(57)【要約】  成長が促進された魚類を提供する。  本発明の魚類は、４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）遺伝子について、機能喪失していることを特徴とする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）遺伝子について、機能喪失していることを特徴とする、魚類。
【請求項２】
ＭＣ４Ｒ遺伝子を部分欠失または完全欠失している、請求項１記載の魚類。
【請求項３】
前記魚類は、フグ科、タイ科、ハタ科、およびメダカ科からなる群から選択された少なくとも一つの魚類である、請求項１または２記載の魚類。
【請求項４】
養殖用である、請求項１から３のいずれか一項に記載の魚類。
【請求項５】
前記魚類は、前記魚類の可食部である、請求項１から４のいずれか一項に記載の魚類。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか一項に記載の魚類と、他の魚類とを交配する交配工程を含むことを特徴とする、魚類の生産方法。
【請求項７】
前記交配工程で得られた魚類を生育する生育工程を含む、請求項６記載の生産方法。
【請求項８】
前記交配工程に先立って、
被検魚類の生体試料における４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）の発現量を測定する測定工程、および
前記被検魚類から、請求項１から４のいずれか一項に記載の魚類を選抜する被検魚類選抜工程を含み、
前記被検魚類選抜工程において、前記被検魚類の生体試料におけるＭＣ４Ｒの発現量と、基準値とに基づき、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失している被検魚類を選抜する、請求項６または７記載の生産方法。
【請求項９】
前記交配工程に先立って、対象魚類から、請求項１から４のいずれか一項に記載の魚類を作出する作出工程を含み、
前記作出工程は、前記対象魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子に、機能喪失変異を導入する変異工程を含む、請求項６または７記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類および魚類の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トラフグ等の魚類の一部は、養殖により供給されている。ただし、養殖でトラフグを生育する場合、性成熟した成魚を得るまでに、例えば、雄では２年、雌では３年という長期間の飼育が必要となる。このため、魚類の養殖にあたり、魚類の飼育期間の短縮化が求められている（非特許文献１）。【０００３】
また、養殖したトラフグの成魚等の養殖された魚類の成魚は、天然の成魚より小型である。このため、成魚の収量（重量）の増加が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Shao Jun Du et.al, “Growth enhancement in transgenic atlantic salmon by the use of an “all fish” chimeric growth hormone gene construct”, 1992, Biotechnology, Vol. 10, pages 176-181
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、成長が促進された魚類の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の魚類は、４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）遺伝子について、機能喪失していることを特徴とする。【０００７】
本発明の魚類の生産方法（以下、「生産方法」ともいう）は、前記本発明の魚類と、他の魚類とを交配する交配工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、例えば、正常型のＭＣ４Ｒ遺伝子を有する魚類と比較して、成長が促進された魚類を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、実施例１におけるＭＣ４Ｒ遺伝子について機能喪失しているトラフグの体重を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例２におけるＭＣ４Ｒ遺伝子について機能喪失しているクサフグの体重を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例４におけるＭＣ４Ｒ遺伝子について機能喪失しているメダカの体重を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例５におけるＭＣ４Ｒ遺伝子について機能喪失しているメダカの接餌量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の魚類は、例えば、ＭＣ４Ｒ遺伝子を部分欠失または完全欠失している。
【００１１】
本発明の魚類において、前記魚類は、例えば、フグ科、タイ科、ハタ科、およびメダカ科からなる群から選択された少なくとも一つの魚類である。
【００１２】
本発明の魚類は、例えば、養殖用である。
【００１３】
本発明の魚類は、例えば、正常型のＭＣ４Ｒ遺伝子を含む対照魚類と比較して、成長が促進されている。
【００１４】
本発明の魚類において、前記魚類は、例えば、前記魚類の可食部である。
【００１５】
本発明の生産方法は、例えば、前記交配工程で得られた魚類を生育する生育工程を含む。
【００１６】
本発明の生産方法は、例えば、前記交配工程に先立って、
被検魚類の生体試料における４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）の発現量を測定する測定工程、および
前記被検魚類から、前記本発明の魚類を選抜する被検魚類選抜工程を含み、
前記被検魚類選抜工程において、前記被検魚類の生体試料におけるＭＣ４Ｒの発現量と、基準値とに基づき、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失している被検魚類を選抜する。
【００１７】
本発明の生産方法は、例えば、前記交配工程に先立って、被検魚類から、前記本発明の魚類を選抜する被検魚類選抜工程を含む。
【００１８】
本発明の生産方法は、例えば、前記被検魚類の生体試料における４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）の発現量を測定する測定工程を含み、
前記被検魚類選抜工程において、前記被検魚類の生体試料におけるＭＣ４Ｒの発現量と、基準値とに基づき、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失している被検魚類を選抜する。
【００１９】
本発明の生産方法は、例えば、前記交配工程に先立って、対象魚類から、前記本発明の魚類を作出する作出工程を含み、
前記作出工程は、前記対象魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子に、機能喪失変異を導入する変異工程を含む。
【００２０】
本発明の生産方法において、前記機能喪失変異は、例えば、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の部分欠失変異または完全欠失変異である。
【００２１】
本発明の生産方法において、前記変異工程は、例えば、
前記対象魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子に変異を導入する変異導入工程、および
前記変異導入工程で得られた対象魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失変異を有している対象魚類を選抜する変異選抜工程を含む。
【００２２】
本発明の生産方法は、例えば、前記変異導入工程後の対象魚類の生体試料におけるＭＣ４Ｒの発現量を測定する測定工程を含み、
前記変異選抜工程において、前記対象魚類の生体試料におけるＭＣ４Ｒの発現量と、基準値とに基づき、ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失変異を有している対象魚類を選抜する。
【００２３】
本発明の生産方法において、前記ＭＣ４Ｒの発現量は、例えば、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子のタンパク質の発現量である。
