(57)【要約】  一標的細胞に複数種存在する染色体異常を同時に検出することができれば、精度高く血液腫瘍の病型分類を行うことが可能となり、診断、治療、予後予測に資する。識別可能な３つ以上の標識を用いて、一標的細胞の染色体複数異常を同時検出する方法（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨ）を確立した。
2019082871.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
識別可能な３以上の標識を用いて、
一標的細胞中の２以上の染色体異常を同時検出するＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）解析法。
【請求項２】
画像解析ソフトによって蛍光を分離して解析する請求項１記載のＦＩＳＨ解析法。
【請求項３】
ホルムアルデヒド固定、メタノール／酢酸後固定、酢酸処理を行い細胞を固定する請求項１又は２記載のＦＩＳＨ解析法。
【請求項４】
細胞表面抗原を染色することにより腫瘍細胞を識別し、
染色体異常を検出する請求項１〜３いずれか１項記載のＦＩＳＨ解析法。
【請求項５】
ＰＦ−４０５、ＰＦ−３８０−ＬＳＳ、ＰＦ−３９５−ＬＳＳ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ、ＰＦ−５１０−ＬＳＳ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、Ｒｅｄ５−ＲＯＸ、ＡＴＴＯ  ６２０、ＰＢ４９５、ＡＦ５９４から選択される複数の蛍光色素によってＦＩＳＨプローブを標識する請求項１〜４いずれか１項記載のＦＩＳＨ解析法。
【請求項６】
表８のいずれか１つの疾患を検出するために用いる請求項１〜５いずれか１項記載のＦＩＳＨ解析法。
【請求項７】
多発性骨髄腫を原因とする染色体異常を検出する請求項６記載のＦＩＳＨ解析法。
【請求項８】
表８に記載のプローブを用いて、
ｄｅｌ１３ｑ３４、ｄｅｌ１７ｐ１３、ｔ（１１；１４）（ｑ１３；ｑ３２）、ｔ（４；１４）（ｐ１６；ｑ３２）、ｔ（１４；１６）（ｑ３２；ｑ２３）、ｔ（６；１４）（ｐ２５；ｑ３２）、ｔ（６；１４）（ｐ２１；ｑ３２）、ｔ（８；１４）（ｑ２４；ｑ３２）、ｔ（１４；２０）（ｑ３２；ｑ１１）、１ｑ２１増幅、ｄｅｌ１ｐ３２．３、ＣＥＰ７、ＣＥＰ９のうちのいずれか２つ以上の染色体異常を同時に検出する請求項７記載のＦＩＳＨ解析法。
【請求項９】
さらに、ＣＤ１３８、及び／又は核を染色する請求項７、又は８記載のＦＩＳＨ解析法。
【請求項１０】
多発性骨髄腫の治療薬を選択するために用いる請求項７〜９いずれか１項記載のＦＩＳＨ解析法。
【請求項１１】
請求項１〜１０いずれか１項記載の解析法に用いる血液腫瘍の検査キットであって、
表８に記載のプローブと
ＦＩＳＨに必要な試薬を含むことを特徴とする検査キット。
【請求項１２】
前記プローブが蛍光標識されたものである請求項１１記載の検査キット。
【請求項１３】
請求項１〜１０いずれか１項記載のＦＩＳＨ解析法で得られた患者の染色体異常パターンと、患者の治療成績を蓄積し、
ＡＩを用いて解析することによって染色体異常パターンごとの最適な治療法を選択する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＦＩＳＨ）を用いて標的細胞における染色体異常を検出する方法に関する。特に、新しいＦＩＳＨ法である一標的細胞の染色体複数異常を同時検出する方法（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは正常な細胞にいくつかの遺伝子変異が生じることに起因する疾患である。遺伝子変異は、遺伝子配列の一塩基置換や一塩基欠失のように、遺伝子に一つ、あるいは数塩基の変異が生じている場合もあれば、染色体の転座や欠失などのように、染色体に大きな変異が生じている場合もある。多発性骨髄腫、白血病などの血液腫瘍では、疾患に特異的な染色体異常が知られている。また、固形腫瘍においても、染色体異常を含む遺伝子変異を検出し、これを標的として治療が行われる場合がある。したがって、がんなど遺伝子変異によって生じる疾患において、どのような遺伝子変異が生じているかを検出することは、診断や治療方針を定めるうえで非常に重要である。【０００３】
遺伝子の変異を検査する方法として、いくつかの方法が開発されている。染色体異常を検出する方法としてはＦＩＳＨ法が開発され、がんや染色体異常症候群の診断に用いられている。ＦＩＳＨは、特定の遺伝子座の配列を有するプローブを酵素反応などによって標識し、検査対象の染色体や間期核中のＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとしておき、ハイブリダイゼーションさせることにより、特定の遺伝子座を顕微鏡下で観察する方法である。【０００４】
血液腫瘍は、クローナルエボリューションと呼ばれる変異の蓄積によって進展すると考えられている。血液腫瘍では複数の染色体異常が、１つの細胞で多段階に渡り引き起こされ、疾患の進展と相関することが知られている。例えば、多発性骨髄腫では、染色体所見によって、高リスク群、中間リスク群、標準リスク群の病型分類が行われており、染色体変異と予後とに相関があることが知られている。そのため、腫瘍細胞に生じている複数の染色体異常を検出することは予後予測のうえでも重要である。【０００５】
