(57)【要約】  臓器保存方法は、生体または死体から分離した臓器を−２．０℃±１．０℃の範囲内で保存することを特徴とする。また、臓器は、過冷却状態で保存することが好ましい。また、予め−２．０℃±１．０℃の範囲内に調整されている冷却材中に、臓器を配置することで臓器を保存することが好ましい。また、臓器を生体または死体から分離して５分以内に冷却材中に配置することが好ましい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体または死体から分離した臓器を−２．０℃±１．０℃の範囲内で保存することを特徴とする臓器保存方法。
【請求項２】
前記臓器を過冷却状態で保存する請求項１に記載の臓器保存方法。
【請求項３】
予め−２．０℃±１．０℃の範囲内に調整されている冷却材中に、前記臓器を配置することで前記臓器を保存する請求項１または２に記載の臓器保存方法。
【請求項４】
前記臓器を前記生体または前記死体から分離して５分以内に前記冷却材中に配置する請求項３に記載の臓器保存方法。
【請求項５】
前記冷却材は、シャーベット状の氷である請求項３または４に記載の臓器保存方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の臓器保存方法で保存した前記臓器を生体に移植することを特徴とする臓器移植方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臓器保存方法および臓器移植方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ドナー（生体または死体）から取り出した臓器の保存方法として、例えば、特許文献１に記載の保存方法が開示されている。特許文献１では、４℃〜２０℃の保存液中で臓器を冷却保存し、さらに、冷却液を臓器に灌流させることで臓器を保存している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１３−０７５８８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、４℃の保存液中で臓器を冷却保存しても臓器を適切に保存することができない。【０００５】
本発明の目的は、臓器を適切に保存することができる臓器保存方法および臓器移植方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の臓器保存方法は、生体または死体から分離した臓器を−２．０℃±１．０℃の範囲内で保存することを特徴とする。【０００７】
本発明の臓器保存方法では、前記臓器を過冷却状態で保存することが好ましい。【０００８】
本発明の臓器保存方法では、予め−２．０℃±１．０℃の範囲内に調整されている冷却材中に、前記臓器を配置することで前記臓器を保存することが好ましい。【０００９】
本発明の臓器保存方法では、前記臓器を前記生体または前記死体から分離して５分以内に前記冷却材中に配置することが好ましい。【００１０】
本発明の臓器保存方法では、前記冷却材は、シャーベット状の氷であることが好ましい。【００１１】
本発明の臓器移植方法は、本発明の臓器保存方法で保存した前記臓器を生体に移植することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、−２．０℃±１．０℃という低温が生体（臓器）の細胞の代謝を低下させ、生体機能を保持した状態での保存に貢献するため、臓器を適切に保存することができる。そのため、例えば、臓器を生体に移植可能な状態でより長時間保存することが可能となる。また、生体移植後の臓器機能の低下を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、異なる温度の冷却材を用いた場合の臓器の温度変化を示すグラフである。
【図２】図２は、保存装置の全体構成を示す図である。
【図３】図３は、体外肺灌流装置を示す図である。
【図４】図４は、ドナー肺の一回換気量を示すグラフである。
【図５】図５は、ドナー肺の酸素濃度を示すグラフである。
【図６】図６は、ドナー肺の重さを示すグラフである。
【図７】図７は、ドナー肺のｍＲＮＡ量を示すグラフである。
【図８】図８は、ＥＤ１陽性細胞を示す画像である。
