(57)【要約】  ＰＧＥ１の作用の持続性、徐放性に優れたＰＧＥ１誘導体を提供すること、更にかかるＰＧＥ１誘導体をナノ粒子化し、患部に効率的にターゲッティングし、薬物徐放性に優れ、かつ副作用を軽減させたＰＧＥ１誘導体含有ナノ粒子の提供であり、次式（Ｉ）：2010058669.tif 000010［式中、ｎは１〜１２の整数を表す］で示されるプロスタグランジンＥ１誘導体であり、これを金属イオンにより疎水化し、ポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及びポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体と作用させることにより得られるプロスタグランジンＥ１誘導体含有ナノ粒子。
2010058669.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）：
【化１】
2010058669.tif 000009
［式中、ｎは１〜１２の整数を表す］
で示されるプロスタグランジンＥ１誘導体。
【請求項２】
式中ｎが２である式（Ｉ）で示されるプロスタグランジンＥ１誘導体。
【請求項３】
請求項１に記載の式（Ｉ）で示されるプロスタグランジンＥ１誘導体を金属イオンにより疎水化し、これをポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及びポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体と作用させることにより得られるプロスタグランジンＥ１誘導体含有ナノ粒子。
【請求項４】
さらに、塩基性低分子化合物を混合することを特徴とする請求項３に記載のプロスタグランジンＥ１誘導体含有ナノ粒子。
【請求項５】
さらに界面活性剤を配合することからなる請求項３又は４に記載のプロスタグランジンＥ１誘導体含有ナノ粒子。
【請求項６】
金属イオンが、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン、ニッケルイオン、ベリリウムイオン、マンガンイオン又はコバルトイオンの１種又は２種以上である請求項３、４又は５に記載のプロスタグランジンＥ１誘導体含有ナノ粒子。
【請求項７】
ポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体の重量平均分子量が３，０００〜３０，０００である請求項３〜６のいずれかに記載のプロスタグランジンＥ１誘導体含有ナノ粒子。
【請求項８】
塩基性低分子化合物が、（ジメチルアミノ）ピリジン、ピリジン、ピペリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、キノリン、キヌクリジン、イソキノリン、ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン、ナフチルアミン、モルホリン、アマンタジン、アニリン、スペルミン、スペルミジン、ヘキサメチレンジアミン、プトレシン、カダベリン、フェネチルアミン、ヒスタミン、ジアザビシクロオクタン、ジイソプロピルエチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、エチレンジアミン、トリメチレンジアミンから選択される１種又は２種以上のものである請求項４に記載のプロスタグランジンＥ１誘導体含有ナノ粒子。
【請求項９】
界面活性剤が、ホスファチジルコリン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート、ポリオキシエチレン（８０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）コレステロールエステル、脂質−ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油及び脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体から選択される１種又は２種以上のものである請求項５に記載のプロスタグランジンＥ１誘導体含有ナノ粒子。
【請求項１０】
粒子の直径が２０〜３００ｎｍである請求項３〜９のいずれかに記載のプロスタグランジンＥ１誘導体含有ナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なプロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）誘導体及びそれを封入したナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロスタグランジン（ＰＧ）は、プロスタン酸骨格をもつ一群の生理活性物質であり、アラキドン酸から生合成されるエイコサノイドの一つであって、種々の強い生理活性を有する化合物である。
これまでに各種のプロスタグランジン誘導体が知られており、その中でもプロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）には、強い血管拡張作用、血小板凝集作用並びにこれら作用に基づく慢性動脈閉塞症の治療作用などが知られており、既に臨床的に幾つかのＰＧＥ１誘導体が登場してきている。【０００３】
本出願人もこれまでに幾つかのＰＧＥ１誘導体を合成し、その薬理作用の検討を行ってきており、例えばその一つとして、ＰＧＥ１をエステル化して脂溶性を高めたＰＧＥ１のプロドラッグである開発コード番号ＡＳ０１３で示されるＰＧＥ１誘導体を提供している（特許文献１）。このＡＳ１０３は、生体内で効率良くＰＧＥ１に変換されるように設計された化合物であり、ＰＧＥ１のプロドラッグであることから、ＰＧＥ１が有する血管拡張作用、血小板凝集作用、及び慢性動脈閉塞症の治療作用などを有することが知られている。また、ＡＳ０１３には血管新生促進作用があることも知られている。
さらに局所への移行性を高めるべく、ＡＳ０１３を脂肪粒子中に包埋したリポ化製剤も提供しており、かかるリポ化製剤は、ＡＳ０１３の局所への親和性、集積性に優れており、そこで徐々にＰＧＥ１へ変換されることから、作用の持続性に優れた製剤である（特許文献２）。【０００４】
