(57)【要約】水分散液中のＰＨＡ粒子の分散性に優れ、なおかつ優れた製膜性を有し、ＰＨＡ粒子またはその水分散液から得られる成形体の臭気が抑制され色調が良好なＰＨＡ粒子及びその水分散液を提供する。粒子状のポリヒドロキシアルカノエートと、該ポリヒドロキシアルカノエートの表面の一部又は全部を被覆するペプチドグリカンとを有し、ポリヒドロキシアルカノエートの含有量が９８．０重量％以上、ペプチドグリカンの含有量が０．１重量％以上１．０重量％以下である、ポリヒドロキシアルカノエート粒子。【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子状のポリヒドロキシアルカノエートと、該ポリヒドロキシアルカノエートの表面の一部又は全部を被覆するペプチドグリカンとを有し、
ポリヒドロキシアルカノエートの含有量が９８．０重量％以上、ペプチドグリカンの含有量が０．１重量％以上１．０重量％以下である、ポリヒドロキシアルカノエート粒子。
【請求項２】
タンパク質の含有量が１．０重量％以下である請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート粒子。
【請求項３】
水系媒体と、該水系媒体中に分散した請求項１又は２に記載のポリヒドロキシアルカノエート粒子と、を有するポリヒドロキシアルカノエート水分散液。
【請求項４】
水系媒体中に分散したポリヒドロキシアルカノエート粒子の平均粒子径が０．０５μｍ以上１０μｍ以下である、請求項３に記載のポリヒドロキシアルカノエート水分散液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート粒子及び該粒子が水系媒体に分散した水分散液に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと称する場合がある）は、細菌や植物が産生可能な樹脂として知られている。このようなＰＨＡは、原料を植物由来とし優れた生分解性を有するため、環境に優しいプラスチック材料として利用することの各種試みが精力的になされている。【０００３】
ＰＨＡをプラスチック材料として利用する試みの一つとして、ＰＨＡの水分散液（エマルジョン）の形態で使用することが検討されている。例えば、特許文献１には、ＰＨＡを有機溶剤に溶解させた後、界面活性剤やＰＶＡ等と共に押し出して水分散液を製造する方法が開示されている。また、例えば、特許文献２には、高圧ホモジナイザーで分散状態にした結晶化度が低い又は非晶性のＰＨＡを含むポリマーを含むスラリーをそのポリマーの融点以上に加熱し、その後冷却することでＰＨＡ分散液を製造する方法が開示されている。また、特許文献３には、ＰＨＡ粒子を分散させるために、水溶性共重合体を添加する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国第２０１３−０２２５７６１号
【特許文献２】米国特許第６２２８９３４号
【特許文献３】国際公開第１９９７／０２１７６２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１、２に記載されるような従来の方法では、有機溶剤の使用により環境負荷が増大したり、分散剤の添加により製品品質を損なうおそれがある。さらに、予め精製したＰＨＡとして用い、その後ＰＨＡを含むスラリーに加熱冷却を繰り返すことでエマルジョンを得るためエネルギー的に不利である。また、特許文献３に記載される方法では、ＰＨＡ粒子同士の凝集を防ぐために、一定濃度以上の分散剤が必要であり、ＰＨＡ本来の生分解性を損ねたり、加熱時に臭気や色調が悪化するおそれがある。【０００６】
したがって、本発明の目的は、水分散液中のＰＨＡ粒子の分散性に優れ、なおかつ優れた製膜性を有し、ＰＨＡ粒子またはその水分散液から得られる成形体の臭気が抑制され色調が良好なＰＨＡ粒子及びその水分散液を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、表面の一部又は全部にペプチドグリカンを有するＰＨＡ粒子であって、そのＰＨＡ量とペプチドグリカン量が特定範囲に制御されたものによると、水中にてＰＨＡ粒子同士が凝集することなく安定に分散したエマルジョン（水分散液）が得られることを見出した。また、上記水分散液は製膜性に優れ、当該水分散液や前記ＰＨＡ粒子を用いて製造した成形体は臭気が抑制され、色調にも優れることを見出した。本発明は、これらの知見に基づき完成された発明である。さらに本発明者は、本発明のＰＨＡ水分散液は、ＰＨＡが結晶化度が比較的高い結晶性ＰＨＡの場合のみならず、結晶化度が低いＰＨＡ又は非晶性ＰＨＡのいずれであっても、優れた製膜性を有することも併せて見出した。【０００８】
すなわち、本発明は、例えば以下の発明に関する。
［１］粒子状のポリヒドロキシアルカノエートと、該ポリヒドロキシアルカノエートの表面の一部又は全部を被覆するペプチドグリカンとを有し、
ポリヒドロキシアルカノエートの含有量が９８．０重量％以上、ペプチドグリカンの含有量が０．１重量％以上１．０重量％以下である、ポリヒドロキシアルカノエート粒子。
［２］タンパク質の含有量が１．０重量％以下である［１］に記載のポリヒドロキシアルカノエート粒子。
［３］水系媒体と、該水系媒体中に分散した［１］又は［２］に記載のポリヒドロキシアルカノエート粒子と、を有するポリヒドロキシアルカノエート水分散液。
［４］水系媒体中に分散したポリヒドロキシアルカノエート粒子の平均粒子径が０．０５μｍ以上１０μｍ以下である、［３］に記載のポリヒドロキシアルカノエート水分散液。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＰＨＡ粒子は上記構成を有するため、水中にて粒子同士が凝集することなく分散した水分散液（エマルジョン）が得られ、当該エマルジョンを用いることにより、臭気が抑制され色調に優れた、良好なＰＨＡ膜等の成形体を形成することができる。また、上記エマルジョンは、長期保管によりＰＨＡ粒子が沈降した場合であっても、振り混ぜる等の簡便な撹拌によりＰＨＡ粒子をほぐすことが可能であり、容易に再分散可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１及び比較例１において作製した水分散体の希釈物を撮影した写真
【図２】実施例１及び比較例１において作製した薄膜を撮影した写真
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［ポリヒドロキシアルカノエート粒子］
本発明のＰＨＡ粒子は、粒子状のＰＨＡと、該ＰＨＡの表面の一部又は全部を被覆するペプチドグリカンとを少なくとも有する粒子である。
【００１２】
（Ａ）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）
