(57)【要約】  本発明は、抗癌剤や放射線に抵抗性を有するグリオーマ幹細胞の腫瘍原性を低下させ、抗癌剤や放射線に対する感受性も上昇させることが可能な医薬を提供することを課題とする。本発明は、グリオーマ幹細胞におけるTGF-β−Sox4−Sox2パスウェイ、即ちTGF-βがSox4の発現を誘導し、Sox4がSox2の発現を促進させるパスウェイを阻害する物質を含む、グリオーマ幹細胞の分化促進剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳腫瘍幹細胞におけるTGF-β−Sox4−Sox2パスウェイを阻害する物質を含む、脳腫瘍幹細胞の分化促進剤。
【請求項２】
前記TGF-β−Sox4−Sox2パスウェイを阻害する物質が、Sox2、Sox4、TGF-β、Smad2、Smad3、及びOct4からなる群より選択される少なくとも1つに対する発現阻害物質又は機能阻害物質である、請求項１に記載の脳腫瘍幹細胞の分化促進剤。
【請求項３】
前記発現阻害物質又は機能阻害物質が、TGF-β受容体アンタゴニストである、請求項２に記載の脳腫瘍幹細胞の分化促進剤。
【請求項４】
前記発現阻害物質又は機能阻害物質が、以下の(a)〜(d)からなる群より選択される化合物である、請求項２に記載の脳腫瘍幹細胞の分化促進剤。
(a)Sox2、Sox4、Smad2、Smad3、及びOct4からなる群より選択される少なくとも一つに対するアンチセンス核酸
(b)Sox2、Sox4、Smad2、Smad3、及びOct4からなる群より選択される少なくとも一つに対するリボザイム活性を有する核酸
(c)Sox2、Sox4、Smad2、Smad3、及びOct4からなる群より選択される少なくとも一つに対するRNAi効果を有する二本鎖核酸
(d) (a)乃至(c)のいずれかに記載の核酸をコードする核酸
【請求項５】
グリオーマ幹細胞の分化促進剤である、請求項１から４のいずれか１項に記載の脳腫瘍幹細胞の分化促進剤。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか１項に記載の脳腫瘍幹細胞の分化促進剤を含む、脳腫瘍の治療剤。
【請求項７】
グリオーマの治療剤である、請求項６に記載の脳腫瘍の治療剤。
【請求項８】
以下の(i)又は(ii)に示す二本の核酸からなる、Sox2に対してRNAi効果を有する二本鎖核酸。
(i)配列番号：１に記載の塩基配列からなる核酸と、それに相補的な塩基配列からなる核酸
(ii)配列番号：２に記載の塩基配列からなる核酸と、それに相補的な塩基配列からなる核酸。
【請求項９】
以下の(iii)又は(iv)に示す二本の核酸からなる、Sox4に対してRNAi効果を有する二本鎖核酸。
(iii)配列番号：３に記載の塩基配列からなる核酸と、それに相補的な塩基配列からなる核酸
(iv)配列番号：４に記載の塩基配列からなる核酸と、それに相補的な塩基配列からなる核酸。
【請求項１０】
配列番号：５に記載の塩基配列からなる核酸と、それに相補的な塩基配列からなる核酸とからなる、Smad2に対してRNAi効果を有する二本鎖核酸。
【請求項１１】
配列番号：６に記載の塩基配列からなる核酸と、それに相補的な塩基配列からなる核酸とからなる、Smad3に対してRNAi効果を有する二本鎖核酸。
【請求項１２】
以下の(v)又は(vi)に示す二本の核酸からなる、Oct4に対してRNAi効果を有する二本鎖核酸。
(v)配列番号：５１に記載の塩基配列からなる核酸と、それに相補的な塩基配列からなる核酸
(vi)配列番号：５２に記載の塩基配列からなる核酸と、それに相補的な塩基配列からなる核酸。
【請求項１３】
患者の脳腫瘍の患部から組織を採取して、該組織における、Sox2及び／又はSox4の発現レベルを測定する工程と、
前記Sox2及び／又はSox4の発現レベルが、正常組織と比較して上昇している場合に、請求項６又は７に記載の脳腫瘍の治療剤を投与する工程と、を含む脳腫瘍の治療方法。
【請求項１４】
脳腫瘍の患者に対する治療方法を決定するためのスクリーニング方法であって、
患者の脳腫瘍の患部から組織を採取して、該組織における、Sox2及び／又はSox4の発現レベルを測定する工程と、
前記発現レベルと、正常組織における発現レベルとを比較する工程と、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳腫瘍幹細胞の分化を促進することによって、その腫瘍原性を低下させる脳腫瘍幹細胞の分化促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳腫瘍は、頭蓋内組織に発生する腫瘍の総称であり、脳細胞だけでなく、硬膜、クモ膜、頭蓋内の血管や末梢神経等、頭蓋内のあらゆる組織に発生する。
脳内の腫瘍は、周囲の正常組織にできるだけ損傷を与えないように治療する必要がある。しかしながら、脳腫瘍の多くは周囲の脳組織や脊髄組織に浸潤し、腫瘍細胞と正常脳組織が混在する領域が生じるため、外科的に切除するのが困難である。放射線治療も、周囲の正常組織に損傷を与えやすい。
また、血液と脳の間には血液脳関門が存在するため、点滴で投与しても脳に到達しない薬剤もあり、化学療法も有効でない場合がある。
このような事情から、脳腫瘍に対して特異的に効果を示す新たな治療法が求められている。【０００３】
脳腫瘍は様々な組織から発生するため、発生母地を基準にした世界保健機構（WHO）の分類が世界的に用いられている。
その中で、神経上皮組織性腫瘍に分類されるグリオーマ（神経膠腫）は、グリア細胞（神経膠細胞）から発生する腫瘍の総称である。グリア細胞は、脳と脊髄において神経細胞と神経線維の間を埋める細胞であり、グリオーマは、脳に原発する腫瘍の約四分の一を占める。
グリオーマには、それぞれ由来する細胞に応じて、星状細胞系腫瘍、稀突起膠細胞系腫瘍、上衣細胞系腫瘍などがあり、これらがさらに細かく分類されている。また、WHOは、臨床的悪性度をグレードで評価している。グレードIVが最も悪性度が高く予後の悪い腫瘍であり、グレードIが最も悪性度が低い。一般に、グレードIII及びIVの腫瘍を、悪性神経膠腫と呼ぶ。
グリオーマの中でも、星状細胞系腫瘍に分類される退形成性星状細胞腫（グレードIII）と膠芽腫（グレードIV）は脳腫瘍の中でも特に悪性度が高い。特に、膠芽腫（Glioblastoma）は、ヒトのがんの中で最も予後が悪いものの1つで、5年生存率は10％未満といわれる。
上述のとおり、脳腫瘍に対する治療は一般に困難とされているが、グリオーマ、特に悪性度の高い膠芽腫に対しても有効な治療法は見出されていない。【０００４】
近年、癌を形成する細胞の中に、幹細胞様の性質を有する細胞が含まれることが明らかになり、癌幹細胞（cancer stem cells; CSCs又はcancer-initiating cells）等と呼ばれている。癌幹細胞は、腫瘍形成を誘導し、且つ自己複製能を有する。最近の研究では、ごくわずかな癌幹細胞が癌の生物学的・病理学的性質を決定することが示されている。【０００５】
他の腫瘍と同様に、ヒトグリオーマの組織からも、複数のグリオーマ幹細胞（glioma stem cells; GSCs）の株が単離されている（非特許文献１〜３参照）。グリオーマ幹細胞は、神経幹細胞（neural stem cell）抗原を発現していること、また、上皮成長因子（epidermal growth factor; EGF）及び塩基性線維芽細胞成長因子（basic fibroblast growth factor; bFGF）の存在下、無血清培地で培養したときに、ニューロスフェア又はグリオーマスフェアと呼ばれる非接着性スフェアを形成することにより特徴付けられる。（非特許文献４参照）。【０００６】
これまでの癌治療は腫瘍（tumor bulk）を標的としており、癌幹細胞に対する効果が十分に得られていなかった可能性がある。実際、他の癌幹細胞と同様に、グリオーマ幹細胞も従来の放射線や薬剤による治療に耐性を示すことが報告されている（非特許文献５及び６参照）。また、癌幹細胞は浸潤能及び転移能を有することも報告されている。
従って、脳腫瘍の治療において、脳腫瘍幹細胞を除去することは必須であると考えられるが、脳腫瘍幹細胞の幹細胞性がどのように維持されるのか、これまで解明されていなかった。【０００７】
ところで、トランスフォーミング増殖因子（transforming growth factor; TGF）-βは、ある種の癌細胞の増殖を抑制する癌抑制剤としてよく知られている。しかしながら、TGF-βは、脳腫瘍や骨肉腫など、非上皮細胞由来の癌の増殖を、PDGF-BBの誘導を介して促進する（非特許文献７及び８参照）。
TGF-βは、セリン／スレオニンキナーゼ受容体I型及びII型に結合し、主としてSmadタンパク質を通じて細胞内シグナルを伝達する。I型受容体がリン酸化されると、receptor-regulated Smad（R-Smad）は、common-partner Smad（Co-Smad）と複合体を形成し、核内に移行して様々な標的遺伝子の発現を調節する。増殖の誘導に加え、TGF-βシグナルは、脳腫瘍における浸潤、転移、腫瘍内血管新生、免疫抑制に関与すると考えられてきた。【０００８】
このような腫瘍におけるTGF-βの複数の役割に基づき、TGF-βシグナルを阻害するグリオーマ治療剤が開発されている（非特許文献９参照）。
また、TGF-β2特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ハイグレードの再発性／難治性グリオーマを対象とする臨床研究が進められている（非特許文献１０参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Singh et al., Nature, 2004, 432:396-401.
【非特許文献２】Kondo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101:781-786.
【非特許文献３】Hirschmann-Jax et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101:14228-14233.
【非特許文献４】Vescovi et al., Cancer, 2006, 6:425-436.
【非特許文献５】Bao et al., Nature, 2006, 444:756-760.
【非特許文献６】Liu et al., Cancer, 2006, 5:67.
【非特許文献７】Bruna et al., Cancer Cell, 2007, 11:147-160.
【非特許文献８】Matsuyama et al., Cancer Res., 2003, 63:7791-7798.
