(57)【要約】  本発明のヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法は、少なくとも３つの塩基からなる核酸と、末端デオキシヌクレオチド転移酵素と、２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸とを混合してインキュベートする工程を含む。本発明の方法に用いられる２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸としては、例えば、５−メチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−（メチレンオキシメチレン）ウリジン−５’−三リン酸、５−メチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−（アミノメチレン）ウリジン−５’−三リン酸、および５−メチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−（ベンジルオキシメチレン）ウリジン−５’−三リン酸が挙げられる。本発明の方法によれば、既存の機能性核酸に対して、後から簡単に優れたヌクレアーゼ耐性を付与することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法であって、
少なくとも３つの塩基からなる核酸と、末端デオキシヌクレオチド転移酵素と、２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸とを混合してインキュベートする工程を含み、
該２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸が、以下の式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩ：
【化１】
2010021344.tif 000028
【化２】
2010021344.tif 000029
【化３】
2010021344.tif 000030
（式中、
Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
ｍは、１から５の整数であり；そして
ｎは、１から５の整数である）
で表される構造を有する、方法。
【請求項２】
前記式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩにおいて、前記Ｂａｓｅが、６−アミノプリン−９−イル基、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２，４−ジヒドロキシピリミジン−１−イル基、２，４−ジヒドロキシ−５−メチルピリミジン−１−イル基、または４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記式ＩＩにおいて、前記Ｒが、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩにおいて、前記ｍが１であり、そして前記ｎが１である、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項５】
前記式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩにおいて、前記Ｂａｓｅが、２，４−ジヒドロキシ−５−メチルピリミジン−１−イル基である、請求項１から４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項６】
前記式ＩＩＩにおいて、前記Ｒ１およびＲ２のいずれか一方が、水素原子である、請求項１から５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項７】
前記式ＩＩＩにおいて、前記Ｒ１およびＲ２のいずれか一方が、フェニル基である、請求項１から６のいずれかの項に記載の方法。
【請求項８】
末端デオキシヌクレオチド転移酵素、および２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸を含む、ヌクレアーゼ耐性核酸の調製用キットであって、
該２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸が、以下の式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩ：
【化４】
2010021344.tif 000031
【化５】
2010021344.tif 000032
【化６】
2010021344.tif 000033
（式中、
Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
ｍは、１から５の整数であり；そして
ｎは、１から５の整数である）
で表される構造を有する、キット。
【請求項９】
以下の式ＩＩＩで表される２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸：
【化７】
2010021344.tif 000034
（式中、
Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
そして
ｎは、１から５の整数である）。
【請求項１０】
以下の式Ｉ’、式ＩＩ’または式ＩＩＩ’で表される２’，４’−架橋型ヌクレオチド：
【化８】
2010021344.tif 000035
【化９】
2010021344.tif 000036
【化１０】
2010021344.tif 000037
（式中、
Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
そして
ｎは、１から５の整数である）
を３’末端に有する、ヌクレアーゼ耐性核酸。
【請求項１１】
請求項１から７のいずれかの項に記載の方法により調製された、ヌクレアーゼ耐性核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規核酸誘導体およびそれを用いたヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法に関する。より詳細には、既存の機能性核酸に対して、後からヌクレアーゼ耐性を付与するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸分子は、分子生物学や化学生物学などの種々の分野で使用され、医薬・診断薬への応用も盛んに検討されている。核酸分子をインビボで使用する場合、ヌクレアーゼ（核酸分解酵素）耐性を考慮しなくてはならない。そのため、インビトロで機能を十分に果たすという治験が得られた核酸分子であっても、改めて分子設計を行って、その核酸分子に耐性を付与しなければならない。【０００３】
これまでの研究で、架橋型ヌクレオチドを機能性核酸（アンチセンス、アプタマーなど）に導入することによって、ヌクレアーゼ耐性が向上することが知られている。例えば、二環系の糖部分を有するロックト核酸（Locked Nucleic Acid：ＬＮＡ）が化学合成され、このＬＮＡを有するオリゴヌクレオチドは、天然型のオリゴヌクレオチドよりもヌクレアーゼへの耐性が向上しており、したがって体内での安定性が改善される可能性が示唆されている（非特許文献１）。さらに、ヌクレアーゼ耐性を付与することが可能な架橋型核酸（Bridged Nucleic Acid）が、種々設計および合成されている（非特許文献２〜４）。また、このような架橋型ヌクレオチドの三リン酸アナログを含むプライマーについて、ＤＮＡポリメラーゼに対する影響が検討されており、糖部分の改変が、ポリメラーゼ反応に大きく影響を及ぼすことが報告されている（非特許文献５）。【０００４】
しかし、これらの架橋型ヌクレオチドおよびそのアナログを核酸（オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）中に付与または導入するためには、いずれも化学合成により（例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いて）作成する必要がある。そのため、配列未知のＤＮＡ鎖や１００残基を超える長い塩基長のＤＮＡ鎖について、従来法でヌクレアーゼ耐性を付与することは、非常に手間がかかる。【０００５】
