(57)【要約】  本発明は、ＳＳＥＡ−４をマーカーとして歯や歯周組織由来の幹細胞を同定・単離する方法、ならびに該方法によって得られる分化能の高い幹細胞を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯または歯周組織から細胞を得て、
得られた細胞のなかからＳＳＥＡ−４陽性細胞を検出する
ことを特徴とする、歯または歯周組織由来の幹細胞を同定する方法。
【請求項２】
検出がフローサイトメーターを用いて行われる請求項１記載の方法。
【請求項３】
歯または歯周組織から細胞を得て、
得られた細胞のなかからＳＳＥＡ−４陽性細胞を単離する
ことを特徴とする、歯または歯周組織から幹細胞を得る方法。
【請求項４】
単離がフローサイトメーターまたは磁気ビーズを用いて行われる請求項３記載の方法。
【請求項５】
歯または歯周組織から得られる、単離されたＳＳＥＡ−４陽性幹細胞。
【請求項６】
請求項３または４記載の方法により得られる、単離されたＳＳＥＡ−４陽性幹細胞。
【請求項７】
歯根膜由来である請求項５または６記載の幹細胞。
【請求項８】
外胚葉、中胚葉および内胚葉由来のいずれの組織へも分化できる請求項５〜７のいずれか１項記載の幹細胞。
【請求項９】
請求項５〜７のいずれか１項記載の幹細胞を分化させることを特徴とする、外胚葉由来組織の製造方法。
【請求項１０】
請求項５〜７のいずれか１項記載の幹細胞を分化させることを特徴とする、中胚葉由来組織の製造方法。
【請求項１１】
請求項５〜７のいずれか１項記載の幹細胞を分化させることを特徴とする、内胚葉由来組織の製造方法。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項記載の方法により得られる組織。
【請求項１３】
歯根膜からＳＳＥＡ−４陽性幹細胞を単離し、これを歯あるいは歯周組織に分化させ、分化組織を患部に移植することを特徴とする、欠損した歯あるいは歯周組織の再生方法。
【請求項１４】
欠損した歯あるいは歯周組織の再生に用いられる歯あるいは歯周組織を製造するための、歯根膜由来のＳＳＥＡ−４陽性細胞の使用。
【請求項１５】
欠損した歯あるいは歯周組織の再生に用いられる歯あるいは歯周組織の製造方法であって、歯根膜由来のＳＳＥＡ−４陽性細胞を分化培地にて歯あるいは歯周組織へと分化させることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞の同定および取得方法に関する。詳細には、ＳＳＥＡ−４をマーカーとした歯根膜幹細胞の同定および取得方法、ならびに該方法により得られる幹細胞に関する。さらに本発明は、該幹細胞の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、様々な身体の組織や臓器に分化する能力を有する細胞であり、発生の研究や再生医療において非常に有用である。これらの幹細胞を取得するには、確実でしかも簡便な同定方法が要求される。これまでに幹細胞を同定する方法としては、例えば、骨髄間葉系幹細胞を同定するマーカーの１つとしてＳＴＲＯ−１が報告されている。最近、歯および歯周組織が幹細胞のソースとして注目されている。その理由は、骨髄幹細胞などよりも取得が容易であること、ＥＳ細胞のような倫理的問題が少ないことなどが挙げられる。【０００３】
いままでのところ、ヒトの歯から幹細胞を同定する方法についてはＳＴＲＯ−１抗体を用いる方法のみが報告されている（非特許文献１参照）。しかし、ＳＴＲＯ−１の発現は必ずしも一定ではなく、発現が認められないという報告もある。また、ＳＴＲＯ−１抗原がどのような分子であるかについても未だに解明されていないので、その発現の不安定性についても未だに解明されていない。【０００４】
ＳＳＥＡ−４が、歯および歯周組織由来の幹細胞のマーカーとして用いられた例はなく、歯および歯周組織由来のＳＳＥＡ−４陽性幹細胞の分化能について調べた例もない。
【非特許文献１】Seo BM, et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. Lancet, 2004 Jul 10-16; 364(9429): 149-55.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の解決すべき課題は、歯や歯周組織から幹細胞を正確にしかも簡便に同定し、単離する方法を開発し、歯や歯周組織から幹細胞を効率よく得て、これを再生医療等に応用することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究を行い、ＳＳＥＡ−４をマーカーとして用いて歯または歯周組織由来の細胞から確実かつ効率的に幹細胞を同定し、単離できること、そして、歯または歯周組織由来のＳＳＥＡ−４を発現する幹細胞（ＳＳＥＡ−４陽性幹細胞ともいう）は外胚葉、中胚葉および内胚葉由来のいずれの組織へも分化できる高い分化能を持つことを見出し、本発明を完成させるに至った。【０００７】
すなわち本発明は：
（１）歯または歯周組織から細胞を得て、
得られた細胞のなかからＳＳＥＡ−４陽性細胞を検出する
ことを特徴とする、歯または歯周組織由来の幹細胞を同定する方法；
（２）検出がフローサイトメーターを用いて行われる（１）記載の方法；
（３）歯または歯周組織から細胞を得て、
得られた細胞のなかからＳＳＥＡ−４陽性細胞を単離する
