(57)【要約】本願発明は、肝疾患を検出できる糖鎖マーカーの開発を課題とする。より具体的には、肝疾患病態の指標となる糖鎖マーカーの開発を課題とする。さらに、本願発明は、肝細胞がんの進行に応じた肝疾患病態を区別できる糖鎖マーカーの開発も課題とする。本願発明者等は、血清糖タンパク質のうち、肝細胞がんを含む肝疾患で糖鎖構造が特異的に変化する糖ペプチドおよび糖タンパク質群を同定し、これを新規肝疾患病態特異的（糖ペプチドおよび糖タンパク質）糖鎖マーカーとして提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１に記載の糖鎖を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド。
【表１】
2011007764.tif 000027
2011007764.tif 000028
2011007764.tif 000029
【請求項２】
請求項１に記載の(１）から（１５７）の群から選択されるいずれか１以上の糖ペプチドの配列を含む表2に示す肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質（但し、以下表2中のタンパク質番号９７及び９８（AGP)並びに65（M2BP）は除く）。
。
【表２】
2011007764.tif 000030
2011007764.tif 000031
2011007764.tif 000032
【請求項３】
以下の(１）から（８）の群から選択される1以上の肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド又はその組み合わせ： 
（１）表1中のペプチド番号１９で表されるポリペプチドである肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド。
（２）表1中のペプチド番号２６で表されるポリペプチドである肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド。
（３）表1中のペプチド番号１１８で表されるポリペプチドである肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド。
（４）表1中のペプチド番号１２４で表されるポリペプチドである肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド。
（５）表1中のペプチド番号１２５で表されるポリペプチドである肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド。
（６）表1中のペプチド番号１３０で表されるポリペプチドである肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド。
（７）表1中のペプチド番号１３２で表されるポリペプチドである肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド。
（８）表1中のペプチド番号１３５で表されるポリペプチドである肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド。
【請求項４】
以下の(１）から（１４）の群から選択される1以上の肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質又はその組み合わせ：
（１）表２中のタンパク質番号２２で表されるポリペプチドを含む糖タンパク質であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。
（２）表２中のタンパク質番号８９もしくは９０で表されるポリペプチドを含む糖タンパク質であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。
（３）表２中のタンパク質番号１４５−LRで表されるポリペプチドを含む糖タンパク質であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。
（４）表２中のタンパク質番号９で表されるポリペプチドを含む糖タンパク質であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。
（５）表２中のタンパク質番号８で表されるポリペプチドを含む糖タンパク質であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。
（６）表２中のタンパク質番号１０３もしくは１０４で表されるポリペプチドを含む糖タンパク質であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。
（７）表２中のタンパク質番号４７で表されるポリペプチドを含む糖タンパク質であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。
（８）上記表２中のタンパク質番号１０５で表されるポリペプチドを含むタンパク質pIgRであって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。
（９）上記表２中のタンパク質番号３２で表されるポリペプチドを含むタンパク質CSF1Rであって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。
（１０）上記表２中のタンパク質番号１２９で表されるポリペプチドを含むタンパク質SHBGであって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。
（１１）上記表２中のタンパク質番号１２２又は１２３で表されるポリペプチドを含むタンパク質SEPP1であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。
（１２）上記表２中のタンパク質番号１３０で表されるポリペプチドを含むタンパク質SPARCL1であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。
（１３）上記表２中のタンパク質番号１２６で表されるポリペプチドを含むタンパク質SERPINA7であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。
（１４）上記表２中のタンパク質番号９２で表されるポリペプチドを含むタンパク質MANA2であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。
【請求項５】
被験者より採取された試料について、請求項３に記載の(１)から（８)からなる群から選択される１以上の肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチドを分析することによる線維化の進展を判別する方法。
【請求項６】
被験者より採取された試料について、請求項４に記載の（１）から（１４）からなる群から選択される１以上の肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質を分析することによる線維化の進展を判別する方法。
【請求項７】
被験者より採取された試料について、請求項３記載の(１)から（８)からなる群から選択される1以上の肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチドを分析することによる肝硬変の検出方法。
【請求項８】
被験者より採取された試料について、請求項４記載の（１）から（１４）からなる群から選択される1以上の肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質を分析することによる肝硬変の検出方法。
【請求項９】
被験者より採取された試料について、請求項３記載の(１)から（８)からなる群から選択される1以上の肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチドを分析することによる肝細胞がんの検出方法。
【請求項１０】
被験者より採取された試料について、請求項４記載の（１）から（１４）からなる群から選択される1以上の肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質を分析することによる肝細胞がんの検出方法。
【請求項１１】
被験者より採取された試料について、請求項４に記載の（９）のCSF1RのうちのAOL、AAL、ECA、ABA、及びWFAのそれぞれとの結合性CSF1R量を測定することによる早期に肝細胞がんの発生や、再発を予測する方法。
【請求項１２】
被験者より採取された試料について、請求項４に記載の（８）のpIgRについて、AOL、AAL、SNA、SSA、TJA-I、BPL、ABA、MAL、DSA、EEL、WFA、及びHPAのそれぞれとの結合性pIgR量を測定することによる早期に肝細胞がんの発生や、再発を予測する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、糖鎖を有する1以上の肝疾患病態指標糖鎖マーカー、より具体的には、ペプチドおよびタンパク質上の糖鎖の変化により肝疾患病態の指標となるマーカーに関する。更に、本願発明は、糖鎖の違いにより、肝細胞がん及び炎症・線維化といった背景肝の状態を検出することができるマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓がんは、肝臓で発生する原発性肝がんと、転移性肝がんに大きく分けることができ、原発性肝がんの90％が肝細胞がんであるといわれている。【０００３】
肝細胞がん患者は、基礎疾患として、C型肝炎ウイルス、又はB型肝炎ウイルスに感染している場合が多く、急性ウイルス性肝炎から、慢性ウイルス性肝炎、肝硬変へと進行し、ウイルス性肝炎に罹患した後、長期間経過後、初めてがん化することが多い。肝硬変では、炎症と再生を繰り返すことにより、正常な肝細胞が減少し、線維組織から構成される臓器へと変化する。例えば、C型肝炎患者は、わが国だけでも300万人、中国やアフリカでは、1000万以上とも言われている。また、B型・C型肝炎患者の場合、慢性肝炎からの発がん率は、慢性肝炎軽度（F1）では年率0.8%、慢性肝炎中度（F2）では年率0.9%であるが、慢性肝炎重度（F3）になると年率3.5%になり、更に肝硬変（F4）からがんとなる確率は、年率7%にも上昇する（図2,3）。又肝疾患は、病態の進行に伴い、まず慢性肝炎で機能が消失し始め、肝硬変で病的構造が現れ、肝臓の線維化が進むなど、組織像が変化する(図1)。【０００４】
がん治療においては、がんの早期発見が重要で、肝細胞がんの場合も早期のがん発見が治療、術後予後に大きく影響している。肝切除治療による5年生存率は、ステージIであれば80％のところ、ステージIVでは38%に過ぎない。【０００５】
肝がんマーカーとしては、現在までに、α-フェトプロテイン（AFP）やprotein induced by Vitamin K absence or antagonist-II（PIVKA-II）が知られている(特許文献1，2)が、その特異性、感度とも十分ではない。そのため、現在は、肝がん早期発見のために検診は、肝がんマーカーと、超音波検査、コンピューター断層撮影（CT）、核磁気共鳴画像法（MRI）など画像検査によりおこなわれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平10−26622号
【特許文献２】特開平8-184594号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願発明は、肝疾患を検出できる糖鎖マーカーの開発を課題とし、より具体的には、肝疾患病態の指標となる糖鎖マーカーの開発を課題とする。さらに、本願発明は、肝細胞がんの進行に応じた肝疾患病態を区別できる糖鎖マーカーの開発も課題とする。更に、本願発明は、肝疾患病態指標糖鎖マーカーとしての、肝細胞がん糖鎖マーカー、肝硬変糖鎖マーカー、慢性肝炎糖鎖マーカー、及び肝線維化糖鎖マーカーの開発を課題とする。C型肝炎の場合、肝硬変から肝細胞がんとなる確率は、年率７％ぐらいといわれており、現在のところは、このがん化を検出するために、肝硬変患者は、3ヶ月に1度程度の検査を受ける必要がある。この肝硬変からがん化の検査を簡易化するため、例えば血液検査でがん化を検出できるような肝細胞がんマーカーを提供することも本願発明の課題である。【０００８】
また、従来のタンパク質からなるがんマーカーなどは、がんでの発現量増加を見ているが、多くのタンパク質は正常細胞でも発現されている。発現量の程度比較でがん化を判断することは、判断が困難なことも少なくなかった。そこで、発現量の程度のみの比較によらない、簡便な肝細胞がんマーカーを提供することも課題とする。【０００９】
更に、肝細胞がんへの進行過程から、その進行にある病気の背景を特定できれば、がん化の進行を抑制できることが期待される。そこで、肝細胞がんの背景疾患の特定を可能とする肝疾患病態マーカーの提供を更なる課題とする。【００１０】
また、従来のがん関連糖鎖マーカーなど疾患病態指標マーカーをプロテオミクスにより探索する場合には、（イ）がんなど疾患病態特異的な糖鎖を有するタンパク質を細胞や病理切片から濃縮する技術、（ロ）同定したマーカー候補タンパク質の糖鎖の構造解析技術に確立した手法がないという問題点があった。そこでグライコプロテオミクスを基軸とした疾患マーカー探索方法により、肝疾患病態糖鎖マーカーを探索することを更なる課題とする。【００１１】
更に、本願発明は、肝疾患病態の進行度を検出するマーカーの開発を課題とする。とくに肝疾患におけるF1及びF2のグループとF3及びF4のグループを区分けできる肝臓の線維化マーカー、もしくはF1,F2,F3のグループとF4を区分けできる肝硬変マーカーの開発を課題とする(図4)。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者等は、グライコプロテオミクスを利用して、血清糖タンパク質のうち、肝細胞がんを含む肝疾患で糖鎖構造が特異的に変化する糖タンパク質群を同定し、これを新規肝疾患病態特異的（糖ペプチドおよび糖タンパク質）糖鎖マーカーとして提供する。【００１３】
本願発明者等は、さらに、上記糖鎖マーカーを、質量分析やレクチンアレイをはじめとする糖鎖解析手段を用いた比較糖鎖解析することにより、肝細胞がんの背景となる肝疾患の病態を特定する手法及びそのためのマーカーを提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本願発明の肝疾患病態指標糖鎖マーカーは、血清など血液を検査することにより簡便に、高い信頼性で肝細胞がんなどの肝疾患病態の検出を可能とするという、優れた効果を奏する。更に、本願の肝疾患病態指標糖鎖マーカーは、比較糖鎖解析をすることにより、肝細胞がんの背景となる病態の特定を可能とする。【００１５】
更に本願発明は、既存の血清マーカーよりも正診率が高く、かつ微量の血清により検査が可能な肝線維化進展モニタリング技術により、病態進展の把握のみならず、インターフェロンをはじめとする抗ウイルス療法後の肝線維化や炎症の改善を評価できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】C型肝炎は、感染から5年〜15年かけて慢性化する。感染より20年経つと肝硬変へ、25年〜30年で肝細胞がんへと至る。進展のスピードに個人差はあるものの、時間経過と伴に肝細胞がんの危険度は上昇する。
【図２】慢性肝炎からの肝細胞がん発がん率を示す図である。肝線維化の程度F1〜3は慢性肝炎に分類されるが、慢性肝炎からの肝細胞がん発がん率は線維化の程度が弱い程、低い。F1では年率0.8％、F2では年率0.9％であるのに対し、F3では年率3.5%となる。
【図３】肝硬変の肝細胞がん発がん率を示す図である。肝生検標本に対する病理組織学的診断によって決定される線維化の程度が、F4であった場合には、発がん率は年率7.0％にも及ぶ。
【図４】肝臓に生じたC型肝炎ウイルス感染は、障害された肝細胞の再生と瘢痕修復としての線維化を惹起する。肝臓の線維化が進むにつれて発がんのリスクが高まることから、「線維化の程度」は、発がんへと向かう指標となる。がんを生じる背景肝組織では、構成細胞が変化することから、線維化の進展に伴って糖鎖変化を生じることが期待される。
【図５】感染から経時的に発がんへ至る。この時、正常構造や機能の恒常的活動性の喪失が観察され、同時に線維化を特徴とする病的構造の出現をみる。肝細胞がんは、早期肝細胞がんから古典的肝細胞がんへ進展して細胞の性質が変化する事が知られており、2cmを超えると早期肝細胞がんのなかに古典的肝細胞がんが出現する。
【図６】慢性肝炎に対しては、ペグインターフェロン/リバビリン併用療法（PEG-IFN+RBV療法）がなされるのに対し、早期肝細胞がんに対してはラジオ波焼灼術（RFA）がなされる。肝硬変に対しては、診断的検査法や、有効な治療法がない。本願発明のバイオマーカーは、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞がんを区別できるので、肝硬変に対する新規治療開発における指標となる。また、ファイブロスキャンと共用する事で、線維化の定量的評価は可能となる事が期待されるので、診断的血清マーカーによって、線維化(F3〜4)症例の囲い込みも可能となる。これは、線維化の定量的診断に加えて、肝線維化進展や発がん抑制を目指した治療の臨床導入に際し、治療効果の血清評価マーカーとして活用される事が期待される。
