(57)【要約】  本発明は、バナジウム含有化合物と、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムと、を有効成分として含む、糖消費促進剤及び／又は糖代謝促進剤を提供する。また、本発明は、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムを有効成分として含む、糖消費促進剤及び／又は糖代謝促進剤を提供する。
2019066017.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バナジウム含有化合物と、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムと、を有効成分として含む、糖消費促進剤。
【請求項２】
バナジウム含有化合物と併用するための、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムを有効成分として含む、糖消費促進剤。
【請求項３】
炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムを有効成分として含む糖消費促進剤。
【請求項４】
水溶液である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖消費促進剤。
【請求項５】
０．１〜５ｇ／Ｌの炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖消費促進剤。
【請求項６】
１００〜２０００μｇ／Ｌのバナジウム含有化合物を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の糖消費促進剤。
【請求項７】
バナジウム含有化合物と炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムの含有量の比（炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウム／バナジウム含有化合物）が、重量比で、０．５〜３×１０３である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖消費促進剤。
【請求項８】
ｐＨが、７．５〜８．５である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の糖消費促進剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の糖消費促進剤を含む、医薬又は食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖消費促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
すべての医薬品は、東洋薬であっても、西洋薬であっても、その両方において潜在的な健康リスクをもたらす。新しく開発された西洋薬は、その有効性と安全性を確保するために厳格な検査を受けなければならないが、東洋薬の安全性は、一般的に、伝統的な医薬品における、安全に使用されてきた長い歴史の中により確立されている。
また、民間療法は伝統的に長期間にわたり開発されている。
しかしながら、伝統療法や、民間療法及び代替療法において、肯定的及び否定的な双方の健康上の影響を持つ可能性があることに注意することが重要である。【０００３】
糖尿病（ＤＭ）の罹患率は世界中で増加している。ＤＭは心血管疾患、脳卒中、慢性腎不全、足潰瘍及び眼の損傷等の合併症を引き起こすことが知られている。
１型糖尿病（１型ＤＭ）の治療には、インスリンが用いられ、２型糖尿病（２型ＤＭ）の治療には、多くの薬剤が開発されている。しかしながら、これらの薬物は症状を治療するが、ＤＭに対する基本的な治療法ではない。また、ＤＭの治療薬の不適切な使用は深刻な低血糖を引き起こす可能性がある。【０００４】
バナジウム化合物はｉｎ  ｖｉｔｒｏだけでなく、ｉｎ  ｖｉｖｏでもインスリン様活性を有することが知られており、いくつかのバナジウム化合物が研究されている（非特許文献１〜８）。また、バナジン酸塩は、糖尿病患者において４週間経口投与され、重大な症状を伴わずにｉｎ  ｖｉｖｏで有意なグルコース正常化が得られることが開示されている。さらに、バナジウム化合物を含む富士山の伏流水が糖尿病患者の血糖値の改善に有効であることが示されている（非特許文献９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Poucheret, P. et al.，Vanadium and diabetes.，Mol Cell Biochem, 1998, 188 (1-2), 73-80.
【非特許文献２】Shafrir, E. et al.，Treatment of diabetes with vanadium salts: general overview and amelioration of nutritionally induced diabetes in the Psammomys obesus gerbil.，Diabetes Metab Res Rev, 2001, 17 (1), 55-66.
【非特許文献３】D. Rehder, D.，Perspectives for vanadium in health issues.，Fut Med Chem, 2016, 8 (3), pp. 325-338.
【非特許文献４】Kibiti, M. et al.，The Biochemical Role of Macro and Micro-Minerals in the Management of Diabetes Mellitus and its Associated Complications: A Review.，Int J Vit Nut Res, 2015, 85 (1-2), 88-103.
【非特許文献５】Gruzewska, K. et al.，Essentiality and toxicity of vanadium supplements in health and pathology.，J Physiol Pharmaco, 2014, 65 (5), 603-611.
【非特許文献６】Huyer, G. et al.，Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate.，J Biol Chem, 1997, 272 (2), 843-851.
【非特許文献７】Sorimachi, K, et al.，Insulin-like effects of vanadium pentoxide (V2O5) on glucose consumption in primary human fibroblasts.，Journal of Analytical & Pharmaceutical Research, 2017, 5 (4), 00150.
