(57)【要約】  本発明の課題は、アディポネクチンの経口による大量摂取を容易にし、その利用の幅を広げる技術を提供することである。  本発明は、アディポネクチンを有効成分として含有する、経口用摂食調整剤、とくにアディポネクチンを発現する形質転換体を含有する、前記の経口用摂食調整剤、および前記経口用摂食調整剤を含有する摂食調整用食品組成物に関する。
2010087243.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アディポネクチンを有効成分として含有する、経口用摂食調整剤。
【請求項２】
アディポネクチンを発現する形質転換体を含有する、請求項１に記載の経口用摂食調整剤。
【請求項３】
アディポネクチンを発現する形質転換体が、
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、または、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアディポネクチン活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
からなる遺伝子を導入した形質転換体である、請求項２に記載の経口用摂食調整剤。
【請求項４】
アディポネクチンを発現する形質転換体が、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアディポネクチン活性を有するポリペプチド
をコードする遺伝子を導入した形質転換体である、請求項２に記載の経口用摂食調整剤。
【請求項５】
アディポネクチンを発現する形質転換体の可食性組織を含有する、請求項２〜４のいずれかに記載の経口用摂食調整剤。
【請求項６】
可食性組織が生食可能である請求項５に記載の経口用摂食調整剤。
【請求項７】
形質転換体が、形質転換植物である、請求項２〜６のいずれかに記載の経口用摂食調整剤。
【請求項８】
アディポネクチンが、形質転換植物において発現したものである、請求項７に記載の経口用摂食調整剤。
【請求項９】
形質転換植物において発現したアディポネクチン以外の動物由来成分を含有しない、請求項８に記載の経口用摂食調整剤。
【請求項１０】
形質転換植物において発現したアディポネクチン以外は植物由来成分である、請求項９に記載の経口用摂食調整剤。
【請求項１１】
植物がイチゴであり、可食性組織がイチゴ果実である、請求項７〜１０のいずれかに記載の経口用摂食調整剤。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の経口用摂食調整剤を含有する、摂食調整用食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アディポネクチンを含有する摂食調整剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アディポネクチンは、脂肪細胞から分泌されるアディポサイトカインの一種で、メタボリック症候群と密接な関係があることが指摘されている。これまで、メタボリック症候群を改善するため、アディポネクチン産生を促進することを目的として、乳酸菌（特許文献１）、酵母（特許文献２）、冬虫夏草の熱水抽出物（特許文献３）、トリグリセリド（特許文献４）、アシルアミド化合物（特許文献５）など、種々の物質について検討されている。また一方で、アディポネクチンやその断片などを体内に投与することによって、癌（特許文献６）、炎症性疾患（特許文献７）、動脈硬化症（特許文献８）などを治療または予防を行う試みもなされている。さらに、アディポネクチンが視床下部ＡＭＰキナーゼを活性化し摂食亢進することが報告され（非特許文献１）、アディポネクチンによって食欲がコントロールされるモデルが提案されている（非特許文献２）。【０００３】
本発明者らは、既に、アディポネクチンの経口投与の可能性を探り、経口投与時におけるアディポネクチンの生物活性について検討してきたが（非特許文献３）、その内容については、さらなる検討と実証が必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−６３２８９号公報
【特許文献２】特開２００８−６３２９３号公報
【特許文献３】特開２００７−３１３０２号公報
【特許文献４】特開２００８−２４６４７号公報
【特許文献５】特開２００８−１０５９４５号公報
【特許文献６】特開２００４−３４５９６８号公報
【特許文献７】特許第３０１８１８６号公報
【特許文献８】特許第４１４７２２０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】N. Kubota et al. (2007) "Adiponectin stimulates AMP-activated protein kinase in the hypothalamus and increases food intake" Cell Metabolism Vol.6, p55-68.
【非特許文献２】G. R. Steinberg and B. E. Kemp (2007) "Adiponectin: Starving for Attention" Cell Metabolism Vol.6, p3-4.