【図７】レクチンマイクロアレイを基軸としたバイオマーカー候補分子の検証実験戦略を表す図である。肝疾患病態指標マーカーは血清中に存在する糖タンパク質群から選抜される。したがって分析対象試料は血清となる。肝炎ウイルス罹患患者血清を対象に大規模解析より同定されたマーカー候補分子について比較糖鎖解析を行う。候補分子はコアタンパク質に対する抗体を用いた免疫沈降法により簡易にエンリッチされる。レクチンマイクロアレイは高感度な比較糖鎖解析装置であり、100ナノグラム程度のタンパク質調製量で十分分析が可能であることから、上述の前処理はミニスケールで行うことが可能である。エンリッチされた候補分子は速やかにレクチンマイクロアレイに添加され、一定時間反応後、抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイ法により候補分子の糖鎖プロファイルを取得する。この際、レクチンアレイに添加するタンパク質量はタンパク質により異なるが、おおむねナノグラムから数十ナノグラム程度である。統計解析に耐えうるだけの検体数についてアレイ解析を行った後、そのデータセットを用いてStudent-T testやMann-WhitneyのU-testなどの2群比較解析を実施する。それにより、客観的に病態変化によりシグナルに有意差を生じるレクチンを選抜することが可能になる。
【図８】肝疾患病態指標マーカー候補分子の一つであるCarboxypeptidase N, polypeptide 2（CPN2）について、抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイにより比較糖鎖解析を行った結果である。レクチンマイクロアレイ上のレクチン配置を上段左図に示す。本実験により有意なシグナルが得られたレクチンを太字で示す。11種のレクチンにおいてシグナルが得られた。肝細胞がん、肝硬変、および慢性肝炎患者血清、および健常者血清由来CPN2の典型的なスキャンイメージを上段右図に示す。スキャンデータよりアレイ解析ソフトを用い各シグナルを数値化し、11種のレクチンについてグラフで表したものを下段に示す。病態の重篤度に応じてシグナル強度に変化（増加もしくは減少）が生じているのが分かる。
【図９−１】健常人、並びに術前及び術後の肝細胞がん患者血清から調製したペプチド混合物より、プローブレクチンで捕集した糖ペプチドをisotope-coded glycosylation site-specific tagging(IGOT)標識し、ペプチド総量をおよそそろえて、それぞれLC/MS分析した。同定されたペプチドの質量電荷比(m/z)および保持時間より、各マーカーペプチドのイオンを選別し、スペクトルを表示した。術前試料におけるシグナル強度が著しく高い例を図面９−１から９−８までに挙げた。なお、図９−１は、下記表１中のペプチド番号２６についてである。
【図９−２】表１中のペプチド番号１２４について例示。
【図９−３】表１中のペプチド番号１１８について例示。
【図９−４】表１中のペプチド番号１９について例示。
【図９−５】表１中のペプチド番号１３０について例示。
【図９−６】表１中のペプチド番号１３５について例示。
【図９−７】表１中のペプチド番号１２５について例示。
【図９−８】表１中のペプチド番号１３２について例示。
【図１０】レクチン連続クロマトグラフィー法による血清タンパク質の分画手順の概略、ならびにウェスタンブロッティング法によるバンドの定量と解析についての概略を示した図である。各ヒト血清は0.2% SDSを加えて100℃, 15分加熱し、加熱処理血清として、以後の解析に使用した。LCAカラムに通してLCA 結合画分 (LE)とLCA 非結合画分(LT)に分ける。続いてLCA非結合画分をAALカラムに通してAAL結合画分 (AE)とLCA/AAL非結合画分 (LTAT)に分ける。なお、■は, GlcNAc（N-アセチルグルコサミン）; ○は, Man（マンノース）; ●は, Gal（ガラクトース）; △,は Fuc（フコース）をそれぞれ表す。
【図１１】LCA-AALレクチンカラム連続クロマトグラフィー後に取得される各画分のレクチンアレイ解析を示す図である。ここでは生じたシグナルのうち１４種レクチンについて棒グラフにより表示している。縦軸はNet intensityを示している。健常者プール血清（NHS）のデータを白棒で、HCC患者プール血清（HCC）のデータを黒棒で表している。
【図１２】既報により肝線維化や肝がんなどの肝疾患に伴いフコシル化が亢進するとされている特定糖タンパク質AGP, AAT, ACTを対象とした、連続クロマトグラフィー後の各画分中特定糖タンパク質の解析を示す図である。ここでは異なるフコシル化修飾を受ける分子群の比較、すなわちLCA結合分子(LAC elution, LE)とLCA非結合／AAL結合分子（AAL elution, AE）間の比較を図に表している。なお量的比較はウエスタンブロット法により行った。
【図１３Ａ】肝がん状態指標糖鎖マーカー候補のスクリーニング結果を示す図である。健常人、並びに肝細胞がん患者のプール血清から実施例３および４に挙げた連続クロマトグラフィー法により調製された試料に対して、ウェスタンブロット法により、各分画における糖タンパク質（SHBG）の量を解析した。
【図１３Ｂ】肝がん状態指標糖鎖マーカー候補のスクリーニング結果を示す図である。健常人、並びに肝細胞がん患者のプール血清から実施例３および４に挙げた連続クロマトグラフィー法により調製された試料に対して、ウェスタンブロット法により、各分画における糖タンパク質（SEPP1）の量を解析した。
【図１３Ｃ】肝がん状態指標糖鎖マーカー候補のスクリーニング結果を示す図である。健常人、並びに肝細胞がん患者のプール血清から実施例３および４に挙げた連続クロマトグラフィー法により調製された試料に対して、ウェスタンブロット法により、各分画における糖タンパク質（pIgR）の量を解析した。
【図１３Ｄ】肝がん状態指標糖鎖マーカー候補のスクリーニング結果を示す図である。健常人、並びに肝細胞がん患者のプール血清から実施例３および４に挙げた連続クロマトグラフィー法により調製された試料に対して、ウェスタンブロット法により、各分画における糖タンパク質（SPARCL1）の量を解析した。
【図１３Ｅ】肝がん状態指標糖鎖マーカー候補のスクリーニング結果を示す図である。健常人、並びに肝細胞がん患者のプール血清から実施例３および４に挙げた連続クロマトグラフィー法により調製された試料に対して、ウェスタンブロット法により、各分画における糖タンパク質（CSF1R）の量を解析した。
【図１３Ｆ】肝がん状態指標糖鎖マーカー候補のスクリーニング結果を示す図である。健常人、並びに肝細胞がん患者のプール血清から実施例３および４に挙げた連続クロマトグラフィー法により調製された試料に対して、ウェスタンブロット法により、各分画における糖タンパク質（SERPINA7）の量を解析した。
【図１４】健常人、肝硬変患者、および肝細胞がん患者それぞれ３症例の検体中の各糖タンパク質についてレクチン連続クロマトグラフィー及びウェスタンブロット解析を行い、血清各レクチン画分での存在量を解析した。本図では、その存在量に差が出るレクチン画分における、各糖タンパク質の存在量を棒グラフとして示している。縦軸のAAL％とはクロマト処理前の血清中に存在する標的分子Aのタンパク質量を１００％としたときに、AALカラムクロマトで結合画分に含まれる標的分子Aのタンパク質量の割合を示めす。LCA%も同様である。その結果、、CPB2のAAL結合画分（AE)中の存在量、pIgRのLCA結合画分（LE)中の存在量、pIgRのAAL結合画分（AE)中の存在量、CSF1RのLCA結合画分（LE)中の存在量、CSF1RのAAL結合画分（AE)中の存在量、などにおいて、肝がん患者で有意に高い結果を得た。これらの分子(分子複合体)上の上の糖鎖変化、特にLCAあるいはAAL結合性糖鎖を定量・比較することによって、肝臓の疾患状態、特に肝細胞がんを予測することができると考えられる。
【図１５】健常人、慢性肝炎、肝硬変患者、および肝細胞がん患者それぞれ5症例ずつの検体中の各糖タンパク質についてレクチン連続クロマトグラフィー及びウェスタンブロット解析を行い、血清各レクチン画分での存在量を解析した。本図では、LCA結合画分およびAAL結合画分における、各糖タンパク質の存在量を棒グラフとして示している。その結果、pIgRのLCA結合画分（LE)中の存在量、pIgRのAAL結合画分（AE)では、健常人に比較して、肝硬変および肝がん患者でその存在比（存在量）が上昇していた。一方、CSF1RのLCA結合画分（LE)での存在比では、健常人に比較して、肝がん患者でのみ有意に高い結果を得た。また、同CSF1RのAAL結合画分（AE)での存在比（存在量）では、健常人・慢性肝炎患者に比較して、肝硬変で高くなり、肝がん患者でさらに上昇していた。
【図１６】レクチン連続クロマトグラフィー・ウェスタンブロット解析により得られた分画でのpIgR存在比（存在量）と肝臓の線維化進展との相関を示す図である。ここでは線維化の進展がF3あるいはF4（特にF4）の時に、pIgRのAAL結合画分（AE)が上昇してくることを示している。このことはこれらの線維化の進展に伴い、がん細胞が生じてきている可能性を示唆している。
【図１７】レクチン連続クロマトグラフィー・ウェスタンブロット解析により得られた分画でのCSF1R存在比（存在量）と肝臓の線維化進展との相関を示す図である。CSF1RのLCA結合画分（LE)が線維化の進展（F1〜F4）と比例して上昇してくることを示している。また、線維化の進展がF3あるいはF4（特にF4）の時に、CSF1RのAAL結合画分（AE)が急激に上昇してくることを示している。このことはこれらの線維化の進展に伴い、がん細胞が生じてきている可能性を示唆している。
【図１８】肝疾患病態指標マーカー候補分子の一つであるpIgRについて、抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイにより比較糖鎖解析を行った結果である。血清より免疫沈降法により濃縮精製されたpIgR（10 ng相当）を用いて解析を行った。レクチンマイクロアレイ上のレクチン配置を左図に示す。本実験により有意なシグナルが得られたレクチンを太字で示す。19種のレクチンにおいてシグナルが得られた。肝細胞がん患者血清、および健常者血清由来pIgRの典型的なスキャンイメージを右図に示す。この結果、健常人血清由来のものと比較して、肝細胞がん患者血清由来のpIgRでは、7種類のレクチン(AOL, AAL, SNA, SSA, TJA-I, BPL, ABA)でシグナルが上昇し、一方、5種類のレクチン(MAL, DSA, EEL, WFA, HPA)でシグナルが減少した。
【図１９】肝疾患病態指標マーカー候補分子の一つであるpIgRについて、抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイにより比較糖鎖解析を行った結果である。健常人(NHS: 14人分)プール血清および複数の肝細胞がん患者プール血清（HCC：5人分、HCC-K1：2人分、HCC-K2：6人分、HCC-K3：2人分）を用いて行った。これらの血清より免疫沈降法により濃縮精製されたpIgR（10 ng相当）を用いて解析を行った。健常人血清由来のものと比較して、肝細胞がん患者血清由来のpIgRでは、7種類のレクチン(AOL, AAL, SNA, SSA, TJA-I, BPL, ABA)でシグナルが上昇し、一方、5種類のレクチン(MAL, DSA, EEL, WFA, HPA)でシグナルが減少した。
【図２０】肝疾患病態指標マーカー候補分子の一つであるCSF1Rについて、抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイにより比較糖鎖解析を行った結果である。血清より免疫沈降法により濃縮精製されたCSF1R（2 ng相当）を用いて解析を行った。レクチンマイクロアレイ上のレクチン配置を左図に示す。本実験により有意なシグナルが得られたレクチンを太字で示す。２０種のレクチンにおいてシグナルが得られた。肝細胞がん患者血清、および健常者血清由来CSF1Rの典型的なスキャンイメージを右図に示す。この結果、健常人血清由来のものと比較して、肝細胞がん患者血清由来のCSF1Rでは、5種類のレクチン(AOL, AAL, ECA, ABA, WFA)でシグナルが上昇した。
【図２１−１】肝疾患病態指標マーカー候補分子の一つであるCSF1Rについて、抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイにより比較糖鎖解析を行った結果である。血清より免疫沈降法により濃縮精製されたCSF1R（2 ng相当）を用いて解析を行った。健常人（NHS：14人分）、比較的高齢な健常人（GP：5人分）、（ウイルス性）肝炎患者（CH：5人分）、肝硬変患者（LC：5人分）、肝細胞がん患者（HCC：5人分、K1：2人分,K2：6人分、K3：2人分）のプール血清を使用し、同様にしてCSF1Rタンパク質を精製・濃縮し、CSF1Rタンパク（抗CSF1R抗体沈降物）の糖鎖プロファイルの解析を行った。AOL、AAL、ECA、ABA、WFAのレクチンに於いて、健常人（NHS）と比較して肝細胞がん患者（HCC）由来でシグナルが亢進することが分かった。特にWFAシグナルでは、健常人（NHS）、比較的高齢な健常人（GP）、（ウイルス性）肝炎患者（CH）、肝硬変患者（LC）ではほとんど検出されないのに対し、肝細胞がん患者（HCC）由来のもの（HCC、K1、K2、K3）では有意にシグナルが観察された。
【図２１−２】図２１−１のつづき。
【図２２】（A）血清からのWFAによるバッチ分画の方法について、流れを簡単に示した。（B）健常人(NHS)及び肝細胞がん患者(HCC)のプール血清よりWFAレクチンで免疫沈降を行い、抗CSF1R抗体を用いたウェスタンブロット解析を行った。これにより、血清中の、WFA結合性糖鎖を有するCSF1R存在量を検定した。その結果、WFAレクチンのシグナルが肝細胞がん患者（HCC）由来のCSFR1などで有意に亢進するという事が明らかとなった。NHS由来のWFA 結合性CSFR1はほとんど検出されなかった。（C）健常人(Normal)、（ウイルス性）肝炎患者(CHC)、肝硬変患者(LC)、及び肝細胞がん患者(HCC)の血清5例ずつをサンプルセットとして使用し、血清中に存在するWFA結合性CSF1Rの存在量についての検討を行った。この結果では、ウェスタンブロットで得られたバンドの強度を定量し、棒グラフとして表示した。それぞれの疾患での平均値を各疾患の一番左に示している。その結果、肝硬変患者(LC)では健常人(Normal)および（ウイルス性）肝炎患者(CHC)と比較してWFA結合性CSF1Rの存在量が亢進することが明らかとなった。さらに、肝細胞がん患者(HCC)では、健常人(Normal)、（ウイルス性）肝炎患者(CHC)、そして肝硬変患者(LC)と比較しても有意にWFA結合性CSF1R量が亢進していた。(D)線維化の進展との関連について検証するために、前述の方法により、慢性肝炎軽度（F1）、慢性肝炎中度（F2）、慢性肝炎重度（F3）、肝硬変（F4）患者の血清をサンプルセットとして使用し、まずは分画無しにcrudeな血清を用いて、血清中のWFA結合性CSF1R量の解析をした。WFA分画のCSF1Rでは、F1〜F3まではほぼ検出されず、F4患者血清で検出された。ウェスタンブロットで得られたWFA結合性CSF1Rの強度を定量し、棒グラフとして表示した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
１．慢性肝疾患の現状
１−１．肝疾患の病態
B型肝炎ウイルス又はC型肝炎ウイルスに感染すると、急性期炎症から5−15年をかけて慢性期炎症へと進行する。特に慢性期に移行したC型肝炎が自然に治癒する事は稀で、肝機能の低下が進行し肝硬変に至る。慢性肝炎から肝硬変に至る病態を定義するため、肝臓のグリソン領域及び肝小葉に出現する線維性変化を病理形態学的に捉えて、軽度（F1）、中度（F2）、重度（F3）、肝硬変期（F4）に分類する。線維化の進展は肝細胞がん発がんのリスク上昇と相関しており、F1もしくは2である場合年率1％以下であるのに対し、F3である場合には年3−4％に上昇する。線維化の程度がより進展した組織像を確認して診断される肝硬変(F4)では、年率7％程度の確率で肝細胞がんが出現する。従って肝細胞がんを効率良く発見して治療するためには、特にF3およびF4の状態にある患者を簡便に選別して、精密検査対象者としてフォローすることが重要である。【００１８】
我が国のB型およびC型肝炎患者医療給付事業は専ら、肝生検標本に対する病理組織学的診断によって決定される線維化の程度F1〜3を対象とする。その一方、F4と診断される場合には、肝硬変に分類されるため、インターフェロン治療に対するB型およびC型肝炎患者医療給付事業では、一部のみ助成対象となるが、満足のいく治療成績は得られない。【００１９】
１−２．抗ウイルス療法による線維化抑制の評価
C型慢性肝炎に対しては、PEG-IFN+RBV療法、C型肝硬変代償期に対してインターフェロン単独投与が適応されている。一方、B型肝炎（慢性肝炎、肝硬変）に対する治療としては核酸アナログが主体であり、炎症や線維化評価マーカーは必須と思われる。特に、血清バイオマーカーは診断・評価目的に幅広く臨床応用されることが期待される。【００２０】
１−３．肝細胞がん
肝細胞発がんには、 B型肝炎ウイルスもしくはC型肝炎ウイルス感染による微生物学的因子と、環境因子が大きく交互に作用すると考えられている。わが国において、肝細胞がん患者の約9割は、B型あるいはC型肝炎ウイルスの感染既往があり、慢性肝炎・肝硬変患者に発生している事が知られている。肝細胞がんの発がん危険因子には、ウイルス以外にも、男性、高齢、アルコール多飲、タバコ、カビ毒の一つであるアフラトキシンなどが指摘されている（肝がん診療ガイドライン、財）国際医学情報センター）。【００２１】
１−４．肝細胞がんの早期診断
肝細胞がんの発見は、現在のところ、被験者からの血清サンプル中のAFPやPIVKA-IIなどの肝臓がんマーカーの測定、及び超音波検査（エコー検査）を中心とした画像診断が主として用いられている。画像診断としては、最初の検査として、超音波検査又はCTを用い、これらで何らかの異常が見いだされときには、更にMRIや血管造影をするのが通常である。【００２２】
１−５．肝細胞がん予防の観点から発がん高リスク群の囲い込み
肝細胞がん患者の約9割が、B型肝炎ウイルスもしくはC型肝炎ウイルス感染による肝炎患者から発生する我が国においては、ウイルス感染と肝機能低下を指標として、精密検査の対象となる患者を囲い込む事は可能である。【００２３】
