(57)【要約】  高感度かつ高精度であり、迅速性が飛躍的に向上したアッセイ法、該アッセイ法に用いる融合タンパク質含有集合体体及び該集合体の製造方法を提供する。本発明の融合タンパク質含有集合体は、標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質を少なくとも含有すること等を特徴とする。
2010125932.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質を少なくとも含有するか、又は、
標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質と、該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質とを少なくとも含有することを特徴とする融合タンパク質含有集合体。
【請求項２】
上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれにビオチンが固定化され、蛍光色素又は酵素が、該タンパク質（Ａ）、タンパク質（Ｂ）、ビオチン及びアビジンのうち少なくとも１つに固定化され、上記融合タンパク質が、該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）のうち少なくとも一方を合計４個とアビジン１個とを含むことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質含有集合体。
【請求項３】
上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれが、抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメントであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の融合タンパク質含有集合体。
【請求項４】
上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）が、ともに抗体であり、蛍光色素又は酵素が、該抗体のみに固定化されるか、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇのみに固定化されるか、あるいは該抗体とプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇとに固定化され、上記融合タンパク質が、該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）のうち少なくとも一方を合計２〜５個と、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇとを含むことを特徴とする請求項１から請求項３までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体。
【請求項５】
上記部位α及びβが、同一であることを特徴とする請求項１から請求項４までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体。
【請求項６】
上記酵素が、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコースオキシダーゼであることを特徴とする請求項１から請求項５までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体。
【請求項７】
下記工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする融合タンパク質含有集合体の製造方法；
工程（ａ）：標的物質、標的ウイルス又は標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルス又は標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）からなるタンパク質、ビオチンならびにアビジンのうち少なくとも１つに蛍光色素又は酵素を固定化する工程、
工程（ｂ）：蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよい該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれに、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいビオチンを固定化することによって、ビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を得る工程及び
工程（ｃ）：蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ１個以上含むように混合し、
該ビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）の合計に対して、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいアビジンを、そのモル比で４：１以上となるようにさらに混合することによって、融合タンパク質含有集合体を得る工程。
【請求項８】
上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれが、抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメントであることを特徴とする請求項７に記載の融合タンパク質含有集合体の製造方法。
【請求項９】
下記工程（ｄ）及び（ｅ）のうち少なくとも一方と（ｆ）とを含むことを特徴とする請求項７又は請求項８に記載の融合タンパク質含有集合体の製造方法。
工程（ｄ）：標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合する抗体（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合する抗体（Ｂ）それぞれに蛍光色素又は酵素を固定化する工程、
工程（ｅ）：プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇに蛍光色素又は酵素を固定化する工程、及び
工程（ｆ）：蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよい抗体（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ１個以上含むように混合し、該抗体（Ａ）及び（Ｂ）の合計に対して、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇ（ただし、抗体（Ａ）及び（Ｂ）に蛍光色素又は酵素が固定化されていない場合、用いるプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇには蛍光色素又は酵素が固定化されている。）を、そのモル比で２：１以上となるようにさらに混合することによって、集合体を得る工程。
【請求項１０】
上記部位α及びβが、同一であることを特徴とする請求項７から請求項９までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体の製造方法。
【請求項１１】
上記酵素が、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコースオキシダーゼであることを特徴とする請求項７から請求項１０までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体の製造方法。
【請求項１２】
下記工程（ｇ）〜（ｌ）を含むことを特徴とするアッセイ法；
工程（ｇ）：請求項１から請求項６までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体と検体とを接触させることによって、該検体に含有される標的物質、標的ウイルス又は標的細胞を介して凝集体を形成する工程、
工程（ｈ）：該工程（ｇ）を経て得られた反応物をフィルタに通すことによって、該凝集体のみを単離する工程、
工程（ｉ）：該工程（ｈ）を経て得られた凝集体に、蛍光基質又は消光剤基質を反応させ、それぞれ蛍光色素（Ｅ）又は消光剤を生成する工程（ただし、上記工程（ｇ）において、請求項１から請求項６までのいずれか一項に記載の酵素を含む融合タンパク質含有集合体を用いた場合のみ。）、
工程（ｊ）：透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された誘電体からなるスペーサ層、又は該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された蛍光色素（Ｆ）層とを少なくとも有するプラズモン励起センサの、該スペーサ層表面又は該蛍光色素（Ｆ）層表面に、上記工程（ｈ）を経て得られた凝集体又は上記工程（ｉ）を経て得られた蛍光色素（Ｅ）又は消光剤を接触させる工程、
工程（ｋ）：該工程（ｊ）で得られたプラズモン励起センサに、該基板の、該薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、及び
工程（ｌ）：該工程（ｋ）で得られた測定結果から、該標的物質量、該標的ウイルス量又は該標的細胞量を算出する工程。
【請求項１３】
上記工程（ｇ）及び（ｈ）の免疫反応場、及び上記工程（ｊ）及び（ｋ）のＳＰＦＳ検出場が、それぞれ独立していることを特徴とする請求項１２に記載のアッセイ法。
【請求項１４】
上記金属薄膜が、金、銀、アルミニウム、銅及び白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成されることを特徴とする請求項１２又は請求項１３に記載のアッセイ法。
【請求項１５】
上記金属が、金からなることを特徴とする請求項１４に記載のアッセイ法。
【請求項１６】
上記誘電体が、二酸化ケイ素（ＳｉＯ４）又は二酸化チタン（ＴｉＯ２）を含むことを特徴とする請求項１２から請求項１５までのいずれか一項に記載のアッセイ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主にタンパク質から構成される集合体、その製造方法及び該集合体を用いたアッセイ法に関する。さらに詳しくは、本発明は、アナライトと特異的に会合する２種類のタンパク質と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質含有集合体、その製造方法、及び表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）の原理に基づき該集合体を用いたアッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）とは、照射したレーザ光が金薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ）する条件において、金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、照射したレーザ光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金薄膜近傍の蛍光色素を効率良く励起させることによって、極微量及び／又は極低濃度のアナライトを検出することができる方法である。【０００３】
このようなＳＰＦＳの原理に基づいたバイオセンサ又はバイオチップに関する例として、特許文献１には、金属基板表面にカルボキシメチルデキストランを用いたリガンド（１次抗体）固定化膜を配し、表面プラズモンにより増強された電場で、抗原に関係付けられた蛍光色素を検出する方法が示されている。【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載の方法は、基板に固定化された抗体を利用する、いわゆるヘテロジニアスな反応系であるため、抗体の固定化量と自由度に制限があり、抗原抗体反応の効率が低いという問題があった。【０００５】
なお、反応効率を向上させる方法として、遊離の抗体を使用する、いわゆるホモジニアスな反応系が考えられるが、ＳＰＦＳバイオセンサと組み合わせたとき、いかに検出部分へ抗原抗体反応物を回収するかが問題となっていた。【０００６】
他方、特許文献２には、血球などが保持する抗原に対する抗体を用いて、該血球を凝集し、フィルタでトラップさせ、検出する方法が示されている。【０００７】
しかしながら、特許文献２に記載の方法は、標的物質が同一エピトープを複数保持している血球など比較的大きな細胞などを凝集する方法であって、タンパク質や核酸などの分子に対する汎用性はなかった。さらに、凝集物をフィルタでトラップした後、蛍光物質、化学発光物質をさらに反応させる必要があり、感度が低い割に、操作も煩雑であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第３２９４６０５号
【特許文献２】特開２００８−２５６４５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記問題・状況にかんがみてなされたものであり、その解決課題は、高感度かつ高精度であり、迅速性が飛躍的に向上したアッセイ法、該アッセイ法に用いる融合タンパク質含有集合体及び該集合体の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意検討した結果、アナライトが有する部位αに特異的なタンパク質（Ａ）及び該部位αを有するアナライトの部位βに特異的なタンパク質（Ｂ）と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質含有集合体を、ＳＰＦＳを利用したサンドイッチイムノアッセイ法に用いると、迅速性と感度が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明に係る上記課題は、下記の手段により解決される。【００１２】
