(57)【要約】  シルクフィブロイン水溶液に脂肪族カルボン酸を添加したシルクフィブロイン溶液を凍結し、次いで融解することにより、多孔質体を得ることを特徴とするシルクフィブロイン多孔質体の製造方法である。  すぐれた力学的特性を有するシルクフィブロイン多孔質体を製造する方法を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シルクフィブロイン水溶液に脂肪族カルボン酸を添加したシルクフィブロイン溶液を凍結し、次いで融解することにより、多孔質体を得ることを特徴とするシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
【請求項２】
融解後に得られた前記多孔質体を、純水中に浸漬して前記脂肪族カルボン酸を除去する工程又は凍結乾燥して前記脂肪族カルボン酸を除去する工程をさらに含む請求項１に記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
【請求項３】
前記脂肪族カルボン酸を添加したシルクフィブロイン溶液を凍結前に、一定時間過冷却状態で保持することを特徴とする請求項１又は２に記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
【請求項４】
前記脂肪族カルボン酸の添加量が、シルクフィブロイン溶液中で０．０１〜１８．０質量％である請求項１〜３のいずれかに記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
【請求項５】
シルクフィブロインの濃度が、前記脂肪族カルボン酸を添加したシルクフィブロイン溶液中で０．１〜４０質量％である請求項１〜４のいずれかに記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
【請求項６】
前記脂肪族カルボン酸が、炭素数１〜６の飽和又は不飽和のモノカルボン酸、ジカルボン酸、及びトリカルボン酸からなる群から選ばれる１種以上である請求項１〜５のいずれかに記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
【請求項７】
前記脂肪族カルボン酸が、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、コハク酸、乳酸、アクリル酸、２−ブテン酸及び３−ブテン酸からなる群から選ばれる１種以上である請求項６に記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シルクフィブロイン多孔質体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質や糖類などの生物由来物質を利用して作製可能である多孔質体は、創傷被覆材、止血スポンジ、薬剤徐放担体等の医療分野、紙おむつや生理用品等の生活日用品分野、微生物や細菌等の住処になる支持体として活用しうる浄水分野、エステティックサロンや個人での使用による保湿等を目的とした化粧品・エステ分野、組織工学や再生医工学における細胞培養支持体や組織再生支持体など産業上幅広い分野で利用される。
これら多孔質体を構成する生体由来物質としては、セルロースやキチン等の糖類、コラーゲン、ケラチン、シルクフィブロイン等のタンパク質群が知られている。【０００３】
このうち、タンパク質としては、コラーゲンが一番よく利用されてきたが、ＢＳＥ問題が発生してから牛由来のコラーゲンを利用することが非常に難しくなってきた。また、ケラチンは、羊毛や羽毛から得ることができるが、原料入手に問題があり、工業的に利用することは難しい。羊毛は、原料価格が非常に高騰しており、羽毛に関しては市場がないため、原料を入手することができない。これらに対して、シルクフィブロインは、原料入手の観点からは、安定に供給されることが期待でき、さらに価格も安定しているので、工業的に利用することが容易である。
シルクフィブロインは、衣類用途以外に、手術用縫合糸として長く使用されてきた実績があり、現在では食品や化粧品の添加物としても利用され、人体に対する安全性にも問題がないことから上記した多孔質体の利用分野に十分利用可能である。【０００４】
シルクフィブロイン多孔質体を作製する手法に関しては、いくつか報告がある。例えば、シルクフィブロイン水溶液を急速冷凍したのち結晶化溶媒に浸漬し、融解と結晶化を同時進行することによって得る方法がある（特許文献１）。しかしながら、この方法は結晶化溶媒である有機溶媒を大量に使用する必要があり、さらに溶媒の残留の可能性も否定できず、医療分野等の上記した応用分野での使用には問題がある。次に、シルクフィブロイン水溶液のｐＨを６以下に保持してゲル化させるか又はその水溶液に貧溶媒を添加してゲル化させ、得られたゲルを凍結乾燥して多孔質体を作製する方法がある（特許文献２）。しかしながら、この方法は十分な強度をもった多孔質体を得ることはできない。他に、シルクフィブロイン水溶液を冷凍した後に長時間凍結状態を維持することで多孔質体を作製する手法が報告されている（特許文献３）。しかしながら、発明者らの検討ではこの手法は再現性が乏しく、多孔質体が作製できないことが多い。
上記したシルクフィブロイン多孔質体の作製手法と比較すると、確実で簡便な手法が報告されている（特許文献４；非特許文献１）。シルクフィブロイン水溶液に対して少量の有機溶媒を添加した後に、一定時間冷凍して融解することによってシルクフィブロイン多孔質体が得られる手法である。この手法では、少量使用した有機溶媒も超純水による洗浄工程による除去から残留有機溶媒もほぼなくなり、さらには、得られた含水状態の多孔質体は、それまでに報告されていたものよりも強度が高く形態安定性に優れている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平８−４１０９７号公報
【特許文献２】特公平６−９４５１８号公報
【特許文献３】特開２００６−２４９１１５号公報
【特許文献４】特許第３４１２０１４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，６，３１００−３１０６（２００５）
