(57)【要約】  本発明は、年齢層に関係なく患者から採取した細胞から調製可能であって、優れた骨組織の再生能を有しており骨組織の再生に有効な細胞製剤を提供することである。  歯槽骨から得られた未分化骨芽細胞、特に歯槽骨を酵素処理した後に培養することにより得られる未分化骨芽細胞は、優れた骨組織の再生能を有しており、骨組織再生用の細胞製剤として利用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯槽骨由来の未分化骨芽細胞を含有することを特徴とする、骨組織再生用の細胞製剤。
【請求項２】
歯槽骨由来の未分化骨芽細胞が、採取された歯槽骨組織を酵素処理した後に、PDGFを含む培地で培養することにより得られる細胞である、請求項１に記載の細胞製剤。
【請求項３】
歯槽骨由来の未分化骨芽細胞が、STMN2、NEBL、及びMGPが発現している細胞である、請求項１に記載の細胞製剤。
【請求項４】
歯槽骨由来の未分化骨芽細胞がスキャフォールドに担持された状態で含まれる、請求項１に記載の細胞製剤。
【請求項５】
歯槽骨の再生用である、請求項１に記載の細胞製剤。
【請求項６】
下記第１〜３工程を含む、骨組織再生能を有する細胞群を製造する方法：
採取された歯槽骨組織を酵素処理し、歯槽骨由来の細胞を得る第１工程、
前記第１工程で得られた歯槽骨由来の細胞を、未分化骨芽細胞が増殖可能な培地で培養する第２工程、及び
前記第２工程で増殖した細胞群を回収する第３工程。
【請求項７】
第２工程で用いられる未分化骨芽細胞が増殖可能な培地が、PDGFを含む培地である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
第３工程で回収される細胞群が、STMN2、NEBL、及びMGPが発現している細胞の集団である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項９】
歯槽骨から採取された未分化骨芽細胞を培養して得られる、骨組織再生能を有する細胞群。
【請求項１０】
歯槽骨から採取された未分化骨芽細胞の培養が、PDGFを含む培地で行われる、請求項９に記載の細胞群。
【請求項１１】
未分化骨芽細胞が、STMN2、NEBL、及びMGPが発現している細胞である、請求項９に記載の細胞群。
【請求項１２】
骨組織の損傷を伴う患者の該骨組織部位に、請求項１に記載の細胞製剤を投与する工程を含む、骨組織の損傷の治療方法。
【請求項１３】
歯槽骨由来の未分化骨芽細胞の、骨組織再生用の細胞製剤の製造のための使用。
【請求項１４】
歯槽骨由来の未分化骨芽細胞が、採取された歯槽骨組織を酵素処理した後に、PDGFを含む培地で培養することにより得られる細胞である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
歯槽骨由来の未分化骨芽細胞が、STMN2、NEBL、及びMGPが発現している細胞である、請求項１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨組織の再生能に優れた細胞製剤に関する。また、本発明は、優れた骨組織再生能を有する細胞群、及びその製造方法に関する。更に、本発明は、上記細胞製剤を使用した骨組織の損傷の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、歯科や外科の分野で、疾患、外科手術、物理的衝撃等により損傷した骨組織を修復又は再生させる技術が精力的に研究されている。従来、骨組織の損傷の治療には、骨組織の損傷箇所に対して、人工的固定化、自家骨又は骨補填剤の移植補填等が採用されている。しかしながら、これらの方法では、骨組織が正常な状態にまで回復できなかったり、回復するまでに長時間を要することがあるという問題点がある。【０００３】
例えば、歯科分野において、骨組織の損傷が関連する代表的な疾患として歯周病がある。歯周病は、歯を支える歯槽骨が喪失してしまう疾患で、40歳以上の中高年層の50％以上が罹患する生活習慣病である。歯周病は重度に進行すると歯が失われて噛む能力に障害が生じてしまう。これまでに、歯周病の治療法として、ゴアテックス膜や豚歯胚抽出分画から作製した補填剤で、失われた歯周組織を再生する技術が開発されている。しかしながら、これらの技術は、軽度の歯周病に対して有効であるものの、中〜重度の歯周病に対しては有効な治療効果が認められないのが現状である。【０００４】
そこで、近年、歯科や外科の分野で、骨組織を再生できる細胞製剤を用いて、損傷した骨組織を修復又は再生させる技術が注目を浴びている。例えば、歯槽骨の間充織骨髄由来の間充織細胞（BMSCs）を、骨組織の再生に利用する方法が提案されている（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、この手法では、中高年層から採取した細胞では、骨組織の再生に有効な細胞を得ることができず、自家移植による骨組織の再生療法は、適用範囲が患者の年齢によって制限されるという問題点がある。歯周病は60歳以上の中高年層において罹患率が高いことを鑑みれば、臨床的には、中高年層から採取した細胞からも骨組織の再生に有効な細胞を調製可能な技術の確立が重要であると考えられる。【０００５】
また、骨組織を再生させ得る細胞として、大腿骨由来の骨芽細胞が市販されている。しかしながら、大腿骨由来の骨芽細胞では、必ずしも、骨組織再生能の点で満足できるものではなく、より有効に、骨組織再生可能な細胞の開発が望まれている。【０００６】
このような従来技術を背景として、年齢層に関係なく患者から採取した細胞を用いて、骨組織の再生能が優れた細胞を調製でき、骨組織の再生に利用できる細胞製剤を開発することが望まれている。
【非特許文献１】Takehiro Mastubara et al, Alveolar Bone Marrow as a Cell Source for Regenerative Medicine: Differences Between Alveolar and Iliac Bone Marrow Stromal Cells, Journal of Bone and Minerarl Reseach, Vol. 20, No. 3, 2005, pages 399-409
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、上記従来技術の課題を解決することである。詳細には、本発明は、年齢層に関係なく患者から採取した細胞から調製可能であって、優れた骨組織の再生能を有しており骨組織の再生に有効な細胞製剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、歯槽骨から得られた未分化骨芽細胞、特に歯槽骨を酵素処理した後に培養することにより得られる未分化骨芽細胞は、格段優れた骨組織の再生能を有しており、骨組織再生用の細胞製剤に極めて有用であることを見出した。また、かかる細胞は、60歳以上の中高年層の歯槽骨からも調製可能であることを見出した。更に、かかる細胞は、とりわけ歯周病により損傷された歯槽骨の再生に有効であることも見出した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。【０００９】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  歯槽骨由来の未分化骨芽細胞を含有することを特徴とする、骨組織再生用の細胞製剤。
項２．  歯槽骨由来の未分化骨芽細胞が、採取された歯槽骨組織を酵素処理した後に、PDGFを含む培地で培養することにより得られる細胞である、項１に記載の細胞製剤。
項３．  歯槽骨由来の未分化骨芽細胞が、STMN2、NEBL、及びMGPが発現している細胞である、項１に記載の細胞製剤。
項４．  歯槽骨由来の未分化骨芽細胞がスキャフォールドに担持された状態で含まれる、項１に記載の細胞製剤。
項５．  歯槽骨の再生用である、項１に記載の細胞製剤。
項６．  下記第１〜３工程を含む、骨組織再生能を有する細胞群を製造する方法：
採取された歯槽骨組織を酵素処理し、歯槽骨由来の細胞を得る第１工程、
前記第１工程で得られた歯槽骨由来の細胞を、未分化骨芽細胞が増殖可能な培地で培養する第２工程、及び
