(57)【要約】  オーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤は、ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤を含有する。オーキシンデグロンシステムのキットは、前記オーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤と、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質をコードする第二の核酸と、を備える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤を含有するオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤。
【請求項２】
前記ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤が、インドール−３−酢酸誘導体である請求項１に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤。
【請求項３】
前記ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤が、下記一般式（Ｉ）で示される化合物である請求項１又は２に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤。
【化１】
2019107109.tif 000021
（一般式（Ｉ）中、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４は、それぞれ独立に、ＣＨ又は窒素原子である。Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４が窒素原子である場合、ｎ１１は０である。Ｒ１１は、ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｒ１２及びＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｒ１３は、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｙ１１は、単結合、又は、エステル結合、エーテル結合、アミド結合及びカルボニル基からなる群から選択される１種以上を含んでもよい炭素数１〜１０のアルキレン基である。ｎ１１は０〜４の整数であり、ｎ１１が２〜４の整数である場合、ｎ１１個のＲ１１は互いに同一でも異なっていてもよい。Ａｒは置換基を有してもよいアリール基である。）
【請求項４】
前記ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤が、下記一般式（Ｉ−１）で示される化合物である請求項１〜３のいずれか一項に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤。
【化２】
2019107109.tif 000022
（一般式（Ｉ−１）中、Ｒ１２及びＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｒ１１及びＲ１５は、それぞれ独立に、ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。ｎ１１は、０〜４の整数であり、ｎ１１が２〜４の整数である場合、ｎ１１個のＲ１１は互いに同一でも異なっていてもよい。ｎ１２は、０〜５の整数であり、ｎ１２が２〜５の整数である場合、ｎ１２個のＲ１５は互いに同一でも異なっていてもよい。）
【請求項５】
前記ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤が、下記一般式（Ｉ−２）で示される化合物である請求項１〜４のいずれか一項に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤。
【化３】
2019107109.tif 000023
（一般式（Ｉ−２）中、Ｒ１４は、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基である。Ｒ１５ａ及びＲ１５ｂは、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１〜６のアルキル基である。）
【請求項６】
前記ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤が、下記式（Ｉ−１−１）〜（Ｉ−１−８）のいずれかで示される化合物である請求項１〜４のいずれか一項に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤。
【化４】
2019107109.tif 000024
【請求項７】
前記ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤が、前記式（Ｉ−１−２）、（Ｉ−１−４）、又は（Ｉ−１−６）で示される化合物である請求項６に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤と、
ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、
Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質をコードする第二の核酸と、
を備えるオーキシンデグロンシステムのキット。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤と、
ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸、並びに、目的タンパク質をコードする第三の核酸及び前記第三の核酸の上流又は下流に連結されたＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質をコードする第二の核酸を含む真核細胞と、
を備えるオーキシンデグロンシステムのキット。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤を用いた目的タンパク質分解制御方法。
【請求項１１】
ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸、及び前記第一の核酸の５’末端に、作動可能に連結されているテトラサイクリン誘導性プロモーターと、
目的タンパク質及びＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質を含む融合タンパク質をコードする第四の核酸と、を含む真核細胞を含む第一の培養物に、請求項１〜７のいずれか一項に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤、及びテトラサイクリンを添加して、前記ＴＩＲ１ファミリータンパク質、及び前記融合タンパク質を発現した真核細胞を含む第二の培養物を得る工程と、
前記第二の培養物から、前記タンパク質分解阻害剤を除去し、オーキシン類を添加し、前記目的タンパク質を分解させた第三の培養物を得る工程と、
を有する目的タンパク質分解制御方法。
【請求項１２】
ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸、及び前記第一の核酸の５’末端に、作動可能に連結されているプロモーターと、
目的タンパク質及びＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質を含む融合タンパク質をコードする第四の核酸と、を含み、前記ＴＩＲ１ファミリータンパク質、及び前記融合タンパク質を発現している真核細胞を含む第一の培養物に、オーキシン類を添加し、前記目的タンパク質を分解させた第二の培養物を得る工程と、
前記第二の培養物から、前記オーキシン類を除去し、請求項１〜７のいずれか一項に記載のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤を添加し、前記目的タンパク質を発現させた第三の培養物を得る工程と、
を有する目的タンパク質分解制御方法。
【請求項１３】
下記一般式（Ｉ）で示される化合物。
【化５】
2019107109.tif 000025
（一般式（Ｉ）中、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４は、それぞれ独立に、ＣＨ又は窒素原子である。Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４が窒素原子である場合、ｎ１１は０である。Ｒ１１は、ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｒ１２及びＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｒ１３は、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｙ１１は、単結合、又は、エステル結合、エーテル結合、アミド結合及びカルボニル基からなる群から選択される１種以上を含んでもよい炭素数１〜１０のアルキレン基である。ｎ１１は０〜４の整数であり、ｎ１１が２〜４の整数である場合、ｎ１１個のＲ１１は互いに同一でも異なっていてもよい。Ａｒは置換基を有してもよいアリール基である。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤及びその使用に関する。具体的には、本発明は、オーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤、前記オーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤を備えるオーキシンデグロンシステムのキット、前記オーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤を用いた目的タンパク質分解制御方法、及び、化合物に関する。
本願は、２０１７年１１月２８日に、日本に出願された特願２０１７−２２８３１０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らはこれまでに、オーキシンデグロンシステムと呼ばれるタンパク質の分解制御技術の開発を行ってきた（例えば、特許文献１〜３参照）。このシステムでは、まず、オーキシン応答性ユビキチンリガーゼを構成するＴＩＲ１を、酵母や動物細胞等の真核生物由来の細胞に導入する。次いで、オーキシンの添加の有無やタイミングを調整することで、分解誘導ペプチド（植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質又はその部分タンパク質）により標識された目的タンパク質の分解を制御する。【０００３】
また、本発明者らはこれまでに、ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤としてオーキシン（主に、インドール−３−酢酸（ｉｎｄｏｌｅ−３−ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ；ＩＡＡ））誘導体を分子設計し、植物細胞における当該ＩＡＡ誘導体のＴＩＲ１及びＡＵＸ／ＩＡＡに対する分子作用機構を明らかにした（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−１８７９５８号公報
【特許文献２】国際公開第２０１０／１２５６２０号
【特許文献３】国際公開第２０１３／０７３６５３号
【特許文献４】国際公開第９５／０１９４３３号
【特許文献５】米国特許第５１８７２８７号明細書
【特許文献６】米国特許第５８４７１０２号明細書
【特許文献７】米国特許第５２０６１５２号明細書
【特許文献８】米国特許第５１６８０６２号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】林謙一郎ら、「オーキシンの受容と信号伝達の分子機構  ＴＩＲ1オーキシン受容体拮抗剤の分子設計」、化学と生物、Ｖｏｌ．５０、Ｎｏ．１２、ｐ．８７６−８８２、２０１２．
【非特許文献２】Gats C et al., “Stringent repression and homogeneous de-repression by tetracycline of a modified CaMV 35S promoter in intact transgenic tobacco plants.”, Plant J, Vol. 2, Issue 3, p397-404, 1992.
【非特許文献３】Lu B and Federoff HJ, “Herpes Simplex Virus Type 1 Amplicon Vectors with Glucocorticoid-Inducible Gene Expression.”, Hum Gene Ther, Vol. 6, Issue 4, p419-428, 1995.
【非特許文献４】Wagner TE et al., “Microinjection of a rabbit beta-globin gene into zygotes and its subsequent expression in adult mice and their offspring.”, Proc Natl Acad Sci U S A, Vol. 78, No. 10, p6376-6380, 1981.
【非特許文献５】Edlund T at al., “Cell-specific expression of the rat insulin gene: evidence for role of two distinct 5' flanking elements.”, Science, Vol. 230, Issue 4728, p912-916, 1985.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来のオーキシンデグロンシステムでは、オーキシン非存在下においても、ＴＩＲ１を発現させるだけで、分解誘導ペプチドで標識された目的タンパク質が弱い分解を受けるという問題がある。このため、分解対象の目的タンパク質が、生存に必須のタンパク質である場合、細胞株を樹立できない、又は、解析に支障をきたす虞がある。【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、オーキシン非依存的なＴＩＲ１ファミリータンパク質及び分解誘導ペプチドの結合を阻害することができるオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤を提供する。
また、厳密かつ自在にタンパク質の分解制御が可能なオーキシンデグロンシステムのキット及び目的タンパク質分解制御方法を提供する。また、オーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質の分解阻害に有用な新規化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係るオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤は、ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤を含有する。【０００９】
前記ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤がインドール−３−酢酸誘導体であってもよい。【００１０】
前記ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤が下記一般式（Ｉ）で示される化合物であってもよい。【００１１】
【化１】
2019107109.tif 000002
【００１２】
（一般式（Ｉ）中、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４は、それぞれ独立に、ＣＨ又は窒素原子である。Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４が窒素原子である場合、ｎ１１は０である。Ｒ１１は、ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｒ１２及びＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｒ１３は、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｙ１１は、単結合、又は、エステル結合、エーテル結合、アミド結合及びカルボニル基からなる群から選択される１種以上を含んでもよい炭素数１〜１０のアルキレン基である。ｎ１１は０〜４の整数であり、ｎ１１が２〜４の整数である場合、ｎ１１個のＲ１１は互いに同一でも異なっていてもよい。Ａｒは置換基を有してもよいアリール基である。）【００１３】
前記ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤が下記一般式（Ｉ−１）で示される化合物であってもよい。【００１４】
【化２】
2019107109.tif 000003
【００１５】
（一般式（Ｉ−１）中、Ｒ１２及びＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｒ１１及びＲ１５は、それぞれ独立に、ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。ｎ１１は、０〜４の整数であり、ｎ１１が２〜４の整数である場合、ｎ１１個のＲ１１は互いに同一でも異なっていてもよい。ｎ１２は、０〜５の整数であり、ｎ１２が２〜５の整数である場合、ｎ１２個のＲ１５は互いに同一でも異なっていてもよい。）【００１６】
前記ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤が、下記一般式（Ｉ−２）で示される化合物であってもよい。【００１７】
【化３】
2019107109.tif 000004
【００１８】
（一般式（Ｉ−２）中、Ｒ１４は、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基である。Ｒ１５ａ及びＲ１５ｂは、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１〜６のアルキル基である。）【００１９】
前記ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤が、下記式（Ｉ−１−１）〜（Ｉ−１−８）のいずれかで示される化合物であってもよい。【００２０】
【化４】
2019107109.tif 000005
【００２１】
