(57)【要約】  本発明は、セルロース含有バイオマスの加水分解において、効率的に糖化を進める効果のあるβ−グルコシダーゼ遺伝子を、難培養性のイエシロアリ共生原生生物群から取り出し、提供することを目的とし、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＰｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属原生生物由来β−グルコシダーゼに関する。
2019044887.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つのポリペプチド。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項３】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項４】
請求項２または３に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項５】
請求項２または３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載の発現ベクターを有する、形質転換体。
【請求項６】
請求項２または３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載の発現ベクターを有する、形質転換Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌。
【請求項７】
請求項５に記載の形質転換体または請求項６に記載の形質転換Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌を培養する工程を含む、酵素組成物の製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載の酵素組成物を製造する工程を含み、当該工程によって得られた酵素組成物を用いて、セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法。
【請求項９】
グルコース非存在下でのβ−グルコシダーゼの活性を１としたとき、グルコース濃度８ｇ／Ｌの条件下でのβ−グルコシダーゼ活性が０．５以上であることを特徴とする、Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属原生生物由来β−グルコシダーゼ。
【請求項１０】
Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属原生生物由来β−グルコシダーゼと、糸状菌由来セルラーゼとを含む酵素組成物。
【請求項１１】
前記糸状菌がＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌であることを特徴とする、請求項１０に記載の酵素組成物。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の酵素組成物を用いて、セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法。
【請求項１３】
前記糖液から請求項１０または１１に記載の酵素組成物を回収する工程を含む、請求項１２に記載の糖液を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なβ−グルコシダーゼ、当該β−グルコシダーゼを含む酵素組成物およびこれを使用してセルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
原油代替資源として、再生可能なセルロース含有バイオマスを分解し、得られた糖を利用して、バイオ燃料あるいはバイオポリマー原料を発酵生産する試みが国内外で盛んに検討されている。【０００３】
セルロースの糖化には様々な手法があるが、エネルギー使用量が少なく、かつ糖収率の高い酵素糖化法が開発の主流となっている。セルロースの酵素分解には、複数の酵素種が関与しており、大きくセロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼの３種に大別できる。セロビオハイドロラーゼは、セルロースの末端部分より加水分解することを特徴とし、セルロースの結晶領域を分解可能な酵素である。一方エンドグルカナーゼは、セルロース分子鎖の内部領域から加水分解することを特徴とし、セルロース分解による分子量の低下を促進する酵素である。【０００４】
β−グルコシダーゼは、グルコースがβ−１，４結合した２糖であるセロビオースを主に分解し、最終分解産物であるグルコースの生成を触媒する酵素であり、発酵原料として有用なグルコースを十分に得るためには必須の酵素である。また、セロビオハイドロラーゼあるいはエンドグルカナーゼは、セルロース分解で生成したセロビオースの蓄積により反応阻害が引き起こされることが知られている。すなわち、β−グルコシダーゼは、セルロース分解により生成するセロビオースの蓄積を大幅に低減することができるため、セルロース分解効率を大幅に向上させるといった効果を有する。【０００５】
一方、セルラーゼを生産する微生物として、糸状菌が知られている。糸状菌の中でもＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属は、菌体外に大量のエンド型およびエキソ型セルラーゼを培養液中に大量に生産することで知られている。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ由来セルラーゼは、セルロース含有バイオマスの酵素分解に最も多く使用されているものである。しかしながら、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａが産生するβ−グルコシダーゼの一部は、菌体細胞壁に局在しており（非特許文献１）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ培養液より調製されたセルラーゼでは、この中に含まれるβ−グルコシダーゼ量および活性が十分でないといった課題があった。また、多くの糸状菌由来β−グルコシダーゼは、グルコースによるβ−グルコシダーゼ活性阻害を受けることが知られており、セルロース含有バイオマスの糖化において、セルロース分解により糖化反応液中に生成されたグルコースがβ−グルコシダーゼ活性阻害をもたらし、糖化反応液のグルコース蓄積量増加を妨げるという課題があった（非特許文献２）。【０００６】
このため、セルロース含有バイオマスの加水分解において、効率的に糖化を進める効果を有する、良質なβ−グルコシダーゼが求められており、従来から微生物由来β−グルコシダーゼの単離が行われている。【０００７】
木材を唯一の栄養源とするシロアリの共生原生生物群は、セルロース分解効率が非常に高いことが知られていた。しかし、その共生原生生物の難培養性のために解析が進んでおらず、近年でさえ、共生原生生物及びそのセルラーゼに関する研究がわずかに行われているにすぎず(特許文献１)、シロアリの共生原生生物由来β−グルコシダーゼ遺伝子についてはこれまで、その取得例はなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−７０４７５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｅｓｓｎｅｒ, Ｒら“Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｓｉｎｇｌｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｚｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ＱＭ９４１４”Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９０年２１巻６８５−６９０
【非特許文献２】Ａｎｄｒｉｃ，  Ｐら“Ｒｅａｃｔｏｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｍｉｎｉｍｉｚｉｎｇ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ：  Ｉ．  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ  ａｎｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｎ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ａｄｖ．２０１０年２８巻３０８−３２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、セルロース含有バイオマスの加水分解において、効率的に糖化を進める効果のあるβ−グルコシダーゼ遺伝子を、難培養性のイエシロアリ共生原生生物群から取り出し、提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を重ねて、難培養性のイエシロアリ共生原生生物の微量なＲＮＡから１細胞トランスクリプトーム解析法を用いて発現遺伝子を観測し、得られたｃＤＮＡライブラリーの配列情報からβ−グルコシダーゼ候補配列を取得し、β−グルコシダーゼ候補配列を含む形質転換体のβ−グルコシダーゼ活性およびセルロース含有バイオマスの糖化における効果を調べ、β−グルコシダーゼ活性を有する配列を選抜することで、Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属原生生物由来新規β−グルコシダーゼがセルロース含有バイオマスの分解に適用できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
[１]下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つのポリペプチド。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド
[２]下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）[１]に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
[３]下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）[１]に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
[４][２]または[３]に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
[５][２]または[３]に記載のポリヌクレオチドまたは[４]に記載の発現ベクターを有する、形質転換体。
[６][２]または[３]に記載のポリヌクレオチドまたは[４]に記載の発現ベクターを有する、形質転換Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌。
[７][５]に記載の形質転換体または[６]に記載の形質転換Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌を培養する工程を含む、酵素組成物の製造方法。
[８][７]に記載の酵素組成物を製造する工程を含み、当該工程によって得られた酵素組成物を用いて、セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法。
[９]グルコース非存在下でのβ−グルコシダーゼの活性を１としたとき、グルコース濃度８ｇ／Ｌの条件下でのβ−グルコシダーゼ活性が０．５以上であることを特徴とする、Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属原生生物由来β−グルコシダーゼ。
[１０]Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属原生生物由来β−グルコシダーゼと、糸状菌由来セルラーゼとを含む酵素組成物。
[１１]前記糸状菌がＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌であることを特徴とする、[１０]に記載の酵素組成物。
[１２][１０]または[１１]に記載の酵素組成物を用いて、セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法。
