(57)【要約】  リポソーム製剤の品質管理のために有用な、簡便、正確かつ再現性に優れ、しかもＩｎ  Ｖｉｖｏ／Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ相関（ＩＶＩＶＣ）を達成できる、リポソームからの薬物放出手段およびリポソーム製剤の薬物放出性評価方法を提供する。  リポソーム内部において化学平衡の移動を引き起こすことによるリポソームからの薬物放出手段およびリポソーム外部に放出された薬物を定量することによる薬物放出性評価方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物を内封したリポソームを、シフト試薬を添加した溶液中に存在させ、該溶液中の該薬物の濃度を測定する、リポソーム製剤の薬物放出性評価方法。
【請求項２】
前記リポソームの内水相において化学平衡の移動が引き起こされ、前記薬物が前記リポソームの外水相に放出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬物を内封したリポソームがリモートローディング法により薬物を内封したリポソームである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記シフト試薬は、非イオン化状態で前記リポソームの脂質膜を透過して外水相から内水相に移動し、カチオン化して内水相に保持される薬剤を非イオン化する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記溶液が緩衝液である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
次のステップを含む、リポソーム製剤の薬物放出性評価方法：
（１）シフト試薬を添加した溶液を調製するステップ；
（２）薬物を内封したリポソームを該溶液と混合するステップ；
（３）該薬物の該溶液中への放出を開始するステップ；
（４）該リポソームを該溶液から分離するステップ；および
（５）該溶液中に放出された薬物量を定量するステップ。
【請求項７】
前記ステップ（３）において、前記リポソームを含む溶液を所定時間、所定温度で加温する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
次のステップを（３）と（４）の間にさらに含む、請求項６または７に記載の方法。
（３の２）該薬物の該溶液中への放出を停止するステップ；
【請求項９】
前記ステップ（３の２）において、前記リポソームを含む溶液に停止液を加える、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶液が緩衝液である請求項６〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記薬物が両親媒性化合物である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記シフト試薬が、アンモニアおよび分子量５００以下のアミノ化合物からなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソームからの薬物放出手段および該放出手段を利用するリポソーム製剤の薬物放出性評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
＜ＤＤＳ媒体としてのリポソーム＞
リポソームは、Ｂａｎｇｈａｍによって１９６０年代に発見されたリン脂質によって形成される閉鎖型小胞体のことであり、当初は生体膜モデルとして研究が進んでいた。その後、このリポソームの持つ特徴を活かしてＤＤＳへの応用検討が進められ、現在ではＤＤＳ媒体の１つとしてよく知られる存在になっている。【０００３】
＜リポソームの製造方法＞
リポソームの製造方法としては、水和法（Ｂａｎｇｈａｍ法）が一般によく知られている。いくつかの操作の違いによって、超音波処理法、エクストルージョン法とも称されるが、基本操作は同じであり、最も簡便なリポソーム製造方法である。【０００４】
具体的には、薄膜状態のリン脂質を調製し、これに水系溶媒を加えて水和・膨潤させ、超音波処理、またはエクストルージョンを行うことによりリポソームを形成することができる。【０００５】
脂溶性薬物を封入させる場合は、リン脂質膜を調製する段階で一緒に薬物を溶解し、該リン脂質膜中に薬物を組み込む。【０００６】
一方、水溶性薬物を封入させる場合は、水和・膨潤させる水系溶媒に薬物を溶解し、超音波処理またはエクストルージョンにより薬物をリポソーム内部の水相（以下「内水相」という。）に封入する。【０００７】
上記したように、これらの調製法は最も簡便な方法であるが、薬物の封入効率が低いことが問題とされている。具体的には、脂溶性薬物の場合、内水相に取り込まれるのではなく脂質膜に組み込まれるため、脂質モル以上に薬物を封入することは不可能である。水溶性薬物の場合は内水相に取り込まれるが、外水相（リポソーム外部の水相をいう。以下同じ。）に対する内水相の比率でしか内封できず、全薬物のうち数十パーセントを内水相に封入することが限界である。この方法をパッシブローディング（Ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）法という。【０００８】
薬物封入効率の問題を解決した方法としては、リモートローディング（Ｒｅｍｏｔｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）法がある（特許文献１、２）。リモートローディング法によれば、薬物を高い封入効率で安定に導入することができる。【０００９】
＜リモートローディング法＞
リモートローディング法の一例を以下に説明する。
リポソームの外水相には適切なｐＨに調節された緩衝液が用いられる。この外水相はアンモニウムイオンを欠いた媒質（例えば、ＮａＣｌまたは糖類等）が用いられ、リポソームの内水相と外水相は、両者の浸透圧差でリポソームが破壊されることのない範囲の浸透圧に調整される。【００１０】
リポソーム内部のアンモニウムイオンはアンモニアおよびプロトンと平衡状態にある。プロトン化していないアンモニアはリポソームの脂質二重膜を自由に透過し、リポソーム外部へと移行することが可能である。このため、リポソーム内部では平衡が連続的にシフトするという現象が生じる。【００１１】
このリモートローディング法は、適切な水性媒体に溶解された場合に、荷電状態で存在し得る慣用的薬物に用い得ることができる薬物限定的な封入方法である。典型的には、リポソームの内側／外側に、イオン勾配を形成することで、薬物は形成された勾配に従いリポソーム膜を透過し、リポソーム内に封入し得る。該導入法を適用できる薬物であれば１００％近い封入効率で内封することができる（特許文献３〜５、非特許文献１）。【００１２】
＜薬物放出と薬物放出性試験方法＞
リモートローディング法で薬物を封入したリポソームは、製剤としてバイアル等の容器内に保存され、封入時のイオン勾配が維持され、内封薬物はリポソーム内水相に保持され、放出は起こらない。【００１３】
しかし、生体内に投与された後は何らかの因子によって放出が引き起こされる場合があり、その放出プロファイルは封入する薬物によって異なることが知られている。【００１４】
例えば塩酸ドキソルビシンを封入したリポソームの場合は、生体内に投与された後はほとんど放出せず、リポソームの動態と内封された薬物の動態はほぼ等しい。しかし、リモートローディング法で封入することができる薬物の多くは、生体内に投与された後、速やかに放出が始まる製剤であり、これらは徐放製剤としての位置づけとなっている（特許文献４、６、７、非特許文献２）。【００１５】
このような徐放製剤を製造・販売する上では、品質保証および品質管理の一環として、リポソーム製剤からの薬物放出特性が常に所定の規格範囲内であることが要求され、それを確認することが必要となる。【００１６】
一般に、リポソームからの薬物の放出は、外部環境およびリポソーム膜の物理化学的特性に影響される。従って、リポソーム製剤の薬物放出特性を評価する方法は、外部環境による薬物放出特性の評価およびリポソーム膜の物理化学的特性を同時に評価できる方法であることが望ましい。【００１７】
リポソーム膜の物理化学的特性評価方法としては、示差走査熱量測定、電子共鳴を利用した電子スピン共鳴（ＥＳＲ）法、核磁器共鳴（ＮＭＲ）法、蛍光プローブのスペクトル変化や偏向度変化を利用した蛍光法等がある（以下「従来法１」という。）。【００１８】
一方、一般的に知られている、経口投与製剤の確立した放出試験方法をリポソーム製剤の放出試験方法として転用することも考えられる。これは、胃腸管液を想定した緩衝液における製剤の崩壊に起因する薬物放出性を評価するものである（以下「従来法２」という。）。【００１９】
また、リポソームからの薬物放出特性は、実験室レベルの実施では、ｉｎ  ｖｉｖｏで、または血清、血漿等の生体もしくは生体由来の成分を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、評価することができる（以下「従来法３」という。）。【００２０】
さらに、上記方法とは異なる観点からの方法として、リポソーム化前に、試験管内でリポソーム内の状況を模倣し、その状態を観測することによってリポソームの薬物保持能力を判断する、簡便なリポソーム製剤の薬物放出特性評価方法が開示されている（特許文献８、以下「従来法４」という。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】米国特許第５１９２５４９号明細書
【特許文献２】米国特許第５３１６７７１号明細書
【特許文献３】米国特許第５０７７０５６号明細書
【特許文献４】米国特許第５８３７２８２号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００２／０１１０５８６号明細書
【特許文献６】国際公開第０１／００１７３号パンフレット
【特許文献７】米国特許出願公開第２００７／０２３１３７９号明細書
【特許文献８】国際公開第０３／０３２９４７号パンフレット
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Gregoriadis, G.著、「Liposome Technology」、第２版、第Ｉ巻、Liposome Preparation and Related Technologies、米国、CRC Press、1992年12月13日
【非特許文献２】Zamboni, WC他、「Plasma, Tumor, and Tissue Disposition of STEALTH Liposomal CKD-602 (S-CKD602) and Nonliposomal CKD-602 in Mice Bearing A375 Human Melanoma Xenografts」、Clinical Cancer Research、2007年、第13巻、第23号、p7217-7223
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
＜従来の薬物放出性試験方法の問題点＞
従来法１は、それらの多くは、ある種の添加剤が必要であったり、特殊な大型設備の導入が必要であったり、さらに複雑な測定手順が必要で簡便な実施ができなかったりすること等から、リポソーム製剤の薬物放出性試験法としては適していない。【００２４】
従来法２は、リポソーム製剤は、非経口投与が主たる投与経路であるうえに、薬物がリポソーム内に安定的に保持されていて（特に、リモートローディング法により調製されたリポソーム製剤において）、単に緩衝液中に分散しただけでは薬物放出が起こらず、また、薬物放出がリポソームの崩壊により引き起こされるわけでもないから、リポソーム製剤の薬物放出性試験方法として転用することは妥当ではない。【００２５】
従来法３は、産業レベルでの実施では、動物の個体差、生体成分のロット差および生体成分の保存安定性等に起因する、正確性および再現性等の問題があり、リポソーム製剤の薬物放出性試験方法として有用ではない。【００２６】
従来法４は、多くの薬物を相対的に比較することができ、リポソームに封入可能な薬物をスクリーニングするという観点からは有用であるが、あくまでもリポソーム化前に放出を予想する方法であって、リポソーム製剤の実際の薬物放出特性を直接測定することはできない。従って、この方法をリポソーム製剤の薬物放出性試験方法として利用することは妥当ではない。【００２７】
以上述べたように、従来の薬物放出性試験方法を適用したのでは、リポソーム徐放製剤の薬物放出特性を簡便、正確かつ再現性よく試験・評価することが困難であった。【００２８】
＜本発明の目的＞
本発明は、従来の薬物放出性試験方法が有していた問題を解決しようとするものであり、人体、実験動物、培養細胞、血清または血漿等のような、生体または生体由来物質を使用せず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系で、薬物を内封したリポソーム製剤の薬物放出性を測定する、簡便、正確かつ再現性に優れ、しかもＩｎ  Ｖｉｖｏ／Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ相関（ＩＶＩＶＣ）を達成できる、リポソームからの薬物放出手段およびリポソーム製剤の薬物放出性評価方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明は、上記目的を達成するために発明者らが検討を重ねた結果、薬物を内水相に封入したリポソームを、シフト試薬を添加した溶液中に存在させ、その溶液中の薬物の濃度を測定すれば、リポソーム製剤の薬物放出性を評価できることを知見し、本発明を完成するに至った。本発明の一態様では、シフト試薬として脱プロトン化試薬またはプロトン化試薬を使用する。【００３０】
