(57)【要約】  本発明は、肝臓に原発する悪性腫瘍における肝内胆管がんを、早期において簡便な方法で、感度良く、かつ、確実に検出、判別する方法、及びそのためのキットを提供することを課題とし、肝内胆管がんに由来するレクチンＷＦＡ（Wisteria fioribunda Agglutinin）結合性糖タンパク質からなる糖鎖バイオマーカーをがんマーカーとして被検試料における該がんマーカーを検出することによって肝内胆管がんを検出する。本発明の肝内胆管がんの検出方法は、肝内胆管がんを、肝細胞がんと明確に鑑別することができ、しかも、適用性、感度、精度の点で、臨床上許容される性能で早期に検出及び判別することを可能とする。
2010100862.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質をがんマーカーとし、被検試料における該がんマーカーをインビトロで検出することによって肝内胆管がんを検出することを特徴とする肝内胆管がんの検出方法。
【請求項２】
レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質をがんマーカーとする肝内胆管がんの検出が、レクチンＷＦＡ結合性糖タンパクを糖鎖バイオマーカーとし、該糖鎖バイオマーカーの肝内胆管がん特異的糖鎖構造を検出するものであることを特徴とする請求項１記載の肝内胆管がんの検出方法。
【請求項３】
被検試料におけるがんマーカーの存在のインビトロでの検出を、標識化したレクチンＷＦＡを用いた被検細胞のＷＦＡ染色により行うことを特徴とする請求項１記載の肝内胆管がんの検出方法。
【請求項４】
被検試料における該がんマーカーの存在の検出を、レクチンＷＦＡ、がんマーカーであるレクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質、及び、レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体とのサンドイッチ法により行うことを特徴とする請求項１記載の肝内胆管がんの検出方法。
【請求項５】
レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体が、ＣＡ１２５、Ｎ−ＣＡＭ-Ｌ１、Maspin、及びＭＵＣ１を抗原とする抗体の１又は２以上の抗体であることを特徴とする請求項４記載の肝内胆管がんの検出方法。
【請求項６】
レクチンＷＦＡ、がんマーカーであるレクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質、及び、レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体とのサンドイッチ法を、標識化したレクチンＷＦＡ又は標識化したレクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体を用いて行うことを特徴とする請求項４記載の肝内胆管がんの検出方法。
【請求項７】
レクチンＷＦＡ、がんマーカーであるレクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質、及び、レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体とのサンドイッチ法による肝内胆管がんの検出を、レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体を支持体上に固相化し、標識化したレクチンＷＦＡにより、がんマーカーであるレクチンＷＦＡ結合性糖タンパクをサンドイッチしたレクチンオーバーレイにより行なうか、或いは、レクチンＷＦＡを支持体上に固相化し、標識化した抗体によりがんマーカーであるレクチンＷＦＡ結合性糖タンパクをサンドイッチした抗体オーバーレイにより行なうことを特徴とする請求項４記載の肝内胆管がんの検出方法。
【請求項８】
抗体オーバーレイ或いはレクチンＷＦＡオーバーレイによる肝内胆管がんの検出を、マイクロアレイを用い、レクチンマイクロアレイ検出手段或いは抗体マイクロアレイ検出手段により検出することを特徴とする請求項７記載の肝内胆管がんの検出方法。
【請求項９】
肝内胆管がんのインビトロで検出するための被検試料が、胆汁又は血液からなる臨床検体或いは臨床切片であることを特徴とする請求項１記載の肝内胆管がんの検出方法。
【請求項１０】
請求項１記載の肝内胆管がんの検出方法を用いて、被検試料における肝内胆管がんをインビトロで検出し、肝臓に原発する悪性腫瘍における肝内胆管がんを判別することを特徴とする肝内胆管がんの判別方法。
【請求項１１】
レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質をがんマーカーとし、被検試料における該がんマーカーをインビトロで検出することによって肝内胆管がんを検出する肝内胆管がんの検出方法に用いるためのレクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質がんマーカーの使用。
【請求項１２】
標識化したレクチンＷＦＡ及びレクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体、或いは、標識化したレクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体及びレクチンＷＦＡを装備した肝内胆管がん検出及び／又は判別用キット。
【請求項１３】
レクチンＷＦＡ結合性糖タンパクを認識し、そして結合する抗体が、ＣＡ１２５、Ｎ−ＣＡＭ-Ｌ１、Maspin、及びＭＵＣ１を抗原とする抗体の１又は２以上の抗体であることを特徴とする請求項１２記載の肝内胆管がんの検出及び／又は判別用キット。
【請求項１４】
レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体が、支持体上に固相化した形態で調製されているか、或いは、レクチンＷＦＡが、支持体上に固相化した形態で調製されていることを特徴とする請求項１２記載の肝内胆管がんの検出及び／又は判別用キット。
【請求項１５】
レクチンＷＦＡをビオチン化ＷＦＡとし、該レクチンＷＦＡをストレプトアビジンコートした支持体上に固相化した形態で調製したことを特徴とする請求項１４記載の肝内胆管がんの検出及び／又は判別用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓に原発する悪性腫瘍である肝内胆管がんを、早期において簡便な方法で、感度良く、かつ、確実に検出、判別する方法、及びそのためのキットを提供すること、さらに、具体的には、肝内胆管がんに由来するレクチンＷＦＡ（Wisteria fioribunda Agglutinin）結合性糖タンパク質からなる糖鎖バイオマーカーをがんマーカーとし、該糖鎖バイオマーカーの肝内胆管がん特異的糖鎖構造を検出することにより、肝内胆管がんを早期にかつ特異的に検出する手段として、適用性、感度、精度の点で、臨床上許容される性能で、かつ、臨床上適用可能な簡便な手段により、肝内胆管がんを検出及び判別する方法、及びそのためのキットを提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、日本における死亡原因疾患の１位の座にあり、心疾患や、脳疾患等の他の疾患による死亡者数を大きく引き離している。一方、がんは多くの、あらゆる臓器において発症し、進行することで各種臓器への浸潤転移をする。したがって、がんに対する効果的な治療を行うためには、早期発見によって治療可能な時期に処置することが何よりも重要なことである。現在、各種診断方法の開発及び診断による早期発見が可能となったことから、早期治療に繋がり延命がなされるようになってきている。しかしながら、依然として、各種の診断及び治療方法の開発にも関わらず、原発巣からの浸潤転移により治療に困難を来たし、死に至る経過をとる。【０００３】
肝がんは、肝臓に存在する悪性腫瘍のことである。肝がんには肝臓に原発する原発性肝がんと、肝外臓器で発生したがん種が肝内に転移してきた転移性肝がんに分類することができる。肝臓に発生するおもな悪性腫瘍（原発性肝がん）には、肝細胞に由来する肝細胞がんと、胆管上皮細胞に由来する肝内胆管がん（または胆管細胞がん）が存在する。両者の混合型とみるべきものも存在する。肝細胞がん（Hepatocellular carcinoma：ＨＣＣ）は、肝細胞に由来する悪性腫瘍であり、原発性肝がんの９０％以上を占める。肝細胞がんのほとんどはウイルス性肝炎から発生する。肝内胆管がん（Intrahepatic cholangiocarinoma：ＩＣＣ）は、原発性肝がんの３％を占めるがんで、早期発見が困難で、外科的切除後の生存率は低く、化学療法に反応性が乏しく、予後不良とされている。【０００４】
肝がんの早期検出のために、従来より、腫瘍マーカーを用いた検出手段の開発が進められている。肝細胞がんについては、現在までに、多くのがん検出用のマーカーが開発されている。例えば、α１フェトプロティン（ＡＦＰ）は、肝細胞がんの腫瘍マーカーとして臨床的に用いられており、また、ＰＩＶＫＡ−II（New Eng.J.Med.310,1427−1431,1984）も肝細胞がんの腫瘍マーカーとして利用されている。その他にも、肝がんの腫瘍マーカーとしては、例えば、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＫＭＯ−１、ＤｕＰＡＮ−２、ＳＰａｎ−１、ＣＡ５０、ＳＬＸ、塩基性フェトプロテイン（ＢＦＰ）、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、アルカリフォスファターゼアイソザイム、γ−ＧＴＰアイソザイム、ＩＡＰ、ＴＰＡ、β２−ミクログロブリン、フェリチン、ＰＯＡ及びトリプシンインヒビター等が知られている（特開２００２−３２３４９９号公報）。【０００５】
