(57)【要約】  より簡便に且つより細胞毒性が低減された状態で、ポリヌクレオチドを細胞内に導入する技術を提供することを課題し、該課題を、ジスルフィド結合及び／又はチオール基を含む構造を含む分子で修飾されたポリヌクレオチドにより解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（1）：
【化１】
2019039403.tif 000023
［式中、R1及びR2は同一又は異なって、単結合、又は−S−S−及び−SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい二価の基を示す。R3は、−O−、又は−O−R31（式中、R31は、−S−S−及び−SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい一価の基を示す。）を示す。Z1及びZ2は同一又は異なって、−O−又は−NH−を示す。但し、R1、R2、及びR3の内の少なくとも1つは−S−S−及び−SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含む。nは任意の整数を示す。］
で表される構造を含む分子で修飾されてなる、修飾ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記R1がアルキレン基、又は環構造中に−S−S−を有する環由来の基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が−O−、又は−O−R31a−S−S−R31b（式中、R31aはアルキレン基又は−R311a−NH−COO−R312a−（R311a及びR312aは同一又は異なって、アルキレン基を示す。）を示す。R31bは保護基を示す。）である、請求項１に記載の修飾ポリヌクレオチド。
【請求項３】
（A）前記R1がアルキレン基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が−O−R31a−S−S−R31b（式中、R31aはアルキレン基又は−R311a−NH−COO−R312a−（R311a及びR312aは同一又は異なって、アルキレン基を示す。）を示す。R31bは保護基を示す。）である、或いは
（B）前記R1が環構造中に−S−S−で表される基を有する環由来の基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が−O−である、
請求項１又は２に記載の修飾ポリヌクレオチド。
【請求項４】
（A1）前記R1が炭素原子数が3〜6のアルキレン基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が−O−R31a−S−S−R31b（式中、R31aは炭素原子数が3〜6のアルキレン基又は−R311a−NH−COO−R312a−（R311a及びR312aは同一又は異なって、炭素原子数が2〜6のアルキレン基を示す。）を示す。R31bはアルキル基又はアリール基を示す。）である、或いは
（B1）前記R1が環構造中に−S−S−で表される基を有する4〜8員環由来の基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が−O−である、
請求項１〜３のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記nが1〜30である、請求項１〜４のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記Z1及び前記Z2が共に−O−である、請求項１〜５のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
【請求項７】
ポリヌクレオチドが、細胞内への導入用のポリヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
【請求項８】
ポリヌクレオチドが、アンチセンスポリヌクレオチド、siRNA、miRNA、miRNA前駆体、アプタマー、ガイドRNA、mRNA、ノンコーディングRNA、DNA、非天然核酸(LNA、PNA、モルフォリノ核酸からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１〜７のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
【請求項９】
ポリヌクレオチドの塩基長が200塩基長以下である、請求項１〜８のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドの末端に前記一般式（1）で表される構造が連結されてなる、請求項１〜９のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドの5´末端に前記一般式（1）で表される構造が連結されてなる、請求項１〜１０のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチドを含有する、該修飾ポリヌクレオチドの細胞内への導入剤。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチドを含有する、医薬。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチドを含有する、試薬。
【請求項１５】
一般式（1）：
【化２】
2019039403.tif 000024
［式中、R1及びR2は同一又は異なって、単結合、又は−S−S−及び−SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい二価の基を示す。R3は、−O−、又は−O−R31（式中、R31は、−S−S−及び−SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい一価の基を示す。）を示す。Z1及びZ2は同一又は異なって、−O−又は−NH−を示す。但し、R1、R2、及びR3の内の少なくとも1つは−S−S−及び−SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含む。nは任意の整数を示す。］
で表される構造を含むポリヌクレオチド修飾用分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾ポリヌクレオチド等に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療分野等においては、siRNA等のポリヌクレオチドを細胞内に導入して、その機能を発現させる技術の開発が進められている。ポリヌクレオチドはリン酸基の存在により負に帯電しているので、同じく負に帯電している細胞膜を透過する効率が低い。このため、ポリヌクレオチドを細胞内に導入する場合、ポリヌクレオチドをカチオン性脂質と複合体化し、これを細胞内に導入することにより、導入効率を高めることが行われている（特許文献１）。【０００３】
ただ、カチオン性脂質を用いる場合、細胞内への導入前にポリヌクレオチドと複合体化する作業を要する。また、カチオン性脂質には細胞毒性があることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表第2002-529439号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、より簡便に且つより細胞毒性が低減された状態で、ポリヌクレオチドを細胞内に導入する技術を提供することを課題とする。好ましくは、本発明は、より効率的に、ポリヌクレオチドを細胞内に導入する技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究をした結果、ジスルフィド結合及び／又はチオール基を含む構造を含む分子で修飾されたポリヌクレオチドであれば、カチオン性脂質との複合体形成のような煩雑な操作を要さず、単に該修飾ポリヌクレオチドを細胞培養培地に添加することにより、より効率的に細胞内に導入されることを見出した。また、該修飾ポリヌクレオチドは、細胞毒性がより低いことをも見出した。本発明者はこれらの知見に基づいてさらに研究を進め、本発明を完成させた。【０００７】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する。【０００８】
項１．  一般式（1）：【０００９】
【化１】
2019039403.tif 000002
【００１０】
［式中、R1及びR2は同一又は異なって、単結合、又は−S−S−及び−SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい二価の基を示す。R3は、−O−、又は−O−R31（式中、R31は、−S−S−及び−SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい一価の基を示す。）を示す。Z1及びZ2は同一又は異なって、−O−又は−NH−を示す。但し、R1、R2、及びR3の内の少なくとも1つは−S−S−及び−SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含む。nは任意の整数を示す。］
で表される構造を含む分子で修飾されてなる、修飾ポリヌクレオチド。【００１１】
項２．  前記R1がアルキレン基、又は環構造中に−S−S−を有する環由来の基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が−O−、又は−O−R31a−S−S−R31b（式中、R31aはアルキレン基又は−R311a−NH−COO−R312a−（R311a及びR312aは同一又は異なって、アルキレン基を示す。）を示す。R31bは保護基を示す。）である、項１に記載の修飾ポリヌクレオチド。【００１２】
項３．  （A）前記R1がアルキレン基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が−O−R31a−S−S−R31b（式中、R31aはアルキレン基又は−R311a−NH−COO−R312a−（R311a及びR312aは同一又は異なって、アルキレン基を示す。）を示す。R31bは保護基を示す。）である、或いは
（B）前記R1が環構造中に−S−S−で表される基を有する環由来の基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が−O−である、
項１又は２に記載の修飾ポリヌクレオチド。【００１３】
項４．  （A1）前記R1が炭素原子数が3〜6のアルキレン基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が−O−R31a−S−S−R31b（式中、R31aは炭素原子数が3〜6のアルキレン基又は−R311a−NH−COO−R312a−（R311a及びR312aは同一又は異なって、炭素原子数が2〜6のアルキレン基を示す。）を示す。R31bはアルキル基又はアリール基を示す。）である、或いは
