(57)【要約】  本発明は、簡便かつ安全な手段により記憶・学習能力を改善する医薬または食品用組成物、ならびに記憶・学習能力を改善する方法を提供することを目的として、有効量のＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片を含む、神経細胞刺激剤を提供する。ＩｇＧはホエイタンパク質由来であることが好ましい。本発明の神経細胞刺激剤を含む医薬または食品組成物により、記憶・学習能力を改善することができ、また、老化に関連する疾病、例えば、虚血再灌流性肝障害、ストレス性胃粘膜病変形成、心血管系障害、糖尿病、アポトーシスに関する疾患およびアルツハイマー病などの処置もしくは予防や、皮膚の老化の改善もしくは予防、および／または育毛などの広範囲に渡る効果が期待できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片を含む、神経細胞刺激剤。
【請求項２】
ＩｇＧがホエイタンパク質由来である、請求項１に記載の神経細胞刺激剤。
【請求項３】
神経細胞からのＣＧＲＰの放出を誘導する、請求項１または２に記載の神経細胞刺激剤。
【請求項４】
記憶・学習能力の改善のため、虚血再灌流性肝障害、ストレス性胃粘膜病変形成、心血管系障害、糖尿病、アポトーシスに関する疾患、アミロイドーシス、およびアルツハイマー病からなる群より選択される１または２以上の疾患の処置もしくは予防のため、皮膚の老化の改善もしくは予防のため、および／または育毛のための、請求項１〜３のいずれかに記載の神経細胞刺激剤。
【請求項５】
記憶・学習能力の改善のための、請求項４に記載の神経細胞刺激剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の神経細胞刺激剤を含む、医薬用または食品用の組成物。
【請求項７】
医薬が経口投与形態である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片の含有量が０．０２〜９０％（ｗ／ｗ）である、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項９】
ＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片の含有量が８〜２５％（ｗ／ｗ）である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
有効量のＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片を含む医薬または食品組成物を投与または摂取することを含む、神経細胞を刺激する方法。
【請求項１１】
ＩｇＧがホエイタンパク質由来である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
神経細胞からのＣＧＲＰの放出を誘導する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
記憶・学習能力の改善のため、虚血再灌流性肝障害、ストレス性胃粘膜病変形成、心血管系障害、糖尿病、アポトーシスに関する疾患およびアルツハイマー病からなる群より選択される１または２以上の疾患の処置もしくは予防のため、皮膚の老化の改善もしくは予防のため、および／または育毛のための、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
記憶・学習能力の改善のための、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
医薬または食品組成物が、ＩｇＧを１ｍｇ〜５ｇ／ｋｇ体重の範囲で、および／または、ＩｇＧのＦｃ断片を０．１ｍｇ〜０．５ｇ／ｋｇ体重の範囲で含む、請求項１０〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
医薬または食品組成物が、ＩｇＧを１０ｍｇ〜１ｇ／ｋｇ体重の範囲で、および／または、ＩｇＧのＦｃ断片を１ｍｇ〜０．１ｇ／ｋｇ体重の範囲で含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
医薬が経口で投与される、請求項１０〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
有効量のＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片を含む、記憶・学習能力改善剤。
【請求項１９】
ＩｇＧがホエイタンパク質由来である、請求項１８に記載の記憶・学習能力改善剤。
【請求項２０】
ＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片の含有量が０．０２〜９０％（ｗ／ｗ）である、請求項１８または１９に記載の記憶・学習能力改善剤。
【請求項２１】
ＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片の含有量が８〜２５％（ｗ／ｗ）である、請求項２０に記載の記憶・学習能力改善剤。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれかに記載の記憶・学習能力改善剤を含む、医薬用または食品用の組成物。
【請求項２３】
医薬が経口投与形態である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
有効量のＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片を含む医薬または食品組成物を投与または摂取することを含む、記憶・学習能力を改善する方法。
【請求項２５】
ＩｇＧがホエイタンパク質由来である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
医薬または食品組成物が、ＩｇＧを１ｍｇ〜５ｇ／ｋｇ体重の範囲で、および／または、ＩｇＧのＦｃ断片を０．１ｍｇ〜０．５ｇ／ｋｇ体重の範囲で含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
医薬が経口で投与される、請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片、特にＦｃγを有効成分として含む神経細胞刺激剤、該神経細胞刺激剤を有効量で含む食品および医薬用の組成物に関する。本発明はさらに、該神経細胞刺激剤を用いる、老化に関連する種々の疾患および状態の予防または処置のための方法、特に記憶・学習能力の改善方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
記憶は、経験に基づき処理された情報を脳に保存・固定し且つ想起・利用することを行うことで発揮される機能である。この記憶機能を発揮する過程において必要な情報の取得から保存までを学習と称し、これらの学習、記憶などの機能を含めて「認知」と称することができる。近年、この認知機能を著しく損なってしまい、学習、記憶、そして記憶の想起・利用をすることができない、所謂「認知症」が社会的な問題となっている。これらは例えば、アルツハイマー病やピック病等の大脳皮質を主座とするものや、パーキンソン病などの大脳基底核を主座とする疾病として広く知られている。特に、今後の高年齢化社会に伴いこれらの疾病の患者数は増加することが考えられ、患者数増加に対する医学的な対策と社会的な対策との両面での対策が必要となってきている。【０００３】
このような記憶や学習を含む認知症などの障害に対する対策として、例えば、特許文献１には、アルツハイマー型記憶障害の予防、改善、治療に関する薬剤として、中枢神経系におけるアセチルコリン量を上昇させることによるアルツハイマー型記憶障害の予防、改善、治療を目的として、エリスロポエチンを含む治療薬が提案されている。また、特許文献２には、アセチルコリン作動性神経機能低下による記憶、学習能の低下を改善するため、酢酸菌由来のアルカリ安定脂質の成分を用いた脳機能改善作用組成物が提案されている。さらに特許文献３には、黒霊芝の特定の抽出成分がアセチルコリンエステラーゼおよびプロリルエンドペプチダーゼに対する阻害活性を示すことから、これを含有する脳機能改善剤が提案されている。【０００４】