本発明者らは、これら一連のＰＧＥ１誘導体の合成・検索を行ってきたなかで、さらにＰＧＥ１誘導体としてＰＧＥ１の作用の持続性、徐放性を有する化合物の合成の検討を行い、その結果、ＰＧＥ１をリン酸エステル誘導体とすることにより、きわめて効果的なプロドラッグとなることを見出した。
また、これらのＰＧＥ１誘導体をナノ粒子化することにより、細胞内への取り込みに優れ、効果的にＰＧＥ１の作用を発揮することを確認し、本発明を完成させるに至った。
【特許文献１】日本特許第２８４９６０８号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ１９９９／９９９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって本発明は、ＰＧＥ１の作用の持続性、徐放性に優れたＰＧＥ１誘導体を提供すること、更にかかるＰＧＥ１誘導体をナノ粒子化し、患部に効率的にターゲッティングし、薬物徐放性に優れ、かつ副作用を軽減させたＰＧＥ１誘導体含有ナノ粒子を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の課題を解決するために、本発明の第一の基本的態様は、次式（Ｉ）：【０００７】
【化１】
2010058669.tif 000003
［式中、ｎは１〜１２の整数を表す］
で示されるプロスタグランジンＥ１誘導体である。【０００８】
より好ましい本発明は、上記式中、ｎが２である式（Ｉ）で示されるプロスタグランジンＥ１誘導体である。【０００９】
また本発明は、第二の基本的態様として、上記式（Ｉ）で示されるプロスタグランジンＥ１誘導体を含有するナノ粒子を提供するものであり、詳細には、式（Ｉ）で示されるプロスタグランジンＥ１誘導体を金属イオンにより疎水化し、これをポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及びポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体と作用させることにより得られるプロスタグランジンＥ１誘導体含有ナノ粒子である。【００１０】
好ましくは、本発明は、さらに塩基性低分子化合物を混合すること、また更に界面活性剤を配合することからなる上記のプロスタグランジンＥ１誘導体含有ナノ粒子であり、また、金属イオンが、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン、ニッケルイオン、ベリリウムイオン、マンガンイオン又はコバルトイオンの１種又は２種以上であるプロスタグランジンＥ１誘導体含有ナノ粒子である。【００１１】
より好ましくは、本発明は、ポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体、又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体の重量平均分子量が３，０００〜３０，０００であるプロスタグランジンＥ１誘導体含有ナノ粒子である。【００１２】
また本発明は、塩基性低分子化合物が、（ジメチルアミノ）ピリジン、ピリジン、ピペリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、キノリン、キヌクリジン、イソキノリン、ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン、ナフチルアミン、モルホリン、アマンタジン、アニリン、スペルミン、スペルミジン、ヘキサメチレンジアミン、プトレシン、カダベリン、フェネチルアミン、ヒスタミン、ジアザビシクロオクタン、ジイソプロピルエチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、エチレンジアミン、トリメチレンジアミンから選択される１種又は２種以上のものであるプロスタグランジンＥ１誘導体含有ナノ粒子である。【００１３】
さらにまた本発明は、界面活性剤が、ホスファチジルコリン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート、ポリオキシエチレン（８０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）コレステロールエステル、脂質−ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油及び脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体から選択される１種又は２種以上のものであるプロスタグランジンＥ１誘導体含有ナノ粒子である。【００１４】
最も好ましい本発明は、粒子の直径が２０〜３００ｎｍであるプロスタグランジンＥ１誘導体含有ナノ粒子である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ＰＧＥ１の作用の持続性に優れ、効果的にＰＧＥ１に変換されるプロドラッグとしてのＰＧＥ１誘導体が提供される。
本発明が提供するＰＧＥ１誘導体は、ＰＧＥ１より簡便な手段により合成することができる一方、ＰＧＥ１への変換が容易なものであり、またその変換が持続的なものであり、さらに保存安定性に優れたものであることから、徐放性のＰＧＥ１作用を発揮する点で、極めて特異的なものである。【００１６】
また、本発明が提供するＰＧＥ１誘導体は、容易に疎水性の金属塩へ変換することができるため、ポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及びポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体を用いたナノ粒子化することが可能である。
その結果、得られたナノ粒子は極めて安定なものであり、また粒子中におけるＰＧＥ１誘導体の残存が長期間に亘って持続するものである。したがって、本発明が提供するナノ粒子は、薬物の徐放性に優れ、その結果、ＰＧＥ１の作用の持続性を図れる点で、極めて効果的なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例２の結果を示した図であり、ブタ肝臓由来エステラーゼ（ＰＬＥ）で処理した場合のＰＧＥ１及び中間体への変換率を示した。
