(57)【要約】人工真皮を含む医療用材料や細胞培養の足場材などの種々の用途に十分に対応可能であるコラーゲン／エラスチン架橋物を提供すること。魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンを架橋することにより人工真皮を含む医療用材料や細胞培養の足場材などの種々の用途に十分に対応可能であるコラーゲン／エラスチン架橋物を得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンを架橋することにより得られることを特徴とする架橋物。
【請求項２】
前記魚類が、サケ科、サバ科、アジ科、タラ科またはアイナメ科に属する魚類である請求項１に記載の架橋物。
【請求項３】
ＤＮＡ及びプロタミンの少なくとも一方を更に含む請求項１または２に記載の架橋物。
【請求項４】
魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンを該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程と、
該溶液に架橋剤を加えて架橋物を形成する工程と、
得られた架橋物を乾燥させる工程と、
を有する製造方法により得られるものである請求項１または２に記載の架橋物。
【請求項５】
前記架橋物の架橋形成及び乾燥工程が、凍結乾燥によって行われる請求項４に記載の架橋物。
【請求項６】
魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンを該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程と、
該溶液から乾燥物を得る工程と、
該乾燥物を架橋して架橋物を形成する工程と、
を有する製造方法により得られるものである請求項１または２に記載の架橋物。
【請求項７】
前記乾燥物が、凍結乾燥によって得られる請求項６に記載の架橋物。
【請求項８】
前記架橋物が、コラーゲン単体の架橋物より機械的強度を高めた請求項４乃至７のいずれかに記載の架橋物。
【請求項９】
前記溶液が、ＤＮＡ及びプロタミンの少なくとも一方を更に含む請求項４乃至８のいずれかに記載の架橋物。
【請求項１０】
リン酸カルシウムを更に含む請求項４乃至９のいずれかに記載の架橋物。
【請求項１１】
前記架橋物が多孔体として得られる請求項１乃至１０のいずれかに記載の架橋物。
【請求項１２】
前記架橋物がフィルム（膜）として得られる請求項１乃至１０のいずれかに記載の架橋物。
【請求項１３】
魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンを該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程と、
該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で該溶液に架橋剤を加えて架橋物を形成する工程と、
得られた架橋物を乾燥させる工程と、
を有することを特徴とする架橋物の製造方法。
【請求項１４】
前記架橋物の架橋形成及び乾燥工程が、凍結乾燥によって行われる請求項１３に記載の架橋物の製造方法。
【請求項１５】
魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンを該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程と、
該溶液から乾燥物を得る工程と、
該乾燥物を架橋して架橋物を形成する工程と、
を有することを特徴とする架橋物の製造方法。
【請求項１６】
前記乾燥物が凍結乾燥によって得られる請求項１５に記載の架橋物の製造方法。
【請求項１７】
前記架橋物が多孔体として得られる請求項１３乃至１６のいずれかに記載の架橋物の製造方法。
【請求項１８】
前記架橋物がフィルム（膜）として得られる請求項１３乃至１６のいずれかに記載の架橋物の製造方法。
【請求項１９】
前記架橋物が、コラーゲン単体より機械的強度を高めることが可能な請求項１３乃至１８のいずれかに記載の架橋物の製造方法。
【請求項２０】
前記溶液が、ＤＮＡ及びプロタミンの少なくとも一方を更に含む請求項１３乃至１９のいずれかに記載の架橋物の製造方法。
【請求項２１】
リン酸カルシウムを更に含む請求項１３乃至２０のいずれかに記載の架橋物の製造方法。
【請求項２２】
請求項１乃至１２のいずれかに記載の架橋物を含むことを特徴とする医療用材料。
【請求項２３】
人工真皮である請求項２２に記載の医療用材料。
【請求項２４】
軟骨再生基材である請求項２２に記載の医療用材料。
【請求項２５】
骨再生基材である請求項２２に記載の医療用材料。
【請求項２６】
骨形成因子または骨成長因子を担持させた請求項２５に記載の医療用材料。
【請求項２７】
請求項１乃至１２のいずれかに記載の架橋物を含むことを特徴とする細胞培養足場材。
【請求項２８】
軟骨細胞の培養に適した請求項２７に記載の細胞培養足場材。
【請求項２９】
骨細胞の培養に適した請求項２７に記載の細胞培養足場材。
【請求項３０】
請求項１乃至１２のいずれかに記載の架橋物を含むことを特徴とする化粧品基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類由来のエラスチン及び魚類由来のコラーゲンを用いた架橋物及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンを用いた創傷被覆材や人工真皮は、特許２９９７８２３号明細書、特許３７７２２３２号明細書、特許３１０５３０８号明細書等に開示され、実際に市販されているものもある。しかしこれらに用いられているコラーゲンは、そのほとんどが牛、豚などの家畜の組織より採取されているが、近年、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）問題が顕在化し、牛皮を含む哺乳動物由来の原料を用いたコラーゲン製品により、人間に対し病原体が感染する危険性が懸念されている。【０００３】
こうした背景の中、生体親和性が高く、細胞侵入性が良好で、創収縮抑制がおこらず、真皮様組織形成後は速やかに生体分解性を示す、牛や豚などの哺乳動物由来以外の素材を用いた人工真皮の開発が望まれていた。魚皮真皮コラーゲンを含有する発泡体シートおよびその用途が開示されている（特開２００５−９５３３１号公報）。【０００４】
ところでコラーゲンは水溶液あるいは懸濁液中で熱を掛けると変性してゼラチンとなる。変性したコラーゲンは水に溶けやすく強度が弱いため、生体内のタンパク質分解酵素によって分解され、生体に吸収されやすくなり、生体内で適度な安定性が求められる医療用材料としては不向きとなる。更に、魚類由来のコラーゲンは哺乳動物由来のものと比べると変性温度が低く、ゲルの強度が弱い欠点があった。変性を防ぐため変性温度以下で反応させなければならないが、低温下では架橋剤の種類によっては反応が進まない欠点があった。【０００５】
一方、エラスチンは、靭帯や皮膚など種々の組織や器官における弾性線維の主要蛋白質であり、エラスチンの損傷組織や器官の再生のための医療用材料としての用途が検討されている。【０００６】
特公平６−３０６１６号公報には水溶性エラスチンと可溶性コラーゲンを冷時混合してなる成型用組成物が開示されている。また、国際公開第２００２／９６９７８号パンフレット（ＷＯ２００２／９６９７８）には、エラスチンを架橋剤により架橋させる際にコラーゲンなどの成分を化学的に結合させたエラスチン架橋体、並びにその医療用器具及び再生組織が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許２９９７８２３号明細書
【特許文献２】特許３７７２２３２号明細書
【特許文献３】特許３１０５３０８号明細書
【特許文献４】特開２００５−９５３３１号公報
【特許文献５】特公平６−３０６１６号公報
【特許文献６】国際公開第２００２／９６９７８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
コラーゲン及びエラスチンは、人工真皮製造用の材料や組織再生のための医療用材料としての用途が注目されているが、原材料の由来、得られた製品の取り扱い性や機械的強度、目的とする用途に対応した特性などの種々の要件において満足できるものが見当たらないのが現状である。【０００９】
例えば、牛や豚以外に由来するものとしての魚類由来のコラーゲンおよび魚類由来の水溶性エラスチンを用いた創傷被覆材や人工真皮を開示する先行技術文献は現状では見あたらない。また魚類由来のコラーゲンは哺乳動物由来のものと比べると変性温度が低く、ゲルの強度が弱い欠点があった。変性を防ぐため変性温度以下で反応させなければならないが、低温下では架橋剤の種類によっては反応が進まない欠点があった。【００１０】
特公平６−３０６１６号公報には水溶性エラスチンと可溶性コラーゲンを冷時混合してなる成型用組成物及びそれを用いて得られた膜状構造体が開示されている。しかし、この成型用組成物から得られる構造体は架橋等の不溶化処理がされていないことから、長時間水中で形態を保持することができない場合がある。また人工真皮は多孔体であるが、同公報に記載される成型用組成物から人工真皮用の多孔体を得ることは容易ではない。【００１１】