（B1）前記R1が環構造中に−S−S−で表される基を有する4〜8員環由来の基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が−O−である、
項１〜３のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。【００１４】
項５．  前記nが1〜30である、項１〜４のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。【００１５】
項６．  前記Z1及び前記Z2が共に−O−である、項１〜５のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。【００１６】
項７．  ポリヌクレオチドが、細胞内への導入用のポリヌクレオチドである、項１〜６のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。【００１７】
項８．  ポリヌクレオチドが、アンチセンスポリヌクレオチド、siRNA、miRNA、miRNA前駆体、アプタマー、ガイドRNA、mRNA、ノンコーディングRNA、DNA、非天然核酸(LNA、PNA、モルフォリノ核酸からなる群より選択される少なくとも1種である、項１〜７のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。【００１８】
項９．  ポリヌクレオチドの塩基長が200塩基長以下である、項１〜８のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。【００１９】
項１０．  ポリヌクレオチドの末端に前記一般式（1）で表される構造が連結されてなる、項１〜９のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。【００２０】
項１１．  ポリヌクレオチドの5´末端に前記一般式（1）で表される構造が連結されてなる、項１〜１０のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。【００２１】
項１２．  項１〜１１のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチドを含有する、該修飾ポリヌクレオチドの細胞内への導入剤。【００２２】
項１３．  項１〜１１のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチドを含有する、医薬。【００２３】
項１４．  項１〜１１のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチドを含有する、試薬。【００２４】
項１５．  一般式（1）：【００２５】
【化２】
2019039403.tif 000003
【００２６】
［式中、R1及びR2は同一又は異なって、単結合、又は−S−S−及び−SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい二価の基を示す。R3は、−O−、又は−O−R31（式中、R31は、−S−S−及び−SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい一価の基を示す。）を示す。Z1及びZ2は同一又は異なって、−O−又は−NH−を示す。但し、R1、R2、及びR3の内の少なくとも1つは−S−S−及び−SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含む。nは任意の整数を示す。］
で表される構造を含むポリヌクレオチド修飾用分子。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、ジスルフィド結合及び／又はチオール基を含む構造を含む分子で修飾されたポリヌクレオチドを用いることにより、より簡便に且つより細胞毒性が低減された状態で、ポリヌクレオチドを細胞内に導入する技術を提供することができる。本発明の好ましい一態様においては、カチオン性脂質を用いる従来技術よりも効率的に、ポリヌクレオチドを細胞内に導入することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】試験例1の細胞膜透過性試験の結果を示す。横軸中、「N.A.」はポリヌクレオチドを培地に添加していない場合を示し、その他は、実施例又は比較例のポリヌクレオチドをそのまま培地に添加した場合（DNA（比較例1）、PS-DNA（比較例3）、5DTT（実施例1）、10DTT（実施例2）、5ThioL（実施例3）、10ThioL（実施例4））、或いはDNA（比較例1）を核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000）を用いて培地に添加した場合（DNA/Lipo3000）を示す。縦軸は、ポリヌクレオチドに付加されたFAMに由来する蛍光の強度（平均値）の相対値を示す。各カラム上のバーは標準誤差を示す。各カラム上、**は「N.A.」に対するP値が0.01未満であることを示し、***は「N.A.」に対するP値が0.001未満であることを示し、#は「DNA/Lipo3000」に対するP値が0.05未満であることを示し、##は「DNA/Lipo3000」に対するP値が0.01未満であることを示し、###は「DNA/Lipo3000」に対するP値が0.001未満であることを示す。
【図２】試験例2の発現抑制試験の結果を示す。横軸中、「N.A.」はポリヌクレオチドを培地に添加していない場合を示し、その他は、実施例又は比較例のポリヌクレオチドをそのまま培地に添加した場合（DNA（比較例1）、PS-DNA（比較例3）、10ThioL（実施例4））、或いはDNA（比較例1）、R-DNA（比較例2）、又は10ThioL（実施例4）を核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000）を用いて培地に添加した場合（〜/Lipo3000）を示す。縦軸は、ルシフェラーゼ活性比（P. pyralisルシフェラーゼ活性値／Renillaルシフェラーゼ活性値）（平均値）の相対値を示す。各カラム上のバーは標準誤差を示す。各カラム上、*は「N.A.」に対するP値が0.05未満であることを示す。
【図３】試験例3の細胞毒性試験の結果を示す。横軸中、「N.A.」はポリヌクレオチドを培地に添加していない場合を示し、その他は、実施例又は比較例のポリヌクレオチドをそのまま培地に添加した場合（DNA（比較例1）、PS-DNA（比較例3）、5 x DTT（実施例1）、10 x DTT（実施例2）、5 x ThioL（実施例3）、10 x ThioL（実施例4））、或いはDNA（比較例1）を核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000）を用いて培地に添加した場合（DNA/Lipo3000）を示す。縦軸は、吸光度（平均値）の相対値を示す。黒カラムは添加したポリヌクレオチド液中のポリヌクレオチド濃度が1μMである場合を示し、グレーカラムは同濃度が5μMである場合を示す。各カラム上のバーは標準誤差を示す。各カラム上、*は「N.A.」に対するP値が0.05未満であることを示し、**は「N.A.」に対するP値が0.01未満であることを示し、***は「N.A.」に対するP値が0.001未満であることを示す。
【図４】試験例4の細胞膜透過性試験の結果を示す。横軸中、実施例又は比較例のポリヌクレオチドをそのまま培地に添加した場合（PS-DNA（比較例4）、5×tBu（実施例5）、10×tBu（実施例6））、或いはPS-DNA（比較例4）を核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000）を用いて培地に添加した場合（PS-DNA/Lipo）を示す。縦軸は、ポリヌクレオチドに付加されたFAMに由来する蛍光の強度（平均値）を示す。各カラム上のバーは標準誤差を示す。
【図５】試験例5の発現抑制試験の結果を示す。横軸中、「N.A.」はポリヌクレオチドを培地に添加していない場合を示し、その他は、実施例又は比較例のポリヌクレオチドをそのまま培地に添加した場合（PS-DNA（比較例4）、5×tBu（実施例5））、或いはPS-DNA（比較例4）を核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000）を用いて培地に添加した場合（PS-DNA/Lipo）を示す。縦軸は、ルシフェラーゼ活性比（P. pyralisルシフェラーゼ活性値／Renillaルシフェラーゼ活性値）（平均値）の相対値を示す。各カラム上のバーは標準誤差を示す。
【図６】試験例6の細胞毒性試験の結果を示す。横軸中、「N.A.」はポリヌクレオチドを培地に添加していない場合を示し、その他は、実施例又は比較例のポリヌクレオチドをそのまま培地に添加した場合（PS-DNA（比較例4）、5×tBu（実施例5））、或いはPS-DNA（比較例4）を核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000）を用いて培地に添加した場合（PS-DNA/Lipo）を示す。縦軸は、吸光度（平均値）の相対値を示す。各カラム上のバーは標準誤差を示す。
【図７】試験例7の発現抑制試験の結果を示す。横軸中、「N.A.」はポリヌクレオチドを培地に添加していない場合を示し、その他は、実施例又は比較例のポリヌクレオチドをそのまま培地に添加した場合（siRNA（比較例5）、5×ThioL (3’ & 3’)（実施例7）、5×ThioL (3’ & 5’)（実施例8））、或いはsiRNA（比較例5）を核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000）を用いて培地に添加した場合（siRNA/Lipo）を示す。縦軸は、ルシフェラーゼ活性比（P. pyralisルシフェラーゼ活性値／Renillaルシフェラーゼ活性値）（平均値）の相対値を示す。各カラム上のバーは標準誤差を示す。***は「N.A.」に対するP値が0.001未満であることを示す。##は「siRNA/Lipo」に対するP値が0.01未満であることを示す。
【図８】試験例8の細胞膜透過性試験の結果を示す。横軸中、実施例又は比較例のポリヌクレオチドをそのまま培地に添加した場合（PSDNA（比較例6）、5×linker（実施例9））、或いはPSDNA（比較例6）を核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000）を用いて培地に添加した場合（PSDNA/Lipo）を示す。縦軸は、ポリヌクレオチドに付加されたFAMに由来する蛍光の強度（平均値）を示す。各カラム上のバーは標準誤差を示す。***はP値が0.001未満であることを示す。