また、近年、肝細胞がんで発現する遺伝子や、ポリペプチドからなる肝細胞がんの腫瘍マーカーとして多くのものが開示されている。例えば、Ｇｌａ不全血液凝固第VII因子（特開平８−１８４５９４号公報）、アルドラーゼβ遺伝子、カルバミルフォスフェート合成酵素I遺伝子、プラスミノーゲン遺伝子、ＥＳＴ５１５４９、アルブミン遺伝子、チトクロームＰ４５０サブファミリー２Ｅ１遺伝子、レチノール結合タンパク遺伝子、又はオーガニックアニオントランスポーターＣ遺伝子（特開２００４−１０５０１３号公報）、ジンクフィンガードメイン並びにＳＥＴドメインを有するヒト遺伝子ＺＮＦＮ３Ａ１（特表２００５−５１１０２３号公報）、ヘバラン硫酸プロテオグリカンであるグリピカン−３（ＧＰＣ３）（特表２００５−５２６９７９号公報）、染色体バンド１ｐ３６．１３の領域に位置し、アクチン細胞骨格の再編成を調節する発生・分化促進因子１（ＤＤＥＦＬ１）（特表２００５−５０３１７６号公報）、等の遺伝子或いはポリペプチドからなる肝細胞がんの腫瘍マーカーが開示されている。【０００６】
更に、染色体領域の８ｐ１２、１６ｐ１３．２−ｐ１３．３、１６ｑ２３．１−ｑ２４．３、又は１９ｐ１３．２−ｐ１３．３の領域における欠損の有無（特開２００６−９４７２６号公報）、分泌システィンリッチタンパク質のファミリーをコードするＷｎｔ−１（特開２００７−１３９７４２号公報）、カルバモイル−ホスフェートシンセターゼＬ鎖ＭＧＣ４７８１６、及びヘリックスループ−ヘリックスメイン及びオレンジドメインを含むタンパク質ＨＥＳ６の遺伝子（特表２００７−５０６４２５号公報）、ＳＥＭＡ５Ａ（セマフォリン５Ａ）、ＳＬＣ２Ａ２（溶質キャリアーファミリーメンバー）、ＡＢＣＣ２（ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー２）、又は、ＨＡＬ（ヒスチジンアンモニアリアーゼ）からなる細胞関連性の肝細胞がん（ＨＣＣ）タンパク質（特表２００７−５３４７２２号公報）、又は、ヒトα２，６シアル酸転移酵素（特開２００７−３２２３７３号公報）、等の遺伝子或いはポリペプチドからなる肝細胞がんの腫瘍マーカーが開示されている。【０００７】
最近、肝細胞がんに対する特異性の高いマーカーとして、血清中糖タンパク質の構成糖鎖群に注目した肝細胞がんマーカーが開示されている（特開２００７−２７８８０３号公報）。該肝細胞がんマーカーは、肝細胞がんの発症に伴って消失若しくは減少するトリシアリル糖鎖からなる肝細胞がんマーカーからなり、該腫瘍マーカーを使用した肝細胞がんの検出は、標識化した糖鎖を用い、検体中のから調製した肝細胞がんマーカーの量を、陰イオン交換カラムによる分取、ＯＤＳシリカカラムを使用した高速液体クロマトグラフィーによる溶出パターンによる分析によって算出することにより行うことが示されている。【０００８】
一方で、肝内胆管がんを含む胆管がんを検出するための腫瘍マーカーもいくつかのものが開示されている。例えば、特表２００３−５２７５８３号公報には、トリプシノーゲン活性化ペプチド（ＴＡＰ）を胆管−膵臓系がん腫の検出用のマーカーとして使用することが、特開２００５−３０４４９７号公報には、ＺＮＦ１３１、ＤＯＣ２、ＤＡＢ２、ＰＣ４、ＳＫＰ２、ＣＤＨ１０、ＣＤＨ１２、ＴＥＲＴ、ＣＤＫ５、ＢＡ１１、ＰＳＣＡ、ＭＬＺＥ、ＲＥＣＱＬ４、ＢＣＬ１、ＦＧＦ４、ＩＴＧＢ４、Survivin、ＳＲＣ、ＰＴＰＮ１、ＰＣＴＫ１、ＣＴＡＧから選ばれる１種以上のゲノム遺伝子を胆管がんの遺伝子マーカーとして用いるものが、ＷＯ２００５／０２３３０１には、抗グリピカン３抗体を胆管がん診断薬として用いるものが、及び、特開２００８−７２９５２公報には、（１）insulin-like growth factor-binding protein 5(ＩＧＦＢＰ５)、（２）Claudin 4（ＣＬＤＮ４）、（３）PDZ and LIM domain 7（ＰＤＬＩＭ７）、及び（４）Biglycan（ＢＧＮ）からなる群から選択されるClaudin 4を除く１つの遺伝子、又は、少なくとも２つの遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチドを胆管がんを検出するためのマーカーと使用するものが、開示されている。なお、胆管がんとClaudin 4の関係自体については、“Modern Pathology 19,460-469(2006)”に報告されている。【０００９】
肝内胆管がんを含む胆道系腫瘍の克服戦略などの観点から、原発性肝がんにおける肝細胞がん、肝内胆管がん、そして両者の成分を確認できる混合型肝細胞がんの鑑別診断が重要である。組織マーカーとして従来よりCytokeratinが用いられており、最近ではEpCAMなどの新しいマーカーも注目されている。しかしながらこれら既存のマーカーは、胆管がんだけでなく、正常胆管や周辺の間質領域もまた陽性となるため、より胆管がん特異的なマーカーの開発が望まれている（Cytokeratin1：Oncology Rep.17,737-741,2007；Cytokeratin2：Med.Pathology 9,901-909,1996；EpCAM1：Gastoroenterology 136,1012-1024,2009；EpCAM2：Cancer Res.68,1451-1461,2008)。【００１０】
以上のように、肝細胞がんや肝内胆管がんのような肝がんの早期検出のために、多くのがん検出用のマーカーが開示されているが、該腫瘍マーカーは、その殆どが肝がんで発現する遺伝子や、ポリペプチドからなる肝がんの腫瘍マーカーであるため、遺伝子の発現の検出のための複雑な操作や、がん種を特異的に検出するための検出精度の問題等、臨床上の適用性の点や、がん種の鑑別診断或いはがん検出の感度、精度の点で、医療現場で、正確にかつ簡便に用いる肝がんの早期検出・診断のための検出手段としては多くの制約があり、必ずしも満足のできるものではなかった。また、肝がんで発現する遺伝子を腫瘍マーカーとして、肝がんの発生を検出する方法では、例えば、胆汁のようなものを被検試料とする場合には適用することができないものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開平８−１８４５９４号公報
【特許文献２】特開２００２−３２３４９９号公報
【特許文献３】特開２００４−１０５０１３号公報
【特許文献４】特開２００５−３０４４９７号公報
【特許文献５】特開２００６−９４７２６号公報
【特許文献６】特開２００７−１３９７４２号公報
【特許文献７】特開２００７−２７８８０３号公報
【特許文献８】特開２００７−３２２３７３号公報
【特許文献９】特開２００８−７２９５２公報
【特許文献１０】特表２００３−５２７５８３号公報
【特許文献１１】特表２００５−５０３１７６号公報
【特許文献１２】特表２００５−５１１０２３号公報
【特許文献１３】特表２００５−５２６９７９号公報
【特許文献１４】特表２００７−５０６４２５号公報
【特許文献１５】特表２００７−５３４７２２号公報
【特許文献１６】ＷＯ２００５／０２３３０１
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】New Eng.J.Med.310,1427−1431(1984)
【非特許文献２】Modern Pathology 19,460-469(2006)
【非特許文献３】Oncology Rep.17,737-741(2007)
【非特許文献４】Med.Pathology 9,901-909(1996)
【非特許文献５】Gastoroenterology 136,1012-1024(2009)
【非特許文献６】Cancer Res.68,1451-1461(2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
がんに対する効果的な治療を行うためには、肝がんにおいても早期発見による早期治療が何よりも重要な対処となる。原発性肝がんにおいては、肝細胞に由来する肝細胞がんと、胆管上皮細胞に発生する肝内胆管がんとがあるが、いずれにおいても早期に検出し、正確な鑑別診断によって、適切な治療を施すことが治癒につながると期待される。特に、肝細胞がんに比べて肝内胆管がんは、外科的切除後の生存率が低いので、早期発見と正確な診断が必要となる。しかし、肝内胆管がんは早期発見が難しい。更に、ＣＴスキャン等の画像診断において検出できたとしても、肝細胞がんとの鑑別が困難であることがしばしば経験される。【００１４】
そこで、本発明の課題は、肝臓に原発する悪性腫瘍である肝内胆管がんを、早期において簡便な方法で、感度良く、かつ、確実に検出、判別する方法、及びそのためのキットを提供すること、更に、具体的には、肝内胆管がんを、肝細胞がんと明確に鑑別し得るがんマーカーにより、適用性、感度、精度の点で、臨床上許容される性能で早期に検出及び判別する方法、しかも、簡便な手法により、医療現場で適用可能な方法で、肝内胆管がんを検出する方法を提供すること、及びそのためのキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、上記課題を解決すべく、臨床現場で適用可能な肝内胆管がんの検出方法のためのがんマーカーについて、鋭意検討する中で、本発明者の知見により、細胞から分泌される糖タンパク質の糖鎖が、正常細胞由来、或いは、がん細胞の種類により特異的に変化することに着目し、レクチンマイクロアレイ解析を用いて、肝内胆管がんを特異的に認識する糖鎖バイオマーカーを探索する中で、肝内胆管がんを特異的に認識する糖鎖バイオマーカーを見い出し、すなわち、レクチンＷＦＡ（Wisteria fioribunda Agglutinin）結合性糖タンパク質からなる糖鎖バイオマーカーが、肝内胆管がんを特異的に認識するがんマーカーとなることを見い出し、本発明を完成するに至った。【００１６】
