(57)【要約】  ガングリオシドＧＭ３の発現量を増加させる物質を有効成分として含有する、慢性腎臓病の予防又は治療剤。
2019082912.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガングリオシドＧＭ３の発現量を増加させる物質を有効成分として含有する、慢性腎臓病の予防又は治療剤。
【請求項２】
ガングリオシドＧＭ３の発現量を増加させる前記物質が、下記式（１）で表される化合物又はその誘導体である、請求項１に記載の予防又は治療剤。
【化１】
2019082912.tif 000008
［式（１）中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数２〜１６の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表す。］
【請求項３】
請求項１又は２に記載の予防又は治療剤と、薬学的に許容される担体とを含有する、慢性腎臓病の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項４】
慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で、ネフリンタンパク質発現細胞を培養する工程と、
前記細胞に抗ネフリン抗体を反応させる工程と、
前記細胞のＦ−アクチンを検出する工程と、を備え、
検出された前記Ｆ−アクチンの量が、前記被験物質の非存在下における前記Ｆ−アクチンの量と比較して増加することが、前記被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
【請求項５】
慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、
ネフリンタンパク質発現細胞に、抗ネフリン抗体を反応させる工程と、
抗ネフリン抗体を反応させた前記細胞の培地に被験物質を添加する工程と、
前記細胞のＦ−アクチンを検出する工程と、を備え、
検出された前記Ｆ−アクチンの量が、前記被験物質の非存在下における前記Ｆ−アクチンの量と比較して増加することが、前記被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
【請求項６】
慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で、ネフリンタンパク質発現細胞を培養する工程と、
前記細胞に抗ネフリン抗体を反応させる工程と、
前記細胞におけるネフリンタンパク質のリン酸化を検出する工程であって、前記リン酸化が、マウスネフリンタンパク質の第１２３２番目のチロシン残基に相当するチロシン残基のリン酸化である工程と、を備え、
検出された前記リン酸化が、前記被験物質の非存在下における前記リン酸化と比較して低下することが、前記被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
【請求項７】
慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、
ネフリンタンパク質発現細胞に、抗ネフリン抗体を反応させる工程と、
抗ネフリン抗体を反応させた前記細胞の培地に被験物質を添加する工程と、
前記細胞におけるネフリンタンパク質のリン酸化を検出する工程であって、前記リン酸化が、マウスネフリンタンパク質の第１２３２番目のチロシン残基に相当するチロシン残基のリン酸化である工程と、を備え、
検出された前記リン酸化が、前記被験物質の非存在下における前記リン酸化と比較して低下することが、前記被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
【請求項８】
慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で細胞を培養する工程と、
前記細胞におけるガングリオシドＧＭ３又はガングリオシドＧＭ３合成酵素遺伝子の発現量を測定する工程と、を備え、
ガングリオシドＧＭ３又はガングリオシドＧＭ３合成酵素遺伝子の発現量が、前記被験物質の非存在下における発現量と比較して増加することが、前記被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
【請求項９】
慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の投与下で慢性腎臓病を発症する非ヒト動物モデルを飼育する工程と、
前記非ヒト動物モデルの腎機能を評価する工程と、を備え、
被験物質の投与下の前記非ヒト動物モデルの腎機能が、前記被験物質の非投与下の前記非ヒト動物モデルの腎機能と比較して向上したことが、前記被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
【請求項１０】
ネフリンタンパク質発現細胞と、抗ネフリン抗体とを備える、慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニングキット。
【請求項１１】
ファロイジンを更に備える、請求項１０に記載のスクリーニングキット。
【請求項１２】
抗リン酸化ネフリンタンパク質抗体を更に備え、前記抗体が、マウスネフリンタンパク質の第１２３２番目のチロシン残基に相当するチロシン残基のリン酸化を検出する抗体である、請求項１０又は１１に記載のスクリーニングキット。
【請求項１３】
ガングリオシドＧＭ３に対する特異的結合物質、
ガングリオシドＧＭ３合成酵素に対する特異的結合物質、
ガングリオシドＧＭ３合成酵素遺伝子のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーセット、又は
ガングリオシドＧＭ３合成酵素遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、
を備える、慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニングキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性腎臓病の予防又は治療剤に関する。より具体的には、慢性腎臓病の予防又は治療剤、慢性腎臓病の予防又は治療用医薬組成物、慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法、及び、慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニングキットに関する。本願は、２０１７年１０月２７日に、日本に出願された特願２０１７−２０８３０１号、及び、２０１８年４月４日に、日本に出願された特願２０１８−０７２７４７号に基づき優先権を主張し、それらの内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
糸球体上皮細胞の障害は、慢性腎臓病に共通する病態である。慢性腎臓病が進行すると透析が必要となる。現在、特にアジアを中心に透析が必要な患者数が増大しており、大きな社会問題となっている（例えば、非特許文献１を参照）。【０００３】
慢性腎臓病の進行を抑制するためにはタンパク尿を減少させる治療が必要である。しかしながら、この治療は患者の満足度が低いにもかかわらず、久しく新薬の開発がなされていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Liyanage T., et al., Worldwide access to treatment for end-stage kidney disease: a systematic review., Lancet, 385 (9981), 1975-1982, 2015.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような背景のもと、本発明は、慢性腎臓病を予防又は治療する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の態様を含む。
［１］ガングリオシドＧＭ３の発現量を増加させる物質を有効成分として含有する、慢性腎臓病の予防又は治療剤。
［２］ガングリオシドＧＭ３の発現量を増加させる前記物質が、下記式（１）で表される化合物又はその誘導体である、［１］に記載の予防又は治療剤。
【化１】
2019082912.tif 000003
［式（１）中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数２〜１６の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表す。］
［３］［１］又は［２］に記載の予防又は治療剤と、薬学的に許容される担体とを含有する、慢性腎臓病の予防又は治療用医薬組成物。
［４］慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、ネフリンタンパク質発現細胞を培養する工程と、前記細胞に抗ネフリン抗体を反応させる工程と、前記細胞のＦ−アクチンを検出する工程と、を備え、検出された前記Ｆ−アクチンの量が、前記被験物質の非存在下における前記Ｆ−アクチンの量と比較して増加することが、前記被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
［５］慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、ネフリンタンパク質発現細胞に、抗ネフリン抗体を反応させる工程と、抗ネフリン抗体を反応させた前記細胞の培地に被験物質を添加する工程と、前記細胞のＦ−アクチンを検出する工程と、を備え、検出された前記Ｆ−アクチンの量が、前記被験物質の非存在下における前記Ｆ−アクチンの量と比較して増加することが、前記被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
［６］慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、ネフリンタンパク質発現細胞を培養する工程と、前記細胞に抗ネフリン抗体を反応させる工程と、前記細胞におけるネフリンタンパク質のリン酸化を検出する工程であって、前記リン酸化が、マウスネフリンタンパク質の第１２３２番目のチロシン残基に相当するチロシン残基のリン酸化である工程と、を備え、検出された前記リン酸化が、前記被験物質の非存在下における前記リン酸化と比較して低下することが、前記被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
［７］慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、ネフリンタンパク質発現細胞に、抗ネフリン抗体を反応させる工程と、抗ネフリン抗体を反応させた前記細胞の培地に被験物質を添加する工程と、前記細胞におけるネフリンタンパク質のリン酸化を検出する工程であって、前記リン酸化が、マウスネフリンタンパク質の第１２３２番目のチロシン残基に相当するチロシン残基のリン酸化である工程と、を備え、検出された前記リン酸化が、前記被験物質の非存在下における前記リン酸化と比較して低下することが、前記被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
［８］慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で細胞を培養する工程と、前記細胞におけるガングリオシドＧＭ３又はガングリオシドＧＭ３合成酵素遺伝子の発現量を測定する工程と、を備え、ガングリオシドＧＭ３又はガングリオシドＧＭ３合成酵素遺伝子の発現量が、前記被験物質の非存在下における発現量と比較して増加することが、前記被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
［９］慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の投与下で慢性腎臓病を発症する非ヒト動物モデルを飼育する工程と、前記非ヒト動物モデルの腎機能を評価する工程と、を備え、被験物質の投与下の前記非ヒト動物モデルの腎機能が、前記被験物質の非投与下の前記非ヒト動物モデルの腎機能と比較して向上したことが、前記被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