【図２】実施例２の結果を示した図であり、ヒト胎盤由来アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）で処理した場合のＰＧＥ１及び中間体への変換率を示した。
【図３】実施例２の結果を示した図であり、ヒト血清で処理した場合のＰＧＥ１及び中間体への変換率を示した。
【図４】実施例２の結果を示した図であり、ＰＧＥ１（ｎ＝２）リン酸エステル誘導体［ＰＧＥ１(Ｃ２)ＰＯＮａ］のＰＬＥ及びＡＬＰを同時処理したときのＰＧＥ１への変換率を示した。
【００１８】
【図５】実施例４の結果を示した図であり、ラットにおける血流量の変化を示した。
【図６】実施例４の結果を示した図であり、ラット血漿並びにヒト血清でのＰＧＥ１誘導体の、経時的なＰＧＥ１への変換率を示した。
【００１９】
【図７】実施例７の結果を示した図であり、ＰＬＡ（分子量５０００：ＰＬＡ０５）、ＰＬＬＡ（分子量５０００：ＰＬＬＡ０５）及びＰＬＬＡ（分子量２００００：ＰＬＬＡ２０）を基剤とした場合の粒子径を示した。
【図８】実施例７の結果を示した図であり、ＰＧＥ１誘導体の封入率を示した。
【図９】実施例７の結果を示した図であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでの放出試験の結果を示した。
【００２０】
【図１０】実施例８の結果を示した図であり、粒子作製時のｐＨを示した。
【図１１】実施例８の結果を示した図であり、作成した粒子の粒子径を示した。
【図１２】実施例８の結果を示した図であり、作成した粒子のＰＧＥ１誘導体の封入率を示した。
【００２１】
【図１３】実施例９の結果を示した図であり、粒子径を示した。
【図１４】実施例９の結果を示した図であり、封入率を示した。
【図１５】実施例９の結果を示した図であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの放出試験の結果を示した。
【００２２】
【図１６】実施例１０の結果を示した図であり、３７℃における条件下での安定性の結果を示した。
【図１７】実施例１０の結果を示した図であり、４℃における条件下での安定性の結果を示した。
【符号の説明】
【００２３】
図中において、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８及びＣ１２は、それぞれＰＧＥ１(Ｃ２)ＰＯＮａ、ＰＧＥ１(Ｃ３)ＰＯＮａ、ＰＧＥ１(Ｃ４)ＰＯＮａ、ＰＧＥ１(Ｃ６)ＰＯＮａ、ＰＧＥ１(Ｃ８)ＰＯＮａ、及びＰＧＥ１(Ｃ１２)ＰＯＮａを表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の一つの基本的態様は、上記した式（Ｉ）で示されるＰＧＥ１のリン酸エステル誘導体である。
これまで種々のＰＧＥ１誘導体が提供されているが、リン酸エステル誘導体として提供するのは本発明が最初であり、したがって、これらのＰＧＥ１誘導体は新規化合物でもある。【００２５】
本発明が提供するＰＧＥ１誘導体、すなわちＰＧＥ１のリン酸エステル誘導体は、具体的には、以下の製造方法により調製することができる。
その調製方法を化学反応式で記せば、以下の化学式でまとめられる。【００２６】
【化２】
2010058669.tif 000004
【００２７】
上記の化学式中、ｎは１〜１２の整数を表し、ＴＨＰはテトラヒドロピラニル基を表し、Ｂｎはベンジル基を表す。また、（ａ）〜（ｆ）は各工程を表す。【００２８】
すなわち、対応するアルカンジオール化合物（ＩＩ）の片方の水酸基（ＯＨ基）を３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン及び塩化アルミニウムを用いて反応を行い、テトラヒドロピラニル基（ＴＨＰ基）で保護し化合物（ＩＩＩ）を得る［工程ａ］。反応は、通常の保護基（ＴＨＰ基）の導入に適用される反応条件が採用される。
次いで、化合物（ＩＩＩ）にジベンジル  ジイソプロピルホスホラミダイト［((BnO)2-P(O)-N(iso-Pr)２)２］を１Ｈ−テトラゾールの存在下に反応させて、化合物（ＩＩＩ）の他方の水酸基の亜リン酸を調製し、続いて、ｍ−クロロ過安息香酸等の過安息香酸を用いて亜リン酸を酸化し、リン酸誘導体（ＩＶ）を得る［工程ｂ］。
次に、得られたリン酸誘導体（ＩＶ）のテトラヒドロピラニル基をｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム−エタノール溶液中で脱保護を行い、化合物（Ｖ）を得た［工程ｃ］。【００２９】
かくして得られた化合物（Ｖ）を用いてＰＧＥ１をエステル化し、目的とする本発明のＰＧＥ１のリン酸エステル誘導体へ誘導するのであるが、かかる誘導は以下のようにして行われる。
すなわち、化合物（Ｖ）とＰＧＥ１化合物（ＶＩ）を、縮合剤として例えばＥＤＣ［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド］塩酸塩を使用し、塩基として４−ジメチルアミノピリジンを用いて縮合させ、化合物（ＶＩＩ）へ誘導する［工程ｄ］。
次いで、得られた化合物（ＶＩＩ）のテトラヒドロピラニル基を、適当な溶媒、例えば、テトラヒドロフラン−水の混合液中酢酸により脱保護し、化合物（ＶＩＩＩ）を得［工程ｅ］、最後に化合物（ＶＩＩＩ）のベンジル基を還元的に脱保護した後、酢酸ナトリウムによりリン酸ナトリウムに変換し、目的とする本発明のＰＧＥ１誘導体（Ｉ）へ導く［工程ｆ］。
なお、化合物（ＶＩＩＩ）から本発明の目的化合物である式（Ｉ）のＰＧＥ１誘導体への脱ベンジル化は、例えば、１０％パラジウム−炭素を用い、１，４−シクロヘキジエン／酢酸中の接触還元により行うことができる。【００３０】
上記で説明した本発明の式（Ｉ）で示されるＰＧＥ１誘導体の調製法における各工程（ａ）から（ｆ）の反応条件は、一般的な各種化学の教科書に記載される条件を種々応用して行うことができる。【００３１】
かくして調製された本発明のＰＧＥ１誘導体としては、例えば、以下のものを例示することができる。【００３２】
【化３】
2010058669.tif 000005
【００３３】
【表１】
2010058669.tif 000006
【００３４】
