(57)【要約】  一般式（１）（式中、ＸはＣ＝Ｏ又はＣＨ−ＯＨを示し；Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基又は低級アルコキシ基を示し；Ｒ２〜Ｒ４は同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基又は低級アルコキシ基を示し；破線部は、当該結合が二重結合であってもよいことを示す）で表されるジフェニルヘプタノイドを有効成分とする新たな抗インフルエンザウイルス剤を提供する。2010061497.tif 000014
2010061497.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2010061497.tif 000010
（式中、ＸはＣ＝Ｏ又はＣＨ−ＯＨを示し；Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基又は低級アルコキシ基を示し；Ｒ２〜Ｒ４は同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基又は低級アルコキシ基を示し；破線部は、当該結合が二重結合であってもよいことを示す）
で表されるジフェニルヘプタノイドを有効成分とする抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項２】
Ｒ１が水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基であり、Ｒ２〜Ｒ４が同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基である請求項１記載の抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項３】
Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３が水素原子又はヒドロキシ基であり、Ｒ４が水素原子又はメトキシ基である請求項１又は２記載の抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項４】
一般式（１）
【化２】
2010061497.tif 000011
（式中、ＸはＣ＝Ｏ又はＣＨ−ＯＨを示し；Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基又は低級アルコキシ基を示し；Ｒ２〜Ｒ４は同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基又は低級アルコキシ基を示し；破線部は、当該結合が二重結合であってもよいことを示す）
で表されるジフェニルヘプタノイド、並びに薬学的に許容される担体を含有してなるインフルエンザの予防及び／又は治療用組成物。
【請求項５】
Ｒ１が水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基であり、Ｒ２〜Ｒ４が同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基である請求項４記載のインフルエンザの予防及び／又は治療用組成物。
【請求項６】
Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３が水素原子又はヒドロキシ基であり、Ｒ４が水素原子又はメトキシ基である請求項４又は５記載のインフルエンザの予防及び／又は治療用組成物。
【請求項７】
一般式（１）
【化３】
2010061497.tif 000012
（式中、ＸはＣ＝Ｏ又はＣＨ−ＯＨを示し；Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基又は低級アルコキシ基を示し；Ｒ２〜Ｒ４は同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基又は低級アルコキシ基を示し；破線部は、当該結合が二重結合であってもよいことを示す）
で表されるジフェニルヘプタノイドの抗インフルエンザウイルス剤製造のための使用。
【請求項８】
Ｒ１が水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基であり、Ｒ２〜Ｒ４が同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基である請求項７記載の使用。
【請求項９】
Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３が水素原子又はヒドロキシ基であり、Ｒ４が水素原子又はメトキシ基である請求項７又は８記載の使用。
