(57)【要約】  Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導する抗原性ペプチドとキャリアタンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。当該免疫原性組成物は、抗血栓効果を有し、かつ長期的な出血リスクを伴わない、安全性の高い抗血栓ワクチンとして使用することができ、血小板凝集が関与する血栓が形成される疾患の予防、特に、再発性虚血性脳卒中の予防に有用である。
2018155457.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導する抗原性ペプチドとキャリアタンパク質を含む免疫原性組成物。
【請求項２】
抗原性ペプチドが、配列番号２の第１位〜第１６位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号２の第２１位〜第３３位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列、または、配列番号２の第９５位〜第１１４位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなる請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抗原性ペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
抗原性ペプチドが、配列番号６〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
キャリアタンパク質が、スカシガイヘモシアニンである請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
さらにアジュバントを含む請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
血栓の予防に用いるための請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
抗血栓ワクチンとして使用するための請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
脳梗塞、心筋梗塞、閉塞性動脈硬化症、狭心症または血小板増多症の予防に用いるための請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
再発性虚血性脳卒中の予防に用いるための請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
Ｓ１００Ａ９とＣＤ３６が関与する慢性炎症疾患の予防または治療に用いるための請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
Ｓ１００Ａ９とＣＤ３６が関与する慢性炎症疾患が、動脈硬化症、非アルコール性脂肪性肝障害、非アルコール性脂肪性肝炎またはアルツハイマー型認知症である請求項１１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓ１００Ａ９を標的とする免疫原性組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アスピリン、アスピリンと徐放性ジピリダモールの合剤、クロピドグレルなどの抗血小板薬を用いた長期治療は、非心塞栓性脳卒中や一過性脳虚血発作患者の二次脳卒中予防に重要である。しかし、最近のスウェーデンの研究では、２年間で抗血小板薬の投与を中止した患者が２６．３％であったことを報告しており（非特許文献１）、米国の研究では、１年以内にアスピリン治療を受けている患者の２２．５％、アスピリン／ジピリダモール治療を受けている患者の４３．８％、クロピドグレル治療を受けている患者の３５．８％が投与を中止したことを報告している（非特許文献２）。日本においても、再発性虚血性脳卒中と診断された患者の約４０％が、抗血小板薬の服用を中止していたことが報告されている（非特許文献３）。【０００３】
そのため、虚血性脳卒中の再発を予防するために、長期の作用性を有し、かつ費用対効果の高い抗血小板療法の開発が求められている。このような観点から、ワクチンは毎日投与しなくても長期にわたり効果を持続でき、費用対効果が高いので、有望なアプローチの１つである。ワクチンは伝統的に感染症を予防するために使用されてきたが、最近は高血圧や糖尿病などの一般的な成人病にまで適用範囲が拡大している。しかし、抗血栓療法のワクチンは未だ報告されていない。抗血栓ワクチンを開発することが困難な理由の１つは、致命的な頭蓋内出血や胃腸出血を含む出血リスクの長期的増加である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Glader, E.L., Sjolander, M., Eriksson, M. & Lundberg, M. Persistent use of secondary preventive drugs declines rapidly during the first 2 years after stroke. Stroke 41, 397-401 (2010)
【非特許文献２】Bushnell, C.D., et al. Secondary preventive medication persistence and adherence 1 year after stroke. Neurology 77, 1182-1190 (2011)
【非特許文献３】伊藤康幸ら、「虚血性脳血管障害発症前の抗血栓薬内服状況の検討」臨床神経学、２０１１年、第５１巻、５２−５８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、抗血栓効果を有し、かつ長期的な出血リスクを伴わない、安全性の高い免疫原性組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導する抗原性ペプチドとキャリアタンパク質を含む免疫原性組成物。
［２］抗原性ペプチドが、配列番号２の第１位〜第１６位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列、配列番号２の第２１位〜第３３位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列、または、配列番号２の第９５位〜第１１４位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなる前記［１］に記載の組成物。
［３］抗原性ペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる前記［１］に記載の組成物。
［４］抗原性ペプチドが、配列番号６〜２０のいずれかに示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる前記［１］または［２］に記載の組成物。
［５］キャリアタンパク質が、スカシガイヘモシアニンである前記［１］〜［４］のいずれかに記載の組成物。
［６］さらにアジュバントを含む前記［１］〜［５］のいずれかに記載の組成物。
［７］血栓の予防に用いるための前記［１］〜［６］のいずれかに記載の組成物。
［８］抗血栓ワクチンとして使用するための前記［１］〜［６］のいずれかに記載の組成物。
［９］脳梗塞、心筋梗塞、閉塞性動脈硬化症、狭心症または血小板増多症の予防に用いるための前記［１］〜［８］のいずれかに記載の組成物。
［１０］再発性虚血性脳卒中の予防に用いるための前記［１］〜［８］のいずれかに記載の組成物。
［１１］Ｓ１００Ａ９とＣＤ３６が関与する慢性炎症疾患の予防または治療に用いるための前記［１］〜［６］のいずれかに記載の組成物。
［１２］Ｓ１００Ａ９とＣＤ３６が関与する慢性炎症疾患が、動脈硬化症、非アルコール性脂肪性肝障害、非アルコール性脂肪性肝炎またはアルツハイマー型認知症である前記［１１］に記載の組成物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、抗血栓効果を有し、かつ長期的な出血リスクを伴わない、安全性の高い免疫原性組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】（Ａ）はマウスＳ１００Ａ８抗原性ペプチド（ＡＳＨＫＤＳＨＫＥ、配列番号５）とスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）とのコンジュゲート（ＳＡ８００１−Ｋ）ワクチンを投与したマウス血清中のＳ１００Ａ８に対する抗体価をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図であり、（Ｂ）はマウスＳ１００Ａ９抗原性ペプチド（ＧＨＳＨＧＫＧＣＧＫ、配列番号３）とＫＬＨとのコンジュゲート（ＳＡ９００１−Ｋ）ワクチンを投与したマウス血清中のＳ１００Ａ９に対する抗体価をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。
