(57)【要約】心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法であって、（１）弱い細胞接着性を有する基板上で多能性幹細胞を培養し、ドーム状のコロニーを形成させること、（２）ドーム状のコロニーから細胞を得ること、の各段階を含む方法を提供する。また、当該方法により得られる多能性幹細胞の集団を心筋細胞分化誘導することを含む、心筋細胞集団の製造方法を提供する。
2019078278.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法であって、
（１）弱い細胞接着性を有する基板上で多能性幹細胞を培養し、ドーム状のコロニーを形成させること、
（２）ドーム状のコロニーから細胞を得ること、
の各段階を含む方法。
【請求項２】
基板が、ヒドロゲルまたはナノファイバーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
基板が、マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびラミニンから選択されるヒドロゲルを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
基板が、約０.０１〜１.０μｇ／ｃｍ２のマトリゲル、約０.０１〜１.０μｇ／ｃｍ２のフィブロネクチン、約０.０１〜１.０μｇ／ｃｍ２のビトロネクチンおよび約０.０１〜０.１μｇ／ｃｍ２のラミニンから選択されるヒドロゲルを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
基板がゼラチンナノファイバーを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
ゼラチンナノファイバーの密度が約３〜５μｇ／ｃｍ２である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ドーム状のコロニーが、５０μｍ以上の高さのコロニーである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
段階（１）において、１個の多能性幹細胞に由来するコロニーを形成させる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法により得られる多能性幹細胞を含む、心筋細胞を製造するための組成物。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法により得られる多能性幹細胞の集団を心筋細胞分化誘導することを含む、心筋細胞集団の製造方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法により製造される心筋細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、日本国特許出願第２０１７−２０２０２９号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
本願は、心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法、そのような細胞から心筋細胞を製造する方法、並びに、これらの方法により製造される多能性幹細胞または心筋細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多能性幹細胞（例えば、胚性多能性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞））の研究が進められており、再生医療、創薬研究、薬物安全性試験等の様々な用途への応用が期待されている。例えば、ｉＰＳ細胞のような多能性幹細胞からヒトの心筋細胞を誘導し、これを培養して得られる心筋組織片を、移植または薬物の毒性評価や動態評価に使用することが期待されている。【０００３】
このような応用には、多能性および分化能が高い均一な多能性幹細胞株を使用することが求められる。しかしながら、ＥＳ細胞の株によって、多能性と分化能が異なることが報告されている（非特許文献１〜３）。一方、ｉＰＳ細胞を誘導する際には、大量に採取した細胞に初期化遺伝子を導入して初期化を行うため、得られる細胞集団は性質の異なるヘテロな細胞の混合物である。また、細胞株として樹立されたｉＰＳ細胞株の特性は各々異なる。【０００４】
既存のｉＰＳ細胞株の分化誘導法の効率は、目的の細胞によって異なり、例えば、肝臓細胞、肺胞上皮細胞等への分化誘導率は低く、誘導された細胞の機能は不十分である。一方、心筋細胞の分化誘導法は開発が進んでおり（特許文献１および２、非特許文献４および５）、純度の問題はほぼ解決されている。しかしながら、多能性幹細胞から分化誘導された心筋細胞の成熟度は低く、生体内の心筋細胞とは異なるため、薬剤評価や再生医療への応用は達成されていない。【０００５】
このように、多能性幹細胞から分化細胞、特に分化心筋細胞を得る技術は開発途上である。これに関連して、多能性幹細胞の培養方法を改良するために、繊維径がナノメートルのオーダーであるナノファイバーを培養基板として使用することが提唱されている（特許文献３、非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際出願公開第２０１３／１１１８７５号公報
【特許文献２】国際出願公開第２０１５／１８２７６５号公報
【特許文献３】特許第６０２４０４７号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Osafune, K. et al., Nat. Biotechnol. 26, 2007-2009 (2008).
【非特許文献２】Sung-Eun Kim et. al., Comparative analysis of the developmental competence of three human embryonic stem cell lines in vitro.
【非特許文献３】The International Stem Cell Initiative, Nat. Biotechnol. 25, 803-816 (2007)
【非特許文献４】Minami I, et al., Cell Rep. 2012 Nov 29; 2(5): 1448-60
【非特許文献５】Lian, X. et al. Nat. Protoc. 8, 162-175 (2013)
【非特許文献６】L. Liu et al., Biomaterials 35 (2014) 6259-67
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本願の目的は、心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法を提供することである。本願の別の目的は、そのような細胞から心筋細胞を製造する方法を提供することである。本願のまた別の目的は、これらの方法により製造される多能性幹細胞または心筋細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、弱い細胞接着性を有する基板上で多能性幹細胞を培養すると、ドーム状コロニーと単層状コロニーの２種類のコロニーが形成されることを見出した。実施例により立証される通り、ドーム状コロニーを形成する細胞は、単層状コロニーを形成する細胞よりも心筋分化能が高い。従って、本願は以下の態様を提供する。【００１０】
ある態様では、本願は、心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法であって、
（１）弱い細胞接着性を有する基板上で多能性幹細胞を培養し、ドーム状のコロニーを形成させること、
（２）ドーム状のコロニーから細胞を得ること、
の各段階を含む方法を提供する。【００１１】
