(57)【要約】  哺乳類細胞、特にＣＨＯ細胞において組換えタンパク質の遺伝子発現を安定化し発現効率を増大させることができるエレメントを提供する。  配列番号１で示す配列からなるＤＮＡ；配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４１８２０番目から４１８３９番目まで、４１８２１番目から４１８４０番目まで、４５１８２番目から４５２００番目まで、もしくは９１０９４番目から９１１１３番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；これらのＤＮＡの均等物；及びこれらのＤＮＡの相補体のいずれか一つ又はそれらの任意の組合せからなる遺伝子発現安定化エレメント。
2010023787.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれか一つ又はそれらの任意の組合せからなることを特徴とする遺伝子発現安定化エレメント：
（ａ）配列番号１で示す配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４１８２０番目から４１８３９番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４１８２１番目から４１８４０番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４５１８２番目から４５２００番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｅ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち９１０９４番目から９１１１３番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｆ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、宿主細胞中で外来遺伝子発現カセットと近接するように配置された際に、外来遺伝子発現カセットに含まれる外来遺伝子からの目的組換えタンパク質の発現を増大または安定化させることができるＤＮＡ；及び
（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのＤＮＡの相補体。
【請求項２】
（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡが、配列番号１で示す配列のうち４１６０１番目から４６７４６番目までの塩基で示す領域、又はその一部からなることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子発現安定化エレメント。
【請求項３】
（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡが、配列番号１で示す配列のうち４１６０１番目から４２７００番目までの塩基で示す領域、又はその一部からなることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子発現安定化エレメント。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子発現安定化エレメント、及びそれに近接して配置された外来遺伝子発現カセットを含むことを特徴とする外来遺伝子発現ベクター。
【請求項５】
遺伝子発現安定化エレメントが、外来遺伝子発現カセットの上流及び下流の両方に配置されていることを特徴とする請求項４に記載の外来遺伝子発現ベクター。
【請求項６】
複数の外来遺伝子を含むことを特徴とする請求項４又は５に記載のベクター。
【請求項７】
複数の外来遺伝子が、抗体の重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子発現安定化エレメントと外来遺伝子発現カセットとがゲノム中に相互に近接するように配置されていることを特徴とする形質転換された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換えによって外来遺伝子が導入された哺乳類細胞において、組換えタンパク質を効率良く、安定して生産するために使用することができる遺伝子発現安定化エレメントに関する。本発明の遺伝子発現安定化エレメントは、遺伝子工学的手法により、哺乳類細胞において医薬品などの有用タンパク質を生産するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質を生産する発現システムの開発は、研究または治療に供されるタンパク質の供給源を提供するうえで重要である。発現システムとしては、大腸菌などの原核生物、ならびに酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，ＰｉｃｈｉａおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種）および哺乳類細胞を含む真核細胞の両者が用いられている。これらの中で、特に哺乳類細胞における発現システムが治療用タンパク質の製造には好ましい。なぜなら、ヒトをはじめとする哺乳動物において起こるタンパク質の翻訳後修飾は、時にその生物活性に深く寄与するため、タンパク質の投与対象と類似した翻訳後修飾が可能な哺乳類細胞発現システムを利用した方が、治療用タンパク質の有効性を増強しうるからである。【０００３】
哺乳類細胞発現システムとしては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）が広く利用される。ＣＨＯ細胞を用いて組換えタンパク質を高発現するために様々なアプローチが行われてきた。古典的なアプローチとしては、ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎと称される、目的の組換えタンパク質を発現する導入遺伝子のコピー数を増大させた高発現クローンを選択する方法が挙げられる。この方法によれば、ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅのような選択遺伝子と組換えタンパク質を発現する遺伝子とを、選択条件下では生育に選択遺伝子の発現を必要とする変異型細胞に同時導入し、次第に淘汰圧を上げることによって高発現クローンが取得される（非特許文献１，２）。さらに近年のアプローチとしては、ＣＨＯ細胞の核酸配列の中から内在性プロモーターや好ましいインテグレーション部位の核酸配列などを単離し、ベクターに導入する方法が挙げられる。内在性プロモーターとしては、Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ＥＦ−１ａｌｐｈａ（ＣＨＥＦ１）が利用されている（非特許文献３）。一方、インテグレーション部位を使用する方法では、高い転写活性のある染色体上の稀な部位（ホットスポット）を同定し、この部位に導入遺伝子を導入する（特許文献１）。この他にも、高発現細胞の選択やスクリーニング方法の改良、代謝工学的アプローチも行われている。これらのアプローチは、ある程度の高発現を可能にするが、その一方で、高発現株を取得するには膨大な時間を必要としたり、製造フェーズで組換えタンパク質の安定した合成を維持できないケースがある。【０００４】
組換えタンパク質の発現は、組換えタンパク質をコードする遺伝子が宿主細胞ゲノム内のどの部位に導入されるかによって大きく変動するが、導入部位の制御は通常、不可能である。従って、遺伝子導入しても大半の細胞は組換えタンパク質を発現しなかったり、発現量が低いため、スクリーニングに膨大な労力を要する。これに加え、スクリーニング時には十分な発現をしていた細胞でも培養を継続していくうちに次第に発現が低下してしまうこともある。このような位置効果や多大なスクリーニングの必要性を克服するため、導入遺伝子への隣接する染色体や調節エレメントの影響を緩和する染色体エレメント（シス作用性ＤＮＡエレメント）が組換えタンパク質の製造に利用されつつある。このようなエレメントの１つがインスレーターと呼ばれる配列で、ニワトリのβ−グロビンＬＣＲの１．２ｋｂ長のＤＮａｓｅＩ  Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ部位（ｃＨＳ４）などが良く機能解析され、組換えタンパク質の発現に利用されているが（非特許文献４）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるタンパク質発現の増加はそれほど大きなものではないとされている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ００／１７３３７号公報
