(57)【要約】  本発明者らは、これまでにHCVウイルスRNAに対しRNAi活性を示すものとされてきたsiE配列を中心にして、主にIRES領域内に存在するD5-50、D5-197領域を選定し解析を進めた結果、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡに対し、より有効なRNAi活性を示すsiRNA配列の同定に成功した。また、当該siRNAはin vivo系においても有意なHCV増殖抑制効果を示すことが明らかとなった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１〜２０のいずれかに示すヌクレオチド配列を有するオリゴリボヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のオリゴリボヌクレオチドと相補的な配列を有するＨＣＶのＲＮＡ領域、あるいは該オリゴリボヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴリボヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：２４〜２９のいずれかに示すヌクレオチド配列において連続する１９〜２３塩基からなるヌクレオチド配列で示されるオリゴリボヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のオリゴリボヌクレオチドと相補的な配列を有するＨＣＶのＲＮＡ領域、あるいは該オリゴリボヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴリボヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴリボヌクレオチドを発現するベクター。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴリボヌクレオチド若しくはペプチド核酸、または請求項５に記載のベクターを有効成分とするＣ型肝炎治療剤。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸をＨＣＶのＲＮＡに結合させて、ＨＣＶの複製能を阻害する方法。
【請求項８】
標的遺伝子に対する効率的なRNAi活性を有するsiRNAの設計法であって、以下の工程を含む設計方法；
i）標的遺伝子又はその断片に対応するRNAをdicerで切断する工程
ii）当該RNAの上記切断部位を特定する工程
iii）当該RNAの、上記切断部位を含み且つ連続する18〜23塩基からなる配列を選択する工程
iv）iii）で選択した塩基配列を有するsiRNAを設計する工程。
【請求項９】
前記標的遺伝子が宿主細胞遺伝子ある請求項８記載の設計方法。
【請求項１０】
前記標的遺伝子が動物細胞遺伝子である請求項８記載の設計方法。
【請求項１１】
前記標的遺伝子がウイルス遺伝子である請求項８記載の設計方法。
【請求項１２】
前記ウイルス遺伝子がRNAウイルス遺伝子である請求項11記載の設計方法。
【請求項１３】
前記標的遺伝子又はその断片に対応するRNAが、高次構造を有し且つ株間で80〜90%以上保存されている配列を含むRNAである請求項11又は12記載の設計方法。
【請求項１４】
前記標的遺伝子又はその断片に対応するRNAが、高次構造を有し且つ株間で80〜90%以上保存されている配列が、インターナル・リボソーム・エントリー・サイト（IRES領域）を含む配列である請求項13記載の設計方法。
【請求項１５】
前記RNAの配列が20〜400塩基である請求項８の設計方法。
【請求項１６】
前記ウイルスが、HCV、HIV、インフルエンザウイルス、HBV、デングウイルス、又は麻疹ウイルス、ノロウイルス、SARSウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、RSウイルス、マーブルグウイルス、エボラウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、G型肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、又はヒトTリンパ好性ウイルスである請求項11又は12記載の設計方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの働きを阻害するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸、該オリゴヌクレオチドを発現するベクター、これらを有効成分とするＣ型肝炎治療剤、並びに該オリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸をＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡに結合させてウイルスの複製能を阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣＶ」という）は、輸血後の非Ａ非Ｂ型肝炎の主要な原因ウイルスであり、その遺伝子のｃＤＮＡは１９８９年にクローニングされた。これまでにクローニングされた遺伝子ｃＤＮＡを用いてＨＣＶに関する多くの研究が行われており、特に感染予防ならびに診断法の確立など社会的に重要な成果が達成され、現在では輸血後のＨＣＶ感染はほとんど認められない状況に至っている。しかしながら、世界中のＨＣＶ感染者数は全人口の数％にもおよぶとされている。【０００３】
ＨＣＶ感染に起因する肝炎は長期慢性化する特徴があり、これに伴い慢性肝炎を引き起こし、その後肝硬変、さらに肝癌に移行する割合が非常に高いことが知られており、ＨＣＶ感染後の肝炎の確実な治療が重要な課題となっている。【０００４】
Ｃ型慢性肝炎の治療法については、インターフェロン（ＩＦＮ）療法が広く施行されているが、有効率が約３０％であること、高頻度に発熱などの副作用が誘導されること、高薬価であることなどの問題が存在している。ＩＦＮの種類、用法・用量の検討もなされ、コンセンサスＩＦＮの開発などにより有効率の向上も期待され、また、ＩＦＮとリバビリンなどの抗ウイルス剤の併用による治療も試みられているが、現在までのところいずれも確実な治療法には至っていない。【０００５】
一方、近年、動物の生体内における細胞内での特定の遺伝子の発現を抑制する方法として、標的遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡを用いて標的遺伝子の発現を抑制する方法が見出された（非特許文献１）。この方法はＲＮＡインターフェアランス（ＲＮＡｉ）と呼ばれ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞内に導入した際に、そのＲＮＡ配列に対応する細胞内のｍＲＮＡが特異的に分解され、そのｍＲＮＡによってコードされる蛋白質が発現されなくなる現象をいう。ＲＮＡｉは、新規遺伝子の機能を遺伝子発現阻害により調べる上で有効な方法であり、線虫、ショウジョウバエなどで遺伝子機能解析に盛んに用いられている。【０００６】
ＨＣＶの翻訳開始・蛋白質合成には、5’非翻訳領域とコア領域の一部を含むインターナル・リボソーム・エントリー・サイト（Internal Ribosomal Entry Site ： IRES）が重要な役割を果たしていることが知られている（非特許文献２）。HCVの複製に重要な役割を果たしているIRES領域にはステムループを形成するステム領域など高次構造が多く存在する。ＨＣＶの5’非翻訳領域やＩＲＥＳ、ステム領域については既に多くの報告がある(非特許文献２〜１２)。IRES領域はこのようにHCVの複製にとって重要な遺伝子領域であり、その1次構造（核酸塩基配列）が遺伝子型の異なるＨＣＶにおいても、よく保存されている。【０００７】
ＨＣＶは遺伝子型の異なる複数ＨＣＶが存在する。そのようなＨＣＶの例としては、例えば、HCJ6、HCJ8、HCV-1、HCV-BK、HCV-J、HCVSHIMO、JCH1、JCH3、JFH1、R24、R6、S14Jなどが挙げられる。このような遺伝子型の異なる複数のＨＣＶ-ＲＮＡに対応する為には、遺伝子型の異なる複数のＨＣＶの配列の中で同一性が高いIRES領域をターゲットにすることが好ましい。しかしながら、IRES領域はその高次構造によって翻訳開始という機能を果たしているため、複雑な構造をとっており、既存のsiRNA配列同定アルゴリズムでは高効率なRNAi活性を示すsiRNA配列を同定することは困難であった。【０００８】
これまでに、本発明者らは高効率なRNAi活性を示すsiE配列を同定し、報告してきた（非特許文献１３）が、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡに対し、より有効なRNAi活性を示すsiRNA配列の同定が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO2004/078974
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Fire, A. et al., nature (1998) 391, 806-811
【非特許文献２】Tsukiyama-Kohara K. et al., J.Virology (1992) 66, 1476-1483
【非特許文献３】Kato. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87, 9524-9528, (1990)
【非特許文献４】Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 88, 2451-2455, (1991)
【非特許文献５】J. Viol., 65, 1105-1113, (1991)
【非特許文献６】J. Gen. Viol., 72, 2697-2704, (1991)
【非特許文献７】Virology, 188, 331-341, (1992)
【非特許文献８】Honda Masao. et al., J.Virol., 73, 1165-1174, (1999)
【非特許文献９】Honda Masao et al., RNA, 2(10), 955-968, (1996)
