(57)【要約】  本発明は、腫瘍免疫療法の効果を予測するためのコンパニオン診断を提供することを課題とする。  悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、腫瘍細胞とを、直接、又は間接的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程１、前記工程１で末梢血単核細胞と接触した腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する工程２、及び前記工程２において前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定する工程３、を含む方法により、腫瘍免疫療法の効果を予測する。
2019004415.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
工程１：悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、腫瘍細胞とを、直接、又は間接的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程、
工程２：前記工程１で末梢血単核細胞と接触した腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する工程、及び
工程３：前記工程２において前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定する工程、
を含む、腫瘍免疫療法の効果を予測する方法。
【請求項２】
前記工程１が、悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、腫瘍細胞とを、エンゲージャーを介して間接的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する工程が、
前記腫瘍細胞と接触した末梢血単核細胞の腫瘍細胞傷害活性を測定し腫瘍細胞傷害活性を反映する値を取得する工程、及び
前記腫瘍細胞傷害活性を反映する値を対応する基準値と比較し、前記値が対応する基準値より高い場合に腫瘍細胞が傷害されていると決定する工程、
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記エンゲージャーが、二重特異性分子である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記二重特異性分子が、Ｔ細胞の表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域と、前記腫瘍細胞の表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域とを含む分子である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍細胞が、悪性腫瘍由来の培養細胞株である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法を実施するための、エンゲージャーを含む、腫瘍免疫療法の効果を予測するための検査試薬。
【請求項８】
請求項７に記載の検査試薬を含む、腫瘍免疫療法の効果を予測するための検査キット。
【請求項９】
悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、直接、又は間接的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触した腫瘍細胞からの腫瘍細胞傷害活性の測定値を取得するステップと、前記測定値に基づいて前記腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定するステップ、及び前記ステップにおいて前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定するステップ、
をコンピュータに実行させるための、腫瘍免疫療法の効果を予測するためのコンピュータプログラム。
【請求項１０】
請求項９に記載のコンピュータプログラムを記憶した、記憶媒体。
【請求項１１】
少なくとも処理部を備え、
前記処理部は、
悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、直接、又は間接的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触した腫瘍細胞からの腫瘍細胞傷害活性の測定値を取得し、
前記測定値に基づいて前記腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定し、及び
前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定する、
腫瘍免疫療法の効果を予測する予測装置。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性を指標とする腫瘍免疫療法の効果の予測方法、予測装置及び予測用コンピュータプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍免疫療法は、腫瘍患者自身の腫瘍細胞に対する免疫応答を利用した腫瘍の治療方法である。腫瘍免疫療法の一例では、Ｔ細胞上の蛋白質に結合する抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体等を使って、腫瘍患者自身の細胞傷害性Ｔ細胞を活性化し、その機能によりがん細胞を殺傷する（非特許文献１及び非特許文献２）。【０００３】
また、腫瘍組織内に存在する細胞傷害性Ｔ細胞が腫瘍細胞に対して効率よく細胞傷害活性を示すことができるよう、細胞障害性Ｔ細胞を腫瘍細胞に特異的にエンゲージさせる方法も開発されている。そのエンゲージャーとして、現在、腫瘍細胞の細胞表面マーカとＴ細胞の表面マーカとを１分子で特異的に認識する二重特異性分子が使用されている（非特許文献２及び３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】PD1/PD-L1 Combination Therapies, 2015, Evaluate Ltd.
【非特許文献２】ONCOIMMUNOLOGY, 2016, VOL. 5, NO. 2, e1062969
【非特許文献３】Cancer Research, 2013, 73(15) August 1, p4663-4673
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一方で、例えば、非小細胞肺癌で保険適用となっている腫瘍免疫療法治療薬ペムブロリズマブ（商品名キイトルーダ）は、奏効率１９％であり、多くの患者には無効であるのが現状である。このため、当該腫瘍免疫療法治療薬が有効な患者群を選別するためコンパニオン診断が行われている。現在、ペンブロリズマブにおいては、生検検体を用いたＰＤ−Ｌ１染色がコンパニオン診断薬として用いられているが、ＰＤ−Ｌ１染色で５０％以上陽性の患者群でも奏効率は４５％である。このことから、ＰＤ−Ｌ１染色より優れたコンパニオン診断の開発が切望されている。【０００６】
上記のような奏効率の問題や腫瘍免疫療法の効果予測の困難性は、多くのがん免疫療法に共通の課題である。このような腫瘍免疫療法の現状から、本発明は、腫瘍免疫療法の効果を予測するためのコンパニオン診断を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、鋭意研究を重ねたところ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで末梢血中の単核細胞を使用して腫瘍細胞傷害活性を測定することにより、腫瘍免疫療法の効果を簡便に予測できることを見出した。【０００８】
