(57)【要約】  ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を有効成分とする，ＰＵＶＡ療法と組み合わせて用いるための癌治療剤が開示される。また，ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と光増感剤との組み合わせを含む，ＰＵＶＡ療法に用いるための癌治療剤も開示される。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の好ましい例は，酪酸ナトリウム，トリコスタチンＡ（ＴＳＡ），スベロイルアニリドヒドロキサム酸（Ｚｏｌｉｎｚａ／Ｖｏｌｉｎｏｓｔａｔ／ＳＡＨＡ），バルプロ酸，，Ｂｅｌｉｎｏｓｔａｔ／ＰＸＤ１０１，ＩＴＦ２３５７，ＣＲＡ−２４７８１／ＰＣＩ２４７８１，Ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ／ＦＫ２２８／Ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ，Ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ／ＶＰ−１０１／ＥＬ−５３２，Ｐｉｖａｎｅｘ／ＡＮ−９，ＳＢ９３９，ＭＳ−２７５／ＳＮＤＸ−２７５／ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ，ＭＧＣＤ−０１０３，ＪＨＪ−２６４８１５８５である。
2010064422.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と光増感剤との組み合わせを含む，癌光化学療法に用いるための癌治療剤。
【請求項２】
癌光化学療法がＰＵＶＡ療法である，請求項１記載の癌治療剤。
【請求項３】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は，酪酸ナトリウム，バルプロ酸，Ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ／ＶＰ−１０１／ＥＬ−５３２，Ｐｉｖａｎｅｘ／ＡＮ−９，ＯＳＵ−ＨＤＡＣ４２，トリコスタチンＡ，スベロイルアニリドヒドロキサム酸（Ｚｏｌｉｎｚａ／Ｖｏｌｉｎｏｓｔａｔ／ＳＡＨＡ），ＬＡＱ−８２４，Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ／ＬＢＨ−５８９，ＣＲＡ−２４７８１／ＰＣＩ２４７８１，Ｂｅｌｉｎｏｓｔａｔ／ＰＸＤ１０１，Ｔｕｂａｃｉｎ，Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ，ＩＴＦ２３５７，ＳＢ９３９，Ｒ３０６４６５／ＪＮＪ−１６２４１１９９，ＭＳ−２７５／ＳＮＤＸ−２７５／ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ，ＭＧＣＤ−０１０３，Ｐｉｍｅｌｉｃ  ｄｉｐｈｅｎｙｌａｍｉｄｅ，Ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ／ＦＫ２２８／Ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｐｉｃｉｄｉｎ，Ｔｒａｐｏｘｉｎ  Ａ，ＨＣ−Ｔｏｘｉｎ，ＮＣＨ−５１，Ａｌｐｈａ−ｍｅｒｃａｐｔｏｋｅｔｏｎｅ  １９ｙ／ＫＤ５１５０，５−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌ）ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｓ，２−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌｔｈｉｏｐｈｅｎｅ  ｏｘａｄｉａｚｏｌｅｓ，ＣＩ−９９４，Ｃｈｌａｍｙｄｏｃｉｎ，ＪＨＪ−２６４８１５８５，親電子ケトンから選択される，請求項１または２に記載の癌治療剤。
【請求項４】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を有効成分とする鎖間架橋修復またはヌクレオチド除去修復の阻害剤。
【請求項５】
光化学療法により癌を治療する方法であって，患者にヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と光増感剤とを投与した後に，治療すべき部位にＵＶＡを照射することを含む方法。
【請求項６】
光増感剤がソラレンである，請求項５記載の方法。
【請求項７】
癌光化学療法を受けている患者において，ＵＶＡ照射により生ずる鎖間架橋修復またはヌクレオチド除去修復を阻害する方法であって，該患者にヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項８】
癌光化学療法がＰＵＶＡ療法である，請求項７記載の方法。
【請求項９】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は，酪酸ナトリウム，バルプロ酸，Ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ／ＶＰ−１０１／ＥＬ−５３２，Ｐｉｖａｎｅｘ／ＡＮ−９，ＯＳＵ−ＨＤＡＣ４２，トリコスタチンＡ，スベロイルアニリドヒドロキサム酸（Ｚｏｌｉｎｚａ／Ｖｏｌｉｎｏｓｔａｔ／ＳＡＨＡ），ＬＡＱ−８２４，Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ／ＬＢＨ−５８９，ＣＲＡ−２４７８１／ＰＣＩ２４７８１，Ｂｅｌｉｎｏｓｔａｔ／ＰＸＤ１０１，Ｔｕｂａｃｉｎ，Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ，ＩＴＦ２３５７，ＳＢ９３９，Ｒ３０６４６５／ＪＮＪ−１６２４１１９９，ＭＳ−２７５／ＳＮＤＸ−２７５／ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ，ＭＧＣＤ−０１０３，Ｐｉｍｅｌｉｃ  ｄｉｐｈｅｎｙｌａｍｉｄｅ，Ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ／ＦＫ２２８／Ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｐｉｃｉｄｉｎ，Ｔｒａｐｏｘｉｎ  Ａ，ＨＣ−Ｔｏｘｉｎ，ＮＣＨ−５１，Ａｌｐｈａ−ｍｅｒｃａｐｔｏｋｅｔｏｎｅ  １９ｙ／ＫＤ５１５０，５−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌ）ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｓ，２−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌｔｈｉｏｐｈｅｎｅ  ｏｘａｄｉａｚｏｌｅｓ，ＣＩ−９９４，Ｃｈｌａｍｙｄｏｃｉｎ，ＪＨＪ−２６４８１５８５，親電子ケトンから選択される，請求項５−８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願
