(57)【要約】  本発明は生体排出検体に由来する試料中の、非エンベロープ型ＲＮＡウイルスの有無を検出する方法に関する。本発明によれば、核酸増幅反応に先立ち核酸を分離精製するための時間・コストを削減することができるだけではなく、試料ロスやキャリーオーバーの危険性を低減することもできる。特に糞便を試料とする多数の検体を処理するような検査において、本発明によるかかる効果は顕著となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
排出検体に由来する試料中の、非エンベロープ型ＲＮＡウイルスの有無を検出する方法であって、
（ａ）ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料を含むアルカリ性の混合液を調製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた混合液を加熱せず放置する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）の放置後の混合液をｃＤＮＡ合成反応に供する工程、
を包含する、ＲＮＡウイルスの検出方法。
【請求項２】
工程（ａ）が、ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料に強アルカリ性の水酸化物を含む溶液を添加することにより、アルカリ性の混合液を調製する工程である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）が、ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料をキレート剤を含む溶液で懸濁した後に、強アルカリ性の水酸化物を含む溶液を添加することにより、アルカリ性の混合液を調製する工程である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
強アルカリ性の水酸化物が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム及び水酸化カルシウムからなる群より選択される１種以上である、請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）におけるアルカリ性の混合液が水酸化ナトリウムを含有し、該水酸化ナトリウムの濃度が２０〜７０ｍＭである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｄ）として、工程（ｃ）で得られたｃＤＮＡを鋳型とする核酸増幅の工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｄ）における核酸増幅が、ＰＣＲにより実施されることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）と工程（ｄ）が、同一の反応液内で行われることを特徴とする、請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）が、室温での放置により実施されることを特徴する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｂ）が、３０℃以下での放置により実施されることを特徴する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
生体排出検体が糞便であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ａ）におけるＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料が、糞便懸濁液上清であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
糞便懸濁液上清が、糞便を滅菌水、生理食塩水又はＰＢＳに懸濁して、調製されたことを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
アルカリ性の混合液を、中和可能な物質と接触させることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
中和可能な物質が、工程（ｃ）におけるｃＤＮＡ合成反応を実施する反応液中に含まれることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
生体排出検体に由来する試料中の、非エンベロープ型ＲＮＡウイルスの有無を検出する方法であって、
（ａ）ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料を含むアルカリ性の混合液を調製する工程、及び
（ｂ’）工程（ａ）で得られた混合液を加熱することなくｃＤＮＡ合成反応に供する工程、
を包含する、ＲＮＡウイルスの検出方法。
【請求項１７】
工程（ａ）が、ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料をキレート剤を含む溶液で懸濁した後に、強アルカリ性の水酸化物を含む溶液を添加することにより、アルカリ性の混合液を調製する工程である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項１又は１６記載の方法のためのキットであって、
（ｉ）強アルカリ性の水酸化物を含む溶液、
（ｉｉ）逆転写酵素、
（ｉｉｉ）逆転写反応用試薬、
（ｉｖ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及び
（ｖ）ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応用試薬、を含むキット。
【請求項１９】
さらに、（ｖｉ）キレート剤を含む溶液、を含む請求項１８記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡウイルスの検出方法に関する。本発明は、生命科学研究、臨床診断や食品衛生検査、環境検査等にも利用できる。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅法は数コピーの標的核酸を検出可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。【０００３】
核酸増幅法を利用した検査の対象となる検体は、目的に応じて様々である。感染症原因菌の検出であれば、原因菌が存在しうる検体すなわち、尿、喀痰、糞便、血液、鼻腔液、膣分泌液などである。食品衛生検査であれば食品、あるいは食品取扱者から採取された糞便や尿、環境衛生検査であれば土壌や河川水、雨水、海水などの環境水、製造設備等の拭き取り物などである。特に特徴的な症状が発生するまでの潜伏期間がある微生物が原因の食中毒については被害拡大防止のために迅速な検査法が求められており、その場合の検体としては糞便、製造設備等の拭き取り物などになる。【０００４】
ところが検体によっては核酸以外の物質も多量に含んでおり、特に酵素を利用した核酸増幅反応を効率的に行うには通常は検体中の核酸の分離精製が必要とされている。前記核酸の分離精製には様々な手法があるが、基本的には核酸と他の物質を固体相と液体相に分けて固液分離する工程から構成される。例えばエタノール沈殿で核酸を固体相とし遠心分離で分離する方法、固相（例えばビーズ）上の核酸に標的核酸をハイブリダイズし、遠心分離や磁性化体で分離する方法がある。しかし、検体中の成分の分離をともなうこれらの精製法は、操作が煩雑で、かつ時間を要し、操作中に分解やコンタミネーションを生じる危険性がある。また、検体中の核酸含量が少ない場合には、増幅反応に必要な量を回収することができない場合もある。さらに核酸増幅法に要する時間は長くても数時間ほどであるが、このサンプル核酸調製に時間を要すると結果を得るまでの迅速性が失われることにもなる。したがって、検体を、別の容器への分離操作をともなう精製工程を経ることなく反応液へ持込み、標的核酸を増幅する方法が求められていた。【０００５】
このような方法として、例えば、特許文献１では糞便の懸濁上清液にアルカリ含有液を添加し加熱処理したサンプルを反応液に直接添加し核酸増幅反応を実施する方法が開示されている。また特許文献２では糞便の懸濁上清液に対しペクチナーゼ処理を行い加熱処理したサンプルを反応液に直接添加し核酸増幅反応を実施する方法が開示されている。【０００６】
特許文献１、２及び非特許文献１、２の実施例では検体中のＲＮＡを検出するため核酸増幅法としてＲＴ−ＰＣＲが実施されている。しかし上記方法のＲＮＡサンプル調製ではいずれも加熱処理が行われている。また特許文献２には、加熱処理によるＲＮＡの加水分解の危険性が記載されているものの、加熱処理の必要性が記載されている。このように従来の方法では、いずれの方法においても核酸抽出及び反応阻害物失活のために、加熱工程は必須と考えられてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０５２７６５
【特許文献２】特開２０１５−１１９６５６
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】東洋紡株式会社製  製品ＣｏｄｅＮｏ，ＦＩＫ−２５３  取扱説明書
