(57)【要約】  本発明は、一般式（１）【化１】2019039544.tif 000057（式中、ｎは２乃至１００であり；Ｐは、１のアミノ基で置換されている（Ｃ１−Ｃ５）アルキレン基を表し；Ｑは、下記一般式（２）【化２】2019039544.tif 000058（上記一般式（２）において、Ｘは、酸素原子を表し、Ｙ１及びＹ２は、炭素数１乃至６のアルキレン基を表し、ｍは１乃至３０の整数である。）であり；Ｚは、クリック官能基を表す。）で表される構造を有する化合物又はその塩、及び薬理作用物質に上記化合物又はその塩を化学結合により導入した、生体膜透過性と水溶性が一挙に改善された薬理活性物質を提供する。
2019039544.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2019039544.tif 000043
（式中、ｎは２乃至１００であり；
Ｐは、アミノ基で置換されている（Ｃ１−Ｃ５）アルキレン基を表し；
Ｑは、下記一般式（２）
【化２】
2019039544.tif 000044
（上記一般式（２）において、Ｘは、酸素原子、イミノ基、硫黄原子、ＮＨＣＯ又はＣＯＮＨを表し、Ｙ１及びＹ２は、同一又は異なっていてもよく、炭素数１乃至６のアルキレン基、酸素原子又はイミノ基を表し、ｍは１乃至３０の整数である。）又は
下記一般式（３）
【化３】
2019039544.tif 000045
（上記一般式（３）において、Ｘは、酸素原子、イミノ基、硫黄原子、ＮＨＣＯ又はＣＯＮＨを表し、Ｙは、炭素数１乃至６のアルキレン基、酸素原子又はイミノ基を表し、ｍは１乃至３０の整数である。）で表される構造を示し；
Ｚは、クリック官能基を表す。）
で表される構造を有する化合物又はその塩。
【請求項２】
一般式（４）
【化４】
2019039544.tif 000046
（式中、ｎは２乃至１００の整数であり；
ｍは１乃至３０の整数であり；
Ｘは、酸素原子又はイミノ基を表し；
Ｙは、炭素数１乃至６のアルキレン基を表し；
Ｚは、クリック官能基を表す。）
で表される請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
クリック官能基が、アジド基、アルケニル基、アルキニル基、ニトリル基、チオール基、マレイミド基、エポキシド基、アジリジン基、チイラン基又はトリアゾール基である、請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
一般式（２ａ）
【化５】
2019039544.tif 000047
（上記一般式（２ａ）において、Ｘ、Ｙ１、Ｙ２、Ｚおよびｍは、上記一般式（１）におけるそれらと同意義である。）、又は
一般式（３ａ）
【化６】
2019039544.tif 000048
（上記一般式（３ａ）において、Ｘ、Ｙ、Ｚおよびｍは、上記一般式（１）におけるそれらと同意義である。）で表される化合物又はその塩の存在下にε−ポリ−Ｌ−リジン、ε−ポリ−Ｄ−リジン、ε−ポリ−Ｌ−β−リジン、ε−ポリ−Ｄ−β−リジン、δ−ポリ−Ｌ−オルニチン、δ−ポリ−Ｄ−オルニチン、δ−ポリ−Ｌ−β−オルニチン、δ−ポリ−Ｄ−β−オルニチン、γ−ポリ−Ｌ−ジアミノブタン酸、γ−ポリ−Ｄ−ジアミノブタン酸、β−ポリ−Ｌ−ジアミノプロピオン酸又はβ−ポリ−Ｄ−ジアミノプロピオン酸生産菌を培養する工程、及び
産生した請求項１に記載の化合物又はその塩を採取する工程、
を含む請求項１に記載の化合物又はその塩の製造方法。
【請求項５】
一般式（３ａ）
【化７】
2019039544.tif 000049
（上記一般式（３ａ）において、Ｘは酸素原子又はイミノ基を表し、Ｙは炭素数１乃至６のアルキレン基を表し、Ｚはクリック官能基を表し、ｍは１乃至３０の整数を表す）で表される化合物又はその塩の存在下にε−ＰＬ生産菌を培養する工程、及び
産生した請求項２に記載の化合物又はその塩を採取する工程、
を含む請求項２に記載の化合物又はその塩の製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩が化学結合によって導入されている薬理作用物質。
【請求項７】
一般式（４）
【化８】
2019039544.tif 000050
（式中、ｎは２乃至１００の整数であり；
ｍは１乃至３０の整数であり；
Ｘは、酸素原子又イミノ基を表し；
Ｙは、炭素数１乃至６のアルキレン基を表し；
Ｚは、クリック官能基を表す。）
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩が化学結合によって導入されている薬理作用物質。
【請求項８】
薬理作用物質が、少なくとも抗菌剤、抗バクテリア剤及び抗がん剤のいずれかである、請求項６又は７に記載の物質。
【請求項９】
抗菌剤が、（Ａ）抗真菌剤であり；
抗バクテリア剤が、（Ｂ）βラクタム系抗生物質、（Ｃ）アミノグリコシド系抗生物質、（Ｄ）テトラサイクリン系抗生物質、若しくは（Ｅ）ペプチド系抗生物質、（Ｆ）クリック官能基を有機化学的若しくは生化学的に導入可能な抗菌抗生物質であり；又は
抗がん剤が、（Ｇ）クリック官能基を有機化学的若しくは生化学的に導入可能な抗がん剤である、請求項８に記載の物質。
【請求項１０】
（Ａ）抗真菌剤が、（ａ−１）アムフォテリシンＢ、ナイスタチン、トリコマイシン、及びピマリシンから選ばれるポリエン系抗生物質；（ａ−２）ミカファンギン；（ａ−３）イトラコナゾール；（ａ−４）ケトコナゾール；（ａ−５）フルコナゾール：（ａ−６）ミコナゾール：若しくは（ａ−７）フルシトシンであり、
（Ｂ）βラクタム系抗生物質が、（ｂ−１）ペニシリン；（ｂ−２）アンピシリン：（ｂ−３）タランピシリン；（ｂ−４）バカンピシリン；（ｂ−５）セファロスポリンＣ；（ｂ−６）セファレキシン；（ｂ−７）セフラジン；（ｂ−８）セファマイシン；若しくは（ｂ−９）イミペネムであり、
（Ｃ）アミノグリコシド系抗生物質が、（ｃ−１）ゲンタマイシン；（ｃ−２）カナマイシン；（ｃ−３）トブラマイシン；（ｃ−４）アミカシン；（ｃ−５）アルベカシン；若しくは（ｃ−６）リボスタマイシンであり、
（Ｄ）テトラサイクリン系抗生物質が、（ｄ−１）オキシテラザイクリン；又は（ｄ−２）テトラサイクリンであり、
（Ｅ）ペプチド系抗生物質が、（ｅ−１）バシトラシン；（ｅ−２）グラミシジン；（ｅ−３）ポリミキシンＢ；（ｅ−４）バンコマイシン；若しくは（ｅ−５）テイコプラニンであり、
（Ｆ）クリック官能基を有機化学的あるいは生化学的に導入可能な抗菌抗生物質としてアミノ基、イミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、カルボニル基、チオール基、リン酸基、アルデヒド基等のいずれかをもつ抗菌抗生物質、又は
（Ｇ）クリック官能基を有機化学的あるいは生化学的に導入可能な抗がん剤としてアミノ基、イミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、カルボニル基、チオール基、リン酸基、アルデヒド基等のいずれかをもつ抗がん剤であり、例えば、（ｆ−１）アクチノマイシンＤ；（ｆ−２）マイトマイシン；（ｆ−３）ドキソルビシン、ダウノルビシン、及びアクラルビシンから選ばれるアントラサイクリン系抗腫瘍薬；（ｆ−４）ブレオマイシン；若しくは（ｆ−５）シスプラチンである、請求項９に記載の物質。
【請求項１１】
薬理作用物質が、少なくとも、タンパク質及び遺伝子のいずれかである、請求項６又は７に記載の物質。
【請求項１２】
タンパク質及び遺伝子が、クリック官能基を有機化学的又は生化学的に導入可能である、請求項１１に記載の物質。
【請求項１３】
請求項７に記載の一般式（４）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を化学結合によって薬理作用物質に導入することを特徴とする、請求項７に記載の薬理作用物質の製造方法。
【請求項１４】
一般式（５）
【化９】
2019039544.tif 000051
（式中ｎは２乃至１００の整数である）で表される、クリックケミストリーによってε−ＰＬ修飾されたアムフォテリシンＢである、請求項７乃至１０のいずれかに記載の物質。
【請求項１５】
一般式（５−２）
【化１０】
2019039544.tif 000052
（式中ｎは２乃至１００の整数である）で表される、クリックケミストリーによってε−ＰＬ修飾されたドキソルビシンである、請求項７乃至１０のいずれかに記載の物質。
【請求項１６】
一般式（５−３）
【化１１】
2019039544.tif 000053
（式中、ｎは２乃至１００の整数であり、式（５−３）’
【化１２】
2019039544.tif 000054
で表される基は、式（５−３）’’
【化１３】
2019039544.tif 000055
で表される蛍光タンパク質モノメリックアザミグリーンの水素原子を１つ除いて形成される基である）で表される、クリックケミストリーによってε−ＰＬ修飾された蛍光タンパク質モノメリックアザミグリーンである、請求項７乃至１０のいずれかに記載の物質。
【請求項１７】
一般式（２ａ）又は（３ａ）で表される化合物又はその塩の、請求項１に記載された一般式（１）で表される化合物又はその塩の製造のための使用。
【請求項１８】
一般式（３ａ）
【化１４】
2019039544.tif 000056
（Ｘは酸素原子又はイミノ基を表し、Ｙは炭素数１乃至６のアルキレン基を表し、Ｚはクリック官能基を表し、ｍは１乃至３０の整数を表す）で表される化合物又はその塩の、請求項７に記載された一般式（４）で表される化合物又はその塩の製造のための使用。
【請求項１９】
一般式（１）で表される化合物又はその塩を薬理作用物質に導入することを特徴とする、薬理作用物質の生体膜透過性改善方法。
【請求項２０】
一般式（１）で表される化合物又はその塩の、生体膜透過性が改善された薬理作用物質の製造のための使用。
【請求項２１】
一般式（１）で表される化合物又はその塩を薬理作用物質に導入することを特徴とする、薬理作用物質の水溶性向上方法。
【請求項２２】
一般式（１）で表される化合物又はその塩の、水溶性が向上した薬理作用物質の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボキシル末端をクリック官能基で修飾したε−ポリ−Ｌ−リジン誘導体、その製造方法及び薬理作用物質の生体膜透過性と水溶性の一挙改善、産業用基材のポリカチオン修飾及び抗菌コートの用途又は使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ε−ポリ−Ｌ−リジン（以下、ε−ＰＬと記す）は、タンパク性アミノ酸であるＬ−リジンが１０〜３５残基直鎖状につながったアミノ酸ホモポリマーであり、Ｌ−リジンのカルボキシル基とε位のアミノ基がイソペプチド結合でつながった構造を特徴とする。ε−ＰＬは、放線菌を含む数種の微生物によって生産されるが、そのペプチド鎖長（Ｌ−リジンの数）は、生産菌によって異なる（非特許文献１〜４）。ε−ＰＬに関する最初の報告は、放線菌であるストレプトマイセス  アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）Ｎｏ．３４６−Ｄ株の培養液から同定された２５〜３５残基のε−ＰＬであるが、その後、このε−ＰＬよりも鎖長の短いε−ＰＬ（短鎖長ε−ＰＬ）が同定された。しかし、３６残基以上のＬ−リジンからなるε−ＰＬは自然界から見つかっていない。【０００３】
ε−ＰＬのαアミノ基（−ＮＨ２）は、例えば生体内のｐＨが中性から酸性の条件下でプロトン化（−ＮＨ3+）されることから、ε−ＰＬは超水溶性のポリカチオンペプチドとして存在し、合成ポリカチオン抗菌剤と同じく幅広い微生物種に対して抗菌活性を示す（非特許文献４）。ストレプトマイセス  アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）Ｎｏ．３４６−Ｄ株によって生産され２５〜３５残基からなるε−ＰＬは、幅広い抗菌活性と高い安全性のため、食品防腐剤又は食品保存料として利用されている。さらに、食品産業だけでなく化学工業分野、医療分野などにおいても安全性が高く環境負荷も少ない生分解性の天然抗菌剤として期待されている。【０００４】
