(57)【要約】  細胞画像処理装置（１）は、時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、入力された画像の内のいずれか２枚の評価画像を処理して評価画像の所定の計数領域内の単位時間当たりの細胞の量の変化を表す増殖パラメータを算出する増殖パラメータ算出部（４）と、各評価画像の計数領域の単位時間当たりの細胞の流入量または流出量を表す遊走パラメータを算出する遊走パラメータ算出部（６）と、過去の増殖パラメータおよび過去の遊走パラメータに基づいて、計数領域の大きさを算出する領域サイズ算出部（８）と、領域サイズ算出部（８）により算出された大きさの計数領域について算出された増殖パラメータおよび遊走パラメータに基づいて、細胞増殖率を算出する増殖率算出部（７）とを備える。
2019135267.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、
入力された前記画像の内のいずれか２枚の評価画像を処理して該評価画像の所定の計数領域内の単位時間当たりの前記細胞の量の変化を表す増殖パラメータを算出する増殖パラメータ算出部と、
各前記評価画像の前記計数領域の単位時間当たりの前記細胞の流入量または流出量を表す遊走パラメータを算出する遊走パラメータ算出部と、
過去の前記増殖パラメータおよび過去の前記遊走パラメータに基づいて、前記計数領域の大きさを算出する領域サイズ算出部と、
該領域サイズ算出部により算出された大きさの前記計数領域について算出された前記増殖パラメータおよび前記遊走パラメータに基づいて、細胞増殖率を算出する増殖率算出部とを備える細胞画像処理装置。
【請求項２】
前記増殖パラメータ算出部が、単位時間当たりに前記計数領域内において増加した細胞数を前記増殖パラメータとして算出する請求項１に記載の細胞画像処理装置。
【請求項３】
前記遊走パラメータ算出部が、単位時間当たりに前記計数領域の外縁から流入した細胞数と流出した細胞数との差を前記遊走パラメータとして算出する請求項１または請求項２に記載の細胞画像処理装置。
【請求項４】
前記領域サイズ算出部が、過去の前記増殖パラメータに対する過去の前記遊走パラメータの比率と所定の許容誤差とを比較して、前記計数領域の大きさの下限を算出する請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞画像処理装置。
【請求項５】
前記計数領域が長方形である請求項１から請求項４のいずれかに記載の細胞画像処理装置。
【請求項６】
時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力されるプロセッサを備え、
該プロセッサが、過去の所定の計数領域内の単位時間当たりの前記細胞の量の変化を表す増殖パラメータおよび過去の前記計数領域の単位時間当たりの前記細胞の流入量または流出量を表す遊走パラメータに基づいて、前記計数領域の大きさを算出し、算出された大きさの前記計数領域を用いて、入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の前記計数領域内の前記増殖パラメータおよび前記遊走パラメータを算出する細胞画像処理装置。
【請求項７】
時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、
入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の所定の計数領域内の単位時間当たりの前記細胞の量の変化を表す増殖パラメータを算出する増殖パラメータ算出ステップと、
各前記画像の前記計数領域の単位時間当たりの前記細胞の流入量または流出量を表す遊走パラメータを算出する遊走パラメータ算出ステップと、
過去の前記増殖パラメータおよび過去の前記遊走パラメータに基づいて、前記計数領域の大きさを算出する領域サイズ算出ステップと、
該領域サイズ算出ステップにより算出された大きさの前記計数領域について算出された前記増殖パラメータおよび前記遊走パラメータに基づいて、細胞増殖率を算出する増殖率算出ステップとを含む細胞画像処理方法。
【請求項８】
時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、
入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の所定の計数領域内の単位時間当たりの前記細胞の量の変化を表す増殖パラメータを算出する増殖パラメータ算出ステップと、
各前記画像の前記計数領域の単位時間当たりの前記細胞の流入量または流出量を表す遊走パラメータを算出する遊走パラメータ算出ステップと、
過去の前記増殖パラメータおよび過去の前記遊走パラメータに基づいて、前記計数領域の大きさを算出する領域サイズ算出ステップと、
該領域サイズ算出ステップにより算出された大きさの前記計数領域について算出された前記増殖パラメータおよび前記遊走パラメータに基づいて、細胞増殖率を算出する増殖率算出ステップとをコンピュータに実行させる細胞画像処理プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養画像処理装置、細胞画像処理方法および細胞画像処理プログラムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞の増殖の経時変化を定量的に観察するために、細胞の画像を解析して細胞の状況変化を表すパラメータを取得する技術が知られている（例えば、特許文献１参照。）。具体的には、画像内の細胞の占める面積の割合であるコンフルエント率に基づいて継代のタイミングを判定している。【０００３】
