(57)【要約】  細菌の二成分制御系を阻害することにより、薬剤耐性菌、植物病原細菌等の幅広い病原性細菌に対し、優れた抗菌活性、若しくは、前記細菌の有する酵素に対し、酵素阻害活性を有する新規化合物、及びそれらの製造方法、並びに、前記新規化合物の生産菌である新規微生物、及び前記新規化合物を利用した化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤を提供することを目的とする。  下記構造式（１）で表されることを特徴とする化合物、下記構造式（２）で表されることを特徴とする化合物、及び、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、前記化合物を生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、前記培養工程で得られた培養物から前記化合物を採取する採取工程とを含むことを特徴とする前記化合物の製造方法などを提供する。【化１１】2010023725.tif 000015【化１２】2010023725.tif 000016
2010023725.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（１）で表されることを特徴とする化合物。
【化９】
2010023725.tif 000013
【請求項２】
下記構造式（２）で表されることを特徴とする化合物。
【化１０】
2010023725.tif 000014
【請求項３】
請求の範囲第１項に記載の化合物、及び請求の範囲第２項に記載の化合物の少なくともいずれかの製造方法であって、
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、請求の範囲第１項に記載の化合物、及び請求の範囲第２項に記載の化合物の少なくともいずれかを生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から請求の範囲第１項に記載の化合物、及び請求の範囲第２項に記載の化合物の少なくともいずれかを採取する採取工程と
を含むことを特徴とする化合物の製造方法。
【請求項４】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、請求の範囲第１項に記載の化合物、及び請求の範囲第２項に記載の化合物の少なくともいずれかを生産する能力を有する微生物が、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−６１２のストレプトマイセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＭＫ８５１−ｍＦ８株である請求の範囲第３項に記載の化合物の製造方法。
【請求項５】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、請求の範囲第１項に記載の化合物、及び請求の範囲第２項に記載の化合物の少なくともいずれかを生産する能力を有することを特徴とする微生物。
【請求項６】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−６１２のストレプトマイセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＭＫ８５１−ｍＦ８株である請求の範囲第５項に記載の微生物。
【請求項７】
請求の範囲第１項に記載の化合物、及び請求の範囲第２項に記載の化合物の少なくともいずれかを含むことを特徴とする化合物含有組成物。
【請求項８】
請求の範囲第１項に記載の化合物、及び請求の範囲第２項に記載の化合物の少なくともいずれかを含むことを特徴とする抗菌剤。
【請求項９】
請求の範囲第１項に記載の化合物、及び請求の範囲第２項に記載の化合物の少なくともいずれかを含むことを特徴とする酵素活性阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤耐性菌、植物病原細菌等の幅広い病原性細菌に対し、優れた抗菌活性、若しくは、前記細菌の有する酵素に対し、酵素阻害活性を有する新規化合物、その製造方法、及びその用途、並びに、前記新規化合物の生産菌である新規微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、多くの抗菌剤が、細菌感染症の治療薬として用いられてきている。これまでに知られる抗菌剤の多くは、細菌の核酸合成、蛋白質合成、ペプチドグリカン合成等を阻害することにより作用する。これらの標的部位は単一で、主として代謝合成経路を阻害することを目的にしているため、これらの抗菌剤に対する耐性菌が出現しやすく、特に近年では複数の抗生物質に対して耐性を示す多剤耐性菌の出現が問題となっている。
例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）は、化膿性疾患、肺炎、食中毒等の起因菌として知られるが、抗生物質メチシリン等の多くの薬剤に対する耐性を獲得したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の出現が、臨床上大きな問題となっている。現在、ＭＲＳＡに対する代表的な治療薬としては、バンコマイシン、テイコプラニン、アルベカシン、リネゾリドなどが使用されているが、完全にＭＲＳＡを排除することは一般に困難であるとされており、また、これらのうち、バンコマイシンについては、既にバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）の出現が報告されており、その使用には十分な注意が必要であるとされている。
このような薬剤耐性菌の問題を克服するために、従来の抗菌剤とは異なった新しい作用機構による微生物に対する新規抗微生物剤の開発が望まれている（例えば、非特許文献１参照）。【０００３】
一方、細菌には、環境に応答してその変化を受容するレセプターとそれぞれの遺伝子発現を制御する情報伝達機構が知られており、その代表例が二成分制御系（ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍｓ）である。二成分制御系とは、ヒスチジンキナーゼ活性を示すセンサータンパク質とＤＮＡ結合タンパク質であるレギュレーターより構成されている環境応答性の遺伝子発現制御系であり、細菌は様々な環境変化に対応すべく、種々のセンサーとレギュレーターを有している（例えば、非特許文献２参照）。
細菌の二成分制御系としては、グラム陽性菌のＹｙｃＦおよびＹｙｃＧが関与する情報伝達系が存在し、これを阻害すると細菌が死滅することが知られており（例えば、非特許文献３〜６参照）、前記情報伝達系を阻害することによるグラム陽性細菌に抗菌力を示す抗菌剤が期待される。
また、ハクサイ、ジャガイモといった農作物に感染し、農業生産に甚大な被害をもたらす軟腐病菌の病原性は３種の二成分制御系ＰｅｈＳ／ＰｅｈＲ（例えば、非特許文献７参照）、ＰｍｒＢ／ＰｍｒＡ（例えば、非特許文献８参照）、ＥｘｐＳ／ＥｘｐＡ（例えば、非特許文献９参照）によって病原性が調節されていることが知られており、これら病原性を抑制することによる軟腐病菌の防除が期待される。【０００４】
上記知見があるものの、満足のいく抗菌剤、酵素活性阻害剤は未だ得られておらず、優れた抗菌剤などの開発が望まれているのが現状である。【０００５】
【非特許文献１】Ｓｉｅｖｅｒｔ  ＤＭ，ｅｔ  ａｌ：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，２００２．ＭＭＷＲ  Ｊｕｌｙ  ５，２００２；５１：５６５−５６７．
【非特許文献２】バイオサイエンスとインダストリー、第５８巻、第４号
【非特許文献３】Ｆａｂｌｅｔ，  Ｃ．  ａｎｄ  Ｈｏｃｈ，  Ａ．  Ａ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １８０，  ６３７５−６３８３，  １９９８
【非特許文献４】Ｍａｒｔｉ，  Ｐ．  Ｋ．，Ｌｉ，  Ｔ．，  Ｓｕｎ，  Ｄ．，  Ｂｉｅｋ，  Ｄ．  Ｐ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄ，  Ｍ．  Ｂ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １８１，  ３６６６−３６７３，  １９９９
【非特許文献５】Ｌａｎｇｅ，  Ｒ．，  Ｗａｇｎｅｒ，  Ｃ．，  ＤｅＳａｉｚｉｅｕ，  Ａ．，  Ｆｌｉｎｔ，  Ｎ．，  Ｍｏｎｏｓ，  Ｊ．，  Ｓｔｉｇｅｒ，  Ｍ．，  Ｃａｓｐｅｒｓ，  Ｐ．，  Ｋａｍｂｅｒ，  Ｍ．，  Ｋｅｃｋ  ｗｏｌｆｇａｎｇ，  Ａｍｒｅｉｎ，  Ｋ．  Ｅ．，  Ｇｅｎｅ，  ２３７，  ２２３−２３４，  １９９９
