(57)【要約】  本発明は、固形腫瘍の治療に有益な抗体およびその抗体−薬物コンジュゲート並びにこれらを含む抗がん剤を提供する。本発明は、例えば、組織因子に結合する抗体であって、解離速度定数ｋｄが５×１０-4（１／ｓ）以上であり、かつ、結合速度定数Ｋａが１×１０4（１／Ｍｓ）以上である、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織因子に結合する抗体であって、解離速度定数ｋｄが５×１０-4（１／ｓ）以上であり、かつ、結合速度定数Ｋａが１×１０4（１／Ｍｓ）以上である、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
組織因子に結合する抗体であって、
配列番号２〜４のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１〜３を含む重鎖可変領域と、
配列番号６〜８のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１〜３を含む軽鎖可変領域と
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
請求項２に記載の抗体であって、
配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
組織因子に結合する抗体であって、
請求項２または３に記載の抗体と組織因子への結合に関して相互に競合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、がんを治療することに用いるための医薬組成物。
【請求項６】
請求項４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、がんを治療することに用いるための医薬組成物。
【請求項７】
抗体または抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の抗腫瘍効果を予測する方法であって、
固形腫瘍内部へのＡＤＣの浸透能を評価することと、固形腫瘍の内部にまでＡＤＣが浸透する場合にＡＤＣの抗腫瘍効果が高いと予測することを含む、方法。
【請求項８】
抗体または抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の固形腫瘍内部への浸透能を予測する方法であって、
ＡＤＣまたはＡＤＣを構成する抗体若しくはその抗原結合フラグメントの抗原に対する結合速度定数Ｋａおよび解離速度定数Ｋｄを決定することと、結合速度定数Ｋａが第１の所定値以上であり、かつ、解離速度定数Ｋｄが第２の所定値以上である場合に固形腫瘍内部へのＡＤＣの浸透能が高いと予測する、方法。
【請求項９】
抗体または抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の抗腫瘍効果を予測する方法であって、
ＡＤＣまたはＡＤＣを構成する抗体若しくはその抗原結合フラグメントの抗原に対する結合速度定数Ｋａおよび解離速度定数Ｋｄを決定することと、結合速度定数Ｋａが第１の所定値以上であり、かつ、解離速度定数Ｋｄが第２の所定値以上である場合にＡＤＣの抗腫瘍効果が高いと予測することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固形腫瘍の治療に有益な抗体およびその抗体−薬物コンジュゲート並びにこれらを含む抗がん剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織因子（tissue factor）は、多くのヒトがん細胞で発現しており、発現と悪性度との正の相関が臨床研究により実証されている。組織因子を標的とした抗体の一例については、例えば、特許文献１に開示されている。また、抗組織抗体と細胞傷害剤との抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）については、非特許文献１に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】WO2015/115656
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】“Antitumor effect of anti-tissue factor antibody-MMAE conjugate in human pancreatic tumor xenografts" Koga Y, Manabe S, Aihara Y, Sato R, Tsumura R, Iwafuji H, Furuya F, Fuchigami H, Fujiwara Y, Hisada Y, Yamamoto Y, Yasunaga M, Matsumura Y. Int. J. Cancer, 137, 1457-1466 (2015).
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、固形腫瘍の治療に有益な抗体およびその抗体−薬物コンジュゲート並びにこれらを含む抗がん剤を提供する。
【０００６】
本発明者らは、固形腫瘍に発現する腫瘍特異的抗原に対する抗体について、解離速度定数の異なる２つの抗体の対比から解離速度定数が大きな抗体が固形腫瘍の内部まで浸透できることを明らかにした。本発明者らはまた、解離定数ＫＤがより小さいにもかかわらず、解離速度定数ｋｄが大きな抗体（すなわち、抗原から解離しやすい抗体）が、Ｋｄが小さな抗体（すなわち、抗原から解離し難い抗体）よりも、むしろ強い抗腫瘍効果を奏することを明らかにした。
【０００７】
本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）組織因子に結合する抗体であって、解離速度定数ｋｄが５×１０-4（１／ｓ）以上であり、かつ、結合速度定数Ｋａが１×１０4（１／Ｍｓ）以上である、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（２）組織因子に結合する抗体であって、
配列番号２〜４のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１〜３を含む重鎖可変領域と、
