(57)【要約】  本発明は、PHLDAファミリータンパク質のPHドメインを有するポリペプチドを含有する医薬組成物、および、その医薬組成物を含有する腫瘍の治療用医薬剤を提供することを目的とする。本発明の医薬組成物はPHLDAファミリータンパク質のPHドメインを有するポリペプチド、あるいはそのポリペプチドをコードするDNAが挿入された発現ベクターを含有する。さらに、上記いずれかの医薬組成物を含有する医薬剤は、腫瘍の治療用に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
PHLDAファミリータンパク質のPHドメインを有するポリペプチドを含有することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２】
前記PHドメインを有するポリペプチドが、前記ファミリータンパク質の一部または全部であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードするDNAを有する発現ベクターを含有することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項４】
前記PHLDAファミリータンパク質がPHLDA1〜3タンパク質のいずれかであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物を含有することを特徴とする、腫瘍の治療用医薬剤。
【請求項６】
前記腫瘍において、腫瘍細胞の増殖がAktタンパク質の活性化に依存していることを特徴とする、請求項５に記載の腫瘍の治療用医薬剤。
【請求項７】
前記腫瘍において、腫瘍細胞でp53タンパク質の機能不全が生じていることを特徴とする、請求項５または６に記載の腫瘍の治療用医薬剤。
【請求項８】
前記腫瘍において、腫瘍細胞でp53遺伝子に腫瘍化を生じる変異を有していることを特徴とする、請求項７に記載の腫瘍の治療用医薬剤。
【請求項９】
前記腫瘍において、腫瘍細胞でPHLDAファミリーのタンパク質の機能不全を生じていることを特徴とする、請求項５または６に記載の腫瘍の治療用医薬剤。
【請求項１０】
前記腫瘍において、腫瘍細胞でPHLDAファミリー遺伝子に腫瘍化を生じる変異を有していることを特徴とする、請求項７に記載の腫瘍の治療用医薬剤。
【請求項１１】
前記腫瘍が肺癌、膵癌、肝癌、乳癌、子宮癌、脳腫瘍のいずれかであることを特徴とする、請求項５〜１０のいずれかに記載の腫瘍の治療用医薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、PHLDAファミリータンパク質のPHドメインを有するポリペプチドを含有する医薬組成物、PHLDAファミリータンパク質のPHドメインを有するポリペプチドをコードするDNAを含有する医薬組成物、および、これらの医薬組成物を含有する腫瘍の治療用医薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍は全世界において主な死亡原因であり、今なおその有効的な治療法の開発が待ち望まれている疾病の一つである。近年、細胞質内タンパク質Aktの活性化が、乳癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、或いは、白血病及びリンパ系腫瘍のような血液系癌等において、その悪性化に関与することが報告されている（例えば、Chan TO et al., Annual Review of Biochemistry 68, 965-1014 (1999)参照）。【０００３】
AktはPI3K-Akt経路にあるセリン／スレオニンキナーゼであり、成長因子など細胞外からのシグナルによってPI3K-Akt経路が活性化されると、AktのPHドメインが細胞膜上のイノシトールリン脂質に結合することによって、Aktがリン酸化されて活性化し、さらに下流のシグナル伝達系に様々なシグナルを伝えることが知られている。上記のような悪性腫瘍細胞では、Aktの異常な活性化と膜への多量の局在が検出され、Aktの活性化が正常細胞の腫瘍化および悪性化の原因になっていると考えられている。【０００４】
一方、p53は、当初、DNA腫瘍ウイルスSV40により腫瘍化した細胞内でそのウイルス遺伝子により生産されるタンパク質に結合するp53タンパク質として発見された（例えば、Linzer DJ and Levine AJ, Cell 17, 43-52 (1979)参照）。その後、p53遺伝子の変異が様々な腫瘍細胞にみられることが判明し、p53遺伝子は腫瘍抑制遺伝子と呼ばれるようになった（例えば、Finlay CA et al., Cell 30, 1083-1093 (2004)参照）。【０００５】
正常細胞では、p53タンパク質は、PI3K-Akt経路の負の調節因子であるがん抑制遺伝子PTENの転写を活性化することによりPI3K-Akt経路を抑制する。従って、p53遺伝子に変異が生じた腫瘍細胞では、PI3K-Akt経路の抑制が解除され、Aktタンパク質が活性化し、結果として腫瘍細胞の異常な増殖が引き起こされる。【０００６】
このように、Aktの活性化に依存して腫瘍化または悪性化した腫瘍細胞に対し、Aktタンパク質の活性化を阻害することによる腫瘍治療方法の開発が試みられている（例えば、Wang YA et al., Oncology Reports 21(2), 437-442 (2009)参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、PHLDAファミリータンパク質のPHドメインを有するポリペプチドを含有する医薬組成物、および、その医薬組成物を含有する腫瘍の治療用医薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
PHLDAファミリータンパク質は、ヒトにおいてPHLDA1〜3が発見されている。PHLDA1〜3は、ペプチド配列の５１％〜７６％をPHドメインが占めることが知られていたが（例えば、Frank D. et al. Mammalian Genome 10, 1150-1159 (1999)参照）、腫瘍細胞増殖における具体的な機能は不明であった。このPHドメインは、PHLDAファミリータンパク質以外にも様々なタンパク質に認められるが、異なるタンパク質におけるアミノ酸配列の相同性は高くない（例えば、Frank D. et al., Mammalian Genome 10, 1150-1159 (1999)参照）。【０００９】
本発明者らは、PHLDAファミリータンパク質がp53の標的であり、このp53遺伝子によってPHLDA3遺伝子およびタンパク質の発現が促進されることを突き止めた。さらに、このPHLDA3が細胞膜のイノシトールリン脂質に結合することにより、腫瘍細胞の増殖を促進するAktタンパク質のリン酸化による活性化を阻害することを明らかにし、本発明の完成に至った。【００１０】
すなわち、本発明に係る医薬組成物は、PHLDAファミリータンパク質のPHドメインを有するポリペプチドを含有することを特徴とする。【００１１】
ここで、上記「PHドメインを有するポリペプチド」が、PHLDAファミリータンパク質の一部または全部であることが好ましい。【００１２】
さらに、本発明に係る医薬組成物は、上記の「PHLDAファミリータンパク質のPHドメインを有するポリペプチド」、あるいは、「PHLDAファミリータンパク質の、PHドメインを含む一部あるいは全部のポリペプチド」をコードするDNAが挿入された発現ベクターを含有していてもよい。【００１３】
ここで、本発明に係る上記いずれの医薬組成物においても、「PHLDAファミリータンパク質」が、PHLDA1〜3のいずれかであることが好ましい。【００１４】
さらに、本発明に係る腫瘍の治療用医薬剤は、本発明に係る上記いずれかの医薬組成物を含有することを特徴とする。【００１５】
ここで、本発明に係る治療用医薬剤の治療対象となる腫瘍について、その腫瘍細胞の増殖がAktタンパク質の活性化を必要とする腫瘍であることが好ましい。あるいは、その腫瘍細胞において、p53タンパク質の機能不全が生じている細胞であることが好ましい。あるいは、その腫瘍細胞において、p53遺伝子に変異を有している腫瘍であることが好ましい。【００１６】