本発明において、「シフト試薬」は、それを用いることによって、薬物を封入したリポソームの内水相と外水相との間に、薬物封入時に形成されたイオン勾配とは正反対のイオン勾配を形成し、薬物を保持するために形成されているイオン勾配を弱め、内水相の化学平衡の移動（シフト）を引き起こすことによって、内水相に溶解して保持されている薬物の保持力を弱め、リポソーム内部から薬物を放出しやすい環境を作り出す試薬である。要するに、シフト試薬の作用は、リポソームの内水相と外水相との間に形成された、薬物を保持するために形成されているイオン勾配を弱めることであると考えられる。【００３１】
本発明において、「シフト試薬」の一態様である「脱プロトン化試薬」および「プロトン化試薬」は、次のような特徴を有する：
（１）リポソームのリン脂質膜をイオン化しない状態で透過可能である；および
（２）リポソーム内水相において、脱プロトン化剤はブレンステッド塩基として働き薬物を脱プロトン化し、プロトン化剤はブレンステッド酸として働き薬物をプロトン化する。【００３２】
本発明において、前記の「脱プロトン化試薬」または「プロトン化試薬」を溶液中で生じる物質を意味する用語として、「シフト試薬」の用語が使用される場合がある。例えば、酢酸アンモニウムをシフト試薬として用いた場合には、アンモニアを脱プロトン化試薬として溶液中で生じる。【００３３】
本発明における脱プロトン化試薬またはプロトン化試薬の作用効果は、次のように説明することができると考えられる。すなわち、脱プロトン化試薬またはプロトン化試薬が、リポソームのリン脂質膜を透過して外水相から内水相に移動し、内水相においてブレンステッド塩基またはブレンステッド酸として働き、リポソーム内水相に溶解して保持されている薬物に係る化学平衡の移動（シフト）がルシャトリエの原理に従って引き起こされて、内水相における薬物保持力が低下し、その結果、薬物が内水相から外水相に移動すると考えられる。【００３４】
本発明においては、薬物を封入したリポソームを、脱プロトン化試薬またはプロトン化試薬を含む溶液中に存在させ、内封薬物を該溶液中に放出させ、所望により放出を停止させ、該溶液中に放出された薬物の濃度を測定し、リポソーム製剤の薬物放出性を評価する。【００３５】
ここで、シフト試薬をリポソームの外水相溶液中に加えることによって、脱プロトン化試薬またはプロトン化試薬が溶液中に含まれるようにしてもよい。【００３６】
また、ここで、リポソーム内水相から外水相への薬物の放出開始は、所定時間加温することによってもよい。【００３７】
さらに、ここで、リポソーム内水相から外水相への薬物の放出停止は、加温を停止することによる自然冷却によってもよいし、加温を停止したうえさらに氷冷等による強制冷却によってもよい。【００３８】
本発明において、リポソームは、リモートローディング法によって薬物を封入したものであることが好ましい。【００３９】
本発明において、薬物は両親媒性化合物であることが好ましく、両親媒性両性化合物、両親媒性弱塩基性化合物または両親媒性弱酸性化合物であることがより好ましく、両親媒性弱塩基であることがさらに好ましい。【００４０】
本発明において、外水相溶液等のシフト試薬を添加する溶液は、シフト試薬を加える前にシフト試薬を含んでいないことが好ましい。また、本発明において、外水相溶液等のシフト試薬を添加する溶液は、シフト試薬の一態様としての、ブレンステッド塩基である脱プロトン化試薬およびその共役酸またはブレンステッド酸であるプロトン化試薬およびその共役塩基を含まないことが好ましい。【００４１】
また、本発明において、外水相溶液等のシフト試薬を添加する溶液は、血清または血漿等の生体由来成分を含まないことが好ましい。【００４２】
また、本発明において、シフト試薬を添加する溶液に用いる溶液としては、水、生理食塩水、リンゲル液または緩衝液を用いることができ、緩衝液を用いることが好ましい。【００４３】
緩衝液のｐＨは、リポソームに封入される薬物、リン脂質等のリポソーム膜を構成する成分の安定性を考慮して決定することが好ましく、概ねｐＨ５〜９であることが好ましい。【００４４】
本発明の一態様は、また、次のようにも説明される。
薬物（「Ａ」と表記する。）を封入したリポソームを、脱プロトン化試薬（「Ｂ」と表記する。）を含む溶液中に存在させ、該脱プロトン化試薬を、非イオン化状態でリポソーム脂質膜を透過して外水相から内水相に移動させる。【００４５】
脱プロトン化試薬（Ｂ）は、カチオン化した状態で存在する薬物（ＨＡ＋）から水素イオン（プロトン）を受容してプロトン化され（ＨＢ＋）、その一方で薬物（ＨＡ＋）は脱プロトン化試薬に水素イオン（プロトン）を供与して脱プロトン化される（Ａ）。【００４６】
従って、内水相において、薬物および脱プロトン化試薬に係る下記式の化学平衡が成立する。【００４７】
【化１】
2010058840.tif 000003
【００４８】
ただし、
Ａ：薬物（非イオン化状態）；
ＨＡ＋：薬物（カチオン化状態）；
Ｂ：脱プロトン化試薬（非イオン化状態）；
ＨＢ＋：脱プロトン化試薬（カチオン化状態）；および
Ｈ＋：水素イオン（プロトン）である。【００４９】
上式（１）の化学平衡は、左辺の脱プロトン化試薬（非イオン化状態）のモル濃度［Ｂ］が大きくなると、ルシャトリエの原理に従い、右にシフトする。その結果、薬物（非イオン化状態）のモル濃度［Ａ］が大きくなり、薬物がリポソーム脂質膜を透過し、外水相に移動する。【００５０】
上記において、脱プロトン化試薬はシフト試薬を水性溶媒中に存在させたときに存在すればよい。例えば、脱プロトン化試薬がアンモニア（ＮＨ３）である場合、シフト試薬は水性溶媒中でアンモニアを生じればよく、アンモニアそのものであってもよいし、酢酸アンモニウム（ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４）等のアンモニウム塩であってもよい。【００５１】
薬物がアミノ基および／またはイミノ基を有する両親媒性弱塩基化合物である場合には、脱プロトン化試薬はアンモニアまたは分子量５００以下の低分子アミンが好ましく、アンモニアが特に好ましい。【００５２】
本発明の別の一態様は、また、次のようにも説明される。
薬物（「ＨＣ」と表記する。）を封入したリポソームを、プロトン化試薬（「ＨＤ」と表記する。）を含む溶液中に存在させ、該プロトン化試薬を、非イオン化状態でリポソーム脂質膜を透過して外水相から内水相に移動させる。
プロトン化試薬（ＨＤ）は、アニオン化した状態で存在する薬物（Ｃ−）に水素イオン（プロトン）を供与して脱プロトン化され（Ｄ−）、その一方で薬物（Ｃ−）はプロトン化試薬から水素イオン（プロトン）を受容してプロトン化される（ＨＣ）。【００５３】
従って、内水相において、薬物およびプロトン化試薬に係る下記式の化学平衡が成立する。【００５４】
【化２】
2010058840.tif 000004
【００５５】
ただし、
ＨＣ：薬物（非イオン化状態）；
Ｃ−：薬物（アニオン化状態）；
ＨＤ：プロトン化試薬（非イオン化状態）；
Ｄ−：プロトン化試薬（アニオン化状態）；および
Ｈ＋：水素イオン（プロトン）である。【００５６】
上式（２）の化学平衡は、左辺のプロトン化試薬（非イオン化状態）のモル濃度［ＨＤ］が大きくなると、ルシャトリエの原理に従い、右にシフトする。その結果、薬物（非イオン化状態）のモル濃度［ＨＣ］が大きくなり、薬物がリポソーム脂質膜を透過し、外水相に移動する。【００５７】
上記において、プロトン化試薬はシフト試薬を水性溶媒中に存在させたときに存在すればよい。例えば、プロトン化試薬がクエン酸である場合、シフト試薬は水性溶媒中でクエン酸を生じればよく、クエン酸そのものであってもよいし、クエン酸ナトリウム等のクエン酸塩であってもよい。【００５８】
すなわち、本発明は以下のものである。
〔１〕  薬物を封入したリポソームを、シフト試薬を添加した溶液中に存在させ、該溶液中の該薬物の濃度を測定する、リポソーム製剤の薬物放出性評価方法。
〔２〕  前記リポソームの内水相において化学平衡の移動が引き起こされ、前記薬物が前記リポソームの外水相に放出される、〔１〕に記載の方法。
〔３〕  前記薬物を内封したリポソームがリモートローディング法により薬物を内封したリポソームである、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕  前記シフト試薬は、非イオン化状態で前記リポソームの脂質膜を透過して外水相から内水相に移動し、イオン化して内水相に保持される薬剤を非イオン化する、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕  前記溶液が緩衝液である〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕  前記シフト試薬が脱プロトン化試薬またはプロトン化試薬である、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。【００５９】
〔７〕  次のステップを含む、リポソーム製剤の薬物放出性評価方法：
（１）シフト試薬を添加した溶液を調製するステップ；
（２）薬物を内封したリポソームを該溶液と混合するステップ（このステップで得られる懸濁液を「ソリューションＡ」という。）；
（３）該薬物の該溶液中への放出を開始するステップ；
（４）該リポソームをソリューションＡから分離するステップ（このステップで得られる、放出された薬物を含む溶液を「ソリューションＢ」という。）；
（５）ソリューションＢに含まれる薬物の濃度を測定するステップ。
〔８〕  前記ステップ（３）において、ソリューションＡを所定時間、所定温度で加温する、〔７〕に記載の方法。
〔９〕  前記所定温度が３０〜４０℃の間である、〔８〕に記載の方法。
〔１０〕  前記所定時間が１〜１８０分の間である、〔８〕または〔９〕に記載の方法。
〔１１〕  次のステップをステップ（３）と（４）との間にさらに含む、〔７〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法。
（３の２）該薬物の該溶液中への放出を停止するステップ；
〔１２〕  前記ステップ（３の２）において、ソリューションＡを放冷する、〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕  前記ステップ（３の２）において、ソリューションＡを冷却する、〔１１〕に記載の方法。
〔１４〕  前記ステップ（３の２）において、ソリューションＡに停止液を加える、〔１１〕に記載の方法。
〔１５〕  前記停止液が前記シフト試薬を含まない、〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕  前記停止液がソリューションＡと停止液との混合系における前記シフト試薬の濃度を小さくする、〔１４〕または〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕  前記停止液がソリューションＡと停止液との混合系における液温を低下させる、〔１４〕または〔１５〕に記載の方法。
〔１８〕  前記停止液がｐＨ１．０〜５．０の範囲のｐＨを有する溶液である、〔１４〕〜〔１７〕のいずれかに記載の方法。
〔１９〕  前記溶液が緩衝液である〔７〕〜〔１８〕のいずれかに記載の方法。
〔２０〕  前記シフト試薬が脱プロトン化試薬またはプロトン化試薬である、〔７〕〜〔１９〕のいずれかに記載の方法。【００６０】
〔２１〕  薬物を内封したリポソームを、シフト試薬を添加した溶液中に存在させる、リポソームからの薬物放出方法。
〔２２〕  前記リポソームの内水相において化学平衡の移動が引き起こされ、前記薬物が前記リポソームの内水相から外水相に放出される、〔２１〕に記載の薬物放出手段。
〔２３〕  前記薬物を内封したリポソームがリモートローディング法により薬物を内封したリポソームである、〔２１〕または〔２２〕に記載の方法。
〔２４〕  前記溶液が緩衝液である〔２１〕〜〔２３〕のいずれかに記載の方法。
〔２５〕  前記シフト試薬が脱プロトン化試薬またはプロトン化試薬である、〔２１〕〜〔２４〕のいずれかに記載の方法。
〔２６〕  前記脱プロトン化試薬またはプロトン化試薬は、非イオン化状態で前記リポソームの脂質膜を透過して外水相から内水相に移動し、イオン化して内水相に保持される薬剤を非イオン化する、〔２１〕〜〔２５〕のいずれかに記載の方法。【００６１】
〔２７〕  前記シフト試薬がアンモニアおよびアミノ化合物からなる群から選ばれる少なくとも１つである、〔１〕〜〔２６〕のいずれかに記載の方法。
〔２８〕  前記シフト試薬がアンモニアである、〔１〕〜〔２６〕のいずれかに記載の方法。
〔２９〕  前記アミノ化合物が分子量５００以下のアミノ化合物である、〔２６〕に記載の方法。
〔３０〕  前記アミノ化合物がメタノールアミン、エタノールアミン、エチレンジアミンおよびトリエチルアミンからなる群から選択される少なくとも１つである〔２９〕に記載の方法。
〔３１〕  前記シフト試薬を添加した溶液がｐＨ５．５〜７．５の範囲のｐＨを有する、〔１〕〜〔３０〕のいずれかに記載の方法。
〔３２〕  前記シフト試薬を添加した溶液が２０〜４００ｍＯｓｍの範囲の浸透圧を有する、〔１〕〜〔３１〕のいずれかに記載の方法。
〔３３〕  前記シフト試薬を添加した溶液と前記リポソームとの混合系において、シフト試薬の濃度が０．１〜１５０ｍＭの範囲である、〔１〕〜〔３２〕のいずれかに記載の方法。【００６２】
〔３４〕  前記薬物が両親媒性化合物である、〔１〕〜〔３３〕のいずれかに記載の方法。
