(57)【要約】  ＤＣＴＮ１タンパク質の一部とＲＥＴタンパク質の一部とが融合した新規なポリペプチド、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチド又はポリペプチドの検出方法、上記ポリヌクレオチドの発現又はポリペプチドの発現及び／又は活性を抑制する化合物をスクリーニングする方法、及びＲＥＴを阻害する化合物を有効成分とする医薬組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチド。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される請求項１記載のポリペプチド。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
以下の（ｄ）〜（ｆ）から選択される請求項３記載のポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。  （ｆ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
以下の（ｇ）〜（ｉ）から選択される請求項３記載のポリヌクレオチド。
（ｇ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、又は配列番号２３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｈ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、又は配列番号２３で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、又は配列番号２３で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを導入した細胞。
【請求項８】
請求項１又は２記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項９】
試料中の、請求項１又は２記載のポリペプチドの存在を検出する方法。
【請求項１０】
試料中の、請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出するためのプライマー又はプローブであって、当該プライマー又はプローブが以下の（ｊ）〜（ｌ）から選択されるポリヌクレオチド。
（ｊ）ＤＣＴＮ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも１つのプローブであるポリヌクレオチド。
（ｋ）ＤＣＴＮ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド。
（ｌ）ＤＣＴＮ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計されたセンスプライマーとアンチセンスプライマーのセットであるポリヌクレオチド。
【請求項１１】
試料中の、請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出する方法。
【請求項１２】
請求項９又は１１記載の検出方法において、試料中の、請求項１若しくは２記載のポリペプチド又は請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出した場合に、試料の由来となる患者が癌であると判定する方法。
【請求項１３】
ＲＥＴを阻害する化合物を有効成分とする、ＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性及び／又はＤＣＴＮ１タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合タンパク質陽性の癌治療用医薬組成物。
【請求項１４】
以下の（１）及び（２）の工程を含む請求項１又は２記載のポリペプチドの発現及び／又は活性、又は請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現を抑制する化合物をスクリーニングする方法。
（１）請求項１又は２記載のポリペプチド、請求項１若しくは２記載のポリペプチド又は請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを発現している細胞、又は請求項７の細胞に試験化合物を接触する工程。
（２）上記工程（１）において、請求項１又は２記載のポリペプチドの発現及び／又は活性、又は請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現が抑制されるか測定する工程、又は上記工程（１）記載の細胞の増殖が抑制されるか測定する工程。
【請求項１５】
請求項１若しくは２記載のポリペプチド又は請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを、ＲＥＴを阻害する化合物を用いた化学療法が有効であるか否かの指標とする方法であって、請求項９記載の検出方法により、試料中から、請求項１若しくは２記載のポリペプチドを検出した場合、及び／又は請求項１１記載の検出方法により、試料中から、請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出した場合に、ＲＥＴを阻害する化合物を用いた化学療法が有効であると判定する方法。
【請求項１６】
ＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチド、及び当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種からなる癌を検出するためのバイオマーカー。
【請求項１７】
ＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性及び／又はＤＣＴＮ１タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合タンパク質陽性の癌患者に、ＲＥＴを阻害する化合物を用いた化学療法を行う工程を含む、癌の治療方法。
【請求項１８】
被験者由来の試料中から、請求項１又は２記載のポリペプチドの存在を検出すること及び／又は請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出することを行う工程、ならびに
請求項１又は２記載のポリペプチドの存在が検出されるか、かつ／又は請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在が検出された場合に、当該被験者に対し、ＲＥＴを阻害する化合物を用いた化学療法を行う工程を含む、癌の治療方法。
【請求項１９】
ＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性及び／又はＤＣＴＮ１タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合タンパク質陽性の癌患者を治療するための、ＲＥＴを阻害する化合物。
【請求項２０】
ＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性及び／又はＤＣＴＮ１タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合タンパク質陽性の癌患者を治療するための癌治療用医薬組成物を製造するための、ＲＥＴを阻害する化合物の使用。
【請求項２１】
試料中の請求項１又は２記載のポリペプチドの存在を検出するための手段及び／又は試料中の請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出するための手段の、ＲＥＴを阻害する化合物を用いた化学療法が有効であるか否かの判定薬の製造方法。
【請求項２２】
請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出するための抗ＤＣＴＮ１抗体及び抗ＲＥＴ抗体の組み合わせ。
【請求項２３】
請求項１若しくは２記載のポリペプチド又は請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出するための検出薬を製造するための、請求項８記載の抗体、請求項２２記載の抗体の組み合わせ又は請求項１０記載のプライマー若しくはプローブの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＣＴＮ１タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合タンパク質であるポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、当該ポリペプチド又はポリヌクレオチドの検出方法、当該ポリペプチド又はポリヌクレオチドを標的とした化合物、当該化合物をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは日本における死因第一位の疾患であり、その治療法の改善が求められている。甲状腺がんの罹患者数は増加しているが、多くの症例で進行が遅く初期段階に適切な治療をすることで高い生存率を示す。一方で自覚症状がほとんど無いため適切な治療には早期の診断が不可欠である。【０００３】
甲状腺がんは組織型により乳頭がん、濾胞がん、髄様がん、未分化がん、悪性リンパ腫に分けられる。乳頭がんは甲状腺がんの８０％程度を占めており、また未分化がんは低頻度であるが予後が非常に悪いことが知られている（非特許文献１）。【０００４】
乳頭がんにおいて、大部分ががん遺伝子の活性化によって発生することが知られておりＢＲＡＦ変異遺伝子（５０〜６０％）、ＲＡＳ変異遺伝子（１０〜２０％）、ＲＥＴ融合遺伝子（５〜１０％）等の遺伝子異常が相互排他的に生じることが明らかとなってきている。また非小細胞肺がんにおいても、ＲＥＴ融合遺伝子が１〜２％の頻度でＥＧＦＲ変異遺伝子等の他のドライバー変異遺伝子と相互排他的に存在することが報告されている（非特許文献２〜５）。【０００５】
進行した甲状腺がんにおいては薬物治療が主体となり、種々のマルチキナーゼ阻害剤が承認されているが、ドライバー変異遺伝子特異的に効果を示す薬剤は未だ承認されていない。一方、肺がんにおいてはＲＥＴ融合遺伝子陽性の患者でのＲＥＴを阻害することで効果を示すことが報告されており（非特許文献６）、甲状腺がんにおいても変異遺伝子や融合遺伝子といった薬剤効果の指標となりうる遺伝子異常を同定する必要がある。【０００６】
がんにおいて、ドライバーとなる変異遺伝子（変異タンパク質）や融合遺伝子（融合タンパク質）などを同定することは、がんの性質を明らかにするとともに、これら変異遺伝子や融合遺伝子を標的とした新しいがん治療薬や検査方法の開発に大きく寄与するため、強く望まれている。
しかしながら、がんの発生のドライバーとなり得る変異遺伝子や融合遺伝子等は十分に解明されておらず、薬剤の治療効果に関連し得る遺伝子異常を同定することは非常に有意義である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ，１１５（１６），ｐｐ３８０１−７（２００９）
【非特許文献２】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２（２９），ｐｐ４５７８−８０（２００３）
【非特許文献３】Ｃｅｌｌ，１５９（３），ｐｐ６７６−９０（２０１４）
【非特許文献４】Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．，３（６），ｐｐ６３０−５（２０１３）
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ，５１１（７５１１），ｐｐ５４３−５０（２０１４）
【非特許文献６】Ｌａｎｃｅｔ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｍｅｄ．，５（１），ｐｐ４２−５０（２０１７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＲＥＴタンパク質の少なくとも一部を含む融合タンパク質である新規なポリペプチド、又は当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、当該ポリペプチド又はポリヌクレオチドの検出方法、当該ポリペプチド又はポリヌクレオチドを標的とした化合物、当該化合物をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、甲状腺がん患者由来の細胞において、ＤＣＴＮ１タンパク質の一部とＲＥＴタンパク質の一部とが融合した新規なポリペプチド及び当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定した。また、がん細胞における本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドの検出方法、前記ポリヌクレオチドの発現又はポリペプチドの発現及び／又は活性を抑制する化合物をスクリーニングする方法を見出した。多種多様にあるタンパク質のうち、ＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分との組合せを有する融合タンパク質が細胞内で自然に発生すること、さらにＤＣＴＮ１とＲＥＴとの融合遺伝子が癌ドライバーとして働くため、上記融合タンパク質が、がん診断に有効であることは新規の知見でありかつ従来技術から予想し得ない事項である。さらに当該ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを発現している癌患者を治療するためのＲＥＴを阻害する化合物を有効成分とする医薬組成物を見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の態様を提供するものである。【００１１】
項１．ＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチド。【００１２】
項２．以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される項１記載のポリペプチド。【００１３】
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。【００１４】
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。【００１５】
（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。【００１６】
項３．項１又は２記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。【００１７】
項４．以下の（ｄ）〜（ｆ）から選択される項３記載のポリヌクレオチド。【００１８】
（ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。【００１９】
（ｅ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。【００２０】
（ｆ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。【００２１】
項５．以下の（ｇ）〜（ｉ）から選択される項３記載のポリヌクレオチド。【００２２】
（ｇ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、又は配列番号２３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。【００２３】
（ｈ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、又は配列番号２３で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。【００２４】
（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、又は配列番号２３で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチド。【００２５】
項６．項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。【００２６】
項７．項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを導入した細胞。【００２７】
項８．項１又は２記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。【００２８】
項９．試料中の、項１又は２記載のポリペプチドの存在を検出する方法。【００２９】
項１０．試料中の、項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出するためのプライマー又はプローブであって、当該プライマー又はプローブが以下の（ｊ）〜（ｌ）から選択されるポリヌクレオチド。【００３０】
（ｊ）ＤＣＴＮ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも１つのプローブであるポリヌクレオチド。【００３１】
（ｋ）ＤＣＴＮ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド。【００３２】
（ｌ）ＤＣＴＮ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計されたセンスプライマーとアンチセンスプライマーのセットであるポリヌクレオチド。【００３３】
項１１．試料中の、項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出する方法。【００３４】
項１２．項９又は１１記載の検出方法において、試料中の、項１若しくは２記載のポリペプチド又は項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出した場合に、試料の由来となる患者が癌であると判定する方法。【００３５】
項１３．ＲＥＴを阻害する化合物を有効成分とする、ＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性及び／又はＤＣＴＮ１タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合タンパク質陽性の癌治療用医薬組成物。【００３６】
項１４．以下の（１）及び（２）の工程を含む項１又は２記載のポリペプチドの発現及び／又は活性、又は項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現を抑制する化合物をスクリーニングする方法。【００３７】
（１）項１又は２記載のポリペプチド、項１若しくは２記載のポリペプチド又は項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを発現している細胞、又は項７記載の細胞に試験化合物を接触する工程。【００３８】
（２）上記工程（１）において、項１又は２記載のポリペプチドの発現及び／又は活性、又は項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現が抑制されるか測定する工程、又は上記工程（１）記載の細胞の増殖が抑制されるか測定する工程。【００３９】
項１５．項１若しくは２記載のポリペプチド又は項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを、ＲＥＴを阻害する化合物を用いた化学療法が有効であるか否かの指標とする方法であって、項９記載の検出方法により、試料中から、項１若しくは２記載のポリペプチドを検出した場合、及び／又は項１１記載の検出方法により、試料中から、項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出した場合に、ＲＥＴを阻害する化合物を用いた化学療法が有効であると判定する方法。【００４０】
項１６．ＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチド、及び当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種からなる癌を検出するためのバイオマーカー。【００４１】
