(57)【要約】６５Ｂ１３はプルキンエ細胞を含むＧＡＢＡニューロン前駆細胞の分離に有用なマーカーであることを見出し、さらにＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎは、６５Ｂ１３陽性細胞集団の中から、プルキンエ前駆細胞を分離するのに有用なマーカーであることを新たに見出した。即ち、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎは６５Ｂ１３と組み合わせることで、プルキンエ前駆細胞の分離に有用なマーカーであることが見出された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含んでなる、プルキンエ前駆細胞を検出または選択する方法：
（Ａ）  以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質を検出する工程：
（ｖ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質
（Ｂ）  以下の（ｖ’）、（ｖｉ’）、（ｖｉｉ’）、および（ｖｉｉｉ’）から選択されるタンパク質を検出する工程：
（ｖ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質。
【請求項２】
以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡを発現させるプロモーターの制御下にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結させることによって該マーカータンパク質を検出する工程を含んでなる、プルキンエ前駆細胞を検出または選択する方法：
（Ａ）  以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質：
（ｖ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質
（Ｂ）  以下の（ｖ’）、（ｖｉ’）、（ｖｉｉ’）、および（ｖｉｉｉ’）から選択されるタンパク質：
（ｖ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質。
【請求項３】
認識するタンパク質を検出する工程が、下記工程を含んでなる、請求項１または２に記載の方法：
（ｄ）被験細胞試料と請求項１または２に記載されたタンパク質と結合する抗体とを接触させる工程； および
（ｅ）反応性の有無を検出する工程。
【請求項４】
検出する工程の後に、検出物からプルキンエ前駆細胞を分離する工程を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含んでなる、プルキンエ前駆細胞を検出または選択する方法：
（Ａ）  以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出する工程：
（ｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列でコードされるポリペプチドにおいて、１または複数個のアミノ酸残基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸残基の付加がなされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、プルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有し、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド
（Ｂ）  以下の（ｉ’）、（ｉｉ’）、（ｉｉｉ’）、および（ｉｖ’）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出する工程：
（ｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列でコードされるポリペプチドにおいて、１または複数個のアミノ酸残基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸残基の付加がなされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、プルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプルキンエ前駆細胞にポリヌクレオチド；および
（ｉｖ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有し、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド。
【請求項６】
ポリヌクレオチドの発現を検出する工程が、下記工程を含んでなる、請求項５に記載の方法：
（ａ）被験細胞試料と請求項５に記載されたポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドからなるプローブとを接触させる工程；および 
（ｂ）反応性の有無を検出する工程。
【請求項７】
工程（ａ）において、被験細胞試料から調製されたmRNAまたはそのmRNAから転写された相補的DNA（cDNA）を、プローブと接触させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項５に記載されたポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出する工程が、下記工程を含んでなる、請求項５に記載の方法：
（ａ−１）  被験細胞試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、請求項５に記載されたポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドからなるプライマーまたは請求項５で選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて遺伝子増幅法を実施する工程；および
（ｂ−１）  形成された増幅産物を検出する工程。
【請求項９】
工程（ａ−１）において、被験細胞試料から調製されたmRNAまたはそのmRNAから転写された相補的DNA（cDNA）を鋳型として用いる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、検出する工程の後に、検出物からプルキンエ前駆細胞を分離する工程を含んでなる、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
以下（Ａ）および（Ｂ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出または選択することが可能なプローブ、プライマーまたはプライマーセットを含んでなるプルキンエ前駆細胞を検出するためのキット：
（Ａ）
（ｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のアミノ酸残基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸残基の付加がなされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、プルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有し、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド
（Ｂ）
（ｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列でコードされるポリペプチドにおいて、１または複数個のアミノ酸残基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸残基の付加がなされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、プルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；および
（ｉｖ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有し、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド。
【請求項１２】
以下の（Ａ）および（Ｂ）に記載のタンパク質と結合する抗体を含んでなる、プルキンエ前駆細胞を検出または選択するためのキット：
（Ａ）  以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質：
（ｖ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質
（Ｂ）  以下の（ｖ’）、（ｖｉ’）、（ｖｉｉ’）、および（ｖｉｉｉ’）から選択されるタンパク質：
（ｖ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質。
【請求項１３】
以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるタンパクに翻訳されるｍＲＮＡを発現させるプロモーターの制御下にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結させたポリヌクレオチドを含む、プルキンエ前駆細胞を検出または選択するためのキット：
（Ａ）
（ｖ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質
（Ｂ）
（ｖ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質。
【請求項１４】
プルキンエ前駆細胞集団の製造方法であって、
（ＶＩＩ）プルキンエ前駆細胞を含み得る細胞集団を取得する工程；
（ＶＩＩＩ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を用いて、プルキンエ前駆細胞を検出する工程；および
（ＩＸ）工程（ＶＩＩＩ）で検出または選択された細胞を増殖する工程
を含んでなる、方法。
【請求項１５】
プルキンエ前駆細胞が、小脳変性症治療用のプルキンエ前駆細胞である請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
工程
（ＶＩＩ）プルキンエ前駆細胞を含み得る細胞集団を取得する工程；
（ＶＩＩＩ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を用いて、プルキンエ前駆細胞を検出または選択する工程；および
（ＩＸ）工程（ＶＩＩＩ）で検出された細胞を増殖する工程
で得られるプルキンエ前駆細胞集団。
【請求項１７】
以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセットを含んでなるプルキンエ前駆細胞を検出または選択するための試薬：
（Ａ）
（ｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のアミノ酸残基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸残基の付加がなされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、プルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有し、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド
（Ｂ）
（ｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列でコードされるポリペプチドにおいて、１または複数個のアミノ酸残基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸残基の付加がなされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、プルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；および
（ｉｖ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有し、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド。
【請求項１８】
以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるタンパク質と結合する抗体を含んでなる、プルキンエ前駆細胞を検出または選択するための試薬：
（Ａ）
（ｖ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質
（Ｂ）
（ｖ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質。
【請求項１９】
以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡを発現させるプロモーターの制御下にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結させたポリヌクレオチドを含む、プルキンエ前駆細胞を検出または選択するための試薬：
（Ａ）
（ｖ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質
（Ｂ）
（ｖ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質。
【請求項２０】
小脳変性症の再生医療に使用するためのプルキンエ前駆細胞を検出または選択するための以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のアミノ酸残基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸残基の付加がなされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、プルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有し、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド
（Ｂ）
（ｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列でコードされるポリペプチドにおいて、１または複数個のアミノ酸残基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸残基の付加がなされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、プルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；および
（ｉｖ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有し、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド。
【請求項２１】
以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるタンパク質と結合する、小脳変性症の再生医療に使用するためのプルキンエ前駆細胞を検出または選択するための抗体：
（Ａ）
（ｖ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質
（Ｂ）
（ｖ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プルキンエ前駆細胞マーカー遺伝子およびタンパクの提供、並びに、プルキンエ前駆細胞を識別するための該遺伝子および該タンパクの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳は非常に多様な神経細胞が複雑なネットワークを形成することで機能している。その破綻は各種神経疾患に繋がるが、治療法として移植再生治療が検討されつつある。この際まず大切なことは移植材料中の神経細胞の種類を正確に同定できることであり、また、安全性や治療効果の向上を考えれば、移植に必要な細胞種のみを分離できることが望ましい。【０００３】
小脳は、平衡、姿勢、随意運動の調節など、運動機能を円滑に遂行するために機能する。小脳腫瘍や慢性アルコール症による小脳虫部の変性、脊髄小脳変性症などにより、小脳機能が破綻すると、運動失調や平衡障害を示す。失われた神経細胞を補い、ネットワークが再構築されれば、機能回復が期待される。小脳には、プルキンエ細胞をはじめ、５種類ほどの神経細胞が存在し、それぞれが器官発生プログラムに従い正しくネットワークを形成することで、神経伝達を行っている。【０００４】
小脳のプルキンエ細胞の発生については研究が進められており、その起源についてはほぼ理解されている。しかし、この前駆細胞を識別するマーカーはほとんど同定されておらず、また、細胞表面マーカーは同定されていないので、生きたまま前駆細胞を分離する技術は開発されていない。【０００５】
Neph3（以下、「65B13」ということもある。）遺伝子は、分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞で一過性に発現することが知られている（特許文献１参照）ものの、プルキンエ細胞との関連性については報告されていない。また、Corl1遺伝子の発現、またはCorl2遺伝子の発現を指標とすることにより、それぞれ、脊髄の介在ニューロンの種類、またはプルキンエ細胞を識別可能であることが報告されている（特許文献２、３参照）。一方、ES細胞からプルキンエ細胞を誘導する方法に関しては知られているが実用に使用できるものではない（非特許文献１および非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO 2004/038018
【特許文献２】WO 2006/022243
【特許文献３】WO 2006/082826
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Su HL, Muguruma K, Matsuo-Takasaki M, Kengaku M, Watanabe K, Sasai Y.Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells.Dev Biol. 2006 Feb 15;290(2):287-96.
【非特許文献２】Salero E, Hatten ME.Differentiation of ES cells into cerebellar neurons.Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Feb 20;104(8):2997-3002.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上述の状況に鑑みてなされたものであり、プルキンエ前駆細胞を選択的に識別可能なマーカーの提供を課題とする。また、該マーカーを指標とするプルキンエ前駆細胞を識別するための方法、並びに、該方法に用いるための試薬の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、小脳において、GABAニューロン前駆細胞の選択的マーカー65B13を同定し、該遺伝子によってコードされるタンパク質と結合する抗体を用いて、GABAニューロン前駆細胞を分離することに成功した。即ち、65B13は、小脳のGABA産生ニューロン前駆細胞を分離するためのマーカーとして有用であることを見出した。【００１０】
GABA産生ニューロンの中で、小脳皮質から外部に神経シグナルを伝達する唯一のニューロンがプルキンエ細胞であり、その脱落が脊髄小脳変性症などの発症に関与している。65B13はプルキンエ細胞を含むGABAニューロン前駆細胞の分離に有用なマーカーである。しかし、プルキンエ前駆細胞をより高純度に分離するためには、65B13陽性細胞集団の中から、プルキンエ前駆細胞に選択的に発現するマーカーを用いてさらに分離する必要がある。【００１１】
本発明者は鋭意研究の結果、E-cadherin（E-カドヘリン）は、65B13陽性細胞集団の中から、プルキンエ前駆細胞を分離するのに有用なマーカーであることを新たに見出し、本発明を完成させた。【００１２】