本発明は、当該知見に基づいて完成されたものであり、以下の態様を含む。
項１．工程１：悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、腫瘍細胞とを、直接、又は間接的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程、
工程２：前記工程１で末梢血単核細胞と接触した腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する工程、及び
工程３：前記工程２において前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定する工程、
を含む、腫瘍免疫療法の効果を予測する方法。
項２．前記工程１が、悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、腫瘍細胞とを、エンゲージャーを介して間接的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程である、項１に記載の方法。
項３．腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する工程が、
前記腫瘍細胞と接触した末梢血単核細胞の腫瘍細胞傷害活性を測定し腫瘍細胞傷害活性を反映する値を取得する工程、及び
前記腫瘍細胞傷害活性を反映する値を対応する基準値と比較し、前記値が対応する基準値より高い場合に腫瘍細胞が傷害されていると決定する工程、
を含む、項１又は２に記載の方法。
項４．前記エンゲージャーが、二重特異性分子である、項２又は３に記載の方法。
項５．前記二重特異性分子が、Ｔ細胞の表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域と、前記腫瘍細胞の表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域とを含む分子である、項４に記載の方法。
項６．前記腫瘍細胞が、悪性腫瘍由来の培養細胞株である、項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
項７．項２〜６のいずれか一項に記載の方法を実施するための、エンゲージャーを含む、腫瘍免疫療法の効果を予測するための検査試薬。
項８．項７に記載の検査試薬を含む、腫瘍免疫療法の効果を予測するための検査キット。
項９．悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、直接、又は間接的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触した腫瘍細胞からの腫瘍細胞傷害活性の測定値を取得するステップと、前記測定値に基づいて前記腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定するステップ、及び前記ステップにおいて前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定するステップ、
をコンピュータに実行させるための、腫瘍免疫療法の効果を予測するためのコンピュータプログラム。
項１０．項９に記載のコンピュータプログラムを記憶した、記憶媒体。
項１１．少なくとも処理部を備え、
前記処理部は、
悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、直接、又は間接的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触した腫瘍細胞からの腫瘍細胞傷害活性の測定値を取得し、
前記測定値に基づいて前記腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定し、及び
前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定する、
腫瘍免疫療法の効果を予測する予測装置。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで末梢血中の単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用して腫瘍細胞傷害活性を測定することにより、腫瘍免疫療法の効果を簡便に予測できる
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の概要を示す。
【図２】図２は、予測装置の概略を示す。
【図３】図３は、予測装置のハードウェアの構成を示すブロック図である。
【図４】図４は、予測装置の処理部が行う処理を示すフローチャートである。
【図５】図５は、肺癌患者ＰＢＭＣの腫瘍細胞傷害活性を示す。
【図６】図６は、末梢血ＣＤ８陽性Ｔ細胞と肺癌組織内ＣＤ８陽性Ｔ細胞のレパトア解析の結果を示す。
【図７】図７は、腫瘍（肺癌）組織内Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性とエンゲージャーを介したＰＢＭＣによるＩＦＮγ産生量（図７Ａ）、又は末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性（図７Ｂ）との相関関係を示すグラフである。
【図８】図８は、腫瘍（肺癌）組織内Ｔ細胞のニボルマブの効果と末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性との相関関係（図８Ａ）、又は末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性のカットオフ値を28％とした場合の各群の腫瘍（肺癌）組織内Ｔ細胞のニボルマブの効果（図８Ｂ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．腫瘍免疫療法の効果を予測する方法
本発明の第１の実施形態は、腫瘍免疫療法の効果を予測する方法に関する。
はじめに、図１を用いて、本実施態様の概要を説明する。
本実施態様は、図１に示すように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、悪性腫瘍の治療対象患者より採取された末梢血単核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells：ＰＢＭＣ）と、腫瘍細胞とを、直接又はエンゲージャー等を介して間接的に接触させて培養した後に、前記ＰＢＭＣによって腫瘍細胞がどのくらい傷害されたか（腫瘍細胞傷害活性）を測定することにより、前記測定値から前記腫瘍患者における腫瘍免疫療法の効果を予測するものである。図１は、エンゲージャーを介してＰＢＭＣに含まれるＴ細胞と、予めシャーレに播種されて培養された腫瘍細胞とを接触させる例を示す。
【００１２】
より具体的には、本実施態様は、悪性腫瘍の治療対象患者から採取されたＰＢＭＣと、腫瘍細胞とを、直接、又は間接的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程（工程１）と、前記工程１でＰＢＭＣと接触した腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する工程（工程２）と、前記工程２において前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定する工程（工程３）と、を含む、腫瘍免疫療法の効果を予測する方法に関する。
【００１３】
