(57)【要約】  ストレス栽培や高含有品種を使用しなくとも、植物に適宜散布または灌注することで植物の機能性成分の含有量の増加を図ることのできる植物機能性成分含有量向上剤、およびその製造方法を提供すること目的とする。炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含む植物機能性成分含有量向上剤、および炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含む、脂肪酸代謝物を含む植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含む植物機能性成分含有量向上剤。
【請求項２】
前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である請求項１記載の植物機能性成分含有量向上剤。
【請求項３】
前記代謝が、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下での代謝である請求項１または２記載の植物機能性成分含有量向上剤。
【請求項４】
前記プロテオバクテリアが、前培養されたプロテオバクテリアである請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤。
【請求項５】
前記前培養されたプロテオバクテリアが、菌数１×１０8〜９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌに前培養されたプロテオバクテリアである請求項４記載の植物機能性成分含有量向上剤。
【請求項６】
バイオサーファクタントを含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤。
【請求項７】
前記代謝が、２０〜３０℃の条件下での代謝である請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤。
【請求項８】
植物の茎葉もしくは根に接触させる噴霧剤もしくは浸漬用薬剤、または、土壌灌注用薬剤として用いられる請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤。
【請求項９】
前記植物機能性成分が、ポリフェノール類、アミノ酸、テルペノイドおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項１〜８のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤。
【請求項１０】
前記アミノ酸が、プロリン、グルタミン酸およびγ−アミノ酪酸からなる群より選択される請求項９記載の植物機能性成分含有量向上剤。
【請求項１１】
ナス科、アブラナ科、キク科またはアカザ科の植物に対して使用されることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤。
【請求項１２】
炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含む、脂肪酸代謝物を含む植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
【請求項１３】
前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である請求項１２記載の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
【請求項１４】
前記脂肪酸代謝工程を、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下で実施する請求項１２または１３記載の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
【請求項１５】
前記プロテオバクテリアが、前培養されたプロテオバクテリアである請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
【請求項１６】
前記前培養されたプロテオバクテリアが、菌数１×１０8〜９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌに前培養されたプロテオバクテリアである請求項１５記載の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
【請求項１７】
バイオサーファクタントを含む植物機能性成分含有量向上剤の製造方法である請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
【請求項１８】
前記脂肪酸代謝工程を、２０〜３０℃の条件下で実施する請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
【請求項１９】
植物の茎葉もしくは根に接触させる噴霧剤もしくは浸漬用薬剤、または、土壌灌注用薬剤として機能する植物機能性成分含有量向上剤の製造方法である請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