【図９】試験例9の細胞毒性試験の結果を示す。横軸中、「control」はポリヌクレオチドを培地に添加していない場合を示し、その他は、実施例又は比較例のポリヌクレオチドをそのまま培地に添加した場合（PSDNA（比較例6）、5×linker（実施例9））、或いはPSDNA（比較例6）を核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000）を用いて培地に添加した場合（PSDNA/Lipo）を示す。縦軸は、吸光度（平均値）の相対値を示す。各カラム上のバーは標準誤差を示す。*はP値が0.05未満であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００３０】
1．修飾ポリヌクレオチド及び修飾用分子
本発明は、その一態様において、一般式（1）：
【００３１】
【化３】
2019039403.tif 000004
【００３２】
で表される構造を含む分子で修飾されてなる、修飾ポリヌクレオチド（本明細書において、「本発明の修飾ポリヌクレオチド」と示すこともある。）、及び該構造を含むポリヌクレオチド修飾用分子（本明細書において、「本発明の修飾用分子」と示すこともある。）に係る。以下、これについて説明する。
【００３３】
R1及びR2は同一又は異なって、単結合、又は−S−S−及び−SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい二価の基を示す。
【００３４】
R1又はR2で示される二価の基としては、例えばリンカーとして機能し得る基（以下、単に「リンカー」と示すこともある。）、環由来の基、これらが2つ以上連結してなる基等が挙げられる。
【００３５】
リンカーとしては、例えばアルキレン基、アルケニレン基、ヘテロアルキレン基（例えば、主鎖中に−S−S−を含むヘテロアルキレン基、主鎖中に−NH−COO−を含むヘテロアルキレン基等）等が挙げられる。リンカーは、直鎖状又は分岐鎖状のいずれのものも包含し、好ましくは直鎖状である。リンカーの主鎖を構成する原子数（アルキレン基及びアルケニレン基の場合は、炭素原子数）は、特に制限されず、例えば3〜10、好ましくは3〜6、より好ましくは3〜4である。リンカーとして、好ましくはアルキレン基が挙げられ、より好ましくは炭素原子数3〜6のアルキレン基が挙げられ、さらに好ましくは炭素原子数3〜4のアルキレン基が挙げられ、よりさらに好ましくは炭素原子数3〜4の直鎖状のアルキレン基が挙げられる。このようなアルキレン基の具体例としては、ｎ−プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ−ブチレン基、イソブチレン基等が挙げられる。
【００３６】
環由来の基は、環から2つの水素原子が除かれてなる二価の基であり、この限りにおいて特に制限されない。環としては、特に制限されず、単環式又は二環式が好ましく、単環式がより好ましい。環構成原子は、特に制限されず、例えば炭素原子のみである場合、炭素原子とヘテロ原子（例えば、窒素原子、硫黄原子、酸素原子等）からなる場合等が挙げられる。環構成原子数は、特に制限されず、例えば、3〜20、好ましくは3〜12、より好ましくは4〜8、さらに好ましくは5〜7である。このような環としては、例えば環構造中に−S−S−を有する環、シクロアルカン、シクロアルケン、ベンゼン、ナフタレン等が挙げられ、好ましくは環構造中に−S−S−を有する環が挙げられる。環構造中に−S−S−を有する環として、具体的には、シクロアルカン又はシクロアルケン（好ましくはシクロアルカン）中の1つの−C−C−が−S−S−に置き換えられてなる環が挙げられる。
【００３７】
R1としては、好ましくは−S−S−及び−SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい二価の基が挙げられ、より好ましくはアルキレン基、環構造中に−S−S−を有する環由来の基等が挙げられ、より好ましくはアルキレン基が挙げられる。
【００３８】
R2としては、好ましくは単結合が挙げられる。
【００３９】
R3は、−O−、又は−O−R31を示す。
【００４０】
R31は、−S−S−及び−SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい一価の基を示す。R31で示される一価の基としては、例えばアルキル基、アルケニル基、ヘテロアルキル基（例えば、主鎖中に−S−S−を含むヘテロアルキル基、主鎖中に−NH−COO−を含むヘテロアルキル基等）、上記環由来の基、これらが2つ以上連結してなる基等が挙げられる。R31で示される一価の基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれの者も包含する。R31で示される一価の基の主鎖を構成する原子数は、特に制限されず、例えば1〜20、好ましくは3〜12、より好ましくは5〜9である。
【００４１】
−O−R31としては、好ましくは−O−R31a−S−S−R31bで示される基が挙げられる。
【００４２】
R31aはアルキレン基又は−R311a−NH−COO−R312a−（R311a及びR312aは同一又は異なって、アルキレン基を示す。）を示す。R31aは好ましくはアルキレン基である。
【００４３】
R31aで示されるアルキレン基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれのものも包含し、好ましくは直鎖状である。該アルキレン基の炭素原子数は、特に制限されず、例えば3〜10、好ましくは3〜6、より好ましくは3〜4である。このようなアルキレン基の具体例としては、ｎ−プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ−ブチレン基、イソブチレン基等が挙げられる。
【００４４】
R311a又はR312aで示されるアルキレン基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれのものも包含し、好ましくは直鎖状である。該アルキレン基の炭素原子数は、特に制限されず、例えば2〜10、好ましくは2〜6、より好ましくは2〜3である。このようなアルキレン基の具体例としては、エチレン基、ｎ−プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ−ブチレン基、イソブチレン基等が挙げられる。
【００４５】
R31bは保護基を示す。保護基としては、ジスルフィド結合を保護する機能を有するものであれば特に制限されず、例えばアルキル基、アリール基等が挙げられる。
【００４６】
R31bで示されるアルキル基には、直鎖状又は分岐鎖状のいずれのものも包含される。該アルキル基は、好ましくは分岐鎖状アルキル基である。該アルキル基の炭素数は、特に制限されず、例えば1〜6、好ましくは2〜5、より好ましくは3〜5、さらに好ましくは4である。該アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、イソブチル基、tert−ブチル基、sec−ブチル基、n−ペンチル基、ネオペンチル基、n−ヘキシル基、3−メチルペンチル基等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはtert-ブチル基が挙げられる。
【００４７】
R31bで示されるアリール基は、特に制限されないが、炭素数が6〜12のものが好ましく、6〜12のものがより好ましく、6〜8のものがさらに好ましい。該アリール基は、単環式又は多環式（例えば2環式、3環式等）のいずれでも有り得るが、好ましくは単環式である。該アリール基としては、具体的には、例えばフェニル基、ナフチル基、ビフェニル基、ペンタレニル基、インデニル基、アントラニル基、テトラセニル基、ペンタセニル基、ピレニル基、ペリレニル基、フルオレニル基、フェナントリル基等が挙げられる。これらの中でも好ましくはフェニル基が挙げられる。
【００４８】
R3としては、好ましくは−O−R31が挙げられ、より好ましくは−O−R31a−S−S−R31bが挙げられる。
【００４９】
本発明の好ましい一態様において、R1、R2、R3の組み合わせとして、
好ましくは
（A）前記R1がアルキレン基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が−O−R31a−S−S−R31b（式中、R31aはアルキレン基又は−R311a−NH−COO−R312a−（R311a及びR312aは同一又は異なって、アルキレン基を示す。を示す。R31bは保護基を示す。）であるという組み合わせが挙げられ、
より好ましくは
（A1）前記R1が炭素原子数が3〜6のアルキレン基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が−O−R31a−S−S−R31b（式中、R31aは炭素原子数が3〜6のアルキレン基又は−R311a−NH−COO−R312a−（R311a及びR312aは同一又は異なって、炭素原子数が2〜6のアルキレン基を示す。）を示す。R31bはt-ブチル基を示す。）であるという組み合わせが挙げられる。
【００５０】
本発明の別の好ましい一態様において、R1、R2、R3の組み合わせとして、
好ましくは
（B）前記R1が環構造中に−S−S−で表される基を有する環由来の基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が−O−であるという組み合わせが挙げられ、
より好ましくは
（B1）前記R1が環構造中に−S−S−で表される基を有する4〜8員環由来の基であり、前記R2が単結合であり、且つ前記R3が−O−であるという組み合わせが挙げられる。  上記R1、R2、R3の組み合わせの中でも、組み合わせ（A）及び（A1）が好ましく、組み合わせ（A1）がより好ましい。
【００５１】
上記R1、R2、及びR3の内の少なくとも1つは、−S−S−及び−SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含む。換言すれば、上記R1、R2、及びR3の全てが同時に−S−S−及び−SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含まない場合は、一般式（1）で表される構造からは除かれる。
【００５２】
Z1及びZ2は同一又は異なって、−O−又は−NH−を示す。好ましくはZ1及びZ2の少なくとも一方が−O−であり、より好ましくはZ1及びZ2が共に−O−である。
【００５３】
nは任意の整数を示す。nは、例えば1〜50であり、好ましくは1〜30であり、より好ましくは3〜30であり、さらに好ましくは5〜20であり、よりさらに好ましくは7〜20であり、特に好ましくは8〜15である。
【００５４】
「一般式（1）で表される構造を含む分子で修飾されてなる」とは、ポリヌクレオチドが該分子で修飾されてなることを意味する。
【００５５】
