(57)【要約】  本発明の課題は、蛍光色素集積粒子１粒子当たりの輝度変動及び対象標本に対する蛍光色素集積粒子の付着数変動の両者の影響を受けることなく、生体物質を定量解析可能とすることである。蛍光色素集積粒子を用いて染色された対象標本における特定の生体物質の発現量を定量する生体物質定量方法において、対象標本を撮像して得られた第１蛍光画像を入力する入力工程、第１蛍光画像から輝点部を抽出し、輝点部の輝度値である第１輝度値を算出する輝度算出工程、第１輝度値、予め特定の生体物質の発現量が計測された標準標本を撮像して得られた第２蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値である第２輝度値、及び蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第３蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値である第３輝度値の分布を用いて、第１蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出工程、を備える。
2019078230.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された対象標本における、前記特定の生体物質の発現量を定量する生体物質定量方法において、
前記対象標本を撮像して得られた第１蛍光画像を入力する入力工程と、
前記第１蛍光画像から輝点部を抽出し、前記輝点部の輝度値である第１輝度値を算出する輝度算出工程と、
前記第１輝度値、予め前記特定の生体物質の発現量が計測された標準標本を撮像して得られた第２蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値である第２輝度値、及び蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第３蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値である第３輝度値の分布を用いて、前記第１蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出工程と、
を備える生体物質定量方法。
【請求項２】
前記輝点部は、前記蛍光色素集積粒子が存在する領域であり、
前記第１輝度値は、第１蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第１輝度積算値であり、
前記第２輝度値は、第２蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第２輝度積算値であり、
前記第３輝度値は、第３蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第３輝度積算値である
請求項１に記載の生体物質定量方法。
【請求項３】
前記粒子数算出工程は、
前記第３蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第３輝度積算値の分布から前記蛍光色素集積粒子１粒子当たりの単位輝度値を算出する単位輝度値算出工程と、
前記第１輝度積算値及び前記単位輝度値を用いて、前記第１蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を算出する暫定粒子数算出工程と、
前記第２輝度積算値を用いて、前記第１蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を補正する粒子数補正工程と、を含む
請求項２に記載の生体物質定量方法。
【請求項４】
前記粒子数算出工程は、
前記第３蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第３輝度積算値の分布から前記蛍光色素集積粒子１粒子当たりの単位輝度値を算出する単位輝度値算出工程と、
前記単位輝度値と、所定の条件下で予測される前記蛍光色素集積粒子１粒子当たりの基準輝度値との比較に基づいて、前記第１蛍光画像及び前記第２蛍光画像の撮像時における露光時間を算出する露光時間算出工程と、
前記第１輝度積算値及び前記基準輝度値を用いて、前記第１蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を算出する暫定粒子数算出工程と、
前記第２輝度積算値を用いて、前記第１蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を補正する粒子数補正工程と、を含み、
前記第１蛍光画像及び前記第２蛍光画像は、前記露光時間算出工程により算出された露光時間により撮影された画像である
請求項２に記載の生体物質定量方法。
【請求項５】
前記粒子数補正工程は、
前記第２輝度積算値を用いて算出された前記第２蛍光画像における前記輝点部に結合する蛍光色素集積粒子数と、所定の条件下で予測される前記輝点部に結合する基準蛍光色素集積粒子数との比から算出される粒子数補正係数を用いて補正する
請求項３又は４に記載の生体物質定量方法。
【請求項６】
前記単位輝度値算出工程は、
最頻値となる第３輝度積算値を前記単位輝度値として算出する請求項３から５のいずれか一項に記載の生体物質定量方法。
【請求項７】
前記対象標本は、発光波長が異なり、各々の発光波長に対応する複数のフィルターを用いて撮像可能な複数種類の蛍光色素集積粒子を用いて染色され、
一の蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布され、前記複数のフィルターの各々を用いて撮像された複数の第３蛍光画像間の輝度比から算出されるクロストーク補正係数を用いて、当該蛍光色素集積粒子が対応しないフィルターを介して撮像されたクロストークを除去するクロストーク除去工程を含む
請求項１から６のいずれか一項に記載の生体物質定量方法。
【請求項８】
特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された対象標本における、前記特定の生体物質の発現量を定量する画像処理装置において、
前記対象標本を撮像して得られた第１蛍光画像を入力する入力手段と、
前記第１蛍光画像から輝点部を抽出し、前記輝点部の輝度値の積算値である第１輝度積算値を算出する輝度算出手段と、
前記第１輝度積算値、予め前記特定の生体物質の発現量が計測された標準標本を撮像して得られた第２蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第２輝度積算値、及び蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第３蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第３輝度積算値の分布を用いて、前記第１蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出手段と、
を備える画像処理装置。
【請求項９】
特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された対象標本における、前記特定の生体物質の発現量を定量するコンピューターを、
前記対象標本を撮像して得られた第１蛍光画像を入力する入力手段、
前記第１蛍光画像から輝点部を抽出し、前記輝点部の輝度値の積算値である第１輝度積算値を算出する輝度算出手段、
前記第１輝度積算値、予め前記特定の生体物質の発現量が計測された標準標本を撮像して得られた第２蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第２輝度積算値、及び蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第３蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第３輝度積算値の分布を用いて、前記第１蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出手段、
として機能させるためのプログラム。
【請求項１０】
請求項８に記載の画像処理装置と、
前記第１蛍光画像、前記第２蛍光画像及び前記第３蛍光画像を取得する画像取得装置を備える病理診断支援システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラムに関し、特に病理診断に用いられる画像処理に関する。