【請求項２０】
ポリフェノール類、アミノ酸、テルペノイドおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される植物機能性成分の含有量を向上させる薬剤として機能する植物機能性成分含有量向上剤の製造方法である請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
【請求項２１】
プロリン、グルタミン酸およびγ−アミノ酪酸からなる群より選択される前記アミノ酸の含有量を向上させる薬剤として機能する植物機能性成分含有量向上剤の製造方法である請求項２０記載の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
【請求項２２】
ナス科、アブラナ科、キク科またはアカザ科の植物に使用される植物機能性成分含有量向上剤の製造方法である請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物機能性成分含有量向上剤および植物機能性成分含有量向上剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの植物には、ビタミン類、カロチノイド、ポリフェノール類などの様々な機能性成分が含まれている。近年、健康志向から農作物に含まれるこれら機能性成分に対する関心が高まっており、特に、細胞や組織に損傷を与え、ガンや生活習慣病、老化を促進させる一因になっていると考えられる活性酸素等のラジカルを除去する抗酸化活性がある機能性成分を多く含む農産物のニーズは高い。そこで、植物体中での有用な機能性成分の産生を有意に高めるための試みが行われてきている。【０００３】
植物に含まれる機能性成分の増収方法としては、特許文献１に紫外線を照射してイチゴの実に含まれるポリフェノールの量を増やす技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１３３１３０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、紫外線を植物に照射すると植物の生態組織を破壊する場合があり、照射時間には限度があった。また、紫外線は人体に対する害も懸念され、作業者の安全を十分に確保できないという問題があった。【０００６】
本発明は、前記問題点に鑑みてなされたもので、植物の生体組織に悪影響がなく、植物に適宜散布または灌注することで安全に植物の機能性成分の含有量の増加を図ることのできる植物機能性成分含有量向上剤、およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌ（リットル）の溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含む植物機能性成分含有量向上剤に関する。【０００８】
前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である植物機能性成分含有量向上剤が好ましい。【０００９】
前記代謝が、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下での代謝である植物機能性成分含有量向上剤が好ましい。【００１０】
前記プロテオバクテリアが、前培養されたプロテオバクテリアである植物機能性成分含有量向上剤が好ましい。【００１１】
前記前培養されたプロテオバクテリアが、菌数１×１０8〜９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（ミリリットル）に前培養されたプロテオバクテリアである植物機能性成分含有量向上剤が好ましい。【００１２】
前記植物機能性成分含有量向上剤が、バイオサーファクタントを含む植物機能性成分含有量向上剤であることが好ましい。【００１３】
前記代謝が、２０〜３０℃の条件下での代謝である植物機能性成分含有量向上剤が好ましい。【００１４】
前記植物機能性成分含有量向上剤が、植物の茎葉もしくは根に接触させる噴霧剤もしくは浸漬用薬剤、または、土壌灌注用薬剤として用いられる植物機能性成分含有量向上剤が好ましい。【００１５】
前記植物機能性成分が、ポリフェノール類、アミノ酸、テルペノイドおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される植物機能性成分含有量向上剤が好ましい。【００１６】
前記アミノ酸が、プロリン、グルタミン酸およびγ−アミノ酪酸からなる群より選択される植物機能性成分含有量向上剤が好ましい。【００１７】
前記植物機能性成分含有量向上剤が、ナス科、アブラナ科、キク科またはアカザ科の植物に対して使用されることを特徴とする植物機能性成分含有量向上剤が好ましい。【００１８】
また、本発明は、炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含む、脂肪酸代謝物を含む植物機能性成分含有量向上剤の製造方法に関する。【００１９】
前記脂肪酸が、２０℃で液体の脂肪酸である植物機能性成分含有量向上剤の製造方法が好ましい。【００２０】