項１７．ＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性及び／又はＤＣＴＮ１タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合タンパク質陽性の癌患者に、ＲＥＴを阻害する化合物を用いた化学療法を行う工程を含む、癌の治療方法。【００４２】
項１８．被験者由来の試料中から、項１又は２記載のポリペプチドの存在を検出すること及び／又は項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出することを行う工程、ならびに
項１又は２記載のポリペプチドの存在が検出されるか、かつ／又は項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在が検出された場合に、当該被験者に対し、ＲＥＴを阻害する化合物を用いた化学療法を行う工程を含む、癌の治療方法。【００４３】
項１９．ＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性及び／又はＤＣＴＮ１タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合タンパク質陽性の癌患者を治療するための、ＲＥＴを阻害する化合物。【００４４】
項２０．ＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性及び／又はＤＣＴＮ１タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合タンパク質陽性の癌患者を治療するための癌治療用医薬組成物を製造するための、ＲＥＴを阻害する化合物の使用。  【００４５】
項２１．試料中の項１又は２記載のポリペプチドの存在を検出するための手段及び／又は試料中の項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出するための手段の、ＲＥＴを阻害する化合物を用いた化学療法が有効であるか否かの判定薬の製造方法。【００４６】
項２２．項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出するための抗ＤＣＴＮ１抗体及び抗ＲＥＴ抗体の組み合わせ。【００４７】
項２３．項１若しくは２記載のポリペプチド又は項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出するための検出薬を製造するための、項８記載の抗体、項２２記載の抗体の組み合わせ又は項１０記載のプライマー若しくはプローブの使用。
【発明の効果】
【００４８】
本発明によれば、本発明のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドはがん細胞で特異的に発現していることが示された。また、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド及び当該ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを発現している細胞は、本発明のポリヌクレオチドの発現又はポリペプチドの発現及び／又は活性を抑制する化合物をスクリーニングする方法に用いることができる。また、本発明のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの存在を指標にすることにより、ＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性対象及び／又はＤＣＴＮ１タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合タンパク質陽性対象の検出を行うことが可能である。また、ＲＥＴを阻害する化合物は、ＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性及び／又はＤＣＴＮ１タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合タンパク質陽性の癌治療用医薬組成物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いた甲状腺がん組織中のＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子及びＧＡＰＤＨの発現確認
【図２】Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いた正常甲状腺組織中のＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子及びＧＡＰＤＨの発現確認
【図３】正常甲状腺組織及び甲状腺がん組織中のＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子全長の発現確認
【図４】ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞におけるＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合タンパク質の発現確認。ａ）抗リン酸化ＲＥＴ抗体を用いたＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合タンパク質の検出、ｂ）抗ＲＥＴ抗体を用いたＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合タンパク質の検出、ｃ）抗ＤＣＴＮ１抗体を用いたＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合タンパク質の検出。
【図５】ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の３次元培養における増殖確認。Ｎ＝３、平均＋ＳＤ。
【図６】ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の造腫瘍性確認
【図７】ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞におけるＲＥＴ  ｓｉＲＮＡによるリン酸化ＲＥＴの発現抑制の確認
【図８】ＲＥＴ  ｓｉＲＮＡによるＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の増殖抑制効果の確認
【図９】ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞におけるＲＥＴを阻害する化合物によるリン酸化ＲＥＴの発現抑制の確認
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は、新規なポリヌクレオチド又はポリペプチド、当該ポリヌクレオチド又はポリペプチドの検出方法、当該ポリヌクレオチド又はポリペプチドを標的とした化合物、当該化合物をスクリーニングする方法に関する。
【００５１】
本発明は、ＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチド（以下、「本発明のポリペプチド」とも称する）を提供する。また、本発明は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」とも称する）を提供する。
【００５２】
本発明にかかる「ＤＣＴＮ１（Ｄｙｎａｃｔｉｎ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  １）タンパク質」は、１５０  ｋＤａ  Ｄｙｎｅｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅタンパク質、又はＤＡＰ−１５０タンパク質とも称されるタンパク質であり、ヒト又は非ヒト哺乳動物のＤＣＴＮ１タンパク質を含み、好ましくはヒトＤＣＴＮ１タンパク質である。ヒトにおいて２ｐ１３．１に座乗している遺伝子にコードされているタンパク質である。本発明において、「ＤＣＴＮ１タンパク質」は、そのスプライスバリアントであるアイソフォームを含み、ヒト由来のものであれば、例えば、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿００４０７３、ＮＰ＿０７５４０８、ＮＰ＿００１１２８５１２、ＮＰ＿００１１２８５１３、ＮＰ＿００１１７７７６５、又はＮＰ＿００１１７７７６６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。また、より具体的には、例えば、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、又は配列番号３０で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。さらに、本発明において、「ＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端部分」とは、前記ＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端側にあるコイルドコイルドメインの一部又は全部を含むポリペプチドであり、好ましくはＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端側にあるコイルドコイルドメインの全部を含むポリペプチドである。
【００５３】
本発明にかかる「ＲＥＴタンパク質」は、Ｒｅｔ  Ｐｒｏｔｏ−Ｏｎｃｏｇｅｎｅタンパク質、ＲＥＴ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅタンパク質、又はＲｅａｒｒａｎｇｅｄ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎタンパク質とも称されるタンパク質であり、ヒト又は非ヒト哺乳動物のＲＥＴタンパク質を含み、好ましくはヒトＲＥＴタンパク質である。ヒトにおいて１０ｑ１１．２に座乗している遺伝子にコードされているタンパク質である。本発明において、「ＲＥＴタンパク質」は、そのスプライスバリアントであるアイソフォームを含み、ヒト由来のものであれば、例えば、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ＿０６６１２４、又はＮＰ＿０６５６８１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。また、より具体的には、例えば、配列番号３１、又は配列番号３２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。さらに、本発明において、「ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分」とは、前記ＲＥＴタンパク質のＣ末端側にあるキナーゼドメインを含むポリペプチドである。
【００５４】
また、本発明の「ＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチド」としては、前記ＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端側にあるコイルドコイルドメインの一部又は全部を含むポリペプチドと、前記ＲＥＴタンパク質のＣ末端側にあるキナーゼドメインを含むポリペプチドとが融合しているポリペプチドであり、好ましくは前記ＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端側にあるコイルドコイルドメインの全部を含むポリペプチドと、前記ＲＥＴタンパク質のＣ末端側にあるキナーゼドメインを含むポリペプチドとが融合しているポリペプチドであり、より好ましくは以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるポリペプチドである。これらのポリペプチドはキナーゼ活性及び／又は細胞増殖効果を有することが好ましい。
【００５５】
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５６】
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５７】
（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００５８】
より好ましくは以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるポリペプチドである。これらのポリペプチドはキナーゼ活性又は細胞増殖効果を有することが好ましい。
【００５９】
（ａ）配列番号１８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００６０】
（ｂ）配列番号１８で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００６１】
（ｃ）配列番号１８で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００６２】
本発明の「ＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチド」には、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（前記（ｂ））が包含される。このようなアミノ酸配列からなるＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチドとしては、例えば配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列を有するＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチドのアイソフォームが挙げられる。これらのポリペプチドはキナーゼ活性又は細胞増殖効果を有することが好ましい。ここで、欠失、置換又は付加される数個のアミノ酸とは、例えば１〜１０個が好ましく、より好ましくは１〜５個のアミノ酸である。また、上記の付加には、Ｎ末端若しくはＣ末端への１〜数個のアミノ酸の付加、又は両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００６３】
前記ポリペプチドのアミノ酸が置換したポリペプチドとしては、例えば、ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号：ＮＰ＿０６６１２４（配列番号３１）又はＮＰ＿０６５６８１（配列番号３２）で示されるアミノ酸配列を有するＲＥＴタンパク質のゲートキーパー部位である８０４番目（配列番号２及び配列番号４では１３２５番目、配列番号６及び配列番号８では１１９１番目、配列番号１０及び配列番号１２では１３００番目、配列番号１４及び配列番号１６では１１８６番目、配列番号１８及び配列番号２０では１２８３番目、配列番号２２及び配列番号２４では１３１８番目）のバリンがロイシン、メチオニン、若しくはグルタミン酸に置換したポリペプチド、又は８０６番目（配列番号２及び配列番号４では１３２７番目、配列番号６及び配列番号８では１１９３番目、配列番号１０及び配列番号１２では１３０２番目、配列番号１４及び配列番号１６では１１８８番目、配列番号１８及び配列番号２０では１２８５番目、配列番号２２及び配列番号２４では１３２０番目）のチロシンがシステイン、グルタミン酸、セリン、ヒスチジン、若しくはアスパラギンに置換したポリペプチドが挙げられる。
【００６４】
また、ゲートキーパー部位以外のアミノ酸である７６８番目（配列番号２及び配列番号４では１２８９番目、配列番号６及び配列番号８では１１５５番目、配列番号１０及び配列番号１２では１２６４番目、配列番号１４及び配列番号１６では１１５０番目、配列番号１８及び配列番号２０では１２４７番目、配列番号２２及び配列番号２４では１２８２番目）のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換したポリペプチド、８８３番目（配列番号２及び配列番号４では１４０４番目、配列番号６及び配列番号８では１２７０番目、配列番号１０及び配列番号１２では１３７９番目、配列番号１４及び配列番号１６では１２６５番目、配列番号１８及び配列番号２０では１３６２番目、配列番号２２及び配列番号２４では１３９７番目）のアラニンがフェニルアラニン、若しくはセリンに置換したポリペプチド、８８４番目（配列番号２及び配列番号４では１４０５番目、配列番号６及び配列番号８では１２７１番目、配列番号１０及び配列番号１２では１３８０番目、配列番号１４及び配列番号１６では１２６６番目、配列番号１８及び配列番号２０では１３６３番目、配列番号２２及び配列番号２４では１３９８番目）のグルタミン酸がバリンに置換したポリペプチド、８９１番目（配列番号２及び配列番号４では１４１２番目、配列番号６及び配列番号８では１２７８番目、配列番号１０及び配列番号１２では１３８７番目、配列番号１４及び配列番号１６では１２７３番目、配列番号１８及び配列番号２０では１３７０番目、配列番号２２及び配列番号２４では１４０５番目）のセリンがアラニン、若しくはロイシンに置換したポリペプチド、又は９１８番目（配列番号２及び配列番号４では１４３９番目、配列番号６及び配列番号８では１３０５番目、配列番号１０及び配列番号１２では１４１４番目、配列番号１４及び配列番号１６では１３００番目、配列番号１８及び配列番号２０では１３９７番目、配列番号２２及び配列番号２４では１４３２番目）のメチオニンがスレオニンに置換したポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
また、本発明のＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチドには、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、前記配列番号のいずれかで示されるアミノ酸配列の１つと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド（前記（ｃ））が包含される。これらのポリペプチドはキナーゼ活性又は細胞増殖効果を有することが好ましい。
【００６６】
ここで、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列との同一性は、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上であり、さらに好ましくは９８％以上である。当該アミノ酸配列の同一性は、通常慣用の方法で計算することができる。
【００６７】
本発明のポリペプチドは、本発明にかかるポリペプチドを構成するアミノ酸配列以外に、タンパク質タグを構成するアミノ酸を有していてもよい。タグの例としては、発現効率を向上させるタグや、精製効率を向上させるタグ等、当業者に周知のタグを使用することができ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等が挙げられる。
【００６８】
本発明のポリヌクレオチドは、前記ＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、好ましくは以下の（ｄ）〜（ｉ）から選択されるポリヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドは、キナーゼ活性又は細胞増殖効果を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００６９】
（ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００７０】
（ｅ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００７１】
（ｆ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００７２】
（ｇ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、又は配列番号２３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００７３】