１．標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質を少なくとも含有するか、又は、
標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質と、該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質とを少なくとも含有することを特徴とする融合タンパク質含有集合体。【００１３】
２．上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれにビオチンが固定化され、蛍光色素又は酵素が、該タンパク質（Ａ）、タンパク質（Ｂ）、ビオチン及びアビジンのうち少なくとも１つに固定化され、上記融合タンパク質が、該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）の合計４個とアビジン１個とを含むことを特徴とする前記第１項に記載の融合タンパク質含有集合体。【００１４】
３．上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれが、抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメントであることを特徴とする前記第１項又は第２項に記載の融合タンパク質含有集合体。【００１５】
４．上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）が、ともに抗体であり、蛍光色素又は酵素が、該抗体のみに固定化されるか、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇのみに固定化されるか、あるいは該抗体とプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇとに固定化され、上記融合タンパク質が、該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）の合計２〜５個と、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇとを含むことを特徴とする前記第１項から第３項までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体。【００１６】
５．上記部位α及びβが、同一であることを特徴とする前記第１項から第４項までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体。【００１７】
６．上記酵素が、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコースオキシダーゼであることを特徴とする前記第１項から第５項までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体。【００１８】
７．下記工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする融合タンパク質含有集合体の製造方法；
工程（ａ）：標的物質、標的ウイルス又は標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルス又は標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）からなるタンパク質、ビオチンならびにアビジンのうち少なくとも１つに蛍光色素又は酵素を固定化する工程、
工程（ｂ）：蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよい該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれに、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいビオチンを固定化することによって、ビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を得る工程及び
工程（ｃ）：蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ１個以上含むように混合し、
該ビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）の合計に対して、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいアビジンを、そのモル比で４：１以上となるようにさらに混合することによって、融合タンパク質含有集合体を得る工程。【００１９】
８．上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれが、抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメントであることを特徴とする前記第７項に記載の融合タンパク質含有集合体の製造方法。【００２０】
９．下記工程（ｄ）及び（ｅ）のうち少なくとも一方と（ｆ）とを含むことを特徴とする前記第７項又は第８項に記載の融合タンパク質含有集合体の製造方法。【００２１】
工程（ｄ）：標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合する抗体（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合する抗体（Ｂ）それぞれに蛍光色素又は酵素を固定化する工程、
工程（ｅ）：プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇに蛍光色素又は酵素を固定化する工程、及び
工程（ｆ）：蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよい抗体（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ１個以上含むように混合し、該抗体（Ａ）及び（Ｂ）の合計に対して、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇ（ただし、抗体（Ａ）及び（Ｂ）に蛍光色素又は酵素が固定化されていない場合、用いるプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇには蛍光色素又は酵素が固定化されている。）を、そのモル比で２：１以上となるようにさらに混合することによって、集合体を得る工程。【００２２】
１０．上記部位α及びβが、同一であることを特徴とする前記第７項から第９項までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体の製造方法。【００２３】
１１．上記酵素が、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコースオキシダーゼであることを特徴とする前記第７項から第１項０までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体の製造方法。【００２４】
１２．下記工程（ｇ）〜（ｌ）を含むことを特徴とするアッセイ法；
工程（ｇ）：前記第１項から第６項までのいずれか一項に記載の融合タンパク質含有集合体と検体とを接触させることによって、該検体に含有される標的物質、標的ウイルス又は標的細胞を介して凝集体を形成する工程、
工程（ｈ）：該工程（ｇ）を経て得られた反応物をフィルタに通すことによって、該凝集体のみを単離する工程、
工程（ｉ）：該工程（ｈ）を経て得られた凝集体に、蛍光基質又は消光剤基質を反応させ、それぞれ蛍光色素（Ｅ）又は消光剤を生成する工程（ただし、上記工程（ｇ）において、請求項１から請求項６までのいずれか一項に記載の酵素を含む融合タンパク質含有集合体を用いた場合のみ。）、
工程（ｊ）：透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された誘電体からなるスペーサ層、又は該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された蛍光色素（Ｆ）層とを少なくとも有するプラズモン励起センサの、該スペーサ層表面又は該蛍光色素（Ｆ）層表面に、上記工程（ｈ）を経て得られた凝集体又は上記工程（ｉ）を経て得られた蛍光色素（Ｅ）又は消光剤を接触させる工程、
工程（ｋ）：該工程（ｊ）で得られたプラズモン励起センサに、該基板の、該薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、及び
工程（ｌ）：該工程（ｋ）で得られた測定結果から、該標的物質量、該標的ウイルス量又は該標的細胞量を算出する工程。【００２５】
１３．上記工程（ｇ）及び（ｈ）の免疫反応場、及び上記工程（ｊ）及び（ｋ）のＳＰＦＳ検出場が、それぞれ独立していることを特徴とする前記第１２項に記載のアッセイ法。【００２６】
１４．上記金属薄膜が、金、銀、アルミニウム、銅及び白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成されることを特徴とする前記第１２項又は第１３項に記載のアッセイ法。【００２７】
１５．上記金属が、金からなることを特徴とする前記１４項に記載のアッセイ法。【００２８】
１６．上記誘電体が、二酸化ケイ素（ＳｉＯ４）又は二酸化チタン（ＴｉＯ２）を含むことを特徴とする前記第１２項から第１５項までのいずれか一項に記載のアッセイ法。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の集合体をアッセイ法に用いると、（１）ＳＰＦＳ測定用センサ基盤に抗体等を固定化する必要がないことから、抗体等の固定化量に係る問題及び該センサ基盤への非特異的吸着を考慮する必要もなく、（２）免疫反応場が液液系であることから反応効率が向上し、（３）免疫反応場とＳＰＦＳ検出場との完全分離が可能であることから、免疫反応条件及び検出条件を最適化することができ、さらに散乱ノイズの影響を受けづらく、（４）ホモジニアスかつ極めて高効率な抗体抗原反応を実現することができ、さらに、蛍光シグナルが凝集体として濃縮されるので、通常のＳＰＦＳよりも迅速性と感度が飛躍的に向上し、又は（５）融合タンパク質に固定化されている酵素（この酵素は、蛍光基質を蛍光色素（Ｅ）に変換する反応を触媒するか、又は消光剤基質を消光剤に変換する反応を触媒する。）によって、シグナルを増幅することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】蛍光色素を含む融合タンパク質（Ｉ）の一態様の模式図
【図２】酵素を含む融合タンパク質（Ｉ）の一態様の模式図
【図３】蛍光色素を含む融合タンパク質（II）の一態様の模式図
【図４】酵素を含む融合タンパク質（II）の一態様の模式図であって、該融合タンパク質（II）１１に固定化されている酵素３ｂによって蛍光基質１３が加水分解され、蛍光色素（Ｅ）１４に変換される反応を模式的に示す
【図５】蛍光色素を含む融合タンパク質（Ｉ）含有集合体の一態様の模式図
【図６】酵素を含む融合タンパク質（Ｉ）含有集合体の一態様の模式図
【図７】標的物質、標的ウイルス又は標的細胞７を介して蛍光色素を含む融合タンパク質（II）１２が互いに会合して形成された凝集体２１の模式図
【図８】標的物質、標的ウイルス又は標的細胞７を介して酵素を含む融合タンパク質（II）１２が互いに会合して形成された凝集体２１の模式図
【図９】本発明の蛍光色素を含む融合タンパク質含有集合体に係るアッセイ法を模式的に示した図
【図１０】本発明の酵素を含む融合タンパク質含有集合体に係るアッセイ法を模式的に示した図
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の融合タンパク質含有集合体は、標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質を少なくとも含有するか、又は、
標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質と、該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質とを少なくとも含有することを特徴とする。換言すると、本発明の融合タンパク質含有集合体は、標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）のうち少なくとも一方を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質からなる集合体であって、該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ１個以上有することを特徴とする。
【００３２】
この特徴は、請求項１から請求項１６までの請求項に係る発明に共通する技術的特徴である。なお、本発明においては、本発明に係る「酵素」として、後述するように、「蛍光基質」を「蛍光色素」に変換する反応を触媒する酵素、又は「消光剤基質」を「消光剤」に変換する反応を触媒する酵素を用いることを特徴とする。
【００３３】
本発明の実施態様としては、本発明の効果発現の観点から、上記タンパク質にビオチンが固定化され、蛍光色素又は酵素が、該タンパク質、ビオチン及びアビジンのうち少なくとも１つに固定化され、上記融合タンパク質は、該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）の合計４個とアビジン１個とを含むことが好ましく、特に上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれは、抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメントであることが好ましい。