【特許文献２】特開２００１−３７４７８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋａｕｆｍａｎ  Ｒ，Ｓｈａｒｐ  Ｐ．（１９８２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５９：６０１−６２１
【非特許文献２】Ｓｃｈｉｍｋｅ  Ｒ，Ｂｒｏｗｎ  Ｐ，Ｋａｕｆｍａｎ  Ｒ．（１９８２）  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  Ｍｏｎｏｇｒ  ６０：７９−８６
【非特許文献３】Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｄｅｅｒ  Ｊ，Ａｌｌｉｓｏｎ  ＤＳ（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２０：８８０−８８９
【非特許文献４】Ｐｉｋａａｒｔ  ＭＪ，Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ  Ｆ，Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ  Ｇ．（１９９８）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １２：２８５２−６２
【非特許文献５】Ｉｚｕｍｉ  Ｍ，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＤＭ．（１９９９）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７６：２８０−２８９
【非特許文献６】Ｂｌａｓｃｏ  ＭＡ（２００７）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ８：２９９−３０９
【非特許文献７】Ｇｏｎｚａｌｏ  Ｓ，Ｊａｃｏ  Ｉ，Ｆｒａｇａ  ＭＦ，Ｃｈｅｎ  Ｔ，Ｌｉ  Ｅ，Ｅｓｔｅｌｌｅｒ  Ｍ，Ｂｌａｓｃｏ  ＭＡ（２００６）Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８：４１６−４２４
【非特許文献８】Ｐｅｒｒｏｄ  Ｓ，Ｇａｓｓｅｒ  ＳＭ（２００３）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６０：２３０３−２３１８
【非特許文献９】Ｗａｋｉｍｏｔｏ  ＢＴ（１９９８）Ｃｅｌｌ  ９３：２３０３−２３１８
【非特許文献１０】ＭｃＢｒａｔｎｅｙ  Ｓ，Ｃｈｅｎ  ＣＹ，Ｓａｒｎｏｗ  Ｐ．（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：９６１−９６５
【非特許文献１１】Ｋａｕｆｍａｎ  ＲＪ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４４８５−４４９０
【非特許文献１２】Ｂａｏ  Ｌ，Ｚｈｏｕ  Ｍ，Ｃｕｉ  Ｙ（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６，Ｄ８３−Ｄ８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、哺乳類細胞、特にＣＨＯ細胞において組換えタンパク質の遺伝子発現を安定化し発現効率を増大させることができるエレメントを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため、導入された外来性遺伝子が高度に遺伝子増幅されて高度に遺伝子発現するＣＨＯ細胞クローンにおいて外来遺伝子導入部位の近傍の配列を詳しく分析した結果、遺伝子発現の安定化及び発現効率の増大に寄与する特定の領域を同定することに成功し、本発明を完成させるに到った。【０００９】
すなわち、本発明によれば、以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれか一つ又はそれらの任意の組合せからなることを特徴とする遺伝子発現安定化エレメントが提供される：
（ａ）配列番号１で示す配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４１８２０番目から４１８３９番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４１８２１番目から４１８４０番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４５１８２番目から４５２００番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｅ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち９１０９４番目から９１１１３番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｆ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、宿主細胞中で外来遺伝子発現カセットと近接するように配置された際に、外来遺伝子発現カセットに含まれる外来遺伝子からの目的組換えタンパク質の発現を増大または安定化させることができるＤＮＡ；及び
（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのＤＮＡの相補体。
本発明の遺伝子発現安定化エレメントの好ましい態様によれば、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡは、配列番号１で示す配列のうち４１６０１番目から４６７４６番目、好ましくは４１６０１番目から４２７００番目までの塩基で示す領域、又はその一部からなる。【００１０】
また、本発明によれば、かかる遺伝子発現安定化エレメント、及びそれに近接して配置された外来遺伝子発現カセットを含むことを特徴とする外来遺伝子発現ベクター、並びにかかる遺伝子発現安定化エレメントと外来遺伝子発現カセットとがゲノム中に相互に近接するように配置されていることを特徴とする形質転換された宿主細胞も提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の遺伝子発現安定化エレメントは、近接して配置された外来遺伝子への隣接染色体や調節エレメントの影響を低減させて外来遺伝子の遺伝子発現を安定化し発現効率を増大させることができるので、哺乳類細胞発現システム、特にＣＨＯ細胞発現システムにおける高発現細胞株の樹立作業を低減短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】配列番号１の配列中のＣＴＣＦの結合配列モチーフの予測部位を示す図である。
【図２】核酸配列断片の遺伝子発現安定化効果の確認に用いた基本コンストラクトｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰ２６ｍの構築を示す図である。
【図３】配列番号１の配列中のＣＴＣＦの結合配列モチーフ及び被験配列の核酸断片の位置を示す図である。
【図４】各核酸配列の断片を含むＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを安定導入されたＣＨＯ細胞をＦＡＣＳ解析して得られたＳＮＡＰ２６ｍ発現強度と細胞数の分布を示すグラフである。
【図５】各核酸配列の断片を含むＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを安定導入されたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ解析の結果、１０以上のＳＮＡＰ２６ｍの蛍光シグナルを呈した細胞の割合（％）をプロットしたグラフである。
【図６】ＣＨＯ５のデリーションコンストラクト構築、及び配列番号１の配列中の被験配列の位置を示す図である。
【図７】ＣＨＯ５、及びＣＨＯ５デリーションコンストラクトを安定導入して得られたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ解析の結果、１０以上のＳＮＡＰ２６ｍの蛍光シグナルを呈した細胞の割合（％）をプロットしたグラフである。