本発明に係る治療用医薬剤の治療対象となる腫瘍が、肺癌、膵癌、肝癌、乳癌、子宮癌、脳腫瘍のいずれかであることがより好ましい。【００１７】
＝＝関連出願へのクロスリファレンス＝＝
本出願は、平成２１年２月２日付で出願した日本国特許出願第２００９−２２０４８に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の一実施形態である、p53遺伝子導入細胞あるいは非導入細胞における、PHLDA3タンパク質の発現（Ａ）、および、p53ノックダウン細胞、対照細胞における、PHLDA3タンパク質の発現（Ｂ）を示したウエスタンブロットの結果である。
【図２】本発明の一実施形態である、LacZ、あるいはp53遺伝子を導入したMDA-MB-468細胞における、PHLDA3タンパク質およびp53タンパク質の発現を示したウエスタンブロットの結果である。
【図３】本発明の一実施形態である、各種遺伝子挿入組換えベクターを導入したSaos2細胞におけるPHLDA3mRNAの発現誘導を示したノーザンブロットおよび各種p53タンパク質の発現を示したウエスタンブロットの結果である。
【図４】本発明の一実施形態である、GST-PH-AktおよびGST-PHLDA3の各リン脂質への結合を示した、タンパク質−脂質オーバーレイアッセイの結果である。
【図５】本発明の一実施形態である、各遺伝子が導入されたMDA-MB-468細胞およびWI38細胞における、Aktタンパク質のリン酸化を示したウエスタンブロットの結果である。
【図６】本発明の一実施形態である、p53遺伝子導入あるいは非導入細胞におけるPHLDA3のノックダウンがアポトーシス細胞数に与える影響を示したグラフである。
【図７】本発明の一実施形態である、Akt遺伝子導入MDA-MB-468細胞の増殖促進（Ａ、Ｂ）、および、PHLDA3ノックダウンMDA-MB-468細胞の増殖促進（Ｃ、Ｄ）を示した顕微鏡写真（Ａ、Ｃ）とグラフ（Ｂ、Ｄ）である。
【図８】本発明の一実施形態である、肺腫瘍患者および健常者のPHLDA3遺伝子発現を示したグラフである（Ａ、Ｂ）
【図９】本発明の一実施形態である、PHLDA3をはじめとする遺伝子配置を示した図である。
【図１０】本発明の一実施形態である、PHLDA3遺伝子配置および各マーカーの配置を示した図である。
【図１１】本発明の一実施形態である、PHLDA3遺伝子および各マーカーの配置を示した図である。
【図１２】本発明の一実施形態である、PHLDA1遺伝子のホモ欠失を示すグラフである。
【図１３】本発明の一実施形態である、乳癌患者（Ａ）および子宮癌患者（Ｂ）におけるPHLDA1遺伝子の発現を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。ただし、本発明は下記実施例に限定されない。
【００２０】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００２１】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２２】
＝＝医薬組成物に含まれるポリペプチド＝＝
本発明に係る医薬組成物は、PHLDAファミリータンパク質のPHドメインを有するポリペプチドを含有する。
【００２３】
「PHLDAファミリータンパク質」とは、Pleckstrin homology-like domain, family Aに属するタンパク質であって、PHLDA1〜3タンパク質（GeneBank accession number, 順にBC126425、BC005034、BC068273）のいずれかであることが好ましいが、これらに限定されない。
【００２４】
「PHLDAファミリータンパク質」は、このファミリータンパク質を有しているいずれの脊椎動物に由来してもよく、例えば、ヒトを含むマウス、ラット、チンパンジー、ブタ、イヌ等の哺乳類に由来しても、ニワトリ等の鳥類に由来しても、アフリカツメガエル等の両生類に由来してもよい。
【００２５】
「PHLDAファミリータンパク質のPHドメイン」とは、ヒトのPHLDA1〜3タンパク質における以下のアミノ酸配列を有するドメイン、または以下のアミノ酸配列１〜３において、数アミノ酸残基が欠失、挿入、または置換されたアミノ酸配列を有し、リン脂質への結合能を有するドメインと定義される。ここで、数アミノ酸残基とは、１０以下のアミノ酸残基、好ましくは８以下のアミノ酸残基、より好ましくは６以下のアミノ酸残基、さらに好ましくは４以下のアミノ酸残基、さらに好ましくは２以下のアミノ酸残基のことである。
ALKEGVLEKRSDGLLQLWKKKCCILTEEGLLLIPPKQLQHQQQQQQQQQQQQQQPGQGPAEPSQPSGPAVASLEPPVKLKELHFSNMKTVDCVERKGKYMYFTVVMAEGKEIDFRCPQDQGWNAEITLQMVQY  （ヒトPHLDA1のPHドメイン、配列番号１）、
VLREGELEKRSDSLFQLWKKKRGVLTSDRLSLFPASPRARPKELRFHSILKVDCVERTGKYVYFTIVTTDHKEIDFRCAGESCWNAAIALALIDFQ  （ヒトPHLDA2のPHドメイン、配列番号２）、VLKEGVLEKRSGGLLQLWKRKRCVLTERGLQLFEAKGTGGRPKELSFARIKAVECVESTGRHIYFTLVTEGGGEI DFRCPLEDPGWNAQITLGLVKF（ヒトPHLDA3のPHドメイン、配列番号３）
【００２６】
また、他の動物のPHドメインは、ヒトPHLDA1〜3タンパク質のPHドメイン（配列番号１〜３）の相同配列、または当該相同配列において、数アミノ酸残基が欠失、挿入、または置換されたアミノ酸配列を有し、リン脂質への結合能を有するドメインと定義される。
【００２７】
「PHLDAファミリータンパク質のPHドメインを有するポリペプチド」とは、PHLDAファミリータンパク質のPHドメインのみを有するポリペプチド、あるいは、PHドメインを含んだPHLDAファミリータンパク質の一部または全部であるポリペプチド、あるいは、PHドメインのＮ末端側、Ｃ末端側、あるいはその両方に任意のポリペプチドが付加されたポリペプチドのいずれであってもよい。
【００２８】
PHドメインを含んだPHLDAファミリータンパク質の一部または全部であるポリペプチドの場合、このポリペプチドは、Ｎ末端側、Ｃ末端側、あるいは、両側にPHLDAファミリータンパク質の天然由来のポリペプチド配列を有するポリペプチドであってもよい。
【００２９】
PHドメインのＮ末端側、Ｃ末端側、あるいはその両方に任意のポリペプチドが付加されたポリペプチドの場合、この任意のポリペプチドのアミノ酸配列は、PHドメインのリン脂質への結合を妨げない範囲で制限はなく、その配列が天然由来のアミノ酸配列であっても、人為的に設計されたアミノ酸配列であってもであってもよい。このようなポリペプチドとして、例えば、myc−tag、flag−tag、HA−tag、His−tagなどのタグペプチド、GFPやRFPなどの蛍光タンパク質、βガラクトシダーゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等、一般にレポーターや融合タンパク質として周知のタンパク質を例示することができるが、これらに限定されない。また、この任意のポリペプチドの長さについても、PHドメインのリン脂質への結合を妨げない範囲で制限はなく、１０００アミノ酸残基以下であってもよいが、６００アミノ酸残基以下であることが好ましく、３００アミノ酸残基以下であることがより好ましく、１００アミノ酸残基以下であることがさらに好ましく、５０アミノ酸残基以下であることがさらに好ましく、１０アミノ酸残基以下であることがさらに好ましい。例えば、２１９アミノ酸残基（GFP, GeneBank accession number, AB185173）であっても、３２７アミノ酸残基 (ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ, GenBank accession number, X57564)であっても、６６７アミノ酸残基（LacZ, GenBank accession number, EU590652）であってもよい。いずれのタンパク質においても、Ｎ末端はメチオニンであることが好ましく、最短の一例として、PHドメインのポリペプチドのＮ末端にメチオニンが付加されたポリペプチドが挙げられる。