すなわち、本発明は、肝内胆管がんに由来するレクチンＷＦＡ（Wisteria fioribunda Agglutinin）結合性糖タンパク質からなる糖鎖バイオマーカーをがんマーカーとし、被検試料における該がんマーカーを検出することによって肝内胆管がんを検出することを特徴とする肝内胆管がんの検出方法からなる。本発明の肝内胆管がんの検出方法は、肝内胆管がんを、肝細胞がんと明確に鑑別することができ、しかも、適用性、感度、精度の点で、臨床上許容される性能で早期に検出及び判別することを可能とする。しかも、簡便な手法により、医療現場で適用可能な方法で、肝内胆管がんを検出することを可能とする。【００１７】
本発明において、糖鎖バイオマーカーとして、肝内胆管がんを特異的に検出するがんマーカーである「レクチンＷＦＡ（Wisteria fioribunda Agglutinin）結合性糖タンパク質」における「レクチンＷＦＡ（Wisteria fioribunda Agglutinin）」とは、Wisteria fioribunda（ふじ）に由来するAgglutinin（凝集素）であるレクチンを指すものである。ここで、「レクチン」とは、「糖鎖を特異的に認識して結合、架橋形成するタンパク質」と定義されるものである。【００１８】
本発明において、被検試料における該がんマーカーの存在の検出は、標識化したレクチンＷＦＡを用いたＷＦＡ染色により、或いは、標識化したレクチンＷＦＡ、がんマーカーであるレクチンＷＦＡ結合性糖タンパク、及び、レクチンＷＦＡ結合性糖タンパクを認識し、そして結合する抗体とのサンドイッチ法により行うことができる。該サンドイッチ法において用いられる、レクチンＷＦＡ結合性糖タンパクを認識し、そして結合する抗体としては、ＣＡ１２５、Ｎ−ＣＡＭ−Ｌ1、Maspin、及び、ＭＵＣ１を抗原とする抗体を挙げることができる。【００１９】
ＭＵＣ１、ＣＡ１２５、Ｎ−ＣＡＭ−Ｌ１、及び、Maspinは、組織染色の結果、胆管がん特異的にその発現が認められたことから、胆汁、血清マーカーだけでなく、組織においても有力なマーカー候補分子となりえる。原発性肝がんのうち、数パーセントの割合で発生する肝がん、肝内胆管がん両者の併発型である混合型肝がんは、肝がんと胆管がんの治療戦略は両者で異なることから、その識別診断が重要とされている。現状用いられているCytokeratinや、EpCAMなどは胆管がん特異的ではないため、上記候補分子を識別マーカーとして活用することで、診断の正確性の向上に寄与できる可能性が期待される。その他の上記候補分子においては、胆管がん以外にもその発現が認められることから、組織マーカーとしての有用性は低いが、胆汁、血清においては、ＷＦＡとのコンビネーションによって胆管がんとそれ以外の疾患患者及び健常者とを見分けられる可能性がある。【００２０】
本発明において、肝内胆管がんの検出を、サンドイッチ法で行なう場合に用いられる「標識化したレクチンＷＦＡ」としては、蛍光標識したＷＦＡを用いることができる。本発明の肝内胆管がんの検出方法をサンドイッチ法で行なう場合において、「レクチンＷＦＡ結合性糖タンパクを認識し、そして結合する抗体」は、該抗体を支持体上に固相化し、標識化したレクチンＷＦＡにより、がんマーカーであるレクチンＷＦＡ結合性糖タンパクをサンドイッチした形態で準備し、該サンドイッチ法を用い、検出することが好ましい。上記サンドイッチ法において、抗体を支持体上に固相化する代わりに、レクチンＷＦＡを含む複数のレクチンを支持体上に固相化した反応場上でレクチンＷＦＡ結合性糖タンパクを提示し、標識した該抗体を用いて検出することができる。【００２１】
レクチンＷＦＡを含む複数のレクチンを支持体上に固相化し、レクチンＷＦＡ結合性糖タンパクを提示し、標識した該抗体を用いて検出する方法においては、レクチンＷＦＡを直接支持体上に固相化して行うことができるが（直説法）、該方法の改良法として、レクチンＷＦＡをビオチン化ＷＦＡとし、該レクチンＷＦＡをストレプトアビジンコートした支持体上に固相化した形態で調製することにより（間接法）、検出感度の向上と、バックグラウンドの減少を大幅に増進することができる。【００２２】
ＷＦＡ結合性糖タンパク質の測定にサンドイッチ法を使用する場合、その測定には、ＥＬＩＳＡ、イムノクロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ法）、化学発光イムノアッセイ、エバネッセント波分析法などを利用することができる。これらの方法は当業者に公知であり、いずれの方法を選択してもよい。また、これらの方法は通常の手順に従って実施すればよく、実際の反応条件の設定等は、当業者が通常行い得る技術範囲内のものである。これらのうち、タンパク質結合物質及び糖鎖結合物質として、それぞれ抗体及びレクチンを用いたレクチン・抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用することが特に好ましい。【００２３】
サンドイッチ法では、タンパク質結合物質又は糖鎖結合物質のいずれかを固相に結合させる。以下、固相化した結合物質を「捕捉剤」と呼び、他方を「検出剤」と呼ぶ。捕捉剤を固相化する支持体（固相）としては、プレート（例、マイクロウェルプレート）、マイクロアレイ基板（例、マイクロアレイ用スライドガラス）、チューブ、ビーズ（例、プラスチックビーズ、磁気ビーズ）、クロマトグラフィー用担体（例、Sepharose（商標））、メンブレン（例、ニトロセルロースメンブレン、ＰＶＤＦ膜）、ゲル（例、ポリアクリルアミドゲル）などが例示される。その中でもプレート、ビーズおよびメンブレンが好ましく用いられ、取り扱いの簡便性からプレートが最も好ましく用いられる。捕捉剤は、十分な結合強度が得られる限りいずれの方法で固相化してもよく、例えば、共有結合、イオン結合、物理的吸着などによって固相化する。或いは、予め捕捉剤を固相化した支持体を用いてもよい。【００２４】
検出剤は、間接的または直接的に標識物質により標識されていてもよい。標識物質の例としては、蛍光物質（例、ＦＩＴＣ、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５）、放射性物質（例、１３Ｃ、３Ｈ）、酵素（例、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ）、などが挙げられる。また、検出剤をビオチン標識し、（ストレプト）アビジンを上記標識物質で標識して、ビオチンと（ストレプト）アビジンとの結合を利用してもよい。【００２５】
標識物質として酵素を用いる場合、使用する酵素に応じた適切な基質を用いて検出を行なう。例えば、酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合、基質としてはｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などが使用され、アルカリホスファターゼを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）などが使用される。酵素反応停止液、基質溶解液についても、選択した酵素に応じて、従来公知のものを適宜選択して使用することができる。【００２６】
捕捉剤は、体液サンプル中のＷＦＡ結合性マーカー糖タンパク質と複合体を形成する。この複合体に検出剤を適用して生じたシグナルを測定することにより、体液中のＷＦＡ結合性マーカー糖タンパク質を検出・定量する。シグナルの測定は、使用した標識物質に応じて適切な測定装置を用いて行なえばよい。【００２７】
糖鎖とレクチンとの結合は抗体との結合と比較して弱いため、一般には、抗原抗体反応の結合定数は１０６〜１０９Ｍ−１とされているが、レクチンと糖鎖間の結合常数は１０４〜１０７Ｍ−１とされている。糖鎖結合物質としてレクチンを用いる場合、エバネッセント波励起型蛍光検出法を用いてシグナルの検出を行なうことが好ましい。エバネッセント波励起型蛍光検出法とは、スライドガラスの端面（側面）に全反射が起こるような条件で光を入射させると、ガラス（固相）と水（液相）などの屈折率の異なる２相間の場合、界面から数百ｎｍ程度の近接場にだけエバネッセント波と呼ばれるきわめて射程距離の短い光（近接場光と呼ばれる）が滲み出ることを利用する方法である。この方法により、蛍光物質の励起光を端面から入射して近接場に存在する蛍光物質のみを励起し、蛍光観察を行なう。エバネッセント波励起型蛍光検出法は、Kuno et al.,Nature Methods,2,851-856(2005)などに記載されている。この検出には、GlycoStationTMReader 1200（モリテックス）等を使用することができる。【００２８】
糖鎖結合物質としては、レクチンを用いる。「レクチン」とは、特定の糖鎖構造を認識して結合するタンパク質の総称である。糖鎖は一般に、複数種の糖で構成されており、各糖の結合様式も様々であるため、多様で複雑な構造を有している。レクチンとしては多数の動植物に由来するものが知られており、例えば、ガラクトースに対する親和性を持つ動物レクチンファミリーであるガレクチン；カルシウムイオン依存性の動物レクチンファミリーであるC型レクチン；グリコサミノグリカンに対し一定の親和性を示すアネキシン；豆科レクチン；リシン等が挙げられる。本発明においては、ふじ由来レクチンＷＦＡ（Wisteria fioribunda Agglutinin）が用いられる。【００２９】
レクチンは、検出すべき糖タンパク質が持つ糖鎖構造に応じて適宜選択することができる。糖タンパク質の糖鎖構造を解析するための技術としては、フロンタルアフィニティークロマトグラフィー（ＦＡＣ）、レクチンマイクロアレイ、ＭＳ又はＭＳn（質量分析やタンデム質量分析法）などによる糖鎖プロファイリングが挙げられる。糖タンパク質の糖鎖構造が決定されれば、その情報に基づいて適切なレクチンを選択することができる。レクチンについての情報は、レクチンフロンティアデータベース（ＬｆＤＢ）、或いは産業技術総合研究所・糖鎖医工学研究センターのホームページ等から入手可能である。【００３０】