しかしながら、年率7％程度の確率で肝細胞がんが出現する肝硬変(F4)患者であったとしても、早期がんを発見して治療するため、3ヶ月おきに高額で侵襲性の高い精密検査を繰り返す事は、経済的にも身体的にも患者の負担は大きいと言わざるを得ない。年3−4％の発がん率であるF3である場合にはなおさらである。さらには、インターフェロンによるC型肝炎ウイルス治療の成功率が5割程度であることを考慮すると、かなりの人数に上るインターフェロン治療が奏功しなかった慢性肝炎患者には、肝硬変および肝細胞発がんへ至るどの位置にあるのかを明確にして臨床的フォローアップをすることが必要である。つまり現在の肝炎〜肝細胞がんに至る疾病の治療においては、血液検査などの簡易な検査によって肝炎〜肝硬変患者に対して発がんリスクの重み付けを行ない、それに見合った肝細胞がんの診断治療を実施することが必要な状況にある。【００２４】
臨床病理学的には、線維化の程度が肝硬変および肝細胞発がんのリスクと相関する事から、我々は、線維化の進展を血清学的に定量的に測定できる検査技術の開発に、この問題解決の可能性を見いだしている。【００２５】
２．新規肝細胞がん糖鎖マーカーをはじめとする新規肝疾患病態指標糖鎖マーカーの取得
２−１．肝細胞がん糖鎖マーカーを含む新規肝疾患病態指標糖鎖マーカー
本願発明の肝細胞がん糖鎖マーカーは、糖鎖関連腫瘍マーカー又は腫瘍特異的糖鎖マーカー、と記載されることもあるが、いずれも糖タンパク質における肝細胞がん特異的な糖鎖構造を意味し、そのような糖鎖を有する糖タンパク質を包含する。【００２６】
細胞から分泌されるタンパク質上の糖鎖の組成および構造多様性は、数百もの糖鎖関連遺伝子の発現バランスに基づき制御され、細胞の分化、がんの進展の程度に応じて変動する。この糖鎖構造が変化する糖タンパク質は、腫瘍マーカーを含む疾患病態指標マーカーとして利用できる。そこで、プロテオミクスを基盤として利用する糖鎖関連腫瘍マーカー探索がされている。プロテオミクスを基軸としたマーカー探索パイプラインでは、フェーズ１として大規模解析により候補分子が同定される。フェーズ２として定量的解析により候補分子の検証・絞り込まれる。更に、フェーズ3としてバリデーション試験がなされる。グライコプロテオミクスを基軸とした糖鎖関連マーカー探索も、同様に上記パイプラインをベースになされる。【００２７】
更に、本願発明には、新規肝疾患病態指標糖鎖マーカーが包含される。上記肝細胞がん糖鎖マーカーの中には、ウイルス感染による疾患の発症と進展において生じる慢性肝炎、肝硬変、肝細胞がんを特徴づける糖鎖変化がマーカー候補として見出された。このような、ウイルス性肝疾患の病態進行に伴う糖鎖変化を指標として、肝疾患病態を特定できるマーカーを肝疾患病態指標糖鎖マーカーと呼ぶ。【００２８】
本願発明の新規肝疾患病態指標糖鎖マーカーは、ウイルス性肝疾患のそれぞれの病態、つまり、肝細胞がん、肝硬変、肝線維化（F3及びF4マーカー)、あるいは慢性肝炎に特徴的で各疾患の鑑別に有効である。【００２９】
また、本願発明の新規肝疾患病態指標糖鎖マーカーには、肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド及び肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質を包含している。例えば、肝細胞がん患者若しくは肝疾患患者の検体またはがん細胞株、及び健常者検体を用いて、レクチンキャッチIGOT法により前者で特異的に同定された糖ペプチドを肝細胞がんマーカー候補又は肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補糖ペプチドとすることができる。この糖ペプチドは、患者検体100（あるいは病期に沿った患者検体20ずつ）対健常者検体100を用い、安定同位体導入糖ペプチドの比較グライコプロテオミクス法を含む、糖ペプチドの比較糖鎖解析技術により検証(バリデーション)することにより、有用性が強く示唆されるものを確定したマーカー糖ペプチドとすることが出来る。更に、肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補糖ペプチドの配列を含む糖タンパク質を対象に、抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイ法を含む比較糖鎖解析技術により検証(バリデーション)することにより、有用性が強く示唆されるものを確定したマーカー糖タンパク質とすることが出来る。【００３０】
２−２．肝疾患病態指標糖鎖マーカーの取得法
２−２−１．糖タンパク質の大規模同定 
糖ペプチドの大規模な選択的捕集、濃縮は、大きく分けて、（i）糖鎖との親和性を有するプローブを用いる方法、（ii）糖鎖との化学反応を利用する方法（Zhang H.et al.Nat Biotechnol 21、660-666 (2003)）、（iii）糖鎖への親和性タグを導入する方法などいずれの方法を利用することもできる。好適にはプローブを用いることができる。以下プローブを用いる方法について詳述する。【００３１】
（１）プローブによる捕集：プローブとしてはレクチンや抗糖鎖抗体を用いることができる。具体的には、まず、肝細胞がん由来の細胞株の培地上清よりプローブレクチン又は抗体プローブで糖タンパク質を捕集し、次に、健常人の血清からプローブレクチン又は抗体プローブで糖タンパク質を捕集すると共に、プローブレクチン以外のレクチンで網羅的に糖タンパク質を捕集する。【００３２】
（２）プローブレクチンは、主に上述のレクチンマイクロアレイによる糖鎖プロファイルの統計解析により選出することができる。他に糖鎖遺伝子の発現プロファイル（リアルタイム定量的PCRの結果）や文献情報（がん化に伴うフコシル化の亢進など、使うべきプローブレクチンを予想できるものもある）を加味してプローブを選択することもできる。基本的にはプロファイルの統計解析から選択し、選択されたレクチンの結合特異性から選択の妥当性を判断する。肝細胞がんを標的とした場合には、例えばフコシル化を検出できるヒイロチャワンタケ(Aleuria aurantia)由来レクチン（AAL）や糖鎖の高分岐を検出できるチョウセンアサガオ(Datura stramonium)由来レクチン（DSA）などを用いることができる。【００３３】
抗体プローブの作製は、抗原（糖鎖）の構造を明白にしてから実施することもできるが、必要条件ではなく、抗原糖鎖（あるいは糖ペプチド）の構造が未知のまま作製することもできる。【００３４】
（３）網羅的捕集に用いるレクチンは、バイオマーカーの絞り込みを行う上で、対照とすべき試料における糖鎖構造の分布に依存して変化する。たとえば、血清を対照にする場合は、血清糖タンパク質上の糖鎖のほとんどはシアリル化された２本鎖糖鎖ということが判明しており、シアリダーゼ処理すれば、血清糖タンパク質（ペプチド）のほとんどはヒマ（Ricinus communis）由来レクチン（RCA120）によって網羅的に捕集可能と考えられるので、RCA120を用いることができる。なお、シアル酸認識レクチンを用いないのは、人為的操作及び試料の経時的劣化によってシアル酸が脱離する事の影響を避けるためである。対照とする試料が血清でない場合、例えば他の体液の場合は、別のレクチンが選択できる。また、レクチンを用いず、親水性相互作用クロマトグラフィーやゲル濾過で網羅的に捕集することもできる。【００３５】
２−２−２．糖ペプチド又は糖タンパク質の同定
捕集された糖タンパクは、例えば、特開2004-233303号公報（特許第4220257号）やKaji H,ほかMass spectrometric identification of N-linked glycopeptides using lectin-mediated affinity capture and glycosylation site-specific stable isotope tagging. Nature Protocols 1, 3019-3027 (2006)に記載のLec-IGOT-LC/MS法により候補（糖ペプチド）を分析することができる。【００３６】
（１）糖鎖切除と糖鎖付加位置安定同位体標識
試料となる糖ペプチド群は、プローブで捕集された糖タンパク質群をプロテアーゼで消化して得られたペプチド群より同じプローブで再捕集する。あるいは、試料粗タンパク質混合物を分離することなくプロテアーゼ消化して得られた粗ペプチド群より、直接プローブで捕集することもできる。得られた糖ペプチド群は、同位体酸素でラベルされた水の中でグリコペプチダーゼ等の酵素で処理して糖鎖を解離する。すると、糖鎖結合部位のアスパラギンがアスパラギン酸となり、このときに水中の同位体酸素（18O）がペプチドに取り込まれる。このように同位体で糖鎖結合位置を標識することをisotope-coded glycosylation site-specific tagging(IGOT)という。【００３７】
（２）標識ペプチドのLC/MSショットガン分析
IGOTで標識されたペプチドをLCで分離し、MSに導入し、タンデム質量分析法により、ペプチドの配列を網羅的に同定する。【００３８】
（３）ペプチドの同定
例えば、標準技術集(特許庁編)、質量分析の３−６−２−２  アミノ酸配列解析に示されるMS/MSイオンサーチ法により、得られたペプチド混合物のMS/MS ペプチド測定結果に対して、データベースに登録されたMS/MSスペクトルと比較して、検索することができる。検索においては、以下のアミノ酸の修飾を勘案する（メチオニン残基側鎖の酸化、アミノ末端グルタミンのピロ化（脱アミド化、環化）、アミノ末端の脱アミノ化（カルバミドメチルシステイン）、アスパラギン残基側鎖の脱アミド化（ただし、安定同位体酸素の取り込みが生じたもの））。【００３９】
（４）糖鎖結合位置の同定
MS/MSイオンサーチ法によって同定されたペプチドのうち、アスパラギン残基側鎖に脱アミド化（安定同位体取り込み）が生じ、かつN結合型糖鎖付加のコンセンサス配列（Asn-Xaa-[Ser/Thr]、ただしXaaはProでない）を含むペプチドを候補糖ペプチドとし（XaaがLys/Argであり、同定されたペプチド配列がこの位置で切断されている場合、タンパク質全体のアミノ酸配列を参照し、Xaaの次の残基が[Ser/Thr]であることが確認できた場合はこのペプチドも含める）、該糖ペプチドのコンセンサス配列アスパラギン残基を糖鎖結合部位とする。コンセンサス配列が複数有り、かつ、コンセンサス配列よりも脱アミド化（標識）アスパラギン残基の数が少なく、かつMS/MSスペクトルより標識部位を特定できない場合は、それらの標識部位（糖鎖付加位置）を併記し、区別できない旨を表記する。【００４０】
（５）糖ペプチド表記方法
請求の範囲中の表1及び以下の表１に挙げるペプチドはIGOT-LC/MS法により同定された結果を基礎とし、同法における同定過程において、上述（3）に記載の修飾の有無が勘案されている。したがって、該マーカー糖ペプチドは単にアミノ酸配列によってのみ規定されるのではなく、ペプチド中に含まれる官能基の修飾の実態を含んでいる。修飾の実態は数列によって以下のように記載される。（１）ペプチド部分のアミノ酸配列はアミノ酸の一文字表記の列によって示す。（２）修飾位置及び修飾の種類は数列によって示す。数列の最初は、ペプチドの末端アミノ基、最後は末端カルボキシル基、その間の数字は構成する各アミノ酸残基側鎖の位置を表す。また数値は修飾の種類を表す。「０」は未修飾、「１」はアミノ末端グルタミン残基のピロ化（脱アミド化、環化）、「２」はメチオニン残基側鎖の酸化、「３」はアミノ末端カルバミドメチル化システイン残基のピロ化（脱アミド化、環化）、「４」はアスパラギン残基の脱アミド化（IGOT標識）、すなわち糖鎖付加位置、を表す。なお配列表は、以下の表１に基づき作成された。【００４１】
２−２−３．肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補糖ペプチドの絞込み
肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補糖ペプチドは、がんプローブ（レクチン）を用いて、(i)肝細胞がん由来細胞株培養液、および(ii)肝細胞がん患者血清（がん摘出手術前及び手術後に採集）より捕集し、上記2-2-1、2-2-2の糖ペプチドの大規模同定法により同定できる。同定された糖ペプチドは該糖鎖マーカーの初期候補とすることができる。【００４２】
ついで、(iii)健常人血清より、プローブレクチン、および網羅的同定が可能な他のレクチンを用いて捕集した糖ペプチドを同じ手順で同定し、マーカー候補糖ペプチドの絞り込みの参照とすることができる。すなわち、候補糖ペプチドのうち、健常者血清より、がんプローブによって同定されたペプチドは候補の下位とし、反対に網羅的レクチンで同定されたペプチドは血清中での量が比較的高く、検出が容易な候補と評価することができる。【００４３】
さらに、(iv)肝細胞がん患者より、がん摘出手術後に採集された血清から、同様にプローブレクチンおよび他のレクチンで捕集・同定された糖ペプチドを参照に、適用する肝疾患病態ごとに対応するマーカーの絞り込みを実施することができる。すなわち、がん摘出手術前の試料より同定され、術後患者、及び健常人血清から同定されない糖ペプチドは、肝細胞がんの存在を示唆するマーカー、術前、術後を問わず患者血清より同定され、健常人血清より同定されない糖ペプチドは、肝細胞がんの背景（肝炎および肝硬変へ向かう線維化）を反映するマーカー候補と見なすことができる。この時、血清中の糖ペプチドのおおよその量、あるいはその変化は、LC/MS分析における該標識ペプチドのシグナル強度の比較より見積もることができる。【００４４】
このようにして絞り込まれたマーカー候補糖ペプチドは、検証実験を経て各々の病態を対象とした肝疾患病態指標糖鎖マーカーとして使用することができる。また該ペプチド配列を含む糖タンパク質についても、タンパク質の状態での検証実験を経ることで、各々の病態を対象とした肝疾患病態指標糖鎖マーカーとして使用することができる。【００４５】
２−２−４．肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補糖ペプチド
上記工程により選択された肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補糖ペプチド群を、以下の表１に示す。
【表１】
2011007764.tif 000002
【００４６】
2011007764.tif 000003
【００４７】
2011007764.tif 000004
【００４８】
更に、上記工程により選択された肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補糖ペプチド群を含む糖タンパク質を、以下の表２に示す（但し、以下表2中のタンパク質番号９７及び９８（AGP)並びに65（M2BP）は除く）。
【表２】
2011007764.tif 000005
【００４９】
2011007764.tif 000006
【００５０】
2011007764.tif 000007
【００５１】
２−２−５．肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補の検証
例えば、上記「２−２−４.肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補糖ペプチド」に記載の種々の新規糖ペプチドについては、以下に挙げる複数の検証実験によって、肝疾患における各病態について、これを反映するマーカー候補ペプチドを個々に検証、選別することができる。すなわち、i)肝細胞がん患者術前の血清、術後の血清、および健常人血清よりプローブレクチンで捕集した糖ペプチドをIGOT標識し、LC/MS分析した際の各標識ペプチドのシグナル強度の比較、ii) 肝細胞がん患者術前の血清、術後の血清、および健常人血清よりプローブレクチンで捕集した糖タンパク質に対する、安定同位体を利用した公知の比較定量プロテオミクス、iii) 肝細胞がん患者術前の血清、術後の血清、および健常人血清よりプローブレクチンで捕集した糖タンパク質（2-2-4記載の糖ペプチドの配列を含む糖タンパク質）に対し、抗体を用いた定量検出、iv)（ウイルス性）肝炎患者、肝硬変患者、及び肝細胞がん患者の血清より捕集した糖タンパク質（2-2-4記載の糖ペプチドの配列を含む糖タンパク質）に対する抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイ等による比較糖鎖プロファイリング。【００５２】
より具体的には、
i)肝細胞がん患者術前の血清、術後の血清、および健常人血清よりプローブレクチンで捕集した糖ペプチドをIGOT標識し、LC/MS分析した際の各標識ペプチドのシグナル強度の比較：上記試料(血清)タンパク質をそれぞれ還元アルキル化の後、トリプシン消化し、生じたペプチド混合物をプローブレクチンを用いたアフィニティークロマトグラフィーに供し、糖ペプチドを捕集する。これを上述のIGOT法により標識し、おおよその総量を合わせて個別にLC/MS分析する。同定された糖ペプチドの質量電荷比及び溶出位置を参考に、概標識ペプチドのスペクトルを取得し、それらのシグナル強度を比較する。術前のみで顕著なペプチド、術前術後の患者血清で顕著なペプチドなどを選別することができる。【００５３】
ii)肝細胞がん患者術前の血清、術後の血清、および健常人血清よりプローブレクチンで捕集した糖タンパク質に対する、安定同位体を利用した公知の比較定量プロテオミクス：該血清試料よりプローブレクチンで捕集した糖タンパク質について、還元アルキル化の後、トリプシン消化し、生じたペプチドをディファレンシャルに安定同位体標識し（13C/15Nの二重標識したメチルイソ尿素を用いたLys側鎖アミノ基のグアニジノ化反応）、LC/MS分析する。同定された各ペプチドのスペクトルを解析し、シグナル強度の比較より、各試料間での変動を定量的に見積もることができる。がん性糖鎖を持つタンパク質の量的変動から各マーカー候補の有意性を病態ごとに確証し、絞り込みができる。【００５４】