ある態様では、本願は、上記の方法により得られる多能性幹細胞を含む、心筋細胞を製造するための組成物を提供する。【００１２】
ある態様では、本願は、上記の方法により得られる多能性幹細胞の集団を心筋細胞分化誘導することを含む、心筋細胞集団の製造方法を提供する。【００１３】
ある態様では、本願は、上記の方法により製造される心筋細胞集団を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法が提供される。かくして製造された多能性幹細胞から心筋分化誘導すると、成熟度が高い心筋細胞が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】単一の細胞の単離と培養方法の模式図である。
【図２】培養１日目〜１２日目の間に、単一のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）が多細胞のクローンに増殖することを示す。これらのクローンは、２種類の形態を示した：平坦な単層状のコロニー（上段）およびドーム状の多層のコロニー（下段）。
【図３】左：単層状（ＭＣｏＧ）およびドーム状（ＤＣｏＧ）の細胞のコロニーの形態の差異を示すＳＥＭ像である。右：ＭＣｏＧおよびＤＣｏＧコロニーの断面である。光干渉断層撮影（ＯＣＴ）顕微鏡システムによりリアルタイムで観察した。
【図４】培養１、２、３および４日目のＭＣｏＧおよびＤＣｏＧコロニーの高さを示す（平均±ＳＤ、ｎ＝１０）。コロニーの高さは、ＯＣＴ顕微鏡で測定した。
【図５】上段：心筋分化プロトコールの概要を示す。下段：分化０、１、３、５および１０日目のＭＣｏＧおよびＤＣｏＧ細胞の位相差顕微鏡像を示す。スケールバー：１５０μｍ。
【００１６】
【図６】心筋分化１２日目のＤＣｏＧおよびＭＣｏＧ細胞の免疫蛍光染色像を示す。左上および左下：核、右上：ｃＴｎＴ、右下：アクチニン。スケールバー：１００μｍ。
【図７】左：ＤＣｏＧおよびＭＣｏＧ細胞由来の心筋細胞の代表的なストレインを示す。ＤＣｏＧ由来の心筋細胞は、すべての拍動において高いストレイン率を示した。右：拍動当たりのストレイン率（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４、＊Ｐ＜０.０５）。
【図８】１８種の心筋関連遺伝子のｑＰＣＲのヒートマップである：分化前（０日目）および分化後（１０日目）のＤＣｏＧおよびＭＣｏＧ細胞。心筋関連遺伝子：ＡＣＴＮ２、ＤＥＳ、ＭＹＨ７、ＭＹＬ２、ＭＹＬ３、ＭＹＬ７、ＴＮＮＩ３およびＴＮＮＴ２は、心筋細胞の構造に関連する；ＧＡＴＡ４、ＨＡＮＤ２、ＨＫＸ２−５は、心筋細胞に関連する転写因子である；ＮＰＰＡおよびＲＹＲ２は、心筋細胞受容体である；ＫＣＮＱ１、ＰＬＮおよびＳＬＣ８Ａ１は、心筋細胞のイオンチャネルに関連する；ＣＫＭは、心筋細胞の酵素である；ＭＢは、心筋細胞の輸送体である。
【図９】異なる基板上で長期継代した際のＤＣｏＧおよびＭＣｏＧ細胞の形態の変化を示す。各条件で、左のパネルは位相差顕微鏡像であり、右のパネルはＳＥＭ像である。
【００１７】
【図１０】異なる基板上での単一のＤＣｏＧおよびＭＣｏＧ細胞のＳＥＭ像である。ＤＣｏＧ細胞はゼラチンナノファイバー（ＧＮＦ）基板上では伸展しない。矢印は伸展している細胞を示す。
【図１１】ＧＮＦ基板上のＤＣｏＧおよびＭＣｏＧ細胞の接着率を示す。上段：接着試験の模式図である。接着細胞の数を、細胞播種の１０、２０および４０分後に測定した。細胞接着率は、下式に従い算出した：細胞接着率（％）＝（接着細胞の数／播種細胞の数）ｘ１００％。統計解析はｔ検定で行った。３回の独立した実験の結果を示す。下段：ＭＣｏＧ細胞は、ＤＣｏＧ細胞よりも高い接着率を示した（平均±ＳＤ、ｎ＝３、＊Ｐ＜０.０５）。
【図１２】衝撃波を利用して細胞と基板の接着を定量した結果を示す。剥がれた細胞の割合を、流体力学的圧力Ｐの関数としてプロットした。データの各点を正規分布の累積分布関数にフィットさせ、臨界圧Ｐ＊を、５０％の細胞が剥がれるのに必要な圧力として決定した（平均±ＳＥ、ｎ＞５００）。４つの条件を調べた：マトリゲル（ＭＧ）上のＭＣｏＧ細胞（ＭＣｏＧ−ＭＧ）、ＭＧ上のＤＣｏＧ細胞（ＤＣｏＧ−ＭＧ）、ＧＮＦ上のＭＣｏＧ細胞（ＭＣｏＧ−ＧＮＦ）およびＧＮＦ上のＤＣｏＧ細胞（ＤＣｏＧ−ＧＮＦ）。
【図１３】ＭＧおよびＧＮＦ基板上のＭＣｏＧおよびＤＣｏＧ細胞の多能性関連遺伝子および胚盤葉上層遺伝子の相対的発現を示す（平均±ＳＤ、ｎ＞３、＊Ｐ＜０.０５）。
【図１４】ＧＮＦ基板上のＭＣｏＧおよびＤＣｏＧ細胞におけるＦ−アクチンおよびＧ−アクチンの免疫蛍光染色像を示す。基底面の共焦点顕微鏡像を示す。
【００１８】
【図１５】ＭＣｏＧおよびＤＣｏＧ細胞の播種２時間後のＦ−アクチンおよびＧ−アクチンの定量結果を示す。ファロイジン（抗Ｆ−アクチン）およびＤＮａｓｅＩ（抗Ｇ−アクチン）の蛍光の総積分量を、ＭＣｏＧ細胞の蛍光に対して標準化した（平均±ＳＤ、ｎ＝３、＊Ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０.０１）。
【図１６】ＭＣｏＧおよびＤＣｏＧ細胞におけるＭＡＬと核の共局在を示す、強度相関指数（intensity correlation quotients）（ＩＣＱ）である（平均±ＳＤ、ｎ＝３、＊Ｐ＜０.０５）。
【図１７】ＧＮＦ基板上で３日間培養されたＭＣｏＧおよびＤＣｏＧ細胞におけるＥ−カドヘリンの相対的発現を示す（平均±ＳＤ、ｎ＝３、＊Ｐ＜０.０５）。
【図１８】様々な密度（０.１〜４０μｇ／ｃｍ２）のマトリゲルで被覆された基板上のＭＣｏＧおよびＤＣｏＧ細胞の接着曲線を示す（平均±ＳＤ、ｎ＝４、＊Ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０.０１）。
【図１９】様々な密度（０.０１〜８μｇ／ｃｍ２）の様々なヒドロゲル（ＦＮ：フィブロネクチン、ＶＮ：ビトロネクチン、ＬＮ：ラミニン）で被覆された基板上のＭＣｏＧおよびＤＣｏＧ細胞の接着曲線を示す（平均±ＳＤ、ｎ＝４）。
【図２０】３種の異なる密度（０.１、１および１０μｇ／ｃｍ２）のマトリゲル（ＭＧ）で被覆された基板上のＭＣｏＧおよびＤＣｏＧ細胞の位相差顕微鏡像を示す（ＭＧの推奨密度：＞１０μｇ／ｃｍ２）。スケールバー＝１５０μｍ。
【図２１】３種の異なる密度（０.１、１および１０μｇ／ｃｍ２）のマトリゲルで被覆された基板上のＭＣｏＧおよびＤＣｏＧ細胞におけるＫＬＦ４、ＫＬＦ５およびＮＡＮＯＧの相対的発現を示す（平均±ＳＤ、ｎ＝３、＊Ｐ＜０.０５、ＮＳ：有意差なし）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
【００２０】
本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８〜２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０〜３０」は、「１８〜３３」を含むものとする。
【００２１】
「多能性幹細胞」とは、成体を構成する全ての細胞に分化することができる多分化能（pluripotency）と、細胞分裂を経てもその多分化能を維持することができる自己複製能を有する細胞を意味する。多能性幹細胞は、新たに樹立したものでもよく、株化されたものであってもよい。「多能性幹細胞」には、胚性多能性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が含まれる。「多能性幹細胞」の生物種は特に限定はされないが、好ましくは哺乳類であり、より好ましくは齧歯類または霊長類、さらにより好ましくは霊長類である。サルまたはヒト多能性幹細胞、特にサルまたはヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を好適に用い得る。ある実施態様では、多能性幹細胞はヒトｉＰＳ細胞である。
【００２２】
