(57)【要約】  本発明は、新規なメカニズムに基づく抗がん剤を提供するものであり、具体的にはクロマチンリモデリングに関与するSWI/SNF複合体依存的な、NF-κBまたはコリプレッサー複合体による遺伝子発現制御を阻害する阻害剤に関する。より具体的には、本発明は、内在性のSWI/SNF複合体とNF-κBもしくはコリプレッサー複合体との相互作用（結合、転写調節など）を低減する阻害剤、またはd4ファミリータンパク質のアダプター機能を阻害する阻害剤を提供する。本発明の阻害剤は、SWI/SNF複合体が関与するがん（SWI/SNF介在性がんなど）の治療に利用できる。
2018186032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) SWI/SNF複合体依存性の、NF-κBもしくはコリプレッサー複合体による遺伝子発現制御を阻害する、または
(b) d4ファミリータンパク質のアダプター機能を阻害する、阻害剤。
【請求項２】
前記阻害がd4ファミリータンパク質の機能に対する競合阻害、またはd4ファミリータンパク質の発現の抑制である、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
前記d4ファミリータンパク質が、DPF1、DPF2、DPF3aおよびDPF3bから選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の阻害剤。
【請求項４】
前記阻害剤が、d4ファミリータンパク質に対するドミナントネガティブ変異体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項５】
前記ドミナントネガティブ変異体が、配列番号１〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、d4ファミリーに対する競合阻害活性を有するポリペプチドである、請求項４に記載の阻害剤。
【請求項６】
SWI/SNF複合体と結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項７】
NF-κBおよび／またはコリプレッサー複合体と結合する、請求項４〜６のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項８】
IL-6および／またはIL-8の発現を低減する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項９】
配列番号１〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列、または配列番号１〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項１０】
d4ファミリー遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが、d4ファミリー遺伝子の発現を抑制する、RNAiを奏するRNA、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１０に記載の阻害剤。
【請求項１２】
前記d4ファミリー遺伝子の発現を抑制する、RNAiを奏するRNAが、配列番号７４〜７７のいずれかのd4ファミリー遺伝子に特異的であり、d4ファミリー遺伝子の発現を抑制するsiRNAまたはshRNAである、請求項１１に記載の阻害剤。
【請求項１３】
前記d4ファミリー遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドが、配列番号４１〜７３からなる群から選択される配列およびその配列の相補的配列からなる二本鎖RNA、ならびに前記配列に対して欠失、置換、挿入および/または付加されたヌクレオチドを１〜数個含む配列およびその相補的配列を含む二本鎖RNAから選択されるsiRNAまたはshRNAである、請求項１１または１２に記載の阻害剤。
【請求項１４】
前記d4ファミリー遺伝子の発現を阻害するRNAが、配列番号４１の配列と配列番号４２の配列との組合せ、配列番号４３の配列と配列番号４４の配列との組合せ、配列番号４５の配列と配列番号４６の配列との組合せ、配列番号４７の配列と配列番号４８の配列との組合せ、配列番号４９の配列と配列番号５０の配列との組合せ、配列番号５１の配列と配列番号５２の配列との組合せ、配列番号６０の配列と配列番号６１の配列との組合せ、配列番号６２の配列と配列番号６３の配列との組合せ、配列番号６４の配列と配列番号６５の配列との組合せ、配列番号６６の配列と配列番号６７の配列との組合せ、および配列番号６８の配列と配列番号６９の配列との組合せから選択される組のポリヌクレオチドがアニーリングしてなるsiRNAまたは前記siRNAの配列とループ配列を含んでなるshRNAである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項１５】
配列番号１６〜３３のいずれかから選択される配列を有するポリヌクレオチドを含むshRNAである、請求項１１に記載の阻害剤。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の阻害剤を含む医薬品組成物。
【請求項１７】
抗がん剤である、請求項１６に記載の医薬品組成物。
【請求項１８】
上皮がん治療剤である、請求項１６に記載の医薬品組成物。
【請求項１９】
神経膠芽腫治療剤である、請求項１６に記載の医薬品組成物。
【請求項２０】
DPF1遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを阻害剤として含んでなる、請求項１９に記載の医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマチンリモデリングに関与するSWI/SNF複合体依存的な、NF-κBまたはコリプレッサー複合体による遺伝子発現制御を阻害する阻害剤に関する。本発明の阻害剤は、SWI/SNF複合体が関与するがん（SWI/SNF介在性がんなど）の治療に利用できる。
【背景技術】
【０００２】
真核多細胞生物のゲノムDNAは、ヒストン八量体に巻き付いていて密なクロマチン構造を構築する。ゲノム遺伝子の転写、複製、修復などを行うためには，このクロマチン構造の密な構造を解いて、転写因子等の因子がゲノムDNAに直接、結合できるようにする必要がある。このようなエピジェネティカルな制御を担う機構の一つとしてクロマチン構造変換がある。このような活性をもつ進化的に保存された代表的な因子としてSWI/SNF複合体が見出されている。近年、ヒトのがんにおいてこのSWI/SNF複合体を構成するサブユニットの遺伝子に変異や欠失が見出され、SWI/SNF複合体の腫瘍の発生への関与が注目されている（特許文献１、２）。しかしながら、SWI/SNF複合体は各細胞種ごとに極めて幅広い遺伝子群の転写調節を担うため、がんなどの特定の疾患治療に利用する可能性が制限されている。【０００３】
転写因子NF-κBは、B細胞の免疫グロブリンκ鎖の転写に関与するものとして発見された。現在ではこのNF-κBは、幅広い細胞で、サイトカイン増殖因子、接着分子等の発現の活性化を通して発生・分化、細胞増殖およびアポトーシス等を含む多数の生命現象を制御していることが知られる。また、構成的または過剰なNF-κB活性が炎症性疾患や、自己免疫疾患において見出されているばかりか、多くの腫瘍細胞や白血病細胞においても恒常的な活性化が観察されることから、その阻害剤も作成されている（特許文献３〜５）。しかしながら、NF-κBの生物学的効果が非常に広範であるため、副作用の観点からNF-κB阻害剤は疾患治療に利用する可能性が制限されている。本発明者らは、これまでにd4ファミリータンパク質（DPF1、DPF2、DPF3a/b）が、NF-κBとSWI/SNF複合体を連結するアダプタータンパク質として機能することを報告した（非特許文献２〜３）。しかしながら、NF-κBとSWI/SNF複合体とが形成するより大きな複合体により転写活性化を受ける標的遺伝子群やその機構などについてはまだ解明されていない。【０００４】
核内レセプターファミリーに属するテイルレス（tailless：TLX、NR2E1とも命名される）は発生過程において、ショウジョウバエ胚の末端やマウスの前脳などにおいて発現される転写調節因子である。TLXは、ヒト成人の脳内では「脳室下帯（subventicular zone）等に存在する神経幹細胞で発現しており、神経発生に重要な機能を果たすと共に、神経幹細胞に由来する脳腫瘍に関与することも示されている。TLX遺伝子のノックアウトマウスは、辺縁系の欠損など、中枢神経系に関する表現型を有することが示されている。TLXの機能が改変されると、鬱病、不安症、攻撃性疾患、卒中、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ニューロパシー性の痛み、中枢神経系の炎症性疾患および他の神経変性疾患などの中枢神経系の疾患、目の欠陥および中枢神経系の発達などに影響し得る（特許文献６）。【０００５】
神経膠腫幹細胞（glioma initiating cell：GIC）は、成人の致死性原発性脳腫瘍である神経膠芽腫（glioblastoma）の治療抵抗性および腫瘍再発の原因になっていると考えられている。GICの幹細胞様特性、例えば自己複製能および腫瘍形成能はエピジェネティカルに制御されるが、これらの細胞において、ヒトの主要なクロマチンリモデリング複合体であるSWI/SNF複合体などの因子の関与やこれと関連する転写調節因子の役割などは詳細には解明されていない（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2003-299486
【特許文献２】特表2015-536308
【特許文献３】特表2008-538285
【特許文献４】特表2003-521214
【特許文献５】国際公開WO 2006/132204
【特許文献６】特表2000-506397
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ishiduka, A.ら、JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, VOL.287, NO.15, pp. 11924-11933, 2012
【非特許文献２】Nakamura, S.ら、「第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会合同大会, 2LBA-050, 神戸, 2015年12月2日  (on line による要旨集公開日；2015/11/16)「SWI/SNF複合体とNF-κBを連結するアダプタータンパク質の機能阻害によるがんの抑制」
【非特許文献３】Kobayashi, K.ら、「第74回日本癌学会学術総会, J-1183, 名古屋,2015年10月9日  （抄録集公開日（on line を含む）2015/9/18）」「Suppression of adaptor proteins linking the SWI/SNF complex with NF-κB dimers efficiently suppresses cancer development」
【非特許文献４】Hiramatsu  H.ら  「第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会合同大会, 1P-1053, 神戸, 2015年12月1日  (on line 要旨集公開日；2015/11/16)」「グリオーマ幹細胞性の維持におけるSWI/SNFクロマチン構造変換複合体の役割」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、新規のメカニズムに基づく抗がん剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、SWI/SNF複合体依存性の、NF-κBまたはコリプレッサー複合体による遺伝子発現制御を阻害する阻害剤が抗がん活性を有することを見出した。【００１０】
詳細には、本発明者らは、SWI/SNF複合体が機能している上皮がんにおいて、SWI/SNF複合体依存的なNF-κB標的遺伝子の発現に必須であるd4ファミリータンパク質をコードする遺伝子の発現をノックダウン、特にDPF2、DPF3a/3bをコードする遺伝子の発現をノックダウンするsiRNA1、shRNAが、前記上皮がんに対して強い抗がん活性を示すことを見出した。更に、本発明者らは、DPF1、DPF2、DPF3a/3b間で高度に保存されたＮ末端の84アミノ酸残基からなる領域（CT1ペプチドと称する）が、上皮がんに対して前記siRNA、shRNAよりも強い抗がん活性を示すことを見出した。【００１１】
本発明者らはまた、SWI/SNF複合体が、d4ファミリータンパク質、特にDPF1、DPF3aを介して、GICにおける幹細胞性の維持に必須の役割を果たしていることを見出した。詳細には、これらd4ファミリーをコードする遺伝子の発現をノックダウン、特にDPF1、DPF3aをコードする遺伝子の発現をノックダウンするsiRNA、shRNAが、SWI/SNF複合体依存的な核内受容体TLXおよびLSD1/RCOR2を含むコリプレッサー複合体の活性を抑制することで強い抗がん活性を示すことを見出した。【００１２】
本発明は、上記知見に基づくものであり、次に示す阻害剤、医薬品組成物などを提供する。
[１]  (a) SWI/SNF複合体依存性の、NF-κBもしくはコリプレッサー複合体による遺伝子発現制御を阻害する、または(b) d4ファミリータンパク質のアダプター機能を阻害する、阻害剤。
[２]  前記阻害がd4ファミリータンパク質の機能に対する競合阻害、またはd4ファミリータンパク質の発現の抑制である、前記[１]に記載の阻害剤。
[３]  前記d4ファミリータンパク質が、DPF1、DPF2、DPF3aおよびDPF3bから選択される少なくとも１つである、前記[２]に記載の阻害剤。
[４]  前記阻害剤が、d4ファミリータンパク質に対するドミナントネガティブ変異体である、前記[１]〜[３]のいずれかに記載の阻害剤。
[５]  前記ドミナントネガティブ変異体が、配列番号１〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、d4ファミリーに対する競合阻害活性を有するポリペプチドである、前記[４]に記載の阻害剤。
[６]  SWI/SNF複合体と結合する、前記[１]〜[５]のいずれかに記載の阻害剤。
[７]  NF-κBおよび／またはコリプレッサー複合体と結合する、前記[４]〜[６]のいずれかに記載の阻害剤。
[８]  IL-6および／またはIL-8の発現を低減する、前記[１]〜[７]のいずれかに記載の阻害剤。
[９]  配列番号１〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列、または配列番号１〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターである、前記[１]〜[３]のいずれかに記載の阻害剤。
[１０]  d4ファミリー遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドである、前記[１]〜[３]のいずれかに記載の阻害剤。
[１１]  前記ポリヌクレオチドが、d4ファミリー遺伝子の発現を抑制する、RNAiを奏するRNA、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、前記[１０]に記載の阻害剤。
[１２]  前記d4ファミリー遺伝子の発現を抑制する、RNAiを奏するRNAが、配列番号７４〜７７のいずれかのd4ファミリー遺伝子に特異的であり、d4ファミリー遺伝子の発現を抑制するsiRNAまたはshRNAである、前記[１１]に記載の阻害剤。
[１３]  前記d4ファミリー遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドが、配列番号４１〜７３からなる群から選択される配列およびその配列の相補的配列からなる二本鎖RNA、ならびに前記配列に対して欠失、置換、挿入および/または付加されたヌクレオチドを１〜数個含む配列およびその相補的配列を含む二本鎖RNAから選択されるsiRNAまたはshRNAである、前記[１１]または[１２]に記載の阻害剤。
[１４]  前記d4ファミリー遺伝子の発現を阻害するRNAが、配列番号４１の配列と配列番号４２の配列との組合せ、配列番号４３の配列と配列番号４４の配列との組合せ、配列番号４５の配列と配列番号４６の配列との組合せ、配列番号４７の配列と配列番号４８の配列との組合せ、配列番号４９の配列と配列番号５０の配列との組合せ、配列番号５１の配列と配列番号５２の配列との組合せ、配列番号６０の配列と配列番号６１の配列との組合せ、配列番号６２の配列と配列番号６３の配列との組合せ、配列番号６４の配列と配列番号６５の配列との組合せ、配列番号６６の配列と配列番号６７の配列との組合せ、および配列番号６８の配列と配列番号６９の配列との組合せから選択される組のポリヌクレオチドがアニーリングしてなるsiRNAまたは前記siRNAの配列とループ配列を含んでなるshRNAである、前記[１１]〜[１３]のいずれかに記載の阻害剤。
[１５]  配列番号１６〜３３のいずれかから選択される配列を有するポリヌクレオチドを含むshRNAである、前記[１１]に記載の阻害剤。
[１６]   前記[１]〜[１５]のいずれかに記載の阻害剤を含む医薬品組成物。
[１７]  抗がん剤である、前記[１６]に記載の医薬品組成物。
[１８]  上皮がん治療剤である、前記[１６]に記載の医薬品組成物。
[１９]  神経膠芽腫治療剤である、前記[１６]に記載の医薬品組成物。
[２０]  DPF1遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを阻害剤として含んでなる、前記[１９]に記載の医薬品組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、クロマチンリモデリングを担うSWI/SNF複合体依存性の特定の機能を阻害／調節することによって、新規メカニズムに基づく抗がん剤を提供することが可能になる。より具体的には、SWI/SNF複合体が機能している上皮がんに対して、d4ファミリータンパク質由来のドミナントネガティブ変異体（CT1など）またはd4ファミリータンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチド阻害剤（siRNA、shRNAなど）を含む医薬品組成物を提供することができる。また、神経膠腫に対して、d4ファミリータンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチド阻害剤（siRNA、shRNAなど）を含む医薬品組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、HeLaS3（Ａ）およびA549（Ｂ）の足場非依存性増殖に対する、d4ファミリータンパク質ならびにBrmおよびBRG1をコードする各々の遺伝子ノックダウンの効果を示す。
【図２−１】図２は、d4ファミリータンパク質およびそのドミナントネガティブ変異体の構造およびアミノ酸配列を示す。（Ａ）d4ファミリータンパク質ならびにそのC末端側が切除された変異体CT1の構造の模式図を表す。（Ｂ）DPF1、DPF2およびDPF3のＮ末端側領域のCT1に対応するアミノ酸配列のアライメントを示す。boxは、核移行シグナル配列を示す。
【図２−２】図２（Ｃ）および（Ｄ）は、単層培養（Ｃ）および軟寒天中（Ｄ）における、A549細胞およびHeLaS3細胞の細胞増殖に対するHalo-DPF2-CT1およびHalo-DPF3-CT1の異所的な発現の効果を示す。（Ｅ）は単層培養でのA549細胞に導入したHaloタグ付加タンパク質の発現を抗Halo抗体を用いたウエスタンブロット法 により解析した結果を示す。
【図３−１】図３（Ａ）は、A549細胞およびHeLaS3細胞における１時間のTNF-α刺激により誘導されるNF-κB標的遺伝子である、IL-6, IL-8, TNF-αおよびICAM1のｍRNAの発現レベルに対するHalo-DPF2-CT1およびHalo-DPF3-CT1の異所性発現の効果をRT-PCR法で測定した結果を示す。（Ｂ）は、（Ａ）と同様に30分、60分、90分および120分間のTNF-α刺激を行った結果を示す。
【図３−２】図３（Ｃ）は、TNF-α未処理にて維持した培養物からRNAを抽出し（Ａ）と同様に上記４種の遺伝子のmRNAレベルを測定した結果を示す。
【図４−１】図４（Ａ）および（Ｂ）は、HAタグ付のドミナントネガティブ変異体HA-DPF3-CT1の機能解析の結果を示す。単層培養（Ａ）および軟寒天中（Ｂ）でのA549細胞およびHeLaS3細胞の細胞増殖に対する異所性発現させたHA-DPF3-CT1の効果を示す。
【図４−２】図４（Ｃ）および（Ｄ）は同じ条件下でのHA-DPF3-CT1の発現（Ｃ）、並びにSWI/SNF複合体の触媒サブユニットとHA-DPF3-CT1、HA-DPF3aおよびHA-DPF3bとの共免疫沈降実験の結果（Ｄ）を示す。
【図５】図５は、HAタグを付加したDPF3-CT1由来の欠失変異体のA549細胞中での異所性発現性と生物学的活性を示す。
【図６】図６は、A549細胞を使ったマウスXenograftモデルにおける腫瘍形成能に対するHA-DPF3-CT1の異所性発現効果を示す。