【００３０】
PHドメインの結合対象とするリン脂質は、細胞内でAktの結合対象となってAktの活性化に関与するリン脂質であれば限定されず、PI（3,4）P2、PI（4,5）P2、PI（3,5）P2、PI（3,4,5）P3、PI（3）P、PI（4）P、PI（5）P等を例示できる。
【００３１】
ここに記載した何れのポリペプチドも、糖鎖修飾などの修飾がなされていてもよい。
【００３２】
＝＝医薬組成物の製法＝＝ 
本発明に係る医薬組成物は、「医薬組成物に含まれるポリペプチド」に記載のいずれかのポリペプチドを含有していてもよい。
【００３３】
本発明に係る医薬組成物に含まれる、何れのポリペプチドについても、その取得方法や調製方法は特に限定されず、天然由来のペプチドを精製した天然ペプチドであっても、遺伝子組み換え技術を用いて製造された組換えペプチドであっても、またはFmoc法やtBoc法等の周知の方法で化学合成したペプチドであっても、各種市販のペプチド合成機で製造したペプチドであってもよい。
【００３４】
天然由来のポリペプチドは、タンパク質の単離法及び精製法を適宜組み合わせることにより、PHLDAタンパク質を発現している動物組織や細胞から、PHドメインを含んだPHLDAファミリータンパク質の一部、または、全部として取得することができる。
【００３５】
あるいは、上記のように、遺伝子組み換え技術や化学合成法を用いて、天然由来のアミノ酸配列を有する合成ポリペプチド、あるいは、PHドメインを含む任意のアミノ酸配列を有する合成ポリペプチドを調製することができる。
【００３６】
あるいは、本発明に係る医薬組成物は、「医薬組成物に含まれるポリペプチド」に記載のいずれかのポリペプチドをコードするDNAを有する発現ベクターを含有していてもよい。
【００３７】
ここで、「発現ベクター」は、当業者に周知であって、投与対象となる動物の細胞内で組み込まれたDNAから、ポリペプチドを発現するように適切なプロモーターを有していれば特に制限されず、pcDNA3発現ベクターやpMX発現ベクターを例示できる。ここで「DNA」の種類は、発現ベクターにおいて当業者に周知の適切なプロモーターの下流に、発現できるように挿入された際に、上記ポリペプチドを発現することができれば、特に限定されず、cDNAであっても、イントロンを含む遺伝子由来のDNAであってもよい。
【００３８】
なお、本発明に係る医薬組成物は、上記「医薬組成物に含まれるポリペプチド」に記載のいずれかのポリペプチドを一種または複数種含有していても、上記いずれかのDNAが挿入された発現ベクターを一種または複数含有していても、あるいは、一種または複数種のポリペプチドと一種または複数種DNAが挿入されたベクターを含有していてもよい。
【００３９】
＝＝医薬組成物の用途＝＝
本発明に係る医薬組成物の用途に関して、特に制限されず、例えば、腫瘍をはじめとする疾病の治療用医薬剤の製造に用いても、あるいは、PHLDAファミリー遺伝子やタンパク質の関与する細胞内伝達系解析用試薬の製造に用いてもよい。
【００４０】
＝＝腫瘍の治療用医薬剤の製法と使用方法＝＝
本発明に係る腫瘍の治療用医薬剤は、上記いずれかの医薬組成物を含有することを特徴とする。
【００４１】
ここで、「腫瘍」とは、自律的な過剰増殖を示す細胞塊のことを意味する。腫瘍に含まれる腫瘍細胞は生体を構成する細胞自体から生ずるが、その由来に制限は無い。腫瘍は悪性腫瘍であっても良性腫瘍であってもよく、その悪性度に制限はない。
【００４２】
本発明にかかる治療用医薬剤を用いた治療の対象となる腫瘍は、治療用医薬剤の処方により腫瘍細胞増殖が抑制されれば制限がないが、その腫瘍細胞において、その増殖がAktタンパク質に依存している腫瘍であることが好ましく、例えば、肺癌、膵癌、肝癌、乳癌、子宮癌、脳腫瘍のいずれかであることが好ましい。ここで、「増殖がAktタンパク質に依存している」とは、腫瘍細胞では、その腫瘍細胞が由来する正常細胞より高レベルにAktタンパク質が活性化し、そのために正常細胞が腫瘍化または悪性化していることを意味する。
【００４３】
また、Aktタンパク質の腫瘍細胞における活性化の原因は特に限定されず、その腫瘍細胞でp53タンパク質の機能不全が生じている腫瘍であってもよい。p53タンパク質は、正常細胞では、PI3K-Akt経路の負の調節因子であるPTENやPHLDAの転写を活性化することによりPI3K-Akt経路を抑制しているため、p53タンパク質の機能不全が生じた腫瘍細胞では、Aktタンパク質が異所的に活性化するからである。p53タンパク質の機能不全は、多くの場合、その腫瘍細胞がp53遺伝子に変異を有していることに起因する。
【００４４】
なお、「Aktタンパク質」とは、細胞内シグナル伝達系のPI3K-Akt経路における主要なセリン／スレオニン リン酸化酵素であって、哺乳類においては、例えば、Akt1（GeneBank accession number, AH011307）、Akt2（GeneBank accession number, M9536）、Akt3（GeneBank accession number, AF135794）等のアイソフォームを挙げることができる。
【００４５】
また、「p53タンパク質」とはp53遺伝子によりコードされる核タンパク質であって、例えば、GeneBank accession number U94788のヒトp53タンパク質等が挙げられる。このp53タンパク質の機能不全とは、p53タンパク質が核内でその標的タンパク質に対して通常持つべき転写活性化機能が失われている、または低下していることを意味する。p53タンパク質が機能不全であるとき、その原因は特に制限されず、例えば、p53遺伝子に変異が生じたり、p53タンパク質発現過程の障害によってタンパク質が発現しなかったり、または、翻訳後のタンパク質が正常に機能できない構造に変性したりしても、あるいは、修飾等の障害によってタンパク質が正常に機能していなくてもよい。
【００４６】
本発明に係る治療用医薬剤の剤形化には、当業者に周知の薬学的に許容される担体、希釈剤、腑形剤等の製剤用添加物が用いられる。その形態は本医薬剤を患者体内の患部に送達するために適切な剤形であれば特に特定されず、例えば、経口剤として、錠剤、カプセル、顆粒、散剤、シロップ、腸溶剤、徐放性カプセル、カシュー、咀嚼錠、ドロップ、丸剤、内用液剤、菓子錠剤、徐放錠、徐放性顆粒等に剤形化してもよい。また、注射剤に剤形化してもよい。本治療用医薬剤には、上記製剤用添加物の他、異なる医薬組成物を配合することもできる。
【００４７】
なお、本治療用医薬剤の有効成分の処方として、上発明に係る上記医薬組成物の一種を含有していても、あるいは、複数種を含有していても制限はなく、当業者が適宜選択することができる。医薬組成物が含有するポリペプチドは、その医薬組成物を含む医薬剤の投与対象と同じ動物種に由来することが好ましい。例えば、医薬剤をヒトに投与する場合には、ヒト組織由来のPHLDAファミリータンパク質に由来することが好ましい。
【００４８】
また、本発明の治療用医薬剤は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物に対し、必要量を、適した方法で投与することができる。本発明の治療用医薬剤の投与量は、剤形の種類、投与方法、患者等投与対象の年齢や体重、患者等投与対象の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。
【００４９】
本治療用医薬剤の投与対象となる動物に制限はないが、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物であることが好ましい。