［１０］ネフリンタンパク質発現細胞と、抗ネフリン抗体とを備える、慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニングキット。
［１１］ファロイジンを更に備える、［１０］に記載のスクリーニングキット。
［１２］抗リン酸化ネフリンタンパク質抗体を更に備え、前記抗体が、マウスネフリンタンパク質の第１２３２番目のチロシン残基に相当するチロシン残基のリン酸化を検出する抗体である、［１０］又は［１１］に記載のスクリーニングキット。
［１３］ガングリオシドＧＭ３に対する特異的結合物質、ガングリオシドＧＭ３合成酵素に対する特異的結合物質、ガングリオシドＧＭ３合成酵素遺伝子のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーセット、又はガングリオシドＧＭ３合成酵素遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、を備える、慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニングキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、慢性腎臓病を予防又は治療する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実験例１においてネフリンタンパク質及びガングリオシドＧＭ３（以下、「ＧＭ３」という場合がある。）を検出した蛍光顕微鏡写真である。
【図２】実験例２においてネフリンタンパク質及びＧＭ３を検出した蛍光顕微鏡写真である。
【図３】実験例３における免疫薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。
【図４】実験例４においてＧＭ３及びＦ−アクチンを検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図５】実験例５においてＧＭ３及びＦ−アクチンを検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図６】実験例６における免疫沈降−ウエスタンブロッティング法による解析結果を示す写真である。
【図７】実験例７における免疫沈降−ウエスタンブロッティング法による解析結果を示す写真である。
【図８】実験例８におけるウエスタンブロッティング法による解析結果を示す写真である。
【図９】実験例９においてＦ−アクチンを検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１０】実験例９においてＧＭ３を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１１】実験例１０において算出した、マウスの尿中アルブミン（ｍｇ／ｇ・クレアチニン）の変化を示すグラフである。
【図１２】（ａ）は、実験例１０における、マウスの血清アルブミン量の測定結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１０における、マウスの血清クレアチニン量の測定結果を示すグラフである。
【図１３】（ａ）〜（ｇ）は、実験例１０における、マウスの腎臓組織切片のＰＡＳ染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図１４】図１３（ａ）〜（ｇ）の結果に基づいて障害誘導量を数値化した結果を示すグラフである。
【図１５】（ａ）〜（ｆ）は、実験例１０における、マウスの腎臓組織切片のＰＡＳ染色及びｐ５７の免疫染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図１６】図１５（ａ）〜（ｆ）の結果に基づいて、ｐ５７陽性細胞の単位面積当たりの数を測定した結果を示すグラフである。
【図１７】実験例１１において、ＧＭ３及びネフリンタンパク質を検出した代表的な蛍光顕微鏡写真である。
【図１８】実験例１１における代表的な電子顕微鏡写真である。
【図１９】実験例１２において、ＧＭ３を検出した代表的な蛍光顕微鏡写真である。
【図２０】実験例１３において、ＧＭ３を検出した代表的な蛍光顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［慢性腎臓病の予防又は治療剤］
１実施形態において、本発明は、ガングリオシドＧＭ３の発現量（ガングリオシドＧＭ３の存在量）を増加させる物質を有効成分として含有する、慢性腎臓病の予防又は治療剤を提供する。
【００１０】
実施例において後述するように、発明者らは、慢性腎臓病を発症するモデルマウスを用いた検討結果、及び慢性腎臓病細胞モデルを用いた検討結果から、細胞におけるガングリオシドＧＭ３の発現量を増加させる物質を、慢性腎臓病の予防又は治療剤として用いることができることを明らかにした。ここで、細胞としては、ネフリンタンパク質発現細胞が好適である。
【００１１】
本実施形態の予防又は治療剤が対象とする慢性腎臓病としては、糸球体の足細胞（ポドサイト）の傷害による慢性腎臓病が挙げられ、より具体的には、微小変化型ネフローゼ症候群（ＭＣＮＳ）、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、糖尿病性腎症等が挙げられる。
【００１２】
ガングリオシドＧＭ３の発現量を増加させる物質は、細胞におけるガングリオシドＧＭ３合成酵素遺伝子の発現量を増加させる物質であってもよい。
【００１３】
本実施形態の予防又は治療剤としては、細胞におけるガングリオシドＧＭ３の発現量を増加させる物質であれば特に制限なく用いることができるが、より具体的な例としては、下記式（１）で表される化合物又はその誘導体が挙げられる。
【００１４】
【化２】
2019082912.tif 000004
［式（１）中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数２〜１６の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表す。］
【００１５】
実施例において後述するように、発明者らは、上記式（１）で表される化合物を、慢性腎臓病の予防又は治療剤として用いることができることを明らかにした。実施例の結果から、本実施形態の慢性腎臓病の予防又は治療剤は、ガングリオシドＧＭ３の発現を亢進させるものであると考えられる。
【００１６】
式（１）中、Ｒ１で表される、置換されていてもよい直鎖状のアルキル基の炭素数は、慢性腎臓病の予防又は治療剤としての機能を発揮する限り、２〜１６であってもよく、２〜１０であってもよく、２〜５であってもよい。より具体的な直鎖状のアルキル基としては、例えば、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１７】
Ｒ１で表される、置換されていてもよい分岐鎖状のアルキル基の炭素数は、慢性腎臓病の予防又は治療剤としての機能を発揮する限り、２〜１６であってもよく、２〜１０であってもよく、２〜５であってもよい。より具体的な分岐鎖状のアルキル基としては、例えば、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、２−メチルヘプチル基、３−メチルヘプチル基、４−メチルヘプチル基等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１８】
Ｒ１で表される基の置換基としては、例えば、アミノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられる。
【００１９】
また、上記式（１）で表される化合物の誘導体としては、上記式（１）で表される化合物のエステル、上記式（１）で表される化合物のアミド等が挙げられる。
【００２０】
上記式（１）で表される、より具体的な化合物としては、例えば、バルプロ酸、酪酸、プロピオン酸等が挙げられる。下記式（２）にバルプロ酸の化学式を示し、下記式（３）に酪酸の化学式を示し、下記式（４）にプロピオン酸の化学式を示す。
【００２１】
【化３】
2019082912.tif 000005
【００２２】
［医薬組成物］
上述した慢性腎臓病の予防又は治療剤は、医薬組成物として製剤化されていることが好ましい。すなわち、１実施形態において、本発明は、上述した慢性腎臓病の予防又は治療剤と、薬学的に許容される担体とを含有する、慢性腎臓病の予防又は治療用医薬組成物を提供する。
【００２３】
医薬組成物は、経口的に使用される剤型であってもよく、非経口的に使用される剤型であってもよい。経口的に使用される剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。非経口的に使用される剤型としては、例えば注射剤、吸入剤、坐剤、貼付剤等が挙げられる。
【００２４】
薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水、生理食塩水等の溶媒；ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤等が挙げられる。
【００２５】
医薬組成物は添加剤を更に含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノールの安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。
【００２６】
医薬組成物は、上記の担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【００２７】
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、又は経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、患者の症状、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【００２８】
慢性腎臓病の予防又は治療用医薬組成物の投与量は、有効成分の種類、患者の症状等により変動するが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１〜５０００ｍｇ程度の有効成分（慢性腎臓病の予防又は治療剤）を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。
【００２９】
非経口的に投与する場合、その投与量は、有効成分の種類、患者の症状、投与方法等により変動するが、全身投与を行う場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１〜５００ｍｇ程度の有効成分（慢性腎臓病の予防又は治療剤）を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。局所投与を行う場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．００１〜１０ｍｇ程度の有効成分（慢性腎臓病の予防又は治療剤）を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。
【００３０】
［慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、ネフリンタンパク質発現細胞を培養する工程と、前記細胞に抗ネフリン抗体を反応させる工程と、前記細胞のＦ−アクチンを検出する工程と、を備え、検出された前記Ｆ−アクチンの量が、前記被験物質の非存在下における前記Ｆ−アクチンの量と比較して増加することが、前記被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法を提供する。
【００３１】
本実施形態のスクリーニング方法において、被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。
【００３２】