【非特許文献１０】Sasano T. et al., Genome Inf. Ser., 9, 395-396, (1998)
【非特許文献１１】Ito T et al., J. Virol., 72, 8789-8796, (1998)
【非特許文献１２】Kamoshita N et al., Virology., 233, 9-18, (1997)
【非特許文献１３】Watanabe, T. et al., Gene Theraphy 13: 883-892 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、以上の状況を鑑みてなされたものであり、その目的は、従来同定されたオリゴリボヌクレオチドよりもより有効なRNAi活性を示すＣ型肝炎ウイルスの働きを阻害するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸、該オリゴヌクレオチドを発現するベクター、これらを有効成分とするＣ型肝炎治療剤、並びに該オリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸をＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡに結合させてウイルスの複製能を阻害する方法を提供することにある。また、より有効なRNAi活性を示すsiRNAの設計方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために、これまでにHCVウイルスRNAに対しRNAi活性を示すものとされてきたsiE配列を中心にして、主にIRES領域内に存在するD5-50、D5-197領域を選定し解析を進めた結果、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡに対し、より有効なRNAi活性を示すsiRNA配列の同定に成功し、本発明を完成した。
さらに、in vivo系におけるHCV増殖抑制効果の検討したところ、当該siRNAはin vivo系においても有意なHCV増殖抑制効果を示すことが明らかとなった。【００１３】
即ち、本発明は以下〔１〕〜〔１６〕の発明に係るものである。
〔１〕配列番号：１〜２０のいずれかに示すヌクレオチド配列を有するオリゴリボヌクレオチド。
〔２〕〔１〕に記載のオリゴリボヌクレオチドと相補的な配列を有するＨＣＶのＲＮＡ領域、あるいは該オリゴリボヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴリボヌクレオチド。
〔３〕配列番号：２４〜２９のいずれかに示すヌクレオチド配列において連続する１９〜２３塩基からなるヌクレオチド配列で示されるオリゴリボヌクレオチド。
〔４〕〔３〕に記載のオリゴリボヌクレオチドと相補的な配列を有するＨＣＶのＲＮＡ領域、あるいは該オリゴリボヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴリボヌクレオチド。
〔５〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のオリゴリボヌクレオチドを発現するベクター。
〔６〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のオリゴリボヌクレオチド若しくはペプチド核酸、または〔５〕に記載のベクターを有効成分とするＣ型肝炎治療剤。
〔７〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸をＨＣＶのＲＮＡに結合させて、ＨＣＶの複製能を阻害する方法。
〔８〕標的遺伝子に対する効率的なRNAi活性を有するsiRNAの設計法であって、以下の工程を含む設計方法；
i）標的遺伝子又はその断片に対応するRNAをdicerで切断する工程
ii）当該RNAの上記切断部位を特定する工程
iii）当該RNAの、上記切断部位を含み且つ連続する18〜23塩基からなる配列を選択する工程
iv）iii）で選択した塩基配列を有するsiRNAを設計する工程。
〔９〕前記標的遺伝子が宿主細胞遺伝子ある〔８〕記載の設計方法。
〔10〕前記標的遺伝子が動物細胞遺伝子である〔８〕記載の設計方法。
〔11〕前記標的遺伝子がウイルス遺伝子である〔８〕記載の設計方法。
〔12〕前記ウイルス遺伝子がRNAウイルス遺伝子である〔11〕記載の設計方法。
〔13〕前記標的遺伝子又はその断片に対応するRNAが、高次構造を有し且つ株間で80〜90%以上保存されている配列を含むRNAである〔11〕又は〔12〕記載の設計方法。
〔14〕前記標的遺伝子又はその断片に対応するRNAが、高次構造を有し且つ株間で80〜90%以上保存されている配列が、インターナル・リボソーム・エントリー・サイト（IRES領域）を含む配列である〔13〕記載の設計方法。
〔15〕前記RNAの配列が20〜400塩基である〔８〕の設計方法。
〔16〕前記ウイルスが、HCV、HIV、インフルエンザウイルス、HBV、デングウイルス、又は麻疹ウイルス、ノロウイルス、SARSウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、RSウイルス、マーブルグウイルス、エボラウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、G型肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、又はヒトTリンパ好性ウイルスである〔11〕又は〔12〕記載の設計方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】a.長い２本鎖ＲＮＡのＨＣＶ遺伝子上での位置を示した図である。  b.長い２本鎖ＲＮＡをダイサー蛋白で切断したときのsiＲＮＡをゲル電気泳動で確認した図である。  c.長い２本鎖ＲＮＡをダイサー蛋白で切断して作製したsiＲＮＡの抗HCV活性を示した図である。
【図２】siＲＮＡがＨＣＶ遺伝子を切断した切断末端の塩基配列を決定するための方法を示した図である。
【図３】長い２本鎖ＲＮＡをダイサー蛋白で切断して作製したsiＲＮＡが切断したＨＣＶの遺伝子部位を示した図である。
【図４】長い２本鎖ＲＮＡをダイサー蛋白で切断して作製したsiＲＮＡが切断したＨＣＶの遺伝子部位から予測して作製したsiRNAの阻害活性を示した図である。
【図５】塩基配列が異なっているＨＣＶレプリコンに対する、長い２本鎖ＲＮＡをダイサー蛋白で切断して作製したsiＲＮＡが切断したＨＣＶの遺伝子部位から予測して作製したsiRNAの阻害活性を示した図である。３種類を混ぜることで塩基配列が異なっていても強い阻害活性を示している。
【図６】コンピユーターでsiRNA配列を予測するプログラムであるsiBLOCK-iT、siVirus、及びsiDirect法で作製したsiRNAと本法(Rev法）で作製したsiRNAの阻害活性を比較した図である。本法(Rev法）で作製したsiRNAがもっとも強い阻害活性を示している。
【図７】ＨＣＶの５'非翻訳領域（5'-UTR)の２次構造を示した図である。複雑な高次構造をとっていることがわかる。
【図８】in vivo系におけるsiRNAのHCV増殖抑制効果を示す図である。A-1からA-3：ポリIC誘導後180日目にsiSB-Cont#3,1mg/kgを投与したマウス群を示す。B-1からB-3：ポリIC誘導後180日目にsi197-#1,1mg/kgを投与したマウス群を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のＨＣＶ−ＲＮＡに対して配列特異的に結合するオリゴＲＮＡは、糖としてリボースを有するオリゴヌクレオチドであり、塩基としては、天然のＲＮＡ中に存在するアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルの他、チミン、並びに他の修飾塩基等を含むものも包含する。本発明のオリゴＲＮＡは、ＨＣＶ−ＲＮＡに配列特異的に結合可能なオリゴＲＮＡであれば特に制限されないが、ＨＣＶの複製能を阻害するオリゴＲＮＡであることが好ましい。ＨＣＶ−ＲＮＡに配列特異的に結合可能なオリゴＲＮＡとしては、例えば、ＨＣＶ−ＲＮＡの配列と相補的な配列を有するオリゴＲＮＡ、ＨＣＶ−ＲＮＡの配列と相補的な配列と高い同一性を示す配列を有するオリゴＲＮＡ、ＨＣＶ−ＲＮＡの配列を有するＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なオリゴＲＮＡ等を挙げることができる。尚、本発明は特定の理論に拘束されるものではないが、本発明の好ましい一態様であるｓｉＲＮＡは、細胞内で標的遺伝子にハイブリダイズしてダイサーを介して標的遺伝子を切断するものであり、標的遺伝子は１９〜２３塩基の長さに切断されると考えられている。一方、本発明の他の態様であるアンチセンス核酸は、標的遺伝子にハイブリダイズしてＩＦＮを誘導し、ＲＮａｓｅを活性化することによって標的遺伝子を分解すると考えられる。あるいは、結合によって標的ＲＮＡの構造変化を起こして翻訳を阻害すると考えられている。また、本発明において、ＨＣＶ−ＲＮＡの配列とは、ＨＣＶのゲノムＲＮＡ（−鎖）の配列、ゲノムＲＮＡから転写されたｍＲＮＡ（＋鎖）の配列のいずれでも良いが、好ましくは＋鎖の配列である。
【００１６】
尚、本明細書において、ｓｉＲＮＡとは、オリゴＲＮＡの中でも、その長さが１９〜２３塩基（１９〜２３ｂｐ）のものをいう。ｓｉＲＮＡが二本鎖を形成している場合、一方または双方が突出末端を有していても良い。
【００１７】
本発明において高い同一性とは、７０％以上の同一性であり、好ましくは８０％以上の同一性であり、さらに好ましくは９０％以上の同一性（例えば９５％以上の同一性）である。塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）等によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
【００１８】
ハイブリダイゼーション技術は当業者によく知られた技術であり（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９、など）、ストリンジェントな条件も当業者であれば適宜選択することが可能である。ストリンジェントな条件の例としては、例えば、ハイブリダイゼーション後の洗浄において４２℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１９】