【図７】図７は、SWI/SNF複合体、d4ファミリータンパク質、およびNF-κBの間の相互作用に関する模式図を示す。
【図８−１】図８（Ａ）は、異なる患者由来の３種類のGICとそれらから誘導された対応する分化細胞での、SWI/SNF複合体および前記複合体に強く結合するタンパク質のサブユニットをコードするmRNAの発現の変化をRT-PCR法で測定した結果を示す。
【図８−２】図８（Ｂ）は、（Ａ）の結果のうちDPF1、DPF2、DPF3a、DPF3b、BRG1およびBrm ｍRNAの結果を棒グラフ化したものを示す。
【図９−１】図９（Ａ）は、TGS-01細胞のスフェア形成活性に対するd4ファミリータンパク質、BRG1、Brmのノックダウン効果を示す。
【図９−２】図９（Ｂ）は、図９（Ａ）のスフェアの形成活性に対する遺伝子ノックダウン効果が、BRG1、DPF1およびDPF3aのcDNAの同時発現によってレスキューされたことを示す。
【図９−３】図９（Ｃ）は、DPF3aを異所性発現するTGS-01細胞が、DPF1ノックダウンに対して感受性であったが、DPF1を異所性発現するTGS-01細胞は、DPF3ノックダウンに対して抵抗性あったことを示す。
【図１０−１】図１０（Ａ）および（Ｂ）は、TGS-04細胞（Ａ）およびTGS-05細胞（Ｂ）のスフェア形成活性に対するBRG1またはBrmのノックダウンの効果を示す。
【図１０−２】図１０（Ｃ）は、TGS-01細胞におけるBRGのノックダウン効果がBrmのcDNAの同時発現によって部分的にレスキューされたことを示す。
【図１１】図１１は、TGS-01細胞を同所移植したヌードマウスのカプラン-マイヤー生存曲線を示す。
【図１２−１】図１２（Ａ）および（Ｂ）は、TGS-01細胞内におけるTLXおよびLSD1/RCOR2を含むより巨大なSWI/SNF複合体を、免疫沈降物に対するウエスタンブロット法で検出した結果を示す。
【図１２−２】図１２（Ｃ）および（Ｄ）は、FLAGタグを付加したDPF1、DPF2またはDPF3aを異所性に発現するTGS-01細胞のライセートを用いて、免疫沈降物に対するウエスタンブロット法を行いより巨大なSWI/SNF複合体を検出した結果を示す。
【図１３】図１３は、TGS-01細胞内でSWI/SNF複合体とTLXとLSD1/RCOR2とが近位に局在していることをPLA法により検出した結果を示す。
【図１４】図１４は、DPF1ノックダウンによりTGS-01細胞内で近位に位置するSWI/SNF複合体とTLX（またはLSD1/RCOR2）のシグナル（dot数）の変化をPLAによって検出した結果を示す。
【図１５】図１５は、GICにおけるSWI/SNF複合体、d4ファミリータンパク質、およびTLXを含むコリプレッサー複合体の間の相互作用に関する模式図を示す。
【図１６】図１６は、GICの幹細胞性喪失に適した、d4ファミリー遺伝子に対するshRNAの検討結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の各実施形態および各用語について以下に詳細に説明するが、以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をそのような実施の形態のみに限定する趣旨ではない。すなわち、本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
【００１６】
本発明は、SWI/SNF複合体依存的にNF-κB、またはTLXを含むコリプレッサー複合体による遺伝子発現制御を阻害する阻害剤を提供する。好ましくは、本発明の阻害剤は、インビトロおよびインビボの両方においてSWI/SNF複合体依存的なNF-κBまたはTLXを含むコリプレッサー複合体による遺伝子発現制御を阻害する。
【００１７】
（１．SWI/SNF複合体について）
本明細書中、「SWI/SNF複合体」とは分子量約２Ｍダルトンの多種タンパク質から構成される複合体を言う。本明細書中、SWI/SNF複合体の具体例としては、主としてヒトおよびその他の哺乳動物のBrm（GenBankアクセッション番号X72889）またはBRG1（GenBankアクセッション番号U29175）をDNA依存性ATPaseサブユニットとして含む複合体を意味するが、酵母のSWI/SNFまたはDrosophilaのBrahmaのヒトや哺乳動物におけるその他のホモログも含み得る。
【００１８】
ヒトなどの哺乳動物におけるSWI/SNF複合体は、Brmを含むものとBRG1を含むものの２種に大別される。その他のSWI/SNF複合体の構成成分としては、哺乳動物の場合、INI1、BAF250、BAF60a、BAF60b、BAF60c、BAF170、BAF57、BAF155、BAF53、β-アクチン等が挙げられるが、これらに制限されない（Vignali, M.ら、 (2000) Mol. Cell. Biol. 20, 1899-1910）。SWI/SNF複合体の構成因子の一例を以下に示す。
【表１】
2018186032.tif 000003
（「京府医大誌 124（12），825〜838，2015」より一部改変して転記）
【００１９】
SWI/SNF複合体は、DNA依存性ATPaseによってクロマチンリモデリング機能を有する。クロマチンリモデリングとは、DNAのクロマチン構造を変化させる過程を指す。クロマチン構造とは、主としてDNAとヒストンとを主成分とし、４種類のヒストン分子（H2A、H2B、H3およびH4）によって形成されたヒストン八量体の周りに165bp（約２周分）のDNAが巻き付いて形成されたヌクレオソームを基本単位構造とし、このヌクレオソームが折りたたまれて圧縮された構造を指す。この高度に折りたたまれたDNAは転写、複製、修復、組換えなどに対して妨げとなる。そこで、SWI/SNF複合体は、ATP加水分解のエネルギーを利用してヌクレオソームを移動および／または除去することによって、クロマチン構造を変化させる機能を有している。このとき、ヒストンの修飾酵素（ヒストンアセチル化酵素、脱アセチル化酵素、リン酸化酵素、メチル化酵素など）と一緒になって遺伝子の発現および／または制御に重要な働きをする。SWI/SNF複合体は、例えばDNAからmRNAが転写される際、上記のクロマチンリモデリングによってクロマチン構造を変化させて、標的のDNA配列を露出させることで、転写調節因子などがDNAにアクセス可能になる。
【００２０】
本明細書中、「SWI/SNF複合体依存性の、NF-κBまたはコリプレッサー複合体による転写制御」とは、一実施形態において、細胞内のSWI/SNF複合体とd4ファミリータンパク質、NF-κB（通常NF-κBファミリータンパク質サブユニットの2量体から構成される）またはTLXを含んでいるコリプレッサー複合体が巨大な複合体を形成することで転写制御活性を奏することを意味する。
【００２１】
SWI/SNF複合体は、コアユニットまたはサブユニットを介して種々の転写制御因子と結合できることが公知である。例えば、BRG1にはグルココルチコイドレセプターおよびエストロゲンレセプターが結合すること（Peterson, C.L.ら、(2000) Curr.Opin. Gen. Dev. 10, 187-192）、Ini1にはc-Mycが結合すること（Yudkovsky, N.ら、(1999). Genes Dev. 13, 2369-2374）、BAF60aにはc-Fosおよびc-Junが結合すること（Ito, T.ら、(2001) J. Biol.Chem. 276:2852-2857）が知られている。また、d4ファミリータンパク質であるDPF3a/b、DPF2などがアダプターとして機能して、NF-κB（Rel A/p50、Rel B/p52）と結合することが報告されている（Tando, Tら、J. Biol. Chem. 285, 21951-21960(2010)；非特許文献１〜３）。本発明においては、新たにSWI/SNF複合体がd4ファミリータンパク質をアダプターとしてTLXを含むコリプレッサー複合体と結合していることを明らかにした。本発明におけるSWI/SNF複合体依存性の転写制御とは、特にd4ファミリータンパク質、およびNF-κBまたはTLXを含むコリプレッサー複合体のいずれかの転写制御因子からなる巨大複合体による転写制御を対象とする。
【００２２】
SWI/SNF複合体と対象の転写制御因子との相互作用の変化を検出する手段としては、SWI/SNF複合体と対象の転写制御因子とが結合することを検出する手段、SWI/SNF複合体と対象の転写制御因子とが近位に位置していることを検出する手段、SWI/SNF複合体の存在下での対象となる転写制御因子の転写活性（上方制御または下方制御）を検出する手段が挙げられるが、これらに限定されず、当業者に公知の種々の他の手段を用いて検出してもよい。具体的な検出手段としては、例えば、免疫沈降、密度勾配遠心分離法、ゲルシフトアッセイ、ChIP（クロマチン免疫沈降）アッセイ、ファーウェスタンブロット、酵母ツーハイブリッド法、などの方法が挙げられる。SWI/SNF複合体と対象の転写調節因子とが近位に位置していることを検出する手段としては、Proximity Ligationアッセイ（PLA）（本明細書中の実施例に記載の方法）や蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）法、生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）法などが挙げられる。SWI/SNF複合体の存在下での対象となる転写調節因子の転写活性（上方制御または下方制御）を検出する手段としては、レポーター（ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼなど）を用いるレポーターアッセイ、定量的RT-PCR（qRT-PCR）、マイクロアレイ、ノーザンハイブリダイゼーションなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
また、本明細書中、SWI/SNF複合体依存性の転写制御因子による遺伝子発現制御を抑制することは、SWI/SNF複合体と当該転写制御因子との共存、一方の発現量や活性の上下、変異などの変化が生じた結果、細胞が増殖、分化、足場非依存性、細胞表面分子の変化などの異常を示すこと、あるいは宿主細胞の増殖停止もしくは遅滞、休眠、アポトーシスなど、様々な細胞レベルでの変化を引き起こすことも意味する。上記のとおり、SWI/SNF複合体は、細胞内で種々の転写調節因子などとの相互作用を介して、その宿主細胞に変化を生じさせ得る。SWI/SNF複合体のサブユニットにおける変異は、様々ながんで発見され、SWI/SNF複合体とがんの関連が注目されている（Wang Xら、Clin Cancer Res 2014, 20, 21-27；Biegel J.A.ら、Am J Med Genet C Semin Med Genet 2014, 166C, 350-66；Helming  K.C.ら、Cancer Cell 2014, 26, 309-317；Wilson, B.G.ら、Nat. Rev. Cancer 2011, 11:481-492）。
【００２４】
（２．NF-κBについて）
NF-κBは、核内因子κＢともいい、免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子が成熟Ｂ細胞特異的に発現するために必要なエンハンサー領域に結合する転写因子として見出された。NF-κBは、RelA(p65）、RelB、c-Rel、NF-κB1 (p105/p50）、NF-κB2(p100/p52)の5種類のRelファミリータンパク質がそれぞれホモダイマーあるいはヘテロダイマーを形成することによって構成され、免疫、炎症、発生、細胞増殖、アポトーシスなどの細胞内機能を誘導し、さらには外因性である多くのウイルスゲノム遺伝子の発現も誘導する。これら多彩な生命現象を正しく維持するためには、NF-κBが選択性をもって標的遺伝子群のプロモーターを活性化させる必要があるが、その機構の詳細については未解明な点が多い。そこで、例えば、シグナル伝達の最下流で各NF-κBダイマーにプロモーター選択性を与える分子機構の解明が重要である。NF-κBの標的遺伝子の発現制御には、近傍のクロマチン環境も大きく影響を及ぼしていると考えられている。
【００２５】
NF-κBは数多くの疾患と関係しており、前記疾患としては例えば、急性および慢性の炎症反応、クローン病、関節リウマチ、がん、敗血症ショック、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）やサイトメガロウイルスなどのウイルス性疾患、慢性閉塞性肺疾患（COPD）,嚢胞性線維症、神経変性疾患などが挙げられる。
【００２６】
TNF-αまたはLPSのような炎症性刺激による誘導において、IκBαがIκBキナーゼ（IKK）複合体によるリン酸化等を経て、NF-κBの細胞核内への移行が引き起こされる。NF-κBは、多くのサイトカインおよび増殖因子（例えば、IL-2、IL-8、IFN-β、M-CSF、G-CSF、VEGF）、ならびに種々の転写因子およびシグナルレギュレーター（例えば、IκBα、IRF-1、IRF-2）の転写を誘導する。本発明では、上皮がんにおけるNF-κBの機能として、増殖因子IL-6、IL-8およびTNF-α、ならびに細胞接着分子ICAM1から選択されるタンパク質を発現または産生する能力を指標とするが、他の公知のNF-κB依存性のタンパク質を指標として用いることもできる。その他の指標としては、例えば、細胞増殖能の確認、アポトーシス誘導能が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２７】
（３．コリプレッサー複合体について）
一実施形態において、本発明は、コリプレッサー複合体による遺伝子発現制御を阻害する阻害剤を提供する。本発明において、コリプレッサー複合体とはコファクターに属する因子を指す。コファクターとは、転写制御因子と基本転写因子との間の橋渡しを行って転写を促進または抑制する因子を指し、コアクチベーター複合体およびコリプレッサー複合体が含まれる。例えば、コアクチベーター複合体を構成する種々のサブユニットにはヒストンを修飾して転写促進を行う機能を有するもの（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ：HAT）を含み得、一方コリプレッサー複合体を構成するサブユニットにはヒストンの修飾を除去して転写抑制を行う機能を有するもの（例えば、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）、ヒストン脱メチル化酵素など）を含み得る（特許文献１、２、特開2015-147794、Karin Meier & Alexander Brehm (2014), Epigenetics, 9:11, 1485-1495, DOI: １０．4161/15592294.2014.971580など）。また、コリプレッサー複合体の中に、TLX、RCOR2、LSD1から選択される少なくとも1つの分子が含まれているものもある（Yangら、Stem Cells. 2011 29:791-801）。これらコアクチベーター複合体およびコリプレッサー複合体は、上記のSWI/SNF複合体と一緒になってより巨大な複合体を形成し得る。
【００２８】
コリプレッサー複合体を検出するには、構成サブユニットに対する抗体（抗HDAC抗体など）を用いるウエスタンブロット、免疫沈降、ChIPアッセイなどの検出手段、ヒストン脱アセチル化酵素活性を検出する手段など、当業者に公知の手段が利用可能である。
【００２９】
核内受容体ファミリーとは、一般的には、リガンドであるステロイド、甲状腺ホルモン、女性ホルモン、男性ホルモン、レチノイン酸、レチノイド、ビタミンＤ、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド等の受容体であって、こうしたリガンドが結合すると核内で転写因子として機能するタンパク質のファミリーを指す(Parker (1993) Curr. Op. Cell. Biol. 5: 499-504、Laudetら(1992) EMBO J. 11: 1003-1013、Mangelsdorfら,1995 Cell 83: 835-839, Loprs de SilvaおよびBurbach、(1995) Trends Neurosci. 18: 542-548など)。核内受容体ファミリータンパク質は、DNA結合ドメインおよびリガンド結合ドメインを含む類似のドメイン構造を有しており、生体の代謝、恒常性、分化、成長、発生、老化、生殖などの機能を担う。
【００３０】
TLXは、核内受容体ファミリーの一員であり、テイルレスとしても知られる（Monaghanら、1995, Development 121:839-853；Pignoniら、1990, Cell 62: 151-163）。このTLXは、ショウジョウバエ(Pignoniet al,1990)、マウス(Tuら、1994, Nature 370: 375-379；Monaghanら、1995)、アフリカツメガエル（Hollemanら、1996, GenBank受託番号Ｕ67886）、ニワトリ（Yuら、1994）、ヒト（GenBank受託番号Y13276；Jacksonら、Royal Free Hospital, London）等において見出されている。TLXは、リガンドが判明していないオーファンレセプターである。TLXは、発達中のショウジョウバエ胚の末端（Pignoni et al,1990）および発達中のニワトリおよびマウスの前脳（Yu et al,1994；Monaghan et al,1995）において発現している。TLX遺伝子のノックアウトマウスは、辺縁系が欠損しているなどの表現型を有することが示されている(Monaghan et al,1997, Nature 390:515-517)。ホモ接合変異マウスは誕生時には生育可能であるが、嗅覚皮質、下嗅覚皮質および内嗅覚皮質を含む嗅脳および辺縁構造、扁桃および歯状回のサイズが小さい。TLXの機能欠失はすべての原脳神経芽細胞の不存在を招く(Younossi-Hartensteinら、1997, Developmental Biology 182:270-283)。TLXの機能が異常となると、鬱病、不安症、攻撃性疾患、卒中、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ニューロパシー性の痛み、中枢神経系の炎症性疾患および他の神経変性疾患を包含する中枢神経系の疾病など、目および／または中枢神経系に問題が生じ得る。
【００３１】
TLXは、コリプレッサーであるアトロフィン１（ATN1）と複合体を形成すること（Zhang, CL.ら、2006, Genes and Dev. 20: 1308-1320）、ヒストン脱アセチル化酵素複合体１（HDAC1）を動員（リクルート）すること（Sun, GQ.ら、PNAS, 2007, 104, 39, pp.15282-15287）、LSD1およびBCL11Aと一緒に作用すること（Corso-Diaz, Xら、BMC Genomics, 2016, 17:832）など報告されている。しかしながら、SWI/SNF複合体との相互作用や依存性については明確にされたとはいえない。
【００３２】
（４．d4ファミリータンパク質について）
d4ファミリータンパク質は、転写共役因子（コファクター）として機能することが知られている。このd4ファミリータンパク質には、DPF1、DPF2、DPF3a、DPF3bが含まれる。これらファミリータンパク質は核移行シグナルを含むＮ末端側の領域、中央のC2H2型クルッペル様ジンクフィンガーモチーフ、Ｃ末端側にPHDジンクフィンガーモチーフ（PHD1、PHD2）を１つまたは２つを含むd4ドメインを有することにより特徴付けられる(図２（Ａ）、Buchman, V.L.ら、1992, Nucleic Acids Res.20, 5579-5585）。
【００３３】
DPF1（Neud4、BAF45bとも称される）は、ヒトではアイソフォームａ、ｂ、ｄ等が報告されており、ヒトアイソフォームａは414アミノ酸を有する（GenBankアクセッション番号： NP_001128627；Chestkov AVら、Genomics 36 (1), 174-177 (1996)）。またこれに対応するcDNA配列は NM_001135155（配列番号７４） で、Homo sapiens double PHD fingers 1 (DPF1), transcript variant 1, mRNAである。このDPF1および下記のDPF3a/bは、神経細胞内で分化に特異的な様式でSWI/SNF複合体と結合することが報告されている（Lessard, J.ら、2007, Neuron 55, 201-215）。
【００３４】
DPF2（requiem、BAF45dとも称される）は、ヒトではアイソフォーム１、２等が報告されており、ヒトアイソフォーム１は391アミノ酸を有する（GenBankアクセッション番号：NP_006259.1）。これに対応するcDNA配列はNM_006268.4（配列番号７５）でHomo sapiens double PHD fingers 2 (DPF2), transcript variant 1, mRNAである。このDPF2および下記のDPF3a/bは、NF-κBとSWI/SNF複合体との間のアダプター分子として機能し、NF-κBの非標準の経路の下流の大部分においてNF-κBの転写活性化に重要な役割を担うことが報告されている（Tandoら、2010, J. BIOL. CHEM., 285, 29, pp. 21951-21960、非特許文献１）。