【図８】ＣＨＯ５Δ３の３’デリーションコンストラクト構築のためのＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法に用いたプライマーの位置、及びデリーションによって得られた被験挿入配列を示す図である。
【図９】ＣＨＯ５Δ３、及びＣＨＯ５Δ３の３’デリーションコンストラクトを安定導入して得られたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ解析の結果、１０以上のＳＮＡＰ２６ｍの蛍光シグナルを呈した細胞の割合（％）をプロットしたグラフである。
【図１０】ＫＯＤ３Ｇ８抗体生産系での核酸配列断片の遺伝子発現安定化効果の確認に用いた基本コンストラクトｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２の構築を示す図である。
【図１１】ＫＯＤ３Ｇ８抗体生産系での核酸配列断片の遺伝子発現安定化効果の確認に用いた基本コンストラクトｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２の構築を示す図である。
【図１２】ＫＯＤ３Ｇ８抗体生産系での核酸配列断片の遺伝子発現安定化効果の確認に用いた、各被験配列を挿入済のＨ鎖あるいはＬ鎖発現ベクターを示す図である。
【図１３】被験配列を含まないもの（ｃｔｒｌ）、被験配列ＣＨＯ５Δ３を発現カセットの上流に挿入したもの（２．６ｋ）、被験配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流に挿入したもの（１．１ｋ）、被験配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／１．１ｋ）について、ポリクローンの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、抗体生産量をプロットしたグラフである。
【図１４】９６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフである。被験配列を含まないもの（ｃｔｒｌ）と被験配列ＣＨＯ５Δ３を発現カセットの上流に挿入したもの（２．６ｋ）、および被験配列を含まないもの（ｃｔｒｌ）と被験配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／１．１ｋ）をそれぞれ同一グラフ上にプロットしている。
【図１５】６ウェルプレートの培養上清を用いてＥＬＩＳＡを行い算出した、各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフである。被験配列を含まないもの（ｃｔｒｌ）と被験配列ＣＨＯ５Δ３を発現カセットの上流に挿入したもの（２．６ｋ）、および被験配列を含まないもの（ｃｔｒｌ）と被験配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／１．１ｋ）をそれぞれ同一グラフ上にプロットしている。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の遺伝子発現安定化エレメントは、特許文献２に記載のＣＨＯ細胞ＤＲ１０００Ｌ−４Ｎ株（ＣＨＯ細胞−４Ｎ株）から本発明者らによって同定された核酸分子である。当該株は、外来遺伝子としてヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子を、ＤＨＦＲ遺伝子を持つ発現ベクターに導入し、このベクターを、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞ＤＧ４４株に導入し、導入株をＩＭＤＭ培地（核酸含有）に１０％牛胎児血清を添加した培地で培養して形質転換体を得、この形質転換体を、次いでＩＭＤＭ培地（核酸不含）、１０％透析牛胎児血清を添加した培地で選択し、さらに５０ｎＭ、１００ｎＭのメトトレキセート（ＭＴＸ）を含み、核酸を含まないＩＭＤＭ培地を用いて１０から１００倍程度に増加するまで培養し、ＭＴＸ濃度を上昇させることにより得られたテロメアタイプのクローン細胞である。
【００１４】
真核細胞のゲノムは、真正染色質と異質染色質の２つのクラスの染色質に分けられる。セントロメアとテロメアの配列は、構成的な異質染色質の主要な部分である。特に、テロメアは、ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列とサブテロメア領域からなり、際立った異質染色質の立体構造をとる、遺伝子の乏しい領域である（非特許文献６，７）。テロメアは、ゲノムの安定性に対するその寄与や保護的な役割に加え、テロメア位置効果として知られる現象によって、近くに導入された遺伝子の発現にも影響を与える（非特許文献８，９）。
【００１５】
ところが、ＤＲ１０００Ｌ−４Ｎ株は、テロメアタイプのクローン細胞であるにもかかわらず、導入された外来遺伝子は導入部位付近の異質染色体からの不活性化の影響を受けることなく、長期間の培養において、安定したｈＧＭ−ＣＳＦの高い産生を維持した。これは、外来遺伝子の導入された部位の近傍に、不活性化の進行を強力に遮断するような境界エレメントが存在し、遺伝子発現を安定化していることを示唆する。
【００１６】
そこで、本発明者らは、ＤＲ１０００Ｌ−４Ｎ株において外来遺伝子導入部位の近傍の配列を分析した結果、配列表の配列番号１で示す約９１ｋｂｐの配列からなるＤＮＡが遺伝子発現の安定化に関与していることを見出した。そして、この配列をさらに詳細に分析したところ、この配列の中でも、（ｉ）４１８２０番目から４１８３９番目までの塩基で示す領域、（ｉｉ）４１８２１番目から４１８４０番目までの塩基で示す領域、（ｉｉｉ）４５１８２番目から４５２００番目までの塩基で示す領域、及び（ｉｖ）９１０９４番目から９１１１３番目までの塩基で示す領域の４つの領域が、インスレーター結合タンパク質ＣＴＣＦの結合配列モチーフに相当することを見出した。従って、これらの４つの領域の少なくともいずれかを含む、これらの領域の近傍が特に遺伝子発現の安定化に関与していると考えられた。
【００１７】
これらの知見から、本発明者らは、以下の５種類のＤＮＡが遺伝子発現安定化エレメントとして使用できると考えた。
（ａ）配列番号１で示す配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４１８２０番目から４１８３９番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４１８２１番目から４１８４０番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４５１８２番目から４５２００番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；及び
（ｅ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち９１０９４番目から９１１１３番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ。
【００１８】
これらのエレメントは、ＣＨＯゲノムから単離同定されたものであるが、これらのエレメントと相同なエレメントは、他の哺乳類細胞ゲノムにも存在することが予想される。従って、（ｆ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、宿主細胞中で外来遺伝子発現カセットと近接するように配置された際に、外来遺伝子発現カセットに含まれる外来遺伝子からの目的組換えタンパク質の発現を増大または安定化させることができるＤＮＡも、遺伝子発現安定化エレメントとして使用することができる。このような相同エレメントは、この技術分野の周知の技術、例えば、種間ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲなどによって容易に単離同定されることができる。
【００１９】
また、（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのＤＮＡの相補体も当然、遺伝子発現安定化エレメントとして使用することができる。本発明の遺伝子発現安定化エレメントは、これらの（ａ）〜（ｇ）のいずれか一つ又はそれらの任意の組合せからなる。
【００２０】