ＷＦＡ結合性マーカー糖タンパク質のタンパク質部分に特異的に結合する物質としては、抗体を用いることが好ましい。このような抗体として市販の抗体を用いてもよいが、ＷＦＡ結合性マーカー糖タンパク質の配列情報に基づいて、自体公知の方法によりＷＦＡ結合性マーカー糖タンパク質のタンパク質部分に特異的な抗体を作製してもよい。【００３１】
上記ＷＦＡ結合性マーカー糖タンパク質の配列情報に基づき、その部分ペプチドを調製し、以下に記載するような自体公知の方法に従って、抗ＷＦＡ結合性マーカー糖タンパク質抗体を作製することができる。これらのペプチドとしては、調製された抗ＷＦＡ結合性マーカー糖タンパク質抗体がサンプル中に含まれ得る無関係の抗原に対して交差反応しない限り、いずれのペプチドを用いてもよく、１〜数個のアミノ酸の置換、付加、欠失等を含んでいてもよい。例えば、このペプチドは、WFA結合性マーカー糖タンパク質の糖鎖結合アミノ酸残基に近いペプチドであっても遠いペプチドであってもよい。【００３２】
本発明で用いる抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。これらの抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。抗体の製造には、ＷＦＡ結合性マーカー糖タンパク質のタンパク質部分を抗原として用いる。【００３３】
本発明の肝内胆管がんの検出方法を用いて、肝内胆管がんの早期検出を行なうに際しては、肝内胆管がんを検出するための被検試料として、胆汁を含んだ臨床検体或いは臨床切片を用いることができる。該被検試料を用い、精度の高い肝内胆管がんの検出が可能となったことにより、従来の遺伝子マーカーを用いた場合には困難であった、医療現場での簡便かつ精度の高い、肝内胆管がんの発生の早期の検出が可能となった。本発明の肝内胆管がんの検出方を用いることにより、被検試料における肝内胆管がんを検出し、肝臓に原発する肝内胆管がんを早期に検出し、判別することができる。【００３４】
本発明は、本発明の肝内胆管がんの検出方法を実施するために用いられる、標識化したレクチンＷＦＡ及びレクチンＷＦＡ結合性糖タンパクを認識し、そして結合する抗体を装備した肝内胆管がん検出及び／又は判別用キットを包含する。該レクチンＷＦＡ結合性糖タンパクを認識し、そして結合する抗体としては、ＣＡ１２５、Ｎ−ＣＡＭ-Ｌ1、 Maspin、及びＭＵＣ１を抗原とする抗体の１又は２以上の抗体を挙げることができる。【００３５】
胆管がんマーカーとして組織マーカー（細胞診マーカー）、胆汁マーカー、血清マーカーが挙げられる。上記レクチンＷＦＡ結合性糖タンパクを認識し、そして結合する抗体が活用可能なフェーズとして、組織染色よって胆管がんに特異的発現が確認されたＭＵＣ１、ＣＡ１２５、Ｎ−ＣＡＭ−Ｌ1、及びMaspinの４分子については、血清、胆汁マーカーはもちろん、組織マーカーとしての有用性もある。一方で、胆管がん特異的な染色ではなかった他の抗体については、ＷＦＡとの組み合わせによって、胆汁、血清でのマーカーとしての有用性が考えられる。組織染色の結果において、各診断フェーズに合わせて抗体を絞り込む必要があり、胆汁、血清に至ってはＷＦＡとのコンビネーションが重要である。【００３６】
該レクチンＷＦＡ結合性糖タンパクを認識し、そして結合する抗体は、該抗体を固相化した形態とし、レクチンオーバーレイ検出用の肝内胆管がんの検出及び／又は判別用キットとして調製されたものであることが好ましい。上記サンドイッチ法において、抗体を支持体上に固相化する代わりに、レクチンＷＦＡを支持体上に固相化し、該抗体をオーバーレイして検出することもできる。レクチンＷＦＡを支持体上に固相化する場合に、レクチンＷＦＡを直接支持体上に固相化して行うことができるが（直説法）、該方法の改良法として、レクチンＷＦＡをビオチン化ＷＦＡとし、該レクチンＷＦＡをストレプトアビジンコートした支持体上に固相化した形態で調製することにより（間接法）、検出感度の向上と、バックグラウンドの減少を大幅に増進することができる。【００３７】
すなわち具体的には本発明は、（１）レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質をがんマーカーとし、被検試料における該がんマーカーをインビトロで検出することによって肝内胆管がんを検出することを特徴とする肝内胆管がんの検出方法や、（２）レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質をがんマーカーとする肝内胆管がんの検出が、レクチンＷＦＡ結合性糖タンパクを糖鎖バイオマーカーとし、該糖鎖バイオマーカーの肝内胆管がん特異的糖鎖構造を検出するものであることを特徴とする上記（１）記載の肝内胆管がんの検出方法や、（３）被検試料におけるがんマーカーの存在のインビトロでの検出を、標識化したレクチンＷＦＡを用いた被検細胞のＷＦＡ染色により行うことを特徴とする上記（１）記載の肝内胆管がんの検出方法や、（４）被検試料における該がんマーカーの存在の検出を、レクチンＷＦＡ、がんマーカーであるレクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質、及び、レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体とのサンドイッチ法により行うことを特徴とする上記（１）記載の肝内胆管がんの検出方法や、（５）レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体が、ＣＡ１２５、Ｎ−ＣＡＭ-Ｌ１、Maspin、及びＭＵＣ１を抗原とする抗体の１又は２以上の抗体であることを特徴とする上記（４）記載の肝内胆管がんの検出方法からなる。【００３８】
また本発明は、（６）レクチンＷＦＡ、がんマーカーであるレクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質、及び、レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体とのサンドイッチ法を、標識化したレクチンＷＦＡ又は標識化したレクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体を用いて行うことを特徴とする上記（４）記載の肝内胆管がんの検出方法や、（７）レクチンＷＦＡ、がんマーカーであるレクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質、及び、レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体とのサンドイッチ法による肝内胆管がんの検出を、レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体を支持体上に固相化し、標識化したレクチンＷＦＡにより、がんマーカーであるレクチンＷＦＡ結合性糖タンパクをサンドイッチしたレクチンオーバーレイにより行なうか、或いは、レクチンＷＦＡを支持体上に固相化し、標識化した抗体によりがんマーカーであるレクチンＷＦＡ結合性糖タンパクをサンドイッチした抗体オーバーレイにより行なうことを特徴とする上記（４）記載の肝内胆管がんの検出方法や、（８）抗体オーバーレイ或いはレクチンＷＦＡオーバーレイによる肝内胆管がんの検出を、マイクロアレイを用い、レクチンマイクロアレイ検出手段或いは抗体マイクロアレイ検出手段により検出することを特徴とする上記（７）記載の肝内胆管がんの検出方法や、（９）肝内胆管がんのインビトロで検出するための被検試料が、胆汁又は血液からなる臨床検体或いは臨床切片であることを特徴とする上記（１）記載の肝内胆管がんの検出方法や、（１０）上記（１）記載の肝内胆管がんの検出方法を用いて、被検試料における肝内胆管がんをインビトロで検出し、肝臓に原発する悪性腫瘍における肝内胆管がんを判別することを特徴とする肝内胆管がんの判別方法からなる。【００３９】
さらに本発明は、（１１）レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質をがんマーカーとし、被検試料における該がんマーカーをインビトロで検出することによって肝内胆管がんを検出する肝内胆管がんの検出方法に用いるためのレクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質がんマーカーの使用（１２）標識化したレクチンＷＦＡ及びレクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体、或いは、標識化したレクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体及びレクチンＷＦＡを装備した肝内胆管がん検出及び／又は判別用キットや、（１３）レクチンＷＦＡ結合性糖タンパクを認識し、そして結合する抗体が、ＣＡ１２５、Ｎ−ＣＡＭ-Ｌ１、Maspin、及びＭＵＣ１を抗原とする抗体の１又は２以上の抗体であることを特徴とする上記（１２）記載の肝内胆管がんの検出及び／又は判別用キットや、（１４）レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質を認識し、そして結合する抗体が、支持体上に固相化した形態で調製されているか、或いは、レクチンＷＦＡが、支持体上に固相化した形態で調製されていることを特徴とする上記（１２）記載の肝内胆管がんの検出及び／又は判別用キットや、（１５）レクチンＷＦＡをビオチン化ＷＦＡとし、該レクチンＷＦＡをストレプトアビジンコートした支持体上に固相化した形態で調製したことを特徴とする上記（１４）記載の肝内胆管がんの検出及び／又は判別用キットからなる。
