(57)【要約】要約  優れた血管新生誘導活性および抗菌活性を有する新規なポリペプチド並びにその医薬用途が開示されている。新規ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１ないし６のいずれかで表される。これらのポリペプチドは、血管新生誘導剤及び抗菌活性を有し、切創、手術創、びらん、熱傷、褥瘡、難治性創傷、皮膚潰瘍、下肢潰瘍、糖尿病性潰瘍、閉塞性動脈疾患及び閉塞性動脈硬化症に起因する皮膚創傷の予防、改善又は治療や、これらの皮膚創傷における細菌感染の予防、改善又は治療等に有効である。
2010061915.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列が配列番号１ないし６のいずれかで表されるポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドを有効成分として含有する血管新生誘導剤。
【請求項３】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１、２又は３で表わされる請求項２記載の血管新生誘導剤。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドを有効成分として含有する抗菌剤。
【請求項５】
有効量の請求項１に記載のポリペプチドを、血管新生が必要な哺乳動物に投与することを含む、血管新生誘導方法。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチドの、血管新生誘導剤の製造のための使用。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドである、血管新生誘導用ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、皮膚創傷の予防、改善又は治療剤。
【請求項９】
皮膚創傷が、切創、手術創、びらん、熱傷、褥瘡、難治性創傷、皮膚潰瘍、下肢潰瘍、糖尿病性潰瘍、閉塞性動脈疾患及び閉塞性動脈硬化症に起因する皮膚創傷から成る群から選択される請求項８記載の皮膚創傷の予防、改善又は治療剤。
【請求項１０】
皮膚創傷が、難治性創傷である、請求項９記載の予防、改善又は治療剤。
【請求項１１】
皮膚創傷が、感染を伴う創傷である、請求項９記載の予防、改善又は治療剤。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、皮膚創傷における細菌感染の予防、改善又は治療剤。
【請求項１３】
有効量の請求項１に記載のポリペプチドを哺乳動物に投与することを含む、皮膚創傷または皮膚創傷における細菌感染の予防、改善又は治療方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリペプチドの皮膚創傷または皮膚創傷における細菌感染の予防、改善又は治療剤の製造のための使用。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチドである、皮膚創傷または皮膚創傷における細菌感染の予防、改善又は治療用ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生誘導活性及び抗菌活性を有する新規ポリペプチド並びにそれを含有する血管新生誘導剤、皮膚創傷治療剤及び皮膚創傷感染予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
熱傷、褥瘡、創傷、皮膚潰瘍、下肢潰瘍、糖尿病性潰瘍、閉塞性動脈疾患及び閉塞性動脈硬化症等の種々の疾患又は傷害の治療においては、血管の新生が有効である。また、このような疾患においては、細菌感染が病態の重篤な増悪を誘発することから、抗菌活性及び血管新生誘導活性を併せ持つ血管新生誘導剤が求められている。【０００３】
また、細菌感染を伴う皮膚創傷においても、抗菌活性を有する創傷治療剤が有効である。さらに、感染を伴っていない創傷に対しても、将来的な感染を予防する意味において、抗菌活性を有する創傷治療剤の使用が望ましい。【０００４】
血管新生誘導活性及び抗菌活性を有するポリペプチドとしては、LL−37が知られている。（非特許文献１および２）。【０００５】
また、中神らは、血管内皮増殖活性、ひいては血管新生誘導活性を有するポリペプチドを発明し、さらに該ペプチドがLL−37より高い血管新生誘導活性を有するペプチドを有していることを見いだし、これを特許出願した（特許文献１）。さらに中神らは、特許文献１に係るペプチドより高い血管新生誘導活性を有する30アミノ酸残基よりなるポリペプチドAG30-5Cを見出し、これを特許出願した（特許文献２）。特許文献１および２には、該ポリペプチドが抗菌活性を有することも示唆されている。【０００６】
また、褥瘡または皮膚潰瘍に対する治療薬として、154アミノ酸からなる塩基性FGF(bFGF)を有効成分とした製剤（フィブラストスプレー（登録商標））が知られている。しかしながら、このbFGFは抗菌作用がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO 2005/090564 A1
【特許文献２】WO 2008/096816 A1
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Koczulla R, von Degenfeld G, Kupatt C, Krotz F, Zahler S, Gloe T, Issbrucker K, Unterberger P, Zaiou M, Lebherz C, Karl A, Raake P, Pfosser A, Boekstegers P, Welsch U, Hiemstra PS, Vogelmeier C, Gallo RL, Clauss M, Bals R., "An angiogenic role for the human peptide antibiotic LL-37/hCAP-18.", J Clin Invest. 2003 Jun;111(11):1665-72
【非特許文献２】Zanetti M., "Cathelicidins, multifunctional peptides of the innate immunity.," J Leukoc Biol. 2004 Jan;75(1):39-48. Epub 2003 Jul 22.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、公知のポリペプチドよりもさらに優れた血管新生誘導活性及び抗菌活性を有する新規なポリペプチド及びそれを有効成分として含む新規な血管新生誘導剤、皮膚潰瘍、難治性創傷を含む皮膚創傷治療剤、および感染を伴う皮膚創傷の治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、特許文献１および２に記載されたポリペプチドよりも高い血管新生誘導活性および抗菌活性を有するポリペプチドを見出し本発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1)  アミノ酸配列が配列番号１ないし６のいずれかで表されるポリペプチド。