【非特許文献３】安野ら（2007）「ヒトアディポネクチン遺伝子組換え植物の作出と機能解析」、ＢＭＢ２００７（第30回日本分子生物学会年会・第80回日本生化学会大会合同大会）講演要旨集、350頁、2007年11月25日発行。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、アディポネクチンの経口による大量摂取を容易にし、その利用の幅を広げる技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく研究を進める中で、ヒトアディポネクチンを産生する形質転換イチゴを作出し、その果実をマウスに与えることによってアディポネクチンの経口投与による作用を確認していたところ、これまで知られている作用とは全く異質の作用、すなわち摂食による摂食調整作用を見出し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち本発明は、アディポネクチンを有効成分として含有する、経口用摂食調整剤に関する。
さらに本発明は、アディポネクチンを発現する形質転換体を含有する、前記の経口用摂食調整剤に関する。
また本発明は、アディポネクチンを発現する形質転換体が、
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、または、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアディポネクチン活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
からなる遺伝子を導入した形質転換体である、前記の経口用摂食調整剤に関する。【０００９】
さらに本発明は、アディポネクチンを発現する形質転換体が、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアディポネクチン活性を有するポリペプチド
をコードする遺伝子を導入した形質転換体である、前記の経口用摂食調整剤に関する。
また本発明は、アディポネクチンを発現する形質転換体の可食性組織を含有する、前記の経口用摂食調整剤に関する。
さらに本発明は、可食性組織が生食可能である前記の経口用摂食調整剤に関する。【００１０】
また本発明は、形質転換体が、形質転換植物である、前記の経口用摂食調整剤に関する。
さらに本発明は、アディポネクチンが、形質転換植物において発現したものである、前記の経口用摂食調整剤に関する。
また本発明は、形質転換植物において発現したアディポネクチン以外の動物由来成分を含有しない、前記の経口用摂食調整剤に関する。
さらに本発明は、形質転換植物において発現したアディポネクチン以外は植物由来成分である、前記の経口用摂食調整剤に関する。【００１１】
また本発明は、植物がイチゴであり、可食性組織がイチゴ果実である、前記の経口用摂食調整剤に関する。
さらに本発明は、前記の経口用摂食調整剤を含有する、摂食調整用食品組成物に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、アディポネクチンを含有する経口用摂食調整剤を提供することができ、かかる経口用摂食調整剤を摂食することにより、摂食亢進をもたらすなど摂食調整が可能である。【００１３】
また本発明は、経口用摂食調整剤とすることによって経口によってアディポネクチンを取り入れることを可能にするものであって、例えば、血中に直接的に投与するような場合と異なり、血中のアディポネクチン濃度を急激に変化させるものではないので身体への負担も殆どない。すなわち、安全性、安定性に優れたアディポネクチンを含む食品組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、アディポネクチン標品経口投与マウスの肝臓における遺伝子発現プロフィール比較（対照：PBS投与）を示す。
【図２】図２は、アディポネクチン標品経口投与マウスの脾臓における遺伝子発現プロフィール比較（対照：PBS投与）を示す。
【図３】図３は、植物発現ベクターpBE2113へヒトアディポネクチン遺伝子を組み込んで作製したpBE-hAdiを示す。
【図４】図４は、ゲノミックPCRによるイチゴ形質転換株（Km耐性株）におけるヒトアディポネクチン遺伝子の導入を確認した電気泳動図である。
【図５】図５は、ヒトアディポネクチン高発現系統のアディポネクチン濃度を示すグラフである。
【図６】図６は、ヒトアディポネクチン高発現系統のウエスタンブロットを示す。
【図７】図７は、イチゴ果実発現ヒトアディポクチンのウエスタンブロットを示す。
【図８】図８は、構築したレトロウイルスをアッセイ系細胞(Huh7)に感染させ、アディポネクチンを添加した場合のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図９】図９は、アディポネクチン発現イチゴ経口投与（摂食）マウスの肝臓における遺伝子発現プロフィール比較（対照：非組換えイチゴ投与）を示す。
【図１０】図１０は、アディポネクチン発現イチゴ経口投与（摂食）マウスの脾臓における遺伝子発現プロフィール比較（対照：非組換えイチゴ投与）を示す。
【図１１】図１１は、アディポネクチン発現イチゴ経口投与（摂食）マウスの小腸における遺伝子発現プロフィール比較（対照：非組換えイチゴ投与）を示す。
【図１２】図１２は、アディポネクチン発現イチゴ経口投与（摂食）マウス血清の生化学的解析（グルコース含量）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に係るアディポネクチンを有効成分として含有する経口用摂食調整剤は、摂食することによって摂食亢進または摂食抑制に作用し、摂食調整が可能である。かかるアディポネクチンとしては、任意の動物由来のものを用いることができるが、経口にて摂取する観点から、ヒト、ウシ、ブタなど哺乳動物に由来するものが好ましい。
【００１６】
本発明において、「経口用摂食調整剤」とは、例えば、「第１５改正日本薬局方  製剤総則」に記載の方法に従った製剤の常法によって調製されるもので、経口用に適したものであればよい。剤型は、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤、錠剤などをあげることができる他、経口用摂食調整剤の剤型に応じて、各種の添加剤、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤などを配合してもよい。また、経口用摂食調整剤は、人為的に配合した組成物だけに限定されるものではなく、例えば、食品用に用いられる各種の組成物はもちろん、葉、根、果実などの野菜や果物などの食品素材や、飲食料などの加工した最終製品（食品）をも含み、およそ摂食の対象となる任意のものを包含する概念を示している。
【００１７】
本発明に係る経口用摂食調整剤は、アディポネクチンを発現する形質転換体を含有してもよい。前記形質転換体は、摂食に問題がなく、形質転換によりアディポネクチンが発現しているものであれば、とくに限定されない。例えば、納豆菌、乳酸菌、酢酸菌、酵母、担子菌などの従来から食品に用いられる微生物の形質転換体や、アディポネクチンを高発現する形質転換動物であってもよいが、とくに経口で摂取することや、動物に感染性を有する病原体（ウイルス、菌類、細菌類、寄生生物等）の汚染の危険性を回避することが可能であるため、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、イチゴ、トマト、ジャガイモ、レタス、ダイズ、アズキなどの形質転換植物が好ましい。
