(57)【要約】要約  ３−オキソアジピル−ＣｏＡを３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡへと還元する反応を触媒する酵素をコードする核酸を導入した遺伝子改変微生物が開示されている。遺伝子改変微生物は、以下（ａ）〜（ｃ）に記載のポリペプチドをコードする核酸を導入、又は当該ポリペプチドの発現を増強したものである。（ａ）配列番号１〜６、２１３のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）これらのいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−オキソアジピル−ＣｏＡを還元して３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（ｃ）これらのいずれかのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３−オキソアジピル−ＣｏＡを還元して３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを生成する活性を有するポリペプチド。
2019107516.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸を導入、または当該ポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物：
（ａ）配列番号１〜６及び２１３のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１〜６及び２１３のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−オキソアジピル−ＣｏＡを還元して３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１〜６及び２１３のいずれかのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３−オキソアジピル−ＣｏＡを還元して３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
前記（ｂ）及び（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドが、配列番号２１２のアミノ酸配列からなる領域を含む、請求項１記載の遺伝子改変微生物。
【請求項３】
前記配列番号２１２のアミノ酸配列において、Ｎ末端側から１３番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンまたはロイシンであり、Ｎ末端側から１５番目のアミの酸残基がロイシンまたはグルタミンであり、Ｎ末端側から１６番目のアミノ酸残基がリシンまたはアスパラギンであり、Ｎ末端側から１７番目のアミノ酸残基がグリシンまたはセリンであり、Ｎ末端側から１９番目のアミノ酸残基がプロリンまたはアルギニンであり、Ｎ末端側から２１番目のアミノ酸残基が好ましくはロイシン、メチオニンまたはバリンである、請求項２記載の遺伝子改変微生物。
【請求項４】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属からなる群から選ばれる微生物の遺伝子改変体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項５】
アセチル−ＣｏＡ及びスクシニル−ＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡ及び補酵素Ａを生成する能力及び３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡから３−ヒドロキシアジピン酸を生成する能力を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項６】
アセチル−ＣｏＡ及びスクシニル−ＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡ及び補酵素Ａを生成する能力、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡから２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡを生成する能力及び２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡからα−ヒドロムコン酸を生成する能力を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項７】
アセチル−ＣｏＡ及びスクシニル−ＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡ及び補酵素Ａを生成する能力、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡから２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡを生成する能力、２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡからアジピル−ＣｏＡを生成する能力及びアジピル−ＣｏＡからアジピン酸を生成する能力を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、３−ヒドロキシアジピン酸の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜４及び６のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、α−ヒドロムコン酸の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜４及び７のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、アジピン酸の製造方法。
【請求項１１】
Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物において５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子と遺伝子クラスターを構成する３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子にコードされるポリペプチドをコードする核酸を導入または当該ポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、３−ヒドロキシアジピン酸、α−ヒドロムコン酸及びアジピン酸からなる群から選ばれる１つ以上の物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的物質の生産に関与するポリペプチドをコードする核酸を導入、または当該ポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物及び当該微生物を用いた物質製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
３−ヒドロキシアジピン酸（ＩＵＰＡＣ名：３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｅｄｉｏｉｃ  ａｃｉｄ）、α−ヒドロムコン酸（ＩＵＰＡＣ名：（Ｅ）−ｈｅｘ−２−ｅｎｅｄｉｏｉｃ  ａｃｉｄ）およびアジピン酸（ＩＵＰＡＣ名：ｈｅｘａｎｅｄｉｏｉｃ  ａｃｉｄ）は炭素数６のジカルボン酸である。これらは多価アルコールと重合することでポリエステルとして、また多価アミンと重合することでポリアミドの原料として用いることができる。また、これらの末端にアンモニアを付加してラクタム化することで、単独でもポリアミドの原料になり得る。【０００３】
微生物を利用した３−ヒドロキシアジピン酸の生合成に関連する文献の例としては、非天然の微生物を用いた１，３−ブタジエンの製造に関する特許文献１の中で、スクシニル−ＣｏＡから１，３−ブタジエンを生合成する経路において微生物内で生成する代謝中間体として３−ヒドロキシアジピン酸（３−ヒドロキシアジペート）が記載されている。【０００４】
微生物を利用したα−ヒドロムコン酸の生合成に関連する文献の例としては、非天然の微生物を用いたムコン酸の製造に関する特許文献２の中で、スクシニル−ＣｏＡからｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸を生合成する経路において微生物内で生成する代謝中間体としてα−ヒドロムコン酸（２，３−デヒドロアジペート）が記載されている。【０００５】
微生物を利用したアジピン酸の生合成に関連する文献の例としては、非天然の微生物を用いたアジピン酸の製造に関する特許文献３の中で、スクシニル−ＣｏＡからアジピン酸を生合成する逆アジペート分解経路が記載されている。【０００６】
特許文献１から３に記載された生合成経路では、いずれも３−オキソアジピル−ＣｏＡを３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡへと還元する酵素反応を経由するとの記載がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１３−５３５２０３号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１１／０１２４９１１Ａ１号明細書
【特許文献３】特表２０１１−５１５１１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１または２には、微生物内で３−ヒドロキシアジピン酸またはα−ヒドロムコン酸が生成しうる代謝経路の記載はあるが、代謝を３−ヒドロキシアジピン酸またはα−ヒドロムコン酸で止め、培養液中に分泌させるという記載はない。また、特許文献１から３に記載された３−オキソアジピル−ＣｏＡを３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡへと還元する反応を触媒する酵素をコードする核酸を導入した非天然の微生物を用いて、実際に３−ヒドロキシアジピン酸、α−ヒドロムコン酸またはアジピン酸が製造できるかどうかの検証はなされていない。従って特許文献１から３に記載された３−オキソアジピル−ＣｏＡを３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡへと還元する反応を触媒する酵素についても、３−ヒドロキシアジピン酸、α−ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸の製造において優れた活性を示す当該酵素の存在は未だ知られていなかった。【０００９】
そこで本発明では、３−オキソアジピル−ＣｏＡを基質とした還元反応において優れた活性を示す酵素をコードする核酸を導入、または当該酵素の発現を増強した遺伝子改変微生物及び当該改変微生物を用いた物質製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記目的を達成するため鋭意検討した結果、アミノ酸配列が類似する一群のポリペプチドが、３−オキソアジピル−ＣｏＡを３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡへと還元する反応を触媒する優れた活性を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。【００１２】
（１）  以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸を導入、または当該ポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物：
（ａ）配列番号１〜６及び２１３のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１〜６及び２１３のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−オキソアジピル−ＣｏＡを還元して３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１〜６及び２１３のいずれかのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３−オキソアジピル−ＣｏＡを還元して３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド。
（２）  前記（ｂ）及び（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドが、配列番号２１２のアミノ酸配列からなる領域を含む、（１）記載の遺伝子改変微生物。
（３）  前記配列番号２１２のアミノ酸配列において、Ｎ末端側から１３番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンまたはロイシンであり、Ｎ末端側から１５番目のアミの酸残基がロイシンまたはグルタミンであり、Ｎ末端側から１６番目のアミノ酸残基がリシンまたはアスパラギンであり、Ｎ末端側から１７番目のアミノ酸残基がグリシンまたはセリンであり、Ｎ末端側から１９番目のアミノ酸残基がプロリンまたはアルギニンであり、Ｎ末端側から２１番目のアミノ酸残基が好ましくはロイシン、メチオニンまたはバリンである、（２）記載の遺伝子改変微生物。
（４）  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属からなる群から選ばれる微生物の遺伝子改変体である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
（５）  アセチル−ＣｏＡ及びスクシニル−ＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡ及び補酵素Ａを生成する能力及び３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡから３−ヒドロキシアジピン酸を生成する能力を有する、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
（６）  アセチル−ＣｏＡ及びスクシニル−ＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡ及び補酵素Ａを生成する能力、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡから２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡを生成する能力及び２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡからα−ヒドロムコン酸を生成する能力を有する、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
（７）  アセチル−ＣｏＡ及びスクシニル−ＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡ及び補酵素Ａを生成する能力、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡから２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡを生成する能力、２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡからアジピル−ＣｏＡを生成する能力及びアジピル−ＣｏＡからアジピン酸を生成する能力を有する、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物。
（８）  （１）〜（５）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、３−ヒドロキシアジピン酸の製造方法。
（９）  （１）〜（４）及び（６）のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、α−ヒドロムコン酸の製造方法。
（１０）  （１）〜（４）及び（７）のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、アジピン酸の製造方法。
（１１）  Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物において５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子と遺伝子クラスターを構成する３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子にコードされるポリペプチドをコードする核酸を導入または当該ポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地にて培養することを含む、３−ヒドロキシアジピン酸、α−ヒドロムコン酸及びアジピン酸からなる群から選ばれる１つ以上の物質の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る遺伝子改変微生物は、３−オキソアジピル−ＣｏＡから３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡへの還元反応において優れた活性を示す酵素を発現することから、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを経由して生成する３−ヒドロキシアジピン酸、α−ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸の生産性に優れる。【００１４】
本発明に係る物質製造方法は、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを経由して生成する３−ヒドロキシアジピン酸、α−ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸の生産性に優れる遺伝子改変微生物を用いるため、これらの物質の生産性を大幅に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子と、５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子とが構成する遺伝子クラスターを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の微生物は、以下（ａ）〜（ｃ）に記載のポリペプチドをコードする核酸を導入、または当該ポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物である。
（ａ）配列番号１〜６および２１３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１〜６および２１３のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−オキソアジピル−ＣｏＡを還元して３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１〜６および２１３のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３−オキソアジピル−ＣｏＡを還元して３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを生成する活性を有するポリペプチド
【００１７】
以下、本明細書中では３−オキソアジピル−ＣｏＡを還元して３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素を「３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ」と記載する。また、本明細書では３−ヒドロキシアジピン酸を３ＨＡ、α−ヒドロムコン酸をＨＭＡ、アジピン酸をＡＤＡと略すことがある。
【００１８】
本発明で核酸を導入するとは、微生物の菌体外から菌体内へと核酸を導入し、該微生物に該核酸がコードするポリペプチドの生産能を付与することを指す。導入する方法は特に限定されず、微生物内で自律複製可能な発現ベクターに当該核酸を組み込み宿主微生物に導入する方法や、微生物のゲノムに当該核酸を組み込む方法などを用いることができる。
【００１９】
本発明でポリペプチドの発現を増強するとは、微生物が元来有しているポリペプチドの発現を増強することを指す。発現を増強する方法は特に限定されないが、当該ポリペプチドをコードする核酸のコピー数を増加させる方法、当該ポリペプチドのコーディング領域上流のプロモーター領域やリボソーム結合配列を改変する方法などが挙げられる。これらの方法は単独で行ってもよいし、組み合わせてもよい。
【００２０】
また、導入する核酸は１種類でも複数種類でもよい。また核酸の導入とポリペプチドの発現の増強を組み合わせてもよい。
【００２１】
本発明で用いる、配列番号１〜６および２１３のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼの酵素活性を有するポリペプチドついて、「１もしくは数個」の範囲は、１０個以内が好ましく、さらに好ましくは５個以内、特に好ましくは４個以内、最も好ましくは１個又は２個以内である。ここで、アミノ酸が置換される場合、性質が類似したアミノ酸に置換された場合（いわゆる保存的置換）にポリペプチドの活性が維持される可能性が高くなる。すなわち、アミノ酸が置換する場合、類似した性質のアミノ酸に置換しても生理活性が維持される場合が多いので、置換の場合は、類似した性質のアミノ酸に置換したものが好ましい。すなわち、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多い。
【００２２】
本発明で用いる、配列番号１〜６および２１３のいずれかのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼの酵素活性を有するポリペプチドについて、配列同一性の好ましい範囲は、８０％以上が好ましく、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
【００２３】
