(57)【要約】  本発明は、培養容器と；前記培養容器に収容され、１以上の培地流出入口を有する回転式ポリマー多孔質膜収容部と；前記回転式ポリマー多孔質膜収容部に収容された、ポリマー多孔質膜と；を備え、ここで、前記ポリマー多孔質膜が、モジュール化ポリマー多孔質膜であり、前記回転式ポリマー多孔質膜収容部が、前記培養容器とは独立して回転することを特徴とする、細胞培養装置を提供する。
2019146733.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器と；
前記培養容器に収容され、１以上の培地流出入口を有する回転式ポリマー多孔質膜収容部と；
前記回転式ポリマー多孔質膜収容部に収容された、ポリマー多孔質膜と；
を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通するものであって、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、モジュール化ポリマー多孔質膜であり、
前記回転式ポリマー多孔質膜収容部が、前記培養容器とは独立して回転することを特徴とする、細胞培養装置。
【請求項２】
前記回転式ポリマー多孔質膜収容部を回転させるための、回転駆動手段を備えた、請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項３】
前記回転式ポリマー多孔質膜収容部が回転動力受信手段を備えた、請求項２に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
前記回転動力受信手段が、磁石である、請求項３に記載の細胞培養装置。
【請求項５】
前記回転駆動手段が、マグネチックスターラーである、請求項４に記載の細胞培養装置。
【請求項６】
前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜であって、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
前記ケーシング内に収容されたものである、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項７】
前記ポリマー多孔質膜が、平均孔径０．０１〜１００μｍの複数の細孔を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１〜５０μｍである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項９】
前記表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
前記ポリマー多孔質膜の総膜厚が、５〜５００μｍである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１１】
前記ポリマー多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１２】
前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項１１に記載の細胞培養装置。
【請求項１３】
前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、請求項１１又は１２に記載の細胞培養装置。
【請求項１４】
前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細胞培養装置を使用する、細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置に関する。また、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置を使用した細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、治療やワクチンに用いられる酵素、ホルモン、抗体、サイトカイン、ウイルス（ウイルスタンパク質）等のタンパク質が培養細胞を用いて工業的に産生されている。しかし、こうしたタンパク質の生産技術は効率面に課題を抱えており、そのことが、持続的かつ広範な供給が不可欠であるバイオ医薬品のタイムリーな安定供給に影響を及ぼしている。そのため、効率的、安定かつ迅速なタンパク質の生産方法の確立に向けて、高密度に細胞を培養する技術や、高効率連続生産法などの、タンパク質の産生量を増大させるような革新的かつ簡便な技術が求められていた。【０００３】
タンパク質を産生する細胞として、培養基材に接着する足場依存性の接着細胞が用いられることがある。こうした細胞は、足場依存的に増殖するため、シャーレ、プレート又はチャンバーの表面に接着させて培養する必要がある。従来、こうした接着細胞を大量に培養するためには、接着するための表面積を大きくする必要があった。ところが、培養面積を大きくするには、空間を必然的に増大させる必要があり、それが効率的生産や製造量の改善に課題を生じる要因となっていた。【０００４】
培養空間を小さくしつつ、接着細胞を大量に培養する方法として、微小多孔を有する担体、特に、マイクロキャリアを用いた培養法が開発されている（例えば、特許文献１）。マイクロキャリアを用いた細胞培養系は、マイクロキャリアが互いに凝集しないようにするために十分に攪拌・拡散される必要がある。そのため、マイクロキャリアを分散させた培養液を十分に攪拌・拡散することができるだけの容積が必要となるため、培養できる細胞の密度には上限がある。また、マイクロキャリアと培養液とを分離するためには、細かな粒子を分別できるフィルタで分離させる必要があり、それがバイオ医薬品の生産性を低下させる原因ともなっていた。こうした状況から、大量の付着細胞を安定かつ簡便に培養する革新的な細胞培養の方法論が希求されていた。【０００５】
＜ポリイミド多孔質膜＞
ポリイミド多孔質膜は、本出願前よりフィルタ、低誘電率フィルム、燃料電池用電解質膜など、特に電池関係を中心とする用途のために利用されてきた。特許文献２〜４は、特に、気体などの物質透過性に優れ、空孔率の高い、両表面の平滑性が優れ、相対的に強度が高く、高空孔率にもかかわらず、膜厚み方向への圧縮応力に対する耐力に優れるマクロボイドを多数有するポリイミド多孔質膜を記載している。これらはいずれも、アミック酸を経由して作成されたポリイミド多孔質膜である。【０００６】
細胞をポリイミド多孔質膜に適用して培養することを含む、細胞の培養方法が報告されている（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００３／０５４１７４号
【特許文献２】国際公開第２０１０／０３８８７３号
【特許文献３】特開２０１１−２１９５８５号公報
【特許文献４】特開２０１１−２１９５８６号公報
【特許文献５】国際公開第２０１５／０１２４１５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
大量の動物細胞を培養するためには、培地に大量の酸素を継続的に溶存させる必要がある。培地に酸素を溶存させる方法として、培地を攪拌する方法や、バブリングする方法がある。しかしながら、動物細胞の多くは、剪断力に弱く、攪拌培養方法では細胞を死滅させてしまう問題を抱えていた。また、通常のマグネチックスターラーと攪拌子の組み合わせた攪拌培養方法では、培養容器と攪拌子の接触部分において、細胞をすり潰してしまい、細胞を大量に培養することが困難であった。また、バブリングを行う培養方法では、バブリング時に生じる泡沫によって細胞を死滅させてしまう問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、所定の構造を有するポリマー多孔質膜が、細胞を大量に培養可能な最適な空間を提供するのみならず、剪断力を生じる攪拌条件や、泡沫を生じる培養条件においても、細胞を大量に培養できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。【００１０】
［１］  培養容器と；
前記培養容器に収容され、１以上の培地流出入口を有する回転式ポリマー多孔質膜収容部と；
前記回転式ポリマー多孔質膜収容部に収容された、ポリマー多孔質膜と；
を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通するものであって、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、モジュール化ポリマー多孔質膜であり、
前記回転式ポリマー多孔質膜収容部が、前記培養容器とは独立して回転することを特徴とする、細胞培養装置。
［２］  前記回転式ポリマー多孔質膜収容部を回転させるための、回転駆動手段を備えた、［１］に記載の細胞培養装置。
［３］  前記回転式ポリマー多孔質膜収容部が回転動力受信手段を備えた、［２］に記載の細胞培養装置。
［４］  前記回転動力受信手段が、磁石である、［３］に記載の細胞培養装置。
［５］  前記回転駆動手段が、マグネチックスターラーである、［４］に記載の細胞培養装置。
［６］  前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜であって、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
前記ケーシング内に収容されたものである、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［７］  前記ポリマー多孔質膜が、平均孔径０．０１〜１００μｍの複数の細孔を有する、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［８］  前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１〜５０μｍである、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［９］  前記表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１０］  前記ポリマー多孔質膜の総膜厚が、５〜５００μｍである、［１］〜［９］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１１］  前記ポリマー多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜である、［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１２］  前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、［１１］に記載の細胞培養装置。