国際公開第２００２／９６９７８号パンフレットには、水溶性エラスチンを架橋剤で架橋する際にコラーゲンを化学的に結合した架橋体およびその医療用材料としての用途が開示されている。しかしながら、国際公開第２００２／９６９７８号パンフレットに記載される架橋方法では、架橋剤や架橋条件によって鋳型に流し込むことが困難であったり、反応速度の制御が難しく、目的とする形状や性状の架橋体が得られないことが記載されている。更に、この架橋方法によって架橋体が得られた場合でも人工真皮を含む医療用材料や細胞培養の足場材などの種々の用途に十分に対応できない場合がある。【００１２】
本発明の目的は、人工真皮を含む医療用材料や細胞培養の足場材などの種々の用途に十分に対応可能であるコラーゲン／エラスチン架橋物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の架橋物は、魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンを架橋することにより得られることを特徴とするものである。【００１４】
本発明の架橋物の製造方法は、魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンを該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程と、該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で該溶液に架橋剤を加えて凍結乾燥中に架橋を形成させて架橋物を得る工程、もしくは該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で該溶液を乾燥して得られる乾燥物を架橋させる工程を有することを特徴とする。本発明の架橋物の製造方法は、上述の未架橋の乾燥物を架橋する方法として、架橋剤を用いた架橋、熱による架橋、紫外線もしくは放射線による架橋、これら単独もしくは組合せにより、水に不溶な架橋物を得ることを特徴とする。【００１５】
本発明の医療用材料は、上記の架橋物を含むことを特徴とするものである。また、本発明の細胞培養足場材は、上記の架橋物を含むことを特徴とするものである。また、本発明の化粧品基材は、上記の架橋物を含むことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、魚類由来の原料から得られ、人工真皮を含む医療用材料や細胞培養の足場材などの種々の用途に十分に対応可能であるコラーゲン／エラスチン架橋物及びその製造方法、並びに、このコラーゲン／エラスチン架橋物を利用して得られる医療用材料、細胞培養足場材および化粧品基材としての用途を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１における魚類由来アテロコラーゲンの細胞毒性試験の結果を示すグラフである（マイトマイシンＣ（細胞毒性物質、販売:協和発酵キリン株式会社））。
【図２】実施例１における魚類由来水溶性エラスチンの細胞毒性試験の結果を示すグラフである（マイトマイシンＣ（細胞毒性物質、販売:協和発酵キリン株式会社））。
【図３】実施例２における架橋剤を用いた魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体の走査型電子顕微鏡画像（ＳＥＭ画像：２００倍）である。
【図４】実施例３における熱架橋を用いた魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体の走査型電子顕微鏡画像（ＳＥＭ画像：２００倍）である。
【図５】実施例４におけるコラーゲンにエラスチンを添加することによる多孔体の破断強度を示すグラフである。
【図６】実施例４におけるコラーゲンにエラスチンを添加することによる多孔体の破断距離を示すグラフである。
【図７】実施例６におけるコラーゲン／エラスチン多孔体のラット皮下への埋め込み５６日目の組織像（マクロ像）である。
【図８】実施例７における創の面積の推移（術直後の創の面積を１００％とした）を示すグラフである。
【図９】実施例７におけるサンプル群（術後１４日目）の創の状態を示す図である。
【図１０】実施例８における架橋剤を用いたＤＮＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体の走査型電子顕微鏡画像（ＳＥＭ画像：１００倍）である。
【図１１】実施例９における架橋剤を用いたプロタミン添加コラーゲン／エラスチン多孔体の走査型電子顕微鏡画像（ＳＥＭ画像：１００倍）である。
【図１２】実施例１０における架橋剤を用いたヒドロキシアパタイト添加コラーゲン／エラスチン多孔体の走査型電子顕微鏡画像（ＳＥＭ画像：１００倍）である。
【図１３】実施例１１におけるコラーゲン/エラスチン多孔体を細胞培養足場材として用いて培養した組織をアルシアンブルー染色した結果の図である。
【図１４】実施例１１におけるコラーゲン/エラスチン多孔体を細胞培養足場材として用いて培養した組織をトルイジンブルー染色した結果の図である。
【図１５】実施例１１におけるコラーゲン/エラスチン多孔体を細胞培養足場材として用いて培養した組織をＩＩ型コラーゲン抗体による免疫染色した結果の図である。
【図１６】実施例１２におけるフィルム状のコラーゲン／エラスチン複合体（含水状態）の写真画像である。
【図１７】実施例１３における皮膚粘弾性の測定結果のグラフである。（n  ＝  ４、ＣＥＳ＋化粧水塗布部との比較、ｔ  検定、**ｐ＜０．０１、*ｐ＜０．０５）
【図１８】実施例１４におけるフィルム状のコラーゲン／エラスチン複合体（含水状態）の写真画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明においては、エラスチンとして魚類由来のものを用いる。エラスチン調製用の魚類として、サケ、マス等のサケ目サケ科、マグロ、カツオ等のスズキ目サバ科、ブリ等のスズキ目アジ科、Ｌｉｎｇ  Ｃｏｄ等のカサゴ目アイナメ科などを挙げることができる。エラスチンとしては、コラーゲンとの架橋物の形成において、均質な架橋物を得る上では、水溶性エラスチンが好ましい。水溶性エラスチンとしてはエラスチンの生合成前駆体であるトロポエラスチン、エラスチンを酸およびアルカリ処理することで得られるα−エラスチン、κ−エラスチン、および酵素処理して得られるエラスチンの加水分解物がある。本発明で用いるエラスチンとしては、架橋物を調製した際に機械的強度が得られやすい分子量の揃った高分子であるα−エラスチンが望ましい。
【００１９】
また本発明で用いるエラスチンの分子量としては特に限定されないが、重量平均分子量１万〜１０万程度が好ましい。
【００２０】
エラスチンはコラーゲンと比較すると生体内での分解は遅いが、コラーゲンと同様に生体親和性が高く、添加することで機械的強度や柔軟性が付加されることが期待される。またα−エラスチンはマクロファージ遊走活性、細胞接着、血小板凝集阻害等の生物学的機能を有するとされており、α−エラスチンを架橋物の素材として用いた場合、これらの生物学的機能が付加されることも期待される。
【００２１】
魚類からのエラスチンの調製は、常法により行うことができる。
【００２２】
魚類由来のエラスチンは、牛や豚からのエラスチンに比べて、エラスチン分子内の架橋構造に関与するアミノ酸の一種であるデスモシン、イソデスモシンが少ないほか、アミノ酸組成もウシやブタ等の哺乳動物由来とは異なる特徴を有する。
【００２３】
本発明において利用できる魚類由来エラスチンの動物由来のエラスチンに対して異なる含有量のアミノ酸についての組成の一例として、以下の組成（ｍｏｌ％）を挙げることができる。
・グリシン：３５〜４５％
・アラニン：１０〜２０％
・バリン：３〜８％
・イソデスモシン：０．１〜１．０％
・デスモシンが０．１〜１．０％
・非極性アミノ酸の合計が６７〜７７％
なお、上記のアミノ酸組成において分析対象のアミノ酸は、グリシン（Gly）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ileu）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、リシン（Lys）、アルギニン（Arg）、ヒスチジン（His）、ヒドロキシリジン（Hylys）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、チロシン（Tyr）、フェニルアラニン（Phe）、プロリン（Pro）、ヒドロキシプロリン（Hypro）、イソデスモシン（Iso-Des）及びデスモシン（Des）である。上記のグリシン、アラニン、バリン、イソデスモシン、デスモシン以外のアミノ酸の含有率（ｍｏｌ％）の一例を以下にあげる。
・ロイシン：３．４〜４．５
・イソロイシン：０．９〜１．９
・セリン：３．１〜３．４
・トレオニン：３．１〜６．５
・アスパラギン酸：１．６〜２．９
・グルタミン酸：３．２〜４．３
・リシン：０．７〜１．５
・アルギニン：１．６〜２．６
・ヒスチジン：０．２〜０．８
・ヒドロキシリジン：０
・システイン：０〜０．２
・メチオニン：０．４〜０．７
・チロシン：３．４〜４．４
・フェニルアラニン：１．１〜３．１
・プロリン：８．６〜１０．１
・ヒドロキシプロリン：０．５〜０．９
