(57)【要約】  本発明は、白血病幹細胞の細胞周期依存的な化学療法剤の抵抗性を克服するために、該白血病幹細胞の細胞周期の進行を開始させることができる薬剤、及びこれを含む、白血病の再発抑制薬等、即ちG-CSFを含む、白血病幹細胞の細胞周期の進行を誘導するための剤並びにG-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤を組み合わせてなる、白血病の再発抑制薬等を提供する。
2010101257.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
G-CSFを含む、白血病幹細胞の細胞周期の進行を誘導するための剤。
【請求項２】
白血病幹細胞が静止期にある、請求項１記載の剤。
【請求項３】
白血病幹細胞が骨髄ニッチにある、請求項２記載の剤。
【請求項４】
G-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤を組み合わせてなる、白血病幹細胞を殺傷するための医薬。
【請求項５】
G-CSF投与の後で、細胞周期依存的抗腫瘍剤が投与されることを特徴とする、請求項４記載の医薬。
【請求項６】
G-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤を組み合わせてなる、白血病の抑制薬。
【請求項７】
G-CSF投与の後で、細胞周期依存的抗腫瘍剤が投与されることを特徴とする、請求項６記載の抑制薬。
【請求項８】
白血病の再発抑制薬である、請求項６記載の抑制薬。
【請求項９】
哺乳動物に対してG-CSFを投与することを含む、該哺乳動物における白血病幹細胞の細胞周期の進行を誘導する方法。
【請求項１０】
哺乳動物に対してG-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤を投与することを含む、該哺乳動物における白血病幹細胞を殺傷する方法。
【請求項１１】
G-CSF投与の後で、細胞周期依存的抗腫瘍剤が投与される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物に対してG-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤を投与することを含む、該哺乳動物における白血病の抑制方法。
【請求項１３】
G-CSF投与の後で、細胞周期依存的抗腫瘍剤が投与される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
白血病幹細胞の細胞周期の進行の誘導において使用するための、G-CSF。
【請求項１５】
白血病幹細胞の殺傷において使用するための、G-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤を含む組み合わせ物。
【請求項１６】
G-CSF投与の後で、細胞周期依存的抗腫瘍剤が投与されることを特徴とする、請求項１５記載の組み合わせ物。
【請求項１７】
白血病の抑制において使用するための、G-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤を含む組み合わせ物。
【請求項１８】
G-CSF投与の後で、細胞周期依存的抗腫瘍剤が投与されることを特徴とする、請求項１７記載の組み合わせ物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白血病幹細胞の細胞周期依存的な化学療法剤の抵抗性を克服するために、該白血病幹細胞の細胞周期の進行を開始させることができる薬剤、及びこれを含む、白血病の再発抑制薬等に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性骨髄性白血病(AML)は、最も頻度（発症率）の高い成人白血病であり、稀な白血病幹細胞(LSC)から始まる未熟な骨髄芽球のクローン性の増殖によって特徴付けられる（非特許文献１〜３）。【０００３】
従来の化学療法剤はAMLを一時的に寛解し得るものの、後になって再発することが患者を救うことができない困難な問題となっていた。従って有効な治療剤・治療方法の開発のために、LSCの機能的特徴及び分子的特徴を含む白血病の性質を明らかにすることによる、再発メカニズムの解明が強く望まれていた。【０００４】
本発明者らは、共通γ鎖の完全ヌル変異（非特許文献４）を有する、長期異種間生着が改善された新規免疫不全系統NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/J(NOD/SCID/IL2rgnull)マウスを作製した（非特許文献５）。この系統は、90週を超える平均余命を有し、NOD/SCID（非特許文献６）、NOD/SCID/β2mnull（非特許文献７）、NOD-Rag1null（非特許文献８）、NOD-Rag1nullPrf1null（非特許文献９）等の系統よりも、ヒト長期再増殖性造血幹細胞(LT-HSC)の生着及びリンパ系/骨髄系分化能の評価を正確に実施できることを明らかにした（非特許文献１０、１１）。【０００５】
本発明者らは、NOD/SCID/IL2rgKOマウスが従来の免疫不全マウスで獲得免疫系だけでなく自然免疫系も不全状態となったNOD/SCID/b2mKOマウスより白血病の生着率を高率に支持することを明らかにした。さらに新生仔期に移植することが、多くの研究者が技術的な簡便性から用いている成熟期に移植するより有意に高い生着率を支持することを示した。また、本発明者らは、新生仔NOD/SCID/IL2rgnullマウスにヒト急性骨髄性白血病(AML)患者由来のLSCを移植したレシピエントマウスが、個々のヒト患者のAMLの病態を十分再現しており、AMLのモデルマウスとして適切であることを見つけた。さらに、レシピエントマウスから得られたLSCを次のマウスへ二次、三次移植することによっても、患者骨髄で見られた白血病状態を再現し、その形質を維持しながらヒトAML細胞（LSCとnon-LSC）の増幅が可能であることを見出した。さらに、該マウスの解析から、LSCは骨髄(BM)の骨芽細胞リッチな領域（ニッチ）にホーミングしてその中に生着し、そこでLSCは細胞周期が静止期で停止し、そのため細胞周期依存的な化学療法剤により誘導されるアポトーシスから保護されることが判明した（特許文献１、非特許文献１２）。従ってこの細胞周期が静止したLSCこそが、化学療法後に白血病を再発させる原因になると考えられた。【０００６】
静止期にある細胞には、その細胞周期の進行を開始させ、同時に細胞周期依存的な化学療法剤を適用することでアポトーシス等の細胞死を誘導できる。in vitroにおいてAML blast細胞集団にサイトカインを作用させ、そのコロニー形成能を減少させた例は知られているが（非特許文献１３〜１６）、その効果がLSC特異的なのかどうかは、これまで検証されたことはなかった。また、ニッチに局在したままのLSCの細胞周期の進行を誘導できるとは、まったく考えられていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO/2009/051238
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Passegue, E., Jamieson, C.H., Ailles, L.E. & Weissman, I.L. Normal and leukemic hematopoiesis: are leukemias a stem cell disorder or a reacquisition of stem cell characteristics? Proc Natl Acad Sci U S A 100 Suppl 1, 11842-11849 (2003).
【非特許文献２】Hope, K.J., Jin, L. & Dick, J.E. Acute myeloid leukemia originates from a hierarchy of leukemic stem cell classes that differ in self-renewal capacity. Nat Immunol 5, 738-743 (2004).