多発性骨髄腫の場合には、１７ｐ欠失（ｐ５３の欠失）、ｔ（１４；１６）（ＩｇＨ／ＭＡＦ転座）が検出される場合には高リスク群として、１３ｑ欠失（ＲＢ１の欠失）、ｔ（４；１４）（ＦＧＦＲ３／ＩｇＨ転座）が検出される場合には中間リスク群として、ｔ（１１；１４）（ＢＣＬ１／ＩｇＨ転座）が検出される場合には標準リスク群として病型分類される。すなわち、多発性骨髄腫の予後予測を行う場合には５種類の染色体異常を検出する検査を行う必要がある。しかし、染色体異常を検出するＦＩＳＨでは、２種類の蛍光色素を用いて検出を行うことから、１種類から２種類の染色体異常を同時に検出することができるに過ぎない。すなわち、一つの細胞に生じている複数の染色体異常を同時に検出するのではなく、一つの染色体異常を検出する検査を複数種行うことによって、どのような染色体異常が生じているかを推測しているのが現状である。そのため、各染色体異常の頻度はわかるものの、重複して存在している染色体異常の頻度についての情報を得ることはできない。【０００６】
一方で、多数の蛍光色素を用いたＦＩＳＨが知られている（特許文献１、非特許文献１〜３）。特許文献１には、異なる蛍光色素を組み合わせることによって、識別し得るバーコードとすることにより、細胞における多種の標的遺伝子の転写を定性的、定量的に検出することが開示されている。理論的には５種類の蛍光色素を用いることによって、３１の標的を区別し得ることが記載されている。また、非特許文献１には、ショウジョウバエの胚で４種の異なる遺伝子の発現をＦＩＳＨにより解析した結果が開示されている。【０００７】
特許文献１や非特許文献１に記載の発明は、多数の遺伝子発現を解析する方法である。遺伝子発現を解析する場合には、特許文献１のように、数種の蛍光色素を組合せてバーコード化し、多くの遺伝子を識別することが可能である。また、非特許文献１に記載の方法のように、蛍光スペクトルの異なる複数種の蛍光を用いて解析することも可能である。いずれの方法も、胚や組織のようにプローブと結合するｍＲＮＡが一細胞中に多コピー存在し、比較的短いプローブであっても強いシグナルを得ることが期待できる場合に適用できる方法である。【０００８】
染色体の欠失や転座などの異常を検出する場合には、切断領域が広範囲にわたっていることから、数種の蛍光プローブをバーコード化して使用しても、遺伝子の構造変化に対応することができない。そのため、結果を解析することができない場合があるから、特許文献１に記載の方法のように、蛍光色素を組合せてバーコード化してＦＩＳＨに使用することはできない。【０００９】
非特許文献２、３には、Ｍ−ＦＩＳＨ（Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｕｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法によって、染色体を異なる蛍光色素で染色し、染色体異常を検出することが開示されている。非特許文献２、及び３に記載されているＭ−ＦＩＳＨは、染色体全体をペインティングプローブによって染色し、蛍光色素の組合せによって各染色体を識別する方法である。この方法を用いることにより、各染色体の由来を短時間で同定し染色体の構造異常を検出することはできるが、分裂期の細胞を使用する必要があるため、髄液細胞など分裂期の細胞の割合が少ない場合には染色体異常を検出するのは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２００２−５４２７９３号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Bier, E. & De Robertis, E. M. 2015, Science, Vol.348(6242),aaa5838, DOI:10.1126/science.aaa5838
【非特許文献２】Li, J., et al., 2013, BMC Systems Biology, Vol.7 (Suppl. 4):55
【非特許文献３】Brown, J. et al., 2002, Blood, Vol.99, No.7, p. 2526-2531
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記示したように複数の蛍光色素を用いて検出するＦＩＳＨ法が開発されているものの血液腫瘍など一細胞に複数種存在する染色体異常を検出する方法は未だに開発されていない。本発明は、一細胞中に存在する複数の染色体異常を一度に検出する方法、及びプローブを提供することを課題とする。【００１３】
また、血液腫瘍が疑われる患者は、骨髄液を採取し、その中に含まれる細胞にどのような染色体異常が含まれるか検査を行う。しかし、患者の病期等によっては、腫瘍細胞の割合が少ない場合もあり、腫瘍細胞の染色体異常を検出できない可能性がある。そのため、高感度に腫瘍細胞を検出したうえで、一細胞中に存在する複数の遺伝子変異を検出する必要がある。腫瘍細胞を選択したうえで、染色体異常を検出することができれば、腫瘍の早期発見、早期診断を行い治療につなげることができる。本発明は、腫瘍細胞と正常細胞とを区別したうえで、一つの標的細胞に存在する複数の染色体異常を同時に検出することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は以下の検査方法、及びキットに関する。