［１３］  前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、［１１］又は［１２］に記載の細胞培養装置。
［１４］  前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である、［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。【００１１】
［１５］  ［１］〜［１４］のいずれか１項に記載の細胞培養装置を使用する、細胞の培養方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、剪断力を生じる攪拌条件でも培養可能であり、細胞のすり潰しを起こさず、泡沫によっても細胞が死滅しない、新たな細胞培養装置、及びそれを用いた培養方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、一実施形態における細胞培養装置を示す断面図である。
【図２】図２は、一実施形態における細胞培養装置の一部を示す斜視図である。
【図３】図３は、一実施形態における細胞培養装置の一部を示す平面図である。
【図４】図４は、一実施形態における細胞培養装置の一部を示す断面図である。図３（Ａ）のＡ−Ａ断面を示している。
【図５】図５は、一実施形態における、細胞培養装置に適用されるモジュール化ポリイミド多孔質膜を示す平面図である。
【図６】図６は、一実施形態における、細胞培養装置に適用されるモジュール化ポリイミド多孔質膜を示す断面図である。図５のＢ−Ｂ断面を示している。
【図７】図７は、一実施形態における細胞培養装置の一部を示す。（Ａ）側面図、（Ｂ）斜視図、（Ｃ）斜視図（頂部なし）。
【図８】図８は、一実施形態における細胞培養装置の一部を示す。図７（Ａ）〜（Ｃ）それぞれを、回転軸の中心を通る面で切断した図である。
【図９】図９は、一実施形態における、細胞培養装置の使用態様を示す写真である。（Ａ）インキュベータ内に設置した細胞培養装置、（Ｂ）モジュール化ポリマー多孔質膜を設置した回転式ポリマー多孔質膜収容部（頂部なし）、（Ｃ）モジュール化ポリマー多孔質膜を設置した回転式ポリマー多孔質膜収容部（頂部あり）を示している。
【図１０】図１０は、一実施形態の細胞培養装置を用いて培養した後のグルコース濃度（ＧＬＣ）及び乳酸濃度（ＬＡＣ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について、必要に応じて図面を参照しながら説明する。実施形態の構成は例示であり、本発明の構成は、実施形態の具体的構成に限定されない。
【００１５】
１．ポリマー多孔質膜
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ａ（以下で、「Ａ面」又は「メッシュ面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、０．０１μｍ以上２００μｍ未満、０．０１〜１５０μｍ、０．０１〜１００μｍ、０．０１〜５０μｍ、０．０１μｍ〜４０μｍ、０．０１μｍ〜３０μｍ、０．０１μｍ〜２５μｍ、０．０１μｍ〜２０μｍ、又は０．０１μｍ〜１５μｍであり、好ましくは、０．０１μｍ〜２５μｍである。
【００１６】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ｂ（以下で、「Ｂ面」又は「大穴面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、表面層Ａに存在する孔の平均孔径よりも大きい限り特に限定されないが、例えば、５μｍ超２００μｍ以下、２０μｍ〜１００μｍ、２５μｍ〜１００μｍ、３０μｍ〜１００μｍ、３５μｍ〜１００μｍ、４０μｍ〜１００μｍ、５０μｍ〜１００μｍ、又は６０μｍ〜１００μｍであり、好ましくは、３０μｍ〜１００μｍである。
【００１７】
本明細書において、ポリマー多孔質膜表面の平均孔径は面積平均孔径である。面積平均孔径は、以下の（１）及び（２）に従って求めることができる。なお、ポリマー多孔質膜表面以外の部位の平均孔径も同様にして求めることができる。
（１）多孔質膜表面の走査型電子顕微鏡写真から、２００点以上の開孔部について孔面積Ｓを測定し、該孔面積を真円と仮定して式Ｉからそれぞれの孔径ｄを求める。
【数１】
2019146733.tif 000003
（２）上記式Ｉによって求められた全ての孔径を以下の式ＩＩに適用し、孔の形状が真円であるとした際の面積平均孔径ｄａを求める。
【数２】
2019146733.tif 000004
【００１８】
表面層Ａ及びＢの厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは０．０１〜２０μｍである。
【００１９】
ポリマー多孔質膜におけるマクロボイド層中のマクロボイドの膜平面方向の平均孔径は、特に限定されないが、例えば１０〜５００μｍであり、好ましくは１０〜１００μｍであり、より好ましくは１０〜８０μｍである。また、当該マクロボイド層中の隔壁の厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは、０．０１〜２０μｍである。一の実施形態において、当該マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、当該マクロボイド層中の隔壁は孔を有さない。
【００２０】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜表面の総膜厚は、特に限定されないが、５μｍ以上、１０μｍ以上、２０μｍ以上又は２５μｍ以上であってもよく、５００μｍ以下、３００μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下又は５０μｍ以下であってもよい。好ましくは、５〜５００μｍであり、より好ましくは２５〜７５μｍである。
【００２１】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜の膜厚の測定は、接触式の厚み計で行うことができる。
【００２２】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜の空孔率は特に限定されないが、例えば、４０％以上９５％未満である。
【００２３】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜の空孔率は、所定の大きさに切り取った多孔質フィルムの膜厚及び質量を測定し、目付質量から下式ＩＩＩに従って求めることができる。
【数３】
2019146733.tif 000005
（式中、Ｓは多孔質フィルムの面積、ｄは総膜厚、ｗは測定した質量、Ｄはポリマーの密度をそれぞれ意味する。ポリマーがポリイミドである場合は、密度は１．３４ｇ／ｃｍ3とする。）
【００２４】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜２５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は３０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリマー多孔質膜である。一の実施形態において、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、隔壁は、そのような孔を有さない。
【００２５】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、滅菌されていることが好ましい。滅菌処理としては、特に限定されないが、乾熱滅菌、蒸気滅菌、エタノール等消毒剤による滅菌、紫外線やガンマ線等の電磁波滅菌等任意の滅菌処理などが挙げられる。
【００２６】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜は、上記した構造的特徴を備える限り、特に限定されないが、好ましくはポリイミド多孔質膜、又はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である。
【００２７】
１−１．ポリイミド多孔質膜
ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称であり、通常は、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された芳香族ポリイミドを意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。
【００２８】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、好ましくは、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを（主たる成分として）含むポリイミド多孔質膜であり、より好ましくはテトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドからなるポリイミド多孔質膜である。「主たる成分として含む」とは、ポリイミド多孔質膜の構成成分として、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミド以外の成分は、本質的に含まない、あるいは含まれていてもよいが、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドの性質に影響を与えない付加的な成分であることを意味する。
【００２９】
一実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜も含まれる。
【００３０】
ポリアミック酸は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とを重合して得られる。ポリアミック酸は、熱イミド化又は化学イミド化することにより閉環してポリイミドとすることができるポリイミド前駆体である。
【００３１】
ポリアミック酸は、アミック酸の一部がイミド化していても、本発明に影響を及ぼさない範囲であればそれを用いることができる。すなわち、ポリアミック酸は、部分的に熱イミド化又は化学イミド化されていてもよい。
【００３２】
ポリアミック酸を熱イミド化する場合は、必要に応じて、イミド化触媒、有機リン含有化合物、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。また、ポリアミック酸を化学イミド化する場合は、必要に応じて、化学イミド化剤、脱水剤、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。ポリアミック酸溶液に前記成分を配合しても、着色前駆体が析出しない条件で行うことが好ましい。
【００３３】