本発明者らは、ポリカチオン性化合物は抗菌活性を示すと同時に、高極性でありながら高い生体膜透過性も併せ持つことに着眼し、薬理作用物質にε−ＰＬを結合させることで（以下、ε−ＰＬ修飾と記す）、薬理作用物質における水溶性と生体膜透過性の一挙改善が期待できるのではないかと考えた（非特許文献４）。さらに、プラスチック、金属、木材、紙、繊維などの様々な医療基材や工業用基材など（以下、総称して産業用基材と記す）の表面をε−ＰＬ修飾できれば、ポリカチオン性による抗菌活性、培養細胞接着効果、防滴効果、及び帯電防止機能など様々な好ましい機能を付与することが可能であるのではないかと着想した。しかしながら、これまで、薬理作用物質のε−ＰＬ修飾について報告例は全くない。しかし、産業用基材のε−ＰＬ修飾については、ε−ＰＬのポリカチオン性（正電荷）と産業用基材の表面負電荷との静電的相互作用を利用した方法が報告されている（特許文献１）。しかし、この非共有結合による化学修飾法は安定性及び耐久性が極めて低く、実用的なε−ＰＬ修飾法としては確立されていない。また、表面負電荷を持つ材料のみに適用可能であり、汎用的な修飾法とは言えない。さらに、ε−ＰＬのポリカチオン性（正電荷）は、抗菌活性、培養細胞接着効果、防滴効果、及び帯電防止機能などを発揮するための重要な化学的性質であり、静電的相互作用を利用した産業用基材のε−ＰＬ修飾は、ε−ＰＬのポリカチオン性低下につながることから、期待した機能を十分に発揮できない問題点がある。本発明者らは、静電的相互作用ではなく、共有結合によるε−ＰＬ修飾法を開発するとともに強力な作用効果を見出した。【０００５】
ε−ＰＬの製造法としては、自然界から分離されたストレプトマイセス  アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）Ｎｏ.３４６−Ｄ株（ＮＢＲＣ１４１４７）を用いた製造法が知られている（特許文献２）。また、ストレプトマイセス  アルブラス以外の種としては、ストレプトマイセス  ノールセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｕｒｓｅｉ）（特許文献３）やストレプトマイセスｓｐ．ＳＰ−７２株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ.ＳＰ−７２）（特許文献４）を用いた製造法が知られている。また、ストレプトマイセスｓｐ．ＳＰ−６６株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＳＰ−６６）（特許文献５）を用いた短鎖長ε−ＰＬの製造法が知られている。【０００６】
ε−ＰＬのポリカチオン性を全く損なうことなく薬理作用物質及び産業用基材をより安定的な共有結合で化学修飾するためには、ε−ＰＬに1つだけ存在するカルボキシル基を利用した有機合成化学が必要である。しかし、ε−ＰＬの全てのαアミノ基（−ＮＨ２）を保護基で保護する高度な有機合成化学の技術を必要とし、その成功例は報告されていない。【０００７】
クリックケミストリー（Click Chemistry）は、保護基を使用しない反応特異性の高い官能基（以下、クリック官能基と記す）を利用した有機合成技術であり、化学工業分野だけでなく他分野において利用されている化学技術である。ε−ＰＬのカルボキシル基にクリック官能基を導入できれば、薬理作用物質及び産業用基材のε−ＰＬ修飾を極めて容易に行うことが可能であると考えられるが、ε−ＰＬのカルボキシル基にクリック官能基を導入する場合にも、ε−ＰＬの全てのαアミノ基（−ＮＨ２）を保護基で保護する高度な有機合成化学の技術を必要とし、その成功例は報告されていない。また、ε−ＰＬ生産微生物によるクリック官能基が導入されたε−ＰＬ誘導体の生産も知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許３１１１２１６号
【特許文献２】特公昭５９−２０３５９号公報
【特許文献３】特開平１−１８７０９０号公報
【特許文献４】特開２０００−６９９８８号公報
【特許文献５】特開２００１−０１７１５９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Shima S, Sakai H. 1977. Polylysine produced by Streptomyces. 1977.
【非特許文献２】Oppermann-Sanio FB, Steinbuechel A. 2002. Occurrence, functions and biosynthesis of polyamides in microorganisms and biotechnological production. 2002.
【非特許文献３】Takehara M, Hirohara H. 2010. Amino-acid homopolymers occurring in nature, p. 1-22. In Hamano Y (ed.), Microbiology Monographs, vol. 15. Springer, New York.
【非特許文献４】Hamano Y. 2010. Amino-acid homopolymers occurring in nature: Biochemistry and enzymology of poly-epsilon-L-lysine, p23-44. In Hamano (ed), Microbiology Monographs, vol. 15. Springer, New York.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、一般式（１）
【化１】
2019039544.tif 000003
（式中、ｎは２乃至１００であり；
Ｐは、アミノ基で置換されている（Ｃ１−Ｃ５）アルキレン基を表し；
Ｑは、下記一般式（２）
【化２】
2019039544.tif 000004
（上記一般式（２）において、Ｘは、酸素原子、イミノ基、硫黄原子、ＮＨＣＯ又はＣＯＮＨを表し、Ｙ１及びＹ２は、同一又は異なっていてもよく、炭素数１乃至６のアルキレン基を表し、ｍは１乃至３０の整数である。）又は
下記一般式（３）
【化３】
2019039544.tif 000005
（上記一般式（３）において、Ｘは、酸素原子、イミノ基、硫黄原子、ＮＨＣＯ又はＣＯＮＨを表し、Ｙは、炭素数１乃至６のアルキレン基を表し、ｍは１乃至３０の整数である。）で表される構造を示し；
Ｚは、クリック官能基を表す。）
で表される構造を有する化合物若しくはその化学的又は薬学的に許容される塩、及びそれらの化合物又はその化学的又は薬学的に許容される塩の製造方法を提供することである（以下、化学的に許容される塩と薬学的に許容される塩を総称して単に塩と称することもある）。
本発明の別の目的は、一般式（４）
【化４】
2019039544.tif 000006
（式中、ｎは２乃至１００であり；
ｍは１乃至３０の整数であり；
Ｘは、酸素原子又はイミノ基を表し；
Ｙは、炭素数１乃至６のアルキレン基を表し；
Ｚは、クリック官能基を表す。）
で表される構造を有するε−ポリ−Ｌ−リジン（ε−ＰＬ）誘導体若しくはその化学的又は薬学的に許容される塩、及びそれらの化合物又はその化学的又は薬学的に許容される塩の製造方法を提供することである（以下、化学的に許容される塩と薬学的に許容される塩を総称して単に塩と称することもある）。
本発明の別の目的は、例えば抗菌又は抗がん性物質等の低分子化合物及び中分子化合物だけでなく、タンパク質（酵素を含む）等の高分子化合物である薬理作用物質に上記化合物（ε−ＰＬ誘導体を含む）を共有結合により導入した、生体膜透過性と水溶性が一挙に改善された薬理作用物質、及びその製造方法を提供することである。またさらに本発明の別の目的は、薬理作用物質の生体膜透過性改善のための上記化合物（ε−ＰＬ誘導体を含む）の使用を提供することである。
さらに、産業用基材の表面を共有結合で上記化合物（ε−ＰＬ誘導体を含む）を使用することによって、種々の産業用基材に上記化合物を導入し、ポリカチオン性による抗菌活性、培養細胞接着効果、防滴効果、及び帯電防止機能など様々な機能を産業用基材に付与することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］一般式（１）
【化５】
2019039544.tif 000007
（式中、ｎは２乃至１００であり；
Ｐは、アミノ基で置換されている（Ｃ１−Ｃ５）アルキレン基を表し；
Ｑは、下記一般式（２）
【化６】
2019039544.tif 000008
（上記一般式（２）において、Ｘは、酸素原子、イミノ基、硫黄原子、ＮＨＣＯ又はＣＯＮＨを表し、Ｙ１及びＹ２は、同一又は異なっていてもよく、炭素数１乃至６のアルキレン基、酸素原子又はイミノ基を表し、ｍは１乃至３０の整数である。）又は
下記一般式（３）
【化７】
2019039544.tif 000009
（上記一般式（３）において、Ｘは、酸素原子、イミノ基、硫黄原子、ＮＨＣＯ又はＣＯＮＨを表し、Ｙは、炭素数１乃至６のアルキレン基、酸素原子又はイミノ基を表し、ｍは１乃至３０の整数である。）で表される構造を示し；
Ｚは、クリック官能基を表す。）
で表される構造を有する化合物又はその塩。
［２］一般式（４）
【化８】
2019039544.tif 000010
（式中、ｎは２乃至１００の整数であり；
ｍは１乃至３０の整数であり；
Ｘは、酸素原子又はイミノ基を表し；
Ｙは、炭素数１乃至６のアルキレン基を表し；
Ｚは、クリック官能基を表す。）
で表される前記［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］クリック官能基が、アジド基、アルケニル基、アルキニル基、ニトリル基、チオール基、マレイミド基、エポキシド基、アジリジン基、チイラン基又はトリアゾール基である、前記［１］又は［２］に記載の化合物又はその塩。
［４］一般式（２ａ）
【化９】
2019039544.tif 000011
（上記一般式（２ａ）において、Ｘ、Ｙ１、Ｙ２、Ｚおよびｍは、上記一般式（１）におけるそれらと同意義である。）、又は
一般式（３ａ）
【化１０】
2019039544.tif 000012
（上記一般式（３ａ）において、Ｘ、Ｙ、Ｚおよびｍは、上記一般式（１）におけるそれらと同意義である。）で表される化合物又はその塩の存在下にε−ポリ−Ｌ−リジン、ε−ポリ−Ｄ−リジン、ε−ポリ−Ｌ−β−リジン、ε−ポリ−Ｄ−β−リジン、δ−ポリ−Ｌ−オルニチン、δ−ポリ−Ｄ−オルニチン、δ−ポリ−Ｌ−β−オルニチン、δ−ポリ−Ｄ−β−オルニチン、γ−ポリ−Ｌ−ジアミノブタン酸、γ−ポリ−Ｄ−ジアミノブタン酸、β−ポリ−Ｌ−ジアミノプロピオン酸又はβ−ポリ−Ｄ−ジアミノプロピオン酸生産菌を培養する工程、及び
産生した前記［１］に記載の化合物又はその塩を採取する工程、
を含む前記［１］に記載の化合物又はその塩の製造方法。
［５］一般式（３ａ）
【化１１】
2019039544.tif 000013
（上記一般式（３ａ）において、Ｘは酸素原子又はイミノ基を表し、Ｙは炭素数１乃至６のアルキレン基を表し、Ｚはクリック官能基を表し、ｍは１乃至３０の整数を表す）で表される化合物又はその塩の存在下にε−ＰＬ生産菌を培養する工程、及び
産生した前記［２］に記載の化合物又はその塩を採取する工程、
を含む前記［２］に記載の化合物又はその塩の製造方法。
［６］前記［１］に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩が化学結合によって導入されている薬理作用物質。
［７］一般式（４）
【化１２】
2019039544.tif 000014
（式中、ｎは２乃至１００の整数であり；
ｍは１乃至３０の整数であり；
Ｘは、酸素原子又イミノ基を表し；
Ｙは、炭素数１乃至６のアルキレン基を表し；
Ｚは、クリック官能基を表す。）
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩が化学結合によって導入されている薬理作用物質。
［８］薬理作用物質が、少なくとも抗菌剤、抗バクテリア剤及び抗がん剤のいずれかである、前記［６］又は［７］に記載の物質。
［９］抗菌剤が、（Ａ）抗真菌剤であり；
抗バクテリア剤が、（Ｂ）βラクタム系抗生物質、（Ｃ）アミノグリコシド系抗生物質、（Ｄ）テトラサイクリン系抗生物質、若しくは（Ｅ）ペプチド系抗生物質、（Ｆ）クリック官能基を有機化学的若しくは生化学的に導入可能な抗菌抗生物質であり；又は
抗がん剤が、（Ｇ）クリック官能基を有機化学的若しくは生化学的に導入可能な抗がん剤である、前記［８］に記載の物質。
［１０］（Ａ）抗真菌剤が、（ａ−１）アムフォテリシンＢ（以下、AmpBと記す）、ナイスタチン、トリコマイシン、及びピマリシンから選ばれるポリエン系抗生物質；（ａ−２）ミカファンギン；（ａ−３）イトラコナゾール；（ａ−４）ケトコナゾール；（ａ−５）フルコナゾール：（ａ−６）ミコナゾール：若しくは（ａ−７）フルシトシンであり、
（Ｂ）βラクタム系抗生物質が、（ｂ−１）ペニシリン；（ｂ−２）アンピシリン：（ｂ−３）タランピシリン；（ｂ−４）バカンピシリン；（ｂ−５）セファロスポリンＣ；（ｂ−６）セファレキシン；（ｂ−７）セフラジン；（ｂ−８）セファマイシン；若しくは（ｂ−９）イミペネムであり、
（Ｃ）アミノグリコシド系抗生物質が、（ｃ−１）ゲンタマイシン；（ｃ−２）カナマイシン；（ｃ−３）トブラマイシン；（ｃ−４）アミカシン；（ｃ−５）アルベカシン；若しくは（ｃ−６）リボスタマイシンであり、
（Ｄ）テトラサイクリン系抗生物質が、（ｄ−１）オキシテラザイクリン；又は（ｄ−２）テトラサイクリンであり、
（Ｅ）ペプチド系抗生物質が、（ｅ−１）バシトラシン；（ｅ−２）グラミシジン；（ｅ−３）ポリミキシンＢ；（ｅ−４）バンコマイシン；若しくは（ｅ−５）テイコプラニンであり、
