ）−２−メチルピロリジンを得る方法【０００６】
しかしいずれの方法にも、次のような問題点が伴う。
−工程が長い
−危険な水素化試薬を使用する
−高価な光学活性ジオールを原料とする
−光学的な分割方法によって得るため収率が５０％を越えない
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Tetrahedron, 60, 753-758 (2004)
【非特許文献２】Tetrahedron Asymmetry, 19, 93-96 (2008)
【非特許文献３】Acta. Pharm. Suec., 15, 255-263 (1978)
【非特許文献４】J. Org. Chem., 54, 209-216 (1989)
【特許文献１】ＷＯ２００５／０７３３８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、イミン誘導体から光学活性なアミン誘導体を製造するための方法を提供することである。更に本発明は、イミン誘導体を基質として光学活性なアミン誘導体を生成することができる微生物、あるいは酵素の提供を課題とする。更に本発明は、目的とする性状を備えた該酵素をコードするＤＮＡを単離し、組換え体として得ることを課題とする。加えて、組換え体による光学活性アミン誘導体の製造方法の提供をも課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、イミン誘導体を基質として光学活性アミン誘導体を生成する微生物を探索し、目的とする活性を有する微生物を見出すことに成功した。見出された微生物を同定した結果、次のように、いずれもストレプトマイセス属に属する微生物であることが確認された。本発明者らが見出した以下の微生物は、たとえば、２−メチル−１−ピロリンを不斉還元し、（Ｒ）−２−メチルピロリジンを生成する。
ストレプトマイセス・エスピー GF3587（Streptomyces sp. GF3587）、
ストレプトマイセス・エスピー GF3501（Streptomyces sp. GF3501）、
ストレプトマイセス・エスピー GF3585（Streptomyces sp. GF3585）、および
ストレプトマイセス・エスピー GF4415（Streptomyces sp. GF4415）【００１０】
これらの微生物のうち、最も活性が高かったストレプトマイセス・エスピー GF3587を用い、２−メチル−１−ピロリンを不斉還元し、（Ｒ）−２−メチルピロリジンを生成する酵素の性質を解析した結果、本酵素は、ＮＡＤＰＨ依存性のイミン還元酵素であった。更に本発明者らは、GF3587を大量培養し、無細胞抽出液を調製した後、次の工程を経てイミン還元酵素を高度に精製することに成功した。
−  硫安分画、
−  ＤＥＡＥ−セファーセルを用いたイオン交換クロマトグラフィー、
−  フェニル−セファロースを用いた疎水クロマトグラフィー、および
−  ２’，５’−ＡＤＰセファロース４Ｂを用いたアフィニティクロマトグラフィー【００１１】
更に、本酵素をコードするＤＮＡを単離し、本酵素を高発現する組換え菌を造成した。
また、配列番号：６に記載のアミノ酸配列を用いてSWISS-PROTを対象にBLAST programを用いて同一性検索を行った結果、本発明のイミン還元酵素に同一性を有するタンパク質が見出された。具体的には、ストレプトマイセス・カナマイセチカス（Streptomyces kanamyceticus）のゲノム解析の結果より得られたQ1EQE0と命名された予想タンパク質であり、機能は未知である。Q1EQE0を高発現する組換え菌を造成し、性質を調べた結果、イミン還元活性を有する事を見出した。【００１２】
既に述べたように、イミン誘導体を立体選択的に還元する生合成に関与する酵素は知られている。しかし公知の酵素はいずれもアミノ酸や葉酸代謝に関与する酵素である。
そのため、医薬品の中間体などの製造に応用した場合には、工業的な生産に求められる基質特異性や活性は期待できない。特に２−メチル−１−ピロリンなどの環状アルキルイミン誘導体を還元して、光学活性環状アルキルアミン誘導体を得る方法は、まったく知られていなかった。【００１３】
したがって、医薬品の中間体などの製造に好適な基質特異性や触媒活性を備えた微生物が見出されたことは、非常に意外な成果であった。更に驚くべきことに、微生物が有する立体選択的なイミンの還元能力は、十分に高く、工業的な利用に際し問題の無いレベルであった。更に、イミン還元酵素をコードするＤＮＡを単離し、当該酵素を高発現する組換え菌を造成し、本発明を完成した。【００１４】
すなわち、本発明は、以下の光学活性アミンの製造方法を提供する。あるいは本発明は、当該方法に有用な微生物、あるいはイミン還元酵素、当該酵素をコードするＤＮＡを含むポリヌクレオチド、当該酵素の製造方法、および用途に関する。
[１]
次の（１）−（５）に示す理化学的性状を有する、イミン還元酵素；
（１）作用：還元型ニコチナミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと略す）依存的に、２−メチル−１−ピロリンを還元し、（Ｒ）−２−メチルピロリジンを生成する；、および
（２）補酵素依存性：ＮＡＤＰＨを補酵素として利用する。
（３）至適ｐＨ：６．０−７．０
（４）至適温度：４０−５５℃
（５）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）が約３２，０００、ゲルろ過による分子量が６５，０００〜７０，０００。
[２]
ストレプトマイセス属に属する微生物に由来する、[１]に記載のイミン還元酵素。
[３]
ストレプトマイセス属に属する微生物が、下記の群から選択されるいずれかの微生物であることを特徴とする、[２]に記載のイミン還元酵素；
ストレプトマイセス・エスピー NITE  BP-594（Streptomyces sp. NITE  BP-594）、
ストレプトマイセス・エスピー NITE  BP-595（Streptomyces sp. NITE  BP-595）、
ストレプトマイセス・エスピー NITE  BP-596（Streptomyces sp. NITE  BP-596）、および
ストレプトマイセス・エスピー NITE  BP-597（Streptomyces sp. NITE  BP-597）。
[４]
ストレプトマイセス属に属する微生物が、下記の群から選択されるいずれかの微生物であることを特徴とする[２]に記載のイミン還元酵素；
ストレプトマイセス・グリセオルビギノサス (Streptomyces griseorubiginosus)、
ストレプトマイセス・マイクロフラバス(Streptomyces microflavus) 、および
ストレプトマイセス・アルボビリディス (Streptomyces alboviridis)。
[５]
ストレプトマイセス・グリセオルビギノサス (Streptomyces griseorubiginosus)、
ストレプトマイセス・マイクロフラバス(Streptomyces microflavus) 、および
ストレプトマイセス・アルボビリディス (Streptomyces alboviridis)が、それぞれ以下の菌株である[４]に記載のイミン還元酵素；
ストレプトマイセス・グリセオルビギノサス (Streptomyces griseorubiginosus) NBRC 13047、
ストレプトマイセス・マイクロフラバス (Streptomyces microflavus) NBRC 13062、および
ストレプトマイセス・アルボビリディス (Streptomyces alboviridis) NBRC 13013。
[６]
[１]の（１）および（２）に示す理化学的性状を有し、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる、イミン還元酵素。
（ａ）配列番号：５に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：５に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列と８０%以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
[７]
[１]の（１）および（２）に示す理化学的性状を有し、かつ少なくとも８０％ｅｅ以上の（Ｒ）−２−メチルピロリジンを生成する機能を有するタンパク質であって、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含む、イミン還元酵素。
（ａ）配列番号：１６に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１６に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：１７に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
[８]
式（Ｉ）で示されるイミン誘導体に、当該化合物を立体選択的に還元する能力を有する微生物の培養物、菌体、およびその処理物からなる群から選択される、少なくとも一つの酵素活性物質を接触させる工程と、式（ＩＩ）で示される光学活性なＲ体のアミン誘導体を回収する工程を含む、光学活性なＲ体のアミン誘導体の製造方法。
式（Ｉ）
【化１】
2010024444.tif 000003
式（ＩＩ）
【化２】
2010024444.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２基は炭素数１〜３個のアルキル基を、Ｒ３基は、炭素数１〜３個のアルキル基もしくは水素を表し、Ｒ１とＲ３は環を巻いていてもよい）
[９]
式（Ｉ）の化合物が下記式（ＩＩＩ）で表されるイミン誘導体であり、式（ＩＩ）の化合物が式（ＩＶ）で表されるアミン誘導体である、[８]に記載の方法。
式（ＩＩＩ）
【化３】
2010024444.tif 000005
式（ＩＶ）
【化４】
2010024444.tif 000006
（式中、Ｒ基は炭素数１〜３個のアルキル基を、ｎは、１〜４の整数を表す）
[１０]
式（ＩＩＩ）の化合物が２−メチル−１−ピロリンであり、式（ＩＶ）で表される化合物が、２−メチルピロリジンである、[９]に記載の光学活性なＲ体のアミン誘導体の製造方法。
[１１]
微生物が、ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物であることを特徴とする、[８]から[１０]のいずれかに記載の光学活性なＲ体のアミン誘導体の製造方法。
[１２]
ストレプトマイセス属に属する微生物が、下記の群から選択されるいずれかの微生物であることを特徴とする、[１１]に記載の光学活性なＲ体のアミン誘導体の製造方法；
ストレプトマイセス・エスピー NITE  BP-594（Streptomyces sp. NITE  BP-594）、
ストレプトマイセス・エスピー NITE  BP-595（Streptomyces sp. NITE  BP-595）、
ストレプトマイセス・エスピー NITE  BP-596（Streptomyces sp. NITE  BP-596）、および
ストレプトマイセス・エスピー NITE  BP-597（Streptomyces sp. NITE  BP-597）。
[１３]
ストレプトマイセス属に属する微生物が、下記の群から選択されるいずれかの微生物であることを特徴とする、[１１]に記載の光学活性なＲ体のアミン誘導体の製造方法；
ストレプトマイセス・グリセオルビギノサス (Streptomyces griseorubiginosus)、
ストレプトマイセス・マイクロフラバス(Streptomyces microflavus) 、および
ストレプトマイセス・アルボビリディス (Streptomyces alboviridis)。
[１４]
ストレプトマイセス・グリセオルビギノサス (Streptomyces griseorubiginosus)、
ストレプトマイセス・マイクロフラバス(Streptomyces microflavus)、および
ストレプトマイセス・アルボビリディス (Streptomyces alboviridis)が、それぞれ以下の菌株である、[１３]に記載の光学活性なＲ体のアミン誘導体の製造方法；
ストレプトマイセス・グリセオルビギノサス (Streptomyces griseorubiginosus) NBRC 13047、
ストレプトマイセス・マイクロフラバス (Streptomyces microflavus) NBRC 13062、および
ストレプトマイセス・アルボビリディス (Streptomyces alboviridis) NBRC 13013。
[１５]
式（I）で示されるイミン誘導体に[１]〜[７]のいずれかに記載のイミン還元酵素、当該イミン還元酵素を生産する微生物、およびその処理物からなる群から選択される、少なくとも一つの酵素活性物質を接触させる工程と、式（ＩＩ）で示される光学活性なＲ体のアミン誘導体を回収する工程を含む、光学活性なＲ体のアミン誘導体の製造方法。
式（Ｉ）
【化５】
2010024444.tif 000007
式（ＩＩ）
【化６】
2010024444.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２基は炭素数１〜３個のアルキル基を、Ｒ３基は、炭素数１〜３個のアルキル基もしくは水素を表し、Ｒ１とＲ３は環を巻いていてもよい）
[１６]
式（Ｉ）の化合物が下記式（ＩＩＩ）で表されるイミン誘導体であり、式（ＩＩ）の化合物が式（ＩＶ）で表されるアミン誘導体である[１５]に記載の方法。
式（ＩＩＩ）
【化７】
2010024444.tif 000009
式（ＩＶ）
【化８】
2010024444.tif 000010
（式中、Ｒ基は炭素数１〜３個のアルキル基を、ｎは、１〜４の整数を表す）
[１７]
[１]の（１）および（２）に示す理化学的性状を有するイミン還元酵素をコードする、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：５に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：５に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
[１８]
[１]の（１）および（２）に示す理化学的性状を有し、かつ少なくとも８０％ｅｅ以上の（Ｒ）−２−メチルピロリジンを生成する機能を有するイミン還元酵素をコードする、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１６に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１６に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：１７に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
[１９]
[１７]または[１８]に記載されたポリヌクレオチドが挿入された組換えベクター。
[２０]
更に、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を補酵素とする酸化還元反応を触媒することができる脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入された、[１９]に記載された組換えベクター。