（ｈ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、又は配列番号２３で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００７４】
（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、又は配列番号２３で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチド。
【００７５】
より好ましくは以下の（ｄ）〜（ｉ）から選択されるポリヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドは、キナーゼ活性又は細胞増殖効果を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００７６】
（ｄ）配列番号１８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００７７】
（ｅ）配列番号１８で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００７８】
（ｆ）配列番号１８で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００７９】
（ｇ）配列番号１７で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００８０】
（ｈ）配列番号１７で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００８１】
（ｉ）配列番号１７で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチド。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各種１本鎖ＤＮＡやＲＮＡをも包含する。アンチセンス鎖は、プローブ等として利用可能である。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡが含まれる。さらに、本発明にかかるポリヌクレオチドに対し、本発明にかかるポリペプチドをコードする塩基配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列などの塩基配列が付加していてもよい。
【００８３】
ここで、ストリンジェントな条件とは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．ａｌ，１９８９）に記載の条件が挙げられる。すなわち、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。
【００８４】
また、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、又は配列番号２３で示される塩基配列との同一性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上である。当該塩基配列の同一性は、通常慣用の方法で計算することができる。
【００８５】
本明細書中において、「キナーゼ活性又は細胞増殖効果を有する」の「キナーゼ活性を有する」とは、チロシンをリン酸化する酵素としての活性を有することを意味する。また、「キナーゼ活性又は細胞増殖効果を有する」の「細胞増殖効果を有する」とは、本発明のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを細胞に導入することにより、導入していない細胞に比べて、導入した細胞の増殖能が向上する効果である。このような効果は、例えば、サイトカイン依存的に増殖する細胞株にポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを導入した際に、サイトカイン非依存的に増殖した際に、細胞増殖効果を有すると確認することができる。
【００８６】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子を保持する甲状腺がん等から調整したｃＤＮＡライブラリーやゲノムＤＮＡライブラリーを用いて、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプライマーを用いて、抽出することができる。このようなプライマーとしては、本発明にかかるポリヌクレオチド又はそのアンチセンス鎖の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプライマーであれば、いかなる配列および長さのものを用いてもよい。また人工的にポリヌクレオチドを合成する方法が挙げられる（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１：４９９−５０７，２０１４）。
【００８７】
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含み、本発明のポリペプチドを発現させる限り、特に限定されるものではない。例えば、用いる宿主に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。
【００８８】
宿主としては、形質転換が可能な生細胞であれば特に限定されず、例えば、大腸菌、枯草菌等の細菌、酵母や糸状菌等の真菌類、Ｓｆ９細胞等の昆虫細胞、カイコ等の昆虫、動物細胞、植物又は植物由来細胞が挙げられる。
【００８９】
本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、導入する宿主の種類、導入方法等に応じて適宜選択できる。例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ウイルスベクターが挙げられる。発現ベクターの構築に用いられるベクターＤＮＡは、広く普及した入手の容易なものが用いられる。例えば、ｐＵＣ１９（タカラバイオ）、ｐＴＶ１１８Ｎ（タカラバイオ）、ｐＭＡＭｎｅｏ（クロンテック）、ｐＧＥＸ（ＧＥヘルスケア）、ｐＥＴ１６０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＩＥｘ（メルクミリポア）、ｐＢａｃＰＡＫ（クロンテック）が挙げられる。また、ウイルスベクターとしては、例えば、バキュロウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス−４０（ＳＶ−４０）等のＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルスが挙げられる。
【００９０】
当該発現ベクターを用いて宿主を形質転換するには、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。
【００９１】
本発明のポリヌクレオチドを導入した細胞は、例えば、前記の本発明の発現ベクターで形質転換された細胞、ゲノム編集により本発明のポリヌクレオチドを導入した細胞が挙げられる。ここで使用できる細胞としては、前記の宿主細胞が挙げられる。細胞が、発現ベクターで形質転換された細胞であるか確認する方法としては、例えば、本発明のポリペプチドを検出するための方法、又は本発明のポリヌクレオチドを検出するための方法が挙げられる。
【００９２】
「ゲノム編集により本発明のポリヌクレオチドを導入した細胞」として、好ましくは各々単独で存在するＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子をゲノム編集により融合させた遺伝子を有する細胞であり、より好ましくは各々単独で存在するＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子のＤＣＴＮ１のｅｘｏｎ２７とＲＥＴのｅｘｏｎ１２をゲノム編集により融合させた遺伝子を有する細胞である。このような細胞は通常慣用の方法で作製可能であり、例えば、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，９（４），ｐｐ１２１９−１２２７（２０１４）、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，５，３７２８（２０１４）に記載の方法が挙げられる。細胞が、ゲノム編集により本発明のポリヌクレオチドを導入した細胞であるか確認する方法としては、例えば、本発明のポリペプチドを検出するための方法、又は本発明のポリヌクレオチドを検出するための方法が挙げられる。
【００９３】
本発明のポリペプチドは、本発明の発現ベクターで形質転換された細胞を、細胞培養に適した培地を用いて、適当な条件下で培養することにより得られた培養液及び／又は細胞から、一般的な方法によってタンパク質の採取、精製を行うことにより、得ることができる。また、本発明のポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドを有する発現ベクター又は、本発明のポリヌクレオチドをコードする鋳型ＲＮＡ若しくは鋳型ＤＮＡを無細胞タンパク質合成系（例えば、ヒト細胞株由来の細胞抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液、大腸菌抽出液）に導入し、適当な条件下でインキュベーションすることにより得られた反応液から、一般的な方法によってタンパク質の採取、精製を行うことにより、得ることができる。
【００９４】
本発明において、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体は、ＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端部分とＲＥＴタンパク質のＣ末端部分の融合点に特異的に結合する抗体が挙げられる。当該抗体は、ＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端部分とＲＥＴタンパク質のＣ末端部分の融合点に特異的に結合するが、野生型のＤＣＴＮ１、又は野生型のＲＥＴタンパク質のいずれにも結合しない抗体を意味する。
【００９５】
本発明において、「ＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端部分とＲＥＴタンパク質のＣ末端部分の融合点」における「融合点」とは、ＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端部分由来のポリペプチドとＲＥＴタンパク質のＣ末端部分由来のポリペプチドとが融合した点を意味する。配列番号２における融合点は、配列番号２における１−１２３３番目のＤＣＴＮ１のＮ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号２における１２３４−１６３５番目のＲＥＴのＣ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが融合した点である。配列番号４における融合点は、配列番号４における１−１２３３番目のＤＣＴＮ１のＮ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号４における１２３４−１５９３番目のＲＥＴのＣ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが融合した点である。配列番号６における融合点は、配列番号６における１−１０９９番目のＤＣＴＮ１のＮ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号６における１１００−１５０１番目のＲＥＴのＣ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが融合した点である。配列番号８における融合点は、配列番号８における１−１０９９番目のＤＣＴＮ１のＮ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号８における１１００−１４５９番目のＲＥＴのＣ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが融合した点である。配列番号１０における融合点は、配列番号１０における１−１２０８番目のＤＣＴＮ１のＮ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号１０における１２０９−１６１０番目のＲＥＴのＣ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが融合した点である。配列番号１２における融合点は、配列番号１２における１−１２０８番目のＤＣＴＮ１のＮ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号１２における１２０９−１５６８番目のＲＥＴのＣ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが融合した点である。配列番号１４における融合点は、配列番号１４における１−１０９４番目のＤＣＴＮ１のＮ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号１４における１０９５−１４９６番目のＲＥＴのＣ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが融合した点である。配列番号１６における融合点は、配列番号１６における１−１０９４番目のＤＣＴＮ１のＮ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号１６における１０９５−１４５４番目のＲＥＴのＣ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが融合した点である。配列番号１８における融合点は、配列番号１８における１−１１９１番目のＤＣＴＮ１のＮ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号１８における１１９２−１５９３番目のＲＥＴのＣ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが融合した点である。配列番号２０における融合点は、配列番号２０における１−１１９１番目のＤＣＴＮ１のＮ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号２０における１１９２−１５５１番目のＲＥＴのＣ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが融合した点である。配列番号２２における融合点は、配列番号２２における１−１２２６番目のＤＣＴＮ１のＮ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号２２における１２２７−１６２８番目のＲＥＴのＣ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが融合した点である。配列番号２４における融合点は、配列番号２４における１−１２２６番目のＤＣＴＮ１のＮ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号２４における１２２７−１５８６番目のＲＥＴのＣ末端部分由来のアミノ酸配列を有するポリペプチドが融合した点である。
【００９６】
前記抗体は、例えば、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ等）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ'）2フラグメント、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体、Ｄｉａｂｏｄｙ等（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：３４３−３５７，２００６）が挙げられ、これらはヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体、ラマ抗体、ニワトリ抗体等のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００９７】
前記抗体は、種々の公知の方法を用いて作製することができ、作製方法は特に限定されるものではない。かかる公知の手法としては、当該発明のポリペプチド、ＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端部分とＲＥＴタンパク質のＣ末端部分の融合点を含むポリペプチド断片等を免疫動物に接種し、当該動物の免疫系を活性化させた後、当該動物の血清を回収し、ポリクローナル抗体として得る方法、又はハイブリドーマ法、ファージディスプレイ法等によりモノクローナル抗体を得る方法等が挙げられる。
【００９８】
本発明のポリペプチドの発現及び／又は活性、又は本発明のポリヌクレオチドの発現を抑制する化合物をスクリーニングする方法は、以下の（１）及び（２）の工程を含む方法により行うことができる。
【００９９】
すなわち、本発明のスクリーニング方法は、
（１）本発明のポリペプチド、又は本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを発現している細胞に試験化合物を接触する工程。
【０１００】
（２）上記工程（１）において、本発明のポリペプチドの発現及び／又は活性、又は本発明のポリヌクレオチドの発現が抑制されるか測定する工程、又は上記工程（１）記載の細胞の増殖が抑制されるか測定する工程。
を含む方法により行うことができる。
【０１０１】
より好ましくは、以下の（１）及び（２）の工程を含む方法である。
【０１０２】
（１）本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを発現している細胞に試験化合物を接触する工程。
【０１０３】
（２）上記工程（１）記載の細胞の増殖が抑制されるか測定する工程。
【０１０４】
また、本発明のポリペプチドの発現及び／又は活性、又は本発明のポリヌクレオチドの発現を抑制する化合物をスクリーニングする方法は、以下の（１）から（３）の工程を含む方法により行うことができる。
【０１０５】
すなわち、本発明のスクリーニング方法は、
（１）本発明のポリペプチド、又は本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを発現している細胞に試験化合物を接触する工程。
【０１０６】
（２）上記工程（１）において、本発明のポリペプチドの発現及び／又は活性、又は本発明のポリヌクレオチドの発現が抑制されるか測定する工程、又は上記工程（１）記載の細胞の増殖が抑制されるか測定する工程。
【０１０７】
（３）上記工程（２）において、本発明のポリペプチドの発現及び／又は活性、又は本発明のポリヌクレオチドの発現が抑制された場合、又は上記工程（１）記載の細胞の増殖が抑制された場合、試験化合物が本発明のポリペプチドの発現及び／又は活性、又は本発明のポリヌクレオチドの発現を抑制すると判定する工程。
を含む方法により行うことができる。
【０１０８】
より好ましくは、以下の（１）から（３）の工程を含む方法である。
【０１０９】
（１）本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを発現している細胞に試験化合物を接触する工程。
【０１１０】
（２）上記工程（１）記載の細胞の増殖が抑制されるか測定する工程。
【０１１１】
（３）上記工程（２）において、上記工程（１）記載の細胞の増殖が抑制された場合、試験化合物が本発明のポリペプチドの発現及び／又は活性、又は本発明のポリヌクレオチドの発現を抑制すると判定する工程。
【０１１２】