【非特許文献２】株式会社島津製作所製  製品ＣｏｄｅＮｏ，ＰＮ  ２４１−０９５００−９１  取扱説明書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、試料からの核酸精製が特に不要な核酸増幅反応による標的核酸の検出を可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意検討した結果、特に加熱処理工程を必要とせず、また試料中の核酸を別の容器への分離をともなう精製を行わずに増幅反応に供することができる方法を見出し、本発明を完成した。【００１１】
代表的な本願発明は以下の通りである。
［１］  排出検体に由来する試料中の、非エンベロープ型ＲＮＡウイルスの有無を検出する方法であって、
（ａ）ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料を含むアルカリ性の混合液を調製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた混合液を加熱せず放置する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）の放置後の混合液をｃＤＮＡ合成反応に供する工程、
を包含する、ＲＮＡウイルスの検出方法。
［２］  工程（ａ）が、ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料に強アルカリ性の水酸化物を含む溶液を添加することにより、アルカリ性の混合液を調製する工程である、前記[１］記載の方法。
［３］  工程（ａ）が、ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料をキレート剤を含む溶液で懸濁した後に、強アルカリ性の水酸化物を含む溶液を添加することにより、アルカリ性の混合液を調製する工程である、前記[１］記載の方法。
［４］  強アルカリ性の水酸化物が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム及び水酸化カルシウムからなる群より選択される１種以上である、前記[２］又は［３］記載の方法。
［５］  工程（ａ）におけるアルカリ性の混合液が水酸化ナトリウムを含有し、該水酸化ナトリウムの濃度が２０〜７０ｍＭである、前記[１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］  工程（ｄ）として、工程（ｃ）で得られたｃＤＮＡを鋳型とする核酸増幅の工程をさらに含むことを特徴とする、前記[１］〜［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］  工程（ｄ）における核酸増幅が、ＰＣＲにより実施されることを特徴とする、前記[６］記載の方法。
［８］  工程（ｃ）と工程（ｄ）が、同一の反応液内で行われることを特徴とする、前記[６］又は［７］記載の方法。
［９］  工程（ｂ）が、室温での放置により実施されることを特徴する、前記[１］〜［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１０］  工程（ｂ）が、３０℃以下での放置により実施されることを特徴する、前記[１］〜［９］のいずれか１項に記載の方法。【００１２】
［１１］  生体排出検体が糞便であることを特徴とする、前記[１］〜［１０］のいずれか１項に記載の方法。
［１２］  工程（ａ）におけるＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料が、糞便懸濁液上清であることを特徴とする、前記[１］〜［１１］のいずれか１項に記載の方法。
［１３］  糞便懸濁液上清が、糞便を滅菌水、生理食塩水又はＰＢＳに懸濁して、調製されたことを特徴とする、前記[１２］記載の方法。
［１４］  アルカリ性の混合液を、中和可能な物質と接触させることを特徴とする、前記[１］〜［１３］のいずれか１項に記載の方法。
［１５］  中和可能な物質が、工程（ｃ）におけるｃＤＮＡ合成反応を実施する反応液中に含まれることを特徴とする、前記[１４］記載の方法。
［１６］  生体排出検体に由来する試料中の、非エンベロープ型ＲＮＡウイルスの有無を検出する方法であって、
（ａ）ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料を含むアルカリ性の混合液を調製する工程、及び
（ｂ’）工程（ａ）で得られた混合液を加熱することなくｃＤＮＡ合成反応に供する工程、
を包含する、ＲＮＡウイルスの検出方法。
［１７］  工程（ａ）が、ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料をキレート剤を含む溶液で懸濁した後に、強アルカリ性の水酸化物を含む溶液を添加することにより、アルカリ性の混合液を調製する工程である、前記[１６］記載の方法。
［１８］  前記[１］又は[１６］記載の方法のためのキットであって、
（ｉ）強アルカリ性の水酸化物を含む溶液、
（ｉｉ）逆転写酵素、
（ｉｉｉ）逆転写反応用試薬、
（ｉｖ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及び
（ｖ）ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応用試薬、を含むキット。
［１９］  さらに、（ｖｉ）キレート剤を含む溶液、を含む前記[１８］記載のキット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、核酸増幅反応に先立ち核酸を分離精製するための時間・コストを削減することができる。さらに核酸を分離精製する際に生じる可能性のあるリスク、すなわち試料ロスやキャリーオーバーの危険性を低減することができる。特に糞便を試料とする多数の検体を処理するような検査において、その効果は顕著となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】前処理濃度とＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。なお、図１〜図５において、グラフの縦軸はＣｔ値である。
【図２】前処理時間とＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図３】前処理温度とＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図４】前処理時にキレート剤を添加した場合のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図５】前処理温度とキレート剤を添加した場合のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
【００１６】
本発明の検出方法は、アルカリ性とした試料を加熱せずに放置する、例えば室温処理した後に反応液へ直接添加する工程を包含する。
【００１７】
本発明の検出方法を適用する試料としては、ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料であれば特に限定はないが、生体排出検体に由来する試料が挙げられる。前記生体排出検体には糞便、尿、吐瀉物、鼻汁、鼻汁塗沫、唾液、唾液塗沫等が含まれ、さらにこれらの生体排出検体を水（滅菌水等）、生理食塩水、（ＰＢＳ等の）緩衝液、有機溶媒、液体培地、またはゲル培地（例えばキャリブレア培地）に懸濁したもの、前記の懸濁液から調製した上清など、何らかの処理をしたものも含まれる。前記生体としては、ヒト、ペット、家畜、野性動物、昆虫、その他あらゆる動物が挙げられる。
【００１８】
なお糞便は腸内細菌、腸管上皮細胞、食物由来物質などから構成されており、本発明の検体として好適である。また、生体排出検体は環境から採取されたものであってもよい。環境には、ノロウイルス等のＲＮＡウイルスが存在する可能性がある、ありとあらゆる場所が含まれるが、自然環境に限定されるものではない。特に製造施設や調理施設のような施設自体や、当該施設の備品等、ＲＮＡウイルスが存在しうるあらゆる物の表面が例示される。これら環境からの検体の採取には、拭き取り操作や、その他の公知方法などが使用される。
【００１９】
また、本発明の方法に適用される、ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料は、生体排出検体そのものでもよいし、生体排出検体よりウイルスの濃縮、分離やその他の操作を行って調製された試料でもよい。濃縮、分離やその他の操作としては、単糖添加、多糖添加、ウイルス吸着物質添加、ウイルス吸着菌添加、遠心分離、希釈、沈殿、濾過、攪拌、超音波破砕・分散などの処理が挙げられる。例えば、沈殿操作の例としてはエタノール、イソプロパノールなどのアルコール類を用いて行うことができる。
【００２０】
分離操作を行った試料としては、例えば糞便の場合は水（滅菌水等）、生理食塩水、緩衝液等に懸濁し、遠心分離によって固形物を除いた上清が挙げられる。
【００２１】