[１３]前記糖液から[１０]または[１１]に記載の酵素組成物を回収する工程を含む、[１２]に記載の糖液を製造する方法。【００１３】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-165787号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、セルロース含有バイオマスの加水分解において、効率的に糖化を進める効果のあるβ−グルコシダーゼを提供することができる。本発明のβ−グルコシダーゼは、セルロース含有バイオマスの加水分解による糖液の製造に好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例７における、大腸菌で発現され、且つ精製した本発明に係るβ−グルコシダーゼ(配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むβ−グルコシダーゼ)のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図２】実施例１０における、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌で発現された本発明に係るβ−グルコシダーゼ(配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むβ−グルコシダーゼ)のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図３】実施例１４における糖化上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図４】比較例１における、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌で発現されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌由来β−グルコシダーゼ(配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むβ−グルコシダーゼ)のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図５】実施例１８における、本発明のβ−グルコシダーゼおよび本発明のβ−グルコシダーゼ変異体の、グルコースによるβ−グルコシダーゼ活性阻害作用測定結果のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１７】
本発明において「β−グルコシダーゼ」とは、糖のβ−グルコシド結合を加水分解する反応を触媒する酵素を意味する。本発明において、β−グルコシダーゼ活性の測定方法はｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｐＮＰ−Ｇｌｃ）を基質とした反応で測定する。具体的には、５０ｍＭ 酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解したｐＮＰ−Ｇｌｃの基質溶液に酵素液を添加し、３０℃で１０分間反応させた後、反応系体積の１０分の１量の２Ｍ炭酸ナトリウムを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定する。上記反応後、ｐ−ニトロフェノールが遊離し、４０５ｎｍの吸光度が増加すれば、β−グルコシダーゼ活性があると判断する。
【００１８】
本発明のβ−グルコシダーゼはＰｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属原生生物由来であることを特徴とし、具体例として、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのホモログが挙げられる。
【００１９】
さらに具体的には、本発明のＰｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属原生生物由来β−グルコシダーゼは、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つのポリペプチドである。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド。
【００２０】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのホモログは、公知の方法によって調製することができ、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドであれば、その調製方法は特に制限されるものではない。配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのホモログは公知の方法により天然から抽出、またはペプチド合成法として知られる公知の方法を用いて調製することができ、また、該ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを用いて、遺伝子組換え技術により調製することもできる。
【００２１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのホモログは、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドであれば、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１または２個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
【００２２】
また、配列番号１に記載のポリペプチドのホモログは、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドであれば、配列番号１に記載のアミノ配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。例えば、配列番号１と配列同一性８８％のアミノ酸配列からなるポリペプチドとして配列番号６に記載のポリペプチドが挙げられる。また、配列番号１と配列同一性８０％のアミノ酸配列からなるポリペプチドとして配列番号８に記載のポリペプチドが挙げられる。なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列と公知のβ−グルコシダーゼのアミノ酸配列の配列同一性としては、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来β−グルコシダーゼＩ（ＢＧＬＩ）は７４４のアミノ酸からなるが、配列番号１との配列同一性は２９％である。
【００２３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのホモログは、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドであれば、Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属原生生物由来、好ましくは、Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属のＰｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ  ｈｅｒｔｗｉｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ  ｐａｕｌｉｓｔａｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ  ｇｒａｓｓｉｉ由来ポリペプチドであってもよい。
【００２４】
本発明のＰｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属原生生物由来β−グルコシダーゼは、ＧＨ３ファミリーに属することが好ましい。本発明中で「ＧＨ３ファミリー」とは、Ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ｆａｍｉｌｙ  ３  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅを含むポリペプチドを意味する。Ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ｆａｍｉｌｙ  ３  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅは、以下の１８個のアミノ酸からなるアミノ酸配列で定義される。すなわち、Ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ｆａｍｉｌｙ  ３  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅは、Ｌ（ロイシン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｖ（バリン）、Ｍ（メチオニン）のいずれかから選ばれるひとつのアミノ酸をａ、アミノ酸Ｋ（リジン）、Ｒ（アルギニン）のいずれかから選ばれるひとつのアミノ酸をｂ、アミノ酸Ｅ（グルタミン酸）、Ｑ（グルタミン）、Ｋ（リジン）、Ｒ（アルギニン）、Ｄ（アスパラギン酸）のいずれかから選ばれるひとつのアミノ酸をｃ、アミノ酸Ｌ（ロイシン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｖ（バリン）、Ｍ（メチオニン）、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｔ（スレオニン）、Ｃ（システイン）のいずれかから選ばれるひとつのアミノ酸をｄ、アミノ酸Ｌ（ロイシン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｖ（バリン）、Ｔ（スレオニン）のいずれかから選ばれるひとつのアミノ酸をｅ、アミノ酸Ｌ（ロイシン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｖ（バリン）、Ｍ（メチオニン）、Ｆ（フェニルアラニン）のいずれかから選ばれるひとつのアミノ酸をｆ、アミノ酸Ｓ（セリン）、Ｔ（スレオニン）のいずれかから選ばれるひとつのアミノ酸をｇ、アミノ酸Ｓ（セリン）、Ｇ（グリシン）、Ａ（アラニン）、Ｄ（アスパラギン酸）、Ｎ（アスパラギン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｔ（スレオニン）のいずれかから選ばれるひとつのアミノ酸をｈ、任意のアミノ酸をｘとして表し、上記アミノ酸ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｘとアミノ酸Ｇ（グリシン）、Ｄ（アスパラギン酸）からなる１８個のアミノ酸配列ａａｂｘｃｘｘｘｘＧｄｅｆｇＤｘｘｈで定義される。なお、ポリペプチドに含まれるＧｌｙｃｏｓｙｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ｆａｍｉｌｙ  ３  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅは、データベースであるＰＲＯＳＩＴＥ（Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎｓ, ｆａｍｉｌｉｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉｔｅｓ）のｗｅｂサイト（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）で誰でも容易に調べることができる（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，  ｅｔ  ａｌ．２００２，  Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ．ＶＯＬ３．ＮＯ３．２６５−２７４）。配列番号１、６、または８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＧＨ３ファミリーに属する。
【００２５】