本出願は，日本特許出願２００８−３０７２８３（２００８年１２月２日出願）に基づく優先権を主張しており，この内容は本明細書に参照として取り込まれる。【０００２】
技術分野
本発明は，癌光化学療法に関する。
【背景技術】
【０００３】
光増感療法は，光増感剤と紫外線とを組み合わせて用いる光化学療法である。その代表的なものであるＰＵＶＡ療法は，ソラレンと長波長紫外線（ＵＶＡ）とを併用する光化学療法であり，これまで，尋常性白斑，乾癬，アトピー性皮膚炎などの皮膚病に高い効果を示し，多く使用されてきた。【０００４】
光増感剤とは，光を吸収して励起され，そのエネルギーを他の物質に移動させて光化学反応を進めることができる物質である。光増感剤の代表例はソラレンである。これは，柑橘類に含まれる成分であり，光治療作用を有する三環の芳香族化合物である。ソラレンは平面構造を有しているため，ピリミジン−プリンが交互に存在する部位，特にＴＡ部位でＤＮＡ中にインターカレートすることができる（Hearst  JE,  Isaacs  ST,  Kanne  D,  et  al.  Q  Rev  Biophys  1984;17:1-44）。ＵＶＡ（３２０−４００ｎｍ）照射の後，インターカレートした複合体は活性化され，細胞ＤＮＡ中でピリミジン塩基に付加体が形成される。反対側の鎖の適当な位置に利用可能なピリミジンが存在する場合には，次に２番目のＵＶＡ光子がその鎖の遊離ソラレン側に結合し，鎖間架橋（Inter-strand  crosslink;  ＩＣＬ）する（Cimino  GD,  Gamper  HB,  Isaacs  ST,  et  al.  Annu  Rev  Biochem  1985;54:1151-93）。【０００５】
染色体ＤＮＡにおけるＰＵＶＡ誘導性のＩＣＬは，皮膚の治療に有用な抗増殖効果を誘導するため，ソラレン＋ＵＶＡ（ＰＵＶＡ）は，いくつかの高増殖性皮膚疾患，例えば，乾癬，および皮膚Ｔ細胞リンパ腫の治療に用いられている（Stern  RS.  N  Engi  J  Med  2007;357:682-90）。ＰＵＶＡが培養細胞株において細胞殺傷効果（アポトーシス）を示したという報告もあるが（Yoo  EK,  Rook  AH,  Elenitsas  R,  et  al.  J  Invest  Dermatol  1996;107:235-42;  Canton  M,  Caffieri  S,  Dall'Acqua  F,  et  al.  PEBS  Lett  2002;522:168-72），抗癌剤や放射線照射と比較して細胞殺傷力があまり強くないため，これまでＰＵＶＡ療法を癌治療に適用することができるとは考えられていなかった。【０００６】
本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書に参照として取り込まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hearst  JE,  Isaacs  ST,  Kanne  D,  et  al.  Q  Rev  Biophys  1984;17:1-44
【非特許文献２】Cimino  GD,  Gamper  HB,  Isaacs  ST,  et  al.  Annu  Rev  Biochem  1985;54:1151-93
【非特許文献３】Stern  RS.  N  Engi  J  Med  2007;357:682-90
【非特許文献４】Yoo  EK,  Rook  AH,  Elenitsas  R,  et  al.  J  Invest  Dermatol  1996;107:235-42
【非特許文献５】Canton  M,  Caffieri  S,  Dall'Acqua  F,  et  al.  PEBS  Lett  2002;522:168-72
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は，ＰＵＶＡ療法の効力を高めることにより，癌の光増感治療法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは，ＨＤＡＣ阻害剤とＰＵＶＡ療法とを併用することにより，非常に強い腫瘍細胞殺傷効果が得られることを見いだした。すなわち本発明は，ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と光増感剤との組み合わせを含む，癌光化学療法に用いるための癌治療剤を提供する。好ましくは癌光化学療法はＰＵＶＡ療法である。好ましくは，ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は，酪酸ナトリウム，バルプロ酸，Ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ／ＶＰ−１０１／ＥＬ−５３２，Ｐｉｖａｎｅｘ／ＡＮ−９，ＯＳＵ−ＨＤＡＣ４２，トリコスタチンＡ，スベロイルアニリドヒドロキサム酸（Ｚｏｌｉｎｚａ／Ｖｏｌｉｎｏｓｔａｔ／ＳＡＨＡ），ＬＡＱ−８２４，Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ／ＬＢＨ−５８９，ＣＲＡ−２４７８１／ＰＣＩ２４７８１，Ｂｅｌｉｎｏｓｔａｔ／ＰＸＤ１０１，Ｔｕｂａｃｉｎ，Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ，ＩＴＦ２３５７，ＳＢ９３９，Ｒ３０６４６５／ＪＮＪ−１６２４１１９９，ＭＳ−２７５／ＳＮＤＸ−２７５／ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ，ＭＧＣＤ−０１０３，Ｐｉｍｅｌｉｃ  ｄｉｐｈｅｎｙｌａｍｉｄｅ，Ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ／ＦＫ２２８／Ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｐｉｃｉｄｉｎ，Ｔｒａｐｏｘｉｎ  Ａ，ＨＣ−Ｔｏｘｉｎ，ＮＣＨ−５１，Ａｌｐｈａ−ｍｅｒｃａｐｔｏｋｅｔｏｎｅ  １９ｙ／ＫＤ５１５０，５−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌ）ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｓ，２−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌｔｈｉｏｐｈｅｎｅ  ｏｘａｄｉａｚｏｌｅｓ，ＣＩ−９９４，Ｃｈｌａｍｙｄｏｃｉｎ，ＪＨＪ−２６４８１５８５，親電子ケトンから選択される。別の態様においては，本発明は，ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を有効成分とする鎖間架橋修復の阻害剤を提供する。【００１０】