【００３４】
また、上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）は、ともに抗体であり、蛍光色素又は酵素は、該抗体のみに固定化されるか、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇのみに固定化されるか、あるいは該抗体とプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇに固定化され、上記融合タンパク質は、該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）の合計２〜５個と、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇとを含むことも好ましい。
【００３５】
上記部位α及びβは、同一であってもよい。
【００３６】
上記酵素は、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコースオキシダーゼであることが好ましい。
【００３７】
本発明の融合タンパク質含有集合体の製造方法は、前記工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むことを特徴とする。
【００３８】
該製造方法において、上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれは、抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメントであることが好ましい。
【００３９】
また、本発明の融合タンパク質含有集合体の製造方法は、前記工程（ｄ）及び（ｅ）のうち少なくとも一方と（ｆ）とを含むことを特徴とする。
【００４０】
該製造方法において、上記部位α及びβは、同一であってもよい。
【００４１】
上記酵素は、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はグルコースオキシダーゼであることが好ましい。
【００４２】
本発明のアッセイ法は、下記工程（ｇ）〜（ｌ）を含むことを特徴とする。
【００４３】
上記工程（ｇ）、（ｈ）の免疫反応場、及び上記工程（ｊ）、（ｋ）のＳＰＦＳ検出場は、それぞれ独立していることが好ましい。
【００４４】
上記金属薄膜は、金、銀、アルミニウム、銅及び白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成されることが好ましく、該金属は、金からなることがより好ましい。
【００４５】
上記誘電体は、二酸化ケイ素（ＳｉＯ４）又は二酸化チタン（ＴｉＯ２）を含むことが好ましい。
【００４６】
以下、本発明とその構成要素、及び本発明を実施するための形態・態様について詳細な説明をする。
【００４７】
＜集合体＞
本発明の融合タンパク質含有集合体は、標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質を少なくとも含有するか、又は、
標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質と、該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含む融合タンパク質とを少なくとも含有することを特徴とする。
【００４８】
換言すると、本発明の集合体は、「標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）」及び「該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）」のうち少なくとも一方を合計２個以上と「蛍光色素」又は「酵素」とを含む「融合タンパク質」を含有する「集合体」であって、該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ１個以上有することを特徴とするものである。
【００４９】
すなわち、本発明の集合体は、このような融合タンパク質を複数個含むものであって、複数個の融合タンパク質が標的物質、標的ウイルス又は標的細胞を介して形成される「凝集体」（後述する。）とは異なる。
【００５０】
なお、本発明の効果発現を阻害しない限りにおいて、本発明の集合体には、上記の標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する部位とタンパク質との特異的会合を阻害しない何らかの有用物質等を含有させても良い。
【００５１】
本発明の集合体に含まれる上記融合タンパク質の濃度は、高い方が望ましく、少なくとも１０ｎＭ以上が好ましく、１００ｎＭ以上がより好ましく、１μＭ以上が特に好ましい。
【００５２】
本発明の集合体に含まれる上記タンパク質（Ａ）及び上記タンパク質（Ｂ）は、それぞれ少なくとも１個、好ましくは９：１〜１：９、より好ましくは８：２〜２：８、さらに好ましくは７：３〜３：７、特に好ましくは６：４〜４：６、もっとも好ましくは５：５の比で表される。上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）の集合体に含まれる個数が５：５の比に近いほど（同数に近いほど）、凝集体を効率良く安定に形成できることから好ましい。なお、このような態様において、上記タンパク質（Ａ）及び上記タンパク質（Ｂ）の集合体に含まれる合計個数は一定とする。
【００５３】
（標的物質，標的ウイルス，標的細胞）
本発明において、「標的物質」、「標的ウイルス」及び「標的細胞」（以下、これらをまとめて単に「アナライト」ともいう。）それぞれは、タンパク質が特異的に会合（結合）し得る部位を独立して２以上有すれば、物質（単体又は化合物である化学物質）もしくはウイルスである非生物であっても、又は単細胞もしくは多細胞からなる生物であってもよく、特に限定されるものではない。
【００５４】
「標的物質」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、又はヌクレオシド、ヌクレオチド及びそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、又はこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、これらの分子は分子断片であってもよい。さらに具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されるものではない。
【００５５】
「標的ウイルス」としては、例えば、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）など動物に感染するウイルスであっても、植物に感染するウイルスであっても、又は細菌に感染するバクテリオファージであってもよく、特に限定されるものではない。
【００５６】
「標的細胞」としては、例えば、ヒトなどの哺乳動物を含む脊椎動物及び無脊椎動物、植物、藻類、菌類、バクテリアなどに由来する細胞をいい、バクテリアとしては、具体的に、細胞壁に多量のミコール酸を含有する結核菌などが挙げられる。
【００５７】
標的物質、標的ウイルス又は標的細胞が有する、タンパク質が特異的に会合（結合）し得る最小の部位は、２以上あり、かつ完全に独立している（すなわち、１以上の部位α、及び該部位αとはまったく異なる１以上の部位βである。）か、又は該部位αと該部位βとが同一である。なお、「同一である」とは、完全同一以外にも、部分同一（一部重複）も包含する。
【００５８】
ただし、上記部位α及びβが同一である場合、下記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）は同一のものを用いることはできない。
【００５９】
（タンパク質（Ａ）及び（Ｂ））
本発明において、「標的物質、標的ウイルス又は標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）」（以下、単に「タンパク質（Ａ）」ともいう。）は、上述したような標的物質、標的ウイルス又は標的細胞に、それが有する１以上の部位αを介して、特異的に会合（結合）するタンパク質であれば特に限定されるものではなく、例えば、種々のモノクローナル抗体（Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメントも含む。）、ＭＤＰ１（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）などが挙げられる。なお、「タンパク質」は、本発明において、ポリペプチドやオリゴペプチドも包含するものとする。
【００６０】
また、本発明において、「上記部位αを有する標的物質、標的ウイルス又は標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）」（以下、単に「タンパク質（Ｂ）」ともいう。）は、上述したような標的物質、標的ウイルス又は標的細胞が１以上の部位α及び１以上の部位βを有し、該部位βを介して特異的に会合（結合）するタンパク質であれば特に限定されるものではなく、具体例として、タンパク質（Ａ）と同様の種類のものが挙げられる。
【００６１】
（蛍光色素）
本発明において、「蛍光色素」は、所定の励起光を照射して、又は電界効果を利用して、励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も包含する。
【００６２】
本発明で用いられる蛍光色素は、後述する金属薄膜による吸光に起因する消光を受けない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計（ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ）よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。
【００６３】
このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス（株）製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６，４０６，２９７号、同第６，２２１，６０４号、同第５，９９４，０６３号、同第５，８０８，０４４号、同第５，８８０，２８７号、同第５，５５６，９５９号及び同第５，１３５，７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。
【００６４】
これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）及び発光波長（ｎｍ）を表１に示す。
【００６５】
【表１】
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【００６６】
また、蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えば、Ｅｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素も、本発明に用いられる蛍光色素となりうる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０〜３４０ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ３＋が挙げられる。さらに、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）又はＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ；ＬｙｏＦｌｏｇｅｎ（登録商標））などに代表される蛍光タンパク質、ラテックスやシリカなどの蛍光微粒子なども、本発明に用いられる蛍光色素となりうる。
【００６７】
本発明においては、後述する蛍光測定を行う際に、金属薄膜を形成する金属種による吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属薄膜として金を用いる場合には、金による吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が６００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。したがって、この場合には、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７等近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが特に望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、金属薄膜として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が４００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。
【００６８】
これら蛍光色素は１種単独でも、２種以上併用してもよい。
【００６９】
（酵素）
本発明においては、本発明に係る「酵素」として、「蛍光基質」を「蛍光色素（Ｅ）」に変換する反応を触媒する酵素（Ｃ）、又は「消光剤基質」を「消光剤」に変換する反応を触媒する酵素（Ｄ）を用いることを特徴とする。
【００７０】
このような酵素（Ｃ）としては、例えば、アルカリフォスファダーゼ（ＡＬＰ）、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）などが挙げられる。
【００７１】