本発明のＰｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属原生生物由来β−グルコシダーゼは、グルコースによってβ−グルコシダーゼ活性が阻害を受けにくいことが好ましい。具体的には、グルコース非存在下でのβ−グルコシダーゼ活性を１としたとき、グルコース濃度８ｇ／Ｌの条件下(又は８ｇ／Ｌのグルコース存在下)でのβ−グルコシダーゼ活性が好ましくは０．５以上、より好ましくは０．６以上、より好ましくは０．７以上、より好ましくは０．８以上、より好ましくは０．９以上、より好ましくは１．０以上、より好ましくは１．１以上、より好ましくは１．２以上、より好ましくは１．３以上、特に好ましくは１．４以上である。また、前記グルコース濃度８ｇ／Ｌの条件下でのβ−グルコシダーゼの活性に加えて、グルコース非存在下でのβ−グルコシダーゼ活性を１としたとき、グルコース濃度２０ｇ／Ｌの条件下(又は２０ｇ／Ｌのグルコース存在下)でのβ−グルコシダーゼ活性が、好ましくは０．５以上、より好ましくは０．６以上、特に好ましくは０．７以上である。ここで、β−グルコシダーゼ活性の測定方法は、測定時にグルコースを８ｇ／Ｌまたは２０ｇ／Ｌ添加する以外は、前述と同様の方法で測定した結果を用いる。
【００２６】
グルコースによってβ−グルコシダーゼ活性が阻害を受けにくいβ−グルコシダーゼは、セルロース含有バイオマスの糖化において、セルロース分解により糖化反応液中にグルコースが生成されても、β−グルコシダーゼ活性を高く保つことが可能となるため好ましい。
【００２７】
配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはそのホモログは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのホモログをコードしているポリヌクレオチドであれば、その由来は特に制限されるものではない。ここで、「ポリヌクレオチド」とはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、合成ＲＮＡ、レプリコンＲＮＡなど、その由来を問うものではないが、好ましくはＤＮＡである。また、１本鎖でも、その相補鎖を有する２本鎖であってもよい。また、天然のあるいは人工のヌクレオチド誘導体を含んでいてもよい。
【００２８】
配列番号２に記載のポリヌクレオチドのホモログは、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであれば、例えば、配列番号２に記載の塩基配列において、１もしくは数個、好ましくは１から４０個、より好ましくは１から３０個、さらに好ましくは１〜２０個、特に好ましくは１から１０個、最適に好ましくは１から５個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加されている塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよい。
【００２９】
また、配列番号２に記載のポリヌクレオチドのホモログは、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであれば、配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくはその相補鎖の全体またはその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドでもよい。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、もとの塩基配列の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３０個の連続した配列を一つあるいは複数個選択したポリヌクレオチドをプローブとして、公知のハイブリダイゼーション技術（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．  Ａｕｓｕｂｅl  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｐｕｂｌｉｓｈ  ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｙ  ＆  ＳｏｎｓＳｅｃｔｏｉｎ  ６.３−６．４）などを用いて、ハイブリダイズするポリヌクレオチドである。ここでストリンジェントな条件としては、例えば５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が３７℃、より厳しい条件としては４２℃、さらに厳しい条件としては６５℃で、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（saline-sodium citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成：１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）を用いて洗浄することにより達成することができる。
【００３０】
また、配列番号２に記載のポリヌクレオチドのホモログは、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであれば、配列番号２に記載の塩基配列に対して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。例えば、配列番号２と配列同一性６６％の塩基配列からなるポリヌクレオチドとして配列番号３に記載のポリヌクレオチドが挙げられる。また、配列番号２と配列同一性５３％の塩基配列からなるポリヌクレオチドとして配列番号７または９に記載のポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３１】
本明細書中で使用する「同一性」なる用語は、異なる２つのアミノ酸配列又は塩基配列を、配列アラインメントプログラムを用いて整列比較したときの２つの配列の一致度を表わす。具体的には、配列番号１の全アミノ酸数に対する同一アミノ酸数の割合（％）又は配列番号２の全塩基数に対する同一塩基数の割合（％）である。２つの配列を整列比較するために使用する配列アラインメントプログラムとしては、この分野で汎用されているソフトウェアであるＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｐ）を利用して行う。ＢＬＡＳＴは、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のホームページで誰でも利用可能であり、デフォルトのパラメーターを用いて容易に同一性を調べることができる。
【００３２】
配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドのホモログは、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであれば、Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属原生生物由来、好ましくは、Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属のＰｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ  ｈｅｒｔｗｉｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ  ｐａｕｌｉｓｔａｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ  ｇｒａｓｓｉｉ由来ポリヌクレオチドであってもよい。
【００３３】
配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドはＰｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属原生生物からクローニングすることで調製することができるが、化学的に合成することもできる。Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属原生生物からのクローニングは、通常公知の方法を用いて単離することができ、このような方法としては、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属原生生物細胞より単離したＲＮＡより逆転写したｃＤＮＡから全ＯＲＦ配列を決定し、その後ＰＣＲによって増幅することが可能であり、これを直接ＤＮＡ合成装置で化学合成することも可能である。
【００３４】
前記ポリヌクレオチドを、制限酵素およびＤＮＡリガーゼを用いて、宿主細胞で発現可能なプロモーター下流に連結することにより、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを製造することができる。本発明において発現ベクターは、宿主細胞で目的遺伝子を発現可能に導入するベクターであればいかなるベクターでもよい。目的遺伝子が宿主ゲノム外に導入される形態の自立複製可能なプラスミドであってもよく、目的遺伝子が宿主ゲノム内に導入される形態のＤＮＡ断片であってもよい。発現ベクターとしては、例えば細菌プラスミド、酵母プラスミド、ラムダファージなどのファージＤＮＡ、レトロウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ベクターとしてのアグロバクテリウムなどが挙げられる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合、ｐＵＣ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤなどを例示することができる。前記プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主細胞に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合、ｌａｃプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等が挙げられる。宿主細胞がセルラーゼ生産性の糸状菌である場合、好ましくはセルロースで誘導可能なプロモーター、より好ましくはｃｂｈプロモーター、ｅｇｌプロモーター、ｂｇｌプロモーター、ｘｙｎプロモーター、ｂｘｌプロモーターが挙げられる。
【００３５】
本発明の前記ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを有する形質転換体における宿主細胞としては、大腸菌、バクテリア細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞などが好ましい。酵母細胞としては、例えば、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属などが挙げられる。昆虫細胞としてはＳｆ９など、植物細胞としては双子葉植物など、動物細胞としては、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３などが挙げられる。さらに好ましくは糸状菌である真菌細胞、より好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌、より好ましくはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌が挙げられる。宿主細胞としてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌を用いることで、本発明のβ−グルコシダーゼをより多く生産することが可能になる。
【００３６】
形質転換または、トランスフェクションは、リン酸カルシウム法、電気穿孔法、アグロバクテリウム法などの公知の方法で行うことができる。
【００３７】
本発明のβ−グルコシダーゼは、上記のように形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞においてプロモーターの制御下にて発現させ、産生物を回収して得ることができる。発現に際しては、宿主細胞を適切な細胞密度まで増殖または成長させた後、温度シフトまたは培地成分による化学的誘発手段などによってプロモーターを誘発させ、細胞をさらに一定期間培養する。
【００３８】
本発明で、酵素組成物とは、Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属原生生物由来β−グルコシダーゼと他の一種類以上の酵素との混合物を指す。酵素組成物は、前記β−グルコシダーゼと他の一種類以上の酵素を別々に生産した後に混合したものであってもよいし、前記β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは発現ベクターを有する形質転換体の培養物であって、前記β−グルコシダーゼと宿主細胞由来の一種類以上の酵素を含むものであってもよい。培養物とは、培養上清の他、形質転換体または形質転換体の破砕物を包含している。