【００２４】
本発明の生産方法において、前記生体試料は、例えば、脳である。
【００２５】
＜魚類＞
本発明の魚類は、前述のように、４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）遺伝子について、機能喪失していることを特徴とする。本発明の魚類は、ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失していることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の魚類は、例えば、後述の本発明の生産方法、スクリーニング方法、成長促進方法、および変異ＭＣ４Ｒ遺伝子の説明を援用できる。
【００２６】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ＭＣ４Ｒ遺伝子が魚類の成長と関連していること、具体的には、ＭＣ４Ｒ遺伝子の機能喪失により、魚類の成長が促進されることを見出し、本発明を確立するに至った。本発明の魚類は、ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失しているため、例えば、正常型のＭＣ４Ｒ遺伝子（以下、「正常ＭＣ４Ｒ遺伝子」ともいう）を有し、かつＭＣ４Ｒ遺伝子以外が同一である魚類（以下、「野生型の魚類」または「対照魚類」ともいう）と比較して、成長が促進されている。前記成長は、例えば、前記魚類の体長の伸長、体重の増加、体積の増加、および摂餌量の増加のいずれでもよい。このため、本発明の魚類によれば、前記野生型の魚類と比較して、例えば、目的の成長段階に達するまでの飼育期間を短縮でき、特に、養殖用の魚類としての使用に適している。また、本発明の魚類は、メカニズムは不明であるが、例えば、前記野生型の魚類と比較して、性成熟するまでの期間が短い。このため、本発明の魚類によれば、例えば、前記野生型の魚類と比較して、より短い期間で交配（例えば、採卵、採精）可能となるため、特に、養殖用の魚類としての使用に適している。
【００２７】
本発明において、「魚類」は、例えば、脊椎動物亜門から四肢動物を除外した動物群に分類される動物を意味する。具体例として、前記魚類は、例えば、フグ科（Tetraodontidae：puffers）、ハコフグ科（Ostraciidae：boxfishes)、タイ科（Sparidae：sea breams and porgies）、ハタ科（Serranidae：sea basses）、メダカ科（Oryziidae：medakas）、ヒラメ科（Paralichthys）等の魚類があげられる。前記フグ科の魚類は、例えば、トラフグ（Takifugu rubripes）、マフグ（Takifugu porphyreus）、クサフグ（Takifugu niphobles）等のトラフグ属（Takifugu）、シロサバフグ（Lagocephalus wheeleri）等のサバフグ属（Lagocephalus）等の魚類があげられる。前記ハコフグ科の魚類は、例えば、ハコフグ（Ostracion immaculatus）等のハコフグ属の魚類があげられる。前記タイ科の魚類は、例えば、マダイ（Pagrus major）、ゴウシュウマダイ（Pagrus auratus）等のマダイ属（Pagrus）；クロダイ（Acanthopagrus schlegelii）、キチヌ(Acanthopagrus latus)等のAcanthopagrus属；キダイ（連子鯛）（Dentex tumifrons）等のキダイ属（Dentex）等の魚類があげられる。前記ハタ科の魚類は、例えば、マハタ（Epinephelus septemfasciatus）、クエ（Epinephelus bruneus）、キジハタ（Epinephelus akaara)、ヤイトハタ（Epinephelus malabaricus）等のマハタ属（Epinephelus）；スジアラ（Plectropomus leopardus）等のスジアラ属（Plectropomus）等の魚類があげられる。前記メダカ科の魚類は、例えば、メダカ（Oryzias latipes、Oryzias sakaizumii）、ジャワメダカ（Oryzias javanicus）等のメダカ属（Oryzias）等の魚類があげられる。前記ヒラメ科の魚類は、例えば、ヒラメ（Paralichthys olivaceus）等があげられる。本発明において、前記魚類は、例えば、養殖用の魚類であることが好ましい。
【００２８】
本発明において、前記魚類は、前記魚類の全体でもよいし、その一部（部分）でもよい。前記魚類の全体である場合、前記魚類の成長段階は、特に制限されず、例えば、仔魚（幼生）、稚魚、未成魚（幼魚、若魚）、および成魚のいずれでもよい。前記魚類の一部は、特に制限されず、例えば、前記魚類の可食部があげられる。前記可食部は、例えば、筋肉、食道、胃、幽門垂、腸管、精巣、卵巣、肝臓、脾臓、心臓、浮き袋、表皮等があげられる。
【００２９】
本発明において、４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）遺伝子は、魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子であればよい。具体例として、前記魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子は、例えば、下記表１のＭＣ４Ｒ遺伝子（正常ＭＣ４Ｒ遺伝子）が例示できる。下記表１におけるアクセッション番号は、ＧｅｎＢａｎｋにおけるアクセッション番号である。
【００３０】
【表１】
2019066052.tif 000003
【００３１】
トラフグ由来のＭＣ４Ｒ遺伝子のｍＲＮＡ（配列番号１）
5’-ATGAACGCCACCGATCCCCCTGGGAGGGTGCAGGACTTCAGCAACGGGAGCCAAACCCCGGAGACGGACTTTCCAAACGAGGAGAAGGAATCGTCTACGGGATGCTACGAGCAGATGCTGATCTCCACGGAGGTGTTCCTGACTCTGGGAATCATCAGCCTGCTGGAGAACATCCTGGTGGTCGCCGCTATAGTGAAGAACAAGAATCTCCACTCGCCCATGTACTTTTTCATCTGCAGCCTGGCCGTGGCCGACATGCTCGTGAGCGTCTCCAACGCCTCCGAGACGATCGTCATAGCGCTCATCAACAGCGGCACGCTGACCATCCCCGCCACGCTGATCAAGAGCATGGACAACGTGTTTGACTCCATGATCTGCAGCTCTTTGCTGGCGTCCATCTGCAGCCTGCTCGCCATCGCCGTCGACCGCTACATCACCATCTTCTACGCCCTGCGCTACCACAACATCGTCACCCTGCGGAGAGCCTCGCTGGTCATCAGCAGCATCTGGACGTGCTGCACCGTGTCCGGCGTGCTCTTCATCGTCTACTCGGAGAGCACCACCGTGCTCATCTGCCTCATCACCATGTTCTTCACCATGCTGGTGCTCATGGCCTCCCTCTACGTCCACATGTTCCTGCTGGCGCGCCTGCACATGAAGCGGATCGCGGCGATGCCGGGCAACGCGCCCATCCACCAGAGAGCCAACCTGAAGGGCGCCATCACCCTCACCATCCTCCTGGGAGTGTTTGTGGTCTGCTGGGCGCCTTTCTTCCTTCACCTCATCCTCATGATCACCTGCCCCAAGAACCCATACTGCACGTGCTTCATGTCCCACTTCAACATGTACCTCATCCTCATCATGTGCAACTCCGTCATCGACCCCATCATCTACGCCTTTCGCAGCCAGGAGATGAGAAAAACCTTCAAGGAGATCTTCTGCTGCTCCCAAATGCTGGTGTGCATGTGA-3’
【００３２】
マダイ由来のＭＣ４Ｒ遺伝子のｍＲＮＡ（配列番号２）