本発明の遺伝子発現安定化エレメントの好ましい態様では、前記（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡは、配列番号１で示す配列のうち４１６０１番目から４６７４６番目までの塩基で示す領域、又はその一部からなる。本発明の遺伝子発現安定化エレメントのさらに好ましい態様では、前記（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡは、配列番号１で示す配列のうち４１６０１番目から４２７００番目までの塩基で示す領域、又はその一部からなる。
【００２１】
目的遺伝子を宿主細胞ゲノムへ導入するための遺伝子構築物としては、プラスミドベクターが一般に用いられる。プラスミドベクターの長さは最大１０ないし２０ｋｂｐであることから、遺伝子発現安定化エレメントの鎖長は出来るだけ短い方が好ましく、好ましい長さとしては５ｋｂｐ以下、より好ましくは１ｋｂ程度である。
【００２２】
本発明の遺伝子発現安定化エレメントがその発現安定化効果を奏するためには、エレメントが宿主細胞ゲノム中で外来遺伝子発現カセットの導入部位に近接する位置に配置されることが必要である。本発明において、用語「近接する」とは、特に制限されるものではないが、好ましくは本発明の遺伝子発現安定化エレメントと外来遺伝子発現カセットとの間の距離が５０００ｂｐ以下、さらに好ましくは５００ｂｐ以下であることを意味する。
【００２３】
このような近接配置は、本発明のエレメントを含む核酸配列断片と、外来遺伝子の発現カセットを含む核酸配列断片との混合物をエレクトロポレーションやトランスフェクションなどによって宿主細胞内へ導入し、外来遺伝子の発現量の高い宿主細胞クローンを選択することによって実現することもできるが、近接配置を確実に達成させるためには、本発明の遺伝子発現安定化エレメント、及びそれに近接して配置された外来遺伝子発現カセットを含む外来遺伝子発現ベクターをあらかじめ作成しておき、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換させることが望ましい。
【００２４】
本発明において、外来遺伝子の発現カセットとは、例えば外来遺伝子を哺乳類細胞で発現可能なエンハンサー及びプロモーターの下流に配置し、転写された外来遺伝子のＲＮＡが安定化するようにポリアデニル化シグナルを外来遺伝子の下流に配置したものである。かかる発現カセットは、イントロンなどの調節エレメントをさらに含んでもよい。哺乳類細胞で発現可能なエンハンサー及びプロモーターとしては、特に限定されるものではないが、ヒトやマウスのサイトメガロウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスに由来するものや、β−アクチンやユビキチン、ＧＡＰＤＨ、ＥＦ−１αなどの非ウイルス性の細胞遺伝子に由来するエンハンサー／プロモーター、及びそのハイブリッドが挙げられる。外来遺伝子発現カセットには、初めから外来遺伝子を配置しておく必要は必ずしもなく、外来遺伝子の代わりに複数の制限酵素認識配列からなるマルチクローニングサイトを配置しておき、そこに様々な外来遺伝子のｃＤＮＡやコーディング領域を後で導入してもよい。
【００２５】
本発明のベクターにおいては、外来遺伝子発現カセットの上流及び下流の両方に、外来遺伝子発現カセットを挟むように、本発明の遺伝子発現安定化エレメントが配置されていることがさらに好ましい。また、本発明のベクターは、複数の外来遺伝子を含むことが好ましく、これらの複数の外来遺伝子は、抗体の重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチドをコードすることが好ましい。
【００２６】
本発明のベクターとしては、外来遺伝子が導入された細胞を選択するため、薬剤耐性遺伝子を発現できるものがさらに好ましい。薬剤耐性遺伝子としては、ｄｅａｍｉｎａｓｅをコードするＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ（ｂｓｒ）由来のブラストサイジン耐性遺伝子、ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ３’−ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅをコードするＴｎ５由来のネオマイシン耐性遺伝子、大腸菌由来ｈｐｈをコードするハイグロマイシン耐性遺伝子、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  Ｎ−ａｃｅｔｈｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＰＡＣ）をコードするピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。さらに、ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＤＨＦＲ）遺伝子、ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＧＳ）遺伝子などの選択マーカー遺伝子を用いてもよい。
【００２７】
本発明のベクターでは、前記薬剤耐性遺伝子を含む、２つ以上の外来タンパク質を発現させるために“プロモーター−外来遺伝子−ポリアデニル化シグナル”からなる発現カセットを複数含んでもよい。また、“プロモーター−外来遺伝子１−−外来遺伝子２−ポリアデニル化シグナル”のように同じプロモーターの転写調節下に外来遺伝子１，２を配置し、外来遺伝子１，２の間に内在性リボソームエントリー部位（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅｓ、ＩＲＥＳ）を導入し、発現カセット中の第２の遺伝子生成物の翻訳を増強する方法も有用である（非特許文献１０，１１）。
【００２８】
本発明の遺伝子発現安定化エレメントが導入される細胞としては、組換えタンパク質の産生に一般的に用いられるチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）の他、ベビーハムスターキドニー細胞（ＢＨＫ）、ヒト繊維肉腫細胞（ＨＴ１０８０）などの哺乳類由来の細胞が例示されるが、これに限定されるものではなく、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ブタなどの動物由来の細胞なども導入対象とすることができる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。【００３０】
実施例１  核酸配列の決定
ＣＨＯ細胞ＤＲ１０００Ｌ−４Ｎ株（ＣＨＯ細胞−４Ｎ株）より作成されたＢＡＣライブラリーのうち、ｈＧＭ−ＣＳＦ発現カセットを含むクローンＣｇ００３１Ｎ１４を単離した。このクローンＣｇ００３１Ｎ１４に由来するＢＡＣより作成したショットガンクローンの５’，３’ワンパスシーケンスを実施し、Ｐｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ／Ｃｏｎｓｅｄによる配列情報のアッセンブルを行い、ｈＧＭ−ＣＳＦ発現カセットが導入されたＣＨＯ細胞の近傍のゲノム配列約９１ｋｂｐの配列を決定した。その配列を、配列表の配列番号１に示す。【００３１】
実施例２  核酸配列の解析
前記決定された核酸配列中にインスレーター配列が存在するかどうかを、インスレーター結合タンパク質ＣＴＣＦの結合配列モチーフを検索することによって調査した。解析ツールとしてＩｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ＣＴＣＦＢＳ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｉｎｓｕｌａｔｏｒｄｂ．ｕｔｍｅｍ．ｅｄｕ／）（非特許文献１２）を使用した。前記ツールで抽出されたモチーフ配列を表１及び図１に示す。【００３２】
【表１】
2010023787.tif 000003
【００３３】
実施例３  導入遺伝子発現の安定化効果の確認