(2)  (1)に記載のポリペプチドを有効成分として含有する血管新生誘導剤。
(3)  前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１、２又は３で表わされる(2)記載の血管新生誘導剤。
(4)  (1)に記載のポリペプチドを有効成分として含有する抗菌剤。
(5)  有効量の(1)に記載のポリペプチドを、血管新生が必要な哺乳動物に投与することを含む、血管新生誘導方法。
(6)  (1)に記載のポリペプチドの、血管新生誘導剤の製造のための使用。
(7)  (1)に記載のポリペプチドである、血管新生誘導用ポリペプチド。
(8)  (1)に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、皮膚創傷の予防、改善又は治療剤。
(9)  皮膚創傷が、切創、手術創、びらん、熱傷、褥瘡、難治性創傷、皮膚潰瘍、下肢潰瘍、糖尿病性潰瘍、閉塞性動脈疾患及び閉塞性動脈硬化症に起因する皮膚創傷から成る群から選択される疾患の予防、改善又は治療剤。
(10)  皮膚創傷が、難治性創傷である、(9)記載の予防、改善又は治療剤。
(11)  皮膚創傷が、感染を伴う創傷である、(9)記載の予防、改善又は治療剤。
(12)  (1)に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、皮膚創傷における細菌感染の予防、改善又は治療剤。
(13)  有効量の(1)に記載のポリペプチドを哺乳動物に投与することを含む、皮膚創傷または皮膚創傷における細菌感染の予防、改善又は治療方法。
(14)  (1)に記載のポリペプチドの皮膚創傷または皮膚創傷における細菌感染の予防、改善又は治療剤の製造のための使用。
(15)  (1)に記載のポリペプチドである、皮膚創傷または皮膚創傷における細菌感染の予防、改善又は治療用ポリペプチド。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、優れた血管新生誘導活性及び抗菌活性を有する新規なポリペプチドが提供された。また、このポリペプチドを有効成分とする新規な血管新生誘導剤、切創、手術創、びらん、種々の皮膚潰瘍、難治性創傷を含む皮膚創傷治療剤、および感染を伴う皮膚創傷の治療剤が提供された。本発明の創傷治療剤は、感染を予防および/または治療する作用と創傷組織再生を促進する作用とを併せ持つため、皮膚創傷治療剤の治療剤として優れている。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のポリペプチドの、ヒト皮膚繊維芽細胞（NHDF）の増殖に対する影響を調べた結果を示す図である。測定時の陰性対照（Control）群の値を100とした相対値で示す。
【図２Ａ】陽性対照としてのbFGF製剤を含浸したペーパーディスクモデルによる肉芽組織形成能の測定結果を示す図である。2.5μg/mL、25μg/mLおよび250μg/mLは、それぞれ0.1μg/disc、1.0μg/discおよび10μg/discの用量を意味する。
【図２Ｂ】本発明のポリペプチドの１つであるSR-1を含浸したペーパーディスクモデルによる肉芽組織形成能の測定結果を示す図である。25μg/mL、250μg/mLおよび2.5mg/mLは、それぞれ1.0μg/disc、10μg/discおよび100μg/discの用量を意味する。
【図２Ｃ】本発明のポリペプチドの１つであるSR-2を含浸したペーパーディスクモデルによる肉芽組織形成能の測定結果を示す図である。25μg/mL、250μg/mLおよび2.5mg/mLは、それぞれ1.0μg/disc、10μg/discおよび100μg/discの用量を意味する。
【図２Ｄ】本発明のポリペプチドの１つであるSR-3を含浸したペーパーディスクモデルによる肉芽組織形成能の測定結果を示す図である。25μg/mL、250μg/mLおよび2.5mg/mLは、それぞれ1.0μg/disc、10μg/discおよび100μg/discの用量を意味する。
【図２Ｅ】本発明のポリペプチドの１つであるSR-4を含浸したペーパーディスクモデルによる肉芽組織形成能の測定結果を示す図である。25μg/mL、250μg/mLおよび2.5mg/mLは、それぞれ1.0μg/disc、10μg/discおよび100μg/discの用量を意味する。
【図２Ｆ】本発明のポリペプチドの１つであるSR-5を含浸したペーパーディスクモデルによる肉芽組織形成能の測定結果を示す図である。25μg/mL、250μg/mLおよび2.5mg/mLは、それぞれ1.0μg/disc、10μg/discおよび100μg/discの用量を意味する。
【図３Ａ】本発明のポリペプチドの１つであるSR-1を切創に投与した後の切創の創耐張力の測定結果を示す図である。
【図３Ｂ】本発明のポリペプチドの１つであるSR-2を切創に投与した後の切創の創耐張力の測定結果を示す図である。
【図３Ｃ】本発明のポリペプチドの１つであるSR-3を切創に投与した後の切創の創耐張力の測定結果を示す図である。
【図３Ｄ】本発明のポリペプチドの１つであるSR-4を切創に投与した後の切創の創耐張力の測定結果を示す図である。
【図３Ｅ】本発明のポリペプチドの１つであるSR-5を切創に投与した後の切創の創耐張力の測定結果を示す図である。
【図３Ｆ】対照であるbFGF製剤をを切創に投与した後の切創の創耐張力の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
上記の通り、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１〜６のそれぞれで表わされるものである。これらのポリペプチドはいずれも新規物質である。
【００１５】
特許文献２に記載されているポリペプチドAG30-5Cのアミノ酸配列を配列番号７に示す。AG30-5Cは、特許文献２および下記実施例において具体的に記載されているように、抗菌活性及び血管新生誘導活性を有する。上記した本発明のポリペプチドは、血管新生誘導活性及び抗菌活性を有することが明らかになった。そして、下記実施例に具体的に記載するように、本発明の実施例になるポリペプチドは、AG30-5Cよりも高い血管新生誘導活性及び抗菌活性を有していた。
【００１６】