本発明のオリゴＲＮＡは一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、又、さらに二本以上の複数の鎖から形成されていてもよいが、好ましいのは二本鎖である。二本鎖は独立した２本の鎖から形成されていてもよいし、又、自己相補的な一本鎖ＲＮＡ中で形成される二本鎖であってもよく、この場合、一分子でステムループ構造を形成することができる。オリゴＲＮＡが二本鎖の場合、全ての領域において二本鎖を形成していてもよいし、一部の領域（例えば両末端又は片方の末端など）が一本鎖等の他の構造を形成していてもよい。
【００２０】
本発明のオリゴＲＮＡは、ＨＣＶ−ＲＮＡへの配列特異的結合能を有していればよく、その長さは限定されない。本発明のオリゴＲＮＡの長さとしては、例えば、５〜１０００塩基（二本鎖の場合には、５〜１０００ｂｐ）であり、好ましくは１０〜１００塩基（二本鎖の場合には、１０〜１００ｂｐ）であり、さらに好ましくは１５〜２５塩基（二本鎖の場合には、１５〜２５ｂｐ）であり、特に好ましくは１９〜２３塩基（二本鎖の場合には、１９〜２３ｂｐ）である。
【００２１】
本発明において好ましいオリゴＲＮＡは、配列番号１〜２０に示すヌクレオチド配列を有するオリゴＲＮＡであり、特に好ましいものとして配列番号１１、１２、１９及び２０（si197-#1、si197-#6）に示すヌクレオチド配列を有するオリゴＲＮＡが挙げられる。また、本発明において好ましい他のオリゴＲＮＡとして、配列番号２４〜２９に示すヌクレオチド配列における連続した１９〜２３塩基からなるヌクレオチド配列で示されるオリゴＲＮＡが挙げられる。
【００２２】
本発明のRNAは、標的遺伝子mRNAのいずれかの領域に対するアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、標的遺伝子mRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードしたセンスコードDNAより発現させることができる。また、これらのアンチセンスRNAおよびセンスRNAよりdsRNAを作成することもできる。アンチセンスRNAおよびセンスRNAの組み合わせとしては、以下の配列番号に示すヌクレオチド配列を有するオリゴリボヌクレオチドの組み合わせを挙げることができる。配列番号：１及び２、配列番号：３及び４、配列番号：５及び６、配列番号：７及び８、配列番号：９及び１０、配列番号：１１及び１２、配列番号：１３及び１４、配列番号：１５及び１６、配列番号：１７及び１８、並びに配列番号：１９及び２０。
【００２３】
dsRNAにおけるRNA同士が対合した二重鎖RNAの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。
【００２４】
本発明のsiRNAの末端構造は、HCVウイルス遺伝子の発現をRNAi効果により抑制し得るものであれば、平滑末端あるいは粘着（突出）末端のいずれでもよい。また、粘着（突出）末端構造は、3'末端側が突出している構造だけでなく、上記RNAi効果を誘導し得る限り5'末端側が突出している構造も含めることができる。また、突出する塩基数は、すでに報告がある2，3塩基に限定されず、RNAi効果を誘導し得る塩基数とすることができる。例えば、この塩基数としては、1〜8塩基、好適には、2〜4塩基とすることができる。また、この突出している配列部分は、HCVウイルス遺伝子の転写産物との特異性が低いため、標的であるHCVウイルス遺伝子転写物の配列と相補的（アンチセンス）配列あるいは同じ（センス）配列である必要は必ずしもない。
【００２５】
本発明において好ましい更に他のオリゴＲＮＡとして、例えば上記配列番号１〜２０に示すヌクレオチド配列を有するオリゴＲＮＡと相補的な配列を有するＨＣＶのＲＮＡ領域、あるいは該オリゴＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴＲＮＡ、及び上記配列番号２４〜２９に示すヌクレオチド配列における連続した１９〜２３塩基からなるヌクレオチド配列で示されるオリゴＲＮＡと相補的な配列を有するＨＣＶのＲＮＡ領域、あるいは該オリゴリボヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴＲＮＡが挙げられる。当業者であれば、これらのオリゴＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域を任意のＨＣＶ種において容易に決定することができる。これらのオリゴＲＮＡの例として、例えば上記配列番号１〜２０に示すヌクレオチド配列、あるいは上記配列番号２４〜２９に示すヌクレオチド配列における連続した１９〜２３塩基からなるヌクレオチド配列において、７個以下、好ましくは５個以下、より好ましくは３個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＨＣＶのＲＮＡとハイブリダイズすることによってＨＣＶの複製を阻害し得るものが挙げられる。
【００２６】
また、本発明において好適に使用できるペプチド核酸として、本発明において好適に使用できるオリゴＲＮＡと対応する塩基配列を有するペプチド核酸が挙げられる。
【００２７】
ＨＣＶのＲＮＡは、約３４０ヌクレオチドの５’側の非翻訳領域（５’非翻訳領域）、約９４００ヌクレオチドからなるオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）、約５０ヌクレオチドからなる３’側の非翻訳領域（３’非翻訳領域）で構成されている。このＲＮＡ配列中、本発明のオリゴＲＮＡがターゲットとする部位は特に限定されず、どの部位でもよいが、好ましくは５’非翻訳領域〜ＯＲＦの５’末端領域、３’非翻訳領域であり、特に好ましくは５’非翻訳領域である。
【００２８】
ＨＣＶ−ＲＮＡの５’非翻訳領域には、インターナル・リボソーム・エントリー・サイト（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ：ＩＲＥＳ）やステムループを形成するステム領域などが存在する。ＨＣＶの５’非翻訳領域やＩＲＥＳ、ステム領域については既に多くの報告がある（Ｋａｔｏ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８７，９５２４−９５２８，（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８８，２４５１−２４５５，（１９９１）、Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６５，１１０５−１１１３，（１９９１）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｏｌ．，７２，２６９７−２７０４，（１９９１）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８８，３３１−３４１，（１９９２）、Ｔｓｕｋｉｙａｍａ．Ｋｏｈａｒａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，１４７６−１４８３，（１９９２）、Ｈｏｎｄａ Ｍａｓａｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３，１１６５−１１７４，（１９９９）、Ｈｏｎｄａ Ｍａｓａｏ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，２（１０），９５５−９６８，（１９９６）、Ｓａｓａｎｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆ．Ｓｅｒ．，９，３９５−３９６，（１９９８）、Ｉｔｏ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，８７８９−８７９６，（１９９８）、Ｋａｍｏｓｈｉｔａ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．，２３３，９−１８，（１９９７）、など）。図７に、ＨＣＶ−ＲＮＡの５’非翻訳領域における一般的な二次構造を示す。
【００２９】
また、ＨＣＶには遺伝子型の異なる複数種のＨＣＶが存在する。そのようなＨＣＶの例としては、ＨＣＪ６、ＨＣＪ８、ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−ＢＫ、ＨＣＶ−Ｊ、ＪＣＨ１、ＪＣＨ３、ＪＦＨ１、Ｒ２４、Ｒ６、Ｓ１４Ｊ、ｐＨ７７Ｊ６Ｓ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＦ１７７０３９）、ＨＣＪ６ＣＨ、２ｂ＿ＡＢ０３０９０７などが挙げられる。このような遺伝子型の異なる複数のＨＣＶ−ＲＮＡに対応する為には、遺伝子型の異なる複数種のＨＣＶ遺伝子配列の中で同一性が高い領域をターゲットにすることが好ましい。ここで、遺伝子型の異なる複数のＨＣＶ遺伝子配列の中で同一性が高い領域とは、複数種のＨＣＶのＲＮＡ配列がお互いに８０％以上の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有する領域である。そのような領域は、１０塩基以上の長さを有していることが好ましく、さらに好ましくは１５塩基以上、特に好ましくは２０塩基以上の長さを有する。ここで、複数種のＨＣＶとは、通常、３種類以上のＨＣＶ、好ましくは５種類以上、特に好ましくは１０種類以上のＨＣＶのことをいう。遺伝子配列の同一性は、対象となる複数種の遺伝子の配列を比較し、上述したアルゴリズム等を用いて計算することができる。
【００３０】
本発明で用いられるオリゴリボヌクレオチドは、修飾されていない通常のＲＮＡの構成を有するものの他に、リン酸ジエステル部や糖部などを修飾した修飾ＲＮＡなどを用いることも可能であり、特に限定されるものではない。又、本発明のオリゴＲＮＡは、その一部分にデオキシリボヌクレオチドなどのリボヌクレオチドでない分子を含んでいてもよい。
【００３１】
