(57)【要約】  アルスロバクター  グロビホルミス由来のケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列のうち特定のアミノ酸を置換することによって、熱安定性が向上した変異酵素が得られることを見出し、効率的にＤ−プシコースを生産できることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアルスロバクター  グロビホルミス由来の野生型ケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸変異を有し、（１）５０℃における酵素活性（Ｔ５０）に対する７０℃における酵素活性（Ｔ７０）の比：Ｔ７０／Ｔ５０、あるいは（２）未処理の酵素の５０℃における活性を１００とした場合の、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む）懸濁液で、６０℃、１時間処理した同じ酵素の５０℃における残存酵素活性：Ａが、野生型ケトース ３−エピメラーゼのＴ７０／Ｔ５０あるいはＡより高い値を示す、ケトース ３−エピメラーゼ変異体。
【請求項２】
Ｔ７０／Ｔ５０が１．０以上である、請求項１記載のケトース ３−エピメラーゼ変異体。
【請求項３】
残存酵素活性：Ａが４０以上である、請求項１または２記載のケトース ３−エピメラーゼ変異体。
【請求項４】
野生型ケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列内の少なくとも１つのアミノ酸変異が、１〜１０個の位置におけるアミノ酸置換である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のケトース ３−エピメラーゼ変異体。
【請求項５】
野生型ケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列内の、少なくとも１つのアミノ酸変異が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端から数えて下記の位置：
６、１４、２２、２６、３４、６７、６８、６９、７０、７５、９１、９５、１００、１０１、１１０、１２２、１３７、１４４、１６０、１７３、１７７、２００、２１４、２２２、２３７、２６１、２７０、２７１、２７５、２７８、２８１及び２８９、
のいずれかに存在する、請求項１記載のケトース ３−エピメラーゼ変異体。
【請求項６】
ケトース ３−エピメラーゼ変異体が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端から数えて下記の位置においてアミノ酸置換を有する変異体から選択されるケトース ３−エピメラーゼ変異体。
2019146717.tif 000013
【請求項７】
ケトース ３−エピメラーゼ変異体が、さらに下記変異体から選択される請求項６記載のケトース ３−エピメラーゼ変異体。
2019146717.tif 000014
【請求項８】
ケトース ３−エピメラーゼ変異体が、さらに下記変異体から選択される請求項６記載のケトース ３−エピメラーゼ変異体。
2019146717.tif 000015
【請求項９】
固定化担体に固定化した、請求項１〜８のいずれか一項に記載のケトース ３−エピメラーゼ変異体。
【請求項１０】
Ｄ−フルクトースに対して、請求項１〜８のいずれか一項に記載のケトース ３−エピメラーゼ変異体または請求項９記載の固定化されたケトース ３−エピメラーゼ変異体を作用させることを特徴とする、Ｄ−ケトースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱安定性が向上した新規なケトース ３−エピメラーゼ及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−プシコースは、自然界に微量にしか存在しない希少糖の一種として知られており、その甘味度は砂糖の約７０％であることから甘味料として利用されている。Ｄ−プシコースは、カロリー値がほぼゼロに近く、血糖値上昇抑制など各種生理機能を有することも知られており、機能性を有した食品素材として注目されている。このようなことから、食品産業において、Ｄ−プシコースの効率的で安全な生産方法に対する必要性が高まっている。【０００３】
一方、Ｄ−プシコースは、Ｄ−フルクトースのエピマーであることから、Ｄ−フルクトースに対してＤ−プシコース ３−エピメラーゼを作用させる生産方法が確立されている。例えば、アルスロバクター  グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０由来（特許文献１）のケトース ３−エピメラーゼやアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来（特許文献２）のＤ−プシコース ３−エピメラーゼが開示されている。また生産効率を維持するために温度による酵素の変性を抑制し、熱安定性が向上したアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のサイコース(プシコース)エピマー化酵素変異体（特許文献３）やバルクホルデリア由来Ｄ−プシコース ３−エピメラーゼ変異体（特許文献４）がＤ−プシコースの生産に利用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開２０１４／１０９２５４号公報
【特許文献２】特表２００８−５４１７５３号公報