本明細書において、「着色前駆体」とは、２５０℃以上の熱処理により一部または全部が炭化して着色化物を生成する前駆体を意味する。
【００３４】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得る着色前駆体としては、ポリアミック酸溶液又はポリイミド溶液に均一に溶解または分散し、２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理、好ましくは空気等の酸素存在下での２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理により熱分解し、炭化して着色化物を生成するものが好ましく、黒色系の着色化物を生成するものがより好ましく、炭素系着色前駆体がより好ましい。
【００３５】
着色前駆体は、加熱していくと一見炭素化物に見えるものになるが、組織的には炭素以外の異元素を含み、層構造、芳香族架橋構造、四面体炭素を含む無秩序構造のものを含む。
【００３６】
炭素系着色前駆体は特に制限されず、例えば、石油タール、石油ピッチ、石炭タール、石炭ピッチ等のタール又はピッチ、コークス、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体、フェロセン化合物（フェロセン及びフェロセン誘導体）等が挙げられる。これらの中では、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体及び／又はフェロセン化合物が好ましく、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体としてはポリアクリロニトリルが好ましい。
【００３７】
また、別の実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、上記の着色前駆体を使用せずに、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液を成形した後、熱処理することにより得られる、ポリイミド多孔質膜も含まれる。
【００３８】
着色前駆体を使用せずに製造されるポリイミド多孔質膜は、例えば、極限粘度数が１．０〜３．０であるポリアミック酸３〜６０質量％と有機極性溶媒４０〜９７質量％とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製し、その後当該ポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化することにより製造されてもよい。この方法において、水を必須成分とする凝固溶媒が、水であるか、又は５質量％以上１００質量％未満の水と０質量％を超え９５質量％以下の有機極性溶媒との混合液であってもよい。また、上記イミド化の後、得られた多孔質ポリイミド膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施してもよい。
【００３９】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るテトラカルボン酸二無水物は、任意のテトラカルボン酸二無水物を用いることができ、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。テトラカルボン酸二無水物の具体例として、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ａ−ＢＰＤＡ）などのビフェニルテトラカルボン酸二無水物、オキシジフタル酸二無水物、ジフェニルスルホン−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルフィド二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）メタン二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）プロパン二無水物、ｐ−フェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｐ−ビフェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｍ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ｐ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、１，３−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ビフェニル二無水物、２，２−ビス〔（３，４−ジカルボキシフェノキシ）フェニル〕プロパン二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、４，４’−（２，２−ヘキサフルオロイソプロピリデン）ジフタル酸二無水物等を挙げることができる。また、２，３，３’，４’−ジフェニルスルホンテトラカルボン酸等の芳香族テトラカルボン酸を用いることも好ましい。これらは単独でも、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００４０】
これらの中でも、特に、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族テトラカルボン酸二無水物が好ましい。ビフェニルテトラカルボン酸二無水物としては、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物を好適に用いることができる。
【００４１】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るジアミンは、任意のジアミンを用いることができる。ジアミンの具体例として、以下のものを挙げることができる。
１）１，４−ジアミノベンゼン（パラフェニレンジアミン）、１，３−ジアミノベンゼン、２，４−ジアミノトルエン、２，６−ジアミノトルエンなどのベンゼン核１つのべンゼンジアミン；
２）４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ビス（トリフルオロメチル）−４，４’−ジアミノビフェニル、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジカルボキシ−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’，５，５’−テトラメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、ビス（４−アミノフェニル）スルフィド、４，４’−ジアミノベンズアニリド、３，３’−ジクロロベンジジン、３，３’−ジメチルベンジジン、２，２’−ジメチルベンジジン、３，３’−ジメトキシベンジジン、２，２’−ジメトキシベンジジン、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，３’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、４，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，３’−ジアミノジフェニルスルホン、３，４’−ジアミノジフェニルスルホン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン、３，３’−ジアミノベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジクロロベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジメトキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノジフェニルメタン、３，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、３，３’−ジアミノジフェニルスルホキシド、３，４’−ジアミノジフェニルスルホキシド、４，４’−ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核２つのジアミン；
３）１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェノキシ）−４−トリフルオロメチルベンゼン、３，３’−ジアミノ−４−（４−フェニル）フェノキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジ（４−フェニルフェノキシ）ベンゾフェノン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（３−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核３つのジアミン；
４）３，３’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、３，３’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核４つのジアミン。
【００４２】
これらは単独でも、２種以上を混合して用いることもできる。用いるジアミンは、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。
【００４３】
これらの中でも、芳香族ジアミン化合物が好ましく、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル及びパラフェニレンジアミン、１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼンを好適に用いることができる。特に、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンが好ましい。
【００４４】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が２４０℃以上であるか、又は３００℃以上で明確な転移点がないテトラカルボン酸二無水物とジアミンとを組み合わせて得られるポリイミドから形成されていることが好ましい。
【００４５】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、以下の芳香族ポリイミドからなるポリイミド多孔質膜であることが好ましい。
（ｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
（ｉｉ）テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び／又は、
（ｉｉｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。