また、本発明においては、オリゴＲＮＡの代わりにペプチド核酸（ＰＮＡ）などを用いてもよい。ＰＮＡは当業者によく知られた技術であり（Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｐｅｔｅｒ Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０８，３−２６，（２００２）、Ｂｒａａｓｃｈ Ｄｗａｉｎｅ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（１４），４５０３−４５１０，（２００２）、Ｋｏｐｐｅｌｈｕｓ Ｕｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３５９−３７４，（２００１）、Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｐｅｔｅｒ Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３４０，３２９−３４０，（２００１））、上記オリゴＲＮＡと同様に、配列特異的にＨＣＶ−ＲＮＡに結合し得るものを製造できる。本発明において好適なペプチド核酸の長さとしては、例えば、５〜１０００塩基（二本鎖の場合には、５〜１０００ｂｐ）であり、好ましくは１０〜１００塩基（二本鎖の場合には、１０〜１００ｂｐ）であり、さらに好ましくは１５〜２５塩基（二本鎖の場合には、１５〜２５ｂｐ）であり、特に好ましくは１９〜２３塩基（二本鎖の場合には、１９〜２３ｂｐ）である。
本発明のオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸は当業者に公知の方法で作製することが可能である。
【００３２】
本発明のオリゴＲＮＡを継続的に発現させる場合には、本発明のオリゴＲＮＡを発現するベクターを作製してもよい。ベクターは当業者に公知の方法で作製することが可能である。例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００２）１９，４９７−５００に記載されたもの等の公知のベクターに本発明のオリゴＲＮＡをコードする遺伝子を導入することにより作製することが可能である。本発明のオリゴＲＮＡの発現のために好適なプロモーターとしては、特に限定するものではないが、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６プロモーター等が挙げられる。
【００３３】
本発明のsiRNAは、上記アンチセンスRNA鎖をコードするDNA（以下、アンチセンスコードDNA）および上記センスRNA鎖をコードするDNA（以下、センスコードDNA）を用いて、細胞内で発現させることもできる（以下、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAを本発明DNAと略称する。）。上記「アンチセンスコードDNA」および「センスコードDNA」は、プロモーターと共にそのまま細胞内の染色体に導入し、細胞内でアンチセンスRNA、センスRNAを発現させsiRNAを形成させることもできるが、効率的な細胞導入などを行うために、上記siRNA発現システムをベクターに保持させることが好ましい。ここで用いることができる「ベクター」は、導入したい細胞などに対応して選択することができる。例えば、哺乳動物細胞では、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、EBウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクターやカチオニックリポソーム、リガンドDNA複合体、ジーンガンなどの非ウイルスベクターなどが挙げられるが（Y. Niitsuら, Molecular Medicine 35: 1385-1395 (1998)）、これらに限定されるものではない。また、ウイルスベクターではなく、ダンベル型DNA(Zanta M.A. et al., Gene delivery: a single nuclear localization signal peptide is sufficient to carry DNA to the cell nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Jan 5;96(1):91-6)、ヌクレアーゼ耐性を持つような修飾DNA、またはnaked plasmidもまた好適に用いることができる（Liu F, Huang L. Improving plasmid DNA-mediated liver gene transfer by prolonging its retention in the hepatic vasculature. J. Gene Med. 2001 Nov-Dec;3(6):569-76）。
【００３４】
本発明のsiRNAをコードするDNAを、ベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスRNA鎖、センスRNA鎖を発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスRNA鎖、センスRNA鎖を発現させる場合がある。例えば、同一のベクターからアンチセンスRNA鎖、センスRNA鎖を発現させる構成としては、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれpolIII系のような短いRNAを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入することにより構成することができる。また、異なる鎖上に対向するようにアンチセンスコードDNAとセンスコードDNAと逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスRNAコード鎖とセンスRNAコード鎖とが対となった一つの二本鎖DNA（siRNAコードDNA）が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスRNA、センスRNAとを発現し得るようにプロモーターを対向して備えられる。この場合には、センスRNA、アンチセンスRNAの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスRNAコード鎖、センスRNAコード鎖）の３'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、A（アデニン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモーターの種類を異ならせることが好ましい。
【００３５】
ベクターに挿入する本発明のsiRNAをコードするDNAとしては、標的配列のインバーテッドリピートの間に適当な配列（イントロン配列が望ましい）を挿入し、ヘアピン構造を持つダブルストランドRNA(self-complementary ‘hairpin’ RNA(hpRNA))を作るようなコンストラクト（Smith, N.A. et al. Nature, 407:319, 2000、Wesley, S.V. et al. Plant J. 27:581, 2001、Piccin, A. et al. Nucleic Acids Res. 29:E55, 2001）を用いることもできる。
【００３６】
また、異なるベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれ polIII系のような短いRNAを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させることにより構成することができる。
【００３７】
即ち、本発明における「siRNA（二重鎖RNA）をコードするDNA」は、siRNAの双方の鎖をコードする一つのDNAであっても、それぞれの鎖をコードする２つのDNAの組合せであってもよい。また、「siRNA（二重鎖RNA）をコードするDNAが挿入されたベクター」は、siRNAのそれぞれの鎖を２つの転写産物として発現する一つのベクターであっても、siRNAの双方の鎖を１つの転写産物として発現する一つのベクターであってもよく、また、siRNAのそれぞれの鎖を発現する２つのベクターであってもよい。
【００３８】
RNAiに用いるDNAは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上（例えば、96,97,98,99％以上）の配列の同一性を有する。塩基配列の同一性は、上記に記載のアルゴリズムBLASTによって決定することができる。
【００３９】
本発明のオリゴＲＮＡは、ＨＣＶの複製を阻害し、ＨＣＶの増殖を抑制することが可能であるので、Ｃ型肝炎の治療剤として有用である。この場合、複数種類のＨＣＶに対応するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸を提供することで、臨床の場において患者が感染しているウイルスの型を同定することなく治療でき、また複数種のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸を混合して用いる必要もなくなるので好ましい。
【００４０】
治療に用いる場合、細胞内でそのまま機能し得る形態で投与することもできる。この場合、オリゴＲＮＡまたはペプチド核酸の長さは１９〜２３塩基程度とすることが最適である。また細胞内のプロセシングを経て機能し得るものを投与することもできる。この場合には、目的とする配列を含むより長い配列を有するオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸を投与することができる。細胞内に取り込まれた二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）はダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれる酵素によって２１ｍｅｒ前後に分解されてｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）となり、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれる複合体を作り、ゲノムから転写された特定の塩基配列を持ったＲＮＡを破壊する（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，４０９：３６３−３６６，２００１；Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，４０４：２９３−２９６，２０００）。あるいはまた、市販のダイサーを用いて予めｓｉＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで調製して用いることもできる。