本発明の検出方法で検出対象とするＲＮＡウイルスは、非エンベロープ型ＲＮＡウイルスが挙げられる。非エンベロープ型ＲＮＡウイルスとしては、例えばカリシウイルス科に属するウイルス（ノロウイルス（ＮｏＶ）、サポウイルス（ＳＶ）、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）等）やＡ群ロタウイルス（ＲｏｔａＡ）、エコーウイルス（Ｅ）、エンテロウイルス（ＥＶ）等が挙げられる。なお、上記に挙げたネコカリシウイルス（ＦＣＶ）は、容易に培養できないヒトノロウイルス（ＨｕＮｏＶ）に代わって、消毒剤や洗浄剤の評価等に広く用いられている代替ウイルスである。
【００２２】
本発明において強アルカリとは、強塩基（ｓｔｒｏｎｇ  ｂａｓｅ）とも言い、塩基解離定数の大きい塩基を指し、狭義には水溶液中において電離度が１に近く水酸化物イオンを定量的に生成し、塩基解離定数がｐＫｂ  ＜  ０  （Ｋｂ  ＞  １  ）  程度のものを言う。水溶性でかつ水溶液中において強塩基であるものは特に強アルカリである。例えば、ｐＨが１１以上、好ましくは１２以上、さらに好ましくは１３以上である。
【００２３】
本発明に用いられる強アルカリ性の水酸化物は特に限定されないが、１族元素の水酸化物あるいは２族元素の水酸化物、あるいはそれらの混合物が例示される。あるいは、テトラアルキルアンモニウムの水酸化物であってもよい。特に限定はされないが、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウムあるいはセシウムの水酸化物、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウムあるいはラジウムの水酸化物、ユーロピウム、タリウムの水酸化物などが例示される。好ましくは、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、もしくは、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、またはそれらの組合せを含む。さらに好ましくは、ＮａＯＨである。
【００２４】
本発明のＲＮＡウイルスの検出方法は、試料を例えば強アルカリ性の水酸化物を含む溶液と接触させる工程を包含する。前記の工程により、熱処理を行うことなく、試料中のＲＮＡウイルスに含有されている核酸が検出可能な状態となる。
【００２５】
工程（ａ）は、ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料を含むアルカリ性の混合液を調製する工程である。
アルカリ性の混合液を調製するための具体的な方法としては、例えば、ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料に、強アルカリ性の水酸化物を含む溶液を添加する方法が挙げられる。この場合の強アルカリ性の水酸化物溶液中の水酸化物の濃度は、試料との混合比により適宜調整すればよいが、混合後の「アルカリ性の混合液」における水酸化物の終濃度として、好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭ、より好ましくは２０ｍＭ〜７０ｍＭ、更に好ましくは３０ｍＭ〜６０ｍＭ、更に好ましくは３０〜４０ｍＭである。強アルカリ性の水酸化物を複数種使用する場合、各水酸化物の濃度の合計が上記範囲を満たすことが好ましい。
【００２６】
例えば、工程（ａ）におけるアルカリ性の混合液が水酸化ナトリウムを含有する場合、該水酸化ナトリウムの濃度は好ましくは２０〜７０ｍＭであり、より好ましくは３０〜４０ｍＭである。
【００２７】
試料と強アルカリ性水酸化物溶液の混合比も特に限定されないが、試料と強アルカリ性水酸化物溶液の混合比は、好ましくは１：９〜１：３、更に好ましくは１：６〜１：４、特に好ましくは１：５である。
【００２８】
なお、特に断りのない限り、本明細書において「溶液」とは「水溶液」のことを意味する。
【００２９】
本発明の方法では、さらに強アルカリ性の水酸化物との接触の際にＲＮＡ分解の防止手段を加えてもよい。ＲＮＡ分解防止手段としては特に限定されないが、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）活性の阻害手段が挙げられ、例えば、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒやＲＮａｓｅの活性化に必要な金属イオンのキレート剤が挙げられる。ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの具体例としては、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ株式会社製２３１３Ａ)が挙げられる。キレート剤やＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒは、水溶液や公知の緩衝液の溶液として、添加することができる。
【００３０】
当該キレート剤としては、目的の金属イオンを中心に多座配位するものが好ましく、例えば六座配位するものが好適に使用でき、アミノカルボン酸系やホスホン酸系が挙げられる。アミノカルボン酸系のキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、グルタミン酸二酢酸（ＧＬＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）等がある。また、ホスホン酸系のキレート剤としては、ヒドロキシエタンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、メチレンホスホン酸（ＮＴＭＰ）、ホスホノブタントリカルボン酸（ＰＢＴＣ）、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸（ＥＤＴＭＰ）等がある。その他、クエン酸、シュウ酸、フィチン酸、グルコン酸等、リボヌクレアーゼ活性を阻害する、あらゆるキレート剤が、本発明に使用可能である。また、複数のキレート剤を組み合わせて使用してもよい。
【００３１】
ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを使用する際の濃度は、リボヌクレアーゼ活性を阻害するために適用される公知の濃度を採用することができる。
【００３２】
キレート剤を使用する際の濃度は、試料中のリボヌクレアーゼ活性の阻害、もしくは試料中のＲＮＡの検出に有効な濃度であれば特に限定はない。例えば、アルカリ性の混合液中、キレート剤の終濃度は好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは２ｍＭ以上、更に好ましくは３ｍＭ以上、更に好ましくは４ｍＭ以上である。一方、費用対効果の観点から、アルカリ性の混合液中、キレート剤の終濃度は好ましくは２０ｍＭ以下、より好ましくは１５ｍＭ以下、更に好ましくは１０ｍＭ以下である。複数種のキレート剤を用いることも可能であり、その場合、各キレート剤の濃度の合計が上記上限値又は下限値を満たすことが好ましい。
【００３３】
例えば１０％（ｗ／ｖ）の糞便を含む糞便懸濁液を強アルカリ性の水酸化物とＥＧＴＡで処理する場合、アルカリ性の混合液中のＥＧＴＡの終濃度は２ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは４ｍＭ〜４０ｍＭ、より好ましくは６ｍＭ〜３０ｍＭ、更に好ましくは、８ｍＭ〜２０ｍＭ、特に好ましくは、９〜１５ｍＭである。ＥＧＴＡのアルカリ性の混合液中の濃度は糞便懸濁液の濃度によって適宜調整してもよい。例えば、糞便懸濁液の濃度が２０％（ｗ／ｖ）の場合はＥＧＴＡの終濃度を上記濃度の倍の濃度とすることが望ましい。
【００３４】
また、またキレート剤として、ＥＤＴＡを上記の糞便懸濁液の処理に用いる場合は、試料を含むアルカリ性の混合液中のＥＤＴＡの終濃度は、１ｍＭ〜４５ｍＭ、好ましくは、２ｍＭ〜３５ｍＭ、より好ましくは、３ｍＭ〜２５ｍＭ、更に好ましくは、４ｍＭ〜１５ｍＭである。ＥＤＴＡのアルカリ性の混合液中の濃度は糞便懸濁液の濃度によって適宜調整してもよい。糞便懸濁液の濃度が２０％（ｗ／ｖ）の場合はＥＤＴＡの終濃度を上記濃度の倍の濃度とすることが望ましい。
【００３５】
前記の強アルカリ性の水酸化物、及び所望によりリボヌクレアーゼ活性の阻害手段を含有する溶液（本明細書において、「前処理液」ともいう）を予め調製しておくことにより、本発明のＲＮＡウイルスの検出方法における「ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料」の処理、言い換えればウイルスゲノムＲＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成の前処理を簡便に実施することができる。前処理液中の強アルカリ性の水酸化物やリボヌクレアーゼ活性の阻害手段の濃度は、当該前処理液と試料との混合比等を考慮して決定すればよい。
【００３６】
本発明の方法に適用する、「ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料」の形状はとくに限定されないが、糞便のように固形であったり、粘性を伴ったりする生体排出試料の場合は、あらかじめ作製した生体排出検体の懸濁液を試料として取り扱うことが好適である。懸濁液としては、２０％（ｗ／ｖ）以下の生体排出検体を含むものが好ましい。より好ましくは、１％（ｗ／ｖ）〜２０％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは、１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）である。さらに、前記の懸濁液、例えば糞便懸濁液の上清を試料としてもよい。