【実施例】
【００５０】
[実験方法]
＝＝細胞株＝＝
以下の各実施例において、ヒト骨肉腫由来細胞株のSaos2、ヒト乳癌由来p53変異細胞株MDA-MB-468（MM-468）、ヒト繊維芽細胞由来細胞株WI-38、ヒト繊維芽細胞由来MRC5細胞株、ヒト胎児腎臓由来293細胞株（すべてAmerican Type Culture Collectionより購入）を用いた。
以下の実施例で用いる培養細胞株は、特記しない限り、１０％ウシ胎児血清添加DMEMで培養した。 【００５１】
＝＝レンチウイルスの作製＝＝
下記PHLDA3に対するshRNA1（PH3-sh1RNA ：TTGGCCATTAGCATTTCATGTCT、配列番号４）あるいはshRNA2（PH3-sh2RNA ：AGGCGCTGGAGCTGAAGGAATGG、配列番号５）を発現するレンチウイルス、p53に対するshRNA（p53-shRNA ：GACTCCAGTGGTAATCTAC、配列番号６）を発現するレンチウイルス、および、活性化Akt（Myr-Akt）を発現するレンチウイルスをViraPower Lentiviral Gateway Expression kit（Invitrogen社）を用いて添付プロトコールに従い作製した。【００５２】
まず、PHLDA3およびp53のshRNAについては、下記のオリゴヌクレオチドを会合させて２本鎖DNAとしたのちに、pSuperベクター(OligoEngine社)のBgl II-Sal I サイトにクローニングした。このpSuperベクターよりSma I-Xho I領域を切り出して、pLenti6/V5-DESTベクター（Invitrogen社）の平滑化したCla I-Xho Iサイトにクローニングし、組み換えpLenti6/V5-DESTベクターを作製した。また、Aktについては、活性化Akt発現ベクター（Higuchi M et al., Current Biology, Volume 11 (24), 958-1962, 2001）を鋳型とし、下記プライマーを用いてPCRを行った。PCR産物をXba Iで消化し、pLenti6/V5-DEST（Invitrogen社）のXba Iサイトにクローニングした。これらの各組換えpLenti6/V5-DESTベクターを、上記ViraPower Lentiviral Gateway Expression kitに添付のViraPowder packaging Mixと同じく添付293FT細胞に導入し、PH3-sh1RNA発現レンチウイルス、PH3-sh2RNA発現レンチウイルス、p53-shRNA発現レンチウイルス、Myr-Akt発現レンチウイルスを作製した。
PH3-sh1-sense: GATCCCCTTGGCCATTAGCATTTCATGTCTTTCAAGAGAAGACATGAAATGCTAATGGCCAATTTTTGGAAAAG（配列番号７）
PH3-sh1-antisense: TCGACTTTTCCAAAAATTGGCCATTAGCATTTCATGTCTTCTCTTGAAAGACATGAAATGCTAATGGCCAAGGG（配列番号８）
PH3-sh2-sense: GATCCCCAGGCGCTGGAGCTGAAGGAATGGTTCAAGAGACCATTCCTTCAGCTCCAGCGCCTTTTTTGGAAAAG（配列番号９）
PH3-sh2-antisense: TCGACTTTTCCAAAAAAGGCGCTGGAGCTGAAGGAATGGTCTCTTGAACCATTCCTTCAGCTCCAGCGCCTGGG（配列番号１０）
p53-sh-sense: GATCCCCGACTCCAGTGGTAATCTACTTCAAGAGAGTAGATTACCACTGGAGTCTTTTTGGAAAAG（配列番号１１）
p53-sh-antisense: TCGACTTTTCCAAAAAGACTCCAGTGGTAATCTACTCTCTTGAAGTAGATTACCACTGGAGTCGGG（配列番号１２）
Myr-Akt-sense: CGGGCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCC（配列番号１３）
Myr-Akt-antisense: TTATCTAGATTACAGATCCTCTTCTGAGATGAG（配列番号１４）【００５３】
＝＝遺伝子ノックダウン細胞株の樹立＝＝
上記のように作製した各PH3-shRNA発現レンチウイルスをMDA-MB-468細胞に感染させた。また、p53ノックダウン細胞株確立のため、上記p53-shRNA発現レンチウイルスをMRC5細胞に感染させた。【００５４】
以上の細胞を0.6 mg/mlハイグロマイシンによって選択することにより、PHLDA3ノックダウン細胞株(Ph3-Sh1-MM-468細胞株、Ph3-Sh2-MM-468細胞株)、および、p53ノックダウン細胞株（p53-sh-MRC5細胞株）を樹立した。また、非組換えpLenti6/BLOCK-iT Expression Construct vectorを用いて、上記と同様にレンチウイルスを作製し、対照細胞株（Ctrl-sh-MM468およびCtrl-sh-MRC5細胞株）を確立した。【００５５】
＝＝組換えアデノウイルスの調製＝＝
組換えアデノウイルスは、Adenovirus Expression Vector kit (Dual Version)、およびadenovirus genome DNA-TPC(共にTakara社)を用いて作製した。具体的には、pC53-SN3 （Baker SJ et al., Science, 249, 912-915, 1990）をBamH Iで消化してp53遺伝子の翻訳領域全長を切りだし、さらにDNA Blunting kit (Takara社)を用いて末端平滑化を行った。また、N末端をHAタグで標識したPHLDA3断片を得るため、PHLDA3 EST (EST IMAGE ID 3547186、 Open Biosystems社)を鋳型とし、下記プライマーを用いてPCRを行った。ここで得られたDNA増幅断片を、HA タグを挿入したpcDNA3.1ベクター(Invitrogen社)のBamH I-Xho Iサイトに挿入し、クローニングした。このようにして得られたベクターをKpn I およびXho Iを用いた消化した後、このDNA断片を精製し、さらにDNA Blunting kit (Takara社)を用いて末端平滑化を行った。
Ad-PHLDA3-sense: TTAGGATCCATGACGGCGGCGGCGACGGCTAC（配列番号１５）
Ad-PHLDA3-antisense: TTACTCGAGTTAGGACACGAGGGTCCCGGT（配列番号１６）【００５６】
以上のようにして得られた各DNA断片を、コスミドベクター（pAxCAwtit）のSmi I 制限酵素部位に挿入した後、各組換えベクターをそれぞれ293細胞にトランスフェクトし、p53組換えアデノウイルス、および、PHLDA3組換えアデノウイルスを作製した。こうして得られた各組換えアデノウイルスをVirakit Adeno 4 (Virapur社)を用いて精製し、タイターを測定した。MOI（multiplicity of infection、重複感染度）を添付マニュアルに従って293細胞を用いた時の50％組織培養感染用量（TCID50）から決定した。【００５７】
対照群として、上記Adenovirus Expression Vector kit (Dual Version)に付属のControl Cosmid pAxCAiLacZit（LacZ組換えアデノウイルス）を用いた。【００５８】
＝＝組織からのｃDNAの調製法＝＝
採取された組織から、RNeasy Midi Kit（Qiagen社）を用いて全RNAを抽出した。このRNA(０．２〜５μg)をSuperScript First-Strain Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen社）を用いて逆転写し、cDNAを作製した。【００５９】
＝＝ノーザンブロット解析＝＝