本発明において、腫瘍免疫療法は、Ｔ細胞の腫瘍細胞に対する傷害活性を高めることにより腫瘍を治療する方法である限り制限されない。本発明における腫瘍免疫療法には、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体等の免疫チェックポイント阻害療法、キメラ抗原受容体−Ｔ細胞等を投与する養子免疫療法、インターロイキン２等のサイトカイン療法、腫瘍抗原由来の蛋白質又はペプチド（例えばＷＴ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１）等を投与する腫瘍ワクチン療法、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標）ともいう）、若しくは二重特性抗体療法等が含まれる。
【００１４】
本発明において、腫瘍には悪性腫瘍及び良性腫瘍が含まれるが、好ましくは悪性腫瘍である。また、腫瘍には、上皮性腫瘍及び非上皮性腫瘍が含まれるが、好ましくは上皮性腫瘍である。本発明において、腫瘍として最も好ましくは、上皮性悪性腫瘍である。
【００１５】
悪性腫瘍としては、例えば、気管、気管支又は肺等から発生する呼吸器系悪性腫瘍；上咽頭、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、虫垂、上行結腸、横行結腸、Ｓ状結腸、直腸又は肛門部等から発生する消化管系悪性腫瘍；肝臓癌；膵臓癌；膀胱、尿管又は腎臓から発生する泌尿器系悪性腫瘍；卵巣、卵管及び子宮等のから発生する女性生殖器系悪性腫瘍；乳癌：前立腺癌；皮膚癌；視床下部、下垂体、甲状腺、副甲状腺、副腎等の内分泌系悪性腫瘍；中枢神経系悪性腫瘍；骨軟部組織から発生する悪性腫瘍等の固形腫瘍、及び骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、慢性単球性白血病、急性全骨髄性白血病、急性巨核球性白血病、赤白血病、好酸球性白血病、慢性好酸球性白血病、慢性好中球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、ヘアリー細胞白血病、形質細胞性白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫等の造血系悪性腫瘍；リンパ系悪性腫瘍等の造血器腫瘍が挙げられる。より好ましくは、肺癌（扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞癌、腺癌）等の呼吸器系上皮性悪性腫瘍；胃癌、十二指腸癌、大腸癌（Ｓ上結腸癌、直腸癌等）等の消化管系上皮性悪性腫瘍；肝臓癌；膵臓癌；膀胱癌；甲状腺癌；卵巣癌；乳癌：前立腺癌；を挙げることができる。最も好ましくは、肺癌である。
【００１６】
本発明において「悪性腫瘍の治療対象患者」は、腫瘍免疫療法が適用されうる者である限り制限されない。例えば、患者としては、上記に記載のいずれかの腫瘍を有し、かつ未治療である患者、又は既に何らかの腫瘍治療を受けた患者、腫瘍の治療中の患者、腫瘍が再発又は転移している患者を挙げることができる。前記、腫瘍の治療には、好ましくは、外科的腫瘍切除、化学療法（より好ましくは、腫瘍免疫療法以外の抗腫瘍剤投与による化学療法）、放射療法等を含む。
【００１７】
本発明において末梢血は、Ｔ細胞を含む単核細胞を取得できる限り制限されない。末梢血は、動脈血であっても静脈血であってもよいが、好ましくは静脈血である。末梢血の採血は、例えば四肢の血管から行うことができる。また、手術や生検の際に、四肢以外の血管から採血しても良い。
【００１８】
末梢血の採血方法は、単核細胞を取得できる限り制限されないが、抗凝固剤を使用して採血することが好ましい。抗凝固剤としては、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、ヘパリン塩等を挙げることができる。好ましくはヘパリンである。
【００１９】
ＰＢＭＣは、公知の方法に従って取得することができる。例えば、ヒトリンパ球分離用の比重液（１．０７７±０．００１ｇ／ｍｌ程度の密度を有する）を使って遠心分離により取得することができる。また、溶血剤を使って末梢血中の赤血球を溶血させ、得られる有核細胞をＰＢＭＣとして使用してもよい。あるいは、セルソータ、磁気細胞分離法を使って所望の細胞を取得してもよい。前記所望の細胞としては、例えば、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ３陽性Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞を挙げることができる。
【００２０】
ＰＢＭＣと接触する腫瘍細胞は、上記腫瘍に由来する細胞である限り制限されない。腫瘍細胞として好ましくは、培養細胞株を挙げることができる。培養細胞株としては特に制限されないが、例えば、Ｕ２５１細胞株、ＲＥＲＦ細胞株、Ａ５４９細胞株等の悪性腫瘍由来の培養細胞株を挙げることができる。前記腫瘍細胞は、患者が有する悪性腫瘍と同種の細胞である必要はないが、同種の細胞であってもよい。好ましくは、ＰＢＭＣと同じ培養条件で発育できる細胞であることが好ましい。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＰＢＭＣと、腫瘍細胞との接触方法は、ＰＢＭＣと腫瘍細胞が直接、又は間接的に接触する限り制限されない。
【００２１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＰＢＭＣと腫瘍細胞とを接触させる際には、腫瘍細胞を予めｉｎ  ｖｉｔｒｏでプレート、又はカルチャーボトルに播種しておくことが好ましい。腫瘍細胞が接着性の細胞である場合には、前記腫瘍細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生存可能な状態で、シャーレ、又はカルチャーボトルに接着している状態であることがより好ましい。さらには、前記腫瘍細胞が接着性の細胞である場合には、前記腫瘍細胞が発育可能な条件下（例えば、３５℃〜３７℃、５％程度の炭酸ガス存在下）で１２時間〜４８時間程度培養された状態であることが好ましい。前記腫瘍細胞を培養する培養培地は、腫瘍細胞が生存できる、又は発育できる培地である限り制限されない。例えば、ウシ胎児血清を８％〜２０％程度含む、ＲＰＭＩ１６４０培地（改変培地含む）、α−ＭＥＭ培地（改変培地含む）、ダルベッコＭＥＭ培地（改変培地含む）等を挙げることができる。
【００２２】
ＰＢＭＣと腫瘍細胞を接触させる際の細胞数は、例えば９６ウェルプレート１ウェルに対して、１×１０３〜１×１０５個程度、好ましくは５×１０３〜５×１０４個程度の腫瘍細胞に対して、ＰＢＭＣが１×１０３〜１×１０５個程度、好ましくは５×１０３〜５×１０４個程度となるように接触させることが好ましい。
【００２３】
ＰＢＭＣと腫瘍細胞を直接接触させる方法としては、腫瘍細胞が播種されたプレート、又はカルチャーボトルに、ＰＢＭＣを播種する方法を挙げることができる。好ましくは、播種したＰＢＭＣが浮遊している場合には、１，０００から２，０００  ｒ．ｐ．ｍ．程度で５から１０分程度遠心することができる。
【００２４】
ＰＢＭＣと腫瘍細胞を間接的に接触させる方法としては、エンゲージャーを介して接触させる方法を挙げることができる。本実施態様においてエンゲージャーとは、ＰＢＭＣを、好ましくはリンパ球を、より好ましくはＴ細胞を、さらに好ましくはＣＤ８陽性Ｔ細胞（細胞障害性Ｔ細胞）を腫瘍細胞にエンゲージできる分子である限り制限されない。エンゲージとは、少なくとも細胞同士（例えば、Ｔ細胞と腫瘍細胞）を架橋することをいい、好ましくは、細胞障害性Ｔ細胞が架橋した腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を示すことができる状態をいう。
【００２５】