【００３７】
また本発明では、単独検体からなる試料または単独検体から調製された試料のほか、Ｘ種（Ｘは２以上の整数を示す）の検体の混合物から調製した試料でもよい。例えば、検体が糞便の場合、Ｘ種の検体とは、Ｘ種の個体からの糞便である場合や、同一個体が排泄したＸ種の便である場合もある。Ｘについては、特に限定されないが、例えば、三菌種（腸管出血性大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌）の検査の場合では、５０検体を混合することが食品検査業界において、一般的になっているので、参考に出来る。しかし、検出目的がノロウイルスの場合はウイルスの流行時期があり、過剰な数の検体を混合すると返ってコストや試験回数を増やすことになる。このため、過去の陽性率を参考するなど、混合する検体の数を適宜調整することが好ましい。例えば４０検体以下、好ましくは、３０検体以下、より好ましくは、２０検体以下、更に好ましくは、１０検体以下、特に好ましくは、５検体以下の検体が混合されたもの、もしくは当該混合検体から調製された試料が本発明方法に供される。
【００３８】
試料と前処理液の混合には、攪拌、スピンダウン、転倒混和、ピペッティングなどが用いられるが、その方法及び使用容器等を限定するものではない。
【００３９】
前処理液は、反応性改善などを目的として添加される公知の物質を含有していてもよい。添加する物質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなタンパク質、Ｔｗｅｅｎ−２０などの界面活性剤、ベタイン、酸性高分子等が例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
アルカリ性の混合液において、還元剤は含まれていても含まれていなくてもよい。
【００４１】
従って、工程（ａ）の好ましい態様の一つは、ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料をキレート剤を含む溶液で懸濁した後に、強アルカリ性の水酸化物を含む溶液を添加することにより、アルカリ性の混合液を調製する工程である。
【００４２】
工程（ｂ）は、工程（ａ）で得られた混合液を加熱せず放置する工程であり、「前処理」ともいう。
試料と前処理液を混合して得られるアルカリ性の混合液は、従来技術とは異なり、加熱せずに放置しても十分精度の高い結果を得ることができる。
本発明においては、アルカリ性溶液のみ、あるいは前述のキレート剤とアルカリ性溶液の組み合わせのいずれにおいても、室温で実施することが可能である。従って、工程（ｂ）の好ましい態様の一つは、工程（ｂ）を室温での放置により実施することである。ここで、室温とは作業員が作業しやすい環境温度を言う。混合液を放置する温度としては、好ましくは、３０℃以下、より好ましくは、２５℃以下である。処理時間、即ち放置時間は、特に限定はなく、アルカリ性混合液を入れた後、直ちにＲＴ−ＰＣＲに供してもよく、２〜６０分間保持してからＲＴ−ＰＣＲに供してもよく、検体数に応じて適宜調整することができる。保持時間による反応に大差はない。
【００４３】
また冷却ブロック、クラッシュアイス等を用いて、低温で作業を行うことは、放置工程の温度条件を同一にできることから、試験の再現性を高めることに有効である。また、混合液を冷蔵庫や冷蔵室で放置することで、工程（ｂ）を実施してもよい。ゆえに、本工程における好ましい温度範囲は０℃〜３０℃程度になる。本工程における温度範囲は、より好ましくは、０℃〜２５℃、更に好ましくは、０℃〜２０℃、更に好ましくは０℃〜１５℃、更に好ましくは０℃〜１０℃、更に好ましくは０℃〜５℃である。処理時間としては、特に限定はなく、アルカリ性混合液を入れた後、直ちにＲＴ−ＰＣＲに供してもよく、２〜６０分間保持してからＲＴ−ＰＣＲに供してもよく、検体数に応じて適宜調整することができる。また、試料を含むアルカリ性の混合液がキレート剤を含む場合、前記冷却を行わなくとも十分精度の高い結果を得ることができる。
【００４４】
前述のように、工程（ｂ）における放置時間が０の場合、即ち、アルカリ性混合液を入れた後、直ちにｃＤＮＡ合成反応に供する場合、工程（ｂ）と工程（ｃ）とが統合されることになる。かかる態様、即ち、（ａ）ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料を含むアルカリ性の混合液を調製する工程、及び（ｂ’）工程（ａ）で得られた混合液を加熱することなくｃＤＮＡ合成反応に供する工程、を包含する、ＲＮＡウイルスの検出方法も本発明の方法に包含される。この場合、工程（ａ）で得られた混合液に、後述の逆転写酵素等の成分を添加することで工程（ｃ）の実施が可能となる。
【００４５】
工程（ａ）及び工程（ｂ’）を包含する前記方法の好ましい態様の一つは、工程（ａ）が、ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料をキレート剤を含む溶液で懸濁した後に、強アルカリ性の水酸化物を含む溶液を添加することにより、アルカリ性の混合液を調製する工程である。
【００４６】
工程（ｃ）は工程（ｂ）の放置後の混合液をｃＤＮＡ合成反応に供する工程である。
以上のように工程（ｂ）で処理された試料を含むアルカリ性の混合液（本明細書において、「前処理後の試料」とも記載する）を逆転写反応に供して、当該混合液に含有されるＲＮＡに相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成することができる。なお、本発明の好適な態様では、前処理後の試料を含む逆転写反応液を作成する前に、当該前処理後の試料から特定の成分を除去する操作や加熱処理を行う必要はない。
【００４７】
本発明の方法において、前処理後の試料を逆転写に用いる際の当該試料の添加割合に限定はなく、適切に逆転写が実施できる割合であれば良い。例えば逆転写反応液中に１〜３０％（ｖ／ｖ）範囲内で前処理後の試料が添加される。例えば容量２５μＬの反応液でＯｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲを実施する場合、前処理後の試料は０．５〜６μＬ添加される。
【００４８】
逆転写反応の反応液組成の一例としては、検出すべきＲＮＡに相補的な配列を有する逆転写プライマー、塩類、デオキシリボヌクレオチド類（ｄＮＴＰ）、逆転写酵素、及び緩衝液を含むものが挙げられる。該塩類は、ＭｇＣｌ２やＫＣｌなどが用いられるが、逆転写酵素活性には二価金属イオン（一般的にはＭｇ２＋イオン）が必須である。塩類の終濃度の調整や他の塩類への変更は適宜行ってもよい。アルカリ性の混合液にキレート剤が含まれる場合は、該キレート剤で消費される金属イオンを逆転写反応液に補充してもよい。例えば二価金属イオンと１対１のモル比で結合するＥＤＴＡの場合、逆転写反応液に持ち込まれるＥＤＴＡの量を考慮してＭｇ２＋イオンを逆転写反応液に追加すればよい。さらに、逆転写反応に共存させることが可能な他の成分を添加してもよい。
【００４９】
本工程で使用される逆転写酵素としては、特に限定されず、公知のものを使用することができる。逆転写酵素の具体例としては、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ（ＭＭＬＶ）等のマウスのレトロウイルス由来の逆転写酵素；並びにＲｏｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＲＡＶ）及びＡｖｉａｎ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ（ＡＭＶ）等のトリのレトロウイルス由来の逆転写酵素等が挙げられる。
【００５０】
前処理後の試料が酵素反応液（例えば逆転写反応液）へ添加される場合、前記酵素反応液の緩衝能が有効な範囲の量であれば、当該試料を直接酵素反応液に添加することができる。酵素反応液のｐＨがアルカリ側に移行し、酵素活性が低下することが懸念される場合には、中和可能な物質との接触による強アルカリ性水酸化物の中和ステップ、即ち、アルカリ性の混合液を中和可能な物質と接触させることを含んでいてもよい。前処理後の試料を中和可能な物質と接触させて中和してもよいが、酵素反応液にあらかじめ中和可能な物質を添加しておくのが手順の簡略化の点でより好ましい。
【００５１】
ここで使用される中和可能な物質としては、酵素反応を阻害しない酸性の物質であれば特に制限されず、例えば、有機酸や無機酸を問わず使用することができる。中和可能な物質の具体例としては、例えば、ギ酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、コハク酸、乳酸、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、ホウ酸等が挙げられる。中和可能な物質との接触後の混合液のｐＨの範囲としては、好ましくは６．０〜８．０であり、より好ましくは６．５〜７．５である。
【００５２】