【非特許文献６】Ｂｅｉｅｒ，  Ｄ．  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋ，  Ｒ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １８２，  ２０６８−２０７６，  ２０００
【非特許文献７】Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  Ａ．  Ｒ．  Ｂ．，  Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，  Ｒ．  Ａ．，  Ｐｉｒｈｏｎｅｎ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｐａｌｖａ，  Ｅ．  Ｔ．，  Ｍｏｌ．  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，  １１，  ７４３−７５２，  １９９８
【非特許文献８】Ｈｙｙｔｉａｉｎｅｎ，  Ｈ．，  Ｓｊｏｂｌｏｍ，  Ｓ．，  Ｐａｌｏｍａｋｉ，  Ｔ．，  Ｔｕｉｋｋａｌａ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｐａｌｖａ，  Ｅ．  Ｔ．，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ５０，  ７９５−８０７，  ２００３
【非特許文献９】Ｆｌｅｇｏ，  Ｄ．，  Ｍａｒｉｔｓ，  Ｒ．，  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  Ａ．  Ｒ．  Ｂ．，  Ｋｏｉｖ，  Ｖ．，  Ｋａｒｌｓｓｏｎ，  Ｍ．−Ｂ．，  Ｈｅｉｋｉｎｈｅｉｍｏ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｐａｌｖａ，  Ｅ．  Ｔ．，  Ｍｏｌ．  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，  １３，  ４４７−４５５，  ２０００
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、上記従来技術に鑑みて行われたものであり、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、細菌の二成分制御系を阻害することにより、薬剤耐性菌、植物病原細菌等の幅広い病原性細菌に対し、優れた抗菌活性、若しくは、前記細菌の有する酵素に対し、酵素阻害活性を有する新規化合物、及びそれらの製造方法、並びに、前記新規化合物の生産菌である新規微生物、及び前記新規化合物を利用した化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤を提供することを目的とする。
【０００７】
前記課題を解決するため、本発明者らは、細菌細胞の主要な情報伝達機構である二成分制御系に着目し、鋭意検討した結果、新規な微生物として、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌株を分離することに成功し、この菌株が、新規な構造骨格を有し、抗菌活性、若しくは、酵素阻害活性を有する化合物を産生していることを見出した。本発明者らは、前記化合物の化学構造を分析することで、これらが新規化合物であることを確認し、本発明の完成に至った。なお、本発明者らは、これらの新規化合物を「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ」、及び「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂ」と命名した。
【０００８】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  下記構造式（１）で表されることを特徴とする化合物である。
【化１】
2010023725.tif 000003
＜２＞  下記構造式（２）で表されることを特徴とする化合物である。
【化２】
2010023725.tif 000004
＜３＞  前記＜１＞に記載の化合物、及び前記＜２＞に記載の化合物の少なくともいずれかの製造方法であって、
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、前記＜１＞に記載の化合物、及び前記＜２＞に記載の化合物の少なくともいずれかを生産する能力を有する微生物を培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養物から前記＜１＞に記載の化合物、及び前記＜２＞に記載の化合物の少なくともいずれかを採取する採取工程と
を含むことを特徴とする化合物の製造方法である。
＜４＞  ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、前記＜１＞に記載の化合物、及び前記＜２＞に記載の化合物の少なくともいずれかを生産する能力を有する微生物が、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−６１２のストレプトマイセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＭＫ８５１−ｍＦ８株である前記＜３＞に記載の化合物の製造方法である。
＜５＞  ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、前記＜１＞に記載の化合物、及び前記＜２＞に記載の化合物の少なくともいずれかを生産する能力を有することを特徴とする微生物である。
＜６＞  受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−６１２のストレプトマイセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＭＫ８５１−ｍＦ８株である前記＜５＞に記載の微生物である。
＜７＞  前記＜１＞に記載の化合物、及び前記＜２＞に記載の化合物の少なくともいずれかを含むことを特徴とする化合物含有組成物である。
＜８＞  前記＜１＞に記載の化合物、及び前記＜２＞に記載の化合物の少なくともいずれかを含むことを特徴とする抗菌剤である。
＜９＞  前記＜１＞に記載の化合物、及び前記＜２＞に記載の化合物の少なくともいずれかを含むことを特徴とする酵素活性阻害剤である。
＜１０＞  ヒスチジンキナーゼ活性を阻害する前記＜９＞に記載の酵素活性阻害剤である。
【０００９】
本発明によれば、細菌の二成分制御系を阻害することにより、薬剤耐性菌、植物病原細菌等の幅広い病原性細菌に対し、優れた抗菌活性、若しくは、前記細菌の有する酵素に対し、酵素阻害活性を有する新規化合物、及びそれらの製造方法、並びに、前記新規化合物の生産菌である新規微生物、及び前記新規化合物を利用した化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、シグナマイシンＡのＫＢｒ錠剤法で測定した、赤外線スペクトルのチャートである。縦軸：透過率（％）、横軸：波数（ｃｍ−１）。
【図２】図２は、シグナマイシンＡの重クロロホルム中で３０℃にて測定した、６００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【図３】図３は、シグナマイシンＡの重クロロホルム中で３０℃にて測定した、１５０ＭＨｚにおける炭素１３核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【図４】図４は、シグナマイシンＢのＫＢｒ錠剤法で測定した、赤外線スペクトルのチャートである。縦軸：透過率（％）、横軸：波数（ｃｍ−１）。
【図５】図５は、シグナマイシンＢの重クロロホルム中で３０℃にて測定した、６００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【図６】図６は、シグナマイシンＢの重クロロホルム中で３０℃にて測定した、１５０ＭＨｚにおける炭素１３核磁気共鳴スペクトルのチャートである。横軸：ｐｐｍ単位。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（化合物）
−構造式（１）で表される化合物−
本発明の化合物の１つは、下記構造式（１）で表されることを特徴とする。下記構造式（１）で表される化合物は、本発明者らが分離した新規化合物である（以下、「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ」と称することがある）。
【化３】
2010023725.tif 000005
【００１２】
−−物理化学的性状−−
前記構造式（１）で表される化合物の物理化学的性状としては、次の通りである。
（１）  外観  ：  無色粉末
（２）  分子式  ：  Ｃ２２Ｈ３３ＮＯ４
（３）  マススペクトル（ＨＲＥＳＩ）  ：