5’-ATGAACAGCACAGATCTCCATGGATTGATCCAGGGCTACCACAACAGGAGCCAAACGTCAGTTTTGCCTCTGAACAAAGACTTACCAGCCGAGGAGAAGGACTCATCGGCAGGATGCTACGAACAGCTGCTGATTTCTACAGAGGTGTTCCTCACTCTGGGCATCATCAGCCTGCTGGAGAACATCCTGGTTGTTGCTGCAATCGTCAAGAACAAGAACCTTCACTCGCCCATGTACTTCTTCATCTGTAGCCTCGCTGTTGCTGACATGCTCGTGAGCGTCTCCAACGCCTCCGAGACCATCGTCATAGCGCTCATCGATGGAGGCAACCTGACCATCCCCGCCACGCTGATCAAGAACATGGACAATGTATTTGACTCTATGATCTGTAGCTCTCTGTTAGCGTCTATCTGCAGCTTGCTCGCCATCGCCATCGATCGCTACATCACCATCTTCTACGCGCTGCGGTACCACAACATTGTCACCCTGCGGAGAGCCATATTGGTCATCAGCAGCATCTGGACGTGCTGCACCGTCTCTGGCATCCTCTTCATCATCTACTCAGAGAGCACCACGGTGCTCATCTGCCTCATCACCATGTTCTTCACCATGCTCGTTCTCATGGCGTCGCTCTACGTGCACATGTTCCTTCTGGCGCGCTTGCACATGAAGCGGATCGCCGCTCTGCCGGGCAACGCGCCCATCCACCAGCGGGCCAACATGAAGGGCGCCATCACCCTCACCATCCTCCTCGGGGTGTTCGTGGTGTGCTGGGCGCCCTTCTTCCTCCACCTCATCCTCATGATCACCTGCCCCAGGAACCCCTACTGCACCTGCTTCATGTCCCACTTCAACATGTACCTCATCCTCATCATGTGCAACTCCGTCATCGACCCCATCATCTACGCTTTCCGCAGCCAGGAGATGAGGAAGACCTTCAAGGAGATTTTCTGCTGCTCTCACACTTTCCTGTGCGTGtga-3’
【００３３】
クサフグ由来のＭＣ４Ｒ遺伝子のｍＲＮＡの部分配列（配列番号３）
5’-GGAGGTGTTCCTGACTCTGGGAATCATCAGCCTGCTGGAGAACATCCTGGTGGTCGCCGCTATAGTGAAGAACAAGAATCTCCACTCGCCCATGTACTTTTTCATCTGCAGCCTGGCCGTGGCCGACATGCTCGTGAGCGTCTCCAACGCCTCCGAGACGATCGTCATAGCGCTCATCAACAGCGGCACGCTCACCATCCCCGCCACGCTGATCAAGAGCATGGACAACGTGTTTGACTCCATGATCTGCAGCTCCTTGCTGGCGTCCATCTGCAGCCTGCTCGCCATCGCCGTCGACCGCTACATCACCATCTTCTACGCCCTGCGCTACCACAACATCGTCACCCTGCGGAGAGCCTCGCTGGTCATCAGCAGCATCTGGACGTGCTGCACCGTGTCCGGCGTGCTCTTCATCGTCTACTCGGAGAGCACCACCGTGCTCATCTGCCTCATCACCATGTTCTTCACCATGCTGGTGCTCATGGCCTCCCTCTACGTCCACATGTTCCTGCTGGCGCGCCTGCACATGAAGCGGATCGCGGCGATGCCGGGCAACGCGCCCATCCACCAGAGAGCCAACCTGAAGGGCGCCATCACCCTCACCATCCTCCTGGGAGTGTTTGTGGTCTGCTGGGCGCCTTTCTTCCTTCACCTCATCCTCATGATCACCTGCCCCAAGAACCCATACTGCACGTGCTTCATGTCCCACTTCAACATGTACCTCATCCTCATCATGTGCAACTCCGTCATCGACCCCATCATCTACGCCTTTCGCAGCCAGGAGATGA-3’
【００３４】
メダカ由来のＭＣ４Ｒ遺伝子のｍＲＮＡ（配列番号４）
5’-ATGAACTCCACTCTGCCTTATGGGTCGGTCCCCAACAGAAGCCTCTCCTCGGCCACTCTCCCTCCTGACCTGGGAGGACAGAAAGACTCGTCGGCGGGATGCTACGAGCAGCTTCTGATCTCCACTGAGGTCTTCCTCACTTTGGGCATCATCAGCCTGCTGGAGAACATCCTGGTTGTTGCTGCGATCGTTAAAAACAAGAACCTCCACTCCCCCATGTACTTTTTCATCTGCAGCCTCGCAGTAGCCGATATGTTGGTCAGCGTCTCCAACGCGTCTGAGACCATCGTCATAGCGCTCATTAACGGAGGCAACCTGAGCATTCCTGTCAGGCTCATCAAGAGCATGGACAATGTGTTTGACTCCATGATCTGCAGCTCTCTGCTGGCCTCCATCTGCAGCTTGCTGGCCATTGCCGTTGACCGCTACATCACCATCTTCTACGCTCTGCGATACCACAACATCGTGACGCTGCGGCGAGCAGCCGTGGTCATCAGCAGCATCTGGACGTGCTGCATTGTGTCGGGTATCCTCTTCATCATCTACTCGGAGAGTACCACGGTGCTCATCTGTCTCATCACCATGTTCTTCACCATGCTGGTGCTCATGGCCTCCCTCTATGTCCACATGTTCCTGCTGGCACGTCTGCACATGAAGCGGATCGCGGCGCTGCCGGGCAACGCGCCCATCCACCAGCGGGCGAACATGAAGGGCGCCATCACCCTCACCATCCTCCTCGGGGTGTTTGTGGTGTGCTGGGCGCCGTTCTTCCTCCACCTCATCCTCATGATCACCTGCCCCAGGAACCCTTACTGCACCTGCTTCATGTCGCACTTCAACATGTACCTCATTCTCATCATGTGCAACTCCGTCATCGACCCCATCATCTACGCTTTCCGGAGCCAGGAGATGAGGAAAACCTTCAAGGAGATCTTCTGCTGCTCCAACGCTCTCCTGTGTGTGTGA-3’
【００３５】
本発明において、「機能喪失」は、例えば、当該遺伝子の本来有する機能が低下または失われた状態を意味する。前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の機能喪失は、例えば、前記野生型の魚類と比較して、本発明の魚類の成長が促進される程度に、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の機能が低下または失われた状態を意味する。また、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の機能喪失は、例えば、ＭＣ４Ｒを介するシグナル伝達が低下する、または前記シグナル伝達に欠陥が生じることを意味する。前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の機能喪失は、具体的には、例えば、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子のｍＲＮＡもしくはＭＣ４Ｒタンパク質の発現量が低下している状態、または前記ＭＣ４Ｒ遺伝子のｍＲＮＡもしくはＭＣ４Ｒタンパク質が完全に発現していない状態を意味してもよいし、機能的なＭＣ４Ｒ遺伝子のｍＲＮＡもしくはＭＣ４Ｒタンパク質の発現量が低下している状態または機能的なＭＣ４Ｒ遺伝子のｍＲＮＡもしくはＭＣ４Ｒタンパク質が完全に発現していない状態を意味してもよい。
【００３６】
前記魚類は、例えば、一対の常染色体のそれぞれに、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子を有する。また、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の機能喪失により得られる、魚類の成長促進形質は、例えば、優性形質である。このため、本発明の魚類は、例えば、一対の常染色体のＭＣ４Ｒ遺伝子のうち、いずれか一方の常染色体のＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失してもよいし、両方の常染色体のＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失してもよい。
【００３７】