【特許文献３】特表２０１６−５１８１３５号公報
【特許文献４】ＣＮＡ１０６３５０４９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述の通り、Ｄ−プシコース ３−エピメラーゼ等の酵素を作用させることによるＤ−プシコースの生産方法について様々な工夫がなされているが、アルスロバクター  グロビホルミスのような食品の安全性が認められた菌種に由来するＤ−プシコースの生産酵素であって、熱安定性が向上した酵素を製造する方法は、いまだ確立されていなかった。またアルスロバクター  グロビホルミス由来のケトース ３−エピメラーゼの至適温度はマグネシウム（Ｍｇ2+）の存在する条件下では６０〜８０℃であるが、反応温度が５０℃を超えた状態で長時間反応を行うと酵素活性が徐々に低下し、Ｄ−プシコースの生産が減少するという課題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、酵素を作用させてＤ−プシコースを生産する方法について種々検討したところ、アルスロバクター  グロビホルミス由来のケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列のうち特定のアミノ酸を置換することによって、熱安定性が向上した変異酵素が得られることを見出し、効率的にＤ−プシコースを生産できることを見出した。より具体的には、配列番号１で表されるアルスロバクター  グロビホルミス由来の野生型ケトース  ３−エピメラーゼのアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸変異を有し、（１）５０℃における酵素活性（Ｔ５０）に対する７０℃における酵素活性（Ｔ７０）の比：Ｔ７０／Ｔ５０、あるいは（２）未処理の酵素の５０℃における活性を１００とした場合の、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む）懸濁液で、６０℃、１時間処理した同じ酵素の５０℃における残存酵素活性：Ａが、野生型ケトース ３−エピメラーゼのＴ７０／Ｔ５０あるいはＡより高い値を示す、ケトース ３−エピメラーゼ変異体が得られることを見いだした。【０００７】
すなわち、本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下の（１）〜（９）から構成されるものである。
＜１＞配列番号１で表されるアルスロバクター  グロビホルミス由来の野生型ケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸変異を有し、（１）５０℃における酵素活性（Ｔ５０）に対する７０℃における酵素活性（Ｔ７０）の比：Ｔ７０／Ｔ５０、あるいは（２）未処理の酵素の５０℃における活性を１００とした場合の、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む）懸濁液で、６０℃、１時間処理した同じ酵素の５０℃における残存酵素活性：Ａが、野生型ケトース ３−エピメラーゼのＴ７０／Ｔ５０あるいはＡより高い値を示す、ケトース ３−エピメラーゼ変異体。
＜２＞Ｔ７０／Ｔ５０が１．０以上である、上記＜１＞記載のケトース ３−エピメラーゼ変異体。
＜３＞残存酵素活性：Ａが４０以上である、上記＜１＞又は＜２＞記載のケトース ３−エピメラーゼ変異体。
＜４＞野生型ケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列内の少なくとも１つのアミノ酸変異が、１〜１０個の位置におけるアミノ酸置換である、上記＜１＞〜＜３＞のいずれか一に記載のケトース ３−エピメラーゼ変異体。
＜５＞野生型ケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列内の、少なくとも１つのアミノ酸変異が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端から数えて下記の位置：
６、１４、２２、２６、３４、６７、６８、６９、７０、７５、９１、９５、１００、１０１、１１０、１２２、１３７、１４４、１６０、１７３、１７７、１８１、２００、２０３、２１４、２２２、２２６、２３７、２６１、２７０、２７１、２７５、２７８、２８１及び２８９、
のいずれかに存在する、上記＜１＞記載のケトース ３−エピメラーゼ変異体。
＜６＞ケトース ３−エピメラーゼ変異体が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端から数えて下記の位置に変異を有する変異体から選択されるケトース ３−エピメラーゼ変異体。
2019146717.tif 000002
＜７＞ケトース ３−エピメラーゼ変異体が、さらに下記変異体から選択される上記＜６＞記載のケトース ３−エピメラーゼ変異体。
2019146717.tif 000003
＜８＞  ケトース ３−エピメラーゼ変異体が、さらに下記変異体から選択される上記＜６＞記載のケトース ３−エピメラーゼ変異体。
2019146717.tif 000004
＜９＞固定化担体に固定化した、上記＜１＞〜＜８＞のいずれか一に記載のケトース ３−エピメラーゼ変異体。
＜１０＞Ｄ−フルクトースに対して、上記＜１＞〜＜８＞のいずれか一に記載のケトース ３−エピメラーゼ変異体または＜９＞記載の固定化されたケトース ３−エピメラーゼ変異体を作用させることを特徴とする、Ｄ−プシコースの製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、野生型と比べて熱安定性が向上した、食品の安全性が認められたアルスロバクター  グロビホルミスに由来するＤ−プシコースの生産酵素であるケトース ３−エピメラーゼ変異体を提供することができる。
