(57)【要約】  下記の一般式（I）又は（II）で表される蛍光化合物。2018212355.tif 0000452018212355.tif 000046  なお、上記一般式（I）、（II）において、Ｒ１、Ｒ１１は、アルキル基又はω−アミノアルキル基を表し、Ｒ２、Ｒ１２は、水素原子又はアルキル基を表し、Ｒ３、Ｒ１３は、式−（ＣＨ２）ｍ−で表される原子団を表し（ｍは１０以下の自然数）、Ｒ４、Ｒ１４は、式−ＣＨ２−又は−ＮＲ６−（−ＮＲ１６−）で表される原子団を表し（Ｒ６、Ｒ１６はアルキル基を表す。）、Ｒ５、Ｒ１５は、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される原子団を表し（ｎは１０以下の自然数）、ＲＮは、式−ＮＨ２、−ＮＨＲ７、−ＮＲ７Ｒ８及び−Ｎ＋Ｒ７Ｒ８Ｒ９（−ＮＨＲ１７、−ＮＲ１７Ｒ１８及び−Ｎ＋Ｒ１７Ｒ１８Ｒ１９）のいずれかで表される原子団であり（Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９は、それぞれ独立してアルキル基を表す。）、Ｒ２、Ｒ１２がアルキル基であり、かつＲ４（Ｒ１４）が式−ＮＲ６−（−ＮＲ１６−）で表される原子団である場合、Ｒ２とＲ６、Ｒ１２とＲ１６は、互いに結合して環を形成していてもよい。
2018212355.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（I）で表される蛍光化合物又はその塩。
【化１】
2018212355.tif 000025
なお、上記一般式（I）において、
Ｒ１は、アルキル基又はω−アミノアルキル基を表し、
Ｒ２は、水素原子又はアルキル基を表し、
Ｒ３は、式−（ＣＨ２）ｍ−で表される原子団を表し（ｍは１０以下の自然数）、
Ｒ４は、式−ＣＨ２−又は−ＮＲ６−で表される原子団を表し（Ｒ６はアルキル基を表す。）、
Ｒ５は、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される原子団を表し（ｎは１０以下の自然数）、
ＲＮは、式−ＮＨ２、−ＮＨＲ７、−ＮＲ７Ｒ８及び−Ｎ＋Ｒ７Ｒ８Ｒ９のいずれかで表される原子団であり（Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、それぞれ独立してアルキル基を表す。）、
Ｒ２がアルキル基であり、かつＲ４が式−ＮＲ６−で表される原子団である場合、Ｒ２とＲ６は、互いに結合して環を形成していてもよい。
【請求項２】
下記の式４ａ〜４ｆ、６ｈ及び６ｉのいずれかで表されることを特徴とする請求項１に記載の蛍光化合物又はその塩。
【化２】
2018212355.tif 000026
【化３】
2018212355.tif 000027
【請求項３】
下記の式４ｂ又は６ｈで表されることを特徴とする請求項２に記載の蛍光化合物又はその塩。
【化４】
2018212355.tif 000028
【化５】
2018212355.tif 000029
【請求項４】
下記の一般式（II）で表される蛍光化合物又はその塩。
【化６】
2018212355.tif 000030
なお、上記一般式（II）において、
Ｒ１１は、アルキル基又はω−アミノアルキル基を表し、
Ｒ１２は、水素原子又はアルキル基を表し、
Ｒ１３は、式−（ＣＨ２）ｍ−で表される原子団を表し（ｍは１０以下の自然数）、
Ｒ１４は、式−ＣＨ２−又は−ＮＲ１６−で表される原子団を表し（Ｒ１６はアルキル基を表す。）、
Ｒ１５は、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される原子団を表し（ｎは１０以下の自然数）、
ＲＮは、式−ＮＨ２、−ＮＨＲ１７、−ＮＲ１７Ｒ１８及び−Ｎ＋Ｒ１７Ｒ１８Ｒ１９のいずれかで表される原子団であり（Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９は、それぞれ独立してアルキル基を表す。）、
Ｒ１２がアルキル基であり、かつＲ１４が式−ＮＲ１６−で表される原子団である場合、Ｒ１２とＲ１６は、互いに結合して環を形成していてもよい。
【請求項５】
下記の式１１又は１３で表されることを特徴とする請求項４に記載の蛍光化合物又はその塩。
【化７】
2018212355.tif 000031
【化８】
2018212355.tif 000032
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載の蛍光化合物及びそれらの塩からなる群より選択される１又は複数を含むオートファジー検出試薬。
【請求項７】
下記の式４ａ〜４ｆのいずれかで表される蛍光化合物及びそれらの塩からなる群より選択される１又は複数と、下記の式６ｈ及び６ｉのいずれかで表される蛍光化合物及びそれらの塩からなる群より選択される１又は複数とを含むことを特徴とする請求項６に記載のオートファジー検出試薬。
【化９】
2018212355.tif 000033
【化１０】
2018212355.tif 000034
【請求項８】
下記の式４ｂで表される蛍光化合物又はその塩及び下記の式６ｈで表される蛍光化合物又はその塩を含むことを特徴とする請求項７に記載のオートファジー検出試薬。
【化１１】
2018212355.tif 000035
【化１２】
2018212355.tif 000036
【請求項９】
下記の式１１で表される蛍光化合物又はその塩及び下記の式１３で表される蛍光化合物又はその塩を含むことを特徴とする請求項６に記載のオートファジー検出試薬。
【化１３】
2018212355.tif 000037
【化１４】
2018212355.tif 000038
【請求項１０】
下記の一般式（Iａ）で表される蛍光化合物及びその塩からなる群より選択される１又は複数と、下記の一般式（IIｂ）で表される蛍光化合物及びその塩からなる群より選択される１又は複数と、或いは
下記の一般式（Iｂ）で表される蛍光化合物及びその塩からなる群より選択される１又は複数と、下記の一般式（IIａ）で表される蛍光化合物及びその塩からなる群より選択される１又は複数とを含むことを特徴とする請求項６に記載のオートファジー検出試薬。
【化１５】
2018212355.tif 000039
【化１６】
2018212355.tif 000040
なお、上記一般式（Iａ）及び（Iｂ）において、
Ｒ１は、アルキル基又はω−アミノアルキル基を表し、
Ｒ２は、水素原子又はアルキル基を表し、
Ｒ３は、式−（ＣＨ２）ｍ−で表される原子団を表し（ｍは１０以下の自然数）、
Ｒ５は、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される原子団を表し（ｎは１０以下の自然数）、
ＲＮは、式−ＮＨ２、−ＮＨＲ７、−ＮＲ７Ｒ８及び−Ｎ＋Ｒ７Ｒ８Ｒ９のいずれかで表される原子団であり（Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、それぞれ独立してアルキル基を表す。）、
上記一般式（Iａ）において、Ｒ６はアルキル基を表し、Ｒ２とＲ６は、互いに結合して環を形成していてもよく、
上記一般式（IIａ）及び（IIｂ）において、
Ｒ１１は、アルキル基又はω−アミノアルキル基を表し、
Ｒ１２は、水素原子又はアルキル基を表し、
Ｒ１３は、式−（ＣＨ２）ｍ−で表される原子団を表し（ｍは１０以下の自然数）、
Ｒ１５は、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される原子団を表し（ｎは１０以下の自然数）、
ＲＮは、式−ＮＨ２、−ＮＨＲ１７、−ＮＲ１７Ｒ１８及び−Ｎ＋Ｒ１７Ｒ１８Ｒ１９のいずれかで表される原子団であり（Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９は、それぞれ独立してアルキル基を表す。）、
上記一般式（IIａ）において、Ｒ１６はアルキル基を表し、Ｒ１２とＲ１６は、互いに結合して環を形成していてもよい。
【請求項１１】
下記の式６ｈで表される蛍光化合物又はその塩及び下記の式１１で表される蛍光化合物又はその塩、或いは
下記の式４ｂで表される蛍光化合物又はその塩及び下記の式１３で表される蛍光化合物又はその塩を含むことを特徴とする請求項１０に記載のオートファジー検出試薬。
【化１７】
2018212355.tif 000041
【化１８】
2018212355.tif 000042
【化１９】
2018212355.tif 000043
【化２０】
2018212355.tif 000044
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な蛍光化合物及びそれを用いたオートファジー検出試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母からヒトに至る真核生物には、細胞内の不要なタンパク質、細胞小器官等の細胞内成分を再利用又は代謝するための分解過程が普遍的に存在し、オートファジー（autophagy）と呼ばれている。オートファジーは、栄養飢餓状態時に自己を非選択的に分解し、栄養分を確保し、飢餓状態を生き抜くための生存機構であると考えられていたが、その後の研究により、変成タンパク質の除去、細胞内で過剰に産生されたタンパク質の蓄積の防止、劣化した細胞内小器官や病原性微生物の排除等を通して、恒常性の維持、個体発生過程のプログラム細胞死、ハンチントン病等の疾患の抑制や、細胞のガン化の抑制等にも関与していることが解明された。【０００３】
オートファジーには、マクロオートファジー、ミクロオートファジー、シャペロン介在型オートファジー等のメカニズムの異なる複数の過程が存在することが知られている。初期の電子顕微鏡を用いた研究により、マクロオートファジーにおいて、二重膜で構成される隔離膜が次第に伸長し、不要物等の分解基質を覆い、オートファゴソームを形成し、次いで、オートファゴソームとリソソームが融合したオートリソソームの段階で消化酵素により、オートファゴソームの内容物が分解を受けることが確認された。いずれの過程も、分解基質が最終的にリソソームに移行し、そこで分解を受ける点において共通している。【０００４】
近年、オートファジーの分子機構についても解明が進みつつあり、オートファジーに関連する遺伝子等が同定されている。オートファジーの検出法として、細胞を溶解し、得られたｍＲＮＡからオートファジー関連因子の発現量を、ウェスタン・ブロット法や免疫染色法で確認する方法が存在するが（例えば、特許文献１参照）、この方法では、細胞を破砕するため、ライブセルイメージングには適用できない。【０００５】
生細胞内におけるオートファジーをモニタリングする方法として、オートファゴソームの形成に関与する遺伝子産物（Ａｔｇタンパク質）の一種であるＬＣ３にＧＦＰを組み込んだＬＣ３−ＧＦＰをコードするプラスミドベクターを細胞内に導入し、ＬＣ３の発現をＧＦＰの発光によりモニターする方法がある（例えば、非特許文献１参照）。ＧＦＰは、酸性条件下において蛍光強度が低下するため、オートファジーの初期段階の検出には優れている。ただし、この方法では、この方法では、細胞内にＬＣ３−ＧＦＰを発現させる必要があるため、あらゆる細胞に適用できるわけではない。【０００６】
ライブセルイメージングの代表的な方法としては、細胞内にＫｅｉｍａと呼ばれるｐＨ応答蛍光タンパク質を発現させ、Ｋｅｉｍａに由来する蛍光強度をモニタリングする方法がある（例えば、非特許文献２参照）。Ｋｅｉｍａは、励起スペクトルがｐＨにより変化する。中性環境下では短波長側（４４０ｎｍ）が優勢であるが、酸性環境下では長波長側（５５０ｎｍ）が優勢になる。この２つの励起波長による画像データから得られるＲａｔｉｏ（５５０ｎｍ／４４０ｎｍ）画像で観察すると、中性環境下にあるＫｅｉｍａでは、Ｒａｔｉｏ値は低くなり、酸性環境下にあるＫｅｉｍａでは、Ｒａｔｉｏ値は高くなる。この現象を利用して、オートファジーに伴う分解基質のｐＨ変化を蛍光画像から読み出することにより、オートファジーの各段階（オートファゴソームの形成、リソソームとの融合等）を検出することができる。ただし、この方法では、細胞内にＫｅｉｍａを発現させる必要があるため、あらゆる細胞に適用できるわけではない。【０００７】
一方、低分子蛍光色素を用いたオートファジーの検出事例として、モノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）を用いる方法が知られている（例えば、非特許文献３参照）。しかし、ＭＤＣの励起波長は紫外領域であるため、細胞毒性及びブリーチング等の問題点がある。近年、Ｅｎｚｏ社により、ＭＤＣの問題点を克服した新規な色素としてＣＹＴＯ−ＩＤ（商標名）が開発された（非特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１３−９９３０５号公報（段落００１６）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Kuma  A  et  al.  The  role  of  autophagy  during  the  early  neonatal  starvation  period.  Nature  Vol.  432,  1032−1036  (2004).
