(57)【要約】  本発明は、核酸分析装置における核酸分析用デバイス上の反応スポットの無駄をなくし、且つ未観察の核酸計測領域への蛍光励起光の漏れを抑えた核酸分析用デバイス、具体的には、複数の核酸計測領域を有する核酸分析用デバイスであって、一つの核酸計測領域が、照射領域内に他の核酸計測領域が入らないように他の核酸計測領域と十分に離れて配置されていることを特徴とする、前記核酸分析用デバイスに関する。
2010137543.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の核酸計測領域を有する核酸分析用デバイスであって、一つの核酸計測領域が、照射領域内に他の核酸計測領域が入らないように他の核酸計測領域と十分に離れて配置されていることを特徴とする、前記核酸分析用デバイス。
【請求項２】
複数の核酸計測領域と、該核酸計測領域間に反応スポットを有しない余白部分とを有する核酸分析用デバイスであって、光源によって一つの核酸計測領域を照明することを特徴とする、前記核酸分析用デバイス。
【請求項３】
前記核酸計測領域のサイズが光学検出系の計測視野と実質的に同一である、請求項１又は２記載の核酸分析用デバイス。
【請求項４】
照明光としてレーザーを使用し、単一の核酸計測領域を照明した際、レーザー径及び余白の寸法が、近隣の核酸計測領域に照明が漏洩して照射されない寸法に規定されている、請求項１又は２記載の核酸分析用デバイス。
【請求項５】
核酸分析に必要な照明強度を与える照明光照射領域内に、観察対象核酸計測領域の全反応スポットが含まれる、請求項１又は２記載の核酸分析用デバイス。
【請求項６】
観察対象核酸計測領域内に、計測に必要な照明強度を与える照明光照射領域が全て含まれる、請求項１又は２記載の核酸分析用デバイス。
【請求項７】
照明光としてレーザーを使用し、核酸分析に必要な強度の照明が照射される範囲内に観察対象核酸計測領域の全反応スポットが含まれる、請求項１又は２記載の核酸分析用デバイス。
【請求項８】
核酸計測領域の長辺又は最大径が50μm角〜10mm角であることを特徴とする、請求項１又は２記載の核酸分析用デバイス。
【請求項９】
隣接する核酸計測領域の間隔が1μm〜10mmであることを特徴とする、請求項１又は２記載の核酸分析用デバイス。
【請求項１０】
核酸伸長反応を阻害する光分解性物質を有する核酸プローブと、該核酸プローブが複数配置された反応場領域を有する、請求項１又は２記載の核酸分析用デバイス。
【請求項１１】
レーザーホモジナイザーにより所定の観察視野のみが照明されることを特徴とする、請求項１又は２記載の核酸分析用デバイス。
【請求項１２】
前記核酸計測領域が試薬流路上に配置されていることを特徴とする、請求項１又は２記載の核酸分析用デバイス。
【請求項１３】
複数の核酸計測領域と、該核酸計測領域間に反応スポットを有しない余白部分とを有する核酸分析用デバイスであって、光源によって所定数の核酸計測領域から成る核酸計測領域群を照射することを特徴とする、前記核酸分析用デバイス。
【請求項１４】
請求項１又は２記載の核酸分析用デバイスを備える核酸分析装置。
【請求項１５】
反応液流路と、核酸分析用デバイスの所定の核酸計測領域に送液可能な送液機構とを有することを特徴とする、請求項１４記載の核酸分析装置。
【請求項１６】
前記核酸計測領域に標的核酸を固定化した請求項１又は２記載の核酸分析用デバイスを核酸分析に供する工程を含む、核酸分析方法。
【請求項１７】
各前記核酸計測領域における核酸分析を並行して行うことを特徴とする、請求項１６記載の核酸分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、核酸分析用デバイス及び核酸分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、核酸分析装置において、ガラス基板等で作製された反応デバイスに多数のDNAプローブ又はポリメラーゼを固定し、当該反応デバイス上で塩基伸長反応を行うことで配列を決定する方法が提案されている。当該固定及び反応を行う領域を、以下「反応スポット」と呼ぶ。【０００３】
反応スポットにおいては、単一分子を固定する場合(単分子方式)や同一種複数分子を固定する場合(複数分子方式)がある。また多数の反応スポットを配置し、各々の反応スポットで並列して塩基伸長及び配列決定を行う超並列方式核酸分析装置が開発されている。【０００４】
非特許文献１は、反応スポットに単一分子を固定した場合を説明する。非特許文献１では、全反射エバネッセント照射検出方式を用いた単分子レベルのDNA配列解読を行っている。具体的には、励起光として波長532nm及び635nmのレーザーを、それぞれ蛍光体Cy3及び蛍光体Cy5の蛍光励起のために用いる。先ず、屈折率境界平面上の溶液層側に、単一のターゲットDNA分子をビオチン-アビジンのタンパク質結合を利用して固定化し、反応スポットを形成する。溶液中にCy3で標識されたプライマーを溶液交換によって導入すると、単一の蛍光標識プライマー分子がターゲットDNA分子にハイブリダイズする。ある一定時間、当該ハイブリダイゼーション反応を行った後に、未反応の余剰なプライマーを洗い流す。その後、励起光532nmを用いた全反射エバネッセント照射により、Cy3がエバネッセント場に存在するため、ターゲットDNA分子の結合位置を蛍光検出によって確認することができる。当該確認後、Cy3を高出力の励起光で照射することによって蛍光退色させ、以降の蛍光発光を抑制する。【０００５】
次に、溶液中に、ポリメラーゼ及びCy5で標識された一種類の塩基のdNTP(NはA、C、G、Tのいずれかである)を溶液交換によって導入すると、ターゲットDNA分子に対して相補関係にある場合に限り、当該蛍光標識dNTP分子がプライマー分子の伸長鎖に取り込まれることとなる。ある一定時間、当該伸長反応を行った後に、未反応の余剰なdNTPを洗い流す。その後、励起光635nmを用いた全反射エバネッセント照射により、Cy5がエバネッセント場に存在するため、ターゲットDNA分子の結合位置における蛍光検出によって相補関係を確認することができる。確認後、Cy5を高出力の励起光で照射することによって蛍光退色させ、以降の蛍光発光を抑制する。以上のdNTPの取り込み反応プロセスにおいて、塩基の種類を例えばA→C→G→T→A→のように順次段階的に繰り返すことによって(段階的伸長反応)、ターゲットDNA分子と相補関係にある塩基配列を決定することが可能である。【０００６】
蛍光計測に使用する検出器が一度に観察できる領域(以下、「計測視野」と呼ぶ)内に複数の反応スポットを形成し、また各反応スポットに異なるターゲットDNA分子が存在する状態で上記のdNTPの取り込み反応プロセスを並列処理することで、複数のターゲットDNA分子の同時DNAシーケンシングが可能となる。この際の同時並列処理数は、従来の電気泳動をベースにしたDNAシーケンシングと比較して飛躍的に大きくすることができると期待されている。【０００７】
また、単一分子DNAシーケンサーは、その仕組み上、PCR法等による遺伝子増幅は必要ない。しかしながら、観察するターゲットDNA断片が希少であるか又は唯一のDNA断片である場合には、単一分子DNAシーケンサーは、当該DNA断片を無駄にすることなく読み取ることができることが理想である。【０００８】
さらに、先端的な研究においては、一分子単位でのDNA塩基配列解読において、プラズモン共鳴等を発生させるための微細構造を有する半導体チップの組み合わせを使用する方法がある。例えば、特許文献１では、局在型表面プラズモンの数倍から数十倍程度の蛍光増強効果を利用している。蛍光増強の影響が及ぶ範囲は10nm〜20nm程度である。ターゲットDNA分子を固定した金属の微細構造体の表面で、局在型表面プラズモンが発生すると、ターゲットDNA分子に取り込まれた蛍光標識dNTPだけが蛍光増強の恩恵を受け、浮遊する蛍光標識dNTPとは数倍から数十倍以上の蛍光強度の差がもたらされる。この方式により、未反応の蛍光標識dNTPを除去しなくとも、塩基伸長反応を計測することが可能となる。【０００９】