計算値  ３９８．２３０２  （Ｃ２２Ｈ３３ＮＯ４Ｎａとして）
実験値  ３９８．２２９６  （Ｍ＋Ｎａ）＋
（４）  比旋光度  ：  ［α］Ｄ２０  ＝  ＋６５．７４°（ｃ＝０．４６、ＭｅＯＨ）
（５）  赤外線吸収スペクトル  ：
νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１  ：  ３５００−３２００、２９６３、２８７３、
１６８９、１６５５、１６０３、１４５８、
１３７７、１３４０、１２９４、１２３４、
１２０７、１０３４
図１にシグナマイシンＡのＫＢｒ錠剤法で測定した赤外線スペクトルのチャートを示す。
（６）紫外線吸収スペクトル  ：
シグナマイシンＡのメタノール中での紫外線吸収のピークは、以下の通りである。
λｍａｘ  ｎｍ（ε）
０．００５Ｍ  ＨＣｌ    ：  ２２１（ｓｈ）、２８５（１２，３００）
０．００５Ｍ  ＮａＯＨ  ：  ２４３（９，５００）、２８５（１３，０００）
（７）プロトン核磁気共鳴スペクトル  ：
図２に、シグナマイシンＡの重クロロホルム中で３０℃にて測定した、６００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを示す。
（８）炭素１３核磁気共鳴スペクトル  ：
図３に、シグナマイシンＡの重クロロホルム中で３０℃にて測定した、１５０ＭＨｚにおける炭素１３核磁気共鳴スペクトルのチャートを示す。【００１３】
化合物が、前記構造式（１）で表される構造を有するか否かは、適宜選択した各種の分析方法により確認することができ、例えば、前記マススペクトル、前記赤外線吸収スペクトル、前記紫外線吸収スペクトル、前記プロトン核磁気共鳴スペクトル、前記炭素１３核磁気共鳴スペクトル、等の分析を行うことにより、確認することができる。【００１４】
なお、前記シグナマイシンＡは互変異性を有しており、したがって、前記シグナマイシンＡには、その互変異性体も含まれる。前記シグナマイシンＡの互変異性体の構造式としては、例えば、下記に示す４種の構造式などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記シグナマイシンＡは、このような数種類の構造パターンを取り得、ある一定の状態では固定されていない状態で存在しているものと考えられる。
【化４】
2010023725.tif 000006
【００１５】
そのため、前記シグナマイシンＡは、例えば、前記プロトン核磁気共鳴スペクトル、前記炭素１３核磁気共鳴スペクトルなどの分析を行った際に、図２、図３とは多少異なるチャートを示す場合がある。ただし、前記構造式（１）で表されるような構造を有する化合物が、実際には数種類の構造パターンを取り得、ある一定の状態で固定されていないことは、当業者であれば容易に把握ができる事項である。そのため、例えば、前記プロトン核磁気共鳴スペクトル、前記炭素１３核磁気共鳴スペクトルなどにおけるチャートが多少異なる状態を示した場合であっても、当業者であれば、前記シグナマイシンＡを容易に同定することが可能である。【００１６】
−構造式（２）で表される化合物−
また、本発明の化合物の１つは、下記構造式（２）で表されることを特徴とする。下記構造式（２）で表される化合物は、本発明者らが分離した新規化合物である（以下、「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂ」と称することがある）。
【化５】
2010023725.tif 000007
【００１７】
−−物理化学的性状−−
前記構造式（２）で表される化合物の物理化学的性状としては、次の通りである。
（１）  外観  ：  無色粉末
（２）  分子式  ：  Ｃ２３Ｈ３５ＮＯ４
（３）  マススペクトル（ＨＲＥＳＩ）  ：
計算値  ４１２．２４５８  （Ｃ２３Ｈ３５ＮＯ４Ｎａとして）
実験値  ４１２．２４５６  （Ｍ＋Ｎａ）＋
（４）  比旋光度  ：  ［α］Ｄ２０  ＝  ＋６６．４０°（ｃ＝０．４２、ＭｅＯＨ）
（５）  赤外線吸収スペクトル  ：
νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１  ：  ３５００−３２００、２９５６、２８７１、
１６９７、１６５５、１６０３、１４５８、
１３７７、１３３８、１２９２、１２３２、
１２０９、１０３４
図４にシグナマイシンＢのＫＢｒ錠剤法で測定した赤外線スペクトルのチャートを示す。
（６）紫外線吸収スペクトル  ：
シグナマイシンＢのメタノール中での紫外線吸収のピークは、以下の通りである。
λｍａｘ  ｎｍ（ε）
０．００５Ｍ  ＨＣｌ    ：  ２２２（ｓｈ）、２８５（１１，７００）
０．００５Ｍ  ＮａＯＨ  ：  ２４３（９，５００）、２８４（１３，０００）
（７）プロトン核磁気共鳴スペクトル  ：
図５に、シグナマイシンＢの重クロロホルム中で３０℃にて測定した、６００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを示す。
（８）炭素１３核磁気共鳴スペクトル  ：
図６に、シグナマイシンＢの重クロロホルム中で３０℃にて測定した、１５０ＭＨｚにおける炭素１３核磁気共鳴スペクトルのチャートを示す。【００１８】
化合物が、前記構造式（２）で表される構造を有するか否かは、適宜選択した各種の分析方法により確認することができ、例えば、前記マススペクトル、前記赤外線吸収スペクトル、前記紫外線吸収スペクトル、前記プロトン核磁気共鳴スペクトル、前記炭素１３核磁気共鳴スペクトル、等の分析を行うことにより、確認することができる。【００１９】
なお、前記シグナマイシンＢは互変異性を有しており、したがって、前記シグナマイシンＢには、その互変異性体も含まれる。前記シグナマイシンＢの互変異性体の構造式としては、例えば、下記に示す４種の構造式などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記シグナマイシンＢは、このような数種類の構造パターンを取り得、ある一定の状態では固定されていない状態で存在しているものと考えられる。
【化６】
2010023725.tif 000008
【００２０】
そのため、前記シグナマイシンＢは、例えば、前記プロトン核磁気共鳴スペクトル、前記炭素１３核磁気共鳴スペクトルなどの分析を行った際に、図５、図６とは多少異なるチャートを示す場合がある。ただし、前記構造式（２）で表されるような構造を有する化合物が、実際には数種類の構造パターンを取り得、ある一定の状態で固定されていないことは、当業者であれば容易に把握ができる事項である。そのため、例えば、前記プロトン核磁気共鳴スペクトル、前記炭素１３核磁気共鳴スペクトルなどにおけるチャートが多少異なる状態を示した場合であっても、当業者であれば、前記シグナマイシンＢを容易に同定することが可能である。【００２１】
前記シグナマイシンＡ、前記シグナマイシンＢは、シグナマイシンＡ、又はシグナマイシンＢを生産する微生物から得られたものであってもよいし、化学合成により得られたものであってもよい。中でも、前記シグナマイシンＡ、前記シグナマイシンＢは、後述する本発明の、化合物の製造方法により、得られることが好ましい。【００２２】
前記シグナマイシンＡ、前記シグナマイシンＢは、後述する試験例１〜２に示されるように、グラム陽性細菌に対して優れた抗菌活性を有し、また、グラム陽性細菌、及び、グラム陰性細菌が有する酵素に対して優れた酵素阻害活性を有する。そのため、前記シグナマイシンＡ、前記シグナマイシンＢは、例えば、後述する本発明の化合物含有組成物、抗菌剤、酵素活性阻害剤の有効成分として、好適に利用可能である。【００２３】
（化合物の製造方法）
本発明の化合物、即ち「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ」、「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂ」の製造方法は、培養工程と、採取工程とを少なくとも含み、必要に応じてさらにその他の工程を含む。【００２４】
−培養工程−
前記培養工程は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ」、及び「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂ」の少なくともいずれかを生産する能力を有する微生物を培養する工程である。【００２５】