修飾の態様は、特に制限されない。本発明の修飾ポリヌクレオチドは、好ましくはポリヌクレオチドの末端に一般式（1）で表される構造が連結されてなる修飾ポリヌクレオチドであり、より好ましくはポリヌクレオチドの5´末端に一般式（1）で表される構造が連結されてなる修飾ポリヌクレオチドである。また、ポリヌクレオチドの両末端に一般式（1）で表される構造が連結されていてもよい。
【００５６】
一般式（1）で表される構造の向きは特に制限されない。例えば、Z1が修飾ポリヌクレオチドの5´側であり且つR2が修飾ポリヌクレオチドの3´側という向きであってもよいし、その逆、すなわちZ1が修飾ポリヌクレオチドの3´側であり且つR2が修飾ポリヌクレオチドの5´側であるという向きであってもよい。
【００５７】
本発明の修飾ポリヌクレオチドにおいては、末端のZ1又はR2には、他の分子（例えば、蛍光標識等）が連結していてもよいし、連結していなくてもよい。後者の場合、通常は、水素原子が連結している。また、Z1又はR2は、修飾対象のポリヌクレオチドに（好ましくは末端のヌクレオチドに）連結していてもよい。
【００５８】
修飾対象のポリヌクレオチドは、特に制限されず、DNA、RNA等の他にも、次に例示するように、公知の化学修飾が施されていてもよい。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、ヌクレオチドの糖部の2´酸素と4´炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したものであるBNA（LNA）等もまた、好ましく用いられ得る。
【００５９】
修飾対象のポリヌクレオチドは、他の分子が連結されたものであってもよい。他の分子としては、例えば蛍光標識等が挙げられる。
【００６０】
修飾対象のポリヌクレオチドの塩基長は、特に制限されず、例えば500塩基長以下、好ましくは200塩基長以下、より好ましくは100塩基長以下、さらに好ましくは50塩基長以下、よりさらに好ましくは30塩基長以下である。下限は、特に制限されず、例えば5塩基長、10塩基長、15塩基長である。
【００６１】
修飾対象のポリヌクレオチドは、細胞内へ導入して使用されることを主な目的としたものであることが好ましい。このような目的のポリヌクレオチドとしては、例えばポリヌクレオチドが、アンチセンスポリヌクレオチド、siRNA、miRNA、miRNA前駆体、アプタマー、ガイドRNA、mRNA等が挙げられる。
【００６２】
本発明の修飾ポリヌクレオチド及び本発明の修飾用分子は、公知の方法に従って又は準じて合成することができる。例えば、一般式（1）で表される構造を形成可能なホスホロアミダイトモノマーを用いて、ホスホロアミダイト法による核酸合成を行うことにより、得ることができる。具体例として、R1が−S−S−及び−SHからなる群より選択される少なくとも1種の基を含んでいてもよい二価の基であり、且つR2が単結合である場合であれば、ホスホロアミダイトモノマーとして、例えば、一般式（2）：
【００６３】
【化４】
2019039403.tif 000005
【００６４】
［式中、DMTrはジメチルトリチル基を示す。Rxは−O−R31又は−O−(CH2)2−CNを示す。その他については前記に同じである。］
で表される化合物を用いて、定法に従って又は準じてホスホロアミダイト法による核酸合成を行う方法が挙げられる。
【００６５】
合成終了後、生成物はクロマトグラフィー法等の通常の方法で単離精製することができる。また、生成物の構造は、元素分析、MS（FD-MS）分析、IR分析、1H-NMR、13C-NMR等により同定することができる。
【００６６】
2．用途
本発明の修飾ポリヌクレオチドは、カチオン性脂質等と複合体を形成させなくとも、単独で、効率的に細胞膜を透過するので、効率的に細胞内に導入することができる。また、本発明の修飾ポリヌクレオチドは、細胞毒性が比較的低い。このため、本発明の修飾ポリヌクレオチドは、該修飾ポリヌクレオチドの細胞内への導入を目的とする種々の用途、例えば細胞内への導入剤、医薬、試薬等（以下、これらを総称して「本発明の剤」と示すこともある。）に利用することができる。
【００６７】
本発明の剤は、本発明の修飾ポリヌクレオチドを含有する限りにおいて特に制限されず、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、薬学的に許容される成分であれば特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
【００６８】
本発明の剤の使用態様は、特に制限されず、その種類に応じて適切な使用態様を採ることができる。本発明の剤は、例えばin vitroで使用する（例えば、培養細胞の培地に添加する）こともできるし、in vivoで使用する（例えば、動物に投与する）こともできる。
【００６９】
本発明の剤の適用対象は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類動物；  動物細胞等が挙げられる。細胞の種類も特に制限されず、例えば血液細胞、造血幹細胞・前駆細胞、配偶子（精子、卵子）、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、がん細胞等が挙げられる。
【００７０】
本発明の剤を抗がん剤として用いる場合、そのがん細胞の種類は特に限定されず、例えば腎臓がん細胞、白血病細胞、食道がん細胞、胃がん細胞、大腸がん細胞、肝臓がん細胞、すい臓がん細胞、肺がん細胞、前立腺がん細胞、皮膚がん細胞、乳がん細胞、子宮頚がん細胞等が挙げられる。
【００７１】
本発明の剤の剤形は特に制限されず、その使用態様に応じて適切な剤形を採ることができる。例えば、動物に投与する場合であれば、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、シロップ剤、腸溶剤、徐方性カプセル剤、咀嚼錠、ドロップ、丸剤、内用液剤、菓子錠剤、徐放剤、徐放性顆粒剤等の経口剤；  点鼻剤、吸入剤、肛門坐剤、挿入剤、浣腸剤、ゼリー剤等の外用剤等が挙げられる。また、本発明の剤は、固形剤、半固形剤、液剤のいずれでもよい。
【００７２】
本発明の剤中の本発明の修飾ポリヌクレオチドの含有量は、使用態様、適用対象、適用対象の状態等に左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001〜95重量％、好ましくは0.001〜50重量％とすることができる。
【００７３】
本発明の剤を動物に投与する場合の投与量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分である本発明の修飾ポリヌクレオチドの重量として、一般に経口投与の場合には一日あたり0.1〜1000 mg/kg体重、好ましくは一日あたり0.5〜50 mg/kg体重であり、非経口投与の場合には一日あたり0.01〜100 mg/kg体重、好ましくは0.1〜10 mg/kg体重である。上記投与量は1日1回又は2〜3回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
【実施例】
【００７４】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００７５】
参考例1．DTT型ホスホロアミダイトモノマーの合成
以下の合成スキームに従って、DTT型ホスホロアミダイトモノマー（化合物5）を合成した。【００７６】
【化５】
2019039403.tif 000006
【００７７】
＜化合物3の合成＞
ジチオスレイトール(DTT)(1.54 g, 10.0 mmol)にジメチルスルホキシド(0.78 mL)を加えて110℃で4時間撹拌した。室温に冷却後、生じた固体をジクロロメタンに懸濁させ、吸引ろ過にて濾取した。濾取した固体は少量の酢酸エチルで洗浄し、真空下で乾燥させることで目的化合物3を白色固体として得た(1.26 g, 82%)。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 5.24 (2H, d, J = 3.2 Hz), 3.33 (2H, br. s), 3.03 (2H, d, J = 13.2 Hz), 2.74 (1H, d, J = 13.2 Hz) , 2.72 (1H, d, J = 13.6 Hz)。【００７８】
＜化合物4の合成＞
化合物3 (1 g, 6.57 mmol)をメタノールで２回、続いて無水ピリジンで２回共沸した。残渣を無水ピリジン(15 mL)に溶解させた後、ジメトキシトリチルクロライド(3.0 g, 8.85 mmol)を加えて室温にて撹拌した。４時間後、ジメトキシトリチルクロライド(2.0 g, 5.90 mmol)を追加して室温にて撹拌した。４時間後、反応液にメタノールを加えた後、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解させて、水、続いて飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧濃縮した。得られた残渣を中性フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル =  90 : 10 + 1%トリエチルアミン → 80 : 20 + 1%トリエチルアミン)にて精製し、目的化合物4を白色泡状固体として得た(1.67 g, 56%)。
ESI-MS : calcd. for C25H26NaO4S2  477.1170[M+Na]+, found : 477.1262 [M+Na]+。【００７９】
＜化合物5の合成＞
化合物4 (300 mg, 0.66 mmol)を無水アセトニトリルで２回共沸した。残渣をジクロロメタン(2 mL)に溶解させ、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(350 μL, 1.98 mmol)を加えた後、0℃にて2-シアノエチルN,N-ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(217 μL, 0.99 mmol)を滴下し撹拌した。20分後、反応液を酢酸エチルで希釈し、水、続いて飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧濃縮した。得られた残渣を中性フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル =  20 : 1, + 1%トリエチルアミン → 8 : 1, + 1%トリエチルアミン)にて精製し、目的化合物5を白色泡状固体として得た(280 mg, 65%)。
31P NMR (121 MHz, CDCl3)δ: 148.4, 148.1
ESI-MS : calcd for C34H43N2NaO5PS2  677.2249[M+Na]+, found : 677.2134 [M+Na]+。【００８０】
参考例2．ThioL型ホスホロアミダイトモノマーの合成