前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の機能喪失は、例えば、前記正常ＭＣ４Ｒ遺伝子に対し、突然変異、より具体的には、機能喪失変異を導入することにより、引き起こすことができる。前記突然変異の種類は、特に制限されず、例えば、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフト突然変異、広範囲における塩基の欠失（ラージデリーション）等があげられる。具体例として、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の機能喪失は、例えば、前記正常ＭＣ４Ｒ遺伝子の塩基配列に対し、１塩基以上の挿入、欠失、および／または置換等の変異を導入することにより引き起こすことができる。前記ＭＣ４Ｒ遺伝子における変異の位置は、特に制限されず、前記正常ＭＣ４Ｒ遺伝子に関連する任意の領域とすることができるが、例えば、前記正常ＭＣ４Ｒ遺伝子のプロモーター領域等の発現制御領域、前記ＭＣ４Ｒタンパク質の膜貫通領域、リガンド結合領域等のＭＣ４Ｒタンパク質をコードするコーディング領域、前記ＭＣ４Ｒタンパク質をコードしない非コード領域（例えば、イントロン、エンハンサー領域等）等があげられる。前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の機能喪失は、例えば、前記魚類の成長をより促進できることから、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の部分欠失または完全欠失により、引き起こされていることが好ましい。前記部分欠失は、例えば、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子における一部の塩基配列が欠失していること意味する。前記ＭＣ４Ｒ遺伝子における部分欠失の位置は、特に制限されず、例えば、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子における変異の位置の説明を援用できる。また、前記完全欠失は、例えば、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子における全ての塩基配列が欠失していること、すなわち、ＭＣ４Ｒタンパク質をコードする遺伝子が存在しないことを意味する。この場合、本発明の魚類は、例えば、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子を完全欠失している。
【００３８】
前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の機能喪失は、例えば、対象の魚類のゲノムにおけるＭＣ４Ｒ遺伝子に対し、常法により、変異を導入することにより引き起こすことができる。前記変異の導入方法は、例えば、相同組換え、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＰＦ１等を用いたゲノム編集技術等により、実施できる。前記変異の導入方法は、例えば、部位特異的突然変異誘発法等の変異導入法により、実施してもよい。また、前記変異の導入方法は、例えば、ランダム突然変異誘発法により、実施してもよい。前記ランダム突然変異誘発法は、例えば、α線、β線、γ線、Ｘ線等の放射線照射、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、エチニルニトロソウレア（ＥＮＵ）等の変異誘発剤による処理、重イオンビーム等があげられる。なお、上述の各変異の導入方法は、例えば、市販のキット等を用いて実施してもよい。
【００３９】
本発明の魚類は、例えば、後述の本発明の生産方法、スクリーニング方法、および成長促進方法により生産することもできる。
【００４０】
＜魚類の生産方法＞
本発明の魚類の生産方法は、前述のように、前記本発明の魚類と、他の魚類とを交配する交配工程を含むことを特徴とする。本発明の生産方法は、前記交配工程において、前記本発明の魚類を用いることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の生産方法によれば、例えば、前記野生型の魚類と比較して、成長が促進された魚類を生産することができる。前記機能喪失変異を有するＭＣ４Ｒ遺伝子は、本発明の魚類の生殖細胞を介して、後代の魚類に受け継がせることが可能である。このため、本発明の生産方法によれば、例えば、本発明の魚類と、他の魚類とを交配することにより、前記機能喪失変異を有するＭＣ４Ｒ遺伝子および前記機能喪失変異を有するＭＣ４Ｒ遺伝子に起因する形質を受け継ぐ後代の魚類を簡易に生産できる。本発明の生産方法は、例えば、前記本発明の魚類、後述のスクリーニング方法、成長促進方法、および変異ＭＣ４Ｒ遺伝子の説明を援用できる。
【００４１】
前記交配工程において、第一の親として使用する魚類は、前記本発明の魚類であればよい。前述のように、前記本発明の魚類は、例えば、後述の前記本発明のスクリーニング方法および成長促進方法により得ることもできる。このため、前記本発明の魚類は、例えば、前記交配工程に先立って、被検魚類から、選抜することで準備してもよい。また、前記本発明の魚類は、例えば、対象魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子に、機能喪失変異を導入することで準備してもよい。
【００４２】
前記被検魚類から選抜する場合、本発明の生産方法は、例えば、前記被検魚類から、前記本発明の魚類を選抜する被検魚類選抜工程を含む。前記被検魚類選抜工程において、前記本発明の魚類の選抜は、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失している被検魚類の選抜ということができる。前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の機能喪失は、例えば、前記被検魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子の塩基配列を解読し、前記正常ＭＣ４Ｒ遺伝子の塩基配列と比較することにより、実施してもよい。そして、例えば、前記被検魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子の塩基配列が、前記正常ＭＣ４Ｒ遺伝子の塩基配列に対して、機能喪失変異が導入されている場合、前記被検魚類を本発明の魚類として選抜する。前記塩基配列の比較は、例えば、公知の塩基配列の解析ソフトにより実施できる。また、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の機能喪失が、前記正常ＭＣ４Ｒ遺伝子の塩基配列に対し、１塩基以上の挿入、欠失、および／または置換等の変異を導入することにより引き起こされる場合、例えば、少なくとも１つの変異を検出可能なプライマーセット、プローブ、またはこれらの組合せを用いて、実施してもよい。前記プライマーセットおよびプローブは、例えば、前記変異の種類に基づき、公知の設計方法を用いて設計できる。また、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の機能喪失は、例えば、前記被検魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子のｍＲＮＡまたはＭＣ４Ｒタンパク質の機能に基づき、判断することで、実施してもよい。さらに、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の機能喪失は、例えば、前記被検魚類におけるＭＣ４Ｒの発現の有無またはＭＣ４Ｒの発現量に基づき、判断することで、実施してもよい。
【００４３】
前記ＭＣ４Ｒの発現量に基づき、判断する場合、本発明の生産方法は、例えば、前記被検魚類の生体試料におけるＭＣ４Ｒの発現量を測定する測定工程を含み、前記被検魚類選抜工程において、前記被検魚類の生体試料におけるＭＣ４Ｒの発現量と、基準値とに基づき、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失している被検魚類を選抜することにより実施できる。具体的に、前記機能喪失している被検魚類の選抜は、例えば、前記被検魚類の生体試料におけるＭＣ４Ｒの発現量と、前記基準値とを比較することにより実施できる。
【００４４】
前記被検魚類の生体試料は、特に制限されず、例えば、前記被検魚類の全身のいずれの臓器でもよいし、前記臓器由来の細胞でもよい。前記被検魚類の生体試料は、例えば、鰭、脳等があげられる。前記測定工程で使用する生体試料の種類は、例えば、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。
【００４５】
前記測定工程において測定するＭＣ４Ｒの発現量は、例えば、前記ＭＣ４Ｒタンパク質の発現量があげられる。前記ＭＣ４Ｒタンパク質の発現量は、例えば、紫外吸収法、ビシンコニン酸法等の分光光度計を用いた方法、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング等の公知のタンパク質の定量方法により、実施できる。
【００４６】