【非特許文献２】T.  Kogure,  et  al.  A  fluorescent  variant  of  a  protein  from  the  stony  coral  Montipora  facilitates  dual-color  single-laser  fluorescence  cross-correlation  spectroscopy;  Nature  Biotechnology.   vol.  24,  577-581  (2006).
【非特許文献３】"Autophagy  Preceded  Apoptosis  in  Oridonin-Treated  Human  Breast  Cancer  MCF-7  Cells",  Qiao  CUI  et  al.  Biol.  Pharm.  Bull.,  vol.  30,  No.  5,  p.859-864  (2007).
【非特許文献４】http://www.enzolifesciences.com/ENZ-51031/cyto-id-autophagy-detection-kit/
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、非特許文献４に記載の色素は、ｐＨ応答性がないため、オートファジーのどの段階を検出しているか不明瞭である。【００１１】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、遺伝子組換え等の煩雑な操作が不要で、あらゆる細胞においてオートファジーの検出が可能な蛍光化合物及びそれを用いたオートファジー検出試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的に沿う本発明の第１の態様は、下記の一般式（I）で表される蛍光化合物又はその塩を提供することにより上記課題を解決するものである。【００１３】
【化１】
2018212355.tif 000003
【００１４】
なお、上記一般式（I）において、
Ｒ１は、アルキル基又はω−アミノアルキル基を表し、
Ｒ２は、水素原子又はアルキル基を表し、
Ｒ３は、式−（ＣＨ２）ｍ−で表される原子団を表し（ｍは１０以下の自然数）、
Ｒ４は、式−ＣＨ２−又は−ＮＲ６−で表される原子団を表し（Ｒ６はアルキル基を表す。）、
Ｒ５は、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される原子団を表し（ｎは１０以下の自然数）、
ＲＮは、式−ＮＨ２、−ＮＨＲ７、−ＮＲ７Ｒ８及び−Ｎ＋Ｒ７Ｒ８Ｒ９のいずれかで表される原子団であり（Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、それぞれ独立してアルキル基を表す。）、
Ｒ２がアルキル基であり、かつＲ４が式−ＮＲ６−で表される原子団である場合、Ｒ２とＲ６は、互いに結合して環を形成していてもよい。【００１５】
本発明の第１の態様に係る蛍光化合物は、下記の式４ａ〜４ｆ、６ｈ及び６ｉのいずれかで表されるもの又はその塩であってもよい。【００１６】
【化２】
2018212355.tif 000004
【００１７】
【化３】
2018212355.tif 000005
【００１８】
本発明の第１の態様に係る蛍光化合物は、下記の式４ｂ又は６ｈで表されるもの又はその塩であることが好ましい。【００１９】
【化４】
2018212355.tif 000006
【００２０】
【化５】
2018212355.tif 000007
【００２１】
本発明の第２の態様は、下記の一般式（II）で表される蛍光化合物又はその塩を提供することにより上記課題を解決するものである。【００２２】
【化６】
2018212355.tif 000008
【００２３】
なお、上記一般式（II）において、
Ｒ１１は、アルキル基又はω−アミノアルキル基を表し、
Ｒ１２は、水素原子又はアルキル基を表し、
Ｒ１３は、式−（ＣＨ２）ｍ−で表される原子団を表し（ｍは１０以下の自然数）、
Ｒ１４は、式−ＣＨ２−又は−ＮＲ１６−で表される原子団を表し（Ｒ１６はアルキル基を表す。）、
Ｒ１５は、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される原子団を表し（ｎは１０以下の自然数）、
ＲＮは、式−ＮＨ２、−ＮＨＲ１７、−ＮＲ１７Ｒ１８及び−Ｎ＋Ｒ１７Ｒ１８Ｒ１９のいずれかで表される原子団であり（Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９は、それぞれ独立してアルキル基を表す。）、
Ｒ１２がアルキル基であり、かつＲ１４が式−ＮＲ１６−で表される原子団である場合、Ｒ１２とＲ１６は、互いに結合して環を形成していてもよい。【００２４】
本発明の第２の態様に係る蛍光化合物は、下記の式１１又は１３で表されるもの又はその塩であることが好ましい。【００２５】
【化７】
2018212355.tif 000009
【００２６】
【化８】
2018212355.tif 000010
【００２７】
本発明の第３の態様は、本発明の第１又は第２の態様に係る蛍光化合物及びそれらの塩からなる群より選択される１又は複数を含むオートファジー検出試薬を提供することにより上記課題を解決するものである。【００２８】
本発明の第３の態様に係るオートファジー検出試薬において、上記の式４ａ〜４ｆのいずれかで表される蛍光化合物及びそれらの塩からなる群より選択される１又は複数と、上記の式６ｈ及び６ｉのいずれかで表される蛍光化合物及びそれらの塩からなる群より選択される１又は複数を含んでいてもよい。【００２９】
本発明の第３の態様に係るオートファジー検出試薬において、上記の式４ｂで表される蛍光化合物又はその塩及び上記の式６ｈで表される蛍光化合物又はその塩を含んでいることが好ましい。【００３０】
本発明の第３の態様に係るオートファジー検出試薬において、上記の式１１で表される蛍光化合物又はその塩及び上記の式１３で表される蛍光化合物又はその塩を含んでいてもよい。【００３１】
本発明の第３の態様に係るオートファジー検出試薬において、下記の一般式（Iａ）で表される蛍光化合物及びその塩からなる群より選択される１又は複数と、下記の一般式（IIｂ）で表される蛍光化合物及びその塩からなる群より選択される１又は複数と、或いは下記の一般式（Iｂ）で表される蛍光化合物及びその塩からなる群より選択される１又は複数と、下記の一般式（IIａ）で表される蛍光化合物及びその塩からなる群より選択される１又は複数とを含むことが好ましい。【００３２】
【化９】
2018212355.tif 000011
【００３３】
【化１０】
2018212355.tif 000012
【００３４】
なお、上記一般式（Iａ）及び（Iｂ）において、
Ｒ１は、アルキル基又はω−アミノアルキル基を表し、
Ｒ２は、水素原子又はアルキル基を表し、
Ｒ３は、式−（ＣＨ２）ｍ−で表される原子団を表し（ｍは１０以下の自然数）、
Ｒ５は、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される原子団を表し（ｎは１０以下の自然数）、
ＲＮは、式−ＮＨ２、−ＮＨＲ７、−ＮＲ７Ｒ８及び−Ｎ＋Ｒ７Ｒ８Ｒ９のいずれかで表される原子団であり（Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、それぞれ独立してアルキル基を表す。）、
上記一般式（Iａ）において、Ｒ６はアルキル基を表し、Ｒ２とＲ６は、互いに結合して環を形成していてもよく、
上記一般式（IIａ）及び（IIｂ）において、
Ｒ１１は、アルキル基又はω−アミノアルキル基を表し、
Ｒ１２は、水素原子又はアルキル基を表し、
Ｒ１３は、式−（ＣＨ２）ｍ−で表される原子団を表し（ｍは１０以下の自然数）、
Ｒ１５は、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される原子団を表し（ｎは１０以下の自然数）、
ＲＮは、式−ＮＨ２、−ＮＨＲ１７、−ＮＲ１７Ｒ１８及び−Ｎ＋Ｒ１７Ｒ１８Ｒ１９のいずれかで表される原子団であり（Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９は、それぞれ独立してアルキル基を表す。）、
上記一般式（IIａ）において、Ｒ１６はアルキル基を表し、Ｒ１２とＲ１６は、互いに結合して環を形成していてもよい。【００３５】
本発明の第３の態様に係るオートファジー検出試薬において、上記の式６ｈで表される蛍光化合物又はその塩及び上記の式１１で表される蛍光化合物又はその塩、或いは上記の式４ｂで表される蛍光化合物又はその塩及び上記の式１３で表される蛍光化合物又はその塩を含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００３６】
上記一般式で表される蛍光化合物は、疎水場で蛍光発光するナフタルイミド及びペリレンイミドを蛍光発色団として用いている。そのため、オートファゴソームやオートリソソームに取り込まれることにより蛍光強度が増大するため、オートファジーを蛍光発光により読み出すことができる。また、官能基Ｒ１〜Ｒ５を適宜選択することにより、疎水性の制御や、光誘起電子移動（ＰＥＴ）を利用した蛍光強度又は蛍光波長のｐＨ応答性の付与等を容易に行うことができる。更に、オートファジーの各段階におけるオートファゴソーム及びオートリソソームの内部環境（ｐＨ等）の変化に対する感受性の異なる複数の蛍光化合物を組み合わせることにより、オートファジーの各段階を観測することが可能になる。特に、オートファゴソーム及びオートリソソームの内部環境の変化に対する感受性に加え、発光波長の異なる一般式（Iａ）で表される蛍光化合物及びその塩からなる群より選択される１又は複数と、一般式（IIｂ）で表される蛍光化合物及びその塩からなる群より選択される１又は複数、或いは一般式（Iｂ）で表される蛍光化合物及びその塩からなる群より選択される１又は複数と、一般式（IIａ）で表される蛍光化合物及びその塩からなる群より選択される１又は複数とを組み合わせて用いる場合、オートファジーの各段階を段階的に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】蛍光化合物４ａ、４ｂ、４ｅ及び４ｆの蛍光強度のｐＨ依存性を示すグラフである。
【図２】Ｈｅｌａ細胞に化合物４ｂを導入し、６時間及び２０時間インキュベートした後の蛍光顕微鏡写真である。
【図３】Ｈｅｌａ細胞に化合物４ｂを導入し、飢餓培養条件下で６時間及び２０時間インキュベートした後のフローサイトメトリーの測定結果を示すグラフである。
【図４】クロロキン存在下で、ラパマイシン又は飢餓誘導によるオートファジーを行ったＨｅｌａ細胞における蛍光強度の変化を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図５】クロロキン存在下で、ラパマイシン又は飢餓誘導によるオートファジーを行ったＨｅｌａ細胞における、ＬＣ３の発現量の定量結果を示す写真である。
【図６】蛍光化合物４ｂ及び６ｈの蛍光強度のｐＨ依存性を示すグラフである。
【図７】Ｈｅｌａ細胞に導入した化合物４ｂ及び化合物６ｈの蛍光強度の比較結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図８】Ｈｅｌａ細胞に導入した化合物４ｂ及び化合物６ｈの蛍光強度の比較結果を示す高倍率蛍光顕微鏡写真である。
【図９】蛍光化合物１１の蛍光強度のｐＨ依存性を示すグラフである。
【図１０】Ｈｅｌａ細胞に化合物１１を導入し、５時間インキュベートした後の蛍光顕微鏡写真である。
【図１１】Ｈｅｌａ細胞に化合物６ｈ及び化合物１１を導入し、３時間及び６時間インキュベートした後の蛍光顕微鏡写真である。
【図１２】Ｈｅｌａ細胞に化合物４ｂ及び化合物１３を導入し、３時間及び６時間インキュベートした後の蛍光顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明の第一の実施の形態に係る蛍光化合物は、下記の一般式（I）で表される。
【００３９】
【化１１】
2018212355.tif 000013
【００４０】
なお、上記一般式（I）において、Ｒ１は、アルキル基又はω−アミノアルキル基を表す。アルキル基又はω−アミノアルキル基は、分岐又は置換基を有していてもよいが、直鎖アルキル基又はω−アミノアルキル基であることが好ましく、炭素数は特に制限されないが、１以上１８以下であることが好ましく、１以上１２以下であることがより好ましく、１以上１０以下であることが更に好ましい。
【００４１】
上記一般式（I）において、Ｒ２は、水素原子又はアルキル基を表す。アルキル基は、分岐又は置換基を有していてもよいが、直鎖アルキル基であることが好ましく、炭素数は特に制限されないが、１以上１８以下であることが好ましく、１以上１２以下であることがより好ましく、１以上１０以下であることが更に好ましい。
【００４２】
上記一般式（I）において、Ｒ３は、式−（ＣＨ２）ｍ−で表される原子団を表す。ｍは１０以下の自然数であり、２以上６以下であることが好ましい。
【００４３】
上記一般式（I）において、Ｒ４は、式−ＣＨ２−又は−ＮＲ６−で表される原子団を表す。Ｒ６はアルキル基を表す。アルキル基は、分岐又は置換基を有していてもよいが、直鎖アルキル基であることが好ましく、炭素数は特に制限されないが、１以上１８以下であることが好ましく、１以上１２以下であることがより好ましく、１以上１０以下であることが更に好ましい。
【００４４】
上記一般式（I）において、Ｒ５は、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される原子団を表す。ｎは１０以下の自然数であり、２以上６以下であることが好ましい。
【００４５】
上記一般式（I）において、ＲＮは、式−ＮＨ２、−ＮＨＲ７、−ＮＲ７Ｒ８及び−Ｎ＋Ｒ７Ｒ８Ｒ９のいずれかで表される原子団である。Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、それぞれ独立してアルキル基を表す。アルキル基は、分岐又は置換基を有していてもよいが、直鎖アルキル基であることが好ましく、炭素数は特に制限されないが、１以上１８以下であることが好ましく、１以上１２以下であることがより好ましく、１以上１０以下であることが更に好ましい。