上記のようにして調製された本発明のＰＧＥ１誘導体は、体内において容易にＰＧＥ１そのものに変換され、効果的にＰＧＥ１の有する血管拡張作用、血小板凝集作用等を発揮するものであった（後記する実施例を参照）。【００３５】
本発明は、また上記で調製したＰＧＥ１誘導体を封入したナノ粒子であるが、かかるナノ粒子は具体的には以下のようにして調製される。
すなわち、従来から、乳酸・グリコール酸共重合体（以後、「ＰＬＧＡ」と記す場合もある）、または乳酸重合体（以後、「ＰＬＡ」と記す場合もある）のマイクロ粒子ないしナノ粒子に薬物を封入する研究が種々行われている。
本発明のナノ粒子の調製にあたってもこれらの生分解性重合体を使用するのが好ましく、これらのなかでも、特に、ポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体（ＤＬ−体をＰＤＬＬＡ−ＰＥＧ、Ｌ−体をＰＬＬＡ−ＰＥＧということもある）又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体（ＤＬ−体をＰＤＬＬＧＡ−ＰＥＧ、Ｌ−体をＰＬＬＧＡ−ＰＥＧということもある）は、ポリＤＬ−乳酸（ＰＤＬＬＡということもある）若しくはポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡということもある）又はポリ（ＤＬ−乳酸／グリコール酸）共重合体（ＰＤＬＬＧＡということもある）若しくはポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体（ＰＬＬＧＡということもある）（これらの重合体をブロックＡという）とポリエチレングリコール（ＰＥＧということもある）（ブロックＢという）とを、エチレンジメチルアミノプロピルカルボジイミドなどの縮合剤のもとで反応させることにより得られた共重合体を使用してナノ粒子化するのが好ましい。
なお、これらの共重合体は目的に応じて合成することができるが、市販されている同様のブロック共重合体を使用してもよい。【００３６】
ブロック共重合体の構成としてはＡ−Ｂタイプ、Ａ−Ｂ−Ａタイプ、Ｂ−Ａ−Ｂタイプのいずれであっても本発明の目的を達成することができる。また、これらのブロック共重合体の重量平均分子量は３，０００〜３０，０００であることが好ましい。【００３７】
本発明が提供するナノ粒子の調製は、具体的には、式（Ｉ）で示されるＰＧＥ１誘導体を金属イオンにより疎水化し、この疎水化したＰＧＥ１誘導体をポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及びポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体と作用させることにより行うことができる。【００３８】
より具体的には、式（Ｉ）で示されるＰＧＥ１誘導体と金属イオンを、有機溶媒又は含水有機溶媒の溶媒中で混合して疎水性薬物とし、この混合液中にポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、さらにポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体を加えて攪拌し、この溶液を水中に添加、拡散することにより調製することができる。【００３９】
また、ポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、さらにポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体を溶媒に溶解した溶液と、式（Ｉ）で示されるＰＧＥ１誘導体の水溶液、及び金属イオン水溶液を同時に加えて混合しても同様のナノ粒子を調製することができる。【００４０】
使用される金属イオンとしては、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン、ニッケルイオン、ベリリウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオンのいずれかであり、それらの水溶性金属塩の１種又は２種以上が使用される。そのなかでも好ましくは亜鉛イオン、鉄イオンであり、塩化亜鉛、塩化鉄などが好ましく使用できる。【００４１】
上記の反応に使用される溶媒としては、アセトン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、プロパノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、テトラヒドロフランなどの有機溶媒、あるいはこれらの含水溶媒であり、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、テトラヒドロフランが好ましい。【００４２】
本発明の式（Ｉ）で示されるＰＧＥ１誘導体含有ナノ粒子おいて、さらに塩基性低分子化合物を混合することによりＰＧＥ１誘導体のナノ粒子への封入率が増加し、１０％程度まで封入することができる。
このような塩基性低分子化合物としては（ジメチルアミノ）ピリジン、ピリジン、ピペリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、キノリン、キヌクリジン、イソキノリン、ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン、ナフチルアミン、モルホリン、アマンタジン、アニリン、スペルミン、スペルミジン、ヘキサメチレンジアミン、プトレシン、カダベリン、フェネチルアミン、ヒスタミン、ジアザビシクロオクタン、ジイソプロピルエチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、エチレンジアミン、トリメチレンジアミン等を挙げることができ、好ましくは、２級又は３級アミン類であり、ジエタノールアミンが特に好ましい。【００４３】
かくして調製された式（Ｉ）で示されるＰＧＥ１誘導体を含有するナノ粒子に更に界面活性剤を配合してもよく、界面活性剤を配合することにより、生成したナノ粒子を安定化し、かつ粒子間の凝集を抑制することができる。したがって、ナノ粒子を含有する製剤の製剤化工程にとって好ましいものとなる。【００４４】
