(57)【要約】  この発明は、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質、又は連続する７以上のアミノ酸を含むその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含む、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物に関する。
2010016526.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号で表されるいずれかのアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質、又は連続する７以上のアミノ酸を含むその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
【請求項２】
前記ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の断片が、配列番号２〜３０のうち配列番号６および配列番号１８を除く偶数の配列番号で表されるいずれかのアミノ酸配列中のアミノ酸残基番号５０−９８又はアミノ酸残基番号２３３−３０５の領域内の連続する７個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は該ポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
配列番号３７又は配列番号１３６で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するＣＡＰＲＩＮ−１の部分ポリペプチド、又は連続する７以上のアミノ酸を含むその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記癌が乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、肺癌、食道癌もしくは大腸癌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
配列番号３７又は配列番号１３６で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するポリペプチドと免疫学的反応性を有する抗体。
【請求項８】
配列番号４０、４１及び４２を含む重鎖可変領域と配列番号４４、４５及び４６を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体。
【請求項９】
配列番号４０，４１及び４２を含む重鎖可変領域と配列番号５０，５１及び５２を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体。
【請求項１０】
配列番号４０，４１及び４２を含む重鎖可変領域と配列番号５５，５６及び５７を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体。
【請求項１１】
配列番号４０，４１及び４２を含む重鎖可変領域と配列番号６０，６１及び６２を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体。
【請求項１２】
配列番号４０，４１及び４２を含む重鎖可変領域と配列番号６５，６６及び６７を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体。
【請求項１３】
配列番号７０，７１及び７２を含む重鎖可変領域と配列番号７４，７５及び７６を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体。
【請求項１４】
配列番号８０，８１及び８２を含む重鎖可変領域と配列番号８４，８５及び８６を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体。
【請求項１５】
配列番号９０，９１及び９２を含む重鎖可変領域と配列番号９４，９５及び９６を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体。
【請求項１６】
配列番号１００，１０１及び１０２を含む重鎖可変領域と配列番号１０４，１０５及び１０６を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体。
【請求項１７】
配列番号１１０，１１１及び１１２を含む重鎖可変領域と配列番号１１４，１１５及び１１６を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体。
【請求項１７】
配列番号１２０，１２１及び１２２を含む重鎖可変領域と配列番号１２４，１２５及び１２６を含む軽鎖可変領域とを含み、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体。
【請求項１８】
ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体である、請求項７〜１７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１９】
請求項７〜１８のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
【請求項２０】
配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質、又は連続する７以上のアミノ酸を含むその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを用いた、癌の治療及び／又は予防方法。
【請求項２１】
請求項７〜１８のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメントを用いた、癌の治療及び／又は予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体又はそのフラグメントの、癌の治療及び／又は予防剤等としての新規な医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。近年、分子生物学や癌免疫学の進歩によって、癌に特異的に反応する抗体類、細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原類、癌抗原をコードする遺伝子類などが同定されており、癌抗原類をターゲットにした特異的癌治療法への期待が高まっている（非特許文献１）。【０００３】
癌治療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、正常細胞にはほとんど存在せず、癌細胞に特異的に存在していることが望ましい。１９９１年、ベルギー国Ｌｕｄｗｉｇ研究所のＢｏｏｎらは自己癌細胞株と癌反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するヒトメラノーマ抗原ＭＡＧＥ１を単離した（非特許文献２）。その後、癌患者の生体内で自己の癌に反応して産生される抗体が認識する腫瘍抗原を遺伝子の発現クローニングの手法を取り入れて同定する、ＳＥＲＥＸ（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ）法が報告され（非特許文献３及び特許文献１）、この方法により、正常細胞にはほとんど発現がなく、癌に特異的に発現するいくつかの癌抗原が単離されている（非特許文献４〜９）。さらに、その一部をターゲットにして、癌抗原に特異的に反応する免疫細胞を用いた細胞療法や、癌抗原を含むワクチンなどの癌特異的免疫療法の臨床試験が実施されている。【０００４】
一方、近年、癌細胞上の抗原タンパク質を標的にした、癌を治療するための各種抗体医薬が世の中に台頭してきた。癌特異的治療薬として一定の薬効が得られ注目されているが、標的となる抗原タンパク質の大部分は正常細胞にも発現するものであり、抗体投与の結果、癌細胞だけでなく、抗原が発現する正常細胞も障害されてしまい、その結果生じる副作用が問題になっている。従って、癌細胞表面に特異的に発現する癌抗原を同定し、それを標的とした抗体を医薬品として使用することができれば、より副作用の少ない抗体医薬による治療が可能になると期待される。【０００５】
Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＣＡＰＲＩＮ−１）は、休止期の正常細胞が活性化や細胞分裂を起こす際に発現し、また細胞内でＲＮＡと細胞内ストレス顆粒を形成してｍＲＮＡの輸送、翻訳の制御に関与することなどが知られている細胞内タンパク質である。一方で、ＣＡＰＲＩＮ−１には色々な別名が存在しており、その一例としてＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １やＭｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｒｋｅｒ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ  （Ｍ１１Ｓ１）などがあり、あたかも本タンパク質が細胞膜タンパク質であることが知られていたかのような名称がある。これらの別名は、元々、ＣＡＰＲＩＮ−１の遺伝子配列が、ＧＰＩ結合領域を有し、大腸癌細胞に発現する膜タンパク質であるとする報告（非特許文献１０）に由来するが、後にこの報告でのＣＡＰＲＩＮ−１の遺伝子配列は誤りであり、現在ＧｅｎＢａｎｋ等に登録されているＣＡＰＲＩＮ−１の遺伝子配列が１塩基欠損することによりフレームシフトが起きることでＣ末端から８０アミノ酸が欠損し、その結果生じるａｒｔｉｆａｃｔ（７４アミノ酸）が前報告でのＧＰＩ結合部分であり、さらに５’側にも遺伝子配列のエラーがあり、Ｎ末端から５３アミノ酸が欠損していることが報告されている（非特許文献１１）。また、現在ＧｅｎＢａｎｋ等に登録されているＣＡＰＲＩＮ−１の遺伝子配列がコードするタンパク質は細胞膜タンパク質ではないことが報告されている（非特許文献１１）。【０００６】
なお、ＣＡＰＲＩＮ−１が細胞膜タンパク質であるとする非特許文献１０の報告に基づき、特許文献２及び３には、Ｍ１１Ｓ１の名称で、ＣＡＰＲＩＮ−１が細胞膜タンパク質の１つとして抗体医薬の標的として癌治療に使用されうることが記載されている（実施例には本タンパク質に対する抗体を用いた治療に関する記載は一切ない）。しかし、非特許文献１１の報告の通り、特許文献２の出願当時から現在まで、ＣＡＰＲＩＮ−１は細胞表面には発現していないものであることが通説になっており、ＣＡＰＲＩＮ−１が細胞膜タンパク質であるという誤った情報のみに基づく特許文献２及び３の内容は、当業者の技術常識として理解されるべきものでないことは明らかである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５６９８３９６号
【特許文献２】ＵＳ２００８／００７５７２２
【特許文献３】ＷＯ２００５／１００９９８
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】秋吉毅，「癌と化学療法」、１９９７年、第２４巻、ｐ５５１−５１９（癌と化学療法社、日本）
【非特許文献２】Ｂｒｕｇｇｅｎ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５４：１６４３−１６４７（１９９１）
【非特許文献３】Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９２：１１８１０−１１８１３（１９９５）
【非特許文献４】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７２：９６５−９７１（１９９７）
【非特許文献５】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５８：１０３４−１０４１（１９９８）
【非特許文献６】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２９：６５２−６５８（１９９８）
【非特許文献７】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，１４：７０３−７０８（１９９９）
【非特許文献８】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５６：４７６６−４７７２（１９９６）
【非特許文献９】Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ６：３３−３９，  １９９７
【非特許文献１０】Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７０：２０７１７−２０７２３，  １９９５
【非特許文献１１】Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７２：２３８９−２４００，  ２００４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、癌細胞の表面に特異的に発現する癌抗原タンパク質を同定し、それを標的とした抗体の、癌の治療及び／又は予防剤としての用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究の結果、イヌの精巣組織由来ｃＤＮＡライブラリーと乳癌患犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを取得し、取得した遺伝子及びそのヒト、ウシ、ウマ、マウス、ニワトリ相同性遺伝子を基にして、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号で示されるアミノ酸配列を有するＣＡＰＲＩＮ−１及びそれらＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体を作製した。そしてＣＡＰＲＩＮ−１が乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、肺癌、食道癌、大腸癌、胃癌及び腎臓癌細胞の特異的に発現していること、そしてＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の一部がそれら癌細胞の細胞表面に特異的に発現していることを見出した。そして、それらＣＡＰＲＩＮ−１の各癌細胞の細胞表面に発現する部分に対する抗体が、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する癌細胞を障害することを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１１】
したがって、本発明は、以下の特徴を有する。【００１２】
本発明は、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有する、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質、又は連続する７以上のアミノ酸を含むその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。【００１３】
その実施形態において、上記癌は、乳癌、脳腫瘍、白血病、リンパ腫、肺癌、食道癌、大腸癌、胃癌もしくは腎臓癌である。【００１４】
別の実施形態において、上記抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。【００１５】
別の実施形態において、上記抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、又は二重特異抗体である。【００１６】
別の実施形態において、上記抗体は、配列番号３７又は１３６で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するポリペプチド又その断片と免疫学的反応性を有する抗体である。【００１７】
別の実施形態において、上記抗体は、以下の（ａ）〜（ｋ）のいずれかの抗体であって、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体、又は該抗体を有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物である
（ａ）配列番号４０、４１および４２を含む重鎖可変領域と配列番号４４、４５および４６を含む軽鎖可変領域とを含む抗体。【００１８】
（ｂ）配列番号４０、４１および４２を含む重鎖可変領域と配列番号５０、５１および５２を含む軽鎖可変領域とを含む抗体。【００１９】
（ｃ）配列番号４０、４１および４２を含む重鎖可変領域と配列番号５５、５６および５７を含む軽鎖可変領域とを含む抗体。【００２０】
（ｄ）配列番号４０、４１および４２を含む重鎖可変領域と配列番号６０、６１および６２を含む軽鎖可変領域とを含む抗体。【００２１】
（ｅ）配列番号４０、４１および４２を含む重鎖可変領域と配列番号６５、６６および６７を含む軽鎖可変領域とを含む抗体。【００２２】
（ｆ）配列番号７０，７１および７２を含む重鎖可変領域と配列番号７４，７５および７６を含む軽鎖可変領域とを含む抗体。【００２３】
（ｇ）配列番号８０，８１および８２を含む重鎖可変領域と配列番号８４，８５および８６を含む軽鎖可変領域とを含む抗体。【００２４】
（ｈ）配列番号９０，９１および９２を含む重鎖可変領域と配列番号９４，９５および９６を含む軽鎖可変領域とを含む抗体。【００２５】
（ｉ）配列番号１００，１０１および１０２を含む重鎖可変領域と配列番号１０４，１０５および１０６を含む軽鎖可変領域とを含む抗体。【００２６】
（ｊ）配列番号１１０，１１１および１１２を含む重鎖可変領域と配列番号１１４，１１５および１１６を含む軽鎖可変領域とを含む抗体。【００２７】
（ｋ）配列番号１２０，１２１および１２２を含む重鎖可変領域と配列番号１２４１２５および１２６を含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
【発明の効果】
【００２８】
本発明で用いられるＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体は、癌細胞を障害する。従って、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体は癌の治療や予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質をコードする遺伝子の、正常組織及び腫瘍細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号１；ＣＡＰＲＩＮ−１タンパクをコードする遺伝子の発現パターン、参照番号２；ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現パターンを示す。
【図２】ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体（抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体）による、ＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子を発現する乳癌細胞株（Ｔ４７Ｄ）に対する細胞障害活性を示す図である。参照番号３；抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を添加したときの活性、参照番号４；コントロール抗体を添加したときの活性、参照番号５；抗体なしの場合の活性を示す。
【図３】ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体（抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体）による、ＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子を発現する乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−１５７）に対する細胞障害活性を示す図である。参照番号６；抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を添加したときの活性、参照番号７；コントロール抗体を添加したときの活性、参照番号８；抗体なしの場合の活性を示す。