また、コロニーの形成など細胞の凝集と細胞分裂との関係を観察するために、細胞の凝集を表すパラメータとして注目画素と周辺画素の位置関係の統計量を取得する技術が知られている（例えば、特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２０１６／０９８２７１号公報
【特許文献２】特開２００９−２２９２７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞の培養を精度よく管理するには、細胞が増殖しているか否かを精度よく検出する必要がある。しかしながら、特許文献１のようなコンフルエント率や特許文献２のような注目細胞周辺での細胞の凝集などのパラメータを取得しただけでは細胞の増殖を精度よく検出することはできないという不都合がある。【０００６】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞の増殖を精度よく検出して、細胞の培養を精度よく管理することができる細胞画像処理装置、細胞画像処理方法および細胞画像処理プログラムを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様は、時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、入力された前記画像の内のいずれか２枚の評価画像を処理して該評価画像の所定の計数領域内の単位時間当たりの前記細胞の量の変化を表す増殖パラメータを算出する増殖パラメータ算出部と、各前記評価画像の前記計数領域の単位時間当たりの前記細胞の流入量または流出量を表す遊走パラメータを算出する遊走パラメータ算出部と、過去の前記増殖パラメータおよび過去の前記遊走パラメータに基づいて、前記計数領域の大きさを算出する領域サイズ算出部と、該領域サイズ算出部により算出された大きさの前記計数領域について算出された前記増殖パラメータおよび前記遊走パラメータに基づいて、細胞増殖率を算出する増殖率算出部とを備える細胞画像処理装置である。【０００８】
本態様によれば、時間間隔をあけて撮影することにより取得された複数枚の画像が入力されると、入力された画像の内のいずれか２枚の評価画像が増殖パラメータ算出部により処理されて計数領域内の増殖パラメータが算出される。また、評価画像が遊走パラメータ算出部により処理されて計数領域の遊走パラメータが算出される。【０００９】
そして、領域サイズ算出部により、過去の増殖パラメータおよび過去の遊走パラメータに基づいて計数領域の大きさが算出され、算出された大きさの計数領域について算出された増殖パラメータおよび遊走パラメータに基づいて増殖率算出部により処理されて細胞増殖率が算出される。
細胞増殖率が、時間間隔をあけた２枚の画像における細胞量の変化を示す増殖パラメータのみならず、細胞流入量および細胞流出量を表す遊走パラメータをも考慮して求められるので、細胞分裂による細胞の増殖の度合をより精度よく検出して、細胞培養を精度よく管理することができる。【００１０】
この場合において、増殖パラメータは計数領域の面積に比例し、遊走パラメータは計数領域の周囲長に比例するので、計数領域が小さくなればなるほど、細胞増殖率の算出における遊走パラメータの影響が大きくなり誤差が大きくなる。したがって、適正な大きさに設定された計数領域について算出された増殖パラメータおよび遊走パラメータに基づいて細胞増殖率を算出することにより、細胞増殖率を精度よく算出することができる。【００１１】
ここで、評価画像と増殖測定画像とは、同じ画像を用いてもよいし異なる画像を用いてもよい。すなわち、２枚の評価画像の時間間隔と２枚の増殖測定画像の時間間隔は、それぞれ同じであっても異なっていてもよい。例えば、評価画像については隣接する全ての２枚の画像を用いてもよいし、周期的にあるいは非周期的に選択した２枚の画像を用いてもよい。【００１２】
上記態様においては、前記増殖パラメータ算出部が、単位時間当たりに前記計数領域内において増加した細胞数を前記増殖パラメータとして算出してもよい。
このようにすることで、時間間隔をあけて取得された２枚の評価画像を処理してそれぞれの計数領域内に存在する細胞数を計数してその差分を時間間隔で除算することにより簡易に増殖パラメータを算出することができる。【００１３】
また、上記態様においては、前記遊走パラメータ算出部が、単位時間当たりに前記計数領域の外縁から流入した細胞数と流出した細胞数との差を前記遊走パラメータとして算出してもよい。
このようにすることで、時間間隔をあけて取得された２枚の評価画像を処理してそれぞれの計数領域の外縁を超えて流入した細胞数および流出した細胞数を計数してその差分を時間間隔で除算することにより簡易に遊走パラメータを算出することができる。【００１４】