上記架橋型ヌクレオチドであるＬＮＡについては、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）によって認識され、ＤＮＡオリゴヌクレオチドに組込まれること、およびそれによってＤＮＡオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性が付与されることが知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００２−５２１３１０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】C. Wahlestedtら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2000年，97巻，10号，5633-5638頁
【非特許文献２】Y. Hariら、Bioorg. Med. Chem.，2006年，14巻，1029-1038頁
【非特許文献３】K. Miyashitaら、Chem. Commun.，2007年，3765-3767頁
【非特許文献４】S.M.A. Rahmanら、J. Am. Chem. Soc.，2008年，130巻，14号，4886-4896頁
【非特許文献５】M. Kuwaharaら、Nucleic Acids Res.，2008年，36巻，13号，4257-4265頁
【非特許文献６】S. Obikaら、Bioorg. Med. Chem.，2001年，9巻，1001-1011頁
【非特許文献７】S. K. Singhら、Chem. Commun.，1998年，455-456頁
【非特許文献８】R. D. Youssefyehら、J. Org. Chem.；1979年，44巻，1301-1309頁
【非特許文献９】K. Morihiroら、ChemBioChem，2009年，10巻，1784-1788頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、既存の機能性核酸に対して、後から簡単に優れたヌクレアーゼ耐性を付与する方法を提供すること、ならびにそれに用いるための新規な核酸誘導体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）および２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸を用いることにより、一本鎖のデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）の３’末端に架橋型ヌクレオチドを効率よく付加できること、ならびにこのようにして生成した３’末端修飾ＤＮＡが非常に高いヌクレアーゼ耐性を示すことを見いだし、本発明を完成した。【００１０】
本発明は、ヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法を提供し、該方法は、
少なくとも３つの塩基からなる核酸と、末端デオキシヌクレオチド転移酵素と、２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸とを混合してインキュベートする工程を含み、
該２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸が、以下の式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩ：【００１１】
【化１】
2010021344.tif 000002
【００１２】
【化２】
2010021344.tif 000003
【００１３】
【化３】
2010021344.tif 000004
【００１４】
（式中、
Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
ｍは、１から５の整数であり；そして
ｎは、１から５の整数である）
で表される構造を有する。【００１５】
１つの実施態様では、上記式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩにおいて、上記Ｂａｓｅは、６−アミノプリン−９−イル基、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２，４−ジヒドロキシピリミジン−１−イル基、２，４−ジヒドロキシ−５−メチルピリミジン−１−イル基、または４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である。【００１６】
１つの実施態様では、上記式ＩＩにおいて、上記Ｒは、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基である。【００１７】
１つの実施態様では、上記式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩにおいて、上記ｍは１であり、そして上記ｎも１である。【００１８】
１つの実施態様では、上記式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩにおいて、上記Ｂａｓｅは、２，４−ジヒドロキシ−５−メチルピリミジン−１−イル基である。【００１９】
１つの実施態様では、上記式ＩＩＩにおいて、上記Ｒ１およびＲ２のいずれか一方は、水素原子である。【００２０】
１つの実施態様では、上記式ＩＩＩにおいて、上記Ｒ１およびＲ２のいずれか一方は、フェニル基である。【００２１】
本発明はまた、末端デオキシヌクレオチド転移酵素、および２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸を含む、ヌクレアーゼ耐性核酸の調製用キットを提供し、
ここで、該２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸は、以下の式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩ：【００２２】
【化４】
2010021344.tif 000005
【００２３】
【化５】
2010021344.tif 000006
【００２４】
【化６】
2010021344.tif 000007
【００２５】
（式中、
Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
ｍは、１から５の整数であり；そして
ｎは、１から５の整数である）
で表される構造を有する。【００２６】
本発明はまた、以下の式ＩＩＩで表される２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸を提供する：【００２７】
【化７】
2010021344.tif 000008
【００２８】
（式中、
Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
そして
ｎは、１から５の整数である）。【００２９】
本発明はまた、以下の式Ｉ’、式ＩＩ’または式ＩＩＩ’で表される２’，４’−架橋型ヌクレオチド：【００３０】
【化８】
2010021344.tif 000009
【００３１】
【化９】
2010021344.tif 000010
【００３２】
【化１０】
2010021344.tif 000011
【００３３】
（式中、
Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
そして
ｎは、１から５の整数である）
を３’末端に有する、ヌクレアーゼ耐性核酸を提供する。【００３４】
本発明はさらに、上記のいずれかの方法により調製された、新規なヌクレアーゼ耐性核酸を提供する。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によれば、既存の核酸に対してだけでなく、配列未知のＤＮＡ鎖や１００残基を超える長い塩基長のＤＮＡ鎖に対しても、非常に簡便に高いヌクレアーゼ耐性を付与することが可能である。したがって、医薬および診断薬の分野、ゲノム研究の分野、特にゲノム研究用試薬の調製に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】架橋型ヌクレオシド三リン酸（ＫＴＰ、ＬＴＰまたはＭＴＰ）とＴｄＴとのインキュベートにより得られた一本鎖ＤＮＡおよび未処理の一本鎖（ＯＤＮ１）の電気泳動写真である。
【図２】架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加された一本鎖ＤＮＡ（ＯＤＮ１＃Ｋ、ＯＤＮ１＃Ｌ、ＯＤＮ１＃Ｍ、およびＯＤＮ１＃Ｑ）および未処理の一本鎖（ＯＤＮ１）の、ヌクレアーゼ処理による反応液の電気泳動写真である。