【００１８】
また、前記形質転換体は可食性組織を有していることが好ましい。かかる可食性組織としては、例えば、担子菌の子実体（キノコ）、植物の果実（例えば、イチゴ果実、トマト）、根（大根、ジャガイモ）、葉（キャベツ、レタス）、種子（イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシなど穀物およびダイズ、アズキなど豆類）などが挙げられる。なかでも、加熱などの調理によってアディポネクチンが変性しないことや摂食が簡便であることから、生食が可能な可食性組織が好ましい。
【００１９】
形質転換体の作成方法は、とくに限定されず、一般によく知られる方法で作出することができる。例えば、カルシウム法によるコンピテント化を利用する方法（主に細菌）、ファージやプラスミドなどのベクターを用いる方法（主に細菌）、プロトプラスト−ＰＥＧ法（主に糸状菌）、リチウム法（主に酵母）、エレクトロポレーション法、パーティクルガンによる方法、アグロバクテリウム法（植物）など、各種の対象に適した形質転換法を用いることができる。
【００２０】
本発明のアディポネクチンを発現する形質転換体は、一態様において、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、または、（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアディポネクチン活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、からなる遺伝子を導入してなる。
【００２１】
配列番号１に記載の塩基配列は、ヒトアディポネクチン遺伝子(NCBI Accession No.NM_004797)の翻訳領域および終止コドン（８５番〜８１９番まで）を表している。
【００２２】
また、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。かかる条件は、当業者が理解するものであるが、例えば、９９．５％以上であるような相同性が高い核酸同士はハイブリダイズするが、それより相同性が低いＤＮＡ同士はハイブリダイズしないような条件が挙げられる。
【００２３】
本発明のアディポネクチンを発現する形質転換体は、一態様において、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアディポネクチン活性を有するポリペプチド、をコードする遺伝子を導入してなる。
【００２４】
ここで、「１個もしくは数個」とは、アミノ酸が付加、欠失もしくは置換されるアミノ酸残基の前記ポリペプチドの立体構造における部位またはアミノ酸残基の種類によって異なり得るが、通常２〜２０個、好ましくは２〜１５個程度を指す。
また、「アディポネクチン活性を有する」とは、アディポネクチンの有する活性のうち少なくとも１つを有することを意味し、好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の活性を有する。
【００２５】
かかるアディポネクチン活性としては、例えば、前記特許文献６（特開２００４−３４５９６８号公報）などに記載されているような、アディポネクチンの作用としてよく知られた活性：
（１）Ｃ２Ｃ１２細胞における、ＡＭＰＫ活性化作用およびＡＣＣ抑制作用、グルコース取り込み促進活性、脂肪酸酸化促進活性（Nat. Med. 8:1288-1295,2002）；
（２）初代培養肝細胞におけるＡＭＰＫ活性化作用（Nat. Med. 8:1288-1295, 2002）、グルコース放出抑制作用（Nat. Med. 7:947-953, 2001）；
（３）血管内皮細胞におけるＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎ（Circulation 100:2473-2476, 1999）；
（４）マクロファージにおける、コレステロールエステル量の低下（Eur. J. Clin. Invest. 27:285, 1997）、リピッドドロップレット蓄積低下（Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19:1333, 1999）、スカベンジャーレセプター（Biochem. Biophys. Res. Commun. 22:277, 2000）、またはリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）発現抑制活性（Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 15:522, 1995）、またはＴＮＦ−α産生抑制活性；
（５）血管平滑筋細胞の増殖・遊走抑制活性（Circulation 105:2893, 2002） ；
（６）コラーゲンＩ、ＩＩＩ、Ｖ結合活性（Horm. Metab. Res. 32:47-50, 2000）、
などが挙げられる。
【００２６】
また、本発明者らの構築したPhosphoenolpyruvate carboxykinase（PEPCK）プロモーターとルシフェラーゼを利用したアディポネクチンの評価系においても簡便に確認することができる（下記実施例「３．PEPCKプロモーター-ルシフェラーゼを利用したアディポネクチンの評価系」参照）。
本発明のアディポネクチンを含有する経口用摂食調整剤を液体で投与する場合のアディポネクチンの投与濃度は、適宜設定することができるが、例えば、経口投与により有害性が認められないとの観点から、母乳における含有量である１０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ（L. J. Martin et al., Am J Clin Nutr 2006, Vol.83, p1106-1011）を基準として調整することが可能である。
【００２７】
また、本発明のアディポネクチンを含有する経口用摂食調整剤を固体または液体で投与する場合、アディポネクチンの投与量および含有量は、適宜調整することができる。とくにアディポネクチン源として、形質転換体イチゴ果実を利用する場合、次のように調整することができる。すなわち、収穫した果実を一まとめ（＝１バッチ。なお、栽培区画、収穫期間、組換え体の系統などを勘案して、任意に１バッチを規定することができる）として、１バッチ毎の果実全体を凍結磨砕（もしくはジュース化）等の処理を施し、１バッチ中のアディポネクチン濃度を測定する。これに、適宜、非組換えイチゴ果実を任意に混合し、投与量および含有量の調整する。そして、利用者の健康状態に応じた組換えアディポネクチン含量を調整することができる。
以下に本発明を実施例により、さらに詳細に説明するが、本発明は、これらの態様に限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
１．アディポネクチンの経口投与による活性評価
