(57)【要約】 本発明は、糞便中の核酸を安定して保存することが可能な糞便試料を、煩雑な操作を必要とせずに調製する方法、その方法に用いられる糞便試料調製用溶液及び採便用キット、並びに、本発明の調製方法により調製された糞便試料を用いて糞便中の核酸を回収し解析する方法の提供に関し、採取された糞便を、有機酸を含有する水溶性有機溶媒を有効成分とする糞便試料調製用溶液に混合させることで、糞便試料中に含まれる核酸の保存性に優れた糞便試料を調製する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
採取された糞便を、糞便試料調製用溶液と混合する糞便試料の調製方法。
【請求項２】
採取された糞便の混合に用いられ、
有機酸を含有する水溶性有機溶媒を有効成分とする糞便試料調製用溶液。
【請求項３】
前記糞便試料調製用溶液が緩衝作用を有する請求項２に記載の糞便試料調製用溶液。
【請求項４】
前記水溶性有機溶媒が、水溶性アルコール、ケトン類、及びアルデヒド類からなる群より選択される１種以上である請求項２又は３に記載の糞便試料調製用溶液。
【請求項５】
前記糞便試料調製用溶液のｐＨが２〜６．５である請求項２〜４のいずれかに記載の糞便試料調製用溶液。
【請求項６】
前記糞便試料調製用溶液のｐＨが３〜６である請求項５に記載の糞便試料調製用溶液。
【請求項７】
前記有機酸が、直鎖脂肪酸、ジカルボン酸、アミノ酸、ヒドロキシ酸、及び、芳香族又は複素環のポリカルボン酸からなる群より選択される１種以上である請求項２〜６のいずれかに記載の糞便試料調製用溶液。
【請求項８】
前記有機酸が、酢酸、乳酸、クエン酸、及びアジピン酸からなる群より選択される１種以上である請求項７に記載の糞便試料調製用溶液。
【請求項９】
前記糞便試料調製用溶液のｐＨが４．５〜５．５である請求項６〜８のいずれかに記載の糞便試料調製用溶液。
【請求項１０】
前記糞便試料調製用溶液の有機酸濃度が０．０１〜０．１Ｍである請求項２〜９のいずれか記載の糞便試料調製用溶液。
【請求項１１】
前記水溶性有機溶媒が水溶性アルコール及び／又はケトン類であり、その水溶性有機溶媒の濃度が３０％以上である請求項４〜１０のいずれかに記載の糞便試料調製用溶液。
【請求項１２】
前記水溶性有機溶媒が、水溶性アルコールとして、エタノール、プロパノール、及びメタノールからなる群より選ばれる１以上を含む請求項１１に記載の糞便試料調製用溶液。
【請求項１３】
前記水溶性有機溶媒がエタノールである請求項１１に記載の糞便試料調製用溶液。
【請求項１４】
前記水溶性有機溶媒が、ケトン類として、アセトン及び／又はメチルエチルケトンを含む請求項１１又は１２に記載の糞便試料調製用溶液。
【請求項１５】
前記水溶性有機溶媒がアルデヒド類であり、その水溶性有機溶媒の濃度が０．０１〜３０％である請求項４〜１０のいずれかに記載の糞便試料調製用溶液。
【請求項１６】
前記糞便と前記糞便試料調製用溶液の混合比率が、糞便容量１に対して糞便試料調製用溶液容量が１以上である請求項２〜１５のいずれかに記載の糞便試料調製用溶液。
【請求項１７】
前記糞便試料調製用溶液が界面活性剤を含有する請求項２〜１６のいずれかに記載の糞便試料調製用溶液。
【請求項１８】
前記糞便試料調製用溶液が着色剤を含有する請求項２〜１７のいずれかに記載の糞便試料調製用溶液。
【請求項１９】
前記糞便試料調製用溶液中の前記水溶性有機溶媒の濃度が３０％以上である請求項２〜１８のいずれかに記載の糞便試料調製用溶液。
【請求項２０】
有機酸を含有する水溶性有機溶媒を有効成分とする糞便試料調製用溶液と、
前記糞便試料調製用溶液を含有する採便容器と、を有する採便用キット。
【請求項２１】
前記糞便試料調製用溶液中の水溶性有機溶媒の濃度が３０％以上である請求項２０に記載の採便用キット。
【請求項２２】
請求項２〜１９のいずれか記載の糞便試料調製用溶液を用いて調製された糞便試料。
【請求項２３】
請求項２２に記載の糞便試料中から、腸内常在菌由来の核酸と腸内常在菌以外の生物由来の核酸とを同時に回収する糞便試料から核酸を回収する核酸回収方法。
【請求項２４】
前記腸内常在菌以外の生物由来の核酸が、哺乳細胞由来の核酸である請求項２３に記載の核酸回収方法。
【請求項２５】
核酸を回収する工程が、
（ａ）前記糞便試料中のタンパク質を変性させ、前記糞便試料中の腸内常在菌及び腸内常在菌以外の生物から、核酸を溶出させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において溶出させた核酸を回収する工程と、
を有する請求項２３又は２４に記載の核酸回収方法。
【請求項２６】
前記工程（ａ）の後、前記工程（ｂ）の前に、
（ｃ）前記工程（ａ）により変性させたタンパク質を除去する工程と、
を更に有する請求項２５に記載の核酸回収方法。
【請求項２７】
前記工程（ａ）におけるタンパク質の変性が、カオトロピック塩、有機溶媒、及び界面活性剤からなる群より選ばれる１以上を用いて行われる請求項２５又は２６に記載の核酸回収方法。
【請求項２８】
前記有機溶媒がフェノールである請求項２７に記載の核酸回収方法。
【請求項２９】
前記工程（ｃ）における変性させたタンパク質の除去が、クロロホルムを用いて行われる請求項２６〜２８のいずれか記載の核酸回収方法。
【請求項３０】
前記工程（ｂ）における核酸の回収が、
（ｂ１）前記工程（ａ）において溶出させた核酸を無機支持体に吸着させる工程と、
（ｂ２）前記工程（ｂ１）において吸着させた核酸を無機支持体から溶出させる工程と、を有する請求項２５〜２９のいずれか記載の核酸回収方法。
【請求項３１】
前記工程（ａ）の前に、
（ｄ）前記糞便試料から固形成分を回収する工程と、
を有する請求項２５〜３０のいずれか記載の核酸回収方法。
【請求項３２】
請求項２３〜３１のいずれか記載の核酸回収方法から回収された核酸を用いて、哺乳細胞由来の核酸を解析する核酸解析方法。
【請求項３３】
前記哺乳細胞が消化管細胞である請求項３２に記載の核酸解析方法。
【請求項３４】
前記哺乳細胞が大腸剥離細胞である請求項３２に記載の核酸解析方法。
【請求項３５】
前記哺乳細胞由来の核酸が、新生物性転化を示すマーカーである請求項３２〜３４のいずれか記載の核酸解析方法。
【請求項３６】
前記哺乳細胞由来の核酸が、炎症性消化器疾患を示すマーカーである請求項３２〜３４のいずれか記載の核酸解析方法。
【請求項３７】
前記解析が、ＲＮＡ解析及び／又はＤＮＡ解析である請求項３２〜３６のいずれか記載の核酸解析方法。
【請求項３８】
前記ＲＮＡ解析が、ＲＮＡ上の塩基の挿入、欠失、置換、重複、逆位、又はスプライシングバリアントの解析、ｍＲＮＡ発現解析、及び機能性ＲＮＡ解析のいずれか１以上である請求項３７に記載の核酸解析方法。
【請求項３９】
前記ＤＮＡ解析が、変異解析及びエピジェネティック変化解析のいずれか１以上である請求項３７に記載の核酸解析方法。
【請求項４０】
前記変異解析が、塩基の挿入、欠失、置換、重複、又は逆位のいずれか１以上の変異の解析である請求項３９に記載の核酸解析方法。
【請求項４１】
前記エピジェネティック変化解析が、ＤＮＡのメチル化解析及びＤＮＡの脱メチル化解析のいずれか１以上である請求項３９に記載の核酸解析方法。
【請求項４２】
前記変異解析がＫ−ｒａｓ遺伝子の変異解析である請求項３９に記載の核酸解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糞便試料中に含まれる核酸の保存性に優れた糞便試料を調製するための糞便試料の調製方法、糞便試料調製用溶液及び採便用キット、その調製方法により調製された糞便試料、その糞便試料からの核酸回収方法、及びその核酸回収方法により回収された核酸を用いた核酸解析方法に関する。
本願は、２００８年８月２６日に、日本に出願された特願２００８−２１７０１９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
欧米と同様に日本においても、大腸がんの患者数は、年々急激に増加しており、大腸がんが、がん死亡率の上位を占めている。これは、日本人の食生活が欧米型の肉食中心となったことに原因があると考えられる。具体的には、毎年約６万人程度が大腸がんに罹患しており、臓器別の死亡数でも、胃がん、肺がんに続く３番目の多さであり、今後更なる増加も予想されている。一方で、大腸がんは、他のがんと異なり、発症の初期に治療することにより、１００％近く治癒可能である。したがって、大腸がんを早期がん検診の対象とすることは極めて有意義であり、大腸がんの早期発見のための検査方法の研究・開発が盛んに行われている。【０００３】
大腸がんの早期発見のための検査方法として、例えば、注腸検査、大腸内視鏡検査等が行われている。注腸検査とは、大腸にバリウムを注入し、大腸の粘膜面に付着させ、Ｘ線を照射しその表面の凹凸の撮影を行い、大腸の表面を観察する検査である。一方、大腸内視鏡検査とは、内視鏡により直接大腸内部を観察する検査である。特に大腸内視鏡検査は、感度や特異性が高く、ポリープや早期がんの切除も可能であるという利点も有している。
しかしながら、これらの検査方法は、コストが高い上に被験者への負担が大きく、合併症のリスクを伴うという問題がある。例えば、注腸検査には、Ｘ線被爆や腸閉塞の危険性がある。また、大腸内視鏡検査は、内視鏡を直接大腸内に投入するため侵襲的である。更に、内視鏡操作には熟練を要し、検査のできる施設が限られている。このため、これらの検査方法は、定期健診等の無症状の一般人を対象とした大腸がん検査に適していない。【０００４】
近年、大腸がんの一次スクリーニング法として、非侵襲的で低コストである便潜血検査が広く実施されている。便潜血検査は、糞便中に含まれる赤血球由来のヘモグロビンの有無を調べる検査であり、間接的に大腸がんの存在を予測する方法である。便潜血検査が広く利用される理由としては、便の採取や保存を常温で行うことができ、冷蔵・冷凍等の特別な保存条件も必要としないこと、及び、一般的な家庭で簡単に行うことができ、操作が非常に簡便であることが挙げられる。但し、便潜血検査では、感度が２５％程度と低く、大腸がんを見落とす確率が高いという問題がある。さらに、陽性的中率も低く、便潜血検査陽性の被験者の中で実際に大腸がん患者である割合は１０％以下であり、多くの偽陽性を含んでいる。このため、より信頼性の高い新たな検査法の開発が強く望まれている。【０００５】
定期健診等にも適した、非侵襲的で簡便であり、かつ信頼性の高い新たな検査方法として、糞便中のがん細胞の有無やがん細胞由来遺伝子の有無を調べる検査が注目されている。これらの検査方法は、直接的にがん細胞やがん細胞由来遺伝子の有無を調べるため、大腸がんの罹患に伴い間接的に生じる消化管からの出血の有無を調べる便潜血検査法に比べて、より信頼性の高い検査法になると期待できる。【０００６】