【図３】架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加された一本鎖ＤＮＡ（ＯＤＮ１＃Ｋ、ＯＤＮ１＃Ｌ、ＯＤＮ１＃Ｍ、およびＯＤＮ１＃Ｑ）および未処理の一本鎖（ＯＤＮ１）の、ヌクレアーゼ処理による残存率の経時変化を示すグラフである。
【図４】架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加されたトロンビン結合アプタマー（ＴＢＡ１＃Ｋ、ＴＢＡ１＃Ｌ、ＴＢＡ１＃Ｍ、およびＴＢＡ１＃Ｑ）および未処理のトロンビン結合アプタマー（ＴＢＡ１）の、ヌクレアーゼ処理による残存率の経時変化を示すグラフである。
【図５】架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加されたトロンビン結合アプタマー（ＴＢＡ１＃Ｋ、ＴＢＡ１＃Ｌ、ＴＢＡ１＃Ｍ、およびＴＢＡ１＃Ｑ）および未処理のトロンビン結合アプタマー（ＴＢＡ１）の、血清中での残存率の経時変化を示すグラフである。
【図６】架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加されたトロンビン結合アプタマー（ＴＢＡ１＃Ｋ、ＴＢＡ１＃Ｌ、ＴＢＡ１＃Ｍ、およびＴＢＡ１＃Ｑ）および未処理のトロンビン結合アプタマー（ＴＢＡ１）とトロンビンとをインキュベートした反応液についてのキャピラリー電気泳動によるエレクトログラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
まず、本明細書中で用いられる用語を定義する。
【００３８】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキル基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基をいい、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、またはｎ−ヘキシル基をいう。
【００３９】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メチルオキシ基、エチルオキシ基、ｎ−プロピルオキシ基などが挙げられる。
【００４０】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−プロピルチオ基などが挙げられる。
【００４１】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルアミノ基を１つまたは２つ有するアルキルアミノ基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基などが挙げられる。
【００４２】
本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基」は、炭素数１〜７の任意の直鎖アルキル基、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルキル基、および炭素数３〜７の任意の環状アルキル基を包含する。例えば、炭素数１〜７の任意の直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、およびｎ−ヘプチル基が挙げられ、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基などが挙げられ、そして炭素数３〜７の任意の環状アルキル基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。
【００４３】
本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基」は、炭素数２〜７の任意の直鎖アルケニル基、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルケニル基、および炭素数３〜７の任意の環状アルケニル基を包含する。例えば、炭素数２〜７の任意の直鎖アルケニル基としては、エテニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、１−ヘキセニル基などが挙げられ、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルケニル基としては、イソプロペニル基、１−メチル−１−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、２−メチル−２−プロペニル基、１−メチル−２−ブテニル基などが挙げられ、そして炭素数３〜７の任意の環状アルケニル基としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。
【００４４】
本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基」は、炭化水素のみで構成された炭素数６〜１２の任意の芳香族炭化水素および環構造にヘテロ原子（窒素原子、酸素原子、または硫黄原子）を含む炭素数３〜１２の任意の複素芳香族化合物を包含する。炭化水素のみで構成された炭素数６〜１２の芳香族炭化水素としては、フェニル基、ナフチル基、インデニル基、アズレニル基などが挙げられ、そして環構造にヘテロ原子を含む炭素数３〜１２の任意の複素芳香族化合物としては、ピリジル基、ピロリル基、キノリル基、インドリル基、イミダゾリル基、フリル基、チエニル基などが挙げられる。
【００４５】
本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基」の例としては、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、３−フェニルプロピル基、２−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基、２−フェニルブチル基、ピリジルメチル基、インドリルメチル基、フリルメチル基、チエニルメチル基、ピロリルメチル基、２−ピリジルエチル基、１−ピリジルエチル基、３−チエニルプロピル基などが挙げられる。
【００４６】
本明細書において、用語「炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基」の例としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ペンテニレン基、ヘキセニレン基、ビニレン基、プロペニレン基、ブタジエニレン基などが挙げられる。
【００４７】
以下、本発明について詳述する。
【００４８】
本発明のヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法は、少なくとも３つの塩基からなる核酸と、末端デオキシヌクレオチド転移酵素と、２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸とを混合してインキュベートする工程を含む。
【００４９】
本発明において、ヌクレアーゼ耐性を付与する対象となる核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）のいずれであってもよい。核酸の塩基長は、少なくとも３つの塩基長であれば、特に限定されない。核酸は、天然物から単離した核酸、組換え発現させた核酸、化学的に合成した核酸、酵素的に合成した核酸のいずれの由来であってもよい。また、核酸中に、人工的に改変された塩基および修飾塩基（メチル化など）を含んでいてもよい。また、蛍光物質などの標識物質が結合されていてもよい。本発明においては、好適な対象となり得る核酸としては、アンチセンスＤＮＡ分子、アンチジーンＤＮＡ分子、ＤＮＡアプタマー、ＤＮＡザイム、ｓｉＲＮＡなどの種々の機能性核酸が挙げられる。
【００５０】
本発明においてヌクレアーゼとは、ＤＮＡまたはＲＮＡの糖とリン酸の間のホスホジエステル結合を加水分解してヌクレオチドとする核酸分解酵素をいう。ヌクレアーゼは、生体内または細胞中に遍在するため、外因性の核酸が生体内または細胞中に入ると、この酵素によって分解され得る。本発明においては、このようなヌクレアーゼによる分解を防止するために、核酸にヌクレアーゼ耐性を付与する。
【００５１】