本発明のＰＨＡ粒子を構成するＰＨＡは、ヒドロキシアルカン酸をモノマー成分とする重合体である。中でも、ＰＨＡとしては、本発明のＰＨＡ粒子を容易に得られる点で、微生物から生産される微生物産生ＰＨＡが好ましく、より好ましくは下記一般式（１）
［−ＣＨＲ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−］          （１）
（式中、ＲはＣｎＨ２ｎ＋１で表されるアルキル基で、ｎは１以上１５以下の整数である。）で示される繰り返し単位を含む微生物産生ＰＨＡ（脂肪族ポリエステル）である。
【００１３】
なお、一般的にＰＨＡは上述の微生物産生ＰＨＡと、ラクトンの開環重合といった化学合成により得られる化学合成ＰＨＡとに分類される。これらＰＨＡは構造が異なり、微生物産生ＰＨＡは、そのモノマー構造単位がＤ体（Ｒ体）のみからなり光学活性を有するのに対して、化学合成ＰＨＡは、Ｄ体（Ｒ体）及びＬ体（Ｓ体）から誘導されたモノマー構造単位がランダムに結合したものであって光学的に不活性である。
【００１４】
ＰＨＡとしては、３−ヒドロキシブチレート単位を含むＰＨＡが好ましく、このようなＰＨＡとしては、例えば、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）、〔ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＶ３ＨＨ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート）（ＰＨＢＨ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート）（Ｐ３ＨＢ４ＨＢ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシオクタノエート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシオクタデカノエート）等が、工業的に生産が容易である点から、好ましい。これらの中でも特に、ＰＨＢ、ＰＨＢＶ、Ｐ３ＨＢ３ＨＶ３ＨＨ、ＰＨＢＨ、Ｐ３ＨＢ４ＨＢがより好ましい。ＰＨＡが３−ヒドロキシブチレート単位構造を含むＰＨＡである場合、繰り返し単位（モノマー構造単位）の平均組成比は、柔軟性と強度のバランスの観点から、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）の組成比が６０〜９９モル％が好ましく、より好ましくは７０〜９９モル％、さらに好ましくは８０〜９９モル％、さらに好ましくは８５〜９７モル％である。
【００１５】
結晶化度が低いＰＨＡ又は非晶性ＰＨＡとしては、例えば、文献：Ｙ．Ｄｏｉ，Ｓ．ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｈ．Ａｂｅ．，Ｍａｃｒｏｌｅｃｕｌｅｓ．，２８，ｐｐ．４８２２−４８２８（１９９５）に記載の結晶化度が３０％以下のＰＨＡが挙げられる。結晶化度が低いＰＨＡ又は非晶性ＰＨＡとしては、より具体的には、前記ＰＨＢＨにおいて、３−ヒドロキシヘキサノエート（以下、「３ＨＨ」と略称する）の組成比が１５ｍｏｌ％以上のＰＨＢＨが好適に用いられる。例えば、３ＨＨの組成比が１５ｍｏｌ％の場合、結晶化度は２６±５％となり、３ＨＨの組成比が増えるにつれて結晶化度は低下し、３ＨＨ組成が２５ｍｏｌ％では結晶化度は１８±５％となる。また、３ＨＨ組成が１５ｍｏｌ％を超えると、ＰＨＢＨ粒子の付着性が高まり、２５ｍｏｌ％では、室温でガム状となる。なお、結晶化度は通常、経時的に又は環境等により変化し得るが、上述の文献に記載の結晶化度は、とり得る結晶化度の最大値の意味である。
【００１６】
本発明のＰＨＡ粒子におけるＰＨＡは、公知乃至慣用の方法により製造することができる。ＰＨＡが微生物産生ＰＨＡの場合、当該ＰＨＡの生産に用いる微生物としては、ＰＨＡ類生産能を有する微生物であれば特に限定されない。例えば、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）（以下、「ＰＨＢ」と略称する。）生産菌としては、１９２５年に発見されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍが最初で、他にもカプリアビダス・ネケイター（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）（旧分類：アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、ラルストニア・ユートロフア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ））、アルカリゲネス・ラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ）などの天然微生物が知られており、これらの微生物ではＰＨＢが菌体内に蓄積される。
【００１７】
また、ヒドロキシブチレート単位とその他のヒドロキシアルカノエート単位とを含む共重合体の生産菌としては、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）およびポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート）生産菌であるアエロモナス・キヤビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート）生産菌であるアルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）などが知られている。特に、ＰＨＢＨに関し、ＰＨＢＨの生産性を上げるために、ＰＨＡ合成酵素群の遺伝子を導入したアルカリゲネス・ユートロファス  ＡＣ３２株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＣ３２，  ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０３８）（Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ｊ．Ｂａｔｅｒｉｏｌ．，１７９，ｐ４８２１−４８３０（１９９７））などがより好ましく、これらの微生物を適切な条件で培養して菌体内にＰＨＢＨを蓄積させた微生物菌体が用いられる。また上記以外にも、生産したいＰＨＡに合わせて、各種ＰＨＡ合成関連遺伝子を導入した遺伝子組換え微生物を用いても良いし、基質の種類を含む培養条件の最適化をすればよい。
【００１８】