【発明の効果】
【００４０】
本発明の肝内胆管がんの検出方法は、肝細胞がんとの鑑別が難しく、早期の正確な発見が難しい肝内胆管がんを、適用性、感度、精度の点で、臨床上許容される性能で早期に検出及び判別する方法、しかも、簡便な手法により、医療現場で適用可能な方法で、肝内胆管がんを検出する方法を提供する。特に、本発明の肝内胆管がんの検出方法は、肝内胆管がんを検出するための被検試料として、胆汁を含む臨床検体或いは臨床切片を用い、精度の高い肝内胆管がんの検出を可能としたことから、従来の遺伝子マーカー等を用いた場合には困難であった、医療現場での簡便かつ精度の高い、肝内胆管がんの発生の早期の検出を可能とした。更に、本発明において、肝内胆管がんの検出方法を実施するために提供される肝内胆管がんの検出及び／又は判別用のキットは、肝内胆管がんの検出の簡便さと精度を備えた、医療現場で容易に適用できる、臨床適用上優れたキットを提供する。【００４１】
肝内胆管がんを特異的に検出するマーカー候補分子のうち、特に胆管がん特異的に染色が認められたＭＹ．１Ｅ１２結合性ＭＵＣ１、ＣＡ１２５、Ｎ−ＣＡＭ−Ｌ1、及びMaspinは、組織染色によって混合型肝がんにおける肝内胆管がんを識別診断するための有用な組織マーカーを提供する。従来の診療で行われている胆汁細胞診は胆汁の採取法や標本作製手技に結果が左右されるほか、細胞の形状を見分ける診断者の間で結果のばらつきが大きく、感度も低い。そのような問題に対して、組織染色に加え、ＷＦＡを含むこれらの分子で細胞染色を行うことで、従来の細胞診に比べ、より精度よく見分けることができる細胞診マーカーとしての活用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明による胆汁を含んだ臨床検体を用いた肝内胆管がん検査の最良の形態を示す図である。「ａ」は、抗体固定ウェルプレートを使用した場合（直接的、間接的に蛍光標識したレクチンをオーバーレイして、抗体でトラップされた候補分子のうちＷＦＡに結合する分子を選択的に検出する場合）を示す。「ｂ」は、ＷＦＡ固定ウェルプレートを使用した場合（直接的、間接的に蛍光標識した抗体をオーバーレイして、ＷＦＡでトラップされる候補分子を選択的に検出する場合）を示す。
【図２】本発明の実施例における肝内結石症合併及び非合併型肝内胆管がん組織切片中がん部及び非がん部のレクチンマイクロアレイによる比較糖鎖プロファイリング解析のうち、ＷＦＡシグナルを統計解析した結果を示す図である。「ａ」は、結石合併型の場合を、「ｂ」は、結石非合併型の場合を示す（いずれにおいてもがん部において有意にシグナルが上昇している）。「ｃ」は、がんと非がんを判別する検出力をＲＯＣ曲線により求めた結果を示す（その感度は８４％、特異度は９２％であり、よく見分けられることを示している）。
【図３】本発明の実施例において、肝内胆管がん患者組織切片をＷＦＡ（ＦＩＴＣ染色, 緑）及びＭＹ．１Ｅ１２抗体（Ｃｙ５染色,赤）により二重染色した結果を示す図である（ＷＦＡ陽性部位は、公知の肝内胆管がんマーカー抗体であるＭＹ．１Ｅ１２による染色領域とほぼ一致している）。
【図４】本発明の実施例において、肝内胆管がんによる閉塞性黄疸を解除する目的にて胆道ドレナージが施行され，その際の胆汁細胞診にてがん細胞が検出された患者について，細胞診標本におけるＷＦＡ染色による組織化学解析を行った結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例におけるＷＦＡ結合性タンパク質候補分子の絞り込みについての試験例において、マーカー候補分子に対する抗体を用いた組織染色スコアリングによる絞込みの結果、有力とされる候補分子（MUC1, CA125, Maspin, N-CAM-L1, Lactoferrin, Cathepsin W, Collagen IV）について、肝内胆管がん組織切片を用いて、各候補分子抗体による組織染色を行った結果を示す図である。
【図６】本発明の実施例における試験例において、肝内胆管がん患者３０例、肝内結石症患者２２例の胆汁を対象に、ＷＦＡ固定ウェルプレートを使用し、間接的に蛍光標識したＭＹ．１Ｅ１２抗体をオーバーレイして、ＷＦＡでトラップされる候補分子を選択的に検出した分析結果を示す図である。「ａ」は、得られたシグナルはＭＹ．１Ｅ１２結合性ＭＵＣ１を含まない健常者血清をネガティブコントロール（Ｎ）とし、Ｓ／Ｎ比として数値化し、グラフ化した結果を示す図である。また、「ｂ」は、がんと結石症を判別する検出力をＲＯＣ曲線により求めた図である（その感度は９０％、特異度は６０％であった）。
【図７】本発明の実施例における胆汁を用いた肝内胆管がんの検出についての試験例において、サンドイッチＥＬＩＳＡの改良ＷＦＡのＥＬＩＳＡ・プレートへの固定化において、マイクロタイタープレート(グライナー社製 ９６ウェル平底高結合性プレート)へ未標識のＷＦＡを固定化していたが、プレートをストレプトアビジンコートプレート（NUNC社製 ９６ウェル平底ストレプトアビジンコートプレート）に変更し、固定化するＷＦＡを未標識のものから、ビオチン化ＷＦＡ（Vector社製）に変更し、固定化をストレプトアビジン−ビオチンの系に改良した模式図を示す図である。
【図８】本発明の実施例における胆汁を用いた肝内胆管がんの検出についての試験例において、ＭＹ．１Ｅ１２結合性ＭＵＣ１−ＷＦＡ及びＣＡ１２５−ＷＦＡのサンドイッチ・ＥＬＩＳＡ・ストレプトアビジ−ビオチンの系によって、ＷＦＡを固定化した際のＷＦＡ−ＭＹ．１Ｅ１２・サンドイッチ・ＥＬＩＳＡの結果を示す。「ａ」には、良性疾患患者として胆嚢結石症、総胆管結石症、肝内結石症と胆管がん患者との比較解析を行ったグラフを示す。「ｂ」では、ａの結果に基づき、がんと結石症を判別する検出力をＲＯＣ曲線により求めた図である（その感度は９０％、特異度は７６％であった）。また、ストレプトアビジン-ビオチンの系によってＷＦＡを固定化した際のＷＦＡ−ＣＡ１２５・サンドイッチ・ＥＬＩＳＡの結果も示す。「ｃ」には、良性疾患患者として胆嚢結石症、総胆管結石症、肝内結石症と胆管がん患者との比較解析を行ったグラフを示す。「ｄ」では、ｃの結果に基づき、がんと結石症を判別する検出力をＲＯＣ曲線により求めた図である（その感度は５７％、特異度は６４％であった）。
【図９】本発明の実施例における血液を用いた肝内胆管がんの検出についての試験例において、各患者ごとの血清中、ＷＦＡ−ＭＹ．１Ｅ１２・サンドイッチ・ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。縦軸には得られたＯＤ値を示している。それぞれ「ａ」は胆管がん患者由来血清５例、「ｂ」はＰＢＣ患者由来血清、「ｃ」は肝内結石症患者由来血清、「ｄ」は健常者由来血清の結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明は、肝内胆管がんに由来するレクチンＷＦＡ結合性糖タンパクからなる糖鎖バイオマーカーをがんマーカーとし、該糖鎖バイオマーカーの肝内胆管がん特異的糖鎖構造を検出することによって肝内胆管がんを検出することを特徴とする肝内胆管がんの検出方法からなる。本発明において、糖鎖バイオマーカーとして、肝内胆管がんを特異的に検出するがんマーカーである「レクチンＷＦＡ（Wisteria fioribunda Agglutinin）結合性糖タンパク質」に結合する「レクチンＷＦＡ（Wisteria fioribunda Agglutinin）」とは、Wisteria fioribunda（ふじ）に由来するAgglutinin（凝集素）であるレクチンを指すものである。該「レクチンＷＦＡ」自体は、周知のレクチンであり、容易に入手することができるものである。本発明において、「レクチンＷＦＡ」は、蛍光標識等により、標識化して用いられる。若しくは基板やアガロースなどの支持体に固定し、胆汁からＷＦＡ結合性タンパク質群だけを提示したり、捕獲、エンリッチするのに用いられる。
【００４４】
本発明において、予め「レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質」を同定する（候補分子を絞り込む）には、糖タンパク質の糖鎖結合性レクチンとして、ＷＦＡ（Wisteria fioribunda Agglutinin）をアガロースなどに固定した支持体を用い、胆汁などの生体試料からWFA結合性タンパク質を捕獲、エンリッチすることが望ましい。エンリッチしたタンパク質は質量分析等を用いたプロテオミクスにより同定することができる。
【００４５】
本発明の肝内胆管がんの検出方法は、被検試料における該がんマーカーの存在を、標識化したレクチンＷＦＡを用いたＷＦＡ染色により、或いは、標識化したレクチンＷＦＡ、がんマーカーであるレクチンＷＦＡ結合性糖タンパク、及び、レクチンＷＦＡ結合性糖タンパクを認識し・結合する抗体とのサンドイッチ法により行うことができる。本発明のサンドイッチ法を用いた肝内胆管がんの検出のイメージを、図１に示す。該図において、抗体固定ウェルプレートを使用し、直接的、間接的に蛍光標識したレクチンをオーバーレイして、抗体でトラップされた候補分子のうちＷＦＡに結合する分子を選択的に検出する場合の肝内胆管がんの検出のイメージを図１の「ａ」に、ＷＦＡ固定ウェルプレートを使用し、直接的、間接的に蛍光標識した抗体をオーバーレイして、ＷＦＡでトラップされる候補分子を選択的に検出する場合の肝内胆管がんの検出のイメージを図１の「ｂ」に示す。
【００４６】