【図９】図９は、ＥＤ１陽性細胞の数を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ラットの生存率を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ドナー肺移植片を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の臓器保存方法および臓器移植方法について、添付図面を参照しつつ詳細に説明する。
【００１５】
近年、過冷却技術の発達によって、臓器移植のためにドナー（生体または死体）から摘出（分離）した臓器を氷点（０℃）以下、具体的には−６℃〜−５℃で未凍結のままの過冷却状態で保存する技術が研究・開発されている。このような保存方法によれば、臓器を新鮮なまま、長時間保存することが可能になると考えられている。そこで、本願発明者は、上記技術のさらなる向上のために研究を重ねた結果、臓器の保存により適した保存温度が存在することを見出した。そのことを以下に説明する。なお、本願明細書では、前記死体には心臓死の他、脳死、これらに類するもの（例えば、デッド・ドナー・ルールで死を判定されたもの）も含まれる。
【００１６】
本願発明者は、ドナーから摘出した臓器を−２．０℃±１．０℃の範囲内において過冷却状態（氷点（０℃）以下で未凍結を保っている状態）で保存することにより、臓器を新鮮なまま、より長時間保存することが可能となり、さらには、患者への臓器移植後の臓器機能の低下を効果的に抑制することができることを見出した。これは、−２．０℃±１．０℃という低温が生体（臓器）の細胞の代謝を低下させ、生体機能を保持した状態での保存に貢献するためであると考えられる。
【００１７】
なお、保存される臓器としては、特に限定されず、例えば、心臓、肺、胃、小腸、十二指腸、大腸、直腸、肝臓、腎臓、脾臓等（移植可能な全ての臓器）や、組織（角膜、気管、心臓弁、靭帯、骨等）が挙げられる。
【００１８】
ここで、臓器の種類によっては、適した保存温度が若干異なる場合もある。例えば、ある臓器に関しては、−１．５℃が最適な保存温度であり、別の臓器に関しては、−２．０℃が最適な保存温度であり、さらに別の臓器に関しては、−２．５℃が最適な保存温度である場合もある。そこで、保存する臓器によって、保存温度を適宜変更することが好ましい。なお、保存温度は、その臓器に適した温度（以下、最適保存温度）からの揺らぎが少ない程好ましい。具体的には、最適保存温度±０．５℃の範囲内で保存することがより好ましく、最適保存温度±０．１℃の範囲内で保存することがさらに好ましい。
【００１９】
ドナーから摘出した臓器は、例えば、コンプレッサー式、ペルチェ式等の冷却装置によって、予め−２．０℃±１．０℃の範囲内に調整（維持）されている冷却材（保存液）中に浸して（配置して）保存することが好ましい。このように、−２．０℃±１．０℃の範囲内に調整されている冷却材中に臓器を浸すことで、摘出してからより短時間で臓器を−２．０℃±１．０℃の範囲内まで冷却することができる。そのため、臓器をより新鮮なまま保存することができる。なお、冷却材の温度は、−２．０℃からの揺らぎが少ない程、臓器を−２．０℃付近で安定して保存することができる点で好ましい。具体的には、−２．０℃±０．５℃の範囲内に維持されていることがより好ましく、−２．０℃±０．１℃の範囲内に維持されていることがより好ましい。ただし、例えば、常温の冷却材中に臓器を浸して、それから冷却材を冷却してもよい。
【００２０】
冷却材としては、特に限定されず、例えば、生理食塩水やＥＴ京都（ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ）液等の公知の臓器・組織保存液を用いることができる。
【００２１】
なお、冷却材としては、上述の臓器・組織保存液の他にも、例えば、シャーベット状の氷（すなわち水と氷の混合物）を用いてもよい。シャーベット状の氷は、塩水（生理食塩水）から製造されており、凝固点が−２．０℃程度に調整されている。また、シャーベット状の氷の氷濃度としては、特に限定されないが、例えば、４０％以上、６０％以下程度であることが好ましい。上述の臓器・組織保存液では冷却装置等によって温度を管理しなければならないため、例えば、温度揺らぎが生じやすい。また、冷却装置を駆動する電源が必要となるため、例えば、臓器の搬送に制約が生じることも考えられる。これに対して、シャーベット状の氷を冷却材として用いれば、電源が必要ないし、温度揺らぎを低減することもできる。
【００２２】