【図２】ＳＡ８００１−Ｋワクチン投与マウス血清中の抗Ｓ１００Ａ８抗体、および、ＳＡ９００１−Ｋワクチン投与マウス血清中の抗Ｓ１００Ａ９抗体をウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す図である。
【図３】遠位中大脳動脈閉塞症モデルマウスを用いて、Ｓ１００Ａ８ワクチンおよびＳ１００Ａ９ワクチンの中大脳動脈閉塞に対する効果を検討した結果を示す図である。
【図４】中大脳動脈に塩化第二鉄誘発性血栓形成処置を行ったＳＡ９００１−Ｋワクチン投与マウスおよびＫＬＨ投与マウスから摘出した中大脳動脈の病理組織学的検査結果を示す図であり、左は非潅流脳の中大脳動脈標本であり、右は潅流固定脳の中大脳動脈標本である。
【図５】Ｓ１００Ａ９ワクチンの血小板血栓形成に対する効果を検討した結果を示す図である。
【図６】Ｓ１００Ａ９ワクチンの出血に対する効果を検討した結果を示す図である。
【図７】（Ａ）は血小板数を測定した結果を示す図であり、（Ｂ）は活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定した結果を示す図であり、（Ｃ）はプロトロンビン時間（ＰＴ）を測定した結果を示す図である。
【図８】Ｓ１００Ａ９ワクチンの血清Ｓ１００Ａ９レベルに対する効果を検討した結果を示す図である。
【図９】Ｓ１００Ａ９ワクチンにより誘導された抗体のＩｇＧサブクラスごとの力価を測定した結果を示す図である。
【図１０】ＳＡ９００１−Ｋワクチン投与マウス由来の脾細胞をＳ１００Ａ９抗原性ペプチド、リコンビナントＳ１００Ａ９タンパク質またはＫＬＨで刺激し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによりＴ細胞活性化を評価した結果を示す図であり、（Ａ）は各群の代表的なウェルの顕微鏡画像であり、（Ｂ）は染色スポット数を測定した結果を示す図である。
【図１１】ＳＡ９００１−Ｋワクチン投与マウスにおけるＳ１００Ａ９に対する抗体価を経時的に測定した結果を示す図である。
【図１２】追加のＳＡ９００１−Ｋワクチン投与（ブースター免疫）後、中大脳動脈閉塞時間を測定した結果を示す図である。
【図１３】追加のＳＡ９００１−Ｋワクチン投与（ブースター免疫）後、尾出血時間を測定した結果を示す図である。
【図１４】初回ワクチン投与から１４７日目の腎臓の病理組織学的検査結果を示す図であり、（Ａ）はＫＬＨ投与マウスの結果、（Ｂ）はＳＡ９００１−Ｋワクチン投与マウスの結果である。
【図１５】初回ワクチン投与から１４７日目の脳の病理組織学的検査結果を示す図であり、（Ａ）はＫＬＨ投与マウスの結果、（Ｂ）はＳＡ９００１−Ｋワクチン投与マウスの結果である。
【図１６】Ｓ１００Ａ９ワクチンのＳ１００Ａ９／ＣＤ３６シグナル伝達に及ぼす効果を検討した結果を示す図である。
【図１７】総頸動脈閉塞モデルマウスを用いて、Ｓ１００Ａ９ワクチンの総頸動脈閉塞に対する効果を検討した結果を示す図である。
【図１８】内頸静脈血栓症モデルマウスを用いて、Ｓ１００Ａ９ワクチンの総頸動脈閉塞に対する効果を検討した結果を示す図である。
【図１９】サルにＫＬＨ−ヒトＳ１００Ａ９抗原性ペプチドコンジュゲート（ＳＡ９００２−Ｋ）ワクチンを投与し、血清中の抗体価を測定した結果を示す図であり、（Ａ）はヒトＳ１００Ａ９抗原性ペプチドとＢＳＡのコンジュゲートに対する抗体価の測定結果であり、（Ｂ）は組換えヒトＳ１００Ａ９に対する抗体価の測定結果である。
【図２０】マウスＳ１００Ａ９抗原性ペプチド（ＥＮＮＰＲＧＨＧＨＳ、配列番号６）とＫＬＨコンジュゲート（ＳＡ９００３−Ｋ）ワクチン投与マウス血清中のＳ１００Ａ９抗原性ペプチドに対する抗体価をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。
【図２１】マウスＳ１００Ａ９抗原性ペプチド（ＡＮＫＡＰＳＱＭＥＲ、配列番号７）とＫＬＨとのコンジュゲート（ＳＡ９００４−Ｋ）ワクチン投与マウス血清中のＳ１００Ａ９抗原性ペプチドに対する抗体価をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す図である。
【図２２】Ｓ１００Ａ９ワクチンの動脈硬化に対する効果を、高脂肪食を摂取させたＡｐｏＥ欠損マウスの動脈に形成されたプラーク面積により評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導する抗原性ペプチドとキャリアタンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。
【００１０】
Ｓ１００タンパク質は、細胞種特異的に発現する２個のＥＦ−ｈａｎｄを持つカルシウム結合性タンパク質であり、現在までに２０種類のサブファミリーが確認されている。Ｓ１００Ａ９（ＭＲＰ１４とも称される）は低分子量カルシウム結合性Ｓ１００タンパク質に属しており、通常Ｓ１００Ａ８（ＭＲＰ８とも称される）と共に発現し、両者はヘテロ二量体を形成する。Ｓ１００Ａ８／Ａ９複合体は、種々の炎症性疾患に関連していることがわかっている。また、巨細胞性動脈炎、嚢胞性線維症、慢性関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、慢性炎症性腸疾患、慢性気管支炎、いくつかの悪性腫瘍、および自己免疫疾患を含む数多くの炎症性疾患の患者において、Ｓ１００Ａ８／Ａ９複合体の血清レベルが亢進することが明らかにされている。
【００１１】
Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導する抗原性ペプチドは、Ｓ１００Ａ９のアミノ酸配列に基づいて設計できる。主要な哺乳動物のＳ１００Ａ９のアミノ酸配列は公知のデータベース（ＮＣＢＩ等）から取得することができる。例えば、ヒトＳ１００Ａ９のアミノ酸配列（配列番号２）のアクセッション番号はＮＰ＿００２９５６（ＮＣＢＩ）であり、マウスＳ１００Ａ９のアミノ酸配列（配列番号４）のアクセッション番号はＣＡＣ１４２９２（ＮＣＢＩ）である。
【００１２】
Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導する抗原性ペプチドは、ヒトＳ１００Ａ９のフラグメントであって、抗原性を有するフラグメントであれば特に限定されないが、配列番号２の第１位〜第１６位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２の第２１位〜第３３位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチド、または、配列番号２の第９５位〜第１１４位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましい。
【００１３】
配列番号２の第１位〜第１６位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列は、配列番号２の第６位〜第１０位と同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。このようなアミノ酸配列としては、例えば、ＭＴＣＫＭＳＱＬＥＲ（配列番号６）、ＴＣＫＭＳＱＬＥＲＮ（配列番号７）、ＣＫＭＳＱＬＥＲＮＩ（配列番号８）、ＫＭＳＱＬＥＲＮＩＥ（配列番号９）、ＭＳＱＬＥＲＮＩＥＴ（配列番号１０）、ＳＱＬＥＲＮＩＥＴＩ（配列番号１１）などが挙げられる。
【００１４】
配列番号２の第２１位〜第３３位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、ＱＹＳＶＫＬＧＨＰＤ（配列番号１２）、ＹＳＶＫＬＧＨＰＤＴ（配列番号１３）、ＳＶＫＬＧＨＰＤＴＬ（配列番号１４）、ＶＫＬＧＨＰＤＴＬＮ（配列番号１５）などが挙げられる。
【００１５】
配列番号２の第９５位〜第１１４位に示されるアミノ酸配列に含まれる連続する７アミノ酸以上のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列は、配列番号２の第１０２位〜第１０６位と同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。このようなアミノ酸配列としては、例えば、ＧＤＥＧＰＧＨＨＨＫ（配列番号１６）、ＤＥＧＰＧＨＨＨＫＰ（配列番号１７）、ＥＧＰＧＨＨＨＫＰＧ（配列番号１８）、ＧＰＧＨＨＨＫＰＧＬ（配列番号１９）、ＰＧＨＨＨＫＰＧＬＧ（配列番号２０）、ＧＨＨＨＫＰＧＬＧＥ（配列番号１）などが挙げられる。
【００１６】
Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導する抗原性ペプチドとして、より好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＧＨＨＨＫＰＧＬＧＥ）と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドであり、さらに好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００１７】
Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導する抗原性ペプチドは、ヒトＳ１００Ａ９のアミノ酸配列（配列番号２）の部分配列と同一の配列からなるペプチドに限定されず、ヒトＳ１００Ａ９のアミノ酸配列（配列番号２）の部分配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導できるアミノ酸配列であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列が挙げられる。好ましくは、Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導できるアミノ酸配列であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列である。具体例としては、リンカーを介してキャリアタンパク質と連結（コンジュゲート）するためにＮ末端またはＣ末端に１個のアミノ酸（例えば、システイン）が付加されたアミノ酸配列が挙げられる。
【００１８】
本発明の免疫原性組成物の効果を確認するために、実験動物（マウス等）を用いて実験を行う場合、ヒトＳ１００Ａ９の抗原性ペプチド配列に対応する実験動物のアミノ酸配列を用いて実験を行うことが好ましい。用いる実験動物のＳ１００Ａ９のアミノ酸配列は、公知のデータベース（ＮＣＢＩ等）から取得することができ、ヒトＳ１００Ａ９のアミノ酸配列とアライメントすることにより、用いる実験動物の抗原性ペプチド配列を設計することができる。上記配列番号１で示されるヒト抗原性ペプチド配列に対応するマウス抗原性ペプチド配列は、ＧＨＳＨＧＫＧＣＧＫ（配列番号３）である。なお、実験動物としてサルを用いれば、ヒトＳ１００Ａ９の抗原性ペプチドを含む本発明の免疫原性組成物の効果を確認することができる。
【００１９】
キャリアタンパク質は特に限定されず、ワクチンに使用できる公知のキャリアタンパク質の中から適宜選択して用いることができる。公知のキャリアタンパク質としては、例えばアルブミン、オボアルブミン、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ：keyhole limpet hemocyanin）、緑膿菌外毒素、破傷風毒素、リシン毒素、ジフテリア毒素、コレラ毒素、易熱性エンテロトキシン、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフェリン、血小板由来増殖因子、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−グルタミン、マンノース−６−ホスフェート、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などが挙げられる。なかでも、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）が好ましい。
【００２０】
抗原性ペプチドとキャリアタンパク質は、連結（コンジュゲート）していることが好ましい。抗原性ペプチドとキャリアタンパク質は、融合タンパク質のように直接連結されていてもよく、リンカー（スペーサーと同義）を介して連結されていてもよい。リンカーは抗原性ペプチドとキャリアタンパク質を連結できるものであれば特に限定されない。例えば、β−アミノアラニン、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、１２−アミノラウリン酸、グルタミン酸、ｐ−アミノ安息香酸等のアミノカルボン酸を用いることができる。また、天然のタンパク質に存在するＬ−アミノ酸やそれらのＤ−アミノ酸も用いることができる。また、ＥＭＣＳ（N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide）、グルタルアルデヒド、スルホＧＭＢＳ（N-γ-maleimidobutyryl-oxysulfosuccinimide ester）などのクロスリンカーを用いることができる。
【００２１】
キャリアタンパクとして上記のＫＬＨを用いる場合、抗原性ペプチドにリシン（Ｌｙｓ；Ｋ）が含まれない場合は、グルタルアルデヒドを好ましく用いることができる。抗原性ペプチドにリシンが含まれる場合でも、抗原性ペプチドのＮ末端またはＣ末端にのみリシンが含まれる場合は、グルタルアルデヒドを好ましく用いることができる。抗原性ペプチドがＮ末端またはＣ末端以外の位置にリシンを含む場合には、抗原性ペプチドのＮ末端あるいはＣ末端にシステイン（Ｃｙｓ；Ｃ）を導入すること、および／または、ＥＭＣＳを用いて連結することが好ましい。また、抗原性ペプチドの配列に関わらず、Ｃ末端にシステインを導入し、スルホＧＭＢＳを用いて連結することができる。
【００２２】
本発明の免疫原性組成物は、さらに１種以上のアジュバントを含んでいてもよい。アジュバントは、公知のアジュバントの中から適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等のアルミニウム塩またはその組み合わせ）、フロイントアジュバント（完全または不完全）、ＴＬＲリガンド（例えば、ＣｐＧ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、Ｐａｍ３ＣＳＫ４など）、ＢＡＹ、ＤＣ−ｃｈｏｌ、ｐｃｐｐ、モノホスホリル脂質Ａ、ＱＳ−２１、コレラ毒素、ホルミルメチオニルペプチドなどが挙げられる。好ましくは、アルミニウムアジュバントである。
【００２３】
本発明の免疫原性組成物を動物に投与することにより、血小板凝集が関与する血栓を有効に予防することができる。それゆえ、本発明の免疫原性組成物は、抗血栓ワクチンとして好適に用いることができる。
【００２４】
本発明の免疫原性組成物は、脳梗塞、心筋梗塞、閉塞性動脈硬化症、狭心症、血小板増多症等の血小板凝集が関与する血栓が形成される疾患の予防に好適に用いることができる。また、本発明の免疫原性組成物は、再発性虚血性脳卒中の予防に好適に用いることができる。
【００２５】
本発明の免疫原性組成物は、Ｓ１００Ａ９とＣＤ３６が関与する慢性炎症疾患の予防または治療に好適に用いることができる。Ｓ１００Ａ９とＣＤ３６が関与する慢性炎症疾患としては、動脈硬化症、非アルコール性脂肪性肝障害（nonalcoholic fatty liver disease: NAFLD）、非アルコール性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis: NASH）、アルツハイマー型認知症などが挙げられる。本発明の免疫原性組成物は、動脈硬化症の予防または治療に用いることが好ましい。
【００２６】
本発明の免疫原性組成物は、経口投与または非経口投与により投与することができる。非経口投与としては、例えば腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、鼻腔内投与、経皮投与、経粘膜投与、舌下投与、吸入投与などが挙げられる。好ましくは、非経口投与であり、より好ましくは、皮内投与、皮下投与または筋肉内投与である。
【００２７】
本発明の免疫原性組成物は、Ｓ１００Ａ９に対する中和抗体の産生を誘導する抗原性ペプチドとキャリアタンパク質と薬学的に許容される担体、さらに添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口投与用製剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口投与用製剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
【００２８】
経口投与用の固形製剤に用いられる添加剤としては、例えば、ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、トウモロコシデンプン等の賦形剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等の結合剤；トウモロコシデンプン等の分散剤；繊維素グリコール酸カルシウム等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；グルタミン酸、アスパラギン酸等の溶解補助剤；安定剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース類、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子類等の水溶性高分子；白糖、粉糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖、乳糖、還元麦芽糖水アメ、粉末還元麦芽糖水アメ、ブドウ糖果糖液糖、果糖ブドウ糖液糖、ハチミツ、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、アスパルテーム、サッカリン、サッカリンナトリウム等の甘味剤、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等のコーティング剤等が挙げられる。