前記脂肪酸代謝工程を、Ｍｇ、Ｐ、ＮａおよびＫから選ばれる少なくとも１種以上のミネラルの存在下で実施する植物機能性成分含有量向上剤の製造方法が好ましい。【００２１】
前記プロテオバクテリアが、前培養されたプロテオバクテリアである植物機能性成分含有量向上剤の製造方法が好ましい。【００２２】
前記前培養されたプロテオバクテリアが、菌数１×１０8〜９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌに前培養されたプロテオバクテリアである植物機能性成分含有量向上剤の製造方法が好ましい。【００２３】
バイオサーファクタントを含む植物機能性成分含有量向上剤の製造方法である植物機能性成分含有量向上剤の製造方法が好ましい。【００２４】
前記脂肪酸代謝工程を、２０〜３０℃の条件下で実施する植物機能性成分含有量向上剤の製造方法が好ましい。【００２５】
植物の茎葉もしくは根に接触させる噴霧剤もしくは浸漬用薬剤、または、土壌灌注用薬剤としてとして機能する植物機能性成分含有量向上剤の製造方法である植物機能性成分含有量向上剤の製造方法が好ましい。【００２６】
ポリフェノール類、アミノ酸、テルペノイドおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される植物機能性成分の含有量を向上させる薬剤として機能する植物機能性成分含有量向上剤の製造方法である植物機能性成分含有量向上剤の製造方法が好ましい。【００２７】
プロリン、グルタミン酸およびγ−アミノ酪酸からなる群より選択される前記アミノ酸の含有量を向上させる薬剤として機能する植物機能性成分含有量向上剤の製造方法である植物機能性成分含有量向上剤の製造方法が好ましい。【００２８】
ナス科、アブラナ科、キク科またはアカザ科の植物に使用される植物機能性成分含有量向上剤の製造方法である植物機能性成分含有量向上剤の製造方法が好ましい。【００２９】
なお、本発明でいう植物機能性成分含有量向上剤は、植物内で機能性成分の生成促進および／または分解の抑制を起こさせ、植物中の機能性成分含有量を増加させるものである。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の植物機能性成分含有量向上剤は、ストレス栽培や高含有品種を使用しなくとも、植物に適宜散布または灌注することで植物機能性成分の含有量を向上させることができる。また、本発明の植物機能性成分含有量向上剤の製造方法によれば、ストレス栽培や高含有品種を使用しなくとも、植物に適宜散布または灌注することで植物機能性成分の含有量を向上させることができる植物機能性成分含有量向上剤を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の植物機能性成分含有量向上剤を小松菜に対して使用した場合の、機能性成分間比較解析を示すボルケーノプロットである。
【図２】本発明の植物機能性成分含有量向上剤を水菜に対して使用した場合の、機能性成分間比較解析を示すボルケーノプロットである。
【図３】本発明の植物機能性成分含有量向上剤をルッコラに対して使用した場合の、機能性成分間比較解析を示すボルケーノプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
植物機能性成分含有量向上剤
本発明の植物機能性成分含有量向上剤は、炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させることで得られる脂肪酸代謝物を含むことを特徴とする。
【００３３】
脂肪酸代謝物を植物の茎葉または根の一部に接触させることで、植物機能性成分の含有量を向上させることができる。一般的に行われるストレス栽培において増加する成分と同じ成分の植物体内での向上が確認できることから、本発明の脂肪酸代謝物は、植物体に吸収されることによって、本来植物体内で環境ストレスによりシグナルとして産生され作用する分子と同様の作用を植物体内で行う物質および／またはその前駆体を含んでいると考えられる。すなわち、本発明の脂肪酸代謝物により、植物が本来有しているストレス耐性機能を強化することができる。その結果、植物体内での機能性成分の生成促進および／または分解の抑制が起き、植物体内での機能性成分が増加される。
【００３４】
本発明における代謝とは、所定の溶存酸素濃度環境下においてプロテオバクテリアが外分泌または内分泌する酵素等により炭素数４〜３０の脂肪酸の分解が行われることをいう。例えば、所定の溶存酸素濃度環境下、脂肪酸を含有する培地でプロテオバクテリアを培養する方法が挙げられる。
【００３５】
プロテオバクテリアは、脂肪酸の代謝に関わる酵素であるリポキシゲナーゼ（lipoxygenase:ＬＯＸ）を産生する遺伝子を持っており、脂肪酸代謝物を生成できる。
【００３６】
本発明において用いられる脂肪酸の炭素数は４〜３０であり、１０〜２０が好ましい。炭素数が４未満の場合は、融点・沸点が低いため、培養時の温度で揮発性が高まり培地中に残存しにくくなる傾向がある。また、炭素数が３０を超える場合は、融点・沸点が高くなるため、培養時の温度で固体となり培地と混合できず分離してしまう傾向がある。ただし、融点は水素結合の数によって炭素数のみに依存しない場合もある。
【００３７】