前記第２工程で増殖した細胞群を回収する第３工程。
項７．  第２工程で用いられる未分化骨芽細胞が増殖可能な培地が、PDGFを含む培地である、項６に記載の製造方法。
項８．  第３工程で回収される細胞群が、STMN2、NEBL、及びMGPが発現している細胞の集団である、項６に記載の製造方法。
項９．  歯槽骨から採取された未分化骨芽細胞を培養して得られる、骨組織再生能を有する細胞群。
項１０．  歯槽骨から採取された未分化骨芽細胞の培養が、PDGFを含む培地で行われる、項９に記載の細胞群。
項１１．  未分化骨芽細胞が、STMN2、NEBL、及びMGPが発現している細胞である、項９に記載の細胞群。
項１２．  骨組織の損傷を伴う患者の該骨組織部位に、請求項１に記載の細胞製剤を投与する工程を含む、骨組織の損傷の治療方法。
項１３．  歯槽骨由来の未分化骨芽細胞の、骨組織再生用の細胞製剤の製造のための使用。
項１４．  歯槽骨由来の未分化骨芽細胞が、採取された歯槽骨組織を酵素処理した後に、PDGFを含む培地で培養することにより得られる細胞である、請求項１３に記載の使用。
項１５．  歯槽骨由来の未分化骨芽細胞が、STMN2、NEBL、及びMGPが発現している細胞である、項１３に記載の使用。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、世界で初めて、中高年層の患者から得られる細胞を用いて骨組織再生能を有する細胞を調製する技術に成功しており、従来、自家移植による骨組織の再生治療が不可能であった中高年層の患者に対しても、新たな自家移植による治療法を提供することができる。また、本発明の細胞製剤は、少量の歯槽骨組織から調製することができるので、患者に強いる負担が少なく、臨床上の有用性が極めて高い。【００１１】
本発明の細胞製剤は、様々な骨組織の損傷の治療に有効であるが、とりわけ歯周病により損傷した歯槽骨の再生に有効であり、歯周病治療用の医薬或いは歯槽骨の再生用医薬として特に好適である。また、本発明の細胞製剤は、歯周病の罹患率が高まる中高年層の歯槽骨からも調製可能な細胞を利用するため、あらゆる年齢層の歯周病患者に対して有効な治療方法を提供するという点でも利点がある。更に、本発明の細胞製剤は、骨に転移した癌組織の除去、或いは骨肉腫の治療後の再生医療にも有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
１．骨組織再生用の細胞製剤
本発明の細胞製剤は、骨組織を再生するために使用されるものであって、歯槽骨由来の未分化骨芽細胞を含有することを特徴とする。以下、本発明の細胞製剤について、詳細に説明する。【００１３】
本発明において、未分化骨芽細胞とは、骨芽細胞に分化する前の前骨芽細胞であって、増殖能を有しており、骨芽細胞に分化する能力を有する細胞を意味する。ここで、「増殖能を有する」とは、後述する未分化骨芽細胞が増殖可能な培地において、細胞分裂して増殖できることを示す。また、「骨芽細胞に分化する能力を有する」とは、BMP2等の骨芽細胞誘導因子の存在下で、或いはスキャフォールドに担持された状態で、骨芽細胞に分化する性質を有していることを示す。骨芽細胞に分化した場合、例えば、アルカリホスファターゼ活性の増大、アリザリンレッド染色による細胞の染色強度の上昇、及び骨芽細胞の分化マーカー（RUNX2、OSTERIX、OSTEOCALCIN(OCN)、BONE SIALOPROTEIN(BSP)、OSTEOPONTIN（OPN））の発現量の増大等が認められるので、骨芽細胞に分化したか否かはこれらを指標として判断される。【００１４】
本発明の細胞製剤に使用される細胞は、歯槽骨から得られる未分化骨芽細胞である。歯槽骨は、通常の外科的手法によって採取することができるが、簡便には、抜歯時に除去された歯槽骨を使用することもできる。【００１５】
本発明で使用される未分化骨芽細胞は、歯槽骨を酵素処理して、歯槽骨由来の細胞を得た後に、未分化骨芽細胞が増殖可能な培地で培養することによって得ることができる。【００１６】
ここで、歯槽骨を酵素処理して歯槽骨由来の細胞を得るには、リン酸緩衝液等の適切な緩衝液中で歯槽骨に対して酵素を作用させればよい。歯槽骨から歯槽骨由来の細胞を得るために使用される酵素としては、生体組織片から細胞を分離する際に一般的に使用される酵素を使用すればよく、具体的には、コラーゲナーゼ、ペプシン、トリプシン等のプロテアーゼが例示される。これらの酵素の中で、歯槽骨から効率的に細胞を回収するとの観点から、コラーゲナーゼが好適である。【００１７】
また、酵素処理効率を高めるために、酵素処理に先立って、採取された歯槽骨を5〜10mm片程度に細切化しておいてもよい。【００１８】
歯槽骨に対して酵素を作用させる条件としては、歯槽骨由来の細胞を遊離させ得る限り特に制限されないが、一例として以下の条件が挙げられる。
歯槽骨濃度：通常3つの歯槽骨片に対して1ｍｌ、好ましくは１つの歯槽骨片に対して1ｍｌ程度となるように歯槽骨の濃度を設定する。
酵素濃度：例えば、コラーゲナーゼ（＞1.5 U/mg）を使用する場合であれば、通常１〜４mg/ml、好ましくは２mg/ml程度となるように酵素濃度を設定する。なお、本明細書において、コラーゲナーゼ１Ｕとは、25℃で1分間に、4-phenyl-azobenxyl-oxycarbonyl-L-prolyl-L-leucyl-L-glycyl-L-prolyl-D-arginineから、１μモルの4-phenyl-azobenxyl-oxycarbonyl-L-prolyl-L-leucineを遊離できる酵素力価を表す。
処理温度：37℃程度に設定する。
処理時間：通常１０〜４０分間、好ましくは２０分間程度に設定する。【００１９】
歯槽骨に対する酵素処理は、歯槽骨由来の細胞の回収率を高めるために、必要に応じて複数回繰り返して行ってもよい。【００２０】
斯くして酵素処理することにより、歯槽骨から歯槽骨由来の細胞が遊離するので、酵素処理後に、歯槽骨由来の細胞を遠心分離等の公知の手段によって、該細胞を取得することができる。【００２１】
斯くして得られる歯槽骨由来の細胞を、未分化骨芽細胞が増殖可能な培地で培養することによって、歯槽骨由来の未分化骨芽細胞群を得ることができる。【００２２】
未分化骨芽細胞が増殖可能な培地としては、動物細胞を増殖するに際して必須成分である、無機塩類、アミノ酸、ビタミン類等を含む基礎培地に、未分化骨芽細胞が増殖に求められる増殖因子や添加成分が添加されたものが挙げられる。このような基礎培地としては、例えばイーグル基本培地（MEM）、αイーグル基本培地（αMEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、ハムＦ−１２培地等が挙げられる。【００２３】
未分化骨芽細胞が増殖可能な培地の好適な例として、増殖因子として、PDGF（血小板由来増殖因子）が添加された培地が挙げられる。PDGFが存在することによって、歯槽骨由来の細胞から骨組織再生能が優れた未分化骨芽細胞を効率的に増殖させることが可能になる。培地に添加されるPDGFは、サブユニットの組合せにより、PDGFAA、PDGFAB、PDGFBB等に別けられるが、本発明ではいずれを使用してもよい。また、PDGFの由来についても特に制限されず、動物組織由来のもの、遺伝子組換技術により作製したもの等のいずれであってもよい。培地に添加されるPDGFの濃度としては、通常１〜100ng/ml、好ましくは10〜30ng/mlが挙げられる。【００２４】
また、未分化骨芽細胞が増殖可能な培地として、上記PDGF以外に、モノエタノールアミンを含んでいることが望ましい。モノエタノールアミンを培地に添加する場合、培地中のモノエタノールアミンの濃度としては、通常0.1〜100μg/ml、好ましくは6μg/mlが挙げられる。【００２５】
更に、上記培地には、インスリン、トランスフェリン、及びbFGF（塩基性繊維芽細胞成長因子）の内、1種又は2種以上が添加されていてもよい。インスリンを培地に添加する場合、培地中のインスリンの濃度としては、通常1〜100μg/ml、好ましくは10μg/mlが挙げられる。トランスフェリンを培地に添加する場合、培地中のトランスフェリンの濃度としては、通常1〜100μg/ml、好ましくは10μg/mlが挙げられる。bFGFを培地に添加する場合、培地中のbFGFの濃度としては、通常1〜100ng/ml、好ましくは10ng/mlが挙げられる。【００２６】