また、上記態様においては、前記領域サイズ算出部が、過去の前記増殖パラメータに対する過去の前記遊走パラメータの比率と所定の許容誤差とを比較して、前記計数領域の大きさの下限を算出してもよい。
このようにすることで、増殖率算出部により、許容誤差以下の精度の高い細胞増殖率を算出することができる。【００１５】
また、上記態様においては、前記計数領域が長方形であってもよい。
このようにすることで、増殖パラメータ、遊走パラメータおよび細胞増殖率を簡易に算出することができる。【００１６】
また、本発明の他の態様は、時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力されるプロセッサを備え、該プロセッサが、過去の所定の計数領域内の単位時間当たりの前記細胞の量の変化を表す増殖パラメータおよび過去の前記計数領域の単位時間当たりの前記細胞の流入量または流出量を表す遊走パラメータに基づいて、前記計数領域の大きさを算出し、算出された大きさの前記計数領域を用いて、入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の前記計数領域内の前記増殖パラメータおよび前記遊走パラメータを算出する細胞画像処理装置である。【００１７】
また、本発明の他の態様は、時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の所定の計数領域内の単位時間当たりの前記細胞の量の変化を表す増殖パラメータを算出する増殖パラメータ算出ステップと、各前記画像の前記計数領域の単位時間当たりの前記細胞の流入量または流出量を表す遊走パラメータを算出する遊走パラメータ算出ステップと、過去の前記増殖パラメータおよび過去の前記遊走パラメータに基づいて、前記計数領域の大きさを算出する領域サイズ算出ステップと、該領域サイズ算出ステップにより算出された大きさの前記計数領域について算出された前記増殖パラメータおよび前記遊走パラメータに基づいて、細胞増殖率を算出する増殖率算出ステップとを含む細胞画像処理方法である。【００１８】
また、本発明の他の態様は、時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の所定の計数領域内の単位時間当たりの前記細胞の量の変化を表す増殖パラメータを算出する増殖パラメータ算出ステップと、各前記画像の前記計数領域の単位時間当たりの前記細胞の流入量または流出量を表す遊走パラメータを算出する遊走パラメータ算出ステップと、過去の前記増殖パラメータおよび過去の前記遊走パラメータに基づいて、前記計数領域の大きさを算出する領域サイズ算出ステップと、該領域サイズ算出ステップにより算出された大きさの前記計数領域について算出された前記増殖パラメータおよび前記遊走パラメータに基づいて、細胞増殖率を算出する増殖率算出ステップとをコンピュータに実行させる細胞画像処理プログラムである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、細胞の増殖を精度よく検出して、細胞の培養を精度よく管理することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞画像処理装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の細胞画像処理装置における細胞数変化率算出部の作用を説明する図である。
【図３】図１の細胞画像処理装置における細胞流入率算出部および細胞流出率算出部の作用を説明する図である。
【図４】図１の細胞画像処理装置における増殖率算出部の作用を説明する図である。
【図５】図３の細胞流入あるいは細胞流出を判定する閾値の例を説明する図である。
【図６】図１の細胞画像処理装置を用いた細胞が像処理方法を説明するフローチャートである。
【図７】図１の細胞画像処理装置の変形例による処理を説明する図である。
【図８】図７の細胞画像処理装置を示す全体構成図である。
【図９】図７の細胞画像処理装置を用いた細胞が像処理方法を説明するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の一実施形態に係る細胞画像処理装置１、細胞画像処理方法および細胞画像処理プログラムについて、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞画像処理装置１は、図１に示されるように、顕微鏡等の撮像部５０により時間間隔をあけた撮影により取得された複数枚の画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１が入力され、細胞Ｘの増殖率等の情報をモニタ等の表示部６０に向けて出力する装置である。
【００２２】
細胞画像処理装置１は、撮像部５０から入力されてきた画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１をその画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１を撮影した時刻情報と対応づけて逐次記憶するメモリ２と、メモリ２に記憶された画像を処理する処理部３とを備えている。
