(57)【要約】  本発明は、自然免疫による樹状細胞（DC）の活性化を利用した、新しい癌又は感染症の免疫療法に用いるための手段、即ち標的抗原に対する免疫活性化能を有する、標的抗原及びCD1dを共発現する細胞の作製方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程、（ａ）CD1d発現細胞に標的抗原をコードするmRNAで形質導入して、標的抗原及びCD1dの共発現細胞を得る工程；及び（ｂ）培養培地において、工程（ａ）で得られた標的抗原及びCD1dの共発現細胞をCD1dリガンドで処理する工程、を含むことを特徴とする、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的抗原に対する免疫活性化能を有する、標的抗原及びCD1dを共発現する細胞の作製方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含むことを特徴とする、方法：
（ａ）CD1d発現細胞に標的抗原をコードするmRNAで形質導入して、標的抗原及びCD1dの共発現細胞を得る工程；及び
（ｂ）培養培地において、工程（ａ）で得られた標的抗原及びCD1dの共発現細胞をCD1dリガンドで処理する工程。
【請求項２】
標的抗原が、腫瘍抗原又は病原体抗原である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
免疫活性化能が、腫瘍細胞又はウイルス若しくはウイルス感染細胞に対するものである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
腫瘍細胞が、固形腫瘍細胞、又は造血組織における腫瘍細胞である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか1項に記載の方法によって得られる、標的抗原に対する免疫活性化能を有する細胞。
【請求項６】
標的抗原が、腫瘍抗原又は病原体抗原である、請求項５記載の細胞。
【請求項７】
免疫活性化能が、腫瘍細胞又はウイルス若しくはウイルス感染細胞に対するものである、請求項５記載の細胞。
【請求項８】
請求項５記載の細胞を含む、標的抗原に対する免疫誘導剤。
【請求項９】
請求項５記載の細胞、ならびにアジュバントを含む、組成物。
【請求項１０】
請求項５記載の細胞を含む、医薬。
【請求項１１】
固形腫瘍、造血組織における腫瘍、又は感染症の治療剤である、請求項１０記載の医薬。
【請求項１２】
標的抗原及びCD1dを共発現するように、あるいは標的抗原及び／又はCD1dの発現を増強するように処理された、標的抗原及びCD1dを共発現する細胞であって、以下（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される1種である、細胞：
（ａ）標的抗原をコードするmRNAで形質導入された、CD1d天然発現細胞；
（ｂ）CD1dを発現するベクターで形質転換され、かつ標的抗原をコードするmRNAで形質導入された、細胞；及び
（ｃ）CD1dをコードするmRNAで形質導入され、かつ標的抗原をコードするmRNAで形質導入された、細胞。
【請求項１３】
標的抗原及びCD1dを共発現するように、あるいは標的抗原及び／又はCD1dの発現を増強するように処理された、標的抗原及びCD1dを共発現する細胞であって、以下（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される1種である、細胞：
（ａ）標的抗原をコードするmRNAで形質導入された、CD1d発現抗原提示細胞；
（ｂ）CD1dを発現するベクターで形質転換され、かつ標的抗原をコードするmRNAで形質導入された、CD1d発現抗原提示細胞；及び
（ｃ）CD1dをコードするmRNAで形質導入され、かつ標的抗原をコードするmRNAで形質導入された、CD1d発現抗原提示細胞。
【請求項１４】
以下（１）〜（８）のいずれかを含む、キット：
（１）（１−１）CD1d発現細胞、及び（１−２）標的抗原をコードするmRNAをインビトロにおいて転写するためのコンストラクトの組合せ；
（２）（２−１）CD1d発現細胞、及び（２−２）標的抗原をコードするmRNA、の組合せ；
（３）（３−１）CD1dをコードするmRNAをインビトロにおいて転写するためのコンストラクト、（３−２）標的抗原をコードするmRNAをインビトロにおいて転写するためのコンストラクト、及び（３−３）目的細胞、の組合わせ；
（４）（４−１）CD1dをコードするmRNA及び標的抗原をコードするmRNAをインビトロにおいて転写するためのコンストラクト、及び（４−２）目的細胞、の組合わせ；
（５）（５−１）CD1dをコードするmRNAをインビトロにおいて転写するためのコンストラクト、（５−２）標的抗原をコードするmRNA、及び（５−３）目的細胞、の組合せ； 
（６）（６−１）CD1d及び標的抗原をコードするmRNA、（６−２）標的抗原をコードするmRNAをインビトロにおいて転写するためのコンストラクト、及び（６−３）目的細胞、の組合わせ；
（７）（７−１）CD1d及び標的抗原をコードするmRNA、（７−２）標的抗原をコードするmRNA、及び（７−３）目的細胞、の組合わせ；及び
（８）（８−１）CD1d及び標的抗原をコードするmRNA、及び（８−２）目的細胞、の組合わせ。
【請求項１５】
さらに、CD1dリガンドを含む、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
免疫誘導用である、請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
CD1d発現細胞又は目的細胞が免疫誘導を必要とする対象に対してアロジェニックであることを特徴とする、請求項１６記載のキット。
【請求項１８】
CD1d発現細胞又は目的細胞が線維芽細胞である、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
請求項５に記載の細胞の有効量を、それを必要とする、被験体（ヒトを除く）に投与することを含む免疫誘導方法であって、該細胞が被験体に対してアロジェニックであることを特徴とする、免疫誘導方法。
【請求項２０】
該細胞が、線維芽細胞である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
さらにアジュバントが投与される、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
免疫誘導剤の製造における、請求項５に記載の細胞の使用。
【請求項２３】
さらにアジュバントを使用する、請求項２２記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自然免疫による樹状細胞（DC）の活性化を利用した、新しい癌又は感染症の免疫療法に用いるための、標的抗原及びCD1dの共発現細胞、標的抗原に対する免疫活性化能を有する、標的抗原及びCD1dの共発現細胞、それらの作製方法、ならびに標的抗原に対する免疫誘導剤などに関する。詳しくは、個々人の腫瘍又は感染症に特徴的な抗原をコードするmRNAを導入した、アロ細胞を用いた、オーダーメイドの抗腫瘍又は抗感染症免疫療法に用いるための、標的抗原及びCD1dの共発現細胞、標的抗原に対する免疫活性化能を有する、標的抗原及びCD1dの共発現細胞、それらの作製方法、ならびに標的抗原に対する免疫誘導剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでNKT細胞の抗腫瘍効果として、腫瘍に対する直接効果や樹状細胞の成熟化を介してのアジュバント効果（間接効果）が示されてきた。発明者らはこれに基づき、CD1dを発現した自己の腫瘍細胞にNKT細胞のリガンドを提示させることによって、NKT細胞の活性化と腫瘍特異的なT細胞免疫応答の両者を誘導する方法を確立してきており（特許文献１）、白血病を始めとする様々な抗腫瘍免疫療法として応用が可能であると考えている。【０００３】
以前より、NKT細胞の免疫療法では、NKT細胞の活性化を促進させた直接的抗腫瘍療法として、腫瘍抗原を提示させた樹状細胞を投与する免疫療法が行われ、臨床応用に向けられている（非特許文献１〜７）。一方、マウスモデルでは、本発明者らのグループの成果を始めとして、NKT細胞のリガンドを投与することによって、アジュバント効果として抗原特異的なT細胞免疫が誘導されることが報告されてきた。更に両者を同時に誘導する方法を用いるために、CD1dを発現している腫瘍に着目して、NKT細胞のリガンドであるα-GalCerをインビトロで腫瘍細胞にパルスすることにより、インビボでNK/NKT細胞の活性化とT細胞の活性化の誘導が確認されてきた。つまり強力な自然免疫、獲得免疫の誘導を確認できた。しかしながら、これまでの研究における問題点は、患者から腫瘍細胞が少量しか得られない場合には、応用が困難なことであった。【０００４】
また、腫瘍抗原由来のmRNAを樹状細胞に導入することにより、抗原特異的な免疫療法を誘導する試みは、既に確立されており、臨床応用でも用いられている（非特許文献８〜１５）。しかしながらこの方法の問題点は、樹状細胞におけるmRNA導入効率と腫瘍抗原の発現量が依然として弱いことであり、現在アジュバントを併用することで、治療効果の改善が試みられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO2007/097370号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nat. Immunol. 3, 867-874（2002）.
【非特許文献２】J. Immunol. Meth. 272, 147-159（2003）.
【非特許文献３】J. Exp. Med. 198, 267-279（2003）.
【非特許文献４】J. Exp. Med. 199, 1607-1618（2004）.
【非特許文献５】J. Immunol. 167, 3114-3122（2001）.
【非特許文献６】Int. J. Cancer 109, 402-11（2004）.
【非特許文献７】J. Immunol. 171, 5140-5147（2003）.
【非特許文献８】J. Clin. Invest. 114, 1800-11（2004）.
【非特許文献９】J. Exp. Med. 184:465-472（1996）.
【非特許文献１０】Nat. Med. 2:1122-1128（1996）.
【非特許文献１１】Nat. Med. 6:1011-1017（2000）.
【非特許文献１２】J. Clin. Invest. 109:409-417（2002）.
【非特許文献１３】J. Immunol. 174:3798-3807（2005）.
【非特許文献１４】Br. J. Cancer 93:749-756（2005）.