また、未分化骨芽細胞が増殖可能な培地には、ストレプトマイシン、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を含有していてもよい。【００２７】
未分化骨芽細胞が増殖可能な培地の好適な具体例として、MF培地（東洋紡社製）が例示される。【００２８】
歯槽骨由来の未分化骨芽細胞を得るには、未分化骨芽細胞が増殖可能な培地に歯槽骨由来の細胞を添加して、37℃、5％CO2条件下で、通常１〜７日間、好ましくは４日間行えばよい。【００２９】
斯くして培養することにより、増殖した未分化骨芽細胞は培養容器の基底に付着した状態で存在するので、培養容器の基底に付着した細胞を回収することによって、本発明の細胞製剤に使用される未分化骨芽細胞を得ることができる。培養容器の基底に付着した細胞を回収する方法は、公知の方法に従えばよく、例えば培養容器の基底に付着した細胞に対して0.25％トリプシン及び1mMEDTA（エチレンジアミン四酢酸）を作用させればよい。【００３０】
本発明で使用される歯槽骨由来の未分化骨芽細胞は、従来公知の骨芽細胞に比して、骨組織再生能が格段に優れている。また、該未分化骨芽細胞は、継代培養が長期間（例えば３０ Population Doubling程度まで）可能であるという点でも特筆すべき特徴がある。更に、該未分化骨芽細胞は、in vitroで、BMP-2（bone morphogenetic protein-2）の存在下で骨細胞に分化誘導されるという特徴も備えている。なお、該未分化骨芽細胞を骨細胞に分化させるには、具体的には、BMP-2デキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロリン酸を含む培地で培養すればよい。更に、該未分化骨芽細胞は、BMP-2の存在下で分化誘導することにより、BMP-2を分泌するという特徴も備えている。このような特徴は、歯槽骨由来の未分化骨芽細胞が、従来公知の骨芽細胞とは異なるものであることを裏付ける1つの証左である。【００３１】
また、本発明で使用される歯槽骨由来の未分化骨芽細胞は、MGP(matrix gla protein  ：  NM_000900（National center for biotechnology（NCBI））)、STMN2（stathmin-like 2 ：NM_007029（NCBI））、及びNEBL(nebulette：NM_006393（NCBI）)を発現しているという特徴もある。これらの遺伝子は、大腿骨由来の骨芽細胞では殆ど発現していない或いは発現量が少なく、本発明で使用される歯槽骨由来の未分化骨芽細胞において高発現しており、歯槽骨由来の未分化骨芽細胞に特有の新規なマーカーとして使用できる。より具体的には、β-Actinの発現量を100とした相対値で、MGPが70以上、NEBLが50以上、及びSTMN2が50以上発現しているものが、本発明で使用される歯槽骨由来の未分化骨芽細胞として特定される。これらの遺伝子の発現量は、遺伝子チップ解析、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等の従来公知の方法で測定される。これらの遺伝子の発現量の測定方法としては、遺伝子チップ解析及びリアルタイムＰＣＲ法が好適である。遺伝子チップ解析に使用される遺伝子チップは、市販のもの（例えば、HT Human Genome U133 Array Plate Set(Gene Chip; Affymetrix，CA，U.S.A.)）を使用してもよく、また公知の方法（Lipshutz, R. J. et al., (1999) Nature genet. 21, Suppliment, 20-24）に従って作製したものを使用してもよい。【００３２】
本発明の細胞製剤は、上記歯槽骨由来の未分化骨芽細胞と共に、必要に応じて、薬学的に許容される希釈用担体を含んでいてもよい。ここで、薬学的に許容される希釈用担体としては、例えば、生理食塩水、緩衝液等が例示される。更に、本発明の細胞製剤は、必要に応じて、薬理活性成分が含まれていてもよい。【００３３】
また、本発明の細胞製剤は、上記歯槽骨由来の未分化骨芽細胞がスキャフォールド（足場）に担持されている状態で含まれていることが望ましい。このようにスキャフォールドに歯槽骨由来の未分化骨芽細胞を担持させておくことによって、歯槽骨由来の未分化骨芽細胞の骨組織の損傷部位での生着率を高めて、骨組織再生を一層促進することが可能になる。【００３４】
本発明の細胞製剤において使用可能なスキャフォールドとしては、薬学的に許容される限り、特に制限されないが、例えば、ゲル状体又は多孔体で、生体分解性（biodgradable）又は生体吸収性（bioresorbable）の材料が挙げられる。使用可能なスキャフォールドとして、好ましくはフィブリンゲル（フィブリン糊）、ヒドロシキアパタイト、PGLA（poly DL-lactic-co-glycolic acid)−コラーゲンスポンジ、更に好ましくはフィブリンゲルが例示される。スキャフォールドは、１種単独で使用してもよく、また２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。【００３５】
スキャフォールドの形態については特に制限されず、本発明の細胞製剤の適用対象となる骨組織の損傷部位に応じて適宜設計すればよい。【００３６】
本発明の細胞製剤において、スキャフォールドに上記歯槽骨由来の未分化骨芽細胞を担持させる場合、上記歯槽骨由来の未分化骨芽細胞の担持量については、スキャフォールドの種類等に応じて適宜設定すればよいが、一例として、スキャフォールド100mg当たり、上記歯槽骨由来の未分化骨芽細胞が通常3×106〜5×106cells、好ましくは4×106cells程度となる担持量が例示される。【００３７】
スキャフォールドに細胞を担持させる手法は公知であり、従来公知の手法で、スキャフォールドに上記歯槽骨由来の未分化骨芽細胞を担持させることができる。【００３８】
本発明の細胞製剤は、優れた骨組織再生能を有しており、骨組織の損傷を伴う疾患において、骨組織を再生して正常な状態に回復させるために使用することができる。本発明の細胞製剤は、歯周病によって損傷した歯槽骨、骨肉腫により損傷した骨、骨転移した癌により損傷した骨、骨折等のあらゆる骨組織の損傷に対して適用することができるが、格段に優れた治療（再生）効果を奏させるとの観点から、歯周病によって損傷した歯槽骨が好適な適用対象である。【００３９】
本発明の細胞製剤は、骨組織の損傷部位に投与（移植）することによって使用される。骨組織の損傷部位に、本発明の細胞製剤を投与（移植）する方法としては、対象となる骨組織の種類や損傷の程度等に応じて適宜設定すればよい。【００４０】
本発明の細胞製剤を用いた骨組織の再生において、本発明の細胞製剤の投与量については、疾患の症状の程度、患者の性別や年齢等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、骨組織の損傷部位に対して、上記歯槽骨由来の未分化骨芽細胞の適用量が2×106〜4×106cells、好ましくは3×106cells程度となるように設定すればよい。【００４１】
なお、本発明の細胞製剤は、自家移植のための細胞製剤として調製されたものであってもよく、また他家移植のための細胞製剤として調製されたものであってもよい。拒絶反応を抑制するとの観点から、本発明の細胞製剤は、自家移植用として調製されていることが望ましい。【００４２】
２．骨組織再生能を有する細胞群、及びその製造方法
本発明は、更に、骨組織再生能を有する細胞群、及びその製造方法を提供する。具体的には、本発明は、歯槽骨から採取された未分化骨芽細胞を培養して得られる、骨組織再生能を有する細胞群を提供する。また、本発明は、採取された歯槽骨組織を酵素処理し、歯槽骨由来の未分化細胞を得る第１工程、前記第１工程で得られた歯槽骨由来の未分化細胞を、未分化骨芽細胞が増殖可能な培地で培養する第２工程、及び前記第２工程で増殖した細胞群（即ち歯槽骨由来の未分化骨芽細胞群）を回収する第３工程を含む、骨組織再生能を有する細胞群を製造する方法を提供する。該細胞群、及びその製造方法については、上記「１．骨組織再生用の細胞製剤」の欄に記載の通りである。【００４３】