一般に、ポリペプチドから成る医薬において、生体内でのポリペプチドの安定性を高めるために、ポリペプチドに糖鎖やポリエチレングリコール(PEG)鎖を付加したり、ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部としてＤ体アミノ酸を用いたりする技術が広く知られており、用いられている。糖鎖やPEG鎖を付加したり、ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部としてＤ体アミノ酸を用いたりすることにより、生体内でのペプチダーゼによる分解を受けにくくなり、生体内におけるポリペプチドの半減期が長くなる。また、ペプチドのＮ末端のアセチル化および／またはＣ末端のアミド化によって、ペプチドの安定性が向上することもよく知られている。本発明のポリペプチドは、抗菌活性を有する限り、生体内安定化のためのこれらの公知の修飾を施したものであってもよく、本明細書及び特許請求の範囲における「ポリペプチド」という語は、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、生体内安定化のための修飾を施したものも包含する意味で用いている。このような安定化修飾ポリペプチドであっても、ポリペプチド部分のアミノ酸配列は、上記の通り配列番号１〜６のいずれかで表わされるものであり（ただし、上記アセチル化やアミド化されたアミノ酸は、アセチル化やアミド化されていないアミノ酸と同じアミノ酸であると考える)、従って、該安定化修飾ポリペプチドは、配列番号１〜６のいずれかで表わされるアミノ酸配列から成るポリペプチドに、生体内安定化のためのPEGのような構造を付加したもの、その少なくとも一部のアミノ酸をＤ体に変えたもの、並びに該ポリペプチドのＮ末端をアセチル化および／またはＣ末端をアミド化したもの、並びにこれらの修飾の組み合わせにより修飾されたポリペプチドを包含する。
【００１７】
ポリペプチドに対する糖鎖付加は周知であり、例えば、Sato M, Furuike T, Sadamoto R, Fujitani N, Nakahara T, Niikura K, Monde K, Kondo H, Nishimura S., "Glycoinsulins: dendritic sialyloligosaccharide-displaying insulins showing a prolonged blood-sugar-lowering activity.",J Am Chem Soc. 2004 Nov 3;126(43):14013-22やSato M, Sadamoto R, Niikura K, Monde K, Kondo H, Nishimura S,"Site-specific introduction of sialic acid into insulin.", Angew Chem Int Ed Engl. 2004 Mar 12;43(12):1516-20等に記載されている。糖鎖は、Ｎ末端、Ｃ末端又はそれらの間のアミノ酸に結合可能であるが、ポリペプチドの活性を阻害しないためにＮ末端又はＣ末端に結合することが好ましい。また、付加する糖鎖の個数は、１個又は２個が好ましく、１個がより好ましい。糖鎖は、単糖から４糖が好ましく、さらには２糖又は３糖が好ましい。糖鎖は、ポリペプチドの遊離のアミノ基又はカルボキシル基に直接又は例えば炭素数１〜１０程度のメチレン鎖等のスペーサー構造を介して結合することができる。
【００１８】
ポリペプチドに対するPEG鎖の付加も周知であり、例えば、Ulbricht K, Bucha E, Poschel KA, Stein G, Wolf G, Nowak G., "The use of PEG-Hirudin in chronic hemodialysis monitored by the Ecarin Clotting Time: influence on clotting of the extracorporeal system and hemostatic parameters.", Clin Nephrol. 2006 Mar;65(3):180-90.やDharap SS, Wang Y, Chandna P, Khandare JJ, Qiu B, Gunaseelan S, Sinko PJ, Stein S, Farmanfarmaian A, Minko T., "Tumor-specific targeting of an anticancer drug delivery system by LHRH peptide.", Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Sep 6;102(36):12962-7."等に記載されている。PEG鎖は、Ｎ末端、Ｃ末端又はそれらの間のアミノ酸に結合可能であり、通常、１個又は２個のPEG鎖が、ポリペプチド上の遊離のアミノ基やカルボキシル基に結合される。PEG鎖の分子量は、特に限定されないが、通常3000〜7000程度、好ましくは5000程度のものが用いられる。
【００１９】
ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部をＤ体とする方法も周知であり、例えば、Brenneman DE, Spong CY, Hauser JM, Abebe D, Pinhasov A, Golian T, Gozes I., "Protective peptides that are orally active and mechanistically nonchiral.", J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jun;309(3):1190-7やWilkemeyer MF, Chen SY, Menkari CE, Sulik KK, Charness ME., "Ethanol antagonist peptides: structural specificity without stereospecificity.", J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jun;309(3):1183-9.等に記載されている。ポリペプチドを構成するアミノ酸の一部をＤ体としてもよいが、ポリペプチドの活性をできるだけ阻害しないため、ポリペプチドを構成するアミノ酸の全てをＤ体アミノ酸とすることが好ましい。
【００２０】
本発明の血管新生誘導剤の有効成分であるポリペプチドは、市販のペプチド合成機を用いた化学合成等の常法により容易に製造することができる。また、上記安定化修飾も、上記各文献に記載されているような周知の方法により容易に行なうことができる。
【００２１】
本発明のポリペプチドは、高い血管新生誘導活性を有するので、血管新生誘導剤として用いることができ、さらに皮膚創傷治療剤としても用いることができる。
【００２２】
本明細書中、「血管新生誘導剤」とは、生体に局所投与した場合、その投与部位およびその周辺における、血管新生を誘導および/または増大させることができる薬剤を言う。血管新生の誘導は、該当部位での血流量測定など、公知の方法で評価することができる。創傷部位に局所投与した場合、血管新生の誘導および/または増大によって、肉芽形成、皮膚組織の再生が促進され、治癒が促進される。
【００２３】