図２に示すスキームに従って、プラスミドｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰ２６ｍを構築した。即ち、まずＥｍｅｒａｌｄ  ＬｕｃベクターｐＥＬｕｃ−ｔｅｓｔ（東洋紡績）の制限酵素ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩサイトにＣＭＶプロモーター（配列番号６）を導入されたｐＥＬｕｃ−ＣＭＶプラスミドからＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩでＥｍｅｒａｌｄ  Ｌｕｃ（ＥＬｕｃ）遺伝子を切出した。一方、ＳＮＡＰｍ発現プラスミドｐＳＮＡＰｍ（Ｃｏｖａｌｙｓ社）からＳＮＡＰ２６ｍ遺伝子を配列番号７，８のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＬｕｃ−ＣＭＶプラスミドのＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに導入してｐＳＮＡＰ２６ｍ−ＣＭＶを構築した。続いて、ｐＳＮＡＰ２６ｍ−ＣＭＶより、ＣＭＶプロモーター／ＳＮＡＰ２６ｍ／ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡを配列番号９，１０のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、部分消化によって、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社）のＢａｍＨＩ、ＳａｃＩサイトへ導入し、プラスミドｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰ２６ｍを構築した。【００３４】
次に、実施例１で作成したショットガンライブラリーのクローンうち、４１８２０位、４５１８２位のＣＴＣＦの結合配列モチーフの付近のＣＨＯゲノム配列を含むクローンを抽出し、ＣＨＯゲノムに由来する導入配列（図３参照）をＰＣＲで増幅し、ｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰ２６ｍのＫｐｎＩ、ＸｈｏＩまたはＸｈｏＩ、ＣｌａＩサイトに導入した。ショットガンライブラリークローンと、当該導入配列が組み込まれたＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトの対応関係を表２に示す。なお、表２中のＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトの欄の（−）は、ＣＨＯのゲノム配列が導入されていないｐＢＳ−ＣＭＶ−ＳＮＡＰ２６ｍである。【００３５】
【表２】
2010023787.tif 000004
【００３６】
これらのＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトとｐＰＵＲ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性ベクター）を制限酵素ＡｈｄＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）でリニアライズした後、それぞれ重量比が９：１となるように混合して混合プラスミドを調製した。【００３７】
一方、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整したＣＨＯ−Ｋ１細胞を１２ウェルプレートに２ｍｌずつ前日に播種し、一晩培養して、トランスフェクション用のＣＨＯ−Ｋ１細胞を準備した。この際、培地として１０％牛胎児血清を添加したＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（日水製薬）を使用した。【００３８】
トランスフェクションは、１８μｌ  ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（メルク）を６００μｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ）で希釈し、前記の混合プラスミド１μｇにこの希釈液１０３μｌを加え、１０分間放置した後、この混合液を前記ＣＨＯ−Ｋ１細胞に加え、２４時間インキュベートすることにより行った。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク）で処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、６μｇ／ｍｌ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で３週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、２×１０５細胞を１２ウェルプレートに播き込み、翌日、０．５ｍｌのＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地に２μＭ  ＳＮＡＰ−Ｃｅｌｌ−５０５（Ｃｏｖａｌｙｓ社）を加え、６０分間、３７℃でインキュベートした。その後、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地で３回リンスし、培地交換をしながら、１０分間のインキュベートを３回行い、未反応の蛍光色素を除去した。この細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、Ｄ−ＰＢＳ（−）（ナカライテスク）に細胞を懸濁し、フローサイトメーターＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。【００３９】
図４は、被験配列ＣＨＯ１〜ＣＨＯ６がそれぞれ導入されたＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果を示す。また、図５は、未処理のＣＨＯ細胞（図４左上の（−））の解析結果から１０以上のシグナル（図４中のＭ２）を示す細胞をＳＮＡＰ２６ｍの発現細胞とし、その細胞の割合をプロットしたグラフである。図４，５から明らかな通り、ＣＨＯ細胞ゲノムの一部を導入したコンストラクト、特に配列番号１の４１６０１〜４６７４６位を導入したＣＨＯ４及び５において、有意な発現の上昇が認められた。ＣＨＯ４とＣＨＯ５の間の差異はサンプル間のバラツキの範囲内と考えられるが、念のため、以後の最適領域の絞り込みはＣＨＯ５に基づいて実施した。【００４０】
実施例４  遺伝子発現安定化能を有する配列領域の絞り込み（１）
実施例３で発現の上昇が最も高かったコンストラクトＣＨＯ５をもとに、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績）を用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号２１、２２のプライマーを使って被験配列から配列番号１の４１６０１−４２９０２位に相当する領域をデリーションしたＣＨＯ５Δ５を構築した。同様にして、配列番号２３，２４のプライマーを使って被験配列から配列番号１の４２９０３−４４２００位に相当する領域をデリーションしたＣＨＯ５ΔＭ、及び配列番号２５，２６のプライマーを使って被験配列から配列番号１の４４２０１−４６７４６位に相当する領域をデリーションしたＣＨＯ５Δ３をそれぞれ構築した（図６）。【００４１】
これらのＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトとｐＰＵＲ（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性ベクター）を制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした後、それぞれ重量比が９：１となるように混合して混合プラスミドを調製した。【００４２】
前記の混合プラスミド１μｇを、前日に１２ウェルプレートに播種しておいたＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、６μｇ／ｍｌ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で３週間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、２×１０５細胞を１２ウェルプレートに播き込み、翌日、０．５ｍｌのＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地に２μＭ  ＳＮＡＰ−Ｃｅｌｌ−５０５（Ｃｏｖａｌｙｓ社）を加え、６０分間、３７℃でインキュベートした。その後、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地で３回リンスし、培地交換をしながら、１０分間のインキュベートを３回行い、未反応の蛍光色素を除去した。この細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、Ｄ−ＰＢＳ（−）（ナカライテスク）に細胞を懸濁し、フローサイトメーターＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。【００４３】