iii) 肝細胞がん患者術前の血清、術後の血清、および健常人血清よりプローブレクチンで捕集した糖タンパク質に対する、標的糖タンパク質（2-2-4記載の糖ペプチドの配列を含む糖タンパク質）の免疫学的定量検出：該血清試料よりプローブレクチンで捕集した糖タンパク質について、例えばSDS-PAGEを行い、膜転写後にウエスタンブロットにより免疫学的な検出をする。得られたバンドのシグナル強度の比較より、各試料間での変動を定量的に見積もることができる。がん性糖鎖を持つタンパク質の量的変動から各マーカー候補の有意性を病態ごとに確証し、絞り込みができる。又抗体としては、表３に記載の抗体を用いることができる。【００５５】
iv)（ウイルス性）肝炎患者、肝硬変患者、及び肝細胞がん患者の血清より捕集した糖タンパク質（2-2-4記載の糖ペプチドの配列を含む糖タンパク質）に対する抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイ等による比較糖鎖プロファイリング：（ウイルス性）肝炎患者、慢性肝炎、肝硬変患者、及び肝細胞がん患者から得られた血液試料を採取する。採取されたそれぞれの血液試料から、肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補糖タンパク質について、抗体を用いた免疫沈降により濃縮精製し、抗体オーバーレイ・レクチンアレイを用いて、肝疾患病態の糖鎖マーカー候補を選択できる（図7）。レクチンマイクロアレイとしては、たとえば、後に示す表４に記載のレクチンの一部または全部を含む複数のレクチンを固相化したレクチンマイクロアレイを用いることができ、更に具体的には、Kuno A., et al. Nat. Methods 2,851-856(2005).に記載のレクチンマイクロアレイまたはGPバイオサイエンス社製のLecChipを用いることができる。又抗体としては、表３に記載の抗体を用いることができる。
【表３】
2011007764.tif 000008
【００５６】
2011007764.tif 000009
【００５７】
2011007764.tif 000010
【００５８】
2011007764.tif 000011
【００５９】
2011007764.tif 000012
【００６０】
このように、糖ペプチドもしくは糖タンパク質の糖鎖構造を網羅的に解析し、（ウイルス性）肝炎患者、慢性肝炎、肝硬変患者、及び肝細胞がん患者の間で糖鎖構造の変化の有無を分析し、変化があるものを肝疾患病態指標糖鎖マーカーとして利用することができる。【００６１】
３.肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド及び肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質の検出
３−１．質量分析法
肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド及び糖タンパク質は、糖鎖マーカーに結合するプローブレクチン等で捕集した試料について、質量分析計を検出器として検出することができる。【００６２】
糖鎖マーカーペプチドの検出は、好適には捕集した糖ペプチドの糖鎖を切除処理した後、液体クロマトグラフィーで分離し、溶出したペプチドを順次、直接オンラインで質量分析計に導入し検出することができる。質量スペクトルの収集は、単に質量スペクトルを取得することに加え、衝突誘起解離（CID）などの破断法を利用したMS/MSスペクトルの取得、さらには、予め選択したイオンが検出された場合のみCID等で破断し、生じた複数のフラグメントイオンを検出すること（シングルリアクションモニタリング、あるいはマルチリアクションモニタリングと呼ばれる手法）もできる。さらに分析試料に、糖鎖マーカーペプチドのコアペプチド部分を合成し、その一部に安定同位体を取り込ませて質量差を生じさせた対象ペプチドを加え、それぞれのシグナル強度を比較することで相対的あるいは絶対的定量分析を行うこともできる。簡易的には検出されたイオンのシグナル強度を複数の試料間あるいは標準試料と比較し、簡易定量することもできる。【００６３】
糖鎖マーカー糖タンパク質の検出には、様々な公知のプロテオミクスの手法を用いることができる。たとえば捕集したタンパク質を1次元あるいは2次元のゲル電気泳動を用いて分離し、標的スポットの検出強度（染色、蛍光等）を標準試料と比較し、定量することができる。質量分析計を利用した検出法としては、捕集したタンパク質群をプロテアーゼで消化し、生じたペプチドをLC/MS法で分析検出することができる。定量するには安定同位体標識を利用した各種方法（ICAT、MCAT、iTRAQ、SILAC法など）や非標識の簡易定量法（ペプチドカウント法、エリア積算法など）を併用することができる。さらに後述するように、ELISA法によって定量することも可能である。【００６４】
３−２．レクチンマイクロアレイ
３−２−１．レクチンマイクロアレイによる糖鎖プロファイリング
（１）レクチンマイクロアレイ（単にレクチンアレイとも呼ぶ）
レクチンアレイは、複数種の特異性の異なる判別子（プローブ）レクチンを1つの基板上に並列に固定（アレイ化）したもので、分析対象となる複合糖質にどのレクチンがどれだけ相互作用したかを一斉に解析できるものである。レクチンアレイを用いることで、糖鎖構造推定に必要な情報が一度の分析で取得でき、かつ、サンプル調製からスキャンまでの操作工程は迅速かつ簡便にできる。質量分析などの糖鎖プロファイリングシステムでは、糖タンパク質をそのまま分析することはできず、あらかじめ糖ペプチドや遊離糖鎖の状態にまで処理をしなければならない。一方、レクチンマイクロアレイでは、例えば、コアタンパク質部分へ直接蛍光体を導入するだけで、そのまま分析できるという利点がある。レクチンマイクロアレイ技術は、本発明者等が開発したもので、その原理・基礎は、例えば、Kuno A., et al. Nat. Methods 2,851-856(2005).に記載されている。【００６５】
レクチンアレイに用いるレクチンとしては、次の表４に記載のものが挙げられる。
【表４】
2011007764.tif 000013
【００６６】
2011007764.tif 000014
【００６７】
例えば、45種類のレクチンを基盤に固定化したレクチンアレイ（GPバイオサイエンス社製のLecChip）が既に商用上入手可能である。【００６８】
（２）レクチンアレイによる糖鎖プロファイルの統計解析
レクチンアレイは、現在では、精製標品だけでなく、血清や細胞ライセートなどの混合試料の定量比較糖鎖プロファイリングができる実用化技術にまで発展してきている。特に細胞表層糖鎖の比較糖鎖プロファイリングはその発展がめざましい（Ebe, Y. et al. J. Biochem. 139, 323-327(2006)、Pilobello, K.T. et al. Proc Natl Acad Sci USA.104,11534-11539(2007)、Tateno, H. et al. Glycobiology 17, 1138-1146(2007)）。【００６９】
また、糖鎖プロファイルの統計解析によるデータマイニングについては、例えば、「Kuno A, et al. J Proteomics Bioinform. 1, 68-72(2008).」、あるいは、「日本糖質学会2008/8/18レクチンマイクロアレイ応用技術開発〜生体試料の比較糖鎖プロファイリングと統計解析〜久野敦、松田厚志、板倉陽子、松崎英樹、成松久、平林淳」および「Matsuda A, et al. Biochem Biophys Res Commun. 370, 259-263(2008).」に示される方法で行うことができる。【００７０】
（３）抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイ法
レクチンマイクロアレイのプラットフォームは基本的に上記の通りとし、検出に際しては上記被検体を直接蛍光などで標識するのではなく、抗体を介して間接的に蛍光基などを被検体に導入することで、一斉に多検体に対する分析を簡便、高速化することができる応用法である（「Kuno A, Kato Y, Matsuda A, Kaneko MK, Ito H, Amano K, Chiba Y, Narimatsu H, Hirabayashi J. Mol Cell Proteomics. 8, 99-108(2009)」、「平林淳、久野敦、内山昇「レクチンマイクロアレイを用いた糖鎖プロファイリング応用技術の開発」、実験医学増刊「分子レベルから迫る癌診断研究〜臨床応用への挑戦〜」、羊土社、Vol25(17)164-171(2007)」、久野敦、平林淳「レクチンマイクロアレイによる糖鎖プロファイリングシステムの糖鎖バイオマーカー探索への活用」、遺伝子医学MOOK11号「臨床糖鎖バイオマーカーの開発と糖鎖機能の解明」、pp.34-39、メディカルドゥ（2008）参照）。【００７１】
たとえば糖タンパク質が被検体であれば糖鎖部分はレクチンマイクロアレイ上のレクチンによって認識されるため、コアタンパク質部分に対する抗体をその上から被せる（オーバーレイ）ことによって、被検糖タンパク質を標識したり、あるいは高度に精製したりすることなく、特定的に感度高く検出することができる。【００７２】
（４）レクチンオーバーレイ・抗体マイクロアレイ法
レクチンマイクロアレイの代わりにコアタンパク質に対する抗体をガラス基板などの基板上に並列に固定（アレイ化）した抗体マイクロアレイを用いる方法である。調べるマーカーに対するだけの数の抗体が必要である。糖鎖変化を検出するレクチンをあらかじめ確定することが必要である。【００７３】
３−３  レクチン―抗体サンドイッチ免疫学的検出
レクチンアレイの結果をもとに簡易で安価なサンドイッチ検出法をデザインできる。基本的には2種の抗体を用いたサンドイッチ検出法に用いられるプロトコルのうち、一方の抗体をレクチンに置き換えるだけで適用できる。したがって、この手法は既存の自動免疫検出装置を用いた自動化にも適用可能である。唯一考慮しなければならない点は、サンドイッチに用いる抗体とレクチン間の反応である。抗体は少なくとも2本のN結合型糖鎖を有する。したがって、使用するレクチンが抗体上の糖鎖を認識する場合は、サンドイッチ検出時にその結合反応に起因するバックグランドノイズを生じてしまう。このノイズシグナルの発生を抑制するのに抗体上の糖鎖部分に修飾を導入する方法や、糖鎖部分を含まないFabのみを用いる方法が考えられるが、これらは公知の手法を用いればよい。糖鎖部分への修飾方法としては、例えばChen SらNat Methods. 4, 437-44 (2007)やComunale MAらJ Proteome Res. 8, 595-602 (2009)などがあり、Fabを用いる方法としては例えばMatsumoto HらClin Chem Lab Med 48, 505-512 (2010)などがある。【００７４】
３−４．連続クロマトグラフィーを用いる方法
抗体オーバーレイ・レクチンアレイは新規肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補分子上の疾患特異的糖鎖変化が最も反映するレクチンを統計学的に見出す最善の手法である一方で、免疫沈降およびオーバーレイ検出が可能な抗体が必須である。しかしながら必ずしもそのような抗体が入手できるとは限らない。したがって、より多くの候補分子を肝疾患検出に利用するための手段として、プローブレクチンで捕集した糖タンパク質に対する、標的糖タンパク質の免疫学的定量検出を行うのが一般的である。具体的にはSDS-PAGEを行い、膜転写後にウエスタンブロットにより免疫学的な検出をする。得られたバンドのシグナル強度の比較より、各試料間での変動を定量的に見積もることができる。がん性糖鎖を持つタンパク質の量的変動から各マーカー候補の有意性を病態ごとに確証し、絞り込みができる。本課題では肝疾患の進展に伴いフコース修飾の増加が認められる糖鎖マーカー候補分子群の検証を行う。その場合、候補分子の同定工程において使用したAALレクチンを、検証時においてもプローブタンパク質として用いるのが一般的である。例えばその様な戦略で実施している例として、Liu YらJ Proteome Res. 9, 798-805 (2010)の報告などがあげられる。ところが血清中のタンパク質は、その種類によってN結合型糖鎖の構造（分岐の度合いなど）、フコース修飾（コアフコース、血液型抗原など）は異なることが知られている。たとえ同一分子であったとしても異なるフコース修飾を受ける場合があることも報じられている。例えばNakagawa TらJ. Biol. Chem. 281, 29797-29806 (2006)の中で、α１アンチトリプシンが異なるフコース修飾を受けていることを報じられている。これらは疾患の種類、進展度合いによる増加の有無、タイミングを異にするため、ほぼすべてのフコース修飾を認識し捕集できるAALをプローブとして用い、フコース含有糖タンパク質全体を捕集し、量的比較するのは理想的とはいえない。そこでわれわれは２つの異なるフコース認識レクチンを用いて連続クロマトグラフィーにより分離分画し、それぞれの画分を定量比較解析することを考えた。この手法のスキームを図１０に示す。このときに使用するレクチンはLCAとAALである。これまでのレクチン特異性解析に
よりLCAはN結合型糖鎖のうち低分岐型のコアフコース修飾を受けたものを認識するレクチンであることが知られている。AALはN結合型糖鎖のどのような分岐のコアフコースでも認識することができ、かつABOやルイス抗原などに代表される非還元末端側のフコース修飾をも認識することができることも知られている。つまり、LCAは特異性が高く、AALは低い。そこで第一段階としてLCAカラムクロマトグラフィーを行い、LCAに結合するフコース含有糖タンパク質を捕獲する。これをLCA結合性フコース含有糖タンパク質とする。クロマトグラフィー時において、コアフコース修飾を受けている低分岐型N結合型糖鎖を有さないフコース含有糖タンパク質はLCAカラムには結合せず、非結合画分に分画される。このようなフコース含有糖タンパク質群をLCA非結合画分から捕獲するために、LCA非結合画分に対しAALカラムクロマトフラフィーを行う。この時にAALに捕獲された糖タンパク質群をLCA非結合／AAL結合性フコース含有糖タンパク質とする。この操作により、疾患に伴う同一タンパク質上のフコシル化の増減を修飾の種類ごとに評価することができると推測される。【００７５】
４．肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補
上記工程により選択された肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補のいくつかの例を、以下に示す。【００７６】
４−１．肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補糖ペプチドとしては次のものが挙げられる。【００７７】
（１）表１中のペプチド番号１９で表されるポリペプチドである肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド。【００７８】
（２）表１中のペプチド番号２６で表されるポリペプチドである肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド。【００７９】
（３）表1中のペプチド番号１１８で表されるポリペプチドである肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド。【００８０】
（４）表1中のペプチド番号１２４で表されるポリペプチドである肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド。【００８１】
（５）表1中のペプチド番号１２５で表されるポリペプチドである肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド。【００８２】
（６）表1中のペプチド番号１３０で表されるポリペプチドである肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド。【００８３】
（７）表1中のペプチド番号１３２で表されるポリペプチドである肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド。【００８４】
（８）表1中のペプチド番号１３５で表されるポリペプチドである肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖ペプチド。【００８５】
なお、上記(１)から(８)のもの２以上を組み合わせて用いることもできる。【００８６】
４−２．肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補糖タンパクとしては次のものが挙げられる。【００８７】
（１）上記表２中のタンパク質番号２２で表されるポリペプチドを含む糖タンパク質であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。【００８８】
（２）上記表２中のタンパク質番号８９もしくは９０で表されるポリペプチドを含む糖タンパク質であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。【００８９】
（３）上記表２中のタンパク質番号１４５−LRで表されるポリペプチドを含む糖タンパク質であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。【００９０】
（４）上記表２中のタンパク質番号９で表されるポリペプチドを含む糖タンパク質であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。【００９１】
（５）上記表２中のタンパク質番号８で表されるポリペプチドを含む糖タンパク質であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。【００９２】
（６）上記表２中のタンパク質番号１０３もしくは１０４で表されるポリペプチドを含む糖タンパク質であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。【００９３】