【非特許文献１５】Cancer Gene Ther. 13:905-918（2006）.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
治療対象が固形腫瘍などの場合、治療に用いる十分量の腫瘍細胞を確保することが困難な事例が想定される。また、治療対象がウイルス感染症などの場合も、自己のウイルス感染細胞を、常に、治療に好適な態様で十分量取得できるとは限らない。本発明者らは、これまでの、CD1dを発現した自己の腫瘍細胞等にNKT細胞のリガンドを提示させる方法を改良し、より機能性及び汎用性が高い方法の開発を探索した。またこの際に、遺伝子治療で一般的に懸念される副作用の可能性をできる限り抑制するための、安全性の高い手法の確立も追求した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
生体内で実際にNKT細胞やCD8+T細胞を活性化するのは自己の樹状細胞であるから、免疫療法においても、患者由来の樹状細胞を用いることが望ましいと考えられてきたし、腫瘍細胞も、主要組織適合性抗原（MHC）が一致する自己のものを用いることが望ましいと考えられてきた。しかし、本発明者らは意外にも、標的抗原をコードするmRNAで形質導入し、標的抗原を十分発現できていることを確認したアロジェニックな培養細胞を用いても、自己由来の細胞と同等の効果を発揮できることを発見した。これは、免疫療法に使用可能な細胞が事実上無尽蔵に確保できることを意味するもので、この治療の普及に向けての画期的な成果といえる。本発明者らはさらに研究を進め、NKT細胞リガンドと腫瘍又はウイルス由来のmRNA及びアロジェニックな抗原提示細胞を用いた、免疫療法のための「細胞キット」を開発し、本発明を完成するに至った。【０００９】
即ち、本発明は以下に示すとおりである。
［１］標的抗原に対する免疫活性化能を有する、標的抗原及びCD1dを共発現する細胞の作製方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含むことを特徴とする、方法。
（ａ）CD1d発現細胞に標的抗原をコードするmRNAで形質導入して、標的抗原及びCD1dの共発現細胞を得る工程；及び
（ｂ）培養培地において、工程（ａ）で得られた標的抗原及びCD1dの共発現細胞をCD1dリガンドで処理する工程。
［２］標的抗原が、腫瘍抗原又は病原体抗原である、［１］に記載の方法。
［３］免疫活性化能が、腫瘍細胞又はウイルス若しくはウイルス感染細胞に対するものである、［１］に記載の方法。
［４］腫瘍細胞が、固形腫瘍細胞、又は造血組織における腫瘍細胞である、［３］に記載の方法。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の方法によって得られる、標的抗原に対する免疫活性化能を有する細胞。
［６］標的抗原が、腫瘍抗原又は病原体抗原である、［５］に記載の細胞。
［７］免疫活性化能が、腫瘍細胞又はウイルス若しくはウイルス感染細胞に対するものである、［５］に記載の細胞。
［８］［５］に記載の細胞を含む、標的抗原に対する免疫誘導剤。
［９］［５］に記載の細胞、ならびにアジュバントを含む、組成物。
［１０］［５］に記載の細胞を含む、医薬。
［１１］固形腫瘍、造血組織における腫瘍、又は感染症の治療剤である、［１０］に記載の医薬。
［１２］標的抗原及びCD1dを共発現するように、あるいは標的抗原及び／又はCD1dの発現を増強するように処理された、標的抗原及びCD1dを共発現する細胞であって、以下（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される1種である、細胞：
（ａ）標的抗原をコードするmRNAで形質導入された、CD1d天然発現細胞；
（ｂ）CD1dを発現するベクターで形質転換され、かつ標的抗原をコードするmRNAで形質導入された、細胞；及び
（ｃ）CD1dをコードするmRNAで形質導入され、かつ標的抗原をコードするmRNAで形質導入された、細胞。
［１３］標的抗原及びCD1dを共発現するように、あるいは標的抗原及び／又はCD1dの発現を増強するように処理された、標的抗原及びCD1dを共発現する細胞であって、以下（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される1種である、細胞：
（ａ）標的抗原をコードするmRNAで形質導入された、CD1d発現抗原提示細胞；
（ｂ）CD1dを発現するベクターで形質転換され、かつ標的抗原をコードするmRNAで形質導入された、CD1d発現抗原提示細胞；及び
（ｃ）CD1dをコードするmRNAで形質導入され、かつ標的抗原をコードするmRNAで形質導入された、CD1d発現抗原提示細胞。
［１４］以下（１）〜（８）のいずれかを含む、キット：
（１）（１−１）CD1d発現細胞、及び（１−２）標的抗原をコードするmRNAをインビトロにおいて転写するためのコンストラクトの組合せ；
（２）（２−１）CD1d発現細胞、及び（２−２）標的抗原をコードするmRNA、の組合せ；
（３）（３−１）CD1dをコードするmRNAをインビトロにおいて転写するためのコンストラクト、（３−２）標的抗原をコードするmRNAをインビトロにおいて転写するためのコンストラクト、及び（３−３）目的細胞、の組合わせ；
（４）（４−１）CD1dをコードするmRNA及び標的抗原をコードするmRNAをインビトロにおいて転写するためのコンストラクト、及び（４−２）目的細胞、の組合わせ；
（５）（５−１）CD1dをコードするmRNAをインビトロにおいて転写するためのコンストラクト、（５−２）標的抗原をコードするmRNA、及び（５−３）目的細胞、の組合せ； 
（６）（６−１）CD1d及び標的抗原をコードするmRNA、（６−２）標的抗原をコードするmRNAをインビトロにおいて転写するためのコンストラクト、及び（６−３）目的細胞、の組合わせ；
（７）（７−１）CD1d及び標的抗原をコードするmRNA、（７−２）標的抗原をコードするmRNA、及び（７−３）目的細胞、の組合わせ；及び
（８）（８−１）CD1d及び標的抗原をコードするmRNA、及び（８−２）目的細胞、の組合わせ。
［１５］さらに、CD1dリガンドを含む、［１４］に記載のキット。
［１６］免疫誘導用である、［１５］に記載のキット。
［１７］CD1d発現細胞又は目的細胞が免疫誘導を必要とする対象に対してアロジェニックであることを特徴とする、［１６］に記載のキット。
［１８］CD1d発現細胞又は目的細胞が線維芽細胞である、［１７］に記載のキット。
［１９］［５］に記載の細胞の有効量を、それを必要とする、被験体（ヒト）又は被験体（ヒトを除く）に投与することを含む免疫誘導方法であって、該細胞が被験体に対してアロジェニックであることを特徴とする、免疫誘導方法。
［２０］該細胞が、線維芽細胞である、［１９］に記載の方法。
［２１］さらにアジュバントが投与される、［１９］に記載の方法。
［２２］免疫誘導剤の製造における、［５］に記載の細胞の使用。
［２３］さらにアジュバントを使用する、［２２］に記載の使用。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、NKT細胞のリガンドであるCD1dリガンドを、自己の樹状細胞や腫瘍細胞ではなく、標的抗原のmRNAを導入したアロジェニックな線維芽細胞に負荷し、その細胞を投与することによって、インビボでNKT細胞、NK細胞を活性化させ、十分な治療効果を得ることができる。さらに、少量の腫瘍細胞又は病原体感染細胞さえ採取できれば、それらのmRNAを同定できることから、本発明によれば、より広範囲の治療対象に免疫療法を確立できることになる。また本発明によれば、導入mRNAから高効率でタンパク質を発現できるアロ細胞を選択し、それにmRNAのみによって形質導入を行って、標的抗原に対する免疫活性化能を有する細胞を調製できる。この際、ウイルスベクターを用いないので遺伝子治療を行っていることにはならず、この免疫療法には、細胞ゲノムを改変することによって生じる副作用の懸念がない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ベクター中にクローニングされた全長cDNAから、それがコードするタンパク質を細胞内で発現させるためのmRNAを、インビトロで調製する過程を概説した模式図である。
【図２】Aは、各像の左側に示した量のEGFPmRNAで形質導入したB16メラノーマ細胞のGFP発現量を共焦点顕微鏡により画像化した図である。Bは、5μgのEGFPmRNAで形質導入したNIH3T3細胞のGFP発現量を共焦点顕微鏡により画像化した図である。Cは、5μgのEGFPmRNAで形質導入したB16（上）又はNIH3T3（下）細胞のEGFP発現レベルをFACSで解析した結果を示す図であり、グラフ内の53.5及び68.3は、それぞれにおいてGFPポジティブな細胞のパーセンテージを示す。Dは、横軸の1°で示した時間インキュベートしたB16メラノーマ細胞を、5μgのOVAmRNAで形質導入し、2°で示した時間経過後にOVA発現レベルをELISAで決定した結果を示した図である。Eは、横軸の1°で示した時間インキュベートしたNIH3T3細胞を、5μgのOVAmRNAで形質導入し、2°で示した時間経過後にOVA発現レベルをELISAで決定した結果を示した図である。Fは、横軸の1°で示した時間インキュベートしたEL4細胞を、5μgのOVAmRNAで形質導入し、2°で示した時間経過後にOVA発現レベルをELISAで決定した結果を示した図である。
【図３】Aは、横軸に示した各細胞におけるCD1dの発現レベルをリアルタイムPCRで定量し、rRNAに対する相対値で表示した図である。Bは、CD1d及びEGFPの発現量を示した図（左）及び縦軸に示した各細胞におけるCD1d発現量をFACSで解析した結果を示す図（右）である。Cは、OVAmRNAで形質導入した、横軸に示す各細胞のOVA分泌量を4時間後にELISAで測定した結果を示す図である。Dは、OVAで形質転換したCD8+T細胞（OT-I（図中、OT-1）細胞）と、横軸に示した各細胞を共培養し、その上清中のIFN-γ分泌量をELISAで測定した結果を示す図である。Eは、OT-I細胞を与え、その24時間後にα-GalCerを負荷した、又は負荷していないOVAmRNAトランスフェクタントで免疫したマウス脾臓のOT-I細胞数を、3日後に測定した結果を示す図である。