[２１]
脱水素酵素がグルコース脱水素酵素である、[２０]に記載のベクター。
[２２]
グルコース脱水素酵素がバシラス・サブチルス（Bacillus subtilis）に由来する、[２１]に記載の組換えベクター。
[２３]
[１７]または[１８]に記載されたポリヌクレオチド、または[１９]に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換体。
[２４]
[２３]に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、[１７]または[１８]に記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、微生物の還元能を使用したイミンの立体選択的還元により、（Ｒ）体光学活性アミンを効率的に製造する方法が提供された。また、該反応を担うイミン還元酵素が提供された。さらに、イミン還元酵素をコードするＤＮＡを単離し、当該酵素を高発現する組換え菌が提供された。本発明の方法は、安価に合成可能なイミン誘導体を基質とし、微生物もしくは酵素の高い立体選択性を利用して、光学活性アミンが合成できるため、工業的に有利である。本発明は、特に、（Ｒ）−２−メチルピロリジンの製造に有用である。（Ｒ）−２−メチルピロリジンは、医薬品を合成するための中間体として有用な化合物である。本発明によって、当該化合物を微生物や酵素の作用によって簡便にかつ効率的に製造することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ストレプトマイセス sp. GF3587の 16S-rDNAの塩基配列（配列番号：１）に基づいて作成した分子系統樹を示す図である。
【図２】ストレプトマイセス sp. GF3501の 16S-rDNAの塩基配列（配列番号：２）に基づいて作成した分子系統樹を示す図である。
【図３】ストレプトマイセス sp. GF3585の16S-rDNAの塩基配列（配列番号：３）に基づいて作成した分子系統樹を示す図である。
【図４】ストレプトマイセス sp. GF4415の16S-rDNAの塩基配列（配列番号：４）に基づいて作成した分子系統樹を示す図である。
【図５】ストレプトマイセス sp. GF3587による２−メチル−１−ピロリン（２−ＭＰＮ）の還元反応の結果を示すグラフである。縦軸は（Ｒ）−２−メチルピロリジン（２−ＭＰ）の生成量（ｍＭ）、横軸は反応時間（時間）を示す。
【図６】ストレプトマイセス sp. GF3587による２−メチル−１−ピロリン（２−ＭＰＮ）の還元反応の結果を示すグラフである。縦軸は（Ｒ）−２−メチルピロリジン（２−ＭＰ）の生成量（ｍＭ）、横軸は反応時間（時間）を示す。
【図７】ストレプトマイセス sp. GF3587由来のイミン還元酵素の至適温度を検討した結果を示すグラフである。縦軸は、最も高い活性が見られた５０℃（１２．３Ｕ／ｍＬ）における活性値を１００とする相対活性（％）を、横軸は酵素反応液の温度（℃）を示す。
【図８】ストレプトマイセス sp. GF3587由来のイミン還元酵素の熱安定性を検討した結果を示すグラフである。縦軸は、最も高い残存活性が見られた２０−２５℃（６．６５Ｕ／ｍＬ）における活性値を１００とする相対活性（％）を、横軸は酵素を処理した温度（℃）を示す。
【図９】ストレプトマイセス sp. GF3587由来のイミン還元酵素の至適ｐＨを検討した結果を示すグラフである。縦軸は、最も高い活性が見られたｐＨ７．０における活性値を１００（６．８２Ｕ／ｍＬ）とする相対活性（％）を、横軸は酵素反応液のｐＨを示す。
【図１０】ストレプトマイセス sp. GF3587由来のイミン還元酵素のｐＨ安定性を検討した結果を示すグラフである。縦軸は、最も高い残存活性が見られたｐＨ７．５における活性値を１００（３．６７Ｕ／ｍＬ）とする相対活性（％）を、横軸は酵素を処理したｐＨを示す。
【図１１】ストレプトマイセス sp. GF3587由来のイミン還元酵素遺伝子が挿入されたプラスミド(pSUSRIR1)の構築の過程を示した図である。
【図１２】ストレプトマイセス sp. GF3587由来のイミン還元酵素遺伝子と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子が挿入されたプラスミド(pSGSRIR1)の構築の過程を示した図である。
【図１３】Ｑ１ＥＱＥ０と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子が挿入されたプラスミド(pSG-SKI1)の構築の過程を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、式（Ｉ）で示されるイミン誘導体に、当該化合物を立体選択的に還元する能力を有する微生物の培養物、菌体、およびその処理物からなる群から選択される、少なくとも一つの酵素活性物質を接触させる工程と、式（ＩＩ）で示される光学活性なＲ体のアミン誘導体を回収する工程を含む、光学活性なＲ体のアミン誘導体の製造方法に関する。
式（Ｉ）
【化１７】
2010024444.tif 000011
式（ＩＩ）
【化１８】
2010024444.tif 000012
（式中、Ｒ１、Ｒ２基は、炭素数１〜３個のアルキル基を、Ｒ３基は、炭素数１〜３個のアルキル基もしくは水素を表し、Ｒ１とＲ３は、環を巻いていてもよい）
【００１８】
本発明において、環状イミン化合物は式（Ｉ）の化合物として好ましい。本発明において、環状イミン化合物は、たとえば下記式（ＩＩＩ）で表されるイミン誘導体を含む。
式（ＩＩＩ）
【化１９】
2010024444.tif 000013
（式中、Ｒ基は、炭素数１〜３個のアルキル基を、ｎは、１〜４の整数を表す）
【００１９】
上記式（ＩＩＩ）の化合物を基質として用いた場合、光学活性アミン誘導体として式（ＩＶ）に示される化合物を得ることができる。当該化合物は、本発明によって製造することができる好ましい光学活性アミン誘導体である。
式（ＩＶ）
【化２０】
2010024444.tif 000014
（式中、Ｒ基は、炭素数１〜３個のアルキル基を、ｎは、１〜４の整数を表す）
【００２０】
本発明における好ましい化合物は、前記式（ＩＩＩ）において、たとえばＲがメチル基、エチル基、あるいはプロピル基であり、ｎが２〜３の化合物である。より具体的には、本発明における好ましいイミン誘導体として次の化合物を示すことができる。
２−メチル−１−ピロリン
２−メチル−１−ピペリデイン
２−エチル−１−ピロリン
２−エチル−１−ピペリデイン
【化２１】
2010024444.tif 000015
【００２１】
これらの化合物を基質として、それぞれ以下の光学活性アミン誘導体を製造することができる。
２−メチル−１−ピロリン      →  （Ｒ）−２−メチルピロリジン
２−メチル−１−ピペリデイン  →  （Ｒ）−２−メチルピペリジン
２−エチル−１−ピロリン      →  （Ｒ）−２−エチルピロリジン
２−エチル−１−ピペリデイン  →  （Ｒ）−２−エチルピペリジン
【化２２】
2010024444.tif 000016
【００２２】
本発明における「光学活性なアミン誘導体」とは、ある光学異性体が別の光学異性体より多く含まれるアミン誘導体を言う。本発明において、好ましい光学活性なアミン誘導体は、たとえば６０%、通常７０%以上、好ましくは８０%以上、更に好ましくは９０％以上の光学純度（enantiomeric excess;ｅｅ）を有する。本発明の「光学異性体」は、一般的に「鏡像異性体」(enantiomer)と呼ばれる場合もある。
【００２３】
本発明において、イミン誘導体を立体選択的に還元しうる能力とは、前記式（Ｉ）望ましくは式（ＩＩＩ）で示されるイミン誘導体を基質として、式（ＩＩ）もしくは式（ＩＶ）で示されるＲ体のアミン誘導体を生成する能力を言う。本発明の微生物は、Ｒ体のアミン誘導体を生成しうる微生物であれば、任意の微生物を用いることができる。本発明に用いることができる微生物は、イミン誘導体に作用し、Ｒ体のアミン誘導体を生成する能力を確認することにより得ることができる。
【００２４】
たとえば、化合物（Ｉ）、望ましくは化合物（ＩＩＩ）で示されるイミン誘導体を含む培地中で被験微生物を培養し、その培養液中に生成したアミン誘導体の光学純度を測定する。その結果、光学活性な（Ｒ）−アミン誘導体の生成が確認できれば、当該微生物を本発明に用いることができる。
【００２５】
あるいは、予め適当な培地中で増殖させた被験微生物を集菌し、適当な緩衝液中に懸濁させる。更に化合物（Ｉ）、望ましくは化合物（ＩＩＩ）で示されるイミン誘導体と接触、反応させて、この緩衝液中に生成するアミン誘導体の光学純度を測定する。光学活性な（Ｒ）−アミン誘導体の生成が確認できれば、当該微生物を本発明に用いることができる。このとき、被験微生物の培養時に、培地中に化合物（Ｉ）、望ましくは化合物（ＩＩＩ）を加えておけば、この化合物を還元するための酵素の誘導が期待できる。更に反応時に還元エネルギー源を加えておけば、より効果的な生成物の蓄積が期待できる。還元エネルギー源としては、通常、グルコース、スクロース、アルコール、有機酸などを用いることができる。
【００２６】
例えば、微生物を必要に応じて２−メチル−１−ピロリンを含む適当な培地で培養し、得られた微生物菌体を、１０ｍＭ ２−メチル−１−ピロリン、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）及び必要に応じてグルコースを含む反応液に懸濁し、２５℃で２４時間振盪し、生成物をＴＬＣもしくはＨＰＬＣにより分析することにより、微生物の２−メチル−１−ピロリン還元能を確認することができる。
【００２７】
ＴＬＣの条件としては、例えば、Silica gel 60 F254 プレートを用い、１−ブタノール／酢酸／水＝２／１／１の展開液で展開し、ニンヒドリンにより呈色する方法が挙げられる。
【００２８】
生成したアミン誘導体の光学純度は、例えば、以下の方法により測定することができる。
被検サンプル５０μＬに以下の成分を添加して、４０℃、１時間反応することにより生成したアミンをＧＩＴＣ化し、ＨＰＬＣにより分離し定量する。
２ｍｇ／ｍＬ トリエチルアミン５０μＬおよび８ｍｇ／ｍＬ ２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）１００μＬ
【００２９】
ＨＰＬＣの条件としては、例えば、以下のような条件を用いることができる。
−ＨＰＬＣカラム：和光純薬株式会社製 Wakosil II 5C18 (4.6mm x 150 mm)
−溶離液        ：１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ２．５）：メタノール＝５５：４５
−流速          ：１ｍＬ／ｍｉｎ
−検出          ：２５４ｎｍにおけるＵＶ吸収
上記条件下で、（Ｒ）−２−メチルピロリジン誘導体は２６．３分に、（Ｓ）−２−メチルピロリジン誘導体は２４．９分に溶出される。
【００３０】
光学純度の高い生成物を得るには、より選択性の高い微生物を用いることが有利であることは言うまでも無い。具体的には、その立体選択性は、たとえば６０％、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の、光学活性なＲ体のアミン誘導体を生成しうる微生物を用いることができる。
【００３１】
（Ｒ）体アミン誘導体を生成する微生物として、たとえば、ストレプトマイセス属に属し、２−メチル−１−ピロリンから（Ｒ）−２−メチルピロリジンを生成する能力を有する微生物を挙げることができる。たとえば以下の微生物は、本発明における（Ｒ）体アミン誘導体を生成する微生物として利用することができる。
ストレプトマイセス・エスピー GF3587（Streptomyces sp. GF3587）、
ストレプトマイセス・エスピー GF3501（Streptomyces sp. GF3501）、
ストレプトマイセス・エスピー GF3585（Streptomyces sp. GF3585）、および
ストレプトマイセス・エスピー GF4415（Streptomyces sp. GF4415）。
【００３２】
これらの微生物は、それぞれ次のとおり寄託されている。
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構
（２）連絡先：  〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（３）識別のための表示および受託番号
ストレプトマイセス・エスピー GF3587（Streptomyces sp. GF3587）
；受託番号  NITE  P-594 （受託日２００８年６月２４日）
ストレプトマイセス・エスピー GF3585（Streptomyces sp. GF3585）
；受託番号  NITE  P-596 （受託日２００８年６月２４日）
ストレプトマイセス・エスピー GF3501（Streptomyces sp. GF3501）
；受託番号  NITE  P-595 （受託日２００８年６月２４日）
ストレプトマイセス・エスピー GF4415（Streptomyces sp. GF4415）
；受託番号  NITE  P-597 （受託日２００８年６月２４日）
【００３３】
さらにこれらの微生物は、ブダペスト条約に基づく国際寄託に、次のとおり移管されている。
（１）国際寄託当局：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
（２）住所：  〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（３）識別の表示および受託番号
ストレプトマイセス・エスピー GF3587（Streptomyces sp. GF3587）
；受託番号  NITE  BP-594 （移管日２００９年６月２９日）
ストレプトマイセス・エスピー GF3585（Streptomyces sp. GF3585）
；受託番号  NITE  BP-596 （移管日２００９年６月２９日）
ストレプトマイセス・エスピー GF3501（Streptomyces sp. GF3501）
；受託番号  NITE  BP-595 （移管日２００９年６月２９日）
ストレプトマイセス・エスピー GF4415（Streptomyces sp. GF4415）
；受託番号  NITE  BP-597 （移管日２００９年６月２９日）
【００３４】
本発明において、前記式（Ｉ）あるいは（ＩＩＩ）で示されるイミン誘導体を立体選択的に還元する能力を有する微生物は、これらの寄託菌株のみならず、種々の微生物資源（micro biological resource）からも見出すことができる。微生物資源には、自然環境から単離される微生物群、微生物寄託機関に保存された微生物菌株などが含まれる。たとえば、次のようなストレプトマイセス属に属する微生物は、本発明において、前記式（Ｉ）あるいは（ＩＩＩ）で示されるイミン誘導体を立体選択的に還元する能力を有する微生物として好ましい。
ストレプトマイセス・グリセオルビギノサス (Streptomyces griseorubiginosus)
ストレプトマイセス・マイクロフラバス (Streptomyces microflavus)