経口投与用の液体製剤は、一般的に用いられる希釈剤に溶解、懸濁または乳化されて製剤化される。希釈剤としては、例えば、精製水、エタノール、それらの混液等が挙げられる。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤、緩衝剤等を含有していてもよい。
【００２９】
非経口投与用の注射剤に用いられる添加剤としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等の等張化剤；リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等の緩衝剤；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等の保存剤；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等の増粘剤；亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等の安定化剤；塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等のｐＨ調整剤等が挙げられる。また注射剤には、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、リソレシチン、プルロニックポリオール等の非イオン界面活性剤等をさらに配合してもよい。注射剤等の液状製剤は、凍結保存または凍結乾燥等により水分を除去して保存することもできる。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
【００３０】
本発明の免疫原性組成物は、免疫系を有するあらゆる動物（ヒト、非ヒト）を投与対象とすることができる。例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス等の哺乳動物；ニワトリ、アヒル、ガチョウ等の鳥類が挙げられる。本発明の免疫原性組成物は、ヒトの小児および成人を対象とすることが好ましい。
【００３１】
本発明の免疫原性組成物の投与回数および投与間隔は特に限定されない。例えば、単回投与でもよく、約２日〜約８週間の間隔で複数回投与してもよい。免疫原性組成物の投与量は、投与対象、投与方法などにより異なるが、１回投与量を、抗原性ペプチド量として約０．０１μｇ〜約１０ｍｇとすることが好ましく、約０．１μｇ〜約１ｍｇとすることがより好ましく、約１μｇ〜約０．１ｍｇとすることがさらに好ましい。
【００３２】
本発明の免疫原性組成物は、マウスを用いた実験において、最終投与から少なくとも２か月間Ｓ１００Ａ９に対する抗体の産生を維持できること、およびその後の追加投与によりブースター効果が得られることが実証されている（実施例参照）。それゆえ、再発性虚血性脳卒中と診断された患者の約４０％が、抗血小板薬の服用を中止していた問題（非特許文献３）を考慮すれば、このように長期の作用性と追加投与のブースター効果を有する本発明の免疫原性組成物は、非心塞栓性脳卒中や一過性脳虚血発作患者の再発性脳卒中予防に非常に有用なワクチンまたは医薬を提供するものであると考えられる。
【００３３】
本発明には、以下の各発明が含まれる。
本発明の免疫原性組成物を動物に投与することを含む、血栓の予防、またはＳ１００Ａ９とＣＤ３６が関与する慢性炎症疾患の予防もしくは治療方法。
血栓の予防、またはＳ１００Ａ９とＣＤ３６が関与する慢性炎症疾患の予防もしくは治療に使用するための、本発明の免疫原性組成物。
血栓の予防用、またはＳ１００Ａ９とＣＤ３６が関与する慢性炎症疾患の予防もしくは治療用ワクチンまたは医薬を製造するための、本発明の免疫原性組成物の使用。
【００３４】
本発明の免疫原性組成物は、止血パラメータに影響を及ぼさず、有害な自己免疫応答を誘発することなく、用量依存的に閉塞時間を延長することができる。さらに、本発明の免疫原性組成物は、投与後少なくとも２か月間は抗Ｓ１００Ａ９抗体の産生を持続でき、その後の追加投与によりブースター効果を発現し、閉塞時間の延長効果をさらに持続させることができる。したがって、本発明の免疫原性組成物は、脳梗塞、心筋梗塞、閉塞性動脈硬化症、血小板増多症等の疾患における血栓予防に有用であり、特に、毎日の経口抗血小板薬の服用が困難な虚血性脳卒中患者における再発予防に非常に有用である。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例におけるマウスを用いた動物実験は、大阪大学大学院医学系研究科動物実験委員会の承認を受け、サルを用いた動物実験はシミックファーマサイエンス株式会社動物実験審査委員会の承認を受けて実施した。【００３６】
［実施例１：ワクチン投与による抗体の産生］
（１）ワクチンの設計および合成
マウスＳ１００Ａ９の抗原性ペプチドとしてＣ末端領域（第１０４〜１１３位、ＧＨＳＨＧＫＧＣＧＫ、配列番号３）のアミノ酸配列を選択した。マウスＳ１００Ａ８の抗原性ペプチドとしてＣ末端領域（第８１〜８９位、ＡＳＨＫＤＳＨＫＥ、配列番号５）のアミノ酸配列を選択した。文献「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ（１９８４）、Ｆｍｏｃ ｓｏｌｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）」および「第５版  実験化学講座１６  有機化合物の合成ＩＶ」等に記載の方法に従い、全自動固相合成機を用いて、保護ペプチド樹脂をＦｍｏｃ法で合成した。得られた保護ペプチド樹脂にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）とスカベンジャー（チオアニオール、エタンジチオール、フェノール、トリイソプロピルシラン、水等の混合物）を加えて、樹脂から切り出すとともに脱保護して、粗ペプチドを得た。この粗ペプチドを、逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ）を用いて、０．１％ＴＦＡ−Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮの系でグラジエント溶出し、精製を行った。目的物を含む画分を集め凍結乾燥して、目的のペプチドを得た。合成したペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸シーケンサーで確認した。
得られたマウスＳ１００Ａ９の抗原性ペプチド（配列番号３）およびマウスＳ１００Ａ８の抗原性ペプチド（配列番号５）を、ＥＭＣＳ（N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide）を介してＫＬＨ（Keyhole limpet hemocyanin：スカシガイヘモシアニン、株式会社ペプチド研究所）と連結（コンジュゲート）した。以下、マウスＳ１００Ａ９の抗原性ペプチド（配列番号３）とＫＬＨとのコンジュゲートを「ＳＡ９００１−Ｋ」と称し、マウスＳ１００Ａ８の抗原性ペプチド（配列番号５）とＫＬＨとのコンジュゲートを「ＳＡ８００１−Ｋ」と称する。【００３７】
（２）実験方法
７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスを日本クレアから購入した。ＳＡ８００１−Ｋワクチン群（20μg（抗原性ペプチド）／mouse）、ＳＡ９００１−Ｋワクチン低用量群（20μg（抗原性ペプチド）／mouse）、ＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群（50μg（抗原性ペプチド）／mouse）およびコントロールとしてＫＬＨ群を設けた。ＫＬＨ群のマウスには、コンジュゲートに含まれるＫＬＨと等量のＫＬＨを投与した。投与前にＳＡ８００１−Ｋ、ＳＡ９００１−ＫまたはＫＬＨ単独を等容積のフロイントアジュバント（和光純薬）と混合し、皮下投与した。初回はフロイント完全アジュバントを使用し、２回目以降はフロイント不完全アジュバントを使用した。ＳＡ９００１−Ｋワクチン低用量群およびＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群には、合計３回（０、１４および２８日目）ワクチンを投与した。ＳＡ８００１−Ｋワクチン群には、合計２回（０および１４日目）ワクチンを投与した。最終投与の２週間後（ＳＡ８００１−Ｋワクチン群は２８日目、ＳＡ９００１−Ｋワクチン群（低用量、高用量とも）は４２日目）に尾静脈から採血した。血清を分離し、本実施例の試料とした。【００３８】
Ｓ１００Ａ８またはＳ１００Ａ９に対する抗体価は、ＥＬＩＳＡで測定した。すなわち、ＢＳＡ−Ｓ１００Ａ８コンジュゲート（ペプチド研究所）またはＢＳＡ−Ｓ１００Ａ９コンジュゲート（ペプチド研究所）をコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを用いて行った。検出抗体には、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧヒツジ抗体（NA931V、GEヘルスケア）を使用した。【００３９】