図７は、被験配列ＣＨＯ５Δ５、ＣＨＯ５ΔＭ、ＣＨＯ５Δ３がそれぞれ導入されたＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果、シグナル値１０以上を示した細胞の割合をプロットしたものである。図７から明らかな通り、ＣＨＯ５Δ３についてはデリーション前とほぼ同程度のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度が認められたのに対し、ＣＨＯ５ΔＭ、ＣＨＯ５Δ５では発現上昇の効果が明らかに低減した。このことから、発現の安定化には配列番号１の配列の４１６０１〜４６７４６位のうちの５’側〜前半部分が主に寄与していると考えられる。【００４４】
実施例５  遺伝子発現安定化能を有する配列領域の絞り込み（２）
配列番号２６〜３１のプライマーを使用し、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績）を用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、ＣＨＯ５Δ３の被験配列の３’がさらにデリーションされたＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを構築した（図８及び表３参照）。【００４５】
【表３】
2010023787.tif 000005
【００４６】
これらのＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトを実施例４と同様にして処理し、ＳＮＡＰ２６ｍの発現強度を解析した。【００４７】
図９は、被験配列ＣＨＯ５Δ３、ＣＨＯ５Δ３−１〜５のＳＮＡＰ２６ｍ発現コンストラクトで形質転換された細胞集団のＦＡＣＳ解析の結果、シグナル値１０以上を示した細胞の割合をプロットしたものである。図９から明らかな通り、配列番号１の配列の４１６０１〜４２７００位を含むＣＨＯ５Δ３−１からＣＨＯ５Δ３−３までについては、サンプル間のバラツキはあるものの、デリーション前とほぼ同程度のＳＮＡＰ２６ｍの発現強度が認められたのに対し、かかる領域の３’側が欠失したＣＨＯ５Δ３−４及びＣＨＯ５Δ３−５では発現上昇の効果が明らかに低減した。【００４８】
実施例６  抗ＫＯＤ抗体発現系における遺伝子発現安定化能の評価
図１０および１１に示すスキームに従って、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２およびｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２を構築した。即ち、既存のプロモーターをＥＦ−１αプロモーターに変更したｐＣＩ−ｎｅｏプラスミド（プロメガ社）のＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトに抗ＫＯＤ抗体の重鎖あるいは軽鎖を挿入したプラスミドであるｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣあるいはｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣを鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績）を用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号３２、３３のプライマーを使って発現カセット上流への被験配列挿入用に制限酵素ＳａｌＩおよびＮｈｅＩサイトを付加したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥおよびｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥを構築した。更に本プラスミドを鋳型に、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績）を用いたＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法によって、配列番号３４、３５のプライマーを使って発現カセット下流への被験配列挿入用に制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＸｈｏＩサイトを付加したｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２およびｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２を構築した。ｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２については、さらにＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩで処理し、ネオマイシン耐性遺伝子を切出した。一方、ｐＴＫ−Ｈｙｇ（クロンテック社）からハイグロマイシン耐性遺伝子を配列番号３６、３７のプライマーを使ってＰＣＲで増幅し、上述のネオマイシン耐性遺伝子が切出されたｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−ＲＥ２のＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＢＩサイトに導入してｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２を構築した。【００４９】
次に、これらのプラスミドの発現カセットの上流あるいは発現カセットの上流および下流の両方に被験配列を挿入し、図１２に記載のプラスミドを構築した。具体的には、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２およびｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２の発現カセット上流のＮｈｅＩ、ＢｇｌＩＩサイトに、配列番号３８、３９のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した被験配列ＣＨＯ５Δ３を挿入して、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−２．６ｋおよびｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−２．６ｋを構築した。また、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−ＲＥ２およびｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−ＲＥ２の発現カセット上流のＮｈｅＩ、ＢｇｌＩＩサイトに、配列番号３８、４０のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した被験配列ＣＨＯ５Δ３−３を挿入して、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋおよびｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋを構築した。更に、プラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋおよびｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋの発現カセット下流のＢｓｉＷＩ、ＸｈｏＩサイトに、配列番号４１、４２のプライマーセットを使ってＰＣＲで増幅した被験配列ＣＨＯ５Δ３−３を挿入してプラスミドｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＨＣ−１．１ｋ／１．１ｋおよびｐＥＦ１α−ＫＯＤ３Ｇ８ＬＣ−Ｈｙｇ−１．１ｋ／１．１ｋを構築した。【００５０】