糞便中のがん細胞等を精度よく検出するためには、糞便中のがん細胞由来核酸を効率よく回収することが重要である。特に、糞便中のがん細胞由来核酸は微量であり、かつ、糞便中には、消化残留物やバクテリアが大量に含まれているため、核酸は非常に分解され易い。このため、糞便試料から核酸、特にヒト等の哺乳細胞由来の核酸を効率よく回収するためには、糞便中の核酸の分解を防止し、検査操作時まで安定して保存し得るように糞便試料を調製することが重要である。このような糞便試料の調製方法として、例えば、採取された糞便から、大腸等の消化管から剥離したがん細胞を分離する方法がある。糞便からがん細胞を分離することにより、バクテリア等由来のプロテアーゼやＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ等の分解酵素による影響を抑えることができる。糞便からがん細胞を分離する方法として、例えば、（１）糞便から細胞を分離する方法であって、ａ）便をそのゲル氷点未満の温度に冷却する工程と、ｂ）便が実質的に完全な状態を残すように、便をそのゲル氷点未満の温度に維持しながら便から細胞を採取する工程と、を含むことを特徴とする方法が開示されている（例えば特許文献１参照。）。その他、（２）通常周囲温度で、プロテアーゼ阻害物質、粘液溶解剤、殺細菌剤を有する輸送培地に糞便を分散させた後、大腸剥離細胞を単離する方法が開示されている（例えば特許文献２参照。）。【０００７】
一方で、細胞の形態を組織学的及び細胞学的に観察する場合に、採取された細胞の形態を観察時まで維持するために、ホルマリン固定やアルコール固定等の多くの固定方法が従来から行われている。これらの固定方法を応用した方法であって、哺乳細胞試料の長期保存及び保存後の細胞観察を可能にするための保存溶液として、例えば、（３）哺乳細胞を定着するために充分な量の水と混和可能なアルコールと、溶液内での哺乳細胞の凝集を防ぐために充分な量の抗凝集剤と、細胞を保存する間、溶液のｐＨを４から７の範囲に保つ緩衝剤と、を含む細胞溶液保存剤が開示されている（例えば特許文献３参照。）。【０００８】
また、細胞の組織学的及び細胞学的観察に加え、保存後の細胞中のタンパク質や核酸等に対する分子学的解析をも可能とする保存溶液として、例えば、（４）緩衝成分、少なくとも１つのアルコール成分、固定剤成分、並びにＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質からなる群の少なくとも１つの分解を抑制する薬剤を含む普遍的収集培地（例えば特許文献４参照。）や、（５）５〜２０％ポリエチレングリコール及び８０〜９５％メタノールを含む非水溶液（例えば特許文献５参照。）等が開示されている。その他、（６）細胞の構造及び核酸を安定化する組成物であって、（ａ）少なくとも１種のアルコール又はケトンを含む、タンパク質を沈殿又は変性させることができる第１の物質と、（ｂ）第１の物質の少なくとも１個の細胞への注入を促進する第２の促進物質とを含む組成物（例えば特許文献６参照。）や、（７）組織及び生物学的サンプルの保存のための固定液組成物であって、一以上のアルコール、２００〜６００の分子量を有するポリエチレングリコール、固定液組成物１リットル当り０．０１〜０．１０モルの濃度で混合された一以上の弱有機酸、及び水を含有し、該固定液組成物がホルムアルデヒド等の架橋結合剤を本質的に含まないことを特徴とする固定液組成物（例えば特許文献７参照。）が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表平１１−５１１９８２号公報
【特許文献２】特表２００４−５１９２０２号公報
【特許文献３】特開２００３−１５３６８８号公報
【特許文献４】特表２００４−５００８９７号公報
【特許文献５】特表２００５−５３２８２４号公報
【特許文献６】特開２００１−１２８６６２号公報
【特許文献７】特表２００８−５０２９１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記（１）の方法においては、糞便試料を冷却しながら細胞を分離している。この分離操作を冷却せずに行うと、糞便試料の変質等により正しい検出結果を得ることができなくなってしまう。したがって、糞便試料の変質を効果的に防止するためには、採便直後に冷却することが重要である。しかしながら、検診等のように家庭において採便が行われる場合には、採取後速やかに糞便試料を冷却することは非常に困難であり、現実的ではない。
また、糞便試料の変質を防ぐために、糞便試料を凍結することが考えられるが、凍結させた糞便試料は、検査前に融解しなければならず、その為に操作が煩雑となる。【００１１】
上記（２）の方法では、殺菌剤等を添加することにより、冷却操作を必要とせず、室温で糞便試料の調製や保存が可能であるものの、糞便から大腸剥離細胞を分離する作業は煩雑であるという問題がある。また、殺菌剤等により破壊されたバクテリア由来の核酸分解酵素やタンパク質分解酵素により、大腸剥離細胞及び大腸剥離細胞由来の核酸等が分解されてしまうため、大腸がん検出の精度が低下するおそれがある。その他、細胞を生存させた状態で保存しているために、大腸剥離細胞中の遺伝子発現等の分子学的プロファイリングが培地中の抗生物質等の成分や経時的な影響を受けて変化してしまう問題もある。【００１２】
一方、上記（３）〜（５）の保存溶液を用いることにより、細胞を室温で安定して保存することができる。しかしながら、これらの保存溶液は、ほぼ単離された細胞に対して用いられるものであり、糞便のような多種多様な物質が含まれている生体試料に直接用いることは困難である。また、上記（６）の組成物は、主に膣スワブ試料中の、主にバクテリア由来の核酸を安定して保存する為に用いられる。上記（６）の組成物は、バクテリアとは大きく異なる構造を有し、かつバクテリアよりもはるかに微量である哺乳細胞由来の核酸も安定して保存できる組成物であるかについては一切記載されていない。また、上記（６）の組成物を、膣スワブ試料と異なり消化残留物等を多く含む糞便に用いた場合であっても、核酸を安定して保存できるかについても、一切記載が無い。同様に、上記（７）の組成物は、標本等の夾雑物の非常に少ない試料に対して、固定液として用いられる組成物であり、消化残留物等を多く含む糞便に用いた場合であっても核酸を安定して保存できるか、についても一切記載が無い。【００１３】
本発明は、糞便中の核酸を安定して保存することが可能な糞便試料を、煩雑な操作を必要とせずに調製する方法、その調製方法に用いられる糞便試料調製用溶液及び採便用キット、並びに、その調製方法により調製された糞便試料を用いて糞便中の核酸を回収し解析する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するために、以下を達成することで、本発明を完成させた。
Ｉ．採取された糞便を、有機酸を含有する水溶性有機溶媒を有効成分とする糞便試料調製用溶液に混合させることにより、糞便中に含まれている核酸を安定して保存することができる糞便試料を調製できたこと、及び、
ＩＩ．その調製方法により調製された糞便試料から、検出対象である哺乳細胞等の腸内常在菌以外の生物由来の核酸と、糞便中に大量に含まれている腸内常在菌由来の核酸を同時に回収することにより、微量である腸内常在菌以外の生物由来の核酸をも非常に効率よく回収できた。【００１５】
すなわち、本発明は、
（１）採取された糞便を、糞便試料調製用溶液と混合する糞便試料の調製方法である。【００１６】
(２)  また、本発明は、採取された糞便の混合に用いられ、有機酸を含有する水溶性有機溶媒を有効成分とする糞便試料調製用溶液である。【００１７】
（３）上記（２）に記載の糞便試料調製用溶液が緩衝作用を有していても良い。【００１８】
（４）上記（２）又は（３）に記載の糞便試料調製用溶液に含まれる前記水溶性有機溶媒が、水溶性アルコール、ケトン類、及びアルデヒド類からなる群より選択される１種以上であっても良い。  【００１９】
（５）上記（２）〜（４）のいずれかに記載の糞便試料調製用溶液のｐＨは、２〜６．５であっても良い。【００２０】
（６）上記（５）に記載の糞便試料調製用溶液のｐＨは、３〜６であっても良い。  【００２１】
（７）上記（２）〜（６）のいずれかに記載の糞便試料調製用溶液中に含まれる前記有機酸が、直鎖脂肪酸、ジカルボン酸、アミノ酸、ヒドロキシ酸、及び、芳香族又は複素環のポリカルボン酸からなる群より選択される１種以上であっても良い。【００２２】
（８）上記（７）に記載の糞便試料調製用溶液中に含まれる前記有機酸が、酢酸、乳酸、クエン酸、及びアジピン酸からなる群より選択される１種以上であっても良い。【００２３】
（９）上記（６）〜（８）のいずれか記載の糞便試料調製用溶液のｐＨは、４．５〜５．５であっても良い。【００２４】
（１０）上記（２）〜（９）のいずれか記載の糞便試料調製用溶液の有機酸濃度は、０．０１〜０．１Ｍであっても良い。【００２５】
（１１）上記（４）〜（１０）のいずれか記載の糞便試料調製用溶液に含まれる前記水溶性有機溶媒が、水溶性アルコール及び／又はケトン類であり、その水溶性有機溶媒の濃度が３０％以上であっても良い。【００２６】
（１２）上記（１１）に記載の糞便試料調製用溶液に含まれる前記水溶性有機溶媒が、水溶性アルコールとして、エタノール、プロパノール、及びメタノールからなる群より選ばれる１以上を含んでも良い。【００２７】
（１３）上記（１１）に記載の糞便試料調製用溶液に含まれる前記水溶性有機溶媒がエタノールであっても良い。【００２８】
（１４）上記（１１）又は（１２）に記載の糞便試料調製用溶液に含まれる前記水溶性有機溶媒が、ケトン類として、アセトン及び／又はメチルエチルケトンを含んでも良い。【００２９】
（１５）上記（４）〜（１０）のいずれか記載の糞便試料調製用溶液に含まれる前記水溶性有機溶媒が、アルデヒド類であり、この水溶性有機溶媒の濃度が０．０１〜３０％である。【００３０】
（１６）上記（２）〜（１５）のいずれか記載の糞便試料調製用溶液では、前記糞便と前記糞便試料調製用溶液の混合比率が、糞便容量１に対して糞便試料調製用溶液容量が１以上であっても良い。【００３１】
（１７）上記（２）〜（１６）のいずれか記載の糞便試料調製用溶液が、界面活性剤を含有しても良い。【００３２】
（１８）上記（２）〜（１７）のいずれか記載の糞便試料調製用溶液が着色剤を含有しても良い。【００３３】
（１９）上記（２）〜（１８）のいずれか記載の糞便試料調製用溶液中の前記水溶性有機溶媒の濃度が３０％以上でも良い。【００３４】
（２０）また、本発明は、有機酸を含有する水溶性有機溶媒を有効成分とする糞便試料調製用溶液と、この糞便試料調製用溶液を含有する採便容器と、を含む採便用キットである。【００３５】
（２１）上記（２０）に記載の採便用キットに含まれる前記糞便試料調製用溶液中の有機酸を含有する水溶性有機溶媒の濃度が３０％以上であっても良い。【００３６】
（２２）また、本発明は、上記（２）〜（１９）のいずれか記載の糞便試料調製用溶液を用いて調製された糞便試料である。【００３７】
（２３）また、本発明は、糞便試料から核酸を回収する方法であって、上記（２２）に記載の糞便試料中から、腸内常在菌由来の核酸と腸内常在菌以外の生物由来の核酸とを同時に回収する。【００３８】
（２４）上記（２３）に記載の核酸回収方法は、前記腸内常在菌以外の生物由来の核酸が、哺乳細胞由来の核酸であっても良い。【００３９】
（２５）上記（２３）又は（２４）に記載の核酸回収方法中での核酸を回収する工程が、（ａ）前記糞便試料中のタンパク質を変性させ、前記糞便試料中の腸内常在菌及び腸内常在菌以外の生物から、核酸を溶出させる工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において溶出させた核酸を回収する工程と、を含んでも良い。【００４０】