【非特許文献８】Sorimachi, K. et al.，Insulin-like effect of Mt. Fuji subsoil water which contains vanadium on cultured cells: Insight from Japan.，Current Traditional Medicine, 2017, 3 (3), 178-189.
【非特許文献９】橘田  力  他、天然Vanadiumを含有する富士山伏流水のヒト高血糖症に及ぼす影響，応用薬理、２００３、６４（５／６）、７７−８４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、インスリン様作用を有する新規な糖消費促進剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、バナジウム含有化合物と、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムとが、インスリン様作用を有することを見出し、本発明を完成した。また、本発明者は、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムが、糖代謝促進作用を有することをも見出し、本発明を完成した。【０００８】
本発明は以下のとおりである。
（１）
バナジウム含有化合物と、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムと、を有効成分として含む、糖消費促進剤。
（２）
バナジウム含有化合物と併用するための、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムを有効成分として含む、糖消費促進剤。
（３）
炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムを有効成分として含む糖消費促進剤。
（４）
０．１〜５ｇ／Ｌ、好ましくは１〜２．５ｇ／Ｌの炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムを有効成分として含む糖消費促進剤。
（５）
水溶液である、（１）〜（４）のいずれかに記載の糖消費促進剤。
（６）
０．１〜５ｇ／Ｌの炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムを含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の糖消費促進剤。
（７）
１００〜２０００μｇ／Ｌのバナジウム含有化合物を含む、（１）〜（６）のいずれかにに記載の糖消費促進剤。
（８）
バナジウム含有化合物と炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムの含有量の比（炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウム／バナジウム含有化合物）が、重量比で、０．５〜３×１０３、好ましくは０．５〜３×１０３である、（１）〜（７）のいずれかに記載の糖消費促進剤。
（９）
０．１〜５ｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜２．５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．５〜２ｇ／Ｌの炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムを有効成分として含み、
バナジウム含有化合物をさらに含む、糖消費促進剤。
（１０）
ｐＨが、７．５〜８．５である、（１）〜（９）のいずれかに記載の糖消費促進剤。
（１１）
（１）〜（１０）のいずれかに記載の糖消費促進剤を含む、医薬又は食品。
（１２）
（１）〜（１１）に記載の発明において、糖消費促進剤は、糖代謝促進剤であり得る。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、インスリン様作用を有する新規な糖消費促進剤を提供することができる。また、本発明におよれば、新規な糖代謝促進剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＮａＨＣＯ３の濃度を０．５〜１０．０ｍｇ／ｍＬとした場合の、培養細胞におけるグルコース消費の結果を示す。実験は６回行い、その平均として結果を示す（**: p < 0.01, and *: p < 0.05）。
【図２】バナジウムの濃度を１．０ｍｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３の濃度を１．０ｍｇ／ｍＬとした場合の、培養細胞におけるグルコース消費の結果を示す。実験は５回行い、その平均として結果を示す（**: p < 0.01, and *: p < 0.05）。
【図３】バナジウムの濃度を０．５ｍｇ／Ｌとした場合に、ＮａＨＣＯ３の濃度を１．０ｍｇ／ｍＬから５．０ｍｇ／ｍＬまで変化させた場合の、培養細胞におけるグルコース消費の結果を示す。実験は３回行い、その平均として結果を示す（**: p< 0.01，*: p< 0.05）。