ネフリンタンパク質発現細胞としては、腎臓の糸球体部位に存在する足細胞（ポドサイト）等の、元々ネフリンタンパク質を発現している細胞を用いてもよく、元々ネフリンタンパク質を発現していないか、発現量がわずかである細胞に、ネフリンタンパク質の発現ベクターを導入して、ネフリンタンパク質を発現させた細胞を用いてもよい。ここで、発現ベクターは特に制限されず、プラスミドベクター、ウイルスベクター等を用いることができる。
【００３３】
ネフリンタンパク質発現細胞として、元々ネフリンタンパク質を発現している細胞を用いる場合、ネフリンタンパク質発現細胞の由来は特に制限されないが、なかでも、慢性腎臓病の予防又は治療剤の投与対象の種由来の細胞であることが好ましく、ヒト又はマウス由来の細胞であることが好ましい。
【００３４】
また、細胞にネフリンタンパク質の発現ベクターを導入する場合、ネフリンタンパク質としては、哺乳動物由来のネフリンタンパク質であれば特に制限なく用いることができる。なかでも、慢性腎臓病の予防又は治療剤の投与対象の種由来のネフリンタンパク質であることが好ましく、ヒト又はマウス由来のネフリンタンパク質であることが好ましい。
【００３５】
ヒトネフリンタンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＫＤのアクセッション番号はＯ６０５００であり、マウスネフリンタンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＫＤのアクセッション番号はＱ９ＱＺＳ７である。
【００３６】
ネフリンタンパク質発現細胞は、腎臓由来の細胞であることが好ましい。なかでも、慢性腎臓病の予防又は治療剤の投与対象の種由来の細胞であることが好ましく、ヒト又はマウス由来の細胞であることが好ましい。具体的な細胞の例としては、実施例で使用したヒト胎児腎細胞株であるＨＥＫ２９３細胞に、ネフリンタンパク質を発現させた細胞、元々ネフリンタンパク質を発現している足細胞等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３７】
ネフリンタンパク質発現細胞に反応させる抗ネフリン抗体としては、ネフリンタンパク質発現細胞が発現しているネフリンタンパク質に特異的に反応する抗体を用いることができ、ポリクローナル抗体であることが好ましい。
【００３８】
例えば、ネフリンタンパク質発現細胞がマウスネフリンタンパク質を発現する場合には、抗マウスネフリン抗体を用いることが好ましい。なかでも、マウスネフリンタンパク質をコードするＤＮＡを、遺伝子免疫法によりウサギに免疫して作製したポリクローナル抗体が好ましい。
【００３９】
抗体は、抗体断片であってもよい。抗体断片としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。
【００４０】
抗ネフリン抗体は、ネフリンタンパク質に対する特異的な結合性を有している限り、抗体以外の特異的結合物質であってもよい。抗体以外の特異的結合物質としては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。
【００４１】
実施例において後述するように、発明者らは、ネフリンタンパク質発現細胞に抗ネフリン抗体を反応させる、慢性腎臓病細胞モデルを開発した。そして、ネフリンタンパク質発現細胞に抗ネフリン抗体を反応させると、細胞のＦ−アクチンが減少することを明らかにした。したがって、この慢性腎臓病細胞モデルを用いることにより、慢性腎臓病の予防又は治療剤をスクリーニングすることができる。
【００４２】
ここで、慢性腎臓病細胞モデルに用いるネフリンタンパク質発現細胞は、上述したものと同様であり、元々ネフリンタンパク質を発現している細胞であってもよく、元々ネフリンタンパク質を発現していないか、発現量がわずかである細胞に、ネフリンタンパク質の発現ベクターを導入して、ネフリンタンパク質を発現させた細胞であってもよい。
【００４３】
より具体的には、まず、被験物質の存在下で、ネフリンタンパク質発現細胞を培養する工程を実施した後、上記の細胞に抗ネフリン抗体を反応させる工程を実施する。その後、上記の細胞のＦ−アクチンを検出する工程を実施する。Ｆ−アクチンはＧ−アクチンが多数重合した重合体である。
【００４４】
Ｆ−アクチンの検出方法は特に限定されず、例えば標識されたファロイジンを反応させた後、当該標識を検出する方法が挙げられる。標識としては、例えば蛍光標識が挙げられる。この場合、Ｆ−アクチンの検出は蛍光顕微鏡観察により実施することができる。
【００４５】
そして、検出された前記Ｆ−アクチンの量が、被験物質の非存在下におけるＦ−アクチンの量と比較して増加した場合、当該被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であると判断することができる。
【００４６】
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、ネフリンタンパク質発現細胞に、抗ネフリン抗体を反応させる工程と、抗ネフリン抗体を反応させた前記細胞の培地に被験物質を添加する工程と、前記細胞のＦ−アクチンを検出する工程と、を備え、検出された前記Ｆ−アクチンの量が、前記被験物質の非投与下における前記Ｆ−アクチンの量と比較して増加することが、前記被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法を提供する。
【００４７】
本実施形態のスクリーニング方法は、第１実施形態のスクリーニング方法と、被験物質を投与するタイミングが主に異なる。本実施形態のスクリーニング方法において、被験物質、ネフリンタンパク質発現細胞、抗ネフリン抗体、Ｆ−アクチンを検出する工程は第１実施形態のスクリーニング方法と同様である。
【００４８】
本実施形態のスクリーニング方法により、慢性腎臓病を発症後に投与して治療効果が得られる薬物を、効率よくスクリーニングすることができる。
【００４９】
（第３実施形態）
１実施形態において、本発明は、慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、ネフリンタンパク質発現細胞を培養する工程と、前記細胞に抗ネフリン抗体を反応させる工程と、前記細胞におけるネフリンタンパク質のリン酸化を検出する工程であって、前記リン酸化が、マウスネフリンタンパク質の第１２３２番目のチロシン残基に相当するチロシン残基のリン酸化である工程と、を備え、検出された前記リン酸化が、前記被験物質の非存在下における前記リン酸化と比較して低下することが、前記被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法を提供する。
【００５０】
本実施形態のスクリーニング方法は、第１実施形態のスクリーニング方法、第２実施形態のスクリーニング方法とは、慢性腎臓病の予防又は治療剤であるか否かの判定方法が主に異なる。
【００５１】
本実施形態のスクリーニング方法において、被験物質、ネフリンタンパク質発現細胞、抗ネフリン抗体、Ｆ−アクチンを検出する工程は第１実施形態のスクリーニング方法と同様である。
【００５２】
実施例において後述するように、発明者らは、ネフリンタンパク質発現細胞に抗ネフリン抗体を反応させると、ネフリンタンパク質がリン酸化されることを明らかにした。したがって、ネフリンタンパク質のリン酸化を指標として、慢性腎臓病の予防又は治療剤をスクリーニングすることができる。
【００５３】
抗ネフリン抗体を反応させることによりリン酸化されるアミノ酸残基は、マウスネフリンタンパク質の場合、第１２３２番目のチロシン残基であった。したがって、細胞に発現させるネフリンタンパク質として、ヒトネフリンタンパク質や、ヒトやマウス以外の種のネフリンタンパク質を用いる場合には、マウスネフリンタンパク質の１２３２番目のチロシン残基に相当するチロシン残基のリン酸化を検出すればよい。
【００５４】
マウスネフリンタンパク質の１２３２番目のチロシン残基に相当するチロシン残基とは、例えば、ヒトネフリンタンパク質の場合には、第１２１７番目のチロシン残基である。
【００５５】
マウスネフリンタンパク質の１２３２番目のチロシン残基に相当するチロシン残基は、以下のようにして特定することもできる。まず、被験物質の非存在下で、ネフリンタンパク質発現細胞を培養する工程と、当該細胞に抗ネフリン抗体を反応させる工程を実施する。続いて、上記のネフリンタンパク質のリン酸化されたチロシン残基を特定する。リン酸化されたチロシン残基は、リン酸化ネフリンタンパク質特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法等により検出することができる。この結果特定された、リン酸化されたチロシン残基が、マウスネフリンタンパク質の１２３２番目のチロシン残基に相当するチロシン残基である。
【００５６】
被験物質の存在下において検出された、マウスネフリンタンパク質の第１２３２番目のチロシン残基に相当するチロシン残基のリン酸化が、被験物質の非存在下における前記リン酸化（マウスネフリンタンパク質の第１２３２番目のチロシン残基に相当するチロシン残基のリン酸化）と比較して低下した場合、当該被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であると判断することができる。
【００５７】
（第４実施形態）
１実施形態において、本発明は、慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、ネフリンタンパク質発現細胞に、抗ネフリン抗体を反応させる工程と、抗ネフリン抗体を反応させた前記細胞の培地に被験物質を添加する工程と、前記細胞におけるネフリンタンパク質のリン酸化を検出する工程であって、前記リン酸化が、マウスネフリンタンパク質の第１２３２番目のチロシン残基に相当するチロシン残基のリン酸化である工程と、を備え、検出された前記リン酸化が、前記被験物質の非存在下における前記リン酸化と比較して低下することが、前記被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法を提供する。
【００５８】
本実施形態のスクリーニング方法は、第３実施形態のスクリーニング方法と、被験物質を投与するタイミングが主に異なる。本実施形態のスクリーニング方法において、被験物質、ネフリンタンパク質発現細胞、抗ネフリン抗体、ネフリンタンパク質のリン酸化を検出する工程は第３実施形態のスクリーニング方法と同様である。
【００５９】
本実施形態のスクリーニング方法により、慢性腎臓病を発症後に投与して治療効果が得られる薬物を、効率よくスクリーニングすることができる。
【００６０】
（第５実施形態）
１実施形態において、本発明は、慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で細胞を培養する工程と、前記細胞におけるガングリオシドＧＭ３又はガングリオシドＧＭ３合成酵素遺伝子の発現量を測定する工程と、を備え、ガングリオシドＧＭ３又はガングリオシドＧＭ３合成酵素遺伝子の発現量が、前記被験物質の非存在下における発現量と比較して増加することが、前記被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法を提供する。
【００６１】
本実施形態のスクリーニング方法は、第１実施形態のスクリーニング方法、第２実施形態のスクリーニング方法、第３実施形態のスクリーニング方法、第４実施形態のスクリーニング方法とは、慢性腎臓病の予防又は治療剤であるか否かの判定方法が主に異なる。
【００６２】
本実施形態のスクリーニング方法において、被験物質は第１実施形態のスクリーニング方法と同様である。
【００６３】
また、細胞は特に限定されず、例えば腎臓由来の細胞であることが好ましいがこれに限定されない。細胞としては、第１実施形態のスクリーニング方法、第２実施形態のスクリーニング方法、第３実施形態のスクリーニング方法、第４実施形態のスクリーニング方法におけるものと同様の、ネフリンタンパク質発現細胞を用いてもよい。
【００６４】
ＧＭ３の発現量は、例えば薄層クロマトグラフィー法等により測定することができる。また、ＧＭ３合成酵素遺伝子の発現量は、例えばウエスタンブロッティング法等によりタンパク質レベルで測定してもよいし、例えば定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、マイクロアレイ等によりｍＲＮＡレベルで測定してもよい。