【背景技術】
【０００２】
病理診断において、組織切片で過剰発現をしている生体物質の発現量を定量することは、予後の予測やその後の治療計画を決める上で非常に重要な情報となり得る。こうした生体物質の定量においては、組織切片内に設定した解析対象領域である関心領域内における特定の生体物質の発現量を解析することから、生体物質の定量及び関心領域の抽出を正確に行うことができる手法の開発が望まれている。【０００３】
従来、蛍光色素集積粒子を用いて特定タンパクを染色した組織標本を撮像した蛍光画像から蛍光輝点を抽出し、輝点数を計測することで生体物質の定量評価を行う方法が用いられている。しかしながら、蛍光画像上では一つの輝点に見えていても、実際には複数の蛍光色素集積粒子が集積している場合があり、単純に輝点数を計測するのみでは正確な定量は難しい。
そこで、例えば特許文献１には、上記の方法と同様に蛍光画像から蛍光輝点を抽出し、蛍光色素集積粒子１粒子当たりの平均輝度値に基づいて、各輝点に含まれる粒子数を算出する方法が記載されている。特許文献１に記載の方法では、各輝点の輝度値を算出して、最頻値となる輝度値を蛍光色素集積粒子１粒子当たりの平均輝度値として用いている。【０００４】
しかし、輝度値は蛍光色素集積粒子１粒子ごとの輝度の違いや光源強度の違い、顕微鏡個体差、蛍光色素集積粒子作成条件の違い、対象となる組織切片等の染色条件の違い等によって変動するため、定量の精度を向上させるためにはこれらの要因による輝度変動を補正する必要がある。このような課題に対し、蛍光検出装置の感度校正を行う方法や（例えば、特許文献２参照）、励起光源の強度及び顕微鏡固有因子に関する標準化を行う方法（例えば、特許文献３参照）によって、輝度変動の補正が行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開２０１２／０２９３４２号
【特許文献２】特開２００４−１５７０１８号公報
【特許文献３】特許第５５９３２２１号
【特許文献４】国際公開２０１６／１２９０６１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一方で、対象標本に付着する蛍光色素集積粒子数は、蛍光色素集積粒子の表面修飾条件、対象となる組織切片等の染色条件や腑活化処理条件等の違いによって変動する。特許文献２及び特許文献３の方法では、このような付着数の変動には対応できない。
そこで、例えば特許文献４には、タンパク質の発現量が明らかな培養細胞を標準標本として対象標本と同じ条件下で観察を行い、蛍光輝点数の違いから標準標本における生体物質の発現量を算出する方法が開示されている。これにより、染色条件等の変動要因に影響されることなく定量評価することができる。
しかしながら、特許文献４の方法では、蛍光色素集積粒子１粒子当たりの輝度値が明らかではないため、例えば蛍光色素集積粒子の輝度が著しく低下する場合に、そもそも輝点を抽出することができないなど、標準標本における生体物質の発現量を算出することが困難となる。【０００７】
本発明は上記課題を鑑みてなされたものであり、蛍光色素集積粒子１粒子当たりの輝度変動及び対象標本に対する蛍光色素集積粒子の付着数変動の両者の影響を受けることなく、生体物質を定量解析可能な生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、請求項１に記載の生体物質定量方法は、
特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された対象標本における、前記特定の生体物質の発現量を定量する生体物質定量方法において、
前記対象標本を撮像して得られた第１蛍光画像を入力する入力工程と、
前記第１蛍光画像から輝点部を抽出し、前記輝点部の輝度値である第１輝度値を算出する輝度算出工程と、
前記第１輝度値、予め前記特定の生体物質の発現量が計測された標準標本を撮像して得られた第２蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値である第２輝度値、及び蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第３蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値である第３輝度値の分布を用いて、前記第１蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出工程と、
を備えることを特徴とする。【０００９】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の生体物質定量方法において、
前記輝点部は、前記蛍光色素集積粒子が存在する領域であり、
前記第１輝度値は、第１蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第１輝度積算値であり、
前記第２輝度値は、第２蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第２輝度積算値であり、
前記第３輝度値は、第３蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第３輝度積算値である
ことを特徴とする。【００１０】
請求項３に記載の発明は、請求項２に記載の生体物質定量方法において、
前記粒子数算出工程は、
前記第３蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第３輝度積算値の分布から前記蛍光色素集積粒子１粒子当たりの単位輝度値を算出する単位輝度値算出工程と、
前記第１輝度積算値及び前記単位輝度値を用いて、前記第１蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を算出する暫定粒子数算出工程と、
前記第２輝度積算値を用いて、前記第１蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を補正する粒子数補正工程と、を含む
ことを特徴とする。【００１１】
請求項４に記載の発明は、請求項２に記載の生体物質定量方法において、
前記粒子数算出工程は、
前記第３蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第３輝度積算値の分布から前記蛍光色素集積粒子１粒子当たりの単位輝度値を算出する単位輝度値算出工程と、
前記単位輝度値と、所定の条件下で予測される前記蛍光色素集積粒子１粒子当たりの基準輝度値との比較に基づいて、前記第１蛍光画像及び前記第２蛍光画像の撮像時における露光時間を算出する露光時間算出工程と、
前記第１輝度積算値及び前記基準輝度値を用いて、前記第１蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を算出する暫定粒子数算出工程と、
前記第２輝度積算値を用いて、前記第１蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の暫定数を補正する粒子数補正工程と、を含み、
前記第１蛍光画像及び前記第２蛍光画像は、前記露光時間算出工程により算出された露光時間により撮影された画像である
ことを特徴とする。【００１２】
請求項５に記載の発明は、請求項３又は４に記載の生体物質定量方法において、
前記粒子数補正工程は、
前記第２輝度積算値を用いて算出された前記第２蛍光画像における前記輝点部に結合する蛍光色素集積粒子数と、所定の条件下で予測される前記輝点部に結合する基準蛍光色素集積粒子数との比から算出される粒子数補正係数を用いて補正する
ことを特徴とする。【００１３】
請求項６に記載の発明は、請求項３から５のいずれか一項に記載の生体物質定量方法において、
前記単位輝度値算出工程は、
最頻値となる第３輝度積算値を前記単位輝度値として算出することを特徴とする。【００１４】
請求項７に記載の発明は、請求項１から６のいずれか一項に記載の生体物質定量方法において、
前記対象標本は、発光波長が異なり、各々の発光波長に対応する複数のフィルターを用いて撮像可能な複数種類の蛍光色素集積粒子を用いて染色され、
一の蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布され、前記複数のフィルターの各々を用いて撮像された複数の第３蛍光画像間の輝度比から算出されるクロストーク補正係数を用いて、当該蛍光色素集積粒子が対応しないフィルターを介して撮像されたクロストークを除去するクロストーク除去工程を含む