処理部３は、メモリ２に記憶されている画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１を処理して、画像（評価画像）Ｐｎ，Ｐｎ＋１内の所定の計数領域Ｒ内における細胞数の単位時間当たりの変化率である細胞数変化率（増殖パラメータ）を算出する細胞数変化率算出部（増殖パラメータ算出部）４と、画像（評価画像）Ｐｎ，Ｐｎ＋１内の計数領域Ｒ内への単位時間当たりの細胞Ｘの流入数である細胞流入率（遊走パラメータ）を算出する細胞流入率算出部（遊走パラメータ算出部）５と、画像（評価画像）Ｐｎ，Ｐｎ＋１内の計数領域Ｒ内からの単位時間当たりの細胞Ｘの流出数である細胞流出率（遊走パラメータ）を算出する細胞流出率算出部（遊走パラメータ算出部）６と、算出された細胞数変化率、細胞流入率および細胞流出率から増殖測定画像内の計数領域Ｒにおける細胞増殖率を算出する増殖率算出部７とを備えている。
また、本実施形態に係る細胞画像処理装置１は、計数領域Ｒの大きさを設定する領域サイズ算出部８を備えている。
【００２３】
細胞数変化率算出部４は、図２に示されるように、第１時間Δｔ１だけ時間間隔をあけて取得された２枚の画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１内の計数領域Ｒにおける細胞数Ｎｎ，Ｎｎ＋１をそれぞれ計数し、各画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１において計数された細胞数Ｎｎ，Ｎｎ＋１の差分を第１時間Δｔ１で除算することにより、単位時間当たりの細胞数Ｎｎ，Ｎｎ＋１の変化率である細胞数変化率ΔＮ／Δｔを算出するようになっている。
【００２４】
細胞流入率算出部５は、図３に示されるように、第２時間Δｔ２だけ時間間隔をあけて取得された２枚の画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１に基づいて画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１内の計数領域Ｒに、隣接する領域から境界を横切って進入した細胞Ｘの流入数ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１を計数し、計数された細胞Ｘの流入数ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１を第２時間Δｔ２で除算することにより、単位時間当たりの細胞Ｘの流入数ΔＮＭＯＶＥＩＮである細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮ／Δｔ２を算出するようになっている。
【００２５】
細胞流出率算出部６も、図３に示されるように、第２時間Δｔ２だけ時間間隔をあけて取得された２枚の画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１に基づいて画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１内の計数領域Ｒから隣接する領域に境界を横切って退出した細胞Ｘの流出数ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１を計数し、計数された細胞Ｘの流出数ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１を第２時間Δｔ２で除算することにより、単位時間当たりの細胞Ｘの流出数ΔＮＭＯＶＥＯＵＴである細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴ／Δｔ２を算出するようになっている。
【００２６】
細胞Ｘの計数領域Ｒへの流入および計数領域Ｒからの流出を算出するための第２時間Δｔ２は、下式の条件式（１）を満たすことが好ましい。
Δｔ２≦Ｄ／Ｖ      （１）
ここで、Ｄは細胞Ｘの長さ、Ｖは細胞Ｘの遊走速度である。
【００２７】
細胞Ｘの長さＤおよび遊走速度Ｖとしては過去の計数時の基準値に設定してもよいし、計数領域Ｒ内の平均値に設定してもよい。また、図５に示されるように、進入または退出を判定する長さの閾値Ｅを用いて、計数領域Ｒと隣接領域との境界から閾値Ｅだけ細胞Ｘが入ったら進入と判断し、境界から閾値Ｅだけ細胞Ｘが計数領域Ｒから隣接領域へ出たら退出と判断してもよい。
【００２８】
領域サイズ算出部８は、細胞Ｘ毎に算出された過去の細胞増殖率ΔＮＢＩＲＴＨ／Δｔ、過去の細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮ／Δｔおよび過去の細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴ／Δｔを記憶するメモリ２に接続され、メモリ２に記憶されている過去の細胞増殖率ΔＮＢＩＲＴＨ／Δｔ、細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮ／Δｔおよび細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴ／Δｔに基づいて、誤差評価の指標が所定の許容誤差Ｋａ以下となるように計数領域Ｒの大きさを決定するようになっている。
【００２９】
具体的には、以下の条件式が成立する。
ΔＮＢＩＲＴＨ／Δｔ＝Ａ×Ｌ２        （２）
