(57)【要約】  プラズマローゲンを安定に長期間保存することができる手法が提供される。  より具体的には、プラズマローゲン、γ−シクロデキストリン、及びｐＨアルカリ調整剤を含有し、１質量％水懸濁液としたときのｐＨが６〜８である、プラズマローゲン含有固形組成物等が提供される。
2020009173.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラズマローゲン、
γ−シクロデキストリン、及び
ｐＨアルカリ調整剤
を含有し、
１質量％水懸濁液としたときのｐＨが６〜８である、
プラズマローゲン含有固形組成物。
【請求項２】
プラズマローゲン、
γ−シクロデキストリン、並びに
クエン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、及びリン酸水素ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１種
を含有し、
１質量％水懸濁液としたときのｐＨが６〜８である、
プラズマローゲン含有固形組成物。
【請求項３】
乾燥組成物である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
粉末状である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
プラズマローゲンを０．１〜１０質量％含有する請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
プラズマローゲン、
γ−シクロデキストリン、及び
ｐＨアルカリ調整剤
を含有する、
ｐＨが６〜８である懸濁液。
【請求項７】
プラズマローゲン、
γ−シクロデキストリン、並びに
クエン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、及びリン酸水素ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１種
を含有する、
ｐＨが６〜８である懸濁液。
【請求項８】
溶媒が水である、請求項６又は７に記載の懸濁液。
【請求項９】
（Ａ）少なくともプラズマローゲン、γ−シクロデキストリン、ｐＨ調整剤、及び水を混合してｐＨ６〜８の懸濁液を調製する工程
を含む、プラズマローゲン含有組成物の製造方法。
【請求項１０】
（Ｂ）工程（Ａ）で得た懸濁液を乾燥させて乾燥組成物を得る工程をさらに含む、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（Ａ）少なくともプラズマローゲン、γ−シクロデキストリン、ｐＨ調整剤、及び水を混合してｐＨ６〜８の懸濁液を調製する工程
を含む、プラズマローゲンの安定性を高める方法。
【請求項１２】
（Ｂ）工程（Ａ）で得た懸濁液を乾燥させて乾燥組成物を得る工程をさらに含む、
請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラズマローゲン含有組成物及びその製造方法等に関する。なお、本明細書に記載される全ての文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
プラズマローゲンは、 グリセロール骨格の１位にビニルエーテル結合をもつエーテル型グリセロリン脂質の１種である。プラズマローゲンは、動物全般およびある種の嫌気性微生物に広く分布しており、ヒトにおいては、神経、心血管、免疫系などに多く存在することが知られている。さらに、プラズマローゲンは、細胞核やシナプス間隙にも存在することが知られており、プラズマローゲンは神経活動において広範に機能していることが示唆されている。【０００３】
これまでに、プラズマローゲンの機能として、脳神経細胞新生作用（特許文献１）、抗中枢神経系炎症作用（特許文献２）、健常な学習記憶能力の増強作用（特許文献３）などが明らかにされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０８３８２７号
【特許文献２】国際公開第２０１２／０３９４７２号
【特許文献３】特開２０１６−２１０６９６号公報
