(57)【要約】本発明は、微生物の血中バイオマーカー、及び、血中バイオマーカーを利用した微生物の感染を判定するための方法に関する。  本発明の血中バイオマーカーは、ＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質からなる、ことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質からなる、微生物の血中バイオマーカー。
【請求項２】
微生物による感染の有無を判定する請求項１に記載の血中バイオマーカー。
【請求項３】
手術における微生物の感染を判定するための請求項１又は２に記載の血中バイオマーカー。
【請求項４】
手術後１日以降の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の６０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、請求項１−３のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。
【請求項５】
手術後１−３０日の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の６０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、請求項１−３のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。
【請求項６】
手術後１−１４日の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の６０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、請求項１−３のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。
【請求項７】
手術後１−７日の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の６０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、請求項１−３のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。
【請求項８】
手術後１日以降の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の５０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、請求項１−７のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。
【請求項９】
手術後１日以降の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の３０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、請求項１−７のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。
【請求項１０】
手術後１日以降の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の１０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、請求項１−７のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。
【請求項１１】
ＴＣＡ回路中の物質が、α−ケトグルタル酸、コハク酸及びフマル酸からなる群から選択される、１以上の物質である、請求項１−１０のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。
【請求項１２】
手術後１日以降の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、コハク酸及びフマル酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の３０％以下に減少している場合、微生物感染していると判断される、請求項１又は１１に記載の血中バイオマーカー。
【請求項１３】
手術後１日以降の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、コハク酸及びフマル酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の１０％以下に減少している場合、微生物感染していると判断される、請求項１又は１１に記載の血中バイオマーカー。
【請求項１４】
微生物が、細菌、真菌及びウイルスからなる群から選択される、請求項１−１３のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。
【請求項１５】
微生物が細菌である、請求項１−１４のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。
【請求項１６】
細菌が、グラム陽性菌である請求項１５に記載の血中バイオマーカー。
【請求項１７】
細菌が、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、アクネ菌及び腸球菌からなる群から選択される、請求項１５又は１６に記載の血中バイオマーカー。
【請求項１８】
細菌が、黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌である、請求項１５−１７のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。
【請求項１９】
細菌が、黄色ブドウ球菌である、請求項１５−１８のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。
【請求項２０】
細菌が、グラム陰性菌である請求項１５に記載の血中バイオマーカー。
【請求項２１】
手術における微生物の感染を判定するための方法であって、
（１）手術前の対象において、ＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度を測定し、
（２）手術後の対象において、工程（１）で測定した物質の血中濃度を測定し、
（３）（２）で測定した濃度が（１）で測定した濃度よりも減少している場合、微生物に感染していると判断する、
前記判定方法。
【請求項２２】
工程（２）において、工程（１）で測定した物質の血中濃度を手術後１日以降の対象において測定し、（２）で測定した血中濃度が（１）で測定した血中濃度の６０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断する、請求項２１に記載の判定方法。
【請求項２３】
工程（２）において、工程（１）で測定した物質の血中濃度を手術後１日−３０日の対象において測定し、（２）で測定した血中濃度が（１）で測定した血中濃度の６０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断する、請求項２１又は２２に記載の判定方法。
【請求項２４】
ＴＣＡ回路中の物質が、α−ケトグルタル酸、コハク酸及びフマル酸からなる群から選択される、１以上の物質である、請求項２１−２３のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項２５】
工程（２）において、工程（１）で測定した物質の血中濃度を手術後１日以降の対象において測定し、（２）で測定した血中濃度が（１）で測定した血中濃度よりも３０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断する、請求項２４に記載の判定方法。
【請求項２６】
微生物が、細菌、真菌及びウイルスからなる群から選択される、請求項２１−２５のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項２７】
微生物が細菌である、請求項２１−２６のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項２８】
細菌が、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、アクネ菌及び腸球菌からなる群から選択される、請求項２６又は２７に記載の判定方法。
【請求項２９】