エンゲージャーとして、好ましくは二重特異性分子、三重特異性分子等を挙げることができる。エンゲージャーとしてより好ましくは二重特異性分子である。二重特性分子及び三重特異性分子は、Ｔ細胞の表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域と、前記腫瘍細胞の表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域とを含む分子であることが好ましい。前記抗原結合領域は、標的とする抗原と結合する限り制限されない。前記抗原結合領域は、例えば、前記抗原に結合する免疫グロブリンの相補鎖決定領域１（ＣＤＲ１）、相補鎖決定領域２（ＣＤＲ２）及び相補鎖決定領域３（ＣＤＲ３）よりなる群からなる少なくとも一つのＣＤＲを含む。前記抗原結合領域は、好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３よりなる群からなる少なくとも二つのＣＤＲを含み、より好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。前記ＣＤＲは、免疫グロブリンの重鎖由来であっても、免疫グロブリンの軽鎖由来であってもよい。さらに好ましくは、前記抗原結合領域において、各ＣＤＲは、それぞれに対応するフレームワーク領域に隣接していてもよい。また、前記抗原結合領域は、免疫グロブリンの可変領域（Ｖ領域）、ｓｃ−Ｆｖ、免疫グロブリンのＦａｂ領域等であってもよい。
【００２６】
表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域は、１つの抗原に対して、１つであっても２以上であってもよい。例えば、表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域は、同種のＦａｂ領域の組み合わせ、同種の可変領域の組み合わせ、同種のｓｃ−Ｆｖの組み合わせ、１種の抗体に由来する重鎖Ｆａｂ領域と軽鎖Ｆａｂ領域の組み合わせ１種の抗体に由来する重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組み合わせ、１種の抗体に由来する重鎖ｓｃ−Ｆｖの組み合わせであってもよい。
【００２７】
Ｔ細胞の表面抗原は、Ｔ細胞の表面に存在し、二重特異性分子又は三重特異性分子に含まれる少なくとも一つの抗原結合領域が結合できる限り制限されない。Ｔ細胞の表面抗原として、好ましくは細胞障害性Ｔ細胞の表面抗原を挙げることができる。例えば、Ｔ細胞の表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＴＣＲ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、Ｔｉｍ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）を挙げることができる。好ましくはＣＤ３である。
【００２８】
腫瘍細胞の表面抗原は、腫瘍細胞の表面に存在し、二重特異性分子又は三重特異性分子に含まれる少なくとも一つの抗原結合領域が結合できる限り制限されない。腫瘍細胞の表面抗原としては、ＥｐｈＡ１（ｅｐｈｒｉｎ  ｔｙｐｅ−Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １）、ＥｐｈＡ２、ＦｏｌＲ１（ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １）、ＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ＣＤ１９、Ｈｅｒ１  （ｖ−ｅｒｂ−ｂ２  ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒａｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １：  ＥｒｂＢ１）、Ｈｅｒ２、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＣＣＲ４（Ｃ−Ｃ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ４）、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＧＤ２、ＧＤ３，ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＵＣ１（Ｍｕｃｉｎ１）、ＰＳＣＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＳＭＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ１（ＨＬＡ−Ａ１  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＮＹ−ＥＳＯ１）、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ１（ＨＬＡ−Ａ２  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＮＹ−ＥＳＯ１）、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ１（ＨＬＡ−Ａ３  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＮＹ−ＥＳＯ１）等を挙げることができる。
【００２９】
二重特異性分子には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、二重特性抗体等が含まれる。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーとしては、ＣＤ１９とＣＤ３を標的とするエンゲージャー、ＥｐｈＡ２とＣＤ３を標的とするエンゲージャーを挙げることができる。また二重特異性抗体としては、ＥｐＣＡＭとＣＤ３を標的とする抗体を挙げることができる。
【００３０】
ＰＢＭＣと腫瘍細胞を接触させる際の細胞数は、例えば９６ウェルプレート１ウェルに対して、１×１０３〜１×１０５個程度、好ましくは５×１０３〜５×１０４個程度の腫瘍細胞に対して、ＰＢＭＣが１×１０３〜１×１０５個程度、好ましくは５×１０３〜５×１０４個程度となるように接触させることが好ましい。二重特異性分子を添加する場合には、９６ウェルプレート１ウェルに対して５０〜２００ｎｇ／ｍｌの終濃度となるように添加することが好ましい。
【００３１】
ＰＢＭＣと腫瘍細胞の直接又は間接的な接触は、ＰＢＭＣと腫瘍細胞のそれぞれが、通常発育可能な条件で行うことが好ましい。例えば、発育可能な条件下（例えば、３５℃〜３７℃、５％程度の炭酸ガス存在下）で１６時間〜７２時間、好ましくは３６〜５０時間程度行うことができる。前記ＰＢＭＣと腫瘍細胞を接触させる時の培養培地は、ＰＢＭＣと腫瘍細胞が生存できる、又は発育できる培地である限り制限されない。例えば、ウシ胎児血清を８％〜２０％程度含む、ＲＰＭＩ１６４０培地（改変培地含む）を挙げることができる。
【００３２】
次に細胞傷害活性を測定する。細胞傷害活性の測定方法は、ＰＢＭＣがどのくらい腫瘍細胞を傷害できたかを評価できる限り制限されない。例えば、ＰＢＭＣと腫瘍細胞とを直接接触させる場合には、ＰＢＭＣと腫瘍細胞とを接触させた直後の生細胞数とＰＢＭＣと腫瘍細胞とを接触させてから４８時間後の生細胞数の値から求めることができる。また、ＰＢＭＣと腫瘍細胞とをエンゲージャーを介して、間接的に接触させる場合には、ＰＢＭＣと腫瘍細胞とを接触させる際にエンゲージャーを添加するウェル（測定ウェル）と、ＰＢＭＣと腫瘍細胞とを接触させる際にエンゲージャーを添加しないウェル（陰性対照ウェル）を作成し、測定ウェルの生細胞数と、陰性対照ウェルの生細胞数を比較することにより、腫瘍細胞傷害活性を反映する値として取得することができる。例えば、腫瘍細胞傷害活性を反映する値は、下式により求めることができる。
【００３３】
［数１］
腫瘍細胞傷害活性（％）
＝｛（［陰性対照ウェルの生細胞数］−［測定ウェルの生細胞数］）／［陰性対照ウェルの生細胞数］｝×１００
【００３４】