【請求項１０】
一般式（１）
【化４】
2010061497.tif 000013
（式中、ＸはＣ＝Ｏ又はＣＨ−ＯＨを示し；Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基又は低級アルコキシ基を示し；Ｒ２〜Ｒ４は同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基又は低級アルコキシ基を示し；破線部は、当該結合が二重結合であってもよいことを示す）
で表されるジフェニルヘプタノイドの有効量を投与するインフルエンザの予防及び／又は治療方法。
【請求項１１】
Ｒ１が水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基であり、Ｒ２〜Ｒ４が同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基又はメトキシ基である請求項１０記載のインフルエンザの予防及び／又は治療方法。
【請求項１２】
Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３が水素原子又はヒドロキシ基であり、Ｒ４が水素原子又はメトキシ基である請求項１０又は１１記載のインフルエンザの予防及び／又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗インフルエンザウイルス剤、特に植物由来の成分を有効成分とする抗インフルエンザウイルス剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、インフルエンザウイルスによる急性感染症の一種であり、発症すると高熱、筋肉痛などを伴い風邪と同様な症状があらわれ、まれに急性脳症や二次感染により死亡することもある。流行性であることから、被害が大きく、医学上最も重要視されている疾患の一つである。【０００３】
インフルエンザの治療薬としては、インフルエンザウイルスの増殖を抑制する、抗インフルエンザウイルス剤が有効であり、現在、アマンタジン、ザナミビル、オセルタミビルの３種類が実用化されている。しかし、すでに薬剤耐性ウイルスが発現する、副作用がある等の問題がある。【０００４】
一方、植物は古来より医薬品資源として注目されており、これまでにも様々な医薬品あるいは医薬品素材が植物中から見出されている。ショウガ科コウリョウキョウの根茎由来の生薬である良姜（リョウキョウ）には、古くから鎮吐作用があることが知られている。また、リョウキョウには、精油成分として１，８−シネオール、メチルシンナメート、オイゲノール、ピネン、カディネンなどが含まれており、また辛味成分としてガランゴールなどが含まれていることが知られている。またリョウキョウには、抗ウイルス作用を有することが報告されている（特許文献１）が、その対象となるウイルスとしてヘルペスウイルス、ポリオウイルス、水疱ウイルス等が記載されているが、インフルエンザウイルスに有効か否かの記載はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平６−２５００３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、植物由来成分から新たな抗インフルエンザウイルス剤を探索することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、リョウキョウの抽出物及びその類縁体を対象として抗インフルエンザウイルス活性を指標にスクリーニングしたところ、後記式（１）で表されるジフェニルヘプタノイド類がヘルペスウイルスに対して全く作用しないにもかかわらず、インフルエンザウイルスに対しては強力な増殖抑制作用を有し、かつ細胞毒性が低いことから抗インフルエンザウイルス剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は、一般式（１）【０００９】
【化１】
2010061497.tif 000003
【００１０】
（式中、ＸはＣ＝Ｏ又はＣＨ−ＯＨを示し；Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基又は低級アルコキシ基を示し；Ｒ２〜Ｒ４は同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基又は低級アルコキシ基を示し；破線部は、当該結合が二重結合であってもよいことを示す）
で表されるジフェニルヘプタノイドを有効成分とする抗インフルエンザウイルス剤を提供するものである。