（７）上記表２中のタンパク質番号４７で表されるポリペプチドを含む糖タンパク質であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。【００９４】
（８）上記表２中のタンパク質番号１０５で表されるポリペプチドを含むタンパク質pIgRであって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。【００９５】
（９）上記表２中のタンパク質番号３２で表されるポリペプチドを含むタンパク質CSF1Rであって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。【００９６】
（１０）上記表２中のタンパク質番号１２９で表されるポリペプチドを含むタンパク質SHBGであって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。【００９７】
（１１）上記表２中のタンパク質番号１２２又は１２３で表されるポリペプチドを含むタンパク質SEPP1であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。【００９８】
（１２）上記表２中のタンパク質番号１３０で表されるポリペプチドを含むタンパク質SPARCL1であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。【００９９】
（１３）上記表２中のタンパク質番号１２６で表されるポリペプチドを含むタンパク質SERPINA7であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。【０１００】
（１４）上記表２中のタンパク質番号９２で表されるポリペプチドを含むタンパク質MANA2であって、フコース修飾を伴う糖鎖変化を有することを特徴とする肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質。【０１０１】
なお、上記(１)から（１４）の２以上を組み合わせて用いることもできる。【０１０２】
また、上記４−１．記載の（１）〜（８）と上記４−２．記載の（１）から（1４）のいずれか２以上を組み合わせて用いることもできる。【０１０３】
５．肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補の検証
上記で同定されたマーカー候補について、1)病気の進み具合に応じてどの程度の測定値変化が見られるのか、2)測定値の変化は、どの病期（初期か晩期か）にもっとも顕著となるのか、3）測定値変化の情報は、疾病のコントロールに資するかどうかを検討し、有用性を評価し、どの肝疾患病態に適したマーカーであるかを検証することができる。【０１０４】
６．新規肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補を利用する肝疾患の検出及び又は同定方法
また、本願発明は、上記表２に示される新規疾患病態指標糖鎖マーカー候補を検出及び／又は同定することを含む肝疾患の特異的検出方法を包含する（なお、以下では、ある新規肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補に特異的に反応するレクチンをレクチン“A”と標記する）。【０１０５】
例えば、レクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を有する新規肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補の検出手段としては、
（１）（イ）レクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を検出する手段及び（ロ）肝疾患病態指標糖鎖マーカーの糖鎖以外の部分(コアタンパク質)を検出する手段によりコアタンパク質を検出する手段の組み合わせ、並びに（２）レクチン“A”と特異的に結合する糖鎖を有する肝疾患病態指標糖鎖マーカーに対する特異的な抗体であって、糖鎖結合部分付近をエピトープとする抗体を挙げることができる。ここで、レクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を検出する手段及びコアタンパク質を検出する手段は、それぞれ、レクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を測定する手段、及びコアタンパク質を測定する手段であっても良い。【０１０６】
例えば、コアタンパク質に対する抗体及びレクチン“A”を用いて、新規肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補を検出することにより、肝疾患患者を健常人と区別して検出することができ、好適には、レクチンアレイを用いる抗体オバーレイ法(「Kuno A, Kato Y, Matsuda A, Kaneko MK, Ito H, Amano K, Chiba Y, Narimatsu H, Hirabayashi J. Mol Cell Proteomics. 8, 99-108(2009)）を用いることができる。【０１０７】
より簡易に検出するための手法としてはレクチン‐抗体サンドイッチ免疫学的検出法を用いることができる。【０１０８】
６−１．たとえば、レクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を有する新規肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補を用いる具体的な肝疾患の検出方法としては、
１）被験者から体外に採取された試料中のレクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を有する肝疾患病態指標糖鎖マーカー又はその断片（糖鎖修飾部位を含むペプチド）を測定する工程、
２）健常者から体外に採取された試料中のレクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を有する肝疾患病態指標糖鎖マーカー又はその断片（糖鎖修飾部位を含むペプチド）を測定する工程、
３）肝疾患患者から体外に採取された試料中のレクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を有する肝疾患病態指標糖鎖マーカー又はその断片（糖鎖修飾部位を含むペプチド）を測定する工程、
及び
４）被験者から得られたレクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を有する肝疾患病態指標糖鎖マーカー又はその断片（糖鎖修飾部位を含むペプチド）の測定結果と健常者又は肝疾患患者からレクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を有する肝疾患病態指標糖鎖マーカー又はその断片（糖鎖修飾部位を含むペプチド）の測定結果を比較し、被験者の測定結果がより肝疾患患者の測定値に近い場合に肝疾患であると判別する工程を含む肝疾患の検出方法が挙げられる。【０１０９】
６−１−１．
１）線維化の進展測定方法
肝炎ウイルス感染による肝炎の進展に於いて、線維化の程度は、肝機能低下及び肝細胞発がんのリスクと相関する事が知られている。したがって線維化の測定は、肝機能低下および発がんリスクを評価することを意味する。また肝炎患者の全体の4割程度は、インターフェロン治療に反応せずウイルス感染が持続する。これらの病態が活動性に進行するか否かは、線維化の進展で判断されるべきであると考えられている。これらの観点から、線維化の進展を測定する事は、肝炎の診断治療に於いて重要な意味を持つ。【０１１０】
現在行なわれている線維化の評価は、生検標本に対する病理診断による。近年、ファイブロスキャンの導入されたことで、当該方法が普及する事が期待される。また線維化を血清学的に評価する方法として、Fibro Test、Forn`s index、Hepatoscoreなどが臨床的に使用されているが、生検診断に比べて感度と特異度のいずれも劣る。【０１１１】
本発明で取得された表1又は2記載のあるマーカー候補糖ペプチドおよび糖タンパク質について、線維化の進展度合いの異なる患者血清群を用いて、抗体オーバレイ・レクチンマイクロアレイにより線維化の進展度合いに相関してシグナル強度が増加もしくは減少するレクチンを選択する。この情報をもとに、マーカー候補分子に対する抗体および線維化の進展でシグナル変動するレクチン“A”を用いたサンドイッチ検出方法、たとえばレクチン―抗体サンドイッチELISAや抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイ法が確立できる。病理診断により線維化のステージングがされている患者血清を100程度収集し、それらについて分析を行い、各ステージにおけるカットオフ値を設定することにより、被患者血清を用い、肝線維化の進展をモニタリングすることができる。【０１１２】
２）肝硬変の検出
肝硬変は、肝小葉構造の消失した再生結節とこれを取り囲む緻密な線維性結合組織が肝全体に瀰漫性に出現する病態と定義される。これは、肝細胞障害と線維化が持続する進行性慢性肝疾患の終末状態でもある。肝硬変における肝生検は成因診断を探るために行なわれるもので、早期の肝硬変や大結節型の肝硬変では診断困難な症例が多い（外科病理学第4版、文光堂より）。したがって、肝硬変を定性的、定量的に診断できる検査技術が必要とされている。この目的に対し、１）の線維化の進展測定方法、の項で見出された線維化の進展をモニタリングできる候補分子抗体およびレクチンセットのうち、線維化ステージF3とF4を見分けることができる場合、肝硬変検出に使用できる。【０１１３】
３）早期肝細胞がんの検出
早期肝細胞がんは、病理学的に間質浸潤を伴う1.5cm前後の高分化型肝細胞と定義され、通常型肝細胞がんや再生結節、境界病変（異型腺腫瘍過形成）とは鑑別される病変である。特に、境界病変と高分化型肝細胞がんは発がん過程で同一線上にあると考えられており、臨床経過のうちに、通常型肝細胞がんへ進展することが知られている。また、高分化型肝細胞がんは通常型肝細胞がんの前段階病変の一つであると考えられ、この病変を発見して処置する事で、がんの根治が期待できる。【０１１４】
これを達成するための手段として、本発明で取得された表1又は2記載のあるマーカー候補糖ペプチドおよび糖タンパク質について、肝がんの発見された線維化ステージF4患者群に対し、がん発見までの数年間複数点の血清シリーズを用い、レクチン‐抗体サンドイッチELISAや抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイなどの比較糖鎖解析手法により糖鎖変化を検証する。それにより、肝硬変の初期段階から発がんまでに有意差を持って変動がある糖鎖を有する候補分子、およびその糖鎖変化をとらえることのできるレクチンのセットを早期肝細胞がん検出ツールとして用いることができる。【０１１５】
６−２．試料中のレクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を有する新規肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補又はその断片（糖鎖修飾部位を含むペプチド）の検出
試料としては、生検試料、体液試料、好適には、血液（血清、血漿等）が挙げられる。【０１１６】
測定とは、定性的測定及び定量的測定の両者を包含する。【０１１７】
レクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を有する肝疾患病態指標糖鎖マーカー又はその断片（糖鎖修飾部位を含むペプチド）の測定は、例えば、（１）レクチン“A”に特異的に結合する糖鎖を測定する手段、具体的には、レクチン“A”を固定したカラムやアレイ、及び（２）新規肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補又はその断片を測定する手段、具体的には、新規肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補又はその断片に対する抗体を用いて行なうことができる。好適には、レクチン‐抗体サンドイッチELISAや抗体オーバーレイ・レクチンアレイ法を用いることができる。【０１１８】
また、レクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を有する新規肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補又はその断片（糖鎖修飾部位を含むペプチド）の濃度を計測することもでき、これには、レクチンアレイを用いた抗体オーバーレイ・レクチンアレイ法、LC-MS、免疫学的測定法、酵素活性測定法、キャピラリー電気泳動法等が挙げられる。好適には、LC-MS、レクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を有する新規肝細胞がん糖鎖マーカー候補又はその断片に特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いた、酵素免疫測定法、２抗体サンドイッチELISA法、金コロイド法、放射免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、蛍光免疫測定法、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、表面プラズモン共鳴法（以下、ＳＰＲ法と記す）等による定性的又は定量的手法を用いることができる。【０１１９】
更に具体的には、準定量を、レクチン“A”及び抗新規疾患病態指標糖鎖マーカー候補抗体を用いるウエスタンブロッティング法により行なうこともできる。定性的測定において、前記「被験者の測定結果がより高い場合」とは、正常者より被験者の試料中にレクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を有する新規疾患病態指標糖鎖マーカー候補がより多く存在することが定性的に示された場合を意味する。更に、抗体を介さない糖鎖の直接測定法としてのレクチン法及び質量分析法も含まれる。【０１２０】
ここで、肝線維化進展に伴うAAT, ACT, pIgR, CPB2, CSF1Rの糖鎖構造の変化に対応して反応性が変化するレクチン“A”としては、AALを挙げることができる。CSF1Rはタンパク質量自体も肝臓の線維化進展に伴って上昇する傾向にあるが、この量的変動は別の疾患でも生じてしまうため、正確な線維化進展鑑別手法とはならない。一方、糖鎖構造の変化によるAAL結合性CSF1Rの量的変動は他の疾患に左右されることはないため、精度が向上する。さらに、AAL結合性AAT, ACT, pIgR, CPB2, CSF1R検出の前段階として、LCA結合性AAT, ACT, pIgR, CPB2, CSF1Rの除去工程を追加することで、線維化進展のF3からF4の範囲を鑑別する精度は向上する。【０１２１】
肝硬変から肝細胞がん発がんへの進展に伴うCSF1Rの糖鎖構造の変化に対応して反応性が変化するレクチン“A”としては、抗体オーバーレイ・レクチンアレイ法により厳選されたWFAを挙げることができる。上述した通り血清中のCSF1Rタンパク量は肝臓の線維化の進展に従って高くなっていくため、より厳密な診断のためにはCSF1Rのコアタンパク質量を別に測定し、その値でWFA結合性CSF1R測定値を規格化することが好ましい。【０１２２】
７．新規肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補又はその断片を用いた新規の特異的ポリクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体の調製
新規肝疾患病態指標糖鎖マーカーを利用する肝細胞がんの検出方法において、肝疾患病態指標糖鎖マーカー特異的ポリクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体が容易に入手できる場合は、それらを用いることができるが、容易に入手できない場合は、例えば、以下のように調製できる。【０１２３】
７−１．抗体の調製
本願発明の新規肝疾患病態指標糖鎖マーカーは、肝疾患検出用のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の調製に用いることができる。【０１２４】
例えば、新規肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補の断片に対する抗体は、周知の方法で、調製出来る。フロインドの完全アジュバントを同時投与して抗体の生成をブーストすることもできる。また、Xの糖鎖が結合している結合位置を含むペプチドを合成し、このペプチドを市販キーホール・リンペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin、KLH）に共有結合させ、動物に投与する。なお、このとき顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF）を同時に投与して抗体産生をブーストすることもできる。【０１２５】
また、例えば、抗新規肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補モノクローナル抗体は、ケラーとミルシュタインの方法で調製することができる（Nature Vol.256,pp495-497 (1975)）。例えば、抗原で免疫した動物から得られる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを調製し、得られるハイブリドーマから抗X抗体を産生するクローンを選択することにより調製することができる。【０１２６】
具体的には、得られた抗原用の肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補にアジュバントを添加する。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。【０１２７】