ことを特徴とする、歯または歯周組織から幹細胞を得る方法；
（４）単離がフローサイトメーターまたは磁気ビーズを用いて行われる（１）記載の方法；
（５）歯または歯周組織から得られる、単離されたＳＳＥＡ−４陽性幹細胞；
（６）（３）または（４）記載の方法により得られる単離されたＳＳＥＡ−４陽性幹細胞；
（７）歯根膜由来である（５）または（６）記載の幹細胞；
（８）外胚葉、中胚葉および内胚葉由来のいずれの組織へも分化できる（５）〜（７）のいずれかに記載の幹細胞；
（９）（５）〜（７）のいずれかに記載の幹細胞を分化させることを特徴とする、外胚葉由来組織の製造方法；
（１０）（５）〜（７）のいずれかに記載の幹細胞を分化させることを特徴とする、中胚葉由来組織の製造方法；
（１１）（５）〜（７）のいずれかに記載の幹細胞を分化させることを特徴とする、内胚葉由来組織の製造方法；
（１２）（９）〜（１１）のいずれかに記載の方法により得られる組織；
（１３）歯根膜からＳＳＥＡ−４陽性幹細胞を単離し、これを歯あるいは歯周組織に分化させ、分化組織を患部に移植することを特徴とする、欠損した歯あるいは歯周組織の再生方法；
（１４）欠損した歯あるいは歯周組織の再生に用いられる歯あるいは歯周組織を製造するための、歯根膜由来のＳＳＥＡ−４陽性細胞の使用；ならびに
（１５）欠損した歯あるいは歯周組織の再生に用いられる歯あるいは歯周組織の製造方法であって、歯根膜由来のＳＳＥＡ−４陽性細胞を分化培地にて歯あるいは歯周組織へと分化させることを特徴とする方法
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、歯または歯周組織由来の細胞から確実、簡便かつ効率的に幹細胞を同定し、単離することができる。また、本発明により、高い分化能を持つ有用性の高い幹細胞が得られる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、プラスチック培養皿にて培養した初代ヒト歯根膜細胞の写真である。左上および左下パネルは培養２４時間後、右上および右下パネルは培養７日後の細胞である。スケールバーは４００μｍ（左上および右上パネル）、１００μｍ（左下および右下パネル）。
【図２−Ａ】図２Ａは、フローサイトメトリーを用いて培養ヒト歯根膜細胞における各種抗原の発現を解析した結果を示す図である。Ａ：接着分子。図中、横軸の数値は相対的な蛍光強度を示し、左から０、１０２、１０３、１０４、１０５であり、縦軸の数値は細胞数を示し、下から０、２０、４０、６０、８０、１００である。
【図２−Ｂ】図２Ｂは、フローサイトメトリーを用いて培養ヒト歯根膜細胞における各種抗原の発現を解析した結果を示す図である。Ｂ：サイトカイン受容体。図中、横軸の数値は相対的な蛍光強度を示し、左から０、１０２、１０３、１０４、１０５であり、縦軸の数値は細胞数を示し、下から０、２０、４０、６０、８０、１００である。
【図２−Ｃ】図２Ｃは、フローサイトメトリーを用いて培養ヒト歯根膜細胞における各種抗原の発現を解析した結果を示す図である。Ｃ：血球マーカー。図中、横軸の数値は相対的な蛍光強度を示し、左から０、１０２、１０３、１０４、１０５であり、縦軸の数値は細胞数を示し、下から０、２０、４０、６０、８０、１００である。
【図２−Ｄ】図２Ｄは、フローサイトメトリーを用いて培養ヒト歯根膜細胞における各種抗原の発現を解析した結果を示す図である。Ｄ：その他。図中、横軸の数値は相対的な蛍光強度を示し、左から０、１０２、１０３、１０４、１０５であり、縦軸の数値は細胞数を示し、下から０、２０、４０、６０、８０、１００である。
【図３−Ａ】図３Ａ〜Ｅは、培養ヒト歯根膜細胞における胚性幹細胞関連分子の発現について調べた結果を示す。図３Ａは、蛍光免疫染色によるＥＳ細胞関連分子の発現の解析およびアルカリホスファターゼ活性の検出を示す。上段左から、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１の発現を示す。下段左から、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＲＥＸ１、アルカリホスファターゼ活性の発現を示す。スケールバーは５０μｍ（蛍光像）および１００μｍ（ＡＬＰ）。
【図３−Ｂ】図３Ｂは、フローサイトメトリーを用いて培養ヒト歯根膜細胞におけるＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４の発現を調べた結果を示す。
【図３−Ｃ】図３Ｃは、レチノイン酸を用いて、培養ヒト歯根膜細胞を分化誘導した時の、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４抗原発現の変化を調べた結果を示す。Ｃｏｎｔはレチノイン酸非添加群、ＲＡはレチノイン酸添加群であることを示す。縦軸は陽性細胞のパーセンテージである。
【図３−Ｄ】図３Ｄは、培養ヒト歯根膜細胞におけるＳＳＥＡ−４陽性細胞と陰性細胞のテロメア長の比較を示す図である。縦軸は蛍光ユニット数を示す。
【図３−Ｅ】図３Ｅは、培養ヒト歯根膜細胞におけるＳＳＥＡ−４陽性細胞と陰性細胞の増殖能の比較を示す図である。縦軸は吸光度を示す。
【図４−Ａ】図４Ａ〜Ｉは、本発明のヒト歯根膜由来のＳＳＥＡ−４陽性幹細胞の中胚葉系組織への分化能を検討した結果を示す。図中、対照群（Ｃｏｎｔ）は分化誘導因子非添加の基本培地にて培養したものである。図４Ａ〜Ｄは脂肪細胞への分化を調べた結果を示す。図４Ａは脂肪細胞分化誘導培地にて２１日間培養した後、オイルレッドＯ染色を行った結果を示す。スケールバーは５０μｍである。