ストレプトマイセス・アルボビリディス (Streptomyces alboviridis)
【００３５】
したがって、たとえば、微生物寄託機関に保存されたストレプトマイセス属微生物を対象として、先に述べたような選択方法によって、目的の作用を有する微生物を選択することができる。寄託された微生物は、たとえば次のような寄託機関から分譲を受けることができる。
生物遺伝資源センター (NBRC)
理化学研究所 (JCM)
東京農業大学菌株保存室 (IAM)
American Type Culture Collection (ATCC)
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM)
【００３６】
あるいはリボソーマルＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の塩基配列情報に基づいて、本発明に利用しうる微生物を選択することもできる。一般にｒＤＮＡの塩基配列情報は、生物間の遺伝学的な近さを表す指標として有用であることが広く知られている。特に１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ（以下１６Ｓ ｒＤＮＡと記載する）は、微生物の遺伝的な同一性あるいは類似性を決定するためのツールとして活用されている。１６Ｓ ｒＲＮＡは、全生物に存在しており、生物間で構造の違いは見られるが、アライメント可能な程度に配列が保存されている。１６Ｓ ｒＲＮＡの生物間水平伝播の頻度は低いので、分類に使用する方法が汎用されている。
【００３７】
具体的には、小サブユニットリボソームＲＮＡ（ＳＳＵ ｒＲＮＡ）は、タンパク質合成の場であるリボソームを構成する核酸分子の１つである。その塩基配列の長さは、多少の違いはあるものの、細菌からヒトまで起源は同じものと見なされている。したがって、ｒＲＮＡの塩基配列は進化的保存性が高く、生物の系統解析において最も頻繁に利用されている(Microbiol. Rev., 58, 1-9 (1994))。原核生物におけるＳＳＵ ｒＲＮＡは約１５００塩基の１６Ｓ ｒＲＮＡである。原核生物の分類と同定に１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を利用する系統分類が一般に用いられている（ASM News, 65, 752-757 (1999)、 生物工学実験書 p113 日本生物工学会編, 培風館）。
【００３８】
現在の放線菌の分類体系は、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の類似性に基づいて構成されている(Stackebrandt, et al. (1997) Int. J. Syst. Bacteriol., 47, 479-491)。菌株の同定においても、属レベルだけではなく種レベルにおいても１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の同一性に基づく同定が、細菌系統分類学の主流となっている（「放線菌の分類と同定」（日本放線菌学会)p19)。
【００３９】
本発明者らが見出した上記の菌株は、１６Ｓ ｒＤＮＡ中にそれぞれ配列番号：１〜配列番号：４に示す塩基配列を含んでいた。塩基配列情報データベースを対象として、これらの塩基配列情報を検索すれば、既に１６Ｓ ｒＤＮＡが決定された微生物の中から、その１６Ｓ ｒＤＮＡ中に同一性の高い塩基配列を含む菌株を見つけ出すことができる。たとえば、DNA Data Bank of Japan (DDBJ)などの公共データベースサービス機関では、１６Ｓ ｒＲＮＡ(Prokaryotes)の塩基配列情報を対象とする検索サービスが提供されている。こうして見出された微生物のうち、特にストレプトマイセス属に属する微生物を選択することによって、本発明に利用しうる微生物とすることができる。必要に応じ、こうして選択された微生物のイミン誘導体に対する作用を予め確認することもできる。
【００４０】
実際、本発明者らは、このようにして選択された複数の微生物が、目的とする触媒作用を有していることを実験的に確認した。具体的には、ＧＦ３５８７株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と９９．９％の同一性を有する以下のストレプトマイセス属微生物が、２−メチル−１−ピロリンを光学特異的に還元し、高い光学純度の（Ｒ）−２−メチルピロリジンを与えることを確認した。
ストレプトマイセス・グリセオルビギノサス (Streptomyces griseorubiginosus) NBRC 13047
ストレプトマイセス・マイクロフラバス (Streptomyces microflavus) NBRC 13062
ストレプトマイセス・アルボビリディス (Streptomyces alboviridis) NBRC 13013
【００４１】
これら微生物は、醗酵学の分野で公知の方法に従って培養することができる。培地としては炭素源、窒素源、無機物およびその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地または天然培地のいずれでも使用することができる。培地は、液体培地または固体培地を使用することができる。
【００４２】
具体的には、炭素源として、次に示すような一般的な炭素源より、使用する微生物の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。
糖類：グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、ラクトースなど
デンプン、
デンプン加水分解物、
廃糖蜜、
アルコール：グリセロール、メタノール、エタノールなど
糖アルコール、
有機酸：酢酸、グルコン酸、ピルビン酸、α-ケトグルタル酸、クエン酸など
脂肪類：パーム油、大豆油、オリーブオイルなど
炭化水素類：ノルマルパラフィンなど
【００４３】
窒素源としては、次に示すような一般的な窒素源の中から、使用する微生物の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。
有機窒素化合物：例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆加水分解物、ミルクカゼイン、カザミノ酸、廃糖蜜、アスパラギン、グルタミン、あるいはグルタミン酸などのアミノ酸類やコーンスティープリカー、ＮＺアミンなど
無機窒素化合物：アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムなど、
尿素、硝酸塩など
【００４４】
さらに、無機塩として微量のマグネシウム、マンガン、カリウム、カルシウム、ナトリウム、銅、亜鉛などの塩や各種ビタミンなどの微量栄養素を添加することもできる。
また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を培養液中に添加することもできる。また、微生物のイミン誘導体の立体選択的還元能力を高めるために、誘導物質を用いることができる。誘導物質としては、イミン誘導体を、使用する微生物に応じて使用することができる。
【００４５】
あるいは、好適な培養条件とすることで、誘導物質を用いることなく目的とする酵素の産生を誘導することもができる。たとえば本発明者らは、以下のようなイミン還元酵素の誘導に最適化した培地を利用することによって、ストレプトマイセス属のイミン還元酵素の誘導に成功した。すなわち本発明は、以下の組成を有する培地でストレプトマイセス属微生物を培養し、培養物からイミン還元酵素を回収する工程を含む、イミン還元酵素の製造方法を提供する。
ＮＺアミン          ４ｇ
麦芽エキス          ２０ｇ
グルコース          ８ｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ５ｍｇ
以上の組成を水道水で溶解し１Ｌとし、ｐＨを７．３に調整する
上記組成の培地によって、たとえば、次の微生物を培養することにより、イミン誘導体などの誘導物質を添加することなく、本発明のイミン還元酵素の産生を誘導することができる。
ストレプトマイセス・グリセオルビギノサス (Streptomyces griseorubiginosus)
ストレプトマイセス・マイクロフラバス (Streptomyces microflavus)
ストレプトマイセス・アルボビリディス (Streptomyces alboviridis)
【００４６】
培養は前記培地成分を含有する液体培地中で、通常の培養方法を用いて行うことができる。たとえば次のような培養方法を利用することができる。
振とう培養 (shaking culture)
通気攪拌培養 (aeration-agitation culture)
連続培養 (continuous culture)
流加培養 (feeding culture, fed batch culture)
【００４７】
培養条件は、微生物の種類、培養の種類、培養方法により適宜選択することができる。利用する菌株が増殖し、イミン誘導体の立体選択的還元能力を有しうる条件であれば特に制限はない。一般的な培養条件として次のような条件を示すことができる。
培養開始時のｐＨを４から１０、好ましくは６から８に調節
１５から７０℃、好ましくは２０から４０℃の温度条件下で培養
培養時間はイミン誘導体の還元能力を有する菌体を得ることができれば特に制限されない。通常は１日から１４日、好ましくは１日から７日培養する。
【００４８】
本発明において、微生物菌体の処理物とは、菌体を目的とする酵素活性が維持される条件で処理したものを意味する。酵素活性の維持とは、生菌体で得られる酵素活性の一般的には２０％以上、通常３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上の活性を維持することを言う。生菌体とその処理物の酵素活性は、生菌体の酵素活性と、同量の生菌体から得られた処理物の酵素活性を比較することによって定量的に比較することができる。本発明における処理物は、生菌体よりも高い酵素活性を有する場合もある。
【００４９】
このような処理物を得る方法としては、凍結乾燥、有機溶媒による脱水乾燥、菌体の自己消化、酵素活性画分の抽出、超音波処理などを利用することができる。このような処理方法によって、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体自己消化物、菌体抽出物、菌体磨砕物、菌体の超音波処理物等を得ることができる。
【００５０】
これらの処理は、単独で、あるいは複数の処理を重複して適用することもできる。たとえば適当な培養液で微生物を培養後、菌体を破砕して、遠心分離等により無細胞抽出液を調製することができる。菌体は、機械的な破砕、超音波、高圧処理、酵素消化、自己消化などにより破砕することができる。無細胞抽出液は本発明における菌体の処理物に含まれる。
【００５１】
更に本発明においては、当該菌体から当該反応を触媒する酵素を部分精製したものや完全に精製したものなどを得ることができる。すなわち本発明は、本発明によって提供されたイミン還元酵素活性を有する微生物の菌体から精製することができるイミン還元酵素に関する。本発明のイミン還元酵素は、次の（１）〜（２）に示す理化学的性状を有する。
（１）作用：還元型ニコチナミドアデニンジヌクレオチドリン酸依存的に、２−メチル−１−ピロリンを還元し、（Ｒ）−２−メチルピロリジンを生成する；、および
（２）補酵素依存性：ＮＡＤＰＨを補酵素として利用する
【００５２】
本発明者らが見出したイミン還元酵素は、好ましい態様において、前記性状（１）〜（２）に加えて、更に次の理化学的性状を有する。このようなイミン還元酵素は、たとえばストレプトマイセス・エスピー ＧＦ３５８７から得ることができる。
（３）分子量：ゲル濾過で６５，０００−７０，０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約３２，０００
（４）至適ｐＨ：ｐＨ６．５（ｐＨ６．０−７．５で最大活性の８０％以上）
（５）至適温度：５０℃（４０−５５℃で最大活性の８０％以上）
（６）安定ｐＨ：ｐＨ６．５−８．５で８０％以上安定（３０℃，３０分間処理後の残存活性）
（７）安定温度：３５℃まで８０％以上安定（各温度で３０分間処理後の残存活性）
（８）基質特異性：２−メチル−１−ピロリンに対する還元作用を１００としたとき、以下に示す化合物に対してそれぞれ次の還元活性を持つ：
２−メチル−１−ピロリン：                            １００％
【化２３】
2010024444.tif 000017
Ｎ−ベンジリデンベンジルアミン：                      ３０％
【化２４】
2010024444.tif 000018
Ｎ−（Ｅ）−Ｎ−（１−フェニルエチリデン）アニリン：  ２９％
【化２５】
2010024444.tif 000019
ジヒドロ葉酸：                                        ７．６％
【化２６】
2010024444.tif 000020
【００５３】
本発明のイミン還元酵素は、上記微生物、あるいは、その無細胞抽出液などから精製することができる。具体的には、次のような精製工程を適宜組み合わせることによって、無細胞抽出液から実質的に純粋なイミン還元酵素を得ることができる。
硫安、アセトンなどを用いた溶解度による分割、
イオン交換クロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、
２’，５’−ＡＤＰセファロースやブルーもしくはレッドセファロースなどを用いたアフィニティクロマトグラフィー、
ゲル濾過
【００５４】
例えば、微生物を集菌後、次のような精製工程を経て、本発明のイミン還元酵素を実質的な純粋な酵素として単離することができる。
超音波による菌体の破砕と無細胞抽出液の調製、
硫安分画によるタンパク画分の分離、
ＤＥＡＥ−セファーセルを用いたイオン交換クロマトグラフィー、
フェニルセファロースを用いた疎水クロマトグラフィー、および
２’，５’−ＡＤＰセファロース・アフィニティクロマトクロマトグラフィーによるイミン還元酵素活性分画の単離、
【００５５】
本発明において、「実質的に純粋」とは、当該酵素が、当該酵素以外の生物学的な高分子化合物や化学物質を実質的に含まないことを言う。当該酵素以外の生物学的な高分子化合物とは、たとえば菌体や培養液に由来するタンパク、糖類、脂質、核酸類が含まれる。
本発明における実質的に純粋な酵素は、少なくとも７５％以上、通常８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、あるいは９９％以上の純度を有する。酵素の純度を決定する方法は公知である。たとえば、各種のクロマトグラフィーや、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などによって蛋白質の純度を決定する方法が周知である。
【００５６】
あるいは本発明によって、上記理化学的性状（１）〜（２）を有する単離されたイミン還元酵素が提供される。本発明において、単離されたイミン還元酵素とは、それが存在する天然の環境から分離されて存在していることを意味する。したがって、菌体から分離されたイミン還元酵素は、本発明における単離されたイミン還元酵素に含まれる。
【００５７】