（２６）上記（２５）に記載の核酸回収方法では、前記工程（ａ）の後、前記工程（ｂ）の前に、（ｃ）前記工程（ａ）により変性させたタンパク質を除去する工程を含んでも良い。【００４１】
（２７）上記（２５）または（２６）に記載の核酸回収方法での前記工程（ａ）におけるタンパク質の変性が、カオトロピック塩、有機溶媒、及び界面活性剤からなる群より選ばれる１以上を用いて行われても良い。【００４２】
（２８）上記（２７）に記載の核酸回収方法で使用される前記有機溶媒がフェノールであっても良い。【００４３】
（２９）上記（２６）〜（２８）のいずれかに記載の核酸回収方法での前記工程（ｃ）における変性させたタンパク質の除去が、クロロホルムを用いて行われても良い。【００４４】
（３０）上記（２５）〜（２９）のいずれかに記載の核酸回収方法での前記工程（ｂ）における核酸の回収が、（ｂ１）前記工程（ａ）において溶出させた核酸を無機支持体に吸着させる工程と、（ｂ２）前記工程（ｂ１）において吸着させた核酸を無機支持体から溶出させる工程と、を含んでも良い。【００４５】
（３１）上記（２５）〜（３０）のいずれかに記載の核酸回収方法での前記工程（ａ）の前に、（ｄ）前記糞便試料から固形成分を回収する工程と、を含んでも良い。【００４６】
（３２）また、本発明は、上記（２３）〜（３１）のいずれか記載の核酸回収方法から回収された核酸を用いて、哺乳細胞由来の核酸を解析する。【００４７】
（３３）上記（３２）記載の核酸解析方法で用いられる前記哺乳細胞が、消化管細胞であっても良い。【００４８】
（３４）上記（３２）記載の核酸解析方法で用いられる前記哺乳細胞が、大腸剥離細胞であっても良い。【００４９】
（３５）上記（３２）〜（３４）に記載の核酸解析方法で用いられる前記哺乳細胞由来の核酸が、新生物性転化を示すマーカーであっても良い。【００５０】
（３６）上記（３２）〜（３４）のいずれかに記載の核酸解析方法で用いられる前記哺乳細胞由来の核酸が、炎症性消化器疾患を示すマーカーであっても良い。【００５１】
（３７）上記（３２）〜（３６）のいずれかに記載の核酸解析方法は、ＲＮＡ解析及び／又はＤＮＡ解析であっても良い。【００５２】
（３８）上記（３７）に記載の核酸解析方法では、前記ＲＮＡ解析が、ＲＮＡ上の塩基の挿入、欠失、置換、重複、逆位、又はスプライシングバリアントの解析、ｍＲＮＡ発現解析、及び機能性ＲＮＡ解析のいずれか１以上であっても良い。【００５３】
（３９）上記（３７）に記載の核酸解析方法では、前記ＤＮＡ解析が、変異解析及びエピジェネティック変化解析のいずれか１以上であっても良い。【００５４】
（４０）上記（３９）に記載の核酸解析方法では、前記変異解析が、塩基の挿入、欠失、置換、重複、又は逆位のいずれか１以上の変異の解析であっても良い。【００５５】
（４１）上記（３９）に記載の核酸解析方法では、前記エピジェネティック変化解析が、ＤＮＡのメチル化解析及びＤＮＡの脱メチル化解析のいずれか１以上であっても良い。【００５６】
（４２）上記（３９）に記載の核酸解析方法では、前記変異解析がＫ−ｒａｓ遺伝子の変異解析であっても良い。
【発明の効果】
【００５７】
本発明の糞便試料調製用溶液は、糞便試料中に含まれる核酸の保存性に優れており、有機酸を含有する水溶性有機溶媒を有効成分とする。糞便を、有機酸を含有する水溶性有機溶媒に混合させることにより、糞便中に含まれる核酸の分解等による損失を最小限に抑えて、該水溶性有機溶媒中において非常に安定的に核酸を保存することができる。このような高い核酸保存効果は、水溶性有機溶媒成分が有する脱水作用により、腸内常在菌、哺乳細胞、ウィルス等の核酸を有する生物の細胞活性が顕著に低下することにより、経時的な核酸の変化が抑制される。また、本発明の糞便試料調製用溶液の高い核酸保存効果は、水溶性有機溶媒成分が有するタンパク質変性作用により、糞便中のプロテアーゼ、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ等の各種分解酵素の活性が顕著に低下し、核酸の分解が抑制されるためと推察される。さらに、本発明の糞便試料調製用溶液は、有機酸を含有する水溶性有機溶媒を有効成分とするため、糞便試料調製用溶液を酸性に保持できる。このため、水溶性有機溶媒成分によるタンパク質変性作用をより高めることができる。更に、核酸の加水分解等も効果的に抑制し得るため、非常に優れた核酸高保存効果が得られると推察される。【００５８】
また、本発明の糞便試料の調製方法により、糞便中の核酸を安定して保存可能な糞便試料を調製することができる。すなわち、本発明の糞便試料の調製方法により、糞便試料中に比較的少量含まれている哺乳細胞等の腸内常在菌以外の生物由来の核酸をも、室温で長期間保存可能なほど安定的に維持することができる。このように、本発明の糞便試料の調製方法を用いることにより、糞便の採取から糞便試料の調製、保存、輸送を、糞便試料中の核酸を安定的に保存しつつ、室温で簡便に行うことができるため、検診等のスクリーニング検査のための糞便試料の調製に非常に好適である。さらに、哺乳細胞等の腸内常在菌以外の生物由来の核酸を解析するための糞便試料を調製する場合であっても、糞便試料から、哺乳細胞等の検出の対象である生物又はその細胞等を分離するという煩雑な操作を必要としないため、多数の検体を処理する場合であっても、労力とコストを効果的に低減することができる。特に、本発明の採便用キットを用いることにより、より簡便に糞便試料を調製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明の採便用キットに用いることができる採便容器Ａの一実施形態を示した図である。
【図２】本発明の採便用キットに用いることができる採便容器Ｂの一実施形態と、その使用方法の一例を示した図である。
【図３】実施例１において、各糞便試料由来のＲＮＡ中のＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を相対比較した結果を示した図である。
【図４】実施例２において、糞便試料２−１〜２−３及び５−１由来のＲＮＡ中のＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を相対比較した結果を示した図である。
【図５】実施例２において、糞便試料３−１〜３−３及び５−１由来のＲＮＡ中のＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を相対比較した結果を示した図である。
【図６】実施例２において、糞便試料４−１〜４−３及び５−１由来のＲＮＡ中のＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を相対比較した結果を示した図である。
【図７】参考例１において、各糞便試料から回収されたＲＮＡ量を示した図である。
【図８】参考例３において、各濃度のエタノール溶液を用いて調製された糞便試料から回収されたＲＮＡ量を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本発明の糞便試料の調製方法において用いられる糞便試料調製用溶液（以下、調製用溶液Ｓと略す）、すなわち、本発明の調製用溶液Ｓは、有機酸を含有する水溶性有機溶媒を有効成分とする。糞便等の生体試料は、通常多量の水分を含有しており、水に対する溶解度が高い溶媒や水と任意の割合で混合可能な水溶性有機溶媒を有効成分とする。これにより、本発明の調製用溶液Ｓは、糞便試料と速やかに混合することができ、より高い核酸高保存効果を得ることができる。
【００６１】
本発明において水溶性有機溶媒とは、アルコール類、ケトン類、又はアルデヒド類を含む。また前記水溶性有機溶媒は、直鎖構造を有し、室温付近、例えば１５〜４０℃において液状である。直鎖構造を有する水溶性有機溶媒を有効成分とすることにより、ベンゼン環等の環状構造を有する有機溶媒を有効成分とするよりも、糞便との混合を素早く行うことができる。環状構造を有する有機溶媒は、一般的に水と分離しやすいため、糞便と混合しにくく、高い核酸保存効果を得ることは難しい。たとえ水にある程度溶解する溶媒であっても、糞便を均一に分散させるためには、激しく混合したり、加温する必要があるためである。なお、糞便と環状構造を有する有機溶媒の混合を容易にするために、あらかじめ、有機溶媒と水の混合溶液を作製した後、糞便と前記混合溶液を混合させることも考えられる。しかしながら、前記混合溶液を作製するためには、環状構造を有する有機溶媒と水とを激しく混合したり、加温する必要があり、好ましくない。
【００６２】
本発明の調製用溶液Ｓは、水に対する溶解度が１２重量％以上の水溶性有機溶媒であることが好ましく、前記溶解度が２０重量％以上の水溶性有機溶媒であることがより好ましく、前記溶解度が９０重量％以上の水溶性有機溶媒であることがさらに好ましく、水と任意の割合で混合可能である水溶性有機溶媒であることが特に好ましい。水と任意の割合で混合可能である水溶性有機溶媒として、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、アセトン、ホルムアルデヒド等がある。
【００６３】
本発明の調製用溶液Ｓに含まれる水溶性有機溶媒は、上記定義を満たすものであって、高い核酸保存効果を奏する溶媒であれば特に限定されない。前記水溶性有機溶媒として、例えば、アルコール類としては、水溶性アルコールであるメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、メルカプトエタノール等があり。ケトン類としては、アセトン、メチルエチルケトン（水に対する溶解度９０重量％）等があり、アルデヒド類としては、アセトアルデヒド(アセチルアルデヒド)、ホルムアルデヒド（ホルマリン）、グルタールアルデヒド、パラフォルムアルデヒド、グリオキサール（ｇｌｙｏｘａｌ）等がある。プロパノールは、ｎ−プロパノールであってもよく、２−プロパノールであってもよい。また、ブタノールは、１−ブタノール（水に対する溶解度２０重量％）でもよく、２−ブタノール（水に対する溶解度１２．５重量％）でもよい。本発明において用いられる水溶性有機溶媒としては、水に対する溶解度が十分に高いため、水溶性アルコール、アセトン、メチルエチルケトン、ホルムアルデヒドが好ましい。入手容易性、取り扱い性、安全性等の点から、水溶性アルコールがより好ましく、エタノール、プロパノール、メタノールがさらに好ましい。特にエタノールは、最も安全性が高く、家庭内でも容易に扱うことが可能なため、定期健診等のスクリーニング検査において特に有用である。
【００６４】
本発明の調製用溶液Ｓ中の水溶性有機溶媒の濃度は、高い核酸保存効果を奏する濃度であれば、特に限定されるものではなく、水溶性有機溶媒の種類等を考慮して、適宜決定できる。例えば、有効成分として、水溶性アルコールやケトン類を用いる場合には、本発明の調製用溶液Ｓの水溶性有機溶媒の濃度は３０％以上であることが好ましい。水溶性有機溶媒の濃度が充分に高濃度であることにより、糞便と調製用溶液Ｓを混合した場合に、糞便中の哺乳細胞等や腸内常在菌に水溶性有機溶媒成分が迅速に浸透し、高い核酸保存効果を速やかに奏することができる。
なお、本発明及び本願明細書中においては、特に記載がない限り、「％」は「体積％」を意味する。
【００６５】