【発明の開示】
【０００７】
多孔質体の使用される分野や使用方法にもよるが、特許文献４による手法により作製された多孔質体でも強度が足りない場合があり、さらなる強度向上が望まれていた。
そこで、本発明は、すぐれた力学的特性を有するシルクフィブロイン多孔質体を製造する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、シルクフィブロイン水溶液に脂肪族カルボン酸を添加した溶液を凍結させ、次いで融解することによって、強度が高い多孔質体が得られることを見出した。
すなわち、本発明は、シルクフィブロイン水溶液に脂肪族カルボン酸を添加したシルクフィブロイン溶液を凍結させ、次いで融解することにより、多孔質体を得るシルクフィブロイン多孔質体の製造方法を提供するものである。
【０００９】
本発明によれば、強度が高いシルクフィブロイン多孔質体を簡便に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図２】実施例２で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図３】実施例３で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図４】実施例４で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図５】実施例５で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図６】実施例６で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図７】実施例７で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図８】実施例８で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図９】実施例９で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１０】比較例１で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１１】比較例２で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１２】比較例３で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１３】比較例４で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１４】比較例５で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１５】比較例６で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１６】比較例７で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１７】比較例８で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１８】比較例９で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図１９】比較例１０で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図２０】比較例１１で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図２１】比較例１２で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図２２】実施例１０〜１３で作製したシルクフィブロイン多孔質体の２５％圧縮硬さを示すグラフである。
【図２３】実施例１０で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図２４】実施例１２で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図２５】実施例１４〜１６で作製したシルクフィブロイン多孔質体の２５％圧縮硬さをしめすグラフである。
【図２６】実施例１４で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図２７】実施例１５で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図２８】実施例１６で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図２９】実施例１７〜１９で作製したシルクフィブロイン多孔質体の２５％圧縮硬さを示すグラフである。
【図３０】実施例１７で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図３１】実施例１８で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図３２】実施例１９で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図３３】実施例２０〜２２で作製したシルクフィブロイン多孔質体の力学的特性を示すグラフである。
【図３４】実施例２０で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図３５】実施例２１で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図３６】実施例２２で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法は、シルクフィブロイン水溶液に脂肪族カルボン酸を添加したシルクフィブロイン溶液を凍結させ、次いで融解することにより多孔質体を得ることを特徴とする。