本発明で「配列同一性」とは、２つのアミノ酸配列または塩基配列にギャップを導入して、またはギャップを導入しないで整列させた場合の、最適なアライメントにおいて、オーバーラップする全アミノ酸配列（翻訳開始点となるアミノ酸を含む）または塩基配列（開始コドンを含む）に対する同一アミノ酸または塩基の割合（パーセンテージ）を意味し、式（１）によって算出する。式（１）において、比較する短い方の配列長は４００アミノ酸以上であり、４００アミノ酸未満の場合には配列同一性は定義されない。配列同一性は、この分野で汎用されているアルゴリズムであるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用いて容易に調べることができる。例えばＢＬＡＳＴは、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）やＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）などのウェブサイトから誰でも利用可能であり、デフォルトのパラメーターを用いて容易に配列同一性を調べることができる。また、配列同一性はＧｅｎｅｔｙｘなどのソフトウェアに搭載されている同様の機能を用いても調べることができる。
【００２４】
配列同一性（％）＝一致数（ギャップ同士はカウントしない）／短い方の配列長（両端のギャップを含まない長さ）×１００・・・式（１）
式（１）に従い、Ｇｅｎｅｔｙｘの機能（％Ｉｄｅｎｔｉｔｙ  Ｍａｔｒｉｘ）を用いて配列番号１〜６および２１３に記載のアミノ酸配列間の配列同一性を算出すると、最も配列同一性の値が低い配列番号２と４との値は７１．５１％となり、配列番号１〜６および２１３に記載のアミノ酸配列は、お互いに少なくとも７０％以上の配列同一性を有している。Ｇｅｎｅｔｙｘを用いた配列同一性の算出結果を表１に示す。なお、下記表１〜表５において、一番左側の数字は配列番号を示す。
【００２５】
【表１】
2019107516.tif 000003
【００２６】
配列番号１〜６および２１３に記載の各アミノ酸配列をＱｕｅｒｙとして、ＮＣＢＩのアミノ酸データベース（Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に登録されている全アミノ酸配列との配列同一性を、ＢＬＡＳＴＰを用いて調べた結果、配列同一性が７０％以上の配列は全てＳｅｒｒａｔｉａ属細菌由来であった。
【００２７】
前記（ａ）の配列番号１〜６および２１３に記載のポリペプチドは、いずれもＮ末端側からのアミノ酸残基１５〜３８番目（以下、便宜的に、Ｎ末端側から何番目のアミノ酸残基かを、「a.a.」で表すことがある。したがって、例えば、Ｎ末端側からのアミノ酸残基１５〜３８番目は、単に「１５〜３８a.a.」と表すことがある）において配列番号２１２に示す２４アミノ酸残基からなる共通配列１を有している。共通配列１において、Ｘａａは任意のアミノ酸残基であるが、１３a.a.は好ましくはフェニルアラニンまたはロイシンであり、１５a.a.は好ましくはロイシンまたはグルタミンであり、１６a.a.は好ましくはリシンまたはアスパラギンであり、１７a.a.はグリシンまたはセリン、より好ましくはグリシンであり、１９a.a.は好ましくはプロリンまたはアルギニンであり、２１a.a.は好ましくはロイシン、メチオニンまたはバリンである。共通配列１は、ＮＡＤ＋結合残基およびその周辺のアミノ酸残基にあたる。ＮＡＤ＋結合残基は、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．  ２０１２  Ｆｅｂ；９４（２）：４７１−８．で示されているように、共通配列１の２４番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸であるが、共通配列１ではアスパラギンである点が特徴である。共通配列１を有することによって、配列番号１〜６および２１３に記載のポリペプチドは、３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼとしての優れた酵素活性を示すと考える。
【００２８】
前記（ｂ）および（ｃ）に記載のポリペプチドについても、１〜２００a.a.以内に配列番号２１２に示す２４アミノ酸残基からなる共通配列１を有していることが好ましい。より好ましい共通配列の位置は、１〜１５０a.a.以内であり、さらに好ましくは、１〜１００a.a.以内である。その具体例としては、配列番号７〜１６および７０〜１３８のアミノ酸配列が挙げられる。配列番号７〜１６および７０〜１３８のアミノ酸配列は、１５〜３８a.a.において配列番号２１２に示す２４アミノ酸残基からなる共通配列１を有している。なお、配列番号７〜１６および７０〜１３８のアミノ酸配列は、配列番号１〜６および２１３のいずれかのアミノ酸配列と配列同一性が９０％以上である。Ｇｅｎｅｔｙｘを用いた配列同一性の算出結果を表２−１から表２−３および表３−１から表３−３に示す。
【００２９】
【表２−１】
2019107516.tif 000004
【００３０】
【表２−２】
2019107516.tif 000005
【００３１】
【表２−３】
2019107516.tif 000006
【００３２】
【表３−１】
2019107516.tif 000007
【００３３】
【表３−２】
2019107516.tif 000008
【００３４】
【表３−３】
2019107516.tif 000009
【００３５】
本発明の（ａ）〜（ｃ）に記載のポリペプチドをコードする核酸は、当該ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端にさらなるペプチド又はタンパク質が付加されるような配列を含んでいてもよい。このようなペプチド又はタンパク質としては、例えば、分泌シグナル配列、輸送タンパク質、結合タンパク質、精製用のタグペプチド、蛍光タンパク質等を含むものが例示できる。こうしたペプチド又はタンパク質に関しては、当業者が目的に応じて、付加する機能を有するペプチド又はタンパク質を選択して、本発明のポリペプチドに付加することができる。なお、アミノ酸配列の配列同一性には、このようなペプチド又はタンパク質は含まれない。
【００３６】
配列番号１〜１６、７０〜１３８または２１３に記載のポリペプチドをコードする核酸は、配列番号１〜１６または７０〜１３８に記載のアミノ酸配列に翻訳されうるような塩基配列であれば特に限定されず、各アミノ酸に対応するコドン（標準遺伝暗号）を参考に決定することができる。その際、本発明に使用する宿主微生物にとってよく使用されているコドンで塩基配列を再設計してもよい。
【００３７】
配列番号１〜１６、７０〜１３８および２１３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸の塩基配列の具体例としては、それぞれ、配列番号５４〜６９、１３９〜２０７および２１４に記載の塩基配列が挙げられる。
【００３８】
本発明において、ある核酸がコードするポリペプチドが、３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有しているかどうかは、以下の形質転換株Ａと形質転換株Ｂを作製し、培養試験の結果、培養液中に３−ヒドロキシアジピン酸またはα−ヒドロムコン酸を確認することができれば、当該核酸が３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードしていると判断する。判断方法を下記スキーム１に示す生合成経路を用いて説明する。
【００３９】
【化１】
2019107516.tif 000010
【００４０】
上記スキーム１は、３−ヒドロキシアジピン酸、α−ヒドロムコン酸、および／またはアジピン酸を生産するために必要な反応経路の例を示している。ここで、反応Ａは、アセチル−ＣｏＡおよびスクシニル−ＣｏＡから３−オキソアジピル−ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する反応を示す。反応Ｂは、３−オキソアジピル−ＣｏＡから３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを生成する反応を示す。反応Ｃは、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡから２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡを生成する反応を示す。反応Ｄは、２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡからアジピル−ＣｏＡを生成する反応を示す。反応Ｅは３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡから３−ヒドロキシアジピン酸を生成する反応を示す。反応Ｆは、２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡからα−ヒドロムコン酸を生成する反応を示す。反応Ｇは、アジピル−ＣｏＡからアジピン酸を生成する反応を示す。
【００４１】
形質転換株Ａは、反応Ａ，反応Ｅおよび反応Ｆを触媒する酵素を有する。形質転換株Ｂは、反応Ａ、反応Ｃ、反応Ｅおよび反応Ｆを触媒する酵素を有する。
【００４２】
まず、形質転換株Ａを作製する。反応Ａ、反応Ｅおよび反応Ｆをそれぞれ触媒する酵素を発現するプラスミドを作製する。なお、反応ＥとＦは同一の酵素で反応を触媒することが可能である。当該プラスミドを、３−ヒドロキシアジピン酸、α−ヒドロムコン酸、及びアジピン酸のいずれも生産する能力のない微生物株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入する。得られた形質転換株に対し、酵素活性の有無を調べる対象となるポリペプチドをコードする核酸を適当なプロモーターの下流に組み込んだ発現プラスミドを導入し、形質転換株Ａを得る。形質転換株Ａを培養し、培養後の培養液に３−ヒドロキシアジピン酸が含まれているかどうかを確認する。３−ヒドロキシアジピン酸が培養液中に確認できた場合、次に形質転換株Ｂを作製する。形質転換株Ｂは、形質転換株Ａに対し、反応Ｃを触媒する酵素を発現するプラスミドを作製して導入することで得る。形質転換株Ｂを培養し、培養後の培養液にα−ヒドロムコン酸が含まれているかどうかを確認する。培養後の培養液にα−ヒドロムコン酸が含まれることを確認することができれば、形質転換株Ａが生産した３−ヒドロキシアジピン酸および形質転換株Ｂが生産したα−ヒドロムコン酸は、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを経由して生成されたことがわかるため、対象となるポリペプチドが３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有していると判断する。
【００４３】
反応Ａを触媒する酵素をコードする遺伝子として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株由来のｐｃａＦ（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：  １０４１７５５、配列番号２０）を用いる。
【００４４】
反応ＥおよびＦを触媒する酵素をコードする遺伝子として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株由来のｐｃａＩおよびｐｃａＪ（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：  １０４６６１３、１０４６６１２、配列番号２３、２４）の全長を含む連続した配列を用いる。ｐｃａＩおよびｐｃａＪがコードするポリペプチドは、複合体を形成することによって反応Ｅと反応Ｆを触媒する。
【００４５】
反応Ｃを触媒する酵素をコードする核酸として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株遺伝子ｐａａＦ（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：  １０４６９３２、配列番号４７）を用いる。
【００４６】
形質転換株Ａ、形質転換株Ｂの培養方法は、以下のとおりである。なお培養の際には、プラスミドを安定に保持するための抗生物質や、組み込んだ核酸がコードするポリペプチドの発現を誘導する物質を適宜加えることができる。ｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）５ｍＬに、形質転換株ＡまたはＢを一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ−１で１８時間振とう培養し、前培養液とする。続いて当該前培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（コハク酸１０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ）５ｍＬに添加し、３０℃、１２０ｍｉｎ−１で２４時間振とう培養する。得られた培養液中に３−ヒドロキシアジピン酸またはα−ヒドロムコン酸が含まれているかを確認する。
【００４７】
培養液中に３−ヒドロキシアジピン酸またはα−ヒドロムコン酸が含まれることは、培養液を遠心し、上清をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析することにより確認できる。分析の条件は以下のとおりである。
【００４８】
・ＨＰＬＣ：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ  ｈｙｄｒｏ−ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ：Ｔｒｉｐｌｅ−Ｑｕａｄ  ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩ  ネガティブモード。
【００４９】
３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼの活性の値は、３−オキソアジピン酸から酵素反応で調製した３−オキソアジピル−ＣｏＡを基質として、精製３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼを用いて生成する３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを測定することで算出できる。具体的な方法は、以下の通りである。
【００５０】
３−オキソアジピン酸は公知の方法（例えば、ＷＯ２０１７／０９９２０９の参考例１に記載された方法）により調製することができる。
【００５１】
３−オキソアジピル−ＣｏＡ溶液の調製：常法に従いＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸（ｐｃａＩおよびｐｃａＪ、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：１０４６６１３および１０４６６１２）の全長を増幅する。なお、このＰＣＲで用いるプライマーの塩基配列は、例えば配列番号２５および２６である。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ−１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の３−オキソアジピル−ＣｏＡ調製用酵素反応溶液を調製し、２５℃で３分分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、得られた透過液を３−オキソアジピル−ＣｏＡ溶液とする。
【００５２】
３−オキソアジピル−ＣｏＡ調製用酵素反応溶液：
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．５ｍＭ  ｓｕｃｃｉｎｉｙ−ＣｏＡ
５ｍＭ  ３−ｏｘｏａｄｉｐｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ
２μＭ  ＣｏＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
【００５３】
３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸全長を増幅する。なお、このＰＣＲで用いるプライマーの塩基配列は、例えば配列番号３１および３２である。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＢａｍＨＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ溶液を得る。３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ活性は、本酵素溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、２５℃における３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡの生成量を測定することで確認できる。
【００５４】
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１５０μＬ／ｍＬ  ３−ｏｘｏａｄｉｐｙｌ−ＣｏＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
０．５ｍＭ  ＮＡＤＨ
１ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
１０μＭ  ３−ｏｘｏａｄｉｐｙｌ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ。
【００５５】
本発明で、（ａ）〜（ｃ）に記載のポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物は、（ａ）〜（ｃ）に記載のポリペプチドをコードする核酸を元来有している微生物を宿主として、当該宿主微生物が有する（ａ）〜（ｃ）に記載のポリペプチドの発現を、遺伝子改変により増強した微生物である。
【００５６】
（ａ）〜（ｃ）に記載のポリペプチドをコードする核酸を元来有している微生物の具体例は、以下のＳｅｒｒａｔｉａ属微生物が挙げられる。Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ（配列番号１、７０〜８０、８２〜８５、８７〜１１８を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ（配列番号２、８１、１１９を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ（配列番号３、１３１〜１３６、１３８を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ（配列番号４、１３７を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ（配列番号５を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＢＷ１０６（配列番号６を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  Ｓ１１９（配列番号７を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＹＤ２５（配列番号８を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＦＳ１４（配列番号９を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＨＭＳＣ１５Ｆ１１（配列番号１０を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＪＫＳ０００１９９（配列番号１１を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＴＥＬ（配列番号１２を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＩＳＴＤ０４（配列番号１３を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＳＣＢＩ（配列番号１４を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  Ｓ４（配列番号１５を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  Ｃ−１（配列番号１６を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＯＭＬＷ３（配列番号８６を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＯＬＥＬ１（配列番号１２０を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＯＬＥＬ２（配列番号１２３を有する微生物）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（配列番号２１３を有する微生物）などが挙げられる。
【００５７】
上記した(ａ）、（ｂ）、（ｃ）に記載したポリペプチドは、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性をも兼備しており、この３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物において５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子と遺伝子クラスターを構成する３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子によりコードされるものである。
【００５８】