特に、有効成分として、水溶性アルコールを用いる場合には、本発明の調製用溶液Ｓの水溶性有機溶媒の濃度は３０％以上が好ましく、５０％以上がより好ましく、５０〜８０％の範囲がさらに好ましく、６０〜７０％の範囲が特に好ましい。水溶性有機溶媒の濃度が高い程、水分含量の多い糞便に対しても少量の調製用溶液Ｓを用いることによって、高い核酸保存効果を充分に得ることができる。
【００６６】
また、有効成分として、アセトン、メチルエチルケトンを用いる場合には、本発明の調製用溶液Ｓの水溶性有機溶媒の濃度は３０％以上が好ましく、６０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましい。その他、有効成分として、アセトアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、パラフォルムアルデヒド、グリオキサールを用いる場合には、本発明の調製用溶液Ｓの水溶性有機溶媒の濃度は０．０１〜３０％の範囲が好ましく、０．０３〜１０％の範囲がより好ましく、３〜５％の範囲がさらに好ましい。アルデヒド類は、アルコール類やケトン類よりも低濃度においても、高い核酸保存効果を奏することができる。
【００６７】
その他、本発明において用いられる水溶性有機溶媒は、１種類の水溶性有機溶媒のみを含有してもよく、２種類以上の水溶性有機溶媒の混合溶液でもよい。例えば、２種類以上のアルコールの混合溶液でもよく、アルコールと他種類の水溶性有機溶媒との混合溶液でもよい。核酸保存効率がより改善されるため、アルコールとアセトンの混合溶液でも好ましい。
【００６８】
本発明において用いられる有機酸としては、例えば、直鎖脂肪酸、ジカルボン酸、アミノ酸、ヒドロキシ酸、芳香族又は複素環のポリカルボン酸等がある。より具体的には、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸等の直鎖脂肪酸；シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、フマル酸、マレイン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸等のジカルボン酸；グリシン、アラニン、メチオニン、セリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、システイン、シスチン、フェニルアラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸；グリコール酸、乳酸、ヒドロキシアクリル酸、α−オキシ酪酸、グリセリン酸、タルトロン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、サリチル酸、没食子酸、マンデル酸、トロバ酸、アスコルビン酸、グルコン酸等のヒドロキシ酸；桂皮酸、安息香酸、フェニル酢酸、ニコチン酸、カイニン酸、ソルビン酸、ピロリドンカルボン酸、トリメリット酸等の芳香族又は複素環のポリカルボン酸；等が挙げられる。  
本発明の調製用溶液Ｓに添加される有機酸としては、特に、直鎖脂肪酸、ジカルボン酸、ヒドロキシ酸等であることが好ましく、酢酸、アジピン酸、クエン酸、乳酸であることがより好ましい。アジピン酸やクエン酸を用いることにより、特に優れた核酸保存効果を得ることができる。その他、酢酸は、充分な核酸保存効果を得ることができることに加えて、汎用されており、かつ経済的であることから特に好ましい。
【００６９】
なお、本発明の調製用溶液Ｓは、１種類の有機酸のみを含有していてもよく、２種類以上の有機酸を含有するものであってもよい。また、本発明の調製用溶液Ｓに添加される有機酸の量は、前記調製用溶液Ｓを酸性に維持することができる量であれば特に限定されなく、添加される有機酸の種類や、前記調製用溶液Ｓ中の水溶性有機溶媒の種類や濃度等を考慮して適宜決定できる。
【００７０】
本発明の調製用溶液ＳのｐＨは、酸性であることが好ましい。核酸の加水分解をより効果的に抑制できるためである。本発明の調製用溶液Ｓとしては、ｐＨが２〜６．５の範囲が好ましく、３〜６の範囲がより好ましく、４．５〜５．５の範囲がさらに好ましい。
【００７１】
本発明の調製用溶液Ｓは、多少の酸や塩基が添加された場合であっても、特に糞便が添加された場合であっても、ｐＨの変動が少なく、前述のｐＨ範囲内に維持されるような緩衝作用を有する調製用溶液Ｓが好ましい。緩衝作用を有する調製用溶液Ｓとしては、適当な緩衝液に有機酸と水溶性有機溶媒を添加したものでもよいが、本発明においては、特に、有機酸とこの有機酸の共役塩基とを含有する調製用溶液Ｓであって、前記有機酸とその共役塩基とにより緩衝作用を奏するものが好ましい。例えば、調製用溶液Ｓに、有機酸とその有機酸のアルカリ金属塩や、アルカリ土類金属塩を添加することにより、所望のｐＨに調整してもよい。また、有機酸を添加した後に、アルカリ金属やアルカリ土類金属の水酸化物を用いてｐＨを調整してもよい。
【００７２】
その他、本発明の調製用溶液Ｓとしては、有機酸と鉱酸の双方を含む溶液であって、適当な緩衝作用を有するものでもよい。例えば、グリシン／ＨＣｌ緩衝系、カコジル酸Ｎａ／ＨＣｌ緩衝系、又はフタル酸ＨＫ／ＨＣｌ緩衝系等の、酸性側で緩衝作用を有する緩衝系に、水溶性有機溶媒を混合した溶液でもよい。
【００７３】
このため、本発明においては、調製用溶液Ｓの有機酸の濃度は、緩衝作用を十分に発揮できる濃度が好ましい。例えば、調製用溶液Ｓにおける最終濃度が、０．０１Ｍ〜０．１Ｍとなるように有機酸を添加することにより、十分な緩衝作用を備えることができる。
【００７４】
なお、本発明において、調製用溶液ＳのｐＨは、ガラス電極法を測定原理としたｐＨメーター（例えば東亜ディーケーケー社製）を、フタル酸塩標準液と中性リン酸塩標準液によって校正した後に、測定して得られた値である。
【００７５】
採取された糞便と混合する調製用溶液Ｓの容量は、特に限定されないが、糞便と調製用溶液Ｓの混合比率は、糞便容量を１とすると、糞便容量１に対して調製用溶液容Ｓ量が１以上であることが好ましい。調製用溶液Ｓ入り採便容器に糞便を入れる場合に、糞便と同等量以上の調製用溶液Ｓであれば、糞便の全周囲が調製用溶液Ｓに浸るため、本発明の効果を得られる。例えば、糞便と調製用溶液Ｓが同等量である場合には、調製用溶液Ｓ入り採便容器の軽量化・小型化が可能となる。一方で、糞便に対して、５倍以上の容量の調製用溶液Ｓを混合させることにより、調製用溶液Ｓ中への糞便の分散を迅速かつ効果的に行うことができ、さらに、糞便に含有されている水分による水溶性アルコール濃度の低下による糞便への影響を抑えることもできる。調製用溶液Ｓ入り採便容器の軽量化と糞便の分散性の向上との両方の効果を、バランス良く備えることが可能となるため、糞便と調製用溶液Ｓの混合比率は、１：１〜１：２０の範囲がより好ましく、１：３〜１：１０の範囲がさらに好ましく１：５程度がより好ましい。
【００７６】
なお、本発明の糞便試料の調製方法に用いられる糞便は、動物由来であれば特に限定されないが、哺乳動物由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。例えば、定期健診や診断等のために採取されたヒトの糞便であることが好ましいが、家畜や野生動物等の糞便であってもよい。また、採取後、一定期間保存された糞便でもよいが、採取直後の糞便が好ましい。さらに、採取される糞便は、排泄直後のものが好ましいが、排泄後時間を経たものでもよい。
【００７７】
本発明の糞便試料の調製方法に供される糞便の量は、特に限定されないが、１０ｍｇ〜１ｇの範囲が好ましい。糞便量があまりに多くなってしまうと、採取作業に手間がかかり、採便容器も大きくなってしまうため、取り扱い性等が低下するおそれがある。逆に糞便量があまりに少量である場合には、糞便中に含まれる大腸剥離細胞等の哺乳細胞数が少なくなりすぎるため、必要な核酸量を回収できず、目的の核酸解析の精度が低下するおそれがある。また、糞便はヘテロジニアスである、つまり、多種多様な成分が不均一に存在しているため、哺乳細胞の局在の影響を避けるために、採糞時には、糞便の広範囲から採取することが好ましい。
【００７８】
調製用溶液Ｓは、水溶性有機溶媒を適宜希釈し、所望の濃度に調整した上で、適当量の有機酸を添加することにより得られる。希釈に用いる溶媒は特に限定されないが、水又はリン酸バッファー等の緩衝液が好ましい。例えば、水溶性有機溶媒を水により適宜希釈した後、十分量の有機酸を添加し、さらに水酸化ナトリウム等のアルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物溶液を用いて所望のｐＨとなるように調整することにより、好ましい緩衝作用を有する調製用溶液Ｓを得ることができる。
【００７９】
また、本発明の調製用溶液Ｓは、水溶性有機溶媒成分による高い核酸保存効果を損なわない限り、有機酸や水溶性有機溶媒以外にも、任意の成分を含んでいてもよい。例えば、カオトロピック塩を含有してもよく、界面活性剤を含有しても良い。カオトロピック塩や界面活性剤を含有することにより、糞便中の細胞活性や各種分解酵素の酵素活性をより効果的に阻害することができる。調製用溶液Ｓに添加可能なカオトロピック塩としては、例えば、塩酸グアニジン、グアニジンイソチオシアネート、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びトリクロロ酢酸ナトリウム等がある。調製用溶液Ｓに添加可能な界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好ましい。
前記非イオン性界面活性剤としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ＣＨＡＰＳ（３−［３−コラミドプロピルジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホネート）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０等がある。カオトロピック塩や界面活性剤の種類や濃度は、高い核酸保存効果が得られる濃度であれば、特に限定されなく、糞便量やその後の核酸回収・解析方法等を考慮して、適宜決定できる。
【００８０】
その他、調製用溶液Ｓには、適宜着色剤を添加してもよい。調製用溶液Ｓを着色することにより、誤飲防止、糞便の色が緩和される等の効果が得られる。前記着色剤としては、食品添加物として使用される着色料が好ましく、青色や緑色等が好ましい。例えば、ファストグリーンＦＣＦ（緑色３号）、ブリリアントブルーＦＣＦ（青色１号）、インジゴカルミン（青色２号）等が挙げられる。また、複数の着色剤を混合して添加してもよく、単独で添加しても良い。
【００８１】
糞便と調製用溶液Ｓとの混合は、速やかに行われることが好ましい。糞便を速やかに調製用溶液Ｓ中に分散させることにより、糞便中の細胞に対する水溶性有機溶媒成分の浸透を迅速に行うことができ、高い核酸保存効果が速やかに得られるためである。
なお、糞便と調製用溶液Ｓを混合する方法は、物理的手法により混合する方法であれば、特に限定されない。例えば、予め調製用溶液Ｓを入れておいた密閉可能な容器に、採取された糞便を投入して密閉した後、その容器を上下に転倒させることにより、混合してもよく、前記容器をボルテックス等の振とう機にかけることにより混合してもよい。また、糞便と調製用溶液Ｓを、混合用粒子の存在下で混合してもよい。