【図４−Ｂ】図４ＢはＲＴ−ＰＣＲを用いて脂肪細胞マーカーの発現を調べた結果を示す。図４Ｂ、４Ｃおよび４ＤのＡｄｉｐｏは脂肪細胞分化誘導培地で培養したことを示す。
【図４−Ｃ】図４ＣはオイルレッドＯ染色による脂肪滴形成の定量的解析結果を示す。図４Ｂ、４Ｃおよび４ＤのＡｄｉｐｏは脂肪細胞分化誘導培地で培養したことを示す。
【図４−Ｄ】図４Ｄは細胞培養上清におけるアジポネクチン分泌のＥＬＩＳＡによる解析結果を示す。図４Ｄの縦軸は細胞培養上清中のアジポネクチン濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。図４Ｂ、４Ｃおよび４ＤのＡｄｉｐｏは脂肪細胞分化誘導培地で培養したことを示す。
【図４−Ｅ】図４Ｅ〜Ｇは骨芽細胞への分化を調べた結果を示す。図４Ｅは骨芽細胞分化誘導培地にて２１日間培養した後、アリザリンレッドＳ染色の結果を示す。スケールバーは５０μｍである。
【図４−Ｆ】図４ＦはＲＴ−ＰＣＲを用いて骨芽細胞マーカーの発現を調べた結果を示す。図４Ｆおよび４ＧのＯｓｔｅｏは骨芽細胞分化誘導培地で培養したことを示す。
【図４−Ｇ】図４Ｇは細胞に沈着したＣａの定量的解析結果を示す。図４Ｇの縦軸は単位面積当りのＣａ沈着量（μｇ／ｃｍ２）を示す。図４Ｆおよび４ＧのＯｓｔｅｏは骨芽細胞分化誘導培地で培養したことを示す。
【図４−Ｈ】図４Ｈ〜Ｉは軟骨細胞への分化を調べた結果を示す。図４Ｈは軟骨細胞分化誘導培地にて２１日間培養した後、パラフィン包埋して切片作成後、アルシアンブルー染色した結果を示す。スケールバーは５０μｍである。
【図４−Ｉ】図４ＩはＲＴ−ＰＣＲを用いて軟骨細胞マーカーの発現を調べた結果を示す。図ＩのＤ０は培養０日目、Ｄ２１は培養２１日目を示す。図４Ｃの縦軸は吸光度を示す。
【図５】図５は、本発明のヒト歯根膜由来のＳＳＥＡ−４陽性ヒト歯根膜細胞の外胚葉系組織への分化能を検討した結果を示す。図中、対照群（Ｃｏｎｔ）は分化誘導因子非添加の基本培地にて培養したものである。図５Ａは神経細胞分化誘導培地にて３日間培養した後、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）の蛍光免疫染色を行った結果を示す。スケールバーは５０μｍである。図５ＢはＲＴ−ＰＣＲを用いて神経細胞マーカーの発現を調べた結果を示す。Ｎｅｕｒｏは神経細胞分化誘導培地で培養したことを示す。
【図６−Ａ】図６Ａ〜Ｄは、本発明のヒト歯根膜由来のＳＳＥＡ−４陽性ヒト歯根膜細胞の内胚葉系組織への分化能を検討した結果を示す。図中、対照群（Ｃｏｎｔ）は分化誘導因子非添加の基本培地にて培養したものである。図６Ａは肝細胞分化誘導培地にて２１日間培養した後、アルブミンの蛍光免疫染色を行った結果を示す。
【図６−Ｂ】図６Ｂは過ヨウ素酸−シフ（ＰＡＳ）染色の結果を示す。矢頭は二核細胞の核を示す。スケールバーは５０μｍである。
【図６−Ｃ】図６ＣはＲＴ−ＰＣＲを用いて肝細胞マーカーの発現を調べた結果を示す。Ｈｅｐａｔｏは肝細胞分化誘導培地で培養したことを示す。
【図６−Ｄ】図６Ｄは細胞培養上清におけるアルブミン分泌のＥＬＩＳＡによる解析結果を示す。Ｈｅｐａｔｏは肝細胞分化誘導培地で培養したことを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、第１の態様において、歯または歯周組織から細胞を得て、得られた細胞のなかからＳＳＥＡ−４陽性細胞を検出することを特徴とする、歯または歯周組織由来の幹細胞を同定する方法に関するものである。【００１１】
本発明はもう１つの態様において、歯または歯周組織から細胞を得て、得られた細胞のなかからＳＳＥＡ−４陽性細胞を単離することを特徴とする、歯または歯周組織から幹細胞を得る方法に関するものである。【００１２】
ＳＳＥＡ−４は、従来からヒトの歯の幹細胞の同定に用いられているＳＴＲＯ−１よりも抗原の発現が安定しているので、より正確にかつ効率よく、歯または歯周組織由来の幹細胞を同定あるいは単離することができる。しかしながら、上述のごとく、ＳＳＥＡ−４を歯および歯周組織由来の幹細胞のマーカーとして用いられた例はなく、歯および歯周組織由来のＳＳＥＡ−４陽性幹細胞の分化能について調べた例もない。【００１３】
本発明の上記方法における細胞源は歯または歯周組織であり、例えば、歯根膜・歯髄・セメント質・歯槽骨・歯肉・歯胚などの組織が細胞源となりうる。抜歯等の歯科的処置などにより比較的得やすいことから、細胞源として歯根膜が好ましい。歯から歯根膜を得る方法は公知であり、例えば、洗浄した歯から外科用メスを用いて歯根膜を採取することができる。他の組織の取得手段、方法も公知である。【００１４】
得られた組織を消化して細胞を得ることができる。組織の消化方法も公知であり、例えば、蛋白分解酵素を含む溶液中で消化を行うことができる。【００１５】