３．骨組織の損傷の治療方法
また、本発明は、骨組織の損傷を伴う患者の該骨組織部位に、上記骨組織再生用の細胞製剤を投与する工程を含む、骨組織の損傷の治療方法を提供する。当該治療方法において、治療対象となる骨組織の損傷、使用される細胞製剤、細胞製剤の投与量等については、上記「１．骨組織再生用の細胞製剤」の欄に記載の通りである。
【実施例】
【００４４】
以下に、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【００４５】
実施例１：歯槽骨由来の未分化骨芽細胞の調製
倫理委員会の規約に基づいてインフォームドコンセントを得られた４名の患者（66歳、53歳、52歳、27歳の4名の患者）から抜歯時に除去された歯槽骨を用いて、歯槽骨由来の未分化骨芽細胞の調製を行った。得られた歯槽骨を、2mg/mlの細菌由来のコラーゲナーゼ（＞1.5 U/mg；Collagenase P, Roche社製）を含むPBS（Phosphate bufferd saline, pH 7.2）４ml中に入れて、３７℃で20分間酵素反応を行った。反応後、酵素液と等量のウシ血清を加えた後に遠心分離にて遊離した細胞を回収し、残存する歯槽骨に対しては、再度、上記と同条件で酵素処理を行った。この操作を繰り返して、最終的に８回の酵素処理を行った。それぞれの酵素処理後に回収された８個の細胞分画の内、１回目と２回目の酵素処理後に回収された細胞分画は廃棄し、残りの６つの細胞分画をそれぞれMFスタート培地（Toyobo, Tokyo, Japan）４mlを含む35mm培養皿に入れ、5%CO2、37℃の条件下で培養を行った。培養皿中で細胞が80％コンフルエントに達した時に、0.25％トリプシン／1mM EDTAを含むPBSで細胞を遊離させ、ヒト歯槽骨由来の未分化骨芽細胞（HAOB）を回収した。なお、以降に示す試験は、５回目の酵素処理後に回収された細胞分画から得られたHAOBを使用した。また、以降、66歳の患者から得られた歯槽骨由来のHAOBをHAOB1；53歳の患者から得られた歯槽骨由来のHAOBをHAOB3；52歳の患者から得られた歯槽骨由来のHAOBをHAOB4；及び27歳の患者性から得られた歯槽骨由来のHAOBをHAOB5とそれぞれ表記する。【００４６】
実施例２：歯槽骨由来の未分化骨芽細胞の増殖能の評価
実施例１で得られたHAOBを、MF培地（Toyobo, Tokyo, Japan）に、3×104cells/mlとなるように播種し、3日間おきに培地を交換することにより、70日間継代培養した。その間、HAOBのpopulation doubling(PD)を測定した。【００４７】
また、35PDのHAOB3をColcemid (Karyo Max; Gibco BRL; 100 ng/ml for 6 h)処理を行うことにより間期に誘導した。斯くして間期に誘導されたHAOB3（約50cells）に対して、Gバンド法にてHAOB3の染色体構造を解析した。更に、斯くして間期に誘導されたHAOB3に対して、SKY（Spectral Karyotyping）法にてHAOB3の染色体構造を解析した。【００４８】
結果を図１に示す。この結果から、中高年層の歯槽骨から得られたHAOB（HAOB1〜3）は、若年者の歯槽骨から得られたHAOB（HAOB4）と同等の増殖速度を示すことが確認された。また、間期のHAOB3の染色体構造を解析した結果から、正常２倍体像が確認されたことから、HAOBは正常且つ安定な増殖能を備えていることが分かった。【００４９】
実施例３：歯槽骨由来の未分化骨芽細胞の増殖特性の評価
実施例１で得られたHAOB3を2×104 cells/wellで96穴プレートに播種し、血清非添加のDulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)で24 時間培養した後に、10ng/mlのbFGF、PDGFAA、PDGFAB又はPDGFBBを含むDMEM培地で96時間培養し、細胞増殖活性を評価した。また、コントロールとして、同様に、DMEM培地で培養後のHAOB3を、血清非添加のDMEM、又は20容量％FCSを含むDMEM、MF培地を用いて96時間培養して、細胞増殖活性を評価した。なお、細胞増殖活性は、Celltiter-Glo luminesescent cell viability assay (promega)を用い、業者指定の方法に従って測定した。【００５０】
結果を図２に示す。図２の縦軸には、細胞増殖活性として、血清非添加のDMEMを用いて培養した場合の細胞数を１として算出した相対値を示す。この結果から、HAOBの増殖は、PDGFAA、PDGFAB又はPDGFBBを添加した場合に格段に向上しており、これらの増殖因子の存在下で培養することがHAOBの増殖に有効であることが明らかとなった。【００５１】
実施例４：歯槽骨由来の未分化骨芽細胞の分化能の評価（In vitro）−１
培養皿に、実施例１で得られたHAOB3を3×104 cells/ml/cm2の濃度で２ml播種した後に、100nMデキサメタゾン、50μg/mlアルコルビン酸、10mM β−グリセロリン酸、及び100ng/ml rhBMP-2（Recombinant human bone morphogenetic protein-2）を含むMF培地（以下、rhBMP-2添加培地と表記する）１ml/cm2に交換し、培地を3日間おきに交換しながら9日間培養し、HAOB3の分化特性を評価した。また、比較として、rhBMP-2添加培地の代わりに、rhBMP-2を含まないこと以外は上記rhBMP-2添加培地と同組成の培地を用いて上記と同条件で培養を行い、HAOB3の分化特性を評価した。【００５２】
更に、比較のために、ヒト表皮由来繊維芽細胞（HFF）（タカラバイオ株式会社）を上記と同条件で、hBMP-2添加培地又はMF培地で培養を行い、HFFの分化特性を評価した。【００５３】
なお、本試験において、分化特性は、アルカリホスファターゼ活性の測定、アリザリンレッド染色、骨芽細胞の分化マーカー（RUNX2、OSTERIX、OSTEOCALCIN(OCN)、BONE SIALOPROTEIN(BSP)）の発現レベルの測定、及びOSTEOPONTIN(OPN)とOCNに対する抗体で免疫染色を行うことにより、評価した。これの具体的な測定条件は次の通りである。【００５４】
＜アルカリホスファターゼ活性の測定＞
細胞を４％パラホルムアルデヒドで20分間固定した後に、0.1 mg/ml naphthol AS-MX phosphate(Sigma)、0.5% N-N dimethyl formamide (Sigma)、2 mM MgCl2、0.6 mg/ml Fast Blue BB salt(Sigma)を含む0.1M TRIS-HCl(pH 8.5)溶液で室温にて反応させることにより、アルカリホスファターゼ活性を測定した。【００５５】
＜アリザリンレッド染色＞
細胞を４％パラホルムアルデヒドで20分間固定した後に、2% alizarin red S (pH 6.4)(Sigma) で染色し、検出した。【００５６】
＜骨芽細胞の分化マーカー発現レベルの測定＞
細胞から全RNAを抽出し、PCR法によりRUNX2、OSTERIX、OCN、及びBSPの発現レベルを測定した。細胞から全RNAの抽出は、Isogen(Nippon Gene, Tokyo, Japan)を用いて業者指定の方法に従って実施した。cDNAは、１μg）の全RNAとreverse transcriptase（M-MLV reverse transcriptase, Invitrogen Corporation ）を用いて作製した。また、mRNAの発現レベルは、Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)を用いてAB 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems)にて解析した。使用したプライマーの配列は以下の通りである。
OSTERIX (Forward primer : CTGAAGAATGGGTGGGGAAGG（配列番号1）, reverse primer : GGCCTCTGTCCTCCTAGCTC（配列番号2）)
