(57)【要約】合成樹脂を含有する幹細胞培養用足場材料であって、合成樹脂の窒素含有量が０．１質量％以上１０質量％以下である幹細胞培養用足場材料。この幹細胞培養用足場材料によれば、適度な親水性と強度を備え、幹細胞の播種後の定着性が高く、高効率に細胞増殖が可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成樹脂を含有する幹細胞培養用足場材料であって、
前記合成樹脂の窒素含有量が０．１質量％以上１０質量％以下である幹細胞培養用足場材料。
【請求項２】
前記合成樹脂が、ブレンステッド塩基性基を１モル％以上５０モル％以下含む、請求項１記載の幹細胞培養用足場材料。
【請求項３】
前記ブレンステッド塩基性基がアミン系塩基性基である請求項２記載の幹細胞培養用足場材料。
【請求項４】
前記合成樹脂が、アミン構造を有する構成単位、イミン構造を有する構成単位およびアミド構造を有する構成単位からなる群より選択される少なくとも１つを備える請求項２又は３記載の幹細胞培養用足場材料。
【請求項５】
前記合成樹脂がアミド構造を有する構成単位を備える請求項１，２，４のいずれか1項記載の幹細胞培養用足場材料。 
【請求項６】
前記合成樹脂がイミン構造を有する構成単位およびアミン構造を有する構成単位の両方を備える請求項１，２，４のいずれか1項記載の幹細胞培養用足場材料。
【請求項７】
前記幹細胞が多能性幹細胞である請求項１〜６のいずれか１項記載の幹細胞培養用足場材料。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の幹細胞培養用足場材料を備える、幹細胞培養用容器。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項記載の幹細胞培養用足場材料と、
多糖類と、を含有する幹細胞培養用担体。 
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項記載の幹細胞培養用足場材料を備える幹細胞培養用繊維。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項記載の幹細胞培養用足場材料を用いる幹細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞培養用足場材料及びそれを用いた幹細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は創薬や再生医療への応用が期待されている。幹細胞は、自己複製能と分化能を有する細胞であり、全ての細胞種へ分化可能な多能性幹細胞と、同系列の体組織の構成細胞種へのみ分化可能な組織幹細胞および組織前駆細胞がある。多能性幹細胞は、例えばヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）や、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）などのヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）等が挙げられる。幹細胞を安全に、そして再現性良く培養し、増殖させることは、これらの細胞を医療応用する上では必須の基盤技術となる。特に、再生医療の産業利用上においては、幹細胞を未分化状態で多量に扱う必要がある。そのため、天然および合成の高分子やフィーダー細胞を用いて幹細胞の増殖を行うと共に、多能性能（または多分化能）を維持する技術について広範な研究が行われている。特に天然高分子としてラミニン、ヴィトロネクチンなどの接着タンパク質やマウス肉腫由来のマトリゲルを使用すると播種後の細胞定着性が非常に高いことが知られている。【０００３】
しかし、天然高分子は生産性が非常に低いため高価であること、天然由来物質であるためロット間にバラツキが見られること、動物由来の成分による安全性上の懸念があることが課題として挙げられる。【０００４】
上記課題を解決するために、合成樹脂を使用した幹細胞培養樹脂担体が提案されている。例えば、特許文献１の実施例の欄には、マウス線維芽細胞の培養において、親水性かつ耐水性に優れる足場材を提供するためにアセタール化度が２０〜６０モル％のポリビニルアセタール化合物が開示されている。特許文献２の実施例の欄にはマウスＥＳ細胞の培養において、アクリルポリマーによって構成されたハイドロゲルが開示されている。特許文献３の実施例の欄にはマウスｉＰＳ細胞の培養において、親水性を有し、かつ柔軟なポリロタキサンゲルが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６-３１４２８５号公報
【特許文献２】特開２０１０-１５８１８０号公報
【特許文献３】特開２０１７-２３００８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１には、親水性が高いため培地中で膨潤し、足場材樹脂が剥がれる問題がある。また、幹細胞や多能性幹細胞の播種後の定着性が低く、十分に増殖しないという問題がある。特許文献２には、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム塩、および、ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミドを使用しており、親水性が高いため培地中で膨潤し、足場材樹脂が剥がれる問題がある。特許文献３には、親水性が高いため培地中で膨潤し、足場材樹脂が剥がれる問題がある。柔軟な足場材であるために心筋細胞への分化が促進されるという問題がある。【０００７】
以上より、適度な親水性と強度を備える幹細胞培養用足場材料及びそれを用いた幹細胞培養方法が求められている。
本発明は、適度な親水性と強度を備え、幹細胞の播種後の定着性が高く、高効率に細胞増殖が可能な幹細胞培養用足場材料及びそれを用いた幹細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の内容に関する。
（１）合成樹脂を含有する幹細胞培養用足場材料であって、合成樹脂の窒素含有量が０．１質量％以上１０質量％以下である幹細胞培養用足場材料。
（２）合成樹脂が、１モル％以上５０モル％以下でブレンステッド塩基性基を備える、（１）記載の幹細胞培養用足場材料。
（３）ブレンステッド塩基性基を有する化合物がアミン系塩基性基である（２）記載の幹細胞培養用足場材料。
（４）合成樹脂が、アミン構造を有する構成単位、イミン構造を有する構成単位およびアミド構造を有する構成単位からなる群より選択される少なくとも１つを備える（２）又は（３）記載の幹細胞培養用足場材料。
（５）合成樹脂がアミド構造を有する構成単位を備える（１）、（２）、（４）のいずれか１つに記載の幹細胞培養用足場材料。 
（６）合成樹脂がイミン構造を有する構成単位およびアミン構造を有する構成単位の両方を備える（１）、（２）、（４）のいずれか１つに記載の幹細胞培養用足場材料。
（７）幹細胞が多能性幹細胞である（１）〜（６）のいずれか１つに記載の幹細胞培養用足場材料。
（８）（１）〜（７）のいずれか１つに記載の幹細胞培養用足場材料を備える、幹細胞培養用容器。
（９）（１）〜（７）のいずれか１つに記載の幹細胞培養用足場材料と、
多糖類と、を含有する幹細胞培養用担体。 
（１０）（１）〜（７）のいずれか１つに記載の幹細胞培養用足場材料を備える幹細胞培養用繊維。
（１１）（１）〜（７）のいずれか１つに記載の幹細胞培養用足場材料を用いる幹細胞の培養方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、適度な親水性と強度を備え、幹細胞の播種後の定着性が高い幹細胞培養用足場材料及びそれを用いた幹細胞培養方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａは実施の形態に係る幹細胞培養用容器の斜視概念図、図１Ｂはその側面断面概念図である。
【図２】図２は実施の形態に係る６ウェル型の幹細胞培養用容器の斜視概念図である。
【図３】図３は細胞播種後２４時間後の初期接着性の評価基準を示す図である。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂのそれぞれは、実施例及び比較例に係る細胞の播種後２４時間後の位相差顕微鏡写真である。
【図５】図５は細胞播種後５日後の細胞増殖性の評価基準を示す図である。