【図４】Aは、縦軸に記載された各細胞で免疫したマウスの脾臓細胞における、横軸の各タンパク質の発現レベルをFACSで解析した図である。Bは、ELISPOTアッセイにより、横軸の各細胞で免疫したマウスの脾臓細胞が産生するIFN-γのレベルを示した図である。Cは、肺転移モデルにおける抗腫瘍免疫の差異を、肺の像及び肺転移数で示す。
【図５】Aは、縦軸に記載された各細胞で免疫したマウスのDCにおける、横軸の各タンパク質の発現レベルをFACSで解析し、CD8a+とCD8a-のDCサブセットごとに記載した図である。Bは、縦軸に記載された各細胞で免疫したマウスのDCにおける、CD70の発現レベルを免疫後12時間後及び40時間後にFACSで解析し、CD8a+とCD8a-のDCサブセットごとに記載した図である。Cは、フローサイトメーターによる、各細胞のCD8及びIL-12の発現レベルを記載した図である。Dは、CFSEラベルされたOT-I細胞を投与した、縦軸に記載されたマウスにおいて、CD1dhi-NIH3T3/Gal-ova（CD1dNIH/Gal-ova）で免疫した場合としない場合の、OT-I細胞の増殖を評価した図である。
【図６】Aは、各グラフの上部に記載した細胞で免疫したマウスの脾臓細胞表面における、CD8とOVAペプチドの量を示した図である。Bは、CD1dhi-NIH3T3/Gal-ova細胞で免疫した、各グラフの上部に記載したマウスの脾臓細胞表面における、CD8とOVAペプチドの量を示した図である。Cは、各グラフの上部に記載した細胞で免疫したマウスの脾臓細胞表面における、CD8とOVAペプチドの量を示した図である。Dは、横軸に記載した細胞で免疫したマウスのCD8+細胞をOVAペプチドでパルスしたCD11c+と共培養し、分泌されたIFN-γの定量結果を示した図である。
【図７】Aは、各グラフの内部に下線を付して記載した細胞で免疫し、2週間後にEG7（左）又はEL4（右）を皮下投与したマウスにおいて、横軸に示した日数経過後の腫瘍サイズを示した図である。Bは、CD1dhi-NIH3T3/Gal-ovaで免疫し、2週間後にEG7を皮下投与した、各グラフの内部に下線を付して記載した遺伝子ノックアウトマウスにおいて、横軸に示した日数経過後の腫瘍サイズを示した図である。
【図８】Aは、各レーンの番号で示した細胞におけるtrp2の発現量をRT-PCRで示した図である。Bは、横軸に示した各細胞におけるtrp2の発現量をリアルタイムPCRで定量した図である。Cは、各グラフの左右1組の上部に記載した細胞で免疫し、2週間後に、各グラフの内部に下線を付して記載した細胞を皮下投与したマウスにおいて、横軸に示した日数経過後の腫瘍サイズを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（１．細胞）
本発明は、CD1dリガンドを負荷した、標的抗原及びCD1dを共発現する細胞、特にCD1d発現細胞に標的抗原をコードするmRNAを導入して得られる、標的抗原及びCD1dの共発現細胞を提供する。CD1dリガンドを負荷したこのような共発現細胞は、標的抗原に対する免疫活性化能を有し得る。本発明の細胞は、当該細胞で免疫されるべき個体と同種の別の個体由来の細胞、すなわち投与対象に対して同種異系の細胞（アロ細胞）であることを特徴とし、以下、本発明で提供される、標的抗原及びCD1dの共発現細胞を、本発明のアロ細胞とも称する。
【００１３】
CD1dリガンドとは、CD1d発現抗原提示細胞（APC）上に提示され、以ってNKT細胞を活性化し得る物質をいう。「CD1dリガンド」としては、例えば、α-GalCer（α-galactosylceramide）、α-C-GalCer（α-C-galactosylceramide）、iGB3（isoglobotrihexosylceramide）、GD3（ganglioside 3）、GSL-1（α-linked glucuronic acid）、GSL-1'SA（galacturonic acid）が挙げられるが、α-GalCer、α-C-GalCerが好ましい。本発明のアロ細胞は、CD1dリガンドを、CD1dを介してその細胞表面上に提示し、NKT細胞を活性化し得る。
【００１４】
さらに本発明のアロ細胞は、標的抗原をコードするmRNAを導入したとき、それにコードされるタンパク質を、高発現させることができる。そのような細胞としては、例えば、EGFPタンパク質をコードする5μgのmRNAを2×105個の細胞に対して、TransMessenger transfection kit（Qiagen）を用い、そのプロトコールに従って導入し、4時間後にFACSによる解析で同定したEGFPポジティブな細胞が、好ましくは全体の50%以上、より好ましくは全体の60%以上となる細胞が挙げられる。但し、EGFPmRNAの導入及びEGFPタンパク質の発現効率は低くても、標的抗原mRNAの導入及びそれらタンパク質の発現効率が高い場合は、そのような細胞を用いてもよい。導入するmRNAによってコードされるタンパク質の発現効率が培養条件等に依存する場合は、実験により、最適な導入条件を決定し、それに基づいて、本発明の細胞を作製することができる。
【００１５】
本発明はまた、CD1dリガンドを負荷し得る所定の細胞のうち、新規細胞を提供する。本発明者らは、CD1dリガンドを負荷したアロ細胞であって、標的抗原をコードするmRNAで形質導入された、標的抗原及びCD1dの共発現細胞が、免疫療法において非常に有用であることを初めて見出した。したがって、このように作製される、標的抗原及びCD1dの共発現細胞は、新規なものであり得る。
【００１６】
本発明のアロ細胞のうち、CD1dリガンドを負荷された細胞を、必要に応じて、「本発明の負荷細胞」（標的抗原に対する免疫活性化能を有し得る細胞を意味する）と称する。さらに、本発明のアロ細胞のうち、CD1dリガンドが負荷されていない細胞を、必要に応じて、「本発明の非負荷細胞」（CD1dリガンドを負荷することによって標的抗原に対する免疫活性化能を獲得し得るものの、CD1dリガンドを負荷していないため、標的抗原に対する免疫活性化能を有し得ない細胞を意味する）と称する。
【００１７】
本発明のアロ細胞は、単離及び／又は精製されたものであり得る。細胞の単離及び精製は、自体公知の方法により行うことができる。
【００１８】
本発明のアロ細胞はまた、任意の動物種由来の細胞であり得る。このような動物種としては、例えば、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ等の哺乳動物が挙げられるが、臨床応用という観点からは、ヒト由来の細胞であることが好ましい。
【００１９】
本発明のアロ細胞はさらに、任意の組織由来の細胞種であり得る。このような組織としては、例えば、胃、小腸（例、十二指腸、空腸、回腸、結腸）、大腸、直腸、肺、膵臓、腎臓、肝臓、胸腺、脾臓、甲状腺、副腎、前立腺、卵巣、子宮、骨髄、皮膚、末梢血が挙げられる。本発明のアロ細胞はまた、上記組織における特定の細胞種又は上記組織以外の組織に存在する細胞種であり得る。このような細胞種としては、例えば、上皮細胞、内皮細胞、表皮細胞、間質細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、乳腺細胞、メサンギウム細胞、膵β細胞、神経細胞、グリア細胞、免疫細胞（例、T細胞、B細胞、NK細胞、NKT細胞、マクロファージ、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、ならびにこれら細胞の前駆細胞及び幹細胞が挙げられる。
【００２０】
本発明のアロ細胞はさらに、動物より採取された細胞（例、初代培養細胞）又は細胞株であり得る。細胞株は既存の細胞株又は新たに作製される細胞株であり得る。細胞株は自体公知の方法により作製できる。
【００２１】
より重要には、本発明のアロ細胞は、標的抗原及びCD1dの双方を発現する細胞であり得る。
【００２２】
標的抗原は、異常細胞又は病原体（pathogen）に発現している抗原であって、それを標的とする免疫作用により、体内における当該異常細胞又は病原体の消失、あるいは当該異常細胞又は病原体量の減少が期待できるものである限り特に限定されない。例えば、標的抗原としては、腫瘍抗原、病原体抗原が挙げられる。本発明の細胞は、同一標的に対する1又は2以上の標的抗原を発現し得る。
【００２３】
腫瘍抗原は、上皮性及び非上皮性腫瘍を含む固形腫瘍、造血組織における腫瘍の抗原であり得る。固形腫瘍抗原としては特に限定されないが、例えば、MART-1/Melan-A、Mage-1、Mage-3、gp100、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質2（trp2）、CEA、PSA、CA-125、erb-2、Muc-1、Muc-２、TAG-72、AES、FBP、C-レクチン、NY-ESO-1、galectin-4/NY-CO-27、Pec60、HER-2/erbB-2/neu、テロメラーゼ、G250、Hsp105、点変異ras癌遺伝子、点変異p53癌遺伝子、癌胎児性抗原が挙げられる（例えば、特開2005-139118号公報、特開2004-147649号公報、特開2002-112780号公報、特開2004-222726号公報を参照）。造血組織における腫瘍（例、白血病）の抗原としては特に限定されないが、例えば、proteinase 3、WT-1、hTERT、PRAME、PML/RAR-a、DEK/CAN、シクロフィリンB、TEL-MAL1、BCR-ABL、OFA-iLRP、Survivin、idiotype、Sperm protein 17、SPAN-Xb、CT-27、MUC1が挙げられる。
【００２４】
病原体抗原は、病原性ウイルス抗原、病原性微生物抗原、又は病原性原生動物抗原であり得る。病原性ウイルス抗原としては特に限定されないが、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、肝炎ウイルス（例、A型、B型、C型、D型及びE型肝炎ウイルス）、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、西ナイル熱ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ウマ脳炎ウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス（例、HTLV-I）等のウイルスの抗原が挙げられる。具体的には、例えば、GP-120、p17、GP-160（以上、HIV）、NP、HA（以上、インフルエンザウイルス）、HBs Ag、HBVエンベロープタンパク質、コアタンパク質、ポリメラーゼタンパク質、NS3、NS5（以上、肝炎ウイルス）、HSVdD（単純ヘルペスウイルス）、EBNA1、2、3A、3B及び3C、LMP1及び2、BZLF1、BMLF1、BMRF1、BHRF1（以上、EBウイルス）、Tax（HTLV-I）、SARS-CoVスパイクタンパク質（SARSウイルス）、CMV pp5、IE-1（以上、CMV）、E6、E7タンパク質（以上、HPV）が挙げられる（例えば、特開2004-222726号公報参照）。病原性微生物抗原としては、例えば、病原性細菌（例、クラミジア、ミコバクテリア、レジオネラ）、病原性酵母（例、アスペルギルス、カンジダ）に発現している抗原が挙げられる。病原性原生動物抗原としては、例えば、マラリア、住血吸虫に発現している抗原が挙げられる。