前記微生物としては、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ」、及び「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂ」の少なくともいずれかを生産する能力を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、本発明者らの分離したストレプトマイセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＭＫ８５１−ｍＦ８株（ＮＩＴＥ  Ｐ−６１２、詳細は後述する本発明の微生物の項目に記す）が挙げられる。また、「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ」、及び「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂ」の少なくともいずれかを生産できるその他の菌株についても、常法によって、自然界より分離することが可能である。なお、前記ストレプトマイセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＭＫ８５１−ｍＦ８株を含め、「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ」、及び「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂ」の少なくともいずれかを生産する生産菌を、放射線照射やその他の変異処理に供することにより、「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ」、及び「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂ」の少なくともいずれかの生産能を高めることも可能である。さらに、遺伝子工学的手法による「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ」、及び「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂ」の少なくともいずれかの生産も可能である。【００２６】
前記培養は、「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ」、及び「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂ」の少なくともいずれかを生産する生産菌（以下、単に「シグナマイシン類生産菌」と称することがある）を栄養培地中に接種し、「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ」、及び「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂ」の少なくともいずれかの生産に良好な温度で培養することによって行われる。
前記栄養培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、従来放線菌の培養に利用されている公知のものを使用することができる。
前記栄養培地に添加する栄養源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、窒素源として、市販されている大豆粉、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウムなどが使用でき、炭素源として、トマトペースト、グリセリン、でん粉、グルコース、ガラクトース、デキストリンなどの炭水化物、脂肪などが使用できる。さらに、食塩、炭酸カルシウムなどの無機塩を培地に添加して使用することもでき、その他、必要に応じて微量の金属塩を培地に添加して使用することもできる。
これらの材料は、シグナマイシン類生産菌が利用し、「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ」、及び「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂ」の少なくともいずれかの生産に役立つものであればよく、公知の培養材料はすべて用いることができる。【００２７】
「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ」、及び「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂ」の少なくともいずれかの生産のための種母培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、寒天培地上、シグナマイシン類生産菌の斜面培養から得た生育物を使用することができる。【００２８】
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、好気的条件の培養方法が好ましい。
前記培養の温度としては、シグナマイシン類生産菌の発育が実質的に阻害されずに、「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ」、及び「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂ」の少なくともいずれかを生産しうる範囲であれば、特に制限はなく、使用する生産菌に応じて適宜選択することができるが、２５℃〜３５℃が好ましい。
前記培養の期間としては、特に制限はなく、「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ」、及び「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂ」の少なくともいずれかの蓄積に合わせて適宜選択することができる。通常、培養３日間〜１０日間で「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ」、及び「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂ」の少なくともいずれかの蓄積が最高となる。【００２９】
−採取工程−
前記採取工程は、前記培養工程で得られた培養物から「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ」、及び「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂ」の少なくともいずれかを採取する工程である。
前記「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ」、及び「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂ」は、上述した物理化学的性状を有するので、その性状に従って培養物から採取することができる。【００３０】
前記採取の方法としては、特に制限はなく、微生物の生産する代謝物を採取するのに用いられる方法を適宜選択することができる。例えば、水と混ざらない溶媒により抽出する方法、各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用する方法、ゲルろ過、向流分配を利用したクロマトグラフィーなどを単独、又は組み合わせる方法、などが挙げられる。
また、分離した菌体からは、適当な有機溶媒を用いた抽出方法や、菌体破砕による溶出方法などにより、前記「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ」や、「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ)Ｂ」を菌体から抽出し、上記と同様に単離精製して採取することができる。【００３１】
以上のようにして前記製造方法を行うことができ、これにより、「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ」、「シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂ」を得ることができる。【００３２】
（微生物）
本発明の微生物は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、上述した本発明の化合物、即ちシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ、及びシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂの少なくともいずれかを生産する能力を有することを特徴とする。前記微生物は、シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ、及びシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂの少なくともいずれかを生産する能力を有し、そのために、上述した本発明の化合物の製造方法において、シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ、及びシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂの少なくともいずれかの生産菌として使用され得る微生物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。【００３３】
