(57)【要約】  細胞の大量培養に好適な細胞浮遊培養装置として、外管と該外管の内腔に挿入された内管とからなる二重管構造を有する培養液アスピレータと、浮遊培養槽と、を備える細胞培養装置であり、前記培養液アスピレータにおいて、前記外管は、培養液を通液させるフィルタを備え、前記内管は、前記フィルタを通液した培養液の吸引口を備え、前記外管の前記浮遊培養槽への挿入方向遠位に、該外管の内腔と外部とを連絡する空気孔が設けられている、細胞培養装置を提供する。
2019124540.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外管と該外管の内腔に挿入された内管とからなる二重管構造を有する培養液アスピレータと、浮遊培養槽と、を備える細胞培養装置であり、
前記培養液アスピレータにおいて、
前記外管は、培養液を通液させるフィルタを備え、
前記内管は、前記フィルタを通液した培養液の吸引口を備え、
前記外管の前記浮遊培養槽への挿入方向遠位に、該外管の内腔と外部とを連絡する空気孔が設けられている、細胞培養装置。
【請求項２】
前記浮遊培養槽へ培養液を供給する培養液供給路をさらに備える、請求項１記載の細胞培養装置。
【請求項３】
外管と、該外管の内腔に挿入された内管とからなる二重管構造を有する培養液アスピレータであり、
前記外管は、培養液を通液させるフィルタを備え、
前記内管は、前記フィルタを通液した培養液の吸引口を備え、
前記外管の培養液への挿入方向遠位に、該外管の内腔と外部とを連絡する空気孔が設けられている、培養液アスピレータ。
【請求項４】
浮遊培養槽における細胞培養方法であり、
外管と該外管の内腔に挿入された内管とからなる二重管構造を有する培養液アスピレータを用いて前記浮遊培養槽内の培養液を前記浮遊培養槽外に排出する手順を含み、
ここで、前記培養液アスピレータにおいて、
前記外管は、培養液を通液させるフィルタを備え、
前記内管は、前記フィルタを通液した培養液の吸引口を備え、
前記外管の前記浮遊培養槽への挿入方向遠位に、該外管の内腔と外部を連絡する空気孔が設けられている、細胞培養方法。
【請求項５】
前記手順において前記浮遊培養槽への培養液の供給が同時に行われる、請求項４記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養装置、培養液アスピレータ及び細胞培養方法に関する。
［発明の背景］【０００２】
胚性幹細胞（ES細胞）及び人工多能性幹細胞（iPS細胞）等の多能性幹細胞（pluripotent stem cell）を用いた再生医療の臨床応用のためには、ディッシュやフラスコを用いた実験室的培養手法を量的に拡大（スケールアップ）し、一定以上の品質の細胞を大量かつ低コストに製造可能な培養装置の開発が必要である。細胞の大量培養プロセスの確立には、酸素の供給や培養液の交換の効率化が重要であり、増殖因子の使用量削減などを介した低コスト化も求められる。【０００３】
細胞の培養方法として、細胞外基質やフィーダー細胞で被覆した培養器表面に細胞を接着させて培養を行う接着培養と、培養液中に細胞を浮遊させて培養を行う浮遊培養（懸濁培養）とがある。接着培養では、細胞の最大収量は培養面積に依存するが、浮遊培養では、細胞の最大収量は培養液体積に依存する。このため、スケールアップには浮遊培養が有利である。【０００４】
多能性幹細胞などの細胞は、浮遊培養されると凝集体を形成する。非特許文献１には、スピナーフラスコを用いて細胞の過剰な凝集を抑制しつつ培養液流による剪断応力によって細胞死が引き起こされないように培養液を撹拌し、多能性幹細胞を安定的に増殖させる技術が開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Olmer R, et al., "Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors.", Tissue Eng. Part. C Methods, 2012, 18(10):772-84.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
実験室的培養手法における培養液の交換は、遠心分離等によって細胞を培養液から分離し、分離した細胞を新たな培養液に再懸濁することによって行うことができる。しかし、浮遊培養による大量培養では、遠心分離等の細胞分離操作の実施は困難であるため、細胞の凝集体を自然沈降させることによって細胞と培養液とを分離して培養液の交換を行っている。この培養液の交換は、培養液の攪拌を一時停止して細胞の自然沈降を待つ時間が必要となるため、手間を要し、かつ当該時間における細胞増殖や細胞の性質の不安定化および不均質化を生じさせるおそれがあった。【０００７】
本発明は、細胞の大量培養に好適な細胞浮遊培養装置を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題解決のため、本発明は、以下の［１］〜［４ｈ］を提供する。
［１］  外管と該外管の内腔に挿入された内管とからなる二重管構造を有する培養液アスピレータと、浮遊培養槽と、を備える細胞培養装置であり、
前記培養液アスピレータにおいて、
前記外管は、培養液を通液させるフィルタを備え、
前記内管は、前記フィルタを通液した培養液の吸引口を備え、
前記外管の前記浮遊培養槽への挿入方向遠位に、該外管の内腔と外部とを連絡する空気孔が設けられている、細胞培養装置。
［１ａ］  前記培養液アスピレータを、前記フィルタをその下方に位置させて配置した場合に、前記空気孔が前記吸引口よりも上方に設けられている、［１］の細胞培養装置。
［１ｂ］  前記内管は、前記浮遊培養槽への挿入方向先端が前記吸引口として構成され、反対端の管口がポンプに接続される、［１］又は［１ａ］の細胞培養装置。
［１ｃ］  前記外管は、前記浮遊培養槽への挿入方向先端に前記フィルタを備え、反対端が前記内管の挿入口として構成され、
前記挿入口における、前記外管の内腔面と前記内管外面との間隙が前記空気孔として構成されている、［１ｂ］の細胞培養装置。
［１ｄ］  前記外管は、外周面に前記フィルタを備える、［１ｂ］の細胞培養装置。
［２］  前記浮遊培養槽へ培養液を供給する培養液供給路をさらに備える、［１］、［１ａ］−［１ｄ］のいずれかの細胞培養装置。
［２ａ］  前記浮遊培養槽が、培養液を攪拌するための攪拌器を備える、［１］、［１ａ］−［１ｄ］、［２］のいずれかの細胞培養装置。
［２ｂ］  前記培養液アスピレータの作動時に、前記攪拌器も作動するように構成された、［２ａ］の細胞培養装置。【０００９】
［３］  外管と、該外管の内腔に挿入された内管とからなる二重管構造を有する培養液アスピレータであり、
前記外管は、培養液を通液させるフィルタを備え、
前記内管は、前記フィルタを通液した培養液の吸引口を備え、
前記外管の培養液への挿入方向遠位に、該外管の内腔と外部とを連絡する空気孔が設けられている、培養液アスピレータ。
［３ａ］  前記内管は、培養液への挿入方向先端が前記吸引口として構成され、反対端の管口がポンプに接続される、［３］の細胞培養装置。
［３ｂ］  前記外管は、培養液への挿入方向先端に前記フィルタを備え、反対端が前記内管の挿入口として構成され、
前記挿入口における、前記外管の内腔面と前記内管外面との間隙が前記空気孔として構成されている、［３ａ］の細胞培養液アスピレータ。
［３ｃ］  前記外管は、外周面に前記フィルタを備える、［３ａ］の細胞培養装置。
［３ｄ］  ［３］、［３ａ］−［３ｃ］のいずれかの細胞培養液アスピレータを構成し、前記内管と組み合わせて用いられ得る前記外管。
［３ｅ］  ［３］、［３ａ］−［３ｃ］のいずれかの細胞培養液アスピレータを構成し、前記外管と組み合わせて用いられ得る前記内管。【００１０】