本発明のＰＨＡ粒子においてＰＨＡは、１種類を単独で用いても良いし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１９】
本発明のＰＨＡ粒子におけるＰＨＡの含有量は、ＰＨＡ粒子１００重量％に対し、９８．０重量％以上であり、好ましくは９８．５重量％以上、さらに好ましくは９９．０重量％以上である。ＰＨＡの含有量の上限は特に限定されないが、９９．９重量％以下が好ましく、より好ましくは９９．８重量％以下、さらに好ましくは９９．５重量％以下である。ＰＨＡの含有量を９８．０重量％以上とすることにより、溶融加工がしやすく、加熱成形時の臭気が低減された成形体が得られる。一方、ＰＨＡの含有量を９９．９重量％以下とすることにより、これによりある程度のペプチドグリカン量を確保でき、ＰＨＡ水分散液の分散性がいっそう向上する傾向がある。本発明のＰＨＡ粒子におけるＰＨＡの含有量は、例えば、ガスクロマトグラフやＴＧ−ＤＴＡより求めることができ、より具体的には実施例に記載した方法により測定できる。
【００２０】
本発明のＰＨＡ粒子を構成するＰＨＡは、粒子状のＰＨＡである。粒子状であればその形状は特に限定されず、粒状、略球状、球状、繊維状、針状、柱状、棒状、板状、これらに類する形状、不定形状等のいずれであってもよい。微生物産生ＰＨＡから製造した本発明のＰＨＡ水分散液におけるＰＨＡ粒子の形状は、通常、粒状である。
【００２１】
（Ｂ）ペプチドグリカン
本発明のＰＨＡ粒子を構成するペプチドグリカンは、微生物など大部分の原核生物の細胞壁成分をなす糖ペプチドのポリマーである。ペプチドグリカンは、Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｃ  ａｃｉｄまたはＮ−ｇｌｙｃｏｓｙｌｍｕｒａｍｉｃ  ａｃｉｄとＤ−アミノ酸を含み、グリカン鎖とペプチド鎖とが網目状に結合して三次元構造を構築し、物理的に極めて堅固な構造を形成している。
【００２２】
ペプチドグリカンとしては、ＰＨＡを産生した微生物のペプチドグリカンが好ましい。即ち、本発明のＰＨＡ粒子を構成するペプチドグリカンとしては、ＰＨＡを産生した微生物由来のペプチドグリカンをそのまま残して利用することが好ましい。
【００２３】
本発明のＰＨＡ粒子におけるペプチドグリカンの含有量は、０．１重量％以上であり、好ましくは０．２重量％以上、より好ましくは０．５重量％以上であり、また、１．０重量％以下であり、好ましくは０．９８重量％以下、より好ましくは０．９５重量％以下である。ペプチドグリカンの含有量を０．１重量％以上とすることにより、分散性及び製膜性に優れた水分散液が得られる。一方、ペプチドグリカンの含有量を１．０重量％以下とすることにより、色調が良好であり臭気が抑制された成形体（薄膜等）を得ることができる。本発明のＰＨＡ粒子におけるペプチドグリカンの含有量は、例えば、実施例に記載した方法により測定できる。
【００２４】
（Ｃ）その他の成分
本発明のＰＨＡ粒子は、ＰＨＡとペプチドグリカンのみを構成成分とするものであってもよく、さらにその他の成分を含むものであってもよい。その他の成分の代表例としては、微生物由来の不純物が挙げられる。当該不純物として代表的なものとして、タンパク質が挙げられる。当該タンパク質は、微生物など大部分の原核生物を構成する成分である、アミノ酸のポリマーである。アミノ酸同士がペプチド結合にて結合し、タンパク質となる。タンパク質は通常、ＰＨＡ以外の微生物由来の不純物の４０％程度を占める。
【００２５】
本発明のＰＨＡ粒子におけるタンパク質の含有量は、１．０重量％以下が好ましく、より好ましくは０．５重量％以下である。タンパク質の含有量を１．０重量％以下に制御することにより、ＰＨＡ粒子又はその水分散液を使用して製造した成形物の着色が抑制されたり、当該成形物の加熱時の臭気発生が抑制される傾向がある。タンパク質の含有量の下限は、特に限定されず、０重量％であることが最も好ましいが、例えば０．０１重量％以上であってもよい。本発明のＰＨＡ粒子におけるタンパク質の含有量は、例えば、実施例に記載した方法により牛血清アルブミン換算の量として測定できる。
【００２６】
本発明のＰＨＡ粒子は、さらにタンパク質以外の微生物由来の不純物等を含むものであってもよい。当該不純物として、核酸、脂質、多糖やその他の炭化物等が挙げられる。
【００２７】
本発明のＰＨＡ粒子は、あらゆる形態で使用することができる。例えば、実質的に乾燥した状態で使用することもできるし、分散媒に分散させた分散液の形態で使用することもできる。ＰＨＡ粒子の粒子径は特に限定されないが、例えば、その一次粒子の平均粒子径は、０．０５〜１０μｍが好ましく、より好ましくは０．３〜５．０μｍ、さらに好ましくは０．５〜３．０μｍである。上記平均粒子径は、マイクロトラック粒度計（日機装社製）などの汎用粒度計を用い、ＰＨＡ粒子を水に分散させて、正規分布の全粒子５０％蓄積量に対する粒子径（体積平均粒径）として測定される。
【００２８】
［ＰＨＡ水分散液］
本発明のＰＨＡ水分散液（ポリヒドロキシアルカノエート水分散液）は、水系媒体と、当該水系媒体中に分散したＰＨＡ粒子（本発明のＰＨＡ粒子）とを少なくとも有する水分散液である。後述のように本発明のＰＨＡ水分散液は、その他の成分を含んでいてもよい。本発明における「ＰＨＡ水分散液」とは、媒体として水を含有する分散液に限定されず、後述するように、媒体として、水と相溶性のある有機溶媒を含有する分散液も含む用語である。
【００２９】
本発明のＰＨＡ水分散液におけるＰＨＡ粒子の濃度は特に限定されないが、好ましくは３００ｇ／Ｌ以上、より好ましくは４００ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは５００ｇ／Ｌ以上である。濃度の上限値も特に限定されないが、好ましくは７００ｇ／Ｌ以下、より好ましくは６００ｇ／Ｌ以下である。また、水分散液のｐＨは特に限定されないが、ＰＨＡ粒子の分散性の面で、４．０〜９．０が好ましい。
【００３０】