別の観点においては，本発明は，光化学療法により癌を治療する方法を提供し，この方法は，患者にヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と光増感剤とを投与した後に，治療すべき部位にＵＶＡを照射することを含む。好ましくは，光増感剤はソラレンである。さらに別の観点においては，本発明は，癌光化学療法を受けている患者において，ＵＶＡ照射により生ずる鎖間架橋の修復を阻害する方法を提供し，この方法は，該患者にヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を投与することを含む。好ましくは，癌光化学療法はＰＵＶＡ療法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明にしたがえば，非常に効率よくかつ短時間で癌細胞を殺傷することが可能であり，新たな癌光増感治療法として有望である。また光照射を行うという点に置いて，がん細胞のみをターゲットとすることができ，正常細胞を障害する心配がないため治療による二次発ガンを防ぐことが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は，メラノーマ細胞をＨＤＡＣ阻害剤で処理した後に，ＰＵＶＡで処理したときの細胞生存率を示す。
【図２】図２は，メラノーマ細胞をＨＤＡＣ阻害剤で処理したときの，ヒストンＨ３のアセチル化状態を示す。
【図３】図３は，Ａ５４９およびＭＣＦ−７細胞をＨＤＡＣ阻害剤で処理した後に，ＰＵＶＡで処理したときの細胞生存率を示す。
【図４】図４はメラノーマ細胞をＨＤＡＣ阻害剤で処理した後に，５−ＭＯＰ＋ＵＶＡで処理したときの細胞生存率を示す。
【図５】図５は，メラノーマ細胞をＨＤＡＣ阻害剤とＰＵＶＡとの組み合わせで処理したときのアポトーシスの誘導を示す。
【図６】図６は，メラノーマ細胞をＨＤＡＣ阻害剤と種々の抗癌剤との組み合わせで処理したときの細胞生存率を示す。
【図７】図７は，メラノーマ細胞をＨＤＡＣ阻害剤で処理した後にＵＶＣを照射したときのＣＰＤの修復速度論を示す。
【図８】図８は，メラノーマ細胞をＨＤＡＣ阻害剤で処理した後にＵＶＣを照射したときの細胞生存率を示す。
【図９】図９は，メラノーマ細胞をＨＤＡＣ阻害剤で処理した後にＨＤＡＣ阻害剤を含まない培地で培養したときの細胞生存率およびヒストンＨ３のアセチル化レベルの経時変化を示す。
【図１０】図１０は，皮膚Ｔ細胞リンパ腫をＨＤＡＣ阻害剤と種々の抗癌剤との組み合わせで処理したときの細胞生存率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者らは，ＨＤＡＣ阻害剤である酪酸ナトリウム（ＳＢ）で処理した細胞において，ＵＶＡと光増感剤である８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）の光増感作用（ＰＵＶＡ）が，高感度に誘導され，さらに抗癌剤に耐性を示すヒトメラノーマ細胞，皮膚扁平上皮癌細胞，乳がん細胞，肺上皮がん細胞，皮膚  T  細胞性リンパ腫において効果的に細胞死（アポトーシス）を誘導することを見いだし，そのメカニズムを明らかにした。
【００１４】
ＤＮＡは４種類のコアヒストンからなるヒストン八量体に巻き付き，クロマチン構造を形成している。ヒストンのアセチル化は，そのレベルがヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）とヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）とによって調節されている。ＨＡＴによりアセチル化されたヒストンは，凝集したクロマチン構造をほどき，種々の分子がＤＮＡに接近できるようになるため，遺伝子の転写が活性化される。
【００１５】
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤は，固形癌および血液悪性腫瘍を治療するための有望な新しい種類の抗腫瘍剤として注目されている（Marks  PA,  Miller  T,  Richon  VM.  Curr  Opin  Pharmacol  2003;3:344-51;  Marks  PA,  Richon  VM,  Miller  T,  et  al.  Adv  Cancer  Res  2004;91:137-68;  Mai  A,  Massa  S,  Rotili  D,  et  al.  Med  Res  Rev  2005;25:261-309）。ＨＤＡＣは，アミノ末端残基からアセチル基を除去することにより，コアヌクレオソームヒストンのアセチル化状態を制御する酵素である。ＨＤＡＣを阻害すると，ヒストンアセチルトランスフェラーゼの作用によりアセチル化ヒストンが蓄積する。これは，ヒストン−ＤＮＡ相互作用を弱め，その結果転写因子のＤＮＡへのアクセス可能性が増加し，細胞サイクル，分化およびアポトーシスの制御に関与するいくつかの蛋白質群の発現の変化を引き起こす（Marks  PA,  Richon  VM,  Rifkind  RA.  J  Nad  Cancer  Inst  2000,92:1210-6）。例えば，プロ−アポトーシス因子（例えば，Ｂａｋ，Ｂａｘ，およびＢｉｍ）およびアンチ−アポトーシス因子（例えば，Ｂｃｌ−２，Ｂｃｌ−ＸＬ，ＸＩＡＰ，およびＭｃｌ−１）は，ＨＤＡＣ阻害剤によりそれぞれアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされ，抗腫瘍活性において重要な役割を果たしていると考えられている（Zhang  XD,  Gillespie  SK,  Borrow  JM,  et  al.  Mol  Cancer  Ther  2004;3:425-35）。
【００１６】
また，ＨＤＡＣ阻害剤を放射線や抗癌剤と組み合わせて用いて癌を治療することが注目されている（Karagiannis  TC,  El-Osta  A.  Cell  Cycle  2006:5:288-95;  Camphausen  K,  Tofilon  PJ.  J  Clin  Oncol  2007;25:4051-6）。種々のＨＤＡＣ阻害剤（酪酸ナトリウム（ＳＢ），トリコスタチンＡ（ＴＳＡ），スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ），バルプロ酸等）によって，放射線照射および抗癌剤の細胞殺傷効果が増強されることが報告されている。しかし，その分子メカニズムは完全には解明されていない。
【００１７】
本発明者らは，最も広く研究されているＨＤＡＣ阻害剤である酪酸ナトリウム（ＳＢ）とトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）が，皮膚悪性メラノーマ細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２８，Ｇ−３６１，皮膚扁平上皮癌細胞ＨＳＣ−１，乳がん細胞ＭＣＦ−７，肺上皮がん細胞Ａ５４９，皮膚Ｔ細胞リンパ腫ＨＨ，ＨＵＴ−７８において，ＰＵＶＡのアポトーシス細胞殺傷効果を顕著に増強しうることを見いだした。下記の実施例に示されるように，ＰＵＶＡまたはＳＢ単独による処理は，ＳＫ−ＭＥＬ−２８の細胞生存率にほとんど影響を及ぼさなかったが，ＳＢとＰＵＶＡとの組み合わせ処理は２４時間以内に顕著にアポトーシスを誘導した。ＳＢにより誘導された細胞殺傷効果の増強の程度は，抗癌剤との組み合わせより，ＰＵＶＡとの組み合わせにおいてはるかに高かった。また，皮膚Ｔ細胞リンパ腫ＨＨ，ＨＵＴ−７８に対する細胞殺傷効果の増強の程度も，抗癌剤との組み合わせより，ＰＵＶＡとの組み合わせにおいてはるかに高かった。これらはＨＤＡＣ阻害剤がＴＳＡでも同様であった。染色体ＤＮＡにおけるＰＵＶＡ誘導性鎖間架橋（ＩＣＬ）の修復過程で形成された二本鎖切断の数は，ＳＢで前処理した細胞において有意に減少しており，このことから，ＩＣＬを修復する能力がＳＢにより低下したことが示唆される。