この混合方法は、速やかに混合させることができるため、振とう機を用いる方法や、混合用粒子を用いる方法が好ましい。特に、予め混合用粒子を含有させた採便容器を用いることにより、家庭等の特殊な装置のない環境においても迅速に混合できる。
【００８２】
混合用粒子としては、水溶性有機溶媒成分による高い核酸保存効果を損なわない組成物であって、糞便と衝突することにより、糞便を迅速に調製用溶液Ｓ中に分散させることができる硬度や比重を有する粒子であれば、特に限定されない。更に、混合用粒子は１種類の材質からなる粒子でもよく、２種類以上の材質からなる粒子でもよい。このような混合用粒子として、例えば、ガラス、セラミックス、プラスチック、ラテックス、金属等からなる粒子がある。その他、混合用粒子は、磁性粒子でもよく、非磁性粒子でもよい。
【００８３】
腸内常在菌以外の生物由来の核酸、すなわち、糞便試料中に大量に含まれている腸内常在菌由来の核酸よりも少量しか含まれていない核酸を標的核酸として解析する場合には、本発明の調製用溶液Ｓを用いて糞便を調製することが好ましい。排泄後時間の経過とともに、糞便中の核酸は分解等により徐々に損なわれていく。このため、標的核酸が糞便中に少量しか存在していない核酸である場合には、核酸の分解が進行した糞便試料を用いて解析を行うと、解析に充分な量の標的核酸を回収することができない。その結果、排泄直後の糞便中に標的核酸が存在していた場合であっても、陰性（糞便中に該標的核酸は存在していない）と判断されるおそれがある。本発明の調製用溶液Ｓを用いて糞便を調製することにより、糞便中の核酸を安定して保存できるため、糞便中に少量しか存在していない核酸であっても、効率よく回収できる。よって、核酸解析の信頼性が向上できる。
【００８４】
このような腸内常在菌以外の生物由来の核酸としては、例えば、がん細胞由来の核酸等の哺乳細胞由来の核酸や、肝炎ウィルス等の感染症の初期または後期におけるこれら感染症の原因菌由来の核酸等がある。その他、寄生虫由来の核酸であってもよい。
【００８５】
なお、本発明において、腸内常在菌とは、糞便中に比較的大量に存在するバクテリア細胞であり、通常ヒト等の動物の腸内に生息する常在菌を意味する。該腸内常在菌として、例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属等の偏性嫌気性菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属等の通性嫌気性菌等がある。
【００８６】
また、このような水溶性有機溶媒成分による高い核酸保存効果は、充分な水溶性有機溶媒量が存在する限り、特に温度条件に影響を受けない。したがって、本発明の糞便試料の調製方法は、通常糞便の採取が行われる温度において調製を行なう場合、すなわち、室温において行う場合であっても、糞便中の核酸の損失を抑えて核酸を保存できる。また、調製された糞便試料は、室温で保存又は輸送した場合であっても、その糞便試料中の核酸を安定して保存できる。但し、該糞便試料の保存温度は、５０℃以下が好ましい。高温条件下で長期間保存することにより、揮発等により、糞便試料中の水溶性有機溶媒の濃度が、高い核酸保存効果を奏するに充分な濃度よりも低下するおそれがある。
【００８７】
本発明の糞便試料の調製方法により調製された糞便試料、すなわち本発明の糞便試料は、有機酸を含有する水溶性有機溶媒の脱水作用やタンパク質変性作用、核酸分解抑制作用により、糞便中の核酸、特に哺乳細胞等由来の糞便中に比較的少量しか存在していない核酸を、より安定して保存することができる。このため、糞便試料を本発明の調製方法により調製した場合には、調製直後の糞便試料のみならず、長期保存後又は輸送後の糞便試料を用いて核酸解析を行った場合であっても、信頼性の高い解析結果を得ることが期待できる。特に、糞便に含まれている大腸剥離細胞等の哺乳細胞の分子学的プロファイリングに対する経時的な変化を最小限に抑えつつ、糞便中の核酸、特に哺乳細胞由来の核酸を長期間室温で安定して保存することができる。そのため、採取された糞便を、本発明の調製方法を用いて調製することにより、検診等のスクリーニング検査のように、糞便採取後から核酸解析時まで間がある場合や、糞便採取場所が核酸解析場所から離れているような場合であっても、核酸、特に壊れやすいＲＮＡの分解を抑制しつつ、糞便試料を保存又は輸送することが可能である。また、冷蔵や冷凍のための特別な機器や保存温度条件を設定する必要がなく、簡便かつ低コストで糞便試料を保存又は輸送することができる。
【００８８】
本発明の糞便試料は、核酸を含有するその他の生体試料と同様に、様々な核酸解析に応用することができる。特に、早期発見が重要であるがんの発症や感染症の罹患の有無を調べるための核酸解析に用いられることが好ましい。また、大腸炎、小腸炎、胃炎、膵炎等の炎症性疾患の発症の有無を調べるための核酸解析に用いられることも好ましい。その他、ポリープ等の隆起性病変の検査や胃潰瘍等の大腸、小腸、胃、肝臓、胆嚢、胆管の疾患の検査に用いられてもよい。
【００８９】
例えば、糞便試料から、がん細胞由来の核酸、すなわち、変異等が起こっている核酸を検出し解析することにより、大腸がんや膵臓がん等のがんの発症の有無を検査できる。また、糞便試料から、感染症等の原因である病原菌由来の核酸、例えばウィルス由来の核酸や寄生虫由来の核酸等の検出により、感染症の罹患の有無や寄生虫の存在の有無を調べることができる。特に、Ａ型・Ｅ型肝炎ウィルス等の糞便中に排出される病原菌の検出に糞便試料を用いることにより、非侵襲的かつ簡便に感染症検査を行うことができる。その他、腸内常在菌以外の病原バクテリア、例えば腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７等の食中毒菌や病原菌由来の核酸の検出により、細菌感染症の罹患の有無を調べることもできる。
【００９０】
特に、核酸解析により、新生物性転化を示すマーカーや炎症性消化器疾患を示すマーカーを検出することが好ましい。新生物性転化を示すマーカーとして、例えば、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、シアリルＴｎ抗原（ＳＴＮ）等の公知のがんマーカーや、ＡＰＣ遺伝子、ｐ５３遺伝子、Ｋ−ｒａｓ遺伝子等の変異の有無等がある。また、ｐ１６、ｈＭＬＨＩ、ＭＧＭＴ、ｐ１４、ＡＰＣ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥＳＲ１、ＳＦＲＰ２等の遺伝子のメチル化の検出も、大腸疾患の診断マーカーとして有用である（例えば、Lind et al.、「A CpG island hypermethylation profile of primary colorectal carcinomas andcolon cancer cell lines」、Molecular Cancer、２００４年、第３巻第２８章参照。）。その他、糞便試料中のヘリコバクターピロリ菌由来のＤＮＡが、胃がんマーカーとして使用できることが既に報告されている（例えばNilsson et al.、Journal of ClinicalMicrobiology、２００４年、第４２巻第８号、第３７８１〜８ページ参照。）。一方、炎症性消化器疾患を示すマーカーとしては、例えば、Ｃｏｘ−２遺伝子由来核酸等がある。
【００９１】
本発明の調製方法により調製された糞便試料からは、核酸を非常に効率よく回収することができるため、糞便中に大量に存在する腸内常在菌由来の核酸のみならず、微量に存在する哺乳細胞由来の核酸の解析に非常に好適な試料である。特に糞便であることから、大腸、小腸、胃等の消化管細胞由来の核酸を解析することが好ましく、大腸剥離細胞由来の核酸を解析することが特に好ましい。
【００９２】
糞便試料中には、多種多様な物質が存在しており、核酸解析において阻害要因となる物質も多数存在している。このため、糞便試料を直接解析に用いるのではなく、糞便試料から核酸を回収し、回収された核酸を用いて核酸解析を行うことにより、解析の精度をより向上させることができる。糞便試料から核酸を回収する方法は、特に限定されなく、試料から核酸を回収する場合に通常用いられる方法であれば、いずれの方法によっても行うことができる。本発明の糞便試料中には、主に哺乳細胞等の腸内常在菌以外の生物（以下、哺乳細胞と称する）由来の核酸と、腸内常在菌由来の核酸が含まれている。糞便試料からの核酸回収においては、哺乳細胞等由来の核酸と腸内常在菌細胞由来の核酸を別々に回収してもよいが、同時に回収することが特に好ましい。哺乳細胞等由来の核酸と腸内常在菌由来の核酸とを同時に回収することにより、糞便中に大量に存在する腸内常在菌由来の核酸がキャリアーとして機能する。その結果、少数である哺乳細胞等由来の核酸を、哺乳細胞等を予め糞便から単離した後に核酸を回収する場合よりも、非常に効率よく回収できる。そして、このように回収された核酸を用いて核酸解析を行うことにより、大腸がん等の特定の疾患マーカーを非常に高感度かつ高精度に検出できる。なお、糞便試料から回収する核酸は、ＤＮＡでもよく、ＲＮＡでもよく、ＤＮＡとＲＮＡの両方でもよい。
【００９３】
例えば、工程（ａ）として、本発明の糞便試料中のタンパク質を変性させ、前記糞便試料中の哺乳細胞等及び腸内常在菌から、核酸を溶出させた後、工程（ｂ）として、溶出させた核酸を回収することにより、糞便試料から哺乳細胞由来の核酸と腸内常在菌由来の核酸を同時に回収できる。
【００９４】
工程（ａ）における糞便試料中のタンパク質の変性は、公知の手法で行うことができる。例えば、糞便試料にカオトロピック塩、有機溶媒、界面活性剤等の、通常タンパク質の変性剤として用いられている化合物を添加することにより、糞便試料中のタンパク質を変性させることができる。工程（ａ）において糞便試料に添加されるカオトロピック塩や界面活性剤は、本発明の調製用溶液Ｓに添加されるカオトロピック塩及び界面活性剤として挙げたものと同様のものを用いることができる。有機溶媒としては、フェノールが好ましい。フェノールは中性でもよく、酸性でもよい。酸性のフェノールを用いた場合には、ＤＮＡよりもＲＮＡを選択的に水層に抽出できる。なお、工程（ａ）において、糞便試料にカオトロピック塩、有機溶媒、界面活性剤等を添加する場合には、１種類の化合物を添加してもよく、２種類以上の化合物を添加してもよい。
【００９５】
工程（ａ）と工程（ｂ）の間に、工程（ｃ）を設けて、工程（ａ）により変性させたタンパク質を除去してもよい。核酸を回収する前に、予め変性させたタンパク質を除去することにより、回収される核酸の品質を向上できる。工程（ｃ）におけるタンパク質の除去は、公知の手法で行うことができる。例えば、遠心分離により、変性タンパク質を沈殿させて上清のみを回収することにより、変性タンパク質を除去できる。また、クロロホルムを添加し、ボルテックス等により充分に攪拌混合させた後に遠心分離を行い、変性タンパク質を沈殿させて上清のみを回収しても良い。これにより、単に遠心分離を行う場合よりも、より完全に変性タンパク質を除去できる。
【００９６】