以下の合成スキームに従って、ThioL型ホスホロアミダイトモノマー（化合物4）を合成した。3-メルカプトプロパノールを出発原料とし、チオール基をジスルフィド構造へと変換し化合物1を得た。別途合成したC3リンカー誘導体3とカップリングさせることでThioL型ホスホロアミダイトモノマー4を得た。【００８１】
【化６】
2019039403.tif 000007
【００８２】
＜化合物1の合成＞
アルゴン雰囲気下、撹拌中のジ-tert-ブチル1-(tert-ブチルチオ)-1,2-ヒドラジンジカルボキシレート(3.0 g, 9.36 mmol)とトリエチルアミン(1.09 mL, 7.80 mmol)のアセトニトリル溶液(36 mL)に3-メルカプトプロパノール(808 μL, 9.36 mmol)を滴下した。室温にて終夜撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。得られた残渣にヘキサン(10 mL)を加えて生じた沈殿を濾過にて除去し、濾液を減圧濃縮した。残渣を中性フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン/酢酸エチル = 15 : 1)にて精製し、目的化合物1を淡黄色油状物質として得た(731 mg, 85%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 3.75 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.82 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.93 (2H, m, J = 6.8 Hz), 1.33 (s, 9H)。【００８３】
＜化合物2の合成＞
プロパンジオール(13 mL, 181.0 mmol)のピリジン溶液(52 mL)にジメトキシトリチルクロライド(3.0 g, 9.10 mmol)のピリジン溶液(20 mL)を加え、室温にて撹拌した。26時間後、反応液を減圧濃縮した後、酢酸エチル(20 mL)に溶解させ、水(80 mL)で2回、次いで飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧濃縮した。得られた残渣を中性フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル =  3 : 1 → 1 : 1)にて精製し、目的化合物2を白色固体として得た(2.50 g, 83%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ:7.43−7.38 (2H, m), 7.33−7.26 (5H, m), 7.24−7.16 (2H, m), 6.79−6.85 (4H, m), 3.87 (1H, t, J = 5.6 Hz), 3.79 (3H, s), 3.78 (3H, s), 3.28 (1H, t, J = 5.6 Hz), 1.91−1.80 (2H, m), 1.60 (1H, br. s)
ESI-MS : calcd. for C24H26NaO4  401.1723 [M+Na]+, found : 401.176 [M+Na]+。【００８４】
＜化合物4の合成＞
ビス(N,N-ジイソプロピルアミノ)クロロフォスフィン(240  mg, 0.79 mmol)、トリエチルアミン(120 μL)の無水テトラヒドロフラン溶液(5 mL)に0℃にて化合物2 (300 mg, 0.79 mmol)の無水テトラヒドロフラン溶液(3 mL)を滴下した。室温にて反応溶液を撹拌し、100分後に31P NMRにて反応の終結を確認した(135.5 ppm から121.8 ppm, C6D6)。反応溶液に化合物1(142 mg, 0.79 mmol)、次いで5-ベンジルチオ-1H-テトラゾールのアセトニトリル溶液(0.25M, 750 μL)を加えた。室温にて反応溶液を撹拌し、80分後に31P NMRにて反応の終結を確認した(121.8 ppm から147.0 ppm, C6D6)。反応溶液を酢酸エチル(70 mL)で希釈し、飽和重曹水(70 mL)、水(70 mL)、次いで飽和食塩水(70 mL)で2回洗浄した。有機層を減圧濃縮し、得られた残渣を中性フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル =  15 : 1, +1%トリエチルアミン)にて精製し、目的化合物4を淡黄色油状物質として得た(189 mg, 63%)。
31P NMR (121 MHz, C6D6)  δ: 146.97
1H NMR (400 MHz, C6D6) δ:7.68 (d, 2H, J = 11.0 Hz), 7.51 (4H, d, J = 11.2 Hz), 7.19 (3H, d, J = 11.4 Hz)，6.79 (4H, d, J = 11 Hz), 3.31(14H, m), 2.11(2H, m), 1.92 (2H, m), 1.19 (9H, s, 3CH3; 12H, d, 3CH3)
13C NMR (100 MHz, C6D6) δ:158.7, 145.9, 136.7, 130.2, 128.4, 127.7, 126.5, 113.1, 86.0, 61.6, 61.4, 60.4, 54.4, 47.1, 42.8, 37.2, 32.2, 31.1, 29.6, 24.5,
ESI-MS : calcd. for C37H54NO5PS2, 598.276 [M-C4H9S]+; found : 598.277[M-C4H9S]+。【００８５】
実施例1．DTT型修飾ポリヌクレオチド（5DTT-DNA）の合成
5´−AACCGCTTCCCCGACTTCC（配列番号1）で示される塩基配列からなるDNAの5´末端が、下記式（A）：【００８６】
【化７】
2019039403.tif 000008
【００８７】
で表される構造が連結され、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるDTT型修飾ポリヌクレオチド（5DTT-DNA）を、β−シアノエチルホスホロアミダイト（Glen Research社製）、DTT型ホスホロアミダイトモノマー（参考例1）、及び6-FAMを用い、DNA/RNA固相合成機（NTS M-2-MX, 日本テクノサービス社製）を使用し、定法により合成した。なお、配列番号1は、P. pyralis由来ルシフェラーゼ遺伝子のアンチセンス配列である。得られた修飾ポリヌクレオチドは定法に従い脱樹脂・脱保護を行い、高速液体クロマトグラフィーによって精製した。カラム： C18Hydrosphere 10 x 250 mm (YMC社製)、カラム温度：室温、測定波長：260 nm、移動相：50 mM トリエチルアンモニウムアセテートバッファー(pH7.0)(+5% アセトニトリル)/アセトニトリル = 100 : 0 → 70 : 30 (20 min, linear gradient)。修飾ポリヌクレオチドを含む分画は分取後、遠心エバポレーターによって濃縮した。構造決定は質量分析法(MALDI-TOF MS)を用いて行った。得られた修飾ポリヌクレオチドは超純水に溶解し、適宜希釈後UV吸収スペクトルを測定し、濃度を決定した。
MALDI-MS : calcd. 7361.628 [M+H]+; found :7362.888 [M+H]+。【００８８】
実施例2．DTT型修飾ポリヌクレオチド（10DTT-DNA）の合成
配列番号1で示される塩基配列からなるDNAの5´末端が、下記式（B）：【００８９】
【化８】
2019039403.tif 000009
【００９０】
で表される構造が連結され、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるDTT型修飾ポリヌクレオチド（10DTT-DNA）を、実施例1と同様にして合成した。
MALDI-MS : calcd.8434.762 [M+H]+; found : 8434.22 [M+H]+。【００９１】
実施例3．ThioL型修飾ポリヌクレオチド（5ThioL-DNA）の合成
配列番号1で示される塩基配列からなるDNAの5´末端が、下記式（C）：【００９２】
【化９】
2019039403.tif 000010
【００９３】
で表される構造が連結され、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるThioL型修飾ポリヌクレオチド（5ThioL-DNA）を、DTT型ホスホロアミダイトモノマー（参考例1）に代えてThioL型ホスホロアミダイトモノマー（参考例2）を用いる以外は、実施例1と同様にして合成した。
MALDI-MS : calcd. 7789.695 [M+H]+; found : 7789.289 [M+H]+。【００９４】
実施例4．ThioL型修飾ポリヌクレオチド（10ThioL-DNA）の合成
配列番号1で示される塩基配列からなるDNAの5´末端が、下記式（D）：【００９５】
【化１０】
2019039403.tif 000011
【００９６】
で表される構造が連結され、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるThioL型修飾ポリヌクレオチド（10ThioL-DNA）を、実施例3と同様にして合成した。
MALDI-MS : calcd. 9287.426 [M+H]+; found : 9288.527 [M+H]+。【００９７】
比較例1．未修飾ポリヌクレオチド（DNA）の合成
配列番号1で示される塩基配列からなり、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるDNA（DNA）を、定法により合成した。
MALDI-MS : calcd. 6212.113 [M+H]+; found : 6212.705 [M+H]+。【００９８】
比較例2．未修飾ポリヌクレオチド（R-DNA）の合成
5´−ACACGTCCTCTCAGCCCTC（配列番号2）で示される塩基配列からなり、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるDNA（R-DNA）を、定法により合成した。【００９９】
比較例3．ホスホロチオエートDNA（PS-DNA）の合成
配列番号1で示される塩基配列からなり、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるホスホロチオエートDNA（PS-DNA）を、定法により合成した。
MALDI-MS : calcd. 6499.02 [M+H]+; found : 6502.773[M+H]+。【０１００】
試験例1．細胞膜透過性試験1
FAMで修飾されている実施例又は比較例のポリヌクレオチドを培地に添加し、細胞の蛍光強度（＝ポリヌクレオチドの細胞内への取り込み量）を測定することにより、ポリヌクレオチドの細胞膜透過性を調べた。具体的には以下のようにして行った。【０１０１】