【００３９】
前記β−グルコシダーゼと混合する酵素としては、セルラーゼが好ましい。ここでいうセルラーゼとは、セルロースを分解する活性を有する酵素であれば特に限定されず、二種類以上の酵素の混合物であってもよい。このような酵素としては、例えばセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、セロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼなどが挙げられる。セルラーゼに含まれるセロビオハイドロラーゼおよびエンドグルカナーゼの活性はｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシド（ｐＮＰ−Ｌａｃ）を基質として、β−キシロシダーゼの活性はｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド（ｐＮＰ−Ｘｙｌ）を基質として測定する。具体的には、５０ｍＭ 酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解したｐＮＰ−Ｌａｃの基質溶液に酵素液を添加し、３０℃で１０分間反応させた後、反応系体積の１０分の１量の２Ｍ炭酸ナトリウムを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定する。上記反応後、ｐ-ニトロフェノールが遊離し、４０５ｎｍの吸光度が増加すれば、セロビオハイドロラーゼおよびエンドグルカナーゼの活性があると判断する。β−キシロシダーゼの活性は、上記と同様にｐＮＰ−Ｘｙｌを基質とした反応を行い、反応後、ｐ-ニトロフェノールが遊離し、４０５ｎｍの吸光度が増加すれば、β−キシロシダーゼ活性があると判断する。
【００４０】
前記セルラーゼは、好ましくは糸状菌由来セルラーゼである。糸状菌由来セルラーゼは、少なくともエンドグルカナーゼおよびセロビオハイドロラーゼの双方を含んでなる混合物である。前記糸状菌由来セルラーゼを生産する微生物として、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ｉｒｐｅｘ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属などの微生物を挙げることができる。これら微生物は、培養液中にセルラーゼを産生するために、その培養液を未精製の糸状菌由来セルラーゼとしてそのまま使用してもよいし、また培養液を精製し、製剤化したものを糸状菌由来セルラーゼ混合物として使用してもよい。
【００４１】
上記糸状菌由来セルラーゼは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属由来セルラーゼであることが好ましい。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属は、少なくとも２種のエンドグルカナーゼ、および、少なくとも２種のセロビオハイドロラーゼを含んでなるセルラーゼを培養液中に産生し、こうした培養液より調製されたセルラーゼは本発明に好ましく使用することができる。すなわち、本発明のβ−グルコシダーゼは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属由来セルラーゼとともに酵素組成物として用いられると、セルロース含有バイオマスの糖化において、糖収量を増加させることができる。
【００４２】
本発明のβ−グルコシダーゼを用いて、セルロース含有バイオマスを酵素処理した場合、酵素処理で得られた糖化液から、高い残存活性を有する本発明のβ−グルコシダーゼを回収することができる。また、本発明のβ-グルコシダーゼと、上記糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を用いて、セルロース含有バイオマスを酵素処理して得られた糖化液からも、高い残存活性を有する本発明のβ−グルコシダーゼを回収することができる。さらに、糸状菌由来酵素組成物についても、本発明のβ−グルコシダーゼと、上記糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を用いて、セルロース含有バイオマスを酵素処理して得られた糖化液からは、糸状菌由来セルラーゼのみを用いてセルロース含有バイオマスを酵素処理した糖化液と比べて、高い残存活性を有する糸状菌由来セルラーゼを回収することができる。上記糸状菌由来セルラーゼとしては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属由来エンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼ、β−キシロシダーゼなどが好ましく、特にβ−キシロシダーゼが好ましい。
【００４３】
こうしたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属のうち、より好ましくは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来のセルラーゼである。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来のセルラーゼ混合物としては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ ＱＭ９４１４、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ ＱＭ９１２３、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ Ｒｕｔ−３０、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ ＰＣ３−７、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ ＣＬ−８４７、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ ＭＣＧ７７、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ ＭＣＧ８０、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ ＱＭ９１２３に由来するセルラーゼ混合物が挙げられる。また、前記Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属に由来し、変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理を施し、セルラーゼ生産性が向上した変異株に由来するセルラーゼ混合物であってもよい。
【００４４】
本発明において、前記β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは発現ベクターが導入されている形質転換体を培養する工程を含む酵素組成物の製造方法は、前記β−グルコシダーゼを発現可能な培養工程を含む方法であれば、いかなる方法であってもよい。前記形質転換体を培養すると、該形質転換体内でβ−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドの発現が新たに付与または増強され、その結果、培養物中から前記β−グルコシダーゼと宿主細胞由来の一種類以上の酵素を含む酵素組成物が得られる。培養物とは、培養上清の他、形質転換体または形質転換体の破砕物のいずれでもよい。
【００４５】
前記形質転換体の培養方法については特に限定はなく、公知の方法が採用される。培養には、振とう培養、撹拌培養、撹拌振とう培養、静置培養、連続培養など、様々な培養方式を採用しうる。前記形質転換体を培養する培地としては、該形質転換体が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。前記形質転換体がＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌である場合、セルロース含有バイオマスを含有する培地で培養することがより好ましい。本発明のβ−グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチドまたは発現ベクターが導入されている形質転換Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌をセルロース含有バイオマス含有培地で培養することで、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼが発現し、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼと前記β−グルコシダーゼを含む酵素組成物を生産することができる。
【００４６】
本発明においてセルロース含有バイオマスとは、少なくともセルロースを含むものであれば限定されない。具体的には、バガス、コーンストーバー、コーンコブ、スイッチグラス、稲藁、麦藁、樹木、木材、廃建材、新聞紙、古紙、パルプなどである。これらセルロース含有バイオマスは、高分子芳香族化合物リグニンやヘミセルロースなどの不純物が含まれているが、前処理として、酸、アルカリ、加圧熱水などを用いて、リグニンやヘミセルロースを全部または部分的に、分解または除去したものも、セルロース含有バイオマスとして用いることができる。
【００４７】
前記酵素組成物を用いて、セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法は、特に限定されない。この酵素組成物による糖液製造は、バッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。また、セルロース含有バイオマスの酵素処理で得られた糖化液から、使用した酵素組成物を分離して回収することができる。酵素を分離回収する方法は、特に限定されないが、糖化液を限外濾過膜などでろ過し、非透過側に回収することができる。必要に応じてろ過の前工程として、糖化液から固形分を取り除いておいてもよい。回収した酵素組成物は、再び糖化反応に用いることができる。
【実施例】
【００４８】
（参考例１）タンパク質濃度測定方法
市販のタンパク質濃度測定試薬（Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を使用した。室温に戻したタンパク質濃度測定試薬２５０μＬに希釈した糸状菌由来セルラーゼ溶液を５μＬ添加し、室温で５分間静置後の５９５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。標準品としてＢＳＡを使用し、検量線に照らし合わせてタンパク質濃度を算出した。【００４９】
（参考例２）β−グルコシダーゼ活性測定方法
１ｍＭｐ-ニトロフェニル-β−グルコピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加して３０℃で１０分間反応させた。その後２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。１分間あたり１μｍｏｌのｐ-ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕと定義した。ブランクは１ｍＭ ｐ-ニトロフェニル-β−グルコピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー９０μＬに２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合し、その後酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で３０分間反応させた。その後、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。この際に４０５ｎｍの吸光度が１を超えないように酵素液を希釈しておいた。また、検量線はｐ−ニトロフェノール溶液を濃度０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭになるように調製し、酵素希釈液の代わりに１０μＬを入れ、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して発色させ、測定した吸光度から作成した。【００５０】
（参考例３）β−キシロシダーゼ活性測定方法