【図６】図６Ａ及び図６Ｂのそれぞれは、実施例及び比較例に係る細胞の播種後５日後の位相差顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、実施形態を挙げて本発明の説明を行うが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１２】
［幹細胞培養用足場材料］
本発明者らは鋭意検討した結果、窒素含有量が０．１％以上１０％以下である合成樹脂を用いることで、上述の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、合成樹脂を含有する幹細胞培養用足場材料であって、合成樹脂の窒素含有量が０．１％以上１０％以下である幹細胞培養用足場材料に関する。
窒素含有量は０．３質量％以上８質量％以下がより好ましく、０．５質量％以上、５質量％以下がより好ましい。合成樹脂としては、ブレンステッド塩基性基を１モル％以上５０モル％以下含むことが好ましく、１モル％以上３０モル％以下含むことがより好ましい。
【００１３】
得られた合成樹脂の元素組成はＸ線光電子分光法（装置：アルバック・ファイ社製、多機能走査型Ｘ線光電子分光分析装置（ＸＰＳ）、ＰＨＩ  ５０００  ＶｅｒｓａＰｒｏｂｅ  ＩＩＩ）によって分析できる。検出された全元素の総量を１００％とし、全元素中における窒素の占有率（％）を窒素含有量とする。
なお、本発明の幹細胞培養用足場材料には、合成樹脂のみからなる態様が含まれる。
この幹細胞培養用足場材料は、適度な親水性と強度を備えるため、幹細胞の播種後の定着性が向上する。特にフィーダー細胞や接着タンパク質を含まない無血清培地培養において、幹細胞播種後の初期定着率が向上する。
【００１４】
幹細胞培養用足場材料は、上述の要件を満たせば成分は特に制限されないが、合成樹脂を含有することが好ましい。
合成樹脂は、重合性モノマー（以下、単に「モノマー」ともいう）を重合（重縮合も含む）して得られるポリマー（以下、単に「ポリマー」ともいう）を主成分とするものをいう。上記ポリマーは一種または二種以上の重合性モノマーのコポリマーも含む。
【００１５】
上記ポリマーとしては、例えば、（不）飽和炭化水素、芳香族炭化水素、（不）飽和脂肪酸、芳香族カルボン酸、（不）飽和ケトン、芳香族ケトン、（不）飽和アルコール、芳香族アルコール、（不）飽和アミン、芳香族アミン、（不）飽和チオール、芳香族チオール、有機ケイ素化合物の１種以上の重合性モノマーからなるポリマーが挙げられる。
具体的な上記ポリマーとしては、例えば、ポリオレフィン、ポリエーテル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、ポリエステル、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、エポキシ樹脂、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、ポリカーボネート、セルロース、ポリペプチド等が挙げられる。これらのなかでも、幹細胞の定着性の観点より、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、ポリビニルアセタールが好ましく、ポリビニルアセタールがより好ましい。
なお、これらのポリマーは、一種類で用いてもよいし、二種類以上組み合わせて用いてもよい。二種類以上のポリマーを組み合わせる場合は、二種類以上のポリマーを混合して用いてもよいし、二種類以上のポリマーの骨格を化学結合させたポリマーとして用いてもよい。したがって、合成樹脂として、複数のものを組み合わせる場合には、ポリ（メタ）アクリル酸エステルと、ポリビニルアセタールを組み合わせることが好ましい。
【００１６】
本明細書における「（メタ）アクリル酸類」とは、（メタ）アクリル酸エステル及び（メタ）アクリル酸からなる群より選択される少なくとも１種をいう。またポリ（メタ）アクリル酸類は、そのモノマーである（メタ）アクリル酸エステル又は（メタ）アクリル酸を重合することによって得られる重合体であるが、（メタ）アクリル酸エステル又は（メタ）アクリル酸以外のモノマーを共重合したものも含む。
上記（メタ）アクリル酸エステルとしては特に限定されないが、（メタ）アクリル酸アルキルエステル、（メタ）アクリル酸環状アルキルエステル、（メタ）アクリル酸アリールエステル、（メタ）アクリルアミド類、（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコール類、（メタ）アクリル酸ホスホリルコリンより選択される少なくとも１種を含有することが好ましい。
【００１７】
上記（メタ）アクリル酸アルキルエステルとしては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−プロピル（メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、イソオクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、イソノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、イソデシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、イソテトラデシル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
なお、これらの（メタ）アクリル酸アルキルエステルは、特に制限はないが、炭素原子数１〜３のアルコキシ基、テトラヒドロフルフリル基等の種々の置換基で置換されていてもよい。例としては、メトキシエチルアクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレート等が挙げられる。
上記（メタ）アクリル酸環状アルキルエステルとしては、例えば、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
上記（メタ）アクリル酸アリールエステルとしては、例えば、フェニル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
上記アクリルアミド類としては、例えば、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチル（メタ）アクリルアミド、(３−（メタ）アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド、４−（メタ）アクリロイルモルホリン、３−（メタ）アクリロイル−２−オキサゾリジノン、 Ｎ−[３−(ジメチルアミノ)プロピル]（メタ）アクリルアミド、Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロール（メタ）アクリルアミド、６−（メタ）アクリルアミドヘキサン酸などが挙げられる。
上記（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコール類としては、例えば、メトキシ-ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシ-ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヒドロキシ-ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシ-ジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシ-ジエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヒドロキシ-ジエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシ-トリエチレングルコール（メタ）アクリレート、エトキシ-トリエチレングルコール（メタ）アクリレート、ヒドロキシ-トリエチレングルコール（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
上記（メタ）アクリル酸ホスホリルコリンとしては、例えば、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが挙げられる。
（メタ）アクリル酸エステル以外のモノマーとしては、特に限定はなく、（メタ）アクリル酸、エチレン、ビニルエステル等が挙げられる。