配列番号６〜８のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１〜３を含む軽鎖可変領域と
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（３）上記（２）に記載の抗体であって、
配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（４）組織因子に結合する抗体であって、
上記（２）または（３）に記載の抗体と組織因子への結合に関して相互に競合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、がんを治療することに用いるための医薬組成物。
（６）上記（４）に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、がんを治療することに用いるための医薬組成物。
（７）抗体または抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の抗腫瘍効果を予測する方法であって、
固形腫瘍内部へのＡＤＣの浸透能を評価することと、固形腫瘍の内部にまでＡＤＣが浸透する場合にＡＤＣの抗腫瘍効果が高いと予測することを含む、方法。
（８）抗体または抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の固形腫瘍内部への浸透能を予測する方法であって、
ＡＤＣまたはＡＤＣを構成する抗体若しくはその抗原結合フラグメントの抗原に対する結合速度定数Ｋａおよび解離速度定数Ｋｄを決定することと、結合速度定数Ｋａが第１の所定値以上であり、かつ、解離速度定数Ｋｄが第２の所定値以上である場合に固形腫瘍内部へのＡＤＣの浸透能が高いと予測する、方法。
（９）抗体または抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の抗腫瘍効果を予測する方法であって、
ＡＤＣまたはＡＤＣを構成する抗体若しくはその抗原結合フラグメントの抗原に対する結合速度定数Ｋａおよび解離速度定数Ｋｄを決定することと、結合速度定数Ｋａが第１の所定値以上であり、かつ、解離速度定数Ｋｄが第２の所定値以上である場合にＡＤＣの抗腫瘍効果が高いと予測することを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の固定化抗原に対するＳＲＰ測定によるセンサーグラムを示す。図１では、センサーグラムが近似曲線によりkinetic titration 1:1 interaction modelでカーブフィットされている。図１〜３において、「１０８４ＡＤＣ」は、クローンNo.1084が産生するモノクローナル抗体とモノメチルアウリスタチンＥとのＡＤＣを示し、「１８４９ＡＤＣ」は、クローンNo.1849が産生するモノクローナル抗体とモノメチルアウリスタチンＥとのＡＤＣを示す。図中の「解離相」は、フローバッファーのみをフローさせ抗体の抗原からの解離を観察している状態を意味する。
【図２】図２は、腫瘍担持モデルに対する１０８４ＡＤＣと１８４９ＡＤＣの抗腫瘍効果を投与後の腫瘍サイズ変化により示す図である。
【図３】図３は、１０８４ＡＤＣと１８４９ＡＤＣの固形腫瘍内部への浸透を示す蛍光顕微鏡写真である。
【発明の詳細な説明】
【０００９】
本発明では、「対象」とは、哺乳動物を意味し、特にヒトであり得る。
【００１０】
本明細書では、「治療」とは、疾患若しくは障害の治療、治癒、防止若しくは、寛解の改善、または、疾患若しくは障害の進行速度の低減を意味する。
【００１１】
本明細書では、「疾患」とは、治療が有益な症状を意味する。
【００１２】
本明細書では、「治療上有効量」とは、疾患や状態を処置（予防または治療）するために有効な薬剤の量を意味する。治療上有効量の薬剤は、疾患または状態の症状の悪化速度を低下させること、前記症状の悪化を止めること、前記症状を改善すること、前記症状を治癒すること、または前記症状の発症または発展を抑制することが可能である。
【００１３】
本明細書では、「抗体」とは、免疫グロブリンを意味し、ジスルフィド結合で安定化された2本の重鎖（H鎖）と2本の軽鎖（L鎖）が会合した構造をとるタンパク質をいう。重鎖は、重鎖可変領域VH、重鎖定常領域CH1、CH2、CH3、及びCH1とCH2の間に位置するヒンジ領域からなり、軽鎖は、軽鎖可変領域VLと軽鎖定常領域CLとからなる。この中で、VHとVLからなる可変領域断片（Fv）が、抗原結合に直接関与し、抗体に多様性を与える領域である。また、VL、CL、VH、CH1からなる抗原結合領域をFab領域と呼び、ヒンジ領域、CH2、CH3からなる領域をFc領域と呼ぶ。
可変領域のうち、直接抗原と接触する領域は特に変化が大きく、相補性決定領域（complementarity-determining region: CDR）と呼ばれる。CDR以外の比較的変異の少ない部分をフレームワーク（framework region: FR）と呼ぶ。軽鎖と重鎖の可変領域には、それぞれ3つのCDRが存在し、それぞれN末端側から順に、重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3と呼ばれる。
抗体は、組換え抗体であってもよく、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト化抗体であってもよい。抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。キメラ抗体とは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域に異なる種の重鎖定常領域および軽鎖定常領域がそれぞれ連結した抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト由来の抗体に特徴的なアミノ酸配列で、ヒト抗体の対応する位置を置換した抗体を意味し、例えば、マウス又はラットを免疫して作製した抗体の重鎖CDR1〜3及び軽鎖CDR1〜3を有し、重鎖及び軽鎖のそれぞれ4つのフレームワーク領域（FR）を含むその他のすべての領域がヒト抗体に由来するものが挙げられる。かかる抗体は、CDR移植抗体と呼ばれる場合もある。用語「ヒト化抗体」は、ヒトキメラ抗体を含む場合もある。「ヒトキメラ抗体」は、非ヒト由来の抗体において、非ヒト由来の抗体の定常領域がヒトの抗体の定常領域に置換されている抗体である。ヒトキメラ抗体では、ADCC活性を高める観点では、例えば、定常領域に用いるヒトの抗体のサブタイプはIgG1とすることができる。また、抗体の細胞傷害性を増強する目的で抗体を抗体−薬物コンジュゲートの形態とすることもできる。