【非特許文献９】Golestaneh and Mishra, Oncogene, 2005, 24:5722-5730.
【非特許文献１０】Schlingensiepen et al., Cytokine Growth Factor Rev., 2006, 17:129-139
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、脳腫瘍幹細胞の腫瘍原性を低下させ、抗癌剤や放射線に対する感受性も上昇させることが可能な医薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、これまで知られていなかったTGF-βパスウェイが、脳腫瘍幹細胞の幹細胞性の維持に重要な役割を果たしていることを見出した。即ち、TGF-βがSox4の発現レベルを上昇させ、Sox4が、幹細胞性遺伝子（stemness gene）であるSox2の発現レベルを上昇させることによって、脳腫瘍幹細胞の幹細胞性が維持されることを確認した。
さらに、このTGF-βパスウェイに直接的又は間接的に関与するSox2、Sox4、TGF-β、Smad2、Smad3、及びOct4のいずれかの機能又は発現を阻害することにより、脳腫瘍幹細胞の分化が促進され、同細胞の腫瘍原性を著しく低下させるとともに、抗癌剤や放射線に対する感受性を上昇させることを確認し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
〔１〕脳腫瘍幹細胞におけるTGF-β−Sox4−Sox2パスウェイを阻害する物質を含む、脳腫瘍幹細胞の分化促進剤；
〔２〕前記TGF-β−Sox4−Sox2パスウェイを阻害する物質が、Sox2、Sox4、TGF-β、Smad2、Smad3、及びOct4からなる群より選択される少なくとも1つに対する発現阻害物質又は機能阻害物質である、上記〔１〕に記載の脳腫瘍幹細胞の分化促進剤；
〔３〕前記発現阻害物質又は機能阻害物質が、TGF-β受容体アンタゴニストである、上記〔２〕に記載の脳腫瘍幹細胞の分化促進剤；
〔４〕前記発現阻害物質又は機能阻害物質が、以下の(a)〜(d)からなる群より選択される化合物である、上記〔２〕に記載の脳腫瘍幹細胞の分化促進剤、
(a)Sox2、Sox4、Smad2、Smad3、及びOct4からなる群より選択される少なくとも一つに対するアンチセンス核酸
(b)Sox2、Sox4、Smad2、Smad3、及びOct4からなる群より選択される少なくとも一つに対するリボザイム活性を有する核酸
(c)Sox2、Sox4、Smad2、Smad3、及びOct4からなる群より選択される少なくとも一つに対するRNAi効果を有する二本鎖核酸
(d) (a)乃至(c)のいずれかに記載の核酸をコードする核酸；
〔５〕グリオーマ幹細胞の分化促進剤である、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の脳腫瘍幹細胞の分化促進剤；
〔６〕上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の脳腫瘍幹細胞の分化促進剤を含む、脳腫瘍の治療剤；
〔７〕グリオーマの治療剤である、上記〔６〕に記載の脳腫瘍の治療剤；
〔８〕以下の(i)又は(ii)に示す二本の核酸からなる、Sox2に対してRNAi効果を有する二本鎖核酸、
(i)配列番号：１に記載の塩基配列からなる核酸と、それに相補的な塩基配列からなる核酸
(ii)配列番号：２に記載の塩基配列からなる核酸と、それに相補的な塩基配列からなる核酸；
〔９〕以下の(iii)又は(iv)に示す二本の核酸からなる、Sox4に対してRNAi効果を有する二本鎖核酸、
(iii)配列番号：３に記載の塩基配列からなる核酸と、それに相補的な塩基配列からなる核酸
(iv)配列番号：４に記載の塩基配列からなる核酸と、それに相補的な塩基配列からなる核酸；
〔１０〕配列番号：５に記載の塩基配列からなる核酸と、それに相補的な塩基配列からなる核酸とからなる、Smad2に対してRNAi効果を有する二本鎖核酸；
〔１１〕配列番号：６に記載の塩基配列からなる核酸と、それに相補的な塩基配列からなる核酸とからなる、Smad3に対してRNAi効果を有する二本鎖核酸；
〔１２〕以下の(v)又は(vi)に示す二本の核酸からなる、Oct4に対してRNAi効果を有する二本鎖核酸、
(v)配列番号：５１に記載の塩基配列からなる核酸と、それに相補的な塩基配列からなる核酸
(vi)配列番号：５２に記載の塩基配列からなる核酸と、それに相補的な塩基配列からなる核酸；
〔１３〕患者の脳腫瘍の患部から組織を採取して、該組織における、Sox2及び／又はSox4の発現レベルを測定する工程と、前記Sox2及び／又はSox4の発現レベルが、正常組織と比較して上昇している場合に、上記〔６〕又は〔７〕に記載の脳腫瘍の治療剤を投与する工程と、を含む脳腫瘍の治療方法；
〔１４〕脳腫瘍の患者に対する治療方法を決定するためのスクリーニング方法であって、患者の脳腫瘍の患部から組織を採取して、該組織における、Sox2及び／又はSox4の発現レベルを測定する工程と、前記発現レベルと、正常組織における発現レベルとを比較する工程と、を含む方法、
に関する。
に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る脳腫瘍幹細胞の分化促進剤は、従来抗癌剤や放射線に抵抗性を示すことが報告されている脳腫瘍幹細胞に直接作用して、その分化を促進させることにより、腫瘍原性を著しく低下させ、抗癌剤や放射線への感受性を上昇させることができる。
従って、脳腫瘍幹細胞の浸潤や転移を防ぎ、癌の再発や転移を抑制することができる。また、周囲の正常な脳組織に悪影響を及ぼすことなく、脳腫瘍のみを根本的に治療することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａは、グリオーマスフェアと、分化した細胞の写真である。スケールバーは100μmを示す。図１Ｂは、グリオーマスフェアと分化した細胞におけるCD133陽性細胞をフローサイトメトリーで測定した結果である。図１Ｃは、グリオーマスフェアにおいて神経前駆細胞マーカーのNestinが発現していることを示す写真である。スケールバーは20μmである。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、TGF-β阻害剤SB431542の存在下でのスフェア形成アッセイの結果である。スケールバーは100μmである。図２Ｃは、TGF-β受容体II/Fcキメラ存在下でのスフェア形成アッセイの結果である。スケールバーは100μmである。図２Ｄは、TGF-β阻害剤A-78-03又はLY364947の存在下でのスフェア形成アッセイの結果である。図２Ｅは、TGF-βシグナルの負の調節因子Smad7存在下でのスフェア形成アッセイの結果である。図２Ｆは、SB431542を加えると、いったん形成されたスフェアが接着性細胞となることを示す写真である。
【図３】図３Ａは、TGF-β阻害剤が、グリオーマスフェアにおけるCD133陽性細胞の割合に与える影響をフローサイトメトリーで調べた結果である。図３Ｂは、TGF-β阻害剤存在下で、グリオーマスフェアにおける神経前駆細胞マーカー又は神経細胞分化マーカーの発現を調べた結果である。
【図４】図４Ａは、TGF-β又はSB431542がSox2の発現に与える影響を定量的リアルタイムRT-PCRで測定した結果である。図４Ｂは、Smad2/3に対するsiRNAが、TGF-βによるSox2発現誘導に与える影響を調べた結果である。図４Ｃは、TGF-β又はSB431542存在下でのSox2発現をタンパク質レベルで測定した結果である。図４Ｄは、siRNAによるSox2のノックダウンが、グリオーマ幹細胞のスフェア形成能に与える影響を、スフェア形成アッセイで測定した結果である。図４Ｅ及びＧは、siRNAによるSox2のノックダウンが、グリオーマ幹細胞の自己複製能に与える影響を、限界希釈アッセイによって測定した結果である。図４Ｆは、siRNAによるSox2のノックダウンが、グリオーマスフェアにおけるCD133陽性細胞の割合に与える影響をフローサイトメトリーによって測定した結果である。図４Ｈは、siRNAによるSox2のノックダウンが、全細胞におけるNestin陽性細胞とGFAP陽性細胞の割合に与える影響を調べた結果である。
【図５】図５Ａは、Sox2を過剰発現させたグリオーマ幹細胞のスフェア形成能を、TGF-β阻害剤の存在下又は非存在下でスフェア形成能アッセイによって測定した結果である。図５Ｂは、Sox2を過剰発現させたグリオーマスフェアにおけるNestin陽性細胞又はGFAP陽性細胞の割合を測定した結果である。
【図６】図６Ａは、シクロヘキシミド（CHX）存在下でのSox2発現に対するTGF-βの影響を調べた結果である。図６Ｂは、グリオーマ幹細胞とグリオーマ分化細胞とにおけるSox4の発現レベルを測定した結果である。図６Ｃは、TGF-β又はTGF-β阻害剤の存在下でのSox4のmRNAの発現レベルを測定した結果である。図６Ｄは、TGF-β又はTGF-β阻害剤の存在下でのSox4タンパク質の発現レベルを測定した結果である。図６Ｅは、TGF-βシグナルにおけるDNA結合性シグナルメディエータであるSmad複合体がSox4のプロモータに結合するか確認するために行った、Smad2/3に対する抗体を用いたクロマチン免疫沈降アッセイの結果である。図６Ｆは、シクロヘキシミド存在下でのSox4の発現に対するTGF-βの影響を調べた結果である。
【図７】図７Ａは、Sox4を過剰発現させた細胞におけるSox2 mRNAの発現レベルを測定した結果である。図７Ｂは、siRNAによるSox4のノックダウンがSox2 mRNAの発現レベルに及ぼす影響を調べた結果である。図７Ｃは、Sox4がSox2のエンハンサー領域に結合することを確認するために行ったクロマチン免疫沈降の結果である。図７Ｄは、siRNAによるSox4のノックダウンがTGF-βによるSox2発現誘導に及ぼす影響を調べた結果である。
【図８】図８Ａは、siRNAによるSox4のノックダウンがグリオーマ幹細胞のスフェア形成能に及ぼす影響を、スフェア形成アッセイによって調べた結果である。図８Ｂは、siRNAによるSox4のノックダウンがグリオーマ幹細胞の自己複製能に及ぼす影響を、限界希釈アッセイによって調べた結果である。図８Ｃは、siRNAによるSox4のノックダウンが、グリオーマスフェアにおけるCD133陽性細胞の割合に及ぼす影響をフローサイトメトリーによって測定した結果である。図８Ｄは、siRNAによるSox4のノックダウンが、グリオーマ幹細胞の分化に及ぼす影響を調べるため、全細胞中のNestin陽性細胞又はGFAP陽性細胞の割合を測定した結果である。
【図９】図９Ａは、Sox4を過剰発現が、グリオーマ幹細胞へのTGF-β阻害剤による幹細胞性維持に及ぼす影響を、スフェア形成アッセイによって調べた結果である。図９Ｂは、Sox4の過剰発現が，グリオーマ幹細胞の分化に及ぼす影響を調べるため、全細胞中のNestin陽性細胞又はGFAP陽性細胞の割合を測定した結果である。