【図４】癌細胞の細胞表面に反応するＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体（＃１〜＃１１）による、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１５７に対する細胞障害性を示す図である。参照番号９；＃１のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号１０；＃２のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号１１；＃３のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号１２；＃４のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号１３；＃５のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号１４；＃６のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号１５；＃７のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号１６；＃８のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号１７；＃９のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号１８；＃１０のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号１９；＃１１のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体を添加したときの活性、参照番号２０；ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク自体には反応するが、癌細胞の細胞表面に反応しないモノクローナルを添加したときの活性、参照番号２１；抗体の代わりにＰＢＳを添加したときの活性を示す。
【図５】癌細胞の細胞表面に反応するＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体（＃１〜＃１１）の、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現するマウス癌細胞株ＣＴ２６が移植されたＢａｌｂ／ｃマウスに対する抗腫瘍効果を示す図（５ａ〜５ｃ）である。参照番号２２；＃１のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号２３；＃２のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号２４；＃３のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号２５；＃４のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号２６；＃５のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号２７；＃６のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号２８；＃７のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号２９；＃８のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号３０；＃９のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号３１；＃１０のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号３２；＃１１のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体ＣＡＰＲＩＮ−１を投与されたマウスの腫瘍の大きさを、参照番号３３；ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク自体には反応するが、癌細胞の細胞表面に反応しないモノクローナルを投与されたマウスの腫瘍の大きさを、参照番号３４；抗体の代わりにＰＢＳを投与されたマウスの腫瘍の大きさを示す。
【図６】癌細胞の細胞表面に反応するＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体（＃１〜＃１１）の、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現するマウス癌細胞株Ｎ１Ｅが移植されたＢａｌｂ／ｃマウスに対する抗腫瘍効果を示す図（６ａ〜６ｃ）である。参照番号３５；＃１のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号３６；＃２のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号３７；＃３のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号３８；＃４のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号３９；＃５のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号４０；＃６のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号４１；＃７のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号４２；＃８のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号４３；＃９のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号４４；＃１０のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体、参照番号４５；＃１１のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体ＣＡＰＲＩＮ−１を投与されたマウスの腫瘍の大きさを、参照番号４６；ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク自体には反応するが、癌細胞の細胞表面に反応しないモノクローナルを投与されたマウスの腫瘍の大きさ、参照番号４７；抗体の代わりにＰＢＳを投与されたマウスの腫瘍の大きさを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明で用いられる配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号のポリペプチドに対する抗体の抗腫瘍活性は、後述するように、生体内で担癌動物に対する腫瘍増殖の抑制を調べることによって、あるいは、生体外で該ポリペプチドを発現する腫瘍細胞に対して、免疫細胞又は補体を介した細胞障害活性を示すか否かを調べることによって評価することができる。
【００３１】
なお、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号（すなわち、配列番号２，４，６・・２８，３０）のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列はそれぞれ、配列番号１〜２９のうち奇数の配列番号（すなわち、配列番号１，３，５・・２７，２９）に示されている。
【００３２】
本発明が開示する配列表の配列番号６、８、１０、１２及び１４で示されるアミノ酸配列は、イヌ精巣組織由来ｃＤＮＡライブラリーと乳癌患犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体と結合するポリペプチドとして、また配列番号２及び４で示されるアミノ酸配列は、そのヒト相同因子（ホモログ）として、配列番号１６で示されるアミノ酸配列は、そのウシ相同因子として、配列番号１８で示されるアミノ酸配列は、そのウマ相同因子として、配列番号２０〜２８で示されるアミノ酸配列は、そのマウス相同因子として、配列番号３０で示されるアミノ酸配列は、そのニワトリ相同因子として単離された、ＣＡＰＲＩＮ−１のアミノ酸配列である（後述の実施例１参照）。ＣＡＰＲＩＮ−１は、休止期の正常細胞が活性化や細胞分裂を起こす際に発現することが知られている。
【００３３】
ＣＡＰＲＩＮ−１は、細胞表面には発現しないことが知られていたが、本検討により、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の一部が各種癌細胞の細胞表面に発現することが明らかになった。本発明では、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の内、癌細胞の細胞表面に発現する部分に結合する抗体が好ましく用いられる。癌細胞の細胞表面に発現するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質中の部分ペプチドとして、配列表の配列番号２〜３０のうち配列番号６および配列番号１８を除く偶数番号で表されるアミノ酸配列中のアミノ酸残基番号（ａａ）５０−９８又はアミノ酸残基番号（ａａ）２３３−３０５の領域内の連続する７個以上のアミノ酸配列から成るポリペプチドが挙げられ、具体的には例えば、配列番号３７又は配列番号１３６（配列番号１３６で表されるアミノ酸配列の中でも、配列番号１３７又は配列番号１３８で表されるアミノ酸配列の領域が好ましい。）で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、本発明の抗体は、これらペプチドに結合する、かつ、抗腫瘍活性を示すすべての抗体が含まれる。
【００３４】
本発明で用いられる上記ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体は、抗腫瘍活性を発揮しうる限りいかなる種類の抗体であってもよく、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体（ｓｃＦＶ）、抗体フラグメント、例えばＦａｂやＦ（ａｂ’）２、などを含む。これらの抗体及びそのフラグメントは、また当業者に公知の方法により調製することが可能である。本発明においては、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と特異的に結合することが可能な抗体が望ましいし、モノクローナル抗体であることが好ましいが、均質な抗体を安定に生産できるかぎり、ポリクローナル抗体であっても良い。また、被験者がヒトである場合には、拒絶反応を回避もしくは抑制するためにヒト抗体又はヒト化抗体であることが望ましい。
【００３５】
ここで、「ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と特異的に結合する」とは、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質に特異的に結合し、それ以外のタンパク質と実質的に結合しないことを意味する。
【００３６】
本発明で用いることができる抗体の抗腫瘍活性は、後述するように、生体内で担癌動物に対する腫瘍増殖の抑制を調べることによって、あるいは、生体外で該ポリペプチドを発現する腫瘍細胞に対して、免疫細胞又は補体を介した細胞障害活性を示すか否かを調べることによって評価することができる。
【００３７】
さらにまた、本発明における癌の治療及び／又は予防の対象である被験者は、ヒト、ペット動物、家畜類、競技用動物などの哺乳動物であり、好ましい被験者は、ヒトである。
【００３８】
以下に、本発明に関する抗原の作製、抗体の作製、ならびに医薬組成物について説明する。
【００３９】
＜抗体作製用抗原の作製＞
本発明で用いられるＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体を取得するための感作抗原として使用されるタンパク質又はその断片は、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリなど、その由来となる動物種に制限されない。しかし細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく、一般的には、哺乳動物由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。例えば、ＣＡＰＲＩＮ−１がヒトＣＡＰＲＩＮ−１の場合、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質やその部分ペプチド、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１を発現する細胞などを用いることができる。
【００４０】
ヒトＣＡＰＲＩＮ−１及びそのホモログの塩基配列及びアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）にアクセスし、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：５８７３−５８７７，１９９３；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２，  １９９７）を利用することによって入手することができる。
【００４１】
本発明では、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１の塩基配列（配列番号１もしくは３）又はアミノ酸配列（配列番号２もしくは４）を基準とした場合、これらのＯＲＦ又は成熟部分の塩基配列又はアミノ酸配列と７０％〜１００％、好ましくは８０％〜１００％、より好ましくは９０％〜１００％、さらに好ましくは９５％〜１００％、例えば９７％〜１００％、９８％〜１００％、９９％〜１００％又は９９．５％〜１００％の配列同一性を有する配列からなる核酸又はタンパク質がターゲットになる。ここで、「％配列同一性」は、２つの配列を、ギャップを導入してか又はギャップを導入しないで、最大の類似度となるようにアラインメント（整列）したとき、アミノ酸（又は塩基）の総数に対する同一アミノ酸（又は塩基）のパーセンテージ（％）を意味する。
【００４２】
ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の断片は、抗体が認識する最小単位であるエピトープ（抗原決定基）のアミノ酸長から、該タンパク質の全長未満の長さを有する。エピトープは、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、抗原性又は免疫原性を有するポリペプチド断片を指し、その最小単位は、約７〜１２アミノ酸、例えば８〜１１アミノ酸、からなる。具体例としては、配列番号３７、配列番号１３７又は配列番号１３８で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
【００４３】
上記した、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質やその部分ペプチドを含むポリペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ―ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる（日本生化学会編、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、化学修飾とペプチド合成、東京化学同人（日本）、１９８１年）。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  第２版，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第３版，  Ａ  ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９５），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓなど）を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でポリペプチドを生産させることにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。
【００４４】
上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡは、ヒト染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することができる。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼなど）及びＭｇ２＋含有ＰＣＲバッファーを用いて、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応行程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができるが、これに限定されない。ＰＣＲの手法、条件等については、例えばＡｕｓｕｂｅｌら，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第３版，  Ａ  ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９５），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（特に第１５章）に記載されている。
【００４５】
また、本明細書中の配列表の配列番号１〜３０に示される塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてヒトなどのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号のタンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。そのような細胞や組織の例は、精巣、白血病、乳癌、リンパ腫、脳腫瘍、肺癌、大腸癌などの癌又は腫瘍に由来する細胞又は組織である。上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ならびに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  第２版，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９８９）、Ａｕｓｂｅｌら（上記）等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたＤＮＡから、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質やその部分ペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００４６】
上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞ＣＯＳ１、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ等の哺乳動物細胞、ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３、マウス胎仔皮膚細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、出芽酵母、分裂酵母等の酵母細胞、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、マルチクローニングサイト、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子、等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。
【００４８】
宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＹＥＳ２等が例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１等を用いた場合には、Ｈｉｓタグ（例えば（Ｈｉｓ）６〜（Ｈｉｓ）１０）、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。
【００４９】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション、ウイルス感染、リポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、等の周知の方法を用いることができる。
