(57)【要約】  プロテアーゼ認識配列とタグペプチドに対する抗体のエピトープとが重複していることにより、プロテアーゼ認識配列そのものが検出や精製のために利用可能なタグペプチドを提供するとともに、当該タグペプチドおよび当該タグペプチドに対する抗体を利用した組換えタンパク質の精製方法を提供する。このようなタグペプチドとして、プロテアーゼ認識配列が、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ認識配列であることが好ましく、例えば、アミノ酸配列（１）ＲＸ１Ｘ２ＬＹＸ３ＱＧＫＤＧ（Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）を有するタグペプチドが挙げられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ認識配列を有するタグペプチドであって、該プロテアーゼ認識配列と該タグペプチドに対する抗体のエピトープとが重複していることを特徴とするタグペプチド。
【請求項２】
プロテアーゼ認識配列を有するタグペプチドであって、該プロテアーゼ認識配列と該タグペプチドに対する抗体のエピトープとが重複しており、該プロテアーゼ認識配列が、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ認識配列であることを特徴とするタグペプチド。
【請求項３】
以下のアミノ酸配列（１）を有することを特徴とする請求項１または２に記載のタグペプチド。
（１）ＲＸ１Ｘ２ＬＹＸ３ＱＧＫＤＧ（配列番号１）
（Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
【請求項４】
アミノ酸配列（１）が、以下のアミノ酸配列（２）である請求項３に記載のタグペプチド。
（２）ＲＥＮＬＹＦＱＧＫＤＧ（配列番号２）
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のタグペプチドと第２のタグペプチドとを組み合わせてなることを特徴とするタグペプチド。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のタグペプチドに対する抗体と、第２のタグペプチドに対する抗体が、同時に結合できることを特徴とする請求項５に記載のタグペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のタグペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載のタグペプチドに対する抗体。
【請求項１０】
ラット−マウス  ハイブリドーマ２Ｈ５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２４５）により産生されるモノクローナル抗体である請求項８に記載の抗体。
【請求項１１】
ラット−マウス  ハイブリドーマ２Ｈ５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２４５）。
【請求項１２】
下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含む、タンパク質の精製方法。
（ｉ）請求項１〜４のいずれかに記載のタグペプチドと目的のタンパク質との融合タンパク質を含む試料に、請求項９または１０に記載の抗体を作用させて融合タンパク質と抗体との結合物を形成させる工程
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られた結合物に溶離物質を作用させて融合タンパク質を抗体から遊離させる工程
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）の工程で得られた融合タンパク質からタグペプチドを切断する工程
【請求項１３】
タンパク質を発現、精製、検出、もしくは定量するためのキットであって、請求項８に記載の組換えベクター、または、請求項９もしくは１０に記載の抗体を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼ認識配列を有するタグペプチドおよびその利用に関し、詳細には、プロテアーゼ認識配列を有するタグペプチド、当該タグペプチドをコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、当該タグペプチドに対する抗体、並びに当該抗体を用いるタンパク質の精製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ライフサイエンス分野において、遺伝子組換え技術を用いたタンパク質の生産は、基礎研究、応用研究および製品開発のすべての分野で広く行われている。そして、大腸菌や動物細胞によって発現させた組換えタンパク質の検出や精製のために、目的タンパク質の末端に数残基のペプチドからなるタグを付加することが通常行われている。しかし、そのタグは目的タンパク質の生物活性や結晶構造等に影響を及ぼすと考えられるため、最終的には切り離さなければならない。そのために特異的なプロテアーゼ認識配列をタグと目的タンパク質との間に挿入しておく必要がある。【０００３】
例えば、非特許文献１には、ヒスチジンタグとＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）タグとを組み合わせ、さらにタバコエッチウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ、以下「ＴＥＶ」という）プロテアーゼ認識配列を付加した複合タグが記載されている。また、非特許文献２には、プロテインＡとカルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）とＴＥＶプロテアーゼ認識配列とを組み合わせた複合タグが記載されている。しかしながら、いずれの文献に記載のＴＥＶプロテアーゼ認識配列も、付加されたタグを切り離すために用いられているに過ぎず、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列自身が検出や精製のためのタグとして使用されているものではない。もし、プロテアーゼ認識配列そのものを検出や精製のためのタグとして使うことができれば、コンストラクトのデザインを飛躍的に単純化させることができるものと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】David S. Waugh, Making the most of affinity tags. TRENDS in Biotechnology Vol.23 No.6 June 316-320 (2005)
【非特許文献２】Oscar Puig, et al.,The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. METHODS 24, 218-229 (2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、プロテアーゼ認識配列そのものが検出や精製のために利用可能なタグペプチドを提供し、当該タグペプチドおよび当該タグペプチドに対する抗体を利用した組換えタンパク質の精製方法を提供することを目的とする。さらに、当該タグペプチドと第２のタグペプチドとを組み合わせてなり、２種類の抗体が同時に結合可能なタグペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の発明を包含する。
［１］プロテアーゼ認識配列を有するタグペプチドであって、該プロテアーゼ認識配列と該タグペプチドに対する抗体のエピトープとが重複していることを特徴とするタグペプチド。
［２］プロテアーゼ認識配列を有するタグペプチドであって、該プロテアーゼ認識配列と該タグペプチドに対する抗体のエピトープとが重複しており、該プロテアーゼ認識配列が、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ認識配列であることを特徴とするタグペプチド。
［３］以下のアミノ酸配列（１）を有することを特徴とする前記［１］または［２］に記載のタグペプチド。
（１）ＲＸ１Ｘ２ＬＹＸ３ＱＧＫＤＧ（配列番号１）
（Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
［４］アミノ酸配列（１）が、以下のアミノ酸配列（２）である前記［３］に記載のタグペプチド。
（２）ＲＥＮＬＹＦＱＧＫＤＧ（配列番号２）