【特許文献４】国際公開第２０１７／１８７５４０号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】日本畜産学会報８５（２），１５３−１６１，２０１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上のように、プラズマローゲンは多くの有利な効果を奏することが明らかになってきており、その利用が拡大することが期待されている。一方で、他のグリセロリン脂質と比較してプラズマローゲン特異的な構造であるビニルエーテル結合は活性酸素やラジカルとの反応性が高く、実際に酸化されやすいことから、プラズマローゲンは経時安定性が悪く、安定に長期間保存することが難しい。【０００７】
そこで、本発明者らは、プラズマローゲンを安定に長期間保存することができる手法を開発すべく研究を行った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、プラズマローゲンに、ｐＨアルカリ調整剤及びγ―シクロデキストリンを加えることにより、プラズマローゲンが長期間安定に保持される可能性を見いだし、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。【０００９】
本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
プラズマローゲン、
γ−シクロデキストリン、及び
ｐＨアルカリ調整剤
を含有し、
１質量％水懸濁液としたときのｐＨが６〜８である、
プラズマローゲン含有固形組成物。
項２．
プラズマローゲン、
γ−シクロデキストリン、並びに
クエン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、及びリン酸水素ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１種
を含有し、
１質量％水懸濁液としたときのｐＨが６〜８である、
プラズマローゲン含有固形組成物。
項３．
乾燥組成物である、項１又は２に記載の組成物。
項４．
粉末状である、項１〜３のいずれかに記載の組成物。
項５．
プラズマローゲンを０．１〜１０質量％含有する項１〜４のいずれかに記載の組成物。
項６．
プラズマローゲン、
γ−シクロデキストリン、及び
ｐＨアルカリ調整剤
を含有する、
ｐＨが６〜８である懸濁液。
項７．
プラズマローゲン、
γ−シクロデキストリン、並びに
クエン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、及びリン酸水素ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１種
を含有する、
ｐＨが６〜８である懸濁液。
項８．
溶媒が水である、項６又は７に記載の懸濁液。
項９．
（Ａ）少なくともプラズマローゲン、γ−シクロデキストリン、ｐＨ調整剤、及び水を混合してｐＨ６〜８の懸濁液を調製する工程
を含む、プラズマローゲン含有組成物の製造方法。
項１０．
（Ｂ）工程（Ａ）で得た懸濁液を乾燥させて乾燥組成物を得る工程をさらに含む、
項９に記載の方法。
項１１．
（Ａ）少なくともプラズマローゲン、γ−シクロデキストリン、ｐＨ調整剤、及び水を混合してｐＨ６〜８の懸濁液を調製する工程
を含む、プラズマローゲンの安定性を高める方法。
項１２．
（Ｂ）工程（Ａ）で得た懸濁液を乾燥させて乾燥組成物を得る工程をさらに含む、
項１１に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
プラズマローゲンを安定に長期間保存することができる手法が提供される。【００１１】
加えて、プラズマローゲンは、精製することにより粘度が高まり、非常に扱いづらくなる物質であるところ、プラズマローゲンにｐＨアルカリ調整剤及びγ―シクロデキストリンを加えて乾燥させることにより、固形組成物（好ましくは乾燥組成物、より好ましくは粉末組成物）とすることができ、これにより、プラズマローゲンを安定に長期間保存することができるとともに、粘度が高いなどの扱いづらさが低減された組成物が提供される。また、その製造方法等も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】鶏ムネ肉のエタノール抽出液濃縮物とエタノール水溶液との混合及び静置を行い混合液の分離を行った結果を示す。