細菌が、黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌である、請求項２６−２８のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項３０】
細菌が、黄色ブドウ球菌である、請求項２６−２９のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項３１】
対象における微生物の感染を判定するための方法であって、
ＴＣＡ回路中のα−ケトグルタル酸、コハク酸及びフマル酸からなる群から選択される１以上の物質の血中濃度を測定し、
上記物質の血中濃度が検出限界以下の場合、微生物に感染していると判断する、前記判定方法。
【請求項３２】
微生物が、細菌、真菌及びウイルスからなる群から選択される、請求項３１に記載の判定方法。
【請求項３３】
微生物が細菌である、請求項３１又は３２に記載の判定方法。
【請求項３４】
細菌が、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、アクネ菌及び腸球菌からなる群から選択される、請求項３２又は３３に記載の判定方法。
【請求項３５】
細菌が、黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌である、請求項３２−３４のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項３６】
細菌が、黄色ブドウ球菌である、請求項３２−３５のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項３７】
検出限界以下とは、０．０３μＭ以下である、請求項２９−３３のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項３８】
対象が、手術後１日以降の哺乳動物である、請求項３１−３７のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項３９】
対象が、手術後１日−３０日の哺乳動物である、請求項３１−３８のいずれか１項に記載の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の血中バイオマーカー及び当該血中バイオマーカーを利用した微生物の感染を判定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染症は、細菌、真菌、ウイルス、寄生虫、異常プリオン等の病原体の感染より、宿主に生じる望まざる反応（病気）の総称である。感染症には、感染しても症状を呈さないもの、感染しても一定期間経過後に症状がでるものも多い。微生物学、免疫学、薬理学、内科学、外科学、公衆衛生学等の進歩を背景として、感染症の診断、治療、予防を扱う感染症学が発展しつつある今日であっても、世界全体では未だに死因の最も高い割合を感染症が占めている。感染症を早期に診断し、早期に必要な治療を行うことは感染症の発症、重篤化を防ぐ意味で、極めて重要である。【０００３】
細菌等の微生物の感染症は、例えば、手術後に発症する場合がある。整形外科領域など種々の領域において手術療法の進歩はめざましく、多くの患者の運動・疼痛・内臓などの機能面での回復や生命予後の延長などに寄与している。しかし手術後の感染症はその治療成績を大幅に低下させる合併症であり、早期発見による対処はその影響を最低限にとどめるために非常に重要である。通常術後感染は手術部位の疼痛の悪化や、膿の排出、発熱などの臨床症状や画像所見に加えて、白血球やＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）等による血液検査の炎症所見などで総合的に診断が下される。しかしながら、臨床症状・血液検査ともに顕在化するまでに術後１−２週間以上かかるのが現状である。その理由として既存の血液検査では手術の侵襲による影響が数日から１週間程度残存してしまい、感染との区別がつかないからである。即ち、術後感染症は手術自体の侵襲により血中炎症性サイトカインが上昇するため、術後炎症の遷延化は手術侵襲によるものか、術後感染症の発症によるものかの鑑別が困難である。【０００４】
手術後以外に、外傷後または易感染宿主に感染症が発症することがある。例えば、自己免疫疾患などの慢性炎症性疾患患者において感染症が発症することがあるが、その早期の診断は困難である。【０００５】
Ｐｉｅｒｒａｋｏｓ  Ｃ，Ｖｉｎｃｅｎｔ  ＪＬ．Ｓｅｐｓｉｓ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ．２０１０；１４（１）：Ｒ１５．によると感染症全般のバイオマーカーとして、１７８もの物質を報告している。しかしながら、そのいずれも感染症において高い特異性は報告されていない。感染症のバイオマーカーとして高い感度特異度が報告されているプロカルシトニンも、Ｓｈｅｎ  ＣＪ，Ｗｕ  ＭＳ，Ｌｉｎ  ＫＨ，Ｌｉｎ  ＷＬ，Ｃｈｅｎ  ＨＣ，Ｗｕ  ＪＹ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｊｏｉｎｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：  ａ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２０１３  Ｊｕｎ；３２（６）：８０７−１４（例えば、ｐ．８１３、１８−２２行）によるとすべての感染症においてはその有用性は確立されていない。【０００６】
特開２０１１−９５０５２は、ベントラキシン３及びアズロジシンを含んでなる、感染症の疾患マーカー、及び、当該疾患マーカーを利用した感染症の罹患の有無の検出方法を記載している。具体的に開示されているのは、ベントラキシン３及びアズロジシンの複合体を、抗ベントラキシン３抗体を用いて検出する方法であり、抗体の特異性に依存する、複雑な工程を含む方法であり、また感度も良いとは言えない。【０００７】
上記のように微生物の感染症の診断に特異的なバイオマーカーは、臨床的意義が大きいにも関わらず、実用的で感染症を早期に同定できるバイオマーカーは未だ提供されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特願２０１１−９５０５２
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  １４（１）Ｒ１５（２０１０）
【非特許文献２】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ＩｎｆｅｃｔＤｉｓ．３２（６）８０７（２０１３）
【非特許文献３】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００９，８１，６１６５−６１７４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、上記問題解決のために鋭意研究に努めた結果、微生物に感染した場合、感染初期の段階より、ＴＣＡ回路（クエン酸回路）中の特定の５つの物質（α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸）が、感染していない場合と比較してその血中濃度が減少していることを見出し、本発明を想到した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。【００１２】
［態様１］
ＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質からなる、微生物の血中バイオマーカー。【００１３】
［態様２］
微生物による感染の有無を判定する態様１に記載の血中バイオマーカー。【００１４】
［態様３］
手術における微生物の感染を判定するための態様１又は２に記載の血中バイオマーカー。【００１５】
［態様４］
手術後１日以降の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の６０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、態様１−３のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。【００１６】
［態様５］
手術後１−３０日の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の６０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、態様１−３のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。【００１７】