逆転写反応液は、反応性改善などを目的として添加される公知の物質を含有していてもよい。添加する物質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなタンパク質、Ｔｗｅｅｎ−２０などの界面活性剤、ベタイン、酸性高分子等が例示されるが、これらに限定されるものではない。またｄＮＴＰは通常、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの４種が用いられるが、ＰＣＲ増幅物が他の核酸増幅反応の鋳型となる汚染を防止する目的でさらにｄＵＴＰを反応液に添加してもよい。この反応で得られた核酸増幅物には、ｄＵＴＰが取り込まれることになり、ウラシル含有ＤＮＡの分解活性を有するＵｒａｃｉｌ−Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｒａｓｅ（ＵＮＧ）を核酸増幅反応前に作用させることで、前記核酸増幅物を分解することができる。こうして、先に実施された反応で得られた増幅物が後の反応に混入しておこる汚染を防止することができる。
【００５３】
工程（ｄ）は、工程（ｃ）で得られたｃＤＮＡを鋳型とする核酸増幅の工程である。
本発明の方法において、得られたｃＤＮＡを鋳型とした核酸増幅を利用すると、微量のウイルスゲノムＲＮＡを検出することができる。従って、本発明において、かかる工程（ｄ）をさらに含むことがより好ましい。
【００５４】
工程（ｄ）で用いられる核酸増幅法は特に限定はないが、逆転写反応（ＲＴ）によりＲＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成を行い、該ｃＤＮＡを増幅する方法、例えばＲＴ−ＬＡＭＰ法やＲＴ−ＰＣＲ法を用いることができる。なお逆転写反応とＤＮＡ増幅反応を独立した反応液で行うＴｗｏ−Ｓｔｅｐ法もあるが、本発明においては、作業の簡略化の面では逆転写反応とＤＮＡ増幅反応がひとつの反応液組成、即ち、同一の反応液で可能なＯｎｅ−Ｓｔｅｐ法が好ましい。即ち、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ法においては、工程（ｃ）と工程（ｄ）が同一の反応液内で進行することが一つの特徴である。
【００５５】
本発明の方法において、前処理後の試料又は工程（ｃ）を経て得られた溶液を核酸増幅に用いる際の当該試料の添加割合に限定はなく、適切に核酸合成が実施できる割合であれば良い。例えば反応液中に１〜３０％（ｖ／ｖ）範囲内で前処理後の試料又は工程（ｃ）を経て得られた溶液が添加される。例えば容量２５μＬの反応液でＯｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲを実施する場合、前処理後の試料又は工程（ｃ）を経て得られた溶液は０．５〜６μＬ添加される。
【００５６】
ＰＣＲの反応組成の一例としては、一方のプライマーが、他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種一組のＰＣＲ用プライマー対、塩類、デオキシリボヌクレオチド類、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び緩衝液を含むものが挙げられる。上記の塩類は、ＭｇＣｌ２やＫＣｌなどが用いられるが、ＤＮＡポリメラーゼ活性には二価金属イオン（一般的にはＭｇ２＋イオン）が必須である。塩類の終濃度の調整や他の塩類への変更は適宜行ってもよい。キレート剤を添加した前処理液によるアルカリ処理工程を行う場合は、該キレート剤で消費される、金属イオンを補充してもよい。例えば二価金属イオンと１対１のモル比で結合するＥＤＴＡの場合、ＰＣＲ反応液に持ち込まれるＥＤＴＡの量を考慮してＭｇ２＋イオンの量を調整すればよい。さらにＰＣＲに共存させることが可能な他の成分を添加してもよい。
【００５７】
前記２種一組のＰＣＲ用プライマー対としては、検出対象のウイルスが有する塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチドが好ましい。具体的には、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）を検出しようとする場合、一例として、配列表の配列番号：１に記載の塩基配列及び配列番号：２に記載の塩基配列を２種一組のＰＣＲ用プライマー対として用いることができる。あるいは、ノロウイルス（ＮｏＶ）を検出しようとする場合、一例として、配列表の配列番号：４に記載の塩基配列及び配列番号：５に記載の塩基配列を２種一組のＰＣＲ用プライマー対として、又は配列表の配列番号：７に記載の塩基配列及び配列番号：８に記載の塩基配列を２種一組のＰＣＲ用プライマー対として用いることができる。これらの配列番号に規定された塩基配列において、１又は複数個（好ましくは２〜５個）の塩基が欠失、置換又は付加されたものもプライマーとして使用することができる。
【００５８】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、特に限定されず、公知のものを使用することができる。例えば、ファミリーＡ（ＰｏｌＩ型）に属するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼやＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＢ（α型）に属するＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｕｌｔｉｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＤＮＡポリメラーゼのシリーズ（ＨＳ、ＧＸＬ、Ｍａｘ）などが挙げられる。これらのうち２以上を組み合わせて用いても良い。
【００５９】
核酸増幅反応液は、反応性改善などを目的として添加される公知の物質を含有していてもよい。添加する物質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなタンパク質、Ｔｗｅｅｎ−２０などの界面活性剤、ベタイン、酸性高分子等が例示されるが、これらに限定されるものではない。またｄＮＴＰは通常、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの４種が用いられるが、ＰＣＲ増幅物が他の核酸増幅反応の鋳型となる汚染を防止する目的でさらにｄＵＴＰを反応液に添加してもよい。この反応で得られた核酸増幅物には、ｄＵＴＰが取り込まれることになり、ウラシル含有ＤＮＡの分解活性を有するＵｒａｃｉｌ−Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｒａｓｅ（ＵＮＧ）を核酸増幅反応前に作用させることで、前記核酸増幅物を分解することができる。こうして、先に実施された反応で得られた増幅物が後の反応に混入しておこる汚染を防止することができる。
【００６０】
本発明の方法の好ましい態様である「工程（ｃ）と工程（ｄ）が同一の反応液内で行われる態様」としては、ＲＴ−ＰＣＲ法が挙げられる。ＲＴ−ＰＣＲ法ではｃＤＮＡ合成用プライマーはＰＣＲ用プライマー対の一方のプライマーを兼ねることもできる。Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれる、１反応で複数種の増幅物を得られるように複数のｃＤＮＡ合成用プライマーやＰＣＲ用プライマー対が含まれる反応の場合もある。
【００６１】
ＲＴ−ＰＣＲ法では、増幅物を検出するためのプローブを使用してもよい。例えば、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）を検出しようとする場合、一例として、配列表の配列番号：１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができる。あるいは、ノロウイルス（ＮｏＶ）を検出しようとする場合、一例として、配列表の配列番号：６に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドや、配列表の配列番号：９に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。これらの配列番号に規定された塩基配列において、１又は複数個（好ましくは２〜５個）の塩基が欠失、置換又は付加されたものもプローブとして使用することができる。かかるプローブを、公知の、蛍光物質及び／又は蛍光抑制物質でラベルして用いても良い。
【００６２】
ＲＴ−ＰＣＲ法を採用する場合、前処理後の試料と逆転写酵素等とを用いてＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製し、公知のサーマルサイクラーを利用して工程（ｃ）と工程（ｄ）とを同一の反応液内で進行させる。ＲＴ−ＰＣＲ用反応液は、前述の各種成分、例えば、前処理後の試料、緩衝液、逆転写酵素、ＰＣＲ酵素、二価金属塩、ｄＮＴＰｓ、還元剤、適切なプライマー、適切なプローブ、滅菌水等を適宜取捨選択し、組み合わせて調製される。
【００６３】
試料に含まれていたＲＮＡより得られたｃＤＮＡや、該ｃＤＮＡを鋳型として増幅生成されたＤＮＡ断片は、電気泳動法、融解曲線法、各種プローブ法（Ｑプローブ、スコーピオンプローブ、ハイブリプローブなど）で検出、識別することができる。また、温度昇降機能と蛍光測定機能を備えた機器であれば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、インターカレーティング色素などを用いることにより、反応中に増幅生成したＤＮＡ断片をリアルタイムに検出識別することができる。ここで、検出対象の非エンベロープ型ＲＮＡウイルスの種類に応じた、逆転写反応用又は核酸増幅反応用のプライマー及び／又はプローブを使用することにより、検出対象の非エンベロープ型ＲＮＡウイルスを特異的に検出することができる。