また、記憶改善作用を有することが従来より知られている線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１８）やこの誘導体の一種（αＦＧＦ）を用いた記憶障害・脳機能改善剤も提案されている（特許文献４および特許文献５）。【０００５】
さらに、食品などに用いる際の臭い、味、安定供給性などの問題点を改良した、ホスファチジルコリンやシアル酸などの脳機能改善成分を多く含む卵黄由来の脳機能改善組成物（特許文献６）や、安全性、日常的摂取性などを考慮したネギ属由来のトリスルフィドを含有する記憶障害改善作用を有する組成物（特許文献７）も提案されている。【０００６】
【特許文献１】特許第３１５６２３６号公報
【特許文献２】特許第４０４００６９号公報
【特許文献３】特開２００８−１５６２４０号公報
【特許文献４】特開平９−１２５９７号公報
【特許文献５】特表２００６−５１６５３８号公報
【特許文献６】特開２００３−３００８９１号公報
【特許文献７】特開２００４−１７５６９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記提案の治療薬や組成物は、以下のような問題を含んでいる。
例えば、特許文献１に記載のエリスロポエチンは遺伝子工学的手段により高純度な貧血治療薬として大量生産が為されているが、医薬品として高価であるため経済的な問題点があり、またその具体的な効果についても、明確な障害治癒効果が得られていない。【０００８】
また、特許文献２に記載の酢酸菌由来のアルカリ安定脂質の成分については、有効成分の抽出に有機溶媒が必須であるため、残留溶媒が、特に食用および医薬製剤において、問題となる可能性がある。また生理学的効果を得るために必要な摂取量が非常に多く、製造および実施における経済的な問題点があった。さらに有効成分を濃縮しない場合、有効量を摂るためには大量の菌体破砕物を摂取する必要があるなど、安全上の問題も存在する。【０００９】
特許文献３に記載の黒霊芝の特定の抽出成分は、黒霊芝自身が非常に高価であり、さらにその高価な原料から極微量の有効成分しか分取できないので、経済的に解決しなければならない問題点を含んでいる。また、その効果についても未だ不十分である。【００１０】
一方、特許文献４や５において開示されている線維芽細胞増殖因子やその誘導体は、その製造に付随する種々の複雑な工程を必要とする上、その効果についても未だ不十分である。【００１１】
また、特許文献６や７に開示されている組成物は、卵黄やネギなどを用いる点において原料の入手が容易ではあるものの、その効果はいまだ不十分なレベルである。【００１２】
したがって、記憶・学習能力を改善するための、安価であり、製造が容易であり、かつ安全性が高い医薬または食品が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、驚くべきことに、チーズ製造時の副産物であるホエイタンパク質に、学習、記憶機能を向上する作用があることを見出した。特にＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片を対象に投与することにより、学習、記憶機能が著しく向上するという、従来全く知られていなかった効果を見出し、しかも、本発明の記憶・学習能力改善剤や医薬・食品組成物は、消化器官への刺激を伴わず、さらに副作用のない自然の食品成分を用いているため、安全な手法により所期の目的が達成できることを実証した。本発明者らはさらに研究を進めた結果、ＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片を投与または摂取することにより、知覚神経からカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）が放出され、その結果インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）の産生が促進されることにより、記憶・学習能力が改善されることを突き止め、記憶・学習のみならず、老化に関連する種々の疾患および状態の処置および予防において効果を奏し得ることを見出し、発明を完成するに至った。【００１４】
即ち、本発明は、有効量のＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片を含む、神経細胞刺激剤に関する。
本発明はまた、ＩｇＧがホエイタンパク質由来である、前記神経細胞刺激剤に関する。
本発明はさらに、神経細胞からのＣＧＲＰの放出を誘導する、前記神経細胞刺激剤に関する。【００１５】
本発明はまた、記憶・学習能力の改善のため、虚血再灌流性肝障害、ストレス性胃粘膜病変形成、心血管系障害、糖尿病、アポトーシスに関する疾患、アミロイドーシス、およびアルツハイマー病からなる群より選択される１または２以上の疾患の処置もしくは予防のため、皮膚の老化の改善もしくは予防のため、および／または育毛のための、前記神経細胞刺激剤に関する。
本発明は特に、記憶・学習能力の改善のための、前記神経細胞刺激剤に関する。【００１６】
また、本発明は、前記神経細胞刺激剤を含む、医薬用または食品用の組成物に関する。
本発明はまた、医薬が経口投与形態である、前記組成物に関する。
本発明はまた、ＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片の含有量が０．０２〜９０％（ｗ／ｗ）である、前記組成物に関する。
本発明はさらに、ＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片の含有量が８〜２５％（ｗ／ｗ）である、前記組成物に関する。【００１７】
また、本発明は、有効量のＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片を含む医薬または食品組成物を投与または摂取することを含む、神経細胞を刺激する方法に関する。
本発明はまた、ＩｇＧがホエイタンパク質由来である、前記方法に関する。
本発明はさらに、神経細胞からのＣＧＲＰの放出を誘導する、前記方法に関する。【００１８】
本発明はまた、記憶・学習能力の改善のため、虚血再灌流性肝障害、ストレス性胃粘膜病変形成、心血管系障害、糖尿病、アポトーシスに関する疾患およびアルツハイマー病からなる群より選択される１または２以上の疾患の処置もしくは予防のため、皮膚の老化の改善もしくは予防のため、および／または育毛のための、前記方法に関する。
本発明は特に、記憶・学習能力の改善のための、前記方法に関する。【００１９】
本発明はまた、医薬または食品組成物が、ＩｇＧを１ｍｇ〜５ｇ／ｋｇ体重の範囲で、および／または、ＩｇＧのＦｃ断片を０．１ｍｇ〜０．５ｇ／ｋｇ体重の範囲で含む、前記方法に関する。
本発明はさらに、医薬または食品組成物が、ＩｇＧを１０ｍｇ〜１ｇ／ｋｇ体重の範囲で、および／または、ＩｇＧのＦｃ断片を１ｍｇ〜０．１ｇ／ｋｇ体重の範囲で含む、前記方法に関する。
本発明はまた、医薬が経口で投与される、前記方法に関する。【００２０】
また、本発明は、有効量のＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片を含む、記憶・学習能力改善剤に関する。
本発明はまた、ＩｇＧがホエイタンパク質由来である、前記記憶・学習能力改善剤に関する。【００２１】
本発明はまた、ＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片の含有量が０．０２〜９０％（ｗ／ｗ）である、前記記憶・学習能力改善剤に関する。
本発明はさらに、ＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片の含有量が８〜２５％（ｗ／ｗ）である、前記記憶・学習能力改善剤に関する。【００２２】
また、本発明は、前記記憶・学習能力改善剤を含む、医薬用または食品用の組成物に関する。
本発明はまた、医薬が経口投与形態である、前記組成物に関する。【００２３】