また、ターゲット分子を任意の形状や配置に整列する様々な方法が提案されている。非特許文献２では、始めに基板上に所望のパターンの電極を設け、PLL-g-PEG(Poly-L-Lysin-g-polyethylene glycol)を基板全面に塗布する。その後、前記電極に電圧を印加することで、前記電極部PLL-g-PEGを退ける。これにより、蛍光分子等を電極部のみに特異的に吸着する方法が提示されている。非特許文献３では、基板に光解離性の分子を塗布した後、近接場走査光によるリソグラフィー手法を用いてナノスケールのターゲット分子の固定領域パターンを作製している。これらの手法では、基板上に100nm以下のDNA又はタンパク質のパターンを作製する方法が示されている。【００１０】
一方、非特許文献４は、4種類のヌクレオチドに各々異なる蛍光色素を有するものを供給し、洗浄することなく、連続的な核酸伸長反応を起こすことによる、リアルタイムDNA配列決定分析を開示する。また、特許文献２は、局所的に塩基伸長反応の開始を制御する方法として、プローブの3'位置に光照射で切断可能な保護基を配置する方法を開示する。具体的には、保護基としてオリゴプローブ側の3'位置にケージド化合物を配置し、UV光照射により保護基を切断することでリアルタイム塩基伸長反応を開始する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開2009-45057号公報
【特許文献２】特開2010-48号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ido Braslavskyら, 「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」, 2003年, Vol. 100, No. 7, pp. 3960-3964
【非特許文献２】C.S. Tangら, 「Analytical Chemistry」, 2006年, Vol. 78, No. 3, pp. 711-717
【非特許文献３】Yasuhiro Kobayashiら, 「Analytical Sciences」, 2008年, Vol. 24, No. 5, pp. 571-576
【非特許文献４】John Eidら, 「Science」, 2009年1月2日, Vol. 323, No. 5910, pp. 133-138
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本願発明者が、超並列方式核酸分析装置のスループット向上について鋭意検討した結果、次の知見を得るに至った。【００１４】
超並列方式核酸分析装置では、レンズや検出器で構成される一つの光学検出系で同時に計測できる範囲(すなわち、計測領域内の有効な反応スポットの数)に比例してスループットが向上する。また、反応デバイス上に反応スポットを高密度に配置することにより、同じ反応スポット数でも反応チャンバーの大きさが小さくなることで使用する試薬量が低減し、解析の低コスト化が可能となる。しかしながら、現実には光学検出系の分解能及び検出器の画素数に起因して、同時に計測可能な有効反応スポットの数及び反応デバイスにおける反応スポットの密度は制限される。【００１５】
光学検出系の分解能は、光学検出系を構成する対物レンズの回折限界によって決定される。当該回折限界は、具体的には以下の式に従って決定される。
【数１】
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(式中、「λ」は計測する光の波長を表し、「NA」は対物レンズの開口数を表す。)【００１６】
計測する蛍光の波長は、おおよそ500〜800nm程度であり、一方、対物レンズのNAは1程度であるため、上記式によれば、対物レンズの回折限界は300〜500nm程度となる。現実の光学検出系での分解能は、レンズの収差や位置精度等により、前記値よりさらに低くなり、おおよそ1μm程度となる。このことから、個々の反応スポット上の蛍光を確実に識別するためには、反応スポットの間隔はおおよそ1μm以上離れていなければならない。一方、計測できる視野の範囲(有効視野サイズ)は、使用する対物レンズのNAに依存する。NAが1程度の場合、有効視野サイズは、おおよそ１mm2程度となる。そのため、計測領域内の反応スポット数を最大にするためには、１mm2の範囲に1μmピッチで形成する必要があり、反応スポットの最大数は1×106個程度となる。【００１７】
より一層のスループット向上のためには、より多くの反応スポットを形成する必要がある。そこで、基板上に1×106個以上の反応スポットを形成し、スキャンしながら計測する方法が存在する。【００１８】
前記計測を行う際には、検出器のダイナミックレンジ内に信号強度を抑える必要があることから、計測領域内の励起光強度を極力均一にする必要がある。そのため、励起光の照射領域は、計測領域よりも大きくする必要があり、蛍光計測対象の計測領域に隣接する反応スポットにも励起光が漏れ、漏れ光が発生する。この場合、蛍光色素は励起光を照射することにより分解し、消光するため、蛍光計測対象の計測領域に隣接する反応スポット内の蛍光を消光させる可能性がある。当該隣接の反応スポットが未計測領域内のものである場合、複数分子方式では、当該反応スポット内の同一種複数分子に標識された蛍光体又は前記同一種複数分子に取り込まれる分子に標識された蛍光体の幾つかが漏れ光により消光され、十分な信号強度が得られない場合がある。これは、解読しようとする塩基配列に対するノイズ情報を増加させる原因となる。単分子方式では、反応スポット内に一分子しかターゲット分子は存在しないため、複数分子方式よりも漏れ光による消光の問題は一層深刻となる。【００１９】
当該漏れ光による蛍光の消光の問題を解決する手段として、個々の照射領域が重ならないように、計測領域同士を十分に離して計測することが考えられる。しかしながら、計測領域同士を十分に離した構造を採用する場合には、計測領域間に存在する反応スポットのターゲット分子は計測されないため、当該領域に存在するターゲット分子の情報が得られないこととなる。【００２０】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、核酸分析装置における核酸分析用デバイス上の反応スポットの無駄をなくし、且つ未観察の計測領域への蛍光励起光の漏れを抑えた核酸分析用デバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上述した目的を達成するため鋭意検討した結果、核酸分析用デバイス上で、一つの核酸計測領域を、照射領域内に他の核酸計測領域が入らないように他の核酸計測領域と十分に離れて配置することで、目的の核酸計測領域以外への蛍光励起光の漏れを抑えることができることを見出し、本発明を完成するに至った。【００２２】
すなわち、本発明は、一つの核酸計測領域が、照射領域内に他の核酸計測領域が入らないように他の核酸計測領域と十分に離れて配置された、複数の核酸計測領域を有する核酸分析用デバイスである。また、本発明は、当該核酸分析用デバイスを備える核酸分析装置、及び当該核酸分析用デバイスを用いた核酸分析方法である。【００２３】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009-127907号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、目的の核酸測定領域内に固定化した標的核酸からの蛍光シグナルを確実に取得できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】核酸分析用デバイス及び検出光学系の一例を説明するための概略図。
【図２】塩基配列解読を行うための核酸分析用デバイスを備える装置の例を示す概略図。
【図３】核酸分析用デバイスにおける観察視野の変更後を示す概略図。
【図４】核酸分析用デバイスにおいて試薬流路を有する構造例を説明するための概略図。
【図５】複数の試薬流路での並行処理ステップの例を示した図。