一方、コラーゲンとしても魚類由来のものを用いる。コラーゲン調製用の魚類として、サケ、マス等のサケ目サケ科、マグロ、カツオ等のスズキ目・サバ科、ブリ等のスズキ目・アジ科、マダラ、スケトウダラ等のタラ目タラ科などを挙げることができる。コラーゲンとしては、エラスチンとの架橋物の形成において、均質な架橋物を得る上では、可溶性（水溶性）コラーゲンが好ましい。魚類からのコラーゲンの調製は、常法により行うことができる。ところでコラーゲンの両端には、コラーゲンの主たる抗原部位であるテロペプチドが存在する。この部分を酵素処理で取り外すと、コラーゲンの抗原性が極端に低くなる。このようなコラーゲンをアテロコラーゲンと呼び、医療用のインプラント材料や組織工学用の足場材料に応用されている。本発明に用いる可溶性コラーゲンとしては、魚類由来のアテロコラーゲンがより好ましい。
【００２４】
また本発明で用いるコラーゲンの分子量としては特に限定されないが、重量平均分子量１万〜３０万程度が好ましい。
【００２５】
魚類由来のコラーゲンは、牛や豚からのコラーゲンに比べて、プロリンやヒドロキシプロリンが低いなどアミノ酸組成がことなる。またコラーゲンはある温度以上となると変性しゼラチン化する性質があるが、魚類由来のコラーゲンの変性温度は牛や豚由来のコラーゲンと比較すると一般的に低い。
【００２６】
本発明において利用できる魚類由来コラーゲンのアミノ酸組成の動物由来のコラーゲンに対して異なる含有量のアミノ酸についての組成の一例として、以下の組成（ｍｏｌ％）を挙げることができる。
・グリシン：３４〜４０％
・プロリン：５．０〜１１．０％
・ヒドロキシプロリン：４．０〜８．０％
・ヒスチジン：０．８〜２．０％
なお、上記のアミノ酸組成において分析対象のアミノ酸は、グリシン（Gly）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ileu）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、アスパアラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、リシン（Lys）、アルギニン（Arg）、ヒスチジン（His）、ヒドロキシリジン（Hylys）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、フェニルアラニン（Phe）、プロリン（Pro）及びヒドロキシプロリン（Hypro）である。
【００２７】
上記のグリシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、ヒスチジン以外のアミノ酸の含有率（mol%）の一例を以下にあげる。
・アラニン：１０．５〜１５．０
・バリン：１．１〜２．２
・ロイシン：１．５〜２．３
・イソロイシン：０．５〜１．１
・セリン：３．５〜６．３
・トレオニン：２．１〜３．６
・アスパアラギン酸：４．３〜５．３
・グルタミン酸：７．４〜９．５
・リシン：２．４〜２．９
・アルギニン：４．９〜５．５
・ヒドロキシリジン：０．５〜０．８
・システイン：０〜０．２
・メチオニン：０．３〜１．７
・トリプトファン：０
・チロシン：０．２〜０．３
・フェニルアラニン：１．１〜１．４
エラスチンとコラーゲンの架橋物の形成には、架橋剤を用いてもよい。特に、架橋物に強度安定性が求められる場合には、架橋剤を用いておくことが好ましい。架橋剤としては、これらを架橋できるものであればよい。例えば、カルボジイミド系、アジド系、フルオロホスフェート系、トリアジン系、エポキシ系の架橋剤（縮合剤）などを挙げることができる。また縮合助剤を用いてもよく、N-ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類、N-ヒドロキシトリアゾール類、トリアジン類、及び２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステル等が挙げられる。これらの縮合剤および縮合助剤としては、医療用材料として用いる場合は残留性や毒性が低いものを選択することが望ましい。
【００２８】
本発明の架橋物は、魚類由来のエラスチンと魚類由来のコラーゲンを、架橋剤を用いた架橋法、熱による架橋法、紫外線もしくは放射線による架橋法により製造することができる。人工真皮などの医療用材料、細胞培養用の足場材および化粧品基材としての特性を得る上では、以下の工程を有する製造方法により架橋物を製造することが好ましい。
（Ａ）魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンをエラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程。
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた溶液からエラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で架橋物を得る工程。
【００２９】
工程（Ｂ）としては、以下の工程（Ｂ−１）または（Ｂ−２）を用いることができる。
（Ｂ−１）エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で、工程（Ａ）で得られた溶液に架橋剤を加えて凍結乾燥中に架橋を形成させて架橋物を得る工程。
（Ｂ−２）工程（Ａ）で得られた溶液をエラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で乾燥させて得た乾燥物を架橋させる工程。
【００３０】
工程（Ｂ−２）における乾燥方法としては、凍結乾燥、真空乾燥、送風乾燥、脱水溶剤による乾燥、自然乾燥などが利用できる。また工程（Ｂ）の後に、更に架橋剤による架橋、熱による架橋、紫外線もしくは放射線による架橋など、これら単独もしくは組合せた架橋処理を加えてもよい。
【００３１】
従ってこの製造方法は、エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で、エラスチンを溶解し、その状態でエラスチン及びコラーゲンが溶解した溶液に架橋剤を加えて凍結乾燥中に架橋を形成させて架橋物を得る工程、もしくはこの溶液をエラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で乾燥して得られる乾燥物を架橋させる工程に特徴を有する。水溶性エラスチンには水溶液中でコアセルベーションという現象を起こす温度やｐＨの条件が存在する。コアセルベーションが生じると、液底に水あめ状に凝集していまい、他の混合物とは均一に架橋しないばかりか、架橋剤の種類や架橋条件によっては、水溶性エラスチンは全く架橋せず、他の混合物と分離してしまう。従って、架橋用の溶液中においてエラスチンのコアセルベーションが生じないようにしておくことが好ましい。エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下でコラーゲン及び架橋剤と反応させることにより、エラスチンと、コラーゲン及び架橋剤との均一な反応が進行し、均質な架橋物を得ることができる。架橋物を多孔体として得る場合においても、より均質な空孔分布を有する多孔体が形成可能となる。エラスチンのコアセルベーションが生じた状態で架橋を行うと、架橋物中にエラスチンが偏在した部分が生じ、更に、架橋構造が架橋物全体に十分に形成できない場合が生じる。
【００３２】
コアセルベーションが生じない条件は、用いる水溶性エラスチンの種類によって設定可能である。通常、０〜４０℃の範囲の温度、及び１〜１２の範囲のｐＨから選択した温度及びｐＨ条件が採用可能である。
【００３３】
一方、コラーゲンはある温度以上になると変性してゼラチンとなる。変性したコラーゲンは水に溶けやすく強度が弱いため、生体内のタンパク質分解酵素によって分解吸収されやすくなり、生体内で適度な安定性が求められる医療用材料としては不向きとなる。上記理由より変性温度以下で溶液の調製および架橋反応を行う必要がある。一般的に魚類由来のコラーゲンの変性温度は２０℃前後と言われており、これより低い温度帯で溶液の調製および架橋反応を行うことが望ましい。またコラーゲンは酸性より中性域では可溶化しているが、アルカリ性では不溶化する性質を有する。これらのことからコラーゲンを含む組成物を均一な条件で架橋させるためには、コラーゲンが溶解している溶液のｐＨは、１〜７、さらに好ましくは３〜６が望ましい。
【００３４】
従ってエラスチンとコラーゲンの均質な溶液を得るためには、両者が溶解している状態であることが必要である。すなわち、温度はエラスチンがコアセルベーションを起こさず、かつコラーゲンが変性しない１０度以下、さらに好ましくは０〜５℃、ｐＨはエラスチンがコアセルベーションを起こさず、かつコラーゲンが溶解している３〜６、さらに好ましくは選択した架橋剤が反応しやすいｐＨが好ましい。
【００３５】
エラスチンとコラーゲンとを溶解させる場合の溶媒としては、水、もしくは酸、アルカリ、界面活性剤を含む水、低濃度の水溶性有機溶媒を含む水などを用いることができる。
【００３６】
エラスチンとコラーゲンの混合割合（重量％）としては、架橋物重量に対してエラスチンが０．５％〜９９．５％の範囲であることが好ましい。さらに好ましくは１〜５０％であり、この範囲であれば良好な多孔質な成型体を得ることができ、人工真皮を含む医療用器具、細胞培養足場剤および化粧品基材として良好な成形物を得ることができる。
【００３７】