ここで、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物において５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子と遺伝子クラスターを構成する３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子において、「遺伝子クラスター」とは、関連する機能を有する一連の核酸群が近接して存在する領域を意味する。遺伝子クラスターの具体的な構成要素としては、例えば単一の転写制御因子により転写調節される核酸群、単一の転写プロモーター制御下で転写されるオペロンなどが挙げられる。ある核酸が遺伝子クラスターを構成する核酸であるかどうかは、オンラインでａｎｔｉＳＭＡＳＨなどの遺伝子クラスター検索プログラムを用いて調べることもできる。また、あるポリペプチドが３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼあるいは５−アミノレブリン酸シンターゼに分類されるかどうかは、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）やＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）などのウェブサイトでＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）検索を行い、当該ポリペプチドのアミノ酸配列との相同性が高い酵素を調べることでわかる。例えば配列番号４のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのデータベース上で、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ：ＡＢＶ４０９３５．１として登録されており、アミノ酸配列から、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質であると推定されることが記載されている。また、配列番号４のアミノ酸配列をコードする遺伝子は、ＮＣＢＩのデータベース上で、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：ＣＰ０００８２６．１として登録されており、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ  ５６８のゲノム上に保存されていること、またＧｅｎｅ  ＩＤ：ＣＰ０００８２６．１の位置２０１５３１３から２０１６８４２に保存されていることが検索できる。さらに、この遺伝子の位置情報から、その前後の遺伝子配列を確認することができ、５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ：ＡＢＶ４０９３３．１）と図１に示す遺伝子クラスターを構成することも確認できる。同様に、配列番号１〜３、６〜１６、７０〜７２、７４〜８２、８４〜８７、８９、９０、９２、９４〜１００、１０３〜１０８、１１１〜１１５、１１７、１１８、１２０〜１２５、１２７〜１３３、１３５〜１３７、２１３のアミノ酸配列については、表１３に示すプロテインＩＤとＧｅｎｅ  ＩＤによって、ＮＣＢＩ上でその情報を確認することが可能である。
【００５９】
【表３−４】
2019107516.tif 000011
【００６０】
【表３−５】
2019107516.tif 000012
【００６１】
以下、本明細書中では、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物において５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子と遺伝子クラスターを構成する３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子にコードされるポリペプチドをコードする核酸を、「本発明で用いる３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子」と記載し、当該３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子がコードするポリペプチドを、「本発明で用いる３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」と記載する。
【００６２】
本発明で用いる３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子が含まれる遺伝子クラスターは、少なくとも３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子および５−アミノレブリン酸シンターゼ遺伝子を含んでいれば、他の核酸がクラスターに含まれていてもよい。図１に本発明で用いる３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子が含まれる遺伝子クラスターの具体例を示す。
【００６３】
当該遺伝子クラスターを有するＳｅｒｒａｔｉａ属微生物の具体例は、Ｓ．  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓ．  ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ、Ｓ．  ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓ．  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ、Ｓ．  ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ、Ｓ．  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＢＷ１０６、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  Ｓ１１９、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＹＤ２５、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＦＳ１４、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＨＭＳＣ１５Ｆ１１、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＪＫＳ０００１９９、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＴＥＬ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＩＳＴＤ０４、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＳＣＢＩ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  Ｓ４、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  Ｃ−１、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＯＭＬＷ３、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＯＬＥＬ１、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＯＬＥＬ２、Ｓ．  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓなどが挙げられる。
【００６４】
本発明で用いる、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、優れた３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有している。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする核酸が、３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有しているかどうかは、上記と同様の方法で確認することができる。
【００６５】
本発明で用いる３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子がコードするポリペプチドは、共通配列１を有していることを特徴とする。このようなポリペプチドのアミノ酸配列の具体例としては、配列番号１〜１６、７０〜１３８または２１３のアミノ酸配列が挙げられる。
【００６６】
本発明では、前記共通配列１を有していれば、配列番号７〜１６または７０〜１３８のいずれのポリペプチドのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−オキソアジピル−ＣｏＡを還元して３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸も好ましく用いることができる。ここで、「１もしくは数個」の範囲は、１０個以内が好ましく、さらに好ましくは５個以内、特に好ましくは４個以内、最も好ましくは１個又は２個以内である。ここで、アミノ酸が置換される場合、性質が類似したアミノ酸に置換された場合（すなわち、上記した保存的置換）にポリペプチドの活性が維持される可能性が高くなる。また、配列番号７〜１６または７０〜１３８のいずれのポリペプチドのアミノ酸配列と、配列同一性が７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、かつ３−オキソアジピル−ＣｏＡを還元して３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸も好ましく用いることができる。
【００６７】
一方で、本発明で用いる３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼには該当しないが、３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼの活性を有しているポリペプチドとして、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株由来のＰａａＨ（配列番号２０８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒ．  Ｋ−１２  ｓｕｂｓｔｒ．  ＭＧ１６５５株由来のＰａａＨ（配列番号２０９）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ１株由来のＤｃａＨ（配列番号２１０）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ  ＮＢＲＣ１０２５９９株由来のＰａａＨ（配列番号２１１）などが挙げられるが、これらのポリペプチドには、表４および表５に示すように共通配列１が含まれていないことがわかる。なお、これらのポリペプチドは、（ｂ）配列番号１〜６及び２１３のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−オキソアジピル−ＣｏＡを還元して３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチド、または（ｃ）配列番号１〜６及び２１３のいずれかのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ３−オキソアジピル−ＣｏＡを還元して３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチドには該当しない。
【００６８】
【表４】
2019107516.tif 000013
【００６９】
【表５】
2019107516.tif 000014
【００７０】
本発明で遺伝子改変微生物を得るための宿主として用いることができる微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属およびＣａｎｄｉｄａ属に属する微生物が挙げられる。これらの中でも、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物が好ましい。
【００７１】
本発明の遺伝子改変微生物を用いて３−ヒドロキシアジピン酸、α−ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を製造する方法を説明する。
【００７２】
本発明の遺伝子改変微生物が、アセチル−ＣｏＡおよびスクシニル−ＣｏＡから３−オキソアジピル−ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成（反応Ａ）する能力、および３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡから３−ヒドロキシアジピン酸を生成（反応Ｅ）する能力を有していれば、３−ヒドロキシアジピン酸を製造することができる。これらの生成能力を有する微生物を宿主微生物とすれば、３−ヒドロキシアジピン酸を高生産することができる遺伝子改変微生物を取得することができる。これらの生成能力を元来有すると推定される微生物としては、以下の微生物が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓなどのＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属、Ｈａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉなどのＨａｆｎｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｏｓｅｕｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｎａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｋａｒｎａｔａｋｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｏｌｉｖａｃｅｕｓなどのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｏｘａｌａｔｉｃｕｓなどのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓなどのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ  ａｌｂｕｓなどのＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｏｄｉｎｕｍなどのＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓなどのＤｅｌｆｔｉａ属、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ  ｂｌａｔｔａｅなどのＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅなどのＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒなどのＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａまたはＳｅｒｒａｔｉａ  ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属。これらの微生物を宿主微生物として本発明の遺伝子改変微生物を取得することで、３−ヒドロキシアジピン酸を高生産する遺伝子改変微生物を取得することができる。
【００７３】
本発明の遺伝子改変微生物が、アセチル−ＣｏＡおよびスクシニル−ＣｏＡから３−オキソアジピル−ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成（反応Ａ）する能力、および／または３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡから３−ヒドロキシアジピン酸を生成（反応Ｅ）する能力を元来有していない場合には、反応Ａ、Ｅを触媒する酵素をコードする核酸を適当に組み合わせて微生物に導入することで、これらの生成能を付与することができる。
【００７４】
本発明の遺伝子改変微生物が、アセチル−ＣｏＡおよびスクシニル−ＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよび補酵素Ａを生成（反応Ａ）する能力、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを脱水して２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡを生成（反応Ｃ）する能力、および２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡからα−ヒドロムコン酸を生成（反応Ｆ）する能力を有していれば、α−ヒドロムコン酸を製造することができる。これらの生成能力を有する微生物を宿主微生物とすれば、α−ヒドロムコン酸を高生産することができる遺伝子改変微生物を取得することができる。これらの生成能力を元来有すると推定される微生物としては、以下の微生物が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓなどのＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属、Ｈａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉなどのＨａｆｎｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂａｄｉｕｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｕｍａｚｕｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｏｘａｌａｔｉｃｕｓなどのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓなどのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓなどのＤｅｌｆｔｉａ属、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ  ｂｌａｔｔａｅなどのＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａまたはＳｅｒｒａｔｉａ  ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属。
【００７５】
本発明の遺伝子改変微生物が、アセチル−ＣｏＡおよびスクシニル−ＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよび補酵素Ａを生成（反応Ａ）する能力、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを脱水して２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡを生成（反応Ｃ）する能力、および２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡからα−ヒドロムコン酸を生成（反応Ｆ）する能力を元来有していない場合には、反応Ａ、Ｃ、Ｆを触媒する酵素をコードする核酸を適当に組み合わせて微生物に導入することで、これらの生成能を付与することができる。
【００７６】
本発明の遺伝子改変微生物が、スクシニル−ＣｏＡから３−オキソアジピル−ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成（反応Ａ）する能力、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを脱水して２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡを生成（反応Ｃ）する能力、２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡを還元してアジピル−ＣｏＡを生成（反応Ｄ）する能力、およびアジピル−ＣｏＡからアジピン酸を生成（反応Ｇ）する能力を有していれば、アジピン酸を製造することができる。これらの生成能力を有する微生物を宿主微生物とすれば、アジピン産を高生産することができる遺伝子改変微生物を取得することができる。これらの生成能力を元来有すると推定される微生物としては、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａなどのＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属が挙げられる。
【００７７】
本発明の遺伝子改変微生物が、スクシニル−ＣｏＡから３−オキソアジピル−ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成（反応Ａ）する能力、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを脱水して２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡを生成（反応Ｃ）する能力、２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡを還元してアジピル−ＣｏＡを生成（反応Ｄ）する能力、およびアジピル−ＣｏＡからアジピン酸を生成（反応Ｇ）する能力を元来有していない場合には、反応Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇを触媒する酵素をコードする核酸を適当に組み合わせて微生物に導入することで、これらの生成能を付与することができる。
【００７８】
以下に反応Ａ、Ｃ〜Ｇを触媒する酵素の具体例を示す。
【００７９】
３−オキソアジピル−ＣｏＡを生成する反応Ａを触媒する酵素は、例えば、アシルトランスフェラーゼ（β−ケトチオラーゼ）などを用いることができる。アシルトランスフェラーゼとしてはＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ２．３．１．−に分類されるアシルトランスフェラーゼが好ましく、具体的には３−オキソアジピル−ＣｏＡチオラーゼとしてＥＣ２．３．１．１７４に分類される酵素、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼとしてＥＣ２．３．１．９に分類される酵素、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アシルトランスフェラーゼとしてＥＣ２．３．１．１６に分類される酵素が挙げられる。これらの中でもＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株由来のＰａａＪ（ＮＣＢＩ−ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１５９１５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株由来のＰｃａＦ（ＮＣＢＩ−ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４３５３６）などを好ましく用いることができる。
