(57)【要約】  複数の再生毛包原基の製造方法は、規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を同時に播種し、線維芽細胞増殖因子を含む培地を用いて、前記マイクロ凹版の少なくとも上面及び底面から前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞に対して酸素を供給しながら共培養することにより、前記微小凹部内に毛包原基を形成させる工程を備える方法であり、前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなる。毛髪再生用キットは、規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版と、線維芽細胞増殖因子と、を備え、前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を同時に播種し、線維芽細胞増殖因子を含む培地を用いて、前記マイクロ凹版の少なくとも上面及び底面から前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞に対して酸素を供給しながら共培養することにより、前記微小凹部内に毛包原基を形成させる工程を備え、
前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなる複数の再生毛包原基の製造方法。
【請求項２】
前記毛包原基形成工程において、さらに、血管を構築しうる細胞を前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞と同時に播種する請求項１に記載の複数の再生毛包原基の製造方法。
【請求項３】
前記血管を構築しうる細胞が血管内皮細胞である請求項２に記載の複数の再生毛包原基の製造方法。
【請求項４】
前記線維芽細胞増殖因子が塩基性線維芽細胞増殖因子である請求項１〜３のいずれか一項に記載の複数の再生毛包原基の製造方法。
【請求項５】
前記培地中の前記線維芽細胞増殖因子の含有量が１ｎｇ／ｍＬ以上２００ｎｇ／ｍＬ以下である請求項１〜４のいずれか一項に記載の複数の再生毛包原基の製造方法。
【請求項６】
前記培地が前記線維芽細胞増殖因子として多血小板血漿を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の複数の再生毛包原基の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の複数の再生毛包原基の製造方法により得られた複数の再生毛包原基を前記微小凹部内に保持された状態で、生体適合性ハイドロゲルに転写する工程を備える毛包組織含有シートの製造方法。
【請求項８】
前記マイクロ凹版における前記微小凹部の密度が２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下である請求項７に記載の毛包組織含有シートの製造方法。
【請求項９】
前記生体適合性ハイドロゲルがコラーゲンである請求項７又は８に記載の毛包組織含有シートの製造方法。
【請求項１０】
規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版と、
線維芽細胞増殖因子と、
を備え、
前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなる毛髪再生用キット。
【請求項１１】
さらに、培地を備える請求項１０に記載の毛髪再生用キット。
【請求項１２】
前記培地が間葉系細胞増殖用培地、上皮系細胞増殖用培地及び血管内皮系細胞増殖用培地からなる群から選択される１種類以上である請求項１１に記載の毛髪再生用キット。
【請求項１３】
前記線維芽細胞増殖因子が塩基性線維芽細胞増殖因子である請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の毛髪再生用キット。
【請求項１４】
前記線維芽細胞増殖因子として多血小板血漿を備える請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の毛髪再生用キット。
【請求項１５】
間葉系細胞及び上皮系細胞に候補物質を接触させる工程１と、
培養容器に、前記候補物質に接触させた前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞、並びに、対照として前記候補物質に接触させていない間葉系細胞及び上皮系細胞をそれぞれ播種し、線維芽細胞増殖因子を含む培地を用いて、酸素を供給しながら共培養することにより、前記培養容器内に候補物質と接触させた毛包原基及び対照毛包原基を形成させる工程２と、
前記候補物質と接触させた毛包原基において、前記対照毛包原基よりも早く毛幹様構造が形成された場合、前記候補物質を発毛促進物質と判断し、前記対照毛包原基よりも遅く毛幹様構造が形成された場合、発毛抑制物質であると判断し、前記対照原基と毛幹様構造が形成された時期が同じ場合、発毛抑制物質及び発毛抑制物質のいずれでもないと判断する工程３と、
を備える発毛促進又は抑制物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の再生毛包原基の製造方法、毛包組織含有シートの製造方法、毛髪再生用キット及び発毛促進又は抑制物質をスクリーニングする方法に関する。
本願は、２０１７年８月２２日に、日本に出願された特願２０１７−１５９６６１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
臨床応用に足る毛包再生医療の確立には、再生毛包が正常な組織構造を有し、移植部位に適した毛幹を有する毛が、形成、伸長することが必要である。毛等の皮膚付属器を含む外胚葉性付属器官は、通常、胎児期において、上皮系細胞及び間葉系細胞の相互作用により発生する。外胚葉性付属器官の一つである毛包は、個体の生涯にわたって成長及び退行（毛周期）を繰り返し、成長期における毛球部の再生は、毛包器官発生期と同様な分子機構により誘導されることが知られている。また、このような毛周期における毛球部の再生は、間葉系細胞である毛乳頭細胞により誘導されると考えられている。すなわち、成長期において、毛包上皮幹細胞が間葉系細胞である毛乳頭細胞により分化誘導され毛球部が再生される。【０００３】
これまでに毛包再生に向けて間葉系細胞（毛乳頭細胞及び真皮毛根鞘細胞）を置換することによる毛包可変領域の再生、毛包誘導能を有する間葉系細胞による毛包新生、又は上皮系細胞及び間葉系細胞による毛包の再構築等が試みられてきた。
具体的には、例えば、体性に由来する複数の細胞種を、Ｗｎｔシグナル活性化剤を添加した培養液を備えるスフェロイド容器に播種することで、原始的な毛包器官を形成する方法（例えば、特許文献１参照）が挙げられる。
また、例えば、間葉系細胞から実質的になる第１の細胞集合体と、上皮系細胞から実質的になる第２の細胞集合体と、をゲル内で区画化して配置することで毛包原基を構築し、化学繊維等のガイドを挿入した後、それを移植することで毛包器官を再生する方法（例えば、特許文献２参照）が挙げられる。【０００４】
また、本発明者らはこれまで、複数の再生毛包原基の製造方法を開発してきた（例えば、特許文献３参照）。具体的には、規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、当該マイクロ凹版の少なくとも上面及び底面から前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞に対して酸素を供給しながら共培養することで、毛包原基を形成させる工程を備える方法である。
一方、最近、多血小板血漿抽出物を含む培養液を用いて間葉系細胞を培養し、該間葉系細胞を生まれつき毛の生えないマウスの皮膚に移植することで、高い毛髪再生能が実現できることが明らかとなった（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】日本国特開２０１５−１６５８２３号公報
【特許文献２】国際公開第２０１２／１０８０６９号
【特許文献３】国際公開第２０１７／０７３６２５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Xiao S-E., et al., “As a carrier-transporter for hair follicle reconstitution, platelet-rich plasma promotes proliferation and induction of mouse dermal papilla cells.”, Nature, Scientific Reports, 7: 1125, DOI:10.1038/s41598-017-01105-8, 2017.
【非特許文献２】Toyoshima, K., et al., “Fully functional hair follicle regeneration through the rearrangement of stem cells and their niches”, Nat. Commun., vol.3, no.784, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１では、多血小板血漿抽出物を含む培養液を用いて間葉系細胞のみを培養しており、間葉系細胞及び上皮系細胞を共培養することは検討されておらず、また、多血小板血漿抽出物に含まれる成分のうち、有効な成分については特定されていない。
また、本発明者らは、これまで、特許文献３に示すように、間葉系細胞及び上皮系細胞から構成された毛包原基を大量に製造すべく、酸素透過性に優れた培養容器を用いた培養方法に着目してきた。しかしながら、従来から間葉系細胞又は上皮系細胞それぞれの機能を損なわずに培養するために用いられる培地成分は各種知られているものの、上記培養容器を用いて毛包原基を製造する際に、優れた毛髪再生効率を有する毛包原基を大量に得るために必要な特定の培地成分については知られていない。
よって、上記の従来の製造方法よりも、毛髪再生効率が高く、哺乳動物の毛包組織と類似し、規則的且つ高密度の複数の再生毛包原基を製造可能な方法が求められていた。【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、毛髪再生効率が優れており、哺乳動物の毛包組織と類似し、規則的且つ高密度の複数の再生毛包原基の製造方法及び毛髪再生用キットを提供する。また、前記複数の再生毛包原基の製造方法を用いた毛包組織含有シートの製造方法及び発毛促進又は抑制物質をスクリーニングする方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る複数の再生毛包原基の製造方法は、規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を同時に播種し、線維芽細胞増殖因子を含む培地を用いて、前記マイクロ凹版の少なくとも上面及び底面から前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞に対して酸素を供給しながら共培養することにより、前記微小凹部内に毛包原基を形成させる工程を備える方法であり、前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなる。
前記毛包原基形成工程において、さらに、血管を構築しうる細胞を前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞と同時に播種してもよい。
前記血管を構築しうる細胞が血管内皮細胞であってもよい。
前記線維芽細胞増殖因子が塩基性線維芽細胞増殖因子であってもよい。
前記培地中の前記線維芽細胞増殖因子の含有量が１ｎｇ／ｍＬ以上５００ｎｇ／ｍＬ以下であってもよい。
前記培地は前記線維芽細胞増殖因子として多血小板血漿を含んでもよい。【００１０】
本発明の第２態様に係る毛包組織含有シートの製造方法は、上記第１態様に係る複数の再生毛包原基の製造方法により得られた複数の再生毛包原基を前記微小凹部内に保持された状態で、生体適合性ハイドロゲルに転写する工程を備える方法である。
前記マイクロ凹版における前記微小凹部の密度が２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下であってもよい。
前記生体適合性ハイドロゲルがコラーゲンであってもよい。【００１１】
本発明の第３態様に係る毛髪再生用キットは、規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版と、線維芽細胞増殖因子と、を備え、前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなる。
上記第３態様に係る毛髪再生用キットは、さらに、培地を備えてもよい。
前記培地が間葉系細胞増殖用培地、上皮系細胞増殖用培地及び血管内皮系細胞増殖用培地からなる群から選択される１種類以上であってもよい。
前記線維芽細胞増殖因子が塩基性線維芽細胞増殖因子であってもよい。
前記線維芽細胞増殖因子として多血小板血漿であってもよい。【００１２】
本発明の第４態様に係る発毛促進又は抑制物質をスクリーニングする方法は、間葉系細胞及び上皮系細胞に候補物質を接触させる工程１と、培養容器に、前記候補物質に接触させた前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞、並びに、対照として前記候補物質に接触させていない間葉系細胞及び上皮系細胞をそれぞれ播種し、線維芽細胞増殖因子を含む培地を用いて、酸素を供給しながら共培養することにより、前記培養容器内に候補物質と接触させた毛包原基及び対照毛包原基を形成させる工程２と、前記候補物質と接触させた毛包原基において、前記対照毛包原基よりも早く毛幹様構造が形成された場合、前記候補物質を発毛促進物質と判断し、前記対照毛包原基よりも遅く毛幹様構造が形成された場合、発毛抑制物質であると判断し、前記対照原基と毛幹様構造が形成された時期が同じ場合、発毛抑制物質及び発毛抑制物質のいずれでもないと判断する工程３と、を備える方法である。
【発明の効果】
【００１３】
上記態様の複数の再生毛包原基の製造方法及び毛髪再生用キットによれば、毛髪再生効率に優れており、哺乳動物の毛包組織と類似し、規則的且つ高密度の複数の再生毛包原基を提供することができる。また、上記態様の毛包組織含有シートの製造方法によれば、毛髪再生効率が優れており、規則的且つ高密度の毛包組織を備えた毛包組織含有シートを提供することができる。上記態様の発毛促進又は抑制物質をスクリーニングする方法によれば、簡便に発毛促進又は抑制物質をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明に係る複数の再生毛包原基の製造方法の一例を示す概略工程図である。
【図２】本発明に係る複数の再生毛包原基の製造方法の一例を示す概略工程図である。
【図３】本発明に係る毛包組織含有シートの製造方法の一例を示す概略工程図である。
【図４】本発明に係る毛包組織含有シートの製造方法の一例を示す概略工程図である。
【図５】実施例１におけるマイクロ凹版の作製方法を示す概略工程図である。
【図６Ａ】実施例１における多血小板血漿溶液を含有する培地（ＰＲＰｒ＋）を用いて培養した間葉系細胞及び上皮系細胞の培養３日目での自己凝集の様子を示す顕微鏡像である。スケールバーは１００μｍを表す。
【図６Ｂ】実施例１における多血小板血漿溶液を含有しない培地（ＰＲＰｒ−）を用いて培養した間葉系細胞及び上皮系細胞の培養３日目での自己凝集の様子を示す顕微鏡像である。スケールバーは１００μｍを表す。
【図７Ａ】実施例１におけるＰＲＰｒ＋又はＰＲＰｒ−条件下で培養した間葉系細胞及び上皮系細胞の培養３日目でのＶｅｒｓｉｃａｎの相対的な発現量を示すグラフである。グラフにおいて、ＰＲＰｒ−条件下でのＶｅｒｓｉｃａｎの発現量を１としたときのＰＲＰｒ＋条件下でのＶｅｒｓｉｃａｎの発現量を示している。
【図７Ｂ】実施例１におけるＰＲＰｒ＋又はＰＲＰｒ−条件下で培養した間葉系細胞及び上皮系細胞の培養３日目でのＮｅｘｉｎの相対的な発現量を示すグラフである。グラフにおいて、ＰＲＰｒ−条件下でのＮｅｘｉｎの発現量を１としたときのＰＲＰｒ＋条件下でのＮｅｘｉｎの発現量を示している。
【図７Ｃ】実施例１におけるＰＲＰｒ＋又はＰＲＰｒ−条件下で培養した間葉系細胞及び上皮系細胞の培養３日目でのＩｇｆｂｐ５の相対的な発現量を示すグラフである。グラフにおいて、ＰＲＰｒ−条件下でのＩｇｆｂｐ５の発現量を１としたときのＰＲＰｒ＋条件下でのＩｇｆｂｐ５の発現量を示している。
【図７Ｄ】実施例１におけるＰＲＰｒ＋又はＰＲＰｒ−条件下で培養した間葉系細胞及び上皮系細胞の培養３日目でのＴｇｆβ２の相対的な発現量を示すグラフである。グラフにおいて、ＰＲＰｒ−条件下でのＴｇｆβ２の発現量を１としたときのＰＲＰｒ＋条件下でのＴｇｆβ２の発現量を示している。