このような微生物の中でも、特に、平成９年９月、財団法人  微生物化学研究会  微生物化学研究センターにおいて、東京都目黒区の土壌より分離された放線菌で、ＭＫ８５１−ｍＦ８株の菌株番号が付された微生物を使用することが好ましい。前記ＭＫ８５１−ｍＦ８株の菌学的性状は、以下の通りである。【００３４】
１．形態
ＭＫ８５１−ｍＦ８株は、分枝した基生菌糸より、比較的長い気菌糸を伸長し、その先端は８回転〜１０回転のらせんを形成する。成熟した胞子鎖は１０個〜５０個の卵円形〜円筒形の胞子を連鎖する。胞子の大きさは約０.５μｍ〜０.６μｍ×０.９μｍ〜１.１μｍで、胞子の表面はとげ状である。輪生枝、菌糸束、胞子のう、及び運動性胞子は認められない。【００３５】
２．各種培地における生育状態
色の記載について［  ］内に示す標準は、コンティナー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモニー・マニュアル（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａのｃｏｌｏｒ  ｈａｒｍｏｎｙ  ｍａｎｕａｌ）を用いた。
（１）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、２７℃培養）
赤茶［７  ｐｉ，  Ｄｋ  Ｗｉｎｅ］の発育上に、明るい茶灰［４  ｇｅ，  Ｌｔ  Ｆａｗｎ］の気菌糸を着生し、赤茶の可溶性色素を産生する。発育の色、及び可溶性色素は、０．１モル塩酸の添加でにぶ赤紫に変化するが、０．１モル水酸化ナトリウムの添加による変化は認められない。
（２）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−培地３、２７℃培養）
灰味黄茶［３  ｎｉ，  Ｃｌｏｖｅ  Ｂｒｏｗｎ］の発育上に、灰白［ｂ，  Ｏｙｓｔｅｒ  Ｗｈｉｔｅ］の気菌糸をうっすらと着生する。可溶性色素は、かすかに灰味赤を呈する。
（３）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、２７℃培養）
にぶ黄［２  ｎｅ，  Ｍｕｓｔａｒｄ  Ｇｏｌｄ］の発育上に、黄味灰［２  ｃａ，  Ｌｔ  Ｉｖｏｒｙ］〜明るい灰［ｄ］の気菌糸を着生する。可溶性色素は、かすかにうす黄だいだいを呈する。０．１モル塩酸、及び０．１モル水酸化ナトリウムの添加による発育の色、及び可溶性色素の変化は認められない。
（４）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培地５、２７℃培養）
にぶ黄［２  ｎｅ，  Ｍｕｓｔａｒｄ  Ｇｏｌｄ〜３  ｎｅ，  Ｔｏｐａｚ］の発育上に、黄味白の気菌糸をうっすらと着生し、可溶性色素はうす赤を帯びる。
（５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地７、２７℃培養）
黄茶［３  ｎｇ，  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｍａｐｌｅ〜３  ｐｉ，  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｂｒｏｗｎ］の発育上に、白の気菌糸をわずかに着生し、可溶性色素は茶色味を帯びる。
（６）シュクロース・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）
うす黄［２  ｇｃ，  Ｂａｍｂｏｏ］の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、可溶性色素は認められない。【００３６】
３．生理的性質
（１）生育温度範囲
イースト・スターチ寒天培地（溶性デンプン  １.０％、イーストエキス  ０.２％、ひも寒天  ２.６％、ｐＨ７.０）を用い、１０℃、２０℃、２４℃、２７℃、３０℃、３７℃、及び５０℃の各温度で試験した結果、１０℃、５０℃での生育は認められず、２０℃〜３７℃の範囲で生育した。生育至適温度は、３０℃付近である。
（２）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地、ＩＳＰ−培地４、２７℃培養）
培養後５日目にはスターチの加水分解が認められ、その作用は中等度である。
（３）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・プロス、ＩＳＰ−培地１；ペプトン・イースト・鉄寒天培地、ＩＳＰ−培地６；チロシン寒天培地、ＩＳＰ−培地７；いずれも２７℃培養）
ペプトン・イースト・鉄寒天培地、及びチロシン寒天培地では陽性である。トリプトン・イースト・プロスでは判然としない。
（４）炭素源の利用性（プリドハム・ゴドリーブ寒天培地、ＩＳＰ−培地９；２７℃培養）
Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−フルクトース、スクロース、イノシトール、ラムノース、ラフィノース、及びＤ−マンニトールを利用して発育し、Ｄ−キシロースもおそらく利用する。【００３７】
４．菌体成分
細胞壁中の２，６−ジアミノピメリン酸はＬＬ−型である。【００３８】
５．１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子解析
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列（１４８１ｂｐ）を決定し、ＤＮＡデータベースに登録された公知菌株のデータと比較した。その結果、ＭＫ８５１−ｍＦ８株の塩基配列は以下に示すように、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属放線菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と高い相同性を示した。即ち、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｎｕｓ（９９％）、Ｓ． ｃｉｓｃａｕｃａｓｉｃｕｓ（９９％）、Ｓ． ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ（９９％）、Ｓ． ｐｓｅｕｄｏｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ（９９％）、Ｓ． ｐｕｒｐｕｒｅｏｆｕｓｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ａｃｏａｇｕｌａｎｓ（９９％）、Ｓ． ｒｅｓｉｓｔｏｍｙｃｉｆｉｃｕｓ（９９％）、Ｓ． ｒｏｓｅｏｇｒｉｓｅｕｓ（９９％）、Ｓ． ｐａｎａｙｅｎｓｉｓ（９９％）等である。なお、括弧内は塩基配列の相同値を表記した。【００３９】
以上の性状を要約すると、ＭＫ８５１−ｍＦ８株は、その形態上、よく分枝した基生菌糸より、比較的長い気菌糸を伸長する。その先端はらせんを形成し、卵円形〜円筒形の胞子を連鎖する。種々の培地で、にぶ黄〜赤茶の発育上に黄味白〜明るい灰〜明るい茶灰の気菌糸を着生する。赤色系の可溶性色素を産生する。生育至適温度は３０℃付近である。メラニン様色素の生成は陽性、スターチの水解性は中等度である。
ＭＫ８５１−ｍＦ８株の細胞壁中の２，６−ジアミノピメリン酸はＬＬ−型である。
ＭＫ８５１−ｍＦ８株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列を解析し、公知菌株のデータと比較したところ、ストレプトマイセス属放線菌と高い相同性を示した。【００４０】
以上の結果より、前記ＭＫ８５１−ｍＦ８株はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属するものと考えられた。そこで、前記ＭＫ８５１−ｍＦ８株をストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＭＫ８５１−ｍＦ８株とした。
なお、前記ＭＫ８５１−ｍＦ８株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託申請し、平成２０年７月２３日、ＮＩＴＥ  Ｐ−６１２として受託された。【００４１】
なお、他の菌にも見られるように、前記ＭＫ８５１−ｍＦ８株は、性状が変化し易いが、例えば、前記ＭＫ８５１−ｍＦ８株に由来する突然変異株（自然発生、又は誘発性）、形質接合体、遺伝子組換体などであっても、シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ、及びシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂの少なくともいずれかを生産する能力を有するものは、本発明の微生物に含まれる。【００４２】