【図１０】図１０Ａは、siRNAによるOct4のノックダウンが、グリオーマ幹細胞のスフェア形成能に与える影響を、スフェア形成アッセイで測定した結果である。図１０Ｂは、siRNAによるOct4のノックダウンが、グリオーマ幹細胞の自己複製能に与える影響を、限界希釈アッセイによって測定した結果である。図１０Ｃは、siRNAによるOct4のノックダウンが、全細胞におけるNestin陽性細胞、Musashi陽性細胞、及びGFAP陽性細胞の割合に与える影響を調べた結果である。
【図１１】図１１左は、TGF-β阻害剤で前処理をしたグリオーマ幹細胞（Adeno-LacZ, SB431542）及び未処理のグリオーマ幹細胞（Adeno-LacZ, (-)）をマウス頭蓋内に移植してその生存期間を調べた結果である。同様の条件において、Sox4を過剰発現させたグリオーマ幹細胞を用いた移植も行った（Adeno-Sox4, SB431542及びAdeno-Sox4, (-)）。同図右は、移植30日後の組織学的検査の結果を示す。左の4つの写真のスケールバーは50μm（×20）、右の写真のスケールバーは300μm（×4）である。
【図１２】図１２は、TGF-βシグナルによるグリオーマ幹細胞の幹細胞性維持の仕組みを説明する概念図である。TGF-βはSox4の発現を直接誘導し、続いてSox4がSox2の発現を促進し、グリオーマ幹細胞の幹細胞性を維持する（左）。TGF-β阻害剤は、TGF-β−Sox4−Sox2パスウェイを阻害し、グリオーマ幹細胞の分化促し、腫瘍原性を低下させる（右）。破線の矢印は、他のシグナルパスウェイが関与する可能性を示している。
【図１３】図１３は、Hedgehog-Gil1パスウェイの阻害剤シクロパミンがグリオーマ幹細胞の分化に与える影響を調べるために行ったスフェア形成アッセイの結果である。
【図１４】図１４は、グリオーマ幹細胞の分化における白血病阻止因子（LIF）の役割を調べるために行ったスフェア形成アッセイの結果である。
【図１５】図１５は、TGF-β刺激が、グリオーマ幹細胞における幹細胞マーカー（Oct4、Nanog、LIF）の発現に及ぼす影響を調べた結果である。プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（PAI-1）はポジティブコントロールとして測定した。
【図１６】図１６は、TGS-01〜TGS-05細胞におけるTGF-βの各サブタイプの発現をELISA法によって測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（脳腫瘍幹細胞の分化促進剤）
本発明に係る脳腫瘍幹細胞の分化促進剤は、TGF-β−Sox4−Sox2パスウェイを阻害する物質を含む。
本明細書において、「脳腫瘍」とは、頭蓋内組織に発生する腫瘍を意味する。脳腫瘍は、WHOによる脳腫瘍組織分類により、神経上皮組織性腫瘍（グリオーマ、脳室上衣腫、神経細胞性腫瘍、胎児型の神経外胚葉性腫瘍等）、神経鞘性腫瘍(神経鞘腫、神経線維種等)、髄膜性腫瘍（髄膜腫、その他の間葉性腫瘍等）、リンパ腫及び造血細胞性新生物、胚細胞性腫瘍（胚細胞腫、卵黄嚢腫瘍、奇形腫等）、トルコ鞍部腫瘍、転移性腫瘍に大別される。
【００１５】
本明細書において、「脳腫瘍幹細胞」とは、脳腫瘍における癌幹細胞である。脳腫瘍幹細胞は、CD133を発現することが知られ、これがマーカーとして用いられている。
【００１６】
脳腫瘍幹細胞は、分化すると腫瘍原性能を失い、抗癌剤や放射線に対して感受性を有するようになる。従って、脳腫瘍幹細胞の分化を促進させることにより、抗癌剤療法や放射線療法の効果を上昇させ、脳腫瘍の増殖そのものを抑えられるだけでなく、再発や転移リスクを抑制することができる。
本発明に係る「脳腫瘍幹細胞の分化促進剤」は、脳腫瘍幹細胞に直接作用して、その分化を促進する。脳腫瘍幹細胞が分化した細胞（以下「脳腫瘍分化細胞」と呼ぶこともある。）は、腫瘍形成能、非対称性の細胞分裂能、薬剤耐性能といった、癌幹細胞に典型的な性質を失う。
【００１７】
グリオーマにおける脳腫瘍幹細胞、即ちグリオーマ幹細胞については、上述のとおりこれまでに数々の報告がなされている。本発明の脳腫瘍幹細胞の分化促進剤は、グリオーマ幹細胞の分化促進剤としても当然に有用である。「グリオーマ幹細胞」とは、グリオーマにおける癌幹細胞であり、神経幹細胞抗原（幹細胞マーカー；例えば、Nestin、Musashi等）を発現する；EGF及びbFGFの存在下、無血清培地で培養するとニューロスフェア又はグリオーマスフェアと呼ばれる非接着性の球状の細胞塊を形成する；自己複製能を有する、等の特徴を有する。
従って、これらの性質の少なくとも一つを有することを確認することにより、グリオーマ幹細胞を同定することができる。
グリオーマ幹細胞は、強い腫瘍原性を有し、且つ、浸潤能や転移能も有する一方、抗癌剤や放射線治療に対して抵抗性を有することが知られている。
【００１８】
グリオーマ幹細胞が分化した細胞（以下「グリオーマ分化細胞」と呼ぶこともある。）は、EGF及びbFGFの存在下、無血清培地で培養してもスフェアを形成せず、接着性細胞となる；自己複製能を有しない；幹細胞マーカーを発現せず、分化細胞マーカー（例えば、GFAPやTuj1等）を発現する、等の特徴を有する。
従って、グリオーマ幹細胞において、所定の条件下でスフェア形成能が低下すること、自己複製能が低下すること、幹細胞マーカーの発現が減少すること、及び、分化細胞マーカーの発現が上昇すること、の少なくとも一つを確認することにより、グリオーマ幹細胞が分化したと判断することができる。
なお、スフェアの形成は、例えば適当な培地で細胞を培養し、形成されるスフェアの数を数えることによって評価できる。また、自己複製能は、例えば限界希釈アッセイ等を応用して評価することができる。幹細胞マーカー又は分化細胞マーカーの発現は、公知の方法（例えば、ノーザンブロッティング法、RNase Protection Assay法、RT-PCR等）に従って測定することができる。
【００１９】
なお、本明細書において「グリオーマ」とは、グリオーマ細胞から発生する腫瘍の総称であり、星状細胞系腫瘍、稀突起膠細胞系腫瘍、上衣細胞系腫瘍、脈絡叢系腫瘍等を含む。星状細胞系腫瘍は、毛様細胞性星状細胞腫（グレードI）、上衣下巨細胞性星状細胞腫（グレードI）、多型黄色星状細胞腫（グレードII）、びまん性星状細胞腫（グレードII）、退形成星状細胞腫（グレードIII）、膠芽腫（グレードIV）に分類される。稀突起膠細胞系腫瘍は、稀突起神経膠腫（グレードII）及び退形成性稀突起神経膠腫（グレードIII）に分類され、上衣細胞系腫瘍は、上衣腫（グレードII）及び退形成性上衣腫（グレードIII）に分類され、脈絡叢系腫瘍は、脈絡叢乳頭腫（グレードI）及び脈絡叢癌（グレードIII）に分類される。
【００２０】
本明細書において、「TGF-β−Sox4−Sox2パスウェイ」とは、脳腫瘍幹細胞において、TGF-βがSox4の発現を誘導し、Sox4がSox2の発現を促進するパスウェイをいう。本発明者らは、当該パスウェイが、脳腫瘍幹細胞の幹細胞性の維持に必須であることを見出した。
本明細書において、「TGF-β−Sox4−Sox2パスウェイを阻害する物質」は、当該パスウェイが脳腫瘍幹細胞の幹細胞性を維持する機能を低下又は消失させる物質である限り特に限定されず、TGF-β、Sox4及びSox2のいずれかに作用する物質であっても、当該パスウェイに直接的又は間接的に関与する他の物質を標的とするものであってもよい。当該パスウェイに間接的に関与する物質としては、例えば、Smad2、Smad3、Oct4、Smad4等が挙げられるがこれらに限定されない。
後述する実施例で示されるように、TGF-β−Sox4−Sox2パスウェイを阻害することによって、脳腫瘍幹細胞の分化が促進され、その腫瘍原性が著しく低下する。
【００２１】
本発明のTGF-β−Sox4−Sox2パスウェイを阻害する物質としては、Sox2、Sox4、TGF-β、Smad2、Smad3、及びOct4からなる群より選択される少なくとも１つに対する発現阻害物質又は機能阻害物質であることが好ましい。実施例に示されるように、Sox2、Sox4、TGF-β、Smad2、Smad3、及びOct4のいずれを阻害しても、脳腫瘍幹細胞の幹細胞性が失われ、分化が促進される。
なお、本明細書において、「発現」は、転写及び翻訳を含む概念で用いられ、発現を阻害するという場合、転写レベルで阻害することも翻訳レベルで阻害することも含みうる。
また、本明細書において、「機能」は、遺伝子、転写産物、タンパク質のいずれかの機能も含むものとし、機能を阻害するという場合は、これらのいずれかの機能の全部又は一部を阻害することを意味する。
【００２２】
（Sox2阻害物質）
Sox2は、Oct4やNanogと同様に自己複製遺伝子（self-renewal gene）の一つとして知られ、胚性幹細胞の幹細胞性の維持において重要な役割を果たす。また、Oct4、Klf4、及びc-Mycと共にヒト又はマウスの繊維芽細胞に導入すると、人工多能性幹細胞（iPS細胞）が誘導されることが報告されている（Takahashi and Yamanaka, 2006; Takahashi et al., 2007）。これまでにも、グリオーマ組織等の脳腫瘍組織においては、非悪性組織と比較して、Sox2のmRNAレベルの発現が上昇していることが報告されているが、脳腫瘍の成長においてSox2がどのような機能を果たすのか解明されていなかった。
本発明者らは、TGF-βによるSox2の発現誘導が、脳腫瘍幹細胞の幹細胞性の維持に必要であること、また、Sox2の機能又は発現を阻害することによって脳腫瘍幹細胞の分化が誘導されることを確認した。
【００２３】
Sox2の発現阻害物質又は機能阻害物質は、脳腫瘍幹細胞の幹細胞性を維持するというSox2の機能を抑制できる物質である限り特に限定されず、低分子化合物、高分子化合物、核酸、ペプチド、タンパク質等あらゆる物質を用いることができる。具体的には、Sox2の活性を中和する抗Sox2抗体、Sox2の発現を抑制する核酸等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
本明細書において「抗体」は抗体断片も含むものとし、本発明の抗Sox2抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab')2抗体、scFv、二重特異抗体、合成抗体等であり得る。
これらの抗体は、当業者に公知の方法に従って作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、Sox2で免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、Sox2で免疫した動物の血清等から得ることができる。
一旦、Sox2の活性を中和する非ヒトモノクローナル抗体が得られたら、そのアミノ酸配列を特定し、これを遺伝子組換え法により産生することもできる。また、公知の方法又はそれに準ずる方法に従って、ヒト化抗体、ヒト抗体を作製することも好ましい。
本発明の抗Sox2抗体が、Fab断片、F(ab')2抗体、scFv等の低分子抗体である場合は、低分子抗体をコードする核酸を用いて遺伝子組換え法により発現させることもでき、また、抗体をパパイン、ペプシン等の酵素で処理して作製することもできる。
【００２５】
また、「Sox2の発現を抑制する核酸」としては、RNAi効果を有する二本鎖核酸、アンチセンス核酸、リボザイム等が挙げられる。