［態様６］
手術後１−１４日の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の６０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、態様１−３のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。【００１８】
［態様７］
手術後１−７日の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の６０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、態様１−３のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。【００１９】
［態様８］
手術後１日以降の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の５０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、態様１−７のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。【００２０】
［態様９］
手術後１日以降の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の３０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、態様１−７のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。【００２１】
［態様１０］
手術後１日以降の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の１０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、態様１−７のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。【００２２】
［態様１１］
ＴＣＡ回路中の物質が、α−ケトグルタル酸、コハク酸及びフマル酸からなる群から選択される、１以上の物質である、態様１−１０のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。【００２３】
［態様１２］
手術後１日以降の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、コハク酸及びフマル酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の３０％以下に減少している場合、微生物感染していると判断される、態様１又は１１に記載の血中バイオマーカー。【００２４】
［態様１３］
手術後１日以降の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、コハク酸及びフマル酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の１０％以下に減少している場合、微生物感染していると判断される、態様１又は１１に記載の血中バイオマーカー。【００２５】
［態様１４］
微生物が、細菌、真菌及びウイルスからなる群から選択される、態様１−１３のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。【００２６】
［態様１５］
微生物が細菌である、態様１−１４のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。【００２７】
［態様１６］
細菌が、グラム陽性菌である態様１５に記載の血中バイオマーカー。【００２８】
［態様１７］
細菌が、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、アクネ菌及び腸球菌からなる群から選択される、態様１５又は１６に記載の血中バイオマーカー。【００２９】
［態様１８］
細菌が、黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌である、態様１５−１７のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。【００３０】
［態様１９］
細菌が、黄色ブドウ球菌である、態様１５−１８のいずれか１項に記載の血中バイオマーカー。【００３１】
［態様２０］
細菌が、グラム陰性菌である態様１５に記載の血中バイオマーカー。【００３２】
［態様２１］
手術における微生物の感染を判定するための方法であって、
（１）手術前の対象において、ＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度を測定し、
（２）手術後の対象において、工程（１）で測定した物質の血中濃度を測定し、
（３）（２）で測定した濃度が（１）で測定した濃度よりも減少している場合、微生物に感染していると判断する、
前記判定方法。【００３３】
［態様２２］
工程（２）において、工程（１）で測定した物質の血中濃度を手術後１日以降の対象において測定し、（２）で測定した血中濃度が（１）で測定した血中濃度の６０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断する、態様２１に記載の判定方法。【００３４】
［態様２３］
工程（２）において、工程（１）で測定した物質の血中濃度を手術後１日−３０日の対象において測定し、（２）で測定した血中濃度が（１）で測定した血中濃度の６０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断する、態様２１又は２２に記載の判定方法。【００３５】
［態様２４］
ＴＣＡ回路中の物質が、α−ケトグルタル酸、コハク酸及びフマル酸からなる群から選択される、１以上の物質である、態様２１−２３のいずれか１項に記載の判定方法。【００３６】
［態様２５］
工程（２）において、工程（１）で測定した物質の血中濃度を手術後１日以降の対象において測定し、（２）で測定した血中濃度が（１）で測定した血中濃度よりも３０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断する、態様２４に記載の判定方法。【００３７】
［態様２６］
微生物が、細菌、真菌及びウイルスからなる群から選択される、態様２１−２５のいずれか１項に記載の判定方法。【００３８】
［態様２７］
微生物が細菌である、態様２１−２６のいずれか１項に記載の判定方法。【００３９】
［態様２８］
細菌が、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、アクネ菌及び腸球菌からなる群から選択される、態様２６又は２７に記載の判定方法。【００４０】
［態様２９］
細菌が、黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌である、態様２６−２８のいずれか１項に記載の判定方法。【００４１】
［態様３０］
細菌が、黄色ブドウ球菌である、態様２６−２９のいずれか１項に記載の判定方法。【００４２】
［態様３１］
対象における微生物の感染を判定するための方法であって、
ＴＣＡ回路中のα−ケトグルタル酸、コハク酸及びフマル酸からなる群から選択される１以上の物質の血中濃度を測定し、
上記物質の血中濃度が検出限界以下の場合、微生物に感染していると判断する、前記判定方法。【００４３】
［態様３２］
微生物が、細菌、真菌及びウイルスからなる群から選択される、態様３１に記載の判定方法。【００４４】
［態様３３］
微生物が細菌である、態様３１又は３２に記載の判定方法。【００４５】
［態様３４］
細菌が、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、アクネ菌及び腸球菌からなる群から選択される、態様３２又は３３に記載の判定方法。【００４６】
［態様３５］
細菌が、黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌である、態様３２−３４のいずれか１項に記載の判定方法。【００４７】
［態様３６］
細菌が、黄色ブドウ球菌である、態様３２−３５のいずれか１項に記載の判定方法。【００４８】
［態様３７］