本発明において用いられる脂肪酸は、代謝効率の観点や培地中で固化することを抑制する観点から、２０〜３０℃で液体であることが好ましく、２０℃で液体であることがより好ましい。
【００３８】
本発明の脂肪酸は、飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸のいずれか、または両方を含む混合物とすることができる。また、植物油やグリセリドの形態や遊離脂肪酸を用いることができるが、分解速度に優れるという理由から遊離脂肪酸（モノカルボン酸）が好ましい。
【００３９】
炭素数４〜３０の遊離脂肪酸としては、酪酸（ブチル酸）、吉草酸（バレリアン酸）、カプロン酸、エナント酸（ヘプチル酸）、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、ミード酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸などが挙げられ、なかでも炭素数が１０〜２０のカプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、ミード酸、アラキドン酸が好ましく、炭素数が１８のオレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸がより好ましい。
【００４０】
脂肪酸を含有する培地を使用する場合の脂肪酸の含有量は、１２０ｇ／ｌ以下が好ましく、１００ｇ／ｌ以下がより好ましく、６０ｇ／ｌ以下がさらに好ましい。１２０ｇ／ｌを超える場合は、培地の水分との乳化が困難となり、代謝効率が悪化する恐れやプロテオバクテリアの生育を阻害する恐れがある。また、脂肪酸の含有量の下限は特に限定されないが、１．０ｇ／ｌ以上が好ましい。
【００４１】
脂肪酸を含有する培地は、他にミネラル成分を含有することが好ましい。ミネラル成分としては、特に限定されず微生物培養に通常用いられるミネラル成分を挙げることができる。例えば、マグネシウム（Ｍｇ）、リン（Ｐ）、ナトリウム（Ｎａ）またはカリウム（Ｋ）を有する成分が挙げられる。これらの成分は単独で使用することも、複数を併用することもできる。好ましくはこれらの成分のうちの２種類、さらに好ましくは３種類以上が使用され得る。培地中のミネラル成分の含有量は特に限定されず、従来の好気性細菌の培養方法で使用される量とすることができるが、植物への施用時に塩害が発生する恐れがあるため、好ましくは１５ｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｇ／ｌ以下で使用され得る。
【００４２】
本発明にて用いられるプロテオバクテリアは、本発明の効果を損なわない限り特に限定されない。好ましくは脂肪酸の代謝効率や生育効率の観点から、増殖に適した温度（至適温度）が１０〜４０℃のプロテオバクテリアが好ましく、２０〜３０℃のプロテオバクテリアがより好ましい。
【００４３】
プロテオバクテリアは、脂肪酸の代謝効率に優れるという理由から、前培養されたプロテオバクテリアであることが好ましく、菌数が１×１０8〜９×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌまで前培養されていることがより好ましい。
【００４４】
本発明においては、代謝は、０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下で行われる。溶存酸素濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満の場合は、プロテオバクテリアの活動が低下し脂肪酸の代謝効率が極めて低くなる傾向がある。また、溶存酸素濃度が８ｍｇ／ｌを超える場合は、プロテオバクテリアによる代謝工程と並行して、基質である脂肪酸の培地中の酸素による分解が進行してしまい、代謝効率が低下し、ひいては有効成分である代謝産物の産生量が低下してしまう恐れがある。より好ましくは、溶存酸素濃度は０．１〜５ｍｇ／ｌであり、さらに好ましくは０．１〜４ｍｇ／ｌである。なお、溶存酸素濃度は株式会社堀場製作所製の溶存酸素計でＰＯ電極に隔膜ガルバニ電極法または隔膜ポーラログラフ法により測定される値とする。
【００４５】
代謝における温度は使用するプロテオバクテリアに応じて適宜調整することができ、脂肪酸の代謝効率の観点から、２０〜３０℃がより好ましい。
【００４６】
本発明において、植物機能性成分含有量向上剤は、脂肪酸代謝物に加えバイオサーファクタントを含有し得る。脂肪酸代謝物が水に分散されやすくなり、植物機能性成分含有量向上剤の取扱性の観点から好ましいと考えられる。本発明に係るバイオサーファクタントとは、微生物が疎水性の高い物質を取り込むために産生し、細胞外へと分泌する界面活性剤様の物質を意味する。本発明において、プロテオバクテリアによって分泌されたバイオサーファクタントは、脂肪酸代謝物の水への分散も容易にするため、脂肪酸代謝物を含む植物機能性成分含有量向上剤の散布や灌注などが効率よく簡単に行えるようになる。しかしながら、バイオサーファクタントとしては、脂肪酸の分解時に本発明のプロテオバクテリアによって産生されたバイオサーファクタントだけではなく、他の微生物が産生したバイオサーファクタントが使用されてもよく、すなわち、本発明の植物機能性成分含有量向上剤には他の微生物によって産生されたバイオサーファクタントがさらに添加されてもよい。人工的に合成された界面活性剤と比較して、バイオサーファクタントは生物に関する毒性が低く、また、生分解性も高いため、より環境に優しい植物機能性成分含有量向上剤が得られると考えられる。また、プロテオバクテリアによる脂肪酸分解を促進させるために、他の微生物が産生したバイオサーファクタントが、プロテオバクテリアによる脂肪酸分解において添加されてもよい。プロテオバクテリアによる脂肪酸の取り込みが促進される可能性がある。