RNAi効果は、二本鎖核酸によって誘導される配列特異的な遺伝子発現抑制機構である。標的特異性が非常に高く、生体内にもともと存在する遺伝子発現抑制メカニズムを利用する方法なので安全性が高い。
RNAi効果を有する二本鎖核酸としては、例えば、siRNAが挙げられる。siRNAは、哺乳動物細胞に用いられる場合、通常19〜30塩基程度、好ましくは21塩基〜25塩基程度の二本鎖RNAである。但し、本発明のSox2の発現抑制剤としては、酵素（Dicer）により切断されてsiRNAとなり得るより長い二本鎖RNAであってもよい。RNAi効果を有する二本鎖核酸は、一般に、その一方が標的核酸の一部と相補的な塩基配列を有し、他方がこれに相補的な配列を有する。RNAi効果を有する二本鎖核酸は、互いに3’末端に2塩基の突出塩基（オーバーハング）を有していることが一般的であるが、オーバーハングを有しないブラントエンド型であってもよい。例えば、25塩基のブラントエンドRNAは、インターフェロン応答遺伝子の活性化を最小にし、センス鎖由来のオフターゲット効果を防ぎ、血清中で安定性が非常に高いという利点を有し、in vivoでの使用にも適している。
RNAi効果を有する二本鎖核酸は、標的遺伝子の塩基配列に基づき、公知の方法に従って設計することができる。また、RNAi効果を有する二本鎖核酸は、二本鎖RNAであってもよいし、DNA-RNAキメラ型二本鎖核酸であってもよく、人工核酸や各種の修飾が施された核酸であってもよい。
Sox2に対するRNAi効果を有する二本鎖核酸としては、例えば、配列番号：１に記載の塩基配列からなるRNAと、これに相補的な塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖RNA、配列番号：２に記載の塩基配列からなるRNAと、これに相補的な塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖RNAが挙げられる。
【００２６】
アンチセンス核酸は、標的遺伝子（基本的には転写産物であるmRNA）に相補的な塩基配列を有し、一般的には10塩基長〜100塩基長、好ましくは15塩基長〜30塩基長の一本鎖核酸である。アンチセンス核酸を細胞内に導入し、標的遺伝子にハイブリダイズさせることによって遺伝子の発現が阻害される。アンチセンス核酸は、標的遺伝子の発現阻害効果が得られる限り、標的遺伝子と完全に相補的でなくてもよい。アンチセンス核酸は、公知のソフトウエア等を用いて当業者が適宜設計することができる。アンチセンス核酸は、DNA、RNA、DNA-RNAキメラのいずれであってもよく、また修飾されていてもよい。
【００２７】
リボザイムは、標的RNAを触媒的に加水分解する核酸分子であり、標的RNAと相補的な配列を有するアンチセンス領域と、切断反応を担う触媒中心領域から構成されている。リボザイムは当業者が公知の方法に従って適宜設計することができる。リボザイムは一般的にはRNA分子であるが、DNA-RNAキメラ型分子を用いることもできる。
【００２８】
また、上述したRNAi効果を有する二本鎖核酸、アンチセンス核酸、リボザイムのいずれかをコードする核酸も、本発明のSox2の発現抑制物質として用いることができる。かかる核酸を含むベクターを細胞内に導入すれば、細胞内でRNAi効果を有する二本鎖核酸、アンチセンス核酸、及びリボザイムが発現し、それぞれSox2の発現抑制効果を発揮する。
RNAi効果を有する二本鎖核酸をコードする核酸としては、二本鎖のそれぞれをコードするDNAを用いてもよいし、二本鎖核酸がループを介して連結されてできる一本鎖核酸をコードするDNAを用いてもよい。後者の場合、細胞内で転写により得られる一本鎖RNAは、その相補的な部分が分子内でハイブリダイズし、ヘアピン型の構造を取る。このRNAはshRNA（short hairpin RNA）と呼ばれる。shRNAは細胞質に移行すると酵素（Dicer）によってループ部分が切断され、二本鎖RNAとなって、RNAi効果を発揮する。
【００２９】
（Sox4阻害物質）
Sox2は神経幹細胞の幹細胞性に重要な分子として知られていたが、幹細胞性に関するSox4の機能ついてはこれまでに報告がない。Sox4が、正常脳組織と比較して、グリオーマ組織等の脳腫瘍組織において過剰に発現していることは報告されているが、脳腫瘍の成長においてどのような役割を果たすかは明らかにされていなかった。
本発明者らは、Sox4が、Sox2のエンハンサー領域に結合してその発現を誘導し、脳腫瘍幹細胞の腫瘍原性の維持に重要な役割を果たすことを確認した。
【００３０】
Sox4の発現阻害物質又は機能阻害物質は、Sox2の発現を誘導するというSox4の機能を抑制できる物質である限り特に限定されず、低分子化合物、高分子化合物、核酸、ペプチド、タンパク質等あらゆる物質を用いることができる。具体的には、Sox4の活性を中和する抗Sox4抗体、Sox4の発現を抑制する核酸等が挙げられるが、これらに限定されない。
抗Sox4抗体やSox4の発現を抑制する核酸は、上述した抗Sox2抗体及びSox2の発現を抑制する核酸と同様に作製し、使用することができる。
また、Sox4に対するRNAi効果を有する二本鎖核酸としては、例えば、配列番号：３に記載の塩基配列からなるRNAと、これに相補的な塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖RNA、配列番号：４に記載の塩基配列からなるRNAと、これに相補的な塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖RNAが挙げられる。
【００３１】
（TGF-β阻害物質）
TGF-βシグナルは、癌抑制的な効果と癌促進的な効果を併せ持つことが知られている。即ち、ある細胞においては、癌細胞の増殖を阻害するが、別の細胞においてはその増殖を促進する。これまでにも、TGF-βに基づく癌の治療が検討されているが、その矛盾した挙動がかかるアプローチを困難にしている。
本発明者らは、脳腫瘍幹細胞においては、TGF-βがその幹細胞性を維持する機能を有していることを確認した。従って、TGF-βの機能又は発現を阻害することにより、脳腫瘍幹細胞の分化を促進することができる。
【００３２】
TGF-βの発現阻害物質又は機能阻害物質は、TGF-βがSox4の発現を誘導することを抑制できる物質である限り特に限定されず、低分子化合物、高分子化合物、核酸、ペプチド、タンパク質等あらゆる物質を用いることができる。具体的には、TGF-βの活性を中和する抗TGF-β抗体、TGF-βがTGF-β受容体に結合するのを阻害するTGF-β受容体アンタゴニスト、TGF-βの発現を抑制する核酸（アンチセンス核酸、RNAi効果を有する二本鎖核酸、リボザイム等）等が挙げられるが、これらに限定されない。
抗TGF-β抗体やTGF-βの発現を抑制する核酸は、抗Sox2抗体及びSox2の発現を抑制する核酸と同様に作製し、使用することができる。
また、TGF-βには、TGF-β1からTGF-β3の3つのサブタイプが存在し、いずれもTGF-βI型受容体及びII型受容体に結合してシグナルを伝達するが、後述する参考例に示すとおり、患者によって発現しているサブタイプが異なる。従って、TGF-β発現阻害物質又は機能阻害物質としては、TGF-β受容体アンタゴニストを用いると、いずれのサブタイプを発現する患者にも効果を有するので好ましい。
また、TGF-βの機能阻害物質としては、TGF-β受容体を標的とするものを用いることも好ましく、例えば、TGF-β受容体の発現阻害物質（TGF-β受容体の発現を抑制する核酸等）、ドミナントネガティブ（優性阻害）型のTGF-β受容体、TGF-β受容体に対する機能阻害型抗体等が挙げられる。TGF-β受容体に対する機能阻害型抗体や、TGF-β受容体の発現を抑制する核酸は、上述した抗Sox2抗体及びSox2の発現を抑制する核酸と同様に作製し、使用することができる。ドミナントネガティブ型のTGF-β受容体は、公知のものまたはそれに準ずるものを使用することができる。
本発明の脳腫瘍幹細胞の分化促進剤に好ましく用いられるTGF-βの発現阻害物質又は機能阻害物質としては、例えば、SB431542（Inman et al, 2002）、A-78-03（Tojo et al, 2005）、LY364947（Sawyer et al., 2003）等が挙げられる。
【００３３】
（Smad2及びSmad3阻害物質）
Smad2及びSmad3は、TGF-β又はTGF-βスーパーファミリーに属するアクチビンがセリン／スレオニンキナーゼ受容体に結合することにより活性化され、細胞内でのシグナルを伝達するR-Smadである。R-Smadは、Co-SmadであるSmad4と複合体を形成し、核内に移行して様々な標的遺伝子の発現を調節する。
本発明者らは、後述する実施例で示されるとおり、Smad2及びSmad3の発現を阻害することによって、Sox2の発現が抑制されることを確認した。また、Smad2/3に対する抗体を用いたクロマチン免疫沈降アッセイにより、Smad複合体がTGF-β刺激によってSox4プロモータに直接結合することを確認した。以上より、Smad2及びSmad3の阻害は、Sox2又はSox4の発現の抑制を介して、TGF-β−Sox4−Sox2パスウェイを阻害するものといえる。
【００３４】
Smad2又はSmad3の発現阻害物質又は機能阻害物質は、それを投与した結果脳腫瘍幹細胞の分化が誘導されるものである限り特に限定されず、低分子化合物、高分子化合物、核酸、ペプチド、タンパク質等あらゆる物質を用いることができる。具体的には、Smad2又はSmad3の活性を中和する抗Smad2抗体又は抗Smad3抗体、Smad2又はSmad3の発現を抑制する核酸等が挙げられるが、これらに限定されない。
抗Smad2/3抗体やSmad2/3の発現を抑制する核酸は、上述した抗Sox2抗体及びSox2の発現を抑制する核酸と同様に作製し、使用することができる。
また、Smad2に対するRNAi効果を有する二本鎖核酸としては、例えば、配列番号：５に記載の塩基配列からなるRNAと、これに相補的な塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖RNAが挙げられる。また、Smad3に対するRNAi効果を有する二本鎖核酸としては、例えば、配列番号：６に記載の塩基配列からなるRNAと、これに相補的な塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖RNAが挙げられる。
【００３５】
（Oct4阻害物質）
Oct4は、POUファミリーの転写因子であり、胚性幹細胞の幹細胞性の維持において重要な役割を果たす自己複製遺伝子（self-renewal gene）の一つとして知られ、iPS細胞の誘導にも用いられている。
本発明者らは、後述する実施例で示されるとおり、Oct4の発現を阻害することによっても脳腫瘍幹細胞の分化が誘導されることを確認した。
【００３６】
Oct4の発現阻害物質又は機能阻害物質は、それを投与した結果脳腫瘍幹細胞の分化が誘導されるものである限り特に限定されず、低分子化合物、高分子化合物、核酸、ペプチド、タンパク質等あらゆる物質を用いることができる。具体的には、Oct4の活性を中和する抗Oct4抗体、Oct4の発現を抑制する核酸等が挙げられるが、これらに限定されない。
抗Oct4抗体やOct4の発現を抑制する核酸は、上述した抗Sox2抗体及びSox2の発現を抑制する核酸と同様に作製し、使用することができる。