本発明における実質的に純粋なイミン還元酵素、あるいは単離されたイミン還元酵素は、精製、あるいは単離された後に、酵素組成物とすることもできる。たとえば、精製、あるいは単離されたイミン還元酵素を適当な担体と配合することによって、本発明のイミン還元酵素を含む酵素組成物を調製することができる。担体としては、アルブミンなどの不活性蛋白質、ショ糖などの糖類あるいは糖アルコールなどを利用することができる。酵素組成物は、液状であることもできるし、乾燥状態であることもできる。酵素と担体を含む水溶液を凍結乾燥することによって得られる酵素組成物は、本発明における好ましい組成物の一つである。
【００５８】
本発明のイミン還元酵素は、以下の方法によりその活性を定量することができる。すなわち、次の組成の反応液中（１ｍＬ）で、３０℃で反応を行い、ＮＡＤＰＨの減少に由来する３４０ｎｍの吸光度の減少を測定する。
１０ｍＭ  ２−メチル−１−ピロリン、
１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、
０．１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ及び
酵素
１Ｕは、上記条件下、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの減少を触媒する酵素量とした。
【００５９】
本発明は、配列番号：６または１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に関する。本発明はまた、配列番号：６または１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のホモログを含む。本発明のイミン還元酵素のホモログとは、配列番号：６または１７に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号：６または１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を意味する。配列番号：６または１７に記載のアミノ酸配列において、たとえば１００以下、通常５０以下、好ましくは３０以下、より好ましくは１５以下、更に好ましくは１０以下、あるいは５以下のアミノ酸残基の変異は許容される。
【００６０】
本発明は、イミン還元酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそのホモログに関する。本発明において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡやＲＮＡ等の天然のポリヌクレオチドに加え、人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であることもできる。また本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ−ＲＮＡのキメラ分子であることもできる。本発明のイミン還元酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば配列番号：５に示す塩基配列を含む。配列番号：５に示す塩基配列は、配列番号：６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明によるイミン還元酵素の好ましい態様を構成する。
【００６１】
本発明のイミン還元酵素をコードするポリヌクレオチドのホモログとは、配列番号：６に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、前記理化学的性質（１）〜（２）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。当業者であれば、配列番号：５記載のポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりポリヌクレオチドのホモログを得ることが可能である。
【００６２】
また、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ、前記理化学的性質（１）〜（２）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：５に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択したＤＮＡをプローブＤＮＡとし、たとえばECL direct nucleic acid labeling and detection system (GEヘルスケア社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（wash：42℃、0.5x SSCを含むprimary wash buffer）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
【００６３】
さらに、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：６に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、より好ましくは９０%以上の同一性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質の同一性検索は、たとえばSWISS-PROT, PIR,DADなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースや DDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、ＤＮＡ配列を基にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST, FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。
【００６４】
配列番号：６に記載のアミノ酸配列を用いてDADを対象にBLASTプログラムを用いて同一性検索を行った結果、既知のタンパク質の中で高い同一性を示したのは、ストレプトマイセス・カナマイセチカス（Streptomyces kanamyceticus）の産生するQ1EQE0（５１％）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）が産生するA3KHV9（４２％）であった。本発明の７０％以上の同一性とは、例えば、Lipman-Pearson法(Science,227,1435-1441(1985))によるプログラムを用いて計算した値を表す。
【００６５】
これらの予想タンパク質が本発明のイミン還元酵素活性を有するか否かを明らかにするために、ＤＤＢＪに登録されているDNA配列を基にプライマーを合成し、ストレプトマイセス・カナマイセチカス、あるいは、ストレプトマイセス・アンボファシエンスのゲノムDNAより予想ＯＲＦ部分をＰＣＲクローニングした。各ＯＲＦを発現ベクターに導入し、大腸菌を形質転換して得られた形質転換株を培養して、それぞれのタンパク質を発現させた結果、Q1EQE0がイミン還元活性を示した。また、Q1EQE0はイミン還元反応において２−メチル−１−ピロリンを還元して高い光学純度の（Ｒ）−２−メチルピロリジンを生成した。すなわち、配列番号：１７に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明のイミン還元酵素のホモログの好ましい態様を表す。
【００６６】
本発明は、配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に関する。本発明はまた、配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のホモログを含む。
【００６７】
本発明のイミン還元酵素のホモログとは、配列番号：６に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を意味する。本発明において、配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等とは、当該タンパク質が前記（１）〜（２）に示した物理化学的性状を有することを意味する。当業者であれば、配列番号：５記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりイミン還元酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。そのイミン還元酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより、配列番号：６に記載のイミン還元酵素のホモログを得ることが可能である。
【００６８】
さらに、本発明のイミン還元酵素のホモログとは、配列番号：６に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％以上の同一性を有するタンパク質をいう。タンパク質の同一性検索は、たとえばSWISS-PROT, PIR,DADなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースやDDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、ＤＮＡ配列を基にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。
【００６９】
本発明のイミン還元酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば、以下のような方法によって単離することができる。
【００７０】
配列番号：５に記載の塩基配列を基にＰＣＲ用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことにより本発明のＤＮＡを得ることができる。
【００７１】
さらに、得られたＤＮＡ断片をプローブとして、酵素生産株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。
【００７２】
また、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のＤＮＡの外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応によりＤＮＡを鋳型として逆ＰＣＲを行うことにより（Genetics 120, 621-623 (1988)）、また、ＲＡＣＥ法（Rapid Amplification of cDNA End、「ＰＣＲ実験マニュアル」p25-33, ＨＢＪ出版局）などにより本発明のポリヌクレオチドを得ることも可能である。
【００７３】
なお本発明のポリヌクレオチドには、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡ、あるいはｃＤＮＡの他、合成によって得られたＤＮＡが含まれる。
【００７４】
このようにして単離された、本発明によるイミン還元酵素をコードするポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、イミン還元酵素発現ベクターが提供される。
【００７５】
また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明のイミン還元酵素を組換え体から得ることができる。
【００７６】
本発明においてイミン還元酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、イミン還元酵素を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、イミン還元酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、たとえば以下のような微生物を示すことができる。
【００７７】
エシェリヒア(Escherichia)属
バチルス(Bacillus)属
シュードモナス(Pseudomonas)属
セラチア(Serratia)属
ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属
コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属
ストレプトコッカス(Streptococcus)属
ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス(Rhodococcus)属
ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス(Saccharomyces)属
クライベロマイセス(Kluyveromyces)属
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属
チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属
ヤロウイア(Yarrowia)属
トリコスポロン(Trichosporon)属
ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属
ピキア(Pichia)属
キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ(Neurospora)属
アスペルギルス(Aspergillus)属
セファロスポリウム(Cephalosporium)属
トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ
【００７８】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。微生物中などにおいて、本発明のＮＡＤＰＨを電子供与体とするイミン還元酵素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
【００７９】
そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターなどに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488 (1992)、などに詳細に記述されている。
【００８０】
例えばエシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとして、pBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、 trc (lac、trpの融合)、λファージ PＬ、PＲなどに由来するプロモーターなどが利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどを用いることができる。これらの中で、市販のｐＳＥ４２０（Invitrogen製）のマルチクローニングサイトを一部改変したベクターｐＳＥ４２０Ｄ（特開2000-189170に記載）が好適に利用できる。
【００８１】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとしてapr(アルカリプロテアーゼ)、npr(中性プロテアーゼ)、amy(α−アミラーゼ)などが利用できる。