また、酵素（Ｄ）は、酵素反応（Ｄ−１）として、保護基によってブロックされている「消光剤基質」を、酵素反応によって消光剤を活性化したり、酵素反応（Ｄ−２）として、特定の「消光剤基質」を用いた酵素反応によって活性化した消光剤によりｐＨを低下させたりする。
【００７２】
酵素（Ｄ）のうち、酵素反応（Ｄ−１）に用いられるものとしては、例えば、β−ガラクトシダーゼ（βＧＡＬ）、β−グルコシダーゼ（βＧｌｕ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）などが挙げられ、酵素反応（Ｄ−２）に用いられるものとしては、例えば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）などが挙げられる。
【００７３】
これら酵素は、１種単独でも、また２種以上併用することもできる。
【００７４】
なお、「蛍光基質」、「蛍光色素（Ｅ）」、「消光剤基質」及び「消光剤」についは後述する。
【００７５】
〔融合タンパク質〕
本発明の集合体を構成する融合タンパク質は、タンパク質（Ａ）及びタンパク質（Ｂ）のうち少なくとも一方を合計２個以上と蛍光色素又は酵素とを含むものであり、以下の融合タンパク質（Ｉ）及び（II）が好ましい態様として挙げられる。
【００７６】
（融合タンパク質（Ｉ））
図１及び図２に例示するように、融合タンパク質（Ｉ）１０は、タンパク質（Ａ）１及びタンパク質（Ｂ）２が、ともに抗体であってもよく、該抗体に蛍光色素３ａ又は酵素３ｂ、及びビオチン４が固定化され（図示していないが、蛍光色素又は酵素は、抗体以外にもビオチン及び／又はアビジンに固定化することができ、例えば、蛍光色素又は酵素は、抗体、ビオチン及びアビジンに同時に固定化されていてもよい。）、このようなタンパク質（Ａ）１及びタンパク質（Ｂ）２の合計４個とアビジン５の１個とを含むものである。
【００７７】
なお、図１及び図２に示す融合タンパク質（Ｉ）１０が有する抗体は、タンパク質（Ａ）１が２個及びタンパク質（Ｂ）２が２個であるが、本発明は、この態様に限定されず、タンパク質（Ａ）のみを４個有する態様なども包含される。
【００７８】
本発明において、アビジンは、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンも包含するものとする。
【００７９】
（融合タンパク質（II））
図３及び図４に例示するように、融合タンパク質（II）１１は、タンパク質（Ａ）１及びタンパク質（Ｂ）２が、ともに抗体であり、蛍光色素３ａ又は酵素３ｂが、該抗体のＦｃフラグメントに固定化され（図示していないが、蛍光色素又は酵素は、抗体のＦｃフラグメント以外にプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇに固定化することができ、例えば、蛍光色素又は酵素は、抗体のＦｃフラグメントと、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇとに同時に固定化されていてもよい。）、タンパク質（Ａ）１及びタンパク質（Ｂ）２の合計２個とプロテインＡ６（図示していないが、プロテインＡ以外にプロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇであってもよい。プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇを用いる場合、会合（結合）し得るタンパク質（Ａ）及びタンパク質（Ｂ）は、合計２〜５個である。）とを含むものである。
【００８０】
なお、図３及び図４に示す融合タンパク質（II）１１が有する抗体は、それぞれ１個のタンパク質（Ａ）１及びタンパク質（Ｂ）２であるが、本発明は、この態様に限定されず、タンパク質（Ａ）１のみからなる態様なども包含される。
【００８１】
本発明において、プロテインＡ及びプロテインＧは天然型であっても組換え型であってもよい。
【００８２】
これら融合タンパク質のうち、後述する凝集体を効率良く安定に形成できることから、融合タンパク質が有するタンパク質（Ａ）及びタンパク質（Ｂ）の合計個数が多い（すなわち、濃度が高い）ものほど好ましい。
【００８３】
＜集合体の製造方法＞
本発明の集合体の製造方法は、以下の製造方法（ｉ）〜（iv）のいずれかの態様を有し、製造方法（ｉ）は、下記工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含み；製造方法（ii）は、下記工程（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）を含み；製造方法（iii）は、下記工程（ｄ）及び（ｆ）を含み；製造方法（iv）は、下記工程（ｅ）及び（ｆ）を含むことを特徴とするものである。
【００８４】
工程（ａ）：標的物質、標的ウイルス又は標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルス又は標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）からなるタンパク質、ビオチンならびにアビジンのうち少なくとも１つに蛍光色素又は酵素を固定化する工程。
【００８５】
工程（ｂ）：蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよい上記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれに、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいビオチンを固定化することによって、ビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を得る工程。
【００８６】
工程（ｃ）：蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ１個以上含むように混合し、該ビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）の合計に対して、蛍光色素又は酵素に固定化されていてもよいアビジンを、そのモル比で４：１以上となるようにさらに混合することによって、集合体を得る工程。
【００８７】
工程（ｄ）：標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合する抗体（Ａ）及び該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合する抗体（Ｂ）それぞれに蛍光色素又は酵素を固定化する工程。
【００８８】
工程（ｅ）：プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇに蛍光色素又は酵素を固定化する工程。
【００８９】
工程（ｆ）：蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよい抗体（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ１個以上含むように混合し、該抗体（Ａ）及び（Ｂ）の合計に対して、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇを、そのモル比で２：１以上となるようにさらに混合することによって、融合タンパク質含有集合体を得る工程。
【００９０】
〔製造方法（ｉ）〕
製造方法（ｉ）は、上記工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むものであって、タンパク質（（Ａ），（Ｂ））、ビオチン及びアビジンのうち少なくとも１つに蛍光色素又は酵素が固定化されている融合タンパク質（Ｉ）含有集合体を製造する方法である。
【００９１】
該タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）それぞれは、抗体（免疫グロブリン）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント及びＦ（ａｂ’）フラグメントのいずれかであることが好ましい。
【００９２】
（工程（ａ））
工程（ａ）とは、「標的物質、標的ウイルス又は標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）」（タンパク質（Ａ））、及び「該部位αを有する標的物質、標的ウイルス又は標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）」（タンパク質（Ｂ））からなるタンパク質、ビオチンならびにアビジンのうち少なくとも１つに「蛍光色素」又は「酵素」を固定化する工程である。
【００９３】
タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）、ならびに「蛍光色素」及び「酵素」は、上記＜集合体＞の項目内で記載したものと同様である。なお、上記工程（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）に記載のこれらの用語についても同様である。
【００９４】
タンパク質（（Ａ）及び（Ｂ））、ビオチン及び／又はアビジンに酵素を固定化する方法として、例えば、アミンカップリングする方法、チオールカップリングする方法、アルデヒドカップリングする方法などが挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されない。
【００９５】
タンパク質（Ａ），（Ｂ）に蛍光色素又は酵素を固定化する際、タンパク質（Ａ），（Ｂ）が、抗体である場合、蛍光色素又は酵素は、好ましくは定常領域（ＣＨ１及びＣＬ）、より好ましくはＦｃフラグメントに固定化し、タンパク質（Ａ），（Ｂ）が、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメントである場合、蛍光色素又は酵素は、定常領域（ＣＨ１及びＣＬ）に固定化することが好ましい。
【００９６】
このようにしてタンパク質（Ａ）、タンパク質（Ｂ）、ビオチン及びアビジンに蛍光色素又は酵素を固定化したものを、それぞれ「蛍光色素又は酵素標識タンパク質（Ａ）」、「蛍光色素又は酵素標識タンパク質（Ｂ）」、「蛍光色素又は酵素標識ビオチン」及び「蛍光色素又は酵素標識アビジン」ともいう。
【００９７】
（工程（ｂ））
工程（ｂ）とは、「蛍光色素」又は「酵素」が固定化されていてもよい「標的物質、標的ウイルス又は標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）」及び「該部位αを有する標的物質、標的ウイルス又は標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）」それぞれに、「蛍光色素」又は「酵素」が固定化されていてもよいビオチンを固定化することによって、「ビオチン化タンパク質（Ａ）」及び「ビオチン化タンパク質（Ｂ）」を得る工程である。なお、「蛍光色素」又は酵素は、タンパク質（Ａ），（Ｂ）及びビオチンに同時に固定化されていてもよい。
【００９８】
すなわち、工程（ｂ）とは、（１）蛍光色素又は酵素標識タンパク質（Ａ），（Ｂ）にビオチンを固定化する工程；（２）タンパク質（Ａ），（Ｂ）に蛍光色素又は酵素標識ビオチンを固定化する工程；（３）タンパク質（Ａ），（Ｂ）にビオチンを固定化する工程；（４）蛍光色素又は酵素標識抗体（Ａ），（Ｂ）に蛍光色素又は酵素標識ビオチンを固定化する工程のいずれかである。
【００９９】
タンパク質にビオチンを固定化する方法として、例えば、アミンカップリングする方法、チオールカップリングする方法、アルデヒドカップリングする方法などが挙げられるが、タンパク質及びビオチンのいずれかに酵素が固定化されている場合であっても、本発明はこれらの方法に限定するものではない。
【０１００】
タンパク質（Ａ），（Ｂ）が、抗体である場合、ビオチンは、好ましくは定常領域（ＣＨ１及びＣＬ）、より好ましくはＦｃフラグメントに固定化し、タンパク質（Ａ），（Ｂ）が、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメントである場合、ビオチンは、定常領域（ＣＨ１及びＣＬ）に固定化することが好ましい。
【０１０１】
このようにしてタンパク質（Ａ）及びタンパク質（Ｂ）それぞれにビオチンを固定化したものを、それぞれ「ビオチン化タンパク質（Ａ）」及び「ビオチン化タンパク質（Ｂ）」ともいう。
【０１０２】
（工程（ｃ））
工程（ｃ）とは、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ１個以上含むように混合し、該ビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）の合計に対して、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいアビジンを、そのモル比で４：１以上となるようにさらに混合することによって、集合体を得る工程である。
【０１０３】
すなわち、工程（ｃ）は、上記工程（ｂ）を経て得られた、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ少なくとも１個、好ましくは９：１〜１：９、より好ましくは８：２〜２：８、さらに好ましくは７：３〜３：７、特に好ましくは６：４〜４：６、もっとも好ましくは５：５の比で含むように混合し、該ビオチン化タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）の合計に対して、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいアビジンを、そのモル比で４：１以上、好ましくは４：１となるようにさらに混合することによって、図１及び図２に示すような融合タンパク質（Ｉ）含有集合体を得る工程である。