また、ドナーから臓器を摘出してから、その臓器を冷却材に浸すまでの時間は、短い程好ましい。具体的には、５分以内であることが好ましく、３分以内であることがより好ましく、１分以内であることがさらに好ましい。このように、臓器を素早く冷却材に浸すことで、臓器をより新鮮なまま保存することができる。
【００２３】
また、ドナーから摘出した臓器は、なるべく短時間で０℃以下の過冷却状態とすることが好ましい。臓器は、冷却している最中にも細胞代謝が起こるため、なるべく短時間で過冷却状態とすることで、この細胞代謝を抑えることができ、臓器の劣化を効果的に抑制することができる。そのため、臓器をより新鮮なまま、かつより長時間保存することができる。
【００２４】
図１は、−２．０℃に調整されている冷却材中に臓器を浸した場合の臓器の温度変化と、０℃に調整されている冷却材中に臓器を浸した場合の臓器の温度変化とを比較するグラフである。この図からわかるように、−２．０℃に調整されている冷却材中に臓器を浸した場合では、２０分以内に臓器が０℃以下に冷やされている。そのため、より短時間で臓器を過冷却状態とすることができ、臓器をより新鮮なまま、かつより長時間保存することができる。
【００２５】
このようにして保存された臓器（ここでは肺を代表して説明する）は、例えば、後述する体外肺灌流装置１００を用いて機能を確認し、移植可能と判断された場合にのみ、実際に患者に移植される。また、移植後に血液を灌流される際は、例えば、２分間隔で１０ｍｌ／ｍｉｎずつ灌流量を高めていくことが好ましい。これにより、例えば、血管へのダメージを低減することができる。
【００２６】
このような体外肺灌流装置１００を用いることで、肺機能を確認することができると共に、肺機能を回復することもできる。具体的には、例えば、肺に溜まりすぎた水分を減らしたり、糖分、酸素等の栄養を供給したり、縮みきった部分を正常に戻すことができたりする。そのため、移植可能な肺を増やすことができ、より多くの患者に肺を移植することができるようになる。
【００２７】
次に、ドナーから摘出した臓器を保存する保存装置について説明する。図２に示す保存装置２００は、冷却材２９０（保存液）を貯留し、冷却材２９０に臓器４００を浸して保存する保存室２１０と、保存室２１０に貯留された冷却材２９０の温度を調整する温度調整装置２２０と、を有している。また、温度調整装置２２０は、例えば、コンプレッサー式、ペルチェ式等であって、冷却材２９０を循環させて冷却する冷却装置２３０と、冷却装置２３０の駆動を制御する制御装置２４０と、を有している。
【００２８】
制御装置２４０は、コンピューターで構成され、例えば、図２に示すように、プロセッサー２４１（ＣＰＵ）、メモリー２４２、Ｉ／Ｆ２４３（インターフェース）等を有している。そして、プロセッサー２４１が、メモリー２４２に格納されている所定のプログラム（コード列）を実行することで、冷却装置２３０の駆動を制御し、冷却材２９０の温度を調整する。なお、前記プログラムは、Ｉ／Ｆ２４３を介して外部のサーバーからダウンロードしてもよい。また、制御装置２４０の構成の全部または一部は、保存装置２００の外部に設けられ、ＬＡＮ（ローカルエリアネットワーク）等の通信網を介して接続された構成となっていてもよい。
【００２９】
このような制御は、例えば、Ｉ／Ｆ２４３を介して、パーソナルコンピューター、ＵＳＢメモリー等のホストコンピューターＸから入力された制御信号に基づいて実行される。ホストコンピューターＸから入力される制御信号は、例えば、保存する臓器の種類、当該臓器の最適保存温度等から臓器ごとに個別に生成されている。これにより、臓器をより適切に保存することができる。また、ホストコンピューターＸから入力される制御信号を入力することで、制御装置２４０に臓器ごとの最適保存温度およびそれに基づくプログラムを予め保存しておく必要がないため、制御装置２４０の容量を小さく抑えることができるし、プログラムの削除、追加、更新等の面倒な作業も不要となる。
【００３０】
以上、本発明の臓器保存方法および臓器移植方法について説明したが、本発明は、これに限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
［被験体］
個体差を小さくするために、被験体として近交性の雄ラットを用いた。【００３２】
≪実施例１≫