即ち、E-cadherinは65B13と組み合わせることで、プルキンエ前駆細胞の分離に有用なマーカーであることが見出された。【００１３】
本発明は、プルキンエ前駆細胞を選択的に検出可能なマーカー、該マーカーを指標とするプルキンエ前駆細胞を検出するための方法、該方法により検出された細胞集団、並びに、該方法に用いるための試薬に関し、より具体的には、以下を提供する。
〔１〕  以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含んでなる、プルキンエ前駆細胞を検出または選択する方法：
（Ａ）  以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質を検出する工程：
（ｖ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質
（Ｂ）  以下の（ｖ’）、（ｖｉ’）、（ｖｉｉ’）、および（ｖｉｉｉ’）から選択されるタンパク質を検出する工程：
（ｖ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質。
〔２〕  以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡを発現させるプロモーターの制御下にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結させることによって該マーカータンパク質を検出する工程を含んでなる、プルキンエ前駆細胞を検出または選択する方法：
（Ａ）  以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質：
（ｖ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質
（Ｂ）  以下の（ｖ’）、（ｖｉ’）、（ｖｉｉ’）、および（ｖｉｉｉ’）から選択されるタンパク質：
（ｖ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質。
〔３〕  認識するタンパク質を検出する工程が、下記工程を含んでなる、〔１〕または〔２〕に記載の方法：
（ｄ）被験細胞試料と〔１〕または〔２〕に記載されたタンパク質と結合する抗体とを接触させる工程； および
（ｅ）反応性の有無を検出する工程。
〔４〕  検出する工程の後に、検出物からプルキンエ前駆細胞を分離する工程を含んでなる、〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５〕  以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含んでなる、プルキンエ前駆細胞を検出または選択する方法：
（Ａ）  以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出する工程：
（ｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列でコードされるポリペプチドにおいて、１または複数個のアミノ酸残基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸残基の付加がなされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、プルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有し、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド
（Ｂ）  以下の（ｉ’）、（ｉｉ’）、（ｉｉｉ’）、および（ｉｖ’）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出する工程：
（ｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列でコードされるポリペプチドにおいて、１または複数個のアミノ酸残基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸残基の付加がなされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、プルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプルキンエ前駆細胞にポリヌクレオチド；および
（ｉｖ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有し、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド。
〔６〕  ポリヌクレオチドの発現を検出する工程が、下記工程を含んでなる、〔５〕に記載の方法：
（ａ）被験細胞試料と〔５〕に記載されたポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドからなるプローブとを接触させる工程；および 
（ｂ）反応性の有無を検出する工程。
〔７〕  工程（ａ）において、被験細胞試料から調製されたmRNAまたはそのmRNAから転写された相補的DNA（cDNA）を、プローブと接触させる、〔６〕に記載の方法。
〔８〕  〔５〕に記載されたポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出する工程が、下記工程を含んでなる、〔５〕に記載の方法：
（ａ−１）  被験細胞試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、〔５〕に記載されたポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドからなるプライマーまたは〔５〕で選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて遺伝子増幅法を実施する工程；および
（ｂ−１）  形成された増幅産物を検出する工程。
〔９〕  工程（ａ−１）において、被験細胞試料から調製されたmRNAまたはそのmRNAから転写された相補的DNA（cDNA）を鋳型として用いる、〔８〕に記載の方法。
〔１０〕  さらに、検出する工程の後に、検出物からプルキンエ前駆細胞を分離する工程を含んでなる、〔５〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１１〕  以下（Ａ）および（Ｂ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出または選択することが可能なプローブ、プライマーまたはプライマーセットを含んでなるプルキンエ前駆細胞を検出するためのキット：
（Ａ）
（ｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のアミノ酸残基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸残基の付加がなされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、プルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有し、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド
（Ｂ）
（ｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列でコードされるポリペプチドにおいて、１または複数個のアミノ酸残基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸残基の付加がなされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、プルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；および
（ｉｖ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有し、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド。
〔１２〕  以下の（Ａ）および（Ｂ）に記載のタンパク質と結合する抗体を含んでなる、プルキンエ前駆細胞を検出または選択するためのキット：
（Ａ）  以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質：
（ｖ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質
（Ｂ）  以下の（ｖ’）、（ｖｉ’）、（ｖｉｉ’）、および（ｖｉｉｉ’）から選択されるタンパク質：
（ｖ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質。
〔１３〕  以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるタンパクに翻訳されるｍＲＮＡを発現させるプロモーターの制御下にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結させたポリヌクレオチドを含む、プルキンエ前駆細胞を検出または選択するためのキット：
（Ａ）
（ｖ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質
（Ｂ）
（ｖ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質。
〔１４〕  プルキンエ前駆細胞集団の製造方法であって、
（ＶＩＩ）プルキンエ前駆細胞を含み得る細胞集団を取得する工程；
（ＶＩＩＩ）〔１〕〜〔１０〕のいずれか一項に記載の方法を用いて、プルキンエ前駆細胞を検出する工程；および
（ＩＸ）工程（ＶＩＩＩ）で検出または選択された細胞を増殖する工程
を含んでなる、方法。
〔１５〕  プルキンエ前駆細胞が、小脳変性症治療用のプルキンエ前駆細胞である〔１４〕に記載の製造方法。
〔１６〕  工程
（ＶＩＩ）プルキンエ前駆細胞を含み得る細胞集団を取得する工程；
（ＶＩＩＩ）〔１〕〜〔１０〕のいずれか一項に記載の方法を用いて、プルキンエ前駆細胞を検出または選択する工程；および
（ＩＸ）工程（ＶＩＩＩ）で検出された細胞を増殖する工程
で得られるプルキンエ前駆細胞集団。
〔１７〕  以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセットを含んでなるプルキンエ前駆細胞を検出または選択するための試薬：
（Ａ）
（ｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のアミノ酸残基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸残基の付加がなされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、プルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有し、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド
（Ｂ）
（ｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列でコードされるポリペプチドにおいて、１または複数個のアミノ酸残基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸残基の付加がなされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、プルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；および
（ｉｖ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有し、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド。
〔１８〕  以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるタンパク質と結合する抗体を含んでなる、プルキンエ前駆細胞を検出または選択するための試薬：
（Ａ）
（ｖ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質
（Ｂ）
（ｖ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質。
〔１９〕  以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡを発現させるプロモーターの制御下にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結させたポリヌクレオチドを含む、プルキンエ前駆細胞を検出または選択するための試薬：
（Ａ）
（ｖ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質
（Ｂ）
（ｖ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質。
〔２０〕  小脳変性症の再生医療に使用するためのプルキンエ前駆細胞を検出または選択するための以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のアミノ酸残基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸残基の付加がなされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、プルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有し、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド
（Ｂ）
（ｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列でコードされるポリペプチドにおいて、１または複数個のアミノ酸残基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸残基の付加がなされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、プルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；および
（ｉｖ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有し、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド。
〔２１〕  以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるタンパク質と結合する、小脳変性症の再生医療に使用するためのプルキンエ前駆細胞を検出または選択するための抗体：
（Ａ）
（ｖ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質
（Ｂ）
（ｖ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質。【００１４】
さらに本発明は以下に関する。
〔２２〕小脳変性症を治療する方法であって、以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドによって検出または選択されたプルキンエ前駆細胞を移植する方法：
（Ａ）
（ｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のアミノ酸残基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸残基の付加がなされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、プルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有し、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド
（Ｂ）
（ｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列でコードされるポリペプチドにおいて、１または複数個のアミノ酸残基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸残基の付加がなされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、プルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；および
（ｉｖ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有し、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド。
〔２３〕  プルキンエ前駆細胞が、脊髄または小脳のプルキンエ前駆細胞である〔２２〕に記載のプルキンエ前駆細胞を移植する方法。
〔２４〕  ポリヌクレオチドが、前記（Ａ）および（Ｂ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、〔２２〕または〔２３〕に記載のプルキンエ前駆細胞を移植する方法。
〔２５〕  ポリヌクレオチドが、前記（Ａ）および（Ｂ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、〔２２〕または〔２３〕に記載のプルキンエ前駆細胞を移植する方法。
〔２６〕  小脳変性症を治療する方法であって、以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるタンパク質と結合する抗体によって検出または選択されたプルキンエ前駆細胞を移植する方法：
（Ａ）
（ｖ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質
（Ｂ）
（ｖ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質。
〔２７〕  プルキンエ前駆細胞が、脊髄または小脳のプルキンエ前駆細胞である〔２６〕記載のプルキンエ前駆細胞を移植する方法。
〔２８〕  抗体が、以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるタンパク質と結合する抗体である、〔２６〕または〔２７〕に記載のプルキンエ前駆細胞を移植する方法：
（Ａ）
（ｖ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質
（Ｂ）
（ｖ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質。
【発明の効果】
【００１５】
本発明では、プルキンエ前駆細胞選択的マーカー65B13およびE-cadherinを同定し、当該マーカー対する抗体を用いて、プルキンエ前駆細胞の分離に成功した。この技術は、プルキンエ前駆細胞を生きた状態のまま提供することが出来、また変性疾患などの移植治療のための材料調製や、特異的遺伝子の探索、プルキンエ細胞をターゲットにした創薬などに有用であると期待される。【００１６】
本発明のマーカーを利用した、プルキンエ前駆細胞の取得方法により、高純度のプルキンエ細胞が得られることから、例えば、脊髄小脳変性症に対する創薬や再生医療などに適用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、65B13遺伝子の胎児期マウス神経系における発現パターンを示す写真である。Ａ：E12.5 sagittal切片、Ｂ：E12.5小脳原基、Ｃ：E12.5脊髄、Ｄ：E10.5脊髄、Ｅ：E12.5脊髄、Ｆ：E14.5脊髄。CB：小脳原基、SC：脊髄。
【図２】図２は、胎児期小脳原基における65B13, Corl2, Pax2の発現の比較を示す写真である。ＡはE12.5、ＢはE14.5の時の発現解析結果を示す。Ｂの左の写真は65B13、右の写真はPax2の発現を示す。
【図３】図３は、胎児期マウス小脳原基から65B13陽性細胞を分離できることを示す図である。ＡはE12.5、ＢはE.14.5の時の小脳および分離した65B13陽性細胞に関する結果を示す。
【図４】図４は、E12.5（Ａ）およびE14.5（Ｂ）マウス小脳原基から分離した65B13陽性細胞が、それぞれGABA産生プルキンエ細胞およびGABA産生ゴルジ細胞に分化することを示す写真である。