RUNX2 (Forward primer : GAAACTCAACAGATTAACTATCGTTTGC（配列番号3）, Reverse primer : GAATTTATCACAGATGGTCCCTAATGG（配列番号4）)
OSTEOCALCIN (Forward primer : CACACTCCTCGCCCTATTGG（配列番号5）, Reverse primer : TGCACCTTTGCTGGACTCTG（配列番号6）)
BONE SIALOPROTEIN (Forward primer : CGAATACACGGGCGTCAATG（配列番号7）, Reverse primer : GTAGCTGTACTCATCTTCATAGGC（配列番号8）)
BMP2 (Forward primer : CCAGAAACGAGTGGGAAAAC（配列番号9）, Reverse primer : AATTCGGTGATGGAAACTGC（配列番号10）)
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) (Forward primer :AAGAGCACAAGAGGAAGAGAGAGAC（配列番号11）、Reverse primer : TTATTGATGGTACATGACAAGGTG（配列番号12）)。【００５７】
＜OPNとOCNに対する抗体を用いた免疫染色＞
細胞を４％パラフォルムアルデヒドで固定後、OPNに対する抗体及びOCNに対する抗体で免疫染色を行い、OPNとOCNの発現量を測定した。【００５８】
結果を図３−１と図３−２に示す。図３−１のA)にアリザリンレッド染色結果（左）及びアルカリホスファターゼ活性の測定結果（右）を示す。図３−１のA)の左図から明らかなように、HAOB3はhBMP-2添加培地で培養することにより、アリザリンレッドによる染色が顕著に認められたことから、高い石灰化能力が発現していることが分かった。また、図３−１のA)の右図に示されるように、HAOB3はhBMP-2添加培地で培養することによって、骨形成の指標となるアルカリホスファターゼ活性が著しく向上していることも確認された。一方、HFFでは、hBMP-2添加培地で培養しても、アリザリンレッドにより染色されず、アルカリホスファターゼ活性も認められなかった。【００５９】
更に、図３−１のB)にRUNX2、OSTERIX、OCN及びBSPの発現レベルを測定した結果を示す。図３−１のB)では、各分化マーカーの発現量について、β-Actinの発現量を100とした相対値を示している。この結果からも、HAOB3はhBMP-2添加培地で培養することによって、RUNX2、OSTERIX、OCN及びBSPの発現レベルが上昇しており、骨形成能が発現されていることが確認された。一方、HFFでは、hBMP-2添加培地及びMF培地のいずれで培養しても、上記分化マーカーの発現は認められなかった。【００６０】
また、図３−２に、OPNとOCNに対する抗体を用いて免疫染色した結果を示す。図３−２から分かるように、rhBMP-2で刺激していないHAOB3はわずかながらOPN及びOCNを発現していたが、rhBMP-2で刺激したHAOB3ではOPN及びOCN抗体に強陽性の反応を示した。この結果からも、HAOBは、分化誘導前は未分化骨芽細胞の性質を示し、rhBMP-2刺激によりOPN陽性及びOCN陽性の骨芽細胞へと分化することが確認された。【００６１】
実施例５：歯槽骨由来の未分化骨芽細胞の分化能の評価（In vitro）−２
実施例１で得られたHAOB3を、MF培地（Toyobo, Tokyo, Japan）に、3×104cells/mlとなるように播種し、3日間おきに培地を交換しながら、29PDまで培養を行った。6PD、11PD、16PD、21PD、24PD及び29PDのHAOB3について、上記実施例４と同条件で、rhBMP-2添加培地で培養した後に、アリザリンレッド染色及び骨芽細胞の分化マーカー（RUNX2、OSTERIX、OCN、BSP）の発現レベルの測定を行った。【００６２】
結果を図４に示す。図４のA)にアリザリンレッド染色結果、B)にOCNの発現レベルを測定した結果、並びにC)にRUNX2、OSTERIX及びBSPの発現レベルを測定した結果を示す。図４のB)及びC)では、各分化マーカーの発現量について、β-Actinの発現量を100とした相対値を示している。図４から明らかなように、16PDのHAOB3であっても、骨形成能を十分に発現可能であり、骨芽細胞分化能を保持していた。【００６３】
実施例６：歯槽骨由来の未分化骨芽細胞の骨細胞への分化能の評価（In vitro）−３
培養皿に、実施例１で得られたHAOB3を3×104 cells/ml/cm2の濃度で播種した後に、100nMデキサメタゾン、50μg/mlアルコルビン酸、10mM β−グリセロリン酸、及び50, 100, 200, 500又は1000 ng/mlのrhBMP-2を含むMF培地に交換し、培地を3日間おきに交換しながら9日間培養し、HAOB3の分化特性を評価した。分化特性は、上記実施例４と同様の方法で、アルカリホスファターゼ活性の測定、アリザリンレッド染色、及び骨芽細胞の分化マーカー（RUNX2、OSTERIX、OCN、BSP）の発現レベルの測定を行うことにより、評価した。【００６４】
また、比較として、大腿骨由来骨芽細胞（NHOst）（Lonza Walkersville Inc 、MD、USA）を用いて、上記と同条件で培養を行い、同様に分化特性を評価した。【００６５】
結果を図５に示す。図５のA)にアリザリンレッド染色結果（左）及びアルカリホスファターゼ活性の測定結果（右）を示す。この結果から、HAOB3は、NHOstに比べて、アルカリフォスファターゼ活性に関しては両者共に同程度の活性が観察されたが、石灰化能力に関しては低濃度のrhBMP-2でアリザリンレッド染色陽性の石灰化物が形成されており、骨形成能を強く発現できることが確認された。【００６６】
また、図５のB)に100ng/mlのrhBMP-2で分化誘導したHAOB3とNHOstのRUNX2、OSTERIX及びBSPの発現レベルを測定した結果を示す。図５のB)では、各分化マーカーの発現量について、β-Actinの発現量を100とした相対値を示している。この結果からも、100ng/mlのrhBMP-2では、HAOB3は、NHOstに比べて強く分化誘導されており、骨形成能を強く発現できることが確認された。【００６７】
実施例７：歯槽骨由来の未分化骨芽細胞の分化能の評価（In vitro）−４
100nMデキサメタゾン、50μg/mlアルコルビン酸、10mM β−グリセロリン酸、及び100ng/ml rhBMP-2を含むMF培地に、HAOB3又はNHOstを3×104 cells/ml/cm2となる濃度で混合し、その0.5mlをカバーグラス上に添加した。これを5%CO2、37℃の条件下で72時間培養を行った。次いで、カバーグラス上から培養上清を取り除き、50% acetone/methanol溶液で2分間固定した後に、1mg/ml ウシアルブミンを含むPBSでブロッキングを行った。斯くしてブロッキングを行ったカバーグラス上の細胞に、抗OCNモノクローナル抗体(clone GluOC4-5、Takara、Tokyo、Japan)を作用させた後に、抗mouse alexa 488二次抗体(Invitrogen Corporation)と反応させることによりOCNを染色した。また、ブロッキングを行ったカバーグラス上の細胞に、抗OSTEOPONTIN(OPN)ポリクローナル抗体（O-17、IBL、Gunnma 、Japan）を作用させた後に、抗rabbit alexa 555 二次抗体 (Invitrogen Corporation)と反応させることによりOPNを染色した。更に、ブロッキングを行ったカバーグラス上の細胞に対して、DAPI(4’,6-diamino-2-phenylindole)で核染色を行った。【００６８】