前記基準値は、例えば、前記野生型の魚類におけるＭＣ４Ｒの発現量、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失している魚類（例えば、ＭＣ４Ｒ遺伝子の完全欠失魚類）におけるＭＣ４Ｒの発現量等があげられる。前記基準値として前記機能喪失している魚類におけるＭＣ４Ｒ遺伝子の発現量を用いる場合、前記機能喪失している魚類は、例えば、一対の染色体上のそれぞれに座乗する２つのＭＣ４Ｒ遺伝子のうち、いずれか一方のＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失している魚類でもよいし、両方のＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失している魚類でもよい。前記基準値とするＭＣ４Ｒの発現量は、例えば、前記被検魚類の生体試料と同じ条件で採取した生体試料におけるＭＣ４Ｒの発現量を、前記被検魚類の生体試料と同様の方法で測定することにより、得ることができる。前記基準値は、例えば、予め測定してもよいし、前記被検魚類の生体試料と同時に測定してもよい。
【００４７】
この場合、前記被検魚類選抜工程において、前記被検魚類におけるＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失しているかの評価方法は、特に制限されず、前記基準値の種類によって、適宜決定できる。具体例として、前記被検魚類の生体試料におけるＭＣ４Ｒの発現量が、前記野生型の魚類におけるＭＣ４Ｒの発現量より低い場合、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失している魚類におけるＭＣ４Ｒの発現量と同じ場合（有意差がない場合）、および／または機能喪失している魚類におけるＭＣ４Ｒの発現量より低い場合、前記被検魚類は、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失していると評価できる。そして、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失していると評価された被検魚類を、例えば、前記本発明の魚類として選抜する。
【００４８】
前記対象魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子に、機能喪失変異を導入する場合、本発明の生産方法は、例えば、前記交配工程に先立って、前記対象魚類から、前記本発明の魚類を作出する作出工程を含む。前記作出工程は、例えば、前記対象魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子に、機能喪失変異を導入する変異工程を含む。前記ＭＣ４Ｒ遺伝子に対する機能喪失変異の導入は、例えば、前記正常ＭＣ４Ｒ遺伝子に対し、突然変異を導入することにより、実施できる。具体例として、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子に対する機能喪失変異の導入は、例えば、前記正常ＭＣ４Ｒ遺伝子の塩基配列に対し、１塩基以上の挿入、欠失、および／または置換等の変異を導入することにより、実施できる。前記変異工程において、前記機能喪失変異は、例えば、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の部分欠失変異または完全欠失変異である。前記対象魚類は、例えば、前記野生型の魚類があげられる。前記突然変異の種類、変異の位置等は、前述の本発明の魚類における前記突然変異の種類、変異の位置等の説明を援用できる。
【００４９】
前記変異工程は、前記対象魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子に変異を導入する変異導入工程、および前記変異導入工程で得られた対象魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失変異を有している対象魚類を選抜する変異選抜工程を含むことが好ましい。前記変異工程における機能喪失変異の導入方法および前記変異導入工程における変異の導入方法は、例えば、前述の変異の導入方法の説明を援用できる。
【００５０】
前記変異選抜工程において、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子における機能喪失変異の有無は、例えば、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の機能が喪失しているかを評価することにより実施できる。前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の機能喪失は、例えば、前記対象魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子の塩基配列を解読し、前記正常ＭＣ４Ｒ遺伝子の塩基配列と比較することにより、実施してもよい。また、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の機能喪失は、例えば、前記対象魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子のｍＲＮＡまたはＭＣ４Ｒタンパク質の機能に基づき、判断することで、実施してもよい。さらに、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の機能喪失は、例えば、前記対象魚類におけるＭＣ４Ｒの発現の有無またはＭＣ４Ｒの発現量に基づき、判断することで、実施してもよい。
【００５１】
前記ＭＣ４Ｒの発現量に基づき、判断する場合、本発明の生産方法は、例えば、前記変異導入後の対象魚類の生体試料におけるＭＣ４Ｒの発現量を測定する測定工程を含み、前記変異選抜工程において、前記対象魚類の生体試料におけるＭＣ４Ｒの発現量と、基準値とに基づき、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失している対象魚類を選抜することにより実施できる。前記測定工程および前記変異選抜工程は、例えば、前記被検魚類から選抜する場合における前記測定工程および前記被検魚類選抜工程と同様に実施でき、「被検魚類」を「対象魚類」に、「被検魚類選抜工程」を「変異選抜工程」と読み替えて、その説明を援用できる。そして、前記機能喪失しているかの評価後において、例えば、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失していると評価された対象魚類を、前記対象魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失変異を有している対象魚類、すなわち、前記本発明の魚類として選抜する。
【００５２】
前記交配工程は、前述のように、前記本発明の魚類と、他の魚類とを交配する工程である。交配に使用する前記本発明の魚類は、例えば、他の魚類と同種の魚類である。前記他の魚類は、本発明の魚類と交配可能な魚類であればよく、例えば、前記正常ＭＣ４Ｒ遺伝子を有する魚類でもよいし、機能喪失しているＭＣ４Ｒ遺伝子を有する魚類でもよい。前記「交配可能」は、例えば、自然または人工的に交配可能なことを意味する。前記交配工程において、前記本発明の魚類と、他の魚類との交配方法は、特に制限されず、雄の魚類と雌の魚類とによる自然繁殖でもよいし、雄の魚類の配偶子（精子）および雌の魚類の配偶子（卵）を用いた人工繁殖でもよい。前記人工繁殖により交配を実施する場合、例えば、性成熟した本発明の魚類および他の魚類から配偶子を採取する。そして、例えば、一方の魚類に由来する卵と、他方の魚類に由来する精子とを受精させることにより、交配させる、すなわち、受精卵を作製する。また、前記交配工程では、例えば、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失している魚類から採取した生殖細胞等を別の魚類に移植し、移植された魚類と、他の魚類とを交配することにより、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失している魚類等を取得してもよい。
【００５３】
本発明の生産方法は、例えば、前記交配工程で得られた魚類を生育する生育工程を含んでもよい。前記魚類の生育条件および生育方法は、例えば、前記魚類の成長段階および前記魚類の種類に応じて適宜決定できる。前記生育工程では、例えば、前記魚類の任意の成長段階まで生育してよい。
【００５４】
＜成長が促進された魚類のスクリーニング方法＞