【００５０】
宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
＜抗体の構造＞
抗体は通常少なくとも２本の重鎖および２本の軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質である。ＩｇＭは別として、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖で構成される約１５０ｋＤａのヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、それぞれの軽鎖は１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結されているが、種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は変動する。それぞれの重鎖および軽鎖はまた鎖内ジスルフィド結合も有する。それぞれの重鎖は一方の端に可変ドメイン（ＶＨ領域）を有し、それにいくつかの定常領域が続く。それぞれ軽鎖は可変ドメイン（ＶＬ領域）を有し、その反対の端に１つの定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の最初の定常領域と整列しており、かつ軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。抗体の可変ドメインは特定の領域が相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる特定の可変性を示して抗体に結合特異性を付与する。可変領域の相対的に保存されている部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれている。完全な重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ３つのＣＤＲにより連結された４つのＦＲを含む。３つのＣＤＲは重鎖ではそのＮ末から順にＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２，ＣＤＲＨ３、同様に軽鎖ではＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２，ＣＤＲＬ３と呼ばれている。抗体の抗原への結合特異性には、ＣＤＲＨ３が最も重要である。また、各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって近接した状態で一緒に保持され、他方の鎖からのＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は抗体が抗原に結合することに直接寄与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）への関与、Ｆｃγ受容体への結合を介した食作用、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介した半減期／クリアランス速度、補体カスケードのＣ１ｑ構成要素を介した補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を示す。
【００５２】
＜抗体の作製＞
本発明における抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体とは、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の全長又はその断片と免疫学的反応性を有する抗体を意味する。
【００５３】
ここで、「免疫学的反応性」とは、生体内で抗体とＣＡＰＲＩＮ−１抗原とが結合する特性を意味し、このような結合を介して腫瘍を障害（例えば、死滅、抑制又は退縮）する機能、が発揮される。すなわち、本発明で使用される抗体は、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と結合して腫瘍、例えば白血病、リンパ腫、乳癌、脳腫瘍、肺癌、食道癌、胃癌、腎臓癌、大腸癌などを障害することができるならば、その種類を問わない。
【００５４】
抗体の例は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、抗体フラグメント（例えばＦａｂやＦ（ａｂ’）２）などを含む。また、抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス、例えばＩｇＧ，ＩｇＥ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ及びＩｇＹ、又は任意のサブクラス、例えばＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２などである。
【００５５】
抗体はさらに、グリコシル化の他に、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、またはペグ（ＰＥＧ）化などによって修飾されていてもよい。
【００５６】
以下に、種々の抗体の作製例を示す。
【００５７】
抗体が、モノクローナル抗体であるときには、例えば、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３などをマウスに投与して免疫し、同マウスより脾臓を抽出し、細胞を分離の上、該細胞とマウスミエローマ細胞とを融合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、癌細胞増殖抑制作用を持つ抗体を産生するクローンを選択する。癌細胞増殖抑制作用を持つモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを単離し、当該ハイブリドーマを培養し、培養上清から一般的なアフィニティ精製法により抗体を精製することで、調製することが可能である。
【００５８】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、例えば以下のようにしても作製することができる。まず、公知の方法にしたがって、感作抗原を動物に免疫する。一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
【００５９】
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付すが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【００６０】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３Ｕ１（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （１９７９）１２３，  １５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （１９７８）８１，  １−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．  Ｇ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｃ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （１９７６）６，  ５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．  Ｄ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  （１９７６）８，  ４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  （１９７８）２７６，  ２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅＳｔ．  Ｇｒｏｔｈ，  Ｓ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９８０）３５，  １−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，  Ｉ．Ｓ．  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  （１９７８）１４８，  ３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  （１９７９）２７７，  １３１−１３３）等が好適に使用される。
【００６１】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｃ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  （１９８１）７３，  ３−４６）等に準じて行うことができる。
【００６２】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００６３】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００６４】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とするハイブリドーマを形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
【００６５】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを行う。
【００６６】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウイルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６（登録番号ＴＩＢ１９６）と融合させ、所望の活性（例えば、細胞増殖抑制活性）を有するヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。
【００６７】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００６８】
すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。
【００６９】
本発明で使用可能な抗体の別の例がポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、例えば、次のようにして得ることができる。
【００７０】
天然のＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質、あるいはＧＳＴなどとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させた組換えＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質、又はその部分ペプチドをマウス、ヒト抗体産生マウス、ウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。後述の実施例では、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質のアミノ酸配列中、癌細胞の細胞表面に発現する領域の一部のペプチド（配列番号３７で表される）に対するウサギポリクローナル抗体が作製され、抗腫瘍効果が確認されている。
【００７１】
ここで、ヒト抗体産生マウスとしては、例えばＫＭマウス（キリンファーマ／Ｍｅｄａｒｅｘ）及びＸｅｎｏマウス（Ａｍｇｅｎ）が知られている（例えば、国際公開第ＷＯ０２／４３４７８号、同第ＷＯ０２／０９２８１２号など）。このようなマウスをＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質又はその断片で免疫するときには、完全ヒトポリクローナル抗体を血液から得ることができる。また、免疫後のマウスから脾臓細胞を取出し、ミエローマ細胞との融合法によりヒト型モノクローナル抗体を作製することができる。
【００７２】
抗原の調製は、例えば、動物細胞を用いた方法（特表２００７−５３００６８）やバキュロウイルスを用いた方法（例えば、国際公開第ＷＯ９８／４６７７７号など）などに準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。
【００７３】
さらにまた、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ，  Ａ．Ｋ．  Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，  Ｊａｍｅｓ，  Ｗ．  Ｌａｒｒｉｃｋ，  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，  １９９０参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
【００７４】
本発明の抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。しかし、ポリクローナル抗体、遺伝子改変抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体など）などであってもよい。
【００７５】
モノクローナル抗体には、ヒトモノクローナル抗体、非ヒト動物モノクローナル抗体（例えばマウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体など）などが含まれる。モノクローナル抗体は、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質を免疫した非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ヒト抗体産生マウスなど）からの脾細胞とミエローマ細胞との融合によって得られたハイブリドーマを培養することによって作製されうる。後述の実施例では、マウスモノクローナル抗体が作製され、抗腫瘍効果が確認された。これらのモノクローナル抗体は、配列番号４３、配列番号７３、配列番号８３、配列番号９３、配列番号１０３、配列番号１１３又は配列番号１２３のアミノ酸配列を有する重鎖可変（ＶＨ）領域と、配列番号４７、配列番号５３、配列番号５８、配列番号６３、配列番号６８、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１０７，配列番号１１７又は配列番号１２７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域とを含み、ここで、該ＶＨ領域に配列番号４０、配列番号７０、配列番号８０、配列番号９０、配列番号１００、配列番号１１０又は配列番号１２０のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、配列番号４１、配列番号７１、配列番号８１、配列番号９１、配列番号１０１、配列番号１１１又は配列番号１２１のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ２及び配列番号４２、配列番号７２、配列番号８２、配列番号９２、配列番号１０２、配列番号１１２又は配列番号１２２のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ３が含まれ、該ＶＬ領域に配列番号４４、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６０、配列番号６５、配列番号７４、配列番号８４、配列番号９４、配列番号１０４，配列番号１１４又は配列番号１２４のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ１、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６６、配列番号７５、配列番号８５、配列番号９５、配列番号１０５，配列番号１１５又は配列番号１２５のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ２及び配列番号４６、配列番号５２、配列番号５７、配列番号６２、配列番号６７、配列番号７６、配列番号８６、配列番号９６、配列番号１０６、配列番号１１６又は配列番号１２６のアミノ酸配列で表されるＣＤＲ３が含まれる。
【００７６】
キメラ抗体は、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体であり、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体などである。キメラ抗体の作製は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡとヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡとを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。
【００７７】
ポリクローナル抗体には、ヒト抗体産生動物（例えば、マウス）にＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質を免疫して得られる抗体が含まれる。
【００７８】
ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト化抗体は、免疫動物由来の抗体のＣＤＲを、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構築される。その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。
【００７９】
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；  ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開第ＥＰ２３９４００号、国際公開第ＷＯ９６／０２５７６号参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９３，  ５３：  ８５１−８５６）。また、様々なヒト抗体由来のフレームワーク領域に置換してもよい（国際公開第ＷＯ９９／５１７４３号参照）。
【００８０】
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９３，  ５３：  ８５１−８５６）。
【００８１】
キメラ抗体やヒト化抗体を作製した後に、可変領域（例えば、ＦＲ）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等してもよい。
【００８２】
アミノ酸の置換は、例えば１５未満、１０未満、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下のアミノ酸、好ましくは１〜５アミノ酸、より好ましくは１又は２アミノ酸、の置換であり、置換抗体は、未置換抗体と機能的に同等であるべきである。置換は、保存的アミノ酸置換が望ましく、これは、電荷、側鎖、極性、芳香族性などの性質の類似するアミノ酸間の置換である。性質の類似したアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（トレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）などに分類しうる。
【００８３】
抗体修飾物としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を挙げることができる。本発明の抗体修飾物においては、結合される物質は限定されない。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
【００８４】
ここで「機能的に同等」とは、対象となる抗体が本発明の抗体と同様の生物学的あるいは生化学的活性、具体的には腫瘍を障害する機能、を有すること、ヒトへの適用時に拒絶反応を本質的に起こさないことなどを指す。このような活性としては、例えば、細胞増殖抑制活性、あるいは結合活性を例示することができる。
【００８５】
あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｇｅｎｅ  １５２，  ２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，  ＭＪ．，  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｍ．  （１９８３）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １００，  ４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２，  ９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ，  Ｗ．  ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ，  ＨＪ．，  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４，  ３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，  ＴＡ．，  （１９８５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ８２，  ４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ  （１９８８）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ８５，  ２７６３−２７６６）などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。
【００８６】
上記抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体が認識するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質のエピトープを認識する抗体は、当業者に公知の方法により得ることが可能である。例えば、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体が認識するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質のエピトープを通常の方法（例えば、エピトープマッピングなど）により決定し、該エピトープに含まれるアミノ酸配列を有するポリペプチドを免疫原として抗体を作製する方法や、通常の方法で作製された抗体のエピトープを決定し、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体とエピトープが同じ抗体を選択する方法などにより得ることができる。ここで、「エピトープ」は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、抗原性又は免疫原性を有するポリペプチド断片を指し、その最小単位は、約７〜１２アミノ酸、好ましくは８〜１１アミノ酸からなる。
【００８７】
本発明の抗体の親和定数Ｋａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）は、好ましくは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５×１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５×１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、あるいは、少なくとも１０１３Ｍ−１である。
【００８８】
本発明の抗体は、抗腫瘍剤とコンジュゲートすることができる。抗体と抗腫瘍剤との結合は、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、チオール基などと反応性の基（例えば、コハク酸イミジル基、ホルミル基、２−ピリジルジチオ基、マレイイミジル基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシ基など）をもつスペーサーを介して行うことができる。
【００８９】
抗腫瘍剤の例は、文献等で公知の下記の抗腫瘍剤、すなわち、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、チオテパ、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、ウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）、アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）、ブラタシン、ブラタシノン、カンプトセシン、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、クリプトフィシン１、クリプトフィシン８、ドラスタチン、ズオカルマイシン、エレウテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）、スポンジスタチン、クロランブシル、クロロナファジン（ｃｈｌｏＲＮＡｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ダイネマイシン、クロドロネート、エスペラマイシン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、アンシタ���ン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）；アンドロゲン類、例えばカルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、エルフォルニチン  （ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｅ）、ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、ピラルビシン、ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）、テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎｅ）Ａ、アングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ）、ウレタン、ビンデシン、ダカーバジン、マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ミトブロニトール、ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）、ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）、ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ドキセタキセル、クロランブシル、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６−チオグアニン、メルカプトプリン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、イホスファミド、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、テニポシド、エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）、イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）、イリノテカン、トポイソメラーゼインヒビター、ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、並びにそれらの薬学的に許容可能な塩又は誘導体を包含する。
【００９０】
あるいは、本発明の抗体には、文献等で公知の、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３ＳＭ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、１７５Ｌｕ、１７６Ｌｕなどの放射性同位体を結合することも可能である。放射性同位体は、腫瘍の治療や診断のために有効なものが望ましい。
【００９１】
本発明の抗体は、ＣＡＰＲＩＮ−１と免疫学的反応性を有する抗体、あるいは、ＣＡＰＲＩＮ−１を特異的に認識する抗体である。該抗体は、それを投与する対象動物において拒絶反応がほとんど又はまったく回避されるような構造をもつ抗体であるべきである。そのよう抗体としては、例えば対象動物がヒトである場合、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体（例えばヒト−マウスキメラ抗体）、単鎖抗体、二重特異性抗体などが挙げられる。これらの抗体は、重鎖及び軽鎖の可変領域がヒト抗体由来のものであるか、あるいは、重鎖及び軽鎖の可変領域が非ヒト動物抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）とヒト抗体由来のフレームワーク領域からなるものであるか、あるいは、重鎖及び軽鎖の可変領域が非ヒト動物抗体由来のものであり、かつ、重鎖及び軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のものである組換え型抗体である。好ましい抗体は、前２つの抗体である。
【００９２】
これらの組換え型抗体は、次のようにして作製することができる。ハイブリドーマなどの抗体産生細胞からヒトＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体（例えば、ヒトモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体など）をコードするＤＮＡをクローニングし、これを鋳型にして該抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法等により作製し、Ｋａｂａｔ  ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈＥｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  （１９９１））に基づいて軽鎖及び重鎖の各可変領域の配列又は各ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列を決定する。
【００９３】
さらに、これらの各可変領域をコードするＤＮＡ又は各ＣＤＲをコードするＤＮＡを、遺伝子組換え技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９））又はＤＮＡ合成機を用いて作製する。ここで、上記ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、ヒト抗体産生動物（例えば、マウス）にヒトＣＡＰＲＩＮ−１を免疫したのち、該免疫動物から切除した脾細胞とミエローマ細胞とを融合させることによって作製することができる。これとは別に、必要に応じて、遺伝子組換え技術又はＤＮＡ合成機を用いてヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の可変領域及び定常領域をコードするＤＮＡを作製する。
【００９４】
ヒト化抗体の場合には、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードするＤＮＡ中のＣＤＲコーディング配列を、それらに対応する、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲコーディング配列と置換したＤＮＡを作製し、それによって得られたＤＮＡをそれぞれ、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするＤＮＡと連結することによって、ヒト化抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。
【００９５】
キメラ抗体の場合には、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードするＤＮＡをそれぞれ、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするＤＮＡと連結することによって、キメラ抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。
【００９６】
単鎖抗体の場合には、この抗体は重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーを介して直線状に連結された抗体であり、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、リンカーをコードするＤＮＡ、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを結合することによって単鎖抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はいずれも、ヒト抗体由来のものであるか、あるいは、ＣＤＲのみヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲによって置換されたヒト抗体由来のものである。また、リンカーは、１２〜１９アミノ酸からなり、例えば１５アミノ酸の（Ｇ４Ｓ）３（Ｇ．  ■Ｂ．  Ｋｉｍら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２００７，  ２０（９）：  ４２５−４３２）が挙げられる。
【００９７】
二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）の場合には、この抗体は２つの異なるエピトープと特異的に結合可能な抗体であり、例えば重鎖可変領域ＡをコードするＤＮＡ、軽鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡ、重鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡ、及び軽鎖可変領域ＡをコードするＤＮＡをこの順序で結合する（ただし、軽鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡと重鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡとは上記のようなリンカーをコードするＤＮＡを介して結合される。）ことによって二重特異性抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はいずれも、ヒト抗体由来のものであるか、あるいは、ＣＤＲのみヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲによって置換されたヒト抗体由来のものである。
【００９８】
上記のようにして作製された組換えＤＮＡを、１つ又は複数の適当なベクターに組み込み、これを宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し、（共）発現させることによって組換え型抗体を作製することができる（Ｐ．Ｊ．  Ｄｅｌｖｅｓ．，  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．，  １９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｄｅａｎ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，  ２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ；  Ｊ．Ｗ．  Ｇｏｄｉｎｇ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．，  １９９３  ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ）。
【００９９】
上記の方法によって作製される本発明の抗体は、例えば以下の（ａ）〜（ｋ）の抗体が挙げられる。
【０１００】
（ａ）配列番号４０、４１および４２を含む重鎖可変領域と配列番号４４、４５および４６を含む軽鎖可変領域とを含む抗体（好ましくは配列番号４３の重鎖可変領域および配列番号４７の軽鎖可変領域で構成される抗体）。
【０１０１】
（ｂ）配列番号４０，４１および４２を含む重鎖可変領域と配列番号５０，５１および５２を含む軽鎖可変領域とを含む抗体（好ましくは配列番号４３の重鎖可変領域および配列番号５３の軽鎖可変領域で構成される抗体）。
【０１０２】
（ｃ）配列番号４０，４１および４２を含む重鎖可変領域と配列番号５５，５６および５７を含む軽鎖可変領域とを含む抗体（好ましくは配列番号４３の重鎖可変領域および配列番号５８の軽鎖可変領域で構成される抗体）。
【０１０３】
（ｄ）配列番号４０，４１および４２を含む重鎖可変領域と配列番号６０，６１および６２を含む軽鎖可変領域とを含む抗体（好ましくは配列番号４３の重鎖可変領域および配列番号６３の軽鎖可変領域で構成される抗体）。
【０１０４】
（ｅ）配列番号４０，４１および４２を含む重鎖可変領域と配列番号６５，６６および６７を含む軽鎖可変領域とを含む抗体（好ましくは配列番号４３の重鎖可変領域および配列番号６８の軽鎖可変領域で構成される抗体）。
【０１０５】
（ｆ）配列番号７０、７１および７２を含む重鎖可変領域と配列番号７４，７５および７６を含む軽鎖可変領域とを含む抗体（好ましくは配列番号７３の重鎖可変領域および配列番号７７の軽鎖可変領域で構成される抗体）。
【０１０６】
（ｇ）配列番号８０，８１および８２を含む重鎖可変領域と配列番号８４，８５および８６を含む軽鎖可変領域とを含む抗体（好ましくは配列番号８３の重鎖可変領域および配列番号８７の軽鎖可変領域で構成される抗体）。
【０１０７】
（ｈ）配列番号９０，９１および９２を含む重鎖可変領域と配列番号９４，９５および９６を含む軽鎖可変領域とを含む抗体（好ましくは配列番号９３の重鎖可変領域および配列番号９７の軽鎖可変領域で構成される抗体）。
【０１０８】
（ｉ）配列番号１００，１０１および１０２を含む重鎖可変領域と配列番号１０４，１０５および１０６を含む軽鎖可変領域とを含む抗体（好ましくは配列番号１０３の重鎖可変領域および配列番号１０７の軽鎖可変領域で構成される抗体）
（ｊ）配列番号１１０，１１１および１１２を含む重鎖可変領域と配列番号１１４，１１５および１１６を含む軽鎖可変領域とを含む抗体（好ましくは配列番号１１３の重鎖可変領域および配列番号１１７の軽鎖可変領域で構成される抗体）。
【０１０９】
（ｋ）配列番号１２０，１２１および１２２を含む重鎖可変領域と配列番号１２４，１２５および１２６を含む軽鎖可変領域とを含む抗体（好ましくは配列番号１２３の重鎖可変領域および配列番号１２７の軽鎖可変領域で構成される抗体）。
【０１１０】
ここで、配列番号４０、４１および４２、配列番号７０，７１および７２、配列番号８０，８１および８２、配列番号９０，９１および９２、配列番号１００，１０１および１０２、配列番号１１０，１１１および１１２、配列番号１２０，１２１および１２２に示すアミノ酸配列はそれぞれ、マウス抗体重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３であり、また、配列番号４４、４５および４６、配列番号５０，５１および５２、配列番号５５，５６および５７、配列番号６０，６１および６２、配列番号６５、６６および６７、配列番号７４，７５および７６、配列番号８４、８５および８６、配列番号９４，９５および９６、配列番号１０４，１０５および１０６、配列番号１１４，１１５および１１６、配列番号１２４，１２５および１２６に示すアミノ酸配列はそれぞれ、マウス抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３である。
【０１１１】
また、本発明のヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体は、例えば以下の抗体である（抗体（ａ）で例示する）。
【０１１２】
（ｉ）重鎖の可変領域が配列番号４０、４１および４２のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号４４、４５および４６のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含む抗体（好ましくは重鎖可変領域に配列番号４３のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域に配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗体）。
【０１１３】