「本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを発現している細胞」は、本発明の発現ベクターで形質転換された細胞、ゲノム編集により本発明のポリヌクレオチドを導入した細胞、本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを発現している初代培養細胞、本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを発現している株化細胞、本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを発現しているがん患者由来の細胞等が挙げられる。細胞が、本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを発現している細胞であるか確認する方法としては、例えば、本発明のポリペプチドを検出するための方法、又は本発明のポリヌクレオチドを検出するための方法が挙げられる。
【０１１３】
本発明において、「本発明のポリペプチドの発現及び／又は活性、又は本発明のポリヌクレオチドの発現が抑制される」の中で、「本発明のポリペプチドの発現、又は本発明のポリヌクレオチドの発現が抑制される」とは、例えば、本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを発現している細胞に試験化合物を接触させた後、当該細胞における本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現量を、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドの存在を検出する方法を用いて評価した際に、試験化合物を接触させていない細胞と比較して、試験化合物を接触させた細胞において、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現量が統計学上有意に低下した際に、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現が抑制されたと判断することができる。
【０１１４】
また、「本発明のポリペプチドの発現及び／又は活性、又は本発明のポリヌクレオチドの発現が抑制される」の中で、「本発明のポリペプチドの活性が抑制される」とは、例えば、本発明のポリペプチド、又は本発明のポリペプチドを発現している細胞を用いて、試験化合物を接触させていない場合と比較して、試験化合物を接触させた場合に、チロシンのリン酸化の割合が統計学上有意に低下した際に、本発明のポリペプチドの活性が抑制されたと判断することができる。
【０１１５】
また、本発明のポリペプチドを発現している細胞を用いて、試験化合物を接触させていない場合と比較して、試験化合物を接触させた場合に、細胞増殖が統計学上有意に抑制された際に、本発明のポリペプチドの活性が抑制されたと判断することができる。
【０１１６】
本発明において、「チロシンのリン酸化」とは、ＲＥＴタンパク質（他のタンパク質と融合しているＲＥＴタンパク質も含む）のチロシンのリン酸化のみならず、ＲＥＴ下流シグナル上のタンパク質のチロシンのリン酸化も含まれる。ＲＥＴ下流シグナル上のタンパク質としては、例えば、ＳＴＡＴ、ＡＫＴ、ＥＲＫが挙げられる。好ましくは、ＲＥＴタンパク質（他のタンパク質と融合しているＲＥＴタンパク質も含む）のチロシンのリン酸化である。
【０１１７】
また、「チロシンのリン酸化の割合」は、例えば、リン酸化ＲＥＴ特異的抗体を用いて、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーにより測定可能である。
【０１１８】
本発明において「試料」とは、生体試料（例えば、細胞、組織、臓器、体液（血液、リンパ液等）、消化液、尿）のみならず、これらの生体試料から得られる核酸抽出物（ゲノムＤＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物から調製されたｃＤＮＡ調製物やｃＲＮＡ調製物等）やタンパク質抽出物も含む。また、前記試料は、ホルマリン固定処理、アルコール固定処理、凍結処理又はパラフィン包埋処理が施してあるものでもよい。前記生体試料としては、生体から採取したものを使用することができる。好ましくはがん患者由来の試料であり、より好ましくは腫瘍細胞を含む試料である。また、生体試料の採取方法は、生体試料の種類に応じて適宜選択することができる。
【０１１９】
本発明には、試料中の、本発明のポリペプチドの存在を検出する方法が含まれる。
【０１２０】
本発明において、試料中の、本発明のポリペプチドの存在を検出する方法は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、若しくは免疫組織化学染色法、又はＤＣＴＮ１タンパク質に特異的に結合する抗体及びＲＥＴタンパク質に特異的に結合する抗体を用いたＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）法など、通常慣用の検出法により検出する方法が挙げられる。好ましくは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、又は免疫組織化学染色法である。
【０１２１】
ＤＣＴＮ１タンパク質に特異的に結合する抗体及びＲＥＴタンパク質に特異的に結合する抗体としては、ＤＣＴＮ１タンパク質の前記融合点よりＮ末端部分に結合する抗体及びＲＥＴタンパク質の前記融合点よりＣ末端部分に結合する抗体が好ましく、これらの抗体は、市販品を使用すること、又は通常公知の方法で作製することが可能である。
【０１２２】
本発明において、試料中の、本発明のポリペプチドの存在を検出する方法として、好ましくは本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体又はＤＣＴＮ１タンパク質に特異的に結合する抗体及びＲＥＴタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて本発明のポリペプチドを検出する工程を含むことを特徴とする、本発明のポリペプチドの存在を検出する方法であり、より好ましくは本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いて本発明のポリペプチドを検出する工程を含むことを特徴とする、本発明のポリペプチドの存在を検出する方法である。従って、本発明のポリペプチドの存在を検出するための手段としては、特に限定されないが、例えば、ＤＣＴＮ１タンパク質に特異的に結合する抗体及びＲＥＴタンパク質に特異的に結合する抗体の組合せ；本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体等が挙げられる。
【０１２３】
本発明には、試料中の、本発明のポリヌクレオチドの存在を検出するためのプライマー又はプローブが含まれる。本発明において、本発明のポリペプチドの存在を検出するための手段としては、特に限定されないが、例えば、本発明のポリヌクレオチドの存在を検出するためのプライマー又はプローブ等が挙げられる。
【０１２４】
当該プライマー又はプローブとしては、（ｊ）〜（ｌ）から選択されるポリヌクレオチド；
（ｊ）ＤＣＴＮ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも１つのプローブであるポリヌクレオチド。
【０１２５】
（ｋ）ＤＣＴＮ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド。
【０１２６】
（ｌ）ＤＣＴＮ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計されたセンスプライマーとアンチセンスプライマーのセットであるポリヌクレオチド。
が挙げられる。
【０１２７】
本発明において、「ＤＣＴＮ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点」における「融合点」とは、ＤＣＴＮ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとが融合した点を意味する。配列番号１における融合点は、配列番号１における１−３６９９番目のＤＣＴＮ１をコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドと配列番号１における３７００−４９０５番目のＲＥＴをコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドが融合した点である。配列番号３における融合点は、配列番号３における１−３６９９番目のＤＣＴＮ１をコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドと配列番号３における３７００−４７７９番目のＲＥＴをコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドが融合した点である。配列番号５における融合点は、配列番号５における１−３２９７番目のＤＣＴＮ１をコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドと配列番号５における３２９８−４５０３番目のＲＥＴをコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドが融合した点である。配列番号７における融合点は、配列番号７における１−３２９７番目のＤＣＴＮ１をコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドと配列番号７における３２９８−４３７７番目のＲＥＴをコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドが融合した点である。配列番号９における融合点は、配列番号９における１−３６２４番目のＤＣＴＮ１をコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドと配列番号９における３６２５−４８３０番目のＲＥＴをコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドが融合した点である。配列番号１１における融合点は、配列番号１１における１−３６２４番目のＤＣＴＮ１をコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドと配列番号１１における３６２５−４７０４番目のＲＥＴをコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドが融合した点である。配列番号１３における融合点は、配列番号１３における１−３２８２番目のＤＣＴＮ１をコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドと配列番号１３における３２８３−４４８８番目のＲＥＴをコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドが融合した点である。配列番号１５における融合点は、配列番号１５における１−３２８２番目のＤＣＴＮ１をコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドと配列番号１５における３２８３−４３６２番目のＲＥＴをコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドが融合した点である。配列番号１７における融合点は、配列番号１７における１−３５７３番目のＤＣＴＮ１をコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドと配列番号１７における３５７４−４７７９番目のＲＥＴをコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドが融合した点である。配列番号１９における融合点は、配列番号１９における１−３５７３番目のＤＣＴＮ１をコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドと配列番号１９における３５７４−４６５３番目のＲＥＴをコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドが融合した点である。配列番号２１における融合点は、配列番号２１における１−３６７８番目のＤＣＴＮ１をコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドと配列番号２１における３６７９−４８８４番目のＲＥＴをコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドが融合した点である。配列番号２３における融合点は、配列番号２３における１−３６７８番目のＤＣＴＮ１をコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドと配列番号２３における３６７９−４７５８番目のＲＥＴをコードするポリヌクレオチド由来の塩基配列を有するポリヌクレオチドが融合した点である。
【０１２８】
本発明において、プライマー又はプローブは、本発明のポリヌクレオチドの配列情報に基づき、本発明のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドとして、通常公知の手法により作製される。当該プライマー又はプローブの塩基数は、１０〜５０塩基、好ましくは１５〜５０塩基、より好ましくは１８〜３５塩基である。
【０１２９】
当該プライマー又はプローブは、本発明のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするものであれば、完全に相補的である必要は無い。かかるプライマー又はプローブは、対応する塩基配列と比較して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するポリヌクレオチドである。
【０１３０】
本発明のプライマー又はプローブとしては、好ましくは（ｉ）配列番号６９、（ｉｉ）配列番号７０、又は（ｉｉｉ）配列番号７１で表されるポリヌクレオチドであり、より好ましくは（ｉｖ）配列番号６９と配列番号７０で表されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーのセットであるポリヌクレオチドであり、より好ましくは（ｖ）配列番号６９、配列番号７０及び配列番号７１で表されるセンスプライマー、アンチセンスプライマー及びプローブのセットであるポリヌクレオチドである。
【０１３１】
本発明には、試料中の、本発明のポリヌクレオチドの存在を検出する方法が含まれる。
【０１３２】
本発明において、試料中の、本発明のポリヌクレオチドの存在を検出する方法は、ノーザンブロッティング法、サザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、デジタルＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、シークエンス解析法など、通常慣用の検出法により検出する方法である。
【０１３３】
本発明において、試料中の、本発明のポリヌクレオチドの存在を検出する方法には、本発明のポリヌクレオチドを含むＲＥＴ融合遺伝子のポリヌクレオチドの存在を検出するための方法も含まれる。当該方法としては、ＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプライマー（例えば、ＲＥＴキナーゼドメイン以降の３'側の配列にハイブリダイズするプライマー）を用いて、５'ＲＡＣＥ法により増幅させたＰＣＲ産物をシークエンス解析する方法等が挙げられる。
【０１３４】
本発明において、試料中の、本発明のポリヌクレオチドの存在を検出する方法として、好ましくは本発明のプライマー又はプローブを用いて本発明のポリヌクレオチドを検出する工程を含むことを特徴とする、本発明のポリヌクレオチドの存在を検出する方法である。
【０１３５】
本発明には、ＲＥＴを阻害する化合物を有効成分とする、ＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性又はＤＣＴＮ１タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合タンパク質陽性の癌治療用医薬組成物が包含される。
【０１３６】
より好ましくは、本発明のポリペプチドの発現及び／又は活性、又は本発明のポリヌクレオチドの発現を抑制する化合物を有効成分とする、ＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性又はＤＣＴＮ１タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合タンパク質陽性の癌治療用医薬組成物が包含される。
【０１３７】
本発明において、「ＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性及び／又はＤＣＴＮ１タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合タンパク質陽性の癌」における「ＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性の癌」とは、本発明のポリヌクレオチドが発現している癌であり、好ましくは本発明のポリヌクレオチドの存在を検出する方法を用いて、本発明のポリヌクレオチドが検出された癌である。
【０１３８】
また、本発明において、「ＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性又はＤＣＴＮ１タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合タンパク質陽性の癌」における「ＤＣＴＮ１タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合タンパク質陽性の癌」とは、本発明のポリペプチドが発現している癌であり、好ましくは本発明のポリペプチドの存在を検出する方法を用いて、本発明のポリペプチドが検出された癌である。
【０１３９】
本発明の癌治療用医薬組成物における有効成分としては、ＲＥＴを阻害する化合物であり、より好ましくは本発明のポリペプチドの発現及び／又は活性、又は本発明のポリヌクレオチドの発現を抑制する化合物である。また、本発明のスクリーニング方法により選択した化合物を有効成分として用いることができる。例えば、公知のＲＥＴを阻害する化合物を本発明の医薬組成物における有効成分として用いることができる。ＲＥＴを阻害する化合物としては、ＲＥＴの発現及び／又は活性を阻害できる化合物であれば、他のチロシンキナーゼの発現及び／又は活性を阻害する化合物であってもよく、より好ましくはＲＥＴの活性を阻害できる化合物であり、他のチロシンキナーゼの発現及び／又は活性を阻害する化合物であってもよい。このような化合物として、例えば、バンデタニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、モテサニブ、カボザンチニブ、レンバチニブ、国際公開第２０１６／１２７０７４号パンフレット、国際公開第２０１７／０４３５５０号パンフレット、国際公開第２０１７／０１１７７６号パンフレット、国際公開第２０１７／１４６１１６号パンフレットに記載の化合物が挙げられる。
ＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性及び／又はＤＣＴＮ１タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合タンパク質陽性の癌治療用医薬組成物の有効性分としては、ＲＥＴを阻害する化合物であり、より好ましくはバンデタニブ、カボザンチニブ、レンバチニブ、国際公開第２０１７／０４３５５０号パンフレットに記載の一般式（１）で示される縮合ピリミジン化合物又は国際公開第２０１７／１４６１１６号パンフレットに記載の一般式（１）で示される縮合ピリミジン化合物であり、より好ましくは、バンデタニブ、カボザンチニブ、レンバチニブ、国際公開第２０１７／０４３５５０号パンフレットに記載の実施例化合物１から９０又は国際公開第２０１７／１４６１１６号パンフレットに記載の実施例化合物１から２０７であり、さらに好ましくはバンデタニブ、カボザンチニブ、レンバチニブ、４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−カルボキサミド、４−アミノ−７−（ｔｅｒｔ−ブチル）−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミド、４−アミノ−７−（１−フルオロ−２−メチルプロパン−２−イル）―Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミド、４−アミノ−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）―７−（１―メチルシクロプロピル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミド、４−アミノ−７−（２−シクロプロピルプロパン−２−イル）−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミド、４−アミノ−Ｎ−［４−（メトキシメチル）フェニル］−７−（１−メチルシクロプロピル）−６−（３−モルホリノプロ−１−ピン−１−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミド、４−アミノ−Ｎ−［４−（メトキシメチル）フェニル］−７−（１−メチルシクロプロピル）−６−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）エチニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミド、（Ｒ）−４−アミノ−Ｎ−［４−（メトキシメチル）フェニル］−７−（１−メチルシクロプロピル）−６−（（テトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミド又は４−アミノ−Ｎ−［４−（メトキシメチル）フェニル］−６−（（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）エチニル）−７−（１−メチルシクロプロピル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミドであり、特に好ましくは４−アミノ−１−（ｔｅｒｔ−ブチル）−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−カルボキサミド、４−アミノ−７−（ｔｅｒｔ−ブチル）−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミド、４−アミノ−７−（１−フルオロ−２−メチルプロパン−２−イル）―Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミド、４−アミノ−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）―７−（１―メチルシクロプロピル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミド、４−アミノ−７−（２−シクロプロピルプロパン−２−イル）−Ｎ−（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミド、４−アミノ−Ｎ−［４−（メトキシメチル）フェニル］−７−（１−メチルシクロプロピル）−６−（３−モルホリノプロ−１−ピン−１−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミド、４−アミノ−Ｎ−［４−（メトキシメチル）フェニル］−７−（１−メチルシクロプロピル）−６−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）エチニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミド、（Ｒ）−４−アミノ−Ｎ−［４−（メトキシメチル）フェニル］−７−（１−メチルシクロプロピル）−６−（（テトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミド又は４−アミノ−Ｎ−［４−（メトキシメチル）フェニル］−６−（（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）エチニル）−７−（１−メチルシクロプロピル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサミドである。
【０１４０】
本発明において、「ＲＥＴの発現及び／又は活性を阻害できる化合物」の中で、「ＲＥＴの発現を阻害できる」とは、例えば、ＲＥＴのポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを発現している細胞に試験化合物を接触させた後、当該細胞におけるＲＥＴのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現量を検出した際に、試験化合物を接触させていない細胞と比較して、試験化合物を接触させた細胞において、ＲＥＴのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現量が低下した際に、ＲＥＴの発現が抑制されたと判断することができる。このような化合物としては、前記のような化合物、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）アプタマーなどが挙げられる。ｓｉＲＮＡとしては、例えば、ＣＡＣＡＵＧＵＣＡＵＣＡＡＡＵＵＧＵＡＴＴ（配列番号７４）、ＧＧＡＵＵＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＵＣＵＡＴＴ（配列番号７５）、ＧＣＵＵＧＵＣＣＣＧＡＧＡＵＧＵＵＵＡＴＴ（配列番号７６）が挙げられ、好ましくは、ＣＡＣＡＵＧＵＣＡＵＣＡＡＡＵＵＧＵＡＴＴ（配列番号７４）又はＧＧＡＵＵＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＵＣＵＡＴＴ（配列番号７５）である。
【０１４１】
また、「ＲＥＴの発現及び／又は活性を阻害できる化合物」の中で、「ＲＥＴの活性を阻害できる」とは、例えば、チロシンのリン酸化を指標に判断することができる。チロシンのリン酸化を測定する方法としては、例えば、国際公開第２０１７／０４３５５０号パンフレットの試験例１に記載の方法が挙げられる。
【０１４２】
また、ＲＥＴのポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを発現している細胞を用いて、細胞増殖抑制効果を指標として、「ＲＥＴの活性を阻害できる」と判断することができる。細胞増殖抑制効果は、例えば、国際公開第２０１７／０４３５５０号パンフレットの試験例３及び試験例４に記載の方法が挙げられる。
【０１４３】
本発明の医薬組成物の対象となる癌は、本発明のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを発現している限り特に制限されないが、例えば、頭頚部癌、甲状腺癌、消化器癌（食道癌、胃癌、十二指腸癌、肝臓癌、胆道癌（胆嚢・胆管癌など）、膵臓癌、小腸癌、大腸癌（結腸直腸癌、結腸癌、直腸癌など）、消化管間質腫瘍など）、肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌）、乳癌、卵巣癌、子宮癌（子宮頚癌、子宮体癌など）、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌等が挙げられ、好ましくは甲状腺癌、又は肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌）である。なお、ここで癌には、原発巣のみならず、他の臓器（肝臓など）に転移した癌をも含む。
【０１４４】
本発明のポリペプチドの発現及び／又は活性、又は本発明のポリヌクレオチドの発現を抑制する化合物を有効成分とする製剤は、薬学的担体を配合し、種々の投与形態に応じた医薬組成物として製造することができる。当該形態としては、例えば、経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤が挙げられる。これらの投与形態は、各々当業者に公知慣用の製剤方法により製造できる。
【０１４５】
薬学的担体としては、製剤素材として慣用の各種有機或いは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤等、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調節剤・緩衝剤、無痛化剤等として配合される。また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、着色剤、矯味・矯臭剤、安定化剤等の製剤添加物を用いることもできる。
【０１４６】
経口用固形製剤を調製する場合は、本発明化合物に賦形剤、必要に応じて賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。
【０１４７】
経口用液体製剤を調製する場合は、本発明化合物にｐＨ調節剤・緩衝剤、安定化剤、矯味・矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。
【０１４８】
注射剤を調製する場合は、本発明化合物にｐＨ調節剤・緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。
【０１４９】
本発明には、本発明のポリペプチドを検出するための方法又は本発明のポリヌクレオチドを検出するための方法において、試料中の、本発明のポリペプチド又は本発明のポリヌクレオチドの存在を検出した場合に、癌であると判定する方法が包含される。本発明により判定し得る癌としては、本発明の医薬組成物の対象となる癌として列挙したもの等が挙げられる。上記のように、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドを用いることにより、癌の判定をすることができる。従って、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドは、癌を検出するためのバイオマーカーとして用いることもできる。
【０１５０】
本発明のポリペプチド又は本発明のポリヌクレオチドを、ＲＥＴを阻害する化合物を用いた化学療法が有効であるか否かの指標とする方法であって、本発明の検出方法により、試料中から、本発明のポリペプチドを検出した場合、及び／又は本発明の検出方法により、試料中から、本発明のポリヌクレオチドの存在を検出した場合に、ＲＥＴを阻害する化合物を用いた化学療法が有効であると判定する方法が包含される。
【０１５１】
より好ましくは、本発明のポリペプチド又は本発明のポリヌクレオチドを、本発明のポリペプチドの発現及び／又は活性、又は本発明のポリヌクレオチドの発現を抑制する化合物を用いた化学療法が有効であるか否かの指標とする方法であって、本発明の検出方法により、試料中から、本発明のポリペプチドを検出した場合、及び／又は本発明の検出方法により、試料中から、本発明のポリヌクレオチドの存在を検出した場合に、本発明のポリペプチドの発現及び／又は活性、又は本発明のポリヌクレオチドの発現を抑制する化合物を用いた化学療法が有効であると判定する方法が包含される。
【０１５２】
より好ましくは、本発明のポリペプチド又は本発明のポリヌクレオチドを、本発明のスクリーニング方法で得られた化合物を用いた化学療法が有効であるか否かの指標とする方法であって、本発明の検出方法により、試料中から、本発明のポリペプチドを検出した場合、及び／又は本発明の検出方法により、試料中から、本発明のポリヌクレオチドの存在を検出した場合に、本発明のスクリーニング方法で得られた化合物を用いた化学療法が有効であると判定する方法が包含される。
【０１５３】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【０１５４】
実施例１  ＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子（ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子）の取得
＜１−１  臨床検体由来ＲＮＡの抽出＞
Ａｓｔｅｒａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅより購入したヒト甲状腺がん組織から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて以下の方法によりＲＮＡを抽出した。甲状腺がん組織にＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴを６００μＬ加え、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムにアプライした後遠心し  （１６，０００  ｒｐｍ、２分、室温）、濾液を回収した。回収した濾液に同量の７０％エタノール水溶液を加え混和した後に、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉカラムにアプライし遠心した（１０，０００  ｒｐｍ、１５秒、室温）。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉカラムに７００μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＲＷ１を添加し遠心した  （１０，０００  ｒｐｍ、１５秒、室温）。さらに５００μＬのｂｕｆｆｅｒ  ＲＰＥを加え遠心した（１０，０００  ｒｐｍ、１５秒、室温）。同様に再度５００μＬのｂｕｆｆｅｒ  ＲＰＥを加え遠心した  （１０，０００  ｒｐｍ、２分、室温）。再度ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉカラムを遠心（１６，０００  ｒｐｍ、１分、室温）し、持ち越したｂｕｆｆｅｒを取り除いた。ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎｉカラムにＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを４０μＬアプライした後、遠心（１０，０００  ｒｐｍ、１分、室温）し、濾液をｔｏｔａｌ  ＲＮＡとして回収した。【０１５５】
＜１−２  臨床検体由来ｃＤＮＡの作製＞
上記１−１で得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を用いて、以下の方法によりｃＤＮＡを合成した。５００ｎｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを容量が１４μＬになるようにＲＮＡｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒで調製し、４μＬの５×  ＶＩＬＯ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ及び２μＬの１０×  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを加え混和した。２５℃で１０分間保温しその後４２℃で６０分保温した。反応を停止させるために最後に８５℃で５分間インキュベートし、ｃＤＮＡを得た。【０１５６】
＜１−３  クローニングベクターの作製及び精製＞
ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子を増幅させるため、表１に示すように、センスプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ１（配列番号３３）とアンチセンスプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ２（配列番号３４）、さらにｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲに用いるセンスプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ３（配列番号３５）とアンチセンスプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ４（配列番号３６）を設計した。【０１５７】
【表１】
2019039439.tif 000002
【０１５８】
これらのプライマーを用いて上記１−２で合成したｃＤＮＡをテンプレートとして、ＫＯＤ  -Ｐｌｕｓ−  Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し以下の方法でＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子を増幅させた。２μＬのｃＤＮＡ、５μＬの１０×  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｎｅｏ、５μＬの２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、３μＬの２５ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１μＬのＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｎｅｏ、１．５μＬのＰｒｉｍｅｒ１（１０μＭ）、１．５μＬのＰｒｉｍｅｒ２（１０μＭ）、及び３１μＬのｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ（ＤＤＷ）を混和し、ＰＣＲを行った。次いで得られたＰＣＲ産物を１００倍に希釈し、２μＬの希釈したＰＣＲ産物、５μＬの１０×  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｎｅｏ、５μＬの２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、３μＬの２５ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１μＬのＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｎｅｏ、１．５μＬのＰｒｉｍｅｒ３（１０μＭ）、１．５μＬのＰｒｉｍｅｒ４（１０μＭ）及び３１μＬのＤＤＷを混和し、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。【０１５９】
Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル（ナカライ）を用いた電気泳動により分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ゲルからＰＣＲ産物を精製した。【０１６０】
制限酵素ＳｍａＩ（ＮＥＢ）で切断したｐＵＣ１８  ＤＮＡ（タカラバイオ）と精製したＰＣＲ産物とＴ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）とＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）を混和し、一晩１６℃でインキュベートした。Ｌｉｇａｔｉｏｎ産物をＳｍａＩ（ＮＥＢ）で処理し、以下の方法でコンピテント細胞へのｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを行った。５０μＬのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）にＳｍａＩ処理をしたＬｉｇａｔｉｏｎ産物を加え３０分氷上で静置した。その後４２℃で３０秒間ヒートショックを加え、２分間氷上で静置した。ＳＯＣ培地（タカラバイオ）を加え、３７℃で１時間振盪培養した後、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地プレート（ＵＮＩＴＥＣＨ）に培養液を塗布し、３７℃で一晩静置した。大腸菌コロニーをアンピシリン含有ＬＢ培地（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に懸濁し３７℃で一晩振盪培養した。増殖した大腸菌からＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、添付のプロコールに準じてＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子が組み込まれたプラスミドＤＮＡを精製した。【０１６１】