上記のようにして得られた抗原を哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウマ、サル、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に投与する。免疫は、既存の方法であれば何れの方法をも用いることができるが、主として静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射などにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは4〜21日間隔で免疫する。【０１２８】
最終の免疫日から2〜3日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞が挙げられる。【０１２９】
抗体産生細胞と融合させるミエローマ（骨髄腫）細胞として、マウス、ラット、ヒトなど種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地（例えばＨＡＴ培地）で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが用いられる。一般的に8-アザグアニン耐性株が用いられ、この細胞株は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できないものである。【０１３０】
ミエローマ細胞は、既に公知の種々の細胞株、例えば、P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol. 123, 1548-1550 1979))、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology 81, 1-7 (1978))、NS-1(Kohler, G. and Milstein, C., Eur. J. Immunol. 6,511-519(1976))、MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell  8,405-415(1976))、SP2/0(Shulman, M. et al., Nature 276,269-270(1978)) 、FO(de St.Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods 35, 1-21(1980))、S194(Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. 148, 313-323(1978))、R210(Galfre, G. et al.,Nature 277, 131-133(1979))等が好適に使用される。【０１３１】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、MEM、DMEM、RPME-1640培地などの動物細胞培養用培地中で、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを、混合比１：１〜１：10で融合促進剤の存在下、30〜37℃で１〜15分間接触させることによって行われる。細胞融合を促進させるためには、平均分子量1,000〜6,000のポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール又はセンダイウイルスなどの融合促進剤や融合ウイルスを使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。【０１３２】
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、選択培地における細胞の選択的増殖を利用する方法等が挙げられる。すなわち、細胞懸濁液を適切な培地で希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ウェルに選択培地（HAT培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。【０１３３】
ハイブリドーマのスクリーニングは、限界希釈法、蛍光励起セルソーター法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得する。取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法等が挙げられる。
【実施例】
【０１３４】
[実施例1]
グライコプロテオミクス（IGOT-LC/MS法）による糖ペプチドバイオマーカーの選択
１．培養上清の調製法（HepG2、HuH-7： -Lot. 071213）
高グルコース含有90%DMEM、10%FBS,PS+,（HuH-7のみITS+）の培地を用いて、直径１４ｃｍのディッシュで3日間、HepG2及びHuH-7細胞を培養し、80〜90％コンフルエントとした。前記FBS血清入り培養上清を吸引して廃棄し、無血清培地10ml / dish（100%DMEM-high glucose, 添加物など無し）で洗浄し、無血清培地 30ml / dish 添加して、４８時間培養した。（HepG2、HuH-7の場合これ以上無血清を続けると細胞が壊れる）
培養後、4500G x 30minで遠心し、上清を回収し、−８０℃凍結保存した。【０１３５】
保存した培養上清は、使用前に融解し、0.45μmフィルターろ過して、以下の実施例に用いた。なお、NaN3を0.1% NaN3となるように添加した。【０１３６】
２．糖タンパク質の大規模同定法
１）ペプチド試料の調製
血清(希釈、変性処理済み)、細胞培養液に、終濃度10％となるようトリクロロ酢酸（TCA、１００％飽和水溶液）を加え、氷上で10-60分冷却し、タンパク質を沈殿させた。４℃で高速遠心分離し、沈殿を回収した。沈殿は氷冷したアセトンに懸濁し、TCAを洗浄、除去した。洗浄は２回行った。【０１３７】
沈殿に可溶化緩衝液（0.5Mトリスー塩酸緩衝液、pH8-8.5、７Mグアニジン塩酸、10ｍM  EDTA（エチレンジアミン4酢酸）を含む）を、タンパク質濃度がおよそ5-10mg/mlとなるように加え、溶解した。高速遠心分離により、沈殿を除去した。抽出液に窒素ガスを通じるか吹きつけ、溶存酸素を除いた後、タンパク質重量と等量のジチオスレイトール（DTT）を粉末あるいは少量の可溶化緩衝液に溶かし、加えた。窒素ガスを通じながら、あるいは窒素ガス雰囲気下、室温で1-2時間反応（ジスルフィド結合を還元）させた。次いで、タンパク質重量の2.5倍のヨード酢酸アミドを加え、遮光下、室温で1-2時間反応させた（S-アルキル化）。反応後、50-100倍量の緩衝液（一般的には10ｍM 重炭酸アンモニウム緩衝液、pH8.6）を外液として、4℃（冷室）で透析した。外液を適当な時間をおいて3-5回交換し、変性剤（グアニジン塩酸）や過剰の試薬を除いた。タンパク質が部分的に沈殿することがあったが、懸濁液のままタンパク質定量した。タンパク質量の1/100-1/50重量のトリプシン（シークエンスグレード以上）を加え、37℃、終夜（およそ16時間）反応させた（消化）。消化の進行はSDS-ゲル電気泳動法により確認し、十分に消化されていると判断されたときに、終濃度５ｍM のフッ化フェニルメタンスルフォニル（PMSF）を加え、反応を停止した。【０１３８】
２）糖ペプチドの捕集・精製
試料ペプチドを、プローブレクチンを固定化したカラムに供し、洗浄後、レクチンの特異性に応じた方法で糖ペプチドを溶出した。得られた糖ペプチド溶液にエタノール（等容）および1-ブタノール（4倍容）を加え、水-エタノール-1-ブタノール(1:1:4, v/v)で平衡化したSepharoseカラムに供した。洗浄後、50％エタノール（v/v）で糖ペプチドを溶出した。糖ペプチド画分を、少量（2マイクロリットル）のグリセロールの入ったマイクロチューブに少量ずつ移し、減圧遠心濃縮した(水の除去、この操作を繰り返し、全糖ペプチド画分を濃縮した)。【０１３９】
３）糖鎖切除と糖鎖付加位置安定同位体標識（IGOT）
精製した糖ペプチド(グリセロール溶液)に必要量の緩衝液を加え、再度減圧遠心濃縮した後、安定同位体酸素-18で標識した水（H218O）を加え、溶解した(グリセロール濃度は10％以下とする)。これに標識水で調製したペプチド-N-グリカナーゼ(グリコペプチダーゼF、PNGase)を加え、37℃で終夜反応させた。【０１４０】
４）標識ペプチドのLC/MSショットガン分析
反応液を0.1％ギ酸で希釈し、LC/MSショットガン分析した。このとき高分離能、高再現性、高感度に検出するため、ダイレクトナノフローポンプを基礎とするナノLCシステムを利用した。インジェクトしたペプチドは脱塩を目的としたトラップカラム(逆相C18シリカゲル系の担体)上に一旦捕集し、洗浄後、同じ樹脂を詰めたスプレーチップの形状をしたフリットレス微小カラム（内径150micrometer x 50 mm L）を用い、有機溶媒(アセトニトリル)の濃度グラジェント法で分離した。溶出液はエレクトロスプレーインターフェースを介してイオン化して、直接質量分析機に導入した。質量分析はデータ依存モードで最大2つのイオンを選択しながら、衝突誘起解離（CID）によるタンデム質量分析を行った。【０１４１】
５）MS/MS-イオンサーチ法によるペプチドの検索
得られた数千のMS/MSスペクトルについて、個々にスムージング、中心化処理を行ってピークリストを作成し、このデータを元にタンパク質アミノ酸配列データベースを用いてMS/MSイオンサーチ法で、ペプチドを同定した。検索エンジンにはマトリックスサイエンス社のMascotを用いた。検索条件のパラメータとして、使用した断片化法(トリプシン消化)、ミスクリーベージ許容数：２、固定する修飾：システインのカルバミドメチル化、変動的な修飾：N末端アミノ基の脱アミノ化(末端グルタミン)、酸化(メチオニン)、18Oを取り込んだ脱アミド化(アスパラギン:糖鎖付加部位)、MSスペクトルの許容誤差：500ppm、MS/MSスペクトルの許容誤差：0.5Daを用いた。【０１４２】
６）糖ペプチドの同定
上述の条件で検索し、得られた結果より、下記の同定確認処理を行った。【０１４３】
（１）同定の確からしさのスコア（偶然の一致の確率：Expect値）が0.05以下であること。【０１４４】
（２）同定に寄与したフラグメントイオンの数が4つ以上であること。【０１４５】
（３）誤差（ppm）が系統的誤差より大きくずれていないこと（質量誤差が0.5Da以下であること）。【０１４６】
（４）同定されたペプチドにコンセンサス配列があり、その数以下のAsn修飾（Aspへの変換、および18Oの取り込み）があること。【０１４７】
３．マーカー糖ペプチドの絞り込みの手順
１）肝炎ウィルスの感染を基礎とする原発性肝細胞がん患者の血清（がん組織を切除する手術前、及び施術後に採取した2種の血清を用意した）および、がん細胞培養上清より調製したタンパク質のトリプシン消化物より、プローブレクチンで糖ペプチドを捕集し、上述のIGOT-LC/MS法で同定した。同定された糖ペプチドを初期肝疾患病態マーカー糖ペプチドとした。たとえば表５中のC. HCC関連試料(培地2+血清10（手術前の試料が５、術後の試料が５）)よりプローブ（AAL）で検出された回数として、プローブレクチンにより検出された頻度を表すことができる。【０１４８】
２）次いで、健常者の血清より、同じプローブレクチンで糖ペプチドを捕集し、同定した（網羅的リスト2）。たとえば表５中のB. 健常血清よりプローブ（AAL）で検出された回数として、プローブレクチンにより検出された頻度を表すことができる。【０１４９】
３）さらに、同様に健常者血清および肝細胞がん患者血清より調製したペプチドをシアリダーゼ処理後、網羅的な捕集を目的に、レクチンRCA120を固定化したカラムに供し、糖ペプチドを捕集後、同定した（網羅的リスト3）。たとえば表５中のF.血清よりRCA120で検出された回数として、プローブレクチンにより検出された頻度を表すことができる。【０１５０】
４）これらの糖ペプチドリストを相互に比較し、以下のように分類及び絞り込みを実施した。【０１５１】
(i)１）の初期糖ペプチドリストと網羅的リスト2を比較し、基本的に重複しなかったタンパク質群をマーカー糖ペプチドとした。ただし、重複した糖ペプチドのうち、患者術後血清からは同定されず、かつ培養上清及び術前血清から同定された糖ペプチドをマーカー糖ペプチドの下位に位置づけ、これを第5群とした。これらを合わせた糖ペプチドを表５に挙げ、第5群の糖ペプチドの通し番号には末尾にLR（Low-ranking）を付した）。【０１５２】
(ii)重複しなかったペプチドについては、培養上清及び術前血清からのみ同定されたものを選別し、「肝細胞がんマーカー糖ペプチド」とし、術前術後の両方から同定されたものを「肝細胞線維化マーカー糖ペプチド」とした。さらにこれらを網羅的リスト３と比較し、重複した糖ペプチドは血清中の濃度が比較的高いマーカーペプチドとして上位に位置づけた。より具体的には、「肝細胞がんマーカー糖ペプチド」を血清中の存在量の高低でそれぞれ第１群および第3群に分類し、「肝細胞線維化マーカー糖ペプチド」を血清中の存在量の高低でそれぞれ第２群および第４群に分類した。【０１５３】
以上のように選別、絞り込みを実施したマーカー糖ペプチドは、単にアミノ酸配列によってのみ規定するのではなく、ペプチド部分の修飾、特に糖鎖付加位置を明確にし、合わせてマーカー糖ペプチドを規定し、前記表1に示した。
【表５】
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【０１５４】
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【０１５５】
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【０１５６】
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【０１５７】
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【０１５８】
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【０１５９】
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【０１６０】
４.マーカー糖タンパク質
３.で同定、選別されたマーカー糖ペプチドの配列から、この配列を含む糖タンパク質を規定することができる。より具体的には、表５で得られた糖ペプチドとその配列を含む糖タンパク質それぞれの番号を対応させた表（表６）を作成することで、容易にマーカー糖タンパク質のリストを作成することができる。これらの糖タンパク質を、前記表2に示した。
【表６】
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【０１６１】
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【０１６２】
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【０１６３】
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【０１６４】
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【０１６５】
（但し、上記表６中のタンパク質番号９７及び９８（AGP)並びに65（M2BP）は除く）
５．IGOT-LC/MS分析における各糖ペプチドの質量分析シグナル強度比較による実証
３．で同定された各糖ペプチド（IGOT-LC/MS分析においては、糖鎖付加部位に安定同位体標識が導入されたペプチドとして検出される）をマーカーとして用いた肝疾患病態検出例を以下にしめす。健常人血清、術前血清、および術後血清に含まれるタンパク質について上述の手法によりペプチド断片化し、IGOT-LC/MS分析を行った。得られた各糖ペプチドのシグナル強度を、健常人血清、術前血清、術後血清間で比較したところ、術前血清でのみ顕著であるマーカー糖ペプチドが見出された。その一部を図9に示す。これらは肝疾患病態指標マーカー糖ペプチドのうち、本願発明の早期肝細胞がん検出に使用できる「肝細胞がんマーカー糖ペプチド」となることが期待できる。【０１６６】
[実施例２]  肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補糖タンパク質の肝疾患検出への利用
前記肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補の検証および絞り込みにより、（ウイルス性）肝炎患者、肝硬変患者、及び肝細胞がん患者の血清より捕集した糖タンパク質（糖ペプチドの配列を含む糖タンパク質）に対する抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイ等による比較糖鎖プロファイリング中にある手順で検証された糖タンパク質のうち、CPN2について、新規肝疾患病態指標糖鎖マーカー候補を利用する肝疾患の検出について抗体オーバーレイ・レクチンアレイを活用し実施した例を以下に示す。なお、本手法による（ウイルス性）肝炎患者（CH）、肝硬変患者（LC）、肝細胞がん患者（HCC）、および健常者（HV）血清に由来する該マーカー糖タンパク質上糖鎖の比較解析の戦略を図7に示す。【０１６７】
１．マーカータンパク質の血清からのエンリッチ