【００６４】
本発明は、前述の非エンベロープ型ＲＮＡウイルスの有無を検出する方法のためのキットを提供する。本発明のキットは、ＲＮＡウイルスの検出に供される試料を処理するための、前記の強アルカリ性の水酸化物をコンポーネントとして含有することを一つの特徴とする。前記の強アルカリ性の水酸化物は、溶液として、好ましくは水溶液として（例えば前記の前処理液として）キットに含有される。強アルカリ性の水酸化物の濃度は、試料に添加した際に、前記の、本発明の方法に好適な終濃度となるように調整されていればよく、特に限定はない。
【００６５】
強アルカリ性の水酸化物を含む溶液に加えて、リボヌクレアーゼ活性の阻害手段（例えばキレート剤及び／又はＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を含む溶液を含むキットであってもよい。リボヌクレアーゼ活性の阻害手段を含む溶液は、キットを構成する独立したコンポーネントであってもよく、強アルカリ性の水酸化物を含む溶液にリボヌクレアーゼ活性の阻害手段が含まれたコンポーネントであってもよい。さらに、本発明のキットは、試料や各種試薬を希釈もしくは懸濁するための溶液を含んでいてもよい。
【００６６】
本発明のキットとしては、さらに、目的のＲＮＡウイルス由来のＲＮＡを検出するための試薬を含むものが好適である。前記の試薬としては、目的のＲＮＡウイルス由来のＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する逆転写反応のための試薬（例えば逆転写酵素及び逆転写反応用試薬）、前記ｃＤＮＡ若しくはその一部を増幅する核酸増幅反応のための試薬（例えば耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応用試薬）が例示される。好ましくは、増幅された核酸断片を検出するための試薬も例示される。これら試薬は前記本発明の方法について記載した前述の試薬類の他、公知のＲＮＡ検出技術に使用されているものを利用することができる。
【００６７】
本発明のキットには、目的のＲＮＡウイルスを特異的に検出するためのプライマーやプローブが含まれていることがより好ましい。これらのプライマーやプローブは、当該ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡの配列に基づいて合成することができる。
【００６８】
本発明のキットの好ましい一例としては、試料の前処理液（例えば、強アルカリ性の水酸化物、及び所望によりキレート剤及び／又はＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを含有する溶液）とＯｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ反応液を調製するためのコンポーネント（例えば、適切な濃度で調製された反応緩衝液、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合物、プライマー、プローブ等）とを含むものが例示される。例えば、前記の各コンポーネントのいくつかが混合された状態で含まれているキットは、反応液を簡便に調製することができる。
【実施例】
【００６９】
以下実施例をもって本発明を具体的に説明する。なお、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００７０】
実施例１．  アルカリ処理時の塩基性物質濃度の検討
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）より購入したＶＲ−７８２，Ｆｅｌｉｎｅ  ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ，Ｆ−９  （Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）を２０倍になるよう生理食塩水で希釈してウイルス懸濁液を作成した。ＦＣＶが検出できるよう、別途ＦＣＶ  Ｐｒｉｍｅｒ／Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｘを作成した。該懸濁液１μＬに対し６．２５、１２．５、２５、１００ｍＭのＮａＯＨ溶液を４μＬずつ添加し、ＮａＯＨの終濃度５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ、８０ｍＭのアルカリ性の混合液を調製した。該混合液を室温（２７℃）にて５分間放置後、前処理後の試料とした。【００７１】
この前処理後の試料と、ＴａＫａＲａノロウイルスＧＩ／ＧＩＩ検出キット（高速検出用）（タカラバイオ株式会社製ＲＲ２９６Ａ）の構成品を用いて、下記の組成のＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製し、この反応液を速やかに下記の反応条件でＲＴ−ＰＣＲに供しし、操作マニュアルに従ってＣｔ値による定量を実施した。一つの濃度のＮａＯＨ溶液あたり実験を２回行い、Ｃｔ値の平均値を結果に示した。Ｃｔ値は特定の蛍光値に達したサイクル数であり、増幅産物の量比を示している。すなわちＣｔ値が小さいほど、増幅量が多いということを示す。なお、核酸増幅装置には製品ＣｏｄｅＮｏ，ＴＰ−９９０  ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）ＲｅａｌＴｉｍｅ  ＳｙｓｔｅｍＩＩＩ（タカラバイオ株式会社製）を用いた。【００７２】
（ＦＣＶ  Ｐｒｉｍｅｒ／Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｘ）
２μＭ  ＦＣＶ検出プライマー  ＣＣＡＴＴＧＧＴＧＣＴＡＡＴＡＧＧＧＡＡＡＧＧ（配列番号１）
２μＭ  ＦＣＶ検出プライマー  ＣＣＡＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＣＡＧＴＴＴ（配列番号２）
２μＭ  ＦＣＶ検出プローブ  ＦＡＭ−ＴＧＣＧＣＡＴＣＡＧＣＡＣＧＣＴＴＣＣＣ−ＢＨＱ１（配列番号３）【００７３】
（ＲＴ−ＰＣＲ用反応液）
５．０μＬ  前処理後の試料
１２．０μＬ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＶ）４
２．５μＬ  ＦＣＶ  Ｐｒｉｍｅｒ／Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｘ
１．５μＬ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（ＮＶ）４
４．０μＬ  滅菌水【００７４】
（反応条件）
前記反応液２５μＬを以下の温度サイクルで反応した。
４２℃  ５ｍｉｎ、
９５℃  ３０ｓｅｃ、
９５℃  ５ｓｅｃ−５４℃  ３０ｓｅｃ  ４５サイクル（ＦＡＭ、ＲＯＸ、Ｃｙ５蛍光検出）【００７５】
結果を表１に示した。いずれの条件でも増幅物は検出されたものの、特に終濃度４０ｍＭのＮａＯＨを共存させた際にもっとも低いＣｔ値を示し、良好な結果を得ることが出来た。【００７６】
【表１】
2019017452.tif 000002
【００７７】
実施例２．  室温放置時間の検討
実施例１で調製したＦＣＶ懸濁液１μＬに対し、５０ｍＭのＮａＯＨ溶液を４μＬ添加し、ＮａＯＨの終濃度４０ｍＭのアルカリ性の混合液５μＬを調製し室温（２７℃）に放置した。該混合液を前処理後の試料とした。
この前処理後の試料を用いて実施例１と同様の組成物のＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製し、実施例１と同様の反応条件でＲＴ−ＰＣＲに供し、Ｃｔ値を求めた。なお、室温放置時間の検討として以下１〜６番までの試験を実施した。【００７８】
試験番号１はＮａＯＨを添加後、直ちにＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＶ）４等を添加・混合してＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製した。試験番号２はＮａＯＨを添加後、１分室温に放置し、同様にＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製した。試験番号３はＮａＯＨを添加後、２分室温に放置し、同様にＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製した。試験番号４はＮａＯＨを添加後、５分室温に放置し、同様にＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製した。試験番号５はＮａＯＨを添加後、３０分室温に放置し、同様にＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製した。試験番号６はＮａＯＨを添加後、６０分室温に放置し、同様にＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製した。実施例１と同条件で、各ＲＴ−ＰＣＲ用反応液をただちにＲＴ−ＰＣＲに供し、Ｃｔ値を求めた。一つの試験番号あたり実験を２回行い、Ｃｔ値の平均値を結果に示した。【００７９】