ことを特徴とする。【００１５】
請求項８に記載の画像処理装置は、
特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された対象標本における、前記特定の生体物質の発現量を定量する画像処理装置において、
前記対象標本を撮像して得られた第１蛍光画像を入力する入力手段と、
前記第１蛍光画像から輝点部を抽出し、前記輝点部の輝度値の積算値である第１輝度積算値を算出する輝度算出手段と、
前記第１輝度積算値、予め前記特定の生体物質の発現量が計測された標準標本を撮像して得られた第２蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第２輝度積算値、及び蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第３蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第３輝度積算値の分布を用いて、前記第１蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出手段と、
を備えることを特徴とする。【００１６】
請求項９に記載のプログラムは、
特定の生体物質に結合可能な蛍光色素集積粒子を用いて染色された対象標本における、前記特定の生体物質の発現量を定量するコンピューターを、
前記対象標本を撮像して得られた第１蛍光画像を入力する入力手段、
前記第１蛍光画像から輝点部を抽出し、前記輝点部の輝度値の積算値である第１輝度積算値を算出する輝度算出手段、
前記第１輝度積算値、予め前記特定の生体物質の発現量が計測された標準標本を撮像して得られた第２蛍光画像において抽出された輝点部の輝度値の積算値である第２輝度積算値、及び蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布されたプレパラートを撮像して得られた第３蛍光画像において蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点部毎の輝度値を積算した第３輝度積算値の分布を用いて、前記第１蛍光画像において抽出された輝点部に含まれる蛍光色素集積粒子の数を算出する粒子数算出手段、
として機能させる。【００１７】
請求項１０に記載の病理診断支援システムは、
請求項８に記載の画像処理装置と、
前記第１蛍光画像、前記第２蛍光画像及び前記第３蛍光画像を取得する画像取得装置を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、蛍光色素集積粒子１粒子当たりの輝度変動及び対象標本に対する蛍光色素集積粒子の付着数変動の両者の影響を受けることなく、生体物質を定量解析可能な生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の生体物質定量方法を用いた病理診断支援システムのシステム構成を示す図である。
【図２】図１の画像処理装置の機能的構成を示すブロック図である。
【図３】図２の制御部により実行される第１実施形態に係る画像解析処理を示すフローチャートである。
【図４Ａ】第３蛍光画像の一例を示す図である。
【図４Ｂ】第３輝点領域画像の一例を示す図である。
【図５】輝度分布曲線の一例である。
【図６】図２の制御部により実行される第２実施形態に係る輝度値補正処理を示すフローチャートである。
【図７】図２の制御部により実行される第２実施形態に係る粒子数補正処理を示すフローチャートである。
【図８】図２の制御部により実行される第３実施形態に係るクロストーク除去処理を示すフローチャートである。
【図９】図２の制御部により実行される第３実施形態に係る輝度値・粒子数補正処理を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
[第１実施形態]
以下、図面を参照して本発明を実施するための第１実施形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００２１】
＜病理診断支援システム１００の構成＞
図１に、本発明の組織評価方法を用いた病理診断支援システム１００の全体構成例を示す。病理診断支援システム１００は、所定の染色試薬で染色された組織標本の顕微鏡画像を取得し、取得された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織標本における特定の生体物質の発現を定量的に表す特徴量を出力するシステムである。
病理診断支援システム１００は、図１に示すように、顕微鏡画像取得装置１Ａと、画像処理装置２Ａと、がケーブル３Ａ等のインターフェースを介してデータ送受信可能に接続されて構成されている。なお、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２Ａとの接続方式は特に限定されない。例えば、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２ＡはLAN（Local  Area  Network）により接続されることとしてもよいし、無線により接続される構成としてもよい。また、病理診断支援システム１００は、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２Ａが一体に形成された装置でもよい。また、外部の任意の装置を用いて取得した画像をHDD、CD、DVD等のストレージを用いて画像処理装置に入力してもよい。
【００２２】
顕微鏡画像取得装置１Ａは、公知のカメラ付き光学顕微鏡であり、スライド固定ステージ上に載置されたスライド上の組織標本の顕微鏡画像を取得するものであって画像取得装置として機能する。
顕微鏡画像取得装置１Ａは、照射手段、結像手段、撮像手段、通信Ｉ／Ｆ等を備えて構成されている。照射手段は、光源、フィルター等により構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の組織標本に光を照射する。結像手段は、接眼レンズ、対物レンズ等により構成され、照射した光によりスライド上の組織標本から発せられる透過光、反射光、又は蛍光を結像する。撮像手段は、CCD(Charge  Coupled  Device)センサー等を備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して顕微鏡画像のデジタル画像データを生成する顕微鏡設置カメラである。通信Ｉ／Ｆは、生成された顕微鏡画像の画像データを画像処理装置２Ａに送信する。
【００２３】
画像処理装置２Ａは、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された顕微鏡画像（明視野画像及び蛍光画像）を解析することにより、観察対象の組織標本における特定の生体物質の発現分布を算出する。
画像処理装置２Ａは、図２に示すように、制御部２１、操作部２２、表示部２３、通信Ｉ／Ｆ２４、記憶部２５等を備えて構成され、各部はバス２６を介して接続されている。
【００２４】
制御部２１は、CPU（Central  Processing  Unit）、RAM（Random  Access  Memory）等を備えて構成され、記憶部２５に記憶されている各種プログラムとの協働により各種処理を実行し、画像処理装置２Ａの動作を統括的に制御する。例えば、制御部２１は、記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により画像解析処理を実行し、輝度算出工程、粒子数算出工程、単位輝度値算出工程、暫定粒子数算出工程、粒子数補正工程、露光時間算出工程、及びクロストーク除去工程を実行する手段としての機能を実現する。
操作部２２は、文字入力キー、数字入力キー、及び各種機能キー等を備えたキーボードと、マウス等のポインティングデバイスを備えて構成され、キーボードで押下操作されたキーの押下信号とマウスによる操作信号とを、入力信号として制御部２１に出力する。
表示部２３は、例えば、CRT（Cathode  Ray  Tube）やLCD（Liquid  Crystal  Display）等のモニタを備えて構成されており、制御部２１から入力される表示信号の指示に従って、各種画面を表示する。本実施形態において、表示部２３は、例えば、画像解析結果を出力するための出力手段として機能する。
通信Ｉ／Ｆ２４は、顕微鏡画像取得装置１Ａをはじめとする外部機器との間でデータ送受信を行なうためのインターフェースである。通信Ｉ／Ｆ２４は、入力工程を実行する手段として機能する。