【図６】円形の核酸計測領域を配置した核酸分析用デバイスの例を示す概略図。
【図７】リアルタイム塩基伸長反応の一般的な手順を示すフローチャート。
【図８】反応開始抑制のために取り付けられた保護基を切断するための光照射が視野以外に漏れた場合、不要な塩基伸長反応を引き起こす例を示す図。
【図９】核酸分析用デバイスの一例を示す概略図。
【図１０】溶液導入量の制御により、所定の視野までに限定して送液することで、リアルタイム塩基伸長反応を制御する例を示す図。
【符号の説明】
【００２６】
101…核酸分析用デバイス
102…金属構造体
103…全反射プリズム
104…励起光レーザー
105…励起光照射領域
106…検出器
107…結像レンズ
108…蛍光波長フィルター
109…核酸計測領域
201…温度制御ユニット
202…試薬保管ユニット
203…分注ユニット
204…送液チューブ
205…廃液チューブ
206…廃液容器
207…2次元センサーカメラ
208…解析用コンピュータ
209…装置制御用コンピュータ
210…励起光用レーザーユニット1
211…励起光用レーザーユニット2
212…λ/4波長版
213…ミラー
214…ダイクロイックミラー
215…計測光路
216…対物レンズ
217…フィルター
218…結像レンズ
219…カメラコントローラ
220…分析装置
301…新たな励起光照射領域
401…試薬流路付き核酸分析用デバイス
402…注入口
403…試薬流路1
404…核酸計測領域
405…吐出口
406…励起光
407…試薬流路2
408…試薬流路3
409…試薬流路4
601…核酸計測領域
602…励起光照射領域
603…試薬流路
604…注入口
711…テンプレートDNAの核酸分析用デバイスへの固定ステップ
712…核酸分析用デバイスの装置へのセットステップ
713…反応試薬供給ステップ
714…次観察視野への移動ステップ
715…反応開始及び塩基伸長反応観察ステップ
716…全視野完了？の判定ステップ
717…核酸分析用デバイス洗浄ステップ
718…核酸分析用デバイス取出しステップ
801…核酸分析用デバイス
802…流路
803…インレット
804…アウトレット
805…反応スポット群
806…照野
807…観察視野
901…反応スポット群
902…観察視野
903…照野
1001…試薬溶液流域
1002…観察視野
1003…照野
1004…反応スポット群
【発明を実施するための形態】
【００２７】
実施形態に係る核酸分析用デバイスは、複数の核酸計測領域を有し、一つの核酸計測領域が、照射領域内に他の核酸計測領域が入らないように他の核酸計測領域と十分に離れて配置されている反応デバイスである。換言すれば、複数の核酸計測領域と該核酸計測領域間に反応スポットを有しない余白部分とを有し、光源によって一つの核酸計測領域を照明することを特徴とする核酸分析用デバイスということができる。実施形態に係る核酸分析用デバイスを用いた核酸分析によれば、原理的に未反応の核酸計測領域に励起光が照射されないことから、解読しようとする塩基配列に対するノイズ情報を低減することができ、目的の核酸計測領域内の反応スポットに固定化した個々の標的核酸からの蛍光シグナルの観察を確実に行うことができる。また、実施形態に係る核酸分析用デバイスは、核酸分析装置等の解析装置に設置し、遺伝子診断等に使用できる。
【００２８】
ここで、「核酸計測領域」とは、ターゲットDNA分子等の標的核酸が固定化され、且つ核酸分析のための反応が行われる1又は複数の反応スポットを有する領域を意味する。
【００２９】
実施形態に係る核酸分析用デバイスは、基板上に核酸計測領域を設けることにより作製される。基板としては、特に限定されるものではないが、例えば石英、シリコン等の材質から成るものが挙げられる。
【００３０】
核酸計測領域は、励起光照射による照射領域内に一つの核酸計測領域のみが設けられ、且つその他の核酸計測領域が当該照射領域内に入らないように、互いに十分に離れた間隔で基板上に配置される。当該核酸計測領域間には、反応スポットを有しない余白部分が存在する。現在入手可能なCCD又はCMOS撮像素子の1/2インチ2次元イメージセンサーを用いた高感度カメラで、倍率40倍程度の対物レンズを使用し、画像収集した場合、およそ140μm角、すなわち、およそ20000μm2の領域が観察可能である。このことから、1視野のサイズは、およそ140μm角であれば撮像素子の画素の無駄がない。実施形態に係る核酸分析用デバイスにおける核酸測定領域のサイズは、このような光学検出系の計測視野と実質的に同一にすることが好ましい。従って、基板上における核酸測定領域のサイズ(長辺又は最大径)は、例えば、50μm角〜10mm角、特に好ましくは140μm角である。また、核酸計測領域の形状としては、例えば正方形、四角形、円形等が挙げられる。
【００３１】
一方、上述のサイズ(すなわち、およそ140μm角)の計測視野に均一にレーザー光を照射し、且つ近隣する視野へ励起光の影響を与えないように核酸計測領域を配置するためには、レーザー光の照射分布を考慮し、隣接する核酸計測領域間の間隔を、例えば、1μm〜10mm、好ましくは50μm〜200μmとする。特に、核酸計測領域間の間隔を1視野幅分(すなわち140μm程度)とすることが望ましい。当該幅は、使用するレーザーの照射領域内の強度均一性及び得たい励起光強度に鑑み、設定される。例えば、照明光としてレーザーを使用し、単一の核酸計測領域を照明した際、レーザー径及び余白の寸法が、近隣の核酸計測領域に照明が漏洩して照射されない寸法に規定される。あるいは、光源によって所定数の核酸計測領域から成る核酸計測領域群を照射することもできる。
【００３２】
一方、例えばレーザー等の照明光による核酸分析に必要な照明強度を与える照明光照射領域内に、観察対象核酸計測領域の全反応スポットが含まれるものとすることができる。あるいは、観察対象核酸計測領域内に、計測に必要な照明強度を与える照明光照射領域が全て含まれるものとすることができる。
【００３３】
照明光にレーザーを用いる場合において、下記の実施形態４で説明するようにレーザーホモジナイザーにより所定の観察視野(計測視野)のみが照明されるようにすることができる。
【００３４】
核酸測定領域は、例えば縦横にそれぞれ10個程度を碁盤の目状に基板上に配置する。なお、基板上の当該核酸測定領域数は、反応観察のスループットや1回の核酸分析当たりの実施形態に係る核酸分析用デバイスの交換回数を考慮し、また核酸分析装置の特性や使い勝手を最も向上させる数とすることが好ましい。また、下記の実施形態２で説明するように、核酸計測領域を試薬流路上に配置してもよい。
【００３５】
核酸計測領域には、反応スポットが存在する。1個の核酸計測領域における反応スポットの数は、例えば、100〜108、好ましくは104〜106である。
【００３６】
核酸計測領域においては、反応スポット上に標的核酸が固定化される。標的核酸としては、例えばDNA、RNA、PNA(ペプチド核酸)等が挙げられる。反応スポット上への標的核酸の固定化方法としては、例えば抗原と抗体との結合、His-Tag(ヒスチジンタグ)/ニトリロトリ酢酸(NTA)又はイミノジ酢酸(IDA)、GST-Tag(グルタチオンSトランスフェラーゼタグ)/グルタチオン等のタグとタグに結合する物質との結合、アビジンとビオチンとの結合等を用いた方法が挙げられる。例えばビオチン-アビジン結合(反応スポットと標的核酸のうち、一方にビオチンを連結し、他方にアビジンを連結する)を利用して、特異的に標的核酸を反応スポット上に固定化する。また、基板上の当該核酸測定領域外の領域は、吸着防止分子を固定化し、不要な標的核酸が付着しないように処理することができる。吸着防止分子としては、特に限定されるものではないが、例えば非特許文献２に記載のPLL-g-PEGが挙げられる。例えば非特許文献２に記載の方法に準じて、基板上に所望のパターンの電極を設け、PLL-g-PEGを基板全面に塗布した後、前記電極に電圧を印加することで前記電極部PLL-g-PEGを退け、退けた領域に標的核酸を固定化する。あるいは、例えば非特許文献３に記載の近接場走査光によるリソグラフィー手法を用いた方法に準じて、反応スポット上に標的核酸を固定化することができる。