〔３５〕  前記薬物が両親媒性弱塩基性化合物である、〔１〕〜〔３３〕のいずれかに記載の方法。
〔３６〕  前記両親媒性弱塩基性化合物が、エピルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、カルシノマイシン、Ｎ−アセチルアドリアマイシン、ルビダゾン、５−イミドダウノマイシン、Ｎ−アセチルダウノマイシン、全てのアントラシリン薬品、ダウノリリン、トポテカン、９−アミノカンプトテシン、１０，１１−メチレンジオキシカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、ＴＡＳ１０３、７−（４−メチルーピペラジノーメチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン、７−（２−イソプロピルアミノ）エチル−２０（Ｓ）−カンプトテシン、ＣＫＤ−６０２、ＵＣＮ−０１、プロプラノロール、ペンタミジン、ジブカイン、ブピバカイン、テトラカイン、プロカイン、クロルプロマジン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ミトマイシンＣ、ピロカルピン、フィソスチグミン、ネオスチグミン、クロロキン、アモジアキン、クロログアニド、プリマキン、メフロキン、キニン、プリジノール、プロジピン、ベンズトロピンメシレート、トリヘキシフェニジル塩酸塩、シプロフロキサシン、チモロール、ピンドロール、キナクリン、ベナドリル、塩酸ファチジル、プロメタジン、ドーパミン、Ｌ−ＤＯＰＡ、セロトニン、エピネフリン、コデイン、メペリジン、メタドン、モルフィン、アトロピン、デシクロミン、メチキセン、プロパンテリン、イミプラミン、アミトリプチリン、ドキセピン、デシプラミン、キニジン、プロパラノロール、リドカイン、クロルプロマジン、プロメタジン、ペルフェナジン、アクリジンオレンジ、モルヒネおよびブピバカインならびにこれらの組合せからなる群から選ばれる少なくとも１つである、〔３５〕に記載の方法。【００６３】
〔３７〕  リポソーム製剤の品質管理に利用できる、〔１〕〜〔３６〕のいずれかに記載の方法。
〔３８〕  生体および／または生体由来成分を用いず、簡便性、正確性および再現性に優れる、〔１〕〜〔３６〕のいずれかに記載の方法。
〔３９〕  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｉｎ  ｖｉｖｏの薬物動態を予測することが可能な、〔１〕〜〔３６〕のいずれかに記載の方法。
〔４０〕  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ／Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ相関（ＩＶＩＶＣ）を達成できる、〔１〕〜〔３６〕のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００６４】
本発明によれば、実験動物等の生体や血清等の生体由来の物質を用いることなく、簡便にリポソーム製剤の薬物放出特性を直接測定することによって、正確で再現性が高い試験結果を得ることが可能であり、しかもＩＶＩＶＣ（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ／Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ相関）が達成される。そして、本発明の方法は、製造されたリポソーム製剤のロット毎にその放出性を確認することが可能であり、リポソーム製剤の品質管理方法として好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ｐＨ勾配法をリモートローディング法として用い、シフト試薬にアンモニアを用いた内封薬物放出システムのイメージ図である。  封入された薬物は外水相に放出される。
【００６６】
【化３】
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【００６７】
【図２】ｐＨ勾配法をリモートローディング法として用いた場合の内封薬物放出システム詳細を示す概念図である。
【図３】本発明の薬物放出試験法を示すフローチャートである。
【図４】シフト試薬濃度とＶＣＲ放出挙動を示すグラフである。
【図５】シフト試薬濃度とＶＣＲ放出速度定数の関係を示すグラフである。
【図６】シフト試薬溶液ｐＨと薬物放出性の関係を示すグラフである。
【図７】リポソームからのＶＣＲ放出におけるシフト試薬溶液浸透圧の影響を示すグラフである。
【図８】アミノ化合物を含むシフト試薬溶液中におけるＶＣＲ放出挙動を示すグラフである。
【図９】リポソームのリン脂質／コレステロール比によるＶＣＲ放出挙動変化を示すグラフである。
【図１０】異なる相転移温度を有するリン脂質からなるリポソームからの薬物放出を示すグラフである。
【図１１】ＤＸＲおよびＶＣＲの放出性を示すグラフである。
【図１２】ＤＸＲおよびＶＣＲの血中薬物挙動を示すグラフである。
【図１３】ＶＣＲおよびＣＦＸの放出性を示すグラフである。
【図１４】ＤＸＲの放出性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
以下、本発明の好適な実施の形態について、詳細に説明する。
＜リポソーム−膜構造＞
本発明において、リポソームとは、リン脂質二重膜で形成される閉鎖小胞を意味するが、そのようなリポソームを含んでなる懸濁液であるリポソーム製剤をも意味する場合がある。
【００６９】
本発明のリポソームの膜構造は、特に限定されず、脂質二重膜の１枚膜からなるユニラメラ小胞（Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅ）、多重ラメラ小胞（Ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅ，ＭＬＶ）またはその他の構造のいずれでもよく、また、ユニラメラ小胞の場合には、ＳＵＶ（Ｓｍａｌｌ  Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＬＵＶ（Ｌａｒｇｅ  Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅ）またはその他の構造のいずれでもよい。
【００７０】
＜リポソーム−粒径とＥＰＲ効果＞
本発明のリポソームの粒径は、ＥＰＲ効果を利用できる範囲で設定されることが好ましい。より詳細には、リポソームの粒径は、２００ｎｍ以下とすることが好ましく、５０〜２００ｎｍとすることがより好ましい。ただし、ＥＰＲ効果を利用することを求めない場合は、この限りではない。
【００７１】
本明細書において、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果の用語は、当業者が通常使用する意味で使われ、炎症部位近辺において血管透過性が向上する現象を意味する。
【００７２】
一般に、ＥＰＲ効果がある場合には、血管壁を粒径約２００ｎｍ以下の粒子が透過することができることが知られている（Int. J. Pharm. 1999, 190:49-56）。従って、リポソームの粒径を２００ｎｍ以下とすることによって、標的細胞への移行を達成することができる。さらに、このＥＰＲ効果により、リポソームは持続的に標的臓器に送達されることとなり、標的臓器中の薬物は、投与後数時間遅れて最高血中濃度に達し、標的臓器に送達される薬物量は飛躍的に向上することとなる（Lasic, DD他１名著、「MEDICAL APPLICATION OF LIPOSOMES」）。なお、肝臓を標的とする場合等においては、ＥＰＲ効果を求めない。
【００７３】
＜リポソーム−リン脂質膜＞
本発明のリポソームのリン脂質膜を構成する主膜材であるリン脂質は、当業者が知るリン脂質を単一種または複数種組合せで使用することができるが、その相転移点が、生体内温度（３５〜３７℃）より高いことが好ましく、４０℃以上であることがより好ましい。
【００７４】
当業者が知るリン脂質としては、分子内に長鎖アルキル基より構成される疎水性基と、リン酸基より構成される親水性基とをもつ両親媒性物質である、ホスファチジルコリン（＝レシチン）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール等のグリセロリン酸；スフィンゴミエリン（ＳＭ）等のスフィンゴリン脂質；カルジオリピン等の天然または合成のジホスファチジルリン脂質およびこれらの誘導体；これらの水素添加物、例えば、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）等を例示的に挙げることができる。
【００７５】
リン脂質として、特に好ましくは、リポソームに封入された薬物が、保存時に、または血液等の生体中で容易に漏出しない相転移温度を持つ、ＨＳＰＣ等の水素添加リン脂質、またはＳＭ等が好ましい。
【００７６】
＜リポソーム−リン脂質以外の膜成分＞
本発明のリポソームのリン脂質膜は、リポソームを安定的に形成できるものであれば、リン脂質以外の膜成分を含むこともできる。
【００７７】
リン脂質以外の膜成分としては、例えば、リン酸を含まない脂質（他の膜脂質）、膜安定化剤、酸化防止剤等を、所望により、または必要に応じて含むことができる。
【００７８】
他の脂質としては、例えば、脂肪酸等が挙げられる。
【００７９】
膜安定化剤としては、例えば、膜流動性を低下させるコレステロール等のステロール、グリセロール、スクロース等の糖類が挙げられる。
【００８０】
酸化防止剤としては、例えば、アスコルビン酸、尿酸またはトコフェロール同族体すなわちビタミンＥ等が挙げられる。トコフェロールには、α、β、γ、δの４個の異性体が存在するが、本発明ではいずれを使用してもよい。
【００８１】
なお、本発明においては、リポソーム膜成分の脂質とは、主膜材のリン脂質、他の膜脂質および上記膜安定化剤であるステロール等の脂質、さらには後述の膜修飾剤に含まれる脂質等、薬物以外の脂質をすべて含む意味で用いられる。
【００８２】
このような膜成分の脂質全量を１００ｍｏｌ％とするとき、リン脂質は、好ましくは２０〜１００ｍｏｌ％、より好ましくは４０〜１００ｍｏｌ％であり、他の脂質は、好ましくは０〜８０ｍｏｌ％、より好ましくは０〜６０ｍｏｌ％である。
【００８３】
また本発明では、リポソームの膜構造を保持できる限りにおいて、リポソーム製剤に含むことができる他の膜修飾成分を、本発明の目的を損なわない範囲で含むことができる。
【００８４】
＜リポソーム−表面修飾・親水性高分子＞
本発明のリポソームは、その表面のリン脂質膜が修飾されてもよい。
【００８５】
膜修飾成分としては、親水性高分子および他の表面修飾剤が例示される。
【００８６】
親水性高分子は、その脂質誘導体として用いると、疎水性部分である脂質部分が膜中に保持されることで、親水性高分子鎖を安定に外表面に分布させることができる。
【００８７】
親水性高分子は、特に制限されないが、例えば、ポリエチレングリコール、ポリグリセリン、ポリプロピレングリコール、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタアクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアスパルトアミド、合成ポリアミノ酸等が挙げられる。さらに、グルクロン酸、シアル酸、デキストラン、プルラン、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナン等の水溶性多糖類およびその誘導体、例えば糖脂質が例示される。
【００８８】
特に好ましい親水性高分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。血中滞留性を向上させる効果があるためであるが、この理由に限定されない。
【００８９】
ＰＥＧの分子量は、特に限定されないが、好ましくは５００〜１０，０００Ｄａ、より好ましくは１，０００〜７，０００Ｄａ、さらに好ましくは２，０００〜５，０００Ｄａである。
【００９０】
親水性高分子脂質誘導体の脂質（疎水性部分）としては、例えばリン脂質、長鎖脂肪族アルコール、ステロール、ポリオキシプロピレンアルキル、またはグリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。より詳細には、親水性高分子がＰＥＧである場合には、ＰＥＧのリン脂質誘導体またはコレステロール誘導体が挙げられる。このリン脂質は、ホスファチジルエタノールアミンが好ましく挙げられ、そのアシル鎖は通常、Ｃ１４−Ｃ２０程度の飽和脂肪酸、例えばジパルミトイル、ジステアロイルあるいはパルミトイルステアロイル等が挙げられる。例えばＰＥＧのジステアロイルホスファチジルエタノールアミン誘導体（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）等は、入手容易な汎用化合物である。
【００９１】
リポソーム製造工程において、膜修飾成分の使用時期は特に制限されないが、親水性高分子による膜修飾は、分布の効率ならびに親水性高分子が内水相に存在する薬物の影響を受けにくい等の面から、親水性高分子をリポソーム膜の外表面、特に脂質二重膜の外膜から外液側に選択的に分布させることが好ましい。このため、本発明では、リポソームを生成させた後、特に整粒化工程後に添加することが望ましい。
【００９２】
親水性高分子によるリポソーム修飾率は、膜（総脂質）に対する親水性高分子量の割合として、好ましくは０．１〜１０ｍｏｌ％、より好ましくは０．１〜５ｍｏｌ％である。
【００９３】