１ｍＭｐ-ニトロフェニル-β−キシロピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で３０分間反応させた。その後、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。１分間あたり１μｍｏｌのｐ-ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕと定義した。ブランクは１ｍＭｐ-ニトロフェニル-β−キシロピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合し、その後酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で３０分間反応させた。その後、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。この際に４０５ｎｍの吸光度が１を超えないように酵素液を希釈しておいた。また、検量線はｐ−ニトロフェノール溶液を濃度０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭになるように調製し、酵素希釈液の代わりに１０μＬを入れ、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して発色させ、測定した吸光度から作成した。【００５１】
（参考例４）セロビオハイドロラーゼ・エンドグルカナーゼ活性測定方法
１ｍＭｐ-ニトロフェニル-β−ラクトピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で６０分間反応させた。その後、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。１分間あたり１μｍｏｌのｐ-ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕと定義した。ブランクは１ｍＭｐ-ニトロフェニル-β−ラクトピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合し、その後酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で３０分間反応させた。その後、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。この際に４０５ｎｍの吸光度が１を超えないように酵素液を希釈しておいた。また、検量線はｐ−ニトロフェノール溶液を濃度０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭになるように調製し、酵素希釈液の代わりに１０μＬを入れ、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して発色させ、測定した吸光度から作成した。【００５２】
（参考例５）糖濃度の測定
グルコース、セロビオースは、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  システム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて、以下の条件で定量分析した。
グルコース、セロビオースの標品で作成した検量線をもとに、定量分析した。セロビオースが１ｇ／Ｌより低い値の場合は、検出限界以下とした。
カラム：ＡＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ １．７μｍ ２．１×１００ｍｍ Ｃｏｌｕｍｎ
分離法：ＨＩＬＩＣ
移動相：移動相Ａ：８０％アセトニトリル、０．２％ＴＥＡ（トリエチルアミン）水溶液、移動相Ｂ：３０％アセトニトリル、０．２％ＴＥＡ（トリエチルアミン）水溶液とし、下記グラジエントに従った。グラジエントは下記の時間に対応する混合比に到達する直線的なグラジエントとした。
開始条件：（Ａ９９．９０％、Ｂ０．１０％）、開始２分後：（Ａ９６．７０％、Ｂ３．３０％）、開始３．５分後：（Ａ９５．００％、Ｂ５．００％）、開始３．５５分後：（Ａ９９．９０％、Ｂ０．１０％）、開始６分後：（Ａ９９．９０％、Ｂ０．１０％）。
検出方法：ＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出器）
流速：０．３ｍＬ/ｍｉｎ
温度：５５℃【００５３】
（参考例６）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１５％ポリアクリルアミドゲルｅ−ＰＡＧＥＬ（アトー）を使用した。該β−グルコシダーゼ形質転換Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ株酵素５μｇを、等体積のサンプルバッファーＥｚ−ａｐｐｌｙ（アトー）と混合し、９５℃１０分加熱して、泳動サンプルとした。分子量マーカーは、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（バイオラッド）を使用した。泳動バッファーは２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ水溶液とし、２０ｍＡ定電流で９０分間電気泳動を行った。電気泳動後のゲルはＢｉｏ−Ｓａｆｅ  Ｃｏｍａｓｓｉｅ  Ｇ−２５０  Ｓｔａｉｎ（バイオラッド）により染色し、純水で脱染した。【００５４】
(参考例７)Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌の培養によるセルラーゼ生産
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌の胞子を１．０×１０７／ｍＬになるように生理食塩水で希釈し、その希釈胞子溶液２．５ｍＬを１Ｌバッフル付フラスコに入れた表１に記した組成で構成される培養液２５０ｍＬへ接種し、２８℃、１６０ｒｐｍの培養条件にて３日間培養（前培養）を行った。本培養は前培養液２５０ｍＬをそれぞれ５Ｌ容ミニジャーに入れた表２に示した本培養液２．５Ｌへ接種させ、２８℃、７００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ５の培養条件にて４日間培養を行った。中和は１０％アンモニアと１Ｎ硫酸を使用した。培養開始４日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行うことで、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを取得した。【００５５】
【表１】
2019044887.tif 000003
【００５６】
【表２】
2019044887.tif 000004
【００５７】
（参考例８）グルコースによるβ−グルコシダーゼ活性阻害作用測定方法
１ｍＭｐ-ニトロフェニル-β−グルコピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）、５０ｍＭ酢酸バッファーおよびグルコースを０、４、８または２０ｇ／Ｌ含有する混合液に酵素液を添加して反応液合計が１００μＬとなるように調製し、３０℃で１００分間反応させた。その後２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。１分間あたり１μｍｏｌのｐ-ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕと定義した。ブランクは、上記反応液の酵素液添加前の混合液と同量の、１ｍＭ ｐ-ニトロフェニル-β−グルコピラノシド、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーおよびグルコースを０、４、８または２０ｇ／Ｌを含有する混合液に２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合した後、酵素液を、ブランクの総液量が１１０μＬになるよう添加し３０℃で３０分間反応させた。その後、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。【００５８】
（実施例１）難培養性イエシロアリ共生生物１細胞からのＲＮＡ‐Ｓｅｑ解析とβ−グルコシダーゼ候補配列の解析
イエシロアリ腸管抽出物中に含まれる難培養性のシロアリ共生原生生物群の中からＰｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ  ｇｒａｓｓｉｉ細胞を選定し、マイクロキャピラリーで分画して、１細胞からのＲＮＡ抽出、逆転写、ｃＤＮＡ増幅、ライブラリーへの変換、およびシークエンシングを笹川らのＱｕａｒｔｚ−ｓｅｑ法によって行った（Ｓａｓａｇａｗａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．：Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，１４： Ｒ３１，２０１３）。シークエンシングの結果から、β−グルコシダーゼ候補をコードする塩基配列の選定を行った。タンパク質のシグナル配列を予測するツールＳｉｇｎａｌＰ（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｃｂｓ.ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を用いて前記塩基配列がコードするアミノ酸配列の、シグナル配列部分を予測した。結果、シグナル配列を除いたβ−グルコシダーゼ候補配列として配列番号１に記載のアミノ酸配列、該アミノ酸配列をコードする塩基配列として配列番号２の塩基配列を取得した。配列番号１に記載のアミノ酸配列のファミリーをＰＲＯＳＩＴＥで調べたところ、配列番号１の２５９番目から２７６番目にＧｌｙｃｏｓｙｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ｆａｍｉｌｙ  ３  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅにあたる配列番号５のアミノ酸配列を有していることが分かった。【００５９】
（実施例２）β−グルコシダーゼ遺伝子形質転換大腸菌の作製
実施例１で取得した、配列番号２（Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属原生生物由来β−グルコシダーゼ候補遺伝子をコードする塩基配列）に記載のポリヌクレオチドをｐＥＴ１４ｂのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素サイトに連結したプラスミドを人工遺伝子合成サービス（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）により合成した。ここで、上記プラスミド配列の構成は形質転換体においてＮ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付加された、配列番号１に記載のアミノ酸配列をもつβ−グルコシダーゼが発現するように設計した。前記プラスミドを大腸菌（Ｒｏｓｓｅｔｔａ２（ＤＥ３））株に形質転換した。【００６０】
（実施例３）β−グルコシダーゼ遺伝子形質転換大腸菌無細胞抽出液の作製
実施例２で作製したβ−グルコシダーゼ遺伝子形質転換大腸菌をアンピシリン含有ＬＢ培地１０ｍＬに植菌し、３７℃で一晩振とう培養（前培養）を行った。本培養として、アンピシリン含有ＬＢ培地に、前培養で得られた菌体を植菌し、波長６００ｎｍでの濁度ＯＤ６００が０．８となるまで３７℃で振とう培養を行った。その後、最終濃度が０．１ｍＭになるようにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加え、さらに１６℃で一晩培養した。培養後、菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）に再懸濁した。この溶液を氷冷しながら、超音波破砕を行い、その上清を無細胞抽出液として遠心分離により回収した。前記β−グルコシダーゼ候補遺伝子形質転換大腸菌の無細胞抽出液のβ−グルコシダーゼ活性を測定したところ、無細胞抽出液に含まれるタンパク質１ｍｇあたり０．１４Ｕであった。また、β−グルコシダーゼ遺伝子形質転換大腸菌の培養液１Ｌから得られる全β−グルコシダーゼ活性は２１．６Ｕであった。比較対照として、β−グルコシダーゼ候補遺伝子を含まないプラスミドの形質転換体の無細胞抽出液を同様に調製し、β−グルコシダーゼ活性を測定したところ、β−グルコシダーゼ活性は検出されなかった。すなわち、配列番号１に記載のアミノ酸配列にＨｉｓ−ｔａｇが付加したポリペプチドを発現した無細胞抽出液からのみ、β−グルコシダーゼ活性が検出されたことから、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属原生生物由来β−グルコシダーゼ配列であることが分かった。【００６１】