使用される界面活性剤としては、ホスファチジルコリン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート、ポリオキシエチレン（８０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）コレステロールエステル、脂質−ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油及び脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体等をあげることができ、これらの界面活性剤から選択される１種又は２種以上を使用するのが好ましい。【００４５】
本発明が提供するＰＧＥ１誘導体を含有するナノ粒子にあっては、その粒子の粒子径は２０〜３００ｎｍの範囲内であり、好ましくは５０〜２００ｎｍであり、それぞれの薬物が目的とするターゲット患部に依存して、その粒子径を決定することができる。【００４６】
かくして調製した本発明の式（Ｉ）で示されるＰＧＥ１誘導体を含有するナノ粒子は、ナノ粒子の溶液又は懸濁液を、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、フィルター濾過、ファイバー透析などの操作により適宜精製した後、凍結乾燥して取得、保存される。【００４７】
その際、凍結乾燥した製剤を再懸濁して投与できるようにするため安定化剤及び／又は分散化剤を加えて凍結乾燥されることが好ましく、そのような安定化剤、分散化剤としてはショ糖、トレハロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどが好ましく使用される。【００４８】
本発明が提供する式（Ｉ）で示されるＰＧＥ１誘導体を含有するナノ粒子は、静脈注射用製剤、局所注射用製剤、点鼻剤、点眼剤、吸入剤、噴霧剤などの非経口投与用製剤の医薬品として使用され、なかでも静脈注射用製剤とすることで、当該ナノ粒子の特性、効果をより良く発揮することができる。【００４９】
これらの非経口投与用製剤の調製に使用される基剤、その他の添加剤成分としては、製剤学的に許容され、使用されている各種基剤、添加剤成分を挙げることができる。具体的には、生理食塩水、単糖類、二糖類、糖アルコール類、多糖類などの糖類；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースなどの高分子添加剤；イオン性又は非イオン性界面活性剤；などが剤型に応じて適宜選択され、使用することができる。
【実施例】
【００５０】
以下に本発明を具体的実施例で詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。【００５１】
実施例１：ＰＧＥ１誘導体の製造
上記した製造方法に従って、上記した表１に記載の各種ＰＧＥ１誘導体を合成した。
すなわち、式（ＩＩ）の化合物１．７ｍｍｏｌのジクロロメタン１０ｍＬ溶液を、１Ｈ−テトラゾール２．５ｍｍｏｌ及びＮ，Ｎ−ジベンジル  ジイソプロピルホスホラミダイト３．４ｍｍｏｌと混合し、室温にて一夜攪拌した。その後ｍ−クロロ過安息香酸３．４ｍｍｏｌを加え、室温にて３０分間攪拌を行った。混合物にクロロホルム３０ｍＬを加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１０ｍＬ及び食塩水にてそれぞれ３回洗浄し、溶媒を留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル：ヘキサン＝１：１〜酢酸エチルにて溶出し、対応する式（ＩＶ）の化合物を無色油状物として得た。【００５２】
得られた式（ＩＶ）の化合物１．３５ｍｍｏｌ及びｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム０．３ｍｍｏｌのエタノール５ｍＬ溶液を５５℃にて３時間攪拌した。溶媒を留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル：ヘキサン＝３：２〜酢酸エチルにて溶出し、対応する式（Ｖ）の化合物を無色油状物として得た。【００５３】
次いで、得られた式（Ｖ）の化合物０．２５ｍｍｏｌ、ＥＤＣ［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド］塩酸塩０．４ｍｍｏｌ、４−ジメチルアミノピリジン０．２０ｍｍｏｌ及び式（ＶＩ）のＰＧＥ１誘導体のジクロロメタン３ｍＬを室温下に１０分間攪拌した。混合物にクロロホルム３０ｍＬを加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１０ｍＬ及び食塩水にてそれぞれ３回洗浄し、溶媒を留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル：ヘキサン＝１：１にて溶出し、対応する式（ＶＩＩ）の化合物を無色油状物として得た。【００５４】
上記で得られた式（ＶＩＩ）の化合物０．０５２ｍｍｏｌを、酢酸１．８ｍＬ、テトラヒドロフラン０．４６ｍＬ及び水１．８ｍＬの混合液に溶解させ、３５℃にて４時間攪拌した。０℃にて反応物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液５ｍＬを加え、酢酸エチル５０ｍＬで３回抽出を行った。有機層を合わせ、食塩水１０ｍＬにて３回洗浄後、溶媒を留去した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル：ヘキサン＝１：１にて溶出し、対応する式（ＶＩＩＩ）の化合物を無色油状物として得た。【００５５】
式（ＶＩＩＩ）の化合物０．０２６ｍｍｏｌを、１０％パラジウム−炭素６４ｍｇ、１．４−シクロヘキサジエン２．８ｍＬ及び酢酸０．２ｍＬとエタノール５ｍＬ中に混合し、水素ガス雰囲気下、室温にて２時間攪拌した。１０％パラジウム−炭素を濾別し、エタノールにて洗浄した。有機層を合わせ、濃縮し、目的とする式（Ｉ）の化合物を黄色油状物として得た。
得られた化合物の性状、ＮＭＲデータを、前記表１中に示した。【００５６】
実施例２：各種ＰＧＥ１誘導体の酵素及び血清処理によるＰＧＥ１への変換