また、本発明の製造方法においては、融解後に得られた多孔質体を純水中に浸漬して、又は凍結乾燥により前記脂肪族カルボン酸を除去する工程をさらに有することが好ましい。【００１２】
本発明において用いられるシルクフィブロインは、家蚕、野蚕、天蚕等の蚕から産生されるものであればいずれでもよく、その製造方法も問わない。本発明では、シルクフィブロイン水溶液として用いるが、シルクフィブロインは溶解性が悪く、直接水に溶解することが困難である。シルクフィブロイン水溶液を得る方法としては、公知のいかなる手法を用いてもよいが、高濃度の臭化リチウム水溶液にシルクフィブロインを溶解後、透析による脱塩、風乾による濃縮を経る手法が簡便である。
本発明のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法において、シルクフィブロインの濃度は、脂肪族カルボン酸を添加したシルクフィブロイン溶液中で０．１〜４０質量％であることが好ましく、０．５〜２０質量％であることがより好ましく、１．０〜１２質量％であることがさらに好ましい。この範囲内に設定することで、十分な強度を持った多孔質体を効率的に製造することができる。【００１３】
本発明において、シルクフィブロイン水溶液に添加する脂肪族カルボン酸としては、特に制限はないが、水溶性のものが好ましく、水への溶解度が高いものがより好ましい。また、本発明において用いられる脂肪族カルボン酸としては、ｐＫａが、５．０以下のものが好ましく、３．０〜５．０のものがより好ましく、３．５〜５．０のものがさらに好ましい。
本発明において用いられる脂肪族カルボン酸としては、たとえば、炭素数１〜６の飽和または不飽和のモノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸を好ましく用いることができ、例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、コハク酸、乳酸、アクリル酸、２−ブテン酸、３−ブテン酸等が挙げられる。これらの脂肪族カルボン酸は、単独あるいは２種以上組み合わせて使用することができる。
シルクフィブロイン水溶液に添加する脂肪族カルボン酸の量は、シルクフィブロイン溶液中で０．０１〜１８．０質量％であることが好ましく、０．１〜５．０質量％であることがより好ましい。この範囲内に設定することで、十分な強度を持った多孔質体を製造することができる。【００１４】
本発明の製造方法では、シルクフィブロイン水溶液に脂肪族カルボン酸を添加した溶液を型あるいは容器に流し込み、低温恒温槽中に入れて凍結させ、次いで融解することによって、シルクフィブロイン多孔質体を製造する。
凍結温度としては、脂肪族カルボン酸を添加したシルクフィブロイン水溶液が凍結する温度であれば特に制限されないが、−１〜−４０℃程度が好ましく、−５〜−４０℃程度がより好ましく、−１０〜−３０℃がさらに好ましい。
凍結時間としては、脂肪族カルボン酸を添加したシルクフィブロイン水溶液が十分に凍結し、かつ凍結状態を一定時間保持できるよう、２時間以上であることが好ましく、４時間以上であることがさらに好ましい。【００１５】
凍結の方法としては、脂肪族カルボン酸を添加したシルクフィブロイン水溶液を一気に凍結温度まで下げて凍結してもよいが、凍結の前に脂肪族カルボン酸を添加したシルクフィブロイン水溶液を一旦、４〜−９℃程度、好ましくは０〜−５℃程度で３０分以上保持して反応容器内を均一にしてから、凍結温度まで下げて凍結した方が均一な構造のシルクフィブロイン多孔質体を得る上で好ましい。さらに、この保持する温度を−１〜−９℃程度、好ましくは−１℃〜−５℃程度にした場合には、シルクフィブロイン水溶液が、凍結の前に過冷却状態となる温度（過冷却温度）になり、より均一な構造のシルクフィブロイン多孔質体を得ることができる。また、この過冷却温度に保持する時間を調整すること、過冷却温度から凍結温度に下げるまでの温度勾配を調整すること等により、さらに均一な構造のシルクフィブロイン多孔質体を得ることができるほか、多孔質体の構造や強度をある程度制御することが可能である。
その後に、凍結したシルクフィブロイン溶液を、融解することによってシルクフィブロイン多孔質体を得ることができる。融解の方法としては、特に制限はなく、自然融解や恒温槽での保管等が挙げられる。【００１６】
得られた多孔質体には脂肪族カルボン酸が含まれるが、用途によっては、脂肪族カルボン酸を除去又はその濃度を調整する必要がある。その場合には、シルクフィブロイン多孔質体製造後に、適当な方法で多孔質体中の脂肪族カルボン酸を除去し、その濃度を調整することができる。具体的には、多孔質体を、純水中に浸漬して透析することが最も簡便な方法として挙げられる。
また、シルクフィブロイン多孔質体製造後に、水分濃度を調整する方法としては、例えば、シルクフィブロイン多孔質体を乾燥して水分を蒸発させる方法が挙げられる。乾燥の方法としては、自然乾燥、凍結乾燥、加熱乾燥などが挙げられるが、乾燥時の収縮が抑えられるという観点からは、凍結乾燥が好ましい。多孔質体を凍結乾燥等により乾燥することによって、脂肪族カルボン酸と水分を同時に除去することが可能である。【００１７】
なお、本発明の製造方法により得られるシルクフィブロイン多孔質体は、多孔質体作製時の型あるいは容器を適宜選択することにより、フィルム状、ブロック状、管状等、目的に応じた形状とすることができる。【００１８】
本発明の製造方法により得られるシルクフィブロイン多孔質体は、スポンジ状の多孔質構造を有しており、通常この多孔質体には凍結乾燥等により水除去を行わなければ水が含まれ、含水状態で堅い構造物である。
本発明の製造方法により得られる多孔質体中の細孔の大きさ（細孔直径）は、通常、１０〜３００μｍである。また、多孔質体を凍結乾燥することにより、シルクフィブロイン多孔質体の乾燥品を得ることができる。