【００４６】
ＲＮが、式−ＮＨ２、−ＮＨＲ７又は−ＮＲ７Ｒ８で表される原子団である場合、ＲＮは、窒素原子がプロトン化を受けた塩を形成していてもよい。塩の種類は、蛍光強度に影響を与えない限り特に限定されないが、塩の具体例としては、塩酸塩、臭化水素塩、硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等が挙げられる。ＲＮが、式−Ｎ＋Ｒ７Ｒ８Ｒ９で表される原子団である場合も、ＲＮは、上述のものと同様の塩を形成していてもよい。
【００４７】
なお、上記一般式（I）において、Ｒ２がアルキル基であり、かつＲ４が式−ＮＲ６−で表される原子団である場合、Ｒ２とＲ６は、互いに結合して、ピペラジン環等の含窒素環を形成していてもよい。
【００４８】
上記一般式（I）で表される蛍光化合物の好ましい例としては、下記の式４ａ〜４ｆ、６ｈ及び６ｉのいずれかで表されるもの並びにそれらの塩が挙げられる。
【００４９】
【化１２】
2018212355.tif 000014
【００５０】
【化１３】
2018212355.tif 000015
【００５１】
これらの化合物は、疎水場で蛍光発光するナフタルイミド基を蛍光発色団として有しており、オートファゴソームの内部に取り込まれることによって初めて蛍光発光するよう分子設計されている。また、式４ａ〜４ｆ及び６ｉで表される蛍光化合物は、窒素原子上の非共有電子対からの光誘起電子移動（ＰＥＴ）により蛍光が消光されるが、酸性条件下で窒素原子がプロトン化を受けると、蛍光の発光強度が増大する。そのため、これらの蛍光化合物は、オートファジーにおけるリソソームとの融合以降の段階の読み出しに好適に用いることができる。一方、側鎖内に窒素原子を有しない、式６ｈで表される蛍光化合物は、蛍光強度がｐＨの影響を受けないため、オートファジーの前段階の読み出しに好適に用いることができる。更に、両者の化合物を適宜組み合わせることにより、オートファジーの全段階を蛍光強度の変化で読み出すことができる。
【００５２】
一般式（I）で表される蛍光化合物は、任意の公知の方法を用いて合成することができるが、例えば、式４ａ〜４ｆ、６ｈ及び６ｉで表される化合物（の塩酸塩）は、下記のスキームにしたがって合成することができる。
【００５３】
【化１４】
2018212355.tif 000016
【００５４】
【化１５】
2018212355.tif 000017
【００５５】
本発明の第一の実施の形態に係る蛍光化合物は、下記の一般式（II）で表される。
【００５６】
【化１６】
2018212355.tif 000018
【００５７】
なお、上記一般式（II）において、Ｒ１１は、アルキル基又はω−アミノアルキル基を表す。アルキル基又はω−アミノアルキル基は、分岐又は置換基を有していてもよいが、直鎖アルキル基又はω−アミノアルキル基であることが好ましく、炭素数は特に制限されないが、１以上１８以下であることが好ましく、１以上１２以下であることがより好ましく、１以上１０以下であることが更に好ましい。
【００５８】
上記一般式（II）において、Ｒ１２は、水素原子又はアルキル基を表す。アルキル基は、分岐又は置換基を有していてもよいが、直鎖アルキル基であることが好ましく、炭素数は特に制限されないが、１以上１８以下であることが好ましく、１以上１２以下であることがより好ましく、１以上１０以下であることが更に好ましい。
【００５９】
上記一般式（II）において、Ｒ１３は、式−（ＣＨ２）ｍ−で表される原子団を表す。ｍは１０以下の自然数であり、２以上６以下であることが好ましい。
【００６０】
上記一般式（II）において、Ｒ１４は、式−ＣＨ２−又は−ＮＲ１６−で表される原子団を表す。Ｒ１６はアルキル基を表す。アルキル基は、分岐又は置換基を有していてもよいが、直鎖アルキル基であることが好ましく、炭素数は特に制限されないが、１以上１８以下であることが好ましく、１以上１２以下であることがより好ましく、１以上１０以下であることが更に好ましい。
【００６１】
上記一般式（II）において、Ｒ１５は、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される原子団を表す。ｎは１０以下の自然数であり、２以上６以下であることが好ましい。
【００６２】
上記一般式（II）において、ＲＮは、式−ＮＨ２、−ＮＨＲ１７、−ＮＲ１７Ｒ１８及び−Ｎ＋Ｒ１７Ｒ１８Ｒ１９のいずれかで表される原子団である。Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９は、それぞれ独立してアルキル基を表す。アルキル基は、分岐又は置換基を有していてもよいが、直鎖アルキル基であることが好ましく、炭素数は特に制限されないが、１以上１８以下であることが好ましく、１以上１２以下であることがより好ましく、１以上１０以下であることが更に好ましい。
【００６３】
ＲＮが、式−ＮＨ２、−ＮＨＲ１７又は−ＮＲ１７Ｒ１８で表される原子団である場合、ＲＮは、窒素原子がプロトン化を受けた塩を形成していてもよい。塩の種類は、蛍光強度に影響を与えない限り特に限定されないが、塩の具体例としては、塩酸塩、臭化水素塩、硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等が挙げられる。ＲＮが、式−Ｎ＋Ｒ１７Ｒ１８Ｒ１９で表される原子団である場合も、ＲＮは、上述のものと同様の塩を形成していてもよい。
【００６４】
なお、上記一般式（II）において、Ｒ１２がアルキル基であり、かつＲ１４が式−ＮＲ１６−で表される原子団である場合、Ｒ１２とＲ１６は、互いに結合して、ピペラジン環等の含窒素環を形成していてもよい。
【００６５】
上記一般式（II）で表される蛍光化合物の好ましい例としては、下記の式１１及び１３で表されるもの並びにそれらの塩が挙げられる。
【００６６】
【化１７】
2018212355.tif 000019
【００６７】
【化１８】
2018212355.tif 000020
【００６８】
これらの化合物は、疎水場で蛍光発光するペリレンイミド基を蛍光発色団として有しており、オートファゴソームの内部に取り込まれることによって初めて蛍光発光するよう分子設計されている。また、式１１で表される蛍光化合物は、窒素原子上の非共有電子対からの光誘起電子移動（ＰＥＴ）により蛍光が消光されるが、酸性条件下で窒素原子がプロトン化を受けると、蛍光の発光強度が増大する。そのため、これらの蛍光化合物は、オートファジーにおけるリソソームとの融合以降の段階の読み出しに好適に用いることができる。
【００６９】
一般式（II）で表される蛍光化合物は、任意の公知の方法を用いて合成することができるが、例えば、式１１で表される化合物（の塩酸塩）は、下記のスキームにしたがって合成することができる。
【００７０】
【化１９】
2018212355.tif 000021
【００７１】
また、式１３で表される化合物（の塩酸塩）は、下記のスキームにしたがって合成することができる。
【００７２】
【化２０】
2018212355.tif 000022
【００７３】
上記の一般式（I）及び（II）で表される蛍光化合物（以下、「同化合物」と略称する場合がある。）は、細胞膜、オートファゴソーム及びリソソーム（オートリソソーム）に対する透過性を有しているため、同化合物の細胞への導入は、特別な方法を用いることなく、単に同化合物を細胞に接触させることにより行うことができる。このようにして、同化合物を導入した細胞を所定時間インキュベートし、蛍光顕微鏡等の任意の公知の手段を用いて、細胞からの蛍光発光を測定することにより、細胞内におけるオートファジーを検出することができる。本発明のある実施形態は、上記の一般式で表される蛍光化合物を細胞内に投与する工程と、所定時間インキュベート後、細胞からの蛍光発光を測定する工程とを含む細胞内におけるオートファジーを検知する方法に関する。
【００７４】
下記の一般式（Iａ）及び（IIａ）で表される蛍光化合物は、窒素原子上の非共有電子対からの光誘起電子移動（ＰＥＴ）により蛍光が消光されるが、酸性条件下で窒素原子がプロトン化を受けると、蛍光の発光強度が増大する。そのため、これらの蛍光化合物は、オートファジーにおけるリソソームとの融合以降の段階の読み出しに好適に用いることができる。一方、側鎖内に窒素原子を有しない、一般式（Iｂ）又は（IIｂ）で表される蛍光化合物は、蛍光強度がｐＨの影響を受けないため、オートファジーの前段階の読み出しに好適に用いることができる。したがって、下記の一般式（Iａ）で表される蛍光化合物及びその塩からなる群より選択される１又は複数と、下記の一般式（IIｂ）で表される蛍光化合物及びその塩からなる群より選択される１又は複数、或いは下記の一般式（Iｂ）で表される蛍光化合物及びその塩からなる群より選択される１又は複数と、下記の一般式（IIａ）で表される蛍光化合物及びその塩からなる群より選択される１又は複数を組み合わせることにより、オートファジーの全段階を蛍光波長及び蛍光強度の変化で読み出すことができる。
【００７５】
【化２１】
2018212355.tif 000023
【００７６】
【化２２】
2018212355.tif 000024
【００７７】
なお、上記一般式（Iａ）及び（Iｂ）において、
Ｒ１は、アルキル基又はω−アミノアルキル基を表し、
Ｒ２は、水素原子又はアルキル基を表し、
Ｒ３は、式−（ＣＨ２）ｍ−で表される原子団を表し（ｍは１０以下の自然数）、
Ｒ５は、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される原子団を表し（ｎは１０以下の自然数）、
ＲＮは、式−ＮＨ２、−ＮＨＲ７、−ＮＲ７Ｒ８及び−Ｎ＋Ｒ７Ｒ８Ｒ９のいずれかで表される原子団であり（Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、それぞれ独立してアルキル基を表す。）、
上記一般式（Iａ）においてＲ２とＲ６は、互いに結合して環を形成していてもよく、
上記一般式（IIａ）及び（IIｂ）において、
Ｒ１１は、アルキル基又はω−アミノアルキル基を表し、
Ｒ１２は、水素原子又はアルキル基を表し、
Ｒ１３は、式−（ＣＨ２）ｍ−で表される原子団を表し（ｍは１０以下の自然数）、
Ｒ１５は、式−（ＣＨ２）ｎ−で表される原子団を表し（ｎは１０以下の自然数）、
ＲＮは、式−ＮＨ２、−ＮＨＲ１７、−ＮＲ１７Ｒ１８及び−Ｎ＋Ｒ１７Ｒ１８Ｒ１９のいずれかで表される原子団であり（Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９は、それぞれ独立してアルキル基を表す。）、
上記一般式（IIａ）においてＲ１２とＲ１６は、互いに結合して環を形成していてもよい。
【００７８】
上記の組み合わせの好ましい例としては、上記の式６ｈで表される蛍光化合物又はその塩及び上記の式１１で表される蛍光化合物又はその塩、或いは上記の式４ｂで表される蛍光化合物又はその塩及び上記の式１３で表される蛍光化合物又はその塩の組み合わせが挙げられる。
【００７９】
同化合物の細胞への導入の際には、同化合物を適当な溶媒又は緩衝液に、所定の濃度で溶解又は分散させた状態で行うことができる。本発明のある実施形態は、溶媒又は緩衝液に所定の濃度で同化合物を溶解又は分散させたオートファジー検出試薬に関する。
【実施例】
【００８０】
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。なお、以下の実施例において、「式Ｘで表される化合物」を「化合物Ｘ」と呼称する場合がある。【００８１】
実施例１：蛍光化合物の合成（１）【００８２】
６−ブロモ−２−プロピル−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−１，３（２Ｈ）−ジオン（１ａ）の合成
２００ｍＬのナスフラスコに４−ブロモ−１，８−無水ナフタル酸（１ｇ、３．６ｍｍｏｌ）、プロピルアミン（２９８ｍｇ、１．４当量、５．０４ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（５２８ｍｇ、１．２当量、４．３ｍｍｏｌ）、５０ｍＬのＥｔＯＨを加え８０℃で１６時間還流した。室温に戻した後、析出した結晶をろ過し黄色結晶を９３０ｍｇ得た（収率：８４％）。
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.65  (d,  1H,  J  =  7.2  Hz),  8.55  (d,  1H,  J  =  8.5  Hz),  8.40  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  8.03  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.84  (t,  1H,  J  =  7.8  Hz),  4.13  (t,  2H,  J  =  7.5  Hz),  1.79-1.71  (m,  2H),  1.01  (t,  3H,  J  =  7.3  Hz);  13C-NMR  (101  MHz,  CDCl3):  δ  163.5,  133.1,  131.9,  131.1,  131.0,  130.5,  130.1,  128.9,  128.0,  123.1,  122.2,  42.0,  21.3,  11.5.【００８３】
６−ブロモ−２−ペンチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−１，３（２Ｈ）−ジオン（１ｂ）の合成