［５］前記［１］〜［４］のいずれかに記載のタグペプチドと第２のタグペプチドとを組み合わせてなることを特徴とするタグペプチド。
［６］前記［１］〜［４］のいずれかに記載のタグペプチドに対する抗体と、第２のタグペプチドに対する抗体が、同時に結合できることを特徴とする前記［５］に記載のタグペプチド。
［７］前記［１］〜［６］のいずれかに記載のタグペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［８］前記［７］に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
［９］前記［１］〜［４］のいずれかに記載のタグペプチドに対する抗体。
［１０］ラット−マウス  ハイブリドーマ２Ｈ５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２４５）により産生されるモノクローナル抗体である前記［８］に記載の抗体。
［１１］ラット−マウス  ハイブリドーマ２Ｈ５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２４５）。
［１２］下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含む、タンパク質の精製方法。
（ｉ）前記［１］〜［４］のいずれかに記載のタグペプチドと目的のタンパク質との融合タンパク質を含む試料に、前記［９］もしくは［１０］に記載の抗体を作用させて融合タンパク質と抗体との結合物を形成させる工程
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られた結合物に溶離物質を作用させて融合タンパク質を抗体から遊離させる工程
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）の工程で得られた融合タンパク質からタグペプチドを切断する工程
［１３］タンパク質を発現、精製、検出、もしくは定量するためのキットであって、前記［８］に記載の組換えベクター、または、前記［９］もしくは［１０］に記載の抗体を含むキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、プロテアーゼ認識配列を有するタグペプチドおよび当該タグペプチドに対する抗体を提供することができる。当該タグペプチドおよび当該タグペプチドに対する抗体を利用することにより、当該タグペプチドが融合した目的タンパク質を容易な操作で高純度に精製することができ、さらに容易にタグを切り離すことができる。
また、本発明によれば、プロテアーゼ認識配列を有するタグペプチドと第２のタグペプチドとを組み合わせてなるタグペプチドを提供する。当該タグペプチドには、当該タグペプチドに対する２種類の抗体が同時に結合することができるので、目的タンパク質に対する抗体が容易に入手できない場合でも、サンドイッチＥＬＩＳＡ等を利用することが可能となり、微量タンパク質を検出することができる。したがって、本発明によれば、未熟練者であってもクローニングされた遺伝子から発現される不安定かつ微量な組換えタンパク質を容易に精製または検出することができる。さらに、複数の試料における目的タンパク質の含量を高精度で比較することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１（ａ）】タグペプチドとプロテアーゼ認識配列と目的タンパク質との融合タンパク質を示す模式図である。
【図１（ｂ）】本発明のプロテアーゼ認識配列を有するタグペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質を示す模式図である。
【図２（ａ）】２種類のタグペプチドを利用したサンドイッチＥＬＩＳＡ法を示す模式図である。
【図２（ｂ）】本発明のプロテアーゼ認識配列を有するタグペプチドと第２のタグペプチドとを組み合わせてなるタグペプチドを利用したンドイッチＥＬＩＳＡ法を示す模式図である。
【図３】ヒトフィブロネクチンの第９−第１０Ｆｎ３ドメイン部分のＮ末端に種々のＴＥＶ配列を付加したタグペプチド融合タンパク質を示した図である。
【図４】モノクローナル抗体２Ｈ５のエピトープを解析した結果を示す図である。
【図５】ＴＥＶプロテアーゼによる認識と切断に必須のアミノ酸を解析した結果を示す図である。
【図６】２Ｈ５抗体のｅＴＥＶペプチドに対する親和性を、ビアコアによる表面プラズモン共鳴解析により解析した結果を示す図である。
【図７】２Ｈ５抗体を用いたウェスタンブロッティングによって、ｅＴＥＶタグ融合タンパク質を検出した結果、および、抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２を用いたウェスタンブロッティングによって、ＦＬＡＧペプチド融合タンパク質を検出した結果を示す図である。
【図８】ｅＴＥＶ−ＮＰ１を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養上清から２Ｈ５抗体固定化セファロースを用いてｅＴＥＶ−ＮＰ１を精製した結果を示す図である。
【図９】ｅＴＥＶ−ＥＧＦＰを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養上清から２Ｈ５抗体固定化セファロースを用いてｅＴＥＶ−ＥＧＦＰを精製した結果を示す図である。
【図１０】ｈＧＨ−ｅＴＥＶ−ｓｅｍａ６Ｃを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養上清から２Ｈ５抗体固定化セファロースを用いてｈＧＨ−ｅＴＥＶ−ｓｅｍａ６Ｃを精製した結果を示す図である。
【図１１】ｓｅｍａ３Ａ−ｅＴＥＶを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養上清から２Ｈ５抗体固定化セファロースを用いてｓｅｍａ３Ａ−ｅＴＥＶを精製した結果を示す図である。
【図１２】ＧＦＰＵＶのタグペプチド融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図１３】２Ｈ５抗体固定化セファロースを用いて精製したｅＴＥＶ−ＧＦＰＵＶをＳＤＳゲル電気泳動により分析した結果を示す図である。
【図１４】２Ｈ５抗体固定化セファロースに結合したｅＴＥＶ−ＧＦＰＵＶの溶出条件（競合的ペプチド濃度）を検討した結果を示す図である。
【図１５】２Ｈ５抗体固定化セファロースに結合したｅＴＥＶ−ＧＦＰＵＶの溶出条件（緩衝液の種類）を検討した結果を示す図である。
【図１６】ターゲットタグとｅＴＥＶタグとを結合したダブルタグのアミノ酸配列を示す図である。
【図１７】ダブルタグ融合タンパク質をサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である。
【図１８】ダブルタグ融合タンパク質用発現ベクターｐＣＤ−ＮＷ３の構造を示す図である。
【図１９（ａ）】オータキシン高発現株の一次スクリーニング結果を示す図である。
【図１９（ｂ）】オータキシン高発現株の二次スクリーニング結果を示す図である。
【図２０】ＣＲＩＳＰａ高発現株のスクリーニング結果を示す図である。
【図２１（ａ）】セマフォリン３Ａ高発現株の一次スクリーニング結果を示す図である。
【図２１（ｂ）】セマフォリン３Ａ高発現株の二次スクリーニング結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
〔タグペプチド〕
本発明のタグペプチドは、当該タグペプチドに対する抗体のエピトープとプロテアーゼ認識配列とを含み、かつ、当該エピトープと当該プロテアーゼ認識配列とが重複しているものであればよい。エピトープとプロテアーゼ認識配列とが重複している状態とは、タグペプチドからエピトープの範囲を除いたときにプロテアーゼが当該ペプチドを認識（切断）できなくなる状態、または、タグペプチドからプロテアーゼ認識配列を除いたときに当該タグペプチドに対する抗体が当該ペプチドを認識（特異的結合）できなくなる状態を意味する。より好ましくは、タグペプチドからエピトープの範囲を除いたときにプロテアーゼが当該ペプチドを認識（切断）できなくなり、かつ、タグペプチドからプロテアーゼ認識配列を除いたときに当該タグペプチドに対する抗体が当該ペプチドを認識（特異的結合）できなくなる状態である。
【００１０】
したがって、本発明のタグペプチドが付加された目的タンパク質をプロテアーゼで切断することにより、当該タグペプチドに対する抗体による目的タンパク質の認識をできなくすることが可能となり、目的タンパク質を抗体固定化担体等に結合しない状態にすることができる。また、プロテアーゼ処理によりタグペプチドが切断されたか否かを抗体との結合の有無で確認することができる。これは、タグペプチドの切断による分子量変化がわかりにくい場合に、特に有利である。