精製アディポネクチン標品（recombinant human adiponectin、R & D Systems社製）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（組成：137ｍM  塩化ナトリウム、2.7mM  塩化カリウム、10mM  リン酸水素２ナトリウム、1.8ｍM  リン酸２水素カリウム  ｐH 7.4）に１０μｇ／２０μｌの濃度で溶解し、得られたアディポネクチン水溶液を標準的な体型のマウス（Balb/c、メス８週齢）に１回あたり２０μｌを経口的に投与した。対照として、PBSのみを１回当たり２０μlを経口的に投与した。これを５日間連続して行い、最終投与後６時間後に脊髄脱臼した後、内臓（肝臓、脾臓）を摘出し、試料とした。各試料をＲＮＡＬａｔｅｒ(Ambion,Inc)に浸漬後、−８０℃に凍結した。凍結した試料からｍＲＮＡを抽出し、ＤＮＡマイクロアレイ解析をAffimetrix社Gene Chip（Mouse Genome 430 2.0、1-cycle target labeling プロトコール)を用いて行った。投与群と対照群とのデータを比較し、発現亢進、あるいは抑制が起きている遺伝子を同定した。【００２９】
投与群と対照群の遺伝子発現プロフィール比較をスキャッタープロットで示した（図１および２）。アディポネクチン受容体が存在する肝臓では、発現亢進（５倍以上）されたものは、１５０遺伝子であり、発現抑制（１／５以下）されたものは６４遺伝子であった。
発現が亢進した遺伝子として、以下のものが認められた；ELAV-like 2、defensin beta 8、DEAD box polypeptide 24、CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing 2A、early B-cell factor 3、SH3-domain kinase binding protein 1、olfactomedin 3、Kinesin family member 16B、leucine rich repeat containing 52、Septin 11、tripartite motif-containing 36、catenin delta 1、opioid receptor mu 1、phosphatase and actin regulator 1、protein phosphatase 1 regulatory (inhibitor) subunit 9A、transient receptor potential cation channel、regulator of G-protein signaling 18、Spire homolog 1 、【００３０】
zinc finger protein 423、chemokine ligand 15、junction adhesion molecule 2、ubiquitin-activating enzyme E1、Rho GTPase activating protein 23、Ssu72 RNA polymerase II CTD phosphatase homolog、Yip1 domain family member 6、Cdc2-related kinase, arginine/serine-rich、DCP1 decapping enzyme homolog b 、syndecan binding protein、F-box and WD-40 domain protein 19、nucleoporin 153、Thyroid hormone receptor beta、prolactin-like protein C 1、Shc SH2-domain binding protein 1、FAT tumor suppressor homolog 4、amiloride-sensitive cation channel 3、Eyes absent 3 homolog、testis expressed gene 13、【００３１】
RGM domain family, member B、methyl-CpG binding domain protein 3-like 2、mesoderm posterior 2、prostaglandin F receptor、nucleolar complex associated 2 homolog、potassium voltage-gated channel(shaker-related subfamily member 4)、ankyrin repeat domain 44、MYST histone acetyltransferase monocytic leukemia 4、fibronectin type III domain containing 1、pantothenate kinase 2 (Hallervorden-Spatz syndrome)、Lemur tyrosine kinase 2、cyclic nucleotide gated channel alpha 2、RAD54 like、carbonic anhydrase 3、PR domain containing 8、Chaperonin subunit 4 (delta)、SAM domain and HD domain 1、【００３２】
chromodomain helicase DNA binding protein 8、sperm associated antigen 1、Phosphofurin acidic cluster sorting protein 1、ribonucleotide reductase M2 B (TP53 inducible)、six transmembrane epithelial antigen of prostate 2、Neural cell adhesion molecule 1、Ubiquitin-conjugating enzyme E2R 2、TAF11 RNA polymerase II、SMC6 structural maintenance of chromosomes 6-like 1 、fibroblast growth factor 4、Rho guanine nucleotide exchange factor15、SMC2 structural maintenance of chromosomes 2-like 1 、heparin-binding EGF-like growth factor、Calcium channel、Serine/arginine repetitive matrix 1、【００３３】
protocadherin beta 15、DEAD box polypeptide 25、seminal vesicle antigen-like 2、similar to late cornified envelope protein、protein kinase cAMP dependent regulatory, type II beta、coagulation factor II (thrombin) receptor-like 3、tetratricopeptide repeat domain 9、intraflagellar transport 57 homolog、IQ motif and Sec7 domain 1、diacylglycerol kinase iota、Protein kinase (cGMP-dependent type I)、cofactor required for Sp1 transcriptional activation subunit 6、SWI/SNF related、vomeronasal 1 receptor D4、ATPase, Na+/K+ transporting(alpha 1 polypeptide)、cholinergic receptor、ELAV-like 4、solute carrier family 25 member 31。【００３４】