【００４１】
細胞、又は細胞培養物、組織、もしくは胚のような細胞集団へsiRNAを送達するには、様々な方法を用いることが可能である。例えば、RNAは直接的に細胞内に導入され得る。マイクロインジェクションによる投与のような様々な物理的方法が、一般に、そのような場合において使用される。細胞送達のためのその他の方法としては、siRNAの存在下での細胞膜の透過性化及び電気穿孔、リポソーム媒介トランスフェクション、又はリン酸カルシウムのような化学物質を使用したトランスフェクションが含まれる。多数の確立された遺伝子治療技術を、細胞へsiRNAを導入するために使用してもよい。ウイルス粒子へウイルス構築物を導入することによって、例えば、発現構築物の細胞への導入、及び構築物によってコードされたRNAの転写が、効率的に達成される。
【００４２】
本発明のオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸を有効成分とするＣ型肝炎治療剤は、必要に応じて、製薬上許容される賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤などの医薬組成物として調製することができ、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。又、本発明のオリゴＲＮＡを発現するベクターを投与することも可能である。
【００４３】
本発明のオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸の投与経路は特に限定するものではないが、好ましくは患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高める封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
【００４４】
本発明のオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができるが、特に限定するものではない。
【００４５】
本発明は更に、上記本発明のオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸をＨＣＶのＲＮＡに結合させて、ＨＣＶの複製能を阻害する方法を提供する。本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの双方でＨＣＶを含むか、または含むおそれのあるサンプルと本発明のオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸とを接触させることを含む。ＨＣＶの複製能の阻害の有無は、当分野で通常用いられる方法によって検出することができる。
【００４６】
本発明はさらに、標的遺伝子に対して高いRNAi活性を有するsiRNAの配列を効率的に選択、設計できる方法を開示する。従来より、siRNAの設計方法については種々のアルゴリズムが知られており、そのアルゴリズムに基づいて様々なsiRNAが設計されている。例えば、標的RNAをDicerで切断し、切り出された配列をsiRNAとして使用することなども知られている。しかし、これらの方法で見出されたsiRNA群は、顕著に高いRNAi活性を有しているとはいえず、或いは、高い活性を有するものの割合も低い。
【００４７】
本発明者らは、Dicerで切り出された配列をもとにするのではなく、標的RNA配列におけるDicerによる切断部位を特定し、その特定部位を含む標的RNAの19〜23個の塩基配列を選択し、その配列をもとにsiRNAの配列を選択することにより、従来よりも効率的に高いRNAi活性を有するsiRNAを設計することができることを見出した。さらには本発明の設計方法により、従来よりも高い活性を有するsiRNAを設計することも可能となる。
本発明の設計方法において、Dicerで切断する際の標的RNAの長さは特に制限されないが、好ましくは20〜400塩基の長さである。
【００４８】
本発明者らは、標的RNA をDicerで切断する場合、用いる標的RNAの長さによって、同じ配列であっても切断される部位が異なることを見出した。本実施例のごとく、HCVのIRES領域を標的とする場合は、約50〜約200塩基の長さの標的RNAをDicerで切断したときの切断部位を含む配列を基にsiRNAを設計することが好ましい。
本発明の方法でsiRNAを設計する場合、対応する標的遺伝子の切断部位が設計したsiRNAの配列の中心付近に存在することが好ましく、具体的には、切断部位を中心に5'側に5〜12塩基又は3'側に5〜12塩基存在することが好ましく、5'側に8〜12塩基又は3'側に8〜12塩基存在することがさらに好ましい。
【００４９】
本発明の設計方法で、宿主細胞遺伝子或いは動物細胞遺伝子を標的遺伝子とする場合は、例えば、そのmRNA又はその断片をDicerで切断し、その切断部位を特定することにより、標的遺伝子に対するsiRNAを設計することができる。
【００５０】
本発明の設計方法で、RNAウイルス等のウイルス遺伝子を標的遺伝子とする場合は、例えば、そのウイルス遺伝子に対応するRNA配列のなかで、高次構造を有し且つ株間で80％以上、好ましく90%以上保存（conservation)されている配列を含む標的遺伝子のRNA断片をDicerで切断し、その切断部位を特定することにより、標的ウイルス遺伝子に対するsiRNAを設計することができる。
【００５１】
上記の高次構造を有し且つ株間で80％以上、好ましく90%以上保存（conservation)されている配列としては、例えば、HCV等のRNAウイルス中のインターナル・リボソーム・エントリー・サイト（IRES配列）、HIVの高度保存領域（the best conserved regions；Retrovirology, 2007, 4:80, Yuki Naito et al）、インフルエンザウイルスの5'末の高度保存（highly conserved）領域などが挙げられる。
【００５２】
本発明の設計方法における標的ウイルスは、高次構造を有し且つ株間で80％以上保存（conservation)されている塩基配列を有するものであれば特に制限されないが、好ましくはDNAウイルス（ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、アデノウイルス科、パポバウイルス科、パルボウイルス科、又はペパドナウイルス科）及びRNAウイルス（アレナウイルス科、オルトミクソウイルス科、カリシウイルス科、コロナウイルス科、トガウイルス科、ノダウイルス科、パラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、フェロウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科）を挙げることが出来る。上記標的ウイルスとして、具体的には、HCV、HIV、インフルエンザウイルス、HBV、デングウイルス、麻疹ウイルス、ノロウイルス、SARSウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、RSウイルス、マーブルグウイルス、エボラウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、G型肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、又はヒトTリンパ好性ウイルスなどが挙げられ、好ましくは、HCV、HIV、インフルエンザウイルス、HBV、デングウイルス、麻疹ウイルスであり、最も好ましくはHCVである。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕  Diced-siRNAのHCVレプリコンRNA切断部位の解析
Diced-siRNAのトランスフェクション
<Lipofectamine2000を用いたトランスフェクション法>
実験開始前日に、HCVレプリコン保持細胞div. bla n3を6ウェルプレート（BECTON DICKINSON, cat.#353046）に250000個/2ml/ウェルで撒いた。この時5%非働化済みFCS（invitrogen, cat.#26140-079）を含むDMEM+GlutaMAX-I（invitrogen, cat.#10569-044）を使用した。
実験開始当日、終濃度が30 nMになるようにDiced siRNA（D5-50, D5-197）（図３）をLipofectamine 2000 Reagent（invitrogen, cat.#11668-019）を用いてdiv. bla n3にトランスフェクションした。以下に、その方法（製品のマニュアルに従った方法）を示す。
トランスフェクション用のDiced-siRNAは、0.23% のNaHCO3を含むOPTI-MEM I（invitrogen, cat.#22600-050）で300 nMに希釈した。一方、Lipofectamine2000 は、0.23% NaHCO3/OPTI-MEM Iで3%に希釈し、ゆるやかに混合し、5分間室温で放置した。300 nM Diced-siRNA溶液と、3% Lipofectamine 2000溶液を等量で混合し、20分間室温で放置した。前日に調整したdiv. bla n3 に、siRNA-Lipofectamine 混合溶液を500 μL/wellで6ウェルプレートに加え、なじませた。37℃、5% CO2インキュベーターにて培養し、トランスフェクション開始後6時間後にサンプルを回収した。【００５４】
<Lipofectamine RNAiMAXを用いたトランスフェクション法>