【図４】バナジウムの濃度を１．０ｍｇ／Ｌとした場合に、ＮａＨＣＯ３の濃度を１．０ｍｇ／ｍＬから５．０ｍｇ／ｍＬまで変化させた場合の、培養細胞におけるグルコース消費の結果を示す。実験は４回行い、その平均として結果を示す（*: p< 0.05）。
【図５】Ｎａ２ＣＯ３の濃度を０．５〜１０．０ｍｇ／ｍＬとした場合の、培養細胞におけるグルコース消費の結果を示す。実験は４〜１７回行い、その平均として結果を示す（**: p < 0.01）。
【図６】バナジウムの濃度を１．０ｍｇ／Ｌとした場合に、Ｎａ２ＣＯ３の濃度を０．５ｍｇ／ｍＬから２．５ｍｇ／ｍＬまで変化させた場合の、培養細胞におけるグルコース消費の結果を示す。実験は５回行い、その平均として結果を示す（**： p < 0.01, *: p < 0.05）。
【図７】ＮａＨＣＯ３又はＮａ２ＣＯ３の濃度を１．０ｍｇ／ｍＬとした場合の、培養細胞における乳酸産生の結果を示す。実験は３回行い、その平均として結果を示す（**: p < 0.01, and *: p < 0.05）。
【図８】ＮａＨＣＯ３又はＮａ２ＣＯ３の濃度を１．０ｍｇ／ｍＬ、かつバナジウムの濃度を１．０ｍｇ／Ｌとした場合の、培養細胞における乳酸産生の結果を示す。実験は３回行い、その平均として結果を示す（*: p < 0.05）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、糖消費促進剤であって、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムを有効成分として含む。また、本発明は、糖消費促進剤であって、バナジウム含有化合物と、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムと、を有効成分として含む。
本発明における糖消費促進剤は、糖消費を促進させることができ、インスリン様作用を示す。
糖消費の促進は、細胞における糖消費であってもよく、動物、好ましくはヒトにおける生体内での糖消費であってもよい。
本発明において、糖消費が促進していることは、特に限定されるものではないが、実施例に記載の方法により測定することができる。
本発明において、有効成分とは、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムが、糖消費促進活性を有する成分であることを意味する。また、バナジウム含有化合物と、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムと、を有効成分として含む場合には、有効成分とは、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムとバナジウム含有化合物とが、糖消費促進活性を示すことを意味する。
【００１２】
本発明の糖消費促進剤は、生細胞の糖消費を促進するため、インスリン様作用を示し、本発明の糖消費促進剤を用いることにより１型ＤＭ及び２型ＤＭにおける糖代謝の改善が期待できる。中でも、本発明の糖消費促進剤を、１型ＤＭにおける糖代謝の改善において用いることが好ましい。
本発明の糖消費促進剤を摂取することにより、糖尿病の治療又は予防効果が期待でき、ひいては、糖尿病による合併症の予防につながる。糖尿病としては、１型ＤＭでもよく、２型ＤＭでもよいが、１型ＤＭであることが好ましい。
【００１３】
糖消費に係る糖は、糖代謝に関する糖であれば特に限定されるものではないが、グルコースであることが好ましい。
【００１４】
本発明における糖消費促進剤は、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムを含むか、バナジウム含有化合物と、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムを含むが、バナジウムは体内で減少した遊離脂肪酸を介して血糖値を低下させることが報告されているように、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムに、バナジウム含有化合物を併用した場合、バナジウム含有化合物により糖消費の調節が起こる。バナジウム含有化合物と炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムによる糖代謝促進の作用メカニズムは、両者が別々に、あるいは同時に、細胞膜上のインスリン受容体に作用し、グルコーストランスポーター（ＧＬＴ４）を活性化し、糖の細胞内摂取を促進することによると考えられる。
また、本発明における糖消費促進剤は、細胞内での糖消費を促進して、解糖系の代謝産物である乳酸の産生を増加させるという効果を奏する。
したがって、本発明における糖消費促進剤は、糖代謝促進剤であり得る。よって、本明細書において、糖消費促進剤として記載されている事項は、糖代謝促進剤としての記載と読み替え可能である。
【００１５】
本発明で用いられるバナジウム含有化合物は、その分子内に、原素記号をＶとするバナジウムを含有する化合物である。
バナジウム含有化合物としては、in vitro又はin vivoでインスリン様活性を有することが知られているものを用いることができる。