また、発現が抑制された遺伝子として、以下のものが認められた；Histocompatibility 2K region、growth arrest and DNA-damage-inducible 45 gamma、sema domain(semaphorin) 4D、transformation related protein 53、matrix metallopeptidase 14 (membrane-inserted)、regulator of G-protein signaling 16、phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase, type 1 beta、ATP-binding cassette sub-family F (GCN20)  member 1、HCF-binding transcription factor Zhangfei、methionine aminopeptidase 2、ring finger protein 2、ubiquitin-conjugating enzyme E2C、prosaposin、arylacetamide deacetylase-like 1、nuclear factor I/X、glucose-6-phosphate dehydrogenase X-linked、vesicle-associated membrane protein、ADP-ribosylation factor 4-like、CCAAT/enhancer binding protein beta、【００３５】
nuclear receptor subfamily 0 group B member 2、spastic paraplegia 20、DNA-damage-inducible transcript 4、cyclin-dependent kinase 5, regulatory subunit (p35) 1、methyltransferase like 7A 、sialic acid binding Ig-like lectin 1、insulin-like growth factor binding protein 1、solute carrier organic anion transporter family, member 1a1、PRP40 pre-mRNA processing factor 40 homolog A 、GNAS complex locus、amyloid beta (A4) precursor-like protein 2、phosphoenolpyruvate carboxykinase 1、interleukin 2 receptor gamma chain、TSC22 domain family 3、solute carrier family 45 member 3、macrophage receptor with collagenous structure、ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1。
脾臓では５２遺伝子が発現亢進され、また１０９遺伝子が発現抑制された。【００３６】
この結果から、アディポネクチンを含む組成物を経口的に投与した場合、遺伝子発現に変化が生じることが明確に示された。すなわち、アディポネクチンを摂食した場合、食物消化作用によってアディポネクチンが分解、消化されてしまい何らの影響も与えないのではないかとの一般的な考え方を否定し、アディポネクチンを摂食することが有意義であることが明確に示されたといえる。これは特に、例えば、腸溶性カプセルなどの薬物送達を念頭に置いた経口投与用医薬ではなく、通常の摂食である点でも有意義であり、アディポネクチンを含有する食品組成物を摂食することでアディポネクチンの効果を得ることができることを示唆するものである。【００３７】
２．ヒトアディポネクチン発現イチゴの作出
（１）ヒトアディポネクチン人工合成遺伝子の作製
ヒトアディポネクチン遺伝子(NCBI Accession No.NM_004797)の翻訳領域(Position 85-816)（以下、hAdiとも記す）をコードするロングプライマーを人工合成し、オーバーラップ法にて当該遺伝子の翻訳領域を作製した。この人工合成遺伝子をTAクローニング法でpGEM-T vector(Promega)に導入してpGEM-bαLAを作出した。大腸菌の形質転換を通じて導入プラスミドpGEM-bαLAを回収し、これをシークエンス解析に供して遺伝子配列を同定した。【００３８】
（２）植物発現用ヒトアディポネクチン遺伝子の作製
次に、配列確認後のクローンpGEM-hAdiを鋳型に用いてアダプタープライマーによるPCRを行い、制限酵素認識配列およびタグ配列を付加した。即ち、5’末端側にBam HI、Xba I認識配列、3’末端側にHis-Tag(6xHis)、KDEL配列、終止コドン、ならびにSac I認識配列を持つ遺伝子を作製した。これをpGEM-T Vector(Promega)にクローニングし、pGEM-hAdi/His+KDELを得た。【００３９】
（３）ヒトアディポネクチン遺伝子の植物発現ベクターpBE2113への組み込み
植物発現ベクターpBE2113-GUS（Mitsuhara et al.(1996) Plant and Cell Physiology Vol.37, No.1, p49-59）を制限酵素Xba I・Sac Iで同時消化した後、CIAP処理を施した。一方、ヒトアディポネクチン遺伝子cDNA断片は、pGEM-hAdi/His+KDELを制限酵素Xba I・Sac Iで同時消化して当該遺伝子領域を切り出して回収した。これらベクター側とcDNA断片を混和してライゲース処理を行い、pBE-hAdiを作製した（図３）。【００４０】
なお、図３中の各略号は、夫々、次のとおりである：Pnos：ノパリン合成酵素  プロモーター、nptII：neomycin phosphotransferase II、Tnos：ノパリン合成酵素  ターミネーター、eP35S：カリフラワーモザイクウイルス  35Sプロモーター、H.Adiponectin：ヒトアディポネクチン遺伝子（配列番号１）、AdiFW1：AdiFW1プライマー（配列番号３）認識領域、AdiRV1：AdiRV1プライマー（配列番号４）認識領域、His tag：ヒスチジン・タグ、KDEL：小胞体保留シグナル。【００４１】
（４）イチゴ形質転換(Km耐性株の作出)
ヒトアディポネクチン遺伝子植物発現用ベクターpBE-hAdiを直接導入法にてアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404）に導入した。得られたカナマイシン（Km）耐性株（導入プラスミド確認済み）を用いてイチゴの形質転換試験を行った。Km添加培地を用いてカルス誘導と再分化を行い、Km耐性個体を選抜した。【００４２】
（５）イチゴ形質転換株（Km耐性株）におけるヒトアディポネクチン遺伝子の導入確認