前記ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤が、前記式（Ｉ−１−２）、（Ｉ−１−４）、又は（Ｉ−１−６）で示される化合物であってもよい。【００２２】
本発明の第２態様に係るオーキシンデグロンシステムのキットは、上記第１態様に係るオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤と、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質をコードする第二の核酸と、を備える。【００２３】
本発明の第３態様に係るオーキシンデグロンシステムのキットは、上記第１態様に係るオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤と、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸、並びに、目的タンパク質をコードする第三の核酸及び前記第三の核酸の上流又は下流に連結されたＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質をコードする第二の核酸を含む真核細胞と、を備える。【００２４】
本発明の第４態様に係る目的タンパク質分解制御方法は、上記第１態様に係るオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤を用いた方法である。【００２５】
本発明の第５態様に係る目的タンパク質分解制御方法は、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸、及び前記第一の核酸の５’末端に、作動可能に連結されているテトラサイクリン誘導性プロモーターと、目的タンパク質及びＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質を含む融合タンパク質をコードする第四の核酸と、を含む真核細胞を含む第一の培養物に、上記第１態様に係るオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤、及びテトラサイクリンを添加して、前記ＴＩＲ１ファミリータンパク質、及び前記融合タンパク質を発現した真核細胞を含む第二の培養物を得る工程と、前記第二の培養物から、前記タンパク質分解阻害剤を除去し、オーキシン類を添加し、前記目的タンパク質を分解させた第三の培養物を得る工程と、を有する方法である。【００２６】
本発明の第６態様に係る目的タンパク質分解制御方法は、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸、及び前記第一の核酸の５’末端に、作動可能に連結されているプロモーターと、目的タンパク質及びＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質を含む融合タンパク質をコードする第四の核酸と、を含み、前記ＴＩＲ１ファミリータンパク質、及び前記融合タンパク質を発現している真核細胞を含む第一の培養物に、オーキシン類を添加し、前記目的タンパク質を分解させた第二の培養物を得る工程と、前記第二の培養物から、前記オーキシン類を除去し、上記第１態様に係るオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤を添加し、前記目的タンパク質を発現させた第三の培養物を得る工程と、を有する方法である。【００２７】
本発明の第７態様に係る化合物は、下記一般式（Ｉ）で示される化合物である。【００２８】
【化５】
2019107109.tif 000006
【００２９】
（一般式（Ｉ）中、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４は、それぞれ独立に、ＣＨ又は窒素原子である。Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４が窒素原子である場合、ｎ１１は０である。Ｒ１１は、ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｒ１２及びＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｒ１３は、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｙ１１は、単結合、又は、エステル結合、エーテル結合、アミド結合及びカルボニル基からなる群から選択される１種以上を含んでもよい炭素数１〜１０のアルキレン基である。ｎ１１は０〜４の整数であり、ｎ１１が２〜４の整数である場合、ｎ１１個のＲ１１は互いに同一でも異なっていてもよい。Ａｒは置換基を有してもよいアリール基である。）
【発明の効果】
【００３０】
上記態様のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤によれば、オーキシン非依存的なＴＩＲ１ファミリータンパク質及び分解誘導ペプチドの結合を阻害することができる。
上記態様のオーキシンデグロンシステムのキット及び目的タンパク質分解制御方法によれば、厳密かつ自在にタンパク質の分解制御が可能である。
また、上記態様の化合物は、オーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質の分解阻害に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例１におけるオーキシンデグロンシステムでのタンパク質分解阻害剤候補化合物をＦＡＣＳ解析によりスクリーニングした結果を示すグラフである。
【図２】実施例２におけるオーキシンデグロンシステムでのＡｕｘｉｎｏｌｅのタンパク質分解阻害効果をＦＡＣＳ解析した結果を示すグラフである。
【図３Ａ】参考例１におけるドキシサイクリン（Ｄｏｘ）及びオーキシン（Ａｕｘｉｎ）添加、Ｄｏｘのみ添加、並びに、Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎ未添加のＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞での経時的な細胞数の変化を示すグラフである。
【図３Ｂ】参考例１におけるＤｏｘ添加から４８時間後での、Ｄｏｘのみ添加、並びに、Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎ未添加（Ｃｏｎｔｒｏｌ）のＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞の位相差顕微鏡像である。
【図３Ｃ】参考例１におけるＴｅｔ添加から４２時間後での、Ｔｅｔ及びＡｕｘｉｎ添加、Ｔｅｔのみ添加、並びに、Ｔｅｔ及びＡｕｘｉｎ未添加のＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞を用いたウエスタンブロッティング解析の結果を示す画像である。
【図４】実施例３におけるＤｏｘ添加から２４時間後での、Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎｏｌｅ添加、Ｄｏｘのみ添加、並びに、Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎｏｌｅ未添加（Ｃｏｎｔｒｏｌ）のＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞を観察した画像である。上は、蛍光顕微鏡像である。下は明視野像である。
【図５Ａ】実施例４におけるＤｏｘ添加から４８時間後での、Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎｏｌｅ添加、Ａｕｘｉｎｏｌｅのみ添加、Ｄｏｘのみ添加、並びに、Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎｏｌｅ未添加のＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞を観察した画像である。
【図５Ｂ】実施例４におけるオーキシンデグロンシステムでのＡｕｘｉｎｏｌｅによるＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ融合タンパク質の分解制御をＦＡＣＳ解析した結果を示すグラフである。
【図６】実施例５におけるオーキシンデグロンシステムでのＡｕｘｉｎｏｌｅによるＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ融合タンパク質の発現制御をＦＡＣＳ解析した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
≪オーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤≫
本発明の一実施形態に係るオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤は、ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤を含有する。
【００３３】
ここでいう「オーキシンデグロンシステム」とは、本発明者らが開発したタンパク質の分解制御技術である（例えば、特許文献１〜３参照）。具体的には、まず、オーキシン応答性ユビキチンリガーゼを構成するＴＩＲ１ファミリータンパク質を、酵母や動物細胞等の真核生物由来の細胞に導入する。次いで、オーキシン類の添加によって、任意の時期に、発現した分解誘導ペプチドにより標識された目的タンパク質を分解することができる。前記分解誘導ペプチドとは、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質又はその部分配列からなるペプチドである。
【００３４】
また、「目的タンパク質」は、オーキシンデグロンシステムを用いて、分解を誘導したいタンパク質であれば、特別な限定はない。また、目的タンパク質は、外来遺伝子がコードするタンパク質であってもよく、オーキシンデグロンシステム導入対象の細胞に内在するタンパク質であってもよい。
【００３５】
＜ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤＞
本実施形態のタンパク質分解阻害剤に含まれるＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤は、ＴＩＲ１ファミリータンパク質への結合能を要するが、分解誘導ペプチド（特に、ｍＡＩＤ）への結合能を有さないものである。これにより、ＴＩＲ１ファミリータンパク質と、分解誘導ペプチド（特に、ｍＡＩＤ）との結合を阻害することができる。本発明者らは、ＴＩＲ１−オーキシン類−分解誘導ペプチドの結合構造から、ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤となり得る化合物を分子設計し、オーキシン類の誘導体が有効であることを見出した。
【００３６】
前記オーキシン類としては、例えば、インドール−３−酢酸（ｉｎｄｏｌｅ−３−ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ：ＩＡＡ）、インドール−３−酪酸（ｉｎｄｏｌｅ−３−ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ：ＩＢＡ）、インドール−３−酢酸メチルエステル、４−クロロインドール酢酸、フェニル酢酸等の天然オーキシン類；１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、ナフトキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５−Ｔ）、４−クロロフェノキシ酢酸、１−ナフタレンアセトアミド、４−パラクロロ酢酸、２，６−ジクロロ安息香酸等の合成オーキシン類等が挙げられる。これらオーキシン類の側鎖の一部において、官能基を置換又は付加して得られる誘導体は、ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤として好ましく用いることができる。中でも、ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤としては、ＩＡＡ誘導体が好ましい。
【００３７】
［化合物（Ｉ）］
ＩＡＡ誘導体としては、例えば、下記一般式（Ｉ）で示される化合物（以下、「化合物（Ｉ）」と略記する）等が挙げられる。
【００３８】
【化６】
2019107109.tif 000007
【００３９】
（一般式（Ｉ）中、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４は、それぞれ独立に、ＣＨ又は窒素原子である。Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４が窒素原子である場合、ｎ１１は０である。Ｒ１１は、ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｒ１２及びＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｒ１３は、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｙ１１は、単結合、又は、エステル結合、エーテル結合、アミド結合及びカルボニル基からなる群から選択される１種以上を含んでもよい炭素数１〜１０のアルキレン基である。ｎ１１は０〜４の整数であり、ｎ１１が２〜４の整数である場合、ｎ１１個のＲ１１は互いに同一でも異なっていてもよい。Ａｒは置換基を有してもよいアリール基である。）
【００４０】
（Ａｒ）
一般式（Ｉ）中、Ａｒは置換基を有してもよいアリール基である。
【００４１】
Ａｒを構成するアリール基としては、炭素数６〜１４のアリール基であることが好ましく、具体的には、例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、インデニル基等が挙げられる。中でも、Ａｒを構成するアリール基としては、フェニル基であることが好ましい。
【００４２】
Ａｒは、１又は２個以上の任意の種類の置換基を、化学的に可能な任意の位置に有してもよい。置換基が２個以上の場合、それぞれの置換基は同一であっても異なっていてもよい。置換基として具体的には、例えば、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、アルキルアミノ基、カルボキシ基、ホルミル基、アセチル基、ベンゾイル基等が挙げられる。中でも、置換基としては、ハロゲン原子又はアルキル基であることが好ましい。
【００４３】
前記ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。中でも、前記ハロゲン原子としては、フッ素原子又は塩素原子であることが好ましい。
【００４４】
前記アルキル基としては、炭素数１〜３の直鎖状、分枝状又は環状のアルキル基であることが好ましく、具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基等が挙げられる。中でも、前記アルキル基としては、メチル基又はエチル基であることが好ましい。
【００４５】
前記アルコキシ基としては、炭素数１〜３の直鎖状、分枝状又は環状のアルキル基を有するアルコキシ基であることが好ましく、具体的には、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、シクロプロピルオキシ基等を挙げられる。中でも、前記アルコキシ基としては、メトキシ基又はエトキシ基であることが好ましい。
【００４６】
前記アルキルアミノ基としては、炭素数１〜３の直鎖状、分枝状又は環状のアルキル基を有するアミノ基であることが好ましく、具体的には、例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、シクロプロピルアミノ基等が挙げられる。中でも、前記アルキルアミノ基としては、メチルアミノ基又はエチルアミノ基であることが好ましい。
【００４７】
（Ｙ１１）
一般式（Ｉ）中、Ｙ１１は、単結合、又は、エステル結合、エーテル結合、アミド結合及びカルボニル基からなる群から選択される１種以上を含んでもよい炭素数１〜１０のアルキレン基である。
【００４８】
Ｙ１１がエステル結合、エーテル結合、アミド結合及びカルボニル基からなる群から選択される１種以上を含まない炭素数１〜１０のアルキレン基である場合、このアルキレン基は、直鎖状、分枝状又は環状のいずれであってもよい。中でも、前記炭素数１〜１０のアルキレン基は、直鎖状であることが好ましい。また、炭素数は、１〜１０であり、１〜５であることが好ましく、１〜３であることがより好ましく、１又は２であることがさらに好ましい。
【００４９】
前記炭素数１〜１０のアルキレン基として具体的には、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、シクロプロピレン基、シクロブチレン基、トリメチレン基、シクロペンチレン基、テトラメチレン基、プロパン−１，２−ジイル基、ｎ−ヘキシレン基、シクロヘキレン基、ペンタメチレン基、ブタン−１，３−ジイル基、シクロへプチレン基、シクロオクチレン基、シクロノニレン基、シクロデシレン基等が挙げられる。中でも、前記炭素数１〜１０のアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、テトラメチレン基又はペンタメチレン基であることが好ましく、メチレン基、エチレン基又はプロピレン基であることがより好ましく、メチレン基又はエチレン基であることがさらに好ましい。
【００５０】
＜基（ＩＩ）＞
Ｙ１１がエステル結合、エーテル結合、アミド結合及びカルボニル基からなる群から選択される１種以上を含む炭素数１〜１０のアルキレン基である場合、例えば、下記一般式（ＩＩ）で示される基（以下、「基（ＩＩ）」と略記することがある）等が挙げられる。
【００５１】
−（ＣＨ２）ｎ１１１−Ｙ１１１−（ＣＨ２）ｎ１１２−      ・・・（ＩＩ）
【００５２】
基（ＩＩ）において、−（ＣＨ２）ｎ１１１−のＹ１１１と反対の結合手が上記一般式（Ｉ）中のＡｒと結合しており、−（ＣＨ２）ｎ１１２−のＹ１１１と反対の結合手が上記一般式（Ｉ）中の−ＣＯＯＲ１４を側鎖として有するＣと結合している。
【００５３】
・ｎ１１１及びｎ１１２
基（ＩＩ）において、ｎ１１１及びｎ１１２は、それぞれ独立して、０〜１０の整数である。また、１≦ｎ１１１＋ｎ１１２≦１０である。また、中でも、ｎ１１１が０以上２以下であり、ｎ１１２が１以下上３以下であることが好ましく、ｎ１１１が０以上１以下であり、ｎ１１２が１以下上２以下であることがより好ましく、ｎ１１１が０であり、ｎ１１２が１であることがさらに好ましい。
【００５４】
・Ｙ１１１