【００３５】
DPF3（Cerd4、BAF45cとも称される）は、２つのスプライシングバリアント（DPF3aおよびDPF3b）があり、それら産物はC末端側が異なる。ヒトDPF3aおよびDPF3bは、それぞれ357アミノ酸および378アミノ酸を有する（GenBankアクセッション番号： NP_036206.3；Liu, H.ら、Int J Clin Exp Pathol 7 (7), 3966-3974 (2014)、およびGenBankアクセッション番号：Q92784.3；Lange, M.ら、2008, Genes Dev.22, 2370-2384）。対応するcDNA配列はそれぞれDPF3aはNM_012074.4（配列番号７６）で Homo sapiens D4, zinc and double PHD fingers, family 3 (DPF3), transcript variant 1, mRNA、またDPF3bはNM_001280542.1（配列番号７７）で Homo sapiens D4, zinc and double PHD fingers, family 3 (DPF3), transcript variant 2, mRNAである。DPF3bタンパク質は、２つのPHDフィンガーを介したヒストンH3およびH4のメチル化残基またはアセチル化残基のいずれかに対する結合活性など、他のd4ファミリーメンバーの特徴を全て有しているが、DPF3aはPHDドメイン内にあるd4ドメイン末端が欠如して不完全なPHDフィンガーが１つであり、これら修飾ヒストンとの結合機能を欠いている。
【００３６】
（ａ．アダプター機能について）
本発明において、アダプター機能とは、SWI/SNF複合体と転写制御因子との相互作用（結合）や転写制御に関わる新たな活性の付与などを担う機能を意味する。SWI/SNF複合体と転写制御因子との相互作用を変化させる手段として、従来では、SWI/SNF複合体の成分（１つまたはそれ以上の成分）の発現を低下または欠損させるなど、細胞内に存在する機能的SWI/SNF複合体レベルを低下させることが行われた（特許文献１、２）。しかしながら、SWI/SNF複合体と相互作用することが知られる上記の様々な転写制御因子の標的となっている遺伝子群は、必ずしもSWI/SNF複合体に依存して制御を受ける場合だけではなく、SWI/SNF複合体なしにこの転写制御因子により制御を受ける場合も知られる。
【００３７】
したがって、本発明では、SWI/SNF複合体依存性の特定の転写制御因子（例えば、NF-κB、TLXを含むコリプレッサー複合体）との相互作用や転写制御に関わる新たな活性を低減させることによって、その転写制御因子の特定の機能を阻害する方法を提供する。このような方法として、例えば、SWI/SNF複合体と種々の転写制御因子との間のアダプターとして機能する物質（タンパク質）のアダプター機能を阻害することにより、SWI/SNF複合体依存性の転写制御因子の作用を低減させる方法が挙げられる。このアダプター機能の阻害は、上記の相互作用の変化や特定の転写制御活性を検出する手段を用いることによって、適宜検出し定量化することが可能である。
【００３８】
本発明において、SWI/SNF複合体と特定の転写制御因子との間のアダプター機能を阻害する手段として、当該機能を阻害する阻害タンパク質も含まれる。一実施形態において、本発明は、上記アダプタータンパク質のドミナントネガティブ変異体を用いて、SWI/SNF複合体と特定の転写制御因子との間のアダプター機能を阻害する手段を提供する。別の実施形態において、本発明は、アダプター機能を低減させる手段として上記アダプタータンパク質の遺伝子発現を阻害することによって、SWI/SNF複合体と特定の転写制御因子の間のアダプター機能を阻害する手段を提供する。
【００３９】
（ｂ．本発明のドミナントネガティブ変異体について）
本発明の「d4ファミリータンパク質に対するドミナントネガティブ変異体」は、細胞内でd4ファミリータンパク質とSWI/SNF複合体および／またはd4ファミリータンパク質と転写制御因子との結合に対して競合し、野生型のd4ファミリータンパク質、SWI/SNF複合体、転写制御因子を含む、巨大複合体が奏する機能（転写制御など）を低減させ得る。d4ファミリータンパク質は、SWI/SNF複合体と転写制御因子（NF-κB、コリプレッサー複合体）とのアダプター機能を有している（非特許文献１など）。例えば、d4ファミリータンパク質とSWI/SNF複合体との結合部および／またはd4ファミリータンパク質と転写制御因子との結合部位以外の部位を除去することにより、d4ファミリータンパク質に対するドミナントネガティブ変異体を調製できる可能性がある。
【００４０】
本発明のドミナントネガティブ変異体が「SWI/SNF複合体と結合する」とは、この変異体が細胞核内に存在する場合、内在性のSWI/SNF複合体と結合して複合体を形成できることを意味する。また、本発明のドミナントネガティブ変異体が「NF-κB、および／またはコリプレッサー複合体と結合する」とは、この変異体が細胞質または細胞核内、好ましくは細胞核内、に存在する場合、内在性のNF-κB、コリプレッサー複合体と結合して複合体を形成できることを意味する。
【００４１】
本発明の前記ドミナントネガティブ変異体は、細胞内でSWI/SNF複合体および／またはNF-κB、コリプレッサー複合体と複合体を形成する場合、結果としてNF-κB、コリプレッサー複合体のSWI/SNF複合体依存性の転写制御を阻害することができる。例えば、NF-κBを活性化させる外部シグナル（TNF-α）に応答する場合、NF-κBによってSWI/SNF複合体依存性に転写調節される遺伝子、例えばIL-6遺伝子およびIL-8遺伝子の転写は本発明のドミナントネガティブ変異体によって有意に阻害されるが、NF-κBによってSWI/SNF複合体非依存性に転写調節される遺伝子、例えばTNF-α遺伝子およびICAM1遺伝子の転写は、本発明のドミナントネガティブ変異体によって有意には影響されない。
【００４２】
本発明に係るd4ファミリータンパク質に対するドミナントネガティブ変異体は、例えば、d4ファミリータンパク質のＮ末側部分のポリペプチドであって、d4ファミリータンパク質の核移行シグナル（NLS）を含む。より具体的な例としては、本発明のドミナントネガティブ変異体は、本明細書中に提供される配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列と85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、もしくは98％以上の同一性、または配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列に対してアミノ酸の欠失、置換および／もしくは付加されたアミノ酸残基を１〜数個有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、SWI/SNF複合体、NF-κB、コリプレッサー複合体などの転写制御因子との結合能を有し、d4ファミリータンパク質による内在性のSWI/SNF複合体および／もしくはNF-κB、コリプレッサー複合体などの転写制御因子との間の結合と競合する機能、ならびに／またはその転写調節因子の転写活性を変化（好ましくは低減もしくは阻害）させる機能など、前述の相互作用の変化を測定する手段によって検出し定量化され得る機能を有する。上記の同一性の割合は高いほど好ましい。また上記の各同一性を有するポリペプチド変異体は、元のポリペプチド変異体と比較して、上記の各機能の少なくとも１つについて、10％以上、好ましくは20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、または90％以上の比活性を有し得る。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態において、本発明のd4ファミリータンパク質に対するドミナントネガティブ変異体は、d4ファミリータンパク質の機能部分のさらに限定されたポリペプチドのみを含み得る。例えば、本発明のドミナントネガティブ変異体は、配列番号１〜３のアミノ酸配列のうちのさらに限定された部分、例えば、配列番号３の9〜84番目のアミノ酸残基の配列（配列番号４）、33〜84番目のアミノ酸残基の配列（配列番号５）、40〜84番目のアミノ酸残基の配列（配列番号６）、または53〜84番目のアミノ酸残基の配列（配列番号７）を含むペプチド、あるいはこれらアミノ酸配列と対応する配列番号１または２由来のアミノ酸配列であって、SWI/SNF複合体とNF-κBとの間のアダプター機能を阻害し、SWI/SNF複合体依存性のNF-κBの転写調節機能を低減させるペプチドも含み得る（図５を参照のこと）。なお、配列番号１〜３のアミノ酸配列の対応箇所は、d4ファミリータンパク質のアミノ酸配列アライメント（図２Ｂなど）に基づいて決定できる。本発明のドミナントネガティブ変異体はさらに、上記の限定された部分のアミノ酸配列と、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、または98％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、SWI/SNF複合体とNF-κBなどの転写調節因子との間のアダプター機能を備え、その転写調節因子の転写活性を変化（好ましくは低減もしくは阻害）させる変異体も含み得る。
【００４４】
本発明のタンパク質（ポリペプチド）において相互に置換可能なアミノ酸残基の例を以下に示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸；
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸；
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン；
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
【００４５】
本明細書において、「タンパク質」と「ポリペプチド」とは相互に交換可能に用いられ、アミノ酸の重合体が意図される。本明細書において使用されるポリペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がN末端（アミノ末端）、右端がC末端（カルボキシル末端）である。本発明のポリペプチドの部分ペプチド（本明細書中、本発明の部分ペプチドと略記する場合がある）としては、前記した本発明のポリペプチドの部分ペプチドで、好ましくは、前記した本発明のポリペプチドと同様の性質を有するものである。
【００４６】
別の実施形態において、本発明に係るd4ファミリータンパク質のドミナントネガティブ変異体は、目的のポリペプチドを細胞内で発現可能とするポリヌクレオチドの形態であってもよい。そのようなポリヌクレオチドとしては、配列番号１〜３のアミノ酸配列、配列番号１〜３のアミノ酸配列と上記の所定の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１〜３のアミノ酸配列のうちのさらに特定部分のアミノ酸配列を有するドミナントネガティブ変異体をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。これら本発明のポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１０〜１３のポリヌクレオチド、それらポリヌクレオチドと80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドであって、d4ファミリータンパク質のドミナントネガティブ変異体をコードするものを挙げることができる。これら本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の発現カセット、発現ベクターと組み合わせることによって、目的の細胞内で発現可能にできる。
CT1領域の塩基配列
DPF1>NM_001135155.2 Homo sapiens double PHD fingers 1 (DPF1), transcript variant 1, mRNA 由来  (110 アミノ酸残基)
ATGGGCGGCCTCAGCGCCCGCCCGACCGCTGGGAGGACCGACCCGGCGGGGACCTGCTGGGGGCAGGACCCGGGGAGCAAGATGGCCACTGTCATCCCTGGCCCCCTGAGCCTAGGCGAGGACTTCTACCGCGAGGCCATCGAGCACTGCCGCAGTTACAACGCGCGCCTGTGCGCCGAGCGCAGCCTGCGACTGCCCTTCCTCGACTCGCAGACCGGCGTGGCCCAGAACAACTGCTACATCTGGATGGAGAAGACCCACCGCGGGCCGGGTTTGGCCCCGGGACAGATTTACACGTACCCCGCCCGCTGTTGGAGGAAGAAACGGAGA（配列番号１０）
DPF2>NM_006268.4 Homo sapiens double PHD fingers 2 (DPF2), transcript variant 1, mRNA由来  (84 アミノ酸残基)
ATGGCGGCTGTGGTGGAGAATGTAGTGAAGCTCCTTGGGGAGCAGTACTACAAAGATGCCATGGAGCAGTGCCACAATTACAATGCTCGCCTCTGTGCTGAGCGCAGCGTGCGCCTGCCTTTCTTGGACTCACAGACCGGAGTAGCCCAGAGCAATTGTTACATCTGGATGGAAAAGCGACACCGGGGTCCAGGATTGGCCTCCGGACAGCTGTACTCCTACCCTGCCCGGCGCTGGCGGAAAAAGCGGCGA（配列番号１１）
DPF3a>NM_012074.4 Homo sapiens double PHD fingers 3 (DPF3), transcript variant
1, mRNA (84 アミノ酸残基)
ATGGCGACTGTCATTCACAACCCCCTGAAAGCGCTCGGGGACCAGTTCTACAAGGAAGCCATTGAGCACTGCCGGAGTTACAACTCACGGCTGTGTGCAGAGCGCAGCGTGCGTCTTCCCTTCCTGGACTCACAGACTGGGGTGGCCCAGAACAACTGCTACATCTGGATGGAGAAGAGGCACCGAGGCCCAGGCCTTGCCCCGGGCCAGCTGTATACATACCCTGCCCGCTGCTGGCGCAAGAAGAGACGA（配列番号１２）
DPF3b>NM_001280542.1 Homo sapiens double PHD fingers 3 (DPF3), transcript variant 2, mRNA(CT1領域を含むN末端配列はDPF3aと同じ配列) (84 アミノ酸残基)
ATGGCGACTGTCATTCACAACCCCCTGAAAGCGCTCGGGGACCAGTTCTACAAGGAAGCCATTGAGCACTGCCGGAGTTACAACTCACGGCTGTGTGCAGAGCGCAGCGTGCGTCTTCCCTTCCTGGACTCACAGACTGGGGTGGCCCAGAACAACTGCTACATCTGGATGGAGAAGAGGCACCGAGGCCCAGGCCTTGCCCCGGGCCAGCTGTATACATACCCTGCCCGCTGCTGGCGCAAGAAGAGACGA（配列番号１３）
【化１】
2018186032.tif 000004
各d4ファミリータンパク質のN末端からNLSの最後のアルギニン(R)残基までをコードする塩基配列を上に示す（配列番号１０〜１３）。DPF1は、保存領域にない26アミノ酸残基分（78ヌクレオチド、上記配列番号１０の下線部のヌクレオチド）長い。DPF1由来のCT1ペプチドは前記26アミノ酸残基を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。
【００４７】
また、本発明は、配列番号１０〜１３のポリヌクレオチド配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつd4ファミリータンパク質のドミナントネガティブ変異体をコードするポリヌクレオチドも包含する。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号１０〜１３のポリヌクレオチド配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、DNA）をいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。また、「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件および高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、５×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、DNA）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００４８】
これらハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１０〜１３のポリヌクレオチド配列と80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上99.8％以上、99.9％以上の同一性を有する配列を有するポリヌクレオチドであって、本発明の上記のドミナントネガティブ変異体として機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４９】
本発明において適宜利用されるアミノ酸置換またはヌクレオチド置換は、当業者に公知である種々の遺伝子操作技術を用いて作製することができる。このような遺伝子操作手順については、例えば、Molecular Cloning 3rd Edition, J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などを参照することができる。
【００５０】
上記のアミノ酸配列やポリヌクレオチド配列の同一性または相同性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268,1990； Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403,1990）。本願発明においてBLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターとしてscore＝100、wordlength＝12を用いるものとする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合、パラメーターとしてscore＝50、wordlength＝3を用いるものとする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
本明細書中、特定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列に対する上記の配列同一性または相同性は高いほど好ましい。また、本明細書中、特定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列に対して特定の同一性または相同性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、元の配列のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比較して同等に機能できるものが意図される。本明細書中、同等に機能できるとは、その機能について元の配列のものと比較した場合、10％以上、好ましくは20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、またはそれ以上の比活性を示すポリペプチドまたはポリヌクレオチドが意図される。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」、「遺伝子」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸配列」または「塩基配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。例えば、「配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
【００５２】
本発明に係る「ポリヌクレオチド」は各々、DNAの形態（例えば、cDNAまたはゲノムDNA）で存在し得るが、場合によってはRNA（例えば、mRNA）の形態であってもよい。本明細書において使用されるポリヌクレオチドは各々、二本鎖または一本鎖のDNAであり得る。一本鎖DNAまたはRNAの場合、コード鎖（センス鎖としても知られる）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であってもよい。
【００５３】
（ｃ．本発明のd4ファミリー遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドについて）