（ウイルス性）肝炎患者（CH）、肝硬変患者（LC）、肝細胞がん患者（HCC）、および健常者（HV）血清に由来する該マーカー糖タンパク質のエンリッチは、「Kuno A, Kato Y, Matsuda A, Kaneko MK, Ito H, Amano K, Chiba Y, Narimatsu H, Hirabayashi J.Mol Cell Proteomics. 8, 99-108 (2009) 」に従って行われた。なお、得られる結果が病態に依存していることを明らかにするため、各病態につき５例ずつを分析に用いることにした。各患者血清を0.2%SDS含有PBS緩衝液で１０倍希釈し、10分間95℃で加熱処理したものを、CPN2においては25μL反応チューブに分注し、そこへ500 ngのCPN2に対する抗体（ビオチン化物）を添加した。各反応溶液は反応バッファー（1%Triton X-100入りTris-buffered saline (TBSTx)）により、45μLに調整された後、4℃で2時間振盪反応された。抗原抗体反応後、速やかにストレプトアビジン固定化磁気ビーズ溶液（Dynabeads MyOne Streptavidin T1, DYNAL Biotech ASA製）をあらかじめ反応バッファーで3回洗浄し、かつ2倍濃縮状態で調整したもの5μL（元のビーズ溶液10μL分に相当）を上記反応溶液へ加え、1時間さらに反応した。この反応により、ビオチン化抗体を介して、該糖タンパク質は磁気ビーズと複合体を形成する。この複合体を磁気ビーズ回収用マグネットに吸着させた後に溶液を廃棄した。回収された複合体は500μLの反応バッファーにより3回洗浄された後に、10μLの溶出バッファー（0.2%SDS含有TBS）に懸濁された。この懸濁溶液を95℃で5分間熱処理することで、該糖タンパク質を磁気ビーズから解離溶出し、得られた溶液を溶出液とした。その際、熱変性されたビオチン抗体も混入するため、溶出液に上述の手法で2倍濃縮状態で調整された磁気ビーズ溶液を10μL（元のビーズ溶液20μl分に相当）加え、1時間反応することで、ビオチン化抗体を吸着除去した。これにより得られた溶液を血清由来該糖タンパク質溶液とし、以降の実験に用いた。【０１６８】
２．抗体オーバーレイ・レクチンアレイ
上述により得られた該糖タンパク質溶液適当量とり、レクチンアレイ反応バッファーである1%Triton X-100含有Phosphate-buffered saline (PBSTx)により、６０μLに調整した。この溶液をレクチンマイクロアレイの各反応槽（ガラス１枚当たり８つの反応槽が形成されている）へ添加し、２０℃で１０時間以上反応した。この８つの反応槽からなるレクチンマイクロアレイ基盤の作製は内山ら（Proteomics 8, 3042-3050 (2008)）の手法に従った。これにより該糖タンパク質上の糖鎖とアレイ基板上に固定されている４３種のレクチンとの結合反応が平衡状態に達する。その後、未反応の基盤上レクチンへ検出用抗体上の糖鎖が結合し、ノイズとして生じてしまうことを避けるため、ヒト血清由来IgG溶液（シグマ社製）を２μL加え、３０分反応させた。60μLのPBSTxで各反応槽を３回洗浄した後、再度ヒト血清由来IgG溶液を２μL加え、若干攪拌した後に、検出用の該糖タンパク質に対する抗体（ビオチン化物）を100 ng相当加え、20℃で1時間反応させた。抗原抗体反応後、60μLのPBSTxで各反応槽を３回洗浄し、次いでCy3標識ストレプトアビジン200 ng相当が含有しているPBSTx溶液を加え、さらに30分、20℃で反応した。反応後、60μLのPBSTxで各反応槽を３回洗浄した後、モリテックス社製アレイスキャナーGlycoStationによりアレイスキャンを行った。【０１６９】
得られた結果のうち、各病態の典型例をCPN2は図8に示す。図を見て明らかな通り、実施例1の「糖タンパク質の大規模同定法  ２）糖ペプチドの捕集・精製」に用いられたレクチンAAL、および糖結合特性の類似しているAOLレクチン上のシグナルは、いずれの候補分子においても慢性肝炎、肝硬変、および肝細胞がんと肝疾患の重篤度が増すにつれ、強くなる傾向を示した。【０１７０】
この結果より、上述の大規模解析によりAAL結合性糖ペプチドと同定されたものの中で、肝細胞がん患者に存在し、かつ健常者で同定されない糖ペプチドの配列を含む糖タンパク質が、該糖ペプチドと同様に肝疾患病態マーカーとなりうることが実証された。【０１７１】
さらに、今回の実験により、AALおよび糖結合特性の類似するレクチン以外においても、肝疾患病態に応じ増減を示すものが存在することが明らかになった。これは、糖タンパク質上の複数のレクチンシグナルを組み合わせ、その組み合わせ方にバリエーションを持たせることにより、さまざまなフェーズの病態をより精度高く検出することができる可能性を意味している。【０１７２】
[実施例３]  連続クロマトグラフィーによるフコース含有糖タンパク質の分離分画と定量比較解析手法の検討
図10に示す2つの異なるフコース認識レクチンを活用した連続クロマトグラフィーを用いたマーカー候補分子の検証方法について、その手順を具体的に記載する。【０１７３】
１．LCA-AAL連続カラムクロマトグラフィーによるフコース含有糖タンパク質の分離分画
健常者プール血清(NHS)およびC型肝炎ウイルス陽性肝細胞がん患者血清（HCC）50 μLを0.2%SDS含有PBSバッファーにより10倍希釈し、95℃で20分加熱処理することでウイルスを不活化した。熱処理サンプルは、予め開始バッファー（0.1%SDS, 1%TritonX-100含有PBS）により平衡化したLCAレクチンカラム (生化学工業)（5 mL, φ7.0 mm, 高さ100.0 mm）にアプライした。クロマト時の流速は200μL／minに調整した。サンプルアプライ後、3カラム量の開始バッファー、次いで3カラム量の洗浄バッファー（0.02%SDS含有PBS）でカラムを洗浄した。LCAカラムへ吸着した糖タンパク質は溶出バッファーA（200 mMメチルαマンノシド含有0.02%SDS含有PBS）により溶出した。クロマト溶液はフラクションコレクターにより1.0 mLずつ回収した。LCA非結合画分および結合画分の分画位置はタンパク定量により確定した。次に、LCA非結合画分を、予め開始バッファー（0.1%SDS, 1%TritonX-100含有PBS）により平衡化したAALレクチンカラム (和光純薬工業)（0.5 mL, φ5.0 mm, 高さ20.0 mm）にアプライした。クロマト時の流速は40μL／minに調整した。サンプルアプライ後、3カラム量の開始バッファー、次いで6カラム量の洗浄バッファー（0.02%SDS含有PBS）でカラムを洗浄した。AALカラムへ吸着した糖タンパク質は溶出バッファーB（200 mMフコース含有0.02%SDS含有PBS）により溶出した。クロマト溶液はフラクションコレクターにより1.0 mLずつ回収した。AAL非結合画分および結合画分の分画位置はタンパク定量により確定した。各画分（LCA結合画分(LE)、LCA非結合／AAL結合画分(AE)、およびLCA／AAL非結合画分(LTAT)）を確定後、SDS-PAGEにより分離状況を確認した。なお、NHSおよびHCCクロマト時の各画分の液量は、NHSの場合LEは7.7 mL, AEは1.34 mL, LTATは9.25 mLで、HCCの場合LEは12.48 mL, AEは1.79 mL, LTATは11.91 mLであった。【０１７４】
２．レクチンアレイによる各画分の定性・定量比較
レクチンアレイによる熱処理後血清および各画分中糖タンパク質の糖鎖プロファイリングは基本的に久野ら（文献1 Kuno et al., Nature Method 2005）、内山らの手法（文献2 Uchiyama et al. Proteomics 2008）に従った。熱処理後血清は、タンパク質量1μg相当を以下の手法により蛍光標識した。連続クロマトグラフィー後の各画分中糖タンパク質の蛍光標識は、分画後の溶液量比から血清タンパク質1μg相当を分画したものとして換算した液量を用いて行った。また、溶出画分は競合糖を含むため、それを除去するために0.1%SDS含有PBSによる希釈と、限外ろ過カラム[Millipore Amicon Ultra（商標）0.5 mL 3K cut]を用いた遠心濃縮を繰り返した。サンプルは1%Triton X-100含有PBSバッファーにより10μLに調製し、そこへ10μgの蛍光ラベル化試薬（Cy3-SE、GEヘルスケア社）を加え、1時間室温にて蛍光ラベル反応した。反応産物中に90μLのグリシン含有緩衝液を加え、2時間室温にて反応することで、余剰蛍光ラベル化試薬を不活化した。これを蛍光標識糖タンパク質溶液としてレクチンアレイに供じた。表4に示したレクチンアレイは43種類の異なるレクチンが固定化されているものを使用した。蛍光標識糖タンパク質溶液は終濃度で2.0μg／mLとなるようにレクチンアレイへアプライした。AE画分だけは終濃度で8.0μg／mLのサンプルでアプライした。レクチンと分析対象糖タンパク質との結合反応は20℃で12時間行った。反応後、アレイ上のサンプル溶液は除去し、専用バッファーで3回洗浄し、GPバイオサイエンス社製のレクチンアレイ用スキャナーGlycoStationTM Reader1200でスキャンした。スキャンにより得られたデータはjpegファイルおよびTIFFファイルとして保存した。シグナルの数値化はTIFFファイルを用い専用ソフトArrayPro Analyzerにより行った。【０１７５】
各画分の糖鎖プロファイルを図１１に示す。各レクチン（LCA, AAL）カラムを用いたクロマトグラフィーの効果は、それぞれLCA, AALのシグナルの変動、および2つのレクチンのシグナル強度比をみることで検証できる。例えば、血清解析時に観察されたLCAシグナルは、LE画分に保持されており、LT画分にはほとんど観察されなかった。これはLCAに結合する糖タンパク質の大部分がLCAカラムに吸着し、溶出液により溶出されたことを意味している。また、AALカラムはLCAに結合しないもしくは弱い相互作用しか示さない糖フコース含有糖タンパク質を吸着させるため、その溶出画分はAALシグナルに比べLCAシグナルが低いが、LCAの結合画分においてはLCAシグナルの方がAALシグナルよりも強い。ここで、AAL非結合画分においてもLCA, AALシグナルが観察されているが、これはそれぞれのレクチンに対して弱いながらも相互作用することができるが、クロマト時にレクチンカラムへ結合できなかったものが存在したことを意味している。その代表的な分子としてIgGが考えられる。IgGはN結合型糖鎖含有糖タンパク質のひとつで、その7割以上がN結合型糖鎖中にコアフコースを有している。しかしながらIgGのN結合型糖鎖はIgG分子に近接して存在するため、レクチンとの相互作用がしにくいことが明らかになっている。これによりレクチンカラムに結合できなかった。ところが、レクチンアレイは弱い相互作用をも観察できる解析手法であるため、LCA/AAL非結合画分においてもシグナルが生じたと思われる。【０１７６】
次にNHSおよびHCCのシグナルパターンの比較を試みた。血清ではほとんどパターンに差はないが、フコース認識レクチンであるLCA, PSA, AAL, AOLなどで若干の差がみられる。一方LCA結合画分の場合、全体的にHCCでシグナルが高い傾向を示し、その傾向はAAL結合画分でより顕著に見られた。興味深いことにLCA/AAL非結合画分はNHSとHCCでほとんど差が見られなかった。以上により、HCCはNHSにくらべフコース含有糖タンパク質の量が増えており、それはLCA結合性フコース含有糖タンパク質およびLCA非結合／AAL結合性フコース含有糖タンパク質の両者が増加していることが示唆された。【０１７７】
３．特定糖タンパク質のLCA結合性フコース含有分子およびLCA非結合／AAL結合性フコース含有分子の量的比較
特定糖タンパク質を対象とし、LCA結合性フコース含有分子およびLCA非結合／AAL結合性フコース含有分子が、肝がんに伴いどれだけ増加するかを検討した。上述のように取得したNHSおよびHCCのLCA結合画分(LE)およびLCA非結合／AAL結合画分（AE）はLaemmli sample bufferと混合して加熱した後に5〜20％グラジェント・ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS/PAGEに供じた。電気泳動後、分離されたタンパク質は、PVDF膜に転写された。膜上のタンパク質の検出は定法に従った。その際、ブロッキング剤はBlock Ace (DS Pharma Biomedical, Osaka, Japan)を、一次抗体はビオチン化抗体を、検出試薬にはalkaline phospatase-conjugated streptavidin (1/5000 diluted with TBST; ProZyme, Inc., San Leandoro, CA)とWetern Blue（商標）stabilized substrate for alkaline phosphatase (Promega, Madison, WI)を用いた。【０１７８】
ここでは、これまでの報告（J Proteome Res. 2006 Feb;5(2):308-15.）で肝線維化やHCC発がんに伴いフコース修飾が亢進することが明らかになている、AGP, α１アンチトリプシン(AAT),およびα１アンチキモトリプシン（ACT）を対象に行った結果を図１２に示す。ウエスタンブロットのバンド強度から量的な比較をすると、AGPにおいてフコース含有分子はLCA結合画分には全く存在せず、AAL結合画分にのみ存在することが分かる。そしてその量はNHSに対しHCCで有意に増加しているのが分かる。AATの場合、フコース含有分子はLCA結合画分とAAL結合画分に分けられる。つまり同じAAT分子でありながら異なるフコース修飾を受けたものが存在していることを示唆している。NHSとHCCを比較すると、LCA結合画分にてNHSで若干の存在が確認され、それがHCCで顕著に増加している。またAAL結合画分ではNHSではほとんど存在が確認されていないのに対し、HCCでは有意に存在している。ACTの場合もフコース含有分子はLCA結合画分とAAL結合画分に分けられるが、その存在比がAATのそれとは異なっていた。すなわち、NHSとHCCを比較すると、LCA結合画分にてNHS、HCCともに存在は確認されているがその量的差はほとんどない。それに対しAAL結合画分ではNHS、HCCともに存在が確認できるが、HCCの量が有意に高いことが分かる。【０１７９】
以上の結果からわかるように、タンパク質の種類によってN結合型糖鎖の構造（分岐の度合いなど）、フコース修飾（コアフコース、血液型抗原など）は異なり、さらには、たとえ同一分子であったとしても異なるフコース修飾を受ける場合がある。これらは疾患の種類、進展度合いによる増加の有無、タイミングを異にする。２つの異なるフコース認識レクチンを用いた連続クロマトグラフィーにより分離分画後、定量比較解析することの利点ここにある。すなわち、この操作により、疾患に伴う同一タンパク質上のフコシル化の増減を修飾の種類ごとに評価することができるわけである。以降ではマーカー候補分子群を対象に本手法による比較解析を実施する。【０１８０】
[実施例４]  肝がん指標バイオマーカーの同定と検証
実施例３にある連続クロマトグラフィー処理を用いた肝がんマーカーのスクリーニングと同定方法について記す。具体的には洗浄バッファー（Triton X-100濃度の最適化: 1.0%から0.1%にする）や、溶出バッファー（SDS濃度の最適化: 0.02%から0.1％にする）などの最適化である。以下に具体的な血清の分画方法について記す。血清をPBS[pH7.4]で10倍に希釈後、0.2% SDS存在下で100℃、15分間熱処理した。この熱処理血清試料10μLを洗浄バッファー[0.1% SDS, 0.1% TritonX-100, in PBS]にて10倍に希釈し、全量を100μLとした(crude)。【０１８１】
LCAアガロースビーズ（Jオイルミルズ）100μLと希釈した熱処理血清試料(crude) 100μLをエッペンチューブ中で混和し、シェイカーにて1,400 rpm、4℃で5時間振盪した。振盪した後、2,000 rpm, 4℃, 2分間遠心分離を行い、上清を100μL取得した。LCAアガロースビーズに洗浄バッファーを100μL加え、ボルテックスにて軽く混和した後、2,000 rpm,4℃, 2分間遠心分離を行い、上清を100μL取得した。この操作を2回行った。取得した上清をまとめ、300μLのLCA 非結合画分 (LT)とした。【０１８２】
エッペンチューブ中に残ったLCAアガロースビーズを1mLのPBSで2回洗浄した後、溶出バッファー1[0.1% SDS, 0.2M Methyl α-D-Mannose in PBS]を100μL加え、シェイカーにて1,400 rpm,4℃, O/N振盪した。一方LT 300μLとAALアガロースビーズ（Jオイルミルズ）50μLをエッペンチューブ中で混和し、シェイカーにて1,400rpm, 4℃, O/N振盪した。【０１８３】
LCAアガロースビーズを溶出バッファー1を加えて一晩振盪した後、2,000 rpm,4℃,2分間遠心分離し、上清を90μL取得した。続いてLCAアガロースビーズに溶出バッファー 1を100μL加え、ボルテックスにて軽く混和した後、2,000 rpm,4℃, 2分間遠心を行い、上清を100μL取得した。この操作を2回行ったのち、溶出バッファー1を50μL加え、同様の操作によって40μLの上清を取得した。取得した上清をまとめ、330μLのLCA溶出画分(LE)とした。【０１８４】
一晩振盪したAALアガロースビーズを、2,000 rpm, 4℃, 2分間遠心分離を行い、上清を300μL取得した。AALアガロースビーズに洗浄バッファーを50μL加え、ボルテックスにて軽く混和した後、2,000 rpm, 4℃, 2分間遠心分離を行い、上清を50μL取得した。この操作を2回行った。取得した上清をまとめ、400μLとし、LCA／AAL非結合画分(LTAT)とした。【０１８５】
エッペンチューブ中に残ったAALアガロースビーズを500μLのPBSで2回洗浄した後、溶出バッファー2[0.1%SDS, 0.2M L-(-)-Fucose in PBS]を50μL加え、シェイカーにて1,400 rpm、4℃で5時間振盪した。振盪した後、2,000 rpm, 4℃, 2分間遠心分離を行い、上清を50μL取得した。AALアガロースビーズに溶出バッファー 2を50 μL加え、ボルテックスにて軽く混和した後、2,000 rpm,4℃, 2分間遠心分離を行い、上清を50μL取得した。この操作を2回行った。取得した上清をまとめ、150μLのAAL 溶出画分(AE)とした。【０１８６】