斯くして染色された細胞を403-, 488- 及び543nmのレーザー光線を用いた共焦点レーザー顕微鏡（LSM510; Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany ）にて観察した。結果を図６に示す。図６中、ａには分化誘導したHAOB3のOPNを染色した結果、ｂには分化誘導したHAOB3のOCNを染色した結果、ｃにはａとｂを重ね合わせた像、ｄには分化誘導したNHOstのOPNを染色した結果、ｅには分化誘導したNHOstのOCNを染色した結果、ｆにはｄとｅを重ね合わせた像を示す。この結果からも、分化誘導されたHAOB3は、全て抗OPN抗体と抗OCN抗体に陽性反応を示しており、OPNとOCNの発現の程度も、NHOst と比較して顕著に高いものであった。【００６９】
実施例８：歯槽骨由来の未分化骨芽細胞の分化特性の評価
培養皿に、実施例１で得られたHAOB3又はNHOstを3×104 cells/ml/cm2の濃度で播種した後に、100nMデキサメタゾン、50μg/mlアルコルビン酸、10mM β−グリセロリン酸、及び100ng/ml rhBMP-2を含むMF培地1ml/cm2に交換し、培地を3日間おきに交換しながら9日間培養した。培養9日後の細胞について、BMP-2の発現量をReal-Time PCR法により測定した。なお、細胞からのRNA採取およびcDNA合成は、上記実施例４と同じ手法で行った。RT−PCRはTakara EX taq (Takara 、Tokyo、Japan) を用い、業者指定の方法に従って行った。【００７０】
結果を図７に示す。図７に示すように、HAOB3から分化誘導された細胞は、NHOstから分化誘導された細胞に比して200倍以上ものBMP-2を発現していた。この結果からも、HAOB3は、NHOstとは明らかに異なる特徴を有していることが支持された。【００７１】
実施例９：歯槽骨由来の未分化骨芽細胞に特異的な遺伝子の解析
歯槽骨由来の未分化骨芽細胞に特異的な遺伝子の発現を解析するために以下の試験を行った。【００７２】
実施例１で得られたHAOB1〜4を、MF培地（Toyobo, Tokyo, Japan）に、3×104cells/mlとなるように播種し、3日間おきに培地を交換しながら、35PDまで培養を行った。【００７３】
次いで、6PD、11PD、16PD、21PD、24PD、29PD及び35PDのHAOBから全RNAを抽出し、6PD及び35PDのHAOBにおける発現遺伝子の強度を分析した。発現遺伝子の強度は、約3，3000個の遺伝子の完全長のプローブを含むHT Human Genome U133 Array Plate Set(Gene Chip; Affymetrix，CA，U.S.A.)を用い、Affymetrix社のマニュアル[http://www.affymetrix.com/support/technical/index.affx]に従い行った。データ解析はGene Chip Operation System(Affymetrix CA，U.S.A.)、及びGeneSpringGX software (Silicon Genetics)を用いて行った。チップ間の染色性の変化を標準化するため，全ての遺伝子のチップ上における測定値の中央値の平均を採用した。また、特異値分解(SVD)を用いた主成分分析(PCA法)にてロウデータおよび対数変換したデータにおける固有ベクトルを作製した。（参考文献：Kami D， Shiojima I， Makino H， Matsumoto K， Takahashi Y， Ishii R， Naito AT， Toyoda M， Saito H， Watanabe M， Komuro I， Umezawa A: Gremlin enhances the determined path to cardiomyogenesis， PLoS ONE， 3:e2407.2008）【００７４】
また、比較のために、ヒト表皮由来線維芽細胞（HFF）（タカラバイオ株式会社）、ヒト骨肉腫細胞(MG63)（理研バイオリソースセンター）、及び大腿骨由来骨芽細胞（NHOst）（Lonza Walkersville Inc 、MD、USA）についても、同様に発現遺伝子の強度を分析した。【００７５】
PCA解析の結果、PDの増加に伴い、発現が低下する遺伝子群の存在が判明した。これらの遺伝子中から特にHAOBにおいて高発現している遺伝子をスクリーニングし、リアルタイムPCRにより遺伝子の発現量の測定を行った。その結果を図８のA)に示す。図８のA)では、各遺伝子の発現量について、β-Actinの発現量を100とした相対値を示している。図８のA)に示されるように、STMN2、NEBL、及びMGPがPD６のHAOBでは高発現しているが、PD35のHAOB3では殆ど発現していないことを確認した。HAOB3のPD6において、これらの遺伝子発現と骨マーカー遺伝子であるRUNX2、OSTERIX、OSTEOCALCIN及びBSPの遺伝子発現量をリアルタイムPCRにより測定した。その結果を図８のB)に示す。図８のB)では、各遺伝子の発現量について、β-Actinの発現量を100とした相対値を示している。図８のB)に示されるように、STMN2、NEBL及びMGPの発現量が明らかに高い値であった。また、図８のC)に示すように、HAOB3のPD6とPD35における遺伝子変化率を解析した結果、OCNが最も高い変化率を示した。しかしながら、OCNはPD６での発現量が少ないため、HAOBの識別マーカーとしては適していないと考えられる。【００７６】
次に、ヒト表皮由来繊維芽細胞（HFF）、ヒト骨肉腫細胞(MG63)、大腿骨由来骨芽細胞（NHOst）及びPD6のHAOB1〜4におけるSTMN2、NEBL及びMGPの発現量をリアルタイムPCRで測定した。なお、リアルタイムPCRで使用したプライマーの配列は以下の通りである。
STMN2 （Forward primer :acgtctgcaggaaaaggaga（配列番号13）、Reverse primer : acgatgtagtcgccgtctct（配列番号14）)
NEBL（Forward primer : cattcccaaggctatggcta（配列番号15）、Reverse primer : acgatgtagtcgccgtctct（配列番号16）)
MGP（Forward primer :cgcttcctgaagtagcgatt（配列番号17）、Reverse primer : ccctcagcagagatggagag（配列番号18）)【００７７】
得られた結果を図９に示す。図９では、各遺伝子の発現量について、β-Actinの発現量を100とした相対値を示している。図９から分かるように、HAOBにおいて明らかに高いSTMN2、NEBL及びMGPの発現が観察された。【００７８】
以上の結果より、STMN2、NEBL及びMGPの発現がHAOBの特異的マーカーになり得ることが確認された。【００７９】
実施例１０：歯槽骨由来の未分化骨芽細胞の生体内骨形成能の評価（In vivo）
HAOBの生体内での分化能力について、半田らの方法(K.Handa et al., 2002, Cementum matrix formation in vivo by cultured dental follicle cells. Bone. 31(5):606-611.)に従い、CB-17 scid/scid (SCID) mice (Nihoncrea, Tokyo, Japan)への移植実験にて判定した。【００８０】
まず、1mlのMF培地に1.5×106cellsのHAOB3と40mgのハイドロキシアパタイトパウダー（Osferion 、Olympus、Tokyo 、Japan）を混合させ、12時間培養した後に、更にフィブリン糊（マウスフィブリノーゲン15μlとトロンビンの混合物15μl；Sigma）30μlと混合し、5週齢のSCIDマウスの背中皮下に移植した。移植後4週間後に移植片（以下、HAOB3投与移植片と表記する）を取り出した。取り出した移植片の半分を骨マーカー遺伝子（OCN、BSP、GAPDH）発現の解析に供し、残りの移植片を組織化学的解析に供した。【００８１】
また、比較のために、HAOB3の代わりにNHOstを用いて、上記と同条件でNHOstをSCIDマウスの背中皮下に移植した後、移植後4週間後に移植片（以下、NHOst投与移植片と表記する）を取り出し、同様の解析を行った。【００８２】
更に比較のために、細胞を播種せずに、ハイドロキシアパタイトパウダーとフィブリン糊の混合物を、上記と同条件でSCIDマウスの背中皮下に移植した後、移植後4週間後に移植片（以下、細胞非投与移植片と表記する）を取り出し同様に試験を実施した。【００８３】