本発明の熱安定性が向上したアルスロバクター  グロビホルミス由来のケトース ３−エピメラーゼ酵素変異体は、５０℃よりも高い温度で酵素活性を比較的長時間維持することができるため、これを、基質のＤ−フルクトースに作用させることで、従来のアルスロバクター  グロビホルミス由来のケトース ３−エピメラーゼ（野生型）と比較して、Ｄ−プシコースを効率的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】反応塔の運転開始から４２日目における各固定化酵素の残存活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（アルスロバクター グロビホルミス）
本発明で利用するケトース ３−エピメラーゼの野生型酵素はアルスロバクター  グロビホルミスに由来するものである。食品産業では本細菌の安全性は確認されている。アメリカにおいては、ＦＤＡのＥＡＦＵＳ（Everything Added to Food in the United States）:A Food Additive Databaseに“Glucose isomerase from immobilized arthrobacter globiformis”として収載されている。この使用法は、菌体をそのまま固定化するもので、菌体自体の安全性が非常に高いことを証明するものである。
【００１１】
また欧州においては、ＥＦＦＣＡ（The European food&feed cultures as sociation）とＩＦＤ（International Federation for the Roofing Trade）による“Inventory of Microorganisms with a documented history of use in food”において“Citrus fermentation to remove limonin and reduce bitterness”として使用されている旨が記載されている。これは、酵母等と同様に、この菌種が発酵に使われていることを示すもので、この菌種が極めて安全性が高いことを示している。
【００１２】
日本においては、アルスロバクター属は“α−アミラーゼ、イソマルトデキストラーゼ”などの酵素基原微生物として食品添加物リストに収載されている。
このように日米欧において長い使用実績があり、アルスロバクター属は安全性の高い菌種であるといえる。
【００１３】
（ケトース ３−エピメラーゼ）
（１）本発明で使用する野生型のケトース ３−エピメラーゼは、アルスロバクター  グロビホルミス由来のものである。好ましくは、アルスロバクター  グロビホルミス  Ｍ３０（寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１１１）由来のものであり、下記アミノ酸配列（配列番号１）を有する。
また、本発明の野生型ケトース ３−エピメラーゼは、好ましくは、下記（Ａ）、（Ｂ）の基質特異性を有し、且つ、下記（ａ）〜（ｆ）の理化学的性質を有するケトース ３−エピメラーゼである。
【００１４】
（配列番号１）
1        MKIGCHGLVW TGHFDAEGIR YSVQKTREAG FDLVEFPLMD PFSFDVQTAK 
51       SALAEHGLAA SASLGLSDAT DVSSEDPAVV KAGEELLNRA VDVLAELGAT
101      DFCGVIYSAM KKYMEPATAA GLANSKAAVG RVADRASDLG INVSLEVVNR
151      YETNVLNTGR QALAYLEELN RPNLGIHLDT YHMNIEESDM FSPILDTAEA
201      LRYVHIGESH RGYLGTGSVD FDTFFKALGR IGYDGPVVFE SFSSSVVAPD
251      LSRMLGIWRN LWADNEELGA HANAFIRDKL TAIKTIELH
【００１５】
野生型ケトース ３−エピメラーゼの基質特異性：
（Ａ）Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを生成する。
（Ｂ）Ｄ−またはＬ−ケトースの中ではＤ−フラクトースおよびＤ−プシコースに対する基質特異性が最も高い。
【００１６】
野生型ケトース ３−エピメラーゼの理化学的性質：
（ａ）分子量
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによるサブユニットの分子量が約３２ｋＤａであり、ゲル濾過法による分子量が１２０ｋＤａである、サブユニットの分子量が３２ｋＤａのホモテトラマー構造である。
（ｂ）至適ｐＨ
３０℃、３０分間反応、２０ｍＭのマグネシウム（Ｍｇ2+）存在下の条件で、６ないし１１。
（ｃ）至適温度
ｐＨ７．５、３０分間反応、２０ｍＭのマグネシウム（Ｍｇ2+）存在下の条件で、６０ないし８０℃。
（ｄ）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下で、少なくともｐＨ５ないし１１の範囲で安定。
（ｅ）熱安定性
ｐＨ７．５、１時間保持、４ｍＭのマグネシウムイオン（Ｍｇ2+）の存在下の条件で、約５０℃以下で安定。マグネシウムイオン（Ｍｇ2+）の非存在下の条件で、約４０℃以下で安定。