また、本発明は、有効量のＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片を含む医薬または食品組成物を投与または摂取することを含む、記憶・学習能力を改善する方法に関する。
本発明はまた、ＩｇＧがホエイタンパク質由来である、前記方法に関する。【００２４】
本発明はまた、医薬または食品組成物が、ＩｇＧを１ｍｇ〜５ｇ／ｋｇ体重の範囲で、および／または、ＩｇＧのＦｃ断片を０．１ｍｇ〜０．５ｇ／ｋｇ体重の範囲で含む、前記方法に関する。
本発明はさらに、医薬が経口で投与される、前記方法に関する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明による神経細胞刺激剤およびこれを含む医薬または食品組成物を用いることにより、簡便かつ安全な手段により、記憶・学習能力を改善することができる。
また、本発明の神経細胞刺激剤は、神経終末からのＣＧＲＰの放出を促進することから、老化に伴う種々の疾患および状態に対する広範囲に渡る予防・治療効果が期待できる。例えば、虚血再灌流性肝障害やストレス性胃粘膜病変形成を軽減する作用、骨密度を増加させる作用などが期待し得、また、ＣＧＲＰの放出によりＩＧＦ−Ｉの産生を増大させることから、心筋梗塞等の原因となる心血管系障害の保護作用、糖尿病患者における血糖降下作用、細胞のアポトーシス抑制作用、海馬におけるアミロイドβ蛋白の除去およびアルツハイマー病の治療効果、皮膚のコラーゲンやエラスチンの産生増加作用、ならびに育毛作用などが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１（Ａ）はMorris水迷路の側面図であり、図１（Ｂ）はその平面図である。
【図２】図２は、ＩｇＧ投与の後、水迷路試験で測定された投与群と比較群の遊泳時間（秒）の測定結果を示す図である。
【図３】図３は、ＩｇＧのＦｃ断片投与の後、水迷路試験で測定された投与群と比較群の遊泳時間（秒）の測定結果を示す図である。
【図４】図４は、in vitroの神経細胞培養系にＩｇＧから調製したＦｃ断片（Ｆｃγ）を添加した場合に、神経細胞から培地中にＣＧＲＰが放出されることを示した図である。
【図５】図５は、ＣＧＲＰはＦｃ断片（Ｆｃγ）で刺激を受けたＤＲＧ神経細胞から放出されることを確認した図である。
【図６】図６は、ＤＲＧ神経細胞を用いたＦｃ断片（Ｆｃγ）によるＣＧＲＰ放出アッセイ系が、薬理学的に妥当であることを示した図である。
【図７】図７は、Ｆｃ断片（Ｆｃγ）がＤＲＧ神経細胞に対して、濃度依存的にＣＧＲＰを放出させることを示した図である。
【図８】図８は、Ｆｃ断片（Ｆｃγ）で刺激を受けたＤＲＧ神経細胞が、刺激後３０分以内に一過的にＣＧＲＰを放出させることを示した図である。
【図９】図９は、ＤＲＧ神経細胞に高親和性Ｆｃγ受容体が発現していることを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下に述べる個々の形態には限定されない。
本発明において用いられるＩｇＧはImmunoglobulin Ｇ（免疫グロブリンＧ）の略語であり、抗体の１種である。免疫グロブリンはタンパク質であり、Ｂ細胞から作られ、免疫反応に関与する分子として最初に解析された分子で、現在では最もよく解明されている分子でもある。免疫グロブリンは生化学的および機能的に５つのクラスに分けられるが、全ての免疫グロブリンは４本のポリペプチド鎖から構成されており、そのポリペプチド鎖にはさらに、２つのサブユニット、すなわちＨ鎖（heavy chain；重鎖）とＬ鎖（light chain；軽鎖）とが存在する。Ｈ鎖は５つのクラスが存在し、このクラスによって免疫グロブリンのクラスが分けられている。それらは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）と呼ばれる。また、ＩｇＧはさらに４つのサブクラス、すなわちヒトの場合、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けられる。本明細書ではこれらのＩｇＧサブクラスを含めてＩｇＧと記載する。
【００２８】
我々の周囲には種々の病原菌が存在するが、これらの病原菌から生体を防御するために免疫システムを持っている。免疫システムはリンパ球等の細胞を中心に働く細胞性免疫と、抗体等を中心とする液性免疫が存在し、ＩｇＧは液性免疫システムとして、病原菌への結合とその中和、病原菌との結合による病原菌の食細胞への取り込み促進、さらには病原菌との結合による補体の活性化を促すなどの機能を有する。さらに他の免疫グロブリンクラスに比べて、ＩｇＧの血中含量は最も高い。従ってＩｇＧ分子は免疫システムにおいて非常に重要な役割を果たしている。しかしながら、このように免疫システムにおいて重要な役割を果たしているＩｇＧであるが、免疫システム以外において有効な機能については殆ど知られていない。
【００２９】
本明細書において以下に記載するとおり、本発明のＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片（Ｆｃγ）を含む神経細胞刺激剤により、知覚神経からのカルシトニン遺伝子関連ペプチド（Calcitonin gene related peptide：ＣＧＲＰ）の放出が誘導され、動物モデルにおいて、学習・記憶能力が改善され、また海馬におけるインスリン様成長因子−Ｉ（ＩＦＧ−Ｉ）の産生が増大することが実証された。
【００３０】
インスリン様成長因子−Ｉ（Insulin-like growth factor-I：ＩＧＦ−Ｉ）は、インスリンに非常によく似た構造および作用を有する分子量約７，５００ダルトンのペプチド性ホルモンである（Organization and sequence of human insulin-like growth factor I gene. Alternative RNA processing produces two insulin-like growth factor I precursor peptides.  Rotwein P, et al. J. Biol. Chem. vol. 261(11), 4828-4832, (1986)）。ＩＧＦ−Ｉは成長ホルモン分泌刺激によって、主に肝臓で生成されることが知られているポリペプチドであり、血中ではＩＧＦ結合タンパクと結合して高分子複合体として存在している。ＩＧＦ−Ｉの代謝およびＩＧＦ−Ｉの受容体への親和性は、このＩＧＦ結合タンパクによって調節されており、ＩＧＦ結合タンパクの発現は成長ホルモンによって制御されることが知られている（Humbel R.E., 前出）。ＩＧＦ−Ｉは細胞の分化を促進し、細胞の増殖を助ける等、積極的に細胞を健康な状態に維持し、老化の進行を抑制することが知られている（Insulin-like growth factorIandII, Review.  Humbel R.E.,  Eur. J. Biochem., vol. 190, 445-462, (1990)）。
【００３１】