検出限界以下とは、０．０３μＭ以下である、態様２９−３３のいずれか１項に記載の判定方法。【００４９】
［態様３８］
対象が、手術後１日以降の哺乳動物である、態様３１−３７のいずれか１項に記載の判定方法。【００５０】
［態様３９］
対象が、手術後１日−３０日の哺乳動物である、態様３１−３８のいずれか１項に記載の判定方法。
【発明の効果】
【００５１】
本発明は、代謝産物の解析において、特に、これまで全く着目されていなかったＴＣＡ回路の物質が顕著に変化していたことを発見したことによる。ＴＣＡ回路の特定の物質が、著しく減少する、あるいは、ほとんど検出できないという顕著な差であるので、微生物の感染のバイオマーカーとして非常に有効である。また、感染のごく初期の、従来のマーカーでは検出不可能であった早期における検出・判定が可能である。さらに、本発明のバイオマーカーはこれらの物質の血中濃度に基づくので、測定も簡便で、迅速、かつ、安価である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１Ａ】図１Ａは、実施例の光イメージングに用いた超高感度ＣＣＤカメラを使用して生体内の微弱な光を捉えることができる器具（製品名：ＩＶＩＳ−Ｌｕｍｉｎａ  ＬＴ）（Ｓｕｍｍｉｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  社製）の写真である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、発光細菌を注入した大腿骨骨髄炎モデルマウスについて、光イメージングにより細菌の感染度合いを示した写真図である。発光細菌が発する微弱な光を動物の体表から超高感度ＣＣＤカメラが検出し、細菌の存在する部位が疑似カラーによる光イメージとして描出される。赤い部分ほど細菌量が多く、部分ほど細菌量が少ない。また、酸素とＡＴＰの存在下でのみ発光するため、生きた細菌のみが発光し、細菌が死滅した場合は発光しない。
【図２】図２は、細菌量と発光量の相関関係を示した図である。細菌量（×１０７ＣＦＵ）と発光量（×１０６光子／秒／ｃｍ２）とは強い正の相関関係を示す。すなわち、発光量から細菌量が算出できる。
【図３】図３は、実施例において大腿骨骨髄炎モデルマウスを作製し、光イメージングで感染を確認した工程を示した模式図である。
【図４】図４は、実施例における「感染群」、「シャム群」、「コントロール群」について、大腿骨にドリルで穴をあける手術の有無、及び、発光細菌の注入の有無、を整理した表である。
【図５】図５は、メタボローム解析の結果に基づき、微生物の感染を判定する血中バイオマーカーを選定するための条件を示した図である。コントロール群とシャム群で差がなく、かつ、感染群でのみ高値（または低値）をとる物質が、手術後の感染を早期に判定できる血中バイオマーカーとして重要であると考えて、選定した。
【図６】図６は、メタボローム解析の結果を示す図である。赤色（＋１〜＋３）が高値、緑色（−１〜−３）が低値を示す。全部で２９７の物質が同定され、感染群で高濃度な物質は６６種類、そのうち統計学的に有意な物質は１２種類であった。感染群で低濃度な物質は１９５種類、統計学的に有意な物質は４８種類であった。
【図７】図７は、感染群で高値をとる１２物質について、コントロールを１．０としたときの、シャム群及び感染群の相対値を示したグラフである。各物質について、グラフの上から順に、「コントロール群」、「シャム群」、「感染群」の結果を示す。
【図８】図８は、感染群で低値をとる４８物質について、コントロールを１．０としたときの、シャム群及び感染群の相対値を示したグラフである。各物質について、グラフの上から順に、「コントロール群」、「シャム群」、「感染群」の結果を示す。コハク酸、α−ケトグルタル酸（２−オキソグルタル酸、２−ＯＧ）、フマル酸の３物質は、「感染群」では、検出限界以下まで減少した。
【図９】図９は、β酸化の模式図である。実施例では、ＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）が、「感染群」においてのみ検出不能であった（枯渇）。これは、感染を一種の飢餓状態と解し、β酸化が亢進したためと考えられた。
【図１０】図１０は、ＴＣＡ回路の模式図である。
【図１１】図１１は、メタボローム解析の結果、ＴＣＡ回路の各物質が「コントロール群」、「シャム群」、「感染群」でどのように相違するか、図７及び図８の結果をＴＣＡ回路図中の表示したものである。各物質に関するグラフは青色（左）、緑色（中央）、赤色（右）が各々、「コントロール群」、「シャム群」、「感染群」の結果を示す。ＴＣＡ回路の、α−ケトグルタル酸（２−ＯＧ）より下流の物質が、「感染群」においてのみ枯渇し、一方、「コントロール群」、「シャム群」では維持されていることが理解される。
【図１２】図１２は、本発明の技術的思想を理解するための模式図である。実施例において、ＴＣＡ回路のうちα−ケトグルタル酸からリンゴ酸までの５つの物質が、感染群でのみほぼ枯渇していた。これはイソクエン酸からα−ケトグルタル酸が生成される反応においては必要なＮＡＤ＋が感染群ではβ酸化の亢進により枯渇したことにより、α−ケトグルタル酸以降の物質が産生されなかったためと考えられる。本発明は、ＴＣＡ回路のα−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸の５つの物質を、感染を早期に発見する血中バイオマーカーとして利用する。
【図１３】図１３は、整形外科における術後感染を疑われる３名の患者について、血中（血漿中）のクエン酸及びコハク酸の存在を調べた結果を示す。クエン酸は、ＵＶ吸収性測定キット（Ｆ−キットクエン酸・Ｊ．Ｋ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）、コハク酸は、比色法による測定キット（コハク酸測定キット（Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製）を用いて測定した。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本発明者らは、週齢１２週のマウスで大腿骨に細菌を注入する手術を施行した骨髄炎モデルマウス１２匹（感染群）、同様の手術のみおこない細菌を注入しないマウス１２匹（シャム群）、手術をおこなわない１２匹（コントロール群）を使用した。術後３日目に腹部大動脈から採血をおこない、約１２００の代謝産物を検出できるメタボローム解析を実施し、３群間で比較した。その結果、骨髄炎モデルマウスで特異的に高値となる物質が１２種類、特異的に低値となる物質が４８種類同定された。その中でもＴＣＡ回路に関与する物質について、イソクエン酸から先の物質が感染群でのみほぼ枯渇しており、α−ケトグルタル酸（２−オキソグルタル酸、２−ＯＧ）、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸の５つの物質にその影響がみとめられた。本発明は、この５つの物質を微生物感染の血中バイオマーカーとして利用するものである。
【００５４】
本発明は非限定的に以下の態様を含む。
１．微生物中の血中バイオマーカー
本発明は、微生物中の血中バイオマーカーに関する。
【００５５】
本発明の血中バイオマーカーは、ＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質からなる。
【００５６】
（１）ＴＣＡ回路中の物質
「ＴＣＡ回路」とは、好気的代謝に関する最も重要な生化学反応回路であり、酵素呼吸を行う生物全般に見られる。解糖や脂肪酸のβ酸化によって生成するアセチルＣｏＡがこの回路に組み込まれ、酸化されることによって、ＡＴＰや電子伝達系で用いられるＮＡＤＨなどが生じ、効率の良いエネルギー生産を可能にしている（図１０）。また、アミノ酸などの生合成の前駆体も供給する。ＴＣＡ回路は、ＴＣＡサイクル、トリカルボン酸回路、クエン酸回路、クレブス回路、などと呼ばれる場合もある。
【００５７】
本発明者らは、微生物感染したマウスでは、感染していないマウスと比較して、ＴＣＡ回路中のα−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸が減少していることを見出し、本発明を想到した。本発明は、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質からなる血中バイオマーカーであり、これらの物質のうち１またはそれより多くの血中濃度が正常値（感染前）と比較して減少している、あるいは、これらの物質のうち１またはそれより多くが枯渇している、即ち、血中濃度が検出限界以下の場合に、微生物に感染していると判断する。