エラスチン及びコラーゲンを含む乾燥物を架橋する場合の架橋方法としては、架橋剤を用いた化学架橋、熱による架橋、紫外線もしくは放射線による架橋などを用いることができる。すなわち、エラスチン及びコラーゲンを含む乾燥物は架橋剤を添加しない場合においても、熱、紫外線及び放射線の少なくとも１つによって架橋させることができる。
【００３８】
また、乾燥物の架橋は、必要に応じて溶媒中で行うことができる。例えば、乾燥物が溶媒中に溶解しないように、高濃度の塩類水溶液中、もしくはアルコール類、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ジオキサン等などの有機溶媒中、及びこれらの混合溶媒中で、必要に応じて架橋剤の存在下で架橋を行うことができる。
【００３９】
架橋剤の配合割合（重量％）としては、特に限定されるものではないが、架橋させる組成物重量に対し１〜５０％が好ましい。人工真皮を含む医療用器具、細胞培養足場剤および化粧品基材として良好な成形物を得るためには１〜３０％の配合割合が特に好ましい。
【００４０】
溶液中でエラスチンとコラーゲンとを架橋させる場合のこれらの濃度（重量％）としては、特に限定されるものではないが、コラーゲンおよびエラスチンの溶解性、混合液の粘性による成型性を考慮すると０．５〜５０％濃度が好ましい。人工真皮を含む医療用器具、細胞培養足場剤および化粧品基材として良好な成形物を得るためには１〜１０％の濃度範囲が特に好ましい。
【００４１】
本発明のコラーゲン／エラスチン架橋体の成型方法は特に限定されるものではないが、一般的な合成樹脂の成型に用いられる成型用の型を用いることができる。例えば、エラスチンおよびコラーゲンを含む溶液に架橋剤を加えて型に流し込み、これを凍結乾燥することで架橋させる、もしくはエラスチンおよびコラーゲンを含む溶液を型に流し込み、これを乾燥して成型された乾燥物を得て、該乾燥物を架橋することで成形物を得る。このような方法で、使用した鋳型を反映したスポンジ状、糸状、膜状、棒状、ペレット状、チューブ状などのコラーゲン／エラスチン架橋体を成型することが出来る。また、溶液キャスト法により膜状に成型することができる。例えば、エラスチンおよびコラーゲンを含む溶液に架橋剤を加えたものを樹脂や金属などの基板上に薄く広げた後、溶媒を除去乾燥させることで架橋体を得る、もしくはエラスチンおよびコラーゲンを含む溶液を樹脂等の基板上に薄く広げた後、溶媒を除去乾燥したものを架橋することでフィルム状のコラーゲン／エラスチン架橋体を得ることが出来る。
【００４２】
本発明の架橋物には、エラスチン及びコラーゲンの他に、魚類由来のＤＮＡやプロタミンを添加することができる。
【００４３】
ＤＮＡにはヒト皮膚正常線維芽細胞に対するヒアルロン酸産生促進効果を有し、またこれらの分解物であるデオキシリボヌクレオチド類はヒト皮膚正常線維芽細胞の増殖活性やコラーゲン産生促進効果を有する。魚類由来のＤＮＡとしては、サケ科の由来のＤＮＡなどを用いることができる。また本発明で用いるＤＮＡの分子量としては特に限定されないが、重量平均分子量１万〜１０００万程度が好ましい。
【００４４】
プロタミンは脊椎動物の精子核に特異的に存在するタンパク質で抗菌効果を有することから、創傷の感染予防作用が期待される。プロタミンとしては、サケ科由来のサルミン、ニシン科由来のクルペインなどを用いることができる。
【００４５】
プロタミンを構成するアミノ酸にはアルギニンが多く含まれており、サケ科由来のプロタミンであるサルミンではおおよそ７０％はアルギニンであるが、コラーゲン／エラスチン多孔体にプロタミンを含有させた場合、これらの生体内での分解過程でアルギニンが生じる。アルギニンは組織の炎症反応に伴って放出される過剰なサイトカイン（刺激を与える生理活性物質）の発現を抑制する。また、アルギニンは代表的なＮＯ（一酸化窒素）を産生する成分で、ＮＯは腫瘍細胞や感染を伴った細胞に攻撃を加える働きを持っている。さらに、アルギニンは、Ｔ−リンパ球の成熟にとっても重要な役割を果たす。このように、アルギニンは免疫反応の活性化、細胞増殖促進効果、コラーゲン生成促進効果などを有し、創傷や褥瘡の治癒を促進する重要なアミノ酸である。
【００４６】
従ってこれら魚類由来のＤＮＡやプロタミンをコラーゲン／エラスチン架橋物に添加することで上述のような効果が期待できる。これらの成分の配合量は目的とする物性や、特性あるいは機能性を架橋物に付与できるように配合する。配合量は特に限定されるわけではないが、コラーゲンとエラスチンの合計重量に対し０．５％〜５０％、好ましくは１〜２０％のＤＮＡおよびまたはプロタミンを添加する。
【００４７】
さらに本発明の架橋物には、魚類由来のエラスチン及びコラーゲンの他に、粉末状または顆粒状のリン酸カルシウムを添加することができる。この架橋物は、骨再生誘導剤もしくは再生促進剤、あるいは骨欠損部における骨形成の誘導もしくは促進を目的とした骨補填材としての応用が可能であるが、これらの用途に限定されるものではない。
【００４８】
リン酸カルシウムの配合量は目的とする物性や、特性あるいは機能性を架橋物に付与できるように配合する。配合量は特に限定されるわけではないが、コラーゲンとエラスチンの合計重量に対し０．５％〜５０％、好ましくは１〜２０％のリン酸カルシウムを添加する。
【００４９】
リン酸カルシウムとしては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）、リン酸三カルシウム（α―ＴＣＰ，β―ＴＣＰ）、リン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）、リン酸八カルシウム（ＯＣＰ）、リン酸四カルシウム（ＴｅＣＰ）、炭酸アパタイト（ＣＡＰ）などを挙げることができ、これらの少なくとも１種を用いることができる。
【００５０】
本発明によれば、水不溶性である均質な複合体よりなる架橋物を得ることができ、多孔体とした場合でも、人工真皮や細胞培養用の足場材として好適な多孔質構造を架橋物に得ることができる。更に、本発明にかかる架橋物の製造に用いるエラスチン及びコラーゲンは、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）などの感染症が懸念される従来の哺乳動物由来の素材ではなく、魚類由来の天然素材であるため、より安全性の高い架橋物を提供することができる。
【００５１】
本発明にかかる架橋物は、エラスチンを添加したことで、コラーゲン単体より生体内での安定性と機械強度が向上し、且つ生体内での分解性も有しており、医療用材料として好適な物性を有していた。
【００５２】
本発明にかかる架橋物からなる多孔体は、均質であり、かつ、人工真皮や細胞培養用の足場材として好適な多孔質構造を有している。従って、人工真皮として用いた場合に、皮膚線維芽細胞の侵入性に優れ、肉芽形成が良好であり創収縮を抑制し、創傷治癒後は速やかに生体に吸収性されることから、創傷、熱創、褥瘡等により皮膚が損傷を受けた際に、損傷面に適用され、真皮成分の欠損部位に使用できる。従って、本発明によれば、効果的に創傷治癒を促進する人工真皮を提供することができる。
【００５３】
さらには本発明にかかる架橋物からなる多孔体は、内部に均一な細孔が存在し、生体適合性および生体内で徐々に分解する性質を有することから、成長因子（ｂ−ＦＧＦ、ＢＭＰなど）や抗生物質などの薬物を保持し、患部など必要な箇所に送達し、供給することのできる送達システム（ＤＤＳ）用の素材としても利用することができる。また、人工真皮にとどまらず、再生医療用の足場材（スキャフォールド材）として、移植材料等の医療用材料として多岐に利用することも可能である。
【００５４】
本発明にかかる架橋物は、骨再生基材としての利用が可能であるが、骨形成因子及び成長因子を含ませることも出来る。例えば、骨形成因子としては骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、組換えヒト骨形成タンパク質（ｒｈＢＭＰ）を、成長因子としては線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ―β）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経栄養因子（ＮＧＦ）などを挙げることができ、これらの少なくとも１種を用いることができる。
【００５５】
本発明にかかる架橋物は、医療用および細胞培養足場剤用の軟骨再生基材としての利用が可能である。例えばコラーゲン／エラスチン多孔体は均質であり、かつ、細胞の侵入性に優れた好適な多孔質構造を有していることから、軟骨様組織を維持することができる。軟骨再生後は速やかに生体に吸収性されることから、軟骨の損傷面に適用され、効果的に軟骨様組織を再生できる。従って、本発明によれば、効果的に軟骨再生を促進する軟骨再生基材を提供することができる。
【００５６】
本発明にかかる架橋物は、医療用および細胞培養足場剤用の軟骨再生基材としての利用が可能である軟骨分化誘導因子及び成長因子を含ませることも出来る。例えば、軟骨分化誘導因子としては、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ―β）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、組換えヒト骨形成タンパク質（ｒｈＢＭＰ）、Ｓｏｘ遺伝子群（Ｓｏｘ９、Ｓｏｘ５あるいはＳｏｘ６）などを挙げることができ、これらの少なくとも１種を用いることができる。
