(57)【要約】  複数のポリマー多孔質膜に均質な培養条件を適用し、安定かつ大量に細胞を培養することのできる手段の提供の提供。頂部と、底部と、培養液流出入口を有する側部と、前記頂部、底部及び側部によって形成される空間を仕切る、培養液流出入口を有する複数の仕切り部と、頂部とそれに隣接する仕切り部との間の隙間空間、底部とそれに隣接する仕切り部との間の隙間空間、及び隣接する仕切り部同士の間の複数の隙間空間から選択される、２つ以上の隙間空間のそれぞれに固定される、ポリマー多孔質膜と、を備える、細胞培養モジュールであって、ここで、前記ポリマー多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、細胞培養モジュール。【特許請求の範囲】
【請求項１】
頂部と、
底部と、
培養液流出入口を有する側部と、
前記頂部、底部及び側部によって形成される空間を仕切る、培養液流出入口を有する複数の仕切り部と、
頂部とそれに隣接する仕切り部との間の隙間空間、底部とそれに隣接する仕切り部との間の隙間空間、及び隣接する仕切り部同士の間の複数の隙間空間から選択される、２つ以上の隙間空間のそれぞれに固定される、ポリマー多孔質膜と、
を備える、細胞培養モジュールであって、
ここで、前記ポリマー多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、
細胞培養モジュール。
【請求項２】
ポリマー多孔質膜が固定されている隙間空間に隣接する隙間空間の少なくとも一方は、ポリマー多孔質膜を含まない、請求項１に記載の細胞培養モジュール。
【請求項３】
頂部とそれに隣接する仕切り部との間の隙間空間、底部とそれに隣接する仕切り部との間の隙間空間、及び隣接する仕切り部同士の間の複数の隙間空間から選択される、２以上の隙間空間のそれぞれに、３〜１００枚のポリマー多孔質膜が積層されて配置される、請求項１又は２に記載の細胞培養モジュール。
【請求項４】
前記ポリマー多孔質膜がポリイミド多孔質膜である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【請求項５】
前記ポリマー多孔質膜がポリエーテルスルホン多孔質膜である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【請求項６】
前記頂部及び底部は培養液流出入口を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【請求項７】
直方体形状を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【請求項８】
立方体形状を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【請求項９】
卵形状を有する、請求項１〜６のいずれか１項に細胞培養モジュール。
【請求項１０】
複数の請求項７又は８に記載の細胞培養モジュールが連結されてなる、細胞培養モジュール複合体。
【請求項１１】
複数の細胞培養サブモジュールと、
前記複数の細胞培養サブモジュールを積層して収容するための、培養液流出入口を有する細胞培養サブモジュール収容用ケーシングと
を備える、細胞培養モジュールであって、
ここで、前記細胞培養サブモジュールは、
ポリマー多孔質膜と、
培養液流出入口を有するポリマー多孔質膜収容用ケーシングであって、前記ポリマー多孔質膜が固定されて収容される、前記ポリマー多孔質膜収容用ケーシングと
を備え、
前記ポリマー多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、
細胞培養モジュール。
【請求項１２】
積層された前記複数の細胞培養サブモジュールと、細胞培養サブモジュール収容用ケーシングとの間に隙間空間を有する、請求項１１に記載の細胞培養モジュール。
【請求項１３】
前記ポリマー多孔質膜収容用ケーシングに、３〜１００枚のポリマー多孔質膜が積層されて収容される、請求項１１又は１２に記載の細胞培養モジュール。
【請求項１４】
前記ポリマー多孔質膜がポリイミド多孔質膜である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【請求項１５】
前記ポリマー多孔質膜がポリエーテルスルホン多孔質膜である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養モジュールに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、治療やワクチンに用いられる酵素、ホルモン、抗体、サイトカイン、ウイルス（ウイルスタンパク質）等のタンパク質が培養細胞を用いて工業的に産生されている。しかし、こうしたタンパク質の生産技術は効率面に課題を抱えており、そのことが、持続的かつ広範な供給が不可欠であるバイオ医薬品のタイムリーな安定供給に影響を及ぼしている。そのため、効率的、安定かつ迅速なタンパク質の生産方法の確立に向けて、高密度に細胞を培養する技術や、高効率連続生産法などの、タンパク質の産生量を増大させるような革新的かつ簡便な技術が求められていた。【０００３】
タンパク質を産生する細胞として、培養基材に接着する足場依存性の接着細胞が用いられることがある。こうした細胞は、足場依存的に増殖するため、シャーレ、プレート又はチャンバーの表面に接着させて培養する必要がある。従来、こうした接着細胞を大量に培養するためには、接着するための表面積を大きくする必要があった。ところが、培養面積を大きくするには、空間を必然的に増大させる必要があり、それが効率的生産や製造量の改善に課題を生じる要因となっていた。【０００４】
培養空間を小さくしつつ、接着細胞を大量に培養する方法として、微小多孔を有する担体、特に、マイクロキャリアを用いた培養法が開発されている（例えば、特許文献１）。マイクロキャリアを用いた細胞培養系は、マイクロキャリアが互いに凝集しないようにするために十分に攪拌・拡散される必要がある。そのため、マイクロキャリアを分散させた培養液を十分に攪拌・拡散することができるだけの容積が必要となるため、培養できる細胞の密度には上限がある。また、マイクロキャリアと培養液とを分離するためには、細かな粒子を分別できるフィルターで分離させる必要があり、それがバイオ医薬品の生産性を低下させる原因ともなっていた。こうした状況から、大量の付着細胞を安定かつ簡便に培養する革新的な細胞培養の方法論が希求されていた。【０００５】
＜ポリイミド多孔質膜＞
ポリイミド多孔質膜は、本出願前よりフィルター、低誘電率フィルム、燃料電池用電解質膜など、特に電池関係を中心とする用途のために利用されてきた。特許文献２〜４は、特に、気体などの物質透過性に優れ、空孔率の高い、両表面の平滑性が優れ、相対的に強度が高く、高空孔率にもかかわらず、膜厚み方向への圧縮応力に対する耐力に優れるマクロボイドを多数有するポリイミド多孔質膜を記載している。これらはいずれも、アミック酸を経由して作成されたポリイミド多孔質膜である。【０００６】
細胞をポリイミド多孔質膜に適用して培養することを含む、細胞の培養方法が報告されている（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００３／０５４１７４号
【特許文献２】国際公開第２０１０／０３８８７３号
【特許文献３】特開２０１１−２１９５８５号公報
【特許文献４】特開２０１１−２１９５８６号公報
【特許文献５】国際公開第２０１５／０１２４１５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
１つの培養容器又はバッグ中で複数のポリイミド多孔質膜を用いて細胞を振盪培養又は攪拌培養する場合に、当該容器又はバッグ中においてポリイミド多孔質膜のそれぞれが受ける力は異なる。したがって、全てのポリイミド多孔質膜に対して均質な条件で細胞培養を行うことは困難であった。また、ポリイミド多孔質膜を用いて振盪培養又は攪拌培養する場合に、継続的に当該膜の形態が変形することによって、当該膜内に生育される細胞にストレスが加わって細胞が死滅してしまうため、安定な細胞培養が困難であった。【０００９】
したがって、本発明は複数のポリマー多孔質膜に均質な培養条件を適用し、安定かつ大量に細胞を培養することのできる手段の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、複数のポリマー多孔質膜を備える、特定の立体構造を有するモジュールを使用することで安定かつ大量に細胞を培養できることを見出し、本発明に至った。【００１１】
本発明は、以下の＜１＞〜＜１５＞を包含する。
＜１＞
頂部と、
底部と、
培養液流出入口を有する側部と、
前記頂部、底部及び側部によって形成される空間を仕切る、培養液流出入口を有する複数の仕切り部と、
頂部とそれに隣接する仕切り部との間の隙間空間、底部とそれに隣接する仕切り部との間の隙間空間、及び隣接する仕切り部同士の間の複数の隙間空間から選択される、２つ以上の隙間空間のそれぞれに固定される、ポリマー多孔質膜と、
を備える、細胞培養モジュールであって、
ここで、前記ポリマー多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、
細胞培養モジュール。
＜２＞
ポリマー多孔質膜が固定されている隙間空間に隣接する隙間空間の少なくとも一方は、ポリマー多孔質膜を含まない、＜１＞に記載の細胞培養モジュール。
＜３＞