【００２５】
CD1dは、ペプチドではなく糖脂質を提示する主要組織適合抗原（MHC）様分子として知られている。CD1dは、抗原提示細胞（例、樹状細胞）、腸管、肝臓等の組織における上皮細胞の他、一部の腫瘍細胞（例、固形腫瘍細胞、白血病細胞）、ウイルス感染細胞でも発現している。
【００２６】
本発明のアロ細胞はまた、非形質転換体又は形質転換体であり得る。本明細書中で用いられる場合、形質転換とは、人為的な遺伝子導入操作をいい、形質転換体とはそのような人為的な操作により作出された細胞を意味する。したがって、非人為的操作により生じた細胞は、本明細書中では形質転換体に該当しないものとして扱う。より詳細には、本発明の細胞が形質転換体である場合、本発明のアロ細胞は、宿主細胞として、CD1d発現細胞を用い標的抗原をコードするmRNAで形質転換することにより作製されるものであり得る（詳細は後述）。形質転換における宿主細胞は、CD1dを発現している任意の細胞であり得、例えば、CD1dの天然発現細胞や人為的な操作によりCD1dを発現するように調製された細胞であり得る。
【００２７】
本発明のアロ細胞はさらに、天然に存在する、抗原提示細胞（APC）又は非APCに由来する細胞であり得る。天然に存在するAPCとしては、例えば、樹状細胞、マクロファージ、B細胞、ランゲルハンス細胞、活性化T細胞が挙げられる。したがって、本発明のアロ細胞は、標的抗原をコードするmRNAで形質転換された、天然に存在するAPC又は非APC由来であってもよい。
【００２８】
本発明のアロ細胞はまた、天然に存在する、CD1d発現抗原提示細胞（CD1d発現APC）又は非CD1d発現APCに由来する細胞であり得る。CD1d発現APCとは、その細胞表面上にCD1dを有する、NKT細胞を活性化し得る細胞をいう。CD1d発現APCとしては、例えば、樹状細胞、マクロファージ、B細胞が挙げられる。したがって、本発明のアロ細胞は、標的抗原をコードするmRNAで形質転換された、天然に存在するCD1d発現APC又は非CD1d発現APC由来であってもよい。
【００２９】
本発明のアロ細胞は、標的抗原の天然発現細胞由来であってもよい。
【００３０】
本発明の負荷細胞は、後述するように、医薬、免疫活性化剤などとして有用である。本発明の非負荷細胞は、例えば、本発明の負荷細胞の作製に有用である。
【００３１】
（２．作製及び同定方法）
本発明は、本発明のアロ細胞の作製方法を提供する。
【００３２】
一実施形態では、本発明の作製方法は、本発明の非負荷細胞の作製方法であり得る。本発明の非負荷細胞の作製方法は、目的細胞において標的抗原及びCD1dが共発現するように、あるいは標的抗原及びCD1dの共発現細胞において標的抗原及び／又はCD1dの発現を増強するように細胞を処理することを含み得る。
【００３３】
例えば、本発明の作製方法が、目的細胞において標的抗原及びCD1dが共発現するように細胞を処理することを含む場合、目的細胞は、標的抗原及びCD1dの双方を発現しない細胞、CD1d発現細胞であり得る。
【００３４】
また、本発明の作製方法が、標的抗原及びCD1dの共発現細胞において標的抗原及び／又はCD1dの発現を増強するように細胞を処理することを含む場合、本発明の細胞による免疫療法の治療効果を十分に高める程度に標的抗原及び／又はCD1dの発現が増強され得る。
【００３５】
本発明の作製方法における処理は、形質転換、又は標的抗原のmRNAの導入操作であり得る。より詳細には、本発明の作製方法は、（ａ）CD1d発現細胞に標的抗原をコードするmRNAで形質導入すること、（ｂ）細胞に標的抗原及びCD1dをコードする1又は2分子種のmRNAで、形質導入すること、あるいは（ｃ）CD1dを発現するベクターで細胞を形質転換し、次いで標的抗原をコードするmRNAで形質導入すること、を含み得る。細胞の形質転換やmRNA形質導入は、リポフェクション法、リン酸カルシウム沈殿法、エレクトロポレーション法等の自体公知の方法により行われ得る。
上記態様（ｂ）において、「標的抗原及びCD1dをコードする1分子種のmRNA」とは、標的抗原及びCD1dの両方が１つのmRNAでコードされる場合であり、「標的抗原及びCD1dをコードする2分子種のmRNA」とは、標的抗原及びCD1dの各々が別々のmRNAでコードされる場合である。
ここで、目的細胞で発現する標的抗原は、1種類又は2種類以上であってもよい。すなわち、当該アロ細胞の作製方法に用いる標的抗原のmRNAは、1種類の抗原由来のmRNAであっても、複数種の抗原由来のmRNAの混合物（抗原をコードするmRNAの種類が複数ある）であってもよい。
【００３６】
上述の作製方法では、（ａ）におけるCD1d発現細胞は、CD1dを発現し、かつ標的抗原を発現しない細胞であり得る。（ｂ）及び（ｃ）における細胞は、標的抗原及びCD1dの双方を発現しない細胞であり得る。
【００３７】
別の実施形態では、本発明の作製方法は、本発明の負荷細胞の作製方法であり得る。本発明の負荷細胞の作製方法は、培養培地において、標的抗原及びCD1dの共発現細胞、例えば本発明の非負荷細胞をCD1dリガンドで処理することを含み得る。このような処理により、標的抗原及びCD1dの共発現細胞上にCD1dリガンドが提示され、該共発現細胞の標的抗原に対する免疫活性化能を獲得し得る。
【００３８】
培養培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、MEM培地、DMEM培地、αMEM培地、ハム培地、RPMI1640培地、Fischer’s培地、及びこれらの混合培地が挙げられる。培養培地は、例えば、血清（例えば、FCS）、血清代替物（例えば、Knockout Serum Replacement（KSR））、脂肪酸又は脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含むことができる。培養温度、CO2濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約30〜40℃、好ましくは約37℃である。また、CO2濃度は、例えば約1〜10%、好ましくは約5%である。培養における細胞数、各種因子の濃度等のその他の条件は、自体公知の方法により適宜設定できる。
【００３９】
標的抗原及びCD1dの共発現細胞として処理された細胞（例、形質転換体）が用いられる場合、本発明の作製方法は、目的細胞において標的抗原及びCD1dが共発現するように、あるいは標的抗原及びCD1dの共発現細胞において標的抗原及び／又はCD1dの発現を増強するように細胞を処理して、標的抗原及びCD1dの共発現細胞を得ることをさらに含み得る。本方法論は、上述の本発明の作製方法と同様に行われ得る。目的細胞は、本発明の細胞が投与される個体と同種の個体由来の細胞（同種異系細胞）である。
【００４０】
（３．インビトロ転写用コンストラクト及びmRNA）
本発明では、標的抗原をコードするmRNAを作成するための、インビトロ転写用コンストラクトが提供される。該コンストラクトとしては、標的抗原mRNAのみを転写する鋳型コンストラクト、ならびに標的抗原mRNA及びその他の有用な因子のmRNAを転写する鋳型コンストラクトが挙げられる。標的抗原mRNAが複数種用いられる場合には、各mRNAは同一のコンストラクトに存在しても、異なるコンストラクトに別々に存在してもよい。標的抗原をコードするmRNAを作成するための、インビトロ転写用コンストラクトとしては、例えば、標的抗原発現ベクター由来の鋳型コンストラクト、標的抗原及びCD1dの共発現ベクター由来の鋳型コンストラクトが挙げられる。
【００４１】
同様にしてCD1dをコードするmRNAを、インビトロで転写するためのコンストラクトが提供される。該コンストラクトとしては、CD1dmRNAのみを発現する鋳型コンストラクト、ならびにCD1dmRNA及びその他の有用な因子のmRNAを発現する鋳型コンストラクトが挙げられる。CD1dをコードするmRNAを作成するための、インビトロ転写用コンストラクトとしては、例えば、CD1d発現ベクター由来の鋳型コンストラクト、標的抗原及びCD1dの共発現ベクター由来の鋳型コンストラクトが挙げられる。
【００４２】
同様にして、標的抗原及びCD1dをコードする1又は2分子種のmRNAを、インビトロで転写するためのコンストラクトが提供される。該コンストラクトとしては、標的抗原mRNA及びCD1dmRNAの双方を発現する鋳型コンストラクト、ならびに少なくとも標的抗原mRNAを発現する鋳型コンストラクトと少なくともCD1dmRNAを発現する鋳型コンストラクトとの組合せが挙げられる。標的抗原及びCD1dをコードする1又は2分子種のmRNAを作成するための、インビトロ転写用コンストラクトとしては、例えば、標的抗原及びCD1dの共発現ベクター由来の鋳型コンストラクト、ならびに標的抗原発現ベクター由来の鋳型コンストラクトとCD1d発現ベクター由来の鋳型コンストラクトとの組合せが挙げられる。標的抗原mRNAが複数種用いられる場合には、各mRNAは同一のコンストラクトに存在しても、異なるコンストラクトに別々に存在してもよい。
【００４３】
本発明はまた、このようなmRNAを共発現するためのコンストラクトを提供する。
【００４４】
本発明の共発現用コンストラクトは、標的抗原をコードする第１のポリヌクレオチド及びCD1dをコードする第２のポリヌクレオチドを含み得る。複数種の標的抗原を対象とする場合には、各標的抗原は同一のポリヌクレオチドに含まれていても、異なるポリヌクレオチドに別々に含まれていてもよい。本発明の共発現用コンストラクトはまた、上記第１及び第２のポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。プロモーターの機能可能な連結とは、プロモーターが、その制御下にあるポリヌクレオチドによりコードされる因子の発現を可能とするように、該ポリヌクレオチドに結合していることを意味する。