【図８Ａ】試験例１における実施例１で得られたＰＲＰｒ＋条件下で形成された毛包原基の移植から３週間後のヌードマウスの移植部の様子を示す顕微鏡像である。スケールバーは１０００μｍを表す。
【図８Ｂ】試験例１における実施例１で得られたＰＲＰｒ−条件下で形成された毛包原基の移植から３週間後のヌードマウスの移植部の様子を示す顕微鏡像である。スケールバーは１０００μｍを表す。
【図９】試験例１における実施例１で得られたＰＲＰｒ＋又はＰＲＰｒ−条件下で形成された毛包原基の移植から３週間後のヌードマウスの移植部での毛髪再生数を示すグラフである。
【図１０】実施例２における毛包原基での毛幹伸長時期及び毛幹様構造を示す顕微鏡像である。左側は、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）無添加（ＦＧＦ２−）条件下で形成された毛包原基での毛幹伸長時期（培養１２日目）及び培養２３日目での毛包原基の毛幹様構造（矢印）を示す顕微鏡像である。一方、右側は、ＦＧＦ２添加（ＦＧＦ２＋）条件下で形成された毛包原基での毛幹伸長時期（培養８日目）及び培養１０日目での毛包原基の毛幹様構造（矢印）を示す顕微鏡像である。スケールバーはそれぞれ２００μｍを表す。
【図１１】実施例２におけるＦＧＦ２＋又はＦＧＦ２−条件下で形成された毛包原基の培養１０日目でのＶｅｒｓｉｃａｎ及びＴｇｆβ２の相対的な発現量を示すグラフである。グラフにおいて、ＦＧＦ２−条件下でのＶｅｒｓｉｃａｎ又はＴｇｆβ２の発現量を１としたときのＦＧＦ２＋条件下でのＶｅｒｓｉｃａｎ又はＴｇｆβ２の発現量を示している。
【図１２】参考例１におけるＰＲＰ＋（５％、１０％及び２０％）、並びに、ＰＲＰ−（０％）条件下で培養した間葉系細胞及び上皮系細胞の培養３日目での自己凝集の様子を示す顕微鏡像である。スケールバーは１００μｍを表す。
【図１３】参考例１におけるＰＲＰ＋（５％）又はＰＲＰ−（０％）条件下で培養した間葉系細胞及び上皮系細胞の培養３日目でのＶｅｒｓｉｃａｎの相対的な発現量を示すグラフである。グラフにおいて、ＰＲＰ−条件下でのＶｅｒｓｉｃａｎの発現量を１としたときの各条件下でのＶｅｒｓｉｃａｎの発現量を示している。
【図１４】実施例３におけるＦＧＦ２＋（１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ及び４０ｎｇ／ｍＬ）条件下で培養した間葉系細胞及び上皮系細胞の培養３日目でのＶｅｒｓｉｃａｎの相対的な発現量を示すグラフである。グラフにおいて、ＦＧＦ２＋（１ｎｇ／ｍＬ）条件下でのＶｅｒｓｉｃａｎ（Ｖｃａｎ）の発現量を１としたときの各条件下でのＶｅｒｓｉｃａｎ（Ｖｃａｎ）の発現量を示している。
【図１５】実施例３におけるＦＧＦ２＋（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ２−／ＰＲＰｒ＋及びＦＧＦ２−／ＰＲＰｒ−条件下で培養した間葉系細胞及び上皮系細胞の培養３日目でのＶｅｒｓｉｃａｎの相対的な発現量を示すグラフである。グラフにおいて、ＦＧＦ２−／ＰＲＰｒ−条件下でのＶｅｒｓｉｃａｎ（Ｖｃａｎ）の発現量を１としたときの各条件下でのＶｅｒｓｉｃａｎ（Ｖｃａｎ）の発現量を示している。
【図１６】実施例４におけるＦＧＦ２＋（１０ｎｇ／ｍＬ及び４０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ２−／ＰＲＰｒ＋、並びに、ＦＧＦ２−／ＰＲＰｒ−条件下で培養した間葉系細胞及び上皮系細胞の培養３日目での自己凝集の様子を示す顕微鏡像である。スケールバーは１００μｍを表す。上の画像は明視野での画像であり、下の画像は暗視野での画像である。
【図１７】実施例４におけるＦＧＦ２＋（１０ｎｇ／ｍＬ及び４０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ２−／ＰＲＰｒ＋、並びに、ＦＧＦ２−／ＰＲＰｒ−条件下で培養した間葉系細胞及び上皮系細胞の培養３日目でのＶｅｒｓｉｃａｎの相対的な発現量を示すグラフである。グラフにおいて、ＦＧＦ２−／ＰＲＰｒ−条件下でのＶｅｒｓｉｃａｎの発現量を１としたときの各条件下でのＶｅｒｓｉｃａｎの発現量を示している。
【図１８】実施例５におけるＦＧＦ２＋（１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬ）条件下で培養した間葉系細胞及び上皮系細胞の培養３日目でのＶｅｒｓｉｃａｎ及びＷｎｔ１０ｂの相対的な発現量を示すグラフである。
【図１９】試験例２における実施例５で得られたＦＧＦ２＋（１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬ）又はＦＧＦ２−（０ｎｇ／ｍＬ）条件下で形成された毛包原基の移植から３週間後のヌードマウスの移植部の様子を示す顕微鏡像である。
【図２０Ａ】実施例６におけるＦＧＦ２−（０ｎｇ／ｍＬ）又はＦＧＦ２＋（１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬ）条件下で培養した間葉系細胞及び上皮系細胞の培養３日目でのＷｎｔ１０ｂの相対的な発現量を示すグラフである。
【図２０Ｂ】実施例６におけるＰＤＧＦ−（０ｎｇ／ｍＬ）又はＰＤＧＦ＋（１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬ）条件下で培養した間葉系細胞及び上皮系細胞の培養３日目でのＶｅｒｓｉｃａｎの相対的な発現量を示すグラフである。
【図２０Ｃ】実施例６におけるＰＤＧＦ−（０ｎｇ／ｍＬ）又はＰＤＧＦ＋（１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬ）条件下で培養した間葉系細胞及び上皮系細胞の培養３日目でのＷｎｔ１０ｂの相対的な発現量を示すグラフである。
【図２０Ｄ】実施例６におけるＶＥＧＦ（０ｎｇ／ｍＬ）又はＶＥＧＦ（１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬ）条件下で培養した間葉系細胞及び上皮系細胞の培養３日目でのＶｅｒｓｉｃａｎの相対的な発現量を示すグラフである。
【図２０Ｅ】実施例６におけるＶＥＧＦ（０ｎｇ／ｍＬ）又はＶＥＧＦ（１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬ）条件下で培養した間葉系細胞及び上皮系細胞の培養３日目でのＷｎｔ１０ｂの相対的な発現量を示すグラフである。
【図２１】試験例３における実施例７で得られたＦＧＦ２＋（１０ｎｇ／ｍＬ）条件下で形成された毛包原基の移植から１８日目のヌードマウスの移植部の様子を示す顕微鏡像である。
【図２２】試験例４における実施例８で得られたＦＧＦ２＋（１０ｎｇ／ｍＬ）条件下で形成された毛包原基の移植から１４日目のヌードマウスの移植部の様子を示す顕微鏡像である。
【図２３Ａ】試験例５における実施例９で得られたＦＧＦ２＋（１００ｎｇ／ｍＬ）条件下で形成された毛包原基の移植から１６日目のヌードマウスの移植部の様子を示す顕微鏡像である。
【図２３Ｂ】試験例５における実施例９で得られたＦＧＦ２＋（１００ｎｇ／ｍＬ）条件下で形成された毛包原基の移植から５０日後のヌードマウスの移植部の様子を示す顕微鏡像である。
【図２３Ｃ】試験例５における再生毛髪の表面構造を示す電子顕微鏡像である。
【図２３Ｄ】試験例５における移植部での毛周期を示す顕微鏡像である。
【図２４】試験例６における実施例１０で得られたＦＧＦ２＋（１００ｎｇ／ｍＬ）条件下で形成された毛包原基の移植から３０日目のヌードマウスの移植部の様子を示す顕微鏡像である。スケールバーは１００μｍである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
≪複数の再生毛包原基の製造方法≫
本発明の一実施形態に係る複数の再生毛包原基の製造方法は、規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を同時に播種し、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ＦＧＦ）を含む培地を用いて、前記マイクロ凹版の少なくとも上面及び底面から前記間葉系細胞及び上皮系細胞に対して酸素を供給しながら共培養することにより、前記微小凹部内に毛包原基を形成させる工程である。また、前記マイクロ凹版は、規則的な配置の微小凹部からなり、且つ、酸素透過性を有する材質からなる。
【００１６】
本実施形態の製造方法によれば、規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版を用いることで、哺乳動物の毛包組織と類似し、規則的且つ高密度で毛包原基を再生することができる。また、培養時に間葉系細胞及び上皮系細胞は、三次元の細胞集合体内で相互接触してシグナル伝達を行っているため、培養時にＦＧＦを含む培地を用いることで、ＦＧＦは、直接的に、間葉系細胞を介して間接的に、又はそれら両方の経路で上皮系細胞に作用し、毛包原基における毛髪再生能を増強すると推察される。そのため、形成された毛包原基において、優れた毛髪再生効率を達成することができる。
【００１７】
本明細書において、「間葉系細胞」とは、間葉組織由来の細胞又はその細胞を培養して得られる細胞を意味する。例えば、毛乳頭細胞、真皮毛根鞘細胞、発生期の皮膚間葉系細胞、万能細胞（例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞等）から誘導された毛包間葉系細胞等が挙げられる。
本明細書において、「上皮系細胞」とは、上皮組織由来の細胞及びその細胞を培養して得られる細胞を意味する。例えば、バルジ領域の外毛根鞘最外層細胞、毛母基部の上皮系細胞、万能細胞（例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞等）から誘導された毛包上皮系細胞等が挙げられる。
上述の間葉系細胞及び上述の上皮系細胞の由来としては、動物であればよく、脊椎動物であることが好ましく、哺乳動物であることがより好ましい。
哺乳動物しては、例えば、ヒト、チンパンジー及びその他の霊長類；イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ラット（ヌードラットも包含する）、マウス（ヌードマウス及びスキッドマウスも包含する）、モルモット等の家畜動物、愛玩動物及び実験用動物等が挙げられ、これらに限定されない。
中でも、細胞の由来としては、ヒトであることが特に好ましい。
【００１８】
本明細書において、「毛包原基」とは、毛包のもととなる組織を意味し、主に、上述の間葉系細胞及び上述の上皮系細胞から構成されている。毛包原基が形成される流れとしては、まず、上皮系細胞が肥厚し、間葉系細胞側に陥入することで、間葉系細胞の細胞集塊（スフェロイド）を包み込む。続いて、間葉系細胞のスフェロイドを包み込んだ上皮性細胞は毛母原基を形成し、間葉系細胞のスフェロイドは毛誘導能を持つ毛乳頭を形成することで、毛母原基及び毛乳頭等からなる毛包原基を形成する。この毛包原基では、毛乳頭が毛母原基に増殖因子を提供しており、毛母原基の分化を誘導し、分化した細胞は毛を形成することができる。
本明細書において、「毛包」とは、表皮が内側に筒状に入り込んだ部分であって、毛を産生する皮膚の付属器官を意味する。
本明細書において、「再生毛包原基」とは、例えば、本実施形態の製造方法等により作製された毛包原基を意味する。
本明細書において、「複数の再生毛包原基」とは、上述の再生毛包原基が複数集まった状態のものを意味する。本実施形態の製造方法では、簡便に、複数の上述の毛包原基が哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で規則的に整列した複数の再生毛包原基を得ることができる。また、複数の再生毛包原基はそれぞれの毛包原基が分化し、毛包を形成していてもよい。
【００１９】
従来では、間葉系細胞のスフェロイドを高密度で規則的な配列で培養した後に、上皮系細胞を後から播種し、間葉系細胞のスフェロイドの周囲を覆わせる方法によって、高密度で規則的な配列の複数の再生毛包原基を得ていた。
これに対し、本実施形態の製造方法では、間葉系細胞及び上皮系細胞を同時に播種し、マイクロ凹版内で、ＦＧＦを含む培地を用いて、当該マイクロ凹版の少なくとも上面及び底面から酸素を供給しながら共培養することにより、簡便に、複数の毛包原基が哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で規則的に整列しており、優れた毛髪再生効率を有する複数の再生毛包原基を得ることができる。
【００２０】
本明細書において、「規則的」とは、等間隔で毛包原基が配置されている状態を表しており、哺乳動物の皮膚における毛穴と毛穴との間隔と同程度であればよい。また、哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度とは、特に、哺乳動物がヒトを含む霊長類である場合、具体的には、２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下であることが好ましく、５０個／ｃｍ２以上２５０個／ｃｍ２以下であることがより好ましく、１００個／ｃｍ２以上２００個／ｃｍ２以下であることがさらに好ましい。密度が上記範囲であることにより、正常な毛包組織の配置をより正確に再現した毛包組織を再生することができる。
【００２１】
図１は、本発明に係る複数の再生毛包原基の製造方法の一例を示す概略工程図である。図１を参照しながら、本実施形態の製造方法を構成する工程について、以下に詳細を説明する。
【００２２】
［毛包原基形成工程］
本実施形態の製造方法における毛包原基形成工程は、間葉系細胞及び上皮系細胞から毛包原基を微小凹部内に形成させる工程である。具体的には、まず、間葉系細胞１及び上皮系細胞２を含む細胞混合懸濁液を調製する。このとき、間葉系細胞１及び上皮系細胞２の混合比は、間葉系細胞：上皮系細胞＝１：２〜２：１であることが好ましく、１：１．５〜１．５：１であることがより好ましく、１：１であることがさらに好ましい。
【００２３】
次いで、調製した細胞混合懸濁液をマイクロ凹版４の微小凹部内に注入する。播種する細胞数はマイクロ凹版４の微小凹部５の大きさに応じて適宜調整すればよい。このとき、播種する細胞が多いほど、毛包原基の形成効率が高く、毛包原基の大きさも大きくなる。
【００２４】
次いで、ＦＧＦを含む培地８ａを用いて、酸素を供給しながら共培養する。培養時間は、１日以上５日以下（好ましくは、３日）とすることができ、培養温度は２５℃以上４０℃未満（好ましくは、３７℃）とすることができる。
【００２５】
酸素を供給しながら培養する方法としては、マイクロ凹版に酸素を直接吹きかける等して供給しながら培養する方法や、酸素透過性を有する材質からなるマイクロ凹版を用いて培養する方法等が挙げられる。中でも、マイクロ凹版の全面から細胞に対して酸素を供給でき、得られた毛包原基が優れた毛髪再生効率を達成できることから、酸素透過性を有する材質からなるマイクロ凹版を用いて培養する方法が好ましい。
【００２６】
本実施形態の製造方法において、毛包原基が形成される流れとしては、まず、上皮系細胞２が肥厚し、間葉系細胞１側に陥入することで、間葉系細胞１のスフェロイドを包み込む。続いて、間葉系細胞１のスフェロイドを包み込んだ上皮性細胞２は毛母原基を形成し、間葉系細胞１のスフェロイドは毛誘導能を持つ毛乳頭を形成する。これにより、毛母原基及び毛乳頭等からなる毛包原基６が形成される。この毛包原基６では、毛乳頭が毛母原基に増殖因子を提供しており、毛母原基の分化を誘導し、分化した細胞は毛を形成することができる。さらに、本実施形態の製造方法において、毛包原基が分化し、毛包を形成していてもよい。
【００２７】
毛包原基形成工程において、さらに、血管を構築しうる細胞を間葉系細胞及び上皮系細胞と同時に播種してもよい。
この場合、毛包原基形成工程は、マイクロ凹版に、間葉系細胞、上皮系細胞及び血管を構築しうる細胞を含む細胞混合懸濁液を播種し、ＦＧＦを含む培地を用いて、マイクロ凹版の少なくとも上面及び底面から酸素を供給しながら共培養することにより、微小凹部内に毛包原基を形成させる工程である。
【００２８】
細胞混合懸濁液が、さらに、血管を構築しうる細胞を含むことで、内部に毛細血管構造を有する複数の再生毛包原基が得られる。得られた複数の再生毛包原基において、毛細血管構造を有することで、各毛包原基内部に栄養成分等を充分に供給することができ、毛髪再生効率をより向上させることができる。さらに、得られた複数の再生毛包原基を移植に用いた場合において、毛包原基内部の毛細血管構造と移植体の血管とが連通し、栄養成分を得ることにより、移植部において、高い毛包誘導能を発揮することができる。
【００２９】