本明細書では、「天然型抗体」とは、動物を免疫して得られるインタクトの抗体（例えば、2本の軽鎖全長と2本の重鎖全長を有する抗体）を意味する。本発明では、「裸の抗体」とは、細胞傷害剤と連結していない抗体を意味する。
抗体は、組換えタンパク質として、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などの動物細胞に産生させることができる。
【００１４】
本明細書において、「抗原結合フラグメント」とは、抗体のフラグメントであって、組織因子に結合するフラグメントをいう。具体的には、VL、VH、CL及びCH1領域からなるFab；Fab断片とヒンジとを含むFab’；2つのFabがヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結されているF(ab')2；VL及びVHからなるFv；VL及びVHを人工のポリペプチドリンカーで連結した一本鎖抗体であるscFvのほか、diabody型、scDb型、tandem scFv型、ロイシンジッパー型などの二重特異性抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
本明細書では、「組織因子」（Tissue factor）とは、血液凝固因子の１つであり、トロンボプラスチンとも呼ばれるタンパク量である。組織因子は、膜貫通型の糖タンパク質であり、外因系血液凝固反応の開始因子として知られる。組織因子は、好ましくはヒト組織因子である。ヒト組織因子のアミノ酸配列は、例えば、NCBI Reference Sequence ID: P#001984.1に示される通りである。
【００１６】
本明細書では、「結合速度定数」（ｋａ）および「解離速度定数」（ｋｄ）とは、２分子の結合解離反応における速度定数である。ｋａおよびｋｄは、当業者に周知の定数であり、適宜周知の技術、例えば、表面プラズモン共鳴法を用いて決定することができる。
【００１７】
「表面プラズモン共鳴測定」（ＳＰＲ測定）は、平坦な金属／液体界面に対して一定の入射角で偏光を照射すると、反射光において生じる反射高強度が低下した部分（消失光）の角度が、当該界面に結合した物質の量により変動することを利用した物質間相互作用の測定方法である。消失光の角度の０．１度の変化を1000RUと定義すると、1RUはタンパク質で1 pg/mm2に相当することが確認されている。
【００１８】
本明細書では、「抗体薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）とは、抗体と薬物とが連結した物質を意味する。ＡＤＣでは、抗体としてはモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが有利に用いられ得る。ＡＤＣでは、モノクローナル抗体と薬物とは適切なリンカーを介して連結させることができる。ＡＤＣは、細胞膜上の膜成分（例えば、受容体等の膜貫通タンパク質）に結合し、エンドサイトーシスやインターナライゼーションにより、細胞内に取り込まれ、抗体と切り離されて細胞内に放出される。細胞内で抗体と薬物との間に開裂性リンカーを導入しておくことで、細胞内、例えばエンドソーム内でリンカーを開裂させ薬物を抗体から乖離させて細胞質内に放出させることが可能である。薬物として、細胞傷害剤を用いると薬物が送達された細胞を死滅させることが可能である。細胞傷害剤としては、化学療法剤、放射性同位体、および毒素を用いることができる。
【００１９】
これまでの研究では、抗体は標的分子に強く結合し、解離し難い方が、治療用途に適していると考えられてきた。しかしながら、これとは対照的に、本発明によれば、抗組織因子抗体は、解離速度定数ｋｄの大きな抗体（組織因子から解離しやすい抗体）の方が、ｋｄの小さな抗体（解離し難い抗体）よりも、組織因子陽性の腫瘍組織への浸透性が高く、腫瘍の内部まで浸透することができる。この発見に基づいて、本発明者らは、腫瘍の内部まで浸透する抗体、そのような抗体と薬物とのＡＤＣ、これら抗体またはＡＤＣを含む、がんを治療することに用いるための医薬組成物を発明した。
【００２０】
本発明によれば、組織因子に結合する抗体であって、解離速度定数ｋｄが第１の規定値以上であり、かつ、結合速度定数ｋａが第２の規定値以上である、抗体が提供される。第１の規定値は、１×１０-4（１／ｓ）以上であり、２×１０-4（１／ｓ）以上であり、３×１０-4（１／ｓ）以上であり、４×１０-4（１／ｓ）以上であり、５×１０-4（１／ｓ）以上であり、６×１０-4（１／ｓ）以上であり、７×１０-4（１／ｓ）以上であり、または８×１０-4（１／ｓ）以上であり得る。また、第２の規定値は、１×１０-4（１／Ｍｓ）以上、１．５×１０-4（１／Ｍｓ）以上、または２×１０-4（１／Ｍｓ）以上であり得る。抗体のＫＤは、１ｎＭ〜１００ｎＭ、１０ｎＭ〜５０ｎＭ、２０ｎＭ〜４０ｎＭ、または３０ｎＭ〜４０ｎＭであり得る。第１の規定値と第２の規定値の組合せとしては、第２の規定値が１×１０-4（１／Ｍｓ）以上であり、第１の規定値が１×１０-4（１／ｓ）以上であり得；第２の規定値が１．５×１０-4（１／Ｍｓ）以上であり、第１の規定値が２×１０-4（１／ｓ）以上であり得；または第２の規定値が２×１０-4（１／Ｍｓ）以上であり、第１の規定値が３×１０-4（１／ｓ）以上であり得る。ｋａおよびｋｄの上限は、動物に免疫して得られる抗体のｋａおよびｋｄの範囲であり得る。
【００２１】