【００４５】
より詳細には、本発明の共発現用コンストラクトは、ポリシストロニックmRNA発現用コンストラクトであり得る。ポリシストロニックmRNA発現用コンストラクトは、1又は2以上の標的抗原及びCD1dのポリシストロニックmRNAの発現を可能とする、第１のポリヌクレオチド（1又は2以上の標的抗原をコードする）及び第２のポリヌクレオチドの連結物、ならびに当該連結物に機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。
【００４６】
本発明の共発現用コンストラクトはまた、非ポリシストロニックmRNA発現ベクターであり得る。非ポリシストロニックmRNA発現用コンストラクトは、第１のポリヌクレオチド及び当該ポリヌクレオチドに機能可能に連結された第１のプロモーター、ならびに第２のポリヌクレオチド及び当該ポリヌクレオチドに機能可能に連結された第２のプロモーターを含み得る。複数種の標的抗原を対象とする場合には、各標的抗原は同一のポリヌクレオチドに含まれていても、異なるポリヌクレオチドに別々に含まれていてもよい。
【００４７】
インビトロ転写用コンストラクトで用いられるプロモーターは、インビトロで機能し得るものであれば特に制限されず、例えば、T7プロモーター、SP6プロモーター、T3プロモーターなどが挙げられる。
【００４８】
インビトロ転写用コンストラクトは、好ましくは核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含む。さらに、合成されたmRNAの安定性などの観点からポリA配列を有しているのが好ましい。上記ターミネーター配列としては、たとえば、SP6ターミネーター、T7ターミネーター、T3ターミネーターなどが挙げられる。また、共発現用コンストラクト自体を増幅させるために、ベクターとして機能し、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含んでいてもよい。増幅のためには、PCRが用いられてもよい。
【００４９】
インビトロ転写用コンストラクトがベクター由来の場合、その基本骨格は、例えば、プラスミド又はウイルスベクター（例、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、レンチウイルス等のウイルス由来ベクター）由来であり得る。
【００５０】
本発明において用いられる標的抗原をコードするmRNA及びCD1dをコードするmRNA、あるいは標的抗原及びCD1dをコードするmRNA（以下、単に本発明のmRNAとも称する）は、上記の本発明のコンストラクト及び市販のインビトロ転写用キット等を用いて、公知の方法により調製される。転写反応液に含有される鋳型コンストラクトは、環状であっても、直鎖状であってもよい。環状DNAの場合は、適切な位置の制限酵素部位を認識する制限酵素によって切断され、直鎖状にされてもよい。また本発明に用いる鋳型コンストラクトは、塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならば全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各鋳型コンストラクトは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されたものであってよい。また、安定性の点から、5’のキャップ構造を有していることが望ましい。
【００５１】
本発明のmRNAは、例えば、下記の本発明の剤と同様に、医薬として、及び免疫細胞の活性化、ならびに本発明のアロ細胞の作製に有用である。
【００５２】
（４．剤及び組成物）
本発明は、本発明のアロ細胞、特にCD1dリガンドが負荷された本発明の負荷細胞を含む剤（又は組成物）を提供する。
【００５３】
本発明の剤が投与される動物種は、本発明のアロ細胞が由来する動物種と同様であり得る。すなわち本発明の剤は、本発明のアロ細胞による免疫において、同種異系による免疫を達成し得る。
【００５４】
本発明の剤は、本発明の負荷細胞に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体及び／又はアジュバントを含み得る。医薬上許容され得る担体としては、例えば、水、生理食塩水等の希釈剤などが挙げられるが、それらに限定されるものではない。アジュバントとしては、標的抗原の抗原性を増強し得るものである限り特に限定されないが、例えば、BCG、トレハロースダイマイコレート（TDM）、Merck65、AS-2、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、デキストラン、TLRリガンド（例、リポ多糖（LPS）、CpG）が挙げられる。
【００５５】
本発明の剤は、例えば、医薬又は試薬として有用である。より詳細には、本発明の剤は、腫瘍性疾患又は感染症の予防・治療、あるいは免疫療法（例、NK/NKT細胞、T細胞等の免疫細胞の活性化）に有用である。本発明の剤により予防・治療され得る腫瘍性疾患としては、上述の組織及び細胞種における腫瘍、例えば、固形腫瘍（例、上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍）、造血組織における腫瘍が挙げられる。より詳細には、本発明の剤により予防・治療され得る固形腫瘍としては、例えば、消化器癌（例、胃癌、結腸癌、大腸癌、直腸癌）、肺癌（例、小細胞癌、非小細胞癌）、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、胸腺、脾臓、甲状腺癌、副腎癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌（例、子宮内膜癌、子宮頚癌）、骨癌、皮膚癌、肉腫（例、カポシ肉腫）、黒色腫、芽細胞腫（例、神経芽細胞腫）、腺癌、扁平細胞癌、非扁平細胞癌、脳腫瘍、ならびにこれらの固形腫瘍の再発及び転移が挙げられる。本発明の剤により予防・治療され得る、造血組織における腫瘍としては、白血病（例、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）、急性リンパ球性白血病（ALL）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、成人T細胞白血病（ATL）、骨髄異形成症候群（MDS））、リンパ腫（例、Tリンパ腫、Bリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、骨髄腫（多発性骨髄腫）、ならびにこれらの腫瘍の再発が挙げられる。本発明の剤により治療され得る感染症としては、例えば、上述の病原体により引き起こされる感染症が挙げられる。
【００５６】
本発明者らはまた、本発明の負荷細胞が、NK/NKT細胞の活性化及びT細胞免疫応答の同時誘導能を有し得ることを今回見出している。NK/NKT細胞は、MHCクラスＩ非発現細胞を良好な標的とし、また、T細胞は、MHCクラスI発現細胞を良好な標的とすることが知られている。従って、本発明の剤は、このように種々の標的抗原発現細胞に対する効果が期待できるという利点を有する。
【００５７】
本発明の剤の投与量は、本発明の負荷細胞の種類、本発明の負荷細胞における標的抗原及びCD1dの発現量、投与様式、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、所望の免疫活性を達成するような細胞数が適宜投与され得る。本発明の剤（又は組成物）は、ワクチンとして用いることもでき、標的抗原に対する免疫誘導剤として用いることもできる。複数種の標的抗原を対象とした場合（例えば複数の標的抗原由来のmRNAを目的細胞に形質導入した場合等）には、多価抗原を提示するアロ細胞が得られ、かかるアロ細胞は多価ワクチンとして使用することができ、複数の標的抗原に対する免疫誘導剤として用いることができる。
【００５８】
本発明の剤（ワクチンを含む）を調製する際の標的抗原mRNAの例としては、例えば、メラノサイト分化抗原、チロシナーゼ関連タンパク質2（trp2）mRNAが挙げられるが、限定されない。標的抗原mRNAを用いて本発明のアロ細胞を調製し、さらにCD1dリガンドを負荷することにより本発明の負荷細胞を調製し、得られた細胞を個体に免疫することにより、個体内における当該標的抗原を含むことを特徴とする細胞の増殖を、特異的に、著しく抑制することができる。
【００５９】
本発明では、CD1d発現細胞を作成する手段として、CD1d発現ベクターを用いることができる。CD1d発現ベクターとしては、上記した、CD1dをコードするmRNAを、インビトロで転写するためのコンストラクトと同様なものが利用される。
【００６０】
（５．キット）
上記した、各種物質及び／又は細胞は、必要に応じてキット化することができる。
【００６１】
より詳細には、本発明のキットは、必須の構成成分として標的抗原を発現させるための成分及びCD1dを発現させるための成分を含むキット（キットＩ）、さらに必須の構成成分としてCD1dリガンドを含むキット（キットＩＩ）、ならびにさらに必須の構成成分として発現測定用手段を含むキット（キットＩＩＩ）に大別することができる。
【００６２】
本発明のキットＩは、例えば、以下（１）〜（８）のいずれかを含むものであり得る：
（１）（１−１）CD1d発現細胞、及び（１−２）標的抗原をコードするmRNAをインビトロにおいて転写するためのコンストラクトの組合せ；
（２）（２−１）CD1d発現細胞、及び（２−２）標的抗原をコードするmRNA、の組合せ；
（３）（３−１）CD1dをコードするmRNAをインビトロにおいて転写するためのコンストラクト、（３−２）標的抗原をコードするmRNAをインビトロにおいて転写するためのコンストラクト、及び（３−３）目的細胞、の組合わせ；
（４）（４−１）CD1dをコードするmRNA及び標的抗原をコードするmRNAをインビトロにおいて転写するためのコンストラクト、及び（４−２）目的細胞、の組合わせ；
（５）（５−１）CD1dをコードするmRNAをインビトロにおいて転写するためのコンストラクト、（５−２）標的抗原をコードするmRNA、及び（５−３）目的細胞、の組合せ； 