これまでにＩＧＦ−Ｉの作用として、心筋梗塞等の原因となる心血管系障害の保護作用（The GH−IGF-I axis and the cardiovascular system：clinical implications.  Annamaria Colao,  Clinical Endocrinology, vol. 69, 347-358, (2008)）、糖尿病患者における血糖降下作用（The role of insulin-like growth factor-I and its binding proteins in glucose homeostasis and type 2 diabetes.  Swapnil N.R. et al, Diabetes Metab. Res. and Rev., vol. 25, 3-12, (2009)）、細胞のアポトーシス抑制作用（IGF-I inhibition of apoptosis is associated with decreased expression of prostate apoptosis response-4.  Hyunju C. et al., J. Endocrinology, vol. 194, 77-85, (2007)）、海馬におけるアミロイドβ蛋白の除去およびアルツハイマー病の治療効果（Insulin-like growth factor I and Alzheimer’s disease：therapeutic prospects ?  Eva C. and Ignacio T.A., Expert Rev. Neurotherapeutics, vol. 4(1), 79-86, (2004)）、皮膚におけるコラーゲンやエラスチンの産生増加作用（Epidermal Homeostasis：The Role of the Growth Hormone and Insulin-Like Growth Factor Systems.  Stephanie R. et al., Endocrine Reviews, vol. 24(6), 737-764, (2003)）、および育毛作用（Administration of capsaicin and isoflavone promotes hair growth by increasing insulin-like growth factor-I production in mice and in humans with alopecia.  Harada N. et al., Growth Horm. IGF Res., vol. 17(5), 408-415, (2007)）などが報告されている。
【００３２】
最近の研究報告において、全身に分布している知覚神経に存在するバニロイド受容体を活性化することによって、知覚神経からＣＧＲＰが放出され、それが種々の臓器の幼若細胞に存在するＣＧＲＰ受容体に作用して、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）産生を促進することが報告されている（Effect of topical application of capsaicin and its related compounds on dermal insulin-like growth factor-I levels in mice and on facial skin elasticity in humans.  Harada N. and Okajima K., Growth Horm IGF Res. vol.17(2):171-176, (2007)；Effect of capsaicin on plasma and tissue levels of insulin-like growth factor-I in spontaneously hypertensive rats.  Harada N. and Okajima K., Growth Horm IGF Res. vol.18(1):75-81, (2008)）。
【００３３】
ＩＧＦ−Ｉを増加させる方法は、これまでは成長ホルモン（ＧＨ）投与しか知られていなかったが、最近の研究（Harada N. and Okajima K.、2007および2008年、前出）により、知覚神経を刺激することで各組織のＩＧＦ−Ｉ産生量を増加させることが明らかになった。同様な効果を期待するために、ＧＨやＩＧＦ−Ｉを投与することも考えられるが、これらの成分は遺伝子組換え医薬品であったとしても依然として高価であり、また経口投与では分解されてしまうことから、医療機関での皮下注射や静脈投与に限られる。さらにＩＧＦ−Ｉについては、これを静脈内投与した場合、インスリンと同様の作用によって、低血糖を引き起こすことが懸念される。
【００３４】
一方、他の成分を用いて胃の知覚神経を刺激して海馬組織のＩＧＦ−Ｉ産生量を増加させる方法は、ＣＧＲＰ放出を介した神経伝達によって起こるため、血液脳関門の通過性を懸念する必要はない。こうした背景から、より安全に且つ安価に各組織のＩＧＦ−Ｉの分泌を促進する手段として食品成分が注目されており、これまでにカプサイシンが有効であるとの報告が数多くある。
【００３５】
カプサイシンを経口投与して知覚神経を刺激すると、野生型マウスでは海馬のＣＧＲＰやＩＧＦ−Ｉ産生量が上昇し、海馬歯状回では血管新生やニューロン新生が亢進するが、ＣＧＲＰ遺伝子のノックアウトマウスではこれらの現象が起こらない。さらに、野生型マウスでは、カプサイシン投与によって空間認識能が改善するが、ＩＧＦ−Ｉに対する抗体やＣＧＲＰ受容体のアンタゴニストを投与してやると、その改善が抑制される。これらの結果は、カプサイシン等で知覚神経を刺激することにより、ＣＧＲＰレベルを上昇させて海馬のＩＧＦ−Ｉ産生量を促し、血管やニューロンの新生を介して認識機能を改善させ得る可能性を強く示唆している（Stimulation of sensory neurons improves cognitive function by promoting the hippocampal production of insulin-like growth factor-I in mice.  Harada N. et al.  Transl Res. vol. 154(2), 90-102, (2009)、Donepezil improves cognitive function in mice by increasing the production of insulin-like growth factor-I in the hippocampus.  Narimatsu N. et al.  J. Pharmacol. Exp. Ther. vol. 330(1), 2-12, (2009)）。
【００３６】
例えばカプサイシンなどの知覚神経刺激作用を有する物質は、経口投与すると消化管で知覚神経を刺激する。そのシグナルが、脊髄視床路や迷走知覚神経を介して副交感神経を刺激し、全身のＩＧＦ−Ｉ産生を増加させている可能性が推察される。すなわち、これらの経路を介して視床に到達したシグナルは、延髄の迷走神経運動核に作用して、全身に分布する迷走神経終末からアセチルコリンの分泌を引き起こす。アセチルコリンは知覚神経刺激作用を有しているので、全身に分布する知覚神経終末からＣＧＲＰの放出が促進され、結果として全身の組織、例えば中枢神経系において、ＩＧＦ−Ｉ産生が促進すると考えられる。
【００３７】
本明細書において以下に記載する実験の結果とこれまでに報告されている研究結果とを総合すると、経口投与された本発明のＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片により、消化管の知覚神経終末からのＣＧＲＰ放出を促進するのみならず、これを起点とするシグナル伝達系を介して全身の組織におけるＩＧＦ−Ｉの産生を増強し、その結果の１つとして、中枢神経系においてもＣＧＲＰおよびＩＧＦ−Ｉの産生量を増大させ、特に海馬における学習・記憶機能を増強することが強く示唆される。
【００３８】
したがって、本発明の神経細胞刺激剤によって期待される効果としては、記憶・学習改善効果に限定されることなく、消化管の知覚神経刺激を介した全身組織のＩＧＦ−Ｉ産生増強により、上記に示した種々の疾患を予防または改善させる効果などが挙げられる。例えば、本発明の神経細胞刺激剤に対しては、ＩＧＦ−Ｉの産生を増大させることにより、心血管系障害の保護作用、糖尿病患者における血糖降下作用、細胞のアポトーシス抑制作用、海馬におけるアミロイドβ蛋白の除去およびアルツハイマー病の治療効果、皮膚におけるコラーゲンやエラスチンの産生増加作用および育毛作用などの効果が期待し得る。
【００３９】