本発明のd4ファミリータンパク質をコードする遺伝子（d4ファミリー遺伝子）の発現を抑制するポリヌクレオチドとしては、特に制限はなく、遺伝子発現の抑制に用いられる公知のヌクレオチドの中から、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、d4ファミリー遺伝子の発現を抑制することができるsiRNA、shRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。中でも、d4ファミリー遺伝子の発現抑制効果が高い点で、siRNAまたはshRNAが望ましい。これらのポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの形態、当該分野で公知のベクターに組み込まれた形態で、標的の細胞に導入された場合には、d4ファミリータンパク質の発現を抑制することができる。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「遺伝子の発現」とは、ゲノム遺伝子を鋳型として、プロモーター配列の制御下でmRNAを発現するプロセス（転写）、および／またはこのmRNAを鋳型としてタンパク質を合成するプロセス（翻訳）を含む。よって、本発明の「d4ファミリー遺伝子の発現を阻害する」とは、d4ファミリー遺伝子（好ましくは内在性のもの）の転写プロセスまたは翻訳プロセスを阻害することを意味する。
【００５５】
本明細書中、「遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、遺伝子のセンス鎖に対するアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをいう。アンチセンス技術は、特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法として公知であり、種々の文献に記載されている（例えば、平島および井上：新生化学実験講座2  核酸IV
遺伝子の複製と発現（日本生化学会編，東京化学同人）pp.319-347，1993などを参照）。アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。例えば、一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、内在性遺伝子またはその一部に対して欠失、置換、挿入および/または付加されたヌクレオチドを1〜数個含んでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは11〜20塩基長、12〜19塩基長、13〜18塩基長、14〜17塩基長または14〜16塩基長であってよい。本発明において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然(非修飾)ヌクレオチド(デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、若しくは両者)および/または非天然(修飾)ヌクレオチドを含み得る。
【００５６】
本明細書中、「遺伝子の発現を抑制する、RNAiを奏するRNA」とは、RNA干渉（RNAi）によって遺伝子の発現を抑制するRNAのことをいう。「RNAi」とは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖RNAを細胞内に導入することで、標的内在性遺伝子または導入した外来遺伝子の発現が抑制される現象のことを指す。ここで用いられるRNAとしては、例えば、21〜25塩基長のRNAiを奏する二本鎖RNAであるsiRNA（small interfering RNA）または細胞内でDicer（RNase III酵素）で切断されて前記siRNAを生じる、siRNAの前記二本鎖RNAをつなぐループ配列を含んでなるshRNA（short hairpin RNA）が挙げられる。前記ループ配列としては特に制限はなく、RNAiを奏する二本鎖RNAが、ヘアピンループ構造を形成する一本鎖RNAとして発現させるのに使えるヌクレオチド配列であればよい。 RNAiを奏するRNAは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記siRNAやshRNAが生成されるような発現ベクターを用いて所望の部位において発現させることができる。このようなRNA（RNA、siRNA、shRNA）の調製方法、使用方法などは多くの文献に記載される公知技術を利用して、目的遺伝子の配列に基づいて設計することができる（特表2002-516062号公報; 米国公開許第2002/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.; Genesis, 26(4), 240-244, 2000 April； Nature, 407:6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol.16, (8), 948-958, 2002 Apr.15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99(8), 5515-5520, 2002 Apr. 16; Science, 296(5567), 550-553, 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99:9, 6047-6052, 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), 497-500, 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20(5), 500-505, 2002 May; Nucleic Acids Res., 30:10, e46,2002 May 15等参照）。
【００５７】
本発明の「d4ファミリー遺伝子の発現を抑制する、RNAiを奏するRNA」（以下、「本発明のRNA」ともいう）は、例えば、配列番号７４〜７７のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列に特異的であり、d4ファミリー遺伝子の発現を阻害するsiRNAやshRNAが挙げられる。このような本発明のRNAは、BLAST等の配列データベースを利用してd4ファミリー遺伝子に特定的な箇所の配列を基に、本発明のRNAを設計することができる。本発明のRNAは1種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００５８】
また、本発明のRNAは、例えば、配列番号７４〜７７に記載のポリヌクレオチド配列に特異的であり、d4ファミリー遺伝子の発現を阻害するshRNAであってもよい。このようなRNAの例としては、配列番号１４〜４０からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列からなるshRNAが挙げられる。このようなshRNAは、細胞内の酵素（Dicerなど）によってsiRNAに変換される。
【００５９】
さらに本発明の「d4ファミリー遺伝子からの発現を阻害するRNA」は、例えば、配列番号４１〜７３からなる群から選択されるいずれかの配列、およびその配列に対して欠失、置換、挿入および/または付加されたヌクレオチドを1〜数個含んでもよい。また、上記配列に対して少なくとも90％以上の同一性を有する配列を有するsiRNAであってもよい。例えば、siRNAが突出末端（例えば2個のヌクレオチド）を有する二本鎖である場合、一方の鎖と相補的な部分と相補的でない数個（例えば、2個）のヌクレオチド部分とを含み得る。さらに好ましくは、本発明の「d4ファミリー遺伝子からの発現を阻害するRNA」は、配列番号４１の配列と配列番号４２の配列との組合せ、配列番号４３の配列と配列番号４４の配列との組合せ、配列番号４５の配列と配列番号４６の配列との組合せ、配列番号４７の配列と配列番号４８の配列との組合せ、配列番号４９の配列と配列番号５０の配列との組合せ、配列番号５１の配列と配列番号５２の配列と組合せ、配列番号６０の配列と配列番号６１の配列と組合せ、配列番号６２の配列と配列番号６３の配列と組合せ、配列番号６４の配列と配列番号６５の配列と組合せ、および配列番号６６の配列と配列番号６７の配列と組合せ、および配列番号６８の配列と配列番号６９の配列と組合せから選択される組のヌクレオチド配列がアニーリングしてなるsiRNA、または前記siRNAの配列とループ配列を含んでなるshRNAを少なくとも１つ含み得る。上記ヌクレオチド配列は欠失、置換、挿入および/または付加されたヌクレオチドを1〜数個含んでもよく、よって得られるsiRNAは二本鎖を形成していないヌクレオチドを1〜数個含み得る。
【００６０】
さらに、本発明のRNAは、生体内安定性の向上などの目的のため、例えば、ペプチド核酸（PNA）、ロックド核酸（LNA）、アラビノ核酸（FANA）などの、非天然のヌクレオチドを含むことができる（特表2010-521973など）。さらにまた、本発明のsiRNAは、ヌクレオチドの修飾として、ホスホロチオエート、アルキルホスホナート、ホスホロジチオアート、アルキルホスホノチオアート、ホスホロアミダート、カルバメート、炭酸塩、リン酸トリエステル、アセトアミダート、カルボキシメチルエステル、およびこれらの組合せから選択される、公知の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。
【００６１】
（５．本発明に係る医薬品組成物）
本発明は、一実施形態において、上皮がんなどのがんの治療用の医薬品組成物を提供する。本明細書中、「上皮がん」とは、上皮細胞ががん化したものを指す。上皮とは、動物の体の外表面あるいは体腔諸臓器の内面を覆う細胞層を指す。上皮には血管がなく各細胞が集団をなし密になっている。上皮としては、皮膚ないし粘膜の表面を被覆している被覆(蓋)上皮、腺管部の実質細胞を構成する腺上皮、線(繊)毛上皮、色素上皮などが挙げられるがこれに限定されない。本発明に係る上皮がんは悪性のものも良性のものも含む。上皮がんの例としては、扁平上皮がん、上皮種（上皮性腫瘍をいい、乳頭腫、腺腫、嚢腫などを含む）、神経上皮腫、上皮性悪性腫瘍（肝細胞がん、基底細胞がん、皮膚がんなど）、上皮内腺がんなどが挙げられる。
【００６２】
本発明は、別の実施形態において、神経膠（グリア細胞）腫（グリオーマ）、特に神経膠芽腫（グリオブラストーマ）の治療用の医薬品組成物を提供する。グリオブラストーマ幹細胞（Glioblastoma Intiating Cell: GIC）は、成人における致死的かつ重要な脳腫瘍である神経膠芽腫において、治療耐性や腫瘍再発に寄与すると考えられている（Singh, S.K.ら、Nature 432, 396-401 (2004)；Bao, S.ら、Nature 444, 756-760 (2006)；Chen, J.ら、Nature 488, 522-526 (2012)）。クロマチン構造の修飾は、GICの幹細胞性の維持およびそれらの分化の誘導の重要な決定因子であることが示されている（Natsume, A.ら、Cancer Res 73, 4559-4570 (2013)；Safa, A.R.ら、J Biomed Res 30, (2015)）。近年、幹細胞様の細胞集団および分化した細胞集団の両方からの遺伝子発現データを用いて見出された、４種の中心的な転写因子であるPOU3F2、SALL2、SOX2、OLIG2の異所性発現により、分化した神経膠芽腫細胞をスフェロイド形成性の幹細胞に類似した腫瘍増殖性細胞へとリプログラミングできることが示された（Suva, M. L.ら、Cell 157, 580-594 (2014)）。これらの結果は、神経膠芽腫細胞集団における分化状態としての可逆的な階層性を示し、これら生物学的プロセスにおけるエピジェネティックな制御の重要性を明らかにしている（Gronych, J.ら、Cell 157, 525-527 (2014)）。
【００６３】
一実施形態において、本発明は、d4ファミリータンパク質に対するドミナントネガティブ変異体、d4ファミリー遺伝子の発現を阻害するポリヌクレオチドを含む医薬品組成物を提供する。本明細書中、医薬品組成物とは、主薬のみの医薬、または主薬と賦形剤とを組み合わせた医薬品組成物を意味する。必要に応じて、例えば以下に説明される適当な賦形剤と組み合わせることができる。本明細書中、医薬品組成物とは、種々の剤形のものを指し、例えば、経口、非経口（静脈内）、筋肉、口腔粘膜、直腸、膣、経皮、鼻腔経由または吸入経由などの剤形が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の医薬品組成物の投与量は、例えば、成人（例えば、体重60kg）１日当たり1〜5000mg、好ましくは10〜1000mg、10〜800mg、10〜600mg、10〜500mg、10〜400mg、10〜300mg、10〜200mg、10〜100mg、10〜75mg、10〜50mgなどの範囲内の用量とすることができる。これらの１日投与量は複数回、例えば、２回以上、３回以上などに分けて投与されても良い。
【００６４】
別の実施形態において、本発明の医薬品組成物は、d4ファミリータンパク質に対するドミナントネガティブ変異体をコードするポリヌクレオチド、またはd4ファミリーの発現を阻害するポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む。このようなポリヌクレオチドは、プロモーターなどを含む適当な発現カセットと組み合わせて、標的の細胞内に送達された後、目的の阻害剤を発現することができるように設計され得る。このような発現カセットは、例えば、好適なウイルスベクターを利用して、標的の細胞に送達することができる。一般に、ウイルスベクターは、標的細胞に対して高い効率で遺伝子を導入することができるため、疾患の治療において好適である。本発明の医薬品組成物において利用可能なウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに制限されない（Miller, A.D. et al. (1991) J. Virol. 65, 2220-2224; Miyake,S. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 8802-8806；Samulski, R. J. et al. (1989) J. Virol. 63, 3822-3828；特表2004-528836号公報）。特に本発明における外来遺伝子導入は、レトロウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターを介して行うことが好ましい。なお、レトロウイルスベクターにはレンチウイルスベクターも含まれる。レトロウイルスベクターとしては、例えばエコトロフィックウイルスベクター（Kitamura, T. et al. (1995) Proc. Natl. Acad.  Sci. USA.92, 9146-9150）、アンフォトロピックウイルスベクター、VSV-G等によりシュードタイプ化されたウイルスベクター（Arai, T. et al. (1998) J. Virol. 72, 1115-1121）、HIVベクター等のレンチウイルスベクター（Shimada, T. et al. (1991) J. Clin. Inv.88, 1043-1047）などが含まれるが、これらに限定されない。ヘルペスウイルスベクターとしては、例えば神経向性ヘルペスウイルスベクター、Bリンパ球向性ヘルペスウイルスベクター、Tリンパ球向性ヘルペスウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクターなどが挙げられる。単純ヘルペスウイルスベクターとしては、例えば、H S V-1またはHSV-2の由来の単純ヘルペスウイルスベクターが使用され得る。または、以下のウイルス：水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）、ヘルペスウイルス6型（HSV-6）、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、HHV6、およびHHV7のうちの任意のものがウイルスベクターとして使用され得る。前記ヘルペスウイルスベクターは、１つ以上のウイルス内在遺伝子の不活化変異を含んでいてもよい。また、本願発明の阻害剤をコードするポリヌクレオチドと組み合わされる発現制御配列としては、標的となるがん細胞の内在性プロモーター、またはウイルスなどの外因性のプロモーターおよび／またはエンハンサーが挙げられる。具体的には、例えばウイルスプロモーターとしては、レトロウイルスLTR（MuLV、MMTV、RSV、HIV、FIVなどのウイルスを含む)、SV40プロモーター、CMVプロモーター、およびHPVプロモーターなどが挙げられる。また、宿主の内在性プロモーターとしては、EF1αプロモーター、β-グロビンプロモーターなどが挙げられる。このようなベクターを含む本発明の医薬を投与する場合、投与量として、例えば、成人（例えば、体重60kg）１日当たり1〜5000mg、好ましくは10〜1000mg、より好ましくは、10〜800mg、10〜600mg、10〜500mg、10〜400mg、10〜300mg、10〜200mg、10〜100mg、10〜75mg、10〜50mgなどとすることができる。これらの１日投与量は複数回、例えば、２回以上、３回以上などに分けて投与されても良い。
【００６５】
本発明の医薬品組成物を投与する場合、例えば、経口、非経口（静脈内）、筋肉、口腔粘膜、直腸、膣、経皮、鼻腔経由または吸入経由などですることができるが、非経口的に投与するのが好ましい。静脈内投与がさらに好ましい。本発明の医薬品組成物の有効成分は単独で、あるいは組み合わせて配合されても良いが、これに製薬学的に許容しうる担体あるいは製剤用添加物を配合して製剤の形態で提供することもできる。この場合、本発明の有効成分は、例えば、製剤中、0.1重量％以上であって、99.9重量％以下、好ましくは、90重量％以下、80重量％以下、70重量％以下、60重量％以下、50重量％以下、40重量％以下、30重量％以下、20重量％以下、10重量％以下含有することができる。本発明の医薬品組成物の有効成分は単独で、あるいは複数の有効成分が組み合わせて配合されても良い。この場合、本発明の有効成分の合計は、例えば、製剤中、0.1重量％以上であって、99.9重量％以下、好ましくは、90重量％以下、80重量％以下、70重量％以下、60重量％以下、50重量％以下、40重量％以下、30重量％以下、20重量％以下、10重量％以下含有することができる。
【００６６】
また、製薬学的に許容しうる担体あるいは添加剤としては、例えば賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、溶解剤、溶解補助剤、等張化剤、pH調整剤、安定化剤等を用いることができる。
【００６７】
経口投与に適する製剤の例としては、例えば散剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、液剤またはシロップ剤等を挙げることが出来る。経口投与の場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシンのような種々の賦形剤を、澱粉、好適にはとうもろこし、じゃがいもまたはタピオカの澱粉、およびアルギン酸やある種のケイ酸複塩のような種々の崩壊剤、およびポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼラチン、アラビアゴムのような顆粒形成結合剤と共に使用することができる。また、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の滑沢剤も錠剤形成に非常に有効であることが多い。同種の固体組成物をゼラチンカプセルに充填して使用することもできる。これに関連して好適な物質としてラクトースまたは乳糖の他、高分子量のポリエチレングリコールを挙げることができる。経口投与用として水性懸濁液および／またはエリキシルにしたい場合、活性成分を各種の甘味料または香味料、着色料または染料と併用する他、必要であれば乳化剤および／または懸濁化剤も併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等、およびそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。
【００６８】
非経口投与に適する製剤としては、例えば注射剤、坐剤等を挙げることが出来る。非経口投与の場合、本発明の有効成分をゴマ油または落花生油のいずれかに溶解するか、あるいはプロピレングリコール水溶液に溶解した溶液を使用することができる。水溶液は必要に応じて適宜に緩衝し（好適にはpH8以上）、液体希釈剤をまず等張にする必要がある。このような液体希釈剤としては、例えば、生理食塩水を使用できる。調製された水溶液は静脈内注射に適し、一方、油性溶液は関節内注射、筋肉注射および皮下注射に適する。これらすべての溶液を無菌状態で製造するには、当業者に周知の標準的な製薬技術で容易に達成することができる。さらに、本発明の有効成分は皮膚など局所的に投与することも可能である。この場合は標準的な医薬慣行によりクリーム、ゼリー、ペースト、軟膏の形で局所投与するのが望ましい。
【００６９】