（ｆ）金属イオンによる活性化
二価マンガンイオン（Ｍｎ2+）、二価コバルトイオン（Ｃｏ2+）、カルシウム（Ｃａ2+）およびマグネシウムイオン（Ｍｇ2+）により活性化される。
【００１７】
（ケトース ３−エピメラーゼ変異体）
本発明のケトース ３−エピメラーゼ変異体は、配列番号１で表されるアルスロバクター  グロビホルミス由来の野生型ケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸変異を有し、（１）５０℃における酵素活性（Ｔ５０）に対する７０℃における酵素活性（Ｔ７０）の比：Ｔ７０／Ｔ５０、あるいは（２）未処理の酵素の５０℃における活性を１００とした場合の、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む）懸濁液で、６０℃、１時間処理した同じ酵素の５０℃における残存酵素活性：Ａが、野生型ケトース ３−エピメラーゼのＴ７０／Ｔ５０あるいはＡより高い値を示す変異体である。
【００１８】
本発明の変異型のケトース ３−エピメラーゼは、野生型のケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列をもとに一部のアミノ酸配列を特定のアミノ酸配列へ置換することにより得られたものである。
表１に示す様々な位置のアミノ酸を置換することにより酵素変異体を得て、各変異体について、熱安定性が実際に向上したか否かを試験した。
【００１９】
その結果、配列番号１で表されるアルスロバクター  グロビホルミス由来の野生型ケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸変異を有し、（１）５０℃における酵素活性（Ｔ５０）に対する７０℃における酵素活性（Ｔ７０）の比：Ｔ７０／Ｔ５０が、野生型ケトース ３−エピメラーゼのＴ７０／Ｔ５０より高い値を示すか、あるいは、（２）未処理の酵素の５０℃における活性を１００とした場合の、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む）懸濁液で、６０℃、１時間処理した同じ酵素の５０℃における残存酵素活性：Ａが、野生型ケトース ３−エピメラーゼのＡより高い値を示す変異体を得ることができた。
【００２０】
（１）５０℃における酵素活性（Ｔ５０）に対する７０℃における酵素活性（Ｔ７０）の比：Ｔ７０／Ｔ５０は、例えば、Ｄ−プシコース(２ｍＭのＭｇ2ＳＯ4を含有する、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０）溶液）を基質として、ケトース ３−エピメラーゼを５０℃又は７０℃で１０分間反応させ、反応生成物であるＤ−フルクトースを測定することによりエピメラーゼ活性を求めることができる。より具体的には、反応停止後、反応液をＨＰＬＣに供して、５０℃および７０℃の基質であるＤ−プシコースと反応生成物であるＤ−フルクトースのピーク面積比から、酵素活性を算出することができる。
このようにして算出された上記変異型ケトース ３−エピメラーゼのＴ７０／Ｔ５０が、好ましくは０．７０以上であり、より好ましくは０．８０以上であり、さらに好ましくは１．０以上であり、よりさらに好ましくは１．５以上である。
【００２１】
（２）未処理の酵素の５０℃における活性を１００とした場合の、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む）懸濁液で、６０℃、１時間処理した同じ酵素の５０℃における残存酵素活性：Ａは、例えば、酵素を５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む）懸濁液として、６０℃で１時間処理し、その後Ｄ−プシコースを基質として５０℃で１０分間反応させ、そのエピメラーゼ活性を測定して求めることができる。より具体的には、反応停止後、反応液をＨＰＬＣに供して、基質であるＤ−プシコースと反応生成物であるＤ−フルクトースのピーク面積比から、未処理酵素と、６０℃１時間処理酵素の酵素活性を算出することができる。
好ましくは、上記変異型ケトース ３−エピメラーゼの残存酵素活性：Ａは、配列番号１の野生型ケトース ３−エピメラーゼの酵素活性を１００とした場合に、４０以上であり、より好ましくは５０以上であり、さらに好ましくは６０以上であり、よりさらに好ましくは７０以上である。
【００２２】
配列番号１で表されるアルスロバクター  グロビホルミス由来の野生型ケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列内の少なくとも１つのアミノ酸変異は、上記活性を示す限り、少なくとも１つの変異であればよいが、さらに、１〜１０個の位置におけるアミノ酸の置換であることが好ましく、１〜８個の位置におけるアミノ酸の置換であることがより好ましい。
【００２３】
さらに、野生型ケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列内の少なくとも１つのアミノ酸変異は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端から数えて下記の位置のいずれかに存在することが好ましい。
位置：６、１４、２２、２６、３４、６７、６８、６９、７０、７５、９１、９５、１００、１０１、１１０、１２２、１３７、１４４、１６０、１７３、１７７、１８１、２００、２０３、２１４、２２２、２２６、２３７、２６１、２７０、２７１、２７５、２７８、２８１及び２８９