＜１−４  配列の決定＞
上記１−３で得られたプラスミドＤＮＡをテンプレートにして、表２に示したシークエンス用プライマーＰｒｉｍｅｒ５からＰｒｉｍｅｒ３６を用い、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを用いシークエンス反応を行い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０ｘｌ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてシークエンス解析を実施した。シークエンス解析の結果、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子は、ＤＣＴＮ１  ｖａｒｉａｎｔ  ５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１１９０８３６）のｅｘｏｎ１〜ｅｘｏｎ２７の３'側の下流にＲＥＴ  ｖａｒｉａｎｔ  ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２０９７５）のｅｘｏｎ１２〜ｅｘｏｎ２０が融合した遺伝子（配列番号１７）であった。【０１６２】
【表２】
2019039439.tif 000003
【０１６３】
実施例２  ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子の検出
Ａｓｔｅｒａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅより購入したヒト正常甲状腺組織由来ＲＮＡと前記１−１で得られたヒト甲状腺がん組織由来ＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を用いて、以下の方法によりｃＤＮＡを合成した。２８０ｎｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを  容量が１４μＬになるようにＲＮＡｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒで調製し、５×  ＶＩＬＯ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘを４μＬ、１０×  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを２μＬそれぞれ加え混和した。２５℃で１０分間保温しその後４２℃で６０分保温した。反応を停止させるために最後に８５℃で５分間インキュベートした。【０１６４】
ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子の検出のために、表３に示すように、ＤＣＴＮ−ＲＥＴ融合遺伝子検出用センスプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ３７（配列番号６９）とＤＣＴＮ−ＲＥＴ融合遺伝子検出用アンチセンスプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ３８（配列番号７０）、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子検出用プローブ（プローブはＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ、蛍光色素はＦＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））としてＰｒｉｍｅｒ３９（配列番号７１）を設計した。【０１６５】
【表３】
2019039439.tif 000004
【０１６６】
得られたｃＤＮＡを１０倍希釈し１．１μＬをテンプレートとして使用し、１１μＬのｄｄＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｆｏｒ  ｐｒｏｂｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、２μＬのＰｒｉｍｅｒ３７（１０μＭ）、２μＬのＰｒｉｍｅｒ３８（１０μＭ）、０．６μＬのＰｒｉｍｅｒ３９（１０μＭ）、１．１μＬのＧＡＰＤＨを検出する２０×  ＨＥＸ  ａｓｓａｙ（ＰｒｉｍｅＰＣＲ  ｄｄＰＣＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ａｓｓａｙ：ＧＡＰＤＨ，Ｈｕｍａｎ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を混和させて、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でドロップレットを作製した。作製したドロップレットを用いてＰＣＲを行い、Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にてＤＣＴＮ１−ＲＥＴ及びＧＡＰＤＨ陽性のドロップレットをカウントした。結果を図１及び図２に示す。【０１６７】
また、上記で合成したｃＤＮＡをテンプレートとして、ＫＯＤ  -Ｐｌｕｓ−  Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し以下の方法でＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子を増幅させた。２μＬのｃＤＮＡ、５μＬの１０×  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｎｅｏ、５μＬの２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、３μＬの２５ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１μＬのＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｎｅｏ、１．５μＬのＰｒｉｍｅｒ１（１０μＭ）、１．５μＬのＰｒｉｍｅｒ２（１０μＭ）、及び３１μＬのＤＤＷを混和し、ＰＣＲを行った。次いで得られたＰＣＲ産物を１００倍に希釈し、２μＬの希釈したＰＣＲ産物、５μＬの１０×  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｎｅｏ、５μＬの２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、３μＬの２５ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１μＬのＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｎｅｏ、１．５μＬのＰｒｉｍｅｒ３（１０μＭ）、１．５μＬのＰｒｉｍｅｒ４（１０μＭ）及び３１μＬのＤＤＷを混和し、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル（ナカライ）を用いた電気泳動により分離し撮影を行った。結果を図３に示す。【０１６８】
図１、図２及び図３に示したように、ヒト甲状腺がん組織由来のＲＮＡから合成したｃＤＮＡにおいては、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子が検出されたのに対し、ヒト正常甲状腺組織由来ＲＮＡから合成したｃＤＮＡにおいては、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子が検出されなかった。以上の結果から、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子はがんバイオマーカーとして有用であることが示された。【０１６９】
実施例３  ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子の発現ベクターの構築
発現ベクター構築のため、表４に示すように、センスプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ４０（配列番号７２）とアンチセンスプライマーとしてＰｒｉｍｅｒ４１（配列番号７３）を設計した。【０１７０】
【表４】
2019039439.tif 000005
【０１７１】
これらのプライマーを用いて上記１−２で合成したｃＤＮＡをテンプレートとして、Ｐｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を使用し以下の方法でＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子を増幅させた。１μＬのｃＤＮＡ、２５μＬの２×  Ｐｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１μＬのＰｒｉｍｅｒ４０（１０μＭ）、１μＬのＰｒｉｍｅｒ４１（１０μＭ）、及び２２μＬのｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ（ＤＤＷ）を混和し、ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲル（ナカライ）を用いた電気泳動により分離し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ゲルからＰＣＲ産物を精製した。次いで得られた精製ＰＣＲ産物をＧａｔｅｗａｙ  ＢＰ  Ｃｌｏｎａｓｅ ＩＩ  Ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用し以下の方法でＧａｔｅｗａｙ  ｐＤＯＮＲ２２１  Ｖｅｃｔｏｒに組み込み、エントリーベクターを作製した。具体的には、５．０μＬの精製ＰＣＲ産物、３．５μＬのｐＤＯＮＲ２２１（８５ｎｇ／μＬ）、４．０μＬのＢＰ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ  ＥｎｚｙｍｅＭｉｘ、７．５μＬのＴＥを混和し、２５℃で９０分間インキュベートした。インキュベート後にＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（２ｍｇ／ｍＬ）を１μＬ添加し、３７℃にて１０分間インキュベートすることによりエントリーベクターを得た。【０１７２】
得られたエントリーベクターを５０μＬのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に加え３０分氷上で静置した。その後３７℃で２０秒間ヒートショックを加え、２分間氷上で静置した。ＳＯＣ培地（タカラバイオ）を加え、３７℃で１時間振盪培養した後、カナマイシン含有ＬＢ寒天培地プレートに培養液を塗布し、３７℃で一晩静置した。大腸菌コロニーをカナマイシン含有ＬＢ培地に懸濁し、３７℃で一晩振盪培養した。増殖した大腸菌からＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子が組み込まれたプラスミドＤＮＡ（エントリーベクタークローン）をＤＮＡ自動分離装置  ＧＥＮＥ ＰＲＥＰ ＳＴＡＲ ＰＩ−４８０（クラボウ）にて精製した。【０１７３】
得られたプラスミドとＧａｔｅｗａｙ  ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ  Ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、以下の方法で、ｐＪＴＩ  Ｆａｓｔ  ＤＥＳＴベクターにＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子を組み込み、発現ベクターとした。１５０ｎｇのエントリーベクタークローン、１μＬのｐＪＴＩ  Ｆａｓｔ  ＤＥＳＴベクター（１５０ｎｇ／μＬ）、２μＬのＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ  Ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ、およびＴＥ  ｂｕｆｆｅｒを混和して、全量を１０μＬとし、２５℃で９０分間インキュベートした。インキュベート後にＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（２ｍｇ／ｍＬ）を１μＬ添加し、３７℃にて１０分間インキュベートすることにより、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子が組み込まれたｐＪＴＩ  Ｆａｓｔ  ＤＥＳＴベクター（ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ベクター）を得た。得られたＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ベクターを５０μＬのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に加え３０分氷上で静置した。その後３７℃で２０秒間ヒートショックを加え、２分間氷上で静置した。ＳＯＣ培地（タカラバイオ）を加え、３７℃で１時間振盪培養した後、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地プレートに培養液を塗布し、３７℃で一晩静置した。大腸菌コロニーをアンピシリン含有ＬＢ培地に懸濁し３７℃で一晩振盪培養した。増殖した大腸菌からＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子が組み込まれたプラスミドＤＮＡ（ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ベクター）をｐｌａｓｍｉｄ  ｐｌｕｓ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用し、精製した。【０１７４】
実施例４  ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現細胞の樹立
＜４−１  細胞の樹立＞
ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現細胞の樹立のための宿主細胞として、マウス胎児線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を選択し、上記にて作製したＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子が組み込まれた発現ベクターをトランスフェクションすることにより、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現細胞を樹立した。詳細な方法は以下に示すとおりに実施した。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、通常の培養（２次元培養）のために、Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）(Ｌ−グルタミン、フェノールレッド、ピルビン酸ナトリウム、１５００ｍｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム含有)（ＷＡＫＯ）に１０％となるようにＮｅｗｂｏｒｎ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ（ＮＢＣＳ）（ＧＩＢＣＯ）を添加したものを２次元培養用の培地として使用し、３７℃、５％ＣＯ2にて培養したものを使用した。トランスフェクションを行う前日に、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を１．５×１０5ｃｅｌｌｓ／２ｍＬにて、６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ）に播種し、３７℃、５％ＣＯ2にて、一晩インキュベートした。１．５μｇのＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ベクター、１．５μｇのｐＪＴＩ  ｐｈｉＣ３１  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｖｅｃｔｏｒを混合した混合液に、その混合液の６倍量のＶｉａＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを添加した後、全量が３００μＬとなるようにＯｐｔｉ−ＭＥＭを添加し、室温にて５分間インキュベートすることによりトランスフェクション溶液を作製した。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞が播種されているｗｅｌｌから培地を３００μＬ除去し、上記で作製したトランスフェクション溶液を３００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ2にて、一晩インキュベートした。翌日、トランスフェクション溶液を除去するために、培地を交換した。培地を交換する際に、新しい培地には、ハイグロマイシンＢ（ナカライテスク）を５００μｇ／ｍＬとなるように添加した。ハイグロマイシンＢにより、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子導入発現ベクターが導入されていない細胞を除去した。
トランスフェクション後、１週間に２回程度の培地交換をしながら、細胞が増殖するまで、培養を行った。トランスフェクション２２日後に、細胞をトリプシンにて回収し、以下の方法にてシングルセルクローニングを行った。回収した細胞の細胞数を測定し、１ｃｅｌｌ／２００μＬとなるように培地を添加した。９６ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に２００μＬ／１ｗｅｌｌとなるように細胞を播種した。播種後、日々観察を行い、シングルセルから増殖してきた細胞を取得し、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現細胞（ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞）とした。【０１７５】
＜４−２  目的タンパク質の発現確認＞
得られたＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞におけるＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合タンパク質の発現を、ウエスタンブロット法にて確認した。すなわち、培養フラスコから培地を除去し、ＰＢＳにて１度洗浄した。培養フラスコ内にＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ロシュ）とＰｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ロシュ）を含有したＳａｍｐｌｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ２（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ）を添加し、スクレイパーにて細胞溶解液を回収した。回収した細胞溶解液から遠心分離により、タンパク質サンプルを得た。タンパク質サンプルは、タンパク質定量を行い、タンパク質濃度を一定にした。一定濃度のタンパク質サンプルに対して、Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（６ｘ）  ｆｏｒ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ナカライテスク）を加え、９５℃にて５分間インキュベートすることにより、タンパク質を変性させ、ウエスタンブロッティング用のサンプルを得た。なお、ネガティブコントロール用のサンプルとして、親株であるＮＩＨ／３Ｔ３細胞を用いて、同様の方法にてウエスタンブロティング用のサンプルを得た。上記サンプルを用いて、以下に示す方法にて、タンパク質の発現を確認した。４−１５パーセント  Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ（ＢＩＯ―ＲＡＤ）および１×  Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（２００Ｖで３０分）にて、タンパク質を分離した。Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂ  ＲＴＡ  Ｍｉｄｉ  ＰＶＤＦ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ―ＲＡＤ）とＴｒａｎｓｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ  転写システム（ＢＩＯ―ＲＡＤ）を用いてＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写し、ＰＶＤＦ膜をＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ−Ｐに１時間浸漬した。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ−Ｐが１０％となるようにＴＢＳ−Ｔで希釈した溶液で一次抗体（Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｒｅｔ  （Ｔｙｒ９０５）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＳＴ）、Ｒｅｔ  （Ｃ３１Ｂ４）  Ｒａｂｂｉｔ  ｍＡｂ（ＣＳＴ）及びＡｎｔｉ−Ｄｃｔｎ１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＡＴＬＡＳ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ））を１/１０００濃度になるように希釈し、ＰＶＤＦ膜を浸漬させ、４℃にて一晩インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔにて洗浄後、Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＳＴ）を１／２０００濃度になるようにＴＢＳ−Ｔにて希釈した２次抗体希釈液にて、ＰＶＤＦ膜を浸漬させ、室温にて１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔにて洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びルミノ・イメージアナライザー  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｍａｇｅｒ  ６００（ＧＥヘルスケア）を用いてタンパク質の検出を行った。なお、検出タンパク質の分子量は、プレシジョン Ｐｌｕｓプロテイ  カレイドスコープスタンダード（ＢＩＯＲＡＤ）により確認した。
その結果、図４ａ）及びｂ）に示すように、抗ｐＲＥＴ抗体と抗ＲＥＴ抗体を用いたところ内在性のＲＥＴ（１５０及び１７５ｋＤａ）は検出されなかった。一方、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞においてのみ、１７５ｋＤａ付近にＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合タンパク質と推測されるバンドが確認できた。
また、図４ｃ）に示すように抗ＤＣＴＮ１抗体を用いたところ、１５０ｋＤａ付近に内在性のＤＣＴＮ１が検出された。一方、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞においてのみ、内在性の１５０ｋＤａのＤＣＴＮ１のバンドの上の１７５ｋＤａ付近にバンドが検出された。すなわち、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞においてのみ、ＲＥＴに対する抗体及びＤＣＴＮ１に対する抗体の両方で１７５ｋＤａ付近のバンドが検出されたことから、作成したＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞では、ＤＣＴＮ１とＲＥＴが融合したタンパク質が発現していることが明らかとなった。【０１７６】
実施例５  ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の３次元培養による増殖確認
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、２次元培養条件では良好な増殖を示すが、３次元培養条件では、ほとんど増殖しない。一方で、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に癌遺伝子を発現させることにより、３次元培養条件でも増殖することが知られている。その性質を利用し、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子が癌遺伝子であるかの確認を行った。３７℃、５％ＣＯ2にて、２次元培養で培養したＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞及びＮＩＨ／３Ｔ３細胞をトリプシンにて回収し、細胞数を測定した。３次元培養を行うために、ＦＣｅＭ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（日産化学工業株式会社）とＤ−ＭＥＭ（高グルコース）(Ｌ−グルタミン、フェノールレッド、ピルビン酸ナトリウム、１５００ｍｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム含有)（ＷＡＫＯ）とＮｅｗｂｏｒｎ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ（ＮＢＣＳ）（ＧＩＢＣＯ）を用いて、３次元培養用の培地を作製した。作製した３次元培養用の培地に、細胞を１０００ｃｅｌｌｓ／９０μＬとなるように懸濁し、９６  Ｗｅｌｌ  Ｃｌｅａｒ  Ｂｌａｃｋ  Ｒｏｕｎｄ  Ｂｏｔｔｏｍ、Ｓｐｈｅｒｏｉｄ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に９０μＬ／１ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ2にてインキュベートした。播種翌日（Ｄａｙ１）及び播種８日後（Ｄａｙ８）に細胞内ＡＴＰ発光検出試薬であるＣｅｌｌｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ２．０Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｇｅｍａ）及びルミノメーター（ＥｎＳｐｉｒｅ，  ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて発光量（ｃｏｕｎｔｓ  ｐｅｒ  ｓｅｃｏｎｄ：ｃｐｓ）を測定し、生細胞数の指標とした。Ｄａｙ１での測定結果とＤａｙ８での測定結果から各細胞の増殖率を算出した（Ｎ＝３）。
その結果、図５に示すように、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞では、Ｄａｙ８の細胞数はＤａｙ１の細胞数と比較して２．４倍であったのに対して、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞では、２０．９倍であった。また、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、３次元培養において細胞の凝集塊は形成されないが、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞では、３次元培養により細胞の凝集塊が形成されていることが確認された。
すなわち、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子を導入することにより、細胞の増殖が亢進したことが明らかとなり、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子が癌遺伝子であることが示唆された。【０１７７】
実施例６  ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける造腫瘍性確認
ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける造腫瘍性を確認するために、ヌードマウスを用いた移植実験を行った。なお、親株であるＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、ヌードマウスの皮下では増殖しないことが、一般的に知られており、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞をヌードマウスの皮下に移植することにより、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子が造腫瘍性に寄与するか、すなわち癌遺伝子であるかの確認ができる。被移植動物としては、ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕ、日本クレア）を用いた。ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞をトリプシンにて回収し、最終的に１×１０8ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＢＳに懸濁し、同量のマトリゲル基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を加え、５×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍＬにしたものを移植用細胞液とした。２５Ｇ注射針と１ｍＬシリンジを用いて、移植用細胞液をヌードマウス（Ｎ＝１０）の右側胸部の皮下に０．１ｍＬずつ移植した。電子ノギス（ミツトヨ）を用い、移植後、１０、１３、１７日目に、１匹ずつ腫瘍の長径及び短径を測定し、以下の式を用いて腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積（ｍｍ3）=（長径、ｍｍ）×（短径、ｍｍ）×（短径、ｍｍ）／２
腫瘍体積の測定結果を図６に示す。その結果、ヌードマウスの皮下に移植されたＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、腫瘍を形成し、良好に増殖することが確認され、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験においてもＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子が癌遺伝子であることが示唆された。【０１７８】
実施例７  ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を用いたｓｉＲＮＡによるＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合タンパク質の抑制と細胞増殖抑制効果の確認
ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に対するｓｉＲＮＡ処理による影響を確認した。用いたｓｉＲＮＡは、下記の表５に示した３種類のＲＥＴ  ｓｉＲＮＡとネガティブコントロールとしてＳｉｌｅｎｃｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＃１  ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用した。なお、３種類のＲＥＴ  ｓｉＲＮＡは、いずれもヒトＲＥＴを標的とするｓｉＲＮＡであるが、ＲＥＴ  ｓｉＲＮＡ１及びＲＥＴ  ｓｉＲＮＡ２はＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子内のＲＥＴ部分に結合する配列を含み、ＲＥＴ  ｓｉＲＮＡ３はＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子内に結合する配列を含まない。すなわち、ＲＥＴ  ｓｉＲＮＡ１及びＲＥＴ  ｓｉＲＮＡ２はＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子の発現を抑制するが、ＲＥＴ  ｓｉＲＮＡ３はＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子の発現を抑制しないことが想定された。以下にｓｉＲＮＡを用いた実験の方法について記載した。【０１７９】
【表５】
2019039439.tif 000006
【０１８０】
ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、２次元培養用の培地を使用し、３７℃、５％ＣＯ2にて培養したものを使用した。ｓｉＲＮＡ処理を行う前日に、各細胞を３×１０5ｃｅｌｌｓ／２ｍＬにて、６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ）に播種し、３７℃、５％ＣＯ2にて、一晩インキュベートした。事前に水を用いて２０μＭに調製した各ｓｉＲＮＡを１２μＬ、４μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ＲＮＡｉＭＡＸ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及び３８４μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭを混合し、室温にて１５分インキュベートすることによりｓｉＲＮＡ溶液を作製した。各細胞が播種されているｗｅｌｌにｓｉＲＮＡ溶液を４００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ2にて、一晩インキュベートした。
翌日、一部は、タンパク質発現解析用にサンプリングを行い、一部については、細胞増殖確認用に再播種を行った。タンパク質発現解析用のサンプリング及びタンパク質発現解析は、一次抗体として、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｒｅｔ  （Ｔｙｒ９０５）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＳＴ）、Ｒｅｔ  （Ｃ３１Ｂ４）  Ｒａｂｂｉｔ  ｍＡｂ（ＣＳＴ）及びＧＡＰＤＨ  （Ｄ１６Ｈ１１）  ＸＰ  Ｒａｂｂｉｔ  ｍＡｂ（ＣＳＴ）を用いた以外は、上記＜４−２  目的タンパク質の発現確認＞と同様の方法で実施した。その結果、図７に示すように、ｓｉＲＮＡ処理していない細胞（無処理）に比べ、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（ＮＣ）を処理した細胞において、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合タンパク質の発現は抑制されていないことが確認できた。一方、ＲＥＴ  ｓｉＲＮＡ１及びＲＥＴ  ｓｉＲＮＡ２を処理した場合、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞のＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合タンパク質の発現が抑制されることが確認され、ＲＥＴ  ｓｉＲＮＡ３では抑制されないことが明らかとなった。
次に細胞増殖抑制効果の確認のために、無処理又はｓｉＲＮＡ処理されたｗｅｌｌからトリプシンにより細胞を回収し、細胞数を測定した。上記実施例５と同様の方法で３次元培養を行い、播種当日（Ｄａｙ０）及び播種４日後（Ｄａｙ４）に実施例５と同様の方法で生細胞数を測定した。Ｄａｙ０での測定結果とＤａｙ４での測定結果から各細胞における増殖率を算出した。
その結果、図８に示すように、ｓｉＲＮＡを処理していない細胞（無処理）及びネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（ＮＣ）を処理した細胞では、Ｄａｙ４の細胞数は、Ｄａｙ０の細胞数と比較して、４．９倍及び３．６倍であったのに対して、ＲＥＴ  ｓｉＲＮＡ１及びＲＥＴ  ｓｉＲＮＡ２で処理した細胞では、２．０倍及び２．４倍程度の増殖であり、顕著に増殖率が低下した。一方、ＲＥＴ  ｓｉＲＮＡ３はで処理した細胞では、３．７倍の増殖であり、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡと同程度の増殖率であり、増殖率の低下は見られなかった。これらの結果から、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の増殖は、ｓｉＲＮＡによってＲＥＴの発現を阻害した場合にも抑制されることが明らかとなった。【０１８１】
実施例８  ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を用いた細胞増殖抑制効果
ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖試験を行った。上記実施例５と同様の方法で、３次元培養及び播種を行った。播種後３７℃、５％ＣＯ2にて一晩インキュベートした（Ｄａｙ０）。ＲＥＴを阻害すると報告されているカボザンチニブ、バンデタニブ、アレクチニブ、レンバチニブ、縮合ピリミジン化合物（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ１から９；表６に示す）をジメチルスルホキシドにて１０  ｍｍｏｌ／Ｌの濃度に溶解し、さらに３次元培養用の培地を用いて、これらの化合物の最終濃度がそれぞれ１０００、３３３、１１１、３７．０、１２．３、４．１２、１．３７、０．４５７ｎｍｏｌ／Ｌになるように希釈を行った。これを先に述べた細胞が播種されたプレートの各Ｗｅｌｌに０．０１ｍＬずつ加え（Ｄａｙ１）、３７℃、５％ＣＯ2にて７日間インキュベートした。培養後（Ｄａｙ８）、全てのＷｅｌｌに細胞内ＡＴＰ発光検出試薬であるＣｅｌｌｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ２．０Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｇｅｍａ）を添加し、ルミノメーター（ＥｎＳｐｉｒｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて発光量（ｃｏｕｎｔｓ  ｐｅｒ  ｓｅｃｏｎｄ：ｃｐｓ）を測定した。Ｔday8とＣday1の値の大きさに応じて、以下の式より化合物の各濃度におけるＤａｙ１からの増殖率を算出し、細胞増殖を５０％抑制する被験化合物の濃度（ＧＩ50（ｎＭ））を求めた。
１）Ｔday8≧Ｃday1の場合
増殖率（％）＝（Ｔday8−Ｃday1）／（Ｃday8−Ｃday1）×１００
Ｔ：被験化合物を添加したＷｅｌｌのｃｐｓ
Ｃ：被験化合物を添加しなかったＷｅｌｌのｃｐｓ
Ｄａｙ１：被験化合物を添加した日
Ｄａｙ８：評価日
２）Ｔday8＜Ｃday1の場合
増殖率（％）＝（Ｔday8−Ｃday1）／（Ｃday1）×１００
Ｔ：被験化合物を添加したＷｅｌｌのｃｐｓ
Ｃ：被験化合物を添加しなかったＷｅｌｌのｃｐｓ
Ｄａｙ１：被験化合物を添加した日
Ｄａｙ８：評価日【０１８２】
【表６】
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【０１８３】
その結果、表７に示すように、カボザンチニブ、バンデタニブ、レンバチニブ及び縮合ピリミジン化合物（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ１から９）において、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の増殖が抑制された。【０１８４】
【表７】
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【０１８５】