化合物１ａと同様に、４−ブロモ−１，８−無水ナフタル酸（１ｇ、３．６ｍｍｏｌ）、アミルアミン（４３６ｍｇ、１．４当量、５．０４ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（５２８ｍｇ、１．２当量、４．３ｍｍｏｌ）、５０ｍＬのＥｔＯＨを用いて合成し、黄色結晶を１．２ｇ得た（収率：８０％）。【００８４】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.65  (d,  1H,  J  =  7.2  Hz),  8.56  (d,  1H,  J  =  8.5  Hz),  8.40  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  8.03  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.84  (t,  1H,  J  =  7.8  Hz),  4.16  (t,  2H,  J  =  7.5  Hz),  1.75-1.69  (m,  2H),  1.42-1.38  (m,  4H),  0.91  (t,  3H,  J  =  7.3  Hz);  13C-NMR  (101  MHz,  CDCl3):  δ  163.5,  133.1,  131.9,  131.1,  131.0,  130.5,  130.1,  128.9,  128.0,  123.1,  122.3,  40.6,  29.2,  27.7,  22.4,  14.0.【００８５】
６−ブロモ−２−ヘプチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−１，３（２Ｈ）−ジオン（１ｃ）の合成
化合物１ａと同様に、４−ブロモ−１，８−無水ナフタル酸（２．０ｇ、７．２ｍｍｏｌ）、ヘプチルアミン（１．１ｇ、１．４当量、１０．１ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１．０ｇ、１．２当量、８．６ｍｍｏｌ）、１００ｍＬのＥｔＯＨを用いて合成し、黄色結晶を１．５ｇ得た（収率：５５．６％）。【００８６】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.65  (d,  1H,  J  =  7.2  Hz),  8.56  (d,  1H,  J  =  8.5  Hz),  8.41  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  8.03  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.84  (t,  1H,  J  =  7.8  Hz),  4.16  (t,  2H,  J  =  7.5  Hz),  1.76-1.68  (m,  2H),  1.43-1.30  (m,  8H),  0.89  (t,  3H,  J  =  7.3  Hz);  13C-NMR  (101  MHz,  CDCl3):  δ  163.5,  133.1,  131.9,  131.1,  131.0,  130.5,  130.1,  128.9,  128.0,  123.1,  122.2,  40.6,  31.7,  29.0,  28.0,  27.0,  22.6,  14.0.【００８７】
６−ブロモ−２−デシル−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−１，３（２Ｈ）−ジオン（１ｄ）の合成
化合物１ａと同様に、４−ブロモ−１，８−無水ナフタル酸（２．０ｇ、７．２ｍｍｏｌ）、１−アミノデカン（１．６ｇ、１．４当量、１０．１ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１．０ｇ、１．２当量、８．６ｍｍｏｌ）、１００ｍＬのＥｔＯＨを用いて合成し、黄色結晶を１．５ｇ得た（収率：５０％）。【００８８】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.65  (d,  1H,  J  =  7.2  Hz),  8.56  (d,  1H,  J  =  8.5  Hz),  8.41  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  8.04  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.84  (t,  1H,  J  =  7.8  Hz),  4.16  (t,  2H,  J  =  7.5  Hz),  1.76-1.68  (m,  2H),  1.45-1.25  (m,  17H),  0.88  (t,  3H,  J  =  7.3  Hz);  13C-NMR  (101  MHz,  CDCl3):  δ  163.5,  133.1,  131.9,  131.1,  131.0,  130.5,  130.1,  128.9,  128.0,  123.1,  122.2,  40.6,  31.9,  29.5,  29.3,  28.0,  27.1  22.6,  14.1.【００８９】
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（６−ブロモ−１，３−ジオキソ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−２（３Ｈ）−イル）エチル）カルバメート（１ｅ）の合成
化合物１ａと同様に、４−ブロモ−１，８−無水ナフタル酸（１．０ｇ、３．６ｍｍｏｌ）、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１，２−ジアミノエタン（８０７ｍｇ、１．４当量、５．０４ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（５２８ｍｇ、１．２当量、４．３ｍｍｏｌ）、５０ｍＬのＥｔＯＨを用いて（１ａ）と同様に合成し、黄色結晶を１．３ｇ得た（収率：８６％）。【００９０】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.66  (d,  1H,  J  =  7.2  Hz),  8.57  (d,  1H,  J  =  8.5  Hz),  8.41  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  8.04  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.84  (t,  1H,  J  =  7.8  Hz),  4.93  (s,  1H),  4.35  (t,  2H,  J  =  7.5  Hz),  3.54-3.53  (m,  2H),  1.27  (s,  9H,  J  =  7.3  Hz);  13C-NMR  (101  MHz,  CDCl3):  δ  163.9,  156.0,  133.3,  132.2,  131.3,  131.0,  130.5,  130.3,  129.0,  128.0,  122.8,  122.0,  79.1,  40.0,  39.5,  28.2.【００９１】
ｔｅｒｔ−ブチル（４−（６−ブロモ−１，３−ジオキソ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−２（３Ｈ）−イル）ブチル）カルバメート（１ｆ）の合成
化合物１ａと同様に、４−ブロモ−１，８−無水ナフタル酸（１．０ｇ、３．６ｍｍｏｌ）、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１，４−ジアミノブタン（９４８ｍｇ、１．４当量、５．０４ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（５２８ｍｇ、１．２当量、４．３ｍｍｏｌ）、５０ｍＬのＥｔＯＨを用いて（１ａ）と同様に合成し、を用いて（１ａ）と同様に合成し、黄色結晶を９００ｍｇ得た（収率：５６％）。【００９２】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.65  (d,  1H,  J  =  7.2  Hz),  8.57  (d,  1H,  J  =  8.5  Hz),  8.41  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  8.04  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.85  (t,  1H,  J  =  7.8  Hz),  4.62  (s,  1H),  4.18  (t,  2H,  J  =  7.5  Hz),  3.20-3.18  (m,  2H),  1.79-1.75  (m,  2H),  1.62-1.57  (m,  2H),  1.42  (s,  9H,  J  =  7.3  Hz);  13C-NMR  (101  MHz,  CDCl3):  δ  163.5,  155.9,  133.2,  132.0,  131.2,  131.0,  130.5,  130.2,  128.9,  128.0,  123.0,  122.1,  79.0,  40.2,  40.0,  28.4,  27.5,  25.4.【００９３】
６−（ピペラジン−１−イル）−２−プロピル−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−１，３（２Ｈ）−ジオン（２ａ）の合成
２００ｍＬのナスフラスコに、化合物１ａ（５００ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）、ピペラジン（１．３ｇ、１０当量、１５ｍｍｏｌ）、５０ｍＬの２−メトキシエタノールを加え１２０℃で１６時間還流した。反応の進行を確認後、反応溶液をエバポレーターで留去した。精製はシリカゲルカラムを使用し、１００％クロロホルムからクロロホルム／メタノール＝７／３のグラジェントにて行った。黄色結晶を４００ｍｇ得た（収率：８２％）。【００９４】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.58  (d,  1H,  J  =  7.2  Hz),  8.52  (d,  1H,  J  =  8.5  Hz),  8.42  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.69  (t,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.21  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  4.13  (t,  2H,  J  =  7.5  Hz),  3.22  (d,  8H,  J  =  7.8  Hz),  1.78-1.73  (m,  2H),  1.01  (t,  3H,  J  =  7.3  Hz);  13C-NMR  (101  MHz,  CDCl3):  δ  164.5,  164.0,  156.3,  132.5,  131.0,  130.2,  129.9,  126.2,  125.6,  123.3,  116.7,  114.9,  54.4,  46.2,  41.7,  21.4,  11.5.【００９５】
２−ペンチル−６-（ピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−１，３（２Ｈ）−ジオン（２ｂ）の合成
化合物２ａと同様に、化合物１ｂ（１ｇ、２．８ｍｍｏｌ）、ピペラジン（２．６ｇ、１０当量、３１ｍｍｏｌ）、１００ｍＬの２−メトキシエタノールを用いて合成し、黄色結晶を８００ｍｇ得た（収率：７９％）。【００９６】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.56  (d,  1H,  J  =  8.5  Hz),  8.51  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  8.41  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.69  (t,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.21  (d,  1H,  J  =  7.2  Hz),  4.15  (t,  2H,  J  =  7.5  Hz),  3.24-3.21  (m,  2H),  1.91  (s,  2H),  1.72  (m,  2H),  1.39  (s,  4H),  0.91  (t,  3H,  J  =  7.3  Hz);  13C-NMR  (101  MHz,  CDCl3):  δ  164.4,  163.9,  156.3,  132.5,  131.0,  130.2,  129.8,  126.1,  125.5,  123.2,  116.7,  114.8,  54.4,  46.2,  40.2,  29.2,  27.8,  22.4,  14.0.【００９７】
２−ヘプチル−６−（ピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−１，３（２Ｈ）−ジオン（２ｃ）の合成