「弱い細胞接着性を有する基板」とは、その上で多能性幹細胞を培養したときに、少なくとも１個のドーム状コロニーが形成される基板を意味する。細胞接着性を有する物質を適当な条件で使用して常套の培養容器やカバースライド等のシートの表面を被覆することにより、弱い細胞接着性を有する基板を得ることができる。
【００２３】
基板の細胞接着性は、公知の方法により測定できる。例えば、予め計数した任意の接着性細胞を基板上に播種し、所定の時間（例えば、数分間〜数時間、例えば、１０、２０、３０または４０分間）インキュベートした後に細胞を洗い流し、基板に接着している細胞を計数し、下式に従い細胞接着率を算出し得る。
細胞接着率（％）＝（接着細胞の数／播種細胞の数）ｘ１００％
細胞接着率は、基板の細胞接着性と細胞の接着能によって決まるので、一定の接着能の細胞（例えば、同じ組織から採取した細胞または同じ細胞株の細胞）を使用して算出した細胞接着率は、基板の細胞接着性の指標となる。
【００２４】
あるいは、細胞接着性は、Yoshikawa, H. Y. et al., J. Am. Chem. Soc. 133, 1367-1374 (2011) に記載の方法により測定できる。この方法では、基板に接着している細胞集団に対して、１点でレーザーパルスによる衝撃波を与え、その点の周囲で剥離した細胞の面積を測定し、基板と細胞の間の接着力を算出する。異なる基板と一定の接着能の細胞（例えば、同じ組織から採取した細胞または同じ細胞株の細胞）との間の接着力を測定すれば、基板の細胞接着性を比較することができる。
【００２５】
培養容器は、一般的に細胞培養に使用される容器であればよく、特に限定されない。本体部分の形状は、シャーレ、プレート、ボトル、チャンバー、マルチウェルプレート（例えば、６、１２、２４、４８、９６、または３８４ウェルプレート）等であり得る。カバースライド等のシートに細胞接着性を有する物質を被覆し、それを他の培養容器内に置いてもよい。あるいは、カバースライド等のシートに細胞接着性を有する物質を被覆し、それに孔の開いた別のシートを重ねることにより、培養容器を作製することもできる。培養容器またはシートの材質は、特に限定されない。具体的には、金属、ガラス、およびシリコーン等の無機材料、プラスチック等の有機材料を挙げることができる。
【００２６】
細胞接着性を有する物質としては、マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等のヒドロゲル、ゼラチン、コラーゲン、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）およびその共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリスチレン（ＰＳ）等の高分子を含むナノファイバー等が挙げられる。これらの物質は市販されている。
【００２７】
ヒドロゲルは、基板に所望の弱い細胞接着性を与える密度で使用する。製造業者により推奨される通常の使用密度より低い密度で使用してもよい。例えば、マトリゲル、フィブロネクチンまたはビトロネクチンは、約０.０１〜１.０μｇ／ｃｍ２または約０.０５〜０.３μｇ／ｃｍ２、例えば、約０.１μｇ／ｃｍ２の密度で培養容器を被覆するように使用し得る。例えば、ラミニンは、約０.０１〜０.１μｇ／ｃｍ２、例えば、約０.０５μｇ／ｃｍ２の密度で培養容器を被覆するように使用し得る。他の材料を使用する場合には、上記のヒドロゲルを上記の密度で用いて被覆した場合と同等の細胞接着性が得られるように、例えば、約０.０１〜１.０μｇ／ｃｍ２または約０.０５〜０.３μｇ／ｃｍ２、好ましくは約０.１μｇ／ｃｍ２のマトリゲルで被覆した場合と同程度の細胞接着性が得られるように、密度を調整し得る。ある実施態様では、弱い細胞接着性を有する基板は、約０.０１〜１.０μｇ／ｃｍ２または約０.０５〜０.３μｇ／ｃｍ２、好ましくは約０.１μｇ／ｃｍ２のマトリゲルで被覆したガラス表面と同程度の細胞接着性を有する基板である。
【００２８】
高分子を含むナノファイバーの材料としては、例えば、ゼラチン、コラーゲン、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＣＬ、ＰＳ等が挙げられる。ゼラチンは、主として牛骨および牛皮、豚皮を原料として製造されるが、鮭等の魚の皮や鱗を原料とする場合もあり、その由来については特に限定されない。これらの原料からゼラチンを抽出・精製する方法は周知である。また、市販のゼラチンを用いることもできる。コラーゲンは、ゼラチン製造の過程で酸・アルカリによる変性前のコラーゲン原料から精製することができる。コラーゲンの由来にも特に限定はない。また、市販のコラーゲン、例えば、細胞培養用のコーティング基質として市販されているもの等を用いることもできる。ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＣＬ、ＰＳ等の非生体高分子は、当業者に周知の方法に従って合成したものを用いてもよく、市販のものを用いてもよい。高分子の分子量は特に限定されないが、例えば、ゼラチンの場合、約１０ｋＤａ以上、好ましくは約２０〜７０ｋＤａ、より好ましくは約３０〜４０ｋＤａの範囲で適宜選択することができる。
【００２９】
これらの高分子からナノファイバーを作製する方法は特に限定されず、例えばエレクトロスピニング法、コンジュゲート溶融紡糸法、メルトブロー法等が挙げられるが、エレクトロスピニング法が好ましく用いられる。エレクトロスピニング法による場合、まず高分子を適当な溶媒に溶解する。ここで用いられる溶媒としては、高分子を溶解し得る溶媒であれば、無機溶媒、有機溶媒を問わずいかなるものも使用可能であるが、例えば、ゼラチンナノファイバーの作製においては、酢酸やギ酸等が好ましく用いられ得る。コラーゲンナノファイバーの作製においては、例えば、１,１,１,２,２,２−ヘキサフルオロ−２−プロパノール等が用いられ得る。高分子溶液の濃度は特に限定されないが、好ましい繊維径および均一性を得るためには、例えば、ゼラチンの酢酸溶液を用いる場合には、約５〜１５ｗ／ｖ％、好ましくは約８〜１２ｗ／ｖ％の濃度範囲で使用することが望ましい。
【００３０】
エレクトロスピニング法は自体公知の手法に従って実施することができる。エレクトロスピニング法の原理は、電気の力で材料をスプレーし、ナノサイズの繊維にすることである。高分子溶液をシリンジに充填し、先端に注射針のようなノズルを設置したものに、シリンジポンプを接続して流速を与えるようにする。ノズルから適当な距離の位置にナノファイバーが収集するコレクタ（平板でもよいし、巻き取り式とすることもできる。平板なコレクタ上に基板、例えばガラス等を設置して、基板上にナノファイバーを形成させてもよい）を設置し、ノズル側に電源の＋極、コレクタ側に−極を接続する。シリンジポンプに電圧をかけることにより、コレクタ上に高分子が噴射され、ナノファイバーが形成される。ここで、電圧、ノズルからコレクタまでの距離、ノズルの内径等により、繊維形態や繊維径が変動するが、当業者であれば、これらを適宜選択して所望の繊維径を有し、かつ均一なナノファイバーを作製することができる。例えば、後述の実施例で用いた各種条件を採用することもできるし、Advanced Drug Delivery Reviews, 61(12): 1084-1096 (2009) または Journal of Cellular and Molecular Medicine, 13(9B): 3475-3484 (2009) に記載の条件を適宜用いることもできる。
【００３１】
ナノファイバーは、約１〜１０００ｎｍ、好ましくは約１０〜８００ｎｍ、より好ましくは約５０〜５００ｎｍの繊維径を有し得る。ナノファイバーで被覆された培養容器上の高分子の密度は、約０.１〜１０μｇ／ｃｍ２、好ましくは約１〜８μｇ／ｃｍ２、より好ましくは約３〜５μｇ／ｃｍ２であり得る。
【００３２】