バナジウム含有化合物としては、有機酸あるいは無機酸のバナジウム塩や、五酸化バナジウム（Ｖ２Ｏ５、バナジン酸塩ともいう）等を用いることができる。
バナジウム含有化合物としては、水溶液とした場合に、バナジウムイオンを遊離するものが好適に用いられる。バナジウム含有化合物として、バナジウムと塩酸等の酸を用い溶解させて水溶液中のバナジウム塩としたものも含まれる。
五酸化バナジウムは、Ｖ２Ｏ５と記載されるバナジウムの酸化物であって、市販品を用いることができる。
本発明の糖消費促進剤は、好適には、水溶液であって、バナジウムイオンをさらに含む。また、本発明の糖消費促進剤は、五酸化バナジウムを溶解させた水溶液に炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムを溶解させた溶液であってもよい。
【００１６】
本発明においては、バナジウムイオンやバナジン酸塩を含むことが知られる水を用いてもよく、富士土壌水、都市水、井戸水といった水を、バナジウム含有化合物を含む水として用いてもよい。
富士土壌水とは、富士山水系から汲み出される水であって、バナジウム含有化合物を含む地下水である。
バナジウム含有化合物を含む水として、内因的に、バナジウム含有化合物は水に含まれるものであってもよく、外因的に、水に添加したものであってもよく、バナジウム含有化合物を含む水に、さらにバナジウム含有化合物を添加したものであってもよい。
【００１７】
また、糖消費促進剤を、水溶液として用いる場合には、バナジウム含有化合物を、バナジウムイオンや五酸化バナジウム（Ｖ２Ｏ５）等の濃度として、好ましくは、１０〜５０００μｇ／Ｌ、１０〜１０００μｇ／Ｌ、５０〜１０００μｇ／Ｌ、１００〜１０００μｇ／Ｌ、１００〜５００μｇ含む。
バナジウム含有化合物を、バナジウムイオンや五酸化バナジウム（Ｖ２Ｏ５）等の濃度の下限値として、上記範囲内で、１００μｇ／Ｌ以上であってもよく、２００μｇ／Ｌ以上であってもよく、３００μｇ／Ｌ以上であってもよく、４００μｇ／Ｌ以上であってもよく、該濃度の上限値としては、２０００μｇ／Ｌ以下であってもよく、１０００μｇ／Ｌ以下であってもよく、９００μｇ／Ｌ以下であってもよく、８００μｇ／Ｌ以下であってもよく、７００μｇ／Ｌ以下であってもよく、６００μｇ／Ｌ以下であってもよく、５００μｇ／Ｌ以下であってもよい。
また、バナジウム含有化合物を、バナジウムイオンや五酸化バナジウム（Ｖ２Ｏ５）等の濃度として、１０〜３００μｇ／Ｌ、５０〜２５０μｇ／Ｌ、５０〜２００μｇ／Ｌ、５０〜１５０μｇ／Ｌ含んでもよい。
バナジウム含有化合物を、バナジウムイオンや五酸化バナジウム（Ｖ２Ｏ５）等の濃度として、糖消費促進作用と、毒性といった観点を総合考慮すると、１００〜２０００μｇ／Ｌ又は１００〜５００μｇ／Ｌ含むこと好適である。
【００１８】
糖消費促進剤が水溶液である場合、バナジウムイオンやバナジン酸塩の存在（含有量）は、実施例に記載の方法で、試料分析を行うことによって確認することができる。
【００１９】
本発明で用いられる炭酸ナトリウムは、Ｎａ２ＣＯ３という化学式を有する。
炭酸ナトリウムは、特に限定されず市販品を用いることができる。
また、糖消費促進剤を、水溶液として用いる場合には、炭酸ナトリウムを、炭酸ナトリウムの濃度として、好ましくは、１０〜５０００ｍｇ／Ｌ（０．０１〜５ｇ／Ｌ）、１００〜５０００ｍｇ／Ｌ（０．１〜５ｇ／Ｌ）含む。また、炭酸ナトリウムを、好ましい０．０１〜５ｇ／Ｌの範囲内で、４ｇ／Ｌ以下、３ｇ／Ｌ以下、あるいは２．５ｇ／Ｌ以下で含んでもよく、０．５ｇ／Ｌ以上、１ｇ／Ｌ以上、２ｇ／Ｌ以上含んでもよい。
炭酸ナトリウムを、炭酸ナトリウムの濃度として、糖消費促進作用の観点で、０．５〜３ｇ／Ｌ含むことが好適であり、より好適には１〜２．５ｇ／Ｌ、２〜２．５ｇ／Ｌ含む。
【００２０】
バナジウム含有化合物と炭酸ナトリウムの含有量の比（炭酸ナトリウム／バナジウム含有化合物）が、重量比で、０．５〜３×１０３、０．５〜２．５×１０３、０．５〜２×１０３、０．５〜１×１０３であることが好適である。
炭酸ナトリウムと、所望によりバナジウム含有化合物との、糖消費促進剤における含有量及び含有量の比は、炭酸ナトリウムと、所望により加えられるバナジウム含有化合物の混合量として適宜調整することができる。
【００２１】
本発明で用いられる炭酸水素ナトリウムは、ＮａＨＣＯ３という化学式を有し、重曹とも呼ばれる化合物である。
炭酸水素ナトリウムは、特に限定されず市販品を用いることができる。
また、糖消費促進剤を、水溶液として用いる場合には、炭酸水素ナトリウムを、炭酸水素ナトリウムの濃度として、好ましくは、１０〜１００００ｍｇ／Ｌ（０．０１〜１０ｇ／Ｌ）、１０〜８０００ｍｇ／Ｌ（０．０１〜８ｇ／Ｌ）、１０〜５０００ｍｇ／Ｌ（０．０１〜５ｇ／Ｌ）、１００〜５０００ｍｇ／Ｌ（０．１〜５ｇ／Ｌ）、１０００〜５０００ｍｇ／Ｌ（１〜５ｇ／Ｌ）含む。また、また、炭酸水素ナトリウムを、好ましい０．０１〜８ｇ／Ｌの範囲内で、７ｇ／Ｌ以下、５ｇ／Ｌ以下、４ｇ／Ｌ以下、３ｇ／Ｌ以下、あるいは２．５ｇ／Ｌ以下で含んでもよく、０．５ｇ／Ｌ以上、１ｇ／Ｌ以上、２ｇ／Ｌ以上含んでもよく、炭酸水素ナトリウムを、１〜２．５ｇ／Ｌ含んでもよい。