HeLa細胞にPhotinus pyralis由来およびRenilla reniformis由来ルシフェラーゼの発現プラスミドであるpGL3(Promega社製)とpTK-Green Renilla Luc (Thermo Fisher Scientific社製) を導入した。これをG418およびピューロマイシン存在下で培養することでルシフェラーゼを安定して発現する細胞株、HeLa-LucRlucを樹立した。この HeLa 細胞を、ウシ胎児血清（FBS）を10％、ペニシリンを100 U/mL、ストレプトマイシンを100μg/mLになるように添加したDMEM培地（Wako社製）で培養した。培養条件は、37℃、CO2濃度5％の大気下、湿度95％とした。12ウェルプレートの1ウェル当たり、2×104のHeLa p13細胞を播種して、1日間培養した。実施例及び比較例のポリヌクレオチドそれぞれを、1μMの濃度になるように、血清を含まないDMEM培地0.3 mLに添加して、混合した。得られた混合液を培地に添加して、3時間インキュベートした。一方で、ポジティブコントロールとして、比較例1の未修飾ポリヌクレオチドを、核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000、Invitrogen社製）を用いて、試薬説明書の指示に従って、培地に添加し、インキュベートした。インキュベート終了後、細胞を、培地でリンスしてからトリプシン処理により剥した。得られた細胞のFAM由来の蛍光強度を、フローサイトメーター（BD FACSCanto II、Becton Dickinson社製）で測定した。この蛍光強度が高い程、より多くのポリヌクレオチド（FAM修飾されている）が細胞膜を透過して、細胞内に導入されたことを示す。【０１０２】
結果を図１に示す。DNA（比較例1）はほとんど膜透過性を示さなかった。一方、DTT（実施例1及び2）及びThioL（実施例3及び4）は、それぞれ細胞内に取り込まれていることが分かった。特に、10ThioL（実施例4）は、市販のLipofetamine3000を用いた場合に比べて、2倍以上、細胞内に取り込まれていることが分かった。【０１０３】
試験例2．アンチセンス配列による発現抑制試験1
P. pyralis由来ルシフェラーゼ遺伝子のアンチセンス配列を有する実施例及び比較例のポリヌクレオチドを培地に添加し、ルシフェラーゼの発現量を測定した。これにより、ポリヌクレオチドが細胞膜を透過して、その機能（アンチセンス核酸としての遺伝子発現抑制効果）を発揮できるか否かを調べた。具体的には以下のようにして行った。【０１０４】
HeLa-LucRluc細胞（P. pyralisルシフェラーゼとRenillaルシフェラーゼとを安定的に発現するHeLa細胞）を、ウシ胎児血清（FBS）を10％、ペニシリンを100 U/mL、ストレプトマイシンを100μg/mLになるように添加したDMEM培地（Wako社製）で培養した。培養条件は、37℃、CO2濃度5％の大気下、湿度95％とした。12ウェルプレートの1ウェル当たり、2×104のHeLa-LucRluc細胞を播種して、1日間培養した。実施例及び比較例のポリヌクレオチドそれぞれを、1μMの濃度になるように、血清を含まないDMEM培地0.3 mLに添加して、混合した。得られた混合液を培地に添加して、インキュベートした。一方で、実施例4、比較例1及び3のポリヌクレオチドそれぞれを、核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000、Invitrogen社製）を用いて、試薬説明書の指示に従って、培地に添加し、インキュベートした。インキュベート終了後、細胞を、reporter lysis buffer（Promega社製）で溶解させた。得られた細胞溶解液のルシフェラーゼ活性（P. pyralisルシフェラーゼ活性とRenillaルシフェラーゼ活性）を、ルミノメーター（uminescencer-PSN、ATTO社製）及びluciferase assay reagent（Promega社製）を用いて測定した。【０１０５】
結果を図２に示す。DNA/Lipo3000やPS-DNA（比較例3）では全く遺伝子発現抑制効果を示さないが、10ThioL（実施例4）は遺伝子発現抑制効果を示した。これは、本手法が、ポリヌクレオチドを細胞に導入する手法としてリポソームよりも有用であり得ることを示す。【０１０６】
試験例3．細胞毒性試験1
実施例及び比較例のポリヌクレオチドの細胞毒性をMTTアッセイにより調べた。具体的には以下のようにして行った。【０１０７】
HeLa-LucRluc細胞（P. pyralisルシフェラーゼとRenillaルシフェラーゼとを安定的に発現するHeLa細胞）を、ウシ胎児血清（FBS）を10％、ペニシリンを100 U/mL、ストレプトマイシンを100μg/mLになるように添加したDMEM培地（Wako社製）で培養した。培養条件は、37℃、CO2濃度5％の大気下、湿度95％とした。96ウェルプレートの1ウェル当たり、2×104のHeLa-LucRluc細胞を播種して、1日間培養した。実施例及び比較例のポリヌクレオチドそれぞれを、1μM又は5μMの濃度になるように、血清を含まないDMEM培地0.3 mLに添加して、混合した。得られた混合液を培地に添加して、インキュベートした。一方で、ポジティブコントロールとして、比較例1の未修飾ポリヌクレオチドを、核酸導入試薬（Lipofectoamine 3000、Invitrogen社製）を用いて、試薬説明書の指示に従って、培地に添加し、インキュベートした。24時間インキュベート後、CellTiter 96（登録商標） AQueous One Solution Reagent（Promega社製）20μLを添加して、2.5時間インキュベートした。490 nmの吸光度を、96ウェルプレートリーダーを用いて測定した。吸光度が高い程、添加したポリヌクレオチドの細胞毒性がより低いことを示す。【０１０８】
結果を図３に示す。DNA/Lipo3000およびPS-DNA（比較例3）は毒性を示したが、実施例のポリヌクレオチド（5 x DTT（実施例1）、10 x DTT（実施例2）、5 x ThioL（実施例3）、10 x ThioL（実施例4））は毒性を示さなかった。このことから、実施例のポリヌクレオチドは毒性が低いといえる。【０１０９】
実施例5．ThioL型修飾ポリヌクレオチド（5×tBu-PS-DNA）の合成
5´−CGGTATCCAGATCCACAAC（配列番号3）からなるPS-DNAの5´末端が、下記式（C）：【０１１０】
【化１１】
2019039403.tif 000012
【０１１１】
で表される構造が連結され、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるThioL型修飾ポリヌクレオチド（5×tBu-PS-DNA）を、実施例3と同様にして合成した。【０１１２】
実施例6．ThioL型修飾ポリヌクレオチド（10×tBu-PS-DNA）の合成
配列番号3で示される塩基配列からなるPS-DNAの5´末端が、下記式（D）：【０１１３】
【化１２】
2019039403.tif 000013
【０１１４】
で表される構造が連結され、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるThioL型修飾ポリヌクレオチド（10×tBu-PS-DNA）を、実施例3と同様にして合成した。【０１１５】
比較例4．ホスホロチオエートDNA（PS-DNA）の合成
配列番号3で示される塩基配列からなり、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるホスホロチオエートDNA（PS-DNA）を、定法により合成した。【０１１６】
実施例7．ThioL型siRNA（5×ThioL siRNA (3’ & 3’)）の合成
5´−UUUCGAAGUACUCAGCGUAAGUU（配列番号4）からなるRNAの3´末端が、下記式（C）：【０１１７】
【化１３】
2019039403.tif 000014
【０１１８】
で表される構造が連結されてなるThioL型修飾1本鎖RNA（5×ThioL guide strand (3’)）を、実施例3と同様にして合成した。【０１１９】
一方で、5´−CUUACGCUGAGUACUUCGAAAUU（配列番号5）からなるRNAの3´末端が、下記式（C）：【０１２０】
【化１４】
2019039403.tif 000015
【０１２１】
で表される構造が連結されてなるThioL型修飾1本鎖RNA（5×ThioL passenger strand (3’)）を、実施例3と同様にして合成した。【０１２２】
5×ThioL guide strand (3’)と5×ThioL passenger strand (3’)とを混合したのち、1×annealing buffer (60 mM KCl, 6 mM HEPES-KOH pH 7.5, 0.2 mM MgCl2) 中で目的濃度 (0.1〜1 μM) になるように調製し、90℃で3分間置いた後、3時間室温に戻るまで静置し、二本鎖RNA（ThioL型siRNA（5×ThioL siRNA (3’ & 3’)））を形成させた。【０１２３】
実施例8．ThioL型siRNA（5×ThioL siRNA (3’ & 5’)）の合成
配列番号5で示される塩基配列からなるRNAの5´末端が、下記式（C）：【０１２４】
【化１５】
2019039403.tif 000016
【０１２５】
で表される構造が連結されてなるThioL型修飾1本鎖RNA（5×ThioL passenger strand (5’)）を、実施例3と同様にして合成した。【０１２６】
5×ThioL guide strand (3’)と5×ThioL passenger strand (5’)とを混合したのち、1×annealing buffer (60 mM KCl, 6 mM HEPES-KOH pH 7.5, 0.2 mM MgCl2) 中で目的濃度 (0.1〜1 μM) になるように調製し、90℃で3分間置いた後、3時間室温に戻るまで静置し、二本鎖RNA（ThioL型siRNA（5×ThioL siRNA (3’ & 5’)））を形成させた。【０１２７】
比較例5．未修飾siRNAの合成
配列番号4で示される塩基配列からなるRNA及び配列番号5で示される塩基配列からなるRNAを定法により合成し、実施例7と同様にして二本鎖（未修飾siRNA）を形成させた。【０１２８】
試験例4．細胞膜透過性試験2
ポリヌクレオチドとして、実施例5、実施例6及び比較例4のアンチセンスポリヌクレオチドを使用する以外は、試験例1と同様にして行った。ポリヌクレオチド濃度は100nMとした。【０１２９】
結果を図４に示す。ThioL修飾の場合、市販のLipofetamine3000を用いた場合と同等或いはそれ以上の細胞膜透過性を示した。【０１３０】