【図２】図１の各分離層をＴＬＣ分析した結果を示す。
【図３】プラズマローゲンとシクロデキストリン（α−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリン）とを組み合わせて粉末を調製した時の、プラズマローゲンの経時安定性を示す。
【図４】プラズマローゲン、γ−シクロデキストリン、及びクエン酸ナトリウムを組み合わせて凍結乾燥法により粉末を調製した時の、プラズマローゲンの経時安定性を示す。
【図５】プラズマローゲン、γ−シクロデキストリン、及びクエン酸ナトリウムを組み合わせて噴霧乾燥法により粉末を調製した時の、プラズマローゲンの経時安定性を示す。
【図６】プラズマローゲン、γ−シクロデキストリン、及び各種ｐＨアルカリ調整剤を組み合わせて凍結乾燥法により粉末を調製した時の、プラズマローゲンの経時安定性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。本発明は、プラズマローゲン含有組成物、プラズマローゲン含有組成物の製造方法、及びプラズマローゲンの安定性を高める方法等を好ましく包含するが、これらに限定されるわけではなく、本発明は本明細書に開示され当業者が認識できる全てを包含する。
【００１４】
本発明に包含されるプラズマローゲン含有組成物は、プラズマローゲン、γ−シクロデキストリン、及びｐＨアルカリ調整剤を含有する。以下、当該組成物を「Ｐｌｓ−γＣＤ−ｐＨ剤含有組成物」ということがある。
【００１５】
プラズマローゲンとは、通常、グリセロール骨格の１位（ｓｎ−１位）にビニルエーテル結合を介した長鎖アルケニル基をもつグリセロリン脂質をいう。以下にプラズマローゲンの一般式を示す。
【００１６】
【化１】
2020009173.tif 000003
【００１７】
［式中、Ｒ１及びＲ２は脂肪族炭化水素基を表す。Ｒ１は通常、炭素数１〜２０（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０）の脂肪族炭化水素基であり、例えば、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基、イコサニル基等が挙げられる。Ｒ２は通常、脂肪酸残基由来の脂肪族炭化水素基であり、例えば、オクタデカジエノイル基、オクタデカトリエノイル基、イコサテトラエノイル基、ドコサテトラエノイル基、ドコサペンタエノイル基、ドコサヘキサエノイル基等が挙げられる。また、式中、Ｘは極性基を表す。Ｘは好ましくは、エタノールアミン、コリン、セリン、イノシトール、又はグリセロールである。］
【００１８】
特に、上記式中、Ｘがエタノールアミンであるエタノールアミンプラズマローゲン、及びＸがコリンであるコリンプラズマローゲンは、自然界に広く存在するプラズマローゲンであり、本発明に用いるプラズマローゲンとしても好ましい。
【００１９】
Ｐｌｓ−γＣＤ−ｐＨ剤含有組成物に用いるプラズマローゲンとしては、例えば合成品及び抽出物等を用いることができ、特に制限はされないが、中でも生体組織から抽出されるものが好ましい。生体組織とは、生物におけるプラズマローゲンを含有する組織をいう。プラズマローゲンを抽出するために用いる生物としては、例えば、動物及び微生物が挙げられる。微生物としては嫌気性細菌が好ましく、例えば、腸内細菌のＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科の細菌などは特に好ましい。なお、細菌の場合、「生体組織」は細菌そのものである。動物としては、鳥類、哺乳類、魚類、貝類等が好ましい。哺乳類としては、供給安定性及び安全性の観点から家畜や家禽が好ましく、例えば、牛、豚、馬、羊、山羊、鳥類等が挙げられる。哺乳類の場合、プラズマローゲンを含有する組織としては、主に、皮膚、脳、腸、心臓、生殖器等が挙げられ、これらの組織からプラズマローゲンを抽出することができる。また、鳥類としては、鶏、家鴨、鶉、鴨、雉、七面鳥等が挙げられる。入手のし易さ、コスト面、及び口にすることに対する抵抗感等も考慮すると、鶏が特に好ましい。また、鳥組織としては、特に制限されないが、例えば、鳥肉（特に、鳥ムネ肉）、鳥皮、鳥の内臓等が好ましい。貝類としては、例えばホタテが好ましい。なお、１又は複数種の生物の異なる組織を２種以上組み合わせてもよい。