【００３７】
さらに、特許文献１に記載のように金属構造体を用いる場合には、核酸計測領域内のみに金属構造体を形成する。具体的には、例えば、金においては金−チオール結合によって、金属構造体上に標的核酸を固定化することができる。このように、金属構造体上に標的核酸を固定化することで、核酸分析の際に検出すべき標的核酸に取り込まれた蛍光分子からの蛍光を増強することができる。また、当該金属構造体が希少金属から成る場合には、実施形態に係る核酸分析用デバイスにおいて反応スポットを無駄なく使用できることから、従来の核酸分析用デバイスに比較して当該希少金属の消費量を低減できる。
【００３８】
また、例えば、核酸分析用デバイスは、核酸伸長反応を阻害する光分解性物質を有する核酸プローブと、該核酸プローブが複数配置された反応場領域(核酸計測領域)を有するものとすることができる。下記実施形態４で説明するように、光分解性物質(光照射で切断可能な保護基)を核酸プローブに連結し、UV光照射により当該物質を切断することで塩基伸長反応を開始する。この方法を用いることで、UV光照射が行われない段階では塩基伸長反応が抑止され、UV光照射により反応を開始することができる。光分解性物質としては、例えば2-ニトロベンジル型、デシル・フェナシル型、又はクマリニルメチル型等のケージド化合物が挙げられる(特許文献２)。ケージド化合物とは、生理活性分子を光分解性保護基で修飾して一時的にその活性を失わせたものの総称である。生理活性を檻(cage)に入れて眠らせた分子という意味でケージド化合物(caged compounds)という名称が付いている。
【００３９】
核酸分析を行うために、上記のように作製した核酸分析用デバイスを核酸分析装置に備える。当該装置は、核酸分析用デバイスの他に、例えば、核酸分析用デバイスに対して、蛍光標識したプライマーやdNTP(NはA、C、G、Tのいずれかである)等を供給する手段、核酸分析用デバイスに光を照射する手段、核酸分析用デバイス上での標的核酸へのハイブリダイゼーションや核酸伸長反応に起因したプライマーやdNTPに標識した蛍光分子の蛍光を測定する発光検出手段等を備えることができる。さらに、当該装置は、反応液流路と、核酸分析用デバイスの所定の核酸計測領域に送液可能な送液機構とを有することができる。
【００４０】
実施形態に係る核酸分析装置によれば、標的核酸上の塩基配列情報を取得できる。例えば、核酸分析用デバイス上の核酸計測領域に対して、蛍光分子で標識したプライマーを含む溶液を供する。次いで、標的核酸と当該プライマーとのハイブリダイゼーションにより標的核酸に蛍光分子が取り込まれることとなる。当該核酸計測領域に対してプライマーに標識した蛍光分子に準じた励起光を照射し、蛍光を検出することで、当該ハイブリダイゼーションを確認することができる。さらに、ポリメラーゼ(例えば、DNAポリメラーゼ、RNA依存性DNAポリメラーゼ(逆転写酵素)、RNAポリメラーゼ、RNA依存性RNAポリメラーゼ等)及びプライマーに標識した蛍光分子とは異なる蛍光特性(蛍光波長や励起波長)を有する蛍光分子で標識したdNTPを含む溶液を核酸計測領域に供することで、塩基伸長反応が生じることとなる。次いで、当該核酸計測領域に対してdNTPに標識した蛍光分子に準じた励起光を照射し、蛍光を検出する。当該蛍光に基づき、標的核酸の塩基情報を取得できる。
【００４１】
また、実施形態に係る核酸分析用デバイスによれば、反応スポット上における塩基伸長反応をもれなく観察でき、実施形態に係る核酸分析用デバイスを希少な又は唯一のDNA断片を標的核酸とする単分子DNAシーケンシングに適用することができる。さらに、実施形態に係る核酸分析用デバイスによれば、リアルタイム方式で標的核酸の塩基伸長反応を行い、塩基配列情報を取得することもできる。
【００４２】
以下、本発明を実施するための好適な実施形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、各実施形態は、本発明に関わる物や方法の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
【００４３】
〔実施形態１〕
本実施形態では、プラズモン共鳴を応用した単分子核酸分析装置における核酸分析用デバイス及び検出光学系の一例を説明する。
【００４４】
図１に、実施形態の一例を示す。核酸分析用デバイス101は、石英、シリコン等の材質を基板として用いることで作製される。当該材質から成る基板上に、金属構造体102が複数の核酸計測領域に分割され、生成される。当該構造体には、金、銀、アルミニウムや合金等の材質が用いられる。また、当該構造体の形状は、様々な形状であって良く、例えばビーズ形、コーン形等が挙げられる。金属構造体の高さは、例えばおよそ数十〜数百nm程度である。また、金属構造体上に塩基伸長反応を行う際のターゲットDNA分子(標的核酸)をタンパク質結合その他の方法で固定化する。
【００４５】
また、塩基配列解読を行うための核酸分析用デバイスを備える装置の例を図２に示す。図２に示す装置は、単分子DNAシーケンサーの一例であり、分析装置220と解析用コンピュータ208とから成る。分析装置220では、核酸分析用デバイス101における反応を2次元センサーカメラ207で観測する。核酸分析用デバイス101への試薬の供給は、試薬保管ユニット202内の各容器に格納された試薬を分注ユニット203によって分注し、送液チューブ204によって行う。また供給した試薬は、反応を進行させるのに最適な温度となるように、温度制御ユニット201により適切に温度調整される。反応が完了した後の廃液は、廃液チューブ205を経由し、廃液容器206へ廃棄される。
【００４６】
図２に示す装置において、例えばエバネッセント光による計測が行われる場合には、全反射プリズム103に光学的に結合され、且つ励起光レーザー104による全反射照明により核酸分析用デバイスを照明に供する。励起光レーザー104は、計測する一瞬のみ1つの核酸計測領域のみを照明する。励起光照射領域105では、基板上面側の屈折率境界平面上で全反射が起こり、この際、およそ入射光の1波長程度までの高さだけ低媒質側の内部に電磁波が浸透する。これにより、金属構造体102を含めた極々限られた領域のみが照明される。当該領域を「エバネッセント場」と呼ぶ。
【００４７】
また、核酸分析用デバイス上で塩基伸長反応を進行させると、金属構造体102上に固定化したターゲットDNA分子により取り込まれた蛍光を計測できる。当該蛍光を、蛍光波長のみを透過する光学フィルターである蛍光波長フィルター108及び結像レンズ107並びに検出器106から成る光学検出系により2次元画像として捉える。
【００４８】
本実施形態は、金属構造体102の配置が核酸計測領域109毎に分割されている点を最も特徴とする。当該核酸計測領域109は、励起光照射領域105で特定の核酸計測領域を照明した際に、他の核酸計測領域へ影響を与えない程度の間隔をもって配置されている。本実施形態では、レーザー照射方向については300μm、レーザー照射と直角方向では100μmの間隔をもって核酸計測領域を配置する。なお、当該距離は、使用するレーザーの照射強度分布が観察しようとする蛍光色素を励起するのに十分で、且つ近隣の計測視野に影響を及ぼさない間隔を保つように設定する。
【００４９】
以上に説明する構成を有する図２に示す装置において、核酸分析用デバイス101上へ蛍光分子で標識されたプライマーを溶液交換によって一定濃度になるように導入すると、単一の当該蛍光標識プライマー分子は、金属構造体102に固定化した相補関係にあるターゲットDNA分子のみにハイブリダイズする。この際、蛍光分子はエバネッセント場に存在するため、エバネッセント光により励起され蛍光を発する。当該蛍光は、金属構造体102により増強され、蛍光波長フィルター108及び結像レンズ107を通じて、検出器106により2次元画像として捉えられる。
【００５０】