（ΔＮＭＯＶＥＩＮ−ΔＮＭＯＶＥＯＵＴ）／Δｔ＝４×Ｌ×（Ｂ−Ｃ）        （３）
Ｋ＝（（ΔＮＭＯＶＥＩＮ−ΔＮＭＯＶＥＯＵＴ）／Δｔ）／（ΔＮＢＩＲＴＨ／Δｔ）
＝４（Ｂ−Ｃ）／Ａ×Ｌ        （４）
ここで、
Ａは計数領域Ｒにおいて、単位面積当たり単位時間に発生する細胞数、
Ｂは計数領域Ｒの境界線において、単位長さ当たり単位時間に計数領域Ｒに進入する細胞数、
Ｃは計数領域Ｒの境界線において、単位長さ当たり単位時間に計数領域Ｒから退出する細胞数、
Ｌは正方形からなる計数領域Ｒの一辺の長さである。
【００３０】
領域サイズ算出部８は、計数の許容誤差をＫａとして、条件式（４）を変形して得られる下記の条件式（５）を用いて、計数領域Ｒの一辺の長さＬ（大きさ）を算出するようになっている。
Ｌ＝４（Ｂ−Ｃ）／Ａ×Ｋａ        （５）
【００３１】
メモリ２には過去に算出され、あるいは細胞Ｘ毎に定められた過去の細胞増殖率ΔＮＢＩＲＴＨ／Δｔを表す過去の細胞数Ａ，Ｂ，Ｃ、および計数の許容誤差Ｋａが記憶されている。
領域サイズ算出部８は、過去の細胞数Ａ，Ｂ，Ｃおよび許容誤差Ｋａをメモリ２から読み出し、読み出された細胞数Ａ，Ｂ，Ｃおよび許容誤差Ｋａを用いて条件式（５）を用いて計数領域Ｒの一辺の長さを算出するようになっている。
【００３２】
増殖率算出部７は、図４に示されるように、計数領域Ｒにおける単位時間当たりの細胞分裂数である細胞増殖率ΔＮＢＩＲＴＨ／Δｔを算出するようになっている。具体的には、下式（６）により細胞数変化率ΔＮ／Δｔから細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮ／Δｔを減算し、細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴ／Δｔを加算することにより、細胞増殖率ΔＮＢＩＲＴＨ／Δｔを算出するようになっている。
ΔＮＢＩＲＴＨ／Δｔ＝ΔＮ／Δｔ−ΔＮＭＯＶＥＩＮ／Δｔ＋ΔＮＭＯＶＥＯＵＴ／Δｔ      （６）
【００３３】
このように構成された本実施形態に係る細胞画像処理装置１を用いた細胞画像処理方法について以下に説明する。
ここでは、本実施形態に係る細胞画像処理方法を、
Δｔ１＝Δｔ２＝Δｔ
として説明する。
【００３４】
まず、図６に示されるように、計数の開始時刻ｔ１、終了時刻ｔｍおよび計数の時間間隔Δｔが設定される（ステップＳ１）。
次に、メモリ２から細胞数Ａ，Ｂ，Ｃおよび許容誤差Ｋａが読み出される（ステップＳ２）。そして、読み出された細胞数Ａ，Ｂ，Ｃおよび許容誤差Ｋａを用いて計数領域Ｒの一辺の長さＬが算出される（領域サイズ算出ステップＳ３）。
【００３５】
次に、カウンタｎ＝１が設定され（ステップＳ４）、時刻ｔｎにおいて取得された画像Ｐｎが細胞数変化率算出部４において処理されて、一辺の長さＬの正方形の計数領域Ｒ内の細胞数Ｎｎが計数される（増殖パラメータ算出ステップＳ５）。さらに、時刻ｔｎから時間間隔Δｔだけ経過した時刻ｔｎ＋１において取得された画像Ｐｎ＋１が細胞数変化率算出部４において処理されて計数領域Ｒ内の細胞数Ｎｎ＋１が計数される（増殖パラメータ算出ステップＳ６）。
【００３６】
次いで、画像Ｐｎと画像Ｐｎ＋１が用いられて両者の対比により、計数領域Ｒ外から計数領域Ｒ内に進入してきた細胞数ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１と計数領域Ｒ内から計数領域Ｒ外に退出した細胞数ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１とが算出される（遊走パラメータ算出ステップＳ７，Ｓ８）。
そして、増殖率算出部７において、下式（７）により単位時間当たりの細胞増殖率ΔＮＢＩＲＴＨｎ＋１／Δｔが算出される（増殖率算出ステップＳ９）。
ΔＮＢＩＲＴＨｎ＋１／Δｔ
＝（Ｎｎ＋１−Ｎｎ）／Δｔ−ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１／Δｔ＋ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１／Δｔ  （７）
【００３７】
ここで、細胞数変化率ΔＮ／Δｔ、細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１／Δｔ、細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１／Δｔおよび細胞増殖率ΔＮＢＩＲＴＨｎ＋１／Δｔは、全て、同じ隣接画像に基づいて算出しているので、上式（７）の全ての項には分母にΔｔが存在する。したがって、全ての項にΔｔを乗算して、以下の条件式（８）に等価的に変換することができる。
ΔＮＢＩＲＴＨｎ＋１＝（Ｎｎ＋１−Ｎｎ）−ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１＋ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１        （８）
【００３８】
計数された細胞数Ｎｎ＋１および算出された増殖細胞数ΔＮＢＩＲＴＨｎ＋１は表示部６０に出力されて、横軸を時間とした時間変化を表すグラフとして表示される（ステップＳ１０）。これとともに、カウンタｎがｎ＝ｍか否かが判定され（ステップＳ１１）、ｎ＜ｍである場合には、ｎがインクリメントされてステップＳ５からの工程が繰り返される（ステップＳ１２）。