（Ｆ）クリック官能基を有機化学的あるいは生化学的に導入可能な抗菌抗生物質としてアミノ基、イミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、カルボニル基、チオール基、リン酸基、アルデヒド基等のいずれかをもつ抗菌抗生物質、又は
（Ｇ）クリック官能基を有機化学的あるいは生化学的に導入可能な抗がん剤としてアミノ基、イミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、カルボニル基、チオール基、リン酸基、アルデヒド基等のいずれかをもつ抗がん剤であり、例えば、（ｆ−１）アクチノマイシンＤ；（ｆ−２）マイトマイシン；（ｆ−３）ドキソルビシン（以下、Doxと記す）、ダウノルビシン、及びアクラルビシンから選ばれるアントラサイクリン系抗腫瘍薬；（ｆ−４）ブレオマイシン；若しくは（ｆ−５）シスプラチンである、前記［９］に記載の物質。
［１１］薬理作用物質が、少なくとも、例えば酵素若しくは抗体等のタンパク質及び遺伝子のいずれかである、前記［６］又は［７］に記載の物質。
［１２］タンパク質及び遺伝子が、クリック官能基を有機化学的又は生化学的に導入可能である、前記［１１］に記載の物質。
［１３］前記［７］に記載の一般式（４）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を化学結合によって薬理作用物質に導入することを特徴とする、前記［７］に記載の薬理作用物質の製造方法。
［１４］一般式（５）
【化１３】
2019039544.tif 000015
（式中ｎは２乃至１００の整数である）で表される、クリックケミストリーによってε−ＰＬ修飾されたAmpB（以下、ε-PL-DBCO-AmpBと記す）である、前記［７］乃至［１０］のいずれかに記載の物質。
［１５］一般式（５−２）
【化１４】
2019039544.tif 000016
（式中ｎは２乃至１００の整数である）で表される、クリックケミストリーによってε−ＰＬ修飾されたDox（以下、ε-ＰＬ-DBCO-Doxと記す）である、前記［７］乃至［１０］のいずれかに記載の物質。
［１６］一般式（５−３）
【化１５】
2019039544.tif 000017
（式中、ｎは２乃至１００の整数であり、式（５−３）’
【化１６】
2019039544.tif 000018
で表される基は、式（５−３）’’
【化１７】
2019039544.tif 000019
で表される蛍光タンパク質モノメリックアザミグリーン（以下、mAGと記す）の水素原子を１つ除いて形成される基である）で表される、クリックケミストリーによってε−ＰＬ修飾されたmAG（以下、ε-PL-DBCO-mAGと記す）である、前記［７］乃至［１０］のいずれかに記載の物質。
［１７］一般式（２ａ）又は（３ａ）で表される化合物又はその塩の前記［１］に記載された一般式（１）で表される化合物又はその塩の製造のための使用。
［１８］一般式（３ａ）
【化１８】
2019039544.tif 000020
（Ｘは酸素原子又はイミノ基を表し、Ｙは炭素数１乃至６のアルキレン基を表し、Ｚはクリック官能基を表し、ｍは１乃至３０の整数を表す）で表される化合物又はその塩の前記［７］に記載された一般式（４）で表される化合物又はその塩の製造のための使用。
［１９］一般式（１）で表される化合物又はその塩を薬理作用物質に導入することを特徴とする、薬理作用物質の生体膜透過性改善方法、又は一般式（１）で表される化合物又はその塩の生体膜透過性が改善された薬理作用物質の製造のための使用。
［２０］前記［７］に記載された一般式（４）で表される化合物又はその塩を薬理作用物質に導入することを特徴とする、薬理作用物質の生体膜透過性改善方法、又は一般式（４）で表される化合物又はその塩の、生体膜透過性が改善された薬理作用物質の製造のための使用。
［２１］一般式（１）で表される化合物又はその塩を薬理作用物質に導入することを特徴とする、薬理作用物質の水溶性向上方法。
［２２］一般式（１）で表される化合物又はその塩の、水溶性が向上した薬理作用物質の製造のための使用。
［２３］前記［７］に記載された一般式（４）で表される化合物又はその塩を薬理作用物質に導入することを特徴とする、薬理作用物質の水溶性向上方法、又は一般式（４）で表される化合物の、水溶性が向上した薬理作用物質の製造のための使用。
【発明の効果】
【００１２】
病原菌やガン細胞における薬物排出機能の亢進は、治療薬物への耐性につながる。薬物などの薬理作用物質の生体膜透過性を改善できれば、この耐性機構を回避できるだけでなく、耐性により利用できなくなった薬理作用物質を再利用し得、及び生理活性が増強し得る。膜透過性改善の一般的な戦略は、薬理作用物質の疎水化である。しかし、その反面生じる水溶性の低下は、予期しない副作用の出現や製剤調製の複雑化など新たな問題を生む。そこで、本発明者らは、生体膜透過性と水溶性を一挙に改善させる機能性低分子の化学修飾技術を開発できれば、現代社会が求める創薬スピードをさらに加速させることができると考えた。
タンパク質（酵素を含む）のような高分子化合物は、通常、細胞膜を透過しない。細胞の恒常性維持においてこの性質は重要であるが、一方で、機能解析や制御あるいは医療目的で、これらの分子を細胞外から内に直接導入することも困難と言える。これまでに、マイクロインジェクションやエレクトロポレーションなど細胞膜を一過的に破壊し導入する方法や、リポソームを用いて導入する方法などが用いられてきた。しかし、導入効率や細胞に与える損傷の大きさから、必ずしも満足のいく結果は得られていない。一方で、塩基性（ポリカチオン性）ペプチドの優れた細胞膜透過性が注目され、タンパク質（酵素を含む）をポリカチオン性ペプチドで修飾し、細胞内に直接導入する方法が盛んに試みられるようになってきた（非特許文献、S.R., Schwarze, et al., Science, 285, 1569, 1999）。実際に、ポリカチオン性ペプチドとの化学的架橋体あるいは融合タンパク質としてポリカチオン修飾したタンパク質を調製し、細胞培養液に加えるだけで細胞機能が制御できた例も数多く報告され、細胞生化学的手法の一つとして認知されるとともに、バイオ医薬品（抗体医薬など）の新しい送達法としても注目されている。【００１３】
本発明者らは、これら課題を解決できる化合物として、高極性及び超水溶性かつ高い生体膜透過性を併せ持つポリカチオン性天然化合物であるε−ＰＬを含むポリカチオン体に着想した。細菌の細胞膜表層には酸性リン脂質が露出しており、動物細胞表面には硫酸基やカルボキシル基を多く含む糖鎖が豊富にあるため、その表層は負に帯電している。本発明者らは、正電荷のε−ＰＬを含むポリカチオン体は、この負電荷表層に引き寄せられ、細胞膜を容易に透過し細胞内に移行することに着想した。すなわち、本開示において、ポリカチオン体とは、例えば、ポリカチオン性を有する化合物のことをいう。ポリカチオン体は、例えば、ポリリジンのリジン基のアミノ基に、例えば生体内で、Ｈ＋が付加することによって生成する。
また、例えば、γ-ポリ-L-ジアミノブタン酸、γ-ポリ-D-ジアミノブタン酸、β-ポリ-L-ジアミノプロピオン酸等のε−ＰＬ以外の天然ポリカチオン類縁体等においても同様の効果を奏し得る。
本発明者らは、一般式（１）によって表されるε−ＰＬ誘導体を含む上記［１］に記載されている化合物は、クリックケミストリーによって様々な薬理作用物質に容易に安定な共有結合を介して結合することを見出した。通常、水溶性が高い化合物は生体膜透過性が低いが、ε−ＰＬを含むポリカチオン体が共有結合によって導入された薬理作用物質は、水溶性が非常に高いにも関わらず、ε−ＰＬを含むポリカチオン体のポリカチオン性のため生体膜透過性も非常に高い。このように、薬理作用物質の生体膜透過性と水溶性を一挙に改善させる簡便なε−ＰＬを含むポリカチオン体修飾法に必要な化合物の簡便かつ効果的な新規製造方法が本発明の重要な特徴の一つである。
また、タンパク質（酵素を含む）のような高分子化合物においてもクリックケミストリーによってポリカチオン化することで生体膜透過性を付与させることが可能になる。本開示により、細胞内に高分子化合物を直接送達させるための新規製造方法を提供することができる。なお、クリックケミストリーは従来充分に確立されており、本発明においてもそれに従ってよい。【００１４】
本発明では、上記した一般式（１）で表される化合物（本明細書において、一般式（４）で表される化合物を含む。）又はその塩を導入した薬理作用物質で処理することによって、様々な産業基材（例えば、プラスチック製、繊維製等の医療機材、機能性材料等）等をポリカチオン化（ε−ＰＬ修飾を含む）することを可能することにより、優れた抗菌活性、培養細胞接着効果、浸水処理、防滴効果、帯電防止機能を該産業機材などに付与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａは、Streptomyces albulus NBRC14147の培養上清をESI-TOF-MS/HPLC分析によりクロマトグラフィー解析した結果を示す。上図は無添加培養液の分析結果、中図はε−ＰＬ-PEG-アジドを添加した培養液、下図はε−ＰＬ-PEG-アルキンを添加した培養液の分析結果を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ε−ＰＬ（上図）、ε−ＰＬ-PEG-アジド（中図）とε−ＰＬ-PEG-アルキン（下図）のESI-TOF-MSの結果を示している。
【図２Ａ】図２Ａは、ε−ＰＬ生産菌Streptomyces albulus NBRC14147によって生産された17〜26 merのε−ＰＬからなるε−ＰＬ-PEG-アジドの1H-NMRによる構造決定の結果を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ε−ＰＬ生産菌Streptomyces albulus NBRC14147によって生産されたε−ＰＬ-PEG-アルキンの1H-NMRによる構造決定の結果を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、クリックケミストリーによってε−ＰＬ−DBCO-FAMを合成した反応溶液のESI-TOF-MS/HPLC分析によるクロマトグラフィーの結果を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、合成したε−ＰＬ−DBCO-FAMのESI-TOF-MSの結果を示す。
【図４】図４は、式（１２）で表されるDBCO-PEG4-5/6-FAM及び一般式（１３）で表されるε−ＰＬ−DBCO-FAMにおけるHeLa細胞を用いた生体膜透過性試験の結果を示す。
【図５】図５は、一般式（１３）で表されるε−ＰＬ−DBCO-FAMにおけるHeLa細胞を用いた生体膜透過性評価について共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す。生体膜と核をそれぞれAlexa594 WGA（小麦胚芽レクチン）と4,6-diamidino-2-phenylindole（DAPI)で染色した。
【図６Ａ】図６Ａは、クリックケミストリーによってε−ＰＬ−DBCO-AmpBを合成した反応溶液のESI-TOF-MS/HPLC分析によるクロマトグラフィーの結果を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、合成したε−ＰＬ−DBCO-AmpBのESI-TOF-MSの結果を示す。
【図７】図７は、ε−ＰＬ−DBCO-AmpBの水溶性を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、クリックケミストリーによってε−ＰＬ−DBCO-Docを合成した反応溶液のESI-TOF-MS/HPLC分析によるクロマトグラフィーの結果を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、合成したε−ＰＬ−DBCO-DocのESI-TOF-MSの結果を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、一般式（５−３）’’で表されるmAGのESI-TOF-MS/HPLC分析によるクロマトグラフィー（左）、ESI-TOF-MSによるマススペクトル（中）、得られたマススペクトルのデコンボリューション（右）の結果を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、DBCO-mAGのESI-TOF-MS/HPLC分析によるクロマトグラフィー（左）、ESI-TOF-MSによるマススペクトル（中）、得られたマススペクトルのデコンボリューション（右）の結果を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、一般式（５−３）で表されるε−ＰＬ−DBCO-mAGのESI-TOF-MS/HPLC分析によるクロマトグラフィー（左）、ESI-TOF-MSによるマススペクトル（中）、得られたマススペクトルのデコンボリューション（右）の結果を示す。