上記実施例１で合成した各種ＰＧＥ１誘導体を、ブタ肝臓由来エステラーゼ（ＰＬＥ）、ヒト胎盤由来アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）及びヒト血清で処理した場合のＰＧＥ１及び中間体への変換率を、ＨＰＬＣを用いて測定した。
また、ＰＧＥ１（ｎ＝２）リン酸エステルナトリウム［ＰＧＥ１(Ｃ２)ＰＯＮａ］のＰＬＥ及びＡＬＰ同時処理したときのＰＧＥ１への変換率も検討した。
さらに、対照としてＰＧＥ１のエステル誘導体であるＡＳ１０３も同様実施した。
なお、反応前のＰＧＥ１誘導体が完全にＰＧＥ１に変換された場合を変換率１００％とした。
具体的方法は以下のとおりである。【００５７】
方法：
［ヒト血清処理］
ＰＧＥ１誘導体は、１００ｍＭエタノール溶液１μＬとヒト血清９９μＬを混合し、３７℃でインキュベーションした。その後２倍量のメタノールを添加し、氷上で３０分間除タンパク質を行った。次いで、４℃、１３２００ｒｐｍ、１０分間の遠心を行い、上清２００μＬを遠心濃縮機で乾燥させた。乾燥したサンプルに、内部標準物資として１０μｇ／ｍＬの３−フェニルプロピオネート３００μＬを添加し、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ３．６）１．７ｍＬを添加した。２０分後、溶液をＣ１８逆相カートリッジカラム（SepPack C-18）にロードし、超純水６ｍＬで洗浄した後、アセトニトリル３ｍＬで溶出した。溶出液は、等量の０．２ｍｇ／ｍＬの９−anthryldiazomethane（ＡＤＡＭ）のアセトン溶液と混合し、遮光下３７℃で１８時間インキュベートし、インキュベーション後、サンプル中に含まれるＰＧＥ１量を、Super-ODS columnと蛍光検出器を用いて測定した。【００５８】
［ブタ肝臓由来エステラーゼ（ＰＬＥ）処理］
ＰＧＥ１誘導体は、１００ｍＭエタノール溶液１μＬ、ブタ肝臓由来エステラーゼ（ＰＬＥ）溶液０．７５μＬ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）９８．２５μＬを混合し、３７℃でインキュベーションした。その後等量のメタノールを添加し、氷上で３０分間除タンパク質を行った。次いで、４℃、１３２００ｒｐｍ、１０分間の遠心を行い、上清１５０μＬを遠心濃縮機で乾燥させた。乾燥したサンプルに、内部標準物資として１０μｇ／ｍＬの３−フェニルプロピオネート３００μＬを添加し、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ３．６）１．７ｍＬを添加した。２０分後、溶液をＣ１８逆相カートリッジカラム（SepPack C-18）にロードし、超純水６ｍＬで洗浄した後、アセトニトリル３ｍＬで溶出した。溶出液は、等量の０．２ｍｇ／ｍＬの９−anthryldiazomethane（ＡＤＡＭ）のアセトン溶液と混合し、遮光下３７℃で１８時間インキュベートした。インキュベーション後、サンプル中に含まれるＰＧＥ１誘導体量を、Super-ODS columnと蛍光検出器を用いて測定した。【００５９】
［ヒト胎盤由来アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）処理］
ＰＧＥ１誘導体は、１００ｍＭエタノール溶液１μＬ、ヒト胎盤由来アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）溶液１μＬ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）９８μＬを混合し、３７℃でインキュベーションした。その後等量のメタノールを添加し、氷上で３０分間除タンパク質を行った。次いで、４℃、１３２００ｒｐｍ、１０分間の遠心し、上清をＨＰＬＣで分析した。【００６０】
上記におけるＨＰＬＣ分析の条件は以下のとおりである
［ＨＰＬＣ条件］
ＨＰＬＣは、Waters Alliance HPLS system、ソフトウェアはEmpowerを使用した。ポンプやオートサンプラー等は、2795 Separation module、検出器は、2996 Photodiode Array detector、カラムは、4.6×100-mm（2-um）TSKgel super-ODS columnを使用した。移動相Ａはアセトニトリル、移動相Ｂは５ｍＭ酢酸アンモニウム溶液を使用した。移動相Ａを２５％で１分間、その後７分で２５〜６０％、さらに５分で６０〜１００％となるように勾配をかけ、７分間１００％で保つ条件でサンプルを分離した。
流速は０．５ｍＬ／分、サンプル注入量は１０μＬ、検出波長は１９５ｎｍとした。【００６１】
結果：
これらの結果を図１〜図４に示した。図１はブタ肝臓由来エステラーゼ（ＰＬＥ）で処理した場合のＰＧＥ１及び中間体への変換率を、図２はヒト胎盤由来アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）で処理した場合のＰＧＥ１及び中間体への変換率を、図３はヒト血清で処理した場合のＰＧＥ１及び中間体への変換率を示した。
また図４は、ＰＧＥ１（ｎ＝２）リン酸エステル誘導体［ＰＧＥ１(Ｃ２)ＰＯＮａ］のＰＬＥ及びＡＬＰを同時処理したときのＰＧＥ１への変換率を示した。
本発明が提供するＰＧＥ１誘導体は、持続的に活性体であるＰＧＥ１に変換されているのが判明する。【００６２】
実施例３：ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）によって誘導される血小板凝集に対するＰＧＥ１誘導体の効果
血小板を豊富に含む画分（ＰＲＰ）と、ＰＧＥ１誘導体を３７℃でインキュベートした後、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）（最終濃度：２μＭ）を添加することにより凝集を誘導した。３分後、血小板凝集計を用いて凝集の程度を測定した。
サンプルとして、生理食塩水を用いたときに誘導された凝集を１００％とし、凝集を５０％阻害するＰＧＥ１誘導体の濃度を測定した。
さらに、対照としてＰＧＥ１のエステル誘導体であるＡＳ１０３も同様実施した。【００６３】
具体的方法は、以下のとおりである。
［血小板処理］