なお、本明細書において、「血管を構築し得る細胞」とは、血管を構築することができる細胞を意味する。例えば、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞等が挙げられ、これらの細胞を１種単独、又は、２種以上を組み合わせて含有していてもよい。
中でも、血管を構築し得る細胞としては、血管内皮細胞であることが好ましい。
血管を構築しうる細胞の由来としては、上述の間葉系細胞及び上述の上皮系細胞の由来として例示したものと同様のものが挙げられる。
【００３０】
図２は、本発明に係る複数の再生毛包原基の製造方法の一例を示す概略工程図である。図２を参照しながら、本実施形態の製造方法を構成する工程について、以下に詳細を説明する。
【００３１】
血管を構築し得る細胞を用いる場合、毛包原基形成工程において、まず、間葉系細胞１、上皮系細胞２及び血管を構築し得る細胞３を含む細胞混合懸濁液を調製する。このとき、間葉系細胞１、上皮系細胞２及び血管を構築し得る細胞３の混合比は、間葉系細胞：上皮系細胞：血管を構築し得る細胞＝２：２：１〜８：８：１であることが好ましく、４：４：１であることが特に好ましい。
【００３２】
細胞混合懸濁液が間葉系細胞１、上皮系細胞２及び血管を構築し得る細胞３を含む場合での、毛包原基が形成される流れとしては以下に示すとおりである。
まず、上皮系細胞２が肥厚し、間葉系細胞１側に陥入することで、間葉系細胞１及び血管を構築し得る細胞３のスフェロイドを包み込み、上皮系細胞２、間葉系細胞１及び血管を構築し得る細胞３からなる混合スフェロイド６ａが形成される。続いて、混合スフェロイド６ａ内に置いて、上皮性細胞２は毛母原基を形成し、間葉系細胞１及び血管を構築し得る細胞３のスフェロイドは毛誘導能を持つ毛乳頭を形成する。これにより、毛母原基及び毛乳頭等からなる毛包原基６ｂが形成される。この毛包原基６ｂでは、毛乳頭が毛母原基６ｂに増殖因子を提供しており、毛母原基６ｂの分化を誘導し、分化した細胞は毛を形成することができる。また、このとき、毛包原基６ｂの間葉系細胞側、すなわち毛乳頭の内部では、血管を構築し得る細胞３が毛細血管構造７を構築している。さらに、本実施形態の製造方法において、毛包原基６ｂが分化し、毛包を形成していてもよい。
【００３３】
（マイクロ凹版）
毛包原基を形成させる際に使用するマイクロ凹版４は、複数の微小凹部５が規則的に配置されているものが好ましい。マイクロ凹版４は、市販のものを用いてもよいし、後述の実施例１に記載の方法等で作製してもよい。また、マイクロ凹版４における微小凹部５の密度は、２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下であることが好ましく、５０個／ｃｍ２以上２５０個／ｃｍ２以下であることがより好ましく、１００個／ｃｍ２以上２００個／ｃｍ２以下であることがさらに好ましい。密度が上記範囲であることにより、哺乳動物の毛穴（特に、ヒトを含む霊長類の毛穴）の密度と同程度の密度で毛包原基が配置された状態で培養することができる。後述するとおり、この規則的な配置且つ高密度の毛包原基をそのままの配置を保ちながら、被験動物の毛包欠損部に移植することで、正常な毛包組織の配置をより正確に再現した毛包組織を再生することができる。また、複数の再生毛包原基の上記密度は、移植に用いた場合における治療的に有効量であると考えられる。
【００３４】
また、微小凹部の開口形状について、特別な限定はない。例えば、円形状、四角状、六角状、ライン状等であってもよく、中でも、毛穴に近い形状であるという観点から、円形状であることが好ましい。
微小凹部の開口部の直径及び深さについて、間葉系細胞及び上皮系細胞を含む混合細胞集塊（以下、「混合スフェロイド」とも呼ぶ。）を収容し培養できる大きさであれば特別な限定はないが、直径については、哺乳動物の毛穴と同程度の大きさであってよく、例えば、２０μｍ以上１ｍｍ以下であってよい。また、深さについては、毛包組織含有シートの移植後の被験動物の皮膚への定着の観点から、１ｍｍ以下であってよい。
得られる毛包原基の配置及び大きさは、マイクロ凹版の微小凹部の開口形状、直径及び深さ等に依存するため、被験動物の種類、移植する部位等に合わせて、適宜マイクロ凹版の微小凹部を調製すればよい。
【００３５】
マイクロ凹版の材質は、細胞培養に適したものであればよく、特別な限定はない。例えば、透明なガラス、ポリマー材等が挙げられる。中でも、酸素透過性を有するポリマー材が好ましい。酸素透過性を有するポリマー材として具体的には、例えば、フッ素樹脂、シリコンゴム（例えば、ポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）：ＰＤＭＳ）等）等が挙げられる。これらの材質を単独で使用してもよいし、組み合わせて使用してもよい。
【００３６】
本明細書において、「酸素透過性」とは、分子状の酸素を透過し、マイクロ凹版の微小凹部内まで到達させる性質を表している。具体的な酸素透過率としては、約１００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以上５０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以下であってよく、約１１００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以上３０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以下であってよく、約１２５０ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以上２７５０ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以下であってよい。なお、「２４ｈ」は２４時間を意味し、「ａｔｍ」とは、気圧をの単位を意味する。すなわち、上記単位「ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ」は、１気圧の環境下において、２４時間で透過する酸素の１ｍ２あたりの容量（ｃｍ３）を表している。酸素透過率が上記範囲である材質からなるマイクロ凹版を使用することにより、十分な量の酸素を混合スフェロイドに供給でき、毛包原基を形成することができる。
【００３７】
（培地）
・ＦＧＦ
本実施形態の製造方法で用いられる培地は、ＦＧＦを含むものである。
また、培地に含まれるＦＧＦは、ＦＧＦのみからなるものであってもよく、又は、ＦＧＦを主成分とした混合物であってもよい。
ＦＧＦとして具体的には、例えば、ＦＧＦ１（酸性ＦＧＦ、ａＦＧＦ）、ＦＧＦ３、ＦＧＦ２（塩基性ＦＧＦ、ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０等が挙げられる。培地は、これらのＦＧＦを１種含んでもよく、２種以上組み合わせて含んでいてもよい。
中でも、ＦＧＦとしては、ＦＧＦ２（塩基性ＦＧＦ、ｂＦＧＦ）であることが好ましい。
ＦＧＦがＦＧＦを主成分とした混合物である場合、具体的には、例えば、多血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｒｉｃｈ  Ｐｌａｓｍａ；ＰＲＰ）等が挙げられる。
なお、本明細書において、「多血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｒｉｃｈ  Ｐｌａｓｍａ；ＰＲＰ）」とは、その一般的な意味において用いられる広い範囲の用語であり、末梢血よりも高い濃度の血小板が血漿に再懸濁されたものである。典型的には、５０万個／ｍｍ３以上１２０万個／ｍｍ３以下の血小板を含む。
【００３８】
また、一般に、「血小板」は、止血機序に関与し、いくつかの血液凝集因子を分泌する。血小板はまた、創傷治療に関与するいくつかのサイトカインも分泌する。このサイトカインは、血小板の分泌顆粒のうちα顆粒から放出される成長因子群である。サイトカインとしては、ＦＧＦ（特に、ＦＧＦ２）が主成分として挙げられるが、その他に具体的には、例えば、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ、ＰＦ−４／β−ＴＧ等が挙げられる。
ここで、「ＰＤＧＦ」とは血小板由来増殖因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ)のことであり、血管新生、すなわち既に存在する微少血管から新たな血管を形成する作用を有する。
「ＴＧＦ−β」とは、形質転換成長因子β (Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃ ｏｒ  β)を意味する。
「ＶＥＧＦ」とは、血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を意味する。
「ＰＦ−４／β−ＴＧ」とは、血小板第４因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｆａｃｔｏｒ−４）／β−トロンボグロブリン（β−ｔｈｒｏｍｂｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）を意味し、ともに血小板の活性化に伴い循環血中に放出されるものである。
ＰＲＰは、ＦＧＦを含む各種成長因子を分泌することから、ＰＲＰを含む培地を用いて毛包原基を培養することで、これらの成長因子が毛包原基に作用し、優れた毛髪再生効率を達成することができる。
【００３９】
また、ＰＲＰは後述の実施例に示す方法を用いることで、調製することができる。本実施形態において、培地に含まれるＰＲＰは、活性化状態のＰＲＰ（ＰＲＰ−ｒｅｌｅａｓａｔｅ；ＰＲＰｒ）であることが好ましい。ＰＲＰは、カルシウムイオンを含む溶液と接触させることでＰＲＰｒとすることができる。
【００４０】
培地中のＦＧＦの含有量としては、０．１ｎｇ／ｍＬ以上５００ｎｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１ｎｇ／ｍＬ以上２００ｎｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、１ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であることが特に好ましい。培地中のＦＧＦの含有量が上記範囲であることにより、得られる毛包原基はより優れた毛髪再生効率を達成することができる。特に、治療を必要とする患者から採取された間葉系細胞及び上皮系細胞を用いて、自家移植するための毛包原基を製造する場合には、１０ｎｇ／ｍＬ以上２００ｎｇ／ｍＬ以下程度の高濃度のＦＧＦ含有量とすることで、移植部において、優れた毛髪再生効率を達成することができる。
【００４１】
また、培地に含まれるＦＧＦを主成分とした混合物がＰＲＰｒである場合、培地中のＰＲＰｒの含有量は、ＰＲＰｒ中のＦＧＦ等の含有成分の量により、適宜調整することができる。なお、一般的に、ＰＲＰｒ中にＦＧＦは２５０ｎｇ／ｍＬ程度含まれる。培地中のＰＲＰｒの含有量としてより具体的には、例えば１質量％以上１５質量％以下であってもよく、３質量％以上１０質量％以下であってもよく、４．５質量％以上６．５質量％以下であってもよい。培地中のＰＲＰｒの含有量が上記範囲であることにより、ＦＧＦの含有量を上記範囲とすることができ、得られる毛包原基はより優れた毛髪再生効率を達成することができる。
【００４２】
・培地
本実施形態の製造方法において用いられる培地は、特別な限定はなく、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基本培地であればよい。
【００４３】
培地に含まれる無機塩は、細胞の浸透圧平衡の維持を助けるために、および膜電位の調節を助けるためのものである。
無機塩としては、特別な限定はなく、例えば、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛等の塩が挙げられる。塩は、通常、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、及び重炭酸塩の形で用いられる。
【００４４】
一般的に、培地の重量オスモル濃度は、例えば２００ｍＯｓｍ／ｋｇ以上４００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下であればよく、例えば２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下であればよく、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３００ｍＯｓｍ／ｋｇ未満（具体的には、２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ）であればよい。
【００４５】
炭水化物としては、特別な限定はなく、例えば、グルコース、ガラクトース、マルトース、フルクトース等が挙げられる。
一般的に、培地中の炭水化物（好ましくは、Ｄ−グルコース）の濃度としては、０．５ｇ／Ｌ以上２ｇ／Ｌであることが好ましい。
【００４６】
アミノ酸としては、特別な限定はなく、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、及びその組み合わせ等が挙げられる。
一般的に、培地に含まれるグルタミンの濃度は０．０５ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下（通常、０．１ｇ／Ｌ以上０．７５ｇ／Ｌ以下)である。培地に含まれるグルタミン以外の各アミノ酸は、０．００１ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ(通常、０．０１ｇ／Ｌ以上０．１５ｇ／Ｌ以下)である。アミノ酸は合成由来でもよい。
【００４７】
ビタミンとしては、特別な限定はなく、例えば、チアミン（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ナイアシンアミド（ビタミンＢ３）、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム、（ビタミンＢ５）、ピリドキサール／ピリドキサミン／ピリドキシン（ビタミンＢ６）、葉酸（ビタミンＢ９）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、カルシフェロール（ビタミンＤ２）、ＤＬ−αトコフェロール（ビタミンＥ）、ビオチン（ビタミンＨ）、メナジオン（ビタミンＫ）、塩化コリン、ｍｙｏ−イノシトール、等が挙げられる。
【００４８】
培地は、さらに抗生物質、血清、成長因子、又はホルモンを含んでいてもよい。
【００４９】
抗生物質としては、例えば、ゲンタマイシン、アンフォテリシン、アンピシリン、ミノマイシン、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタシン、タイロシン、オーレオマイシン等、通常の動物細胞の培養に用いられるものが挙げられる。これらの抗生物質を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
一般的に、培地に含まれる抗生物質の濃度は、特別な限定はなく、例えば０．１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下であればよい。
【００５０】
血清としては、例えば、ＦＢＳ／ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ／Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）、ＮＣＳ（Ｎｅｗｂｏｒｎ  Ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）、ＣＳ（Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）、ＨＳ（Ｈｏｒｓｅ  Ｓｅｒｕｍ）等が挙げられ、これらに限定されない。
一般的に、培地に含まれる血清の濃度は、例えば２質量％以上１０質量％以下であればよい。
【００５１】
成長因子として上述のＦＧＦ以外のものを含んでいてもよく、具体的には、例えば、細胞増殖因子、細胞接着因子等が挙げられ、これらに限定されない。
成長因子としてより具体的には、例えば、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）、インスリン様成長因子−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１；ＩＧＦ−１）、マクロファージ由来成長因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＭＤＧＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）等が挙げられる。これらの成長因子を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