【図１０】図１０は、一般式（５−３）’’で表されるmAG及び一般式（５−３）で表されるε−ＰＬ−DBCO-mAGにおけるHeLa細胞を用いた生体膜透過性試験の結果を示す。
【図１１】図１１は、一般式（５−３）で表されるε−ＰＬ−DBCO-mAGにおけるHeLa細胞を用いた生体膜透過性評価について共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す。生体膜をAlexa594 WGA（小麦胚芽レクチン）で染色した。
【図１２Ａ】図１２Ａは、一般式（１５）で表されるε−ＰＬ-アルキンのエステル結合の化学的安定性について検証した結果を示す。ε−ＰＬ-アルキンをTris-HCl緩衝液（pH8.0）に1ｍＭの濃度で溶解し、６０℃で５分間加熱後、ESI-TOF-MS/HPLCで分析した。#はε−ＰＬ-アルキンのシグナルを示し、*はε−ＰＬ-アルキンのエステル結合が加水分解されて生じたε−ＰＬのシグナルを示す。
【図１２Ｂ】１２Ｂは、一般式（１１）で表されるε−ＰＬ-PEG-アルキンのエステル結合の化学的安定性について検証した結果を示す。ε−ＰＬ-PEG-アルキンをTris-HCl緩衝液（pH8.0）に1ｍＭの濃度で溶解し、６０℃で５分間加熱後、ESI-TOF-MS/HPLCで分析した。+はε−ＰＬ-PEG-アルキンのシグナルを示し、*はε−ＰＬ-PEG-アルキンのエステル結合が加水分解されて生じたε−ＰＬのシグナルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明において、一般式（１）で表される化合物中のＰは、１又は２以上のアミノ基で置換されている（Ｃ１−Ｃ５）アルキレン基である。（Ｃ１−Ｃ５）アルキレン基は、直鎖状であってもよく、分岐していてもよいが、直鎖状であることが好ましい。一般式（１）で表される化合物中のＰは、１のアミノ基で置換されている（Ｃ１−Ｃ５）アルキレン基であることが好ましく、具体的には、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ＊Ｈ（ＮＨ２）、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ＊Ｈ（ＮＨ２）ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ＊Ｈ（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２Ｃ＊Ｈ（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、Ｃ＊Ｈ（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ＊Ｈ（ＮＨ２）、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ＊Ｈ（ＮＨ２）ＣＨ２、ＣＨ２Ｃ＊Ｈ（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＨ２、Ｃ＊Ｈ（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２Ｃ＊Ｈ（ＮＨ２）、ＣＨ２Ｃ＊Ｈ（ＮＨ２）ＣＨ２、Ｃ＊Ｈ（ＮＨ２）ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２Ｃ＊Ｈ（ＮＨ２）又はＣ＊Ｈ（ＮＨ２）ＣＨ２等が例示される。ここで＊は、不斉炭素であることを示し、Ｒ体であってもよく、Ｓ体であってもよい。
【００１７】
本発明において、一般式（１）で表される化合物について、Ｘで表されるイミノ基は、―ＮＲ―で表され、Ｒとしては、Ｈ又は適当な置換基、例えば、メチル基、エチル基などの炭素数１乃至６の低級アルキル基、例えば、フェニル基などのアリール基、例えば、フリール基、ピリジル基、チエニル基などのヘテロ原子１乃至３を含む複素環基などが挙げられる。中でも、Ｒは５乃至６員複素環基であることが好ましい。
Ｙ、Ｙ１又はＹ２で表される炭素数１乃至６のアルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、イソプロピレン基、ブチレン基、イソブチレン基、ペンテン基、ヘキセン基などが挙げられる。中でも、Ｙは炭素数２乃至６のアルキレン基が好ましい。当該アルキレン基は、通常の置換基で置換されていてもよく、そのような置換基としては、ハロゲン原子（例えば、臭素原子、塩素原子、フッ素原子など）、水酸基、アミノ基、メルカプト基、カルボキシル基、スルホ基などが例示される。アルキレン基には、例えば、―Ｏ―、―Ｓ―、―Ｓ―Ｓ―、シリル基など介在基が含まれていてもよい。
【００１８】
本発明におけるクリック官能基としては、例えば、アジド基（―Ｎ３）、アルケニル基（例えば、―ＣＨ＝ＣＨ２、―ＣＨ＝ＣＨ―ＣＨ３）、アルキニル基（例えば、―Ｃ≡ＣＨ、―Ｃ≡Ｃ―ＣＨ３）、ニトリル基、チオール基、マレイミド基、エポキシド基、アジリジン基、チイラン基、トリアゾール基等が挙げられる。
【００１９】
一般式（１）、（４）、（５）、（５−２）及び（５−３）、並びに後述の一般式（６）、（７）、（１０）、（１１）、（１３）及び（１５）のそれぞれにおいて、ｎは２乃至１００のいずれであってもよいが、好ましくは１０乃至４０程度、より好ましくは９乃至３０程度である。ｎは培養する菌の種類、菌の培養条件（例えば、ｐＨ、温度、時間等）により異なるため、一概には言えないが、通常はｎが２乃至３５の化合物、２５乃至３５の化合物、９乃至１８の化合物、又は１７乃至２６の化合物も好ましい。
一般式（１）又は（４）において、ｍは１乃至３０のいずれであってもよいが、好ましくは２乃至２０程度である。ｍが２以上であることにより、一般式（１）で表される化合物又はその塩が導入された薬理作用物質の生体膜透過性改善効果又は水溶性向上効果がさらに高まり得るとともに、化学的に高い安定性を有し得る。
【００２０】
一般式（１）で表される化合物（但し、Ｑが一般式（２）で表される構造を示す場合）の具体例を以下に示す。
【００２１】
【表１】
2019039544.tif 000021
上記表１において、Ｐは、CH2CH2CH2CH2C*H(NH2)（ここで、不斉炭素はＲ体である。）を示す。
【００２２】
【表２】
2019039544.tif 000022
上記表２において、化合物番号３１〜４５におけるＰは、CH2CH2CH2C*H(NH2)CH2（ここで、不斉炭素はＳ体である。）を、化合物番号４６〜６０におけるＰは、CH2CH2CH2C*H(NH2)（ここで、不斉炭素はＲ体である。）を示す。
【００２３】
【表３】
2019039544.tif 000023
上記表３において、化合物番号６１〜７０におけるＰは、CH2CH2C*H(NH2)CH2（ここで、不斉炭素はＳ体である。）を、化合物番号７１〜８０におけるＰは、CH2CH2C*H(NH2)（ここで、不斉炭素はＲ体である。）を、化合物番号８１〜９０におけるＰは、CH2C*H(NH2)（ここで、不斉炭素はＳ体である。）を示す。
【００２４】
一般式（１）で表される化合物（但し、Ｑが一般式（３）で表される構造を示す場合）の具体例を以下に示す。
【００２５】
【表４】
2019039544.tif 000024
上記表４において、Ｐは、CH2CH2CH2CH2C*H(NH2)（ここで、不斉炭素はＳ体である。）を示す。
【００２６】
【表５】
2019039544.tif 000025
上記表５において、化合物番号１２１〜１３５におけるＰは、CH2CH2CH2C*H(NH2)CH2（ここで、不斉炭素はＲ体である。）を、化合物番号１３６〜１５０におけるＰは、CH2CH2CH2C*H(NH2)（ここで、不斉炭素はＳ体である。）を示す。
【００２７】
【表６】
2019039544.tif 000026
上記表６において、化合物番号１５１〜１６０におけるＰは、CH2CH2C*H(NH2)CH2（ここで、不斉炭素はＲ体である。）を、化合物番号１６１〜１７０おけるＰは、CH2CH2C*H(NH2)（ここで、不斉炭素はＳ体である。）を、化合物番号１７１〜１８０おけるＰは、CH2C*H(NH2)（ここで、不斉炭素はＲ体である。）を示す。
【００２８】
一般式（１）又は（４）の薬理学的に許容しうる塩としては、例えば、塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸との塩、例えば、シュウ酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸などの有機酸との塩、例えば、ナトリウム、カリウムなどの無機塩基との塩、例えば、ジメチルアミン、トリエチルアミンなどの有機塩基との塩が例示される。
【００２９】
一般式（１）で表される化合物又はその塩は、一般式（６）
【化１９】
2019039544.tif 000027
（式中、Ｐ＋は、１又は２以上の（好ましくは１の）Ｎ＋Ｈ３で置換されている（Ｃ１−Ｃ５）アルキレン基を示し、ｎは前記と同意義である。）で表される化合物と、一般式ＨＱＺ（式中、Ｑ及びＺは、前記と同意義である。）で表される化合物又はその塩を縮合反応に付することにより製造できる。
また、一般式（４）で表される化合物又はその塩は、一般式（７）
【化２０】
2019039544.tif 000028
（式中、ｎは前記と同意義である。）
で表されるε−ＰＬと、一般式（３ａ）
【化２１】
2019039544.tif 000029
（式中、Ｘ、Ｙ及びｍは前記と同意義である。）
で表される化合物又はその塩を縮合反応に付することにより製造できる。
縮合反応前、原料物質の反応に関与するアミノ基は、保護基によって予め保護しておき、縮合反応後に除去することによって、目的物である一般式（１）で表される化合物又はその塩を得ることができる。縮合反応の仕方は、従来この分野で充分に確立されているので、本発明でもそれに従ってよい。目的物の合成反応液の濃縮、転溶、クロマトグラフィーなどの常套手段によって、一般式（１）で表される化合物を取得することができる。このような技術はペプチド合成の分野で充分確立されているから、本発明もそれに従ってよい。
【００３０】
一般式（６）で表される化合物（一般式（７）で表される化合物ε−ＰＬを含む）は、例えば発酵法、化学合成等の化学反応のいずれの方法によって得られたものであってもよく、リジンから化学合成により得られたものでもよい。例えば、特許第１２４５３６１号明細書に記載のストレプトマイセズ・アルブラス・サブスピーシーズ・リジノポリメラスを培地、例えば、グルコース５重量％、酵母エキス０．５重量％、硫酸アンモニウム１重量％、リン酸水素二カリウム０．０８重量％、リン酸二水素カリウム０．１３６重量％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５重量％、硫酸亜鉛・７水和物０．００４重量％、硫酸鉄・７水和物０．０３重量％、ｐＨ６．８に調整した培地にて培養し、得られた培養物からε−ポリリジンを分離・採取することによって得られるε−ＰＬを挙げることができる。
また、一般式（７）で表される化合物ε−ＰＬの類縁体を含むポリカチオン体は、いずれの方法によって得られたものであってもよく、次の非特許文献に記載の方法でも得ることが可能である。
例えば、γ−ポリ−Ｌ−ジアミノブタン酸は、例えば論文（Takehara, M., Saimura, M., Inaba, H. & Hirohara, H. Poly(gamma-L-diaminobutanoic acid), a novel poly(amino acid), coproduced with poly(epsilon-L-lysine) by two strains of Streptomyces celluloflavus. FEMS Microbiol Lett 286, 110-7 (2008).）を参照することにより製造され得る。
また、γ−ポリ−Ｄ−ジアミノブタン酸は、例えば論文（Ohkuma, H., Tenmyo, O., Konishi, M., Oki, T. & Kawaguchi, H. BMY-28190, a novel antiviral antibiotic complex. J Antibiot (Tokyo) 41, 849-54 (1988). ）を参照することにより製造され得る。