次いで、得られた細胞のなかからＳＳＥＡ−４陽性細胞を検出および／または選別および／または同定する。これらのプロセスを行うために、フローサイトメトリーや磁気ビーズ法などの様々な方法が公知であり、本発明に適用することができる。好ましい方法はフローサイトメトリーである。細胞をフローサイトメトリーに供する前に、ＳＳＥＡ−４に特異的な物質にて細胞を標識あるいは染色しておく。細胞の標識あるいは染色に一般的に用いられる方法としては抗体染色法が例示される。好ましくは、細胞のＳＳＥＡ−４に特異的な一次抗体と、検出可能な蛍光標識を付した二次抗体の組合せを用いて細胞を染色し、フローサイトメトリーに供する。染色された細胞の解析も様々な方法、機器により行うことができるが、フローサイトメーターを用いるのが一般的である。フローサイトメーターを用いることは、本発明において目的とするＳＳＥＡ−４陽性細胞を検出および／または選別および／または同定するための好ましい手段・方法である。【００１６】
上記のようにして選別・同定されたＳＳＥＡ−４陽性細胞を、公知の方法を用いて単離することができる。細胞の単離方法としては、フローサイトメトリーや磁気ビーズ法などがあるが、フローサイトメーターを用いれば、より正確に目的のＳＳＥＡ−４陽性細胞を単離することができる。【００１７】
さらなる態様において、本発明は、歯または歯周組織から得られる、ＳＳＥＡ−４陽性幹細胞に関するものである。好ましくは、歯周組織は歯根膜である。好ましくは、本発明により得られるＳＳＥＡ−４陽性細胞は単離されたものである。このような細胞は、上記の本発明の方法を用いてＳＳＥＡ−４をマーカーとして得ることができる。本発明により得られる歯または歯周組織由来の幹細胞は元来増殖能が高いことに加えて、中胚葉のみならず、外胚葉・内胚葉由来のいずれの組織へも分化できる高い多分化能を有することが特色である。【００１８】
したがって、本発明は、さらなる態様において、ＳＳＥＡ−４陽性幹細胞を分化させることを特徴とする外胚葉由来組織および／または中胚葉由来組織および／または内胚葉由来組織の製造方法を提供する。これらの方法に用いる好ましいＳＳＥＡ−４陽性幹細胞は歯または歯周組織から本発明により得られるものである。ＳＳＥＡ−４陽性幹細胞を外胚葉由来組織、中胚葉由来組織または内胚葉由来組織へと分化させるための条件は、当業者に公知である。さらに本発明は、上記製造方法により得られる組織も包含する。【００１９】
本発明のＳＳＥＡ−４陽性細胞が外胚葉由来組織、中胚葉由来組織、内胚葉由来組織のいずれにも分化しうるという特色は、発生学的研究およびその他の研究分野ならびに再生医療の分野において非常に有用である。例えば、歯あるいは歯周組織が欠損した患者において、親知らずの抜歯後に歯根膜からＳＳＥＡ−４陽性幹細胞を単離し、これを歯あるいは歯周組織に分化させることにより、欠損した歯あるいは歯周組織を再生させることもできる。したがって、本発明は、歯根膜からＳＳＥＡ−４陽性幹細胞を単離し、これを歯あるいは歯周組織に分化させ、分化組織を患部に移植することを特徴とする、欠損した歯あるいは歯周組織の再生方法を提供する。また本発明は、欠損した歯あるいは歯周組織の再生に用いられる歯あるいは歯周組織を製造するための、歯根膜由来のＳＳＥＡ−４陽性細胞の使用を提供する。さらに本発明は、欠損した歯あるいは歯周組織の再生に用いられる歯あるいは歯周組織の製造方法であって、歯根膜由来のＳＳＥＡ−４陽性細胞を分化培地にて歯あるいは歯周組織へと分化させることを特徴とする方法を提供する。根膜由来のＳＳＥＡ−４陽性細胞を分化培地にて歯あるいは歯周組織へと分化させるための条件は当業者に公知であり、適宜選択して用いることができる。【００２０】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解釈してはならない。
【実施例１】
【００２１】
実施例１：歯根膜からの幹細胞の同定および単離、ならびに得られた幹細胞における各種因子の発現【００２２】
本研究は、岡山大学大学院医歯薬学総合研究科倫理委員会の承認（承認番号３６５）のもとに行われた。本研究に用いたヒト歯根膜は、矯正治療を目的に便宜抜去された患者の健全歯より採取した。歯根膜の提供を受けるに際して、規定に基づきこの歯根膜の使用目的を十分に説明し、同意を得たうえで本研究を開始した。【００２３】
提供を受けた患者の歯をＣａ２＋、Ｍｇ２＋非含有リン酸緩衝液（phosphate-buffered saline: PBS(-)）で２回洗浄した後、外科用替え刃メスを使用して歯根表面を削がないよう歯根膜を採取した。得られた歯根膜は、５ｍｇ／ｍＬ  コラゲナーゼ  タイプＩＩ（Worthington, Lakewood, NJ, USA）および２．５ｍｇ／ｍＬ  ディスパーゼ  Ｉ（Roche, Penzbeg, Germany）含有低グルコースダルベッコ変法イーグル培地（DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）にて３７℃で６０分間消化した。得られたヒト歯根膜細胞は、１５％非働化済ウシ胎仔血清（heat inactivated fetal bovine serum: HIFBS; HyClone, Logan, UT, USA）および１％  ペニシリン／ストレプトマイシン（最終濃度各々１００Ｕ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬ；Invitrogen）含有低グルコースＤＭＥＭで培養した。培地は週２回、半量を交換した。
上記条件下、プラスチック培養皿にて培養したヒト歯根膜細胞を位相差顕微鏡にて観察した。細胞は紡錘形で単核の繊維芽細胞様の形態を呈しており、形態的には骨髄間葉系幹細胞と同じであった。培養２４時間後には、細胞の対称分裂が認められた（図１左上および左下パネル）。培養７日後には、網目状ネットワークを形成した（図１右上および右下パネル）。【００２４】