（ｉｉ）重鎖の可変領域が配列番号４０、４１および４２のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号４４、４５および４６のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体（好ましくは重鎖の可変領域が配列番号４３のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含む、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号４７のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体）。
【０１１４】
なお、ヒト抗体重鎖及び軽鎖の定常領域及び可変領域の配列は、例えばＮＣＢＩ（米国：ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＧｅｎｅなど）から入手可能であり、例えばヒトＩｇＧ１重鎖定常領域については登録番号Ｊ００２２８、ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域については登録番号Ｊ００２３０、ヒトＩｇＧ３重鎖定常領域については登録番号Ｘ０３６０４、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域については登録番号Ｋ０１３１６、ヒト軽鎖κ定常領域については登録番号Ｖ００５５７、Ｘ６４１３５、Ｘ６４１３３など、ヒト軽鎖λ定常領域については登録番号Ｘ６４１３２、Ｘ６４１３４などの配列を参照することができる。
【０１１５】
上記抗体は、好ましくは、細胞障害活性を有しており、これによって抗腫瘍効果を発揮することができる。
【０１１６】
また、上記抗体における重鎖及び軽鎖の可変領域やＣＤＲの特定の配列は、単に例示を目的としたものであり、特定の配列に限定されないことは明らかである。ヒトＣＡＰＲＩＮ−１に対する別のヒト抗体又は非ヒト動物抗体（例えばマウス抗体）を産生しうるハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を回収し、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１との免疫学的結合性及び細胞障害活性を指標として目的の抗体であるか否かを判定する。それによって目的のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを識別したのち、上記のとおり、該ハイブリドーマから目的の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを作製し配列決定し、該ＤＮＡを別の抗体の作製のために利用する。
【０１１７】
さらに本発明の上記抗体は、ＣＡＰＲＩＮ−１を特異的に認識するという特異性を有する限り、上記（ｉ）から（ｉｖ）の各抗体の特にフレームワーク領域の配列及び／又は定常領域の配列において、１若しくは数個（好ましくは、１若しくは２個）のアミノ酸の置換、欠失又は付加があってもよい。ここで数個とは、２〜５個、好ましくは２個又は３個を意味する。
【０１１８】
本発明はさらに、本発明の上記抗体をコードするＤＮＡ、あるいは、上記抗体の重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡ、あるいは、上記抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡも提供する。そのようなＤＮＡは、例えば抗体（ａ）の場合、配列番号４０、４１および４２のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、配列番号４４、４５及び４６のアミノ酸配列をコードする塩基配列含む軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ、などを含む。
【０１１９】
これらの配列のＤＮＡによってコードされる相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体の特異性を決定する領域であるため、抗体のそれ以外の領域（すなわち、定常領域及びフレームワーク領域）をコードする配列は他の抗体由来の配列であってもよい。ここで他の抗体とはヒト以外の生物由来の抗体も含むが、副作用低減の観点からはヒト由来のものが好ましい。すなわち、上記のＤＮＡでは、重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域及び各定常領域をコードする領域がヒト抗体由来の対応アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが好ましい。
【０１２０】
さらに、本発明の抗体をコードするＤＮＡの別の例は、例えば抗体（ａ）の場合、配列番号４３のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、軽鎖可変領域をコードする領域が配列番号４７のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡなどである。ここで、配列番号４３のアミノ酸配列をコードする塩基配列の例は、配列番号４８の塩基配列である。また、配列番号４７のアミノ酸配列をコードする塩基配列の例は、配列番号４９の塩基配列である。これらのＤＮＡでも、重鎖及び軽鎖の各定常領域をコードする領域がヒト抗体由来の対応アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが好ましい。
【０１２１】
本発明のＤＮＡは、例えば上記の方法又は以下の方法で得ることができる。まず、本発明の抗体に関わるハイブリドーマから、市販のＲＮＡ抽出キットを用いて全ＲＮＡを調製し、ランダムプライマー等を用いて逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する。次いで既知のマウス抗体重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子の各可変領域において、それぞれ保存されている配列のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ法によって、抗体をコードするｃＤＮＡを増幅させる。定常領域をコードする配列については、既知の配列をＰＣＲ法で増幅することによって得ることができる。ＤＮＡの塩基配列は、配列決定用プラスミド又はファージに組み込むなどして、常法により決定することができる。
【０１２２】
本発明で用いられる抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体によるＣＡＰＲＩＮ−１発現癌細胞に対する抗腫瘍効果は、以下の機序により起こると考えられる。
【０１２３】
ＣＡＰＲＩＮ−１発現細胞のエフェクター細胞抗体依存的細胞障害性（ＡＤＣＣ）、及びＣＡＰＲＩＮ−１発現細胞の補体依存的細胞障害性（ＣＤＣ）。
【０１２４】
従って、本発明で用いられる抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体の活性評価は、以下実施例に具体的に示されるように、生体外でＣＡＰＲＩＮ−１を発現する癌細胞に対して上記ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を測定することで評価することができる。
【０１２５】
本発明で用いられる抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体は、癌細胞上のＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と結合し、上記活性によって、抗腫瘍作用を示すことから、癌の治療あるいは予防に有用であると考えられる。すなわち本発明は、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を有効成分とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト化抗体にすることが好ましい。
【０１２６】
なお、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体と癌細胞表面上のＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質との結合親和性が高い程、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体による、より強い抗腫瘍活性が得られる。従って、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質と高い結合親和性を有する抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を獲得できれば、より強い抗腫瘍効果が期待でき、癌の治療及び／または予防を目的とした医薬組成物として適応することが可能になる。高い結合親和性として、前述したように、結合定数（親和定数）Ｋａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）が、好ましくは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５×１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５×１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、あるいは、少なくとも１０１３Ｍ−１であることが望ましい。
【０１２７】
＜抗原発現細胞への結合＞
抗体がＣＡＰＲＩＮ−１に結合する能力は、実施例で述べられるようなたとえば  ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、免疫蛍光およびフローサイトメトリー分析などを用いた結合アッセイを利用して特定することができる。
【０１２８】
＜免疫組織化学染色＞
ＣＡＰＲＩＮ−１を認識する抗体は、当業者に周知の方法での免疫組織化学により、外科手術の間に患者から得た組織や、自然にまたはトランスフェクション後にＣＡＰＲＩＮ−１を発現する細胞系を接種した異種移植組織を担持する動物から得た組織から、パラホルムアルデヒドまたはアセトン固定した凍結切片またはパラホルムアルデヒドで固定したパラフィン包埋した組織切片を使用して、ＣＡＰＲＩＮ−１との反応性に関して試験することができる。
【０１２９】
免疫組織化学染色のため、ＣＡＰＲＩＮ−１に対して反応性のある抗体を、様々な方法で染色させることができる。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウス抗体やヤギ抗ウサギ抗体を反応させることにより、可視化することができる。
【０１３０】
＜医薬組成物＞
本発明の癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物の標的は、ＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子を発現する癌（細胞）であれば特に限定されない。
【０１３１】
本明細書で使用される「腫瘍」及び「癌」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。
【０１３２】
本発明において対象となる癌としては、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号のアミノ酸配列又は７以上の連続アミノ酸からなるその部分配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子を発現している癌であり、好ましくは、乳癌、脳腫瘍、白血病、肺癌、リンパ腫、肥満細胞腫、食道癌及び大腸癌である。
【０１３３】
これらの特定の癌には、例えば、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、肺腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞癌、神経上皮組織性腫瘍である神経膠腫、脳室上衣腫、神経細胞性腫瘍、胎児型の神経外胚葉性腫瘍、神経鞘腫、神経線維腫、髄膜腫、慢性型リンパ球性白血病、リンパ腫、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小〜中細胞型リンパ腫、盲腸癌、上行結腸癌、下行結腸癌、横行結腸癌、Ｓ状結腸癌、直腸癌が包含されるが、これらに限定されない。
【０１３４】
また、対象となる動物は、哺乳動物であり、例えば霊長類、ペット動物、家畜類、競技用動物などを含む哺乳動物であり、特にヒト、イヌおよびネコが好ましい。
【０１３５】
本発明で用いられる抗体を医薬組成物として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【０１３６】
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
【０１３７】
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−６０と併用してもよい。
【０１３８】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【０１３９】
投与は、経口又は非経口であり、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身又は局部的に投与することができる。
【０１４０】
また、患者の年齢、体重、性別、症状などにより適宜投与方法を選択することができる。抗体又は抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重、年齢、性別、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【０１４１】
＜ポリペプチド及びＤＮＡ＞
本発明は更に、上記抗体（ａ）〜（ｋ）に関わる以下のポリペプチド及びＤＮＡも提供する。
【０１４２】
（ｉ）配列番号４３、配列番号７３、配列番号８３、配列番号９３、配列番号１０３、配列番号１１３および配列番号１２３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【０１４３】
（ｉｉ）配列番号４７、配列番号５３、配列番号５８、配列番号６３、配列番号６８、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１０７，配列番号１１７配列番号１２７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【０１４４】
（ｉｉｉ）配列番号４８、配列番号７８、配列番号８８、配列番号９８、配列番号１０８、配列番号１１８および配列番号１２８の塩基配列を含むＤＮＡ。
【０１４５】
（ｉｖ）配列番号４９、配列番号５４、配列番号５９、配列番号６４、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１９及び配列番号１２９の塩基配列を含むＤＮＡ。
【０１４６】
（ｖ）配列番号４０、４１および４２、配列番号７０，７１および７２、配列番号８０，８１および８２、配列番号９０，９１および９２、配列番号１００，１０１および１０２、配列番号１１０，１１１および１１２、配列番号１２０，１２１および１２２に示すアミノ酸配列からなる群から選択される、重鎖ＣＤＲポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【０１４７】
（ｖｉ）配列番号４４、４５および４６、配列番号５０，５１および５２、配列番号５５，５６および５７、配列番号６０，６１および６２、配列番号６５，６６および６７、配列番号７４，７５および７６、配列番号８４，８５および８６、配列番号９４，９５および９６、配列番号１０４，１０５および１０６、配列番号１１４，１１５および１１６、配列番号１２４，１２５および１２６に示すアミノ酸配列からなる群から選択される、軽鎖ＣＤＲポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【０１４８】
これらのポリペプチド及びＤＮＡは、上記のとおり、遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。
【実施例】
【０１４９】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの具体例によって制限されないものとする。【０１５０】
実施例１  ＳＥＲＥＸ法による新規癌抗原タンパクの同定
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
健常な犬の精巣組織から酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム法（Ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）により全ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０  ｍＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリＡ  ＲＮＡを精製した。【０１５１】
この得られたｍＲＮＡ（５μｇ）を用いてイヌ精巣ｃＤＮＡファージライブラリーを合成した。ｃＤＮＡファージライブラリーの作製にはｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，  ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，  ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｃｌｏｎｉｇ  Ｋｉｔ  （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリーを作製した。作製したｃＤＮＡファージライブラリーのサイズは７．７３×１０５ｐｆｕ／ｍｌであった。【０１５２】
（２）血清によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
上記作製したイヌ精巣ｃＤＮＡファージライブラリーを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレートに２２１０クローンとなるように宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’）に感染させ、４２℃、３〜４時間培養し、溶菌斑（プラーク）を作らせ、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を浸透させたニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｃ  Ｅｘｔｒａ：  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｎｅｃｅ社製）でプレートを３７℃で４時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５）に浸し４℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを５００倍希釈した患犬血清と室温で２〜３時間反応させた。【０１５３】
上記患犬血清としては、乳癌の患犬より採取した血清を用いた。これらの血清は−８０℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ  ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓファージを宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｒｅ  ＭＲＦ’）に感染させた後、ＮＺＹプレート培地上で３７℃、一晩培養した。次いで０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．３のバッファーをプレートに加え、４℃で１５時間静置後、上清を大腸菌／ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌／ファージ抽出液をＮＨＳ−カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク固定化カラムに患犬血清を通液・反応させ、大腸菌及びファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５００倍希釈し、これをイムノスクリーニング材料とした。【０１５４】