【０１０４】
該ビオチン化タンパク質（Ａ）と（Ｂ）との個数の比、及び該ビオチン化タンパク質（Ａ），（Ｂ）と該アビジンとのモル比が上記範囲内であると、凝集体を効率良く安定に形成できることから好ましい。
【０１０５】
〔製造方法（ii）〕
製造方法（ii）は、上記工程（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）を含むものであって、抗体（好ましくは抗体の定常領域（ＣＨ１及びＣＬ）、より好ましくは抗体のＦｃフラグメント）と、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇとに蛍光色素又は酵素が固定化されている融合タンパク質（II）含有集合体を製造する方法である。
【０１０６】
（工程（ｄ））
工程（ｄ）とは、「標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合する抗体（Ａ）」及び「該部位αを有する標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞の１以上の部位βと特異的に会合する抗体（Ｂ）」それぞれに「蛍光色素」又は「酵素」を固定化する工程である。
【０１０７】
該抗体（Ａ）及び（Ｂ）のそれぞれに蛍光色素又は酵素を固定化する方法は、上記工程（ａ）に記載のタンパク質への固定化方法と同様である。
【０１０８】
該抗体（Ａ）及び（Ｂ）に蛍光色素又は酵素を固定化したものを、それぞれ「）蛍光色素又は酵素標識抗体（Ａ）」及び「蛍光色素又は酵素標識抗体（Ｂ）」ともいう。
【０１０９】
（工程（ｅ））
工程（ｅ）とは、「プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇ」に「蛍光色素」又は「酵素」を固定化する工程である。
【０１１０】
「プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇ」は上述した通りである。
【０１１１】
プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇに蛍光色素又は酵素を固定化する方法として、例えば、アミンカップリングする方法、チオールカップリングする方法、アルデヒドカップリングする方法などが挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定するものではない。
【０１１２】
このようにプロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＡ／Ｇそれぞれに蛍光色素又は酵素を固定化したものを、「蛍光色素又は酵素標識プロテインＡ」、「蛍光色素又は酵素標識プロテインＧ」及び「蛍光色素又は酵素標識プロテインＡ／Ｇ」ともいう。
【０１１３】
（工程（ｆ））
工程（ｆ）とは、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよい抗体（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ１個以上含むように混合し、該抗体（Ａ）及び（Ｂ）の合計に対して、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇを、そのモル比で２：１以上となるようにさらに混合することによって、集合体を得る工程である。
【０１１４】
すなわち、工程（ｆ）とは、該抗体（Ａ）及び（Ｂ）を、それぞれ少なくとも１個、好ましくは９：１〜１：９、より好ましくは８：２〜２：８、さらに好ましくは７：３〜３：７、特に好ましくは６：４〜４：６、もっとも好ましくは５：５の比で含むように混合し、該抗体（Ａ）及び（Ｂ）の合計に対して、蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇを、そのモル比で２：１以上、好ましくは２：１となるようにさらに混合することによって、図３及び図４に示すような融合タンパク質（II）含有集合体を得る工程である。
【０１１５】
蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよい抗体（Ａ）と（Ｂ）との個数の比、及び該抗体（Ａ），（Ｂ）と蛍光色素又は酵素が固定化されていてもよいプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇとのモル比が上記範囲内であると、凝集体を効率良く安定に形成できることから好ましい。
【０１１６】
〔製造方法（iii）〕
製造方法（iii）は、上記工程（ｄ）及び（ｆ）を含むものであって、抗体（好ましくは抗体の定常領域（ＣＨ１及びＣＬ）、より好ましくは抗体のＦｃフラグメント）のみに蛍光色素又は酵素が固定化されている融合タンパク質（II）含有集合体を製造する方法である。
【０１１７】
〔製造方法（iv）〕
製造方法（iv）は、上記工程（ｅ）及び（ｆ）を含むものであって、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＡ／Ｇのみに蛍光色素又は酵素が固定化されている融合タンパク質（II）含有集合体を製造する方法である。
【０１１８】
＜アッセイ法＞
本発明のアッセイ法は、下記工程（ｇ）〜（ｌ）を含むことを特徴とするものである。
【０１１９】
工程（ｇ）：本発明の集合体と検体とを接触させることによって、該検体に含有される標的物質、標的ウイルス又は標的細胞を介して凝集体を形成する工程。
【０１２０】
工程（ｈ）：上記工程（ｇ）を経て得られた反応物をフィルタに通すことによって、該凝集体のみを単離する工程。
【０１２１】
工程（ｉ）：上記工程（ｈ）を経て得られた凝集体に、蛍光基質又は消光剤基質を反応させ、それぞれ蛍光色素（Ｅ）又は消光剤を生成する工程（ただし、上記工程（ｇ）において酵素を含む融合タンパク質含有集合体を用いた場合のみ。）。
【０１２２】
工程（ｊ）：透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された誘電体からなるスペーサ層、又は該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された蛍光色素（Ｆ）層とを少なくとも有するプラズモン励起センサの、該スペーサ層表面又は該蛍光色素（Ｆ）層表面に、上記工程（ｈ）を経て得られた凝集体又は上記工程（ｉ）を経て得られた蛍光色素（Ｅ）又は消光剤を接触させる工程。
【０１２３】
工程（ｋ）：上記工程（ｊ）で得られたプラズモン励起センサに、該基板の、該薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程。及び、
工程（ｌ）：上記工程（ｋ）で得られた測定結果から、上記標的物質量、上記標的ウイルス量又は上記標的細胞量を算出する工程。
【０１２４】
本発明のアッセイ法は、上記工程（ｇ），（ｈ）の免疫反応場、及び上記工程（ｊ），（ｋ）のＳＰＦＳ検出場をそれぞれ独立することができ、免疫反応条件及び検出条件の最適化をすることができることから好適である。
【０１２５】
〔工程（ｇ）〕
工程（ｇ）とは、本発明の「集合体」と「検体」とを「接触」させることによって、該検体に含有される標的物質、標的ウイルス又は標的細胞を介して「凝集体」を形成する工程である。
【０１２６】
本発明の「集合体」は上述した通りであって、例えば、図５及び図６に示す集合体２０のように、融合タンパク質（Ｉ）１０が複数個存在するものを言う。
【０１２７】
（検体）
「検体」としては、例えば、血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液及び唾液が好ましい。
【０１２８】
（接触）
集合体と検体とを接触させる条件として、温度は、通常４〜５０℃、好ましくは１０〜４０℃、時間としては、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。
【０１２９】
（凝集体）
本発明において、「凝集体」とは、例えば、図７及び図８に示すように、融合タンパク質（II）１２同士が、標的物質、標的ウイルス又は標的細胞７に会合（結合）して形成された高分子量体であり、図７及び図８に示すように、融合タンパク質（Ｉ）１０含有集合体２０と検体とを免疫反応場において接触させることによって凝集体２１を製造することができる。
【０１３０】
〔工程（ｈ）〕
工程（ｈ）とは、上記工程（ｇ）を経て得られた「反応物」を「フィルタ」に通すことによって、上記凝集体のみを単離する工程である。
【０１３１】
（反応物）
「反応物」とは、上記工程（ｇ）を経て得られたものであり、図９及び図１０に示すように、標的物質、標的ウイルス又は標的細胞７のうち、例えば、検体が標的細胞を含む血液である場合、「反応物」とは、凝集体２１と、未反応の融合タンパク質（II）１２と、標的細胞が除かれた検体（これは、検体に含まれる標的細胞が、融合タンパク質（II）１２と会合し、凝集体２１を形成したため、検体から標的細胞のみが特異的に除かれた。）とを含む。
【０１３２】
（フィルタ）
本発明で用いるフィルタは、本発明の融合タンパク質、標的物質、標的ウイルス又は標的細胞それぞれ単体ではトラップしないが、凝集体をトラップするものであれば特に限定するものではなく、標的物質１個を介して融合タンパク質が２個以上連なった凝集体をトラップするものが好ましい。市販品としては、例えば、ワットマン（株）製の「アノポア、孔径：０．０２（μｍ）」などが好適である。
【０１３３】
〔工程（ｉ）〕
工程（ｉ）とは、上記工程（ｇ）において酵素を含む融合タンパク質含有集合体を用いた場合、上記工程（ｈ）を経て得られた凝集体に、「蛍光基質」又は「消光剤基質」を反応させ、それぞれ「蛍光色素（Ｅ）」又は「消光剤」を生成する工程である。
【０１３４】
さらに該工程（ｉ）は、蛍光色素（Ｅ）又は消光剤が生成した後に、該凝集体と蛍光色素（Ｅ）又は消光剤との混合物から、上記フィルタによって蛍光色素（Ｅ）のみ又は消光剤のみを単離することが好ましい。
【０１３５】
（蛍光基質）
本発明で用いられる「蛍光基質」とは、それ自体は蛍光を発することはなく、上記融合タンパク質に固定化されている酵素（Ｃ）によって加水分解され蛍光色素（Ｅ）に変換されるものであれば、本発明は特に限定するものではなく、例えば、表２に記載のＮｏ．１〜８などを用いることができる。
【０１３６】
これら蛍光基質のうち、下記「プラズモン励起センサ」が含む金属薄膜が、金を含む金属から形成されている場合、金の透過率や励起波長の観点から、表２中Ｎｏ．７の１，３−ｄｉｃｌｏｒｏ−９，９−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｃｒｉｄｉｎｅ−２−ｏｎｅ−７−ｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤＤＡＯ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）が好ましい。
【０１３７】
蛍光基質の自家蛍光波長は、自家蛍光波長と蛍光色素（Ｅ）の蛍光波長との差が大きいほどバックグラウンドシグナルの影響を回避しやすく高精度な測定が可能となるが、特に制限されるものではない。
【０１３８】
（蛍光色素（Ｅ））
本発明において、「蛍光色素（Ｅ）」は、所定の励起光を照射する、又は電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も包含する。
【０１３９】
本発明で用いられる蛍光色素（Ｅ）は、上記融合タンパク質に固定化されている酵素（Ｃ）によって前述の蛍光基質が加水分解されたものであり、後述する金属薄膜による吸光に起因する消光を受けない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計（ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ）よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。
【０１４０】
表２に、本発明に用いられる蛍光基質の例を示す。
【０１４１】
【表２】
2010125932.tif 000004
【０１４２】
（消光剤基質／消光剤）
上記「酵素反応（Ｄ−１）」に用いられ得るβ−ガラクトシダーゼ（βＧＡＬ）は、「消光剤基質」であるＴＧ−βＧａｌからβＧａｌを脱離させ、「消光剤」であるＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ（ＴＧ）を生成する反応を触媒する。
【０１４３】
また、β−グルコシダーゼ（βＧｌｕ）は、「消光剤基質」であるＴＧ−βＧｌｕからβＧｌｕを脱離させ、「消光剤」であるＴＧを生成する反応を触媒する。
【０１４４】
なお、遊離のＴＧは励起波長が４９０ｎｍであり、蛍光波長が４７５〜４９５ｎｍである蛍光色素（Ｆ）とＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ；蛍光共鳴エネルギー移動）を起すので、蛍光色素（Ｆ）であるテルビウム（Ｔｂ）キレートの蛍光（蛍光波長：４９５ｎｍ）又は強化シアン蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｙａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＣＦＰ）（蛍光波長：４７５ｎｍ）などの蛍光を消光することができる。
【０１４５】
また、ＴＧは、本発明において、下記式で表される２−Ｍｅ  ＴＧや、
【０１４６】
【化１】
2010125932.tif 000005
【０１４７】
下記式で表される２−Ｍｅ−４−ＯＭｅ  ＴＧなども包含する。
【０１４８】
【化２】
2010125932.tif 000006
【０１４９】
アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）は、「消光剤基質」であるＡｔｔｏＰｈｏｓ（登録商標）基質を加水分解する反応を触媒し、「消光剤」であるＢＢＴ（２′−［２−ｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｙｌ］−６′−ｈｙｄｒｏｘｙｌ−ｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｅ）を生成させる。ここで、蛍光色素（Ｆ）でもあるＢＢＴ（励起波長４８２ｎｍ）は、上述のＴＧと同様、テルビウム（Ｔｂ）キレート又はＥＣＦＰとＦＲＥＴを起し、それぞれ消光することができる。
【０１５０】
上記「酵素反応（Ｄ−２）」に用いられ得るグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）は、グルコースを「消光剤基質」とする酵素反応により、「消光剤」であるグルコノラクトンと過酸化水素とを生成する。生成した過酸化水素は、過酸化水素が溶解した水系溶液のｐＨを低下させ、蛍光色素（Ｆ）として用いている２−Ｍｅ−４−ＯＭｅ  ＴＧ、２−ＯＭｅ−５−Ｍｅ  ＴＧ又は２−ＯＭｅ  ＴＧなどの蛍光強度が小さくする（すなわち消光する。）ことができる。
【０１５１】
本発明において、消光剤基質、酵素、消光剤及び蛍光色素（Ｆ）の好ましい組み合わせとして、下表３に示すものが挙げられる。
【０１５２】
【表３】
2010125932.tif 000007
【０１５３】
このような消光剤基質の送液中の濃度は、０．００１〜１０，０００μｇ／ｍＬが好ましく、１〜１，０００μｇ／ｍＬがより好ましい。
【０１５４】
送液を循環させる温度、時間及び流速は、それぞれ上記工程（ｇ）の場合と同様である。
【０１５５】
〔工程（ｊ）〕
工程（ｊ）とは、「透明平面基板」と、該基板の一方の表面に形成された「金属薄膜」と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された「誘電体からなるスペーサ層」、又は該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された「蛍光色素（Ｆ）層」とを少なくとも有するプラズモン励起センサの、該スペーサ層表面又は該蛍光色素（Ｆ）層表面に、上記工程（ｈ）を経て得られた凝集体又は上記工程（ｉ）を経て得られた蛍光色素（Ｅ）又は消光剤を「接触」させる工程である。
【０１５６】
より詳細には、工程（ｊ）とは、「透明平面基板」と、該基板の一方の表面に形成された「金属薄膜」と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された「誘電体からなるスペーサ層」とを少なくとも有するプラズモン励起センサの、該スペーサ層表面に、上記工程（ｈ）を経て得られた凝集体又は上記工程（ｉ）を経て得られた蛍光色素（Ｅ）を「接触」させる工程、又は
工程（ｊ）とは、「透明平面基板」と、該基板の一方の表面に形成された「金属薄膜」と、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された「蛍光色素（Ｆ）層」とを少なくとも有するプラズモン励起センサの、該蛍光色素（Ｆ）層表面に、上記工程（ｉ）を経て得られた消光剤を「接触」させる工程である。
【０１５７】
なお、後者の工程（ｊ）において、プラズモン励起センサは、「金属薄膜」と「蛍光色素（Ｆ）層」との間に、前者の工程（ｊ）に含まれる「誘電体からなるスペーサ層」を有していてもよい。
【０１５８】
（透明平面基板）
本発明で用いられる「透明平面基板」としては、石英製やガラス製であっても、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのプラスチック製であってもよく、屈折率〔ｎｄ〕が好ましくは１．４０〜２．２０であり、厚さが好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
【０１５９】
なお、ガラス製の透明平面基板は、市販品として、ショット日本（株）製の「ＢＫ７」（屈折率〔ｎｄ〕１．５２）及び「ＬａＳＦＮ９」（屈折率〔ｎｄ〕１．８５）、（株）住田光学ガラス製の「Ｋ−ＰＳＦｎ３」（屈折率〔ｎｄ〕１．８４）、「Ｋ−ＬａＳＦｎ１７」（屈折率〔ｎｄ〕１．８８）及び「Ｋ−ＬａＳＦｎ２２」（屈折率〔ｎｄ〕１．９０）、（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ１０」（屈折率〔ｎｄ〕１．７２）などが光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。
【０１６０】
透明平面基板は、その表面に金属突起を形成する前に、その表面を酸及び／又はプラズマにより洗浄することが好ましい。
【０１６１】
酸による洗浄処理としては、０．００１〜１Ｎの塩酸中に、１〜３時間浸漬することが好ましい。
【０１６２】
プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製の「ＰＤＣ２００」）中に、０．１〜３０分間浸漬させる方法が挙げられる。
【０１６３】
（金属薄膜）
上記透明平面基板の一方の表面に形成された「金属薄膜」としては、好ましくは、金、銀、アルミニウム、銅、及び白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなることが望ましく、これら金属の合金であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。
【０１６４】
なお、透明平面基板としてガラス製平面基板を用いる場合に限り、ガラスと金属薄膜とをより強固に接着することができることから、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金又はチタンの薄膜を形成することが好ましい。
【０１６５】
透明平面基板上に金属薄膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法又は蒸着法によりクロムの薄膜及び／又は金属薄膜を形成することが好ましい。
【０１６６】
金属薄膜の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、及びそれらの合金：５〜５００ｎｍが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜２０ｎｍが好ましい。
【０１６７】
電場増強効果の観点から、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、及びそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜３ｎｍがより好ましい。
【０１６８】
金属薄膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
【０１６９】
（誘電体からなるスペーサ層）
「誘電体からなるスペーサ層」の形成に用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然又は合成ポリマーを用いることもできる。その中で、化学的安定性、製造安定性及び光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）又は二酸化チタン（ＴｉＯ２）を含むことが好ましい。
【０１７０】
誘電体からなるスペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ〜１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１０〜２０ｎｍである。一方、電場増強の観点から、好ましくは２００ｎｍ〜１ｍｍであり、さらに電場増強の効果の安定性から、４００ｎｍ〜１，６００ｎｍがより好ましい。
【０１７１】
誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、電子線蒸着法、熱蒸着法、ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、又はスピンコータによる塗布などが挙げられる。
【０１７２】
（蛍光色素（Ｆ）層）
「蛍光色素（Ｆ）層」とは、上記金属薄膜の、上記透明平面基板とは接していないもう一方の表面に、蛍光色素（Ｆ）を固定化した層であって、（１）蛍光色素（Ｆ）とポリマーとを含有する組成物を該金属薄膜上に塗工することによって形成することもでき、（２）アルカンチオールなどからなるＳＡＭ（自己組織化単分子膜；Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を介して、蛍光色素（Ｆ）を該金属薄膜上に結合することによって形成することもできる。
【０１７３】
（１）の場合、蛍光色素（Ｆ）とポリマーとは化学的結合をしていても、していなくてもよく、また重合性基を有するアルカンチオールなどからなるＳＡＭを金属薄膜に結合させて、他の重合性モノマー、蛍光色素（Ｆ）及び重合開始剤を加えて共重合させることにより蛍光色素（Ｆ）とポリマーとを含有する組成物を形成することもできる。
【０１７４】
（２）の場合、アミノ基又はカルボキシル基を有するアルカンチオールと、それらの基と反応して共有結合する基を有する蛍光色素（Ｆ）とを結合することによって、蛍光色素（Ｆ）を金属薄膜に固定化することができる。なお、蛍光色素（Ｆ）層と金属薄膜との間に誘電体からなるスペーサ層を設ける場合、従来公知のシランカップリング剤を介して該スペーサ層と蛍光色素（Ｆ）とを結合することができる。
【０１７５】
このように、蛍光色素（Ｆ）とポリマーとを含有してなる層を形成する（１）の場合は、固定化できる蛍光色素（Ｆ）量が多く、得られる層の強度が高いことから好ましい。
【０１７６】
「蛍光色素（Ｆ）」も蛍光色素（Ｅ）と同様に、本発明において、所定の励起光を照射する、又は電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
【０１７７】
本発明で用いられる「蛍光色素（Ｆ）」としては、例えば、テルビウム（Ｔｂ）キレート（蛍光波長：４９０ｎｍ）、強化シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）（蛍光波長：４７５ｎｍ）、２−Ｍｅ−４−ＯＭｅ  ＴＧ、２−ＯＭｅ−５−Ｍｅ  ＴＧ、２−ＯＭｅ  ＴＧなどが挙げられる。
【０１７８】
このような蛍光色素（Ｆ）は、水溶性が高いものが多く、これら蛍光色素（Ｆ）を蛍光色素（Ｆ）層としてポリマー中に分子間相互作用で固定化するためには、蛍光色素（Ｆ）が有するカルボキシル基に、疎水性の芳香族環が有するアミノ基やアルコールを反応させて水に不溶性の構造にするか、又は疎水性ポリマーと蛍光色素（Ｆ）の活性エステルとの反応によって化学的に結合する必要がある。ポリマーと蛍光色素（Ｆ）とが化学的な結合を有しない場合、ポリマーの溶解パラメータ（Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒ；ＳＰ）に近い構造となるように蛍光色素（Ｆ）を修飾することが好ましい。
【０１７９】
これら蛍光色素（Ｆ）は１種単独でも、２種以上併用してもよい。
【０１８０】
（接触）
プラズモン励起センサの、誘電体からなるスペーサ層表面又は蛍光色素（Ｆ）層表面に、上記工程（ｈ）を経て得られた凝集体又は上記工程（ｉ）を経て得られた蛍光色素（Ｅ）又は消光剤を「接触」させる方法としては、例えば、単離した蛍光色素（Ｅ）又は消光剤を含有した溶液の滴下、吹付、塗布などの方法が挙げられる。また、プラズモン励起センサに後述する流路を形成し、蛍光色素（Ｅ）又は消光剤を含有した溶液をプラズモン励起センサ表面に接触させるような方法も挙げられる。
【０１８１】
「流路」とは、微量な薬液の送達を効率的に行うことができ、反応促進を行うために送液速度を変化させたり、循環させたりすることができる角筒状又は円筒（管）状のものであって、プラズモン励起センサを設置する個所近傍は角筒状構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は円筒（管）状を有することが好ましい。
【０１８２】
その材料としては、プラズモン励起センサ部ではメチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマー又は共重合体；ポリエチレン、ポリオレフィン等からなり、薬液送達部ではシリコンゴム、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いる。
【０１８３】
プラズモン励起センサ部においては、凝集体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、プラズモン励起センサ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に１００ｎｍ〜１ｍｍ程度が好ましい。
【０１８４】
流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、該プラズモン励起センサの誘電体からなるスペーサ層が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている部位を囲むようにして圧着し、次に、該ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートと該プラズモン励起センサとをビス等の閉め具により固定する方法が好ましい。
【０１８５】
工業的に製造される大ロット（工場レベル）では、流路にプラズモン励起センサを固定する方法として、プラスチックの一体成形品に金基板を形成、又は別途作製した金基板を固定し、金表面に誘電体層又は蛍光色素（Ｆ）層形成と、リガンド固定化とを行った後、流路の天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。