【非特許文献３】Jordan, C.T. & Guzman, M.L. Mechanisms controlling pathogenesis and survival of leukemic stem cells. Oncogene 23, 7178-7187 (2004).
【非特許文献４】Cao, X. et al. Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity 2, 223-238 (1995).
【非特許文献５】Ishikawa, F. et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood 106,1565-1573 (2005).
【非特許文献６】Shultz, L.D. et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J Immunol 154, 180-191 (1995).
【非特許文献７】Christianson, S.W. et al. Enhanced human CD4+ T cell engraftment in beta2-microglobulin-deficient NOD-scid mice. J Immunol 158, 3578-3586 (1997).
【非特許文献８】Shultz, L.D. et al. NOD/LtSz-Rag1null mice: an immunodeficient and radioresistant model for engraftment of human hematolymphoid cells, HIV infection, and adoptive transfer of NOD mouse diabetogenic T cells. Journal of Immunology 164, 2496-2507 (2000).
【非特許文献９】Shultz, L.D. et al. NOD/LtSz-Rag1nullPfpnull mice: a new model system with increased levels of human peripheral leukocyte and hematopoietic stem-cell engraftment. Transplantation 76, 1036-1042 (2003).
【非特許文献１０】Huntly, B.J. et al. MOZ-TIF2, but not BCR-ABL, confers properties of leukemic stem cells to committed murine hematopoietic progenitors. Cancer Cell 6, 587-596 (2004).
【非特許文献１１】Shultz, L.D. et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol 174, 6477-6489 (2005).
【非特許文献１２】Ishikawa, F. et al. Chemotherapy-resistant human AML stem cells home to and engraft within the bone-marrow endosteal region. Nat Biotechnol 25, 1315-1321 (2007).
【非特許文献１３】Cannistra, S.A. et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor enhances the cytotoxic effects of cytosine arabinoside in acute myeloblastic leukemia and in the myeloid blast crisis phase of chronic myeloid leukemia. Leukemia 3, 328-34 (1989).
【非特許文献１４】Miyauchi, J. et al. Growth factors influence the sensitivity of leukemic stem cells to cytosine arabinoside in culture. Blood 73, 1272-1278 (1989).
【非特許文献１５】Andreeff, M. et al. Colony-stimulating factors (rhG-CSF, rhGM-CSF, rhIL-3, and BCGF) recruit myeloblastic and lymphoblastic leukemic cells and enhance the cytotoxic effects of cytosine-arabinoside. Haematol Blood Transfus 33, 747-762 (1990).
【非特許文献１６】te Boekhorst, PA. et al. Hematopoietic growth factor stimulation and cytarabine cytotoxicity in vitro: effects in untreated and relapsed or primary refractory acute myeloid leukemia cells. Leukemia 8, 1480-1486 (1994).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、静止期にある白血病幹細胞を細胞周期依存的な化学療法剤に感受性にするために、該白血病幹細胞の細胞周期の進行を開始させることにより、従来の化学療法単独でなく、白血病幹細胞を殺傷し、白血病の再発を抑制・防止する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述の様に、本発明者らは、化学療法抵抗性の白血病幹細胞が骨髄(BM)中のニッチに局在しており（Nat Biotechnol 25, 1315-1321 (2007)）、白血病幹細胞がニッチにおいて、細胞周期が静止していることを明らかにした。すなわち、ニッチにおいて白血病幹細胞の細胞周期を動かすことが再発克服の鍵となる。そこで、細胞周期が静止期で停止しており、そのため細胞周期依存的な化学療法剤によって死滅できない白血病幹細胞の細胞周期の進行を、ニッチにおいても特異的に開始させることができる薬剤を、上記AMLマウスモデル（NOD/SCID/IL2rgnull）を用いて探索した。その結果、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）の投与によって、in vivoで該LSCの細胞周期の進行開始をニッチにおいても誘導できることを発見した。さらに、G-CSFと細胞周期依存的な化学療法剤とを組み合わせて投与することにより、非常に高効率でニッチに局在する該白血病幹細胞のアポトーシスを誘導でき、その結果白血病の再発防止を実現できることを移植実験において有意に延長する生存曲線から実証し、本発明を完成させた。【００１１】
即ち、本発明は次の通りである。
［１］  G-CSFを含む、白血病幹細胞の細胞周期の進行を誘導するための剤。
［２］  白血病幹細胞が静止期にある、［１］記載の剤。
［３］  白血病幹細胞が骨髄ニッチにある、［２］記載の剤。
［４］  G-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤を組み合わせてなる、白血病幹細胞を殺傷するための医薬。
［５］  G-CSF投与の後で、細胞周期依存的抗腫瘍剤が投与されることを特徴とする、［４］記載の医薬。
［６］  G-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤を組み合わせてなる、白血病の抑制薬。