【００４６】
本発明において用いられるポリイミド多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜２５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は３０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリイミド多孔質膜である。ここで、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。
【００４７】
例えば、国際公開第２０１０／０３８８７３号、特開２０１１−２１９５８５号公報、又は特開２０１１−２１９５８６号公報に記載されているポリイミド多孔質膜も、本発明に使用可能である。
【００４８】
１−２．ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、ポリエーテルスルホンを含み、典型的には実質的にポリエーテルスルホンからなる。ポリエーテルスルホンは当業者に公知の方法で合成されたものであってよく、例えば、二価フェノール、アルカリ金属化合物及びジハロゲノジフェニル化合物を有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法、二価フェノールのアルカリ金属二塩を予め合成しジハロゲノジフェニル化合物と有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法等によって製造できる。
【００４９】
アルカリ金属化合物としては、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属水素化物、アルカリ金属アルコキシド等が挙げられる。特に、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムが好ましい。
【００５０】
二価フェノール化合物としては、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシン、４，４’−ビフェノール、ビス（ヒドロキシフェニル）アルカン類（例えば２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）プロパン、及び２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）メタン）、ジヒドロキシジフェニルスルホン類、ジヒドロキシジフェニルエーテル類、又はそれらのベンゼン環の水素の少なくとも１つが、メチル基、エチル基、プロピル基等の低級アルキル基、又はメトキシ基、エトキシ基等の低級アルコキシ基で置換されたものが挙げられる。二価フェノール化合物としては、上記の化合物を二種類以上混合して用いることができる。
【００５１】
ポリエーテルスルホンは市販品であってもよい。市販品の例としては、スミカエクセル７６００Ｐ、スミカエクセル５９００Ｐ（以上、住友化学(株)製）等が挙げられる。
【００５２】
ポリエーテルスルホンの対数粘度は、多孔質ポリエーテルスルホン膜のマクロボイドを良好に形成する観点で、好ましくは０．５以上、より好ましくは０．５５以上であり、多孔質ポリエーテルスルホン膜の製造容易性の観点から、好ましくは１．０以下、より好ましくは０．９以下、更に好ましくは０．８以下、特に好ましくは０．７５以下である。
【００５３】
また、ＰＥＳ多孔質膜、又はその原料としてのポリエーテルスルホンは、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が、２００℃以上であるか、又は明確なガラス転移温度が観察されないことが好ましい。
【００５４】
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜の製造方法は特に限定されないが、例えば、
対数粘度０．５〜１．０のポリエーテルスルホンの０．３質量％〜６０質量％と有機極性溶媒４０質量％〜９９．７質量％とを含むポリエーテルスルホン溶液を、フィルム状に流延し、ポリエーテルスルホンの貧溶媒又は非溶媒を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、空孔を有する凝固膜を作製する工程、及び
前記工程で得られた空孔を有する凝固膜を熱処理して前記空孔を粗大化させて、ＰＥＳ多孔質膜を得る工程
を含み、前記熱処理は、前記空孔を有する凝固膜を、前記ポリエーテルスルホンのガラス転移温度以上、若しくは２４０℃以上まで昇温させることを含む、方法で製造されてもよい。
【００５５】
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、好ましくは、表面層Ａ、表面層Ｂ、及び前記表面層Ａと前記表面層Ｂとの間に挟まれたマクロボイド層、を有するＰＥＳ多孔質膜であって、
前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた、膜平面方向の平均孔径が１０μｍ〜５００μｍである複数のマクロボイドとを有し、
前記マクロボイド層の隔壁は、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢはそれぞれ、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢのうち、一方が平均孔径５μｍ超２００μｍ以下の複数の細孔を有し、かつ他方が平均孔径０．０１μｍ以上２００μｍ未満の複数の細孔を有し、
表面層Ａ及び表面層Ｂの、一方の表面開口率が１５％以上であり、他方の表面層の表面開口率が１０％以上であり、
前記表面層Ａ及び前記表面層Ｂの前記細孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記ＰＥＳ多孔質膜は、総膜厚が５μｍ〜５００μｍであり、かつ空孔率が５０％〜９５％である、
ＰＥＳ多孔質膜である。
【００５６】
本発明の細胞培養装置に用いられる、細胞培養担体としての上述のポリマー多孔質膜は、微親水性の多孔質特性を有するため、ポリマー多孔質膜内に安定した液保持がなされ、乾燥にも強い湿潤環境が保たれる。そのため、従来の細胞培養担体を用いる細胞培養装置と比較して、極めて少量の培地でも細胞の生存及び増殖を達成することができる。また、ポリマー多孔質膜に播種された細胞は、剪断力や、泡沫によっても細胞が死滅することなく培養が可能であるため、細胞に対して効率的に酸素や栄養を供給することができ、大量の細胞を培養することができる。
【００５７】
本発明によれば、細胞への酸素供給を十分に行うことが可能となる。
【００５８】
２．細胞培養装置
本発明は、
培養容器と；
前記培養容器に収容され、１以上の培地流出入口を有する回転式ポリマー多孔質膜収容部と；
前記回転式ポリマー多孔質膜収容部に収容された、ポリマー多孔質膜と；
を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通するものであって、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、モジュール化ポリマー多孔質膜であり、
前記回転式ポリマー多孔質膜収容部が、前記培養容器とは独立して回転することを特徴とする、細胞培養装置に関する。
【００５９】
該細胞培養装置を、以下で、「本発明の細胞培養装置」とも呼ぶ。以下に本発明の細胞培養装置の実施態様について、図を示しながら説明する。
【００６０】
２−１．細胞培養装置
図１は、一実施態様における本発明の細胞培養装置１を示す図である。また、図２〜４は、一実施態様における、回転式ポリマー多孔質膜収容部３を示す図である。
【００６１】
回転式ポリマー多孔質膜収容部３は、培養容器２に収容されている。一実施形態において、培養容器２の培養空間を覆うために、蓋体２０をさらに備えている。培養容器２の内部に酸素を含む気体が供給されるように、蓋体２０の一部にはフィルタ２１を備えていることが好ましい。これにより、培養容器２の内部と外部の間でガス交換が可能となり、なおかつ培地が汚染されることを防止する。
【００６２】
回転式ポリマー多孔質膜収容部３には、モジュール化ポリマー多孔質膜９０が収容される。回転式ポリマー多孔質膜収容部３は、１以上の培地流出入口を有している。一実施態様において、回転式ポリマー多孔質膜収容部３は、底部３０と、底部３０に略垂直に設けられた側部３１と、側部３１の上部に設けられた頂部３２とを有し、外観において円柱形状の容器を形成している。他の実施形態において、回転式ポリマー多孔質膜収容部３は、例えば、三角柱、四角柱、五角柱、多角柱であってもよい。底部３０は、１以上の第１培地流出入口３００を有している。側部３１は、１以上の第２培地流出入口３１０を有している。頂部３２は、１以上の第３培地流出入口３２０を有している。第１培地流出入口３００、第２培地流出入口３１０又は第３培地流出入口３２０の形状は、例えば、円形、楕円形、三角形、四角形、五角形、六角形、多角形などであってもよい。第１培地流出入口３００、第２培地流出入口３１０及び第３培地流出入口３２０の大きさは、モジュール化ポリマー多孔質膜９０が回転式ポリマー多孔質膜収容部３から飛び出ない程度であればよく、適宜設計変更することができる。第１培地流出入口３００、第２培地流出入口３１０又は第３培地流出入口３２０の数は、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、１０個、１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、５０個、１００個などである。
【００６３】
第１培地流出入口３００、第２培地流出入口３１０及び第３培地流出入口３２０を介して、回転式ポリマー多孔質膜収容部３の内部及び外部へ培地が供給／排出される。他の実施形態において、例えば、回転式ポリマー多孔質膜収容部３は、球形、円錐形、角錐形、円錐台形、任意の多角形の回転体形状などであってもよい。
【００６４】
本実施態様において、頂部３２は、側部３１へ着脱可能であり、回転式ポリマー多孔質膜収容部３の内部へモジュール化ポリマー多孔質膜９０を収容及び／又は取り出し可能である。
【００６５】
一実施態様において、回転式ポリマー多孔質膜収容部３は、回転部３３を有する。一実施態様において、回転部３３は、回転式ポリマー多孔質膜収容部３の底部３０の下面に設けられており、円筒形の回転側部３３０と、回転底部３３１と、回転底部３３１に固定された回転動力受信手段３３３とを備えている。回転動力受信手段３３３は、例えば、磁石や、回転軸である。一実施態様において、回転動力受信手段３３３は、例えば、マグネチック攪拌子を用いてもよい。一実施態様において、回転動力受信手段３３３が磁石である場合、回転駆動手段４は、例えば、マグネチックスターラーを用いることができ、非接触的に回転式ポリマー多孔質膜収容部３を回転させることができる。他の実施態様において、回転動力受信手段３３３が回転軸である場合、回転駆動手段４は、例えば、回転軸と接続された回転モータを用いることができる。回転駆動手段４の回転運動が、回転動力受信手段３３３に伝達され、その結果、回転式ポリマー多孔質膜収容部３が回転する。図２〜４の実施態様における回転式ポリマー多孔質膜収容部３は、回転底部３３１の底面が、培養容器底部２２と接触して回転する。本発明の細胞培養装置１であれば、回転式ポリマー多孔質膜収容部３が、培養容器２とは独立して回転することにより、細胞が適用されたモジュール化ポリマー多孔質膜９０に、十分に酸素及び栄養を供給することが可能となり、大量の細胞培養が可能となる。