【図５】図５は、GABA産生ニューロン前駆細胞を選択するために利用可能なDNA構築物の構造を模式的に表した図である。
【図６】図６は、65B13プロモーターにより外来遺伝子（Gsh1）をGABA産生ニューロン前駆細胞特異的に発現させられることを示す図である。
【図７】図７は、小脳原基、後脳（myelencephalon）および脊髄由来65B13陽性細胞における、65B13およびE-cadherinのmRNA発現をRT-PCR法により解析した結果を示した図である。CB：小脳原基、Mye：後脳、SC：脊髄。
【図８】図８は、E12.5およびE14.5のマウス小脳原基および後脳領域におけるE-cadherin, 65B13, Corl2および Pax2の発現の比較を示す写真である。CB：小脳原基、Mye：後脳、E-cad：E-cadherin。
【図９】図９は、E12.5マウス小脳原基、後脳および脊髄における65B13およびE-cadherinの細胞表面における発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。
【図１０】図１０は、E12.5マウス小脳原基から分離したE-cadherin/65B13共陽性細胞が、プルキンエ細胞に分化することを示す写真である。A、分離前のフローサイトメトリー解析像。P5集団を分離した。B、分離後の純度検定。C、分離した細胞を2日間培養した後の染色像。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
65B13遺伝子は、分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞で一過性に発現することが知られている（WO 2004/038018）ものの、GABAニューロンとの関連性については報告されていない。
本発明者らは、65B13遺伝子の発現を指標に、GABAニューロン前駆細胞を分離できることを見出した。さらに65B13陽性細胞の中から、プルキンエ前駆細胞に選択的に発現するマーカーであるE-cadherin遺伝子を見出すことに成功した。
即ち本発明は、プルキンエ前駆細胞を検出または選択するための方法を提供する。
【００１９】
本発明は、65B13タンパク質を検出する工程、およびE-cadherinタンパク質を検出する工程を含んでなるプルキンエ前駆細胞を検出または選択する方法を提供する。
65B13タンパク質を検出する工程およびE-cadherinタンパク質を検出する工程は、同時に行ってもよいし、いずれか一方の工程を行った後に他方の工程を行ってもよい。
【００２０】
本発明における65B13遺伝子の一例として、該遺伝子のオルタナティブアイソフォームである65B13-a及び65B13-bと名づけた２種の遺伝子が挙げられる。それぞれの塩基配列を配列番号：１および３に、該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を配列番号：２および４に示す。
【００２１】
65B13-aのコード領域は、配列番号：１の178番目のAから始まり、2278〜2280番目の終止コドンまで続き、700アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち178番目から228番目までの配列にコードされる17アミノ酸残基はシグナル配列、1717番目から1767番目までの配列にコードされる17アミノ酸残基は膜貫通領域であった。
【００２２】
それに対し、65B13-bのコード領域は、配列番号：２の127番目のAから始まり、2277〜2079番目の終止コドンまで続き、650アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち127番目から178番目までの配列にコードされる17アミノ酸残基はシグナル配列、1516番目から1566番目までの配列にコードされる17アミノ酸残基は膜貫通領域である。
【００２３】
また、配列番号：１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３及び３５で示される遺伝子も本発明における65B13遺伝子の一例として挙げることができる。それぞれの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６に示す。
【００２４】
それぞれのアミノ酸配列のコード領域は、配列番号：１９の場合、668番目のAから始まり、2768〜2770番目の終止コドンまで続き、700アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち668番目から724番目までの配列にコードされる19個のアミノ酸残基はシグナル配列、725番目から2206番目までの配列にコードされる494個のアミノ酸残基は細胞外領域である。
【００２５】
配列番号：２１の場合、130番目のAから始まり、2230〜2232番目の終止コドンまで続き、700アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち130番目から186番目までの配列にコードされる19個のアミノ酸残基はシグナル配列、187番目から1668番目までの配列にコードされる494個のアミノ酸残基は細胞外領域である。
【００２６】
配列番号：２３の場合、199番目のAから始まり、2098〜2100番目の終止コドンまで続き、633アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち199番目から258番目までの配列にコードされる20個のアミノ酸残基はシグナル配列、259番目から1728番目までの配列にコードされる490個のアミノ酸残基は細胞外領域である。
【００２７】
配列番号：２５の場合、199番目のAから始まり、2323〜2325番目の終止コドンまで続き、708アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち199番目から258番目までの配列にコードされる20個のアミノ酸残基はシグナル配列、259番目から1728番目までの配列にコードされる490個のアミノ酸残基は細胞外領域である。
【００２８】
配列番号：２７の場合、199番目のAから始まり、2323〜2325番目の終止コドンまで続き、708アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち199番目から258番目までの配列にコードされる20個のアミノ酸残基はシグナル配列、259番目から1728番目までの配列にコードされる490個のアミノ酸残基は細胞外領域である。
【００２９】
配列番号：２９の場合、15番目のAから始まり、1914〜1916番目の終止コドンまで続き、633アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち15番目から74番目までの配列にコードされる20個のアミノ酸残基はシグナル配列、75番目から1544番目までの配列にコードされる490個のアミノ酸残基は細胞外領域である。
【００３０】
配列番号：３１の場合、199番目のAから始まり、1948〜1950番目の終止コドンまで続き、583アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち199番目から258番目までの配列にコードされる20個のアミノ酸残基はシグナル配列、259番目から1578番目までの配列にコードされる440個のアミノ酸残基は細胞外領域である。
【００３１】
配列番号：３３の場合、15番目のAから始まり、1764〜1766番目の終止コドンまで続き、583アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち15番目から74番目までの配列にコードされる20個のアミノ酸残基はシグナル配列、75番目から1394番目までの配列にコードされる440個のアミノ酸残基は細胞外領域である。
【００３２】
配列番号：３５の場合、196番目のAから始まり、2260〜2262番目の終止コドンまで続き、688アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち196番目から255番目までの配列にコードされる20個のアミノ酸残基はシグナル配列、256番目から1665番目までの配列にコードされる470個のアミノ酸残基は細胞外領域である。
【００３３】
その他、アクセッション番号XM_994164、AL136654、XM_512603、XR_012248、XM_541684またはXM_583222で示される配列も本発明における65B13遺伝子の一例として含まれる。
【００３４】
配列番号：４６の場合、125番目のAから始まり、2771〜2773番目の終止コドンまで続き、883アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち125番目から190番目までの配列にコードされる22個のアミノ酸残基はシグナル配列、191番目から2248番目までの配列にコードされる686個のアミノ酸残基は細胞外領域である。
【００３５】
配列番号：４８の場合、128番目のAから始まり、2780〜2782番目の終止コドンまで続き、885アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち128番目から193番目までの配列にコードされる22個のアミノ酸残基はシグナル配列、194番目から2257番目までの配列にコードされる688個のアミノ酸残基は細胞外領域である。
【００３６】
配列番号：５０の場合、127番目のAから始まり、2785〜2787番目の終止コドンまで続き、887アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち127番目から192番目までの配列にコードされる22個のアミノ酸残基はシグナル配列、193番目から2262番目までの配列にコードされる690個のアミノ酸残基は細胞外領域である。
【００３７】
配列番号：５２の場合、192番目のAから始まり、2838〜2840番目の終止コドンまで続き、883アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち192番目から257番目までの配列にコードされる22個のアミノ酸残基はシグナル配列、258番目から1933番目までの配列にコードされる686個のアミノ酸残基は細胞外領域である。
【００３８】
本発明のプルキンエ前駆細胞を検出または選択する方法の好ましい態様としては、以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含んでなる方法が挙げられる；
（Ａ）以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質を検出する工程；
（ｖ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質
（Ｂ）以下の（ｖ’）、（ｖｉ’）、（ｖｉｉ’）、および（ｖｉｉｉ’）から選択されるタンパク質を検出する工程：
（ｖ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質
【００３９】
本発明における「タンパク質」は、通常、ポリペプチドと表現することも可能である。本発明の「ポリペプチド」は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるペプチド重合体である。本発明においては、65B13タンパク質、またはE-cadherinタンパク質を有するタンパク質を挙げることができる。好ましい例として、配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。
【００４０】
本発明のポリペプチドを構成するアミノ酸残基は天然に存在するものでも、また修飾されたものであっても良い。アミノ酸残基の修飾としては、アシル化、アセチル化、アミド化、アルギニル化、GPIアンカー形成、架橋、γ-カルボキシル化、環化、共有架橋の形成、グリコシル化、酸化、脂質または脂肪誘導体の共有結合化、シスチンの形成、ジスルフィド結合の形成、セレノイル化、脱メチル化、タンパク質の分解処理、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合化、ヒドロキシル化、ピログルタメートの形成、フラビンの共有結合化、プレニル化、ヘム部分の共有結合化、ホスファチジルイノシトールの共有結合化、ホルミル化、ミリストイル化、メチル化、ユビキチン化、ヨウ素化、ラセミ化、ADP-リボシル化、硫酸化、リン酸化等が例示される。
【００４１】
さらに、本発明のポリペプチドにはシグナルペプチド部分がついた前駆体、シグナルペプチド部分を欠く成熟タンパク質、及びその他のペプチド配列により修飾された融合タンパク質を含む。本発明のポリペプチドに付加するペプチド配列としては、インフルエンザ凝集素(HA)、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、サブスタンスP、多重ヒスチジンタグ(6×His、10×His等)、プロテインC断片、マルトース結合タンパク質(MBP)、免疫グロブリン定常領域、α-チューブリン断片、β-ガラクトシダーゼ、B-タグ、c-myc断片、E-タグ(モノクローナルファージ上のエピトープ)、FLAG(Hopp et al. (1988) Bio/Technol. 6: 1204-10)、lckタグ、p18 HIV断片、HSV-タグ(ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質)、SV40T抗原断片、T7-タグ(T7 gene10タンパク質)、VSV-GP断片(Vesicular stomatitisウイルス糖タンパク質)等のタンパク質の精製を容易にする配列(例えば、pcDNA3.1/Myc−His(Invitrogen)のようなベクターを利用できる)、組換え技術によりタンパク質を生産する際に安定性を付与する配列等を選択することができる。
【００４２】
1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異ポリペプチドで、元のポリペプチドと同じ生物学的活性が維持されることは公知である(Mark et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5662-6; Zoller and Smith (1982) Nucleic Acids Res. 10: 6487-500; Wang et al. (1984) Science 224: 1431-3; Dalbadie-McFarland et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6409-13)。変異ポリペプチドは、例えば、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個のアミノ酸の挿入、置換、または欠失、あるいはその一方または両末端への付加がなされたものであることができる。変異ポリペプチドは、好ましくは、そのアミノ酸配列において１または複数個（好ましくは１または数個、より好ましくは、１、２、または３個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。
【００４３】
ここで、アミノ酸の置換とは、配列中のアミノ酸残基の一つ以上が、異なる種類のアミノ酸残基に変えられた変異を意味する。このような置換により本発明のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を改変する場合、タンパク質の機能を保持することが必要な場合には、保存的な置換を行うことが好ましい。保存的な置換とは、置換前のアミノ酸と似た性質のアミノ酸をコードするように配列を変化させることである。
【００４４】
アミノ酸の性質は、例えば、非極性アミノ酸(Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val)、非荷電性アミノ酸(Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, His, Lys)、中性アミノ酸(Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val)、脂肪族アミノ酸(Ala, Gly)、分枝アミノ酸(Ile, Leu, Val)、ヒドロキシアミノ酸(Ser, Thr)、アミド型アミノ酸(Gln, Asn)、含硫アミノ酸(Cys, Met)、芳香族アミノ酸(His, Phe, Trp, Tyr)、複素環式アミノ酸(His, Trp)、イミノ酸(Pro, 4Hyp)等に分類することができる。中でも、Ala、Val、Leu及びIleの間、Ser及びThrの間、Asp及びGluの間、Asn及びGlnの間、Lys及びArgの間、Phe及びTyrの間の置換は、タンパク質の性質を保持する置換として好ましい。変異されるアミノ酸の数及び部位は特に制限されず、該ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸が65B13またはE-cadherinの抗原性を有していれば良い。
【００４５】
このような配列番号:２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列、もしくは配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press (1989))、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997);特にSection8.1-8.5)、Hashimoto-Goto et al. (1995) Gene 152: 271-5、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kramer and Fritz (1987) Method. Enzymol. 154: 350-67、Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。
【００４６】
また上記本発明のタンパク質には、配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６、もしくは配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列、もしくは配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質も含まれる。
【００４７】
なお、「配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列で表されるタンパク質と同等の機能」の好ましい機能としては、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現していることを意味する。また「配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列で表されるタンパク質と同等の機能」の好ましい機能としては、プルキンエ前駆細胞に選択的に発現していることを意味する。
【００４８】
本発明におけるハイブリダイゼーション条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」、「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer(Amersham Life Science)を用いた方法として、68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して1時間以上68℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分の洗浄を3回、1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分の洗浄を3回、最後に、1×SSC、0.1％SDS中、50℃で20分の洗浄を2回行うことも考えられる。その他、例えばExpresshyb Hybridization Solution (CLONTECH)中、55℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加し、37〜55℃で1時間以上インキュベートし、2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分の洗浄を3回、1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分の洗浄を1回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや2度目の洗浄の際の温度を上げることにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの温度を60℃、さらにストリンジェントな条件としては68℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、65B13のアイソフォーム、アレリック変異体、及び対応する他種生物由来の遺伝子を得るための条件を設定することができる。