本明細書中、「抗菌剤」とは、生体に投与した場合、既に感染した細菌を死滅させる、またはその増殖を抑制もしくは低減させる効果、あるいは、細菌への感染を抑制・阻止する効果を有する薬剤を指す。
【００２４】
本明細書中、「皮膚創傷治療剤」とは、創傷部位および/またはその周囲に局所投与した場合、その創傷の治癒もしくは改善の促進または悪化の予防もしくは遅延をもたらす薬剤を指す。創傷の治癒もしくは改善の促進は、創傷部位の面積の早期縮小または創傷部位での肉芽形成および/もしくは皮膚組織の再生の促進を言う。
【００２５】
血管新生誘導剤および皮膚創傷治療剤、並びに後述する皮膚創傷の予防、改善又は治療剤、並びに後述する皮膚創傷における細菌感染の予防、改善又は治療剤としての使用方法は公知のポリペプチド系の血管新生誘導剤と同様であり、溶液剤、乳剤、懸濁剤、粉剤、散剤、顆粒剤、ゲル、軟膏、または経皮パッチとして、特に好ましくは溶液剤、粉剤、あるいは経皮パッチとして投与することができる。溶液剤として好ましくは緩衝液、特に好ましくは生理食塩緩衝液等の水系媒体に溶解した溶液を投与することができる。溶液中のポリペプチドの濃度は、特に限定されないが、通常、0.01mg /mL〜100mg/mL程度、好ましくは0.1mg /mL〜50mg/mL程度、特に好ましくは1mg/mL〜10mg/mL程度である。投与経路は、通常、血管新生または創傷治癒もしくは改善が必要な部位への噴霧、塗布や注射等の局所投与である。投与量は、症状や患部の大きさ等に応じて適宜選択されるが、通常、ポリペプチド量として0.01mg〜100mg程度、好ましくは0.005mg〜50mg程度、特に好ましくは0.005mg〜0.5mg程度であるが、もちろん、これらの範囲に限定されるものではない。例えば、1回あたり0.05mg程度とすることができる。
【００２６】
あるいはまた、血管新生または創傷治癒もしくは改善が必要な部位の面積に応じて投与量を設定することも可能であり、例えば、1〜100μg/cm2とすることができる。
【００２７】
なお、本発明の血管新生誘導剤を製剤化する際に用いられる薬剤的に許容できる担体としては、上記した水系媒体の他にも、製剤分野で常用されている担体を用いることができ、例えば、軟膏のような外用剤の場合には、炭化水素類（親水ワセリン、白色ワセリン、精製ラノリン、流動パラフィン等）、酸化亜鉛、高級脂肪酸及びそのエステル（アジピン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、アジピン酸エステル、ミリスチン酸エステル、パルミチン酸エステル、セバシン酸ジエチル、ラウリン酸ヘキシル、イソオクタン酸セチル等）、ロウ類（鯨ロウ、ミツロウ、セレシン等）、高級アルコール（セタノール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール等）などが挙げられる。溶液剤の場合には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等を挙げることができ、経口剤の場合には、乳糖、デンプン等を挙げることができる。その他、必要に応じ、乳化剤、界面活性剤、等張化剤、pH調整剤等の各種医薬添加剤を配合することもできる。なお、これらの薬剤的に許容できる担体及び医薬添加剤は、製剤分野において周知であり、広く用いられているものである。
【００２８】
生体に投与する場合の具体的な疾患及び障害の例として、熱傷、褥瘡、創傷、皮膚潰瘍、下肢潰瘍、糖尿病性潰瘍、閉塞性動脈疾患及び閉塞性動脈硬化症を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。本発明の血管新生誘導剤は、これらの疾患又は障害に対する予防、改善又は治療剤として用いることができる。なお、本発明のポリペプチドは、高い血管新生誘導活性を有する一方、抗菌活性をも有している。すなわち、黄色ブドウ球菌（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を包含する）、表皮ブドウ球菌等のグラム陽性細菌、大腸菌、肺炎桿菌、腸内細菌等のグラム陰性細菌に対して抗菌活性を有するので、抗菌活性を併有することが望まれる疾患又は障害の予防、改善又は治療剤として特に適しており、このような疾患又は障害として、上記の疾患又は障害のうち熱傷、褥瘡、創傷、皮膚潰瘍、下肢潰瘍、糖尿病性潰瘍等を挙げることができる。
【００２９】
本明細書中、「皮膚創傷」（単に創傷と称する場合もある）とは、外的、内的要因によって起こる体表組織の物理的な損傷を指し、切創、裂創、刺創、咬創、銃創、挫創、擦過傷、手術創、びらん、熱傷、褥瘡、難治性創傷、皮膚潰瘍、下肢潰瘍、糖尿病性潰瘍、閉塞性動脈疾患及び閉塞性動脈硬化症に起因する皮膚創傷を含む。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、創傷治療剤、抗菌剤、または感染予防剤として治療に用いることができる。SR-1（配列番号１）、SR-2（配列番号２）、SR-3（配列番号３）、SR-4（配列番号４）、SR-5（配列番号５）及びSR-6（配列番号６）のいずれのペプチドも該治療に用いることができるが、SR-1およびSR-3がより好ましく、SR-1が特に好ましい。本発明のポリペプチドは、一つの有効成分で感染の治癒および予防と創傷治癒との2つの効果を有する。
【００３１】
本発明のポリペプチドは、創傷治療剤として既に使用されているbFGF を有効成分とする薬剤（フィブラストスプレー（登録商標）、本明細書中、bFGF製剤と称する）に匹敵する創傷治癒効果を示しうる。bFGFには抗菌作用はないが、本発明のポリペプチドは抗菌作用を有していることから、感染を伴う皮膚創傷に対してより有効な治療剤となりうる。下記実施例に示すとおり、感染を伴う創傷において本発明のポリペプチドがbFGF製剤に比べて早期治癒効果を有している。本明細書中の実施例には、SR-1ポリペプチドが黄色ブドウ球菌感染を伴う創傷に対する効果を例示しているが、実施例に限定されるものではなく、本発明のポリペプチドのいずれもが、黄色ブドウ球菌ならびに他の細菌、特に本発明のポリペプチドが抗菌性を示す細菌、例えば大腸菌、緑膿菌、表皮ブドウ球菌、肺炎桿菌および腸内細菌に対しても同様の効果を示すことは、当業者であれば容易に理解できる。
さらに、感染が認められない創傷に対して本発明のポリペプチドの投与後、細菌と接触させた場合でも、該実施例と同様、細菌感染を予防し、早期治癒効果を示すこともまた、当業者であれば容易に理解できる。  
【００３２】
したがって、本発明のポリペプチド、好ましくはSR-1およびSR-3、特にSR-1ポリペプチドは、切創、手術創、びらん、熱傷、褥瘡、難治性創傷、皮膚潰瘍、下肢潰瘍、糖尿病性潰瘍、閉塞性動脈疾患及び閉塞性動脈硬化症に起因する皮膚創傷を含むあらゆる皮膚創傷のうち、感染を伴わないあらゆる創傷の治療または改善に用いることができ、さらに、感染を伴うあらゆる創傷の治療または改善に用いることができる。また、これらのポリペプチドは感染を引き起こす可能性のある創傷に対して感染を予防する効果を有する。ここで「創傷の治療または改善」とは、創傷の治癒、創傷の程度の軽減、および創傷の悪化の抑制を包含する。本発明のポリペプチドは、創傷部位が細菌感染を起こすことを予防し得るため、創傷の悪化を抑制することができる。