次に、核酸分析用デバイスにおける他の核酸計測領域を計測する様子を図３に示す。図３は、図１と比較し、検出器106が次の核酸計測領域を捉えるように、核酸分析用デバイス101を移動した後の様子を示す。核酸分析用デバイス101の移動は、当該デバイスをX-Y電動ステージ等により保持し、自動制御可能とすることが望ましい。核酸分析用デバイスを移動することで、新たな励起光照射領域301へ視野が切り替えられ、当該デバイスを取り外すことなく、計測する核酸計測領域を移動することができる。
【００５１】
以上に説明するように、核酸分析用デバイスを用いて、各核酸計測領域を順次計測する方式を用いることにより、計測不可能な領域にある金属構造体を排除し、且つ計測時のみ照明光が照射される方式とすることができる。
【００５２】
さらに、移動と計測とを繰り返すことで、核酸分析用デバイス101上の全ての核酸計測領域を計測する。全ての計測が完了した段階で、1塩基伸長に対する計測が完了する。以降、プライマー内のdNTP種をA、C、G、Tと順番に違え、当該プライマーを含む溶液を核酸分析用デバイスに供し、その都度、全ての核酸計測領域の計測と移動とを繰り返すことで、塩基伸長反応を進め、ターゲットDNA分子の塩基配列の解読を進める。
【００５３】
〔実施形態２〕
本実施形態では、複数種類の試料を測定する実施形態を説明する。
【００５４】
図４は、核酸分析用デバイスにおいて試薬流路を有する構造例を示す。
【００５５】
図４に示す試薬流路付き核酸分析用デバイス401は、注入口402及び吐出口405を両端に有する試薬流路403を有する。また、当該試薬流路の両端の間に核酸計測領域404を配置する。
【００５６】
試薬流路403内の核酸計測領域404の領域を、上述の非特許文献２あるいは非特許文献３に示されるような特異的吸着を促す方法(すなわち、PLL-g-PEGを用いた方法)に準じて、ターゲットDNA分子が吸着する表面処理に供する。あるいは、核酸計測領域404以外の領域に対し、ターゲットDNA分子が吸着しないように化学的、光化学的若しくは電磁気的非特異吸着防止処理又は物理的な基板表面改変処理を施す手法を用いても良い。
【００５７】
本実施形態では、核酸分析用デバイス401に対し、注入口402より特異的吸着のためのリンカーを有するターゲットDNA分子を含む試薬を注入する。ターゲットDNA分子は前記表面処理により核酸計測領域404にのみ特異的に吸着する。十分な量のターゲットDNA分子が固定化された後、注入口402より洗浄液を注入し、試薬を排出する。さらに、蛍光分子で標識されたプライマーを、溶液交換によって一定濃度になるように注入口402より導入すると、単一の当該蛍光標識プライマー分子は相補関係にあるターゲットDNA分子のみにハイブリダイズする。十分なハイブリダイゼーションが行われた後、注入口402より洗浄液を注入し、プライマーを排出する。
【００５８】
次いで、励起光406を各核酸計測領域に対して照射し、蛍光を計測する。計測が完了した後、蛍光が十分に退色する程度の励起光を照射し、計測領域内の蛍光を消光させる。全ての計測領域の計測が完了した段階で、1塩基伸長に対する計測が完了する。以降、プライマー内のdNTP種をA、C、G、Tと順番に違え、当該プライマーを含む溶液を核酸分析用デバイスに供し、その都度、全ての核酸計測領域の計測と移動とを繰り返すことで、塩基伸長反応を進め、ターゲットDNA分子の塩基配列の解読を進める。
【００５９】
本実施形態のように、核酸分析用デバイスが試薬流路を有することで、当該デバイス全体を交換することなく、例えば、図４に示すように試薬流路403/試薬流路407/試薬流路408/試薬流路409等の試薬流路別に異なった試料を複数分析することが可能となる。あるいは、これらの試薬流路のうち任意の試薬流路を用いて反応及び観察を行った後、一時使用を中断し、後に未使用の試薬流路を使用して、計測を再開することが可能である。この場合、使用済みの試薬流路を判別できるように非可逆なマーキングを施しておき、再開の際には未使用の領域を区別できるような仕組みを有することが望ましい。
【００６０】
さらに、本実施形態の特徴としては、前処理・後処理が必要となる反応を行う場合に、観察を行っていない試薬流路を利用し、当該処理を進めることが可能である点が挙げられる。当該態様として、複数の試薬流路での並行処理ステップの例を図５に示す。
【００６１】
図５は、塩基伸長反応の繰り返し処理の際に、図４に示す試薬流路403及び407を利用し、且つ各試薬流路に含まれる6つの計測視野(核酸測定領域404)を順次計測する例を示す。
【００６２】
先ず、ステップ1では、試薬流路403において、プライマー導入を行う。プライマー導入処理中、計測や退色を行うことができない。プライマー導入が完了すると、次にステップ2として計測視野1における計測を開始する。一方、試薬流路407では、計測や退色の処理を行っていないため、試薬流路403と独立してプライマー導入処理を行うことができる。
【００６３】
さらに、ステップ3では、試薬流路403において、計測視野2を計測に供しつつ、計測視野1において、退色を行う。この間も、試薬流路407では、プライマー導入処理を継続することができる。このようにして、試薬流路403においてステップ2〜7の処理を進め、これと並行して試薬流路407ではプライマー導入処理を行うことができる。試薬流路403における計測視野6の計測が完了した後には、ステップ8として、引き続いて試薬流路407の計測視野1における計測と同時に試薬流路403の計測視野6における退色とを行う。これにより、試薬流路403の一塩基伸長分の計測視野全ての計測が完了する。
【００６４】
ステップ9からは、次のdNTP種を含むプライマーの導入を開始する。この間も、ステップ9〜12として試薬流路407における計測と退色を進めることができる。
【００６５】
以上のようなステップにより、プライマー導入のための時間を短縮することができ、より高スループットに塩基配列解読を進めることができる。
【００６６】
〔実施形態３〕
本実施形態では、核酸分析用デバイスにおける核酸計測領域の配置の他の例を説明する。
【００６７】
図６は、円形の核酸計測領域を配置した核酸分析用デバイスの例を示す。
【００６８】
正方形又は長方形の核酸計測領域において反応を計測する光学系では、光学系の性能によっては周辺部の分解能が十分でない場合がある。このような場合においては、核酸計測領域を円形とし、性能が低下する周辺部位を除外して観察することにより、より高品質な観察結果を得ることができる場合がある。
【００６９】
本実施形態では、図６に示すように、核酸計測領域601を円形とし、また核酸計測領域の各列が段違いに交互に配置されている。このような配置によれば、視野配置の際の密度を向上させることができる。
【００７０】
図６に示す核酸分析用デバイスによれば、レーザー光を照射した際の励起光照射領域602は、前後の核酸計測領域と重ならない。また、核酸計測領域を縦横に整列した場合と比較して、より高密度に核酸計測領域を配置することができる。本実施形態における核酸分析用デバイスは、試薬流路603及び注入口604を有し、実施形態１と同様の使用方法により塩基伸長反応の計測が可能である。
【００７１】
〔実施形態４〕
本実施形態は、実施形態１に示す単分子核酸分析装置において、連続的にdNTP分子がプライマー分子の伸長鎖に取り込まれ続ける、リアルタイム伸長反応系の実施形態を示す。非特許文献４に記載のリアルタイムDNA配列決定分析では、4種類のヌクレオチドに各々異なる蛍光色素を有するものを供給し、洗浄することなく、連続的な核酸伸長反応を起こす。蛍光色素がリン酸部位に付いたヌクレオチドを用いると、伸長反応後リン酸部位が切断されるため、消光することなく連続的に蛍光測定できる。これを連続的に蛍光観察することで、いわゆるリアルタイム反応方式を実現することができる。また、本出願人が出願した特願2009-266920において、リアルタイム単一分子シークエンス反応プロトコルを、より具体的に述べている。これらの方法では、必要な試薬の導入と同時に塩基伸長反応が進むため、視野ごとに送液を制御するか、あるいは1回の測定が終わったら、次の基板をセットする必要がある。