本発明の製造方法により得られるシルクフィブロイン多孔質体は、すぐれた力学的特性を有する。すなわち、特許文献４において使用されている有機溶媒であるメタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、グリセロール、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ピリジン、アセトン、アセトニトリルを用いた多孔質体よりも大きな引張り強度を有し、また、相対的に大きな伸びを有する。【００１９】
本発明の製造方法により得られるフィブロイン多孔質体は、吸水性が高く、かつ安全性にも問題がないことから、保湿等を目的とした化粧品・エステ分野等に広く適用することができる。具体的には、ピーリングパックや化粧用パフとして好適に使用することができる。また、凍結に用いる容器の形状を変えることで、所望の形状のものを容易に得ることができることから、例えば、顔の形状に合わせたフェイスマスクとして好適に使用することができる。
また、本発明の製造方法により得られるフィブロイン多孔質体は、吸水量を変えることでその重さを制御することができ、かつ安全性にも問題がないことから、例えば、内視鏡観察下で切除された生体組織を牽引するための重りとして、好適に使用し得る。
その他、本発明の製造方法により得られるフィブロイン多孔質体は、強度・吸水性が高く、かつ安全性にも問題がないことから、創傷被覆材や薬剤徐放担体、止血スポンジ等の医療分野、紙おむつや生理用品等の生活日用品分野、組織工学や再生医工学における細胞培養支持体や組織再生支持体、浄水用途・環境分野における微生物や細菌等の住処になる支持体などに好適に使用することができる。
【実施例】
【００２０】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によってなんら限定されるものではない。【００２１】
実施例１
（シルクフィブロイン溶液の調製）
シルクフィブロイン溶液は、フィブロイン粉末（ＫＢセーレン社製、商品名：「ＳｉｌｋｐｏｗｄｅｒＩＭ」）を９Ｍ臭化リチウム水溶液に溶解し、遠心分離で不溶物を除去したのち、超純水に対して透析を繰り返すことによって得た。得られたシルクフィブロイン溶液を透析チューブ中で風乾し濃縮した。この濃縮液に蟻酸水溶液を添加し、シルクフィブロイン濃度が５質量％、蟻酸濃度が２質量％であるシルクフィブロイン溶液を調製した。
（シルクフィブロイン多孔質体の製造）
このシルクフィブロイン溶液をアルミ板で作製した型（内側サイズ；８０ｍｍ×４０ｍｍ×４ｍｍ）に流し込み、低温恒温槽（ＥＹＥＬＡ社製ＮＣＢ−３３００）に入れて凍結保存した。
（凍結条件）
凍結は、予め−５℃に冷却しておいた低温恒温槽中にシルクフィブロイン溶液を入れた型を投入して２時間保持し、その後、冷却速度３℃／ｈで槽内が−２０℃になるまで、５時間かけて冷却した後、−２０℃で５時間保持した。
凍結した試料を自然解凍で室温に戻した後、型から取り出し、超純水に浸漬し、超純水を１日２回、３日間交換することによって、使用した蟻酸を除去した。【００２２】
得られたシルクフィブロイン多孔質体の力学的特性を、ＩＮＳＴＲＯＮ社マイクロテスター５５４８型を用いて評価した。作製したシルクフィブロイン多孔質体から４０ｍｍ×４ｍｍ×４ｍｍの試験片を切り出し、この試験片を２ｍｍ／ｍｉｎの条件で引っ張った際の引っ張り強度（最大破断強度）と最大（破断）ひずみ（伸び）を測定した。また、強度とひずみをグラフ化した時の傾きから弾性率を求めた。その結果を表１に示す。なお、測定結果は、作製した多孔質体から５点の試験片を切り出し、さらに異なる日に作製した多孔質体から５点の試験片を切り出し、それら１０点について測定を行った平均値を示している。【００２３】
また、得られたシルクフィブロイン多孔質体の構造を、走査型電子顕微鏡を用いて観察した。走査型電子顕微鏡は、Ｐｈｉｌｉｐｓ社製ＸＬ３０−ＦＥＧを使用して、低真空無蒸着モード、加速電圧１０ｋＶで測定を行った。なお、シルクフィブロイン多孔質体の構造は、多孔質体の表面ではなく、多孔質体を切断して露出させた内部を観察した。得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図１に示す。【００２４】
また、得られたシルクフィブロイン多孔質体を超純水中に浸漬して平衡状態まで含水させ、湿重量を測定した（Ｗａ）。この多孔質体を凍結乾燥して充分に乾燥し、多孔質体の乾燥重量を測定した（Ｗｂ）。これらの値から多孔質体の含水率を次式に従って算出した。結果は後述する。
含水率（％）＝（Ｗａ−Ｗｂ）×１００／Ｗａ【００２５】
実施例２
実施例１において、蟻酸に代えて、酢酸を用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表１に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図２に示す。【００２６】
実施例３
実施例１において、蟻酸に代えて、プロピオン酸を用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表１に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図３に示す。【００２７】
実施例４
実施例１において、蟻酸に代えて、酪酸を用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表１に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図４に示す。【００２８】
実施例５
実施例１において、蟻酸に代えて、コハク酸を用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表１に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図５に示す。【００２９】
実施例６
実施例１において、蟻酸に代えて、乳酸を用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表１に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図６に示す。【００３０】
実施例７