［７］  G-CSF投与の後で、細胞周期依存的抗腫瘍剤が投与されることを特徴とする、［６］記載の抑制薬。
［８］  白血病の再発抑制薬である、［６］記載の抑制薬。
［９］  哺乳動物に対してG-CSFを投与することを含む、該哺乳動物における白血病幹細胞の細胞周期の進行を誘導する方法。
［１０］  哺乳動物に対してG-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤を投与することを含む、該哺乳動物における白血病幹細胞を殺傷する方法。
［１１］  G-CSF投与の後で、細胞周期依存的抗腫瘍剤が投与される、［１０］記載の方法。
［１２］  哺乳動物に対してG-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤を投与することを含む、該哺乳動物における白血病の抑制方法。
［１３］  G-CSF投与の後で、細胞周期依存的抗腫瘍剤が投与される、［１２］記載の方法。
［１４］  白血病幹細胞の細胞周期の進行の誘導において使用するための、G-CSF。
［１５］  白血病幹細胞の殺傷において使用するための、G-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤を含む組み合わせ物。
［１６］  G-CSF投与の後で、細胞周期依存的抗腫瘍剤が投与されることを特徴とする、［１５］記載の組み合わせ物。
［１７］  白血病の抑制において使用するための、G-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤を含む組み合わせ物。
［１８］  G-CSF投与の後で、細胞周期依存的抗腫瘍剤が投与されることを特徴とする、［１７］記載の組み合わせ物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の細胞周期の進行誘導剤を用いることにより、骨髄(BM)中のニッチに局在して細胞周期が静止期で停止した白血病幹細胞の細胞周期の進行を誘導することができる。細胞周期が進行した白血病幹細胞は、細胞周期依存的抗腫瘍剤に対して感受性が高くなるため、本発明の細胞周期の進行誘導剤と細胞周期依存的抗腫瘍剤を組み合わせて投与することにより、白血病幹細胞を高い効率で殺傷することが可能となる。白血病幹細胞は白血病の再発の主要な原因となっているため、白血病幹細胞を殺傷することにより白血病の再発を抑制し、予防することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、in vivoでのG-CSF投与により、静止期LSCの細胞周期が進行を開始することを示した図である。（A）G-CSF等の薬剤を投与しない定常状態、in vivoにおいてシタラビン（Ara-C）を投与した後、及びin vivoにおいてG-CSFを投与した後にシタラビンを投与した後の、ヒトAMLを一次移植したレシピエントのBMのbase lineにおけるhCD34+CD38-LSCを、フローサイトメトリーで解析した代表的な等高線図。（B）in vivoでのG-CSF投与（白丸）により、細胞周期のG0期中のレシピエントBM LSCの比率は、G-CSF投与しない（黒丸）場合に比べ減少した。水平方向のバーは平均+SEMを示す。両側t-検定により、各例においてp<0.005であった。
【図２】図２は、G-CSFにより、骨内膜領域内に存在するAML細胞の細胞周期の進行開始が誘導されることを示した図である。（A）ヒトAMLを移植したレシピエントの骨の切片であって、in vivoにおいてG-CSF投与したレシピエント又は投与しないレシピエント由来のもので、BrdUを免疫組織化学標識した代表的な例を示す。これにより、G-CSF投与に関連して骨内膜領域中のAMLがBrdU（灰色）の取り込みを増大させることが証明された。（B）細胞周期の進行のマーカーであるKi67についての免疫蛍光標識により、骨内膜領域中のAML細胞の細胞周期の進行開始がG-CSF投与によって誘導されることが証明された。CD34、Ki67、DAPI及びこれらを合成した像を示す。スケールバーは（A）20μｍ；（B）10μｍである。
【図３】図３は、G-CSF前投与によりAra-Cで誘導されるアポトーシスがBM骨内膜領域内で亢進することを示した図である。（A）in vivoでのAra-C単独投与後、及びin vivoでのG-CSF投与に続くAra-C投与後の、ヒトAMLを一次移植したレシピエントのBM由来のヒトCD34+CD38-LSC及びCD34+CD38+AML非幹細胞において、化学療法後の活性化カスパーゼ-3の発現がG-CSFの前投与によって亢進することを証明するヒストグラムの代表例。（B）7例の各LSCを移植したレシピエントにおいて、LSCの生存がG-CSF前投与と続くAra-C投与により減少した。Ara-Cを単独投与（黒丸）又はG-CSF投与に続いてAra-C投与（白丸）した際の、活性型カスパーゼ-3が陰性（すなわち抗がん剤抵抗性）のBM LSCのパーセンテージを示す。両側t-検定により、各例において有意な差を認めた（p<0.05）。（C）AMLを移植したレシピエントの骨の切片のHE染色及びTUNEL染色により、Ara-C単独投与では、アポトーシスがBMの中央領域で誘導されるが、骨内膜に隣接する細胞は生存することが明らかである（*）。対照的に、G-CSF投与に続いてAra-C投与したレシピエントのBMでは、中央領域に加えて治療抵抗性の白血病幹細胞が生着する骨内膜領域（+）でもアポトーシスによる細胞死が示された。スケールバーは10μｍである。
【図４】図４は、G-CSF前投与とAra-C投与を組み合わせることにより、LSCの頻度を減少させ二次レシピエントの生存を向上させることを示した図である。（A）最尤法（method of maximum likelihood）を用いた白血病の再発／発症がLSCのみから起きることが実証されているため、ポアソン統計によりLSCの頻度を推計した。解析においては、陽性移植を移植から18週目に末梢血でhCD45+>1.0%であることと定義した。*投与後、限界希釈移植のためのhCD34+細胞が十分数単離できなかった。**全レシピエントにて生着したため、頻度を推計できなかった。***全レシピエントにて生着しなかったため、頻度を推計できなかった。P値は両側t-検定により得た。範囲は+/-SEMを示す。（B）Ara-Cを単独投与又はG-CSF投与と組み合わせてAra-C投与した、AMLを移植したレシピエント由来の生hCD34+AML細胞を受容したマウスの生存をKaplan-Meier法により全体的に推計した。各投与レベルごと及び投与レベル同士での比較により、G-CSFと組み合わせてAra-Cを受容した、AMLを移植したマウスの二次レシピエントにおいては、生存が全体的に、統計的に有意に向上することがわかった(log-rank検定により、p<0.0001)。投与量2×103(実線)：Ara-C単独n=25、G-CSF+Ara-C n=21；投与量2×104(破線)：Ara-C単独n=22、G-CSF+Ara-C n=14；投与量2x105(破点線)：Ara-C単独n=15、G-CSF+Ara-C n=14。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（１）白血病幹細胞の細胞周期の進行を誘導するためのG-CSFの使用
本発明は、G-CSFを含む、白血病幹細胞の細胞周期の進行を誘導するための剤を提供する。
【００１５】
G-CSFは公知のサイトカインであり、そのアミノ酸配列等も公知である。本発明において用いられるG-CSFは、通常哺乳動物由来である。「哺乳動物由来」とは、G-CSFのアミノ酸配列が哺乳動物の配列であることを意味する。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類を挙げることが出来る。本発明において用いられるG-CSFは、好ましくはヒト由来である。