【００１１】
本発明のタグペプチドにおいて、当該タグペプチドに対する抗体のエピトープとプロテアーゼ認識配列とは、上記の状態に該当する限り、少なくとも１アミノ酸以上重複していればよいが、特に好ましくは、エピトープの範囲内にプロテアーゼ認識配列が含まれる形態、プロテアーゼ認識配列内にエピトープの範囲が含まれる形態、または、エピトープの範囲とプロテアーゼ認識配列とが一致する形態である。
【００１２】
タグペプチドを融合した目的タンパク質において、タグペプチドが目的タンパク質の生物活性や結晶構造等に何らかの影響を及ぼすことは否定できないので、タグペプチドを利用して目的タンパク質を精製した後は、タグペプチドを切り離す必要がある。図１（ａ）に示すように、従来はタグペプチド（図１（ａ）中「ｔａｇ」）とは別にプロテアーゼ認識配列（図１（ａ）中「ＴＥＶ」）を挿入する必要があった。しかし、図１（ｂ）に示すように、本発明のタグペプチド（図１（ｂ）中「ｅＴＥＶ」）にはプロテアーゼ認識配列が含まれているので、別途プロテアーゼ認識配列を挿入する必要がない。これにより、コンストラクトのデザインを飛躍的に単純化させることができ、コンストラクト作製の時間およびコストを大幅に減少させることができる。また、タグ配列部分が長すぎることによって蛋白質の機能に予想外の悪影響を及ぼす可能性を低減させる効果がある。
【００１３】
タグペプチドの切断に使用するプロテアーゼとしては、タグペプチドを融合した目的タンパク質を非特異的に切断することのないプロテアーゼであれば、特に限定されない。すなわち、本発明のタグペプチドは、プロテアーゼ認識配列を有するタグペプチドであって、該プロテアーゼ認識配列を認識し、切断するプロテアーゼは、該タグペプチドを融合した目的タンパク質を非特異的に切断しないことを特徴とすることが好ましい。具体的には、例えば、ＴＥＶプロテアーゼ、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）プロテアーゼ、エンテロキナーゼ（ＥＫ）、トロンビン（Ｔｂ）、第Ｘａ因子（Ｘａ）などが挙げられる。使用するプロテアーゼに応じて、プロテアーゼ認識配列が決定される。なお、一般に非特異的な切断を特徴とするプロテアーゼ（例えば、トリプシンのような１アミノ酸のみを認識するプロテアーゼ）であっても、目的タンパク質内に当該プロテアーゼの認識配列を持たず、タグペプチドのみに当該プロテアーゼの認識配列が含まれる場合には、本発明のタグペプチドのプロテアーゼ認識配列として使用することが可能である。
【００１４】
本発明のタグペプチドとしては、以下のアミノ酸配列（１）を有することが好ましい。
アミノ酸配列（１）：ＲＸ１Ｘ２ＬＹＸ３ＱＧＫＤＧ（配列番号１）
（Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は、同一または異なって任意のアミノ酸残基を表す。）
アミノ酸配列（１）は、後述する２Ｈ５抗体のエピトープとして必須の１位のＲ、４位のＬ、５位のＹ、８位のＧ、９位のＫ、１０位のＤ、１１位のＧを含み、かつ、ＴＥＶプロテアーゼの認識配列であるＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号３）のうち、基質として重要なＬ、Ｙ、Ｑを含む配列となっている。上記アミノ酸配列（１）において、Ｘ１は特に限定されないが、例えばグルタミン酸（Ｅ）が好ましい。Ｘ２は特に限定されないが、例えばアスパラギン（Ｎ）が好ましい。Ｘ３は特に限定されないが、例えばフェニルアラニン（Ｆ）が好ましい。
【００１５】
本発明のタグペプチドとして特に好ましくは、以下のアミノ酸配列（２）を有するタグペプチドである。
アミノ酸配列（２）：ＲＥＮＬＹＦＱＧＫＤＧ（配列番号２）
アミノ酸配列（２）は上記アミノ酸配列（１）においてＸ１にグルタミン酸（Ｅ）を、Ｘ２にアスパラギン（Ｎ）を、Ｘ３にフェニルアラニン（Ｆ）を選択したものである。以下、アミノ酸配列（２）を「ｅＴＥＶ配列」と、ｅＴＥＶ配列からなるペプチドを「ｅＴＥＶペプチド」と、ｅＴＥＶペプチドからなるタグペプチドを「ｅＴＥＶタグ」と、それぞれ称する。なお、「ｅＴＥＶペプチド」および「ｅＴＥＶタグ」には、Ｎ末端に開始コドンに由来するメチオニンが付加された１２アミノ酸からなるペプチド（ＭＲＥＮＬＹＦＱＧＫＤＧ（配列番号４））が含まれるものとする。
【００１６】
本発明のタグペプチドの他の実施形態として、上記プロテアーゼ認識配列を有するタグペプチドと第２のタグペプチドとを組み合わせてなるタグペプチドが挙げられる。第２のタグペプチドは特に限定されず、公知のタグペプチドから適宜選択して用いることができる。好ましくは、特異的抗体により認識されるタグペプチドである。具体的には、例えば、ＦＬＡＧタグ、ＭＹＣタグ、ＨＡタグ、Ｖ５タグなどが挙げられる。また、本発明者が開発したＹＰＧＱ（配列番号５）を３〜５回繰りかえしたアミノ酸配列を有するタグペプチド等も第２のタグペプチドとして好適に用いることができる。プロテアーゼ認識配列を有するタグペプチドと第２のタグペプチドとを組み合わせてなるタグペプチドは、２種類の抗体のエピトープが含まれ、２種類の抗体が同時にタグペプチドに結合可能であり、かつ、一方の抗体エピトープとプロテアーゼ認識配列とが重複している点に特徴がある。プロテアーゼ認識配列を有するタグペプチドと第２のタグペプチドとは、直接結合していてもよく、また任意のスペーサー配列が挿入されていてもよい。以下、当該タグペプチドを「ダブルタグ」と称する。
【００１７】
図２（ａ）に示すように、通常２種類の抗体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡにより目的タンパク質を検出または定量しようとすれば、２種類のタグペプチド（図２（ａ）中「ｔａｇＡ」および「ｔａｇＢ」）を用い、それぞれについてプロテアーゼ認識配列（図２（ａ）中「ＴＥＶ」および「ＥＫ」）を挿入して、例えば目的タンパク質のＮ末端とＣ末端に結合させたタグペプチド融合タンパク質のコンストラクトを作製する必要があった。しかし、ダブルタグを用いると、１つのタグペプチドでサンドイッチＥＬＩＳＡとタグペプチドの切断、除去が可能となる。したがって、コンストラクトのデザインを飛躍的に単純化させることができ、コンストラクト作製の時間およびコストを大幅に減少させることができる。また、ＮもしくはＣ末端に機能的に重要な構造があり、タグ付加ができないようなケースでも、どちらか一方にダブルタグを付加することで目的を達成することができる。
【００１８】
本発明のタグペプチドは、遺伝子工学的に任意のタンパク質と結合させてタグペプチドと任意のタンパク質との融合タンパク質とすることができる。この場合、タグペプチドをタンパク質のＮ末端およびＣ末端のいずれに結合していてもよい。このようなタグペプチドがそのＮ末端およびＣ末端に結合したタグペプチド融合タンパク質は、本発明のタグペプチドと特異的に結合する抗体を用いて１段階で高純度に精製することができる。さらに、精製後のタグペプチド融合タンパク質からタグペプチドを容易に切断し、除去することができる。また、上記抗体を用いてタグペプチド融合タンパク質を検出、定量等することができる。
【００１９】
本発明のタグペプチドは、任意の物質に化学的に結合させることができる。本発明のタグペプチドが化学結合した物質は、本発明のタグペプチドと特異的に結合する抗体を用いて簡便かつ高純度に精製することができ、また検出、定量等することができる。本発明のタグペプチドを化学的に結合させる相手の物質は限定されないが、例えば、タンパク質、核酸、糖類、有機高分子、金属などが挙げられる。
【００２０】
本発明のタグペプチドと、任意のタンパク質との融合タンパク質の製造方法の概略は、以下のとおりである。
まず、本発明のタグペプチドをコードするポリヌクレオチドを、公知の方法により合成する。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられるが、ＤＮＡが好ましい。ポリヌクレオチドがＤＮＡの場合には、ＤＮＡ合成機によりＤＮＡを合成することができる。また、ＤＮＡは、いくつかの部分に分けて合成した後、それらを連結してもよい。タグペプチドのＤＮＡ配列は、遺伝子暗号の縮重により多くの種類がありうるが、ＤＮＡから発現されるペプチドが本発明のタグペプチドのアミノ酸配列を有することになる限り、特に限定されない。ｅＴＥＶタグをコードするポリヌクレオチドとして、例えば配列番号６で示される塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。またダブルタグをコードするポリヌクレオチドとして、例えば配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