（６）（６−１）CD1d及び標的抗原をコードするmRNA、（６−２）標的抗原をコードするmRNAをインビトロにおいて転写するためのコンストラクト、及び（６−３）目的細胞、の組合わせ；
（７）（７−１）CD1d及び標的抗原をコードするmRNA、（７−２）標的抗原をコードするmRNA、及び（７−３）目的細胞、の組合わせ；及び
（８）（８−１）CD1d及び標的抗原をコードするmRNA、及び（８−２）目的細胞、の組合わせ。
【００６３】
本発明のキットＩＩは、上記キットＩの各構成要素に加え、CD1dリガンドを必須の構成要素として含む。キットＩＩに含められるCD1dリガンドは上記したものと同様なものが用いられる。好ましくはα-GalCerやα-C-GalCerである。
【００６４】
本発明のキットＩＩＩは、標的抗原の発現を測定可能な手段、及びCD1dの発現を測定可能な手段を含み得る。標的抗原の発現を測定可能な手段としては、例えば、抗体が挙げられる。
【００６５】
本発明のキットにおける、インビトロにおけるmRNAの転写で用いられるプロモーター、基本骨格のコンストラクト及びその他の要素は、本発明のコンストラクトで用いられるものと同様であり得る。
【００６６】
本発明のキットに含められるCD1d発現細胞は、CD1dを発現し、かつ標的抗原を発現しない細胞であり得る。本発明のキットに含められる目的細胞とは、CD1d及び標的抗原を発現していない細胞、あるいはCD1dは発現しているもののその発現量が低い細胞であって標的抗原を発現していない細胞であり得る。尚、本発明で用いる細胞は、当該細胞で免疫されるべき個体と同種の別の個体由来の細胞、すなわち投与対象に対して同種異系の細胞（アロ細胞）であることを特徴とする。
【００６７】
本発明のキットはまた、上述のアジュバントを含んでいてもよい。
【００６８】
本発明のキットはまた、免疫細胞の活性化を確認可能な試薬を含んでいてもよい。免疫細胞の活性化を確認可能な試薬としては、例えば、NK細胞、NKT細胞及びT細胞からなる群より選ばれる１以上の免疫細胞数の測定用試薬、ならびに活性化した当該免疫細胞に特異的な物質の測定用試薬が挙げられる。
【００６９】
免疫細胞数の測定用試薬は、例えば、NK細胞、NKT細胞及びT細胞の細胞表面マーカー（例、Vα24、Vβ11）に対する特異的な抗体、あるいは当該マーカーをコードする転写産物を検出可能な核酸プローブ又は増幅可能な複数のプライマー（例えば、プライマー対）を含むものであり得る。
【００７０】
活性化免疫細胞に特異的な物質の測定用試薬は、例えば、活性化されたNK細胞、NKT細胞及びT細胞に特異的な物質（例えば、IFN-γ、パーフォリン、グランザイムB）に対する抗体、あるいは当該物質をコードする転写産物を検出可能な核酸プローブ又は増幅可能な複数のプライマー（例えば、プライマー対）を含むものであり得る。
【００７１】
本発明のキットは、例えば、上述した本発明の剤と同様に、医薬用キット、又は免疫細胞の活性化用キット、あるいは本発明の細胞の作製又は同定用キットとして有用である。
【００７２】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。【００７４】
［材料と方法］
（マウス及び細胞株）
6〜8週齢の、病原体フリーのC57BL/6（B6）マウスはCLEA Japan（Tokyo）から購入し、B6 CD4-/-及びCD8-/-雌性マウスはJackson Laboratory（Bar Harbor, ME）から購入した。OT-I TCR遺伝子組み換えマウス、CD11c-DTR/GFPマウス、Jα18-/-マウスは、それぞれDr. Heath（Walter and Eliza Hall Institute, Victoria, Australia）、Dr. Littman（New York University, New York, NY）、Dr. Taniguchi（RIKEN）より提供された。上記に列挙したマウスは、特定の病原体フリーの条件下で飼育した。そして理化学研究所ガイドラインに従って研究した。B16、EL4及びEG7細胞株はAmerican Type Culture Collection（Rockville, MD）から取得し、NIH3T3細胞はRIKEN BANKから取得した。CD1d導入のために、J Immunol. 2007;178:2853-2861の記載のように、mCD1dを有するpMX-mCD1d-IRES-GFPをB16メラノーマ又はNIH3T3細胞にレトロウイルスで形質導入した。続いてGFPの発現に基づいて、FACS Vantage Cell Sorterによって分取した。【００７５】
（細胞調製）
骨髄由来のDCは、J Exp Med. 1992;176:1693-1702の記載のように、骨髄前駆細胞から作製した。6日目に、α-GalCer（100 ng/mL）をDCに40時間添加し、そのうちの最後の16時間に100ng/mLのLPSを添加した。他の細胞へα-GalCerを負荷するために、500ng/mLα-GalCerの存在下、線維芽細胞（NIH3T3又はCD1dhi-NIH3T3）又は腫瘍細胞を48時間培養した。α-GalCerを負荷したこれらの細胞は、注射前に3回洗浄した。CD1dhi-NIH3T3は、J Immunol. 2007;178:2853-2861等に記載したように調製した。CD70-NIH3T3、Rae1ε-NIH3T3、Rae1γ-NIH3T3及びMult1-NIH3T3は、次のように調製した。マウスCD70相補（c）DNA、Rae1εcDNA、Rae1γcDNA及びMult1cDNAを、pMX-リガンドcDNA-IRES-GFPを有するレトロウイルスベクターにクローニングし、NIH3T3に感染させた。続いて細胞を、GFPの発現によって分取した。【００７６】
（EGFP、OVA及びTRP-2 mRNAの調製）
各々の全長cDNA（EGFP、OVA、TRP-2）を、pSP64 poly（A）ベクター（Promega, Madison, WI）（図１）を用いてサブクローニングした。各々のcDNAを有するベクターを増幅し、次いで、酵素EcoRI（EGFP又はOVAの場合）或いはPvuII（TRP-2の場合）で切断してリニアライズした。キャップされたmRNAを作製した後、Ribo m7G cap analog（Ambion, Austin, TX）を、RiboMax Large scale RNA large scale RNA production systems-SP6（Promega）を用いてmRNAを増幅するためのRiboMax転写反応中に取り込ませた（図１）。【００７７】
（mRNAのトランスフェクション）
インビトロで転写した（IVT）RNAを、製造元のプロトコールに従ってTransMessenger transfection kit（Qiagen）を用いて種々の細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクションの1日前に、60mmの組織培養ペトリ皿に2x105細胞を播いた。翌日、細胞をPBSで3回洗浄し、異なる量のIVT RNAでトランスフェクトした。mRNA、エンハンサーソリューション、及びtransmessenger reagentの比率は1: 2: 4であった。細胞を異なる時間でトランスフェクトし、直接回収（2時間、4時間、8時間又は16時間）するか、又は10%ウシ血清アルブミンを含有するRPMI 1640を補充して1晩培養（2時間+16時間培養、4時間+16時間培養、8時間+16時間培養又は16時間+16時間培養）した。これらの細胞をFACS及び共焦点レーザー顕微鏡（TCS-SP2 Leica DMRE, Heidelberg, Germany）で解析するか、又はELISA（Morinaga）によって測定した。【００７８】
（リアルタイムPCRアッセイ）
RNeasyキット（Qiagen, Valencia, CA）又はTrizol試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用い、製造者のプロトコールに従って種々の細胞株から全RNAを単離した。Trizol試薬で少数の細胞（2×105未満の細胞）から全RNAを単離する場合は、5μgのグリコーゲン（Roche, Indianapolis, IN）を共沈殿に用いた。1μgの全RNAからcDNAを合成した後、Taqman probe primer（Applied, Biosystems）を用いてリアルタイムPCRによりmRNA発現の定量を行った。【００７９】
（インビトロでの腫瘍研究）
α-GalCerを負荷し、抗原をコードするmRNAでトランスフェクトしたNIH3T3線維芽細胞（5×105細胞/マウス）を、マウスに静注して免疫した。腫瘍投与に対する防護免疫の発達を評価する実験においては、免疫したマウスに、2週間後に腫瘍細胞を皮下投与し、次いで腫瘍サイズを測定した。いくつかの実験においては、CD4-/-及びCD8-/-マウスをレシピエントマウスとして用いた。【００８０】
（統計解析）
インビトロデータにおける差は、Mann-Whitney U-検定を用いて解析した。P<0.05を統計学的有意とみなした。【００８１】
［実施例１］
（抗原をコードするmRNAをアロジェニック細胞に導入するための最適条件の決定）（図２）
リポフェクションを用いる化学的方法によって細胞にmRNAを導入するための、最適なトランスフェクション条件を決定した。抗原をコードするmRNAの、細胞への濃度依存的な形質導入率を決定するため、EGFPを有し、リニアライズされたSP6ベクターからインビトロで転写されたEGFPmRNAの発現を評価した。mRNA濃度の段階別に、蛍光顕微鏡法によって、トランスフェクトしたB16メラノーマ細胞（H2-Kb）又はNIH3T3線維芽細胞（H2-Kq）におけるEGFPの発現を解析した（図２A、B）。異なるmRNA濃度のトランスフェクションを比較することにより、5μgのEGFPmRNAで、B16細胞（図２A）及びNIH3T3細胞（図２B）中でEGFPを発現させるのに十分であると決定した。両方の細胞で、EGFPは4時間目には十分に発現し、少なくとも12時間継続した（データ示さず）。FACSで解析すると、EGFPmRNAの、B16メラノーマ細胞又はNIH3T3線維芽細胞への形質導入効率は、ほぼ等しかった（図２C；データは3回の独立した実験の代表例である）。そしてEL4胸腺腫細胞（H2-Kb）への形質導入効率（5%未満；データ示さず）よりもはるかに良好であった。【００８２】