【００１６】
ヒトG-CSFの代表的なアミノ酸配列としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列（全長）や、配列番号３（シグナル配列が切断された成熟型）を挙げることが出来る。本明細書において、蛋白質及びペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）で記載される。
【００１７】
天然型のG-CSFのアミノ酸配列の一部を欠失、置換、付加及び／又は挿入されたポリペプチドであって、顆粒球コロニー形成活性を有するポリペプチド（G-CSF誘導体）も、本発明に用いられるG-CSFに含まれる。このようなG-CSF誘導体は、例えば、特許第2718426号、特許第2527365号、特許第2660178号、特許第2660179号、特公平6-8317号、特許第2673099号等に開示されている。
【００１８】
G-CSFは、これを産生する細胞やその培養上清から自体公知の蛋白質分離精製技術により単離又は精製されたものであってよい。また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成された蛋白質であってもよいし、或いは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。
【００１９】
本発明に用いられるG-CSFは単離又は精製されていることが好ましい。「単離又は精製」とは、目的とする成分以外の成分を除去する操作が施されていることを意味する。単離又は精製されたG-CSFの純度（全ポリペプチド重量に対する、G-CSF）は、通常50重%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上（例えば実質的に100%）である。
【００２０】
本発明に用いられるG-CSFは修飾されていてもよい。該修飾としては、脂質鎖の付加（脂肪族アシル化（パルミトイル化、ミリストイル化等）、プレニル化（ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化等）等）、リン酸化（セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基等におけるリン酸化）、アセチル化、糖鎖の付加（Nグリコシル化、Oグリコシル化）、ポリエチレングリコール鎖の付加等を挙げることが出来るが、これらに限定されない。
【００２１】
白血病幹細胞とは、次の要件を満たす細胞を指す：
1  生体内での白血病発症能を選択的且つ独占的に有する。
2  自身では白血病を発症することのできない白血病非幹細胞分画を作り出すことができる。
3  生体に生着することができる。
4  自己複製能を有する。
ここで、自己複製能とは、細胞分裂の結果生じる2個の細胞のうち、1つが自分自身、すなわち幹細胞となり、もう1つが分化の進んだ前駆細胞となるように、分裂し得る能力をさす。白血病幹細胞の概念は、本技術分野において既に確立しており、広く受け入れられている（D. Bonnet, J.E. Dick, Nat. Med. 3, 730 (1997)、T. Lapidot et al., Nature 367, 645 (1994)）。
【００２２】
本明細書において、白血病幹細胞は、あらゆるタイプの白血病細胞の幹細胞を包含するが、好ましくは、急性骨髄性白血病細胞の幹細胞をいう。
【００２３】
本発明の剤の適用対象である白血病幹細胞は、通常哺乳動物由来である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類を挙げることが出来る。本発明において用いられる白血病幹細胞は、好ましくは霊長類（例えばヒト）又はげっ歯類（例えばマウス）由来である。
【００２４】
ヒト白血病細胞は、通常hCD45+hCD33+の表現系を有する。ヒト白血病細胞のうち、白血病幹細胞は、通常hCD34+の表現系を有する。ヒト白血病幹細胞のうち、白血病発症の能力を選択的に有し、細胞周期が静止期で停止した化学療法剤抵抗性の白血病幹細胞は、通常hCD38-の表現系を有する。
【００２５】
細胞周期とは、真核生物において、有糸分裂、細胞質分裂及び間期を含む細胞分裂を構成する事象のサイクルを言う。細胞は、第一間期（G1期）、次いでDNA合成期（S期）に進み、DNA合成を行う。DNA合成が完了すると第二間期（G2期）に進み、細胞分裂の準備が行われる。該準備が整い、ゲノム複製が完了すると分裂期（M期）に進み、細胞分裂が開始される。そして、同一の遺伝情報を持つ2個の細胞に増え、再び第一間期（G1期）に戻る。細胞への増殖刺激が続く場合には、更にDNA合成期（S期）に進み、細胞周期を繰り返す。細胞刺激を受けなければ、静止期（G0期）に留まる。
【００２６】
「細胞周期の進行の誘導」とは、細胞周期が静止期にある細胞を、細胞周期の中へ入場（エントリー）させることをいう。従って、細胞周期の進行の誘導により、細胞分裂が開始される。
【００２７】
後述の実施例に示されるように、白血病幹細胞の大部分は骨髄のニッチ（骨芽細胞が豊富に存在する領域に隣接する骨内膜表面）に存在し、細胞周期が静止している。さらに、細胞周期に入った幹細胞は、たとえCD34+CD38-という幹細胞に特徴的な表現型を有していても、抗がん剤によって殺される。したがって、白血病幹細胞の細胞周期を静止期から脱却させ、G1、S、G2、Mという周期に入れる事が該細胞を死滅させる上で肝要である。白血病幹細胞にG-CSFを適用することにより、白血病幹細胞が細胞周期の中へエントリーし、又は細胞周期の回転スピードが上昇し、細胞周期依存的抗腫瘍剤に対する感受性を高めることが出来る。従って本発明の剤は、白血病幹細胞の細胞周期依存的抗腫瘍剤に対する感受性を高めるための医薬として有用である。後述のように、本発明の剤と細胞周期依存的抗腫瘍剤とを組み合わせることにより、効率的に白血病幹細胞を殺傷することが可能である。
【００２８】
本発明の剤は、G-CSF自体をそのまま、又は適当な医薬組成物として、ヒト又は非ヒト哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与し得る。投与に用いられる医薬組成物としては、G-CSFと薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。
【００２９】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記G-CSFを通常注射剤に用いられる無菌の水性液、又は油性液に溶解、懸濁又は乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO-50（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記G-CSFを通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
【００３０】
経口投与のための組成物としては、固体又は液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【００３１】
また、本発明の剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）、酸化防止剤等と配合してもよい。調製された医薬は、適当なアンプルに充填することができる。
【００３２】
上記の非経口用又は経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、エアロゾル剤、坐剤が挙げられる。また、infusion pumpや経皮的パッチや皮下包埋剤も、持続的な薬剤の効果を継続的に発揮するために、適した投与法として含まれる。G-CSFの含有量としては、投薬単位剤形当たり通常1〜5000mg、とりわけ注射剤では2〜3000mg、その他の剤形では5〜3000mgの上記G-CSFが含有されていることが好ましい。