【００４９】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press (1989);特にSection9.47-9.58) 、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997);特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995);条件については特にSection2.10)等を参照することができる。ハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６、もしくは配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも50％以上、好ましくは70％、さらに好ましくは80％、より一層好ましくは90％(例えば、95％以上、98％以上、さらには99％)の同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。このような同一性は、BLASTアルゴリズム(Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいたプログラムとして、アミノ酸配列についての同一性を決定するプログラムとしてはBLASTX、ヌクレオチド配列についてはBLASTN(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)等が開発されており、本発明の配列に対して使用することができる。具体的な解析方法については、例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov.等を参照することができる。
【００５０】
その他本発明においては、以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質に翻訳されるmRNAを発現させるプロモーター（修飾されたプロモーターを含む）を利用してプルキンエ前駆細胞を検出または選択することもできる(例えば、特開2002-51775号公報参照)；
（Ａ）前記（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質、
（Ｂ）前記（ｖ’）、（ｖｉ’）、（ｖｉｉ’）、および（ｖｉｉｉ’）から選択されるタンパク質。
【００５１】
例えば、発現領域解析により得られたプロモーター部分に対し、GFP等の検出可能なマーカーをコードする遺伝子を連結した構築物を含むベクターを細胞に対してトランスフェクションすることができる。また該構築物は、発現制御配列（プロモーター、エンハンサー等を含む）の制御下に、遺伝子がマーカー遺伝子の上流もしくは下流に連結された構造を有していてもよい。その他、遺伝子座へマーカーをコードする遺伝子をノックインすることができる。65B13を用いた場合の該構築物の好ましい態様として、例えば、図５において2〜4に模式的に記載された構造の構築物を挙げることができる。E-cadherinについても同様の構築物を挙げることができる。（Ａ）によってプルキンエ細胞を含むGABA産生ニューロン前駆細胞特異的にマーカー遺伝子の発現が検出され、（Ｂ）によってプルキンエ前駆細胞特異的にマーカー遺伝子の発現が検出されることとなり、両者を組み合わせることによりプルキンエ前駆細胞特異的な細胞の選択が可能となる。
【００５２】
認識するタンパク質を検出する工程は、具体的には、以下の工程が挙げられる。
（ｄ）被験細胞試料と上記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質と結合する抗体とを接触させる工程
（ｅ）反応性の有無を検出する工程
【００５３】
本発明の（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質と結合する抗体とプルキンエ前駆細胞を含むことが予測される細胞試料とを接触させ、反応性の有無を検出することで本発明のタンパク質を検出することができる。細胞との接触前に、抗体を適当な担体に固定化して用いることも可能である。または、細胞と抗体とを接触させ、結合させた後、抗体のアフィニティーによる精製を行うことで、該抗体と結合した細胞を選択的に回収することもできる。例えば、本発明の抗体がビオチンと結合されている場合には、アビジンやストレプトアビジンを結合したプレートやカラムに対して添加することにより精製を行うことができる。
【００５４】
前記検出する工程の後に、検出物からプルキンエ前駆細胞を分離する工程が含まれていてもよい。本発明におけるプルキンエ前駆細胞の分離は、後述の65B13に結合する抗体（抗65B13抗体）およびE-cadherinに結合する抗体（抗E-cadherin抗体）を用いたフローサイトメトリーにより効率的に行なうことができる。
【００５５】
ここで使用する細胞試料は好ましくは、in vitroで分化誘導されたプルキンエ細胞を含む培養細胞である。in vitroにおけるプルキンエ細胞の分化誘導は、公知のES細胞、iPS細胞、脱分化細胞等を出発材料として、行うことができる。通常、プルキンエ細胞は、脳のプルキンエ細胞領域から得た組織を神経組織由来の支持細胞層と共培養することにより分化させることができる。本発明のプルキンエ前駆細胞の選択に用いる細胞試料は、如何なる方法により分離または培養された細胞群であってもよい。
【００５６】
また本発明は、以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含んでなる、プルキンエ前駆細胞を検出または選択する方法に関する；
（Ａ）65B13タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を検出する工程、
（Ｂ）E-cadherinタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を検出する工程。
【００５７】
上記工程（Ａ）におけるポリヌクレオチドの好ましい態様としては、以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができる、プルキンエ前駆細胞を検出または選択するためのポリヌクレオチドが挙げられる。
（ｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列でコードされるポリペプチドにおいて、１または複数個のアミノ酸残基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸残基の付加がなされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、プルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有し、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド
【００５８】
上記工程（Ｂ）におけるポリヌクレオチドの好ましい態様としては、以下の（ｉ’）、（ｉｉ’）、（ｉｉｉ’）、および（ｉｖ’）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができる、プルキンエ前駆細胞を検出または選択するためのポリヌクレオチドが挙げられる。
（ｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列でコードされるポリペプチドにおいて、１または複数個のアミノ酸残基の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸残基の付加がなされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、プルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド；および
（ｉｖ’）配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、または配列番号：５２の192番目から2849番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有し、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているポリヌクレオチド。
【００５９】
本発明においては、上記（Ａ）および（Ｂ）に記載のポリヌクレオチドを、「本発明のポリヌクレオチド」と記載する場合がある。
【００６０】
本発明において「ポリヌクレオチド」とは、複数のデオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）等の塩基または塩基対からなる重合体を指し、DNA、cDNA、ゲノムDNA、化学合成DNA及びRNAを含む。また、天然以外の塩基、例えば、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン、2’-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、2’-O-メチルプソイドウリジン、β-D-ガラクトシルキュェオシン、2’-O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、β-D-マンノシルキュェオシン、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メトキシウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、N-((9-β-D-リボフラノシル-2-メチルチオプリン-6-イル)カルバモイル)トレオニン、N-((9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル)N-メチルカルバモイル)トレオニン、ウリジン-5-オキシ酢酸-メチルエステル、ウリジン-5オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、キュェオシン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、N-((9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル)カルバモイル)トレオニン、2’-O-メチル-5-メチルウリジン、2’-O-メチルウリジン、ワイブトシン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン等を必要に応じて含むポリヌクレオチドも包含する。
【００６１】
本発明のポリヌクレオチドは、65B13およびE-cadherinの公知の配列情報に基づいて化学合成により製造することができる。また、65B13遺伝子およびE-cadherin遺伝子を発現する細胞よりハイブリダイゼーション法、PCR法等を利用して調製することも可能である。
【００６２】
また本発明のポリヌクレオチドには、
配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、
配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、
配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、
配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、
配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、
配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、
配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、
配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、
配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、
配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは
配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列
からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能（好ましい機能としては、プルキンエ前駆細胞に発現していることをいう。）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれる。該ポリペプチドには、65B13のアイソフォーム、アルタナティブアイソフォーム、アレリック変異体も含まれる。
【００６３】
このようなポリヌクレオチドは、
配列番号：１の1番目から2876番目で表される塩基配列、
配列番号：３の1番目から2243番目で表される塩基配列、
配列番号：１９の1番目から3123番目で表される塩基配列、
配列番号：２１の1番目から3247番目で表される塩基配列、
配列番号：２３の1番目から2153番目で表される塩基配列、
配列番号：２５の1番目から2979番目で表される塩基配列、
配列番号：２７の1番目から2973番目で表される塩基配列、
配列番号：２９の1番目から1969番目で表される塩基配列、
配列番号：３１の1番目から2003番目で表される塩基配列、
配列番号：３３の1番目から1819番目で表される塩基配列、若しくは
配列番号：３５の1番目から2959番目で表される塩基配列、
好ましくは、
配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、
配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、
配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、
配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、
配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、
配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、
配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、
配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、
配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、
配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは
配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列、
からなるポリヌクレオチドをプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、サル、イヌ等の動物のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。cDNAライブラリーの作成方法については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press (1989))を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。
【００６４】
また本発明のポリヌクレオチドには、
配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、
配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、
配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、若しくは
配列番号：５２の192番目から2840番目で表される塩基配列、
からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能（好ましい機能としては、プルキンエ前駆細胞に発現していることをいう。）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれる。該ポリペプチドには、E-cadherinのアイソフォーム、アルタナティブアイソフォーム、アレリック変異体も含まれる。
【００６５】
このようなポリヌクレオチドは、
配列番号：４６の1番目から4828番目で表される塩基配列、
配列番号：４８の1番目から4413番目で表される塩基配列、
配列番号：５０の1番目から4396番目で表される塩基配列、若しくは
配列番号：５２の1番目から4877番目で表される塩基配列、
好ましくは、
配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、
配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、
配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、若しくは
配列番号：５２の192番目から2840番目で表される塩基配列、
からなるからなるポリヌクレオチドをプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、サル、イヌ等の動物のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。cDNAライブラリーの作成方法については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press (1989))を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。
【００６６】
上記の「同等の機能」とは、対象となるタンパク質が、65B13タンパク質（例えば、配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列）またはE-cadherinタンパク質（例えば配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列）と同等の生物学的特性を有していることを意味する。65B13タンパク質（例えば、配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列）が持つ生物学的特性としては、例えば、嗅覚神経回路パターン等が挙げられる。さらに、プルキンエ前駆細胞前駆細胞に選択的に発現していることも機能（生物学的特性）といえる。E-cadherinタンパク質（例えば配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列）が持つ生物学的特性（機能）としては、例えばプルキンエ前駆細胞に選択的に発現していることが挙げられる。
【００６７】
従って、対象となるタンパク質が本発明者らにより同定された65B13タンパク質（配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列）と同等の生物学的特性を有しているか否かの判定は、当業者においては例えば、嗅覚神経回路パターンまたはプルキンエ前駆細胞に選択的に発現していることを測定することにより行うことができる。
【００６８】
また、対象となるタンパク質がE-cadherinタンパク質（配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列）と同等の生物学的特性を有しているか否かの判定は、当業者においては例えばプルキンエ前駆細胞に選択的に発現していることを測定することにより行うことができる。
【００６９】