さらに、野生型ケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列内の少なくとも１つのアミノ酸変異は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端から数えて下記の位置のいずれかに存在することがより好ましい。
位置：６、１４、２２、２６、３４、６７、６８、６９、７０、７５、９１、９５、１００、１０１、１１０、１２２、１３７、１４４、１６０、１７３、１７７、２００、２１４、２２２、２３７、２６１、２７０、２７１、２７５、２７８、２８１及び２８９
【００２４】
各位置において置換により挿入されるアミノ酸の種類は、上述したＴ７０／Ｔ５０あるいは残存酵素活性：Ａを満たす限りにおいて、どのようなアミノ酸であってもよい。通常、１のアミノ酸を１の他のアミノ酸で置換することが好ましいが、カルボキシ末端においては、１のアミノ酸を１〜１０の連続するアミノ酸で置換してもよい。
【００２５】
ケトース ３−エピメラーゼ変異体は、下記の位置においてアミノ酸置換を有する変異体から選択されることがより好ましい。
2019146717.tif 000005
【００２６】
ケトース ３−エピメラーゼ変異体は、下記の位置においてアミノ酸置換を有する変異体から選択されることがよりさらに好ましい。
2019146717.tif 000006
【００２７】
よりさらに好ましくは、野生型より向上した熱安定性を示した変異体は、下記に示すアミノ酸置換を有する。本明細書において、例えば、Ｒ１６０Ａとは、配列番号１のアミノ末端から１６０番目のアルギニン（Ｒ）をアラニン（Ａ）に置換したことを示す。Ｈ２８９ＶＳＡＲＨＫＰは、配列番号１のアミノ末端から２８９番目のヒスチジン（Ｈ）をＶＳＡＲＨＫＰの配列に置換したことを示す。
2019146717.tif 000007
【００２８】
上記変異体のうちさらに好ましいケトース ３−エピメラーゼ変異体としては、ＰＭ３、ＰＭ４、ＰＭ５、ＰＭ９、ＰＭ１２、ＰＭ１４、ＰＭ１７、ＰＭ１８、ＰＭ１９、ＰＭ２３、ＰＭ２６、ＰＭ２８、ＰＭ２９、ＰＭ３１、ＰＭ３２、ＰＭ３３、ＰＭ３８、ＰＭ３９、ＰＭ４１、ＰＭ４３、ＰＭ４４、ＰＭ４５、ＰＭ４６、ＰＭ４８、ＰＭ５１、ＰＭ５５、ＰＭ５６、ＰＭ５７、ＰＭ５８、ＰＭ５９、ＰＭ６０、ＰＭ６１、ＰＭ６２、ＰＭ６３、ＰＭ６４及びＰＭ６５が挙げられる。
上記変異体のうちさらにより好ましいケトース ３−エピメラーゼ変異体としては、ＰＭ４、ＰＭ１７、ＰＭ１８、ＰＭ２３、ＰＭ２６、ＰＭ２９、ＰＭ３２、ＰＭ３３、ＰＭ３８、ＰＭ３９、ＰＭ４１、ＰＭ４３、ＰＭ４４、ＰＭ４５、ＰＭ４８、ＰＭ５１、ＰＭ５５、ＰＭ５７、ＰＭ５８、ＰＭ６０、ＰＭ６１、ＰＭ６３及びＰＭ６５が挙げられる。
上記変異体のうち、ＰＭ１７、ＰＭ２３、ＰＭ２６、ＰＭ２９、ＰＭ３２、ＰＭ３８、ＰＭ３９、ＰＭ４１、ＰＭ４３、ＰＭ５１、ＰＭ５７、ＰＭ６０、ＰＭ６１及びＰＭ６５が特に好ましい。
【００２９】
本発明のケトース ３−エピメラーゼ変異体は、野生型ケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列内の少なくとも１つのアミノ酸（より具体的には、配列番号１のアミノ酸配列内の少なくとも１つのアミノ酸）のいずれかの位置において、公知の方法を適宜使用することにより置換することができる。例えば、公知の遺伝子工学的手法により、目的の位置のアミノ酸置換を行った変異体を得ることができる。
また、本発明のケトース ３−エピメラーゼ変異体は、例えば各変異体のアミノ酸配列をコードする核酸配列を用いて、あるいはケトース ３−エピメラーゼの変異導入したＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドベクターを、大腸菌（宿主）などに導入し、目的の形質転換体を得て、製造することができる。使用する組換えベクターの種類は特に制限されることなく、当該技術分野で通常使用されるベクターであってもよい。またケトース ３−エピメラーゼを生産する組換え体は、大腸菌、バチルス、酵母、又はアグロバクテリウムを用いてもよい。
【００３０】
本発明のケトース ３−エピメラーゼ変異体は、粗酵素、又は精製酵素を液状酵素として用いてもよいが、公知の固定化手段、例えば、担体結合法、架橋法、ゲル包括法等を利用して、固定化酵素として用いてもよい。
担体結合法を利用する場合は、公知の固定化担体、例えばイオン交換樹脂、合成吸着剤、活性炭、多孔性ガラス、あるいはシリカゲルを用いることができる。固定化担体にイオン交換樹脂を用いる場合、例えば、フェノール系ゲル型弱塩基性イオン交換樹脂あるいはスチレン系マクロポーラス型弱塩基性イオン交換樹脂を使用することができる。本発明ではこれらのイオン交換樹脂の市販品を用いても良く、フェノール系ゲル型弱塩基性イオン交換樹脂の市販品として、デュオライトＡ５６１、デュオライトＡ５６８、デュオライトＰＷＡ７（以上、ダウ・デュポン社製）等が挙げられる。また、スチレン系マクロポーラス型弱塩基性イオン交換樹脂の市販品として、アンバーライトＦＰＡ９５、アンバーライトＩＲＡ９０４、アンバーライトＸＥ５８３（以上、ダウ・デュポン社製）、ピュロライトＡ１１１Ｓ、ピュロライトＡ１０３Ｓ（以上、ピュロライト社製）、ダイヤイオンＷＡ２０、ダイヤイオンＷＡ３０（以上、三菱化学社製）等が挙げられる。
【００３１】
本発明のケトース ３−エピメラーゼ変異体あるいは固定化された本発明のケトース ３−エピメラーゼ変異体を用いて、Ｄ−プシコースを効率的に生産することが可能である。