【００１８】
ＰＵＶＡにより生成するソラレン鎖間架橋（ＩＣＬ）の修復には，ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）や相同組換修復等，複数の修復経路が関与していることが知られている。特にヌクレオチド除去修復は，ＩＣＬ損傷の認識および損傷部位の切り出しなど，ＩＣＬ修復の初期段階で関与することが報告されている。本発明においては，ＰＵＶＡ処理後のＩＣＬの除去におけるヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）に伴う，ブロモデオキシウリジンの取り込みおよび増殖細胞の核抗原（ＰＣＮＡ）の修復フォーカスの形成は，ＳＢで前処理した細胞においては観察されなかった。これは，ＳＢがＤＮＡ修復，特にヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）を低下させ，これがＰＵＶＡの増強された細胞殺傷効果に寄与することを示す。また，ＵＶ誘導性シクロブタンピリミジンダイマー（ＮＥＲにより修復される光傷害としてよく知られる）の修復速度は，ＳＢで前処理した細胞においては未処理細胞と比べてはるかに遅かった。この結果は，紫外線照射(UVC)によって誘導されたDNA損傷の修復がＳＢにより促進されるという先の報告（Smerdon  et  al.,  J.  Biol.  Chem.,  1982;257(22),  13441-13447;  Ramanathan  and  Smerdon,  J.  Biol.  Chem.,  1989;264(19),  10026-11034）とは逆の結果を示している。上記の論文が主張するように，紫外線(UVC)が誘導するDNA損傷の修復がSB作用により促進するのであれば，紫外線照射とSBを併作用した後の細胞生存率は回復するはずであるが，そのような事象は一切観察されなかった(図８)。したがって，本発明において見いだされた現象は，本発明者らによる驚くべき発見である。
【００１９】
いかなる理論にも拘束されることを意図するものではないが，本発明者らは現在のところ，本発明によって得られる細胞死亢進のメカニズムは，ＨＤＡＣ阻害剤の前処理により，ＩＣＬ修復経路，特にヌクレオチド除去修復が阻害され，ＤＮＡ損傷（ＩＣＬ）が修復できなかった結果，効果的にアポトーシスが誘導されたためと考えている。
【００２０】
本発明の癌治療剤の有効成分として用いられるＨＤＡＣ阻害剤としては，ヒストン脱アセチル化酵素を阻害するものであればいずれの物質を用いてもよく，例えば，酪酸ナトリウム，バルプロ酸，Ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ／ＶＰ−１０１／ＥＬ−５３２，Ｐｉｖａｎｅｘ／ＡＮ−９，ＯＳＵ−ＨＤＡＣ４２，トリコスタチンＡ，スベロイルアニリドヒドロキサム酸（Ｚｏｌｉｎｚａ／Ｖｏｌｉｎｏｓｔａｔ／ＳＡＨＡ），ＬＡＱ−８２４，Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ／ＬＢＨ−５８９，ＣＲＡ−２４７８１／ＰＣＩ２４７８１，Ｂｅｌｉｎｏｓｔａｔ／ＰＸＤ１０１，Ｔｕｂａｃｉｎ，Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ，ＩＴＦ２３５７，ＳＢ９３９，Ｒ３０６４６５／ＪＮＪ−１６２４１１９９，ＭＳ−２７５／ＳＮＤＸ−２７５／ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ，ＭＧＣＤ−０１０３，Ｐｉｍｅｌｉｃ  ｄｉｐｈｅｎｙｌａｍｉｄｅ，Ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ／ＦＫ２２８／Ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｐｉｃｉｄｉｎ，Ｔｒａｐｏｘｉｎ  Ａ，ＨＣ−Ｔｏｘｉｎ，ＮＣＨ−５１，Ａｌｐｈａ−ｍｅｒｃａｐｔｏｋｅｔｏｎｅ  １９ｙ／ＫＤ５１５０，５−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌ）ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｓ，２−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌｔｈｉｏｐｈｅｎｅ  ｏｘａｄｉａｚｏｌｅｓ，ＣＩ−９９４，Ｃｈｌａｍｙｄｏｃｉｎ，ＪＨＪ−２６４８１５８５，親電子ケトン等を用いることができる。好ましくは，ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は，酪酸ナトリウム，トリコスタチンＡ（ＴＳＡ），スベロイルアニリドヒドロキサム酸（Ｚｏｌｉｎｚａ／Ｖｏｌｉｎｏｓｔａｔ／ＳＡＨＡ），バルプロ酸，Ｂｅｌｉｎｏｓｔａｔ／ＰＸＤ１０１，ＩＴＦ２３５７，ＣＲＡ−２４７８１／ＰＣＩ２４７８１，Ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ／ＦＫ２２８／Ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ，Ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ／ＶＰ−１０１／ＥＬ−５３２，Ｐｉｖａｎｅｘ／ＡＮ−９，ＳＢ９３９，ＭＳ−２７５／ＳＮＤＸ−２７５／ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ，ＭＧＣＤ−０１０３，ＪＨＪ−２６４８１５８５である。これらの物質はすべて，市販されているか，またはその構造が知られており，当業者であれば容易に製造することができる。
【００２１】
本発明の癌治療剤の有効成分として用いられる光増感剤としては，例えば，ソラレンおよびその誘導体が挙げられる。ソラレンおよびその誘導体は，下記の一般式：
【化１】
2010064422.tif 000003
［式中，各Ｒは独立して，水素またはＣ１−６のアルキル基もしくはアルコキシ基を表す］
で表すことができる。特に好ましいものは，８−メトキシソラレン（メソキサレン），５−メトキシソラレンおよびトリメチルソラレン（トリオキサレン）である。これらの光増感剤は，市販されているか，または当業者であれば容易に製造することができる。
【００２２】