【００６６】
一実施態様において、モジュール化ポリマー多孔質膜９０を収容した回転式ポリマー多孔質膜収容部３は、培養容器２と組み合わせることによって、細胞培養装置１として即座に使用することができる。回転式ポリマー多孔質膜収容部３は、新鮮な培地が充填された培養容器２へ移し替えることが可能であり、培地交換を簡単に行うことも可能である。また、他の実施形態として、培養容器２と、モジュール化ポリマー多孔質膜９０を収容した回転式ポリマー多孔質膜収容部３とが含まれる、細胞培養キットとして提供されてもよい。
【００６７】
図７及び図８は、他の実施態様における、細胞培養装置１に適用される回転式ポリマー多孔質膜収容部３ａを示す図であり、図９はその使用状態を示す写真である。なお、図７及び図８で示される回転式ポリマー多孔質膜収容部３ａの基本的な構成、発明の概念は回転式ポリマー多孔質膜収容部３の各部材と同一である。各部材の符号の番号に「ａ」が付加されていること以外、回転式ポリマー多孔質膜収容部３に設けられた各部材と同一の符号番号が付与されている回転式ポリマー多孔質膜収容部３ａに設けられた各部材についての説明は、回転式ポリマー多孔質膜収容部３の対応する各部材についての上述の説明が適用される。ここでは、回転式ポリマー多孔質膜収容部３の各部材の説明が適用されない部材についてのみ説明する。
【００６８】
回転式ポリマー多孔質膜収容部３ａには、回転式ポリマー多孔質膜収容部３ａの回転を安定させるための軸部３５ａが設けられている。軸部３５ａは、蓋体２０に設けられた貫通孔を貫通している（図９参照）。他の態様において、軸部３５ａは、蓋体２０を貫通せず、蓋体２０の内側に設けられた軸受で支持されるものであってもよい。
【００６９】
側部３１ａには、回転翼３１１ａが設けられてもよい。回転式ポリマー多孔質膜収容部３ａが回転する時に、回転翼３１１ａによって液流が生じ、培地中に効率よく気相中の酸素を取り込むことができる。回転翼３１１ａの形状及び数は、目的に応じて適宜調製することができる。
【００７０】
回転部３３ａの下部には、回転軸部材３３４ａが設けられている。また、培養容器２の底面（図示しない）には、回転軸部材３３４ａを受けるための軸受３４ａが設けられている。回転軸部材３３４ａが軸受３４ａの凹部で支持されることによって、回転式ポリマー多孔質膜収容部３ａの回転を安定させることができる。
【００７１】
図８は、図７で示される回転式ポリマー多孔質膜収容部３ａの断面図である。回転部３３ａは、回転動力受信手段３３３ａ（例えば、棒状のマグネチック攪拌子）を備えている。回転動力受信手段３３３ａは、それを取り囲む固定部材３３５ａによって固定されている。
【００７２】
回転式ポリマー多孔質膜収容部３ａの内部には、仕切部材３１２ａが設けられていてもよい。例えば図９（Ｂ）のようにモジュール化ポリマー多孔質膜９０を設置して回転式ポリマー多孔質膜収容部３ａを回転した時に、仕切部材３１２ａによって、モジュール化ポリマー多孔質膜９０が液流によって偏ることを軽減させることができる。仕切部材３１２ａは、モジュール化ポリマー多孔質膜９０の偏りを軽減させることが出来、液流を生じさせる程度の形状及び数であればよく、適宜調製することができる。
【００７３】
２−２．細胞培養装置に用いられるポリマー多孔質膜の実施形態
【００７４】
本発明の実施態様で使用されるポリマー多孔質膜は、モジュール化されたポリマー多孔質膜が用いられる。本明細書において「モジュール化ポリマー多孔質膜」とは、ケーシング９００に収容されたポリマー多孔質膜９をいう（例えば、図５及び図６参照）。本明細書において、「モジュール化ポリマー多孔質膜」との記載は、単に「モジュール」と記載することができ、相互に変更しても同一のことを意味する。
【００７５】
本発明の実施態様で使用されるモジュール化ポリマー多孔質膜９０は、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜９が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜９が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜９が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜９が、縄状に結ばれて、
該ケーシング９００内に収容されたものであってもよく、該モジュール化ポリマー多孔質膜９０を回転式ポリマー多孔質膜収容部３へ適用することが可能である。
【００７６】
本明細書において、「ケーシング内に２以上の独立した該ポリマー多孔質膜が集約されて収容されている」とは、互いに独立した２以上のポリマー多孔質膜９が、ケーシング９００で囲まれた一定空間内に集約されて収容されている状態を指す。本発明において、２以上の独立した該ポリマー多孔質膜９は、該ポリマー多孔質膜９の少なくとも１カ所と該ケーシング９００内の少なくとも１カ所とを任意の方法によって固定され、該ポリマー多孔質膜９がケーシング９００内で動かない状態に固定されたものであってもよい。また、２以上の独立したポリマー多孔質膜９は、小片であってもよい。小片の形状は、例えば、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など、任意の形をとりうるが、好ましくは、ひも状、又は四角が好ましい。本発明において、小片の大きさは、任意の大きさをとりうるが、ひも状である場合、長さは任意の長さでよいが、幅は、８０ｍｍ以下がよく、好ましくは３０ｍｍ以下がよく、より好ましくは１０ｍｍ以下がよい。これによって、ポリマー多孔質膜９内で生育される細胞にストレスが加えられることが防止される。本発明において、ポリマー多孔質膜９の小片が四角である場合、略正方形であることがより好ましく、その一辺の長さは、ポリマー多孔質膜がケーシング９００内で動かない状態となるように、ケーシングの内壁に沿って、又は内壁の一辺の長さより短く（例えば、０．１ｍｍ〜１ｍｍ程度短い）形成されたものであればよい。また、本発明において、ポリマー多孔質膜９の小片が略正方形である場合、長さは任意の長さでよいが、例えば、８０ｍｍ以下がよく、好ましくは５０ｍｍ以下がよく、より好ましくは３０ｍｍ以下がよく、さらにより好ましくは２０ｍｍ以下がよく、１０ｍｍ以下であってもよい。
【００７７】
本明細書において、「折り畳まれたポリマー多孔質膜」とは、該ケーシング９００内にて折り畳まれていることで、ポリマー多孔質膜９の各面及び／又はケーシング９００内の表面との摩擦力によってケーシング９００内で動かない状態となったポリマー多孔質膜９である。本明細書において、「折り畳まれた」とは、ポリマー多孔質膜９に折り目がついた状態であってもよく、折り目がついていない状態であってもよい。
【００７８】
本明細書において、「ロール状に巻き込まれたポリマー多孔質膜」とは、ポリマー多孔質膜９が、ロール状に巻き込まれて、ポリマー多孔質膜９の各面及び／又はケーシング９００内の表面との摩擦力によってケーシング９００内で動かない状態となったポリマー多孔質膜９をいう。また、本発明おいて、縄状に編み込まれたポリマー多孔質膜９とは、例えば短冊状の複数のポリマー多孔質膜９を、任意の方法によって縄状に編み込み、ポリマー多孔質膜９同士の摩擦力によって互いに動かない状態のポリマー多孔質膜９をいう。（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜９が集約されたポリマー多孔質膜９、（ｉｉ）折り畳まれたポリマー多孔質膜９、（ｉｉｉ）ロール状に巻き込まれたポリマー多孔質膜９、及び（ｉｖ）縄状に結ばれたポリマー多孔質膜９、が、組み合わせられてケーシング９００内に収容されていてもよい。
【００７９】
本明細書において、「該ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態」とは、該モジュール化ポリマー多孔質膜９０を細胞培養培地中で培養する場合に、該ポリマー多孔質膜９が継続的に形態変化しない状態になるようにケーシング９００内に収容されている状態をいう。換言すれば、該ポリマー多孔質膜９自体が、流体によって、継続的に波打つ動きを行わないように抑制された状態である。ポリマー多孔質膜９がケーシング９００内で動かない状態を保つため、ポリマー多孔質膜９内で生育されている細胞にストレスが加えられることが防止され、細胞が死滅されることなく安定的に細胞が培養可能となる。
【００８０】
図５及び図６では、一実施形態におけるモジュール化ポリマー多孔質膜９０の構造を示す。モジュール化ポリマー多孔質膜９０は、複数のポリマー多孔質膜９の積層体が、ケーシング９００に収容されている。積層されるポリマー多孔質膜９は小片であってもよく、その形状は例えば、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など、任意の形であってもよい。好ましくは、積層されるポリマー多孔質膜９の小片は略正方形である。小片の大きさは、任意の大きさをとり得る。小片が略正方形である場合、その長さは特に限定されないが、例えば、８０ｍｍ以下、５０ｍｍ以下、３０ｍｍ以下、２０ｍｍ以下又は１０ｍｍ以下である。
【００８１】
ケーシング９００に収容されるポリマー多孔質膜９が、複数のポリマー多孔質膜９の積層体である場合、好ましくは、２枚以上、３枚以上、４枚以上又は５枚以上であって、かつ１００枚以下、５０枚以下、４０枚以下、３０枚以下、２０枚以下、１５枚以下又は１０枚以下のポリマー多孔質膜の積層体であり、より好ましくは３〜１００枚の、より好ましくは５〜５０枚のポリマー多孔質膜の積層体である。
【００８２】
ケーシング９００に収容されるポリマー多孔質膜９が、複数のポリマー多孔性膜の積層体である場合、ポリマー多孔質膜９とポリマー多孔質膜９の間には中敷き９０１が設けられてもよい（図６参照）。中敷き９０１が設けられることにより、積層されたポリマー多孔質膜９の間に効率的に培地を供給させることができる。中敷き９０１は、積層されたポリマー多孔質膜９の間に任意の空間を形成し、効率的に培地を供給させる機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、メッシュ構造を有する平面構造体を用いることができる。中敷き９０１の材質は、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ステンレス鋼製のメッシュを用いることができるが、これに限定されない。メッシュ構造を有する中敷き９０１を有する場合、積層されたポリマー多孔質膜９の間に培地を供給できる程度の目開きを有していればよく、適宜選択することができる。