Ｙ１１１は、エステル結合（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、エーテル結合（−Ｏ−）、アミド結合（−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−）及びカルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）からなる群から選択される１種以上である。中でも、Ｙ１１１は、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）であることが好ましい。
【００５５】
好ましい基（ＩＩ）としては、例えば、以下の式（ＩＩ−１）で示される基（以下、「基（ＩＩ−１）」と略記することがある）等が挙げられる。
【００５６】
−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−      ・・・（ＩＩ−１）
【００５７】
なお、基（ＩＩ−１）において、−Ｃ（＝Ｏ）−のＣＨ２と反対の結合手が上記一般式（Ｉ）中のＡｒと結合し、−ＣＨ２−のＣ（＝Ｏ）と反対の結合手が上記一般式（Ｉ）中の−ＣＯＯＲ１４を側鎖として有するＣと結合することが好ましい。
【００５８】
（Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４）
一般式（Ｉ）中、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４は、それぞれ独立に、ＣＨ又は窒素原子である。また、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４が窒素原子である場合、ｎ１１は０である。
【００５９】
一般式（Ｉ）において、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４は、同一であってもよく、異なっていてもよい。中でも、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４は、ＣＨであることが好ましい。
【００６０】
（Ｒ１１）
一般式（Ｉ）中、Ｒ１１は、インドール環様構造を形成するベンゼン環の置換基である。また、Ｒ１１は、ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。また、ｎ１１が２〜４の整数である場合、ｎ１１個のＲ１１は互いに同一であってもよく、異なっていてもよい。中でも、合成が容易であることから、Ｒ１１を２つ以上有する場合、Ｒ１１は同一であることが好ましい。
【００６１】
また、例えば、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４が窒素原子である場合、ｎ１１は０であり、置換基Ｒ１１を有しない。また、例えば、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４からなる群の１つ以上がＣＨである場合、置換基Ｒ１１を１つ以上有してもよい。中でも、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４からなる群の１つ以上がＣＨである場合、合成が容易であり、タンパク質分解阻害効果が優れることから、置換基Ｒ１１は有しない、又は、置換基Ｒ１１を１つ有することが好ましい。
【００６２】
前記ハロゲン原子としては、上述の「Ａｒ」において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、前記ハロゲン原子としては、フッ素原子又は塩素原子であることが好ましい。
【００６３】
前記炭素数１〜１０のアルキル基は、直鎖状、分枝状又は環状のいずれであってもよい。中でも、前記炭素数１〜１０のアルキル基は、直鎖状であることが好ましい。また、炭素数は、１〜１０であり、１〜５であることが好ましく、１〜３であることがより好ましく、１又は２であることがさらに好ましい。
【００６４】
前記炭素数１〜１０のアルキル基として具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、シクロペンチル基、２，３−ジメチルプロピル基、１−エチルプロピル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、シクロヘキシル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、１，１，２−トリメチルプロピル基、３，３−ジメチルブチル基、ｎ−ヘプチル基、シクロへプチル基、２−メチルヘキシル基、３−メチルヘキシル基、５−メチルヘキシル基、ｎ−オクチル基、シクロオクチル基、２−メチルヘプチル基、３−メチルヘプチル基、４−メチルヘプチル基、ｎ−ノ二ル基、シクロノニル基、ｎ−デシル基、シクロデシル基等が挙げられる。中でも、前記炭素数１〜１０のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基又はｎ−ペンチル基であることが好ましく、メチル基、エチル基又はｎ−プロピル基であることがより好ましく、メチル基又はエチル基であることがさらに好ましい。
【００６５】
（Ｒ１２及びＲ１４）
一般式（Ｉ）中、Ｒ１２及びＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｒ１２及びＲ１４は、同じであってもよく、異なっていてもよい。
【００６６】
前記炭素数１〜１０のアルキル基としては、上述の「Ｒ１１」において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、前記炭素数１〜１０のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基又はｎ−ペンチル基であることが好ましく、メチル基、エチル基又はｎ−プロピル基であることがより好ましく、メチル基又はエチル基であることがさらに好ましい。
【００６７】
中でも、Ｒ１２及びＲ１４は、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基又はｎ−ペンチル基であることが好ましく、水素原子、メチル基、エチル基又はｎ−プロピル基であることがより好ましく、水素原子、メチル基又はエチル基であることがさらに好ましい。
【００６８】
（Ｒ１３）
一般式（Ｉ）中、Ｒ１３は、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。
【００６９】
前記ハロゲン原子としては、上述の「Ａｒ」において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、前記ハロゲン原子としては、フッ素原子又は塩素原子であることが好ましい。
【００７０】
前記炭素数１〜１０のアルキル基としては、上述の「Ｒ１１」において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、前記炭素数１〜１０のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基又はｎ−ペンチル基であることが好ましく、メチル基、エチル基又はｎ−プロピル基であることがより好ましく、メチル基又はエチル基であることがさらに好ましい。
【００７１】
前記炭素数１〜１０のアルキル基としては、上述の「Ｒ１１」において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、前記炭素数１〜１０のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基又はｎ−ペンチル基であることが好ましく、メチル基、エチル基又はｎ−プロピル基であることがより好ましく、メチル基又はエチル基であることがさらに好ましい。
【００７２】
中でも、Ｒ１３は、水素原子、メチル基、エチル基又はｎ−プロピル基であることが好ましく、水素原子、メチル基又はエチル基であることがより好ましく、水素原子であることがさらに好ましい。
【００７３】
（ｎ１１）
一般式（Ｉ）中、ｎ１１は、置換基Ｒ１１の数を示し、０〜４の整数である。例えば、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４が窒素原子である場合、ｎ１１は０である。また、例えば、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３及びＡ１４からなる群の１つ以上がＣＨである場合、ｎは０〜４である。中でも、ｎ１１は０〜３であることが好ましく、０〜２であることがより好ましく、０又は１がさらに好ましい。
【００７４】
化合物（Ｉ）で好ましいものとしては、例えば、下記一般式（Ｉ−１）で示される化合物（以下、「化合物（Ｉ−１）」と略記する）等が挙げられる。なお、化合物（Ｉ−１）は、好ましい化合物（Ｉ）の一例に過ぎず、好ましい化合物（Ｉ）はこれらに限定されない。
【００７５】
【化７】
2019107109.tif 000008
【００７６】
（一般式（Ｉ−１）中、Ｒ１２及びＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｒ１１及びＲ１５は、それぞれ独立に、ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。ｎ１１は、０〜４の整数であり、ｎ１１が２〜４の整数である場合、ｎ１１個のＲ１１は互いに同一でも異なっていてもよい。ｎ１２は、０〜５の整数であり、ｎ１２が２〜５の整数である場合、ｎ１２個のＲ１５は互いに同一でも異なっていてもよい。）
【００７７】
（Ｒ１５）
一般式（Ｉ−１）中、Ｒ１５は、ベンゼン環の置換基である。Ｒ１５は、ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。また、ｎ１２が２〜５の整数である場合、ｎ１２個のＲ１５は互いに同一であってもよく、異なっていてもよい。中でも、合成が容易であることから、Ｒ１５を２つ以上有する場合、Ｒ１５は同一であることが好ましい。
【００７８】
前記ハロゲン原子としては、上述の「Ａｒ」において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、前記ハロゲン原子としては、フッ素原子又は塩素原子であることが好ましい。
【００７９】
前記炭素数１〜１０のアルキル基としては、上述の「Ｒ１１」において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、前記炭素数１〜１０のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基又はｎ−ペンチル基であることが好ましく、メチル基、エチル基又はｎ−プロピル基であることがより好ましく、メチル基又はエチル基であることがさらに好ましい。
【００８０】
（ｎ１２）
一般式（Ｉ−１）中、ｎ１２は置換基Ｒ１５の数を示し、０〜５の整数である。中でも、合成が容易であり、タンパク質分解阻害効果が優れることから、ｎ１２は０〜４であることが好ましく、０〜３であることがより好ましく、０〜２がさらに好ましい。また、化合物（Ｉ−１）において、ｎ１２が２である場合、置換基Ｒ１５は置換基Ｒ１５同士がメタ位となるように配置されていることが好ましい。
【００８１】
化合物（Ｉ−１）で好ましいものとしては、例えば、Ｒ１１及びＲ１５がハロゲン原子、メチル基、エチル基又はｎ−プロピル基であり、Ｒ１２及びＲ１４が水素原子、メチル基、エチル基又はｎ−プロピル基であり、ｎ１１及びｎ１２が０〜３の整数であるもの等が挙げられる。
化合物（Ｉ−１）でより好ましいものとしては、例えば、Ｒ１１及びＲ１５がフッ素原子、塩素原子、メチル基又はエチル基であり、Ｒ１２及びＲ１４が水素原子、メチル基又はエチル基であり、ｎ１１及びｎ１２が０〜２であるもの等が挙げられる。
【００８２】
化合物（Ｉ−１）で好ましいものとして具体的には、例えば、下記一般式（Ｉ−２）で示される化合物（以下、「化合物（Ｉ−２）」と略記する）等が挙げられる。なお、化合物（Ｉ−２）は、好ましい化合物（Ｉ−１）の一例に過ぎず、好ましい化合物（Ｉ−１）はこれらに限定されない。
【００８３】
【化８】
2019107109.tif 000009
【００８４】
（一般式（Ｉ−２）中、Ｒ１４は、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基である。Ｒ１５ａ及びＲ１５ｂは、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１〜６のアルキル基である。）
【００８５】
（Ｒ１４）
Ｒ１４としては、上記一般式（Ｉ）中のＲ１４と同じである。中でも、Ｒ１４は、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基又はｎ−ペンチル基であることが好ましく、水素原子、メチル基、エチル基又はｎ−プロピル基であることがより好ましく、水素原子、メチル基又はエチル基であることがさらに好ましい。
【００８６】
（Ｒ１５ａ及びＲ１５ｂ）
Ｒ１５ａ及びＲ１５ｂとしては、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１〜６のアルキル基である。Ｒ１５ａ及びＲ１５ｂは同一であってもよく、異なっていてもよい。
【００８７】
前記ハロゲン原子としては、上述の「Ａｒ」において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、前記ハロゲン原子としては、フッ素原子又は塩素原子であることが好ましい。
【００８８】
前記炭素数１〜１０のアルキル基としては、上述の「Ｒ１１」において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、前記炭素数１〜１０のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基又はｎ−ペンチル基であることが好ましく、メチル基、エチル基又はｎ−プロピル基であることがより好ましく、メチル基又はエチル基であることがさらに好ましい。
【００８９】
中でも、Ｒ１５ａとしては、水素原子、塩素原子又はメチル基が好ましい。また、Ｒ１５ｂとしては、水素原子又はメチル基が好ましい。
【００９０】
化合物（Ｉ−２）で好ましいものとしては、例えば、Ｒ１４が水素原子、メチル基、エチル基又はｎ−プロピル基であり、Ｒ１５ａが水素原子、フッ素原子、塩素原子、メチル基又はエチル基であり、Ｒ１５ｂが水素原子、メチル基又はエチル基であるもの等が挙げられる。
化合物（Ｉ−２）でより好ましいものとしては、例えば、Ｒ１４が水素原子又はメチル基であり、Ｒ１５ａが水素原子、塩素原子又はメチル基であり、Ｒ１５ｂが水素原子又はメチル基であるもの等が挙げられる。
【００９１】
化合物（Ｉ）のうち、化合物（Ｉ−１）で好ましいものとしてより具体的には、例えば、以下に示すもの等が挙げられる。
下記式（Ｉ−１−１）で示される化合物（以下、「化合物（Ｉ−１−１）」と略記する）（ＰＥＯ−ＩＡＡ）；
下記式（Ｉ−１−２）で示される化合物（以下、「化合物（Ｉ−１−２）」と略記する）（Ａｕｘｉｎｏｌｅ）；
下記式（Ｉ−１−３）で示される化合物（以下、「化合物（Ｉ−１−３」と略記する）（４Ｆ−ＰＥＯ−ＩＡＡ）；
下記式（Ｉ−１−４）で示される化合物（以下、「化合物（Ｉ−１−４）」と略記する）（ＰＥＯ−ＩＡＡ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ）；
下記式（Ｉ−１−５）で示される化合物（以下、「化合物（Ｉ−１−５）」と略記する）（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−ＰＥＯ−ＩＡＡ）；
下記式（Ｉ−１−６）で示される化合物（以下、「化合物（Ｉ−１−６）」と略記する）（４Ｃｌ−ＰＥＯ−ＩＡＡ）；
下記式（Ｉ−１−７）で示される化合物（以下、「化合物（Ｉ−１−７）」と略記する）（４’−Ｍｅｔｈｙｌ−ＰＥＯ−ＩＡＡ）；
下記式（Ｉ−１−８）で示される化合物（以下、「化合物（Ｉ−１−８）」と略記する）（６’−Ｆ−Ａｕｘｉｎｏｌｅ）
【００９２】
なお、これら化合物は、好ましい化合物（Ｉ）の一例に過ぎず、好ましい化合物（Ｉ）はこれらに限定されない。
【００９３】
【化９】
2019107109.tif 000010
【００９４】
これらの中でも、後述の実施例に示すように、化合物（Ｉ−１−２）（Ａｕｘｉｎｏｌｅ）、化合物（Ｉ−１−４）（ＰＥＯ−ＩＡＡ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ）、又は化合物（Ｉ−１−６）（４Ｃｌ−ＰＥＯ−ＩＡＡ）は優れたタンパク質分解阻害効果を有し、化合物（Ｉ−１−２）（Ａｕｘｉｎｏｌｅ）は、特に優れたタンパク質分解阻害効果を有する。
【００９５】
また、化合物（Ｉ−１−７）及び化合物（Ｉ−１−８）はタンパク質分解阻害効果を有する新規化合物である。
【００９６】
［化合物（Ｉ）の製造方法］
化合物（Ｉ）は、例えば、Ａｒ及びリンカーであるＹ１１の種類に応じて、公知の方法を用いて、単環又は多環式芳香族炭化水素を二環式化合物に反応させることで製造できる。より具体的には、以下のとおりである。
【００９７】
〇化合物（（Ｉ−１）−１ａ）の製造方法
化合物（Ｉ）のうち、化合物（Ｉ−１）は、Ｒ１４が水素原子である場合、例えば、以下の工程１）及び工程２）を備える製造方法により製造できる。
１）下記一般式（Ｉ−１ａ）で示される化合物（以下、「化合物（Ｉ−１ａ）」と略記する）と、無水マレイン酸とを反応させて、下記一般式（Ｉ−１ｂ）で示される化合物（以下、「化合物（Ｉ−１ｂ）」と略記する）を得る工程（以下、「化合物（Ｉ−１ｂ）製造工程」と略記する）；
２）化合物（Ｉ−１ｂ）と、下記一般式（Ｉ−１ｃ）で示される化合物（以下、「化合物（Ｉ−１ｃ）」と略記する）とを反応させて、下記一般式（Ｉ−１）−１ａで示される化合物（以下、「化合物（（Ｉ−１）−１ａ）」と略記する）を得る工程（以下、「化合物（（Ｉ−１）−１ａ）製造工程」と略記する）
【００９８】
以下、各工程について、詳細に説明する。
【００９９】
【化１０】
2019107109.tif 000011
【０１００】
（式中、Ｒ１６はハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｒ１６は無水マレイン酸との反応前のＲ１５であり、Ｒ１５及びＲ１６は同一である。ｎ１３は０〜６の整数である。ｎ１２及びｎ１３は、ｎ１３＝ｎ１２＋１となる関係である。Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１５、ｎ１１及びｎ１２はいずれも上記と同じである。）
【０１０１】
（化合物（Ｉ−１ｂ）製造工程）
前記化合物（Ｉ−１ｂ）製造工程では、化合物（Ｉ−１ａ）と無水マレイン酸とをフリーデル−クラフツ（Ｆｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓ）アルキル化反応により反応させて、化合物（Ｉ−１ｂ）を得る。
【０１０２】
・化合物（Ｉ−１ａ）
化合物（Ｉ−１ａ）は置換基を有してもよいベンゼンであり、公知化合物である。