［４］  浮遊培養槽における細胞培養方法であり、
外管と該外管の内腔に挿入された内管とからなる二重管構造を有する培養液アスピレータを用いて前記浮遊培養槽内の培養液を前記浮遊培養槽外に排出する手順を含み、
ここで、前記培養液アスピレータにおいて、
前記外管は、培養液を通液させるフィルタを備え、
前記内管は、前記フィルタを通液した培養液の吸引口を備え、
前記外管の前記浮遊培養槽への挿入方向遠位に、該外管の内腔と外部を連絡する空気孔が設けられている、細胞培養方法。
［４ａ］  前記手順において前記浮遊培養槽への培養液の供給が同時に（concurrently）行われる、［４］の細胞培養方法。
［４ｂ］  前記手順において前記浮遊培養槽へ培養液を供給しながら排出を行い、これによって培養液が交換される、［４ａ］の細胞培養方法。
［４ｃ］  培養液の攪拌器を備えた、気密な浮遊培養槽における細胞培養方法であり、
外管と該外管の内腔に挿入された内管とからなる二重管構造を有する培養液アスピレータを用いて前記浮遊培養槽内の培養液を前記浮遊培養槽外に排出する手順を含み、
ここで、前記培養液アスピレータにおいて、
前記外管は、培養液を通液させるフィルタを備え、
前記内管は、前記フィルタを通液した培養液の吸引口を備え、
前記外管の前記浮遊培養槽への挿入方向遠位に、該外管の内腔と外部を連絡する空気孔が設けられている、細胞培養方法。
［４ｄ］  前記手順において前記攪拌器の作動が維持される、［４ｃ］の細胞培養方法。
［４ｅ］  前記手順において前記浮遊培養槽への培養液の供給が同時に（concurrently）行われる、［４ｄ］又は［４ｃ］の細胞培養方法。
［４ｆ］  前記手順において前記浮遊培養槽へ培養液を供給しながら排出を行い、これによって培養液が交換される、［４ｅ］の細胞培養方法。【００１１】
［４ｇ］  浮遊培養槽の培養液を排出する又は交換する方法であり、
外管と該外管の内腔に挿入された内管とからなる二重管構造を有する培養液アスピレータを用いて前記浮遊培養槽内の培養液を前記浮遊培養槽外に排出する手順を含み、
ここで、前記培養液アスピレータにおいて、
前記外管は、培養液を通液させるフィルタを備え、
前記内管は、前記フィルタを通液した培養液の吸引口を備え、
前記外管の前記浮遊培養槽への挿入方向遠位に、該外管の内腔と外部を連絡する空気孔が設けられている、方法。【００１２】
［４ｈ］  多能性幹細胞又は多能性幹細胞由来細胞を浮遊培養層内で分化させる方法であり、
該浮遊培養槽の培養液を排出する又は交換する手順を含み、
該手順において、外管と該外管の内腔に挿入された内管とからなる二重管構造を有する培養液アスピレータを用いて前記浮遊培養槽内の培養液を前記浮遊培養槽外に排出する、
ここで、前記培養液アスピレータにおいて、
前記外管は、培養液を通液させるフィルタを備え、
前記内管は、前記フィルタを通液した培養液の吸引口を備え、
前記外管の前記浮遊培養槽への挿入方向遠位に、該外管の内腔と外部を連絡する空気孔が設けられている、方法。【００１３】
また、本発明は、上記課題解決のため、以下の［５］〜［８］をも提供する。
［５］  浮遊培養槽と、培養液アスピレータと、を含んでなる細胞培養装置であり、
前記培養液アスピレータは近位端と遠位端とを有し、
該近位端の管口が培養液の吸引口として構成され、
該遠位端の管口がポンプに接続され、
前記浮遊培養槽は、培養液を攪拌するための攪拌器と、培養液を通流させるフィルタと、を備え、
前記フィルタは、前記浮遊培養槽の槽内を、前記攪拌器が配設されている第一の領域と、前記培養液アスピレータが挿入されている第二の領域とに区分する、
細胞培養装置。
［６］  前記フィルタが前記浮遊培養槽の槽内に鉛直あるいは略鉛直に配設されている、［５］の細胞培養装置。
［７］  前記培養液アスピレータの作動時に、前記攪拌器も作動するように構成された、［５］又は［６］の細胞培養装置。
［８］  前記浮遊培養槽へ培養液を供給する培養液供給路をさらに備える、［５］−［７］のいずれかの細胞培養装置。【００１４】
本明細書において、「培養」または「培養する」とは、組織外又は体外で、例えば、細胞培養ディッシュ、フラスコ、あるいは培養槽（タンク）中で細胞を維持させ、持続させ、増殖させ、かつ／又は分化させることを意味する。好ましくは、「培養」または「培養する」とは、組織外又は体外で、培養槽（タンク）中で細胞を分化させることを意味する。
別の態様としては、好ましくは、「培養」または「培養する」とは、組織外又は体外で、培養槽（タンク）中で細胞を維持または増殖させることを意味する。【００１５】
本明細書において、「多能性（pluripotency）」とは、種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、３胚葉のどの系統の細胞にも分化し得る能力を意味する。「多能性（pluripotency）」は、胚盤には分化できず、したがって個体を形成する能力はないという点で、胚盤を含めて、生体のあらゆる組織に分化しうる「全能性（totipotency）」とは区別される。【００１６】
本明細書において、「多能性（multipotency）」とは、複数の限定的な数の系統の細胞へと分化できる能力を意味する。例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞はmultipotentだが、pluripotentではない。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、細胞の大量培養に好適な細胞浮遊培養装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明に係る細胞培養装置の構成を説明する図である。
【図２】本発明の第一実施形態に係る培養液アスピレータの構成を説明する斜視図である。
【図３】本発明の第一実施形態に係る培養液アスピレータの構成を説明する断面図（図２中Ｐ−Ｐ断面）である。
【図４】本発明の第一実施形態に係る培養液アスピレータの変形例の構成を説明する断面図である。
【図５】本発明の第二実施形態に係る培養液アスピレータ、特に外管、の構成を説明する図である。
【図６】本発明の第二実施形態に係る培養液アスピレータ、特に内管、の構成を説明する図である。
【図７】本発明（第２発明）に係る細胞培養装置の構成を説明する図である。
【図８】実施例１の培養４日目の細胞の位相差顕微鏡像を示す。
【図９】比較例１の培養４日目の細胞の位相差顕微鏡像を示す。
【図１０】実施例１及び比較例１の培養４日目の細胞凝集体のサイズ分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２０】
［細胞培養装置（第１発明）］
本発明に係る細胞培養装置は、外管と該外管の内腔に挿入された内管とからなる二重管構造を有する培養液アスピレータと、浮遊培養槽と、を備える。培養液アスピレータにおいて、前記外管は、培養液を通液させるフィルタを備える。また、前記内管は、前記フィルタを通液した培養液の吸引口を備え、前記外管の前記浮遊培養槽への挿入方向遠位に、該外管の内腔と外部とを連絡する空気孔が設けられている。なお、ここにいう「外管の外部」は、培養液アスピレータの浮遊培養槽への挿入時においては、培養槽内の気相に相当してもよい。
【００２１】
図１に、本発明に係る細胞培養装置の構成を示す。細胞培養装置Ａは、本発明の第一実施形態に係る培養液アスピレータ１と、細胞と培養液とを貯留する、気密な浮遊培養槽２と、を備える。培養液アスピレータ１は、浮遊培養槽２内の培養液を外部に排出するために機能する。図中符号３は培養液供給路であり、符号４は空気供給路を示す。培養液供給路３は、浮遊培養槽２内へ培養液を供給するために機能する。空気供給路４は、浮遊培養槽２内へ空気を供給するために機能する。符号５は攪拌器であり、撹拌子５１を備える。攪拌器５は、撹拌子５１を回転又は上下動させることによって浮遊培養槽２内の培養液を攪拌する。培養液アスピレータ１は、培養供給路をかねていてもよい。