本発明の水分散液に含まれる水系媒体としては、水、水と相溶性のある有機溶媒、又は、水と前記有機溶媒との混合溶媒等が挙げられる。前記有機溶媒は１種類のみを使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。また、水と前記有機溶媒との混合溶媒中の前記有機溶媒の濃度としては、使用する有機溶媒の水への溶解度以下であれば特に限定されない。また、水と相溶性のある有機溶媒としては特に限定されるものではないが、例えばメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノールなどのアルコール類；アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類；テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類；アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類；ジメチルホルムアミド、アセトアミドなどのアミド類；ジメチルスルホキシド、ピリジン、ピペリジンなどが挙げられる。なかでも、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、プロピオニトリルなどが除去の容易さの面などから好適である。さらに、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、アセトンなどが入手容易であることからより好ましい。さらに好ましくは、メタノール、エタノール、アセトンである。なお、本発明の本質を損なわない限り、他の溶媒や菌体由来の成分および精製時に発生する化合物を含んでいても構わない。
【００３１】
本発明のＰＨＡ水分散液は、その他の成分を含んでいてもよい。その他の成分としては、例えば、界面活性剤、分散剤、防腐剤等が挙げられる。界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム及びオレイン酸ナトリウム等）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテルやポリオキシアルキレンアルキルエーテル等）が価格、使用量や添加効果の点で好ましい。分散剤としては、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリアクリル酸カリウム、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸ナトリウム等の水溶性高分子が挙げられる。中でも、ポリビニルアルコール、メチルセルロースが好ましい。また、防腐剤としては、過酸化水素、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、ヒノキチオール、パラベン等が挙げられる。
【００３２】
本発明のＰＨＡ水分散液におけるＰＨＡ粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、０．０５〜１０μｍが好ましく、より好ましくは０．３〜５．０μｍ、さらに好ましくは０．５〜３．０μｍである。上記平均粒子径は、マイクロトラック粒度計（日機装社製）などの汎用粒度計を用い、ＰＨＡ水分散液を測定サンプルとし、正規分布の全粒子５０％蓄積量に対する粒子径（体積平均粒径）として測定される。平均粒子径が上記範囲にあることにより、ハンドリング性、水分散性及び製膜性がいっそう向上する傾向がある。
【００３３】
（ＰＨＡ粒子及びＰＨＡ水分散液の製造方法）
本発明のＰＨＡ粒子は、特に限定されず、公知乃至慣用の技術を利用した製造方法により製造することができる。例えば、ＰＨＡを体内に蓄積した微生物（ＰＨＡ類生産能を有する微生物）について、ＰＨＡ以外の微生物由来の成分（特に有機物）を分解、可溶化及び／又は除去し、その後、粒子状のＰＨＡを回収する工程を含む方法等が挙げられる。本方法において、微生物の細胞壁由来のペプチドグリカンが所定量（０．１重量％以上１．０重量％以下）となるように残しつつ、その他の不純物を除去するためには、例えば、細胞壁分解酵素を使用しないか、その使用量を少なくすること；高圧破砕時の圧力を低過ぎず高過ぎない範囲に設定すること；高圧破砕の時間を制御すること；これらを組み合わせて制御すること等、を実施することが好ましい。高圧破砕時の圧力は特に限定されないが、１００〜５００ｋｇ／ｃｍ２が好ましい。
【００３４】
上記製造方法においてＰＨＡ粒子以外の微生物由来成分等の不純物を分解、可溶化及び／又は除去する方法としては、ＰＨＡを含有する細胞を物理的処理、化学的処理または生物学的処理する方法が好ましい。これにより、微生物由来成分の不純物の分解及び／又は除去工程を効率的に実施することができる。物理的処理、化学的処理または生物学的処理の方法としては特に限定されないが、従来公知のフレンチプレスや高圧ホモジナイザー、Ｘ−プレス、ボールミル、コロイドミル、ＤＹＮＯミル、超音波ホモジナイザーなどの、流体せん断力や固体せん断力、磨砕を利用した方法が使用しうる。高圧ホモジナイザーを用いる場合、操作圧力を高めると、微生物由来の不純物が減少する傾向があるので、ペプチドグリカンが０．１重量％以上、タンパク質が１．０重量％以下、ＰＨＡが９８重量％以上になるように操作圧力を調整すると良い。
【００３５】
また、酸やアルカリ、界面活性剤、有機溶剤、細胞壁合成阻害剤などの薬剤を用いる方法、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、チモリアーゼなどの酵素を用いる方法、超臨界流体を用いる方法や、浸透圧破砕法、凍結法、乾燥粉砕法などが挙げられる。また、細胞自身に含まれるプロテアーゼやエステラーゼなどの作用を利用する自己消化法も破砕法の一種として挙げられる。これらの破砕方法においては、一連の処理によるＰＨＡの分子量低下を抑える方法を選択することが望ましい。また、これらの破砕方法は単独で用いても良いし、複数の方法を組み合わせても良い。また、バッチ処理でも良いし、連続処理を行っても良い。
【００３６】
ＰＨＡ粒子以外の微生物由来成分等の不純物を分解及び／又は除去する方法としては、特に限定されないが、例えば酵素を用いる方法を挙げることができる。使用する酵素としては、蛋白質分解酵素、脂質分解酵素、細胞壁分解酵素、核酸分解酵素等が挙げられる。これらの酵素の具体例としては下記のものが挙げられる。これらは、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３７】
（１）蛋白質分解酵素
エスペラーゼ、アルカラーゼ、ペプシン、トリプシン、パパイン、キモトリプシン、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ等
（２）脂質分解酵素
リパーゼ、ホスホリパーゼ、コリンエステラーゼ、ホスファターゼ等
（３）核酸分解酵素
リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ等
ＰＨＡ粒子以外の微生物由来成分等の不純物の分解に用いられる酵素は、上記のものに限定されるわけではなく、工業的な製品に用いられ得るものであれば、微生物由来成分を分解する活性を有する任意の酵素であってよい。また、一般に市販されている洗濯用酵素洗剤等も用いることができる。さらには、例えば、酵素の安定化剤や再汚染防止剤等と酵素とを含有する酵素組成物であってもよく、酵素のみには限定されない。好ましい蛋白質分解酵素としては、上記例示に含まれるもののうち、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＰ、プロテアーゼＮ（以上、天野エンザイム社製）、エスペラーゼ、アルカラーゼ、ザビナーゼ、エバラーゼ（以上、ノボザイム社製）等が工業的に使用可能なものとして挙げられ、分解活性の点からも好適に使用できる。しかし、これらに限られるものではない。