【００８２】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)などで宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子などが利用できる。
【００８３】
ブレビバクテリウム属特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
【００８４】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターが利用可能である。
【００８５】
ストレプトコッカス(Streptococcus)属においては、pHV1301(FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985)）などがプラスミドベクターとして利用可能である。
【００８６】
ラクトバチルス(Lactobacillus)属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J. Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００８７】
ロドコッカス(Rhodococcus)属においては、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)から単離されたプラスミドベクターが使用可能である (J. Gen. Microbiol. 138,1003 (1992) )。
【００８８】
ストレプトマイセス(Streptomyces)属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gene 103,97-99 (1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1995) )が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア(Streptomyces virginiae)においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53 (1997) ）。
【００８９】
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームＤＮＡとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵素)、GAPDH(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)、PHO(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシダーゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノラーゼ)などのプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００９０】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390 (1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームＤＮＡなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００９１】
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS (自律複製に関与する遺伝子)及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 (1987)）。特に、pAUR224は、タカラバイオから市販されており容易に利用できる。
【００９２】
チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces)においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ(Zygosaccharomyces rouxii)由来のpSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990)）などが利用可能である。
【００９３】
ピキア(Pichia)属においては、ピキア・アンガスタ（旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)）において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (1991)）。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ)、FDH(ギ酸脱水素酵素)のプロモーターなどが利用可能である。また、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 (PARS1、 PARS2)などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)）。
【００９４】
キャンディダ(Candida)属においては、キャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・ウチルス(Candida utilis)などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニングされ（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)）、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平０８−１７３１７０）。
【００９５】
アスペルギルス(Aspergillus)属においては、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 、アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)）。
【００９６】
トリコデルマ(Trichoderma)属においては、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnology 7, 596-603 (1989)）。
【００９７】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。
【００９８】
本発明において使用するイミン還元酵素生産能を有する微生物は、イミン還元酵素生産能を有するストレプトマイセス属に属するすべての菌株、突然変異株、変種、遺伝子操作技術の利用により作成された本発明の酵素生産能を獲得した形質転換株を含む。
【００９９】
本発明の光学活性アミン誘導体の製造方法は、式（Ｉ）あるいは式（ＩＩＩ）で示される基質化合物を立体選択的に還元する能力を有するイミン還元酵素活性を有する酵素活性物質を、この酵素活性物質によって当該基質化合物の還元が可能な条件下で当該基質化合物に接触させる工程を含む。本発明において、酵素活性物質(enzymatic active materials)とは、式（Ｉ）あるいは式（ＩＩＩ）で示される基質化合物を立体選択的に還元する能力を有する微生物に由来する物質であって、その能力が維持された物質を意味する。具体的には、たとえば次のような要素は、イミン還元酵素活性を維持する限り、本発明における酵素活性物質に含まれる。
i) 式（Ｉ）あるいは式（ＩＩＩ）で示される基質化合物を立体選択的に還元する能力を有する微生物
ii) i)の微生物菌体の処理物
【０１００】
本発明において、微生物は、培養物であることもできるし、菌体であることもできる。培養物は、微生物の生存と増殖を支持する培地とともに当該微生物が存在する状態を言う。たとえば微生物を含む液体培地は、培養物である。一方、本発明においては、微生物そのものを指す用語として「菌体」（microbial cell）を用いる。菌体は、培養物から回収された微生物細胞を指す。たとえば遠心分離によって液体培地から微生物の菌体を回収することができる。培養物から回収された菌体を洗浄することによって、菌体表面の培地成分を除くこともできる。
【０１０１】
更に、ある態様においては、本発明における酵素活性物質は、上記i)の微生物から単離することができるイミン還元酵素を含む。また当該イミン還元酵素を担体に固定化されたものも、イミン還元酵素活性を維持する限り、酵素活性物質に含まれる。
【０１０２】
本発明において酵素活性物質は、そのまま、あるいは固定化して基質化合物と接触させることができる。微生物菌体あるいはその処理物を固定化するための種々の方法が公知である。たとえば、以下のような方法が微生物やその処理物の固定化方法として公知である。
ポリアクリルアミド法、
含硫多糖ゲル法（κ-カラギーナンゲル法など）、
アルギン酸ゲル法、
寒天ゲル法、
イオン交換樹脂法
あるいは、限外濾過膜等を用いたメンブレンバイオリアクター中で、微生物、その処理物、あるいは酵素を基質化合物と接触させて反応させることもできる。
【０１０３】
本発明における微生物による立体選択的なイミンの還元反応は、微生物を酵素が誘導される適切な前記培養条件において培養を行い、得られた培養液、あるいは培養液から採取した菌体や該菌体処理物、並びに酵素に反応基質であるイミン誘導体を加えて、インキュベートすることにより行うことができる。また、前記微生物の培養開始時、もしくは、培養途中に基質となるイミン誘導体を添加して、培養しながらイミンの立体選択的還元反応を行うこともできる。
【０１０４】
反応条件としては、たとえば以下の条件を示すことができる。
ｐＨ４．０から９．０、好ましくはｐＨ６．０から８．０、
温度１５から５０℃、好ましくは２０から４０℃、
反応時間は、４時間から７日間接触させる
一般に、微生物の培養と反応とを、別に行った方が、培地中の不純物の反応系への持ち込みを最小限に抑えることができる。その結果、反応後の生成物の精製において、有利な結果を期待できる。
【０１０５】
また酵素的還元反応においては、還元エネルギー源として、糖類、有機酸、アミノ酸、アルコールなどの存在下で反応を行うことにより、さらに効率的な反応が期待できる。還元エネルギー源として添加する化合物は、反応基質であるイミン誘導体量に応じて添加することができる。より具体的には、次のような還元エネルギー源に利用することができる。
糖類：グルコース、グルコース−６−リン酸、スクロースなど
有機酸：リンゴ酸、クエン酸、ギ酸など
アミノ酸：アラニン、グルタミン酸、リジンなど
アルコール：エタノール、イソプロパノールなど
その他、亜リン酸など無機化合物を還元エネルギー源として利用できる場合もある。
【０１０６】
本発明における還元反応は、水素供与体の存在下で進行する。したがって、本発明における基質化合物の還元が可能な条件は、水素供与体の存在下で、基質化合物と酵素活性物質とをインキュベートすることによって提供することができる。本発明における還元反応を助けるものであれば、任意の水素供与体を利用することができる。本発明における好ましい水素供与体は、ＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨである。本発明者らが単離に成功したストレプトマイセス・エスピー GF3587に由来するイミン還元酵素、およびそのホモログ、あるいは酵素活性物質を利用する場合には、ＮＡＤＰＨを利用するのが好ましい。
【０１０７】
上記還元反応に付随してＮＡＤＰＨから生成するＮＡＤＰ＋のＮＡＤＰＨへの再生は、微生物の持つＮＡＤＰ＋還元能（解糖系、メチロトローフのＣ１化合物資化経路など）を用いて行うことができる。これらＮＡＤＰ＋還元能は、反応系にグルコースやエタノール、などを添加することにより増強することが可能である。また、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。たとえば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などを含む微生物、その処理物、ならびに部分精製もしくは精製酵素を用いてＮＡＤＰＨの再生を行うことができる。これらのＮＡＤＰＨ再生に必要な反応を構成する成分は、本発明による光学活性アミンの製造のための反応系に添加する、固定化したものを添加する、あるいはＮＡＤＰＨの交換が可能な膜を介して接触させることができる。
【０１０８】
また、本発明のＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換した微生物の生菌体を前記光学活性アミンの製造方法に利用する場合には、ＮＡＤＰＨ再生のための付加的な反応系を不要とできる場合がある。すなわち、ＮＡＤＰＨ再生活性の高い微生物を用いることにより、形質転換体を用いた還元反応において、ＮＡＤＰＨ再生用の酵素を添加することなく効率的な反応が行える。さらに、ＮＡＤＰＨ再生に利用可能なグルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などの遺伝子を、本発明のイミン還元酵素をコードするＤＮＡと同時に宿主に導入することによって、より効率的なＮＡＤＰＨ再生酵素とイミン還元酵素の同時発現、イミン還元反応を行うことも可能である。これらの２つもしくはそれ以上の遺伝子の宿主への導入には、不和合性を避けるために複製起源のことなる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組換えベクターにより宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに両遺伝子を導入する方法、両方、もしくは、片方の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用することができる。
【０１０９】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
例えば、ＮＡＤＰＨ再生用酵素として、バシラス・サブチルス（Bacillus subtilis）やサーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）に由来するグルコース脱水素酵素が利用可能であり、具体的には、イミン還元酵素とバシラス・サブチリス由来のグルコース脱水素酵素の遺伝子を導入した組換えベクターであるpSGSRIR1などが好適に利用される。
【０１１０】
アミン誘導体の分解に伴って、反応液のｐＨに変化が見られる場合には、適当な酸、アルカリを用いてｐＨを一定範囲に調節することで、さらに良好な反応性を維持して、反応を継続することもできる。
【０１１１】
本発明において生菌体を使用した場合、反応液中に界面活性剤を添加しておけば反応時間の短縮を期待できる場合がある。この目的に用いられる界面活性剤としては、生菌体の細胞壁の透過性をあげるものであれば特に制限はなく、臭化セチルピリミジウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、トリトンＸ−１００、パライソオクチルフェニルエーテル、ツイーン８０、スパン６０等があげられ、反応液に対して、０．０００１〜１％程度使用することが好ましい。
【０１１２】