一方、カルシトニン遺伝子関連ペプチドについては、さらに、虚血再灌流性肝障害やストレス性胃粘膜病変モデルにおいて、知覚神経末端から放出されるＣＧＲＰが、血管内皮細胞の一酸化窒素（ＮＯ）やＰＧＩ２、ＰＧＥ２といったプロスタグランディン産生を促進して、炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）の産生を抑制し、虚血再灌流性肝障害やストレス性胃粘膜病変形成を軽減することが明らかになっている（Stimulation of sensory neurons by capsaicin increases tissue levels of IGF-I, thereby reducing reperfusion-induced apoptosis in mice.  Harada N. et al.,  Neuropharmacology, vol. 52(5), 1303-1311, (2007)；Antithrombin prevents reperfusion-induced hepatic apoptosis by enhancing insulin-like growth factor-I production in mice.  Harada N. et al.,  Crit Care Med., vol. 36(3), 971-974, (2008)）。
【００４０】
また、ＣＧＲＰが骨芽細胞におけるＩＧＦ−Ｉ産生を促進して、骨密度を増加させる作用を有することも報告されている（The neuropeptide calcitonin gene-related peptide stimulates insulin-like growth factor-I production by primary fetal rat osteoblasts.  Vignery A. and McCarthy T.L.,  Bone, vol. 18(4), 331-335, (1996)；Effects of calcitonin gene-related peptide on bone turnover in ovariectomized rats.  Valentijn K. et al.,  Bone, vol. 21(3), 269-274, (1997)；Targeted expression of calcitonin gene-related peptide to osteoblasts increases bone density in mice.  Ballica R. et al.,  J. Bone Miner. Res., vol. 14(7), 1067-1074, (1999)）。
【００４１】
したがって、本発明の神経細胞刺激剤は、知覚神経細胞からのＣＧＲＰ放出を誘導することから、虚血再灌流性肝障害やストレス性胃粘膜病変形成の処置（軽減および改善）および予防効果、および／または骨密度を増加させる作用が期待される。
【００４２】
本発明に用いられるＩｇＧは、好ましくは、ヒトを含む哺乳動物の乳中に見出されるものであり、またチーズ製造工程の副産物であるホエイからも得ることができるものである。本発明による食品用組成物においては、ＩｇＧがホエイタンパク質由来であることが好ましい。チーズ製造時における副産物であるホエイは、その組成に多くの有用なタンパク質を含んでいるので栄養価値が高い。本発明において用いられるＩｇＧとしては、好ましくは、ホエイタンパク質よりイオン交換樹脂クロマトグラフィーとＵＦ膜による分子篩技術を組み合わせることで得られる、高純度のＩｇＧを用いることができる。例えば、本発明においては特表２００１−５１６５９９号公報に記載されている方法によって得られるＩｇＧを用いることができる。
【００４３】
本発明の神経細胞刺激剤を経口投与する場合、ＩｇＧは消化管においてペプシンにより分解され、Ｆ（ａｂ’）２および多数のＦｃ断片に分解される。したがって、経口で（胃を介して）投与されるものである場合、または食品として摂取されるものである場合、有効成分はＩｇＧであっても、ＩｇＧのＦｃ断片であってもよい。非経腸投与の場合は、有効成分がＦｃ断片を含むことが好ましい。
【００４４】
本発明に用いられるＩｇＧのＦｃ断片は、ＩｇＧを所定の酵素処理（例えば、ＩｇＧのパパイン消化）を行い、断片化して精製することで得ることができる。精製方法としては、プロテインＧカラムなどのＩｇＧに対するアフィニティーを有するカラムを用いるなどの方法がある。
【００４５】
本発明の神経細胞刺激剤は、ＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片のみで、または他の活性物質と共に、あるいは他の薬理学的な活性物質と共に用いることができる。そのような活性物質として、例えば、アルツハイマー病治療薬（例えばセクレターゼ阻害薬、ドネペジルなどのアセチルコリンエステラーゼ阻害剤）、炎症性サイトカイン産生抑制剤、胃または腸粘膜保護剤、心血管系疾患治療薬、糖尿病治療薬（例えば血糖値降下薬、チアゾリジン誘導体、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト、インスリンなど）、骨粗鬆症治療薬（例えばカルシトニン、エストロゲン、カルシウム、ビタミンＤ、ビタミンＫなど）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４６】
本発明は、一態様において、有効成分として前記ＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片を含む神経細胞刺激剤を有効量で含む医薬用または食品用組成物である。有効量とは、対象において所望の生理学的効果を奏するのに十分な量であって、例えば、神経細胞からのＣＧＲＰの放出を促進する量、ＩＧＦ−Ｉの産生を促進する量、細胞のアポトーシスを抑制する量、血管および神経細胞の新生を促進する量、アミロイドβ蛋白沈着物の除去を促進する量、アルツハイマー病、心血管系障害、虚血再灌流性肝障害および／またはストレス性胃粘膜病変形成の発症を低減し、症状を軽減し、および／または進行を防止する量、記憶・学習能力の改善をもたらす量、コラーゲンやエラスチンの産生を促進する量、または発毛を促進する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。
【００４７】
本発明の医薬用組成物は、ヒト医薬または獣医薬として効果的に用いることができ、知覚神経を刺激し得る投与形態であれば特に限定されないが、例えば、経口、経皮、経粘膜、皮下、舌下、直腸内、腹腔内、鼻内などの種々の投与経路により投与することができる。投与が容易であり、かつ高い効果が得られることから、経口投与が好ましい。経口投与に好適な剤形としては、錠剤、ピル、被覆錠、カプセル剤、顆粒剤、散剤、分散性粉末、溶液、シロップ剤、ジュース、乳液、懸濁液またはドロップなどが挙げられる。直腸投与に好適な剤形としては坐剤、非経口投与に好適な剤形としては、注射可能な溶液、好ましくはオイルベースのまたは水性の溶液、懸濁液、乳液またはトランスプラントなどが挙げられる。経皮または経粘膜投与に好適な剤形としては、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パウダーまたは貼付剤（パッチ）が挙げられる。
【００４８】
これらの各種製剤は、常法に従って賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。例えば、経口投与に好適な賦形剤として、マンニトール、ラクトース、マルトース、サッカロース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。非経口または局所投与に好適な賦形剤として、不活性な有機または無機物質、例えば水、植物油、ベンジルアルコール、アルキレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールトリアセテート、ゼラチン、タルクまたはワセリンなどが挙げられる。
【００４９】
本発明の食品用組成物としては、具体的には、各種飲食品（牛乳、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、チーズ、クリーム、パン、ビスケット、クラッカー、バー、ゼリー、ピッツァクラスト、調製粉乳、流動食、病者用食品、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、栄養食品等）に添加し、これを摂取してもよい。本有効成分は、そのまま使用したり、他の食品ないし食品成分と混合したりするなど、通常の食品組成物における常法にしたがって使用できる。また、その性状についても、通常用いられる飲食品の状態、例えば、固体状（粉末、顆粒状その他）、ペースト状、液状ないし懸濁状のいずれでもよい。