【００３３】
G-CSFを含有する上記製剤の投与量は、投与対象、症状、投与ルート等によっても異なるが、例えば、成人の白血病幹細胞の細胞周期の進行を誘導するために使用する場合には、G-CSFを1回量として、通常0.01〜50mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜20mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.2〜10mg/kg体重程度を、1日1〜3回程度、好ましくは1日1回、静脈注射又は点滴により投与するのが好都合である。他の非経口投与（筋肉内投与、皮下投与）及び経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。G-CSFの投与頻度は、投与対象、症状、投与ルート等によっても異なるが、例えば1〜７日に１回の頻度、好ましくは1〜3日に1回の頻度である。G-CSFの投与回数は、投与対象、症状、投与ルート、抗腫瘍剤の種類等によっても異なるが、通常1〜15回、好ましくは2〜10回程度である。
【００３４】
（２）G-CSFと細胞周期依存的抗腫瘍剤の組み合わせ
更に本発明は、G-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤を組み合わせてなる医薬を提供する。
【００３５】
細胞周期依存的抗腫瘍剤とは、有効成分が細胞周期の進行に寄与する分子やメカニズムを標的にしていることにより、細胞周期が停止している細胞よりも細胞周期が進行している細胞に対してより高い殺傷効果を有する抗腫瘍剤を意味する。該細胞周期依存的抗腫瘍剤としては、癌の化学療法剤として公知の薬剤、例えばアルキル化剤（例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、代謝拮抗剤（例、シタラビン、5-フルオロウラシル、メソトレキセート等）、抗癌性抗生物質（例、アドリアマイシン等、マイトマイシン）、植物由来抗癌剤（例、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド等が挙げられるが、これらに限定されない。なかでもシタラビン、5-フルオロウラシル等が好ましい。「細胞周期依存的抗腫瘍剤」については、例えば文献Brunton, LL. Parker, KL. and Lazo, JS., Goodman and Gillman's The Pharmacological Basis of Therapeutics. 11thed. McGraw Hill Publishing (2005)やWikipediaの「抗ガン剤」の項等に詳細に記載されている。
【００３６】
本発明において使用される、細胞周期依存的抗腫瘍剤としては、白血病（特に急性骨髄性白血病）に有効なものが好ましい。
【００３７】
G-CSFと細胞周期依存的抗腫瘍剤との併用に際しては、G-CSFと細胞周期依存的抗腫瘍剤の投与時期は限定されず、G-CSFと細胞周期依存的抗腫瘍剤とを、投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。G-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤の投与量は、目的とする効果（白血病幹細胞の殺傷又は白血病の抑制・予防）を達成し得る範囲で特に限定されず、投与対象、投与ルート、症状、組み合わせ等により適宜選択することが出来る。
【００３８】
G-CSFと細胞周期依存的抗腫瘍剤の投与形態は、特に限定されず、投与時に、G-CSFと細胞周期依存的抗腫瘍剤とが組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例えば、（１）G-CSFと細胞周期依存的抗腫瘍剤とを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、（２）G-CSFと細胞周期依存的抗腫瘍剤とを別々に製剤化して得られる2種の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）G-CSFと細胞周期依存的抗腫瘍剤とを別々に製剤化して得られる2種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）G-CSFと細胞周期依存的抗腫瘍剤とを別々に製剤化して得られる2種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）G-CSFと細胞周期依存的抗腫瘍剤とを別々に製剤化して得られる2種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例えば、G-CSF→細胞周期依存的抗腫瘍剤の順序での投与、或いは逆の順序での投与）等が挙げられる。
【００３９】
本発明の医薬は、G-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤自体をそのまま、又は適当な医薬組成物として、ヒト又は非ヒト哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与し得る。投与に用いられる医薬組成物としては、G-CSF及び／又は細胞周期依存的抗腫瘍剤と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。
【００４０】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記G-CSF及び／又は細胞周期依存的抗腫瘍剤を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、又は油性液に溶解、懸濁又は乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO-50（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記G-CSF及び／又は細胞周期依存的抗腫瘍剤を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
【００４１】
経口投与のための組成物としては、固体又は液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【００４２】
また、本発明の医薬は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）、酸化防止剤等と配合してもよい。調製された医薬は、適当なアンプルに充填することができる。
【００４３】
上記の非経口用又は経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、エアロゾル剤、坐剤が挙げられる。
【００４４】
G-CSFと細胞周期依存的抗腫瘍剤とを別々に製剤化する場合、本発明の医薬におけるG-CSFの含有量は、（１）の項で記載した通りである。
【００４５】
また、本発明の医薬における細胞周期依存的抗腫瘍剤の含有量は、製剤の形態や抗腫瘍剤の種類によって相違するが、通常、製剤全体に対して約0.1〜99.9重量%、好ましくは約1〜99重量%、さらに好ましくは約10〜90重量%程度である。
【００４６】
G-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤を同時に製剤化して単一の製剤として使用する場合も、上記に準じた含有量でよい。この場合、G-CSFと細胞周期依存的抗腫瘍剤との配合比は、投与対象、投与ルート、症状、細胞周期依存的抗腫瘍剤の種類等により適宜選択することができる。