血液は、１週間以上薬剤を服用していない健常人から、抗凝固剤として３．８％クエン酸ナトリウム（血液の１／９量）を使用して得た。血液を１０００ｒｐｍで１５分間遠心し、platelet-rich plasma（ＰＲＰ）を得た。残りの血液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、platelet-poor plasma（ＰＰＰ）を得た。
ＰＲＰの２１５μＬを３７℃で１分間インキュベーションし、サンプル１０μＬを添加した後、２０μＬ  ＡＤＰを２５μＬ添加することにより凝集を誘導した。３分後、血小板凝集計（NKK hematracer 6：二光バイオサイエンス社、PAC-8S）を用いて、凝集の程度を測定した。
ＰＰＰはコントロールとして用いた。
サンプルとして生理食塩水を用いたときに誘発された凝集を１００％として、凝集を５０％阻害するＰＧＥ１誘導体の濃度を計算した。
サンプルは、２５ｍＭのエタノール溶液を生理食塩水で種々の濃度に希釈して、実験に供した。
その結果を下記表２に示した。【００６４】
【表２】
2010058669.tif 000007
【００６５】
本発明の式（Ｉ）中ｎ＝２のＰＧＥ１誘導体であるＰＧＥ１(Ｃ２)ＰＯＮａは、徐放的な血小板凝集作用を示していることが判明する。【００６６】
実施例４：ＰＧＥ１誘導体のラット血流増加作用
Ｗｉｓｔｅｒ系雄性ラットを麻酔下にレーザードップラー法により足蹠皮膚血流量を測定し、尾静脈よりＰＧＥ１誘導体［（ｎ＝２）：ＰＧＥ１(Ｃ２)ＰＯＮａ］を投与した。サンプル投与時を０分とし、血流量変化を観察した。
また、ＰＧＥ１誘導体［（ｎ＝２）：ＰＧＥ１(Ｃ２)ＰＯＮａ］をラット血漿で処理した時のＰＧＥ１への変換率を検討した。
反応前のＰＧＥ１誘導体が完全にＰＧＥ１に変換された場合を１００％とした。【００６７】
方法：
具体的方法は以下のとおりである。
［血流量の測定］
Ｗｉｓｔｅｒ系雄性ラットを麻酔下にレーザードップラー法により足蹠皮膚血流量を測定し、尾静脈よりＰＧＥ１誘導体を投与した。
サンプルの投与量は、１０ｎｍｏｌ／ｋｇとした。
サンプル投与時を０分として、血流量の変化を観察した。【００６８】
結果：
図５及び図６にその結果を示した。図５はラットにおける血流量の変化を示すが、その結果から判明するように、本発明の式（Ｉ）で示されるＰＧＥ１誘導体にあっては、血流量が持続的に維持されていることが理解される。
図６はラット血漿並びにヒト血清でのＰＧＥ１誘導体の、経時的なＰＧＥ１への変換率を示したものであるが、上記の結果は、ＰＧＥ１への変換が持続的である点からも理解されるものである。【００６９】
以下に、本発明の粒子の調製、得られたナノ粒子の特徴について記載していく。
実施例５：ナノ粒子の調製に使用するＰＬＡ−ＰＥＧの合成
ＰＥＧ２ｇ、dl−Ｌａｃｔｉｄｅ２〜６ｇ及びオクチル酸スズ（０．５％重量）を重合管に入れ、充分に混合した後、油圧ポンプにて脱気した。オイルバスにて１２５℃で加熱し溶解させ、１６０℃に昇温して３〜５時間反応させた。反応物を冷却後、２０ｍＬ程度のジクロルメタンに溶解した。その後氷冷した大量のイソプロパノールに徐々に添加することで再沈澱させ、沈澱物を水に懸濁させ、凍結乾燥を行った。ゲル浸透クロマトグラフィー（TSKgel α−4000、α−3000、α−2000）及びＮＭＲ測定により、分子量を計算した。
なお使用したＰＥＧの平均分子量は約５０００であり、ＰＬＡの平均分子量は約３０００であった。【００７０】
実施例６：ナノ粒子の作成方法
粒子は、水中油溶媒拡散法で作製した。ＰＬＬＡは１，４−ジオキサンに、ＰＥＧ−ＰＬＡ及びＤＥＡ（ジエタノールアミン）はアセトンに、塩化亜鉛及びＰＧＥ１誘導体は超純水に溶解して用いた。ＰＬＬＡ及びＰＥＧ−ＰＬＡの総量は２５ｍｇとした。
ＰＬＬＡ溶液２２．５μＬ、ＰＥＧ−ＰＬＡ溶液２７．５μＬ、１Ｍ塩化亜鉛水溶液２０．３μＬ、ＰＧＥ１誘導体水溶液１４．３μＬの順に混合し、室温にて１０分間インキュベーションした。超純水２５ｍＬを１０００ｒｐｍで攪拌しているなかに得られた混合物を２６Ｇの注射針を通して、４８ｍＬ／時間の速度で滴下した。滴下終了後、０．５Ｍクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．４）５００μＬ、２００ｍｇ／ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ８０水溶液１２．５μＬを添加することにより、過剰な亜鉛イオンをキレートし、粒子の拡散を安定化させた。粒子の懸濁液は、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ−５０を用いて限外濾過により濃縮し、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７）及び超純水を添加して濃縮を重ね、粒子を精製した。
粒子中のＰＧＥ１誘導体封入量は、ＡＤＡＭと反応させることにより、Super-ODS columnと蛍光検出器を用いて測定した。
粒子中へのＰＧＥ１誘導体の封入率は、粒子の総重量に対するＰＧＥ１誘導体の重量比として定義した。
粒子径とその分布は、動的光拡散法により測定した。
その結果を下記表３に示した【００７１】
【表３】
2010058669.tif 000008
【００７２】
表中に示した結果からも判明するように、粒子中へのＰＧＥ１誘導体の封入率は充分なものであった。【００７３】
なお、ナノ粒子中へのＰＧＥ１誘導体の封入量の測定は以下のとおりである。
［粒子中のＰＧＥ１量の測定方法］
粒子中のＰＧＥ１量は以下のようにして測定した。
粒子懸濁液５０μＬを遠心濃縮機で乾燥させた。乾燥した粒子は、１，４−ジオキサン１５０μＬで溶解した。続いて、内部標準物資として６０μｇ／ｍＬの３−フェニルプロピオネート１５０μＬ添加し、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ３．６）１．７ｍＬを添加した。２０分後、溶液をＣ１８逆相カートリッジカラム（ＳｅｐＰａｃｋ  Ｃ−１８）にロードした。超純水６ｍLで洗浄した後、アセトニトリル４．５ｍLで溶出した。溶出液は、等量の０．２ｍｇ／ｍＬの９−anthryldiazomethane（ＡＤＡＭ）のアセトン溶液と混合し、遮光下３７℃で１８時間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＧＥ１量は、Ｓｕｐｅｒ−ＯＤＳカラムと蛍光検出器を用いて測定した。