フローサイトメトリーを用いて、培養ヒト歯根膜細胞における各種抗原の発現を解析した。フローサイトメトリーの手順は以下のとおりであった。【００２５】
細胞は２％  ＨＩＦＢＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Invitrogen）および１％  ペニシリン／ストレプトマイシン含有ハンクス平衡緩衝塩溶液（HBSS; Invitrogen）に再懸濁した。細胞内抗原の検出の際は、細胞を４％  パラホルムアルデヒド（PFA; Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA）にて５分間固定を行った後、０．１％  ノニデット  Ｐ−４０（Nacalai Tesque, Kyoto, Japan）にて５分間透過化処理を行った。【００２６】
抗体染色の場合、細胞懸濁液に一次抗体を添加し、６０分間氷上にて反応させた。未標識一次抗体を用いる場合は、一次抗体反応後さらに蛍光標識された二次抗体を添加し、３０分間氷上にて反応させた。死細胞の検出には、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（7-AAD;BD Biosciences, San Jose, CA, USA）を用いた。【００２７】
染色した細胞は、ＦＡＣＳＡｒｉａ（BD Biosciences）を用いて解析した。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、フィコエリスリン（PE）、７−ＡＡＤおよびＰＥ−Ｃｙ７は、４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザーで励起し、それぞれ５３０／３０、５７５／２６、６９５／４０、７８０／６０のフィルターを用いて検出した。アロフィコシアニン（APC）は６３３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザーで励起し、６６０／２０のフィルターで検出した。死細胞は前方・側方散乱光上でのゲーティング、および７−ＡＡＤ陽性集団を除くことによって除外した。データ解析にはＦｌｏｗＪｏ（Tree Star, Ashland, OR, USA）を用いた。【００２８】
フローサイトメトリーの結果を図２に示す。培養ヒト歯根膜細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５を発現するなど、骨髄間葉系幹細胞と同様の抗原の発現パターンを呈していた。【００２９】
次に、培養ヒト歯根膜細胞における胚性幹細胞関連分子の発現について調べた。用いた手法は、蛍光免疫細胞化学、アルカリフォスファターゼ活性の検出、フローサイトメトリー、テロメア長の測定、および細胞増殖能の評価であった。これらの実験手順を以下に説明する（フローサイトメトリーは上で説明した）。【００３０】
蛍光免疫細胞化学
細胞は４％  ＰＦＡにより１０分間固定した後、０．１％  ノニデットＰ−４０および１０％正常ヤギ血清（Sigma）含有ＰＢＳ（−）を用いて３０分間透過化処理およびブロッキングを行った。一次抗体は室温にて６０分間、二次抗体は室温にて３０分間、それぞれ反応させた。核染色は、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（DAPI; Sigma）を用いて行った。染色した細胞は蛍光顕微鏡下にて観察を行った。【００３１】
アルカリフォスファターゼ活性の検出
アルカリフォスファターゼ活性の検出は、Alkaline Phosphatase Detection Kit（Chemicon, Temecula, CA, USA）を用いて行った。【００３２】
テロメア長の測定
テロメア長の測定は、Telomere PNA Kit/FITC for Flow Cytometry（Dako, Glostrup, Denmark）を用いて行った。【００３３】
細胞増殖能の評価
細胞を、フローサイトメトリーを用いて３００個／ウェルの濃度で９６−ウェル培養プレートに播種し、培養を行った。培養７日目に、Cell Titer 96 AQueous（Promega, Madison, WI, USA）を用いて細胞増殖を測定した。【００３４】
結果を図３に示す。培養ヒト歯根膜細胞は、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）のマーカー分子を発現していた。これらの結果より、ＳＳＥＡ−４を用いて、未分化なヒト歯根膜幹細胞を同定できることがわかった。【００３５】
免疫蛍光染色の結果を図３Ａに示す。本発明により得られた幹細胞においてＥＳ細胞関連分子（表面抗原分子：ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、および転写因子：ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＲＥＸ１）の発現が確認された。また、本発明により得られた幹細胞においてアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性も検出された。【００３６】