実施例１において、蟻酸に代えて、アクリル酸を用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表１に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図７に示す。【００３１】
実施例８
実施例１において、蟻酸に代えて、２−ブテン酸を用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表１に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図８に示す。【００３２】
実施例９
実施例１において、蟻酸に代えて、３−ブテン酸を用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表１に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図９に示す。【００３３】
比較例１
実施例１において、蟻酸に代えて、メタノールを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表１に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図１０に示す。【００３４】
比較例２
実施例１において、蟻酸に代えて、エタノールを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表１に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図１１に示す。【００３５】
比較例３
実施例１において、蟻酸に代えて、イソプロパノールを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表１に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図１２に示す。【００３６】
比較例４
実施例１において、蟻酸に代えて、ブタノールを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表１に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図１３に示す。【００３７】
比較例５
実施例１において、蟻酸に代えて、ｔ−ブタノールを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表１に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図１４に示す。【００３８】
比較例６
実施例１において、蟻酸に代えて、グリセロールを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表１に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図１５に示す。【００３９】
比較例７
実施例１において、蟻酸に代えて、ＤＭＳＯを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表１に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図１６に示す。【００４０】
比較例８
実施例１において、蟻酸に代えて、ＤＭＦを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表１に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図１７に示す。【００４１】
比較例９
実施例１において、蟻酸に代えて、ピリジンを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表１に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図１８に示す。【００４２】
比較例１０
実施例１において、蟻酸に代えて、アセトニトリルを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表１に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図１９に示す。【００４３】
比較例１１
実施例１において、蟻酸に代えて、アセトンを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表１に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図２０に示す。【００４４】
比較例１２
特許文献２の実施例８では、シルクフィブロイン水溶液に酢酸溶液を加えてゲル状物を析出させ、得られたゲルを凍結乾燥して多孔質体を得ている。その記載の通りの追試ではゲルを生成しなかったが、下記条件でゲル状物及び多孔質体を得た。
まず、５％シルクフィブロイン水溶液５０ｍＬにｐＨ２．６５酢酸溶液を１３０ｍＬ加え（この段階でｐＨ３．０）、得られた溶液を５℃で４０時間静置したところ、ゲルが生成した。得られたゲルを遠心分離して、上澄み液を除去した後に、−３０℃で３時間凍結後、凍結乾燥を５０時間行ったところ、多孔質体が得られた。その多孔質体の力学的特性評価結果を表１に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図２１に示す。【００４５】
【表１】
2010116994.tif 000002
【００４６】
表１に示す結果から、脂肪族カルボン酸を用いた実施例１〜９のシルクフィブロイン多孔質体の引っ張り強度は、特許文献４で使用されている有機溶媒である、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ｔ−ブタノール、グリセロール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ピリジン、アセトニトリル、アセトンを用いた比較例１〜１１のいずれのシルクフィブロイン多孔質体の引っ張り強度よりも大きいことがわかる。また、実施例１〜９のシルクフィブロイン多孔質体は、最大ひずみ（伸び）も大きい。更に、実施例１〜９で作製した多孔質体は、比較例１２と比較した場合には、高い引っ張り強度を示した。