【００２２】
図１−図３を参照して本発明の第一実施形態に係る培養液アスピレータ１の構成を説明する。培養液アスピレータ１は、外管１１と、外管１１の内腔１１１に挿入された内管１２とからなる二重管構造を有する。外管１１は遠位端と近位端を有し、遠位端から近位端にいたる内腔１１１を有する。近位端を培養液アスピレータ１の浮遊培養槽２への挿入方向下側（図下方）、遠位端を同上側（図上方）と定義する。内管１２も同様に遠位端と近位端を有し、遠位端から近位端にいたる内腔を有する。
【００２３】
外管１１は、細胞の凝集体を透過させず、培養液を通液させるフィルタ１３を備える。外管１１におけるフィルタ１３の配設位置は、浮遊培養槽２への挿入時に培養液中に浸漬され得る部位であれば特に限定されないが、例えば図に示すように浮遊培養槽２への挿入方向先端に設けることができる。
【００２４】
外管１１の材質は、従来細胞の培養に用いられている、金属、ガラス、ポリスチレン及びポリプロピレン等の樹脂材料を好適に用いることができる。これらの材料には、細胞やタンパク質の付着を防止するためのコーティングを施してもよい。コーティング剤としては、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（MPC）ポリマー、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７、ポリ（2-メトキシエチルアクリレート）（PMEA）、ポリ（メタクリル酸2-ヒドロキエチルメタクリレート）（pHEMA）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニルアルコール（PVA）などが挙げられるが、ＭＰＣポリマーが好ましい。
【００２５】
外管１１の形状や直径、長さは特に限定されない。形状は、円柱又は多角柱であってよく、一部又は全部がテーパ状に形成されていてもよい。直径（内径）及び長さは、浮遊培養槽２の容積（すなわち培養スケール）に応じて適宜設定され得る。
例えば浮遊培養槽２の容積が２５０ｍＬの場合、直径は０．５ｃｍ程度であり、長さは５−１０ｃｍ程度である。同容積が２０００Ｌの場合、直径は１０ｃｍ程度であり、長さは２００−２５０ｃｍ程度である。したがって、外管１１の直径は例えば０．５−１０ｃｍ、長さは５−２５０ｃｍである。外管１１の長さは、培養液の深さＤ（図１参照）に対して５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは１５％以上、さらに好ましくは２０％以上、特に好ましくは２５％以上長くされる。
【００２６】
フィルタ１３には、従来細胞の分離に用いられている、ナイロン及びポリエステル等の樹脂製メッシュ又はメンブレンを好適に用いることができる。フィルタ１３の材質は、樹脂のほか、金属、ガラス及び繊維などであってもよい。これらの材料には、細胞やタンパク質の付着を防止するためのコーティングを施してもよい。コーティング剤としては、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（MPC）ポリマー、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７、ポリ（2-メトキシエチルアクリレート）（PMEA）、ポリ（メタクリル酸2-ヒドロキエチルメタクリレート）（pHEMA）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニルアルコール（PVA）などが挙げられるが、ＭＰＣポリマーが好ましい。メッシュサイズあるいはポアサイズは、培養の目的とする細胞と該細胞が形成する凝集体のサイズに応じて適宜設定され得る。フィルタ１３の形状や直径、厚さは特に限定されない。形状は、円形又は多角形であってよい。直径は、例えば外管の直径に合わせて０．５−１０ｃｍであってよいが、外管１１の直径よりも小さくてもよい。フィルタ１３は、培養液交換の効率を上げるため、後述する第二実施形態のように、外管１１の外周面に配設されてもよい。厚さは、例えば０．０５〜２ｍｍ程度である。フィルタ１３は交換可能に配設されていてよい。フィルタ１３は、外管１１の一部もしくは全部と一体となって立体形状（例えば、球体、球体の変形立体、円錐、円錐台、多面体）を構成することもできる。
【００２７】
本発明において、培養の目的とする細胞には、浮遊培養下で増殖して凝集体を形成し得る細胞が広く含まれ得る。ここにいう「凝集体」には、細胞に加えて、該細胞が接着する担体が含まれていてもよい。細胞が付着可能な浮遊培養用の担体は、マイクロキャリアと称され、ポリスチレン、セルロース及びデキストランなどからなる粒子が市販されている。本発明の培養の目的とする細胞には、これらの担体への接着能を有し、担体への接着状態で浮遊培養され得る細胞も広く包含され得る。
培養の目的とする細胞は、１種類又は２種類以上であってよい。
例えば、多能性幹細胞（pluripotent stem cell）、多能性幹細胞（multipotent stem cell）、多能性幹細胞由来細胞、癌細胞、及び株化細胞等が挙げられる。
「多能性幹細胞（pluripotent stem cell）」とは、胚性幹細胞（ES細胞）及びこれと同様の分化多能性、すなわち生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞を指す。ES細胞と同様の分化多能性を有する細胞としては、「人工多能性幹細胞」（本明細書中、「iPS細胞」と称することもある）が挙げられる。
「ES細胞」としては、マウスES細胞であれば、inGenious targeting laboratory社、理研（理化学研究所）等が樹立した各種マウスES細胞株が利用可能であり、ヒトES細胞であれば、米国ウイスコンシン大Thomsonら、米国NIH、理研、京都大学、Cellartis社が樹立した各種ヒトES細胞株が利用可能である。たとえば、ヒトES細胞株としては、NIHのCHB-1〜CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1〜HUES28株等、WisCell ResearchのH1株、H9株、理研のKhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等を利用することができる。
「人工多能性幹細胞」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にOct3/4・Sox2・Klf4・c-Mycの４因子を導入することにより、樹立されたiPS細胞（Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のiPS細胞（Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872.）、上記４因子導入後、Nanogの発現を指標として選別し、樹立したNanog-iPS細胞（Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.）、c-Mycを含まない方法で作製されたiPS細胞（Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101 - 106）、ウイルスフリー法で6因子を導入して樹立されたiPS細胞（Okita K et al. Nat. Methods 2011 May;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66.）も用いることができる。また、Thomsonらにより作製されたOCT3/4・SOX2・NANOG・LIN28の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.）、Daleyらにより作製された人工多能性幹細胞（Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開2008-307007号）等も用いることができる。