フローサイトメトリーを用いて培養ヒト歯根膜細胞におけるＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４の発現を調べた結果を図３Ｂに示す。ＳＳＥＡ−４の発現が多くみとめられた。【００３７】
さらに、レチノイン酸を用いて、培養ヒト歯根膜細胞を分化誘導した時の、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４抗原発現の変化を調べた。培地に１０−５Ｍ  オールトランスレチノイン酸を添加し、７日間培養した。結果を図３Ｃに示す。未分化な状態では、グロボ系糖脂質（ＳＳＥＡ−３・ＳＳＥＡ−４）の発現が高く、ラクト系糖脂質（ＳＳＥＡ−１）の発現が低かった。レチノイン酸で分化誘導を引き起こすと、グロボ系糖脂質の発現が下がり、ラクト系糖脂質の発現が上昇した。このように、ヒトＥＳ細胞と同様、ヒト歯根膜細胞もその分化状態に応じて細胞膜糖脂質の変化が起こることがわかった。【００３８】
培養ヒト歯根膜細胞における、ＳＳＥＡ−４陽性細胞と陰性細胞のテロメア長の比較を行った結果を図３Ｄに示す。ＳＳＥＡ−４陽性細胞はテロメア長が長く、ＳＳＥＡ−４陰性細胞は短いことがわかった。【００３９】
培養ヒト歯根膜細胞における、ＳＳＥＡ−４陽性細胞と陰性細胞の増殖能の比較を行った結果を図３Ｅに示す。ＳＳＥＡ−４陽性細胞は増殖能が高く、ＳＳＥＡ−４陰性細胞は低かった。
【実施例２】
【００４０】
実施例２：ヒト歯根膜由来のＳＳＥＡ−４陽性幹細胞の分化能
本発明のヒト歯根膜由来のＳＳＥＡ−４陽性幹細胞の中胚葉系組織、外胚葉系組織および内胚葉系組織への分化能について、インビトロにて調べた。実験手順を以下に示す。【００４１】
培養ヒト歯根膜細胞より、フローサイトメトリーを用いてＳＳＥＡ−４陽性細胞の単一クローン細胞を単離し、以下の分化誘導を行った。【００４２】
脂肪細胞への分化誘導は、１０％  ＨＩＦＢＳ、１％  ペニシリン／ストレプトマイシン、１μＭ  デキサメタソン（Sigma）、０．２ｍＭ  インドメタシン（Sigma）、０．０１ｍｇ／ｍＬ  インスリン（Sigma）、０．５ｍＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（Sigma）含有高グルコースＤＭＥＭ（Invitrogen）にて２１日間培養を行った。培養した細胞は、オイルレッドＯ（Sigma）にて染色し光学顕微鏡下において観察を行った。細胞培養上清におけるアジポネクチンの分泌は、Human Adiponectin/Acrp30 Immunoassay（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）を用いて測定した。【００４３】
骨芽細胞への分化誘導は、１０％  ＨＩＦＢＳ、１％  ペニシリン／ストレプトマイシン、１００ｎＭ  デキサメタソン、０．０５ｍＭ  Ｌ−アスコルビン酸（Sigma）、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸（Sigma）含有最小必須アルファ培地（α-MEM; Invitrogen）にて２１日間培養を行った。培養した細胞は、アリザリンレッドＳ（Sigma）にて染色し光学顕微鏡下において観察を行った。細胞に沈着したカルシウムの測定は、Calcium E-Test Wako（Wako Pure Chemical, Tokyo, Japan）を用いて測定した。【００４４】
軟骨細胞への分化誘導は、まず３Ｘ１０５の細胞を１５ｍＬ  ポリプロピレン製コニカルチューブ（Corning, Corning, NY, USA）に分注し、遠心して細胞塊を形成した。この細胞塊を１％  ペニシリン／ストレプトマイシン、１００ｎＭ  デキサメタソン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Sigma）、０．１７ｍＭ  Ｌ−アスコルビン酸、０．３５ｍＭ  Ｌ−プロリン（Sigma）、ITS + Universal Culture Supplement Premix(BD Biosciences）、１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β３（R&D Systems）含有高グルコースＤＭＥＭにて２１日間培養を行った。培養した細胞は、パラフィン包埋して切片を作成した後、アルシアンブルー（Sigma）にて染色し光学顕微鏡下において観察を行った。【００４５】
神経細胞への分化誘導は、１５％  ＨＩＦＢＳ、１％  ペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）含有低グルコースＤＭＥＭにて２４時間培養した後、２％  ジメチルスルホキシド（DMSO; Sigma）、１００μＭ  ブチレート化ヒドロキシアニソール（BHA; Sigma）、１０μＭ  フォルスコリン（Sigma）、５Ｕ／ｍＬ  ヘパリン（Sigma）、５ｎＭ  Ｋ２５２ａ（Sigma）、２５ｍＭ  ＫＣｌ（Sigma）、２ｍＭ  ２−プロピルペンタン酸（Sigma）、１Ｘ  Ｎ２サプリメント（Invitrogen）、１０ｎｇ／ｍＬ  ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF; R&D Systems）、１０ｎｇ／ｍＬ  ヒト血小板由来増殖因子ＢＢ（PDGF-BB; R&D Systems）含有低グルコースＤＭＥＭにて４８時間培養した。培養した細胞は、抗ニューロン−特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）抗体およびAlexa Fluor 594標識二次抗体を用いて染色し蛍光顕微鏡下にて観察を行った。【００４６】