ナノファイバーに好適な三次元特性を与え、かつ継代時の細胞の解離を容易にするために、生成したナノファイバーは適当な架橋剤を用いて架橋処理することが好ましい。架橋剤の種類は特に制限はないが、好ましい架橋剤として、Ｎ−エチル−Ｎ'−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどの水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等が挙げられる。２種類以上の架橋剤を混合して用いてもよい。架橋処理は、例えば、架橋剤を適当な溶媒に溶解し、該架橋剤溶液中に得られたナノファイバーを浸漬することにより行うことができる。当業者であれば、架橋剤の種類に応じて、溶液濃度、架橋処理時間を適宜設定することができる。
【００３３】
ある態様では、ゼラチンナノファイバーを使用する。ゼラチンナノファイバーは、上記の通りに、または、例えば、特許文献３および非特許文献６等に記載の通りに製造し得る。ある実施態様では、酢酸、酢酸エチルおよび蒸留水（酢酸：酢酸エチル＝３：２）の混合物にゼラチンを溶解することにより、ゼラチン（１１ｗｔ％、タイプＢ、ブタ皮膚由来）溶液を調製し、培養カバーガラススライド上にエレクトロスピニングし（電圧：１１ｋＶ、流速：０.２ｍＬ／ｈ、時間：８分間）、次いで、０.２Ｍ Ｎ−エチル−Ｎ'−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよび０.２Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（エタノール中）でゼラチンナノファイバーを４時間架橋することにより、ゼラチンナノファイバーを作成する。高分子を含むナノファイバーを使用する場合には、上記の条件で製造したゼラチンナノファイバーで培養容器を被覆した場合と同程度の細胞接着性となるように、製造条件を調整し得る。ある実施態様では、弱い細胞接着性を有する基板は、上記の条件で製造したゼラチンナノファイバーで被覆したガラス表面と同程度の細胞接着性を有する基板である。ある実施態様では、弱い細胞接着性を有する基板は、約３〜５μｇ／ｃｍ２のゼラチンナノファイバーで被覆したガラス表面と同程度の細胞接着性を有する基板である。
【００３４】
多能性幹細胞の培養は、当業者に周知の従来の方法により実施し得る。例えば、特許文献３または非特許文献６に記載の方法を用いる。例えば、多能性幹細胞を、好ましくはＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ２７６３２）を添加した培地に懸濁し、弱い細胞接着性を有する基板上に、細胞約１×１０２〜１×１０５個／ｃｍ２、好ましくは約０.５×１０４〜１×１０５個／ｃｍ２、より好ましくは約２〜６×１０４個／ｃｍ２の細胞密度となるように播種する。好ましくは、１個の多能性幹細胞に由来するコロニーを取得できる密度で多能性幹細胞を播種する。より好ましくは、１つの培養容器または培養容器の１つのウェルに１個の多能性幹細胞を播種する。
【００３５】
培養には、多能性幹細胞の維持に適する任意の培地を使用し得る。例えば、０.１ｍＭ２−メルカプトエタノール、０.１ｍＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、２０％ＫＳＲおよび４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培養液（もしくは、合成培地：mTeSR、Stem Proなど）、１０〜１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２またはＤＭＥ培養液（これらの培養液にはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜添加してもよい）または市販の培養液（例えば、マウスＥＳ細胞培養用培養液（ＴＸ−ＷＥＳ培養液、トロンボＸ社）、霊長類ＥＳ細胞培養用培養液（霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培養液、リプロセル社）を使用し得る。組換え動物タンパク質を含むｍＴｅＳＲ培地などの無血清培地、ヒト血清アルブミン、ヒトｂＦＧＦを含むＴｅＳＲ２培地などのｘｅｎｏフリー培地、Ｅ８培地などのタンパク質不含培地も使用し得る。培地はＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ２７６３２）を含んでもよい。
【００３６】
培養は、例えば、ＣＯ２インキュベーター中、約１〜約１０％、好ましくは約２〜約５％のＣＯ２濃度の雰囲気下、約３０〜約４０℃、好ましくは約３７℃で行われる。好ましくは、多能性幹細胞を播種の約２日後に、ＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地と交換し、以後は１〜２日毎に新鮮な培地と交換する。
【００３７】
多能性幹細胞は、適当な時期に継代してもよい。多能性幹細胞を継代する際には、基板から多能性幹細胞を解離させ、単一の細胞または細胞集団を別の基板上に再播種する。例えば、酵素を含まない解離液を用いて容易に基板から細胞を解離させることができ、さらにわずかなピペッティング操作により単一の細胞まで分散させることができる。酵素を含まない解離液としては、機械的に細胞を解離する方法において従来使用されている解離液を同様に用いることができ、例えば、ハンクス液やクエン酸とＥＤＴＡを組み合わせた溶液等が挙げられる。あるいは、酵素（例えば、トリプシン、TryoLE TM Express、コラゲナーゼ、ディスパーゼ）処理により細胞を分散させてもよい。多能性幹細胞は実質的に何回でも継代することができる。
【００３８】
多能性幹細胞を細胞接着性の弱い基板上で適当な期間にわたって培養することにより、多能性幹細胞のコロニーが形成される。例えば、１個の細胞から、少なくとも約１〜２日間でコロニーが形成され、その後、その培養条件下で可能な限り、コロニーは成長する。かくして形成されるコロニーは、光学顕微鏡下で明確に見分けられる、ドーム状または単層状の形態を有する。「ドーム状のコロニー」とは、複数の細胞の層からなるコロニー（多層状のコロニー）である。ドーム状のコロニーは、コロニーに含まれる細胞が上下に重なり、従って最下層の細胞のみが基板と接着し、その他の細胞は基板と接着していないことを特徴とする。「単層状のコロニー」とは、１つの細胞層からなるコロニーであり、コロニーに含まれる実質的にすべての細胞が基板と接着していることを特徴とする。単層状のコロニーの高さは細胞１個分（例えば、５０μｍ）を超えることはないのに対し、ドーム状のコロニーの高さはコロニーの成長に伴って増大する。ある実施態様では、ドーム状のコロニーは、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、９０μｍ以上、１００μｍ以上の高さのコロニーである。ある実施態様では、ドーム状のコロニーは、５０μｍ以上の高さのコロニーである。
【００３９】
本願に関して、ドーム状のコロニーを構成する細胞を、ＤＣｏＧ細胞と称する。単層状のコロニーを構成する細胞を、ＭＣｏＧ細胞と称する。実施例により立証される通り、ＤＣｏＧ細胞の多能性および分裂能は、ＭＣｏＧ細胞より高い。ＤＣｏＧ細胞は、ＭＣｏＧ細胞よりも、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４およびＫＬＦ５の発現レベルが高い傾向にあり、例えば、１.２倍、１.５倍、２倍、２.５倍または３倍以上高い。個々の細胞を単独で観察すると、ＭＣｏＧ細胞は、平坦に伸展し、長い糸状仮足を形成し得る。ＤＣｏＧ細胞は、あまり伸展せず、少数の短い糸状仮足を形成し、半球状であり得る。
【００４０】
ドーム状のコロニーから細胞を得るには、コロニー全体を回収してもよく、上記の継代操作と同様の酵素処理または機械的処理により細胞を分離させて回収してもよい。得られた細胞は、当業者に公知の方法で冷凍して保存されてもよい。得られた細胞を、継続して弱い細胞接着性を有する基板上で培養してもよく、多能性幹細胞の培養に適する他のいかなる基板上で培養してもよい。