【００３３】
ここで、「びらん」とは、当業者に公知であり、また汎用の医学専門書に記載されているとおりであるが、例えば、伝染性膿痂疹や天疱瘡などの水疱症、熱傷、およびアトピー性皮膚炎の掻破などで生じる表皮までの皮膚の損傷であり、水ぶくれが生じた後にできる表面が湿潤した状態を指す。また、「潰瘍」とは、当業者に公知であり、また汎用の医学専門書に記載されているとおりであるが、概して述べるとすると、真皮以下の組織に達する皮膚の損傷であり、びらんに比べて深い傷である。多くの場合、出血や浸出液が認められる。この潰瘍は、膠原病、糖尿病もしくは血管炎などの血行障害を伴う疾患または悪性腫瘍などに引き続いて生じる場合もあるが、熱傷潰瘍および褥瘡（床ずれ）などの圧迫性潰瘍も挙げられる。治癒後も瘢痕と呼ばれる傷跡が残る場合が多い。
【００３４】
したがって、これらのポリペプチドは、一般に難治性創傷と称される治癒の困難な創傷に対する治療、改善または予防効果を有する。難治性創傷とは、糖尿病性潰瘍・下腿潰瘍、熱傷潰瘍、褥瘡（床ずれ）、圧迫性潰瘍、壊死などを含む。これらの潰瘍および壊死は、細菌感染を伴いやすく、その感染が憎悪を招く。したがって、これらの創傷の治療または改善は、肉芽形成を経て創傷部位の皮膚組織の再生を促すとともに、細菌感染の予防および治療を行うことが望ましい。本発明のポリペプチドを創傷の細菌感染（二次感染を含む）の予防、改善または治療剤として用いると、感染の予防、改善または治療効果および/または該ポリペプチドの有する血管新生効果もしくは創傷治癒効果により創傷の早期予防、改善または治療効果が得られる。
【００３５】
創傷の細菌感染は、種々の菌の感染があるが、特に、黄色ブドウ球菌（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を含む）、緑膿菌、大腸菌、肺炎桿菌等が挙げられる。これらに対して抗菌性を有する薬剤を、感染後に投与することが治療上望ましいが、感染予防を目的として感染前に投与することも創傷治療上大変有益である。
【００３６】
また、本発明のポリペプチドは、創傷治療剤として広く利用されているbFGF製剤に比べて、瘢痕が残りにくく、美容的な観点からもより望ましい。
【００３７】
本発明の血管新生誘導剤、抗菌剤、皮膚創傷治療剤または皮膚創傷感染予防剤は、単独で使用することもできるし、本発明のポリペプチドの２種以上を併用することもできる。また、さらなる抗菌性が望まれる場合には他の抗菌剤又は抗生物質と併用することもできる。これらの抗菌剤又は抗生物質の例として、セフェム系、カルバペネム系、アミノグリコシト系、ニューキノロン系、β-ラクタム系、ペニシリン系及びグリコペプチド系抗生物質等を挙げることができ、より具体的には、セフタジジム、メロペネム、トブラマイシン、シプロフロキサシン、メチシリン、アンピシリン及びバンコマイシン等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００３８】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
１．  ポリペプチドの合成
文献Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce (1984)、Fmoc solid synthesis：a practical approach, Oxford University Press（2000）および第5版  実験化学講座16  有機化合物の合成IV等に記載の方法に従い、全自動固相合成機を用いて、保護ペプチド樹脂をFmoc法で合成した。得られた保護ペプチド樹脂にトリフルオロ酢酸（TFA）とスカベンジャー（チオアニオール、エタンジチオール、フェノール、トリイソプロピルシラン、水などの混合物）を加えて、樹脂から切り出すとともに脱保護して、粗ペプチドを得た。この粗ペプチドを、逆相HPLCカラム(ODS)を用いて、0.1%TFA-H2O/CH3CNの系でグラジエント溶出し、精製を行った。目的物を含む分画を集め凍結乾燥して、目的のペプチドを得た。合成したペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸シーケンサーG1000A（Hewlett Packard）、PPSQ-23A（島津製作所）又はProciscLC（ABI社）を用いて確認した。ペプチドの配列を以下に示す。SR-２、SR-３、SR-４およびSR-６はＣ末端をアミド化した。【００４０】
SR-１（配列番号１）
MLKLIFLHRLKRMRKRLKRK
SR-２（配列番号２）
ELRFLHRLKRRLRKRLKRKLR-amide
SR-３（配列番号３）
ELRFLHRLKRMRKRLKRKLR-amide
SR-４（配列番号４）
KLIFLHRLKRMRKRLKRKLR-amide
SR-５（配列番号５）
KRMRKRLKRKLRLWHRKRYK
SR-６（配列番号６）
MRKRLKRKLRLWHRKRYK-amide
AG30-5C（配列番号７）
MLKLIFLHRLKRMRKRLKRKLRFWHRKRYK【００４１】
２．ポリペプチドのMALDI-TOF/MSを用いた分析
合成したポリペプチドの配列をMALDI-TOF/MSを用いた分析結果により確認した。最終濃度100μg/mLのポリペプチド0.1% TFA/50% アセトニトリル溶液 1μLにマトリクス溶液（α-シアノ4-ヒドロキシ桂皮酸(α-Cyano 4-Hydroxy Cinnamic Acid）)1μLを加え、MALDI用測定試料とした。MALDI用測定試料（0.4μL）をMALDIターゲットプレートに塗布し、乾燥させた。MALDI-TOF/MSを用いて測定した。【００４２】
MALDI-TOF/MS条件：
レーザー強度：  2100
照射回数：  1000【００４３】
結果
各ポリペプチドのMALDI-TOF/MSの理論値及び実測値を表1に示した。各ポリペプチドの検出されたm/zは、それぞれの理論値と一致し、合成したポリペプチドの配列を確認することができた。【００４４】
【表１】
2010061915.tif 000003
【００４５】
３．  ポリペプチドの血管新生誘導活性
AG30-5Cを陽性対象として、SR-１およびSR-２の血管新生誘導活性を測定した。具体的には、血管新生キット(Angiogenesis Kit, KZ-1000, 倉敷紡績株式会社)を用いてポリペプチドの管腔形成能を評価した。陰性対照としてポリペプチドなしの群（コントロール）を用いた。【００４６】
各ポリペプチドの濃度が10 μg/mLとなるように血管新生専用培地（倉敷紡績（株）KZ-1500）に添加した。ポリペプチドを添加した専用培地を用いて細胞を37℃、5% CO2条件下で24ウェルプレート内で培養した。培地は、培養4日目、7日目及び9日目に同じポリペプチドを含有するものと交換した。培養開始11日目に培地を除き、管腔染色キット（CD31抗体染色用）を用いて以下の手順に従い染色を行った。【００４７】