より具体的には、例えば、固定化された本発明のケトース ３−エピメラーゼ変異体を用いる場合、それが充填された反応塔にＤ−フラクトース水溶液を連続的に通過させることで、Ｄ−フラクトースの一部がＤ−プシコースに変換されたＤ−フラクトースおよびＤ−プシコースの混合水溶液を得て、その後公知の方法により脱色・脱塩・クロマト分画を施すことにより高純度なＤ−プシコース水溶液を生産することができる。その後さらに公知の方法により結晶Ｄ−プシコースを生産することもできる。
反応塔にＤ−フラクトース水溶液を通過させる際、Ｄ−フラクトース水溶液は５０〜８０℃に加温されているのが望ましく、その濃度は３０〜７０ｗｔ％であるのが望ましく、苛性ソーダ等のｐＨ調節剤でｐＨ６〜９に調整されているのが望ましい。また、反応塔にＤ−フラクトース水溶液を通過させる際の流速は、Ｄ−フラクトースからＤ−プシコースへの変換率が酵素の反応平衡に近い２０％以上となるように調節されているのが望ましい。また、酵素の活性化剤および安定剤として各種のイオン、例えば１０〜１００ｐｐｍのマグネシウムイオンや５０〜５００ｐｐｍの亜硫酸イオンを含んでいても良い。
【００３２】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明するが、本発明の内容はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３３】
（実施例）
＜ケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列内の置換部位の選定＞
まず、ケトース ３−エピメラーゼの活性および熱安定性に関わるアミノ酸配列を選定するため、本菌株に由来するケトース ３−エピメラーゼと相同性の高い一次構造（アミノ酸配列）をＢｌａｓｔにより検索した。その結果、ケトース ３−エピメラーゼと相同性が高い１２種類の酵素の一次構造情報を得ることができた。本菌株に由来する酵素の立体構造は決定されていないため、その情報を利用することができない。そこで、上記１２種類の中から立体構造が解明されている酵素種を選定し、スイスモデルおよびエネルギー最小化計算を用いて目的酵素の推定立体構造のモデルを構築した。本モデル構造と類似酵素の構造を比較することで、本酵素における構造安定性に寄与する部位を検索・抽出し、物理化学的に酵素の立体構造を熱安定化できると思われるアミノ酸の改変を行った。
熱安定性を向上させることが予想される特定のアミノ酸配列位置として、表１に示す各位置を選定し、特定のアミノ酸配列へ置換することとした。
特定のアミノ酸配列への変換とは、例えば、疎水性相互作用の向上、ペプチド主鎖のループ構造の安定化、ジスルフィド結合によるアミノ酸間の共有結合導入、空間密度向上、タンパク質Ｃ末端の伸長による会合体の安定化等において効果があると予測されるアミノ酸配列への置換とした（表１）。
【００３４】
2019146717.tif 000008
【００３５】
＜発現ベクターの作成及び大腸菌の形質転換＞
まず、表１に記載の１又は２以上置換したアミノ酸配列を含むケトース ３−エピメラーゼのＤＮＡに基づきＰＣＲ法、又は遺伝子合成サービス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により変異導入を行った。変異導入したＤＮＡ断片を大腸菌発現用のｐＱＥ６０（Ｑｉａｇｅｎ社）ベクターに組み込み、大腸菌（宿主）を形質転換した。変異導入部位はシーケンス解析により確認した。
【００３６】
＜粗酵素液の調製＞
まず、ケトース ３−エピメラーゼ変異酵素を発現する形質転換体（大腸菌）をアンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（培養液）に植菌し、３７℃で１６時間、前培養した。この前培養液を０．１ｍＭ ＩＰＴＧを含む１０〜１００倍量の本培養液に添加し、２０℃で２４時間培養し、目的の酵素発現を誘導した。次に遠心分離機にて本培養液を４℃、５，５００×ｇで２０分間遠心した。遠心後、上清を取り除き、菌体を回収した。回収した菌体を適当量の５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む）に懸濁し、４５秒間隔で１５秒間超音波破砕を６サイクル行った。その後、４℃、５，５００×ｇで２０分間遠心して上清を取り出し、粗酵素液を得た。表１の各変異酵素の粗酵素液を、上述の方法により得て、酵素活性の評価に用いた。
【００３７】
＜粗酵素液の活性評価＞
(i) ５０℃における酵素活性（Ｔ５０）に対する７０℃における酵素活性（Ｔ７０）の比：Ｔ７０／Ｔ５０の比較
ケトース ３−エピメラーゼの酵素反応は平衡反応であり、平衡状態ではおおよそＤ−プシコース：Ｄ−フルクトース＝３０：７０となるため、Ｄ−プシコースを基質とした場合のＤ−フルクトースの生成量は測定しやすい。よって、ケトース ３−エピメラーゼ活性の評価は、Ｄ−プシコースを基質として酵素反応させた場合に生じるＤ−フルクトースの生成量を測定することにより行うこととした。
具体的には、上述の方法により得られた各粗酵素液を用いて表２に示す反応条件下で酵素反応を行った。反応停止後、反応液をイオン交換樹脂による脱塩により精製し、フィルター処理し、ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣシステム（東ソー社製）、ＭＣＩＧＥＬ  ＣＫ０８ＥＣ（三菱化学社製））に供試した。ＨＰＬＣによって測定されたＤ−フルクトースのピーク面積を算出し、５０℃および７０℃のピーク面積比から、各酵素活性を算出した。酵素活性１単位は、各条件下において、Ｄ−プシコースをエピマー化し、１分間に１μｍｏｌのＤ−フルクトースを生成する酵素量と定義する。得られた結果を表４に示す。