【００３９】
このように構成された本実施形態に係る細胞画像処理装置１および細胞が像処理方法によれば、細胞増殖率ΔＮＢＩＲＴＨｎ＋１／Δｔが、時間間隔Δｔをあけた２枚の画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１における細胞数変化率ΔＮ／Δｔのみならず、細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１／Δｔおよび細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１／Δｔをも考慮して求められるので、細胞分裂による細胞Ｘの増殖の度合をより精度よく検出して、細胞培養を精度よく管理することができるという利点がある。
【００４０】
また、本実施形態においては、細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１／Δｔ２および細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１／Δｔ２を算出するための第２時間Δｔ２については、条件式（１）を満足することにより、計数領域Ｒに進入する細胞Ｘおよび退出する細胞Ｘを適正に検出することができる。すなわち、Δｔ２が短すぎると多数の画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１について逐一細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１／Δｔ２および細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１／Δｔ２を算出する必要があり、データ量が増加して計数の負担が大きくなる一方、Δｔ２が長すぎると細胞Ｘの遊走を捕捉できず、細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１／Δｔ２および細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１／Δｔ２が算出できなくなるが、条件式（１）を満たすことによりそのような不都合はない。
【００４１】
なお、本実施形態に係る細胞画像処理装置１の説明では、Δｔ１＝Δｔ２＝Δｔ、第１領域＝第２領域＝計数領域Ｒとして説明したが、異なっていてもよい。この場合、細胞数変化率ΔＮ／Δｔ１を算出するための時間Δｔ１は最も短く設定し、細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１／Δｔ２および細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１／Δｔ２を算出するための時間Δｔ２は時間Δｔ１より大きく条件式（１）を満たす適正な時間に設定することが好ましい。
【００４２】
また、本実施形態においては、処理部３が細胞数変化率算出部４、細胞流入率算出部５、細胞流出率算出部６、増殖率算出部７および領域サイズ算出部８を備えることとした、処理部３は、電気回路によって構成してもよいし、１以上のプロセッサによって構成してもよい。
プロセッサにより構成する場合、本発明は、増殖パラメータ算出ステップＳ５，Ｓ６、遊走パラメータ算出ステップＳ７，Ｓ８および増殖率算出ステップＳ９および領域サイズ算出ステップＳ３をコンピュータにより実行可能な細胞画像処理プログラムにより構成してもよい。
【００４３】
また、本実施形態においては、図７から図９に示されるように、計数領域Ｒ内における単位時間当たりの細胞Ｘの死亡数である細胞死亡率ΔＮＤＥＡＴＨｎ＋１／Δｔを算出する細胞死亡率算出部９をさらに備えていてもよい。
この場合には、増殖率算出部７は、下式（９）により細胞増殖率ΔＮＢＩＲＴＨｎ＋１／Δｔを算出すればよい（ステップＳ１３）。
ΔＮＢＩＲＴＨｎ＋１／Δｔ
＝（Ｎｎ＋１−Ｎｎ）／Δｔ−ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１／Δｔ
＋ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１／Δｔ＋ΔＮＤＥＡＴＨｎ＋１／Δｔ  （９）
【００４４】
このようにすることで、細胞Ｘが死亡する事象が発生する環境下においても、細胞分裂による細胞Ｘの増殖の度合をより精度よく検出して、細胞培養を精度よく管理することができるという利点がある。
ここで、細胞Ｘとして培養容器の底面に接着して増殖する細胞Ｘを観察している場合には、細胞Ｘの死亡数ΔＮＢＩＲＴＨｎ＋１は、底面に接着できずに浮遊した細胞数Ｎｎ＋１を計数することにより容易に検出することができる。
【００４５】
また、本実施形態においては、表示部６０に、計数された細胞数Ｎおよび算出された増殖細胞数ΔＮＢＩＲＴＨの時間変化をグラフ表示することとしたが、これに代えて、あるいは、これに加えて、細胞Ｘの死亡数ΔＮＤＥＡＴＨ、細胞流入数ΔＮＭＯＶＥＩＮおよび細胞Ｘの流出数ΔＮＭＯＶＥＯＵＴの少なくとも１つをグラフ表示することにしてもよい。
【００４６】