これらのＫＯＤ３Ｇ８のＨ鎖およびＬ鎖発現コンストラクトを制限酵素ＡｈｄＩでリニアライズした後、被験配列ＣＨＯ５Δ３を発現カセットの上流に挿入したもの（２．６ｋ）、被験配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流に挿入したもの（１．１ｋ）、被験配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセットの上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／１．１ｋ）、および被験配列を含まないもの（ｃｔｒｌ）のそれぞれについて、Ｈ鎖およびＬ鎖発現コンストラクトを重量比が１：１となるように混合して混合プラスミドを調製した。【００５１】
前記の混合プラスミド２μｇを、前日に６ウェルプレートに播種しておいたＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。翌日、培地を除去し、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散させ、９０ｍｍペトリディッシュに移し、Ｇ４１８およびＨｙｇｒｏＧｏｌｄを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地中で１０日間選択培養を行った。選択培養中、３〜４日ごとに培地を交換し、Ｇ４１８濃度を２５０μｇ／ｍｌから７００μｇ／ｍｌまで、ＨｙｇｒｏＧｏｌｄ濃度を１５０μｇ／ｍｌから３５０μｇ／ｍｌまで段階的に上昇させた。選択培養終了後、２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、ポリクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量をＥＬＩＳＡ（パイロコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼを固相化したもの）で測定した。
具体的には、３０μｇ／ｍｌ濃度のＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼ抗原を固相化したＥＬＩＳＡプレートに、培養上清を添加し、３５℃で２時間インキュベートした。次に、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１００００倍希釈した抗マウス抗体−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ製）を５０μｌ添加して３５℃で１時間インキュベートした後、さらにＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＴＭＢ＋（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＤＡＫＯ製）で５分間反応させた。５０μｌの１Ｎ硫酸を加えて反応停止後、プレートリーダー（主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍ）で吸光度を測定した。【００５２】
標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。なお、標準品として、ＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞系３Ｇ８から得られた抗体を用いた。結果を図１３に示す。図１３から明らかな通り、被験配列を含まないもの（ｃｔｒｌ）と比較して、被験配列ＣＨＯ５Δ３あるいはＣＨＯ５Δ３−３を発現カセット上流に挿入したもの（２．６ｋあるいは１．１ｋ）、被験配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセット上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／１．１ｋ）の全てで抗体生産量が上昇していた。【００５３】
そこで、被験配列ＣＨＯ５Δ３を発現カセット上流に挿入したもの、被験配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセット上流および下流の両方に挿入したもの、被験配列を含まないものの計３系列について、限界希釈を行い、モノクローンでの生産性の比較を行った。
具体的には、前記のＫＯＤ３Ｇ８抗体を安定導入したポリクローンの細胞を２．５ｇ／ｌ−Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで処理して細胞を分散し、０．７５細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播き込んだ。２週間培養後、培養上清を回収し、ＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を前記と同様の方法でＥＬＩＳＡで測定した。【００５４】
標準品から作成した検量線をもとに算出した各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフを図１４に示す。図１４から明らかな通り、被験配列を含まないもの（ｃｔｒｌ）と比較して、被験配列ＣＨＯ５Δ３を発現カセット上流に挿入したもの（２．６ｋ）、被験配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセット上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／１．１ｋ）のどちらにおいても高発現クローンの割合が顕著に上昇していた。【００５５】
次に、９６ウェルプレートでの培養上清を用いたスクリーニングでそれぞれについて発現量上位１８クローンを拡大培養した後、１．８４×１０５細胞を６ウェルプレートに播き込んだ。３日間培養後、培養上清を回収し、モノクローンでのＫＯＤ３Ｇ８抗体の生産量を前記と同様の方法でＥＬＩＳＡで測定した。【００５６】
標準品から作成した検量線をもとに算出した各クローンの抗体生産量をプロットしたグラフを図１５に示す。図１５から明らかな通り、９６ウェルプレートでのスクリーニングの場合と同様、被験配列を含まないもの（ｃｔｒｌ）と比較して、被験配列ＣＨＯ５Δ３を発現カセット上流に挿入したもの（２．６ｋ）、被験配列ＣＨＯ５Δ３−３を発現カセット上流および下流の両方に挿入したもの（１．１ｋ／１．１ｋ）のどちらにおいても高発現クローンの割合が顕著に上昇していた。【００５７】
以上の結果から、被験配列ＣＨＯ５Δ３又はＣＨＯ５Δ３−３は、近接して配置された外来遺伝子の遺伝子発現を安定化し、発現効率を増大させることができることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明の遺伝子発現安定化エレメントは、哺乳類細胞、特にＣＨＯ細胞における外来遺伝子の発現を安定化し、高発現細胞株の樹立作業を低減短縮することができる。従って、本発明の遺伝子発現エレメントを使用した細胞発現システムは、種々の哺乳類細胞のタンパク質の機能解析は勿論、バイオ医薬品として創薬・医療などの産業界に寄与することが大である。
【配列表フリーテキスト】
【００５９】
配列番号７〜２０は、実施例３で使用したプライマーの配列である。
配列番号２１〜２６は、実施例４で使用したプライマーの配列である。
配列番号２７〜３１は、実施例５で使用したプライマーの配列である。
配列番号３２〜４２は、実施例６で使用したプライマーの配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年2月19日(2010.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれか一つ又はそれらの任意の組合せからなることを特徴とする遺伝子発現安定化エレメント：
（ａ）配列番号１で示す配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４１８２０番目から４１８３９番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４１８２１番目から４１８４０番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４５１８２番目から４５２００番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｅ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち９１０９４番目から９１１１３番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；