【００７２】
このようなケースにおいては、局所的に塩基伸長反応の開始を制御する方法として、例えば特許文献２に示すような、プローブの3'位置に光照射で切断可能な保護基を配置する方法がある。特許文献２では、保護基としてオリゴプローブ側の3'位置にケージド化合物を配置し、UV光照射により保護基を切断することでリアルタイム塩基伸長反応を開始する。この方法を用いることで、UV光照射が行われない段階では塩基伸長反応が抑止され、UV光照射により反応を開始することができる。
【００７３】
光照射により塩基伸長が開始する反応系では、観察視野(計測視野)範囲にのみ照明を照射し、それ以外の部分への漏れ光を抑制する必要がある。このような目的に対し、実施形態に係る核酸分析用デバイスが有効である。
【００７４】
図７に、リアルタイム塩基伸長反応の一般的な手順を示す。図７は、非特許文献４で示されているリアルタイム塩基伸長反応に、前述した光照射で切断可能な保護基を配置した場合の手順である。以下、図７の各ステップを説明する。
【００７５】
テンプレートDNAの核酸分析用デバイスへの固定ステップ711では、鋳型DNA、プライマー及び酵素を核酸分析用デバイス上へ固定する。固定方法については、ビオチン-アビジン結合やチオール-金の化学結合等が利用できる。また、ビーズ、あるいは金属構造体等を予め基板上に規則的に配置し、そこへ鋳型DNAを固定する技術が実用化されているのは背景技術で述べた通りである。
【００７６】
核酸分析用デバイスの装置へのセットステップ712では、前記処理を行った核酸分析用デバイスを、例えば実施形態１で示したようなエバネッセント光を励起光として蛍光観察できる装置へセットする。この時点で送液系の接続や観察光学系の焦点調整等を済ませておく。
【００７７】
反応試薬供給ステップ713は、核酸分析用デバイスの流路へ反応試薬を送液するステップである。このステップにより、蛍光標識されたdNTPを流して、塩基の伸長反応を開始する。ここで用いるdNTPは、末端のリン酸にホスホリンクヌクレオチドをつけることで、酵素が塩基を取り込む過程で蛍光色素を切り離す構造となっている。光照射により、反応開始抑制のために取り付けられた保護基が切断されれば、連続的に塩基伸長反応が行われ、塩基が取り込まれる毎に当該ヌクレオチドを標識する蛍光が検出される。
【００７８】
次観察視野(計測視野)への移動ステップ714は、複数の観察視野を有する核酸分析用デバイス上の観察視野を順次移動していく手順である。視野の移動には、核酸分析用デバイスをXYステージで移動する方法、又は観察光学系を移動する方法がある。視野の移動に伴い、光学系焦点の再調整が必要となる場合がある。
【００７９】
次いで、反応開始及び塩基伸長反応観察ステップ715を行う。保護基切断のための光を照射すると、リアルタイム塩基伸長反応が開始する。リアルタイム塩基伸長反応の蛍光信号を連続的に観察し、塩基配列情報を収集する。1回のリアルタイム塩基伸長シークエンスが終了するまでは視野を固定する必要がある。1回あたりに要するシークエンス時間は、酵素活性が失われるまでの時間から0〜60分程度と想定される。
【００８０】
酵素活性が失われ、伸長反応の観察が困難となれば、全視野完了？の判定ステップ716を行う。全ての視野の観察が完了するまで、次観察視野への移動ステップ714から、全視野完了？の判定ステップ716を繰り返し、リアルタイム塩基伸長反応と観察を繰り返す。
【００８１】
全視野の観察が完了した後、核酸分析用デバイス洗浄ステップ717を行い、核酸分析用デバイス内に残存する試薬等を排出する。処理完了後、核酸分析用デバイス取出しステップ718を行う。
【００８２】
図８に示すような、一連の反応スポット群805を有する核酸分析用デバイスで図７の手順を行った場合、反応開始抑制のために取り付けられた保護基を切断するための光照射が視野以外に漏れた場合、不要な塩基伸長反応を引き起こす。この様子を図８に示す。反応スポット群805を配置した核酸分析用デバイス801に、太実線で示した流路802を配置した例を示している。試薬はインレット803から送液し、矢印方向に流れ、アウトレット804から吐出される。図７に示す反応開始及び塩基伸長反応観察ステップ715では、例えば図８に示す円形状の照野806により照明された領域のうち、破線で示した観察視野807を観察する。観察視野807からはみ出した照野は、観察外の領域のリアルタイム塩基伸長反応を進める。この後、全視野完了？の判定ステップ716を経て、次観察視野への移動ステップ714で隣接する領域へ移動した場合、はみ出した照野により既に反応済みの反応スポットでは、リアルタイム塩基伸長反応が観察されないこととなる。
【００８３】
図９は、実施形態に係る核酸分析用デバイスである。反応スポット群901は、破線で示した観察視野902と同一か、やや広い寸法に区分されている。また円形で示した照野903は少なくとも観察対象の反応スポット群901を全て照明する寸法である。反応スポット群の互いの間隔は、照野903がある反応スポット群901を照明したとき、他の反応スポット群を照明しない距離に規定されている。このため照野903は反応スポット群901の領域から一部はみ出すが、反応スポット群901が視野毎に分割されているため、他の反応スポット群に影響を与えない。
【００８４】
なお、照明光にレーザーを用いる場合において、レーザーホモジナイザー技術により、レーザー光照野を長方形あるいは正方形とすることが可能である。この場合には、照野が近隣の視野に影響を与えない範囲で反応スポット群901の間隔を狭めることが可能である。
【００８５】
〔実施形態５〕
実施形態４におけるリアルタイム塩基伸長反応では、光照射で切断可能な保護基を配置することで、反応開始を制御する例を示した。一方で、当該保護基を使用しない反応系では、蛍光分子で標識したプライマーを含む溶液を導入すると同時に反応が開始する。このような反応系では、観察していない反応スポット上でもリアルタイム塩基伸長反応が進行するため、実施形態４に示す流路で使用することができない。溶液導入と同時に反応が進行する反応系では、送液方法の工夫により反応開始を制御する必要がある。このような場合においても、実施形態に係る核酸分析用デバイスが有効である。
【００８６】
図１０は、溶液導入量の制御により、所定の視野までに限定して送液することで、リアルタイム塩基伸長反応を制御するように、実施形態４を改良した例である。核酸分析用デバイスは、初期状態では乾燥状態、あるいはバッファー液を充填した状態である。導入した試薬溶液は、その導入量を制御することにより、所定の反応スポット群1004まで送液される。試薬溶液流域1001は、核酸分析用デバイス上が乾燥状態である場合は、流路内の濡れ性等により、凹型又は凸型に流路内を進行する。またバッファー液が充填されている場合には、試薬溶液がバッファー液と混合しないよう、若干の空気層を配置した後試薬溶液を導入する。図１０では凸型に流路内を進行した例である。流路内を試薬溶液が進行し、反応スポット群1004に到達した場合、直ちにリアルタイム反応が開始する。このため、予め照野1003の範囲に蛍光励起光を照射し、観察視野1002の領域の観察を開始した後、試薬溶液を送液し反応スポット群1004に液端を進行させるのが望ましい。図８に示したような、反応スポット群が一連となっている核酸分析用デバイスで、溶液導入量の制御による反応制御を行った場合、観察視野807以外の反応スポットでもリアルタイム伸長反応が進行し、導入した試薬のdNTPを消費する。これに対し、図１０に示した核酸分析用デバイスでは、反応スポット群1004以外では試薬溶液が到達せずリアルタイム伸長反応が起こらないため、反応スポット群を試薬溶液湿潤のバラつきを考慮し十分な間隔をもち配置することで、意図しないリアルタイム伸長反応を抑止することができる。この場合、反応スポット群の互いの間隔は、照野1003が反応スポット群1004を照明したとき、他の反応スポット群を照明しない距離で、且つ試薬溶液湿潤のバラつきにより、近隣の反応スポット群に試薬溶液が接触しない距離に規定される。