頂部とそれに隣接する仕切り部との間の隙間空間、底部とそれに隣接する仕切り部との間の隙間空間、及び隣接する仕切り部同士の間の複数の隙間空間から選択される、２以上の隙間空間のそれぞれに、３〜１００枚のポリマー多孔質膜が積層されて配置される、＜１＞又は＜２＞に記載の細胞培養モジュール。
＜４＞
前記ポリマー多孔質膜がポリイミド多孔質膜である、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の細胞培養モジュール。
＜５＞
前記ポリマー多孔質膜がポリエーテルスルホン多孔質膜である、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の細胞培養モジュール。
＜６＞
前記頂部及び底部は培養液流出入口を有する、＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の細胞培養モジュール。
＜７＞
直方体形状を有する、＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の細胞培養モジュール。
＜８＞
立方体形状を有する、＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の細胞培養モジュール。
＜９＞
卵形状を有する、＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに細胞培養モジュール。
＜１０＞
複数の＜７＞又は＜８＞に記載の細胞培養モジュールが連結されてなる、細胞培養モジュール複合体。
＜１１＞
複数の細胞培養サブモジュールと、
前記複数の細胞培養サブモジュールを積層して収容するための、培養液流出入口を有する細胞培養サブモジュール収容用ケーシングと
を備える、細胞培養モジュールであって、
ここで、前記細胞培養サブモジュールは、
ポリマー多孔質膜と、
培養液流出入口を有するポリマー多孔質膜収容用ケーシングであって、前記ポリマー多孔質膜が固定されて収容される、前記ポリマー多孔質膜収容用ケーシングと
を備え、
前記ポリマー多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、
細胞培養モジュール。
＜１２＞
積層された前記複数の細胞培養サブモジュールと、細胞培養サブモジュール収容用ケーシングとの間に隙間空間を有する、＜１１＞に記載の細胞培養モジュール。
＜１３＞
前記ポリマー多孔質膜収容用ケーシングに、３〜１００枚のポリマー多孔質膜が積層されて収容される、＜１１＞又は＜１２＞に記載の細胞培養モジュール。
＜１４＞
前記ポリマー多孔質膜がポリイミド多孔質膜である、＜１１＞〜＜１３＞のいずれか１つに記載の細胞培養モジュール。
＜１５＞
前記ポリマー多孔質膜がポリエーテルスルホン多孔質膜である、＜１１＞〜＜１３＞のいずれか１つに記載の細胞培養モジュール。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、複数のポリマー多孔質膜に均質な培養条件を適用し、安定かつ大量に細胞を培養することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、細胞培養モジュール１の斜視図である。ただし、細胞培養モジュール中のポリマー多孔質膜の図示は省略している。
【図２】図２は、細胞培養モジュール１の内部を説明するための正面図である。
【図３】図３は、細胞培養モジュール１の内部を説明するための斜視図である。
【図４】図１のＡ−Ａ線で切断された、細胞培養モジュール１の内部を説明するための斜視図である。
【図５】図５は、図１〜３に示す細胞培養モジュール１を２つ用意し、一方の頂部と他方の頂部とを連結することによって製造される、細胞培養モジュール複合体１０の斜視図である。ただし、細胞培養モジュール中のポリマー多孔質膜の図示は省略している。
【図６】図６は、細胞培養モジュール複合体１０の正面図である。
【図７】図７は、細胞培養モジュール２０の斜視図である。
【図８】図８は、細胞培養モジュール２０の正面図である。
【図９】図９は、図７及び８に示す細胞培養モジュール２０に使用される、細胞培養サブモジュール３０の上面図である。
【図１０】図１０は、図９のＢ−Ｂ線における細胞培養サブモジュール３０の断面図である。
【図１１】図１１は、細胞培養モジュール２０を用いた細胞培養によって産生される抗体量の経時変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について、必要に応じて図面を参照しながら説明する。実施形態の構成は例示であり、本発明の構成は、実施形態の具体的構成に限定されない。
【００１５】
＜＜ポリマー多孔質膜＞＞
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ａ（以下で、「Ａ面」又は「メッシュ面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、０．０１μｍ以上２００μｍ未満、０．０１〜１５０μｍ、０．０１〜１００μｍ、０．０１〜５０μｍ、０．０１μｍ〜４０μｍ、０．０１μｍ〜３０μｍ、０．０１μｍ〜２５μｍ、０．０１μｍ〜２０μｍ、又は０．０１μｍ〜１５μｍであり、好ましくは、０．０１μｍ〜２５μｍである。
【００１６】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ｂ（以下で、「Ｂ面」又は「大穴面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、表面層Ａに存在する孔の平均孔径よりも大きい限り特に限定されないが、例えば、５μｍ超２００μｍ以下、２０μｍ〜１００μｍ、２５μｍ〜１００μｍ、３０μｍ〜１００μｍ、３５μｍ〜１００μｍ、４０μｍ〜１００μｍ、５０μｍ〜１００μｍ、又は６０μｍ〜１００μｍであり、好ましくは、３０μｍ〜１００μｍである。
【００１７】
本明細書において、ポリマー多孔質膜表面の平均孔径は面積平均孔径である。面積平均孔径は、以下の（１）及び（２）に従って求めることができる。なお、ポリマー多孔質膜表面以外の部位の平均孔径も同様にして求めることができる。
（１）多孔質膜表面の走査型電子顕微鏡写真から、２００点以上の開孔部について孔面積Ｓを測定し、該孔面積を真円と仮定して式Ｉからそれぞれの孔径ｄを求める。
【数１】
2019146732.tif 000002
（２）上記式Ｉによって求められた全ての孔径を以下の式ＩＩに適用し、孔の形状が真円であるとした際の面積平均孔径ｄａを求める。
【数２】
2019146732.tif 000003
【００１８】
表面層Ａ及びＢの厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは０．０１〜２０μｍである。
【００１９】
ポリマー多孔質膜におけるマクロボイド層中のマクロボイドの膜平面方向の平均孔径は、特に限定されないが、例えば１０〜５００μｍであり、好ましくは１０〜１００μｍであり、より好ましくは１０〜８０μｍである。また、当該マクロボイド層中の隔壁の厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは、０．０１〜２０μｍである。一の実施形態において、当該マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、当該マクロボイド層中の隔壁は孔を有さない。
【００２０】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜表面の総膜厚は、特に限定されないが、５μｍ以上、１０μｍ以上、２０μｍ以上又は２５μｍ以上であってもよく、５００μｍ以下、３００μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下又は５０μｍ以下であってもよい。好ましくは、５〜５００μｍであり、より好ましくは２５〜７５μｍである。
【００２１】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜の膜厚の測定は、接触式の厚み計で行うことができる。
【００２２】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜の空孔率は特に限定されないが、例えば、４０％以上９５％未満である。
【００２３】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜の空孔率は、所定の大きさに切り取った多孔質フィルムの膜厚及び質量を測定し、目付質量から下式ＩＩＩに従って求めることができる。
【数３】
2019146732.tif 000004
（式中、Ｓは多孔質フィルムの面積、ｄは総膜厚、ｗは測定した質量、Ｄはポリマーの密度をそれぞれ意味する。ポリマーがポリイミドである場合は、密度は１．３４ｇ／ｃｍ3とする。）
【００２４】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜２５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は３０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリマー多孔質膜である。一の実施形態において、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、隔壁は、そのような孔を有さない。