【００２１】
合成したタグペプチドをコードするＤＮＡの３’末端または５’末端に、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを連結する。あるいは、目的とするタンパク質のＤＮＡをＰＣＲ等の手法によって得る際に、ＤＮＡの３’末端または５’末端のプライマーにタグペプチドをコードするＤＮＡを使用すると、タグペプチドをコードするＤＮＡが目的タンパク質の遺伝子に連結された遺伝子を、ＰＣＲ産物として得ることができる。
【００２２】
得られたタグペプチドおよびタンパク質をコードするＤＮＡを含んだＤＮＡを発現ベクターに適宜挿入する。ベクターとしては、公知の発現ベクター（細菌由来、酵母由来、ウイルス由来など）を好適に用いることができ、特に限定されない。発現ベクターに含まれるプロモーターは、発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればよい。発現ベクターにはこれ以外に、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製オリジンなどを含有しているものを用いることができる。このように得られた発現ベクターを宿主細胞に導入する。宿主細胞としては特に限定されず、大腸菌、酵母等の微生物；動物細胞等を用いることができる。好ましい宿主細胞は、動物細胞である。発現ベクターを宿主細胞に導入する方法は、公知の形質転換の中から宿主細胞に応じて適宜選択して用いればよい。得られた組換え微生物または細胞を適当な培地で培養し、タグペプチドが結合した融合タンパク質を発現させる。タグペプチドが結合した融合タンパク質は、組換え微生物もしくは細胞中、または培養液中から、後述する抗体を用いて一段階で精製され得る。
【００２３】
上記タグペプチド融合タンパク質の製造方法において説明した本発明のタグペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを含む組換えベクターも本発明に含まれる。なお、本発明の組換えベクターはタグペプチドと目的のタンパク質との融合タンパク質（タグペプチド融合タンパク質）を発現可能な組み換えベクターに限定されず、本発明のタグペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものであればよい。
【００２４】
〔抗体〕
本発明は、上記本発明のタグペプチドに対する抗体を提供する。本発明の抗体は、本発明のプロテアーゼ認識配列を有するタグペプチドを認識し、特異的に相互作用する抗体であれば特に限定されない。本発明の抗体は、本発明のタグペプチド（プロテアーゼ認識配列を含むペプチド断片）を抗原として、公知の方法に従ってマウス、ウサギ等の哺乳動物を免疫することにより得ることができる。本発明の抗体の具体例として、ＴＥＶプロテアーゼの認識配列を含む１１アミノ酸からなるペプチド（ＲＥＮＬＹＦＱＧＫＤＣ（配列番号８））を抗原として、マウス、ウサギ等の哺乳動物を免疫することにより得られる抗体が挙げられる。また、ラット−マウス  ハイブリドーマ２Ｈ５（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２４５として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に国際寄託済み。受託日：２００８年１０月３１日）により産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。さらに、当該モノクローナル抗体の抗原認識領域をプロテアーゼ等で切り出し、Ｆｖ、ＦａｂやＦ（ａｂ’）２として用いることもできる。また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換え型のモノクローナル抗体を産生させることもできる。なお、本発明の抗体を産生するラット−マウス  ハイブリドーマ２Ｈ５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２４５）も、本発明に含まれる。
【００２５】
〔タンパク質の精製方法〕
本発明は、上記本発明の抗体を用いたタンパク質の精製方法を提供する。本発明のタンパク質の精製方法は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含む方法であればよい。本発明の抗体は、本発明のプロテアーゼ認識配列を有するタグペプチドと特異的に相互作用することから、該抗体を用いると、本発明のタグペプチドと任意のタンパク質との融合タンパク質を一段階で高純度に精製することができ、さらに容易にタグを切り離すことができる。
（ｉ）本発明のタグペプチドと目的のタンパク質との融合タンパク質を含む試料に、本発明の抗体を作用させて融合タンパク質と抗体との結合物を形成させる工程
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られた結合物に溶離物質を作用させて融合タンパク質を抗体から遊離させる工程
（ｉｉｉ）前記（ｉ）の工程で得られた融合タンパク質からタグペプチドを切断する工程
【００２６】
（ｉ）の工程において、試料は、本発明のタグペプチドと目的のタンパク質との融合タンパク質を含むものであれば特に限定されない。例えば、当該融合タンパク質を発現する形質転換細胞の培養上清、細胞溶解液等が挙げられる。融合タンパク質が封入体等の不溶性画分として得られる場合には、タンパク質の可溶化および折りたたみ（巻き戻し）を適宜行ってもよい。試料は、遠心分離等により固形成分を除去したものであることが好ましく、必要に応じてｐＨを中性（７〜８）に合わせることが好ましい。また、試料中の目的タンパク質の濃度は０．２μｇ／ｍＬ以上であることが好ましい。
【００２７】
（ｉ）の工程では、本発明の抗体を担体に固定化した固定化抗体を用いることが好ましい。抗体を固定する担体としては、本発明の効果を奏することになる限り特に限定されず、公知の担体を用いることができる。例えば、セファロース（ＧＥヘルスケア社）、アフィゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）等が好適である。抗体を担体に固定化する方法は、担体の種類等に応じて適宜選択すればよく、特に限定されない。例えば、セファロースを用いる場合には、抗体をカップリングバッファーで透析し、次いでＣＮＢｒ活性化セファロース（ＧＥヘルスケア）と抗体とを室温で約１〜２時間混合することにより、セファロース固定化抗体を作製することができる。
【００２８】
本発明のタンパク質の精製方法においては、上記固定化抗体をカラムに充填して使用するカラム法、試料と混合して懸濁状態で結合させるバッチ法をともに利用できる。前者の場合には、固定化抗体をカラムに充填し、カラムに試料を流して本発明の抗体をタグペプチドに作用させる。これにより、タグペプチドと抗体とが結合し、タグペプチド融合タンパク質と抗体との結合物が形成される。後者の場合は、試料溶液１０ｍＬあたり１００μＬ程度の固定化抗体を加えて穏やかに混和し、融合タンパク質と抗体との結合物を形成させてからカラムに充填する。
【００２９】
次いで（ｉｉ）の工程において、前記（ｉ）の工程で得られた結合物に溶離物質を作用させてタグペプチド融合タンパク質を抗体から遊離させる。すなわち、結合物に溶離物質を作用させることにより抗体とタグペプチドとを解離させ、タグペプチドを介して固定化抗体に結合したタグペプチド融合タンパク質を、抗体から遊離させる。溶離物質としては、本発明のタグペプチドと本発明の抗体との結合を解離させる作用を有する物質であればよい。このような物質として、ポリオールなどの親水性の有機溶媒、本発明のタグペプチド等が挙げられる。
【００３０】
タグペプチド融合タンパク質と抗体との結合物に溶離物質を作用させる方法としては、溶離物質を水または適当な緩衝液と混合して溶離液とし、該溶離液をカラムに流す方法が好ましい。この場合、溶離液中の溶離物質により抗体から遊離したタグペプチド融合タンパク質は、溶離液とともにカラムから溶出する。水または緩衝液は、タンパク質の種類に応じて選択すればよい。
【００３１】
溶離液中の溶離物質の含有量は、目的とするタグペプチド融合タンパク質、溶離物質の種類等により適宜変更するのが好ましい。例えば、溶離物質として親水性の有機溶媒を用いる場合には、水または緩衝液と親水性の有機溶媒との合計体積を１００として、親水性の有機溶媒を約３０％（ｖ／ｖ）以上で混合することが好ましく、約４０％（ｖ／ｖ）以上で混合することがより好ましい。水または緩衝液と親水性の有機溶媒とを体積比（水または緩衝液：親水性の有機溶媒）を約７０：３０〜３０：７０とすることが好ましい。このとき緩衝液には高濃度の塩、たとえば２ＭのＮａＣｌが含まれることが望ましい。