また、本発明は、式（１）で表されるジフェニルヘプタノイド、並びに薬学的に許容される担体を含有してなるインフルエンザの予防及び／又は治療用組成物を提供するものである。
また、本発明は、式（１）で表されるジフェニルヘプタノイドの抗インフルエンザウイルス剤製造のための使用を提供するものである。
また、本発明は、式（１）で表されるジフェニルヘプタノイドの有効量を投与するインフルエンザの予防及び／又は治療方法を提供するものである。
また、本発明はインフルエンザの予防及び／又は治療のための式（１）で表されるジフェニルヘプタノイドを提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、インフルエンザウイルス、特にＡ型ウイルスの増殖を強く抑制するので、インフルエンザの予防・治療に有用である。また、リョウキョウ自体に抗ヘルペスウイルス作用はあるが、本発明の抗インフルエンザウイルス剤の有効成分である式（１）の化合物は単純ヘルペスウイルス１型に対する抑制作用を示さないことから、式（１）の化合物が優れた抗インフルエンザウイルス剤として有用であることは、リョウキョウ自体の作用からは全く予想外であった。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明化合物の抽出方法の概略を示す図である。
【図２】インフルエンザウイルス感染マウスの体重変化に対する化合物（１ｂ)の影響を示す図である。
【図３】インフルエンザウイルス感染マウスの生存日数に対する化合物（１ｂ)の影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤の有効成分は、前記一般式（１）で表される化合物である。式（１）中、ＸはＣ＝Ｏ又はＣＨ−ＯＨを示す。Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基又は低級アルコキシ基を示す。ここで低級アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基等の炭素数１〜６のアルコキシ基が挙げられ、このうちメトキシ基が特に好ましい。
【００１４】
Ｒ２〜Ｒ４は、同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基又は低級アルコキシ基を示す。ここで低級アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基等の炭素数１〜６のアルコキシ基が挙げられ、このうちメトキシ基が特に好ましい。またＲ２としては水素原子が特に好ましい。Ｒ３としては水素原子又はヒドロキシ基が特に好ましい。Ｒ４としては水素原子又はメトキシ基が特に好ましい。
【００１５】
式（１）中の破線部は、当該結合が二重結合であってもよいことを示す。この結合が二重結合であるとき、Ｒ１は水素原子であるのが好ましい。
【００１６】
一般式（１）の化合物には不斉炭素原子が存在する場合がある。その場合には、式（１）の化合物は、光学活性体の混合物であってもよく、光学活性体であってもよい。
【００１７】
一般式（１）の化合物のうち、好ましい化合物は次の式（１ａ）〜（１ｌ）の化合物であり、このうちさらに式（１ａ）、（１ｂ）、（１ｆ）、（１ｇ）、（１ｈ）、（１ｉ）、（１ｊ）、（１ｋ）及び（１ｌ）の化合物が好ましく、特に式（１ｂ）、（１ｇ）、（１ｈ）、（１ｉ）及び（１ｌ）の化合物が好ましい。
【００１８】
【化２】
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【００１９】
一般式（１）で表される化合物は、例えばリョウキョウから抽出することにより、又は化学合成（Ｊａｃｏｂｓ，Ｐ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｏｌｏｗａｙ，Ａ．Ｈ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ３，５−ｄｉａｌｋｙｌ−１，２−ｄｉｏｘｏｌａｎｅｓ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３９（２３），３４２７−３４２９）により製造することができる。例えば、抽出溶媒としては、低級アルコール、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール及びこれらの水性媒体やエーテルを挙げることができる。これらは単独で用いても良いし、混合しても良い。好ましくは、メタノール、エタノール又はエーテルである。また、酢酸エチルやアセトンなども好ましい抽出溶媒である。本発明に係る化合物は、上記抽出物から分離精製することで得られる。
【００２０】