次に、mRNA形質導入後、タンパク質産生が最大となる時間を決定した。5μgのOVAmRNAで形質導入したB16、EL4又はNIH3T3細胞（それぞれB-16ova、EL4-ova又はNIH3T3-ovaと表す）が産生するOVAタンパク質量を、細胞溶解後にELISAによって測定した。トランスフェクション時間（2-16時間）を評価すると、B-16ova及びNIH3T3-ovaはトランスフェクション後4時間で最も多くのOVAタンパク質を産生することがわかった。【００８３】
OVAタンパク質量の測定によって、トランスフェクション後に細胞がOVAタンパク質を産生し続けるかどうか解析した。図２D及びEに示すように、OVAmRNAでトランスフェクトしたNIH3T3におけるOVAタンパク質発現は、B16のトランスフェクタントと同レベルであったが、B16よりも長時間継続した。OVAmRNAでトランスフェクトしたEL4細胞株は、トランスフェクションレベルが低く、OVAタンパク質をほとんど発現しなかった（図２F）。従って、以後の実験のために、NIH3T3線維芽細胞を選択した。【００８４】
［実施例２］
（共刺激分子をもたない細胞株へのCD1d遺伝子の形質導入）
CD1d分子を発現した腫瘍細胞は、刺激共分子をもっていなくても、一次iNKT細胞にα-GalCerを提示できる。本発明者らは、NIH3T3線維芽細胞及びB16メラノーマ細胞がCD40、CD70、CD86及びMHCクラスIIを発現しないことを確認した（データ示さず）。CD1d発現に関しては、図３A及びBのとおり、親細胞株（NIH3T3（図中、NIH）及びB16）を解析し、そしてレトロウイルスが発現する高レベルのマウスCD1dで形質導入した安定な形質転換体も樹立した。安定なCD1dhi細胞株（図中、それぞれCD1dNIH、CD1dB16）は、FACS Vantage Cell Sorterを用いた分取により>98%の純度で選別した（図３B、左）。B16メラノーマ及びNIH3T3の親細胞は骨髄由来DC（図中、mBMDC）よりも、CD1dの発現レベルが低かった（図３A）。リアルタイムPCRで細胞株及びDCのCD1d発現レベルを比較し、CD1dhi-NIH3T3細胞（図中、CD1dNIH）が最も高いことがわかった。この知見は、FACSでも確認した（図３B、右）。【００８５】
（mRNAを形質導入した細胞株におけるMHCクラスI抗原ペプチドの発現測定）
高レベル又は低レベルのCD1dを発現する、樹立細胞株をOVAmRNAでトランスフェクトし、4時間後すぐにELISAにより、細胞ライセートでOVA発現レベルを解析した。B16親細胞及びCD1dhi-B16トランスフェクタント（図中、それぞれB16、CD1d-B16）のOVA発現レベルは、NIH3T3又はCD1dhi-NIH3T3トランスフェクタント（図中、それぞれNIH、CD1d-NIH）のそれとほぼ等しいことがわかった（図３C）。細胞株だけでなく、EGFP-NIH3T3（図中、EGFP-NIH）又はCD1dhi-NIH3T3（図中、CD1d-NIH）を含むトランスフェクタントも、mRNAで安定に形質導入できることを確認した。
抗原提示細胞としての各トランスフェクタントの、直接的な提示活性を測定した。OVA特異的なT細胞応答をインビトロで容易に解析するために、クラスIを高発現するB16細胞株を、組み換えIFN-γに12時間曝すことによって樹立した（データ示さず）。親細胞又はトランスフェクトした細胞を、OVA特異的TCRを組み換えたCD8+T細胞（OT-I細胞、図中OT-1）と48時間共培養し、上清のIFN-γレベルを測定した。IFN-γの分泌は、OVA-mRNAでトランスフェクトしたB16細胞（B16-ova；図中、OVA-B16）由来の上清に応答して上昇したが、それと同レベルのOVAタンパク質を分泌しているにもかかわらず、OVA-mRNAでトランスフェクトしたNIH3T3（NIH3T3-ova；図中、OVA-NIH）ではそうならなかった（図３D）。このことは、OVAペプチドがMHCクラスI分子に関連して発現するのはOT-I及びB16（Kb）と同じであるが、NIH3T3細胞（Kq）にはミスマッチであることを示している。【００８６】
（NKT細胞の支援の有無による、mRNAをトランスフェクトした細胞での、OVA抗原のインビボクロスプレゼンテーション）
図３Dに示すように、OVA分泌が同レベルなのにもかかわらず、OT-I細胞はMHCクラスIにミスマッチのNIH3T3上のペプチド抗原を認識しなかった。我々はこの観察がインビボにも当てはまるのかどうか試験した。線維芽細胞トランスフェクタントのインビボ抗原提示能を測定するため、α-GalCerを負荷したか、又は負荷していないOVA-mRNAのトランスフェクタントを、OT-I細胞の注入を受けたマウスに与えた。免疫したマウスにおける、分裂したOT-I細胞の絶対数を3日後に解析した。図３Eに示すとおり、α-GalCerを負荷し、OVA-mRNAでトランスフェクトしたCD1dhi-NIH3T3（CD1dhi-NIH3T3/Gal-ova；図中、CD1d-NIH/Gal）を与えたマウスのOT-I細胞は、OVA-mRNAでトランスフェクトしたCD1dhi-NIH3T3（CD1dhi-NIH3T3-ova；図中、CD1d-NIH）を与えたマウス中のOT-I細胞よりも多く増殖した。CD1dhi-NIH3T3/Gal-ovaを与えたマウスにおけるOT-I細胞の数は、腫瘍/Gal、即ちCD1dhi-B16/Gal-ova （図中、CD1d-B16/Gal）を与えたマウスにおいて見られるOT-I細胞の数に等しかった（図３E；データは1群あたり2匹のマウスを用いた独立した2回の実験の代表例を示し、CD1dhi-NIH3T3-ova対CD1dhi-NIH3T3/Gal-ova及びCD1dhi-B16-ova（図中、CD1d-B16/Gal）対CD1dhi-B16/Gal-ovaの差はp<0.05で有意だった）。従って、MHCクラスIミスマッチのために、CD1dhi-NIH3T3-ovaは、インビトロでOT-I細胞を刺激できない（図３D）。しかしながら、CD1dhi-NIH3T3/Gal-ovaは、インビボでOT-I細胞を増殖させることができた。MHCクラスIミスマッチにもかかわらずこのように増殖することから、アロジェニックな宿主における、内生DCによるクロスプレゼンテーションが示唆される。【００８７】
［実施例３］
（α-GalCerを負荷した線維芽細胞は、インビボでアロジェニックNK及びiNKT細胞を活性化する）
アロジェニック細胞が、α-GalCerによってインビボで自然免疫系を刺激するかどうか調べるために、免疫したマウスの脾臓細胞をCD3-FITC及びNK1.1-APCで染色し、NK細胞（CD3-NK1.1+）の応答を、免疫から16時間後のCD69（CD69-PEで染色）及びIFN-γ（IFN-γ-PEで染色）の発現でフローサイトメトリーにより解析した（図４A）。CD1dhi-NIH3T3/Gal（図中、CD1dNIH/Gal）を与えたマウスでは、NK細胞はCD69の発現を上昇させ、IFN-γを分泌した。NIH3T3（図中、NIH）又はCD1dhi-NIH3T3（図中、CD1dNIH）を注射したマウスのNK細胞では、弱いアロジェニック応答しか見られなかった。【００８８】
CD1dをトランスフェクトした親細胞のNIH3T3又はB16細胞が、α-GalCerによってiNK細胞を活性化するかどうか解析するために、IFN-γELISPOTアッセイにおいて、100ng/mLα-GalCerの存在下（図４B黒）／非存在下（図４B白）で免疫2日後の脾臓細胞を懸濁して再刺激した。NIH3T3/Gal（図中、NIH/Gal）又はCD1dhi-NIH3T3/Gal（図中、CD1dNIH/Gal）を注射したマウス細胞のIFN-γ産生スポット数は、それぞれB16/Gal又はCD1dhi-B16/Gal（図中、CD1B16/Gal）のスポット数と同様であった。データは1群あたり3匹のマウスの平均である。このことは、CD1dhi-NIH3T3/Gal及びCD1dhi-B16/Galが、iNKT細胞の自然免疫応答及び引き続くNK細胞の応答のために、抗原提示細胞としてはたらくことを示している。【００８９】
（α-GalCerを負荷したアロジェニック線維芽細胞によって生じた、自然リンパ球を介した抗腫瘍効果）
次に、mRNAをトランスフェクトし、CD1dリガンド負荷したアロジェニック線維芽細胞による抗腫瘍効果を、B16肺転移モデルを用いて検討した。2×105細胞のB16（コントロール）を一律に投与した後、3時間後に、NIH3T3又はCD1d発現増強NIH3T3（CD1dhi-NIH3T3）、あるいはα-GalCerを負荷したNIH3T3（NIH3T3/Gal）又はCD1d発現増強NIH3T3（CD1dhi-NIH3T3/Gal）（いずれも5×105細胞）を、各群ごとのマウスに静脈内投与した。次いで、投与14日後、各マウスから肺を摘出し、抗腫瘍効果を評価した（1群あたり、n=5）（図４C）。【００９０】
その結果、α-GalCerを負荷したNIH3T3（NIH3T3/Gal；図中、NIH/Gal）又はCD1d発現増強NIH3T3（CD1dhi-NIH3T3/Gal；図中、CD1dNIH/Gal）を投与した群のモデルマウスでは、他の群に比べ、腫瘍が著しく減少していた。2回の独立した実験で同様の効果を得た。（*）は、NIH3T3/Gal、CD1dhi-NIH3T3/Galに比して他のグループ、即ちNIH3T3（図中、NIH）、CD1dhi-NIH3T3（図中、CD1dNIH）及びコントロールの差がp<0.05で有意であることを示す。
以上より、mRNAをトランスフェクトし、CD1dリガンド負荷したアロジェニック線維芽細胞は、自然リンパ球の活性化により、肺転移の抑止に十分な抗腫瘍効果を示すことが明らかとなった。【００９１】
［実施例４］
（α-GalCerを負荷したアロジェニック線維芽細胞への応答における、インビボDC成熟化の重要な役割）