以上のLCA、AALによる分画操作を2回繰り返し、それぞれの画分を2倍量取得した。取得したLTAT 600μL、及びLE 660μL、及びAE 300μLを限外ろ過カラム[Millipore Amicon Ultra（商標）0.5 mL 3K cut]にて濃縮し、終容量を各々40μLとした。濃縮後は直ちに5xSDSサンプルバッファー[250 mM Tris-HCl(pH6.8), 10% SDS, 5% β-ME, 50% glycerol, 0.05% BPB]を10μL加え、98℃,5分間熱処理を行い、SDS-PAGEに用いる試料として-20℃にて保存した。【０１８７】
[実施例５]  肝がん指標バイオマーカーのスクリーニング
前述の連続クロマトグラフィーの方法により健常人（14人分）のプール血清及び肝細胞がん患者（採取された血清中のAFP-L3値がそれぞれ1855.4、130.1、171420.0、1562.0 である患者4人分）のプール血清をサンプルセットとして使用し、表（表2）にあるもののうち、SHBG、SEPP1、pIgR、SPARCL1、CSF1R、SERPINA7、MANA2について、それぞれの血清分画（血清Crude、LCA結合分画、LCA非結合／AAL 結合分画、非結合分画）における発現量を比較した（図１３A〜H）。その結果と実施例3にも記述した各レクチンのこれまでの特異性か軌跡の知見を併せて考えると、肝細胞がん患者が健常人よりもLCA画分に於ける発現量が高値になるものとしては、SHBG、pIgR、CSF1R、がある。このことはつまり、肝細胞がん患者血清では健常人に比較して、これらのタンパク質のうちの一部において、そのタンパク質に付加されたコアフコースを含有する低分岐型のN-結合型糖鎖の量が増えているという事を示している。一方、肝細胞がん患者が健常人よりもLCA非結合／AAL結合画分に於ける発現量が高値になるものとしては、SEPP1、pIgR、SPARCL1、CSF1R、SERPINA7、MANA2がある。これは、肝細胞がん患者血清では健常人に比較して、これらのタンパク質のうちの一部において、そのタンパク質に付加されたコアフコースを含有する3本鎖以上の高分岐型もしくは非還元末端側のフコース修飾を有したN-結合型糖鎖の量が増えている事を示している。肝がん患者では、これらのタンパク質のうちの一部において、そのタンパク質に付加されたコアフコースを含有する3本鎖以上の高分岐型もしくは非還元末端側のフコース修飾を有したN-結合型糖鎖という事を示している。【０１８８】
[実施例６]  肝がん指標バイオマーカーのスクリーニング２
前述の連続クロマトグラフィーの方法により健常人（Healthy）、肝硬変患者（LC）、肝細胞がん患者（HCC）の血清各3例ずつをサンプルセットとして使用して比較解析した（図１４）。その結果、pIgRのLCA結合画分、pIgRのLCA非結合／AAL結合画分、CPB2のLCA非結合／AAL結合画分、CSF1RのLCA分画、CSF1RのLCA非結合／AAL結合画分で、健常人に比較して、有意に肝硬変あるいは肝細胞がん患者で高いという結果であった。特に、pIgRのLCA分画、CSF1RのLCA分画、CSF1RのLCA非結合／AAL結合画分では肝硬変よりも肝細胞がん患者の方が高いという結果であり、肝細胞がん患者の特定に有用なマーカーであるということが示された。これらの各分子(分子複合体)の上記に示した分画が肝臓の疾患状態を見分けるのに非常に有効なことが示された。【０１８９】
[実施例７]  肝がん指標バイオマーカーのスクリーニング３
前述の連続クロマトグラフィーの方法により健常人（Healthy）、（ウイルス性）肝炎患者（CH）、肝硬変患者（LC）、肝細胞がん患者（HCC）の血清、各5例ずつをサンプルセットとして使用して比較解析した（図１５）。pIgRのLCA非結合／AAL結合分画では健常人・肝炎患者に比較して、有意に肝硬変あるいは肝細胞がん患者で高いという結果であった。CSF1RのLCA分画では健常人・肝炎患者・肝硬変患者に比較して、有意に肝細胞がん患者で高いという結果であった。また、CSF1RのLCA非結合／AAL結合分画では健常人・肝炎患者が同程度で低く、それらに比較して肝硬変患者では有意に高くなり、肝硬変患者と比較して、肝細胞がん患者でさらに高いという結果であった。これらの分子(分子複合体)のそれぞれの分画を定量する事により、これらの肝疾患状態を見分けるのに非常に有効なことが示された。【０１９０】
[実施例８]  線維化の進展との関連についてのスクリーニング
線維化の進展との関連について検証するために、前述の連続クロマトグラフィーの方法により、慢性肝炎軽度（F1）、慢性肝炎中度（F2）、慢性肝炎重度（F3）、肝硬変（F4）患者の血清をサンプルセットとして使用して比較解析した。pIgRのLCA非結合／AAL結合分画ではF1・F2に比較して、F3あるいはF4患者血清で高くなるという結果であった（図１６）。一方、CSF1RのLCA結合分画ではF1からF4へと進展するに従って高くなっていくという結果であった（図１７）。また、CSF1RのAAL結合分画では、F1・F2に比較してF3で高くなり、F4患者血清ではさらに高くなるという結果であった（図１７）。これらの分子(分子複合体)上の上の糖鎖変化、特にLCA結合性あるいはLCA非結合/ＡＡＬ結合性糖鎖を定量・比較することによって、肝臓の疾患状態、特に肝臓の線維化の進展あるいは早期の肝細胞がんを予測することができると考えられる。【０１９１】
[実施例９]  免疫沈降による生体試料からpIgRの調製
血清をPBS[pH7.4]で10倍に希釈後、0.2%SDS存在下で100℃、15分間熱処理した。【０１９２】
次いで、熱処理血清試料40μLとアフィニティー精製済みのビオチン化ヤギ抗ヒトpIgR抗体[R&D Cat#BAF2717, Lot#WZN01]を0.2μg分混合し、シェイカーにて1,400rpm, 20℃, 2時間抗原抗体反応を行った。反応後の溶液に洗浄バッファー[20mM Tris-HCl pH8.0, 1%TritonX100, 0.1%Na3N ]で平衡化した磁気ビーズ[invitrogen Dynabeads（商標）MyOneTM Streptavidin T1 Cat#656.02]20μLを加え、軽く混和し、シェイカーにて1,400rpm, 20℃, 1時間振盪した。振盪した後、マグネットスタンド[invitrogen Dynal MPCTM-S Cat#120.20D]を用いて磁気ビーズと上清を分離した。分離した上清を取り除いた後、磁気ビーズをPBS 1mLで3回洗浄した。洗浄済みの磁気ビーズへ溶出バッファー[0.2%SDS in PBS]を20μL加え、ボルテックスで軽く混合し、70℃, 5分間溶出反応を行った。その後エッペンチューブを5分間室温で放置し、6,400rpmで3秒程度遠心した。遠心した溶液に洗浄バッファー 20μLを加えて溶液量を40μLとし、ボルテックスで軽く混合した。マグネットスタンドで上清とビーズを分離し、上清を分取して溶出画分とした。溶出画分中のpIgR量をウエスタンブロットによって定量した。以上の操作を数回繰り返し、12.5ng以上のpIgRを含む溶液を得た。この溶液を2D-Clean up kit[GEヘルスケア, Code#80-6484-51]を用いたTCA/アセトン沈殿を行い、最後にPBS溶液中に溶解することで濃縮・精製を行った。終濃度10ng/20μLとなるよう調整した。【０１９３】
[実施例１０]  免疫沈降後pIgR試料のレクチンマイクロアレイによる糖鎖プロファイルの解析
前述の方法により、健常人（NHS：14人分）のプール血清、及び肝細胞がん患者（HCC：4人分）のプール血清よりpIgRタンパク質を精製・濃縮した。これをレクチンマイクロアレイに供し、pIgRタンパク（抗pIgR抗体沈降物）の糖鎖プロファイルの解析を行った（図１８）。その結果、19種のレクチンでシグナルを観察し、そのうちAOL、AAL、SNA、SSA、TJA-I、BPL、ABAのレクチンに於いて、健常人（NHS）と比較して肝細胞がん患者（HCC）由来でシグナルが亢進することが分かった。一方、MAL、DSA、EEL、WFA、HPAのレクチンに於いて、健常人（NHS）と比較して肝細胞がん患者（HCC）由来でシグナルが減少することが分かった。【０１９４】
また、肝細胞がん患者（HCC）に関しては、複数のプール血清（HCC、HCC-K1、HCC-K2、HCC-K3）を使用し、もう一度確認を行った。同様にしてpIgRタンパク質を精製・濃縮し、pIgRタンパク（抗pIgR抗体沈降物）の糖鎖プロファイルの解析を行った（図１９）。その結果、前述図１８と同様の結果が得られた。MAL、SSA、SNA、TJA-I、EEL、ABA、WFAでは再現性良くシグナルの変化が確認出来た。【０１９５】
[実施例１１]  免疫沈降による生体試料からCSF1Rの簡易精製
血清をPBS[pH7.4]で10倍に希釈後、0.2%SDS存在下で100℃、15分間熱処理した。次いで、熱処理血清試料40μLとアフィニティー精製済みのビオチン化ヤギ抗ヒトCSF1R抗体[R&D Cat#BAF329, Lot#BXD03]を0.2μg分混合し、シェイカーにて1,400rpm, 20℃, 2時間抗原抗体反応を行った。反応後の溶液に洗浄バッファー[20mM Tris-HCl pH8.0, 1%TritonX100, 0.1%Na3N ]で平衡化した磁気ビーズ[invitrogen Dynabeads（商標）MyOneTM Streptavidin T1 Cat#656.02]20μLを加え、軽く混和し、シェイカーにて1,400rpm, 20℃, 1時間振盪した。振盪した後、マグネットスタンド[invitrogen Dynal MPCTM-S Cat#120.20D]を用いて磁気ビーズと上清を分離した。分離した上清を取り除いた後、磁気ビーズをPBS 1mLで3回洗浄した。洗浄済みの磁気ビーズへ溶出バッファー[0.2%SDS in PBS]を20μL加え、ボルテックスで軽く混合し、70℃, 5分間溶出反応を行った。その後エッペンチューブを5分間室温で放置し、6,400rpmで3秒程度遠心した。遠心した溶液に洗浄バッファー20μLを加えて溶液量を40μLとし、ボルテックスで軽く混合した。マグネットスタンドで上清とビーズを分離し、上清を分取してElute画分とした。溶出画分中のCSF1R量をウエスタンブロットによって定量した。【０１９６】
[実施例１２]  免疫沈降後CSF1R試料のレクチンマイクロアレイによる糖鎖プロファイルの解析
前述の方法により、健常人（NHS）、及び肝細胞がん患者（HCC）それぞれのプール血清よりCSF1Rタンパク質を精製・濃縮した。これをレクチンマイクロアレイに供し、CSF1Rタンパク（抗pIgR抗体沈降物）の糖鎖プロファイルの解析を行った（図２０）。その結果、20種のレクチンでシグナルを観察し、そのうちAOL、AAL、ECA、ABA、WFAのレクチンに於いて、健常人（NHS）由来のCSFR1と比較して肝細胞がん患者（HCC）由来のCSFR1でシグナルが亢進することが分かった。これらのレクチンのシグナルを定量・比較することによって、肝臓の疾患状態、特に肝細胞がんを予測することができると考えられる。【０１９７】
[実施例１３]免疫沈降後CSF1R試料のレクチンマイクロアレイによる比較糖鎖プロファイルの解析
また、健常人（NHS：14人分）、比較的高齢な健常人（GP：5人分）、（ウイルス性）肝炎患者（CH：5人分）、肝硬変患者（LC：5人分）、肝細胞がん患者（HCC：5人分、K1：2人分,K2：6人分、K3：2人分）それぞれのプール血清を使用し、同様にしてCSF1Rタンパク質を精製・濃縮し、CSF1Rタンパク（抗CSF1R抗体沈降物）の糖鎖プロファイルの解析を行った（図２１−１及び２１−２）。その結果、前述図２０の結果と同様のレクチンプロファイルの結果が得られた。しかしながら、疾患状態により、そのシグナル強度が異なるものが存在した。具体的にはWFAレクチンシグナルは健常人（NHS）、比較的高齢な健常人（GP）、（ウイルス性）肝炎患者（CH）、肝硬変患者（LC）由来のCSFR1ではほとんど検出されないのに対し、肝細胞がん患者（HCC）由来のもの（HCC、K1、K2、K3）では有意にシグナルが観察された。これらのレクチンのシグナルを定量・比較することによって、肝臓の疾患状態、特に肝細胞がんを予測することができると考えられる。【０１９８】
[実施例１４]  血清からのWFAによるバッチ分画の方法
ここまでの解析でWFAレクチンのシグナルが肝細胞がん患者（HCC）由来のCSFR1などで有意に亢進するという事が明らかとなったので、これの検証を図２２Aに従い行った。すなわち、血清よりレクチンアフィニティークロマトグラフィーなどによりWFAレクチン結合性タンパク質を捕獲し、その結合画分をインプット（未処理サンプル）とともに電気泳動後に抗CSF1R抗体を用いたウェスタンブロット解析することで、WFA結合性標的タンパク質の割合を算出する。最終的には血清中の、WFA結合性糖鎖を有するCSF1R存在量を図２２Bのように検定するという手順である。【０１９９】
WFA結合性タンパク質の捕獲回収までのより具体的な方法を以下に記載する。【０２００】
まず、ビオチン化WFA[vector Biotinilated WFA Cat#B-1355 ]5μgを40μL PBS[pH 7.4]に希釈し、レクチン希釈溶液とした。レクチン希釈液にPBSで平衡化した磁気ビーズ[invitrogen Dynabeads（商標）MyOneTM Streptavidin T1 Cat#656.02]20μLを加え、軽く混和し、シェイカーにて1,400rpm, 20℃, 30分間振盪した。振盪した後、マグネットスタンド[invitrogen Dynal MPCTM-S Cat#120.20D]を用いて磁気ビーズと上清を分離した。分離した上清を取り除いた後、磁気ビーズをPBS 100μLで3回洗浄した。血清をPBS[pH7.4]で10倍に希釈後、0.2%SDS存在下で100℃、15分間熱処理した。この熱処理血清試料10μLをPBSにて10倍に希釈し、全量を100μLとした(crude)。WFA化した磁気ビーズ20μL分と調整した血清100μLをエッペンチューブ中で混和し、シェイカーにて1,400 rpm, 4℃, O/Nで攪拌した。振盪した後、マグネットスタンドを用いて磁気ビーズと上清を分離した。分離した上清を取り除いた後(WFA非結合画分)、磁気ビーズをPBS 500μLで3回洗浄した。洗浄した磁気ビーズへ溶出バッファー[0.1%SDS, 0.2M Lactose in PBS]を20μL加え、ボルテックスで軽く混和し、1,400rpm, 20℃, 2時間用出反応を行った。その後マグネットスタンドを用いて磁気ビーズと上清を分離し、上清を回収した(WFA結合画分)。【０２０１】
[実施例１５]
前述の方法により健常人(Normal)、（ウイルス性）肝炎患者(CHC)、肝硬変患者(LC)、及び肝細胞がん患者(HCC)の血清5例ずつをサンプルセットとして使用し、実施例１４の方法により、血清中に存在するWFA結合性CSF1Rの存在量についての検討を行った。その結果、図２２Cに示すように、肝硬変患者(LC)では健常人(Normal)および（ウイルス性）肝炎患者(CHC)と比較してWFA結合性CSF1Rの存在量が亢進した。さらに、肝細胞がん患者(HCC)では、健常人(Normal)、（ウイルス性）肝炎患者(CHC)、そして肝硬変患者(LC)と比較しても有意にWFA結合性CSF1R量が亢進していた。肝硬変患者(LC)では例外として有意に高いものが見受けられるものがあった。肝硬変患者では肝臓がん（の芽）のリスクをはらんでおり、これらは肝細胞がんを反映している可能性があることが示唆された。このように、CSF1R上のWFAレクチンのシグナル（WFA結合性糖鎖）を定量・比較することによって、肝臓の疾患状態、特に肝細胞がんを予測することができると考えられる。【０２０２】
[実施例１６]  線維化の進展との関連についてのスクリーニング
線維化の進展との関連について検証するために、前述の方法により、慢性肝炎軽度（F1）、慢性肝炎中度（F2）、慢性肝炎重度（F3）、肝硬変（F4）患者の血清をサンプルセットとして使用して実施例１４と同様にしてWFA結合性CSF1R量の解析をした。WFA結合分画のCSF1Rでは、F1〜F3まではほぼ検出されず、一部のF4患者血清で検出された（2例中1例）（図２２D）。また、分画無しにcrudeな血清を用いて、血清中のCSF1R量について検討を行った。その結果、血清中のCSF1Rタンパク量はF1からF4へと進展するに従って高くなっていくという結果であった。このことはタンパク量で線維化の進展を定量できる可能性を示唆するが、これに加えて実施例８に示したように、CSF1R上の糖鎖構造の変化（LCA結合性糖鎖あるいはLCA非結合/AAL結合性糖鎖）と組み合わせることによって鑑別の精度を上げることができると考えられる。加えて、2例のF4患者間の結果をみると、血清中のCSF1R量はともに比較的多く見受けられるが、WFA結合性糖鎖を有するCSF1Rの量には大きな差が見受けられる。このことは線維化よりも別の事象を反映しているものと考えられる。F4のステージではほとんどの場合、肝硬変を伴っており、肝臓がん（の芽）を既に有している可能性も高い。故に、これらは肝細胞がんを反映している可能性が十分にあると考えられる。CSF1R上のWFA結合性糖鎖を定量・比較することによって、肝臓の疾患状態、特に早期の肝細胞がんを予測することができると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０２０３】
本願発明は、肝疾患又は肝疾患病態の判定のための装置、器具又はキット製造や、肝疾患の病態の判別、あるいは、肝硬変の検出などに用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図９−８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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