後記実施例から明らかなように、一般式（１）の化合物は、インフルエンザウイルスに対して優れた増殖抑制活性を有する。また、一般式（１）の化合物の抗インフルエンザウイルス作用と細胞毒性との間には大きな差があり、一般式（１）の化合物は安全性も高い。従って、一般式（１）の化合物、あるいはこれらの化合物を含有するリョウキョウ抽出物は、ヒトを含む哺乳動物のインフルエンザ予防・治療薬、インフルエンザ予防・治療用組成物として有用である。
【００２１】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤、インフルエンザ予防・治療用組成物の対象となるインフルエンザウイルスには、Ａ型及びＢ型のいずれも含まれるが、特にインフルエンザウイルスＡ型に対して有用である。
【００２２】
インフルエンザ予防・治療薬、インフルエンザ予防・治療用組成物とする場合、式（１）の化合物、あるいは前記抽出物に、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、被覆剤、乳化剤、懸濁化剤、溶剤、安定化剤、吸収助剤、軟膏基剤、増粘剤、界面活性剤、保存剤、色素、香料等の１以上の薬学的に許容される担体を適宜添加し、常法により経口投与用の製剤；注射投与用、直腸内投与用、外用、鼻腔内投与用、含嗽用等の非経口投与用の製剤の剤形とすることができる。
【００２３】
経口投与用の製剤としては、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤等が；注射投与用の製剤としては、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、点滴注射用の製剤等が；直腸内投与用の製剤としては、坐薬軟カプセル等が好ましい。
【００２４】
また、外用の製剤としては、液剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤等が；鼻腔内投与用の製剤としては、点鼻剤、鼻洗浄剤等が；含嗽用の製剤としては、口腔咽頭剤、含嗽剤等が好ましい。鼻腔内投与用又は含嗽用の製剤は、例えば、液剤、顆粒剤、散剤等の形態で、使用時に適宜希釈又は溶解して用いるのが好ましい。
【００２５】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤、インフルエンザ予防・治療用組成物は、上記の如き製剤として、ヒトを含む哺乳動物に投与することができる。
【００２６】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤、インフルエンザ予防・治療用組成物は、式（１）の化合物として、１日当り約１〜５００ｍｇ／ｋｇを１〜４回投与するのが好ましい。
また、本発明の抗インフルエンザウイルス剤、インフルエンザ予防・治療用組成物を外用、鼻腔内投与用又は含嗽用の製剤とする場合、該製剤中の式（１）の化合物の含有量を、０．００１〜５質量％、好ましくは０．００１〜１質量％として、一日１〜数回に分けて使用するのが好ましい。
【００２７】
また、インフルエンザ予防・治療用組成物は、食品、飼料、化粧料としても使用できる。その形態は、特に制限されず、例えば固形、半固形、ゲル状又は液状等であり得る。例えば、食品では、茶等の飲料、ゼリー、あめ、チョコレート、チューインガム等の形態が挙げられ、上記の製剤と同様、錠剤形態、丸剤形態、カプセル形態、液剤形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。飼料では、マッシュ、ペレット、フレーク等の形態が挙げられ、家畜、家禽、小動物等に用いることができる。また、化粧料では、皮膚外用剤、洗浄剤等とすることができ、使用方法に応じて、ローション、乳液、ゲル、クリーム、固形、粉末、顆粒等の種々の剤形で提供することができる。  
【００２８】
インフルエンザ予防・治療用組成物における式（１）の化合物、あるいは前記抽出物の含有量は、形態、用途等によっても異なるが、一般に０．００１〜５質量％、特に０．００１〜１質量％が好ましい。
【実施例】
【００２９】
次に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。【００３０】
実施例１
以下、リョウキョウから各種のジフェニルヘプタノイド類化合物を分離精製する方法の一例を、図１を用いて説明する。【００３１】
リョウキョウのメタノール抽出エキスは、先ず酢酸エチル−水（１：１）で溶媒分画を行い、酢酸エチル画分（回収量：２５．７ｇ）と水層を得た。【００３２】