【０１８６】
「送液」としては、検体を希釈した溶媒又は緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【０１８７】
送液を循環させる温度及び時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０〜４０℃×１〜６０分間、好ましくは３７℃×５〜１５分間である。
【０１８８】
送液中の凝集体の初期濃度は、１００μｇ／ｍＬ〜０．００１ｐｇ／ｍＬであってもよい。
【０１８９】
送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常０．００１〜２０ｍＬ、好ましくは０．１〜１ｍＬである。
【０１９０】
送液の流速は、通常１〜２，０００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５〜５００μＬ／ｍｉｎである。
【０１９１】
〔工程（ｋ）〕
工程（ｋ）とは、上記工程（ｊ）で得られたプラズモン励起センサに、該基板の、該薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程である。
【０１９２】
（光学系）
本発明のアッセイ法で用いる光源は、金属薄膜にプラズモン励起を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性及び光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギー及びフォトン量を調節することが望ましい。
【０１９３】
レーザ光の照射により、全反射減衰条件（ＡＴＲ）において、金属薄膜の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十〜数百倍に増えたフォトンにより蛍光色素を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、透明平面基板の屈折率、金属薄膜の金属種及びその膜厚に依存するが、通常、金では約１０〜２０倍の増加量となる。
【０１９４】
蛍光色素は、光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。
【０１９５】
「レーザ光」としては、例えば、波長２００〜９００ｎｍ、０．００１〜１，０００ｍＷのＬＤ、波長２３０〜８００ｎｍ（金属薄膜に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。）、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザなどが挙げられる。
【０１９６】
「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン励起センサに効率よく入射することを目的としており、屈折率が透明平面基板１と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明平面基板」の市販品と同様のものが挙げられる。
【０１９７】
「光学フィルタ」としては、例えば、減光（ＮＤ）フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。「減光（ＮＤ）フィルタ」（又は、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
【０１９８】
「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
【０１９９】
「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体又は付着物などの影響で発生する散乱光）などの光学ノイズ、及び蛍光色素（Ｅ）又は（Ｆ）の自家蛍光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
【０２００】
「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製又はオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【０２０１】
「ＳＰＦＳ検出部」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。
【０２０２】
〔工程（ｌ）〕
工程（ｌ）とは、上記工程（ｋ）で得られた測定結果から、上記標的物質量、上記標的ウイルス量又は上記標的細胞量を算出する工程である。
【０２０３】
より具体的には、工程（ｌ）は、既知濃度のアナライトでの測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中のアナライト量を測定シグナルから算出する工程である。
【０２０４】
（アッセイシグナル）
アッセイシグナルは、上記工程（ｋ）の前に測定したシグナルを“ブランクシグナル”、としたとき、下記式で算出することができる。
アッセイシグナル＝｜（アッセイ測定シグナル）−（ブランクシグナル）｜
【実施例】
【０２０５】
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
（Ｉ）蛍光色素を含む融合タンパク質含有集合体の場合
［実施例１］
（蛍光色素を含む融合タンパク質（Ｉ）含有集合体の製造方法（ｉ）の実施）
工程（ａ）として、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体１Ｄ５及び抗ＡＦＰモノクローナル抗体６Ｄ２（２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）に、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を用いて、それぞれＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を固定化した。【０２０６】
工程（ｂ）として、上記工程（ａ）で得られた蛍光標識抗体１Ｄ５及び６Ｄ２に、「ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＯ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いてビオチン化した。【０２０７】
工程（ｃ）として、上記工程（ｂ）で得られた蛍光標識ビオチン化抗体１Ｄ５及び６Ｄ２とアビジンとを、該１Ｄ５：該６Ｄ２：アビジンのモル比が、２：２：１になるように混合することによって、融合タンパク質（Ｉ）含有集合体を製造した。【０２０８】
［実施例２］
（融合タンパク質（II）含有集合体の製造方法（iv））
工程（ｄ）として、抗ＡＦＰモノクローナル抗体１Ｄ５及び抗ＡＦＰモノクローナル抗体６Ｄ２それぞれに、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）を用いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を固定化した。【０２０９】
工程（ｆ）として、上記工程（ｄ）で得られた蛍光標識抗体１Ｄ５と蛍光標識抗体６Ｄ２とプロテインＡ／Ｇとを、該１Ｄ５：該６Ｄ２：プロテインＡ／Ｇのモル比が１：１：１になるように混合することで、融合タンパク質（Ｉ）含有集合体を製造した。【０２１０】
［作製例１］
（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識２次抗体の作製）
抗ＡＦＰモノクローナル抗体６Ｄ２に、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を用いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を固定化した。【０２１１】
［実施例３］
（プラズモン励起センサの作製）
屈折率〔ｎｄ〕１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ  １０」）をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。【０２１２】
金薄膜の、クロム薄膜とは接していない片面に対して、誘電体として二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）からなるスペーサ層をスパッタリング法により形成した。該スペーサ層の厚さは、１５ｎｍであった。【０２１３】
（アッセイ法の実施）
工程（ｇ）として、まず実施例１で製造した融合タンパク質（Ｉ）含有集合体の溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬに、標的抗原としてＡＦＰ（１ｎｇ／ｍＬのＴＢＳ溶液に調製）８００μＬを含有する検体を２５分間接触させた。【０２１４】
工程（ｈ）として、上記工程（ｇ）を経て得られた反応物を、フィルタとしてワットマン（株）製の「ベクタスピン  ミクロ（孔径：０．０２μｍ）」に添加し、フィルタ上の溶液がなくなるまで遠心分離することによって、凝集体を単離した。その後、洗浄工程として、該フィルタに、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＴＢＳ  １，０００μＬを添加し、再度、フィルタ上の溶液がなくなるまで遠心分離することによって、凝集体を洗浄した。【０２１５】
工程（ｉ）として、上記工程（ｈ）を経てフィルタ上にトラップされた凝集体を、５０μＬのＰＢＳで再懸濁し、得られた溶液を、上記（プラズマ励起センサの作製）で得られたプラズマ励起センサの表面に送液することで接触させた。【０２１６】
工程（ｊ）として、上記工程（ｉ）で得られたプラズモン励起センサに、ガラス製の透明平面基板の、金薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズム（シグマ光機（株）製）を経由してレーザ光（６３３ｎｍ、１０μＷ）を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量をＣＣＤから観察したときのシグナル値を計測し「アッセイ測定シグナル」とした。【０２１７】
なお、ＡＦＰが０ｎｇ／ｍＬ時のＳＰＦＳ測定シグナルを「ブランクシグナル」とした。【０２１８】
工程（ｋ）として、上記工程（ｊ）で得られた測定結果から、アッセイシグナルを以下の式で評価した。
アッセイシグナル＝｜（アッセイ測定シグナル）−（ブランクシグナル）｜
得られた結果を表４に示す。【０２１９】
［実施例４］
（プラズモン励起センサの作製）
実施例３と同様にしてプラズモン励起センサを作製した。【０２２０】
（アッセイ法の実施）
実施例２で得られた融合タンパク質（II）含有集合体の溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを用いた以外は、実施例３と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を表４に示す。【０２２１】
［比較例１］
（プラズモン励起センサの作製）
屈折率〔ｎｄ〕１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（（株）オハラ製のＳ−ＬＡＬ  １０）をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。【０２２２】
このようにして得られた基板を、１０−カルボキシ−１−デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭ（Ｓｅｌｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）を形成した。基板を該溶液から取り出し、エタノール及びイソプロパノールで洗浄した後、エアガンで乾燥させた。【０２２３】
ＳＡＭの表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを設け、ＳＡＭ表面が流路の内側となるように基板を配置し（ただし、該シリコンゴムスペーサは送液に触れない状態とする。）、流路の外側から圧着し、ビスで流路シートと該プラズモン励起センサとを固定した。【０２２４】
（アッセイ法の実施）
得られたプラズモン励起センサを流路に固定し、送液として超純水を１０分間、その後ＭＥＳ（２５℃、ｐＨ５．０）を２０分間、ペリスタポンプにより、室温（２５℃）、流速５００μＬ／ｍｉｎで循環させ、その表面を平衡化した。【０２２５】
続いて、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を２５ｍｇ／ｍＬと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を２５ｍｇ／ｍＬとを含むＭＥＳ（２５℃、ｐＨ５．０）を５ｍＬ送液し、２０分間循環送液させた後に、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）を含むＡｃｅｔａｔｅ溶液（２５℃、ｐＨ６．０）２．５ｍＬを３０分間循環送液することで、ＳＡＭ上に１次抗体を固相化した。次いで、５０ｍＭＴｒｉｓ（２５℃、ｐＨ７．４）５ｍＬを１５分間循環送液することで、未反応の活性化エステル基をブロッキングし、１質量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて３０分間循環送液することで、非特異的吸着防止処理を行った。【０２２６】
送液をＰＢＳに代え、ＡＦＰを１ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳ溶液を０．８ｍＬ添加し、２５分間循環させた。【０２２７】
Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＴＢＳを送液として５分間循環させることによって洗浄した。【０２２８】