工程（ｂ）における溶出させた核酸の回収は、エタノール沈殿法や塩化セシウム超遠心法等の公知の手法で行うことができる。回収方法の例として、以下の工程（ｂ１）と工程（ｂ２）が挙げられる。工程（ａ）において溶出させた核酸を、工程（ｂ１）として、無機支持体に吸着させる。その後、工程（ｂ２）として、工程（ｂ１）において吸着させた核酸を無機支持体から溶出させる。これにより、核酸を回収できる。工程（ｂ１）で用いられる無機支持体は、核酸を吸着することができる公知の無機支持体を用いることができる。また、この無機支持体の形状も特に限定されるものではなく、粒子状であってもよく、膜状であってもよい。例えば、この無機支持体としては、シリカゲル、シリカ質オキシド、ガラス、珪藻土等のシリカ含有粒子（ビーズ）や、ナイロン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ニトロセルロース等の多孔質膜等がある。
工程（ｂ２）で用いられる溶媒は、回収する核酸の種類やその後の核酸解析方法等を考慮して、これらの公知の無機支持体から核酸を溶出するために通常用いられている溶媒を適宜用いることができる。例えば、この溶出用溶媒として、特に精製水が好ましい。なお、工程（ｂ１）の後、工程（ｂ２）の前に、核酸を吸着させた無機支持体を適当な洗浄バッファーを用いて洗浄することが好ましい。
【００９７】
なお、糞便試料が、哺乳細胞等から核酸を溶出するために充分な濃度のカオトロピック塩や界面活性剤を含む調製用溶液Ｓを用いて調製されている場合には、糞便試料からの核酸の回収工程において、工程（ａ）を省略することもできる。
【００９８】
糞便試料が、哺乳細胞等から核酸を溶出するために充分な濃度のカオトロピック塩や界面活性剤を含まない調製用溶液Ｓを用いて調製されている場合には、工程（ａ）の前に、工程（ｄ）を設けて、糞便試料から固形成分を回収することが好ましい。糞便試料は、糞便と調製用溶液Ｓを迅速に混合させるために、糞便中の固形成分に対する液体成分の比率が大きい。そこで、糞便試料から調製用溶液Ｓを除去し、哺乳細胞等や腸内常在菌を含む固形成分のみを回収することにより、核酸の回収工程及び解析の規模（スケール）を小さくすることができる。また、固形成分から水溶性有機溶媒を除去することにより、その固形成分から核酸を回収する工程における水溶性有機溶媒の影響を抑えることもできる。例えば、本発明の糞便試料を遠心分離することにより、固形成分を沈殿させて上清を除去することにより、固形成分のみを回収ができる。その他、フィルター濾過等によっても、固形成分のみを回収できる。さらに、回収された固形成分をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等の適当なバッファーを用いて洗浄することも好ましい。
【００９９】
なお、回収された固形成分に、カオトロピック塩等のタンパク質変性剤を直接添加してもよいが、一旦、適当な溶出用薬剤に懸濁させた後にタンパク質変性剤を添加することが好ましい。ＤＮＡを回収する場合には、溶出用薬剤として、例えば、リン酸バッファーやトリスバッファー等を用いることができる。溶出用薬剤は、高圧蒸気滅菌等により、ＤＮａｓｅを失活させた薬剤が好ましく、さらにプロテイナーゼＫ等のタンパク質分解酵素を含有させた薬剤がより好ましい。一方、ＲＮＡを回収する場合には、溶出用薬剤として、例えば、クエン酸バッファー等を用いることができるが、ＲＮＡは非常に分解され易い物質であるため、チオシアン酸グアニジンや塩酸グアニジン等のＲＮａｓｅ阻害剤を含有したバッファーを用いることが好ましい。
【０１００】
その後の解析方法は、糞便試料から核酸を回収しなくてもよく、糞便試料中の哺乳細胞等や腸内常在菌から核酸を溶出させた後、核酸が溶出されたバッファーをそのまま核酸解析に用いることができる。例えば、糞便試料中に病原菌等が大量に存在している場合であって、その病原菌由来の核酸を解析する場合には、糞便試料から固形成分のみを回収した後、プロテイナーゼＫ等のタンパク質分解酵素を含有するＰＢＳ等の溶出用薬剤を添加して糞便試料溶液を得る。その糞便試料溶液をそのまま核酸解析に用いることにより、病原菌由来の遺伝子等を検出できる。その他、糞便試料からの核酸の回収は、核酸抽出キットやウィルス検出キット等の市販のキットを用いて行うこともできる。
【０１０１】
本発明の糞便試料より回収された核酸は、公知の核酸解析方法を用いて解析することができる。これら核酸解析方法としては、例えば、核酸を定量する方法や、ＰＣＲ等を用いて特定の塩基配列領域を検出する方法等がある。例えば、がん遺伝子等がコードされている塩基配列領域や、マイクロサテライトを含む塩基配列領域等の遺伝的変異の有無を検出することにより、がんの発症の有無を調べることができる。糞便試料から回収されたＤＮＡを用いた場合には、例えば、ＤＮＡ上の変異解析やエピジェネティック変化解析を行うことができる。変異解析としては、例えば、塩基の挿入、欠失、置換、重複、又は逆位の解析等が挙げられる。また、エピジェネティック変化解析としては、例えば、メチル化や脱メチル化の解析等が挙げられる。その他、ＲＮＡを回収した場合には、逆転写反応（ＲＴ−ＰＣＲ：Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ)によりｃＤＮＡを合成した後、そのｃＤＮＡを、ＤＮＡと同様にして解析に用いることができる。回収されたＲＮＡを用いた場合には、例えば、ＲＮＡ上の塩基の挿入、欠失、置換、重複、逆位、又はスプライシングバリアント（アイソフォーム）等の変異を検出できる。その他、機能性ＲＮＡ（ノンコーディングＲＮＡ）解析、例えば、転移ＲＮＡ（ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ、ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ、ｒＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）等の解析を行うことができる。また、ＲＮＡ発現量を検出し解析することもできる。特に、ｍＲＮＡの発現解析、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の変異解析、及びＤＮＡのメチル化の解析等を行うことが好ましい。なお、これらの解析は、この分野において公知の方法により行うことができる。また、Ｋ−ｒａｓ遺伝子変異解析キット、メチル化検出キット等の市販の解析キットを用いてもよい。
【０１０２】
このように、本発明の糞便試料の調製方法、この調製方法により調製された糞便試料からの核酸回収方法、及びこの核酸回収方法により回収された核酸を用いた核酸解析方法を用いることにより、糞便中の核酸を高感度かつ高精度に解析することができる。そのため、大腸がんをはじめ、様々な症状や疾患の早期発見や診断、治療経過の観察、及び他の異常な容態の病理学的研究等に貢献・応用することが期待できる。
【０１０３】
本発明は、予め調製用溶液Ｓを含有させた採便容器に糞便を採取することにより、より簡便かつ迅速に採取された糞便を調製することができる。また、本発明の調製用溶液Ｓと、その調製用溶液Ｓを含有する採便容器と、を有する採便用キットを用いることにより、より簡便に本発明の効果を発揮することができる。なお、該採便用キットには、採便棒等の、該調製用溶液Ｓ及びそれを含有する採便容器以外の構成物を適宜有していてもよい。
【０１０４】
本発明で用いられる採便容器の形態や大きさ等は特に限定されるものではなく、溶媒を含むことができる公知の採便容器が用いられる。取り扱いが簡便であるため、採便容器の蓋と採便棒が一体化している採便容器が好ましい。また、採便量をコントロールできるため、採便棒が一定量の糞便を採取できるものがより好ましい。このような公知の採便容器として、例えば、特公平６−７２８３７号公報に開示されている採便容器等がある。
【０１０５】
図１及び図２は、本発明の採便用キットに用いることができる採便容器ＡおよびＢの実施形態をそれぞれ示した図である。なお、本発明の採便用キットに用いることができる採便容器は、これらの採便容器に限定されるものではない。
【０１０６】
まず図１の採便容器について説明する。本実施形態の採便容器Ａは、採便棒３と一体化した蓋２と、容器本体１を有し、容器本体１の内部に本発明の調製用溶液Ｓを含有する。採便棒３の先端には糞便を一定量採取できるカップ３ａがあり、このカップ３ａの底部にはふるいとして網が張られている。一方、容器本体１の底部には、カップ３ａの形状と略同一で、カップ３ａの形状と重なり合う隆起部１ａがある。カップ３ａを隆起部１ａに嵌合させることにより、カップ３ａに採取された糞便は、カップ３ａの底部に張られた網から押し出されるため、調製用溶液Ｓに糞便を速やかに分散させることができる。
【０１０７】
図２に記載の採便容器は、先端が尖っている採便棒１３と一体化した蓋１２と、容器本体１１を有し、容器本体１１内部に、調製用溶液Ｓを含有する密封された袋１５を有する採便容器Ｂである。採便棒１３の先端側には、糞便Ｅを一定量採取できる穴１３ａが空いている。また、採便棒１３上をスライドすることにより穴１３ａの蓋となる可動蓋１３ｂが採便棒１３の両側部に付いている。本採便容器Ｂの使用方法の一実施形態を、以下に説明する。
まず、図２ａに示すように、採便棒１３を、可動蓋１３ｂを穴１３ａよりも蓋１２側に寄せて、穴１３ａが完全に開口している状態としたところで、採便棒１３を糞便Ｅに押し付ける。すると図２ｂに示すように、穴１３ａに糞便Ｅが充填される。この状態で、可動蓋１３ｂを採便棒１３の先端側にスライドさせて穴１３ａに蓋をすることにより、余分な糞便Ｅが分離されるため、穴１３ａの容量分のみ糞便を正確に採取することができる（図２ｃ）。その後、可動蓋１３ｂを元の位置に戻して穴１３ａが完全に開口している状態とした後に（図２ｄ）、蓋１２を容器本体１１に収納する（図２ｅ）。採便棒１３が容器本体１１に収納される際に、採便棒１３の尖った先端が調製用溶液Ｓを含有する袋１５を破ることにより、容器本体１１は、糞便Ｅを含んだ穴１３ａ以上の水位まで、調製用溶液Ｓにより満たされ、糞便Ｅと調製用溶液Ｓが直接接触する（図３ｆ）。この時、容器本体１１は蓋１２により栓をされているので、調製用溶液Ｓが漏れることはない。その後、運搬等により容器本体１１が動かされることで、容器１１内部の調製用溶液Ｓと糞便Ｅが混合される。このような採便容器Ｂは、採便棒１３を容器に入れて始めて溶液が容器中に満たされるため、メタノールのような人体に有害な調製用溶液Ｓを用いる場合であっても、溶液漏れによる事故を回避することができ、家庭でも安全に取り扱うことが出来る。
【実施例】
【０１０８】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、特に記載が無い場合には、「％」は「体積％」を意味する。また、培養細胞であるＣａｃｏ−２細胞、ＳＷ６２０細胞、及びＭＫＮ４５細胞、並びにバクテリア細胞であるＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓは、常法により培養した。【０１０９】
［実施例１］
健常人１名より採取された糞便を、８本の１５ｍＬのポリプロピレンチューブにそれぞれ０．５ｇずつ分取した。各糞便に対して、表１に記載の調製用溶液Ｓ１０ｍＬを加えて糞便をよく分散させ、糞便試料１−１〜１−８をそれぞれ調製した。なお、０．１Ｍのクエン酸を添加した調製用溶液Ｓは、表１に記載のｐＨとなるように、ＮａＯＨを用いて調整した。また、有機酸を添加していない６０％エタノール溶液のｐＨは、糞便に添加される前のｐＨである。【０１１０】