次に酢酸エチル画分について、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０−カラムクロマトグラフィー（以下、カラムクロマトグラフィーを「ＣＣ」と略す。）［Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０使用量：１２０ｇ、溶出液：クロロホルム−メタノール（１：１）］により７の画分（フラクション１〜７）に分画した。【００３３】
上記画分のうちフラクション（以下、「Ｆｒ．」と略す。）４（回収量：１．５ｇ）はシリカゲル−ＣＣ（シリカゲル使用量：３００ｇ、溶出溶媒：クロロホルム−メタノール）により、１０の画分（フラクション４−１〜４−１０）に分画した。【００３４】
Ｆｒ．４−３（回収量：５２．３ｍｇ）はシリカゲル−ＣＣ［シリカゲル使用量：１００ｇ、溶出溶媒：ｎ−ヘキサン―酢酸エチル（４：１）］により、５の画分（フラクション４−３−１〜４−３−５）に分画した。Ｆｒ．４−３−４（回収量：４４．３ｍｇ）は、分取ＯＤＳ−ＨＰＬＣを繰返すことにより、（５Ｓ）−１，７−ジフェニル−５−メトキシ−３−ヘプタノン（化合物１ｉ；回収量：４２ｍｇ）を得た。【００３５】
Ｆｒ．４−５（回収量：６２ｍｇ）はシリカゲル−ＣＣ［シリカゲル使用量：１００ｇ、溶出溶媒：ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（４：１）］により、５の画分（フラクション４−５−１〜４−５−５）に分画した。一方、Ｆｒ．４−５−４（回収量：４１ｍｇ）は、分取ＯＤＳ−ＨＰＬＣを繰返すことにより、７−（４”−ヒドロキシ−３”−メトキシフェニル）−１−フェニル−４Ｅ−ヘプテン−３−オン（化合物１ｂ；回収量：３６ｍｇ）を得た。【００３６】
Ｆｒ．４−７（回収量：３１３ｍｇ）はシリカゲル−ＣＣ［シリカゲル使用量：２００ｇ、溶出溶媒：ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（４：１）］により、３の画分（フラクション４−７−１〜４−７−３）に分画した。Ｆｒ．４−７−２（回収量：２７５ｍｇ）は、分取ＯＤＳ−ＨＰＬＣを繰返すことにより、（５Ｒ）−７−（４”−ヒドロキシ−３”−メトキシフェニル）−５−メトキシ−１−フェニル−３−ヘプタノン（化合物１ｃ；回収量：２７０ｍｇ）を得た。【００３７】
Ｆｒ．４−８（回収量：１１２ｍｇ）はシリカゲル−ＣＣ［シリカゲル使用量：２００ｇ、溶出溶媒：ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（４：１）］により、５の画分（フラクション４−８−１〜４−８−５）に分画した。Ｆｒ．４−８−２（回収量：１００．８ｍｇ）は、分取ＯＤＳ−ＨＰＬＣを繰返すことにより、５−ヒドロキシ−７−（４”−ヒドロキシ−３”−メトキシフェニル）−１−フェニル−３−ヘプタノン（化合物１ａ；回収量：９７ｍｇ）を得た。【００３８】
Ｆｒ．４−９（回収量：３３１ｍｇ）はシリカゲル−ＣＣ［シリカゲル使用量：２００ｇ、溶出溶媒：ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（３：１）］により、６の画分（フラクション４−９−１〜４−９−６）に分画した。Ｆｒ．４−９−２（回収量：１７０．３ｍｇ）は、分取ＯＤＳ−ＨＰＬＣを繰返すことにより、（５Ｒ）−１，７−ジフェニル−５−ヒドロキシ−３−ヘプタノン（化合物１ｆ；回収量：１５５．６ｍｇ）を得た。次に、Ｆｒ．４−９−３（回収量：３１ｍｇ）は、分取ＯＤＳ−ＨＰＬＣを繰返すことにより、７−（４”−ヒドロキシフェニル）−１−フェニル−４Ｅ−ヘプテン−３−オン（化合物１ｄ；回収量：２４ｍｇ）を得た。更に、Ｆｒ．４−９−５（回収量：５６．８ｍｇ）は、分取ＯＤＳ−ＨＰＬＣを繰返すことにより、１，７−ジフェニル−４Ｅ−ヘプテン−３−オン（化合物１ｅ；回収量：４０ｍｇ）を得た。【００３９】
Ｆｒ．４−１０（回収量：３９８ｍｇ）はシリカゲル−ＣＣ［シリカゲル使用量：２００ｇ、溶出溶媒：ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（３：１）］により、８の画分（フラクション４−１０−１〜４−１０−８）に分画した。Ｆｒ．４−１０−２（回収量：１７．３ｍｇ）は、分取ＯＤＳ−ＨＰＬＣを繰返すことにより、（５Ｓ）−７−（４”−ヒドロキシフェニル）−５−メトキシ−１−フェニル−３−ヘプタノン（化合物１ｇ；回収量：１２ｍｇ）を得た。Ｆｒ．４−１０−３（回収量：７．３ｍｇ）は、分取ＯＤＳ−ＨＰＬＣを繰返すことにより、（３Ｒ，５Ｒ）−１，７−ジフェニル−３，５−ヘプタンジオール（化合物１ｊ；回収量：３．６ｍｇ）を得た。次に、Ｆｒ．４−１０−４（回収量：２２ｍｇ）は、分取ＯＤＳ−ＨＰＬＣを繰返すことにより、（５Ｓ）−５−ヒドロキシ−７−（４”−ヒドロキシフェニル）−１−フェニル−３−ヘプタノン（化合物１ｈ；回収量：１３．２ｍｇ）を得た。【００４０】