【００８０】
上記のアシルトランスフェラーゼが、スクシニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡを基質として、３−オキソアジピル−ＣｏＡを生成できるかどうかは、精製アシルトランスフェラーゼによる３−オキソアジピル−ＣｏＡ生成反応と、３−オキソアジピル−ＣｏＡを基質とした精製３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼによる還元反応を組み合わせ、３−オキソアジピル−ＣｏＡの還元に伴うＮＡＤＨの減少量を測定することで確認できる。具体的な測定方法は、例えば以下の通りである。
【００８１】
アシルトランスフェラーゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、アシルトランスフェラーゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＳａｃＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、アシルトランスフェラーゼ溶液を得る。アシルトランスフェラーゼ活性は、当該酵素溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃におけるＮＡＤＨの酸化に伴う３４０ｎｍ吸収の減少を測定することで確認できる。
【００８２】
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．１ｍＭ  ｓｕｃｃｉｎｙｌ−ＣｏＡ
０．２ｍＭ  ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ
０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ
１ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
１０μｇ／ｍＬ  ３−ｏｘｏａｄｉｐｙｌ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ
５μｇ／ｍＬ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
【００８３】
本発明で用いる宿主微生物において元来発現する酵素がアシルトランスフェラーゼ活性を有しているかどうかは、精製アシルトランスフェラーゼの代わりに細胞破砕液（ｃｅｌｌ  ｆｒｅｅ  ｅｘｔｒａｃｔ：  ＣＦＥ）を用いて上述の測定を行うことで確認できる。大腸菌を対象とした具体的な測定方法は、例えば以下の通りである。
【００８４】
ＣＦＥの調製：ｐＨ７に調整した培地（培地組成：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）５ｍＬに活性測定の対象となる大腸菌ＭＧ１６５５株を一白金耳植菌し、３０℃で１８時間振とう培養する。得られた培養液をｐＨ７に調整した培地（培地組成：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、フェルラ酸２．５ｍＭ、ｐ−クマル酸２．５ｍＭ、安息香酸２．５ｍＭ、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸２．５ｍＭ、プロトカテク酸２．５ｍＭ、カテコール２．５ｍＭ、３ＯＡ２．５ｍＭ、３−ヒドロキシアジピン酸２．５ｍＭ、α−ヒドロムコン酸２．５ｍＭ、アジピン酸２．５ｍＭ、フェニルエチルアミン２．５ｍＭ）５ｍＬに添加し、３０℃で３時間振とう培養する。
【００８５】
得られた培養液に１０ｍＬの０．９％塩化ナトリウムを加え、菌体を遠心分離して上清を取り除く操作を３回行い、菌体を洗浄する。洗浄後の菌体をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００ｍＭ、ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ１ｍＭからなるＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー１ｍＬに懸濁し、得られた懸濁液にガラスビーズ（φ０．１ｍｍ）を加え、超音波破砕機を用い４℃で菌体を破砕する。菌体破砕液を遠心して得られる上清のうち０．５ｍＬをＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に通し、透過液を除去したのちＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー０．４ｍＬを添加することを３回繰り返すことで低分子量の夾雑物を除去した後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーで再懸濁して液量を０．１ｍＬとしたものをＣＦＥとする。精製酵素の代わりに当該ＣＦＥを全量０．１ｍＬの酵素反応溶液に対して０．０５ｍＬ添加し、酵素活性の確認を行う。
【００８６】
２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡを生成する反応Ｃを触媒する酵素は、例えば、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼなどを用いることができる。エノイル−ＣｏＡヒドラターゼとしては、ＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ番号４．２．１．−に分類されるエノイル−ＣｏＡヒドラターゼが好ましく、具体的にはエノイル−ＣｏＡヒドラターゼまたは２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡヒドラターゼとしてＥＣ４．２．１．１７に分類される酵素が挙げられる。これらの中でもＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株由来のＰａａＦ（ＮＣＢＩ−ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１５９１１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株由来のＰａａＦ（ＮＣＢＩ−ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４５４２７）などを好ましく用いることができる。
【００８７】
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼが触媒する反応は一般的に可逆反応であることから、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼが、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを基質として２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡが生成する反応を触媒する活性を有することは、α−ヒドロムコン酸から酵素反応で調製した２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡを基質として、精製エノイル−ＣｏＡヒドラターゼを用いて生成する３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを検出することで確認することができる。具体的な測定方法は、例えば以下の通りである。
【００８８】
ここで用いるα−ヒドロムコン酸は、公知の方法（例えば、ＷＯ２０１６／１９９８５８Ａ１の参考例１に記載された方法）により調製することができる。
【００８９】
２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡ溶液の調製：常法に従いＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸（ｐｃａＩおよびｐｃａＪ、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：１０４６６１３および１０４６６１２）の全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ−１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡ調製用酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、得られた透過液を２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡ溶液とする。
【００９０】
２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡ調製用酵素反応溶液
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．４ｍＭ  ｓｕｃｃｉｎｉｙ−ＣｏＡ
２ｍＭ  α−ｈｙｄｒｏｍｕｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ
２０μｇ／ｍＬ  ＣｏＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
【００９１】
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターｐＥＴ−１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ溶液を得る。エノイル−ＣｏＡ  ヒドラターゼ活性は、当該溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、得られた透過液中の３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で検出することで確認できる。
【００９２】
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
３００μＬ／ｍＬ  ２，３−ｄｅｈｙｄｒｏａｄｉｐｙｌ−ＣｏＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
１ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
２０μｇ／ｍＬ  ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ  ｈｙｄｒａｔａｓｅ。
【００９３】
本発明で用いる宿主微生物において元来発現する酵素がエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有しているかどうかは、精製エノイル−ＣｏＡヒドラターゼの代わりにＣＦＥを全量０．１ｍＬの酵素反応溶液に対して０．０５ｍＬ添加して上述の測定を行うことで確認できる。大腸菌を対象としたＣＦＥの調製方法の具体例はアシルトランスフェラーゼ活性の確認方法に記載した通りである。
【００９４】
アジピル−ＣｏＡを生成する反応Ｄを触媒する酵素は、例えば、エノイル−ＣｏＡレダクターゼなどを用いることができる。エノイル−ＣｏＡレダクターゼとしては、ＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ番号１．３．−．−に分類されるエノイル−ＣｏＡレダクターゼが好ましく、具体的にはｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼとしてＥＣ１．３．１．４４に分類される酵素、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼとしてＥＣ１．３．８．７に分類される酵素が挙げられる。これらの具体例は、例えば特表２０１１−５１５１１１、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１５  Ｏｃｔ；１１９（４）：１０５７−６３．などに開示されているが、中でもＥｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ  Ｚ株由来のＴＥＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５ＥＵ９０）、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  ＹＸ株由来のＴｆｕ＿１６４７（ＮＣＢＩ−ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＡＡＺ５５６８２）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ１株由来のＤｃａＡ（ＮＣＢＩ−ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＡＡＬ０９０９４．１）などを好ましく用いることができる。
【００９５】
エノイル−ＣｏＡレダクターゼが、２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡを基質とした場合、アジピル−ＣｏＡが生成する活性を有することは、α−ヒドロムコン酸から酵素反応で調製した２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡを基質として、精製エノイル−ＣｏＡレダクターゼを用いて２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡの還元に伴うＮＡＤＨの減少量を測定することで確認できる。
【００９６】
α−ヒドロムコン酸の調製と、２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡ溶液の調製は、上記と同様に行うことができる。
【００９７】
エノイル−ＣｏＡレダクターゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、エノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターｐＥＴ−１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ溶液を得る。エノイル−ＣｏＡレダクターゼ活性は、本酵素溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃におけるＮＡＤＨの酸化に伴う３４０ｎｍ吸収の減少を測定することで確認できる。
【００９８】
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
３００μＬ／ｍＬ  ２，３−ｄｅｈｙｄｒｏａｄｉｐｙｌ−ＣｏＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ
１ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
２０μｇ／ｍＬ  ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ。
【００９９】
本発明で用いる宿主微生物において元来発現する酵素がエノイル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有しているかどうかは、精製エノイル−ＣｏＡレダクターゼの代わりにＣＦＥを全量０．１ｍＬの酵素反応溶液に対して０．０５ｍＬ添加して上述の測定を行うことで確認できる。大腸菌を対象としたＣＦＥの調製方法の具体例はアシルトランスフェラーゼ活性の確認方法に記載した通りである。
【０１００】
３−ヒドロキシアジピン酸を生成する反応Ｅ、α−ヒドロムコン酸を生成する反応Ｆ、アジピン酸を生成する反応Ｇを触媒する酵素は、例えば、ＣｏＡトランスフェラーゼあるいはアシル−ＣｏＡヒドロラーゼなどを用いることができるが、ＣｏＡトランスフェラーゼが好ましい。
【０１０１】
ＣｏＡトランスフェラーゼとしては、ＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ番号２．８．３．−に分類されるＣｏＡトランスフェラーゼが好ましく、具体的にはＣｏＡトランスフェラーゼまたはアシル−ＣｏＡトランスフェラーゼとしてＥＣ２．８．３．６に分類される酵素などが挙げられる。
【０１０２】
本発明において、「ＣｏＡトランスフェラーゼ」とは、アシル−ＣｏＡおよびコハク酸を基質としてカルボン酸およびスクシニル−ＣｏＡを生成する反応の触媒活性（ＣｏＡトランスフェラーゼ活性）を有する酵素を意味する。
【０１０３】
３−ヒドロキシアジピン酸を生成する反応Ｅ、α−ヒドロムコン酸を生成する反応Ｆを触媒する酵素には、中でもＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株由来のＰｃａＩおよびＰｃａＪ（ＮＣＢＩ−ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４６０８１およびＮＰ＿７４６０８２）等を好ましく用いることができる。
【０１０４】
また、アジピン酸を生成する反応Ｇを触媒する酵素には、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ１株由来のＤｃａＩおよびＤｃａＪ（ＮＣＢＩ−ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＣＡＧ６８５３８およびＣＡＧ６８５３９）などを好ましく用いることができる。
【０１０５】
３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ、２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡまたはアジピル−ＣｏＡを基質とするＣｏＡトランスフェラーゼ活性は、本酵素反応が可逆反応であることから、３−ヒドロキシアジピン酸およびスクシニル−ＣｏＡ、α−ヒドロムコン酸およびスクシニル−ＣｏＡ、またはアジピン酸およびスクシニル−ＣｏＡを基質として、精製ＣｏＡトランスフェラーゼを用いて生成する３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ、２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡまたはアジピル−ＣｏＡを検出することで確認することができる。具体的な測定方法は、例えば以下の通りである。
【０１０６】
３−ヒドロキシアジピン酸の調製：３−ヒドロキシアジピン酸はＷＯ２０１６／１９９８５６Ａ１の参考例１に記載された方法により調製する。
【０１０７】
３−ヒドロキシアジピン酸を基質としたＣｏＡトランスフェラーゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ−１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、透過液中の３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で検出することで確認できる。
【０１０８】
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．４ｍＭ  ｓｕｃｃｉｎｉｙ−ＣｏＡ
２ｍＭ  ３−ｈｙｄｒｏｘｙａｄｉｐｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ
２０μｇ／ｍＬ  ＣｏＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
【０１０９】
α−ヒドロムコン酸の調製：α−ヒドロムコン酸はＷＯ２０１６／１９９８５８Ａ１の参考例１に記載された方法により調製する。
【０１１０】
α−ヒドロムコン酸を基質としたＣｏＡトランスフェラーゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ−１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、透過液中の２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡを高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で検出することで確認できる。
【０１１１】
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．４ｍＭ  ｓｕｃｃｉｎｉｙ−ＣｏＡ
２ｍＭ  α−ｈｙｄｒｏｍｕｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ
２０μｇ／ｍＬ  ＣｏＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
【０１１２】
アジピン酸を基質としたＣｏＡトランスフェラーゼ活性の確認：常法に従い対象とする微生物株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸全長を増幅する。当該増幅断片を大腸菌用発現ベクターであるｐＲＳＦ−１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＫｐｎＩサイトに、ヒスチジンタグ配列と同じフレームとなるよう挿入する。当該プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得る。当該溶液を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、３０℃で１０分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、透過液中のアジピル−ＣｏＡを高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で検出することで確認できる。
【０１１３】
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．４ｍＭ  ｓｕｃｃｉｎｉｙ−ＣｏＡ