また、図１によると、実施例１で作製したシルクフィブロイン多孔質体は、比較的薄い壁と数十μｍの空孔からなる多孔質構造である。実施例２〜９で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面（図２〜９）についても、ほぼ同様の走査型電子顕微鏡写真を得た。
なお、比較例のシルクフィブロイン多孔質体の断面（図１０〜２０）も同様の多孔質構造を有するものと、層状構造的なものとがあったが、それら構造と力学的特性との相関は認められなかった。また、比較例１２では、明確な多孔質構造を確認することはできなかった。
実施例１〜９で作製したシルクフィブロイン多孔質体の含水率は、比較例１〜１１で作製した多孔質体の含水率とほぼ同じであり、９４％〜９６％の範囲にあることが分かった。なお、比較例１２で作製した多孔質体は、非常に脆く、含水率を算出することはできなかった。
なお、上記実施例で得られたシルクフィブロイン多孔質体を培養床として用いて、光合成細菌を培養したところ、細菌の増殖が確認された。【００４７】
実施例１０
実施例１において、蟻酸に代えて酢酸を用い、アルミ板で作製した型を内側サイズ８０ｍｍ×４０ｍｍ×１０ｍｍとし、凍結条件を以下としたこと以外は実施例１と同様にして、フィブロイン多孔質体を得た。なお、得られた多孔質体は、実施例１に記載と同様の方法で酢酸を除去した。
（凍結条件）
凍結は、予め−１℃に冷却しておいた低温恒温槽中にシルクフィブロイン溶液を入れた型を投入して０．５時間保持し、その後冷却速度３℃／ｈで槽内が−２０℃になるまで、６時間２０分かけて冷却した後、−２０℃で５時間保持した。凍結した試料を自然解凍で室温に戻した後、型から取り出すことによってフィブロイン多孔質体を得た。該フィブロイン多孔質体は、型として用いた容器の形状を保持したものとなった。
該フィブロイン多孔質体について、以下の方法で２５％圧縮硬さを測定した。
（圧縮試験による２５％圧縮硬さの測定）
得られたフィブロイン多孔質体を純水中に1日静置し完全に吸水させた後、その硬さを圧縮試験機で測定した。圧縮試験機は、（株）島津製作所製ＥＺ  Ｔｅｓｔを、ロードセルは１０Ｎと５０Ｎのものを、ロードプレートは直径８ｍｍのものを使用した。多孔質体を１ｍｍ／ｍｉｎの速度で初期厚さの２５％圧縮し、その時かかっている荷重を読み取り２５％圧縮硬さとした。２５％圧縮硬さを図２２及び表２に示す。
なお、測定結果は、作製した多孔質体の任意の５箇所、及び異なる日に作成した多孔質体の任意の５箇所、計１０箇所について測定を行った平均値（±標準偏差）である。
また、該シルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図２３に示す。【００４８】
実施例１１
実施例１０において、−１℃に維持した時間を０．５時間から５時間に変えたこと以外は実施例１０と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の２５％圧縮硬さを図２２及び表２に示す。【００４９】
実施例１２
実施例１０において、−１℃に維持した時間を０．５時間から１０時間に変えたこと以外は実施例１０と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の２５％圧縮硬さを図２２及び表２に示す。また、該フィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図２４に示す。【００５０】
実施例１３
実施例１０において、−１℃に維持した時間を０．５時間から５０時間に変えたこと以外は実施例１０と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の２５％圧縮硬さを図２２及び表２に示す。【００５１】
【表２】
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【００５２】
実施例１４
実施例１０において、凍結条件を以下としたこと以外は実施例１０と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の２５％圧縮硬さを図２５及び表３に示す。また、該シルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図２６に示す。
（凍結条件）
凍結は、予め−５℃に冷却しておいた低温恒温槽中にシルクフィブロイン溶液を入れた型を投入して２時間保持し、その後冷却速度０．３℃／ｈで、槽内が−２０℃になるまで、５０時間かけて冷却した後、−２０℃で５時間保持した。凍結した試料を自然解凍で室温に戻した後、型から取り出すことによってシルクフィブロイン多孔質体を得た。該シルクフィブロイン多孔質体は、型として用いた容器の形状を保持したものとなった。【００５３】
実施例１５
実施例１４において、−５℃から−２０℃にかけての冷却速度を３℃／ｈに変えて、その冷却時間を５時間としたこと以外は実施例１４と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の２５％圧縮硬さを図２５及び表３に示す。また、該シルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図２７に示す。【００５４】
実施例１６
実施例１４において、−５℃から−２０℃にかけての冷却速度を６℃／ｈに変えて、その冷却時間を２．５時間としたこと以外は実施例１４と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の２５％圧縮硬さを図２５及び表３に示す。また、該シルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図２８に示す。【００５５】