実施例２（抗インフルエンザウイルス活性）
（方法）
（１）インフルエンザウイルス増殖抑制
ＭＴＴ（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）法を用いて評価した。以下、詳細を記述する。
ジアリルへプタノイド類はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解後、維持培地（０．１％ウシアルブミン血清含有ＭＥＭ培地）を加えて希釈し、最終濃度を０．１、０．３、１．３、１０、３０、５０μｇ／ｍＬとした。なお、ＤＭＳＯの最終濃度は０．５％以下とし、細胞への毒性が出ない濃度とした。
インフルエンザウイルス（Ａ／Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８／３４株）は、１％ウシアルブミン血清含有リン酸緩衝溶液にて希釈しウイルス液として用いた。細胞はＭＤＣＫ（イヌ腎臓細胞由来）細胞を用いた。【００４１】
まず、９６ｗｅｌｌプレートに２×１０４個／ｗｅｌｌのＭＤＣＫ細胞を増殖培地（１０％ウシ胎児血清含有ＭＥＭ培地）にて培養した。培養４日後、増殖培地を除去した後に、リン酸緩衝溶液を用いて細胞を洗浄し、ウイルス液５０μｌ（ＭＯＩ＝０．００３／ｗｅｌｌに相当）を各ｗｅｌｌに加えて３７℃でインキュベートした。なお、非感染コントロールとして、ウイルス非存在下のｗｅｌｌを１列（計６ｗｅｌｌ）作製した。１時間インキュベート後、各濃度にて希釈したジアリルへプタノイド類の存在あるいは、非存在下（ウイルス感染コントロール）にて維持培地を各々５０μｌ／ｗｅｌｌ加え、３７℃で培養した。４日後、ＭＴＴ−リン酸緩衝溶液（７．５ｍｇ／ｍＬ）１０μｌ／ｗｅｌｌを加え、３７℃にてインキュベートした。４時間後、２０％含有ドデシル硫酸ナトリウム／５０％含有Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド混液を各々１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
なお、非感染コントロールの吸光度：（ＯＤｃ）ｍ、ウイルス感染コントロールの吸光度：（ＯＤｃ）ｖ、及びウイルス感染後ジアリルへプタノド類添加群の吸光度：（ＯＤｔ）ｖをそれぞれ測定後、以下の数式（ｉ）を用いて各ジアリルへプタノイド類のＥＣ５０を算出し、それぞれの抗ウイルス活性とした。【００４２】
【数１】
2010061497.tif 000005
【００４３】
（２）細胞毒性
上記（１）の方法に従い、ＭＤＣＫ細胞を培養後、維持培地にて各濃度に希釈したジアリルヘプタノイド類の存在、あるいは非存在下における細胞への毒性について検討を行った。
（結果）【００４４】
【表１】
2010061497.tif 000006
【００４５】
表１から明らかなように、式（１）の化合物は優れたインフルエンザウイルス増殖抑制作用を有し、細胞毒性は低い。【００４６】
実施例３
化合物（１ｂ）及び（１ｈ）について、抗ヘルペスウイルス活性を検討した。
（方法）
（１）ヘルペスウイルス増殖抑制
プラーク減少法を用いて評価した。以下、詳細を記述する。
ジアリルへプタノイド類はＤＭＳＯに溶解後、メチルセルロース含有維持培地（２％ウシ血清含有ＭＥＭ培地）に加えて、最終濃度を（１ｂ）は０．１、１、３、１０、３０μｇ／ｍＬ、（１ｈ）は０．１、１、３、１０、５０、８０μｇ／ｍＬとした。なお、ＤＭＳＯの最終濃度は０．１％以下とし、細胞への毒性が出ない濃度とした。
ヘルペスウイルスには、単純ヘルペスウイルス１型（７４０１Ｈ株）を用い、維持培地にて希釈しウイルス液として用いた。細胞はＶｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓由来）細胞を用いた。
まず、６０ｍｍディッシュに５×１０５個／ディッシュのＶｅｒｏ細胞を増殖培地（８％ウシ血清含有ＭＥＭ培地）にて培養した。培養４日後、増殖培地を除去した後に、リン酸緩衝溶液を用いて細胞を洗浄し、ウイルス液２００μｌ（１００ｐｆｕ／ディッシュに相当）を各ディッシュに加えて３７℃でインキュベートした。１時間インキュベート後、リン酸緩衝溶液を用いて細胞を洗浄し、各濃度にて希釈したジアリルへプタノイド類の存在あるいは、非存在下（ウイルス感染コントロール）にてメチルセルロース含有維持培地を各々５ｍＬ／ディッシュ加え、３７℃で培養した。４日後、５％ホルマリン液５ｍＬを加え、細胞を固定した。一晩放置後、ホルマリン液を洗い流し、０．０３％メチレンブルー染色液を各々５ｍＬ／ディッシュ加え染色した。染色液を洗い流し、風乾後、プラークを計数した。