ヒトアディポネクチン遺伝子両端部に設定した特異的プライマーAdiFW1（順方向プライマー）とAdiRV1（逆方向プライマー）を用い、ゲノミックPCRを行った。ゲノムDNAの抽出には核酸抽出キットMagExtractor-Plant Genome-(TOYOBO)を用い、核酸精製システムMagExtractor MFX-6100 (TOYOBO)を使用するプロトコールに準じて行った。PCR産物は、１．５％TBEアガロースゲルを用いた電気泳動により検出した。その結果、供試した２３個体のうち２１個体で目的の増幅断片(732bp)が検出され、遺伝子の導入が確認された（図４）。
AdiFW1プライマー配列：5’-ATGCTGTTGCTGGGAGCTGTTCTA-3’（配列番号３）
AdiRV1プライマー配列：5’-GGTGTCATGGTAGAGAAGAAAGCC-3’（配列番号４）【００４３】
（６）ヒトアディポネクチン高発現系統の選抜
Human Adiponectin/Acrp30 Immunoassay〈Quantikine〉(R&D Systems)を用い、添付のプロトコールに準じて、エライザ検定を行った。100系統の培養株（夫々、系統No.1〜系統No.100と記す）より葉組織を採取し、液体窒素存在下で粉末化した後、生重量の5倍量の磨砕用緩衝液 (リン酸カリウム緩衝液pH7.0 1％ Triton X-100, Protease inhibitor〈Roche Diagnostics GmbH；濃度 1tablet/25ml〉)を添加して得られた磨砕液の遠心上清を、検定試料として供試した。
その結果、200ng/gFW以上の発現量を示す株が確認された（図５）。なお、200ng/gFW以上の発現量があれば、標準的なイチゴの一果実（約10ｇ）で、母乳100ｍｌに含まれるアディポネクチン量が確保できる。【００４４】
（７）ウエスタンブロットによる発現確認
イチゴ発現ヒトアディポネクチンのタンパク解析を行うために、ウエスタンブロットを行った。イチゴ試料はエライザ検定と同様(前記（６）に記述)に調製したものを供した。還元剤(2-Me)を添加したLaemmliバッファー系でプレキャストゲルSDS-PAGE Mini 10％ (TEFCO)を用いてSDS-PAGEを行った後、分離したタンパク質をHybond-P (GE Healthcare, Inc.)へ転写した。得られたブロットをECL blocking agent (GE Healthcare,Inc.)でブロッキングし、１次抗体toshiteMouse anti-adiponectin, human monoclonal antibody (CHEMICON) 5,000倍希釈液を、２次抗体としてAnti- Mouse IgG-Peroxidase ,Goat(SIGMA)の10,000倍希釈液を反応させ、ECL plus Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare,Inc.)で検出した。
解析の結果、推定分子量(28kDa)の位置にバンドが確認され,ヒトアディポネクチンの葉組織における発現が確認された（図６）。【００４５】
（８）ヒトアディポネクチン高発現イチゴ系統果実における発現解析 
イチゴ果実におけるヒトアディポネクチンの発現および多量体形成の有無の確認を試みた。ヒトアディポネクチン高発現系統No．5（以下、単に系統No.5ともいう）を栽培し果実を採取した。イチゴ果実試料を液体窒素存在下で粉末化後、生重量の3倍量の磨砕用緩衝液 (リン酸カリウム緩衝液, pH7.0, 1% Triton X-100, Protease inhibitor〈Roche Diagnostics GmbH；濃度 1tablet/25ml〉)を添加して得られた磨砕液の遠心上清をタンパク抽出液とした。同試料に、Lammliサンプルバッファー（BIO-RAD)を添加し、タンパク量16.5μg/laneとなるように調整し、プレキャストゲルSDS-PAGE Mini 12%(TEFCO)を用いてSDS-PAGEを行い、前記（７）と同様のプロトコール(還元処理）でウエスタンブロットを行った。その結果、葉試料の場合と同様に、単量体の推定分子量である約28kDaの位置に2本のバンドが確認された（図７）。【００４６】
次に、多量体解析を目的として、還元剤を含まないサンプルバッファー (2%SDS, 20M Tris-HCl pH6.8, 10%Glycerol, 0.05%BPB, 0.05% XC)をタンパク質抽出液に添加した。タンパク量は16.5μg/laneに調整し、30分間インキュベートした後、熱処理を行わず、4-20％ gradient SDS gel(TEFCO)にてSDS-PAGEを行い、前記（７）と同様にウエスタンブロットを行った。その結果、単量体より大きな分子量域に複数のバンドが確認され、形質転換イチゴ果実においても多量体が形成されていることが示唆された（図７）。 【００４７】
以上の結果から、イチゴ発現ヒトアディポネクチンが多量体を形成していることが確認された。アディポネクチン分子は、体内で単量体ではなく、３量体、６量体、１２量体以上の多量体を形成しており、これらの多量体が活性型となることが推定されている。したがって、上記の結果は、前記形質転換イチゴ葉組織内で発現したヒトアディポネクチンもまた活性型であることを示唆するものである。【００４８】
３．PEPCKプロモーター−ルシフェラーゼを利用したアディポネクチンの評価系
アディポネクチンにより発現が抑制されるPEPCK(Phosphoenolpyruvate carboxykinase)のプロモーターとルシフェラーゼをレポーター遺伝子とした蛍光による活性測定系を構築した。活性測定系はレンチウイルスベクターシステムを活用した。ベクターを構成するプラスミドコンストラクト（パッケージングプラスミド、エンベロープ＆Rev プラスミドおよびSIN（Self  Inactivating)ベクタープラスミド）は既存のものを活用し、これに以下の改変を加えてアディポネクチン活性測定系を構築した。すなわち、エンベロープは、VSV（Vesicular Stomatitis virus）のG糖タンパク質に変換し、宿主域を広げたものを使用した。SINベクタープラスミドにおいては、プロモーター領域にマウスおよびヒトのPEPCKプロモーターを導入し（それぞれgenomic DNAより取得）、その下流にルシフェラーゼ遺伝子（ヒト型コドンに改変したGaussia Luciferase；GLuc）を組み込んだ。更に、GLuc下流には、薬剤選択性を付与するために、SV40プロモーターとハイグロマイシン耐性遺伝子を組み込んだ。上記レトロウイルスベクターを構築し、パッケージング細胞にトランスフェクトし、感染性ウイルス粒子を得た。【００４９】
このウイルスをアッセイ系細胞(Huh7)に感染させ、アディポネクチンを添加した場合のルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を図８に示す。
濃度依存性に発現抑制が起きることが確認できたことから、アディポネクチンの測定系として十分に利用できることが分かった。【００５０】
４．アディポネクチン経口投与（摂食）マウスにおけるＤＮＡマイクロアレイ試験
標準的な体型のマウスを用いて、下記の対照群および投与群を用意し、実験を行った。
対照群：イチゴ果実（非組換え体）
投与群：アディポネクチン発現イチゴ果実（凍結乾燥果実、アディポネクチン含量：４２μg/g乾燥重量）【００５１】
対照群および投与群は、マウス５匹（Balb/c、オス７週齢）を同一ゲージに入れ、１日６時間の自由採食（０．２ｇ（乾燥重量））で、連続５日間投与した。なお、投与群のマウス１匹あたりの摂食した形質転換イチゴ果実に含まれるアディポネクチン含量は、約８．４μｇ／１日と推定される。