一般的に、培地に含まれる成長因子の濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であればよい。
【００５２】
ホルモンとしては、例えば、インスリン、グルカゴン、トリヨードチロニン、副腎皮質ホルモン（ハイドロコーチゾン等）等が挙げられる。これらのホルモンを単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
一般的に、培地に含まれるホルモンの濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下であればよい。
【００５３】
また、成長因子及びホルモンを含む培地添加剤として、ウシ脳下垂体抽出物（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ；ＢＰＥ）を用いてもよい。
【００５４】
中でも、本実施形態の製造方法で用いられる培地としては、間葉系細胞増殖用培地及び上皮系細胞増殖用培地を混合したものであることが好ましい。
間葉系細胞増殖用培地及び上皮系細胞増殖用培地の混合比としては、容量比で、間葉系細胞増殖用培地：上皮系細胞増殖用培地＝１：２〜２：１であることが好ましく、１：１．５〜１．５〜１であることがより好ましく、１：１であることがさらに好ましい。
【００５５】
間葉系細胞増殖用培地としては、任意の抗生物質及び任意の血清、並びに、必要に応じて、任意の成長因子及び任意のホルモンを添加した公知の基本培地を用いればよい。
公知の基本培地（任意の抗生物質及び任意の血清、並びに、必要に応じて、任意の成長因子及び任意のホルモン等は不含）として具体的には、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、ＤＭＥＭ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ（Ｇ−ＭＥＭ）等が挙げられる。
また、任意の抗生物質及び任意の血清、並びに、必要に応じて、任意の成長因子及び任意のホルモンを含む公知の基本培地として具体的には、例えば、毛乳頭細胞増殖培地（Ｆｏｌｌｉｃｌｅ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｐａｐｉｌｌａ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＰＣＧＭ）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）等が挙げられる。
【００５６】
上皮系細胞増殖用培地としては、塩化カルシウムを含み、無血清であって、上皮成長因子、並びに、必要に応じて任意の抗生物質及び任意のホルモンを添加した公知の上皮系細胞用基本培地を用いればよい。
上皮系細胞用基本培地（上皮成長因子、並びに、必要に応じて任意の抗生物質及び任意のホルモン不含）としてより具体的には、例えば、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２（クラボウ社製）、角化細胞基本培地２（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）、ＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）等が挙げられる。
また、上皮成長因子、任意の抗生物質、及び任意のホルモンを含む上皮系細胞増殖用培地としては、例えば、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボウ社製）、角化細胞増殖培地２（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）等が挙げられる。
【００５７】
本実施形態の製造方法において、細胞混合懸濁液が間葉系細胞、上皮系細胞及び血管を構築し得る細胞を含む場合、培地としては、間葉系細胞増殖用培地、上皮系細胞増殖用培地及び血管内皮細胞増殖用培地を混合したものを用いることが好ましい。
間葉系細胞増殖用培地、上皮系細胞増殖用培地及び血管内皮細胞増殖用培地の混合比としては、容量比で、間葉系細胞増殖用培地：上皮系細胞増殖用培地：血管内皮細胞増殖用培地＝１：１：１であることが好ましい。
【００５８】
血管内皮細胞増殖用培地としては、血管内皮細胞増殖因子、並びに、必要に応じて任意の成長因子、任意の抗生物質、任意の血清、及び任意のホルモンを添加した公知の血管内皮細胞用基本培地を用いればよい。
血管内皮細胞用基本培地（血管内皮細胞増殖因子、並びに、必要に応じて任意の成長因子、任意の抗生物質、任意の血清、及び任意のホルモン不含）としてより具体的には、例えば、ＥＢＭ−２  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ社製）、内皮細胞基本培地（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）、内皮細胞基本培地２（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ２）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）等が挙げられる。
また、血管内皮細胞増殖因子、任意の成長因子、任意の抗生物質、任意の血清、及び任意のホルモンを含む血管内皮細胞増殖用培地としては、例えば、ＥＧＭ２（Ｌｏｎｚａ社製）、内皮細胞増殖培地（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）、内皮細胞増殖培地２（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）等が挙げられる。
【００５９】
≪毛包組織含有シートの製造方法≫
本発明の一実施形態に係る毛包組織含有シートの製造方法は、上述の複数の再生毛包原基の製造方法により得られた複数の再生毛包原基を、前記微小凹部内に保持された状態で、生体適合性ハイドロゲルに転写する工程を備える方法である。
【００６０】
本実施形態の製造方法によれば、簡便に、規則的且つ高密度の毛包組織含有シートを得ることができる。また、得られた毛包組織含有シート内の毛包組織は、優れた毛髪再生効率を有するものである。
【００６１】
図３は、本発明に係る毛包組織含有シートの製造方法の一例を示す概略工程図である。図３を参照しながら、本実施形態の製造方法を構成する工程について、以下に詳細を説明する。
【００６２】
［転写工程］
本実施形態の製造方法における転写工程は、マイクロ凹版の微小凹部内に形成された毛包原基を、微小凹部内に保持しながら、生体適合性ハイドロゲルに転写する工程である。
また、転写工程において用いられる毛包原基の形成方法については、上述の複数の再生毛包原基の製造方法に記載の方法と同様の方法が挙げられる。
【００６３】
転写工程として具体的には、まず、微小凹部５内の培地８ａを除去し、生体適合性ハイドロゲル９を含む溶液を添加して、生体適合性ハイドロゲル９をゲル化させる。溶液中の生体適合性ハイドロゲル９の濃度は、必要とするゲルの硬さに応じて、適宜調整することができる。また、ゲル化させるための時間についても、必要とするゲルの硬さに応じて、適宜調整することができる。ゲル化させる温度等の条件については、特別な限定はなく、例えば３７℃のＣ０２インキュベーター内で培養する方法等が挙げられる。
次いで、マイクロ凹版から毛包原基６を含むゲル化した生体適合性ハイドロゲル９を取り外すことで、毛包組織含有シート１０が得られる。
【００６４】
得られた毛包組織含有シート１０において、毛包原基６（又は毛包）が生体適合性ハイドロゲル９上に規則的且つ哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で配置されていることが好ましい。規則的とは、等間隔で毛包原基６が配置されている状態を表しており、哺乳動物の皮膚における毛穴と毛穴との間隔と同程度であればよい。また、哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度とは、特に、哺乳動物がヒトを含む霊長類である場合、具体的には、２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下であることが好ましく、５０個／ｃｍ２２５０個／ｃｍ２以下であることがより好ましく、１００個／ｃｍ２２００個／ｃｍ２以下であることがさらに好ましい。密度が上記範囲であることにより、正常な毛包組織の配置をより正確に再現した毛包組織を再生することができる。また、毛包組織含有シートにおける毛包原基の上記密度は、移植に用いた場合における治療的に有効量であると考えられる。
【００６５】
転写工程において、内部に毛細血管構造を有する毛包原基を用いてもよい。
この場合、転写工程は、内部に毛細血管構造を有する毛包原基を、生体適合性ハイドロゲルに転写する工程である。
【００６６】
内部に毛細血管構造を有する毛包原基を用いた場合、得られた毛包組織含有シートは各毛包原基の内部に毛細血管構造を有する。そのため、毛包組織含有シートを移植に用いた場合において、毛包原基内部の毛細血管構造と移植体の血管とが連通し、栄養成分を得ることにより、移植部において、高い毛包誘導能を発揮することができる。
【００６７】
図４は、本発明に係る毛包組織含有シートの製造方法の一例を示す概略工程図である。図４を参照しながら、本実施形態の製造方法を構成する工程について、以下に詳細を説明する。
【００６８】
内部に毛細血管構造を有する毛包原基を用いた場合での、転写工程の流れとしては以下に示すとおりである。
まず、微小凹部５内の培地８ｂを除去し、生体適合性ハイドロゲル９を含む溶液を添加して、生体適合性ハイドロゲル９をゲル化させる。溶液中の生体適合性ハイドロゲル９の濃度は、必要とするゲルの硬さに応じて、適宜調整することができる。また、ゲル化させるための時間についても、必要とするゲルの硬さに応じて、適宜調整することができる。ゲル化させる温度等の条件については、特別な限定はなく、例えば３７℃のＣ０２インキュベーター内で培養する方法等が挙げられる。
次いで、マイクロ凹版から毛包原基６ｂを含むゲル化した生体適合性ハイドロゲル９を取り外すことで、毛包組織含有シート１０が得られる。
【００６９】
得られた毛包組織含有シート１０において、毛包原基６ｂ（又は毛包）が生体適合性ハイドロゲル９上に規則的且つ哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で配置されていることが好ましい。規則的とは、等間隔で毛包原基６ｂが配置されている状態を表しており、哺乳動物の皮膚における毛穴と毛穴との間隔と同程度であればよい。また、哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度とは、上述に記載の密度と同様である。
【００７０】
（生体適合性ハイドロゲル）
本明細書において、「生体適合性ハイドロゲル」とは、生体への適合性を有するゲルであって、高分子が化学結合によって網目構造をとり、その網目に多量の水を保有した物質を意味する。より具体的には、天然物由来の高分子や合成高分子の人工素材に架橋を導入してゲル化させたものをいう。
【００７１】
天然物由来の高分子としては、ゲル化する細胞外マトリックス成分等が挙げられる。ゲル化する細胞外マトリックス成分としては、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型等）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン等を含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン等を例示することができる。その他天然物由来の高分子として、ゼラチン、寒天、アガロース等を使用することもできる。それぞれのゲル化に至適な塩等の成分、その濃度、ｐＨ等を選択しハイドロゲルを作製することが可能である。また、これらの天然物由来の高分子を単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００７２】
また、合成高分子としては、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ｐｏｌｙ（ＩＩ−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）／ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ等が挙げられる。また、これらの合成高分子を単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００７３】
中でも、生体適合性ハイドロゲルは、天然物由来の高分子であることが好ましく、ゲル化する細胞外マトリックス成分であることがより好ましく、コラーゲン（特に、Ｉ型コラーゲン）であることがさらに好ましい。コラーゲンを含有することにより、より皮膚に近しい組成となり、高い毛包再生効率を実現できる。
【００７４】
生体適合性ハイドロゲルを含む溶液は、Ｈａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ  Ｆ−１０又はＨａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ  Ｆ−１２等の無血清培地や、生体適合性ハイドロゲル再構成用の緩衝液（例えば、水酸化ナトリウム、炭酸水水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ−Ｂｕｆｆｅｒからなる緩衝液等）等を含んでいてもよい。
【００７５】
本実施形態の製造方法において、生体適合性ハイドロゲルをゲル化させる際に、ゲルの強度を補強するために、支持体を内包させてもよい。
支持体の材質としては、移植後に、毛包原基の上皮系細胞側の部分と被験動物側の上皮系細胞との連結を促進させることができるものであれば、特別な限定はない。支持体の材質として具体的には、例えば、ナイロン等のポリマーや合成又は天然の生体吸収可能なポリマーより作られた繊維、ステンレス等の金属繊維、炭素繊維、及びガラス繊維等の化学繊維、並びに天然の動物繊維（生体由来の毛髪等）や植物繊維等を挙げられる。支持体の材質としてより具体的には、例えば、ナイロン糸やステンレス線等を挙げられる。
支持体の直径及び長さは、再生対象となる部分により適宜設計することができる。直径は、例えば、５μｍ以上１００μｍ以下であってよく、２０μｍ以上５０μｍ以下であってよい。また、長さは、例えば、１ｍｍ以上１０ｍｍ以下であってよく、４ｍｍ以上６ｍｍ以下であってよい。
【００７６】
≪複数の再生毛包原基の移植方法≫
本発明の一実施形態に係る複数の再生毛包原基の移植方法は、上述の複数の再生毛包原基の製造方法により得られた複数の毛包原基を、前記微小凹部の規則的な配置を保ちながら、被験動物の毛包欠損部に移植する工程を備える方法である。
【００７７】
本実施形態の移植方法によれば、簡便に、規則的且つ高密度の毛包組織を再生することができる。また、本実施形態の移植方法において用いられる複数の再生毛包原基は、優れた毛髪再生効率を有するものである。さらに、本実施形態の移植方法において、内部に毛細血管構造を有する複数の再生毛包原基を用いる場合、移植後、毛包原基内部の毛細血管構造と被験動物（移植体）の血管とが連通し、栄養成分を得ることにより、移植部において、高い毛包誘導能を発揮することができる。
【００７８】
［移植工程］
毛包原基は、例えば、上述の微小凹部と同様の規則的な配置である複数のチップ、ニードル、又はノズルを有するマルチピペットを用いて吸引する。次いで、被験動物の毛包欠損部に規則的な配置のまま毛包原基を移植する。規則的な配置を保つことにより、正常な毛包組織の配置をより正確に再現した毛包組織を再生することができる。マルチピペットは手動のものでもよく、全自動のものでもよい。
なお、被験動物としては、ヒト又は非ヒト動物を含む各種哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。
【００７９】
本明細書において、「マルチピペット」とは、複数のチップ、ニードル又はノズルを先端に有し、上述の微小凹部と同様の規則的な配置でチップ、ニードル又はノズルが備えられており、毛髪原基を吸引及び排出できるものであれば、特別な限定はない。材質は、細胞に有害なものでなければ特別な限定はなく、また、マルチピペットに装着するチップ、ニードル又はノズルの先端の口径は、マイクロ凹版の微小凹部に差し込むことができる程度の大きさであれば、特別な限定はない。
【００８０】
また、移植深度としては、再生対象となる部位により適宜変更することができる。例えば０．０５ｍｍ以上５ｍｍ以下であってよく、例えば０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下であってよく、例えば０．３ｍｍ以上０．５ｍｍ以下であってよい。