ヌクレアーゼとしては、ＤＮＡ特異的なデオキシリボヌクレアーゼ、ＲＮＡ特異的なリボヌクレアーゼ、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡのいずれにも作用するヌクレアーゼが挙げられる。また、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、ならびにＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのいずれに作用するヌクレアーゼも挙げられる。本発明においては、好ましくは、核酸配列の外側から、すなわち、核酸の５’末端または３’末端から分解するエキソヌクレアーゼ、より好ましくは３’末端から分解するエキソヌクレアーゼに対して、耐性が付与され得る。
【００５２】
本発明の方法に用いられる末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）は、鋳型に依存せずに、二本鎖および一本鎖ＤＮＡの３’−ＯＨ末端へ、デオキシリボースを有するヌクレオチドを連結させる（付加する）反応を触媒する酵素である。ＴｄＴは、放射性標識ヌクレオチドやジゴキシゲニンやビオチンのようなハプテンで標識されたヌクレオチドも基質として利用し得る。本発明において用いるＴｄＴの由来は、特に限定されず、市販のＴｄＴを用い得る。
【００５３】
ＴｄＴの１ユニットは、通常、ｄ（ｐＴ）６をプライマーとして用いて、１２０μＬの反応液（１２０ｍＭのカコジル酸カリウム、１ｍＭのＣｏＣｌ２、１ｍＭのｄＴＴＰ、０．１ＯＤのｄ（ｐＴ）６、および６．２５ｐｍｏｌの［３Ｈ］−ｄＴＴＰ）中、３７℃にて３０分間の反応させた場合に、１ｎｍｏｌのｄＡＭＰを酸沈殿産物に取り込む活性量として表される。
【００５４】
本発明の方法で用いられる２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸は、以下の式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩ：
【００５５】
【化１１】
2010021344.tif 000012
【００５６】
【化１２】
2010021344.tif 000013
【００５７】
【化１３】
2010021344.tif 000014
【００５８】
（式中、
Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
ｍは、１から５の整数であり；そして
ｎは、１から５の整数である）
で表される構造を有する。
【００５９】
上記式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩにおいて、Ｂａｓｅは、プリン塩基（すなわち、プリン−９−イル基）またはピリミジン塩基（すなわち、２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基）である。これらの塩基は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群より選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
【００６０】
上記の塩基（Ｂａｓｅ）の具体例としては、６−アミノプリン−９−イル基（アデニニル基）、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基（グアニニル基）、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（シトシニル基）、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２，４−ジヒドロキシピリミジン−１−イル基（ウラシリル基）、２，４−ジヒドロキシ−５−メチルピリミジン−１−イル基（チミニル基）、および４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基が挙げられる。
【００６１】
中でも、Ｂａｓｅは、ＴｄＴのより好適な基質となり得る点で、以下の構造式：
【００６２】
【化１４】
2010021344.tif 000015
【００６３】
でそれぞれ表される、２，４−ジヒドロキシ−５−メチルピリミジン−１−イル基（チミニル基）、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（シトシニル基）、６−アミノプリン−９−イル基（アデニニル基）、および２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基（グアニニル基）が好適であり、特に、２，４−ジヒドロキシ−５−メチルピリミジン−１−イル基（チミニル基）が好適である。
【００６４】
上記式ＩＩにおいて、Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基である。より好適には、Ｒは、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基であり、さらに好適には、Ｒは、水素原子またはメチル基である。
【００６５】
上記式ＩＩＩにおいて、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではない。より好適には、上記Ｒ１およびＲ２のいずれか一方は、水素原子であり、他方は、フェニル基である。
【００６６】
上記式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩにおいて、ｎは、１から５の整数であり、好ましくは１または２であり、より好ましくは１である。
【００６７】
上記式Ｉにおいて、ｍは、１から５の整数であり、好ましくは１または２であり、より好ましくは１である。
【００６８】
上記式Ｉ、式ＩＩおよび式ＩＩＩで表される２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸の代表的な例として、Ｂａｓｅがチミニル基であり、Ｒが水素原子であり、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ水素原子およびフェニル基であり、そしてｍおよびｎがいずれも１である場合のそれぞれの構造式（それぞれＬＴＰ、ＭＴＰ、ＱＴＰと称する）を以下に示す。
【００６９】
【化１５】
2010021344.tif 000016
【００７０】
【化１６】
2010021344.tif 000017
【００７１】
【化１７】
2010021344.tif 000018
【００７２】
このような２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸は、非特許文献１〜４または６に記載の方法によって任意のヌクレオシド（天然型あるいは非架橋型）から２’，４’−架橋型ヌクレオシドを調製し、さらに非特許文献５に記載の方法に従って三リン酸化することによって調製することができる。２’，４’−架橋型ヌクレオシドは、市販のものを用いてもよい。
【００７３】
本発明の方法では、少なくとも３つの塩基からなる核酸と、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）と、２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸とを混合してインキュベートする工程により、ヌクレアーゼ耐性核酸を調製することができる。
【００７４】
このインキュベートする工程において、耐性を付与すべき核酸に対する、２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸の量は特に限定されないが、効率よく確実に核酸の３’末端に付加するために過剰量であることが好ましい。また、ＴｄＴの使用量も特に限定されず、核酸の量に応じて適宜設定され得る。反応液の組成も、ＴｄＴの活性が発揮されれば特に限定されない。市販のＴｄＴを用いる場合は、ＴｄＴに添付されているバッファー溶液を用いることが好ましい。
【００７５】
また、インキュベート条件も、通常ＴｄＴの活性を発揮させるに適する条件であれば、特に限定されず、用いるＴｄＴに応じて適宜設定される。例えば、インキュベート温度は、３０℃〜４０℃、好適には３７℃であり得る。インキュベート時間も、ＴｄＴの量、核酸および２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸の量に応じて適宜設定される。
【００７６】
このようにして、入手の容易なＴｄＴと、２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸とを用いて、当業者が一般的に用いる条件下でインキュベートするという極めて簡単な操作により、任意の核酸の３’末端に２’，４’−架橋型ヌクレオチドを付加することができる。
【００７７】