全RNAをRNeasy Midi Kit（Qiagen社）を用いて抽出した。ノーザンブロットはOhki et al. (Cancer Sci. 98, 189-200, 2007)の記載に従って行った。PHLDA3mRNAの検出用ハイブリダイズ用プローブとして、ESTクローン（IMAGE ID 3547186、 Open Biosystems社）から得られるSma I-Apa I DNA断片を使用した。この断片はPHLDA3の翻訳領域の全長を含む。このハイブリダイズ用プローブを、BcaBEST labeling kit (Takara社)を用いて標識した後、Probe Quant G-50 Micro ColumnとNICK Column (共にAmersham社)で精製した。なお、内部標準として28SRNAを用いた。【００６０】
＝＝ウエスタンブロット解析＝＝
培養細胞を50 mM 細胞溶解バッファー（Tris-HCl(pH 8.0)、1% NP40、250 mM NaCl、50 mM NaF、1 mM NaVO4、1 mM プロテアーゼ阻害剤 (PMSF、aprotinin、leupeptin)、1 mM DDT）中で溶解し、遠心分離した。ここで得られた上清を変性SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、PVDF膜にブロットした後、膜上のタンパク質を各タンパク質に特異的な抗体を用いて検出した。泳動時、PHLDA3タンパク質の検出のため、ゲルの１レーンにつき20μgのタンパク質を電気泳動し、その他のタンパク質の検出のため、１レーンにつき5μgのタンパク質を電気泳動した。一次抗体として、抗PHLDA3 ヤギポリクローナル抗体（カタログ番号：ab22822、Abcam社）、抗p53ヤギポリクローナル抗体（カタログ番号：9282G、Cell signaling Technology社）、抗p53-phospho-Ser15特異的ウサギポリクローナル抗体（カタログ番号：９２８４、Cell signaling Technology社）、抗Aktウサギポリクローナル抗体（カタログ番号：９２７２、Cell signaling Technology社）、抗phospho-Akt(S473)ウサギポリクローナル抗体（カタログ番号：９２７１、Cell signaling Technology社）、抗phospho-Akt(T308)ウサギポリクローナル抗体（カタログ番号：９２７５、Cell signaling Technology社）を適宜用いた。以上の一次抗体は、室温で一晩、1000〜3000倍希釈で反応させた。二次抗体として、抗ウサギIgG HRP標識ヤギIgG（カタログ番号：７０７４、Cell signaling Technology社）、ECL 抗マウスIgG HRP標識ヒツジ抗体（カタログ番号：NA931、Amersham Bioscience社）、抗ヤギIgG HRP標識ウシ抗体（カタログ番号：co306、santa cruz biotechnology社）を用いた。以上の二次抗体は、室温で３時間、２０００〜４０００倍希釈で反応させた。シグナルの可視化には、Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer Life sciences社)を用いた。なお、内部標準およびゲルに泳動したタンパク質量補正のため、βアクチンを用いた。【００６１】
＝＝組織試料からのゲノムDNAの調製＝＝
組織をメタノールあるいはホルマリンで固定し、５μmのパラフィン切片を作製した。この切片から、lazer captured microdissection法（Emmert-Buck MR et al., Science 274, 998-1001, 1996）により腫瘍細胞を単離した。この単離腫瘍細胞あるいは正常組織を、２００μｌ溶解バッファー（10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.5% SDS）で溶解し、proteinaseＫで消化した後、phenol-chloroform抽出法でゲノムDNAを精製した。【００６２】
＝＝マイクロサテライト解析＝＝
本解析法は、Takahashi et al. (Clin. Cancer Res. 2007, 13(1), 111-120, 2007)の記載に従って行った。まず、上記ゲノムDNAの調製法に従い、組織からゲノムDNAを抽出した。このDNAを鋳型とし、FAMで蛍光標識したプライマーを用いて４０サイクルのPCRを行った。PCR産物は、ABI Prism 3100 DNA Sequencer (Applied Biosystems社)を用いて配列を決定し、GeneScanおよびGenotyper software(Applied Biosystems社)を用いてシークエンスデータを解析した。正常組織の２つのアレルのシグナルの比と比較し、腫瘍組織の２つのシグナルの比が0.65以下であった場合にアレル不均衡があると判断した。【００６３】
[実施例１]
本実施例は、細胞にp53遺伝子を導入することによりPHLDA3遺伝子発現が促進されること、および、細胞でp53遺伝子をノックダウンすることにより、PHLDA3遺伝子の発現が抑制されることを示す。【００６４】
細胞へp53遺伝子を導入することによるPHLDA3遺伝子発現への影響を調べるため、Saos2細胞に、pcDNA3-p53組換え発現ベクター、あるいは、対照群としてpcDNA3ベクターを一過的に導入し、２４時間培養した。この遺伝子導入細胞におけるPHLDA3遺伝子発現量をノーザンブロット解析によって検出した。
この結果、図１Ａに示すように、対照群と比較し、p53遺伝子を導入したSaos2細胞ではPHLDA3遺伝子の発現量が増加した。【００６５】
さらに、p53遺伝子のノックダウンによるPHLDA3遺伝子発現への影響を調べるため、p53-sh-MRC5細胞株、および、Ctrl-sh-MRC5細胞株に、３０グレイの放射線照射を行い、６時間または１０時間後に細胞を回収した。この放射線照射は、p53タンパク質の発現を増加させることが知られている。その後、これらの細胞におけるPHLDA3遺伝子発現をノーザンブロットに解析により検出した。【００６６】
図１Ｂに示すように、対照群の細胞においては、放射線照射後にPHLDA3遺伝子発現量が増加した。一方、p53遺伝子をノックダウンした細胞では放射線の照射、未照射に関わらず、PHLDA3遺伝子の発現は抑制された。【００６７】
これらの実験から示されるように、p53遺伝子は、PHLDA3遺伝子の発現を正に制御している。【００６８】
[実施例２]
本実施例は、p53遺伝子の導入によってPHLDA3のタンパク質の発現量が増加することを示す。
MDA-MB-468細胞に、p53組換えアデノウイルス、あるいは、対照群として、LacZ組換えアデノウイルスを感染させた（MOI：15）。さらに１８時間培養を続けた後、PHLDA3タンパク質、p53タンパク質の発現量を検出するため、この細胞をウエスタンブロット法で解析した。【００６９】
図２に示すように、p53遺伝子が導入されたMDA-MB-468細胞では、対照群に比較してPHLDA3タンパク質の発現量が増加し、p53タンパク質量が増加していた。
この実験から示されるように、p53遺伝子は、PHLDA3の発現を、タンパク質レベルで増強させる。【００７０】
[実施例３]
本実施例は、細胞に導入するp53遺伝子に変異を導入することによって、PHLDA3タンパク質の発現量の増加が抑制されることを示す。【００７１】
＝＝組換え発現ベクターの調製＝＝