化合物（Ｉ−１ａ）において、Ｒ１６はベンゼン環中の置換基を示す。また、Ｒ１６はハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。また、Ｒ１６は無水マレイン酸との反応前のＲ１５であり、Ｒ１５及びＲ１６は同一である。
【０１０３】
また、ｎ１３が２以上であり、Ｒ１６を２つ以上有する場合、Ｒ１６は同一であってもよく、異なっていてもよい。中でも、合成が容易であることから、Ｒ１６を２つ以上有する場合、Ｒ１６は同一であることが好ましい。
【０１０４】
また、化合物（Ｉ−１ａ）において、Ｒ１６はハロゲン原子、メチル基、エチル基又はｎ−プロピル基であることが好ましく、フッ素原子、塩素原子、メチル基又はエチル基であることがより好ましい。
【０１０５】
化合物（Ｉ−１ａ）において、ｎ１３は置換基Ｒ１６の数を示す。また、ｎ１３は０〜６の整数である。また、ｎ１２及びｎ１３は、ｎ１３＝ｎ１２＋１となる関係である。中でも、合成が容易であることから、ｎ１３は０〜４であることが好ましく、０〜３であることがより好ましく、０〜２であることがさらに好ましい。
また、化合物（Ｉ−１ａ）において、ｎ１３が２である場合、置換基Ｒ１６は置換基Ｒ１６同士がメタ位となるように配置されていることが好ましい。
【０１０６】
・化合物（Ｉ−１ｂ）
化合物（Ｉ−１ｂ）は置換基を有してもよいフェニル基を側鎖に有するアクリル酸誘導体であり、公知化合物である。
化合物（Ｉ−１ｂ）において、Ｒ１５はベンゼン環の置換基である。また、Ｒ１５は、ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。また、化合物（Ｉ−１ｂ）において、Ｒ１５は化合物（Ｉ−１ａ）中の無水マレイン酸と反応後のＲ１６であり、Ｒ１５及びＲ１６は同一である。
【０１０７】
また、ｎ１２が２以上であり、Ｒ１５を２つ以上有する場合、Ｒ１５は同一であってもよく、異なっていてもよい。中でも、合成が容易であることから、Ｒ１５を２つ以上有する場合、Ｒ１５は同一であることが好ましい。
【０１０８】
また、化合物（Ｉ−１ｂ）において、Ｒ１５はハロゲン原子、メチル基、エチル基又はｎ−プロピル基であることが好ましく、フッ素原子、塩素原子、メチル基又はエチル基であることがより好ましい。
【０１０９】
化合物（Ｉ−１ｂ）において、ｎ１２は置換基Ｒ１５の数を示す。また、ｎ１２は０〜５の整数である。また、ｎ１２及びｎ１３は、ｎ１２＝ｎ１３−１となる関係である。中でも、合成が容易であることから、ｎ１２は０〜４であることが好ましく、０〜３であることがより好ましく、０〜２であることがさらに好ましい。
【０１１０】
・反応条件
化合物（Ｉ−１ｂ）製造工程においては、触媒を用いて反応を行うことが好ましい。
前記触媒は特に限定されないが、例えば、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化アルミニウム等の金属ハロゲン化物が挙げられる。
前記触媒は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
前記触媒の使用量は、化合物（Ｉ−１ａ）の使用量の１倍モル量以上３倍モル量以下であることが好ましい。
【０１１１】
化合物（Ｉ−１ｂ）製造工程においては、非プロトン性溶媒を反応溶媒として用いることが好ましい。
前記非プロトン性溶媒は特に限定されないが、例えば、ペルフルオロヘキサン、α，α，α−トリフルオロトルエン、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、デカヒドロナフタレン、四塩化炭素、ジオキサン、フルオロトリクロロメタン、ベンゼン、トルエン、トリエチルアミン、二硫化炭素、ジイソプロピルエーテル、ジエチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、クロロホルム、酢酸エチル、２−メトキシエチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、塩化メチレン、ピリジン、２−ブタノン、アセトン、ヘキサメチルホスホルアミド、Ｎ−メチルピロリジノン、ニトロメタン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、スルホラン、ジメチルスルホキシド、ジイソプロピルエチルアミン、酢酸イソプロピル、ジクロロメタン、ジメチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、炭酸プロピレン等が挙げられる。
前記溶媒は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
前記溶媒の使用量は、化合物（Ｉ−１ａ）の使用量の１０倍モル量以上２００倍モル量以下であることが好ましい。
【０１１２】
化合物（Ｉ−１ｂ）製造工程においては、不活性ガス雰囲気下で反応を行うことが好ましい。
前記不活性ガスは特に限定されないが、例えば、窒素、ヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノン等が挙げられる。
前記不活性ガスは、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
【０１１３】
化合物（Ｉ−１ｂ）製造工程において、無水マレイン酸の使用量は、化合物（Ｉ−１ａ）の０．５倍モル量以上２倍モル量以下であることが好ましい。
【０１１４】
化合物（Ｉ−１ｂ）製造工程において、反応温度は、１０℃以上４０℃以下であることが好ましく、１５℃以上３５℃以下であることがより好ましい。
化合物（Ｉ−１ｂ）製造工程において、反応時間は、３０分以上１０時間以下であることが好ましく、１時間以上５時間以下であることがより好ましい。
【０１１５】
化合物（Ｉ−１ｂ）製造工程において、反応終了後は、公知の手法によって、必要に応じて後処理を行い、化合物（Ｉ−１ｂ）を取り出せばよい。すなわち、適宜必要に応じて、ろ過、洗浄、抽出、ｐＨ調整、脱水、濃縮等の後処理操作をいずれか単独で、又は２種以上組み合わせて行い、濃縮、結晶化、再沈殿、カラムクロマトグラフィー等により、化合物（Ｉ−１ｂ）を取り出せばよい。また、取り出した化合物（Ｉ−１ｂ）は、さらに必要に応じて、結晶化、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、抽出、溶媒による結晶の撹拌洗浄等の操作をいずれか単独で、又は２種以上組み合わせて１回以上行うことで、精製してもよい。
化合物（Ｉ−１ｂ）製造工程においては、反応終了後、化合物（Ｉ−１ｂ）を取り出さずに、次工程で用いてもよいが、目的物である化合物（（Ｉ−１）−１ａ）の収率が向上する点から、化合物（Ｉ−１ｂ）を上述の方法で取り出すことが好ましい。
【０１１６】
（化合物（（Ｉ−１）−１ａ）製造工程）
前記化合物（（Ｉ−１）−１ａ）製造工程においては、化合物（Ｉ−１ｂ）と化合物（Ｉ−１ｃ）とをマイケル（Ｍｉｃｈａｅｌ）反応により反応させて、化合物（（Ｉ−１）−１ａ）を得る。
【０１１７】
・化合物（Ｉ−１ｃ）
化合物（Ｉ−１ｃ）は、インドール環様構造を有する化合物であり、公知化合物である。
化合物（Ｉ−１ｃ）において、Ｒ１１はインドール環様構造を形成するベンゼン環の置換基である。また、Ｒ１１は、ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｒ１１を２つ以上有する場合、Ｒ１１は同一であってもよく、異なっていてもよい。中でも、合成が容易であることから、Ｒ１１を２つ以上有する場合、Ｒ１１は同一であることが好ましい。
【０１１８】
また、化合物（Ｉ−１ｃ）において、Ｒ１１はハロゲン原子、メチル基、エチル基又はｎ−プロピル基であることが好ましく、フッ素原子、塩素原子、メチル基又はエチル基であることがより好ましい。
【０１１９】
化合物（Ｉ−１ｃ）において、ｎ１１は、置換基Ｒ１１の数を示す。また、ｎ１１は０〜４の整数である。中でも、合成が容易であることから、ｎ１１は０〜３であることが好ましく、０〜２であることがより好ましく、０又は１がさらに好ましい。
【０１２０】
化合物（Ｉ−１ｃ）において、Ｒ１４は水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｒ１４は、水素原子、メチル基、エチル基又はｎ−プロピル基であることが好ましく、水素原子、メチル基又はエチル基であることがより好ましい。
【０１２１】
・反応条件
化合物（（Ｉ−１）−１ａ）製造工程においては、非プロトン性溶媒を反応溶媒として用いることが好ましい。前記非プロトン性溶媒としては、上述の「化合物（Ｉ−１ｂ）製造工程」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
前記溶媒の使用量は、化合物（Ｉ−１ｂ）の使用量の１０倍モル量以上２００倍モル量以下であることが好ましい。
【０１２２】
化合物（（Ｉ−１）−１ａ）製造工程においては、化合物（Ｉ−１ｃ）の使用量は、化合物（Ｉ−１ｂ）の使用量の１倍モル量以上３倍モル量以下であることが好ましい。
【０１２３】
化合物（（Ｉ−１）−１ａ）製造工程においては、反応温度は、６０℃以上１００℃以下であることが好ましく、７０℃以上９０℃以下であることがより好ましい。
化合物（（Ｉ−１）−１ａ）製造工程においては、反応時間は、３０分以上１０時間以下であることが好ましく、１時間以上５時間以下であることがより好ましい。
【０１２４】
化合物（（Ｉ−１）−１ａ）製造工程において、反応終了後は、化合物（Ｉ−１ｂ）製造工程の場合と同様の方法で、化合物（（Ｉ−１）−１ａ）を取り出すことができ、取り出した化合物（（Ｉ−１）−１ａ）をさらに同様の方法で精製してもよい。
【０１２５】
化合物（（Ｉ−１）−１ａ）、化合物（Ｉ−１ａ）、化合物（Ｉ−１ｂ）、化合物（Ｉ−１ｃ）等の各化合物は、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、質量分析法（ＭＳ）、赤外分光法（ＩＲ）等、公知の手法で構造を確認できる。
【０１２６】
〇化合物（（Ｉ−１）−１ｂ）の製造方法
化合物（Ｉ）のうち、化合物（Ｉ−１）は、Ｒ１４が炭素数１〜１０のアルキル基である場合、例えば、以下の工程１）、工程２）及び工程３）を備える製造方法により製造できる。
１）化合物（Ｉ−１ａ）と、無水マレイン酸とを反応させて、化合物（Ｉ−１ｂ）を得る工程（化合物（Ｉ−１ｂ）製造工程）
２）化合物（Ｉ−１ｂ）と、１価のアルコールとを反応させて、下記一般式（Ｉ−１ｄ）で示される化合物（以下、「化合物（Ｉ−１ｄ）」と略記する）を得る工程（以下、「化合物（Ｉ−１ｄ）製造工程」と略記する）
３）化合物（Ｉ−１ｄ）と、化合物（Ｉ−１ｃ）とを反応させて、下記一般式（Ｉ−１）−１ｂで示される化合物（以下、「化合物（（Ｉ−１）−１ｂ）」と略記する）を得る工程（以下、「化合物（（Ｉ−１）−１ｂ）製造工程」と略記する）
【０１２７】
化合物（Ｉ−１ｂ）製造工程は上述の「化合物（（Ｉ−１）−１ａ）の製造方法」と同様であるため、化合物（（Ｉ−１）−１ｂ）製造工程及び化合物（Ｉ−１ｄ）製造工程について、詳細に説明する。
【０１２８】
【化１１】
2019107109.tif 000012
【０１２９】
（式中、Ｒ１７は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１５、Ｒ１６、ｎ１１、ｎ１２及びｎ１３はいずれも上記と同じである。）
【０１３０】
（化合物（Ｉ−１ｄ）製造工程）
前記化合物（Ｉ−１ｄ）製造工程では、化合物（Ｉ−１ｂ）と１価のアルコールとを脱水縮合により反応させて、化合物（Ｉ−１ｄ）を得る。
【０１３１】
・１価のアルコール
１価のアルコールは公知化合物である。
１価のアルコールとしては、炭素数１〜１０のアルキル基を有する１価のアルコールであること好ましい。前記１価のアルコールとして具体的には、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、２−メチル−１−プロパノール、２−メチル−２−プロパノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２−エチル−１−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、３−ヘキサノール、４−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−メチル−２−ペンタノール、３−メチル−２−ペンタノール、３−メチル−３−ペンタノール、２，３−ジメチル−２−ブタノール、３，３−ジメチル−１−ブタノール、３，３−ジメチル−２−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、４−ヘプタノール、３−エチル−３−ペンタノール、２，４−ジメチル−３−ペンタノール、２，４−ジメチル−２−ペンタノール、２，３−ジメチル−２−ペンタノール、２，３−ジメチル−３−ペンタノール、２，２−ジメチル−３−ペンタノール、２，３，３−トリメチル-2-ブタノール、２，３，３−トリメチル−３−ペンタノール、２，２−ジエチル−１−ペンタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、７−メチル−１−オクタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、３，５，５−トリメチル−１−ヘキサノール、１−ノナノール、２−ノナノール、３−ノナノール、４−ノナノール、５−ノナノール、２，６−ジメチル−４−ヘプタノール、３，５−ジメチル−４−ヘプタノール１−デカノール等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、１価のアルコールとしては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、１−ブタノール又は１−ペンタノールが好ましく、メタノール、エタノール又は１−プロパノールがより好ましく、メタノール又はエタノールがさらに好ましい。
【０１３２】
・化合物（Ｉ−１ｄ）
化合物（Ｉ−１ｄ）は公知化合物である。
化合物（Ｉ−１ｄ）において、Ｒ１５はベンゼン環の置換基である。ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。また、Ｒ１５は、ハロゲン原子又は炭素数１〜１０のアルキル基である。Ｒ１５を２つ以上有する場合、Ｒ１５は同一であってもよく、異なっていてもよい。中でも、合成が容易であることから、Ｒ１５を２つ以上有する場合、Ｒ１５は同一であることが好ましい。
【０１３３】
また、化合物（Ｉ−１ｄ）において、Ｒ１５はハロゲン原子、メチル基、エチル基又はｎ−プロピル基であることが好ましく、フッ素原子、塩素原子、メチル基又はエチル基であることがより好ましい。
【０１３４】
化合物（Ｉ−１ｄ）において、Ｒ１７は１価のアルコールに由来する炭素数１〜１０のアルキル基である。中でも、合成が容易であることから、Ｒ１７はメチル基、エチル基又はｎ−プロピル基であることが好ましく、メチル基又はエチル基であることがより好ましい。
【０１３５】
化合物（Ｉ−１ｂ）において、ｎ１２は置換基Ｒ１５の数を示す。また、ｎ１２は０〜５の整数である。中でも、合成が容易であることから、ｎ１２は０〜４であることが好ましく、０〜３であることがより好ましく、０〜２であることがさらに好ましい。
【０１３６】
・反応条件
化合物（Ｉ−１ｄ）製造工程においては、縮合剤を用いて反応を行うことが好ましい。
前記縮合剤は特に限定されないが、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（Ｎ,Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ；ＤＭＡＰ）等が挙げられる。
前記縮合剤は１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよく、２種以上を併用する場合、それらの組み合わせ及び比率は任意に選択できる。
前記縮合剤の使用量は、化合物（Ｉ−１ｂ）の使用量の０．０５モル量以上０．２倍モル量以下であることが好ましい。
【０１３７】
化合物（Ｉ−１ｄ）製造工程においては、非プロトン性溶媒を反応溶媒として用いることが好ましい。前記非プロトン性溶媒としては、上述の「化合物（Ｉ−１ｂ）製造工程」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
前記溶媒の使用量は、化合物（Ｉ−１ｂ）の使用量の１０倍モル量以上２００倍モル量以下であることが好ましい。
【０１３８】
化合物（Ｉ−１ｄ）製造工程においては、１価のアルコールの使用量は、化合物（Ｉ−１ｂ）の使用量の１倍モル量以上３倍モル量以下であることが好ましい。
【０１３９】
化合物（Ｉ−１ｄ）製造工程においては、反応温度は、１０℃以上４０℃以下であることが好ましく、１５℃以上３５℃以下であることがより好ましい。
化合物（Ｉ−１ｄ）製造工程においては、反応時間は、３０分以上１０時間以下であることが好ましく、１時間以上５時間以下であることがより好ましい。
【０１４０】
化合物（Ｉ−１ｄ）製造工程において、反応終了後は、化合物（Ｉ−１ｂ）製造工程の場合と同様の方法で、化合物（Ｉ−１ｄ）を取り出すことができ、取り出した化合物（Ｉ−１ｄ）をさらに同様の方法で精製してもよい。
【０１４１】
（化合物（（Ｉ−１）−１ｂ）製造工程）
前記化合物（（Ｉ−１）−１ｂ）製造工程においては、化合物（Ｉ−１ｄ）と化合物（Ｉ−１ｃ）とをマイケル（Ｍｉｃｈａｅｌ）反応により反応させて、化合物（（Ｉ−１）−１ｂ）を得る。
【０１４２】
・反応条件
化合物（（Ｉ−１）−１ｂ）製造工程においては、非プロトン性溶媒を反応溶媒として用いることが好ましい。前記非プロトン性溶媒としては、上述の「化合物（Ｉ−１ｂ）製造工程」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
前記溶媒の使用量は、化合物（Ｉ−１ｄ）の使用量の１０倍モル量以上１００倍モル量以下であることが好ましい。
【０１４３】
化合物（（Ｉ−１）−１ｂ）製造工程においては、化合物（Ｉ−１ｃ）の使用量は、化合物（Ｉ−１ｄ）の使用量の１倍モル量以上３倍モル量以下であることが好ましい。
【０１４４】
化合物（（Ｉ−１）−１ｂ）製造工程においては、反応温度は、６０℃以上１００℃以下であることが好ましく、７０℃以上９０℃以下であることがより好ましい。
化合物（（Ｉ−１）−１ｂ）製造工程においては、反応時間は、３０分以上１０時間以下であることが好ましく、１時間以上５時間以下であることがより好ましい。
【０１４５】
化合物（（Ｉ−１）−１ｂ）製造工程において、反応終了後は、化合物（Ｉ−１ｂ）製造工程の場合と同様の方法で、化合物（（Ｉ−１）−１ｂ）を取り出すことができ、取り出した化合物（（Ｉ−１）−１ｂ）をさらに同様の方法で精製してもよい。
【０１４６】
化合物（（Ｉ−１）−１ｂ）、化合物（Ｉ−１ａ）、化合物（Ｉ−１ｂ）、化合物（Ｉ−１ｃ）、化合物（Ｉ−１ｄ）等の各化合物は、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、質量分析法（ＭＳ）、赤外分光法（ＩＲ）等、公知の手法で構造を確認できる。