本発明によれば、組織因子に結合する抗体であって、解離速度定数ｋｄが５×１０-4（１／ｓ）以上であり、かつ、結合速度定数ｋａが１×１０4（１／Ｍｓ）以上である、抗体が提供される。解離速度定数ｋｄは、例えば、１×１０-4（１／ｓ）以上であり、２×１０-4（１／ｓ）以上であり、３×１０-4（１／ｓ）以上であり、４×１０-4（１／ｓ）以上であり、５×１０-4（１／ｓ）以上であり、６×１０-4（１／ｓ）以上であり、７×１０-4（１／ｓ）以上であり、または８×１０-4（１／ｓ）以上であり得る。また、結合速度定数ｋａは、１×１０-4（１／Ｍｓ）以上、１．５×１０-4（１／Ｍｓ）以上、または２×１０-4（１／Ｍｓ）以上であり得る。そして、ＫＤは、１ｎＭ〜１００ｎＭ、１０ｎＭ〜５０ｎＭ、２０ｎＭ〜４０ｎＭ、または３０ｎＭ〜４０ｎＭであり得る。また特に、ＫａとＫｄとの組合せとしては、Ｋａが１×１０-4（１／Ｍｓ）以上であり、Ｋｄが１×１０-4（１／ｓ）以上であり得；Ｋａが１．５×１０-4（１／Ｍｓ）以上であり、Ｋｄが２×１０-4（１／ｓ）以上であり得；またはＫａが２×１０-4（１／Ｍｓ）以上であり、Ｋｄが３×１０-4（１／ｓ）以上であり得る。結合速度定数および解離速度定数を有する抗体は、組織因子に対して結合が迅速である一方で解離も迅速である。ｋａおよびｋｄの上限は、動物に免疫して得られる抗体のｋａおよびｋｄの範囲であり得る。
【００２２】
抗体の結合速度定数ｋａおよび解離速度定数ｋｄはそれぞれ、例えば、ＳＰＲ測定により決定することができる。抗体と抗原間の結合のＳＰＲ測定は周知であり、当業者であれば周知技術に基づいて抗体の結合速度定数ｋａおよび解離速度定数ｋｄを求めることができる。ＳＰＲ測定では、アナライトを一定濃度でフローさせる相（結合相）において結合速度定数をＲＵの変化量から求めることができ、その後ランニングバッファーをフローさせる相（解離相）において解離定数をＲＵの変化量から求めることができる。測定は、single-cycle kineticsにより行うことができる。また解析は、bivalent analysisにより行うことができる。実測されるＳＰＲセンサーグラムに対する近似曲線のカーブフィットは、kinetic titration 1:1 interaction modelにより行うことができる。カーブフィットの詳細は、Karlsson, R., Katsamba, P. S., Nordin, H., Pol, E. and Myszka, D. G. (2006). "Analyzing a kinetic titration series using affinity biosensors." Anal. Biochem. 349(1): 136-47.を参照することができる。
抗体の結合速度定数ｋａおよび解離速度定数ｋｄはまた、例えば、GE Healthcare社から市販されるbiacore（商標）などのＳＰＲ装置を用いて製造者マニュアルに従って求めることができる。例えば、ＳＰＲ測定装置にもｋａおよびｋｄを求めるプログラムが搭載されており、ＳＰＲセンサーグラムからｋａおよびｋｄを算出することができる。例えば、Biacore（商標）装置により得られたSPRセンサーグラムをBiacore T200 Evaluation Softwareを用いて解析し、Fitting modelとしてBivalent Analyte modelを採用することにより、Fitting curveを導出し、抗体またはADCのKinetics parameterとしてｋａやｋｄ、ＫＤを算出することもできる。
当業者であれば、周知慣用技術を用いて上記解離速度定数および／または結合速度定数を有する抗体を作製し得る。
【００２３】
組織因子に結合する抗体であって、解離速度定数ｋｄが５×１０-4（１／ｓ）以上であり、かつ、結合速度定数ｋａが１×１０4（１／Ｍｓ）以上である、抗体の例としては、特に限定されないが例えば、
組織因子に結合する抗体であって、
配列番号２〜４のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１〜３を含む重鎖可変領域と、
配列番号６〜８のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１〜３を含む軽鎖可変領域と
を含む、抗体；および
組織因子に結合する抗体であって、
配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と
を含む、抗体
が挙げられる。
【００２４】
抗体が互いに類似した結合特性を有することは、競合アッセイにより検証することができる。ある抗体と抗原との結合において競合する抗体は、当業者に周知の競合アッセイなどにより得ることができる。競合アッセイで、例えば、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２０〜５０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、とりわけ好ましくは９０％以上、所望の抗体の結合をブロックすることができるならば、同じ抗原に対する結合において競合する抗体とすることができる。競合する抗体は、交差ブロッキングアッセイ、好ましくは、競合ＥＬＩＳＡアッセイにより確認することができる。交差ブロッキングアッセイでは、抗原を、例えばマイクロタイタープレート上にコーティングし、ここに候補となる競合抗体存在を添加してインキュベートし、抗原と候補抗体との結合を形成させる。その後、所望の抗体を標識した上でさらにウェルに添加してインキュベートし、洗浄して、所望の抗体の結合量を定量することにより、抗体が競合したか否かを判断することができる。競合する場合には、ウェル中に残存する標識量が少なくなるはずである。
【００２５】
一般的に、競合アッセイにおいて、抗体Ａが抗体Ｂと抗原との結合を解離させるからといって、抗体Ｂが抗体Ａと抗原との結合を解離させるとは限らない。これは、抗体Ａが抗体Ｂよりも極めて強い結合を抗原に対して示す場合を考えれば容易に理解できる。結合特性の近い抗体を得るためには、抗体Ａが抗体Ｂと抗原との結合を解離させ、かつ、抗体Ｂが抗体Ａと抗原との結合を解離させることを確認すればよく、本明細書では、このような競合状態を「抗体Ａと抗体Ｂが抗原との結合において相互に競合する」という。
【００２６】