【００３８】
一方で、細胞壁分解酵素は、ＰＨＡ粒子に含まれるペプチドグリカンの含有量が０．１重量％以上となるように制御できる範囲で使用してもよい。
【００３９】
（１）細胞壁分解酵素
リゾチーム、アミラーゼ、セルラーゼ、マルターゼ、サッカラーゼ、α−グリコシダーゼ、β−グリコシダーゼ、Ｎ−グリコシダーゼ等
酵素処理時間は、所望の処理度を達成するまで行うのが好ましく、通常０．５〜２時間である。酵素の使用量は、酵素の種類及び活性に依存し、特に制限はされないが、ＰＨＡ粒子１００重量部に対して、０．００１〜１０重量部が好ましく、さらにはコストの点から０．００１〜５重量部がより好ましい。
【００４０】
ＰＨＡ粒子以外の生物由来成分等の不純物を分解するその他の方法としては、次亜塩素酸や過酸化水素を用いる方法が挙げられる。次亜塩素酸を用いる際は、系のｐＨをアルカリ領域とし、熱や光、金属との接触を抑制した条件で次亜塩素酸処理を実施することで、塩素残量の低いＰＨＡ粒子を得ることができる。系のｐＨは８以上が望ましく、より望ましくは１０以上、さらに望ましくは１２以上である。処理温度は４０℃以下が望ましく、より望ましくは３０℃以下であり、さらに望ましくは２０℃以下、確実に効果を発揮するためには１０℃以下で実施することが望ましい。
【００４１】
通常、上記方法にてＰＨＡ含有菌体を物理的処理、化学的処理もしくは生物学的処理して得たＰＨＡ水性懸濁液には、細胞中のタンパク質や核酸、脂質、糖成分およびその他の菌体構成成分や、培養基質残分などが混入している。これらのタンパク質等を含む水を分離する脱水工程を実施することが好ましい。これにより、ＰＨＡ水性懸濁液に含まれる不純物の量を低減することができる。脱水の方法としては特に限定されないが、ろ過や遠心分離、沈降分離による方法が挙げられる。
【００４２】
上述したように前記脱水工程では、ＰＨＡ粒子と、それ以外の生物由来成分等の不純物を含む水を分離するために、ろ過や遠心分離等を実施することができる。ろ過の方法は特に制限がないが、ヌッチェなどを用いる方法や、吸引ろ過や加圧ろ過などの方法が望ましい。工業的にはフィルタープレス、チューブプレス、プレートプレス、ゲージプレス、ベルトプレス、スクリュープレス、円板プレスなどの圧搾機能を有したろ過装置や、遠心脱水機、多室円筒ろ過機なども選択可能である。生産性を高める場合には多室円筒ろ過機などの連続式ろ過機が望ましい。連続式ろ過機の粒子の除滓方法として、ストリング方式、スクレパー方式、プレコートスクレパー方式などが挙げられる。また、膜分離方式を用いてもよい。膜分離を含めたろ過の方法としては、デッドエンドろ過、クロスフローろ過を選択することができる。いずれもろ過性やろ材、膜などへの閉塞の程度などから選択できる。また減圧、あるいは真空にしてもよいし、加圧してもよい。また、遠心力を用いる方法であってもよい。ろ材としては、紙、織布、不織布、スクリーン、焼結板、素焼、高分子膜、パンチングメタル、ウェッジワイヤーなど様々な素材を選択できる。いずれも生産性や閉塞の程度などから選択できる。また、ろ過助剤を用いてもよいし、用いなくともよい。ろ過助剤を用いる場合にも、ろ材に予めプレコートしておく方法（プレコート方式）、ろ過原液に予め添加しておく方法がある（ボディーフィード法）。
【００４３】
前記脱水工程での遠心分離の方法は特に限定されないが、遠心沈降機や遠心脱水機等を使用できる。遠心沈降機であれば分離板型、円筒型、デカンター型が挙げられる。分離板型であれば、ディスク型、セルフクリーニング型、ノズル型、スクリューデカンター型、スキミング型などが挙げられる。それぞれ沈降成分の排出の方法により回分式と連続式がある。また遠心脱水機についても回分式と連続式が挙げられる。これらの機器によって比重差により、ＰＨＡ粒子を含む沈降物と、培養液成分とを分離することが可能である。
【００４４】
前記脱水工程で使用可能な他の方法としてはフローテーション法、電気泳動法、サイクロン処理などが挙げられる。ろ過や遠心分離、またフローテーションなどの方法を単独で用いてもよいし、組み合わせてもよい。
【００４５】
前記脱水工程でろ過や遠心分離などの方法でＰＨＡ粒子を回収した後、回収したＰＨＡ粒子を水等の水系媒体で洗浄することで、更に精製度を高めたＰＨＡ粒子を得ることができる。洗浄は水以外にも有機溶媒を使用してもよいし、水と有機溶媒を混合して用いても良い。また水のｐＨを調整してもよい。有機溶媒を洗浄溶媒として用いる場合、好ましくは、親水性溶媒、具体的にはメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ケトン類、アミン類などを用いる。また界面活性剤などを水に添加してもよい。これらの有機溶媒や水を複数種類混合して用いてもよい。また、短時間であれば水やこれらの有機溶媒を加温したり蒸気として噴霧することで洗浄性を高めることもできる。
【００４６】
本発明のＰＨＡ粒子の製造方法は、上述のＰＨＡを体内に蓄積した微生物を得る工程（ＰＨＡ類生産能を有する微生物を培養してＰＨＡを製造する工程）を含むものであってもよい。また、本発明のＰＨＡ粒子の製造方法における各工程は、連続的に実施してもよいし、非連続的に実施してもよい。
【００４７】
本発明のＰＨＡ水分散液は、例えば上述のような方法で得られたＰＨＡ粒子を、所定の濃度となるように水系媒体に分散させることにより、製造することができる。分散させる方法は特に限定されず、攪拌機、ホモジナイザーを用いる方法等の公知乃至慣用の分散手段を利用することができる。水系媒体に分散させる際のＰＨＡ粒子は、水系媒体で洗浄した後の湿潤状態であることが、水分散液の製造のしやすさの観点で好ましい。
【００４８】
本発明のＰＨＡ粒子及び本発明のＰＨＡ水分散液は各種用途に使用することができ、特に限定されないが、例えば、公知乃至慣用の成形方法に付すことにより、各種成形体を得るための用途に使用することができる。特に、本発明の水分散液は製膜性に優れるため、当該水分散液を基材（例えば、金属、紙、プラスチック、繊維等の基材）上に塗工し、乾燥させることによって、ＰＨＡの膜（被膜）やフィルム等を得ることができる。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は当該実施例に限定されるものではない。【００５０】
（製造例１）
ＰＨＡを含む菌体培養液の製造
培養生産にはＫＮＫ−６３１株（国際公開第２００９／１４５１６４号参照）を用いた。【００５１】