また、本実施形態においては、増殖パラメータとして細胞増殖率ΔＮＢＩＲＴＨｎ＋１／Δｔを例示したが、これに代えて、計数領域Ｒの面積に対する細胞領域の面積の割合であるコンフルエンシーの変化率を採用してもよい。
また、遊走パラメータとして、細胞流入率ΔＮＭＯＶＥＩＮｎ＋１／Δｔと細胞流出率ΔＮＭＯＶＥＯＵＴｎ＋１／Δｔとの差分を例示したが、これに代えて、計数領域Ｒを撮影した２枚の画像Ｐｎ，Ｐｎ＋１の射影変換の変換パラメータである画像変形量、あるいは、画像処理で検出したいくつかの注目細胞の移動量の平均値である注目細胞移動量を採用してもよい。
【００４７】
また、本実施形態においては、過去の増殖パラメータおよび遊走パラメータと許容誤差Ｋａとに基づいて計数領域Ｒの大きさを算出することとしたが、計数領域Ｒの大きさが予め定められている場合に、誤差の大きさを見積もることにしてもよい。
【００４８】
また、本実施形態においては、計数領域Ｒの大きさとして、正方形の計数領域Ｒの一辺の長さＬを算出することとしたが、これに代えて、計数領域Ｒが円形の場合、半径ｒの長さを下式（１０）により算出することにしてもよい。
ｒ＝２×（Ｂ−Ｃ）／（Ａ×Ｋ）              （１０）
【００４９】
また、長辺Ｌ１と短辺Ｌ２とを有する長方形の計数領域Ｒの、例えば、長辺Ｌ１を規定して短辺Ｌ２を下式（１１）により算出することにしてもよい。
Ｌ２＝２×（Ｂ−Ｃ）×Ｌ１／（Ａ×Ｌ１×Ｋ＋２×（Ｃ−Ｂ））          （１１）
【符号の説明】
【００５０】
１  細胞画像処理装置
４  細胞数変化率算出部（増殖パラメータ算出部）
５  細胞流入率算出部（遊走パラメータ算出部）
６  細胞流出率算出部（遊走パラメータ算出部）
７  増殖率算出部（増殖率算出部）
Ｘ  細胞
Ｎｎ，Ｎｎ＋１  細胞数
ΔＮ／Δｔ  細胞数変化率
ΔＮＭＯＶＥＯＵＴ／Δｔ，ΔＮＭＯＶＥＩＮ／Δｔ２  細胞流入率（遊走パラメータ）
ΔＮＭＯＶＥＯＵＴ／Δｔ，ΔＮＭＯＶＥＯＵＴ／Δｔ２  細胞流出率（遊走パラメータ）
ΔＮＢＩＲＴＨ／Δｔ  細胞増殖率（増殖パラメータ）
Ｐｎ，Ｐｎ＋１  画像（評価画像）
Ｓ３  領域サイズ算出ステップ
Ｓ５，Ｓ６  増殖パラメータ算出ステップ
Ｓ７，Ｓ８  遊走パラメータ算出ステップ
Ｓ９  増殖率算出ステップ
【図１】
2019135267.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月2日(2020.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、
入力された前記画像の内のいずれか２枚の評価画像を処理して該評価画像の所定の計数領域内の単位時間当たりの前記細胞の量の変化を表す増殖パラメータを算出する増殖パラメータ算出部と、
各前記評価画像の前記計数領域の単位時間当たりの前記細胞の流入量または流出量を表す遊走パラメータを算出する遊走パラメータ算出部と、
過去の前記増殖パラメータおよび過去の前記遊走パラメータに基づいて、前記計数領域の大きさを算出する領域サイズ算出部と、
該領域サイズ算出部により算出された大きさの前記計数領域について算出された前記増殖パラメータおよび前記遊走パラメータに基づいて、細胞増殖率を算出する増殖率算出部とを備える細胞画像処理装置。
【請求項２】
前記増殖パラメータ算出部が、単位時間当たりに前記計数領域内において増加した細胞数を前記増殖パラメータとして算出する請求項１に記載の細胞画像処理装置。
【請求項３】
前記増殖パラメータ算出部が、前記計数領域の面積に対する細胞領域の面積の割合であるコンフルエンシーの変化率を増殖パラメータとして算出する請求項１に記載の細胞画像処理装置。
【請求項４】
前記遊走パラメータ算出部が、単位時間当たりに前記計数領域の外縁から流入した細胞数と流出した細胞数との差を前記遊走パラメータとして算出する請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞画像処理装置。
【請求項５】
前記遊走パラメータ算出部が、前記計数領域を撮影した２枚の画像の射影変換の変換パラメータである画像変形量を遊走パラメータとして算出する請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞画像処理装置。
【請求項６】
前記遊走パラメータ算出部が、画像処理で検出したいくつかの注目細胞の移動量の平均値である注目細胞移動量を遊走パラメータとする請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞画像処理装置。
【請求項７】
前記遊走パラメータ算出部が、前記細胞の長さを前記細胞の速度で除算した時間以下の間隔をあけて撮影した、前記画像を用いる請求項１から請求項６のいずれかに記載の細胞画像処理装置。
【請求項８】
前記領域サイズ算出部が、過去の前記増殖パラメータに対する過去の前記遊走パラメータの比率と所定の許容誤差とを比較して、前記計数領域の大きさの下限を算出する請求項１から請求項７のいずれかに記載の細胞画像処理装置。
【請求項９】
前記計数領域が長方形である請求項１から請求項８のいずれかに記載の細胞画像処理装置。
【請求項１０】