本発明によれば、クローンNo.1084から得られる抗体と組織因子との結合において互いに競合する抗体は、クローンNo.1084から得られる抗体と類似した結合活性を有すると考えられる。抗体の結合特性は、その重鎖可変領域および軽鎖可変領域、特に重鎖ＣＤＲ１〜３と軽鎖ＣＤＲ１〜３によって規定され得る。従って、本発明によれば、
クローンNo.1084から得られる抗体と組織因子との結合において互いに競合する抗体；
配列番号２〜４のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１〜３を含む重鎖可変領域と、
配列番号６〜８のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１〜３を含む軽鎖可変領域と
を含む抗体と組織因子との結合において相互に競合する抗体；および
配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と
を含む抗体と組織因子との結合において相互に競合する抗体
が提供される。
【００２７】
本発明によれば、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントと薬物とのＡＤＣが提供される。本発明のＡＤＣでは、抗体またはその抗原結合フラグメントと薬物（例えば、細胞傷害剤）とはリンカーを介して連結し得る。本発明のＡＤＣでは、細胞傷害剤としては、化学療法剤（例えば、市販の抗がん剤などの抗がん剤、例えば、アウリスタチン（アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦフェニレンジアミン（ＡＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＦとそれらの誘導体）、メイタンシノイドＤＭ１およびＤＭ４とそれらの誘導体）、カンプトテシン（ＳＮ−３８、トポテカンおよびエキソテカンとそれらの誘導体）、ＤＮＡ副溝結合剤（エネジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシンとそれらの誘導体）、タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセルとそれらの誘導体）、ポリケチド（ディスコデルモライドとその誘導体）、アントラキノン系（ミトキサントロンとその誘導体）、ベンゾジアゼピン（ピロロベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピン、およびオキサゾリジノベンゾジアゼピンとそれらの誘導体）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビンとそれらの誘導体）、ドキソルビシン類（ドキソルビシン、モルホリノ−ドキソルビシン、およびシアノモルホリノ−ドキソルビシンとそれらの誘導体）、強心配糖体（ジギトキシンやその誘導体）、カレキアマイシン、エポチロン、クリプトフィシン、セマドチン、セマドチン、リゾキシン、ネトロプシン、コンブレタスタチン、エリュテロビン、エトポシド、Ｔ６７（チュラリク）、およびノコダゾール）、放射性同位体（例えば、32Ｐ、60Ｃ、90Ｙ、111Ｉｎ、131Ｉ、125Ｉ、153Ｓｍ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、および212Ｂｉ）、および毒素（例えば、ジフテリアトキシンＡ、シュードモナスエンドトキシン、リシン、サポリン等）が挙げられ、本発明のＡＤＣにおける細胞傷害剤として用いることができる。細胞傷害剤はいずれも、がんの処置に用いられるものを用いることができる。
【００２８】
本発明のある態様では、リンカーは非開裂性リンカーまたは開裂性リンカーであり得る。抗体とリンカーとの結合は、例えば抗体のスルフヒドリル基にマレイミド基を介して連結することができる。リンカーには必要に応じてポリエチレングリコールブロックが含まれていてもよい。
【００２９】
例えば、開裂性リンカーとしては、バリン−シトルリン（Ｖａｌ−Ｃｉｔ）およびフェニルアラニン−リジン（Ｐｈｅ−ｌｙｓ）リンカーなどのペプチドリンカーや、ｐＨ依存的に開裂するヒドラゾンリンカーが挙げられる。開裂性リンカーとしてはまた、カルバメート結合またはエステル結合を含むリンカーが挙げられ、これらは酵素的に細胞内で分解されうる。これらのリンカーは組み合わせて用いてもよい。
本発明のある態様では、マレイミド基−ＰＥＧ−Ｖａｌ−Ｃｉｔにより抗体と細胞傷害剤を連結することができる。本発明のある態様では、本願実施例で用いたリンカー（例えば、マレイミド基−ＰＥＧ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−細胞傷害剤）を用いることができる。
また、リンカーと細胞傷害剤との間には、スペーサーを介在させてもよい。
【００３０】
本発明によれば、本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、またはこれらと細胞傷害剤との抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含む、がんを治療することに用いるための医薬組成物が提供される。
【００３１】
本発明の医薬組成物で治療するがんとしては、例えば、固形腫瘍が挙げられる。本発明の医薬組成物で治療するがんとしてはまた、例えば、リンパ腫、肺がん、膵臓がん、頭頸部がん、前立腺がん、膀胱がん、乳がん、食道がん、胃がん、大腸がん、子宮がん、卵巣がん、皮膚がん、甲状腺がん、胸腺がん、腎臓がん、精巣がん、陰茎がん、肝臓がん、胆道がん、脳腫瘍、骨軟部腫瘍、後腹膜腫瘍、血管・リンパ管肉腫、およびこれらの転移性のがん（例えば、転移性固形腫瘍）が挙げられる。例えば、本発明の医薬組成物で治療するがんは、脳腫瘍、膵がん、乳がん、または胃がんであり得る。特に固形腫瘍において、本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、またはこれらと細胞傷害剤との抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、腫瘍塊の内部まで浸透し、内部のがん細胞を殺傷することができる。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、またはこれらと細胞傷害剤との抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に加えて、賦形剤を含んでいてもよい。賦形剤としては、例えば、緩衝液が挙げられる。本発明の医薬組成物は、静脈内投与、腹腔内投与等により投与することができる。本発明の医薬組成物は、注射剤の形態であり得、例えば、シリンジに導入された形態であり得る。