記憶部２５は、例えばHDD（Hard  Disk  Drive）や半導体の不揮発性メモリー等で構成されている。記憶部２５には、前述のように各種プログラムや各種データ等が記憶されている。
その他、画像処理装置２Ａは、LANアダプターやルーター等を備え、LAN等の通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。
【００２５】
＜組織標本からの画像の取得＞
ここで、本発明に係る、目的生体物質定量の対象となる組織標本（対象標本）の準備について、染色試薬及び染色方法も含めて詳細に説明する。
【００２６】
（１）目的生体物質
本発明に係る組織標本は、目的生体物質を染色可能な蛍光色素集積粒子を含む染色試薬により染色されている。目的生体物質とは、組織切片に発現している生体物質、特にタンパク質（抗原）である。典型的な目的生体物質としては、各種の癌組織の細胞膜で発現しており、バイオマーカーとして利用することができる生体物質（例えば、ＨＥＲ２タンパク質等）が挙げられる。
【００２７】
（２）蛍光色素集積粒子
本発明に係る蛍光色素集積粒子とは、励起光の照射を受けて蛍光発光するナノサイズの粒子であって、目的生体物質を１分子ずつ輝点として表すのに十分な強度の蛍光を発光しうる粒子である。
蛍光色素集積粒子の発光波長は、蛍光顕微鏡の撮像素子の感度域内であれば任意である。具体的には、発光波長が４００〜７００ｎｍであることが好ましい。
【００２８】
蛍光色素集積粒子の平均粒径は特に限定されないが、粒径が大きいものは抗原にアクセスしにくく、粒径が小さく輝度値が低いものは発する蛍光がバックグラウンドノイズ（カメラのノイズや細胞の自家蛍光）に埋もれてしまうことから、２０〜２００ｎｍ程度のものが好適である。
また、粒径の変動係数が１５％以下であることが好ましい。蛍光色素集積粒子の粒径のばらつきが小さいことにより、１粒子当たりの蛍光の輝度値がほぼ一定となるため定量精度が高まる。
平均粒径は、走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径として求めた。本願においては、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
【００２９】
蛍光色素集積粒子は、有機物または無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光色素がその中に内包されている及び／又はその表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である。
蛍光色素集積粒子としては、母体と蛍光色素とが、互いに反対の電荷を有する置換基または部位を有し、静電的相互作用が働くものであることが好適である。
【００３０】
（２．１）母体
母体のうち、有機物としては、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂、フラン樹脂など、一般的に熱硬化性樹脂に分類される樹脂；スチレン樹脂、アクリル樹脂、アクリロニトリル樹脂、ＡＳ樹脂（アクリロニトリル−スチレン共重合体）、ＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル−スチレン−アクリル酸メチル共重合体）など、一般的に熱可塑性樹脂に分類される樹脂；ポリ乳酸等のその他の樹脂；多糖を例示することができる。
母体のうち、無機物としては、シリカ、ガラスなどを例示することができる。
特に、メラミン樹脂を母体として用いると、シリカ等を用いる場合に比べて粒径のバラつきを抑えることができるため、好適である。
【００３１】
（２．２）蛍光色素集積粒子
蛍光色素集積粒子とは、蛍光色素が上記母体の中に内包されている、及び／又はその表面に吸着している構造を有する。
蛍光色素としては、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などを例示することができる。
蛍光色素としては、Alexa  Fluor（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、BODIPY（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Cy（登録商標、GEヘルスケア社製）系色素分子、HiLyte（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、DyLight（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ATTO（登録商標、ATTO-TEC社製）系色素分子、MFP（登録商標、Mobitec社製）系色素分子、CF（登録商標、Biotium社製）系色素分子、DY（登録商標、DYOMICS社製）系色素分子、CAL（登録商標、BioSearch  Technologies社製）系色素分子などを用いることができる。
なお、蛍光色素が母体に内包されている場合、蛍光色素は母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
【００３２】
（２．３）量子ドット集積粒子
本発明においては、蛍光色素集積粒子として量子ドット集積粒子を用いてもよい。
量子ドット集積粒子とは、量子ドットが上記母体の中に内包されている、および／またはその表面に吸着している構造を有する。
量子ドットとしては、ＩＩ−ＶＩ族化合物、ＩＩＩ−Ｖ族化合物またはＩＶ族元素を含有する半導体ナノ粒子が使用される。たとえば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅなどが挙げられる。
量子ドットが母体に内包されている場合、量子ドットは母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
【００３３】
（３）染色試薬（抗体−蛍光色素集積粒子の結合体）
染色試薬は、目的生体物質の１つに対して、蛍光色素集積粒子の１つが結合するように設計される。
免疫染色に用いる染色試薬（免疫染色剤）の場合は、蛍光標識の効率を向上させて蛍光の劣化につながる時間経過をなるべく抑えるために、一次抗体および蛍光色素集積粒子が間接的に、つまり抗原抗体反応などを利用した、共有結合以外の結合によって連結される複合体を用いることが好ましい。染色操作を簡便にするため、免疫染色剤として、一次抗体または二次抗体に蛍光色素集積粒子が直結している複合体を用いることもできる。
【００３４】
免疫染色剤の一例として、［目的生体物質に対する一次抗体］…［一次抗体に対する抗体（二次抗体）］〜［蛍光色素集積粒子］が挙げられる。
“…”は抗原抗体反応により結合していることを表し、“〜”が示す結合の態様としては特に限定されず、たとえば、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、抗原抗体結合、ビオチンアビジン反応、物理吸着、化学吸着などが挙げられ、必要に応じてリンカー分子を介していてもよい。
【００３５】
一次抗体としては、目的生体物質を抗原として特異的に認識して結合する抗体を用いる。例えば、HER2を目的生体物質とする場合は抗HER2抗体を、HER3を目的生体物質とする場合は抗HER3抗体を、それぞれ用いる。
二次抗体には、一次抗体を抗原として特異的に認識して結合する抗体を用いる。
抗体を産生する動物（免疫動物）の種類は特に限定されるものではなく、従来と同様、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどから選択する。
【００３６】
（４）組織標本の染色方法
以下、組織標本の染色方法の一例について、パラフィン包埋された組織切片（以下、単に「切片」ともいう。）を染色する場合を例にとって説明するが、本発明に係る組織標本は、針生検により取得した標本等から任意のものを用いて良い。
【００３７】
（４．１）標本作製工程
（４．１．１）脱パラフィン処理
キシレンを入れた容器に、切片を浸漬させ、パラフィン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
次いで、エタノールを入れた容器に切片を浸漬させ、キシレン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
次いで、水を入れた容器に、切片を浸漬させ、エタノール除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
【００３８】
（４．１．２）賦活化処理