一次抗体（マウス抗ヒトCD31抗体）をブロッキング液（1％BSAを含むダルベッコリン酸緩衝液（PBS（−）））で4000倍に希釈した。各ウェルにこの一次抗体溶液0.5 mLを添加し、60分間37℃でインキュベートした。インキュベート終了後、1 mLのブロッキング液で各ウェルを計3回洗浄した。【００４８】
次いでブロッキング液で500倍希釈した二次抗体溶液（ヤギ抗マウスIgGアルカリホスファターゼ複合体）0.5 mLを各ウェルに添加し、60分間37℃でインキュベートした後、1 mLの蒸留水で3回洗浄した。その間に、BCIP/NBTの錠剤2錠を蒸留水に溶解し、ポアサイズ0.2 μmのフィルターで濾過して基質溶液を準備した。調製したBCIP/NBT基質溶液0.5 mLを各ウェルに添加し，管腔が深紫色になるまで（通常5-10分間）37℃でインキュベートした。インキュベート終了後、蒸留水1 mLで各ウェルを3回洗浄した。洗浄後、洗浄液を吸引除去し、自然乾燥するため静置した。乾燥後、顕微鏡下で各ウェルの写真を撮影した。【００４９】
得られた各画像を、血管新生定量ソフトウェアを用い定量化した。様々な指標でコンピューター解析を行い、このスケールをもとに各視野中に形成された管腔の長さを測定し、コントロールに対するポリペプチド添加の効果を評価した。【００５０】
結果を表２に示す。【００５１】
【表２】
2010061915.tif 000004
【００５２】
表２に示されるように、本発明のポリペプチドSR-１およびSR-２は、いずれも血管新生誘導活性を有していた。その活性は、AG30-5Cよりも高かった。【００５３】
４．ポリペプチドの抗菌活性（その１）
ATPアッセイ法を用いてポリペプチドの抗菌活性を測定した。【００５４】
すなわち、PROMEGA社BacTiter-Glo  Microbial Cell Viability Assay  kitを用いて、細菌の生存率からペプチドの抗菌活性を評価した。すなわち、マイクロタイタープレートあるいは試験管を用いて、ペプチド濃度10μg/mLにおける生菌中のATP量を測定した。【００５５】
菌株には、グラム陽性菌として黄色ブドウ球菌ATCC29213 (S. aureus ATCC29213) あるいはグラム陰性菌として緑膿菌（P. aeruginosa ATCC27853）を用いた。細菌を培地で３〜４時間培養した後、A600における吸光度を測定した。McFarland #0.5にしたがって、ミューラー・ヒントン・ブロス（Mueller-Hinton broth：MHB）で菌液を希釈した。各菌株を大腸菌換算で0.5−1x105CFU/mL（最終濃度）程度になるように添加した。マイクロプレートあるいは試験管に各ペプチドを最終濃度10μg/mLになるよう調製、分注し、菌液を添加した。ペプチド無添加のものを陰性対照とし、トブラマイシン（TOB）を陽性対照とした。プレートを37℃で3時間培養し、培養液中のATP量を測定した。陰性対照と比較して相対値を求め、それを生存率とした。【００５６】
結果を表３に示す。【００５７】
【表３】
2010061915.tif 000005
【００５８】
表３に示されるように、本発明のポリペプチドSR-１、SR-２、SR-３、SR-４およびSR-６は、AG30-5Cより黄色ブドウ球菌に対して優れた抗菌活性を示した。さらに、SR-２およびSR−３は、AG30-5Cより緑膿菌に対して優れた抗菌活性を示した。【００５９】
５．ポリペプチドの抗菌活性（その２）
さらに、上記ポリペプチドの抗菌活性を明らかにするために、上記黄色ブドウ球菌、緑膿菌に加えて大腸菌、腸内細菌２種（それぞれ腸内細菌(1)及び腸内細菌(2)）、肺炎桿菌、および表皮ブドウ球菌に対する抗菌活性も測定した。【００６０】
抗菌活性のATP（％）については上記と同様に測定し、「最小発育阻止濃度（minimum inhibitory concentration：MIC）」については以下のとおり測定した。MICは菌の発育が阻止される最小の薬剤濃度であり、抗菌剤の効力、菌の感受性の強さなどの指標として用いられ、その濃度以下であれば、菌は生育(増殖)でき、濃度以上であれば生育できないという濃度である。この測定は、日本化学療法学会またはCLINICAL AND LABORATORY STANDARD INSTITUTE（CLSI）が標準法として定める方法に従って測定されるが、ここではＣＬＳＩが2007年1月発行した「Ｍ１００−Ｓ１７  /Ｍ７−Ａ７」（Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Seventeenth Informational Supplemen、Vol. 27  No.1）に準拠し、微量液体希釈法で測定した。すなわち、マイクロタイタープレートあるいは試験管を用いて、薬剤感受性試験を行った。【００６１】
細菌を液体培地で４〜６時間培養した後、A600における吸光度を測定した。McFarland #0.5にしたがって、ミューラー・ヒントン・ブロス（Mueller-Hinton broth：MHB）で希釈した。各菌株を105CFU/ml（最終濃度）程度になるように添加した。各ペプチドは任意の濃度に調製し、そこから段階希釈を行った。各濃度段階のポリペプチドを分注したマイクロプレートあるいは試験管に菌液を添加した。ペプチド無添加のものを陰性対照、メロペネム(MEPM)、シプロフロキサシン(CPFX)、トブラマイシン（TOB）、オキサシリン（OX）を陽性対照とした。プレートを３７℃で20時間培養し、生育の阻止された最小の濃度を最小生育阻止濃度とした。【００６２】
それぞれの菌株は、大腸菌：ATCC 25922（Escherichia coli  ATCC  25922）、緑膿菌：ATCC  27853（Pseudomonas aeruginosa ATCC  27853）、黄色ブドウ球菌：ATCC29213 (Staphylococcus aureus ATCC29213)、肺炎桿菌：JCM 1662（ Klebsiella pneumoniae  JCM  1662）、腸内細菌(1)：JCM  1232（Enterobacter cloacae JCM  1232）、腸内細菌(2)：JCM  1235（Enterobacter aerogenes JCM  1235）、表皮ブドウ球菌：JCM  2414（Staphylococcus epidermidis JCM  2414）を用いた。【００６３】
黄色ブドウ球菌、緑膿菌、大腸菌、および表皮ブドウ球菌については、MICおよびATPアッセイ法の両方の測定を行ったが、腸内細菌２種（それぞれ腸内細菌(1)および腸内細菌(2)）および肺炎桿菌についてはATPアッセイのみ行った。なお、ＡＴＰアッセイの薬剤濃度は、表中に記載の濃度で行った。【００６４】