また、反応液中に有機溶媒を添加することによっても、同様の効果を期待できる場合がある。この目的に用いられる界面活性剤としては、生菌体の細胞壁の透過性をあげるものであれば特に制限はなく、トルエン、キシレンなどの有機溶媒があげられ、反応液に対して、０．０００１〜１％程度使用することが好ましい。
【０１１３】
また、反応液に添加せずとも、菌体を集菌後、界面活性剤および有機溶媒を含む水もしくはバッファーで前処理することにより、細胞壁の透過性を上げた菌体を用いてもよい。
【０１１４】
本発明における反応基質であるイミン誘導体は、目的とする生成物を効率的に生成できるように、適切な濃度で用いることができる。イミン誘導体は、菌体および当該反応を触媒する酵素に対して毒性を有することがあり、必ずしも高濃度反応が効率的な生産に結びつかないことがあり、注意を要する。イミン誘導体の反応液中における濃度として、たとえば０．０５から５０%w/v、好ましくは０．１から１０%w/vを示すことができる。イミン誘導体は、一括（バッチ法）、分割添加（フェドバッチ法）あるいは連続添加（フィード法）等の任意の方法で添加することができる。更に、基質となるイミンを添加せず、イミンの原料となるケトンとアミンを反応液に添加し、反応液中でイミンを生成させ、基質として供給することもできる。
【０１１５】
添加されるイミン誘導体は、不活性ガス雰囲気下で扱うことによって、着色が抑制され、製品品質の向上が期待できる。このような効果を期待して、不活性ガス雰囲気下で原料を反応液に添加することもできる。更に酵素反応をも不活性ガス雰囲気下で行うことによって、着色を防ぐことができる。ここで使用する不活性ガスとしては、たとえば窒素、アルゴン、ヘリウムなどが使用できる。特に窒素は、容易に入手することができる不活性ガスである。あるいは、アルゴンは空気よりも比重が大きいため、容易に拡散しない。したがって、開放作業においても、不活性ガス雰囲気下環境を維持できることから、操作上有利である。
【０１１６】
本発明は、基質化合物と酵素活性物質との接触によって得られた光学活性アミン誘導体を回収する工程を含む。具体的には、イミン誘導体の立体選択的還元により得られた光学活性なアミン誘導体は、各種クロマトグラフィーや結晶化などを組み合わせることにより、反応液から単離することができる。反応液中に蓄積された光学活性アミン誘導体は、たとえば次のような溶媒で抽出することができる。
酢酸エチル、
酢酸ブチル、
トルエン、
キシレン、
ヘキサン、
ヘプタン
メチルイソブチルケトン、
メチル−t-ブチルエーテル、
ハロゲン系などの有機溶媒。
【０１１７】
そして抽出されたアミン誘導体は、以下のようなクロマトグラフィーによって更に精製することができる。精製に先立って、必要に応じて、酸やアルカリによる洗浄、脱水剤による脱水などの処理を組み合わせることもできる。
イオン交換クロマトグラフィー、
吸着クロマトグラフィー
【０１１８】
たとえば、反応液から遠心分離や膜濾過などによって菌体などの不溶性物質を除去した後、アルカリ条件下で酢酸エチルなどの有機溶媒により抽出後、減圧濃縮することにより、光学活性アミン誘導体を採取することができる。
【０１１９】
また、菌体などの不溶性物質を除去した液を、アミン誘導体を吸着できるイオン交換樹脂などに吸着させ、アンモニア水や水酸化ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウムメタノール溶液、水酸化ナトリウムエタノール溶液などのアルカリで溶出させれば、簡便に高濃度溶液を得ることができる。
【０１２０】
また、溶媒抽出後、塩酸で塩酸塩化することにより、光学活性アミン誘導体を結晶として採取することができる。回収率を高めるために、溶媒を減圧濃縮しておいてもよく、あるいは溶媒を結晶性のよい溶媒に置換しておくこともできる。
【０１２１】
あるいは、光学活性アミン誘導体を、酸との塩の結晶として採取することにより、その光学純度を高めることができる場合がある。塩を精製する酸としては、塩酸、硫酸などの鉱酸、あるいはマンデル酸、クエン酸、酒石酸などの有機酸を利用することができる。こうして得られたアミン誘導体の塩を、強酸あるいは強アルカリに溶解した後、適当なアルカリもしくは酸で、ｐＨを中性付近とし、中和晶析することで、容易に他の不純物と分離することができる。アミン誘導体の塩を溶解する強酸性水溶液には、たとえば塩酸、硫酸などの鉱酸を利用することができる。また、強アルカリ性水溶液には、ＮａＯＨ水溶液やアンモニア水を利用することができる。
【０１２２】
また、加熱下水溶液とし、冷却し、再結晶することで容易に他の不純物と分離することができる。更に得られた結晶を少量の水に溶解し、適当な展開相で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行うことで更に高度に精製することができる。シリカゲルゲルクロマトグラフィーの展開相には、たとえばブタノール、酢酸、あるいはそれらと水の混合溶剤などを利用することができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１２３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。また、表中菌株の株名の示すGFとは、国立大学法人岐阜大学の保存菌株であることを示す。
［実施例１］（スクリーニング）
酵母エキス４ｇ／Ｌ、麦芽エキス１０ｇ／Ｌ、グルコース４ｇ／Ｌ、硫酸第二鉄・７水和物５ｍｇ／Ｌ、２−メチル−１−ピロリン１ｇ／ＬからなるｐＨ７．３に調製した液体培地を、１８ｍｍφ試験管に４ｍＬずつ分注し、オートクレーブを用い１２１℃、１５分間加熱滅菌した。ここに各種微生物を一白金耳接種し、２８℃、２〜６日間、振とう培養した。【０１２４】
得られた培養液から遠心分離によって集菌し、２−メチル−１−ピロリン１０ｍＭを含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、２５℃、２４時間振とう反応した。反応後、遠心分離によって菌を除いた後、シリカゲルを使用したＴＬＣ（展開液 １−ブタノール：酢酸：水＝２：１：１）で分析を行った。検出は、ニンヒドリンスプレーを噴霧することで行った。２−メチル−１−ピロリンが生成していた表１に示す４株の微生物による反応液は、さらに、ＧＩＴＣによる誘導体化後、液体クロマトグラフィーで２−メチル−１−ピロリンの光学純度を測定した。分析結果を表１に示す。その結果、（Ｒ）−２−メチルピロリジンが生成していることが確認できた。【０１２５】
［表１］
＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝
菌株名        蓄積量（ｍＭ）    光学純度（％ｅｅ）
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ＧＦ３５０１      ２．１０ｍＭ      ７１．６（Ｒ）
ＧＦ３５８５      １．００ｍＭ      ７９．８（Ｒ）
ＧＦ３５８７      ４．２０ｍＭ      ９９．１（Ｒ）
ＧＦ４４１５      １．２９ｍＭ      ８９．６（Ｒ）
＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝【０１２６】
［実施例２］ＧＦ３５８７の同定
ＧＦ３５８７の微生物学的特徴は、表２にまとめたとおりである。
［表２］
2010024444.tif 000021
続いて１６Ｓ ｒＤＮＡの解析によりＧＦ３５８７を同定した。１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列は、MicroSeq Full Gene 16S rDNA PCR/Sequencing kit (ABI製)により解析した。解析操作はキットの指示書に従った。得られた塩基配列を配列番号：１に示した。配列番号：１の塩基配列を元に、アポロンＤＢ（株式会社テクノスルガ、商品名）を用いて、Blast検索を行った結果、次の菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列にそれぞれ９９．９％の同一性を示した。
Streptomyces luridiseabiei S63、
S. griseorubiginosus NBRC 13047、
S. alboviridis NBRC 13013、
S. fulvorobeus NBRC 15898、
S. microflavus NBRC 13062【０１２７】
得られた結果を元に分子系統樹を作成した結果を図１に示した。クラスター解析の結果、ＧＦ３５８７は、以下の種のいずれかに帰属すると考えられたので、ＧＦ３５８７菌をストレプトマイセス・エスピー (Streptomyces sp.)と同定した。
Streptomyces griseorubiginosus
S. alboviridi
S. fulvorobeus 
S. microflavus【０１２８】
［実施例３］ＧＦ３５０１の同定
MicroSeq 500 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit (ABI製)を用いてＧＦ３５０１の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を解析した。解析操作はキットの指示書に従った。得られた結果を配列番号：２に示した。配列番号：２の塩基配列を、アポロンＤＢを用いてBlast検索を行った結果、最も高い同一性を示した基準株は Streptomyces rishiriensis NBRC 13407の９９．４％であった。同一性検索の結果に基づいて作成した分子系統樹を図２に示した。これらの結果より、ＧＦ３５０１をストレプトマイセス・エスピーと同定した。【０１２９】
［実施例４］ＧＦ３５８５の同定
MicroSeq 500 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit (ABI製)を用いてＧＦ３５８５の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を解析した。解析操作はキットの指示書に従った。得られた結果を配列番号：３に示した。配列番号：３の塩基配列を、アポロンＤＢを用いてBlast検索を行った結果、最も高い同一性を示した基準株は次のとおりで、同一性はいずれも９９．８％であった。
Streptomyces luridiscabiei S63, 
S. microflavus NBRC 13062, 
S. praecox NBRC 13073, 
S. halstedii NBRC 12783, 
S. griseorubiginosus NBRC 13047, 
S. griseolus NBRC 3415, 
S. anulatus NBRC 13369, 
S. alboviridis NBRC 13013, 
S. fulvorobeus NBRC 15897, 
S. griseus subsp. griseus NBRC 15744
同一性検索の結果に基づいて作成した分子系統樹を図３に示した。これらの結果より、GF3585をストレプトマイセス・カボウレンシス・サブスピーシーズ・ワシントネンシスに近縁のストレプトマイセス・エスピーと同定した。【０１３０】
［実施例５］ＧＦ４４１５の同定
MicroSeq 500 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit (ABI製)を用いてＧＦ４４１５の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を解析した。解析操作はキットの指示書に従った。得られた結果を配列番号：４に示した。配列番号：４の塩基配列を、アポロンＤＢを用いてBlast検索を行った結果、最も高い同一性を示した基準株は Streptomyces  omiyaensis NBRC 13449の９５．６％であり、別種の目安となる９７％以下の同一性であった。同一性検索の結果に基づいて作成した分子系統樹を図４に示した。これらの結果より、ＧＦ４４１５株をストレプトマイセス・エスピーと同定した。【０１３１】
［実施例６］酵素反応
実施例１にしたがって培養したStreptomyces sp. GF3587菌体を、ガラスビーズを用いて破砕し、遠心分離によって、未破砕菌体および菌体の残渣を除いた粗酵素液を得た。１０ｍＭ ２−メチル−１−ピロリンと、１０ｍＭ ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨを含む１００ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．０）に本粗酵素液１００μＬを加え、３０℃で保持しながら３４０ｎｍの吸光度を測定してＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を追跡することで、酵素活性を測定した。その結果、ＮＡＤＰＨを補酵素としたときの活性を１００％とすると、ＮＡＤＨでは７％の活性を示した。本結果より、２−メチル−１−ピロリンを還元するイミン還元酵素は、主にＮＡＤＰＨを補酵素として利用することを確認した。【０１３２】
［実施例７］菌体反応１
ＮＺアミン ４ｇ／Ｌ、麦芽エキス １０ｇ／Ｌ、グルコース ８ｇ／Ｌ、硫酸第二鉄・７水和物 ５ｍｇ／ＬからなるｐＨ７．３に調製した液体培地を、振とうフラスコに４０ｍＬずつ分注し、オートクレーブ中１２１℃、１５分間加熱滅菌した。ここに、Streptomyces sp. GF 3587を一白金耳接種し、２８℃、２４時間、振とう培養した。【０１３３】
得られた培養液から遠心分離によって菌体を集め、７５ｍＭ ２−メチル−１−ピロリン及び１００ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．０）を加え、２５℃で振とう反応させた。反応２４時間後に、一方の反応液には２％グルコースを添加し、もう一方の反応液はそのまま反応を継続した。反応結果を図５に示した。グルコースの添加により明らかに２−メチル−１−ピロリン還元反応は効率よく進行し、反応７２時間後には５４ｍＭの（Ｒ）−２−メチルピロリジンが生成した。【０１３４】
［実施例８］菌体反応２
実施例７に従ってStreptomyces sp. GF 3587を培養し、菌体を集めた。集めた菌体を、５０ｍＭ ２−メチル−１−ピロリン、４％グルコース、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、２５℃で振とう反応させた。反応開始後２４時間、４８時間、７２時間後に、２−メチル−１−ピロリンをそれぞれ２０ｍＭ、２０ｍＭ、１０ｍＭ添加して、反応性生物である（Ｒ）−２−メチルピロリジンの蓄積を観察した。反応結果を、図６に示した。反応８４時間後には、９１ｍＭ （Ｒ）−２−メチルピロリジンが蓄積した。生成した、（Ｒ）−２−メチルピロリジンの光学純度は９５％ｅｅ以上であった。光学純度の測定方法は以下のとおりである。【０１３５】
反応液５０μＬに以下の成分を添加して、４０℃、１時間反応することにより生成したアミンをＧＩＴＣ化し、ＨＰＬＣにより分離し定量した。
２ｍｇ／ｍＬトリエチルアミン ５０μＬおよび
８ｍｇ／ｍＬ２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルイソチオシアネート（ＧＩＴＣ） １００μＬ【０１３６】
ＨＰＬＣの条件は、以下のとおりである。