また、例えばCellTiter 96（登録商標） AQueous One Solution Reagent （MTS reagent：プロメガ）等の生細胞染色試薬を用いて上記生細胞数を計数する場合には、上記生細胞数に変えて、各ウェルの吸光度を腫瘍細胞傷害活性を反映する値として使用してもよい。
【００３５】
腫瘍細胞が傷害されているか否かの決定は、腫瘍細胞傷害活性を反映する値を、対応する基準値と比較することにより行うことができる。例えば、上記方法により測定した腫瘍細胞傷害活性を反映する値が対応する基準値よりも高い場合には、腫瘍細胞が傷害されていると決定することができる。上記方法により測定した腫瘍細胞傷害活性が対応する基準値以下である場合には、腫瘍細胞が傷害されていないと決定することができる。腫瘍免疫療法の効果を予測する方法は、腫瘍免疫療法の効果が有効である患者を検出する方法でもある。また、腫瘍免疫療法の効果が有効でない患者を検出する方法でもある。
【００３６】
前記基準値は、腫瘍細胞が傷害されているか否かを判定できる値である限り制限されない。例えば、基準値は、腫瘍免疫が活性化していない陰性対照のＰＢＭＣの腫瘍細胞傷害活性値や、腫瘍免疫が活性化している陽性対照のＰＢＭＣの腫瘍細胞傷害活性値から求めることができる。陰性対照のＰＢＭＣの腫瘍細胞傷害活性値、及び陽性対照のＰＢＭＣの腫瘍細胞傷害活性値を測定する方法は、治療対象患者のＰＢＭＣの腫瘍細胞傷害活性値を測定する方法と同じであることが好ましい。基準値は、陰性対照のＰＢＭＣの腫瘍細胞傷害活性値の上限値、陽性対照のＰＢＭＣの腫瘍細胞傷害活性値の下限値、陰性対照のＰＢＭＣの腫瘍細胞傷害活性値と陽性対照のＰＢＭＣの腫瘍細胞傷害活性値の中央値、平均値、最頻値等とすることができる。あるいは、基準値は、ＲＯＣ曲線（Receiver Operatorating Characteristic curve、受信者動作特性曲線）、判別分析法、モード法、Ｋｉｔｔｌｅｒ法、３σ法、ｐ‐ｔｉｌｅ法等により算出してもよい。また別の態様として、前記基準値を腫瘍細胞傷害活性５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％又は４０％から選択してもよい。
【００３７】
腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合には、腫瘍細胞傷害活性を測定したＰＢＭＣを採取した患者において、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定することができる。また、腫瘍細胞が傷害されていないと決定された場合には、腫瘍細胞傷害活性を測定したＰＢＭＣを採取した患者において、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法は有効でないと決定することができる。
【００３８】
本明細書において、特に言及しない限り、本項における用語の説明は、本明細書における他の実施態様における説明、特許請求の範囲及び図面全体において援用される。
【００３９】
２．腫瘍免疫療法の効果を予測するための検査試薬及びキット
本発明の第２の実施態様は、少なくとも上記１．で述べたエンゲージャーを含む、腫瘍免疫療法の効果を予測するための検査試薬に関する。前記検査試薬は、エンゲージャーを溶解するための緩衝液等を含んでいてもよい。また緩衝液は、エンゲージャーを安定化させるための還元剤（β−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール等）、界面活性剤、アルブミン等を含んでいてもよい。また、アジ化ナトリウム等の防腐剤を含んでいても良い。エンゲージャーは、乾燥状態であっても、前記緩衝液に溶解されていてもよい。
【００４０】
本発明の第３の実施態様は、前記検査試薬を含む、腫瘍免疫療法の効果を予測するためのキットに関する。本態様のキットには、少なくとも第３の実施態様に係る検査試薬と、前記検査試薬を使って行う測定方法を記載したプロトコール、又は前記プロトコールにアクセスするためのＵＲＬ、Ｑコード等の情報を含む。
【００４１】
３．腫瘍免疫療法の効果を予測する予測装置
本発明の第４の実施態様は、腫瘍免疫療法の効果を予測する予測装置に関する。
具体的には、前記予測装置は、少なくとも処理部を備え、前記処理部は、悪性腫瘍の治療対象患者から採取された末梢血単核細胞と、直接、又は間接的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触した腫瘍細胞からの腫瘍細胞傷害活性の測定値を取得し、前記測定値に基づいて前記腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定し、及び前記腫瘍細胞が傷害されていると決定された場合に、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定する。
【００４２】
図３に、予測装置１０のハードウェアの構成を示す。予測装置１０は、入力部１１１と、出力部１１２と、記憶媒体１１３とに接続されていてもよい。また、マイクロプレートリーダ等により構成される測定部３０と接続されていてもよい。すなわち、予測装置１０は、測定部３０と直接又はネットワーク等を介して接続された、腫瘍免疫療法の効果を予測する予測システムを構成することもある。
【００４３】
予測装置１０において、ＣＰＵ１０１と、主記憶部１０２と、ＲＯＭ（ｒｅａｄ  ｏｎｌｙ  ｍｅｍｏｒｙ）１０３と、補助記憶部１０４と、通信インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０５と、入力インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０６と、出力インタフェース（Ｉ／Ｆ）１０７と、メディアインターフェース（Ｉ／Ｆ）１０８は、バス１０９によって互いにデータ通信可能に接続されている。主記憶部１０２と補助記憶部１０４とを合わせて、単に記憶部と呼ぶこともある。
【００４４】
ＣＰＵ１０１は、予測装置１０の処理部である。ＣＰＵ１０１が、補助記憶部１０４又はＲＯＭ１０３に記憶されているコンピュータプログラムを実行し、取得されるデータの処理を行うことにより、予測装置１０が機能する。
【００４５】
ＲＯＭ１０３は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成され、ＣＰＵ１０１により実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。ＣＰＵ１０１はＭＰＵ１０１としてもよい。ＲＯＭ１０３は、予測装置１０の起動時に、ＣＰＵ１０１によって実行されるブートプログラムや予測装置１０のハードウェアの動作に関連するプログラムや設定を記憶する。
【００４６】
主記憶部１０２は、ＳＲＡＭ又はＤＲＡＭなどのＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  ａｃｃｅｓｓ  ｍｅｍｏｒｙ）によって構成される。主記憶部１０２は、ＲＯＭ１０３及び補助記憶部１０４に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、主記憶部１０２は、ＣＰＵ１０１がこれらのコンピュータプログラムを実行するときの作業領域として利用される。
【００４７】
補助記憶部１０４は、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等によって構成される。補助記憶部１０４には、オペレーティングシステム及びアプリケーションプログラムなどの、ＣＰＵ１０１に実行させるための種々のコンピュータプログラム及びコンピュータプログラムの実行に用いる各種設定データが記憶されている。具体的には、基準値等を不揮発性に記憶する。
【００４８】