【００８７】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
2010137543.tif 000004
【図２】
2010137543.tif 000005
【図３】
2010137543.tif 000006
【図４】
2010137543.tif 000007
【図５】
2010137543.tif 000008
【図６】
2010137543.tif 000009
【図７】
2010137543.tif 000010
【図８】
2010137543.tif 000011
【図９】
2010137543.tif 000012
【図１０】
2010137543.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成22年10月27日(2010.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
標的核酸が固定化された基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出するための核酸分析用デバイスであって、
標的核酸が固定化され、且つ核酸分析のための反応が行われ、個々に識別し計測されうる反応スポット領域が複数設けられた核酸計測領域と、
反応スポット領域を有しない余白部分とを有し、
複数の核酸計測領域と複数の余白部分が交互に配置され、
核酸計測領域毎に蛍光検出されることを特徴とする、前記核酸分析用デバイス。
【請求項１９】
標的核酸が固定化された基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出するための核酸分析用デバイスであって、
標的核酸が固定化され、且つ核酸分析のための反応が行われ、個々に識別し計測されうる反応スポット領域が複数設けられた核酸計測領域と、
反応スポット領域を有しない余白部分とを有し、
試薬流路上に複数の核酸計測領域と複数の余白部分が交互に配置され、
核酸計測領域毎に蛍光検出されることを特徴とする、前記核酸分析用デバイス。
【請求項２０】
標的核酸が固定化された基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出するための核酸分析用デバイスであって、
標的核酸が固定化され、且つ核酸分析のための反応が行われ、個々に識別し計測されうる反応スポット領域が複数設けられた核酸計測領域と、
反応スポット領域を有しない余白部分とを有し、
該個々の反応スポット領域において単一標的核酸分子が固定化され、
複数の核酸計測領域と複数の余白部分が交互に配置され、
核酸計測領域毎に蛍光検出されることを特徴とする、前記核酸分析用デバイス。
【請求項２１】
前記個々の反応スポット領域において単一標的核酸分子が固定化されることを特徴とする、請求項１８又は１９記載の核酸分析用デバイス。
【請求項２２】
前記個々の反応スポット領域において同一種の複数の標的核酸分子が固定化されることを特徴とする、請求項１８又は１９記載の核酸分析用デバイス。
【請求項２３】
核酸計測領域の大きさが２次元検出器の計測視野と実質的に同一であることを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか１項記載の核酸分析用デバイス。
【請求項２４】
任意の１つの核酸計測領域を照明する光が、近隣の核酸計測領域を実質的に照明しないことを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか１項記載の核酸分析用デバイス。
【請求項２５】
核酸分析に必要な照明強度を与える照明光照射領域の大きさが、核酸計測領域より大きいことを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか１項記載の核酸分析用デバイス。
【請求項２６】
照明する光がレーザ光であることを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか１項記載の核酸分析用デバイス。
【請求項２７】
照明する光がレーザ光であり、ホモジナイザにより、照明光の形状が核酸計測領域とほぼ同じに整形することを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか１項記載の核酸分析用デバイス。
【請求項２８】
核酸計測領域の長辺又は最大径が５０μｍ〜１０ｍｍであることを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか１項記載の核酸分析用デバイス。
【請求項２９】
隣り合う核酸計測領域の間が１μｍ〜１０ｍｍであることを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか１項記載の核酸分析用デバイス。
【請求項３０】
核酸計測領域の幅と余白部分の幅が実質的に同じであることを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか１項記載の核酸分析用デバイス。
【請求項３１】
反応スポット領域に核酸伸長反応を阻害する光分解性物質を有する核酸プローブが配置されることを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか１項記載の核酸分析用デバイス。
【請求項３２】
標的核酸が固定化された基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出するための核酸分析装置であって、
標的核酸が固定化され、且つ核酸分析のための反応が行われ、個々に識別し計測されうる反応スポット領域が複数設けられた核酸計測領域と、反応スポット領域を有しない余白部分とを有し、複数の核酸計測領域と複数の余白部分が交互に配置されている核酸分析用デバイスと、
光励起用の光源と、
核酸計測領域毎に光照射し、蛍光を検出する光学検出系と、
結像された光を各々検出するための複数の検出画素を備えた検出器、
を具備する、前記核酸分析装置。
【請求項３３】
標的核酸が固定化された基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出するための核酸分析装置であって、
標的核酸が固定化され、且つ核酸分析のための反応が行われ、個々に識別し計測されうる反応スポット領域が複数設けられた核酸計測領域と、反応スポット領域を有しない余白部分とを有し、少なくとも１本の試薬流路上に複数の核酸計測領域と複数の余白部分が交互に配置されている核酸分析用デバイスと、
光励起用の光源と、
核酸計測領域毎に光照射し、蛍光を検出する光学検出系と、
結像された光を各々検出するための複数の検出画素を備えた検出器、
を具備する、前記核酸分析装置。
【請求項３４】
標的核酸が固定化された基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出するための核酸分析装置であって、
単一標的核酸分子が固定化され、且つ核酸分析のための反応が行われ、個々に識別し計測されうる反応スポット領域が複数設けられた核酸計測領域と、反応スポット領域を有しない余白部分とを有し、複数の核酸計測領域と複数の余白部分が交互に配置されている核酸分析用デバイスと、
光励起用の光源と、
核酸計測領域毎に光照射し、蛍光を検出する光学検出系と、
結像された光を各々検出するための複数の検出画素を備えた検出器、
を具備する、前記核酸分析装置。
【請求項３５】
標的核酸が固定化された基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出するための核酸分析装置であって、
標的核酸が固定化され、且つ核酸分析のための反応が行われ、個々に識別し計測されうる反応スポット領域が複数設けられた核酸計測領域と、反応スポット領域を有しない余白部分とを有し、少なくとも１本の試薬流路上に複数の核酸計測領域と複数の余白部分が交互に配置されている核酸分析用デバイスと、