公知の方法に倣い、目的生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭのEDTA溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。
pH条件は用いる組織切片に応じてｐＨ２．０〜１３．０の範囲から、シグナルが出て、組織の荒れがシグナルを評価できる程度となる条件で行う。通常はｐＨ６．０〜８．０で行うが、特殊な組織切片ではたとえばｐＨ３．０でも行う。
加熱機器はオートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではなく、温度は５０〜１３０℃、時間は５〜３０分で行うことができる。室温で行うこともできる。
次いで、PBSを入れた容器に、賦活処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でPBSを交換してもよい。
【００３９】
（４．２）免疫染色工程
免疫染色工程では、目的生体物質を染色するために、目的生体物質に直接的または間接的に結合しうる部位を有する蛍光色素集積粒子を含む免疫染色剤の溶液を切片に乗せ、目的生体物質との反応を行う。免疫染色工程に用いる免疫染色剤の溶液については、この工程の前にあらかじめ調製しておけばよい。
免疫染色工程を行う上での条件、すなわち免疫染色剤の溶液に組織標本を浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
上述したような処理を行う前に、BSA含有PBSなど公知のブロッキング剤やTween20などの界面活性剤を滴下することが好ましい。
【００４０】
（４．３）標本後処理工程
免疫染色工程を終えた組織標本は、観察に適したものとなるよう、固定化・脱水、透徹、封入などの処理を行うことが好ましい。
固定化・脱水処理は、組織標本を固定処理液（ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノールなどの架橋剤）に浸漬すればよい。透徹処理は、固定化・脱水処理を終えた組織標本を透徹液（キシレンなど）に浸漬すればよい。封入処理は、透徹処理を終えた組織標本を封入液に浸漬すればよい。
これらの処理を行う上での条件、たとえば組織標本を所定の処理液に浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
【００４１】
（４．４）形態観察染色工程
免疫染色工程とは別に、明視野において細胞、組織、臓器などの形態の観察を容易にするための形態観察染色を行う。形態観察染色工程は、公知の任意の方法に従って行うことができ、免疫染色工程の前又は後の何れに行ってもよい。
組織標本の形態観察に関しては、細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤〜濃赤色に染色される、エオジンを用いた染色が標準的に用いられている。細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色〜淡青色に染色される、ヘマトキシリンを用いた染色も標準的に用いられている（これら２つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）として知られている）。
【００４２】
＜標準標本からの画像の取得＞
次に、細胞へ付着する蛍光色素集積粒子数の補正に用いられる、標準標本の準備について説明する。
以下、市販されているスライドガラス等の基材上に培養され、目的生体物質を発現する培養細胞を標準標本とする場合を例にとり説明する。
【００４３】
（１）目的生体物質の定量
標準標本として用いる培養細胞から、目的生体物質の濃度を定量する。目的生体物質の定量は、例えばＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット等、周知の任意の方法により行うことができ、一細胞当たりの目的生体物質の濃度が算出可能である。なお、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットによれば、所定の溶液中に溶解した細胞から目的生体物質を定量可能であり、また、フローサイトメトリーによれば、所定の溶液中に分散させた細胞に対してレーザー光を用いて光散乱や蛍光測定を行うことにより、一細胞当たりの生体分子の検出や定量が可能である。
【００４４】
（２）標準標本の染色
まず、目的生体物質を定量した培養細胞と均一な品質である同一ロットの培養細胞を標準標本として選択する。選択する標準標本の種類数は任意であるが、標準標本の計測結果に基づく検量線を作成して制度の高い定量結果を得るために、予め定量された目的生体物質濃度の差が大きな、複数種類の標準標本を用いることが好ましい。
培養細胞に対して、組織切片の染色と同一条件下で免疫染色及び形態観察染色を行い、標準標本を得る。これらの染色方法は、組織切片の染色方法（上記（４．２）免疫染色工程、及び（４．４）形態観察染色工程）と同様であるため、詳細な説明は省略する。なお、同一条件で染色するとは、例えば、一人の操作者が、同じロットの染色試薬を用いて染色を行い、かつ、染色における各行程の所要時間、温度及び湿度がほぼ一定であることを示す。一人の操作者が、同じロットの染色試薬を用いて、標準標本及び組織標本の染色作業を並行して順次行うこととすれば、染色条件を容易に同一にすることができるため、好ましい。
【００４５】
＜蛍光色素集積粒子散布プレパラートの作製＞
次に、蛍光色素集積粒子１粒子当たりの平均輝度値算出に用いられる蛍光色素集積粒子散布プレパラートについて説明する。
以下、蛍光色素集積粒子散布プレパラートの作製工程を具体的に説明するが、本発明の蛍光色素集積粒子散布プレパラートは、上述した蛍光色素集積粒子が凝集しないように散布されたものであれば任意である。
【００４６】
［作製方法］
（１）任意の平均粒径（例えば１５０ｎｍ）の蛍光色素集積粒子を準備する。
（２）蛍光色素集積粒子をPBSで希釈して、濃度０．００５ｎＭの蛍光色素集積粒子液を作製する。
（３）スライドガラスを準備する。
（４）スライドガラス上に蛍光色素集積粒子液７．５ｕＬを滴下して、滴下面積が直径5.0mmの円と同程度になるようにする。
（５）１０分間静置する。
（６）純水を入れた３００mLビーカーにスライドガラスを漬けて洗浄する。
（７）スライドガラスを染色かごに嵌め、流水で１０分間洗浄する。
（８）染色かごを水から上げ、脱水のためにエタノール相を３相、キシレン置換のためにキシレン相を３相通す。
（９）スライドガラスをキシレン系封入剤（マリノール）で封入する。
【００４７】
上記作製方法では、例えば蛍光色素集積粒子液の濃度を変更することにより、蛍光色素集積粒子の密度を制御することが可能である。蛍光色素集積粒子散布プレパラートにおける粒子密度は、好ましくは１０６個／ｍｍ２以下である。
【００４８】
なお、標準標本と散布蛍光色素集積粒子は、同一スライド上に作成して、コントロールスライドとしてもよい。この場合には、スライドを交換する作業を省くことができるため、効率的である。本実施形態では、両者を同一スライド上に作成したコントロールスライドを解析に用いるものとする。
【００４９】
＜病理診断支援システム１００の動作（画像処理方法を含む。）＞
以下、病理診断支援システム１００において、上述した組織標本、標準標本及び蛍光色素集積粒子を散布させたコントロールスライドを撮影した蛍光画像及び明視野画像に基づく解析動作について説明するが、本発明の画像処理は、これに限定されるものではない。
【００５０】
まず、操作者は、ヘマトキシリン染色試薬と、目的生体物質に結合する蛍光色素集積粒子を用いた染色試薬を用いて組織標本及び標準標本を染色する。さらに、組織標本及び標準標本の染色に用いた蛍光色素集積粒子と同様にして作製された蛍光色素集積粒子を、標準標本と同一のスライドガラス上に散布させたコントロールスライドを準備する。
その後、顕微鏡画像取得装置１Ａを用いて、組織標本の明視野画像（第１明視野画像）及び蛍光画像（第１蛍光画像）、標準標本の明視野画像（第２明視野画像）及び蛍光画像（第２蛍光画像）並びに散布された蛍光色素集積粒子（以降、散布粒子と表記）の蛍光画像（第３蛍光画像）を取得して、各画像のデータを画像処理装置２Ａに送信する。
【００５１】
図３に、画像処理装置２Ａにおける画像解析処理のフローチャートを示す。図３に示す画像解析処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの第１明視野画像が入力されると（ステップＳ３０１）、第１明視野画像から細胞核の領域が抽出された第１細胞核画像が作成される（ステップＳ３０２）。ステップＳ３０２では、公知の任意の方法を用いて抽出することとしてよく、また、細胞核に限らず任意の領域を関心領域（ROI）として抽出してよい。