【００３８】
＜表２＞
2019146717.tif 000009
【００３９】
測定の結果、表４よりＴ７０／Ｔ５０が野生型の活性値（０．７±０．１）よりも高い変異酵素を認めた。これらの変異酵素は、熱安定性の向上が示唆された。
先に述べたとおり、熱安定性を向上させることが予想される特定のアミノ酸配列位置として、表１に示す各位置を選定してアミノ酸配列の置換を行ったが、作成した変異体の中には、熱安定性があまり変化しないか、低下さえする場合もあり、予想に反する結果となった。
【００４０】
(ii) 未処理の酵素の５０℃における活性を１００とした場合の、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む）懸濁液で、６０℃、１時間処理した同じ酵素の５０℃における残存酵素活性：Ａの比較
次に、６０℃、１時間静置した熱処理後の酵素の残存活性を測定した。上述により得られた粗酵素液を用いて以下の表３に示す条件下で、Ｄ−プシコースを基質として熱処理後の酵素を反応させた。酵素反応停止後、氷水中で１０分間冷却した反応液をイオン交換樹脂による脱塩によって精製し、ＨＰＬＣに供試した。ＨＰＬＣによって測定されたＤ−プシコースのピーク面積を算出し、熱処理後及び未処理の酵素の５０℃における酵素活性を算出した。熱処理後の残存酵素活性は、未処理の酵素活性を１００とした場合の相対活性として算出した。得られた結果は表４に示す。
【００４１】
＜表３＞
2019146717.tif 000010
【００４２】
その結果、表４より残存酵素活性：Ａが野生型酵素の残存酵素活性値を超えた変異酵素を認めた。これらの酵素は熱安定性が高いことが示唆された。
【００４３】
2019146717.tif 000011
【００４４】
上記変異体のうち、特に、ＰＭ３、ＰＭ４、ＰＭ５、ＰＭ９、ＰＭ１２、ＰＭ１４、ＰＭ１７、ＰＭ１８、ＰＭ１９、ＰＭ２３、ＰＭ２６、ＰＭ２８、ＰＭ２９、ＰＭ３１、ＰＭ３２、ＰＭ３３、ＰＭ３８、ＰＭ３９、ＰＭ４１、ＰＭ４３、ＰＭ４４、ＰＭ４５、ＰＭ４６、ＰＭ４８、ＰＭ５１、ＰＭ５５、ＰＭ５６、ＰＭ５７、ＰＭ５８、ＰＭ５９、ＰＭ６０、ＰＭ６１、ＰＭ６２、ＰＭ６３、ＰＭ６４及びＰＭ６５については、野生型に比してＴ７０／Ｔ５０または残存酵素活性：Ａが優れていた。
またこれらの中でも特にＰＭ４、ＰＭ１７、ＰＭ１８、ＰＭ２３、ＰＭ２６、ＰＭ２９、ＰＭ３２、ＰＭ３３、ＰＭ３８、ＰＭ３９、ＰＭ４１、ＰＭ４３、ＰＭ４４、ＰＭ４５、ＰＭ４８、ＰＭ５１、ＰＭ５５、ＰＭ５７、ＰＭ５８、ＰＭ６０、ＰＭ６１、ＰＭ６３及びＰＭ６５は、野生型に比してＴ７０／Ｔ５０が１．０以上あるいは残存酵素活性：Ａが４０以上であり優れていた。
さらに、ＰＭ１７、ＰＭ２３、ＰＭ２６、ＰＭ２９、ＰＭ３２、ＰＭ３８、ＰＭ３９、ＰＭ４１、ＰＭ４３、ＰＭ５１、ＰＭ５７、ＰＭ６０、ＰＭ６１及びＰＭ６５は、野生型Ｔ７０／Ｔ５０あるいは残存酵素活性：Ａの数値に対して２倍以上の活性を示しており特に優れていた。
【００４５】
＜固定化酵素の作製＞
１．前述の＜粗酵素液の調製＞に記載した方法と同じ方法で、ＰＭ３８／４１／４３／５１／野生型（以下ＷＴ）の粗酵素液を得た。
それぞれの粗酵素液の酵素活性を、前述の＜粗酵素液の活性評価＞及び＜表２＞に記載した方法及び条件で測定した。
２．２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、平衡化させた固定化担体（イオン交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＦＰＡ９５またはＤｕｏｌｉｔｅ  Ａ５６８（ともにダウ・デュポン社製））と粗酵素液を固定化担体１ｍＬに対して粗酵素液の酵素活性６３０Ｕの割合で、バイアル瓶中で混合し、２４時間以上転倒混和した。
３．以上の方法により作製した固定化酵素は、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、使用時まで４℃の冷蔵庫中で保管した。
【００４６】
＜連続反応＞
以下の実験操作はＪＩＳ  Ｋ  ７００２：１９８８（工業用グルコースイソメラーゼ）に準じて実施した。
１．５５℃に加温された反応塔（φ１８ｍｍ×Ｌ４００ｍｍ）に固定化酵素２９ｍＬを充填し、反応原料（５０ｗｔ％果糖、２４０ｐｐｍのＭｇＳＯ4および１５０ｐｐｍのＮａ2ＳＯ3を含む）を反応塔に供給した。
２．反応塔からの流出液は１日ごとに貯留し、ＨＰＬＣ分析（＜粗酵素液の活性評価＞と同様の方法）を実施し、ＨＰＬＣクロマトグラムにおけるプシコースおよび果糖の面積ＡPsiおよびＡFruを算出した。
３．反応原料の流速は、式（１）で表す異性化率ｘが２０％以上となるように適宜調節した。
ｘ＝ＡPsi／（ＡPsi＋ＡFru）                  （１）
４．固定化酵素の酵素活性ａは式（２）により算出した。
ａ＝Ｆ／ＶＣSｘeｌｎ（ｘe／（ｘe−ｘ））      （２）
式中、Ｆは基質の流速、ＣSは基質濃度、ｘeはみかけの平衡反応率（０．２９）、Ｖは固定化酵素のベッド体積である。
【００４７】
反応塔の運転開始から４２日目の酵素活性ａ42と運転開始１日目の酵素活性ａ1の比（以下、４２日目の残存活性）を図１に示す。ＷＴの４２日目の残存活性は６０％程度であったが、ＰＭ３８／４１／４３／５１の４２日目の残存活性は８０％程度であり、４２日間の運転による酵素活性の低下幅が小さかった。このことは、活性低下が遅いことを表す。