（化合物含有組成物、抗菌剤、酵素活性阻害剤）
−化合物含有組成物−
本発明の化合物含有組成物は、上述した本発明の化合物、即ちシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ、及びシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂの少なくともいずれかを含み、必要に応じて適宜その他の成分を含む。【００４３】
前記化合物含有組成物中のシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ、及びシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記化合物含有組成物は、シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ、又はシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂそのものであってもよい。【００４４】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。前記化合物含有組成物中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ、又はシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂの効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記化合物含有組成物は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用されてもよい。また、前記化合物含有組成物は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。【００４５】
前記化合物含有組成物は、シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ、及びシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂの少なくともいずれかを含むことから、抗菌作用、及び、酵素活性阻害作用の少なくともいずれかを有するものである。【００４６】
−抗菌剤−
本発明の抗菌剤は、上述した本発明の化合物、即ちシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ、及びシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂの少なくともいずれかを含み、必要に応じて適宜その他の成分を含む。【００４７】
前記抗菌剤中のシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ、及びシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記抗菌剤は、シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ、又はシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂそのものであってもよい。【００４８】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。前記抗菌剤中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ、又はシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂの効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記抗菌剤は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用されてもよい。また、前記抗菌剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。【００４９】
前記抗菌剤は、シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ、及びシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂの少なくともいずれかを含むことから、後述する試験例１に示されるように薬剤耐性菌を含む幅広いグラム陽性細菌に対して優れた抗菌活性を有するものである。
したがって、前記抗菌剤は、薬剤耐性菌などに起因する感染症の予防、又は治療に好適に利用可能である。また、前記抗菌剤は、農園芸用殺菌剤としても好適に利用可能である。【００５０】
−酵素活性阻害剤−
本発明の酵素活性阻害剤は、上述した本発明の化合物、即ちシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ、及びシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂの少なくともいずれかを含み、必要に応じて適宜その他の成分を含む。
前記酵素活性阻害剤は、ヒスチジンキナーゼ活性を好適に阻害することができる。【００５１】
前記酵素活性阻害剤中のシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ、及びシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記酵素活性阻害剤は、シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ、又はシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂそのものであってもよい。【００５２】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。前記酵素活性阻害剤中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ、又はシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂの効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記酵素活性阻害剤は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用されてもよい。また、前記酵素活性阻害剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。【００５３】
前記酵素活性阻害剤は、シグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ａ、及びシグナマイシン（ｓｉｇｎａｍｙｃｉｎ）Ｂの少なくともいずれかを含むことから、後述する試験例２に示されるように薬剤耐性菌、植物病原性細菌、などを含む幅広いグラム陽性細菌、及びグラム陰性細菌が有する酵素に対して優れた酵素阻害活性を有するものである。
したがって、前記酵素活性阻害剤は、薬剤耐性菌などを含む幅広いグラム陽性細菌、及びグラム陰性細菌の病原性を抑制することができ、前記細菌に起因する感染症の予防、又は治療に好適に利用可能である。また、農園芸用殺菌剤の有効成分としても好適に利用可能である。【００５４】
−剤型−
前記化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粉末状、カプセル状、錠剤状、液状等の剤型とすることができる。これらの剤型の前記化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤は、常法に従い製造することができる。【００５５】
また、前記農園芸用殺菌剤として用いる場合の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、通常、固体担体、液体担体、界面活性剤、その他の製剤の補助剤との混合として慣用の処方により乳剤、水和剤、液剤、フロアブル（ゾル）剤、粉剤、粒剤、微粒剤、錠剤などの適宜の形態として調整できる。
また、乳剤、水和剤、液剤、フロアブル（ゾル）剤、粉剤、粒剤、微粒剤、錠剤などの目的で各種の界面活性剤（または、乳化剤）が使用される。このような界面活性剤としては、非イオン型（ポリアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルなど）、陰イオン型（アルキルオコシエチレンアルキルサルフェート、アリールスルホネートなど）、陽イオン型（アルキルアミン類、ポリオキシアルキルアミン類など）、両性型（硫酸エステル塩など）が挙げられるが、もちろんこれらの例示のみに限定されるものではない。また、これらの他にポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、ポリビニルアセテート、アルギン酸ソーダ、ゼラチン、トラガカントガムなどの各種補助剤を使用することができる。【００５６】