化合物２ａと同様に、化合物１ｃ（１ｇ、２．６ｍｍｏｌ）、ピペラジン（２．３ｇ、１０当量、２６ｍｍｏｌ）、１００ｍＬの２−メトキシエタノールを用いて合成し、黄色結晶を８００ｍｇ得た（収率：７９％）。【００９８】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.57  (d,  1H,  J  =  8.5  Hz),  8.51  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  8.41  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.69  (t,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.21  (d,  1H,  J  =  7.2  Hz),  4.15  (t,  2H,  J  =  7.5  Hz),  3.25-3.20  (m,  8H),  1.75-1.68  (m,  2H),  1.43-1.28  (m,  8H),  0.89  (t,  3H,  J  =  7.3  Hz);  13C-NMR  (101  MHz,  CDCl3):  δ  164.3,  163.8,  156.2,  132.4,  130.9,  130.1,  129.7,  126.3,  126.0,  125.5,  123.2,  116.6,  114.8,  54.3,  46.2,  40.2,  31.7,  31.5,  29.0,  28.8,  28.1,  27.2,  27.1,  22.7,  22.5,  22.4,  14.0.【００９９】
２−デシル−６−（ピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−１，３（２Ｈ）−ジオン（２ｄ）の合成
化合物２ａと同様に、化合物１ｄ（１ｇ、２．４ｍｍｏｌ）、ピペラジン（２．０ｇ、１０当量、２４ｍｍｏｌ）、１００ｍＬの２−メトキシエタノールを用いて合成し、黄色結晶を８００ｍｇ得た（収率：７９％）。【０１００】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.57  (d,  1H,  J  =  8.5  Hz),  8.51  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  8.41  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.69  (t,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.22  (d,  1H,  J  =  7.2  Hz),  4.15  (t,  2H,  J  =  7.5  Hz),  3.25-3.20  (m,  8H),  1.75-1.67  (m,  2H),  1.44-1.25  (m,  14H),  0.88  (t,  3H,  J  =  7.3  Hz);  13C-NMR  (101  MHz,  CDCl3):  δ  164.3,  163.9,  156.2,  132.4,  130.9,  130.1,  129.8,  126.1,  125.8,  125.5,  123.2,  116.7,  114.8,  54.3,  46.2,  40.3,  31.8,  31.6,  29.5,  29.3,  29.2,  28.1,  27.1,  22.6,  22.4,  14.1.【０１０１】
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（１，３−ジオキソ−６−（ピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−２（３Ｈ）−イル）エチル）カルバメート（２ｅ）の合成
化合物２ａと同様に、化合物１ｅ（５００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）ピペラジン（１．０ｇ、１０当量、１２ｍｍｏｌ）、５０ｍＬの２−メトキシエタノールを用いて合成し、黄色結晶を４２０ｍｇ得た（収率：８２％）。【０１０２】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.57  (d,  1H,  J  =  8.5  Hz),  8.51  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  8.40  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.68  (t,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.20  (d,  1H,  J  =  7.2  Hz),  5.08  (s,  1H),  4.34  (t,  2H,  J  =  7.5  Hz),  3.52-3.51  (m,  2H),  3.23-3.21  (m,  8H),  1.30  (s,  9H);  13C-NMR  (101  MHz,  CDCl3):  δ  164.8,  164.3,  156.5,  156.0,  132.8,  131.3,  130.4,  129.9,  126.1,  125.6,  123.0,  116.3,  114.9,  79.0,  54.3,  46.2,  39.9,  39.6,  28.2.【０１０３】
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（１，３−ジオキソ−６−（ピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−２（３Ｈ）−イル）ブチル）カルバメート（２ｆ）の合成
化合物２ａと同様に、化合物１ｆ（５００ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）ピペラジン（９６２ｍｇ、１０当量、１１ｍｍｏｌ）、５０ｍＬの２−メトキシエタノールを用いて合成し、黄色結晶を３３０ｍｇ得た（収率：６６％）。【０１０４】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.57  (d,  1H,  J  =  8.5  Hz),  8.50  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  8.41  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.69  (t,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.21  (d,  1H,  J  =  7.2  Hz),  4.67  (s,  1H),  4.18  (t,  2H,  J  =  7.5  Hz),  3.25-3.18  (m,  10H),  1.78-1.74  (m,  2H),  1.62-1.58  (m,  2H),  1.42  (s,  9H);  13C-NMR  (101  MHz,  CDCl3):  δ  164.5,  164.0,  156.4,  155.9,  132.6,  131.1,  130.3,  129.9,  126.1,  125.6,  123.2,  116.6,  114.9,  79.0,  54.4,  46.2,  40.2,  39.7,  28.4,  27.5,  25.4.【０１０５】
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（４−（１，３−ジオキソ−２−プロピル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−６−イル）ピペラジン−１−イル）エチル）カルバメート（３ａ）の合成
１００ｍＬのナスフラスコに、化合物２ａ（５００ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）、２−（ｂｏｃ−アミノ）臭化エチル（８２７ｍｇ、２．５当量、３．７ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（５１０ｍｇ、２．５当量、３．７ｍｍｏｌ）５０ｍＬのアセトニトリルを加え１００℃で１６時間還流した。反応溶液を室温に戻しろ過後、反応溶液をエバポレーターで留去した。精製はシリカゲルカラムを使用し、１００％クロロホルムからクロロホルム／メタノール＝９／１のグラジェントにて行った。黄色結晶を３８０ｍｇ得た（収率：５４％）。【０１０６】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.58  (d,  1H,  J  =  7.2  Hz),  8.51  (d,  1H,  J  =  8.5  Hz),  8.39  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.68  (t,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.21  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  5.01  (s,  1H),  4.13  (t,  2H,  J  =  7.5  Hz),  3.29  (m,  6H),  2.79  (s,  4H),  2.62  (t,  2H,  J  =  7.3  Hz),  1.78-1.73  (m,  2H),  1.47  (s,  9H),  1.00  (t,  3H,  J  =  7.3  Hz);  13C-NMR  (101  MHz,  CDCl3):  δ  164.4,  163.9,  155.9,  155.8,  132.4,  131.0,  130.1,  129.8,  126.1,  125.6,  123.2,  116.7,  114.8,  79.2,  61.9,  57.2,  52.9,  42.3,  41.7,  37.1,  28.4,  23.2,  21.4,  11.5.【０１０７】
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（４−（１，３−ジオキソ−２−ペンチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−６−イル）ピペラジン−１−イル）エチル）カルバメート（３ｂ）の合成
化合物３ａと同様に、化合物２ｂ（１５０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、２−（ｂｏｃ−アミノ）臭化エチル（２８７ｍｇ、３．０当量、１．２６ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（１７７ｍｇ、３．０当量、１．２６ｍｍｏｌ）１５ｍＬのアセトニトリルを用いて合成し、黄色結晶を１００ｍｇ得た（収率：４８％）。【０１０８】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.58  (d,  1H,  J  =  8.5  Hz),  8.51  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  8.39  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.68  (t,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.21  (d,  1H,  J  =  7.2  Hz),  4.99  (s,  1H),  4.15  (t,  2H,  J  =  7.5  Hz),  3.29  (s,  6H),  2.78  (s,  4H),  2.62  (m,  2H),  1.72  (m,  2H),  1.47  (s,  9H),  1.39  (s,  2H),  1.39  (s,  4H),  0.91  (t,  3H,  J  =  7.3  Hz);  13C-NMR  (101  MHz,  CDCl3):  δ  164.4,  164.0,  155.9,  155.8,  132.5,  131.0,  130.1,  129.8,  126.1,  125.6,  123.3,  116.8,  114.9,  79.3,  57.2,  53.0,  45.7,  40.3,  37.1,  29.7,  29.2,  28.4,  27.8,  22.4,  14.0.【０１０９】
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（４−（２−ヘプチル−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−６−イル）ピペラジン−１−イル）エチル）カルバメート（３ｃ）の合成
化合物３ａと同様に、化合物２ｃ（３００ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）、２−（ｂｏｃ−アミノ）臭化エチル（５３１ｍｇ、３．０当量、２．４ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（３２７ｍｇ、３．０当量、２．４ｍｍｏｌ）３０ｍＬのアセトニトリルを用いて合成し、黄色結晶を２２０ｍｇ得た（収率：５３％）。【０１１０】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.56  (d,  1H,  J  =  8.5  Hz),  8.51  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  8.39  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.68  (t,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.21  (d,  1H,  J  =  7.2  Hz),  4.99  (s,  1H),  4.15  (t,  2H,  J  =  7.5  Hz),  3.29  (s,  6H),  2.78  (s,  4H),  2.62  (t,  2H,  J  =  7.8  Hz),  1.75-1.68  (m,  2H),  1.47  (s,  9H),  1.43-1.28  (m,  8H),  0.87  (t,  3H,  J  =  7.3  Hz);  13C-NMR  (101  MHz,  CDCl3):  δ  164.4,  164.0,  155.9,  155.8,  132.4,  131.0,  130.1,  129.8,  126.1,  125.6,  123.3,  116.8,  114.9,  79.3,  57.2,  53.0,  40.3,  31.7,  29.6,  29.0,  28.4,  28.1,  27.9,  27.1,  23.2,  22.6,  14.0.【０１１１】