また、β−ポリ−Ｌ−ジアミノプロピオン酸は、例えば論文（Xia, J., Xu, H., Feng, X., Xu, Z. & Chi, B. Poly(L-diaminopropionic acid), a novel non-proteinic amino acid oligomer co-produced with poly(epsilon-L-lysine) by Streptomyces albulus PD-1. Appl Microbiol Biotechnol 97, 7597-605 (2013).又はXu, Z. et al. Systematic unravelling of the biosynthesis of poly (L-diaminopropionic acid) in Streptomyces albulus PD-1. Sci Rep 5, 17400 (2015). ）を参照することにより製造され得る。
【００３１】
本発明において使用される一般式（７）で表されるε−ＰＬ等のポリカチオン体は塩として使用されてもよく、そのような塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、及びリン酸等の無機酸とポリカチオン体とで形成されるポリカチオン体の無機酸塩、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、リンゴ酸、クエン酸、マレイン酸、アジピン酸、グルコン酸、及び乳酸等の有機酸とポリカチオン体とで形成されるポリカチオン体の有機酸塩、カプロン酸、ラウリン酸、及びステアリン酸等の中鎖及び長鎖の飽和脂肪酸とポリカチオン体とで形成されるポリカチオン体の飽和脂肪酸塩、オレイン酸、リノール酸、及びアラキドン酸等の中鎖及び長鎖の不飽和脂肪酸とポリカチオン体とで形成されるポリカチオン体の不飽和脂肪酸塩等が挙げられる。
【００３２】
一般式（２ａ）又は（３ａ）で表される化合物は、公知化合物であるか、公知化合物と類似の化合物である。したがって、一般式（２ａ）又は（３ａ）で表される化合物は、公知方法又は自体公知の方法に従って容易に製造できる。
【００３３】
一般式（１）又は（４）で表される化合物は、下記する微生物培養方法によって簡便かつ効率よく製造することが可能である。
【００３４】
本発明で用いる微生物としては、ε−ＰＬ等のポリカチオン体を生産する能力を持つ微生物であればいずれでもかまわないが、好ましくはキタサトスポラ（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ）属細菌あるいはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌である。
キタサトスポラ属細菌としては、例えば、Ｉｎｔｅｒｅｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、４７巻、１０４８−１０５４頁、１９９７年に記載されているものが挙げられるが、その中でもキタサトスポラ・キフネンセ（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａｋｉｆｕｎｅｎｓｅ）が好ましく、キタサトスポラ・キフネンセＭＮ−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９７１２）がより好ましい。
ストレプトマイセス属としては、例えば、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ ｓｕｂｓｐ. ｌｙｓｉｎｏｐｏｌｙｍｅｒｕｓ）Ｎｏ.３４６−Ｄ株（ＩＦＯ１４１４７、特公昭５９−２０３５９号公報）、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラス１１０１１Ａ株（特公平３−４２０７０公報）、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラスＢ２１０２１株（特開平０９−１７３０５７号公報）、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラスＢ１５２０８株(特開平１０−２９０６８８号公報)、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシーズＳＰ−２５株（特開２００２−０９５４６７号公報）、ストレプトマイセスｓｐ．ＳＰ−７２株（特開２０００−０６９９８８号公報）、ストレプトマイセスｓｐ．ＳＰ−６６株（特開２００１−０１７１５９号公報）、ストレプトマイセス・ヘルバリカラーＳＰ−１３株（特開２００２−０９５４６６号公報）、ストレプトマイセス・ラベンデュラエU ＳＥ−５３株（特開２００３−０５２３５８号公報）、ストレプトマイセス・ノールセイ（特開平１−１８７０９０号公報）などを挙げることができる。この中でも、ストレプトマイセス アルブラスに分類される微生物が好ましく、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラスＮｏ.３４６−Ｄ株（Streptomyces albulus NBRC14147株と同一株）がより好ましい。
また、本発明で用いる微生物は、上記γ-ポリ-L-ジアミノブタン酸、γ-ポリ-D-ジアミノブタン酸、β-ポリ-L-ジアミノプロピオン酸等のε−ＰＬの類縁体の生産菌であってもよい。
【００３５】
これら微生物を培養する培地中には、クリック官能基を含む一般式（２ａ）又は（３ａ）で表される化合物を添加する。一般式（２ａ）又は（３ａ）で表される化合物は、一般式（２ａ）又は（３ａ）で表される化合物の範囲に属するものであればどのようなものでもよく、例えば、ＰＥＧ−アジド、ＰＥＧ−アルキン（すなわち、アルキニルＰＥＧ）等が挙げられる。培地中に添加する一般式（２ａ）又は（３ａ）で表される化合物の濃度は、0.1％〜1.0％（％は容量百分率）が好ましい。また一般式（２ａ）又は（３ａ）で表される化合物以外の培地成分として炭素源、窒素源、無機物及びその他栄養物等を適当に含有する培地ならばいずれも使用可能である。炭素源としては、ポリカチオン体生産株が資化可能であるものであればよく、例えば、グルコース、フルクトース、スターチ、グリセロール等が挙げられる。炭素源の含有量は、1.0％〜10.0％が好ましく、1.0％〜5.0％がより好ましい。窒素源としては、例えば、ペプトン、カゼイン加水分解物、アミノ酸、無機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム等が挙げられるが、なかでも硫酸アンモニウムが好ましい。窒素源の含有量は、0.1％〜5.0％が好ましく、0.1％〜1.0％がより好ましい。炭素源又は窒素源は、培養途中で逐次添加してもよい。無機物としては、リン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、硫酸イオンなどが挙げられる。菌の生育を良好にするために、培地中に酵母エキスを含有させることが好ましい。酵母エキスの含有量は、0.05％〜0.5％が好ましく、0.1％〜0.5％がより好ましい。培地のｐＨは、微生物が培養できるｐＨであればよいが、例えば、ｐＨ３〜ｐＨ８が挙げられ、なかでも微生物の成育には中性付近（ｐＨ６〜８）が好ましく、一般式（１）で表される化合物の生産においてはｐＨ３〜ｐＨ５がさらに好ましい。なお、本発明において、％は特にことわりのない限り、ｗ／ｖ％である。より詳しくは、下記する実施例を参照。
【００３６】
培養は、振盪培養又は撹拌培養等、酸素を供給する好気条件下で行うことが好ましい。培養温度は、ポリカチオン体生産株が生育できれば特に限定されないが、例えば、２５〜３５℃等が挙げられる。培養開始後、菌の増殖とともに培養液のｐＨが低下するが、ｐＨを維持するための方法としては、例えば、培養液にアルカリ溶液を添加する等して培養液のｐＨを４付近で維持する方法等が挙げられる。添加するアルカリ溶液は特に限定されるものではなく、例えば、水酸化ナトリウム、アンモニア水等が挙げられる。
【００３７】
上記培養液から遠心分離若しくはフィルター濾過で菌体を除去した後、菌体除去液を弱酸性陽イオン交換樹脂に吸着させる。弱酸性陽イオン交換樹脂は特に限定されるものではないが、例えば、アンバーライトＩＲＣ−５０（ローム・アンド・ハース社製）等が挙げられる。吸着後、塩酸で溶出することにより、純度の高い一般式（１）で表されるポリカチオン体誘導体を得ることができる。また、これをテトラフェニルボレイト法（非特許文献、H. Katanoら、Anal. Sci., 28, 1153-1157, 2012）で単離精製することも可能である。
【００３８】
次いで、一般式（１）で表される化合物を薬理作用物質にクリックケミストリーを利用して共有結合により導入する。クリックケミストリーは、当業者によく知られている。本発明において、そのように知られた技術に従ってよい。本発明で使用される薬理作用物質としては、一般式（１）で表される化合物又はその塩がクリック官能基による共有結合形成によって導入可能であればどのようなものでもよいが、例えば、三重結合（例えば、−Ｃ≡Ｃ−）を有する化合物が好ましい。要するに薬理作用物質として、クリック官能基と反応して化学結合する薬理作用物質などのようなものでも好ましい。これによって、生体膜透過性と水溶性が一挙に改善される。
【００３９】
薬理作用物質としては、例えば、抗真菌剤を含む抗菌剤、抗バクテリア剤、抗がん剤、酵素又は抗体等のタンパク質、遺伝子等が挙げられる。抗真菌剤としては、例えば、ポリエン系抗生物質（アムフォテリシンＢ、ナイスタチン、トリコマイシン、ピマリシン等）、ミカファンギン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、フルコナゾール、ミコナゾール、フルシトシン等が挙げられる。抗バクテリア剤としては、例えば、βラクタム系抗生物質（ペニシリン、アンピシリン、タランピシリン、バカンピシリン、セファロスポリンＣ、セファレキシン、セフラジン、セファマイシン、イミペネム等）、アミノグリコシド系抗生物質（ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、アミカシン、アルベカシン、リボスタマイシン等）、テトラサイクリン系抗生物質（オキシテラサイクリン、テトラサイクリン等）、ペプチド系抗生物質（バシトラシン、グラミシジン、ポリミキシンＢ、バンコマイシン、テイコプラニン等）等が挙げられる。抗がん剤としては、例えば、クリック官能基を導入可能な抗がん剤等が挙げられる。クリック官能基を導入可能な抗がん剤としては、例えばアクチノマイシンD、マイトマイシン、アントラサイクリン系抗腫瘍薬（ドキソルビシン、ダウノルビシン、アクラルビシン等）、ブレオマイシン、シスプラチンが挙げられる。タンパク質としては、mAG等の蛍光タンパク質、CRISPR-Cas9 システムに使用される、Casタンパク質(Cas,Cas9)、Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Myc等の遺伝子産物であるヤマナカファクタータンパク質、遺伝子発現制御タンパク質等が例示される。酵素としては、トリプシン、Cre Recombinase、λ-Red recombinase等が例示される。抗体としては、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＹ抗体等の免疫グロブリン等が例示される。遺伝子としては、プラスミド、オリゴヌクレオチド、Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Myc等のヤマナカファクター、CRISPR-Cas9 システムに使用される、PAM配列、gRNA(ガイドRNA,guide RNA,sgRNA)等が例示される。
【００４０】
一般式（１）で表される化合物又はその塩を、薬理作用物質に導入する場合に、クリックケミストリーの分野で従来常套手段として用いられている介在基を使用するのが便利である。介在基とは、要するに、薬理作用物質と一般式（１）で表される化合物又はその塩とを一体化させるために介在し得る基であり、本発明の目的を阻害しない限りどのような基であってもよい。そのような介在基としては、例えば下記式（９a）〜（9ｄ）のいずれか等で示される、介在基のもととなる化合物におけるアミノ基、カルボキシル基又は水酸基が、薬理作用物質におけるカルボキシル基、水酸基又はアミノ基と反応して共有結合を形成し、当該化合物における三重結合が一般式（１）で表される化合物又はその塩におけるクリック官能基と反応して共有結合を形成している介在基が挙げられ、このような基の種類、薬理作用物質への導入方法（アミド化反応、エステル化反応、フィスゲン反応など）などは、クリックケミストリーの分野で従来充分に確立されているので、本発明でもそれに従ってよい。
【００４１】
【化２２】
2019039544.tif 000030
【化２３】
2019039544.tif 000031
【化２４】
2019039544.tif 000032
【化２５】
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【００４２】