また、移植する部位としては、被験動物の真皮層内に移植することが好ましく、毛包形成及びその後の毛髪再生効率が優れることから、真皮及び皮下組織の境界面より上方とすることがより好ましい。また、移植創上端部に毛包原基の上皮系細胞成分の上端部が露出するよう移植深度を調節すると、さらに被験動物の上皮系細胞との連続性を高めることができるため、好ましい。
【００８１】
≪毛包組織含有シートの移植方法≫
本実施形態の毛包組織含有シートは、当業者に公知の方法で対象となる部位に移植することができる。例えば、シャピロ式植毛術やチョイ式植毛器を用いた植毛、空気圧を利用したインプランター等を使用し、移植することができる。シャピロ式植毛術とは、移植部位をマイクロメス等で移植創を作った後に、ピンセットを用いて移植する方法である。
本実施形態の毛包組織含有シートの大きさは、被験動物の年齢、性別、症状、治療部位、治療時間等を勘案して適宜調節される。
【００８２】
また、移植深度及び移植部位としては、上述の複数の再生毛包原基の移植方法に記載のものと同様のものが挙げられる。
本実施形態の毛包組織含有シートにおいて、皮膚接合用のテープやバンド、縫合等により、毛包組織含有シートと移植対象部位とを固定してもよい。
【００８３】
本実施形態の毛包組織含有シートにおいて、上述の支持体を内包している場合は、再生毛包原基を移植後しばらくして、被験動物の上皮系細胞と毛包原基の上皮系細胞由来の側との連続性が確保された後、移植部位より抜くことができる。移植後の状態により適宜設定することができるが、例えば、移植後３日以上７日以下で移植部位から抜くことが好ましい。又は、支持体が、自然と移植部位より抜けるまで放置することもできる。生体吸収性の材料の支持体は、自然と移植部位より抜けるか、分解又は吸収されるまで放置することができる。
【００８４】
また、本実施形態の毛包組織含有シートにおいて、上述の支持体を内包している場合は、毛包原基の上皮系細胞由来の細胞が、支持体に沿って伸長する。これにより、移植後の被験動物側の上皮系細胞と毛包原基の上皮系細胞側との連続性を向上させることができる。特に、支持体が移植部位の表皮より外に維持される場合には、被験動物側の上皮系細胞が、異物を排除するように、支持体に沿って移植部位の内側へ伸長するため、連続性をさらに向上させることができる。さらに、意図した方向へ毛包形成を促すことができる。その結果、毛包原基からの毛髪再生効率を向上させることができるとともに、発毛方向の制御も可能となる。
【００８５】
≪毛包組織の再生治療方法≫
一実施形態において、本発明は、治療的に有効量の上述の製造方法により得られた複数の再生毛包原基を含む毛包再生治療剤を提供する。
また、一実施形態において、本発明は、治療的に有効量の上述の製造方法により得られた毛包組織含有シートを含む毛包再生治療剤を提供する。
また、一実施形態において、本発明は、前記毛包再生治療剤を含む、医薬組成物を提供する。
また、一実施形態において、本発明は、前記毛包再生治療剤を含む、医薬組成物を製造するための上述の製造方法により得られた複数の再生毛包原基の使用を提供する。
また、一実施形態において、本発明は、前記毛包再生治療剤を含む、医薬組成物を製造するための上述の製造方法により得られた毛包組織含有シートの使用を提供する。
また、一実施形態において、本発明は、上述の製造方法により得られた複数の再生毛包原基の有効量を、治療を必要とする患者に移植することを含む、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療方法を提供する。
また、一実施形態において、本発明は、上述の製造方法により得られた毛包組織含有シートの有効量を、治療を必要とする患者に移植することを含む、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療方法を提供する。
【００８６】
本実施形態の毛包組織の再生治療方法において、移植対象となる組織としては、毛包を再生し、さらに毛髪を再生したい体表皮であれば、特別な限定はなく、例えば、頭皮等が挙げられる。
また、適用可能な疾患としては、脱毛を伴う任意の疾患であって、例えば男性型脱毛症（Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｏｐｅｃｉａ：ＡＧＡ）、女子男性型脱毛症（Ｆｅｍａｌｅ  Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｏｐｅｃｉａ：ＦＡＧＡ）、分娩後脱毛症、びまん性脱毛症、脂漏性脱毛症、粃糠性脱毛症、牽引性脱毛症、代謝異常性脱毛症、圧迫性脱毛症、円形脱毛症、神経性脱毛症、抜毛症、全身性脱毛症、症候性脱毛症等が挙げられ、これらに限定されない。
【００８７】
治療対象としては、特別な限定はなく、哺乳動物が好ましい、哺乳動物としては、例えば、霊長類（例えばヒト、サル、チンパンジー等）、げっ歯類（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター等）、有蹄類（例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等）、及び愛玩動物（例えばイヌ、ネコ、ウサギ等）が挙げられ、中でも、ヒトが好ましい。
【００８８】
≪毛髪再生用キット≫
本発明の一実施形態に係る毛髪再生用キットは、マイクロ凹版と、ＦＧＦと、を備える。また、前記マイクロ凹版は、規則的な配置の微小凹部を備え、且つ、酸素透過性を有する材質からなる。
【００８９】
本実施形態の毛髪再生用キットによれば、規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版を用いることで、哺乳動物の毛包組織と類似し、規則的且つ高密度で毛包原基を再生することができる。また、培養時にＦＧＦを含む培地を用いることで、形成された毛包原基において、優れた毛髪再生効率を達成することができる。
【００９０】
本実施形態の毛髪再生用キットが備えるマイクロ凹版及びＦＧＦとしては、上述の複数の再生毛包原基の製造方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００９１】
本実施形態の毛髪再生用キットは、さらに、培地を備えていてもよい。
前記培地としては、上述の複数の再生毛包原基の製造方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。
中でも、本実施形態の毛髪再生用キットが備える培地としては、間葉系細胞増殖用培地、上皮系細胞増殖用培地及び血管内皮系細胞増殖用培地からなる群から選択される１種類以上であることが好ましい。
本実施形態の毛髪再生用キットを用いて複数の再生毛包原基の製造するために、間葉系細胞及び上皮系細胞のみを用いる場合は、間葉系細胞増殖用培地及び上皮系細胞増殖用培地であることが好ましい。
本実施形態の毛髪再生用キットを用いて複数の再生毛包原基の製造するために、間葉系細胞、上皮系細胞及び血管を構築し得る細胞を用いる場合は、間葉系細胞増殖用培地、上皮系細胞増殖用培地及び血管内皮系細胞増殖用培地であることが好ましい。
前記間葉系細胞増殖用培地、前記上皮系細胞増殖用培地及び前記血管内皮系細胞増殖用培地としては、上述の複数の再生毛包原基の製造方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００９２】
本実施形態の毛髪再生用キットは、さらに、生体適合性ハイドロゲルを備えていてもよい。該生体適合性ハイドロゲルを備えることで、毛包組織含有シートを製造することができる。
前記生体適合性ハイドロゲルとしては、上述の毛包組織含有シートの製造方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００９３】
本実施形態の毛髪再生用キットは、さらに、得られた複数の再生毛包原基又は毛包組織含有シートを移植するために使用する器具等を備えていてもよい。
前記器具として具体的には、例えば、ピンセット、マルチピペット等が挙げられ、これらに限定されない。
本実施形態の毛髪再生用キットは、さらに、支持体を備えていてもよい。
支持体としては、上述の毛包組織含有シートの製造方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００９４】
≪発毛促進又は抑制物質をスクリーニングする方法≫
本発明の一実施形態に係る発毛促進又は抑制物質をスクリーニングする方法は、以下の工程１〜３を備える方法である。
工程１：間葉系細胞及び上皮系細胞に候補物質を接触させる工程
工程２：培養容器に、前記候補物質に接触させた前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞、並びに、対照として前記候補物質に接触させていない間葉系細胞及び上皮系細胞をそれぞれ播種し、線維芽細胞増殖因子を含む培地を用いて、酸素を供給しながら共培養することにより、前記培養容器内に候補物質と接触させた毛包原基及び対照毛包原基を形成させる工程
工程３：前記候補物質と接触させた毛包原基において、前記対照毛包原基よりも早く毛幹様構造が形成された場合、前記候補物質を発毛促進物質と判断し、前記対照毛包原基よりも遅く毛幹様構造が形成された場合、発毛抑制物質であると判断し、前記対照原基と毛幹様構造が形成された時期が同じ場合、発毛抑制物質及び発毛抑制物質のいずれでもないと判断する工程
【００９５】
本実施形態のスクリーニング方法によれば、目視又は顕微鏡等による観察を行うことで、簡便に発毛促進又は抑制物質をスクリーニングすることができる。
本実施形態のスクリーニング方法を構成する各工程について、以下に詳細を説明する。
【００９６】
［工程１ ］
工程１は、間葉系細胞及び上皮系細胞に候補物質を接触させる工程である。
間葉系細胞及び上皮系細胞としては、上述の複数の再生毛包原基の製造方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、間葉系細胞及び上皮系細胞に加えて、さらに、血管を構築し得る細胞も同時に候補物質に接触させてもよい。
血管を構築し得る細胞としては、上述の複数の再生毛包原基の製造方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、本明細書において、「候補物質」には、例えば、有機又は無機の化合物（特に、低分子量の化合物） 、タンパク質、ペプチド等が含まれる。
【００９７】
接触時間については、特別な限定はなく、工程１の後に続く、工程２及び工程３においても、候補物質の存在下で行ってもよい。
接触条件としては、特別な限定はなく、細胞混合懸濁液中の各細胞が生存可能な条件であればよい。具体的には、例えば、２５℃以上４０℃未満（好ましくは、３７℃）の温度で、５％ＣＯ２環境下等が挙げられる。
【００９８】
［工程２］
工程２は、培養容器内に候補物質と接触させた毛包原基及び対照毛包原基を形成させる工程である。
工程２として具体的には、まず、培養容器に、候補物質と接触させた間葉系細胞及び上皮系細胞の細胞混合懸濁液を注入する。また、対照として、候補物質とさせていない間葉系細胞及び上皮系細胞の細胞混合懸濁液も準備し、培養容器に注入する。
培養容器の材質は、細胞培養に適したものであればよく、特別な限定はない。例えば、透明なガラス、ポリマー材等が挙げられる。中でも、より短時間で毛包原基を形成できることから、酸素透過性を有するポリマー材が好ましい。酸素透過性を有するポリマー材として具体的には、例えば、フッ素樹脂、シリコンゴム（例えば、ポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）：ＰＤＭＳ）等）等が挙げられる。これらの材質を単独で使用してもよいし、組み合わせて使用してもよい。
【００９９】
次いで、播種された混合細胞を、ＦＧＦを含む培地を用いて、酸素を供給しながら共培養する。培養時間は、１日以上１４日以下（好ましくは、８日程度）であってよく、培養温度は２５℃以上４０℃未満（好ましくは、３７℃）であってよい。
後述の実施例に示すように、ＦＧＦの添加有無にかかわらず、培養から３日程度で毛包原基が形成される。さらに、培養を続けることで、ＦＧＦを含まない培地を用いた毛包原基では、毛幹様構造が形成されるまで培養開始から１２日程度要する。これに対し、ＦＧＦを含有する培地を用いた毛包原基では、毛幹様構造が形成されるまで培養開始から８日程度と短時間で形成される。また、培養容器内というｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験系において、毛包原基が毛幹様構造を形成し得ることは、今回、本発明者らが初めて見出したことである。
【０１００】
使用するＦＧＦ及び培地としては、上述の複数の再生毛包原基の製造方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、ＦＧＦとしては、ＦＧＦ２（塩基性ＦＧＦ、ｂＦＧＦ）であることが好ましい。
【０１０１】
［工程３］
工程３は、前記毛包原基における毛幹様構造の形成状態から前記候補物質を発毛促進物質又は発毛抑制物質であると判断する工程である。
候補物質と接触していない毛包原基（以下、「対照毛包原基」と称する場合がある）において毛幹様構造が形成されたタイミングと比較することで、候補物質を発毛促進物質又は発毛抑制物質と判断することができる。具体的には、候補物質と接触させた毛包原基において、対照毛包原基よりも早く毛幹様構造が形成された場合には、候補物質が発毛促進物質であると判断できる。一方、候補物質と接触させた毛包原基において、対照毛包原基よりも遅く毛幹様構造が形成された場合又は毛幹様構造が形成されていない場合、候補物質が発毛抑制物質であると判断できる。また、候補物質と接触させた毛包原基において、対照毛包原基と同程度の培養日数で毛幹様構造が形成された場合には、候補物質は、発毛促進作用及び発毛抑制作用のいずれも有しないと判断できる。
【０１０２】
また、対照毛包原基を作製していない場合には、培養日数によって、判断することができる。具体的には、培養開始から３日以上１４日以下における毛包原基について、目視又は顕微鏡等による観察を行うことで、毛幹様構造の形成有無を確認する。毛幹様構造が形成されたタイミングが培養開始から３日以上８日未満である場合、候補物質が発毛促進物質であると判断できる。一方、毛幹様構造が形成されたタイミングが培養開始から９日以上１４日以下、又は、毛幹様構造が形成されていない場合、候補物質が発毛抑制物質であると判断できる。また、毛幹様構造が形成されたタイミングが培養開始から８日程度である場合、候補物質は、発毛促進作用及び発毛抑制作用のいずれも有しないと判断できる。
【０１０３】
さらに、毛包原基における発毛に関連するマーカー遺伝子（例えば、Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子、Ｎｅｘｉｎ遺伝子、Ｉｇｆｂｐ５遺伝子、Ｔｇｆβ２遺伝子等）の発現量をＲＴ−ＰＣＲ等により確認してもよい。毛幹様構造の形成有無と、前記マーカー遺伝子の発現量とから、より正確に、候補物質を発毛促進物質又は発毛抑制物質と判断することができる。
【実施例】
【０１０４】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０１０５】
［実施例１］複数のマウス再生毛包原基の製造（活性型ＰＲＰの添加）
１．マイクロ凹版の作製
マイクロ凹版の作製方法の概略図を図５に示す。具体的には、ＣＡＤソフト（Ｖ  Ｃａｒｖｅ  Ｐｒｏ  ６．５）を用いて、作製するマイクロ凹版のパターンをコンピューターで設計した。続いて、切削機を用いて、設計したパターン通りにオレフィン系基板を切削することで、パターンをもつ凹鋳型を作製した（工程（Ｉ））。この凹鋳型にエポキシ樹脂（クリスタルリジン：日新レジン社製）を流しこみ（工程（ＩＩ））、１日硬化させた後（工程（ＩＩＩ））、離型することで、パターンをもつ凸鋳型を形成した（工程（ＩＶ））。続いて、形成した凸鋳型を６ｃｍディッシュ底面に固定し、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を流し込み（工程（Ｖ））、固化した（工程（ＶＩ））。続いて、離型することで、ＰＤＭＳに規則的なパターンが形成されたマイクロ凹版を作製した（工程（ＶＩＩ））。なお、マイクロ凹版のパターンデザインは、日本人の頭髪の平均毛包密度に合わせて作製した。マイクロ凹版のサイズとして具体的には、高さ１ｃｍ、２ｃｍ×２ｃｍ四方の容器の底面に直径約１ｍｍ、高さ５００μｍのウェルが約１００ウェル／ｃｍ２の密度で配置された容器が得られた。【０１０６】
２．多血小板血漿（活性型ＰＲＰ）の調製