【表１】
2010024251.tif 000002
【０１１１】
これらの糞便試料を、２５℃で７日間保存した後、各糞便試料からＲＮＡを回収した。このＲＮＡの回収工程としては、各チューブを遠心処理して糞便の固形成分を回収した後、フェノール混合物「Ｔｒｉｚｏｌ」（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を添加し、ボモジナイザーで十分に混合した。その後、糞便試料とＴｒｉｚｏｌ混合液に、クロロホルムを添加し、ボルテックスを用いて十分に混合した後、１２，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離処理を行った。この遠心分離処理により上清（水層）を分離させ、その上清（水層）を、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）のＲＮＡ回収用カラムに通した。この添付のプロトコールに従ってこのキットのＲＮＡ回収用カラムの洗浄操作及びＲＮＡ溶出操作を行うことにより、ＲＮＡを回収した。
回収されたＲＮＡ１μｇに対してＲＴ−ＰＣＲを行い、得られたｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の検出を行った。プライマーとして、アプライドバイオシステム社製のＧＡＰＤＨプライマープローブＭＩＸ（カタログＮｏ：Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇｌ）を用いた。
このＰＣＲ工程としては、０．２ｍＬの９６ウェルＰＣＲプレートに、得られたｃＤＮＡを１μＬずつそれぞれ分取した。その後、各ウェルに８μＬの超純水と１０μＬの核酸増幅試薬「ＴａｑＭａｎ  ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ」（アプライドバイオシステム社製）を添加し、さらに、１μＬのＧＡＰＤＨプライマープローブＭＩＸ（アプライドバイオシステム社製）をそれぞれ添加して混合し、ＰＣＲ反応溶液を調製した。
このＰＣＲプレートを、ＡＢＩリアルタイムＰＣＲ装置に設置し、９５℃で１０分間処理した後、９５℃で１分間、５６．５℃で１分間、７２℃で１分間の熱サイクルを４０サイクル行った後、さらに７２℃で７分間処理することにより、経時的に蛍光強度を計測しながらＰＣＲを行った。蛍光強度の計測結果を分析して、各試料から回収されたＲＮＡ中のＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量の相対値を算出した。
各糞便試料由来のＲＮＡ中のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量を相対比較した結果を図３に示す。この結果から、調製用溶液Ｓとして緩衝作用を有していない６０％エタノール溶液を用いた糞便試料１−８よりも、緩衝作用を有する有機酸が添加された調製用溶液Ｓを用いた糞便試料１−１〜１−７のほうが、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現量が高い、という結果が得られた。また、中性のｐＨ７よりも酸性領域のｐＨ３〜６において、特にｐＨ４．５〜５．５において、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現量が高い、という結果が得られた。糞便試料１−１〜１−８は、同一人由来の糞便から回収されたＲＮＡであることから、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現量が高いものほど、糞便中の核酸の分解が少なく、保存が良好に行われたことを示している。すなわち、有機酸を添加することによりｐＨが酸性である調製用溶液Ｓのほうが、有機酸を添加しないものよりも、高い核酸保存効果があることが分かった。
なお、核酸の分解の程度を示すと考えられるリボゾーマルＲＮＡの状態を電気泳動で確認したところ、特にｐＨ４〜５．５である糞便試料１−３〜１−６では、２本のバンドが明確に検出されたことから、ＲＮＡの分解が非常に少ないことが確認された。【０１１２】
［実施例２］
調製用溶液Ｓに添加する有機酸として、クエン酸に換えて、アジピン酸を用いた場合の、核酸保存効果を調べた。ＲＮＡ回収工程およびＰＣＲ工程に関しては、調製用溶液Ｓとして、表２に記載のものを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。なお、０．１Ｍのアビジン酸を添加した調製用溶液ＳのｐＨ調整は、ＮａＯＨを用いて行った。一方、０．１Ｍの酢酸を添加した調製用溶液Ｓは酢酸ナトリウムを、０．１Ｍの乳酸を添加した調製用溶液Ｓは乳酸ナトリウムを、それぞれ用いてｐＨ調整を行った。【０１１３】
【表２】
2010024251.tif 000003
【０１１４】
図４は、有機酸としてアジピン酸を用いた場合の糞便試料２−１〜２−３と、有機酸が添加されていない糞便試料５−１との相対比較した結果を示した図である。図５は、有機酸として酢酸を用いた場合の糞便試料３−１〜３−３と、有機酸が添加されていない糞便試料５−１とを相対比較した結果を示した図である。図６は、有機酸として乳酸を用いた場合の糞便試料４−１〜４−３と、有機酸が添加されていない糞便試料５−１とを相対比較した結果を示した図である。各糞便試料由来のＲＮＡ中のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量を相対比較した結果、いずれの有機酸を用いた場合であっても、有機酸が無添加の緩衝作用を有していない糞便試料５−１よりも高い核酸保存効果が得られることが分かった。特に、アジピン酸は、実施例１のクエン酸と同様に、非常に優れた核酸保存効果を有することがわかった。また、有機酸として酢酸や乳酸を用いた場合にも、アジピン酸やクエン酸とは若干劣るものの、ｐＨ５において、有機酸が添加されていない糞便試料５−１の７倍程度のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量が確認され、良好な核酸保存効果を有することが確認された。
さらに、実施例１と同様に、リボゾーマルＲＮＡの状態を電気泳動で確認したところ、本実施例では、糞便試料５−１以外のすべての糞便試料由来のＲＮＡにおいて、２本のバンドが明確に検出された。この結果により、ＲＮＡの分解が非常に少ないことが確認された。【０１１５】
［参考例１］
健常人１名より採取された糞便を、３本の１５ｍＬのポリプロピレンチューブにそれぞれ１ｇずつ分取した。このうち１本に対して、分取直後、速やかに液体窒素を用いて凍結処理を行い、糞便試料（１Ａ）とした。他の１本に対して、分取後、１０ｍＬの７０％エタノール溶液を加えて糞便をよく分散させた後、室温で１時間静置し、糞便試料（１Ｂ）とした。残りの１本は、分取後、溶液等を添加せずに速やかに抽出工程に移行させ、これを糞便試料（１Ｃ）とした。
その後、各糞便試料からＲＮＡを回収した。具体的には、各糞便試料に、３ｍＬのフェノール混合物「Ｔｒｉｚｏｌ」（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を添加し、３０秒以上ボモジナイザーで十分に混合した。その混合液に、３ｍＬのクロロホルムを添加し、ボルテックスを用いて十分に混合した後、１２，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離処理を行った。この遠心分離処理により得た上清（水層）を、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）のＲＮＡ回収用カラムに通し、添付のプロトコールに従ってこのＲＮＡ回収用カラムの洗浄操作及びＲＮＡ溶出操作を行うことにより、ＲＮＡを回収した。ナノドロップ（ナノドロップ社製）を用いて、回収したＲＮＡの定量を行った。【０１１６】
図７は、各糞便試料から回収されたＲＮＡ量を示した図である。調製用溶液Ｓがエタノール溶液を用いて調製された糞便試料（１Ｂ）からは、採取直後に凍結処理を行った糞便試料（１Ａ）から回収されたＲＮＡ量には若干及ばないものの、溶液等を添加せずに採取直後速やかに核酸抽出を行った糞便試料（１Ｃ）に比べて、非常に多くのＲＮＡを回収することができた。これらの結果から、本発明の調製用溶液Ｓを用いて調製することにより、室温での調製であっても、非常に効率よく核酸を回収できる糞便試料が得られることがわかった。検診等の場合のように、患者が自宅で採便する場合には、糞便試料の調製を室温付近で行えることが望まれるが、本発明の調製用溶液Ｓは、このような要請に充分に応えることが可能である。【０１１７】
［参考例２］
ＭＤＲ１（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ１）遺伝子を多く発現しているヒト大腸がん由来培養細胞Ｃａｃｏ−２細胞を、健常人の糞便０．５ｇに対し、５．０×１０5ｃｅｌｌｓ混合させて大腸がん患者擬似糞便とした。この大腸がん患者擬似糞便から、本発明の糞便試料の調製方法により糞便試料を調製した。
調製方法としては、この大腸がん患者擬似糞便を、１５ｍＬのポリプロピレンチューブに０．５ｇずつ分取し、表３に記載の調製用溶液Ｓをそれぞれ添加して混合することにより糞便試料を調製した。なお、表中、「普遍的収集培地」とは、特許文献４に記載の保存培地（５００ｍＬのＰａｃｋ食塩水Ｇ、４００ｍｇの重炭酸ナトリウム、１０ｇのＢＳＡ、５００ｕｎｉｔｓ／Ｌのｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｇ、５００ｍｇ／Ｌの硫酸ストレプトマイシン、１．２５ｍｇ／Ｌのａｍｐｈｏｒｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ、５０ｍｇ／Ｌのｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）である。調製した糞便試料を、室温（２５℃）の恒温インキュベータにおいて、１、３、７、１０日間、それぞれ保存した。【０１１８】
【表３】
2010024251.tif 000004
【０１１９】
保存後、各糞便試料からＲＮＡを回収し、回収されたＲＮＡに対して、ＭＤＲ１遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの検出を試みた。調製用溶液Ｓが２Ｃ（即ち、普遍的収集培地）を用いて調製した糞便試料（以下、糞便試料（２Ｃ）という。）については、まず、Ｃａｃｏ−２細胞を含む哺乳細胞を分離した後、ＲＮＡの回収を行った。調製用溶液Ｓが普遍的収集培地以外の調製用溶液Ｓを用いて調製した糞便試料については、哺乳細胞を分離せずに、哺乳細胞由来の核酸とバクテリア由来の核酸を同時に回収した。糞便試料（２Ｃ）からの哺乳細胞の分離方法は、糞便試料（２Ｃ）に５ｍＬのヒストパック１０７７溶液（Ｓｉｇｍａ社製）を添加して混合した後、２００×ｇ、３０分間室温で遠心分離処理を行い、懸濁液とヒストパック１０７７溶液の間の界面の層を回収した（この層に哺乳細胞が含有されている）。分離した哺乳細胞は、ＰＢＳで３回洗浄した。