一般式（１）又はその塩を、薬理作用物質に導入する場合に、例えば、ＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチン）等のクリックケミストリー介在化合物を介在させてもよい。すなわち、薬理作用物質とＤＢＣＯ等クリックケミストリー介在化合物を結合させて得られる化合物に一般式（１）で表される化合物又はその塩を導入するのが有利である。
【００４３】
例えば、一般式（１）で表される化合物を薬理作用物質に共有結合によって導入する例として、下記の例が挙げられる。
【００４４】
式（８）
【化２６】
2019039544.tif 000034
で表される水難溶性のAmp-Bから出発する有機合成反応によって、式（９）
【化２７】
2019039544.tif 000035
で表されるAmpB-DBCOを製造する。この反応は、公知の方法又は自体公知のアミド化反応によって行われてよい。このようにして製造される化合物（９）又はその塩に一般式（１０）
【化２８】
2019039544.tif 000036
（式中ｎは２乃至１００の整数である）で表されるε−ＰＬ誘導体（以下、ε−ＰＬ−PEG-アジドと記す）又はその塩を反応させて、一般式（５）
【化２９】
2019039544.tif 000037
（式中ｎは２乃至１００の整数である）で表される水溶性のε−ＰＬ−DBCO-AmpB又はその塩を製造することができる。より詳しくは、下記する実施例を参照。
【００４５】
このようにして製造される一般式（５）で表される水溶性のε−ＰＬ−DBCO-AmpB又はその塩は、深在性真菌症治療薬として有用なアムフォテリシンＢの抗菌効力を維持しつつ、アムフォテリシンＢの欠点である腸管から吸収されにくく、経口投与が困難であり静脈投与に頼らざるを得ないという点を克服できるのみならず、さらには水難溶性（点滴時間が長い）といった欠点を克服するものである。
【００４６】
一般式（５−２）で表される水溶性のε−ＰＬ−DBCO-Doxとその塩は、一般式（５）で表される化合物の製造方法と同様の方法で製造することができる。より詳しくは、下記する実施例を参照。
【００４７】
このようにして製造される一般式（５−２）で表される水溶性のε−ＰＬ−DBCO-Dox又はその塩は、抗がん剤として有用なドキソルビシンの抗がん活性を維持しつつ、腸管からの吸収と副作用を軽減し得る。また、ε−ＰＬ−DBCO-DoxのDox構造がDNAの二重螺旋構造にインターカーレートすることから、プラスミドDNAや遺伝子断片、又は、RNAとε−ＰＬ−DBCO-Doxを混合するだけで、DNA又はRNAを共有結合なしにポリカチオン修飾することが可能である。本法でポリカチオン修飾したプラスミドDNAや遺伝子断片、又はRNAを、細胞内に直接送達し得る。より詳しくは、下記する実施例を参照。
【００４８】
一般式（５−３）で表されるε−ＰＬ−DBCO-mAG又はその塩は、一般式（５）で表される化合物の製造方法と同様の方法で製造することができる。より詳しくは、下記する実施例を参照。
【００４９】
このようにして製造される一般式（５−３）で表されるε−ＰＬ−DBCO-mAG又はその塩は、蛍光タンパク質であるmAGを細胞内に直接送達させることが可能である。同様に高分子の薬理作用物質、例えば、タンパク質（酵素、抗体を含む）などもε−ＰＬ修飾することで細胞内へ直接送達し得る。
【００５０】
本発明のクリック官能基を介したポリカチオン体導入法は、例えば、産業基材（例えば、プラスチック製又は繊維性等の医療機材若しくは機能性材料）等にも応用できる。医療機材としては、例えば、細胞培養ディッシュ、医療器具、再生医療機材等が挙げられる。機能性材料としては、例えば、電子基板、特殊コーティングガラス等が挙げられる。産業基材等に本発明のポリカチオン体導入を適用することによって、例えば、抗菌活性、培養細胞接着効果、親水効果、防滴効果、帯電防止効果等を付与することができる。
【００５１】
以下にいくつかの実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。本発明は以下の実施例に限定されるものでなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに本発明は技術的実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００５２】
［実施例１］
微生物による一般式（１）で表される化合物の生産方法
ε−ＰＬ生産菌としてStreptomyces albulus NBRC1417を用い、短鎖ε−ＰＬ生産菌として、pls L883P/pLAE009/S. albulus CRM003（非特許文献：Y. Hamanoら, Appl. Environ. Microbiol., 80, 4993-5000, 2014）を用いた。また、その培養には滅菌したSLB培地（スクロース、10.3 g; トリプトン、10 g; 酵母エキス、5 gの各成分を１Ｌの蒸留水に溶解したもの）、及びM3G培地（グルコース、50 g; 硫酸アンモニウム、10 g; 酵母エキス、5 g; リン酸二水素カリウム、1.36 g; リン酸水素二ナトリウム・12水、1.58 g; 硫酸亜鉛七水和物、0.04 g; 硫酸鉄(II)七水和物、0.03 g; 硫酸マグネシウム七水和物、0.5 gの各成分を１Ｌの蒸留水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨを７．０に調整したもの）を使用した。
Streptomyces albulus NBRC14147、又はpls L883P/pLAE009/S. albulus CRM003の胞子懸濁液をSLB培地3 mLに植菌し、28 ℃で36時間振盪培養した。なお、pls L883P/pLAE009/S. albulus CRM003の培養においては、選択薬剤として抗生物質ネオマイシンを50 μg/mLの濃度で培地に加え培養した。この培養液500μLをM3G培地50 mLに加え、28℃で8時間培養し、一般式（２ａ）又は（３ａ）で表される化合物として、2-[2-[2-(2-Propyn-1-yloxy)ethoxy]ethoxy]ethanol（以下、PEG-アルキンと記す）、あるいは、2-[2-[2-(2-Azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]ethanol（以下、PEG-アジドと記す）を0.2％（w/v）になるように培養液に添加し、28 ℃でさらに2〜4日間振盪培養した。培養液を遠心分離し、培養上清を得た。
【００５３】
一般式（１）の構造決定
実施例１で得たStreptomyces albulus NBRC14147の培養上清をエレクトロイオンスプレーイオン化型-飛行時間計測型質量分析/高速液体クロマトグラフィー（以下、ESI-TOF-MS/HPLCと記す）で分析し、精密分子量を測定した（図１Ａ及び１Ｂ）。ESI-TOF-MS/HPLCのESI-TOF-MSはブルカーダルトニクス社製のmaXis plusを用い、HPLCはアジレントテクノロジー社のAgilent 1290 Infinity LC システムを用いた。HPLCの条件は、カラムはSunShell RP-AQUA（クロマニックテクノロジー社製、2.6μm、内径2.1 mm、長さ50 mm）、カラム温度は40℃、移動相Aは0.05％ギ酸と0.05％ヘプタフルオロ酪酸を含む水溶液、移動相Bは0.05％ギ酸と0.05％ヘプタフルオロ酪酸を含むアセトニトリルを用いた。移動相流速は0.3 mL/分とし、分析開始の3分までは移動相Bの10％〜25％のリニアグラジエント、3分から12分は移動相Bの25％〜90％のリニアグラジエント、12分から16分は移動相Bの90％〜100％のリニアグラジエント、16分から18分は移動相B100％で分析した。溶出物のモニタリングはESI-TOF-MSの計測により行った。
【００５４】
結果
ε−ＰＬのカルボキシル基とPEG-アジドがエステル結合で連結した一般式（１）で表される化合物であり一般式（１０）（但し、式中ｎは１７乃至２６の整数である）で表されるε−ＰＬ-PEG-アジド、及びε−ＰＬのカルボキシル基とPEG-アルキンがエステル結合で連結した一般式（１）で表される化合物であり一般式（１１）（但し、式中ｎは１７乃至２６の整数である）で表されるε−ＰＬ-PEG-アルキンの生産が確認された。さらに、培養液からε−ＰＬ-PEG-アジド及びε−ＰＬ-PEG-アルキンをテトラフェニルボレイト法で単離精製し（非特許文献、H. Katanoら、Anal. Sci., 28, 1153-1157, 2012）、核磁気共鳴スペクトル（１H-NMR）によりその化学構造を確認した（図２Ａ及び２Ｂ）。これらの結果から、ε−ＰＬ生産菌であるStreptomyces albulus NBRC14147を利用することで17〜26 merのε−ＰＬからなるε−ＰＬ-PEG-アジド、及びε−ＰＬ-PEG-アルキンが生産されることが判明した。他方、短鎖ε−ＰＬ生産菌であるpls L883P/pLAE009/S. albulus CRM003を利用することで、短鎖長のε−ＰＬ-PEG-アジドとε−ＰＬ-PEG-アルキンの生産が可能である。
【化３０】
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【００５５】
［実施例２］
化合物のε−ＰＬ修飾による水溶性及び生体膜透過性の一挙改善
ε−ＰＬ修飾が化合物の水溶性及び生体膜透過性を一挙改善するモデル実験として、式（１２）で表される水難溶性の蛍光色素（DBCO-PEG4-5/6-FAM）のε−ＰＬ修飾を行った。
【化３１】
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【００５６】
式（１２）で表される市販のDBCO-PEG4-5/6-FAM（0.5 μmol）、及び一般式（１０）（但し、式中ｎは９乃至１８の整数である）で表される9〜18 merのε−ＰＬからなるε−ＰＬ−PEG-アジド（1.0 μmol）を80%ジメチルスルホオキシド（以下、DMSOと記す）に溶解し、30℃で24時間攪拌しながらクリックケミストリー反応を行った。実施例１に記載の方法に従い、反応溶液をESI-TOF-MS/HPLCで分析したところ、加えたDBCO-PEG4-5/6-FAMは全て一般式（１３）（但し、式中ｎは９乃至１８の整数である）で表される化合物（ε−ＰＬ−DBCO-FAM）に変換していることを確認した（図３Ａ及び３Ｂ）。さらに、反応溶液から精製したε−ＰＬ−DBCO-FAMは、水に容易に溶解したことから、ε−ＰＬ修飾によって水難溶性のDBCO-PEG4-5/6-FAMが水溶性へと変換できたことを明らかにした。
【化３２】
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【００５７】
式（１２）で表されるDBCO-PEG4-5/6-FAMは、生体膜透過性を示さない。そこで、ε−ＰＬ修飾したDBCO-PEG4-5/6-FAM、すなわち一般式（１３）（但し、式中ｎは９乃至１８の整数である）で表されるε−ＰＬ−DBCO-FAMの生体膜透過性を動物細胞であるHeLa細胞を用いて確認した。HeLa細胞の培養には、10％のウシ胎児血清（FBS）を含むDulbecco’s modified Eagle’s 培地（DMEM）を用い、5％の二酸化炭素を含む大気中にて37℃で培養した。この培養条件にて、HeLa細胞を70〜80％コンフルエントになるまで12ウェルプレートで培養し、FBSを含まないDMEM（DMEM w/o FBS）で細胞を2回洗浄した。細胞にDMEM w/o FBSを加え、4℃に冷却した後、式（１２）で表されるDBCO-PEG4-5/6-FAM、又は一般式（１３）（但し、式中ｎは９乃至１８の整数である）で表されるε−ＰＬ−DBCO-FAMをそれぞれ30μMになるように加え、4℃にて30分間保温した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、ヘパリン（100μg/mL）を含むPBSあるいはPBSのみで洗浄した後、さらにPBSで2回洗浄した。300μLの1％トリトンX-100を含む100 mMトリス-塩酸緩衝液（pH8.0）を加え、細胞内に取り込まれた化合物を抽出し、遠心分離により不溶性画分を除いた後、蛍光強度を測定した。その結果、細胞表層に結合しているε−ＰＬ−DBCO-FAMを洗浄する為のヘパリン洗浄を行った場合と、行わなかった場合の両者において、式（１２）で表されるDBCO-PEG4-5/6-FAMと比較し、一般式（１３）で表されるε−ＰＬ−DBCO-FAMの方が約3.5倍生体膜の透過性が高いことを確認した（図４）。また、ヘパリン洗浄なしの場合、ε−ＰＬ−DBCO-FAM処理においてその蛍光高度がより高いことから、細胞表層に結合したε−ＰＬ−DBCO-FAMの一部が細胞内に取り込まれることが判明した（図４）。実際に、共焦点レーザー顕微鏡で、一般式（１３）で表されるε−ＰＬ−DBCO-FAMが細胞内に存在し、またその一部は核内にも存在することを視覚的に確認した（図５）。
【００５８】