また、Oct4に対するRNAi効果を有する二本鎖核酸としては、例えば、配列番号： ５１に記載の塩基配列からなるRNAと、これに相補的な塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖RNA、配列番号５２に記載の塩基配列からなるRNAと、これに相補的な塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖RNAが挙げられる。
【００３７】
（治療剤）
本発明の脳腫瘍の治療剤は、上述した本発明に係る脳腫瘍幹細胞の分化促進剤を含む。
本発明の脳腫瘍の治療剤は、通常の医療製剤の形態に製剤化し、経口的又は非経口的に、全身にあるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。
本発明の脳腫瘍の治療剤の場合、特に、脳内に直接投与することも好ましい。例えば、定位脳手術法によってカニューレ等を挿入し、当該カニューレを通じて治療剤を脳腫瘍の患部に直接投与することができる。かかる方法は、薬剤を患部に直接作用させることができるとともに、他の組織に影響を与えないため好ましい。カニューレを固定したまま、一定期間薬剤を灌流させてもよい。
【００３８】
本明細書において、「通常の医療製剤」は、製剤上許容しうる担体を用いて適宜調製される。医療製剤の形態としては特に限定はなく、治療目的に応じて適宜選択して使用される。その代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤、乳剤）等が挙げられる。これら製剤は、通常用いられる方法により製造すればよい。
【００３９】
本明細書において、「製剤上許容しうる担体」は、本発明の脳腫瘍幹細胞の分化促進剤とともに投与可能な材料を意味する。製剤上許容しうる担体は、薬理学的及び製剤学的に許容されるものであればよく、特に制限されない。例えば、水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤、賦形剤、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４０】
また、本発明の治療剤が核酸を含む場合、リポソーム、高分子ミセル、カチオン性キャリア等のキャリアに核酸を封入して製剤化することができる。また、プロタミンのような核酸キャリアを利用してもよい。これらのキャリアに抗体等を結合させて、患部を標的化することも好ましい。また、核酸にコレステロール等を結合させて血中滞留性を高めることも可能である。また、本発明の医薬組成物が、siRNA等をコードする核酸を含み、投与された後細胞内で発現させるものである場合、当該核酸を、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターに挿入し、細胞内に投与することもできる。
【００４１】
また、本発明の治療剤に含まれる有効成分の量は、当業者が有効成分の種類に応じて適宜決定することができる。例えば、核酸の場合、投与量は、1日当たり、0.025〜1000mg/m2、好ましくは0.1〜500mg/m2であり、より好ましくは10〜400mg/m2とすることができるが、これに限定されない。
本発明の治療剤は、グリオーマ幹細胞に作用することから、長期間投与することも好ましい。例えば、2ヶ月以上、好ましくは3ヶ月以上継続して投与することができる。長期間投与する場合、短い投与期間と非投与期間を交互に繰り返してもよく、例えば、投与期間と非投与期間をそれぞれ1〜10日とすることができる。
また、本発明の治療剤は、他の抗癌剤や癌の治療方法と組み合わせて用いられることも好ましい。
【００４２】
本発明の治療剤は、TGF-β−Sox4−Sox2パスウェイによって脳腫瘍幹細胞の幹細胞性が維持されているあらゆる脳腫瘍に有効である。
例えば、本発明の治療剤は、グリオーマを対象とすることができ、予後が悪く、これまで有効な治療方法がなかった退形成性星状細胞腫又は膠芽腫の治療にも好ましく用いられる。また、Sox2が腫瘍原性能に必須である髄芽腫（Sutter, R. et al., Oncogene (2010) doi:10.1038/onc.2009.472）も、本発明の治療剤が好ましく用いられる脳腫瘍の一つである。
【００４３】
なお、本明細書において治療とは、腫瘍サイズの低下（遅延又は停止）、腫瘍の転移の阻害（遅延又は停止）、腫瘍の増殖の阻害（遅延又は停止）、及び脳腫瘍と関連する一又は複数の症状の緩和、の少なくとも一つを生じさせることをいう。
【００４４】
（治療方法）
また、本発明は、患者から採取した脳腫瘍組織におけるSox2及び／又はSox4の発現レベルを測定する工程と、発現レベルが、正常組織と比較して上昇している場合に、本発明の脳腫瘍の治療剤を投与する工程と、を含む脳腫瘍の治療方法を提供する。
本発明者らはTGF-β−Sox4−Sox2パスウェイが脳腫瘍幹細胞の幹細胞性の維持に不可欠であることを示したが、生体においては、これに関与する他のパスウェイの存在も否定できない。例えば、後述する参考例に示されるとおり、グリオーマ幹細胞には、Hedgehog-Gil1パスウェイに依存するものとTGF-β−Sox4−Sox2パスウェイに依存するものの少なくとも二種類が存在し、TGF-βシグナルに依存するものの中にも、Sox-4−Sox2ではなくLIFを介するもの等が存在する。
本発明に係る治療剤は、TGF-β−Sox4−Sox2パスウェイを阻害するものであるから、患者の脳腫瘍の患部から組織を採取して、該組織における、Sox2及び／又はSox4の発現レベルを測定し、発現レベルが上昇している場合に有効である可能性が高い。
脳腫瘍組織は、例えば、定位脳手術によってカニューレを用いて患者から採取することができる。また、採取した組織におけるSox4、Sox2の発現は、例えば、ノーザンブロッティング法、RNase Protection Assay法、RT-PCR等、常法に従って行うことができる。
【００４５】
（スクリーニング方法）
本発明はさらに、患者から採取した脳腫瘍組織におけるSox2及び／又はSox4の発現レベルを測定する工程と、当該発現レベルと正常組織における発現レベルとを比較する工程と、を含む脳腫瘍の患者に対する治療方法を決定するためのスクリーニング方法をも提供する。
かかる方法により、本発明の治療剤が有効である可能性が高い患者を特定し、治療剤を投与することができる。
【００４６】
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。【００４８】
実施例で用いた材料及び手法を以下に示す。
<グリオーマ試料>
以下の実施例において、グレードIVのグリオーマのサンプルは、東京大学医学部附属病院の治験審査委員会の承認を受け、同意を得た患者（表１）から手術中に採取した。
【表１】
2010092974.tif 000002
【００４９】
<免疫染色>
グリオーマ幹細胞（glioma-initiating cells; GICs）を、ポリ-L-オルニチン（Sigma社）及びフィブロネクチン（Sigma社）でコートしたスライドグラス上に播種し、無血清培地中で、各種リガンド又は阻害剤と共に7日間培養した。
細胞を3.7％のパラホルムアルデヒドで固定し、PBSを含む0.3％Triton X-100により細胞膜を透過性にし、各種抗体と共にインキュベートした。【００５０】
<フローサイトメトリー>
細胞をsingle cellに分離し、フィコエリスリン標識CD133抗体で標識した。発現レベルを、Beckman Coulter EPICS XL flow cytometerによりEXPO32 ADCソフトウエアを使用して測定した。【００５１】
<スフェア形成アッセイ>
グリオーマ幹細胞を、ベントキャップ付き非組織培養処理フラスコ（non-tissue-culture-treated flask；BD Bioscience社）で7日間培養した。各サンプルにつき、顕微鏡下の5カ所の視野において浮遊スフェアを数えた。【００５２】
<RNAi>
以下の表に示すsiRNAをInvitrogen社から購入し、Oligofectamine transfection reagent（Invitrogen社）を使用し、説明書に従って細胞に導入した。なお、siRNAは、以下の表に示された塩基配列からなるRNAを一本鎖とするブラントエンド型の二本鎖RNAである。ネガティブコントロールとして、stealth siRNA 12935-400を使用した。
【表２】
2010092974.tif 000003
【００５３】
<アデノウイルス>
Flagタグで標識したSox2及びSox4の全長cDNAを、pENTRベクター（Invitrogen社）にクローニングし、LR Clonaseを使用してpENTRベクターとpAd/CMV/V5-DESTベクター間の組換えを介してアデノウイルスゲノムに挿入した。
Pac1でlinealizationした後、HEK293A細胞にpAd/CMV/Sox2又はpAD/CMV/Sox4を感染させた。ウイルス粒子を3回の凍結融解サイクルで単離し、HEK293A細胞に再感染させて増幅した。【００５４】
<細胞溶解及びイムノブロッティング>
1％のNonidet P-40、20mMのTris-HCl (pH7.4)、150mMのNaCl、1mMのPMSF、1%のアプロチニン及び5mMのEDTAを含む緩衝液で細胞を溶解した。細胞溶解物から精製したタンパク質をSDS-PAGEに供し、Fluoro Trans W membrane（Pall社）に移した。各種抗体を用いたイムノブロッティングを行った。【００５５】
<定量的リアルタイムPCR>
定量的リアルタイムRT-PCRは、Ikushimaら（EMBO J. 2008, 27:2955-2965）の方法に従って行った。すべてのサンプルについてトリプリケートで行った。データは、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）で正規化した。
なお、それぞれの発現解析で用いたプライマーは以下のとおりである。
【表３】
2010092974.tif 000004
【００５６】
<限界希釈アッセイ>
スフェア細胞をsingle cellに分離し、96穴プレートで200μlの無血清培地に入れた。培養7日後、each cell-plating densityに対するスフェアを含まないウェルの割合（％）を計算し、ウェルごとに、細胞数に対してプロットした。【００５７】
<クロマチン免疫沈降>
クロマチン免疫沈降はKoinumaら（Mol. Cell. Biol. 2009, 29:172-186, 10.1128/MCB. 01038-08）の方法に従って行った。reverse cross linkingの後、DNAをプロテイナーゼKで処理し、PCR Purification Kit （Qiagen社）を用いて精製した。DNAを30μlのTE中に溶出させ、PCR法又は定量的リアルタイムPCRに使用した。PCRに用いたプライマーは以下のとおりである。
【表４】
2010092974.tif 000005
<頭蓋内増殖アッセイ>