【００５０】
また、本発明の組成物は、医薬品類似の形態をした所謂健康食品と称される組成物として提供されてもよい。本発明の組成物はさらに、チーズやヨーグルト、発酵乳、牛乳、アイスクリームなどの乳製品その他の食品中に添加して用いることもできる。
【００５１】
本発明は、一態様において、上記の医薬用組成物を対象に投与することを含む、神経細胞を刺激する方法に関する。また、本発明は別の態様において、上記の食品用組成物を対象に摂取させることを含む、神経細胞の刺激方法に関する。これらの方法において投与または摂取された組成物中のＩｇＧまたはＩｇＧのＦｃ断片が、神経細胞からのＣＧＲＰの分泌を促進し、ＩＧＦ−Ｉの産生を誘導することにより、例えば、学習・記憶能力を改善し、脳におけるアミロイドβ沈着を除去し、皮膚におけるコラーゲン産生量を増大させるなどの効果をもたらす。
【００５２】
本発明の方法において投与または摂取する組成物の具体的な用量は、その目的（記憶・学習能力の改善、疾患または状態の処置または予防、育毛など）および用途（医薬または食品など）に加えて、投与または摂取すべき対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、投与経路、併用している医薬、治療への反応性、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。上記用量は、有効成分としてＩｇＧを用いる場合、好ましくは１ｍｇ〜５ｇ／ｋｇ体重の範囲であり、例えば１０ｍｇ〜１ｇ／ｋｇ体重、または７５〜１５０ｍｇ／ｋｇ体重で用いることができる。また、上記用量は、有効成分としてＩｇＧのＦｃ断片を用いる場合、好ましくは０．１ｍｇ〜０．５ｇ／ｋｇ体重の範囲であり、例えば１ｍｇ〜０．１ｇ／ｋｇ体重、または５ｍｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ体重で用いることができる。しかしながら、長期間にわたって治療または予防の目的で摂取する場合には、上記範囲よりも少量であってもよいし、また本有効成分は、天然由来であり安全性について問題がないので、上記範囲よりも多量に使用することもできる。
【００５３】
投与または摂取頻度は、用いる組成物の性状や、上記のような対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間に数回（例えば、１週間に２、３、４回など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。
【００５４】
本発明の組成物における有効成分としてのＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片の含有量は、用途（医薬または食品用）、服用または摂食の形態または剤形などに応じて適宜決定することができるが、一般に、組成物全体に対して、０．０２〜９０％（ｗ／ｗ）の範囲であり、例えば０．２〜５０％（ｗ／ｗ）、または８〜２５％（ｗ／ｗ）で用いることができる。高濃度の組成物が望ましい場合、例えば経口適用する製剤やタブレットなどの小さな食品、または徐放製剤やリザーバ型製剤などにおいて用いる場合、例えば５０〜９０％（ｗ／ｗ）を超える含有量で用いてもよい。
【００５５】
本発明のＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片を含む神経細胞刺激剤を含む組成物は、その他の成分についても特に限定されないが、本発明の食品用組成物は、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を含んでもよい。タンパク質としては、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、α−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これら加水分解物；バター、乳性ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分などが挙げられる。糖質としては、糖類、加工澱粉（デキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂；パーム油、サンフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロチン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレンなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用することができ、合成品および／またはこれらを多く含む食品を用いてもよい。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。なお、本明細書において％表示は、特に明示しない場合には重量％を示す。【００５７】
水迷路学習試験（Ｍｏｒｒｉｓ水迷路学習試験）
Ｍｏｒｒｉｓ水迷路試験は、マウスが水を嫌い、水から逃れようとする習性を利用した空間認知能力を見る試験である。所定形状のプールに水を１３ｃｍ深さに張り、水温を２３℃に保ち、図１（Ａ）（側面図）に示すように、水面下約１ｃｍに円形（直径約１２ｃｍ）の透明なアクリル製プラットフォームをマウスから見えないように設置した。装置の周辺の空間的手掛かり（実験者、テーブル、蛍光灯、実験機械など）は実験期間を通じて常に一定にした。【００５８】
試験は、図１（Ｂ）（平面図）のような３箇所（Ａ、Ｂ、Ｃ）のスタート位置のうち１箇所から、マウスにプラットフォームの位置が見えないように、マウスをプールの壁に向けそっと水に入れて実施した。なお、試験前日に、マウスを水に馴らすために、プールからプラットフォームをはずした状態でマウスを９０秒間泳がせた。【００５９】
試験開始のスタート位置はランダムな組み合わせで、前日の最終スタート位置と次の日の最初のスタート位置が同じにならないようにして、１日に３箇所からマウスを水中に入れ、プラットフォームに到着するまでの時間を最大９０秒、連続５日間計測した。マウスが９０秒以内に水から逃れてプラットフォーム上に２０秒間留まっていた場合、マウスがプラットフォームに到着した時間をそのマウスの遊泳時間とした。９０秒以内にプラットフォームに到着しなかった場合は、実験者がマウスをプラットフォームに３０秒間乗せて終了し、９０秒をそのマウスの遊泳時間とした。【００６０】
実施例１：ＩｇＧの経口投与によるマウスにおける学習記憶能力の亢進
ＩｇＧ経口投与
８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６系雄マウス（体重約２０〜２５ｇ、１群５匹）に、ＩｇＧ凍結乾燥品（Sigma-Aldrich Inc.製、商品名：BOVINE IgG Lyophilized、Product No.:I5506、Purified Immunoglobulin Reagent Grade、純度：ＳＤＳ電気泳動で少なくとも９５％）を生理食塩水に溶解し（２５ｍｇ／ｍＬ）、１日１回、０．１ｍＬを経口で１４日間連続して投与した。ＩｇＧ投与量は、２．５ｍｇ／マウスとした（１００〜１２５ｍｇ／ｋｇ体重）。最終投与の翌日から上記の水迷路試験を５日間実施した。対照群のマウスには、生理的食塩水を０．１ｍＬ／マウスで経口投与した。投与試験期間における各群の体重の平均値の変化を観察したが、マウスの対照群とＩｇＧ投与群では、体重の変化に違いは見られなかった。【００６１】
上記水迷路試験で測定された各群の遊泳時間（秒）の測定結果（平均値および標準誤差）
を、図２に示す。これらの結果から明らかなように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのうち、ＩｇＧ投与群において、対照群に比較し、第１日目より次第に逃避遊泳時間の減少が見られた。特に、試験４日目、５日目には逃避遊泳時間の有意な減少を示した。この結果は、ＩｇＧの投与が、マウスにおける学習記憶を亢進する作用を有していることが判った。【００６２】