【００３３】
本発明によれば、がんをその必要のある対象において治療する方法であって、
治療上有効量の本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、またはこれらと細胞傷害剤との抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を当該対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００３４】
本発明によれば、がんを治療することに用いるための医薬の製造における、本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、またはこれらと細胞傷害剤との抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の使用が提供される。
【実施例】
【００３５】
実施例１：組織因子（Tissue Factor）に結合する抗体の取得
本実施例では、抗組織因子抗体を取得し、そのアミノ酸配列を決定した。【００３６】
免疫方法
FCAアジュバントでミセル化した組み換えヒト組織因子（rhTF；配列番号１３）をWisterラットの腹腔へ投与した。免疫を複数回行った後、rhTFを固相としたELISA法でラット抗血清を評価した。抗体価の上昇したラット個体から摘出した脾臓から得た脾細胞とp3X63マウスミエローマ細胞とをPEG法で融合し、HAT培地で培養することでハイブリドーマ細胞を選択した。ELISA法でrhTFに対して陽性を示し、かつフローサイトメトリーでヒト組織因子を強発現する例えばMCF7細胞などに陽性を示すハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、限界希釈法にてクローニングすることで抗組織因子抗体産生ハイブリドーマ細胞クローンを樹立した。【００３７】
得られたハイブリドーマクローンのうち、抗組織因子抗体を産生するクローンNo. 1084およびクローンNo. 1849を取得し、それぞれのクローンから常法に従ってtotal RNAを抽出した。その後、SMARTer RACE 5'/3' Kit（Takara bio社）を用いてcDNA合成を行った。
合成したcDNAを鋳型として、PCR法によってNo.1084とNo.1849の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするDNA配列を増幅した。PCR反応にはセンスプライマーとして10× Universal Primer A Mix（SMARTer RACE 5'/3' Kit、Takara bio社）を用い、リバースプライマーには重鎖と軽鎖それぞれ下記に示すプライマー配列を用いた。【００３８】
【表１】
2019087994.tif 000002
【００３９】
上記で得られた各PCR産物を常法に従ってベクターにクローニングし、塩基配列を決定した。その結果、クローンNo.1084から産生されるモノクローナル抗体は、以下の表に示される塩基配列およびアミノ酸配列を有することが明らかとなった。【００４０】
【化１】
2019087994.tif 000003
【００４１】
上記アミノ酸配列と、配列表中の配列番号とは以下の対応関係となっている。
配列番号１：1084抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列、
配列番号２：1084抗体の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
配列番号３：1084抗体の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、
配列番号４：1084抗体の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列。【００４２】
【化２】
2019087994.tif 000004
【００４３】
上記アミノ酸配列と、配列表中の配列番号とは以下の対応関係となっている。
配列番号５：1084抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、
配列番号６：1084抗体の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列、
配列番号７：1084抗体の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列、
配列番号８：1084抗体の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列。【００４４】
No.1084の重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３および軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３は、上記重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を既知の抗体のアミノ酸配列のデータベース（IMGTのウェブサイト：ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ.ｉｍｇｔ.ｏｒｇ／）と比較して相同性を調べることにより、決定した。【００４５】
実施例２：抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の作製
本実施例では、得られたモノクローナル抗体と細胞傷害剤との抗体−薬物コンジュゲートを作製した。【００４６】
本実施例では、細胞傷害剤としては、モノメチルオーリスタチンＥ（以下、「ＭＭＡＥ」という）を用いた。抗体と細胞傷害剤との連結は以下の通り行った。【００４７】