【００４１】
本願の方法によれば、心筋細胞分化能が高い多能性幹細胞が得られる。「心筋細胞分化能が高い」とは、多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導することにより得られる細胞集団が、誘導処理の完了後に、以下の特徴の少なくとも１つを有することを意味する；（１）好ましくは約７０％以上、より好ましくは約７５％以上、さらに好ましくは約８０％以上の、高い拍動率（全細胞クラスター中の、拍動のあるクラスターの割合）を示すこと、（２）各拍動が強いこと、好ましくは、ストレイン率（１／ｓ）が約０.０２、約０.０３、約０.０４または約０.０５以上である、（３）好ましくは約３５％、約４０％、約４５％または約５０％以上の、高いｃＴｎＴ陽性率を示すこと、および（４）心筋細胞特異的マーカーの発現レベルが高いこと。
【００４２】
心筋細胞特異的マーカーとしては、例えば、α−ＭＨＣ、β−ＭＨＣ、ＡＣＴＮ２、ＭＹＨ７、ＳＬＣ８Ａ１、ＭＹＬ２、ＴＮＮＩ３、ＣＫＭ、ＭＹＬ３、ＴＮＮＴ２、ＤＥＳ、ＭＹＬ７、ＮＡＴ１、ＧＡＴＡ４、ＮＫＸ２−５、ＨＡＮＤ２、ＮＰＰＡ、ＫＣＮＱ１、ＰＬＮ、ＭＢ、ＲＹＲ２およびＰＰＣが例示される。心筋細胞特異的マーカーの発現は、従来の生化学法または免疫化学法（例えば酵素結合免疫吸着測定法、免疫組織化学的アッセイ等）により検出され得る。あるいは、心筋細胞特異的マーカーをコードする核酸の発現が評価され得る。ある実施態様では、ＤＣｏＧ細胞から心筋分化誘導された心筋細胞集団におけるＭＹＨ７遺伝子（β−ＭＨＣをコードする）の発現レベルは、ＭＣｏＧ群から心筋分化誘導された心筋細胞集団と比較して、約４倍高い。
【００４３】
ある態様では、上記の方法により得られる多能性幹細胞を含む、心筋細胞を製造するための組成物が提供される。当該組成物は、上記の方法により得られる多能性幹細胞を、その生存、増殖または保存に適する培地または溶液中に含む。そのような培地または溶液は、当業者に公知であり、容易に調製できるか、または、購入できる。多能性幹細胞は冷凍されていても、いなくてもよい。
【００４４】
ある態様では、上記方法で得られる多能性幹細胞の集団を心筋細胞分化誘導することを含む、心筋細胞集団の製造方法が提供される。実施例（特に、結果（２））により立証される通り、ＤＣｏＧ細胞は、心筋分化誘導されると、ＭＣｏＧ細胞よりも高い効率で心筋細胞に分化し、かつ、ＭＣｏＧ細胞よりも成熟度の高い心筋細胞に分化する。従来の心筋細胞分化誘導法では、ＤＣｏＧ細胞とＭＣｏＧ細胞は区別されず、これらの混合物が心筋分化誘導されるため、得られる心筋細胞集団内には様々な成熟度の心筋細胞が含まれる。ＤＣｏＧ細胞から心筋分化誘導された心筋細胞集団は、従来の方法で得られた心筋細胞集団と比較して成熟度が高く、集団内の細胞の均一性が高い。
【００４５】
心筋細胞集団に関して「成熟度が高い」とは、以下の特徴の少なくとも１つを有することを意味する：（１）好ましくは約７０％以上、より好ましくは約７５％以上、さらに好ましくは約８０％以上の、高い拍動率（全細胞クラスター中の、拍動のあるクラスターの割合）を示すこと、（２）各拍動が強いこと、好ましくは、ストレイン率（１／ｓ）が約０.０２、約０.０３、約０.０４または約０.０５以上である、（３）好ましくは約３５％、約４０％、約４５％または約５０％以上の、高いｃＴｎＴ陽性率を示すこと、および（４）心筋細胞特異的マーカーの発現レベルが高いこと。
【００４６】
多能性幹細胞から心筋細胞を誘導する方法は種々知られており、いかなる方法を用いてもよい。例えば特許文献１および２、並びに非特許文献４および５に記載の方法が例示される。心筋分化誘導には、ＲＰＭＩ／Ｂ２７、ＩＭＤＭなどの心筋分化誘導に適する培地を使用し得る。心筋分化誘導は、弱い細胞接着性を有する基板上で行ってもよく、心筋分化誘導に適する他のいかなる基板上で行ってもよい。
【００４７】
ある実施態様では、非特許文献５に記載の方法により多能性幹細胞から心筋細胞を誘導する。簡潔に述べると、（１）多能性幹細胞をＧＳＫ３阻害剤またはＷＮＴシグナル活性化剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）を含み、インシュリンを含まず、場合によりＲＯＣＫ阻害剤（例えば、ｙ２７６３２）を含む培地中で培養する工程、（２）工程（１）で得られた細胞をＷＮＴシグナル阻害剤（例えば、ＩＷＰ２またはＩＷＰ４などのポルクピン（porcupine）阻害剤、β−カテニンｓｈＲＮＡなどのβ−カテニン阻害剤、ＳＯ３０４２（２−（４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタンアミド）−６−ヨードベンゾチアゾール、ＫＹ０３−Ｉ）、または、ＸＡＶ９３９）を含み、インシュリンを含まない培地中で培養する工程、および、（３）工程（２）で得られた細胞を、インシュリンを含む培地中で培養する工程を含む方法により、多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導することができる。
【００４８】
ある実施態様では、特許文献２に記載の方法により多能性幹細胞から心筋細胞を誘導する。簡潔に述べると、（１）多能性幹細胞をＧＳＫ３阻害剤またはＷＮＴシグナル活性化剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）およびＰＫＣ活性化剤（例えば、ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート）を含む培地中で培養する工程、および；（２）工程（１）で得られた細胞をＷＮＴシグナル阻害剤（例えば、ＳＯ３０４２およびＸＡＶ９３９）、Ｓｒｃ阻害剤（例えば、Ａ４１９２５９）、およびＥＧＦ受容体阻害剤（例えば、ＡＧ１４７８）を含む培地中で培養する工程を含む方法により、多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導することができる。
【００４９】
ある態様では、上記の方法により得られる心筋細胞集団が提供される。別の態様では、上記の方法により得られる心筋細胞集団を含む組成物が提供される。当該組成物は、心筋細胞集団を、その生存または保存に適する培地または溶液中に含む。そのような培地または溶液は、当業者に公知であり、容易に調製できるか、または、購入できる。心筋細胞集団は冷凍されていても、いなくてもよい。
【００５０】
例えば、本願は下記の実施態様を提供する。
［１］心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法であって、
（１）弱い細胞接着性を有する基板上で多能性幹細胞を培養し、ドーム状のコロニーを形成させること、
（２）ドーム状のコロニーから細胞を得ること、
の各段階を含む方法。
［２］基板が、ヒドロゲルまたはナノファイバーを含む、第１項に記載の方法。
［３］心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法であって、
（１）ヒドロゲルまたはナノファイバーを含む基板上で、多能性幹細胞を培養し、ドーム状のコロニーを形成させること、
（２）ドーム状のコロニーから細胞を得ること、
の各段階を含む方法。
［４］基板がヒドロゲルを含む、第２項または第３項に記載の方法。
［５］ヒドロゲルが、マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチンまたはラミニンである、第５項に記載の方法。
［６］ヒドロゲルが、マトリゲル、フィブロネクチンまたはビトロネクチンを含む、第４項または第５項に記載の方法。
［７］マトリゲル、フィブロネクチンまたはビトロネクチンの密度が、約０.０１〜１.０μｇ／ｃｍ２である、第６項に記載の方法。
［８］マトリゲル、フィブロネクチンまたはビトロネクチンの密度が、約０.０５〜０.３μｇ／ｃｍ２である、第６項または第７項に記載の方法。