（１）識別可能な３以上の標識を用いて、一標的細胞中の２以上の染色体異常を同時検出するＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）解析法。
（２）画像解析ソフトによって蛍光を分離して解析する（１）記載のＦＩＳＨ解析法。
（３）ホルムアルデヒド固定、メタノール／酢酸後固定、酢酸処理を行い細胞を固定する（１）又は（２）記載のＦＩＳＨ解析法。
（４）細胞表面抗原を染色することにより腫瘍細胞を識別し、染色体異常を検出する（１）〜（３）いずれか１つ記載のＦＩＳＨ解析法。
（５）ＰＦ−４０５、ＰＦ−３８０−ＬＳＳ、ＰＦ−３９５−ＬＳＳ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ、ＰＦ−５１０−ＬＳＳ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、Ｒｅｄ５−ＲＯＸ、ＡＴＴＯ  ６２０、ＰＢ４９５、ＡＦ５９４から選択される複数の蛍光色素によってＦＩＳＨプローブを標識する（１）〜（４）いずれか１つ記載のＦＩＳＨ解析法。
（６）表８のいずれか１つの疾患を検出するために用いる（１）〜（５）いずれか１つ記載のＦＩＳＨ解析法。
（７）多発性骨髄腫を原因とする染色体異常を検出する（６）記載のＦＩＳＨ解析法。
（８）表８に記載のプローブを用いて、ｄｅｌ１３ｑ３４、ｄｅｌ１７ｐ１３、ｔ（１１；１４）（ｑ１３；ｑ３２）、ｔ（４；１４）（ｐ１６；ｑ３２）、ｔ（１４；１６）（ｑ３２；ｑ２３）、ｔ（６；１４）（ｐ２５；ｑ３２）、ｔ（６；１４）（ｐ２１；ｑ３２）、ｔ（８；１４）（ｑ２４；ｑ３２）、ｔ（１４；２０）（ｑ３２；ｑ１１）、１ｑ２１増幅、ｄｅｌ１ｐ３２．３、ＣＥＰ７、ＣＥＰ９のうちのいずれか２つ以上の染色体異常を同時に検出する（７）記載のＦＩＳＨ解析法。
（９）さらに、ＣＤ１３８、及び／又は核を染色する（７）、又は（８）記載のＦＩＳＨ解析法。
（１０）多発性骨髄腫の治療薬を選択するために用いる（７）〜（９）いずれか１つ記載のＦＩＳＨ解析法。
（１１）（１）〜（１０）いずれか１つ記載の血液腫瘍の解析法に用いる検査キットであって、表８に記載のプローブとＦＩＳＨに必要な試薬を含むことを特徴とする検査キット。
（１２）前記プローブが蛍光標識されたものである（１１）記載の検査キット。
（１３）（１）〜（１０）いずれか１つ記載のＦＩＳＨ解析法で得られた患者の染色体異常パターンと、患者の治療成績を蓄積し、ＡＩを用いて解析することによって染色体異常パターンごとの最適な治療法を選択する方法。
（１４）一標的細胞の染色体複数異常を同時検出する方法（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨ）によって、識別可能な３以上の標識を用いて、画像解析ソフトによって蛍光を分離して検出し、１細胞中の２以上の染色体異常を同時に検出し、染色体異常パターンによって疾患の病型を分類することを特徴とする診断方法。
（１５）ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨ解析法によって、識別可能な３以上の標識を用いて、画像解析ソフトによって蛍光を分離して検出し、１細胞中の２以上の染色体異常を同時に検出し、染色体異常パターンによって治療薬を選択することを特徴とする治療方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨ法の概略を示す図。
【図２】実施例１においてＳＣＡＴ  ＦＩＳＨ法で染色を行った顕微鏡像。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に述べる染色体異常の解析方法は、どのような疾患に由来する染色体異常であっても検査することが可能である。特に、複数種の染色体異常が一つの細胞に生じる血液腫瘍の検査に用いることによって、病型、予後予測を判定し、治療方法の選択に活かすことができる。
【００１７】
血液腫瘍には、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞形Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞性リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病などがある。
【００１８】
これら血液腫瘍において、一つの腫瘍細胞中に検出される複数の染色体異常をより詳細に解析し、情報を蓄積することによって、新たな治療法や予後予測方法を確立できる可能性がある。例えば、多発性骨髄腫の治療には、ボルテゾミブ、レナリドミド、サリドマイドなどいくつかの治療薬が用いられている。各医薬は、腫瘍に対する作用機序や効果が異なることから、単独であるいは組み合わせて使用されている。現在のところ治療薬の選択は、症状と照らし合わせて最適と考えられるものが選択されているが、客観的な指標があればより効果的な治療を医師の経験によらず選択することが可能となる。