（実施例４）β−グルコシダーゼ変異体遺伝子形質転換大腸菌の作製
実施例２と同様に、配列番号２と配列同一性５３％の配列番号７および配列番号２と配列同一性５３％の配列番号９に記載のポリヌクレオチドをそれぞれｐＥＴ１４ｂのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素サイトに連結したプラスミドを人工遺伝子合成サービス（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）により合成した。ここで、上記プラスミド配列の構成は形質転換体においてＮ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付加された、配列番号６および配列番号８に記載のアミノ酸配列をもつβ−グルコシダーゼがそれぞれ発現するように設計した。前記プラスミドを大腸菌（Ｒｏｓｓｅｔｔａ２（ＤＥ３））株に形質転換した。【００６２】
（実施例５）β−グルコシダーゼ変異体遺伝子形質転換大腸菌無細胞抽出液の作製
実施例４で作製したβ−グルコシダーゼ変異体遺伝子形質転換大腸菌をアンピシリン含有ＬＢ培地１０ｍＬに植菌し、３７℃で一晩振とう培養（前培養）を行った。本培養として、アンピシリン含有ＬＢ培地に、前培養で得られた菌体を植菌し、波長６００ｎｍでの濁度ＯＤ６００が０．８となるまで３７℃で振とう培養を行った。その後、最終濃度が０．１ｍＭになるようにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加え、さらに１６℃で一晩培養した。培養後、菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）に再懸濁した。この溶液を氷冷しながら、超音波破砕を行い、その上清を無細胞抽出液として遠心分離により回収した後、限外ろ過膜ユニットで抽出液体積を１２分の１にした後、β−グルコシダーゼ活性の有無を調べた。比較対照として、β−グルコシダーゼ候補遺伝子を含まないプラスミドの形質転換体の無細胞抽出液を同様に調製し、β−グルコシダーゼ活性の有無を調べたところ、β−グルコシダーゼ活性は検出されなかった。すなわち、配列番号１と配列同一性８８%の配列番号６および配列番号１と配列同一性８０％の配列番号８に記載のアミノ酸配列にＨｉｓ−ｔａｇが付加したポリペプチドを発現した無細胞抽出液からのみ、β−グルコシダーゼ活性が検出されたことから、配列番号６および配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、β−グルコシダーゼ活性を持つことが分かった。β−グルコシダーゼ活性測定の結果を表３に示した。【００６３】
【表３】
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【００６４】
（実施例６）β−グルコシダーゼ遺伝子形質転換大腸菌無細胞抽出液とＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物の調製および木材原料粉末セルロース糖化
参考例７に従って、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉの培養を行い、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを製造した。実施例３で作製したβ−グルコシダーゼ遺伝子形質転換大腸菌の無細胞抽出液を、前記Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼと混合した酵素組成物を調製し、糖化反応に使用した。前記酵素組成物は、糖化反応液１ｍＬあたりのＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼのタンパク濃度が０．２ｇ／Ｌ、β−グルコシダーゼ遺伝子形質転換大腸菌の無細胞抽出液のタンパク濃度が２．１ｇ／Ｌとなるように混合した。糖化対象のバイオマスとしては、木材原料粉末セルロースＡｒｂｏｃｅｌ（登録商標）（Ｊ．Ｒｅｔｔｅｎｍａｉｅｒ＆Ｓｏｈｎｅ）を使用した。糖化反応は以下のようにして行った。２ｍＬチューブの中にバイオマスを５０ｍｇ分入れ、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．２）を終濃度５０ｍＭになるように添加し、木材原料粉末セルロースの固形分濃度が反応開始時に５重量％となるように純水を加えた。さらに、前記酵素組成物を、前記調製液に添加し、ヒートブロックローテーターを用いて、３５℃の反応条件で反応を開始した。２４時間糖化反応後のサンプルを１０，０００×ｇの条件下で５分間遠心分離を行い、上清を分取し、上清のボリュームの１０分の１量の１Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液を添加し、糖化反応を停止した。その上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、そのろ液を参考例５に従い糖分析に供した。比較対照として、β−グルコシダーゼ遺伝子を含まないベクターのみを形質転換した大腸菌の無細胞抽出液を用い、上記と同様に糖化反応液１ｍＬあたりのタンパク濃度が２．１ｇ／ＬになるようＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼと混合して、糖化反応、および糖化上清の糖分析を行った。なお、上記糖化反応に使用したβ−グルコシダーゼ遺伝子形質転換大腸菌無細胞抽出液とＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物のβ−グルコシダーゼ活性はβ−グルコシダーゼ遺伝子形質転換大腸菌無細胞抽出液を含まないＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼの活性の２．６倍となった。糖化反応の結果、β−グルコシダーゼ遺伝子形質転換大腸菌無細胞抽出液とＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を添加した場合、本発明のβ−グルコシダーゼを含まないＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを添加した場合に比べて、グルコース蓄積量が約２．７倍に増加し、セロビオースの蓄積量は減少した。糖分析のグルコース・セロビオースの結果を表４に示した。【００６５】
【表４】
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【００６６】
（実施例７）β−グルコシダーゼのＨｉｓ−ｔａｇ粗精製
実施例３で酵素活性を確認できたβ−グルコシダーゼ遺伝子形質転換大腸菌の無細胞抽出液のＨｉｓ−ｔａｇ精製を行った。Ｈｉｓ−ｔａｇ精製はＨｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（メルクミリポア）を用い、説明書のバッチメソッドに従った。参考例６に従って、精製画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、溶出画分において分子量７５ｋＤａから１００ｋＤａの間に最も濃いバンドが検出され、理論分子量８３．９ｋＤａであるＨｉｓ−ｔａｇ付きβ−グルコシダーゼが精製されたことが確認できた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を図１に示した。ゲルろ過カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア）を用いて説明書の方法に従い、前記溶出画分のバッファーを２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ７．６）に交換し、これを粗精製β−グルコシダーゼとした。該粗精製β−グルコシダーゼのタンパク質濃度およびβ−グルコシダーゼ活性を測定したところ、粗精製β−グルコシダーゼに含まれるタンパク質１ｍｇあたり３．５０Ｕであった。【００６７】
（実施例８）粗精製β−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物の調製および木材原料粉末セルロース糖化
参考例７に従って、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉの培養を行い、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを製造した。実施例７で作製した粗精製β−グルコシダーゼを前記Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼと混合した酵素組成物を調製し、糖化反応に使用した。前記酵素組成物は、糖化反応液１ｍＬあたりのＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼのタンパク濃度が０．２ｇ／Ｌ、粗精製β−グルコシダーゼのタンパク濃度が０．０１７ｇ／Ｌとなるように混合した。酵素組成物に粗精製β−グルコシダーゼを用いた以外は、実施例６と同様に糖化反応、および糖化上清の糖分析を行った。比較対照としてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼのみを用い、上記と同様に糖化反応液１ｍＬあたりのタンパク濃度が２．１ｇ／ＬになるようＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを添加して、糖化反応、および糖化上清の糖分析を行った。なお、上記糖化反応に使用した粗精製β−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物のβ−グルコシダーゼ活性は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼのみの活性の１．６倍となった。糖化反応の結果、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａセルラーゼに粗精製β−グルコシダーゼを混合した酵素組成物を添加した場合、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼのみを添加した場合に比べて、いずれもグルコース蓄積量が約１．８倍に増加し、セロビオースの蓄積量は減少した。糖分析のグルコース・セロビオースの結果を表５に示した。【００６８】
【表５】
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【００６９】
（実施例９）β−グルコシダーゼ遺伝子形質転換Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌の作製
配列番号２に記載の塩基配列（ＰｓｅｕｄｏＴｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属原生生物由来β−グルコシダーゼ遺伝子をコードする塩基配列）と配列同一性６６％の配列番号３に記載のポリヌクレオチドをｐＥＴ１４ｂのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素サイトに連結したプラスミドを、人工遺伝子合成サービス（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）により合成した。前記プラスミドから、配列番号３の塩基配列部分をＰＣＲにより増幅し、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来エンドグルカナーゼ１プロモーターの下流に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓのβ−グルコシダーゼの分泌シグナル配列とｉｎ−ｆｒａｍｅになるように連結し、該配列と形質転換体のハイグロマイシン耐性遺伝子をｐＢＩ１０１プラスミドのＴ−ＤＮＡボーダー間にクローニングした。作製したプラスミドのＴ−ＤＮＡボーダー間の配列を配列番号４に示した。ここで、配列番号４は上記配列が宿主細胞のゲノム中に導入され、下記塩基番号９７８〜３１６１（配列番号３）がコードする、配列番号１に記載のアミノ酸配列をもつβ−グルコシダーゼが発現し、分泌されるように設計した。配列番号４の構成を下記に示す。【００７０】
ＬＢ＝左Ｔ−ＤＮＡボーダー：塩基番号１〜２６
Ｐｅｇｌ１＝Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来エンドグルカナーゼ１プロモーター：塩基番号２７〜９２０