このほか、公開されているすべての論文（例えば、Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574；、Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650；Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797）、あるいは特許（例えば、特開2008-307007号、特開2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
人工多能性細胞株としては、NIH、理化学研究所（理研）、京都大学等が樹立した各種iPS細胞株が利用可能である。例えば、ヒトiPS細胞株であれば、理研のHiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大学のFf-WJ-18株、Ff-I01s01株、Ff-I01s02株、Ff-I01s04株、Ff-I01s06株、Ff-I14s03株、Ff-I14s04株、QHJI01s01株、QHJI01s04株、QHJI14s03株、QHJI14s04株253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、CDI社のMyCell iPS Cells（21525.102.10A)株、MyCell iPS Cells（21526.101.10A)株、等が挙げられる。
容易に入手可能な人工多能性細胞株としては、NIH、理研、京都大学等が樹立した各種iPS細胞株がある。例えば、ヒトiPS細胞株であれば、理研のHiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大学の253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株等が挙げられる。
【００２８】
多能性幹細胞由来細胞とは、多能性幹細胞より分化誘導される細胞を示し、特に限定されないが、心筋細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、後前腸細胞、膵前駆細胞、神経前駆細胞、肝細胞及び血管内皮細胞等が上げられる。
【００２９】
癌細胞としては、特に限定されないが、肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌及び食道癌等に由来する癌細胞が挙げられる。
【００３０】
株化細胞としては、特に限定されないが、MRC-5、GL37、Vero及びCHO等が挙げられる。
【００３１】
これらの細胞のサイズは、通常１０〜２０μｍ程度である。細胞凝集体のサイズは、通常２０〜１０００μｍ程度であり、培養の目的に応じて特には２０−４００μｍ程度である。
したがって、メッシュサイズあるいはポアサイズを目的とする細胞凝集体のサイズよりも小さく設定すれば、フィルタ１３において、目的とするサイズ以上の大きさの細胞凝集体を透過させずに、目的サイズ未満の大きさの細胞凝集体と非凝集細胞及び培養液を通液させることができる。非凝集細胞には死細胞が含まれ得る。メンブレンを用いる場合、そのポアサイズは、例えば１５−９９５μｍ程度、例として１５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、３９５、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９９５μｍであり、好ましくは１５−３９５μｍ程度、、特には１５−４０μｍ程度である。あるいは、ポアサイズは、目的とする細胞凝集体のサイズよりも５μｍ程度小さくされることが好ましい。メッシュサイズ（目開き）についても、ポアサイズと同じサイズでよい。
【００３２】
内管１２は、フィルタ１３を通液した培養液を吸引する吸引口１２１を備える。吸引口１２１からは、フィルタ１３を通液した培養液とともに目的サイズ未満の細胞凝集体及び非凝集細胞、細胞破片（debris）も吸引される。吸引口１２１から吸引された培養液、目的サイズ未満の大きさの細胞凝集体及び非凝集細胞は、内管１２の内腔を通流して浮遊培養槽２の外部へ排出される。内管１２における吸引口１２１の配設位置は、浮遊培養槽２への挿入時にフィルタ１３を通液した培養液中に浸漬され得る部位であれば特に限定されないが、浮遊培養槽２への挿入方向先端（近位端）に設けられていることが好ましい。
【００３３】
吸引口１２１の形状や直径は特に限定されない。形状は、円孔又は多角孔であってよい。直径（内径）は、例えば０．０１−３ｃｍ程度である。
【００３４】
内管１２の材質は、外管１１の材質と同様であってよく、金属、ガラス、ポリスチレン及びポリプロピレン等の樹脂材料が好適に用いられる。これらの材料には、細胞やタンパク質の付着を防止するためのコーティング（例えば、ＭＰＣコート）を施してもよい。
【００３５】
内管１２の形状や直径、長さは特に限定されない。形状は、円柱又は多角柱であってよく、一部又は全部がテーパ状に形成されていてもよい。直径（内径）は、例えば０．０４−３ｃｍ程度である。外管１１の近位端に配設されたフィルタ１３と、内管１２の近位端に配設された吸引口１２１との距離ｈ（図３参照）は、特に限定されないが、外管の長さの１／１０〜１／５０程度とされることが好ましい。
【００３６】
内管１２の吸引口１２１との反対端（遠位端）は、培養液等の吸引のための陰圧源となるポンプに接続されている。ポンプには、細胞培養装置において従来培養液を送液するために用いられているものを採用できる。ポンプによる培養液の吸引は、浮遊培養槽２の容積（培養スケール）に応じて適宜設定され得る。例えば浮遊培養槽２の容積が２５０ｍＬの場合は毎分０．１−１０ｍｌ程度であり、２０００Ｌの場合は毎分０．８−８０Ｌ程度である。ポンプによる培養液の吸引は、連続的あるいは間欠的に行われてよい。
【００３７】
外管１１は、浮遊培養槽２への挿入方向遠位に、内腔１１１と外部とを連絡する空気孔１１２を有する。空気孔１１２は、外管１１の内腔１１１内の陰圧を外部（浮遊培養槽２内の気相）に逃がすために機能する。
空気孔１１２の形状や大きさは特に限定されない。形状は、四角形、多角形、円形又は楕円形であってよい。大きさは、外管１１の内腔１１１内の陰圧を外部に逃がすために十分な大きさであればよい。
外管１１と内管１２は、外管１１の内腔１１１内の空気の通流を妨げないように結合される。例えば、図３に示されるように、内管１２が外管１１の上部端面を貫通する部位にて外管１１と内管１２との結合がなされていてよい。あるいは、外管１１から内腔１１１へ支持部材を突設し、当該支持部材に内管１１を結合してもよい。
別の態様として、外管１１と内管１２は結合していなくてもよく、例えば、図１に示されるように、外管１１が浮遊培養槽２の底面に結合され、内管１２が浮遊培養槽２の上面を貫通する部位にて内管１２が浮遊培養槽２の上面に結合していてもよい。
【００３８】