かかる処理血清と上記融合タンパク質をブロットしたメンブレンをＴＢＳ−Ｔ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）にて４回洗浄を行った後、二次抗体として０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５０００倍希釈を行ったヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  Ｄｏｇ  ＩｇＧ−ｈ＋Ｉ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ：  ＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を、室温１時間反応させ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ反応液（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌＳＯ４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％ゼラチン  ｐＨ７．５）５００μｌに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のＩｇＧと反応する３０９４０個のファージクローンをスクリーニングして、５個の陽性クローンを単離した。【０１５５】
（３）単離抗原遺伝子の相同性検索
上記方法により単離した５個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μｌと、精製したファージ溶液２５０μｌさらにＥｘＡｓｓｉｓｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）１μｌを混合した後３７℃で１５分間反応後、ＬＢ培地を３ｍｌ添加し３７℃で２．５〜３時間培養を行い、直ちに７０℃の水浴にて２０分間保温した後、４℃、１０００×ｇ、１５分間遠心分離を行い上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌（ＳＯＬＲ）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μｌと、精製したファージ溶液１０μｌを混合した後３７℃で１５分間反応させ、５０μｌをアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に播き３７℃一晩培養した。トランスフォームしたＳＯＬＲのシングルコロニーを採取し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地３７℃にて培養後、ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を使って目的のインサートを持つプラスミドＤＮＡを精製した。【０１５６】
精製したプラスミドは、配列番号３１に記載のＴ３プライマーと配列番号３２に記載のＴ７プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により配列番号５，７，９，１１，１３に記載の遺伝子配列を取得した。この遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列（配列番号６，８，１０，１２，１４）を用いて、相同性検索プログラムＢＬＡＳＴサーチ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を行い既知遺伝子との相同性検索を行った結果、得られた５個の遺伝子全てがＣＡＰＲＩＮ−１をコードする遺伝子であることが判明した。５個の遺伝子間の配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において塩基配列１００％、アミノ酸配列９９％であった。この遺伝子のヒト相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９４％、アミノ酸配列９８％であった。ヒト相同因子の塩基配列を配列番号１，３に、アミノ酸配列を配列番号２，４に示す。また、取得したイヌ遺伝子のウシ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９４％、アミノ酸配列９７％であった。ウシ相同因子の塩基配列を配列番号１５に、アミノ酸配列を配列番号１６に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とウシ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９４％、アミノ酸配列９３〜９７％であった。また、取得したイヌ遺伝子のウマ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９３％、アミノ酸配列９７％であった。ウマ相同因子の塩基配列を配列番号１７に、アミノ酸配列を配列番号１８に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とウマ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列９３％、アミノ酸配列９６％であった。また、取得したイヌ遺伝子のマウス相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８７〜８９％、アミノ酸配列９５〜９７％であった。マウス相同因子の塩基配列を配列番号１９，２１，２３，２５，２７に、アミノ酸配列を配列番号２０，２２，２４，２６，２８に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とマウス相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８９〜９１％、アミノ酸配列９５〜９６％であった。また、取得したイヌ遺伝子のニワトリ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８２％、アミノ酸配列８７％であった。ニワトリ相同因子の塩基配列を配列番号２９に、アミノ酸配列を配列番号３０に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とニワトリ相同因子をコードする遺伝子との配列同一性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列８１〜８２％、アミノ酸配列８６％であった。【０１５７】
（４）各組織での遺伝子発現解析
上記方法により得られた遺伝子に対しイヌ及びヒトの正常組織及び各種細胞株における発現をＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。逆転写反応は以下の通り行なった。すなわち、各組織５０〜１００ｍｇ及び各細胞株５〜１０×１０６個の細胞からＴＲＩＺＯＬ試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー（配列番号３３及び３４に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル０．２５μｌ、上記プライマーを各２μＭ、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．６５ＵのＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を２５μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）を用いて、９４℃−３０秒、６０℃−３０秒、７２℃−３０秒のサイクルを３０回繰り返して行った。なお、上記遺伝子特異的プライマーは、配列番号５の塩基配列（イヌＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子）中の２０６番〜６３２番及び配列番号１の塩基配列（ヒトＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子）中の６９８番〜１１２４番塩基の領域を増幅するものであった。比較対照のため、ＧＡＰＤＨ特異的なプライマー（配列番号３５及び３６に記載）も同時に用いた。その結果、図１に示すように、健常なイヌ組織では精巣に強い発現が見られ、一方イヌ乳癌及び腺癌組織で発現が見られた。さらに、取得した遺伝子のヒト相同因子の発現を併せて確認したところ、イヌＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子と同様、正常組織で発現が確認できたのは精巣のみだったが、癌細胞では乳癌、脳腫瘍、白血病、肺癌、食道癌細胞株など、多種類の癌細胞株で発現が検出され、特に多くの乳癌細胞株で発現が確認された。この結果から、ＣＡＰＲＩＮ−１は精巣以外の正常組織では発現が見られず、一方、多くの癌細胞で発現しており、特に乳癌細胞株に発現していることが確認された。【０１５８】
なお、図１中、縦軸の参照番号１は、上記で同定した遺伝子の発現パターンを、参照番号２は、比較対照であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現パターンを示す。【０１５９】
（５）ＣＡＰＲＩＮ−１由来ペプチドに対するポリクローナル抗体の作製
ＣＡＰＲＩＮ−１に結合する抗体を得るために、ＣＡＰＲＩＮ−１由来ペプチド（Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ（配列番号３７））を合成した。このペプチド１ｍｇを抗原として、等容量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）溶液と混合し、これを２週間毎に４回、ウサギの皮下に投与を行った。その後血液を採取し、ポリクローナル抗体を含む抗血清を得た。さらにこの抗血清をプロテインＧ担体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて精製し、ＣＡＰＲＩＮ−１由来ペプチドに対するポリクローナル抗体を得た。また、抗原を投与していないウサギの血清を上記と同様にしてプロテインＧ担体を用いて精製したものをコントロール抗体とした。【０１６０】
（６）癌細胞上での抗原タンパクの発現解析
次にＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子の発現が多く確認された乳癌細胞株７種（ＭＤＡ−ＭＢ−１５７，  Ｔ４７Ｄ，  ＭＲＫ−ｎｕ−１，  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖ，  ＢＴ２０，  ＳＫ−ＢＲ−３，  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｔ）について、その細胞表面上にＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質が発現しているかどうかを調べた。上記で遺伝子発現が認められた各ヒト乳癌細胞株それぞれ１０６細胞を１．５ｍｌのミクロ遠心チューブにて遠心分離した。これに上記（５）で調製したＣＡＰＲＩＮ−１由来ペプチドに対するポリクローナル抗体２μｇ（５μｌ）を添加し、さらに９５μｌの０．１％牛胎児血清を含むＰＢＳで懸濁後、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、５μｌのＦＩＴＣ標識ヤギ抗ラビットＩｇＧ抗体（サンタクルズ社製）及び９５μｌの０．１％  牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳで懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、ＣＡＰＲＩＮ−１由来ペプチドに対するポリクローナル抗体の代わりに上記（５）で調製したコントロール抗体を用いて行い、コントロールとした。その結果、抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１抗体を添加された細胞は、コントロールに比べて、いずれも蛍光強度が３０％以上強かった。具体的には、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７が１８４％、Ｔ４７Ｄが２２１％、ＭＲＫ−ｎｕ−１が１１５％、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖが８２％、ＢＴ２０が３２％、ＳＫ−ＢＲ−３が２７９％、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｔが８０％の蛍光強度の増強を示した。このことから、上記ヒト癌細胞株の細胞膜表面上にＣＡＰＲＩＮ−１タンパクが発現していることが確認された。なお、上記蛍光強度の増強率は、各細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ値）の増加率にて表され、以下の計算式により算出した。【０１６１】
平均蛍光強度の増加率（蛍光強度の増強率）（％）＝（（抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１抗体を反応させた細胞のＭＦＩ値）−（コントロールＭＦＩ値））÷（コントロールＭＦＩ値）×１００
（７）免疫組織化学染色
（７）−１  マウスおよびイヌ正常組織におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、雌）およびイヌ（ビーグル犬、雌）をエーテル麻酔下およびケタミン／イソフルラン麻酔下で放血させ、開腹後、各臓器（胃、肝臓、眼球、胸腺、筋肉、骨髄、子宮、小腸、食道、心臓、腎臓、唾液腺、大腸、乳腺、脳、肺、皮膚、副腎、卵巣、膵臓、脾臓、膀胱）をそれぞれＰＢＳの入った１０ｃｍディッシュに移した。ＰＢＳ中で各臓器を切り開き、４％  ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ＰＦＡ）を含む０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で一晩還流固定した。還流液を捨て、ＰＢＳで各臓器の組織表面をすすぎ、１０％ショ糖を含むＰＢＳ溶液を５０ｍｌ容の遠心チューブに入れ、その中に各組織を入れて４℃で２時間ローターを用いて振とうした。２０％ショ糖を含むＰＢＳ溶液に入れ替え、４℃で組織が沈むまで静置後、３０％ショ糖を含むＰＢＳ溶液に入れ替え、４℃で組織が沈むまで静置した。組織を取り出し、必要な部分を手術用メスで切りだした。次に、ＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ社製）をかけて組織表面になじませた後、クライオモルドに組織を配置した。ドライアイスの上にクライオモルドをおいて急速凍結させた後、クライオスタット（ＬＥＩＣＡ社製）を用いて１０〜２０μｍに薄切し、スライドガラスごとヘアードライアーで３０分間風乾し、薄切組織がのったスライドガラス作製した。次にＰＢＳ−Ｔ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）を満たした染色瓶に入れて５分ごとにＰＢＳ−Ｔを入れ替える操作を３回行った。切片周囲の余分な水分をキムワイプでふき取り、ＤＡＫＯＰＥＮ（ＤＡＫＯ社製）で囲んだ後、ブロッキング液として、マウス組織はＭＯＭマウスＩｇブロッキング試薬（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）を、イヌ組織は１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ−Ｔ溶液をそれぞれのせ、モイストチャンバー上で室温で１時間静置した。次に、実施例４で作製した癌細胞表面に反応する、配列番号：７３の重鎖可変領域と配列番号：７７の軽鎖可変領域を有するＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体（モノクローナル抗体＃６）をブロッキング液で１０μｇ／ｍｌに調製した溶液をのせ、モイストチャンバー内で４℃下で一晩静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ブロッキング液で２５０倍に希釈したＭＯＭビオチン標識抗ＩｇＧ抗体（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）をのせ、モイストチャンバー内で室温で１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、アビジンービオチンＡＢＣ試薬（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）をのせ、モイストチャンバー内で室温で５分間静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ＤＡＢ発色液（ＤＡＢ  １０ｍｇ＋３０％  Ｈ２Ｏ２  １０μｌ／０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）５０ｍｌ）をのせ、モイストチャンバー内で室温で３０分間静置した。蒸留水でリンスし、ヘマトキシリン試薬（ＤＡＫＯ社製）を載せて室温で１分間静置後、蒸留水でリンスした。７０％、８０％、９０％、９５％、１００％の各エタノール溶液に順番に１分間ずつ入れた後、キシレン中で一晩静置した。スライドガラスを取り出し、Ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ社製）で封入後、観察を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は、���液腺、腎臓、結腸、胃の各組織において細胞内で僅かに発現が認められたが、細胞表面での発現は認められず、また、その他の臓器由来の組織では全く発現が認められなかった。なお、本結果は、配列番号：１０３の重鎖可変領域と配列番号：１０７の軽鎖可変領域を有するＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体（モノクローナル抗体＃９）を用いた場合も同様であった。【０１６２】
（７）−２  イヌ乳癌組織におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
病理診断で悪性乳癌と診断されたイヌの凍結された乳癌組織１０８検体を用いて、上述と同様の方法で凍結切片スライド作製および実施例４で作製したモノクローナル抗体＃６を用いた免疫組織化学染色を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は１０８検体中１００検体（９２．５％）で発現が確認され、特に異型度の高い癌細胞表面に強く発現していた。なお、本結果は、実施例４で作製したモノクローナル抗体＃９を用いた場合も同様であった。【０１６３】
（７）−３  ヒト乳癌組織におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
パラフィン包埋されたヒト乳癌組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）の乳癌組織１８８検体を用いて、免疫組織化学染色を行った。ヒト乳癌組織アレイを６０℃で３時間処理後、キシレンを満たした染色瓶に入れて５分ごとにキシレンを入れ替える操作を３回行った。次にキシレンの代わりにエタノールおよびＰＢＳ−Ｔで同様の操作を行った。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を満たした染色瓶にヒト乳癌組織アレイを入れ、１２５℃で５分間処理後、室温で４０分以上静置した。切片周囲の余分な水分をキムワイプでふき取り、ＤＡＫＯＰＥＮで囲み、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ（ＤＡＫＯ社製）を適量滴下した。室温で５分間静置後、ＰＢＳ−Ｔを満たした染色瓶に入れて５分ごとにＰＢＳ−Ｔを入れ替える操作を３回行った。ブロッキング液として、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ−Ｔ溶液をのせ、モイストチャンバー内で室温で１時間静置した。次に実施例４で作製した癌細胞表面に反応するモノクローナル抗体＃６を５％ＦＢＳを含むＰＢＳ−Ｔ溶液で１０μｇ／ｍｌに調製した溶液をのせ、モイストチャンバー内で４℃で一晩静置し、ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＤＡＫＯ社製）適量滴下し、モイストチャンバー内で室温で３０分間静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ＤＡＢ発色液（ＤＡＫＯ社製）をのせ、室温で１０分程度静置した後、発色液を捨て、ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、蒸留水でリンスし、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％の各エタノール溶液に順番に１分間ずつ入れた後、キシレン中で一晩静置した。スライドガラスを取り出し、Ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ社製）で封入後、観察を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は全乳癌組織１８８検体の内、１３８検体（７３％）で強い発現が認められた。なお、本結果は、実施例４で作製したモノクローナル抗体＃９を用いた場合も同様であった。【０１６４】