（ｆ）配列番号１で示す配列の部分配列からなるＤＮＡであって、宿主細胞中で外来遺伝子発現カセットと近接するように配置された際に、外来遺伝子発現カセットに含まれる外来遺伝子からの目的組換えタンパク質の発現を増大または安定化させることができるＤＮＡ；及び
（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのＤＮＡの相補体。
【請求項２】
（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡが、配列番号１で示す配列のうち４１６０１番目から４６７４６番目までの塩基で示す領域、又はその一部からなることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子発現安定化エレメント。
【請求項３】
（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡが、配列番号１で示す配列のうち４１６０１番目から４２７００番目までの塩基で示す領域、又はその一部からなることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子発現安定化エレメント。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子発現安定化エレメント、及びそれに近接して配置された外来遺伝子発現カセットを含むことを特徴とする外来遺伝子発現ベクター。
【請求項５】
遺伝子発現安定化エレメントが、外来遺伝子発現カセットの上流及び下流の両方に配置されていることを特徴とする請求項４に記載の外来遺伝子発現ベクター。
【請求項６】
外来遺伝子が、抗体の重鎖又は軽鎖ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項４又は５に記載のベクター。
【請求項７】
複数の外来遺伝子を含むことを特徴とする請求項４又は５に記載のベクター。
【請求項８】
複数の外来遺伝子が、抗体の重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子発現安定化エレメントと外来遺伝子発現カセットとがゲノム中に相互に近接するように配置されていることを特徴とする形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
宿主細胞が哺乳類動物細胞であることを特徴とする請求項９に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
哺乳類動物細胞がＣＨＯ細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれかに記載の形質転換された宿主細胞を用いることを特徴とするタンパク質を生産する方法。
【請求項１３】
タンパク質が抗体であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋａｕｆｍａｎ  Ｒ，Ｓｈａｒｐ  Ｐ．（１９８２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５９：６０１−６２１
【非特許文献２】Ｓｃｈｉｍｋｅ  Ｒ，Ｂｒｏｗｎ  Ｐ，Ｋａｕｆｍａｎ  Ｒ．（１９８２）  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  Ｍｏｎｏｇｒ  ６０：７９−８６
【非特許文献３】Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｄｅｅｒ  Ｊ，Ａｌｌｉｓｏｎ  ＤＳ（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２０：８８０−８８９
【非特許文献４】Ｐｉｋａａｒｔ  ＭＪ，Ｒｅｃｉｌｌａｓ−Ｔａｒｇａ  Ｆ，Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ  Ｇ．（１９９８）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １２：２８５２−６２
【非特許文献５】Ｉｚｕｍｉ  Ｍ，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＤＭ．（１９９９）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７６：２８０−２８９
【非特許文献６】Ｂｌａｓｃｏ  ＭＡ（２００７）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ８：２９９−３０９
【非特許文献７】Ｇｏｎｚａｌｏ  Ｓ，Ｊａｃｏ  Ｉ，Ｆｒａｇａ  ＭＦ，Ｃｈｅｎ  Ｔ，Ｌｉ  Ｅ，Ｅｓｔｅｌｌｅｒ  Ｍ，Ｂｌａｓｃｏ  ＭＡ（２００６）Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８：４１６−４２４
【非特許文献８】Ｐｅｒｒｏｄ  Ｓ，Ｇａｓｓｅｒ  ＳＭ（２００３）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６０：２３０３−２３１８
【非特許文献９】Ｗａｋｉｍｏｔｏ  ＢＴ（１９９８）Ｃｅｌｌ  ９３：３２１−３２４
【非特許文献１０】ＭｃＢｒａｔｎｅｙ  Ｓ，Ｃｈｅｎ  ＣＹ，Ｓａｒｎｏｗ  Ｐ．（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：９６１−９６５
【非特許文献１１】Ｋａｕｆｍａｎ  ＲＪ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４４８５−４４９０
【非特許文献１２】Ｂａｏ  Ｌ，Ｚｈｏｕ  Ｍ，Ｃｕｉ  Ｙ（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６，Ｄ８３−Ｄ８７
【手続補正書】
【提出日】平成22年7月16日(2010.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つ又はそれらの任意の組合せからなることを特徴とする遺伝子発現増大エレメント：
（ａ）配列番号１で示す配列のうち４１６０１番目から４６７４６番目までの塩基で示す領域からなるＤＮＡ；
（ｂ）（ａ）の配列の部分配列からなるＤＮＡであって、配列番号１で示す配列のうち４１６０１番目から４２７００番目までの塩基で示す領域の配列を少なくとも含むＤＮＡ；及び
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡの相補体。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子発現増大エレメント及び外来遺伝子発現カセットを含み、前記遺伝子発現増大エレメントと前記外来遺伝子発現カセットとの間の距離が５０００ｂｐ以下であることを特徴とする外来遺伝子発現ベクター。
【請求項３】
遺伝子発現増大エレメントが、外来遺伝子発現カセットの上流及び下流の両方に配置されていることを特徴とする請求項２に記載の外来遺伝子発現ベクター。
【請求項４】
外来遺伝子が、抗体の重鎖又は軽鎖ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項２又は３に記載のベクター。
【請求項５】
複数の外来遺伝子を含むことを特徴とする請求項２又は３に記載のベクター。
【請求項６】
複数の外来遺伝子が、抗体の重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項１に記載の遺伝子発現増大エレメントと外来遺伝子発現カセットとがゲノム中に５０００ｂｐ以下の距離に配置されていることを特徴とする形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
宿主細胞が哺乳類動物細胞であることを特徴とする請求項７に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
哺乳類動物細胞がＣＨＯ細胞であることを特徴とする請求項８に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかに記載の形質転換された宿主細胞を用いることを特徴とするタンパク質を生産する方法。
【請求項１１】
タンパク質が抗体であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【国際調査報告】
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