内管１２の吸引口１２１からの培養液等の吸引によって外管１１の内腔１１１に過剰な陰圧が加わると、フィルタ１３を介した培養液等の吸引圧が大きくなり過ぎ、メッシュサイズあるいはポアサイズ以上の大きさの細胞凝集体がフィルタ１３に目詰まりしてしまうおそれがある。フィルタ１３に目詰まりが生じると、培養液の交換が不能となったりフィルタ全面での均一ろ過が不能となって培養液の交換が遅滞したりする。内腔１１１内の陰圧が空気孔１１２から外部に逃げることより、内腔１１１に過剰な陰圧が加わることを防止できる。これによって、メッシュサイズあるいはポアサイズ以上の大きさの細胞凝集体がフィルタ１３に目詰まりすることを抑制しつつ、目的サイズ未満の細胞凝集体及び非凝集細胞をフィルタ１３に通過させて、目的サイズの大きさの細胞凝集体のみを浮遊培養槽２に残すことができる。また、仮にフィルタ１３に目詰まりが生じたとしても、内管１２による吸引を止めるだけで空気孔１１２から内腔１１１内に空気が流入して内腔１１１内の陰圧がキャンセルされるので、通常のフィルタを用いた培養液交換で目詰まりを解消するために必要とされるバックフロー作業をせずに目詰まりを解消できる。
【００３９】
外管１１における空気孔１１２の配設位置は、外管１１の浮遊培養槽２への挿入時に浮遊培養槽２内の気相に位置し得る部位（培養液中に浸漬されない部位）であれば特に限定されない。培養液アスピレータ１を、フィルタ１３をその下方に位置させて配置した場合に、空気孔１１２が吸引口１２１よりも上方に設けられていることが必要である。さらに、外管１１においてフィルタ１３が浮遊培養槽２への挿入方向先端（近位端）に設けられる場合、フィルタ１３と空気孔１１２との距離（図３中符号Ｈ参照）は、浮遊培養槽２における培養液の深さＤ（図１参照）に比べて十分大きくされることが好ましい。距離Ｈは、培養液の深さＤに対して１０５％以上、好ましくは１１０％以上、より好ましくは１１５％以上、さらに好ましくは１２０％以上、特に好ましくは１２５％以上大きくされる。
空気孔１１２は、図４に示すように、外管１１における内管１２の挿入口として構成されていてもよい。この場合においては、挿入口における、外管１１の内腔面と内管１２の外面との間隙が空気孔１１２として機能する。
【００４０】
図５及び図６を参照して本発明の第二実施形態に係る培養液アスピレータ６の構成を説明する。培養液アスピレータ６は、第一実施形態に係る培養液アスピレータ１に比して、フィルタ６３が外管６１の外周面に配設されている点で異なる。以下に特に言及しない培養液アスピレータ６の構成は、培養液アスピレータ１の構成と同様であってよいものとする。
【００４１】
フィルタ６３は、外管６１に設けられた開口窓に張り付けられたものとできる。目的サイズ未満の大きさの細胞凝集体及び非凝集細胞、細胞破片（debris）はフィルタ６３を通過して内腔６１１に導入され、内管６２の吸引口６２１から吸引されて内管６２の内腔を通流し、外部へ排出される。
【００４２】
外管６１及び内管６２の材質、形状や直径、長さは、第一実施形態に係る培養液アスピレータ１と同様である。
【００４３】
外管６１におけるフィルタ６３の配設位置は、浮遊培養槽２への挿入時に培養液中に浸漬され得る部位であれば特に限定されない。フィルタ６３は、外管６１の外周面において、浮遊培養槽２への挿入方向先端（近位端）と空気孔６１２の配設位置との間の任意の領域に任意の面積で設けることができる。フィルタ６３は外管６１の外周面に１つ又は２つ以上配設されていてよい。外管６１の外周面に占めるフィルタ６３の合計面積の割合は、例えば１０％、２０％、３０％、好ましくは４０％、５０％、６０％、より好ましくは７０％、８０％、特に好ましくは９０％、９５％である。フィルタ６３の形状や厚さも特に限定されない。形状は、円形又は多角形であってよい。厚さは、例えば０．１〜２ｍｍ程度である。
【００４４】
内管６２における吸引口６２１の配設位置は、浮遊培養槽２への挿入時にフィルタ６３を通液した培養液中に浸漬され得る部位であれば特に限定されないが、浮遊培養槽２への挿入方向先端（近位端）に設けられていることが好ましい。吸引口６２１の形状や直径は、第一実施形態に係る培養液アスピレータ１と同様である。
【００４５】
外管６１における空気孔６１２の配設位置は、外管６１の浮遊培養槽２への挿入時に浮遊培養槽２内の気相に位置し得る部位（培養液中に浸漬されない部位）であれば特に限定されない。培養液アスピレータ６を、フィルタ６３をその下方に位置させて配置した場合に、空気孔６１２が吸引口６２１及びフィルタ６３よりも上方に設けられていることが必要である。
なお、浮遊培養槽２への挿入時において、フィルタ６３の一部が、培養液中に浸漬されず、浮遊培養槽２内の気相に位置する場合がある。例えば、培養液の排出に伴って培養液の液面が下がった場合には、フィルタ６３のうち上方部が浮遊培養槽２内の気相に露出することとなる。このように、フィルタ６３の一部が、培養液中に浸漬されずに浮遊培養槽２内の気相に露出した場合には、フィルタ６３の当該部分が、空気孔６１２と同様に、外管６１の内腔６１１内の陰圧を外部（浮遊培養槽２内の気相）に逃がすために機能し得る。
【００４６】
浮遊培養槽２は、細胞と培養液とを貯留する機能を有する、気密なタンクである（図１を再参照）。
培養液供給路３は、新たな培養液を浮遊培養槽２内へ連続的あるいは間欠的に供給するために機能する。好ましくは、培養液供給路３は、連続的に培養液を供給するものとされる。この場合において、細胞培養槽Ａは、浮遊培養槽２内から培養液アスピレータ１によって培養液を排出すると同時に、同量の新たな培養液を培養液供給路３によって浮遊培養槽２内に供給する灌流培養装置として構成され得る。
空気供給路４は、浮遊培養槽２内へ空気を供給するために機能する。空気供給路４は、浮遊培養槽２の底面に沿って延設されて該底面近くから上方に気泡を吐出するよう構成されることが好ましい。
攪拌器５には、例えば撹拌子５１を回転又は上下動させることによって浮遊培養槽２内の培養液を攪拌する構成のものを採用できる。
浮遊培養槽２、培養液供給路３、空気供給路４及び攪拌器５には、従来細胞培養に用いられているタンクやチューブ、機器を適宜採用でき、上述した機能を発揮し得る機器等であれば広く採用可能である。
【００４７】
これらに加えて、細胞培養装置Ａは、浮遊培養槽２内の培養液の温度を制御するための過冷却手段（サーマルジェット）や、培養液の温度や酸素濃度、栄養因子等の濃度などを検出するためのプローブを有していてもよい。また、プローブから出力を受け、プローブによる温度の検出値に基づいて過冷却手段の制御を行うシステムユニットを有していてもよい。システムユニットは、プローブから出力を受け、プローブによる酸素濃度や栄養因子等の濃度の検出値に基づいて、空気供給路４による空気供給量の制御や、培養液供給路３と培養液アスピレータ１による培養液の供給／排出量を制御するものであってもよい。
【００４８】
本発明に係る細胞培養装置Ａでは、メッシュサイズあるいはポアサイズ以上の大きさの細胞凝集体がフィルタ１３に目詰まりすることを抑制しつつ、目的サイズ未満の細胞凝集体及び非凝集細胞、細胞破片（debris）をフィルタ１３に通過させて浮遊培養槽２から取り除き、目的サイズの大きさの細胞凝集体のみを浮遊培養槽２に残して、培養液を交換できる。したがって、本発明に係る細胞培養装置Ａでは、大量培養時においても培養液交換のために攪拌器５を一時停止して細胞の自然沈降を待つ時間が必要なく、培養液交換にかかる時間を短縮でき、かつ細胞増殖や細胞の性質の不安定化および不均質化が生じることも抑制できる。特に、本発明に係る細胞培養装置Ａによれば、従来培養液の攪拌を一時停止させる間に生じていた細胞の過剰な凝集（目的サイズよりも過大な凝集体の形成）を抑制できる。
【００４９】
［細胞培養装置（第２発明）］