【００５７】
本発明のコラーゲン/エラスチン架橋体は化粧品基材として用いることができる。化粧品基材としては、化粧用フェイスマスクやウエットシートなどに用いることができる。特に多孔体とした場合は、多くの化粧水や美容液を含浸させることができ、コラーゲン、エラスチンの機能性も期待できる。化粧用フェイスマスクとして用いる場合、厚さ1〜5mm程度のシート状多孔体で、顔の形状に合わせたものや一部を覆う形状のものが利用できる。
【実施例】
【００５８】
次に実施例を示して本発明を実施するための最良の形態について、詳細に記載するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において特に規定がない限りは「％」は重量基準である。【００５９】
〔実施例１〕
（魚類由来のアテロコラーゲン及び水溶性エラスチンの細胞毒性試験）
試料としてサケ皮由来のアテロコラーゲン、サケ心臓由来の水溶性エラスチンを用いた。評価細胞は皮膚マトリックス内の主体をなすヒト皮膚正常線維芽細胞を用いた。細胞毒性試験は、ＷＳＴ-１アッセイにて実施した。ＷＳＴ-１アッセイは、細胞内のミトコンドリアの働きによりＷＳＴ−１が分解されて生成するホルマザン（Ｆｏｒｍａｚａｎ）を比色定量（測定波長４５０ｎｍ）し、その吸光度が生細胞数と相関することを利用して生細胞数を測定する当業者において周知の方法である。得られた結果を図１及び図２に示す。いずれのサンプルも０．１〜１０μｇ/ｍＬの濃度において細胞生存率が高く、細胞毒性を示さないことが確認された。【００６０】
〔実施例２〕
（架橋剤を用いた魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体の調製例）
実施例１で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて多孔体を調製した。すなわち鮭皮由来アテロコラーゲンと鮭心臓由来水溶性エラスチンの配合比（重量比）がコラーゲン／エラスチン＝８:２となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン／エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、冷蔵下（３℃）攪拌して濃度５％のコラーゲン／エラスチン混合溶液を得た。調製したコラーゲン／エラスチン混合溶液に冷蔵下（３℃）でＥＤＣ（架橋剤：1-Ethyl-3-（3-dimetylaminopropyl）-carbodiimide  hydrochloride、東京化成（株））水溶液を加えて混合した（コラーゲンとエラスチンの総重量に対してＥＤＣが２０％（ｗ／ｗ）となるように添加した）。ＥＤＣを添加したコラーゲン／エラスチン混合溶液を目的とする形状の型に流し込み、凍結乾燥して、コラーゲン／エラスチン多孔体を得た。得られたコラーゲン／エラスチン多孔体をイオン交換水で洗浄した。洗浄後、含水状態のコラーゲン／エラスチン多孔体を凍結乾燥させ、コラーゲン／エラスチン多孔体を得た。【００６１】
得られたコラーゲン／エラスチン多孔体の構造を走査型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ製，ＪＳＭ−６３８０ＬＶ，以下ＳＥＭ)により観察した結果、孔の大きさは５０〜１００μｍであり、孔径は揃っていた（図３参照）。【００６２】
〔実施例３〕
（熱架橋を用いた魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体の調製例）
実施例１で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて多孔体を調製した。すなわち鮭皮由来アテロコラーゲンと鮭心臓由来水溶性エラスチンの配合比（重量比）がコラーゲン／エラスチン＝７：３となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン／エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、冷蔵下（３℃）攪拌して濃度１０％のコラーゲン／エラスチン混合溶液を得た。該混合溶液を目的とする形状の型に流し込み、凍結乾燥して、凍結乾燥物を得た。該凍結乾燥物を減圧下で１５０度、２４時間熱架橋を行い、コラーゲン／エラスチン多孔体を得た。得られた多孔体を水中に入れたところ1週間以上形状を保持していた。得られたコラーゲン／エラスチン多孔体の構造を走査型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ製，ＪＳＭ-６３８０ＬＶ，以下ＳＥＭ)により観察した結果、孔の大きさは５０〜１００μｍであり、孔径は揃っていた（図４参照）。【００６３】
〔実施例４〕コラーゲンにエラスチンを添加することによる多孔体の物性変化
サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて、実施例２と同様の架橋方法で、コラーゲン１００％の多孔体、コラーゲンに対し２０％（ｗ/ｗ）のエラスチンを添加した多孔体、コラーゲンに対し４０％（ｗ/ｗ）のエラスチンを添加した多孔体をそれぞれ同一の大きさ及び形状（直径１２ｍｍ厚さ６ｍｍの円柱状）となるように調製した（コラーゲンとエラスチンの合計濃度は５％とした）。これらの多孔体を水中に２４時間放置して、膨潤状態のゲルとした。このゲルの機械的強度をＲＥＯＭＥＴＥＲ（製造販売：（株）サン科学）で測定した。その結果、エラスチンを添加することでコラーゲン単体（エラスチン含有率０％）の場合より、ゲルの破断強度、およびゲルの柔軟性を示す値である破断距離が長くなった（図５、図６参照）。また比較対照として哺乳動物由来のコラーゲンを使用した市販されている人工真皮を上記と同じ分析条件で測定したところ、強度が弱く破断距離は測定できなかった。【００６４】
〔実施例５〕
（魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体のスキャホールド（細胞培養足場材）としての評価）
実施例２と同じ方法で調製した魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体（径１１ｍｍ×厚さ３ｍｍ）を用いた。評価用の細胞として、ＷＦＢ（ＷＫＡラットの線維芽細胞不死化株）、ヒト皮膚正常線維芽細胞を用いた。コラーゲン／エラスチン多孔体をエチレンオキサイドガス滅菌し、脱気処置した多孔体を１２穴培養プレートに置いた。次に細胞含培養液（細胞濃度５×１０５個／ｍＬ）を１ｍＬずつ各スポンジに染み込ませたのち、１ｍＬの培養液を注ぎ、これを３、４日ごとに培養液を交換して培養した。細胞の生存確認と組織学的評価を培養後１４，２８日目に実施した。細胞の生存確認はＷＳＴ−１アッセイの変法を用いた。すなわち培養プレートに接着した細胞を除去し、多孔体に生着した細胞のみを測定するため、多孔体を新しい培養プレートに移した。２〜３ｍＬのＷＳＴ−１液−培養液（１：１０）を新しい培養プレートに注ぎ、そのまま４時間反応させて、吸光度をプレートリーダーで測定した。組織学的評価はコラーゲン／エラスチン多孔体をホルマリン固定し、これをパラフィンブロックに包埋し、薄切後にヘマトキシリン−エオジン染色して実施した。【００６５】
ＷＳＴ−１アッセイ変法による結果を表１に示す。【００６６】
【表１】
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表１に示すとおり、両細胞ともブランク（無細胞）と比較した場合、吸光度が明らかに存在し、更にまた１４日目と比較し２８日目では吸光度が増大していることから、多孔体内で生存し、且つ増殖していることが示唆された。培養組織を染色して顕微鏡下に観察した結果、ヒト皮膚正常線維芽細胞，ＷＦＢいずれの細胞も細胞同士が接着し、多孔体に付着している事が認められた。これらのことから魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体は細胞培養足場材として使用できることが明らかとなった。【００６７】
〔実施例６〕
（魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体の生体内（ラット皮下）への埋め込み試験）
実施例２と同じ方法で調製した魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体（径１１ｍｍ×厚さ５ｍｍ）を用いた。Ｗｉｓｔｅｒ系ラット(４週齢、２００ｇ前後、メス)にエーテルで麻酔をかけ、背部の毛をバリカンで剃り落とした。剪刀にて背部皮膚を約１ｃｍ切開し、皮下（肉様膜下）に直径約１ｃｍのポケットを作成後、エチレンオキサイドガス滅菌した多孔体を埋入し、ナイロン糸で縫合閉創した。手術日より３、７、１４、２１、２８、５６日目にラットを計画屠殺し、多孔体を埋入した部分を生検した。組織をホルマリン固定した後、パラフィン標本とした。これをヘマトキシリン-エオジン染色して、生体適合性を評価した。【００６８】
多孔体埋め込み後の組織を観察した結果、移植早期には多孔体周囲に炎症細胞浸潤、毛細血管、線維芽細胞・内皮細胞のいわゆる肉芽組織が散見され、その後次第に肉芽組織が増生し、新しい膠原繊維（コラーゲン等）が産生され、５６日目にはほぼ完全に瘢痕化した。一方、多孔体は周囲から破壊・吸収され、５６日目には完全に吸収された（図７参照）。これは、以前に報告されているコラーゲン使用人工真皮であるペルナック(販売元；ジョンソン＆ジョンソン、製造元；グンゼ)の動物実験の結果とほぼ同等であった。【００６９】