【００４７】
G-CSFの投与量は、投与対象、症状、投与ルート等によっても異なるが、例えば、成人の白血病幹細胞を殺傷するために使用する場合には、G-CSFを1回量として、通常0.01〜50mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜20mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.2〜10mg/kg体重程度を、1日1〜3回程度、好ましくは1日1回、静脈注射又は点滴により投与するのが好都合である。他の非経口投与及び経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【００４８】
細胞周期依存的抗腫瘍剤の投与量は、投与対象、症状、投与ルート、抗腫瘍剤の種類等によっても異なるが、例えば、成人の白血病幹細胞を殺傷するために、シタラビンを使用する場合には、シタラビンを1回量として、通常0.01〜2g/kg体重程度、好ましくは0.05〜1g/kg体重程度、さらに好ましくは0.1〜0.5g/kg体重程度を、1日1〜3回程度、好ましくは1日1回、静脈注射又は点滴により投与するのが好都合である。他の非経口投与及び経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【００４９】
G-CSF及び／又は細胞周期依存的抗腫瘍剤の投与頻度は、投与対象、症状、投与ルート、抗腫瘍剤の種類等によっても異なるが、例えば1〜7日に1回の頻度、好ましくは1〜3日に1回の頻度である。G-CSF及び／又は細胞周期依存的抗腫瘍剤の投与回数は、投与対象、症状、投与ルート、抗腫瘍剤の種類等によっても異なるが、通常1〜15回、好ましくは2〜10回程度である。
【００５０】
上述のG-CSFと細胞周期依存的抗腫瘍剤をそれぞれ別々に製剤化して併用投与するに際しては、G-CSFを含有する製剤と細胞周期依存的抗腫瘍剤を含有する製剤とを同時期に投与してもよいが、細胞周期依存的抗腫瘍剤を含有する製剤を先に投与した後、G-CSFを含有する製剤を投与してもよいし、G-CSFを含有する製剤を先に投与し、その後で細胞周期依存的抗腫瘍剤を含有する製剤を投与してもよい。時間差をおいて投与する場合、時間差は投与する有効成分、剤形、投与方法により異なるが、例えば、G-CSFを含有する製剤を先に投与する場合、G-CSFを含有する製剤を投与した後、1分〜3日以内に細胞周期依存的抗腫瘍剤を含有する製剤を投与する方法が挙げられる。細胞周期依存的抗腫瘍剤を含有する製剤を先に投与する場合、細胞周期依存的抗腫瘍剤を投与した後1分〜3日以内にG-CSFを含有する製剤を投与する方法が挙げられる。
【００５１】
上述の通り、白血病幹細胞は、通常は、細胞周期から外れた静止期にあるか、或いは細胞周期の回転スピードが遅いため、細胞周期依存的抗腫瘍剤に対して耐性を有する。また、白血病幹細胞にG-CSFを適用することにより、白血病幹細胞が細胞周期の中へエントリーし、細胞周期依存的抗腫瘍剤に対する感受性を高めることが出来る。そして、細胞周期依存的抗腫瘍剤に対する感受性が高くなった細胞に対して、細胞周期依存的抗腫瘍剤を作用させることにより、結果として高い効率で白血病幹細胞を殺傷することが可能になる。従って、本発明の医薬を白血病幹細胞を有する哺乳動物へ投与することにより、該哺乳動物内の白血病幹細胞を殺傷することが可能である。
【００５２】
このような理論に基づけば、細胞周期依存的抗腫瘍剤の投与は、G-CSFの投与と同時又はG-CSFの投与から一定期間後であることが好ましく、G-CSFの投与から一定期間後であることがより好ましい。即ち、本発明の医薬の投与プロトコールには、好ましくはG-CSFと細胞周期依存的抗腫瘍剤とを同時に投与する工程、又はG-CSFを投与し、その後細胞周期依存的抗腫瘍剤を投与する工程が含まれ、より好ましくはG-CSFを投与し、その後細胞周期依存的抗腫瘍剤を投与する工程が含まれる。G-CSFを投与した後に、白血病幹細胞の細胞周期の進行が開始されたことを確認し、その後、細胞周期依存的抗腫瘍剤を投与するのも、また好ましい。
【００５３】
従って、本発明の医薬の投与プロトコールには、好ましくは、
（１）G-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤を単回又は複数回投与すること、
（２）第一段階としてG-CSFを単回又は複数回投与し、第二段階として細胞周期依存的抗腫瘍剤を単回又は複数回投与すること、
（３）第一段階としてG-CSFを単回又は複数回投与し、第二段階としてG-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤を単回又は複数回投与すること、
（４）（２）又は（３）の工程を複数回繰り返すこと
等の工程が含まれ、より好ましくは上記（２）〜（４）から選択されるいずれかの工程が含まれる。
【００５４】
（２）及び（３）において、第一段階の最後の投与と第二段階の最後の投与との間隔は、投与対象、症状、投与ルート、抗腫瘍剤の種類等によっても異なるが、通常1分〜3日以内である。
【００５５】
上記投与プロトコール中の工程のより具体的な例としては、例えば
（１）G-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤を1〜7日に1回の頻度、好ましくは1〜3日に1回の頻度で、1〜15回、好ましくは2〜10回投与すること、
（２）第一段階としてG-CSFを1〜7日に1回の頻度、好ましくは1〜3日に1回の頻度で、1〜15回、好ましくは2〜10回投与し、第二段階として細胞周期依存的抗腫瘍剤を1〜7日に1回の頻度、好ましくは1〜3日に1回の頻度で、1〜15回、好ましくは2〜10回投与すること、
（３）第一段階としてG-CSFを1〜7日に1回の頻度、好ましくは1〜3日に1回の頻度で、1〜15回、好ましくは2〜10回投与し、第二段階としてG-CSF及び細胞周期依存的抗腫瘍剤を1〜7日に1回の頻度、好ましくは1〜3日に1回の頻度で、1〜15回、好ましくは2〜10回投与すること、
（４）（２）又は（３）の工程を複数回繰り返すこと
等を挙げることができる。
【００５６】
白血病幹細胞は、白血病の再発の原因と考えられているので、本発明の医薬を用いることにより、白血病の再発を抑制し、予防することができる。即ち、本発明の医薬は白血病の抑制薬（好ましくは白血病の再発の抑制薬）として有用である。白血病の再発とは、治療により白血病の症状が完全に又は一部寛解した後に、再び白血病細胞が増殖し、白血病の症状が再び現れるか又は悪化することを意味する。本発明の医薬を白血病の発症（又は再発）のリスクのある哺乳動物に投与することにより、該哺乳動物における白血病の発症（又は再発）を抑制し、予防することが出来る。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。【００５８】
（材料及び方法）
患者サンプル
理研RCAIのInstitutional Review Board for Human Researchからの承認により、全ての実験を実施した。AML患者由来の白血病細胞は、書面によるインフォームドコンセントにより収集した。サンプルは、French-American-British(FAB)分類システムのサブタイプM1(前骨髄球性を超える成熟を伴わない;症例4)、M2(骨髄芽球性、成熟を伴う;症例3、6、7)、M4(骨髄単球性;症例1、2)を有するAML患者に由来した。BMMNC（骨髄単核球細胞）は、密度勾配遠心分離を使用して単離した。【００５９】
マウス