【００３２】
タグペプチドを溶離物質とする場合には、水または緩衝液中にタグペプチド濃度が約０．０１〜２ｍｇ／ｍＬとなるように溶離液を調製することが好ましい。より好ましくは約０．０３〜１ｍｇ／ｍＬである。溶離物質とするタグペプチドとしては、本発明のタグペプチドであれば限定されない。本発明のタグペプチドは、公知のペプチド合成法によって製造することができる。
【００３３】
タグペプチド融合タンパク質を精製した後の固定化抗体は、溶離物質を含む溶離液で十分洗浄することにより、繰り返し使用することが可能である。
【００３４】
次いで（ｉｉｉ）の工程において、前記（ｉｉ）の工程で得られたタグペプチド融合タンパク質からタグペプチドを切断する。すなわち、本発明のタグペプチドに含まれるプロテアーゼ認識配列を認識するプロテアーゼを適当な条件で作用させることにより、タグペプチドが結合していない目的タンパク質を得ることができる。
【００３５】
本発明のタンパク質の精製方法においては、タグペプチドと抗体とが特異的に相互作用し、該相互作用は、タグペプチド、親水性の有機溶媒等の溶離物質により容易に解離することから、タグペプチド融合タンパク質を一段階で高純度に精製することができる。また、溶離物質に親水性の有機溶媒等を用いることから、タグペプチド融合タンパク質および抗体を変性させることなく精製することができる。さらに、タグペプチド融合タンパク質からタグペプチドを切断し、除去することができる。したがって、本発明によれば、Ｘ線結晶構造解析のための高品質かつタグペプチドが除去された組換えタンパク質を、簡便に十分量得ることが期待できる。
【００３６】
〔タンパク質の検出または定量方法〕
本発明のタグペプチドおよび本発明の抗体を用いることにより、目的タンパク質の検出または定量を行うことができる。特に、ダブルタグを用いることにより、目的タンパク質に対する抗体が容易に入手できない場合でも、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施することが可能となり、極微量の目的タンパク質を検出することができる。さらに、複数の試料における目的タンパク質の含量を高精度で比較することができる。ダブルタグと目的タンパク質との融合タンパク質（以下、「ダブルタグ融合タンパク質」という）を、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて検出または定量する場合、本発明のプロテアーゼ認識配列を有するタグペプチドに対する抗体（本発明の抗体）と第２のタグペプチドに対する抗体との２種類の抗体を用い、いずれの抗体をキャプチャー抗体に用いてもよく、他方の抗体を検出抗体とする。試料は、ダブルタグ融合タンパク質を含むものであれば特に限定されない。例えば、ダブルタグ融合タンパク質を発現する形質転換細胞の培養上清、細胞溶解液等が挙げられる。
【００３７】
サンドイッチＥＬＩＳＡを用いてダブルタグ融合タンパク質を検出または定量する手順の概略を以下に示す。
１）予め検出抗体を何らかの手段により修飾または標識しておく。修飾または標識手段は特に限定されず、例えば、ビオチン化、ペルオキシダーゼ等の酵素標識、フルオレセインなどの蛍光色素標識、１２５Ｉなどの放射性同位元素による標識などが挙げられる。
２）キャプチャー抗体をマイクロタイタープレートに固相化する。
３）固相化したキャプチャー抗体上に、ダブルタグ融合タンパク質を含む試料を流し、ダブルタグ融合タンパク質をキャプチャー抗体に捕獲させる。
４）次いで、捕獲されたダブルタグ融合タンパク質に、検出抗体を作用させてダブルタグ融合タンパク質と検出抗体との結合物を形成させる。検出抗体を酵素標識して用いた場合には、次に６）の操作を行う。
５）検出抗体をビオチン化して用いた場合には、形成された結合物に酵素標識したストレプトアビジンを作用させ、抗体中のビオチンとストレプトアビジンとを結合させる。
６）酵素の発色または発光基質（例えば、ペルオキシダーゼであればＡＢＴＳ）を加える。酵素により基質が分解されて発色反応産物が得られるため、試料の吸光度を測定することによりダブルタグ融合タンパク質と検出抗体との結合物を検出することができる。また、吸光度は試料中のダブルタグ融合タンパク質量に定量的に相関することから、ダブルタグ融合タンパク質と抗体との結合物を定量することができる。さらに、この場合に発色基質とともに基質増感剤を併用することにより、検出感度を上げることが可能である。
【００３８】
ウェスタンブロッティングにより目的タンパク質を検出することができる。この場合、タグペプチドはダブルタグでもよいし、第２のタグペプチドを有しないタグペプチドでもよい。以下に、ウェスタンブロッティングの手順の概略を示す。
１）本発明のタグペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質を含む試料をＳＤＳ電気泳動に供し、タグペプチド融合タンパク質を分離して、ニトロセルロース膜またはＰＤＶＦ膜に転写する。
２）膜上の融合タンパク質に、本発明の抗体を作用させて結合物を形成させる。本発明の抗体を酵素標識して用いた場合には、次に４）の操作を行う。
３）本発明の抗体を酵素で標識していない場合には、２）で加えた抗体と特異的に反応する抗体（酵素標識抗体：二次抗体）をさらに作用させる。
４）酵素の基質（通常、発色または発光基質）を加え、酵素反応の生成物を検出する。
【００３９】
本発明のタグペプチドおよび本発明の抗体は、蛍光抗体法、免疫沈降法等や、検出試薬の開発、細胞イメージング、センサー開発等にも応用可能である。
【００４０】
〔キット〕
本発明は、タンパク質の発現、精製、検出または定量のためのキットを提供する。本発明のキットは、本発明の組換えベクターまたは本発明の抗体を含むものであればよい。本発明のキットを用いることにより、タンパク質の発現、精製、検出または定量を簡便に行うことができる。発現用キットには本発明の組換えベクターが必須に含まれ、精製、検出または定量用キットには、本発明の抗体が必須に含まれる。本発明の組換えベクターおよび本発明の抗体の両方を含むキットとすることが好ましい。
【００４１】
発現用キットに含まれる組換えベクターは、キットのユーザーが目的のタンパク質をコードするＤＮＡを組み込むことにより本発明のタグペプチドと目的のタンパク質が結合したタグペプチド融合タンパク質の発現ベクターを作製できる形態で提供されることが好ましい。ユーザーは、作製した発現ベクターを適当な宿主細胞に導入して宿主細胞を培養することにより、所望のタグペプチド融合タンパク質を簡便に発現させることができる。精製用キットには、本発明の抗体が適当な担体に固定化された状態で含まれることが好ましい。また、タグペプチドを切断するためのプロテアーゼが含まれていることが好ましい。発現用キットと精製用キットと組み合わせて、発現および精製用キットとすることが、より好ましい。
【００４２】
検出または定量用キットには、本発明の抗体およびダブルタグを構成する第２のタグペプチドに対する抗体が含まれることが好ましい。また、本発明の抗体および第２のタグペプチドに対する抗体のいずれか一方は、適当な標識（酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）や修飾（ビオチン化等）がされた状態で含まれることが好ましい。さらに、キットには、二次抗体、反応用緩衝液、基質、使用説明書等の構成を含んでいてもよい。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４４】
〔実施例１：モノクローナル抗体作製〕
抗ｅＴＥＶペプチド抗体は定法により以下のように作製した。
（１−１）ペプチドの合成、免疫
ＴＥＶプロテアーゼの認識配列（ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号３））を含んでさらにその両側に荷電性アミノ酸を加えた１１アミノ酸からなるペプチド（ＲＥＮＬＹＦＱＧＫＤＣ（配列番号８））をＦｍｏｃ固相法により合成した。逆層ＨＰＬＣにより精製したｅＴＥＶペプチドを、Ｃ末端のＣｙｓ残基を介してキャリアータンパク質であるｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ （ＫＬＨ）に結合させ、これを免疫原とした。このｅＴＥＶペプチド−ＫＬＨ複合体を、アジュバントとともにラット（ＳＤ、雌、８週齢）の両足の裏に皮内投与（片足１００μＬで計２００μＬ／匹）することで免疫した。免疫２週間後にＥＬＩＳＡ法にて抗体価を測定したところ、高い抗体価が得られた。このラットより摘出した腸骨リンパ細胞を融合に供した。【００４５】