上記（メタ）アクリル酸エステルは単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。なお、本明細書において、上記（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸及びメタクリル酸を総称するものであり、上記（メタ）アクリレートとは、アクリレート及びメタクリレートを総称するものとする。
合成樹脂のなかでも、ポリビニルアセタール樹脂を用いることが好ましい。以下、ポリビニルアセタール樹脂について説明する。
【００１８】
（ポリビニルアセタール樹脂）
ポリビニルアセタール樹脂は、ポリビニルアルコールに対して、アルデヒドによりアセタール化することにより合成される樹脂であり、側鎖にアセチル基と水酸基、そしてアセタール基を有する。ポリビニルアセタール樹脂は、側鎖にその他の置換基（アセチル基、水酸基、アセタール基以外の置換基）を有する変性ポリビニルアセタール樹脂であってもよい。その他の置換基としては、後述するブレンステッド塩基性基を有する置換基が好ましい。
【００１９】
上記アセタール化に用いられるアルデヒドとしては、炭素数１〜１０の鎖状脂肪族基、環状脂肪族基又は芳香族基を有するアルデヒドが挙げられる。これらのアルデヒドとしては、従来公知のアルデヒドを使用できる。
上記アルデヒドの種類は特に限定されないが、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、ペンタナール、ヘキサナール、ヘプタナール、オクタナール、ノナナール、デカナール、アクロレイン、ベンズアルデヒド、シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ホルミルピリジン、ホルミルイミダゾール、ホルミルピロール、ホルミルピペリジン、ホルミルピペリジン、ホルミルトリアゾール、ホルミルテトラゾール、ホルミルインドール、ホルミルイソインドール、ホルミルプリン、ホルミルプリン、ホルミルベンゾイミダゾール、ホルミルベンゾトリアゾール、ホルミルキノリン、ホルミルイソキノリン、ホルミルキノキサリン、ホルミルシンノリン、ホルミルプテリジン、ホルミルフラン、ホルミルオキソラン、ホルミルオキサン、ホルミルチオフェン、ホルミルチオラン、ホルミルチアン、ホルミルアデニン、ホルミルグアニン、ホルミルシトシン、ホルミルチミン、ホルミルウラシルなどが挙げられる。上記アルデヒドは鎖状であっても環状であっても良い。
【００２０】
上記アルデヒドはホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、ペンタナールであることが好ましく、ブチルアルデヒドがさらに好ましい。
【００２１】
上記アルデヒドの添加量としては、目的とするアセタール基量にあわせて適宜設定することができる。特に、ポリビニルアルコール１００モル％に対して、上記アルデヒドの添加量を６０〜９５モル％、好ましくは６５〜９０モル％とすると、アセタール化反応が効率よく行われ、未反応のアルデヒドも除去しやすいため好ましい。
【００２２】
上記ポリビニルアルコールはビニル化合物との共重合体であっても良い。ビニル化合物としては、エチレン、ビニルアミン、アリルアミン、ビニルピロリドン、無水マレイン酸、マレイミド、イタコン酸、（メタ）アクリル酸類が挙げられる。
【００２３】
上記（メタ）アクリル酸類のうち、（メタ）アクリル酸エステルとしては特に限定されないが、（メタ）アクリル酸アルキルエステル、（メタ）アクリル酸環状アルキルエステル、（メタ）アクリル酸アリールエステル、（メタ）アクリルアミド類、（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコール類、（メタ）アクリル酸ホスホリルコリンより選択される少なくとも１種を含有することが好ましい。
【００２４】
上記（メタ）アクリル酸アルキルエステルとしては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−プロピル（メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、イソオクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、イソノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、イソデシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、イソテトラデシル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
上記（メタ）アクリル酸環状アルキルエステルとしては、例えば、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
上記（メタ）アクリル酸アリールエステルとしては、例えば、フェニル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
上記アクリルアミド類としては、例えば、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチル（メタ）アクリルアミド、(３−（メタ）アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド、４−（メタ）アクリロイルモルホリン、３−（メタ）アクリロイル−２−オキサゾリジノン、 Ｎ−[３−(ジメチルアミノ)プロピル]（メタ）アクリルアミド、Ｎ−(２−ヒドロキシエチル)（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロール（メタ）アクリルアミド、６−（メタ）アクリルアミドヘキサン酸などが挙げられる。
上記（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコール類としては、例えば、メトキシ-ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシ-ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヒドロキシ-ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシ-ジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシ-ジエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヒドロキシ-ジエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシ-トリエチレングルコール（メタ）アクリレート、エトキシ-トリエチレングルコール（メタ）アクリレート、ヒドロキシ-トリエチレングルコール（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
上記（メタ）アクリル酸ホスホリルコリンとしては、例えば、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが挙げられる。
上記（メタ）アクリル酸類は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。なお、本明細書において、上記（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸及びメタクリル酸を総称するものであり、上記（メタ）アクリレートとは、アクリレート及びメタクリレートを総称するものとする。
【００２５】
上記アセタール化度が６０％を超えるように調整する方法は特に限定されないが、アセタール化反応の際に上記アルデヒドを過剰量添加することでアセタール化反応が十分に進行させることが可能である。
【００２６】
本明細書において、合成樹脂は、その一部にブレンステッド塩基性基を有することが好ましい。合成樹脂の一部がブレンステッド塩基性基により変性されている場合、フィーダー細胞や接着タンパク質を含まない無血清培地培養において、幹細胞播種後の初期定着率が向上し、幹細胞の培養がし易くなるからである。
【００２７】