まず、還元処理時に用いるバッファーの作製を行った。バッファーＡとして、5 mM EDTA（pH8.0）を含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）を作製し、またバッファーＢとして、100 mM リン酸二水素ナトリウム、150 mM 塩化ナトリウム、5 mM EDTA（pH8.0）を調製した。還元剤として、メルカプトエチルアミン塩酸塩（Sigma-aldrich）をバッファーＡに溶解して、還元剤溶液を調製した。
次に、２〜５ｍｇ／ｍＬの抗体を含むDPBSに0.5 M EDTA（pH8.0）を最終EDTA濃度が5 mMになるように加え、抗体溶液を調製した。【００４８】
最終抗体濃度が1 mg/mLになる液量を抗体還元反応の全反応液量とした。全反応液量の1/6量のバッファーＢと、抗体溶液を混合して、最後にバッファーＡで最終抗体濃度を1 mg/mLに調製した。この混合液を37℃で15分間、恒温槽を用いてプレインキュベーションした。その後、混合液全体の1/100量の還元剤溶液を添加して、37℃で30分間恒温槽を用いてインキュベーションした。還元剤の最終濃度は、No.1084及びNo.1849でそれぞれ6.4及び6.5 mMとした。反応終了後、速やかに氷上にサンプルを移し、VIVASPIN TURBO 15（Sartorius, Gottingen, Germany）を用いて、バッファーＡにバッファー置換を行い、還元剤を除去した。バッファー置換は、元の反応液が100万倍以上希釈されるまで繰り返した。
続いて、抗体溶液の最終濃度が0.5 mg/mLになる液量を薬剤連結反応の全反応液量とした。全反応液量の1/6量のバッファーＢと、還元された抗体を含む抗体溶液、フリーになったチオール基の3倍のモル量のリンカー−ＭＭＡＥを混合して、バッファーＡにより抗体の最終濃度が0.5 mg/mLになるように調製した。混合液を転倒混和により、穏やかに攪拌した後に、4℃で18時間静置した。【００４９】
【化３】
2019087994.tif 000005
｛式中、ＰＥＧ12は、ポリエチレングリコール（−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−）12を表し、Ｍｅはメチル基を表す。｝
すなわち、上記リンカーは、右から、マレイミド基、ＰＥＧ、バリン−シトルリン、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、およびＭＭＡＥが連結した化合物である。なお、上記リンカーは、還元された抗体が有するスルフヒドリル基とマレイミド基を介して連結させることができる。【００５０】
最後に、再度VIVASPIN TURBO 15を用いて、DPBSにバッファー置換を行った。バッファー置換は、元の反応液が100万倍以上希釈されるまで繰り返した。作製したADCは、無菌条件下においてPVDF membrane 0.22 μm filter Unitを用いてフィルター処理した後に、抗体濃度を滅菌済みのDPBSで2 mg/mLに調製して分注し、使用時まで-80℃に凍結保存した。凍結はこの1回のみとし、凍結融解後は速やかに各実験に用いた。クローンNo. 1084が産生する抗体のＡＤＣを１０８４ＡＤＣと呼び、クローンNo. 1849が産生する抗体のＡＤＣを１８４９ＡＤＣと呼ぶ。【００５１】
実施例３：得られたモノクローナル抗体の抗原に対する結合活性の評価
本実施例では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Surface Plasmon Resonance）法により抗体と抗原との結合活性を評価した。【００５２】
ヒト組織因子（hTF：UniProtKB-P13726）の発現ベクターは、hTFのアミノ酸配列の33番目から251番目を有するペプチドのＣ末端にHis6タグが付加するようにpET21b(Novagen)に挿入して作成した。目的配列を組み込んだ発現ベクターを大腸菌BL21(DE3) (novagen)に形質転換した。形質転換した大腸菌をOD600が0.6になるまで培養し、終濃度1 mMになるようにIPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)を添加し、さらに3時間培養後、大腸菌を回収した。回収した大腸菌をリゾチームで溶菌し、不溶成分を8 MのUreaで可溶化し、Ni-NTAカラムにて精製後、PBS(-)で透析することでリフォールディングを行った。精製した組み換えヒト組織因子（rhTF）を電気泳動で確認し、最終サンプルとした。【００５３】
ＳＰＲによる測定は、BiaCore T200（GE healthcare社）を用いて行った。組換えヒト組織因子抗原（ｒｈＴＦ抗原）を10 mM 酢酸ナトリウム溶液（pH5.0）にバッファー置換して、タンパク終濃度が2〜10 μg/mLになるように調製した。その後、contact timeを30秒に設定し、アミンカップリング法を用いた基本プロトコールに基づいてCM5 sensor chip（GE healthcare社）に抗原を固定化した。次に、各ADC溶液を終濃度が320 nM、160 nM、80 nM、40 nM、20 nMとなるようにDPBSで希釈して、5段階希釈抗体溶液の系列を調製した。測定はDPBSをランニングバッファーとして用い、contact time及びdissociation timeをそれぞれ60秒及び3200秒に設定し、single-cycle kineticsにより測定を行った。測定結果は、Biacore T200 Evaluation Softwareを用いて解析し、Fitting modelとしてBivalent Analyte modelを採用することにより、Fitting curveを導出し、抗体またはADCのKinetics parameterとしてｋａやｋｄ、ＫＤを算出した。解析により得られた結合速度定数ｋａおよび解離速度定数ｋｄを表２に示す。【００５４】
【表２】
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【００５５】