【００１９】
本発明の方法を用いて腫瘍細胞に生じている複数の染色体異常の組合せや比率、さらに、治療方法による効果や検出される染色体異常の推移などのデータを蓄積することにより、染色体異常と治療法による予後との相関を明らかにできる可能性がある。その結果、現在医師の経験によって選択している治療法も、患者の腫瘍の染色体異常のパターンを客観的な指標として用い、選択することができる可能性がある。
【００２０】
まず、ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨ法の概要について説明する。図１に方法の概略を示す。
（１）方法
試料としては、染色体異常が存在する可能性のある細胞であれば、どのような試料を用いてもよい。血液腫瘍であれば、骨髄穿刺によって得られた骨髄液、あるいは末梢血を試料として用いることができる。試料は患者から採取後すぐに、あるいは凍結保存したものを３７℃で速やかに解凍して使用する。骨髄液には、骨髄芽球などの白血球系の細胞、赤芽球系の細胞、骨髄巨核球、形質細胞が含まれる。そこで、腫瘍細胞において発現している表面抗原に対する抗体を用いて陽性細胞を分離し、さらに、腫瘍細胞の表面抗原を染色することによって腫瘍細胞を選択的に検出することができる。
【００２１】
具体的には、多発性骨髄腫などの形質細胞に由来する腫瘍の場合は抗ＣＤ１３８抗体、骨髄性白血病の場合には抗ＣＤ３３抗体、Ｂ細胞リンパ腫の場合には抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、Ｔ細胞リンパ腫の場合には抗ＣＤ３抗体、ＮＫ細胞リンパ腫の場合には抗ＣＤ５６抗体など、各腫瘍細胞の由来に応じた抗体を使用すればよい。例えば、骨髄液に抗ＣＤ１３８抗体を結合させた磁気ビーズと混合し反応させた後、磁力により表面抗原が発現している陽性細胞を分離する。多発性骨髄腫などの形質細胞由来の腫瘍では、多くの場合ＣＤ１３８が発現しているので、形質細胞とともに腫瘍細胞を分離することができる。
【００２２】
また、特定の表面抗原を発現している細胞を選択的に濃縮するだけではなく、陰性の細胞を選択するネガティブセレクションの手法を用いることもできる。特に、Ｔ細胞、Ｂ細胞に由来する腫瘍の場合には、ネガティブセレクションによって腫瘍細胞を濃縮してもよい。濃縮する手法は、磁気ビーズ以外にも、ＦＡＣＳによって腫瘍細胞を分離するなど、腫瘍細胞を分離できればどのような方法を用いてもよい。
【００２３】
次に、腫瘍細胞に特異的に発現している細胞表面抗原を染色する。例えば、細胞表面抗原に対するビオチン標識化抗体を結合させ、蛍光標識ストレプトアビジンを用いて細胞表面抗原を染色する。ビオチン標識化抗体は、上記で分離に用いたものと同一の抗原に対するものを用いても、異なる抗原に対するものを用いてもよい。また、蛍光標識された細胞表面抗原に対する抗体を使用して直接細胞染色を行ってもよい。細胞表面を染色した後、定法によりホルムアルデヒド固定、メタノール／酢酸による後固定を行う。遠心により上清を除いた後、１０％酢酸を加え、室温で１０分間静置する。
【００２４】
また、検体中に腫瘍細胞の比率が高いことが予測される場合には、細胞表面抗原の染色を行わなくてもよい。表面抗原の染色を行う必要がなければ、ＦＩＳＨにその色素を割り当てることが可能となり、より多数の染色体異常を検出することができる。
【００２５】
ＦＩＳＨは、固定法として通常カルノア固定が用いられている。しかし、カルノア固定を行ってＳＣＡＴ  ＦＩＳＨを行うと、表面抗原が失われてしまうため、腫瘍細胞を判別することができなかった。そこで、固定方法を検討した結果、ホルムアルデヒド固定、メタノール／酢酸により後固定を行うことにより、表面抗原の染色が可能となり、バックグラウンドが低減することが明らかとなった。さらに、固定後に１０％酢酸処理を行うことにより、バックグラウンドがより低減し、各蛍光を明瞭に区別することが可能となった。多色で染色を行うことから、個々のシグナルを明確に区別するためにも、バックグラウンドを低減させることは重要である。
【００２６】
酢酸を洗浄により除去した後、スライドガラスにスポットする。風乾したスライドはすぐにＤＮＡプローブとハイブリダイズさせてもよいし、−２０℃で使用時まで保存することもできる。準備されたスライドガラスは、所望のプローブとハイブリダイゼーションを行い、画像を取得し解析を行う。
【００２７】