本明細書において、用語「プラスミド」は、種々の公知の遺伝子要素、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体等を意味する。プラスミドは特定の宿主において複製することができ、そして細胞間で遺伝子配列を輸送できる。本明細書において、プラスミドは、種々の公知のヌクレオチド（DNA、RNAなど）を含み、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖である。
【００７０】
本発明において標的とされるがん細胞への外来遺伝子の導入方法は、特に制限されず、公知の遺伝子導入方法を利用できる。例えば発現プラスミド等を細胞や組織に導入するには、リン酸カルシウム共沈殿法、リポフェクション、DEAEデキストラン法、注射針等により直接DNA溶液を組織に注入する方法、ジーンガンによる導入などの公知の方法が挙げられる。
【００７１】
本明細書中、特には説明されない用語については、当業者が通常理解する用語が意味する範囲を指すことが意図される。
【実施例】
【００７２】
（実験手順）
（A549細胞、HeLaS3細胞およびMDA-MB-231細胞の培養および増殖アッセイ）
ヒトがん細胞株A549（非小細胞肺癌）；HeLaS3（子宮頸癌）；MDA-MB-231（ヒト乳がん）については全て10％ウシ胎仔血清を含有するダルベッコ改変イーグル培地中で培養、維持した。A549細胞株、MDA-MB-231細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入した。HeLaS3細胞株は、東北大学加齢医学研究所の医用細胞資源センターから取得した。単層培養物中での細胞増殖を、Cell-Titer Glo（Promega、Madison、WI）を用いて、製造業者の指示書にしたがって測定した。足場非依存性増殖アッセイについては、以前に記載されたようにして実施した（Tando, T.ら、J Biol Chem 285: 21951-60 (2010)）。【００７３】
（TGS-01、TGS-04およびTGS-05の細胞培養）
国立大学法人東京大学医学部附属病院の施設内倫理委員会によって認可を得た上で、同意した患者から外科手術中に原発性グレードIV神経膠芽腫試料を得た。前記試料からTGS-01、TGS-04およびTGS-05と呼ばれる３つの独立したグリオーマ幹細胞（GIC）を樹立した。全てのGICとそれを使った実験手順については東京大学医学部附属病院（24-69-250809）および千葉大学真菌医学研究センター（#10）の倫理委員会による承認を得た。GICを、超低接着皿またはフラスコを用いて、B27（Thermo Fisher Scientific）、20ng/mlのEGF、および20ng/mlのbFGF（両方ともＰeproTechから）を補充したDMEM/F12無血清培地（Thermo Fisher Scientific）中で継代した。GICの分化の誘導、ならびにHEK293FT細胞およびPLAT-A細胞（ヒト胚性腎臓細胞）の継代のために、10％ウシ胎仔血清（FBS）を含有するダルベッコ改変イーグル培地を用いた。【００７４】
（抽出物の単離および免疫沈降（１））
核抽出物を、NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents(Pierce、Rockford、IL）を用いて、製造業者の指示書にしたがってA549細胞またはHeLaS3細胞から調製し、バッファー［50mM Tris-HCl（pH7.5）、100mM KCl、1mM DTT、20％グリセロールおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク）］を用いて8倍に最終希釈した。免疫沈降はDynabeads Protein G（Invitrogen）と抗HA抗体（C29F4; Cell Signaling）を用いて、製造業者の指示書にしたがって実施した。【００７５】
（レトロ/レンチウイルスベクターのためのプラスミド調製）
遺伝子特異的ショートヘアピンRNA（shRNA）をコードするオリゴヌクレオチドの対を合成し（配列番号１４〜４０）、pmU6（Haraguchi T.ら、Nucleic Acids Res 37: e434 (2009)）のBbsI/EcoRI部位に挿入した。
shCre#4（Haraguchiら、FEBS Letters;581:4949-4954 (2007)）［ネガティブコントロール（NC）として用いられる］およびshBrm#4（Yamamichiら、Oncogene 24:5471-5481 (2005)）の配列については以前の論文に記載されている（Kobayashi, K.ら、Sci. Rep. 5: 8427 (2015)）。これらのプラスミドをBamHIおよびEcoRIで二重に消化して得られるshRNAをコードする断片を、pSSSP（Yamamichiら、Oncogene 24:5471-5481 (2005)）（EV-1）の同じ部位に挿入して、レトロウイルスベクタープラスミドを作製した。IL-6 shRNAをコードするオリゴヌクレオチド対については、同様にpmU6に挿入後これをBamHIおよびEcoRIで消化し、pLSP（Haraguchi T.ら、Nucleic Acids Res 37: e434 (2009)）（EV-4）中のこれらの部位の間に挿入しIL-6 shRNA発現用のレンチウイルスベクタープラスミドを作製した。Haloタグ付きCT1発現ベクターのために、pFN21K HaloタグCMV Flexiベクター（Promega）のSgfI/PmeI断片（大腸菌の致死遺伝子であるBarnane遺伝子をコードする）を、アダプターオリゴヌクレオチドまたはSgfI/PmeIの末端配列を含有するDPF2-CT1をコードするDNA断片で置換して、pFN21K-HaloとpFN21K-Halo-DPF2-CT1をそれぞれ作製した。これらのプラスミドをNheIおよびBamHIで二重消化することによって、HaloおよびHalo-DPF2-CT1含有断片を単離し、tTR-KRABiをコードするpXL001（26112、Addgene）のSpeI/BamHI断片と置換し、pXL001-Halo（EV-2）およびpXL001-Halo-DPF2-CT1を作製した。pXL001-Halo-DPF3-CT1の構築には、SgfIまたはPmeI部位を含有するプライマー対を用いたPCRによって調製されたDPF3-CT1断片（約250bp）を、pXL001-HaloのSgfI/PmeI消化物と置換した。HAタグ付きベクター構築のために、HA配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを、pcDNA3.1(+)（Invitrogen）のBamHI/EcoRI部位に挿入して、pcDNA3.1(+)-HA-MCSを作製した。【００７６】
EcoRIの末端配列を含むプライマーとBglII-EcoRVの末端配列を含むプライマーのセットを用いたPCRによって得られたDPF3-CT1断片、DPF3a断片およびDPF3b断片を、EcoRIおよびEcoRVで消化し、pcDNA3.1(+)-HA-MCSのEcoRI/EcoRV部位に挿入して、それぞれ、pcDNA3.1(+)-HA-DPF3-CT1、pcDNA3.1(+)-HA-DPF3aおよびpcDNA3.1(+)-HA-DPF3bを作製した。これらをNheIおよびBglIIで二重消化することによってHAタグ付きタンパク質をコードするDNA断片ならびにHA断片を得て、pXL001のSpeI/BamHI中に挿入し、pXL001-HA-DPF3-CT1、pXL001-HA-DPF3a、pXL001-HA-DPF3bおよびpXL001-HA（EV-3）をそれぞれ作製した。【００７７】
BrmおよびBRG1発現プラスミド（pLE-Brm-IP、pLE-BRG1-IP）は、pCAG-BrmおよびBRG1発現ベクターにより得られるBrmおよびBRG1 cDNA断片をpLE-IP（EV-6）中に挿入することにより調製した。【００７８】
（DNAのトランスフェクションおよびレトロ／レンチウイルスの調製）
各細胞株へのプラスミドのトランスフェクションには、Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）を、製造業者の指示書にしたがって用いた。水疱性口内炎ウイルス-G（VSV-G）シュードタイプレトロウイルスベクターは、プレパッケージング細胞株（PLAT-A）により生成した。VSV-Gシュードタイプレンチウイルスベクターは、ViraPower Lentiviral Expression System（Thermo Fisher Scientific）を用いて、製造業者の指示書にしたがってプレパッケージング細胞株HEK293FTを用いて作製した。上皮がん細胞株への感染に用いるウイルスベクターはトランスフェクションの３時間後、DMEMに交換した。トランスフェクション上清を、トランスフェクションの24時間後および48時間後に収集し、0.45μmフィルターを通して濾過した。上皮がん細胞株をウイルスベクターストックとpolybrene (終濃度8μg/ml)と共に37℃で一晩保温してトランスダクションを行った。GICへの感染に用いるウイルスベクターの場合はトランスフェクションの３時間後、4mM L-グルタミンを含有するウイルス産生無血清培地(VP-SFM；Thermo Fisher Scientific）に交換した。トランスフェクション上清を、トランスフェクションの24時間後および48時間後に収集し、0.45μmフィルターを通して濾過後、4℃で16時間、6000ｘgで遠心し、得られたペレットを、GICの培養に用いる培養培地中に懸濁した。GICをウイルスベクターストックと共に37℃で4時間保温してトランスダクションを行った。【００７９】
（定量的RT-PCR）
総RNAを、mirVanaマイクロRNA単離キット（AmbionまたはThermo Fisher Scientific）を用いて抽出した。場合により、次いで、全てのRNA試料を、TURBO DNase酵素（TURBO DNA-freeキット；Thermo Fisher Scientific）で処理した。コード遺伝子のmRNAを検出するために、製造業者の指示書にしたがって、cDNA Eraser（Perfect Real Time）を含むPrimeScript(商標)RT Reagent Kit（TaKaRa Bio）、またはPrimeScript RT Master Mix（TaKaRa Bio）を用いてcDNAを合成した。定量的リアルタイムRT-PCR（qRT-PCR）を、SYBR(登録商標)Select Master Mix（Applied BiosystemsまたはThermo Fisher Scientific）を用いて実施した。GAPDH mRNAを内部コントロールとして用いた。StepOne PlusリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems またはThermo Fisher Scientific）を用いて、PCRを３回実施した。【００８０】
（ウェスタンブロッティング）
総タンパク質抽出物を、95℃で10分、SDS試料バッファー中で細胞を煮沸することにより調製した。次いで、10％ SDS-PAGEによりタンパク質を電気泳動し、Immobilon-PSQ膜またはImmobilon-P PVDF膜（Millipore）上にトランスファーした。以下の各タンパク質：Brm（ab15597；Abcam）、BRG1（sc-10768；Santa Cruz）、Halo-Tag（G928A；Promega）、HA-Tag（C29F4；Cell Signalling）およびβ−アクチン（sc-47778；Santa Cruz）に対する一次抗体と共に、４℃で一晩、膜をインキュベートすることによってイムノブロッティングを行った。あるいは、一次抗体を含有するCan Get Signal Solution I（TOYOBO）中、4℃で一晩、膜をインキュベートすることによってウェスタンブロッティングを行った。Tween 20を含有するTris緩衝化生理食塩水（TBS）で３回洗浄した後、室温で１時間、膜を二次抗体（ロバ抗ウサギ西洋わさびペルオキシダーゼ抗体（AP182P）またはロバ抗マウス西洋わさびペルオキシダーゼ抗体（ＡP192P）；Millipore）と共にインキュベートした。シグナルを、ECL試薬（Promega）またはImmunoStar LD（Wako）を用いてAE-9300H-CP Ez-CaptureMG（ATTO）上でシグナルを検出した。電気泳動したタンパク質試料の量を、β−アクチンに対して正規化した。【００８１】
（単一細胞スフェア形成アッセイ）
shRNA発現レトロウイルスベクター（pSSCG）またはshRNA/cDNA共発現レンチウイルスベクター（pLE-IG）による形質導入の２日後、TrypLE express（Thermo Fisher Scientific）を用いてGICを解離させ、100μlのDMEM/F12無血清培地中、超低接着９６ウェルプレート（Corning）中にウェルあたり１個の細胞の密度でFACS ARIA1またはARIA2（Becton Dickinson）によりGFP(+)/7-AAD(-)細胞を選別した。２週間後、スフェアを含有するウェルのパーセンテージを算出した。【００８２】
（頭蓋内増殖アッセイ）
shRNA発現レンチウイルスベクター（pLE-IG）による形質導入の２日後、GICを回収し、FACS ARIA1またはARIA2によってGFP(+)/7-AAD(-)細胞を選別し、遠心分離し、DMEM/F12無血清培地中に再懸濁した。3ｘ10３個の細胞（2μl）を、5週齢の雌のBALB/c nu/nuマウスの右大脳半球中、3mmの深さに定位的に注入した。全ての動物実験プロトコールを、東京大学の動物実験委員会（Animal Ethics Committee）の方針にしたがって実施した。【００８３】
（免疫沈降（２））
50mM Tris-HCl（pH7.5）、140mM NaCl、1mM MgCl2、0.5mM DTT、0.1％Tween20、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク）およびホスファターゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク）を含有するバッファーを用いて、細胞を溶解した。Dynabeads Protein G（Thermo Fisher Scientific）を用いて、製造業者の指示書にしたがって免疫沈降を実施した。【００８４】
（蛍光免疫染色および近接ライゲーションアッセイ）
蛍光免疫染色のために、GICを、ポリ−Ｌ−リシンでコーティングされた8ウェルLab-Tek IIチャンバースライド（Nunc）上に播種した。細胞を、室温（RT）で10min、４％パラホルムアルデヒド（ナカライテスク）を含有するPBSで固定し、PBSで２回洗浄し、室温で15min、0.2% Triton X-100 PBSで透過処理した。PBSで2回洗浄した後、37℃で1時間、5%BSA、0.02% NaN3PBSと、Blocking one（ナカライテスク）との１：１混合物を用いて、ブロッキングを実施した。次いで、試料を、４℃で一晩、ブロッキングバッファー中で各一次抗体と共にインキュベートした。試料を２回洗浄した後、暗室中、ＲＴで１時間、ブロッキングバッファー中のAlexa Fluor 546または488コンジュゲート化二次抗体（Thermo Fisher Scientific、1：1000）と共にインキュベートした。試料を、DAPIを含むVectashield Mounting Medium（Vector Laboratories）中でマウントした。蛍光顕微鏡（BZ-X710；Keyence）を用いて、蛍光を検出した。Adobe Photoshop CS3ソフトウェアを用いて、画像を処理した。【００８５】
近位ライゲーションアッセイ（Proximity Ligation Assay: PLA）のために、GICを播種し、処理し、上記のような一次抗体と共にインキュベートした。Duolink In Situ Starter Set ORANGE（SIGMA）を用いて、製造業者の指示書にしたがってPLAを実施した。抗マウスMINUSおよび抗ウサギＰLUS PLAプローブを用いた。蛍光顕微鏡（BZ-X710；Keyence）を用いて蛍光を検出した。【００８６】
（統計分析）
得られた結果を、平均±標準偏差（S.D.）として示す。定量的RT-PCRアッセイに関する統計的有意性および単一細胞スフェア形成アッセイに関する統計的有意性を、両側ステューデントｔ検定を用いて決定した。図６および図１１における生存分析について、生存率の差異を、ログランク検定によって評価した。
【実施例１】
【００８７】
（d4ファミリータンパク質DPF1、DPF2、DPF3a/bのシングルノックダウンは腫瘍細胞株の足場非依存性増殖を抑制する）
２種のヒトの上皮に由来するがん細胞株（子宮頸部腫瘍を起源とするもの（HeLaS3)および非小胞肺がん細胞（A549））を用いて足場非依存性増殖について各d4ファミリータンパク質の発現のsiRNAによるノックダウンの効果を試験した。使用したsiRNAをコードするDNA配列を表２に示す。前記がん細胞株は発現レベルは異なるが３種のd4ファミリータンパク質全てを発現している（データは示さず）。HeLaS3細胞は、BrmとBRG1を共に発現しており、一方A549はBRG1の発現は無い。これら細胞におけるd4ファミリー遺伝子のいずれかの発現抑制によって、単層培養における（A549細胞の）細胞増殖はわずかに影響を受けたが（データは示さず）、軟寒天中でのコロニー形成（足場非依存性増殖）は、コントロール細胞（shRNA発現ベクター（shCre#4）を導入したもの）に対して30〜60％まで低減された（図１Ａ（HeLaS3細胞）および１Ｂ（A549細胞））。この結果は、d4ファミリータンパク質のいずれのシングルノックダウンも、SWI/SNF複合体とNF-κBダイマーとの間のアダプターを介した連結を部分的には阻害可能であり、これらがん細胞株の形質転換活性を抑制することを示唆している。しかしながら、足場非依存性増殖の抑制はかなり穏やかであった。これはd4ファミリータンパク質のシングルノックダウンの後であっても、発現の低下していないd4ファミリータンパク質の他のメンバーが存在するためと考えられる。各d4ファミリータンパク質の発現レベルは、上皮腫瘍細胞株の間で異なるため、d4ファミリータンパク質全ての同時の抑制が、上皮がん細胞の種類に関係なく効果的なNF-κB阻害剤を開発するのに必要だとと考えられた。
【表２−１】
2018186032.tif 000005
【表２−２】
2018186032.tif 000006
（上記の各ヌクレオチド配列は配列番号１４〜４０にそれぞれ記載される）
【実施例２】
【００８８】
（ドミナント変異体として機能するd4ファミリータンパク質欠失変異体の設計）
d4ファミリータンパク質は、保存されているN末端側ドメイン、中央のC2H2型クルッペルジンクフィンガーモチーフ、およびC末端側の対になった植物ホメオボックスドメイン（PHD）フィンガー（修飾されたヒストンなど、タンパク質との相互作用を媒介すると考えられている）を保有している（Lange, M.ら、Genes Dev 22: 2370-84 (2008)、図２Ａ）。GST-DPF2融合タンパク質がSWI/SNF複合体のサブユニットであるBrm、BRG1、Ini1、BAF60a、およびNF-κBのサブユニットであるp52に直接結合することを、本発明者らは以前に示した（Tando, T.ら、J Biol Chem 285: 21951-60 (2010)）。【００８９】
本発明者らは、DPF2タンパク質の複数の欠失変異体を構築し、前記変異体のSWI/SNF複合体のサブユニットまたはp52タンパク質に対する結合活性を試験したところ、DPF2のＮ末端側領域の限られた領域（アミノ酸残基1〜84；以降ではCT1ペプチドと称する、配列番号２）が上記対象タンパク質の全てとの結合に十分であることを見出した（図２Ａ）。d4ファミリータンパク質全てのアミノ酸配列を整列して比較すると、図２Ｂに示すように、４種のd4ファミリータンパク質（DPF3aとDPF3bとはＮ末端領域が同じである）の間でCT1領域は高度に保存されていることが分かった。重要なことに、CT1のC末端側の8アミノ酸残基は、代表的な核移行シグナルから構成されており、前記8アミノ酸残基は細胞核へのCT1の移送を促進していると考えられる。そこで、本発明者らは、d4ファミリータンパク質のいずれかを起源とするCT1ペプチドは、高レベルで発現される場合に、d4ファミリータンパク質のSWI/SNF複合体のサブユニットおよびNF-κBのサブユニット間のアダプター分子としての役割と競合することで、全てのd4ファミリータンパク質に対するドミナントネガティブ変異体として機能し得ると予想した。
【実施例３】
【００９０】
（CT1ペプチドの異所性発現は腫瘍細胞株の足場非依存性増殖を阻害する）