表２に示されるように、rhTFに対する1084ADCの結合速度定数（Ka）は2.61 ± 0.87 (1/Ms ×104)、解離速度定数（Kd）は8.25 ± 0.64 (1/s ×10-4)、KDは34.96 ± 0.47 (nM)であった。一方、rhTFに対する1849ADCの結合速度定数（Ka）は4.20 ± 1.97 (1/Ms ×104)、解離速度定数（Kd）は0.21 ± 0.09 (1/s ×10-4)、KDは0.54 ± 0.19 (nM)であった。【００５６】
結合速度定数（Ka）は1849ADCが1084ADCの1.61倍であるのに対し、解離速度定数（Kd）は1084ADCが1849ADCの39.29倍であることから、両ADCのKD値（Kd/Ka）の違いは主にKdに起因すると考えられる。すなわち、1849ADCは解離速度が遅く、抗原から解離しにくい性状を持つ一方で、1084ADCは解離速度が速く、抗原から解離しやすい性状を持つことが示唆された。【００５７】
実施例４：作製したＡＤＣの抗腫瘍効果の評価
本実施例では、上記で特性分析されたＡＤＣの抗腫瘍効果を調べた。【００５８】
5週齢のBALB/c-nu/nuマウス雌に吸入麻酔を行い、ヒト膵がん細胞株BxPC3細胞懸濁液を100 μL（1×106 cells）/匹の量でマウスの右背側部に皮下注射した。マウスを飼育し、腫瘍サイズが約600 mm3に達したマウスをBxPC3皮下移植モデルとして実験に使用した。治療開始時を0日目とし、0日目、3日目、7日目、10日目、1日目4及び17日目に5 mg/kgのＡＤＣ（タンパク量換算）をBxPC3皮下移植モデルの尾静脈投与し、以降、腫瘍体積を週2回測定した。腫瘍体積の変化を図２に示す。【００５９】
図２に示されるように、無治療群及びコントロールADC投与群と比較して、1084ADC及び1849ADC投与群では有意な腫瘍増殖抑制効果が見られた。また、1084ADC投与群では薬剤投与開始直後に腫瘍退縮が見られたのに対し、1849ADC投与群では3日目以降に腫瘍退縮が見られた。薬剤投与開始3日及び7日目（図中、印「＊」で示される）において、両者間で統計的な有意差が見られた。（3日目; p < 0.05, 7日目; p < 0.01）【００６０】
実施例３によれば、1084ADCよりも1849ADCの方がTFに対して強く結合し、実施例２および３によれば、1084ADCよりも1849ADCの方がTFから解離し難い。これに対して、本実施例では、抗腫瘍効果は、1084ADCの方が1849ADCよりも優れていた。ADCは、抗体のKD値のみではその有効性を正確に予測できないことを示唆する結果である。【００６１】
実施例５：ＡＤＣの腫瘍内分布
本実施例では、投与後の1084ADCと1849ADCの腫瘍内分布を調べた。【００６２】
BxPC3皮下移植モデルマウスとしては実施例４の方法で得られるマウスを用いた。各ADCをAlexaFluor647Labeling kit（Thermo Fisher Scientific社）を用いて、蛍光標識した。蛍光標識した各ADCをBxPC3皮下移植モデルマウスに5 mg/kg（タンパク量換算）の用量で尾静脈投与し、投与3時間後にマウスを安楽死させ、BxPC3により形成された腫瘍を摘出した。腫瘍組織はTissue-Tec optimal-cutting-temperature compound （Sakura Finetek社）に埋包して、-80℃で凍結保存した。以降の操作は、蛍光画像の撮影まで、可能な限り遮光条件下で行った。【００６３】
次に、凍結した腫瘍組織からLeica CM1860クリオスタット（Leica Biosystems社）を用いて、厚さ6 μmの凍結切片を作製し、スライドガラスにのせて30分間風乾した。その後、4%パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液に15分間室温で浸し、組織切片の固定を行った。続いてDPBSでスライドガラスを3回洗浄した後に、5%（w/v）スキムミルク（Becton, Dickinson and Campany）をDPBSで調製したブロッキング溶液を、組織切片にアプライし、湿潤器内において18時間4℃で静置して、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング溶液をDPBSで洗浄した後に、1次抗体として0.2 mg/mLのgoat anti-mouse CD31 polyclonal antibody（R&D Systems社）をブロッキング溶液で100倍希釈して、組織切片に適量アプライし、湿潤器内において1時間室温で静置した。
再度、DPBSでスライドガラスを3回洗浄した後に、 2次抗体として用いるAlexa FluorR 555 anti-goat polyclonal antibody（Thermo Fisher Scientific社）をブロッキング溶液で500倍希釈して、組織切片に適量アプライし、湿潤器内において1時間室温で静置した。
最後に、DPBSでスライドガラスを3回washした後に、1 mg/mLのDAPIをDPBSで500倍希釈して調製した核染色溶液を、組織切片に適量アプライして、湿潤器内において5分間室温で静置し、核染色を行った。その後、再度DPBSでスライドガラスを3回洗浄して、よく水分を取り除いてからFluoromount-Gを用いてマイクロカバーガラスをかぶせて組織切片を封入した。蛍光免疫染色画像はバーチャルスライドシステム（オリンパス社）を用いて、同条件下で撮影した。得られた染色画像を図３に示す。
図３に示されるように、1084ADC（左図下：赤）は腫瘍組織に均一に分布しているのに対し、1849ADC（右図下：赤）は腫瘍血管（緑）の近くに分布し、腫瘍組織内部まで浸透していないことから、1084ADCは1849ADCより腫瘍組織浸透性に優れることが示唆された。【００６４】
実施例４の結果と合わせて考察すると、1084ADCは1849ADCより腫瘍組織浸透性に優れることが高い抗腫瘍効果を奏する原因の１つであると考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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