本発明において、サンドイッチ法を用いた肝内胆管がんの検出を行なうに際しては、レクチンＷＦＡ結合性糖タンパクを認識し・結合する抗体を調製する。該抗体は、市販の或いは公知の抗体の中から、スクリーニングすることができる。該レクチンＷＦＡ結合性糖タンパクを認識し、そして結合する抗体としては、ＣＡ１２５（Hytest Ltd）、Ｎ−ＣＡＭ-Ｌ1（R&D systems,Inc.）、Maspin（Santa Cyuz Biotechnology,Inc.）、及びＭＵＣ１を抗原とする抗体を挙げることができる。そして肝内胆管がんを特異的に検出するマーカー候補分子のうち、特に胆管がん特異的に染色が認められたＭＹ．１Ｅ１２結合性ＭＵＣ１、ＣＡ１２５、Ｎ−ＣＡＭ−Ｌ1、及びMaspinは組織染色によって混合型肝がんにおける肝内胆管がんを識別診断するための有用な組織マーカーを提供する。
【００４７】
本発明のサンドイッチ法を用いた肝内胆管がんの検出に際しては、レクチンＷＦＡ結合性糖タンパクを認識し、そして結合する抗体をアレイ上に固相化し、標識化したレクチンＷＦＡにより、がんマーカーであるレクチンＷＦＡ結合性糖タンパクをサンドイッチしたレクチンオーバーレイ・抗体マイクロアレイを、マイクロアレイ検出手段により検出することができ、かかるマイクロアレイ検出手段による検出として、エバネッセント波励起蛍光法を用いた検出を用いることができる（「実験医学」Vol.25,No.17（増刊）P164-171,2007）。また、本発明の肝内胆管がんの検出法において、ＷＦＡ固定ウェルプレートを使用し、直接的、間接的に蛍光標識した抗体をオーバーレイして、ＷＦＡでトラップされる候補分子を選択的に検出するサンドイッチＥＬＩＳＡ法を特に好ましい肝内胆管がんの検出法として用いることができる。
【００４８】
本発明の肝内胆管がんの検出及び／又は判別方法を実施するには、上記のとおり標識化したレクチンＷＦＡ及びレクチンＷＦＡ結合性糖タンパクを認識し、そして結合する抗体を装備した肝内胆管がん検出及び／又は判別用キットを用いることができるが、該キットは、レクチンＷＦＡ結合性糖タンパクを認識し、そして結合する抗体をアレイ上に固相化したキット、或いは、レクチンＷＦＡをアレイ上に固相化したキットを検出用に調製されたものを用いることができる。該抗体としては、ＣＡ１２５、Ｎ−ＣＡＭ−Ｌ1、 Maspin、及びＭＵＣ１を抗原とする抗体を挙げることができる。
【００４９】
本発明の肝内胆管がんの検出方法により、肝内胆管がんの存在を検出する際には、肝内胆管がんの検出に供される患者由来の被検試料を調製して用いる。本発明において、被検試料としては、患者から採取された胆汁を含む臨床検体或いは臨床切片が用いられる。臨床切片を用いる方法は、末梢型の肝内胆管がんの検出に適合し、胆汁を用いる方法は、肝門部型の肝内胆管がんの検出に適合する。該被検試料を用いて、上記の検出手段により、がんの存在を検出する。
【００５０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５１】
［レクチンアレイを用いた肝内胆管がん特異糖鎖認識レクチンの選定］
（試験方法）
レクチンマイクロアレイは特異性の異なる４０種以上の植物レクチンが同一基板上に固定化されており、分析対象となる糖タンパク質上の糖鎖との相互作用（結合性）を一斉に解析するシステムである（Kuno et al.,Nature Methods 2,851-856,2005）。これを用い肝内胆管がん特異的に染色するのに最適なレクチンを絞り込むことを試みた。本実験には、結石症合併型患者１４例（同一切片内がん部・非がん部領域）、結石症非合併型患者１０例（同一切片内がん部・非がん部領域）、結石症非合併型患者がん部２１例、及び結石症非合併型患者非がん部１４例を用いた。つまり、総解析数はがん部４５例および非がん部３８例となる。なお、組織切片からタンパク質を回収し、蛍光標識後レクチンアレイ解析するまでのプロトコルは松田ら（Biochem.Biophys.Res.Commun.370,259-263,2008）に従った。【００５２】
＜１．組織切片からタンパク質の回収＞
まず顕微鏡により確認した各サンプルのがん部及び非がん部領域（およそ１×１ｍｍ相当）をかきとり、その組織フラグメントをあらかじめ１０ｍＭクエン酸（ｐＨ６．０）２００μＬを入れた１．５ｍＬ容マイクロチューブに回収した。得られた組織フラグメント入り溶液はホルマリンによる分子内および分子間架橋を解離するため９５℃で９０分処理した。熱処理後、２０，０００×ｇ、５分、４℃で遠心分離し、上清を除いた。残りの組織フラグメント含有ペレットにＰＢＳ（−）２００μＬを加えた（バッファー交換工程）。更に、２０，０００×ｇ、５分、４℃で遠心後、上澄みを除き、ペレットに０．５％ＮＰ４０−ＰＢＳ２０μＬを加えた。ペレットを超音波破砕により細粒化した後に、氷上で６０分反応し、膜タンパク質を可溶化した。反応後、２０，０００×ｇ、５分、４℃で遠心し、上清を組織抽出タンパク質として回収した。【００５３】
＜２．タンパク質の蛍光標識＞
回収したすべての組織抽出タンパク質溶液は、予め１０μｇずつＰＣＲチューブに小分けしたＣｙ３−ＳＥ（GEヘルスケア社製) に添加した。室温、暗所で１時間化学反応を行った後、反応を完全に止めるためグリシン含有バッファー１８０μＬ添加し、室温、暗所で２時間反応した。得られた溶液を蛍光標識組織切片由来タンパク質溶液とした。【００５４】
＜３．レクチンアレイ解析＞
蛍光標識組織切片由来タンパク質溶液はレクチンアレイ用バッファーにより２倍、８倍へ希釈され、それぞれ６０μＬをレクチンアレイの各反応槽へ添加した。なお８つの反応槽からなるレクチンマイクロアレイ基盤の作製は内山ら（Proteomics 8,3042-3050(2008)）の手法に従った。１晩２０℃にて相互作用反応させた後、各反応槽をレクチンアレイ用バッファーで３回洗浄し、定法に従いスキャニングした。得られたスキャンデータは定法に従いシグナルをNet Intensityとして数値化し、次の統計解析のために久野ら（Journal of Proteomics and Bioinformatics 1,68-72(2008)）の手法に従い規格化された。【００５５】
＜４．統計解析＞
規格化されたすべてのデータは、がん部及び非がん部の２群比較検定に用いた。各データはレクチンごとにWhelch's t-testやＲＯＣ曲線解析を用いて有意差検定し、肝内胆管がんで有意なシグナル上昇を示すレクチンを選定するのに用いた。【００５６】
（結果）
表１（肝内胆管がん組織がん部（Ｔ）及び非がん部（Ｎ）領域中糖タンパク質にの比較糖鎖プロファイリング結果）に示すようにレクチンマイクロアレイ後の統計解析から、５種のレクチンで非がん部と比較してがん部において２倍以上の結合シグナルを示し、ＷＦＡが最も特異度が高かった（４．６倍）。そこで、結石症合併型１４症例、結石症非合併型１０症例についてがん部及び非がん部のＷＦＡシグナルについてWhelch's t-testにより、統計的に有意差の有無を確認したところ、それぞれ危険度はＰ＜０．０００１，Ｐ＝０．００１５であった。またＲＯＣ曲線解析により、その感度は８４％、特異度は９２％、ＡＵＣ０．９３であった。【００５７】
結果を、図２に示す（肝内結石症合併及び非合併型肝内胆管がん組織切片中がん部及び非がん部のレクチンマイクロアレイによる比較糖鎖プロファイリング解析のうちＷＦＡシグナルを統計解析した結果）。以上のことから、ＷＦＡによる組織染色は切片中肝内胆管がんの検出を可能にすることが示唆された。また、ＷＦＡ結合糖鎖（ＷＦＡ結合性糖タンパク質）は、肝内胆管がんの特異的マーカーとなる可能性が見出された。【００５８】
【表１】
2010100862.tif 000003
【実施例２】
【００５９】
［肝内胆管組織を用いた肝内胆管がんの検出］
実施例１から、ＷＦＡによる組織染色で、組織切片中肝内胆管がんを検出できる可能性が見出されたため、肝内胆管がん患者組織切片結石非合併型症例について以下の通り検討した。【００６０】
（実験方法）
ＷＦＡによる組織染色は、染色キット：Histo-fine (ニチレイ)を用い、以下のとおり実施した。まず、ホルマリン固定肝内胆管がん患者組織切片（５μｍ厚)を定法に従い組織切片上に被覆しているパラフィンを脱パラフィン化した。脱パラフィン化した組織切片はＰＢＳ にて洗浄し、風乾後、１０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）中に浸し、１２１℃、１５分間オートクレーブすることで、ホルマリンによる分子間（分子内）架橋を解離した。処理後の切片は室温でしばらく放置した後、ＰＢＳに５分間３回繰り返し浸し、組織表面を洗浄した。次いで０．３％ Ｈ２Ｏ２−ＭｅＯＨにて１０分間、室温で処理することで、内在性ペルオキシダーゼのブロッキング反応を行った。【００６１】
ＰＢＳにて洗浄 (５分、３回)後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳにて１０分間、室温反応し、ビオチン化レクチンの非特異的吸着を抑えるブロッキング反応を行った。更に、ＰＢＳにて洗浄 ５分、３回)後、ビオチン化ＷＦＡ溶液 (Vector社製、５μｇ／ｍＬになるようＨＥＰＥＳで懸濁) を組織切片上へ添加し、保湿箱中にて２０℃で２時間結合反応した。ＰＢＳにて洗浄 (５分、３回)した後、次いでストレプトアビジン溶液を加え、保湿箱中にて室温で１０分間反応した。更にＰＢＳにて洗浄 (５分、３回)後、基質溶液を加え、約５分間、室温にて発色反応した。反応を停止するため、ミリＱ水に５分間３回浸した。最後にヘマトキシリンで、室温、１分間処理し、核酸を染色後、流水にて洗浄した。【００６２】
（結果）