種母培地の組成は１ｗ／ｖ％  Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％  Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％  Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８）とした。【００５２】
前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、１．２９ｗ／ｖ％  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％  微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、とした。炭素源としてはパーム油を用い、これを１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。【００５３】
ＰＨＡ生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、０．２９１ｗ／ｖ％  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％  微量金属塩溶液（０．１Ｎ  塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、０．０５ｗ／ｖ％  ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。【００５４】
まず、ＫＮＫ−６３１株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し、種母培養を行った。次に、種母培養液を１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら２８時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。【００５５】
次に、前培養液を、６ＬのＰＨＡ生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＳ−１０００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量６．０Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。上述のように、培養においては、炭素源としてパーム油を使用した。培養は６４時間行い、ＰＨＢＨであるＰＨＡを含む菌体培養液を得た。【００５６】
上記で得たＰＨＡを含む菌体培養液について、遠心分離を行うことによって菌体を回収し、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体を得た。この乾燥菌体の重量を測定しところ、乾燥菌体重量は２３０ｇ／Ｌであり、ＰＨＡ濃度は７０％であった。また、上記で得たＰＨＡを含む菌体培養液におけるＰＨＡの３ＨＨ（３−ヒドロキシヘキサノエート）組成比、結晶化度、重量平均分子量を以下の方法に従って測定したところ、それぞれ１１．５ｍｏｌ％、３０％、１２０万であった。【００５７】
（ＰＨＡの３ＨＨ組成比の測定方法）
上記の方法で得た乾燥菌体１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍｌになるまで濃縮後、９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥し、精製ＰＨＡを得た。【００５８】
得られた精製ＰＨＡの３ＨＨ組成比分析は、以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。精製ＰＨＡ２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱して、ＰＨＡ分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のポリエステル分解物のモノマーユニット組成比をキャピラリーガスクロマトグラフィー島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ  ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）により分析した。【００５９】
（ＰＨＡの結晶化度の測定方法）
上記の方法で得た精製ＰＨＡについて、ＤＳＣ（エスアイアイ・ナノテクノロジー（株）製ＤＳＣ２２０）を用い、２５℃から樹脂の融点より高い温度まで１０℃／ｍｉｎで昇温して２分間ホールドし、樹脂を融解させたあと、１０℃／分で冷却した。この冷却過程において見られる、結晶化を示すピークの温度と大きさ（結晶化熱量）により結晶化度を評価した。【００６０】
（ＰＨＡの重量平均分子量の測定方法）
上記の方法で得た精製ＰＨＡについて、ゲル浸透クロマトグラフィー（昭和電工社製「Ｓｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ−１０１」）を用い、カラムにポリスチレンゲル（昭和電工社製「Ｓｈｏｄｅｘ  Ｋ−８０４」）を用い、クロロホルムを移動相として、標準ポリスチレン換算の分子量を測定し、当該分子量から重量平均分子量を算出した。【００６１】
（製造例２）
ＫＮＫ−６３１株の代わりにＫＮＫ−００５株を用いたこと以外は製造例１と同様の方法で、ＰＨＢＨであるＰＨＡを含む菌体培養液を得た。【００６２】
上記で得たＰＨＡを含む菌体培養液について、製造例１と同様の方法で乾燥菌体重量を測定しところ２５０ｇ／Ｌであり、ＰＨＡ濃度は８０％であった。また、製造例１と同様の方法でＰＨＡの３ＨＨ組成比、結晶化度、重量平均分子量を測定したところ、それぞれ５．８ｍｏｌ％、４０％、１５０万であった。【００６３】
（製造例３）
ＫＮＫ−６３１株の代わりにＫＮＫ−２５２株を用い、炭素源としてパーム油の代わりにＰＦＡＤ（Ｐａｌｍ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｅ）を使用したこと以外は、製造例１に記載の方法で、ＰＨＢＨであるＰＨＡを含む菌体培養液を得た。【００６４】
上記で得たＰＨＡを含む菌体培養液について、製造例１と同様の方法で乾燥菌体重量を測定しところ２５５ｇ／Ｌであり、ＰＨＡ濃度は８２％であった。また、製造例１と同様の方法でＰＨＡの３ＨＨ組成比、結晶化度、重量平均分子量を測定したところ、それぞれ１６．９ｍｏｌ％、２６％、１２０万であった。【００６５】
（実施例１）