各グループとも連続５日間の投与の後、最終投与後６時間後に脊髄脱臼した後、内臓（肝臓、脾臓、小腸）を摘出し、試料とした。各試料をＲＮＡＬａｔｅｒ(Ambion,Inc)に浸漬後、−８０℃に凍結した。凍結した試料からｍＲＮＡを抽出し、ＤＮＡマイクロアレイ解析をAffimetrix社Gene Chip（Mouse Genome 430 2.0、1-cycle target labeling プロトコール)を用いて行った。投与群と対照群とのデータを比較し、発現亢進、あるいは抑制が起きている遺伝子を同定した。【００５２】
投与群と対照群の遺伝子発現プロフィール比較をスキャッタープロットで示した（図９〜１１）。アディポネクチン受容体が存在する肝臓では、発現亢進（５倍以上）されたものは、１０遺伝子であり、発現抑制（１／５以下）されたものは５８遺伝子であった。
発現が亢進した遺伝子として、以下のものが認められた；parathyroid hormone receptor 2、sodium channel(voltage-gated)type II alpha 1、Chemokine (C-C motif) receptor 9、potassium voltage gated channel Shaw-related subfamily  member 3、tankyrase TRF1-interacting ankyrin-related ADP-ribose polymerase、thioredoxin-like 1、tumor necrosis factor receptor superfamily member 12a。【００５３】
また、発現が抑制された遺伝子として、以下のものが認められた；RAD51 associated protein 1、pleckstrin homology domain interacting protein、FAST kinase domains 3、tryptase beta 2、solute carrier family 35 member F2 、hemoglobin Z beta-like embryonic chain 、scrapie responsive gene 1、leucine rich repeat containing 34、coiled-coil domain containing 38、Nephronectin、calcium channel voltage-dependent N type alpha 1B subunit、interleukin 7 receptor、ST6-N-acetylgalactosaminide alpha-2,6-sialyltransferase 1、neurexophilin 1、cellular retinoic acid binding protein I、Adult male hippocampus cDNA、layilin、Eph receptor A7、secretory blood group 1、lysyl oxidase、serine peptidase inhibitor clade A member 1f、trophoblast glycoprotein、anaplastic lymphoma kinase、cytochrome P450 family 26 subfamily a polypeptide 1、zinc finger protein 352、synapsin II、Catenin alpha 1、RUN and TBC1 domain containing 2、kinesin family member 2C。【００５４】
その他の器官においては、脾臓では５０３遺伝子が、小腸では２３８遺伝子がそれぞれ発現亢進され、また脾臓では４１７遺伝子が、小腸では４遺伝子がそれぞれ発現抑制された。
以上のことから、アディポネクチンの摂食によって、極めて多数の遺伝子の発現状態に変化が起こり、なかでも糖代謝や摂食調整に関連した遺伝子発現においても変化が起こっていることが分かった。【００５５】
５．アディポネクチン経口投与（摂食）マウスにおけるペプチドマーカーアレイ（肥満関連）試験
前記４の対照群および投与群から血清を採取し、これをペプチドマーカーアレイ（肥満関係）に供した。ペプチドマーカーアレイは、PHOENIX Pharmaceuticals社製 Obesity Peptide Biomarker ArrayおよびObesity Biomarker Chip (Rat, Mouse)を用い、製造者のプロトコールに準じて解析を行った。【００５６】
ペプチドマーカーアレイ（肥満関係）解析の結果、全体的な傾向として、投与群において、糖代謝に関連するペプチド、摂食調整に関連したペプチドの挙動を確認した。代表的なものを表１（形質転換イチゴの摂食により向上）および表２（形質転換イチゴの摂食により減少）に示す。なお、表中のペプチドはいずれもＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information：URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）などの国際的なデータベースにより、そのペプチド配列、生体内での役割などについての情報が提供される。【００５７】
【表１】
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【００５８】
【表２】
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【００５９】
とくに、顕著な向上の見られたグレリン（Ghrelin）、ＮＰＹ（neuropeptide Y）などは、摂食亢進に関与するペプチドである。また、顕著な減少の見られたACTHなどは、摂食抑制に関与するペプチドである。
以上のことから、アディポネクチンの摂食によって、糖代謝や摂食調整に関連したペプチドの挙動に変化が起こり、摂食した個体において摂食調整作用が生じると考えられる。【００６０】
６．アディポネクチン経口投与（摂食）マウスの血液における生化学的解析
標準的な体型のマウスを用いて、下記Ａ〜Ｃの各グループを用意し、実験を行った。
Ａ：通常飼料＋ヒトアディポネクチン発現イチゴ果実
Ｂ：通常飼料＋非組換えイチゴ果実
Ｃ：通常飼料（対照）【００６１】
各グループは、マウス１４匹（Ｂａｌｂ／ｃ、オス７週齢）を同一ゲージに入れ、１日６時間の自由採食で１０日間あるいは２０日間投与した。なお、グループＡおよびＢは、通常飼料にイチゴホモジネートを添加した（２ｍｌ／匹相当量）。グループＡのヒトアディポネクチン発現イチゴ果実のホモジネートには、１．２μｇ／２ｍｌの組換えアディポネクチンを含む。投与１０日後に５匹のマウスより、投与２０日後に残り９匹のマウスより、それぞれ最終投与後６時間後に血清を採取し、当該血清中のグルコース含量を測定した。【００６２】