試験例5．アンチセンス配列による発現抑制試験2
ポリヌクレオチドとして、実施例5及び比較例4のアンチセンスポリヌクレオチドを使用する以外は、試験例2と同様にして行った。ポリヌクレオチド濃度は1μMとした。【０１３１】
結果を図５に示す。ThioL修飾の場合、市販のLipofetamine3000を用いた場合と同等の遺伝子発現抑制効果を示した。【０１３２】
試験例6．細胞毒性試験2
ポリヌクレオチドとして、実施例5及び比較例4のアンチセンスポリヌクレオチドを使用する以外は、試験例3と同様にして行った。ポリヌクレオチド濃度は5μMとした。【０１３３】
結果を図６に示す。実施例のポリヌクレオチド（5×tBu-PS-DNA）は毒性を示さなかった。【０１３４】
試験例7．siRNAによる発現抑制試験1
ポリヌクレオチドとして、実施例7、実施例8及び比較例5のsiRNAを使用する以外は、試験例2と同様にして行った。ポリヌクレオチド濃度は1μM又は100nMとした。【０１３５】
結果を図７に示す。ThioL修飾の場合、市販のLipofetamine3000を用いた場合と同等或いはそれ以上の遺伝子発現抑制効果を示した。【０１３６】
参考例3．プロカチオン性ホスホロアミダイトモノマーの合成
以下の合成スキームに従って、プロカチオン性ホスホロアミダイトモノマー（化合物4）を合成した。【０１３７】
【化１６】
2019039403.tif 000017
【０１３８】
【化１７】
2019039403.tif 000018
【０１３９】
＜化合物b：2-(tert-Buthyldisulfanyl)ethanolの合成＞
100% ethanol (22 mL), 2-mercaptoethanol (0.77 mL, 23 mmol, 1.0 eq.) に2-methyl-2-propanethiol (12 mL, 230 mmol, 10 eq.) を加え、氷浴中で撹拌した。100% ethanol (17 mL ) にI2 (3.0 g, 36.8 mmol, 1.1 eq.) を溶かし、反応溶液に色が無色から赤色に変わるまで滴下し、一晩反応させた。NaHCO3 (飽和, 23 mL) をpH７以上になるまで加え、減圧留去した。AcOEtを加え、10% Na2S2O5、brineで分液し、有機層を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (中性フラッシュ、Hexane/AcOEt = 2/1) にて精製し、油状の化合物b (1.62 g, 9.72 mmol, 91%) を得た。 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.842 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.827 (2H, t, J = 6.0 Hz),1.317 (9H, s) 他各種スペクトルデータは文献記載のデータと良い一致を示した（Tetrahedron, 2005, 61, 6138.）。【０１４０】
＜化合物c：2-(tert-Buthyldisulfanyl)ethyl 4-Nitrophenyl carbonateの合成＞
化合物b (5.45 g, 32.8 mmol, 1.0 eq.) に4-nitrophenyl chloroformate (9.89 g, 49.1 mmol, 1.5eq.)、THF (10 mL) を加え、アルゴン雰囲気下、氷浴中で反応させた。さらに、TEA (6.8 mL)、脱水THF (25 mL) を滴下し、氷浴中で10分反応させた後、室温で18時間反応させた。反応液を濾過、洗浄し (Hexane/AcOEt = 5/1)、減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (中性フラッシュ、Hexane/AcOEt = 4/1) を行い、化合物c (9.69 g, 29.2 mmol, 89%) を得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.27 (2H, m), 7.37 (2H, m), 4.51 (3H, t, J = 6.8 Hz), 2.99 (3H, t, J = 6.8 Hz), 1.34 (9H, s) 他各種スペクトルデータは文献記載のデータと良い一致を示した（Angew. Chem. Int. Ed., 2012, 51, 10347.）。【０１４１】
＜化合物d：2-(tert-butyldisulfanyel)ethyl (3-hydroxypropyl)carbamateの合成＞
3-amino-1-propanol (3.2 mL, 41.4 mmol, 1.0 eq.) を加えたCH2Cl2 (25 mL) にTEA (6.4 mL)、化合物c (9.15 g, 27.6 mmol,1.0 eq.) を加えたCH2Cl2 (15 mL) を加え、1時間室温で撹拌した。減圧留去し、AcOEt (15 mL)に溶かし、水、飽和NaHCO3、0.1M NaOH、brineで洗浄した。Na2SO4で乾燥させ、減圧留去を行った。油状化合物4 (7.49 g, 27.0 mmol, 97%) を得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.28 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.67 (2H, t, J = 5.6 Hz), 3.13 (2H, t, J = 6.0 Hz), 2.88 (2H, t, J = 6.4 Hz), 1.69 (2H, t, J = 6.0 Hz), 1.31 (9H, s); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3):δ 157.22, 63.24, 59.60, 48.04, 39.19, 37.77, 32.55, 29.92; HRMS (ESI) calcd for C10H21NO3S2[M+Na]+:  290.10, found for 290.0913。【０１４２】
＜化合物2：3-(4,4'-dimethoxytrityl)propan-1-olの合成＞
4,4'-dimethoxytrityl chloride (3.09 mg，9.12 mmol) をピリジン (72 mL) に溶解し，アルゴン雰囲気下で propan-1,3-diol (13 mL，181 mmol) を加え，5.5 時間撹拌した。溶媒を減圧留去し，残渣を Et2O/H2O で抽出した。有機層を Na2SO4で脱水し，溶媒を減圧留去した。残差をカラムクロマトグラフィー (Hexane/AcOEt = 3/1 → 1/1，1% TEA) で精製し，化合物2 (1.58 g，3.28 mmol，65%) を黄色油状物質として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.43−7.40 (2H, m), 7.33−7.20 (7H, m), 6.88−6.78 (4H, m), 3.82−3.74 (8H, m), 3.27 (2H, q, J= 5.6 Hz), 2.24 (1H, t, J = 5.6 Hz), 1.85 (2H, q, J = 5.6) 他各種スペクトルデータは文献記載のデータと良い一致を示した。【０１４３】
＜化合物4：2-(tert-butyldisulfaneyl)ethyl(3-(((3-(bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)ethoxy)propoxy) (diisopropylamino)phosphaneyl)propyl)carbamateの合成＞
ピリジンで共沸したN,N-bis(diisopropylamino)chlorophosphine (776 mg, 2.91 mmol, 1.0 eq.) にTHF (脱水, 8 mL)、TEA (脱水, 0.5 mL, 3.96 mmol, 1.4 eq.)を加えた。化合物2 (1.06 mg, 2.8 mmol, 1.0eq.)にTHF (脱水, 3 mL) を加え、0 ℃、アルゴン雰囲気下で滴下した後、室温で2 時間反応させた。ピリジンで共沸した化合物4 (530 mg, 1.99 mmol, 0.7 eq.) にTHF (脱水, 4 mL) を加え、0 ℃、アルゴン雰囲気下で反応溶液に滴下した。1H-tetrazole (95.5 mg, 1.36 mmol, 0.5 eq.) にTHF (脱水, 3 mL) を加え、さらに滴下し、室温で2時間反応させた。CH2Cl2とNaHCO3を予め0 ℃で冷やしておき、分液した。有機層を減圧留去し、黄色油状crude (2.13 g) を得た。カラムクロマトグラフィー (中性フラッシュ, Hexane/AcOEt = 15/1 → 10/1, 1% TEA) により精製し、無色油状化合物4 (284 mg, 0.37 mmol, 19%) を得た。1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ 7.24 (9H, m), 6.80 (4H, d), 4.23 (2H, t, J = 7.2 Hz), 3.78 (6H, s), 3.59 (6H, m), 3.23 (2H, t, J = 6.0 Hz), 3.14 (2H, t, J = 6.4 Hz), 2.85 (t, 2H, J = 6.8 Hz) , 1.91 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 1.73 (t, 2H, J = 6.4 Hz), 1.31 (s, 9H), 1.12 (d, 12H, J = 7.2 Hz);13C-NMR (100 MHz, CDCl3):δ 158.39, 145.36, 136.62, 130.12, 128.27, 127.73, 126. 67, 113.04, 85.85, 62.96, 60.49, 60.36, 47.93, 42.95, 42.82, 39.28, 38.84, 32.04, 31.96, 29.94, 24.72; 31P-NMR (162 MHz, CDCl3): δ 146.21; HRMS (ESI) calcd for C40H59N2O7PS2 [M+H]+: 775.35, found for 776.3627。【０１４４】
実施例9．プロカチオン性修飾ポリヌクレオチド（5×cation-PS-DNA）の合成
配列番号1で示される塩基配列からなるPS-DNAの5´末端が、下記式（E）：【０１４５】
【化１８】
2019039403.tif 000019
【０１４６】