【００５２】
通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの第１蛍光画像が入力されると（ステップＳ３０３：入力工程）、制御部２１により、第１蛍光画像から蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点領域（輝点部）を抽出した第１輝点領域画像が作成される（ステップＳ３０４）。次いで、制御部２１により、第１輝点領域画像における各輝点領域に対して、第１輝度積算値が算出される（ステップＳ３０５：輝度算出工程）。
なお、ステップＳ３０４〜Ｓ３０５の処理は、公開解析ソフトImageJ、株式会社ジーオングストローム社製の全輝点自動計測ソフトG-Count等、公知の任意の方法を用いて計測することができる。
【００５３】
通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの第２明視野画像が入力されると（ステップＳ３０６）、制御部２１により、第２明視野画像から細胞核の領域が抽出された第２細胞核画像が作成される（ステップＳ３０７）。
【００５４】
通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの第２蛍光画像が入力されると（ステップＳ３０８）、制御部２１により、第２蛍光画像から蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点領域（輝点部）を抽出した第２輝点領域画像が作成される（ステップＳ３０９）。次いで、制御部２１により、第２輝点領域画像における各輝点領域に対して、第２輝度積算値が算出される。
【００５５】
通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの第３蛍光画像(図４Ａ)が入力されると（ステップＳ３１１）、制御部２１により、第３蛍光画像から蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点領域（輝点部）を抽出した第３輝点領域画像（図４Ｂ）が作成され（ステップＳ３１２）、各輝点領域に対して、第３輝度積算値が算出される（ステップＳ３１３）。
具体的には、第３輝点領域画像が生成されると（図４Ｂ）、輝点領域ごとにＸ座標位置及びＹ座標位置における輝度値を数値化した輝度分布が作成され、この値を乗算したものが当該輝点領域における第３輝度積算値である。
【００５６】
次いで、制御部２１により、第３輝度積算値の分布に基づき、蛍光色素集積粒子１粒子当たりの平均輝度値が算出される（ステップＳ３１４：単位輝度値算出工程）。具体的には、図５に示すように、第３輝点領域画像における輝点領域の第３輝度積算値を横軸、輝度積算値の頻度を縦軸として輝度分布曲線が作成される。この輝度分布曲線に基づいて、例えば、最頻値となる第３輝度積算値（輝度分布曲線のピークの輝度積算値Ｌ）が平均輝度値として算出される。なお、輝度分布曲線ではなく、第３輝度積算値の頻度を示すヒストグラムを作成してもよい。
【００５７】
算出される平均輝度値の精度を高める観点から、ステップＳ３１４（単位輝度値算出工程）では１００００個以上の輝点領域から第３輝度積算値が算出され、その分布に基づいて平均輝度値が算出されることが好ましい。
また、最頻値の算出においては、第３輝度積算値の分布に対してフィッティング又は補間を行い、フィッティング曲線または補間曲線のピークの輝度積算値を前記平均輝度値とすることが好ましい。本発明の第３輝度積算値の分布は、例えば、ガウス曲線、二次曲線、ポアソン分布、二項分布、等に好適にフィッティングさせることができる。
【００５８】
ステップＳ３０５とステップＳ３１４の処理の終了後、制御部２１により、第１輝点領域画像の各輝点領域の第１輝度積算値及び蛍光色素集積粒子１粒子当たりの平均輝度値から、第１輝点領域画像の各輝点領域に含まれる蛍光色素集積粒子の数が算出される（ステップＳ３１５）。具体的には、例えば、各輝点領域の第１輝度積算値を平均輝度値で除算して得られた値が、各輝点領域における蛍光色素集積粒子数である。ステップＳ３１５の処理により、一蛍光色素集積粒子あたりの輝度変動が補正されたうえで算出された、蛍光色素集積粒子の数が得られる。
ステップＳ３０２及びＳ３１５の処理の終了後、制御部２１により、第１細胞核画像と第１輝点領域画像の加算処理が行われ（ステップＳ３１６）、一細胞核当たりの蛍光色素集積粒子数が算出される（ステップＳ３１７：暫定粒子数算出工程）。
【００５９】
ステップＳ３１０とステップＳ３１４の処理の終了後、制御部２１により、第２輝点領域画像の各輝点領域の第２輝度積算値及び蛍光色素集積粒子１粒子当たりの平均輝度値から、第２輝点領域画像の各輝点領域に含まれる蛍光色素集積粒子の数が算出される（ステップＳ３１８）。
ステップＳ３０７及びＳ３１８の処理の終了後、制御部２１により、第２細胞核画像と第２領域画像の加算処理が行われ（ステップＳ３１９）、一細胞核当たりの蛍光色素集積粒子数が算出される（ステップＳ３２０）。
【００６０】
続いて、制御部２１により、ステップＳ３２０で得られた標準標本における一細胞核当たりの蛍光色素集積粒子数と、基準蛍光色素集積粒子数との比から、粒子数補正係数（補正係数）が算出される（ステップＳ３２１）。ここで基準蛍光色素集積粒子数とは、本実施形態における実験条件下において予測される、一細胞核あたりに結合する蛍光色素集積粒子の数である。即ち、目的生体物質に付着する蛍光色素集積粒子の数は、実験場の種々の条件によって変動するため、標準標本における粒子数を用いて付着する蛍光色素集積粒子数を補正するための補正係数を算出し、これによって組織標本における蛍光色素集積粒子数を補正することで、より正確な値を導くことが可能となる。なお、粒子数補正係数は、一次関数で表すことができる。
【００６１】
ステップＳ３１７及びＳ３２１の処理の終了後、制御部２１により、ステップＳ３２１で算出された粒子数補正係数を用いて、ステップＳ３１７で算出された一細胞核あたりの蛍光色素集積粒子数を補正する（ステップＳ３２２：粒子数補正工程）。具体的には、一細胞核あたりの蛍光色素集積粒子数を粒子数補正係数に代入した値が蛍光色素集積粒子数である。ステップＳ３２２の処理により、細胞への付着数の変動を補正した、一細胞核当たりの蛍光色素集積粒子数が算出される。
【００６２】
以上説明した本発明の第１実施形態によれば、第３蛍光画像における第３輝度積算値の分布から、単位輝度値としての平均輝度値を算出し、第１輝度積算値と平均輝度値を用いて、一細胞核あたりの蛍光色素集積粒子数を算出し、これを、第２輝度積算値を用いて補正する。したがって、蛍光色素集積粒子１粒子当たりの輝度変動、及び対象標本に対する蛍光色素集積粒子の付着数変動の両者の影響を受けることなく、目的生体物質の発現量を精度よく定量解析することができる。
【００６３】
[第２実施形態]
以下、図面を参照して本発明を実施するための第２実施形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００６４】
第１の実施形態においては、第３蛍光画像における一蛍光色素集積粒子当たりの平均輝度値によって、第１蛍光画像及び第２蛍光画像の各輝点領域の蛍光色素集積粒子数を補正したが、本実施形態では、一蛍光色素集積粒子当たりの平均輝度値に基づいて第１蛍光画像及び第２蛍光画像の取得時における露光時間を補正することによって、以降の観察を、すべて輝度値を一定に保ったまま解析を行うことが可能となる。
＜病理診断支援システム１００の構成＞、＜組織標本からの画像の取得＞、＜標準標本からの画像の取得＞及び＜蛍光色素集積粒子散布プレパラートの作製＞については第１実施形態と同様であるため、その詳細な説明は省略する。
【００６５】
＜病理診断支援システム１００の動作（画像処理方法を含む。）＞
以下、病理診断支援システム１００において、組織標本、標準標本、及び散布粒子を撮影した蛍光画像及び明視野画像に基づく解析動作について説明するが、本発明の画像処理は、これに限定されるものではない。
【００６６】
図６及び図７に、画像処理装置２Ａにおける画像解析処理のフローチャートを示す。図６及び図７に示す画像解析処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。図６に輝度値補正処理に係るフローチャートを、図７に粒子数補正処理に係るフローチャートを示す。