【００６５】
ＧＭ３合成酵素は、ラクトシルセラミドα２，３シアル酸転移酵素とも呼ばれるものである。ヒトＧＭ３合成酵素のＵｎｉＰｒｏｔＫＤのアクセッション番号はＱ９ＵＮＰ４であり、マウスＧＭ３合成酵素のＵｎｉＰｒｏｔＫＤのアクセッション番号はＯ８８８２９である。
【００６６】
実施例において後述するように、発明者らは、慢性腎臓病細胞モデルにおいて、ＧＭ３の発現量を増加させると、慢性腎臓病を予防又は治療することができることを明らかにした。したがって、ＧＭ３の発現量を増加させる被験物質は慢性腎臓病の予防又は治療剤であるということができる。
【００６７】
すなわち、本実施形態のスクリーニング方法において、被験物質の存在下において検出された、ＧＭ３又はＧＭ３合成酵素遺伝子の発現量が、被験物質の非存在下における発現量と比較して増加した場合、当該被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であると判断することができる。
【００６８】
（第６実施形態）
１実施形態において、本発明は、慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の投与下で慢性腎臓病を発症する非ヒト動物モデルを飼育する工程と、前記非ヒト動物モデルの腎機能を評価する工程と、を備え、被験物質の投与下の前記非ヒト動物モデルの腎機能が、前記被験物質の非投与下の前記非ヒト動物モデルの腎機能と比較して向上したことが、前記被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であることを示す、スクリーニング方法を提供する。
【００６９】
本実施形態のスクリーニング方法は、第１実施形態のスクリーニング方法、第２実施形態のスクリーニング方法、第３実施形態のスクリーニング方法、第４実施形態のスクリーニング方法とは、慢性腎臓病を発症する非ヒト動物モデルを用いる点で主に異なる。
【００７０】
本実施形態のスクリーニング方法において、被験物質は第１実施形態のスクリーニング方法と同様である。
【００７１】
また、慢性腎臓病を発症する非ヒト動物モデルとしては、例えば、実施例において後述する、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体をマウスに投与すると、当該マウスが慢性腎臓病（より正確には巣状分節性糸球体硬化症、以下「ＦＳＧＳ」という場合がある。）を発症するモデル等を利用することができる。ここで、非ヒト動物はマウスに限られず、例えば、ラット、ブタ、ヤギ、ヒツジ、サル等であってもよい。
【００７２】
本実施形態のスクリーニング方法において、腎機能は、例えば、血中アルブミン量の測定、尿中アルブミン量の測定、腎臓標本の組織学的解析による、糸球体硬化病変の進行の測定、ポドサイトの単位面積当たりの数の測定、ガングリオシドＧＭ３の存在量の測定、ネフリンタンパク質の存在量の測定等により評価することができる。
【００７３】
本実施形態のスクリーニング方法において、被験物質の投与下の非ヒト動物モデルの腎機能が、被験物質の非投与下の前記非ヒト動物モデルの腎機能と比較して向上した場合、当該被験物質が慢性腎臓病の予防又は治療剤であると判断することができる。
【００７４】
［慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニングキット］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、ネフリンタンパク質発現細胞と、抗ネフリン抗体とを備える、慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニングキットを提供する。
【００７５】
本実施形態のキットを用いることにより、上述した慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法を実施することができる。
【００７６】
本実施形態のキットにおいて、ネフリンタンパク質発現細胞、抗ネフリン抗体としては、上述した第１実施形態に係る慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法と同様のものを用いることができる。
【００７７】
本実施形態のキットは、ファロイジンを更に備えていてもよい。ファロイジンは、Ｆ−アクチンを検出する試薬である。ファロイジンを備えることにより、本実施形態のキットを、上述した第１実施形態、第２実施形態に係る慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法に好適に用いることができる。
【００７８】
本実施形態のキットは、抗リン酸化ネフリンタンパク質抗体を更に備え、当該抗体は、マウスネフリンタンパク質の第１２３２番目のチロシン残基に相当するチロシン残基のリン酸化を検出する抗体であってもよい。
【００７９】
ここで、マウスネフリンタンパク質の第１２３２番目のチロシン残基に相当するチロシン残基のリン酸化を検出する抗体としては、上述した第３実施形態係る慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法と同様のものを用いることができる。
【００８０】
マウスネフリンタンパク質の第１２３２番目のチロシン残基に相当するチロシン残基のリン酸化を検出する抗体を備えることにより、本実施形態のキットを、上述した第３実施形態、第４実施形態に係る慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法に好適に用いることができる。
【００８１】
マウスネフリンタンパク質の第１２３２番目のチロシン残基に相当するチロシン残基のリン酸化を検出する抗体は、抗体以外の特異的結合物質であってもよい。抗体以外の特異的結合物質としては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。
【００８２】
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、ＧＭ３に対する特異的結合物質、ＧＭ３合成酵素に対する特異的結合物質、ＧＭ３合成酵素遺伝子のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーセット、又はＧＭ３合成酵素遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、を備える、慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニングキットを提供する。
【００８３】
本実施形態のキットを用いることにより、上述した第５実施形態に係る慢性腎臓病の予防又は治療剤のスクリーニング方法を実施することができる。
【００８４】
《特異的結合物質》
特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。
【００８５】
特異的結合物質は、対象タンパク質又は対象糖脂質に特異的に結合することができれば特に制限されず、市販のものであってもよい。また、特異的結合物質は、担体上に固定されてプロテインチップ等を構成していてもよい。
【００８６】
《プライマーセット》
プライマーセットとしては、ＧＭ３合成酵素遺伝子のｃＤＮＡを増幅することができるものであれば特に限定されない。
【００８７】
《プローブ》
プローブとしては、ＧＭ３合成酵素遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば特に限定されない。プローブは、担体上に固定されてＤＮＡマイクロアレイ等を構成していてもよい。
【００８８】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、下記式（１）で表される化合物の有効量を、治療を必要とする患者又は患畜に投与する工程を備える、慢性腎臓病の予防又は治療方法を提供する。
【００８９】
【化４】
2019082912.tif 000006
［式（１）中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数２〜１６の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表す。］
【００９０】
１実施形態において、本発明は、慢性腎臓病の予防又は治療のための上記式（１）で表される化合物を提供する。
【００９１】
１実施形態において、本発明は、慢性腎臓病の予防又は治療剤を製造するための上記式（１）で表される化合物の使用を提供する。
【００９２】
これらの実施形態において、上記式（１）で表される化合物のより限定された例は、慢性腎臓病の予防又は治療剤の実施形態について上述したものと同様である。
【実施例】
【００９３】
［実験例１］
（慢性腎臓病を発症するモデルマウスを用いた検討）
発明者らは、以前に慢性腎臓病を発症するモデルマウスを開発した。このモデルマウスは、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体をマウスに投与すると、当該マウスが慢性腎臓病（より正確には巣状分節性糸球体硬化症、以下「ＦＳＧＳ」という場合がある。）を発症するものである。上記の抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体としては、マウスネフリンタンパク質をコードするＤＮＡを、遺伝子免疫法によりウサギに免疫して作製したものを用いる。【００９４】
このモデルマウスは、ヒトの慢性腎臓病やネフローゼ症候群において観察される、タンパク尿、浮腫、高コレステロール血症等の全ての現象を呈するものであり、ヒトの慢性腎臓病を正確に反映するモデルマウスであると考えられる。【００９５】
そこで、このマウスモデルを用いた検討を行った。具体的には、まず、マウスに抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を経静脈的に０.５〜５ｍｇ投与した。続いて、抗体の投与前、投与から９０分後、３時間後、７日後にマウスの腎臓を摘出して薄膜組織切片を作製し、糸球体における、ネフリンタンパク質及びガングリオシドＧＭ３を、それぞれ、発明者らが作製した抗ネフリン抗体及び抗ＧＭ３抗体（型式「Ａ２５８２」、東京化成工業株式会社）を用いた蛍光免疫染色により検出した。【００９６】
図１は、ネフリンタンパク質及びＧＭ３を検出した蛍光顕微鏡写真である。倍率は４００倍である。図１中、「ネフリン」はネフリンタンパク質を検出した結果であることを意味し、「ＧＭ３」はＧＭ３を検出した結果であることを意味し、「Ｏｖｅｒｌａｙ」はネフリンタンパク質を検出した結果とＧＭ３を検出した結果を合成した結果であることを意味する。【００９７】
その結果、マウスに抗ネフリン抗体を投与すると、ネフリンタンパク質及びＧＭ３の発現量が減少することが明らかとなった。ネフリンタンパク質及びＧＭ３の発現量の減少は、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体の投与から９０分後以降において認められた。【００９８】
［実験例２］
（慢性腎臓病細胞モデルを用いた検討）
実験例１で用いたマウスモデルの結果に基づいて、培養細胞レベルで慢性腎臓病のモデルを構築できるか否かについて検討した。【００９９】
具体的には、まず、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターをヒト胎児腎細胞株であるＨＥＫ２９３細胞に導入した。続いて、この細胞の培地に抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を終濃度５〜３０μｇ／ｍＬで添加した。【０１００】
続いて、抗体の投与直後、６時間後、４８時間後に、各細胞をパラホルムアルデヒド固定し、各細胞における、ネフリンタンパク質、Ｆ−アクチン及びガングリオシドＧＭ３を、それぞれ、発明者らが作製した抗ネフリン抗体、ファロイジン（型式「Ａ３４０５５」、インビトロジェン社）及び抗ＧＭ３抗体（型式「Ａ２５８２」、東京化成工業株式会社）を用いた蛍光染色により検出した。【０１０１】