ＳＡ８００１−Ｋワクチン群、ＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群およびＫＬＨ群の血清中の抗Ｓ１００Ａ８抗体および抗Ｓ１００Ａ９抗体をウエスタンブロッティングにより検出した。すなわち、リコンビナントマウスＳ１００Ａ８（アブカム）およびリコンビナントマウスＳ１００Ａ９（アブカム）をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜（ミリポア）に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜を各血清とインキュベートした後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧヒツジ抗体（NA931V、ＧＥヘルスケア）とインキュベートし、化学発光シグナルをＬＡＳ１０００カメラ（富士フィルム）で検出し、ＭｕｌｔｉＧａｕｇｅ ｖｅｒ．３．２ソフトウェア（富士フィルム）で解析した。陽性対照として、転写後のＰＶＤＦ膜を市販の抗マウスＳ１００Ａ８抗体（R＆D Systems）または抗マウスＳ１００Ａ９抗体（LifeSpan BioScience）とインキュベーションし、同様に化学発光シグナルを検出した。【００４０】
（３）結果
ＥＬＩＳＡによる抗体価の測定結果を図１（Ａ）、（Ｂ）に示した。（Ａ）はＳＡ８００１−Ｋワクチン群の結果、（Ｂ）はＳＡ９００１−Ｋワクチン低用量群およびＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群の結果である。ＳＡ８００１−Ｋワクチン投与マウス血清中のＳ１００Ａ８に対する抗体価は２８日目に完全に増加した。また、ＳＡ９００１−Ｋワクチン投与マウス血清中のＳ１００Ａ９に対する抗体価は、低用量群および高用量群とも４２日目に完全に増加した。【００４１】
ウエスタンブロッティングの結果を図２に示した。ＳＡ８００１−Ｋワクチン群（図中、S100A8 vaccine group）の血清中にはＳ１００Ａ８と反応する抗体が検出され、ＳＡ９００１−Ｋワクチン群（図中、S100A9 vaccine group）の血清中にはＳ１００Ａ９と反応する抗体が検出された。【００４２】
［実施例２：中大脳動脈閉塞に対する効果の検討］
（１）実験方法
実施例１のＳＡ８００１−Ｋワクチン群、ＳＡ９００１−Ｋワクチン低用量群、ＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群およびＫＬＨ群のマウスを用い、最終投与の３週間後に中大脳動脈閉塞試験を実施した。別途、クロピドグレル（Clopidogrel）低用量群（3mg/kg）およびクロピドグレル高用量群（6mg/kg）を設けた。クロピドグレル群には、ＳＡ９００１−Ｋワクチン群と同じスケジュール（０、１４および２８日目）で生理食塩水とフロイントアジュバントの混合物を投与したマウスを用いた。クロピドグレル（サノフィ）を水に溶解し、中大脳動脈閉塞試験実施の前日と当日に２日間連続で経口投与した。【００４３】
遠位中大脳動脈閉塞症モデルとして、Ｋａｒａｔａｓらの方法（Karatas, H. et al., J Cereb Blood Flow Metab 31, 1452-1460, 2011）に従い、塩化第二鉄誘発性血栓症マウスモデルを作製した。具体的には、１．４％イソフルレンで吸入麻酔し、体温を直腸プローブでモニターし、手術中は３７．０±０．５℃に維持した。固定台に固定したマウスを高速ドリル（リューターミニペンＬＰ−１２０、日本精密機械工作株式会社）を用いて開頭し、レーザードップラー血流計（株式会社ユニークメディカル）を頭蓋骨に設置し、局所脳血流（regional cerebral blood flow：rCBF）をモニターした。２０％塩化第二鉄に浸した濾紙を右遠位中大脳動脈上の軟膜に３分間静置した後、取り除いた。局所脳血流を損傷発生後３０分間継続的にモニターした。局所脳血流が４０％以上減少し、その減少が少なくとも５分間維持される時間を閉塞時間として記録した。【００４４】
中大脳動脈の組織学的検査は、非灌流または灌流固定の脳で行った。非灌流の場合は、塩化鉄刺激を加えた２５分後に脳に付着した状態で中大脳動脈を回収し、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した後、パラフィンに包埋した。灌流固定の場合は、塩化鉄刺激を加えた２５分後に深麻酔下で０．１Ｍリン酸緩衝液２０ｍｌを心尖部より投与し、続いて４％パラホルムアルデヒド２０ｍｌを心尖部より投与した。その後脳に付着した状態で中大脳動脈を回収し、パラフィンに包埋した。脳を厚さ３μｍの切片に切断し、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。【００４５】
（２）結果
中大脳動脈閉塞時間の結果を図３に示した。ＫＬＨ群と比較して、ＳＡ９００１−Ｋワクチン群は、中大脳動脈閉塞時間を有意に延長した（ＫＬＨ群：6.4±0.6（分）、ＳＡ９００１−Ｋワクチン低用量群：15.8±3.9（分）p<0.05、ＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群：23.3±4.3（分）p<0.01）。ＫＬＨ群と比較して、クロピドグレル低用量群には有意差が認められなかったが、クロピドグレル高用量群は、中大脳動脈閉塞時間を有意に延長した（18.6±3.4（分）p<0.01）。ＳＡ８００１−Ｋワクチン群は、中大脳動脈閉塞時間に影響を及ぼさなかった。【００４６】
病理組織学的検査の結果を図４に示した。図中左側は非潅流標本、右側は潅流固定標本であり、上段はＫＬＨ群、下段はＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群である。スケールバーは５０μｍを示す。ＫＬＨ群の非潅流標本では管腔を満たすフィブリン−血小板が豊富な血栓が観察されたが（図４Ａの矢印）、ＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群の非潅流標本では管腔を満たす血栓は観察されなかった。ＫＬＨ群の潅流固定標本では管腔は血栓で充満し閉塞していた（図４Ｂの矢頭）。一方、ＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群の潅流固定標本では血管壁に沿って小さな血栓が観察されたが、内腔は開存していた。
これらの結果から、Ｓ１００Ａ９ワクチン投与により、血栓はほとんど形成されず、形成されても脆い血栓であることが示された。【００４７】
［実施例３：血小板血栓形成に対する効果の検討］
（１）実験方法
実施例１のＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群およびＫＬＨ群から採血した血液を用いて血小板血栓形成に対するＳ１００Ａ９ワクチンの効果を評価した。陰性対照として、生理食塩水群を設けた。生理食塩水群には、ＳＡ９００１−Ｋワクチン群と同じスケジュール（０、１４および２８日目）で生理食塩水とフロイントアジュバントの混合物を投与し、最終投与の２週間後に採血した。【００４８】
Ｈｏｓｏｋａｗａらの方法（Hosokawa, K. et al., Microvasc Res 83, 154-161, 2012）に従い、自動マイクロチップ型フローチャンバーシステム（藤森工業株式会社）を用いて、血小板血栓形成アッセイを行った。具体的には、ヒルジン（25μg/ml）により抗凝固処理した全血（350μl）をコラーゲンコートマイクロチップ内に、ずり速度１０００／秒でかん流させた。その後、コンピュータ支援画像解析法（Image J:version 1.48 および GIMP 2.8）を用いて、血栓領域を定量化した。【００４９】
（２）結果
結果を図５に示した。ＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群では、生理食塩水群およびＫＬＨ群と比較して、マイクロチップ型フローチャンバーシステムにおける血小板血栓形成が有意に減少した（p<0.05）。この結果から、Ｓ１００Ａ９ワクチンが血小板機能を阻害することで、血小板血栓形成を防いでいることが明らかになった。【００５０】
［実施例４：出血に対する効果の検討］
（１）実験方法
実施例２で中大脳動脈閉塞モデルを作製したＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群、ＫＬＨ群およびクロピドグレル高用量群のマウスを用い、中大脳動脈閉塞実験の３日後に尾出血アッセイを行った。クロピドグレル高用量群には、中大脳動脈閉塞実験の翌日から尾出血アッセイの当日まで、さらに３日間連続でクロピドグレルを投与した。