具体的には、まず、スライドガラス上の細胞がスポットされている箇所に、プローブを含まないハイブリダイゼーション溶液を滴下し、８０℃で１時間静置することにより、抗原賦活化（熱変性）を行う。通常、ＦＩＳＨプローブは、標本と一緒、あるいは別々に熱変性させて用いる。一般的に、プローブと標本を一緒に熱変性させる場合には、７５℃〜８０℃で、１〜５分間処理して変性させる。また、プローブと標本を別々に熱処理する場合には、プローブは７０℃〜７５℃で５分間加熱した後、氷上で急冷し、標本スライドは変性液に浸漬し、７０℃〜７５℃で２〜５分間変性させて用いる。しかし、通常用いられている上記熱変性の条件では、プローブの種類によって蛍光が検出できないものがあった。ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨでは、一度に多種類のプローブとハイブリダイズさせ解析するため、すべてのプローブについて感度良く蛍光を検出できる条件が必要である。そこで、標本スライドの熱変性条件について、温度条件、及び時間条件を変えて検討を行った。プローブによって異なるものの、温度が高いほど、また、処理時間が長いほど蛍光シグナルが強くなることが明らかとなった。そこで、ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨでは、８０℃で６０分間、標本の熱変性処理を行うこととしている。また、抗原賦活化処理の後、室温で７０％エタノール１分、８５％エタノール１分、１００％エタノール１分浸漬し、エタノール置換後に風乾する。
【００２８】
標識された所望の組合せのプローブは、ハイブリダイゼーション溶液中で混合して７５℃で１０分間熱変性させ、使用するまで４５℃に保温しておく。風乾したスライドガラスを４５℃で保持した状態でプローブを載せ、４０℃で１６〜２０時間ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション後のスライドガラスは洗浄後風乾し封入し観察を行う。
【００２９】
（２）ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨに用いる色素、及び画像解析方法
本方法では、複数の蛍光色素で標識されたプローブを用いてＦＩＳＨを行うので、各スペクトルに重複する波長領域が生じる。そこで、ラムダスキャン（Ｌａｍｂｄａ  ｓｃａｎ、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によって画像を取得し、蛍光スペクトルを分離し解析を行う。種々の蛍光色素を検討した結果、現在ラムダスキャンによって画像取得後に蛍光スペクトルを分離し、最も明瞭に解析を行うことができるのは、以下の１０の蛍光色素であった（表１）。なお、ＤＲＡＱ５はＤＮＡに結合する試薬であり、核染色に用いている。
【００３０】
表１に示す核染色に用いたＤＲＡＱ５以外の９種類の色素を用いて、所望のＦＩＳＨプローブを標識し、染色体異常を検出すれば、９種類の染色体異常の解析が可能である。また、抗ＣＤ１３８抗体などの細胞表面抗原により、細胞表面を染色する場合には、ＦＩＳＨプローブを標識するために使用できる色素は８種類となり、一つの細胞内に複数存在する染色体異常を８種類まで同時に検出することが可能となる。今後さらに新しい色素が開発されれば、より多くの波長を分離可能となり、より多くのプローブを使用してＦＩＳＨ解析を行うことが可能となる。また、ここではラムダスキャンを用いて解析を行っているが、同様に画像を処理し、各蛍光を分離して解析を行うソフトであれば、どのようなソフトを用いてもよい。
【００３１】
また、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎの代わりにＰＢ４９５（使用レーザー４８８ｎｍ、極大励起波長４９５ｎｍ、極大放射波長５１７ｎｍ、Ｌｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を、Ｒｅｄ  ５−ＲＯＸの代わりにＡＦ５９４（使用レーザー５６１ｎｍ、極大励起波長５９０ｎｍ、極大放射波長６１７ｎｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用することもできる。各レーザーによって励起され、表１に記載の色素と同様のスペクトルパターンを示す蛍光色素であれば、どのような色素でも使用することができる。
【００３２】
【表１】
2019082871.tif 000003
【００３３】
以下の実施例では、血液腫瘍の中でも、比較的患者数が多く、治療法についてもある程度確立されている多発性骨髄腫を中心に説明するが、これに限らずどのような疾患における染色体異常であっても検出できることは言うまでもない。
【００３４】
［実施例１］
＜表面抗原染色＞
多発性骨髄腫患者の骨髄液を採取し、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳを加え１５００ｒｐｍ５分間の遠心処理を行った後、沈殿を最初の試料の量と同じ量になるようにＭＡＣＳ（登録商標）バッファー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）で懸濁した。次に、抗ＣＤ１３８抗体が結合した磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を試料の１／２０量加え、４℃で１５分間反応させた後、ＡｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）によりＣＤ１３８陽性細胞を分離した。２０００ｒｐｍ３分間の遠心により上清を除き、１０μｌの細胞懸濁液とした。ビオチン標識抗ＣＤ１３８抗体（Ａｃｒｉｓ社製）を１０μｌ添加し、４℃で１０分インキュベートした。次に、１．２ｍｌ  ＭＡＣＳバッファーを加え、２０００ｒｐｍ３分間の遠心後、上清を除き、１０μｌの細胞懸濁液とした。１０倍希釈したＡＴＴＯ  ６２０−ストレプトアビジン（ＡＴＴＯＴＥＣＨ社製）を１μｌ加え、４℃で１５分間反応させた。次に、１．２ｍｌ  ＭＡＣＳバッファーを加え、２０００ｒｐｍ３分の遠心を２回繰り返し洗浄後、ＭＡＣＳバッファーで５０μｌの細胞懸濁液とした。