【００２５】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、滅菌されていることが好ましい。滅菌処理としては、特に限定されないが、乾熱滅菌、蒸気滅菌、エタノール等消毒剤による滅菌、紫外線やガンマ線等の電磁波滅菌等任意の滅菌処理などが挙げられる。
【００２６】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜は、上記した構造的特徴を備える限り、特に限定されないが、好ましくはポリイミド多孔質膜、又はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である。
【００２７】
＜ポリイミド多孔質膜＞
ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称であり、通常は、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された芳香族ポリイミドを意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。
【００２８】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、好ましくは、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを（主たる成分として）含むポリイミド多孔質膜であり、より好ましくはテトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドからなるポリイミド多孔質膜である。「主たる成分として含む」とは、ポリイミド多孔質膜の構成成分として、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミド以外の成分は、本質的に含まない、あるいは含まれていてもよいが、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドの性質に影響を与えない付加的な成分であることを意味する。
【００２９】
一実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜も含まれる。
【００３０】
ポリアミック酸は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とを重合して得られる。ポリアミック酸は、熱イミド化又は化学イミド化することにより閉環してポリイミドとすることができるポリイミド前駆体である。
【００３１】
ポリアミック酸は、アミック酸の一部がイミド化していても、本発明に影響を及ぼさない範囲であればそれを用いることができる。すなわち、ポリアミック酸は、部分的に熱イミド化又は化学イミド化されていてもよい。
【００３２】
ポリアミック酸を熱イミド化する場合は、必要に応じて、イミド化触媒、有機リン含有化合物、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。また、ポリアミック酸を化学イミド化する場合は、必要に応じて、化学イミド化剤、脱水剤、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。ポリアミック酸溶液に前記成分を配合しても、着色前駆体が析出しない条件で行うことが好ましい。
【００３３】
本明細書において、「着色前駆体」とは、２５０℃以上の熱処理により一部または全部が炭化して着色化物を生成する前駆体を意味する。
【００３４】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得る着色前駆体としては、ポリアミック酸溶液又はポリイミド溶液に均一に溶解または分散し、２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理、好ましくは空気等の酸素存在下での２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理により熱分解し、炭化して着色化物を生成するものが好ましく、黒色系の着色化物を生成するものがより好ましく、炭素系着色前駆体がより好ましい。
【００３５】
着色前駆体は、加熱していくと一見炭素化物に見えるものになるが、組織的には炭素以外の異元素を含み、層構造、芳香族架橋構造、四面体炭素を含む無秩序構造のものを含む。
【００３６】
炭素系着色前駆体は特に制限されず、例えば、石油タール、石油ピッチ、石炭タール、石炭ピッチ等のタール又はピッチ、コークス、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体、フェロセン化合物（フェロセン及びフェロセン誘導体）等が挙げられる。これらの中では、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体及び／又はフェロセン化合物が好ましく、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体としてはポリアクリルニトリルが好ましい。
【００３７】
また、別の実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、上記の着色前駆体を使用せずに、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液を成形した後、熱処理することにより得られる、ポリイミド多孔質膜も含まれる。
【００３８】
着色前駆体を使用せずに製造されるポリイミド多孔質膜は、例えば、極限粘度数が１．０〜３．０であるポリアミック酸３〜６０質量％と有機極性溶媒４０〜９７質量％とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製し、その後当該ポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化することにより製造されてもよい。この方法において、水を必須成分とする凝固溶媒が、水であるか、又は５質量％以上１００質量％未満の水と０質量％を超え９５質量％以下の有機極性溶媒との混合液であってもよい。また、上記イミド化の後、得られた多孔質ポリイミド膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施してもよい。
【００３９】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るテトラカルボン酸二無水物は、任意のテトラカルボン酸二無水物を用いることができ、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。テトラカルボン酸二無水物の具体例として、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ａ−ＢＰＤＡ）などのビフェニルテトラカルボン酸二無水物、オキシジフタル酸二無水物、ジフェニルスルホン−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルフィド二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）メタン二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）プロパン二無水物、ｐ−フェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｐ−ビフェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｍ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ｐ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、１，３−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ビフェニル二無水物、２，２−ビス〔（３，４−ジカルボキシフェノキシ）フェニル〕プロパン二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、４，４’−（２，２−ヘキサフルオロイソプロピリデン）ジフタル酸二無水物等を挙げることができる。また、２，３，３’，４’−ジフェニルスルホンテトラカルボン酸等の芳香族テトラカルボン酸を用いることも好ましい。これらは単独でも、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００４０】
これらの中でも、特に、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族テトラカルボン酸二無水物が好ましい。ビフェニルテトラカルボン酸二無水物としては、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物を好適に用いることができる。
【００４１】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るジアミンは、任意のジアミンを用いることができる。ジアミンの具体例として、以下のものを挙げることができる。