図２は、ネフリンタンパク質及びＧＭ３を検出した蛍光顕微鏡写真である。倍率は４００倍である。図２中、「ネフリン」はネフリンタンパク質を検出した結果であることを意味し、「Ｆ−ａｃｔｉｎ」はＦ−アクチンを検出した結果であることを意味し、「ＧＭ３」はＧＭ３を検出した結果であることを意味する。【０１０２】
その結果、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞に抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を反応させると、ネフリンタンパク質が減少し、Ｆ−アクチンが減少し、ＧＭ３が減少することが明らかとなった。この結果は、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞に抗ネフリン抗体を反応させる系を、慢性腎臓病細胞モデルとして使用することができることを示す。【０１０３】
［実験例３］
（慢性腎臓病細胞モデルにおけるＧＭ３の発現量の検討）
実験例２と同様の慢性腎臓病細胞モデル、すなわち、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞に抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を反応させるモデルを用いて、ガングリオシドＧＭ３の発現量を検討した。【０１０４】
具体的には、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞の培地に抗ネフリンウサギポリクローナル抗体を、終濃度５〜３０μｇ／ｍＬで添加し、６時間後及び４８時間後にＧＭ３の発現量を検討した。また、対照として、培地に抗ネフリン抗体を添加しなかった細胞中のＧＭ３の発現量を検討した。また、陽性対照として、ＧＭ３の標準品を用いた。ＧＭ３の検出は、抗ＧＭ３抗体（型式「Ａ２５８２」、東京化成工業株式会社）を用いた免疫薄層クロマトグラフィーにより行った。【０１０５】
図３は、免疫薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。図３中、レーン１は、ＧＭ３の標準品の解析結果であり、レーン２は培地に抗ネフリン抗体を添加しなかったＨＥＫ２９３細胞の解析結果であり、レーン３は培地に抗ネフリン抗体を添加したＨＥＫ２９３細胞の解析結果である。図３中、「＊」、「＊＊」は、ＧＭ３のバンドを示す。【０１０６】
その結果、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体の添加により、ＧＭ３の発現量が低下したことが明らかとなった。特に、図３中「＊」で示すバンドの低下が顕著であった。【０１０７】
以上の結果から、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体の添加により、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞におけるＧＭ３の発現量が低下することが再度確認された。【０１０８】
［実験例４］
（慢性腎臓病細胞モデルへのＧＭ３の添加の検討）
実験例２と同様の慢性腎臓病細胞モデル、すなわち、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞に抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を反応させるモデルを用いて、培地へのＧＭ３の添加の影響を検討した。【０１０９】
具体的には、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞の培地に、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体の存在下及び非存在下でガングリオシドＧＭ３を添加し、その影響を検討した。【０１１０】
抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体は、終濃度５〜３０μｇ／ｍＬで培地に添加した。また、ＧＭ３は、終濃度０、１２５又は２５０μＭで培地に添加した。続いて、実験開始から４８時間後に各細胞をパラホルムアルデヒド固定し、各細胞における、ＧＭ３及びＦ−アクチンを、それぞれ抗ＧＭ３抗体（型式「Ａ２５８２」、東京化成工業株式会社）及びファロイジン（型式「Ａ３４０５５」、インビトロジェン社）を用いた蛍光染色により検出した。【０１１１】
図４は、ＧＭ３及びＦ−アクチンを検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。倍率は４００倍である。図４中、「Ｎｅｐ  Ａｂ」は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を意味し、「＋」は添加したことを意味し、「−」は添加しなかったことを意味する。また、「ＧＭ３」はＧＭ３を検出した結果であることを意味し、「Ｆ−ａｃｔｉｎ」はＦ−アクチンを検出した結果であることを意味し、「ＤＡＰＩ」は４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で核を染色した結果であることを意味する。【０１１２】
その結果、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞に抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を反応させると、Ｆ−アクチンが減少し、ＧＭ３が減少することが再度確認された。また、ＧＭ３を慢性腎臓病細胞モデルの培地に添加することにより、Ｆ−アクチンの減少を抑制することができることが明らかとなった。【０１１３】
［実験例５］
（慢性腎臓病細胞モデルへのバルプロ酸の添加の検討）
実験例２と同様の慢性腎臓病細胞モデル、すなわち、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞に抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を反応させるモデルを用いて、培地へのバルプロ酸の添加の影響を検討した。【０１１４】
具体的には、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞の培地に、バルプロ酸の存在下で抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を反応させ、その影響を検討した。【０１１５】
抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体は、終濃度５〜３０μｇ／ｍＬで培地に添加した。また、バルプロ酸は、終濃度０、１、２又は３ｍＭで培地に添加した。続いて、実験開始から４８時間後に各細胞をパラホルムアルデヒド固定し、各細胞における、ＧＭ３及びＦ−アクチンを、それぞれ抗ＧＭ３抗体（型式「Ａ２５８２」、東京化成工業株式会社）及びファロイジン（型式「Ａ３４０５５」、インビトロジェン社）を用いた蛍光染色により検出した。【０１１６】
図５は、ＧＭ３及びＦ−アクチンを検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。倍率は４００倍である。図５中、「Ｎｅｐ  Ａｂ」は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を意味し、「＋」は添加したことを意味する。また、「ＶＰＡ」はバルプロ酸を意味し、「ＧＭ３」はＧＭ３を検出した結果であることを意味し、「Ｆ−ａｃｔｉｎ」はＦ−アクチンを検出した結果であることを意味し、「Ｏｖｅｒｌａｙ」はＧＭ３を検出した結果とＦ−アクチンを検出した結果を合成した結果であることを意味し、「ＤＡＰＩ」はＤＡＰＩで核を染色した結果であることを意味する。【０１１７】
その結果、バルプロ酸の存在下では、抗ネフリン抗体の添加によるＦ−アクチンの減少が抑制されることが明らかとなった。この結果は、バルプロ酸を慢性腎臓病の予防又は治療剤として用いることができることを意味する。【０１１８】
［実験例６］
（ＧＭ３とネフリンタンパク質との相互作用の検討）
実験例２と同様の慢性腎臓病細胞モデル、すなわち、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞に抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を反応させるモデルを用いて、ガングリオシドＧＭ３とネフリンタンパク質との相互作用を検討した。【０１１９】
具体的には、まず、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞から全タンパク質を抽出し、免疫沈降−ウエスタンブロッティング法により、ＧＭ３とネフリンタンパク質との相互作用を検出した。【０１２０】
また、比較のために、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞の培地に終濃度５〜３０μｇ／ｍＬの抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を添加して２４時間後に全タンパク質を抽出し、免疫沈降−ウエスタンブロッティング法により、ＧＭ３とネフリンタンパク質との相互作用を検出した。【０１２１】
マウスネフリンタンパク質の免疫沈降には、発明者らが作製した抗ネフリン抗体を使用した。また、ＧＭ３の免疫沈降には抗ＧＭ３抗体（型式「Ａ２５８２」、東京化成工業株式会社）を使用した。また、マウスネフリンタンパク質のウエスタンブロッティング法による検出には、発明者らが作製した抗ネフリン抗体を使用した。【０１２２】
図６は、免疫沈降−ウエスタンブロッティング法による解析結果を示す写真である。図６中、「ＩＰ」は免疫沈降を意味し、「ＩＢ」はウエスタンブロッティング法により検出したことを意味し、「ＧＭ３」は抗ＧＭ３抗体を使用したことを意味し、「Ｎｅｐｈｒｉｎ」は抗ネフリン抗体を使用したことを意味し、「ｕｎｔｒｅａｔ」は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を反応させなかったことを意味し、「Ａｂ  ｔｒｅａｔ」は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を反応させたことを意味する。【０１２３】
その結果、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞では、ＧＭ３とネフリンタンパク質が相互作用していることが明らかとなった。また、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞に抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を反応させると、ＧＭ３とネフリンタンパク質との相互作用が低下することが明らかとなった。【０１２４】
［実験例７］
（ＧＭ３とネフリンタンパク質との相互作用に対するバルプロ酸の影響の検討）
実験例２と同様の慢性腎臓病細胞モデル、すなわち、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞に抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を反応させるモデルを用いて、ガングリオシドＧＭ３とネフリンタンパク質との相互作用に対するバルプロ酸の影響を検討した。【０１２５】
具体的には、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞の培地に、終濃度３ｍＭのバルプロ酸の存在下又はバルプロ酸の非存在下で、終濃度５〜３０μｇ／ｍＬの抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を添加し、２４時間後に全タンパク質を抽出し、免疫沈降−ウエスタンブロッティング法により、ＧＭ３とネフリンタンパク質との相互作用を検出した。【０１２６】
マウスネフリンタンパク質の免疫沈降には、発明者らが作製した抗ネフリン抗体を使用した。また、ＧＭ３の免疫沈降には抗ＧＭ３抗体（型式「Ａ２５８２」、東京化成工業株式会社）を使用した。また、マウスネフリンタンパク質のウエスタンブロッティング法による検出には、発明者らが作製した抗ネフリン抗体を使用した。【０１２７】