以上の結果から、上記のＲＥＴ阻害剤は、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子が検出されたがんに対する治療薬として有用である可能性が示唆された。また、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を用いることで、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴを抑制する化合物のスクリーニングが可能であることが示唆された。【０１８６】
実施例９  ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現細胞を用いたＲＥＴのリン酸化阻害
ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現細胞におけるＲＥＴのリン酸化が、ＲＥＴを阻害すると報告されている既存の薬剤で阻害されるかについて以下の方法にて検討した。
ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、２次元培養用の培地を使用し、３７℃、５％ＣＯ2にて培養したものを使用した。薬剤処理を行う前日に、各細胞を３×１０5ｃｅｌｌｓ／２ｍＬにて、６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ）に播種し、３７℃、５％ＣＯ2にて、一晩インキュベートした。カボザンチニブ、バンデタニブ、アレクチニブ、レンバチニブをジメチルスルホキシドにて１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度に溶解し、さらにＰＢＳを用いて、これらの化合物の最終濃度がそれぞれ１０００、１００、１０ｎｍｏｌ／Ｌになるように希釈を行った。これを先に述べた細胞が播種されたプレートの各Ｗｅｌｌに２０μＬずつ加え（Ｄａｙ１）、３７℃、５％ＣＯ2にて１時間インキュベートした。インキュベート後、上記実施例７に記載されている方法と同様の方法でタンパク質発現解析用のサンプリングを行い、タンパク質発現解析を実施した。
その結果、図９に示すように、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞のリン酸化ＲＥＴレベルがカボザンチニブ及びレンバチニブにより顕著に減少することが確認された。また、上記と同様の方法で、縮合ピリミジン化合物を用いて、ＲＥＴのリン酸化阻害を評価した結果、縮合ピリミジン化合物においてもＲＥＴのリン酸化が顕著に減少することが確認できた。
以上の結果から、リン酸化ＲＥＴレベルを顕著に減少させる薬剤は、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の増殖を抑制できる化合物であり、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子が検出されたがんに対する治療薬として有用である可能性が示唆された。また、ＤＣＴＮ１−ＲＥＴ融合遺伝子発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞のリン酸化ＲＥＴレベルを用いることでＲＥＴ阻害剤のスクリーニングが可能であることが示唆された。
【配列表フリーテキスト】
【０１８７】
配列番号１は、ＤＣＴＮ１  ｖａｒｉａｎｔ  １（ｖ１）［配列番号２５の一部］とＲＥＴ  ｖａｒｉａｎｔ  ２（ｖ２）［配列番号３１の一部］との融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を示す。
配列番号２は、ＤＣＴＮ１  ｖ１とＲＥＴ  ｖ２との融合ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ＤＣＴＮ１  ｖ１とＲＥＴ  ｖａｒｉａｎｔ  ４（ｖ４）［配列番号３２の一部］との融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を示す。
配列番号４は、ＤＣＴＮ１  ｖ１とＲＥＴ  ｖ４との融合ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、ＤＣＴＮ１  ｖａｒｉａｎｔ  ２（ｖ２）［配列番号２６の一部］とＲＥＴ  ｖ２との融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を示す。
配列番号６は、ＤＣＴＮ１  ｖ２とＲＥＴ  ｖ２との融合ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、ＤＣＴＮ１  ｖ２とＲＥＴ  ｖ４との融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を示す。
配列番号８は、ＤＣＴＮ１  ｖ２とＲＥＴ  ｖ４との融合ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、ＤＣＴＮ１  ｖａｒｉａｎｔ  ３（ｖ３）［配列番号２７の一部］とＲＥＴ  ｖ２との融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を示す。
配列番号１０は、ＤＣＴＮ１  ｖ３とＲＥＴ  ｖ２との融合ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、ＤＣＴＮ１  ｖ３とＲＥＴ  ｖ４との融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を示す。
配列番号１２は、ＤＣＴＮ１  ｖ３とＲＥＴ  ｖ４との融合ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、ＤＣＴＮ１  ｖａｒｉａｎｔ  ４（ｖ４）［配列番号２８の一部］とＲＥＴ  ｖ２との融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を示す。
配列番号１４は、ＤＣＴＮ１  ｖ４とＲＥＴ  ｖ２との融合ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、ＤＣＴＮ１  ｖ４とＲＥＴ  ｖ４との融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を示す。
配列番号１６は、ＤＣＴＮ１  ｖ４とＲＥＴ  ｖ４との融合ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７は、ＤＣＴＮ１  ｖａｒｉａｎｔ  ５（ｖ５）［配列番号２９の一部］とＲＥＴ  ｖ２との融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を示す。
配列番号１８は、ＤＣＴＮ１  ｖ５とＲＥＴ  ｖ２との融合ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１９は、ＤＣＴＮ１  ｖ５とＲＥＴ  ｖ４との融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を示す。
配列番号２０は、ＤＣＴＮ１  ｖ５とＲＥＴ  ｖ４との融合ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２１は、ＤＣＴＮ１  ｖ６とＲＥＴ  ｖ２との融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を示す。
配列番号２２は、ＤＣＴＮ１  ｖ６とＲＥＴ  ｖ２との融合ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２３は、ＤＣＴＮ１  ｖ６とＲＥＴ  ｖ４との融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を示す。
配列番号２４は、ＤＣＴＮ１  ｖ６とＲＥＴ  ｖ４との融合ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３３は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号３４は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号３５は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号３６は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号３７は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号３８は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号３９は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号４０は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号４１は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号４２は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号４３は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号４４は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号４５は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号４６は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号４７は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号４８は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号４９は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号５０は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号５１は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号５２は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号５３は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号５４は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号５５は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号５６は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号５７は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号５８は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号５９は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号６０は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号６１は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号６２は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号６３は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号６４は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号６５は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号６６は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号６７は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号６８は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号６９は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号７０は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号７１は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号７２は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号７３は、プライマーの塩基配列を示す。
配列番号７４は、ＲＥＴ  ｓｉＲＮＡの塩基配列を示す。
配列番号７５は、ＲＥＴ  ｓｉＲＮＡの塩基配列を示す。
配列番号７６は、ＲＥＴ  ｓｉＲＮＡの塩基配列を示す。
配列番号７７は、ＲＥＴ  ｓｉＲＮＡの塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月26日(2019.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチド。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される請求項１記載のポリペプチド。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
以下の（ｄ）〜（ｆ）から選択される請求項３記載のポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。  （ｆ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
以下の（ｇ）〜（ｉ）から選択される請求項３記載のポリヌクレオチド。
（ｇ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、又は配列番号２３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｈ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、又は配列番号２３で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、又は配列番号２３で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを導入した細胞。
【請求項８】
請求項１又は２記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項９】
試料中の、請求項１又は２記載のポリペプチドの存在を検出する方法。
【請求項１０】
試料中の、請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出するためのプライマー又はプローブであって、当該プライマー又はプローブが以下の（ｊ）〜（ｌ）から選択されるポリヌクレオチド。
（ｊ）ＤＣＴＮ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも１つのプローブであるポリヌクレオチド。
（ｋ）ＤＣＴＮ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド。
（ｌ）ＤＣＴＮ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計されたセンスプライマーとアンチセンスプライマーのセットであるポリヌクレオチド。
【請求項１１】
試料中の、請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出する方法。
【請求項１２】
請求項９又は１１記載の検出方法において、試料中の、請求項１若しくは２記載のポリペプチド又は請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出した場合に、試料の由来となる患者が癌であると判定する方法。
【請求項１３】
ＲＥＴを阻害する化合物を有効成分とする、ＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性及び／又はＤＣＴＮ１タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合タンパク質陽性の癌治療用医薬組成物。
【請求項１４】
以下の（１）及び（２）の工程を含む請求項１又は２記載のポリペプチドの発現及び／又は活性、又は請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現を抑制する化合物をスクリーニングする方法。
（１）請求項１又は２記載のポリペプチド、請求項１若しくは２記載のポリペプチド又は請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを発現している細胞、又は請求項７の細胞に試験化合物を接触する工程。
（２）上記工程（１）において、請求項１又は２記載のポリペプチドの発現及び／又は活性、又は請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現が抑制されるか測定する工程、又は上記工程（１）記載の細胞の増殖が抑制されるか測定する工程。
【請求項１５】
請求項１若しくは２記載のポリペプチド又は請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを、ＲＥＴを阻害する化合物を用いた化学療法が有効であるか否かの指標とする方法であって、請求項９記載の検出方法により、試料中から、請求項１若しくは２記載のポリペプチドを検出した場合、及び／又は請求項１１記載の検出方法により、試料中から、請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出した場合に、ＲＥＴを阻害する化合物を用いた化学療法が有効であると判定する方法。
【請求項１６】
ＤＣＴＮ１タンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチド、及び当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種からなる癌を検出するためのバイオマーカー。
【請求項１７】
ＤＣＴＮ１遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子陽性及び／又はＤＣＴＮ１タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合タンパク質陽性の癌患者を治療するための癌治療用医薬組成物を製造するための、ＲＥＴを阻害する化合物の使用。
【請求項１８】
試料中の請求項１又は２記載のポリペプチドの存在を検出するための手段及び／又は試料中の請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出するための手段の、ＲＥＴを阻害する化合物を用いた化学療法が有効であるか否かの判定薬の製造方法。
【請求項１９】
請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出するための抗ＤＣＴＮ１抗体及び抗ＲＥＴ抗体の組み合わせ。
【請求項２０】
請求項１若しくは２記載のポリペプチド又は請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの存在を検出するための検出薬を製造するための、請求項８記載の抗体、請求項１９記載の抗体の組み合わせ又は請求項１０記載のプライマー若しくはプローブの使用。
【国際調査報告】
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