上記ブレンステッド塩基性基は、水素イオンＨ＋を他の物質から受け取ることができる置換基の総称である。上記ブレンステッド塩基性基としては、例えば、アミン構造を有する置換基、イミン構造を有する置換基、アミド構造を有する置換基、イミド構造を有する置換基等のアミン系塩基性基が挙げられる。
従って、このような合成樹脂としては、イミン構造を有する構成単位、アミン構造を有する構成単位、アミド構造を有する構成単位、及びイミド構造を有する構成単位からなる群から選択される少なくとも一種を構成単位として含む合成樹脂が好ましい。
【００２８】
本発明において、上記イミン構造とは、Ｃ＝Ｎ結合を有する構造をいう。上記合成樹脂は、イミン構造を側鎖に有することが好ましい。また、上記イミン構造は、合成樹脂の主鎖を構成する炭素に直接結合してもよく、アルキレン基等の連結基を介して結合していてもよい。なお、上記イミン構造を側鎖に有するとは、上記イミン構造を合成樹脂のグラフト鎖に有することを含む。上記イミン構造を有する構成単位としては、例えば、下記式（１）に示す構成単位が挙げられる。
【００２９】
【化１】
2019131981.tif 000002
式（１）中、Ｒ１は、単結合、又は、アルキレン基を表し、Ｒ２は、イミン構造を有する基を表す。
【００３０】
上記式（１）中、Ｒ１がアルキレン基である場合、該アルキレン基の炭素数の好ましい下限は１、好ましい上限は１２である。上記アルキレン基の炭素数が１２を超えると、最適な強度が得られないことがある。上記Ｒ１がアルキレン基である場合、上記アルキレン基の炭素数のより好ましい上限は５である。
【００３１】
上記式（１）中、Ｒ１がアルキレン基である場合、該アルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、オクタメチレン基、デカメチレン基等の直鎖状アルキレン基、メチルメチレン基、メチルエチレン基、１−メチルペンチレン基、１，４−ジメチルブチレン基等の分岐状アルキレン基、シクロプロピレン基、シクロブチレン基、シクロヘキシレン基等の環状アルキレン基等が挙げられる。なかでも、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、
テトラメチレン基等の直鎖状アルキル基が好ましく、メチレン基、エチレン基がより好ましい。
【００３２】
上記Ｒ２としては、下記式（２）に示す官能基が挙げられる。
【００３３】
【化２】
2019131981.tif 000003
式（２）中、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜１８の炭化水素基を表し、Ｒ４は炭素数１〜１８の炭化水素基を表す。
【００３４】
上記炭化水素基としては、飽和炭化水素基、不飽和炭化水素基、芳香族系炭化水素基等が挙げられる。なお、上記炭化水素基は、飽和炭化水素基、不飽和炭化水素基、芳香族系炭化水素基のいずれか一種のみからなるものであってもよく、これらが２種以上用いられたものであってもよい。
【００３５】
上記飽和炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、へキシル基、へプチル基、２−エチルヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、オクタデシル基等が挙げられる。なかでも、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基が好ましい。
上記芳香族系炭化水素基としては、例えば、フェニル基、トルイル基、キシリル基、ｔ−ブチルフェニル基、ベンジル基等が挙げられる。
【００３６】
上記合成樹脂において、上記イミン構造を有する構成単位中、Ｒ１が単結合、Ｒ３が水素原子、メチル基又はエチル基、Ｒ４がメチル基、エチル基又はプロピル基であることが好ましい。
【００３７】
上記合成樹脂は、イミン構造を有する構成単位の含有量の好ましい下限が０．１モル％、好ましい上限が２０．０モル％である。上記イミン構造を有する構成単位の含有量が０．１モル％以上であると、経時粘度安定性が良好なものとなる。上記イミン構造を有する構成単位の含有量が２０．０モル％以下であると、幹細胞の定着性を高めることができる。上記イミン構造を有する構成単位の含有量のより好ましい下限は１．０モル％、より好ましい上限は１５．０モル％である。
【００３８】
上記合成樹脂において、合成樹脂として変性ポリビニルアセタール樹脂を用いる場合、イミン構造を有する構成単位の含有量と、後述するアセタール化度の比率（イミン構造を有する構成単位の含有量／アセタール化度）は、０．００１〜０．５が好ましい。上記範囲内とすることで、高い強度及び優れた接着性を両立して、接着後の耐久性を向上させることが可能となる。
【００３９】
上記合成樹脂は、アミン構造を有する構成単位又はアミド構造を有する構成単位を有することが好ましい。
上記合成樹脂は、上記アミン構造又はアミド構造を側鎖に有することが好ましい。また、上記アミン構造又はアミド構造は、合成樹脂の主鎖を構成する炭素に直接結合してもよく、アルキレン基等の連結基を介して結合していてもよい。更に、上記アミン構造は第一級アミンでもよく、第二級アミンでもよく、第三級アミンでもよく、第四級アミンでもよい。これらのなかでも、細胞定着性の観点より、第一級アミンが好ましい。
なお、上記アミン構造又はアミド構造を側鎖に有するとは、上記アミン構造又はアミド構造を合成樹脂のグラフト鎖に有することを意味する。
特に、上記アミン構造は、−ＮＨ２であることが好ましい。なお、本発明において、アミド構造とは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−を有する構造をいう。なかでも、上記アミン構造を有する構成単位は、下記式（３）に示す構造であることが好ましい。また、上記アミド構造を有する構成単位は、下記式（４）に示す構造であることが好ましい。
【００４０】
【化３】
2019131981.tif 000004
【００４１】
【化４】
2019131981.tif 000005
式（４）中、Ｒ５は水素原子又は炭素数１〜１０の炭化水素基を表す。なお、上記炭化水素基としては、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基が挙げられる。
【００４２】
上記アミン構造又はアミド構造を有する構成単位の含有量の好ましい下限は０．１モル％、好ましい上限は２０モル％である。上記アミン構造又はアミド構造を有する構成単位の含有量が０．１モル％以上であると、付加特性を充分なものとすることができる。上記含有量が２０モル％以下であると、溶解性が上がりすぎることがなく、沈殿法による変性ポリビニルアセタール樹脂粉末の取り出しが容易となる。上記含有量のより好ましい下限は０．５モル％、より好ましい上限は１０モル％である。なお、上記アミン構造又はアミド構造を有する構成単位の含有量はＮＭＲ等で測定可能である。また、上記アミン構造又はアミド構造を有する構成単位と、イミン構造を有する構成単位とを合計した含有量の好ましい下限は０．１モル％、好ましい上限は２０モル％である。上記含有量のより好ましい下限は０．５モル％、より好ましい上限は１０モル％である。
【００４３】
上記合成樹脂において、イミン構造とアミン構造又はアミド構造の双方を有する場合、イミン構造を有する構成単位と、アミン構造又はアミド構造を有する構成単位との含有量の比率（イミン構造を有する構成単位／アミノ基又はアミド構造を有する構成単位）は、０．５／９９．５〜９９．５／０．５であることが好ましい。上記比率が０．５／９９．５以上であると、経時粘度安定性を充分なものとすることができ、上記比率が９９．５／０．５以下であると、幹細胞の定着性の観点より架橋性能を充分に発揮することができる。上記比率のより好ましい下限は５／９５、より好ましい上限は７５／２５である。
【００４４】
上記合成樹脂としてポリビニルアセタール樹脂を用いる場合、ポリビニルアセタール樹脂のアセタール化度は特に限定されないが、好ましい下限が６０モル％、好ましい上限は９０モル％である。アセタール化度が６０モル％以上であると、幹細胞の定着性に優れ、高効率に細胞増殖を行うことができる。また、アセタール化度が９０モル％以下であると、溶剤への溶解性を良好なものとすることができる。より好ましい下限が６５モル％、より好ましい上限が８５モル％である。上記合成樹脂のアセタール度はＮＭＲ等で測定可能である。
【００４５】
上記合成樹脂としてポリビニルアセタール樹脂を用いる場合のポリビニルアセタール樹脂のアセチル基量は特に限定されず、好ましい下限が０．０００１モル％、好ましい上限が５モル％である。