（１−２）細胞融合、ハイブリドーマ樹立
上記ラットリンパ細胞とマウスミエローマ細胞（ＳＰ２／０株）とをポリエチレングリコール法にて融合した後、ＨＡＴ選択培地にて培養した。コロニーを生じたウェルの上清をＥＬＩＳＡ法にてスクリーニングし、陽性の強かったものを二次スクリーニングにまわした。二次スクリーニングでは、抗原として後述する融合蛋白質（ＴＥＶ−Ｆｎ）を使用した。その結果、反応性の高い一つのクローンを得た。当該クローンを限界希釈法によりクローニングし、最終的に抗ｅＴＥＶ抗体産生ハイブリドーマ２Ｈ５（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２４５として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に国際寄託済み。受託日：２００８年１０月３１日）を樹立した。【００４６】
（１−３）抗体の精製、セファロース固定化抗体の調製
（１）抗体の精製
１−２で樹立したハイブリドーマ２Ｈ５を、１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて培養した。この培養上清からプロテインＧセファロースを用いて２Ｈ５抗体を精製した。精製抗体のアイソタイプはＩｇＧ２ａ、軽鎖はκであった。【００４７】
（２）セファロース固定化抗体の調製
精製ＩｇＧ（約２０ｍｇ）をカップリングバッファー（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）に透析した。次いで、１ｍＭ塩酸で洗ったＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ＧＥヘルスケア）と室温で１時間混合することにより、セファロース固定化抗体を作製した。未反応の活性基を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓによってブロックし、０．１Ｍ  Ｇｌｙ−ＨＣｌ、ｐＨ ２．２で非特異的に結合した抗体を除去した。未結合の抗体の定量結果から、セファロースレジン１ｍＬあたり約２ｍｇの２Ｈ５抗体を固定化することができたことがわかった。【００４８】
〔実施例２：タグ配列融合タンパク質の作製〕
（２−１）大腸菌発現用コンストラクトによるタグ配列融合タンパク質の作製
ヒトフィブロネクチンの第９−第１０Ｆｎ３ドメイン部分の１８５残基を発現するコンストラクトを用い、そのＮ末端に、図３に示す種々のＴＥＶ由来の配列（ｅＴＥＶ配列を含む）を付加したタグ配列融合タンパク質を作製した。インサートはｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲで作製し、発現ベクターｐＥＴ１１ｃ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入した。また、Ａｌａ変異体のコンストラクトはＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）を用いて作製した。得られたコンストラクトを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換し、定法に従って発現誘導を行った。融合蛋白質は大腸菌可溶化物から陰イオン交換クロマトグラフィー（ＴＥＶ−Ｆｎ）もしくはＮｉ−ＮＴＡアガロースクロマトグラフィー（Ｈｉｓ−ｅＴＥＶ−Ｆｎなど）によって精製した。【００４９】
（２−２）動物細胞発現用コンストラクトによるタグ配列融合タンパク質の作製
ほ乳類細胞での発現用ベクターは、ｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、あるいはヒト成長因子（ｈＧＨ）融合発現ベクター（ｐＳＧＨＶ０、Ｄ.Ｌｅａｈｙ教授より供与）を用いた。各種標的タンパク質のＤＮＡ断片とｅＴＥＶ配列をコードする塩基配列とをｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲで融合し、上記ベクターのクローニングサイトへ挿入した。作製したプラスミドをヒト線維芽細胞株ＨＥＫ２９３Ｔにトランスフェクションし、得られた培養上清をプルダウン実験等に供した。【００５０】
〔実施例３：モノクローナル抗体２Ｈ５の性状解析〕
（３−１）エピトープの解析
モノクローナル抗体２Ｈ５（以下「２Ｈ５抗体」という）によって認識される必要最小のペプチド配列を、上記（２−１）で作製した各種のｅＴＥＶ−Ｆｎ融合タンパク質を用いたＥＬＩＳＡ法で調べた。プロトコールは以下のとおりである。
(1) １０μｇ／ｍＬに希釈したＨｉｓ−ｅＴＥＶ−Ｆｎ融合タンパク質（野生型または各Ａｌａ変異体）溶液５０μＬを９６ｗｅｌｌプレートに加えて静置（４℃、１６時間）した。
(2) アスピレーターで吸引し、５％ スキムミルクｉｎ  Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５）を２００μＬ／ｗｅｌｌ加えて室温で１時間静置した。
(3) ０．０１−３０μｇ／ｍＬの２Ｈ５抗体を５０μＬ加えて室温で１時間静置した。
(4) ２００μＬ／ｗｅｌｌのＴＢＳで３回洗浄した。
(5) ペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇＧ（1/1000希釈）を５０μＬ加えて室温で３０分間静置した。
(6) ２００μＬ／ｗｅｌｌのＴＢＳで４回洗浄した。
(7) ペルオキシダーゼ発色基質（ＡＢＴＳ）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、室温で５〜１０分静置後、各ｗｅｌｌ中の溶液の４０５ｎｍの吸光度を測定した。【００５１】
２Ｈ５抗体は１１残基の合成ペプチド（ＲＥＮＬＹＦＱＧＫＤＣ（配列番号８））に対して作られたものであるが（実施例１参照）、Ｃ末端のＣｙｓ残基はＫＬＨとの反応に使われているので、抗原認識に重要な残基は、原理的にはＣ末端のＣｙｓ残基を除く１０残基の内部にあるはずである。しかしながら最初に作成したスクリーニング用融合タンパク質ＴＥＶ−Ｆｎ（上記１０残基の両端にＭｅｔおよびＧｌｙが存在、図３参照）に対する結合が非常に強かったため、念のためこの両末端のアミノ酸（Ｍｅｔ０とＧｌｙ１１）のＡｌａ変異体も作成し、解析に加えた。その結果を図４に示した。図４からわかるように、Ａｌａ変異体は２Ｈ５抗体との反応性において３つのグループに分かれた。第一のグループは、その反応性が野生型のｅＴＥＶペプチドと全く変わらないもの（Ｍ０、Ｅ２、Ｎ３、Ｆ６およびＱ７）であった。第二のグループは、反応性はあるものの野生型に比べて１００倍以上低下しているもの（Ｒ１およびＧ１１）であった。第３のグループはほぼ完全に反応性が失われているもの（Ｌ４、Ｙ５、Ｇ８、Ｋ９およびＤ１０）であった。この結果は、２Ｈ５抗体が抗原ペプチドを１１残基（ＲＥＮＬＹＦＱＧＫＤＧ（配列番号２））という極めて長い領域にわたって認識して結合することを示すものであった。通常、抗ペプチド抗体が認識するのは数残基とされているところ、２Ｈ５抗体は、抗ペプチド抗体として極めて特殊な抗原結合部位を有していることが示唆された。【００５２】
（３−２）２Ｈ５抗体の抗原認識部位とＴＥＶプロテアーゼによる認識特異性との関係
ｅＴＥＶペプチドはＴＥＶプロテアーゼによって認識、切断される。２Ｈ５抗体のエピトープ決定のために作成した一連のＡｌａ変異体を用いて、ＴＥＶプロテアーゼによる認識に必須なアミノ酸残基の同定を行った。具体的には、Ｈｉｓ−ｅＴＥＶ−Ｆｎ融合タンパク質（野生型またはＡｌａ変異体）を４００μｇ／ｍＬの濃度でＴＢＳに溶解し、そこに１／１０量のＴＥＶプロテアーゼを添加し、２０℃で１６時間反応させた。ＳＤＳを加えて反応を停止し、反応液の全量を１５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。切断前の基質タンパク質は分子量２４ｋＤａの移動度を示し、ＴＥＶプロテアーゼで切断されると２０ｋＤａの位置へとシフトすることに基づき、切断を評価した。【００５３】