実験開始当日、終濃度が30 nMになるようにsiRNA (siE-R5)（図３）をLipofectamine RNAiMAX Reagent（invitrogen, cat.#13778-015）を用いてdiv. bla n3にトランスフェクションした。以下に、その方法（製品のマニュアルに従った方法）を示す。
トランスフェクション用のsiRNA (siE-R5)は、0.23% NaHCO3/OPTI-MEM Iで180 nMに希釈した。希釈したsiRNAを6ウェルプレートに500 μL/wellで分注し、Lipofectamine RNAiMAX Reagentを2.5 μL/wellで加えた。緩やかに混合し、20分間室温で放置した。div. bla n3細胞をsiRNA-Lipofectamine 混合溶液が入った6ウェルプレートに380000個/2.5ml/wellで撒いた。このとき10%非働化済みFCSを含むDMEM+GlutaMAX-Iを使用した。37℃、5% CO2インキュベーターにて培養し、トランスフェクション開始後6時間後にサンプルを回収した。【００５５】
RNA抽出方法
トランスフェクション開始後6時間後に、培地を吸引廃棄し、1.4%の2-Mercaptoethanol(nacalai tesque, cat.#21438-82)を含む5 M GTC溶液（5 M Guanidine thiocyanate (Fluka, cat.#50980), 37.5 mM Sodium Citrate(pH 7.0)(WAKO, cat.#191-01785), 0.75% Sarkosyl ; N-Lauroylsarcosine Sodium Salt (nacalai tesque, cat.#201-17)を1300 μL/wellで加え、ピペッティングで完全に溶解した。
400 μLの5M GTC細胞溶解液に対し、27 μLの3M Sodium Acetate(pH 5.2)(Wako, cat.#198-01055)を加えて混合し、さらに400 μLのTE飽和フェノール(Wako, cat.#160-12725)を加えて1分間緩やかに混和した。その後氷上にて15分静置した。次にクロロホルム/イソアミルアルコール(49:1)（Chloroform, Wako, cat.#038-02606, Isoamyl Alcohol, Wako, cat.#017-03676）溶液を90 μL加え、1分間緩やかに混和し、その後氷上にて15分間静置した。15000 rpm、4℃にて、20分間遠心し、上層を新しいチューブに移し、等量の2-プロパノール（Wako, 166-04836）を加え、混和した。-20℃で2時間処理し、15000 rpm、4℃にて、10分間遠心し、RNAを沈殿させた。RNAのペレットを-20℃で冷やした80% エタノール(Wako, cat.#057-00451)で洗浄し、 15000 rpm、4℃にて、5分間遠心した。この洗浄作業を4回繰り返した。ペレットを数秒風乾させ、11 μLのRNA/DW（10 mM DTT(Fluka, cat.#43815), 200U/ml Ribonuclease Inhibitor (TaKaRa, cat.#2310A)）で溶解し、RNA濃度を定量した。【００５６】
同定法１  アダプター法によるHCVレプリコンRNA切断部位の同定
GeneRacer Kit (invitrogen, cat.#L1502-01)の一部を使用して行った（製品マニュアルの「RNA Oligoの付加」以降のプロトコールに従って行った）。【００５７】
HCV RNA サンプルへのRNA Oligoの付加
1〜5 μgのRNAサンプルを総量 7 μLに調整し、凍結乾燥されたGeneRacer RNA Oligoのtubeへ加え、数回ピペッティングしてRNA Oligoと混ぜた。65℃で5分間処理し、氷上にて急冷した。ライゲーション用の試薬（10 x Ligase Buffer, 10 mM ATP, RNase OUT, T4 RNA Ligase）を各1 μLずつ加え、37℃で1時間処理した。Nuclease-Free Water(Ambion, cat.#9932)を90 μL加えた後、等量のフェノール／クロロホルム溶液で混和後遠心し、上清を新しいチューブへ移した。2 μLの10mg/ml mussel glycogenと、10 μLの3 M Na-Acetate (pH5.2)を加えて混合し、220 μLのEtOHを加えて混合した。-80℃で15分間冷やし、15000 rpm、4℃にて、20分間遠心した。ペレットを70% EtOHで洗浄し、軽く風乾させた。9 μLのNuclease-Free Waterに溶解した。【００５８】
HCV RNAの逆転写
GeneRacer Kit付属のSuperScript III RT Moduleを使用して行った。
RNA Oliogoを付加したRNAに100 μMのGene Specific Reverse Primer（R6-876-R20）(配列番号：２１、表１参照)を1 μL加え、10 mM dNTP Mixture solution（GE Healthcare, cat.# 28-4065-51）を1 μL加えた。70℃で3分間処理し、氷上にて急冷した。2 μLの10 x RT Buffer、4 μLの25 mM MgCl2、2 μLの0.1M DTT、1 μLのRNase OUTを加え、ピペッティングで混合した。25℃で2分間処理し、SuperScript III RTを1 μL加え混合した。その後25℃ 10分間、50℃ 30分間、55℃ 30分間、85℃ 5分間処理し、氷上に静置した。RNase H を1 μL加え、37℃で20分間処理した。本反応液のうち2 μLをテンプレートにして1st PCRを行った。【００５９】
【表１】
2010061881.tif 000002
【００６０】
Oligo付加HCV RNA の1st PCR
Phusion DNA Polymerase（Finnzymes, cat.#F-530L）を使用した。
テンプレートcDNA 2 μLに対して、ddH2Oを28.2 μL, 5 x Phusion HF Bufferを10 μL, 10 mM dNTPsを1 μL, 10 μM GeneRacer 5’ Primerを5 μL, 10 μM R6 610-R24 reverse primer (配列番号：２２、表１参照)を3.3 μL, Phusion DNA Polymeraseを0.5 μL加え、計50 μLでPCR反応を行った。PCRのプログラムは98℃ 2分の後、98℃ 10秒→72℃ 30秒のサイクルを20サイクル繰り返し、72℃ 5分処理後、4℃に急冷した。この1st PCR産物をテンプレートにして、2nd PCRを行った。【００６１】
Oligo付加HCV RNA の2nd PCR
AmpliTaq Gold with GeneAmp（Applied Biosystems, cat.#N888-0249）を使用した。
1st PCR DNAサンプル5 μLに対して、ddH2Oを24.2 μL, 10 x PCR Buffer IIを5 μL, 25 mM MgCl2を6 μL, 10 mM dNTPsを1 μL, 10 μM GeneRacer 5’ Primerを5 μL, 10 μM R6 536-R20 reverse primer (配列番号：２３、表１参照)を3.3 μL, Taq Gold DNA Polymeraseを0.5 μL加え、計50 μLでPCR反応を行った。95℃ 5分の後、95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分のサイクルを20サイクル繰り返し、72℃ 7分処理後、4℃に急冷した。3 μLを電気泳動で確認し、残りすべてをエタノール沈殿し、増幅したDNA断片の切り出しを行った。【００６２】
同定法２  c-tailing法によるHCVレプリコンRNA切断部位の同定
5’ Race System (invitrogen, cat.#18374-058)の一部を使用して行った（製品のマニュアルに従った方法で行った）。【００６３】
HCV RNA の逆転写
0.5 mlシリコナイズドチューブ（アシスト、cat.#72.699Z）に2.5 μMのGene Specific Reverse Primer (R6-876-R20；配列番号：２１、表１参照)を1 μLと、HCV RNAサンプルを1〜5 μg加え、Nuclease-Free Water(Ambion, cat.#9932)で総量15.5 μLにした。70℃で10分間処理し、氷上にて急冷した。2.5 μLの10 x PCR Buffer、2.5 μLの25 mM MgCl2、1 μLの10 mM dNTP Mixture solution（GE Healthcare, cat.# 28-4065-51）、2.5 μLの0.1 M DTTを加え、ピペッティングで混合した。42℃で1分間処理し、SuperScript II RTを1 μL加え混合した。42℃で50分間反応させた。70℃で15分間処理し、反応を停止させ、37℃に置いた。RNase mixを1 μL加え、37℃で30分間処理した。【００６４】
cDNAのS.N.A.P.カラム精製
室温にしたBinding solution (6 M sodium iodide)120 μLをcDNAに加え、S.N.A.P.カラムに全量移し、遠心（13000 x g, 20秒）した。冷やしたWash Bufferを加え、同様に遠心し、4回洗浄を行った。次に冷やした70% エタノールを加え、同様に2回洗浄した。最後のエタノールを除いてから1分間遠心した。65℃に暖めた50 μLのNuclease-Free Waterをカラムに加え、遠心（13000 x g, 20秒）し、cDNAを溶出した。【００６５】
dCTPの付加
溶出したcDNA, 10 μLに対して、Nuclease-Free Waterを6.5 μL, 5x tailing Bufferを5 μL, 2mM dCTP (GE Healthcare, cat.# 28-4065-51)を2.5 μLを加え、穏やかに混合した。94℃で2分間処理し、氷中で急冷した。1 μL のTdTを加え、穏やかに混合し、37℃で10分間処理した。10分後すぐに65℃で10分間処理し、TdTを不活化した。軽く遠心して氷上に置いた。【００６６】