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtmlWjl/Sz(NOD/SCID/IL2rgnull)マウスは、Il2rg遺伝子座の完全ヌル変異(Shultz, L.D. et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J Immunol 154, 180-191 (1995))をNOD.Cg-Prkdcscid(NOD/SCID)系統と戻し交雑することによって、The Jackson Laboratoryで開発された。マウスを、理研及びThe Jackson Laboratoryの動物施設で、各施設でInstitutional Animal Committeesによって確立されたガイドラインに従って、照射した食物及び酸性化した水を用いて飼育し、規定された細菌叢のもとで維持した。【００６０】
異種移植
新生仔(誕生後2日以内)のNOD/SCID/IL2rgnullレシピエントに、137Cs源照射器を使用して、150cGyの全身照射を与え、その後2時間以内にAML細胞の静脈内注射を行なった。F. Ishikawa et al., Nat. Biotechnol. 25, 1315 (2007)に記載したように、一次移植のために、レシピエントあたり103〜5×104個のソートした7AAD-系(hCD3/hCD4/hCD8)-hCD34+hCD38-AML患者のBM細胞を用いた。Ara-C（シタラビン）投与後又はG-CSF投与に続くAra-C投与後の二次移植のために、レシピエントあたり2×102、2×103、2×104、又は2×105個のソートした7AAD-hCD45+hCD34+BM細胞を用いた。蛍光活性化セルソーティングのために、AML患者のBMMNC細胞を蛍光色素が結合したマウス抗hCD3、抗hCD4、抗hCD8、抗hCD34及び抗hCD38モノクローナル抗体(BD Immunocytometry)で標識し、レシピエントのBMMNC細胞をマウス抗hCD45、抗hCD34及び抗hCD38モノクローナル抗体(BD Immunocytometry)で標識してFACSAria(Beckton Dickinson, CA)を用いて細胞をソートした。doubletはFSC/SSC-高及びFSC/SSC-幅の解析によって排除した。ソート後のhCD34+hCD38-細胞及びhCD34+細胞の純度は98%を上回った。【００６１】
G-CSF及びAra-C投与
G-CSF単独、Ara-C単独、及びG-CSFとその後にAra-Cを続けて投与する実験のために、ヒトAMLを一次移植したレシピエントを移植後16〜24週後に用いた。投与群と比較する各実験のために、レシピエントのペアは同腹仔から選び、同一の一次AMLサンプルを同一の量同日に移植し、同腹仔間のばらつき及び移植レベルにおける差異に起因するばらつきを抑制した。組み換えヒトG-CSF(Wako, Japan)投与：300μg/kg s.c. qd×5日；Ara-C (Biogenesis, Poole, UK)投与：1g/kg i.p. qd×2日；G-CSF+Ara-C投与：G-CSF 300μg/kg s.c. qd×5日並びに投与4日目及び5日目のAra-C 1g/kg i.p.同時投与qd×2日を行った。レシピエントは最終の注射から16時間後に屠殺した。BrdU(1.5mg/mouse; BD Biosciences, CA)は、該最終の注射後直ちにi.p.で、BrdUの取り込みによる細胞周期解析を行っているレシピエントに注射した（s.c.は皮下投与、i.p.は腹腔内投与をさす）。【００６２】
フローサイトメトリー
ヒトAML移植の評価のために、移植後6週目から開始して3週目ごとに、レシピエントの眼窩静脈叢から採血した。解析した各レシピエントから脛骨2本及び大腿骨1本から骨髄細胞を回収し、MNC（単核球）の計数を手動及び自動血球分析装置(Celltac α, Nihon Kohden, Japan)を使用して行って、各レシピエント由来のBMMNCの絶対数を推計した。マウスあたりのヒトCD34+細胞(脛骨2本及び大腿骨1本由来)の絶対数は、このようにして得られた全BMMNC数に7AAD-hCD45+hCD34+BM細胞（%）を乗じることにより決定した。BrdUの取り込みはBrdU flow kit (BD Pharmingen, CA)を用いて測定した。細胞周期のG0期の細胞を定量するために、Hoechst33342及びPyronin Yで細胞を染色し、次いで標準的な手順を用いて表面染色した。アポトーシスを起こした細胞の定量は、ウサギ抗活性型カスパーゼ-3モノクローナル抗体(BD Pharmingen, CA)を用いて、活性型カスパーゼ-3を細胞内で染色することにより行った。表面標識については、マウス抗ヒトCD45、抗CD34及び抗CD38モノクローナル抗体(BD Immunocytometry)を用いた。解析はFACSAria及びFACSCanto II(Becton Dickinson, CA)を用いて行った。【００６３】
組織学的分析及び免疫蛍光画像化
パラホルムアルデヒドで固定し、脱灰し、パラフィン包埋した切片を、AMLを一次移植したレシピエントの大腿骨から調製した。マウス抗ヒトCD34モノクローナル抗体(Immunotech, France)、ウサギ抗Ki67ポリクローナル抗体(Spring Bioscience, CA)及びマウス抗BrdUモノクローナル抗体(DAKO, Denmark)を抗体染色に用いた。ヘマトキシリン−エオシン(HE)染色は標準的な方法論により行った。TUNEL染色を、Biopathology Institute(Oita, Japan)によるApopTagペルオキシダーゼin situアポトーシス検出キット(Intergene, Purchase, NY)を使用して、標準的な手順に従って実施した。光学顕微鏡観察は、Zeiss Axiovert 200(Carl Zeiss, Germany)を用いて行った。共焦点レーザー走査画像化を、Zeiss LSM Exciter及びLSM 710(Carl Zeiss, Germany)を使用して実施した。【００６４】
統計的分析
細胞周期における細胞（%）、活性型カスパーゼ陰性細胞（%）、BM CD34+細胞の比／絶対数の差異は、両側t-検定を用いて解析した(GraphPad Prism, GraphPad, San Diego, CA)。生存数の差異はlog-rank(Mantel-Cox)検定(GraphPad Prism, GraphPad, San Diego, CA)により解析した。LSCの頻度はL-Calc software(StemSoft Software, Vancouver, Canada)によって行う最尤法及び両側t-検定を用いたポアソン統計により推定した。【００６５】
実施例１
まず、7人のAML患者のBMから得られたLSCを移植したNOD/SCID/IL2rgnullレシピエントの、BM中のLSC及び白血病非幹細胞の細胞周期の進行状況を解析した。症例に依存したばらつきはあったが、レシピエントのBMにおいてはG0期及びG1期の割合が非幹細胞(hCD34+CD38+)に比べLSCで有意に高かった（表１）。【００６６】
【表１】
2010101257.tif 000003
【００６７】
AMLを移植したレシピエントから得られたBMMNC内で、CD34+CD38-LSC及びCD34+CD38+AML非幹細胞を比較した。結果を平均値+/-SEMで示し、差異は両側t-検定で検証した。【００６８】
次に、LSCの細胞周期の進行状況と化学療法剤のシタラビン（Ara-C）の細胞傷害効果との関係を解析した。AMLを一次移植したNOD/SCID/IL2rgnullレシピエントの腹膜腔内にAra-Cを与えると、細胞周期のS期のCD34+CD38-AML細胞が選択的に除去されたが、その一方G0/G1期のCD34+CD38-AML細胞は比較的耐性であり濃縮された(%S=0.1+/-0.1及び%G0/G1=91.7+/-2.3 post-Ara-C, n=15; 未投与のレシピエントと比較した両側t-検定により、p < 0.0005；フローサイトメトリーの代表的なデータセットを図１Aに示す)。【００６９】