本実験によって、化合物をε−ＰＬ修飾することで、水溶性付与と生体膜透過性改善を一挙に解決できることを明らかにした。
【００５９】
［実施例３］
一般式（１）で表される化合物であり一般式（１０）（但し、式中ｎは９乃至１８の整数である）で表されるε−ＰＬ-PEG-アジドの有用性をさらに評価するために、式（８）で表される抗真菌抗生物質AmpBのε−ＰＬ修飾を行った。AmpBは、真菌に強力な抗菌活性を示すため深在性真菌症を初めとする様々な真菌感染症の治療薬として利用されている臨床上重要な抗生物質である。しかし、水にほとんど溶けない水難溶性のため製剤調整の複雑化や腎毒性などの副作用が問題になっている。現在、その水難溶性を改善するリポソーム製剤など様々な製剤技術が検討されているが、十分満足できる結果は得られていない。AmpBは、経口投与においてほとんど腸管吸収されることなく、最新の製剤技術においても腸管吸収の問題点は克服できていない。他方、ε−ＰＬ修飾されたAmpBが強力な抗真菌活性を維持できれば、水に容易に溶けるAmpBの開発につながり、上記の諸問題を一挙に改善できると期待された。
【００６０】
抗真菌抗生物質AmpBのε−ＰＬ修飾
AmpB（ナカライテスク社製）100 mgとN-[(9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyloxy] succinimide（Fmoc-OSu）73 mgを無水ジメチルホルムアミド30 mLに溶解した。28℃で4時間攪拌し、AmpBのアミノ糖のアミノ基をFmoc基で保護した化合物（AmpB-Fmoc）を合成した。反応液に25 mM塩酸水溶液を420 mL加え、遠心分離により白色の沈殿として得られたAmpB-FmocをDMSOに溶解し凍結乾燥しAmpB-Fmocの粉末を得た。AmpB-Fmoc 24.8 mg、N,N-diisopropylethylamine 8.88 μL、4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride 9.0mgを無水ジメチルホルムアミド4.5 mLに溶解した。反応液を室温にて30分攪拌しながら反応させた後、市販のDBCO-PEG4-amine 12.5 mgを加え、28℃で5時間攪拌し、ピペリジンを1.2 mL加えることでFmoc基を脱保護し、一般式（９）で表されるAmpB-DBCOを合成した。反応液にジエチルエーテルを120 mL加え、遠心分離により黄色の沈殿として得られたAmpB-DBCOをDMSOに溶解し逆相カラム（Sunniest RP-AQUA, 5μm, 250 × 10 mm, ChromaNik Technologies）を用いた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）にて精製した。HPLCの諸条件は次の通りである。カラム温度、30℃；検出、UV405 nmの吸収；移動相A、0.1 %(v/v)ギ酸水溶液；移動相B、アセトニトリル；移動相のグラジエント、30分間におけるB液40％〜100％のリニアグラジエント。一般式（９）で表されるAmpB-DBCOを含む溶出画分からアセトニトリルを留去し、凍結乾燥し黄色の粉末として一般式（６）で表されるAmpB-DBCOを得た。一般式（９）で表されるAmpB-DBCO 366μg、及び一般式（７）で表される9〜18 merのε−ＰＬからなるε−ＰＬ−PEG-アジド 689μgを86％DMSO水溶液に溶解し、30℃で5時間攪拌しながらクリックケミストリー反応を行った。反応溶液をESI-TOF-MS/HPLCで分析したところ、一般式（５）（但し、式中ｎは９乃至１７の整数である）で表されるε−ＰＬ−DBCO-AmpBの合成を確認した（図６Ａ及び６Ｂ）。
【００６１】
一般式（５）で表されるε−ＰＬ−DBCO-AmpBの水溶性
一般式（５）（但し、式中ｎは９乃至１７の整数である）で表されるε−ＰＬ−DBCO-AmpB及び式（８）で表されるAmpBを水に溶解したところ、AmpBは、1.08 mMの濃度において全く水に不溶であったが、一般式（５）（但し、式中ｎは９乃至１７の整数である）で表されるε−ＰＬ−DBCO-AmpBは、5.63 mMの濃度においても水に容易に溶け、高い水溶性を示した（図７）。よって、水難溶性であるAmpBをε−ＰＬ修飾することで高い水溶性を付加できることを明らかにするとともに、一般式（１０）（但し、式中ｎは９乃至１８の整数である）で表されるε−ＰＬ-PEG-アジドを利用することで医薬品などの薬物を効果的かつ簡便にε−ＰＬ修飾できることを示し、その有用性を明らかにした。
【００６２】
一般式（５）で表されるε−ＰＬ−DBCO-AmpBの抗真菌活性
真菌の被検菌としてAspergillus brasiliensis NBRC9455を用い、一般式（５）（但し、式中ｎは９乃至１７の整数である）で表されるε−ＰＬ−DBCO-AmpB、式（８）で表されるAmpB、一般式（１０）（但し、式中ｎは９乃至１８の整数である）で表される9〜18 merのε−ＰＬからなるε−ＰＬ−PEG-アジドの最少生育阻止濃度（MIC）を測定した。培地は市販のRPMI-1640培地を用い、30℃にて5日間培養したところ、一般式（５）で表されるε−ＰＬ−DBCO-AmpBのMICは1.9μg/mL、式（８）で表されるAmpBのMICは0.3μg/mL、一般式（１０）で表される9〜18 merのε−ＰＬからなるε−ＰＬ−PEG-アジドのMICは72μg/mLであった。以上の結果から、ε−ＰＬ修飾したAmpB、すなわち一般式（５）で表されるε−ＰＬ−DBCO-AmpBは水溶性であるとともに、十分な抗真菌活性を維持していることを明らかにした。式（８）で表される水難溶性のAmpBは、経口投与において腸管吸収されないことから、口腔や食道などの消化管の真菌感染症にのみ適応されていた。しかし、一般式（５）で表される水溶性のε−ＰＬ−DBCO-AmpBはε−ＰＬ修飾（ポリカチオン修飾）により生体膜透過性も改善されていることを知ることができ、経口投与においても深在性真菌症へ適応され得る。
【００６３】
［実施例４］
抗がん剤Doxのε−ＰＬ修飾
Dox（塩酸塩、フナコシ社製）17.4 mg、DBCO-PEG4-NHS Ester 19.4 mg 及びN,N-dimethyl-4-aminopyridine 4.9 mgをDMSO 3 mLで溶解した。室温で4時間攪拌し、Doxのアミノ糖のアミノ基にDBCO-PEG4が結合した化合物（DBCO-Dox）を合成した。合成したDBCO-Doxを逆相カラム（Sunniest RP-AQUA, 5μm, 250 × 10 mm, ChromaNik Technologies）を用いた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）にて精製した。HPLCの諸条件は次の通りである。カラム温度、35 ℃；検出、UV254 nmの吸収；移動相A、0.05 %(v/v)ギ酸水溶液及び0.05 %(v/v)HFBA水溶液；移動相B、0.05 %(v/v)ギ酸アセトニトリル溶液及び0.05 %(v/v)HFBAアセトニトリル溶液；移動相のグラジエント、18分間におけるB液50 ％のアイソクラティック。DBCO-Doxを含む溶出画分からアセトニトリルを留去し、酢酸エチルで、DBCO-Doxを抽出し、乾固させた。DBCO-Doxを、クロロホルム1 mLで完全に溶解し、再度乾固させた。DBCO-Dox 10 μmolとε−ＰＬ−PEG-アジド 11 μmolを80％DMSO水溶液に溶解し、室温で3時間攪拌しながらクリックケミストリー反応を行った。反応溶液をESI-TOF-MS/HPLCで分析したところ、一般式（５−２）（但し、式中ｎは１８乃至２９の整数である）で表されるε−ＰＬ−DBCO-Doxの合成を確認した（図８Ａ及びＢ）。
【００６４】
一般式（５−２）で表されるε−ＰＬ−DBCO-Doxの細胞毒性（抗がん活性）
【化３３】
2019039544.tif 000041
【００６５】
式（１４）で表されるDox及び一般式（５−２）（但し、式中ｎは１８乃至２９の整数である）で表されるε−ＰＬ−DBCO-Doxについて、ヒト慢性骨髄性白血病細胞であるK562細胞およびDox耐性のK562細胞であるK562/ADR細胞に対する細胞毒性を検証した。K562細胞およびK562/ADR細胞の培養には、10％のウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI1640 培地を用い、5％の二酸化炭素を含む大気中にて37℃で培養した。それぞれの細胞が1105細胞/mLになるように培地で懸濁し、100μL（1104細胞）ずつ96-wellプレートに播種し、24時間培養した。各種濃度のDox及びε−ＰＬ−DBCO-Doxを含む培地100μLを加え、48時間培養した。MTTアッセイにて生細胞数を計測し、細胞毒性を算出した。その結果、式（１４）で表されるDoxのK562細胞とK562/ADR細胞におけるIC50はそれぞれ、239  72 nMと1,043  72 nMであった。また、一般式（５−２）で表されるε−ＰＬ−DBCO-DoxのK562細胞とK562/ADR細胞におけるIC50はそれぞれ、12.5  1.31 μMと49.9  9.43 μMであった。したがって、一般式（５−２）で表されるε−ＰＬ−DBCO-Doxは、式（１４）で表されるDoxと比較して約５０倍の抗がん活性の低下が認められたが、抗がん剤として有用なドキソルビシンの抗がん活性を維持しつつ、腸管からの吸収と副作用が軽減され得る。また、本結果は、ε−ＰＬ−DBCO-DoxのDox構造がDNAの二重螺旋構造にインターカーレートすることを示していることから、プラスミドDNAや遺伝子断片、あるいは、RNAとε−ＰＬ−DBCO-Doxを混合するだけで、DNAやRNAを共有結合なしにポリカチオン修飾することが可能である。本法でポリカチオン修飾したプラスミドDNAや遺伝子断片、またはRNAを、細胞内に直接送達し得る。
【００６６】
［実施例５］
高分子薬理作用物質のε−ＰＬ修飾
高分子薬理作用物質の例として蛍光タンパク質モノメリックアザミグリーン（mAG）のε−ＰＬ修飾を行った。mAGをC末端ヒスタグ融合タンパク質として高発現するプラスミド（mAG/pET21a）を大腸菌BL21(DE3)に導入した。この大腸菌をLB培地（１００μg/mLのアンピシリンを含む）に植菌し、３７℃で2.5時間培養し、0.1 mM IPTGでmAGの発現誘導を行なった後、１８℃にて終夜培養した。菌体を回収し、緩衝液（50 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、10 mMイミダゾール、pH7.0）で懸濁した後、超音波で菌体破砕した。破砕液を遠心分離して無細胞抽出液を回収し、Niアフィニティーカラムを用いてmAGを精製した。精製したmAGを透析外液 100 ｍM重炭酸ナトリウムバッファー（pH9.0）用いて終夜透析した。mAGに対して1当量のDBCO-sulfo-NHSを4℃にて撹拌しながら1時間おきに3回に分けて添加し、合計3時間反応させることでDBCO化されたmAG（DBCO-mAG）を調製した。透析外液 100 mMリン酸ナトリウムバッファー（pH6.0）で終夜透析した後、DBCO-mAGに対して1.1当量の一般式（１０）（但し、式中ｎは２０乃至３０の整数である）で表される20〜30 merのε−ＰＬからなるε−ＰＬ−PEG-アジドを加え、4℃にて1時間反応した。反応溶液をESI-TOF-MS/HPLCで分析したところ、一般式（５−３）（但し、式中ｎは２３乃至２９の整数である）で表されるε−ＰＬ−DBCO-mAGの合成を確認した（図９Ａ、９Ｂ及び９Ｃ）。
【００６７】
ε−ＰＬ−DBCO-mAGの生体膜透過性評価
通常、タンパク質は細胞膜などの生体膜を透過できない。そこで、ε−ＰＬ修飾したmAG、すなわち一般式（５−３）（但し、式中ｎは２３乃至２９の整数である）で表されるε−ＰＬ−DBCO-mAGが生体膜を透過するか動物細胞であるHeLa細胞を用いて確認した。HeLa細胞の培養には、10％のウシ胎児血清（FBS）を含むDulbecco’s modified Eagle’s 培地（DMEM）を用い、5％の二酸化炭素を含む大気中にて37℃で培養した。この培養条件にて、HeLa細胞を70〜80％コンフルエントになるまで12ウェルプレートで培養し、FBSを含まないDMEM（DMEM w/o FBS）で細胞を2回洗浄した。細胞にDMEM w/o FBSを加え、4℃に冷却した後、mAG、又は一般式（５−３）で表されるε−ＰＬ−DBCO-mAGをそれぞれ50μMになるように加え、4℃にて30分間保温した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、ヘパリン（100μg/mL）を含むPBSで洗浄した後、さらにPBSで2回洗浄した。300μLの1％トリトンX-100を含む100 mMトリス-塩酸緩衝液（pH8.0）を加え、細胞内に取り込まれた化合物を抽出し、遠心分離により不溶性画分を除いた後、蛍光強度を測定した。その結果、一般式（５−３）’’で表されるmAGと比較し、一般式（５−３）で表されるε−ＰＬ−DBCO-mAGの方が約１０倍生体膜の透過性が高いことを確認した（図１０）。また、実際に、共焦点レーザ顕微鏡で観察したところ、一般式（５−３）で表されるε−ＰＬ−DBCO-mAGが細胞内に存在し、またその一部は核内にも存在することを視覚的に確認した（図１１）。