本発明の成長が促進された魚類のスクリーニング方法（以下、「スクリーニング方法」ともいう）は、被検魚類から、４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）遺伝子について、機能喪失している被検魚類を選抜する被検魚類選抜工程を含むことを特徴とする。本発明のスクリーニング方法は、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失している被検魚類を選抜することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明のスクリーニング方法によれば、例えば、特に養殖に適した成長が促進された魚類を簡便にスクリーニングできる。このため、本発明のスクリーニング方法は、例えば、成長が促進された魚類の生産方法ということもできる。本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記本発明の魚類、生産方法、後述の成長促進方法、および変異ＭＣ４Ｒ遺伝子の説明を援用できる。
【００５５】
本発明のスクリーニング方法における被検魚類選抜工程は、例えば、前記本発明の生産方法における被検魚類選抜工程と同様に実施でき、その説明を援用できる。
【００５６】
本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記被検魚類の生体試料における４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）の発現量を測定する測定工程を含み、前記被検魚類選抜工程において、前記被検魚類の生体試料におけるＭＣ４Ｒの発現量と、基準値とに基づき、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失している被検魚類を選抜する。
【００５７】
本発明のスクリーニング方法において、前記ＭＣ４Ｒの発現量は、例えば、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子のタンパク質の発現量である。
【００５８】
本発明のスクリーニング方法において、前記生体試料は、例えば、鰭、脳等があげられる。
【００５９】
＜魚類の成長促進方法＞
本発明の魚類の成長促進方法（以下、「成長促進方法」ともいう）は、前述のように、対象魚類の４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）遺伝子に、機能喪失変異を導入する変異工程を含むことを特徴とする。本発明の成長促進方法は、ＭＣ４Ｒ遺伝子に、機能喪失変異を導入することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の成長促進方法によれば、例えば、前記対象魚類の成長を促進できる。このため、本発明のスクリーニング方法は、例えば、成長が促進された魚類の生産方法ということもできる。本発明の成長促進方法は、例えば、前記本発明の魚類、生産方法、スクリーニング方法、および後述の変異ＭＣ４Ｒ遺伝子の説明を援用できる。
【００６０】
本発明の成長促進方法における変異工程は、例えば、前記本発明の生産方法における変異工程と同様に実施でき、その説明を援用できる。
【００６１】
本発明の成長促進方法において、前記機能喪失変異は、例えば、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の部分欠失変異または完全欠失変異である。
【００６２】
本発明の成長促進方法において、前記変異工程は、例えば、前記対象魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子に変異を導入する変異導入工程、および前記変異導入工程で得られた対象魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失変異を有している対象魚類を選抜する変異選抜工程を含む。
【００６３】
本発明の成長促進方法は、例えば、前記変異導入工程後の対象魚類の生体試料におけるＭＣ４Ｒの発現量を測定する測定工程を含み、前記変異選抜工程において、前記対象魚類の生体試料におけるＭＣ４Ｒの発現量と、基準値とに基づき、ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失変異を有している対象魚類を選抜する。
【００６４】
本発明の成長促進方法において、前記ＭＣ４Ｒの発現量は、例えば、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子のタンパク質の発現量である。
【００６５】
本発明の成長促進方法において、前記生体試料は、例えば、鰭、脳等があげられる。
【００６６】
＜魚類の変異型の４型メラノコルチン受容体遺伝子＞
本発明の魚類の変異型の４型メラノコルチン受容体（ＭＣ４Ｒ）遺伝子（以下、「変異ＭＣ４Ｒ遺伝子」ともいう）は、前述のように、魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子において、機能喪失変異を有していることを特徴とする。本発明の変異ＭＣ４Ｒ遺伝子は、魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子において、機能喪失変異を有していることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の変異ＭＣ４Ｒ遺伝子によれば、例えば、魚類の成長を促進することができる。本発明の変異ＭＣ４Ｒ遺伝子は、例えば、前記本発明の魚類、生産方法、スクリーニング方法、および成長促進方法の説明を援用できる。
【００６７】
前記魚類のＭＣ４Ｒ遺伝子は、前記魚類の正常ＭＣ４Ｒ遺伝子である。前記機能喪失変異の種類は、特に制限されず、例えば、前述の突然変異の説明を援用できる。本発明の変異ＭＣ４Ｒ遺伝子において、前記機能喪失変異は、例えば、前記ＭＣ４Ｒ遺伝子の部分欠失変異である。
【００６８】
本発明の変異ＭＣ４Ｒ遺伝子は、例えば、前記正常ＭＣ４Ｒ遺伝子に対して、機能喪失変異を導入することにより製造できる。前記機能喪失変異の導入は、例えば、前述の変異の導入方法があげられる。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。【００７０】
［実施例１］
ＭＣ４Ｒ遺伝子について機能喪失しているトラフグを作出し、それぞれ、野生型のトラフグと比較して、成長が促進されていることを確認した。【００７１】
（１）受精卵の作製
性成熟した雌雄のトラフグに対して、性ホルモン（雌：des Gly10 [D-Ala6]-LHRH, 400 μg/kg 体重、雄：des Gly10 [D-Ala6]-LHRH, 200 μg/kg 体重または、Human chorionic gonadotropin, 500IU/kg 体重）を筋肉内投与することにより、性ホルモン処理を実施した。性ホルモン処理後、３−６日において、腹部を圧迫することにより、雌雄のトラフグから、それぞれ、卵（未受精卵）および精子を採取した。得られた卵および精子について、人工授精させ、受精卵を取得した。【００７２】
（２）機能喪失トラフグの作出
変異の導入は、下記参考文献１を参照し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いて実施した。まず、ＳＰ６  ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用のＣａｓ９発現ベクター（pCS2+hSpCas9）を以下の手順で作製した。ヒト用にコドン最適化したS. pyogenesのＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列は、下記Ｃａｓ９用プライマーセットとｐＸ３３０（Addgene Plasmid 42230）とを用いて、ＰＣＲにより増幅した。得られたＰＣＲ産物を、ｐＣＳ２＋ＭＴベクターの制限酵素サイト（ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ）にクローニングすることで、Ｃａｓ９発現ベクターを取得した。なお、前記Ｃａｓ９発現ベクターは、Addgene（http://www.addgene.org）から入手可能である。
参考文献１：Satoshi Ansai et.al, “Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka”, Biology Open, 2014, vol.3, pages 362-371
参考文献２：Turner, D. L. and Weintraub, H. “Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.”, 1994, Genes Dev, vol. 8, pages 1434-1447.【００７３】