（７）−４  ヒト悪性脳腫瘍におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
パラフィン包埋されたヒト悪性脳腫瘍組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）の悪性脳腫瘍組織２４７検体を用いて、上述（７）−３と同様の方法で実施例４で作製したモノクローナル抗体＃６を用いた免疫組織化学染色を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は全悪性脳腫瘍組織２４７検体の内、２２７検体（９２％）で強い発現が認められた。なお、本結果は、実施例４で作製したモノクローナル抗体＃９を用いた場合も同様であった。【０１６５】
（７）−５  ヒト乳癌転移リンパ節におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現
パラフィン包埋されたヒト乳癌転移リンパ節組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）の乳癌転移リンパ節組織１５０検体を用いて、上述（７）−３と同様の方法で実施例４で作製したモノクローナル抗体＃６を用いた免疫組織化学染色を行った。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は全乳癌転移リンパ節組織１５０検体の内、１３６検体（９０％）で強い発現が認められた。すなわち、乳癌から転移した癌組織においてもＣＡＰＲＩＮ−１は強く発現することが判った。なお、本結果は、実施例４で作製したモノクローナル抗体＃９を用いた場合も同様であった。【０１６６】
実施例２  ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体の癌細胞に対する抗腫瘍効果（ＡＤＣＣ活性）
次にＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体が、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する腫瘍細胞を障害することができるかどうかを検討した。実施例１で調製したヒトＣＡＰＲＩＮ−１由来ペプチドに対するポリクローナル抗体を用いて評価を行った。ＣＡＰＲＩＮ−１の発現が確認されている２種類のヒト乳癌細胞株、Ｔ４７Ｄ及びＭＤＡ−ＭＢ−１５７をそれぞれ１０６個５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個ずつ添加した。これに、上記ヒトＣＡＰＲＩＮ−１由来ペプチドに対するポリクローナル抗体をそれぞれ１μｇずつ添加し、さらにウサギの末梢血から分離したリンパ球をそれぞれ２×１０５個ずつ添加して、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム（Ｃｒ）５１の量を測定し、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１由来ペプチドに対するポリクローナル抗体による各癌細胞に対するＡＤＣＣ活性を算出した。その結果、Ｔ４７Ｄ及びＭＤＡ−ＭＢ−１５７それぞれに対して、それぞれ１５．４％及び１７．３％のＡＤＣＣ活性が確認された（図２及び図３参照）。一方、抗原が免疫されていないウサギの末梢血から調製したコントロール抗体（実施例１（５））を用いて同様の操作を行った場合、及び抗体を添加しなかった場合には、活性はほとんど認められなかった（図２及び３参照）。従って、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体を用いたＡＤＣＣ活性により、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する腫瘍細胞を障害することができることが明らかになった。【０１６７】
なお、細胞障害活性は、上記のように、本発明で用いられるＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体、マウスリンパ球及びクロミウム５１を取り込ませた１０３個の各白血病細胞株を混合して４時間培養し、培養後培地に放出されたクロミウム５１の量を測定して、以下計算式＊により算出した各白血病細胞株に対する細胞障害活性を示した結果である。【０１６８】
＊式：細胞障害活性（％）＝ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体及びマウスリンパ球を加えた際のＴ４７Ｄ及びＭＤＡ−ＭＢ−１５７からのクロミウム５１遊離量÷１Ｎ塩酸を加えた標的細胞からのクロミウム５１遊離量×１００。【０１６９】
実施例３  ヒト新規癌抗原タンパクの作製
（１）組換えタンパク質の作製
実施例１で取得した配列番号１の遺伝子を基に、以下の方法にてヒト相同遺伝子の組換えタンパク質を作製した。ＰＣＲは、実施例１で作製した各種組織・細胞ｃＤＮＡよりＲＴ−ＰＣＲ法による発現が確認できたｃＤＮＡを１μｌ、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号３８および３９に記載）を各０．４μＭ，  ０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ，  １．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃−１０秒、６８℃−２．５分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号２のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製した。【０１７０】
精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＳａｃＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＳａｃＩ、ＸｈｏＩ制限酵素で処理した大腸菌用発現ベクターｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。このベクターの使用によりＨｉｓタグ融合型の組換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ｍＭ  ＩＰＴＧによる発現誘導を行うことで目的タンパク質を大腸菌内で発現させた
（２）組換えタンパク質の精製
上記で得られた、配列番号１の遺伝子を発現するそれぞれの組換え大腸菌を３０μｇ／ｍｌ  カナマイシン含有ＬＢ培地にて６００ｎｍでの吸光度が０．７付近になるまで３７℃で培養後、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド終濃度が１ｍＭとなるよう添加し、３７℃で４時間培養した。その後４８００ｒｐｍで１０分間遠心し集菌した。この菌体ペレットをリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、さらに４８００ｒｐｍで１０分間遠心し菌体の洗浄を行った。【０１７１】
この菌体をリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、氷上にて超音波破砕を行った。大腸菌超音波破砕液を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた上清を可溶性画分、沈殿物を不溶性画分とした。【０１７２】
可溶性画分を、定法に従って調整したニッケルキレートカラム（担体：Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ社）、カラム容量５ｍｌ、平衡化緩衝液５０ｍＭ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０））に添加した。未吸着画分をカラム容量の１０倍量の５０ｍＭ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）と２０ｍＭイミダゾール含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて洗浄操作を行った後、直ちに、１００ｍＭイミダゾール含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて６ベッド溶出した。クマシー染色によって目的タンパク質の溶出を確認した１００ｍＭイミダゾール含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）溶出画分を強陰イオン交換カラム（担体：Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ社）、カラム容量５ｍｌ、平衡化緩衝液としての２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０））に添加した。未吸着画分をカラム容量の１０倍量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）と２００ｍＭ塩化ナトリウム含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄操作を行った後、直ちに、４００ｍＭ塩化ナトリウム含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて５ベッド溶出を行い、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する各タンパク質の精製画分を得た。【０１７３】
上記方法によって得られた各精製標品のうち、２００μｌを１ｍｌの反応用緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ，  ５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  ２ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ７．４）に分注を行った後、エンテロキナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）２μｌ添加した後、室温にて一晩静置、反応を行い、Ｈｉｓタグを切断し、Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて添付プロトコールに従って精製を行った。次に、上記方法によって得られた精製標品１．２ｍｌを、限外ろ過ＮＡＮＯＳＥＰ  １０Ｋ  ＯＭＥＧＡ（ＰＡＬＬ社製）を用いて、生理用リン酸緩衝液（日水製薬社製）置換した後、ＨＴタフリンアクロディスク０．２２μｍ（ＰＡＬＬ社製）にて無菌ろ過を行い、これを以下の実験に用いた。【０１７４】
実施例４  ＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体の作製
実施例３で調製した配列番号２に示される、抗原タンパク質（ヒトＣＡＰＲＩＮ−１）１００μｇを等量のＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント（シグマ社製）と混合し、これをマウス１匹当たりの抗原溶液とした。抗原溶液を６週齢のＢａｌｂ／ｃｃマウス（日本ＳＬＣ社製）の腹腔内に投与後、１週間毎にさらに３回および２４回投与を行い免疫を完了した。最後の免疫から３日後に摘出したそれぞれの脾臓を滅菌した２枚のスライドガラスに挟んで擦り潰し、ＰＢＳ（−）（日水社製）を用いて洗浄し１５００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を除去する操作を３回繰り返して脾臓細胞を得た。得られた脾臓細胞とマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣから購入）とを１０：１の比率にて混和し、そこに３７℃に加温した１０％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地２００μｌとＰＥＧ１５００（ベーリンガー社製）８００μｌを混和して調製したＰＥＧ溶液を加えて５分間静置して細胞融合を行った。１７００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去後、Ｇｉｂｃｏ社製のＨＡＴ溶液を２％当量加えた１５％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＨＡＴ選択培地）１５０ｍｌで細胞を懸濁し、９６穴プレート（ヌンク社製）の１ウェル当たり１００μｌずつ、プレート１５枚に播種した。７日間、３７℃、５％  ＣＯ２の条件で培養することで、脾臓細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを得た。【０１７５】
作製したハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに対する結合親和性を指標にハイブリドーマを選抜した。実施例３で調製したＣＡＰＲＩＮ−１タンパク溶液１μｇ／ｍｌを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μｌ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、０．５％  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）溶液（シグマ社製）を１ウェル当たり４００μｌ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μｌのＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを３回洗浄した後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（インビトロジェン社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して１５〜３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μｌ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、吸光度値が高かった抗体を産生するハイブリドーマを複数個選抜した。【０１７６】
選抜したハイブリドーマを９６穴プレート１ウェル当たりに０．５個となるようにプレートに添加し培養した。１週間後、ウェル中に単一のコロニーを形成しているハイブリドーマが観察された。それらウェルの細胞をさらに培養して、クローニングされたハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに対する結合親和性を指標にハイブリドーマを選抜した。実施例３で調製したＣＡＰＲＩＮ−１タンパク溶液１μｇ／ｍｌを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μｌ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、０．５％  ＢＳＡ溶液を１ウェル当たり４００μｌ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μｌのＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを３回洗浄後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（インビトロジェン社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して１５〜３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μｌ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに反応性を示すモノクローナル抗体を産生する１５０個のハイブリドーマ株を得た。【０１７７】
次にそれらモノクローナル抗体の内、ＣＡＰＲＩＮ−１が発現する乳癌細胞の細胞表面に反応性を示すものを選抜した。具体的には、１０６個のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖを１．５ｍｌ容のミクロ遠心チューブにて遠心分離し、これに上記各ハイブリドーマの培養上清１００μｌを添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１％  ＦＢＳを含むＰＢＳで５００倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（インビトロジェン社製）を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、抗体の代わりに何も処理していない６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの血清をハイブリドーマ培養用培地で５００倍希釈したものを用いて行い、コントロールとした。その結果、コントロールに比べて蛍光強度が強い、すなわち、乳癌細胞の細胞表面に反応するモノクローナル抗体１１個（＃１〜＃１１）を選抜した。【０１７８】
実施例５  選抜した抗体の特徴付け
（１）抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体の可変領域遺伝子のクローニング
実施例４で選抜した１１個のモノクローナル抗体をそれぞれ産生する各ハイブリドーマ株から、ｍＲＮＡを抽出し、マウスＦＲ１由来配列およびマウスＦＲ４由来の配列に特異的なプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲ法により、全ての抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体の重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域の遺伝子を取得した。配列決定のために、それら遺伝子をｐＣＲ２．１ベクター（インビトロジェン社製）にクローニングした。【０１７９】
（１）−１  ＲＴ−ＰＣＲ
１０６個の各ハイブリドーマ株から、ｍＲＮＡ  ｍｉｃｒｏ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてｍＲＮＡを調製し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて、得られたｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成した。これら操作は各キットの添付プロトコールに従って行った。【０１８０】
得られたｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法により抗体遺伝子の増幅を行った。【０１８１】
ＶＨ領域の遺伝子取得のために、マウス重鎖ＦＲ１配列に特異的なプライマー（配列番号１３０）およびマウス重鎖ＦＲ４配列に特異的なプライマー（配列番号１３１）を使用した。またＶＬ領域の遺伝子取得のために、マウス軽鎖ＦＲ１配列に特異的なプライマー（配列番号１３２）およびマウス軽鎖ＦＲ４に特異的なプライマー（配列番号１３３）を使用した。これらプライマーはＪｏｎｅｓ，  Ｓ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｂｅｎｄｉｎｇ，  Ｍ．Ｍ．  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，  ８８−８９  （１９９１）を参考に設計した。ＰＣＲは、Ｅｘ−ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いた。１０×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ）４μｌ、プライマー（１．０μＭ）各２μｌ、Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）０．２５μｌにｃＤＮＡサンプルを加え、滅菌水により総量５０μｌとした。９４℃で２分処理後、変性９４℃１分、アニーリング５８℃３０秒、伸長反応７２℃１分の組み合わせで３０サイクルの条件で行った。【０１８２】