通信Ｉ／Ｆ１０５は、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェース、ネットワークインタフェースコントローラ（Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ：ＮＩＣ）等から構成される。通信Ｉ／Ｆ１０５は、ＣＰＵ１０１の制御下で、測定部３０又は他の外部機器からのデータを受信し、必要に応じて予測装置１０が保存又は生成する情報を、測定部３０又は外部に送信又は表示する。通信Ｉ／Ｆ１０５は、ネットワークを介して測定部３０又は他の外部機器と通信を行ってもよい。
【００４９】
入力Ｉ／Ｆ１０６は、例えばＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェースなどから構成される。入力Ｉ／Ｆ１０６は、入力部１１１から文字入力、クリック、音声入力等を受け付ける。受け付けた入力内容は、主記憶部１０２又は補助記憶部１０４に記憶される。
【００５０】
入力部１１１は、タッチパネル、キーボード、マウス、ペンタブレット、マイク等から構成され、予測装置１０に文字入力又は音声入力を行う。入力部１１１は、予測装置１０の外部から接続されても、予測装置１０と一体となっていてもよい。
【００５１】
出力Ｉ／Ｆ１０７は、例えば入力Ｉ／Ｆ１０６と同様のインタフェースから構成される。出力Ｉ／Ｆ１０７は、ＣＰＵ１０１が生成した情報を出力部１１２に出力する。出力Ｉ／Ｆ１０７は、ＣＰＵ１０１が生成し、補助記憶部１０４に記憶した情報を、出力部１１２に出力する。
【００５２】
出力部１１２は、例えばディスプレイ、プリンター等で構成され、測定部３０から送信される測定結果及び予測装置１０における各種操作ウインドウ、分析結果等を表示する。
【００５３】
メディアＩ／Ｆ１０８は、記憶媒体１１３に記憶された例えばアプリケーションソフト等を読み出す。読み出されたアプリケーションソフト等は、主記憶部１０２又は補助記憶部１０４に記憶される。また、メディアＩ／Ｆ１０８は、ＣＰＵ１０１が生成した情報を記憶媒体１１３に書き込む。メディアＩ／Ｆ１０８は、ＣＰＵ１０１が生成し、補助記憶部１０４に記憶した情報を、記憶媒体１１３に書き込む。
【００５４】
記憶媒体１１３は、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、又はＤＶＤ−ＲＯＭ等で構成される。記憶媒体１１３は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、又はＤＶＤ−ＲＯＭドライブ等によってメディアＩ／Ｆ１０８と接続される。記憶媒体１１３には、コンピュータがオペレーションを実行するためのアプリケーションプログラム等が格納されていてもよい。
【００５５】
ＣＰＵ１０１は、予測装置１０の制御に必要なアプリケーションソフトや各種設定をＲＯＭ１０３又は補助記憶部１０４からの読み出しに代えて、ネットワークを介して取得してもよい。前記アプリケーションプログラムがネットワーク上のサーバコンピュータの補助記憶部内に格納されており、このサーバコンピュータに予測装置１０がアクセスして、コンピュータプログラムをダウンロードし、これをＲＯＭ１０３又は補助記憶部１０４に記憶することも可能である。
【００５６】
また、ＲＯＭ１０３又は補助記憶部１０４には、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）などのグラフィカルユーザインタフェース環境を提供するオペレーションシステムがインストールされている。第２の実施形態に係るアプリケーションプログラムは、前記オペレーティングシステム上で動作するものとする。すなわち、予測装置１０は、パーソナルコンピュータ等であり得る。
【００５７】
次に、図４を用いて、予測装置１０の動作について説明する。予測装置１０の動作は、後述する腫瘍免疫療法の効果を予測するためのコンピュータプログラムにしたがって、予測装置１０の処理部１０１が制御する。
【００５８】
初めに、処理部１０１は、検査者によって入力部１１１から入力される、上記１．で述べた方法により取得された腫瘍細胞傷害活性の測定値を取得する（ステップＳ１１）。または、測定部３０から腫瘍細胞傷害活性を算出するための情報を取得する。前記情報は、ＰＢＭＣと接触した腫瘍細胞の生細胞数を反映する情報であり、例えば生細胞染色試薬の吸光度等である。
【００５９】
次に、処理部１０１は、ステップＳ１１で取得された測定値を補助記憶部１０４に記憶されている基準値と比較する（ステップＳ１２）。
【００６０】
続いて処理部１０１は、ステップＳ１２の比較結果から腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する（ステップＳ１３）。
【００６１】
処理部１０１は、ステップＳ１３において腫瘍細胞が傷害されている（ＹＥＳ）場合には、ステップＳ１４において腫瘍細胞が傷害されていると決定し、さらにステップＳ１５で、ＰＢＭＣを採取した患者において、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法が有効であると決定する。また、ステップＳ１３において腫瘍細胞が傷害されていない（ＮＯ）場合には、ステップＳ１６において腫瘍細胞が傷害されていないと決定し、さらにステップＳ１７で、ＰＢＭＣを採取した患者において、前記患者が有する悪性腫瘍に対して腫瘍免疫療法は有効でないと決定する。
【００６２】
また、図示しないが、ステップS１３は、腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する工程が、
前記腫瘍細胞と接触した末梢血単核細胞の腫瘍細胞傷害活性を測定し腫瘍細胞傷害活性を反映する値を取得するステップと、前記腫瘍細胞傷害活性を反映する値を対応する基準値と比較し、前記測定値が対応する基準値より高い場合に腫瘍細胞が傷害されていると決定するステップとに分かれていても良い。
【００６３】
腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定するステップの各態様の説明は、上記１．で述べた腫瘍細胞が傷害されているか否かを決定する工程についての説明をここに援用する。
【００６４】
処理部１０１は、上記ステップＳ１４、又はステップＳ１６で得られた結果を出力部１１２から出力するか、記録媒体１１３に記録してもよい。
【００６５】
４．腫瘍免疫療法の効果を予測するためのコンピュータプログラム及び前記コンピュータプログラムを記憶した記憶媒体
本発明の第５の実施態様は、腫瘍免疫療法の効果を予測するためのコンピュータプログラムに関する。具体的には、上記３．で述べた腫瘍免疫療法の効果を予測する予測装置の動作を制御するコンピュータプログラムである。
【００６６】
第５の実施態様のコンピュータプログラムが実行する各ステップは、上記３．で述べたステップＳ１１〜１６である。上記３．に記載の各ステップの説明は、第５の実施態様に援用することができる。
【００６７】
さらに、本発明の第６の実施態様は、前記コンピュータプログラムを記憶した、記憶媒体に関する。すなわち、前記コンピュータプログラムは、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等の記憶媒体に記憶される。前記記憶媒体へのプログラムの記憶形式は、前記提示
装置が前記プログラムを読み取り可能である限り制限されない。前記記憶媒体への記憶は、不揮発性であることが好ましい。
【実施例】
【００６８】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定し解釈されるものではない。【００６９】
Ｉ．実施例１：末梢血単核細胞を用いた腫瘍細胞傷害活性の測定
１．方法
（１）U251細胞株を、1×105個／mLとなるように10％FBSを添加したRPMI1640培地（10％FBS加RPMI1640培地）に懸濁した細胞懸濁液を調製した。前記細胞懸濁液を100μL／ウェルとなるように96ウェルプレートに播種し、５％炭酸ガスが存在する湿式インキュベータ内で、24時間、37℃でインキュベーションした。【００７０】