本発明（第２発明）に係る細胞培養装置は、浮遊培養槽と、培養液アスピレータと、を含んでなる。前記培養液アスピレータは近位端と遠位端とを有し、該近位端の管口が培養液の吸引口として構成され、該遠位端の管口がポンプに接続される。前記浮遊培養槽は、培養液を攪拌するための攪拌器と、培養液を通流させるフィルタと、を備える。前記フィルタは、前記浮遊培養槽の槽内を、前記攪拌器が配設されている第一の領域と、前記培養液アスピレータが挿入されている第二の領域とに区分する。
【００５０】
図７を参照して本発明（第２発明）に係る細胞培養装置Ｂの構成を説明する。細胞培養装置Ｂは、細胞と培養液とを貯留する浮遊培養槽７と、浮遊培養槽７内の培養液を外部に排出する培養液アスピレータ９と、を備える。
図中符号３は培養液供給路であり、符号４は空気供給路を示す。培養液供給路３は、新たな培養液を浮遊培養槽７内へ連続的あるいは間欠的に供給するために機能する。好ましくは、培養液供給路３は、連続的に培養液を供給するものとされる。この場合において、細胞培養槽Ｂは、浮遊培養槽７内から培養液アスピレータ９によって培養液を排出すると同時に、同量の新たな培養液を培養液供給路３によって浮遊培養槽７内に供給する灌流培養装置として構成され得る。空気供給路４は、浮遊培養槽７内へ空気を供給するために機能する。空気供給路４は、浮遊培養槽７の底面に沿って延設されて該底面近くから上方に気泡を吐出するよう構成されることが好ましい。
符号５は攪拌器であり、撹拌子５１を備える。攪拌器５は、撹拌子５１を回転又は上下動させることによって浮遊培養槽７内の培養液を攪拌する。
培養液供給路３、空気供給路４、攪拌器５及び培養液アスピレータ９には、従来細胞培養に用いられているチューブや機器を適宜採用でき、上述した機能を発揮し得る機器等であれば広く採用可能である。
【００５１】
培養液アスピレータ９は、単一の管状構造を有するものであってよい。培養液アスピレータ９は遠位端と近位端を有し、遠位端から近位端にいたる内腔を有する。近位端を培養液アスピレータ９の浮遊培養槽７への挿入方向下側（図下方）、遠位端を同上側（図上方）と定義する。
【００５２】
培養液アスピレータ９は、培養液を吸引する吸引口９１を備える。吸引口９１からは、培養液とともに目的サイズ未満の細胞凝集体及び非凝集細胞、細胞破片（debris）も吸引される。吸引口９１から吸引された培養液、目的サイズ未満の大きさの細胞凝集体及び非凝集細胞、細胞破片（debris）は、培養液アスピレータ９の内腔を通流して浮遊培養槽７の外部へ排出される。培養液アスピレータ９における吸引口９１の配設位置は、浮遊培養槽７への挿入時に培養液中に浸漬され得る部位であれば特に限定されないが、浮遊培養槽７への挿入方向先端（近位端）に設けられていることが好ましい。
【００５３】
吸引口９１の形状や直径は特に限定されない。形状は、円孔又は多角孔であってよい。直径（内径）は、例えば０．０１−３ｃｍ程度である。
【００５４】
培養液アスピレータ９の吸引口９１との反対端（遠位端）は、培養液等の吸引のための陰圧源となるポンプに接続されている。ポンプには、細胞培養装置において従来培養液を送液するために用いられているものを採用できる。ポンプによる培養液の吸引は、浮遊培養槽７の容積（培養スケール）に応じて適宜設定され得る。例えば浮遊培養槽７の容積が２５０ｍＬの場合は毎分０．１−１０ｍｌ程度であり、２０００Ｌの場合は毎分０．８−８０Ｌ程度である。ポンプによる培養液の吸引は、連続的あるいは間欠的に行われてよい。
【００５５】
培養液アスピレータ９の材質は、従来細胞の培養に用いられている、金属、ガラス、ポリスチレン及びポリプロピレン等の材料を好適に用いることができる。これらの材料には、細胞やタンパク質の付着を防止するためのコーティングを施してもよい。コーティング剤としては、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（MPC）ポリマー、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７、ポリ（2-メトキシエチルアクリレート）PMEA）、ポリ（メタクリル酸2-ヒドロキエチルメタクリレート）（pHEMA）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニルアルコール（PVA）などが挙げられるが、ＭＰＣポリマーが好ましい。
【００５６】
培養液アスピレータ９の形状や直径、長さは特に限定されない。形状は、円柱又は多角柱であってよく、一部又は全部がテーパ状に形成されていてもよい。直径（内径）及び長さは、浮遊培養槽７の容積（すなわち培養スケール）に応じて適宜設定され得る。直径（内径）は、例えば０．０４−３ｃｍ程度である。
【００５７】
浮遊培養槽７は、細胞と培養液とを貯留する機能を有するタンクである。浮遊培養槽７は、細胞の凝集体を透過させず、培養液を通液させるフィルタ８を備える。フィルタ８は、浮遊培養槽７の槽内を、攪拌器５が配設されている第一の領域７１と、培養液アスピレータ９が挿入される第二の領域７２とに区分する。培養液供給路３及び空気供給路４は、第一の領域７１または第二の領域７２にそれぞれ培養液及び空気を供給するよう構成されていてもよいが、第一の領域７１にそれぞれ培養液及び空気を供給するよう構成されることが好ましい。フィルタ８は、浮遊培養槽７への培養液の充填時において培養液に浸漬される部分と浸漬されない部分が生じるように上下方向に張設され、好適には図に示すように鉛直又は略鉛直に配設される。
【００５８】
フィルタ８には、従来細胞の分離に用いられている、ナイロン及びポリエステル等の樹脂製メッシュ又はメンブレンを好適に用いることができる。フィルタ８の材質は、樹脂のほか、金属、ガラス及び繊維などであってもよい。これらの材料には、細胞やタンパク質の付着を防止するためのコーティングを施してもよい。コーティング剤としては、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（MPC）ポリマー、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７、ポリ（2-メトキシエチルアクリレート）PMEA）、ポリ（メタクリル酸2-ヒドロキエチルメタクリレート）（pHEMA）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニルアルコール（PVA）などが挙げられるが、ＭＰＣポリマーが好ましい。メッシュサイズあるいはポアサイズは、培養の目的とする細胞と該細胞が形成する凝集体のサイズに応じて適宜設定され得る。フィルタ８の形状は、浮遊培養槽７の形状に応じて適宜設計されえる。フィルタ８の厚さは、特に限定されないが、例えば０．０５〜２ｍｍ程度である。フィルタ８は交換可能に配設されていてよい。
【００５９】
上述のとおり、細胞のサイズは、通常１０〜２０μｍ程度である。細胞凝集体のサイズは、通常２０〜１０００μｍ程度であり、培養の目的に応じて特には２０−４００μｍ程度である。
したがって、メッシュサイズあるいはポアサイズを目的とする細胞凝集体のサイズよりも小さく設定すれば、フィルタ８において、目的とするサイズ以上の大きさの細胞凝集体を透過させずに、目的サイズ未満の大きさの細胞凝集体と非凝集細胞及び培養液を通液させることができる。非凝集細胞には死細胞が含まれ得る。メンブレンを用いる場合、そのポアサイズは、例えば１５−９９５μｍ程度、例として１５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、３９５、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９９５μｍであり、好ましくは１５−３９５μｍ程度、特には１５−４０μｍ程度である。あるいは、ポアサイズは、目的とする細胞凝集体のサイズよりも５μｍ程度小さくされることが好ましい。メッシュサイズ（目開き）についても、ポアサイズと同じサイズでよい。