結果を図５に示した。図５から明らかなように、ＴＥＶプロテアーゼの基質となるためには４、５および７番目のアミノ酸（すなわちＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ）が重要であり、その他の残基はＡｌａでも差し支えないことがわかった。この結果は、すでにＤｏｕｇｈｅｒｔｙら（EMBO J., 7, 1281-1287, 1988）によって報告されている認識特異性とほぼ一致するものであったが、２番目のＧｌｕをＡｌａに変えても切断に大きな変化がないこと、４番目のＬｅｕ残基はＡｌａのような小さなアミノ酸側鎖は許容されないことなど、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙらの報告にない新しい知見が得られた。重要なことは、Ｇｌｎ７がＴＥＶプロテアーゼによる認識に重要であるのに対して２Ｈ５抗体による認識には不要であることであり、これは７番目の残基を変えることによりプロテアーゼと抗体のデュアル認識モードからシングル認識モードへとペプチドの性質を変えることが可能であることを示している。【００５４】
（３−３）結合親和性
２Ｈ５抗体のｅＴＥＶペプチドに対する結合親和性を調べるため、ビアコアによる表面プラズモン共鳴解析を行った。２Ｈ５抗体をＣＭ５センサーチップ上に固定化し、３１、６２、１２５、２５０、５００、１０００μＭの各濃度のｅＴＥＶ−Ｆｎ融合タンパク質を流してそのセンサーグラムを記録した（図６参照）。図６に示された濃度依存性からＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０プログラムを用いて親和性を測定したところ、４０ｎＭという見かけ上の解離平衡定数が得られ、２Ｈ５抗体のｅＴＥＶペプチドへの親和性は比較的高いことがわかった。【００５５】
（３−４）ウェスタンブロッティングへの応用
ｅＴＥＶ−Ｆｎ融合タンパク質を０．６３−１０ｎｇ／レーンでＳＤＳ電気泳動に供し、ＰＤＶＦ膜に転写後、１μｇ／ｍＬの２Ｈ５抗体と反応させ、続いてペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇＧとケミルミネッセンス基質によって検出した。比較のために、ＦＬＡＧペプチド融合タンパク質を同じ量電気泳動に供して、抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２（シグマ・アルドリッチ社）で検出した。結果を図７に示した。図７から明らかなように、２Ｈ５抗体は約２ｎｇ（０．０８ｐｍｏｌ）以上のｅＴＥＶペプチド融合タンパク質をウェスタンブロッティングで検出でき、その感度は市販のＦＬＡＧ／Ｍ２システムに匹敵することがわかった。【００５６】
〔実施例４：２Ｈ５抗体固定化セファロースを用いたタグ配列融合タンパク質のプルダウン〕
ｅＴＥＶタグを組み換えタンパク質の精製に使うためには、発現細胞の培養上清や、大腸菌の可溶化物といった混合物から目的タンパク質を特異的に捕捉できなければならない。これを様々なコンストラクトで調べるために、プルダウン実験を行った。【００５７】
（実験方法）
様々なｅＴＥＶタグ付加コンストラクトをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性に発現させ、その培養上清１ｍＬに対して２０μＬの２Ｈ５抗体を固定化したセファロース（以下「２Ｈ５セファロース」という）または２Ｈ５抗体を固定化していないセファロース（対照）を加えて４℃、１時間反応させた。遠心により２Ｈ５セファロースを沈降させ、ＴＢＳにて２回洗浄後、ＳＤＳサンプルバッファーで溶出し、そのままＳＤＳゲル電気泳動で分析した。ただし、目的タンパク質の分子量に応じて異なるアクリルアミド濃度のゲルを使用した。泳動したゲルはクマシーブリリアントブルーもしくは銀染色によってタンパク質を可視化した。使用したｅＴＥＶタグ付加コンストラクトは以下の通りである。
（１）ｅＴＥＶ−ＮＰ１：ｅＴＥＶタグをＮ末端に持ち、マウスのニューロピリン１のａ１ａ２ドメイン（２５１残基）からなるコンストラクト
（２）ｅＴＥＶ−ＥＧＦＰ：ｅＴＥＶタグをＮ末端に持ち、ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＧＦＰ（２４１残基）からなるコンストラクト
（３）ｈＧＨ−ｅＴＥＶ−ｓｅｍａ６Ｃ：Ｎ末端にヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、中央にｅＴＥＶタグ、Ｃ末端側にラットセマフォリン６Ｃ（ｓｅｍａ６Ｃ）をもつコンストラクト
（４）ｓｅｍａ３Ａ−ｅＴＥＶ：マウスセマフォリン３Ａ（ｓｅｍａ３Ａ）のＣ末端側にｅＴＥＶタグを持つコンストラクト【００５８】
（１）ｅＴＥＶ−ＮＰ１の結果を図８に、（２）ｅＴＥＶ−ＥＧＦＰの結果を図９に、（３）ｈＧＨ−ｅＴＥＶ−ｓｅｍａ６Ｃの結果を図１０に、（４）ｓｅｍａ３Ａ−ｅＴＥＶの結果を図１１にそれぞれ示した。図８〜１１中、Ｍは分子量マーカーを、２Ｈ５は２Ｈ５セファロースを添加した試料を、Ｃｏｎt.は対照を添加した試料を表わす。矢印は目的タンパク質のバンドを表わす。図８〜１１から明らかなように、調べた全てのコンストラクトにおいてタグ付加タンパク質が２Ｈ５セファロースに特異的に結合することがわかった。特筆すべきは、ｅＴＥＶタグが目的遺伝子のＮ末端（ｅＴＥＶ−ＮＰ１、ｅＴＥＶ−ＥＧＦＰ）、中央（ｈＧＨ−ｅＴＥＶ−ｓｅｍａ６Ｃ）、Ｃ末端（ｓｅｍａ３Ａ−ｅＴＥＶ）のどこに付加されていても、プルダウンに支障が無いことである。このことは、２Ｈ５がｅＴＥＶ配列を認識する際には、その前後の構造にはほとんど影響を受けない事を示唆している。【００５９】
〔実施例５：ｅＴＥＶタグ融合タンパク質の２Ｈ５セファロースによる精製〕
（５−１）精製効率の検討
２Ｈ５セファロースを用いて、緑色蛍光タンパク質の一種であるＧＦＰＵＶのｅＴＥＶタグ融合タンパク質（以下「ｅＴＥＶ−ＧＦＰＵＶ」ともいう）の一段階精製を行った。ＧＦＰＵＶはＵＶランプなどで蛍光観察しやすいように励起波長を短波長側にシフトさせたＧＦＰの変異体である。Ｎ末端にＰ４×３タグ、続いてｅＴＥＶ配列、その後に２３８アミノ酸からなるＧＦＰＵＶ、さらにヒスチジンタグを付加した融合タンパク質（図１２参照、配列番号９）をコードする融合遺伝子のコンストラクトを大腸菌用発現ベクターｐＥＴ１１ｂに組み込んだ。【００６０】
上記発現ベクターで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、定法に従って発現誘導を行った。この可溶性画分１ｍＬを４℃で２Ｈ５セファロース（０．５ｍＬ ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ）に通し、結合させた。未結合のタンパク質をＴＢＳで洗浄後、１００μｇ／ｍＬのｅＴＥＶペプチドを含むＴＢＳで溶出した。１フラクションあたりのサイズは０．５ｍＬとした。大腸菌破砕物の可溶性画分、並びに洗浄および溶出フラクションの各サンプルをＳＤＳゲル電気泳動に供した。
結果を図１３に示した。図１３中ｏｒｉは大腸菌破砕物の可溶性画分を示す。レーン１〜５は洗浄フラクションのサンプル、６〜１０は溶出フラクションのサンプルを示す。図１３からわかるように、ＧＦＰＵＶは大腸菌破砕物の可溶性画分に３０ｋＤａ付近のバンドとして確認された（図１３の矢印）。そして、２Ｈ５セファロースによるアフィニティクロマトグラフィーによって、ＧＦＰＵＶは１段階で完全に精製することが可能であった。各フラクションの蛍光（Ｅｘ４９０ｎｍ／Ｅｍ５２０ｎｍ）測定によって収率を計算すると、発現していたＧＦＰＵＶの約９３％が溶出画分に回収されていたことが明らかとなった。【００６１】
（５−２）溶出条件の検討
２Ｈ５セファロースからｅＴＥＶ−ＧＦＰＵＶを溶出する際の緩衝液の条件について検討した。まず、競合的な溶出を行うためのペプチドの濃度条件を検討した。上記（５−１）と同様に、ｅＴＥＶ−ＧＦＰＵＶ発現大腸菌の可溶性画分を２Ｈ５セファロースに通し、未結合のタンパク質をＴＢＳで洗浄後、０〜１０００μｇ／ｍＬの各濃度ｅＴＥＶペプチドを含むＴＢＳで溶出した。
結果を図１４に示した。図１４中、Ｍは分子量マーカーを、ｏｒｉは大腸菌破砕物の可溶性画分を示す。図１４から明らかなように、ｅＴＥＶペプチド３０μｇ／ｍＬという低濃度で２Ｈ５セファロースからｅＴＥＶ−ＧＦＰＵＶを完全に溶離することができた。通常、抗ペプチド抗体レジンからの競合的な溶出には１００〜５００μｇ／ｍＬのペプチド溶液が用いられることから考えると、２Ｈ５抗体を用いたｅＴＥＶタグタンパク質の精製システムは極めて安価に構築できることが示唆された。【００６２】
次に、水溶性の有機溶媒やカオトロピックイオンを含む緩衝液を用い、それぞれの溶出能を調べた。結果を図１５に示した。使用した緩衝液は以下のとおりである。
レーン１：０．１ｍｇ／ｍＬのｅＴＥＶペプチドを含むＴＢＳ
レーン２：４０％プロピレングリコール＋２Ｍ ＮａＣｌ
レーン３：４０％プロピレングリコール＋２Ｍ ＮａＩ
レーン４：２Ｍ ＮａＩ
レーン５：０．１Ｍ Ｇｌｙ−ＨＣｌ, ｐＨ３．０