DPF2もしくはDPF3に由来するCT1をHaloタグ（このタグは短いペプチドを融合すると安定化させることが多い）のC末端、またはＮ末端と融合させた。N末端側にHaloタグを融合したDPF2のCT1ペプチド（以下「Halo-DPF2-CT1」と称する）を、HeLaS3細胞およびA549細胞内で異所性発現した場合、抗Haloタグ抗体による染色によって細胞核内に局在することが示された（データは示さず）。Halo-DPF2-CT1を異所性発現した前記細胞は単層培養においては増殖速度がほんのわずかに低下しただけであったが（図２Ｃ）、軟寒天中の足場非依存的な状態においては前記細胞のコロニー形成能が強力に阻害され（図２Ｄ）、そのコロニー数は空ベクター（EV-2）を導入した細胞と比較すると著しく低下していた。さらにDPF3の CT1領域に由来するHalo-DPF3-CT1の効果も足場非依存性増殖と単層での増殖おいて、Halo-DPF2-CT1の効果と非常に類似していることが観察された（図２Ｃおよび２Ｄ）。【００９１】
上記の結果は、CT1ペプチドが、どのd4ファミリータンパク質に由来するものであっても全ての野生型d4ファミリータンパク質に対するドミナントネガティブ変異体として機能することを示唆している。また、上皮がん細胞のがん形質を反映している軟寒天中のコロニー形成においては、単層培養での増殖よりもより高レベルのSWI/SNF複合体依存性のNF-κB活性を必要とすることが明らかになった。Halo-DPF3-CT1はHeLaS3細胞およびA549細胞の両方においてHalo-DPF2-CT1よりも足場非依存性増殖をより効果的に阻害した。このことは、同じ発現ベクターにより発現される場合、Halo-DPF3-CT1がHalo-DPF2-CT1よりも高レベルで発現していることを反映するものと考えられる（図２Ｅ）。
【実施例４】
【００９２】
（NF-κB標的遺伝子の特定の一部は、その遺伝子発現にSWI/SNF複合体を必要とする）
本発明者らは以前にd4ファミリーに属するタンパク質に対するshRNAならびにBrmおよびBRG1に対するshRNAが、細胞の染色体に組み込まれたNF-κBレポーターのルシフェラーゼ活性を抑制することを報告した（Ishizuka A.ら、J. Biol. Chem. 287: 11924-33 (2012)）。さらに、本発明者らを含むいくつかのグループによって、内在性NF-κB標的遺伝子の特定の一部がSWI/SNF複合体によるクロマチンリモデリングを必要とすることが報告されている（Ramirez-Carrozzi V.R.ら、Cell 138: 114-28 (2009)）。【００９３】
そこで、次に本発明者らは、代表的なNF-κB標的遺伝子のSWI/SNF複合体依存性を試験した。試験遺伝子として、IL-6（Libermann, T.A.ら、Mol Cell Biol 10: 2327-34 (1990)；Ray A.ら、Mol Cell Biol 10: 5736-46(1990)）、IL-8（Kunsch C.ら、Mol Cell Biol 13: 6137-46 (1993)）、TNF-α（Collart M.A,ら、Mol Cell Biol 10: 1498-506 (1990)；Shakhov A.N.ら、Gene 95: 215-21 (1990)）およびICAM1（van de Stolpe A.ら、J Biol Chem 269: 6185-92 (1994)）の4種の遺伝子を選択した。これら遺伝子はいずれも、数種の上皮がん細胞株において、TNF-α刺激により、前記遺伝子のプロモーター上に存在するNF-κB結合部位を介して発現誘導されることが知られていた。A549細胞では、SWI/SNF複合体のサブユニットであるBrmのノックダウンは、TNF-α刺激によるIL-6およびIL-8の誘導を大きく低減させたが、TNF-αおよびICAM1の誘導には影響を与えなかった。TNF-α刺激により発現が誘導されるこれら4種の遺伝子のBrm依存性に明確な差があることは、TNF-αで刺激しない基盤レベルの発現においても認めることができる（データは示さず）。【００９４】
BrmとBRG1のいずれをも発現しないSW13細胞にBrmまたはBRG1を導入し発現させると、空ベクターを移入したSW13細胞と比較して、IL-6遺伝子およびIL-8遺伝子の基底レベルの発現は劇的に上昇した（37倍以上）。これら2種の遺伝子と比較して、TNF-α遺伝子およびICAM1遺伝子の基底レベルの発現は、遺伝子導入されたBrmの発現によっても大きくは影響されなかった（データは示さず）。【００９５】
上記の機能欠失実験および機能獲得実験は、NF-κBの標的遺伝子がSWI/SNF複合体への依存性に関して2つのサブタイプに分類できること、上皮がん細胞株ではNF-κBによるIL-6遺伝子およびIL-8遺伝子の活性化のためにSWI/SNF複合体を必要とするが、TNF-α遺伝子およびICAM1遺伝子の活性化には前記複合体を必要としないことを示すものである。
【実施例５】
【００９６】
（CT1はNF-κB標的遺伝子の特定のサブセットの誘導を阻害する）
NF-κB結合部位を含む遺伝子の各プロモーターは、NF-κBを活性化するTNF-α処理による誘導性に関して大きな差が生じ得る。また、この誘導性は、使用された細胞型におけるプロモーターのクロマチンの状況、TNF-α処理後にNF-κBによって二次的に誘導される他の転写因子などのいくつかの要因によっても影響を受ける。【００９７】
プロモーター解析によって確認された（https;//www.bu.edu/nf-kb/、NF-κB標的遺伝子のための594種のプローブ）NF-κB標的遺伝子のリストに基づき、本発明者らは、A549細胞とHeLaS3細胞の2種の細胞株について、TNF-α処理により誘導されたNF-κB標的遺伝子発現のCT1感受性に関するマイクロアレイ解析を行った（データは示さず）。A549細胞の54遺伝子およびHeLaS3細胞の50遺伝子は、1時間のTNF-α処理によって1.5倍超に誘導された。A549細胞またはHeLaS3細胞のいずれかの細胞でTNF-αによって誘導された71種の遺伝子には、19種のサイトカインの遺伝子が含まれていた。コントロールのEV-2ベクターを導入した細胞と比較して、CT1を異所性発現した細胞では、前記サイトカイン遺伝子のうち６種の遺伝子の発現が、コントロールに比べ66％未満まで抑制された。また、発現がSWI/SNF複合体依存性であるIL-6およびIL-8の遺伝子は予想通りこれら誘導される遺伝子中に検出された。【００９８】
前記マイクロアレイ解析に用いたRNAサンプルを定量的逆転写PCR（qRT-PCR）によっても分析したところ、マイクロアレイ解析により得られたのと同様の結果が得られた（図３Ａ）。CT1を発現させることで、TNF-α刺激後少なくとも100分以内に、誘導プロフィール自体には影響を与えずにIL-6およびIL-8の発現レベルが低減されることを確認した（図３Ｂ）。【００９９】
HeLaS3細胞およびA549細胞を通常の培地中で維持した場合、上記の4種の遺伝子は、低い基盤レベルで発現している。A549細胞について、これら４種の遺伝子の基盤レベルの発現を、qRT-PCRによって測定した。重要なことに、基盤レベルでの発現は、TNF-αによる刺激後のCT1発現に対する挙動と類似しており、IL-6遺伝子およびIL-8遺伝子はCT1の異所性発現に感受性であったが、TNF-α遺伝子およびICAM1遺伝子は前記異所性発現に非感受性であった（図３Ｃ）。このことはCT1感受性によるこれらの４種の遺伝子の発現のSWI/SNF複合体依存性は、基盤レベルでの発現とTNF-α刺激後の発現の間で変わらないことを示している。
【実施例６】
【０１００】
（HAタグ付CT1も効果的なドミナントネガティブ変異体、およびSWI/SNFとNF-κBの間をつなぐアダプターとして機能する）
Halo-CT1は細胞内で非常に安定していたが、Haloタグよりも短いタグであるHAタグをN末側に付加したHA-CT1も細胞中で安定的に発現させることができた。HA-CT1はHalo-CT1と同様のドミナントネガティブ機能を有しており、A549細胞やHeLaS3細胞で異所性発現した場合に、単層培養における細胞増殖には影響を与えずに足場非依存性増殖を低減した。（図４Ａおよび４Ｂ）。HA-CT1が細胞内でBrmまたはBRG1に結合できるかどうかを試験するために、HA-CT1を異所性発現させたA549細胞とHeLaS3細胞の全ライセート（図４Ｃ）を抗HA抗体で免疫沈降させた。BrmまたはBRG1のいずれも、全長のHA-DPF3aおよびHA-DPF3bと同様の効率で、HeLaS3細胞において共沈した（図４Ｃ、Ｄ）。BRG1が発現していないA549細胞の場合、BrmはHA-CT1と共沈した。CT1のドミナントネガティブ機能に必要な領域を絞り込むために、CT1の末端切除変異体または欠失変異体を数種構築した（図５）。CT1の40番目から76番目までのアミノ酸残基を欠失したΔ40-76ペプチドおよび53番目から76番目までのアミノ酸残基を欠失したΔ53-76ペプチドは、TNF-αによるIL-6誘導および足場依存性増殖に対する抑制効果を失っていた。1番目から8番目までのアミノ酸残基を欠失したΔ1-8は、元のドミナントネガティブ活性を相当程度保持した。ウイルスベクターを用いてA549細胞内で発現させようとした場合、1番目から39番目までのアミノ酸残基を欠失したΔ1-39ペプチドおよび1番目から32番目までのアミノ酸残基を欠失したΔ1-32ペプチドは不安定であり検出不能だった（具体的なデータは示さず）。【０１０１】
前記の結果は、CT1のアミノ酸残基で53番目から76番目の領域（配列番号７８）または40番目から76番目の領域（配列番号７９）にd4ファミリーのSWI/SNF複合体およびNF-κBとの結合領域が含まれていることを強く示唆している。これら2つの領域を含むペプチドについては、細胞内導入シグナルと核内移行シグナルを付加したものをペプチド合成した。これら合成ペプチドを使う場合、CT1同様にd4ファミリータンパク質に対するドミナントネガティブ変異体として機能させることが可能である（データは示さず）。
【実施例７】
【０１０２】
（CT1は、マウス異種移植モデルにおいて上皮がん細胞の腫瘍原性を強く抑制する）
CT1の腫瘍抑制活性を試験するために、HA-DPF3-CT1を異所性発現するA549細胞を免疫不全マウスに注射した。図６に示すように、CT1の導入によって腫瘍形成の開始は大きく遅延され、腫瘍の成長が大きく低減された。本結果によって、本発明のペプチドの上皮がんに対する治療効果が実証された。【０１０３】
（図面の説明）
図１。HeLaS3細胞（Ａ）およびA549細胞（Ｂ）の足場非依存性増殖に対する、ｄ４ファミリータンパク質ならびにBrmおよびBRG1の各々のノックダウンの効果を示す。軟寒天中で形成したコロニー（直径100nm以上のもの）の数を測定し、shCre#4発現細胞（コントロール、Kobayashi, K.ら、Sci. Rep. 5: 8427 (2015)）の数に対して正規化した。shDPF1-3’UTR#2（配列番号４９または配列番号１６）および#4（配列番号５１または配列番号１８）（レーン3および4）、shDPF2-3’UTR#3（配列番号５５または配列番号２０）、#4（配列番号５６または配列番号２２）および#6（配列番号５７または配列番号２４）（レーン5、6、7）、shDPF3a-CDS#2（配列番号６８または配列番号２６）、およびshDPF3a-3’UTR#4（配列番号６４または配列番号２８）（レーン8、9）、shDPF3b-CDS#6（配列番号７２または配列番号３０）および#7（配列番号７３、または配列番号３２）（レーン10、11）、shBrm-#4（配列番号３４）および#8（配列番号３６）（レーン12、13）、ならびにshBRG1-CDS#2（配列番号３８）および#4（配列番号４０）（レーン14、15）。データはｎ＝３の平均±標準偏差を表す。【０１０４】
図２。（Ａ）はｄ４ファミリータンパク質およびその変異体CT1の構造を模式図で表す。NLS：核内移行シグナル。Zn：C2H2型クルッペルタイプジンクフィンガーモチーフ。PHD：植物ホメオドメイン。破線で示した枠内は、d4ファミリータンパク質の間のＮ末端側保存領域を示す。（Ｂ）はDPF1、DPF2およびDPF3のＮ末端側領域のアミノ酸配列のアライメントを示す。DPF1は、DPF2、DPF3に対して、27アミノ酸からなる付加的な配列をＮ末端に有する。アスタリスク（*）は、同一のアミノ酸残基を有する位置を示す。コロン（：）は、アミノ酸残基が高度に保存されている位置を示す。（Ｃ）および（Ｄ）のパネルは単層培養（Ｃ）ならびに軟寒天中（Ｄ）における、A549細胞およびHeLaS3細胞の細胞増殖に対するHalo-DPF2-CT1とHalo-DPF3-CT1の異所性発現の効果を示す。（Ｃ）の実験ではA549細胞とHeLaS3細胞それぞれに、Halo-DPF2-CT1、またはHalo-DPF3-CT1を保有するレンチウイルスベクターをトランスダクション（導入）した。ピューロマイシン選択の後、細胞を96ウェルプレートに播種し、CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assayを用いて単層培養時の細胞増殖を24時間ごとにモニタリングした。単層培養用にプレートに蒔いたのと同時に、一部の細胞を60mmプレートの軟寒天中に懸濁し、播種の18〜25日後にコロニー（直径100mn以上のもの）の数を測定した。コントロールのEV-2を移入した細胞により形成されたコロニー数を1.0とし相対値で表した（Ｄ）。データは平均（n＝3）±標準偏差を示す。（Ｅ）は単層培養でのA549細胞に導入したHaloタグ付加タンパク質の発現を示す。培養後に全タンパク質を調製し、導入した遺伝子の発現を抗Haloタグ抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。β−アクチンを内部標準として用いた。【０１０５】
図３。TNF-α刺激後のCT1による阻害効果を定量的RT-PCR分析によって試験した。Halo-DPF3-CT1発現レトロウイルスベクターまたはコントロールの空ベクター（EV-2）をHeLaS3細胞またはA549細胞にトランスダクション（導入）した。これら細胞をTNF-αにより1時間（Ａ）または30分、60分、90分および120分の間（Ｂ）刺激したそれぞれの細胞から全RNAを調製した。IL-6、IL-8、TNF-αおよびICAM1のmRNAレベルを定量的RT-PCRにより測定した。（Ａ）では、コントロールのHeLa細胞（EV-2を導入したもの）のmRNAレベルに対する比率で示す。（Ｂ）では、TNF-α処理前のRNAレベルを1.0とした。（Ｃ）同時に、TNF-α未処理にて維持した培養物からもRNAを抽出し、（Ａ）のようにIL-6、IL-8、TNFおよびICAM1の4種の遺伝子のmRNAレベルを測定して示した。【０１０６】
図４。（Ａ、Ｂ）A549細胞またはHeLaS3細胞の単層培養（Ａ）および軟寒天中（Ｂ）の細胞増殖に対する、異所性発現させたHA-DPF3-CT1の効果を試験した。（Ｃ）はSWI/SNF複合体の触媒サブユニットとHA-DPF3-CT1、HA-DPF3aおよびHA-DPF3bとの共免疫沈降実験の結果を示す。HA-DPF3a、HA-DPF3bまたはHADPF3-CT1を発現する細胞から細胞核を調製し、細胞核由来のタンパク質を抗HA抗体により免疫沈降させ、沈降物のSDS-PAGEを行った。BrmおよびBRG1をウェスタンブロットにより検出した。EV-3はHAタグのみを発現する細胞を表し、ネガティブコントロールとして用いた。【０１０７】
図５。HA-DPF3-CT1由来の欠失変異体のA549細胞中での生物学的活性をまとめた。Ａ：タンパク質発現を抗体による免疫染色によって評価した。Ｂ：TNF-αによる処理１時間後の、CT1またはその変異体の発現ウイルスベクターをトランスダクション（導入）したA549細胞におけるIL-6およびIL-8の遺伝子レベルをRT-PCRによって試験し、コントロールのEV-3を導入したA549細胞のそれら遺伝子発現レベルに対するパーセンテージによって示す。Ｃ：前記コントロール細胞に対する相対的なコロニー形成能を数値で示した。【０１０８】
図６。異種移植でのHA-DPF3-CT1を発現するA549細胞の腫瘍形成能を示す。HA-DPF3-CT1を発現するまたはコントロール（EV-1）のレンチウイルスベクターをMOI=3.0で導入したA549細胞を、ヌードマウスの左側胴体に注入した（1×10６個）。腫瘍体積を測定し、テューキーの事後範囲検定（P＜0.001）を用いた2要因ANOVAによって分析し、平均（n＝5）±標準偏差として示した。【０１０９】
図７。SWI/SNF複合体、d4ファミリータンパク質、およびNF-κBの間の相互作用に関する模式図を示す。【０１１０】
（上皮がんにおけるNF-κB標的遺伝子に対するd4ファミリータンパク質のドミナントネガティブ変異体の効果のまとめ）
腫瘍壊死因子TNF-α誘導性NF-κB標的遺伝子をCT1感受性に従って分類したところ、IL-6遺伝子およびIL-8遺伝子の誘導はSWI/SNF依存性であり、かつCT1の抑制を受けた。一方、ICAM1およびTNF-α遺伝子は、SWI/SNF非依存性でありCT1非感受性であった。これら特性は、上皮がん治療剤として好都合である。
【実施例８】
【０１１１】
（DPF1およびDPF3a/bの転写物はスフェア培養物中のGIC中に豊富であるが、分化すると発現が抑制される）
神経膠芽腫（以下「GBM」という）患者由来の3つの独立した細胞株（TGS-01、TGS-04およびTGS-05）は、血清を含まない特定の培地中で非接着性のスフェアとして培養すると幹細胞（神経膠腫幹細胞、以下「GIC」という）様特性を有することが以前に報告されている（Ikushima, H.ら、Cell Stem Cell 5, 504-514 (2009)）。前記3種の単離されたGIC株の分化を、血清含有培地中で接着性の単層として細胞培養することによって誘導できる（Lee, J.ら、Cancer Cell 9, 391-403 (2006)）。本発明者らは、3種の細胞それぞれのスフェアでのGIC培養物、および分化させたGIC培養物から全RNAサンプルおよび全タンパク質サンプルを調製した。前記GIC調製サンプルを用いたqRT-PCRおよびウェスタンブロッティングを行い、まず、分化した細胞を幹細胞に再構成するため、および幹細胞がその幹細胞性の維持のために必要であると報告されているPOU3F2、SOX2、SALL2およびOLIG2の発現を調べた（Suva, M. L.ら、Cell 157, 580-594 (2014)）（図８Ａ）。スフェアで培養した細胞と分化させた細胞について、RNAレベルでの発現を比較することにより、発明者は4つの転写因子すべてがスフェア培養時に、分化した細胞より高レベルで発現していて、これらのGIC培養物が、以前に報告された幹様腫瘍増殖細胞（TPC）（Lee, J.ら、Cancer Cell 9, 391-403 (2006)）と非常に類似の特性を有することを示した。【０１１２】
次いで、上記と同じサンプルを用いて、SWI/SNF複合体のコア成分の発現レベルおよびSWI/SNF複合体と強く関連する数種のタンパク質の発現を調べた。胚および神経幹細胞の幹細胞性維持に関与すると考えられる触媒サブユニットであるBRG1のmRNA（図８Ａ、Ｂ）およびタンパク質レベル（データ示さず）は、GBM患者より単離した3種の独立した細胞株（TGS-01、TGS-04およびTGS-05）の全てで、スフェア培養した時の方が分化させた時よりも高かった。興味深いことに、3つの細胞株のスフェア培養において、DPF3a/bの発現レベルは差があった（図８Ｂ）。また、d4ファミリーメンバーの中では、DPF1およびDPF3a/bの発現が、スフェア培養に、分化させた時よりも高いことが判明した（図８Ａ）。
【実施例９】
【０１１３】
（DPF1とDPF3aはGICの幹細胞性の維持に重要な役割を果たす）
GICにおける幹細胞性の維持においてBRG1とd4ファミリータンパク質とが関与しているかどうかを試験するため、効率的な抑制活性を有する少なくとも２セットのshRNAを用いてそれぞれの遺伝子発現のノックダウン実験を行った。予備実験の結果から、DPF1およびDPF3aのノックダウンの生物学的効果が非常に速いため、非接着性のスフェア培養物中の安定した形質導入体をピューロマイシン選択によって単離できない可能性が考えられた。そこで、GFPを同時発現するshRNA発現レンチウイルスベクターを使用した。GICの幹細胞性を評価するために、形質導入後48時間でGFP陽性細胞をウェルに個々に分別して、スフェア形成アッセイを行ってスフェア形成活性を評価した。このアッセイにおいて、BRG1、DPF1、DPF3a、およびDPF3bのノックダウンはTGS-01細胞のスフェア形成活性を劇的に低下させたが、DPF2ノックダウンはわずかな効果しか示さなかった（図９Ａ）。DPF1とDPF3aの幹細胞性維持における重要な機能が、他のGIC株にも拡張できるかどうかを調べるために、我々はTGS-04細胞およびTGS-05細胞をDPF1またはDPF3aノックダウンに供したところ、TGS-01細胞と同様に、両方の細胞においてスフェア形成活性が低減されることを見出した（データ示さず）。【０１１４】