次に、多血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｒｉｃｈ  Ｐｌａｓｍａ；ＰＲＰ）を調製した。具体的には、まず、吸引麻酔下で妊娠マウスを開腹し、２６Ｇ注射針を心臓に突き刺し、約１ｍＬの血液をシリンジに採取した（この時、シリンジにあらかじめ血液抗凝固剤ＡＣＤ−Ａ液を０．１ｍＬ加えておいた）。なお、血液抗凝固剤ＡＣＤ−Ａ液の組成は、２．２ｗｔ％クエン酸Ｎａ、０．８ｗｔ％クエン酸２水和物及び２．２ｗｔ％グルコースである。続いて、採取した血液を１５６０×ｇで１０分間遠心することで、沈殿した赤血球を除去し、上清を得た。さらに、得られた上清を２３４０×ｇで１０分間遠心することで、ＰＲＰを回収した。回収したＰＲＰと１０ｗｔ％の塩化カルシウム溶液を７：１で混合し、ゲルを形成させた。形成したゲルを１６１００×ｇで１０分遠心することで、活性型ＰＲＰ（ＰＲＰ−ｒｅｌｅａｓａｔｅ；ＰＲＰｒ）溶液を回収した。【０１０７】
３．毛包原基の形成
（１）間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
胎齢１８日齢のＣ５７ＢＬ／６マウス胎児より背部皮膚を採取し、豊島らが報告した方法（非特許文献２）を一部改変した方法を用いて、間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。より具体的には、妊娠マウスＣ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌの子宮内の胎齢１８日齢のマウス胎児の背部皮膚を採取し、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）ＩＩ（Ｗａｋｏ社製）による処理を４℃で３０ｒｐｍの振盪条件で１時間行い、上皮層と間葉層とを分離した。次いで、上皮層は１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ（Ｗａｋｏ社製）による処理を２時間、さらにトリプシンによる処理を１０分行い、上皮系細胞を単離した。一方、間葉層は１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ（Ｗａｋｏ社製）による処理を２時間行い、間葉系細胞を単離した。【０１０８】
（２）毛包原基形成工程
続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が４×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェルずつ（全細胞数８×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）となるように注入し、３日間培養した。使用した培地（以下、「ＰＲＰｒ＋」と称する場合がある）の組成は、以下の表１に示すとおりである。また、対照として、活性型ＰＲＰ（ＰＲＰｒ）溶液を含有せず、間葉系細胞培養培地と上皮系細胞培地とを１：１で混合した培地（以下、「ＰＲＰｒ−」と称する場合がある）を用いて、同様に３日間培養した。培地交換は毎日行った。【０１０９】
【表１】
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【０１１０】
（３）観察結果
培養開始から３日目に、倒立型位相差顕微鏡（ＩＸ−７１、ＭＩ−ＩＢＣ  ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を用いて観察した。結果を図６Ａ（ＰＲＰｒ＋）及び図６Ｂ（ＰＲＰｒ−）に示す。【０１１１】
図６Ａ及び図６Ｂから、ＰＲＰｒの添加有無にかかわらず、播種した２種類の細胞は、1つの凝集体を形成した後、３日間の培養中に凝集体内で同種細胞同士が集合しあい、毛包原基を形成した。【０１１２】
（４）Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子、Ｎｅｘｉｎ遺伝子、Ｉｇｆｂｐ５遺伝子及びＴｇｆβ２遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ解析
（２）でＰＲＰｒ＋又はＰＲＰｒ−条件下で形成された毛包原基について、発毛に関連するマーカー遺伝子（Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子、Ｎｅｘｉｎ遺伝子、Ｉｇｆｂｐ５遺伝子及びＴｇｆβ２遺伝子）の発現を評価した。【０１１３】
（４−１）ＲＮＡ抽出
まず、ＰＲＰｒ＋又はＰＲＰｒ−条件下で形成された毛包原基をそれぞれ１５ｍＬチューブに回収し、各毛包原基が沈殿したら、１ｍＬの溶液となるように上澄みの培地を除去した。次いで、１ｍＬとなった各毛包原基を含む溶液を１．５ｍＬマイクロチューブに移しかえた。
次いで、４℃、５０００ｒｐｍで、３分間遠心した。この操作は、残存する培地を捨てるため、各毛包原基を沈殿させると同時に、遠心分離機内の予冷のために行った。次いで、上清（培地）を捨てた後、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＬＴを３５０μＬ加え、よくピペッティングした。次いで、ピペッティング後の溶液をＱＩＡ  Ｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムに回収し、４℃、１００００ｒｐｍで、２分間遠心した。次いで、ＱＩＡ  Ｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムの上部を捨て、コレクションチューブ内の溶液に７０％エタノールを３５０μＬ加え、ＲＮｅａｓｙスピンカラムに移した。次いで、４℃、１００００ｒｐｍで、１５秒間遠心した。次いで、コレクションチューブ内の濾液を捨て、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＷ１を７００μＬ加え、４℃、１００００ｒｐｍで、１５秒間遠心した。次いで、コレクションチューブ内の濾液を捨て、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＰＥを５００μＬ加え、４℃、１００００ｒｐｍで、１５秒間遠心した。次いで、コレクションチューブ内の濾液を捨て、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＰＥを５００μＬ加え、４℃、１００００ｒｐｍで、２分間遠心した。次いで、新しい２ｍＬコレクションチューブに遠心後のカラムを移し、４℃、１００００ｒｐｍで、１分間遠心した。これは、残存するＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥを除去するために行った。次いで、１ｍＬマイクロチューブに遠心後のカラムを移し、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを３０μＬ加え、４℃、１００００ｒｐｍで、１分間遠心した。次いで、遠心後のカラムが設置された１ｍＬマイクロチューブに、再度ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを３０μＬ加え、４℃、１００００ｒｐｍで、１分間遠心し、ＲＮＡ溶解液を得た。【０１１４】
（４−２）ＲＴ−ＰＣＲ
次いで、得られたＲＮＡ溶解液のＲＮＡ濃度を測定し、それぞれ１５０μｇ／ｍＬとなるように希釈した。次いで、ＲＮＡ希釈液を６５℃で、５分間インキュベートし、その後氷上で冷却した。次いで、マイクロチューブに下記表２に示す組成の溶液を加え、透明フィルムで覆った。表２において、ＲＮＡとは、ＰＲＰｒ＋又はＰＲＰｒ−条件下で形成された毛包原基のＲＮＡ溶解液を示す。【０１１５】
【表２】
2019039376.tif 000003
【０１１６】
次いで、サーマルサイクラーにセットし、しっかり閉まっていることを確認した。次いで、３７℃で１５分間、９８℃で５分間の逆転写反応を行い、ＰＲＰｒ＋条件下で形成された毛包原基のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡ、及びＰＲＰｒ−条件下で形成された毛包原基のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡをそれぞれ得た。【０１１７】
次いで、マイクロチューブに下記表３に示す組成の溶液を加え、透明フィルムで覆った。表３において、ＤＮＡとは、ＰＲＰｒ＋条件下で形成された毛包原基のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡ、及びＰＲＰｒ−条件下で形成された毛包原基のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡを示す。さらに、ＰＣＲで用いたプライマーの塩基配列について、表４に示す。【０１１８】
【表３】
2019039376.tif 000004
【０１１９】
【表４】
2019039376.tif 000005
【０１２０】
次いで、サーマルサイクラーにセットし、しっかり閉まっていることを確認した。次いで、９５℃で４分間、（９５℃で５秒間、６０℃で６０秒間）×４５サイクル、７２℃で１０分間のプロトコールにてＰＣＲを行った。コントロールとして、ＧＡＰＤＨの発現量を測定した。結果を図７Ａ（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、図７Ｂ（Ｎｅｘｉｎ）、図７Ｃ（Ｉｇｆｂｐ５）及び図７Ｄ（Ｔｇｆβ２）に示す。なお、図７Ａ〜図７Ｄにおいて、ＰＲＰｒ−条件下での各遺伝子の発現量を１としたときのＰＲＰｒ＋条件下での各遺伝子の発現量を示している。【０１２１】
図７Ａ〜図７Ｄから、ＰＲＰｒ−条件下で形成された毛包原基と比較して、ＰＲＰｒ＋条件下で形成された毛包原基では、Ｖｅｒｓｉｃａｎ、ＴＧＦβ２、Ｎｅｘｉｎ及びＩｇｆｂｐ５のいずれの遺伝子の発現も上昇していた。
このことから、ＰＲＰｒが毛包原基の培養において毛髪再生を促進する可能性が示唆された。【０１２２】
［試験例１］ヌードマウスを用いた皮下移植試験１
（１）ヌードマウスへの皮下移植
実施例１で得られたＰＲＰｒ＋条件下で形成された毛包原基をヌードマウス皮内にパッチ法を用いて移植した。動物の飼育及び動物実験は、横浜国立大学動物実験委員会の指針に遵守して行った。対照として、ＰＲＰｒ−条件下で形成された毛包原基についても同様に移植した。
具体的には、まず、ヌードマウスにイソフルラン吸引麻酔を行い、背部をイソジンで消毒した。次いで、Ｖランスマイクロメス（日本アルコン社製）を用いて、皮膚表皮層から真皮層下部に至る移植創を形成した。次いで、実施例１で得られたＰＲＰｒ＋条件下で形成された毛包原基各３０個／１箇所、又はＰＲＰｒ−条件下で形成された毛包原基各３０個／１箇所を合計３箇所（合計９０個）の移植創に挿入した。移植から３週間後のヌードマウスの移植部での再生毛髪の様子を図８Ａ（ＰＲＰｒ＋）及び図８Ｂ（ＰＲＰｒ−）に示す。【０１２３】
図８Ａ及び図８Ｂから、ＰＲＰｒ＋条件下で形成された毛包原基を移植した移植部では、黒い毛が大量に形成されていた。また、ＰＲＰｒ−条件下で形成された毛包原基を移植した移植部と比較して、毛の再生数が多い様子が観察された。また、ＰＲＰｒ＋又はＰＲＰｒ−のいずれの条件下で形成された毛包原基を移植した移植部においても、再生された毛髪はキューティクル構造を有する形態的に正常な毛が形成されていた。【０１２４】
また、移植部の皮膚を採取し、コラゲナーゼ溶液に１時間浸漬させた後、再生した毛髪をばらばらにほぐし、再生した毛髪の本数を計測した。結果を図９に示す。【０１２５】
図９から、毛髪の再生本数は、ＰＲＰｒ＋条件下で形成された毛包原基では、約４２本であったのに対し、ＰＲＰｒ−条件下で形成された毛包原基では約２４本であり、約１．７５倍程度多かった。
以上のことから、多血小板血漿を含む培地で培養した毛包原基が高い毛包誘導能を有することが示された。【０１２６】
［実施例２］複数のマウス再生毛包原基の製造（ＦＧＦの添加）
続いて、ＰＲＰｒ内に豊富に含まれる毛髪再生因子である線維芽細胞成長因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ２；ＦＧＦ２）に着目し、毛包原基への添加による毛包誘導能の向上について検討した。なお、ＦＧＦ２は、脱毛症治療法の一つであるＨＡＲＧ治療にも用いられている。また、一般的に、ＰＲＰｒ中にＦＧＦ２は２５０ｎｇ／ｍＬ程度含まれており、実施例１で毛包原基の形成時に使用された培地中のＦＧＦ２濃度は約１５ｎｇ／ｍＬであった。【０１２７】
１．毛包原基の形成
（１）間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
実施例１の「３．（１）」と同様の方法を用いて、マウス胎児から間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。【０１２８】
（２）毛包原基形成工程
続いて、９６ウェルマイクロプレート（住友ベークライト社製、Ｐｒｉｍｅｓｕｒｆａｃｅ（登録商標）  ９６Ｕ  Ｐｌａｔｅ）に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が１．５×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェルずつ（全細胞数３×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）となるように注入し、培養した。使用した培地（以下、「ＦＧＦ２＋」と称する場合がある）の組成は、以下の表５に示すとおりである。また、対照として、繊維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）を含有せず、間葉系細胞培養培地と上皮系細胞培地とを１：１で混合した培地（以下、「ＦＧＦ２−」と称する場合がある）を用いて、同様に培養した。培地交換は２〜３日おきに行った。【０１２９】
【表５】
2019039376.tif 000006
【０１３０】
（３）観察結果
培養開始から毎日、倒立型位相差顕微鏡（ＩＸ−７１、ＭＩ−ＩＢＣ  ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を用いて観察した。結果を図１０に示す。図１０において、ＦＧＦ２不含培地を用いて培養した間葉系細胞及び上皮系細胞については、培養２３日目の顕微鏡像を示す。一方、ＦＧＦ２含有培地を用いて培養した間葉系細胞及び上皮系細胞については、培養１０日目の顕微鏡像を示す。【０１３１】
培養３日目には、ＦＧＦ２の添加有無にかかわらず、播種した２種類の細胞は、１つの凝集体を形成した後、３日間の培養中に凝集体内で同種細胞同士が集合しあい、毛包原基を形成した（図示せず）。
その後、ＦＧＦ２＋条件下で形成された毛包原基では、培養８日目に毛幹様構造の形成が観察された。一方、ＦＧＦ２−条件下で形成された毛包原基では、培養１２日目に同様の毛幹様構造の形成が観察された。
以上のことから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験系において、ＦＧＦ２の添加により毛包原基での毛髪再生が促進され、早期に毛幹様構造が観察されたと考えられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験系において、この毛包原基での毛幹様構造の形成は、非常に興味深い現象である。よって、発毛因子であるＦＧＦにより毛幹様構造の形成が促進されたことから、発毛剤の評価ツール等、発毛促進作用又は発毛抑制作用を有する候補化合物のスクリーニングへの応用も期待できる。【０１３２】
（４）Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子及びＴｇｆβ２遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ解析
（２）でＦＧＦ２＋又はＦＧＦ２−条件下で形成された毛包原基（培養１０日目）について、発毛に関連するマーカー遺伝子（Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子及びＴｇｆβ２遺伝子）の発現を評価した。【０１３３】
（４−１）ＲＮＡ抽出
実施例１の（４−１）と同様の方法を用いて、ＲＮＡ溶解液を調製した。【０１３４】
（４−２）ＲＴ−ＰＣＲ
（４−１）で得られたＲＮＡ溶解液について、実施例１の（４−２）と同様方法を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＦＧＦ２＋条件下で形成された毛包原基のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡ、及びＦＧＦ２−条件下で形成された毛包原基のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡをそれぞれ得た。得られたｃＤＮＡについて、上記表３に示す組成の溶液を加え、さらに、上記表４に示すＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子、Ｔｇｆβ２遺伝子及びＧＡＰＤＨ遺伝子のプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。結果を図１１に示す。【０１３５】