肝細胞への分化誘導は、第１段階として２％  ＨＩＦＢＳ、１％  ペニシリン／ストレプトマイシン、１００ｎｇ／ｍＬ  ａＦＧＦ（R&D Systems）含有低グルコースＤＭＥＭにて５日間培養、第２段階として２％  ＨＩＦＢＳ、１％  ペニシリン／ストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦ（R&D Systems）含有低グルコースＤＭＥＭにて５日間培養した後、第３段階として２％  ＨＩＦＢＳ、１％  ペニシリン／ストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦ、１０ｎＭ  デキサメタソン、1X insulin-transferrin-selenium-X（Invitrogen）、１０ｎｇ／ｍＬ  オンコスタチンＭ（R&D Systems）含有低グルコースＤＭＥＭにて１１日間培養した。培養した細胞は、抗アルブミン抗体およびAlexa Fluor 594標識二次抗体を用いて染色し蛍光顕微鏡下にて観察を行った。細胞内グリコーゲンは、Periodic acid-schiff (PAS) staining kit（Sigma）を用いて検出した。細胞培養上清におけるアルブミンの分泌は、Human serum albumin assay（Cygnous Technologies, Southport, NC, USA）を用いて測定した。【００４７】
本発明のヒト歯根膜由来のＳＳＥＡ−４陽性幹細胞の中胚葉系組織への分化能を検討した結果を図４Ａ〜Ｉに、外胚葉系組織への分化能を検討した結果を図５Ａ〜Ｂに、そして内胚葉系組織への分化能を検討した結果を図６Ａ〜Ｄに示す。６３．６％（１４／２２）のＳＳＥＡ−４陽性幹細胞株が多分化能を有していることが示された。【００４８】
ＳＳＥＡ−４陽性幹細胞を脂肪細胞分化誘導培地にて２１日間培養した後、以下の解析を行った。図４Ａに示すように、オイルレッドＯ染色を行ったところ、染色像が確認された。図４Ｂに示すように、ＲＴ−ＰＣＲにより脂肪細胞マーカーの発現を調べたところ、ＰＰＡＲ−γ、ＡＬＢＰ、ＬＰＬといった脂肪細胞マーカーの発現が確認された。図４Ｃに示すように、オイルレッドＯ染色による脂肪滴形成の定量的解析を行ったところ、対照群と比較して約５倍のオイルレッドＯ染色性がみとめられた。図４Ｄに示すように、ＥＬＩＳＡにより細胞培養上清におけるアジポネクチン分泌の解析を行ったところ、その分泌が経時的に増加することが確認された。【００４９】
ＳＳＥＡ−４陽性幹細胞を骨芽細胞分化誘導培地にて２１日間培養した後、以下の解析を行った。図４Ｅに示すように、アリザリンレッドＳ染色を行ったところ、染色像が確認された。図４Ｆに示すように、ＲＴ−ＰＣＲにより骨芽細胞マーカーの発現を調べたところ、ＯＰＮ、ＢＳＰといった骨芽細胞マーカーの発現が確認された。図４Ｇに示すように、細胞に沈着したＣａの定量的解析を行ったところ、沈着Ｃａ量が経時的に増加することが確認された。【００５０】
ＳＳＥＡ−４陽性幹細胞を軟骨細胞分化誘導培地にて２１日間培養した後、以下の解析を行った。図４Ｈに示すように、パラフィン包埋して切片作成後、アルシアンブルー染色を行ったところ、染色像が確認された。図４Ｉに示すように、ＲＴ−ＰＣＲにより軟骨細胞マーカーの発現を調べたところ、ＣＯＬ  ＩＩ、ＣＯＬ  Ｘといった軟骨細胞マーカーの発現が確認された。【００５１】
ＳＳＥＡ−４陽性幹細胞を神経細胞分化誘導培地にて３日間培養した後、以下の解析を行った。図５Ａに示すように、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）の蛍光免疫染色を行ったところ、染色像が確認された。図５Ｂに示すように、ＲＴ−ＰＣＲにより神経細胞マーカーの発現を調べたところ、ＮＦ−Ｍ、Ｔｕｂ−β３といった神経細胞マーカーの発現が確認された。【００５２】
ＳＳＥＡ−４陽性幹細胞を肝細胞分化誘導培地にて２１日間培養した後、以下の解析を行った。図６Ａに示すように、アルブミンの蛍光免疫染色を行ったところ、染色像が確認された。図６Ｂに示すように、過ヨウ素酸−シフ（ＰＡＳ）染色を行ったところ、染色像が確認された。図６Ｃに示すように、ＲＴ−ＰＣＲにより肝細胞マーカーの発現を調べたところ、ＡＬＢ、ＡＦＰといった幹細胞マーカーの発現が確認された。図６Ｄに示すように、ＥＬＩＳＡにより細胞培養上清におけるアルブミン分泌の解析を行ったところ、その分泌が経時的に増加することが確認された。【００５３】
このように、本発明のＳＳＥＡ−４陽性幹細胞は、中胚葉系組織のみならず、外胚葉系組織、内胚葉系組織のいずれにも分化できる高い分化能を有することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明によれば、歯または歯周組織由来の細胞から確実、簡便かつ効率的に幹細胞を同定し、単離することができ、得られる幹細胞は外胚葉、中胚葉および内胚葉由来のいずれの組織へも分化できる高い分化能を持つので、発生学的研究およびその他の研究分野ならびに再生医療の分野において有用である。