【００４６】
上記合成樹脂は、アミン構造を有する構成単位、イミン構造を有する構成単位およびアミド構造を有する構成単位からなる群より選択される少なくとも１つを備えることが好ましい。
上記合成樹脂は、イミン構造を有する構成単位およびアミン構造を有する構成単位の両方を備えることが好ましい。
【００４７】
上記変性ポリビニルアセタール樹脂を作製する方法としては、例えば、上記イミン構造を有する単量体と、酢酸ビニルとを共重合させることによって得られたポリ酢酸ビニルをケン化し得られたポリビニルアルコールを、従来公知の方法によりアセタール化する方法が挙げられる。また、アミノ基又はアミド構造を有する構成単位を有するポリビニルアルコールを、従来公知の方法によりアセタール化することでイミン構造を導入する方法を用いてもよい。アミノ基又はアミド構造を有する構成単位を有するポリビニルアルコールを後変性して得られたイミン構造を有する変性ポリビニルアルコールを、従来公知の方法によりアセタール化する方法を用いてもよい。更に、未変性のポリビニルアセタール樹脂を後変性させることでイミン構造を導入してもよい。すなわち、上記変性ポリビニルアセタール樹脂は、アミノ基又はアミド構造を有する構成単位を有するポリビニルアルコールのアセタール化物であってもよい。これらのなかでは、アミノ基又はアミド構造を有する構成単位を有するポリビニルアルコールをアセタール化してなることでイミン構造を有する変性ポリビニルアセタール樹脂を得る方法が好ましい。特に、このような方法を用いる場合、アセタール化に使用するアルデヒド、酸触媒の量を過剰に添加することでイミン構造を得ることが出来る。
【００４８】
上記アルデヒドを過剰に添加する方法では、アミノ基又はアミド構造を有する構成単位を有するポリビニルアルコール１００重量部に対して、アルデヒドを７０〜１５０重量部添加することが好ましい。特に、アルデヒドとしては、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ｎ−ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、ｎ−バレルアルデヒド、フェニルアルデヒドが好ましい。
【００４９】
上記酸触媒を過剰に添加する方法では、酸触媒を全体の０．５重量％以上添加することが好ましい。また、アミノ基又はアミド構造を有する構成単位を有するポリビニルアルコール１００重量部に対して、酸触媒を５．０〜７０．０重量部添加することが好ましい。特に、酸触媒としては、塩酸、硝酸、硫酸、パラトルエンスルホン酸が好ましい。
【００５０】
上記アセタール化は、公知の方法を用いることができ、水溶媒中、水と水との相溶性のある有機溶媒との混合溶媒中、あるいは有機溶媒中で行うことが好ましい。上記水との相溶性のある有機溶媒としては、例えば、アルコール系有機溶剤を用いることができる。上記有機溶媒としては、例えば、アルコール系有機溶剤、芳香族有機溶剤、脂肪族エステル系溶剤、ケトン系溶剤、低級パラフィン系溶剤、エーテル系溶剤、アミン系溶剤等が挙げられる。上記アルコール系有機溶剤としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等が挙げられる。上記芳香族有機溶剤としては、例えば、キシレン、トルエン、エチルベンゼン、安息香酸メチル等が挙げられる。
上記脂肪族エステル系溶剤としては、例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、酪酸メチル、酪酸エチル、アセト酢酸メチル、アセト酢酸エチル等が挙げられる。
上記ケトン系溶剤としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、メチルシクロヘキサノン、ベンゾフェノン、アセトフェノン等が挙げられる。上記低級パラフィン系溶剤としては、ヘキサン、ペンタン、オクタン、シクロヘキサン、デカン等が挙げられる。上記エーテル系溶剤としては、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、プロピレングリコールジエチルエーテル等が挙げられる。上記アミド系溶剤としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルテセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、アセトアニリド等が挙げられる。
上記アミン系溶剤としては、アンモニア、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ｎ−ブチルアミン、ジｎ−ブチルアミン、トリｎ−ブチルアミン、アニリン、Ｎ−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ピリジン等が挙げられる。
これらは、単体で用いることもできるし、２種以上の溶媒を混合で用いることもできる。これらのなかでも、樹脂に対する溶解性及び精製時の簡易性の観点から、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、テトラヒドロフランが特に好ましい。
【００５１】
上記アセタール化は、酸触媒の存在下において行うことが好ましい。上記酸触媒は特に限定されず、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸等の鉱酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸等のカルボン酸や、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸等のスルホン酸が挙げられる。これらの酸触媒は、単独で用いられてもよく、２種以上の化合物を併用してもよい。なかでも、塩酸、硝酸、硫酸が好ましく、塩酸が特に好ましい。
【００５２】
上記ポリビニルアセタール樹脂は上記ビニル化合物とのグラフト共重合体であっても良い。ビニル化合物としては、エチレン、アリルアミン、ビニルピロリドン、無水マレイン酸、マレイミド、イタコン酸、（メタ）アクリル酸類が挙げられる。
【００５３】
上記グラフト共重合体は「ポリビニルアセタールからなるユニット」と「ビニル化合物からなるユニット」とを有するグラフト共重合体（以下、単に「グラフト共重合体」ともいう）を含有する。ビニル化合物とは、エテニル基（Ｈ２Ｃ＝ＣＨ−）を有する構成単位を有する化合物をいう。
本発明において、「ポリビニルアセタールからなるユニット」及び「ビニル化合物からなるユニット」とは、グラフト共重合体中に存在している「ポリビニルアセタール」、「ビニル化合物からなるユニット」のことをいう。また、ポリビニルアセタールからなるユニット及びビニル化合物からなるユニットからなるユニットを有するグラフト共重合体は、主鎖を構成する「ポリビニルアセタールからなるユニット」又は「ビニル化合物からなるユニット」に、該主鎖とは異なる側鎖を構成する「ポリビニルアセタールからなるユニット」又は「ビニル化合物からなるユニット」が結合した分岐状の共重合体のことをいう。
【００５４】
上記グラフト共重合体の分子量としては特に制限は無いが、数平均分子量（Ｍｎ）が１００００〜６０００００で、重量平均分子量（Ｍｗ）が２００００〜１２０００００で、これらの比（Ｍｗ／Ｍｎ）が２．０〜４０であることが好ましい。Ｍｎ、Ｍｗ、Ｍｗ／Ｍｎがこのような範囲であると、上記幹細胞足場材料の強度が好適に保たれる。
【００５５】
上記グラフト共重合体におけるアセタール化度は、上記キシレンにおける可溶分を重水素化ジメチルスルホキシドに溶解し、１Ｈ-ＮＭＲ測定によりアセタール化度を測定する方法等が挙げられる。
【００５６】
ポリビニルアセタール樹脂は、イミン構造を有する構成単位、アミン構造を有する構成単位、及びアミド構造を有する構成単位からなる群から選択される少なくとも一種の構成単位を、０．１〜３０モル％含むことが好ましい。播種直後の細胞接着性の観点から１〜１０モル％含むことがより好ましい。
なお、アミン構造を有する構成単位、アミド構造を有する構成単位、イミン構造を有する構成単位の含有量を確認する方法としては、例えば、１Ｈ―ＮＭＲで確認する方法等が挙げられる。
ここで、本明細書で用いられる用語の説明を行う。
「幹細胞」とは、自己複製能と分化能を有する細胞をいう。幹細胞のうち、自己複製能を有し、かつ、１つの細胞から、内胚葉、中胚葉、外胚葉の全ての細胞へ分化できるものを「多能性幹細胞」という。