図７は、免疫沈降−ウエスタンブロッティング法による解析結果を示す写真である。図７中、「Ｉｎｐｕｔ」は免疫沈降−ウエスタンブロッティング法に使用したものと同一の試料であることを意味し、「ＩＰ」は免疫沈降を意味し、「ＩＢ」はウエスタンブロッティング法により検出したことを意味し、「ＧＭ３」は抗ＧＭ３抗体を使用したことを意味し、「Ｎｅｐｈｒｉｎ」は抗ネフリン抗体を使用したことを意味し、「Ａｂ  ｔｒｅａｔ」はバルプロ酸の非存在下で抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を反応させたことを意味し、「Ａｂ＋ＶＰＡ  ｔｒｅａｔ」はバルプロ酸の存在下で抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を反応させたことを意味する。【０１２８】
その結果、バルプロ酸の存在下では、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞に抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を反応させることによる、ＧＭ３とネフリンタンパク質との相互作用の低下が抑制され、ＧＭ３とネフリンタンパク質との相互作用が維持されることが明らかとなった。【０１２９】
［実験例８］
（ネフリンタンパク質のリン酸化の検討）
実験例２と同様の慢性腎臓病細胞モデル、すなわち、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞に抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を反応させるモデルを用いて、ネフリンタンパク質のリン酸化を検討した。【０１３０】
具体的には、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞の培地に、終濃度３ｍＭのバルプロ酸の存在下又はバルプロ酸の非存在下で、終濃度５〜３０μｇ／ｍＬの抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を添加し、０、３０、６０及び１２０分後に全タンパク質を抽出し、ウエスタンブロッティング法により、ネフリンタンパク質のリン酸化を検討した。また、比較のために抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を添加しなかった試料も用意した。【０１３１】
リン酸化ネフリンタンパク質を検出する抗体としては、マウスネフリンタンパク質の第１２３２番目のチロシン残基のリン酸化を認識する抗体（型式「ａｂ８０２９８」、アブカム社）、マウスネフリンタンパク質の第１１９１番目のチロシン残基のリン酸化及び第１２０８番目のチロシン残基のリン酸化を同時に認識する抗体（型式「ａｂ８０２９９」、アブカム社）を使用した。また、マウスネフリンタンパク質のウエスタンブロッティング法による検出には、発明者らが作製した抗ネフリン抗体を使用した。また、ローディングコントロールとして、抗グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）抗体（型式「２１１８」、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙジャパン株式会社）を使用してＧＡＰＤＨタンパク質を検出した。【０１３２】
図８は、ウエスタンブロッティング法による解析結果を示す写真である。図８中、「Ｕｎｔｒｅａｔ」は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を反応させなかったことを意味し、「Ａｂ  ｔｒｅａｔ」は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を反応させたことを意味し、「Ａｂ＋ＶＰＡ  ｔｒｅａｔ」はバルプロ酸の存在下で抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を反応させたことを意味する。【０１３３】
また、「ＰＹ１２３２」はマウスネフリンタンパク質の第１２３２番目のチロシン残基のリン酸化を認識する抗体を使用したことを意味し、「ＰＹ１１９１＋１２０８」はマウスネフリンタンパク質の第１１９１番目のチロシン残基のリン酸化及び第１２０８番目のチロシン残基のリン酸化を同時に認識する抗体を使用したことを意味し、「Ｎｅｐｈｒｉｎ」は抗ネフリン抗体を使用したことを意味し、「ＧＡＰＤＨ」は抗ＧＡＰＤＨ抗体を使用したことを意味する。【０１３４】
その結果、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞の培地に、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を添加すると、マウスネフリンタンパク質の第１２３２番目のチロシン残基が強くリン酸化されることが明らかとなった。また、バルプロ酸の存在下では、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体の添加によるマウスネフリンタンパク質のリン酸化が抑制されることが明らかとなった。【０１３５】
［実験例９］
（バルプロ酸以外の化合物の検討）
実験例２と同様の慢性腎臓病細胞モデル、すなわち、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞に抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を反応させるモデルを用いて、バルプロ酸以外の化合物の影響を検討した。【０１３６】
具体的には、マウスネフリンタンパク質の発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞の培地に、バルプロ酸、酪酸、プロピオン酸又はγ−アミノ酪酸（以下、「ＧＡＢＡ」という場合がある。）の存在下で抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を反応させ、その影響を検討した。下記式（２）にバルプロ酸の化学式を示し、下記式（３）に酪酸の化学式を示し、下記式（４）にプロピオン酸の化学式を示し、下記式（５）にＧＡＢＡの化学式を示す。【０１３７】
【化５】
2019082912.tif 000007
【０１３８】
抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体は、終濃度５〜３０μｇ／ｍＬで培地に添加した。また、バルプロ酸、酪酸、プロピオン酸及びγ−アミノ酪酸は、それぞれ終濃度３ｍＭで培地に添加した。続いて、実験開始から４８時間後に各細胞をパラホルムアルデヒド固定し、各細胞における、Ｆ−アクチン及びＧＭ３を、それぞれファロイジン（型式「Ａ３４０５５」、インビトロジェン社）及び抗ＧＭ３抗体（型式「Ａ２５８２」、東京化成工業株式会社）を用いた蛍光染色により検出した。【０１３９】
図９は、Ｆ−アクチンを検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真であり、図１０はＧＭ３を検出した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。倍率はいずれも４００倍である。図９及び１０中、「Ｎｅｐ  Ａｂ」は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を意味し、「−」は添加しなかったことを意味し、「＋」は添加したことを意味する。また、「ＶＰＡ」はバルプロ酸を意味し、「ＢＴＡ」は酪酸を意味し、「ＰＰＡ」はプロピオン酸を意味し、「ＧＡＢＡ」はγ−アミノ酪酸を意味する。【０１４０】
また、「Ｆ−ａｃｔｉｎ」はＦ−アクチンを検出した結果であることを意味し、「ＧＭ３」はＧＭ３を検出した結果であることを意味し、「ＤＡＰＩ」はＤＡＰＩで核を染色した結果であることを意味する。また、図９中、「Ｏｖｅｒｌａｙ」はＦ−アクチンを検出した結果とＤＡＰＩで核を染色した結果を合成した結果であることを意味し、図１０中、「Ｏｖｅｒｌａｙ」はＧＭ３を検出した結果とＤＡＰＩで核を染色した結果を合成した結果であることを意味する。【０１４１】
その結果、図９に示すように、バルプロ酸、酪酸、プロピオン酸を培地に添加することにより、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体の添加によるＦ−アクチンの減少を抑制することができることが明らかとなった。一方、ＧＡＢＡの培地への添加ではＦ−アクチンの減少の抑制の程度が低いことが明らかとなった。【０１４２】
また、図１０に示すように、バルプロ酸、酪酸、プロピオン酸を培地に添加することにより、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体の添加によるＧＭ３の減少を抑制することができることが明らかとなった。一方、ＧＡＢＡの培地への添加ではＧＭ３の減少の抑制の程度が低いことが明らかとなった。【０１４３】
［実験例１０］
（慢性腎臓病を発症するモデルマウスへのバルプロ酸の投与１）
実験例１と同様の慢性腎臓病を発症するモデルマウス（より正確には巣状分節性糸球体硬化症、以下「ＦＳＧＳ」という場合がある。）を用いて、インビボにおけるバルプロ酸投与の影響を検討した。【０１４４】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（７週齢）に、バルプロ酸を１日１回、１００ｍｇ／ｋｇの投与量で、２８日間腹腔内投与した。そして、バルプロ酸の投与開始から１４日目に、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を、０．５ｍｇ／匹、１ｍｇ／匹又は２ｍｇ／匹の投与量で１回尾静脈投与し、慢性腎臓病の発症を誘導した。【０１４５】
また、比較のために、バルプロ酸を投与せず、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を２ｍｇ／匹の投与量で１回尾静脈投与し慢性腎臓病の発症を誘導した群、バルプロ酸のみを投与し慢性腎臓病の発症を誘導しなかった群も用意した。【０１４６】
続いて、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体の投与から１、２、３、５及び１４日目に、各マウスから尿を採取し、尿生化学検査を行った。【０１４７】
また、バルプロ酸の投与開始から２８日目（抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体の投与から１４日目）に、各マウスから腎臓を摘出し、組織切片を作製した。またこの際に採血も行い、血清生化学検査を行った。【０１４８】
《尿生化学検査の結果》
図１１は、尿生化学検査の結果に基づいて算出した、各マウスの尿中アルブミン（ｍｇ／ｇ・クレアチニン）の変化を示すグラフである。図１１中、「ＦＳＧＳ」はバルプロ酸を投与せず、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を２ｍｇ／匹投与して慢性腎臓病の発症を誘導した群の結果を示し、「ＶＰＡのみ」はバルプロ酸のみを投与し慢性腎臓病の発症を誘導しなかった群の結果を示し、「Ａｂ  ０．５ｍｇ＋ＶＰＡ」は、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を０．５ｍｇ／匹投与しバルプロ酸を毎日投与した群の結果を示し、「Ａｂ  １ｍｇ＋ＶＰＡ」は、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を１ｍｇ／匹投与しバルプロ酸を毎日投与した群の結果を示し、「Ａｂ  ２ｍｇ＋ＶＰＡ」は、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を２ｍｇ／匹投与しバルプロ酸を毎日投与した群の結果を示し、「ＡＲＢ」は、ヒトやラット等で報告されている、ＡＲＢの投与による尿中アルブミンの抑制率から算出した尿中アルブミン量の最大量の範囲を示す。【０１４９】