作製例１で得られたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を標識した２次抗体（１，０００ｎｇ／ｍＬとなるように調製したＰＢＳ溶液）を２．５ｍＬ添加し、２０分間循環させた。【０２２９】
その後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＴＢＳを送液として１０分間循環させることによって洗浄した。【０２３０】
ＣＣＤから観察したときのシグナル値を計測しアッセイ測定シグナルとした。なお、ＡＦＰを０ｎｇ／ｍＬ時のＳＰＦＳ測定シグナルをブランクシグナルとした。アッセイ評価としては実施例１と同様のアッセイシグナルを算出することで評価した。【０２３１】
本発明のアッセイ法による測定結果を表４に示す。【０２３２】
【表４】
2010125932.tif 000008
【０２３３】
表４から、本発明のアッセイ法は、本発明の集合体を用いたホモジニアスアッセイ系をＳＰＦＳ測定に応用することで、比較例１の従来のヘテロジニアスＳＰＦＳ測定と比べて、桁違いの極めて高感度な測定が可能であることがわかった。
（II）酵素を含む融合タンパク質含有集合体の場合
［実施例１］
（酵素を含む融合タンパク質（Ｉ）含有集合体の製造方法（ｉ）の実施）
工程（ａ）として、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体１Ｄ５及び抗ＡＦＰモノクローナル抗体６Ｄ２（２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）に、「Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ」（（株）同仁化学研究所製）を用いて、アルカリフォスファターゼを固定化することによって、酵素標識抗体１Ｄ５及び６Ｄ２を製造した。【０２３４】
工程（ｂ）として、上記工程（ａ）で得られた酵素標識抗体１Ｄ５及び６Ｄ２に、「ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＯ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いてビオチン化することによって、酵素標識ビオチン化抗体１Ｄ５及び６Ｄ２を製造した。【０２３５】
工程（ｃ）として、上記工程（ｂ）で得られた酵素標識ビオチン化抗体１Ｄ５及び６Ｄ２とアビジンとを、該１Ｄ５：該６Ｄ２：アビジンのモル比が、２：２：１になるように混合することによって、融合タンパク質（Ｉ）含有集合体を製造した。【０２３６】
［実施例２］
（融合タンパク質（II）含有集合体の製造方法（iv））
工程（ｄ）として、抗ＡＦＰモノクローナル抗体１Ｄ５及び抗ＡＦＰモノクローナル抗体６Ｄ２それぞれに、「Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ」（（株）同仁化学研究所製）を用いて、アルカリフォスファターゼを固定化することによって、酵素標識抗体１Ｄ５及び６Ｄ２を製造した。【０２３７】
工程（ｆ）として、上記工程（ｄ）で得られた酵素標識抗体１Ｄ５と酵素標識抗体６Ｄ２とプロテインＡ／Ｇとを、該１Ｄ５：該６Ｄ２：プロテインＡ／Ｇのモル比が１：１：１になるように混合することで、融合タンパク質（II）含有集合体を製造した。【０２３８】
［作製例１］
（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識２次抗体の作製）
抗ＡＦＰモノクローナル抗体６Ｄ２に、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を用いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を固定化した。【０２３９】
［実施例３］
（プラズモン励起センサの作製）
屈折率〔ｎｄ〕１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ  １０」）をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。【０２４０】
金薄膜の、クロム薄膜とは接していない片面に対して、誘電体として二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）からなるスペーサ層をスパッタリング法により形成した。該スペーサ層の厚さは、１５ｎｍであった。【０２４１】
（アッセイ法の実施）
工程（ｇ）として、まず実施例１で製造した融合タンパク質（Ｉ）含有集合体の溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬに、標的抗原としてＡＦＰ（１ｎｇ／ｍＬのＴＢＳ溶液に調製）８００μＬを含有する検体を２５分間接触させた。【０２４２】
工程（ｈ）として、上記工程（ｇ）を経て得られた反応物を、フィルタとしてワットマン（株）製の「ベクタスピン  ミクロ（孔径：０．０２μｍ）」に添加し、フィルタ上の溶液がなくなるまで遠心分離することによって、凝集体を単離した。その後、
洗浄工程として、該フィルタに、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＴＢＳ  １，０００μＬを添加し、再度、フィルタ上の溶液がなくなるまで遠心分離することによって、凝集体を洗浄した。【０２４３】
工程（ｉ）として、上記（ｈ）を経てフィルタ上にトラップされた凝集体に、蛍光基質として（１，３−ｄｉｃｌｏｒｏ−９，９−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｃｒｉｄｉｎｅ−２−ｏｎｅ−７−ｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤＤＡＯ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製））５０μＬを反応させることによって、蛍光色素（Ｅ）であるＤＤＡＯがフィルタ上に生成した。【０２４４】
工程（ｊ）として、上記工程（ｉ）を経てフィルタ上に得られた溶液を、上記（プラズマ励起センサの作製）で得られたプラズマ励起センサの表面に送液することで接触させた。【０２４５】
工程（ｋ）として、上記工程（ｊ）で得られたプラズモン励起センサに、ガラス製の透明平面基板の、金薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズム（シグマ光機（株）製）を経由してレーザ光（６３３ｎｍ、１０μＷ）を照射し、励起された蛍光色素（Ｅ）から発光された蛍光量をＣＣＤから観察したときのシグナル値を計測し「アッセイ測定シグナル」とした。【０２４６】
なお、ＡＦＰが０ｎｇ／ｍＬ時のＳＰＦＳ測定シグナルを「ブランクシグナル」とした。【０２４７】
工程（ｌ）として、上記工程（ｋ）で得られた測定結果から、アッセイシグナルを以下の式で評価した。
アッセイシグナル＝｜（アッセイ測定シグナル）−（ブランクシグナル）｜
得られた結果を表５に示す。【０２４８】
［実施例４］
（プラズモン励起センサの作製）
実施例３と同様にしてプラズモン励起センサを作製した。【０２４９】
（アッセイ法の実施）
実施例２で得られた融合タンパク質（II）含有集合体の溶液（１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを用いた以外は、実施例３と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を表５に示す。【０２５０】
［比較例１］
（プラズモン励起センサの作製）
屈折率〔ｎｄ〕１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（（株）オハラ製のＳ−ＬＡＬ  １０）をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。【０２５１】
このようにして得られた基板を、１０−カルボキシ−１−デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭ（Ｓｅｌｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜）を形成した。基板を該溶液から取り出し、エタノール及びイソプロパノールで洗浄した後、エアガンで乾燥させた。【０２５２】
ＳＡＭの表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを設け、ＳＡＭ表面が流路の内側となるように基板を配置し（ただし、該シリコンゴムスペーサは送液に触れない状態とする。）、流路の外側から圧着し、ビスで流路シートと該プラズモン励起センサとを固定した。【０２５３】
（アッセイ法の実施）
得られたプラズモン励起センサを流路に固定し、送液として超純水を１０分間、その後ＭＥＳ（２５℃、ｐＨ５．０）を２０分間、ペリスタポンプにより、室温（２５℃）、流速５００μＬ／ｍｉｎで循環させ、その表面を平衡化した。【０２５４】
続いて、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を２５ｍｇ／ｍＬと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を２５ｍｇ／ｍＬとを含むＭＥＳ（２５℃、ｐＨ５．０）を５ｍＬ送液し、２０分間循環送液させた後に、抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、（株）日本医学臨床検査研究所製）を含むＡｃｅｔａｔｅ溶液（２５℃、ｐＨ６．０）２．５ｍＬを３０分間循環送液することで、ＳＡＭ上に１次抗体を固相化した。次いで、５０ｍＭＴｒｉｓ（２５℃、ｐＨ７．４）５ｍＬを１５分間循環送液することで、未反応の活性化エステル基をブロッキングし、１質量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて３０分間循環送液することで、非特異的吸着防止処理を行った。【０２５５】
送液をＰＢＳに代え、ＡＦＰを１ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳ溶液を０．８ｍＬ添加し、２５分間循環させた。【０２５６】
Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＴＢＳを送液として５分間循環させることによって洗浄した。【０２５７】
作製例１で得られたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を標識した２次抗体（１，０００ｎｇ／ｍＬとなるように調製したＰＢＳ溶液）を０．８ｍＬ添加し、２０分間循環させた。【０２５８】
その後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５質量％含むＴＢＳを送液として１０分間循環させることによって洗浄した。【０２５９】
ＣＣＤから観察したときのシグナル値を計測しアッセイ測定シグナルとした。なお、ＡＦＰを０ｎｇ／ｍＬ時のＳＰＦＳ測定シグナルをブランクシグナルとした。アッセイ評価としては実施例１と同様のアッセイシグナルを算出することで評価した。【０２６０】
本発明のアッセイ法による測定結果を表５に示す。【０２６１】
【表５】
2010125932.tif 000009
【０２６２】
表５から、本発明のアッセイ法は、本発明の集合体を用いたホモジニアスアッセイ系をＳＰＦＳ測定に応用することで、比較例１の従来のヘテロジニアスＳＰＦＳ測定と比べて、桁違いの極めて高感度な測定が可能であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０２６３】
本発明の融合タンパク質含有集合体は、本発明のアッセイ法に用いた際、高感度かつ高精度であり、迅速性が飛躍的に向上した方法であるから、例えば、血液中に含まれる極微量の腫瘍マーカーであっても検出することができ、この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。
【符号の説明】
【０２６４】
１  標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ａ）
２  標的物質、標的ウイルスもしくは標的細胞が有する１以上の部位αと特異的に会合するタンパク質（Ｂ）
３ａ  蛍光色素
３ｂ  酵素
４  ビオチン
５  アビジン
６  プロテインＡ／Ｇ
７  標的物質、標的ウイルス又は標的細胞
８  フィルタ
９  透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された誘電体からなるスペーサ層とを少なくとも有するプラズモン励起センサ
１０  融合タンパク質（Ｉ）
１１  融合タンパク質（II）
１２  融合タンパク質（II）
１３  蛍光基質
１４  蛍光色素（Ｅ）
２０  集合体
２１  凝集体
【図１】
2010125932.tif 000010
【図２】
2010125932.tif 000011
【図３】
2010125932.tif 000012
【図４】
2010125932.tif 000013
【図５】
2010125932.tif 000014
【図６】
2010125932.tif 000015
【図７】
2010125932.tif 000016
【図８】
2010125932.tif 000017
【図９】
2010125932.tif 000018
【図１０】
2010125932.tif 000019
【国際調査報告】
2010125932.tif 000020
2010125932.tif 000021
2010125932.tif 000022
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