［９］マトリゲル、フィブロネクチンまたはビトロネクチンの密度が、約０.１μｇ／ｃｍ２である、第６項ないし第８項のいずれかに記載の方法。
［１０］ヒドロゲルがマトリゲルである、第５項ないし第９項のいずれかに記載の方法。
［１１］ヒドロゲルがラミニンである、第５項に記載の方法。
［１２］ラミニンの密度が、約０.０１〜０.１μｇ／ｃｍ２である、第１１項に記載の方法。
［１３］ラミニンの密度が、約０.０５μｇ／ｃｍ２である、第１１項または第１２項に記載の方法。
［１４］基板がナノファイバーを含む、第２項または第３項に記載の方法。［１５］ナノファイバーが、ゼラチン、コラーゲン、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）もしくはその共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）またはポリスチレン（ＰＳ）を含む、第１４項に記載の方法。
［１６］ナノファイバーがゼラチンナノファイバーである、第１４項または第１５項に記載の方法。
［１７］ゼラチンナノファイバーの密度が約３〜５μｇ／ｃｍ２である、第１６項に記載の方法。
［１８］ゼラチンナノファイバーの直径が約５０〜５００ｎｍである、第１６項または第１７項に記載の方法。
［１９］ゼラチンナノファイバーが分子量約３０〜４０ｋＤａのゼラチンを含む、第１６項ないし第１８項のいずれかに記載の方法。
［２０］ゼラチンナノファイバーが架橋されている、第１６項ないし第１９項のいずれかに記載の方法。
［２１］ドーム状のコロニーが、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、９０μｍ以上または約１００μｍ以上の高さのコロニーである、第１項〜第２０項のいずれかに記載の方法。
［２２］ドーム状のコロニーが、５０μｍ以上の高さのコロニーである、第１項〜第２１項のいずれかに記載の方法。
［２３］段階（１）において、１個の多能性幹細胞に由来するコロニーを形成させる、第１項〜第２２項のいずれかに記載の方法。
［２４］第１項ないし第２３項のいずれかに記載の方法により得られる多能性幹細胞を含む、心筋細胞を製造するための組成物。
［２５］第１項ないし第２３項のいずれかに記載の方法を含む、第２２項に記載の組成物の製造方法。
［２６］第１項ないし第２３項のいずれかに記載の方法により得られる多能性幹細胞の集団を心筋細胞分化誘導することを含む、心筋細胞集団の製造方法。
［２７］心筋細胞集団の製造方法であって、
（１）第１項ないし第２３項のいずれかに記載の方法により多能性幹細胞を得ること、
（２）（１）で得られた細胞の集団を心筋細胞分化誘導すること、
の各段階を含む方法。
［２６］第２６項または第２７項に記載の方法により製造される心筋細胞集団。
【００５１】
本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本発明を説明するためだけに供されるものである。
【実施例】
【００５２】
材料と方法
単細胞培養デバイスの作製
ゼラチンナノファイバー（ＧＮＦ）をエレクトロスピニング法により培養カバーガラススライド上に作製した（ノズルからコレクタ（カバーガラススライド）までの距離：１１ｃｍ、シリンジ針：２３Ｇ、電圧：１１ｋＶ、流速：０.２ｍＬ／ｈ）。
エレクトロスピニングの１６時間前に、酢酸（４２ｗｔ％）、酢酸エチル（２８ｗｔ％）および蒸留水（２０ｗｔ％）の混合物にゼラチンを溶解し、ゼラチン（１１ｗｔ％、タイプＢ、ブタ皮膚由来；Sigma-Aldrich、米国）溶液を調製した。異なる密度のＧＮＦサンプルを得るために、サンプルを８分間エレクトロスピニングした。エレクトロスピニングの後、エタノール中の０.２Ｍ Ｎ−エチル−Ｎ'−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよび０.２Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドでＧＮＦを４時間架橋した。使用前にＧＮＦを７０％エタノールで３回すすぎ、乾燥させた。【００５３】
ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ、Sylgard 184、Dow Corning Toray、日本）を、１：１０の割合で、高さ１００μｍのピラーの列を含むシリコンウェハーにスピンコーティングすることにより、マルチウェルメンブレンを作製した。この型は、ＳＵ８−１００（Microchem、日本）による標準的なフォトリソグラフィーにより得られた。７０℃で１０分間硬化させた後、ＰＤＭＳメンブレンを型から剥がした。エタノールですすぎ、乾燥させた後、このマイクロウェルをＧＮＦサンプル上に置いた。これにより、直径１０００μｍのウェルを４００個有する単細胞培養デバイスが得られた。【００５４】
単一のｈＰＳＣの単離と培養
細胞をＧＮＦ基板から回収し、計数し、希釈し、細胞２ｘ１０３個／ｍＬの密度の培養物とした。細胞浮遊液（２００ｍＬ）を単細胞培養デバイスに播いた。２時間後、２ｍＬの培養上清（同じ細胞を、ｍＴｅＳＲ１培地中、ゼラチンナノファイバー上で１〜３日間培養した培養上清）を添加し、１〜２日毎に交換した。単一の細胞に由来するコロニーが形成されたら、酵素を含まない溶液により解離させ、再度新しいＧＮＦ基板に播いて増殖させた。【００５５】
多能性幹細胞の培養
ヒトｉＰＳＣ株２５３Ｇ１（ＩＭＲ）およびヒトＥＳＣ細胞株Ｈ１およびＨ９を研究に使用した。ｈＥＳＣは、京都大学のガイドラインに従って使用した。細胞を、４ｘ１０４個／ｃｍ２で、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２（Wako Chemicals、日本）を添加したｍＴｅＳＲ−１細胞培養培地（Stem Cell Technologies、米国）中、ＧＮＦまたはマトリゲル（ＭＧ）被覆基板（BD Biosciences、米国）上に播いた。４８時間後、培地をＹ２７６３２を含まないものに交換した。培養培地を毎日交換した。細胞を単一の細胞に解離させ、３〜４日毎に植え継いだ。非酵素的細胞解離のために、エチレンジアミンテトラ酢酸をベースとする溶液（Thermo Fisher Scientific、米国）を使用してＧＮＦ基板上で培養された細胞を回収し、TrypLE Express (GIBCO, USA) を使用してＭＧ被覆基板上で培養された細胞を回収した。２種類の細胞を比較する場合、全く同じ培養条件で培養した。２０分間隔で４８時間にわたり、顕微鏡（IX81, Olympus Co., Japan）下で、３７℃、５％ＣＯ２下で、種々の領域の画像をスキャンし、継続的に取得した。【００５６】
結果
（１）ＧＮＦ基板上で培養された多能性幹細胞の特徴解析
ヒトｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳＣ）を従来のマトリゲル（ＭＧ）被覆基板ではなく、ＧＮＦ基板上で培養すると、同じｈｉＰＳＣ培養条件で形態の異なる２種類のコロニーが観察された。この現象をさらに調べるために、ポリジメチルシロキサンマルチウェルメンブレンおよびＧＮＦ基板を含む単細胞培養デバイスを開発した（図１）。単一のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を単離し、条件培地を使用して培養すると、形態により識別可能な２種類のコロニーを形成した（図２）。【００５７】