【００８３】
３．細胞培養装置を使用した細胞培養方法
【００８４】
本明細書において、「培地」とは、細胞、特に動物細胞を培養するための細胞培養培地のことを指す。培地は、細胞培養液と同義の意味として用いられる。そのため、本発明において用いられる培地とは、液体培地のことを指す。培地の種類は、通常使用される培地を使用することが可能であり、培養する細胞の種類によって適宜決定される。
【００８５】
＜細胞をポリマー多孔質膜へ適用する工程＞
本発明で使用される細胞のポリマー多孔質膜への適用の具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程、あるいは、細胞を膜状の担体に適用するのに適した任意の手法を採用することが可能である。限定されるわけではないが、本発明の方法において、細胞のポリマー多孔質膜への適用は、例えば、以下のような態様を含む。
【００８６】
（Ａ）細胞を前記ポリマー多孔質膜の表面に播種する工程を含む、態様；
（Ｂ）前記ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に細胞懸濁液を載せ、
放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞懸濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞懸濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様；並びに、
（Ｃ）前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリマー多孔質膜に細胞懸濁液を装填し、そして、
細胞懸濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。
【００８７】
（Ａ）の態様は、ポリマー多孔質膜の表面に細胞、細胞塊を直接播種することを含む。あるいは、ポリマー多孔質膜を細胞懸濁液中に入れて、膜の表面から細胞培養液を浸潤させる態様も含む。
【００８８】
ポリマー多孔質膜の表面に播種された細胞は、ポリマー多孔質膜に接着し、多孔の内部に入り込んでいく。好ましくは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞はポリマー多孔質膜に接着する。ポリマー多孔質膜の表面に播種された細胞は、膜の表面及び／又は内部において安定して生育・増殖することが可能である。細胞は生育・増殖する膜の位置に応じて、種々の異なる形態をとりうる。
【００８９】
（Ｂ）の態様において、ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に細胞懸濁液を載せる。ポリマー多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞懸濁液を前記膜に吸い込ませることにより、細胞懸濁液が膜中に浸透する。理論に縛られるわけではないが、これはポリマー多孔質膜の各表面形状等に由来する性質によるものであると考えられる。本態様により、膜の細胞懸濁液が装填された箇所に細胞が吸い込まれて播種される。
【００９０】
あるいは、（Ｃ）の態様のように、前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面の部分又は全体を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤してから、湿潤したポリマー多孔質膜に細胞懸濁液を装填してもよい。この場合、細胞懸濁液の通過速度は大きく向上する。
【００９１】
例えば、膜の飛散防止を主目的として膜極一部を湿潤させる方法（以後、これを「一点ウェット法」と記載する）を用いることができる。一点ウェット法は、実質上は膜を湿潤させないドライ法（（Ｂ）の態様）にほぼ近いものである。ただし、湿潤させた小部分については、細胞液の膜透過が迅速になると考えられる。また、ポリマー多孔質膜の片面又は両面の全体を十分に湿潤させたもの（以後、これを「ウェット膜」と記載する）に細胞懸濁液を装填する方法も用いることができる（以後、これを「ウェット膜法」と記載する）。この場合、ポリマー多孔質膜の全体において、細胞懸濁液の通過速度が大きく向上する。
【００９２】
（Ｂ）及び（Ｃ）の態様において、細胞懸濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる。これにより細胞懸濁液中の細胞の濃度を濃縮する、細胞以外の不要な成分を水分とともに流出させる、などの処理も可能になる。
【００９３】
（Ａ）の態様を「自然播種」（Ｂ）及び（Ｃ）の態様を「吸込み播種」と呼称する場合がある。
【００９４】
限定されるわけではないが、好ましくは、ポリマー多孔質膜には生細胞が選択的に留まる。よって、本発明の方法の好ましい実施形態において、生細胞が前記ポリマー多孔質膜内に留まり、死細胞は優先的に水分とともに流出する。
【００９５】
態様（Ｃ）において用いる滅菌された液体は特に限定されないが、滅菌された緩衝液若しくは滅菌水である。緩衝液は、例えば、(+)及び(-)Dulbecco’s PBS 、(+)及び(-)Hank's Balanced Salt Solution等である。緩衝液の例を以下の表１に示す。
【００９６】
【表１】
2019146733.tif 000006
【００９７】
さらに、本発明の方法において、細胞のポリマー多孔質膜への適用は、浮遊状態にある接着性細胞をポリマー多孔質膜と懸濁的に共存させることにより細胞を膜に付着させる態様（絡め取り）も含む。例えば、本発明の方法において、細胞をポリマー多孔質膜に適用するために、細胞培養容器中に、細胞培養培地、細胞及び１又はそれ以上の前記ポリマー多孔質膜を入れてもよい。細胞培養培地が液体の場合、ポリマー多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態で存在する。ポリマー多孔質膜の性質から、細胞はポリマー多孔質膜に接着しうる。よって、生来、浮遊培養に適さない接着性の細胞であっても、ポリマー多孔質膜を用いることにより、ポリマー多孔質膜に吸着させた状態で浮遊させながら培養することが可能となる。好ましくは、細胞は、ポリマー多孔質膜に接着する。「自発的に接着する」とは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞がポリマー多孔質膜の表面又は内部に留まることを意味する。
【００９８】
上述した細胞のポリマー多孔質膜への適用は、２種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いてもよい。例えば、態様（Ａ）〜（Ｃ）のうち、２つ以上の方法を組み合わせてポリマー多孔質膜に細胞を適用してもよい。細胞を担持させたポリマー多孔質膜を、上述の細胞培養装置における、ポリマー多孔質膜載置部へ適用して、培養することが可能である。
【００９９】
その他、モジュール化ポリマー多孔質膜が収容されたポリマー多孔質膜収容部に、懸濁された細胞が含まれる培地を滴下して播種してもよい。
【０１００】
あるいは、培養容器２を、細胞が含まれた細胞懸濁液で充填することにより（例えば、細胞懸濁液面Ｌまで細胞懸濁液を充填する）、モジュール化ポリマー多孔質膜に、均質に細胞を播種することができる。これにより、ポリマー多孔質膜に播種された細胞が、部分的にコンフルエントになることを防ぎ、効率よく増殖可能となる。
【０１０１】
本明細書において、「懸濁された細胞」とは、例えば、トリプシン等のタンパク質分解酵素によって、接着細胞を強制的に浮遊させて培地中に懸濁して得られた細胞や、公知の馴化工程によって、培地中に浮遊培養可能となった接着細胞などを含んでいる。
【０１０２】
本発明に利用し得る細胞の種類は、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される。動物細胞は、脊椎動物門に属する動物由来の細胞と無脊椎動物（脊椎動物門に属する動物以外の動物）由来の細胞とに大別される。本明細書における、動物細胞の由来は特に限定されない。好ましくは、脊椎動物門に属する動物由来の細胞を意味する。脊椎動物門は、無顎上綱と顎口上綱を含み、顎口上綱は、哺乳綱、鳥綱、両生綱、爬虫綱などを含む。好ましくは、一般に、哺乳動物と言われる哺乳綱に属する動物由来の細胞である。哺乳動物は、特に限定されないが、好ましくは、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギなどを含む。
【０１０３】
本発明に利用しうる動物細胞の種類は、限定されるわけではないが、好ましくは、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、及び生殖細胞からなる群から選択される。
【０１０４】
本明細書において「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称することを意図する。限定されるわけではないが、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等を含む。好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞は倫理的な問題もない等の理由により特に好ましい。多能性幹細胞としては公知の任意のものを使用可能であるが、例えば、国際公開第２００９／１２３３４９号（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５７０４１）に記載の多能性幹細胞を使用可能である。
【０１０５】
「組織幹細胞」とは、分化可能な細胞系列が特定の組織に限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力（分化多能性）を有する幹細胞を意味する。例えば骨髄中の造血幹細胞は血球のもととなり、神経幹細胞は神経細胞へと分化する。このほかにも肝臓をつくる肝幹細胞、皮膚組織になる皮膚幹細胞などさまざまな種類がある。好ましくは、組織幹細胞は、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択される。
【０１０６】
「体細胞」とは、多細胞生物を構成する細胞のうち生殖細胞以外の細胞のことを言う。有性生殖においては次世代へは受け継がれない。好ましくは、体細胞は、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ若しくは巨核球の血球細胞から選択される。