（１）−２  クローニング
上記で得られた各ＰＣＲ産物を用いてアガロースゲルにて電気泳動を行い、ＶＨ領域およびＶＬ領域それぞれのＤＮＡバンドを切り出した。ＤＮＡ断片はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてその添付プロトコールに従って行った。精製した各ＤＮＡはＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）を用いてｐＣＲ２．１ベクターにクローニングした。連結したベクターをＤＨ５ａコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）に定法に従い形質転換を行った。各形質転換体それぞれ１０クローンを培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）で３７℃一晩培養後、各プラスミドＤＮＡをＱｉａｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。【０１８３】
（１）−３  配列決定
上記で得られた各プラスミド中のＶＨ領域およびＶＬ領域の遺伝子配列解析は、Ｍ１３フォワードプライマー（配列番号１３４）およびＭ１３リバースプライマー（配列番号１３５）を用いて、蛍光シーケンサー（ＡＢＩ社製ＤＮＡシーケンサー３１３０ＸＬ）により、ＡＢＩ社製のビッグダイターミネーターＶｅｒ３．１サイクルシーケンシングキットを用いて、その添付プロトコールに従い行った。その結果、各々の遺伝子配列が決定された（各々１０クローンで一致）。【０１８４】
得られたモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号４３、配列番号７３、配列番号８３、配列番号９３、配列番号１０３、配列番号１１３、および配列番号１２３に、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号４７、配列番号５３、配列番号５８、配列番号６３、配列番号６８、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１０７，配列番号１１７および配列番号１２７に示す。【０１８５】
すなわち、モノクローナル抗体＃１は配列番号：４３の重鎖可変領域と配列番号：４７の軽鎖可変領域から成り、＃２は配列番号：４３の重鎖可変領域と配列番号：５３の軽鎖可変領域から成り、＃３は配列番号：４３の重鎖可変領域と配列番号：５８の軽鎖可変領域から成り、＃４は配列番号：４３の重鎖可変領域と配列番号：６３の軽鎖可変領域から成り、＃５は配列番号：４３の重鎖可変領域と配列番号：６８の軽鎖可変領域から成り、＃６は配列番号：７３の重鎖可変領域と配列番号：７７の軽鎖可変領域から成り、＃７は配列番号：８３の重鎖可変領域と配列番号：８７の軽鎖可変領域から成り、＃８は配列番号：９３の重鎖可変領域と配列番号：９７の軽鎖可変領域から成り、＃９は配列番号：１０３の重鎖可変領域と配列番号：１０７の軽鎖可変領域から成り、＃１０は配列番号：１１３の重鎖可変領域と配列番号：１１７の軽鎖可変領域から成り、＃１１は配列番号：１２３の重鎖可変領域と配列番号：１２７の軽鎖可変領域から成る。【０１８６】
（２）取得したモノクローナル抗体を用いた各種癌細胞表面でのＣＡＰＲＩＮ−１の発現
次にＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子の発現が確認された乳癌細胞株７種（ＭＤＡ−ＭＢ−１５７，Ｔ４７Ｄ，ＭＲＫ−ｎｕ−１，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖ，ＢＴ２０，ＳＫ−ＢＲ−３，ＤＡ−ＭＢ−２３１Ｔ）およびその他の乳癌細胞株３種（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｃ，ＭＣＦ−７，ＺＲ７５−１）、グリオーマ細胞株６種（Ｔ９８Ｇ，ＳＮＢ１９，Ｕ２５１，Ｕ８７Ｇ）、腎臓癌細胞株３種（Ｃａｋｉ−１，Ｃａｋｉ２，Ａ４９８）、胃癌細胞株１種（ＭＫＮ４５）、大腸癌細胞株１種（Ｃａｃｏ２）、肺癌細胞株３種（Ａ５４９、ＱＧ５６、ＰＣ８）、白血病細胞株３種（Ｎａｍａｌｗａ、ＢＤＣＭ、ＲＰＩ１７８８）について、その細胞表面上にＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質が発現しているかどうかを調べた。各細胞株それぞれ１０６細胞を１．５ｍｌ容のミクロ遠心チューブにて遠心分離した。これに実施例４で作製した癌細胞表面に反応する、＃１から＃１１のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体を含むハイブリドーマ上清（１００μｌ）を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１％  ＦＢＳを含むＰＢＳで５００倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（インビトロジェン社製）で懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、＃１から＃１１のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体を含むハイブリドーマ上清の代わりに上記（５）で調製したコントロール抗体を用いて行い、コントロールとした。その結果、＃１〜＃１１のモノクローナル抗体を添加された細胞は、コントロールに比べて、いずれも蛍光強度が３０％以上強かった。具体的例を挙げると、＃９のモノクローナル抗体を用いた場合、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７が２１１％、Ｔ４７Ｄが１４５％、ＭＲＫ−ｎｕ−１が１２３％、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖが２５１％、ＢＴ２０が１６８％、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｔが９４％の蛍光強度の増強を示した。このことから、上記ヒト癌細胞株の細胞膜表面上にＣＡＰＲＩＮ−１タンパクが発現していることが確認された。なお、上記蛍光強度の増強率は、各細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ値）の増加率にて表され、以下の計算式により算出した。【０１８７】
平均蛍光強度の増加率（蛍光強度の増強率）（％）＝（（抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１抗体を反応させた細胞のＭＦＩ値）−（コントロールＭＦＩ値））÷（コントロールＭＦＩ値）×１００
（３）ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体の癌細胞に対する抗腫瘍効果（ＡＤＣＣ活性）
上記で選抜した＃１〜＃１１のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体の癌細胞に対する細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）を評価した。＃１〜＃１１のモノクローナル抗体を産生する各ハイブリドーマをハイブリドーマＳＦＭ（インビトロジェン社製）培地を用いて培養し、得られた上清をＨｉｔｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製し、ＰＢＳ（−）に置換して０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製）で濾過したものを活性測定用の抗体として用いた。１０６個のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１５７を５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個ずつ添加して標的細胞とした。これに、上記精製抗体をそれぞれ１μｇ添加し、さらにマウス脾臓から分離したマウスリンパ球を２×１０５個添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定し、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体による癌細胞に対するＡＤＣＣ活性を算出した。その結果、＃１〜＃１１の全てのモノクローナル抗体が、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７に対して、２０％以上のＡＤＣＣ活性を示した。具体的には、例えば、＃１は２２．１％、＃２は２９．１％、＃６は３０．２％、＃９は３２．４％の細胞障害活性が得られた（図４参照）。一方、実施例４で作製した、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク自体には反応するが、癌細胞の細胞表面に反応しないモノクローナル抗体を用いて同様の操作を行った場合、細胞障害活性は認められなかった（図４参照）。以上の結果より、取得した抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体（＃１〜＃１１は、ＡＤＣＣ活性によってＣＡＰＲＩＮ−１を発現する癌細胞を障害することが示された。【０１８８】
（４）ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体の癌細胞に対する抗腫瘍効果（ＣＤＣ活性）
上記で選抜した＃１〜＃１１のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体の癌細胞に対する細胞障害活性（ＣＤＣ活性）を評価した。ウサギから採血した血液をエッペンドルフチューブに入れ、室温で６０分間、静置した後３０００ｒｐｍで５分間、遠心分離することで、ＣＤＣ活性測定用の血清を調製した。ヒト乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖを１０５個を５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした後、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で３回洗浄した。その後上記で調製したウサギ血清を５０％含むＲＰＭＩ培地で懸濁し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個ずつ添加した。これに上述（３）で得た＃１〜＃１１のモノクローナル抗体をそれぞれ１μｇずつ添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定し、ハイブリドーマ上清中の抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体によるＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖに対するＣＤＣ活性を算出した。その結果、＃１〜＃１１の全てのモノクローナル抗体が、３０％以上のＣＤＣ活性を示した。一方、実施例４で作製した、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク自体には反応するが、癌細胞の細胞表面に反応しないモノクローナル抗体を用いて同様の操作を行った場合、細胞障害活性は認められなかった。従って、ＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体（＃１〜＃１１）は、ＣＤＣ活性によっても、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する腫瘍細胞を障害することができることが明らかになった。【０１８９】
実施例６  マウス生体内における抗ＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体の抗腫瘍効果
次に、取得した＃１〜＃１１のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体の担癌マウス生体内における抗腫瘍効果を評価した。使用した抗体は上記と同様に各ハイブリドーマの培養上清をカラム精製したものを用いた。【０１９０】
ＣＡＰＲＩＮ−１を発現するマウス由来の癌細胞株を移植した担癌マウスを用いて、＃１〜＃１１ＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体の抗腫瘍効果を検討した。７０匹のＢａｌｂ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社製）の背部皮下に、１匹あたり１０６個のＣＴ２６細胞（ＡＴＣＣより購入）を移植し、腫瘍が直径７ｍｍ程度の大きさになるまで成長させた。その内、６０匹の担癌マウスに対して、＃１〜＃１１のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体および実施例４で作製した、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク自体には反応するが、癌細胞の細胞表面に反応しないモノクローナル抗体１種を１匹あたり３００μｇ（３００μｌ）ずつ、１抗体につき５匹に腹腔内投与した。その後、２日間計３回、同量の各抗体を各担癌マウスの腹腔に投与し、毎日腫瘍の大きさを計測し、抗腫瘍効果を観察した。一方、残り１０匹の担癌マウスに対して、抗体の代わりにＰＢＳ（−）を投与し、これをコントロール群とした。抗腫瘍効果の観察の結果、＃１〜＃１１のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体を投与した検討群は、腫瘍が抗体投与開始時の腫瘍体積を１００％とした場合に、４日目には５０％程度にまで退縮し、６日目には１０％程度、８日目には数％にまで腫瘍が退縮し、１１〜１４日目までには腫瘍はほぼ完全に退縮した（図５参照）。一方、コントロール群では、４日目、６日目、８日目、１１日目にはそれぞれ、約２６０％，３５０％，５５０％，８００％にまで腫瘍が増大した（図５参照）。また、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク自体には反応するが、癌細胞の細胞表面に反応しないモノクローナル抗体を投与した群では、抗腫瘍効果は得られず、コントロール群と同様に腫瘍が増大した。この結果から、取得した＃１〜＃１１のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体は、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する癌細胞に対して、生体内で強い抗腫瘍効果を発揮することが示された。なお、腫瘍の大きさは、長径×短径×短径×０．５の計算式を用いて、体積を算出した。【０１９１】
さらに、マウス癌細胞株Ｎ１Ｅ細胞（ＡＴＣＣより購入）が移植された担癌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に対して、＃１〜＃１１のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体を上記と同様に投与した結果、抗体投与後１５日目には完全に腫瘍が退縮した。一方コントロール群では約９５０％にまで腫瘍は増大した（図６参照）。【０１９２】
実施例７  癌細胞の細胞表面に反応するＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体が結合するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質中のペプチドの同定
上記で取得した、癌細胞の細胞表面に反応する＃１〜＃１１のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体を用いて、それらが認識するＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質中の部分配列の同定を行った。【０１９３】
まず、ＰＢＳで１μｇ／μｌの濃度に溶解した組換えＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質溶液１００μｌに、終濃度が１０ｍＭになるようにＤＴＴ（Ｆｌｕｋａ社製）を添加し、９５℃、５分間反応させてＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質内のジスルフィド結合の還元を行い、次に終濃度２０ｍＭのヨードアセトアミド（和光純薬社製）を添加し、３７℃、遮光条件下にて３０分間チオール基のアルキル化反応を行った。得られた還元アルキル化ＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質４０μｇに、＃１〜＃１１のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体をそれぞれ５０μｇ添加し、２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌにメスアップして撹拌混合しながら４℃で一晩反応させた。【０１９４】
次に、トリプシン（プロメガ社製）を終濃度０．２μｇとなるように添加し、３７℃１時間、２時間、４時間、１２時間反応させた後、予め１％ＢＳＡ（シグマ社製）を含むＰＢＳでブロッキングし、ＰＢＳで洗浄したプロテインＡ−ガラスビーズ（ＧＥ社製）と１ｍＭ  炭酸カルシウム、ＮＰ−４０緩衝液（２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０）中で混合し、それぞれ３０分間反応させた。【０１９５】
反応液を２５ｍＭ  炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、０．１％  ギ酸１００μｌを用いて抗原抗体複合体を溶出し、溶出液についてＱ−ＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｗａｔｅｒｓ−ＭｉｃｒｏＭａｓｓ社製）を用いてＬＣ−ＭＳ解析を行った。解析は機器に付属のプロトコルに従った。【０１９６】
その結果、＃１〜＃１１のＣＡＰＲＩＮ−１に対するモノクローナル抗体がいずれも認識するＣＡＰＲＩＮ−１の部分配列として、配列番号１３６のポリペプチドが同定された。さらに、モノクローナル抗体＃２〜＃５、＃６〜＃８および＃１０が認識する、上記配列番号１３６のポリペプチド中の部分配列として配列番号１３７のペプチドが同定され、さらにその部分配列ペプチドである配列番号１３８のペプチドをモノクローナル抗体＃２〜＃５が認識することが判った。
【産業上の利用可能性】
【０１９７】
本発明の抗体は、癌の治療及び／又は予防のため有用である。【０１９８】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００９−０８７２８５号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。また、本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【０１９９】
配列番号３１〜３９、配列番号１３０〜１３５：プライマー
【図１】
2010016526.tif 000003
【図２】
2010016526.tif 000004
【図３】
2010016526.tif 000005
【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
2010016526.tif 000008
【図５ｃ】
2010016526.tif 000009
【図６ａ】
2010016526.tif 000010
【図６ｂ】
2010016526.tif 000011
【図６ｃ】
2010016526.tif 000012
【配列表】
2010016526000001.app
【国際調査報告】
2010016526.tif 000013
2010016526.tif 000014
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