また、ヌクレアーゼ耐性核酸の調製のために、２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸とＴｄＴとは、キットの形態で提供されてもよい。このようなキットには、上記のインキュベートを行うために適切なバッファー溶液、使用指示書なども含まれ得る。
【００７８】
上記方法により得られる生成物は、以下の式Ｉ’、式ＩＩ’または式ＩＩＩ’
【００７９】
【化１８】
2010021344.tif 000019
【００８０】
【化１９】
2010021344.tif 000020
【００８１】
【化２０】
2010021344.tif 000021
【００８２】
を３’末端に有する核酸である。
【００８３】
これらの２’，４’−架橋型ヌクレオチドが付加した核酸は、ヌクレアーゼに対する耐性が付与された新規な核酸である。したがって、ヌクレアーゼが存在するインビボにおいて、所望の核酸の機能をより効果的に発揮させることができる。
【実施例】
【００８４】
(参考調製例１：５−メチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンウリジン−５’−三リン酸（ＫＴＰ）の調製)【００８５】
【化２１】
2010021344.tif 000022
【００８６】
非特許文献５の記載に従ってＫＴＰを調製した。まず、５−メチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンウリジン（ヌクレオシド１：非特許文献６に従って合成）（１００ｍｇ，０．３７０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，８−ナフタレンジアミン（Proton Sponge（登録商標）：１１９ｍｇ；０．５５５ｍｍｏｌ；１．５当量）をフラスコに入れ、真空下で一晩乾燥させた。次いで、トリメチルリン酸（２．６ｍＬ）をアルゴン雰囲気下でフラスコに入れ、混合物を０℃まで冷却した。次いで、オキシ塩化リン（４２μＬ；０．４４４ｍｍｏｌ；１．２当量）を滴下し、反応混合物を０℃にて攪拌した。４５分後、ｎ−トリブチルアミン（３２８μＬ；１．３７ｍｍｏｌ；３．７当量）およびｎ−ピロリン酸ｎ−トリブチルアミン（０．５ＭのＤＭＦ溶液を３．７ｍＬ；１．８５ｍｍｏｌ；５当量）を０℃にて添加し、反応混合物を室温まで温め、さらに１時間攪拌した後、炭酸水素トリエチルアンモニウム（１．０Ｍ水溶液）で反応をクエンチした。溶媒を真空下で除去し、そして残渣を水に溶解した。この残渣を、０．０５〜１．０Ｍの炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ８）の直線グラジエントでＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＤＥＡＥ  Ａ−２５カラムを用いて精製した。対応する画分を合わせ、減圧下でエバポレートした。過剰のピロリン酸を除去するために、残渣を、１０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７）中０％(v/v)〜２０％(v/v)アセトニトリルの直線グラジエントでの逆相ＭＰＬＣにより精製した。さらなる精製を、５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液中０％(v/v)〜４．９％(v/v)アセトニトリルの直線グラジエントでの逆相ＨＰＬＣ（φ２０×２５０ｍｍ）で行い、架橋型ヌクレオシド三リン酸ＫＴＰを得た（２４．８μｍｏｌ：収率６．７％）。【００８７】
得られたＫＴＰのスペクトルデータは、以下のとおりであった：1H NMR (500 MHz, D2O)δ7.55 (s, 1H), 5.48 (s, 1H), 4.36-4.12 (m, 4H), 3.95-3.75 (m, 2H), 1.75 (s, 3H)；31P NMR (500 MHz, D2O)δ-10.35 (d), -11.17 (d), -22.81 (t)；ESI-MS（ネガティブイオンモード）m/z，実測値＝508.8，計算値 [(M-H)-]＝508.98。【００８８】
(調製例１：５−メチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−（メチレンオキシメチレン）ウリジン−５’−三リン酸（ＬＴＰ）の調製)【００８９】
【化２２】
2010021344.tif 000023
【００９０】
非特許文献５の記載に従ってＬＴＰを調製した。ヌクレオシド１の代わりに５−メチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−（メチレンオキシメチレン）ウリジン（ヌクレオシド２：非特許文献２に従って合成）（１０６ｍｇ，０．３５３ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は、上記参考調製例１と同様の手順で、架橋型ヌクレオシド三リン酸ＬＴＰを得た（１８．７μｍｏｌ：収率５．３％）。【００９１】
得られたＬＴＰのスペクトルデータは、以下のとおりであった：1H NMR (500 MHz, D2O)δ7.67 (s, 1H), 5.84 (s, 1H), 5.06-4.99 (m, 2H), 4.49-4.48 (m, 1H), 4.30-4.23 (m, 1H), 4.30-4.23 (m, 1H), 4.13-3.97 (m, 2H), 3.73-3.65 (m, 2H), 1.75 (s, 3H)；31P NMR (500 MHz, D2O)δ-12.42 (d), -14.44 (d), -25.39 (t)；ESI-MS（ネガティブイオンモード）m/z，実測値＝538.8，計算値[(M-H)-]＝538.99。【００９２】
(調製例２：５−メチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−（アミノメチレン）ウリジン−５’−三リン酸（ＭＴＰ）の調製)【００９３】
【化２３】
2010021344.tif 000024
【００９４】
非特許文献５の記載に従ってＭＴＰを調製した。まず、トリエチルアミン三フッ化水素（３１３μＬ；１．９１ｍｍｏｌ；５当量）を、ヌクレオシド３（非特許文献４に従って合成）（２０１ｍｇ；０．３８１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（４．１ｍＬ）に攪拌しながら加えた。反応混合物を、室温で３時間攪拌した。エバポレーション後、残渣を、逆相カラムクロマトグラフィー（０％(v/v)〜５％(v/v)のアセトニトリル水溶液）により精製した。ヌクレオシド４を含む残渣を、メタノールに溶解し、結晶化して、ヌクレオシド４を定量的収率で得た（１０８ｍｇ；０．３７９ｍｍｏｌ）。【００９５】
得られたヌクレオシド４のスペクトルデータは、以下のとおりであった：1H NMR (300MHz, CD3OD)δ8.13 (d, J = 1 Hz, 1H), 6.24 (s, 1H), 4.23 (d, J = 3 Hz, 1H), 4.16 (d, J = 3 Hz, 1H), 3.71 (q, J = 13 Hz, 2H), 3.55 (d, J = 12 Hz, 1H), 2.51 (d, J = 13 Hz, 1H), 1.87 (d, J = 1 Hz, 3H)；ESI-MS（ポジティブイオンモード）m/z，実測値＝308.1，計算値[(M+Na)+]＝308.1。【００９６】
次いで、ヌクレオシド１の代わりにヌクレオシド４（５７．８ｍｇ，０．２０３ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は、上記参考調製例１と同様の手順で、架橋型ヌクレオシド三リン酸ＭＴＰを得た（３．１９μｍｏｌ：収率１．６％）。【００９７】
得られたＭＴＰのスペクトルデータは、以下のとおりであった：1H NMR (500 MHz, D2O)δ7.75 (s, 1H), 6.06 (s, 1H), 4.36-4.33 (m, 1H), 4.14-3.95 (m, 3H), 3.50 (d, J = 13 Hz, 1H), 2.71 (d, J = 14 Hz, 1H), 1.75 (s, 3H); 31P NMR (500 MHz, D2O)δ-13.51 (d), -14.46 (d), -25.90 (t)；ESI-MS（ネガティブイオンモード）m/z，実測値＝523.9，計算値[(M-H)-]＝524.0。【００９８】
（実施例１：末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）による架橋型ヌクレオチドのＤＮＡ３’末端への付加反応）