２ｍＭ  ａｄｉｐｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ
２０μｇ／ｍＬ  ＣｏＡ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。
【０１１４】
本発明で用いる宿主微生物において元来発現する酵素がＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有しているかどうかは、精製ＣｏＡトランスフェラーゼの代わりにＣＦＥを全量０．１ｍＬの酵素反応溶液に対して０．０５ｍＬ添加して上述の測定を行うことで確認できる。大腸菌を対象としたＣＦＥの調製方法の具体例はアシルトランスフェラーゼ活性の確認方法に記載した通りである。
【０１１５】
本発明で（ａ）〜（ｃ）に記載のポリペプチド、または３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、従来技術で用いられている３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼよりも優れた活性を有することを特徴とする。ここで、「優れた活性」とは、同一の宿主微生物、発現条件下で当該ポリペプチドまたは従来の３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼを発現した遺伝子改変微生物を、炭素源を発酵原料として含む培地で培養した場合、従来の３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼを発現した遺伝子改変微生物に比べて高い収率で３−ヒドロキシアジピン酸、α−ヒドロムコン酸、またはアジピン酸を生産することを意味する。ここで、３−ヒドロキシアジピン酸収率は式（３）に従って算出する。α−ヒドロムコン酸収率またはアジピン酸収率は、式（３）の３−ヒドロキシアジピン酸をそれぞれα−ヒドロムコン酸またはアジピン酸に置き換えることで算出する。
【０１１６】
収率（％）＝３−ヒドロキシアジピン酸生成量（ｍｏｌ）／炭素源の消費量（ｍｏｌ）×１００・・・式（３）。
【０１１７】
本発明で（ａ）〜（ｃ）に記載のポリペプチド、または３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼが、従来技術で用いられている３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼよりも優れた活性を有することを確認する具体的な方法は以下の通りである。大腸菌内で自立複製可能なベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２（ＭＥ  Ｋｏｖａｃｈ，  （１９９５），  Ｇｅｎｅ  １６６：  １７５−１７６）をＸｈｏＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２／ＸｈｏＩを得る。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｇａｐＡ（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：  ＮＣ＿０００９１３．３）の上流域２００ｂを常法に従ってＰＣＲ増幅し（用いるプライマーは、例えば配列番号１８および１９である）、得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２／ＸｈｏＩ  を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：Ｐｇａｐを得る。ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＰｇａｐをＳｃａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを得る。アシルトランスフェラーゼをコードする核酸全長を常法に従ってＰＣＲ増幅し（用いるプライマーは、例えば配列番号２１および２２である）、得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて連結しプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴを得る。ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴをＨｐａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴ／ＨｐａＩを得る。ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸全長を常法に従ってＰＣＲ増幅し（用いるプライマーは、例えば配列番号２５および２６である）、得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴ／ＨｐａＩを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて連結しプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴを得る。
【０１１８】
一方、大腸菌内で自立複製可能な発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）をＢａｍＨＩで切断し、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１／ＢａｍＨＩを得る。配列番号１〜１６または７０〜１３８のポリペプチドあるいは従来技術で用いられている３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸を常法に従ってＰＣＲ増幅し（用いるプライマーは、例えば配列番号３１および３２である）、得られた断片およびｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１／ＢａｍＨＩ  を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、配列番号１〜１６または７０〜１３８のポリペプチドあるいは従来技術で用いられている３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼを発現するプラスミドを得る。
【０１１９】
得られたプラスミドおよびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴを、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）にエレクトロポレーション（ＮＭ  Ｃａｌｖｉｎ，  ＰＣ  Ｈａｎａｗａｌｔ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，  １７０  （１９８８），  ｐｐ．  ２７９６-２８０１）で導入する。導入後の当該株をｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬ）５ｍＬに一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ−１で１８時間振とう培養する。当該培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（コハク酸１０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬおよびＩＰＴＧ０．０１ｍＭ）５ｍＬに添加し、３０℃、１２０ｍｉｎ−１で２４時間振とう培養する。当該培養液より菌体を遠心分離した上清をＭｉｌｌｅｘ−ＧＶ（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて膜処理し、透過液を分析することで培養上清中の３−ヒドロキシアジピン酸および炭素源の濃度を定量する。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる３−ヒドロキシアジピン酸の定量分析は以下の条件で行う。
【０１２０】
・ＨＰＬＣ：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ  ｈｙｄｒｏ−ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ：Ｔｒｉｐｌｅ−Ｑｕａｄ  ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩ  ネガティブモード。
【０１２１】
ＨＰＬＣによる糖、コハク酸などの炭素源の定量分析は以下の条件で行う。
【０１２２】
・ＨＰＬＣ：Ｓｈｉｍａｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）、長さ３００  ｍｍ、内径８  ｍｍ、粒径６μｍ
移動相：０．０５Ｍ  硫酸水溶液
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：６５℃
検出器：ＲＩ。
【０１２３】
本発明においてアシルトランスフェラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、エノイル−ＣｏＡレダクターゼのいずれかをコードする核酸を宿主微生物に導入する場合、当該核酸はデータベース上に存在する当該酵素のアミノ酸配列を元に人工的に合成してもよいし、天然から分離してもよい。人工的に合成する場合、導入する宿主微生物に合わせて各アミノ酸に対応するコドンの使用頻度を変更してもよい。
【０１２４】
本発明で、アシルトランスフェラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、エノイル−ＣｏＡレダクターゼのいずれかをコードする核酸を宿主微生物に導入する方法は特に限定されず、宿主微生物内で自律複製可能な発現ベクターに当該核酸を組み込み宿主微生物に導入する方法や、宿主微生物のゲノムに当該核酸を組み込む方法などを用いることができる。
【０１２５】
当該酵素をコードする核酸を天然から分離する場合、遺伝子源となる生物は特に限定されないが、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅなどのＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓなどのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｏｓｅｕｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｏｄｉｎｕｍなどのＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｕｍａｚｕｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｏｘａｌａｔｉｃｕｓなどのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｄｅｌｆｔｉａ        ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓなどのＤｅｌｆｔｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｈａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉなどのＨａｆｎｉａ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍなどのＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ  ａｌｂｕｓなどのＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属、Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓなどのＰｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｐｔｉｌｉｖｏｒａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒなどのＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓなどのＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ  ｂｌａｔｔａｅなどのＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属、Ｓｔｅｒｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｎａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｋａｒｎａｔａｋｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｏｌｉｖａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｎａｃｅｕｓなどのＳｔｅｒｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ���ｕｃｋｅｒｉなどのＹｅｒｓｉｎｉａ属、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ  などのＥｕｇｌｅｎａ  属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａなどのＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属が挙げられ、好ましくはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｅｕｇｌｅｎａ  属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属である。
【０１２６】
本発明で発現させるポリペプチドをコードする核酸を発現ベクターまたは宿主微生物ゲノムに組み込む場合、当該発現ベクターまたはゲノム組み込み用核酸はプロモーター、リボソーム結合配列、発現させるポリペプチドをコードする核酸、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーター活性を制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【０１２７】
本発明で用いるプロモーターは、宿主微生物内で酵素を発現させられるものであれば特に限定されないが、例えばｇａｐプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが挙げられる。
【０１２８】
本発明で発現ベクターを用いて核酸の導入や、ポリペプチドの発現の増強を行う場合は、当該微生物中で自律複製可能であれば特に限定されないが、例えばｐＢＢＲ１ＭＣＳベクター、ｐＢＲ３２２ベクター、ｐＭＷベクター、ｐＥＴベクター、ｐＲＳＦベクター、ｐＣＤＦベクター、ｐＡＣＹＣベクター、および上述のベクターの派生型などが挙げられる。
【０１２９】
本発明でゲノム組み込み用核酸を用いて核酸の導入や、ポリペプチドの発現の増強を行う場合は、部位特異的相同組換えを用いて導入する。部位相同組換えの方法は特に限定されないが、例えばλ  Ｒｅｄ  レコンビナーゼおよびＦＬＰレコンビナーゼを用いる方法（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０００  Ｊｕｎ  ６；  ９７（１２）：  ６６４０-６６４５．）、λ  Ｒｅｄ  レコンビナーゼおよびｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００７  Ｄｅｃ；７１（１２）：２９０５−１１．）が挙げられる。
【０１３０】
発現ベクターまたはゲノム組み込み用核酸の導入方法は、微生物に核酸を導入する方法であれば特に限定されないが、例えばカルシウムイオン法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ５３，  １５９  （１９７０））、エレクトロポレーション法（ＮＭ  Ｃａｌｖｉｎ，  ＰＣ  Ｈａｎａｗａｌｔ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，  １７０  （１９８８），  ｐｐ．  ２７９６-２８０１）などが挙げられる。
【０１３１】
本発明では、３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸を導入、もしくは当該ポリペプチドの発現を増強した遺伝子改変微生物を、通常の微生物が利用し得る炭素源を発酵原料として含有する培地、好ましくは液体培地中において培養する。当該遺伝子改変微生物が利用し得る炭素源の他には、窒素源、無機塩および必要に応じてアミノ酸やビタミンなどの有機微量栄養素を程よく含有した培地を用いる。上記栄養源を含有していれば天然培地、合成培地のいずれでも利用できる。
【０１３２】
発酵原料とは、当該遺伝子改変微生物が代謝し得る原料である。「代謝」とは、微生物が細胞外から取り入れた、あるいは細胞内で別の化学物質より生じたある化学物質が、酵素反応により別の化学物質へと変換されることを指す。炭素源としては、糖類を好ましく用いることができる。糖類の具体例としては、グルコース、シュクロース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース等の単糖類、これら単糖類が結合した二糖類、多糖類、およびこれらを含有する澱粉糖化液、糖蜜、セルロース含有バイオマス糖化液などが挙げられる。
【０１３３】
また、上記に挙げた糖以外にも、ＣｏＡトランスフェラーゼの基質であるコハク酸を添加することで３−ヒドロキシアジピン酸、α−ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を効率よく生産することができる。
【０１３４】
上記に挙げた炭素源は、一種類のみ用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。炭素源の添加において、培地中の炭素源の濃度は、特に限定されず、炭素源の種類などに応じて適宜設定することができ、好ましくは、糖類は５ｇ／Ｌ〜３００ｇ／Ｌ、コハク酸は０．１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌである。
【０１３５】
当該遺伝子改変微生物の培養に用いる窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用できる。培地中の窒素源の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、０．１ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌである。
【０１３６】
当該遺伝子改変微生物の培養に用いる無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。
【０１３７】
３−ヒドロキシアジピン酸、α−ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物の培養条件は、前記成分組成の培地、培養温度、撹拌速度、ｐＨ、通気量、植菌量などを、当該遺伝子改変微生物の種類および外部条件などに応じて、適宜調節あるいは選択して設定する。液体培養において発泡がある場合には、鉱油、シリコーン油および界面活性剤などの消泡剤を適宜培地に配合することができる。
【０１３８】
前記微生物の培養物中に、３−ヒドロキシアジピン酸、α−ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸が回収可能な量まで生産された後、生産された当該生産物を回収することができる。生産された当該生産物の回収、例えば単離は、蓄積量が適度に高まった時点で培養を停止し、その培養物から、発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて行うことができる。具体的には、遠心分離、ろ過などにより菌体を分離したのち、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、活性炭処理、結晶化、膜分離、蒸留などにより、当該生産物を培養物から単離することができる。より具体的には、当該生産物の塩に酸成分を添加して析出物を回収する方法、培養物を逆浸透膜やエバポレーターなどを用いた濃縮操作により水を除去して当該生産物の濃度を高めた後、冷却結晶化や断熱結晶化により当該生産物および／または当該生産物の塩の結晶を析出させ、遠心分離やろ過などにより当該生産物および／または当該生産物の塩の結晶を得る方法、培養物にアルコールを添加して当該生産物をエステルとした後、蒸留操作により当該生産物のエステルを回収後、加水分解により当該生産物を得る方法等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、これらの回収方法は生成物の物性などにより適当に選択して最適化することができる。
【実施例】
【０１３９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。【０１４０】
参考例１
アセチル−ＣｏＡおよびスクシニル−ＣｏＡから３−オキソアジピル−ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する反応（反応Ａ）を触媒する酵素、及び３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡから３−ヒドロキシアジピン酸を生成する反応（反応Ｅ）かつ２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡからα−ヒドロムコン酸を生成する反応（反応Ｆ）を触媒する酵素を発現するプラスミドの作製