【０１４７】
また、化合物（Ｉ）のうち、化合物（Ｉ−１）は、Ｒ１４が炭素数１〜１０のアルキル基である場合、後述する実施例に示すように、例えば、化合物（（Ｉ−１）−１ａ）と、１価のアルコールとを脱水縮合により反応させて、化合物（（Ｉ−１）−１ｂ）を製造することもできる。１価のアルコール及び反応条件としては、上記「化合物（Ｉ−１ｄ）製造工程」において例示されたものと同じものが挙げられる。
【０１４８】
＜その他構成成分＞
本実施形態のタンパク質分解阻害剤は、上述のＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤の他に、タンパク質分解阻害効果を妨げない範囲で、添加剤等を含んでいてもよい。
【０１４９】
前記添加剤としては、例えば、アジ化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤；水、生理食塩水、緩衝液等の希釈剤、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、グリセロール等の有機溶媒等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【０１５０】
本実施形態のタンパク質分解阻害剤は、粉体であってもよく、上述のＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤が溶剤等に溶解した液体であってもよい。
【０１５１】
≪オーキシンデグロンシステムのキット≫
＜第１実施形態＞
本発明の一実施形態に係るオーキシンデグロンシステムのキットは、上記実施形態に係るオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤と、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸と、少なくともｍＡＩＤをコードする第二の核酸と、を備える。
【０１５２】
本実施形態のキットによれば、厳密かつ自在に目的タンパク質の分解制御が可能である。
本実施形態のキットが備える上記タンパク質分解阻害剤以外の構成成分について、以下に詳細を説明する。
【０１５３】
＜第一の核酸＞
第一の核酸はＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする核酸である。
【０１５４】
本明細書において、「ＴＩＲ１ファミリータンパク質」とは、ユビキチン／プロテアソーム系のタンパク質分解において、Ｅ３ユビキチン化酵素複合体（ＳＣＦ複合体）を形成するサブユニットの一つであるＦ−ｂｏｘタンパク質であり、植物特有のタンパク質である。ＴＩＲ１ファミリータンパク質は、成長ホルモンであるオーキシンの受容体となっており、オーキシンを受容することによって、オーキシン情報伝達系の抑制因子Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を認識して、前記タンパク質を分解することが知られている。
【０１５５】
ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする遺伝子としては、植物由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする遺伝子であれば、その種類は限定されない。また、由来となる植物の種類も限定されず、例えば、シロイヌナズナ、イネ、ヒャクニチソウ、マツ、シダ、ヒメツリガネゴケ等が挙げられる。ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする遺伝子の具体例としては、例えば、ＴＩＲ１遺伝子、ＡＦＢ１遺伝子、ＡＦＢ２遺伝子、ＡＦＢ３遺伝子、ＦＢＸ１４遺伝子、ＡＦＢ５遺伝子等が挙げられる。
【０１５６】
本実施形態のキットは、いずれか一種類のＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする遺伝子を有していてもよいし、二種類以上を有していてもよい。例えば、シロイヌナズナ由来のＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする遺伝子の配列は、ＴＡＩＲウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／）に登録されており、各遺伝子のアクセッションナンバーは、下記表１のとおりである。
【０１５７】
【表１】
2019107109.tif 000013
【０１５８】
ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸は、例えば、植物から抽出した天然の核酸でもよいし、遺伝子工学によって合成した核酸であってもよい。また、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸は、例えば、エキソンとイントロンとを含むＤＮＡでもよいし、エキソンからなるｃＤＮＡであってもよい。ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡにおける全長配列又はｃＤＮＡにおける全長配列であってもよい。また、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸は、発現したタンパク質が、ＴＩＲ１として機能する範囲において、ゲノムＤＮＡにおける部分配列又はｃＤＮＡにおける部分配列であってもよい。
【０１５９】
本明細書において、「ＴＩＲ１ファミリータンパク質として機能する」とは、例えば、オーキシン類の存在下で、分解誘導ペプチド（Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質）を認識することを意味する。ＴＩＲ１ファミリータンパク質が分解誘導ペプチドを認識できれば、分解誘導ペプチドで標識化された目的タンパク質を分解できるからである。
【０１６０】
［プロモーター］
本実施形態のキットにおいて、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸の５’末端に、該第一の核酸の転写を制御するプロモーター配列が作動可能に連結されていることが好ましい。これによって、より確実にＴＩＲ１ファミリータンパク質を発現できる。
【０１６１】
本明細書において、「作動可能に連結」とは、遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター又は一連の転写因子結合部位）と発現させたい遺伝子（本実施形態においては、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸）との間の機能的連結を意味する。ここで、「発現制御配列」とは、その発現させたい遺伝子（本実施形態においては、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸）の転写を指向するものを意味する。
【０１６２】
前記プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、細胞の種類等に応じて適宜決定できる。プロモーターの具体例としては、例えば、誘導性プロモーター、ウイルス性プロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、組織特異的プロモーター等が挙げられる。中でも、本実施形態の細胞において、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸に作動可能に連結されたプロモーターとしては、誘導性プロモーターであることが好ましい。
【０１６３】
（誘導性プロモーター）
誘導性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、化学的誘導性プロモーター、熱ショック誘導性プロモーター、電磁気的誘導性プロモーター、核レセプター誘導性プロモーター、ホルモン誘導性プロモーター等が挙げられる。中でも、本実施形態の細胞において、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸に作動可能に連結された誘導性プロモーターとしては、化学的誘導性プロモーターであることが好ましい。
【０１６４】
化学的誘導性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、サリチル酸誘導性プロモーター（例えば、特許文献４参照。）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（例えば、非特許文献２参照。）、エタノール誘導性プロモーター、亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター等が挙げられる。中でも、本実施形態の細胞において、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸に作動可能に連結された化学的誘導性プロモーターとしては、テトラサイクリン誘導性プロモーターであることが好ましい。
【０１６５】
なお、従来のオーキシンデグロンシステムでは、後述の参考例において示すように、オーキシン非存在下においても、テトラサイクリン存在下で、ＴＩＲ１ファミリータンパク質を発現させるだけで、分解誘導ペプチドで標識された目的タンパク質が弱い分解を受けるという問題があった。これに対し、後述の実施例に示すように、本実施形態のキットに含まれるタンパク質分解阻害剤を用いることで、ＴＩＲ１ファミリータンパク質と分解誘導ペプチドとの結合を阻害して、オーキシン非存在下における目的タンパク質の分解を阻害することができる。
【０１６６】
熱ショック誘導性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、熱誘導性プロモーター（例えば、特許文献５参照。）、低温誘導性プロモーター（例えば、特許文献６参照。）等が挙げられる。
【０１６７】
電磁気的誘導性プロモーターとしては、初期増殖領域−１（ＥＧＲ−１）プロモーター（例えば、特許文献７参照。）、ｃ−Ｊｕｎプロモーター等が挙げられる。
【０１６８】
核レセプター誘導性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、オーファン核受容体ニワトリ卵白アルブミン上流プロモーター等が挙げられる。
【０１６９】
ホルモン誘導性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、グルココルチコイド誘導性プロモーター（例えば、非特許文献３参照）、ＭＭＴＶプロモーター、成長ホルモンプロモーター等が挙げられる。
【０１７０】
（ウイルス性プロモーター）
ウイルス性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ＣＭＶ極初期プロモーター（例えば、特許文献８参照。）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のプロモーター（例えば、ＨＩＶ長末端リピート等）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター（例えば、ＲＳＶ長末端リピート等） 、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＳＶプロモーター（Ｌａｐ２プロモーター又はヘルペスチミジンキナーゼプロモーター等）（例えば、非特許文献４参照） 、ＳＶ４０又はエプスタイン  バール  ウイルス由来のプロモーター、アデノ随伴ウイルスプロモーター（例えば、ｐ５プロモーター等）等が挙げられる。
【０１７１】
（ハウスキーピング遺伝子プロモーター）
ハウスキーピング遺伝子プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子プロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター、β２−マイクログロブリン遺伝子プロモーター、ＨＰＲＴ  １（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １）遺伝子プロモーター等が挙げられる。
【０１７２】
（組織特異的プロモーター）
組織特異的プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、黒色腫細胞又はメラニン細胞の場合は、チロシナーゼプロモーター又はＴＲＰ２プロモーター；乳房細胞又は乳癌の場合は、ＭＭＴＶプロモーター又はＷＡＰプロモーター；腸細胞又は腸癌の場合は、ビリンプロモーター又はＦＡＢＰプロモーター；膵細胞の場合は、ＰＤＸプロモーター；膵ベータ細胞の場合は、ＲＩＰプロモーター；ケラチノサイトの場合は、ケラチンプロモーター；前立腺上皮の場合は、プロバシンプロモーター；中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞又は中枢神経系の癌の場合は、ネスチンプロモーター又はＧＦＡＰプロモーター；ニューロンの場合は、チロシンヒドロキシラーゼ、Ｓ１００プロモーター又は神経フィラメントプロモーター；非特許文献５に記載される、膵臓特異的プロモーター；肺癌の場合は、クラーラ細胞分泌タンパク質プロモーター；心細胞の場合は、αミオシンプロモーター等が挙げられる。
【０１７３】
［ベクター］
本実施形態のキットにおいて、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸及び上流に作動可能に連結されたプロモーター配列は、ベクターに挿入された形であってもよい。
【０１７４】
前記ベクターとしては、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス、肝炎ウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
【０１７５】
前記ベクターは、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸の５’末端又は３’末端に、ポリアデニル化シグナル、ＮＬＳ、蛍光タンパク質のマーカー遺伝子等が作動可能に連結されていてもよい。
【０１７６】
＜第二の核酸＞
第二の核酸はＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質をコードする核酸である。中でも、第二の核酸は、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のうち、ｍＡＩＤの全長又は部分タンパク質をコードする核酸を含むことが好ましい。
【０１７７】
本明細書において、「ｍＡＩＤ」とは、「Ｍｉｎｉ−ａｕｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｄｅｇｒｏｎ」の略称であり、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の一つであるシロイヌナズナＩＡＡ１７の部分配列からなるタンパク質である。前記部分配列とは、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインＩＩ領域のＮ末端側及びＣ末端側に少なくとも２個ずつのＬｙｓ残基を含む領域からなる配列、又は、該配列を２個以上連結してなる配列である。このｍＡＩＤは目的タンパク質を標識する分解誘導ペプチドとなり得る。よって、本実施形態のキットにおいて、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質（特に、ｍＡＩＤの全長又は部分タンパク質）をコードする第二の核酸を備えることで、分解誘導ペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる。
【０１７８】
本実施形態において、第二の核酸がコードするタンパク質としては、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の全長アミノ酸配列からなるタンパク質であってもよく、ｍＡＩＤを含むＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の部分アミノ酸配列からなるタンパク質であってもよく、ｍＡＩＤのみからなるタンパク質であってもよい。
【０１７９】
特に、本実施形態のキットにおいて、第二の核酸がコードするタンパク質はｍＡＩＤのみからなるタンパク質であることが好ましい。これにより、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質全長やドメインＩＩ領域等を使用する場合に比べて、目的タンパク質の分解誘導能が向上し、且つ、目的タンパク質に対する機能阻害が抑制され、安定した目的タンパク質分解誘導性が得られる。
【０１８０】
一般的に、「Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質」とは、全長２５ＫＤａ程度のタンパク質であり、Ｎ末端側からドメインＩ、ドメインＩＩ、ドメインＩＩＩ及びドメインＩＶ等を有するタンパク質である。このうち、ドメインＩＩだけでも目的タンパク質の分解誘導能の向上はみられず、Ｎ末端からドメインＩＩまでの配列でも目的タンパク質の分解誘導能の向上はみられない。
【０１８１】
これに対し、ドメインＩＩのＮ末端側とＣ末端側に少なくとも２個ずつのＬｙｓ残基を含む領域であって、ドメインＩを含まず、ドメインＩＩＩは一部含んでいてもよい領域からなる配列からなるタンパク質を有することにより、目的タンパク質の分解誘導能が顕著に向上する。また、当該配列を２個以上連結した配列を使用すると、目的タンパク質の分解誘導能がさらに向上する。
【０１８２】
Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質をコードする遺伝子としては、植物由来のＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子であれば、その種類について特別な限定はない。前記植物の種類について特別な限定はなく、シロイヌナズナＩＡＡ１７遺伝子が好ましい。Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質をコードする遺伝子の具体例としては、例えば、ＩＡＡ１遺伝子、ＩＡＡ２遺伝子、ＩＡＡ３遺伝子、ＩＡＡ４遺伝子、ＩＡＡ５遺伝子、ＩＡＡ６遺伝子、ＩＡＡ７遺伝子、ＩＡＡ８遺伝子、ＩＡＡ９遺伝子、ＩＡＡ１０遺伝子、ＩＡＡ１１遺伝子、ＩＡＡ１２遺伝子、ＩＡＡ１３遺伝子、ＩＡＡ１４遺伝子、ＩＡＡ１５遺伝子、ＩＡＡ１６遺伝子、ＩＡＡ１７遺伝子、ＩＡＡ１８遺伝子、ＩＡＡ１９遺伝子、ＩＡＡ２０遺伝子、ＩＡＡ２６遺伝子、ＩＡＡ２７遺伝子、ＩＡＡ２８遺伝子、ＩＡＡ２９遺伝子、ＩＡＡ３０遺伝子、ＩＡＡ３１遺伝子、ＩＡＡ３２遺伝子、ＩＡＡ３３遺伝子、ＩＡＡ３４遺伝子等が挙げられる。
【０１８３】