【００３５】
上記細胞懸濁液に、５０μｌの１％ホルムアルデヒドを添加し、室温で１０分間固定した後、２０００ｒｐｍ３分間遠心し、上清を除き沈殿を１００μｌの２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳで懸濁した。細胞懸濁液をボルテックスミキサーで撹拌しながら、氷冷した６．２５％酢酸／９３．７５％メタノール溶液を終濃度が５％酢酸／７５％メタノール溶液になるように添加し、氷上で１０分間、後固定を行った。２０００ｒｐｍ３分間遠心し、上清を除き沈殿に５００μｌの１０％酢酸を添加し、室温で１０分間静置した。２０００ｒｐｍ３分間遠心後、上清を除き沈殿に１．２ｍｌ  ＭＡＣＳバッファーを加え、２０００ｒｐｍ３分間の遠心を２回繰り返して洗浄を行った。洗浄後、上清を除き、細胞懸濁液をスライドガラスにスポットして風乾した。スライトガラスはＦＩＳＨを行うまで−２０℃で保管した。
【００３６】
＜ハイブリダイゼーション＞
スライドガラス上の細胞をスポットした箇所に、ハイブリバッファー（Ｌｉｃａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）３μｌを載置し、カバーガラスを載せ、ペーパーボンド（ＫＯＫＵＹＯ社製）によって封入した。８０℃のホットプレート（ＳｔａｔＳｐｉｎ  ＴｈｅｒｍｏＢｒｉｔｅ、ＡＢＢＯＴＴ社製）上で６０分間、抗原賦活化処理を行った。スライドガラスは、室温の２×ＳＳＣ中でカバーガラスをはずし、７０％、８５％、１００％エタノールに各１分ずつ浸漬し、風乾後４５℃に保温した。
【００３７】
ハイブリバッファーに標識プローブを混合し、７５℃１０分加熱することによって、プローブを熱変性させた。各染色体の変異を検出するために用いたプローブ、及び蛍光標識は表２のとおりである。なお、ＭＡＦ、ＦＧＦＲ３、ＢＣＬ１、ＤＬＥＵ１、１３ｑ３４のプローブはＢＡＣクローンによる。また、Ｅｍｐｉｒｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＩＧＨは、Ｅｍｐｉｒｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社より、Ｖｙｓｉｓ  ｐ５３、及びＶｙｓｉｓ  ＣＥＰ１７は、Ｖｙｓｉｓ社より購入した。また、プローブの蛍光標識はニックトランスレーションキット（ＡＢＢＯＴＴ社製）によって行った。
【００３８】
【表２】
2019082871.tif 000004
【００３９】
スライドガラスは４５℃に保ったまま、プローブ混合液を３μｌ載せ、カバーガラスを載せて、ペーパーボンドで封入した後、４０℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ペーパーボンドを剥がし、２×ＳＳＣ中で、カバーガラスをはずし、洗浄機器（ＡＬＯＫＡ  ＨＹＢＲＩＭＡＳＴＥＲ  ＨＳ−３００、ＡＬＯＫＡ社製）を用い、以下のプログラム（１）から（４）の順序で洗浄を行った。ここでは、洗浄機器を用いて自動で洗浄を行っているが、同じ条件で洗浄すればよく、手動で行うことも可能である。
【００４０】
洗浄プログラム；
（１）５０％  ホルムアミド／２×ＳＳＣ、４５℃、１０分、３回
（２）２×ＳＳＣ  ４５℃、１０分
（３）０．１％ＮＰ４０／２×ＳＳＣ、４５℃、５分
（４）２×ＳＳＣ  すすぎ
【００４１】
洗浄後スライドガラスは風乾し、１／５０００希釈したＤＲＡＱ５ストック液（ＢｉｏＳｔａｔｕｓ社製）を含むＰｒｏＬｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）で封入し、観察を行った。
【００４２】
図２に、表２に示した８つのプローブ、細胞表面抗原としてＣＤ１３８、及び核染色を行った結果を示している。左上の染色像は、染色体異常を検出するためのプローブ（表２参照）の染色像を重ね合わせた像、左下の像は細胞表面抗原（ＣＤ１３８）及び核染色の像、右上の像は、染色体異常が検出されたＰ５３、１３ｑ３４、ＤＬＥＵ１の像とＣＥＰ１７を重ね合わせた像を示している。腫瘍細胞に特異的に発現している抗ＣＤ１３８抗体で染色することにより（図２、左下）、腫瘍細胞と正常細胞の区別を容易に行うことができる。その結果、腫瘍細胞を検出したうえで、染色体異常を解析するので、精度の高い検査を行うことができる。病期によっては腫瘍細胞が骨髄液に含まれる比率が低い場合もあることから、精度の高い検査を行うためには、細胞表面抗原を染色する方法は非常に有効である。
【００４３】
また、各プローブによる染色は、異なる色によって識別することができるので（図２左上）、一細胞中にどのような染色体異常が重複して生じているかを簡単に区別することができる。実施例１に示す細胞では、Ｐ５３、１３ｑ３４、ＤＬＥＵ１のシグナルが夫々１つずつしか検出できないことから、これら遺伝子の欠失が生じているものと考えられる（図２右上）。このように、一細胞で多数の遺伝子異常を同時に検出できることから、より詳細に遺伝子異常の解析を行うことができるようになった。