Ｓｂｇｌ＝Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ由来β−グルコシダーゼ分泌シグナル：塩基番号９２１〜９７７
ｂｇｌ＝Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ属原生生物由来β−グルコシダーゼ：塩基番号９７８〜３１６１（配列番号３）
Ｔｅｇｌ１=Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来エンドグルカナーゼ１ターミネーター：塩基番号３１６２〜４０１９
ＰａｍｄＳ＝Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来アセトアミダーゼプロモーター：塩基番号４０２０〜５０２７
ｈｙｇＲ＝ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス由来ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ：塩基番号５０２８〜６０６５
ＴａｍｄＳ＝Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来アセトアミダーゼターミネーター：塩基番号６０６６〜６７８６
ＲＢ＝右Ｔ−ＤＮＡボーダー：塩基番号６７８７〜６８１０。【００７１】
作製したプラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＧＬ１株に導入し、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉに該形質転換アグロバクテリウムを感染させて、β−グルコシダーゼ形質転換Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ株を取得した。アグロバクテリウムによるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａの形質転換は、Ｍａｒｃｅｌらの方法（Ｍａｒｃｅｌ,  ｅｔ  ａｌ．  ２００６，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６：８３９−８４２）を基にして、グルコースとアセトシリンゴンを含むＩｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭ）液体培地で８時間培養した該形質転換アグロバクテリウムを、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉの胞子溶液と混合し、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭ）固体培地に載せたセロハン上で、３日間培養した後、セフォタキシムとハイグロマイシンを含むポテトデキストロースアガープレート（選択培地）にセロハンを載せかえ、選択培地に生育したコロニーをピックアップして再び選択培地に撒く純化培養を２度繰り返して、形質転換Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ株を取得した。【００７２】
（実施例１０）β−グルコシダーゼ遺伝子形質転換Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌の培養による、酵素組成物の製造
実施例９で作製したβ−グルコシダーゼ遺伝子形質転換Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌を参考例７と同様の方法で培養し、培養開始４日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行うことで、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌で発現した本発明のβ−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を調製した。前記酵素組成物のタンパク質濃度を参考例１に従って測定し、参考例６に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、発現タンパクの確認を行った。比較対照として非形質転換Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌の培養により得られたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼのみを用い、同様に培養、上清回収、培養上清ろ過およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、前記β−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物では、本発明のβ−グルコシダーゼのバンドが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認できる酵素組成物のバンドの合計の１０分の１より多いバンドとして観察され、β−グルコシダーゼ遺伝子形質転換Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌では本発明のβ−グルコシダーゼが多量に発現していることが確認できた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を図２に示した。【００７３】
さらに、参考例２に従い前記β−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物のβ−グルコシダーゼ活性測定を行った。結果、前記β−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物のβ−グルコシダーゼ活性は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼのみのβ−グルコシダーゼ活性の２．０倍となった。また、前記β−グルコシダーゼ遺伝子形質転換Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌の培養液１Ｌから得られる全β−グルコシダーゼ活性は約１．８０×１０３Ｕであり、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌におけるβ−グルコシダーゼ発現では、実施例３の大腸菌におけるβ−グルコシダーゼ発現の場合と比べて、同体積の培養液から約８５０倍のβ−グルコシダーゼが得られ、本発明のβ−グルコシダーゼの生産性が高いことが分かった。【００７４】
（実施例１１）β−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物による微結晶セルロース糖化
実施例１０で調製したβ−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を糖化反応に使用した。糖化対象のバイオマスとしては、微結晶セルロースであるＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ（Ｍｅｒｃｋ社製）を使用した。使用バイオマス以外は実施例６と同様に糖化反応および糖化上清の糖分析を行った。酵素の添加量は８ｍｇ／ｇ−バイオマスとした。比較対照としてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼのみを用い、同様に糖化反応、および糖化上清の糖分析を行った。結果、前記β−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を用いた糖化では、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼのみを用いた糖化に比べて、グルコース蓄積量が約１．６倍に増加し、セロビオースの蓄積量は減少した。糖分析のグルコース・セロビオースの結果を表６に示した。【００７５】
【表６】
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【００７６】
（実施例１２）β−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物による木材原料粉末セルロース糖化
実施例１０で調製したβ−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を糖化反応に使用した。糖化対象のバイオマスとしては、木材原料粉末セルロースＡｒｂｏｃｅｌ（登録商標）（Ｊ．Ｒｅｔｔｅｎｍａｉｅｒ＆Ｓｏｈｎｅ）を使用した。使用バイオマス以外は実施例１１と同様にして、糖化反応、および糖化上清の糖分析を行った。比較対照としてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼのみを用い、同様に糖化、および糖化上清の糖分析を行った。結果、前記β−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を用いた糖化では、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼのみを用いた糖化に比べて、グルコース蓄積量が約１．８倍に増加し、セロビオースの蓄積は検出されなかった。糖分析のグルコース・セロビオースの結果を表７に示した。【００７７】
【表７】
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【００７８】
（実施例１３）β−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物によるアルカリ処理バガス糖化
実施例１０で調製したβ−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を糖化反応に使用した。糖化対象のバイオマスとして、アルカリ処理（前処理）を行ったバガスを使用した。使用バイオマス以外は実施例１１と同様にして、糖化反応、および糖化上清の糖分析を行った。比較対照として、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼのみを用い、同様に糖化、および糖化上清の糖分析を行った。結果、前記β−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を用いた糖化では、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼのみを用いた糖化に比べて、グルコース蓄積量が約１．８倍に増加し、セロビオースの蓄積は検出されなかった。糖分析のグルコース・セロビオースの結果を表８に示した。【００７９】
【表８】
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【００８０】
（実施例１４）β−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物の糖化上清残存成分確認