＜薬物−リモートローディング法＞
本発明の薬物内封リポソームは、好ましくはリモートローディング法を用いて製造される。リモートローディング法の方法については特に限定されないが、クエン酸緩衝液や硫酸アンモニウムを用いた方法が例示される。
【００９４】
本発明においてリモートローディング法の用語は、当業者が通常知る通常の意味で使用され、薬物が内封されていない空リポソームを製造し、リポソーム外液に薬物を加えることによりリポソームに薬物を導入する方法を意味する。
【００９５】
リモートローディング法では、外液に加えられた薬物が、能動的にリポソームへと移行し、リポソームへと取り込まれる。このドライビングフォースとしては、溶解度勾配、イオン勾配、ｐＨ勾配等が用いられている。例えば、リポソーム膜を隔てて形成されるイオン勾配を用いて薬物をリポソーム内部に導入する方法がある。例えば、Ｎａ＋／Ｋ＋濃度勾配に対するリモートローディング法により予め形成されているリポソーム中に薬物を添加する技術がある（特許文献３）。
【００９６】
イオン勾配の中でもプロトン濃度勾配が一般的に用いられ、例えばクエン酸を用いて、リポソーム膜の内側（内水相）ｐＨが、外側（外水相）ｐＨよりも低いｐＨ勾配をもつ態様が挙げられる。ｐＨ勾配は、具体的に、アンモニウムイオン勾配および／またはプロトン化しうるアミノ基を有する有機化合物の濃度勾配等により形成することができる。また近年では、イオノファをリポソーム膜に導入することによりリモートローディングを行う方法も開示されている（米国特許出願公開第２００６／０１９３９０４号明細書）。
【００９７】
＜薬物−封入される薬物の種類＞
本発明の薬物内封リポソームに保持される薬物は、リモートローディング法によってリポソーム内に封入し、保持可能であればよく特に限定されないが、両親媒性化合物が好ましく、両親媒性弱塩基性化合物がより好ましい。
【００９８】
両親媒性弱塩基性化合物の酸解離定数ｐＫａは、好ましくは５〜８である。
【００９９】
両親媒性弱塩基性化合物としては、エピルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、カルシノマイシン、Ｎ−アセチルアドリアマイシン、ルビダゾン、５−イミドダウノマイシン、Ｎ−アセチルダウノマイシン、全てのアントラシリン薬品、ダウノリリン、トポテカン、９−アミノカンプトテシン、１０，１１−メチレンジオキシカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、ＴＡＳ１０３、７−（４−メチルーピペラジノーメチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン、７−（２−イソプロピルアミノ）エチル−２０（Ｓ）−カンプトテシン、ＣＫＤ−６０２、ＵＣＮ−０１、プロプラノロール、ペンタミジン、ジブカイン、ブピバカイン、テトラカイン、プロカイン、クロルプロマジン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ミトマイシンＣ、ピロカルピン、フィソスチグミン、ネオスチグミン、クロロキン、アモジアキン、クロログアニド、プリマキン、メフロキン、キニン、プリジノール、プロジピン、ベンズトロピンメシレート、トリヘキシフェニジル塩酸塩、シプロフロキサシン、チモロール、ピンドロール、キナクリン、ベナドリル、塩酸ファチジル、プロメタジン、ドーパミン、Ｌ−ＤＯＰＡ、セロトニン、エピネフリン、コデイン、メペリジン、メタドン、モルフィン、アトロピン、デシクロミン、メチキセン、プロパンテリン、イミプラミン、アミトリプチリン、ドキセピン、デシプラミン、キニジン、プロパラノロール、リドカイン、クロルプロマジン、プロメタジン、ペルフェナジン、アクリジンオレンジ、鎮痛剤、例えばモルヒネ、ブピバカイン等が好ましく例示される。
【０１００】
また、両親媒性酸性化合物も好ましい薬物であり、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン等のステロイド系抗炎症薬、アスピリン、インドメタシン、イブプロフェン、フェルビナク、ジクロフェナク、ナプロキセン、メフェナム酸、フェニルブタゾン等の非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、カプトプリル、ベナゼプリル、エナラプリル等のアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬等が好ましく例示される。
【０１０１】
＜リポソーム−内水相溶液＞
両親媒性弱塩基性化合物をリポソーム内に封入するために用いられるリポソームの内部水相は、対イオンの選択が重要である。
【０１０２】
例えば、本発明において、前記両親媒性弱塩基性薬物と共にリポソーム内に封入される対イオンは、水酸化物、硫酸塩、燐酸塩、グルクロン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、硝酸塩、シアン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、臭化物、塩化物、および他の無機または有機アニオン類、またはアニオン性重合体、例えば硫酸デキストラン、燐酸デキストラン、ホウ酸デキストラン、カルボキシメチルデキストラン等を包含する非限定的例から選択することができる。
【０１０３】
内水相のｐＨは、リモートローディング法の手法に応じて異なる。例えば、クエン酸を用いた場合、予め内水相と外水相との間のｐＨ勾配を形成しておく必要があり、その場合はΔｐＨが３以上であることが好ましい。それ以外のリモートローディング法の場合は、化学平衡によってｐＨ勾配が形成されるため特に考慮しなくともよい。
【０１０４】
＜リポソーム−外水相溶液＞
本発明において、外水相溶液はシフト試薬と混合する前には、シフト試薬を含まない。例えば、脱プロトン化剤およびその共役酸ならびにプロトン化剤およびその共役塩基等に例示されるシフト試薬に該当する物質を含まない。
【０１０５】
脱プロトン化剤としてアンモニアを用いる場合、シフト試薬と混合する前の外水相溶液は、好ましくはアンモニアおよびアンモニウムイオンを含まない。
【０１０６】
外水相溶液は、ＮａＣｌおよび／またはグルコースやショ糖等の糖類が溶質として好ましく用いられる。
【０１０７】
外水相溶液のｐＨおよび浸透圧は、好ましくは緩衝液によって調節される。
【０１０８】
ｐＨについては、好ましくは５．５〜７．５の範囲に調節される。これは、脂質の分解および生体内投与時のｐＨ格差を考慮してのことであるが、これに限定されない。ただし、クエン酸を用いてリポソーム内外のｐＨ勾配を形成する場合には、先に示したようにｐＨ７．０付近であることが望ましい。
【０１０９】
リポソームの内水相と外水相の浸透圧については、両者の浸透圧差でリポソームが破壊されることのない範囲の浸透圧で調整されていればよく特に限定はされないが、リポソームの物理的安定性を考慮して、内水相と外水相の浸透圧差は少ないほど望ましい。
【０１１０】
＜シフト試薬＞
本発明でいうシフト試薬は、それを用いることによって、薬物を封入したリポソームの内水相と外水相との間に、薬物封入時に形成されたイオン勾配とは正反対のイオン勾配を形成し、薬物を保持するために形成されているイオン勾配を弱め、内水相の化学平衡の移動（シフト）を引き起こすことによって、内水相に溶解して保持されている薬物の保持力を弱め、リポソーム内部から薬物を放出しやすい環境を作り出すと考えられる物質である。例えば、脱プロトン化試薬またはプロトン化試薬が例示される。
【０１１１】
本発明においては、シフト試薬として脱プロトン化試薬またはプロトン化試薬を用いた場合、脱プロトン化試薬またはプロトン化試薬が、（１）リポソームのリン脂質膜をイオン化しない状態で透過して外水相から内水相に移動し、（２）リポソーム内水相において、脱プロトン化剤はブレンステッド塩基として働き薬物を脱プロトン化し、プロトン化剤はブレンステッド酸として働き薬物をプロトン化し、（３）その結果、リポソーム内水相において、薬物に係る化学平衡の移動（シフト）がルシャトリエの原理に従って引き起こされると考えられる。
【０１１２】
脱プロトン化試薬は、アンモニアまたはアミノ化合物が好ましく、アンモニアが特に好ましい。
【０１１３】
アミノ化合物は、分子量５００以下の低分子アミノ化合物が特に好ましい。これは、脂質膜の透過性を考慮してのことであるが、必ずしもそれに限定されない。
【０１１４】
アミノ基の構造としてはアンモニア、一級アミン、二級アミン、三級アミンが挙げられる。
【０１１５】
脱プロトン化試薬としては、アンモニア、メタノールアミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、トリエチルアミン等が好ましく例示されるが、とりわけアンモニアが好ましい。
【０１１６】
緩衝液中で脱プロトン化試薬を生じるシフト試薬は、脱プロトン化試薬そのものであってもよいし、脱プロトン化試薬の共役酸とアニオンからなる塩であってもよい。そのようなアニオンとしては、水酸化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、グルクロン酸イオン、クエン酸イオン、炭酸イオン、炭酸水素イオン、硝酸イオン、シアン酸イオン、酢酸イオン、安息香酸イオン、臭化物イオン、塩化物イオン、および他の無機または有機アニオン類、ならびにデキストラン硫酸、デキストランリン酸、デキストランホウ酸、カルボキシメチルデキストラン等に例示されるアニオン性高分子電解質のアニオンが好ましく例示される。また、そのような共役酸および共役塩基からなる塩としては、硫酸塩、リン酸塩、グルクロン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、硝酸塩、シアン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、臭化物塩、塩化物塩、および他の無機または有機塩、ならびにアニオン性高分子電解質の塩が好ましく例示される。
【０１１７】
また、緩衝液中でプロトン化試薬を生じるシフト試薬は、プロトン化試薬そのものであってもよいし、プロトン化試薬の共役塩基とカチオンとからなる塩であってもよい。
【０１１８】
薬物放出性試験において、脱プロトン化試薬またはプロトン化試薬の濃度は薬物放出速度に影響を与える場合がある。濃度が過剰であるときは、放出速度が速くなりすぎ、放出速度を制御することが困難となり再現性のあるデータの取得が難しい。また逆に濃度が過小であるときは、化学平衡シフトが十分でなく、薬物濃度の測定が可能となるまでに至らない。このような観点から、リポソーム製剤およびシフト試薬を添加した溶液からなる混合系におけるシフト試薬の最終濃度は、好ましくは０．１〜１５０ｍＭである。
【０１１９】
薬物放出性試験において、リポソーム製剤およびシフト試薬を添加した溶液からなる混合系のｐＨおよび浸透圧の具体的数値については特に限定されないが、生体環境条件を模倣すれば、生体内における放出性と比較することが可能となるため有利である。このような観点から、前記混合系におけるｐＨは５．０〜９．０、浸透圧は２０〜４００ｍＯｓｍの範囲であることが好ましい。ｐＨおよび浸透圧は緩衝液によって調整することが好ましい。
【０１２０】
＜放出性試験の加温温度および時間＞
本発明の薬物放出手段および薬物放出性評価方法においては、リポソーム製剤とシフト試薬を添加した溶液との混合系は、所定の温度で、所定の時間加温され放出を促進することができる。
【０１２１】
この温度は、リポソームの脂質における相転移温度を考慮する必要があり、リポソームの脂質組成に応じて変えることができる。また、前記した理由と同様に生態環境条件を模倣することで生体内における放出性と比較することが可能となるという利点から、体温付近の温度、例えば３０から４０℃の範囲で選択されることが好ましいが、薬物、シフト試薬および脂質組成に応じての設定が必要となるため特には限定されない。
【０１２２】
所定の時間は、初期放出速度から安定した放出速度へと移行した後の時間に設定することが好ましく、試験法として最も誤差の少ない時間で設定することが好ましい。
【０１２３】
製造時における品質管理法を考慮した場合、長すぎる時間は好ましくなく、１〜１８０分の範囲で設定することが好ましい。しかし、薬物、シフト試薬および脂質組成に応じての設定が必要となるため、この範囲に限定されるものではない。
【０１２４】
＜停止液＞
本発明の薬物放出手段および薬物放出性評価方法においては、リポソーム製剤とシフト試薬を添加した溶液との混合系は、所定の温度で、所定の時間加温され放出を促進することができる。
【０１２５】
そして、放出は、冷却または停止液を加えることによって停止することができる。
【０１２６】
停止液とは、リポソームからの放出を停止することができる溶液のことであり、シフト試薬が添加されていないことを特徴とする。
【０１２７】
停止液を加えるということは、添加されたシフト試薬の濃度が希釈されるということになり、放出された薬物が再びリポソーム内へと封入される可能性が存在する。また、停止液の役割は、添加されたシフト試薬により惹起される薬物の放出を抑制することである。そのような懸念から、停止液のｐＨはリポソーム内外水相間におけるｐＨ勾配が少ないように、また、添加されたシフト試薬のｐＫａを考慮し、添加されたシフト試薬のリポソーム膜に対する透過性を著しく低下させることができるように設定されることが好ましい。具体的には、ｐＨ１．０〜５．０の範囲であることが望ましい。ｐＨについては緩衝剤を用いて調整されることが好ましい。また停止液の浸透圧としては、リポソーム製剤とシフト試薬が添加された溶液との混合系の浸透圧に近ければ近いほど、浸透圧差による影響を排除することができるため好ましい。