【００４７】
本発明の植物機能性成分含有量向上剤は、施用される植物においてストレス応答遺伝子ＰＲ１、ＰＲ２およびＰＤＦ１．２の発現を誘導することができる。この結果、植物の種類・品種や生育ステージ、また栽培環境や季節に依存して、クチクラの発達、トライコームの発達、毛根発生促進、抗酸化物質の生成量増加、水分蒸散防止機能の促進（プロリンなどの生産増加や葉を厚くする）、茎が太くなる、などが起こる。すなわち、本発明の植物機能性成分含有量向上剤は、植物が本来有しているストレス耐性機能を強化する。したがって、ストレス栽培を用いずとも、植物の機能性成分を増加させることができる。ストレス栽培や高含有品種を使用した場合に発生する収量の低下や病害虫に対する抵抗性の低下といった問題が生じない。本発明の植物機能性成分含有量向上剤によれば、従来の栽培方法を変えることなく簡便な処理によって植物のストレス耐性機能を向上させ、機能性成分含有量を増加させることができる。
【００４８】
本発明によって含量が増加する機能性成分としては、例えば、ポリフェノール類、機能性成分の配糖体、アミノ酸を挙げることができる。ポリフェノール類としては、例えば、クロロゲン酸、スコポレチン、シナピン酸、シナピルアルデヒドなどが挙げられる。機能性成分の配糖体としては、例えば、グルコナスツルチインや２−メチルプロピルグルコシノレートなどのグルコシノレート類、シリンギン、ルテオリングルコシドなどが挙げられる。アミノ酸としては、例えば、プロリン、グルタミン酸、γ−アミノ酪酸、アルギニン、トリプトファンなどが挙げられる。その他、アデノシンなどが挙げられる。本発明の植物機能性成分含有量向上剤によって、これらの機能性成分の少なくとも１つが増加され得る。
【００４９】
本発明を適用することのできる植物は、特に限定されないが、例えば、ナス科、アブラナ科、キク科、マメ科、ユリ科、またはアカザ科の植物が挙げられる。例えば、レタス、ホウレンソウ、コマツナ、ミズナ、キャベツ、白菜などの葉菜類、ロメインレタス、ビーツ、コマツナ、ホウレンソウ、ミズナ、ルッコラ、カラシナ、ケール、チコリーなどのベビーリーフ類、カンゾウ、マオウなどの薬草、トマト、ナス、キュウリ、ピーマン、パプリカ、オクラ、トウガラシ、カボチャなどの果菜類、大豆などの豆類、ネギ、玉ねぎ、ニンジン、レンコン、ゴボウなどの根菜類などに施用することができる。
【００５０】
植物はどのように栽培されていてもよく、すなわち土壌に植え付けられていても、また水耕液に浸して栽培されていてもよい。本発明の植物機能性成分含有量向上剤は、任意の方法で施用することができ、例えば、植物の茎葉もしくは根に接触させる噴霧剤もしくは浸漬用薬剤、または、土壌灌注用薬剤として使用され得る。特殊な設備等を用意せずとも、本発明の植物機能性成分含有量向上剤を散布等するだけで植物の機能性成分を増加させることができるため、本発明は非常に有利である。
【００５１】
本発明はまた、前述した栽培方法により栽培した機能性成分が増加した植物に関する。そのような植物は、食用として或いは化粧品や医薬品、サプリメントなどの原料として有用であると考えられる。
【００５２】
製造方法
本発明の脂肪酸代謝物を含む植物機能性成分含有量向上剤の製造方法は、炭素数４〜３０の脂肪酸を０．１〜８ｍｇ／ｌの溶存酸素濃度環境下でプロテオバクテリアに代謝させる脂肪酸代謝工程を含むことを特徴とする。
【００５３】
本発明における脂肪酸代謝工程は、所定の溶存酸素濃度環境下においてプロテオバクテリアが外分泌または内分泌する酵素等により炭素数４〜３０の脂肪酸の分解が行われる工程である。例えば、所定の溶存酸素濃度環境下、脂肪酸を含有する培地でプロテオバクテリアを培養する方法が挙げられる。
【００５４】
脂肪酸代謝工程における溶存酸素濃度は、０．１〜８ｍｇ／ｌである。溶存酸素濃度が０．１ｍｇ／ｌ未満の場合は、プロテオバクテリアの活動が低下し脂肪酸の代謝効率が極めて低くなる傾向がある。また、溶存酸素濃度が８ｍｇ／ｌを超える場合は、プロテオバクテリアによる代謝工程と並行して、基質である脂肪酸の培地中の酸素による分解が進行してしまい、代謝効率が低下し、ひいては有効成分である代謝産物の産生量が低下してしまう恐れがある。より好ましくは、溶存酸素濃度は０．１〜５ｍｇ／ｌであり、さらに好ましくは０．１〜４ｍｇ／ｌである。なお、溶存酸素濃度は株式会社堀場製作所製の溶存酸素計でＰＯ電極に隔膜ガルバニ電極法または隔膜ポーラログラフ法により測定される値とする。
【００５５】
溶存酸素濃度は、培養容器、振とう数、通気量などによって、調整することができる。
【００５６】