−投与−
前記化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤の剤型などに応じて適宜選択することができ、経口又は非経口で投与することができる。
前記化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤の投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記化合物含有組成物、抗菌剤、及び酵素活性阻害剤の投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられる。
また、前記農園芸用殺菌剤として用いる場合の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【実施例】
【００５７】
以下に実施例及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例及び試験例に何ら限定されるものではない。また、以下の実施例及び試験例中、「％」は、特に明記のない限り「質量％」を表す。【００５８】
（実施例１：シグナマイシンＡ、及びシグナマイシンＢの製造）
−培養工程−
寒天斜面培地に培養したストレプトマイセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＭＫ８５１−ｍＦ８株（ＮＩＴＥ  Ｐ−６１２として寄託）を、ガラクトース  ２％、デキストリン  ２％、グリセリン  １％、バクトソイトン（ディフコ社製）  １％、コーン・スティープ・リカー  ０．５％、硫酸アンモニウム  ０．２％、炭酸カルシウム  ０．２％を含む液体培地（ｐＨ７．０に調整）を三角フラスコ（５００ｍＬ容）に１１０ｍＬずつ分注して、常法により１２０℃で２０分滅菌した培地に接種した。その後に３０℃で４日間回転振とう培養し、種母培養液を得た。【００５９】
グリセリン  ０．５％、デキストリン  ０．５％、バクトソイトン（ディフコ社製）  ０．２５％、酵母エキス（日本製薬製）  ０．０７５％、硫酸アンモニウム  ０．０５％、炭酸カルシウム  ０．０５％を含む液体培地（ｐＨ７．０に調整）を三角フラスコ（５００ｍＬ容）に１１０ｍＬずつ分注して、常法により１２０℃で２０分滅菌し、生産培地とした。この生産培地に、上記の種母培養液の２体積％量を接種し、２７℃、６日間回転振とう培養した（１８０ｒｐｍ）。【００６０】
−採取工程−
このようにして得られた培養液３リットルを遠心分離して、培養ろ液と菌体に分離した。続いて、菌体に１リットルのメタノールを加えてよく撹拌し、菌体からシグナマイシンＡと、シグナマイシンＢとをメタノールで抽出し、シグナマイシンＡ、及びシグナマイシンＢを含む菌体抽出液１．３７リットルを得た。菌体抽出液１.３７リットルに等量の水を加え、十分撹拌した後、ダイヤイオンＣＨＰ２０Ｐ（内径６０ｍｍ×２２０ｍｍ、三菱化学社製）カラムに吸着させ、１．８リットルの５０％メタノール水で洗浄した後、１．８リットルの８０％メタノール水でシグナマイシンＡ、及びシグナマイシンＢを含む活性画分を溶出した。得られた８０％メタノール水１.８リットルは、減圧下で濃縮乾固して、シグナマイシンＡ、及びシグナマイシンＢを含む粗精製物０.８４２ｇを得た。【００６１】
前記シグナマイシンＡ、及びシグナマイシンＢを含む粗精製物０.８４２ｇをメタノールで溶解して、セファデックスＬＨ−２０（内径２６ｍｍ×４８０ｍｍ、ファルマシア  バイオテク社製）カラムにのせ、クロマトグラフィーを行った。１フラクションを５ｇずつ分画すると、活性画分はフラクション２３から３６に溶出され、これを集めて減圧下で濃縮乾固し、６６０ｍｇのシグナマイシンＡ、及びシグナマイシンＢを含む粗精製物を得た。
前記粗精製物６６０ｍgを少量のメタノールに溶解し、Ｃ１８逆層カラムクロマトグラフィー（Ｃａｐｃｅｌｌ  ｐａｋ  ＵＧ１２０、内径３０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、資生堂製）でシグナマイシンＡと、シグナマイシンＢとを分離した。即ち、展開溶媒としてアセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸＝６０：４０：０.００１を用い、流速１５ｍＬ／分でクロマトグラフィーを行うと、シグナマイシンＡは３３分〜３４分に、シグナマイシンＢは４２分〜４８分に溶出し、これらを集めて減圧下で濃縮乾固し、純粋なシグナマイシンＡを２２.５ｍｇと、シグナマイシンＢを２０６.４ｍｇとを得た。【００６２】
得られたシグナマイシンＡの物理化学的性状を測定したところ、以下の通りであり、これらのことから、シグナマイシンＡが、下記構造式（１）で表される構造を有する新規化合物であることが確認された。
（１）  外観  ：  無色粉末
（２）  分子式  ：  Ｃ２２Ｈ３３ＮＯ４
（３）  マススペクトル（ＨＲＥＳＩ）  ：
計算値  ３９８．２３０２  （Ｃ２２Ｈ３３ＮＯ４Ｎａとして）
実験値  ３９８．２２９６  （Ｍ＋Ｎａ）＋
（４）  比旋光度  ：  ［α］Ｄ２０  ＝  ＋６５．７４°（ｃ＝０．４６、ＭｅＯＨ）
（５）  赤外線吸収スペクトル  ：
νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１  ：  ３５００−３２００、２９６３、２８７３、
１６８９、１６５５、１６０３、１４５８、
１３７７、１３４０、１２９４、１２３４、
１２０７、１０３４
図１にシグナマイシンＡのＫＢｒ錠剤法で測定した赤外線スペクトルのチャートを示す。
（６）紫外線吸収スペクトル  ：
シグナマイシンＡのメタノール中での紫外線吸収のピークは、以下の通りである。
λｍａｘ  ｎｍ（ε）
０．００５Ｍ  ＨＣｌ    ：  ２２１（ｓｈ）、２８５（１２，３００）
０．００５Ｍ  ＮａＯＨ  ：  ２４３（９，５００）、２８５（１３，０００）
（７）プロトン核磁気共鳴スペクトル  ：
図２に、シグナマイシンＡの重クロロホルム中で３０℃にて測定した、６００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを示す。
（８）炭素１３核磁気共鳴スペクトル  ：
図３に、シグナマイシンＡの重クロロホルム中で３０℃にて測定した、１５０ＭＨｚにおける炭素１３核磁気共鳴スペクトルのチャートを示す。
【化７】
2010023725.tif 000009
【００６３】
また、得られたシグナマイシンＢの物理化学的性状を測定したところ、以下の通りであり、これらのことから、シグナマイシンＢが、下記構造式（２）で表される構造を有する新規化合物であることが確認された。
（１）  外観  ：  無色粉末
（２）  分子式  ：  Ｃ２３Ｈ３５ＮＯ４
（３）  マススペクトル（ＨＲＥＳＩ）  ：
計算値  ４１２．２４５８  （Ｃ２３Ｈ３５ＮＯ４Ｎａとして）
実験値  ４１２．２４５６  （Ｍ＋Ｎａ）＋
（４）  比旋光度  ：  ［α］Ｄ２０  ＝  ＋６６．４０°（ｃ＝０．４２、ＭｅＯＨ）
（５）  赤外線吸収スペクトル  ：
νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１  ：  ３５００−３２００、２９５６、２８７１、
１６９７、１６５５、１６０３、１４５８、
１３７７、１３３８、１２９２、１２３２、
１２０９、１０３４
図４にシグナマイシンＢのＫＢｒ錠剤法で測定した赤外線スペクトルのチャートを示す。
（６）紫外線吸収スペクトル  ：
シグナマイシンＢのメタノール中での紫外線吸収のピークは、以下の通りである。
λｍａｘ  ｎｍ（ε）
０．００５Ｍ  ＨＣｌ    ：  ２２２（ｓｈ）、２８５（１１，７００）
０．００５Ｍ  ＮａＯＨ  ：  ２４３（９，５００）、２８４（１３，０００）
（７）プロトン核磁気共鳴スペクトル  ：
図５に、シグナマイシンＢの重クロロホルム中で３０℃にて測定した、６００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのチャートを示す。
（８）炭素１３核磁気共鳴スペクトル  ：
図６に、シグナマイシンＢの重クロロホルム中で３０℃にて測定した、１５０ＭＨｚにおける炭素１３核磁気共鳴スペクトルのチャートを示す。
【化８】
2010023725.tif 000010
【００６４】
また、得られたシグナマイシンＡ、及びシグナマイシンＢの抗菌活性、及び酵素阻害活性を、以下の試験例１〜２で確認した。【００６５】
（試験例１：抗菌活性）
薬剤耐性菌（メチシリン耐性菌、バンコマイシン耐性菌等）を含む各種の微生物に対するシグナマイシンＡ、及びシグナマイシンＢの抗菌スペクトルを、日本化学療法学会標準法に基づき、ミュラ・ヒントン寒天培地上で倍数希釈法により測定した。最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定結果を表１に示す。【００６６】