【００４４】
［実施例２］
次に、従来法である１つの染色体の異常をそれぞれ検出するＦＩＳＨと、ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨによる結果比較を示す（表３）。検査会社に、１０名の多発性骨髄腫患者（検体Ｐ１〜Ｐ１０）の骨髄液の検査を依頼し、ＦＡＣＳによるＣＤ１３８陽性細胞の全細胞に対する割合（検査会社のＦＡＣＳ結果）、ＤＬＥＵ１（ＲＢ１）欠損、Ｐ５３欠損、ＢＣＬ１転座、ＦＧＦＲ３転座、ＭＡＦ転座のＦＩＳＨによる検査を依頼した。同じ試料をＳＣＡＴ  ＦＩＳＨによって、実施例１と同様の方法を用いてＦＩＳＨを行い、染色体異常が検出された割合をまとめた。
【００４５】
【表３】
2019082871.tif 000005
【００４６】
表３に示すのは、各検体で検出された染色体異常の割合をパーセントで示したものである。健常人であっても偽陽性が観察されることから、５名の健常人の末梢血試料をＳＣＡＴ  ＦＩＳＨによって解析した。健常人の欄には、健常人において検出される偽陽性の平均（ＡＶＥ）、及び標準偏差（ＳＤ）を示している。表中網掛けをした欄は、ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨで有意に（Ｐ＜０．０５）健常人よりも高い頻度で染色体異常が検出されたことを示している。なお、検査会社の分析でも偽陽性が生じるため、ＤＬＥＵ１（ＲＢ１）欠損は５％以下、Ｐ５３欠損は２％以下、ＢＣＬ１、ＦＧＦＲ３及びＭＡＦの転座は１％以下を偽陽性として判定している。なお、「なし」は検査会社にＦＩＳＨ検査を依頼していないことを示す。
【００４７】
ＤＬＥＵ１（ＲＢ１）欠損は、健常人で１８．６％と比較的高い擬陽性が認められるが、いずれの患者の試料も健常人の平均値よりも有意に高い値を示し、ＤＬＥＵ１欠損があることが明らかとなった。検査会社の分析結果では、ＤＬＥＵ１欠損が認められない患者が半数あり、ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨは非常に感度の良い方法であることが示された。
【００４８】
感度の高さはＣＤ１３８陽性細胞の割合が低い患者では特に顕著に認められる。例えば、検体Ｐ１０では、全細胞に占めるＣＤ１３８の割合が１．３％と非常に低いことから、検査会社で行ったＦＩＳＨ検査では、染色体異常は認められなかった。これに対し、ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨでは、ＤＬＥＵ１（ＲＢ１）欠損が２４．６％と健常人と比較して有意に高い値で認められた。さらに、検体Ｐ１、Ｐ７、Ｐ９、Ｐ１０のＤＬＥＵ１（ＲＢ１）、Ｐ５〜Ｐ７のＢＣＬ１転座、Ｐ１のＦＧＦＲ３転座、Ｐ２〜Ｐ６のＭＡＦ転座は、ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨによってのみ検出されている。ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨでは、形質細胞で発現しているＣＤ１３８陽性細胞を集めて染色することから、非常に感度良く染色体異常を検出することができる。したがって、腫瘍を早期に発見し、予後のタイピングを行うことができる。
【００４９】
［実施例３］
ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨにより一細胞中の染色体異常を複数検出し、解析した例を次に示す。２例の多発性骨髄腫再発例において、実施例１と同様にＳＣＡＴ  ＦＩＳＨを行い、一細胞中でどのような染色体異常が複合して生じているか、解析を行った（表４〜表７）。
【００５０】
表４は再発例の患者Ｐ８における各染色体異常の割合を解析し、パーセントで示したものである。Ｐ８−１からＰ８−２までは３年５ヶ月、Ｐ８−２からＰ８−３までは１年８ヶ月、Ｐ８−３からＰ８−４までは２年がそれぞれ経過している。治療欄のＭＰはメルファラン、プレドニゾロンを、Ｒｄはレナリドミド、デキサメタゾンを、ＢＤはボルテゾミブ、デキサメタゾンを多発性骨髄腫の化学療法レジメンに從って投与したことを示す。また、効果欄のＰＤはＰｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ、ＮＣはＮｏ  Ｃｈａｎｇｅを示す。
【００５１】
【表４】
2019082871.tif 000006
【００５２】
表４に示すように、上位２つの染色体異常がいずれも５０％を超えていることから、１つの細胞に重複した染色体異常が生じていることは明らかである。しかし、どのように重複した変異が生じているかはこの評価から推測することはできない。同じ試料について一細胞中で生じている重複する染色体異常についてＳＣＡＴ  ＦＩＳＨで解析した結果を表５に示す。表５は各時期において、患者Ｐ８で一細胞中に検出された染色体異常を上位から示したものである。
【００５３】
表４に示したように、ＢＣＬ１転座、ＢＣＬ１  ｆｏｃｉ  ３つは単独でも検出される割合が多いが、いずれの時期においても重複して検出される染色体異常として最も割合が高かった。また、一細胞中に存在する染色体異常は、時期による変動が見られる。