種々のｈＰＳＣ株（ｈｉＰＳＣ株：２５３Ｇ１およびＩＭＲ、ｈＥＳＣ（ヒトＥＳ細胞）株：Ｈ１およびＨ９）において、これらの２つのサブタイプの存在が確認された。ＧＮＦ基板上で増殖させると、単細胞由来コロニーの大部分は平坦な単層状のコロニー（Monolayer Colony on Gelatin（ＭＣｏＧ）と称する）の形態を示し、他方のサブタイプは密集したドーム状のコロニー（Domo-like Colony on Gelatin（ＤＣｏＧ）と称する）の形態を示した（図３）。細胞の三次元イメージングにより動画を作成したところ、ＭＣｏＧの単層構造と、ＤＣｏＧの多層構造が確認された。コロニーの高さも大きく異なっていた（図４）。ＭＣｏＧおよびＤＣｏＧ細胞のリアルタイム観察は、２種類の細胞が接着時から異なる形態を示し、増殖中に差異が顕著になっていくことを明らかにした。さらに、これらの単一細胞由来クローンの自己新生特性および形態は、ＧＮＦ基板上で、２７回を超えて継代しても、安定して維持された。これらの２種類の細胞からさらに単一の細胞を単離すると、それから得られたコロニーは、それぞれの形態を維持した。加えて、ショートタンデムリピート分析により、細胞株間での相互の混入はないことが示された。【００５８】
ＤＣｏＧ細胞の平均倍加時間は、２２±０.７時間であり、ＭＣｏＧ細胞の２６.５±１.５ｈより短かった。細胞周期をフローサイトメトリーにより分析した結果、ＭＣｏＧ細胞ではＧ０／Ｇ１期：３８.５３％、Ｓ期：２８.２６％、Ｍ／Ｇ２期：３０.１７％、ＤＣｏＧ細胞では、Ｇ０／Ｇ１期：２７.５３％、Ｓ期：２５.４６％、Ｍ／Ｇ２期：４６.０９％であり、ＭＣｏＧ細胞（５８.４３％）と比較して高い割合のＤＣｏＧ細胞（７１.５５％）がＭ／Ｇ２期およびＳ期にあることが示された。【００５９】
２６回継代した後のこれらの２種類の細胞の多能性を評価した。両サブタイプは、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧおよびアルカリホスファターゼ等の多能性マーカー陽性であり、分化系列決定マーカー（ＰＡＸ６、ブラキュリおよびＡＦＰ）のレベルは最小限であった。フローサイトメトリー分析により、９９.６％以上の細胞がＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０を発現することが示された。次いで、２種類のクローンのインビトロおよびインビボでの分化能力を調べた。ＭＣｏＧおよびＤＣｏＧ細胞は、胚様体および奇形腫を形成し、それらは三胚葉すべての細胞に分化できた。さらに、これらのクローンは２７回を超えて継代しても正常な核型を維持した。これらの結果は、単一のｈＰＳＣに由来する両方のサブタイプが、ＧＮＦ上での長期培養後に適切な多能性を維持することを示す。【００６０】
（２）ＤＣｏＧ細胞の心筋細胞分化能
生物学的な差異を調べるために、非特許文献５に記載の方法に従ってＷｎｔシグナル伝達を調節することにより、２種類の細胞を心筋細胞（ＣＭ）への分化誘導に付した（図５）。簡単に説明すると、ＭＣｏＧおよびＤＣｏＧ細胞を、ＣＨＩＲ９９０２１（１２μＭ）およびｙ２７６３２（１０μＭ）を含むＲＰＭＩ／Ｂ２７（インシュリン不含）中で２日間培養し、ＲＰＭＩ／Ｂ２７（インシュリン不含）中で２日間培養し、ＩＷＰ２（５μＭ）を含むＲＰＭＩ／Ｂ２７（インシュリン不含）中で２日間培養し、ＲＰＭＩ／Ｂ２７（インシュリン不含）中で３日間培養し、その後、細胞をＲＰＭＩ／Ｂ２７（インシュリン含有）中で維持した。【００６１】
分化誘導開始後９日目に、拍動率（全細胞クラスター中の、拍動のあるクラスターの割合）は、ＭＣｏＧ群で６９％、ＤＣｏＧ群で８４％であった。フローサイトメトリーの結果、１０日目に、ｃＴｎＴ（心筋細胞特異的マーカー）陽性細胞がＭＣｏＧ群の３１.９±９.３％、ＤＣｏＧ群の５６.４±１４.６％に見られた。この分化効率の有意な差異に加えて、分化した心筋細胞組織構造は、ＭＣｏＧ群とＤＣｏＧ群で異なり、ＤＣｏＧ群には生体内の心筋構造に類似する細長い構造が見られたが、ＭＣｏＧ群ではそのような構造は見られなかった（図６)。心筋細胞の運動を画像で記録し、フレーム対フレームの相関解析（frame to frame cross correlation）アルゴリズム（Eng, G. et al., Nat. Commun. 7, 1-10 (2016)）においてピクセルの動きを追跡することにより、心筋細胞の収縮機能を示すストレインマップ（Strain map）を生成した。ＤＣｏＧ群は、拍動毎にＭＣｏＧ群より高いストレイン率（ひずみ速度；一定時間内での細胞の変形量を示す）を示し（図７ａ）、ＤＣｏＧ群は、ＭＣｏＧ群の６倍のストレイン／拍動を示した（図７ｂ）。【００６２】
次いで、２種類の細胞におけるＣＭ関連遺伝子の発現を調べた。ＭＣｏＧ群と比較して、ＤＣｏＧ群において、心室構造（ＭＹＬ２、ＨＡＮＤ２、ＭＹＬ３）、心臓のナトリウム／カリウムチャネル（ＳＬＣ８Ａ１、ＫＣＮＱ１）、初期の心臓の転写因子（ＧＡＴＡ４およびＮＫＸ２−５）、ＥＲ−Ｃａ２＋機能（ＰＬＮ）、β１−アドレナリン受容体（ＡＤＲＢ１）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＮＰＰＡ）およびＡＴＰ活性（ＣＫＭ）を含む多数の遺伝子が上方調節されていた（図８）。さらに、ＤＣｏＧ群におけるＭＹＨ７遺伝子（心筋細胞成熟の重要なマーカーであるβ−ＭＨＣをコードする）の発現レベルは、ＭＣｏＧ群よりも４倍高かった。【００６３】
これらの結果は、ＤＣｏＧ細胞は、ＭＣｏＧ細胞より高い分化効率で、ＭＣｏＧ細胞より成熟度と機能が高い心筋細胞に分化することを示す。異なる幹細胞株間で分化効率が異なることはこれまでに報告されているが、本実施例の結果は、同じ細胞株内のサブタイプ間に差異があることを示し、多能性幹細胞をベースとする分化方法のために、より適切な前駆細胞が必要であることを示唆する。【００６４】
（３）ＭＣｏＧおよびＤＣｏＧ細胞に対する基板の影響
２種類の細胞サブタイプに対する基板の影響を調べるために、１０回継代する間、ＧＮＦ基板をＭＧ基板（マトリゲル密度：１０μｇ／ｃｍ２）で置き換えた。ＤＣｏＧ細胞をＭＧ基板に播くと、ドーム状から平坦な単層状に形態が変化した。興味深いことに、これらの細胞をＧＮＦ基板に播き直すと、再度ドーム状のコロニーを形成した。対照的に、ＭＣｏＧ細胞のコロニー形態は、ＧＮＦ基板でもＭＧ基板でも変化しなかった（図９）。ＤＣｏＧ細胞は基板の変化に感受性であり、ＭＣｏＧ細胞はそうではないと考えられ、このことは、２種類の細胞間に、従来の基板で培養しても見出せなかった何らかの内在的な差異があることを示唆する。典型的には、ＤＣｏＧ細胞は基板感受性であり、ＭＣｏＧ細胞は基板非感受性である。標準的な多能性幹細胞の大部分は基板非感受性細胞であり（本実施例では、単離された単一細胞由来クローンの＞９０％が基板非感受性細胞である）、基板の特性の変化に感受性ではない。【００６５】
次いで、単細胞レベルでのＭＣｏＧ細胞およびＤＣｏＧ細胞に対する基板の影響を観察した（図１０）。ＧＮＦ基板上で培養したＤＣｏＧ細胞は、伸展せず、非常に少数の短い糸状仮足を形成し、半球状であった。対照的に、ＭＣｏＧ細胞は、ＧＮＦおよびＭＧ基板の両方で平坦に伸展し、長い糸状仮足を形成した。ＤＣｏＧ細胞はＭＧ基板上ではＭＣｏＧ細胞に似た形態を示し、よく伸展して長い糸状仮足を形成した。【００６６】
ＭＣｏＧ細胞およびＤＣｏＧ細胞に関して、ＲＮＡ分析の結果は、３０９２個の遺伝子の発現における差異を示し、遺伝子オントロジー（ＧＯ）による機能的アノテーション解析は、ＤＣｏＧ細胞で下方調節されている遺伝子の殆どが細胞接着に関連することを示した。これらのデータは、ＤＣｏＧ細胞はＭＣｏＧ細胞よりも接着能が低いことを示唆し、このことは、細胞接着試験により確認された（図１１）。一方、ＧＮＦ基板の接着性は従来の基板（例えば、推奨密度で使用されるＭＧまたはラミニン（ＬＡ））よりも低いことが、以前の研究で示されている（非特許文献５）。さらに、細胞と基板の接着の強さを衝撃波による方法（Yoshikawa, H. Y. et al., J. Am. Chem. Soc. 133, 1367-1374 (2011)）を用いて定量した。試験した４つすべての条件で（ＭＣｏＧ細胞およびＤＣｏＧ細胞を、それぞれＧＮＦおよびＭＧ基板上で）、ＧＮＦ基板上のＤＣｏＧ細胞は、最も低い細胞−マトリックス接着を示した（図１２）。ＧＮＦ基板上のＤＣｏＧ細胞のみがドーム状コロニーを形成することに留意すべきである。これらの４条件で多能性遺伝子の発現を調べたところ、ＧＮＦ上で培養されたＤＣｏＧ細胞は、他の条件と比較して高いＮＡＮＯＧおよびＫＬＦ４／ＫＬＦ５の発現レベルを示した（図１３）。【００６７】