（２）肺癌患者から末梢血（ヘパリン採血）を採取し、LymphoprepTM （Alere Technologies AS）を使って、添付のプロトコールにしたがって末梢血単核細胞を含む細胞群（「PBMC」とする）を回収した。前記PBMCの回収は、後述する（３）の工程の直前に行った。【００７１】
（３）（１）でインキュベーションが終わった96ウェルプレートに、1ウェルあたり、前記PBMCの細胞数が5×104個、EphA2-CD3 BiTE（登録商標）が終濃度で100 ng/mLとなるように添加した。コントロールとして、（１）でインキュベーションが終わった96ウェルプレート内に前記PBMCのみを添加し、EphA2-CD3 BiTE（登録商標）を添加しないウェルを準備した。前記PBMCとEphA2-CD3 BiTE（登録商標）を添加した後の1ウェルあたりの10％FBS加RPMI培地の量は、総量が200μLとなるようにした。PBMCとEphA2-CD3 BiTE（登録商標）を添加したあと、48時間インキュベーションした。【００７２】
（４）インキュベーション終了後、10％FBS加RPMI培地で各ウェルを4回洗浄した。洗浄後培地が除去された各ウェルに、100μLの10％FBS加RPMI培地と20μLのCellTiter 96（登録商標） AQueous One Solution Reagent (MTS reagent：プロメガ)を添加した。その後、96ウェルマイクロプレートを５％炭酸ガスが存在する湿式インキュベータ内で、20分、37℃でインキュベーションした。【００７３】
（５）（４）でインキュベーションが終了した96ウェルマイクロプレートについて、マイクロプレートリーダを使って各ウェルの490 nmにおける吸光度を測定した。続いて、下式にしたがって、腫瘍細胞傷害活性を算出した。
U251細胞株とPBMCを含むウェルの吸光度＝A
U251細胞株とPBMCとEphA2-CD3 BiTEを含むウェルの吸光度＝B【００７４】
腫瘍細胞傷害活性 (%)＝[(A−B)/A]×100【００７５】
２．結果
図５に各患者のPBMCの腫瘍細胞傷害活性を示す。BiTEとしてCD3に結合するものを使用していることから、このPBMCの腫瘍細胞傷害活性は、末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性であると考えられる。図５からわかるように、肺癌患者の末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性は、患者によって異なっており、腫瘍細胞傷害活性が数％しかない患者も存在する一方で、80％以上と高い値を示す患者も存在した。このことから、各患者の末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性には、個人差があることがわかった。【００７６】
ＩＩ．実験例１：肺癌組織内のＴ細胞の腫瘍細胞傷害活性
肺癌組織内のＴ細胞の腫瘍細胞傷害活性は、以下の方法に従って肺癌組織から細胞を回収し、その細胞群の細胞傷害活性として測定した。
癌組織を6 cm Dishに移して細断した後、組織攪拌溶液（HBSS(-) + 2% FBS + 10mM HEPESにTumor Dissociation Kit (Miltenyi Biotec)を添加）に入れてgentleMACSTM Dissociator (Miltenyi Biotec)で攪拌後、37℃で維持したインキュベータ内で30分回転させながらインキュベーションした。その後、細胞を含む攪拌液を70 μmメッシュを通して、組織残渣を取り除き、濾液を600xg、10分遠心して沈殿物を回収した。細胞を含む沈殿物にBD Pharm lyse (BD Biosciences)を添加して2分間静置した。静置後の細胞を含む溶解液にHBSS Bufferを加えて600xg、10分遠心し、再度沈殿物を回収した。再回収された沈殿物に30% パーコール液を加えて12000xg、30秒遠心し、再度沈殿物を回収した。再回収された沈殿物をHBSS Bufferで洗浄し、12000xg、30秒遠心して組織内の細胞を回収した。回収された細胞の腫瘍細胞傷害活性は、上記Ｉ．と同様の方法で測定した。BiTEとしてCD3に結合するものを使用していることから、この肺癌組織内から回収された細胞の腫瘍細胞傷害活性は、肺癌組織内Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性であると考えられる。【００７７】
ＩＩＩ．実施例２：Ｔ細胞レセプターレパトア解析
同一患者において腫瘍内と末梢血に共通するＴ細胞クローンが存在するか否かを確認するため、Ｔ細胞レセプター（TCR）のレパトア解析を行った。
肺癌患者末梢血PBMCおよび肺癌組織内の細胞からFACSAria（Becton Dickinson）を用いてCD8陽性T細胞を採取した。採取したCD8陽性T細胞からRNAを抽出し、Adaptor-Ligation PCR法を用いてTCR遺伝子を増幅した後に、次世代シーケンサーを用いて塩基配列を決定した。TCRレパトア解析はRepertoire Genesis株式会社（http://www.repertoire.co.jp/detailed_repertoire.html）に外注した。
レパトア解析は、TCRαとTCRβそれぞれについて行った。
患者１〜４について、PBMCと肺癌組織内Ｔ細胞について出現頻度の高い上位30クローンのレパートリーを比較した。【００７８】
患者１は及び患者２は、肺癌組織内CD8陽性Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性が高かった例であり、患者３は、前記腫瘍細胞傷害活性が中程度であった例であり、患者４は前記腫瘍細胞傷害活性が低かった例である。
結果を図６に示す。【００７９】
出現頻度の高い上位30クローンのレパートリーを比較した結果、肺癌組織内Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性が高かった又は中程度であった患者１〜３は、末梢血と肺癌組織内CD8陽性Ｔ細胞で複数種の共通クローンが認められた。これに対して、肺癌組織内T細胞の腫瘍細胞傷害活性が低かった患者４では、末梢血と肺癌組織内CD8陽性Ｔ細胞で共通するクローンが１クローンのみ確認された。このことから、肺癌組織内Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性が高い程、肺癌組織内で腫瘍細胞の抗原特異的に増殖した細胞障害性Ｔ細胞が末梢血にも多く出現することが示唆された。【００８０】
ＩＶ．実施例３：肺癌組織内Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性と末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性の相関
次に、肺癌組織内Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性とPBMCに由来する末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性の相関を求めた。結果を図７に示す。相関係数Ｒ２とｐ値は統計ソフトJMPを用いて求めた。ｐ値は、相関の有無の検定値を示す。【００８１】
また、比較例として、患者から採取したPBMCとU251細胞株にEphA2-CD3 BiTEを加えて２日間培養した培養上清について、抗腫瘍作用を示すインターフェロンγ（IFNγ）の濃度を求め、この結果と肺癌組織内Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性の相関を求めた。IFNγの濃度は、Bio-Plex Proヒトサイトカイン GI 27-plexパネル（Bio-Rad）を使用して測定した。【００８２】