【表１】
2010023725.tif 000011
【００６７】
表１の結果から、シグナマイシンＡ、及びシグナマイシンＢは、ＭＤＲ（多剤耐性黄色ブドウ球菌）であるＳ． ａｕｒｅｕｓ  ＭＳ９６１０、ＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）であるＳ． ａｕｒｅｕｓ  ＭＲＳＡ  Ｎｏ．５、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ  ＭＲＳＡ  Ｎｏ．１７、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ  ＭＳ１６５２６、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ  ＴＹ−０４２８２、ＶＲＥ（バンコマイシン耐性腸球菌）であるＥ． ｆａｅｃａｌｉｓ  ＮＣＴＣ  １２２０１、Ｅ． ｆａｅｃａｌｉｓ  ＮＣＴＣ  １２２０３、Ｅ． ｆａｅｃｉｕｍ  ＮＣＴＣ  １２２０２、Ｅ． ｆａｅｃｉｕｍ  ＮＴＣＴＣ  １２２０４、などのグラム陽性細菌に対して抗菌活性を有していることがわかった。
中でも、シグナマイシンＡは、黄色ブドウ球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）に対して抗菌活性が高く、シグナマイシンＢは、黄色ブドウ球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）と、腸球菌（Ｅ． ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ． ｆａｅｃｉｕｍ）に対して抗菌活性が高かった。【００６８】
（試験例２：酵素阻害活性）
−（１）ＶｉｃＫヒスチジンキナーゼ活性阻害試験−
う蝕菌(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ)のＶｉｃＫに対する、シグナマイシンＡ、及びシグナマイシンＢの酵素阻害活性を調べた。
ヒスチジンキナーゼ活性の測定は、Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６４，  ９１９−９２３，  ２０００に報告された方法を改変して行った。
ＶｉｃＫのキナーゼ活性ドメインのみを含む領域（Ｎ−末端から３１番目のアミノ酸から４５０番目のアミノ酸を含む）をＰＣＲ法により、う蝕菌の染色体ＤＮＡから調製し、発現ベクターｐＥＴ２１ａ（＋）にクローニングした。このようにして得られたプラスミドｐＥＴ−ＳＭｖｉｃＫ３１−４５０を大腸菌に形質転換した株の培養液から、ＶｉｃＫのヒスチジンキナーゼ活性ドメインのみを発現させたタンパク質(ＶｉｃＫ−３１−４５０)を精製した。
ヒスチジンキナーゼ活性測定のための反応溶液の組成は、０．５Ｍ  ＶｉｃＫ−３１−４５０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２であり、この反応液  ７μＬにシグナマイシンＡ、又はシグナマイシンＢを  １μＬ加え、２５℃で５分間インキュベートした。その後、［３２Ｐ］ＡＴＰを含む１２．５Ｍ  ＡＴＰを２μＬ加え（終濃度２．５Ｍ）反応を開始し、２５℃で２０分間インキュベート後、反応を終了させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うことによって、う蝕菌のＶｉｃＫに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。結果を表２に示す。【００６９】
−（２）ＹｙｃＧヒスチジンキナーゼ活性阻害試験−
枯草菌１６８株（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８）のＹｙｃＧに対する、シグナマイシンＡ、及びシグナマイシンＢの酵素阻害活性を調べた。
ヒスチジンキナーゼ活性の測定は、Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６４，  ９１９−９２３，  ２０００に報告された方法にしたがって行った。
ＹｙｃＧのキナーゼ活性ドメインのみを含む領域（Ｎ−末端から２０４番目のアミノ酸から６１１番目のアミノ酸を含む）をＰＣＲ法により枯草菌１６８株の染色体ＤＮＡから調製し、発現ベクターｐＥＴ−２１ａ（＋）にクローニングした。このようにして得られたプラスミドｐＥＴ−ｙｙｃＧｔｒｕを大腸菌に形質転換した株の培養液から、ＹｙｃＧのヒスチジンキナーゼ活性ドメインのみを発現させたタンパク質（ＹｙｃＧ−２０４−６１１）を精製した。
ヒスチジンキナーゼ活性測定のための反応溶液の組成は、０．５μＭ  ＹｙｃＧ−２０４−６１１、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２であり、この反応溶液に２．５μＭ  ＡＴＰ−１０μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ混合溶液を加えて１０μＬとし、反応を開始し、３０℃で１０分間インキュベート後、反応を終了させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。阻害活性を調べる際は、ＡＴＰ混合溶液を加える前に所定の濃度のシグナマイシンＡ、又はシグナマイシンＢを反応溶液中に加え、３０℃で５分間インキュベートし、枯草菌のＹｙｃＧに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。結果を表２に示す。【００７０】
−（３）ＰｅｈＳヒスチジンキナーゼ活性阻害試験−
軟腐病菌ＭＡＦＦ３０１３９３株（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ＭＡＦＦ３０１３９３）のＰｅｈＳに対する、シグナマイシンＡ、及びシグナマイシンＢの酵素阻害活性を調べた。
ヒスチジンキナーゼ活性の測定は、Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６４，  ９１９−９２３，  ２０００に報告された方法にしたがって行った。
ＰｅｈＳのキナーゼ活性ドメインのみを含む領域（Ｎ−末端から２０９番目のアミノ酸から４８４番目のアミノ酸を含む）をＰＣＲ法により軟腐病菌ＭＡＦＦ３０１３９３株の染色体ＤＮＡから調製し、発現ベクターｐＥＴ−２１ａ（＋）にクローニングした。このようにして得られたプラスミドｐＥＴ−ｐｅｈＳｃＭ２−２を大腸菌に形質転換した株の培養液から、ＰｅｈＳヒスチジンキナーゼ活性ドメインのみを発現させたタンパク質（ＰｅｈＳ−２０９−４８４）を精製した。
ヒスチジンキナーゼ活性測定のための反応溶液の組成は、４μＭ  ＰｅｈＳ−２０９−４８４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２であり、この反応溶液に２．５μＭ  ＡＴＰ−１０μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ混合溶液を加えて１０μＬとし、反応を開始し、３０℃で２０分間インキュベート後、反応を終了させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。阻害活性を調べる際は、ＡＴＰ混合溶液を加える前に所定の濃度のシグナマイシンＡ、又はシグナマイシンＢを反応溶液中に加え、３０℃で５分間インキュベートし、軟腐病菌のＰｅｈＳに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。結果を表２に示す。【００７１】
【表２】
2010023725.tif 000012
【００７２】
表２の結果から、シグナマイシンＡ、及びシグナマイシンＢは、グラム陽性細菌、及びグラム陰性細菌が有するヒスチジンキナーゼに対して、阻害活性を有していることがわかった。中でも、シグナマイシンＡ、及びシグナマイシンＢは、ＰｅｈＳに対して強い阻害活性を有していることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明の新規化合物（シグナマイシンＡ、及びシグナマイシンＢ）は、グラム陽性細菌に対し、優れた抗菌活性を有し、また、グラム陽性細菌、及びグラム陰性細菌が有する酵素に対し、優れた酵素阻害活性を有することから、新たな抗菌剤、酵素活性阻害剤として好適に利用できる。
【図１】
2010023725.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2010023725.tif 000025
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