図１５から明らかなように、４０％プロピレングリコール＋２Ｍ ＮａＣｌという条件で２Ｈ５セファロースからｅＴＥＶ−ＧＦＰＵＶの溶出が見られ（レーン２）、その効率は０．１ｍｇ／ｍＬのｅＴＥＶペプチドを含むＴＢＳによる溶出（レーン１）の５０％程度であった。カオトロピックイオンであるヨウ化物イオンを含む２Ｍのヨウ化ナトリウムでは溶出は非常にわずかであった（レーン４）。ｐＨ３．０の酸性条件では１００％近い溶出が見られたが（レーン５）、この条件では２Ｈ５セファロースからの抗体の解離が見られ（図１５中の※印で示したバンド）、抗体カラムの繰り返し使用という点で問題があることがわかった。
以上の結果から、精製の際に２Ｈ５セファロースからの目的のｅＴＥＶタグ融合タンパク質を溶出するためには３０μｇ／ｍＬ以上のｅＴＥＶペプチド溶液を用い、レジンの再生のためには４０％プロピレングリコールと２Ｍ ＮａＣｌを含む中性緩衝液を用いればよいことがわかった。完全なレジンの再生は、上の緩衝液をカラムの１００倍量程度流すことで得られることを確認した。【００６３】
〔実施例５：他のタグと組み合わせたダブルタグシステムの構築〕
ｅＴＥＶタグを他のペプチドタグとつなげて一続きの「ダブルタグ」とすることで、組み換えタンパク質の精製やサンドイッチＥＬＩＳＡなどが簡易化できる。そこで、このことを確認するために、図１６に示したターゲットタグとｅＴＥＶタグとを結合した３３アミノ酸のタグ配列（配列番号１０、以下「Ｗタグ」という）をデザインし、これを融合したタンパク質の発現を行った。ＷタグはＧＦＰＵＶもしくはＦｎのＮ末端に融合し、これらを大腸菌にて発現・精製したのち、以下の要領でサンドイッチＥＬＩＳＡを行った。
すなわち、抗ターゲットタグ抗体であるＰ２０．１抗体（マウスＩｇＧ）１０μｇ／ｍＬをマイクロタイタープレートに固相化し、ブロッキング後、精製したＷタグ融合ＧＦＰＵＶ（Ｗ−ＧＦＰＵＶ）あるいはＷタグ融合Ｆｎ（Ｗ−Ｆｎ）を０．００３〜３μｇ／ｍＬの濃度に希釈してウェルに加え、４℃で一晩キャプチャーした。洗浄後、ビオチン化２Ｈ５抗体（５μｇ／ｍＬ）を室温で３０分反応させ、３回洗浄後にペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Zymed）を加えてさらに室温で１５分静置し、ペルオキシダーゼ基質（ABTS）を加えて４０５ｎｍの吸光度を測定した。【００６４】
結果を図１７に示した。図１７から明らかなように、Ｗタグを付加した２種類のタンパク質は２種類の抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、ともに良好な濃度依存的シグナルを与え、１μｇ／ｍＬ以下の濃度でその定量が可能であることがわかった。このことは、隣接したタグ配列に対する２つの抗体が同時に結合できることを示している。ただし、Ｗ−ＧＦＰＵＶとＷ−ＦｎとでサンドイッチＥＬＩＳＡの濃度依存性に３倍程度の差があることから、Ｐ２０．１抗体あるいは２Ｈ５抗体のタグ配列への結合に対して、融合パートナーとなるタンパク質の性質や構造が影響を与えうることが示唆された。
上記のＷタグ融合タンパク質においては、Ｐ２０．１抗体あるいは２Ｈ５抗体を用いたアフィニティー精製、およびＴＥＶプロテアーゼによる切断という点についてもシングルタグの時と同様に可能であることが確認でき、Ｗタグが望み通りの一人二役を果たすことができると結論した。【００６５】
〔実施例７：Ｗタグを用いた安定発現細胞の迅速スクリーニング〕
Ｗタグ融合タンパク質の発現ベクターを構築し、ＨＥＫ３９２Ｔ細胞またはＨＥＫ２９３ＳＧｎＴ１−細胞にトランスフェクションして、目的タンパク質高発現株のスクリーニングを行った。発現ベクターには、ｐＣＤ−ＮＷ３を使用した（図１８参照）。培地には、１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を添加した１０％牛胎児血清含有ダルベッコＭＥＭ培地を使用した。スクリーニングは、実施例６と同様のサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて行った。具体的には、Ｐ２０．１抗体１０μｇ／ｍＬをマイクロタイタープレートに固相化し、ブロッキング後、培養上清をウェルに加え、４℃で一晩キャプチャーした。洗浄後、ビオチン化２Ｈ５抗体（５μｇ／ｍＬ）を室温で３０分反応させ、３回洗浄後にペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Zymed）を加えてさらに室温で１５分静置し、ペルオキシダーゼ基質（ABTS）を加えて４０５ｎｍの吸光度を測定した。【００６６】
（７−１）オータキシン（Autotaxin、癌細胞転移促進因子）発現細胞
オータキシンのＮ末端にＷタグが融合した発現ベクターを構築し、ＨＥＫ２９３ＳＧｎＴ１−細胞にトランスフェクションした。２０日間培養してＧ４１８耐性細胞を選択し、得られたクローンを一次スクリーニングに供した。一次スクリーニングの結果を図１９（ａ）に示した。発現量の高い３クローン（５Ｇ３、５Ｈ１１、３Ｃ１１）を選択し、二次スクリーニングに供した。二次スクリーニングでは、各クローンにつき、１０倍希釈した培養上清、３倍希釈した培養上清および希釈していない培養上清を試料とした。二次スクリーニングの結果を図１９（ｂ）に示した。二次スクリーニングの結果から、クローン５Ｇ３をオータキシン高発現株として選択した。【００６７】
（７−２）ＣＲＩＳＰａ（Cysteine-rich secretory protein a、蛇毒由来血管透過性亢進因子）発現細胞
ＣＲＩＳＰａのＮ末端にＷタグが融合した発現ベクターを構築し、ＨＥＫ３９２Ｔ細胞にトランスフェクションした。１２日間培養してＧ４１８耐性細胞を選択し、得られたクローンをスクリーニングに供した。スクリーニングの結果を図２０に示した。スクリーニングの結果から、クローン＃１７をＣＲＩＳＰａ高発現株として選択した。【００６８】
（７−３）セマフォリン３Ａ（Semaphorin 3A、神経ニューロンガイダンス因子）発現細胞
セマフォリン３ＡのＮ末端にＷタグが融合した発現ベクターを構築し、ＨＥＫ３９２Ｔ細胞にトランスフェクションした。１４日間培養してＧ４１８耐性細胞を選択し、得られたクローンを一次スクリーニングに供した。一次スクリーニングの結果を図２１（ａ）に示した。発現量の高い３クローン（１Ａ２、１Ｂ３、２Ｆ３）を選択し、二次スクリーニングに供した。二次スクリーニングでは、各クローンにつき、１０倍希釈した培養上清、３倍希釈した培養上清および希釈していない培養上清を試料とした。二次スクリーニングの結果を図２１（ｂ）に示した。二次スクリーニングの結果から、クローン２Ｆ３をセマフォリン３Ａ高発現株として選択した。【００６９】
以上のように、目的タンパク質の抗体が容易に入手できない場合でも、Ｗタグを用いることにより、目的タンパク質の発現量を高精度で検出、比較することができ、目的タンパク質の高発現株を簡便に選択できることが示された。【００７０】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、組換えタンパク質を、容易な操作で高純度に、しかも安価に精製できるシステムに使用できるものであり、組換えタンパク質を利用する産業、例えば医薬品産業、研究試薬産業、食品産業等に有用である。
【受託番号】
【００７２】
ハイブリドーマ  ２Ｈ５  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２４５
【図１（ａ）】
2010123013.tif 000002
【図１（ｂ）】
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【図２（ａ）】
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【図２（ｂ）】
2010123013.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９（ａ）】
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【図１９（ｂ）】
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【図２０】
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【図２１（ａ）】
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【図２１（ｂ）】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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