【００５８】
本発明の血中バイオマーカーは、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、５つの物質のうち、１以上、２以上、３以上、４以上又は５つの物質からなる。本発明において、５つの物質のうち、特に、α−ケトグルタル酸、コハク酸及びフマル酸の３つの物質は、微生物の感染群では枯渇している（血中濃度が検出限界以下）ことが明らかになった。よって、好ましくは、本発明の血中バイオマーカーは、α−ケトグルタル酸、コハク酸及びフマル酸からなる群から選択される、１以上の物質である。好ましくは、本発明の血中バイオマーカーは、α−ケトグルタル酸、コハク酸及びフマル酸からなる群から選択される、３つの物質のうち、１以上、２以上又は３つの物質からなる。
【００５９】
（２）本発明の血中バイオマーカーの判定対象
微生物
本発明の血中バイオマーカーは、対象への微生物の感染を判定することが可能なバイオマーカーである。「微生物」とは、人の肉眼でその存在が判別できず、顕微鏡などによって観察できる程度以下の大きさの微小な生物を指す総称である。細菌（真正細菌）、古細菌に加え、真菌（菌類）、原生生物、粘菌、藻類などの真核生物、ワムシのような小型の動物も含まれる。本発明の血中バイオマーカーを用いて判定可能な「微生物」は、狭義の生物に限定されず、対象（生体）に対し、感染可能で何らかの変化を起こしうる微小な物質であればよい。よって、「ウイルス」等の生体に感染可能な物質も、本発明、本明細書においては「微生物」に含む。
【００６０】
本発明における「微生物」は、好ましくは、細菌、真菌及びウイルスからなる群から選択される。より好ましくは、細菌である。細菌は、外科的手術において、最も感染が懸念される（感染を避けるべき）微生物の一態様である。
【００６１】
細菌
「細菌」（真正細菌）は、ｓｎ−グリセロール３リン酸の脂肪酸エステルより構成される細胞膜を有する原核生物で、大腸菌、枯草菌、シアノバクテリアなどを含む生物群で、病原細菌として、ヒトや動物などの態様の感染症の原因となる。ｓｎ−グリセロール１リン酸のイソブレノイドエーテルより構成される細胞膜を有する、古細菌は、細菌（真正細菌）とは異なる系統に属する。
【００６２】
細菌は、グラム染色（細胞壁の相違で、染色に陽性の菌と陰性の菌に分かれる）、構造的または解剖学的性質（直接観察）、化学的性質（脂質の構造等）などによって、分類される。
【００６３】
本発明の一態様において、細菌はグラム陽性菌である。「グラム陽性菌」とは、グラム染色により紺青色あるいは紫色に染色される細菌の総称で、一般に、外膜を持たない、厚いペプチドグルカン層が存在するという特徴を有する。グラム陽性菌の多くがフィルミクテス門と放射菌門に分類される。グラム陽性菌に属する細菌の属には、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（アクネ菌等）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（腸球菌）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）（リステリア・モノサイトゲネス等）、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（肺炎球菌、緑色レンサ球菌、β溶血性レンサ球菌等）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）（ボツリヌス菌、破傷風菌等）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｌｕｓ）（炭疽菌、セレウス菌、枯草菌等）などが含まれる。
【００６４】
ブドウ球菌属は、直径１μｍ程度のグラム陽性球菌で、ブドウの房状の不規則な配列を通性嫌気性の有機栄養菌である。２０１６年の現在、ブドウ球菌属の細菌は３５種類に分類されており、「黄色ブドウ球菌」「表皮ブドウ球菌」、「腐性ブドウ球菌」の３菌種に大別される。「黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）」は、ヒトや動物の皮膚、消化管の常在菌で、膿瘍等の様々な表皮感染症や食中毒、また肺炎、髄膜炎、敗血症等の重篤・致死的な感染症の起因菌でもある。黄色ブドウ球菌による感染は、表皮およびその直下の組織に限局した部位に見られることが多い、外科的手術において、最も感染が懸念される（感染を避けるべき）細菌の一種である。黄色ブドウ球菌は、抗生物質メチシリンに耐性を示すメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）の他、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）などの薬剤耐性菌も含む。「表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）」は、主として鼻腔や表皮に常在する。通常は非病原性であり、他の病原菌から表皮を守るバリアーや、表皮を健康に保つ役目を果たしている菌であるが、体内に侵入すると病原性を発することがある。プラスチック表面などに対する付着性が強くまた表皮の常在菌であるため、手術の際にカテーテルや心臓弁などの医療用器具に付着して体内に侵入することがある。特に体内に留置するタイプの医療器具に付着して、そこで増殖することによって深在性の化膿症の原因になることがある。抗生物質メチシリンに耐性を示すメチシリン感受性表皮ブドウ球菌（ＭＳＳＥ）の他、メチシリン耐性表皮ブドウ球菌（ＭＲＳＥ）などの薬剤耐性菌も含む。
【００６５】
プロピオニバクテリウム属は、無芽胞嫌気桿菌で皮膚や粘膜の常在細菌で、糖からプロピオン酸を産生する。代表的な筋腫として、ニキビの原因と言われているアクネ菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）を含む。
【００６６】
「腸球菌」は、特定の細菌種ではなくエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）に属する約２０種の総称である。腸球菌は、主にヒトを含む哺乳類の腸管内に存在する一群の常在菌で、球菌の形態をとる。健康な人間の腸内から一般的に検出され、通性嫌気性でグラム陽性の連鎖球菌であって、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロースを分解し、６０℃の加熱に３０分間耐える菌が該当する。主な種としてＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属のＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅ．ａｖｉｕｍ、Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｅ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓなどがある。病原性は弱く、通常であれば害はないが、手術後、免疫不全など細菌感染に対する抵抗力が低下した患者に対する日和見感染の例が知られ、場合によっては敗血症などを引き起こすおそれがある。特に、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）が問題となる。
【００６７】
細菌は、好ましくは黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、アクネ菌及び腸球菌からなる群から選択される。より好ましくは、細菌は、黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌である。一態様において、黄色ブドウ球菌である。一態様において、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、又は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＥ）である。
【００６８】
本発明の一態様において、細菌は「グラム陰性菌」である。「グラム陰性菌」は、グラム染色において紫色（クリスタルバイオレット）に染まらず、赤色又は桃色に見える細菌の総称である。グラム陰性菌は、細胞質性の膜、薄いペプチドグリカン層（グラム陽性菌ではより厚い層である）などの特徴を有する。グラム陰性菌の病原性には、細胞壁のある種の成分が関与している。グラム陰性菌の膜の外葉は脂質部位が内毒素として機能する複雑なリポ多糖類（ＬＰＳ）により構成されている。  循環系に内毒素が侵入した場合、発熱、呼吸促拍、低血圧を引き起こす。エンドトキシンショックを引き起こすと死亡することがある。ヒトではＬＰＳはサイトカイン産生、免疫系の活性化による先天性免疫反応を引き起こす。炎症はサイトカイン産生による通常の反応であり、宿主にとって害となり得る。