実施例１０で調製したβ−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を糖化反応に使用した。糖化対象のバイオマスとして、木材原料粉末セルロースＡｒｂｏｃｅｌ（登録商標）（Ｊ．Ｒｅｔｔｅｎｍａｉｅｒ＆Ｓｏｈｎｅ）、アルカリ処理バガスおよび前処理を行っていない無処理バガスを使用した。３５℃の反応条件で実施例１１と同様に糖化反応を行い、２４時間糖化反応後のサンプルを１０，０００×ｇの条件下で５分間遠心分離を行い、糖化上清を回収した。該糖化上清３．５μＬを分取し、等量のサンプルバッファーと混合し、９５℃１０分加熱して、参考例６に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。糖化に供した酵素のバンドの確認のため、糖化反応液中と同濃度になるように希釈した前記酵素組成物も、前記糖化上清と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。比較対照として非形質転換Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌の培養により得られたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼのみを用い、同様に糖化、および糖化上清の回収、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。結果、木材原料粉末セルロース糖化、アルカリ処理バガス糖化および無処理バガス糖化のいずれの場合も、前記β−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物の糖化上清中では、本発明のβ−グルコシダーゼのバンドが明瞭に見られ、本発明のβ−グルコシダーゼはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来の他の多くのセルラーゼ成分よりも糖化上清として回収しやすいことが確認できた。また、木材原料粉末セルロース糖化では、β−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物の糖化上清中では、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼのみの糖化上清中に比べて、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来の多くのセルラーゼ成分のバンドがより多く観察され、本発明のβ−グルコシダーゼがＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼとともに酵素組成物として用いられると、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼも糖化上清として回収しやすくなることが確認できた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を図３に示した。【００８１】
（実施例１５）β−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物の木材原料粉末セルロース糖化上清残存活性測定
実施例１４で回収した、前記酵素組成物の木材原料粉末セルロース糖化上清について、参考例２、３および４に従って、酵素活性測定を行った。実施例１４で糖化反応液中と同濃度になるように希釈した前記酵素組成物についても同様に酵素活性測定を行った。糖化反応液中と同濃度になるように希釈した前記酵素組成物の酵素活性を１００％としたときの糖化上清の酵素活性の割合を糖化上清中の残存活性として表９に示した。β−グルコシダーゼ残存活性の結果から、本発明のβ−グルコシダーゼは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来のβ−グルコシダーゼよりも糖化上清として回収しやすいことが確認できた。また、β−キシロシダーゼ残存活性およびセロビオハイドロラーゼ・エンドグルカナーゼ残存活性の結果から、本発明のβ−グルコシダーゼがＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼとともに酵素組成物として用いられると、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼおよびエンドグルカナーゼが糖化上清として回収しやすくなることが確認できた。【００８２】
【表９】
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【００８３】
（実施例１６）β−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物の未処理バガス糖化上清残存活性測定
実施例１４で回収した、前記酵素組成物の未処理バガス糖化上清について、参考例２、３および４に従って、酵素活性測定を行った。実施例１４で糖化反応液中と同濃度になるように希釈した前記酵素組成物についても同様に酵素活性測定を行った。糖化反応液中と同濃度になるように希釈した前記酵素組成物の酵素活性を１００％としたときの糖化上清の酵素活性の割合を糖化上清中の残存活性として表１０に示した。β−グルコシダーゼ残存活性の結果から、本発明のβ−グルコシダーゼは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来のβ−グルコシダーゼよりも糖化上清として回収しやすいことが確認できた。また、β−キシロシダーゼ残存活性およびセロビオハイドロラーゼ・エンドグルカナーゼ残存活性の結果から、本発明のβ−グルコシダーゼがＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼとともに酵素組成物として用いられると、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼおよびエンドグルカナーゼが糖化上清として回収しやすくなることが確認できた。【００８４】
【表１０】
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【００８５】
（実施例１７）β−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物のアルカリ処理バガス糖化上清残存活性測定
実施例１４で回収した、前記酵素組成物のアルカリ処理バガス糖化上清について、参考例２、３および４に従って、酵素活性測定を行った。実施例１４で糖化反応液中と同濃度になるように希釈した前記酵素組成物についても同様に酵素活性測定を行った。糖化反応液中と同濃度になるように希釈した前記酵素組成物の酵素活性を１００％としたときの糖化上清の酵素活性の割合を糖化上清中の残存活性として表１１に示した。β−グルコシダーゼ残存活性の結果から、本発明のβ−グルコシダーゼは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来β−グルコシダーゼよりも糖化上清として回収しやすいことが確認できた。また、β−キシロシダーゼ残存活性およびセロビオハイドロラーゼ・エンドグルカナーゼ残存活性の結果から、本発明のβ−グルコシダーゼがＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼとともに酵素組成物として用いられると、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼおよびエンドグルカナーゼが糖化上清として回収しやすくなることが確認できた。【００８６】
【表１１】
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【００８７】
（比較例１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌由来β−グルコシダーゼ遺伝子形質転換Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌の作製と該形質転換体の培養による酵素組成物の製造
実施例９と同様に、配列番号１１に記載の塩基配列（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌由来β−グルコシダーゼ遺伝子をコードする塩基配列）が宿主細胞のゲノム中に導入され、配列番号１０に記載のアミノ酸配列をもつβ−グルコシダーゼが発現し、分泌されるように設計したプラスミドを作製した。該プラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＧＬ１株に導入し、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉに該形質転換アグロバクテリウムを感染させて、β−グルコシダーゼ形質転換Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ株を取得した。実施例１０と同様に、上記で作製したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌由来β−グルコシダーゼ遺伝子形質転換Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌を参考例７と同様の方法で培養し、培養開始４日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行うことで、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌で発現したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌由来β−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物を調製した。参考例６に従って前記酵素組成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、発現タンパクの確認を行った。比較対照として非形質転換Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌の培養により得られたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼのみを用い、同様に培養、上清回収、培養上清ろ過およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌由来β−グルコシダーゼが発現していることが確認できた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真を図４に示した。参考例８に従い、該Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌由来β−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物のグルコースによるβ−グルコシダーゼ活性阻害作用測定を行い、結果を実施例１８との比較に用いた。【００８８】
（実施例１８）グルコースによるβ−グルコシダーゼ活性阻害作用測定方法
参考例８に従い、実施例１０で調製したβ−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼおよび実施例５で作製したβ−グルコシダーゼ変異体遺伝子形質転換大腸菌無細胞抽出液を含む酵素組成物のグルコースによるβ−グルコシダーゼ活性阻害作用測定を行った。比較対照としてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼのみを用い、同様にグルコースによるβ−グルコシダーゼ活性阻害作用を測定した。反応液中のグルコース濃度が０ｇ／Ｌの条件のβ−グルコシダーゼ活性を１として標準化したときの、グルコース存在下での相対活性の値を図５に示した。また、反応液中のグルコース濃度が０ｇ／Ｌの条件のβ−グルコシダーゼ活性を１として標準化したときの、グルコース８ｇ／Ｌの条件下での相対活性の値を表１２に、グルコース２０ｇ／Ｌの条件下での相対活性の値を表１３に示した。結果、前記β−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物およびβ−グルコシダーゼ変異体遺伝子形質転換大腸菌無細胞抽出液は、いずれもＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼのみおよび比較例１のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌由来のβ−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物と比較して、グルコースによるβ−グルコシダーゼ活性の低下が小さかった。すなわち、本発明のβ−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物およびβ−グルコシダーゼ変異体遺伝子形質転換大腸菌無細胞抽出液は、いずれもＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼのみおよび比較例１のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌由来のβ−グルコシダーゼとＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌由来セルラーゼを含む酵素組成物と比較して、グルコースによるβ−グルコシダーゼ活性阻害を受けにくかった。【００８９】
【表１２】
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【００９０】
【表１３】
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【００９１】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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