肝内胆管がんの診断マーカーの有力候補であるＷＦＡについて、正常肝（転移性肝がん）２５例、肝内胆管がん９０例、混合型肝がん１０例、肝細胞がん２５例の標本における発現を免疫組織化学にて検討した。表２（組織染色の結果）に示すように、正常胆管上皮では８例（３２％）で、肝内胆管がんでは８３例（８８％）で、混合型肝がんの胆管細胞がん部分では８例（８０％）で、そのがん腺管上皮にＷＦＡリガンドの発現を認めた。混合型肝がんの肝細胞がん部分や肝細胞がんではＷＦＡリガンドの発現を認めなかった。このことより、ＷＦＡは肝内胆管がん並びに混合型肝がんの診断マーカーとして有用であると考えられた。また、ＷＦＡ発現の有無を肝内胆管がんの臨床病型分類の立場より比較検討したところ、部位（肝門部型，末梢型）や肉眼型（腫瘤形成型、胆管浸潤型、混合型、胆管内発育型）によるＷＦＡリガンドの発現頻度の変動は認められなかった。【００６３】
また、興味深いことにＷＦＡ陽性部位は、公知の肝内胆管がんマーカー抗体であるＭＹ．１Ｅ１２（J. Cancer Res.,87:488-496,1999；Hepatology,30:1347-1355,1999）による染色領域とほぼ一致した（図３：肝内胆管がん患者組織切片の免疫組織化学：ＷＦＡ、ＭＹ．１Ｅ１２共に胆管がんで染色される。）。したがってＭＹ．１Ｅ１２抗原であるＭＵＣ１はＷＦＡ結合性タンパク質の１つであることが示された。【００６４】
【表２】
2010100862.tif 000004
【実施例３】
【００６５】
［胆汁中に混入する細胞を用いた肝内胆管がんの検出］
閉塞性黄疸を解除する目的にて胆道ドレナージが施行され、その際に採取された胆汁を検体として解析した。実施例２と同じ手順でＷＦＡ染色を実施したところ、病理組織診断及び細胞診においてがんの存在が確定された検体ではＷＦＡ陽性の細胞が確認され、細胞学的にがんと同定された。しかしながら、病理組織および細胞診において陰性であった検体ではＷＦＡに染色される細胞は確認されなかった（図４：細胞診標本におけるＷＦＡ染色による組織化学解析の結果）。
【実施例４】
【００６６】
［レクチンＷＦＡ結合性糖タンパク質の同定］
（実験方法）
組織切片からのＷＦＡ 結合性糖タンパク質の捕獲及び当該タンパク質の同定は以下の手順に従い実施した。なお、同定されるタンパク質の種類に症例間差が生じる可能性があるため、本実験には４患者症例分の実験を行い、それらをまとめてＷＦＡ結合性タンパク質群とした。【００６７】
＜１．ＷＦＡ陽性組織領域由来タンパク質の抽出＞
ホルマリン固定肝内胆管がん患者組織連続切片（１０μｍ厚)６枚を定法に従い組織切片上に被覆しているパラフィンを脱パラフィン化した。脱パラフィン化した組織切片はＰＢＳにて洗浄後、風乾した。うち１枚を実施例２と同様の方法でＷＦＡ染色した。ＷＦＡ染色組織切片スライドガラスを顕微鏡で確認し、ＷＦＡ陽性領域（５×５ｍｍ 四方程度）を確定後、未染色組織切片スライドガラス５枚から、ＷＦＡ陽性領域をかきとり、その組織フラグメントを予め１０ｍＭクエン酸 (ｐＨ６．０) ２００μＬを入れた１．５ｍＬ容マイクロチューブに回収した。【００６８】
得られた組織フラグメント入り溶液はホルマリンによる分子内および分子間架橋を解離するため９５℃で９０分処理した。熱処理後、２０，０００×ｇ、５分、４℃で遠心分離し、上清を除いた。残りの組織フラグメント含有ペレットにＰＢＳ（−）２００μＬを加えた（バッファー交換工程）。更に、２０，０００×ｇ、５分、４℃で遠心後、上澄みを除き、ペレットに０．５％ＮＰ４０−ＰＢＳ２０μＬを加えた。ペレットを超音波破砕により細粒化した後に、氷上で６０分反応し、膜タンパク質を可溶化した。反応後、２０，０００×ｇ、５分、４℃で遠心し、上清を組織抽出タンパク質溶液として回収した。【００６９】
＜２．ＷＦＡ結合性タンパク質の捕獲＞
まず、２５μｇのビオチン化ＷＦＡを、ストレプトアビジン固定化磁気ビーズ（Dynabeads MyOne Streptavidin T-1, Dynabeads社製、１００μＬ）に固定化し、これをＷＦＡ固定化磁気ビーズとした。予めビーズへ非特異的に結合するタンパク質を吸収するためにストレプトアビジン固定化磁気ビーズと１時間反応した組織抽出タンパク質溶液を、ＷＦＡ固定化磁気ビーズへ添加し、４℃で一晩振盪反応した。結合反応後、磁石によりビーズを回収し、次いで１％Triton X-100含有ＰＢＳ１ｍＬにてビーズを２回洗浄した。洗浄後のビーズへ溶出バッファー（０．１％ＳＤＳ含有ＰＢＳ）１００μＬを加え、５分間加熱処理することで、ＷＦＡ結合性タンパク質を溶出した。これをＷＦＡ結合性タンパク質溶液とした。【００７０】
＜３．ＷＦＡ結合性タンパク質の同定＞
工程２で得られたＷＦＡ結合性タンパク質は、ＴＣＡ処理により濃縮された。濃縮タンパク質溶液は、全量を５〜２０％ ポリアクリルアミドゲルの１ウェルへアプライし、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。分離後、定法により銀染色したゲルから、タンパク質染色性バンドを切り出した。定法によりゲル中のタンパク質はトリプシン処理によりペプチド断片化され、ゲルから抽出、脱塩後、質量分析装置によりそれぞれのタンパク質を同定した。【００７１】
（結果）
今回肝内胆管がん４症例分を用いた上述の実験により、ＷＦＡ結合性タンパク質候補分子として１７１分子が同定された。これら候補分子のうち、本実施例では抗体が市販されている糖タンパク質４７分子に限定し、以降の絞り込みを行った。候補分子の絞り込みは、各分子に関する詳細な情報をもとにしたスコアリングにより、高得点の分子を最有力分子として絞り込みを行った。【００７２】
＜スコアリング方法（１６点満点）＞
（１）トランスクリプトームレベルで、各組織での候補分子の発現情報より、肝内胆管がんで発現している場合、３点を加算する（info）。
（２）基本的に分泌タンパク質を標的とするため、シグナル配列を有する場合、３点加算する（Ｓ）。
（３）タンパク質レベルの発現情報が掲載されているProtein Human Atras (HUPO) により、肝内胆管がんでの発現、肝細胞がん組織での発現が確認された場合３点を加算し、更に正常組織で発現していない場合は２点を追加する（Ｈｕ）。 
（４）既報の糖鎖付加情報より、糖鎖修飾が確認されている場合、１点加算する（Ｕｐ）。 
（５）既報の文献情報により、がん関連分子と報告されていたり、がんによる発現の増減の変動があると確認されていたりする場合、２点加算し、その報告がCCC関連の場合は1点加算、かつ胆汁での発現が報告されている場合はさらに1点追加する（Ｊ）。  【００７３】
（結果）
結果を、表３に示す。表に示されるように、ＣＡ１２５、Ｎ−ＣＡＭ−Ｌ１、 Maspin, Lactoferrin、 CollagenIV,、CathepsinWの６分子が総獲得点数８点以上（１６点満点中）であったため、ＭＵＣ１に加えこれらを肝内胆管がん特異的に発現するＷＦＡ結合性タンパク質の最有力候補分子とした。【００７４】
【表３】
2010100862.tif 000005
【実施例５】
【００７５】
［ＷＦＡ結合性タンパク質候補分子の絞り込み］
この時点では、がん部と非がん部を見分けるものにすぎず、周辺領域である間質、肝実質への染色性を加味したものとなっていない。そこで、次に組織染色によるマーカーの局在を確認し、更なる絞り込みを試みた。【００７６】
（組織染色）
ホルマリン固定肝内胆管がん患者組織連続切片（５μｍ厚)を定法に従い組織切片上に被覆しているパラフィンを脱パラフィン化した。脱パラフィン化した組織切片はＰＢＳにて洗浄後、１０ｍＭクエン酸（ｐＨ６．０）緩衝液中で、１２１℃、１５分間オートクレーブによって抗原の賦活化処理を行った。ＰＢＳにて洗浄後、０．３％過酸化水素加メタノールに２０分浸し、内在性ペルオキシダーゼの活性阻止を行った。ＰＢＳ洗浄後、正常ウサギ血清にてブロッキングしたのち、各抗体（ＭＹ．１Ｅ１２ ;０．５ｍｇ／ｍＬ，anti-CA125 ;１ｍｇ／ｍＬ, anti-Maspin ;２ｍｇ／ｍＬ, anti-N-CAM-L1 ;１ｍｇ／ｍＬ, anti-Cathepsin W ;５ｍｇ／ｍＬ, anti-CollagenIV ;５ｍｇ／ｍＬ, anti-Lactoferrin ;１ｍｇ／ｍＬ, 全てマウスＩｇＧ抗体）を加えた後、室温にて１時間反応させた。ＰＢＳにて洗浄後、ヒストファインシンプルステインキット（ニチレイ社）にて発色を行った。滅菌水にて洗浄後、ヘマトキシリンにより対比染色を行った後、封入した。【００７７】
（結果）
各候補分子の組織染色の典型例を図５に示す。また、その発現パターンを表４に示す。染色が見られるもの（＋）、わずかながらではあるが染色が確認できたもの（−/＋）、染色が見られなかったもの（−）をそれぞれ示す。胆管がん特異的に染色が見られ、組織マーカーとしてあるいは胆汁、血清マーカーとしての有用性が考えられる最有力候補群 (MUC1, CA125, N-CAM-L1, Maspin) と胆管がん特異的ではないがＷＦＡとの組み合わせによって胆汁、血清におけるマーカーとしての可能性が考えられる候補群 (Lactoferrin,CollagenIV,CathepthinW) とに区別できる。前者を組織マーカーを含めた胆汁、血清マーカー、後者を胆汁、血清マーカーとして最終的な有力候補分子とした。【００７８】
【表４】
2010100862.tif 000006
【実施例６】
【００７９】
［胆汁を用いた肝内胆管がんの検出１］
肝内胆管がんに由来するＷＦＡ結合性糖タンパク質からなる糖鎖バイオマーカーをがんマーカーとし、該糖鎖バイオマーカーの肝内胆管がん特異的糖鎖構造を検出する最良の形態としては、組織ライセートや胆汁中に含まれる糖鎖バイオマーカーを臨床上許容される性能で、かつ、臨床上適用可能な簡便な手段により検出及び判別する方法が考えられる。以下にはその例として、選抜された７つの肝内胆管がん特異的マーカー候補分子のうち、実施例２で候補分子として挙げられたＭＹ．１Ｅ１２抗体結合性ＭＵＣ１分子について、肝内胆管がん患者胆汁を対象とした抗体オーバーレイ−ＷＦＡウェルプレート（図１ｂを参照）を用いたサンドイッチ検出分析の結果を示す。【００８０】
（実験方法）
＜１．ＷＦＡ固相化ウェルプレートの作製＞