【０１０７】
「生殖細胞」は、生殖において遺伝情報を次世代へ伝える役割を持つ細胞を意味する。例えば、有性生殖のための配偶子、即ち卵子、卵細胞、精子、精細胞、無性生殖のための胞子などを含む。
【０１０８】
細胞は、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択してもよい。「肉腫」とは、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血液等の非上皮性細胞由来の結合組織細胞に発生する癌で、軟部肉腫、悪性骨腫瘍などを含む。肉腫細胞は、肉腫に由来する細胞である。「株化細胞」とは、長期間にわたって体外で維持され、一定の安定した性質をもつに至り、半永久的な継代培養が可能になった培養細胞を意味する。ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来）、ＨＬ−６０細胞（ヒト白血球細胞由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞由来）、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来細胞株）、ＢＨＫ細胞（新生児ハムスター腎臓細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス胎児線維芽細胞由来）などヒトを含む様々な生物種の様々な組織に由来する細胞株が存在する。「形質転換細胞」は、細胞外部から核酸（ＤＮＡ等）を導入し、遺伝的性質を変化させた細胞を意味する。
【０１０９】
本明細書において、「接着細胞」とは、一般に、増殖のために適切な表面に自身を接着させる必要がある細胞であって、付着細胞又は足場依存性細胞ともいわれる。本発明のいくつかの実施形態では、使用する細胞は接着細胞である。本発明に用いられる細胞は、接着細胞であって、より好ましくは、培地中に懸濁した状態でも培養可能な細胞である。懸濁培養可能な接着細胞とは、公知の方法によって、接着細胞を懸濁培養に適した状態へ馴化させることによって得ることが可能であり、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などや、これらの細胞から派生して得られた細胞株が挙げられる。
【０１１０】
本発明の細胞の培養方法では、ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、培養することにより、ポリマー多孔質膜の有する内部の多面的な連結多孔部分や表面に、大量の細胞が生育するため、大量の細胞を簡便に培養することが可能となる。また、本発明に用いられる、ポリマー多孔質膜に播種された細胞は、従来は死滅するような攪拌条件でも生育可能な環境を提供し、細胞を大量に培養することが可能となる。
【０１１１】
本明細書において、細胞を含まないポリマー多孔質膜がその内部間隙の体積も含めて空間中に占める体積を「見かけ上ポリマー多孔質膜体積」と呼称する。そして、ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、ポリマー多孔質膜の表面及び内部に細胞が担持された状態において、ポリマー多孔質膜、細胞、及びポリマー多孔質膜内部に浸潤した培地が全体として空間中に占める体積を「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積」と呼称する。膜厚２５μｍのポリマー多孔質膜の場合、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積は、見かけ上ポリマー多孔質膜体積より、最大で５０％程度大きな値となる。本発明の方法では、１つの細胞培養容器中に複数のポリマー多孔質膜を収容して培養することができるが、その場合、細胞を担持した複数のポリマー多孔質膜のそれぞれについての細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和を、単に「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和」と記載することがある。
【０１１２】
本発明の方法を用いることにより、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することが可能となる。また、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。さらに、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。そして、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。
【０１１３】
つまり、本発明によれば、細胞培養する空間（容器）を従来の二次元培養を行う細胞培養装置に比べて極限まで小型化可能となる。また、培養する細胞の数を増やしたい場合は、積層するポリマー多孔質膜の枚数を増やす等の簡便な操作により、柔軟に細胞培養する体積を増やすことが可能となる。本発明に用いられるポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置であれば、細胞を培養する空間（容器）と細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）とを分離することが可能となり、培養する細胞数に応じて、必要となる量の細胞培養培地を準備することが可能となる。細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）は、目的に応じて大型化又は小型化してもよく、あるいは取り替え可能な容器であってもよく、特に限定されない。
【０１１４】
本明細書において、細胞の大量培養とは、例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数が、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして、培地１ミリリットルあたり１．０×１０5個以上、１．０×１０6個以上、２．０×１０6個以上、５．０×１０6個以上、１．０×１０7個以上、２．０×１０7個以上、５．０×１０7個以上、１．０×１０8個以上、２．０×１０8個以上、５．０×１０8個以上、１．０×１０9個以上、２．０×１０9個以上、または５．０×１０9個以上となるまで培養することをいう。
【０１１５】
なお、培養中または培養後の細胞数を計測する方法としては、種々の公知の方法を用いることができる。例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数を、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして計測する方法としては、公知の方法を適宜用いることができる。例えば、ＣＣＫ８（次文参照）を用いた細胞数計測法を好適に用いることができる。具体的には、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｉｇ  Ｋｉｔ８；同仁化学研究所製溶液試薬（以下、「ＣＣＫ８」と記載する。）を用いて、ポリマー多孔質膜を用いない通常の培養における細胞数を計測し、吸光度と実際の細胞数との相関係数を求める。その後、細胞を適用し、培養したポリマー多孔質膜を、ＣＣＫ８を含む培地に移し、１〜３時間インキュベータ内で保存し、上清を抜き出して４６０ｎｍの波長にて吸光度を測定して、先に求めた相関係数から細胞数を計算する。
【０１１６】
また、別の観点からは、細胞の大量培養とは、例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後にポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数が１．０×１０5個以上、２．０×１０5個以上、１．０×１０6個以上、２．０×１０6個以上、５．０×１０6個以上、１．０×１０7個以上、２．０×１０7個以上、５．０×１０7個以上、１．０×１０8個以上、２．０×１０8個以上、または５．０×１０8個以上となるまで培養することをいう。ポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数は、上述のＣＣＫ８等の公知の方法を用いて適宜計測することが可能である。
【実施例】
【０１１７】
以下、本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明する。なお本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。【０１１８】
以下の実施例で使用されたポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分である３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）とジアミン成分である４，４’−ジアミノジフェニルエーテル（ＯＤＡ）とから得られるポリアミック酸溶液と、着色前駆体であるポリアクリルアミドとを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより、調製された。得られたポリイミド多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、当該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であり、表面層Ａに存在する孔の平均孔径は１９μｍであり、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は４２μｍであり、膜厚が２５μｍであり、空孔率が７４％であった。【０１１９】
（実施例１）
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が３．５１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、（総細胞数３．８３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞率９２％）になるまで培養を継続した。図５及び６に示す構造を有するモジュールを１００個用意し、希釈したミルトン（登録商標）（杏林製薬、日本）、超純水、７０％エタノール含有水にて洗浄した後、滅菌的に乾燥し、準備を完了した。経時変化を表２に示す。尚、モジュールで使用したポリイミド多孔質膜のサイズは、１．０×１．０ｃｍであり、ポリイミド多孔質膜総枚数は１８００枚、総面積は１８００ｃｍ２となる。３Ｄプリンターにて準備した回転式ポリマー多孔質膜収容部（図２〜４）を用意し、合計１００個のモジュールを滅菌的に上部空洞に設置し、透明容器内部に据えた。マグネチックスターラーをバイオリアクター下部に設置してからＣＯ２インキュベータ内に移送し、培養準備を完了した。尚、透明容器は、上部の開放部分を不織布で覆い、雑菌混入を避けながら空気を取り入れる事の出来る形態とした。【０１２０】