第２実施形態に係る画像解析処理は、輝度値補正処理と粒子数補正処理とからなる。図６に示す輝度値補正処理は、顕微鏡画像取得装置１Ａを用いた第１蛍光画像及び第２蛍光画像の撮像時における露光時間を決定するための処理である。図７に示す粒子数補正処理は、第１実施形態と同様に、標準標本を用いて粒子数補正係数を算出することにより、組織標本における一細胞核あたりの蛍光色素集積粒子数を算出・補正する処理である。
【００６７】
通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの第３蛍光画像が入力されると（ステップＳ６０１）、制御部２１により、第３蛍光画像から蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点領域を抽出した第３輝点領域画像が作成され（ステップＳ６０２）、各輝点領域に対して第３輝度積算値が算出される（ステップＳ６０３）。次いで、制御部２１により、第２輝度積算値の分布に基づき、蛍光色素集積粒子１粒子当たりの平均輝度値が算出される（ステップＳ６０４：単位輝度値算出工程）。
【００６８】
続いて、制御部２１により、ステップＳ６０４において算出された平均輝度値と基準輝度値との比から、第１蛍光画像及び第２蛍光画像の撮像時における露光時間が決定される（ステップＳ６０５：露光時間算出工程）。ここで、基準輝度値とは、露光時間を含む所定の撮像条件下において予測される、一蛍光色素集積粒子当たりの輝度値である。露光時間に応じて蛍光色素集積粒子の輝度を変動可能であることから、露光時間を補正することによって第１蛍光画像及び第２蛍光画像の一蛍光色素集積粒子当たりの平均輝度値を、基準輝度値に揃えることができる。
具体的には、例えば、第３蛍光画像の平均輝度値に対する基準輝度値の比を算出し、これを第３蛍光画像の撮像条件下における露光時間に積算することで、第１蛍光画像及び第２蛍光画像の撮像時における露光時間を算出することができる。
【００６９】
図７に、画像処理装置２Ａにおける粒子数補正処理のフローチャートを示す。図７に示す粒子数補正処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの第１明視野画像が入力されると（ステップＳ７０１）、第１明視野画像から細胞核の領域が抽出された第１細胞核画像が作成される（ステップＳ７０２）
【００７０】
通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの第１蛍光画像が入力されると（ステップＳ７０３：入力工程）、制御部２１により、第１蛍光画像から蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点領域を抽出した第１輝点領域画像が作成される（ステップＳ７０４）。次いで、制御部２１により、第１輝点領域画像における各輝点領域の第１輝度積算値が算出される（ステップＳ７０５：輝度算出工程）。
【００７１】
ステップＳ７０５の処理の終了後、制御部２１により、第１輝点領域画像の各輝点領域の第１輝度積算値及び蛍光色素集積粒子１粒子当たりの基準輝度値から、第１輝点領域画像の各輝点領域に含まれる蛍光色素集積粒子の数が算出される（ステップＳ７０６）。具体的には、例えば、各輝点領域の第１輝度積算値を基準輝度値で除算して得られた値が、各輝点領域における蛍光色素集積粒子数である。
【００７２】
通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの第２明視野画像が入力されると（ステップＳ７０７）、制御部２１により、第２明視野画像から細胞核の領域が抽出された第２細胞核画像が作成される（ステップＳ７０８）。
【００７３】
通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの第２蛍光画像が入力されると（ステップＳ７０９）、制御部２１により、第２蛍光画像から蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点領域を抽出した第２輝点領域画像が作成される（ステップＳ７１０）。次いで、制御部２１により、第２輝点領域画像における各輝点領域の第２輝度積算値が算出される（ステップＳ７１１）。
【００７４】
ステップＳ７１１の処理の終了後、制御部２１により、第２輝点領域画像の各輝点領域の第２輝度積算値及び蛍光色素集積粒子１粒子当たりの基準輝度値から、第２輝点領域画像の各輝点領域に含まれる蛍光色素集積粒子の数が算出される（ステップＳ７１２）。
【００７５】
ステップＳ７１３〜Ｓ７１４及びステップＳ７１５〜Ｓ７１７の処理は、それぞれ図３におけるステップＳ３１６〜Ｓ３１７及びステップＳ３１９〜Ｓ３２１の処理と同様であるため、詳細な説明は省略する。
【００７６】
以上説明した本発明の第２実施形態においては、平均輝度値と、所定の条件下で予測される蛍光色素集積粒子１粒子当たりの基準輝度値との比較に基づいて、第１蛍光画像及び第２蛍光画像の撮像時における露光時間を算出する露光時間算出工程を含む。したがって、露光時間の補正後は、常に輝度値を一定にした状態で組織標本及び標準標本を撮像するため、その都度輝度値を補正する必要がなく、効率的である。
【００７７】
[第３実施形態]
以下、図面を参照して本発明を実施するための第３実施形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００７８】
第１実施形態及び第２実施形態では、一の目的生体物質に対して単一の蛍光色素集積粒子を用いて組織標本及び標準標本を染色するものとしたが、第３実施形態においては、複数の目的生体物質に対して、発光波長が互いに異なる二種以上の蛍光色素集積粒子を用いて、各々の目的生体物質の染色を行う。
＜病理診断支援システム１００の構成＞、＜組織標本からの画像の取得＞、＜標準標本からの画像の取得＞及び＜蛍光色素集積粒子散布プレパラートの作製＞については第１実施形態と同様であるため、その詳細な説明は省略する。
【００７９】
＜病理診断支援システム１００の動作（画像処理方法を含む。）＞
以下、病理診断支援システム１００において、組織標本、標準標本、及び散布粒子を撮影した蛍光画像及び明視野画像に基づく解析動作について説明するが、本発明の画像処理は、これに限定されるものではない。
【００８０】
図８及び図９に、画像処理装置２Ａにおける画像解析処理のフローチャートを示す。図８及び図９に示す画像解析処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。図８にクロストーク除去処理に係るフローチャートを、図９に輝度値・粒子数補正処理に係るフローチャートを示す。
第２実施形態に係る画像解析処理は、クロストーク除去処理と輝度値・粒子数補正処理とからなる。蛍光波長の異なる複数の蛍光物質で組織切片を染色する場合、特定の色の輝点を対象とした解析を行う際に他色の蛍光物質のシグナルが漏れこんでしまう、所謂クロストークという現象が生じる。本実施形態に係るクロストーク除去処理は、このようなノイズを除去することを目的とする。また、本実施形態に係る輝度値・粒子数補正処理は、クロストークを除去したうえで蛍光色素集積粒子ごとに輝度値及び蛍光色素集積粒子数を補正するものである。
【００８１】
なお、以下のフローチャートにおいては、発光波長が互いに異なる蛍光色素集積粒子Ａ，Ｂ，Ｃのそれぞれを有する三種類の免疫染色剤を用いて組織標本及び標準標本を多重染色するものとし、蛍光色素集積粒子Ａ，Ｂ，Ｃの各々で散布したコントロールスライドを用意する。また、蛍光色素集積粒子Ａ，Ｂ，Ｃの色成分はそれぞれフィルターａ，ｂ，ｃによって抽出可能なものとする。
また、以降は蛍光色素集積粒子Ａをフィルターａによって撮像した蛍光画像を第３蛍光画像Ａａ、蛍光色素集積粒子Ａをフィルターｂによって撮像した蛍光画像を第３蛍光画像Ａｂ、・・・、蛍光色素集積粒子Ｃをフィルターｃによって撮像した蛍光画像を第３蛍光画像Ｃｃと表記する。また、第３蛍光画像Ａａにおける蛍光色素集積粒子Ａの平均輝度値を（Ａａ）、第３蛍光画像Ａｂにおける蛍光色素集積粒子Ａの平均輝度値を（Ａｂ）、・・・、第３蛍光画像Ｃｃにおける蛍光色素集積粒子Ｃの平均輝度値を（Ｃｃ）と表記する。
【００８２】
図８のクロストーク除去処理を開始すると、通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの第１蛍光画像（ステップＳ８０１：入力工程）、第２蛍光画像（ステップＳ８０２）が入力される。続いて、通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａから、蛍光色素集積粒子Ａ，Ｂ，Ｃのそれぞれをフィルターａ，ｂ，ｃを用いて撮像した９種類の第３蛍光画像Ａａ，Ａｂ，・・・，Ｃｃが入力される（ステップＳ８０３）。