本発明の癌治療剤は，当業者に公知の方法で製剤化することができる。例えば，ＨＤＡＣ阻害剤または光増感剤を，薬学的に許容しうる担体もしくは媒体，具体的には，滅菌水や生理食塩水，植物油，乳化剤，懸濁剤，界面活性剤，安定剤，香味剤，賦形剤，ベヒクル，防腐剤，結合剤などと適宜組み合わせて，一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。ＨＤＡＣ阻害剤と光増感剤とは別々のパッケージとして提供してもよく，あるいはこれらを組み合わせたキットとして提供してもよい。
【００２３】
本発明の癌治療剤は，経口または非経口投与により全身に投与してもよく，局所的に投与してもよい。本発明の癌治療剤をＰＵＶＡ療法において用いる場合，ＨＤＡＣ阻害剤および光増感剤を経口または非経口投与により投与した後に，治療すべき部位にＵＶＡを照射することができる。また，治療すべき部位にＨＤＡＣ阻害剤および光増感剤を塗布するか，ＨＤＡＣ阻害剤および光増感剤の水溶液に治療すべき部位を浸漬した後，ＵＶＡを照射してもよい。あるいは，ＵＶＡを照射する前に，ＨＤＡＣ阻害剤を全身投与し光増感剤を局所投与してもよく，逆に光増感剤を全身投与しＨＤＡＣ阻害剤を局所投与してもよい。あるいはまた，ＨＤＡＣ阻害剤および光増感剤を経口または非経口投与により投与した後に，患者から血液を取り出してＵＶＡを照射，またはＨＤＡＣ阻害剤を経口または非経口投与により投与した後に，患者から血液を取り出してＰＵＶＡ処理した後に，その血液を患者に戻してもよい。
【００２４】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書に参照として取り込まれる。
【実施例】
【００２５】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００２６】
材料および方法
（１）細胞および細胞培養条件
悪性の色素性メラノーマに由来する細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２８及びG−３６１はＴｈｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｂａｎｋ（Ｊａｐａｎ）から購入した。扁平上皮癌細胞ＨＳＣ−１は理研Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋより購入した。ヒト皮膚Ｔ細胞リンパ腫であるＨＵＴ７８及びＨＨはそれぞれ理研Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）より購入した。細胞は，１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１００ユニット／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを補充した各細胞に適切な培地（ＭＥＭ，  ＤＭＥＭ，  ＲＰＭＩ）で，３７℃で５％ＣＯ２下で維持した。【００２７】
（２）ＳＢとＰＵＶＡの組み合わせによるメラノーマの処理
ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞をＳＢ（０．１−３ｍＭ）を含む培地中で８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ：１０−７−１０−５Ｍ）とともに所定の時間培養し，培地をＳＢフリーＭＥＭに交換した直後にＵＶＡ（１−５Ｊ／ｃｍ２）を照射した。サンプルレベルでの紫外線照射強度は約１．５ｍＷ／ｃｍ２であり，５Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡ照射には約１時間を要した。【００２８】
（３）生存率アッセイ
細胞生存率は，フルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）（Ｗａｋｏ，Ｊａｐａｎ）の代謝により評価した。ＦＤＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳに細胞を懸濁し，３７℃で１５分間インキュベーションした。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１０μｇ／ｍｌ）を加えた後，フローサイトメータ（ＦＣＭ）（Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ；Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて蛍光強度を測定した。ＦＤＡおよびＰＩによる二重染色により，細胞を３つの集団に分けた：（ｉ）生存細胞（ＦＤＡ＋，ＰＩ−），（ｉｉ）死細胞（ＦＤＡ−，ＰＩ＋），および（ｉｉｉ）アポトーシスを生じている細胞（ＦＤＡ−，ＰＩ−）。ＦＤＡとＰＩとの二重染色によるアポトーシスの評価は，アネキシンＶ染色（高度に特異的なアポトーシスの指標）を用いる評価と同等である。【００２９】
（４）アポトーシスアッセイ
アポトーシスは，ＤＮＡ結合蛍光団であるＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色してクロマチンの形態学的変化を検出し，ＰＩによりアポトーシス核（ｓｕｂ−Ｇ１画分）のパーセンテージを測定することにより判定した。カスパーゼ−３活性は酵素の蛍光基質（Ａｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＭＣＡ）を用いて測定した。【００３０】
（５）ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）の検出
ＤＳＢは，バイアス正弦電場ゲル電気泳動（ＢＳＦＧＥ）システム（ＡＴＴＯ，Ｊａｐａｎ）を用いて検出した。細胞を処理直後に１％低融点アガロースに懸濁し，固化させた。アガロースのプラグを０．５ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼＫおよび１ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡで処理し，０．８％アガロースゲルで電気泳動した。臭化エチジウムでゲルを染色し，撮影した。【００３１】
（６）ＤＮＡ修復合成（ＤＲＳ）アッセイ
細胞を６０ｍｍディッシュまたは３５ｍｍガラスディッシュでコンフルエントまで成長させ，血清枯渇ＭＥＭ中でさらに２４時間培養した。これを０．５％ＦＢＳを含むＭＥＭ中でＳＢ（３ｍＭ）で２４時間処理した。次に，ＰＵＶＡ処理を行い，細胞をブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（１０μＭ）とともに所定時間（ＰＵＶＡ処理後０−３０，３０−６０，６０−９０，９０−１２０分間）インキュベーションした。【００３２】
フローサイトメトリ分析のためには，エタノール（７０％）で固定した細胞を２Ｎ  ＨＣｌで室温で１５分間処理した。１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした後，ＢｒｄＵに対する一次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１：２００）とともに，次にフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とコンジュゲートした二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（１：２００）とともに，インキュベートした。各修復期間の間のＢｒｄＵの取り込みに基づくＦＩＴＣの強度の増加をフローサイトメーターを用いて分析した。【００３３】