５’末端を蛍光標識化した２６ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡ（ggcgttgagtgagtgaatgagtgagt：配列番号１）（ＯＤＮ１；０．４μＭ）（株式会社日本バイオサービスより購入）、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ；０．１２５、０．１５０、または０．１７５ユニット／μＬ）（タカラバイオ株式会社より購入）、この酵素に添付のバッファー溶液（１×）および２００μＭの上記調製例１〜３で得た架橋型ヌクレオシド三リン酸（ＫＴＰ、ＬＴＰまたはＭＴＰ）を含む２０μＬの反応液をそれぞれ調製し、３７℃で６０分間インキュベートした。反応終了後、反応液に０．４μＬの色素液（０．１％(v/v)ブロモフェノールブルー）および２．４μＬの７Ｍの尿素溶液（３ｍＭのＥＤＴＡ）を加えた後、９４℃で熱変性させ、２０％(w/v)ポリアクリルアミド変性ゲルを用いて電気泳動を行った（変性ＰＡＧＥ；３００Ｖ、４９℃、１５０分）。泳動後、モレキュラー・イメージャー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてレーザー照射（４８８ｎｍ）し、ゲルを可視化した。得られたゲルの写真を図１に示す。【００９９】
図１からわかるように、一本鎖ＤＮＡ（ＯＤＮ１）を架橋型ヌクレオシド三リン酸とＴｄＴとで処理することにより、分子量がわずかに大きなＤＮＡ、すなわち、架橋型ヌクレオチドが付加されたＤＮＡが得られることがわかった。また、この付加されたＤＮＡは、酵素ＴｄＴの用量依存的に生じることもわかった。【０１００】
（調製例３：５−メチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−（ベンジルオキシメチレン）ウリジン−５’−三リン酸（ＱＴＰ）の調製）【０１０１】
【化２４】
2010021344.tif 000025
【０１０２】
非特許文献７〜９に従って、ヌクレオシド５からヌクレオシド６を合成した。窒素気流下、得られたヌクレオシド６（３７０ｍｇ；０．６９８ｍｍｏｌ）の無水ベンズアルデヒド溶液（３．７ｍＬ）に塩化亜鉛（１１４ｍｇ；０．８３８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１４時間攪拌した。氷冷下、飽和重曹水を加えて酢酸エチルで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒留去後、得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝３：１(v/v)）により精製し、ヌクレオシド７（３３８ｍｇ：収率７８％）を白色泡状物質として得た。【０１０３】
得られたヌクレオシド７の物性データは、以下のとおりであった：融点：103〜105℃；[α]D26 −7.5 (c 1.00, CHCl3)；IR νmax (KBr)：1271, 1464, 1693, 2868, 2946, 3035, 3176 cm-1；1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ1.08-1.12 (28H, m), 1.92 (3H, d, J = 1 Hz), 3.70 (1H, d, J = 13 Hz), 3.76 (1H, d, J = 13 Hz), 3.93 (1H, d, J = 12 Hz), 4.05 (1H, d, J = 13 Hz), 4.43 (1H, d, J = 6 Hz), 4.71 (1H, d, J = 6 Hz), 6.22 (1H, s), 6.24 (1H, s), 7.36-7.64 (6H, m), 8.02 (1H, brs)；13C NMR (67.8 MHz, CDCl3): δ12.4, 12.6, 12.6, 12.7, 13.4, 16.9, 17.1, 17.2, 17.2, 17.3, 17.4, 60.2, 68.8, 70.6, 79.0, 88.9, 92.7, 103.9, 110.1, 126.1, 128.3, 128.9, 135.5, 139.1, 149.7, 163.9；MS (FAB): m/z 619 (M+H)+；HRMS (FAB)：計算値 C30H47N2O8Si2[(M+H)+]＝619.2871, 実測値＝619.2908。【０１０４】
次いで、ヌクレオチド７（２２．０ｍｇ；０．０３５６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（０．９ｍＬ）に、テトラブチルアンモニウムフルオリド（テトラヒドロフラン中１．０Ｍ；０．０７１２ｍｌ；０．０７１２ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下で１時間攪拌した。溶媒留去後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル）により精製し、ヌクレオシド８（１２．９ｍｇ：収率９６％）を白色固体として得た。【０１０５】
得られたヌクレオシド８の物性データは、以下のとおりであった：融点：122〜125℃；[α]D24 ＋17.9 (c 1.00, メタノール)；IR νmax (KBr)：1273, 1470, 1694, 3348 cm-1；1H NMR (270 MHz, CD3OD)：δ1.87 (3H, d, J = 1 Hz), 3.69 (1H, d, J = 12 Hz), 3.77 (1H, d, J = 12 Hz), 3.78 (1H, d, J = 13 Hz), 3.97 (1H, d, J = 13 Hz), 4.30 (1H, d, J = 6 Hz), 4.59 (1H, d, J = 6 Hz), 6.26 (1H, s), 6.32 (1H, s), 7.31-7.50 (5H, m), 7.95 (1H, d, J = 1 Hz)；13C NMR (67.8 MHz, CD3OD)：δ12.6, 60.9, 69.3, 71.6, 81.2, 90.5, 93.2, 104.7, 110.8, 127.3, 129.1, 129.6, 137.8, 141.4, 152.2, 166.5；MS (FAB): m/z 377 (M+H)+；HRMS (FAB)：計算値 C18H21N2O7[(M+H)+]＝377.1349, 実測値＝377.1366。【０１０６】
次に、ヌクレオシド１の代わりにヌクレオシド８（１０６ｍｇ；０．２８２ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は、上記参考調製例１と同様の手順で、架橋型ヌクレオシド三リン酸ＱＴＰを得た（６．５８０μｍｏｌ：収率２．３％）。【０１０７】
得られたＱＴＰのスペクトルデータは、以下のとおりであった：31P NMR (500MHz，D2O)，-10.56(d), -11.369(d), -22.94(t)；ESI-MS（ネガティブイオンモード）m/z, 実測値＝615.1，計算値[(M-H)-]＝615.03。【０１０８】
（実施例２：架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加された一本鎖ＤＮＡのヌクレアーゼ耐性の評価）
上記実施例１と同様の手順で架橋型ヌクレオチドＫＴＰ、ＬＴＰ、ＭＴＰ、およびＱＴＰをそれぞれ３’末端に付加した一本鎖ＤＮＡ（それぞれＯＤＮ１＃Ｋ、ＯＤＮ１＃Ｌ、ＯＤＮ１＃ＭおよびＯＤＮ１＃Ｑという）および未処理の一本鎖（ＯＤＮ１）のうち、いずれか１つの一本鎖ＤＮＡを含む水溶液（１μＭ）を２μＬと、蛇毒ホスホジエステラーゼＩを含む水溶液（２５μユニット／μＬ）を２μＬと、５×濃度の反応緩衝液（２５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０）を１μＬとを混ぜ合わせた反応液（５μＬ）を調製し、３７℃でインキュベートし、反応開始１０分後、２０分後、３０分後、６０分後、および１２０分後に反応液をそれぞれ取り出した。取り出した反応液に色素液（０．１％(v/v) ブロモフェノールブルー）および７Ｍの尿素溶液（３ｍＭのＥＤＴＡ）を加えた後、９４℃で熱変性させ、２０％(w/v)ポリアクリルアミド変性ゲルを用いて電気泳動を行った（変性ＰＡＧＥ；３００Ｖ、４９℃、１３０分）。泳動後、モレキュラー・イメージャー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてレーザー照射（４８８ｎｍ）し、ゲルを可視化した。得られたゲル写真（図２）におけるバンド強度より、未反応の一本鎖ＤＮＡの割合（％）を算出し、反応時間に対してプロットした（図３）。【０１０９】