本実施形態のキットは、いずれか一種の前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質をコードする遺伝子の全長又は部分配列を有していてもよいし、二種類以上を有していてもよい。例えば、シロイヌナズナ由来のＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の配列は、ＴＡＩＲ（ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）に登録されており、各遺伝子のアクセッションナンバーは、次のとおりである。
【０１８４】
ＩＡＡ１遺伝子（ＡＴ４Ｇ１４５６０）、ＩＡＡ２遺伝子（ＡＴ３Ｇ２３０３０）、ＩＡＡ３遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４２４０）、ＩＡＡ４遺伝子（ＡＴ５Ｇ４３７００）、ＩＡＡ５遺伝子（ＡＴ１Ｇ１５５８０）、ＩＡＡ６遺伝子（ＡＴ１Ｇ５２８３０）、ＩＡＡ７遺伝子（ＡＴ３Ｇ２３０５０）、ＩＡＡ８遺伝子（ＡＴ２Ｇ２２６７０）、ＩＡＡ９遺伝子（ＡＴ５Ｇ６５６７０）、ＩＡＡ１０遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４１００）、ＩＡＡ１１遺伝子（ＡＴ４Ｇ２８６４０）、ＩＡＡ１２遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４５５０）、ＩＡＡ１３遺伝子（ＡＴ２Ｇ３３３１０）、ＩＡＡ１４遺伝子（ＡＴ４Ｇ１４５５０）、ＩＡＡ１５遺伝子（ＡＴ１Ｇ８０３９０）、ＩＡＡ１６遺伝子（ＡＴ３Ｇ０４７３０）、ＩＡＡ１７遺伝子（ＡＴ１Ｇ０４２５０）、ＩＡＡ１８遺伝子（ＡＴ１Ｇ５１９５０）、ＩＡＡ１９遺伝子（ＡＴ３Ｇ１５５４０）、ＩＡＡ２０遺伝子（ＡＴ２Ｇ４６９９０）、ＩＡＡ２６遺伝子（ＡＴ３Ｇ１６５００）、ＩＡＡ２７遺伝子（ＡＴ４Ｇ２９０８０）、ＩＡＡ２８遺伝子（ＡＴ５Ｇ２５８９０）、ＩＡＡ２９遺伝子（ＡＴ４Ｇ３２２８０）、ＩＡＡ３０遺伝子（ＡＴ３Ｇ６２１００）、ＩＡＡ３１遺伝子（ＡＴ３Ｇ１７６００）、ＩＡＡ３２遺伝子（ＡＴ２Ｇ０１２００）、ＩＡＡ３３遺伝子（ＡＴ５Ｇ５７４２０）、ＩＡＡ３４遺伝子（ＡＴ１Ｇ１５０５０）。
【０１８５】
第二の核酸がコードするタンパク質を構成するアミノ酸数としては、３２〜８０アミノ酸残基が好ましく、５０〜８０アミノ酸残基がより好ましく、５０〜７５アミノ酸残基がさらに好ましく、５０〜７０アミノ酸残基がさらに好ましい。
【０１８６】
また、第二の核酸がコードするタンパク質を構成するアミノ酸配列としては、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインＩＩ領域のＮ末端側及びＣ末端側に２〜５個ずつ、より好ましくは２〜４個ずつのＬｙｓ残基を含む３２〜８０アミノ酸残基からなる配列であることが好ましい。
【０１８７】
［プロモーター］
本実施形態のキットにおいて、第二の核酸の５’末端に、該第二の核酸の転写を制御するプロモーター配列が作動可能に連結されていることが好ましい。これによって、より確実に分解誘導ペプチドを発現できる。前記プロモーターとしては、上述の「第一の核酸」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１８８】
［ベクター］
本実施形態のキットにおいて、第二の核酸及び上流に作動可能に連結されたプロモーター配列は、ベクターに挿入された形であってもよい。前記ベクターとしては、上述の「第一の核酸」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【０１８９】
＜第２実施形態＞
本発明の一実施形態に係るオーキシンデグロンシステムのキットは、上記実施形態に係るオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤と、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸、並びに、目的タンパク質をコードする第三の核酸及び前記第三の核酸の上流又は下流に連結されたＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質をコードする第二の核酸を含む真核細胞と、を備える。
【０１９０】
本実施形態のキットによれば、真核細胞中においてオーキシンデグロンシステムを用いて、厳密かつ自在に目的タンパク質の分解制御が可能である。
本実施形態のキットが備える上記タンパク質分解阻害剤以外の構成成分について、以下に詳細を説明する。
【０１９１】
＜真核細胞＞
本実施形態のキットが備える真核細胞としては、株化された真核動物由来細胞やＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞であればよい。真核細胞として具体的には、例えば、株化されたヒト由来細胞、株化されたマウス由来細胞、株化されたニワトリ由来細胞、ヒトＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスｉＰＳ細胞等が挙げられる。中でも、ヒトＨＣＴ１１６細胞、ヒトＨＴ１０８０細胞、ヒトＮＡＬＭ６細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスＥＳ細胞、マウスｉＰＳ細胞又はニワトリＤＴ４０細胞が好ましく、ＨＣＴ１１６細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスＥＳ細胞又はマウスｉＰＳ細胞がより好ましい。
【０１９２】
本実施形態のキットが備える真核細胞は、第一の核酸、第二の核酸及び第三の核酸を備える。第一の核酸は、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする核酸であり、上述の「第一実施形態」において例示されたものと同様である。第二の核酸は、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質をコードする核酸であり、上述の「第一実施形態」において例示されたものと同様である。また、第三の核酸は、目的タンパク質をコードする核酸である。前記目的タンパク質としては、上述のとおり、オーキシンデグロンシステムを用いて、分解を誘導したいタンパク質であれば、特別な限定はない。また、目的タンパク質は、外来遺伝子がコードするタンパク質であってもよく、真核細胞に内在するタンパク質であってもよい。
【０１９３】
また、第二の核酸は、後述する第三の核酸の上流又は下流に連結している。これにより、真核細胞内において、分解誘導ペプチドにより標識された目的タンパク質を確実に発現させることができる。
【０１９４】
≪目的タンパク質分解制御方法≫
本発明の一実施形態に係る目的タンパク質分解制御方法は、上記実施形態に係るオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤を用いた方法である。
【０１９５】
オーキシンデグロンシステムにおいて、上述のタンパク質分解阻害剤を用いることで、厳密かつ自在に目的タンパク質の分解制御が可能である。
【０１９６】
例えば、上述の真核細胞を備えるオーキシンデグロンシステムのキットを用いて目的タンパク質の分解制御を行う方法としては、以下の方法等が挙げられる。
【０１９７】
まず、真核細胞内において、分解誘導ペプチドで標識された目的タンパク質及びＴＩＲ１ファミリータンパク質を発現させる。分解誘導ペプチドで標識された目的タンパク質及びＴＩＲ１ファミリータンパク質は定常的に発現していてもよく、テトラサイクリン類等の誘導により発現させてもよい。このとき、上述のタンパク質分解阻害剤を含む培地にて真核細胞を培養する。これにより、オーキシン類の非存在下での目的タンパク質の分解を抑制することができる。培地に含まれるタンパク質分解阻害剤の濃度、すなわち、培地に含まれる有効成分であるＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤の濃度は５μＭ以上５００μＭ以下であることが好ましい。用いる培地としては、真核細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
【０１９８】
次いで、ＴＩＲ１オーキシン受容体拮抗剤を含む培地を、オーキシン類を含む培地に交換する。これにより、タンパク質分解阻害剤が除去され、代わりにオーキシン類が存在することで、分解誘導ペプチドで標識された目的タンパク質がＴＩＲ１ファミリータンパク質により１５〜３０分でほぼ完全に分解される。
【０１９９】
培地に含まれるオーキシン類の濃度は、制限されず、例えば、オーキシン類の種類に応じて適宜決定できる。培地に含まれるオーキシン類の濃度として具体的には、例えば、１μＭ以上１ｍＭ以下であり、２０μＭ以上５００μＭ以下であることが好ましい。
【０２００】
上述のタンパク質分解阻害剤により、オーキシン類非存在での目的タンパク質の分解を抑制し、さらに、オーキシン類の添加により目的タンパク質の分解が速やかに誘導できる。タンパク質分解阻害剤存在下であってオーキシン類非存在下と、タンパク質分解阻害剤非存在下であってオーキシン類存在下とを対比することで、目的タンパク質の影響を検討することができる。
より具体的には、例えば、上述の真核細胞にオーキシン類を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、前記オーキシン類を除去して、上述のタンパク質分解阻害剤を添加し、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する方法等によって検討することができる。又は、例えば、上述の細胞にオーキシン類を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、上述のタンパク質分解阻害剤を添加して、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する方法等によって検討することができる。
【０２０１】
すなわち、本発明の一実施形態に係る目的タンパク質分解制御方法は、工程１ａと、工程２ａとを有する方法である。
工程１ａでは、特定の構成を含む真核細胞を含む第一の培養物に、上記オーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤、及びテトラサイクリンを添加する。工程１ａに用いられる真核細胞は、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸、及び前記第一の核酸の５’末端に、作動可能に連結されているテトラサイクリン誘導性プロモーターと、目的タンパク質及びＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質を含む融合タンパク質をコードする第四の核酸と、を含む。これにより、前記ＴＩＲ１ファミリータンパク質、及び前記融合タンパク質を発現した真核細胞を含む第二の培養物を得る。
工程２ａでは、前記第二の培養物から、前記タンパク質分解阻害剤を除去し、オーキシン類を添加し、前記目的タンパク質を分解させた第三の培養物を得る。
【０２０２】
また、本発明の一実施形態に係る目的タンパク質分解制御方法は、工程１ｂと、工程２ｂとを有する方法である。
工程１ｂでは、特定の構成を含む真核細胞を含む第一の培養物に、オーキシン類を添加し、前記目的タンパク質を分解させた第二の培養物を得る。工程１ｂに用いられる真核細胞は、ＴＩＲ１ファミリータンパク質をコードする第一の核酸、及び前記第一の核酸の５’末端に、作動可能に連結されているプロモーターと、目的タンパク質及びＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の全長又は部分タンパク質を含む融合タンパク質をコードする第四の核酸と、を含み、前記ＴＩＲ１ファミリータンパク質、及び前記融合タンパク質を発現している。
工程２ｂでは、前記第二の培養物から、前記オーキシン類を除去し、上記オーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤を添加し、前記目的タンパク質を発現させた第三の培養物を得る。
【実施例】
【０２０３】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０２０４】
［合成例１］Ａｕｘｉｎｏｌｅの合成
以下に示す経路で、Ａｕｘｉｎｏｌｅ（化合物（Ｉ−１−２））を製造した。【０２０５】
【化１２】
2019107109.tif 000014
【０２０６】
（化合物（Ｉ−１ｂ−１）の合成）
５０ｍＬ丸底フラスコ内で、窒素充填下でｍ−キシレン（１．００ｇ、９．４２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４０ｍＬ） に溶解させた。次いで、無水マレイン酸（０．９３ｇ、９．４２ｍｍｏｌ）と塩化アルミニウム（２．５１ｇ、１８．８４ｍｍｏｌ）とを加え、室温で４時間攪拌した。次いで、反応液に１Ｎ塩酸（１０ｍＬ）を加え、ｐＨ１にした。次いで、酢酸エチル（４０ｍＬ）で３回抽出した。次いで、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。次いで、溶媒を減圧留去した。次いで、ベンゼンから再結晶で精製を行い、化合物（Ｉ−１ｂ−１）（ｔｒａｎｓ−４−（２，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｐｈｅｎｙｌ）−４−ｏｘｏ−ｂｕｔ−２−ｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）を得た（収量：１．４９ｇ、収率：７７％、融点：８５．４〜８８．２℃）。【０２０７】
得られた化合物（Ｉ−１ｂ−１）の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、赤外分光光度（ＩＲ）計及び高速原子衝撃質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）計による分析結果を以下に示す。
1H NMR (CDCl3):δ7.75 (d, J=15.6 Hz, 1H), 7.56 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.10(m, 2H), 6.70 (d, J=15.6 Hz, 1H), 2.50(s, 3H), 2.38(s, 3H).
13C NMR (CDCl3):δ192.5, 170.9, 143.1, 141.7, 139.5, 133.6, 133.0, 130.9, 130.0, 126.4, 21.5 21.2.
IR v max (neat) :2986, 1703, 1667 cm-1.
FAB-MS :m/z 205 [M+H+].【０２０８】
（Ａｕｘｉｎｏｌｅ（化合物（Ｉ−１−２））の合成）
次いで、３０ｍＬ丸底フラスコ内で、化合物（Ｉ−１ｂ−１）（０．４０ｇ、１．９６ｍｍｏｌ）をベンゼン（１０ｍＬ）で溶解させた。次いで、インドール（０．４７ｇ、４．０１ｍｍｏｌ）を加えて、８０℃で８時間撹拌し、室温になるまで攪拌した。次いで、反応液を減圧留去した。次いで、ベンゼンから再結晶を行い、Ａｕｘｉｎｏｌｅ（化合物（Ｉ−１−２））を得た（収量：０．４６ｇ、収率：７２％、融点：１７８．８〜１８３．２℃）。【０２０９】
得られたＡｕｘｉｎｏｌｅ（化合物（Ｉ−１−２））の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＩＲ計及び高分解能高速原子衝撃質量分析（ＨＲＦＡＢ−ＭＳ）計による分析結果を以下に示す。
1H NMR (DMSO-d6) :δ7.79 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.65 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.36 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.31 (d, J=2.3 Hz, 1H), 7.10 (m, 3H), 7.00 (td, J=7.3 Hz, 1.0, 1H), 4.32 (dd, J=10.6, 3.9 Hz,  1H), 3.89 (dd, J=17.9, 10.6 Hz, 1H), 3.23 (dd, J=17.9, 3.9 Hz, 1H), 2.37 (s, 3H), 2.31 (s, 3H).
13C NMR (DMSO-d6) :δ198.8, 175.7, 144.5, 137.8, 134.9, 130.2, 129.0, 127.2, 124.1, 122.1, 112.0, 119.5, 112.9, 112.4, 42.0, 38.6, 22.1.
IR v max (neat): 3428, 2923, 1707 cm-1.
HRFAB-MS: m/z 322.1422 [M+H]+, calcd for 322.1443, C19H17NO3.【０２１０】
［合成例２］４Ｆ−ＰＥＯ−ＩＡＡの合成
以下に示す経路で、４Ｆ−ＰＥＯ−ＩＡＡ（化合物（Ｉ−１−３））を製造した。【０２１１】
【化１３】
2019107109.tif 000015
【０２１２】
（化合物（Ｉ−１ｂ−２）の合成）
５０ｍＬ丸底フラスコ内で、窒素充填下でフルオロベンゼン（０．５０ｇ、５．２１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２０ｍＬ）で溶解させた。次いで、無水マレイン酸（０．５１ｇ、５．２０ｍｍｏｌ）と塩化アルミニウム（１．４０ｇ、１０．４９ｍｍｏｌ）とを加え、室温で４時間攪拌した。次いで、反応液に１Ｎ塩酸（１０ｍＬ）を加え、ｐＨ１にした。次いで、酢酸エチル（４０ｍＬ）で３回抽出した。次いで、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水した。次いで、溶媒を減圧留去した。次いで、ベンゼンから再結晶で精製を行い、化合物（Ｉ−１ｂ−２）（ｔｒａｎｓ−４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−４−ｏｘｏ−ｂｕｔ−２−ｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）を得た（収量：０．５７ｇ、収率：５６％、融点：１１４．８〜１１９．６℃）。【０２１３】
得られた化合物（Ｉ−１ｂ−２）の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及びＦＡＢ−ＭＳ計による分析結果を以下に示す。
1H NMR (CDCl3) :δ8.06 (m, 2H), 7.98 (d, J=15.4 Hz, 1H), 7.21 (m, 2H), 6.90 (d, J=15.4 Hz, 1H).
13C NMR (CDCl3) :δ187.5, 170.7, 166.3 (d, JC-F=255.5 Hz), 138.0, 132.8 (d, JC-F=3.2 Hz), 131.7 (d, JC-F=9.9 Hz), 131.6, 116.2 (d, JC-F=22.1 Hz) .