図１１から、ＦＧＦ２−条件下で形成された毛包原基と比較して、ＦＧＦ２＋条件下で形成された毛包原基では、Ｖｅｒｓｉｃａｎ及びＩｇｆｂｐ５のいずれの遺伝子の発現も上昇していた。
このことから、ＦＧＦ２が毛包原基の培養において毛髪再生を促進する可能性が示唆された。【０１３６】
［参考例１］複数のマウス再生毛包原基の製造（不活性ＰＲＰの添加）
１．マイクロ凹版の作製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。【０１３７】
２．多血小板血漿（不活性型ＰＲＰ）の調製
次に、多血小板血漿（不活性型ＰＲＰ）（以下、単に、「ＰＲＰ」と称する場合がある）を調製した。具体的には、まず、吸引麻酔下で妊娠マウスを開腹し、２６Ｇ注射針を心臓に突き刺し、約１ｍＬの血液をシリンジに採取した（この時、シリンジにあらかじめ血液抗凝固剤ＡＣＤ−Ａ液を０．１ｍＬ加えておいた）。なお、血液抗凝固剤ＡＣＤ−Ａ液の組成は、２．２ｗｔ％クエン酸Ｎａ、０．８ｗｔ％クエン酸２水和物及び２．２ｗｔ％グルコースである。続いて、採取した血液を１５６０×ｇで１０分間遠心することで、沈殿した赤血球を除去し、上清を得た。さらに、得られた上清を２３４０×ｇで１０分間遠心することで、ＰＲＰ（不活性型ＰＲＰ）を回収した。【０１３８】
３．毛包原基の形成
（１）間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
実施例１の「３．（１）」と同様の方法を用いて、マウス胎児から間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。【０１３９】
（２）毛包原基形成工程
続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が４×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェルずつ（全細胞数８×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）となるように注入し、３日間培養した。使用した培地の組成は、以下の表６に示すとおりである。また、対照として、多血小板血漿溶液を含有せず、間葉系細胞培養培地と上皮系細胞培地とを１：１で混合した培地（以下、「ＰＲＰ−」又は「ＰＲＰ−（０％）」と称する場合がある）を用いて、同様に３日間培養した。培地交換は毎日行った。【０１４０】
【表６】
2019039376.tif 000007
【０１４１】
（３）観察結果
培養開始から３日目に、倒立型位相差顕微鏡（ＩＸ−７１、ＭＩ−ＩＢＣ  ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を用いて観察した。結果を図１２に示す。【０１４２】
図１２から、ＰＲＰ＋では、いずれの濃度においても毛包原基の形成が阻害され、１つの球状の組織体を形成していた。球状の組織体のサイズはＰＲＰの添加濃度に依存することから、血小板等が上皮系細胞及び間葉系細胞からなる組織体を形成したと推察された。【０１４３】
（４）Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ解析
（２）においてＰＲＰ＋（５％）条件下で形成された組織体又はＰＲＰ−条件下で形成された毛包原基（培養３日目）について、発毛に関連するマーカー遺伝子（Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子）の発現を評価した。【０１４４】
（４−１）ＲＮＡ抽出
実施例１の（４−１）と同様の方法を用いて、ＲＮＡ溶解液を調製した。【０１４５】
（４−２）ＲＴ−ＰＣＲ
（４−１）で得られたＲＮＡ溶解液について、実施例１の（４−２）と同様方法を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＰＲＰ＋（５％）条件下で形成された組織体のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡ、及び、ＰＲＰ−条件下で形成された毛包原基のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡをそれぞれ得た。得られたｃＤＮＡについて、上記表３に示す組成の溶液を加え、さらに、上記表４に示すＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子及びＧＡＰＤＨ遺伝子のプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。結果を図１３に示す。【０１４６】
図１３から、ＰＲＰ＋（５％）条件下で形成された組織体、及び、ＰＲＰ−条件下で形成された毛包原基でのＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子の発現を比較した結果、ＰＲＰ＋（５％）条件下で形成された組織体では、Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子の発現はほとんど向上しなかった。これは、ＰＲＰに含まれる血小板が活性化していないためであると推察された。【０１４７】
実施例１ではカルシウム溶液と接触させることで活性型ＰＲＰが得られたことから、活性型ＰＲＰを用いることで、毛包原基の毛髪再生能を向上できることが明らかとなった。【０１４８】
［実施例３］複数のマウス再生毛包原基の製造（ＦＧＦの添加量の検討１）
１．マイクロ凹版の作製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。【０１４９】
２．多血小板血漿（活性型ＰＲＰ）の調製
実施例１の「２．」と同様の方法を用いて、多血小板血漿（活性型ＰＲＰ（ＰＲＰｒ））溶液を調製した。【０１５０】
３．毛包原基の形成
（１）間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
実施例１の「３．（１）」と同様の方法を用いて、マウス胎児から間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。【０１５１】
（２）毛包原基形成工程
続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が４×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェルずつ（全細胞数８×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）となるように注入し、３日間培養した。使用した培地の組成は、以下の表７に示すとおりである。また、対照として、ＦＧＦ２を含有せず、間葉系細胞培養培地と上皮系細胞培地とを１：１で混合した培地（以下、「ＦＧＦ２−／ＰＲＰｒ−」と称する場合がある）、及び、ＦＧＦ２を含有せず、活性型ＰＲＰ溶液と間葉系細胞培養培地と上皮系細胞培地とを表７に示す混合比で混合した培地（以下、「ＦＧＦ２−／ＰＲＰｒ＋」と称する場合がある）を用いて、同様に３日間培養した。培地交換は毎日行った。【０１５２】
【表７】
2019039376.tif 000008
【０１５３】
（３）Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ解析
（２）において各条件下で形成された毛包原基（培養３日目）について、発毛に関連するマーカー遺伝子（Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子）の発現を評価した。【０１５４】
（３−１）ＲＮＡ抽出
実施例１の（４−１）と同様の方法を用いて、ＲＮＡ溶解液を調製した。【０１５５】
（３−２）ＲＴ−ＰＣＲ
（３−１）で得られたＲＮＡ溶解液について、実施例１の（４−２）と同様方法を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行い、各条件下で形成された毛包原基のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡをそれぞれ得た。得られたｃＤＮＡについて、上記表３に示す組成の溶液を加え、さらに、上記表４に示すＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子及びＧＡＰＤＨ遺伝子のプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。結果を図１４（ＦＧＦ２＋のみ）及び図１５（ＦＧＦ２−／ＰＲＰｒ−、ＦＧＦ２−／ＰＲＰｒ＋及びＦＧＦ２＋（１０ｎｇ／ｍＬ））に示す。なお、図１４及び図１５において、「Ｖｃａｎ」とは、Ｖｅｒｓｉｃａｎの略称である。【０１５６】
図１４から、ＦＧＦ２含有量が１０ｎｇ／ｍＬの条件下で培養した毛包原基のＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子の発現が最も高い値を示した。
また、図１５から、ＦＧＦ２＋（１０ｎｇ／ｍＬ）条件下で培養した毛包原基は、ＦＧＦ２−／ＰＲＰｒ＋条件下で培養した毛包原基よりもＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子の発現が高く、３倍以上の発現量であった。
以上のことから、ＰＲＰｒに含まれる含有成分のうち、ＦＧＦ２が毛包再生の促進への寄与が高いことが示唆された。【０１５７】
［実施例４］毛細血管構造を有する複数の再生毛包原基の製造
１．マイクロ凹版の作製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。【０１５８】
２．多血小板血漿（活性型ＰＲＰ）の調製
実施例１の「２．」と同様の方法を用いて、多血小板血漿（活性型ＰＲＰ（ＰＲＰｒ））溶液を調製した。【０１５９】
３．毛包原基の形成
（１）間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
実施例１の「３．（１）」と同様の方法を用いて、マウス胎児から間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。【０１６０】
（２）血管内皮細胞の準備
ＲＦＰ遺伝子導入ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＲＦＰ−ＨＵＶＥＣ）（以下、単に「血管内皮細胞」と称する場合がある。）はコンフルエントになるまで培養しておいた。【０１６１】
（３）毛包原基形成工程
続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、上皮系細胞、間葉系細胞及び血管内皮細胞の細胞混合懸濁液を、上皮系細胞及び間葉系細胞がそれぞれ４×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェルずつ、並びに、血管内皮細胞が１×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル（全細胞数９×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）となるように注入し、３日間培養した。使用した培地の組成は、以下の表８に示すとおりである。また、対照として、ＦＧＦ２を含有せず、間葉系細胞培養培地と上皮系細胞培地とを１：１で混合した培地（以下、「ＦＧＦ２−／ＰＲＰｒ−」と称する場合がある）、及び、ＦＧＦ２を含有せず、活性型ＰＲＰ溶液と間葉系細胞培養培地と上皮系細胞培地とを表８に示す混合比で混合した培地（以下、「ＦＧＦ２−／ＰＲＰｒ＋」と称する場合がある）を用いて、同様に３日間培養した。培地交換は毎日行った。【０１６２】
【表８】
2019039376.tif 000009
【０１６３】
（４）観察結果
培養開始から３日目に、倒立型蛍光顕微鏡（ＤＰ−７１、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を用いて観察した。結果を図１６に示す。【０１６４】
図１６から、ＦＧＦ２及びＰＲＰｒの添加の有無にかかわらず、播種した３種類の細胞は、１つの凝集体を形成した。さらに、３日間の培養中に凝集体内で同種細胞同士が集合しあい、血管網を有する毛包原基が形成された（図１６の上の画像、参照）。なお、血管網は、毛包原基の間葉系細胞の凝集体内にのみ形成されていた（図１６の下の画像、参照）。【０１６５】
（５）Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ解析
（３）において各条件下で形成された毛包原基（培養３日目）について、発毛に関連するマーカー遺伝子（Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子）の発現を評価した。【０１６６】
（５−１）ＲＮＡ抽出
実施例１の（４−１）と同様の方法を用いて、ＲＮＡ溶解液を調製した。【０１６７】
（５−２）ＲＴ−ＰＣＲ
（５−１）で得られたＲＮＡ溶解液について、実施例１の（４−２）と同様方法を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行い、各条件下で形成された毛包原基のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡをそれぞれ得た。得られたｃＤＮＡについて、上記表３に示す組成の溶液を加え、さらに、上記表４に示すＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子及びＧＡＰＤＨ遺伝子のプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。結果を図１７に示す。【０１６８】
図１７から、ＦＧＦ２−／ＰＲＰｒ＋、並びに、ＦＧＦ２＋（１０ｎｇ／ｍＬ及び４０ｎｇ／ｍＬ）条件下で培養した毛包原基は、ＦＧＦ２−／ＰＲＰｒ−条件下で培養した毛包原基と比較して、Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子の発現量が高かった。特に、ＦＧＦ２＋（１０ｎｇ／ｍＬ）条件下で培養した毛包原基でのＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子の発現量が最も高かった。【０１６９】
［実施例５］複数のマウス再生毛包原基の製造（ＦＧＦの添加量の検討２）
マウス胎児から採取された細胞では毛髪再生能が高く、成体に成長するほどその能力が落ちることが報告されている。そこで、マウス成体から採取された細胞を用いて、毛包原基を製造する場合でのＦＧＦの添加量を検討した。【０１７０】
１．マイクロ凹版の作製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。【０１７１】
２．毛包原基の形成
（１）間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
豊島らが報告した方法（非特許文献２）を一部改変した方法を用いて、成体マウスの顎鬚毛包から間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。【０１７２】
（２）毛包原基形成工程
続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルずつ（全細胞数２×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）となるように注入し、３日間培養した。使用した培地の組成は、以下の表９に示すとおりである。また、対照として、ＦＧＦ２を含有せず、間葉系細胞培養培地と上皮系細胞培地とを１：１で混合した培地（以下、「ＦＧＦ２−」と称する場合がある）を用いて、同様に３日間培養した。培地交換は毎日行った。【０１７３】
【表９】
2019039376.tif 000010
【０１７４】
（３）Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子及びＷｎｔ１０ｂ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ解析
（２）において各条件下で形成された毛包原基（培養３日目）について、毛髪再生効率の指標であって、間葉系細胞のマーカー遺伝子である（Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子）、及び、毛髪再生効率の指標であって、上皮系細胞のマーカー遺伝子（Ｗｎｔ１０ｂ遺伝子）の発現を評価した。【０１７５】
（３−１）ＲＮＡ抽出
実施例１の（４−１）と同様の方法を用いて、ＲＮＡ溶解液を調製した。【０１７６】