上記にて準備した回転培養装置に、コージンバイオ株式会社製ＣＨＯ細胞単層培養培地ＫＢＭ２７０  ２００．０ｍＬを添加し、５６ｒｐｍの回転速度で１０分間培地をモジュールに浸漬させた。そこへ、ＣＨＯ  ＤＰ−１２浮遊細胞培養液（総細胞数３．８３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞数３．５１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、死細胞数３．２３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞率９２％）３０．８ｍＬと浮遊細胞用培地ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ）６９．２ｍＬの混合液を添加し、ＣＯ２インキュベータ内で５分間緩やかに攪拌・混合した後、２．５時間静置して細胞吸着を実行した。２．５時間後に回収された培地には細胞は殆ど観察されず、細胞吸着率１００％であった。この時点での予想平均細胞密度は、６．００×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２であった。
細胞吸着に用いた培地を排出し、コージンバイオ株式会社製ＣＨＯ細胞単層培養培地ＫＢＭ２７０  ２００ｍｌを回転バイオリアクター容器に注加し、５６ｒｐｍの回転速度でバイオリアクターを回転させて培養を継続した。３日後、回転速度を１９２ｒｐｍに上昇させ、培養を進めた。培地交換は毎日行い、培地中の一日当たりのグルコール消費量、乳酸産生量、乳酸脱水素酵素量および抗体の産生量をロシュ・ダイアグノスティックス社製Ｃｅｄｅｘ  Ｂｉｏを用いて４日間測定した。経時的にグルコース消費及び乳酸の産生が向上し、安定的な細胞培養が進展している事が観察された。結果を表２に示す。
【表２】
2019146733.tif 000007
【０１２１】
（実施例２）
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ）中で浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が２．２９×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、（総細胞数２．６２×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞率８８％）になるまで培養を継続した。【０１２２】
図５及び図６に示す構造を有するモジュール１００個を滅菌用バッグ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に入れ、最小２５ｋＧｙ・最大５０ｋＧｙのガンマ線照射滅菌を行い、モジュール準備を完了した。尚、モジュールで使用したポリイミド多孔質膜のサイズは、１．０ｃｍ×１．０ｃｍであり、ポリイミド多孔質膜の総枚数は１，８００枚、総面積は１，８００ｃｍ２となる。【０１２３】
また、モジュールを収納し回転する回転式ポリマー多孔質膜収容部（図７〜９）を３Ｄプリンターにて作製した後、モジュールと同様の方法で滅菌した。【０１２４】
容器内部液へのエアレーションを可能とするために、上記回転式ポリマー多孔質膜収容部を設置する透明容器の下部にはガラス製スパージャーを設置した。また、軸受（図７〜８参照）を、接着剤を用いて透明容器中央部に据え、固定されるまで十分に放置した。この状態で、モジュールと同様、ガンマ線法により滅菌した。【０１２５】
合計１００個のモジュールを滅菌的に回転培養装置のモジュール収納部内に設置し（図９（Ｂ）参照）、それを透明容器内部の中央軸受部上に据えた。ＣＯ２インキュベータ内にマグネチックスターラーを設置し、その上に回転培養装置を据えた。【０１２６】
上記にて準備したバイオリアクター内に、ＣＨＯ細胞単層培養用培地ＫＢＭ  ＣＨＯ  ＨＢＭ１（コージンバイオ株式会社製）を４５０ｍｌ添加して、６０ｒｐｍの回転速度で約３０分間、モジュールを培地に浸漬させた。ＣＨＯ細胞単層培養用培地ＫＢＭ  ＣＨＯ  ＨＢＭ１（コージンバイオ株式会社製）を５０ｍｌ廃棄し、ＣＨＯ  ＤＰ−１２を含む懸濁液（総細胞数２．６２×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞数２．２９×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、死細胞数３．２３×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞率８８％）５０ｍＬを添加して約１．５時間静置し、その後、バイオリアクターを６０ｒｐｍの回転速度で回転させた状態で約１８．５時間培養し、合計約２０時間、細胞をモジュールへ吸着させた（シート１枚当たりの想定平均生細胞吸着数６．３６×１０4ｃｅｌｌｓ）。回収した培地から計算した生細胞吸着率は９４％であった。【０１２７】
その後、培地を除去し、ＣＨＯ細胞単層培養用培地ＫＢＭ  ＣＨＯ  ＨＢＭ１（コージンバイオ株式会社製）を４５０ｍｌ添加して、泡が容器から溢れ出ない程度の流量にて酸素濃度４０％のエアレーションを行いながら培養した。培養開始から４日、１０日後に培地交換を行った。毎日少量のサンプリングを行い、培地中の一日当たりのグルコース消費量、乳酸産生量、乳酸脱水素酵素量および抗体の産生量をＣｅｄｅｘ  Ｂｉｏ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて測定した。経時的にグルコースが消費され、抗体及び乳酸が持続的に産生されていることを確認した。【０１２８】
尚、初回培地交換までの培養開始後４日間におけるグルコース消費濃度及び乳酸産生濃度を表３に示す。
【表３】
2019146733.tif 000008
【０１２９】
（実施例３）
ヒト皮膚線維芽細胞（Ｌｏｎｚａ  ＣＡＴ＃ＣＣ−２５１１）を、アズワン社製１５０ｃｍ２シャーレ１４枚を用いて、コージンバイオ株式会社製培地（ＫＢＭ  Ｆｉｂｒｏ  Ａｓｓｉｓｔ）中で約６，５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるまで培養した。【０１３０】
図５及び図６に示す構造を有するモジュール３０個を滅菌用バッグ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に入れ、ガンマ線照射滅菌を行った。尚、モジュールで使用したポリイミド多孔質膜のサイズは、１．０ｃｍ×１．０ｃｍであり、ポリイミド多孔質膜の総枚数は５４０枚、総面積は５４０ｃｍ2となる。３Ｄプリンターにて準備した実施例２と類似した形状の回転型リアクター、及び、リアクターを据えるための軸受を付与した透明容器を準備した。実施例２とは異なり、本実施例では、ガラス製スパージャーは設置せず、回転のみで酸素供給を行うシステムを採用した。これら回転培養容器及び透明容器を、モジュールと同様、ガンマ線法で滅菌した後、合計３０個のモジュールを回転型リアクターのモジュール収納部に滅菌的に設置し、それを透明容器内部に据えた。【０１３１】
ＣＯ２インキュベータ内にマグネチックスターラーを設置し、その上に回転培養装置を据えた。【０１３２】
上記にて準備したバイオリアクター内に、コージンバイオ株式会社製培地（ＫＢＭ  Ｆｉｂｒｏ  Ａｓｓｉｓｔ）を２７０ｍｌ添加して、約６０ｒｐｍの回転速度で約３０分間モジュールを培地に浸漬させた。【０１３３】
ヒト皮膚線維芽細胞を含む懸濁液（総細胞数１．２３×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞数１．００×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、死細胞数２．３０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、生細胞率８１％）３０ｍＬを添加して約１時間静置し、その後、バイオリアクターを約６０ｒｐｍの回転速度で回転させた状態で約２３時間培養し、合計約２４時間、細胞をモジュールへ吸着させた（シート１枚当たりの想定平均生細胞吸着数５．５６×１０4ｃｅｌｌｓ）。吸着開始約５時間後の培地から計算した生細胞吸着率は、９５％であった。【０１３４】
その後、培地を除去し、コージンバイオ株式会社製培地（ＫＢＭ  Ｆｉｂｒｏ  Ａｓｓｉｓｔ）を３００ｍｌ添加して培養した。培養開始から基本的に３日あるいは４日の間隔で培地交換を行い、培地中のグルコース消費量、乳酸産生量、乳酸脱水素酵素量をＣｅｄｅｘ  Ｂｉｏ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて測定した。経時的にグルコースが消費され、乳酸が持続的に産生されることを確認した。【０１３５】
培養開始後のグルコース濃度及び乳酸濃度を図１０に示す。
【符号の説明】
【０１３６】
１    細胞培養装置
２    培養容器
２０    蓋体
２１    フィルタ
２２    培養容器底部
３、３ａ    回転式ポリマー多孔質膜収容部
３０、３０ａ    底部
３００、３００ａ    第１培地流出入口
３１、３１ａ    側部
３１０、３１０ａ    第２培地流出入口
３１１ａ    回転翼
３１２ａ    仕切部材
３２、３２ａ    頂部
３２０、３２０ａ    第３培地流出入口
３３、３３ａ    回転部
３３０、３３０ａ    回転側部
３３１、３３１ａ    回転底部
３３２、３３２ａ    第４培地流出入口
３３３、３３３ａ    回転動力受信手段
３３４ａ    回転軸部材
３３５ａ    固定部材
３４ａ    軸受
３５ａ    軸部
４    回転駆動手段
９    ポリマー多孔質膜
９０    モジュール化ポリマー多孔質膜
９００    ケーシング
Ｌ    細胞懸濁液面
【図１】
2019146733.tif 000009
【図２】
2019146733.tif 000010
【図３】
2019146733.tif 000011
【図４】
2019146733.tif 000012
【図５】
2019146733.tif 000013
【図６】
2019146733.tif 000014
【図７】
2019146733.tif 000015
【図８】
2019146733.tif 000016
【図９】
2019146733.tif 000017
【図１０】
2019146733.tif 000018
【国際調査報告】
2019146733.tif 000019
2019146733.tif 000020
2019146733.tif 000021
2019146733.tif 000022