前記計数領域内における単位時間当たりの前記細胞の死亡数である細胞死亡率を算出する細胞死亡率算出部を備える請求項１から請求項９のいずれかに記載の細胞画像処理装置。
【請求項１１】
前記細胞死亡率は、領域内に単位時間当たりに浮遊した細胞数を計数することにより検出される請求項１０に記載の細胞画像処理装置。
【請求項１２】
前記増殖パラメータ、前記遊走パラメータおよび前記細胞増殖率のうちの少なくとも１つをグラフとして出力する請求項１から請求項１１のいずれかに記載の細胞画像処理装置。
【請求項１３】
前記増殖パラメータ、前記遊走パラメータ、前記細胞増殖率および前記細胞死亡率のうちの少なくとも１つを時間変化を表すグラフとして出力する請求項１０または請求項１１に記載の細胞画像処理装置。
【請求項１４】
時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、
入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の所定の計数領域内の単位時間当たりの前記細胞の量の変化を表す増殖パラメータを算出する増殖パラメータ算出ステップと、
各前記画像の前記計数領域の単位時間当たりの前記細胞の流入量または流出量を表す遊走パラメータを算出する遊走パラメータ算出ステップと、
過去の前記増殖パラメータおよび過去の前記遊走パラメータに基づいて、前記計数領域の大きさを算出する領域サイズ算出ステップと、
該領域サイズ算出ステップにより算出された大きさの前記計数領域について算出された前記増殖パラメータおよび前記遊走パラメータに基づいて、細胞増殖率を算出する増殖率算出ステップとを含む細胞画像処理方法。
【請求項１５】
時間間隔をあけて細胞を撮影することにより取得された複数枚の画像が入力され、
入力された前記画像の内のいずれか２枚の前記画像を処理して該画像の所定の計数領域内の単位時間当たりの前記細胞の量の変化を表す増殖パラメータを算出する増殖パラメータ算出ステップと、
各前記画像の前記計数領域の単位時間当たりの前記細胞の流入量または流出量を表す遊走パラメータを算出する遊走パラメータ算出ステップと、
過去の前記増殖パラメータおよび過去の前記遊走パラメータに基づいて、前記計数領域の大きさを算出する領域サイズ算出ステップと、
該領域サイズ算出ステップにより算出された大きさの前記計数領域について算出された前記増殖パラメータおよび前記遊走パラメータに基づいて、細胞増殖率を算出する増殖率算出ステップとをコンピュータに実行させる細胞画像処理プログラム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
上記態様においては、前記増殖パラメータ算出部が、単位時間当たりに前記計数領域内において増加した細胞数を前記増殖パラメータとして算出してもよい。
このようにすることで、時間間隔をあけて取得された２枚の評価画像を処理してそれぞれの計数領域内に存在する細胞数を計数してその差分を時間間隔で除算することにより簡易に増殖パラメータを算出することができる。
また、上記態様においては、前記増殖パラメータ算出部が、前記計数領域の面積に対する細胞領域の面積の割合であるコンフルエンシーの変化率を増殖パラメータとして算出してもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
また、上記態様においては、前記遊走パラメータ算出部が、単位時間当たりに前記計数領域の外縁から流入した細胞数と流出した細胞数との差を前記遊走パラメータとして算出してもよい。
このようにすることで、時間間隔をあけて取得された２枚の評価画像を処理してそれぞれの計数領域の外縁を超えて流入した細胞数および流出した細胞数を計数してその差分を時間間隔で除算することにより簡易に遊走パラメータを算出することができる。
また、上記態様においては、前記遊走パラメータ算出部が、前記計数領域を撮影した２枚の画像の射影変換の変換パラメータである画像変形量を遊走パラメータとして算出してもよい。
また、上記態様においては、前記遊走パラメータ算出部が、画像処理で検出したいくつかの注目細胞の移動量の平均値である注目細胞移動量を遊走パラメータとしてもよい。
また、上記態様においては、前記遊走パラメータ算出部が、前記細胞の長さを前記細胞の速度で除算した時間以下の間隔をあけて撮影した、前記画像を用いてもよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
また、上記態様においては、前記計数領域内における単位時間当たりの前記細胞の死亡数である細胞死亡率を算出する細胞死亡率算出部を備えていてもよい。
また、上記態様においては、前記細胞死亡率は、領域内に単位時間当たりに浮遊した細胞数を計数することにより検出されてもよい。
また、上記態様においては、前記増殖パラメータ、前記遊走パラメータ、前記細胞増殖率および前記細胞死亡率のうちの少なくとも１つをグラフとして出力してもよい。
また、上記態様においては、前記増殖パラメータ、前記遊走パラメータ、前記細胞増殖率および前記細胞死亡率のうちの少なくとも１つを時間変化を表すグラフとして出力してもよい。
【国際調査報告】
2019135267.tif 000012
2019135267.tif 000013
2019135267.tif 000014
2019135267.tif 000015