【００５４】
【表５】
2019082871.tif 000007
【００５５】
他の症例において、解析した結果を次に示す（表６、表７）。再発患者Ｐ１１における各染色体異常の割合を解析し、上記と同様にしてパーセントで示したものである。Ｐ１１−１からＰ１１−２までは５年９ヶ月、Ｐ１１−２からＰ１１−３までは１年８ヶ月がそれぞれ経過している。個々の染色体異常が占める割合（表６）と一細胞中に検出される染色体異常の割合（表７）を示す。なお、表中、治療欄のＰａｎＶＤは、パノビノスタット、ボルテゾミブ、デキタメサゾンを、ＩＲｄはイキサゾミブ、レナリドミド、デキサメタゾン投与による治療を行ったことを示す。また、ＳＤは、Ｓｔａｂｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅを示す。
【００５６】
【表６】
2019082871.tif 000008
【００５７】
【表７】
2019082871.tif 000009
【００５８】
この症例では、個々の染色体異常の頻度が経過とともに増加していることは従来法による解析からも明らかである。しかし、ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨを行うことによって、重複している染色体異常のパターンが変化していることが初めて明らかとなった。
【００５９】
以上示したように、単独の染色体異常についての結果（表４、表６）からは、一細胞中に生じている染色体異常が単独であるのか、あるいは重複しているのかは判定することができない。これに対し、ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨでは、どのような染色体異常が重複して生じているかを明らかにすることができる。これまでどのような染色体異常が見られるかによって、高リスク群、中間リスク群、標準リスク群に病型分類されていたが、染色体異常の組み合わせによって、より詳細、かつ正確に治療予後を予測する方法が確立できる可能性がある。
【００６０】
また、上記結果は、再発毎に染色体異常のパターンが異なることを示している。治療によって染色体異常のパターンが変化することは、特定の染色体異常に対して、有効な治療法が存在する可能性を示唆している。したがって、今後、ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨにより、治療、及びその効果に対する染色体異常の推移などのデータを蓄積し、クローンの種類と治療予後の関連付けを行うことによって、染色体異常のパターンに対してより効果的な治療薬の情報を蓄積することができる。それにより、ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨを行い、患者毎にどのような染色体異常が生じているかを確認し、最適な治療方法を選択することも可能となる。
【００６１】
具体的には、ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨによって詳細に解析された染色体異常のパターンと、特定の治療に対する反応や、再発までの期間など、患者データを機械学習やディープラーニングなどＡＩを用いて解析することにより、特定の染色体異常のパターンにおける最適な治療法や予後予測を行うことができる。したがって、ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨによって染色体異常を検査し、特定の染色体異常のパターンの際の最良の治療法を選択することが可能となる。
［実施例４］
【００６２】
ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨは、多発性骨髄腫だけではなく、種々の血液腫瘍において重複する複数の染色体異常を検出するのに有効である。ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨを用いて得られる詳細な染色体異常の情報を治療方法の選択、予後予測に活用することができる。主な血液腫瘍において、染色体異常、及びそれを検出するためのプローブを表８（表８−１及び表８−２）にまとめた。
【００６３】
【表８−１】
2019082871.tif 000010
【００６４】
【表８−２】
2019082871.tif 000011
【００６５】
表８に示す血液腫瘍でも、複数種の染色体異常が重複して検出されることが知られている。これら腫瘍においても、ＳＣＡＴ  ＦＩＳＨを用いて検査を行うことによって、より詳細な情報が蓄積され、予後予測、治療方法の選択に役立てることができる。表８のプローブを用いて、染色体異常のパターン、治療に対する反応、予後について情報を蓄積することにより、患者に最適な治療法を確立することができる。
【図１】
2019082871.tif 000012
【図２】
2019082871.tif 000013
【国際調査報告】
2019082871.tif 000014
2019082871.tif 000015
2019082871.tif 000016
2019082871.tif 000017