なお、移植片のマーカー遺伝子発現の解析及び移植片の組織化学的解析は、以下の方法に従って実施した。【００８４】
＜移植片のマーカー遺伝子発現の解析＞
移植片からのRNA採取およびcDNA合成は、上記実施例４と同じ手法で行った。RT−PCRはTakara EX taq (Takara 、Tokyo、Japan) を用い、業者指定の方法に従って、OCN、BSP及びGAPDHのmRNA発現量を測定した。【００８５】
＜移植片の組織化学的解析＞
移植片を4％パラホルムアルデヒドで24時間固定した後に、10％ギ酸にて3日間脱灰した後に、パラフィンに包埋し4μmの切片を作製した。【００８６】
パラフィンに包埋された切片の形態をヘマトキシリン・エオジン染色にて観察した。【００８７】
また、パラフィンに包埋された切片に対して、ヒト特異的vimetin抗体を使用して免疫染色を行った。免疫染色は、半田らの方法(K.Handa et al., 2002, Cementum matrix formation in vivo by cultured dental follicle cells. Bone. 31(5):606-611.)に従い、M.O.M kit（Vector Burlingame ）を用いて行った。具体的には、1mg/ml のウシアルブミンを含むPBSで希釈した抗vimentin モノクローナル抗体（V9, Dako, Carpinteria,,CA, USA)を、パラフィンに包埋された切片に対して1時間反応させた後に、ビオチン化二次抗体及びペルオキシダーゼ結合型アビチンと反応させ、diaminobenzidineで発色させた。なお、本免疫染色では、正常マウスIgGをコントロールとして使用した。【００８８】
結果を図１０及び１１に示す。図１０の左側の図に、移植片の組織化学的解析の結果を示す。図中、ａはHAOB3投与移植片をヘマトキシリン・エオジン染色した結果、ｃはHAOB3投与移植片をヒト特異的vimetin抗体で免疫染色した結果、ｂは細胞非投与移植片をヘマトキシリン・エオジン染色した結果、及びｄは細胞非投与移植片をヒト特異的vimetin抗体で免疫染色した結果を示す。この結果から、HAOB3投与移植片では骨用構造物内の骨細胞がヒト特異的vimetin抗体で免疫染色されており、組織片内にHAOB3から分化した骨細胞が存在することが確認された。一方、細胞非投与移植片では、ヒト特異的vimetin抗体で免疫染色されなかった。【００８９】
また、図１０の右の図に、HAOB3投与移植片に含まれる細胞のOCN、BSP及びGAPDHのmRNA発現量を測定した結果を示す。この結果からも、HAOB3投与移植片中において、OCN、BSP及びGAPDHが強く発現しており、HAOB3が骨細胞に分化していることが支持された。【００９０】
更に、図１１に、HAOB3投与移植片、NHOst投与移植片及び細胞非投与移植片を比較した結果を示す。図１１のA)において、ａはHAOB3投与移植片をヘマトキシリン・エオジン染色した結果、ｂはNHOst投与移植片をヘマトキシリン・エオジン染色した結果を示す。これらの結果から、HAOB3投与移植片では骨用構造物の形成が観察されたが、NHOst投与移植片では充分な骨形成量が観察されなかった。【００９１】
また、図１１のB)に、HAOB3投与移植片、NHOst投与移植片及び細胞非投与移植片について、RUNX2、OSTERIX、OCN、BSP及びBMP-2の発現量を測定した結果を示す。この結果から、HAOB3投与移植片では、NHOst投与移植片に比して、骨マーカー遺伝子（RUNX2、OSTERIX、OCN及びBSP）及びBMP-2の発現量が多いことが確認された。【００９２】
即ち、以上の結果から、HAOB3は、市販されている大腿骨由来骨芽細胞であるNHOstに比べて、生体内での骨形成能が格段に優れていることが、マーカー遺伝子発現及び組織化学的解析の双方の点から裏付けられた。【００９３】
実施例１１：歯槽骨由来の未分化骨芽細胞の歯槽骨再生能の評価（In vivo）
１．歯周病動物モデルの作製
生後2.5 年齢メスのビーグル犬を本試験に供した。全身麻酔下にて左右下顎第四前臼歯および第一後臼歯部の歯肉を剥離した後に、両臼歯の分岐部に3×5mmの裂開状の骨欠損（２級根分岐部病変）を作成し、その後同部位にシリコンパテを挿入した。一ヵ月後にシリコンパテを除去し分岐部病変が作成されているのを確認した後に、歯根面にルートプレーニングを施し、移植受容床を作成することにより、歯周病モデルイヌを作製した。【００９４】
２．イヌ由来歯槽骨由来の未分化骨芽細胞の調製
歯周病動物モデル作成時に外科的に切除された3-5mm程度の歯槽骨骨片を、2mg/mlの細菌由来のコラーゲナーゼ（＞1.5 U/mg；Collagenase P, Roche社製）を含むPBS（Phosphate bufferd saline, pH 7.2）4ml中に入れて、37℃で20分間酵素反応を行った。反応後、酵素反応液と等量のウシ血清を加えた後に遠心分離にて遊離した細胞を回収し、残存する歯槽骨に対しては、再度、上記と同条件で酵素処理を行った。この操作を繰り返して、最終的に5回の酵素処理を行った。5回目の酵素処理後に遊離した細胞を回収し、MFスタート培地（Toyobo, Tokyo, Japan）2mlを含む35mm培養皿に入れ、5%CO2、37℃の条件下で培養を行った。培養皿中で細胞が80％コンフルエントに達した時に、0.25％トリプシン／1mM EDTAを含むPBSで細胞を遊離させ、イヌ歯槽骨由来の未分化骨芽細胞（DAOB）を回収した。【００９５】
上記で得られたDAOB1.5×106cellsを30μlのフィブリンゲルに担持させて、DAOB含有細胞製剤を調製した。【００９６】
３．歯周病動物モデルへのDAOBの移植及び結果
上記歯周病モデルイヌの骨欠損部位に、DAOB含有細胞製剤を自家移植した（50万 DAOB cells/骨欠損部位）。また、コントロールとして、DAOB含有細胞製剤を移植せずに、フィブリンゲルのみを移植した。【００９７】
移植６週後に顎骨を取り出し、マイクロCTにて骨再生量を判定した。次に、移植部位をトリミングし、ギ酸を用いて2ヶ月間脱灰を行った後にパラフィン標本を作成し、ヘマトキシリン・エオジン染色し、顕微鏡観察を行った。【００９８】
結果を図１２に示す。図１２中、ａはDAOB含有細胞製剤を移植した病変部位をマイクロCTで解析した結果、ｂはフィブリンゲルのみを移植した病変部位をマイクロCTで解析した結果、ｃはDAOB含有細胞製剤を移植した病変部位をヘマトキシリン・エオジン染色にて観察した結果、及びｄはフィブリンゲルのみを移植した病変部位をヘマトキシリン・エオジン染色にて観察した結果を示す。【００９９】
図１２から明らかなように、DAOB含有細胞製剤を移植した骨欠損部位において新生骨の形成が観察され（図１２のａ）、また組織学的にも顕著な新生骨の形成が確認された(図１２のｃ)。一方、フィブリンゲルのみを移植した骨欠損部位においては、十分な新生骨の形成は観察されなかった（図１２のｂ及びｄ）。【０１００】
以上の結果から、実際の動物実験でも、歯槽骨由来の未分化骨芽細胞が新生骨を形成して骨組織を再生させることが確認された。即ち、本試験結果から、本発明の細胞製剤は、臨床的応用が可能であり、骨組織を再生させて骨組織の損傷を治癒させるために有用であることが裏付けられた。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】A)には、各年齢層の歯槽骨から得られたHAOBのPDを測定した結果を示す。また、B)には、間期に誘導したHAOB3（PD35）をG-band法（上）及びSKY法（下）により核型検査を行った結果を示す。
【図２】各種増殖因子を添加した培地において、HAOB3を培養し、細胞増殖活性を評価した結果を示す。図中、縦軸は、血清非添加のDMEMを用いて培養した場合の細胞数を１として算出した、細胞増殖活性の相対値を示す。また、図中、「MF」はMF培地、「20%FCS」は20容量％のFCSを含むDMEM培地、「PDGFAA」は10ng/mlのPDGFAAを添加したDMDM培地、「PDGFAB」は10ng/mlのPDGFABを添加したDMEM培地、「PDGFBB」は10ng/mlのPDGFBBを添加したDMEM培地、「bFGF」は10ng/mlのbFGFを添加したDMEM培地を示す。