免疫蛍光顕微鏡観察のためには，４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した細胞を０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳに４℃で３分間浸漬し，２Ｎ  ＨＣｌで処理した。なお，このＤＮＡ変性の工程はＢｒｄＵ取り込みの実験の場合にのみ行い，増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の修復フォーカスの検出では行わなかった。１％ＢＳＡでブロッキングした後，ＢｒｄＵ（１：２００）またはＰＣＮＡに対する一次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１：２００）とともに，次にＦＩＴＣとコンジュゲートした二次抗体（１：２００）とともに，インキュベートした。核はＰＩ（２０μｇ／ｍｌ）で染色した。画像はレーザースキャン共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で取得した。【００３４】
（７）シクロブタンピリミジンダイマー（ＣＰＤ）の修復速度論の測定
ＣＰＤのインサイチュー検出のためには，３５ｍｍガラス底ディッシュで培養した細胞をＳＢ（３ｍＭ）で２４時間処理し，ポリカーボネートＩＳＯＰＯＲＥメンブレンフィルター（孔サイズ：３μｍ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通してＵＶＣ（０．０２Ｊ／ｃｍ２）を照射した（主放出波長２５４ｎｍ）（ＡＴＴＯ，Ｊａｐａｎ）。照射後，ＳＢフリーＭＥＭで所定の時間（０−２４時間）インキュベートして，光傷害を修復させた。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し，ＰＢＳ中０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で処理し，２Ｎ  ＨＣｌで処理した。１％ＢＳＡでブロッキングした後，ＣＰＤに対する一次抗体（１：１５００）（Ｍｅｄｉｃａｌ＆Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｊａｐａｎ）とともに，次にＦＩＴＣとコンジュゲートした二次抗体とともに，インキュベートした。核はＰＩで染色した（２０μｇ／ｍｌ）。画像はレーザースキャン共焦点顕微鏡で取得した。【００３５】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるＣＰＤの検出のためには，細胞をＳＢ（３ｍＭ）で２４時間処理し，ＵＶＣ（０．００２Ｊ／ｃｍ２）を照射した。ＳＢフリーＭＥＭで２４時間インキュベーションした後，ゲノムＤＮＡを抽出し，１５分間煮沸することにより変性させた。硫酸プロタミン（０．００３％）を予めコーティングしたポリ塩化ビニル９６ウエルプレートにＤＮＡ（ｌμｇ／ウエル）を加えた。【００３６】
ＰＢＳ中２％ＦＢＳでブロッキングした後，サンプルを，抗ＣＰＤに対する一次抗体（１：２０００）とともに，次に抗マウスＩｇＧのビオチン−Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｚｙｍｅｄ）（１：２０００）とともに，インキュベートした。次に，０．０２％Ｈ２Ｏ２の存在下でｏ−フェニレンジアミン（０．４ｍｇ／ｍｌ）を用いてペルオキシダーゼ反応を行った。Ｈ２ＳＯ４（２Ｍ）を加えることにより反応を停止し，分光光度計で４９２ｎｍの吸光度を測定した。【００３７】
（８）統計学
値は平均±ＳＤ（ｎ＝３−４）で表す。データは一元配置ＡＮＯＶＡにより分析し，群間の比較はダネットｔ検定により行った。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，および＊＊＊ｐ＜０．００１である場合に，統計学的に有意であるとみなした。【００３８】
結果
（１）酪酸ナトリウム（ＳＢ）はＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞において，ＰＵＶＡの細胞殺傷効果を増強する。
ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞をＳＢ（０．１−３ｍＭ）で所定時間（４−２４時間）処理した後，細胞をＰＵＶＡ（８−ＭＯＰ：１０−７−１０−５Ｍ，ＵＶＡ：１−５Ｊ／ｃｍ２）で処理し，ＦＤＡアッセイにより細胞生存率を測定した。図１Ａは，ＰＵＶＡ処理の２４時間後にＦＤＡアッセイにより測定した細胞生存率を示す。ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞はＰＵＶＡ処理に対して高い耐性を示した。ＳＢ−ＰＵＶＡ処理は劇的な細胞死を誘導し，その程度は，ＳＢの用量，ＳＢ処理時間，８−ＭＯＰの用量およびＵＶＡの用量に依存していた。ＳＢ（３ｍＭ）−ＰＵＶＡ（８−ＭＯＰ：１０−５Ｍ，ＵＶＡ：５Ｊ／ｃｍ２）処理の後の細胞生存率の経時変化を調べたところ，生存率は８から２４時間で急速に低下した（図１Ｂ）。なお，細胞を逆の順番で（最初にＰＵＶＡで，次にＳＢで）処理した場合には相乗効果は認められなかった。【００３９】
次に，別のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるＴＳＡ（０．１−１０μＭ）で２４時間前処理した細胞をＰＵＶＡ処理し（８−ＭＯＰ：１０−５Ｍ，ＵＶＡ：５Ｊ／ｃｍ２），２４時間後に細胞生存率を測定した。ＴＳＡもＳＢと同様にＰＵＶＡの細胞殺傷効果を増強した（図１Ｃ）。また，ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞以外のメラノーマ細胞Ｇ−３６１，扁平上皮癌細胞ＨＳＣ−１でも同様の効果が認められた。（図１Ｄ）。【００４０】
ＳＢ処理したときの，ヒストンＨ３のアセチル化状態を調べた。細胞をＳＢ（０．１−３ｍＭ）で所定時間（４−２４時間）処理し，５００μｌの氷冷溶解バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５０ｍＭ  亜硫酸水素ナトリウム，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，８．６％ショ糖，ｐＨ６．５）に懸濁した。ホモジナイズした後，２，０００ｇで５分間遠心分離して核を集め，溶解バッファーで２回，ＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１３ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）で１回洗浄した。ペレットを１５０μｌのＨＣｌ（０．２５Ｎ）に懸濁し，氷上で少なくとも１時間インキュベートした。１２，０００ｇで５分間遠心分離した後，上清を１．２ｍｌのアセトンと混合した。４℃で一晩インキュベートした後，１２，０００ｇで５分間遠心分離して凝集した物質を回収し，風乾した。この酸可溶性ヒストン画分を３０μｌのＨ２Ｏに溶解し，約２０μｇの蛋白質を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ヒストンＨ３のアセチル化状態は抗アセチル−ヒストンＨ３（ＵＰＳＴＡＴＥ）を用いるウエスタンブロットにより確認した。【００４１】