尾出血アッセイは、Ｌｉｕらの方法（Liu, Y. et al., World J Exp Med 2, 30-36, 2012）に従って行った。具体的には、マウスを１．４％イソフルレンで吸入麻酔し、腹臥位に置いた後、尾の先端１ｃｍを外科用メスで切断し、直ちに３７℃に予熱した生理食塩水の入った５０ｍＬチューブに浸した。各マウスを２０分間モニターし、２０分間のうちの出血時間の合計を記録した。【００５１】
（２）結果
結果を図６に示した。ＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群とＫＬＨ群の尾出血時間に有意差は認められなかった。一方、クロピドグレル（3mg/kg）群およびクロピドグレル（6mg/kg）群は、ＫＬＨ群と比較して、尾出血時間が有意に長かった（いずれもp<0.01）。この結果から、Ｓ１００Ａ９ワクチンが出血に影響を及ぼさないことが明らかになった。【００５２】
［実施例５：血小板凝固に対する効果の検討］
（１）実験方法
実施例１のＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群およびＫＬＨ群から採血した血液を用いて血小板凝固に対するＳ１００Ａ９ワクチンの効果を評価した。
血小板数は、ＥＤＴＡを含むチューブに採血し、動物用血球計数装置のベトスキャンＨＭ２(Ａｂａｘｉｓ)を用いて計数した。凝固活性への影響は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）およびプロトロンビン時間（ＰＴ）を測定して評価した。具体的には、クエン酸ナトリウムを含むチューブに採血し、４℃で１５分間遠心分離（1500rpm）した。ａＰＴＴおよびＰＴの測定はＫＡＣ株式会社に委託した。【００５３】
（２）結果
結果を図７（Ａ）〜（Ｃ）に示した。（Ａ）は血小板数の結果、（Ｂ）はａＰＴＴの結果、（Ｃ）はＰＴの結果である。血小板数は、ＫＬＨ群（207±49×109個/L）とＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群（180±49×109個/L）で同様であった（p=0.711）。ａＰＴＴおよびＰＴについても、ＫＬＨ群とＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群の間に有意差は認められなかった（それぞれ、p=0.403、p=0.149）。これらの結果から、Ｓ１００Ａ９ワクチンは恒常性に影響を及ぼさないことが明らかになった。【００５４】
［実施例６：血清Ｓ１００Ａ９レベルに対する効果の検討］
（１）実験方法
実施例２で中大脳動脈閉塞実験を実施したＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群およびＫＬＨ群のマウスから採血した血液を用いた。具体的には、ＳＡ９００１−Ｋワクチンの投与前（免疫前）、初回投与後４２日目（ワクチン３回目投与の２週間後）および中大脳動脈閉塞実験の３日後に採血し、マウスＳ１００Ａ９ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔキット（R＆D Systems）により血清Ｓ１００Ａ９レベルを測定した。【００５５】
（２）結果
結果を図８に示した。免疫前および初回免疫の４２日後では、ＫＬＨ群およびＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群間で血清Ｓ１００Ａ９レベルに有意差は認められなかった。実験的脳卒中の３日後では、ＫＬＨ群の血清Ｓ１００Ａ９レベルは上昇しており、統計的有意差は認められなかったが、ＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群では血清Ｓ１００Ａ９レベルの上昇が抑制される傾向にあった（p=0.053）。この結果から、Ｓ１００Ａ９ワクチンは血清中のＳ１００Ａ９レベルを低下させ、Ｓ１００Ａ９による血小板凝固シグナルを抑制できることが示唆された。【００５６】
［実施例７：Ｔ細胞活性化の評価］
７−１  ＩｇＧサブクラスの決定
（１）実験方法
実施例１のＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群およびＫＬＨ群から、初回投与後４２日目（ワクチン３回目投与の２週間後）に採血した血液を試験に供した。ＳＡ９００１−Ｋワクチン投与により誘導されるＩｇＧサブクラスは、抗マウスＩｇＧサブクラス特異的ＨＲＰ標識抗体（IgG1、IgG2bおよびIgG2c）を用いてＥＬＩＳＡにより決定した。【００５７】
（２）結果
結果を図９に示した。抗Ｓ１００Ａ９抗体プールにおけるＩｇＧ１：ＩｇＧ２ｂの比率は、ＳＡ９００１−Ｋワクチン群（希釈１：２５０）において１．０よりも大きかった。この結果から、Ｓ１００Ａ９ワクチンは、Ｔｈ２型応答（ＩｇＧ１）を誘導することが示された。【００５８】
７−２  Ｓ１００Ａ９ワクチン投与によるＴ細胞活性化
（１）実験方法
Ｓ１００Ａ９ワクチン投与マウスの脾細胞を用いて、Ｔｈ１およびＴｈ２応答にそれぞれ関連するサイトカインであるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の産生を調べた。実施例１のＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群のマウスから、最終ワクチン投与の２〜３週間後に脾臓を摘出し、ＥＬＩＳＰＯＴ（enzyme-linked immunosorbent spot）アッセイに供した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、Ｐａｎｇらの方法（Pang, Z. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 111, E1256-1263, 2014）に従って実施した。具体的には、無菌９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレート（Millipore）に、抗マウスＩＦＮ−γキャプチャー抗体または抗マウスＩＬ−４キャプチャー抗体を、４℃で一晩コーティングした。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）溶液でプレートを洗浄し、１％ＢＳＡおよび５％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロースを含むＰＢＳでブロッキングした。摘出した脾臓から調製した脾細胞懸濁液をプレートに加え（106細胞/ウェル）、１０μｇ／ｍＬのＳ１００Ａ９の抗原性ペプチド（配列番号３）、ＫＬＨまたはリコンビナントＳ１００Ａ９タンパク質を加えて３７℃で４８時間刺激した。陽性対照として、イオノマイシン／ＰＭＡ（Phorbol 12-myristate 13-acetate）を用い、同様に３７℃で４８時間刺激した。ＰＢＳ−Ｔ溶液でプレートを洗浄した後、ビオチン化抗マウスＩＦＮ−γ抗体またはビオチン化抗マウスＩＬ−４抗体を、４℃で一晩、反応させた。プレートを洗浄後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼを各ウェルに加え、室温で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄後、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートＰ−トルイジン塩およびニトロブルーテトラゾリウム溶液と室温で３０分間反応させた。プレートを水で洗浄し、室温で風乾させた後、解剖顕微鏡（Zeiss Stemi 305）を用いて、染色スポットを計測した。【００５９】
（２）結果
結果を図１０（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）は各群の代表的なウェルの顕微鏡画像、（Ｂ）は染色スポット数を測定した結果である。ＫＬＨの刺激によりＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の産生が誘導され、陽性対照のイオノマイシン／ＰＭＡで処理した脾細胞と同様の両サイトカインを産生する脾細胞を有意に多数生成した。しかし、Ｓ１００Ａ９の抗原性ペプチド（図中、S100A9-epitope peptide）およびリコンビナントＳ１００Ａ９タンパク質は、無刺激およびＫＬＨ対照群と比較して有意な応答を誘発しなかった。この結果から、ＫＬＨはＳ１００Ａ９ワクチン投与マウスにおいてＴ細胞の活性化を誘導するのに十分なＴ細胞抗原決定基を含むことが明らかになった。一方、Ｓ１００Ａ９の抗原性ペプチドおよびリコンビナントＳ１００Ａ９タンパク質の刺激ではＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の産生上昇を認めなかったことから、自己タンパク質であるＳ１００Ａ９に対する細胞障害性Ｔ細胞の活性化は回避できていると考えられた。つまり、Ｓ１００Ａ９ワクチン投与マウスではＴｈ細胞は抗体産生を誘導するＴｈ２型を有意に分化したと考えられる。【００６０】
［実施例８：Ｓ１００Ａ９ワクチンの長期有効性の検討］
（１）実験方法