ＣＡＳ９用プライマーセット
フォワードプライマー（hSpCas9FW、配列番号５）
5’-GCAGGATCCGCCACCATGGACTATAAGGAC-3’
リバースプライマー（hSpCas9RV、配列番号６）
5’-AGTTCTAGATTACTTTTTCTTTTTTGCCTGGC-3’【００７４】
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の発現ベクターを以下の手順で作製した。ｓｇＲＮＡ発現ベクターの作製には、部分ガイドＲＮＡ配列の上流に、Ｔ７プロモーターが配置されているｐＤＲ２７４ベクター（Addgene Plasmid 42250）を用いた。各ｓｇＲＮＡ作製用オリゴＤＮＡの１ペアーを合成し、アニーリングした後に、それらをｐＤＲ２７４ベクターに挿入した。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてｓｇＲＮＡ１およびｓｇＲＮＡ２を合成後、ＲＮＡ精製カートリッジを用いて、前記ｓｇＲＮＡ１およびｓｇＲＮＡ２を精製した。前記ｓｇＲＮＡ作製用オリゴＤＮＡの１ペアーの合成は、Operon Biotechnologies社が実施した。前記ｓｇＲＮＡ１およびｓｇＲＮＡ２のゲノム上のターゲットサイトは、下記表２の通りである。なお、前記配列番号１の塩基配列において、１つ目の下線で示す塩基配列が、ｓｇＲＮＡ１のターゲット配列であり、２つ目の下線で示す塩基配列が、ｓｇＲＮＡ２のターゲット配列に相補的な塩基配列である。【００７５】
【表２】
2019066052.tif 000004
【００７６】
前記ｓｇＲＮＡ１作製用オリゴＤＮＡの１ペアー（１Ｓおよび１ＡＳ）を、それぞれの終濃度が、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、アニーリングバッファーに添加し、前記ｓｇＲＮＡ１と相補鎖とをアニーリングした。前記アニーリングバッファーの組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２および５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌとした。前記アニーリングは、９５℃で２分間加熱処理後、１時間かけて２５℃までゆっくり冷却することにより、実施した。また、前記ｓｇＲＮＡ２についても、同様にしてアニーリングした。ｐＤＲ２７４ベクターを、制限酵素（BsaI-HF、New England Biolabs）で処理し、アニーリング後のｓｇＲＮＡ１およびｓｇＲＮＡ２のそれぞれとライゲーションすることで、ｓｇＲＮＡ発現ベクターを取得した。【００７７】
つぎに、前記Ｃａｓ９発現ベクターを制限酵素（ＮｏｔＩ）処理することにより、直線化した。そして、直線化されたＣａｓ９発現ベクターおよびＲＮＡ合成キット（mMessage mMachine SP6 Kit、Life Technologies）を用いて、Ｃａｓ９をコードするキャップＲＮＡ（Ｃａｓ９ＲＮＡ）を合成した。得られたキャップＲＮＡは、ＲＮＡ精製キット（RNeasy Mini Kit 、Qiagen）を用いて、精製した。【００７８】
前記ｓｇＲＮＡ発現ベクターを、制限酵素（ＤｒａＩ）処理することにより、直線化した。そして、直線化されたｓｇＲＮＡ発現ベクターおよびＲＮＡ合成キット（AmpliScribe（商標）T7-Flash（商標）Transcription Kit、Epicentre）を用いて、ｓｇＲＮＡ１およびｓｇＲＮＡ２を合成した。得られたｓｇＲＮＡ１およびｓｇＲＮＡ２を、それぞれ、ＲＮＡ精製キット（RNeasy Mini Kit 、Qiagen）を用いて、精製した。【００７９】
前記（１）で得られた１細胞期の受精卵の細胞質に、２〜１０ｐｇ  Ｃａｓ９ＲＮＡ、および１〜５ｐｇ  ｓｇＲＮＡ１またはｓｇＲＮＡ２を、顕微注入法より導入することにより、ＭＣ４Ｒ遺伝子に変異を導入した。この結果、下記配列番号１３〜１５の塩基配列（ｓｇＲＮＡ１のターゲット配列）において、下線で示す５、７、または１３塩基が欠失した個体（トラフグ系統１〜３）、および下記配列番号１６〜１７の塩基配列（ｓｇＲＮＡ２のターゲット配列）において、下線で示す４または５塩基が欠失した個体（トラフグ系統４〜５）、すなわち、機能喪失変異（機能欠失変異）が導入された個体が得られた。
トラフグ系統１
5’-CAGCAACGGGAGCCAAACCCCGG-3’（配列番号１３）
トラフグ系統２
5’-CAGCAACGGGAGCCAAACCCCGG-3’（配列番号１４）
トラフグ系統３
5’-CAGCAACGGGAGCCAAACCCCGG-3’（配列番号１５）
トラフグ系統４
5’-CATGCTCTTGATCAGCGTGGCGG-3’（配列番号１６）
トラフグ系統５
5’-CATGCTCTTGATCAGCGTGGCGG-3’（配列番号１７）【００８０】
前記導入後の受精卵を培養し、孵化させた後、通常の養殖方法により飼育した。また、飼育開始後７、８、１２、１５、２０、および２４ヶ月における各個体（ｎ＝４９、４９、４８、４８、４５、１７）の体重を測定した。コントロールは、無処理とした以外は同様にして、各個体（各月：ｎ＝３０）の体重を測定した。なお、コントロールは、株式会社ヒガシマルで飼育されたものである。この結果を、下記表３および図１に示す。【００８１】
【表３】
2019066052.tif 000005
【００８２】
図１は、ＭＣ４Ｒ遺伝子について機能喪失しているトラフグの体重を示すグラフである。図１において、横軸は、飼育期間を示し、縦軸は、体重を示す。図１および前記表３に示すように、いずれの飼育期間においても、実施例１のトラフグは、コントロールのトラフグ（野生型のトラフグ）と比較して、体重が有意に増加していた。また、食用として出荷される野生型のトラフグの体重は１ｋｇであることが知られている。前記表３および図１から明らかなように、コントロールのトラフグは、体重１ｋｇに達するためには、２０ヶ月以上の飼育期間が必要であった。これに対し、実施例１のトラフグは、１２ヶ月で体重１ｋｇに達した。すなわち、実施例１のトラフグは、コントロールのトラフグと比較して、約２倍の成長速度で成長した。【００８３】
以上のことから、本発明の魚類は、野生型の魚類と比較して、成長が促進されているため、例えば、飼育期間を短縮できることが分かった。【００８４】
［実施例２］
ＭＣ４Ｒ遺伝子について機能喪失しているクサフグを作出し、それぞれ、野生型のクサフグと比較して、成長が促進されていることを確認した。【００８５】
雌雄のトラフグに代えて、雌雄のクサフグを用い、前記ｓｇＲＮＡ２のみを用いた以外は、同様にして、ＭＣ４Ｒ遺伝子に変異を導入した。この結果、下記塩基配列（ｓｇＲＮＡ１のターゲット配列）において、下線で示す５または７塩基が欠失した個体（クサフグ系統１〜２）すなわち、機能欠失変異が導入された個体が得られた。なお、前記配列番号３の塩基配列における下線で示す塩基配列が、ｓｇＲＮＡ２のターゲット配列に相補的な塩基配列である。
クサフグ系統１
5’-CATGCTCTTGATCAGCGTGGCGG-3’（配列番号１６）
クサフグ系統２
5’-CATGCTCTTGATCAGCGTGGCGG-3’（配列番号１７）【００８６】
つぎに、前記導入後のクサフグの受精卵を用いた以外は、前記実施例１と同様にして、飼育開始後１、２、３、４、５、６、７、および８ヶ月における各個体（ｎ＝１７）の体重を測定した。また、コントロールは、無処理とした以外は同様にして、各個体（ｎ＝７）の体重を測定した。この結果を下記表４および図２に示す。【００８７】
【表４】
2019066052.tif 000006
【００８８】
図２は、ＭＣ４Ｒ遺伝子について機能喪失しているクサフグの体重を示すグラフである。図２において、横軸は、飼育期間を示し、縦軸は、体重を示す。図２および前記表４に示すように、いずれの飼育期間においても、実施例２のクサフグは、コントロールのクサフグ（野生型のクサフグ）と比較して、体重が有意に増加していた。また、飼育期間８ヶ月において、実施例２のクサフグは、野生型のクサフグと比較して、体重が１．２３倍であり、１．２３倍の成長速度を示した。【００８９】
以上のことから、本発明の魚類は、野生型の魚類と比較して、成長が促進されているため、例えば、飼育期間を短縮できることが分かった。【００９０】
［実施例３］
ＭＣ４Ｒ遺伝子について機能喪失しているトラフグおよびクサフグについて、性成熟が促進されていることを確認した。【００９１】