炭酸水素ナトリウムを、炭酸水素ナトリウムの濃度として、糖消費促進作用の観点で、１〜８ｇ／Ｌ、１〜７ｇ／Ｌ、１〜５ｇ／Ｌ含むこと好適である。
【００２２】
バナジウム含有化合物と炭酸水素ナトリウムの含有量の比（炭酸水素ナトリウム／バナジウム含有化合物）が、重量比で、０．５〜３×１０３、０．５〜２．５×１０３、１〜２．５×１０３、１〜２×１０３であることが好適である。
バナジウム含有化合物と、炭酸水素ナトリウムの、糖消費促進剤における含有量、含有量の比は、混合量として適宜調整することができる。
【００２３】
本発明の糖消費促進剤は、好適には、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムを水に混合することで製造することができる。
また、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムを、バナジウム含有化合物と混合することにより製造してもよく、その場合、特に混合する方法は限定されない。
好適には、バナジウム含有化合物を含む水に、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムを混合するか、あるいは炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムを含む水を混合することにより製造することができる。炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムを含む水に、バナジウム含有化合物を混合してもよく、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムを含む水に、バナジウム含有化合物を含む水を混合してもよい。すなわち、本発明の糖消費促進剤が、水溶液である場合、水と炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムの混合順番は特に限定されず、また、水、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムと、バナジウム含有化合物の混合順番は限定されない。
【００２４】
本発明においては、炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムを共に用いてもよい。
【００２５】
本発明の糖消費促進剤は、医薬品中に配合してもよい。
医薬品の形態は、特に限定されるものではないが、錠剤、シロップ剤及びカプセル剤であってもよく、顆粒剤や散剤として調製して、服用時に、懸濁剤や溶液剤として用いてもよい。
医薬品として用いる場合には、有効成分である、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウム及びバナジウム含有化合物以外に、薬学的に許容される添加剤を用いてもよい。
添加剤としては、特に限定されないが、例えば、賦形剤、滑沢剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、乳化剤、安定剤及び嬌味嬌臭剤等として知られる成分を用いることができる。
【００２６】
本発明の糖消費促進剤は、食品中に配合してもよく、健康食品として用いてもよい。
食品の形態は、特に限定されるものではないが、ドリンク剤、カプセル剤、ペースト剤等の水溶液形態が好適な形態として挙げられる。
食品として用いる場合には、有効成分である、炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウム及びバナジウム含有化合物以外に、保存料、着色料、甘味料、酸化防止剤、増粘安定剤、乳化剤、調味料、防腐剤等の食品添加物を用いてもよい。
【実施例】
【００２７】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００２８】
ＲＰＭＩ−１６４０培養培地及びＤＭＥＭ培養培地として、それぞれ、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水にＲＰＭＩ−１６４０粉末（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｌａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）又はダルベッコ改変イーグル培地粉末（ＤＭＥＭ；Ｎｉｓｓｕｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．  ＬＴＤ、Ｔｏｋｙｏ）を溶解することによって調製した。
培養培地中の初期グルコース濃度は、それぞれ１００ｍｇ／ｄＬ及び２００ｍｇ／ｄＬとした。
全ての媒体を、使用前に孔径０．２μｍのフィルターで濾過した。
バナジウム含有化合物を含む水として、和光純薬工業から購入した、０．２ＭのＨＣｌ及び０．５ＭのＨＮＯ３中の原子吸光分光法のための金属イオンからなるｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｍｐｌｅであるバナジウム標準溶液（Ｖ１０００）を用い、バナジウム含有化合物、この場合は、バナジウムイオンの水溶液中の濃度を調節した。