１）１，４−ジアミノベンゼン（パラフェニレンジアミン）、１，３−ジアミノベンゼン、２，４−ジアミノトルエン、２，６−ジアミノトルエンなどのベンゼン核１つのべンゼンジアミン；
２）４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ビス（トリフルオロメチル）−４，４’−ジアミノビフェニル、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジカルボキシ−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’，５，５’−テトラメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、ビス（４−アミノフェニル）スルフィド、４，４’−ジアミノベンズアニリド、３，３’−ジクロロベンジジン、３，３’−ジメチルベンジジン、２，２’−ジメチルベンジジン、３，３’−ジメトキシベンジジン、２，２’−ジメトキシベンジジン、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，３’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、４，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，３’−ジアミノジフェニルスルホン、３，４’−ジアミノジフェニルスルホン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン、３，３’−ジアミノベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジクロロベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジメトキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノジフェニルメタン、３，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、３，３’−ジアミノジフェニルスルホキシド、３，４’−ジアミノジフェニルスルホキシド、４，４’−ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核２つのジアミン；
３）１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェノキシ）−４−トリフルオロメチルベンゼン、３，３’−ジアミノ−４−（４−フェニル）フェノキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジ（４−フェニルフェノキシ）ベンゾフェノン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（３−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核３つのジアミン；
４）３，３’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、３，３’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核４つのジアミン。
【００４２】
これらは単独でも、２種以上を混合して用いることもできる。用いるジアミンは、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。
【００４３】
これらの中でも、芳香族ジアミン化合物が好ましく、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル及びパラフェニレンジアミン、１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼンを好適に用いることができる。特に、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンが好ましい。
【００４４】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が２４０℃以上であるか、又は３００℃以上で明確な転移点がないテトラカルボン酸二無水物とジアミンとを組み合わせて得られるポリイミドから形成されていることが好ましい。
【００４５】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、以下の芳香族ポリイミドからなるポリイミド多孔質膜であることが好ましい。
（ｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
（ｉｉ）テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び／又は、
（ｉｉｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。
【００４６】
本発明において用いられるポリイミド多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜２５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は３０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリイミド多孔質膜である。ここで、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。
【００４７】
例えば、国際公開第２０１０／０３８８７３号、特開２０１１−２１９５８５号公報、又は特開２０１１−２１９５８６号公報に記載されているポリイミド多孔質膜も、本発明に使用可能である。
【００４８】
＜ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜＞
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、ポリエーテルスルホンを含み、典型的には実質的にポリエーテルスルホンからなる。ポリエーテルスルホンは当業者に公知の方法で合成されたものであってよく、例えば、二価フェノール、アルカリ金属化合物及びジハロゲノジフェニル化合物を有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法、二価フェノールのアルカリ金属二塩を予め合成しジハロゲノジフェニル化合物と有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法等によって製造できる。
【００４９】
アルカリ金属化合物としては、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属水素化物、アルカリ金属アルコキシド等が挙げられる。特に、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムが好ましい。
【００５０】
二価フェノール化合物としては、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシン、４，４’−ビフェノール、ビス（ヒドロキシフェニル）アルカン類（例えば２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）プロパン、及び２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）メタン）、ジヒドロキシジフェニルスルホン類、ジヒドロキシジフェニルエーテル類、又はそれらのベンゼン環の水素の少なくとも１つが、メチル基、エチル基、プロピル基等の低級アルキル基、又はメトキシ基、エトキシ基等の低級アルコキシ基で置換されたものが挙げられる。二価フェノール化合物としては、上記の化合物を二種類以上混合して用いることができる。
【００５１】
ポリエーテルスルホンは市販品であってもよい。市販品の例としては、スミカエクセル７６００Ｐ、スミカエクセル５９００Ｐ（以上、住友化学(株)製）等が挙げられる。
【００５２】
ポリエーテルスルホンの対数粘度は、多孔質ポリエーテルスルホン膜のマクロボイドを良好に形成する観点で、好ましくは０．５以上、より好ましくは０．５５以上であり、多孔質ポリエーテルスルホン膜の製造容易性の観点から、好ましくは１．０以下、より好ましくは０．９以下、更に好ましくは０．８以下、特に好ましくは０．７５以下である。
【００５３】
また、ＰＥＳ多孔質膜、又はその原料としてのポリエーテルスルホンは、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が、２００℃以上であるか、又は明確なガラス転移温度が観察されないことが好ましい。
【００５４】
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜の製造方法は特に限定されないが、例えば、
対数粘度０．５〜１．０のポリエーテルスルホンの０．３質量％〜６０質量％と有機極性溶媒４０質量％〜９９．７質量％とを含むポリエーテルスルホン溶液を、フィルム状に流延し、ポリエーテルスルホンの貧溶媒又は非溶媒を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、空孔を有する凝固膜を作製する工程、及び