shRNAコンストラクトによる標的以外への作用（オフターゲット効果）の可能性を排除するために、レスキュー実験を行った。GICの幹細胞性の喪失についてはd4ファミリー遺伝子のshRNAコンストラクト導入後の非常に早期に起こるので、shRNA（mU6 pol IIIプロモーターによって駆動される）および対応するcDNA（幹細胞での遺伝子サイレンシングに対して比較的耐性であることが知られているEF1αpol IIプロモーターによって駆動される）の両方の発現ユニットを有するデュアルレンチウイルス発現ベクターを開発した。このベクターでは、上記cDNAを、対応するshRNAに抵抗性となるように設計した。BRG1、DPF1およびDPF3aの場合、対応するcDNAの同時発現によってスフェアの形成活性が部分的にレスキューされた（図９Ｂ）。興味深いことに、DPF3aノックダウンはDPF1の異所性発現によってもレスキューされたが、DPF1ノックダウンはDPF3aの異所性発現によって有意にはレスキューされなかった（図９Ｂ）。これらの結果は、DPF1が幹細胞の維持に関してDPF3aよりも効果が優勢であることを示唆した。DPF3bノックダウン細胞におけるDPF3b cDNAを用いたレスキュー実験は成功しておらず、また、DPF3bのmRNAレベルはこれらのGIC株におけてqRT-PCRによる検出限界に近かったため、GICにおけるDPF3bのレスキュー実験については解析を行っていない。【０１１５】
FLAGタグ付のd4ファミリータンパク質を異所性発現しているTGS-01細胞由来の細胞を使い、その細胞でもd4ファミリー遺伝子のノックダウン実験を行った結果、デュアルレンチウイルス発現ベクターの実験と同様の傾向がみられた（図９Ｃ）。また、この実験において、d4ファミリータンパク質の異所性発現がGIC細胞株のスフェア形成活性を増加させなかったことは注目に値する。即ち、これらのタンパク質の内在遺伝子からの発現レベルは飽和レベルであり、内在する遺伝子からの発現だけでGICの幹細胞性を維持するのに十分だったことを意味する。【０１１６】
DPF3aを異所性発現する細胞は、さらなるDPF1ノックダウンに対して感受性であることが見出された（図９Ｃ）。これらの結果から、DPF1がDPF3aに対してドミナントであるという、先のデュアル発現ベクターの結果が再確認できた。しかしながら、これらの実験では、対応するcDNA発現によるスフェア形成活性のレスキューは総じて不完全であり、この理由は、部分的には、EF1αプロモーターを用いる場合であっても長期の幹細胞培養中に、レンチウイルスからのcDNA発現が遺伝子サイレンシングに向かう傾向にあるためと考えられる。
【実施例１０】
【０１１７】
（BRG1は、GICの幹細胞性への寄与において、SWI/SNFコア複合体の触媒サブユニットであるBrmで機能的に置換できる）
分化した状態の細胞ではBrm mRNAがより高い発現レベルである点は、３種のGIC株の間で基本的に類似していたが（図８Ａ）、TGS-04細胞およびTGS-05細胞のスフェア培養物中のBrm mRNAレベルは、TGS-01培養物よりも有意に高いことを見出した（図８Ｂ）。一方、TGS-04細胞およびTGS-05細胞のBrmのタンパク質レベルでの発現をウェスタンブロッティングにより分析すると、スフェア培養物中のBrmレベルは分化した培養物中よりも高かった（データ示さず）。このことは、上記細胞において、Brm発現の転写後調節がいくつか存在することを示している。これらの結果はまた、３種のGIC培養物の間でSWI/SNF成分が有意に不均質であることを示唆した。【０１１８】
本発明者らはさらに、TGS-04細胞とTGS-05細胞のスフェア形成活性は、BRG1またはBrmいずれか一方のノックダウンに感受性がないことを見出した（図１０Ａ、１０Ｂ）。この発見は、TGS-01細胞ではBRG1ノックダウンによってスフェア形成活性の低下を引き起こした結果（図９Ａ）とは対照的であった。TGS-04細胞およびTGS-05細胞ではBRG1およびBrmの発現が両方とも高いため、いずれかの単独のノックダウンではスフェア形成活性に大きくは影響しない可能性があると考えられる。このことは、BrmがGICの幹細胞維持のためのSWI/SNF複合体の効果的な触媒サブユニットとしても機能できることを示唆した。【０１１９】
次に、BrmがBRG1を実際に機能的に置換できるかどうかを試験するために、TGS-01細胞においてBrmおよびshBRG1を異所性に共発現させた。BRG1のノックダウンによるスフェア形成活性の低下は、異所性のBrm発現によってレスキューされた（図１０Ｃ）。一方、Brmの異所性発現それ自体は細胞のスフェア形成活性には実質的に影響しなかった（データは示さず）。これらの結果から、BrmがGICにおいて高レベルで発現される場合、幹細胞性の維持にも寄与し得ることが示された。BRG1およびBrmの発現が高いTGS-04細胞およびTGS-05細胞ではBRG1とBrmを同時にノックダウンすると、細胞のスフェア形成活性が著しく低下した（データは示さず）。
【実施例１１】
【０１２０】
（GICにおけるDPF1およびDPF3aノックダウンは強力な抗腫瘍形成活性をもたらす）
DPF1およびDPF3aの幹細胞性維持機能をさらに確認するため、shDPF1発現ベクター、shDPF3a発現ベクターまたはEV-2（コントロール）を導入したTGS-01細胞を、免疫無防備状態のマウス（ヌードマウス）に同所移植した。コントロール細胞を接種したマウスの生存率は急速な低下が認められたが、shDPF1またはshDPF3aを発現する細胞を接種したマウスでは、コントロール細胞を接種したものと比較して生存率の向上がみられた（図１１）。特に、shDPF1の発現は、shDPF3aと比較してもはるかに大きな効果を生じた（shDPF1の発現細胞を移植した６匹中５匹のマウスが試験の間に生存した）。これらの結果は、DPF1がGICの幹細胞性の維持に極めて重要であり、GBMにおける治療標的となり得る可能性を示唆した。本結果によって、本発明のshRNAの神経膠芽腫に対する治療効果が実証された。特に、予想していなかったが、d4ファミリー遺伝子の中でも特にDPF1に対するshRNAの効果は極めて顕著であった。この傾向は、上皮がんの場合ではDPF1よりもDPF2, DPF3に対するshRNAがより効果を持っていた結果（図１）とは異なる。
【実施例１２】
【０１２１】
（DPF1およびDPF3aによる幹細胞性の維持には、NF-κB活性化を必要としない）
上皮がん細胞株を用いた実施例では、d4ファミリータンパク質は、SWI/SNF複合体とNF-κB二量体を連結するアダプタータンパク質として機能することが示された。BRG1、DPF1およびDPF3aの発現がGICの幹細胞性維持へかなり強く関与していた点を考慮して、SWI/SNF依存性NF-κB活性化がGICの生物学的活性（幹細胞性維持）に寄与しているかどうかを次に試験した。NF-κB活性化経路阻害剤IκBαの変異体であるIκBαSRをTGS-01細胞に導入したとき、発明者らはスフェア形成活性に対する何らの影響も検出しなかった。即ち、コントロールのEV-2形質導入細胞およびIκBαSR発現細胞におけるスフェア形成細胞のパーセンテージはそれぞれ20.57±1.59％および21.35±0.60％で差が無かった（データは示さず）。これは、GICにおいてはDPF1とDPF3aがSWI/SNF複合体とNF-κBとの間のアダプター以外の明らかに異なる機能を有していて、その機能によってGCIの幹細胞性の維持に必須の役割を果たす必要があることを示唆した。また、NF-κBのサブユニットであるRelAまたはRelBの免疫染色では、そのシグナルが主に細胞質に存在していたこと、および、後でも述べる近接ライゲーションアッセイ（PLA）で、SWI/SNF複合体とNF-κBの共局在がみられなかったことからも同様の可能性が示唆された（データは示さず）。
【実施例１３】
【０１２２】
（SWI/SNFコア複合体およびコリプレッサー複合体を含む巨大複合体の形成には、DPF1またはDPF3aがアダプターとして必要である）
shDPF1によって、および程度はより低いがshDPF3aよって、GICの幹細胞性の維持が迅速かつ強力に抑制された結果から、発明者らはDPF1およびDPF3aは、GICの幹細胞性の維持に重要な、NF-κB以外の転写調節因子とSWI/SNFコア複合体との間のアダプターとして機能し得るという仮説を立てた。試行錯誤の結果、SWI/SNFコア複合体と巨大複合体を形成する可能性のある候補の中で、TLX（NR2E1）、LSD1（リジン特異的デメチラーゼ1）およびRCOR2（RESTコリプレッサー2; CoREST2）に対する抗体が、TGS-01細胞のライセートからBRG1およびBAF155の両方を同時に共免疫沈降させることを見出した（図１２Ａ、１２Ｂ）。転写抑制機能を有する核オーファンレセプターとして知られているTLXは、これまでにニューロン幹細胞を制御すること、ノックダウン実験によってGICの幹細胞性の維持に必須であることが示されている。ヒストン脱メチル化活性を有する負のエピジェネティックレギュレーターであるLSD1も、よく知られているコリプレクターであるRCOR2（REST corepressor 2：CoREST2）と一緒にGICの幹細胞性を調節すると報告されている。重要なことに、TLXのタンパク質としての発現レベルは、３種類のGICのスフェア培養時と分化誘導後で変化しなかったが、LSD1およびRCOR2のレベルはスフェア培養時の方が高かった。TGS-01細胞のライセートを抗TLX抗体を用いて免疫沈降させると、この免疫沈降物中にLSD1およびHDAC2が検出された（図１２Ａ）。さらに、これらの細胞ライセートを抗LSD1抗体で免疫沈降させるとRCOR2が検出され、逆に抗RCOR2抗体で免疫沈降させるとLSD1が検出された（図１２Ｂ）。このことは、以前に報告された、これら2つのタンパク質間で強固な2量体が形成されることを追認するものである。同様に、TGS-04細胞およびTGS-05細胞の細胞ライセートを抗TLX抗体で免疫沈降させた場合、免疫沈降物中にBRG1およびBAF155の両方が検出された（データは示さず）。さらに、FLAGタグを付加したDPF1、DPF2またはDPF3aを異所性に発現するTGS-01細胞のライセートを抗TLX抗体または抗LSD1抗体で免疫沈降させた場合、DPF1、DPF2またはDPF3a、ならびにBRG1、BAF155およびLSD1が検出された（図１２Ｃ、図１２Ｄ）。FLAGタグ付加したDPF2を用いた場合も同様の結果がみられたが、FLAGタグ付加DPF2の発現レベルは低かった。総括すると、これらの結果は、DPF1およびDPF3aが、TLXおよびLSD1/RCOR2を含むSWI/SNF複合体およびコリプレッサー複合体を連結するアダプタータンパク質として機能し得ることを示唆する。【０１２３】
細胞を溶解して抽出物からタンパク質複合体を単離するのに使用される生化学的プロトコールが、細胞核内の真正なタンパク質相互作用を破壊しがちであることを考慮して、インサイチューで近位ライゲーションアッセイ（PLA）を行った。この方法は、大きく、不安定な複合体を固定した後に、細胞内の近位に位置しているタンパク質の間の相互作用を可視化するものである。分析したタンパク質（BRG1、BAF155、TLXおよびLSD1）はいずれも、免疫蛍光アッセイによって核内に厳密に局在することを先ず確認し、前記アッセイと同じ抗体をPLAに用いた。BRG1/BAF155（SWI/SNFコア複合体の2つのサブユニット）の抗体ペアを用いるポジティブコントロールと同様に、抗BRG1/抗TLX抗体ペア、抗BRG1/抗LSD1抗体ペアおよび抗LSD1/抗TLX抗体ペア、および抗LSD1/抗BAF155抗体ペアを用いて、GICにおいてはこれら５組のタンパク質同士が近位に位置していることを検出した（図１３）。各々の抗体単独を使用する場合、わずかなシグナルのみを検出した。FLAGタグ付きDPF1発現ベクターを導入したTGS-01細胞をPLAによって分析したところ、DPF1とTLX、DPF1とLSD1、DPF1とBAF155との間の近位に位置していることを検出できたが、抗Flag抗体のみを使用した場合、ごくわずかなシグナルしかみられなかった（データ示さず）。これらの結果から、TLXおよびLSD1を含むコリプレッサー複合体は、SWI/SNFコア複合体と密接に結合することが示された。前記のより巨大なSWI/SNF複合体に対するDPF1ノックダウンの影響を調べるために、shDPF1を発現するTGS-01細胞をPLAによって分析した。この結果、BRG1およびTLXの近位の位置またはBRG1およびLSD1の近位の位置を検出するシグナルは劇的に低下した。一方、BRG1およびBAF155の近位の位置またはLSD1およびTLXの近位の位置の検出シグナルには影響を及ぼさなかった（図１４）。これらの結果は、DPF1がTLXおよびLSD1/RCOR2を含むSWI/SNFコア複合体およびコリプレッサー複合体を連結させるアダプターとして働くという考えと矛盾しない。
【実施例１４】
【０１２４】
（GICの幹細胞性を失わせるDPF1およびDPF3に対するshRNA配列に関する最適化検討）
実施例１１に示したように、GICにおけるDPF1および／またはDPF3aのノックダウンはGICの幹細胞性を喪失させることで強力な抗腫瘍形成活性を示した。そこで、GIC の幹細胞性を失わせ、神経膠芽腫の治療にも適するd4ファミリー遺伝子に対するshRNAについてより詳細に検討した。具体的には、実施例９で用いたshRNAに加え、DPF1に特異的なshRNA、DPF3aとDPF3bに対して共通に効果をもつことが期待されるshRNA、およびDPF3aに特異的なshRNAをそれぞれ新たに複数作製し、各shRNAについてTGS-01細胞のスフェア形成に対する効果を検討した。その結果を図１６に示す。【０１２５】
実施例９で使用したDPF1に対するshRNAであるshDPF1-CDS#1（対応するsiRNAのセンス鎖の配列は配列番号４１、以下同様）、shDPF1-3’UTR#4（配列番号５１）と一緒にshDPF1-CDS#2（配列番号４３）、shDPF1-CDS#3（配列番号４５）、shDPF1-3’UTR#1（配列番号４７）、shDPF1-3’UTR#2（配列番号４９）の効果を調べた。その結果、shDPF1-CDS#3とshDPF1-3’UTR#1はshDPF1-CDS#1、shDPF1-3’UTR#4と同等の効果を示したが、shDPF1-CDS#2とshDPF1-3’UTR#2についてはTGS-01細胞のスフェア形成において顕著な阻害効果は示さなかった。【０１２６】
DPF3aとDPF3bに対して共通にノックダウン効果が期待される２つのshRNA、shDPF3-CDS#1（配列番号５８）、shDPF3-CDS#3（配列番号５９）については、shDPF3-CDS#1が顕著なスフェア形成阻害効果を示すのとは対象的にshDPF3-CDS#3の阻害効果は弱かった。【０１２７】
実施例９で使用したDPF3aに対するshRNAであるshDPF3a-3’UTR#2（配列番号６０）、shDPF3a-3’UTR#4（配列番号６４）と一緒にshDPF3a-CDS#1（配列番号６６）、shDPF3a-CDS#2（配列番号６８）、shDPF3a-3’UTR#3（配列番号６２）の効果を調べた。その結果、shDPF3a-CDS#1とshDPF3a-CDS#2は実施例９で使用したshDPF3a-3’UTR#2、shDPF3a-3’UTR#4と同等かそれ以上のスフェア形成阻害効果を示したが、shDPF3a-3’UTR#3の阻害効果は弱かった。【０１２８】
（図面の説明）
図８。3つのGICからの調製物、およびそれらに対応する分化細胞からの調製物中のSWI/SNFコア複合体のサブユニットコードするmRNA、および関連する遺伝子のmRNAの発現のヒートマップによる表示。（Ａ）TGS-01、TGS-04またはTGS-05のスフェア培養時のmRNA発現をqRT-PCRによって分析し、分化させた単層培養のものと比較した。（Ｂ）は（Ａ）に記載のqRT-PCRによって分析したd4ファミリーメンバー、BRG1とBRMの相対的な遺伝子発現レベルを棒グラフ化したもの。Ｓ：スフェア培養、Ｄ：分化のための単層培養。エラーバーは、３つ組の実験からの平均の標準偏差を表す。【０１２９】
図９。TGS-01細胞のスフェア形成活性に対するd4ファミリーメンバー、BRG1またはBrmのノックダウン効果。（Ａ）様々なshRNAを発現する、またはコントロール（EV-1：レーン1）のレトロウイルスベクターを導入したTGS-01細胞の相対的なスフェア形成能を示す：shDPF1-CDS＃1（配列番号４１）（レーン3）、shDPF1-3'UTR＃4（配列番号５１または配列番号１８）（レーン4）、shDPF2-3'UTR＃3（配列番号５５）、shDPF2-3'UTR＃4（配列番号５６）およびshDPF2-3'UTR＃6（配列番号５７）（レーン5〜7）、shDPF3a-3'UTR＃2（配列番号６０）（レーン8）、shDPF3a-3'UTR＃4（配列番号６４）（レーン9）、shDPF3b-CDS＃6（配列番号７２）およびshDPF3b-CDS＃7（配列番号７３）（レーン10、11）、shBRG1-CDS＃2（配列番号３８）およびshBRG1-CDS＃4（配列番号４０）（レーン12、13）、shBrm＃4（配列番号３４）およびshBrm＃8（配列番号３６）（レーン14、15）。（Ｂ）レスキュー実験に関する。mRNA（3×FLAG-DPF1、3×FLAG-DPF3aおよび3×FLAG-BRG1）とshRNA（shCre＃4（Kobayashi, K.ら、Sci. Rep. 5: 8427 (2015)）、shDPF1-3'UTR＃4（配列番号５１または配列番号１８）、shDPF3a-3'UTR＃4（配列番号６４または配列番号２８）、shBRG1-CDS＃2（配列番号３８））とを同時に発現する、pLE-IGに基づくデュアルレンチウイルスベクターを移入したTGS-01細胞の相対的なスフェア形成の比率。（ｃ）d4ファミリータンパク質発現レンチウイルスベクターならびに空ベクター（EV-3）を移入したTGS-01細胞に、shDPF1-3'UTR＃4、shDPF3a-3'UTR＃4、またはshBRG1-CDS＃2を発現するレンチウイルスベクターおよび空ベクター（EV-2）を二次的に導入した。エラーバーは、３つ組の実験からの平均の標準偏差を表す。ＮＳ＝有意ではない、スチューデントt検定により*p<0.05、** p＜0.01。【０１３０】
図１０。TGS-04およびTGS-05細胞のスフェア形成活性に対するBRG1またはBrmのノックダウンの効果。shBrmもしくはshBRG1を発現するレンチウイルスベクターまたは空ベクター（EV-2;レーン1）を導入したTGS-04（Ａ）およびTGS-05（Ｂ）の培養におけるスフェア形成細胞の割合。shBrm＃4（配列番号３４）、shBrm＃8（配列番号３６）（レーン2、3）、shBRG1-CDS＃2（配列番号３８）、shBRG1-CDS＃4（配列番号４０）（レーン4、5）。（Ｃ）レスキュー実験に関する。３×FLAG-BrmおよびshBRG1を同時発現するデュアルレンチウイルスベクターを導入したTGS-01培養におけるスフェア形成細胞の割合。レーン2および３はshBRG1-CDS＃2であり、レーン４および5はshBRG1-CDS＃4である。エラーバーは、３つ組の実験からの平均の標準偏差を表す。ＮＳ＝有意ではない、**スチューデントt検定によりp＜0.01。【０１３１】
図１１。TGS-01細胞を同所移植したマウスのカプラン-マイヤー生存曲線。shDPF1-3'UTR＃4（配列番号５１または配列番号１８）またはshDPF3a-3'UTR＃4（配列番号６４または配列番号２８）を発現するレンチウイルスベクターまたは空ベクター（EV-2）を導入したTGS-01細胞を形質移入の2日後にフローサイトメトリーによって選別し、得られた細胞（それぞれ3×103個の細胞）を6週齢の雌性ヌードマウスの大脳半球に注入した。ログランク検定により*p＜0.05、** p＜0.01。【０１３２】
図１２。GIC内のTLXおよびLSD1/RCOR2を含むより巨大なSWI/SNF複合体の検出。
コリプレッサー複合体を有するSWI/SNF複合体サブユニットの共免疫沈降の結果を示す。（Ａ、Ｂ）TGS-01細胞のライセートを、抗TLX抗体（Ａ）、または抗LSD1抗体もしくは抗RCOR2抗体（Ｂ）で免疫沈降し、得られた免疫沈降物をウェスタンブロッティングで分析した。（Ｃ、Ｄ）3×FLAG-DPF1、3×FLAG-DPF2または3×FLAG-DPF3aを異所性に発現するTGS-01細胞のライセートを抗TLX抗体（Ｃ）または抗LSD1抗体（Ｄ）で免疫沈降し、免疫沈降物をウェスタンブロッティングにより分析した。矢印：FLAGタグ付d4ファミリータンパク質；矢頭：IgG重鎖。試料は同一の実験に由来するものであり、ゲル/ブロットを並列処理した。【０１３３】
図１３。PLAによって検出されたTGS-01細胞におけるSWI/SNFコア複合体、TLXおよびLSD1/RCOR2の近位の局在。
TGS-01細胞を固定し、単独の抗体または抗体ペアと一緒にインキュベートしたものをPLAによって検出した。ドットはタンパク質間の相互作用を示し、核はDAPIにより染色した。蛍光画像は、約10μm深度でBZ-X710（キーエンス）のクイックフルフォーカス（quick-full-focus）を用いて得た。スケールバーは10μmを示す。Rb：ウサギ、Ms：マウス。【０１３４】
図１４。PLAによって検出された、TGS-01細胞内のSWI/SNFコア複合体、TLXおよびLSD1/RCOR2の近位の局在に対するDPF1ノックダウンの効果。
shDPF1-3'UTR＃4（配列番号５１または配列番号１８）の発現レンチウイルスベクターまたは空のベクター（EV-2）を導入したTGS-01細胞を、前記導入の３日後に固定し、抗体ペアと共にインキュベートした。GFP陽性細胞の核あたりのドット数を数えた。エラーバーは平均の95％信頼区間を表す（Ｎ＝50）。【０１３５】
図１５。SWI/SNF複合体、d4ファミリータンパク質、およびTLXの間の相互作用に関する模式図を示す。【０１３６】
図１６。TGS-01細胞のスフェア形成阻害効果を指標とした、GICの幹細胞性喪失に適した、d4ファミリー遺伝子に対するshRNAの検討結果を示す。【０１３７】