c-tailed cDNAの1st PCR
TaKaRa Ex Taq（TaKaRa, cat.#RR001A）を使用した。
テンプレートcDNA 5 μLに対して、Nuclease-Free Waterを34.5 μL, 10 x Ex Taq Bufferを5 μL, 10 mM dNTPsを1 μL, 10 μM 5’ RACE Abridged Anchor Primer(AAP)を2 μL, 10 μM R6 610-R24 reverse primer（配列番号：２２、表１参照)を2 μL, TaKaRa Ex Taq Polymeraseを0.5 μL加え、計50 μLでPCR反応を行った。94℃ 2分の後、94℃ 30秒→55℃ 30秒→72℃ 1分間のサイクルを35サイクル繰り返し、72℃ 5分処理後、4℃に急冷した。この1st PCR産物をテンプレートにして、2nd PCRを行った。【００６７】
c-tailed cDNAの2nd PCR
1st PCR産物 1 μLに対して、ddH2Oを40.5 μL, 10 x Ex Taq Bufferを5 μL, 10 mM dNTPsを1 μL, 10 μM Abridged Universal Amplification Primer(AUAP)を1 μL, 10μM R6 536-R20 reverse primer（配列番号：２３、表１参照)を1 μL, TaKaRa Ex Taq Polymeraseを0.5 μL加え、計50 μLで2nd PCR反応を行った。反応後、3 μLを電気泳動で確認し、残りすべてをエタノール沈殿し、増幅したDNA断片の切り出しを行った。【００６８】
増幅断片の切り出し・精製
2nd PCRで増幅したPCR産物の断片を切り出し、精製を行った。
2nd PCRの結果から、siE-R5, siD5-50は200bp-300bpの間に、siD5-197は150bp-400bpの間にバンドが確認されたので、その領域のバンドをゲルから切り出し、マックスイールドNP (ATTO, Model ; AE-6580)を用いて、50V、1時間泳動し、DNAを溶出した。溶出したDNAサンプルをTE飽和フェノール処理とクロロホルム処理を行い、エタノール沈殿を行った。沈殿したDNAサンプルをライゲーションに用いた。【００６９】
ライゲーション
pGEM-T Easy Vector System I（Promega, cat.#A1360）使用した。
沈殿したDNAサンプルのペレットを7 μLの2mM Tris (Trizma base ; SIGMA, cat.#T1503-1KG) /0.4mM EDTA (2NA ; Dojindo, cat.#345-01865)（T2E0.4）に溶解し、1 μLを5% ポリアクリルアミドゲルで泳動して、同時に泳動したDNA分子量マーカー（100 bp DNA Ladder ; New England Biolabs, cat.#N3231L）からおおよそのDNA濃度を決定した。pGET-T Easyのクローニングベクター50 ngに対し、4.1 ng相当量のDNAサンプルを混合し、T4 DNA Ligaseを加えて4℃にて一晩放置し、ライゲーション反応させた。【００７０】
クローニング
<ケミカルトランスフォーム法>（製品のマニュアルに従った方法で行った）
ライゲーション反応後のサンプル4 μLを、氷中で溶解したワンショットTOP10コンピテントセル（invitrogen, cat.# C4040-10）(50 μL/tube)に加え、緩やかに混ぜ、氷上にて30分間置いた。42℃で30秒処理し、氷水で急冷した。250 μLのHi-Competence Broth（ニッポンジーン, cat.# 319-01343）を加え、37℃で1時間振とう培養した。その後、37℃で暖めておいたLBプレート（Ａ）に150 μLの培養液を撒いた。37℃でインキュベートし、10時間後にコロニーを確認した。250〜300のコロニーが確認された。70個のコロニーを各々10 mlのRich LB培地（Ｂ）に植菌し、37℃で13時間振とう培養した。
LBプレート（Ａ）；1% Bacto-tryptone(BD, cat.#211705)、0.5% Bacto-yeast extract(BD, cat.#212750)、1% NaCl(Wako, cat.#191-01665)、0.002N NaOH(Wako, cat.#197-02125)、1.5% Bacto Agar(BD, cat.#214010)
Rich LB（Ｂ）；2.5% Bacto-tryptone(BD, cat.#211705)、0.75% Bacto-yeast extract(BD, cat.#212750)、0.6% NaCl(Wako, cat.#191-01665)、0.005N NaOH(Wako, cat.#197-02125)【００７１】
<エレクトロポレーション方法>
ライゲーション反応後のサンプルに、グリコーゲンを10 μg加えてエタノール沈殿した。一晩-20℃で処理し、翌日遠心してDNAを沈殿させた。ペレットを70% エタノールでリンスし、風乾後6 μLの2mM Tris/0.4mM EDTA(T2E0.4)に溶解した。2 μLのライゲーションサンプルを50 μLのJM109とともにキュベットに入れ、2.5 kV, 200 OHMS, 25 μFDの条件でエレクトロポレーションした。450 μLのHi-Competence Brothで回収し、1時間、37℃で振とう培養した。その後、37℃で暖めておいたLBプレートに数μLから100 μLの培養液を撒いた。37℃でインキュベートし、10時間後にコロニーを確認した。70個のコロニーを各々10 mlのRich LB 培地に植菌し、37℃で13時間振とう培養した。【００７２】
<ミニプレップ（TENS法）>
振とう培養したRich LB培地10 ml中1 mlの菌液を1.5 mlチューブにとり、15 krpm, 4℃、1分間遠心した。上清を捨て、ボルテックス後、300 μLのTENS溶液（10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.1 N NaOH, 0.5% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate ; Wako, 191-07145)）を加え、緩やかに混ぜた。次に150 μLの3 M NaOAc (Sodium Acetate Trihydrate ; Wako, 198-01055)を加え、緩やかに混ぜ、15 krpm, 4℃、10分間遠心した。遠心後の上清を1 mlの99.5%エタノールに加え、よく混合し、15 krpm, 4℃、10分間遠心した。上清を捨て、沈殿したDNAのペレットを、70%エタノールで2回リンスした。風乾し、0.1 μg/μL RNase A (BOEHRINGER MANNHEIM #1119915) を含むT2E0.4を15 μL加えて、ペレットを溶解した。2 μLをEcoRI（TaKaRa, cat.#1040A）で制限酵素処理し、電気泳動してインサートのチェックを行った。
インサートが認められたサンプルのみ、90 μLのTEを加え、TE飽和フェノール／クロロホルム処理とクロロホルム処理を行い、エタノール沈殿を行った（-80 ℃、15分間）。15krmp, 4℃、10分間遠心し、ペレットを70%エタノールでリンスした。ペレットを風乾し、20 μL のT2E0.4で溶解後、12 μLの20% PEG/2.5M NaCl（Polyethylene Glycol #6000 ; nacalai tesque, cat.#28254-85）を加えて、十分に混合した。氷上に1時間ほど置き、15krmp, 4℃、5分間遠心した。ペレットを70%エタノールで2回リンスし、風乾後、60 μLのT2E0.4に溶解した。DNAを定量し、100-200 ng/μLに希釈した。【００７３】
シークエンス解析
BigDye Terminator v3.1 Cycle Seqencing Kit（Applied Biosystems, cat.#4337456） と、3130xl Genetic Analyzerを用いた。
100-200 ng/μLのプラスミドDNAサンプル1 μLに対し、1 μM R6 536-R20 reverse primer を1 μL、5 x BigDye Terminator v1.1/v3.1 Sequencing Buffer（Applied Biosystems, cat.#4336697）を1.5 μL、BigDye Terminator v3.1 Cycle Seqencing RR100（Applied Biosystems, cat.#4337456）を1 μL、ddH2Oを5.5 μL加えて混合し、PCR Systemを用いて反応させた。反応条件は、95℃ 1分の後、95℃ 30秒→58℃ 20秒→60℃ 3分間のサイクルを30サイクル繰り返した後、4℃に急冷した。
MultiScreen-HV（Millipore, cat.#MAHVN4550)のウェルにSephadex G-50 Superfine (GE Healthcare, cat.#17-0041-01)を詰め、ddH2Oを300 μL/wellで加えて3時間ほど膨潤し、セファデックスカラムを作製した。プレート用の遠心機で余分な水分を除き、シークエンス用のサンプルを10 μL/wellでカラムに加え、2500rpm, 室温, 5分間遠心し、シークエンス用の96プレートに回収した。プレート用エバポレーターで45℃、20分間処理し、水分を蒸発させた。各ウェルにHi-Di Formamide（Applied Biosystems, cat.#4311320）を15 μL/wellで加え、95℃、5分間処理し、氷水で急冷した。
3130xl Genetic Analyzerにシークエンスサンプルのプレートをセットし、シークエンス解析を行った。