図２および３から明らかなように、架橋型ヌクレオチドＬＴＰ、ＭＴＰ、およびＱＴＰが付加したＤＮＡ（それぞれＯＤＮ１＃Ｌ、ＯＤＮ１＃ＭおよびＯＤＮ１＃Ｑ）はいずれも、未処理のＯＤＮ１およびＯＤＮ１＃Ｋ（特許文献１に記載のヌクレオチド）よりも残存率が高く、エキソヌクレアーゼ（蛇毒ホスホジエステラーゼＩ）によって分解されにくかった。このように、ＤＮＡを架橋型ヌクレオチドとＴｄＴとで処理することによって、簡単に高いヌクレアーゼ耐性を付与することができることがわかった。【０１１０】
（実施例３：架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加されたトロンビン結合ＤＮＡアプタマーのヌクレアーゼ耐性の評価）
上記実施例１と同様の手順で、トロンビン結合ＤＮＡアプタマー（ＴＢＡ：Thrombin Binding Aptamer、シグマ−アルドリッチ社より購入）に、架橋型ヌクレオチドＫＴＰ、ＬＴＰ、ＭＴＰ、およびＱＴＰをそれぞれ３’末端に付加した（それぞれＴＢＡ１＃Ｋ、ＴＢＡ１＃Ｌ、ＴＢＡ１＃Ｍ、およびＴＢＡ１＃Ｑという）。なお、用いたトロンビン結合ＤＮＡアプタマー（agtccgtggtagggcaggttggggtgact：配列番号２）は、５’末端がカルボキシフルオレセインで標識化されている。【０１１１】
これらの架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加されたトロンビン結合ＤＮＡアプタマー（それぞれＴＢＡ１＃Ｋ、ＴＢＡ１＃Ｌ、ＴＢＡ１＃ＭおよびＴＢＡ１＃Ｑという）および未修飾のトロンビン結合ＤＮＡアプタマー（ＴＢＡ１）のうち、いずれか１つのＤＮＡアプタマーを含む水溶液（１μＭ）を２μＬと、蛇毒ホスホジエステラーゼＩを含む水溶液（２５μユニット／μＬ）を２μＬと、５×濃度の反応緩衝液（２５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５％(w/v）のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）を１μＬとを混ぜ合わせた反応液（５μＬ）を調製し、３７℃でインキュベートし、反応開始１０分後、２０分後、３０分後、６０分後および１２０分後に反応液をそれぞれ取り出した。取り出した反応液に色素液（０．１％(v/v)ブロモフェノールブルー）および７Ｍの尿素溶液（９ｍＭのＥＤＴＡ）を加えた後、９４℃で熱変性させ、２０％(w/v)ポリアクリルアミド変性ゲルを用いて電気泳動を行った（変性ＰＡＧＥ；３００Ｖ、４９℃、１３０分）。泳動後、モレキュラー・イメージャー（BioRad社製）を用いてレーザー照射（４８８ｎｍ）し、ゲルを可視化した。得られたゲル写真におけるバンド強度より未反応の一本鎖ＤＮＡの割合（％）を算出し、反応時間に対してプロットした。結果を図４に示す。【０１１２】
図４から明らかなように、架橋型ヌクレオチドＬＴＰ、ＭＴＰ、およびＱＴＰとＴｄＴとで処理したＤＮＡ（それぞれＴＢＡ１＃Ｌ、ＴＢＡ１＃ＭおよびＴＢＡ１＃Ｑ）はいずれも、未処理のＴＢＡ１およびＴＢＡ＃Ｋよりも残存率が高く、エキソヌクレアーゼ（蛇毒ホスホジエステラーゼＩ）によって分解されにくかった。特に、ＭＴＰおよびＱＴＰを用いて３’末端に架橋型ヌクレオチドを付加したＤＮＡ（ＴＢＡ１＃ＭおよびＴＢＡ１＃Ｑ）の残存率が高かった。【０１１３】
（実施例４：架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加されたトロンビン結合ＤＮＡアプタマーの血清中における安定性の評価）
上記実施例３と同様に調製した架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加されたトロンビン結合ＤＮＡアプタマー（ＴＢＡ１＃Ｋ、ＴＢＡ１＃Ｌ、ＴＢＡ１＃Ｍ、およびＴＢＡ１＃Ｑ）および未修飾のトロンビン結合ＤＮＡアプタマー（ＴＢＡ１）のうちのいずれか１つのＤＮＡアプタマーを含む水溶液（４μＭ）を０．５μＬと、血清（ヒト男性ＡＢ型血漿：シグマ−アルドリッチ社）を４μＬと、１０×濃度の反応緩衝液（５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０）を０．５μＬとを混ぜ合わせた反応液（５μＬ）を調製し、３７℃でインキュベートし、反応開始１０分後、２０分後、３０分後、６０分後、１２０分後、２４０分後、および４８０分後に反応液をそれぞれ取り出した。取り出した反応液に色素液（０．１％(v/v)ブロモフェノールブルー）および７Ｍの尿素溶液（３ｍＭのＥＤＴＡ）を加えた後、９４℃で熱変性させ、２０％(w/v)ポリアクリルアミド変性ゲルを用いて電気泳動を行った（変性ＰＡＧＥ；３００Ｖ、４９℃、１３０分）。泳動後、モレキュラー・イメージャー（BioRad社製）を用いてレーザー照射（４８８ｎｍ）し、ゲルを可視化した。得られたゲル写真におけるバンド強度より未反応の一本鎖ＤＮＡの割合（％）を算出し、反応時間に対してプロットした。結果を図５に示す。【０１１４】
図５から明らかなように、種々のヌクレアーゼが存在している血清中においても、架橋型ヌクレオチドＬＴＰ、ＭＴＰ、およびＱＴＰとＴｄＴとで処理したＤＮＡ（それぞれＴＢＡ１＃Ｌ、ＴＢＡ１＃ＭおよびＴＢＡ１＃Ｑ）はいずれも、未処理のＴＢＡ１およびＴＢＡ＃Ｋよりも残存率が高く、ヌクレアーゼ耐性を示した。【０１１５】
（実施例５：架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加されたトロンビン結合ＤＮＡアプタマーのトロンビンに対する結合親和性の評価）
上記実施例３と同様に調製した架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加されたトロンビン結合ＤＮＡアプタマー（ＴＢＡ１＃Ｋ、ＴＢＡ１＃Ｌ、ＴＢＡ１＃Ｍ、およびＴＢＡ１＃Ｑ）および未修飾のトロンビン結合ＤＮＡアプタマー（ＴＢＡ１）のうちのいずれか１つのＤＮＡアプタマー（１０ｎＭ）、ヒト血漿由来トロンビン（４０ｎＭ：SIGMA社）およびインキュベーションバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）を含む反応液を調製し、３７℃で３０分間インキュベートした。【０１１６】
インキュベート後の反応液を、それぞれキャピラリー電気泳動にかけた。電気泳動の条件は、以下のとおりであった。キャピラリー電気泳動には、BECKMAN COULTER, P/ACETM MDQ装置を用いた。カートリッジの温度を２５℃、そしてサンプルストレージを１５℃に設定した。検出は蛍光検出器で行い、励起波長を４８８ｎｍおよびモニター波長を５２０ｎｍに設定した。キャピラリーは、内径７５μｍ（BECKMAN COULTER社製）のキャピラリーを長さ３０．２ｃｍ（ウィンドウまでの長さは２０ｃｍ）に調整して用いた。ランニングバッファーは、０．４％(w/v)ホウ酸バッファー（０．３％(w/v)ホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．３５：BECKMAN COULTER社製）を用いた。【０１１７】
まず、キャピラリー内をランニングバッファーで置換（２０ｐｓｉ、２分）した後、サンプルをインジェクト（０．５ｐｓｉ、３．９秒、３０．５ｎＬ）し、１２ｋＶで４分間泳動した。各トロンビン結合ＤＮＡアプタマーについて得られたエレクトログラムを図６に示す。【０１１８】
図６に示すエレクトログラムにおいて、移動時間が２分付近のピークは、各ＴＢＡとトロンビンとの複合体であり、移動時間が３分付近のピークは、各ＴＢＡの遊離体であった。なお、ＴＢＡ１＃Ｍについてのみ、複合体と遊離体との間（２．６分付近）に第３のピークが出現したが、これは、泳動中にトロンビンから解離した遊離のＴＢＡ１＃Ｍが複合体との相互作用により何らかの高次構造をとっているためと考えられる。したがって、このピークについては、複合体とみなした。【０１１９】
エレクトログラムから解離定数Ｋｄを、M.V. Berezovskiら、Nature Protocols，2006年，1巻，3号，1362頁に記載のように、以下の式により算出した。また、算出したＫｄを以下の表１に示す。【０１２０】
【数１】
2010021344.tif 000026
【０１２１】
式中、
[Ｔ]tot：総トロンビン濃度
[ＤＮＡ]tot：総ＴＢＡ濃度
Ａ１：遊離のＴＢＡのピーク面積