【００２０】
生体組織から抽出されたプラズマローゲンとして、鳥組織から抽出されたプラズマローゲンを用いることが特に好ましい。中でも、従来から食用とされてきた鳥（食鳥）は、安全性が確認されており、安定供給もし易いため、好適である。中でも、鶏が最適である。
【００２１】
生体組織からプラズマローゲンを抽出する方法としては、プラズマローゲンが抽出（及び必要に応じて精製）できる限り特に限定されない。例えば、公知の方法や公知の方法から容易に想到できる方法により抽出することができる。
【００２２】
以下に、生体組織からプラズマローゲンを抽出する方法として、２つ具体例を挙げるが、抽出方法はこれらに限定されるわけではない。また、Ｐｌｓ−γＣＤ−ｐＨ剤含有組成物に用いるプラズマローゲンとしては、市販品を購入して用いてもよい。
【００２３】
＜プラズマローゲン抽出方法の例１＞
プラズマローゲンの抽出及び精製方法の１例として、例えば特許文献３（特開２０１６−２１０６９６号公報）等に記載の方法を挙げることができる。より具体的には、（１）生体組織からプラズマローゲンを抽出する工程、（２）抽出物中のプラズマローゲンを精製する工程（具体的には、中性脂質及び／又はスフィンゴ脂質を除去する工程）、及び（３）抽出物を加水分解処理後、精製する工程（具体的には、ジアシル型グリセロリン脂質を加水分解した後、遊離脂肪酸及びリゾリン脂質を除去する工程）を含む方法を挙げることができる。ここで、工程（１）はプラズマローゲンの抽出工程であり、工程（２）及び（３）はプラズマローゲンの精製工程であるということができる。よって、工程（２）及び（３）は任意の工程であり、これらの工程はそれぞれ含まれていなくてもよいが、精製により濃縮されたプラズマローゲンを用いる方が好ましいため、これら（２）及び（３）の工程のうち少なくとも１つが含まれている方が好ましい。特に、工程（１）〜（３）を全て含むことが好ましい。
【００２４】
当該方法において、プラズマローゲンを抽出する際に用いる溶媒としては、水、有機溶媒、又は含水有機溶媒が好ましい。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ヘキサン等、又はこれらからなる群から選択される少なくとも２種以上の混合溶媒が挙げられる。含水有機溶媒の含水率は特に制限されず、例えば、含水率が１０〜９０％（ｖ／ｖ）である含水有機溶媒が挙げられる。これらの中でも、エタノール又は含水エタノールが好ましい。また、抽出に供される生体組織は、生であってもよいし、予め何らかの処理がなされたものであってもよい。例えば、予め乾燥処理及び／又は脱油処理がなされたものであってもよい。
【００２５】
抽出処理方法としては特に制限されず、例えば、冷浸、温浸等の浸漬法やパーコレーション法等により抽出処理を行うことができる。好ましい例としては、鶏ムネ肉１ｋｇに対して１〜１０Ｌ、好ましくは１〜６Ｌ、より好ましくは２〜４Ｌのエタノールを加え、３０℃以上で６０分以上、好ましくは４０℃以上で１８０分以上、静置又は攪拌を行う方法が挙げられる。
【００２６】
得られた有機溶媒抽出液は、濃縮乾固した後、加水分解処理工程に供されることが好ましい。濃縮乾固は公知の方法によって行うことができ、例えば、エバポレーターを用いて行うことができる。このようにして得られた有機溶媒抽出物（有機溶媒抽出乾固物）には、プラズマローゲン等の脂質が濃縮されて含まれている。
【００２７】
さらに、当該有機溶媒抽出乾固物を、例えば、アセトンで遠心処理後、沈殿を回収し、さらにヘキサン及びアセトンを混合した溶媒（ヘキサン／アセトン混合溶媒）で遠心処理後、液層を回収することが好ましい。限定的な解釈を望むものではないが、アセトンで遠心処理後、沈殿を回収することで中性脂質を除去することができ、ヘキサン／アセトン混合溶媒で遠心処理後、液層を回収することでスフィンゴ脂質を除去することができる。
【００２８】
このようにして得られた液層を濃縮乾固することによって、リン脂質濃縮乾固物が得られる。当該リン脂質濃縮乾固物を加水分解処理工程に供し、ジアシル型グリセロリン脂質を加水分解することで、プラズマローゲンを好ましく濃縮することができる。
【００２９】