また、炭酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムは、和光純薬工業から購入した。【００２９】
試料中のバナジウムの分析
試料中のバナジウムの分析は以下のようにして行った。
試料を０．４５μｍ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ）を通して濾過した。１０ｍＬの水を０．０５ｍＬの濃硝酸（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ  Ｇｒａｄｅ，Ｔａｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．，Ｋａｗａｓａｋｉ、Ｊａｐａｎ）に加え、イットリウム（１５０ｐｇ）を内部標準としてスパイクした。
０．５％硝酸で２倍又は５倍希釈した後、バナジウム濃度を、質量電荷比（ｍ／ｋｇ）で誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ；Ｅｌａｎ  ＤＲＣ−ＩＩ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）ＩＣＰ−ＭＳ条件は、１０μｇ／ｍＬストック標準（ＸＳＴＣ−１３  ＳＰＥＸ  ＣｅｒｔｉＰｒｅｐ。Ｉｎｃ．  Ｍｅｔｕｃｈｅｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）からの０．５％硝酸中のバナジウムを含有する１ｎｇ／ｍＬの同調溶液を用いて最適化した。
測定を３回繰り返した。検出限界（ＬＯＤ）および定量限界（ＬＯＱ）は、ｍ／ｚ  ５１でのブランクシグナルの１０回の反復測定の標準偏差の３倍及び１０倍に等しいバナジウムのシグナルの濃度等価物であり、それぞれ、水中のバナジウムの測定のために、ＬＯＤ及びＬＯＱはそれぞれ０．０１及び０．０４ｎｇ／ｍＬとした。【００３０】
細胞培養
ラット線維芽細胞由来のＰｙ−３Ｙ１−Ｓ２細胞を用いた。
細胞を３７℃でプラスチック培養フラスコ（底面積２５ｃｍ２）中で連続的に培養し、１％トリプシンで処理して細胞を単一細胞に分散させた。
分散された細胞を２４個のマルチウェルプラスチック培養プレートに接種し、次いで異なる期間３７℃で５％ＣＯ２下で培養した。
培養培地は５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；  ＧＩＢＣＯ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｕｃｋｌａｎｄ、ＮＺ）を含有した。【００３１】
培養培地におけるグルコース消費アッセイ
培養培地中のグルコース濃度を、グルコースＣＩＩ試験（Ｗａｋｏ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて測定した。
培養培地の１０〜５０μＬアリコートを０．５ｍＬのアッセイ溶液と混合し、５０５ｎｍでの吸光度を１５分後に測定した。
グルコース消費に対する炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムの効果、あるいは炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムとバナジウム含有化合物の効果を表すために、サンプル培地中のグルコース消費量を対照培地（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）の消費量で割った。
炭酸水素ナトリウムの濃度又はバナジウムの濃度を図１〜４に示す範囲とした、グルコース消費アッセイの結果を図１〜４に示す。
炭酸ナトリウムの濃度又はバナジウムの濃度を図５〜６に示す範囲とした、グルコース消費アッセイの結果を図５〜６に示す。【００３２】
培養培地における乳酸アッセイ
培養培地中の乳酸濃度を、培養培地（培養液）を２０倍希釈したサンプル２０μＬを使用して、Ｌａｃｔａｔｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ−ＷＳＴ（同仁化学、Ｊａｐａｎ）を用いて測定した。
乳酸産生に対する炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムの効果、あるいは炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウムとバナジウム含有化合物の効果を表すために、サンプル培地中の乳酸産生量を対照培地（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）の消費量で割った。
炭酸ナトリウム若しくは炭酸水素ナトリウムの濃度を１．０ｍｇ／ｍＬ、又はバナジウムの濃度を１．０ｍｇ／Ｌとした、乳酸アッセイの結果を図７〜８に示す。
乳酸が培養液中に炭酸水素ナトリウム又は炭酸ナトリウムによってまた、バナジウム含有化合物の併用によって顕著に増加した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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