その結果、肺癌組織内Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性と末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性の相関はR2=0.36であり、p=0.009となり、末梢血T細胞の細胞傷害活性は、肺癌組織内Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性を反映すると考えられた。これに対して、IFNγは、R2=0.22であり、p=0.048となり、IFNγも肺癌組織内Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性と相関することが示された。しかし、IFNγに比べ末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性の方が、肺癌組織内T細胞の腫瘍細胞傷害活性とより強く相関することが示された。【００８３】
以上の結果から、末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性を測定することにより、腫瘍組織内のＴ細胞の腫瘍細胞傷害活性を予測することができ、ひいては、末梢血中のPBMCの腫瘍細胞傷害活性を測定することにより、腫瘍免疫療法の効果を予測できると考えられた。【００８４】
Ｖ．実施例４：ニボルマブの効果と末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性との相関
１．方法
18人の患者について、実施例１に従って測定したPBMCに由来する末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性と、ニボルマブの効果とを比較した。ニボルマブの効果は以下の方法により評価した。実施例１に記載の方法に従って、U251細胞株を96ウェルプレートに播種し、５％炭酸ガスが存在する湿式インキュベータ内で、24時間、37℃でインキュベーションした。実験例１に記載の方法に従って回収した各患者の肺癌組織内の細胞（細胞数は5×104個/ウェル）と、１μg/mlのニボルマブ（小野薬品工業株式会社より分与を受けた）とを100 ng/mlのEphA2-CD3 BiTE（登録商標）ともに各ウェルに添加した。陰性コントロールとしてニボルマブに替えて１μg/mlのヒトIgG4（アブカム）を100 ng/mlのEphA2-CD3 BiTE（登録商標）ともに培地に添加した。実施例１に記載の方法に従って、CellTiter 96（登録商標） AQueous One Solution Reagent (MTS reagent：プロメガ)を用いて吸光度を測定し、下式にしたがって腫瘍細胞傷害活性を算出した。【００８５】
U251細胞株と肺癌組織内の細胞と陰性コントロールとEphA2-CD3 BiTEを含むウェルの吸光度＝A
U251細胞株と肺癌組織内の細胞とニボルマブとEphA2-CD3 BiTEを含むウェルの吸光度＝B【００８６】
腫瘍細胞傷害活性 (%) ＝[(A−B)/A]×100
相関係数Ｒ２とｐ値は統計ソフトJMPを用いて求めた。ｐ値は、相関の有無の検定値を示す。【００８７】
２．結果
ニボルマブの効果と末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性の相関を図８Aに示す。R2＝0.27、p＝0.028であり、ニボルマブの効果とPBMCの腫瘍細胞傷害活性が相関することが示された。また、患者を末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性が高い方から９名と、残りの９名との２群に分け、ROC曲線から暫定的なカットオフ値を求めたところ、28％となった。この2群間で、ニボルマブの効果について有意差検定を行ったところ、ｐ＝0.0005となり、末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性の高い群では有意にニボルマブの効果が高かった（図８B）。【００８８】
このことから、PBMCを用いて測定される末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性は腫瘍免疫療法の効果との相関が高いことが示された。また、末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性は腫瘍免疫療法の効果の評価マーカとして使用できることが示された。【００８９】
ＶＩ．実施例５：末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性と腫瘍免疫療法の効果との相関
次に、肺癌患者のPBMCに由来する末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性と、腫瘍免疫療法の効果との相関を検討した。患者から採取したPBMCについて実施例１に従って腫瘍細胞傷害活性を測定し、腫瘍細胞傷害活性が25％以上の患者３名を抽出した。前記３名の患者において、抗PD-1抗体を用いた腫瘍免疫療法により腫瘍の縮小が認められ、その治療継続期間は140日以上であり、長期間の治療が可能であった。このように腫瘍の縮小が認められ、治療を継続できたことは、腫瘍免疫療法が有効であることを意味する。【００９０】
現在、腫瘍免疫療法を適用するか否かを判断するにあたり、腫瘍組織におけるPD-L1発現細胞の陽性率が１つの指標とされている。前記３名の患者について、腫瘍組織におけるPD-L1発現肺癌細胞の陽性率を計測したところ、２名の患者については、陽性率が50％以上であったが、１名の患者は陽性率が２％と非常に低値であった。PD-L1発現細胞の陽性率は、PD-L1タンパク質の免疫染色（免疫抗体法）を行うことにより評価されている。PD-L1発現細胞が２％しかない患者はPD-L1タンパク質の免疫染色では、腫瘍免疫療法が有効な患者であるとは予測することができない。【００９１】
一方で、前記PD-L1発現細胞が２％しかない患者のPBMCに由来する末梢血Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性を測定することにより、前記患者の末梢血Ｔ細胞が腫瘍細胞を傷害すると決定することができ、実際にそのような患者において腫瘍免疫療法の効果が認められた。従って、本開示における腫瘍免疫療法の効果を予測する方法によれば、PD-L1発現細胞の陽性率が低い患者についても、腫瘍免疫療法の適用できるか否かの予測があると考えられた。さらには、腫瘍免疫療法が有効な患者をPD-L1タンパク質の免疫染色よりも高い検出率で検出できると考えられた。
【符号の説明】
【００９２】
１０１  処理部
１０  予測装置  
【図１】
2019004415.tif 000003
【図２】
2019004415.tif 000004
【図３】
2019004415.tif 000005
【図４】
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【図５】
2019004415.tif 000007
【図６】
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【図７】
2019004415.tif 000009
【図８】
2019004415.tif 000010
【国際調査報告】
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2019004415.tif 000012
2019004415.tif 000013
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