より具体的に、cDNAライブラリーの作製においては、まず、本発明のポリヌクレオチドを発現する細胞、臓器、組織等からグアニジン超遠心法(Chirwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-9)、AGPC法(Chomczynski and Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162: 156-9)等の公知の手法により全RNAを調製し、mRNA Purification Kit(Pharmacia)等を用いてmRNAを精製する。QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia)のような、直接mRNAを調製するためのキットを利用してもよい。次に得られたmRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化学工業)のようなcDNA合成のためのキットも市販されている。その他の方法として、cDNAはPCRを利用した5’-RACE法(Frohman et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002; Belyavsky et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 2919-32)により合成、及び増幅させてもよい。また、全長率の高いcDNAライブラリーを作製するために、オリゴキャップ法(Maruyama and Sugano (1994) Gene 138: 171-4; Suzuki (1997) Gene 200: 149-56)等の公知の手法を採用することもできる。上述のようにして得られたcDNAは、適当なベクター中に組み込む。
【００７０】
本発明におけるハイブリダイゼーション条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」、「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer(Amersham Life Science)を用いた方法として、68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して1時間以上68℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分の洗浄を3回、1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分の洗浄を3回、最後に、1×SSC、0.1％SDS中、50℃で20分の洗浄を2回行うことも考えられる。その他、例えばExpresshyb Hybridization Solution (CLONTECH)中、55℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加し、37〜55℃で1時間以上インキュベートし、2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分の洗浄を3回、1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分の洗浄を1回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや2度目の洗浄の際の温度を上げることにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの温度を60℃、さらにストリンジェントな条件としては68℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、本発明の65B13およびE-cadherinのアイソフォーム、アレリック変異体、及び対応する他種生物由来の遺伝子を得るための条件を設定することができる。
【００７１】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press (1989);特にSection9.47-9.58) 、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997);特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995);条件については特にSection2.10)等を参照することができる。
【００７２】
ハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、
配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、
配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、
配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、
配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、
配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、
配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、
配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、
配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、
配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、
配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは
配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列、
からなるポリヌクレオチド、
あるいは
配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、
配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、
配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、若しくは
配列番号：５２の192番目から2840番目で表される塩基配列、
からなるポリヌクレオチド
に対して少なくとも50％以上、好ましくは70％、さらに好ましくは80％、より一層好ましくは90％(例えば、95％以上、さらには99％)の同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００７３】
このような同一性は、BLASTアルゴリズム(Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいたプログラムとして、アミノ酸配列についての同一性を決定するプログラムとしてはBLASTX、ヌクレオチド配列についてはBLASTN(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)等が開発されており、本発明の配列に対して使用することができる。具体的な解析方法については、例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov.等を参照することができる。
【００７４】
その他、遺伝子増幅技術(PCR)(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Section 6.1-6.4)により、65B13またはE-cadherinのアイソフォームやアレリック変異体等、65B13またはE-cadherinと類似した構造及び機能を有する遺伝子を、
配列番号：１の178番目から2280番目で表される塩基配列、
配列番号：３の127番目から2079番目で表される塩基配列、
配列番号：１９の668番目から2770番目で表される塩基配列、
配列番号：２１の130番目から2232番目で表される塩基配列、
配列番号：２３の199番目から2100番目で表される塩基配列、
配列番号：２５の199番目から2325番目で表される塩基配列、
配列番号：２７の15番目から2325番目で表される塩基配列、
配列番号：２９の15番目から1916番目で表される塩基配列、
配列番号：３１の199番目から1950番目で表される塩基配列、
配列番号：３３の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは
配列番号：３５の196番目から2262番目で表される塩基配列、
からなるポリヌクレオチド、
あるいは
配列番号：４６の125番目から2773番目で表される塩基配列、
配列番号：４８の128番目から2782番目で表される塩基配列、
配列番号：５０の127番目から2787番目で表される塩基配列、若しくは
配列番号：５２の192番目から2840番目で表される塩基配列、
からなるポリヌクレオチド
を基にプライマーを設計し、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、サル、イヌ等の動物のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。
【００７５】
本発明のポリヌクレオチドの塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法(Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463)等により行うことができる。また、適当なDNAシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
【００７６】
即ち本発明の方法の好ましい態様としては、、以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含んでなる、プルキンエ前駆細胞を検出または選択する方法である；
（Ａ）  前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出する工程：
（Ｂ）E-cadherinタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を検出する工程。
【００７７】
本発明における「プルキンエ前駆細胞」としては、好ましくは小脳のプルキンエ前駆細胞を挙げることができるが、これに制限されない。
【００７８】
本発明のポリヌクレオチドは、プルキンエ前駆細胞を検出または選択ができれば、その鎖長は特に制限されず、所謂「オリゴヌクレオチド」も本発明のポリヌクレオチドに含まれる。一般的に本発明のポリヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであり、好ましくは連続する少なくとも15塩基長の長さを有するポリヌクレオチドである。
【００７９】
本発明の上記方法において、「ポリヌクレオチドの発現を検出する工程」は、具体的には下記工程を含むことが好ましい。
（ａ）被験細胞試料と、前記本発明の方法で選択されるポリヌクレオチド、その相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドからなるプローブとを接触させる工程；および
（ｂ）反応性の有無を検出する工程
【００８０】
また、本方法の好ましい態様においてはまず、被験細胞試料と、本発明のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドからなるプローブとを接触させる。例えば、被験細胞試料から調製されたmRNAまたはmRNAから転写された相補的DNA（cDNA）を、プローブと接触させることができる。
【００８１】
本方法においては次いで、反応性の有無を検出する。ここで反応性が有るとは、通常、接触させたポリヌクレオチドが対象となる配列とハイブリダイズした（反応した）状態をいう。
【００８２】
本発明の上記方法における工程には、例えば以下の工程が含まれていてもよい。
（ａ−１）被験細胞試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、本発明のポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドからなるプライマーまたは本発明で選択されたポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて遺伝子増幅法を実施する工程；および
（ｂ−１）形成された増幅産物を検出する工程
【００８３】
上記工程における「遺伝子増幅法」としては公知の方法を用いることができるが、例えば、PCR法等を用いることができる。さらに該増幅法により形成された増幅産物の検出も、公知の方法を用いて行うことができる。
【００８４】
また、前記工程（ａ−１）は、例えば、被験細胞試料から調製されたmRNAまたはそのmRNAから転写された相補的DNA（cDNA）を鋳型として用いてもよい。
【００８５】
前記検出する工程の後に、検出物からプルキンエ前駆細胞を分離する工程が含まれていてもよい。
【００８６】
本発明の65B13遺伝子によってコードされるタンパク質は、膜タンパク質であることから、該タンパク質を指標とすることにより、GABA産生ニューロン前駆細胞を生きたまま単離（分離）することが可能である。
【００８７】
またE-cadherin遺伝子によってコードされるタンパク質は膜タンパク質であることから、該タンパク質を指標とすることにより、プルキンエ前駆細胞を生きたまま単離（分離）することが可能である。
【００８８】
さらに本発明の方法は、上述の工程に加えて、Lim1/2遺伝子Corl2遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現を指標として、プルキンエ前駆細胞を検出または選択する工程を含むものであってもよい。
【００８９】
さらに本発明は、本発明のプルキンエ前駆細胞を検出または選択するための上述の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるポリヌクレオチドに相補的な、連続する少なくとも15塩基からなるヌクレオチド鎖も提供する。このような少なくとも連続した15塩基を含む塩基配列からなるポリヌクレオチドは、プルキンエ前駆細胞の発現を検出するためのプローブ、またはプルキンエ前駆細胞を検出するためのプライマーとして有用である。
【００９０】
通常、プローブとして使用する場合には15〜100、好ましくは15〜35個の塩基より構成されていることが望ましく、またポリヌクレオチドは、適宜、放射性同位体または非放射性化合物などで標識して用いられる。プライマーとして使用する場合には、少なくとも15、好ましくは30個の塩基より構成されていることが望ましい。プライマーの場合には、3’末端側の領域を標的とする配列に対して相補的な配列に、5’末端側には制限酵素認識配列、タグ等を付加した形態に設計することができる。本発明のヌクレオチド鎖は、本発明のポリヌクレオチドに対してハイブリダイズすることができる。さらに、これらのプローブまたはプライマーを用いて、細胞内における本発明のポリヌクレオチドの変異を検出することができる。このような変異は、場合により本発明のポリペプチドの活性、または発現の異常を引き起こすものであることから、疾病の診断等に有用と考えられる。
【００９１】
ここで「相補的な配列」とは、ヌクレオチド配列中の少なくとも15個の連続した塩基が鋳型に対して完全に対になっている場合のみならず、そのうちの少なくとも70％、好ましくは80％、より好ましくは90％、さらに好ましくは95％以上(例えば、97％または99％)が対になっているものも含む。対になっているとは、鋳型となるポリヌクレオチドの塩基配列中のAに対しT(RNAの場合はU)、TまたはUに対しA、Cに対しG、そしてGに対しCが対応して鎖が形成されていることを意味する。そして相同性は、上述のハイブリダイズするポリヌクレオチドの場合と同様の方法で決定することができる。
【００９２】
また本発明は、二種以上の本発明のプルキンエ前駆細胞を検出または選択するための上述の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるポリヌクレオチドからなるプライマーセットを提供する。
【００９３】
また本発明は、プルキンエ前駆細胞を検出または選択するためのキットを提供する。本発明のキットには、例えば、上述の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出することが可能なプローブ、プライマーまたはプライマーセットを含めることができる。さらに、緩衝液等を適宜含めることができる。また、キットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくことも可能である。
【００９４】
本発明のプルキンエ前駆細胞を検出または選択するためのキットの他の態様としては、以下の（Ａ）および（Ｂ）に記載のタンパク質と結合する抗体を含むキットが挙げられる；
（Ａ）上記（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質、
（Ｂ）上記（ｖ’）、（ｖｉ’）、（ｖｉｉ’）、および（ｖｉｉｉ’）から選択されるタンパク質。
【００９５】
また本発明のキットの他の態様としては、以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるタンパク質に翻訳されるmRNAを発現させるプロモーターの制御下にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むキットが挙げられる；
（Ａ）上記（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質、
（Ｂ）上記（ｖ’）、（ｖｉ’）、（ｖｉｉ’）、および（ｖｉｉｉ’）から選択されるタンパク質。
【００９６】
本発明のキットには、さらにLim1/2およびCorl2遺伝子からなる群より選択される１または複数の遺伝子の転写産物にハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれていてもよい。
【００９７】
該キットにはさらに、Lim1/2およびCorl2遺伝子からなる群より選択される１または複数の遺伝子でコードされるタンパク質に結合する抗体との組合せが含まれていてもよい。
【００９８】
本発明のキットには、さらに陽性対照としてプルキンエ前駆細胞が含まれていてもよい。
【００９９】
また本発明はプルキンエ前駆細胞集団の製造方法を提供する。該方法としては、例えば、
（ＶＩＩ）プルキンエ前駆細胞を含み得る細胞集団を取得する工程；
（ＶＩＩＩ）本発明のプルキンエ前駆細胞を検出または選択する方法を用いて、プルキンエ前駆細胞を検出する工程；および
（ＩＸ）工程（ＶＩＩＩ）で検出または選択された細胞を増殖する工程
を含んでなる、方法が挙げられる。
【０１００】
前記製造方法によって得られるプルキンエ前駆細胞は、例えば、小脳変性治療のためのプルキンエ前駆細胞である。
【０１０１】
また前記製造方法によって得られるプルキンエ前駆細胞もまた、本発明に含まれる。本発明の上記方法によって製造される細胞は、好ましくは、生きた細胞であるという特徴を有する。
【０１０２】
本発明によって獲得された細胞は、プルキンエ前駆細胞であることから、雑多な細胞集団または外来遺伝子を導入して生成されるプルキンエ前駆細胞と比べて、安全性、生存率、ネットワーク形成能の面で変性疾患の移植治療等に好ましいものである。さらに、本方法により得られた本発明の細胞(群)は、前駆細胞であることから、in vitroにおいて培地等の条件を選択することにより適当な段階まで分化させることも可能であり、種々の神経移植治療の材料としても好ましいものである。本発明の方法により得られたプルキンエ前駆細胞の移植では、1×103〜1×106個、さらに好ましくは5〜6×104個のプルキンエ細胞を移植する。第１の方法としては、細胞の懸濁液を脳に移植する定位脳固定術(stereotaxic surgery)が挙げられる。また、ミクロ手術(microsurgery) により細胞を移植しても良い。プルキンエ組織の移植方法については、Backlund等(Backlund et al. (1985) J. Neurosurg. 62: 169-73)、Lindvall等(Lindvall et al. (1987) Ann. Neurol. 22: 457-68)、Madrazo等(Madrazo et al. (1987) New Engl. J. Med. 316: 831-4)の方法を参照することができる。
【０１０３】
さらに、本発明の細胞は、プルキンエ前駆細胞特異的遺伝子及び前駆細胞からプルキンエ細胞への各成熟段階に特異的な遺伝子の単離、変性疾患治療のターゲット探索、プルキンエ細胞の成熟過程の解明、並びに成熟を指標としたスクリーニング等にも利用することができる。