α-GalCerを負荷した腫瘍細胞をマウスに注射した場合、T細胞応答を生じるためには、宿主DCは、抗原の捕捉後、成熟を経る必要があることがわかっている。図４A及びBに示したように、NIH3T3/Gal（図中、NIH/Gal）は明らかに、自然リンパ球を活性化している。従って、α-GalCerを負荷したか、又は負荷していないNIH3T3（図中、NIH）又はCD1dhi-NIH3T3（図中、CD1dNIH）をマウスに注射した後、インビボのDC成熟化が起きるかどうか試験した（図５A）。注射後12時間で脾臓細胞を収集し、フローサイトメトリーによりDC表面マーカーのCD40、CD86及びCD119の発現を解析した。DC成熟の変化と同じく、CD40及びCD86の発現が上昇し、CD119の発現は減少していることがわかった。図５Aに示すとおり、DCのCD8α+及びCD8α-サブセットでのCD86の発現上昇は、CD1dhi-B16/Gal（図中、CD1dB16/Gal）又は遊離α-GalCerで免疫したマウスにおいて見られる発現上昇と同様であった。遊離α-GalCerを静注して免疫した後のDCでCD70が発現することが最近報告されたので、CD70の発現も同様に解析した（図５B）。CD1dhi-B16/Gal又はCD1dhi-NIH3T3/Gal（図中、CD1dNIH/Gal）注射後12時間はCD70のレベルは上昇しないが、40時間で上昇することがわかった。より後の段階では、CD8a+DCで、CD8a-DCよりも多くのCD70が発現していることがわかった。機能的DCが成熟した兆候としては、一般的にはIL-12分泌が挙げられる。IL-12の分泌も解析した（図５C）。
NIH3T3/Gal又はCD1dhi-NIH3T3/Galを静注して免疫した4時間後のマウス由来のDCは高レベルのIL-12を分泌したが、NIH3T3細胞又はCD1dhi-NIH3T3で免疫したマウス由来のDCはしなかった。これらの、DC成熟、細胞表面マーカーの改変及びIL-12分泌は、Jα18欠損マウスでは見られない（データ示さず）ことから、DC成熟にはiNKT細胞が不可欠であることがわかった。これらのデータより、α-GalCerを負荷したアロジェニック線維芽細胞の注射後すぐに、DCは成熟を開始するようである。線維芽細胞に直接負荷したα-GalCerだけでなく、宿主DCに捕捉された後も間接的に、α-GalCerはiNKT細胞を活性化し、DCを成熟させる。【００９２】
（生体内のDCはCD1dhi-NIH3T3/Gal-ova注入マウスにおいて適合免疫を誘起するために不可欠である）
図３Eにおいて、免疫されたマウスにより、OT-I細胞は、クラスIがCD1dhi-NIH3T3/Gal-ova（図中、CD1dNIH/Gal）と一致していないので、インビボでは宿主のDCが、OT-I細胞へのOVA抗原の提示に関与するかどうか決定するために、ジフテリアトキシン（DT）で処理した、CD11c-ジフテリアトキシン受容体（DTR）組み換え（CD11c-DTR/GFP）マウスを用いて、宿主のインビボCD11c+DCを除去した。これらのマウスにおいてはOT-I細胞の増殖がほとんどなく、DCの、CD1dhi-NIH3T3/Gal-ova細胞を与えたマウス中の、抗原のクロスプレゼンテーションにおける役割が証明された。【００９３】
［実施例５］
（C57BL/6マウスへのCD1dhi-NIH3T3/Gal-ova免疫でもたらされる強力な適応免疫応答）
mRNAをトランスフェクトした線維芽細胞に対する免疫応答を生じる我々の方法が、遺伝子組み換えOT-I細胞を注射したマウスを用いて一度確立されると、野生型マウスにおいて生じる免疫応答を達成しようとすることがより重要になる。我々は次に、CD1dhi-NIH3T3/Gal-ovaで免疫した後、野生型マウスにおいて抗原特異的T細胞免疫が生じ得るかどうか試験した（図６A）。iNKT細胞の活性化及び抗原を持つ細胞でのCD1dの発現レベルが獲得免疫の誘導に重要かどうかを試験した。この研究をするために、種々の親細胞又はOVAmRNAでトランスフェクトされたCD1dhi-NIH3T3細胞：NIH3T3-ova（図中、NIH/OVA）、NIH3T3/Gal-ova（図中、NIH/OVA/G）、CD1dhi-NIH3T3-ova（図中、CD1dNIH/OVA）及びCD1dhi-NIH3T3/Gal-ova（図中、CD1dNIH/OVA/G）でマウスを免疫した。7日後、脾臓細胞を収集してOVAペプチドSIINFEKL（配列番号１）に特異的なCD8+T細胞の数を、KbOVA257-2644量体で染色することにより解析した。図６Aに示したように、NIH3T3/Gal-ova又はCD1dhi-NIH3T3/Gal-ovaを与えたマウスにおけるOVA4量体にポジティブな細胞の数は、NIH3T3-ova又はCD1dhi-NIH3T3-ovaを与えたマウスの当該細胞の数よりはるかに多かった。しかしながら、これはJα-18欠損マウスでは起きなかった（図６B）。【００９４】
次いで我々は、iNKT細胞のリガンドα-GalCerでプライミングした後のT細胞応答の程度を、レチノイン酸初期誘導性-1ε（Rae1ε）、Rae1γ、CD70及びマウスUL16結合タンパク質様転写物1（Mult1）等のNK細胞のリガンドでプライミングした後のものと比較した（図６C）。NK細胞のリガンドはEGFPを有するレトロウイルスベクターを用いてクローニングした。各々の分子とEGFPとの共発現はFACS解析によって確認した（データ示さず）。T細胞の増殖は、CD70-NIH3T3-ova（図中、CD70-NIH/OVA）、Rae1ε-NIH3T3-ova（図中、Rae1ε-NIH/OVA）、Mult1-NIH3T3-ova（図中、Mult1-NIH/OVA）又はRae1γ-NIH3T3-ova（図中、Rae1γ-NIH/OVA）で免疫した1週間後に、4量体染色により評価した。図６Cに示すように、Rae1ε-NIH3T3-ova又はCD70-NIH3T3-ovaで免疫した群はKbOVA257-2644量体ポジティブな細胞増殖を示したが、他のNKリガンドで免疫したグループはそうではなかった。OVAに特異的なT細胞応答は、IFN-γELISPOTを用いても、試験した。CD1dhi-NIH3T3/Gal-ovaを与えたマウスにおける、IFN-γを産生するT細胞応答は、Rae1γ-NIH3T3-ova、Rae1ε-NIH3T3-ova、Mult1-NIH3T3-ova、CD70-NIH3T3-ova又はCD1dhi-NIH3T3-ovaを与えたマウスにおけるそれよりもはるかに高かった（図６D）。従って、α-GalCerを負荷した、抗原を有する線維芽細胞は、ナイーブマウスにおいて、自然免疫と獲得免疫を結びつけることによって、より強固な免疫応答をもたらす。【００９５】
［実施例６］
（CD1dhi-NIH3T3/Gal-ovaワクチンの接種による抗腫瘍T細胞活性の誘導）
CD1dhi-NIH3T3/Gal-ovaで免疫したマウスにおけるT細胞応答が抗腫瘍免疫につながりえるかどうか評価した（図７A）。マウスを5×105細胞のCD1dhi-NIH3T3-ova（図中、CD1dNIH(OVA)）又はCD1dhi-NIH3T3/Gal-ova（図中、CD1dNIH(OVA)/Gal）で静脈内投与により免疫してから2週間後に、1×105EL4胸腺腫又はOVAを発現するEL4（EG7）を投与した。CD1dhi-NIH3T3/Gal-ovaを与えたマウスにおける抗腫瘍効果は、EG7に対しては示されたが、EL4に対しては示されなかった。これは腫瘍特異的な免疫応答であることを示している。CD1dhi-NIH3T3-ova（図７A）又はCD1dhi-NIH3T3/Gal（データ示さず）を与えたマウスはEL4及びEG7腫瘍を発達させた。静脈内接種後の、腫瘍発達に対する防御には、CD4+及びCD8+T細胞応答が必要である（図７B）。腫瘍サイズはグラフに表示された時点で測定した（1群あたりn=6〜8）。2回の独立した実験で同様の結果を得た。CD1dhi-NIH3T3/Gal-ova細胞が、30Gyの放射線照射の後に腫瘍発達からの防御を同様に提供するのかについても試験したが、照射を受けたマウス群においても同様の結果を認めた（データ示さず）。【００９６】
［実施例７］
（α-GalCerを負荷し、trp2mRNAをトランスフェクトしたNIH3T3細胞に応答した適応免疫によって推進される抗腫瘍効果）
我々はOVAモデルにおいて、α-GalCerを負荷し、mRNAをトランスフェクトしたアロジェニック細胞株で免疫することによって、自然及び獲得免疫間の関連性を証明した（図７）。
次いで、我々はこの概念を、メラノサイト分化抗原、チロシナーゼ関連タンパク質2（trp2）mRNAで形質導入したCD1dhi-NIH3T3/Gal細胞でマウスを免疫することによって、現実の腫瘍モデルに適用した（図８A、B）。NIH3T3-trp2（図中、trp2-NIH）におけるtrp2発現はRT-PCRによって確認し（図８A）、リアルタイムPCRによって確認した（図８B）。そして、B16メラノーマ細胞で内生発現するtrp2の3倍近いことを示した。
注射された、trp2をコードするmRNAをトランスフェクトしたCD1dhi-NIH3T3/Galに対する適応抗腫瘍応答を評価した（図８C）。マウスをCD1dhi-NIH3T3/Gal-trp2（図中、CD1dNIH(trp2)/Gal）、CD1dhi-NIH3T3/Gal（図中、CD1dNIH/Gal）又はCD1dhi-NIH3T3-trp2（図中、CD1dNIH(trp2)）を静脈内投与して免疫した。抗腫瘍防御を評価するため、2週間後にマウスにB16メラノーマ細胞（5x104）を投与した場合、CD1dhi-NIH3T3/Gal-trp2（図８C左下）を受けたマウスにおいてはB16腫瘍の増殖は阻害されたが、CD1dhi-NIH3T3-trp2（図８C左中）又はCD1dhi-NIH3T3/Gal（図８C左上）を受けたマウスにおいてはそうならなかった。免疫したマウス群のいずれもが、EL4胸腺腫細胞（1x105）に対する抗腫瘍免疫を示さなかった（図８C右）。腫瘍サイズはグラフに表示された時点で測定した（1群あたりn=6-8）。2回の独立した実験で同様の結果を得た。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明は、腫瘍細胞又は病原体感染細胞を直接使用せず、それらで特徴的に発現するmRNAを調製して利用することによって、その腫瘍細胞又は病原体感染細胞を特異的に殺傷できるT細胞を誘導できる。従って、これらに起因する病気の、効果の高い免疫療法の確立に非常に有用である。さらに本発明によれば、殺傷すべき細胞の抗原特性を明らかにし、それにあわせてmRNAを調製して使用することで、個々人においてオーダーメイドの免疫療法を施行できる可能性が生まれ、治療対象が大幅に拡大される。【００９８】
本出願は、日本で出願された特願２００８−３０５６３９を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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