−ＨＰＬＣカラム：和光純薬株式会社製 Wakosil II 5C18 (4.6mm x 150 mm)
−溶離液：１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ２．５）：メタノール＝５５：４５
−流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
−検出：２５４ｎｍにおけるＵＶ吸収
上記条件下で、（Ｒ）−２−メチルピロリジンは２６．３分に、（Ｓ）−２−メチルピロリジンは２４．９分に溶出された。各溶出フラクションの２５４ｎｍにおけるＵＶ吸収に基づいて光学純度を決定した。【０１３７】
［実施例９］ＧＦ３５８７からのイミン還元酵素の精製
実施例７の方法によりＧＦ３５８７を培養し、菌体を調製した。得られた菌を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）及び１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む標準緩衝液に懸濁し、超音波により菌体を破砕した。
菌体破砕液を４０−７０％硫安分画を行い、得られた酵素を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）及び１ｍＭ ＤＴＴを含む緩衝液に透析した後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファーセルカラム（２．０ｘ１４ｃｍ）にアプライし、塩化カリウムにより段階的に溶出した。イミン還元酵素は、１００ｍＭ 塩化カリウムを含む１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液で溶出した。
活性画分を回収し、濃縮後、３０％硫酸で飽和したフェニル−セファロースカラム（１．０ｘ１４ｃｍ）にアプライし、同緩衝液で洗浄後、硫安濃度を段階的に下げて酵素を溶出した。硫安を含まない緩衝液で溶出した画分にイミン還元酵素は溶出した。精製の要約を表３に示した。【０１３８】
［表３］
ＧＦ３５８７からのイミン還元酵素の精製
＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝
精製ステップ          総タンパク質    総活性        比活性
（ｍｇ）      （Ｕ）      （Ｕ／ｍｇ）
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
無細胞抽出液            ７１７        １１２        ０．１５７
４０−７０％硫安分画    ２６８        ８７．６      ０．３２７
ＤＥＡＥ−セファーセル  ２２．５      ４５．８      ２．０４
フェニル−セファロース  ２．２        ６．６        ３．００
＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝【０１３９】
続いてＧＦ３５８７から精製されたイミン還元酵素の理化学的特徴を明らかにした。
（１）至適温度：
ＧＦ３５８７から精製されたイミン還元酵素の至適温度を検討した。以下の組成の反応液１ｍＬを１０−７０℃でインキュベートし、（Ｒ）−２−メチルピロリジンの生成に伴って減少する反応液中のＮＡＤＰＨの吸収（３４０ｎｍ）を測定した。反応液を各温度で予め５分間プレインキュベーションした後に、イミン還元酵素溶液（１２．３Ｕ／ｍＬ）を添加して反応を開始し、２分後の反応液の３４０ｎｍにおける吸収を測定した。イミン還元酵素１Ｕは、下記の組成の反応液を３０℃でインキュベートしたときに、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの減少（酸化）を触媒する酵素量とした。結果を図７に示す。この結果から、ＧＦ３５８７から精製されたイミン還元酵素の至適温度は５０℃であることが確認された。また４０−５５℃で最大活性の８０％以上が維持された。
反応液の組成：
２−メチル−１−ピロリン            １０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）  １００ｍＭ
ＮＡＤＰＨ                          ０．１ｍＭ
イミン還元酵素溶液                  １μＬ
-------------------------------------------------
total    １ｍＬ【０１４０】
（２）熱安定性：
次に、ＧＦ３５８７から精製されたイミン還元酵素の熱安定性について検討した。まず６．８５Ｕ／ｍＬのイミン還元酵素溶液を０〜５０℃で３０分間プレインキュベートし、１０分間氷冷した。次いで各温度で処理されたイミン還元酵素を（１）と同じ組成の反応液に加えて反応を開始し、３０℃で２分間インキュベートし、（Ｒ）−２−メチルピロリジンの生成に伴って減少する反応液中のＮＡＤＰＨの吸収（３４０ｎｍ）を測定した。結果を図８に示す。この結果から、ＧＦ３５８７から精製されたイミン還元酵素は３５℃まで約８０％の活性を維持し、４０℃以上の温度では急速に活性を失うことが確認された。【０１４１】
（３）至適ｐＨ：
更に、ＧＦ３５８７から精製されたイミン還元酵素の至適ｐＨについて検討した。緩衝液を変えた他は（１）と同じ組成の反応液にイミン還元酵素溶液（６．８２Ｕ／ｍＬ）を加えて反応を開始し、３０℃で２分間インキュベートした。実験に使用した緩衝液と、そのｐＨは次のとおりである。
１００ｍＭ  クエン酸緩衝液                ：ｐＨ３−６
１００ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液          ：ｐＨ４−５．５
１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液          ：ｐＨ６−８
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液            ：ｐＨ７．５−９
１００ｍＭ  グリシン水酸化ナトリウム緩衝液：ｐＨ９−１１
（Ｒ）−２−メチルピロリジンの生成に伴って減少する反応液中のＮＡＤＰＨの吸収（３４０ｎｍ）を測定した。結果を図９に示す。この結果から、ＧＦ３５８７から精製されたイミン還元酵素の至適ｐＨは６．５であることが確認された。またｐＨ６．０〜７．５で最大活性の８０％以上が維持された。【０１４２】
（４）ｐＨ安定性：
次に、ＧＦ３５８７から精製されたイミン還元酵素の安定性に与えるｐＨの影響について検討した。（３）と同じ緩衝液に溶解したイミン還元酵素（３．６７Ｕ／ｍＬ）を３０℃で３０分間プレインキュベーションした。次いで各ｐＨで処理されたイミン還元酵素を（１）と同じ組成の反応液に加えて反応を開始し、３０℃で２分間インキュベートし、（Ｒ）−２−メチルピロリジンの生成に伴って減少する反応液中のＮＡＤＰＨの吸収（３４０ｎｍ）を測定した。結果を図１０に示す。この結果から、ＧＦ３５８７から精製されたイミン還元酵素はｐＨ６．５〜８．５で３０℃、３０分間処理後に活性の８０％以上を維持することが確認された。【０１４３】
（５）基質特異性：
ＧＦ３５８７から精製されたイミン還元酵素の基質特異性を明らかにするために、表４に示す化合物に対する作用を比較した。【０１４４】
（６）分子量の測定：
ＧＦ３５８７から精製されたイミン還元酵素のサブユニットの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより求めた結果、約３２，０００であった。また、SephacrylTM S-200のゲルろ過カラムを用いて分子量を測定したところ、６５，０００〜７０，０００であった。【０１４５】
以下の組成の反応液１ｍＬを３０−６５℃でインキュベートし、（Ｒ）−２−メチルピロリジンの生成に伴って減少する反応液中のＮＡＤＰＨの吸収（３４０ｎｍ）を測定した。表４に示した各基質化合物を含む反応液に、イミン還元酵素溶液（２．０４Ｕ／ｍＬ）を添加して反応を開始し、２分後の反応液の３４０ｎｍにおける吸収を測定した。
反応液の組成：
基質化合物                            ０．０５−２５ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）    １００ｍＭ
ＮＡＤＰＨ                            ０．１ｍＭ
イミン還元酵素溶液                    １μＬ
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
total  １ｍＬ【０１４６】
この結果から、ＧＦ３５８７から精製されたイミン還元酵素、表４に示す化合物のうち、次の化合物に対する還元作用が確認された。表中の相対活性は、２−メチル−１−プロリン（２−ＭＰＮ）に対する酵素作用を１００とする相対活性を意味している。
２−メチル−１−ピロリン：                          １００％
【化２７】
2010024444.tif 000022
Ｎ−ベンジリデンベンジルアミン：                    ３０％
【化２８】
2010024444.tif 000023
Ｎ−（Ｅ）−Ｎ−（１−フェニルエチリデン）アニリン：  ２９％
【化２９】
2010024444.tif 000024
ジヒドロ葉酸：                                      ７．６％
【化３０】
2010024444.tif 000025
【０１４７】
［表４］
==================================================================
基質化合物（濃度）                      相対活性
------------------------------------------------------------------
2-Methyl-1-pyrroline (2-MPN) (10mM)             １００ (2.04U/mL)
N-((E/Z)-N-(1-phenylethylidene) aniline (25mM)  ２９
N-Benzylidenebenzylamine (10mM)                 ３０
Acetophenone oxime (1mM)                        ０
Dihydrofolic acid (0.05mM)                      ７．６
2-Methylpyrazine (10mM)                         ０
2-Methylpyrimidine (10mM)                       ０
2-Methylimidazole (10mM)                        ０
2-Methylthiazole (10mM)                         ０
2-Methylfuran (10mM)                            ０
2-Methylthiophene (5mM)                         ０
1,4,5,6-Tetrahydropyrimidine (10mM)             ０
==================================================================【０１４８】
［実施例１０］GF3587 Streptomyces 近縁株の酵素活性
ＧＦ３５８７の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と９９．９％の同一性を有するストレプトマイセス属のタイプストレインを以下の組成の培養液中で２８℃、４８〜７２時間振盪培養し、集菌して静止菌体を調製した。
培養液組成：
NZ amine 4 g/L
麦芽エキス 20 g/L
グルコース 8 g/L
硫酸鉄(II)七水和物 5 mg/L
-------------------------
水道水で１Lにfill up  (pH 7.3)【０１４９】
培養したストレプトマイセス属のタイプストレインは次の３株である。これらの菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列は、いずれもStreptomyces sp. GF3587と９９．８％の同一性を持つ（実施例４）。
ストレプトマイセス・グリセオルビギノサス (Streptomyces griseorubiginosus) NBRC 13047
ストレプトマイセス・マイクロフラバス (S. microflavus) NBRC 13062
ストレプトマイセス・アルボビリディス (S. alboviridis) NBRC 13013【０１５０】
８ｍＬの培養液より得られた菌体を５０ｍＭ ２−メチル−１−ピロリン、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２％グルコースを含む４ｍＬの反応液中で、２５℃、４８時間反応させ、生成した（Ｒ）−２−メチルピロリジンを定量した。その結果、表５に示すとおり、ＧＦ３５８７の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と９９．９％の同一性を有するストレプトマイセス属のタイプストレイン４株中３株が光学純度９８％ｅｅ以上の（Ｒ）−２−メチルピロリジン（２−ＭＰ）を生成した。【０１５１】
［表５］
=================================================================
株 反応時間 2-MP 光学純度
-----------------------------------------------------------------
S. griseorubiginosus NBRC 13047 24 h 6.4 mM >98% ee(R)
48 h 17.2 mM >98% ee(R)
S. microflavus NBRC 13062 24 h 9.0 mM >98% ee(R)
48 h 35.7 mM >98% ee(R)
S. alboviridis NBRC 13013 24 h 0.17 mM >98% ee(R)
48 h 0.54 mM >98% ee(R)
=================================================================
この実験に用いた３株の微生物は、いずれも製品評価技術基盤機構(http://www.nbrc.nite.go.jp)の生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）より分譲を受けることができる。当該機関の連絡先は次のとおりである。
〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
独立行政法人  製品評価技術基盤機構
バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）遺伝資源保存課【０１５２】
［実施例１１］イミン還元酵素の部分アミノ酸配列