前記流路に反応液を給する送液機構部と、
光励起用の光源と、
核酸計測領域毎に光照射し、蛍光を検出する光学検出系と、
結像された光を各々検出するための複数の検出画素を備えた検出器、
を具備する、前記核酸分析装置。
【手続補正書】
【提出日】平成23年11月24日(2011.11.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸が固定化された基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、2次元検出器に結像させ、2次元検出器にて蛍光検出するための核酸分析用デバイスであって、
標的核酸が固定化され、且つ核酸分析のための反応が行われ、個々に識別し計測されうる反応スポット領域が複数設けられた核酸計測領域と、
反応スポット領域を有しない余白部分とを有し、
複数の核酸計測領域と複数の余白部分が交互に配置され、
核酸計測領域毎に蛍光検出されることを特徴とする、前記核酸分析用デバイス。
【請求項２】
標的核酸が固定化された基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、2次元検出器に結像させ、2次元検出器にて蛍光検出するための核酸分析用デバイスであって、
標的核酸が固定化され、且つ核酸分析のための反応が行われ、個々に識別し計測されうる反応スポット領域が複数設けられた核酸計測領域と、
反応スポット領域を有しない余白部分とを有し、
試薬流路上に複数の核酸計測領域と複数の余白部分が交互に配置され、
核酸計測領域毎に蛍光検出されることを特徴とする、前記核酸分析用デバイス。
【請求項３】
標的核酸が固定化された基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、2次元検出器に結像させ、2次元検出器にて蛍光検出するための核酸分析用デバイスであって、
標的核酸が固定化され、且つ核酸分析のための反応が行われ、個々に識別し計測されうる反応スポット領域が複数設けられた核酸計測領域と、
反応スポット領域を有しない余白部分とを有し、
該個々の反応スポット領域において単一標的核酸分子が固定化され、
複数の核酸計測領域と複数の余白部分が交互に配置され、
核酸計測領域毎に蛍光検出されることを特徴とする、前記核酸分析用デバイス。
【請求項４】
前記個々の反応スポット領域において単一標的核酸分子が固定化されることを特徴とする、請求項１又は２記載の核酸分析用デバイス。
【請求項５】
前記個々の反応スポット領域において同一種の複数の標的核酸分子が固定化されることを特徴とする、請求項１又は２記載の核酸分析用デバイス。
【請求項６】
核酸計測領域の大きさが2次元検出器の計測視野と実質的に同一であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分析用デバイス。
【請求項７】
任意の1つの核酸計測領域を照明する光が、近隣の核酸計測領域を実質的に照明しないことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分析用デバイス。
【請求項８】
核酸分析に必要な照明強度を与える照明光照射領域の大きさが、核酸計測領域より大きいことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分析用デバイス。
【請求項９】
照明する光がレーザ光であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分析用デバイス。
【請求項１０】
照明する光がレーザ光であり、ホモジナイザにより、照明光の形状が核酸計測領域とほぼ同じに整形することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分析用デバイス。
【請求項１１】
核酸計測領域の長辺又は最大径が50μm〜10mmであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分析用デバイス。
【請求項１２】
隣り合う核酸計測領域の間が1μm〜10mmであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分析用デバイス。
【請求項１３】
核酸計測領域の幅と余白部分の幅が実質的に同じであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分析用デバイス。
【請求項１４】
反応スポット領域に核酸伸長反応を阻害する光分解性物質を有する核酸プローブが配置されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分析用デバイス。
【請求項１５】
標的核酸が固定化された基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、2次元検出器に結像させ、2次元検出器にて蛍光検出するための核酸分析装置であって、
標的核酸が固定化され、且つ核酸分析のための反応が行われ、個々に識別し計測されうる反応スポット領域が複数設けられた核酸計測領域と、反応スポット領域を有しない余白部分とを有し、複数の核酸計測領域と複数の余白部分が交互に配置されている核酸分析用デバイスと、
光励起用の光源と、
核酸計測領域毎に光照射し、蛍光を検出する光学検出系と、
結像された光を各々検出するための複数の検出画素を備えた検出器、
を具備する、前記核酸分析装置。
【請求項１６】
標的核酸が固定化された基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、2次元検出器に結像させ、2次元検出器にて蛍光検出するための核酸分析装置であって、
標的核酸が固定化され、且つ核酸分析のための反応が行われ、個々に識別し計測されうる反応スポット領域が複数設けられた核酸計測領域と、反応スポット領域を有しない余白部分とを有し、少なくとも1本の試薬流路上に複数の核酸計測領域と複数の余白部分が交互に配置されている核酸分析用デバイスと、
光励起用の光源と、
核酸計測領域毎に光照射し、蛍光を検出する光学検出系と、
結像された光を各々検出するための複数の検出画素を備えた検出器、
を具備する、前記核酸分析装置。
【請求項１７】
標的核酸が固定化された基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、2次元検出器に結像させ、2次元検出器にて蛍光検出するための核酸分析装置であって、
単一標的核酸分子が固定化され、且つ核酸分析のための反応が行われ、個々に識別し計測されうる反応スポット領域が複数設けられた核酸計測領域と、反応スポット領域を有しない余白部分とを有し、複数の核酸計測領域と複数の余白部分が交互に配置されている核酸分析用デバイスと、
光励起用の光源と、
核酸計測領域毎に光照射し、蛍光を検出する光学検出系と、
結像された光を各々検出するための複数の検出画素を備えた検出器、
を具備する、前記核酸分析装置。
【請求項１８】
標的核酸が固定化された基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を集光し、2次元検出器に結像させ、2次元検出器にて蛍光検出するための核酸分析装置であって、
標的核酸が固定化され、且つ核酸分析のための反応が行われ、個々に識別し計測されうる反応スポット領域が複数設けられた核酸計測領域と、反応スポット領域を有しない余白部分とを有し、少なくとも1本の試薬流路上に複数の核酸計測領域と複数の余白部分が交互に配置されている核酸分析用デバイスと、
前記流路に反応液を給する送液機構部と、
光励起用の光源と、
核酸計測領域毎に光照射し、蛍光を検出する光学検出系と、
結像された光を各々検出するための複数の検出画素を備えた検出器、
を具備する、前記核酸分析装置。
【国際調査報告】
2010137543.tif 000014
2010137543.tif 000015
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