【０１０４】
また本発明は、プルキンエ前駆細胞を検出または選択するための試薬を提供する。
【０１０５】
本発明の試薬の一態様としては、例えば、前記（Ａ）および（Ｂ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセットを含んでなるプルキンエ前駆細胞を検出または選択するための試薬が挙げられる。
【０１０６】
さらに本発明のプルキンエ前駆細胞を検出または選択するための試薬の他の態様として、例えば以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるタンパク質と結合する抗体を含んでなる、プルキンエ前駆細胞を検出または選択するための試薬が挙げられる；
（Ａ）前記（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質、
（Ｂ）前記（ｖ’）、（ｖｉ’）、（ｖｉｉ’）、および（ｖｉｉｉ’）から選択されるタンパク質。
【０１０７】
さらに本発明のプルキンエ細胞前駆細胞を検出または選択するための試薬の他の態様として、例えば以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるタンパク質に翻訳されるmRNAを発現させるプロモーターの制御下にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結させるポリヌクレオチドを含む、プルキンエ前駆細胞を検出または選択するための試薬が挙げられる；
（Ａ）前記（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質、
（Ｂ）前記（ｖ’）、（ｖｉ’）、（ｖｉｉ’）、および（ｖｉｉｉ’）から選択されるタンパク質。
【０１０８】
本発明において「細胞の種類を識別する」とは、対象となる細胞が特定の種類の細胞であると識別する場合のみならず、対象となる細胞が特定の種類の細胞ではないと識別する場合も含まれる。例えば、対象となる小脳細胞において65B13遺伝子およびE-cadherin遺伝子が実質的に発現していれば、該小脳細胞は「プルキンエ前駆細胞の可能性がある」と識別することができる。
【０１０９】
また本発明は、小脳細胞を検出または選択するための試薬を提供する。当該試薬には、前記プルキンエ前駆細胞を検出または選択するための試薬に、さらに他の公知のマーカーを適宜組み合わせて用いることができ、これにより、詳細に細胞の種類の識別を行うことが可能となる。
【０１１０】
従って、本発明の好ましい態様においては、上記プルキンエ前駆細胞を検出または選択するための試薬にLim1/2およびCorl2遺伝子からなる群より選択される１または複数の遺伝子の転写産物にハイブリダイズするポリヌクレオチドとの組合せを含む、小脳細胞を検出または選択するための試薬を提供する。
【０１１１】
これら上記のマーカー遺伝子の配列は以下に示すように公知である。
マウスLim1の塩基配列を配列番号：５、アミノ酸配列を配列番号：６に、ヒトLim1の塩基配列を配列番号：７、アミノ酸配列を配列番号：８に示す。
【０１１２】
マウスLim2の塩基配列を配列番号：９、アミノ酸配列を配列番号：１０に、ヒトLim2の塩基配列を配列番号：１１、アミノ酸配列を配列番号：１２に、ラットLim2の塩基配列を配列番号：１３、アミノ酸配列を配列番号：１４に示す。
【０１１３】
マウスCorl2の塩基配列を配列番号：１５に、アミノ酸配列を配列番号：１６に、ヒトCorl2の塩基配列を配列番号：１７、アミノ酸配列を配列番号：１８に示す。
【０１１４】
前記プルキンエ前駆細胞を検出または選択するための試薬には、さらにLim1/2およびCorl2遺伝子からなる群より選択される１または複数の遺伝子でコードされるタンパク質に結合する抗体との組合せが含まれていてもよい。
前記試薬による識別可能な細胞は、小脳細胞の場合はプルキンエ細胞である。
【０１１５】
また前記試薬には、さらに小脳細胞を含めることができる。
【０１１６】
また本発明は、小脳変性症の再生医療に使用するためのプルキンエ前駆細胞を検出または選択するためのポリヌクレオチドを提供する。
【０１１７】
本発明の好ましい態様としては、以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドである；
（Ａ）前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチド、
（Ｂ）前記（ｉ’）、（ｉｉ’）、（ｉｉｉ’）、および（ｉｖ’）から選択されるポリヌクレオチド。
【０１１８】
本発明はまた、小脳変性症の再生医療に使用するための65B13遺伝子およびE-cadherin遺伝子の翻訳産物と結合する抗体を提供する。本発明の抗体の好ましい態様としては、例えば、以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるタンパク質と結合する、小脳変性症の再生医療に使用するためのプルキンエ前駆細胞を検出または選択するための抗体である。
（Ａ）
（ｖ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４または３６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質
（Ｂ）
（ｖ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、プルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：４７、４９、５１、または５３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつプルキンエ前駆細胞に発現しているタンパク質
【０１１９】
また、本発明の抗体の好ましい態様は、以下の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるポリペプチドと結合する抗体である。
（Ａ）GABA産生ニューロン前駆細胞の細胞外領域のポリペプチド
（Ｂ）プルキンエ前駆細胞の細胞外領域のポリペプチド
【０１２０】
本発明に用いるポリペプチドの細胞外領域はプログラムPSORT（http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/）等を用いて調べることができる。具体的には、当該プログラムPSORTを用いた65B13タンパク質をコードするポリペプチドの細胞外領域は、配列番号：２、４、２４、２６、２８若しくは３０で表されるアミノ酸配列の２１番目〜５１０番目、配列番号：２０若しくは２２で表されるアミノ酸配列の２０番目〜５１３番目、配列番号：３２若しくは３４で表されるアミノ酸配列の２１番目〜４６０番目、または配列番号：３６で表されるアミノ酸配列の２１番目〜４９０番目のアミノ酸配列である。また、E-カドヘリンタンパク質をコードするポリペプチドの細胞外領域は、配列番号：４７で表されるアミノ酸配列の２３番目〜７０８番目、配列番号：４９で表されるアミノ酸配列の２３番目〜７１０番目、配列番号：５１で表されるアミノ酸配列の２３番目〜７１２番目、または配列番号：５３で表されるアミノ酸配列の２３番目〜７０８番目のアミノ酸配列である。
【０１２１】
また本発明の抗体にはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体(scFV)(Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83; The Pharmacology of Monoclonal Antibody, vol.113, Rosenburg and Moore ed., Springer Verlag (1994) pp.269-315)、ヒト化抗体、多特異性抗体(LeDoussal et al. (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7: 58-62; Paulus (1985) Behring Inst. Mitt. 78: 118-32; Millstein and Cuello (1983) Nature 305: 537-9; Zimmermann (1986) Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 105: 176-260; Van Dijk et al. (1989) Int. J. Cancer 43: 944-9)、並びに、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc、Fv等の抗体断片が含まれる。さらに、本発明の抗体は必要に応じ、PEG等により修飾されていてもよい。その他、本発明の抗体は、β-ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、GST、緑色蛍光タンパク質(GFP)等との融合タンパク質として製造され得、二次抗体を用いずに検出できるようにしてもよい。また、ビオチン等により抗体を標識することによりアビジン、ストレプトアビジン等を用いて抗体の回収を行い得るように改変されていてもよい。
【０１２２】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチド若しくはその断片、またはそれらを発現する細胞を感作抗原として製造することができる。また、本発明のポリペプチド若しくはその断片のうち短いものは、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、卵白アルブミン等のキャリアに結合して免疫原として用いてもよい。また、本発明のポリペプチドまたはその断片と共に、アルミニウムアジュバント、完全(または不完全)フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント等の公知のアジュバントを抗原に対する免疫応答を強化するために用いてもよい。
【０１２３】
ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のポリペプチドまたはその断片を所望によりアジュバントと共に哺乳動物に免疫し、免疫した動物より血清を得る。ここで用いる哺乳動物は、特に限定されないが、ゲッ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が一般的である。マウス、ラット、ハムスター等のゲッ歯目、ウサギ等のウサギ目、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等のサル等の霊長目の動物が挙げられる。動物の免疫化は、感作抗原をPhosphate-Buffered Saline(PBS)または生理食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じアジュバントを混合して乳化した後、動物の腹腔内または皮下に注射して行われる。その後、好ましくは、フロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を4〜21日毎に数回投与する。抗体の産生は、血清中の所望の抗体レベルを慣用の方法により測定することにより確認することができる。最終的に、血清そのものをポリクローナル抗体として用いても良いし、さらに精製して用いてもよい。具体的な方法として、例えば、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987) Section 11.12-11.13)を参照することができる。
【０１２４】
モノクローナル抗体を産生するためには、まず、上述のようにして免疫化した動物より脾臓を摘出し、該脾臓より免疫細胞を分離し、適当なミエローマ細胞とポリエチレングリコール(PEG)等を用いて融合してハイブリドーマを作成する。細胞の融合は、Milsteinの方法(Galfre and Milstein (1981) Methods Enzymol. 73: 3-46)に準じて行うことができる。ここで、適当なミエローマ細胞として特に、融合細胞を薬剤により選択することを可能にする細胞が挙げられる。このようなミエローマを用いた場合、融合されたハイブリドーマは、融合された細胞以外は死滅するヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液(HAT培養液)で培養して選択する。次に、作成されたハイブリドーマの中から、本発明のポリペプチドまたはその断片に対して結合する抗体を産生するクローンを選択する。その後、選択したクローンをマウス等の腹腔内に移植し、腹水を回収してモノクローナル抗体を得る。また、具体的な方法として、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987) Section 11.4-11.11)を参照することもできる。
【０１２５】
ハイブリドーマは、その他、最初にEBウイルスに感染させたヒトリンパ球をin vitroで免疫原を用いて感作し、感作リンパ球をヒト由来のミエローマ細胞(U266等)と融合し、ヒト抗体を産生するハイブリドーマを得る方法(特開昭63-17688号公報)によっても得ることができる。また、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物を感作して製造した抗体産生細胞を用いても、ヒト抗体を得ることができる(WO92/03918; WO93/02227; WO94/02602; WO94/25585; WO96/33735; WO96/34096; Mendez et al. (1997) Nat. Genet. 15: 146-56等)。ハイブリドーマを用いない例としては、抗体を産生するリンパ球等の免疫細胞に癌遺伝子を導入して不死化する方法が挙げられる。
【０１２６】
また、遺伝子組換え技術により抗体を製造することもできる(Borrebaeck and Larrick (1990) Therapeutic Monoclonal Antibodies, MacMillan Publishers LTD., UK参照)。そのためには、まず、抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマまたは抗体産生細胞(感作リンパ球等)からクローニングする。得られた遺伝子を適当なベクターに組み込み、宿主に該ベクターを導入し、宿主を培養することにより抗体を産生させる。このような組換え型の抗体も本発明の抗体に含まれる。代表的な組換え型の抗体として、非ヒト抗体由来可変領域及びヒト抗体由来定常領域とからなるキメラ抗体、並びに非ヒト抗体由来相補性決定領域(CDR)、及び、ヒト抗体由来フレームワーク領域(FR)及び定常領域とからなるヒト化抗体が挙げられる(Jones et al. (1986) Nature 321: 522-5; Reichmann et al. (1988) Nature 332: 323-9; Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-6; Methods Enzymol. 203: 99-121 (1991))。
【０１２７】
抗体断片は、上述のポリクローナルまたはモノクローナル抗体をパパイン、ペプシン等の酵素で処理することにより製造し得る。または、抗体断片をコードする遺伝子を用いて遺伝子工学的に製造することも可能である(Co et al., (1994) J. Immunol. 152: 2968-76; Better and Horwitz (1989) Methods Enzymol. 178: 476-96; Pluckthun and Skerra (1989) Methods Enzymol. 178: 497-515; Lamoyi (1986) Methods Enzymol. 121: 652-63; Rousseaux et al. (1986) 121: 663-9; Bird and Walker (1991) Trends Biotechnol. 9: 132-7参照)。
【０１２８】
多特異性抗体には、二特異性抗体(BsAb)、ダイアボディ(Db)等が含まれる。多特異性抗体は、(1)異なる特異性の抗体を異種二機能性リンカーにより化学的にカップリングする方法(Paulus (1985) Behring Inst. Mill. 78: 118-32)、(2)異なるモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを融合する方法(Millstein and Cuello (1983) Nature 305: 537-9)、(3)異なるモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子(4種のDNA)によりマウス骨髄腫細胞等の真核細胞発現系をトランスフェクションした後、二特異性の一価部分を単離する方法(Zimmermann (1986) Rev. Physio. Biochem. Pharmacol. 105: 176-260; Van Dijk et al. (1989) Int. J. Cancer 43: 944-9)等により作製することができる。一方、Dbは遺伝子融合により構築され得る二価の2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーの抗体断片であり、公知の手法により作製することができる(Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-8; EP404097; WO93/11161参照)。
【０１２９】
抗体及び抗体断片の回収及び精製は、プロテインA及びGを用いて行う他、公知のタンパク質精製技術によっても行い得る(Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988))。例えば、本発明の抗体の精製にプロテインAを利用する場合、Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia)等のプロテインAカラムが公知であり、使用可能である。得られた抗体の濃度は、その吸光度を測定することにより、または酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)等により決定することができる。
【０１３０】
抗体の抗原結合活性は、吸光度測定、蛍光抗体法、酵素免疫測定法(EIA)、放射免疫測定法(RIA)、ELISA等により測定することができる。ELISA法による測定の場合、本発明の抗体をプレート等の担体に固相化し、次いで本発明のポリペプチドを添加した後、目的とする抗体を含む試料を添加する。ここで、抗体を含む試料としては、抗体産性細胞の培養上清、精製抗体等が考えられる。続いて、本発明の抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートのインキュベーションを行う。その後、プレートを洗浄し、二次抗体に付加された標識を検出する。即ち、二次抗体がアルカリフォスファターゼで標識されている場合には、p-ニトロフェニルリン酸等の酵素基質を添加して吸光度を測定することで、抗原結合活性を測定することができる。また、抗体の活性評価に、BIAcore(Pharmacia)等の市販の系を使用することもできる。
【０１３１】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドまたはその断片を認識または検出することができる。また、本発明のポリペプチドまたはその断片を認識することから、当該ポリペプチドまたはその断片が発現している細胞等を認識または検出することができる。さらに、本発明のポリペプチドまたはその断片の精製に使用することができる。また、本発明のポリペプチドまたはその断片が発現している細胞等の精製に使用することができる。
【０１３２】
本発明の抗体は、好ましくは、以下の（Ａ’）および（Ｂ’）に記載のアミノ酸配列の少なくとも連続した６アミノ酸残基または全部からなるポリペプチドと結合する抗体であり、より好ましくは、少なくとも６アミノ酸残基からなるポリペプチドと結合する抗体である。
（Ａ’）配列番号：２、４、２４、２６、２８若しくは３０で表されるアミノ酸配列の２１番目〜５１０番目、配列番号：２０若しくは２２で表されるアミノ酸配列の２０番目〜５１３番目、配列番号：３２若しくは３４で表されるアミノ酸配列の２１番目〜４６０番目、または配列番号：３６で表されるアミノ酸配列の２１番目〜４９０番目のアミノ酸配列
（Ｂ’）配列番号：４７で表されるアミノ酸配列の２３番目〜７０８番目、配列番号：４９で表されるアミノ酸配列の２３番目〜７１０番目、配列番号：５１で表されるアミノ酸配列の２３番目〜７１２番目、または配列番号：５３で表されるアミノ酸配列の２３番目〜７０８番目のアミノ酸配列