野生型p53、p53-S15A（１５位のセリンがアラニンに置換されたp53変異体遺伝子）、p53-S15D(１５位のセリンがアスパラギン酸に置換されたp53変異体遺伝子)、p53-S46A（４６位のセリンがアラニンに置換されたp53変異体遺伝子）、あるいはTAD-S/A（転写活性化ドメイン内のセリンが全てアラニンに置換されたp53変異体遺伝子）を有する発現ベクターを作製するため、Oda et al.（Cell 102 (6), 849-862, 2000）に記載の野生型p53発現ベクター（野生型、S15D、S15A、TAD-S/A）あるいはp53-S46A 発現ベクター（S46A）を鋳型とし、それぞれ下記プライマーペア（表１）を用いてPCRを行った。TAD-S/Aに関しては、p53-N-terS/A-primer-senseとp53-primer-antisense-AvaIIでPCRを行った後に、そのPCR産物を鋳型として、p53-S/A-primer-senseとp53-primer-antisense-AvaIIでさらにPCR増幅を行った。得られたPCR産物をBamHIとAvaIIで処理した断片と、野生型p53のPCR断片をAvaIIとEcoRIで処理した断片を以下のベクターにクローニングした。ここで得られた野生型p53をpcDNA3発現ベクター（Invitrogen社）のBamHI-XhoIおよびpMX発現ベクター（Onishi M et al., Mol. Cell. Biol. 18,  3871-3879, 1998）のBamHI-EcoRIサイトに挿入し、pcDNA3-p53組換えベクターおよびpMX-p53組換えベクターを作製した。また、各変異型p53のPCR産物をpMX発現ベクターのBamHI-EcoRIサイトに挿入し、p53pMX-S15A、pMX-S15D、p53pMX-S46A、pMX-TAD-S/A発現ベクターを作製した。【００７２】
【表１】
2010087497.tif 000002
p53-primer-sense:TTAGGATCCATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTC（配列番号１７）
p53-primer-antisense:TTAGAATTCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTTC（配列番号１８）
p53-primer-antisense-2:TTACTCGAGTCAGTCTGAGTCAGGCCCTTC（配列番号１９）
p53S15A-primer-sense:TTAGGATCCATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCGAGCCCCCTCTGGCTCAGGAAACATTTTCAG（配列番号２０）
p53S15D-primer-antisense:TTAGGATCCATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCGAGCCCCCTCTGGATCAGGAAACATTTTCAG（配列番号２１）
p53-N-terS/A-primer-sense:GCAGGCAGATCCTGCCGTCGAGCCCCCTCTGGCTCAGGAAACATTTGCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAACGTTCTGGCCCCCTTGCCGGCCCAAGCAATGGATGATTTGATGCTGgCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACT（配列番号２２）
p53-S/A-primer-sense:TTAGGATCCATGGAGGAGCCGCAGGCAGATCCTAGCGTC（配列番号２３）
p53-primer-antisense-AvaII:TCATCTGGACCTGGGTCTTCAGTGAAGCATTGTTC（配列番号２４）【００７３】
Saos2細胞に、上記各組換え発現ベクターを一過的に導入し、２４時間培養を続けた。対照群として、いずれのDNA配列も挿入されていない非組換えpcDNA3ベクターを導入した。その後、ノーザンブロット法によって、この細胞におけるPHLDA3遺伝子発現量を測定した。さらに、ウエスタンブロット法によってこの細胞におけるp53タンパク質の発現量を解析した。【００７４】
図３に示すように、Saos2細胞におけるPHLDA3タンパク質の発現量は、p53S15D組換えベクター（28S比：９．３）、野生型p53組換えベクター（28S比：４．０）、p53S46A組換えベクター（28S比：３．９）、TAD-S/A組換えベクター（28S比：２．４）、p53S15A組換えベクター（28S比：１．７）、非組換えpcDNA3ベクター、を導入した順に高かった。【００７５】
このように、細胞に導入するp53遺伝子に変異を導入することによって、PHLDA3タンパク質の発現量の増加が抑制される。即ち、p53によるPHLDA3の発現増加は、p53の転写活性化能に依存する。【００７６】
［実施例４]
本実施例は、PHLDA3のリン脂質への結合を示す。【００７７】
＝＝GST融合タンパク質の調製＝＝
PHLDA3のＧＳＴ融合タンパク質(GST-PHLDA3)調製のため、PHLDA3ｃDNA（ESTクローン、IMAGE ID 3547186、 Open Biosystems社）を鋳型として用い、以下のプライマーを用いたPCRによってPHLDA3のコード領域を増幅させた。
GST-PHLDA3-sense:TTAGGATCCATGACGGCGGCGGCGACGGCTAC（配列番号２５）
GST-PHLDA3-antisense:TTACTCGAGTTAGGACACGAGGGTCCCGGT（配列番号２６）
一方、AktのPHドメインのGST融合タンパク質（GST-PH-Akt）調製のため、HCT116細胞（American Type Culture Collection社）の全RNAを用いて作製したcDNAを鋳型として用い、以下のプライマーを用いたＰＣＲによってAktのPHドメインのコード領域を増幅させた。
GST-PH-Akt-sense:TTAGGATCCATGAGCGACGTGGCTATTGTGAAGGAG（配列番号２７）
GST-PH-Akt-antisense:TTACTCGAGTTACTCGTTCATGGTCACGCGGTGC（配列番号２８）
以上のようにして得られた各PCR産物の両末端をBamH IおよびXho Iで消化後、pGEX-6P-1ベクター（Amersham Pharmacia社）のBamH I−Xho I に挿入し、このベクターをBL21-Gold(DE3)コンピテント細胞（Stratagene社）に導入した。さらにこの細胞を溶解した後、溶解液中のGST融合タンパク質をグルタチオン-spharose 4Bビーズ（Amersham Pharmasia社）を用いて精製した。【００７８】
＝＝タンパク質-脂質オーバーレイアッセイ＝＝
各リン脂質（Echelon Bioscience 社）を０．１％HClを含むメタノール−クロロホルム（１：１）混合液に溶解した後、ニトロセルロース膜（NitroPure transfer membrane、Osmonics社）に滴下し、風乾させた。この膜を、４％スキムミルクを含むTBSTバッファー（50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1％ Tween 20, pH 8.0）、および、３％脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン（Sigma社）を含むTBSTによって室温で３０分ずつブロッキングした。この膜を4℃で一晩、５μg／mlの各GST融合タンパク質と反応させた。続いてこの膜をTBSTバッファーで10分間、６回リンスした後、室温で１時間抗-GSTマウスモノクローナル抗体（５０００倍希釈、clone GST-2（G 1160）、Sigma社）と反応させ、TBSTバッファーで再びリンスした。さらに、この膜をECL HRP標識抗マウスIgGヒツジ抗体（20000倍希釈、Amersham Biosciences社）と室温で１時間反応させた。再び膜をTBSTバッファーで同様にリンスし、GST融合タンパク質の各リン脂質への結合を化学発光分析法(Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus 、PerkinElmer Life sciences社)により解析した。なお、対照群として、膜にブロットした各リン脂質に非融合GSTタンパク質を反応させた。【００７９】