【００６９】
プロテオバクテリアはグラム陰性菌の主要なグループであり、大腸菌、サルモネラ、ヘリコバクター、腸内細菌科、シュードモナス、モラクセラ、ステノトロフォモナ、ブデロビブリオ、酢酸菌、レジオネラ、そしてＷｏｌｂａｃｈｉａなどのα−プロテオバクテリアが含まれる。他の代表的なグラム陰性菌のグループとして緑膿菌、アシネトバクター、シアノバクテリア、スピロヘータ、緑色硫黄細菌、バクテロイデスが含まれる。
【００７０】
本発明の一態様において、細菌は、大腸菌、サルモネラ、ヘリコバクター、緑膿菌又はアシネトバクターである。
【００７１】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は、グラム陰性の桿菌で通性嫌気性菌に属し、環境中に存在するバクテリアの主要な種の一つである。大腸菌の株は多数報告されており、一部では動物に害となりうる性質を持つものもある。大部分の健康な成人の持っている株では下痢を起こす程度で何の症状も示さないものがほとんどであるが、幼児や病気などによって衰弱している者、あるいはある種の薬物を服用している者などでは、特殊な株が病気を引き起こすことがあり、時として死亡に至ることもある。例えば、ヒトの場合、大腸内ではなく、血液中や尿路系に侵入した場合（異所感染した場合）に病原体となる。内毒素（リポ多糖）を産生するため、大腸菌による敗血症は重篤なエンドトキシンショックを引き起こす。敗血症の原因（明らかになる場合）として最も多いのは尿路感染症であるが、大腸菌は尿路感染症の原因菌として最も多いものである。大腸菌の株の中でも特に強い病原性を示すものは病原性大腸菌とよばれる。食品衛生学分野では病原大腸菌ともよぶ。ただし、病原性大腸菌の中でも赤痢を起こす株については特に赤痢菌とよび、衛生管理上の問題から別種扱いされる。
【００７２】
真菌
「真菌」（菌類）とは、一般にキノコ・カビ・酵母と呼ばれる生物の総称であり、菌界に属する生物を指す。外部の有機物を利用する従属栄養生物であり、分解酵素を分泌して細胞外で養分を消化し、細胞表面から摂取する。
【００７３】
医学及び獣医学領域においては菌類を真菌と呼び、その学問を医真菌学と称する。真菌による感染症は一般に真菌症と呼ばれ、患部が皮膚の角質などに止まり真皮に及ばない表在性真菌症と、患部が真皮以降の皮下組織におよぶ深部表在性真菌症や、脳、肺、心臓などの内部臓器まで及ぶ深在性真菌症（全身性真菌症、内臓真菌症）に大別される。菌類によってヒトやその他の動物が感染する病気（感染症）として、白癬菌による白癬（水虫、たむし、およびしらくも）やカンジダによるカンジダ症、クリプトコックスによるクリプトコックス症、アスペルギルスによるアスペルギルス症、プネウモキスチス（ニューモシスチス）によるニューモシスチス肺炎などがあり、臨床的に問題となっている。
【００７４】
ウイルス
「ウイルス」は、他の生物の細胞を利用して、自己を複製させることのできる微小な構造体で、タンパク質の殻とその内部に入っている核酸からなる。ウイルスは細胞を構成単位としないが、遺伝子を有し、他の生物の細胞を利用して増殖できるという、生物の特徴を持っている。ウイルスは、感染することで宿主の恒常性に影響を及ぼし、病原体としてふるまうことがある。本発明の血中バイオマーカーによって感染が判定されうる微生物には、微小の感染性因子である「ウイルス」も含む。
【００７５】
ウイルスは遺伝物質の違いから、ＤＮＡを主要な構成要素とするＤＮＡウイルスとＲＮＡを構成要素とするＲＮＡウイルスに大別される。ＤＮＡウイルスには、非限定的に、天然痘ウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ＥＢウイルス、パルボウイルス等が含まれる。ＲＮＡウイルスには、非限定的に、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、ＳＡＲＳウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、エボラウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス等が含まれる。
【００７６】
（３）血中バイオマーカーの血中濃度
本発明は、細菌等の微生物が対象に感染したか否かを、ＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質を血中バイオマーカー（指標）として判定する、というものである。感染とは、生物の体内もしくは表面に、より体積の小さい微生物等の病原体が寄生し、増殖するようになることである。
【００７７】
本発明の血中バイオマーカーを使用できる「対象」は、微生物が感染し宿主となる可能性がある生体であれば特に限定されない。好ましくは、ヒト、サル、ゴリラ、オラウータン、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物である。より好ましくは、ヒト、サル等の霊長類である。最も好ましくはヒトである。
【００７８】
本発明者らは、ＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、微生物の感染により、正常値（感染前）と比較して減少する、あるいは、これらの物質のうち１またはそれより多くが枯渇する、ことを見出し、本発明を想到した。よって、これらの物質が、正常値（感染前）と比較して減少している、あるいは、これらの物質のうち１またはそれより多くが枯渇している、即ち、血中濃度が検出限界以下の場合に、微生物に感染していると判断する。
【００７９】
これらの各物質の血中濃度は、例えば、以下のようにして測定可能である。非限定的に、例えば、ヒトの場合、３ｍｌの血液を採取する。例えば、酵素法、Ｆ−キットシリーズ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）により測定することができる。例えば、コハク酸は、コハク酸測定キット（Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製）を用いて測定することができる。あるいは、例えば、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００９，８１，６１６５−６１７４に記載の方法によって、各物質を測定することも可能である。
【００８０】
微生物に感染していない状態の各物質の血中濃度を予め測定しておくことにより、感染の可能性が疑われる事情が生じた後の血中濃度と比較することが可能である。感染の可能性が疑われる事情とは、例えば、外科的な手術、外傷、感染者との接触、局所の発赤・腫脹・熱感等である。なお、α−ケトグルタル酸、コハク酸及びフマル酸の３つの物質については、微生物の感染により、血中濃度が検出限界以下になることが本発明において見出された。よって、これらの３物質については、正常値が測定されていない場合でも、血中バイオマーカーとして利用可能である。
【００８１】
本発明の微生物の血中バイオマーカーは、一態様として、微生物の感染の有無を判定するために使用することができる。微生物の感染は、手術（手術中、手術後）、治療（注射等）、外傷などによって、あるいは、宿主が易感染宿主の場合（関節リウマチなどの自己免疫疾患、肝機能障害、腎機能障害、免疫不全等）の場合などに生じうる。
【００８２】
一態様において、本発明の血中バイオマーカーは、手術における微生物の感染を判定する。以下、非限定的に、「手術」を感染の可能性が疑われる事情の一例として、本発明の態様を説明する。
【００８３】
本発明の一態様において、手術（感染の可能性が疑われる事情の例）後１日以降の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度を、手術前の対応する物質の血中濃度と比較する。好ましくは、手術後２日以降、３日以降である。好ましくは、手術後３０日以内、１４日以内、７日以内、５日以内である。好ましくは、手術後１−３０日、手術後１−１４日、手術後１−７日である。より好ましくは、１−６日、２−５日、３−４日である。
【００８４】