【００６０】
フィルタ８のうち培養液に浸漬されない部分（図７中、符号Ｖに相当する部分）は、第二の領域７２の陰圧を第一の領域７１に逃がし、第二の領域７２内の圧と第一の領域７１内の圧を平衡化するために機能する。
空気の通流を促進するため、フィルタ８に貫通孔を設けてもよい。貫通孔は、培養液に浸漬されることがない位置に設けられ、好ましくは浮遊培養槽７の上面近くに設けられる。この場合、貫通孔の形状や大きさは特に限定されない。形状は、四角形、多角形、円形又は楕円形であってよい。大きさは、第二の領域７２の陰圧を第一の領域７１に逃がすために十分な大きさであればよい。
【００６１】
培養液アスピレータ９の吸引口９１からの培養液等の吸引によって第二の領域７２に過剰な陰圧が加わると、フィルタ８を介した培養液等の吸引圧が大きくなり過ぎ、メッシュサイズあるいはポアサイズ以上の大きさの細胞凝集体がフィルタ８に目詰まりしてしまうおそれがある。フィルタ８に目詰まりが生じると、培養液の交換が不能となったりフィルタ全面での均一ろ過が不能となって培養液の交換が遅滞したりする。第二の領域７２の陰圧がフィルタ８のうち培養液に浸漬されない部分を介して第一の領域７１に逃げることより、第二の領域７２に過剰な陰圧が加わることを防止できる。これによって、メッシュサイズあるいはポアサイズ以上の大きさの細胞凝集体がフィルタ８に目詰まりすることを抑制しつつ、目的サイズ未満の細胞凝集体及び非凝集細胞をフィルタ８に通過させて、目的サイズの大きさの細胞凝集体のみを第一の領域７１に残すことができる。
【００６２】
細胞培養装置Ｂは、浮遊培養槽７内の培養液の温度を制御するための過冷却手段（サーマルジェット）や、培養液の温度や酸素濃度、栄養因子等の濃度などを検出するためのプローブを有していてもよい。また、プローブから出力を受け、プローブによる温度の検出値に基づいて過冷却手段の制御を行うシステムユニットを有していてもよい。システムユニットは、プローブから出力を受け、プローブによる酸素濃度や栄養因子等の濃度の検出値に基づいて、空気供給路４による空気供給量の制御や、培養液供給路３と培養液アスピレータ９による培養液の供給／排出量を制御するものであってもよい。
【００６３】
本発明に係る細胞培養装置Ｂでは、メッシュサイズあるいはポアサイズ以上の大きさの細胞凝集体がフィルタ８に目詰まりすることを抑制しつつ、目的サイズ未満の細胞凝集体及び非凝集細胞を第二の領域７２へ通過させて、目的サイズの大きさの細胞凝集体のみを第一の領域７１に残して、培養液を交換できる。したがって、本発明に係る細胞培養装置Ｂでは、大量培養時においても培養液交換のために攪拌器５を一時停止して細胞の自然沈降を待つ時間が必要なく、培養液交換にかかる時間を短縮でき、かつ細胞増殖や細胞の性質の不安定化および不均質化が生じることも抑制できる。特に、本発明に係る細胞培養装置Ｂによれば、従来培養液の攪拌を一時停止させる間に生じていた細胞の過剰な凝集（目的サイズよりも過大な凝集体の形成）を抑制できる。
【００６４】
［細胞培養方法］
また、本発明は、上述の細胞培養装置あるいは培養液アスピレータを用いた細胞培養方法をも提供する。本発明に係る細胞培養方法は、上述の培養液アスピレータを用いた浮遊培養槽内からの培養液の排出に特徴を有し、その詳細は、上述の細胞培養装置あるいは培養液アスピレータに関する記載を参照できる。
本発明に係る細胞培養方法では、大量培養時においても、培養液の攪拌を一時停止して細胞の自然沈降を待つことなく、攪拌器を作動させたまま培養液の交換を行うことができる。したがって、培養交換にかかる時間を短縮でき、大量の細胞を効率的に製造できる。また、特に、本発明に係る細胞培養方法によれば、従来培養液の攪拌を一時停止させる間に生じていた細胞の過剰な凝集（目的サイズよりも過大な凝集体の形成）を抑制できる。したがって、過剰な細胞凝集により細胞増殖の阻害が生じたり細胞の性質の不安定化および不均質化が生じたりすることを抑制して、高品質の細胞を製造できる。本発明に係る細胞培養方法はまた、攪拌せずに大量の培地交換（例えば５０−９５％の培地交換）を行う場合でも、細胞凝集体をある程度沈降させれば行えるため、時間短縮が可能である。
この細胞培養方法は、浮遊培養槽内から培養液アスピレータによって培養液を排出すると同時に、新たな培養液を浮遊培養槽内に供給する灌流培養とされ得る。灌流培養では、培養液を供給しながら排出することで培養液が交換される。灌流培養における培養液の供給量と排出量は等しくされることが好ましい。
灌流培養によらない場合には、浮遊培養槽内から培養液アスピレータによって一定量の培養液を排出した後に、新たな培養液を浮遊培養槽内に供給する。排出量は、浮遊培養槽内の培養液量の例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％が挙げられ、好ましくは６０％、より好ましくは７０％、特に好ましくは８０％である。一度の排出量を大きくし過ぎると、予期しない細胞の凝集を引き起こす可能性がある。培養液の供給量は、排出量と等しくされることが好ましい。
【００６５】
本発明に係る細胞培養方法は、多能性幹細胞又は多能性幹細胞由来細胞を浮遊培養層内で維持するためあるいは分化させるために好適に適用できる。本発明に係る細胞培養方法によれば、大量培養時においても目的サイズの大きさの多能性幹細胞の凝集体を効率的、安定的かつ均質に培養可能であるので、大量の未分化細胞あるいは分化細胞を効率的、安定的かつ均質に製造することが可能となる。分化細胞の製造のためには、従来公知の分化誘導手法を適用することができ、例えば後述する実施例では、多能性幹細胞からDE（胚体内胚葉）細胞を誘導しており、このDE細胞をさらに膵前駆細胞へ誘導することもできる。多能性幹細胞からの膵前駆細胞の誘導は、以下の４つの工程により行うことができる（Nature Biotechnology, 2014, Vol.32, No.11, p.1121-1133）。
工程１：ヒト多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞を分化誘導する。
工程２：胚体内胚葉細胞から原腸管細胞を分化誘導する。
工程３：原腸管細胞から後前腸細胞を分化誘導する。
工程４：後前腸細胞から膵前駆細胞を分化誘導する。
【００６６】
本発明で一般に使用する培養液としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM（IMEM）培地、Improved MDM（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地（High glucose、Low glucose）、DMEM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、及びこれらの混合培地が挙げられる。
【００６７】