図４に示すように、GST-PH-AktはPI(3,4）P2およびPI（3，4，5）P3に結合した。一方、GST-PHLDA3はPI（3，4）P2、PI（4，5）P2、PI（3，5）P2、PI（3，4，5）P3、PI（3）P、PI（4）P、PI（5）Pに結合した。
このように、PHLDA3タンパク質は、広くリン脂質に結合する。【００８０】
[実施例５]
本実施例は、p53及びPHLDA3がAktのリン酸化を阻害することを示す。【００８１】
MDA-MB-468細胞、およびWI-38細胞に、p53組換えアデノウイルス、PHLDA3組換えアデノウイルス、あるいは、対照群として、LacZ組換えアデノウイルスを感染させた（MOI: 35）。感染１８時間後には、まだ細胞のアポトーシスは観察されず、これらの培養細胞におけるAktタンパク質の４７３位のセリン、および３０８位のスレオニンにおけるリン酸化を検出するため、各培養細胞に対しウエスタンブロット解析を行った。【００８２】
図５に示すように、MDA-MB-468細胞、およびWI-38細胞では、Aktタンパク質の過剰リン酸化が生じており（対照実験のAd-LacZのレーン参照）、特に、MDA-MB-468細胞は、p53に変異を有するため、その結果として、Aktタンパク質の過剰リン酸化が生じている。
これらの細胞に、p53を導入すると（Ad-p53）、内在性のPHLDA3の発現が亢進するため、そのPHLDA3によって、Aktタンパク質の４７３位のセリンおよび３０８位のスレオニンにおけるリン酸化が阻害された。また、PHLDA3を導入しても（Ad-PHLDA3）、同様にAktタンパク質の４７３位のセリンおよび３０８位のスレオニンにおけるリン酸化が阻害された。【００８３】
このように、PHLDA3の強制発現は、Aktタンパク質の過剰リン酸化が生じている細胞において、Aktの活性化を阻害する。従って、細胞増殖がAktの活性化に依存している腫瘍細胞やp53に変異を生じた腫瘍細胞にPHLDA3を導入すると、Aktの活性化が阻害され、細胞増殖が抑制される。【００８４】
[実施例６]
本実施例は、PHLDA3に変異を生じた腫瘍細胞では、アポトーシスが減少することを示す。【００８５】
PH3-Sh1-MM468細胞株、PH3-Sh2-MM468細胞株、および、Ctrl-Sh-MM468細胞株に、p５３組換えアデノウイルス、あるいは、LacZ組換えアデノウイルスを感染させた（MOI:3）。【００８６】
ウイルス感染４３時間後、上記各細胞を用い、Ohki et al. (Cancer Sci. 96, 551-667, 2000) に従って、細胞周期アッセイを行った。まず、培養細胞を回収し、７０％エタノールで一晩固定した。固定された培養細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄後、１０μg／ml propidium iodideと１００μg／ml RNaseAと共にインキュベートし、Vantage instrument(Becton Dickinson社)を用いて検出した。なお、propidium iodideは細胞死染色剤として知られる。【００８７】
本実験で、p53を導入し、PHLDA3をノックダウンした細胞は、PHLDA3に変異を生じた腫瘍細胞に相当する。図６に示すように、これらの細胞では、PHLDA3を発現している細胞（Ad-p53-ctrl-shRNA）に比べ、有意にアポトーシスが抑制されている。従って、PHLDA3に変異を生じた腫瘍細胞に、PHLDA3を導入することによって、その腫瘍細胞のアポトーシスを増強することができる。【００８８】
[実施例７]
本実施例は、PHLDA3に変異を生じた腫瘍細胞では、細胞増殖が促進されることを示す。【００８９】
＝＝Myr-Akt細胞株の樹立＝＝
Myr-Akt発現レンチウイルスをMDA-MB-468細胞に導入し、続いてこの細胞を０．５ μg／ml Blasticidin S (Invitrogen社)で選択培養することによって、Myr-Akt発現MM-468細胞株を樹立した。対照群細胞株の樹立には、いずれの遺伝子も導入していないレンチウイルスを用いた。【００９０】
上記実験群と対照群の細胞株を、６ cmの培養皿あたり1x104細胞の密度で播種した。このとき、０．５％アガロース／DMEMの上に０．８％メチルセルロース／DMEMを重ねた二層の培地（ソフトアガー培地）を用い、７日毎に新しい上層培地を加えた。４週間培養を続け、形成されたコロニー数をImage J software(NIH)を用いて解析した。この際、各群において、３つの培養皿について解析した。結果を平均値±標準偏差として表した。【００９１】
さらに、PHLDA3遺伝子の抑制がコロニー形成に与える影響を調べるため、Ctrl-sh-MM468細胞株、PH3-sh1-MM468細胞株、および、PH3-sh2-MM468細胞株を、上記と同様にそれぞれソフトアガー培地に播種して４週間培養を続け、コロニーを計数した。【００９２】
図７Ａ、Ｂに示すように、Myr-Akt発現細胞では、対照群と比較して形成されたコロニー数が有意に多かった（P＜0.001）。これは、Aktが細胞増殖を促進することを示している。【００９３】
また、図７Ｃ、Ｄに示すように、Ctrl-sh-MM468細胞株に比較し、PH3-sh1-MM468細胞株およびPH3-sh2-MM468細胞株の形成コロニー数は有意に多かった（P＜0.001）。本実施例で、PHLDA3をノックダウンした細胞は、PHLDA3に変異を生じた腫瘍細胞に相当する。これらの細胞では、PHLDA3を発現している細胞に比べ、有意に細胞増殖が促進されている。従って、PHLDA3に変異を生じた腫瘍細胞に、PHLDA3を導入することによって、実施例６で示したように腫瘍細胞のアポトーシスを増強することができるだけでなく、細胞増殖も抑制できる。【００９４】
[実施例８]
本実施例は、肺腫瘍（大細胞神経内分泌癌（LCNEC））においてPHLDA3遺伝子発現が抑制されていることを示す。【００９５】
＝＝試料＝＝
肺腫瘍（LCNEC）に罹患している患者１２名（１Ｔ〜１２Ｔ、ただし患者３Ｔは本試料採取前に化学療法を受けている）および健常者５名（Ａ〜Ｅ）の肺組織を１９９３年から２０００年の間に国立がんセンター中央病院にて採取した。
＝＝定量RT‐PCR解析＝＝
定量RT−PCRはKaneshiro et al. (Genomics 89, 178-188, 2007)の記載に従い、下記の条件で行った。上記「組織からのｃDNAの調製法」により、採取された肺組織からcDNAを作製した。このcDNAを鋳型として、Lightcycler 480 Instrument (Roche Diagnotics社)により定量PCRを行った。この時、PHLDA3検出用プライマーとしてHs00385313_ml、GAPDH検出用プライマーとしてVIC-MGB 4326317-E-0508009（共にTaqMan probe、 Applied Biosystems社）を用いた。
このようにして得られた各mRNA発現量は内部標準のGAPDHの発現量によって補正した。すべてのRNA試料は、３回ずつ繰り返して解析し、各試料から得られた結果は平均値±標準偏差として表した。【００９６】
＝＝MCG cancer array 800-CGH解析法＝＝
本解析法には、８００種類の腫瘍関連遺伝子の解析のためにカスタムメイドされたMCG cancer array 800を用い、Peng et al.（Cancer Sci. 96, 661-667, 2005）およびSonoda et al.（Cancer Res. 64, 3741-3747, 2004）の記載に従い行った。上記肺組織から、前述のゲノムDNA調製法に従いゲノムDNAを抽出した。このDNAを鋳型として、アダプター（5’側アダプター：AATTCGGCGGCCGCGGATCC、配列番号２９、3’側アダプター：GCCGCCGGCGCCTAGG、配列番号３０）を付加した後、下記プライマーを用いたＰＣＲを行った。
Primer-array-method: GGAATTCGGCGGCCGCGGATCC（配列番号３１）