【０１２８】
リポソームは、脂質の相転移温度以上においてリポソーム外への薬物の拡散が加速することが知られている。本停止液の目的は、薬物拡散を停止させることが目的であるため、停止液の温度は低ければ低いほど好ましく、実施可能な具体例としては、例えば、氷冷である。
【０１２９】
＜放出された薬物の定量法＞
本発明の薬物放出性評価方法においては、放出された薬物をリポソームと分離することが好ましい。
【０１３０】
薬物を分離する方法としては、当業者が知る種々の方法を用いることができ、特に限定されない。薬物を分離する方法としては、透析膜、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー、フィルターを用いたろ過法、超遠心分離機および溶出試験装置の一つであるフロースルーセル法等が好適に例示される。
【０１３１】
本発明の薬物放出性評価方法においては、放出された薬物を分離した後、これら薬物を定量することで放出量および放出率を算出することが可能である。薬物の分析定量法については当業者が知る公知の試験法を用いればよく、例えば紫外吸光光度計および蛍光分光光度計を用いた定量方法、高速液体クロマトグラフ  ＨＰＬＣ）法等が好適に例示される。
【０１３２】
＜放出試験実施のための容器または機器＞
本発明の薬物放出試験において使用する容器または機器は、マイクロチューブから既存の溶出試験器を使用することが可能であり、特に限定されない。
【０１３３】
なお、リポソーム中に担持された薬物と放出された薬物を分離する機能が予め備わっている容器あるいは機器、例えば、透析膜、フロースルーセル等を用いる場合、前記停止液を加えなくてもよい。
【実施例】
【０１３４】
以下に実施例を記載して本発明をより具体的に説明する。しかし、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきものではないことはいうまでもない。【０１３５】
本追加実施例における停止液調製方法、脂質濃度測定方法、粒子径測定方法、薬物定量方法および放出率の算出方法を以下に示す。【０１３６】
＜停止液調製方法＞
塩化ナトリウム５．８４ｇと、リン酸二水素ナトリウム二水和物１５．６０ｇとを、水９００ｍＬに溶かした。次に、その溶液にリン酸緩衝液を加えてｐＨ３．０に調整し、さらに水を加えて全容量を１０００ｍＬとした。
これを停止液（本明細書において「放出停止液」ともいう。）とした。
なお、上記調製方法に従って調製した停止液の浸透圧は３００ｍＯｓｍであった。【０１３７】
＜脂質濃度測定方法＞
リン脂質定量キット（リン脂質Ｃテストワコー、和光純薬工業株式会社）を用いてリポソーム分散液中でのリン脂質（ＨＳＰＣ、ＤＰＰＣ，ＤＭＰＣ，ＤＳＰＣ）濃度（単位：ｍｇ／ｍＬ）を測定した。【０１３８】
＜粒子径測定方法＞
リポソーム分散液２０μＬを生理食塩水で３ｍＬに希釈し、ゼータサイザー（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）  ３０００  ＨＳ（マルバーン（Ｍａｌｖｅｒｎ）社製）を用いて、フォトン相関分光法によって平均粒子径（単位：ｎｍ）を測定した。【０１３９】
＜薬物定量方法＞
（１）ビンクリスチン（ＶＣＲ）定量方法
後記する調製例の記載に従って調製したＶＣＲ含有リポソーム１００μＬを２ｍＬのメタノール中に分散し、試料溶液とした。
これとは別に、濃度の異なるＶＣＲ水溶液を１００μＬとり、２ｍＬのメタノール中に分散させ、検量線用標準溶液を調製した。
これらの液について、下記測定条件に従いＨＰＬＣ法により測定を実施した。
ＶＣＲ濃度は検量線式より算出した。【０１４０】
測定条件
カラム：Ｃ８カラム（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ）
測定波長：２９８ｎｍ
移動相：水／エチレンジアミン（５９／１）７００ｍＬにリン酸を加えてｐＨ７．５に調整した液：メタノール＝７００：３００
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
カラム温度：４０℃【０１４１】
（１．１）外液中ＶＣＲの定量方法
後記する調製例の記載に従って調製したＶＣＲ含有リポソームを生理食塩水で１０倍希釈した後、超遠心分離によりリポソームに含有されていない薬物を分離し、試料溶液とする。別に、濃度の異なるＶＣＲ水溶液を１００μＬとり、水９００μＬを加えて、検量線用標準溶液を調製した。試料溶液および標準溶液につき、ＶＣＲ定量に示したＨＰＬＣ条件に従い、定量を行った。【０１４２】
（１．２）放出したＶＣＲの定量方法
試料を停止液で１０倍希釈した後、超遠心分離によりリポソームに含有されていない薬物を分離し、試料溶液とする。別に、濃度の異なるＶＣＲ水溶液を１００μＬとり、水９００μＬを加えた。さらに、この液を水で１０倍希釈し、検量線用標準溶液とした。試料溶液および標準溶液につき、ＶＣＲ定量に示したＨＰＬＣ条件に従い、定量を行ったが、本定量方法に限り、注入量を５０μＬとした。【０１４３】
（２）シプロフロキサシン（ＣＦＸ）の定量方法
後記する調製例の記載に従って調製したＣＦＸ含有リポソーム１００μＬを２ｍＬのメタノール中に分散し、試料溶液とする。別に、濃度の異なるＣＦＸ水溶液を１００μＬとり、２ｍＬのメタノール中に分散させ、検量線用標準溶液を調製した。これらの液について、下記測定条件に従いＨＰＬＣ法により測定を実施した。ＣＦＸ濃度は検量線式より算出した。【０１４４】
測定条件
カラム：Ｃ８カラム（２５０×４．０ｍｍ、５μｍ）
測定波長：２７８ｎｍ
移動相：ｐＨ  ３．０，  ０．０２ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液８７０ｍＬにアセトニトリル１３０ｍＬを加えた。
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
カラム温度：４０℃【０１４５】
（２．１）外液中ＣＦＸの定量方法
後記する調製例の記載に従って調製したＣＦＸ含有リポソームを生理食塩水で１０倍希釈した後、超遠心分離によりリポソームに含有されていない薬物を分離し、試料溶液とする。別に、濃度の異なるＣＦＸ水溶液を１００μＬとり、水９００μＬを加えて、検量線用標準溶液を調製した。試料溶液および標準溶液につき、ＣＦＸ定量に示したＨＰＬＣ条件に従い、定量を行った。【０１４６】
（２．２）放出したＣＦＸの定量方法
試料を停止液で１０倍希釈した後、超遠心分離によりリポソームに含有されていない薬物を分離し、試料溶液とする。別に、濃度の異なるＶＣＲ水溶液を１００μＬとり、水９００μＬを加えた。さらに、この液を水で１０倍希釈し、検量線用標準溶液とした。試料溶液および標準溶液につき、ＣＦＸ定量に示したＨＰＬＣ条件に従い、定量を行った。【０１４７】
（３）ドキソルビシン（ＤＸＲ）の定量方法
後記する調製例の記載に従って調製したＤＸＲ含有リポソーム０．５ｍＬを２０ｍＬのメタノール中に分散した。この溶液１ｍＬにｐＨ３．０の０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ニ水素ナトリウム溶液１ｍＬを加え混合し、試料溶液とした。別に、濃度の異なるＤＸＲ溶液１ｍＬに、ｐＨ３．０の０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ニ水素ナトリウム溶液１ｍＬを加え混合し、検量線用標準溶液を調製した。試料溶液および標準溶液について、下記測定条件に従いＨＰＬＣ法により測定を実施した。ＤＸＲ濃度は検量線式より算出した。【０１４８】
測定条件
ガードカラム：ＧＬカート  Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２（ジーエルサイエンス社製）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ）（ジーエルサイエンス社製）
測定波長：２５４ｎｍ
移動相：ギ酸５ｍＬにＲＯ水９００ｍＬを加え、アンモニア水でｐＨ４．０に調整した液：アセトニトリル＝７００：３００
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：５０μＬ
カラム温度：４０℃【０１４９】
（３．１）外液中ＤＸＲの定量方法
後記する調製例の記載に従って調製したＤＸＲ含有リポソームを生理食塩水で１０倍希釈した後、超遠心分離によりリポソームに含有されていない薬物を分離した。超遠心後サンプルの上清５０μＬを蛍光分析用メタノール２ｍＬに分散し試料溶液とした。別に、濃度の異なるＤＸＲ水溶液５０μＬを蛍光分析用メタノール２ｍＬに分散し、検量線用標準溶液を調製した。試料溶液および標準溶液について、励起波長４８０ｎｍならびに蛍光波長５８０ｎｍでの蛍光強度を分光蛍光光度計にて定量した。【０１５０】
（３．２）放出したＤＸＲの定量方法
試料を停止液で１０倍希釈した後、超遠心分離によりリポソームに含有されていない薬物を分離した。超遠心後サンプルの上清１ｍＬにｐＨ３．０の０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ニ水素ナトリウム溶液１ｍＬを加え混合し、試料溶液とした。別に、濃度の異なるＤＸＲ溶液１ｍＬに、ｐＨ３．０の０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ニ水素ナトリウム溶液１ｍＬを加え混合し、検量線用標準溶液を調製した。試料溶液および標準溶液について、ＤＸＲ定量に示したＨＰＬＣ条件に従い、定量を行った。【０１５１】
＜放出率の計算方法＞
薬物の放出率（単位：％）を下記式により計算した
放出率（％）＝放出した薬物量／総薬物量×１００【０１５２】
以下に本実施例で使用した薬物等の略称および分子量を示す。
ＨＳＰＣ：水素添加大豆ホスファチジルコリン（分子量：７９０；リポイド（Ｌｉｐｏｉｄ）社製）
ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン（分子量：７３４．１５；日本油脂社製）
ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン（分子量：７９０．１５；日本油脂社製）
ＤＭＰＣ：ジミリストイルホスファチジルコリン（分子量：６７７．９４；日本油脂社製）
ＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ：ポリエチレングリコール（分子量５０００）−ホスファチジルエタノールアミン（分子量６０８１；日本油脂社製）
Ｃｈｏｌ．：コレステロール（分子量：３８６．８６；ソルベイ（Ｓｏｌｖａｙ）社製）
ＶＣＲ：ビンクリスチン硫酸塩（分子量：９２３．０４；常州レオケミカル（Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ  ＬＥＯ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社製）
ＣＦＸ：シプロフロキサシン（分子量：３３１．３４；浙江嘉善誠達薬化（Ｚｈｅｊｉａｎｇ  Ｊｉａｓｈａｎ  Ｃｈｅｎｇｄａ  Ｐｈａｒｍ  ＆  Ｃｈｅｍ）社製）
ＤＸＲ：ドキソルビシン塩酸塩（分子量：５７９．９８；ＲＰＧライフサイエンス（ＲＰＧ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製）
２−アミノエタノール（分子量：６１．０８；関東化学社製）
ジエチルアミン（分子量：７３．１４；関東化学社製）
エチレンジアミン（分子量：６０．１０；関東化学社製）【０１５３】
調製例１：ＶＣＲ含有リポソームの製造
１．ＶＣＲ含有リポソームの製造
以下の工程に従い、ＶＣＲ含有リポソームを製造した。【０１５４】
（１）脂質分散体の調製
ＨＳＰＣ  ０．７１ｇおよびＣｈｏｌ．  ０．２９ｇを、それぞれ量りとった。これらを無水エタノール１ｍＬと混合し、７０℃の恒温層で加温、溶解して、脂質のエタノール溶液を得た。このエタノール溶液に濃度２５０ｍＭのクエン酸水溶液およびスクロースを添加することにより、このエタノール溶液の浸透圧を５００ｍＯｓｍとした。次に、このエタノール溶液に、ｐＨ２に調整した液９ｍＬを添加し、さらに加温して、脂質分散体を得た。【０１５５】
（２）リポソームの整粒化
得られた脂質分散体を、約７０℃に加温したエクストルーダー（Ｅｘｔｒｕｄｅｒ）  Ｔ．１０（リペックス・バイオメンブランズ（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ）社製）に二枚重ねで取り付けたフィルター（０．１μｍ、ポリカーボネートメンブラン；ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）社製）を通して整粒化を行い、整粒化後リポソームの懸濁液を得た。【０１５６】
（３）リポソームの表面修飾
ＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ水溶液（濃度約０．０４ｇ／ｍＬ）を、ＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥの含有量が前記の量りとった総脂質量（ＨＳＰＣとＣｈｏｌ．との和）の０．７５ｍｏｌ％に相当する量となる量準備した。このＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ水溶液を予め６５℃に設定した恒温槽中で加温した。このＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ水溶液と前記の整粒化後リポソームの懸濁液とを混合した。混合後、６５℃に設定した恒温槽中でさらに３０分間加温して、ＰＥＧ修飾リポソームの懸濁液を得た。【０１５７】