結果を図２に示す。ＳＢ処理によってアセチル化ヒストンＨ３のレベルは増加し，その程度は，（Ａ）ＳＢ用量，および（Ｂ）処理時間に依存していた。なお，ＳＢの代わりにＴＳＡで処理した場合も，ヒストンＨ３のアセチル化状態のパターンはほぼ同じであった。【００４２】
ヒト乳腺癌細胞（ＭＣＦ−７），およびヒト肺腺癌上皮細胞（Ａ５４９）に，図１Ａと同様にしてＳＢ−ＰＵＶＡ処理を行った。簡単には，細胞をＳＢ（３ｍＭ）で２４時間処理し，次にＰＵＶＡ処理（８−ＭＯＰ：１０−７−１０−５Ｍ，ＵＶＡ：５Ｊ／ｃｍ２）を行った。処理の２４時間後の細胞生存率をＦＤＡアッセイにより評価した。ＰＵＶＡ処理のみの後の細胞死はわずかであったが，ＳＢで前処理するとＰＵＶＡの細胞殺傷効果が有意に増強され，ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞について得られた結果（図１Ａ）と一致していた（図３）。すなわち，ＳＢ−ＰＵＶＡ処理は，ヒト乳腺癌細胞ＭＣＰ−７およびヒト肺腺癌上皮細胞Ａ５４９も有効に殺傷することができた。【００４３】
ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞をＳＢ（３ｍＭ）で２４時間処理し，８−ＭＯＰの位置異性体である５−メトキシソラレン（５−ＭＯＰ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｅｈ）（１０−７−１０−５Ｍ）を用いて，上述と同様にしてＵＶＡ（５Ｊ／ｃｍ２）による処理を行った。処理の２４時間後の細胞生存率をＦＤＡアッセイにより評価した。５−ＭＯＰ＋ＵＶＡの細胞殺傷効果は，ＳＢで前処理を行うことにより有意に増強された（図４）。すなわち，ＳＢによる前処理は，５−メトキシソラレン＋ＵＶＡにより誘導される細胞毒性を顕著に増加させた。これらの結果は，ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤による前処理はＰＵＶＡによる細胞死を有効に誘導することを示す。【００４４】
（２）ＳＢとＰＵＶＡとの組み合わせ処理はＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞においてアポトーシスを誘導する
ＳＢとＰＵＶＡとの組み合わせ処理によるＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞におけるアポトーシスの誘導を調べた。ＳＢ（３ｍＭ）で２４時間前処理した細胞をＰＵＶＡ（８−ＭＯＰ：１０−５Ｍ，ＵＶＡ：５Ｊ／ｃｍ２）処理し，さらに所定時間（４−２４時間）インキュベートした。各時間におけるアポトーシスの誘導を，ＦＤＡとＰＩとの二重染色によるフローサイトメトリ分析（図５Ａ），ｓｕｂ−Ｇ１画分の検出（図５Ｂ），Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８を用いるアポトーシス細胞の形態学的評価（図５Ｃ），および蛍光基質を用いるカスパーゼ−３活性の測定（図５Ｄ）に基づいて評価した（＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。【００４５】
図５に示されるように，ＳＢ−ＰＵＶＡで処理した後，ＦＤＡ（＋）ＰＩ（−）区画の細胞集団は，時間依存的にＦＤＡ（−）ＰＩ（−）を経てＦＤＡ（−）ＰＩ（＋）に移動した。ｓｕｂ−Ｇ１画分の時間依存的増加も認められた。クロマチン凝縮細胞は，ＳＢ−ＰＵＶＡ処理の後，時間依存的にその数が増加したが，ＵＶＡ単独による処理またはＳＢ−ＵＶＡ処理の後には増加しなかった。カスパーゼ−３の活性化は処理後８から１６時間の間に観察された。さらに，総カスパーゼ阻害剤であるｚ−ｖａｄ−ｆｍｋは，ＳＢ−ＰＵＶＡ処理により誘導される細胞死を明らかに軽減した。これらの結果は，ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞においてＳＢ−ＰＵＶＡ処理が典型的なカスパーゼ依存性アポトーシスを有効に誘導したことを示す。【００４６】
（３）ＳＢとＰＵＶＡとの組み合わせ処理による細胞殺傷効果の増強は，ＳＢと抗癌剤との組み合わせより劇的である。
ＳＢ（３ｍＭ）とともに２４時間前培養した細胞を，種々の抗癌剤（ブレオマイシン，エトポシド，アドリアマイシン，５−フルオロウラシル，パクリタキセル，およびビンクリスチン）で２４時間処理した。ここで用いた抗癌剤の用量範囲は文献の記載に基づく（Kim  MS,  Blake  M,  Baek  JH,  et  al.  Cancer  Res  2003;63:7291-300;  Dowdy  SC,  Jiang  S,  Zhou  XC,  et  al.  Mol  Cancer  Ther  2006,5:2767-76;  Sonnemann  J,  Kumar  KS,  Heesch  S,  et  al.  Int  J  Oncol  2006;28:755-66;  Dong  YB,  Yang  HL,  Elliott  MJ,  et  al.  Cancer  Res  2002;62:1776-83）。細胞生存率はＦＤＡアッセイにより測定した。【００４７】
結果を図６に示す。いずれの場合も，ＳＢと抗癌剤との組み合わせ処理により，抗癌剤単独による処理と比較して細胞毒性が増加したが，ＳＢとＰＵＶＡによる処理の細胞殺傷効果は，ＳＢと抗癌剤との組み合わせ処理よりはるかに高かった。これらの結果は，ＳＢとＰＵＶＡの組み合わせによる細胞殺傷効果の増強は，アポトーシスの誘導の促進だけでは説明できないことを示す。【００４８】
（４）ＳＢはＰＵＶＡ処理により形成されるＤＮＡ２本鎖切断（ＤＳＢ）の数を減少させる。
ＰＵＶＡ処理により誘導されるＤＮＡ損傷は主としてソラレン鎖間架橋（ＩＣＬ）によるものであり，これがＰＵＶＡにより誘導される細胞殺傷効果の主な原因であると思われる。すなわち，ＳＢがソラレンＩＣＬの修復効率を低下させ，これが有意な細胞死につながったと考えられる。ＤＮＡの２本鎖切断（ＤＳＢ）はソラレンＩＣＬの細胞修復において中間体として生ずることが報告されている（Dronkert  ML,  Kanaar  R.  Mutat  Res  2001;486:217-47）。ＰＵＶＡまたはＳＢ−ＰＵＶＡによる処理後のＤＳＢの形成の程度を，ＩＣＬの修復の効率の指標としてＢＳＦＧＥを用いて調べた。【００４９】