その結果を下記表４−１及び表４−２（ATP活性）並びに表５(MIC)に示す。【００６５】
【表４−１】
2010061915.tif 000006
【００６６】
【表４−２】
2010061915.tif 000007
【００６７】
【表５】
2010061915.tif 000008
【００６８】
この結果より、SR-1〜SR-5のポリペプチドは、いずれの菌に対しても抗菌活性を有していることがわかった。【００６９】
６．皮膚繊維芽細胞の増殖への影響
次に、これらポリペプチドのヒト皮膚繊維芽細胞（NHDF）の増殖に対する影響を検討した。同仁化学のCell Counting Kit（WST-1）を用いてポリペプチドの細胞増殖活性を調べた。陰性対照（Control）として、ポリペプチドなしの群を用いた。細胞（正常ヒト新生児包皮皮膚線維芽細胞：NHDF(NB)）を96ウェルプレートに播種する（0.5×104 cells/well/100 μL、血清1%）。細胞を播種してから約3時間後、ポリペプチド（1,3,10,30,または100μg/ml）、陽性対照としてFGF(100ng/ml)を100μL添加した。無刺激の群には培地のみを100 μL添加した。CO2インキュベータ内に約48時間静置した後、WST-1試薬を各ウェルに20μL添加し、CO2インキュベータ内で約 2時間静置した。Wallac 1420 ARVOsx（プログラム：WST-1）にて波長450 nm，620 nmの吸光度を測定した。各測定値のO.D.450 - O.D.620を求めた。測定ウェルのO.D.450 - O.D.620の値から細胞を含まない空ウェルのO.D.450 - O.D.620の平均値を引いたものをNet O.D.450 とした。細胞増殖活性は無刺激のNet O.D.450に対するポリペプチド添加時の割合で評価した。【００７０】
その結果を図１に示す。図１に示されるように、いずれのペプチドも、1〜30μg/ml以下の濃度では、繊維芽細胞に対して増殖促進効果を示したが、100μg/mlの濃度では細胞毒性を示す傾向があった。【００７１】
７．管腔形成
倉敷紡績株式会社の血管新生キット（製品番号：KZ-1000）を用いてポリペプチドの管腔形成を評価した。陽性対照として血管内皮増殖因子A（VEGF-A）、陰性対照としてポリペプチドなしの無刺激の群を用いた。【００７２】
キットに添付の血管新生専用培地を用いて、各ポリペプチドの濃度が0.5、2.5、10 μg/mLとなるように調製した。キットに添付の細胞が播種された24ウェル（ヒト血管内皮細胞と線維芽細胞を最適濃度で共培養した細胞）にポリペプチドを含有する血管新生専用培地を添加し、37℃、5% CO2条件下で培養した。培養4日目、7日目及び9日目に同じ添加物を含有する培地と交換した。培養開始11日目に管腔染色キット（CD31抗体染色用）を用いて以下の手順に従い染色した。【００７３】
培地を除き、ダルベッコリン酸緩衝液（PBS（−））洗浄後、氷冷した70%エタノールを添加し細胞を固定した。ブロッキング液（1％BSAを含むダルベッコリン酸緩衝液（PBS（−））で各ウェルを洗浄し、ブロッキング液で4000倍に希釈したCD31染色1次抗体（マウス抗ヒトCD31抗体）を各ウェルに0.5 mL添加後、60分間37℃でインキュベートした。インキュベート終了後、1 mLのブロッキング液で各ウェルを計3回洗浄した。次いでブロッキング液で500倍希釈した2次抗体溶液（ヤギ抗マウスIgGアルカリホスファターゼ複合体）0.5 mLを各ウェルに添加し、60分間37℃でインキュベートした後、1 mLの蒸留水で3回洗浄した。その間に、BCIP/NBTの錠剤2錠を蒸留水に溶解し、ポアサイズ0.2μmのフィルターで濾過して基質溶液を準備した。調製したBCIP/NBT基質溶液0.5 mLを各ウェルに添加し，管腔が深紫色になるまで（通常5-10分間）37℃でインキュベートした。インキュベート終了後、蒸留水1 mLで各ウェルを3回洗浄した。洗浄後、洗浄液を吸引除去し、自然乾燥するため静置した。乾燥後、顕微鏡下で各ウェルの写真を撮影した。【００７４】
得られた各画像を、血管新生定量ソフトウェアを用い定量化した。倉敷紡績株式会社の血管新生定量ソフトウェア（血管新生定量ソフトウェア Ver 1.0）のスケールをもとに各視野中に形成された管腔の面積及び長さを測定し、陰性対照に対するポリペプチド添加時の割合で評価した。【００７５】
結果を下記表６−１（管腔の面積）及び表６−２（管腔の長さ）に示す。表６−１及び表６−２中、陰性対照を100とした相対値を示す。【００７６】
【表６−１】
2010061915.tif 000009
【００７７】
【表６−２】
2010061915.tif 000010
【００７８】
この結果から、SR-1、SR-2およびSR-3のポリペプチドが、明らかに管腔形成能が高いことが示された。【００７９】
８．安定性
続いて、SR-1〜5の５つのポリペプチドについて、血清中の安定性を評価した。
ペプチドを最終濃度500μg/mLとなるように、ヒト血清（株式会社ケー・エー・シーより購入）またはラットより採血後室温放置後遠心分離により得られたラット血清に溶解させ、３７℃で静置した． 10分もしくは30分または60分の静置後、HPLCクロマトグラム分析に供し分解物ピークを検出し、溶液中に残存するペプチド濃度の開始濃度に対する割合を算出した。また、各ペプチドの血清中の半減期を算出した。【００８０】
ここで、HPLCクロマトグラム分析の条件は下記のとおりである。
カラム：CAPCELL PAK C18 MGII （S-3μm，4.6×150PE，資生堂）
ガードカラム：GUARD CARTRIDGE CAPCELL C18 MG （S-3μm，4.0×10PE，資生堂）
カラム温度：50℃
移動相A：0.025% トリフルオロ酢酸溶液
移動相B：0.025% トリフルオロ酢酸 アセトニトリル
流量：1.0 mL/min
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：220 nm）
注入量：100 μL
グラジェント条件：【００８１】
【表７】
2010061915.tif 000011
【００８２】
結果を下記表８に示す。【００８３】
【表８】
2010061915.tif 000012
【００８４】
【表９】
2010061915.tif 000013
【００８５】
ラット血清中では、SR-1およびSR-５は1時間以内に完全に分解されたが、SR-2、SR-3およびSR-４は、37度1時間では35〜55％が分解されるに留まった。ヒト血清中では、いずれのペプチドも90％以上が、1時間以内に分解されることがわかった。【００８６】
さらに、各ポリペプチド（SR-1〜5）のPBS中の安定性も確認した。  最終濃度1 mg/mLのペプチドPBS溶液を4℃及び室温で保存した．調製直後，2週間及び4週間後にその溶液を、注入量を5μLとした以外は、上記同様の条件でのHPLC分析に供し、分解物ピークの有無により溶液中保存安定性を評価した。その結果、いずれも分解物は認められず、いずれのポリペプチドも、PBS中では室温および４℃のいずれでも十分な保存安定性を有していることがわかった。【００８７】