前記工程で得られた空孔を有する凝固膜を熱処理して前記空孔を粗大化させて、ＰＥＳ多孔質膜を得る工程
を含み、前記熱処理は、前記空孔を有する凝固膜を、前記ポリエーテルスルホンのガラス転移温度以上、もしくは２４０℃以上まで昇温させることを含む、方法で製造されてもよい。
【００５５】
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、好ましくは、表面層Ａ、表面層Ｂ、及び前記表面層Ａと前記表面層Ｂとの間に挟まれたマクロボイド層、を有するＰＥＳ多孔質膜であって、
前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた、膜平面方向の平均孔径が１０μｍ〜５００μｍである複数のマクロボイドとを有し、
前記マクロボイド層の隔壁は、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢはそれぞれ、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢのうち、一方が平均孔径５μｍ超２００μｍ以下の複数の細孔を有し、かつ他方が平均孔径０．０１μｍ以上２００μｍ未満の複数の細孔を有し、
表面層Ａ及び表面層Ｂの、一方の表面開口率が１５％以上であり、他方の表面層の表面開口率が１０％以上であり、
前記表面層Ａ及び前記表面層Ｂの前記細孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記ＰＥＳ多孔質膜は、総膜厚が５μｍ〜５００μｍであり、かつ空孔率が５０％〜９５％である、
ＰＥＳ多孔質膜である。
【００５６】
＜＜細胞培養モジュール＞＞
本明細書において、「細胞培養モジュール」とは、細胞培養容器及び細胞培養装置に適用可能な細胞培養基材をいう。
【００５７】
本発明の細胞培養モジュールを使用し得る細胞培養容器及び細胞培養装置は特に限定されず、例えば市販の細胞培養容器及び細胞培養装置に使用可能である。例えば、可撓性のバッグからなる培養容器を備える培養装置に使用可能であり、当該培養容器内に浮遊させた状態で使用することが可能である。また例えば、スピナーフラスコ等の攪拌培養型容器に適用し、細胞培養することができる。また、培養容器としては、開放容器にも閉鎖容器にも適用可能である。例えば、細胞培養用のシャーレ、フラスコ、プラスチックバッグ、試験管から、大型のタンクまで適宜利用可能である。例えば、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製のセルカルチャーディッシュやサーモサイエンティフィック社製のＮｕｎｃ  セルファクトリー等が含まれる。また、滅菌されたボトル、例えば、コーニング社製ストレージボトル等の単純な柱状容器も、オービタルシェーカーやプログラムシェーカー等の振盪装置を使用することにより、培養容器として効率的に使用可能となる。また同様に、シャーレやフラスコもシェーカーを利用することにより、培養容器として使用可能である。
【００５８】
ポリマー多孔質膜を除く、本発明の細胞培養モジュールの構成部材は、通常の培養条件、例えば、攪拌培養、振盪培養条件における培養液の動きによって変形しない程度に強度を有することが好ましく、非可撓性素材から形成されていることが好ましい。また、当該構成部材は、細胞培養において、細胞の生育に影響を与えない素材によって形成されていることが好ましい。このような材料としては、例えば、ポリオレフィン（例えばポリエチレン、ポリプロピレン）、ナイロン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート等のポリマー、ステンレス綱、チタンなどの金属が挙げられるが、これに限定されない。
【００５９】
＜細胞培養モジュールＡ＞
本発明の細胞培養モジュールの一態様は、
頂部と、
底部と、
培養液流出入口を有する側部と、
前記頂部、底部及び側部によって形成される空間を仕切る、培養液流出入口を有する複数の仕切り部と、
頂部とそれに隣接する仕切り部との間の隙間空間、底部とそれに隣接する仕切り部との間の隙間空間、及び隣接する仕切り部同士の間の複数の隙間空間から選択される、２つ以上の隙間空間のそれぞれに固定される、ポリマー多孔質膜と、
を備える、細胞培養モジュールであって、
ここで、前記ポリマー多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、
細胞培養モジュールである。以下、「細胞培養モジュールＡ」とも呼ぶ。
【００６０】
本発明の細胞培養モジュールにおける「仕切り部」は略平面状である。本発明の細胞培養モジュールにおける「頂部」とは、仕切り部の延在方向に対して略垂直方向の最上部に存在する部分であり、その形状は特に限定されない。本発明の細胞培養モジュールにおける「底部」とは、仕切り部の延在方向に対して略垂直方向の最下部に存在する部分であり、その形状は特に限定されない。本発明の細胞培養モジュールにおいて、「側部」とは、頂部及び底部以外の、細胞培養モジュールの周囲を構成する部分であり、その形状は特に限定されない。
【００６１】
細胞培養モジュールＡの頂部及び底部は、培養液流出入口を有してもよい。頂部及び底部に存在する培養液流出入口の数及び形状は、培養液がモジュール内部に良好に供給される限り特に限定されない。またその大きさは、培養細胞及び培養液の通過を妨げない限り特に限定されない。好ましくは、頂部及び底部は、それぞれ複数の培養液流出入口を有する。
【００６２】
細胞培養モジュールＡの側部は、培養液流出入口を有する。側部に存在する培養液流出入口の数及び形状は、培養液がモジュール内部に良好に供給される限り特に限定されない。またその大きさは、培養細胞及び培養液の通過を妨げない限り特に限定されない。好ましくは、側部は、複数の培養液流出入口を有する。
【００６３】
細胞培養モジュールＡの仕切り部の数は特に限定されないが、好ましくは２〜５０枚であり、より好ましくは２〜３０枚であり、さらに好ましくは２〜２０枚であり、特に好ましくは２〜１０枚である。仕切り部が有する培養液流出入口の数及び形状は、培養液の良好な移動を妨げない限り特に限定されない。またその大きさは、培養細胞及び培養液の通過を妨げない限り特に限定されない。
【００６４】
ポリマー多孔質膜の隙間空間への固定方法は特に限定されない。例えば、頂部とそれに隣接する仕切り部との間、底部とそれに隣接する仕切り部との間、及び隣接する仕切り部同士の間に挟持されることによって固定される。また例えば、ポリマー多孔質膜の少なくとも１カ所が当該隙間空間を形成する頂部、底部又は仕切り部の少なくとも１か所と任意の方法（例えば接着剤による接着、又は留め具を用いた固定）で固定される。ポリマー多孔質膜が隙間空間で固定されることによって、当該ポリマー多孔質膜内で生育される細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等が抑制されて安定的かつ大量に細胞を培養することが可能となる。
【００６５】
ポリマー多孔質膜は、任意の形態で隙間空間に固定され得る。一実施形態において、ポリマー多孔質膜は、複数のポリマー多孔質膜の積層体である。積層されるポリマー多孔質膜は小片であってもよく、その形状は例えば、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など、任意の形であってもよい。好ましくは、積層されるポリマー多孔質膜の小片は略正方形である。小片の大きさは、任意の大きさをとり得る。小片が略正方形である場合、その長さは特に限定されないが、例えば、８０ｍｍ以下、５０ｍｍ以下、３０ｍｍ以下、２０ｍｍ以下又は１０ｍｍ以下である。
【００６６】
隙間空間に固定されるポリマー多孔質膜が、複数のポリマー多孔質膜の積層体である場合、好ましくは、２枚以上、３枚以上、４枚以上又は５枚以上であって、かつ１００枚以下、５０枚以下、４０枚以下、３０枚以下、２０枚以下、１５枚以下又は１０枚以下のポリマー多孔質膜の積層体であり、より好ましくは３〜１００枚の、より好ましくは５〜５０枚のポリマー多孔質膜の積層体である。
【００６７】
隙間空間に固定されるポリマー多孔質膜が、複数のポリマー多孔質膜の積層体である場合、ポリマー多孔質膜とポリマー多孔質膜の間には中敷きが設けられてもよい。中敷きが設けられることにより、積層されたポリマー多孔質膜の間に効率的に培養液を供給させることができる。中敷きは、積層されたポリマー多孔質膜の間に任意の空間を形成し、効率的に培養液を供給させる機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、メッシュ構造を有する平面構造体を用いることができる。中敷きの材質は、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ステンレス鋼製のメッシュを用いることができるが、これに限定されない。メッシュ構造を有する中敷きを有する場合、積層されたポリマー多孔質膜の間に培養液を供給できる程度の目開きを有していればよく、適宜選択することができる。
【００６８】
一実施形態において、隙間空間に固定されるポリマー多孔質膜は、平面状ではなく、立体状に形状を加工して用いてもよい。例えば、ポリマー多孔質膜を、ｉ）折り畳んで、ｉｉ)ロール状に巻き込んで、ｉｉｉ)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、ｉｖ）縄状に結んで、使用されてもよい。