脂肪酸代謝工程における培養条件は、溶存酸素濃度を所定の範囲とすること以外は、従来の好気性細菌を培養する条件と同様の条件とすることができる。例えば、フラスコによる振とうや、スピナーフラスコまたはジャーファメンターによる通気培養により３〜７日間培養する方法が挙げられる。
【００５７】
培養日数は、脂肪酸の乳化、分解等が充分に行われる日数とすることが好ましいが、撹拌や菌量によって培養日数は変化する。なお、脂肪酸代謝工程の終了は、脂肪酸の分解状態を、波長２３０ｎｍにおける吸光度の測定、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）等で確認することが好ましい。
【００５８】
脂肪酸代謝工程における温度は使用するプロテオバクテリアに応じて適宜調整することができ、脂肪酸の代謝効率の観点から、２０〜３０℃の条件下で実施することが好ましい。
【００５９】
脂肪酸代謝工程における脂肪酸およびプロテオバクテリアは、本発明の植物機能性成分含有量向上剤の説明で前述したものを使用することができる。
【００６０】
なお、プロテオバクテリアの前培養工程としては、特に限定されず通常の好気性細菌の培養方法とすることができる。前培養液から遠心分離等により菌体のみを回収し、脂肪酸代謝工程に用いることが好ましい。
【００６１】
本発明の製造方法により得られる植物機能性成分含有量向上剤は、脂肪酸代謝物に加えバイオサーファクタントを含有し得る。本発明に係るバイオサーファクタントとは、微生物が疎水性の高い物質を取り込むために産生し、細胞外へと分泌する界面活性剤様の物質を意味する。本発明において、プロテオバクテリアによって分泌されたバイオサーファクタントは、脂肪酸代謝物の水への分散も容易にする。植物機能性成分含有量向上剤の取扱性が向上すると考えられる。
【００６２】
本発明の植物機能性成分含有量向上剤は、培地、バイオサーファクタントを含むプロテオバクテリアの外分泌物、菌体などとの混合物である培養液として得られる。当該培養液をそのまま本発明の植物機能性成分含有量向上剤としてもよく、培養液から遠心分離などにより菌体を除去した上澄み液を植物機能性成分含有量向上剤としてもよい。本発明の製造方法により得られる植物機能性成分含有量向上剤は、植物に施用される。培養液は原液のままでも使用することができるが、原液の場合は高温時に植物への処理部分が、ミネラル分が蒸発濃縮され浸透圧の影響で縮む恐れがあるため、原液を希釈して使用することが望ましい場合がある。希釈倍率としては本発明の効果を発揮する限り特に限定されないが、１０〜１０００倍希釈が好ましい。なお、除去した菌体を再度、脂肪酸を含有する培地で培養することにより本発明の脂肪酸代謝工程を繰り返し行うことが可能である。
【実施例】
【００６３】
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。【００６４】
試験用植物機能性成分含有量向上剤の調製
＜前培養工程＞
ガラス製三角フラスコ内の１ｌ（リットル）の水にペプトン（Ｄｉｆｃｏ製のタンパク質酵素加水分解物）２０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物１．５ｇおよびリン酸水素二カリウム１．５ｇ、または、１ｌ（リットル）の水にペプトン（Ｄｉｆｃｏ製のタンパク質酵素加水分解物）１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇおよび塩化ナトリウム１０ｇを溶解させ、１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌を行い、室温まで冷却後、プロテオバクテリアの菌液を植菌した。なお、培養容器の口はシリコン栓で密栓した。植菌後の容器をバイオシェーカー（タイテック株式会社製のＢＲ−２３ＵＭ）を用い、２５±５℃、１２０ｒｐｍの条件下で、２４時間培養を行った。培養液中の菌数は５×１０8ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった。培養後、培養液を１５，０００×Ｇ、２０℃の条件で遠心分離することで培養液から菌体を回収した。【００６５】
＜脂肪酸代謝工程＞
ガラス製三角フラスコ内の１ｌ（リットル）の滅菌水に、リノール酸（和光純薬工業株式会社製の一級リノール酸）１２ｇ、硫酸マグネシウム七水和物１．５ｇおよび／またはリン酸水素二カリウム１．５ｇ、および前培養工程から得られた菌体の全量を加えた。これを、バイオシェーカー（タイテック株式会社製のＢＲ−２３ＵＭ）を用い、２０℃、１２０ｒｐｍ、溶存酸素濃度４ｍｇ／ｌの条件下で、４日間培養を行った。なお、リノール酸の分解は、リノール酸中間生成物の１つである酸化脂質の培養液中の濃度を株式会社島津製作所製の分光光度計ＢｉｏＳｐｅｃ−ｍｉｎｉを用いて波長２３０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、確認した。培養後、菌体を含む培養液を試験用植物機能性成分含有量向上剤とし、下記の評価を行った。【００６６】
トマトにおける植物機能性成分含有量向上効果
・実施例１