グリオーマ幹細胞（生細胞；5×104個、5μlのDMEM/F12培地中）を、5週齢の雌BALB/c nu/nuマウスの右大脳半球に、3mmの深さで定位固定的に注入した。すべての動物実験は、東京大学の動物実験委員会のポリシーに従って行った。
<マイクロアレイデータの統計解析>
マイクロアレイデータはGEO（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）及びArrayExpress（http://www.ebi.ac.uk/microarray/）から入手した。データの分析には、統計ソフトウエアRを用いた。【００５８】
実施例１．グリオーマスフェア及びグリオーマ分化細胞の調製及びそれらの特性の評価
グリオーマ幹細胞の幹細胞性が維持されるメカニズムを明らかにするために、まず、TGS-01及びTGS-04を、上記のとおり無血清培地で培養し、スフェアを得た（図１Ａ左）。いずれも自己複製能を有し、免疫不全マウスの脳内に移植したところ、もとの癌と同様の挙動を示した。
一方、同じサンプルを10％ウシ胎児血清で培養したところ、スフェアは形成されなかった（図１Ａ右）。このように培養した細胞を、以下「グリオーマ分化細胞」又は「分化細胞」と呼ぶ場合がある。【００５９】
CD133（Prominin-1）は、グリオーマ幹細胞のマーカーとして報告されている（非特許文献１参照）。そこで細胞をsingle cellに分離し、CD133の発現レベルをフローサイトメトリーで測定した。結果を図１Ｂに示す。グリオーマスフェアにおけるCD133陽性細胞の割合は、グリオーマ分化細胞と比較して増加していることが確認された（スフェアは72.0％、分化細胞は1.6％）。
さらにスフェアは連続的に継代でき、Nestin（神経前駆細胞マーカー）を発現していること、クローン化可能且つ自己複製可能な細胞であることが確認された（図１Ｃ）。
また、頭蓋内増殖アッセイにより、TGS-01及びTGS-04スフェア細胞において、グリオーマ幹細胞が増加することを実証した（データ示さず）。【００６０】
実施例２．グリオーマ幹細胞の腫瘍原性に対するTGF-βシグナル阻害の影響
グリオーマ幹細胞におけるTGF-βシグナルの役割を明らかにするため、まずTGF-βシグナルの阻害による効果を調べた。TGF-β（100pM）又はTGF-β阻害剤（SB431542、1μM）の存在下で、スフェア形成能アッセイを行った。SB431542は、TGF-βのI型受容体（ALK5）キナーゼ阻害剤である（Inman et al., Mol. Pharmacol., 2002, 62:65-74）。
結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。SB431542によって処理すると、グリオーマ幹細胞のスフェア形成能は著しく低下した。【００６１】
SB431542は、TGF-βI型受容体（ALK5）だけでなく、activin/nodal I型受容体シグナルも阻害することができるので、TGF-βシグナルの役割を確定するため、グリオーマ幹細胞に対するTGF-β受容体II/Fcキメラの効果も調べた。グリオーマ幹細胞をsingle cellに分離し、ヒトTGF-βRII/Fcキメラ（1μg/ml）又はコントロールとしてIgG1Fc（1μg/ml）の存在下で、スフェア形成アッセイを行った。結果を図２Ｃに示す。TβRII-Fcで処理したグリオーマ幹細胞は、スフェアを形成したものの効率は低かった。【００６２】
他のTGF-βシグナル阻害剤であるA-78-03（Tojo et al., Cancer Sci., 2005, 96:791-800）又はLY364947（Sawyer et al., J. Med. Chem., 2003, 46:3953-3956）による処理（図２Ｄ）や、TGF-βシグナルの内在性の負の調節因子であるSmad7のcDNAを有するアデノウイルスの感染によっても、スフェア形成アッセイで同様の結果が得られた（図２Ｅ）。さらに、SB431542の存在下では、いったん形成されたスフェア細胞の球状の成長パターンが失われ、接着性細胞となった（図２Ｆ）。
TGF-βシグナル阻害によって、グリオーマ幹細胞によるスフェアの形成数が減少したことは、自己複製能が失われたことを示唆している。【００６３】
次に、TGF-β（100pM）又はSB431542（1μM）がCD133陽性細胞の割合に与える影響をフローサイトメトリーで調べた。TGF-β阻害剤存在下では、グリオーマスフェアにおけるCD133陽性細胞の割合は減少した（図３Ａ）。
また、各細胞における神経前駆細胞マーカー又は神経細胞分化マーカーの発現を調べるために、スフェア（TGS-01）を無血清培地でsingle cellに分離し、ポリ-L-オルニチン（Sigma社）及びフィブロネクチン（Sigma社）でコートしたスライドグラス上に播種し、TGF-β（100pM）又は阻害剤SB431542（1μM）と共に無血清培地中で7日間培養した。細胞を3.7％のパラホルムアルデヒドで固定し、PBSを含む0.3％Triton X-100により細胞膜を透過性にし、抗体と共にインキュベートし、免疫染色を行った。
TGF-βシグナルの阻害は、Nestin及びMusashi（神経前駆細胞マーカー）の陽性細胞を減少させ、GFAP（星状細胞分化マーカー）又はTuj1（βIII-tubulin、神経細胞マーカー）を増加させた（図３Ｂ）。【００６４】
以上の結果から、TGF-βシグナルがグリオーマ幹細胞の腫瘍原性及び幹細胞性を維持していることが示唆された。
逆に、TGF-βを加えても、グリオーマ幹細胞のスフェア形成能、CD133陽性比、マーカー発現に大きな影響を与えなかった（図２Ａ、図３Ａ及びＢ）。これは、グリオーマ幹細胞が、TGF-βシグナルパスウェイの主要な成分をすべて発現しており、TGF-β1及びβ2タンパク質を分泌して、幹細胞性を維持するのに十分な分泌性TGF-βシグナルを産生していることによるものと考えられる。【００６５】
実施例３．Sox2によるグリオーマ幹細胞の幹細胞性の維持、及びTGF-βによるSox2発現の誘導
グリオーマ幹細胞の幹細胞性がTGF-βシグナルによって維持されるメカニズムを明らかにするために、幹細胞マーカーの発現に対するTGF-β又はSB431542の影響を調べた。
結果を図４Ａに示す。HMG-box因子の一つであるSox2のmRNA発現が、TGF-β（100pM）による処理の24時間後に誘導されたが、SB431542（1μM）で処理すると24時間後にSox2の発現は抑制され、その後7日間低い発現レベルが継続した。
対照的に、Oct4、Nanog、LIFなどの他の多能性幹細胞関連分子の発現は、TGF-β又は阻害剤による処理で大きな影響を受けなかった（図１４）。なお、いくつかの細胞において、TGF-β刺激によるNanog及びLIFが誘導されることが報告されている（Xu et al., Cell Stem Cell, 2008, 3: 196-206; Bruna et al., Cancer Cell, 2007, 11: 147-160）。【００６６】
また、TGS-01細胞にSmad2/3に対するsiRNA（siSmad2及びsiSmad3）をトランスフェクトし、24時間インキュベートし、続いてTGF-β（100pM）で24時間処理して、Sox2の発現レベルを測定した。測定値は、GAPDH mRNAで正規化した。結果を図４Ｂに示す。TGF-βによるSox2の誘導は、Smad2/3に対するsiRNAの存在下で明らかに抑制された（図４Ｂ）。このことは、Sox2発現がTGF-β−Smadシグナルによって制御されていることを示す。
さらに、TGF-β（100pM）又はSB431542（1μM）による24時間の処理で、Sox2のタンパク質レベルの発現も制御されることを確認した（図４Ｃ）。図中α-tubulinはローディングコントロールである。【００６７】
また、siRNAによるSox2発現のノックダウンが、グリオーマのスフェア形成能及び自己複製能に与える影響を調べるため、TGS-01細胞をsingle cellに分離し、コントロール（N.C.）又はSox2に対するsiRNA（siSox2 #1、siSox2 #2）を導入して7日間培養し、スフェア形成アッセイ又は限界希釈アッセイを行った。それぞれの結果を図４Ｄ、Ｅ及びＧに示す。Sox2のノックダウンによって、グリオーマ幹細胞のスフェア形成能及び自己複製能は著しく低下した。
さらに、Sox2のノックダウンがTGS-01細胞におけるCD133陽性細胞の割合に与える影響をフローサイトメトリーで測定した。結果を図４Ｆに示す。Sox2のノックダウンにより、CD133陽性細胞は減少した（75.1％から29.3％又は35.9％）。
また、siRNAによるSox2のノックダウンがグリオーマ幹細胞の分化に与える影響を調べるため、全細胞中のNestin陽性細胞及びGFAP陽性細胞の割合を測定した。Sox2をノックダウンするとNestin陽性細胞の割合は減少し、GFAP陽性細胞の割合は増加し（図４Ｈ）、分化が促進されたことが確認された。【００６８】
以上より、グリオーマ幹細胞の幹細胞性の維持にはSox2が不可欠であることがわかった。また、SB431542処理の24時間後のSox2発現のダウンレギュレーションは、グリオーマ幹細胞の幹細胞性を奪う結果ではなくむしろ原因であることが示唆された。【００６９】
実施例４．Sox2過剰発現細胞へのTGF-β阻害剤の影響
TGF-βによる幹細胞性維持におけるSox2の役割をさらに深く調べるため、Sox2のcDNAをコードするアデノウイルスを感染させ、Sox2を過剰発現させたグリオーマ幹細胞におけるTGF-β阻害剤の影響を調べた。
Sox2を過剰発現させたグリオーマ幹細胞にSB431542を投与しても、LacZを過剰発現させた細胞と比較して、わずかにスフェア形成能が低下しただけであった（図５Ａ）。また、Sox2過剰発現細胞にSB431542を投与しても、Nestin陽性細胞の割合は減少せず、GFAP陽性細胞の割合は増加しなかった（図５Ａ）ことから、グリオーマ細胞は幹細胞性を維持しているものと判断された。
これらの結果から、TGF-β阻害剤による幹細胞性のはく奪は、グリオーマ幹細胞の幹細胞性を維持するSox2の下方制御によるものであることがわかった。【００７０】
実施例５．グリオーマ幹細胞におけるSox4の役割
TGF-βによるSox2発現の誘導は刺激から24時間後に観察されたが、3時間後では観察されなかった（図４Ａ）。また、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド存在下でのSox2の発現に対するTGF-βの影響を調べた。24時間のTGF-β処理（100pM）を行い、TGF-β処理の30分前からシクロヘキシミド処理（CHX、3μg/ml）を開始し、Sox2の発現レベルを測定した。測定値は、GAPDH mRNAで正規化した。結果を図６Ａに示す。タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド存在下では、Sox2発現の誘導は低下した。
これらのことから、Sox2発現はTGF-βが直接誘導するのではなく、TGF-βが誘導する他の因子を介して制御されるものと考えられた。
そこで、TGF-βによるSox2発現誘導を仲介する遺伝子の候補を探索するために、公表されているマイクロアレイデータ（Beier et al., 2007; Bruna et al., 2007; Guenther et al., 2008; Lee et al., 2006; Tso et al., 2006）から、以下の基準で候補となる遺伝子を選択した。