このようにして得たDNAをCy-3-dCTPで、また、リファレンスDNAをCy-5-dCTP（共にAmersham Biosciences社）で、ランダムプライム法によってそれぞれ標識しエタノール沈殿法により精製した後、ハイブリダイス用混合液（50% formamide, 10% dextran sulfate, 2X SSC, 4% SDS, pH 7.0）に溶解し、７５℃で１０分間変性させた。この標識DNA溶液を上記MGC cancer array-800のアレイスライドに滴下し、４８〜７２時間、４２℃で振盪しながらハイブリダイズさせた。ハイブリダイズ後、スライドを50% formamide-2X SSC(pH 7.0)（５０℃、１５分）、2X SSC-0.1% SDS (５０℃、１５分)、0.1% NP40添加0.1 M sodium phosphate buffer(pH 8.0)(室温、１５分)で一回ずつリンスした。このスライドを、GenePix 4000B（Axon Instruments社）を用いてスキャンし、画像をGenePix Pro4.1 imaging software (Axon Instruments社)で解析した。シグナル／リファレンス比が0.8より低い場合に、染色体欠失が生じていると判断した。【００９７】
図８Ａ、Ｂに示すように、化学療法を受けた患者（Ｔ３）を除き、肺腫瘍に罹患している患者の肺組織では、健常者に比較してPHLDA3 mRNA量が低かった。【００９８】
さらに、図９は染色体上のPHLDA3遺伝子およびマーカーの位置を示している。また、下記表２はMCG cancer array-800CGHによる解析結果を示し、これによると、肺腫瘍患者の肺組織の遺伝子において、高頻度でPHLDA3近傍に欠失が検出された。【００９９】
【表２】
2010087497.tif 000003
【０１００】
[実施例９]
本実施例は、肺腫瘍（LCNEC）患者の肺組織およびインスリノーマ患者の膵臓組織において、PHLDA3近傍に変異が生じていることを示す。【０１０１】
まず、インスリノーマに罹患している患者１６名および健常者５名の膵臓組織を国立がんセンター中央病院にて採取した。上記ゲノムDNAの調製法に従ってDNAを抽出した。肺腫瘍患者組織およびインスリノーマ患者組織染色体1q31〜32における各遺伝子座欠失と重複を検出するため、このDNAを下記のプライマーを用いた上記「マイクロサテライト解析」に供した。
D1S2622-F:CTGCAACATAAGAACCTAGTGTAAC（配列番号３２)
D1S2622-R:AAACTGGTAGGCCATTGATAGA（配列番号３３）
D1S249-F:TGGCATGTCTTTGAAGGAAT（配列番号３４）
D1S249-R:TGGTTGTAGATGAGACTGGC（配列番号３５）
D1S306-F:CTGGGACTGGAAACACTTTTGAT（配列番号３６）
D1S306-R:CCAGAGGGAGCATTGGTG（配列番号３７）
D1S510-F:TTCCTGCTCCTGTCTGAATA（配列番号３８）
D1S510-R:TGTATATAAGGTGTAGGGGAGG（配列番号３９）【０１０２】
図１０Ａは染色体上のPHLDA3遺伝子および、本実施例で解析した各マーカーの位置を示している。Ｂに示すように、インスリノーマ患者の試料では、PHLDA3近傍のD1S306に高頻度にヘテロ接合性欠失（LOH）が認められる。また、表３に示すように、肺腫瘍患者においてもD1S306に高頻度でLOHが認められた。【０１０３】
【表３】
2010087497.tif 000004
【０１０４】
[実施例１０]
本実施例は、膵臓腫瘍（インスリノーマ、ガストリノーマ）および、髄芽腫においてPHLDA3遺伝子に変異が生じていることを示す。【０１０５】
インスリノーマ患者とガストリノーマ患者の膵臓組織、および髄芽腫患者脳組織において、表４、５、６に示すような各マーカー領域に、LOHが頻繁に認められることが報告されている（Chen YJ et al., Cancer Res. 63, 817-823, 2003; Kraus JA et al., Int. J. Cancer 67, 11-15, 1996; Yang YM et al., J. Int. J. Cancer 117, 234-240, 2005）。【０１０６】
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【０１０７】
ヒトゲノム解析による全ゲノムのDNA配列情報を用い、UCSC genome browser及びNCBI Map Viewer（http://genome.ucsc.edu/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/）を用いてPHLDA3遺伝子と各マーカーの位置を解析した。【０１０８】
図１１は本実施例で解析した、染色体上のPHLDA3遺伝子配置および各マーカーの位置を示している。インスリノーマ（Ｂ）、ガストリノーマ（Ｃ）、髄芽腫（Ｄ）の組織において、高頻度なヘテロ接合性欠失（LOH）が報告されていたGATA135F02マーカー部位、F13Bマーカー部位、およびD1S2796マーカー部位はPHLDA3遺伝子に近傍している。【０１０９】
[実施例１１]
本実施例は、胆道癌において、PHLDA1遺伝子に変異が生じていることを示す。【０１１０】
本実施例では、Alient 44K oligonucleotide micro array CGH (Agilent Technologies社)を用いて、胆道癌患者における遺伝子欠失を解析した。まず、胆道癌患者３０名の胆道組織を国立がんセンター中央病院にて採取した。この癌組織および隣接する正常組織から、上記ゲノムDNAの調製法に従いゲノムDNAを抽出した。ここで得られた各DNA試料をAglient Genomic DNA ULS labeling kit (Aglient Technology社)を用い、添付プロトコールに従って標識および精製した後、添付のHybridization Master Mixに溶解し、変性させた。この試料をアレイスライドに滴下し、６５℃で４０時間ハイブリダイズした。このスライドをAgilent Oligo aCGH 洗浄バッファー１および２で洗浄後、マイクロアレイスキャナー (Agilent社)を用いてスキャンし、画像をCGH Analytics (Agilent社)で解析した。【０１１１】
図１２に示すように、胆道癌組織から得た試料において、PHLDA1遺伝子のホモ欠失が高頻度で認められる。
この結果は、胆道癌をはじめとする腫瘍の発生、増殖にPHLDA1の変異が関与することを示す。【０１１２】
[実施例１２]
本実施例は、乳癌、子宮癌においてPHLDA1遺伝子の発現が低下していることを示す。【０１１３】
小葉発生性乳癌患者および乳管癌患者の乳房組織試料、明細胞子宮癌患者および子宮頸部癌の子宮組織、および健常者の乳房組織と子宮組織試料におけるPHLDA1の発現を遺伝子発現データベースSciantis System Pro (Filgen社)のe-Northern機能を用いて解析した。【０１１４】
図１３に示すように、乳癌患者（Ａ）、子宮癌患者（Ｂ）において健常者と比較してPHLDA1の発現が有意に低下していた（＊、P＜0.001）。
この結果は、PHLDA1の発現低下が乳癌、子宮癌をはじめとする腫瘍の発生、増殖に関与していることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明により、PHLDAファミリータンパク質のPHドメインを有するポリペプチド、あるいは、そのポリペプチドをコードするDNAが挿入された発現ベクターを含有することを特徴とする医薬組成物を提供することができる。さらに、この医薬組成物を含有する腫瘍の治療用医薬剤を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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