これらの現象をもたらすメカニズムを調べるために、細胞接着、運動性、形態および運命決定を制御する転写因子である、血清応答因子（ＳＲＦ）に注目した。ＳＲＦは、その補因子であるＭＡＬ（ＭＲＴＦ−ＡまたはＭＫＬ１としても知られる）と相互作用したときにのみ、活性化される。ＭＡＬは、球状アクチン（Ｇ−アクチン）レベルの変動に感受性である。核内で、Ｇ−アクチンはＭＡＬに結合し、ＭＡＬがＳＲＦに結合することを防ぎ、Ｇ−アクチン依存性核外輸送を活性化して核内のＭＡＬ量を減らし、かくしてＳＲＦ転写の抑制をもたらす。Ｇ−アクチンは、糸状アクチン（Ｆ−アクチン）細胞骨格の単量体として存在し、Ｇ−アクチンとＦ−アクチンは相互に変換できる。細胞の接着および伸展の上昇に伴って、Ｆ−アクチンのレベルが上昇することが報告されている。一方、Ｆ−アクチンの脱重合化は、リプログラミング過程を促進し、かくしてｉＰＳＣの生成を増進し得ることが知られている。【００６８】
細胞を低接着性のＧＮＦ基板上で培養すると、顕著なＦ−アクチンストレスファイバーがＭＣｏＧ細胞の糸状仮足と細胞体の全体に広がった。対照的に、ＤＣｏＧ細胞では、Ｆ−アクチンは皮層の細胞外殻（cortical cell shell）に局在した（図１４）。Ｆ−アクチンおよびＧ−アクチンを、ファロイジンおよびＤＮａｓｅＩをそれぞれ用いる蛍光分析により定量したところ、ＤＣｏＧ細胞では有意にＦ−アクチンのレベルが低く、Ｇ−アクチンのレベルが高かった（図１５）。ＤＣｏＧ細胞における高いＧ−アクチンレベルは、核から細胞質に輸送されるＭＡＬの量の増加をもたらした。ＭＡＬはＭＣｏＧ細胞の核で高濃度であった（図１６）。加えて、高接着性のＭＧ基板上では、ＤＣｏＧとＭＣｏＧ細胞のアクチン細胞骨格およびＭＡＬ分布に差異はなかった。【００６９】
さらに、２種類の形態の異なるコロニーを形成する細胞の出現は、細胞−細胞接触の密度に実質的な差異があり得ることを示唆する。ＤＣｏＧ細胞では、ＭＣｏＧ細胞よりも細胞−細胞相互作用が強く、Ｅ−カドヘリン発現が高かった（図１７）。【００７０】
（４）様々な基板上でのＤＣｏＧおよびＭＣｏＧ細胞の培養
Miyazaki, T. et al., Nat. Commun. 3, 1210-1236 (2012) の記載に従い、細胞−マトリックス接着を測定した。ヒドロゲル（マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびラミニン）の密度を変えて、接着特性の異なる基板を用意した。推奨密度のヒドロゲル（例えば、１０μｇ／ｃｍ２マトリゲル）で被覆された基板では、２種類の細胞は同様の細胞−マトリックス接着を示したが、ＤＣｏＧ細胞の細胞−マトリックス接着は、密度の低下に伴って、ＭＣｏＧ細胞よりも急速に低下した（図１８）。フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびラミニンでも、同様の傾向が見られた（図１９）。低密度でＭＧ被覆された基板（０.１μｇ／ｃｍ２）上でＤＣｏＧ細胞を培養すると、ドーム状のコロニーを形成し、ＫＬＦ４／５およびＮＡＮＯＧ発現の上方調節を示した（図２０および２１）。高密度でＭＧ被覆された基板（１および１０μｇ／ｃｍ２）上では、ＤＣｏＧ細胞は単層のコロニーを形成し、ＭＣｏＧ細胞と同様のＫＬＦ４／５およびＮＡＮＯＧ遺伝子発現を示した（図２０および２１）。対照的に、ＭＣｏＧ細胞については、ＭＧ密度を変えても形態および発現パターンに明白な変化は観察されなかった（図２０および２１）。このように、低密度のマトリゲルで被覆した基板上では、ＤＣｏＧ細胞は、ＧＮＦ上で培養した場合と同様に、ドーム状のコロニーを形成することが明らかになった。細胞−マトリックス接着の結果から、他のヒドロゲルを低密度で使用した場合でも、ＤＣｏＧ細胞はドーム状のコロニーを形成することが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本願は、成熟度が高い心筋細胞集団の製造に有用である。成熟度が高い心筋細胞集団は、例えば、再生医療、薬剤の効果または毒性の評価への応用、特に、心疾患の処置剤のスクリーニングや医薬候補物質の心毒性評価等に寄与すると期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月23日(2019.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法であって、
（１）弱い細胞接着性を有する基板上で、１個の多能性幹細胞からコロニーが形成されるように多能性幹細胞を播種し、培養し、１個の多能性幹細胞に由来するドーム状のコロニーを形成させること、
（２）ドーム状のコロニーから細胞を得ること、
の各段階を含む方法。
【請求項２】
基板が、ヒドロゲルまたはナノファイバーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
基板が、マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびラミニンから選択されるヒドロゲルを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
基板が、約０．０１〜１．０μｇ／ｃｍ２のマトリゲル、約０．０１〜１．０μｇ／ｃｍ２のフィブロネクチン、約０．０１〜１．０μｇ／ｃｍ２のビトロネクチンおよび約０．０１〜０．１μｇ／ｃｍ２のラミニンから選択されるヒドロゲルを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
基板がゼラチンナノファイバーを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
ゼラチンナノファイバーの密度が約３〜５μｇ／ｃｍ２である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ドーム状のコロニーが、５０μｍ以上の高さのコロニーである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
請求項１〜７、１２および１３のいずれかに記載の方法により得られる多能性幹細胞を含む、心筋細胞を製造するための組成物。
【請求項１０】
請求項１〜７、１２および１３のいずれかに記載の方法により得られる多能性幹細胞の集団を心筋細胞分化誘導することを含む、心筋細胞集団の製造方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法により製造される心筋細胞集団。
【請求項１２】
工程（１）において、１つの培養容器または培養容器の１つのウェルに１個の多能性幹細胞を播種する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
工程（１）における多能性幹細胞が、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞またはｉＰＳ細胞である、請求項１〜７および１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法により得られる多能性幹細胞を含む、心筋細胞を製造するための組成物。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法により得られる多能性幹細胞の集団を心筋細胞分化誘導することを含む、心筋細胞集団の製造方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法により製造される心筋細胞集団。
【国際調査報告】
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