多能性幹細胞としては、例えば、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell、以下「ｉＰＳ細胞」という。）、胚性幹細胞（embryonic stem cells、以下「ＥＳ細胞」という。）、Ｍｕｓｅ細胞（multilinege differentiating stress enduring cells）、胚性がん細胞（embryonic germ cell）、胚性生殖幹細胞（embryonic germ cell）、ｍＧＳ細胞（multipotent germ stem cell）等が挙げられる。
幹細胞のうち、自己複製能を有し、外胚葉系組織、内胚葉系組織、中胚葉系組織、生殖系組織のいずれかに属し、それが属している臓器の構成細胞種への限られた分化能を示すものを「組織幹細胞」および「組織前駆細胞」という。
組織幹細胞および組織前駆細胞としては、例えば、神経幹細胞、神経堤幹細胞、網膜幹細胞、角膜幹細胞、ケラチノサイト表皮幹細胞、メラノサイト幹細胞、乳腺幹細胞、肝幹細胞、腸幹細胞、気道幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、血管内皮前駆細胞、血管周皮細胞、骨格筋幹細胞、脂肪幹細胞、腎前駆細胞、精子幹細胞等が挙げられる。
本発明の幹細胞足場材料を使用することで、上記幹細胞種は特に問わないが、幹細胞足場材料として使用することができる。なかでも、多能性幹細胞、特にｉＰＳ細胞の培養に用いられることが好ましい。フィーダー細胞や接着タンパク質を含まない無血清培地培養において、幹細胞播種後の初期定着率が向上し、幹細胞の培養を好適に行うことができる。
この様な幹細胞としては、例えば「もっとよくわかる！幹細胞と再生医療」（羊土社、長船健二著）に記載の幹細胞を挙げることができる。
【００５７】
合成樹脂として、ポリビニルアセタール樹脂を用いる場合のポリビニルアセタール樹脂の重合度の下限は、１００が好ましく、２００がより好ましく、５００がさらに好ましく、１５００がさらにより好ましい。重合度が上記範囲であると、細胞培養にしようする培地で膨潤しても足場材強度を好適に保つことが出来ることから、細胞増殖性が向上する。重合度の上限は６０００が好ましく、３０００がより好ましく、２５００がさらに好ましい。重合度が上記範囲であると、取り扱い性が良く、足場材を好適に成形出来る。
【００５８】
［幹細胞の培養方法］
上述の幹細胞培養用足場材料によれば、様々な幹細胞を培養することができるが、その特性を考慮すると、幹細胞のなかでも多能性幹細胞の培養に用いることが好ましい。一般的に、多能性幹細胞は播種後の培養の定着率が低いとされているが、上述の幹細胞培養用足場材料は、培養培地の水分によって膨潤し難く、適度な親水性と強度を維持できるので、多能性幹細胞の播種後の定着率が向上するからである。
【００５９】
［幹細胞培養用容器］
本発明は上述の幹細胞培養用足場材料を用いた幹細胞培養用容器にも関する。即ち、幹細胞培養用容器であって、幹細胞培養用容器は、幹細胞の培養領域の少なくとも一部に、上述の幹細胞足場材料からなる樹脂膜を備える幹細胞培養用容器に関する。
図１Ａは実施の形態に係る幹細胞培養用容器の斜視概念図、図１Ｂはその側面断面概念図である。幹細胞培養用容器の形状は特に制限されないが、例えば図１Ａに示すような有底円柱状のシャーレ１を用意し、その底面の幹細胞の培養領域に、図１Ｂに示すように樹脂膜１２を設ける態様が挙げられる。
【００６０】
幹細胞培養用足場材料は、幹細胞の培養において、平面培養（二次元培養方法）に用いることの他に、生体内により近い状態、例えば多孔質膜やハイドロゲルなどの基材上での幹細胞の培養（三次元培養方法）に用いることができる。細胞培養用足場材料をバイオリアクター等に用いることにより、効率良く幹細胞を増殖させることができるからである。
細胞培養用足場材料は、適度な親水性と強度を備えることから、二次元培養方法に用いられることが好ましい。
【００６１】
平面培養（二次元培養方法）用容器としては、形状や大きさは特に限定されないが、１つまたは複数のウェル（穴）を備える細胞培養用テストプレートや、細胞培養用フラスコが挙げられる。例えば、図２に示すような６つのウェルを有する幹細胞培養用容器を用いることができる。上記マイクロプレートのウェルの数は限定されず、例えば、２、４、６、１２、２４、４８、９６、３８４等が挙げられる。
上記ウェルの形状は特に限定されないが、真円、楕円、三角形、正方形、長方形、五角形等が挙げられる。上記ウェル底面の形状は特に限定されないが、平底、丸底、凹凸等が挙げられる。
１つまたは複数のウェル（穴）を備える細胞培養用テストプレートや、細胞培養用フラスコの材質は特に限定されないが、高分子樹脂や金属、無機材料が挙げられる。上記高分子樹脂としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリイソプレン、シクロオレフィンポリマー、ポリイミド、ポリアミド、ポリアミドイミド、（メタ）アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン等が挙げられる。金属としては、ステンレス、銅、鉄、ニッケル、アルミ、チタン、金、銀、白金等が挙げられる。無機材料としては、酸化ケイ素（ガラス）、酸化アルミ、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化鉄、窒化ケイ素等が挙げられる。
【００６２】
上述の他にも、細胞培養用足場材料は、幹細胞を培地中で自由に浮遊させて成長させる浮遊培養方法に用いることができる。
【００６３】
［多能性幹細胞の培養方法］
多能性幹細胞の培養方法においては、合成樹脂を含有する幹細胞培養用足場材料上に細胞塊を播種することが好ましい。
細胞塊は、コンフルエントになった培養容器に細胞剥離剤を添加し、ピペッティングにより均一に破砕処理することで得ることが出来る。細胞剥離剤としては、特に限定されないが、エチレンジアミン／リン酸緩衝溶液が好ましい。細胞塊の大きさは５０〜２００μｍであることが好ましい。
【００６４】
［その他の実施の形態］
本発明は、上述の幹細胞培養用足場材料の他にも、その他の実施の形態として、幹細胞培養用足場材料を用いた発明が提供される。
例えば、上述の幹細胞培養用足場材料と、多糖類と、を含有する幹細胞培養用担体（媒体）が提供される。多糖類としては、特に制限なく様々な多糖類を用いることができる。なかでも水溶性多糖類が好ましい。
【００６５】
その他にも、幹細胞培養用足場材料を備える幹細胞培養用繊維が提供される。この場合、幹細胞培養用足場材料は、繊維上に塗布されていることが好ましい。また幹細胞培養用足場材料は、繊維中に含漬されたり、練り込まれている形態であってもよい。幹細胞培養用繊維は、フラスコなどの平面構造には接着しにくいが、線維（fibril）状構造などの立体構造には接着しやすい幹細胞の三次元培養方法に適している。幹細胞のなかでも、特に脂肪幹細胞の培養に適している。
【００６６】
上記幹細胞培養用足場材料は架橋されていても良い。架橋されることで水膨潤性を抑制し、好適に強度を上げることができるからである。幹細胞培養用足場材料に更に架橋剤を加えて架橋させてもよい。
架橋剤としては特に限定されないが、ポリアルコールやポリカルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、金属石鹸、多糖類等が挙げられる。
ポリアルコールとしては特に限定されないが、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオール、ドデカンジオール、ウンデカンジオール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ポリエチレングリコール、カテコール、ピロガロール、ジボロン酸、メチレンジボロン酸、エチレンジボロン酸、プロピレンジボロン酸、フェニレンジボロン酸、ビフェニルジボロン酸、ビスフェノール誘導体等が挙げられる。
ポリカルボン酸としては特に限定されないが、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、ポリ（メタ）アクリル酸等が挙げられる。