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（４−（２−デシル−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−６−イル）ピペラジン−１−イル）エチル）カルバメート（３ｄ）の合成
化合物３ａと同様に、化合物２ｄ（３００ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）、２−（ｂｏｃ−アミノ）臭化エチル（４７８ｍｇ、３．０当量、２．１ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（２９４ｍｇ、３．０当量、２．１ｍｍｏｌ）３０ｍＬのアセトニトリルを用いて合成し、黄色結晶を２００ｍｇ得た（収率：５０％）。【０１１２】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.58  (d,  1H,  J  =  8.5  Hz),  8.51  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  8.39  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.68  (t,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.21  (d,  1H,  J  =  7.2  Hz),  4.99  (s,  1H),  4.15  (t,  2H,  J  =  7.5  Hz),  3.29  (s,  6H),  2.78  (s,  4H),  2.62  (t,  2H,  J  =  7.8  Hz),  1.75-1.67  (m,  2H),  1.47  (s,  9H),  1.44-1.25  (m,  14H),  0.88  (t,  3H,  J  =  7.3  Hz);  13C-NMR  (101  MHz,  CDCl3):  δ  164.4,  163.9,  155.9,  155.8,  132.4,  131.0  130.1,  129.8,  126.1,  125.6,  123.3,  116.8,  114.8,  79.2,  61.2,  57.2,  53.0,  40.3,  37.1,  31.8,  29.5,  29.4,  29.3,  28.7,  28.4,  28.1,  27.9,  27.1,  22.6,  14.1.【０１１３】
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（６−（４−（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）−１，３−ジオキソ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−２（３Ｈ）−イル）エチル）カルバメート（３ｅ）の合成
化合物３ａと同様に、化合物２ｅ（３００ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）、２−（ｂｏｃ−アミノ）臭化エチル（４７５ｍｇ、３．０当量、２．１ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（２９０ｍｇ、３．０当量、２．１ｍｍｏｌ）３０ｍＬのアセトニトリルを用いて合成し、黄色結晶を２２０ｍｇ得た（収率：５４％）。【０１１４】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.58  (d,  1H,  J  =  8.5  Hz),  8.52  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  8.40  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.68  (t,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.21  (d,  1H,  J  =  7.2  Hz),  5.01  (s,  2H),  4.33  (bs,  2H),  3.52-3.51  (m,  2H),  3.29  (s,  6H),  2.79  (s,  4H),  2.62  (bs,  2H),  1.47  (s,  9H),  1.30  (s,  9H);  13C-NMR  (101  MHz,  CDCl3):  δ  164.8,  164.3,  156.0,  155.9,  132.8,  131.3,  130.4,  130.0,  126.1,  125.6,  123.0,  116.5,  114.9,  79.3,  79.0,  57.2,  53.0,  52.9,  39.9,  39.6,  37.1,  28.4,  28.2.【０１１５】
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（６−（４−（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）−１，３−ジオキソ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−２（３Ｈ）−イル）ブチル）カルバメート（３ｆ）の合成
化合物３ａと同様に、化合物２ｆ（１５０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）、２−（ｂｏｃ−アミノ）臭化エチル（３００ｍｇ、４．０当量、１．３２ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（６９ｍｇ、１．５当量、０．５ｍｍｏｌ）１５ｍＬのアセトニトリルを用いて合成し、黄色結晶を１６０ｍｇ得た（収率：８１％）。【０１１６】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.57(d,  1H,  J  =  8.5  Hz),  8.51  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  8.40  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.68  (t,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.21  (d,  1H,  J  =  7.2  Hz),  4.98  (s,  1H),  4.62  (s,  1H),    4.18  (t,  2H,  J  =  7.8  Hz),  3.29  (s,  6H),  3.19-3.18  (m,  2H),  2.79  (s,  4H),  2.62  (t,  2H,  J  =  7.8  Hz),  1.78-1.74  (m,  2H),  1.62-1.58  (m,  2H),  1.47  (s,  9H),  1.42  (s,  9H);  13C-NMR  (101  MHz,  CDCl3):  δ  164.5,  164.0,  155.9,  132.6,  131.1,  130.3,  129.8,  126.1,  125.6,  123.2,  116.7,  114.9,  79.3,  79.0,  57.2,  53.0,  40.2,  39.7,  37.1,  28.4,  27.5,  25.4.【０１１７】
２−（４−（１，３−ジオキソ−２−プロピル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−６−イル）ピペラジン−１−イル）エタン−１−アミン塩酸塩（４ａ）の合成
５０ｍＬのナスフラスコに３ａ（１５０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）、５ｍＬのＴＨＦを加え溶解した。これに５ｍＬの４Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサンを加え室温で２時間撹拌した。析出した結晶をろ取し、ＴＨＦ、ＣＨＣｌ３でろ洗し黄色結晶を１００ｍｇ得た（収率：７７％）。【０１１８】
1H-NMR  (400  MHz,  CD3OD)  δ:  8.61-8.54  (m,  3H),  7.86  (t,  1H,  J  =  8.3  Hz),  7.50  (d,  1H,  J  =  7.3  Hz),  4.12  (t,  2H,  J  =  7.3  Hz),  3.71-3.56  (m,  12H),  1.80-1.71  (m,  2H),  1.01  (t,  3H,  J  =  7.3  Hz);  13C-NMR  (101  MHz,  CD3OD):  δ  164.2,  163.7,  153.7,  131.9,  130.9,  129.8,  129.3,  126.3,  126.0,  122.9,  117.8,  115.8,  53.2,  52.5,  49.6,  41.3,  33.7,  20.9,  10.3.【０１１９】
２−（４−（１，３−ジオキソ−２−ペンチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−６−イル）ピペラジン−１−イル）エタン−１−アミン塩酸塩（４ｂ）の合成
化合物４ａと同様に、化合物３ｂ（１３０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、５ｍＬのＴＨＦ、５ｍＬの４Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサンを用いて合成し、黄色結晶を９０ｍｇ得た（収率：８０％）。【０１２０】
1H-NMR  (400  MHz,  CD3OD)  δ:  8.62-8.54  (m,  3H),  7.87  (t,  1H,  J  =  8.3  Hz),  7.50  (d,  1H,  J  =  7.3  Hz),  4.15  (t,  2H,  J  =  7.3  Hz),  3.68-3.50  (m,  12H),  1.73  (t,  2H,  J  =  8.3  Hz),  1.42  (s,  4H),  0.95  (t,  3H,  J  =  7.3  Hz);  13C-NMR  (101  MHz,  CD3OD):  δ  164.1,  163.7,  153.7,  131.9,  130.9,  129.8,  129.3,  126.3,  126.0,  122.9,  117.8,  115.8,  53.2,  52.5,  49.6,  39.8,  33.7,  28.9,  27.3,  22.0,  12.9.【０１２１】
２−（４−（２−ヘプチル−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−６−イル）ピペラジン−１−イル）エタン−１−アミン塩酸塩（４ｃ）の合成
化合物４ａと同様に、化合物３ｃ（１３０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、５ｍＬのＴＨＦ、５ｍＬの４Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサンを用いて合成し、黄色結晶を８０ｍｇ得た（収率：７０％）。【０１２２】
1H-NMR  (400  MHz,  CD3OD)  δ:  8.50  (d,  1H,  J  =  8.3  Hz),  8.43  (d,  1H,  J  =  8.3  Hz),  7.80  (t,  1H,  J  =  8.3  Hz),  7.42  (d,  1H,  J  =  7.3  Hz),  4.08  (t,  2H,  J  =  7.3  Hz),  3.87-3.59  (m,  12H),  1.68  (t,  2H,  J  =  8.3  Hz),  1.41-1.32  (m,  8H),  0.91  (t,  3H,  J  =  7.3  Hz);  13C-NMR  (101  MHz,  CD3OD):  δ  164.1,  163.7,  153.7,  131.8,  130.8,  129.8,  129.3,  126.3,  126.0,  122.8,  117.8,  115.7,  53.2,  52.5,  49.6,  39.8,  33.7,  31.5,  28.7,  27.6,  26.7,  22.2,  13.0.【０１２３】
２−（４−（２−デシル−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−６−イル）ピペラジン−１−イル）エタン−１−アミン塩酸塩（４ｄ）の合成
化合物４ａと同様に、化合物３ｄ（１３０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）、５ｍＬのＴＨＦ、５ｍＬの４Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサンを用いて合成し、黄色結晶を８０ｍｇ得た（収率：６９％）。【０１２４】