実施例９で得られた酵素を用いて、プロテインシーケンサー（Procise 494 HT Protein Sequencer System）によりＮ末端アミノ酸配列を解析した。アミノ酸配列を配列番号：７に示した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルより、イミン還元酵素を含むゲル断片を切り出し、２回洗浄後、リジルエンドペプチダーゼを用いて、３５℃で終夜イン・ゲル・ダイジェションを行った。消化したペプチドを逆相ＨＰＬＣ(東ソー製TSK gel ODS-80-Ts、 2.0 mm × 250 mm)を用い、０．１％トリフルオロ酢酸中でアセトニトリルのグラジエント溶出によりペプチドを分離し、分取した。【０１５３】
分取したペプチドピーク１種をlep_38とし、プロテインシーケンサー（Procise 494 HT Protein Sequencer System）によりアミノ酸配列の解析を行った。lep_38のアミノ酸配列を配列番号：８で示した。【０１５４】
［実施例１２］Streptomyces sp. GF 3587からの染色体ＤＮＡの精製
実施例７の方法によりＧＦ３５８７を培養し、菌体を調製した。菌体からの染色体ＤＮＡの精製は、J.Dairy Sci. , 75 , 1186-1191(1992)に記載の方法により行った。【０１５５】
［実施例１３］イミン還元酵素遺伝子のコア領域のクローニング
N末端アミノ酸配列、lep_38のアミノ酸配列を基にそれぞれセンスプライマー、アンチセンスプライマーを合成した。それぞれの塩基配列を配列番号：９(SsRIR-Nmix) 、１０(SsRIR-IAmix) に示した。【０１５６】
プライマー各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ １０ｎｍｏｌ、Streptomyces sp. GF 3587由来染色体ＤＮＡ ５０ｎｇ、Ｅｘ−Ｔａｑ用緩衝液（タカラバイオ製）、５％ＤＭＳＯ、Ｅｘ−Ｔａｑ １Ｕ（タカラバイオ製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９４℃、３０秒）、アニール（４５℃、３０秒）、伸長（７０℃、１分５秒）を３０サイクル、GeneAmp PCR System 9700（アプライド・バイオシステムズ製）を用いて行った。【０１５７】
ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、８００ｂｐあたりに特異的と思われるバンドが検出できた。このＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、決定されたコア領域の塩基配列を配列番号：１１として示した。【０１５８】
［実施例１４］イミン還元酵素遺伝子のコア領域周辺の塩基配列の解析
Streptomyces sp. GF 3587由来染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨI、ＡｐａI、ＳａｃIで消化し、Ｔ４リガーゼを用いて１６℃で終夜セルフ・ライゲーション反応により、各断片を環化させた。次に、プライマーSsRIR-UP（配列番号：１２）およびSsRIR-DW（配列番号：１３）を各１００ｐｍｏｌ、環化ＤＮＡを２５ｎｇ、Ｅｘ−Ｔａｑ用緩衝液（タカラバイオ製）、５％ＤＭＳＯ、Ｅｘ−Ｔａｑ １Ｕ（タカラバイオ製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９５℃、３０秒）、アニール（５５℃、３０秒）、伸長（７２℃、７分）を３０サイクル、GeneAmp PCR System 9700（アプライド・バイオシステムズ製）を用いて行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、ＢａｍＨI、ＡｐａI、ＳａｃIで消化した鋳型ＤＮＡに対応して、約６，０００ｂｐ、４，０００ｂｐ、１，４００ｂｐのＤＮＡ断片が検出できた。このＤＮＡ断片の塩基配列を解析した結果、イミン還元酵素遺伝子のＯＲＦ配列を決定することができた。決定したＤＮＡ配列は配列番号：５に、予想されるアミノ酸配列を配列番号：６に示す。【０１５９】
［実施例１５］イミン還元酵素遺伝子のクローニング
イミン還元酵素の構造遺伝子配列を基にＯＲＦのみをクローニングするためのプライマーSsRIR-ATG1（配列番号：１４）、SsRIR-TAA1（配列番号：１５）を合成した。プライマーを各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ １０ｎｍｏｌ、Streptomyces sp. GF 3587由来染色体ＤＮＡ ５０ｎｇ、Pfu Turbo-DNA Polymerase用緩衝液（STRATAGENE製)、５％ＤＭＳＯ、Pfu Turbo-DNA Polymerase １．９Ｕ（STRATAGENE製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９８℃、３０秒）、アニール（６０℃、１分）、伸長（７２℃、１分１０秒）を３０サイクル、GeneAmp PCR System 9700（アプライド・バイオシステムズ製）を用いて行った。【０１６０】
得られたＤＮＡ断片をGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ＧＥヘルスケア製）により精製して回収した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏI、ＸｂａIで２重消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ＧＥヘルスケア製）により精製した。【０１６１】
得られたＤＮＡ断片を、ＮｃｏI、ＸｂａIで２重消化したｐＳＥ４２０Ｄ（Invitrogen製のプラスミドベクターｐＳＥ４２０のマルチクローニングサイトを改変したプラスミド、特開２０００−１８９１７０）とTakara Ligation Kitを用いて、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。【０１６２】
形質転換株をアンピシリンを含むＬＢ培地で生育させ、生育した形質転換体からプラスミドを抽出し、イミン還元酵素遺伝子が挿入されている事が確認できたプラスミドをpSUSRIR1とした。プラスミド構築の過程を図１１に示した。【０１６３】
［実施例１６］組換えイミン還元酵素の活性評価
イミン還元酵素を発現するプラスミドpSUSRIR1で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株を、アンピシリンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行った。【０１６４】
菌体を遠心分離により集菌した後、１ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置ＵＣＤ−２００ＴＭ（コスモバイオ製）を用いて菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液として回収した。また該遺伝子を含まない大腸菌ＪＭ１０９をＬＢ培地で終夜培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ添加後さらに４時間培養した菌体を同様に破砕して、菌体抽出液を回収した。【０１６５】
それぞれの菌体抽出液を用いて２−メチル−１−ピロリンに対するイミン還元活性を測定した。結果を表６に示した。活性測定の方法は実施例６と同様とした。
［表６］
2010024444.tif 000026
【０１６６】
［実施例１７］イミン還元酵素と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素を共発現するプラスミドpSGSRIR1の構築
枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を発現するプラスミドｐＳＥ−ＢＳＧ１（特開２０００−１８９１７０）をＮｃｏI、ＸｂａIの２つの制限酵素で二重消化し、pSUSRIR1から同酵素で切り出したイミン還元酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片とTakara Ligation Kitを用いてライゲーションし、イミン還元酵素とグルコース脱水素酵素を同時に発現可能なプラスミドであるpSGSRIR1を得た。プラスミド構築の過程を図１２に示した。【０１６７】
［実施例１８］イミン還元酵素とグルコース脱水素酵素の大腸菌による同時発現
pSGSRIR1で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株をアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行った。
菌体を遠心分離により集菌した後、１ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置ＵＣＤ−２００ＴＭ（コスモバイオ製）を用いて菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液として回収し、２−メチル−１−ピロリンに対するイミン還元活性とグルコース脱水素活性を測定した。結果を表６に示した。なお、グルコース脱水素活性の測定は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、２．５ｍＭ ＮＡＤＰ＋、１００ｍＭグルコースおよび菌体抽出液を含む反応液中で、３０℃で行った。１Ｕは、上記反応条件において１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨ生成を触媒する酵素量とした。【０１６８】
［実施例１９］Streptomyces kanamyceticusからの染色体ＤＮＡの精製
Streptomyces kanamyceticus NBRC 13414を放線菌用ＹＥＭＥ培地で培養して菌体を調製した。菌体からの染色体ＤＮＡの精製は、J.Dairy Sci. , 75 , 1186-1191(1992)に記載の方法により行った。【０１６９】
［実施例２０］イミン還元酵素のホモログQ1EQE0のクローニング
ＤＤＢＪに登録されている予想タンパク質Q1EQE0のＤＮＡ配列とアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１６、配列番号：１７に示した。配列番号：１６を基にしてＰＣＲ用プライマー（配列番号：１８）、（配列番号：１９）を合成した。プライマーを各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ １０ｎｍｏｌ、Streptomyces kanamyceticus NBRC 13414由来染色体ＤＮＡ ５０ｎｇ、Pfu Turbo-DNA polymerase用緩衝液（STRATAGENE製）、５％ＤＭＳＯ、Pfu Turbo-DNA polymerase １．９Ｕ（STRATAGENE製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９８℃、３０秒）、アニール（６０℃、１分）、伸長（７２℃、１分１０秒）を３０サイクル、GeneAmp PCR System 9700（アプライド・バイオシステムズ製）を用いて行った。得られたＤＮＡ断片をGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ＧＥヘルスケア製）により精製して回収した。
回収したＤＮＡ断片をＮｃｏI、ＸｂａIで２重消化したｐＳＥ−ＢＳＧ１（特開２０００−１８９１７０）にIn-fusion systemにより挿入して、Q1EQE0とグルコース脱水素酵素を同時に発現可能なプラスミドであるpSG-SKI1を得た。プラスミド構築の過程を図１３に示した。【０１７０】
［実施例２１］Ｑ１ＥＱＥ０とグルコース脱水素酵素の大腸菌による同時発現
ｐＳＧ−ＳＫＩ１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株をアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行った。
菌体を遠心分離により集菌した後、１ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置ＵＣＤ−２００ＴＭ（コスモバイオ製）を用いて菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液として回収し、２−メチル−１−ピロリンに対するイミン還元活性とグルコース脱水素活性を測定した。結果を表６に示した。【０１７１】
［実施例２２］組換え大腸菌による（Ｒ）−２−メチルピロリジンの製造
pSGSRIR1で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株およびｐＳＧ−ＳＫＩ１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株をアンピシリンを含む１０ｍＬの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行った。
菌体を遠心分離により集菌した後、４７．５ｍＭ ２−メチル−１−ピロリン、１００ｍＭ グルコースを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬに懸濁し、終夜２５℃で振とう反応を行った。反応後、生成した２−メチルピロリジンの光学純度、及び、反応液中における２−メチル−１−ピロリンと２−メチルピロリジンの濃度を実施例８と同様にして分析した。その結果、生成した（Ｒ）−２−メチルピロリジンの光学純度は９９％ｅｅ以上、反応収率は９５％以上であった。結果を表７に示した。【０１７２】
［表７］
2010024444.tif 000027
【産業上の利用可能性】
【０１７３】
本発明は、イミンの立体選択的還元による、（Ｒ）体光学活性アミン誘導体の製造方法を提供する。本発明によって製造される（Ｒ）体光学活性アミン誘導体は、医薬品原料などとして有用である。たとえば、（Ｒ）−２−メチルピロリジンは、医薬品原料として有用な化合物である。【０１７４】
2010024444.tif 000028
【図１】
2010024444.tif 000038
【図２】
2010024444.tif 000039
【図３】
2010024444.tif 000040
【図４】
2010024444.tif 000041
【図５】
2010024444.tif 000042
【図６】
2010024444.tif 000043
【図７】
2010024444.tif 000044
【図８】
2010024444.tif 000045
【図９】
2010024444.tif 000046
【図１０】
2010024444.tif 000047
【図１１】
2010024444.tif 000048
【図１２】
2010024444.tif 000049
【図１３】
2010024444.tif 000050
【配列表】
2010024444000001.app
【国際調査報告】
2010024444.tif 000051
2010024444.tif 000052
2010024444.tif 000053
2010024444.tif 000054