【図３−１】A)には、HAOB3をhBMP-2添加培地又はMF培地で培養した後に、アリザリンレッド染色した結果（左）及びアルカリホスファターゼ活性を測定した結果（右）を示す。また、B)には、HAOB3をhBMP-2添加培地又はMF培地で培養した後に、細胞内のRUNX2、OSTERIX、OCN及びBSPの発現レベルを測定した結果を示す。B)における縦軸は、β-Actinの発現量を100にして算出した、各分化マーカーの発現量の相対値を示す。
【図３−２】HAOB3をhBMP-2添加培地又はMF培地で培養した後に、OPNに対する抗体とOCNに対する抗体を用いて染色した結果を示す。
【図４】A)には、6PD、11PD、及び16PDのHAOB3をhBMP-2添加培地又はMF培地で培養した後に、アリザリンレッド染色した結果を示す。B)には、6PD、11PD、及び16PDのHAOB3をhBMP-2添加培地で培養した後に、細胞内のOCNの発現レベルを測定した結果を示す。C)には、6PDのHAOB3をhBMP-2添加培地で培養した後に、細胞内のRUNX2、OSTERIX及びBSPの発現レベルを測定した結果を示す。B)及びC)における縦軸は、β-Actinの発現量を100にして算出した、各分化マーカーの発現量の相対値を示す。
【図５】A)には、HAOB3及びNHOstを50〜1000ng/mlの濃度のhBMP-2を含む培地で培養した後に、アリザリンレッド染色した結果（左）及びアルカリホスファターゼ活性を測定した結果（右）を示す。B)には、HAOB3及びNHOstをhBMP-2を100ng/mlの濃度で含む培地で培養した後に、細胞内のRUNX2、OSTERIX、OCN及びBSPの発現レベルを測定した結果を示す。B)における縦軸は、β-Actinの発現量を100にして算出した、各分化マーカーの発現量の相対値を示す。
【図６】ａには分化誘導したHAOB3のOPNを染色した結果、ｂには分化誘導したHAOB3のOCNを染色した結果、ｃにはａとｂを重ね合わせた像、ｄには分化誘導したNHOstのOPNを染色した結果、ｅには分化誘導したNHOstのOCNを染色した結果、ｆにはｄとｅを重ね合わせた像を示す。
【図７】HAOB3及びNHOstをhBMP-2を100ng/mlの濃度で含む培地で培養した後に、BMP-2の発現量を測定した結果を示す。縦軸は、β-Actinの発現量を100にして算出した、hBMP-の発現量の相対値を示す。
【図８】A)は、HAOB3（PD6とPD35）におけるMGP、STMN2、及びNEBLの発現量を測定した結果を示す。A)における縦軸は、β-Actinの発現量を100にして算出した、各遺伝子の発現量の相対値を示す。B)は、HAOB3（PD6）におけるRUNX2、OSTERIX、OCN、BSP、MGP、STMN2、NEBLの発現量を測定した結果を示す。B)における縦軸は、β-Actinの発現量を100にして算出した、各遺伝子の発現量の相対値を示す。C)は、HAOB3のPD６とPD35におけるRUNX2、OSTERIX、OCN、BSP、MGP、STMN2、NEBLの遺伝子発現変化率（％）を示す。この遺伝子発現変化率は、HAOB3のPD6における遺伝子発現量をHAOB3のPD35における遺伝子発現量で除した値に１００を掛けることにより算出している。
【図９】HAOB1〜4、ヒト表皮由来繊維芽細胞（HFF）、ヒト骨肉腫細胞(MG63)、及び大腿骨由来骨芽細胞（NHOst）におけるSTMN2、NEBL及びMGPの発現量を測定した結果を示す。各図における縦軸は、β-Actinの発現量を100にして算出した、各遺伝子の発現量の相対値を示す。
【図１０】左側の図において、ａはHAOB3投与移植片をヘマトキシリン・エオジン染色した結果、ｃはHAOB3投与移植片をヒト特異的vimetin抗体で免疫染色した結果、ｂはHAOB3非投与移植片をヘマトキシリン・エオジン染色した結果、及びｄはHAOB3非投与移植片をヒト特異的vimetin抗体で免疫染色した結果を示す。また、右の図に、HAOB3投与移植片に含まれる細胞のOCN、BSP及びGAPDHのmRNA発現量を測定した結果を示す。なお、右図中のb-TCPのレーンはハイドロキシアパタイトのみで細胞を混合せずに実験を行った場合に、各mRNAの発現量を測定した結果である。
【図１１】A)において、ａはHAOB3投与移植片をヘマトキシリン・エオジン染色した結果、ｂはNHOst投与移植片をヘマトキシリン・エオジン染色した結果を示す。また、B)に、HAOB3投与移植片、NHOst投与移植片について、RUNX2、OSTERIX、OCN、BSP及びBMP-2の発現量を測定した結果を示す。
【図１２】ａはDAOB含有細胞製剤を移植した病変部位をマイクロCTで解析した結果、ｂはフィブリンゲルのみを移植した病変部位をマイクロCTで解析した結果、ｃはDAOB含有細胞製剤を移植した病変部位をヘマトキシリン・エオジン染色にて観察した結果、及びｄはフィブリンゲルのみを移植した病変部位をヘマトキシリン・エオジン染色にて観察した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年10月25日(2010.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯槽骨由来の未分化骨芽細胞を含有することを特徴とする、骨組織再生用の細胞製剤。
【請求項２】
歯槽骨由来の未分化骨芽細胞として、採取された歯槽骨組織を酵素処理した後に、ＰＤＧＦを含む培地で培養することにより得られる細胞群を含有する、請求項１に記載の細胞製剤。
【請求項３】
歯槽骨由来の未分化骨芽細胞が、ＳＴＭＮ２、ＮＥＢＬ、及びＭＧＰが発現している細胞である、請求項１又は２に記載の細胞製剤。
【請求項４】
歯槽骨由来の未分化骨芽細胞がスキャフォールドに担持された状態で含まれる、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞製剤。
【請求項５】
歯槽骨の再生用である、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞製剤。
【請求項６】
下記第１〜３工程を含む、骨組織再生能を有する細胞群を製造する方法：
採取された歯槽骨組織を酵素処理し、歯槽骨由来の細胞を得る第１工程、
前記第１工程で得られた歯槽骨由来の細胞を、未分化骨芽細胞が増殖可能な培地で培養する第２工程、及び
前記第２工程で増殖した細胞群を回収する第３工程。
【請求項７】
第２工程で用いられる未分化骨芽細胞が増殖可能な培地が、ＰＤＧＦを含む培地である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第３工程で回収される細胞群が、ＳＴＭＮ２、ＮＥＢＬ、及びＭＧＰが発現している細胞の集団である、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
歯槽骨から採取された未分化骨芽細胞を培養して得られる、骨組織再生能を有する細胞群。
【請求項１０】
歯槽骨から採取された未分化骨芽細胞の培養が、ＰＤＧＦを含む培地で行われる、請求項９に記載の細胞群。
【請求項１１】
未分化骨芽細胞が、ＳＴＭＮ２、ＮＥＢＬ、及びＭＧＰが発現している細胞である、請求項９又は１０に記載の細胞群。
【請求項１２】
骨組織の損傷を伴う患者の該骨組織部位に、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞製剤を投与する工程を含む、骨組織の損傷の治療方法。
【請求項１３】
歯槽骨由来の未分化骨芽細胞の、骨組織再生用の細胞製剤の製造のための使用。
【請求項１４】
歯槽骨由来の未分化骨芽細胞として、採取された歯槽骨組織を酵素処理した後に、ＰＤＧＦを含む培地で培養することにより得られる細胞群が用いられる、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
歯槽骨由来の未分化骨芽細胞が、ＳＴＭＮ２、ＮＥＢＬ、及びＭＧＰが発現している細胞である、請求項１３又は１４に記載の使用。
【国際調査報告】
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