1H-NMR  (400  MHz,  CD3OD)  δ:  8.56-8.53  (m,  2H),  8.49  (d,  1H,  J  =  8.3  Hz),  7.84  (t,  1H,  J  =  8.3  Hz),  7.46  (d,  1H,  J  =  7.3  Hz),  4.20  (t,  2H,  J  =  7.3  Hz),  3.90-3.58  (m,  12H),  1.74-1.67  (m,  2H),  1.41-1.30  (m,  14H),  0.90  (t,  3H,  J  =  7.3  Hz);  13C-NMR  (101  MHz,  CD3OD):  δ  164.1,  163.7,  153.7,  137.7,  131.8,  130.8,  129.8,  129.3,  128.1,  126.3,  126.0,  124.7,  122.9,  117.8,  115.7,  53.3,  52.5,  49.6,  39.8,  33.9,  33.7,  31.6,  29.4,  29.2,  29.0,  27.6,  27.2,  26.7,  22.3,  13.0.【０１２５】
２−（４−（２−（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）エチル）−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−６−イル）ピペラジン−１−イル）エタン−１−アミン塩酸塩（４ｅ）の合成
化合物４ａと同様に、化合物３ｅ（１２０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）、５ｍＬのＴＨＦ、５ｍＬの４Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサンを用いて合成し、黄色結晶を７０ｍｇ得た（収率：７５％）。【０１２６】
1H-NMR  (400  MHz,  CD3OD)  δ:  8.67-8.59  (m,  3H),  7.90  (t,  1H,  J  =  8.3  Hz),  7.52  (d,  1H,  J  =  7.3  Hz),  4.49  (t,  2H,  J  =  7.3  Hz),  3.71-3.57  (m,  12H).【０１２７】
２−（４−（２−（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）エチル）−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−６−イル）ピペラジン−１−イル）ブタン−１−アミン塩酸塩（４ｆ）の合成
化合物４ａと同様に、化合物３ｆ（４０ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）、５ｍＬのＴＨＦ、５ｍＬの４Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサンを用いて合成し、黄色結晶を２０ｍｇ得た（収率：６４％）。【０１２８】
1H-NMR  (400  MHz,  CD3OD)  δ:  8.63-8.56  (m,  3H),  7.88  (t,  1H,  J  =  8.3  Hz),  7.51  (d,  1H,  J  =  7.3  Hz),  4.22  (t,  2H,  J  =  7.3  Hz),  3.74-3.57  (m,  12H),  3.03  (t,  2H,  J  =  7.3  Hz),  1.87-1.75  (m,  4H);  13C-NMR  (101  MHz,  DMSO-d6):  δ  164.0,  163.5,  154.3,  132.5,  131.3,  130.9,  129.4,  127.0,  125.8,  123.1,  117.2,  116.3,  53.4,  51.9,  49.7,  33.8,  25.2,  25.1.【０１２９】
ｔｅｒｔ−ブチル（５−（（１，３−ジオキソ−２−ペンチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−６−イル）アミノ）ペンチル）カルバメート（５ｈ）の合成
２００ｍＬのナスフラスコに、化合物１ｂ（３００ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル（５−アミノペンチル）カルバメート（２１０ｍｇ、１．２当量、１．０ｍｍｏｌ）、４０ｍＬの２−メトキシエタノールを加え１２０℃で１６時間還流した。反応の進行を確認後、反応溶液をエバポレーターで留去した。精製はシリカゲルカラムを使用し、１００％クロロホルムからクロロホルム／メタノール＝９／１のグラジェントにて行った。微黄色オイルを３１０ｍｇ得た（収率：７７％）。【０１３０】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.58  (d,  1H,  J  =  7.2  Hz),  8.46  (d,  1H,  J  =  8.5  Hz),  8.17  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  7.61  (t,  1H,  J  =  7.8  Hz),  6.70  (d,  1H,  J  =  7.8  Hz),  5.38  (bs,  1H),  4.54  (bs,  1H),  4.15  (t,  2H,  J  =  7.5  Hz),  3.43-3.39  (m,),  3.22−3.10  (m),  1.85  (t),  1.72  (t),  1.59-1.25  (m),  0.90  (t,  3H).【０１３１】
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（（２−（（１，３-ジオキソ−２−ペンチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−６−イル）アミノ）エチル）（メチル）アミノ）エチル）カルバメート（５ｉ）の合成
化合物５ｈと同様に、化合物１ｂ（２００ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル（２−（（２−アミノエチル）（メチル）アミノ）エチル）カルバメート（１８８ｍｇ、１．５当量、０．８６ｍｍｏｌ）、２０ｍＬの２−メトキシエタノールを用いて合成し、微黄色オイルを１２０ｍｇ得た（収率：４３％）。【０１３２】
２−（４−（１，３−ジオキソ−２−プロピル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−６−イル）ピペラジン−１−イル）エタン−１−アミン塩酸塩（６ｈ）の合成
５０ｍＬのナスフラスコに、化合物５ｈ（１００ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）、１０ｍＬのＴＨＦを加え溶解した。これに１０ｍＬの４Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサンを加え室温で２時間撹拌した。析出した結晶をろ取後、ＴＨＦ、ＣＨＣｌ３でろ洗し、黄色結晶を２０ｍｇ得た（収率：２３％）。【０１３３】
1H-NMR  (400  MHz,  CD3OD)  δ:  8.57-8.52  (m,  2H),  8.38  (d,  1H,  J  =  7.3  Hz),  7.67  (t,  1H,  J  =  8.3  Hz),  6.82  (d,  1H,  J  =  7.3  Hz),  4.12  (t,  2H,  J  =  7.3  Hz),  3.51  (t,  2H,  J  =  7.3  Hz),  2.97  (t,  2H),  1.89-1.85  (m,  2H),  1.79-1.69  (m,  2H),  1.63-1.57  (m,  2H),  1.54-1.46  (m,  2H),  1.41  (m,  4H),  0.95  (t,  3H,  J  =  7.3  Hz).【０１３４】
２−（４−（１，３−ジオキソ−２−プロピル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−６−イル）ピペラジン−１−イル）エタン−１−アミン塩酸塩（６ｉ）の合成
５０ｍＬのナスフラスコに、化合物５ｉ（１００ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、１０ｍＬのＴＨＦを加え溶解した。これに１０ｍＬの４Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサンを加え室温で２時間撹拌した。析出した結晶をろ取後、ＴＨＦ、ＣＨＣｌ３でろ洗し、黄色結晶を２０ｍｇ得た（収率：２３％）。【０１３５】
図１に示すように、化合物４ａ、４ｂ、４ｅ及び４ｆは、いずれもｐＨ６以下の酸性環境下において蛍光強度が増大することが確認された。【０１３６】
実施例２：オートファジーの検出試験（１）
（１）細胞への蛍光化合物の導入及びオートファジーの誘導又は阻害
ＨｅＬａ細胞を、μ-slide  8  well  （Ibidi）に播種し、３７℃、ＣＯ２インキュベーターにて一晩培養した。血清培地で希釈した化合物４ｂ（１μＭ）又は化合物６ｈ（０．１μＭ）を添加し３０分インキュベートした。血清培地で２回洗浄後、アミノ酸不含培地又は血清含有培地にて３７℃で６時間又は２０時間インキュベートし、蛍光顕微鏡で観察した。オートファジー誘導剤として、０．５μＭラパマイシン、オートファジー阻害剤として、１０μＭクロロキン及び０．１μＭバフィロマイシンＡ１を使用した。【０１３７】
（２）フローサイトメトリーを用いた評価
ＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに播種し、３７℃、ＣＯ２インキュベーターにて一晩培養した。血清培地で希釈した１μＭの化合物４ｂを添加し、３０分インキュベートした。血清培地で２回洗浄後、アミノ酸及び血清不含培地を加え、３７℃で６時間又は２０時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで１回洗浄後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで剥離し、フローサイトメトリー解析に用いた。【０１３８】
（３）ウェスタン・ブロット解析
任意の条件にて誘導した細胞をＰＢＳで１回洗浄し、プロテアーゼインヒビターを含むLysis  bufferで細胞を回収した。１５％ポリアクリルアミドゲルで分離しＰＶＤＦ膜に転写した。ブロッキング操作後、１，０００倍に希釈したAnti-LC3抗体（MBL）に漬け、４℃で１６時間インキュベートした。ＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで洗浄後、１０，０００倍に希釈したＨＲＰ結合抗体に浸し１時間室温で振とうした。ＰＢＳＴで３回洗浄後、化学発光により検出した。【０１３９】
Ｈｅｌａ細胞に化合物４ｂを導入し、６時間及び２０時間インキュベートした後の蛍光顕微鏡像を図２に示す。図２において、「Control」は対照群の結果を示す。ラパマイシンの添加によりオートファジーを誘導した場合（Rapamycin  &  Chloroquine）、飢餓培養してオートファジーを誘導した場合（Starved）のいずれにおいても、蛍光強度の増大が観測された。【０１４０】
Ｈｅｌａ細胞に化合物４ｂを導入し、飢餓培養条件下で６時間及び２０時間インキュベートした後のフローサイトメトリーの測定結果を図３に示す。化合物４ｂは、蛍光顕微鏡のみならず、フローサイトメトリーを用いたオートファジーの検出にも有用であることが確認された。【０１４１】
クロロキン存在下で、ラパマイシン（Rapamycin  &  Chloroquine）又は飢餓誘導（Starved）によるオートファジーを行ったＨｅｌａ細胞における蛍光強度の変化を図４に示す。図４において、「Nutrient」は、対照群として、通常の栄養培地中でインキュベーションを行ったＨｅｌａ細胞の測定結果を示す。図２の結果と同様、オートファジーの誘導に伴う蛍光強度の増大が確認されたが、蛍光強度の増大は、図５に示す、ウェスタン・ブロット法を用いた、オートファジーマーカーであるＬＣ３の発現量の定量結果と相関することが認められた。【０１４２】
図６は、化合物４ｂ及び６ｈの蛍光強度のｐＨ依存性を示すグラフである。化合物６ｈの蛍光強度は、化合物４ｂと異なり、ｐＨ依存性を示さないことが確認された。化合物６ｈは、側鎖中に非共有電子対を有する窒素原子が存在しないため、光誘起電子移動が起こらないため、ｐＨ６以上の環境下においても蛍光強度が低下しないことがわかる。【０１４３】
図７は、Ｈｅｌａ細胞に導入した化合物４ｂ及び化合物６ｈの蛍光強度の比較結果を示す。オートファジーが殆ど起こらない対照群（Control）、ATPase阻害剤であり、オートファゴソームとリソソームの融合を阻害するバフィロマイシン存在下（Bafilobycin）では、両化合物とも蛍光強度が低く、オートファジーが誘導された飢餓条件下（Starve）において、両化合物とも高い蛍光強度を示すのに対し、飢餓条件下でバフィロマイシンを添加した場合、化合物４ｂの蛍光強度が低下しているのに対し、化合物６ｈの蛍光強度は低下していない。この結果は、リソソームと融合していないオートファゴソームの内部においても、ｐＨに依存せず、化合物６ｈは蛍光発光を示すことを示している。【０１４４】
図８は、化合物４ｂ及び６ｈを導入したＨｅｌａ細胞の、オートファジー誘導条件下における高倍率蛍光顕微鏡像を示す。Ａ−１及びＡ−２に示す蛍光顕微鏡像の部分拡大図から明らかなように、化合物６ｈはリング状に蛍光発光していることが確認された。このことは、化合物６ｈが、オートファゴソーム膜のみを染色していることを示唆している。これらの結果より、化合物６ｈはオートファゴソームの形成段階から応答を示すことが期待される。【０１４５】