大腸菌内で自律複製可能なベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２（ＭＥ  Ｋｏｖａｃｈ，  （１９９５），  Ｇｅｎｅ  １６６：  １７５−１７６）をＸｈｏＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２／ＸｈｏＩを得た。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｇａｐＡ（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：  ＮＣ＿０００９１３．３）の上流域２００ｂ（配列番号１７）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号１８、１９）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２／ＸｈｏＩ  を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え大腸菌株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：Ｐｇａｐとした。続いてｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＰｇａｐをＳｃａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩ  を得た。  反応Ａを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてアシルトランスフェラーゼ遺伝子ｐｃａＦ（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：  １０４１７５５、配列番号２０）の全長をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２１、２２）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴとした。続いてｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴをＨｐａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴ／ＨｐａＩを得た。反応Ｅおよび反応Ｆを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子ＰｃａＩおよびＰｃａＪ（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：  １０４６６１３、１０４６６１２、配列番号２３、２４）の全長を含む連続した配列をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２５、２６）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴ／ＨｐａＩを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴとした。【０１４１】
参考例２
配列番号１、２、３、４、５、６、２１３に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドの作製
大腸菌内で自律複製可能な発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）をＢａｍＨＩで切断し、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１／ＢａｍＨＩを得た。配列番号１のポリペプチドをコードする核酸を増幅するために、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ  ＡＴＣＣ１３８８０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５４に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号３１、３２）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号２のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ  ＤＳＭ２１４２０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５５に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号３３，３４）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号３のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ  ＮＢＲＣ１０２５９９株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５６に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号３５，３６）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号４のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ  ５６８株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５７に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号３７，３８）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号５のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ  Ｌｒ５／４株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５８に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２１５，２１６）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号６のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．  ＢＷ１０６株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５９に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２１７，２１８）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。配列番号２１３のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＦＫ０１株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２１４に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２１９，２２０）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られたそれぞれの断片およびｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１／ＢａｍＨＩ  を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認した。なお当該プラスミドに組み込まれた３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼの発現はＩＰＴＧで誘導され、Ｎ末端にヒスチジンタグを含む１４個のアミノ酸が付加されている。【０１４２】
配列番号１に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｍｒ１」、配列番号２に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｎｍ１」、配列番号３に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｐｌ１」、配列番号４に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｐｅ１」、配列番号５に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｕｒ１」、配列番号６に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｓｐ１」、配列番号２１３に記載のポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｌｑ１」とし、これらのプラスミドについて表６に示す。【０１４３】
参考例３
３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼを発現するためプラスミドの作製
本発明の（ａ）〜（ｃ）に記載のポリペプチド以外で、３−オキソアシル−ＣｏＡを基質として３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを生成する還元反応を触媒する４種類の酵素を発現するためのプラスミドを作製した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株由来のｐａａＨ（配列番号２７）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒ．  Ｋ−１２  ｓｕｂｓｔｒ．  ＭＧ１６５５株由来のｐａａＨ（配列番号２８）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ１株由来のｄｃａＨ（配列番号２９）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ  ＮＢＲＣ１０２５９９株由来のｐａａＨ（配列番号３０）の４種類を用いた。配列番号２７に記載の核酸を増幅するためのプライマーとして（配列番号３９，４０）、配列番号２８に記載の核酸を増幅するためのプライマーとして（配列番号４１，４２）、【０１４４】
配列番号２９に記載の核酸を増幅するためのプライマーとして（配列番号４３，４４）、配列番号３０に記載の核酸を増幅するためのプライマーとして（配列番号４５，４６）を用いた以外は、参考例２と同様の方法でプラスミドを作製した。【０１４５】
配列番号２７に記載の核酸がコードするポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｐｐｕ１」、配列番号２８に記載の核酸がコードするポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｅｃｏ１」、配列番号２９に記載の核酸がコードするポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ａｃｉ１」、配列番号３０に記載の核酸がコードするポリペプチドを発現するためのプラスミドを「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｐｌ２」とし、これらのプラスミドについて表６に示す。【０１４６】
【表６】
2019107516.tif 000015
【０１４７】
実施例１
配列番号１，２，３，４、５、６、２１３に記載のポリペプチドをコードする核酸が導入された３−ヒドロキシアジピン酸生産能を有する大腸菌の作製
参考例１で作製したプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴを、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）にエレクトロポレーション（ＮＭ  Ｃａｌｖｉｎ，  ＰＣ  Ｈａｎａｗａｌｔ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，  １７０  （１９８８），  ｐｐ．  ２７９６-２８０１）で導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて３７℃で培養した。得られた組み換え株をＢＬ２１（ＤＥ３）／  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴとした。【０１４８】
続いて、参考例２で作製した７種類のプラスミドをそれぞれＢＬ２１（ＤＥ３）／  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴにエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて、３７℃で培養した。「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｍｒ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｍｒ１＿３ＨＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｎｍ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｎｍ１＿３ＨＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｐｌ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｐｌ１＿３ＨＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｐｅ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｐｅ１＿３ＨＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｕｒ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｕｒ１＿３ＨＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｓｐ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｓｐ１＿３ＨＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｌｑ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｌｑ１＿３ＨＡ」とし、本実施例で得られた組換え株を表７に示す。【０１４９】
比較例１
３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸が導入された３−ヒドロキシアジピン酸生産能を有する大腸菌の作製
参考例１で作製したプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴを、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）にエレクトロポレーション（ＮＭ  Ｃａｌｖｉｎ，  ＰＣ  Ｈａｎａｗａｌｔ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，  １７０  （１９８８），  ｐｐ．  ２７９６-２８０１）で導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて３７℃で培養した。得られた組み換え株をＢＬ２１（ＤＥ３）／  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴとした。【０１５０】
続いて、参考例３で作製した４種類のプラスミドをそれぞれＢＬ２１（ＤＥ３）／  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴにエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて、３７℃で培養した。【０１５１】
「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｐｐｕ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｐｐｕ１＿３ＨＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｅｃｏ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｅｃｏ１＿３ＨＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ａｃｉ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ａｃｉ１＿３ＨＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｐｌ２」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｐｌ２＿３ＨＡ」とし、本比較例で得られた組換え株を表７に示す。【０１５２】
実施例２
配列番号１，２，３，４、５、６、２１３に記載のポリペプチドをコードする核酸が導入された３−ヒドロキシアジピン酸生産能を有する大腸菌を用いた３−ヒドロキシアジピン酸の生産試験
実施例１で作製した組換え大腸菌株を用いて、３−ヒドロキシアジピン酸の生産試験を行った。【０１５３】
ｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬ）５ｍＬに、実施例１で作製した組換え株を一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ−１で１８時間振とう培養した。当該培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（コハク酸１０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬおよびＩＰＴＧ０．０１ｍＭ）５ｍＬに添加し、３０℃、１２０ｍｉｎ−１で２４時間振とう培養した。【０１５４】
３−ヒドロキシアジピン酸および炭素源の定量分析
当該培養液より菌体を遠心分離した上清をＭｉｌｌｅｘ−ＧＶ（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて膜処理し、透過液を以下の方法で分析することで培養上清中に蓄積した３−ヒドロキシアジピン酸および炭素源の濃度を定量した。その結果を表７に示す。また式（３）用いて算出した３−ヒドロキシアジピン酸の収率を表７に示す。【０１５５】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる３−ヒドロキシアジピン酸の定量分析
・ＨＰＬＣ：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ  ｈｙｄｒｏ−ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ：Ｔｒｉｐｌｅ−Ｑｕａｄ  ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩ  ネガティブモード。【０１５６】
ＨＰＬＣによる糖およびコハク酸の定量分析
・ＨＰＬＣ：Ｓｈｉｍａｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）、長さ３００  ｍｍ、内径８  ｍｍ、粒径６μｍ
移動相：０．０５Ｍ  硫酸水溶液
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：６５℃
検出器：ＲＩ
・ＨＰＬＣ：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ  ｈｙｄｒｏ−ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ：Ｔｒｉｐｌｅ−Ｑｕａｄ  ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩ  ネガティブモード。【０１５７】
比較例２
３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸が導入された３−ヒドロキシアジピン酸生産能を有する大腸菌を用いた３−ヒドロキシアジピン酸の生産試験
実施例２と同様の方法にて、比較例１で作製した大腸菌を用いて３−ヒドロキシアジピン酸の生産試験を行った結果を表７に示す。【０１５８】
表７の結果から、実施例２で用いた組換え株は、本比較例２で用いた組換え株よりも３−ヒドロキシアジピン酸収率が向上することが明らかとなった。すなわち、配列番号１、２，３，４、５、６、２１３に記載のポリペプチドをコードする核酸を微生物に導入することによって、３−ヒドロキシアジピン酸の生産性が著しく向上することがわかった。【０１５９】
【表７】
2019107516.tif 000016
【０１６０】
参考例４
３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡから２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡを生成する反応（反応Ｃ）を触媒する酵素を発現するためのプラスミドの作製
大腸菌内で自律複製可能な発現ベクターｐＣＤＦ−１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）をＫｐｎＩで切断し、ｐＣＤＦ−１ｂ／ＫｐｎＩを得た。反応Ｃを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子ｐａａＦ（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：  １０４６９３２、配列番号４７）の全長をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号４８、４９）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＣＤＦ−１ｂ／ＫｐｎＩ  を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認した。なお当該プラスミドに組み込まれたエノイル−ＣｏＡヒドラターゼの発現はＩＰＴＧで誘導され、Ｎ末端にヒスチジンタグを含む１１個のアミノ酸が付加されている。得られたプラスミドを「ｐＣＤＦ−１ｂ：：ＥＨａ」とした。【０１６１】
実施例３
配列番号１、２、３、４、５、６、２１３に記載のポリペプチドをコードする核酸が導入されたα−ヒドロムコン酸生産能を有する大腸菌の作製