ＳＢ（０．５−３ｍＭ）で２−２４時間前処理した細胞を，ＰＵＶＡ処理し（８−ＭＯＰ：１０−５Ｍ，ＵＶＡ：５Ｊ／ｃｍ２），ＰＵＶＡ処理した直後に，ＢＳＦＧＥによりＤＳＢを検出したところ，明確なＤＳＢが観察された。ＳＢによる前処理は，生成するＤＳＢの数を減少させ，その程度はＳＢ前処理の用量および時間に依存していた。また，ＴＳＡ（０．１−３０μＭ）で２４時間前処理した細胞をＰＵＶＡ処理した（８−ＭＯＰ：１０−５Ｍ，ＵＶＡ：５Ｊ／ｃｍ２）場合にも，ＰＵＶＡによる処理の後のＤＳＢの生成は用量依存的様式で低下した。一方，ＳＢ（３ｍＭ）で２４時間前処理した細胞をさらに，ＳＢフリー培地中で０−２４時間培養し，次にＰＵＶＡ処理（８−ＭＯＰ：１０−５Ｍ，ＵＶＡ：５Ｊ／ｃｍ２）を行った。その結果，ＳＢフリー培地で培養した時間の長さにしたがって，ＳＢにより低下したＤＳＢの形成は，ＰＵＶＡにより誘導された元のレベルまで回復した。これらの結果は，ＳＢがＰＵＶＡにより誘導されるＩＣＬの修復を低下させることを示す。【００５０】
（５）ＳＢはＰＵＶＡ処理後にＤＮＡ修復合成（ＤＲＳ）を低下させる。
ソラレンＩＣＬの除去にはヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）経路が関与していることが提唱されている（Dronkert  ML,  Kanaar  R.  上掲）。ＰＵＶＡ処理後のＳＢ処理細胞におけるＮＥＲの能力をＤＲＳアッセイにより測定した。０．５％ＦＢＳを含有するＭＥＭ中でＳＢ（３ｍＭ）で２４時間処理した細胞をＰＵＶＡ処理した（８−ＭＯＰ：１０−５Ｍ，ＵＶＡ：５Ｊ／ｃｍ２または８−ＭＯＰ：１０−４Ｍ，ＵＶＡ：１Ｊ／ｃｍ２）。次に，ＢｒｄＵ（１０μＭ）とともに示される時間（ＰＵＶＡ処理後０−３０，３０−６０，６０−９０，および９０−１２０分間）インキュベートした。フローサイトメトリを用いて，取り込まれたＢｒｄＵによる蛍光強度を測定した。【００５１】
その結果，取り込まれたＢｒｄＵからの蛍光の強度は，調べたすべての時間（０−２ｈ）について，ＰＵＶＡ処理細胞において未処理細胞より有意に高かった。なお，蛍光強度の増加の程度はＢｒｄＵ標識時間によって大きく相違しなかった。一方，細胞をＳＢで前処理した場合には，ＰＵＶＡ処理後の蛍光の増加は認められなかった。さらに，免疫蛍光顕微鏡でＰＣＮＡの修復フォーカスを調べた。０．５％ＦＢＳを含むＭＥＭ中でＳＢ（３ｍＭ）で２４時間前処理した細胞をＰＵＶＡ処理した（８−ＭＯＰ：１０−５Ｍ，ＵＶＡ：５Ｊ／ｃｍ２）。１時間培養した後，細胞を固定した。核中で，ＰＵＶＡ処理後のＤＲＳに起因するＢｒｄＵの明確なフォーカスを検出することができた。しかし，このようなフォーカスは，ＳＢで前処理した細胞をＰＵＶＡ処理した場合にはほとんど検出することができなかった。これらの結果は，ＳＢによりＮＥＲによりソラレンＩＣＬが除去される能力が低下したことを示す。【００５２】
（６）ＳＢはＵＶＣ照射により形成されたシクロブタンピリミジンダイマー（ＣＰＤ）の修復速度を低下させる。
ＳＢがＮＥＲを低下させたことをさらに確認するために，局所ＵＶＣ暴露により形成されたＣＰＤの修復の速度論を調べた。ＳＢ（３ｍＭ）で２４時間処理した細胞をポリカーボネートＩＳＯＰＯＲＥメンブレンフィルターを通してＵＶＣ（０．０２Ｊ／ｃｍ２）で部分的に照射した。示される時間（０−２４時間）インキュベートした後，細胞を固定した。その結果，ＳＢ前処理細胞および未処理細胞のいずれにおいても，照射の直後（０ｈ）に高い蛍光強度を有する明確なＣＰＤフォーカスが検出された（図７Ａ）。ＳＢによる前処理を行わない場合には，蛍光は弱まり，処理の２４時間後にはＣＰＤフォーカスの輪郭は曖昧になった。一方，ＳＢ前処理細胞では明白なＣＰＤフォーカスがなお検出された。【００５３】
明確な外形および高い蛍光強度の両方を有するＣＰＤフォーカスを有する細胞はＣＰＤ陽性とみなした（図７Ｂ，図中，＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。ＣＰＤ陽性細胞は，修復時間とともに，ＳＢ未処理細胞ではＳＢ前処理細胞より急速に減少した。ＵＶ照射の２４時間後，未処理細胞の約１５％およびＳＢ前処理細胞の６０％がＣＰＤ陽性であった。次に，ＳＢ（３ｍＭ）で２４時間処理した細胞にＵＶＣ（０．００２Ｊ／ｃｍ２，メンブレンフィルターなし）を照射した。２４時間培養した後，ゲノムＤＮＡ中のＣＰＤの量をＥＬＩＳＡにより調べた。ＣＰＤレベルは，ＳＢ前処理細胞について未処理細胞より有意に高かった（図７Ｃ）。つまり，ＳＢ前処理細胞では，ＵＶＣ照射により誘導されるＣＰＤ（ＮＥＲにより修復される光傷害としてよく知られる）の修復がより遅かった。これらの結果は，ＳＢがＮＥＲの能力を低下させるという仮説をさらに裏付けるものである。【００５４】
次に，ＳＢ前処理とＵＶＣの組み合わせの効果を調べた。ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞をＳＢ（３ｍＭ）で２４時間処理した。次に，ＵＶＣ（０．００５−０．０２５Ｊ／ｃｍ２，メンブレンフィルターなし）を照射した。処理の２４時間後の細胞生存率をＦＤＡ取り込みアッセイにより評価した。結果を図８に示す。ＵＶＣ照射は用量依存的様式で細胞生存率を低下させた。すなわち，ＳＢによる前処理は，ＵＶＣにより誘導される細胞死を顕著に増強した。さらに，ＳＢ前処理により増強されたＵＶＣ誘導性細胞死およびＰＵＶＡ誘導性細胞死は，ＸＰＡ（ＮＥＲに必須の蛋白質）を発現する細胞株においてＸＰＡを欠失した同系株におけるより顕著であった。これらの結果は，ＳＢがＤＮＡ修復，特にＮＥＲ経路を低下させるという我々の仮説をさらに裏付ける。【００５５】
上述したように，ＩＣＬの修復の間のＤＳＢの生成はＳＢにより低下するが，ＳＢで処理した後にＳＢフリー培地でインキュベートすると，時間とともに回復する。このことは，ＮＥＲに対する能力が回復したことを示唆する。そこで，次にＳＢ処理の効果が可逆的であるかどうかを調べた。ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞をＳＢ（３ｍＭ）で２４時間処理し，ＳＢフリー培地で所定時間さらに培養した。次に，ＰＵＶＡ処理（８−ＭＯＰ：１０−５Ｍ，ＵＶＡ：５Ｊ／ｃｍ２）を行い，処理の２４時間後の細胞生存率をFＤＡアッセイにより評価した。ＳＢ処理の２４時間後に細胞をＰＵＶＡ処理すると，劇的な細胞死が誘導された。しかし，ＰＵＶＡ処理の前にＳＢフリー培地で培養すると，細胞は徐々にＰＵＶＡに対して耐性となった（図９）。このことは，ＳＢによるＮＥＲの能力の低下は可逆的であることを示す。【００５６】
次に，ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞をＳＢ（３ｍＭ）で２４時間処理し，ＳＢフリー培地で所定時間さらに培養した。ヒストンＨ３のアセチル化状態をウエスタンブロット分析により調べたところ，ＳＢで２４時間処理した直後の高度にアセチル化されたヒストンＨ３は，時間に依存して低下し，ヒストンＨ３のアセチル化レベルは生存率とよく相関していた。【００５７】
皮膚Ｔ細胞リンパ腫細胞ＨＨとＨＵＴ７８をＨＤＡＣ阻害剤で処理した後に，ＰＵＶＡで処理または抗がん剤処理したときの細胞生存率を示す（図１０）。これらの細胞でもＨＤＡＣ阻害剤と抗がん剤処理の組み合わせにくらべＰＵＶＡとの組み合わせが高い抗癌効果を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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