（２）細胞毒性
可視的に細胞毒性を評価した。以下、詳細を記述する。
上記（１）と同時に、ディッシュからの染色細胞の脱落を肉眼的に観察した。非感染細胞と比較して、細胞脱落の程度により細胞毒性が強い（５０％以上脱落）、中程度（５０‐１０％脱落）、弱い（１０％以下脱落）として評価した。
結果、化合物（１ｂ）及び（１ｈ）はいずれも１０μｇ／ｍＬにおいて弱い細胞毒性を示した。【００４７】
【表２】
2010061497.tif 000007
【００４８】
表２の結果より、化合物（１ｂ）及び（１ｈ）は、抗ヘルペスウイルス活性を示さなかった。従って、一般式（１）の化合物はインフルエンザウイルスの増殖を特異的に抑制する。【００４９】
実施例４
化合物（１ｂ)について、インフルエンザウイルス感染マウスに対する抗インフルエンザウイルス活性を検討した。
（方法）
（１）インフルエンザウイルス感染マウスの体重変化と生存日数
化合物（１ｂ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解後、注射用精製水を加えて希釈し、最終濃度３０ｍｇ／０．２ｍＬ、１００ｍｇ／０．２ｍＬとした。なお、ＤＭＳＯの最終濃度は１％以下とし、マウスへの毒性が出ない濃度とした。
インフルエンザウイルス（Ａ／Ｈ１Ｎ１／ＰＲ８／３４株）は、リン酸緩衝溶液にて希釈しウイルス液（５００ＰＦＵ）として用いた。マウスは雌のＢＡＬＢ／ｃＮマウス（６週齢、２０〜２２ｇ）を用いた。【００５０】
マウスへのインフルエンザウイルス感染は、麻酔下マウスに対して経鼻にてウイルス液を注入して行った。各濃度に希釈した化合物（１ｂ)を経口投与にて、感染日（Ｄａｙ０）の感染４時間前に１回、感染後２時間以内に１回、さらに４時間後に１回投与を行った。また、感染５日後迄１日３回投与を行った。非投与群は、注射用精製水を用いて、投与群と同様にマウスへ投与を行った。
感染８日後迄、毎朝投与前に体重を測定した。また、感染５，６，７，９，１１日後におけるウイルス感染マウスの生存数を計測した。【００５１】
（２）ウイルス感染３，６日後（Ｄａｙ３，６）に、リン酸緩衝溶液にてマウスの肺を洗浄し、その肺洗浄液中に含まれるインフルエンザウイルスのウイルス価を評価した。
ウイルス価の評価は、プラーク減少法を用いて行った。以下、詳細を記述する。
６０ｍｍディッシュで２×１０５個／ディッシュのＭＤＣＫ細胞を増殖培地（１０％ウシ胎児血清含有ＭＥＭ培地）にて培養した。培養４日後、増殖培地を除去した後に、リン酸緩衝溶液を用いて細胞を洗浄し、１％ウシアルブミン血清含有リン酸緩衝溶液にて希釈し１０７倍まで段階希釈した肺洗浄液２００μｌを各ディッシュに加えて３７℃でインキュベートした。１時間インキュベート後、リン酸緩衝溶液を用いて細胞を洗浄し、アガロース含有維持培地をそれぞれ５ｍＬ／ディッシュを加え、３７℃で培養した。３日後、５％ホルマリン液５ｍＬを加え、細胞を固定した。一晩放置後、ホルマリン液を洗い流し、０．０３％メチレンブルー染色液をそれぞれ５ｍＬ／ディッシュ加え染色した。染色液を洗い流し、風乾後、プラークを計数した。ウイルス価は以下の数式（ｉｉ）にて表す。【００５２】
【数２】
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【００５３】
（結果）
（１）図２に示すように、インフルエンザウイルス感染マウスの体重減少は、式（１）化合物の１００ｍｇ／０．２ｍＬ投与群で有意に抑制された（＊：ｐ＜０．０５）。また、図３に示すように、インフルエンザウイルス感染マウスの生存日数は、式（１）化合物の１００ｍｇ／０．２ｍＬ投与群で有意に延長した（＊：ｐ＜０．０５）。【００５４】
（２）表３から明らかなように、感染３日後のインフルエンザウイルス感染マウス肺洗浄液中のウイルス価は、式（１）化合物の１００ｍｇ／０．２ｍＬ投与群で有意に減少した（＊：ｐ＜０．０５）。また、感染６日後のインフルエンザウイルス感染マウス肺洗浄液中のウイルス価は、式（１）化合物の３０ｍｇ、１００ｍｇ／０．２ｍＬ投与群でそれぞれ有意に減少した（＊：ｐ＜０．０５）。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、統計処理は、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで検定しコントロールとの比較を行った。【００５５】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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