【００６９】
細胞培養モジュールＡの全体形状は、特に限定されない。頂部、底部、側部及び仕切り部を構成する部材の形状を変更することで、様々な全体形状の細胞培養モジュールを製造することができる。培養時の攪拌の容易性、製造の容易性などの観点から、細胞培養モジュールＡの全体形状は、好ましくは、ｎ角柱形状（例えばｎ＝３〜６）、円柱形状、回転楕円体形状、卵型形状、球形状であり、より好ましくは、直方体形状、立方体形状又は卵型形状である。また、細胞培養モジュールがｎ角柱形状又は円柱形状である場合、モジュール相互の衝突時の衝撃を和らげ、モジュールの破壊を避けるため、当該モジュールの角が面取りされていてもよい。
【００７０】
好ましくは、ポリマー多孔質膜が固定されている隙間空間に隣接する隙間空間の少なくとも一方は、ポリマー多孔質膜を含まない。例えば、頂部とそれに隣接する仕切り部との間の隙間空間にポリマー多孔質膜が固定されている場合には、隣接する隙間空間は１つしかないので、当該空間にはポリマー多孔質膜が含まれない。また例えば、底部とそれに隣接する仕切り部との間の隙間空間にポリマー多孔質膜が固定されている場合には、隣接する隙間空間は１つしかないので、当該空間にはポリマー多孔質膜が含まれない。また例えば、隣接する仕切り部同士の間の隙間空間にポリマー多孔質膜が固定されている場合には、隣接する隙間空間は２つ存在するので、その両方にポリマー多孔質膜が含まれないか、又はその一方にポリマー多孔質膜は含まれない。ポリマー多孔質膜を含まない隙間空間は、培養液通過用クリアランスとして機能する。培養液は、培養液流出入口から、細胞培養モジュールＡ内部に存在する培養液通過用クリアランスに供給される。当該培養液通過用クリアランスに供給された培養液は、仕切り部に存在する培養液流出入口を通過して、ポリマー多孔質膜へと効率よく接触することが可能である。
【００７１】
細胞培養モジュールＡは、頂部とそれに隣接する仕切り部との間、底部とそれに隣接する仕切り部との間、及び隣接する仕切り部同士の間に隙間空間を設けるために、頂部、仕切り部及び底部を一定の距離を置いて配置するための配置手段を備えてもよい。配置手段の形状は特に限定されず、細胞培養モジュールの構成に応じて適宜決定される。例えば、図３及び４に示されるような、仕切り部に設けられた、隣接する仕切り部の載置台であってもよい。また例えば、底部と側部によって形成される容器の側部内壁に設けられた、仕切り部及び頂部を載置するための載置台であってもよい。また例えば、頂部、底部及び仕切り部を構成する部材のそれぞれを連結するための（例えば柱状の）連結部材であってもよい。
【００７２】
図１〜４に、細胞培養モジュールＡの構成例を示す。細胞培養モジュール１は、頂部２と、底部３と、側部４と、第一仕切り部５と、第二仕切り部６とを備える。また、細胞培養モジュール１の頂部２と第一仕切り部５との間、及び底部３と第二仕切り部６との間に、ポリマー多孔質膜積層体７ａ及び７ｂが挟持される。細胞培養モジュール１の頂部２、底部３、側部４、第一仕切り部５及び第二仕切り部６は、それぞれ培養液流出入口８ａ〜８ｅを有する。
【００７３】
第二仕切り部６の上面は、隣接する第一仕切り部５を載置するための載置台９を備える。載置台９は、第一仕切り部５と第二仕切り部６とを一定の間隔を空けて配置するための配置手段として機能する。当該載置台９により、第二仕切り部６と第一仕切り部５との間にポリマー多孔質膜が配置されない隙間空間が形成される。当該隙間空間は、培養液通過用クリアランスとして機能する。頂部２、底部３及び側部４のそれぞれに存在する培養液流出入口から、培養液通過用クリアランスに供給された培養液は、第一仕切り部５及び第二仕切り部６のそれぞれに存在する培養液流出入口８を通過して、ポリマー多孔質膜積層体７ａ及び７ｂへと効率よく接触することが可能である。載置台の数、位置及び形状は特に限定されない。載置台は、第二仕切り部６の上面の代わりに、隣接する第一仕切り部５の下面に設けられてもよい。また、載置台は、底部３と側部４によって形成される容器の側部内壁面に設けられてもよい。
【００７４】
細胞培養モジュールＡが直方体形状又は立方体形状を有する場合、複数の細胞培養モジュールが連結されて、細胞培養モジュール複合体を形成してもよい。図５及び６は、２つの直方体形状の細胞培養モジュールが連結されてなる、細胞培養モジュール複合体の構成例を示す。図５及び６の細胞培養モジュール複合体１０は、図１〜４に示した細胞培養モジュール１を２つ用意し、一方の頂部と他方の頂部とを連結することによって製造され、立方体形状を有する。図５及び６の細胞培養モジュール複合体は、
培養液流出入口を有する頂部と、
培養液流出入口を有する底部と、
培養液流出入口を有する側部と、
前記頂部、底部及び側部によって形成される空間を仕切る、培養液流出入口を有する５つの仕切り部と、
頂部とそれに隣接する仕切り部との間の隙間空間、底部とそれに隣接する仕切り部との間の隙間空間、及び隣接する仕切り部同士の間の複数の隙間空間から選択される、４つの隙間空間のそれぞれに固定される、ポリマー多孔質膜と、
を備え、
ポリマー多孔質膜が固定されている隙間空間に隣接する隙間空間の少なくとも一方は、ポリマー多孔質膜を含まない、
立方体形状の細胞培養モジュール、とみなすことができる。したがって当該細胞培養モジュール複合体は、細胞培養モジュールＡの一実施形態とみなすことができる。
【００７５】
＜細胞培養モジュールＢ＞
複数の細胞培養サブモジュールと、
前記複数の細胞培養サブモジュールを積層して収容するための、培養液流出入口を有する細胞培養サブモジュール収容用ケーシングと
を備える、細胞培養モジュールであって、
ここで、前記細胞培養サブモジュールは、
ポリマー多孔質膜と、
培養液流出入口を有するポリマー多孔質膜収容用ケーシングであって、前記ポリマー多孔質膜が固定されて収容される、前記ポリマー多孔質膜収容用ケーシングと
を備え、
前記ポリマー多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、
細胞培養モジュールである。以下、「細胞培養モジュールＢ」とも呼ぶ。
【００７６】
ケーシング内にポリマー多孔質膜が固定されて収容されることによって、膜状のポリマー多孔質膜の形態が継続的に変形することを防止することができる。これによって、ポリマー多孔質膜内で生育される細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等が抑制されて安定的かつ大量の細胞を培養することが可能となる。ポリマー多孔質膜のポリマー多孔質膜収容用ケーシング内への固定方法は特に限定されない。例えば、ケーシングの頂部と底部との間に挟持されることによって固定される。また例えば、ポリマー多孔質膜の少なくとも１カ所が、該ケーシング内の少なくとも１カ所と任意の方法（例えば接着剤による接着、又は留め具を用いた固定）によって固定される。
【００７７】
ケーシング内に収容されるポリマー多孔質膜の形態は特に限定されない。一実施形態において、ポリマー多孔質膜は、複数のポリマー多孔質膜の積層体である。積層されるポリマー多孔質膜は小片であってもよく、その形状は例えば、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など、任意の形であってもよい。好ましくは、積層されるポリマー多孔質膜の小片は略正方形である。小片の大きさは、任意の大きさをとり得る。小片が略正方形である場合、その長さは特に限定されないが、例えば、８０ｍｍ以下、５０ｍｍ以下、３０ｍｍ以下、２０ｍｍ以下又は１０ｍｍ以下である。
【００７８】
ケーシング内に収容されるポリマー多孔質膜が複数のポリマー多孔質膜の積層体である場合、好ましくは、２枚以上、３枚以上、４枚以上又は５枚以上であって、かつ１００枚以下、５０枚以下、４０枚以下、３０枚以下、２０枚以下、１５枚以下又は１０枚以下のポリマー多孔質膜の積層体であり、より好ましくは、３〜１００枚の、特に好ましくは５〜５０枚のポリマー多孔質膜の積層体である。当該積層体において、ポリマー多孔質膜とポリマー多孔質膜の間には中敷きが設けられてもよい。中敷きが設けられることにより、積層されたポリマー多孔質膜の間に効率的に培養液を供給させることができる。中敷きは、積層されたポリマー多孔質膜の間に任意の空間を形成し、効率的に培養液を供給させる機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、メッシュ構造を有する平面構造体を用いることができる。中敷きの材質は、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ステンレス鋼製のメッシュを用いることができるが、これに限定されない。メッシュ構造を有する中敷きを有する場合、積層されたポリマー多孔質膜の間に培養液を供給できる程度の目開きを有していればよく、適宜選択することができる。
【００７９】
一実施形態において、ケーシング内に収容されるポリマー多孔質膜は、平面状ではなく、立体状に形状を加工して用いてもよい。例えば、ポリマー多孔質膜を、ｉ）折り畳んで、ｉｉ)ロール状に巻き込んで、ｉｉｉ)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、ｉｖ）縄状に結んで、使用されてもよい。
【００８０】
ポリマー多孔質膜を収容するポリマー多孔質膜収容用ケーシングは、培養液流出入口を有する。当該流出入口によって、細胞培養液がケーシングの内部へ供給され、かつ外部へ排出される。当該培養液流出入口の数及び形状は特に限定されない。またその大きさは、培養細胞及び培養液の通過を妨げない限り特に限定されない。