血清中のグルコース含量を図１２に示した。通常飼料＋ヒトアディポネクチン発現イチゴを投与したグループＡのグルコース含量が投与１０日後及び２０日後共に、他のグループと比較して最も低い値を示した。この結果より、イチゴにて発現した組換えヒトアディポネクチンの経口投与により、血糖値が低下促進されることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明において、アディポネクチンを含有する食品組成物を摂食した場合、摂食亢進をもたらすなど摂食調整が可能である。とくにアディポネクチンの摂食により、グレリン分泌促進による摂食亢進効果は、本発明に関する研究の中で見出された新たな知見である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年11月29日(2010.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アディポネクチンを有効成分として含有する、経口用摂食調整剤。
【請求項２】
アディポネクチンを発現する形質転換体を含有する、請求項１に記載の経口用摂食調整剤。
【請求項３】
アディポネクチンを発現する形質転換体が、
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、または、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアディポネクチン活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
からなる遺伝子を導入した形質転換体である、請求項２に記載の経口用摂食調整剤。
【請求項４】
アディポネクチンを発現する形質転換体が、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアディポネクチン活性を有するポリペプチド
をコードする遺伝子を導入した形質転換体である、請求項２に記載の経口用摂食調整剤。
【請求項５】
アディポネクチンを発現する形質転換体の可食性組織を含有する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の経口用摂食調整剤。
【請求項６】
可食性組織が生食可能である請求項５に記載の経口用摂食調整剤。
【請求項７】
形質転換体が、形質転換植物である、請求項２〜６のいずれか一項に記載の経口用摂食調整剤。
【請求項８】
アディポネクチンが、形質転換植物において発現したものである、請求項７に記載の経口用摂食調整剤。
【請求項９】
形質転換植物において発現したアディポネクチン以外の動物由来成分を含有しない、請求項８に記載の経口用摂食調整剤。
【請求項１０】
形質転換植物において発現したアディポネクチン以外は植物由来成分である、請求項９に記載の経口用摂食調整剤。
【請求項１１】
植物がイチゴであり、可食性組織がイチゴ果実である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の経口用摂食調整剤。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の経口用摂食調整剤を含有する、摂食調整用食品組成物。
【請求項１３】
アディポネクチンを発現する形質転換体の、経口用摂食調整剤の製造における使用。
【請求項１４】
アディポネクチンを発現する形質転換体が、
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、または、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアディポネクチン活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
からなる遺伝子を導入した形質転換体である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
アディポネクチンを発現する形質転換体が、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアディポネクチン活性を有するポリペプチド
をコードする遺伝子を導入した形質転換体である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
形質転換体が、形質転換植物である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
植物がイチゴである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
アディポネクチンを有効成分として含有する経口用摂食調整剤の製造方法であって、アディポネクチンを発現する形質転換体イチゴ果実を凍結磨砕またはジュース化する工程を含む、前記製造方法。
【請求項１９】
収穫した形質転換体イチゴ果実を１バッチ毎に凍結磨砕またはジュース化する、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
非組換えイチゴ果実を混合し、アディポネクチン含有量を調整する工程を含む、請求項１８または１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
形質転換体イチゴが、
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、または、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアディポネクチン活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
からなる遺伝子を導入した形質転換体である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２２】
アディポネクチンを発現する形質転換体が、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアディポネクチン活性を有するポリペプチド
をコードする遺伝子を導入した形質転換体である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２３】
アディポネクチンを有効成分として含有する、経口用摂食調整用飼料。
【請求項２４】
アディポネクチンを発現する形質転換体を含有する、請求項２３に記載の飼料。
【請求項２５】
アディポネクチンを発現する形質転換体が、
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、または、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアディポネクチン活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
からなる遺伝子を導入した形質転換体である、請求項２３または２４に記載の飼料。
【請求項２６】
アディポネクチンを発現する形質転換体が、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアディポネクチン活性を有するポリペプチド
をコードする遺伝子を導入した形質転換体である、請求項２３または２４に記載の飼料。
【請求項２７】
形質転換体が、形質転換体イチゴである、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の飼料。
【国際調査報告】
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2010087243.tif 000019
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