（d4ファミリータンパク質の発現阻害ポリヌクレオチドを用いる効果のまとめ）
GICを同所移植したマウス異種移植モデルにおいて、DPF1またはDPF3a遺伝子のshRNA媒介性ノックダウンによりスフェア形成能および腫瘍形成活性の両方が有意に低下した。レスキュー実験によって、DPF1がDPF3aに対して優勢な効果を有することを明らかにした。DPF1またはDPF3aのいずれかをノックダウンするとGICの幹細胞性が速やかに喪失することが示された。これらの実験から、d4ファミリータンパク質を介して、SWI/SNFコア複合体が特定のコリプレッサー複合体と巨大SWI/SNF複合体を形成すること、前記巨大SWI/SNF複合体がGICの重要な特徴の必須決定因子であることが実証された（図１５）。したがって、DPF1およびDPF3a、特にDPF1は、GBMの新しい治療標的であることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１３８】
本発明に係る医薬は、上皮がん、神経膠腫に対する新規の医薬として利用することが期待できる。すなわち、d4ファミリータンパク質のドミナントネガティブ変異体は、d4ファミリータンパク質全てに対するドミナントネガティブ変異体として作用して、NF-κBによる腫瘍亢進能のみを抑制して上皮がんの治療に有効な手段になり得る。また、DPF1をRNAiによって抑制することは神経膠腫の治療に有効な手段になり得る。
【配列表フリーテキスト】
【０１３９】
配列番号  １：DPF1-CT1アミノ酸配列
配列番号  ２：DPF2-CT1アミノ酸配列
配列番号  ３：DPF3a/b-CT1アミノ酸配列
配列番号  ４：DPF3-CT1のΔ1-8変異体（9〜84残基）のアミノ酸配列
配列番号  ５：DPF3-CT1のΔ1-32変異体（33〜84残基）のアミノ酸配列
配列番号  ６：DPF3-CT1のΔ1-39変異体（40〜84残基）のアミノ酸配列
配列番号  ７：DPF3-CT1のΔ1-52変異体（53〜84残基）のアミノ酸配列
配列番号  ８：DPF3-CT1のΔ40-76変異体のアミノ酸配列
配列番号  ９：DPF3-CT1のΔ53-76変異体のアミノ酸配列
配列番号１０：DPF1-CT1のヌクレオチド配列
配列番号１１：DPF2-CT1のヌクレオチド配列
配列番号１２：DPF3a-CT1のヌクレオチド配列
配列番号１３：DPF3b-CT1のヌクレオチド配列
配列番号１４：shIL-6-3'UTR#1-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号１５：shIL-6-3'UTR#1-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号１６：shDPF1-3’UTR#2-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号１７：shDPF1-3'UTR#2-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号１８：shDPF1-3'UTR#4-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号１９：shDPF1-3'UTR#4-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号２０：shDPF2-3'UTR#3-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号２１：shDPF2-3'UTR#3-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号２２：shDPF2-3'UTR#4-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号２３：shDPF2-3'UTR#4-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号２４：shDPF2-3'UTR#6-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号２５：shDPF2-3'UTR#6-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号２６：shDPF3a-CDS#2-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号２７：shDPF3a-CDS#2-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号２８：shDPF3a-3'UTR#4-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号２９：shDPF3a-3'UTR#4-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号３０：shDPF3b-CDS#6-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号３１：shDPF3b-CDS#6-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号３２：shDPF3b-CDS#7-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号３３：shDPF3b-CDS#7-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号３４：shBrm#4-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号３５：shBrm#4-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号３６：shBrm#8-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号３７：shBrm#8-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号３８：shBRG1-CDS#2-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号３９：shBRG1-CDS#2-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号４０：shBRG1-CDS#4-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号４１：shDPF1-CDS#1-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号４２：shDPF1-CDS#1-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号４３：shDPF1-CDS#2-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号４４：shDPF1-CDS#2-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号４５：shDPF1-CDS#3-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号４６：shDPF1-CDS#3-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号４７：shDPF1-3'UTR#1-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号４８：shDPF1-3'UTR#1-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号４９：shDPF1-3'UTR#2-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号５０：shDPF1-3'UTR#2-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号５１：shDPF1-3'UTR#4-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号５２：shDPF1-3'UTR#4-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号５３：shDPF2-#1-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号５４：shDPF2-#2-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号５５：shDPF2-3'UTR#3-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号５６：shDPF2-3'UTR#4-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号５７：shDPF2-3'UTR#6-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号５８：shDPF3-CDS#1-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号５９：shDPF3-CDS#3-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号６０：shDPF3a-3'UTR#2-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号６１：shDPF3a-3'UTR#2-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号６２：shDPF3a-3'UTR#3-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号６３：shDPF3a-3'UTR#3-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号６４：shDPF3a-3'UTR#4-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号６５：shDPF3a-3'UTR#4-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号６６：shDPF3a-CDS#1-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号６７：shDPF3a-CDS#1-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号６８：shDPF3a-CDS#2-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号６９：shDPF3a-CDS#2-antisenseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号７０：shDPF3b-CDS#3-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号７１：shDPF3b-CDS#4-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号７２：shDPF3b-CDS#6-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号７３：shDPF3b-CDS#7-senseオリゴヌクレオチド配列（DNAに置換したもの）
配列番号７４：GenBankアクセッション番号NM_001135155.2のヌクレオチド配列
配列番号７５：GenBankアクセッション番号NM_006268.4のヌクレオチド配列
配列番号７６：GenBankアクセッション番号NM_012074.4のヌクレオチド配列
配列番号７７：GenBankアクセッション番号NM_001280542.1のヌクレオチド配列
配列番号７８：DPF3-CT1のアミノ酸残基で５３番目から７６番目の領域
配列番号７９：DPF3-CT1のアミノ酸残基で４０番目から７６番目の領域
【図１】
2018186032.tif 000007
【図２−１】
2018186032.tif 000008
【図２−２】
2018186032.tif 000009
【図３−１】
2018186032.tif 000010
【図３−２】
2018186032.tif 000011
【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
2018186032.tif 000025
【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
2018186032000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月30日(2018.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体依存性の、ＮＦ−κＢもしくはコリプレッサー複合体による遺伝子発現制御を阻害する、または
（ｂ）ｄ４ファミリータンパク質のアダプター機能を阻害する、阻害剤
を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記阻害がｄ４ファミリータンパク質の機能に対する競合阻害、またはｄ４ファミリータンパク質の発現の抑制である、請求項１または２１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ｄ４ファミリータンパク質が、ＤＰＦ１、ＤＰＦ２、ＤＰＦ３ａおよびＤＰＦ３ｂから選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記阻害剤が、ｄ４ファミリータンパク質に対するドミナントネガティブ変異体である、請求項１〜３および２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ドミナントネガティブ変異体が、配列番号１〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｄ４ファミリーに対する競合阻害活性を有するポリペプチドである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記阻害剤がＳＷＩ／ＳＮＦ複合体と結合する、請求項１〜５および２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記阻害剤がＮＦ−κＢおよび／またはコリプレッサー複合体と結合する、請求項４〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記阻害剤がＩＬ−６および／またはＩＬ−８の発現を低減する、請求項１〜７および２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記阻害剤が、配列番号１〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列、または配列番号１〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターである、請求項１〜３および２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ｄ４ファミリー遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドである、請求項１〜３および２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが、ｄ４ファミリー遺伝子の発現を抑制する、ＲＮＡｉを奏するＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ｄ４ファミリー遺伝子の発現を抑制する、ＲＮＡｉを奏するＲＮＡが、配列番号７４〜７７のいずれかのｄ４ファミリー遺伝子に特異的であり、ｄ４ファミリー遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ｄ４ファミリー遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドが、配列番号４１〜７３からなる群から選択される配列およびその配列の相補的配列からなる二本鎖ＲＮＡ、ならびに前記配列に対して欠失、置換、挿入および／または付加されたヌクレオチドを１〜数個含む配列およびその相補的配列を含む二本鎖ＲＮＡから選択されるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ｄ４ファミリー遺伝子の発現を阻害するＲＮＡが、配列番号４１の配列と配列番号４２の配列との組合せ、配列番号４３の配列と配列番号４４の配列との組合せ、配列番号４５の配列と配列番号４６の配列との組合せ、配列番号４７の配列と配列番号４８の配列との組合せ、配列番号４９の配列と配列番号５０の配列との組合せ、配列番号５１の配列と配列番号５２の配列との組合せ、配列番号６０の配列と配列番号６１の配列との組合せ、配列番号６２の配列と配列番号６３の配列との組合せ、配列番号６４の配列と配列番号６５の配列との組合せ、配列番号６６の配列と配列番号６７の配列との組合せ、および配列番号６８の配列と配列番号６９の配列との組合せから選択される組のポリヌクレオチドがアニーリングしてなるｓｉＲＮＡまたは前記ｓｉＲＮＡの配列とループ配列を含んでなるｓｈＲＮＡである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記阻害剤が配列番号１６〜３３のいずれかから選択される配列を有するポリヌクレオチドを含むｓｈＲＮＡである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
抗がん剤である、請求項１〜１５および２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
上皮がん治療剤である、請求項１〜１５および２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
神経膠芽腫治療剤である、請求項１〜１５および２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ＤＰＦ１遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを阻害剤として含んでなる、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記遺伝子発現制御がＳＷＩ／ＳＮＦ複合体依存性のコリプレッサー複合体によるものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記ドミナントネガティブ変異体が、配列番号２または３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、上皮がん治療剤である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
神経膠芽腫治療剤である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
神経膠芽腫治療剤である、請求項１３または１４に記載の医薬組成物であって、
前記ｄ４ファミリー遺伝子の発現を阻害するＲＮＡが、
配列番号４１の配列と配列番号４２の配列との組合せ、
配列番号４５の配列と配列番号４６の配列との組合せ、
配列番号４７の配列と配列番号４８の配列との組合せ、
配列番号５１の配列と配列番号５２の配列との組合せ、
配列番号５８の配列とその相補的配列との組合せ、
配列番号６０の配列と配列番号６１の配列との組合せ、
配列番号６４の配列と配列番号６５の配列との組合せ、
配列番号６６の配列と配列番号６７の配列との組合せ、および
配列番号６８の配列と配列番号６９の配列との組合せ
から選択される組のポリヌクレオチドがアニーリングしてなるｓｉＲＮＡもしくは前記ｓｉＲＮＡの配列とループ配列を含んでなるｓｈＲＮＡである、医薬組成物。
【請求項２５】
神経膠芽腫治療剤である、請求項２４に記載の医薬組成物であって、
前記ｄ４ファミリー遺伝子の発現を阻害するＲＮＡが、
配列番号４１の配列と配列番号４２の配列との組合せ、
配列番号４５の配列と配列番号４６の配列との組合せ、
配列番号４７の配列と配列番号４８の配列との組合せ、
配列番号５１の配列と配列番号５２の配列との組合せ、
配列番号５８の配列とその相補的配列との組合せ、
配列番号６４の配列と配列番号６５の配列との組合せ、
配列番号６６の配列と配列番号６７の配列との組合せ、および
から選択される組のポリヌクレオチドがアニーリングしてなるｓｉＲＮＡもしくは前記ｓｉＲＮＡの配列とループ配列を含んでなるｓｈＲＮＡである、医薬組成物。
【国際調査報告】
2018186032.tif 000031
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