〔実施例７〕
（ラット皮膚欠損創への魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体の移植試験）
実施例２と同じ方法で魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体（径２０ｍｍ×厚さ５ｍｍ）を調製し、サンプル群はこれを移植材料とした。コントロール群には市販されているコラーゲン使用人工真皮であるテルダーミス（コラーゲン単層タイプ、テルモ製）を移植材料として用いた。Ｗｉｓｔｅｒ系ラットにエーテルで麻酔をかけ、背部に直径１５ｍｍほどの皮膚欠損創を作成し、欠損創に移植材料を置き、ドレッシング保護材で欠損創と移植材料を完全に覆い、ドレッシング保護材と皮膚断端をナイロン糸で縫合した。移植材料と下床を密着させるためガーゼで軽く圧迫し、さらに伸縮性バンドで圧迫固定した。移植材料なしのＯＰＥＮ  ＷＯＵＮＤ群、移植材料として魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体を用いたサンプル群、移植材料としてテルダーミスを用いたコントロール群の３群を作成し、同様の処置を各群５匹行った。【００７０】
試験結果の試料埋入に伴う死亡および感染等の所見は各群ともに確認されなかった。創面の肉眼的所見では、サンプル群は術後より創面が急速に収縮することはなく、７日目では大部分は肉芽化したＯＰＥＮ  ＷＯＵＮＤ群の創面は、術後より急速に収縮し始め、１４日目にはほぼ治癒した。経時的な創面の大きさの比較検討の結果、ＯＰＥＮ  ＷＯＵＮＤ群の創面は術後の早期から急速に収縮し始めるのに対し、サンプル群およびコントロール群では創収縮は比較的緩徐に生じることが認められた（図８、９参照）。創面（治癒面）の組織学的検討の結果、術後７日目のサンプル群では、周囲組織より炎症細胞浸潤、線維芽細胞および血管内皮細胞などが観察された。術後１４日目では下床組織は肉芽・瘢痕組織であり、その上部の皮膚断端より再生上皮が伸展していた。潰瘍底部は細胞成分・毛細血管に富み、深層部位は細胞成分が減少し瘢痕が成熟しつつあった。本結果は市販の人工真皮であるテルダーミスと同様の結果であった。【００７１】
〔実施例８〕
（架橋剤を用いたＤＮＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体の調製例）
実施例１で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて多孔体を調製した。すなわちサケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンの配合比（重量比）がコラーゲン／エラスチン＝８:２となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン／エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、冷蔵下（３℃）攪拌して濃度５％のコラーゲン／エラスチン混合溶液を得た。サケ白子由来ＤＮＡに脱イオン水を加えて、冷蔵下（３℃）攪拌して濃度５％のＤＮＡ溶液を得た。【００７２】
先に調製した濃度５％のコラーゲン／エラスチン混合溶液に対し、濃度５％のＤＮＡ溶液を重量比が８：２となるように添加し、冷蔵下（３℃）攪拌してＤＮＡ添加コラーゲン／エラスチン混合液を得た。このＤＮＡ添加コラーゲン／エラスチン混合液に対し、ＥＤＣ（架橋剤：1-Ethyl-3-（3-dimetylaminopropyl）-carbodiimide  hydrochloride、東京化成（株））水溶液を加えて混合した（コラーゲン、エラスチンおよびＤＮＡの総重量に対してＥＤＣが２０％（ｗ／ｗ）となるように添加した）。ＥＤＣを添加したＤＮＡ添加コラーゲン／エラスチン混合溶液を目的とする形状の型に流し込み、凍結乾燥して、ＤＮＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体を得た。得られたＤＮＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体をイオン交換水で洗浄した。洗浄後、含水状態のＤＮＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体を凍結乾燥させ、ＤＮＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体を得た。【００７３】
得られたＤＮＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体の構造を走査型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ製，ＪＳＭ−６３８０ＬＶ，以下ＳＥＭ)により観察した結果、孔の大きさは１００μｍ前後であり、孔径は揃っていた（図１０参照）。【００７４】
〔実施例９〕
（架橋剤を用いたプロタミン添加コラーゲン／エラスチン多孔体の調製例）
実施例１で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて多孔体を調製した。すなわちサケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンの配合比（重量比）がコラーゲン／エラスチン＝８:２となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン／エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、冷蔵下（３℃）攪拌して濃度５％のコラーゲン／エラスチン混合溶液を得た。サケ白子由来プロタミンに脱イオン水を加えて、冷蔵下（３℃）攪拌して濃度５％のプロタミン溶液を得た。先に調製した濃度５％のコラーゲン／エラスチン混合溶液に対し、濃度５％のプロタミン溶液を重量比が８：２となるように添加し、冷蔵下（３℃）攪拌してプロタミン添加コラーゲン／エラスチン混合液を得た。このプロタミン添加コラーゲン／エラスチン混合液に対し、ＥＤＣ（架橋剤：1-Ethyl-3-（3-dimetylaminopropyl）-carbodiimide  hydrochloride、東京化成（株））水溶液を加えて混合した（コラーゲン、エラスチンおよびプロタミンの総重量に対してＥＤＣが２０％（ｗ／ｗ）となるように添加した）。ＥＤＣを添加したプロタミン添加コラーゲン／エラスチン混合溶液を目的とする形状の型に流し込み、凍結乾燥して、プロタミン添加コラーゲン／エラスチン多孔体を得た。得られたプロタミン添加コラーゲン／エラスチン多孔体をイオン交換水で洗浄した。洗浄後、含水状態のプロタミン添加コラーゲン／エラスチン多孔体を凍結乾燥させ、プロタミン添加コラーゲン／エラスチン多孔体を得た。【００７５】
得られたプロタミン添加コラーゲン／エラスチン多孔体の構造を走査型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ製，ＪＳＭ−６３８０ＬＶ，以下ＳＥＭ)により観察した結果、孔の大きさは１００μｍ前後であり、孔径は揃っていた（図１１参照）。【００７６】
〔実施例１０〕
（架橋剤を用いたヒドロキシアパタイト添加コラーゲン／エラスチン多孔体の調製例）
実施例１で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて多孔体を調製した。すなわちサケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンの配合比（重量比）がコラーゲン／エラスチン＝８:２となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン／エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、冷蔵下（３℃）攪拌して濃度５％のコラーゲン／エラスチン混合溶液を得た。調製したコラーゲン／エラスチン混合溶液に対し、コラーゲンとエラスチンの合計重量とヒドロキシアパタイト（以下、ＨＡ）の重量比が８：２となるようにＨＡを加え、冷蔵下（３℃）で錬和した。このＨＡ添加コラーゲン／エラスチン混合液に対し、ＥＤＣ（架橋剤：1-Ethyl-3-（3-dimetylaminopropyl）-carbodiimide  hydrochloride、東京化成（株））水溶液を加えて混合した（コラーゲンとエラスチンの総重量に対してＥＤＣが２０％（ｗ／ｗ）となるように添加した）。ＥＤＣを添加したＨＡ添加コラーゲン／エラスチン混合溶液を目的とする形状の型に流し込み、凍結乾燥して、ＨＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体を得た。得られたＨＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体をイオン交換水で洗浄した。洗浄後、含水状態のＨＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体を凍結乾燥させ、ＨＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体を得た。【００７７】