(1)  腫瘍細胞と比較してグリオーマ幹細胞において発現が上昇している遺伝子
(2)  グリオーマ細胞においてTGF-βに直接誘導され、TGF-β阻害剤によって抑制される遺伝子
(3)  グリオーマ細胞における発現レベルがSox2の発現レベルと相関性を有する遺伝子
その結果、グリオーマ幹細胞において高発現している遺伝子の中から、転写因子Sox4がTGF-βの標的遺伝子であると同定した。【００７１】
また、TGS-01及びTGS-04細胞（スフェア）と、グリオーマ分化細胞とにおけるSox4のmRNA発現レベルを測定したところ、スフェアにおいて発現レベルが高くなっていることを確認した（図６Ｂ）。図中α-tubulinはローディングコントロールである。
さらに、Sox4発現がTGF-βシグナルに調節されるかどうかを確認するため、TGF-β（100pM）又はSB431542（1μM）による3時間及び24時間の処理後にSox4のmRNA量を測定し、24時間の処理後にSox4タンパク質量を測定した（それぞれ図６Ｃ及びＤ）。TGS-01及びTG-04細胞において、Sox4のmRNA発現は、TGF-β刺激の直後（3時間後）に誘導され、逆に、TGF-β阻害剤によって下方制御された。
Sox4がTGF-βの直接の標的であることを確認するため、TGF-βシグナルにおけるDNA結合性シグナルメディエータであるSmad2/3に対する抗体を用いてクロマチン免疫沈降アッセイを行った。具体的には、TGS-01細胞を、TGF-β（100pM）又はSB431542（1μM）で1.5時間処理し、溶出したDNAをリアルタイムPCR又はRT-PCRに供した。リアルタイムPCRでは、測定値をヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーぜ（HPRT）の第一イントロンで正規化した。結果を図６Ｅに示す。Smad複合体は、TGF-β刺激によってSox4のプロモータに直接結合し、この結合はSB431542によって明らかに抑制された。
さらに、TGF-βによるSox4の誘導は、シクロヘキシミドによる影響を受けなかった（図６Ｆ）。【００７２】
以上の結果から、Sox4がTGF-βシグナルの直接の標的遺伝子であることがわかった。【００７３】
実施例６．Sox2のエンハンサー領域へのSox4の結合、及び当該結合によるSox2発現の促進
Sox4の過剰発現がSox2発現に及ぼす影響を調べた。TGS-01細胞にアデノウイルス-Sox4又はLacZを感染させ、24時間後に回収して、それぞれの発現量を測定した。測定値は、GAPDH mRNAで正規化した。結果を図７Ａに示す。グリオーマ幹細胞におけるSox4の過剰発現は、Sox2の発現を上方制御した。【００７４】
また、siRNAによるSox4のノックダウンがSox2発現に及ぼす影響を調べた。結果を図７Ｂに示す。上段はSox2及びSox4のmRNAの発現レベルを示し、下段はSox4のタンパク質の発現レベルを示す。Sox4のノックダウンによってSox2の発現は抑制された（図７Ｂ）。
一方、サイトメガロウイルス（CMV）プロモータ制御下でのSox2のmRNAの発現は、siRNAによるSox4のノックダウンによって、下方制御されなかった。このことは、Sox2のmRNAがSox4に対するsiRNAの直接の標的ではないことを示している。
以上から、Sox2の発現は、Sox4によって転写レベルで上方制御されていることがわかった。【００７５】
この制御が直接的なものであるか確認するため、Sox4に対する抗体を用いたクロマチン免疫沈降を行った。これまでに、Sox2の発現の制御には、Sox2遺伝子の3’フランキング領域に位置するエンハンサー領域が重要であると報告されている（Chew et al., Mol. Cell. Biol., 2005, 25:6031-6046; Tomioka et al., Nucleic Acids Res., 2002, 30: 3202-3213）。この領域は、Sox4に対するコンセンサス結合モチーフCATTGTAを含んでいる（Liao et al., Oncogene, 2008, 27: 5578-5589）。
そこで、TGS-01細胞をTGF-β（100pM）又はSB431542（1μM）で24時間処理し、溶出したDNAを定量的リアルタイムPCRで解析した。測定値はHPRT1の第一イントロンの量で正規化した。結果を図７Ｃに示す。TGF-βによる24時間の刺激により、Sox2のエンハンサー領域へのSox4のリクルートが増加し、当該リクルートは、SB431542処理で明らかに減少した。
これらの結果は、TGF-β又はTGF-β阻害剤によるSox4発現の調節に基づくものと考えられた。
また、Sox4のノックダウンがTGF-βによるSox2発現誘導に及ぼす影響を調べるため、siRNAを感染させ、その24時間後からTGF-β処理（100pM）を24時間行い、リアルタイムPCRによってSox2 mRNAの発現レベルを測定した。結果を図７Ｄに示す。TGF-βは、Sox4をノックダウンすると、ほんのわずかしかSox2発現を誘導しなかった。【００７６】
以上より、Sox4はTGF-βによって直接誘導され、Sox2のエンハンサー領域に結合してその発現を上方制御することがわかった。【００７７】
実施例７．グリオーマ幹細胞の幹細胞性維持におけるSox4の役割
これまで、幹細胞性の維持とSox4との関係についての報告はまったくなかった。グリオーマ幹細胞におけるSox4の役割を調べるため、Sox4のノックダウンがグリオーマ幹細胞の幹細胞性に与える影響を調べた。
グリオーマ幹細胞（TGS-01）をsingle cellに分離し、siRNAによりSox4をノックダウンして、スフェア形成アッセイ及び限界希釈アッセイに供した。結果を図８Ａ及びＢに示す。Sox4をノックダウンすることにより、グリオーマ幹細胞のスフェア形成能及び自己複製能は低下した。
また、siRNAによりSox4をノックダウンしたグリオーマ幹細胞におけるCD133陽性細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した結果を図８Ｃに示す。Sox4のノックダウンによって、CD133陽性細胞の割合は減少した（72.6％から41.5％又は41.1％）。
さらに、Sox4のノックダウンがグリオーマ幹細胞の分化に及ぼす影響を調べるため、siRNAの導入後7日目に、全細胞におけるNetsin陽性細胞又はGFAP陽性細胞の割合を測定した。結果を図８Ｄに示す。Sox4のノックダウンにより、Nestin陽性細胞が減少し、GFAP陽性細胞は増加し（図８Ｄ）、分化が促進されたことがわかった。【００７８】
以上の結果から、Sox4は、グリオーマ幹細胞の幹細胞性の維持に極めて重要なパスウェイに関与していることがわかった。【００７９】
実施例８．TGF-βによるグリオーマ幹細胞の幹細胞性維持におけるSox4の役割
TGF-βに直接誘導されるSox4発現が、Sox2発現を促進し、グリオーマ幹細胞の幹細胞性を維持しているとの仮説を立て、これを検証するために、Sox4を過剰発現させたグリオーマ幹細胞に対するTGF-β阻害剤の影響を確認した。具体的には、TGS-01細胞をsingle cellに分離し、アデノウイルス-Sox4又はアデノウイルス-LacZを感染させ、SB431542（1μM）の存在下又は非存在下で7日間培養し、スフェア形成アッセイに供した。結果を図９Ａに示す。グリオーマ幹細胞でSox4を過剰発現させると、SB431542に耐性を示すようになり、スフェア形成能の低下が緩和された。
さらに、Sox4の過剰発現がグリオーマ幹細胞の分化に及ぼす影響を調べるため、同様に7日間培養した全細胞におけるNestin陽性細胞とGFAP陽性細胞の割合を測定した。結果を図９Ｂに示す。TGF-β阻害剤SB431542を投与しても、Nestin陽性細胞とGFAP陽性細胞の割合には大きな変化が見られなかった。
これらの結果から、TGF-βによる直接的なSox4発現の誘導が、グリオーマ幹細胞の幹細胞性の維持に不可欠であることがわかった。
実施例９．グリオーマ幹細胞の幹細胞性維持におけるOct4の役割
ES細胞の幹細胞性の維持において重要な役割を果たす転写因子であるOct4が、グリオーマ幹細胞の幹細胞性維持に関与するとの仮説を立て、これを検証するために、siRNAによるOct4のノックダウンを行った。
TGS-01細胞、TGS-04細胞をそれぞれsingle cellに分離し、コントロール（siNC）又はOct4に対するsiRNA（siOct4 #1又はsiOct4 #2）をトランスフェクトして7日間培養し、スフェア形成アッセイ又は限界希釈アッセイを行った。それぞれの結果を図１０Ａ及びＢに示す。Oct4のノックダウンによって、グリオーマ幹細胞のスフェア形成能及び自己複製能は著しく低下した。
また、Oct4のノックダウンがグリオーマ幹細胞の分化に与える影響を調べるため、全細胞中のNestin陽性細胞、Musashi陽性細胞、及びGFAP陽性細胞の割合を測定した。結果を図１０Ｃに示す。幹細胞マーカーであるNestin及びMusashi陽性細胞の割合は減少し、分化細胞マーカーであるGFAP陽性細胞の割合が増加しており、分化が促進されたことが確認された。【００８０】
実施例１０．in vivoにおけるTGF-βシグナル阻害の影響
幹細胞性の維持におけるSox4のin vivoでの役割を解明するため、グリオーマ幹細胞の頭蓋内での成長に対するTGF-β阻害剤とSox4の影響を頭蓋内増殖アッセイによって調べた。
具体的には、アデノウイルス-Sox4又はアデノウイルス-LacZを感染させ、TGF-β阻害剤で24処理後の又は未処理のTGS-01細胞5x104個を頭蓋内に移植した。TGF-βは、グリオーマ細胞の増殖を促進することがよく知られているので、増殖に対する効果と分化に対する効果を区別するため、SB431542処理は、継続的に行うのではなく前処理として行った。マウスは、各条件に6匹ずつ用い、Kaplan-Meier解析で評価した。p値はlong-rank検定により求めた。結果を図１１（左）に示す。SB431542で前処理したグリオーマ幹細胞を移植したマウスの生存期間は、コントロールのグリオーマ幹細胞を移植したマウスの生存期間に比較して、有意に長かった。
また、頭蓋内移植の30日後に解剖したサンプルの組織学的検査の結果を同図（右）に示す。組織切片はヘマトキシリンとエオシンで染色した。コントロールのグリオーマ幹細胞を移植したマウスは、神経学的徴候を示し、腫瘍も大きく成長していた。対照的に、SB431542で前処理したグリオーマ幹細胞を移植したマウスは、神経学的徴候を示さず、HE染色による病理検査では腫瘍が見られなかった。また、Sox4を過剰発現させたグリオーマ幹細胞では、SB431542による生存期間の延長効果は見られなかった。【００８１】
以上より、TGF-βは、Sox4を直接誘導することを介してSox2の発現を上方制御し、それによってグリオーマ幹細胞の幹細胞性を維持していること、また、TGF-β−Sox4−Sox2パスウェイの阻害はグリオーマ幹細胞の分化を促進することが示された（図１２）。【００８２】
参考例１．グリオーマ幹細胞の幹細胞性の維持に関与する他のパスウェイ