９．ペーパーディスクモデルによる肉芽組織形成能の比較
続いて、SR-1〜5の５つのポリペプチドのin vivoにおける肉芽組織形成能について検討した。Crl:CD（SD）系ラット（雄、9週齢、日本チャールス・リバー株式会社より入手）に、25、250、2500μg/ｍLの濃度の被験物質である各ペプチド、2.5、25、250μg/ｍLの濃度のｂFGF製剤（陽性対照）または生食（陰性対照）を40μlずつディスク(disc)に添加し、最終的には、各ペプチドは1, 10及び100μg/disc、ｂFGF製剤は0.1, 1及び10μg/discの用量とし、添加したペーパーディスク（FILTER PAPER φ8 mm , ADVANTEC）をラット背部皮下に埋め込んだ。8日後、ペーパーディスクを摘出し、ペーパーディスク周辺部の肉芽組織を採取し、その湿重量を測定した。【００８８】
結果を図２Ａ〜図２Ｆに示す。SR-1およびSR-3は、10μg/ディスク（250μg/ｍL x 40
μｌ/disc）の用量で最大の肉芽組織重量の増加を示した。この結果から、特に、SR-1およびSR-3は、in vivoの局所投与においても血管新生を促進し、肉芽組織形成に寄与するものと考えられる。【００８９】
９．切創治癒効果
次に、ラット切創モデルを用いて、SR-1〜5の５つのポリペプチドのin vivoにおける切創治癒効果を評価した。ラット切創モデルの作製および創耐張力の測定は、山浦哲明ら（応用薬理22，565〜579(1981)）に記載のとおり行った。【００９０】
すなわち、Crl:CD（SD）系ラット（雄、７週齢、日本チャールス・リバー株式会社より入手）の背部に安全剃刀で30〜36 mmの切創を作製し，等間隔に3ヵ所を縫合した。この外科処置を実施した日を1日目（day０）とした。縫合部位に，各濃度に調製した被験物質である各ペプチド（10, 100及び1000μg/mL）を50μL滴下（添加量として500 ng, 5及び50μg）した。50μLの生理食塩水を添加したものを陰性対象（Saline）とした。なお，各ペプチドは、創耐張力測定日まで1日1回滴下した。3日目（day 3）に抜糸し，6日目（day 6）に創耐張力を測定した。【００９１】
結果を図３Ａ〜図３Ｆに示す。SR-1、SR-3、SR-4およびSR-5は創耐張力の増大効果を示した。なお、bFGF製剤を投与した個体の切創治癒に比べて、本発明のポリペプチド、特にSR-1、SR-2、SR-3およびSR-4のいずれかを投与した個体では、bFGF製剤を投与した固体に比べて明らかに切創の跡がきれいに消失し、目視観察では瘢痕形成が殆ど認められなかった（データ示さず）。【００９２】
１０．SR-1のラット感染創モデルによる治癒効果
上記で切創治癒促進効果が認められたが、さらに、黄色ブドウ球菌に感染した創傷に対する治癒効果を評価した。ラット感染創モデルは、Stenberg BD他（J Surg Res. 1991 Jan;50(1):47-50.）およびHayward P 他（Am J Surg. 1992 Mar;163(3):288-93.）を参考に下記のとおり作製した。HWY/slc系ヘアレスラット（雄、7週齢、日本エスエルシー株式会社より入手）を用いた。全層欠損作製前日に白血球数の測定及びサイクロフォスファマイド（100 mg/kg）の尾静脈内投与を行い、その翌日に白血球数をカウントし、白血球数5000以下の個体のみを使用した。ラットの背部に1.73 x 1.73 cm（約3cm2）の正方形の全層欠損を作製し、欠損部に黄色ブドウ球菌（約105CFU/25μL）及び被験物質としてSR-1ペプチド 2 mg/mLを25μL滴下（投与量として50μg）した。なお、bFGF製剤（陽性対照）群は3μg/25μLを、陰性対象群は生理食塩水を25μL滴下した。被験物質投与後、創部を被覆剤（パーミロール, 日東メディカル）で被覆した（day 0）。その後、黄色ブドウ球菌及び被験物質を1日1回連続4日間（day 0, 1, 2, 3）滴下した。全層欠損作製日の6日目（day 6）に、まだ治癒していない創傷面積を測定し、創傷を与えた面積に対する割合を算出し、6日目創傷面積率とした。【００９３】
結果を下記表１０に示す。【００９４】
【表１０】
2010061915.tif 000014
【００９５】
表１０に示されるように、創傷に感染を誘発した群では、非感染群と比べて創傷治癒が遅延した。また、感染創傷にbFGF製剤を投与した場合に比べて、感染創傷にSR-1投与した群は、より速く創傷表皮が減少し、早く治癒することが分かった。bFGF製剤と同等またはそれ以上の有効性が認められた。以上のことから、感染を伴う創傷については、SR-1は、ｂFGF製剤に比べてより高い治癒効果を示すことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明のポリペプチドは、血管新生誘導剤、抗菌剤、皮膚創傷の予防、改善又は治療剤、及び皮膚創傷における細菌感染の予防、改善又は治療剤として有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００９７】
[配列番号1]  SR-1
[配列番号2]  SR-2。C末端のアルギニン残基がアミド化により修飾されている。
[配列番号3]  SR-3。C末端のアルギニン残基がアミド化により修飾されている。
[配列番号4]  SR-4。C末端のアルギニン残基がアミド化により修飾されている。
[配列番号5]  SR-5
[配列番号6]  SR-6。C末端のリジン残基がアミド化により修飾されている。
【図１】
2010061915.tif 000015
【図２Ａ】
2010061915.tif 000016
【図２Ｂ】
2010061915.tif 000017
【図２Ｃ】
2010061915.tif 000018
【図２Ｄ】
2010061915.tif 000019
【図２Ｅ】
2010061915.tif 000020
【図２Ｆ】
2010061915.tif 000021
【図３Ａ】
2010061915.tif 000022
【図３Ｂ】
2010061915.tif 000023
【図３Ｃ】
2010061915.tif 000024
【図３Ｄ】
2010061915.tif 000025
【図３Ｅ】
2010061915.tif 000026
【図３Ｆ】
2010061915.tif 000027
【配列表】
2010061915000001.app
【国際調査報告】
2010061915.tif 000028
2010061915.tif 000029
2010061915.tif 000030
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2010061915.tif 000032
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