Ara-Cにより細胞周期が進行しているCD34+CD38-AML細胞が選択的に除去されるため、静止期のLSCを細胞周期へ誘導することで、それらの化学療法剤への感受性が増大すると仮定した。この仮定を検証するために、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)投与の効果を、AMLを移植したレシピエントにおいてin vivoで分析した。G-CSFによってヒト及びマウスHSCで細胞周期が誘導されることはよく記載されるが、G-CSFのLSCへの効果は正確に証明されてはいない。従ってまず、AMLを一次移植したレシピエントにおいてin vivoで、G-CSFの投与でCD34+CD38-LSCの細胞周期の進行状況が変化するかどうか分析した。フローサイトメトリーの代表的なデータセットを図１Aに示す。検証した全ての事例において、G-CSFで投与した、AMLを移植したレシピエントのLSCでG0期画分の細胞が有意に減少し、同時にS期及びG2/M期のLSCが増加した。【００７０】
実施例２
本発明者らは以前、CD34+CD38-LSCはBMの骨内膜領域内に選択的に存在する一方、CD38+白血病非幹細胞は主にBMの中心領域で検出されることを証明した。BM骨内膜に隣接するLSCがin vivoで比較的化学療法に耐性を示すのは重要なことである(F. Ishikawa et al., Nat. Biotechnol. 25, 1315 (2007))。従って、BM骨内膜ニッチ内のLSCの細胞周期の進行状況を直接評価するため、ヒトAMLを一次移植したレシピエントの組織学的解析を行った（図２）。G-CSF等の薬剤を投与しない定常状態では、BMの中心領域中の白血病細胞は強いBrdU陽性であり、これらの細胞が高い増殖性を示した一方、骨内膜に隣接するAML細胞はBrdU染色について陰性であることがわかり、これらの細胞では細胞周期が活発に進行していないことを示した（図２A上）。対照的にG-CSF投与後は、BrdUの取り込みの増加でわかるように、骨内膜領域内のAML細胞は細胞周期の進行を開始した（図２A下）。同様に、G1-S-G2期中の核小体の構成成分に結合するKi67の免疫蛍光染色によって、G-CSF等の薬剤を投与しない定常状態では骨内膜に隣接する大半の白血病細胞では細胞周期が活発に進行していないことが明らかとなった（図２B上）。in vivoでのBrdU取り込みアッセイの知見と整合して、骨内膜領域内のAML細胞と同じく、5日間のG-CSF投与の後のBM中心内のAML細胞においてもKi67の発現が誘導された（図２B下）。これらのフローサイトメトリーの知見及び組織学的な知見により、G-CSFが骨内膜ニッチ内に存在する静止期LSCに細胞周期進行の開始を誘導することが示された。【００７１】
実施例３
次に、細胞周期進行の開始によりLSCの化学療法に対する感受性が増大することを証明するために、AMLを一次移植したレシピエントにおいて、Ara-C投与単独及びG-CSF前投与に続けて行うAra-C投与がLSCへ与える効果を評価するin vivoモデルを開発した。Ara-C投与単独又はG-CSF前投与に続けて行ったAra-C投与のいずれかの後、1)フローサイトメトリーによる、活性型カスパーゼ-3陽性の、アポトーシスを起こしたLSCの画分、2)TUNEL染色による、レシピエントBM中のアポトーシスを起こした細胞の組織学的局在、3)残存した生hCD34+AML細胞のパーセンテージ及び絶対数並びに4)ソートされたhCD34+細胞の限界希釈・逐次移植を介した、AML再発に関する可能性ついての代替的測定値としての残存LSCの頻度及びAMLを発症する能力、についてレシピエントのBMを評価した。図３Aに示すとおり、in vivoにおけるAra-C単独投与によりCD34+CD38+AML非幹細胞はアポトーシスを起こしたが、一方大部分のCD34+CD38-LSCはそうはならなかった。対照的にG-CSF+Ara-C投与では、活性型カスパーゼ-3陰性LSCの頻度が減少し、アポトーシスによる細胞死の増加が示された（図３B）。この効果は、症例間の生物学的な不均質性（すなわち個体差）を反映して7症例のAMLサンプル毎でばらつきを認めたが、統計的にはすべての例において「抗がん剤単独では白血病幹細胞が死滅しにくいが、細胞周期を動かすことでより多くの白血病幹細胞が死滅する」という点で有意に差があった。同時にしたBMの直接分析によって、Ara-C投与単独では、レシピエントにおいてTUNEL陰性AML細胞が骨内膜に残存することが示された（図３C）。しかしG-CSF+Ara-C投与では、HE染色によって明らかとなった細胞充実度の減少及びそれら残存細胞でのTUNEL染色陽性の双方により示されるように、レシピエントにおいて、骨内膜（及び中心領域）でより効率的な細胞死が観察された（図３C）。【００７２】
実施例４
各投与後に残存するLSCの頻度及び機能を評価するため、Ara-C単独及びG-CSF+Ara-Cで投与したレシピエントからソートされた白血病幹細胞を含む生きているhCD34+BM細胞の限界希釈・二次移植を行った。hCD34+細胞の絶対数は各レシピエント由来の脛骨2本及び大腿骨1本における単核球の数から得られ、生hCD34+細胞（%）はフローサイトメトリーにより得られた。これによりG-CSF+Ara-Cで投与したレシピエントのBM中で、生hCD34+細胞数が有意に減少することが明らかとなった（表２）。【００７３】
【表２】
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【００７４】
移植したレシピエント由来の脛骨2本及び大腿骨1本から得られたBMのフローサイトメトリー解析により、G-CSF前投与に続いてAra-C投与した、AMLを移植したレシピエントにおいては、生hCD45+CD34+細胞の比率及び絶対数がともに減少することが証明された。結果を平均値+/-SEMで示し、差異は両側t-検定で検証した。【００７５】
各投与後に残存するLSCの機能及び頻度を明確に決定するために、生hCD34+BM細胞をソートし、レシピエントあたり2×102、2×103、2×104及び2×105細胞の投与量で二次レシピエントに再移植した（図４）。LSCの頻度は、限界希釈（異なる細胞数で幹細胞を移植する方法をさす）によるHSC頻度の推計に用いられる標準的な方法論であるポアソン統計により推定した。図４に示すように、推計された再発の原因細胞であるLSCの頻度は、G-CSF+Ara-Cを投与したレシピエントのBM CD34+集団において有意に低いことがわかった。さらに移植から24週後には、G-CSF+Ara-Cを投与したマウス由来のhCD34+細胞の二次レシピエントでは、各投与量で統計的に有意な生存の向上が示された（図４B）。Ara-C単独で投与したマウスの二次レシピエントで、移植から19週を超えて生存したものはなかったが、G-CSF+Ara-Cを投与したマウスの二次レシピエントの79.6%（39/49）は、移植から24週を超えて生存したことから、G-CSF+Ara-C投与によって白血病幹細胞が大部分死滅するとともに、再発が有意に抑制されるという点から、本発明の有効性が証明された。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明により、従来の標準的な治療法では患者予後の平均生存期間が約1年と、非常に難治性であった白血病の治療効率を飛躍的に改善する、白血病の再発抑制剤を提供することができる。【００７７】
本発明は、２００９年３月５日出願の日本国特許出願、特願２００９-０５２７２３を基礎としており、その内容は全て本明細書に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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