一般補場にて、トマト（品種：麗夏）の幼苗５４株を６０ｃｍの株間で植え付け、１週間ごとに、試験用植物機能性成分含有量向上剤を水で５０〜１００倍希釈した希釈液を噴霧（２０ｍｌ／株程度）および／もしくは土壌灌注（２００ｍｌ／株程度）で接種した。対照区として無処理区を設けた。試験を開始してから４週間後に、トマト果実を試験区および無処理区から５個体ずつ採取して植物機能性成分の含有量を評価した。評価は、採取したトマト果実の果肉を破砕し、絹ごしして得られたろ液を凍結乾燥により乾燥させ、これをアセトニトリル：水＝１：１の溶液にて抽出した成分の、ブルカーダルトニクス社製のＭＳ定性機Ｍａｘｉｓとサーモフィッシャーサイエンティフィック社製ＨＰＬＣのＵｌｔｉｍａｔｅ３０００を用いたＬＣＭＳ多変量解析により行った。【００６７】
その結果、試験用植物機能性成分含有量向上剤で処理したトマト果実において、対照区より採取したトマト果実と比べて、プロリン、グルタミン酸、ＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）の含有量が増加していることが判明した。それぞれの増加量は、質量分析におけるピーク強度において、プロリンで２．５倍、グルタミン酸で１．２倍、ＧＡＢＡで１．４倍、であった。プロリンは甘みとして認識されたり、そのヒドロキシ誘導体に美肌効果があることなどが報告されている。また、ＧＡＢＡには血圧低下等の効果があることが報告されている。したがって、プロリンやＧＡＢＡなどはともに植物機能性成分である。【００６８】
以上の結果より、本発明の植物機能性成分含有量向上剤は優れた植物機能性成分含有量向上効果を有していることがわかる。また、プロリンやＧＡＢＡなどの本実施例において含有量の増加が観察された成分は、一般的に行われるストレス栽培において生成の促進および／または分解の抑制により含有量の増加が見られる成分であるため、本発明の植物機能性成分含有量向上剤の抵抗性誘導効果を引き起こしたストレス効果によって増加したと考えられる。すなわち、本発明の植物機能性成分含有量向上効果は、植物中での機能性成分の生成促進、植物中で生成された機能性成分の分解抑制、またはそれらの組合せの結果によるものであると考えられる。【００６９】
葉菜類、ベビーリーフ類およびハーブ類における植物機能性成分含有量向上効果
・実施例２
供試材料として、小松菜、水菜、ルッコラを用いた。培土（タキイ種苗（株）  商品名「種まき培土」）に播種し、発芽後１週間以内に、試験用植物機能性成分含有量向上剤を水で１００倍希釈した希釈液で根（地下部）のみ灌注処理した。播種後およそ１９日までのベビーリーフ期を目安に栽培した。それぞれの可食部を凍結粉砕後に凍結乾燥させ、得られた試料粉３０ｍｇをアセトリル：水＝１：１（２ｍＬ）にて抽出し、抽出液を試料として可食部に含有される成分をＬＣＭＳを用いて主成分分析した。対照として、水のみを灌注したものを準備し、同様の分析を行った。結果を図１、図２および図３ならびに表１に示す。さらに、栽培後の各植物の形質を観察した。【００７０】
図１〜図３は、それぞれ、小松菜、水菜およびルッコラにおける、本発明の植物機能性成分含有量向上剤の付与前と対比した植物機能性成分含有量向上剤付与後の機能性成分の検出量を解析したボルケーノプロットを示している。それぞれのボルケーノプロットにおいて、その横軸は、量的変化の強度変化割合値を示すものであり、マスクロマトグラム上の該当成分エリア値（成分量とほぼ同義である）の変化割合（Ｆｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅ）を底２の対数表示で示したものである。各図中の網掛け部分はｌｏｇ2（Ｆｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅ）の値が１以上である差がある部分で、植物機能性成分含有量向上剤の付与前と付与後とで該当成分のエリア値に２倍以上の差が見られることを示している。そして、各図上の左側の網掛け部分が、植物機能性成分含有量向上剤の付与前と比較して付与後の機能性成分のエリア値が２倍以上高値であることを示している。なお、ここで、−２倍未満の領域は、植物機能性成分含有量向上剤の付与前と付与後のエリア値に有為差があるとは便宜上考えない。【００７１】
縦軸は、統計的信頼度ｐ値を示すものであり、そのときの統計的なｐ値の逆数の対数（１０を底とする）を示している。一般的に、ｐ値が０．０５未満である場合に信頼性があると判断される。−ｌｏｇ10０．０５は、１．３であるので、網掛け領域は縦軸の１．３以上の領域となる。つまり、図１〜図３における図面上の左側の網掛け領域は、本発明の植物機能性成分含有量向上剤を付与することで、マススペクトルで検出される成分が有為に増え、その成分が存在し、かつ増加しているという事象の信頼度が高い領域である。この領域に存在しているプロット数が、本発明の植物機能性成分含有量向上剤を付与することで特異的に増加した成分数であると言える。【００７２】
図１に示されるように、小松菜の抽出液のＬＣＭＳのボルケーノプロットにおいて量とそのばらつきにおいて明確に増加した成分が２１個見出された。図２に示されるように、水菜の抽出液のＬＣＭＳのボルケーノプロットにおいて量とそのばらつきにおいて明確に増加した成分が２３個見出された。図３に示されるように、ルッコラの抽出液のＬＣＭＳのボルケーノプロットにおいて量とそのばらつきにおいて明確に増加した成分が１８個見出された。【００７３】