製造例１で得られたＰＨＡを含む菌体培養液を、８０℃で１時間加熱して滅菌した。次に、ＰＨＡの１／１００量のプロテアーゼ（ノボザイム社、エスペラーゼ）を添加し、ｐＨ８．０で５０℃に保持したまま、２時間攪拌した。その後、この液に対してドデシル硫酸ナトリウムが１．０重量％になるように３０％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を添加し、さらに、ｐＨが１１．５になるように３０％水酸化ナトリウム水溶液を添加した後、５０℃で１時間保温した。その後、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルＰＡ２Ｋ型）で約２００ｋｇｆ／ｃｍ２の圧力で高圧破砕を行った。高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物について、遠心分離による水洗をさらに６回繰り返し、最終的に得られた沈殿物に水を加えてＰＨＡ粒子濃度を５０％に調整し、ＰＨＡ水分散液を得た。該水分散体に含まれるＰＨＡ粒子は、粒子表面がペプチドグリカンで被覆されたものである。【００６６】
当該水分散液におけるＰＨＡ粒子の平均粒子径を、マイクロトラックＭＴ３３００ＥＸＩＩ（日機装社製）にて測定した。また、当該水分散液を約１００倍希釈したものを、ＮＩＫＯＮ製Ｈ５５０Ｓレンズで３００倍の倍率で観察し、撮影した写真を図１に示す。【００６７】
また、得られた水分散液をヌッチェで脱水後、加熱・減圧下で乾燥させてＰＨＡ粒子の乾燥サンプルを取得し、後述の方法で該ＰＨＡ粒子中のＰＨＡ量、タンパク量およびペプチドグリカン量を求めた。また、得られた水分散液１〜３ｇをφ８００ｍｍのガラス皿の底に薄く塗布し、１２０℃に熱したオーブンにて水分を蒸発させた。水分が十分に蒸発したのを確認した後、冷却し、ガラス皿の表面にＰＨＡの薄膜が形成していることを確認した。得られた薄膜の外観と臭気を確認した。結果を表１に示す。また、得られた薄膜を撮影した写真を図２に示す。【００６８】
（実施例２）
製造例２で得られたＰＨＡを含む菌体培養液を、８０℃で１時間加熱して滅菌した。その後、この液に対してドデシル硫酸ナトリウムが１．０重量％になるように３０．０％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を添加し、さらに、ｐＨが１１．５になるように３０％水酸化ナトリウム水溶液を添加した後、５０℃で１時間保温した。その後、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルＰＡ２Ｋ型）で約２００ｋｇｆ／ｃｍ２の圧力で高圧破砕を行った。高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物について、遠心分離による水洗をさらに６回繰り返し、最終的に得られた沈殿物に水を加えてＰＨＡ粒子濃度を５０％に調整し、ＰＨＡ水分散液を得た。該水分散体に含まれるＰＨＡ粒子は、粒子表面がペプチドグリカンで被覆されたものである。【００６９】
当該水分散液におけるＰＨＡ粒子の平均粒子径を、マイクロトラックＭＴ３３００ＥＸＩＩ（日機装社製）にて測定した。また、得られた水分散液をヌッチェで脱水後、加熱・減圧下で乾燥させてＰＨＡ粒子の乾燥サンプルを取得し、後述の方法で該ＰＨＡ粒子中のＰＨＡ量、タンパク量およびペプチドグリカン量を求めた。また、得られた水分散液１〜３ｇをφ８００ｍｍのガラス皿の底に薄く塗布し、１２０℃に熱したオーブンにて水分を蒸発させた。水分が十分に蒸発したのを確認した後、冷却し、ガラス皿の表面にＰＨＡの薄膜が形成していることを確認した。得られた薄膜の外観と臭気を確認した。結果を表１に示す。【００７０】
（実施例３）
製造例３で得られたＰＨＡを含む菌体培養液を、８０℃で１時間加熱して滅菌した。その後、この液に対してドデシル硫酸ナトリウムが１．０重量％になるように３０．０％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を添加し、さらに、ｐＨが１１．５になるように３０％水酸化ナトリウム水溶液を添加した後、５０℃で１時間保温した。その後、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルＰＡ２Ｋ型）で約２００ｋｇｆ／ｃｍ２の圧力で高圧破砕を行った。高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物について、遠心分離による水洗をさらに６回繰り返し、最終的に得られた沈殿物に水を加えてＰＨＡ粒子濃度を５０％に調整し、ＰＨＡ水分散液を得た。該水分散体に含まれるＰＨＡ粒子は、粒子表面がペプチドグリカンで被覆されたものである。【００７１】
当該水分散液におけるＰＨＡ粒子の平均粒子径を、マイクロトラックＭＴ３３００ＥＸＩＩ（日機装社製）にて測定した。また、得られた水分散液をヌッチェで脱水後、加熱・減圧下で乾燥させてＰＨＡ粒子の乾燥サンプルを取得し、後述の方法で該ＰＨＡ粒子中のＰＨＡ量、タンパク量およびペプチドグリカン量を求めた。また、得られた水分散液１〜３ｇをφ８００ｍｍのガラス皿の底に薄く塗布し、１２０℃に熱したオーブンにて水分を蒸発させた。水分が十分に蒸発したのを確認した後、冷却し、ガラス皿の表面にＰＨＡの薄膜が形成していることを確認した。得られた薄膜の外観と臭気を確認した。結果を表１に示す。【００７２】
（ＰＨＡ粒子中のＰＨＡ量の算出法）
上記で得られた水分散液をヌッチェで脱水後、加熱・減圧下で乾燥サンプルを得た。当該乾燥サンプル５ｍｇをＴＧ−ＤＴＡ（エスアイアイ・ナノテクノロジ社製）にて室温から６００℃まで加熱し、加熱前重量に対する３００〜３２０℃における残存重量からＰＨＡ量を求めた。【００７３】
（ＰＨＡ粒子中のペプチドグリカン量の算出法）
上記で得られた水分散液に、（株）和光純薬工業  ＳＬＰ−ＨＳ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｅｔにて調製した溶液を加え、これを３０℃の条件でパワースキャンＨＴ（ＤＳファーマバイオメディカル製）にて、吸光度（６５０ｎｍ）を１２０分間測定した。既知の濃度に調整されたペプチドグリカンの吸光度から検量線を作製し、測定した水分散液の吸光度と比較することでＰＨＡに含まれるペプチドグリカン量を求めた。【００７４】
（ＰＨＡ粒子中の残存タンパク量の算出法）
上記で得られた水分散液をヌッチェで脱水後、加熱・減圧下で乾燥サンプルを得た。当該乾燥サンプル１ｍｇを、蒸留水１ｍｌに懸濁させたのち、（株）タカラバイオＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔにて調製した溶液を加え、６０℃で３０分間処理した。これを冷却後、（株）島津製作所吸光度計ＵＶ−１７００にて分析して、ＰＨＡ粒子中の残存タンパク量を牛血清アルブミン換算で求めた。【００７５】