解析された配列情報の、HCV相同配列とRNA Oligo配列またはCの連続配列の境界が、切断されたHCV配列の5’末端を示しており、すなわち、Diced siRNAによるHCV RNAの切断部位と考えられた（図３）。同じHCV RNA切断部位をもつクローン数を数え、クローン数が多いHCV RNA切断部位を中心にsiRNAをデザインした。デザイン方法は、HCV RNA切断部位を中心に5’末端側に9塩基、3’末端側に12塩基の計21塩基をsiRNAのセンス鎖としてデザインした。siRNAのアンチセンス鎖は、HCV RNA切断部位を中心に3’末端側に11塩基、5’末端側に10塩基の計21塩基となる。デザインしたsiRNAの配列を表２に示す。siRNAの合成はインビトロジェンのカスタムsiRNA合成および、DhamaconのカスタムsiRNA合成に依頼した。【００７４】
【表２】
2010061881.tif 000003
【００７５】
〔実施例２〕デザインしたsiRNAのHCVレプリコン複製阻害活性の検討
<siRNAのリバーストランスフェクション>
各siRNAサンプルを0.23%のNaHCO3を含むopti-MEMで、0.108 μMになるように希釈し、3倍希釈で10段階の希釈系列を作製した。各希釈系列のサンプルを、ルシフェラーゼアッセイ用の細胞培養用マルチプレート96FII（白）（住友ベークライト, cat.#MS-8096W）と細胞毒性測定用の96ウェルプレート（BD, cat.#353072）にそれぞれn=3で10 μL/wellで９６ウェルプレートに加えた。Lipofectamine RNAiMAX Reagent (invitrogen, cat.#13778-150)を、0.23%のNaHCO3を含むOPTI-MEM Iで1%に希釈し、siRNAを分注したウェルに10 μL/wellで９６ウェルプレートに加えて十分に混和後、室温で20分間インキュベートして、siRNA-Lipofectamene複合体を作製した。Lipofectamine RNAiMAXのみを加えたウェルをコントロールとした。本実施例では、ルシフェラーゼ遺伝子を含むHCVレプリコン細胞として、R6 FLR41-14細胞と、FLR3-1細胞、JFH luc 3-13細胞を用いてsiRNAアッセイを行った。各々の細胞の細胞数を数え、10% 非働化済FCSを含むDMEM+GlutaMax-Iにけん濁し、R6 FLR41-14細胞とFLR3-1細胞の場合は5200cells/100 μL/wellで、JFH luc 3-13細胞の場合は6000cells/100 μL/wellで96ウェルプレートに撒いた。siRNAの終濃度は、0.5、1.4、4.1、12.3、37.0、111.1、333.3、1000、3000、9000 pMとなった。37℃、5% CO2にてインキュベートし、72時間後にルシフェラーゼアッセイおよびWST-8による細胞毒性試験を行った。【００７６】
<ルシフェラーゼ活性測定方法>
ルシフェラーゼ活性測定には、Bright-Glo Luciferase Assay System (Promega, cat.#E2620)を使用した。
ルシフェラーゼアッセイ用96ウェルプレートの全ウェルの培地を廃棄し、5% 非働化済FCSを含むDMEM+GlutaMax-Iを75 μL/wellで加え、培地交換した。Bright-Glo Luciferase Assay Systemを75 μL/wellで加えて、Mithras LB 940（Berthold）で1分間振とうした後、ルシフェラーゼ活性を測定した。【００７７】
<細胞毒性測定>
細胞毒性測定には、Cell Counting Kit-8（Dojindo, cat.#343-07623）を使用した。
Cell Counting Kit-8溶液を、5%非働化済FCSを含むDMEM+GlutaMax-Iで7%に希釈し、アッセイ用の溶液を作製した。細胞毒性試験用の96ウェルプレートの全ウェルの培地を廃棄し、上述のアッセイ用の溶液を100 μL/wellで加え、37℃、5% CO2にて1時間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（Bio-Rad model 550）を用いて、波長450 nm（参照波長655 nm）を測定した。
その結果、si197-#1, si197-#6が最も強力なHCVレプリコン複製阻害活性を示し、細胞毒性については軽微であることが明らかになった（図４a,b,c）。【００７８】
〔実施例３〕ウェスタンブロット解析によるsi50とsi197のHCVタンパク質合成阻害活性の測定
<siRNAのリバーストランスフェクション>
各siRNAサンプルを0.23%のNaHCO3を含むopti-MEMで、18 nMになるように希釈し、500 μL/wellで6ウェルプレートに加えた。Lipofectamine RNAiMAXを、siRNAを分注したウェルに2.5 μL/wellで6ウェルプレートに加えて十分に混和し、室温で20分間インキュベートした。R6 FLR41-14細胞の細胞数を数え、10% 非働化済FCSを含むDMEM+GlutaMax-Iにけん濁し、155000 cells/2.5 ml/wellで6ウェルプレートに撒いた（siRNAの終濃度は3 nM）。37℃、5% CO2にてインキュベートし、72時間後に培地を捨て、PBS(-)で1回洗浄し、PBS(-)を吸引除去した後、60 μL/well 6ウェルプレートのRIPA（1% SDS, 0.5% Nonidet P-40 (nacalai tesque, cat.#23640-94), 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 1x Complete (Roche, cat.#11697 498001)）でサンプリングした。【００７９】
<ウェスタンブロット>
上述のサンプルをソニケーターで処理した後、RC DC Protein Assay Reagents（Bio-Rad, cat.#500-0120）を用いて蛋白濃度を定量した。得られたタンパク質10 μgを10% アクリルアミドゲルでトリス−グリシンSDS緩衝液を用いて電気泳動した。分子量サイズマーカーはプレシジョンPlusブルースタンダード（Bio-Rad, cat.#161-0373）とBroad range Marker（Bio-Rad, cat.#161-0317）を用いた。電気泳動したタンパク質をTrans-BLOT SD SEMI-DRY TRANSFER CELL（Bio-Rad）を用いて1 mA/cm2で80分間Immobilon-P (Millipore, cat.#IPVH00010)に転写し、5%スキムミルク（雪印）で1時間ブロッキングした。その後、一次抗体にNS3抗体（1 μg/ml, R212 Rabbit抗体）またはNS5A抗体（Rabbit抗体）を用いて4℃で一晩反応させ、翌日0.1% Tween/TBS溶液で5分間、3回洗浄し、二次抗体に5%スキムミルクで2000倍に希釈したECL Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked F（ab’）2 Fragment（GE Healthcare, cat.#NA9340）を用いて室温で一時間反応させた。その後0.1% Tween/TBS溶液で10分間、3回洗浄し、ECL Western Blotting Detection Reagents（GE Healthcare, cat.#RPN2106）で検出した。β-アクチンの検出は、一次抗体はMonoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse（SIGMA, cat.#A5441）を5000倍希釈で使用し、二次抗体はECL Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab（GE Healthcare, cat.#NA931）を用いて検出した。その結果、合成したsiRNA si50とsiRNA si197によるHCVタンパク質合成阻害が確認された。【００８０】
〔実施例４〕in vivo系におけるsiRNAのHCV増殖抑制効果の検討
<HCV発現マウスの作成>
C型肝炎ウイルス発現マウスであるMxCre/CN2-29マウス（関口敏、飛田良美、小原道法：C型肝炎ウイルスの持続感染機構と病原性  Medical Science Digest.  35(6)：14-17  2009）にポリIC(GE社、アメリカ)を300μg / 匹で48時間おきに3回投与後、180日間飼育した。【００８１】
<siRNAによる治療実験>
siRNAのリポソーム導入はInvivofectamin（Invitrogen社）を用いた。すなわち、100μｇのsiRNAに100μLのInvivofectaminを加え、緩やかに混和した。Invivofectamin  とsiRNA混液を室温で30分間振とうした（オービタル振とう機使用）。14倍量の5%ブトウ糖（1400μL）を加え混和した。アミコンウルトラ-15（ミリポア  Cat. ＵＦＣ900308）にて5,000×G、4℃、室温で遠心した。濃縮部分を回収し、ブトウ糖で２ mLとした。マウスあたり0.2 mLのリポソーム投与液にsiRNAを混ぜ、1日目で1回静脈投与を行い、2日目で肝臓を回収後、HCVコア定量キット（オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス株式会社）にて肝臓中のHCV量を定量した。【００８２】
<効果判定>
コントロールsiRNAを投与した群（A-1からA-3）はHCVコア量が平均211pg/mgであったが、si197-#1投与群（B-1からB-3）はHCVコアが検出されなかった（図８）。図８には各個体のHCVコア量の測定結果を示した。以上のことから、siSB-197は極めて短時間でHCV発現マウスに対して抗ウイルス作用を示すことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明によって、ＨＣＶ−ＲＮＡに対して従来同定されたものよりも、より効率的に配列特異的に結合し、ＨＣＶの働きを阻害するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸、及びこれらを有効成分とするＣ型肝炎治療剤が提供され、ＨＣＶの新規かつ確実な治療法の提供が可能となった。
【図１】
2010061881.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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