マイクロタイタープレート(グライナー社製 ９６ウェル平底高結合性プレート)へＰＢＳ緩衝液に溶解したＷＦＡ（Vector社製、２．５μｇ／ｍＬ）を各ウェルに１００μＬずつ加え、２時間室温で保温し、支持体へＷＦＡを固相化した。未結合ＷＦＡを洗浄液である０．１％Tween２０含有ＰＢＳ（２００μＬ）で２回ずつ洗浄し、ブロッキング剤である１％ＢＳＡ含有洗浄液を２００μＬずつ加えた。２時間室温で反応後、０．１％Tween２０含有ＰＢＳ（２００μＬ）で２回ずつ洗浄し、ＷＦＡ固相化ウェルプレートを完成させた。【００８１】
＜２．結合および検出反応＞
まず、胆汁のタンパク質定量をマイクロBCAタンパク質定量キット（PIERCE社製）により行った。各サンプルは上記洗浄液で２００μｇ／ｍＬになるように希釈し、うち１００μＬを１で作製したＷＦＡ固相化ウェルプレートへ添加した後、２時間室温で結合反応した。反応後、各ウェルは上記洗浄液２００μＬで５回洗浄し、未結合タンパク質を除去した。そこにあらかじめ０．５μｇ／ｍＬへ洗浄液で調整した検出剤（ＭＹ．１Ｅ１２抗体溶液）を１ウェルあたり１００μＬずつ加え、室温で２時間抗原抗体反応した。【００８２】
未結合抗体を除去するために洗浄液２００μＬで洗浄後、洗浄液で４，０００倍希釈した抗マウスＩｇＧ抗体−ＨＲＰ溶液(Jackson immuno Research社製)を、１ウェルあたり１００μＬずつ加え、室温で１時間保温した。各ウェルを２００μＬの洗浄液で５回洗浄後、発色試薬であるULTRA-TMB溶液 (Thermo社製)を各ウェルに１００μＬずつ加え、１０分間発色反応した。１ＭのＨ２ＳＯ４溶液を１ウェルあたり１００μＬ加え反応を停止し、プレートリーダーにより４５０ｎｍで吸光度測定した。得られたシグナルはＭＹ．１Ｅ１２結合性ＭＵＣ１を含まない健常者血清をネガティブコントロール（Ｎ）とし、Ｓ／Ｎ比として数値化し、以降の解析に用いた。【００８３】
（結果）
肝内胆管がん患者由来胆汁３０症例に加え、肝内結石症患者由来胆汁２２症例分について分析を行った。その結果を図６ａに示す。肝内結石症患者に比べ、肝内胆管がん患者においてＳ／Ｎ値が明らかに上昇しているのが分かる。その有意差はＴ−検定により危険度Ｐ＝０．００１６であった。そこで肝内胆管がん患者を陽性、肝内結石症患者を陰性としてＲＯＣ曲線を作成した。その結果を図６ｂに示す。がんと結石症を判別する感度は９０％、特異度は６０％であった。この成績はこれまで報告されているいずれのマーカーによる判別結果よりも優れていることが表５（ＷＦＡ−ＭＹ．１Ｅ１２・サンドイッチ・ＥＬＩＳＡ法と、既報との比較：斜体が本発明実施例；既存マーカーによる検査はいずれも文献値を示す。）に示される。特に感度すなわちがんを検出する能力は９０％であり既存の手法の最高値７１％に比べ群を抜いて優れている。肝内胆管がんはその特性上、早期に発見でき、かつ偽陰性が少ないことが求められている。つまり感度が高いマーカーが重要である。そういう意味でも今回開発した手法は最も優れた肝内胆管がんマーカーであることが示される。【００８４】
【表５】
2010100862.tif 000007
【実施例７】
【００８５】
［胆汁を用いた肝内胆管がんの検出２］
検出感度向上やバックグラウンドノイズの減少を目指し、図７（サンドイッチＥＬＩＳＡの改良）に示すように、レクチンの固定化方法を直接法から間接法に変更した。候補分子のうちＭＹ．１Ｅ１２抗体結合性ＭＵＣ１分子及びＣＡ１２５について検討した。【００８６】
（実験方法）
＜１．ＷＦＡ固相化ウェルプレートの作製＞
ストレプトアビジンコートマイクロタイタープレート(NUNC社製 ９６ウェル平底プレート)へＰＢＳ緩衝液に溶解したビオチン化 ＷＦＡ（Vector社製、２０μｇ／ｍＬ）を各ウェルに５０μＬずつ加え、１時間室温で保温し、支持体へＷＦＡを固相化した。未結合ビオチン化 ＷＦＡを洗浄液である０．１％Tween２０含有ＰＢＳ（３００μＬ）で２回ずつ洗浄し、ＷＦＡ固相化ウェルプレートを完成させた。【００８７】
＜２．結合および検出反応＞
まず、胆汁のタンパク質定量をマイクロＢＣＡタンパク質定量キット（PIERCE社製）により行った。各サンプルは上記洗浄液で４００μｇ／ｍＬになるように希釈し、うち５０μＬを１で作製したＷＦＡ固相化ウェルプレートへ添加した後、２時間室温で結合反応した。反応後、各ウェルは上記洗浄液３００μＬで５回洗浄し、未結合タンパク質を除去した。そこにあらかじめ０．５μｇ／ｍＬへ洗浄液で調整した検出剤（ＭＹ．１Ｅ１２抗体溶液）もしくは１．０μｇ／ｍＬ洗浄液で調整した検出剤（Anti-CA125抗体）を１ウェルあたり５０μＬずつ加え、室温で２時間抗原抗体反応した。【００８８】
未結合抗体を除去するために洗浄液３００μＬで洗浄後、洗浄液で４，０００倍希釈した抗マウスＩｇＧ抗体−ＨＲＰ溶液（Jackson immuno Research社製）を、１ウェルあたり５０μＬずつ加え、室温で１時間保温した。各ウェルを３００μＬの洗浄液で５回洗浄後、発色試薬であるULTRA-TMB溶液（Thermo社製）を各ウェルに１００μＬずつ加え、１０分間発色反応した。１MのＨ２ＳＯ４溶液を１ウェルあたり１００μＬ加え反応を停止し、プレートリーダーにより４５０ｎｍで吸光度測定した。得られたシグナルはＭＹ．１Ｅ１２結合性ＭＵＣ１おしくはCA125を含まない健常者血清をネガティブコントロール（Ｎ）とし、Ｓ／Ｎ比として数値化し、以降の解析に用いた。【００８９】
（結果）
肝内胆管がん患者由来胆汁３０症例に加え、肝内結石症患者由来胆汁２２症例分について分析を行った。その結果を図８ａに示す。肝内結石症患者に比べ、肝内胆管がん患者においてＳ／Ｎ値が明らかに上昇しているのが分かる。その有意差はＴ−検定により危険度Ｐ＝０．００１５であった。そこで肝内胆管がん患者を陽性、肝内結石症患者を陰性としてＲＯＣ曲線を作成した。その結果を図８ｂに示す。がんと結石症を判別する感度は９０％、特異度は７６％で、直接レクチンを固定する場合に比べ特異度が大幅に向上した。なお、図８ｃ、ｄに示す通り、ＷＦＡ−ＣＡ１２５・サンドイッチ・ＥＬＩＳＡでは結石症患者、胆管がん患者との間の有意差は、感度５７％、特異度６４％程度であった。【００９０】
（考察：Cytologyとの比較）
本発明による肝内胆管がん検出、判別法の成績は従来胆汁を用いて行われている胆汁細胞診による判別結果よりも優れていることが表６（ＷＦＡ−ＭＹ．１Ｅ１２・サンドイッチ・ＥＬＩＳＡ法と、胆汁細胞診との比較：斜体が本発明実施例）に示される。感度すなわちがんを検出する能力は胆汁細胞診の２２％（４/１８）に比べ８３％（１５/１８）であり胆汁細胞診に比べ優れている。肝内胆管がんはその特性上、早期に発見でき、かつ偽陰性が少ないことが求められている。つまり感度が高いマーカーが重要である。今回開発した手法は優れた肝内胆管がんマーカーであることが示される。【００９１】
一方でＷＦＡ−ＣＡ１２５・サンドイッチ・ＥＬＩＳＡでは、感度の点ではＷＦＡ−ＭＹ．１Ｅ１２・サンドイッチ・ＥＬＩＳＡに比べて劣るものの、細胞診クラスに依存して陽性率が向上することが示された。したがって、ＷＦＡ−ＣＡ１２５・サンドイッチ・ＥＬＩＳＡは、ＷＦＡ−ＭＹ．１Ｅ１２ サンドイッチ・ＥＬＩＳＡに比べ、よりがんの進行が後期のものを見分けるのに適する可能性が示された。【００９２】
【表６】
2010100862.tif 000008
【実施例８】
【００９３】
［血液を用いた肝内胆管がんの検出］
上述のとおり、高感度な検出系を確立できたため、引き続き血清を用いた検出を試みた。
（実験方法）
＜１．ＷＦＡ固相化ウェルプレートの作製＞
ストレプトアビジンコートマイクロタイタープレート（NUNC社製 ９６ウェル平底プレート）へＰＢＳ緩衝液に溶解したビオチン化 ＷＦＡ（Vector社製、２０μｇ／ｍＬ）を各ウェルに５０μＬずつ加え、１時間室温で保温し、支持体へＷＦＡを固相化した。未結合ビオチン化 ＷＦＡを洗浄液である０．１％Tween２０含有ＰＢＳ（３００μＬ）で２回ずつ洗浄し、ＷＦＡ固相化ウェルプレートを完成させた。【００９４】
＜２．結合および検出反応＞
各血清サンプルは上記洗浄液で４μＬ／１００μＬになるように希釈し、うち５０μＬを１で作製したＷＦＡ固相化ウェルプレートへ添加した後、２時間室温で結合反応した。反応後、各ウェルは上記洗浄液３００μＬで５回洗浄し、未結合タンパク質を除去した。そこにあらかじめ０．５μｇ／ｍＬへ洗浄液で調整した検出剤（ＭＹ．１Ｅ１２抗体溶液）を１ウェルあたり５０μＬずつ加え、室温で２時間抗原抗体反応した。【００９５】
未結合抗体を除去するために洗浄液３００μＬで洗浄後、洗浄液で４，０００倍希釈した抗マウスＩｇＧ抗体−ＨＲＰ溶液（Jackson immuno Research社製）を、1ウェルあたり５０μＬずつ加え、室温で1時間保温した。各ウェルを３００μＬの洗浄液で５回洗浄後、発色試薬であるULTRA-TMB溶液（Thermo社製）を各ウェルに１００μＬずつ加え、１０分間発色反応した。１MのＨ２ＳＯ４溶液を１ウェルあたり１００μＬ加え反応を停止し、プレートリーダーにより４５０ｎｍで吸光度測定した。【００９６】
（結果）
胆管がん患者由来血清５症例に加え、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）患者由来血清３例、肝内結石症患者由来血清５症例、健常者血清６例分について分析を行った。その結果を図９に示す。ＰＢＣ患者（ｂ）、肝内結石症患者（ｃ）、健常者（ｄ）に比べ、胆管がん患者（ａ）において５例中３例が値で明らかに上昇しているのが分かる。
【図１】
2010100862.tif 000009
【図２】
2010100862.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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