実施例１において、０、１４および２８日目にＳＡ９００１−ＫワクチンまたはＫＬＨを投与したＳＡ９００１−Ｋワクチン低用量群（20μg（抗原性ペプチド）／mouse）、ＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群（50μg（抗原性ペプチド）／mouse）およびＫＬＨ（コントロール）群のマウスに対し、１２６日目に追加のワクチン投与を行った。１４、２８、４２、５６、７０、８４、９８、１１２、１２６および１４０日目に尾静脈から採血し、実施例１と同じ方法で、ＥＬＩＳＡによりＳ１００Ａ９に対する抗体価を測定した。【００６１】
（２）結果
結果を図１１に示した。Ｓ１００Ａ９に対する抗体価は、４２、５６および７０日目に用量依存的に増加したが、９８日目まで徐々に減少した。４２日目において、ＳＡ９００１−Ｋワクチン低用量群よりＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群の抗体価が約６倍高かった。１２６日目に追加のワクチン投与を行った結果、追加ワクチン投与の１４日後（１４０日目）のＳ１００Ａ９に対する抗体価は、低用量群および高用量群とも顕著に増加した。この結果から、最後のＳ１００Ａ９ワクチン投与から少なくとも２か月間Ｓ１００Ａ９に対する抗体の産生を維持できること、および追加ワクチン投与によりブースター効果が得られることが実証された。【００６２】
［実施例９：ブースター免疫後のＳ１００Ａ９ワクチンの有効性および安全性の検討］
９−１  中大脳動脈梗塞時間
（１）実験方法
実施例８で追加のワクチン投与（ブースター免疫）を行った３週間後に、実施例２と同じ方法でＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群およびＫＬＨ群のマウスに対して中大脳動脈閉塞試験を実施し、梗塞時間を測定した。【００６３】
（２）結果
結果を図１２に示した。中大脳動脈閉塞時間は、ＫＬＨ群と比較して、ＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群で有意に遅延した（p<0.01）。【００６４】
９−２  尾出血時間
（１）実験方法
９−１で中大脳動脈閉塞試験を実施したマウスを用いて、同日に実施例４と同じ方法で尾出血時間を測定した。【００６５】
（２）結果
結果を図１３に示した。尾出血時間はＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群とＫＬＨ群の間に有意差は認められなかった。【００６６】
９−３  病理組織学的検査
（１）実験方法
実施例８で、１２６日目に追加のワクチン投与（ブースター免疫）を行った後、１４７日目に脳および腎臓を摘出し、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定し、パラフィンに包埋した。脳および腎臓の切片をヘマトキシリン／エオジンで染色した。また、腎臓切片を過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色した。【００６７】
（２）結果
腎臓の結果を図１４に、脳の結果を図１５にそれぞれ示した。スケールバーは１００μｍを示す。腎臓、脳ともに、明らかな病理学的変化は認められず、Ｔ細胞またはマクロファージの浸潤も観察されなかった。【００６８】
［実施例１０：Ｓ１００Ａ９／ＣＤ３６シグナル伝達に及ぼす効果の検討］
（１）実験方法
実施例１のＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群およびＫＬＨ群のマウスを用いた。最終投与の２週間後（４２日目）に、実施例２と同じ方法でマウスを開頭し、２０％塩化第二鉄含有濾紙を右遠位中大脳動脈上の軟膜に４分間静置した。その後下大静脈より採血し、血小板を回収した。血小板からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロッティングに供した。抗体には、抗ＪＮＫ抗体（Cell Signaling Technology）および抗リン酸化ＪＮＫ抗体（Cell Signaling Technology）を用いた。【００６９】
（２）結果
結果を図１６に示した。ＳＡ９００１−Ｋワクチン投与群では、血小板凝集のＳ１００Ａ９／ＣＤ３６シグナルの下流であるＪＮＫのリン酸化が抑制されていることが明らかになった。【００７０】
［実施例１１：総頸動脈閉塞に対する効果の検討］
（１）実験方法
実施例１のＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群およびＫＬＨ群のマウスを用い、最終投与の３週間後に総頸動脈閉塞試験を実施した。１．４％イソフルレンで吸入麻酔したマウスを背位固定し、頸部の皮膚を切開して右総頸動脈を露出させ、外膜を除去した。７．５％塩化第二鉄に浸した濾紙を総頸動脈上に１分間静置した後、取り除いた。レーザースペックル血流イメージャー（OMEGAZONE OZ-2、オメガウェーブ株式会社）を用いて、３０分間血流を記録した。血流が３分超停止した時間を閉塞時間として記録した。【００７１】
（２）結果
結果を図１７に示した。ＫＬＨ群と比較して、ＳＡ９００１−Ｋワクチン群は、総頸動脈閉塞時間を有意に延長した（p<0.05）。この結果から、Ｓ１００Ａ９ワクチン投与は、中大脳動脈の閉塞だけでなく、総頸動脈の閉塞に対しても有効であることが示された。【００７２】
［実施例１２：内頸静脈血栓症に対する効果の検討］
（１）実験方法
実施例１のＳＡ９００１−Ｋワクチン高用量群およびＫＬＨ群のマウスを用い、最終投与の３週間後に内頸静脈血栓症試験を実施した。１．４％イソフルレンで吸入麻酔したマウスを背位固定し、頸部の皮膚を切開して内頸静脈を露出させ、１０％塩化第二鉄に浸した濾紙を総頸動脈上に３分間静置した後、取り除いた。レーザースペックル血流イメージャー（OMEGAZONE OZ-2、オメガウェーブ株式会社）を用いて、３０分間血流を記録した。血流が３分超停止した時間を閉塞時間として記録した。【００７３】
（２）結果
結果を図１８に示した。ＫＬＨ群とＳＡ９００１−Ｋワクチン群の間に有意差は認められなかったが（P=0.062）、ＳＡ９００１−Ｋワクチン群は、ＫＬＨ群と比較して、内頸静脈閉塞時間の遅延傾向が認められた。【００７４】
［実施例１３：サルに対するヒトＳ１００Ａ９ワクチン投与による抗体の産生］
（１）ＫＬＨ−ヒトＳ１００Ａ９抗原性ペプチドコンジュゲートワクチンの調製
配列番号１で示されるアミノ酸配列（ＧＨＨＨＫＰＧＬＧＥ）からなるペプチドを、全自動固相合成機を用いてＦｍｏｃ法で合成した。Ｃ末端にシステインを付加し、ついでＣ末端をアミド化した。得られたペプチドをＥＭＣＳ（N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide）を用いてＫＬＨとコンジュゲートした。以下、ヒトＳ１００Ａ９の抗原性ペプチド（配列番号１）とＫＬＨとのコンジュゲートを「ＳＡ９００２−Ｋ」と称する。【００７５】
ＧＨＨＨＫＰＧＬＧＥ−Ｃ−ＮＨ２とＫＬＨとのコンジュゲート（ＳＡ９００２−Ｋ）は以下の方法で作製した。
ＥＭＣ（6-maleimidocaproyl）化ＫＬＨは、ＫＬＨ（300 mg）のリン酸緩衝液（pH8.0）溶液に、N-(6-maleimidocaproyloxy) succinimide（EMCS 40 mg）のＤＭＳＯ溶液を滴下し、３時間攪拌後、塩溶液に対する透析を三回繰り返して調製した。続いて、ペプチド（6 mg）をリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、ＥＭＣ化ＫＬＨ（25 mg）溶液に滴下後、室温で終夜攪拌した。終夜攪拌した反応溶液は、Ｈ２Ｏに対する透析を三回繰り返した後、透析内液を凍結乾燥して目的物を得た。収量は２４ｍｇであった。ペプチドがキャリアタンパク質に導入されていることをアミノ酸分析により確認した（結果：49〜62 nmol peptide/mg conjugate）。【００７６】
（２）実験方法
実験は、シミックファーマサイエンス株式会社にて行った。３〜４年齢の雄カニクイザル２匹をハムリー株式会社から購入した。ＳＡ９００２−Ｋを、生理食塩水を用いて抗原性ペプチド濃度が０．４ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、等量のアラムと混合して０．２ｍｇ／ｍｌのヒトＳ１００Ａ９ワクチンを調製した。０、１４および２８日目に、このヒトＳ１００Ａ９ワクチンを、１匹あたり１０か所に０．１ｍｌずつ皮下投与した。４２日目に採血して血清を分離し、抗体価測定に供した。【００７７】
（３）抗体価の測定
ヒトＳ１００Ａ９ワクチンに対する抗体価および組換えヒトＳ１００Ａ９タンパク質に対する抗体価をＥＬＩＳＡで測定した。