【００８１】
ポリマー多孔質膜収容用ケーシングにおける培養液流出入口は、メッシュ状の構造であってもよい。また、ポリマー多孔質膜を収容するケーシング自体がメッシュ状であってもよい。メッシュ形状の構造とは、例えば、縦、横、及び／又は斜めの格子状の構造を有するものであって、各目開きが、流体が通過出来る程度に培養液流出入口を形成するものであるが、これに限定されない。
【００８２】
細胞培養モジュールＢにおいて、複数の細胞培養サブモジュールが、細胞培養サブモジュール収容用ケーシングに収容される。細胞培養サブモジュールは、好ましくは２個以上、３個以上、４個以上又は５個以上であって、かつ３０個以下、１５個以下、１０個以下積層され、より好ましくは２〜１５個、特に好ましくは３〜１０個積層される。
【００８３】
細胞培養サブモジュール収容用ケーシングは培養液流出入口を有する。当該流出入口によって、細胞培養液がケーシングの内部へ供給され、かつ外部へ排出される。当該培養液流出入口の数及び形状は特に限定されない。またその大きさは、培養細胞及び培養液の通過を妨げない限り特に限定されない。好ましくは、細胞培養サブモジュール収容用ケーシングは複数の培養液流出入口を有する。
【００８４】
細胞培養モジュールＢは、好ましくは、積層された前記複数の細胞培養サブモジュールと、細胞培養サブモジュール収容用ケーシングとの間に隙間空間を有する。当該隙間空間は、培養液通過用クリアランスとして機能する。培養液は、細胞培養サブモジュール収容用ケーシングに存在する培養液流出入口から、細胞培養モジュールＢ内部に存在する培養液通過用クリアランスに供給される。当該培養液通過用クリアランスに供給された培養液は、ポリマー多孔質膜収容用ケーシングに存在する培養液流出入口を通過して、ポリマー多孔質膜へと効率よく接触することが可能である。
【００８５】
図７及び８は、細胞培養モジュールＢの構成例を示す。細胞培養モジュール２０において、細胞培養サブモジュール３０が積層されている。当該積層体は、細胞培養サブモジュール収容用ケーシング２１に収容されている。当該積層体は、細胞培養サブモジュール収容用ケーシング２１の頂部と底部の間に挟持されている。細胞培養サブモジュール収容用ケーシング２１は、その頂部及び側部に培養液流出入口８ｆ及び８ｇを有する。なお、図に示されていないが、細胞培養サブモジュール収容用ケーシング２１は、その底部にも培養液流出入口を有する。図８に示されるように、積層された複数の細胞培養サブモジュール３０と、細胞培養サブモジュール収容用ケーシング２１との間に隙間空間２２が存在する。当該隙間空間は、培養液通過用クリアランスとして機能する。
【００８６】
図９及び１０は、図７及び８に示した細胞培養モジュール２０の構成要素である細胞培養サブモジュールの構成例を示す。６枚で１セットの正方形のポリマー多孔質膜積層体７ｃ、７ｄ及び７ｅを有し、ポリマー多孔質膜積層体７ｃと７ｄとの間、及びポリマー多孔質膜積層体７ｄと７ｅとの間には、それぞれ中敷き３２ａ及び３２ｂが、ポリマー多孔質膜収容用ケーシング３１に収容されている。ポリマー多孔質膜収容用ケーシング３１の上面は複数の培養液流出入口８ｈを有する。なお、下面も同様に培養液流出入口を有する。図９及び１０に示される細胞培養サブモジュールは、２枚の平板基材の間にポリマー膜の積層体を挟持した後、当該平板基材の周辺端部を固着することによって製造され得る。
【００８７】
図１〜８に示される本発明の細胞培養モジュールは、モジュール内部への優れた液流通性を有し、当該モジュールに収容されるポリマー多孔質膜に酸素及び栄養を良好に供給可能である。また、モジュール全体として高い浮遊力があり、複数のモジュールを効率的に攪拌可能である。また、モジュール内部のポリマー多孔質膜に均質な培養条件を適用することができる。さらに、ポリマー多孔質が固定されているために、ポリマー多孔質膜内で生育される細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等が抑制されて安定的かつ大量の細胞を培養することが可能である。また、本発明の細胞培養モジュールは高い強度を有し、長期細胞培養、及び培養細胞による長期連続的な物質産生のために有利である。
【００８８】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【００８９】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例】
【００９０】
以下の実施例及び比較例で使用されたポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分である３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）とジアミン成分である４，４’−ジアミノジフェニルエーテル（ＯＤＡ）とから得られるポリアミック酸溶液と、着色前駆体であるポリアクリルアミドとを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより、調製された。得られたポリイミド多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、当該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であり、表面層Ａに存在する孔の平均孔径は１９μｍであり、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は４２μｍであり、膜厚が２５μｍであり、空孔率が７４％であった。【００９１】
実施例１
細胞培養モジュール複合体１０を用いた細胞培養
図５及び６に示される細胞培養モジュール複合体１０を用いて、細胞培養を行った。図１〜４に示される細胞培養モジュール１を２つ用意し、それぞれの頂部を対向させ、半田ごてによって熱融着して連結し、立方体形状の細胞培養モジュール複合体１０を調製した。本実施例で使用されたポリイミド多孔質膜のサイズは、１．４ｃｍ×１．４ｃｍである。細胞培養モジュール複合体１０は、１０枚で１セットのポリイミド多孔質膜積層体を４つ有し、その総面積は８０ｃｍ2となる。細胞培養モジュール複合体１０を、希釈したミルトン溶液（キョーリン製薬製）、超純水、７０％エタノール含有水にて洗浄し、滅菌的に乾燥した後に使用した。【００９２】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ）中で浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が３．５１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、（総細胞数３．８３×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞率９２％）になるまで培養を継続した。【００９３】
内容積１５０ｍｌのボトル型滅菌容器（コーニング社製）に、細胞培養モジュール複合体１０を３個加え、そこにＣＨＯ細胞単層培養用培地ＫＢＭ２７０（コージンバイオ株式会社製）を５３．３ｍｌ添加して、ＣＯ2インキュベータ内でプログラムシェーカー（ケニス社製）を用いて３５ｒｐｍの振盪速度で１０分間浸漬させた。ＣＨＯ  ＤＰ−１２浮遊細胞培養液（総細胞数３．８３×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞数３．５１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、死細胞数３．２３×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞率９２％）４．０ｍＬと浮遊細胞用培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ）２２．６ｍＬの混合液を添加し、約１４時間、プログラムシェーカー（ケニス社製）を用いて、３５ｒｐｍの回転条件で細胞を吸着させた（シート１枚当たりの想定平均細胞吸着数５．３０×１０4ｃｅｌｌｓ）。回収された培地から計算した細胞吸着率は、９５％であった。【００９４】
その後培地を除去し、ＣＨＯ細胞単層培養用培地ＫＢＭ２７０（コージンバイオ株式会社製）を４０ｍｌ添加して培養を開始した。培養開始から３日後に、電磁式オービタルシェーカー（ＣＯ2インキュベータ用、アズワン製）に容器を移し、２００ｒｐｍの振盪速度で培養を継続した。培地交換は毎日行い、培地中の一日当たりのグルコース消費量、乳酸産生量、乳酸脱水素酵素量および抗体の産生量をＣｅｄｅｘ  Ｂｉｏ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて測定した。経時的にグルコースが消費され、抗体及び乳酸が持続的に産生されることを確認した。培養開始時３日間におけるグルコース消費量及び乳酸産生量を表１に示す。安定に培養がなされることを確認した。
【表１】
2019146732.tif 000005
【００９５】
実施例２
細胞培養モジュール２０を用いた細胞培養