結果を表２に示した。試験１〜６について、室温での放置時間を長くしてもＣｔ値の増加は認められなかった。【００８０】
【表２】
2019017452.tif 000003
【００８１】
実施例３．  環境温度による反応性の確認
実施例１で調製したＦＣＶ懸濁液１μＬに対し、４２ｍＭのＮａＯＨ溶液５μＬを添加し、ＮａＯＨの終濃度３５ｍＭのアルカリ性の混合液を調製した。該混合液を氷上、室温（２７℃）、３７℃、５０℃でそれぞれ１０分放置後、前処理後の試料とした。【００８２】
この前処理後の試料と、ＴａＫａＲａノロウイルスＧＩ／ＧＩＩ検出キット（高速検出用）（タカラバイオ株式会社製ＲＲ２９６Ａ）の構成品を用いて、実施例１と同様の組成のＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製し、この反応液を実施例１と同条件で、ただちにＲＴ−ＰＣＲに供し、Ｃｔ値を求めた。一つの温度条件あたり実験を２回行い、Ｃｔ値の平均値を結果に示した。【００８３】
結果を表３に示した。氷上、室温で特に良好な結果を示した。なお氷上、室温、３７℃、５０℃ともに極端なＣｔ値の増加は認められなかった。【００８４】
【表３】
2019017452.tif 000004
【００８５】
実施例４．  糞便検体を用いたウイルスＲＮＡの検出
ノロウイルス陽性の糞便検体を５〜１０％（ｗ／ｖ）となるようＰＢＳに懸濁した後、１５，０００ｒｐｍにて５分間遠心処理を行った。該上清１μＬに対し、１２、２４、４２、６６、９６ｍＭのＮａＯＨ溶液を５μＬずつ添加し、ＮａＯＨの終濃度１０、２０、３５、５５、８０ｍＭのアルカリ性の混合液を調製した。該混合液を室温（２７℃）にて５ｍｉｎ放置後、前処理後の試料とした。なお、ノロウイルスが検出できるよう、別途ＮＶ  Ｐｒｉｍｅｒ／Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｘを作成した。【００８６】
この前処理後の試料と、ＴａＫａＲａノロウイルスＧＩ／ＧＩＩ検出キット（高速検出用）（タカラバイオ株式会社製ＲＲ２９６Ａ）の構成品を用いて、下記の組成のＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製し、下記の反応条件でＲＴ−ＰＣＲに供し、Ｃｔ値を求めた。【００８７】
試験用の検体として、ノロウイルスＧＩＩ陽性検体＃８（ＧＩＩ）、＃２７（ＧＩＩ）、＃２８（ＧＩＩ）、ノロウイルスＧＩ陽性検体＃３６０（ＧＩ）の４検体を用意し、結果に示した。なお、核酸増幅には製品ＣｏｄｅＮｏ，ＴＰ−９９０  ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）ＲｅａｌＴｉｍｅ  ＳｙｓｔｅｍＩＩＩを用いた。【００８８】
（ＮＶ  Ｐｒｉｍｅｒ／Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｘ）
４μＭ  ＮＶ検出プライマー  ＣＧＹＴＧＧＡＴＧＣＧＮＴＴＹＣＡＴＧＡ（配列番号４）
４μＭ  ＮＶ検出プライマー  ＣＴＴＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＹＡＣ（配列番号５）
２μＭ  ＮＶ検出プローブ  ＦＡＭ−ＡＧＡＴＹＧＣＧＡＴＣＹＣＣＴＧＴＣＣＡ−ＢＨＱ１（配列番号６）
４μＭ  ＮＶ検出プライマー  ＣＡＲＧＡＲＢＣＮＡＴＧＴＴＹＡＧＲＴＧＧＡＴＧＡＧ（配列番号７）
４μＭ  ＮＶ検出プライマー  ＴＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴＴＣＡＣＡ（配列番号８）
２μＭ  ＮＶ検出プローブ  ＲＯＸ−ＴＧＧＧＡＧＧＧＳＧＡＴＣＧＣＲＡＴＣＴ−ＢＨＱ２（配列番号９）
上記配列番号：４〜６で示されるプライマーとプローブの組み合わせによって、ノロウイルスＧＩを検出することができ、上記配列番号：７〜９で示されるプライマーとプローブの組み合わせによって、ノロウイルスＧＩＩを検出することができる。
なお、上記配列番号：４及び配列番号：７における「Ｎ」とは、その塩基がアデニン、グアニン、シトシン又はチミンであることを示す記号である。【００８９】
（ＲＴ−ＰＣＲ用反応液）
６．０μＬ  前処理後の試料
１２．０μＬ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＶ）４
２．５μＬ  ＮＶ  Ｐｒｉｍｅｒ／Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｘ４
１．５μＬ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（ＮＶ）４
３．０μＬ  滅菌水【００９０】
（反応条件）
前記反応液２５μＬを以下の温度サイクルで反応した。なお、最初の５サイクルは蛍光検出を行っていないため、結果は５サイクルを足したＣｔ値を表記した。
４２℃  ５ｍｉｎ、
９５℃  ３０ｓｅｃ、
９５℃  ５ｓｅｃ−５６℃  ４０ｓｅｃ  ５サイクル
９０℃  ５ｓｅｃ−５６℃  ４０ｓｅｃ  ３５サイクル（ＦＡＭ、ＲＯＸ、Ｃｙ５蛍光検出）【００９１】
結果を図１に示す。ＮａＯＨの終濃度１０、２０、３５、５５、８０ｍＭの前処理後の試料、すべてにおいて増幅物の検出が認められ、終濃度２０〜５５ｍＭが好適であることが見出された。【００９２】
実施例５．  糞便検体を用いた室温放置時間の検討
実施例４と同様に調製したノロウイルス陽性懸濁液の上清１μＬに対し、４２ｍＭのＮａＯＨ溶液５μＬを添加し、アルカリ性の混合液を調製した。該混合液を室温（２７℃）にそれぞれ、２、５、１０、２０、３０分放置後、前処理後の試料とした。【００９３】
この前処理後の試料と、ＴａＫａＲａノロウイルスＧＩ／ＧＩＩ検出キット（高速検出用）（タカラバイオ株式会社製ＲＲ２９６Ａ）の構成品を用いて、実施例４と同様の組成のＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製し、実施例４と同様の反応条件でＲＴ−ＰＣＲに供し、Ｃｔ値を求めた。【００９４】
試験用の検体として、ノロウイルスＧＩ陽性検体＃３６２（ＧＩ）、ノロウイルスＧＩＩ陽性検体＃８（ＧＩＩ）、＃２７（ＧＩＩ）、＃３３６（ＧＩＩ）の４検体を用意し、結果に示した。【００９５】
結果を図２に示す。２、５、１０、２０、３０分放置後の前処理後の試料、すべてにおいて増幅が認められ２、５分がもっとも好適であることが見出された。また２〜３０ｍｉｎでＣｔ値に大差は認められなかった。【００９６】
実施例６．  糞便検体を用いた環境温度による反応性の確認
実施例４と同様に調製したノロウイルス陽性懸濁液の上清１μＬに対し、４２ｍＭのＮａＯＨ溶液５μＬを添加し、ＮａＯＨの終濃度３５ｍＭのアルカリ性の混合液を調製した。該混合液を氷上で、２、５、１０、２０、３０分放置後、前処理後の試料とした。【００９７】
この前処理後の試料と、ＴａＫａＲａノロウイルスＧＩ／ＧＩＩ検出キット（高速検出用）（タカラバイオ株式会社製ＲＲ２９６Ａ）の構成品を用いて、実施例４と同様の組成のＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製し、実施例４と同様の反応条件でＲＴ−ＰＣＲに供し、Ｃｔ値を求めた。【００９８】
試験用の検体として、ノロウイルスＧＩ陽性検体＃３６０（ＧＩ）、ノロウイルスＧＩＩ陽性検体＃８（ＧＩＩ）、＃２７（ＧＩＩ）、＃９１（ＧＩＩ）、＃３６０（ＧＩＩ）の５検体を用意し、結果に示した。【００９９】
結果を図３に示す。２、５、１０、２０、３０分放置後の前処理後の試料、すべてにおいて、増幅が認められ、放置時間によるＣｔの変化は認められなかった。【０１００】
実施例７．  室温で前処理する方法と室温で前処理する方法にキレート剤を添加する場合の反応性を確認
実施例４と同様に調製した、ノロウイルス陽性懸濁液の上清１μＬに対し、４２ｍＭのＮａＯＨ溶液５μＬを添加（ＮａＯＨの終濃度は３５ｍＭ）して、アルカリ性の混合液（最終容量６μＬ）を調製した。一方で、ノロウイルス陽性懸濁液の上清１μＬに対し、６０ｍＭのＥＧＴＡ  １μＬ（終濃度１０ｍＭ）を添加して撹拌して懸濁液を得、次いでこれに５２．５ｍＭのＮａＯＨ溶液４μＬを添加（ＮａＯＨの終濃度３５ｍＭ）して、アルカリ性の混合液（最終容量６μＬ）を調製した。これらのアルカリ性の混合液を室温（２７℃）で３０分放置した後、前処理後の試料とした。【０１０１】
この前処理後の試料の全量と、ＴａＫａＲａノロウイルスＧＩ／ＧＩＩ検出キット（高速検出用）（タカラバイオ株式会社製ＲＲ２９６Ａ）の構成品を用いて、実施例４と同様の組成のＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製し、実施例４と同様の反応条件でＲＴ−ＰＣＲに供し、Ｃｔ値を求めた。【０１０２】