【表３】
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【００５６】
実施例１０〜１６に示すように、本発明の製造方法において、その凍結条件を制御することにより、得られるシルクフィブロイン多孔質の強度を制御することができる。【００５７】
実施例１７
実施例１０において、凍結条件を以下としたこと以外は実施例１０と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の２５％圧縮硬さを図２９及び表４に示す。また、該シルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図３０に示す。
（凍結条件）
凍結は、予め−１℃に冷却しておいた低温恒温槽中にシルクフィブロイン溶液を入れた型を投入して２時間保持し、その後冷却速度３℃／ｈで、槽内が−２０℃になるまで、６時間２０分かけて冷却した後、すぐに８℃／ｈで昇温、融解させた。【００５８】
実施例１８
実施例１７において、槽内温度が−２０℃になるまで冷却した後に−２０℃で１時間保持した（−２０℃に冷却後保持した時間を０時間から１時間に変えた）こと以外は実施例１７と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の２５％圧縮硬さを図２９及び表４に示す。また、該シルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図３１に示す。【００５９】
実施例１９
実施例１７において、槽内温度が−２０℃になるまで冷却した後に−２０℃で５時間保持した（−２０℃に冷却後保持した時間を０時間から５時間に変えた）こと以外は実施例１７と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の２５％圧縮硬さを図２９及び表４に示す。また、該シルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図３２に示す。【００６０】
【表４】
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【００６１】
実施例１７〜１９に示すように、本発明の製造方法において、−１℃から−２０℃までの冷却時間が６時間２０分と、凍結状態を一定時間保持できれば、−２０℃での保持時間にはよらず、同等の強度の多孔質体を得ることができる。【００６２】
実施例２０
実施例１において、蟻酸に代えて酢酸を用い、アルミ板で作製した型を内側サイズ８０ｍｍ×４０ｍｍ×１０ｍｍとし、凍結条件を以下としたこと以外は実施例１と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。なお、得られた多孔質体は、実施例１に記載と同様の方法で酢酸を除去して、力学的特性を評価した。得られた多孔質体の引っ張り強度（最大破断強度）と最大破断ひずみ（伸び）を図３３及び表５に示す（左側が最大破断強度、右側が最大破断ひずみ（伸び）を示す）。
なお、測定結果は、作製した多孔質体の任意の５箇所、及び異なる日に作成した多孔質体の任意の５箇所、計１０箇所について測定を行った平均値（±標準偏差）である。
また、該シルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図３４に示す。
（凍結条件）
凍結は、予め−１℃に冷却しておいた低温恒温槽中にシルクフィブロイン溶液を入れた型を投入して２時間保持し、その後冷却速度３℃／ｈで、槽内が−２０℃になるまで、６時間２０分かけて冷却した後、−２０℃を５時間保持した。【００６３】
実施例２１
実施例２０において、低温恒温槽を予め冷却しておく温度を−１℃から−３℃に変えた（−２０℃までの冷却時間を５時間４０分とした）こと以外は実施例２０と同様にしてシルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の力学的特性を図３３及び表５に示す。また、該シルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図３５に示す。【００６４】
実施例２２
実施例２０において、低温恒温槽を予め冷却しておく温度を−１℃から−５℃に変えた（−２０℃までの冷却時間を５時間とした）こと以外は実施例２０と同様にしてシルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の力学的特性を図３３及び表５に示す。また、該シルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図３６に示す。【００６５】
【表５】
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【００６６】
実施例２０〜２２に示すように、本発明の製造方法において、凍結前の冷却温度を−１〜−５℃程度の過冷却状態となる温度（過冷却温度）とすることで、同等の強度の多孔質体を得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の製造方法により得られるシルクフィブロイン多孔質体は、安全性が高く、かつ優れた力学的特性を有する。したがって、医療分野や、人体に適用する分野への応用が可能である。具体的には、化粧品・エステ分野等に広く適用することができ、顔の形状に合わせたフェイスマスクとして極めて有用である。
また、創傷被覆材や薬剤徐放担体、止血スポンジ等の医療分野、紙おむつや生理用品等の生活日用品分野、組織工学や再生医工学における細胞培養支持体や組織再生支持体、浄水用途・環境分野における微生物や細菌等の住処になる支持体など種々の産業に適用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【国際調査報告】
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