【００８３】
ステップＳ８０３の処理の後、制御部２１により、全ての第３蛍光画像について輝点領域を抽出した第３輝点領域画像が作成され（ステップＳ８０４）、各輝点領域の第３輝度積算値が算出される（ステップＳ８０５）。
【００８４】
次いで、制御部２１により、第３輝度積算値の分布に基づき、各第３蛍光画像について蛍光色素集積粒子１粒子当たりの平均輝度値が算出される（ステップＳ８０６：平均輝度算出工程）。即ち、ステップＳ８０６の処理により、平均輝度値（Ａａ），（Ａｂ），・・・，（Ｃｃ）の９つの値が得られる。
【００８５】
次いで、制御部２１により、同一の蛍光色素集積粒子について異なるフィルターで撮像して得られた平均輝度値の比に基づいて、クロストーク補正係数を算出する（ステップＳ８０７）。具体的には、クロストーク補正係数は、平均輝度値（Ａａ），（Ａｂ），・・・，（Ｃｃ）を成分とする３行３列の行列式を用いて表すことができる。
【００８６】
ステップＳ８０７の処理の後、制御部２１により、第１蛍光画像について、蛍光色素集積粒子Ａ，Ｂ，Ｃのそれぞれに対応しないフィルターを介して漏れこんだノイズを除去する（ステップＳ８０８：クロストーク除去工程）。即ち、ステップＳ８０６で得られたクロストーク補正係数を用いて第１蛍光画像の輝度値を補正することで、例えばフィルターｂを介して漏れこんだ蛍光色素集積粒子Ａのシグナルを除去することができる。
【００８７】
次いで、ステップＳ８０８と同様に、制御部２１により第２蛍光画像について、蛍光色素集積粒子Ａ，Ｂ，Ｃのそれぞれに対応しないフィルターを介して漏れこんだノイズを除去する（ステップＳ８０９）。
ステップＳ８０９の処理によってクロストーク除去処理が完了し、続いて図９に示す輝度値・粒子数補正処理へと移行する。
【００８８】
図９の輝度値・粒子数補正処理を開始し、通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの第１明視野画像が入力されると（ステップＳ９０１）、第１明視野画像から細胞核の領域が抽出された第１細胞核画像が作成される（ステップＳ９０２）。
【００８９】
続いて、制御部２１により、第１蛍光画像から第１輝点領域画像が作成される（ステップＳ９０３）。次いで、制御部２１により、第１輝点領域画像における蛍光色素集積粒子Ａ，Ｂ，Ｃのそれぞれの各輝点領域の第１輝度積算値が算出される（ステップＳ９０４：輝度算出工程）。
【００９０】
通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの第２明視野画像が入力されると（ステップＳ９０５）、制御部２１により、第２明視野画像から細胞核の領域が抽出された第２細胞核画像が作成される（ステップＳ９０６）。
【００９１】
続いて、制御部２１により、第２蛍光画像から蛍光色素集積粒子の発光を表す輝点領域を抽出した第２輝点領域画像が作成される（ステップＳ９０７）。次いで、制御部２１により、第２輝点領域画像における各輝点領域の第２輝度積算値が算出される（ステップＳ９０８）。
【００９２】
ステップＳ９０４の処理の終了後、制御部２１により、第１輝点領域画像における蛍光色素集積粒子Ａ，Ｂ，Ｃのそれぞれの各輝点領域の第１輝度積算値と、蛍光色素集積粒子１粒子当たりの平均輝度値（Ａａ），（Ｂｂ）及び（Ｃｃ）とから、第１輝点領域画像における蛍光色素集積粒子Ａ，Ｂ，Ｃのそれぞれの各輝点領域に含まれる蛍光色素集積粒子の数が算出される（ステップＳ９０９）。即ち、例えば蛍光色素集積粒子Ａについては、フィルターａを介して撮像された第３蛍光画像Ａａの平均輝度値（Ａａ）を用いて粒子数が算出される。
ステップＳ９０２及びＳ９０９の処理の終了後、制御部２１により、第１細胞核画像と第１輝点領域画像の加算処理が行われ（ステップＳ９１０）、蛍光色素集積粒子Ａ，Ｂ，Ｃのそれぞれについて、一細胞核当たりの蛍光色素集積粒子数が算出される（ステップＳ９１１）。
【００９３】
ステップＳ９０８の処理の終了後、制御部２１により、同様にして第２輝点領域画像における蛍光色素集積粒子Ａ，Ｂ，Ｃのそれぞれの各輝点領域に含まれる蛍光色素集積粒子の数が算出される（ステップＳ９１２：暫定粒子数算出工程）。
ステップＳ９０６及びＳ９１２の処理の終了後、制御部２１により、第２細胞核画像と第２輝点領域画像の加算処理が行われ（ステップＳ９１３）、蛍光色素集積粒子Ａ，Ｂ，Ｃのそれぞれについて、一細胞核当たりの蛍光色素集積粒子数が算出される（ステップＳ９１４）。
【００９４】
続いて、制御部２１により、ステップＳ９１４で得られた標準標本における一細胞核当たりの蛍光色素集積粒子数と、基準蛍光色素集積粒子数との比から、粒子数補正係数が算出される（ステップＳ９１５）。ここで、基準蛍光色素集積粒子数は蛍光色素集積粒子Ａ，Ｂ，Ｃそれぞれについて設定されており、即ち蛍光色素集積粒子Ａ，Ｂ，Ｃごとに粒子数補正係数が算出される。
【００９５】
ステップＳ９１１及びＳ９１５の処理の終了後、制御部２１により、ステップＳ９１５で算出された粒子数補正係数を用いて、蛍光色素集積粒子Ａ，Ｂ，Ｃのそれぞれについて、ステップＳ９１１で算出された一細胞核あたりの蛍光色素集積粒子数を補正する（ステップＳ９１６：粒子数補正工程）。ステップＳ９１６の処理により、細胞への付着数の変動を補正した、蛍光色素集積粒子Ａ，Ｂ，Ｃごとの一細胞核当たりの蛍光色素集積粒子数が算出される。
ステップＳ９１６の処理によって輝度値補正処理が完了し、これにより画像解析処理を終了する。
【００９６】
以上説明した本発明の第３実施形態においては、発光波長が異なり、各々の発光波長に対応する複数のフィルターを用いて撮像可能な複数種類の蛍光色素集積粒子を用いて染色された場合、一の蛍光色素集積粒子が凝集せずに散布され、複数のフィルターの各々を用いて撮像された複数の第３蛍光画像間の輝度比から算出されるクロストーク補正係数を用いて、当該蛍光色素集積粒子が対応しないフィルターを介して撮像されたクロストークを除去するクロストーク除去工程を含む。したがって、多色で染色した場合にも、他の蛍光色素集積粒子の影響を受けることなく精度よく定量解析を行うことができる。
【００９７】
なお、本実施形態においても第２実施形態と同様に、第３蛍光画像に基づいて露光時間を補正することももちろん可能である。
【００９８】
[他の実施形態]
なお、上記実施形態における記述内容は、本発明の好適な一例であり、これに限定されるものではない。
【００９９】
例えば、上記実施形態おいては、輝点部として蛍光色素集積粒子が存在する領域を用いて、当該領域に含まれる画素の輝度値の積算値である第１輝度積算値、第２輝度積算値及び第３輝度積算値を算出して解析を行うものとしたが、これに限定されない。例えば、蛍光輝点における輝度値のピーク値を有する画素を輝点部として解析を行ってもよい。即ち、各蛍光画像からピーク値を第１輝度値、第２輝度値及び第３輝度値として検出し、第３蛍光画像の各輝点領域における第３輝度値の平均値を単位輝度値とすることが可能である。
【０１００】
また、上記の説明では、本発明に係るプログラムのコンピューター読み取り可能な媒体としてＨＤＤや半導体の不揮発性メモリー等を使用した例を開示したが、この例に限定されない。その他のコンピューター読み取り可能な媒体として、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬型記録媒体を適用することが可能である。また、本発明に係るプログラムのデータを、通信回線を介して提供する媒体として、キャリアウエーブ（搬送波）も適用される。
その他、病理診断支援システム１００を構成する各装置の細部構成及び細部動作に関しても、発明の趣旨を逸脱することのない範囲で適宜変更可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明は、生体物質定量方法、画像処理装置、病理診断支援システム及びプログラムに利用できる。
【符号の説明】
【０１０２】
１Ａ  顕微鏡画像取得装置（画像取得装置）
２Ａ  画像処理装置
２１  制御部
２２  操作部
２３  表示部
２４  通信Ｉ／Ｆ
２５  記憶部
２６  バス
３Ａ  ケーブル
１００  病理診断支援システム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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