FAB-MS: m/z 195 [M+H] +【０２１４】
（４Ｆ−ＰＥＯ−ＩＡＡ（化合物（Ｉ−１−３））の合成）
２００ｍＬのナスフラスコ内で、化合物（Ｉ−１ｂ−２）（５ｇ、２５．８ｍｍｏｌ、分子量１９４．１６）とインドール（６ｇ、５１．５ｍｍｏｌ、分子量１１７．１５）をトルエンに溶かし、８０℃で４時間撹拌した。次いで、析出した固体を桐山漏斗（登録商標）で集めた。次いで、析出した固体を酢酸エチルとヘキサンとから再結晶し、４Ｆ−ＰＥＯ−ＩＡＡ（化合物（Ｉ−１−３））を白色の粉末として得た（収量：４．８ｇ、収率：６０％、融点：１６２〜１６６℃）。【０２１５】
得られた４Ｆ−ＰＥＯ−ＩＡＡ（化合物（Ｉ−１−３））の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及びＦＡＢ−ＭＳ計による分析結果を以下に示す。
1H NMR (400 MHz, acetone-d6): δ 3.41 ( 1H, dd, J=0.4,0.4) 4.11 (1H, q), 7.05 (1H, m), 7.13 (1H, m ), 7.28 (2H, m,), 7.37 (2H, m), 7.78 (1H, d, J=0.8), 8.16 (2H, m), 10.2 (1H, s).
13C NMR (100 MHz, acetone-d6): δ 38.58, 42.40, 112.32, 113.50, 116.22, 116.44, 119.83, 120.05, 122.42, 131.73, 131.8, 137.71, 167.74, 175.14, 197.16.
FAB-MS: m/z 312 [M+H] +【０２１６】
［合成例３］ＰＥＯ−ＩＡＡ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒの合成
以下に示す経路で、ＰＥＯ−ＩＡＡ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ（化合物（Ｉ−１−４））を製造した。【０２１７】
【化１４】
2019107109.tif 000016
【０２１８】
（ＰＥＯ−ＩＡＡ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ（化合物（Ｉ−１−４））の合成）
５０ｍＬ丸底フラスコ内で、ＰＥＯ−ＩＡＡ（０．５０ｇ、１．７１ｍｍｏｌ）をエタノール（１５ｍＬ） に溶解させた。次いで、塩化アセチル（０．５ｇ、６．３６ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で６時間攪拌した。反応液から溶媒を減圧留去した後，酢酸エチルとヘキサンから再結晶で精製を行い、（化合物（Ｉ−１−４）（ＰＥＯ−ＩＡＡ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ）を得た（収量：０．５０ｇ、収率：９２％、融点：８９〜９２℃）。【０２１９】
得られたＰＥＯ−ＩＡＡ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ（化合物（Ｉ−１−４））の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及びＦＡＢ−ＭＳ計による分析結果を以下に示す。
1H NMR (DMSO-d6) :δ11.0 (brs, 1H), 8.04 (d, J=7.4, 2H), 7.69 (d, J=8.2, 1H), 7.65 (t, J=7.3, 1H), 7.53 (t, J=7.3, 2H), 7.38 (s, 1H), 7.37 (d, J=6.2, 1H), 7.10 (t, J=8.2, 1H), 7.01 (t, J=7.2, 1H), 4.30 (dd, J=10.5 3.6, 1H) , 4.02 (dd, J=18.0, 7.3, 1H), 4.04 (m, 2H), 3.34 (dd, 18.0, 4.0), 1.10 (t, J=7.3, 3H).
13C NMR (DMSO-d6) :δ198.81, 173.78, 136.79, 133.87, 129.26,128.53, 126.62, 123.81, 121.75, 119.38, 119.23, 112.09, 111.83, 60.6, 41.73, 38.23, 14.54.
FAB-MS: m/z 332 [M+H] +【０２２０】
［合成例４］Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−ＰＥＯ−ＩＡＡの合成
以下に示す経路で、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−ＰＥＯ−ＩＡＡ（化合物（Ｉ−１−５））を製造した。【０２２１】
【化１５】
2019107109.tif 000017
【０２２２】
（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−ＰＥＯ−ＩＡＡ（化合物（Ｉ−１−５））の合成）
３０ｍＬ丸底フラスコ内で、化合物（Ｉ−１ｂ−３）（０．４０ｇ、２．２７ｍｍｏｌ）をベンゼン（１０ｍＬ）で溶解させた。次いで、Ｎ−メチルインドール（０．４５ｇ、３．４１ｍｍｏｌ）を加えて、８０℃で８時間撹拌し、室温になるまで攪拌した。反応液を室温まで冷却後、析出した結晶を桐山漏斗（登録商標）で集め、ベンゼン（１ｍＬ）で結晶を洗浄した。その後、結晶を減圧乾燥してＮ−ｍｅｔｈｙｌ−ＰＥＯ−ＩＡＡ（化合物（Ｉ−１−５）を得た（収量：０．３８ｇ、収率：５４％、融点：１８３〜１８６℃）。【０２２３】
得られたＮ−ｍｅｔｈｙｌ−ＰＥＯ−ＩＡＡ（化合物（Ｉ−１−５））の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及びＦＡＢ−ＭＳ計による分析結果を以下に示す。
1H NMR (DMSO-d6) : δ12.2 (brs, 1H), 8.03 (d, J=6.9, 2H), 7.69 (d, J=7.8, 1H), 7.63 (t, J=7.3, 1H), 7.53 (t, J=7.8, 2H), 7.41 (d, J=8.2, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.16 (t, J=6.9, 1H), 7.05 (t, J=7.2, 1H), 4.34 (dd, J=10.5 3.6, 1H) , 4.02 (dd, J=18.0, 7.3, 1H), 3.75 (s, 3H), 3.34 (m, 1H).
13C NMR (DMSO-d6) : δ198.79, 175.14, 137.15, 136.91, 133.81, 129.26, 128.47, 128.02, 127.06, 121.81, 119.74, 119.27, 111.72, 110.24, 41.75, 38.01, 32.87.
FAB-MS: m/z 308 [M+H] +【０２２４】
［合成例５］４Ｃｌ−ＰＥＯ−ＩＡＡの合成
以下に示す経路で、４Ｃｌ−ＰＥＯ−ＩＡＡ（化合物（Ｉ−１−６））を製造した。【０２２５】
【化１６】
2019107109.tif 000018
【０２２６】
（４Ｃｌ−ＰＥＯ−ＩＡＡ（化合物（Ｉ−１−６））の合成）
５０ｍＬのナスフラスコ内で、化合物（Ｉ−１ｂ−４）（市販試薬）（０．５０ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）とインドール（０．４２ｇ、３．５７ｍｍｏｌ）とをトルエンに溶かし、８０℃で４時間撹拌した。室温まで冷却後、次いで、析出した結晶を桐山漏斗（登録商標）で集め、トルエン（１ｍＬ）で結晶を洗浄した。その後、結晶を減圧乾燥して、４Ｃｌ−ＰＥＯ−ＩＡＡ（化合物（Ｉ−１−６））を淡黄色結晶として得た（収量：０．４９ｇ、収率：６３％、融点：１８５〜１９０℃）。【０２２７】
４Ｃｌ−ＰＥＯ−ＩＡＡ（化合物（Ｉ−１−６））の１Ｈ−ＮＭＲ及びＦＡＢ−ＭＳ計による分析結果を以下に示す。
1H NMR(DMSO-d6) : 11.0 (brs, 1H), 8.06 (d, J=8.7, 2H), 7.69 (d, J=8.2, 1H), 7.63 (d, J=8.7, 1H), 7.59 (d, J=8.7, 2H), 7.35 (s, 1H), 7.10 (t, J=8.2, 1H), 7.01 (t, J=7.2, 1H), 4.34 (dd, J=10.5 3.6, 1H) , 4.02 (dd, J=18.3, 10.5, 1H), 3.34 (dd, 18.0, 4.0).
FAB-MS: m/z 328 [M+H] +【０２２８】
［合成例６］４’−Ｍｅｔｈｙｌ−ＰＥＯ−ＩＡＡの合成
以下に示す経路で、４’−Ｍｅｔｈｙｌ−ＰＥＯ−ＩＡＡ（化合物（Ｉ−１−７））を製造した。【０２２９】
【化１７】
2019107109.tif 000019
【０２３０】
（４’−Ｍｅｔｈｙｌ−ＰＥＯ−ＩＡＡ（化合物（Ｉ−１−７））の合成）
３０ｍＬのナスフラスコ内で、化合物（Ｉ−１ｂ−３）（０．６０ｇ、３．４０ｍｍｏｌ）と４−メチルインドール（０．６０ｇ、５．１１ｍｍｏｌ）とをトルエンに溶かし、８０℃で４時間撹拌した。室温まで冷却後、次いで、析出した結晶を桐山漏斗（登録商標）で集め、トルエン（１ｍＬ）で結晶を洗浄した。その後、結晶を減圧乾燥して、４’−Ｍｅｔｈｙｌ−ＰＥＯ−ＩＡＡ（化合物（Ｉ−１−７）を無色結晶として得た（収量：０．５６ｇ、収率：５８％、融点：１７６〜１８０℃）。【０２３１】
得られた４’−Ｍｅｔｈｙｌ−ＰＥＯ−ＩＡＡ（化合物（Ｉ−１−７）の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及びＦＡＢ−ＭＳ計による分析結果を以下に示す。
1H NMR (DMSO-d6) : 11.0 (brs, 1H), 8.04 (d, J=7.9, 2H), 7.63 (t, J=7.3, 1H), 7.53 (d, J=7.8, 1H), 7.51 (t, J=7.3, 1H), 7.30 (d, J=2.8, 1H), 7.20 (d, J=8.2, 1H), 6.96 (t, J=7.8, 1H), 6.74 (d, J=7.3, 1H), 4.72 (dd, J=10.1 4.1, 1H) , 3.94 (dd, J=18.3, 10.5, 1H), 3.34 (dd, 18.0, 4.0), 2.71 (s, 3H).
13C NMR (DMSO-d6) : 198.94, 175.81, 136.95, 136.75, 133.8, 130.07, 129.24, 128.54, 125.37, 123.38, 121.61, 121.18, 113.76, 110.19, 43.49, 38.33, 20.67.
FAB-MS: m/z 308 [M+H] +【０２３２】
［合成例７］６’−Ｆ−Ａｕｘｉｎｏｌｅの合成
以下に示す経路で、６’−Ｆ−Ａｕｘｉｎｏｌｅ（化合物（Ｉ−１−８））を製造した。【０２３３】
【化１８】
2019107109.tif 000020
【０２３４】
（６’−Ｆ−Ａｕｘｉｎｏｌｅ（化合物（Ｉ−１−８））の合成）
３０ｍＬ丸底フラスコ内で、化合物（Ｉ−１ｂ−１）（０．４０ｇ、１．９６ｍｍｏｌ）をベンゼン（１０ｍＬ）で溶解させた。次いで、６−フルオロインドール（０．４０ｇ、２．９５ｍｍｏｌ）を加えて、８０℃で４時間撹拌した。室温まで冷却後、次いで、析出した結晶を桐山漏斗（登録商標）で集め、ベンゼン（１ｍＬ）で結晶を洗浄した。その後、結晶を減圧乾燥して、６’−Ｆ−Ａｕｘｉｎｏｌｅ（化合物（Ｉ−１−８）を得た（収量：０．４５ｇ、収率：６７％、融点：１７８〜１７９℃）。【０２３５】
得られた６’−Ｆ−Ａｕｘｉｎｏｌｅ（化合物（Ｉ−１−８）の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及びＦＡＢ−ＭＳ計による分析結果を以下に示す。
1H NMR (DMSO-d6) : 11.0 (brs, 1H) 7.79 (d, J=7.8, 1H), 7.64 (dd, J=11.4, 5.5, 1H), 7.31 (d, J=2.3, 1H), 7.13 (m, 3H), 6.87 (td, J=9.6, 2.7, 1H), 4.29 (dd, J=10.5 4.1, 1H) , 3.87 (dd, J=17.4, 10.9, 1H), 3.34 (dd, 18.0, 4.0), 2.37 (s, 3H), 2.31 (s, 3H).
13C NMR DMSO-d6) : 201.55, 174.65, (160.00, 157.67: JC-F=234 Hz), 141.44, 137.42, (136.14, 136.01: JC-F=12.4 Hz), 134.62, 132.31, 129.25, 126.40, 123.82, 123.07, (120.09, 119.99: JC-F=10.5 Hz), 112.1, (107.24, 107.00: JC-F=24.0 Hz), (97.52, 97.27: JC-F=25.8 Hz), 43.58, 37.98, 20.87, 20.85.