また、工程（ｂ）である前処理工程に、キレート剤を添加することにより、ＲＴ−ＰＣＲ反応液中のＭｇ２＋イオンに作用し、ＲＴ−ＰＣＲに影響することが考えられたので、あらかじめ、反応阻害がないことを確認している、上記のキットに同梱されている、ノロウイルスＧＩ、ＧＩＩのポジティブコントロール及び、インターナルコントロールを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ反応液中のＭｇ２＋イオンの添加量を検討した。その結果、今回のＲＴ−ＰＣＲ反応条件では、１ｍＭのＭｇ２＋イオンを添加すれば反応が改善することが分かった。よって本実施例及び以後の実施例において、キレート剤を使用する場合には、ＲＴ−ＰＣＲ反応液に１ｍＭのＭｇ２＋イオンを添加することにした。その他の反応条件は実施例４と同様である。【０１０３】
また、試験用の検体として、ノロウイルスＧＩＩ陽性検体＃２８、＃２８８、＃１７３、＃２８９、＃９１、＃２４８、＃２２０、＃１３９、＃８７、＃２５１の１０検体を用意し、結果に示した。なお、核酸増幅には製品ＣｏｄｅＮｏ，ＴＰ−９９０  ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）ＲｅａｌＴｉｍｅ  ＳｙｓｔｅｍＩＩＩを用いた。【０１０４】
結果を図４に示す。図中、白棒グラフは室温でＥＧＴＡを含むアルカリ性の混合液を用いて前処理を行い、その後のＲＴ−ＰＣＲ反応でＭｇ２＋イオン補充をした結果である。黒棒グラフは室温でＥＧＴＡを含まないアルカリ性の混合液を用いて前処理を行った結果である。本実験で使用した上記の１０検体すべてで、キレート剤の添加によってＣｔ値の低下が見られた。このように、ＥＧＴＡを前処理工程に加えて常温処理した場合、反応改善の効果を示すことがわかった。【０１０５】
実施例８．  氷上で前処理する方法と、室温で前処理する方法にキレート剤を添加した場合の反応性を確認
実施例４と同様に調製したノロウイルス陽性懸濁液の上清１μＬに対し、氷上で４２ｍＭのＮａＯＨ水溶液を５μＬ添加（終濃度３５ｍＭ）し、アルカリ性の混合液（最終容量６μＬ）を調製した。該混合液は氷上で３０分放置した。【０１０６】
一方、室温（２７℃）でノロウイルス陽性懸濁液の上清１μＬに対し、３０ｍＭのＥＤＴＡを１μＬ（終濃度５ｍＭ）を添加して撹拌して懸濁液を得、次いでこれに５２．５ｍＭのＮａＯＨ溶液４μＬを添加（終濃度３５ｍＭ）してアルカリ性の混合液（最終容量６μＬ）を調製し、該混合液を室温（２７℃）で３０分放置した。【０１０７】
このように調製し、それぞれの温度条件で３０分の放置を終えた前処理後の試料の全量と、ＴａＫａＲａノロウイルスＧＩ／ＧＩＩ検出キット（高速検出用）（タカラバイオ株式会社製ＲＲ２９６Ａ）の構成品を用いて、実施例４と同様の組成のＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製し、実施例４と同様の反応条件でＲＴ−ＰＣＲに供し、Ｃｔ値を求めた。【０１０８】
なお、ＥＤＴＡを含む前処理後の試料でＲＴ−ＰＣＲ反応液を調製する際には、実施例７と同様にあらかじめＭｇ２＋イオンの添加量を検討し、ＲＴ−ＰＣＲ反応液に１ｍＭのＭｇ２＋イオンを添加した。その他の反応条件は実施例４と同様である。【０１０９】
また、試験用の検体として、ノロウイルスＧＩＩ陽性検体＃９１、ノロウイルスＧＩ／ＧＩＩの共感染モデルとして＃３６０の２種類のサンプルを用意した。一つのサンプルあたり実験を２回行って、平均のＣｔ値を求めた。なお、核酸増幅には製品ＣｏｄｅＮｏ，ＴＰ−９９０  ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）ＲｅａｌＴｉｍｅ  ＳｙｓｔｅｍＩＩＩを用いた。【０１１０】
結果を図５に示す。図中、白棒グラフは氷上で工程（ｂ）を実施した結果である。黒棒グラフは室温でＥＤＴＡの存在下で工程（ｂ）を実施し、その後のＲＴ−ＰＣＲ反応液中にＭｇ２＋イオン補充をした結果である。氷上処理方法と室温処理方法にキレート剤を添加した場合、ＲＴ−ＰＣＲの結果は、同等の反応性を示した。【０１１１】
実施例９  キレート剤添加のタイミング
ノロウイルス陽性の糞便検体を１０％（ｗ/ｖ）糞便懸濁液となるように、１００ｍＭ  ＥＧＴＡ２ナトリウム溶液で懸濁した。この時、ＥＧＴＡ濃度は終濃度で６０ｍＭである。次に前記糞便懸濁液１μＬにＮａＯＨ溶液５μＬを添加した。この時、ＮａＯＨ濃度は、終濃度で３５ｍＭである。当該アルカリ性の混合液６μＬを直ちにＲＴ−ＰＣＲに供した場合のＣｔ値と室温（２７℃）又は氷上で５分間、１５分間又は３０分間それぞれ保持した後にＲＴ−ＰＣＲに供した場合のＣｔ値とを比較した。【０１１２】
ＲＴ−ＰＣＲ用反応液は、実施例４のものと同じである。なお本実施例においても、実施例８と同様に、ＲＴ−ＰＣＲ溶液にＭｇ２＋イオンを追加して、Ｍｇ２＋イオン濃度が１ｍＭプラスになるようにした。
試験用の検体として実検体、即ち、被験者より採取されたノロウイルスＧＩの糞便検体１８−０１６及び１８−０１７、ＧＩＩ陽性検体１８−０７７及び１８−０７８の４種類の検体を使用した。
反応条件は、以下の設定で行った。サーマルサイクラーは、実施例４と同じである。【０１１３】
４２℃  ５ｍｉｎ
９５℃  ３０ｓｅｃ（１サイクル）
９５℃  ５ｓｅｃ−５６℃  ４０ｓｅｃ  （５サイクル）
９０℃  ５ｓｅｃ−５６℃  ４０ｓｅｃ  （３５サイクル）
（ＦＡＭ、ＲＯＸ、Ｃｙ５蛍光検出）【０１１４】
アルカリ性の混合液調製後ただちにＲＴ−ＰＣＲに供した場合のＣｔ値を基準として、室温又は氷上で５分間、１５分間又は３０分間それぞれ保持した後のＲＴ−ＰＣＲのＣｔ値を比較したところ、保持温度及び保持時間にかかわらず、いずれも基準のＣｔ値とほぼ同一のＣｔ値であることが確認できた。このことから、糞便検体をまずキレート剤を含む溶液で懸濁した後、アルカリ処理する場合であっても、室温又は氷上保持の時間にかかわらず目的の非エンベロープウイルスを効率よく検出できた。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明は、食品衛生検査、環境検査、臨床診断等に用いられる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１  ；  ＰＣＲ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＦＣＶｇｐ２−Ｆ．
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２  ；  ＰＣＲ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＦＣＶｇｐ２−Ｒ．
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３  ；  Ｐｒｏｂｅ  ＦＣＶＧＰ２−Ｐ．  ５’−ｅｎｄ  ｉｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ＦＡＭ  ａｎｄ  ３’−ｅｎｄ  ｉｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ＢＨＱ１．
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４  ；  ＰＣＲ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＣＯＧ１Ｆ．
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５  ；  ＰＣＲ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＣＯＧ１Ｒ．
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６  ；  Ｐｒｏｂｅ  ＲＩＮＧ１−ＴＰ（ａ）．  ５’−ｅｎｄ  ｉｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ＦＡＭ  ａｎｄ  ３’−ｅｎｄ  ｉｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ＢＨＱ１．
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７  ；  ＰＣＲ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＣＯＧ２Ｆ．
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８  ；  ＰＣＲ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＣＯＧ２Ｒ．
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：９  ；  Ｐｒｏｂｅ  ＲＩＮＧ２ＡＬ−ＴＰ．  ５’ｅｎｄ  ｉｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ＲＯＸ  ａｎｄ  ３’−ｅｎｄ  ｉｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ＢＨＱ２．
【図１】
2019017452.tif 000005
【図２】
2019017452.tif 000006
【図３】
2019017452.tif 000007
【図４】
2019017452.tif 000008
【図５】
2019017452.tif 000009
【配列表】
2019017452000001.app
【国際調査報告】
2019017452.tif 000010
2019017452.tif 000011