蛍光強度がｐＨ依存性を示す蛍光化合物４ｂ及び蛍光強度がｐＨ依存性を示さない蛍光化合物６ｈを用いることで、オートファゴソームの形成（オートファジーの初期）、分解過程のオートリソソーム（オートファジーの後期）を段階的に検出できる可能性がある。既存の手法と組み合わせることで、オートファジーのメカニズム及び細胞内オルガネラとの関連性の解明も期待できる。【０１４６】
実施例３：蛍光化合物の合成（２）【０１４７】
２−ペンチル−１Ｈ−ベンゾ［１０，５］アントラ［２，１，９−ｄｅｆ］イソキノリン−１，３（２Ｈ）−ジオン（７）の合成
２００ｍＬのナスフラスコにペリレン−３，４−ジカルボン酸無水物（１ｇ、３．１ｍｍｏｌ）、プロピルアミン（３２２ｍｇ、１．２当量、３．７ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（４５２ｍｇ、１．２当量、３．７ｍｍｏｌ）、１００ｍＬのＤＭＦを加え９０℃で１６時間還流した。室温に戻した後、析出した結晶を濾過し赤色結晶を１ｇ得た（収率：８２％）。【０１４８】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.40  (d,  2H),  8.24  (d,  2H),  8.18  (d,  2H),  7.81  (d,  2H),  7.55  (d,  2H),  4.16  (t,  2H),  1.78-1.75  (m,  2H),  1.46-1.42  (m,  4H),  0.94  (t,  3H).【０１４９】
８−ブロモ−２−ｈｅｘイル−１Ｈ−ベンゾ［１０，５］アントラ［２，１，９−ｄｅｆ］イソキノリン−１，３（２Ｈ）−ジオン（８）の合成
２００ｍＬのナスフラスコに化合物７（１ｇ、２．５ｍｍｏｌ）、１００ｍＬの１，２−ジクロロエタンを加え溶解させた。臭素を加え１６時間還流し、黒色結晶を８００ｍｇ得た（収率：６８％）。【０１５０】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.56  (t,  2H),  8.44  (d,  1H),  8.38  (d,  1H),  8.33  (d,  1H),  8.29  (d,  1H),  8.18  (d,  1H),  7.89  (d,  1H),  7.70  (t,  1H),  4.19  (t,  2H),  1.76  (t,  2H),  1.42  (m,  4H),  0.93  (t,  3H).【０１５１】
２−ペンチル−８−（ピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンゾ［１０，５］アントラ［２，１，９−ｄｅｆ］イソキノリン−１，３（２Ｈ）−ジオン（９）の合成
２００ｍＬのナスフラスコに化合物８（３００ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）ピペラジン（５４２ｍｇ、１０当量、６．３ｍｍｏｌ）、１００ｍＬの２−メトキシエタノールを用いて合成し、黒色結晶を３００ｍｇ得た（収率：９５％）。【０１５２】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.52  (t,  2H),  8.41  (d,  1H),  8.34  (t,  2H),  8.24  (t,  2H),  7.62  (t,  1H),  7.19  (d,  1H),  4.19  (t,  2H),  3.22  (m,  8H),  1.70  (m,  2H),  1.42  (m,  4H),  0.92  (t,  3H).【０１５３】
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（４−（１，３−ジオキソ−２−ペンチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［１０，５］アントラ［２，１，９−ｄｅｆ］イソキノリン−８−イル）ピペラジン−１−イル）エチル）カルバメート（１０）の合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物９（３００ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）、２−（ｂｏｃ−アミノ）臭化エチル（２１２ｍｇ、１．５当量、０．９４ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（１３０ｍｇ、１．５当量、０．９４ｍｍｏｌ）５０ｍＬのアセトニトリルを用いて合成し、黒色結晶を１００ｍｇ得た（収率：２５％）。【０１５４】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.54  (t,  2H),  8.43  (d,  1H),  8.37-8.34  (dd,  2H),  8.28  (d,  1H),  8.22  (d,  1H),  7.62  (t,  1H),  7.20  (d,  1H),  5.03  (s,  1H),  4.19  (t,  2H),  3.34-3.25  (m,  6H),  2.80  (s,  4H),  2.63  (t,  2H),  1.76  (m,  2H),  1.60  (s,  8H),  1.49  (s,  9H),  1.42  (m,  5H),  1.33-1.25  (m,  6H),  0.91  (t,  3H)  ;  13C-NMR  (101  MHz,  CDCl3):  δ  164.0,  156.0,  152.6,  137.4,  137.3,  131.5,  131.3,  129.8,  129.5,  129.0,  128.8,  126.7,  126.2,  124.6,  124.0,  123.9,  120.6,  119.7,  118.9,  115.7,  57.3,  53.2,  52.9,  40.4,  37.1,  29.6,  29.5,  29.3,  29.1,  28.4,  27.8,  24.8,  22.6,  22.5,  14.1,  14.0.【０１５５】
８−（４−（２−アミノエチル）ピペラジン−１−イル）−２−ペンチル−１Ｈ−ベンゾ［１０，５］アントラ［２，１，９−ｄｅｆ］イソキノリン−１，３（２Ｈ）−ジオン（１１）の合成
５０ｍＬのナスフラスコに化合物１０（１００ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、５ｍＬのＴＨＦ、５ｍＬの４Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサンを用いて合成し、黒色結晶を３０ｍｇ得た（収率：３３％）。【０１５６】
1H-NMR  (400  MHz,  CD3OD)  δ:  8.34  (d,  1H),  8.27  (d,  1H),  8.23-8.13  (m,  4H),  7.61  (t,  1H),  7.30  (d,  1H),  4.10  (t,  2H),  3.74-3.49  (m,  12H),  1.74  (t,  2H),  1.46-1.45  (m,  4H),  0.99  (t,  3H).【０１５７】
図９に示すように、化合物１１は、ｐＨ６以下の酸性環境下において蛍光強度が増大することが確認された。【０１５８】
ｔｅｒｔ−ブチル（５−（（１，３−ジオキソ−２−ペンチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［１０，５］アントラ［２，１，９−ｄｅｆ］イソキノリン−８−イル）アミノ）ペンチル）カルバメート（１２）の合成
２００ｍＬのナスフラスコに化合物８（３００ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル（２−（（２−アミノエチル）（メチル）アミノ）エチル）カルバメート（２１０ｍｇ、１．５当量、０．９４ｍｍｏｌ）、３０ｍＬの２−メトキシエタノールを用いて合成し、深紫色オイルを１００ｍｇ得た（収率：１９％）。【０１５９】
1H-NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ:  8.21-8.20  (m,  3H),  7.92  (d,  1H),  7.85  (d,  2H),  7.62  (d,  1H),  7.47  (t,  1H),  6.63  (d,  1H),  3.30-3.14  (m,  6H),  1.67-1.50  (m,  6H),  1.42  (s,  9H),  1.29-1.28  (m,  4H),  0.88  (t,  3H).【０１６０】
５−（（１，３−ジオキソ−２−ペンチル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［１０，５］アントラ［２，１，９−ｄｅｆ］イソキノリン−８−イル）アミノ）ペンタン−１−アミン塩酸塩（１３）の合成
５０ｍＬのナスフラスコに化合物１２（１００ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、５ｍＬのＴＨＦ、５ｍＬの４Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサンを用いて合成し、黒色結晶を３０ｍｇ得た（収率：３３％）。【０１６１】
1H-NMR  (400  MHz,  CD3OD)  δ:  8.23-8.22  (m,  3H),  7.94  (d,  1H),  7.86  (d,  2H),  7.65  (d,  1H),  7.46  (t,  1H),  6.66  (d,  1H),  3.35-3.17  (m,  6H),  1.68-1.49  (m,  6H),  1.33-1.29  (m,  4H),  0.92  (t,  3H).【０１６２】
化合物１３の蛍光強度は、化合物６ｈと同様、ｐＨ依存性を示さないことが確認された。【０１６３】
実施例４：オートファジーの検出試験（２）
ＨｅＬａ細胞を、μ-slide  8  well  （Ibidi）に播種し、３７℃、ＣＯ２インキュベーターにて一晩培養した。血清培地で希釈した化合物６ｈ（０．１μＭ）を添加し３０分インキュベートした。血清培地で２回洗浄後、アミノ酸不含培地又は血清含有培地にて３７℃で５時間インキュベートし、蛍光顕微鏡で観察した。【０１６４】
Ｈｅｌａ細胞に化合物６ｈを導入し、５時間インキュベートした後の蛍光顕微鏡像を図１０に示す。図１０において、「Control」は対照群の結果を示す。飢餓培養してオートファジーを誘導した場合（Starve）において、蛍光強度の増大が観測された。【０１６５】
実施例５：オートファジーの検出試験（３）
ＨｅＬａ細胞を、μ-slide  8  well  （Ibidi）に播種し、３７℃、ＣＯ２インキュベーターにて一晩培養した。血清培地で希釈した化合物６ｈ（１μＭ）及び化合物１１（０．１μＭ）を添加し３０分インキュベートした。血清培地で２回洗浄後、アミノ酸不含培地又は血清含有培地にて３７℃で３時間又は６時間インキュベートし、蛍光顕微鏡で観察した。【０１６６】
Ｈｅｌａ細胞に化合物６ｈ及び化合物１１を導入し、３時間及び６時間インキュベートした後の蛍光顕微鏡像を図１１に示す。図１１において、「Control」は対照群の結果を示す。飢餓培養してオートファジーを誘導した場合（Starve）において、化合物６ｈ及び化合物１１を同一細胞内に導入し、飢餓培養を行った結果、化合物６ｈのみによって染色された顆粒点及び化合物６ｈと化合物１１により共染色された顆粒点を確認した。これらの結果は、蛍光波長及びｐＨ応答性の異なる２種類の蛍光化合物を用いることで、オートファゴソーム形成過程とオートリソソーム形成期を段階的に見分けたことを示している。【０１６７】
実施例６：オートファジーの検出試験（４）
ＨｅＬａ細胞を、μ-slide  8  well  （Ibidi）に播種し、３７℃、ＣＯ２インキュベーターにて一晩培養した。血清培地で希釈した化合物４ｂ（１μＭ）及び化合物１３（０．１μＭ）を添加し３０分インキュベートした。血清培地で２回洗浄後、アミノ酸不含培地又は血清含有培地にて３７℃で３時間又は６時間インキュベートし、蛍光顕微鏡で観察した。【０１６８】
Ｈｅｌａ細胞に化合物４ｂ及び化合物１３を導入し、３時間及び６時間インキュベートした後の蛍光顕微鏡像を図１２に示す。図１２において、「Control」は対照群の結果を示す。飢餓培養してオートファジーを誘導した場合（Starve）において、化合物４ｂ及び化合物１３を同一細胞内に導入し、飢餓培養を行った結果、化合物４ｂのみによって染色された顆粒点及び化合物４ｂと化合物１３により共染色された顆粒点を確認した。これらの結果は、蛍光波長及びｐＨ応答性の異なる２種類の蛍光化合物を用いることで、オートファゴソーム形成過程とオートリソソーム形成期を段階的に見分けたことを示している。【０１６９】
なお、本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。つまり、本発明の範囲は、実施形態ではなく、請求の範囲によって示される。そして、請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。【０１７０】
本出願は、２０１７年５月１９日に出願された日本国特許出願２０１７−１００１９７号に基づくものであり、その明細書、特許請求の範囲、図面および要約書を含むものである。上記日本国特許出願における開示は、その全体が本明細書中に参照として含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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