で表される構造が連結され、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるプロカチオン性修飾ポリヌクレオチド（5×cation-PS-DNA）を、プロカチオン性ホスホロアミダイトモノマー（参考例3）を用いて、実施例1と同様にして合成した。【０１４７】
比較例6．ホスホロチオエートDNA（PS-DNA）の合成
配列番号1で示される塩基配列からなり、且つ3´末端が蛍光標識（FAM標識）されてなるホスホロチオエートDNA（PS-DNA）を、定法により合成した。【０１４８】
実施例10．プロカチオン性siRNA（5×ThioL siRNA (3’ & 3’)）の合成
配列番号4で示される塩基配列からなるRNAの3´末端が、下記式（E）：【０１４９】
【化１９】
2019039403.tif 000020
【０１５０】
で表される構造が連結されてなるプロカチオン性修飾1本鎖RNA（5×cagtion guide strand (3’)）を、プロカチオン性ホスホロアミダイトモノマー（参考例3）を用いて、実施例1と同様にして合成した。【０１５１】
一方で、配列番号5で示される塩基配列からなるRNAの3´末端が、下記式（E）：【０１５２】
【化２０】
2019039403.tif 000021
【０１５３】
で表される構造が連結されてなるプロカチオン性修飾1本鎖RNA（5×cation passenger strand (3’)）を、プロカチオン性ホスホロアミダイトモノマー（参考例3）を用いて、実施例1と同様にして合成した。【０１５４】
5×cation guide strand (3’)と5×cation passenger strand (3’)とを混合したのち、1×annealing buffer (60 mM KCl, 6 mM HEPES-KOH pH 7.5, 0.2 mM MgCl2) 中で目的濃度 (0.1〜1 μM) になるように調製し、90℃で3分間置いた後、3時間室温に戻るまで静置し、二本鎖RNA（プロカチオン性siRNA（5×cation siRNA (3’ & 3’)））を形成させた。【０１５５】
実施例11．プロカチオン性siRNA（5×cation siRNA (3’ & 5’)）の合成
配列番号5で示される塩基配列からなるRNAの5´末端が、下記式（E）：【０１５６】
【化２１】
2019039403.tif 000022
【０１５７】
で表される構造が連結されてなるプロカチオン性修飾1本鎖RNA（5×cation passenger strand (5’)）を、プロカチオン性ホスホロアミダイトモノマー（参考例3）を用いて、実施例1と同様にして合成した。【０１５８】
5×cation guide strand (3’)と5×cation passenger strand (5’)とを混合したのち、1×annealing buffer (60 mM KCl, 6 mM HEPES-KOH pH 7.5, 0.2 mM MgCl2) 中で目的濃度 (0.1〜1 μM) になるように調製し、90℃で3分間置いた後、3時間室温に戻るまで静置し、二本鎖RNA（プロカチオン性siRNA（5×cation siRNA (3’ & 5’)））を形成させた。【０１５９】
試験例8．細胞膜透過性試験3
ポリヌクレオチドとして、実施例9及び比較例6のアンチセンスポリヌクレオチドを使用する以外は、試験例1と同様にして行った。ポリヌクレオチド濃度は100nMとした。【０１６０】
結果を図８に示す。プロカチオン修飾の場合、市販のLipofetamine3000を用いた場合と同等の細胞膜透過性を示した。【０１６１】
試験例9．細胞毒性試験3
ポリヌクレオチドとして、実施例9及び比較例6のアンチセンスポリヌクレオチドを使用する以外は、試験例3と同様にして行った。ポリヌクレオチド濃度は1μMとした。【０１６２】
結果を図９に示す。実施例のポリヌクレオチド（5×cation-PS-DNA）は毒性を示さなかった。
【図１】
2019039403.tif 000025
【図２】
2019039403.tif 000026
【図３】
2019039403.tif 000027
【図４】
2019039403.tif 000028
【図５】
2019039403.tif 000029
【図６】
2019039403.tif 000030
【図７】
2019039403.tif 000031
【図８】
2019039403.tif 000032
【図９】
2019039403.tif 000033
【配列表】
2019039403000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月25日(2018.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）：
【化１】
2019039403.tif 000034
［式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、単結合、又は−Ｓ−Ｓ−及び−ＳＨからなる群より選択される少なくとも１種の基を含んでいてもよい二価の基を示す。Ｒ３は、−Ｏ−、又は−Ｏ−Ｒ３１（式中、Ｒ３１は、−Ｓ−Ｓ−及び−ＳＨからなる群より選択される少なくとも１種の基を含んでいてもよい一価の基を示す。）を示す。Ｚ１及びＺ２は同一又は異なって、−Ｏ−又は−ＮＨ−を示す。但し、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の内の少なくとも１つは−Ｓ−Ｓ−及び−ＳＨからなる群より選択される少なくとも１種の基を含む。ｎは任意の整数を示す。］
で表される構造を含む分子で修飾されており、且つ
ポリヌクレオチドの末端に前記一般式（１）で表される構造が連結されてなる、
修飾ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記Ｒ１がアルキレン基、又は環構造中に−Ｓ−Ｓ−を有する環由来の基であり、前記Ｒ２が単結合であり、且つ前記Ｒ３が−Ｏ−、又は−Ｏ−Ｒ３１ａ−Ｓ−Ｓ−Ｒ３１ｂ（式中、Ｒ３１ａはアルキレン基又は−Ｒ３１１ａ−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｒ３１２ａ−（Ｒ３１１ａ及びＲ３１２ａは同一又は異なって、アルキレン基を示す。）を示す。Ｒ３１ｂは保護基を示す。）である、請求項１に記載の修飾ポリヌクレオチド。
【請求項３】
（Ａ）前記Ｒ１がアルキレン基であり、前記Ｒ２が単結合であり、且つ前記Ｒ３が−Ｏ−Ｒ３１ａ−Ｓ−Ｓ−Ｒ３１ｂ（式中、Ｒ３１ａはアルキレン基又は−Ｒ３１１ａ−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｒ３１２ａ−（Ｒ３１１ａ及びＲ３１２ａは同一又は異なって、アルキレン基を示す。）を示す。Ｒ３１ｂは保護基を示す。）である、或いは
（Ｂ）前記Ｒ１が環構造中に−Ｓ−Ｓ−で表される基を有する環由来の基であり、前記Ｒ２が単結合であり、且つ前記Ｒ３が−Ｏ−である、
請求項１又は２に記載の修飾ポリヌクレオチド。
【請求項４】
（Ａ１）前記Ｒ１が炭素原子数が３〜６のアルキレン基であり、前記Ｒ２が単結合であり、且つ前記Ｒ３が−Ｏ−Ｒ３１ａ−Ｓ−Ｓ−Ｒ３１ｂ（式中、Ｒ３１ａは炭素原子数が３〜６のアルキレン基又は−Ｒ３１１ａ−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｒ３１２ａ−（Ｒ３１１ａ及びＲ３１２ａは同一又は異なって、炭素原子数が２〜６のアルキレン基を示す。）を示す。Ｒ３１ｂはアルキル基又はアリール基を示す。）である、或いは
（Ｂ１）前記Ｒ１が環構造中に−Ｓ−Ｓ−で表される基を有する４〜８員環由来の基であり、前記Ｒ２が単結合であり、且つ前記Ｒ３が−Ｏ−である、
請求項１〜３のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ｎが１〜３０である、請求項１〜４のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記Ｚ１及び前記Ｚ２が共に−Ｏ−である、請求項１〜５のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
【請求項７】
ポリヌクレオチドが、細胞内への導入用のポリヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
【請求項８】
ポリヌクレオチドが、アンチセンスポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆体、アプタマー、ガイドＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、ＤＮＡ、非天然核酸（ＬＮＡ、ＰＮＡ、モルフォリノ核酸からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜７のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
【請求項９】
ポリヌクレオチドの塩基長が２００塩基長以下である、請求項１〜８のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
ポリヌクレオチドの５´末端に前記一般式（１）で表される構造が連結されてなる、請求項１〜９のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１〜９及び１１のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチドを含有する、該修飾ポリヌクレオチドの細胞内への導入剤。
【請求項１３】
請求項１〜９及び１１のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチドを含有する、医薬。
【請求項１４】
請求項１〜９及び１１のいずれかに記載の修飾ポリヌクレオチドを含有する、試薬。
【請求項１５】
一般式（１）：
【化２】
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［式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、単結合、又は−Ｓ−Ｓ−及び−ＳＨからなる群より選択される少なくとも１種の基を含んでいてもよい二価の基を示す。Ｒ３は、−Ｏ−、又は−Ｏ−Ｒ３１（式中、Ｒ３１は、−Ｓ−Ｓ−及び−ＳＨからなる群より選択される少なくとも１種の基を含んでいてもよい一価の基を示す。）を示す。Ｚ１及びＺ２は同一又は異なって、−Ｏ−又は−ＮＨ−を示す。但し、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の内の少なくとも１つは−Ｓ−Ｓ−及び−ＳＨからなる群より選択される少なくとも１種の基を含む。ｎは任意の整数を示す。］
で表される構造を含む、ポリヌクレオチド末端への連結用分子。
【国際調査報告】
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