ヒドロキシカルボン酸としては特に限定されないが、グリコール酸、乳酸、タルトロン酸、グリセリン酸、ヒドロキシ酪酸、リンゴ酸、酒石酸、シトマル酸、クエン酸、イソクエン酸、ロイシン酸、メバロン酸、パントイン酸、リシノール酸、リシネライジン酸、セレブロン酸、キナ酸、シキミ酸、ヒドロキシ安息香酸、サリチル酸、クレオソート酸、バニリン酸、シリング酸、ピロカテク酸、レソルシル酸、プロトカテク酸、ゲンチジン酸、オルセリン酸、没食子酸、マンデル酸、ベンジル酸、アトロラクチン酸、メリロト酸、フロレト酸、クマル酸、ウンベル酸、コーヒー酸、フェルラ酸、シナピン酸、ヒドロキシステアリン酸等が挙げられる。
金属石鹸としては特に限定されないが、ステアリン酸、ラウリン酸、リシノール酸、オクチル酸などの脂肪酸と、リチウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、バリウム、亜鉛、アルミニウムなどの金属の塩が挙げられる。
多糖類としては特に限定されないが、ペクチン、グアーガム、キサンタンガム、タマリンドガム、カラギーナン、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、キチン、アガロース、カラギーナン、ヘパリン、ヒアルロン酸、キシログルカン、グルコマンナン酸等が挙げられる。
【実施例】
【００６７】
以下に、実施例及び比較例を挙げて本発明を説明するが本発明は以下の実施例に限定解釈されることはない。なお、得られた合成樹脂における、アミン構造を有する構成単位の含有量（モル％）、イミン構造を有する構成単位の含有量（モル％）、アミド構造を有する構成単位の含有量（モル）、アセタール化度（モル％）、アセチル基量（モル％）、水酸基量（モル％）は、合成樹脂をＤＭＳＯ−ｄ６（ジメチルスルホキサイド）に溶解し、１Ｈ−ＮＭＲ（核磁気共鳴スペクトル）を用いて測定した。【００６８】
［実施例１］
（ポリビニルブチラールの調製）
攪拌装置を備えた反応機に、イオン交換水２７００ｍＬ、上記式（３）に示すアミノ基を有する構成単位を２モル％含有するポリビニルアルコール（平均重合度２５０、鹸化度９７モル％）を３００ｇ投入し、攪拌しながら加熱溶解し、溶液を得た。次に、この溶液に触媒として３５質量％塩酸を、塩酸濃度が０．２質量％となるように添加し、温度を１５℃に調整した後、攪拌しながらｎ−ブチルアルデヒド(ｎ-ＢＡ)２２ｇを添加した。その後、ｎ-ブチルアルデヒド(ｎ-ＢＡ)１４８ｇを添加したところ、白色粒子状のポリビニルブチラールが析出した。析出してから１５分後に、３５質量％塩酸を、塩酸濃度が１．８質量％になるように添加し、５５０℃に加熱した後、５０℃で２時間熟成させた。次いで、溶液を冷却し、中和した後、ポリビニルブチラールを水洗し、乾燥させることにより、ポリビニルブチラールを得た。
得られたポリビニルブチラールは、平均重合度２５０、水酸基量２０モル％、アセチル基量１モル％、アセタール化度７７モル％であった。【００６９】
得られた樹脂の元素組成をＸ線光電子分光法（装置：アルバック・ファイ社製、多機能走査型Ｘ線光電子分光分析装置（ＸＰＳ）、ＰＨＩ  ５０００  ＶｅｒｓａＰｒｏｂｅ  ＩＩＩ）によって分析し、検出された全元素の総量を１００％とし、全元素中における窒素の占有率（％）を窒素含有量とした。【００７０】
（細胞培養用容器の調製）
得られたポリビニルブチラール１ｇをブタノール１９ｇに溶解させることで、ポリビニルブチラール溶液を得た。得られたポリビニルブチラール溶液１５０μＬをφ２２ｍｍのカバーガラス（松浪社製、２２丸Ｎｏ．１をエアダスターで除塵して使用）上に吐出し、スピンコーターを用いて２０００ｒｐｍ、２０秒回転させて平滑な樹脂膜を得た。得られた上記樹脂膜をカバーガラスごとφ２２ｍｍのポリスチレンディッシュに配置することにより細胞培養用容器を得た。
以下の条件において樹脂膜を備える細胞培養用容器について試験を行った。
（細胞培養試験の方法）
得られた細胞培養用容器にリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬを加えて３７℃のインキュベーター内で１時間静置した。ディッシュ内のリン酸緩衝生理食塩水を除いた後、ｈ−ｉＰＳ細胞２５３Ｇ１を１．５×１０４を播種し、培地ＴｅＳＲ Ｅ８（ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬ社製）１ｍＬおよび、ＲＯＣＫ−Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ２７６３２）１０μＭ存在下、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で培養を行った。２４時間毎に培地を７５０μＬ除き、新たなＴｅＳＲ Ｅ８ ２５０μＬを加え、ＲＯＣＫ−Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ２７６３２）１０μＭに調整することで培地交換を行った。【００７１】
（細胞塊培養試験の方法）
得られた細胞培養用容器にリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬを加えて３７℃のインキュベーター内で１時間静置後、培養容器内のリン酸緩衝生理食塩水を除いた。３５ｍｍディッシュにコンフルエント状態になったｈ−ｉＰＳ細胞２５２Ｇ１のコロニーを加え、次に１ｍＬの０．５ｍＭエチレンジアミン／リン酸緩衝溶液を加え、室温で２分静置した。その後、エチレンジアミン/リン酸緩衝溶液を除き、１ｍＬのＴｅＳＲＥ８培地でピペッティングにより５０〜２００μｍに砕かれた細胞塊を１．０×１０５を培養容器に播種し、培地ＴｅＳＲ Ｅ８（ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬ社製）１ｍＬおよび、ＲＯＣＫ−Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ２７６３２）１０μＭ存在下、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で培養を行った。２４時間毎に培地を７５０μＬ除き、新たなＴｅＳＲ Ｅ８を２５０μＬ加えることで培地交換を行った。【００７２】
（培養評価の方法）
（１）初期接着性
細胞培養試験において、細胞播種後２４時間後の細胞像を位相差顕微鏡１０×１０倍の位相差顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ７３）を用いて取得した。その際、培養容器内の最も平均的な接着形態を示す視野の画像の取得を行った。得られた画像を図３の見本１〜見本１０と照らし合わせて、接着細胞数と接着細胞形態を加味して初期接着性の評価を行った。なお、図３において、見本１から見本８に向かうほど細胞が増加していることが示されている。また見本８から見本１０に向かうほど、細胞の仮足が伸長し、より良好な接着状態にあることが示されている。得られた実施例及び比較例の結果を図４Ａ、図４Ｂにまとめて示す。
（２）細胞増殖性
細胞培養試験において、細胞播種後５日経過後の細胞像を位相差顕微鏡１０×４倍の位相差顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ７３）を用いて取得した。その際、培養容器内の最も平均的な接着形態を示す視野の画像の取得を行った。得られた画像を図５の見本１〜見本１０と照らし合わせることで細胞増殖性の評価を行った。図５において、細胞増殖によりコロニーが成長するほど高評価とした。なお、コロニーは横方向（画面の縦横方向）に成長し過ぎると縦方向（画面の手前側方向）に積み重なり始めるため、光の透過性が低くなる傾向がある。得られた実施例及び比較例の結果を図６Ａ、図６Ｂにまとめて示す。
（３）接着維持性
細胞塊培養試験において、細胞塊の接着維持可能時間を以下の基準に従って評価した。
０：培地交換後３０分未満で全ての細胞が剥離した。
１：培地交換後３０分以上接着維持したが、１時間未満で全ての細胞が剥離した。
２：培地交換後１時間以上接着維持したが、２４時間未満で全ての細胞が剥離した。
３：培地交換後２４時間以上接着維持した。
得られた細胞塊はアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色試験により未分化性が保たれていることを確認した。【００７３】
［実施例２］
上記式（３）に示すアミノ基を有する構成単位を２モル％含有するポリビニルアルコール（平均重合度２５０、鹸化度９７モル％）に代えて、平均重合度１６００、鹸化度９７モル％、上記式（３）に示すアミノ基を有する構成単位を２モル％含有するポリビニルアルコールを使用したこと以外は、実施例１と同様にして試験を行った。【００７４】