参考例４で作製したプラスミドｐＣＤＦ−１ｂ：：ＥＨａを、実施例１で作製した大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴにエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて３７℃で培養した。得られた組み換え株をＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴ／  ｐＣＤＦ−１ｂ：：ＥＨａとした。【０１６２】
続いて、参考例２で作製したプラスミド「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｍｒ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｎｍ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｐｌ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｐｅ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｕｒ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｓｐ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｌｑ１」それぞれを、ＢＬ２１（ＤＥ３）／  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴ／  ｐＣＤＦ−１ｂ：：ＥＨａにエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて、３７℃で培養した。「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｍｒ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｍｒ１＿ＨＭＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｎｍ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｎｍ１＿ＨＭＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｐｌ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｐｌ１＿ＨＭＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｐｅ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｐｅ１＿ＨＭＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｕｒ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｕｒ１＿ＨＭＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｓｐ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｓｐ１＿ＨＭＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｌｑ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｌｑ１＿ＨＭＡ」とし、本実施例で得られた組換え株を表８に示す。【０１６３】
比較例３
３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸が導入されたα−ヒドロムコン酸生産能を有する大腸菌の作成
参考例４で作製したプラスミドｐＣＤＦ−１ｂ：：ＥＨａを、参考例２で作製した大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）／  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴにエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて３７℃で培養した。得られた組み換え株をＢＬ２１（ＤＥ３）／  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴ／  ｐＣＤＦ−１ｂ：：ＥＨａとした。【０１６４】
続いて、参考例３で作製したプラスミド「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｐｐｕ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｅｃｏ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ａｃｉ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｐｌ２」それぞれを、ＢＬ２１（ＤＥ３）／  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴ／  ｐＣＤＦ−１ｂ：：ＥＨａにエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて、３７℃で培養した。【０１６５】
「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｐｐｕ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｐｐｕ１＿ＨＭＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｅｃｏ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｅｃｏ１＿ＨＭＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ａｃｉ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ａｃｉ１＿ＨＭＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｐｌ２」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｐｌ２＿ＨＭＡ」とし、本比較例で得られた組換え株を表８に示す。【０１６６】
実施例４
配列番号１、２、３、４、５、６、２１３に記載のポリペプチドをコードする核酸が導入されたα−ヒドロムコン酸生産能を有する大腸菌を用いたα−ヒドロムコン酸の生産試験
実施例３で作製した大腸菌を用いてα−ヒドロムコン酸の生産試験を行った。ｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬ）５ｍＬに、実施例３で作製した組換え大腸菌株を一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ−１で１８時間振とう培養した。当該培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（コハク酸１０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬおよびＩＰＴＧ０．０１ｍＭ）５ｍＬに添加し、３０℃、１２０ｍｉｎ−１で２４時間振とう培養した。【０１６７】
α−ヒドロムコン酸および炭素源の定量分析
当該培養液より菌体を遠心分離した上清をＭｉｌｌｅｘ−ＧＶ（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて膜処理し、透過液を実施例２と同様の条件でＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて分析した。培養上清中に蓄積したα−ヒドロムコン酸の定量分析を行った結果、および式（３）を用いて算出したα−ヒドロムコン酸の収率を表８に示す。【０１６８】
比較例４
３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸が導入されたα−ヒドロムコン酸生産能を有する大腸菌を用いたα−ヒドロムコン酸の生産試験
実施例４と同様の方法にて、比較例３で作製した大腸菌を用いてα−ヒドロムコン酸の生産試験を行った結果を表８に示す。【０１６９】
表８の結果から、実施例４で用いた組換え株は、本比較例４で用いた組換え株よりもα−ヒドロムコン酸収率が向上することが明らかとなった。すなわち、配列番号１、２、３、４、５、６、２１３に記載のポリペプチドをコードする核酸を微生物に導入することによって、α−ヒドロムコン酸の生産性が著しく向上することがわかった。【０１７０】
【表８】
2019107516.tif 000017
【０１７１】
参考例５
配列番号２、３に記載のポリペプチドの発現を増強するためのプラスミドの作製
配列番号２、３に記載のポリペプチドを構成的に発現するための様々なプラスミドを作製した。【０１７２】
配列番号２のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ  ＤＳＭ２１４２０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５５に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号５０，５１）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。また、配列番号３のポリペプチドをコードする核酸を増幅させるために、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ  ＮＢＲＣ１０２５９９株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５６に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号５２，５３）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片および参考例１で作製したｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをそれぞれ「ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：Ｓｎｍ１」および「ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：Ｓｐｌ１」とした。【０１７３】
実施例５
配列番号２、３に記載のポリペプチドの発現を増強するように改変したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物の作製
宿主微生物として、元来配列番号２のポリペプチドをコードする核酸を有する微生物であるＳｅｒｒａｔｉａ  ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ  ＤＳＭ２１４２０株、および元来配列番号３のポリペプチドをコードする核酸を有する微生物であるＳｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ  ＮＢＲＣ１０２５９９株を用いて、それぞれが有するポリペプチドの発現を増大させた組換え株を作製した。参考例５で作製したｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：Ｓｎｍ１あるいはｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：Ｓｐｌ１を、上述のＳｅｒｒａｔｉａ属微生物株それぞれにエレクトロポレーション（ＮＭ  Ｃａｌｖｉｎ，  ＰＣ  Ｈａｎａｗａｌｔ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，  １７０  （１９８８），  ｐｐ．  ２７９６-２８０１）で導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて、３０℃で培養した。本実施例で得られた組換え株をＳｎ／Ｓｎｍ１、Ｓｐ／Ｓｐｌ１とした。【０１７４】
実施例６
配列番号２、３に記載のポリペプチドの発現を増強するように改変したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を用いた３−ヒドロキシアジピン酸およびα−ヒドロムコン酸生産試験
配列番号２、３に記載のポリペプチドの発現を増強した効果を評価するために、実施例５で作製した組換えＳｅｒｒａｔｉａ属微生物株を用いて、３−ヒドロキシアジピン酸およびα−ヒドロムコン酸の生産試験を行った。【０１７５】
ｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ）５ｍＬに、実施例５で作製した組換え株を一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ−１で１８時間振とう培養した。当該培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（コハク酸１０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ）５ｍＬに添加し、３０℃、１２０ｍｉｎ−１で２４時間振とう培養した。【０１７６】
３−ヒドロキシアジピン酸、α−ヒドロムコン酸、および炭素源の定量分析
当該培養液より菌体を遠心分離した上清をＭｉｌｌｅｘ−ＧＶ（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて膜処理し、透過液を実施例２と同様の条件でＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて分析した。培養上清中に蓄積した３−ヒドロキシアジピン酸およびα−ヒドロムコン酸の定量分析を行った結果およびそれぞれの収率を表９に示す。【０１７７】
比較例５
配列番号２、３に記載のポリペプチドの発現を増強していないＳｅｒｒａｔｉａ属微生物の作製
実施例５と同様の方法にて、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ｇａｐをＳｅｒｒａｔｉａ  ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ  ＤＳＭ２１４２０株およびＳｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ  ＮＢＲＣ１０２５９９株それぞれに導入した。得られた組換え株をＳｎ／ＮＣ、およびＳｐ／ＮＣとした。【０１７８】
比較例６
配列番号２、３に記載のポリペプチドの発現を増強していないＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を用いた３−ヒドロキシアジピン酸およびα−ヒドロムコン酸の生産試験
比較例５で作製したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を用いて実施例６と同様の方法にて３−ヒドロキシアジピン酸およびα−ヒドロムコン酸の生産試験を行った。結果を表９に示す。【０１７９】
表９の結果から、実施例６で用いた配列番号２、３に記載のポリペプチドの発現を増大させた組換え株は、本比較例６で用いた、配列番号２、３に記載のポリペプチドの発現を増大させていない組換え株よりも３−ヒドロキシアジピン酸およびα−ヒドロムコン酸収率が向上することが明らかとなった。すなわち、配列番号２，３に記載のポリペプチドの発現を増強することによって、３−ヒドロキシアジピン酸およびα−ヒドロムコン酸の生産性が著しく向上することがわかった。【０１８０】
【表９】
2019107516.tif 000018
【０１８１】
比較例７
配列番号１、２、３、４、５、６、２１３に記載のポリペプチドが、３−オキソアジピル−ＣｏＡを還元して３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを生成する活性を有していることを確認するためのコントロール試験
反応Ａと反応Ｅ、反応Ｆを触媒する酵素を発現させた組換え大腸菌を作製した。実施例１と同様の方法にて、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１をＢＬ２１（ＤＥ３）／  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴに導入した。得られた組換え株をＥｃ／ＮＣ＿３ＨＡとした。【０１８２】
反応Ａ、反応Ｅ、反応Ｆ、反応Ｃを触媒する酵素を発現させた組換え大腸菌を作製した。実施例３と同様の方法にて、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１をＢＬ２１（ＤＥ３）／  ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴ／  ｐＣＤＦ−１ｂ：：ＥＨａに導入した。得られた組換え株をＥｃ／ＮＣ＿ＨＭＡとした。【０１８３】
Ｅｃ／ＮＣ＿３ＨＡ、Ｅｃ／ＮＣ＿ＨＭＡ、実施例１で作製した、組換え大腸菌７株（Ｅｃ／Ｓｍｒ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｎｍ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｐｌ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｐｅ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｕｒ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｓｐ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｌｑ１＿３ＨＡ）、および実施例３で作製した組換え大腸菌７株（Ｅｃ／Ｓｍｒ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｎｍ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｐｌ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｐｅ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｕｒ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｓｐ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｌｑ１＿ＨＭＡ）を用いて、実施例２および実施例４と同様の条件で培養を行い、培養液中の３−ヒドロキシアジピン酸またはα−ヒドロムコン酸を測定した。結果を表１０に示す。【０１８４】
表１０の結果から、Ｅｃ／ＮＣ＿３ＨＡおよびＥｃ／ＮＣ＿ＨＭＡでは、３−ヒドロキシアジピン酸またはα−ヒドロムコン酸が検出されず、実施例２および４で生産された３−ヒドロキシアジピン酸およびα−ヒドロムコン酸は、配列番号１、２、３、４、５、６、２１３に記載のポリペプチドを発現させたことにより生産可能になったことが確認できた。また、Ｅｃ／Ｓｍｒ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｎｍ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｐｌ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｐｅ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｕｒ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｓｐ１＿３ＨＡ、およびＥｃ／Ｓｌｑ１＿３ＨＡではα−ヒドロムコン酸が検出されず、反応Ｃを触媒する酵素を発現させたＥｃ／Ｓｍｒ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｎｍ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｐｌ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｐｅ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｕｒ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｓｐ１＿ＨＭＡ、およびＥｃ／Ｓｌｑ１＿ＨＭＡではα―ヒドロムコン酸の生産が確認された。このことから、Ｅｃ／Ｓｍｒ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｎｍ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｐｌ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｐｅ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｕｒ１＿３ＨＡ、Ｅｃ／Ｓｓｐ１＿３ＨＡ、およびＥｃ／Ｓｌｑ１＿３ＨＡが生産した３−ヒドロキシアジピン酸、およびＥｃ／Ｓｍｒ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｎｍ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｐｌ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｐｅ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｕｒ１＿ＨＭＡ、Ｅｃ／Ｓｓｐ１＿ＨＭＡ、およびＥｃ／Ｓｌｑ１＿ＨＭＡが生産したα−ヒドロムコン酸は、共に３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを経由して生成されたことがわかった。従って、配列番号１、２、３、４、５、６、２１３に記載のポリペプチドは３−オキソアジピル−ＣｏＡを還元して３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを生成する活性を有していることがわかった。【０１８５】