ES細胞やiPS細胞のための培養液としては、例えば、10〜15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12又はDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、puromycin、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）又は市販のiPS細胞用の培養液、例えば、マウスES細胞培養用培養液(TX-WES培養液、トロンボX社)、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTESR、Stemcell Technology社）、iPS/ES細胞増殖用培地／再生医療用培地（StemFit(登録商標)、Ajinomoto Healthy Supply Co., Inc.）が挙げられる。この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Sun N, et al.（2009), Proc Natl Acad Sci USA. 106:15720-15725）。
【００６８】
本発明で使用する培養液には、上記した成分のほか、必要に応じて、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（製品名）、非必須アミノ酸、ビタミン、抗生物質（例えば、Antibiotic-Antimycotic（本明細書中、AAと称することがある）、ペニシリン、ストレプトマイシン、又はこれらの混合物）、抗菌剤（例えば、アンホテリシンB）、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を添加してもよい。
また、本発明の培養液には、分化誘導剤が含まれていてもよい。
【００６９】
浮遊培養では、撹拌または振盪により培養液成分および培養液内酸素濃度を均一化し、凝集体形成を介して細胞を増殖させる。好適な撹拌速度は、細胞密度と培養容器の大きさに応じて、適宜設定されるが、過度の撹拌または振盪は細胞に対して物理的ストレスを与え、細胞凝集体形成を阻害する。したがって、培養液成分および培養液内酸素濃度を均一化でき、かつ、凝集体形成を阻害しないように撹拌または振盪速度を制御する。
【００７０】
培養温度は、特に限定されないが、30〜40℃（例えば、37℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば5％程度である。
【実施例】
【００７１】
［実施例１］
本発明に係る細胞培養装置を用いて、以下の条件でヒトiPS細胞の培養とDE（胚体内胚葉）細胞への分化誘導を行った。本実施例では、図５、図６に示した細胞培養装置と培養液アスピレータを用いた。
細胞：ヒトiPS細胞Ff-I14s04株
浮遊培養槽内の培養液容積：250 ml
攪拌器：HiD 4X4（佐竹化学機会工業）、攪拌翼上下動振幅20 mm、速度100 mm/s
アスピレータ
外管：金属製、長さ8.5 cm、直径1 cm
フィルタ：ＭＰＣコートポリエステル膜（ポアサイズ27μm、厚み0.05 mm）、外管の外側面に占める面積2880 cm2
空気孔：外管の上端（遠位端）に面積50 cm2で設けた。
内管：金属製、長さ146 mm、直径6.35 mm
吸引口：外管の下端（近位端）から0.4 cmの位置に直径6.35 mmで設けた。【００７２】
浮遊培養槽に充填したStemFit（登録商標）（味の素ヘルシーサプライ）にY-27632（CAS RN: 129830-38-2）を添加した培養液250 mlにiPS細胞を播種し（2×105 cells/ml）、１日培養後（培養１日目）、浮遊培養槽内の培養液の４０％量をアスピレータで吸引し、浮遊培養槽外へ排出した。同量の分化誘導用培養液を浮遊培養槽内に加えた後、再度、浮遊培養槽内の培養液の４０％量をアスピレータで吸引し、浮遊培養槽外へ排出した。同量の分化誘導用培養液を浮遊培養槽内に加えた後、培養を再開した。分化誘導用培養液には、文献（Nature Biotechnology, 2014, Vol.32, No.11, p.1121-1133）等に記載の分化誘導因子を含む培地を使用した。【００７３】
培養２日目以降もDE（胚体内胚葉）細胞への分化を続けた。培養２日目及び３日目に上記と同様に培養液交換操作を行い、合計４日間培養を行った。培養４日目にDE細胞への分化が生じていることを確認した。培養４日目以降さらにDE細胞をインスリン産生細胞まで分化誘導する。【００７４】
培養１日目、２日目及び３日目の培養液交換直前の細胞、並びに培養４日目の細胞を採取し、位相差顕微鏡で観察を行った。細胞の位相差顕微鏡像を図８に示す。また、目詰まりを確認するために、培養１日目、２日目及び３日目の培養液交換後のフィルタも観察した。
培養４日目の細胞の顕微鏡写真から画像解析ソフトを用いて細胞凝集体のサイズ分布（直径）を計測した。結果を図１０に示す。【００７５】
培養１日目のiPS細胞の維持培養において、細胞の過剰な凝集は確認されなかった。
培養２−４日は分化誘導を実施したステージであるが、培養４日目において、細胞凝集体は30-90 μmの範囲に主に分布し、60 μmを中心とするサイズ分布の凝集体の集団がほとんどであり、150 μmを超える過大凝集体の割合が少なかった。細胞凝集体サイズの平均値は65 μmであり、標準偏差は25 μmであった。培養１−４日目のいずれの時点においても、細胞が適切なサイズの凝集体として培養されていることが確認された。
また、フィルタへの細胞凝集体の目詰まりはみられなかった。本発明に係る細胞培養装置によれば、培養液交換のために培養液の攪拌を一時停止することなく、目的とするサイズの細胞凝集体を安定的かつ均質に培養できることが確認できた。【００７６】
［比較例１］
使い捨て50 mlピペットを装着した電動ピペットを培養液アスピレータとして用い、かつ、培養交換の際に攪拌を一時停止させた以外は、実施例１と同様の条件で細胞の浮遊培養を行った。【００７７】
浮遊培養槽に充填した培養液250 mlに細胞を播種し（２×１０５cells/ml）、１日培養後（培養１日目）、培養液の攪拌を停止し、細胞を自然沈降させた。浮遊培養槽内の培養液の８０％量をアスピレータで吸引し、浮遊培養槽外へ排出した。同量の培養液を浮遊培養槽内に加えた後、培養を再開した。同様の培養液交換操作を培養２日目及び３日目に行い、合計４日間培養を行った。培養４日目にDE細胞への分化が生じていることを確認した。培養４日目以降さらにDE細胞をインスリン産生細胞まで分化誘導する。【００７８】
培養１日目、２日目及び３日目の培養液交換直前の細胞、並びに培養４日目の細胞を採取し、位相差顕微鏡で観察を行った。細胞の位相差顕微鏡像を図９に示す。
培養４日目の細胞の顕微鏡写真から画像解析ソフトを用いて細胞凝集体のサイズ分布を計測した。結果を図１０に示す。【００７９】
培養１日目において細胞の過剰な凝集が生じ始めており、培養日数を経るにしたがって細胞凝集体がさらに過大となって、培養４日目では170 μm以上のサイズの細胞凝集体の集団が見られた。細胞凝集体サイズの平均値は109 μmであった。細胞凝集体サイズの標準偏差は60 μmであり、サイズ分布のばらつききが大きかった。培養液の攪拌を一時停止した間に、過剰な細胞凝集が生じたと考えられた。
本発明により、過剰な細胞凝集を生じさせることなく、培地交換の手間を要さず、3次元培養で細胞の維持培養及び分化誘導を実施することができた。
【符号の説明】
【００８０】
Ａ：細胞培養装置、Ｂ：細胞培養装置、１：培養液アスピレータ、１１：外管、１１１：内腔、１１２：空気孔、１２：内管、１２１：吸引口、１３：フィルタ、２：浮遊培養槽、３：培養液供給路、４：空気供給路、５：攪拌器、５１：撹拌子、６：培養液アスピレータ、６１：外管、６１１：内腔、６１２：空気孔、６２：内管、６２１：吸引口、６３：フィルタ、７：浮遊培養槽、７１：第一の領域、７２：第二の領域、８：フィルタ、９：培養液アスピレータ、９１：吸引口
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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