FAB-MS: m/z 340[M+H] +【０２３６】
［実施例１］タンパク質分解阻害剤のスクリーニング
１．細胞の準備
Ｔｅｔ−ＯｓＴＩＲ１遺伝子を含むプラスミドが導入されており、ＭＣＭ２−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ遺伝子が染色体上に挿入されているＨＣＴ１１６細胞（ヒト結腸腺癌由来細胞）（以下、「ＭＣＭ２−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞」と称する）を準備した。また、Ｔｅｔ−ＯｓＴＩＲ１遺伝子を含むプラスミドが導入されており、ＳＭＣ６−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ遺伝子が染色体上に挿入されているＨＣＴ１１６細胞（ヒト結腸腺癌由来細胞）（以下、「ＳＭＣ６−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞」と称する）を準備した。【０２３７】
なお、「Ｔｅｔ−ＯｓＴＩＲ１遺伝子」は、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）の存在により、発現が誘導されるイネ由来のＴＩＲ１遺伝子である。また、「ＭＣＭ２−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ遺伝子」は、ＭＣＭ２タンパク質、分解誘導性ペプチドであるミニＡＩＤタグ（ｍＡＩＤ）及び蛍光タンパク質であるｍＣｌｏｖｅｒの融合タンパク質を発現する遺伝子である。また、「ＳＭＣ６−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ遺伝子」は、ＳＭＣ６タンパク質、分解誘導性ペプチドであるミニＡＩＤタグ（ｍＡＩＤ）及び蛍光タンパク質であるｍＣｌｏｖｅｒの融合タンパク質を発現する遺伝子である。【０２３８】
２．ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）及びタンパク質分解阻害剤の添加
ＭＣＭ２−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞及びＳＭＣ６−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞にテトラサイクリン系抗生物質としてドキシサイクリン（Ｄｏｘ）（培地中の濃度：２μｇ／ｍＬ）と、タンパク質分解阻害剤候補化合物として、ＰＥＯ−ＩＡＡ（和光純薬工業社製）又は合成例１〜７で得られた各化合物（培地中の濃度：各１００μＭ）とを添加して、２４時間培養した。また、対照として、Ｄｏｘ及び候補化合物を添加していない細胞、Ｄｏｘのみを添加した細胞、Ｄｏｘ及び天然オーキシンであるＩＡＡを添加した細胞、Ｄｏｘ及びアンチオーキシンとして知られているパラクロロイソ酪酸（ＰＣＩＢ）を添加した細胞も準備した。【０２３９】
３．ＦＡＣＳ解析
各種化合物の添加から２４時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳ解析を行った。結果を図１に示す。図１において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」とは、Ｄｏｘのみを添加した細胞を示し、「Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ」とは、Ｄｏｘ及び候補化合物を添加していない細胞を示す。【０２４０】
図１から、ＰＥＯ−ＩＡＡ（和光純薬工業社製）又は合成例１〜７で得られた各化合物を添加したＭＣＭ２−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞及びＳＭＣ６−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞では、Ｄｏｘのみを添加したＭＣＭ２−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞及びＳＭＣ６−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞と比較して、ＭＣＭ２タンパク質及びＳＭＣ６タンパク質の分解が抑制されていた。
特に、ＭＣＭ２−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞では、Ａｕｘｉｎｏｌを添加した細胞において、ＭＣＭ２タンパク質の分解が顕著に抑制されていた。また、ＳＭＣ６−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞では、Ａｕｘｉｎｏｌ、ＰＥＯ−ＩＡＡ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ及び４Ｃｌ−ＰＥＯ−ＩＡＡを添加した細胞において、ＳＭＣ６タンパク質の分解が顕著に抑制されていた。【０２４１】
さらに、各種化合物の添加から２４時間後の細胞生存率から細胞毒性を評価したところ、Ａｕｘｉｎｏｌは、細胞毒性が低く、タンパク質の分解阻害効果が特に高いことが明らかとなった。【０２４２】
［実施例２］Ａｕｘｉｎｏｌｅを用いたオーキシン非依存性のタンパク質分解阻害の検討
実施例１の結果からＡｕｘｉｎｏｌを用いて、再度タンパク質の分解阻害効果を確認した。【０２４３】
１．細胞の準備
実施例１の「１．」に記載のＳＭＣ６−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞を準備した。【０２４４】
２．Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎｏｌｅの添加
ＳＭＣ６−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞にＤｏｘ及びＡｕｘｉｎｏｌｅを培地中の濃度がそれぞれ２μｇ／ｍＬ及び１００μＭとなるように添加して、２４時間培養した。対照として、Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎｏｌｅを添加していない細胞、Ｄｏｘのみを添加した細胞、Ｄｏｘ及び天然オーキシンであるＩＡＡを添加した細胞も準備した。【０２４５】
３．ＦＡＣＳ解析
Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎｏｌｅの添加から２４時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳ解析を行った。結果を図２に示す。図２において、「＋ＯｓＴＩＲ１」とは、Ｄｏｘのみを添加した細胞を示し、「Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ」とはＤｏｘ及びＡｕｘｉｎｏｌｅを添加していない細胞を示す。【０２４６】
図２から、Ａｕｘｉｎｏｌｅを添加したＳＭＣ６−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞では、Ｄｏｘのみを添加したＳＭＣ６−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞と比較して、ＳＭＣ６タンパク質の分解が抑制されることが確認された。【０２４７】
［参考例１］オーキシン非依存性のタンパク質分解
１．細胞の準備
Ｔｅｔ−ＯｓＴＩＲ１遺伝子を含むプラスミドが導入されており、ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ遺伝子が染色体上に挿入されているＨＣＴ１１６細胞（ヒト結腸腺癌由来細胞）（以下、「ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞」と称する）を準備した。【０２４８】
なお、「ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ遺伝子」はＤＨＣ１タンパク質、ｍＡＩＤ及びＣｌｏｖｅｒの融合タンパク質を発現する遺伝子である。また、「ＤＨＣ１」とはｄｙｎｅｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ１の略称であり、ダイニン重鎖１を意味する。【０２４９】
２．Ｔｅｔ又はＤｏｘ、及び、Ａｕｘｉｎの添加
ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞にＴｅｔ又はＤｏｘ（培地中の濃度：各２μｇ／ｍＬ）及びＡｕｘｉｎを添加して、７２時間培養した。対照として、Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎを添加しない細胞、Ｔｅｔ及びＡｕｘｉｎを添加しない細胞、Ｄｏｘを添加し、Ａｕｘｉｎを添加しない細胞、Ｔｅｔを添加し、Ａｕｘｉｎを添加しない細胞も準備した。【０２５０】
３．細胞数の測定
Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎ添加時に細胞数の測定し、さらに、Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎ添加から２４時間後、４８時間後、７２時間後、及び、９６時間後に細胞数を測定した。結果を図３Ａに示す。図３Ａにおいて、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」とは、Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎを添加しない細胞である。「＋ｄｏｘ」とは、Ｄｏｘを添加し、Ａｕｘｉｎを添加しない細胞である。【０２５１】
４．細胞の観察
Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎ添加から４８時間後に、Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎを添加しない細胞、並びに、Ｄｏｘを添加し、Ａｕｘｉｎを添加しない細胞を、顕微鏡（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、型番：ＶＯＳ  ＸＬ  Ｃｏｒｅ）を用いて観察した（倍率：１０倍）。結果を図３Ｂに示す。【０２５２】
５．ウエスタンブロッティングによる解析
Ｔｅｔ及びＡｕｘｉｎ添加から４２時間後に細胞を回収し、細胞破砕液を調製した。次いで、得られた細胞破砕液を用いて、ウエスタンブロッティングにより、抗ＤＨＣ１抗体、抗ＤＩＣ抗体及び抗ｐ１５０抗体を用いて、ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ、並びに、ＤＨＣ１と複合体を形成するＤＩＣ及びｐ１５０の発現量をそれぞれ解析した。結果を図３Ｃに示す。図３Ｃにおいて、「ＤＨＣ１−ｍＡＣ」とは、抗ＤＨＣ１抗体を用いて検出されたＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ融合タンパク質を示す。また、「ＤＩＣ」とは、ｄｙｎｅｉｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｃｈａｉｎの略称であり、ダイニン中間鎖を意味する。また、ｐ１５０とはダイナクチンのサブユニットである。【０２５３】
図３Ａから、Ｄｏｘを添加し、Ａｕｘｉｎを添加していない細胞において、Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎを添加していない細胞と比較して、細胞増殖の低下がみられた。このことから、Ｄｏｘの添加により発現が誘導されたＴＩＲ１により、ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ融合タンパク質が分解されていることが示唆された。【０２５４】
また、図３Ｂから、Ｄｏｘを添加し、Ａｕｘｉｎを添加していない細胞において、球状の細胞が観察された。このことから、Ｄｏｘの添加により発現が誘導されたＴＩＲ１により、ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ融合タンパク質が分解されることで、分裂期の細胞が蓄積していることが示唆された。【０２５５】
また、図３Ｃから、Ｔｅｔを添加し、Ａｕｘｉｎを添加していない細胞において、ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ融合タンパク質及びＤＩＣがほとんど検出されなかった。このことから、Ｔｅｔの添加により発現が誘導されたＴＩＲ１により、ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ融合タンパク質が分解されることが示唆された。【０２５６】
以上のことから、ＴＩＲ１によるオーキシン非依存性のタンパク質の分解の存在が示唆された。【０２５７】
［実施例３］Ａｕｘｉｎｏｌｅを用いたオーキシン非依存性のタンパク質分解阻害の検討２
参考例１で示唆されたＴＩＲ１によるオーキシン非依存性のタンパク質の分解を阻害するために、Ａｕｘｉｎｏｌｅの添加による阻害効果を検討した。【０２５８】
１．細胞の準備
参考例１の「１．」と同様に、ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞を準備した。【０２５９】
２．Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎｏｌｅの添加
次いで、ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞にＤｏｘ及びＡｕｘｉｎｏｌｅを培地中の濃度がそれぞれ２μｇ／ｍＬ及び１００μＭとなるように添加し、２４時間培養した。【０２６０】
３．細胞の観察
Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎｏｌｅの添加から２４時間後の細胞を、デコンボリューション蛍光顕微鏡（横河電機社製、型番：ＣＶ１０００）を用いて観察した（倍率：６０倍）。結果を図４に示す。図４において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」とは、Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎを添加せず、代わりにジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ＤＭＳＯ）を２μｇ／ｍＬとなるように添加した細胞である。「＋Ｄｏｘ」とは、Ｄｏｘのみを添加した細胞である。「＋Ｄｏｘ  ａｎｄ  ａｕｘｉｎｏｌｅ」はＤｏｘ及びＡｕｘｉｎｏｌｅを添加した細胞である。【０２６１】
図４の上（蛍光顕微鏡像）から、Ａｕｘｉｎｏｌｅの添加により、ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒの分解の抑制が確認された。【０２６２】
また、図４の下（明視野像）から、Ａｕｘｉｎｏｌｅの添加により、分裂期細胞の蓄積が抑制されていることが確認された。【０２６３】
［実施例４］Ａｕｘｉｎｏｌｅを用いた目的タンパク質の分解制御の検討
Ａｕｘｉｎｏｌｅを用いた目的タンパク質の分解制御を検討した。【０２６４】
１．細胞の準備
参考例１の「１．」と同様に、ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞を準備した。【０２６５】
２．細胞の観察
ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞にＤｏｘ及びＡｕｘｉｎｏｌｅを培地中の濃度がそれぞれ２μｇ／ｍＬ及び１００μＭとなるように添加し、４８時間培養した。Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎｏｌｅの添加から４８時間後の細胞を、デコンボリューション蛍光顕微鏡（横河電機社製、型番：ＣＶ１０００）を用いて観察した（倍率：６０倍）。結果を図５Ａに示す。図５Ａにおいて、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」とは、Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎｏｌｅを添加せず、代わりにＤＭＳＯを培地中の濃度が２μｇ／ｍＬとなるように添加した細胞である。「＋Ｄｏｘ」とは、Ｄｏｘを添加した細胞である。「＋ａｕｘｉｎｏｌｅ」とは、ａｕｘｉｎｏｌｅを添加した細胞である。【０２６６】
図５Ａから、Ｄｏｘを添加し、Ａｕｘｉｎｏｌｅを添加していない細胞において、球状の細胞が観察された。このことから、Ｄｏｘの添加により発現が誘導されたＴＩＲ１により、ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ融合タンパク質が分解されることで、分裂期の細胞が蓄積していることが示唆された。
一方、Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎｏｌｅを添加した細胞では、Ｃｏｎｔｒｏｌと比較して大きな変化は見られなかった。よって、Ａｕｘｉｎｏｌｅの添加により、分裂期細胞の蓄積が抑制されていることが確認された。【０２６７】
３．ＦＡＣＳ解析
図５Ｂに示すように、以下のプロトコールに従って、ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞を培養し、ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ融合タンパク質の分解制御を検討した。まず、Ｄｏｘのみを培地中の濃度が２μｇ／ｍＬとなるように添加、又は、Ｄｏｘ及びＡｕｘｉｎｏｌｅを培地中の濃度がそれぞれ２μｇ／ｍＬ及び１００μＭとなるように添加して、２４時間培養した。次いで、Ａｕｘｉｎを培地中の濃度が５００μＭとなるように添加し、Ａｕｘｉｎの添加から１時間後及び４時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳ解析を行った。また、試験開始前の細胞、Ｄｏｘのみを添加又はＤｏｘ及びＡｕｘｉｎｏｌｅを添加して２４時間培養した細胞も同様に回収し、ＦＡＣＳ解析を行った。結果を図５Ｂに示す。【０２６８】
図５Ｂから、Ａｕｘｉｎｏｌｅを添加したＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞では、Ｄｏｘのみを添加したＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞と比較して、ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ融合タンパク質のＯｓＴＩＲ１によるオーキシン非依存性の分解が抑制されており、オーキシン添加後には、ＤＨＣ１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ融合タンパク質を素早く分解できることが確認された。【０２６９】
［実施例６］Ａｕｘｉｎｏｌｅを用いた目的タンパク質の発現制御の検討
Ａｕｘｉｎｏｌｅを用いた目的タンパク質の発現制御を検討した。【０２７０】
１．細胞の準備
ＣＭＶ−ＯｓＴＩＲ１遺伝子を含むプラスミドが導入されており、ＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ遺伝子が染色体上に挿入されているＨＣＴ１１６細胞（ヒト結腸腺癌由来細胞）（以下、「ＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞」と称する）を準備した。【０２７１】
なお、「ＣＭＶ−ＯｓＴＩＲ１遺伝子」は、ＣＭＶプロモーターの制御下にあるイネ由来のＴＩＲ１遺伝子であり、細胞内においてＯｓＴＩＲ１タンパク質が恒常的に発現している。また、「ＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ遺伝子」は、ＲＡＤ２１タンパク質、分解誘導性ペプチドであるミニＡＩＤタグ（ｍＡＩＤ）及び蛍光タンパク質であるｍＣｌｏｖｅｒの融合タンパク質を発現する遺伝子である。また、「ＲＡＤ２１」とは、コヒーシン複合体の構成タンパク質の一つである。【０２７２】
２．ＦＡＣＳ解析
図６に示すように、以下のプロトコールに従って、ＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞を培養し、ＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ融合タンパク質の発現制御を検討した。まず、Ａｕｘｉｎを培地中の濃度が１００μＭとなるように添加し、２時間培養した。次いで、Ａｕｘｉｎを含む培養液を取り除き、Ａｕｘｉｎｏｌｅを培地中の濃度が１００μＭとなるように添加した培地、又は、Ａｕｘｉｎｏｌｅを添加しない培地に交換して、培養した。培地交換から１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後及び６時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳ解析を行った。結果を図６に示す。【０２７３】
図６から、Ａｕｘｉｎｏｌｅを添加したＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞では、Ａｕｘｉｎｏｌｅを添加しなかったＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ発現細胞と比較して、ＲＡＤ２１−ｍＡＩＤ−ｍＣｌｏｖｅｒ融合タンパク質の発現を素早く回復できることが確認された。【０２７４】
以上の結果から、本実施形態のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤を用いることで、オーキシン非依存性のＴＩＲ１によるタンパク質分解が阻害できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０２７５】
本実施形態のオーキシンデグロンシステムにおけるタンパク質分解阻害剤によれば、オーキシン非依存的なＴＩＲ１及びｍＡＩＤの結合を阻害することができる。本実施形態のオーキシンデグロンシステムのキット及び目的タンパク質分解制御方法によれば、厳密かつ自在にタンパク質の分解制御が可能である。
【図１】
2019107109.tif 000026
【図２】
2019107109.tif 000027
【図３Ａ】
2019107109.tif 000028
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2019107109.tif 000030
【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
2019107109.tif 000034
【国際調査報告】
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