［実施例３］
上記式（３）に示すアミノ基を有する構成単位を２モル％含有するポリビニルアルコール（平均重合度２５０、鹸化度９７モル％）に代えて、平均重合度２５０、鹸化度９７モル％のポリビニルアルコールを使用すること以外は実施例１と同様にしてポリビニルアセタールを得た。得られた重合度約２５０のポリビニルアセタール１００重量部、および、Ｎ−ビニルピロリドン１重量部を５００重量部のテトラヒドロフランに溶解させて樹脂溶液を得た。得られた樹脂溶液にＩｒｇａｃｕｒｅ１８４（ＢＡＳＦ社製）０．０５重量部を溶解させ、ＰＥＴフィルム上に塗布した。塗布物を２５℃にてアイグラフィックス社製、ＵＶコンベア装置「ＥＣＳ３０１Ｇ１」を用い、３６５ｎｍの波長の光を積算光量２０００ｍＪ／ｃｍ２で照射することで複合樹脂溶液を得た。得られた複合樹脂溶液を８０℃、３時間真空乾燥させることで複合樹脂を得た。得られた樹脂について、カラムとしてＷａｔｅｒｓ社製「２６９０  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｅｌ」を用いて、ＧＰＣ法によってポリスチレン換算による重量平均分子量を測定したところ、約４万であった。得られた複合樹脂を３重量％ブタノール溶液に調整し、実施例１同様にして試験を行った。【００７５】
［実施例４］
ポリビニルアセタール１００重量部に対してＮ−ビニルピロリドン１０重量部を添加したこと以外は、実施例３と同様にして試験を行った。得られた樹脂の重量平均分子量は約６万であった。【００７６】
［実施例５］
ポリビニルアセタール１００重量部に対してＮ−ビニルピロリドン３０重量部を添加したこと以外は、実施例３と同様にして試験を行った。得られた樹脂の重量平均分子量は約５万であった。【００７７】
［実施例６］
ポリビニルアセタール１００重量部に対してＮ−イソプロピルアクリルアミド２重量部を添加したこと以外は、実施例３と同様にして試験を行った。得られた樹脂の重量平均分子量は約６万であった。【００７８】
［実施例７］
ポリビニルアセタール１００重量部に対してポリアミド２重量部を添加したこと以外は、実施例３と同様にして試験を行った。得られた樹脂の重量平均分子量は約６万であった。【００７９】
［実施例８］
ポリビニルアセタール１００重量部に対してポリ−Ｌ−リジン２重量部を添加したこと以外は、実施例３と同様にして試験を行った。得られた樹脂の重量平均分子量は約５万であった。【００８０】
［実施例９］
Ｎ−ビニルピロリドン５重量部、および、ブチルメタクリレート１５重量部、エチルアクリレート３０重量部、メチルメタクリレート５０重量部をテトラヒドロフラン３００重量部に溶解させてアクリルモノマー溶液を得た。得られたアクリルモノマー溶液にＩｒｇａｃｕｒｅ１８４（ＢＡＳＦ社製）２重量部を溶解させ、ＰＥＴフィル上に塗布した。塗布物を２５℃にてアイグラフィックス社製、ＵＶコンベア装置「ＥＣＳ３０１Ｇ１」を用い、３６５ｎｍの波長の光を積算光量２０００ｍＪ／ｃｍ２で照射することでアクリル樹脂溶液を得た。得られたアクリル樹脂溶液を８０℃、３時間真空乾燥させることでアクリル樹脂を得た。得られたアクリル樹脂を３重量％ブタノール溶液に調整し、実施例１と同様にして試験を行った。得られた樹脂の重量平均分子量は約９万であった。【００８１】
［比較例１］
足場材樹脂を用いず、ポリスチレンディッシュのみで実施例１と同様にて試験を行った。【００８２】
［比較例２］
ｎ-ブチルアルデヒドの添加量を実施例１の２２ｇ、および１４８ｇに代えて２２ｇ、および、８８ｇとしたこと以外は実施例１と同様にして試験を行った。【００８３】
［比較例３］
合成樹脂として平均重合度１０００、鹸化度９８モル％のポリビニルアルコールを使用したこと以外は、実施例１と同様にして試験を行った。【００８４】
［比較例４］
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１００重量部、酢酸エチル７５重量部、アゾビスイソブチロニトリル０．５重量部を混合し、窒素雰囲気下、６５℃で８時間重合を行うことでポリアクリルアミド樹脂を得た。得られた樹脂について、カラムとしてＷａｔｅｒｓ社製「２６９０  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｅｌ」を用いて、ＧＰＣ法によってポリスチレン換算による重量平均分子量を測定したところ、約９万（重合度約８００）であった。合成樹脂として、得られたポリアクリルアミド樹脂を使用したこと以外は実施例１と同様にして試験を行った。【００８５】
［比較例５］
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１００重量部に代えてエチルアクリレート１００重量部を使用したこと以外は比較例４と同様にして試験を行った。得られた樹脂の重量平均分子量は約６万であった。【００８６】
［比較例６］
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１００重量部に代えてブチルメタクリレート１００重量部を使用したこと以外は比較例４と同様にして試験を行った。得られた樹脂の重量平均分子量は約８万であった。【００８７】
［比較例７］
ポリビニルアセタール３０重量部に対してＮ−ビニルピロリドン７０重量部を添加したこと以外は、実施例３と同様にして試験を行った。得られた樹脂の重量平均分子量は約９万であった。【００８８】
得られた結果をまとめて表１に示す。なお、いずれの実施例及び比較例においても分化した細胞は観察されなかった。 
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月24日(2020.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成樹脂を含有する細胞培養用足場材料であって、
前記合成樹脂は、ポリ（メタ）アクリル酸エステル及びポリビニルアセタールのうち少なくとも一方を含み、
前記合成樹脂の窒素含有量が０．１質量％以上１０質量％以下である、細胞培養用足場材料（ただし、前記合成樹脂が２５℃の水１００ｇに対して１．０ｇ以上溶解可能である場合を除く）。
【請求項２】
前記合成樹脂が、ブレンステッド塩基性基を１モル％以上５０モル％以下含む、請求項１に記載の細胞培養用足場材料。
【請求項３】
前記ブレンステッド塩基性基がアミン系塩基性基である、請求項２に記載の細胞培養用足場材料。
【請求項４】
前記合成樹脂が、アミン構造を有する構成単位、イミン構造を有する構成単位およびアミド構造を有する構成単位からなる群より選択される少なくとも１つを備える、請求項２又は３に記載の細胞培養用足場材料。
【請求項５】
前記合成樹脂がアミド構造を有する構成単位を備える、請求項１，２，４のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。
【請求項６】
前記合成樹脂がイミン構造を有する構成単位およびアミン構造を有する構成単位の両方を備える、請求項１，２，４のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。
【請求項７】
前記合成樹脂は、アセタール化度が５４％以上であるポリビニルアセタールを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。
【請求項８】
前記合成樹脂は、ポリビニルブチラールを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。
【請求項９】
前記細胞が多能性幹細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料を備える、細胞培養用容器。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料と、多糖類と、を含有する、細胞培養用担体。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料を備える、細胞培養用繊維。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料を用いる、細胞の培養方法。
【国際調査報告】
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