前記実施例１で得られたＭＣ４Ｒ遺伝子について機能喪失している雌のトラフグ（ｎ＝３）について、飼育期間２４ヶ月において、前述の性ホルモン処理を実施した。そして、性処理ホルモン後、３〜６日において、腹部を圧迫し、排卵を確認したところ、全ての雌のトラフグで排卵が確認された。一般的に、雌の野生型のトラフグの性成熟は、最低３年必要であることが知られている。これに対し、雌のＭＣ４Ｒ遺伝子について機能喪失しているトラフグは、２年で性成熟しており、性成熟が促進されていることが分かった。【００９２】
つぎに、実施例２で得られた雄のクサフグについて、排精を確認した。この結果、飼育期間６ヶ月で排精する雄のクサフグが現れ、７ヶ月では、４個体、８ヶ月では５個体の雄で排精が確認された（全１９個体、雌雄混合）。一般的に、雄の野生型のクサフグの性成熟は、それぞれ、１年必要であることが知られている。これに対し、雄のＭＣ４Ｒ遺伝子について機能喪失しているクサフグは、最も早い個体において６ヶ月で性成熟しており、性成熟が促進されていることが分かった。【００９３】
以上のことから、本発明の魚類は、野生型の魚類と比較して、性成熟が促進されていることが分かった。【００９４】
［実施例４］
ＭＣ４Ｒ遺伝子について機能喪失しているメダカを作出し、それぞれ、野生型のメダカと比較して、成長が促進されていることを確認した。【００９５】
ＴＡＬＥＮは、下記参考文献３に記載された方法で作製した。すなわち、各標的配列に対して、特異的に結合する２種のＴＡＬＥＮ（Left armおよびRight arm）ＲＮＡを合成するためのプラスミドを、ゴールデンゲイト法により作製した。このプラスミドは、ＳＰ６プライマーを有する。ＴＡＬＥＮ−ＲＮＡは、前記ＲＮＡ合成キット（mMessage mMachine SP6 kit、Ambion/Life Technologies)を用いて合成し、ＲＮＡ精製カラム（Qiagen RNeasy mini（Qiagen社製）のスピンカラム）により精製した。
参考文献３：Satoshi Ansai et.al., “Efficient Targeted Mutagenesis in Medaka Using Custom-Designed Transcription Activator-Like Effector Nucleases”, 2013, vol. 193, No. 3, pages 739-749【００９６】
【表５】
2019066052.tif 000007
【００９７】
得られたＴＡＬＥＮ−ＲＮＡについて、１７１個のメダカ受精卵にマイクロインジェクション法により導入した。導入したＲＮＡ量は、５〜１５ｐｇとした。得られた受精卵について、成魚まで飼育した。前記成魚から得られた第２世代（Ｆ２世代）のうち、１４４個体におけるＭＣ４Ｒ遺伝子の塩基配列を解読した結果、前記ＴＡＬＥＮ１のターゲット配列において、下線で示す７塩基が欠失した個体、および前記ＴＡＬＥＮ２のターゲット配列において、下線で示す１１塩基が欠失した個体、すなわち、機能欠失変異が導入された個体が得られた。これらの個体から得られる子孫を継代し、ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失しているメダカ系統を確立した。以下、７塩基が欠失した個体の子孫をメダカ系統１、１１塩基が欠失した個体の子孫をメダカ系統２ともいう。【００９８】
つぎに、１０個体のメダカ系統１および２由来のメダカについて、孵化後２週齢での体重を測定した。また、コントロールは、無処理とした以外は同様にして、体重を測定した。この結果を下記表６および図３に示す。【００９９】
【表６】
2019066052.tif 000008
【０１００】
図３は、ＭＣ４Ｒ遺伝子について機能喪失しているメダカの体重を示すグラフである。図３において、横軸は、メダカの種類を示し、縦軸は、体重を示す。図３および前記表６に示すように、実施例４のメダカは、コントロールのメダカ（野生型のメダカ）と比較して、体重が有意に増加していた。【０１０１】
以上のことから、本発明の魚類は、野生型の魚類と比較して、成長が促進されているため、例えば、飼育期間を短縮できることが分かった。【０１０２】
［実施例５］
ＭＣ４Ｒ遺伝子について機能喪失しているメダカが、野生型のメダカと比較して、接餌量が増加していることを確認した。【０１０３】
前記メダカ系統１および２、ならびにコントロールのメダカ（野生型のメダカ）を、それぞれ、６尾ずつ水槽に入れ、個体数を計測したアルテミアを、餌として与えた。前記投餌後４時間目に残存するアルテミア数を計測し、投与時との差分により、メダカの摂餌数を計測した。接餌量は、メダカの体重１００ｍｇあたりの摂餌されたアルテミア数として算出した。同様の試験を、さらに２回実施し、３回の試験の平均値を算出した。この結果を、下記表７および図４に示す。【０１０４】
【表７】
2019066052.tif 000009
【０１０５】
図４は、ＭＣ４Ｒ遺伝子について機能喪失しているメダカの接餌量を示すグラフである。図４において、横軸は、メダカの種類を示し、縦軸は、接餌量を示す。図４および前記表７に示すように、実施例４のメダカは、コントロールのメダカ（野生型のメダカ）と比較して、接餌量が有意に増加していた。【０１０６】
以上のことから、本発明の魚類は、野生型の魚類と比較して、接餌量が増加しているため、成長が促進されていると推定された。ただし、この推定は、本発明を何ら制限しない。【０１０７】
［実施例６］
ＭＣ４Ｒ遺伝子の機能喪失が、生殖細胞を介して、次世代の個体に受け継がれること、および次世代個体において成長が促進されていることを確認した。【０１０８】
前記実施例１のトラフグ系統３のトラフグ（雄：３尾、雌：３尾）を性成熟するまで飼育した。性成熟後の各個体から精子または未受精卵を採取し、野生型のトラフグから採取した未受精卵または精子と人工授精を行った。得られた受精卵を５日間、２０℃で培養した。得られた胚からゲノムＤＮＡを抽出し、前記ゲノムＤＮＡにおけるＭＣ４Ｒ遺伝子の塩基配列を解析することで、各トラフグの生殖細胞のゲノムＤＮＡにＭＣ４Ｒ遺伝子の機能欠失変異が受け継がれているかを検討した。この結果、雄３尾中、１個体の生殖細胞の２０％で、配列番号１５において下線で示す１３塩基が欠失された変異を有していることが分かった。また、雌３尾中、１個体の生殖細胞の１８％に、配列番号１５において下線で示す１３塩基が欠失された変異を有していることが分かった。【０１０９】
つぎに、生殖細胞にＭＣ４Ｒ遺伝子の機能欠失変異が受け継がれている雄個体および雌個体を交配し、第２世代（Ｆ２世代）を得た。得られたＦ２世代の５０個体を１４ヶ月飼育した。前記飼育後の各個体から、ゲノムＤＮＡを抽出し、前記ゲノムＤＮＡにおけるＭＣ４Ｒ遺伝子の塩基配列を解析した。この結果、Ｆ２世代の個体のうち、１０％の個体（５個体）が、配列番号１５において下線で示す１３塩基が欠失された変異をホモで有していた、すなわち、変異ＭＣ４Ｒ遺伝子をホモで有していた。そして、前記変異をホモで有する各個体（ｎ＝５）について、飼育１４ヶ月目における体重を測定した。なお、コントロールは、実施例１と同様の無処理のトラフグを用いた以外は、同様にして各個体（ｎ＝５）の体重を測定した。この結果、変異ＭＣ４Ｒ遺伝子をホモで有する第２世代のトラフグは、コントロールのトラフグ（野生型のトラフグ）と比較して、体重が有意に増加していた。【０１１０】
以上のことから、ＭＣ４Ｒ遺伝子の機能喪失が、生殖細胞を介して、次世代の個体に受け継がれること、および次世代個体において成長が促進されていることが分かった。【０１１１】
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。【０１１２】
この出願は、２０１７年９月２８日に出願された日本出願特願２０１７―１８７３７４を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
以上のように、本発明の魚類は、ＭＣ４Ｒ遺伝子について、機能喪失しているため、例えば、前記野生型の魚類と比較して、成長が促進されている。このため、本発明の魚類によれば、前記野生型の魚類と比較して、例えば、目的の成長段階に達するまでの飼育期間を短縮でき、特に、養殖用の魚類としての使用に適している。また、本発明の魚類は、メカニズムは不明であるが、例えば、前記野生型の魚類と比較して、性成熟するまでの期間が短い。このため、本発明の魚類によれば、例えば、前記野生型の魚類と比較して、より短い期間で交配（例えば、採卵、採精）可能となるため、特に、養殖用の魚類としての使用に適している。したがって、本発明は、例えば、養殖等の水産分野において極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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