【０１３３】
また、本発明の抗体またはポリペプチドを固定する担体としては、細胞に対して無害なものである必要がある。例えば、合成または天然の有機高分子化合物、ガラスビーズ、シリカゲル、アルミナ、活性炭等の無機材料、及びこれらの表面に多糖類、合成高分子等をコーティングしたものが考えられる。担体の形状には特に制限はなく、膜状、繊維状、顆粒状、中空糸状、不織布状、多孔形状、ハニカム形状等が挙げられ、その厚さ、表面積、太さ、長さ、形状、大きさを種々変えることにより接触面積を制御することができる。
【０１３４】
本発明の方法によって選択されるタンパク質以外のプルキンエ前駆細胞マーカータンパク質としては、例えば、Lim1/2遺伝子およびCorl2遺伝子からなる群から選択される遺伝子によってコードされるタンパク質を挙げることができる。
【０１３５】
また本発明の方法における65B13遺伝子およびE-cadherin遺伝子の転写産物の検出は、本発明のポリヌクレオチドと細胞試料由来の核酸抽出物とを接触させ、核酸抽出物中において該ポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸を検出することにより、実施することができる。
【０１３６】
65B13遺伝子およびE-cadherin遺伝子の転写産物を検出するために、ポリヌクレオチドプローブは、好ましくは放射性同位体または非放射性化合物で標識されたものである。例えば、標識するための放射性同位体としては、35S、3H等を挙げることができる。放射標識したポリヌクレオチドプローブを用いた場合、エマルションオートラジオグラフィーにより銀粒子を検出することによりマーカーと結合するRNAを検出することができる。また、ポリヌクレオチドプローブの標識のため慣用の非放射性同位体としては、ビオチン、ジゴキシゲニン等が公知である。ビオチン標識マーカーの検出は、例えば、蛍光、または、アルカリ性ホスファターゼ若しくは西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素を標識したアビジンを用いて行うことができる。一方、ジゴキシゲニン標識マーカーの検出には、蛍光、または、アルカリ性ホスファターゼ若しくは西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素を標識した抗ジゴキシゲニン抗体を使用することができる。酵素標識を使用する場合には、酵素の基質と共にインキュベートし、安定な色素をマーカー位置に沈着させることで検出を行う。
【０１３７】
65B13遺伝子およびE-cadherin遺伝子の転写産物を検出するために、ポリヌクレオチドプライマーを用いた場合には、65B13遺伝子およびE-cadherin遺伝子の転写産物は、例えば、RT-PCRなどの手法により、該ポリヌクレオチドプライマーとハイブリダイズする核酸を増幅することによって検出することができる。
【０１３８】
本発明の方法における65B13遺伝子およびE-cadherin遺伝子の翻訳産物の検出は、上記した抗体と細胞試料由来のタンパク質抽出物とを接触させ、該抗体と結合するタンパク質を検出することにより、実施することができる。抗体の抗原結合活性の測定方法については、上述したように、吸光度測定、蛍光抗体法、酵素免疫測定法（EIA）、放射免疫測定法（RIA）、ELISA法等により測定することができる。
【０１３９】
本発明の方法においては、65B13遺伝子およびE-cadherin遺伝子の転写産物または翻訳産物に加えて、Lim1/2およびCorl2からなる群より選択される１または複数の遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出することにより、より高精度に識別を行うことが可能であり、このような方法も本発明に含まれる。
【０１４０】
また本発明における65B13およびE-cadherinのポリヌクレオチドの発現を指標とすることにより、プルキンエ前駆細胞の分化誘導に有効な物質をスクリーニングすることが可能である。
【０１４１】
本発明は、プルキンエ前駆細胞分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法を提供する。本方法によりスクリーニングされる化合物は、プルキンエ前駆細胞分化誘導する機能を示すことから、プルキンエ細胞における何等かの欠陥が病因となっている疾患（疾病）の治療のための候補化合物となることが期待され有用である。本スクリーニング方法によって取得される化合物の治療対象となる疾患としては、例えば小脳変性症を挙げることができる。
【０１４２】
本発明の上記スクリーニング方法の好ましい態様としては、以下の工程を含んでなる方法を挙げることができる。
（I）プルキンエ前駆細胞に分化し得る細胞と、被験化合物とを接触させる工程；および
（II）上述の（Ａ）および（Ｂ）から選択されるポリヌクレオチド配列またはその相補配列にハイブリダイズすることができる、プルキンエ前駆細胞のポリヌクレオチドの発現を検出する工程
【０１４３】
ここで、「被験物質」とはどのような化合物であってもよいが、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、合成ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞(微生物、植物細胞、動物細胞)抽出液、細胞(微生物、植物細胞、動物細胞)培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物等由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。
【０１４４】
また、65B13とE-cadherinは、分化誘導したプルキンエ前駆細胞において選択的な発現を示すため、プルキンエ前駆細胞への分化誘導試薬のスクリーニングにおいて利用することも可能である。すなわち、被検試料の存在下で、プルキンエ前駆細胞へ分化する能力のある細胞からプルキンエ前駆細胞への分化を誘導し、分化を誘導した細胞におけるE-cadherinの発現を検出することにより、該被験試料にプルキンエ前駆細胞の分化を誘導する能力があるか否かを決定することができる。
【０１４５】
従って、本発明は下記（ｆ）〜（ｈ）の工程を含む、プルキンエ前駆細胞分化誘導試薬の候補化合物のスクリーニング方法を提供する。
（ｆ）被検試料の存在下で、プルキンエ前駆細胞へ分化する能力のある細胞からプルキンエ前駆細胞への分化を誘導する工程、
（ｇ）分化を誘導した細胞における65B13遺伝子およびE-cadherin遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出する工程、
（ｈ）被検試料の非存在下で検出した場合と比較して、該転写産物または翻訳産物の量を増大させる化合物を選択する工程。
【０１４６】
ここで「プルキンエ前駆細胞へ分化する能力のある細胞」としては、好ましくは多分化能を有するES細胞等、プルキンエ前駆細胞へと分化誘導され得る細胞を含む細胞試料である。
【０１４７】
本発明の65B13遺伝子およびE-cadherin遺伝子の転写産物または翻訳産物の検出は、上記のように、65B13遺伝子およびE-cadherin遺伝子の転写産物にハイブリダイズするポリヌクレオチドや65B13遺伝子およびE-cadherin遺伝子の翻訳産物に結合する抗体を用いて検出することができる。
【０１４８】
本発明において細胞の分化や増殖は、被験物質と接触させない場合における細胞の状態と比較することにより検出することができる。細胞の分化や増殖は、顕微鏡下において形態学的な観察を行うこと、または、細胞の分化に伴って産生される物質を検出、定量することにより、評価することができる。
【０１４９】
細胞の分化は、被検試料の非存在下における65B13遺伝子およびE-cadherin遺伝子発現のレベルと比較することにより判定することができる。すなわち、被検試料の非存在下で検出した場合と比較して、65B13遺伝子およびE-cadherin遺伝子の転写産物または翻訳産物の量を増大させる場合、該被験試料は神経細胞の分化を誘導する能力を有すると判定できる。ここで「増大」とは、例えば、２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍以上をいう。
【０１５０】
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様においては、さらに工程（ＩＩ）でポリヌクレオチドの発現を検出した化合物を選択する工程を含む方法である。
【０１５１】
また本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、例えば下記工程を含んでなる方法が挙げられる。即ち、
（ＩＶ）プルキンエ前駆細胞に分化し得る細胞と、被験化合物とを接触させる工程；および
（Ｖ）以下の（Ａ）および（Ｂ）を含んでなる工程；
（Ａ）前記（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質を検出する工程
（Ｂ）前記（ｖ’）、（ｖｉ’）、（ｖｉｉ’）、および（ｖｉｉｉ’）から選択されるタンパク質を検出する工程。
【０１５２】
上記方法の好ましい態様としては、さらに、
（ＶＩ）工程（Ｖ）でタンパク質を検出した化合物を選択する工程
を含む方法である。
【０１５３】
ここで、当該タンパク質の発現を検出する方法（手段）としては、以下の（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質に翻訳されるmRNAを発現させるプロモーター（修飾されたプロモーターを含む）を利用することもできる；
（Ａ）前記（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質、
（Ｂ）前記（ｖ’）、（ｖｉ’）、（ｖｉｉ’）、および（ｖｉｉｉ’）から選択されるタンパク質。
例えば、発現領域解析により得られたプロモーター部分に対し、例えばGFP（green fluorescent protein）等の検出可能なマーカーをコードする遺伝子を連結した構築物を含むベクターを細胞に対してトランスフェクションすることができる。その他、遺伝子座へマーカーをコードする遺伝子をノックインすることができる。（Ａ）によってプルキンエ細胞を含むGABA産生ニューロン前駆細胞特異的にマーカー遺伝子の発現が検出され、（Ｂ）によってプルキンエ前駆細胞特異的にマーカー遺伝子の発現が検出されることとなり、両者を組み合わせることによりプルキンエ前駆細胞特異的にマーカー遺伝子の発現が検出されることとなり、タンパク質の発現を検出することが可能となる。当該タンパク質の発現を検出する方法（手段）は、当該タンパク質の発現が検出されることから、当該タンパク質をコードする遺伝子を検出する方法（手段）にもなり得る。
【０１５４】
この場合、「プロモーター部分にマーカーをコードする遺伝子を連結」とは、当該マーカーをコードする遺伝子が発現可能な状態になるように当該遺伝子を繋げることをいい、プロモーターに当該遺伝子が直接結合した状態の他、プロモーターから離れた状態でも当該プロモーターの制御下にある状態のものも含む。さらに、65B13に対するプロモーターは、65B13領域を発現させるものであれば、65B13の発現領域解析により得られたプロモーター部分を他のプロモーターに置換することもできる。またE-cadherinに対するプロモーターは、E-cadherin領域を発現させるものであれば、E-cadherinの発現領域解析により得られたプロモーター部分を他のプロモーターに置換することもできる。
【０１５５】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１５６】
以下の実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。【０１５７】
[実施例１]  65B13の小脳原基における発現解析と65B13陽性細胞の分離
65B13（Neph3）は、胎児脳内において幾つかの領域に選択的に発現している（図１；WO 2004/038018；Minaki Y, Mizuhara E, Morimoto K, Nakatani T, Sakamoto Y, Inoue Y, Satoh K, Imai T, Takai Y, Ono Y. Migrating postmitotic neural precursor cells in the ventricular zone extend apical processes and form adherens junctions near the ventricle in the developing spinal cord. Neurosci Res. 2005, 52(3):250-62.）。中脳ではドーパミンニューロン前駆細胞に発現することが明らかになっているが（WO 2004/038018）、それ以外の領域における65B13発現細胞種については同定されていない。小脳はグルタミン酸産生顆粒細胞と、プルキンエ細胞、ゴルジ細胞、星状細胞、籠細胞などのGABA産生ニューロンにより構成される（Wang VY, Zoghbi HY. Genetic regulation of cerebellar development. Nat Rev Neurosci. 2001, 2(7):484-91.）。顆粒細胞はE12.5-14.5にかけてのrhombic lip領域から発生することが知られている（Wang VY, Zoghbi HY. Genetic regulation of cerebellar development. Nat Rev Neurosci. 2001, 2(7):484-91.）。一方、GABA産生ニューロンの発生については明らかでない部分が多いものの、最近の知見から、E11.5-E13.5のrhombomere1背側領域（小脳原基領域）からプルキンエ細胞が産生されると考えられている（Chizhikov VV, Lindgren AG, Currle DS, Rose MF, Monuki ES, Millen KJ. The roof plate regulates cerebellar cell-type specification and proliferation. Development. 2006, 133(15):2793-804.）。ゴルジ細胞については詳細な報告はないが、同様の領域から発生後期（E13.5-15.5）に産生されると考えられ、一方、星状細胞と籠細胞は生後に白質内の前駆細胞から発生すると考えられている（Zhang L, Goldman JE. Generation of cerebellar interneurons from dividing progenitors in white matter. Neuron. 1996, 16(1):47-54.）。【０１５８】
小脳原基における65B13発現細胞を同定するために、各種マーカーとの発現領域の比較を行った。マウス10.5日胚を摘出し4% PFA/PBS(-)で4℃、2時間固定したのち、20% ショ糖/PBS(-)で4℃、一晩置換し、OCTで包埋した。厚さ12μmの切片を作製し、スライドガラスに貼り付けた後、室温で30分乾燥させ、PBS(-)で再び湿潤させた。その後、ブロッキング（ブロックエース）を室温、30分間行い、一次抗体を室温、1時間反応させた後、さらに4℃、一晩反応させた。0.1% Tween-20/PBS(-)で、室温、15分間の洗浄を3回行った。次に蛍光標識した２次抗体を室温、1時間反応させ、同様に洗浄を行った後、PBS(-)によって室温、10分間洗浄し、封入した。一次抗体は、以下のものを使用した。65B13: WO 2004/038018およびMinaki Y, Mizuhara E, Morimoto K, Nakatani T, Sakamoto Y, Inoue Y, Satoh K, Imai T, Takai Y, Ono Y. Migrating postmitotic neural precursor cells in the ventricular zone extend apical processes and form adherens junctions near the ventricle in the developing spinal cord. Neurosci Res. 2005, 52(3):250-62.に記載、Pax2: Zymedより購入、Corl2: WO 2006/082826に記載。【０１５９】
その結果、E12.5小脳原基領域では、65B13は、Corl2陽性プルキンエ細胞発生領域のVZに選択的に発現することが明らかになった（図２Ａ）。一方、E14.5では、同一の65B13陽性領域からPax2陽性のゴルジ細胞と思われるニューロン（Maricich SM, Herrup K. Pax-2 expression defines a subset of GABAergic interneurons and their precursors in the developing murine cerebellum. J Neurobiol. 1999, 41(2):281-94.）が出現し始めることも明らかになった（図２Ｂ）。【０１６０】
そこで、65B13陽性細胞がプルキンエ細胞およびゴルジ細胞の前駆細胞であることを確認するために、65B13陽性細胞の分離および培養実験を行った。【０１６１】
E12.5およびE14.5小脳原基領域を切り出し、細胞分散バッファー（Invitrogen）を用いて分散させた後、固定・透過処理せずに、抗65B13モノクローナル抗体（精製抗体1/100 希釈ずつ、1% ウシ胎児血清、1 mM EDTA/SDIA分化培地（Kawasaki et. al. (2000) Neuron 28(1): 31-40））で4℃、20分間染色した。その後、1% ウシ胎児血清、1 mM EDTA/PBSで4℃、3分間の洗浄を3回行い、PE標識抗ハムスターIgG抗体（Jackson、10μg/ml、1% ウシ胎児血清、1 mM EDTA/ SDIA分化培地）で4℃、30分間染色し、同様に洗浄した。染色後、セルソーターにより65B13発現細胞を分離した。分離した細胞をpoly-L-ornithine（Sigma、0.002% in PBS）、laminin（Invitrogen、5μg/ml in PBS）、fibronectin（Sigma、5μg/ml in PBS）コートしたスライドガラス上に播き、Knockout Serum Replacement (Gibco, 5%)、N2（Invitrogen、1x）、B27（Invitrogen、1x）、アスコルビン酸（Sigma、200μM）BDNF（Invitrogen、20 ng/ml）/ SDIA分化培地中で、37℃、2日間培養した。培養した細胞を2% PFA/PBSで4℃、20分間固定し、PBSで4℃、10分間の洗浄を2回行った。その後、0.3% Triton X-100/PBSで室温、30分間の透過処理を行い、10% normal donkey serum/ブロックエースで室温、20分間のブロッキングを行った。続いて、一次抗体（10% normal donkey serum、2.5% ブロックエース、0.1% Triton X-100/PBS）、で、室温、1時間反応させ、引き続き、4℃、一晩反応させた。翌日、0.1% Triton X-100/PBSで、室温、10分間の洗浄を3回行った後、蛍光標識した二次抗体（いずれもJackson、10μg/ml、10% normal donkey serum、2.5%ブロックエース、0.1% Triton X-100/PBS）で室温、30分間反応させた。その後、同様に洗浄し、PBSで室温、5分間洗浄し、封入して観察した。抗HuC/D抗体はmolecular probeより購入した。【０１６２】
その結果、いずれの発生時期の小脳原基領域からも65B13陽性細胞を生きたまま分離することが可能であることが示された（図３）。そして、２日間の培養により、これらの細胞のほとんどがニューロンに分化し、E12.5の65B13陽性細胞のほとんどはCorl2陽性のプルキンエ細胞に（図４Ａ）、そしてE14.5の65B13陽性細胞のほとんどはPax2陽性のゴルジ細胞様ニューロンに（図４Ｂ）分化することが確認された。したがって、胎児期小脳では、65B13は、プルキンエ細胞およびゴルジ細胞の前駆細胞に選択的に発現し、抗65B13抗体を用いることで、これらの前駆細胞を分離可能であることが明らかになった。すなわち、65B13は小脳のGABA産生ニューロン前駆細胞を分離するためのマーカーとして有用であることが示された。【０１６３】
[実施例２]  65B13プロモーターを用いた外来遺伝子のGABA産生ニューロン前駆細胞特異的発現