得られたＨＡ添加コラーゲン／エラスチン多孔体の構造を走査型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ製，ＪＳＭ−６３８０ＬＶ，以下ＳＥＭ)により観察した結果、孔の大きさは１００μｍ前後であった（図１２参照）。【００７８】
〔実施例１１〕
（コラーゲン/エラスチン多孔体の軟骨再生分野での利用）
実施例２と同じ方法で調製した魚類由来コラーゲン／エラスチン多孔体（直径１１ｍｍ×厚さ５ｍｍ）を用いた。培養液中で脱気処置したコラーゲン／エラスチン多孔体を１０ｃｍ培養皿に設置した。次に培養した軟骨細胞を培養フラスコから回収して細胞数を数え、５×１０６個を５００μＬの培養液中に再懸濁し、細胞培養液とした。この細胞培養液をコラーゲン／エラスチン多孔体に染み込ませ、インキュベーター内で培養を開始した。さらに１２時間後に培養液１０ｍＬを培養皿に注いだ。３日または４日に一度培養液を交換した。培養後１８日目に組織を回収し、これをホルマリン固定した後、パラフィンブロックに包埋・薄切し、組織切片を作成した。組織切片をヘマトキシリン・エオジン染色、アルシアンブルー染色、トルイジンブルー染色、ＩＩ型コラーゲン抗体による免疫染色を行った。【００７９】
アルシアンブルー染色（図１３）とトルイジンブルー染色（図１４）により細胞周囲の基質が濃染されたことから、コンドロイチン硫酸やヒアルロン酸などの酸性ムコ多糖類が多く含まれる軟骨基質であると考えられた。またトルイジンブルー染色では、軟骨細胞に特徴的なメタクロマジーが観察された。さらに軟骨基質に特徴的に含まれるＩＩ型コラーゲンを染色するＩＩ型コラーゲン抗体による免疫染色でも濃染されており、細胞周辺に軟骨器質が産生されていることが確認された（図１５）。以上の結果から、コラーゲン/エラスチン多孔体は軟骨細胞培養基材（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）や軟骨再生基材となることが示唆された。【００８０】
〔実施例１２〕
（フィルム状の魚類由来コラーゲン／エラスチン複合体の調製）
実施例１で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて膜を調製した。すなわちアテロコラーゲンと水溶性エラスチンの配合比（重量比）がコラーゲン／エラスチン＝８：２となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン／エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、濃度２０％のコラーゲン／エラスチン混合溶液を得た。調製したコラーゲン／エラスチン混合溶液にＥＤＣ（架橋剤：１‐Ethyl‐3‐(3-dimethylaminopropyl)‐carbodiimide  hydrochloride、東京化成（株））水溶液を加えて混合した（コラーゲンとエラスチンの総重量に対してＥＤＣが０．５％（w／ｗ）となるように添加した）。ＥＤＣを添加したこの混合溶液をポリプロピレン製のシート上に塗布し、これを乾燥剤入りのデシケータ内に静置し、乾燥・固化させた（以上の操作を５℃以下で行った）。乾燥・固化後、フィルム状のコラーゲン／エラスチン複合体を減圧下で、１８０℃で１時間加熱処理を行った。【００８１】
得られたフィルム状のコラーゲン／エラスチン複合体を水に浸漬させたところ、一週間以上形状を保持していた（図１６）。【００８２】
〔実施例１３〕
（コラーゲン/エラスチン複合体の化粧品基材として利用）
被験者（２０代〜３０代の男性４名）の左前腕を石鹸でよく洗浄し、水洗したのち手を拭き乾かした。洗浄３０分後、左前腕内側３箇所に測定器のプローブを当てる場所に印をつけた。印をつけた部位の粘弾性を皮膚粘弾性測定装置  キュートメーター  ＭＰＡ５８０（Ｃｏｕｒａｇｅ+Ｋｈａｚａｋａ社、測定モード１）で測定した（塗布前：０時）。０時測定後、各被験者の３箇所の印のうち、１箇所に市販化粧水を十分に染み込ませたシート状のコラーゲン／エラスチン多孔体を貼り付け、１５分間放置した。なおシート状のコラーゲン／エラスチン多孔体は実施例２と同様に調製した。１５分後、化粧水を含ませたコラーゲン／エラスチン多孔体（ＣＥＳ＋化粧水塗布と略）を剥がすと同時に、印をつけた別の１箇所に化粧水を塗布した。同様にして全４名の被験者に対し、塗布なし部、化粧水塗布部、ＣＥＳ＋化粧水塗布部を作成した。塗布２時間後、印をつけた部位の皮膚粘弾性を上述と同様に測定した。【００８３】
各部の塗布前後の皮膚粘弾性値（Ｒ７値）の差を比較したところ、ＣＥＳ＋化粧水塗布部では、塗布なし部と比較して有意に皮膚粘弾性が上昇した（図１７）。またＣＥＳ＋化粧水塗布部の肉眼的所見では異常は認められなかった。以上のようにコラーゲン/エラスチン多孔体は化粧品の効果を高めたことから、化粧品基材として使用可能であった。【００８４】
〔実施例１４〕
（フィルム状の魚類由来コラーゲン／エラスチン複合体の調製（２））
実施例１で用いたものと同じ、サケ皮由来アテロコラーゲンとサケ心臓由来水溶性エラスチンを用いて膜を調製した。すなわちアテロコラーゲンと水溶性エラスチンの配合比（重量比）がコラーゲン／エラスチン＝８：２となるように試験管に量り取った。その混合コラーゲン／エラスチン粉末に脱イオン水を加えて、濃度２０％のコラーゲン／エラスチン混合溶液とした。この混合溶液をポリプロピレン製のシート上に塗布し、これを乾燥剤入りのデシケータ内に静置し、乾燥させた（以上の操作を５℃以下で行った）。乾燥・固化後、フィルム状のコラーゲン／エラスチン複合体を減圧下で、１８０℃で１時間、加熱処理を行い、フィルム状のコラーゲン／エラスチンの架橋物を調製した。【００８５】
得られたフィルム状のコラーゲン／エラスチン複合体を水に浸漬させたところ、水中で1週間以上形状を保持していた（図１８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年6月15日(2011.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンを該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程と、
該溶液に架橋剤を加えて架橋物を形成する工程と、
得られた架橋物を乾燥させる工程と、
を有する製造方法により得られることを特徴とする架橋物。
【請求項２】
前記架橋物の架橋形成及び乾燥工程が、凍結乾燥によって行われる請求項１に記載の架橋物。
【請求項３】
魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンを該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程と、
該溶液から乾燥物を得る工程と、
該乾燥物を架橋して架橋物を形成する工程と、
を有する製造方法により得られることを特徴とする架橋物。
【請求項４】
前記乾燥物が、凍結乾燥によって得られる請求項３に記載の架橋物。
【請求項５】
前記架橋物が、コラーゲン単体の架橋物より機械的強度を高めた請求項１乃至４のいずれかに記載の架橋物。
【請求項６】
前記溶液が、ＤＮＡ及びプロタミンの少なくとも一方を更に含む請求項１乃至５のいずれかに記載の架橋物。
【請求項７】
リン酸カルシウムを更に含む請求項１乃至６のいずれかに記載の架橋物。
【請求項８】
前記架橋物が多孔体として得られる請求項１乃至７のいずれかに記載の架橋物。
【請求項９】
前記架橋物がフィルムまたは膜として得られる請求項１乃至７のいずれかに記載の架橋物。
【請求項１０】
魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンを該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程と、
該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で該溶液に架橋剤を加えて架橋物を形成する工程と、
得られた架橋物を乾燥させる工程と、
を有することを特徴とする架橋物の製造方法。
【請求項１１】
前記架橋物の架橋形成及び乾燥工程が、凍結乾燥によって行われる請求項１０に記載の架橋物の製造方法。
【請求項１２】
魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンを該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程と、
該溶液から乾燥物を得る工程と、
該乾燥物を架橋して架橋物を形成する工程と、
を有することを特徴とする架橋物の製造方法。
【請求項１３】
前記乾燥物が凍結乾燥によって得られる請求項１２に記載の架橋物の製造方法。
【請求項１４】
前記架橋物が多孔体として得られる請求項１０乃至１３のいずれかに記載の架橋物の製造方法。
【請求項１５】
前記架橋物がフィルムまたは膜として得られる請求項１０乃至１３のいずれかに記載の架橋物の製造方法。
【請求項１６】
前記架橋物が、コラーゲン単体より機械的強度を高めることが可能な請求項１０乃至１５のいずれかに記載の架橋物の製造方法。
【請求項１７】