上述のとおり、本発明者らは、TGF-β−Sox4−Sox2パスウェイがグリオーマ幹細胞の幹細胞性の維持に不可欠であることを示したが、生体においては、これに関与する他のパスウェイの存在も否定できない。例えば、Hedgehog−Gil1パスウェイがグリオーマ幹細胞の幹細胞性を制御し、hedgehog阻害剤であるシクロパミンがグリオーマの腫瘍の体積を減少させ得るとの報告がある（Clement et al., Curr. Biol., 2007, 17: 165-172）。但し、Hedgehog-Gil1パスウェイの阻害がグリオーマ幹細胞の分化を促進するメカニズムは解明されていない。
そこで、hedgehog阻害剤であるシクロパミン存在下でTGS-01細胞のスフェア形成アッセイを行った。TGS-01細胞をsingle cellに分離し、シクロパミン（2.5、5、10μM; Sigma-Aldrich社）及び／又はSB431542（1μM）の存在下で7日間培養した。結果を図１３に示す。シクロパミンは、TGS-01細胞のスフェア形成能を低下させたが、その効果はSB431542より小さく、また、これらの二種類の薬剤を併用投与しても相加・相乗効果は得られなかった。これらのことから、グリオーマ幹細胞には、Hedgehog-Gil1パスウェイに依存するものと、TGF-β−Sox4−Sox2パスウェイに依存するものの少なくとも二種類が存在すると考えられた。
また、TGF-βが白血病阻止因子（leukemia inhibitory factor; LIF）の誘導を通じて、ヒト膠芽腫細胞の自己複製を促進することも報告されている（Penuelas et al., Cancer Cell, 2009, 15: 315-327）。
そこで、グリオーマ幹細胞におけるLIFの役割を調べるために、TGS-01及びTGS-04細胞をsingle cellに分離し、LIF（20ng/ml；Chemicon社）、コントロールとしてIgG1 Fc（10μg/ml）、又は抗LIF中和抗体（10μg/ml; R&D systems社）の存在下で7日間培養した。結果を図１４に示す。抗LIF中和抗体を投与した細胞のスフェア形成能は低下した。
しかし、TGS-01及びTGS-04細胞において、TGF-βシグナルはLIF発現を誘導しなかった（図１５）。これらの事実から、TGF-βシグナルは、複数の独立したパスウェイを経由してグリオーマ幹細胞の腫瘍原性を維持しているものと考えられる。
参考例２．患者によるTGF-βサブタイプの相違
TGS-01〜TGS-05細胞について、サンプルを酸性化した後、培地に分泌されたTGF-βタンパク質レベルをELISA（R&D Systems社）によって測定した。結果を図１６に示す。TGF-β1を多く発現している例（TGS-05）とTGF-β2を多く発現している例（TGS-01、03及び04）が存在することから、TGF-βのいずれかのサブタイプのみを標的とする治療法は、患者によっては効果を得られないことが示唆された。
【配列表フリーテキスト】
【００８３】
配列番号：１は、siSox2 #1を構成する二本鎖RNAのうちの一本鎖の塩基配列である。
配列番号：２は、siSox2 #2を構成する二本鎖RNAのうちの一本鎖の塩基配列である。
配列番号：３は、siSox4 #1を構成する二本鎖RNAのうちの一本鎖の塩基配列である。
配列番号：４は、siSox4 #1を構成する二本鎖RNAのうちの一本鎖の塩基配列である。
配列番号：５は、siSmad2を構成する二本鎖RNAのうちの一本鎖の塩基配列である。
配列番号：６は、siSmad3を構成する二本鎖RNAのうちの一本鎖の塩基配列である。
配列番号：７は、GAPDHの発現解析に用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：８は、GAPDHの発現解析に用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：９は、Sox2の発現解析に用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：１０は、Sox2の発現解析に用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：１１は、Sox4の発現解析に用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：１２は、Sox4の発現解析に用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：１３は、Oct4の発現解析に用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：１４は、Oct4の発現解析に用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：１５は、Nanogの発現解析に用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：１６は、Nanogの発現解析に用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：１７は、LIFの発現解析に用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：１８は、LIFの発現解析に用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：１９は、PAI-1の発現解析に用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：２０は、PAI-1の発現解析に用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：２１は、p15INK4bの発現解析に用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：２２は、p15INK4bの発現解析に用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：２３は、p21WAF1の発現解析に用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：２４は、p21WAF1の発現解析に用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：２５は、p27KIP1の発現解析に用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：２６は、p27KIP1の発現解析に用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：２７は、c-mycの発現解析に用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：２８は、c-mycの発現解析に用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：２９は、TGF-β1の発現解析に用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：３０は、TGF-β1の発現解析に用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：３１は、TGF-β2の発現解析に用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：３２は、TGF-β2の発現解析に用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：３３は、TGF-β3の発現解析に用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：３４は、TGF-β3の発現解析に用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：３５は、TGF-βII型受容体の発現解析に用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：３６は、TGF-βII型受容体の発現解析に用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：３７は、ALK5の発現解析に用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：３８は、ALK5の発現解析に用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：３９は、Smad2の発現解析に用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：４０は、Smad2の発現解析に用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：４１は、Smad3の発現解析に用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：４２は、Smad3の発現解析に用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：４３は、Smad4の発現解析に用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：４４は、Smad4の発現解析に用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：４５は、免疫沈降の際、HPRT1のPCRに用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：４６は、免疫沈降の際、HPRT1のPCRに用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：４７は、免疫沈降の際、Sox4のPCRに用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：４８は、免疫沈降の際、Sox4のPCRに用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：４９は、免疫沈降の際、Sox2のPCRに用いたフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：５０は、免疫沈降の際、Sox2のPCRに用いたリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：５１は、siOct4 #1を構成する二本鎖RNAのうちの一本鎖の塩基配列である。
配列番号：５２は、siOct4 #2を構成する二本鎖RNAのうちの一本鎖の塩基配列である。
【図１Ｂ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１Ａ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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