（ＰＨＡ水分散液の分散性評価）
上記で得たＰＨＡ水分散液の分散性は、以下の基準で評価した。【００７６】
○（分散性良好）：平均粒子径が０．０５〜１０μｍの範囲
×（分散性不良）：平均粒子径が１０μｍ超
（ＰＨＡ水分散液の製膜性評価）
上記で得たＰＨＡ水分散液の製膜性は、上述の方法で形成させた薄膜を目視で観察することにより評価した。均一な半透明膜又は透明膜が得られた場合には、製膜性に優れている（すなわち、良好な膜を形成できる）と評価できる。【００７７】
（臭気評価）
上述の方法で形成させた薄膜の臭いを嗅ぎ、臭気の有無を評価した。【００７８】
（比較例１）
製造例１で得られたＰＨＡを含む菌体培養液を、８０℃で１時間加熱して滅菌した。次に、ＰＨＡの１／１００量のプロテアーゼ（ノボザイム社、エスペラーゼ）を添加し、ｐＨ８．０で５０℃に保持したまま、２時間攪拌した。その後、この液に対してドデシル硫酸ナトリウムが１．０重量％になるように３０％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を添加し、さらに、ｐＨが１１．５になるように３０％水酸化ナトリウム水溶液を添加した後、５０℃で１時間保温した。その後、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルＰＡ２Ｋ型）で約５５０ｋｇｆ／ｃｍ２の圧力で高圧破砕を行った。高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物について、遠心分離による水洗をさらに６回繰り返し、最終的に得られた沈殿物に水を加えてＰＨＡ粒子濃度を３０％に調整し、ＰＨＡ水分散液を得た。【００７９】
当該水分散液におけるＰＨＡ粒子の平均粒子径を、マイクロトラックＭＴ３３００ＥＸＩＩ（日機装社製）にて測定した。また、当該水分散液を約１００倍希釈したものを、ＮＩＫＯＮ製Ｈ５５０Ｓレンズで３００倍の倍率で観察し、撮影した写真を図１に示す。【００８０】
また、得られた水分散液をヌッチェで脱水後、加熱・減圧下で乾燥させてＰＨＡ粒子の乾燥サンプルを取得し、上述の方法で該ＰＨＡ粒子中のＰＨＡ量、タンパク量およびペプチドグリカン量を求めた。また、得られた水分散液１〜３ｇをφ８００ｍｍのガラス皿の底に薄く塗布し、１２０℃に熱したオーブンにて水分を蒸発させた。水分が十分に蒸発したのを確認した後、冷却し、ガラス皿の表面にＰＨＡの薄膜が形成していることを確認した。得られた薄膜の外観と臭気を確認した。結果を表１に示す。また、得られた薄膜を撮影した写真を図２に示す。【００８１】
（比較例２）
製造例１で得られたＰＨＡを含む菌体培養液を、８０℃で１時間加熱して滅菌した。次に、その後、この液に対してドデシル硫酸ナトリウムが１．０重量％になるように３０．０％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を添加し、さらに、ｐＨが１１．５になるように３０％水酸化ナトリウム水溶液を添加した後、５０℃で１時間保温した。その後、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルＰＡ２Ｋ型）で約１０ｋｇｆ／ｃｍ２の圧力で高圧破砕を行った。高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物について、遠心分離による水洗をさらに６回繰り返し、最終的に得られた沈殿物に水を加えてＰＨＡ粒子濃度を５０％に調整し、ＰＨＡ水分散液を得た。【００８２】
当該水分散液におけるＰＨＡ粒子の平均粒子径を、マイクロトラックＭＴ３３００ＥＸＩＩ（日機装社製）にて測定した。また、得られた水分散液をヌッチェで脱水後、加熱・減圧下で乾燥させてＰＨＡ粒子の乾燥サンプルを取得し、上述の方法で該ＰＨＡ粒子中のＰＨＡ量、タンパク量およびペプチドグリカン量を求めた。また、得られた水分散液１〜３ｇをφ８００ｍｍのガラス皿の底に薄く塗布し、１２０℃に熱したオーブンにて水分を蒸発させた。水分が十分に蒸発したのを確認した後、冷却し、ガラス皿の表面にＰＨＡの薄膜が形成していることを確認した。得られた薄膜の外観と臭気を確認した。結果を表１に示す。【００８３】
（比較例３）
製造例２で得られたＰＨＡを含む菌体培養液を、８０℃で１時間加熱して滅菌した。次に、この液に対してドデシル硫酸ナトリウムが１．０重量％になるように３０．０％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を添加し、さらに、ｐＨが１１．５になるように３０％水酸化ナトリウム水溶液を添加した後、５０℃で１時間保温した。その後、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルＰＡ２Ｋ型）で約１０ｋｇｆ／ｃｍ２の圧力で高圧破砕を行った。高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物について、遠心分離による水洗をさらに６回繰り返し、最終的に得られた沈殿物に水を加えてＰＨＡ粒子濃度を５０％に調整し、ＰＨＡ水分散液を得た。【００８４】
当該水分散液におけるＰＨＡ粒子の平均粒子径を、マイクロトラックＭＴ３３００ＥＸＩＩ（日機装社製）にて測定した。また、得られた水分散液をヌッチェで脱水後、加熱・減圧下で乾燥させてＰＨＡ粒子の乾燥サンプルを取得し、上述の方法で該ＰＨＡ粒子中のＰＨＡ量、タンパク量およびペプチドグリカン量を求めた。また、得られた水分散液１〜３ｇをφ８００ｍｍのガラス皿の底に薄く塗布し、１２０℃に熱したオーブンにて水分を蒸発させた。水分が十分に蒸発したのを確認した後、冷却し、ガラス皿の表面にＰＨＡの薄膜が形成していることを確認した。得られた薄膜の外観と臭気を確認した。結果を表１に示す。【００８５】
【表１】
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【００８６】
表１より、実施例１〜３は、ＰＨＡ水分散液の分散性が良好で、かつ、成膜性に優れ均一な半透明膜または透明膜を得ることができ、形成された薄膜は臭気が感じられないものであった。一方、比較例１は、ＰＨＡ水分散液の分散性が不良で、成膜性も悪く、形成された薄膜はひび割れており、図２でも示しているように白色で不透明のものであった。比較例２は、成膜性が悪く、形成された薄膜は褐色の不溶分を含み、強い黄色みを帯びたものであり、しかも、臭気が感じられるものであった。比較例３は、成膜性が悪く、形成された薄膜が白色で不透明であり、しかも、臭気が感じられるものであった。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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