前記溶液が、ＤＮＡ及びプロタミンの少なくとも一方を更に含む請求項１０乃至１６のいずれかに記載の架橋物の製造方法。
【請求項１８】
リン酸カルシウムを更に含む請求項１０乃至１７のいずれかに記載の架橋物の製造方法。
【請求項１９】
請求項１乃至９のいずれかに記載の架橋物を含むことを特徴とする医療用材料。
【請求項２０】
人工真皮である請求項１９に記載の医療用材料。
【請求項２１】
軟骨再生基材である請求項１９に記載の医療用材料。
【請求項２２】
骨再生基材である請求項１９に記載の医療用材料。
【請求項２３】
骨形成因子または骨成長因子を担持させた請求項２２に記載の医療用材料。
【請求項２４】
請求項１乃至９のいずれかに記載の架橋物を含むことを特徴とする細胞培養足場材。
【請求項２５】
軟骨細胞の培養に適した請求項２４に記載の細胞培養足場材。
【請求項２６】
骨細胞の培養に適した請求項２４に記載の細胞培養足場材。
【請求項２７】
請求項１乃至９のいずれかに記載の架橋物を含むことを特徴とする化粧品基材。
【手続補正書】
【提出日】平成23年10月17日(2011.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類由来のコラーゲンと重量平均分子量が１万〜１０万である魚類由来のエラスチンを該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程と、
該溶液に架橋剤を加えて架橋物を形成する工程と、
得られた架橋物を乾燥させる工程と、
を有する製造方法により得られることを特徴とする架橋物。
【請求項２】
前記架橋物の架橋形成及び乾燥工程が、凍結乾燥によって行われる請求項１に記載の架橋物。
【請求項３】
魚類由来のコラーゲンと重量平均分子量が１万〜１０万である魚類由来のエラスチンを該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程と、
該溶液から乾燥物を得る工程と、
該乾燥物を架橋して架橋物を形成する工程と、
を有する製造方法により得られることを特徴とする架橋物。
【請求項４】
前記乾燥物が、凍結乾燥によって得られる請求項３に記載の架橋物。
【請求項５】
前記架橋物が、コラーゲン単体の架橋物より機械的強度を高めた請求項１乃至４のいずれかに記載の架橋物。
【請求項６】
前記溶液が、ＤＮＡ及びプロタミンの少なくとも一方を更に含む請求項１乃至５のいずれかに記載の架橋物。
【請求項７】
リン酸カルシウムを更に含む請求項１乃至６のいずれかに記載の架橋物。
【請求項８】
前記架橋物が多孔体として得られる請求項１乃至７のいずれかに記載の架橋物。
【請求項９】
前記架橋物がフィルムまたは膜として得られる請求項１乃至７のいずれかに記載の架橋物。
【請求項１０】
魚類由来のコラーゲンと重量平均分子量が１万〜１０万である魚類由来のエラスチンを該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程と、
該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で該溶液に架橋剤を加えて架橋物を形成する工程と、
得られた架橋物を乾燥させる工程と、
を有することを特徴とする架橋物の製造方法。
【請求項１１】
前記架橋物の架橋形成及び乾燥工程が、凍結乾燥によって行われる請求項１０に記載の架橋物の製造方法。
【請求項１２】
魚類由来のコラーゲンと重量平均分子量が１万〜１０万である魚類由来のエラスチンを該エラスチンのコアセルベーションを生じさせない条件下で溶解させた溶液を調製する工程と、
該溶液から乾燥物を得る工程と、
該乾燥物を架橋して架橋物を形成する工程と、
を有することを特徴とする架橋物の製造方法。
【請求項１３】
前記乾燥物が凍結乾燥によって得られる請求項１２に記載の架橋物の製造方法。
【請求項１４】
前記架橋物が多孔体として得られる請求項１０乃至１３のいずれかに記載の架橋物の製造方法。
【請求項１５】
前記架橋物がフィルムまたは膜として得られる請求項１０乃至１３のいずれかに記載の架橋物の製造方法。
【請求項１６】
前記架橋物が、コラーゲン単体より機械的強度を高めることが可能な請求項１０乃至１５のいずれかに記載の架橋物の製造方法。
【請求項１７】
前記溶液が、ＤＮＡ及びプロタミンの少なくとも一方を更に含む請求項１０乃至１６のいずれかに記載の架橋物の製造方法。
【請求項１８】
リン酸カルシウムを更に含む請求項１０乃至１７のいずれかに記載の架橋物の製造方法。
【請求項１９】
請求項１乃至９のいずれかに記載の架橋物を含むことを特徴とする医療用材料。
【請求項２０】
人工真皮である請求項１９に記載の医療用材料。
【請求項２１】
軟骨再生基材である請求項１９に記載の医療用材料。
【請求項２２】
骨再生基材である請求項１９に記載の医療用材料。
【請求項２３】
骨形成因子または骨成長因子を担持させた請求項２２に記載の医療用材料。
【請求項２４】
請求項１乃至９のいずれかに記載の架橋物を含むことを特徴とする細胞培養足場材。
【請求項２５】
軟骨細胞の培養に適した請求項２４に記載の細胞培養足場材。
【請求項２６】
骨細胞の培養に適した請求項２４に記載の細胞培養足場材。
【請求項２７】
請求項１乃至９のいずれかに記載の架橋物を含むことを特徴とする化粧品基材。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
また本発明で用いるエラスチンの分子量は、重量平均分子量１万〜１０万程度である。
【手続補正書】
【提出日】平成24年4月10日(2012.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類由来のコラーゲンと重量平均分子量が１万〜１０万である魚類由来のエラスチンを０〜１０℃で溶解させた溶液を調製する工程と、
５℃以下の温度において該溶液から乾燥物を得る工程と、
該乾燥物を架橋して架橋物を形成する工程と、
を有する製造方法により得られ、
かつ、魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンとの混合割合が、８：２〜５：５である
ことを特徴とする多孔体架橋物。
【請求項２】
前記乾燥物が、凍結乾燥によって得られる請求項１に記載の多孔体架橋物。
【請求項３】
前記架橋物が、コラーゲン単体の架橋物より機械的強度を高めた請求項１または２に記載の多孔体架橋物。
【請求項４】
前記溶液が、ＤＮＡ及びプロタミンの少なくとも一方を更に含む請求項１乃至３のいずれか１項に記載の多孔体架橋物。
【請求項５】
リン酸カルシウムを更に含む請求項１乃至４のいずれか１項に記載の多孔体架橋物。
【請求項６】
前記架橋物が、孔径が５０〜１００μｍの多孔体として得られる請求項１乃至５のいずれか１項に記載の多孔体架橋物。
【請求項７】
前記架橋物がフィルムまたは膜として得られる請求項１乃至５のいずれか１項に記載の多孔体架橋物。
【請求項８】
魚類由来のコラーゲンと重量平均分子量が１万〜１０万である魚類由来のエラスチンを０〜１０℃で溶解させた溶液を調製する工程と、
５℃以下の温度において該溶液から乾燥物を得る工程と、
該乾燥物を架橋して多孔体架橋物を形成する工程と、
を有し、
魚類由来のコラーゲンと魚類由来のエラスチンとの混合割合が、８：２〜５：５である
ことを特徴とする多孔体架橋物の製造方法。
【請求項９】
前記乾燥物が凍結乾燥によって得られる請求項８に記載の多孔体架橋物の製造方法。
【請求項１０】
前記架橋物が、孔径が５０〜１００μｍの多孔体として得られる請求項８または９に記載の多孔体架橋物の製造方法。
【請求項１１】
前記架橋物がフィルムまたは膜として得られる請求項８または９に記載の多孔体架橋物の製造方法。
【請求項１２】
前記架橋物が、コラーゲン単体より機械的強度を高めることが可能な請求項８乃至１１のいずれか１項に記載の多孔体架橋物の製造方法。
【請求項１３】
前記溶液が、ＤＮＡ及びプロタミンの少なくとも一方を更に含む請求項８乃至１２のいずれか１項に記載の多孔体架橋物の製造方法。
【請求項１４】
リン酸カルシウムを更に含む請求項８乃至１３のいずれか１項に記載の多孔体架橋物の製造方法。
【請求項１５】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の多孔体架橋物を含むことを特徴とする医療用材料。
【請求項１６】
人工真皮である請求項１５に記載の医療用材料。
【請求項１７】
軟骨再生基材である請求項１５に記載の医療用材料。
【請求項１８】
骨再生基材である請求項１５に記載の医療用材料。
【請求項１９】
骨形成因子または骨成長因子を担持させた請求項１８に記載の医療用材料。
【請求項２０】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の多孔体架橋物を含むことを特徴とする細胞培養足場材。
【請求項２１】
軟骨細胞の培養に適した請求項２０に記載の細胞培養足場材。
【請求項２２】
骨細胞の培養に適した請求項２０に記載の細胞培養足場材。
【請求項２３】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の多孔体架橋物を含むことを特徴とする化粧品基材。
【国際調査報告】
2010110067.tif 000021
2010110067.tif 000022
2010110067.tif 000023
2010110067.tif 000024