まず、−２．０℃に保たれた５５０ｍｌのＥＴ京都液を用意し、次に、被験体の雄ラットからドナー肺および心臓（以下、「ドナー心肺ブロック」とも言う）を摘出し、摘出したドナー心肺ブロックを速やかにＥＴ京都液に浸した。そして、そのまま、ＥＴ京都液を−２．０℃±０．２５℃の温度範囲に維持しつつ、過冷却状態を安定させ、ドナー心肺ブロックを１７時間保存した。【００３３】
≪比較例１≫
まず、−５．０℃に保たれたＥＴ京都液を用意し、次に、被験体の雄ラットからドナー心肺ブロックを摘出し、摘出したドナー心肺ブロックを速やかにＥＴ京都液に浸した。そして、そのまま、ＥＴ京都液を−５．０℃±０．２５℃の温度範囲に維持しつつ、過冷却状態を安定させ、ドナー心肺ブロックを１７時間保存した。【００３４】
≪比較例２≫
まず、＋４．０℃に保たれたＥＴ京都液を用意し、次に、被験体の雄ラットからドナー心肺ブロックを摘出し、摘出したドナー心肺ブロックを速やかにＥＴ京都液に浸した。そして、そのまま、＋４．０℃±０．２５℃の温度範囲を維持し、ドナー心肺ブロックをＥＴ京都液中で１７時間保存した。【００３５】
≪比較例３≫
被験体の雄ラットから摘出した直後のドナー心肺ブロックを用意した。すなわち、この群のドナー心肺ブロック（ラット肺）には一切の冷保存が行われていない。【００３６】
［評価］
まず、実施例１および比較例１、２で得られたドナー心肺ブロックについて、図３に示す体外肺灌流装置１００（ｅｘ  ｖｉｖｏ）を用いて、灌流液を６０分灌流させた。体外肺灌流装置１００は、臓器を体外に取り出した状態で、人工呼吸器を用いて、血流や呼吸を維持して生体内と同様の状態に臓器を維持することのできる装置である。【００３７】
このような体外肺灌流装置１００は、心肺ブロックを収容するチャンバー１１０と、一端部が肺動脈（ＰＡ）に接続され、他端部が左心房（ＬＡ）に接続される灌流ライン１２０と、肺に空気を送り込む空気供給ライン１３０およびベンチレーター１４０と、灌流ライン１２０の途中に設けられたポンプ１５０と、灌流ライン１２０の途中に設けられ、左心房からの灌流液から酸素を除去する（減らす）酸素除去部１６０と、を有している。なお、灌流液は、ヘパリン添加ラット血液と、４％のウシ血清アルブミンを含む生理食塩水と、ヘモグロビンとで構成し、ｐＨは７．２５〜７．３５に調整した。また、灌流中は、灌流液の温度をほぼ３７℃に保ち、肺動脈に１０ｍｌ／ｍｉｎで灌流液を供給した。また、同時に、肺には２１％酸素を供給した。【００３８】
≪肺への空気換気量に関する評価≫
実施例１および比較例１、２について、上述の体外肺灌流装置１００を用いてドナー肺への灌流液の灌流を開始してから１５分後、３０分後、４５分後、６０分後のタイミングで、ドナー肺の一回換気量（肺に入る空気の量）を測定した。その結果を図４のグラフに示す。なお、本測定は、実施例１および比較例１、２についてそれぞれ４つ（ｎ＝４）のドナー心肺ブロックを用いて行った。図４のグラフから分かるように、比較例１、２の一回換気量は、互いに減少の仕方が異なっているものの、６０分経過後では互いにほぼ同等の値まで大きく減少している。それと比較して、実施例１では、６０分経過までほとんど低下しないままの状態であった。【００３９】
≪酸素濃度に関する評価≫
実施例１および比較例１、２について、上述の体外肺灌流装置１００を用いてドナー肺への灌流液の灌流を開始してから１５分後、３０分後、４５分後、６０分後のタイミングで、ドナー肺の肺静脈から排出された灌流液中の酸素量を測定した。その結果を図５のグラフに示す。なお、本測定は、実施例１および比較例１、２についてそれぞれ４つ（ｎ＝４）のドナー心肺ブロックを用いて行った。図５のグラフから分かるように、比較例１、２の灌流液中の酸素量は、互いに減少の仕方が異なっているものの、６０分経過後では互いにほぼ同等の値まで大きく減少している。それと比較して、実施例１では、６０分経過までほとんど低下しないままの状態であった。【００４０】
≪ドナー肺の重さに関する評価≫
実施例１および比較例１、２について、上述の体外肺灌流装置１００を用いてドナー肺への灌流液の灌流を開始してから１５分後、３０分後、４５分後、６０分後のタイミングで、ドナー肺の重さを測定した。その結果を図６のグラフに示す。なお、本測定は、実施例１および比較例１、２についてそれぞれ４つ（ｎ＝４）のドナー心肺ブロックを用いて行った。図６のグラフから分かるように、比較例１、２のドナー肺は、互いに増加の仕方が異なっているものの、時間の経過と共に重くなっている。このように、比較例１、２では、時間経過と共に肺が重くなり、それに伴って肺機能が低下していることが分かった。それと比較して、実施例１では、６０分経過までほとんど増加しないままの状態であった。【００４１】