【図１】
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【図２−Ａ】
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【図２−Ｂ】
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【図２−Ｃ】
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【図２−Ｄ】
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【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
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【図３−Ｃ】
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【図３−Ｄ】
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【図３−Ｅ】
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【図４−Ａ】
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【図４−Ｂ】
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【図４−Ｃ】
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【図４−Ｄ】
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【図４−Ｅ】
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【図４−Ｆ】
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【図４−Ｇ】
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【図４−Ｈ】
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【図４−Ｉ】
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【図５】
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【図６−Ａ】
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【図６−Ｂ】
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【図６−Ｃ】
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【図６−Ｄ】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年12月8日(2009.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
歯根膜から得られるものであり、外胚葉、中胚葉および内胚葉由来のいずれの組織へも分化できる、単離されたＳＳＥＡ−４陽性幹細胞。
【請求項６】
歯根膜から細胞を得て、次いで、得られた細胞のなかからＳＳＥＡ−４陽性細胞を単離することを特徴とする方法により得られるものであり、外胚葉、中胚葉および内胚葉由来のいずれの組織へも分化できる、歯根膜由来の幹細胞。
【請求項７】
単離がフローサイトメーターまたは磁気ビーズを用いて行われる請求項６記載の幹細胞。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
請求項５〜７のいずれか１項記載の幹細胞を分化させることを特徴とする、外胚葉由来組織の製造方法。
【請求項１０】
請求項５〜７のいずれか１項記載の幹細胞を分化させることを特徴とする、中胚葉由来組織の製造方法。
【請求項１１】
請求項５〜７のいずれか１項記載の幹細胞を分化させることを特徴とする、内胚葉由来組織の製造方法。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項記載の方法により得られる組織。
【請求項１３】
歯根膜からＳＳＥＡ−４陽性幹細胞を単離し、これを歯あるいは歯周組織に分化させ、分化組織を患部に移植することを特徴とする、欠損した歯あるいは歯周組織の再生方法。
【請求項１４】
欠損した歯あるいは歯周組織の再生に用いられる歯あるいは歯周組織を製造するための、歯根膜由来のＳＳＥＡ−４陽性細胞の使用。
【請求項１５】
欠損した歯あるいは歯周組織の再生に用いられる歯あるいは歯周組織の製造方法であって、歯根膜由来のＳＳＥＡ−４陽性細胞を分化培地にて歯あるいは歯周組織へと分化させることを特徴とする方法。
【国際調査報告】
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