【表１０】
2019107516.tif 000019
【０１８６】
参考例６
アセチル−ＣｏＡおよびスクシニル−ＣｏＡから３−オキソアジピル−ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する反応（反応Ａ）を触媒する酵素、及びアジピル−ＣｏＡからアジピン酸を生成する反応（反応Ｇ）を触媒する酵素を発現するプラスミドの作製
参考例１で作製したｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴをＨｐａＩで切断して得られる６．６ｋｂの断片をｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴ／ＨｐａＩとした。反応Ｇを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ１株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子ｄｃａＩおよびｄｃａＪ（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：ＣＲ５４３８６１．１、配列番号２２１、２２２）の全長を含む連続した配列をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２２３、２２４）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴ／ＨｐａＩを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴ２とした。【０１８７】
参考例７
２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡからアジピル−ＣｏＡを生成する反応（反応Ｄ）を触媒する酵素を発現するためのプラスミドの作製
大腸菌内で自律複製可能な発現ベクターｐＭＷ１１９（ニッポンジーン社製）をＳａｃＩで切断し、ｐＭＷ１１９／ＳａｃＩを得た。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｇａｐＡ（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：  ＮＣ＿０００９１３．３）の上流域２００ｂ（配列番号１７）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２２５、２２６）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＭＷ１１９／ＳａｃＩを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え大腸菌株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＭＷ１１９：：Ｐｇａｐとした。続いてｐＭＷ１１９：：ＰｇａｐをＳｐｈＩで切断し、ｐＭＷ１１９：：Ｐｇａｐ／ＳｐｈＩを得た。反応Ｄを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ１株由来のｄｃａＡ（ＮＣＢＩ−ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＡＡＬ０９０９４．１、配列番号２２７）の全長をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２２８、２２９）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＭＷ１１９：：Ｐｇａｐ／ＳｐｈＩを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＭＷ１１９：：ＥＲとした。【０１８８】
実施例７
配列番号１、２、３、４、５、６、２１３に記載のポリペプチドをコードする核酸が導入されたアジピン酸生産能を有する大腸菌の作製
参考例６で作製したプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴ２を、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）にエレクトロポレーション（ＮＭ  Ｃａｌｖｉｎ，  ＰＣ  Ｈａｎａｗａｌｔ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，  １７０  （１９８８），  ｐｐ．  ２７９６-２８０１）で導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて３７℃で培養した。得られた組み換え株をＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴ２とした。【０１８９】
参考例４で作製したプラスミドｐＣＤＦ−１ｂ：：ＥＨａをＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴ２にエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよびストレプトマイシン５０ｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて３７℃で培養した。得られた組み換え株をＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴ２／ｐＣＤＦ−１ｂ：：ＥＨａとした。【０１９０】
参考例７で作製したプラスミドｐＭＷ１１９：：ＥＲをＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴ２／ｐＣＤＦ−１ｂ：：ＥＨａにエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬおよびアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて３７℃で培養した。得られた組み換え株をＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴ２／ｐＣＤＦ−１ｂ：：ＥＨａ／ｐＭＷ１１９：：ＥＲとした。【０１９１】
参考例２で作製した７種類のプラスミドをそれぞれＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴ２／ｐＣＤＦ−１ｂ：：ＥＨａ／ｐＭＷ１１９：：ＥＲにエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて、３７℃で培養した。「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｍｒ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｍｒ１＿ＡＤＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｎｍ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｎｍ１＿ＡＤＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｐｌ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｐｌ１＿ＡＤＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｐｅ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｐｅ１＿ＡＤＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｕｒ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｕｒ１＿ＡＤＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｓｐ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｓｐ１＿ＡＤＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｌｑ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｌｑ１＿ＡＤＡ」とし、本実施例で得られた組換え株を表１１に示す。【０１９２】
比較例８
３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸が導入されたアジピン酸生産能を有する大腸菌の作成
参考例３で作製したプラスミド「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｐｐｕ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｅｃｏ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ａｃｉ１」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｐｌ２」それぞれを、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＡＴＣＴ２／ｐＣＤＦ−１ｂ：：ＥＨａ／ｐＭＷ１１９：：ＥＲにエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて、３７℃で培養した。【０１９３】
「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｐｐｕ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｐｐｕ１＿ＡＤＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｅｃｏ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｅｃｏ１＿ＡＤＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ａｃｉ１」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ａｃｉ１＿ＡＤＡ」、「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｐｌ２」を導入した組換え株を「Ｅｃ／Ｓｐｌ２＿ＡＤＡ」とし、本比較例で得られた組換え株を表１１に示す。【０１９４】
実施例８
配列番号１、２、３、４、５、６、２１３に記載のポリペプチドをコードする核酸が導入されたアジピン酸生産能を有する大腸菌を用いたアジピン酸の生産試験
実施例７で作製した大腸菌を用いてアジピン酸の生産試験を行った。ｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬ）５ｍＬに、実施例３で作製した組換え大腸菌株を一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ−１で１８時間振とう培養した。当該培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（コハク酸１０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬおよびＩＰＴＧ０．０１ｍＭ）５ｍＬに添加し、３０℃、１２０ｍｉｎ−１で２４時間振とう培養した。【０１９５】
アジピン酸および炭素源の定量分析
当該培養液より菌体を遠心分離した上清をＭｉｌｌｅｘ−ＧＶ（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて膜処理し、透過液を実施例２と同様の条件でＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて分析した。培養上清中に蓄積したアジピン酸の定量分析を行った結果、および式（３）を用いて算出したアジピン酸の収率を表１１に示す。【０１９６】
比較例９
３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼをコードする核酸が導入されたアジピン酸生産能を有する大腸菌を用いたアジピン酸の生産試験
実施例８と同様の方法にて、比較例８で作製した大腸菌を用いてアジピン酸の生産試験を行った結果を表１１に示す。【０１９７】
表１１の結果から、実施例８で用いた組換え株は、本比較例９で用いた組換え株よりもアジピン酸収率が向上することが明らかとなった。すなわち、配列番号１、２、３、４、５、６、２１３に記載のポリペプチドをコードする核酸を微生物に導入することによって、アジピン酸の生産性が著しく向上することがわかった。【０１９８】
【表１１】
2019107516.tif 000020
【０１９９】
実施例９
配列番号２および４に記載のポリペプチドが３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼの活性を有していることの確認
参考例２で作製したプラスミドｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｎｍ１およびｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｐｅ１を、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）にエレクトロポレーションで導入した。導入後の当該株をクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地にて３７℃で培養した。得られた組み換え株をＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｎｍ１およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｐｅ１とした。【０２００】
ｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌおよびクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬ）２０ｍＬに、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｎｍ１およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１：：Ｓｐｅ１を一白金耳植菌し、３７℃、１２０ｒｐｍで１７時間回旋培養した。当該培養液１０ｍＬを２Ｌの培地Ｉに添加し、３７℃、１００ｍｉｎ−１で２時間振とう培養した。当該培養液にＩＰＴＧを５００μＭとなるように添加し、１６℃、１００ｍｉｎ−１で１８時間振とう培養した。培養液を６０００ｒｐｍ、４℃で１５分遠心し上清を除去後の細胞ペレットをＨｉｓ−Ｂｉｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｋ社製）のＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで懸濁した。得られた細胞懸濁液を氷冷しながらＤｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）にて細胞を超音波破砕した。破砕後の溶液を１３０００ｒｐｍ、４℃で３０分遠心し、得られた上清を細胞破砕液とした。【０２０１】
細胞破砕液３０ｍＬに適量のＨｉｓ−Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ溶液を加え、４℃で１時間インキュベーションした。当該溶液を４０００ｒｐｍ、４℃で５分遠心し、上清を２０ｍＬ除去後のＨｉｓ−Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ溶液をカラムにロードした。１０ｍＬのＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した後、１０ｍＬのＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ１（イミダゾール２５ｍＭ）で２回、１０ｍＬのＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ２（イミダゾール６０ｍＭ）で２回洗浄した。最後に２ｍＬのＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（イミダゾール１ｍＭ）で４回溶出し、フラクションを回収した。【０２０２】
目的酵素の分子量である５５ｋＤａ付近にバンドが確認できたフラクションを８０００ｒｐｍ、４℃で１５分遠心し、上清を除去後５ｍＬのＳｔｒａｇｅ  Ｂｕｆｆｅｒを添加し、洗浄した。さらに８０００ｒｐｍ、４℃で１５分遠心し、上清を除去後３ｍＬのＳｔｒａｇｅ  Ｂｕｆｆｅｒを添加することを２回繰り返した。得られた溶液を酵素溶液Ｓｎｍ１およびＳｐｅ１とした。【０２０３】
３−オキソアジピン酸の調製：３−オキソアジピン酸はＷＯ２０１７／０９９２０９の参考例１に記載された方法により調製した。【０２０４】
３−オキソアジピル−ＣｏＡ溶液の調製：大腸菌内で自律複製可能な発現ベクターｐＲＳＦ−１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）をＫｐｎＩで切断し、ｐＲＳＦ−１ｂ／ＫｐｎＩを得た。反応Ｅを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＣｏＡトランスフェラーゼｐｃａＩおよびｐｃａＪ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：１０４６６１３および１０４６６１２、配列番号２３および２４）の全長をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２３０、２３１）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＲＳＦ−１ｂ／ＫｐｎＩ  を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認した。得られたプラスミドを「ｐＲＳＦ−１ｂ：：ＣＴ」とした。【０２０５】
ｐＲＳＦ−１ｂ：：ＣＴを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、常法に従いイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による当該酵素の発現誘導、続いて培養液からのヒスチジンタグを利用した精製を行い、ＣｏＡトランスフェラーゼ溶液を得た。当該溶液を用いて以下組成の３−オキソアジピル−ＣｏＡ調製用酵素反応溶液を調製し、２５℃で３分反応させた後、ＵＦ膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で処理することで酵素を除去し、得られた透過液を３−オキソアジピル−ＣｏＡ溶液とした。【０２０６】
３−オキソアジピル−ＣｏＡ調製用酵素反応溶液：
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．５ｍＭ  ｓｕｃｃｉｎｉｙ−ＣｏＡ
５ｍＭ  ３−ｏｘｏａｄｉｐｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ
２μＭ  ＣｏＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。【０２０７】
３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ活性の確認：３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼ活性は、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡの生成量を測定することで確認した。酵素溶液Ｓｎｍ１およびＳｐｅ１を用いて以下組成の酵素反応溶液を調製し、２５℃で1時間反応後の酵素反応溶液をＭｉｌｌｅｘ−ＧＶ（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて膜処理し、透過液を実施例２と同様の条件でＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて分析した。なお３−オキソアジピル−ＣｏＡ濃度はＫａｓｃｈａｂｅｋらの方法（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ２００２  Ｊａｎ；  １８４（１）：  ２０７-２１５）を用いて定量し、酵素反応溶液中の濃度が１５μＭとなるよう調整した。コントロールとして酵素溶液の代わりにＴｒｉｓ−ＨＣｌを添加して同様に反応させた結果も併せて表１２に示す。【０２０８】
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１５０μＬ／ｍＬ  ３−ｏｘｏａｄｉｐｙｌ−ＣｏＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
０．５ｍＭ  ＮＡＤＨ
１ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
１０μＭ  ３−ｏｘｏａｄｉｐｙｌ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ。【０２０９】
表１２の結果から、酵素溶液Ｓｎｍ１およびＳｐｅ１を用いた反応では３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡの生成が確認できた。一方コントロールでは３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡは検出されなかった。従って、酵素溶液Ｓｎｍ１およびＳｐｅ１は３−オキソアジピル−ＣｏＡレダクターゼの活性を有していることが明らかとなった。【０２１０】
【表１２】
2019107516.tif 000021
【図１】
2019107516.tif 000022
【配列表】
2019107516000001.app
【国際調査報告】
2019107516.tif 000023
2019107516.tif 000024
2019107516.tif 000025
2019107516.tif 000026
2019107516.tif 000027