≪ｍＲＮＡ発現に関する評価≫
実施例１および比較例２、３について、サイバーグリーン（登録商標）を用いた２ステップリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によってｍＲＮＡ量を測定した。その結果を図７に示す。なお、本測定は、実施例１および比較例２、３についてそれぞれ７つのドナー心肺ブロックを用いて行った。図７に示すように、ｉＮＯＳ（誘導型一酸化窒素合成酵素）、ＣＯＸ−２（シクロオキシゲナーゼ−２）、ＩＬ−６（インターロイキン−６）、ＩＬ−１ｂｅｔａ（インターロイキン−１ベータ）、ＴＮＦａｌｐｈａ（腫瘍壊死因子α）の各ｍＲＮＡ量について、実施例１は、比較例２よりも大幅に少なく、かつ、比較例３とほぼ同等の少なさである。【００４２】
≪マクロファージの浸潤に関する評価≫
実施例１および比較例２、３について、マクロファージのマーカーとして抗ＥＤ１抗体を用いて免疫染色を行い、移植片でのマクロファージの浸潤を観察した。その結果を図８および図９に示す。図８および図９に示すように、実施例１のＥＤ１陽性細胞は、比較例２よりも大幅に少なく、かつ、比較例３とほぼ同等の少なさである。【００４３】
≪肺移植後の生存率≫
実施例１のドナー肺および比較例２のドナー肺をラットに移植し、その後の生存率を調べた。その結果を図１０および図１１に示す。図１０は、７日間のラットの生存率を示すグラフであり、図１１は、７日経過後の肺移植片の顕微鏡画像である。なお、本測定は、実施例１および比較例２についてそれぞれ７匹のラットを用いて行った。図１０に示すように、実施例１では、７日後の生存率が１００％であるのに対して、比較例２では、３日目から生存率が下がり始めている。また、図１１に示すように、実施例１の移植片は、病理学的にほぼ正常であるのに対して、比較例２では、肺胞内出血や浮腫を伴う重度の線維症が現れている。【００４４】
以上、肺についての実験結果について代表して説明したが、肺以外の臓器（例えば、心臓、胃、小腸、十二指腸、大腸、直腸、肝臓、腎臓、脾臓等）についても同様の効果を発揮することができる。また、実施例１に加えて、ＥＴ京都液を−２．０℃±１．０℃の温度範囲に維持しつつ、過冷却状態を安定させ、ドナー心肺ブロックを１７時間保存したものについても同様の評価をしたところ、実施例１とほぼ同等の結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の臓器保存方法は、生体または死体から分離した臓器を−２．０℃±１．０℃の範囲内で保存することを特徴とする。このような方法によれば、−２．０℃±１．０℃という低温が生体（臓器）の細胞の代謝を低下させ、生体機能を保持した状態での保存に貢献するため、臓器を適切に保存することができる。そのため、例えば、臓器を生体に移植可能な状態でより長時間保存することが可能となる。また、生体移植後の臓器機能の低下を低減することができる。したがって、本発明の臓器保存方法は、産業上の利用可能性を有している。【００４６】
また、本発明の臓器移植方法は、本発明の臓器保存方法で保存した前記臓器を生体に移植することを特徴とする。このような方法によれば、生体移植後の臓器機能の低下を低減することができる。したがって、本発明の臓器移植方法は、産業上の利用可能性を有している。
【符号の説明】
【００４７】
１００…体外肺灌流装置
１１０…チャンバー
１２０…灌流ライン
１３０…空気供給ライン
１４０…ベンチレーター
１５０…ポンプ
１６０…酸素除去部
２００…保存装置
２１０…保存室
２２０…温度調整装置
２３０…冷却装置
２４０…制御装置
２４１…プロセッサー
２４２…メモリー
２４３…Ｉ／Ｆ
２９０…冷却材
４００…臓器
Ｘ…ホストコンピューター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019064443.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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2019064443.tif 000015
2019064443.tif 000016
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