具体的には、ヒトについては、例えば、Iino Y., et al., Renoprotective effect of losartan in comparison to amlodipine in patients with chronic kidney disease and hypertension - a report of the Japanese Losartan Therapy Intended for the Global Renal Protection in Hypertensive Patients (JLIGHT) study., Hypertens Res., 27 (1), 21-30, 2004.に、ＡＲＢ（ロサルタン）投与群で治療開始１２か月後のアルブミン尿が４７．９％低下したことが記載されている。【０１５０】
また、Ono M., et al., Predictors of proteinuria reduction by monotherapy with an angiotensin receptor blocker, olmesartan., J Renin Angiotensin Aldosterone Syst., 13 (2), 239-243, 2012.に、３４人の非糖尿病性腎症患者にＡＲＢ（オルメサルタン）投与した結果、８週後にアルブミン尿が４４％低下したことが記載されている。【０１５１】
また、Usta M., et al., Efficacy of losartan in patients with primary focal segmental glomerulosclerosis resistant to immunosuppressive treatment., J Intern Med., 253 (3), 329-334, 2003.には、ＦＳＧＳ患者１３人にＡＲＢ（ロサルタン）を投与した結果、１２か月後にアルブミン尿が４８％低下したことが記載されている。【０１５２】
また、シュライアー著『腎臓病と病態生理』（メディカルサイエンスインターナショナル社、２０１１年５月発行）の第４３５頁には、治療によって得られる抗蛋白尿効果の最適レベルは不明であるが、治療前の尿蛋白レベルから少なくとも３０〜４０％の減少を目標とすることが推奨されていると記載されている。【０１５３】
また、ラットについては、Takahashi A., et al., Angiotensin II type 1 receptor blockade ameliorates proteinuria in puromycin aminonucleoside nephropathy by inhibiting the reduction of NEPH1 and nephrin., J Nephrol. 27 (6), 627-634, 2014.には、ＰＡＮ腎症ラットモデル（ＭＣＮＳ）にＡＲＢ（イルベサルタン）を投与した結果、８日後にアルブミン尿が３４％低下したことが記載されている。【０１５４】
その結果、バルプロ酸の投与は、慢性腎臓病モデルマウスの尿タンパク量を顕著に減少させることが明らかとなった。また、バルプロ酸の投与による尿タンパク量の減少の程度は、既存薬であるＡＲＢの投与による尿タンパク量の減少の程度よりも顕著に高いことが明らかとなった。【０１５５】
《血清生化学検査の結果》
図１２（ａ）は各マウスの血清アルブミン量の測定結果を示すグラフである。また、図１２（ｂ）は各マウスの血清クレアチニン量の測定結果を示すグラフである。図１２（ａ）及び（ｂ）中、「Ｎｏｒｍａｌ」は通常マウスにおける測定結果を示し、「ＶＰＡ」はバルプロ酸のみを投与し慢性腎臓病の発症を誘導しなかった群の結果を示し、「ＦＳＧＳ」は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を２ｍｇ／匹投与しバルプロ酸を投与しなかった群の結果を示し、「Ａｂ  ０．５ｍｇ＋ＶＰＡ」は、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を０．５ｍｇ／匹投与しバルプロ酸を毎日投与した群の結果を示し、「Ａｂ  １ｍｇ＋ＶＰＡ」は、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を１ｍｇ／匹投与しバルプロ酸を毎日投与した群の結果を示し、「Ａｂ  ２ｍｇ＋ＶＰＡ」は、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を２ｍｇ／匹投与しバルプロ酸を毎日投与した群の結果を示し、「＃」は、「Ｎｏｒｍａｌ」群の結果に対してＰ＜０．０５で有意差が存在することを示す。【０１５６】
図１２（ａ）の結果から、バルプロ酸の投与は、慢性腎臓病モデルマウスの低アルブミン血症を正常化させることが明らかとなった。また、図１２（ｂ）の結果から、バルプロ酸の投与は、慢性腎臓病モデルマウスの腎機能障害を正常化させることが明らかとなった。【０１５７】
《腎臓組織切片のＰＡＳ染色》
各マウスの腎臓組織切片をＰＡＳ染色して顕微鏡観察し、硬化病変を観察した。図１３（ａ）〜（ｇ）は、各群のマウスの腎臓組織切片のＰＡＳ染色の結果を示す顕微鏡写真である。スケールバーは２０μｍを示す。図１３（ａ）はバルプロ酸のみを投与し慢性腎臓病の発症を誘導しなかった群の代表的な結果であり、図１３（ｂ）は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を０．５ｍｇ／匹投与しバルプロ酸を毎日投与した群の代表的な結果であり、図１３（ｃ）は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を１ｍｇ／匹投与しバルプロ酸を毎日投与した群の代表的な結果であり、図１３（ｄ）は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を２ｍｇ／匹投与しバルプロ酸を毎日投与した群の代表的な結果であり、図１３（ｅ）は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を０．５ｍｇ／匹投与してバルプロ酸を投与しなかった群の代表的な結果であり、図１３（ｆ）は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を１ｍｇ／匹投与してバルプロ酸を投与しなかった群の代表的な結果であり、図１３（ｇ）は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を１．５ｍｇ／匹投与してバルプロ酸を投与しなかった群の代表的な結果である。また、図１３（ｄ）〜（ｇ）中、線で囲んだ領域は硬化領域を示し、矢頭は癒着を示す。【０１５８】
また、図１４は、図１３（ａ）〜（ｇ）の結果に基づいて障害誘導量を数値化した結果を示すグラフである。図１４中、「ＶＰＡのみ」はバルプロ酸のみを投与し慢性腎臓病の発症を誘導しなかった群の結果を示し、「Ａｂ  ０．５ｍｇ」は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を０．５ｍｇ／匹投与しバルプロ酸を投与しなかった群の結果を示し、「Ａｂ  ０．５ｍｇ＋ＶＰＡ」は、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を０．５ｍｇ／匹投与しバルプロ酸を毎日投与した群の結果を示し、「Ａｂ  １ｍｇ」は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を１ｍｇ／匹投与しバルプロ酸を投与しなかった群の結果を示し、「Ａｂ  １ｍｇ＋ＶＰＡ」は、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を１ｍｇ／匹投与しバルプロ酸を毎日投与した群の結果を示し、「Ａｂ  １．５ｍｇ」は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を１．５ｍｇ／匹投与しバルプロ酸を投与しなかった群の結果を示し、「Ａｂ  ２ｍｇ＋ＶＰＡ」は、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を２ｍｇ／匹投与しバルプロ酸を毎日投与した群の結果を示す。【０１５９】
その結果、バルプロ酸の投与は、慢性腎臓病モデルマウスの腎臓における糸球体硬化病変の進行を大幅に抑えることができることが明らかとなった。より具体的には、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体の投与量が０．５ｍｇである場合、バルプロ酸の投与により障害誘導量を７４％抑制することができた。また、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体の投与量が１ｍｇである場合、バルプロ酸の投与により障害誘導量を６５％抑制することができた。また、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体の投与量が２ｍｇでありバルプロ酸を毎日投与した場合、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体の投与量が１．５ｍｇでありバルプロ酸を投与しなかった場合と比較して、障害誘導量を５８％抑制することができた。ここで、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体の投与量が１．５ｍｇでありバルプロ酸を毎日投与した場合には、障害誘導量は５８％以上抑制されると予想された。【０１６０】
《腎臓組織切片のＰＡＳ染色及びｐ５７の免疫染色》
各マウスの腎臓組織切片をＰＡＳ染色し、更にｐ５７の免疫染色を行った。ｐ５７はポドサイトのマーカーである。図１５（ａ）〜（ｆ）は、各群のマウスの腎臓組織切片のＰＡＳ染色及びｐ５７の免疫染色の結果を示す顕微鏡写真である。スケールバーは２０μｍを示す。図１５（ａ）は慢性腎臓病の発症を誘導しなかった群の代表的な結果であり、図１５（ｂ）は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を２ｍｇ／匹投与してバルプロ酸を投与しなかった群の代表的な結果であり、図１５（ｃ）はバルプロ酸のみを投与し慢性腎臓病の発症を誘導しなかった群の代表的な結果であり、図１５（ｄ）は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を０．５ｍｇ／匹投与しバルプロ酸を毎日投与した群の代表的な結果であり、図１５（ｅ）は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を１ｍｇ／匹投与しバルプロ酸を毎日投与した群の代表的な結果であり、図１５（ｆ）は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を２ｍｇ／匹投与してバルプロ酸を毎日投与した群の代表的な結果である。【０１６１】
また、図１６は、図１５（ａ）〜（ｆ）の結果に基づいて、ｐ５７陽性細胞の単位面積当たりの数を測定した結果を示すグラフである。図１６中、「Ｖｅｈｉｃｌｅ」は慢性腎臓病の発症を誘導しなかった群の結果を示し、「ＦＳＧＳ」は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を１．５ｍｇ／匹投与してバルプロ酸を投与しなかった群の結果を示し、「ＶＰＡ」はバルプロ酸のみを投与し慢性腎臓病の発症を誘導しなかった群の結果を示し、「Ａｂ  ０．５ｍｇ＋ＶＰＡ」は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を０．５ｍｇ／匹投与しバルプロ酸を毎日投与した群の結果を示し、「Ａｂ  １ｍｇ＋ＶＰＡ」は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を１ｍｇ／匹投与しバルプロ酸を毎日投与した群の結果を示し、「Ａｂ  ２ｍｇ＋ＶＰＡ」は抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を２ｍｇ／匹投与してバルプロ酸を毎日投与した群の結果を示す。【０１６２】