図７及び８に示される細胞培養モジュール２０を用いて、細胞培養を行った。細胞培養モジュール２０は、希釈したミルトン溶液（キョーリン製薬社製）、超純水、７０％エタノール含有水にて洗浄し、滅菌的に乾燥した後に使用した。なお、本実施例で使用された細胞培養モジュール２０で使用したポリイミド多孔質膜のサイズは１．０ｃｍ×１．０ｃｍである。当該ポリイミド多孔質膜を６枚１セットとした積層体を３セット用意し、それぞれの間に中敷きを挟持した。本実施例で使用された細胞培養モジュール２０中のポリイミド多孔質膜の総枚数は１０８枚であり、総面積は１０８ｃｍ2となる。細胞培養モジュール２０を本実施例において５個使用したので、ポリイミド多孔質膜の総枚数は５４０枚であり、総面積は５４０ｃｍ2となる。使用された細胞培養モジュール２０の細胞培養サブモジュール収容用ケーシング及びポリマー多孔質膜収容用ケーシングの材質は、いずれもポリオレフィン系樹脂である。また、使用された中敷きはＮＢＣメッシュテック社製メッシュである。【００９６】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が５．４１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、（総細胞数６．１６×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞率８８％）になるまで培養を継続した。【００９７】
内容積１５０ｍｌのボトル型滅菌容器（コーニング社製）に、滅菌した細胞培養モジュール２０を５個加え、そこにＣＨＯ細胞単層培養用培地ＫＢＭ２７０（コージンバイオ株式会社製）を２６．７ｍｌ添加して、ＣＯ2インキュベータ内でプログラムシェーカー（ケニス社製）を用いて、３５ｒｐｍの振盪速度で１０分間浸漬させた。その後、ＣＨＯ  ＤＰ−１２浮遊細胞培養液（総細胞数６．１６×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞数５．４１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、死細胞数７．５１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞率８８％）６．０ｍＬと、浮遊細胞用培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ）７．３ｍＬの混合液を添加し、約１４時間、プログラムシェーカー（ケニス社製）を用いて、３５ｒｐｍの回転条件で細胞を吸着させた（シート１枚当たりの細胞吸着数５．３０×１０4ｃｅｌｌｓ）。回収された培地から計算した細胞吸着率は、８８％であった。【００９８】
その後、培地を除去し、ＣＨＯ細胞単層培養用培地ＫＢＭ２７０（コージンバイオ株式会社製）を４０ｍｌ添加して培養を開始した。培養開始から２日後に、電磁式オービタルシェーカー  （ＣＯ2インキュベータ用、アズワン製）に容器を移し、２００ｒｐｍの振盪速度で培養を継続した。培地交換は毎日行い、培地中の一日当たりのグルコース消費量、乳酸産生量、乳酸脱水素酵素量および抗体の産生量をＣｅｄｅｘ  Ｂｉｏ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて測定した。経時的にグルコースが消費され、抗体及び乳酸が持続的に産生されることを確認した。抗体産生量の経時変化を図１１に示す。【００９９】
比較例１
図９及び１０に示される細胞培養サブモジュール３０を３０個用意して、滅菌した。ポリイミド多孔質膜の総枚数は５４０枚であり、総面積は５４０ｃｍ2となる。当該サブモジュールを充填した１５０ｍＬストレージボトル（コーニング社製）にCHO細胞単層培養用培地ＫＢＭ２７０（コージンバイオ株式会社製）を２６．７ｍＬ添加し、ＣＯ2インキュベータ内で１０分間、プログラムシェーカー（ケニス社製）を用いて３５ｒｐｍの回転条件で浸漬した。ＣＨＯ  ＤＰ−１２浮遊細胞培養液（総細胞数６．１６×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞数５．４１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、死細胞数７．５１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞率８８％）６．０ｍＬと、浮遊細胞用培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ）７．３ｍＬの混合液を添加し、約１４時間、３５ｒｐｍの回転条件で細胞を吸着させた（シート1枚当たりの細胞吸着数５.８３×１０4ｃｅｌｌｓ）。回収培地から見出された細胞数から計算した細胞吸着率は９７％であった。培地交換は毎日行い、培地中の一日当たりのグルコース消費量、乳酸産生量、乳酸脱水素酵素量および抗体の産生量を、Ｃｅｄｅｘ  Ｂｉｏ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて測定した（図１１）。抗体産生量は、細胞培養モジュールを用いた場合（実施例２）の方が高かった。【０１００】
比較例２
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの細胞数が、２．０×１０6になるまで培養を継続した。【０１０１】
０．３ｃｍ×２．５ｃｍの細長い形状をしたポリイミド多孔質膜を準備して乾熱滅菌を行なった後、２０ｃｍ2シャーレ内に１１〜１２片を設置し、上記浮遊培養液４ｍｌを注加して十分にポリイミド多孔質膜を細胞懸濁液で湿潤させた後、ＣＯ2インキュベータ内に放置した。２時間後、シャーレをインキュベータから取り出し、細胞懸濁液を吸引除去した後に培地（２％ＦＢＳ添加ＩＭＤＭ）４ｍｌを加えて、更にＣＯ2インキュベータ内で培養を継続した。培地は、２日に一回のペースで交換を行なった。【０１０２】
培養開始から７日後、ＣＣＫ８（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｉｇ  Ｋｉｔ８；同仁化学研究所製溶液試薬）を用いて培養された３枚のシャーレ内におけるポリイミド多孔質膜上の細胞数を、面積あたりの細胞数として算出した。翌日、３つのシャーレの内１つはそのまま培養をさらに２日間続けた（以下で「培養１」と呼ぶ）。【０１０３】
残り２つのシャーレのうち１つについては、培養液ごと酸素透過型培養バッグ（ニプロ製）に細胞の生育したポリイミド多孔質膜を移し、ヒートシーラーで滅菌的に密閉した。その後、ＣＯ2インキュベータ内に設置したシェーカーで１分間に２０〜３０回のゆれを生じる設定を行い、振盪培養を２日間実施した（以下、「培養２」と呼ぶ）。【０１０４】
更に、残りのシャーレ１つに含まれるポリイミド多孔質膜をハサミにて、約０．３ｃｍ×０．３ｃｍ細片に滅菌的に細断した。その後、１ｃｍ×１ｃｍ程度の大きさの３０＃ナイロンメッシュの外套を用意し、その中に細断したポリイミド多孔質膜を収容し、ヒートシーラーで滅菌的に密閉した。得られた細胞培養モジュールを、酸素透過型培養バッグ（ニプロ製）に培地ごと移送して、ヒートシーラーで滅菌的に密閉した。その後、ＣＯ2インキュベータ内に設置したシェーカーで１分間に２０〜３０回のゆれを生じる設定を行い、振盪培養を２日間実施した（以下、「培養３」と呼ぶ）。【０１０５】
培養１〜３の実施後の細胞密度を、ＣＣＫ８を用いて算出した。結果を表２に示す。ポリイミド多孔質膜を固定せずに振盪培養をした培養２において、著しい細胞数の減少が観察された。これは、ポリイミド多孔質膜の形態が継続的に変形するために、ポリイミド多孔質膜内で生育される細胞にストレスが加えられ、アポトーシスなどによって細胞が示すためであると考えられる。一方、ポリイミド多孔質膜が外套内に収容されて固定された状態で振盪培養をした培養３において、培養２で見られた細胞数の減少は抑制された。【０１０６】
【表２】
2019146732.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明の細胞培養モジュールは、安定な細胞培養及び物質産生のために好適に利用することができる。
【符号の説明】
【０１０８】
１    細胞培養モジュール
２    頂部
３    底部
４    側部
５    第一仕切り部
６    第二仕切り部
７ａ〜７ｅ    ポリマー多孔質膜積層体
８ａ〜８ｈ    培養液流出入口
９    載置台
１０    細胞培養モジュール複合体
２０    細胞培養モジュール
２１    細胞培養サブモジュール収容用ケーシング
２２    隙間空間
３０    細胞培養サブモジュール
３１    ポリマー多孔質膜収容用ケーシング
３２ａ、３２ｂ    中敷き
【図１】
2019146732.tif 000007
【図２】
2019146732.tif 000008
【図３】
2019146732.tif 000009
【図４】
2019146732.tif 000010
【図５】
2019146732.tif 000011
【図６】
2019146732.tif 000012
【図７】
2019146732.tif 000013
【図８】
2019146732.tif 000014
【図９】
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【図１０】
2019146732.tif 000016
【図１１】
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【国際調査報告】
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