糞便試料からのＲＮＡの回収は、次のようにして行った。まず、糞便試料（糞便試料（２Ｃ）のみ分離した哺乳細胞）に、３ｍＬのフェノール混合物「Ｔｒｉｚｏｌ」（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を添加し、３０秒以上ボモジナイザーで十分に混合した。その後、Ｔｒｉｚｏｌと糞便試料の混合液に、３ｍＬのクロロホルムを添加し、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離処理を行った。この遠心分離処理により得た上清（水層）を新しいポリプロピレンチューブに回収した。その後、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、回収された上清からＲＮＡを回収した。【０１２０】
回収されたＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行い、得られたｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。プライマーとして、配列番号１の塩基配列を有するＭＤＲ１遺伝子増幅用のフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列を有するＭＤＲ１遺伝子増幅用のリバースプライマーを用いた。
このＰＣＲ工程としては、０．２ｍＬのＰＣＲチューブに、１２μＬの超純水と２μＬの１０×バッファーを添加し、さらにｃＤＮＡ、配列番号１の前記フォワードプライマー、配列番号２の前記リバースプライマー、塩化マグネシウム、ｄＮＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼをそれぞれ１μＬずつ添加して混合し、ＰＣＲ反応溶液を調製した。このＰＣＲチューブを、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間を３０サイクル、からなる反応条件によりＰＣＲを行った。この結果、得られたＰＣＲ産物を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ１０００  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キット（アジレント社製）を用いて泳動し、得られたバンドの強度を測定してＰＣＲ産物の増幅の強弱の度合い（degree）を調べた。【０１２１】
【表４】
2010024251.tif 000005
【０１２２】
表４は、各糞便試料由来のＰＣＲ産物の増幅の度合いを、保存期間ごとにまとめた表である。なお、表中「糞便試料（２Ａ）」は、調製用溶液Ｓとして５ｍｌの７０％メタノール溶液（表３中の２Ａ）を用いて調製した糞便試料を；「糞便試料（２Ｂ）」は、調製用溶液Ｓとして１ｍｌの１００％メタノール溶液（表３中の２Ｂ）を用いて調製した糞便試料を；「糞便試料（２Ｄ）」は、調製用溶液Ｓとして５ｍｌのＰＢＳ（表３中の２Ｄ）を用いて調製した糞便試料を；示す。
糞便試料（２Ｄ）では、保存期間が１日の場合にはＰＣＲ産物の増幅が確認されたが、保存期間３日以降は、増幅が確認できなかった。これに対して、調製用溶液Ｓが２Ａや糞便２Ｂを用いて調製された糞便試料（２Ａ）及び（２Ｂ）中からは、保存期間が１０日でもＰＣＲ産物の増幅を確認することができた。一方で、調製用溶液Ｓが普遍的収集培地（表３中の２Ｃ）を用いて調製された糞便試料（２Ｃ）では、保存期間１日であってもＰＣＲ産物の増幅は確認することができなかった。
以上の結果から、本発明の調製方法により調製された糞便試料からは、糞便中に含まれている核酸を効率よく回収することができることがわかった。また、本発明の糞便試料を用いることにより、ＲＮＡ解析の精度を向上できることもわかった。これは、本発明の調製用溶液Ｓを用いることにより、糞便中に含まれる哺乳細胞由来の核酸、特に分解され易いＲＮＡでさえも、室温で長期間保存可能なほど安定して保持できるためと推察される。
一方で、糞便試料（２Ｃ）由来のＰＣＲ産物では増幅が確認されなかったことから、調製用溶液Ｓとして抗生物質を含有する溶液を用いた場合には、この抗生物質により糞便中のバクテリア細胞は殺菌されるものの、死滅したバクテリア細胞からＲＮａｓｅ等が放出される等により、却ってＲＮＡ分解が促進される可能性が示唆される。また、糞便に含まれる哺乳細胞数は少ないため、糞便から哺乳細胞を分離した場合には、バクテリア細胞由来の核酸がキャリアーとして機能する本発明の核酸の回収方法と比較して、充分量の核酸を回収することが困難である可能性も示唆される。【０１２３】
［参考例３］
超純水を用いて希釈することにより、０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％のエタノール溶液をそれぞれ調製した。これらのエタノール溶液を、各５ｍＬずつ１５ｍＬのポリプロピレンチューブにそれぞれ分注した。
これらのチューブに、健常人より採取した糞便０．５ｇをそれぞれ分取した後、３７℃で４８時間静置した。その後、各チューブを遠心分離処理し、上清を除去して得られた固形成分に、３ｍＬのフェノール混合物「Ｔｒｉｚｏｌ」（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を添加し、３０秒以上ボモジナイザーで十分に混合した。その後、Ｔｒｉｚｏｌと糞便試料との混合液に、３ｍＬのクロロホルムを添加し、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離処理を行った。その遠心分離処理により得た上清（水層）を新しいポリプロピレンチューブに回収した。その後、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、回収された上清からＲＮＡを回収した。【０１２４】
図８は、各濃度のエタノール溶液を用いて調製された糞便試料から回収されたＲＮＡ量を示した図である。この結果から、調製用溶液Ｓの有効成分としてエタノール等のアルコールを用いる場合には、アルコール濃度は３０％以上が好ましく、５０％以上がより好ましく、５０〜８０％の範囲がさらに好ましく、６０〜７０％の範囲が特に好ましいことが分かる。【０１２５】
［参考例４］
健常人５名から採取した糞便をよく混合し、０．２ｇずつ２本の１５ｍＬのポリプロピレンチューブにそれぞれ分取した。このうち１本に対して、１ｍＬの１８％イソプロパノールを含有した３２％変性エタノール溶液（ｔｏｔａｌアルコール溶液として５０％）を加えてよく混合した後、２５℃で１日静置した。この糞便試料を糞便試料（４Ａ）とした。残りの１本は対照試料とし、分取後速やかに−８０℃ディープフリーザーに回収した。
両糞便試料から、糞便からのＤＮＡ抽出キット「ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ」（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡの濃度を吸光度法により定量した結果、両糞便試料から、ほぼ同等量のＤＮＡを回収することができた。
回収されたＤＮＡを１００ｎｇ使い、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の変異解析キット「Ｋ−ｒａｓコドン１２変異検出試薬」（湧永製薬社製）を用いて、付属のプロトコールに従い変異解析を行った。その結果、糞便試料（４Ａ）から回収されたＤＮＡの解析結果は、対照試料から回収されたＤＮＡを用いた場合と同様に、６種類の変異遺伝子は全て陰性となった。
以上の結果から、本発明の糞便試料の調製方法、及び、本発明の核酸回収方法により回収された核酸を用いることにより、遺伝子変異等の高い正確性を要求される核酸解析であっても、核酸解析が精度よく行えることが明らかである。また今回はイソプロパノールとエタノールを混合した変性エタノールを処理溶液として使用したが、アルコール濃度は同じである、５０％エタノール溶液を使用しても同等の結果が得られた。【０１２６】
［参考例５］
健常人１名より採取された糞便を、３本の１５ｍＬのポリプロピレンチューブにそれぞれ０．１ｇずつ分取し、このうち１本に対して、３ｍＬの７０％エタノールを加えて糞便をよく分散させ、得られた糞便試料を糞便試料（５Ａ）とした。一方、残りの２本に対して、それぞれ２．４ｍＬの「ＩＳＯＧＥＮ」（ニッポンジーン社製）を加えて糞便をよく分散させ、得られた糞便試料を、それぞれ比較試料（Ｐ１）、比較試料（Ｐ２）とした。なお、「ＩＳＯＧＥＮ」はフェノール（水に対する溶解度約１０重量％）が４０％含有されているフェノール含有物である。
このうち、比較試料（Ｐ１）に対して、糞便分散後、速やかにＲＮＡ回収を行った。このＲＮＡ回収工程は、糞便試料を３０秒以上ボモジナイザーで十分に混合した後、３ｍＬのクロロホルムを添加し、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離処理を行った。この遠心分離処理により得た上清（水層）を新しいポリプロピレンチューブに回収した。その後、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、回収された上清からＲＮＡを回収した。
また、比較試料（Ｐ２）は、室温で５時間静置した後、比較試料（Ｐ１）と同様にして、ＲＮＡ回収を行った。
一方、糞便試料（５Ａ）は、比較試料（Ｐ２）と同様に室温で５時間静置した後、遠心分離処理を行って上清を除去した。上清を除去して得られた沈殿（固形成分）に、２．４ｍＬの「ＩＳＯＧＥＮ」を添加した後、比較試料（Ｐ１）と同様にして、ＲＮＡ回収を行った。
回収されたＲＮＡを、ナノドロップ（ナノドロップ社製）を用いて定量した。この結果、糞便試料の調製直後にＲＮＡ回収を行った比較試料（Ｐ１）からは３２μｇのＲＮＡを回収できたが、５時間室温で静置した後に回収操作を行った比較試料（Ｐ２）からは１４μｇしか回収できなかった。これに対して、糞便試料（５Ａ）からは、５時間室温で静置した後に回収操作を行ったにもかかわらず、回収されたＲＮＡ量は５７μｇであった。この結果から糞便試料（５Ａ）は、比較試料（Ｐ１）よりも大量のＲＮＡを回収することができた。
これらの結果から、本発明の糞便試料調製用溶液を用いることにより、従来のフェノール溶液を用いた場合よりも、非常に効率よくＲＮＡを回収できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明の糞便試料の調製方法により、糞便試料中の核酸を効率よく保存できる糞便試料を簡便に調製できるため、特に糞便試料を用いた定期健診等の臨床検査等の分野において利用が可能である。
【符号の説明】
【０１２８】
１…容器本体、
１ａ…隆起部、
２…蓋、
３…採便棒、
３ａ…カップ、
Ｓ…糞便試料調製用溶液、
１１…容器本体、
１２…蓋、
１３…採便棒、
１３ａ…穴、
１３ｂ…可動蓋、
１５…袋、
Ｅ…糞便
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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