Ａ２：複合体から解離したＴＢＡのピーク面積
Ａ３：複合体のピーク面積。【０１２２】
【表１】
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【０１２３】
表１からわかるように、架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加されていないＴＢＡ１におけるＫｄ値と、架橋型ヌクレオチドが３’末端に付加したＴＢＡにおけるＫｄ値との間に大きな差はなく、ほぼ同等であることがわかった。したがって、３’末端に架橋型ヌク
レオチドが付加されても、アプタマーの機能にはほとんど影響がないことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明によれば、アンチセンスＤＮＡ分子、アンチジーンＤＮＡ分子、ＤＮＡアプタマー、ＤＮＡザイム、ｓｉＲＮＡなどの種々の機能性核酸への架橋型ヌクレオチドの酵素的付加によって、それらの核酸分子のヌクレアーゼ耐性を簡便に向上させることが可能である。そのため、ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡを分子標的としたゲノムテクノロジー（アンチセンス法、アンチジーン法、ＲＮＡｉ、デコイ法、遺伝子相同組換え、リボザイム、ＤＮＡ酵素など）に有用である。したがって、核酸医薬品開発や診断システムなどの共通基盤材料として、基礎生物化学の研究用ツール、医薬品、診断薬、分析試薬などのゲノム研究試薬の開発・調製に利用され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年1月27日(2010.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法であって、
少なくとも３つの塩基からなる核酸と、末端デオキシヌクレオチド転移酵素と、２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸とを混合してインキュベートする工程を含み、
該２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸が、以下の式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩ：
【化１】
2010021344.tif 000044
【化２】
2010021344.tif 000045
【化３】
2010021344.tif 000046
（式中、
Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
ｍは、１から５の整数であり；そして
ｎは、１から５の整数である）
で表される構造を有する、方法。
【請求項２】
前記式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩにおいて、前記Ｂａｓｅが、６−アミノプリン−９−イル基、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２，４−ジヒドロキシピリミジン−１−イル基、２，４−ジヒドロキシ−５−メチルピリミジン−１−イル基、または４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記式ＩＩにおいて、前記Ｒが、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩにおいて、前記ｍが１であり、そして前記ｎが１である、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項５】
前記式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩにおいて、前記Ｂａｓｅが、２，４−ジヒドロキシ−５−メチルピリミジン−１−イル基である、請求項１から４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項６】
前記式ＩＩＩにおいて、前記Ｒ１およびＲ２のいずれか一方が、水素原子である、請求項１から５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項７】
前記式ＩＩＩにおいて、前記Ｒ１およびＲ２のいずれか一方が、フェニル基である、請求項１から６のいずれかの項に記載の方法。
【請求項８】
末端デオキシヌクレオチド転移酵素、および２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸を含む、ヌクレアーゼ耐性核酸の調製用キットであって、
該２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸が、以下の式Ｉ、式ＩＩまたは式ＩＩＩ：
【化４】
2010021344.tif 000047
【化５】
2010021344.tif 000048
【化６】
2010021344.tif 000049
（式中、
Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
ｍは、１から５の整数であり；そして
ｎは、１から５の整数である）
で表される構造を有する、キット。
【請求項９】
以下の式ＩＩＩで表される２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸：
【化７】
2010021344.tif 000050
（式中、
Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
そして
ｎは、１から５の整数である）。
【請求項１０】
以下の式Ｉ’、式ＩＩ’または式ＩＩＩ’で表される２’，４’−架橋型ヌクレオチド：
【化８】
2010021344.tif 000051
【化９】
2010021344.tif 000052
【化１０】
2010021344.tif 000053
（式中、
Ｂａｓｅは、以下のα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表し；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルキニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を有するスルホニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表すか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい炭素数２から１０のアルキレン基またはアルケニレン基を表し、ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素原子ではなく；
そして
ｎは、１から５の整数である）
を３’末端に有する、ヌクレアーゼ耐性核酸。
【請求項１１】
請求項１から７のいずれかの項に記載の方法により調製された、ヌクレアーゼ耐性核酸。
【請求項１２】
前記２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸が、前記式ＩＩＩで表される構造を有し、該式ＩＩＩにおいて、前記Ｒ１およびＲ２のいずれか一方がフェニル基であり、そして他方が水素原子であり、そして前記ｎが１である、請求項１から７のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１３】
前記２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸が、前記式ＩＩＩで表される構造を有し、該式ＩＩＩにおいて、前記Ｒ１およびＲ２のいずれか一方がフェニル基であり、そして他方が水素原子であり、そして前記ｎが１である、請求項８に記載のキット。
【請求項１４】
前記Ｒ１およびＲ２のいずれか一方がフェニル基であり、そして他方が水素原子であり、そして前記ｎが１である、請求項９に記載の２’，４’−架橋型ヌクレオシド三リン酸。
【請求項１５】
前記２’，４’−架橋型ヌクレオチドが、前記式ＩＩＩ’で表される構造を有し、該式ＩＩＩ’において、前記Ｒ１およびＲ２のいずれか一方がフェニル基であり、そして他方が水素原子であり、そして前記ｎが１である、請求項１０に記載のヌクレアーゼ耐性核酸。
【請求項１６】
請求項１２に記載の方法により調製された、ヌクレアーゼ耐性核酸。
【国際調査報告】
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