【００６８】
［実施例６］
一般式（１１）で表されるε−ＰＬ-PEG-アルキンの化学的安定性試験
実施例１で得た一般式（１１）（但し、式中ｎは１７乃至２６の整数である）で表されるε−ＰＬ-PEG-アルキン及び実施例１と同様の手法によって得た一般式（１５）（但し、式中ｎは１７乃至２６の整数である）で表されるε−ＰＬ-アルキンのエステル結合の化学的安定性について検証した。ε−ＰＬ-PEG-アルキンとε−ＰＬ-アルキンをTris-HCl緩衝液（pH8.0）に1ｍＭの濃度で溶解し、６０℃で５分間加熱後、ESI-TOF-MS/HPLCで分析した。その結果、ε−ＰＬ-アルキンと比較し、ε−ＰＬ-PEG-アルキンのエステル結合は加水分解されにくく化学的安定性が高いことが判明した（図１２Ａ及びＢ）。
【化３４】
2019039544.tif 000042
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明は、薬理作用物質に化学結合によって導入することによって、当該薬理作用物質の生体膜透過性を改善するポリカチオン体誘導体を提供するのみならず、ポリカチオン体誘導体導入によって生体膜透過性が改善された薬理作用物質を提供する。
【図１Ａ】
2019039544.tif 000059
【図１Ｂ】
2019039544.tif 000060
【図２Ａ】
2019039544.tif 000061
【図２Ｂ】
2019039544.tif 000062
【図３Ａ】
2019039544.tif 000063
【図３Ｂ】
2019039544.tif 000064
【図４】
2019039544.tif 000065
【図５】
2019039544.tif 000066
【図６Ａ】
2019039544.tif 000067
【図６Ｂ】
2019039544.tif 000068
【図７】
2019039544.tif 000069
【図８Ａ】
2019039544.tif 000070
【図８Ｂ】
2019039544.tif 000071
【図９Ａ】
2019039544.tif 000072
【図９Ｂ】
2019039544.tif 000073
【図９Ｃ】
2019039544.tif 000074
【図１０】
2019039544.tif 000075
【図１１】
2019039544.tif 000076
【図１２Ａ】
2019039544.tif 000077
【図１２Ｂ】
2019039544.tif 000078
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月17日(2019.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2019039544.tif 000079
（式中、ｎは２乃至１００の整数であり；
Ｐは、アミノ基で、置換されている（Ｃ１−Ｃ５）アルキレン基を表し；
Ｑは、下記一般式（２）
【化２】
2019039544.tif 000080
（上記一般式（２）において、Ｘは、酸素原子、イミノ基、硫黄原子、ＮＨＣＯ又はＣＯＮＨを表し、Ｙ１及びＹ２は、同一又は異なっていてもよく、炭素数１乃至６のアルキレン基、酸素原子又はイミノ基を表し、ｍは１乃至３０の整数である。）又は
下記一般式（３）
【化３】
2019039544.tif 000081
（上記一般式（３）において、Ｘは、酸素原子、イミノ基、硫黄原子、ＮＨＣＯ又はＣＯＮＨを表し、Ｙは、炭素数１乃至６のアルキレン基、酸素原子又はイミノ基を表し、ｍは１乃至３０の整数である。）
で表される構造を示し；
Ｚは、クリック官能基を表す。）
で表される構造を有する化合物又はその塩
（但し、
【化４】
2019039544.tif 000082
を除く）。
【請求項２】
一般式（４）
【化５】
2019039544.tif 000083
（式中、ｎは２乃至１００の整数であり；
ｍは１乃至３０の整数であり；
Ｘは、酸素原子又はイミノ基を表し；
Ｙは、炭素数１乃至６のアルキレン基を表し；
Ｚは、クリック官能基を表す。）
で表される請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
クリック官能基が、アジド基、アルケニル基、アルキニル基、ニトリル基、チオール基、マレイミド基、エポキシド基、アジリジン基、チイラン基又はトリアゾール基である、請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
一般式（２ａ）
【化６】
2019039544.tif 000084
（上記一般式（２ａ）において、Ｘ、Ｙ１、Ｙ２、Ｚおよびｍは、上記一般式（１）におけるそれらと同意義である。）、又は
一般式（３ａ）
【化７】
2019039544.tif 000085
（上記一般式（３ａ）において、Ｘ、Ｙ、Ｚおよびｍは、上記一般式（１）におけるそれらと同意義である。）で表される化合物又はその塩の存在下にε−ポリ−Ｌ−リジン、ε−ポリ−Ｄ−リジン、ε−ポリ−Ｌ−β−リジン、ε−ポリ−Ｄ−β−リジン、δ−ポリ−Ｌ−オルニチン、δ−ポリ−Ｄ−オルニチン、δ−ポリ−Ｌ−β−オルニチン、δ−ポリ−Ｄ−β−オルニチン、γ−ポリ−Ｌ−ジアミノブタン酸、γ−ポリ−Ｄ−ジアミノブタン酸、β−ポリ−Ｌ−ジアミノプロピオン酸又はβ−ポリ−Ｄ−ジアミノプロピオン酸生産菌を培養する工程、及び
産生した請求項１に記載の化合物又はその塩を採取する工程、
を含む請求項１に記載の化合物又はその塩の製造方法。
【請求項５】
一般式（３ａ）
【化８】
2019039544.tif 000086
（上記一般式（３ａ）において、Ｘは酸素原子又はイミノ基を表し、Ｙは炭素数１乃至６のアルキレン基を表し、Ｚはクリック官能基を表し、ｍは１乃至３０の整数を表す）で表される化合物又はその塩の存在下にε−ＰＬ生産菌を培養する工程、及び
産生した請求項２に記載の化合物又はその塩を採取する工程、
を含む請求項２に記載の化合物又はその塩の製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩が化学結合によって導入されている薬理作用物質。
【請求項７】
一般式（４）
【化９】
2019039544.tif 000087
（式中、ｎは２乃至１００の整数であり；
ｍは１乃至３０の整数であり；
Ｘは、酸素原子又イミノ基を表し；
Ｙは、炭素数１乃至６のアルキレン基を表し；
Ｚは、クリック官能基を表す。）
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩が化学結合によって導入されている薬理作用物質。
【請求項８】
薬理作用物質が、少なくとも抗菌剤、抗バクテリア剤及び抗がん剤のいずれかである、請求項６又は７に記載の物質。
【請求項９】
抗菌剤が、（Ａ）抗真菌剤であり；
抗バクテリア剤が、（Ｂ）βラクタム系抗生物質、（Ｃ）アミノグリコシド系抗生物質、（Ｄ）テトラサイクリン系抗生物質、若しくは（Ｅ）ペプチド系抗生物質、（Ｆ）クリック官能基を有機化学的若しくは生化学的に導入可能な抗菌抗生物質であり；又は
抗がん剤が、（Ｇ）クリック官能基を有機化学的若しくは生化学的に導入可能な抗がん剤である、請求項８に記載の物質。
【請求項１０】
（Ａ）抗真菌剤が、（ａ−１）アムフォテリシンＢ、ナイスタチン、トリコマイシン、及びピマリシンから選ばれるポリエン系抗生物質；（ａ−２）ミカファンギン；（ａ−３）イトラコナゾール；（ａ−４）ケトコナゾール；（ａ−５）フルコナゾール：（ａ−６）ミコナゾール：若しくは（ａ−７）フルシトシンであり、
（Ｂ）βラクタム系抗生物質が、（ｂ−１）ペニシリン；（ｂ−２）アンピシリン：（ｂ−３）タランピシリン；（ｂ−４）バカンピシリン；（ｂ−５）セファロスポリンＣ；（ｂ−６）セファレキシン；（ｂ−７）セフラジン；（ｂ−８）セファマイシン；若しくは（ｂ−９）イミペネムであり、
（Ｃ）アミノグリコシド系抗生物質が、（ｃ−１）ゲンタマイシン；（ｃ−２）カナマイシン；（ｃ−３）トブラマイシン；（ｃ−４）アミカシン；（ｃ−５）アルベカシン；若しくは（ｃ−６）リボスタマイシンであり、
（Ｄ）テトラサイクリン系抗生物質が、（ｄ−１）オキシテラザイクリン；又は（ｄ−２）テトラサイクリンであり、
（Ｅ）ペプチド系抗生物質が、（ｅ−１）バシトラシン；（ｅ−２）グラミシジン；（ｅ−３）ポリミキシンＢ；（ｅ−４）バンコマイシン；若しくは（ｅ−５）テイコプラニンであり、
（Ｆ）クリック官能基を有機化学的あるいは生化学的に導入可能な抗菌抗生物質としてアミノ基、イミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、カルボニル基、チオール基、リン酸基、アルデヒド基等のいずれかをもつ抗菌抗生物質、又は
（Ｇ）クリック官能基を有機化学的あるいは生化学的に導入可能な抗がん剤としてアミノ基、イミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、カルボニル基、チオール基、リン酸基、アルデヒド基等のいずれかをもつ抗がん剤であり、例えば、（ｆ−１）アクチノマイシンＤ；（ｆ−２）マイトマイシン；（ｆ−３）ドキソルビシン、ダウノルビシン、及びアクラルビシンから選ばれるアントラサイクリン系抗腫瘍薬；（ｆ−４）ブレオマイシン；若しくは（ｆ−５）シスプラチンである、請求項９に記載の物質。
【請求項１１】
薬理作用物質が、少なくとも、タンパク質及び遺伝子のいずれかである、請求項６又は７に記載の物質。
【請求項１２】
タンパク質及び遺伝子が、クリック官能基を有機化学的又は生化学的に導入可能である、請求項１１に記載の物質。
【請求項１３】
請求項７に記載の一般式（４）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩を化学結合によって薬理作用物質に導入することを特徴とする、請求項７に記載の薬理作用物質の製造方法。
【請求項１４】
一般式（５）
【化１０】
2019039544.tif 000088
（式中ｎは２乃至１００の整数である）で表される、クリックケミストリーによってε−ＰＬ修飾されたアムフォテリシンＢである、請求項７乃至１０のいずれかに記載の物質。
【請求項１５】
一般式（５−２）
【化１１】
2019039544.tif 000089
（式中ｎは２乃至１００の整数である）で表される、クリックケミストリーによってε−ＰＬ修飾されたドキソルビシンである、請求項７乃至１０のいずれかに記載の物質。
【請求項１６】
一般式（５−３）
【化１２】
2019039544.tif 000090
（式中、ｎは２乃至１００の整数であり、式（５−３）’
【化１３】
2019039544.tif 000091
で表される基は、式（５−３）’’
【化１４】
2019039544.tif 000092
で表される蛍光タンパク質モノメリックアザミグリーンの水素原子を１つ除いて形成される基である）で表される、クリックケミストリーによってε−ＰＬ修飾された蛍光タンパク質モノメリックアザミグリーンである、請求項７乃至１０のいずれかに記載の物質。
【請求項１７】
一般式（２ａ）又は（３ａ）で表される化合物又はその塩の、請求項１に記載された一般式（１）で表される化合物又はその塩の製造のための使用。
【請求項１８】
一般式（３ａ）
【化１５】
2019039544.tif 000093
（Ｘは酸素原子又はイミノ基を表し、Ｙは炭素数１乃至６のアルキレン基を表し、Ｚはクリック官能基を表し、ｍは１乃至３０の整数を表す）で表される化合物又はその塩の、請求項７に記載された一般式（４）で表される化合物又はその塩の製造のための使用。
【請求項１９】
請求項１に記載の一般式（１）で表される化合物又はその塩を薬理作用物質に導入することを特徴とする、薬理作用物質の生体膜透過性改善方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の一般式（１）で表される化合物又はその塩の、生体膜透過性が改善された薬理作用物質の製造のための使用。
【請求項２１】
請求項１に記載の一般式（１）で表される化合物又はその塩を薬理作用物質に導入することを特徴とする、薬理作用物質の水溶性向上方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の一般式（１）で表される化合物又はその塩の、水溶性が向上した薬理作用物質の製造のための使用。
【国際調査報告】
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