【表１】
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【００７４】
それぞれの植物において特異的に増加した成分のうちの代表的な機能性成分とその増加量が表１に示されている。グルコシノレート類の含有量は、試験用植物機能性成分含有量向上剤で処理した小松菜において９．８倍、そして水菜において５．５倍有意に増加していた。また、ルッコラにおいては、ルテオリン配糖体が１．５倍有意に増加していた。グルコシノレートは硫黄を含むグルコース配糖体であり、発がん抑制作用のあるイソチアシネートなどの前駆体ともなる機能性成分である。また、ルテオリン配糖体は、抗炎症活性や抗酸化活性を有することが報告されている。また、ポリフェノール類の有意な増加も検出され、例えば、試験用植物機能性成分含有量向上剤で処理した小松菜において２．７倍（クロロゲン酸）および１．８倍（スコポレチン）、ルッコラにおいて１．５倍（シナピルアルデヒド）および１．９倍（シナピン酸）、水菜において２．１倍（シナピルアルデヒド）増加していた。これらのポリフェノール類は機能性成分として抗酸化作用や脂肪燃焼作用の効果が報告されているものである。その他、アミノ酸等の増加も検出された。この結果より、本発明の植物機能性成分含有量向上剤が、様々な植物に含まれる種々の機能性成分の生成を促進、および／または分解を抑制して、それらの成分量を増大させることができることがわかる。【００７５】
栽培後の各植物の形質を観察した結果、水菜において、針状トライコームの形成固体が増加していた。ルッコラでは、茎部分を中心に赤系色素が増加していた。これらの形質の変化は、植物のストレス応答反応を由来とするものであり、したがって、本発明の植物機能性成分含有量向上剤が、植物のストレス耐性機能を強化すること、そしてその結果、植物機能性成分含有量を増加させていることがわかる。【００７６】
ハウス栽培トマトにおける植物機能性成分含有量向上効果
・実施例３
屋外一般圃場にて、トマト（品種：レイカ）の第８葉まで展開した苗３６株を６月に圃場に定植した。圃場は３つの畝にそれぞれマルチングシートを敷いて栽培した。試験区は試験用植物機能性成分含有量向上剤を水で５０〜１００倍希釈した希釈液を１株あたり２００ｍｌになるように２週間に１回根元に灌注し、与えた。対照区として無処理区を設けた。試験区および対照区ともに、水は散水チューブにて適宜トマト苗の状態に応じて与えた。試験を開始してから２か月後に、トマト果実を試験区および無処理区から同時期に開花した第一花房から実を無作為に５個体ずつ採取して植物機能性成分の含有量を評価した。評価は、採取したトマト果実の果肉を破砕し、絹ごしして得られたろ液を凍結乾燥して乾燥させ、これをアセトニトリル：水＝１：１の溶液にて抽出した成分の、サーモフィッシャー製のＱ−ＥＸＡＣＴＩＶＥ−ＦＯＣＵＳ−ＬＣＭＳを用いたＬＣＭＳ多変量解析により行った。なお、ＬＣＭＳは、下記の方法で測定した。【００７７】
ＬＣＭＳの移動相としては、移動相Ａを０．１％ぎ酸＋超純水、および、移動相Ｂを０．１％ぎ酸＋アセトニトリルとして、グラジエント法を用い、測定開始後０分から２分までが、移動相Ａ：移動相Ｂ＝９８：２、その後組成を変化させ、６分後における移動相Ａと移動相Ｂとの比が移動相Ａ：移動相Ｂ＝２：９８となるようにして２０分後まで、０．３ｍＬ／分の流量で流した。カラムは、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（１．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ）（ウォーターズ社製）を用いた。【００７８】
その結果、試験用植物機能性成分含有量向上剤で処理したトマト果実において、プロリン、ＧＡＢＡ、およびグルタミン酸等の機能性成分の含有量が増加していた。増加した代表的な成分およびその増加量を表２に示した。【００７９】
【表２】
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【００８０】
試験用植物機能性成分含有量向上剤で処理することにより、トマト果実の糖度が増加し、グルタミン酸の蓄積が促進され、さらにＧＡＢＡの分解が抑制されていることがわかる。また、コラーゲンの合成促進などの機能性のあるプロリンも２．１倍に増加していた。この結果より、本発明の植物機能性成分含有量向上剤は、顕著な植物機能性成分生成促進および／または植物機能性成分分解抑制効果を有しており、このため、植物体内の植物機能性成分含有量の向上に優れた効果を有していることがわかる。【００８１】
上記の結果より、本発明の植物機能性成分含有量向上剤および本発明の製造方法により製造される植物機能性成分含有量向上剤が、植物における機能性成分含有量向上効果に優れた植物機能性成分含有量向上剤であることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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