その結果、バルプロ酸の投与は、慢性腎臓病モデルマウスの腎臓におけるポドサイト数の低下を抑制したことが明らかとなった。より具体的には、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体の投与量が１．５ｍｇであり、バルプロ酸を投与しなかった場合、ポドサイトの数は慢性腎臓病の発症を誘導しなかった群（以下、「対照群」という。）の６６％にまで減少した。これに対し、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体の投与量が０．５ｍｇである場合、バルプロ酸の投与により、ポドサイトの数を対照群の９２％残存させることができた。また、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体の投与量が１ｍｇである場合、バルプロ酸の投与により、ポドサイトの数を対照群の８７％残存させることができた。また、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体の投与量が２ｍｇである場合、バルプロ酸の投与により、ポドサイトの数を対照群の７４％残存させることができた。【０１６３】
［実験例１１］
（慢性腎臓病を発症するモデルマウスへのバルプロ酸の投与２）
実験例１と同様の慢性腎臓病（ＦＳＧＳ）を発症するモデルマウスを用いて、インビボにおけるバルプロ酸投与の影響を検討した。【０１６４】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（７週齢）に、バルプロ酸を１日１回、１００ｍｇ／ｋｇの投与量で、２８日間腹腔内投与した。そして、バルプロ酸の投与開始から１４日目に、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を２ｍｇ／匹の投与量で１回尾静脈投与し、慢性腎臓病の発症を誘導した。【０１６５】
また、比較のために、バルプロ酸を投与せず、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を２ｍｇ／匹の投与量で１回尾静脈投与し慢性腎臓病の発症を誘導した群、バルプロ酸のみを投与し慢性腎臓病の発症を誘導しなかった群、何も処理しなかった群も用意した。【０１６６】
続いて、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体の投与から１４日目に、各マウスから腎臓を摘出し、組織切片を作製した。続いて、糸球体における、ガングリオシドＧＭ３及びネフリンタンパク質を、それぞれ、抗ＧＭ３抗体（型式「Ａ２５８２」、東京化成工業株式会社）及び発明者らが作製した抗ネフリン抗体を用いた蛍光免疫染色により検出した。【０１６７】
図１７は、ＧＭ３及びネフリンタンパク質を検出した代表的な蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは２０μｍである。図１７中、「ＧＭ３」はＧＭ３を検出した結果であることを意味し、「Ｎｅｐｈｒｉｎ」はネフリンタンパク質を検出した結果であることを意味する。また、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は何も処理しなかった群のマウスの結果であることを意味し、「ＶＰＡ」はバルプロ酸のみを投与し慢性腎臓病の発症を誘導しなかった群の結果であることを意味し、「ＦＳＧＳ」は、バルプロ酸を投与せず、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を投与し慢性腎臓病の発症を誘導した群の結果であることを意味し、「ＶＰＡ＋ＦＳＧＳ」は、バルプロ酸の投与開始から１４日目に、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を投与した群の結果であることを意味する。【０１６８】
その結果、マウスにバルプロ酸を投与すると糸球体へのＧＭ３の蓄積量が増加することが明らかとなった。また、マウスに抗ネフリン抗体を投与した慢性腎臓病（ＦＳＧＳ）モデルでは、ネフリンタンパク質及びＧＭ３の発現量が減少することが明らかとなった。一方、マウスにバルプロ酸を事前に投与した後に抗ネフリン抗体を投与するとＧＭ３の減少が顕著に抑制されることが明らかとなった。【０１６９】
また、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体の投与から１４日目に、各マウスから摘出した腎臓から、電子顕微鏡用標本を作製し、電子顕微鏡で糸球体における足細胞の足突起の形状を観察した。【０１７０】
図１８は、代表的な電子顕微鏡写真である。スケールバーは１μｍである。図１８中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は何も処理しなかった群のマウスの結果であることを意味し、「ＶＰＡ」はバルプロ酸のみを投与し慢性腎臓病の発症を誘導しなかった群の結果であることを意味し、「ＦＳＧＳ」は、バルプロ酸を投与せず、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を投与し慢性腎臓病の発症を誘導した群の結果であることを意味し、「ＶＰＡ＋ＦＳＧＳ」は、バルプロ酸の投与開始から１４日目に、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を投与した群の結果であることを意味する。【０１７１】
その結果、マウスに抗ネフリン抗体を投与した慢性腎臓病（ＦＳＧＳ）モデルでは、足細胞足突起の癒合及び退縮が観察された。これに対し、マウスにバルプロ酸を事前に投与した後に抗ネフリン抗体を投与すると、足細胞の癒合及び退縮はほとんど認められず、正常な形状が維持されることが明らかとなった。【０１７２】
以上の結果は、バルプロ酸を投与することにより慢性腎臓病の発症を予防することができることを更に支持するものである。【０１７３】
［実験例１２］
（慢性腎臓病を発症するモデルマウスへのバルプロ酸の投与３）
実験例１と同様の慢性腎臓病（ＦＳＧＳ）を発症するモデルマウスを用いて、インビボにおけるバルプロ酸投与の影響を検討した。本実験例では、バルプロ酸を腹腔内投与ではなく経口投与した。【０１７４】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（７週齢）に、バルプロ酸を１４日間飲水により投与した。１日あたりのバルプロ酸の摂取量は１４５．２ｍｇ／ｋｇと見積もられた。そして、バルプロ酸の飲水投与開始から１５日目に、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を２ｍｇ／匹の投与量で１回尾静脈投与し、慢性腎臓病の発症を誘導した。その後、更にバルプロ酸を１４日間飲水により投与した。【０１７５】
また、比較のために、バルプロ酸を投与せず、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を２ｍｇ／匹の投与量で１回尾静脈投与し慢性腎臓病の発症を誘導した群、バルプロ酸のみを投与し慢性腎臓病の発症を誘導しなかった群、何も処理しなかった群も用意した。【０１７６】
続いて、バルプロ酸の飲水投与の開始から２８日目に、各マウスから腎臓を摘出し、組織切片を作製した。続いて、糸球体における、ガングリオシドＧＭ３を抗ＧＭ３抗体（型式「Ａ２５８２」、東京化成工業株式会社）を用いた蛍光免疫染色により検出した。【０１７７】
図１９は、ＧＭ３を検出した代表的な蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは２０μｍである。図１９中、「ＧＭ３」はＧＭ３を検出した結果であることを意味し、「ＧＭＲ６」は抗ＧＭ３抗体のクローン名を意味する。また、「Ｎｏｒｍａｌ」は何も処理しなかった群のマウスの結果であることを意味し、「ＶＰＡ」はバルプロ酸のみを飲水投与し慢性腎臓病の発症を誘導しなかった群の結果であることを意味し、「ＦＳＧＳ」は、バルプロ酸を投与せず、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を投与し慢性腎臓病の発症を誘導した群の結果であることを意味し、「ＶＰＡ＋ＦＳＧＳ」は、バルプロ酸の飲水投与開始から１５日目に、抗マウスネフリンウサギポリクローナル抗体を投与し、更に１４日間バルプロ酸を飲水投与した群の結果であることを意味する。【０１７８】
その結果、マウスに抗ネフリン抗体を投与した慢性腎臓病（ＦＳＧＳ）モデルでは、ＧＭ３の発現量が減少することが明らかとなった。一方、マウスにバルプロ酸を飲水投与すると、抗ネフリン抗体の投与によるＧＭ３の減少が顕著に抑制されることが明らかとなった。【０１７９】
この結果は、バルプロ酸を経口投与した場合においても慢性腎臓病の発症を予防することができることを示す。【０１８０】
［実験例１３］
（ヒト慢性腎臓病患者の糸球体におけるＧＭ３発現量の検討）
ヒト腎生検組織から、組織切片を作製した。続いて、糸球体における、ガングリオシドＧＭ３を、抗ＧＭ３抗体（型式「Ａ２５８２」、東京化成工業株式会社）を用いた蛍光免疫染色により検出した。【０１８１】
図２０は、ＧＭ３を検出した代表的な蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは４０μｍである。図２０中、「ＧＭ３」はＧＭ３を検出した結果であることを意味し、「ＧＭＲ６」は抗ＧＭ３抗体のクローン名を意味し、「ＤＡＰＩ」は４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で核を染色した結果であることを意味する。また、「Ｎｏｒｍａｌ」はヒト正常糸球体の結果であることを意味し、「ＭＣＮＳ」は慢性腎臓病の一種である微小変化型ネフローゼ症候群の患者の糸球体の結果であることを意味し、「ＦＳＧＳ」は慢性腎臓病の一種である巣状分節性糸球体硬化症の患者の糸球体の結果であることを意味する。【０１８２】
その結果、ヒトにおいても正常な糸球体にはＧＭ３が豊富に発現していることが明らかとなった。これに対し、ＭＣＮＳやＦＳＧＳ等のポドサイト傷害による疾患の患者の糸球体では、ＧＭ３の発現量が顕著に減少することが明らかとなった。【０１８３】
この結果は、モデルマウスで確認された現象がヒトの慢性腎臓病にも適用できることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１８４】
本発明によれば、慢性腎臓病を予防又は治療する技術を提供することができる。
【図１】
2019082912.tif 000009
【図２】
2019082912.tif 000010
【図３】
2019082912.tif 000011
【図４】
2019082912.tif 000012
【図５】
2019082912.tif 000013
【図６】
2019082912.tif 000014
【図７】
2019082912.tif 000015
【図８】
2019082912.tif 000016
【図９】
2019082912.tif 000017
【図１０】
2019082912.tif 000018
【図１１】
2019082912.tif 000019
【図１２】
2019082912.tif 000020
【図１３】
2019082912.tif 000021
【図１４】
2019082912.tif 000022
【図１５】
2019082912.tif 000023
【図１６】
2019082912.tif 000024
【図１７】
2019082912.tif 000025
【図１８】
2019082912.tif 000026
【図１９】
2019082912.tif 000027
【図２０】
2019082912.tif 000028
【国際調査報告】
2019082912.tif 000029
2019082912.tif 000030
2019082912.tif 000031
2019082912.tif 000032
2019082912.tif 000033
2019082912.tif 000034
2019082912.tif 000035
2019082912.tif 000036
2019082912.tif 000037
2019082912.tif 000038
2019082912.tif 000039
2019082912.tif 000040
2019082912.tif 000041
2019082912.tif 000042