（３−２）ＲＴ−ＰＣＲ
（３−１）で得られたＲＮＡ溶解液について、実施例１の（４−２）と同様方法を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行い、各条件下で形成された毛包原基のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡをそれぞれ得た。得られたｃＤＮＡについて、上記表３に示す組成の溶液を加え、さらに、上記表４に示すＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子のプライマー、及び、以下の表１０に示すＷｎｔ１０ｂ遺伝子のプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。代表的な結果として、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２条件下で培養した毛包原基での各遺伝子の相対的な発現量を図１８に示す。なお、図１８において、「Ｖｃａｎ」とは、Ｖｅｒｓｉｃａｎの略称である。【０１７７】
【表１０】
2019039376.tif 000011
【０１７８】
図１８から、ＦＧＦ２含有量が高くなるほど、毛包原基のＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子及びＷｎｔ１０ｂ遺伝子の発現が高まる傾向が示された。
また、図１８から、ＦＧＦ２＋（１００ｎｇ／ｍＬ）条件下で培養した毛包原基は、ＦＧＦ２＋（１０ｎｇ／ｍＬ）条件下で培養した毛包原基よりもＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子及びＷｎｔ１０ｂ遺伝子の発現が高く、３倍以上の発現量であった。
以上のことから、成体から採取された細胞を用いた場合には、ＦＧＦ２をより多く添加することが有効であることが示唆された。【０１７９】
［試験例２］ヌードマウスを用いた皮下移植試験２
（１）ヌードマウスへの皮下移植
実施例５で得られた毛包原基のうち、ＦＧＦ２＋（１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬ）条件下で形成された毛包原基をそれぞれヌードマウス皮内に、試験例１と同様に、パッチ法を用いて移植した。対照として、ＦＧＦ２−（０ｎｇ／ｍＬ）条件下で形成された毛包原基についても同様に移植した。
移植から３週間後のヌードマウスの移植部での再生毛髪の様子を図１９に示す。【０１８０】
図１９から、ＦＧＦ２−（０ｎｇ／ｍＬ）条件下で形成された毛包原基を移植した移植部では、発毛が確認されなかったのに対し、ＦＧＦ２＋（１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬ）条件下で形成された毛包原基では、黒い毛が大量に形成されていた。また、ＦＧＦ２の添加濃度が高いほど、毛髪の再生数が多い様子が観察された。
また、図示しないが、実施例５と同様の方法を用いて、ＦＧＦ２＋（２００ｎｇ／ｍＬ）条件下で形成された毛包原基をヌードマウス皮内に移植した結果、毛髪の再生が確認された。【０１８１】
［実施例６］複数のマウス再生毛包原基の製造（ＰＲＰｒ中の有効成分の検討）
ＰＲＰｒ中には、ＦＧＦ以外にも各種サイトカインが含まれることが知られている。そこで、ＦＧＦの代わりに、ＰＤＧＦ又はＶＥＦＧを添加した培地を用いて、毛包原基を製造する場合でのマーカー遺伝子の発現量を検討した。【０１８２】
１．マイクロ凹版の作製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。【０１８３】
２．毛包原基の形成
（１）間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
実施例１の「３．（１）」と同様の方法を用いて、マウス胎児から間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。【０１８４】
（２）毛包原基形成工程
続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が４×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェルずつ（全細胞数８×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）となるように注入し、３日間培養した。使用した培地の組成としては、間葉系細胞培養培地（ＤＭＥＭ＋１０%ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ)と上皮系細胞培養培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績社製））とを１：１で混合した培地に、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ又はＶＥＧＦをそれぞれ０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ又は１００ｎｇ／ｍＬとなるように添加した培地を用いた。培地交換は毎日行った。【０１８５】
（３）Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子及びＷｎｔ１０ｂ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ解析
（２）において各条件下で形成された毛包原基（培養３日目）について、毛髪再生効率の指標であって、間葉系細胞のマーカー遺伝子である（Ｖｅｒｓｉｃａｎ遺伝子）、及び、毛髪再生効率の指標であって、上皮系細胞のマーカー遺伝子（Ｗｎｔ１０ｂ遺伝子）の発現を評価した。【０１８６】
（３−１）ＲＮＡ抽出
実施例１の（４−１）と同様の方法を用いて、ＲＮＡ溶解液を調製した。【０１８７】
（３−２）ＲＴ−ＰＣＲ
（３−１）で得られたＲＮＡ溶解液について、実施例１の（４−２）と同様方法を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行い、各条件下で形成された毛包原基のＲＮＡの逆転写産物であるｃＤＮＡをそれぞれ得た。得られたｃＤＮＡについて、上記表３に示す組成の溶液を加え、さらに、上記表４に示すＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子のプライマー、及び、上記表１０に示すＷｎｔ１０ｂ遺伝子のプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。結果を図２０Ａ〜２０Ｅに示す。【０１８８】
図２０Ａ〜２０Ｅから、ＰＲＰｒに含まれる成分であるＦＧＦ２、ＰＤＧＦ及びＶＥＧＦのいずれも毛髪再生に関わるＶｅｒｓｉｃａｎ遺伝子及びＷｎｔ１０ｂ遺伝子の発現向上に寄与することが明らかとなった。【０１８９】
［実施例７］複数のマウス再生毛包原基の製造（ヒト毛乳頭細胞の使用）
１．マイクロ凹版の作製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。【０１９０】
２．毛包原基の形成
（１）間葉系細胞の準備及び上皮系細胞の採取
実施例１の「３．（１）」と同様の方法を用いて、マウス胎児から上皮系細胞を採取した。間葉系細胞として、ヒト毛乳頭細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いた。【０１９１】
（２）毛包原基形成工程
続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が４×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェルずつ（全細胞数８×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル）となるように注入し、３日間培養した。使用した培地の組成としては、ヒト毛乳頭細胞増殖培地（Ｆｏｌｌｉｃｌｅ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｐａｐｉｌｌａ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＰＣＧＭ）（Ｐｒｏｍｏ  ｃｅｌｌ社製）と上皮系細胞培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績社製））とを１：１で混合した培地に、ＦＧＦを１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した培地を用いた。培地交換は毎日行った。培養開始から３日後に、毛包原基が形成されていることが確認された。【０１９２】
［試験例３］ヌードマウスを用いた皮下移植試験３
（１）ヌードマウスへの皮下移植
実施例７で得られた毛包原基をヌードマウス皮内に、試験例１と同様に、パッチ法を用いて移植した。移植から１８日目のヌードマウスの移植部での再生毛髪の様子を図２１に示す。【０１９３】
図２１から、間葉系細胞としてヒト毛乳頭細胞を用いて形成された毛包原基を移植した移植部において、毛髪の再生が観察された。また、移植開始から、少なくとも半年にわたり毛周期が維持されることが確認された（図示せず）。【０１９４】
［実施例８］複数のマウス再生毛包原基の製造（ヒト細胞系の使用）
１．マイクロ凹版の作製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。【０１９５】
２．毛包原基の形成
（１）間葉系細胞及び上皮系細胞の準備
間葉系細胞として、ヒト毛乳頭細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いた。また、上皮系細胞として、ヒト表皮ケラチノサイト（ＣＥＬＬｎＴＥＣ社製）を用いた。【０１９６】
（２）毛包原基形成工程
続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルずつ（全細胞数２×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）となるように注入し、３日間培養した。使用した培地の組成としては、ＤＰＣＧＭ（Ｐｒｏｍｏ  ｃｅｌｌ社製）と上皮系細胞培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績社製））とを１：１で混合した培地に、ＦＧＦを１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した培地を用いた。培地交換は毎日行った。培養開始から３日後に、毛包原基が形成されていることが確認された。【０１９７】
［試験例４］ヌードマウスを用いた皮下移植試験４
（１）ヌードマウスへの皮下移植
実施例８で得られた毛包原基をヌードマウス皮内に、試験例１と同様に、パッチ法を用いて移植した。移植から１４日目のヌードマウスの移植部での再生毛髪の様子を図２２に示す。【０１９８】
図２２から、間葉系細胞及び上皮系細胞としてヒト由来の細胞を用いて形成された毛包原基を移植した移植部において、毛髪の再生が観察された。なお、色素細胞（メラノサイト）を含まないため、白毛が再生された。【０１９９】
［実施例９］複数のマウス再生毛包原基の製造（ヒト脱毛症患者由来の毛乳頭細胞の使用）
１．マイクロ凹版の作製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。【０２００】
２．毛包原基の形成
（１）間葉系細胞及び上皮系細胞の準備
実施例１の「３．（１）」と同様の方法を用いて、マウス胎児から上皮系細胞を採取した。ヒト脱毛症患者から承諾を得て、ヒト脱毛症患者の正常頭皮片を採取し、当該正常頭皮片から毛乳頭細胞を分離し、間葉系細胞として用いた。【０２０１】
（２）毛包原基形成工程
続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルずつ（全細胞数２×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）となるように注入し、３日間培養した。使用した培地の組成としては、ＤＰＣＧＭ（Ｐｒｏｍｏ  ｃｅｌｌ社製）と上皮系細胞培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績社製））とを１：１で混合した培地に、ＦＧＦを１００ｎｇ／ｍＬとなるように添加した培地を用いた。培地交換は毎日行った。培養開始から３日後に、毛包原基が形成されていることが確認された。【０２０２】
［試験例５］ヌードマウスを用いた皮下移植試験５
（１）ヌードマウスへの皮下移植
実施例９で得られた毛包原基をそれぞれヌードマウス皮内に、試験例１と同様に、パッチ法を用いて移植した。移植から１６日目のヌードマウスの移植部での再生毛髪の様子を図２３Ａに、移植から５０日後のヌードマウスの移植部での再生毛髪の様子を図２３Ｂに示す。【０２０３】
図２３Ａ及び図２３Ｂから、間葉系細胞としてヒト毛乳頭細胞を用いて形成された毛包原基を移植した移植部において、毛髪の再生が観察された。
また、移植から５０日後のヌードマウスの移植部に再生された毛髪の電子顕微鏡像を図２３Ｃに示す。図２３Ｃから、再生毛髪は、ヒト生体の毛髪と類似したキューティクル構造を有することが確認された。
さらに、移植から１３日目、５０日目、６０日目及び７８日目までのヌードマウスの移植部での再生毛髪の様子を図２３Ｄに示す。図２３Ｄから、移植部において、移植から少なくとも７８日目まで毛周期が維持されることが確認された。
以上のことから、脱毛症患者の正常頭皮由来の毛乳頭細胞を用いても、毛髪が再生できることが確かめられた。【０２０４】
［実施例１０］複数のマウス再生毛包原基の製造（ヒト脱毛症患者由来の細胞系の使用）
１．マイクロ凹版の作製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。【０２０５】
２．毛包原基の形成
（１）間葉系細胞及び上皮系細胞の準備
ヒト脱毛症患者から承諾を得て、ヒト脱毛症患者の正常頭皮片を採取し、当該正常頭皮片から毛乳頭細胞及び表皮ケラチノサイトを分離し、それぞれ間葉系細胞及び上皮系細胞として用いた。【０２０６】
（２）毛包原基形成工程
続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルずつ（全細胞数２×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）となるように注入し、３日間培養した。使用した培地の組成としては、ＤＰＣＧＭ（Ｐｒｏｍｏ  ｃｅｌｌ社製）と上皮系細胞培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績社製））とを１：１で混合した培地に、ＦＧＦを１００ｎｇ／ｍＬとなるように添加した培地を用いた。培地交換は毎日行った。培養開始から３日後に、毛包原基が形成されていることが確認された。【０２０７】
［試験例６］ヌードマウスを用いた皮下移植試験６
（１）ヌードマウスへの皮下移植
実施例１０で得られた毛包原基をヌードマウス皮内に、試験例１と同様に、パッチ法を用いて移植した。移植から３０日目のヌードマウスの移植部での再生毛髪の様子を図２４に示す。【０２０８】
図２４から、間葉系細胞としてヒト毛乳頭細胞を、上皮系細胞としてヒト表皮ケラチノサイトを用いて形成された毛包原基を移植した移植部において、毛髪の再生が観察された。
以上のことから、脱毛症患者の正常頭皮由来の毛乳頭細胞及び表皮ケラチノサイトを用いても、毛髪が再生できることが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【０２０９】
本実施形態の複数の再生毛包原基の製造方法及び毛髪再生用キットによれば、毛髪再生効率が優れており、哺乳動物の毛包組織と類似し、規則的且つ高密度の複数の再生毛包原基を得ることができる。また、前記複数の再生毛包原基の製造方法を用いることで、毛髪再生効率が優れており、規則的且つ高密度の毛包組織を備えた毛包組織含有シートを製造することができる。得られた毛包組織含有シートは、頭皮等の体表皮への移植に好適に用いられる。また、前記複数の再生毛包原基の製造方法を用いることで、簡便に発毛促進又は抑制物質をスクリーニングすることができる。
【符号の説明】
【０２１０】
１…間葉系細胞、２…上皮系細胞、３…血管を構築し得る細胞、４…マイクロ凹版、５…微小凹部、６，６ｂ…毛包原基、６ａ…混合スフェロイド、７…毛細血管構造、８ａ，８ｂ…ＦＧＦを含む培地、９…生体適合性ハイドロゲル、１０…毛包組織含有シート。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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