プシコースの実生産では反応塔は５０℃以上の温度で長時間（数ヶ月〜数年程度）運転される場合が多い。この場合、酵素活性が徐々に低下し、プシコースの生産量が低下する。本実施例で取り上げた変異体は活性低下が遅いことから、プシコース生産量も低下しにくく、産業上有用である。
以上の結果より、本発明の変異酵素は、従来の野生型酵素と比較し、熱安定性を向上することにより至適温度での酵素活性を維持し、Ｄ−プシコースを効率的に生産することが可能となる。
【００４８】
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【図１】
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【配列表】
2019146717000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月23日(2019.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアルスロバクター  グロビホルミス由来の野生型ケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸変異を有するケトース ３−エピメラーゼ変異体であって、
未処理の酵素の５０℃における活性を１００とした場合の、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む）懸濁液で、６０℃、１時間処理した同じ酵素の５０℃における残存酵素活性：Ａが、野生型ケトース ３−エピメラーゼのＡより高い値を示し、かつ４０以上であり、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端から数えて下記の位置においてアミノ酸置換を有する変異体から選択される、ケトース ３−エピメラーゼ変異体。
2019146717.tif 000017
【請求項２】
配列番号１で表されるアルスロバクター  グロビホルミス由来の野生型ケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸変異を有するケトース ３−エピメラーゼ変異体であって、
５０℃における酵素活性（Ｔ５０）に対する７０℃における酵素活性（Ｔ７０）の比：Ｔ７０／Ｔ５０が、野生型ケトース ３−エピメラーゼのＴ７０／Ｔ５０より高く、かつ０．８以上であり、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端から数えて下記の位置においてアミノ酸置換を有する変異体から選択される、ケトース ３−エピメラーゼ変異体。
2019146717.tif 000018
【請求項３】
配列番号１で表されるアルスロバクター  グロビホルミス由来の野生型ケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸変異を有するケトース ３−エピメラーゼ変異体であって、下記のアミノ酸置換を有する変異体から選択されるケトース ３−エピメラーゼ変異体。
2019146717.tif 000019
【請求項４】
配列番号１で表されるアルスロバクター  グロビホルミス由来の野生型ケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸変異を有するケトース ３−エピメラーゼ変異体であって、下記のアミノ酸置換を有する変異体から選択されるケトース ３−エピメラーゼ変異体。
2019146717.tif 000020
【請求項５】
固定化担体に固定化した、請求項１〜４のいずれか一項に記載のケトース ３−エピメラーゼ変異体。
【請求項６】
Ｄ−フルクトースに対して、請求項１〜４のいずれか一項に記載のケトース ３−エピメラーゼ変異体または請求項５記載の固定化されたケトース ３−エピメラーゼ変異体を作用させることを特徴とする、Ｄ−ケトースの製造方法。
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月1日(2019.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアルスロバクター  グロビホルミス由来の野生型ケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸変異を有するケトース ３−エピメラーゼ変異体であって、下記のアミノ酸置換を有する変異体から選択されるケトース ３−エピメラーゼ変異体。
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【請求項２】
配列番号１で表されるアルスロバクター  グロビホルミス由来の野生型ケトース ３−エピメラーゼのアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸変異を有するケトース ３−エピメラーゼ変異体であって、下記のアミノ酸置換を有する変異体から選択されるケトース ３−エピメラーゼ変異体。
2019146717.tif 000022
【請求項３】
固定化担体に固定化した、請求項１または２に記載のケトース ３−エピメラーゼ変異体。
【請求項４】
Ｄ−フルクトースに対して、請求項１または２に記載のケトース ３−エピメラーゼ変異体または請求項３記載の固定化されたケトース ３−エピメラーゼ変異体を作用させることを特徴とする、Ｄ−ケトースの製造方法。
【国際調査報告】
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