ヒトＳ１００Ａ９の抗原性ペプチド（配列番号１）とＢＳＡとのコンジュゲートを１０μｇ／ｍｌに、組換えヒトＳ１００Ａ９タンパク質を２μｇ／ｍｌに、それぞれ５０ｍＭ炭酸緩衝液を用いて希釈した。各希釈液を５０μｌずつウェルに添加して４℃で一晩インキュベートした。ウェルに残存した溶液を廃棄後、１００％ヤギ血清を添加し室温で２時間ブロッキングした。サル血清を１００％ヤギ血清で段階希釈し、５０μｌずつウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄後、Goat Anti-Monkey IgG H&L (HRP)（abcam）を、５％スキムミルクで希釈して各ウェルに添加し、室温で３時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄後、ＴＭＢ溶液を５０μｌずつウェルに添加し、遮光下室温で３０分間インキュベートした。その後、反応停止液（0.5N H2SO4）を加え、マイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。【００７８】
（４）結果
結果を図１９に示した。（Ａ）はヒトＳ１００Ａ９抗原性ペプチド（配列番号１）とＢＳＡとのコンジュゲートに対する抗体価の測定結果、（Ｂ）は組換えヒトＳ１００Ａ９に対する抗体価の測定結果である。抗体価は、half-maximal antibody titer（OD50 %）で示した。いずれの抗体価も、６週間後に顕著に増加していた。【００７９】
［実施例１４：ＳＡ９００１−Ｋワクチン以外のマウスＳ１００Ａ９抗原性ペプチドとＫＬＨとのコンジュゲートワクチン投与による抗体の産生］
（１）マウスＳ１００Ａ９の抗原性ペプチドとＫＬＨとのコンジュゲート調製
マウスＳ１００Ａ９の抗原性ペプチドとして、マウスＳ１００Ａ９のアミノ酸配列（配列番号４）の第９７〜１０６位のアミノ酸配列（ＥＮＮＰＲＧＨＧＨＳ、配列番号２１）、第２〜１１位のアミノ酸配列（ＡＮＫＡＰＳＱＭＥＲ、配列番号２２）および第２５〜３４位のアミノ酸配列（ＲＫＥＧＨＰＤＴＬＳ、配列番号２３）を選択した。３種類のペプチドを、全自動固相合成機を用いてＦｍｏｃ法で合成した。ＥＮＮＰＲＧＨＧＨＳ（配列番号２１）についてはＣ末端をアミド化し、グルタルアルデヒドを介してＫＬＨとコンジュゲートした。ＡＮＫＡＰＳＱＭＥＲ（配列番号２２）についてはＮ末端をアセチル化し、Ｃ末端にシステインを付加した後Ｃ末端をアミド化し、ＥＭＣＳを介してＫＬＨとコンジュゲートした。ＲＫＥＧＨＰＤＴＬＳ（配列番号２３）については、グルタルアルデヒドを介してＫＬＨとコンジュゲートした。以下、マウスＳ１００Ａ９の抗原性ペプチド（配列番号２１）とＫＬＨとのコンジュゲートを「ＳＡ９００３−Ｋ」と称し、マウスＳ１００Ａ９の抗原性ペプチド（配列番号２２）とＫＬＨとのコンジュゲートを「ＳＡ９００４−Ｋ」と称し、マウスＳ１００Ａ９の抗原性ペプチド（配列番号２３）とＫＬＨとのコンジュゲートを「ＳＡ９００５−Ｋ」と称する。【００８０】
ＥＮＮＰＲＧＨＧＨＳ−ＮＨ２とＫＬＨとのコンジュゲート（ＳＡ９００３−Ｋ）は以下の方法で作製した。
５ｍｇのペプチドをリン酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、２０ｍｇのＫＬＨと混合した。２５％グルタルアルデヒド水溶液３０μＬを滴下後、室温で５時間攪拌（pH8.0）した。５時間後、０．５ｍＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH7.5）を添加し、終夜攪拌した。終夜攪拌した反応溶液は、Ｈ２Ｏに対する透析を三回繰り返した後、透析内液を凍結乾燥して目的物を得た。収量は２６ｍｇであった。ペプチドがキャリアタンパク質に導入されていることをアミノ酸分析により確認した（結果：63〜66 nmol peptide/mg conjugate）。【００８１】
Ａｃ−ＡＮＫＡＰＳＱＭＥＲ−Ｃ−ＮＨ２とＫＬＨとのコンジュゲート（ＳＡ９００４−Ｋ）は以下の方法で作製した。
ＥＭＣ（6-maleimidocaproyl）化ＫＬＨは、ＫＬＨ（300 mg）のリン酸緩衝液（pH8.0）溶液に、N-(6-maleimidocaproyloxy) succinimide（EMCS 40 mg）のＤＭＳＯ溶液を滴下し、３時間攪拌後、塩溶液に対する透析を三回繰り返して調製した。続いて、ペプチド（6 mg）を６Ｍグアニジン／リン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、ＥＭＣ化ＫＬＨ（20 mg）溶液に滴下後、室温で終夜攪拌した。終夜攪拌した反応溶液は、Ｈ２Ｏに対する透析を三回繰り返した後、透析内液を凍結乾燥して目的物を得た。収量は２１ｍｇであった。ペプチドがキャリアタンパク質に導入されていることをアミノ酸分析により確認した（結果：102〜105 nmol peptide/mg conjugate）。【００８２】
ＲＫＥＧＨＰＤＴＬＳとＫＬＨとのコンジュゲート（ＳＡ９００５−Ｋ）は以下の方法で作製した。
５ｍｇのペプチドをリン酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、２５ｍｇのＫＬＨと混合した。２５％グルタルアルデヒド水溶液５０μＬを滴下後、室温で５時間攪拌（pH8.0）した。５時間後、０．５ｍＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH7.5）を添加し、終夜攪拌した。終夜攪拌した反応溶液は、Ｈ２Ｏに対する透析を三回繰り返した後、透析内液を凍結乾燥して目的物を得た。収量は３１ｍｇであった。ペプチドがキャリアタンパク質に導入されていることをアミノ酸分析により確認した（結果：80〜90 nmol peptide/mg conjugate）。【００８３】
（２）実験方法
７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスを日本クレアから購入した。ＳＡ９００３−Ｋワクチン群（50μg（抗原性ペプチド）／mouse）、ＳＡ９００４−Ｋワクチン群（50μg（抗原性ペプチド）／mouse）およびＳＡ９００５−Ｋワクチン群（50μg（抗原性ペプチド）／mouse）を設けた。各コンジュゲートを等容積のＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ（商品名、Titer Max 社）と混合し、８週齢時および１０週齢時に皮下投与した。投与前、初回投与後２、４、６、８および１０週に尾静脈から採血した。血清を分離し、抗体価を測定した。【００８４】
ＳＡ９００３−Ｋ、ＳＡ９００４−ＫまたはＳＡ９００５−Ｋに対する抗体価は、ＥＬＩＳＡで測定した。すなわち、ＢＳＡ−ＳＡ９００３コンジュゲート（ペプチド研究所）、ＢＳＡ−ＳＡ９００４コンジュゲート（ペプチド研究所）またはＢＳＡ−ＳＡ９００５コンジュゲート（ペプチド研究所）をコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを用いて行った。検出抗体には、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧヒツジ抗体（NA931V、GEヘルスケア）を使用した。【００８５】
（３）結果
ＳＡ９００３−Ｋの結果を図２０に、ＳＡ９００４−Ｋの結果を図２１にそれぞれ示した。どちらのワクチンも１０週目まで経時的に抗体価が増加した。ＳＡ９００５−Ｋも同様に１０週目まで経時的に抗体価が増加した。【００８６】
［実施例１５：動脈硬化に対する効果］
（１）実験方法
実験には、ＡｐｏＥ欠損マウス（Kawakami R et al., 2018, PLoS ONE 13(2): e0191895 参照）を使用した。ＡｐｏＥ欠損マウスの作製は株式会社ケー・エー・シーに委託した。Ｓ１００Ａ９ワクチンとして、ＳＡ９００１−Ｋを使用した。
８週齢の雄性ＡｐｏＥ欠損マウスを、ＳＡ９００１−Ｋワクチン群（n=5）および対照群（n=3）の２群に群分けした。Ｓ１００Ａ９群には、８週齢時と１０週齢時にＳＡ９００１−Ｋ（50μg（抗原性ペプチド）／mouse）を、等量のＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ（商品名、Titer Max 社）と混合して皮下投与した。両群に８週齢から２０週齢までの１２週間、高脂肪食を自由摂取させた。２０週齢時に、深麻酔下で４％パラホルムアルデヒドを用いて灌流固定し、心臓から腸骨動脈にかけて動脈を摘出した。動脈硬化病変の評価のため、ｏｉｌ Ｏ ｒｅｄ染色を施しプラーク面積を解析した。【００８７】
（２）結果
ＳＡ９００１−Ｋワクチン群は５匹中２匹に、対照群は３匹中３匹に動脈硬化病変が観察された。動脈硬化病変はいずれも大動脈弓部に観察された。プラーク面積（ｏｉｌ Ｏ ｒｅｄ染色陽性部位の面積）を解析した結果を図２２に示した。ＳＡ９００１−Ｋワクチン群（図中A9）のプラーク面積は、対照群（図中CTRL）と比較して有意に低値であった（mean ± SD, 0.04 ± 0.068 (mm2) vs 0.42 ± 0.28 (mm2)、p=0.022）。この結果により、Ｓ１００Ａ９ワクチンは動脈硬化を抑制することが示された。【００８８】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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