実施例２：
ＩｇＧのパパイン消化
ウシＩｇＧを１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するリン酸緩衝液／２０ｍＭシステイン塩酸塩／２０ｍＭエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）（ｐＨ６．０）に、２回結晶化したパパイン（ＭＰバイオメディカルズ社製品）を活性化後に０．１ｍｇ／ｍＬになるように添加した。これを、未消化のＩｇＧが残らなくなるように、３７℃で４時間の消化を行った。反応終了後に、等容量の１００ｍＭヨードアセトアミド／０．２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて反応を停止させた。ｐＨを５．０に調整した後、プロテインＧセファロースカラム（ＧＥヘルスケア社製品）によりＦｃ断片を精製した。【００６３】
ウシ由来のＩｇＧは、プロテインＡに対する吸着性が極めて弱く、一方、プロテインＧには吸着可能である。プロテインＧカラムに対するウシＩｇＧの結合力はｐＨ５．０で最大であることが以下の文献に示されており、Ｆｃ断片の精製条件も以下の文献を参考とした。（Bo Akerstrom and Lars Bjorck,J.Biological Chemistry,vol.261,10240-47,1986）。【００６４】
反応を停止させた消化物を、プロテインＧ結合緩衝液（０．０５％  Tween 20を含む２０ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ５．０）で２倍に希釈し、さらに１Ｎ塩酸にてｐＨ５．０に再度調整した。これを、あらかじめプロテインＧ結合緩衝液で平衡化しておいたプロテインＧカラムにロードし、未吸着画分としてＦａｂ画分を得た。さらに、カラムをプロテインＧ結合緩衝液で十分に洗浄後、カラムに結合しているＦｃ断片を０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）にて溶出し、直ちに１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて中和してＦｃ画分を得た。得られたＦａｂ画分およびＦｃ画分はＰＢＳに対して４℃で透析し、透析回収液はタンパク濃度を測定後、必要に応じて分子量１０ｋＤａカットの限外濾過膜（Amicon社製セントリコンＹＭ−１０）にて濃縮した。【００６５】
投与試験
得られたＦｃ画分を８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６系雄マウス（体重約２０〜２５ｇ、１群５匹）に、ゾンデを用いて１日１回の経口投与を４週間連続して行った。Ｆｃ断片の投与量は１０ｍｇ／ｋｇ体重／日とした。最終投与の翌日から上記の水迷路試験を５日間実施した。対照群のマウスには、生理的食塩水を０．１ｍＬ／マウスで経口投与した。投与試験期間における各群の体重の平均値の変化を観察したが、マウスの対照群とＩｇＧのＦｃ断片投与群では、体重の変化に違いは見られなかった。【００６６】
上記水迷路試験で測定された各群の遊泳時間（秒）の測定結果（平均値および標準誤差）を、図３に示す。これらの結果から明らかなように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのうち、Ｆｃ断片投与群において、対照群に比較し、第１日目より次第に逃避遊泳時間の減少が見られた。特に、試験３〜５日目には逃避遊泳時間の有意な減少を示した。この結果は、ＩｇＧのＦｃ断片投与が、マウスにおける学習記憶を亢進する非常に高い作用を有していることが判った。【００６７】
実施例３：初代神経細胞の培養
Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂａｌｂ／ｃおよびＩＣＲ等の雄マウスから実体顕微鏡下で、後根神経節（ＤＲＧ：Dorsal Root Ganglion）を氷冷したＨＢＳＳ（Hanks’ Balanced Salt Solution）中に採取し、初代神経細胞のin vitro培養を行った。【００６８】
採取したＤＲＧを、ＭＥＭ（Minimal Essential Medium、GIBCO）に溶解した０．２５％のコラゲナーゼＩＩ（GIBCO）に懸濁して無菌的に３７℃、２時間の酵素処理を行った。次いで、コラゲナーゼＩＩ処理したＤＲＧを遠心後に回収し、ＨＢＳＳに再懸濁して洗浄した。この操作を２回行ってコラゲナーゼＩＩを除去した後に、ＨＢＳＳに溶解した０．２５％トリプシン（DIFCO）に懸濁して３７℃、１５分の酵素処理を行った。【００６９】
遠心でＤＲＧを回収した後、１０％ＦＣＳ（GIBCO）、抗生物質および抗真菌剤（１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ；GIBCO）、１００ｎｇ／ｍＬ天然型神経成長因子７Ｓ（GIBCO）を含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培養液（GIBCO）で２回洗浄して残存するトリプシンを除去し、同培養液中でピペッティングを行ってＤＲＧから神経細胞を遊離させた。【００７０】
得られた初代神経細胞を、Ｉ型コラーゲンをコートした３５ｍｍディッシュ（Becton-Dickinson、BioCoat）に播種し、５％ＣＯ２条件下３７℃で一晩培養した。翌日以降は、知覚神経細胞以外の細胞の増殖を抑制するために、DNA合成阻害剤であるシトシンアラビノフラノシド（Cytosine Arabinofuranoside：Ara-C、Sigma）を最終濃度５μＭになるように上記培養液に添加し、３日毎に培地交換を行って培養を継続した。こうした培養の過程で、増殖性のある線維芽細胞などは除去され、ディッシュ内は殆どが神経突起を伸展させた神経細胞となった。【００７１】
実施例４：Ｆｃ断片によるＣＧＲＰ放出
神経突起の十分な伸展が確認された時期（通常は培養７〜９日目）に培養液を吸引除去し、無血清のＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地でリンスした後に、ＩｇＧまたはＩｇＧのＦｃ断片を含む基本培地（１％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２）と交換した。ＩｇＧは、ホエイからプロテインＧカラムによってアフィニティー精製した。Ｆｃ断片は、アフィニティー精製したウシＩｇＧをパパインで消化し、再度プロテインＧアフィニティー精製により、カラム吸着画分を回収した。【００７２】
ＩｇＧまたはＩｇＧのＦｃ断片は、基本培地（１％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２）に目的とする濃度で添加したものを予め準備しておき、神経細胞をＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２でリンスした後にディッシュに１ｍＬ添加した。これをＣＯ２インキュベーターに移し、３７℃で３０分間インキュベート後に培養上清を回収した。回収した培養上清は測定時まで−３０℃以下で凍結保存し、培養上清中のＣＧＲＰの濃度測定は、測定キットのプロトコールどおりに実施した（SPI-Bio）。【００７３】
アフィニティー精製したＩｇＧを基本培地に１ｍｇ／ｍＬで添加した場合は、ＣＧＲＰの放出量が基本培地の場合と同等であったのに対し、パパイン消化後に精製したＦｃ断片（Ｆｃγ）を添加した場合には、ＣＧＲＰの放出量が約３倍に増加した（図４）。【００７４】
実施例５：神経細胞がＦｃ断片（Ｆｃγ）に反応してＣＧＲＰを放出することの確認
Ｆｃ断片（Ｆｃγ）を添加した場合にＣＧＲＰの放出がみられたが、培地中のＦｃ断片（Ｆｃγ）が神経細胞に作用した結果として培養上清中のＣＧＲＰ濃度が上昇していることを確認する目的で以下の検討を行った。【００７５】