手術後の血中濃度と手術前の上記物質の濃度を比較した結果、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度と比較して減少している場合、微生物に感染していると判断される。「減少している場合」とは、非限定的に、例えば、手術後の血中濃度と手術前の上記物質の濃度を比較した結果、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度と比較して６０％以下に減少している場合、より好ましくは、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下である。一態様において、手術後の血中濃度は検出限界以下である。検出限界以下とは、例えば、０．０５μＭ以下、０．０３μＭ以下、０．０１μＭ以下である。特に、α−ケトグルタル酸、コハク酸及びフマル酸の３つの物質は、感染による減少の度合いが著しい。
【００８５】
本発明の血中バイオマーカーは、非限定的に、例えば以下の態様を含む。
−手術後１日以降の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の６０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、血中バイオマーカー。
−手術後１−３０日の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の６０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、血中バイオマーカー。
−手術後１−１４日の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の６０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、血中バイオマーカー。
−手術後１−７日の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の６０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、血中バイオマーカー。
−手術後１日以降の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の５０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、血中バイオマーカー。
−手術後１日以降の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の３０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、血中バイオマーカー。
−手術後１日以降の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の１０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断される、血中バイオマーカー。
−手術後１日以降の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、コハク酸及びフマル酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の３０％以下に減少している場合、微生物感染していると判断される、血中バイオマーカー。
−手術後１日以降の血中のＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、コハク酸及びフマル酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度が、手術前の対応する物質の血中濃度の１０％以下に減少している場合、微生物感染していると判断される、血中バイオマーカー。
【００８６】
２．手術における微生物の感染を判定するための方法
本発明はまた、手術における微生物の感染を判定するための方法に関する。
【００８７】
本発明の判定方法は、
（１）手術前の対象において、ＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質の血中濃度を測定し、
（２）手術後の対象において、工程（１）で測定した物質の血中濃度を測定し、
（３）（２）で測定した濃度が（１）で測定した濃度よりも減少している場合、微生物に感染していると判断する、
という工程を含む。
【００８８】
「微生物」、「ＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸及びリンゴ酸からなる群から選択される、１以上の物質」、「血中濃度」等の定義、説明は、「１．微生物中の血中バイオマーカー」において記載した通りである。
【００８９】
「（２）手術後の対象において、工程（１）で測定した物質の血中濃度を測定」に関し、手術後から何日目に測定をするのかについて、「（２）で測定した濃度が（１）で測定した濃度よりも減少している場合」については、「１．微生物中の血中バイオマーカー」において記載した内容と同様である。
【００９０】
本発明の判定方法、非限定的に、例えば以下の態様を含む。
−上記工程（２）において、工程（１）で測定した物質の血中濃度を手術後１日以降の対象において測定し、（２）で測定した血中濃度が（１）で測定した血中濃度の６０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断する、判定方法。
−上記工程（２）において、工程（１）で測定した物質の血中濃度を手術後１日−３０日の対象において測定し、（２）で測定した血中濃度が（１）で測定した血中濃度の６０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断する、判定方法。
−工程（２）において、工程（１）で測定した物質の血中濃度を手術後１日以降の対象において測定し、（２）で測定した血中濃度が（１）で測定した血中濃度よりも３０％以下に減少している場合、微生物に感染していると判断する、判定方法。
【００９１】
３．対象における微生物の感染を判定するための方法
本発明また、対象における微生物の感染を判定するための方法に関する。
【００９２】
本発明の判定方法は、
ＴＣＡ回路中のα−ケトグルタル酸、コハク酸及びフマル酸からなる群から選択される１以上の物質の血中濃度を測定し、
上記物質の血中濃度が検出限界以下の場合、微生物に感染していると判断する、という工程を含む。
【００９３】
α−ケトグルタル酸、コハク酸及びフマル酸の３つの物質については、微生物の感染により、血中濃度が検出限界以下になることが本発明において見出された。よって、これらの３物質については、正常値が測定されていない場合でも、血中濃度が検出限度以下の場合に、微生物が感染していると判定することができる。
【００９４】
「微生物」、「ＴＣＡ回路中の、α−ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸からなる群から選択される、１以上の物質」、「血中濃度」「検出限度以下」等の定義、説明は、「１．微生物中の血中バイオマーカー」において記載した通りである。
【００９５】
本発明の判定方法、非限定的に、例えば以下の態様を含む。
−検出限界以下とは、０．０３μＭ以下である、判定方法。
−対象が、手術後１日以降の哺乳動物である、判定方法。
−対象が、手術後１日−３０日の哺乳動物である、判定方法。
【実施例】
【００９６】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。【００９７】
実施例１  骨髄炎モデルマウスを用いた新規バイオマーカーの探索
本実施例では、骨髄炎モデルマウスを用いた新規バイオマーカーの探索を行った。具体的には、週齢１２週のマウスで大腿骨に細菌を注入する手術を施行した骨髄炎モデルマウス１２匹（感染群）、同様の手術のみおこない細菌を注入しないマウス１２匹（シャム群）、手術をおこなわない１２匹（コントロール群）を使用した。術後３日目に腹部大動脈から採血をおこない、約１２００の代謝産物を検出できるメタボローム解析を実施し、３群間で比較した。【００９８】
材料及び方法
（１）光イメージングと発光細菌