（４）外液置換
移動相を１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ６．５）で置換したゲルカラム（セファロース  ４  ファストフロー（Ｓｅｐｈａｌｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）；アマシャムバイオサイエンス社製）を準備した。このゲルカラムを用いて、前記のＰＥＧ修飾リポソームの懸濁液の外液を１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ６．５）で置換し、外液置換後リポソームの懸濁液を得た。外液置換により、リポソーム膜内外にｐＨ勾配を形成した。【０１５８】
（５）薬物封入
前記の外液置換後リポソームの懸濁液に、ＶＣＲとＨＳＰＣの質量比（ＶＣＲ／ＨＳＰＣ）が０．１４（ｗ／ｗ）となるように、ＶＣＲ水溶液を加えた。これを６０℃の恒温槽中で３０分間加温して、薬物封入を行い、薬物封入後リポソームの懸濁液を得た。【０１５９】
（６）未封入薬物除去
移動相を１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ６．５）で置換したゲルカラム（セファロース  ４  ファストフロー）を準備した。このゲルカラムを用い、１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ６．５）を移動相として使用して、前記の薬物封入後リポソームの懸濁液の外液中に残存する薬物を除去し、未封入薬物除去後リポソームの懸濁液を得た。
最後に、この懸濁液をフィルター（０．２μｍ）ろ過し、フィルターろ過後リポソームを得た。【０１６０】
２．ＶＣＲ含有リポソームのリポソーム特性
表１に、調製例１に従って製造された未封入薬物除去後リポソーム（以下「ＬＩＰ１」という。）のＶＣＲ濃度および脂質濃度、フィルターろ過後リポソームのＶＣＲ濃度および粒子径を示す。なお、ＶＣＲ濃度の測定（ＶＣＲ定量）、脂質濃度の測定および粒子径の測定は前記した方法により行った。【０１６１】
【表１】
2010058840.tif 000006
【０１６２】
実施例１：シフト試薬濃度による薬物放出性への影響
本実施例において、薬物を担持したリポソームからのリポソーム外液への放出に関して、シフト試薬濃度による影響を検証した。なお、本実施例において、シフト試薬として、酢酸アンモニウムを使用した。【０１６３】
１．シフト試薬溶液の調製
アンモニウムイオン濃度が５、１０、２５、５０、１００ｍＭとなるように酢酸アンモニウムを溶解し、溶液のｐＨを７．０に０．１Ｍ水酸化ナトリウム試液を用いて調整した。さらに、この液に塩化ナトリウムを加えて溶液浸透圧を３００ｍＯｓｍとし、シフト試薬溶液とした。【０１６４】
２．放出したＶＣＲの定量
調製例１に示したリポソームを上記シフト試薬溶液で１０倍希釈し、３７℃で加温した。加温開始後、２．５、５、１０、１５、３０分で試料を取り出した。なお、サンプルは使用するまで氷冷下で保存した。放出したＶＣＲは、上記に述べた方法に従い定量を実施した。【０１６５】
３．結果
図４にＶＣＲ封入リポソームからのＶＣＲ放出に関するシフト試薬溶液中のシフト試薬濃度への影響を検証した結果を示した。その結果、ＶＣＲの放出は、いずれのシフト試薬濃度を持つシフト試薬溶液においても、経時的な増加を示し、さらに、このＶＣＲ放出量はシフト試薬濃度依存的に増加することが明らかとなった。【０１６６】
図５は放出速度定数とシフト試薬濃度の関係を示したものである。
シフト試薬濃度と放出速度定数は高い相関性（ｒ２＝０．９９７５）を示すことから、リポソームからの薬物の放出は、シフト試薬濃度に依存し、薬物の放出は、シフト試薬濃度を調節することにより容易に制御できることが明らかとなった。【０１６７】
実施例２：シフト試薬溶液のｐＨと薬物放出性の関係
本実施例において、薬物を担持したリポソームからのリポソーム外液への放出に関して、シフト試薬溶液のｐＨによる影響を検証した。なお、本実施例において、シフト試薬として、酢酸アンモニウムを使用した。【０１６８】
１．シフト試薬溶液の調製
アンモニウムイオン濃度として５０ｍＭなるように酢酸アンモニウムを溶解し、溶液のｐＨを４．０、５．０、６．０、７．０、８．０に０．１Ｍ水酸化ナトリウム試液を用いてそれぞれ調整した。さらに、この液に塩化ナトリウムを加えて溶液浸透圧を３００ｍＯｓｍとし、シフト試薬溶液とした。【０１６９】
２．放出したＶＣＲの定量
調製例１に示したリポソームをシフト試薬溶液で１０倍希釈し、３７℃で加温した。加温開始後、２．５、５、１０、１５、３０分でサンプリングした。なお、サンプルは使用するまで氷冷下で保存した。放出したＶＣＲは、上記に述べた方法に従い定量を実施した。【０１７０】
３．結果
図６は、シフト試薬溶液のｐＨを４．０、５．０、６．０、７．０または８．０と設定したときのＶＣＲの放出挙動の変化を示したものである。
ＶＣＲの放出挙動は、シフト試薬溶液のｐＨに依存することが明らかとなり、本実施例においては、ｐＨの増加と共にＶＣＲの放出性が促進されることが明らかとなった。【０１７１】
実施例３：シフト試薬溶液の浸透圧と薬物放出性の関係
本実施例において、薬物を担持したリポソームからのリポソーム外液への放出に関して、シフト試薬溶液の浸透圧による影響を検証した。なお、本実施例において、シフト試薬として、酢酸アンモニウムを使用した。【０１７２】
１．シフト試薬の調製
アンモニウムイオン濃度として５０ｍＭとなるように酢酸アンモニウムを溶解し、ｐＨ７．０とした。この液に塩化ナトリウムを加えて、浸透圧を１００ｍＯｓｍから７５０ｍＯｓｍに調整し、シフト試薬溶液とした。【０１７３】
２．放出したＶＣＲの定量
調製例１に示したリポソームをシフト試薬溶液で１０倍希釈し、３７℃で加温した。加温開始後、２．５、５、１０、１５、３０分でサンプリングした試料を取り出した。なお、サンプルは使用するまで氷冷下で保存した。放出したＶＣＲは、上記に述べた方法に従い定量を実施した。【０１７４】
３．結果
図７は、リポソームからのＶＣＲ放出におけるシフト試薬溶液の浸透圧の影響を示した図である。
ＶＣＲの放出率は、浸透圧に大きく影響され、シフト試薬溶液の浸透圧が低いほどＶＣＲの放出が促進されることが明らかとなった。【０１７５】
調製例２：ＶＣＲ含有リポソームの製造
１．ＶＣＲ含有リポソームの製造
以下の工程に従い、ＶＣＲ含有リポソームを製造した。【０１７６】
（１）脂質分散体の調製
ＨＳＰＣ  ０．７１ｇおよびＣｈｏｌ．  ０．２９ｇを、それぞれ量りとった。これらを無水エタノール１ｍＬと混合し、７０℃の恒温槽で加温、溶解して、脂質のエタノール溶液を得た。このエタノール溶液に濃度２５０ｍＭのクエン酸水溶液およびスクロースを添加することにより、このエタノール溶液の浸透圧を５００ｍＯｓｍに調整した。次に、このエタノール溶液に、ｐＨ２．５に調整した液９ｍＬを添加し、さらに加温して、脂質分散体を得た。【０１７７】
（２）リポソームの整粒化
得られた脂質分散体を、約７０℃に加温したエクストルーダー  Ｔ．１０（リペックス・バイオメンブランズ社製）に二枚重ねで取り付けたフィルター（０．１μｍ、ポリカーボネートメンブラン；ワットマン社製）を通して整粒化を行い、整粒化後リポソームの懸濁液を得た。【０１７８】
（３）リポソームの表面修飾
ＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ水溶液（濃度約０．０４ｇ／ｍＬ）を、ＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥの含有量が前記の量りとった総脂質量（ＨＳＰＣとＣｈｏｌ．との和）の０．７５ｍｏｌ％に相当する量となる量準備した。このＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ水溶液を予め６５℃に設定した恒温槽中で加温した。このＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ水溶液と前記の整粒化後リポソームの懸濁液とを混合した。混合後、６５℃に設定した恒温槽中でさらに３０分間加温して、ＰＥＧ修飾リポソームの懸濁液を得た。【０１７９】
（４）外液置換
移動相を１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ６．５）で置換したゲルカラム（セファロース  ４  ファストフロー；アマシャムバイオサイエンス社製）を準備した。このゲルカラムを用いて、前記のＰＥＧ修飾リポソームの懸濁液の外液を１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ６．５）で置換し、外液置換後リポソームの懸濁液を得た。外液置換により、リポソーム膜内外にｐＨ勾配を形成した。【０１８０】
（５）薬物封入
前記の外液置換後リポソームの懸濁液に、ＶＣＲとＨＳＰＣの質量比（ＶＣＲ／ＨＳＰＣ）が０．２２（ｗ／ｗ）となるように、ＶＣＲ水溶液を加えた。これを６０℃の恒温槽中で３０分間加温して、薬物封入を行い、薬物封入後リポソームの懸濁液を得た。【０１８１】
（６）未封入薬物除去
移動相を１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ６．５）で置換したゲルカラム（セファロース  ４  ファストフロー）を準備した。このゲルカラムを用い、１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ６．５）を移動相として使用して、前記の薬物封入後リポソームの懸濁液の外液中に残存する薬物を除去し、未封入薬物除去後リポソームの懸濁液を得た。
最後に、この懸濁液をフィルター（０．２μｍ）ろ過し、フィルターろ過後リポソームを得た。【０１８２】
２．ＶＣＲ含有リポソームのリポソーム特性
表２に、調製例２に従って製造されたＶＣＲ含有リポソーム（以下「ＬＩＰ２」という。）のリポソーム特性を示す。なお、リポソーム中の薬物濃度の測定（ＶＣＲ定量）および粒子径の測定は前記した方法により行った。【０１８３】
【表２】
2010058840.tif 000007
【０１８４】
実施例４：アミノ化合物を含むシフト試薬溶液中におけるＶＣＲ放出性
本実施例においてシフト試薬として一級アミン（２−アミノエタノール、エチレンジアミン）、二級アミン（ジエチルアミン）を用いた時のＶＣＲ放出挙動について示す。なお、本実施例において、対照シフト試薬としてアンモニウム塩である酢酸アンモニウムを用い、リポソームは、ＬＩＰ２を用いた。【０１８５】
１．シフト試薬溶液の調製
シフト試薬を量りとり、リン酸緩衝液を加えてｐＨ７．４、５０ｍＭのシフト試薬溶液を調製した。【０１８６】
２．放出したＶＣＲの定量
リポソームをシフト試薬溶液を加えて１０倍希釈し、３７℃で加温した。加温開始後、２．５、５、１０、１５、３０分でサンプリングした。なお、サンプルは使用するまで氷冷下で保存した。放出したＶＣＲは、上記に述べた方法に従い定量を実施した。【０１８７】
３．結果
図８は、リポソームからのＶＣＲ放出におけるシフト試薬の影響を示した図である。
アミノ化合物を用いることによりその放出挙動は異なるが、ＶＣＲを放出させることができることが明らかとなり、アンモニウム塩以外でもアミノ化合物を本放出試験におけるシフト試薬として選択可能であることが示された。【０１８８】
実施例１〜４の結論
実施例１から４に示すように、リポソームからの薬物の放出は、シフト試薬溶液の溶液特性により影響されることが明らかになった。つまり、リポソームからの薬物の放出には、外部環境により大きく異なることが示唆される。このような観点から、ｉｎ  ｖｉｖｏを想定した薬物放出性を評価する場合には、生体に近い溶液特性に調整することが望ましいことが示唆された。【０１８９】
調製例３：膜物性の異なるＶＣＲ含有リポソームの製造
１．ＶＣＲ含有リポソームの製造
以下の工程に従い、膜物性の異なるＶＣＲ含有リポソームを製造した。【０１９０】
（１）脂質分散体の調製
ＰＣ１（ＨＳＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣまたはＤＭＰＣ）およびＣｈｏｌ．を、表３に示す秤量値（単位：ｇ）のとおり、それぞれ量りとった。これらを無水エタノール１ｍＬと混合し、７０℃の恒温層で加温、溶解して、脂質のエタノール溶液を得た。このエタノール溶液に濃度２５０ｍＭのクエン酸水溶液を添加して、エタノール溶液のｐＨを２．５に調整した。塩化ナトリウムを添加することにより、このエタノール溶液の浸透圧を５００ｍＯｓｍに調整した。さらに、７０℃に設定した恒温槽中で、このエタノール溶液を加温して、脂質分散体を得た。【０１９１】
【表３】
2010058840.tif 000008
【０１９２】
（２）リポソームの整粒化
得られた脂質分散体を、約７０℃に加温したエクストルーダー  Ｔ．１０（リペックス・バイオメンブランズ社製）に二枚重ねで取り付けたフィルター（０．１μｍ、ポリカーボネートメンブラン；ワットマン社製）を通して整粒化を行い、整粒化後リポソームの懸濁液を得た。【０１９３】
（３）リポソームの表面修飾
ＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ水溶液（濃度約０．０４ｇ／ｍＬ）を、ＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥの含有量が前記の量りとった総脂質量（ＰＣ１とＣｈｏｌ．との和）の０．７５ｍｏｌ％に相当する量となる量準備した。このＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ水溶液を予め６５℃に設定した恒温槽中で加温した。このＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ水溶液と前記の整粒化後リポソームの懸濁液とを混合した。混合後、６５℃に設定した恒温槽中でさらに３０分間加温して、ＰＥＧ修飾リポソームの懸濁液を得た。【０１９４】
（４）外液置換
移動相を１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ６．５）で置換したゲルカラム（セファロース  ４  ファストフロー；アマシャムバイオサイエンス社製）を準備した。このゲルカラムを用いて、前記のＰＥＧ修飾リポソームの懸濁液の外液を１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ６．５）で置換し、外液置換後リポソームの懸濁液を得た。外液置換により、リポソーム膜内外にｐＨ勾配を形成した。【０１９５】
（５）薬物封入
前記の外液置換後リポソームに含まれるリン脂質を、リン脂質測定キットを用いて定量した。前記の外液置換後リポソームの懸濁液に、リン脂質定量結果から算出された総脂質濃度に対するＶＣＲ／ＰＣ１の値が０．１０ｍｏｌ／ｍｏｌとなるように、ＶＣＲ水溶液を加えた。これを６０℃の恒温槽中で３０分間加温して、薬物封入を行い、薬物封入後リポソームの懸濁液を得た。【０１９６】
（６）未封入薬物除去
移動相を１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ６．５）で置換したゲルカラム（セファロース  ４  ファストフロー）を準備した。このゲルカラムを用い、１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ６．５）を移動相として使用して、前記の薬物封入後リポソームの懸濁液の外液中に残存する薬物を除去し、未封入薬物除去後リポソームの懸濁液を得た。
最後に、この懸濁液をフィルター（０．２μｍ）ろ過し、フィルターろ過後リポソームを得た。【０１９７】
２．ＶＣＲ含有リポソームのリポソーム特性
表４に、調製例３に従って製造された膜物性の異なるＶＣＲ含有リポソーム（以下、「ＬＩＰ３」、「ＬＩＰ４」、「ＬＩＰ５」、「ＬＩＰ６」または「ＬＩＰ７」という）のリポソーム特性を示す。【０１９８】
【表４】
2010058840.tif 000009
【０１９９】
実施例５：リポソーム膜組成と薬物放出性の関係
本実施例において、リポソームはＬＩＰ３から７のリポソームを用いて検討を行った。【０２００】
１．シフト試薬溶液の調製
ｐＨ７．４のリン酸緩衝液にアンモニウムイオン濃度として５０ｍＭとなるように酢酸アンモニウムを溶解した。さらに、この液に塩化ナトリウムを加えて３００ｍＯｓｍの浸透圧に調整した。この液をシフト試薬溶液として使用した。【０２０１】
２．放出したＶＣＲの定量
リポソームをシフト試薬溶液で１０倍希釈し、３７℃で加温した。加温開始後、２．５、５、１０、１５、３０分でサンプリングした。なお、サンプルは使用するまで氷冷下で保存した。放出したＶＣＲは、上記に述べた方法に従い定量を実施した。【０２０２】
３．結果
図９は、異なるリン脂質とコレステロールの組成比をもつリポソームからの薬物放出性を示したものである。
リポソームからの薬物放出性は、リン脂質とコレステロールの比が５４：４６と６０：４０の間には薬物放出性に明確な差が認められた。この結果は、コレステロール含量により膜流動性は変化することが知られていることから、膜流動性変化による薬物放出性の変化と推察される。従って、本実施例でえられた放出の差は、リポソームの流動性が大きく影響し、本発明の薬物放出性評価方法により、膜の流動性を評価できることが明らかとなった。【０２０３】
図１０は異なる相転移温度を有するリン脂質からなるリポソームからの薬物放出性を示したものである。
ＶＣＲの放出は、ＤＭＰＣ＞ＤＰＰＣ＞ＤＳＰＣの順に高くなることが明らかとなった。その一方で、脂質の相転移温度として示される膜流動性は、ＤＭＰＣ＞ＤＰＰＣ＞ＤＳＰＣの順に高い。リポソームからの薬物の放出は、膜流動性が高いものほど、高い放出性を示すことが明らかとなっている。従って、本実施例で得られたリポソームからの薬物放出性と相転移温度の関係は、これまでの知見と一致した。【０２０４】
リポソームからの薬物放出は、動物を用いた薬物動態試験および生体成分を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出実験においてリポソーム膜の構造、特に流動性が関与しており、薬物放出性は、リポソーム膜の流動性の増加と共に増加する。これは、リポソーム膜から薬物が放出する際には、リポソーム膜が拡散障壁として働いていることによる。従って、リポソームの粒子径に加えて、リポソーム膜物性が製剤品質管理において非常に重要である。これらの観点から、リポソーム製剤における膜物性評価方法の構築ならびにリポソーム製剤からの薬物放出の試験方法が必要となっている。本実施例において、リン脂質とコレステロール比の異なる製剤ならびにリン脂質相転移温度の異なる製剤を用いて、薬物の放出性に関して検討を行った結果、これらの製剤はいずれも異なる放出挙動を示すことが明らかであり、薬物放出性を評価することにより膜流動性による影響を検証することを可能とする。また、膜流動性を高感度に検証する場合、プローブ等の添加剤をリポソーム膜に含有させ、プローブの挙動より膜流動性を評価するという間接的な評価方法である。しかし、本実施例で示した放出性は、プローブを必要とせず、薬物の放出性から流動性の評価が可能である。【０２０５】
調製例４：ＤＸＲ含有リポソームおよびＶＣＲ含有リポソームの製造
１．ＤＸＲ含有リポソームおよびＶＣＲ含有リポソームの製造
以下の工程に従い、ＶＣＲ含有リポソームおよびＤＸＲ含有リポソームを製造した。【０２０６】
（１）脂質分散体の調製
ＨＳＰＣ  ０．７１ｇおよびＣｈｏｌ．  ０．２９ｇを、それぞれ量りとった。これらを無水エタノール１ｍＬと混合し、７０℃の恒温層で加温、溶解して、脂質のエタノール溶液を得た。このエタノール溶液に濃度２５０ｍＭのクエン酸水溶液およびスクロースを添加することにより、このエタノール溶液の浸透圧を５００ｍＯｓｍとした。次に、このエタノール溶液に、ｐＨ２．５に調整した液９ｍＬを添加し、さらに加温して、脂質分散体を得た。【０２０７】
（２）リポソームの整粒化
得られた脂質分散体を、約７０℃に加温したエクストルーダー  Ｔ．１０（リペックス・バイオメンブランズ社製）に二枚重ねで取り付けたフィルター（０．１μｍ、ポリカーボネートメンブラン；ワットマン社製）を通して整粒化を行い、整粒化後リポソームの懸濁液を得た。【０２０８】
（３）リポソームの表面修飾
ＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ水溶液（濃度約０．０４ｇ／ｍＬ）を、ＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥの含有量が前記の量りとった総脂質量（ＨＳＰＣとＣｈｏｌ．との和）の０．７５ｍｏｌ％に相当する量となる量準備した。このＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ水溶液を予め６５℃に設定した恒温槽中で加温した。このＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ水溶液と前記の整粒化後リポソームの懸濁液とを混合した。混合後、６５℃に設定した恒温槽中でさらに３０分間加温して、ＰＥＧ修飾リポソームの懸濁液を得た。【０２０９】
（４）外液置換
移動相を１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ６．５）で置換したゲルカラム（セファロース  ４  ファストフロー（Ｓｅｐｈａｌｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）；アマシャムバイオサイエンス社製）を準備した。このゲルカラムを用いて、前記のＰＥＧ修飾リポソームの懸濁液の外液を１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ６．５）で置換し、外液置換後リポソームの懸濁液を得た。外液置換により、リポソーム膜内外にｐＨ勾配を形成した。【０２１０】
（５）薬物封入
ＤＸＲ含有リポソームの製造においては、前記の外液置換後リポソームの懸濁液に、ＤＸＲとＨＳＰＣとの質量比（ＤＸＲ／ＨＳＰＣ）が０．１４（ｗ／ｗ）となるように、ＤＸＲ水溶液を加えた。これを６０℃の恒温槽中で３０分間加温して、ＤＸＲ封入を行い、ＤＸＲ封入後リポソームの懸濁液を得た。
ＶＣＲ含有リポソームの製造においては、前記の外液置換後リポソームの懸濁液に、ＶＣＲとＨＳＰＣの質量比（ＶＣＲ／ＨＳＰＣ）が０．２２（ｗ／ｗ）となるように、ＶＣＲ水溶液を加えた。これを６０℃の恒温槽中で３０分間加温して、ＶＣＲ封入を行い、ＶＣＲ封入後リポソームの懸濁液を得た。【０２１１】
（６）未封入薬物除去
移動相を１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ６．５）で置換したゲルカラム（セファロース  ４  ファストフロー）を準備した。このゲルカラムを用い、１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ６．５）を移動相として使用して、前記のＤＸＲ封入後リポソームの懸濁液またはＶＣＲ封入後リポソームの懸濁液の外液中に残存する薬物を除去し、未封入薬物除去後リポソームの懸濁液を得た。
最後に、この懸濁液をフィルター（０．２μｍ）ろ過し、フィルターろ過後リポソームを得た。【０２１２】
２．ＤＸＲ含有リポソームおよびＶＣＲ含有リポソームのリポソーム特性
表５に、調製例４に従って製造されたＤＸＲ含有リポソーム（以下「ＬＩＰ8」という。）およびＶＣＲ含有リポソーム（以下「ＬＩＰ９」という。）のリポソーム特性を示す。なお、リポソーム中の薬物濃度の測定（ＤＸＲ定量またはＶＣＲ定量）および粒子径の測定は前記した方法により行った。【０２１３】
【表５】
2010058840.tif 000010
【０２１４】
実施例６：リポソームからのＤＸＲおよびＶＣＲの放出性評価
本実施例においてリポソームはＬＩＰ８およびＬＩＰ９を使用した。【０２１５】
１．シフト試薬溶液の調製
ｐＨ７．４のリン酸緩衝液にアンモニウムイオン濃度として５０ｍＭとなるように酢酸アンモニウムを溶解した。さらに、この液に塩化ナトリウムを加えて３００ｍＯｓｍの浸透圧に調整した。この液をシフト試薬溶液として使用した。【０２１６】
２．放出したＤＸＲおよびＶＣＲの定量
リポソームをシフト試薬溶液で１０倍希釈し、３７℃で加温した。加温開始後、２．５、５、１０、１５、３０分でサンプリングした。なお、サンプルは使用するまで氷冷下で保存した。放出したＤＸＲおよびＶＣＲは、上記に記載した定量方法に従いそれぞれ測定した。【０２１７】
３．結果
図１１は、リポソームからのＤＸＲ放出またはＶＣＲ放出の挙動を示した図である。
ＤＸＲ含有リポソーム（ＬＩＰ８）は、薬物をほとんど放出しなかったが、ＶＣＲ含有リポソーム（ＬＩＰ９）は、薬物放出量を経時的に増加した。【０２１８】
実施例７：ＤＸＲ含有リポソームおよびＶＣＲ含有リポソームの血中体内動態
本実施例は、ＤＸＲ含有リポソームおよびＶＣＲ含有リポソームの血中体内動態を評価したものである。【０２１９】
１．材料
リポソームは調製例４で製造したＬＩＰ８（ＤＸＲ含有リポソーム）およびＬＩＰ９（ＶＣＲ含有リポソーム）を使用した。
血中体内動態を評価する実験動物としては、ＳＤ系雄性ラットを用いた。【０２２０】
２．方法
薬物投与量として０．１０μｍｏｌ／ｋｇをＳＤ系雄性ラットの尾静脈より注入した。
注入後、ラット尾静脈より経時的に採血を行った。得られた血液を遠心分離し（５０００ｒｐｍ、１０分）、血清を得た。この血清４０μＬにメタノール２００μＬを添加した後、さらに遠心分離を行い（３５００ｒｐｍ、１０分）、上清を回収し、試料溶液とした。
各試料溶液について、ＤＸＲ定量およびＶＣＲ定量を前記の方法に従って行った。ただし、本実施例におけるＤＸＲ定量では、検出器として蛍光光度計を使用し，その測定波長は、励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍとし、注入量は１００μＬとした。また、本実施例におけるＶＣＲ定量においては、注入量を５０μＬとした。【０２２１】
３．結果
図１２は、ＤＸＲおよびＶＣＲの薬物血中動態を示す図である。また、表６は、図１２で得られた薬物動態から薬物動態学的パラメーターを１−コンパートメントモデル（１−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｍｏｄｅｌ）に従い算出した結果を示す表である。
図１２に示すように、薬物の違いによりリポソームの薬物体内動態は異なり、また、表６に示すように、薬物の滞留性は、ＤＸＲ含有リポソーム（ＬＩＰ８）よりもＶＣＲ含有リポソーム（ＬＩＰ９）の方が低いことが明らかとなった。【０２２２】
【表６】
2010058840.tif 000011
【０２２３】
ラットにおけるＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥで修飾されたリポソーム自身の消失半減期は、１３時間程度であり（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，５１：３３６−３３８，２００３）、ＤＸＲ含有リポソームの半減期がリポソーム自身の半減期と近似している。さらに、ＬＩＰ８のようにｐＨ勾配法により調製されたＤＸＲ含有リポソームにおけるＤＸＲの保持効力は非常に高いことから、ＤＸＲ含有リポソームの血中動態はリポソーム自身の血中動態を反映しているものと考えられる。その一方で、同じｐＨ勾配法により調製されたＶＣＲ含有リポソームにおいては、ＤＸＲ含有リポソームよりも消失半減期が低下しており、ＶＣＲが血中で薬物が放出されている。つまり、ＤＸＲ含有リポソームでは、ｉｎ  ｖｉｖｏの環境下でも薬物はリポソーム中に保持されている形態であり、ＶＣ含有Ｒリポソームについては、ｉｎ  ｖｉｖｏの環境下で薬物がリポソーム外液中に放出する。これらの関係は、実施例５にて示したように本発明の薬物放出性評価方法を用いることにより明らかとすることが可能である。【０２２４】
従って、本発明の薬物放出性評価方法を用いることにより，リポソームの膜構造変化、内外水相の環境変化の評価を可能とするだけでなく、血中でのリポソームからの薬物放出をｉｎ  ｖｉｖｏを行うことなく、評価できる系であり、この評価方法に基づいて経口製剤で行われているＩｎ  Ｖｉｖｏ／Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎを実現できる方法である。【０２２５】
調製例５：ＶＣＲ含有リポソームおよびＣＦＸ含有リポソームの製造
１．ＶＣＲ含有リポソームおよびＣＦＸ含有リポソームの製造
以下の工程に従い、ＶＣＲ含有リポソームおよびＣＦＸ含有リポソームを製造した。【０２２６】
（１）脂質分散体の調製
ＨＳＰＣ  ７．０６ｇおよびＣｈｏｌ．  ２．９４ｇを、それぞれ量りとった。これらを無水エタノール１０ｍＬと混合し、７０℃の恒温槽で加温、溶解して、脂質のエタノール溶液を得た。これとは別に、濃度２５０ｍＭの硫酸アンモニウム水溶液９０ｍＬを準備し、予め７０℃の恒温槽で加温しておいた。前記エタノール溶液に、この硫酸アンモニウム水溶液を添加し、さらに加温して、脂質分散体を得た。【０２２７】
（２）リポソームの整粒化
得られた脂質分散体を、約７０℃に加温したエクストルーダー（Ｅｘｔｒｕｄｅｒ）  Ｔ．１００（リペックス・バイオメンブランズ社製）に取り付けたフィルター（ポリカーボネートメンブラン，孔径０．２μｍ×３回，０．１μｍ×１０回；ワットマン社製）を順次通して整粒化を行い、整粒化後リポソ−ムを得た。【０２２８】
（３）リポソームの表面修飾
ＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ水溶液（濃度約３７．７ｍｇ／ｍＬ）を、ＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥの含有量が前記の量りとった総脂質量（ＨＳＰＣとＣｈｏｌ．との和）の０．７５ｍｏｌ％に相当する量となる量準備した。このＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ水溶液を予め６５℃に設定した恒温槽中で加温した。このＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ水溶液と前記の整粒化後リポソームの懸濁液とを混合した。混合後、６５℃に設定した恒温槽中でさらに３０分間加温して、ＰＥＧ修飾リポソームの懸濁液を得た。【０２２９】
（４）外液置換
前記のＰＥＧ修飾リポソームの懸濁液の外液を、クロスフローろ過ユニット（ビバフロー５０、ビバサイエンス社製；ＭＷＣＯ  １００，０００）を用いて１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ６．５）に置換し、外液置換後リポソームの懸濁液を得た。【０２３０】
（５）薬物封入
ＶＣＲ含有リポソームの製造においては、前記の外液置換後リポソームの懸濁液に、リン脂質定量キットを用いて測定した脂質濃度に基づき、ＶＣＲとＨＳＰＣとの質量比（ＶＣＲ／ＨＳＰＣ）が０．１０（ｗ／ｗ）となるように、ＶＣＲ水溶液を加えた。これを５５℃の恒温槽中で３０分間加温し、ＶＣＲ封入後リポソームの懸濁液を得た。
ＣＦＸ含有リポソームの製造においては、前記の外液置換後リポソームの懸濁液に、リン脂質定量キットを用いて測定した脂質濃度に基づき、ＣＦＸとＨＳＰＣとの質量比（ＣＦＸ／ＨＳＰＣ）が０．０４（ｗ／ｗ）となるように、ＣＦＸ水溶液を加えた。これを５５℃の恒温槽中で３０分間加温し、ＣＦＸ封入後リポソームの懸濁液を得た。【０２３１】
（６）未封入薬物除去
クロスフローろ過ユニット（ビバフロー５０、ビバサイエンス社製；ＭＷＣＯ  １００，０００）を用いて、試料量が一定となるように１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ６．５）を供給しながら、前記の薬物封入後リポソームの懸濁液（ＶＣＲ封入後リポソームの懸濁液またはＣＦＸ封入後リポソームの懸濁液）に含まれる未封入薬物を除去し、未封入薬物除去後リポソームの懸濁液を得た。
次に、未封入薬物除去後リポソームの薬物定量を行った。
最後に、得られた未封入薬物除去後リポソームの懸濁液をフィルター（０．２μｍ）ろ過し、フィルターろ過後リポソームを得た。【０２３２】
２．ＶＣＲ含有リポソームおよびＣＦＸ含有リポソームのリポソーム特性
表７に、調製例５に従って製造されたＶＣＲ含有リポソーム（以下「ＬＩＰ１０」という。）およびＣＦＸ含有リポソーム（以下「ＬＩＰ１１」という。）のリポソーム特性を示す。【０２３３】
【表７】
2010058840.tif 000012
【０２３４】
実施例８：異なる薬物を担持したリポソームからのリポソーム外液への放出性
本実施例において、リポソームはＬＩＰ１０およびＬＩＰ１１を使用した。【０２３５】
１．シフト試薬溶液の調製
酢酸アンモニウム１．９ｇを量り、０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸水素ニナトリウム溶液２１０ｍＬ、０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸ニ水素ナトリウム溶液４０ｍＬを加えて、さらに水を加えて５００ｍＬとし、ｐＨ６．５のシフト試薬溶液を調製した。【０２３６】
２．放出したＶＣＲおよびＣＦＸの定量
調製例１に示したリポソームを上記シフト試薬溶液で１０倍希釈し、３７℃で加温した。加温開始後、５、１０、１５、３０分で試料を取り出した。なお、サンプルは使用するまで氷冷下で保存した。放出したＶＣＲおよびＣＦＸは、上記に述べた方法に従い定量を実施した。【０２３７】
３．結果
図１３にＶＣＲ含有リポソーム（ＬＩＰ１０）およびＣＦＸ含有リポソーム（ＬＩＰ１１）の薬物放出率の経時的変化を示す。
同一の膜を用いても内封する薬物が異なることによりその放出性は大きく異なることが図１３からわかる。これは、膜に対する親和性に由来するものであると考えられる。【０２３８】
従って、本実施例によって示されるシフト試薬を用いた薬物放出性評価方法は、膜に対する薬物の親和性を評価できる方法であることが明らかとなった。【０２３９】
調製例６：リン脂質が異なるＤＸＲ含有リポソームの製造
１．ＤＸＲ含有リポソームの製造
以下の工程に従い、リン脂質がＨＳＰＣまたはＤＭＰＣのＤＸＲ含有リポソームを製造した。【０２４０】
（１）脂質分散体の調製
ＨＳＰＣ  ０．７０ｇおよびＣｈｏｌ．  ０．２９ｇを、それぞれ量りとった。また、ＤＭＰＣ  ０．６７ｇおよびＣｈｏｌ．  ０．３３ｇをそれぞれ量りとった。これらを無水エタノール１ｍＬと混合し、７０℃の恒温槽で加温、溶解して、脂質のエタノール溶液を得た。これとは別に、濃度２５０ｍＭの硫酸アンモニウム溶液９ｍＬを準備し、予め７０℃の恒温槽で加温しておいた。前記エタノール溶液に、この硫酸アンモニウム水溶液を添加し、さらに加温して、脂質分散体を得た。【０２４１】
（２）リポソームの整粒化
得られた脂質分散体を、約７０℃に加温したエクストルーダー  Ｔ．１０、リペックス・バイオメンブランズ社製）に取り付けたフィルター（ポリカーボネートメンブラン，孔径０．２μｍ×３回，０．１μｍ×１０回；ワットマン社製）を順次通して整粒化を行い、整粒化後リポソ−ムを得た。【０２４２】
（３）リポソームの表面修飾
ＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ水溶液（濃度約３７．７ｍｇ／ｍＬ）を、ＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥの含有量が前記の量りとった総脂質量（ＨＳＰＣとＣｈｏｌ．との和）の０．７５ｍｏｌ％に相当する量となる量準備した。このＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ水溶液を予め６５℃に設定した恒温槽中で加温した。このＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ水溶液と前記の整粒化後リポソームの懸濁液とを混合した。混合後、６５℃に設定した恒温槽中でさらに３０分間加温して、ＰＥＧ修飾リポソームの懸濁液を得た。【０２４３】
（４）外液置換
移動相を１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ７．４）で置換したゲルカラム（セファロース  ４  ファストフロー；アマシャムバイオサイエンス社製）を準備した。このゲルカラムを用いて、前記のＰＥＧ修飾リポソームの懸濁液の外液を１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ７．４）で置換し、外液置換後リポソームの懸濁液を得た。【０２４４】
（５）薬物封入
前記の外液置換後リポソームの懸濁液に、リン脂質定量キットを用いて測定した総脂質濃度に基づき、ＤＸＲと脂質のモル比（ＤＸＲ／総脂質）が０．１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）となるように、ＤＸＲ溶液を加えた。これを６０℃の恒温槽中で６０分間加温し、薬物封入後リポソームの懸濁液を得た。【０２４５】
（６）未封入薬物除去
移動相を１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ６．５）で置換したゲルカラム（セファロース  ４  ファストフロー）を準備した。このゲルカラムを用い、１０％スクロース／１０ｍＭヒスチジン溶液（ｐＨ６．５）を移動相として使用して、前記の薬物封入後リポソームの懸濁液の外液中に残存する薬物を除去し、未封入薬物除去後リポソームの懸濁液を得た。
最後に、この懸濁液をフィルター（０．２μｍ）ろ過し、フィルターろ過後リポソームを得た。【０２４６】
２．ＤＸＲ含有リポソームのリポソーム特性
表８に、調製例６に従って製造したＤＸＲ含有リポソーム（ＬＩＰ１２およびＬＩＰ１３）のリボソーム特性を示す。ＤＸＲ定量、脂質濃度測定および粒子径は、フィルターろ過後リポソームについて、前記した方法により行った。【０２４７】
【表８】
2010058840.tif 000013
【０２４８】
実施例９：シフト試薬としてエチレンジアミンを用いたときのＤＸＲ放出挙動
本実施例においては、シフト試薬としてエチレンジアミンを用いたときのＤＸＲ放出挙動について示す。なお、リポソームはＬＩＰ１２およびＬＩＰ１３を用いた。【０２４９】
１．シフト試薬溶液の調製
シフト試薬を量りとり、リン酸緩衝液を加えてｐＨ７．４、２５０ｍＭのシフト試薬溶液を調製した。【０２５０】
２．放出したＤＸＲの定量
ＤＸＲ含有リポソーム（調製例６で調製したＬＩＰ１２およびＬＩＰ１３）を前記のシフト試薬溶液で１０倍希釈し、３７℃で加温した。加温開始後、０、２、４時間で試料を取り出した。なお、サンプルは使用するまで氷冷下で保存した。放出したＤＸＲは、上記した「放出したＤＸＲの定量方法」により定量を行った。【０２５１】
実施例８に示すシフト試薬溶液を用いてＤＸＲ含有リポソームからのＤＸＲの放出性を評価した場合、ＤＸＲはほとんど放出されなかったことは、既に、実施例６において述べた。【０２５２】
一方、実施例９では、シフト試薬溶液として２５０ｍＭエチレンジアミン／リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いているが、図１４に示すように、ＤＸＲを放出させることができることが明らかとなった。【０２５３】
また、実施例９では、脂質膜として異なるリン脂質を用いて調製したリポソームのＤＸＲ放出性を比較している。リン脂質としてＨＳＰＣを用いたＬＩＰ１２とＤＭＰＣを用いたＬＩＰ１３とでは、ＤＸＲの放出性に明確な差が認められた。本発明者らは、この差は膜流動性の違いによる薬物放出性の変化に基づくのではないかと推測している。【０２５４】
従って、実施例９によって示されるシフト試薬による薬物放出性評価方法は、薬物の種類あるいはリポソーム特性に応じてシフト試薬を選択することにより、薬物が放出されにくいリポソームにおいても、放出特性を評価することが可能である。【０２５５】
また、実施例９によって示した評価方法で得られる特性変化は、単にリポソームからの薬物放出の評価だけでなく、既存の測定装置では検出できないリポソームの微細な物理化学的変化を捕らえられる評価方法であると推察される。
【産業上の利用可能性】
【０２５６】
本発明の薬物放出試験方法等は、リポソーム製剤の薬物放出特性が所定の範囲内にあるか否かを評価する品質管理において使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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