粒子中へのＰＧＥ１の封入率は、粒子の総重量に対するＰＧＥ１の重量の比として定義した。【００７４】
ＰＧＥ１−ＡＤＡＭのＨＰＬＣの測定は以下のとおり行った。
ＨＬＰＣは、Waters Alliance HPLS system、ソフトウェアはEmpowerを使用した。ポンプやオートサンプラー等は、2795 Separation module、検出器は、2996 Photodiode Array detector及び2475 Multi λ Fluorescence Detector、カラムは、4.6×100-mm（２ｕｍ）TSKgel super-ODS columnを使用した。
移動相Ａはアセトニトリル、移動相Ｂは超純水を使用した。
移動相Ａを６５％で２５分間、その後１０分で６５〜１００％となるように勾配をかけ、１０分間１００％で保つ条件でサンプルを分離した。
流速は０．３ｍＬ／分、サンプル注入量は５μＬ、励起波長は３６５ｎｍ、検出波長は４１２ｎｍとした。【００７５】
実施例７：ＰＧＥ１誘導体［ｎ＝２：ＰＧＥ１(Ｃ２)ＰＯＮａ］を封入したナノ粒子の特徴
ナノ粒子は、水中油溶媒拡散法で作製した。
ＰＬＡ（分子量：５０００）或いはＰＬＬＡ（分子量：５０００或いは２００００）及びＰＬＡ−ＰＥＧ（分子量：８０００）を基剤として用いてナノ粒子を作製した。
各種ナノ粒子の粒径、封入率、及びｉｎ  ｖｉｖｏでの放出試験を行った。
なお、放出試験は、ナノ粒子を３７℃、リン酸緩衝液中でインキュベーションし、各時間において粒子中に残存しているＰＧＥ１誘導体［ｎ＝２：ＰＧＥ１(Ｃ２)ＰＯＮａ］量をＨＰＬＣで測定した。【００７６】
その結果を図７〜図９に示した。
図７は、ＰＬＡ（分子量５０００：ＰＬＡ０５）、ＰＬＬＡ（分子量５０００：ＰＬＬＡ０５）及びＰＬＬＡ（分子量２００００：ＰＬＬＡ２０）を基剤とした場合の粒子径を示し、図８はＰＧＥ１誘導体の封入率を示し、図９はｉｎ  ｖｉｖｏでの放出試験の結果を示した。
その結果からも判明するように、ＰＬＬＡを基剤として用いた場合に、得られたナノ粒子は良好な粒子径と薬物封入率、並びに徐放性を示していることが判明する。【００７７】
実施例８：ＰＧＥ１誘導体［ｎ＝２：ＰＧＥ１(Ｃ２)ＰＯＮａ］を効率よくＰＬＬＡナノ粒子中に封入するための条件の検討
上記実施例７の結果を踏まえ、更に効率よくＰＧＥ１誘導体を封入するための条件を検討した。
すなわち、ナノ粒子作製時に、亜鉛量を２１．４ｎｍｏｌに固定し、ＤＥＡ（ジエタノールアミン）量を変更してナノ粒子を作製した。
図１０に、種々の条件において粒子作製時のｐＨを示し、図１１に作製した粒子の粒子径を、図１２にＰＧＥ１誘導体の封入率を示した。【００７８】
実施例９：粒子作成条件変更後のＰＧＥ１誘導体［ｎ＝２：ＰＧＥ１(Ｃ２)ＰＯＮａ］を封入したナノ粒子の特徴
ＤＥＡ量を変更した条件で、ＰＬＬＡ（分子量５０００：ＰＬＬＡ０５或いは２００００：ＰＬＬＡ２０）及びＰＬＡ−ＰＥＧ（分子量：８０００）を基剤として用いてナノ粒子を作製した。
図１３に、得られた各種ナノ粒子についての粒子径を、図１４にＰＧＥ１誘導体の封入率を、図１５にｉｎ  ｖｉｔｒｏでの放出試験の結果を示した。【００７９】
なお、粒子からＰＧＥ１の放出試験は、具体的には以下の方法で行った。
ＰＧＥ１を封入したナノ粒子は、ウシ血清アルブミン（ＦＢＳ）とリン酸緩衝液（ＰＢＳ）の混合液（５０％ｖ／ｖ）中に分散させた。３７℃で各時間インキュベートした後、各溶液１００μＬ  ５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７）９００μＬを添加し、４℃、５０，０００×ｇ、３０分の遠心を行った。上清を除去し、超純水１ｍＬを添加し、さらに遠心した。上清を除去し、沈殿に含まれるＰＧＥ１量をＨＰＬＣで測定した。【００８０】
実施例１０：ＰＧＥ１の安定性試験
ＰＧＥ１誘導体［（ｎ＝２）：ＰＧＥ１(Ｃ２)ＰＯＮａ］の１ｍＭ量の水溶液を、それぞれ３７℃及び４℃の条件下に放置（インキュベート）し、その経過時間による溶液中におけるＰＧＥ１誘導体の残存量をＨＰＬＣで測定した。
さらに、対照としてＰＧＥ１のエステル誘導体であるＡＳ１０３も同様実施した。【００８１】
その結果を図１６及び図１７に示した。なお、値は３回の実施における平均値±S.E.M.で示している。
図１６は、３７℃の条件下でインキュベートした場合の安定性の結果を示したものであるが、本願発明のＰＧＥ１誘導体［（ｎ＝２）：ＰＧＥ１(Ｃ２)ＰＯＮａ］は、ＡＳ１０３に比較してその安定性が優れていることが理解される。
また、図１７は４℃の条件下でインキュベートした場合の安定性の結果を示したものであるが、かかる条件下ではさらに安定性が良好なものであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
以上記載のように、本発明により、ＰＧＥ１の作用の持続性に優れ、効果的にＰＧＥ１に変換されるプロドラッグとしてのＰＧＥ１誘導体が提供される。
本発明が提供するＰＧＥ１誘導体は、ＰＧＥ１への変換が容易なものであり、またその変換が持続的なものであり、さらに保存安定性に優れ、徐放性のＰＧＥ１作用を発揮する点で、極めて特異的なものである。【００８３】
また、本発明が提供するＰＧＥ１誘導体はナノ粒子化することが可能であり、得られたナノ粒子は極めて安定なものであり、また粒子中におけるＰＧＥ１誘導体の残存が長期間に亘って持続するものである。したがって、本発明が提供するナノ粒子は、薬物の徐放性に優れ、その結果、ＰＧＥ１の作用の持続性を図れる点で、極めて効果的なものであり、産業上の利用性は多大なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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2010058669.tif 000029
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