本実施例には光イメージング（ＩＶＩＳ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）と発光細菌（ルシフェラーゼ発現黄色ブドウ球菌）を使用した。光イメージングは超高感度ＣＣＤカメラを使用して生体内の微弱な光を捉えることができる器具（製品名：ＩＶＩＳ−Ｌｕｍｉｎａ  ＬＴ）（Ｓｕｍｍｉｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）であり、発光細菌は生存する限り微弱な蛍光を発光するように遺伝子導入された細菌で、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬＳ社製  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｘｅｎ−２９）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ培地にて  Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｅｎｓｃｅｎｓ  ｌｕｘＡＢＣＤＥを導入することにより入手した。【００９９】
これらを利用すれば、生体内で発光細菌が生存しているかどうかを光イメージングで確認することが可能である（図１Ａ、図１Ｂ）。この検出できる発光の強さと細菌の量は正の相関関係にあることが認められている（図２）。【０１００】
（２）大腿骨骨髄炎モデルマウス
図３に、大腿骨骨髄炎モデルマウスの作製工程を示す。１２週齢のマウスの大腿骨にドリルで穴をあける手術をおこない、ここに、感染群として発光細菌（１μｌ、濃度１．０×１０８ＣＦＵ）を注入した。【０１０１】
これは非常に安定して大腿骨骨髄炎（感染状態）を作成できるモデルである。本実施例では研究ではモデルマウス１２体（感染群）、手術のみおこない細菌を注入しないマウス１２体（シャム群）、手術をおこなわないマウス１２体（コントロール群）を使用し、それぞれを比較することとした（図４）。手術の麻酔は採血結果に影響を及ぼさないエーテル麻酔を用い、術後３日目に腹部大動脈から採血をおこなった（各５００μｌ）。検体は遠心分離にかけて、血漿成分を３００μｌ採取して解析に使用した。【０１０２】
（３）メタボローム解析
生体内には、核酸（ＤＮＡ）やタンパク質の他に、糖、有機酸、アミノ酸、脂質、ステロイド誘導体など多くの低分子が存在し、その種類は数千種類に及ぶ。これらの多くは、酵素などの代謝活動によって作り出された代謝産物である。ある１つの組織に含まれる、代謝中間体、ホルモン、シグナル分子、二次代謝産物などを含む生体中の全ての小分子を集め、カタログ化したもの総称を「メタボローム」と呼称する。メタボロームは、時間ごとに刻々と変化する。メタボローム解析は、新陳代謝の実態および細胞、組織、器官、個体、種の各階層でそれぞれ微妙に異なる代謝経路の多様性の総体をバイオインフォマティクス的手法を基に研究するもので、微小な物質の種類、濃度を網羅的に一度に解析できる手法である。【０１０３】
（２）「大腿骨骨髄炎モデルマウス」において採取した血液に対し、糖、アミノ酸、脂質、ステロイド誘導体などの約１２００種類の分子のデータを網羅的に測定し、メタボローム解析をおこなった。本実施例のメタボローム解析には、ＨｕｍａｎＭｅｔａｂｏｌｏｍｅ社のＤｕａｌ  Ｓｃａｎ（ＣＥ−ＴＯＦＭＳおよびＬＣ−ＴＯＦＭＳ）を用いた。【０１０４】
感染群とシャム群の比較では細菌の感染の有無による違いを、シャム群とコントロール群の比較では手術の有無による違いを判定した。本解析ではコントロール群とシャム群で差がなく、かつ、感染群でのみ高値（または低値）をとる物質が、手術に影響されない早期に感染を同定できる血中バイオマーカーとして重要であると考えて、選定した（図５）。【０１０５】
結果と考察
（１）メタボローム解析の結果を図６に示す。全部で２９７の物質が同定された。それぞれの物質の各群内での濃度を比較すると、感染群で高濃度な物質は６６種類、そのうち統計学的に有意な物質は１２種類であった（図７）。感染群で低濃度な物質は１９５種類、統計学的に有意な物質は４８種類であった（図８）。その中でもβ酸化とＴＣＡ回路という代謝経路に関与する物質の値の変化が非常に特徴的であった。【０１０６】
図８に示したように、α−ケトグルタル酸、コハク酸及びフマル酸の３つの物質は検出限界以下（検出されず）であった。リンゴ酸は、コントロール群と比較して約３０％にまで減少していた（７０％低下）。【０１０７】
（２）β酸化（図９）
β酸化とは脂肪酸からアセチルＣｏＡを産生する反応で、飢餓状態で脂肪からエネルギーを産生する方法である。感染は生体にとっては一種の飢餓状態である。本実施例ではこのβ酸化の反応に必要なＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）が、感染群でのみ検出不能で、特異的に枯渇していた。これは、感染を一種の飢餓状態と解し、β酸化が亢進したためと考えられた。この感染状態（飢餓状態）によるＮＡＤ＋の枯渇は、本実施例の大腿骨骨髄炎モデルマウスのみでなく、ヒトを含む哺乳動物において、そして、黄色ブドウ球菌のみでなく、その他の細菌、種々の微生物の「感染」により、生体が飢餓状態になれば、同様に生じると考えられる。【０１０８】
（３）ＴＣＡ回路（図１０−図１２）
ＴＣＡ回路はアセチルＣｏＡをもとに生体内でエネルギーを産生する、生物の最も重要な代謝経路の一つである（図１０）。メタボローム解析の結果、感染群では、ＴＣＡ回路のうち、α−ケトグルタル酸からリンゴ酸までの物質が、ほぼ枯渇していることが判明した（図１１）。これはイソクエン酸からα−ケトグルタル酸が生成される工程が阻害されれば説明がつく結果である。α−ケトグルタル酸を生成する反応においてはＮＡＤ＋が必要であり、感染群では先述のβ酸化の亢進によりＮＡＤ＋が枯渇したことにより、この反応が滞ったと考えられる（図１２）。このためＴＣＡ回路のα−ケトグルタル酸からリンゴ酸までの物質は、感染を早期に発見する血中バイオマーカーとして有効である。【０１０９】
実施例２  ヒト血中のコハク酸の存在と感染の有無を検証
本実施例では、ヒト血中（血漿中）のコハク酸の存在と感染の有無を検証した。具体的には、整形外科における術後感染の早期発見を目的として、術後感染を疑われる症例（３例）の採血行った。
患者１：４５歳男性  多発海綿状血管腫の手術後、感染が疑われたため、術後９日目に採血。
患者２：５０歳女性  腰椎変性すべり症の手術後、微熱継続していたため、術後７日目に採血。
患者３：７１歳男性  神経鞘腫の手術後、軽度の創癒合不全が観察されたため、術後７日目に採血。【０１１０】
いずれの患者も、術後１週間程度で、微熱の継続や創部の腫脹などがあり、術後感染が否定できない状態であった。採血は１ｍｌ真空採血管（ＥＤＴＡ２Ｋ含・ＴＥＲＵＭＯ社製）を使用し、４℃  １２００回転／分ｘ１０分で直ちに遠心分離をおこない、−８０℃で冷凍保存した。同検体を常温で自然解凍した上で、クエン酸を酵素法によるＵＶ吸収性測定キット（Ｆ−キットクエン酸・Ｊ．Ｋ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）で、コハク酸を比色法による測定キット（コハク酸測定キット（Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製）でそれぞれ測定した。【０１１１】
図１３に示すように、患者１はコハク酸が検出限界（４０μＭ）以下であったが、患者２、３はコハク酸が検出された。クエン酸は、いずれの患者にも検出された。結果として、患者１は感染をしていたことが判明したため、抗生剤の投与など感染症の治療を行った。患者２、３は、感染をしておらず、感染症の治療は不要であった。【０１１２】
本実施例より、ヒト血中（血漿中）のコハク酸の非存在（非検出）が、感染と関連していることが示され、コハク酸は感染のバイオマーカーとして有用ことが裏付けられた。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明は、代謝産物の解析において、特に、これまで全く着目されていなかったＴＣＡ回路の物質が顕著に変化していたことを発見したことによる。ＴＣＡ回路の特定の物質が、著しく減少する、あるいは、ほとんど検出できないという顕著な差であるので、微生物の感染のバイオマーカーとして非常に有効である。また、感染のごく初期の、従来のマーカーでは検出不可能であった早期における検出・判定が可能である。さらに、本発明の血中バイオマーカーはこれらの物質の血中濃度に基づくので、測定も簡便で、迅速、かつ、安価である。そのため微生物の感染を特異的に判定する血中バイオマーカー、判定方法として、早期診断と早期治療の上で、臨床上極めて意義が大きい。さらに、微生物の感染の血中バイオマーカーとして有用なだけでなく、生体内での微生物、特に細菌感染症に対する反応のメカニズムそのものの解明にも寄与する。本発明は感染症の研究分野において革新的な成果をあげられるものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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