基本培地にＦｃ断片（Ｆｃγ）を添加した培地単独の濃度測定ではＣＧＲＰの上昇はなかったが、この培地を神経細胞に添加した後の培養上清では、基本培地に比べて約３倍のＣＧＲＰが検出された。一方、ＩｇＧを添加した場合には、ＣＧＲＰの濃度上昇は認められなかった（図５）。この結果より、ＣＧＲＰ濃度の上昇は、Ｆｃ断片（Ｆｃγ）が神経細胞に直接作用した結果であることが確認された。【００７６】
実施例６：Ｆｃ断片（ＦＣγ）によるＣＧＲＰ放出試験の妥当性検証
本アッセイ系における、Ｆｃ断片（Ｆｃγ）刺激による神経細胞のＣＧＲＰ放出が、薬理学的に妥当なものであるか否かを検証するために、既知の刺激因子であるカプサイシンを用いて検討した。【００７７】
ＤＲＧ神経細胞の培養系に１０μＭのカプサイシンを添加すると、神経細胞のバニロイド受容体（ＶＲ１）の刺激を介してＣＧＲＰが放出されることが明らかになっている（Harada N. and Okajima K.： Effect of topical application of capsaicin and its related compounds on dermal insulin-like growth factor-I levels in mice and on facial skin elasticity in humans. Growth Horm IGF Res. vol.17(2):171-176, 2007）。本実験系でもカプサイシン添加によってＣＧＲＰ放出が認められるか否かを検討した結果、添加濃度が１μＭ〜１０μＭの範囲内で、カプサイシン（Santa Cruz Biotechnology）に対して濃度依存的に、神経細胞からＣＧＲＰが放出されることを確認した（図６）。なお、最終濃度３０μＭおよび１００μＭのカプサイシン添加で、カプサイシンの濃度依存的にＣＧＲＰ放出量が減少しているが、これはカプサイシンの溶媒であるエタノールの影響と推察された。【００７８】
実施例７：ＣＧＲＰ放出におけるＦｃ断片（Ｆｃγ）の濃度依存性
神経細胞によるＣＧＲＰ放出が、添加するＦｃ断片（Ｆｃγ）に対して濃度依存的な反応であるか否かを検討した。基本培地に、Ｆｃ断片（Ｆｃγ）を０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、それぞれを神経細胞に１ｍＬずつ加えて３７℃、３０分のインキュベーションを行った。その結果、培養上清中のＣＧＲＰ放出量は、基本培地に添加したＦｃ断片（Ｆｃγ）に対して、濃度依存的に上昇していることを確認した（図７）。【００７９】
実施例８：ＣＧＲＰ放出における時間的変化
ここまでのＣＧＲＰ放出試験は、Ｆｃ断片（Ｆｃγ）を含む培地を神経細胞に添加してから３７℃、３０分のインキュベーション後の培養上清について検討してきたが、時間依存的にさらに放出量が上昇するか否かを検証する目的で、ＣＧＲＰ放出量の時間依存性について検討した。【００８０】
基本培地に、Ｆｃ断片（Ｆｃγ）を１ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、これを４ディッシュの神経細胞にそれぞれ１ｍＬずつ加えた。対照は、１ｍＬの基本培地を１ディッシュの神経細胞に加えた。全てを３７℃でインキュベートし、３０分後、６０分後、９０分後および１２０分後にインキュベーターから細胞を取りだし、培養上清を回収した。対照の培養上清は、３０分後に回収した。【００８１】
培養上清中のＣＧＲＰ濃度を測定した結果、６０分、９０分、１２０分のインキュベーションでは、３０分間インキュベーションのＣＧＲＰ濃度と同等であった。したがって、神経細胞はＦｃ断片（Ｆｃγ）の刺激により、３０分以内にＣＧＲＰを一過的に放出しているものと推察された（図８）。【００８２】
実施例９：神経細胞における高親和性Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲＩ）発現の確認
Ｆｃ断片（Ｆｃγ）によるＣＧＲＰ放出が、受容体を介して生じているか否かを確認する目的で、神経細胞における高親和性Ｆｃγ受容体の発現について、免疫化学的に検証した。【００８３】
培養したＤＲＧ神経細胞をメタノール固定後に、マウス高親和性Ｆｃγ受容体に対する抗体および神経細胞特異的マーカーに対する抗体で二重染色し、それぞれの抗体に対する蛍光標識２次抗体を用いて、ＤＲＧ神経細胞における高親和性Ｆｃγ受容体の局在について検討した。【００８４】
マウスＦｃγ受容体に対するヤギＩｇＧ（Santa Cruz Biotechnology）およびＦＩＴＣ標識ロバ抗ヤギＩｇＧ（Santa Cruz Biotechnology）によりＦｃγ受容体を染色し（緑色蛍光）、神経細胞特異的マーカー（PGP 9.5）に対するモルモット抗体（Novus Biologicals）およびTexas Red標識ヤギ抗モルモットＩｇＧ（Gene Tex）により、ＤＲＧ神経細胞を染色した（赤色蛍光）。ＦＩＴＣにより観察されるＦｃγ受容体（緑色蛍光）が、神経突起を有する典型的な神経細胞（赤色蛍光）上に局在することが、２色の蛍光を重ね合わせた像（黄色）により明らかとなった。この結果から、ＤＲＧ神経細胞がＦｃγ受容体を発現していることが強く示唆された。培養神経細胞に外からＦｃ断片（Ｆｃγ）を添加した時に、Ｆｃ断片（Ｆｃγ）が刺激となってＣＧＲＰの放出が起こる現象を考慮すると、ＤＲＧ神経細胞はその細胞表面に、高親和性Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲＩ）を発現していると推察される（図９）。【００８５】
培養後根神経節細胞にＦｃγＲＩが発現していることは報告されている（Andoh and Kuraishi, 2003, FASEB Journal, 2003, 18(1):182-4）が、抗原と特異的抗体との複合体によってのみ活性化が認められており、ＩｇＧ単独では細胞は興奮しなかった。したがって、上記のようにホエイから精製されたＦｃγのみにより神経細胞が活性化したことは、予想外の結果であった。【００８６】
実施例１０：
ＩｇＧは海馬のＩＧＦ−Ｉ産生を増強することにより記憶学習能力を改善する
経口投与されたＩｇＧの中枢神経系における作用機序を明らかにすることを目的として、ＩｇＧを多く含むウシ初乳をマウスに経口投与した。【００８７】
野生型マウスに初乳を４週間経口投与したところ、海馬においてＣＧＲＰおよびＩＧＦ−Ｉの産生量ならびにＩＧＦ−ＩのｍＲＮＡ発現量が上昇していることを確認した。また、脊髄後角、結合腕傍核、孤束核および海馬では、初乳投与後に、転写因子の一つであり、神経興奮のマーカーとされているｃ−ｆｏｓの発現量が亢進した。さらに、初乳投与により、海馬の歯状回において、神経が有意に再生していることが観察された。また、初乳投与によってマウスの空間認識能が有意に改善されることを、モリス水迷路試験により確認した。初乳と同様の効果は、野生型マウスにウシ由来精製ＩｇＧを、４週間経口投与した場合にも認められた。一方、ＣＧＲＰ遺伝子を欠損したマウスでは、たとえ初乳を経口投与しても、野生型で見られるような効果は一切観察されなかった。【００８８】
ＩＧＦ−Ｉは、海馬の神経を再生させることによって記憶学習能力の向上に寄与する。上記の結果は、初乳の投与により、初乳中のＩｇＧが胃で消化を受けてＦｃγが生成され、これが胃の知覚神経を刺激して知覚神経から放出されるカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）の量を増強させ、その結果脳におけるＩＧＦ−Ｉ産生を増強することにより、海馬における血管新生や神経再生を誘導することで記憶学習能を改善していると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明により、安全、安価かつ簡便な手段により、記憶・学習能力を改善することが可能となり、また、老化や高齢化に伴う多様な疾患、例えば虚血再灌流性肝障害、ストレス性胃粘膜病変形成、心血管系障害、糖尿病、アポトーシスに関する疾患およびアルツハイマー病などを処置または予防することが可能であるのみならず、皮膚の老化の改善または予防、さらには育毛効果が期待し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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