次に、65B13プロモーターを用いることで、外来遺伝子をGABA産生ニューロン前駆細胞特異的に発現させることが可能であるかを調べるために、以下のプロトコールで、トランスジェニックマウスを作製し、外来遺伝子の発現を解析した。【０１６４】
まず、ウシgrowth hormoneポリA付加配列（配列番号：４１；Invitrogen pcDNA3.1+ベクターより）を増幅し、pSP73（プロメガ）のHindIII/XhoI部位に挿入し、pSP73-polyAを構築した。次に、配列番号：４２と４３の合成DNAをアニーリングしたものをpSP73-polyAのAsp718I/BamHI部位に挿入し、pSP73-polyA IIを構築した。65B13の翻訳開始コドンより上流約3.2ｋｂのマウスゲノム断片（配列番号：４４）をpSP73-polyA IIのClaI/Asp718I部位に挿入し、pN3を構築した。最後に、外来遺伝子としてマウスGsh1 cDNA（配列番号：４５）をpN3のAsp718I/SalI部位に挿入し、pN3-Gsh1を構築した。ClaIで直鎖化したpN3-Gsh1を、Gordonらの方法に従って(Gordon JW, Scangos GA, Plotkin DJ, Barbosa JA, Ruddle FH.Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980 Dec;77(12):7380-4.)、マウス受精卵前核にインジェクションし、仮親に移植した。胎生12.5日に胎児を取り出し、実施例1の方法で、小脳原器におけるNeph3およびGsh1の発現を解析した。抗Gsh1抗体は以下の方法で作製した。まず免疫に必要な抗原であるGsh1の1-72 アミノ酸にあたる領域とGSTの融合タンパク質発現ベクターを構築した。このベクターをE.coli(JM109株)に導入した後、IPTGによって発現誘導し、グルタチオンビーズを用いて融合タンパク質を回収した。回収した融合タンパク質をラットに免疫したのち、リンパ球細胞を取り出してミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１と細胞融合させ、抗Gsh1抗体産生ハイブリドーマを得た（ハイブリドーマ作製はコージンバイオに外注）。【０１６５】
その結果、野生型の小脳ではGsh1は65B13陽性GABA産生ニューロン前駆細胞のうち腹側のごく一部の集団にのみ発現するのに対し、トランスジェニックマウスでは65B13陽性領域の全域でかつ特異的にGsh1の発現が認められた（図６）。このことから、65B13プロモーターを用いることで、GABA産生ニューロン前駆細胞特異的に外来遺伝子を発現させることができることが示された。【０１６６】
[実施例３]  プルキンエ前駆細胞選択的遺伝子の同定
65B13遺伝子は、分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞で一過性に発現することが知られている（特許文献１参照）ものの、GABAニューロンとの関連性については報告されていない（WO 2004/038018；Minaki Y, Mizuhara E, Morimoto K, Nakatani T, Sakamoto Y, Inoue Y, Satoh K, Imai T, Takai Y, Ono Y. Migrating postmitotic neural precursor cells in the ventricular zone extend apical processes and form adherens junctions near the ventricle in the developing spinal cord. Neurosci Res. 2005, 52(3):250-62.）。小脳はプルキンエ細胞、ゴルジ細胞、星状細胞、籠細胞などのGABA産生ニューロンと、グルタミン酸産生顆粒細胞により構成される（Wang VY, Zoghbi HY. Genetic regulation of cerebellar development. Nat Rev Neurosci. 2001, 2(7):484-91.）。顆粒細胞はE12.5-14.5にかけてのrhombic lip領域から発生することが知られている（Wang VY, Zoghbi HY. Genetic regulation of cerebellar development. Nat Rev Neurosci. 2001, 2(7):484-91.）。一方、GABA産生ニューロンの発生については明らかでない部分が多いものの、最近の知見から、E11.5-E13.5のrhombomere1背側領域（小脳原基領域）からプルキンエ細胞が産生されると考えられている（Chizhikov VV, Lindgren AG, Currle DS, Rose MF, Monuki ES, Millen KJ. The roof plate regulates cerebellar cell-type specification and proliferation. Development. 2006, 133(15):2793-804.：Minaki Y, Nakatani T, Mizuhara E, Inoue T, Ono Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expr. Patterns, 2008, 8(6): 418-423）。ゴルジ細胞については詳細な報告はないが、同様の領域から発生後期（E13.5-15.5）に産生されると考えられ、一方、星状細胞と籠細胞は生後に白質内の前駆細胞から発生すると考えられている（Zhang L, Goldman JE. Generation of cerebellar interneurons from dividing progenitors in white matter. Neuron. 1996, 16(1):47-54.）。これらのニューロンの中で、小脳皮質から外部に神経シグナルを伝達する唯一のニューロンがプルキンエ細胞であり、その脱落が脊髄小脳変性症などの発症に関与している。65B13はプルキンエ細胞を含むGABAニューロン前駆細胞の分離に有用なマーカーである。しかし、プルキンエ前駆細胞をより高純度に分離するためには、65B13陽性細胞集団の中から、プルキンエ前駆細胞に選択的に発現するマーカーを用いてさらに分離する必要があると考えられ、以下のプロトコールにより、選択的マーカーの同定を行った。【０１６７】
まず、E12.5マウス小脳原基、後脳（myelencephalon）、脊髄およびE14.5小脳原基を切り出し、accumax（エムエステクノシステムズ）を用いて分散させた後、固定・透過処理せずに、抗65B13モノクローナル抗体（精製抗体（Minaki et al., 2005に記載）1/100 希釈ずつ、1% ウシ胎児血清、1 mM EDTA/D-MEM-F12で4℃、30分間染色した。その後、1% ウシ胎児血清、1 mM EDTA/D-MEM:F12培地で4℃、3分間の洗浄を3回行い、PE標識抗ハムスターIgG抗体（BD pharmingen、8μg/ml、1% ウシ胎児血清、1 mM EDTA/ D-MEM:F12培地）で4℃、30分間染色し、同様に洗浄した。染色後、セルソーターにより65B13発現細胞を分離した。分離直後の細胞からRNeasy mini kit（Qiagen）を用いて全RNAを調製し、cDNA synthesis kit (TAKARA)を用いて二本鎖cDNAを合成した。次に、合成したcDNAを制限酵素AfaI(TAKARA)で消化したのち、ad2を付加し、ad2Sをプライマーとして、PCRを行い、cDNAを増幅した。【０１６８】
増幅条件は、72℃で5分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、および72℃で2分の反応を20サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした。
ad2S：CAGCTCCACAACCTACATCATTCCGT（配列番号：５４）
ad2A：ACGGAATGATGT（配列番号：５５）【０１６９】
PCRは以下の反応液組成で行った。
10×ExTaq                     5μl
2.5 mM  dNTP                  4μl
ExTaq                      0.25μl
100μM  プライマー          0.5μl
cDNA                          2μl
蒸留水                    38.25μl【０１７０】
次にこれらのサンプルを用いて、E12.5小脳原基由来65B13陽性細胞に特異的な遺伝子をサブトラクション（N-RDA）法（WO2004/065599に記載）により探索したところ、単離したcDNA断片の一つはE-cadherinをコードする断片であった。次に、E-cadherinの発現を、下記のプライマーを使用して、以下の方法によりRT-PCR法で確認した。【０１７１】
増幅したcDNA  3 ngおよび0.3 ng相当分のcDNAを鋳型に用いて、以下の反応系でPCRを行った。
10×ExTaq                     1μl
2.5 mM  dNTP                0.8μl
ExTaq                      0.05μl
100μM  プライマー        各0.1μl
cDNA                           1μl
蒸留水                      6.95μl【０１７２】
94℃で2分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で2分の増幅反応を行い、最後に72℃で2分インキュベートした。PCRの増幅は、26サイクルで行った。
下記プライマーをPCRに使用した。【０１７３】
E-cadherin  ：CTCCAATGCCTGCTCTTGATGGTAGC（配列番号：５６）
TCTCTGTGTAGCCCTGGCTGTCCTAG（配列番号：５７）【０１７４】
65B13：CTTCCCGTATGCTACCTTGTCTCCAC（配列番号：５８）
CCAACAGTCCTGCATGCTTGTAATGA（配列番号：５９）【０１７５】
その結果、E-cadherinは、各脳領域由来65B13陽性細胞の中で、プルキンエ細胞を産生する小脳原基由来65B13陽性細胞に特異的であることが明らかになった（図７）。また、小脳原基由来65B13陽性細胞におけるE-cadherin発現も、プルキンエ細胞を産生する時期（E12.5）に特異的であることも明らかになった。【０１７６】
[実施例４]  E-cadherinの胎児脳組織における発現解析
次に、E-cadherinの胎児脳、特に65B13陽性細胞における発現を調べるために、以下のプロトコールにより、E-cadherinおよび65B13の発現を、プルキンエ細胞特異的マーカーCorl2 (Minaki Y, Nakatani T, Mizuhara E, Inoue T, Ono Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expr. Patterns, 2008, 8(6): 418-423)およびそれ以外のGABAニューロンマーカーPax2と比較した。【０１７７】
マウス12.5日胚および14.5日胚の脳組織を摘出し4% PFA/PBS(-)で4℃、それぞれ2時間または1時間固定したのち、10% ショ糖/PBS(-)で4℃、5時間、さらに20% ショ糖/PBS(-)で4℃一晩置換し、OCTで包埋した。厚さ14μmの切片を作製し、スライドガラスに貼り付けた後、室温で30分乾燥させ、0.1% TritonX-100/PBS(-)で再び湿潤させた。その後、ブロッキング（ブロックエース）を室温、30分間行い、一次抗体を4℃、一晩反応させた。0.1% TritonX-100/PBS(-)で、室温、10分間の洗浄を3回行った。次に蛍光標識した2次抗体を室温、40分間反応させ、同様に洗浄を行った後、PBS(-)でリンスし、封入した。一次抗体は、以下のものを使用した。65B13: 実施例３に記載、Corl2: Minaki Y, Nakatani T, Mizuhara E, Inoue T, Ono Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expr. Patterns, 2008, 8(6): 418-423に記載、Pax2: Zymedより購入（1/500希釈）、E-cadherin: TAKARAより購入（1/100希釈）。【０１７８】
その結果、E-cadherinは、後脳（myelencephalon）には発現せず、小脳原基に選択的に発現することが確認された（図８）。また、小脳原基においても65B13陽性領域選択的に発現しており、その発現はプルキンエ細胞を産生する時期（E12.5）に特異的であることも明らかとなった。さらに、E12.5小脳原基65B13陽性領域の中でも、Corl2陽性プルキンエ細胞を産生する背側領域でのE-cadherinの発現レベルは、Pax2陽性小脳核GABAニューロンを産生する腹側領域に比べて、高レベルであることも明らかになった。【０１７９】
[実施例５]  胎児脳細胞におけるE-cadherinおよび65B13発現のFACS解析
次にE-cadherinがプルキンエ前駆細胞のFACS分離に有用なマーカーであることを確認するために、以下のプロトコールでFACS解析を行った。【０１８０】
まず、E12.5マウス小脳原基、後脳（myelencephalon）、脊髄およびE14.5小脳原基を切り出し、NeuroCult Chemical Dissociation Kit ( StemCell Technologies Inc )を用いて分散させた後、固定・透過処理せずに、抗65B13モノクローナル抗体（精製抗体（実施例３に記載）1/100 希釈）および抗E-cadherin抗体（1/100 希釈）で4℃、30分間染色した。その後、1% ウシ胎児血清、1 mM EDTA/PBSで4℃、3分間の洗浄を3回行い、PE標識抗ハムスターIgG抗体（BD pharmingen、8μg/ml、1% ウシ胎児血清、1 mM EDTA/PBS ）およびAPC標識抗ラットIgG抗体（Jackson、10μg/ml、1% ウシ胎児血清、1 mM EDTA/PBS）で4℃、30分間染色し、同様に洗浄した。染色後、フローサイトメーターにてE-cadherinおよび65B13発現細胞を検出した。【０１８１】
その結果、実施例４の組織発現解析結果と一致して、小脳由来の65B13陽性細胞のみがE-cadherinを細胞表面に発現することが確認された（図９）。したがって、E-cadherinは、65B13陽性細胞集団の中から、プルキンエ前駆細胞をFACSを用いて分離するのに有用なマーカーであることが確認された。【０１８２】
[実施例６]  E-cadherin/65B13共陽性細胞の分離および培養
次にE-cadherin/65B13共陽性細胞がプルキンエ前駆細胞であることを確認するために、以下のプロトコールで分離および培養実験を行った。【０１８３】
まず、E12.5マウス小脳原基細胞を、実施例５と同様の方法で染色し、セルソーターでE-cadherin/65B13共陽性細胞を分離した。分離した細胞をpoly-L-ornithine（Sigma、0.002% in PBS）、laminin（Invitrogen、2.5μg/ml in PBS）、fibronectin（Sigma、5μg/ml in PBS）コートしたスライドガラス上に播き、N2（Invitrogen、1x）、B27（Invitrogen、1x）、BDNF（Invitrogen、20 ng/ml）/D-MEM:F12培地中で、37℃、2日間培養した。培養した細胞を2% PFA/PBSで4℃、20分間固定し、PBSで4℃、10分間の洗浄を2回行った。その後、0.3% Triton X-100/PBSで室温、30分間の透過処理を行い、10% normal donkey serum/ブロックエースで室温、20分間のブロッキングを行った。続いて、一次抗体（10% normal donkey serum、2.5% ブロックエース、0.1% Triton X-100/PBS）、で、室温、1時間反応させ、引き続き、4℃、一晩反応させた。翌日、0.1% Triton X-100/PBSで、室温、10分間の洗浄を3回行った後、蛍光標識した二次抗体（いずれもJackson、3μg/ml、10% normal donkey serum、2.5%ブロックエース、0.1% Triton X-100/PBS）で室温、30分間反応させた。その後、同様に洗浄し、PBSで室温、5分間洗浄し、封入して観察した。一次抗体は、以下のものを使用した。HuC/D: molecular probeより購入、Corl2: 実施例１に記載。【０１８４】
その結果、分離したE-cadherin/65B13共陽性細胞のほとんどが、2日間の培養により、Corl2陽性プルキンエ細胞に分化することが明らかになった（図１０）。したがって、E-cadherinは、65B13と組み合わせることで、プルキンエ前駆細胞の分離に有用なマーカーであることが確認された。
【配列表フリーテキスト】
【０１８５】
配列番号：１９  Mouse 65B13 NM_172898 extracellular: 20-513 a.a.
配列番号：２１  Mouse 65B13 BC052773 extracellular: 20-513 a.a.
配列番号：２３  Human 65B13 NM_032123 extracellular: 21-510 a.a.
配列番号：２５  Human 65B13 NM_199180 extracellular: 21-510 a.a.
配列番号：２７  Human 65B13 AY358742 extracellular: 21-510 a.a.
配列番号：２９  Human 65B13 AY305301 extracellular: 21-510 a.a.
配列番号：３１  Human 65B13 NM_199179 extracellular: 21-460 a.a.
配列番号：３３  Human 65B13 AY305302 extracellular: 21-460 a.a.
配列番号：３５  Human 65B13 BC064925 extracellular: 21-490 a.a.
配列番号：３７  Chimpanzee 65B13 (predicted) XM_512603 extracellular: 21-445 a.a.
配列番号：３９  Cattle 65B13 (predicted) XM_583222 extracellular: 44-607 a.a.
配列番号：４６  human E-cadherin NM_004360 ORF: 125-2773
配列番号：４７  human E-cadherin amino acids SS（シグナル配列）: 1-22 TM（膜貫通領域）:709-731
配列番号：４８  mouse E-cadherin NM_009864 ORF: 128-2782
配列番号：４９  mouse E-cadherin amino acids SS: 1-22 TM:711-733
配列番号：５０  rat E-cadherin NM_031334 ORF: 127-2787
配列番号：５１  rat E-cadherin amino acids SS: 1-22 TM:713-735
配列番号：５２  chimpanzee E-cadherin XM_001168150 ORF: 192-2840
配列番号：５３  chimpanzee E-cadherin amino acids SS: 1-22 TM:709-731
【図１】
2010016533.tif 000002
【図２】
2010016533.tif 000003
【図３】
2010016533.tif 000004
【図４】
2010016533.tif 000005
【図５】
2010016533.tif 000006
【図６】
2010016533.tif 000007
【図７】
2010016533.tif 000008
【図８】
2010016533.tif 000009
【図９】
2010016533.tif 000010
【図１０】
2010016533.tif 000011
【配列表】
2010016533000001.app
【国際調査報告】
2010016533.tif 000012
2010016533.tif 000013
2010016533.tif 000014
2010016533.tif 000015
2010016533.tif 000016