加水分解処理としては、例えば、ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）による処理が挙げられる。ＰＬＡ１は、ジアシル型グリセロリン脂質において、ｓｎ−１位の脂肪酸とグリセリン骨格との間のエステル結合を特異的に加水分解する。加水分解されたジアシル型グリセロリン脂質は、遊離脂肪酸及びリゾリン脂質へと分解される。一方、プラズマローゲンは、ｓｎ−１位がビニルエーテル結合であるため、ＰＬＡ１の作用を受けない。そのため、ＰＬＡ１で処理することにより、プラズマローゲンを分解することなく、ジアシル型グリセロリン脂質を特異的に分解することができる。プラズマローゲンと共存しているジアシル型グリセロリン脂質をＰＬＡ１によりリゾ体へと変換し、遊離脂肪酸及びリゾリン脂質を除去することにより、プラズマローゲンを精製することができる。遊離脂肪酸及びリゾリン脂質の除去は、例えば、アセトン及びヘキサンを用いた分配により行うことができる。
【００３０】
ＰＬＡ１は、上述した作用が得られるものであれば、その由来等は特に制限されない。例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｉｚａｅ由来のＰＬＡ１が挙げられる。また、ＰＬＡ１は市販品を用いてもよく、例えば、三菱化学フーズ株式会社等から購入することができる。また、ＰＬＡ１の使用量は、加水分解処理に供される有機溶媒抽出乾固物量に応じて適宜設定することができる。例えば、有機溶媒抽出乾固物１ｍｇあたり、０．２〜２００ｕｎｉｔ程度、好ましくは２〜２００ｕｎｉｔ程度とすることができる。なお、１ｕｎｉｔは、１分間あたり１μｍｏｌの基質（ジアシル型グリセロリン脂質）を変化させる量（１μｍｏｌ／ｍｉｎ）を意味する。
【００３１】
また、使用するバッファーも使用するＰＬＡ１の種類に応じて適宜設定することができる。バッファーとしては、例えば、０．１Ｍクエン酸＋ＨＣｌバッファー（ｐＨ４．５）などが挙げられる。バッファーの使用量は、酵素反応を進行させることができる量であれば特に制限されない。例えば、有機溶媒抽出乾固物１ｇあたり、１〜３０ｍＬ程度、好ましくは５〜１５ｍＬ程度とすることができる。なお、ＰＬＡ１は、有機溶媒抽出乾固物にバッファーを加えて溶解させた後に加えればよい。
【００３２】
さらに、反応条件も適宜設定することができ、好ましくは５０℃で攪拌しながら、１〜２時間反応させる。
【００３３】
なお、ＰＬＡ１には失活処理を施してもよい。例えば、加水分解反応後、温度を７０℃程度まで上昇させることにより、ＰＬＡ１の失活処理を行うことができる。
【００３４】
上記した方法により、ジアシル型グリセロリン脂質が分解された処理液（加水分解処理液）を得ることができる。当該加水分解処理液に、例えば、２〜３倍量程度のヘキサンを加え、遠心処理後、上層（ヘキサン層）を回収することで、酵素バッファー及び酵素タンパク質を除去することができる（酵素バッファー及び酵素タンパク質は下層の水層に溶解し、ヘキサン層には含まれない。）。
【００３５】
さらに、プラズマローゲンは、ヘキサンには溶解するが、アセトンに対しては難溶性であるため、これらの溶媒及び水を適宜組み合わせて分配を行い、さらに水又は水溶液により溶液分配することにより、リゾリン脂質を除去してプラズマローゲンを得ることができる。即ち、アセトンによりリン脂質以外の中性脂質を除去することができ、液−液分配によりプラズマローゲンとリゾリン脂質を分離することができる。
【００３６】
なお、以上の記載から解るように、上記工程（１）〜（３）をより具体的に記載すると、例えば、以下のようになる。
（１）生体組織をエタノール又は含水エタノールで抽出処理する工程、
（２）工程（１）で得られた抽出物をアセトンで遠心処理後、沈殿を回収し、さらにヘキサン／アセトン混合溶媒で遠心処理後、液層を回収する工程、及び
（３）工程（２）で回収した液をホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）により処理する工程（さらに、必要に応じて、アセトン及びヘキサンを用いた分配により、遊離脂肪酸及びリゾリン脂質を除去する工程）。
【００３７】
＜プラズマローゲン抽出方法の例２＞
プラズマローゲンの抽出及び精製方法のまた別の１例として、例えば生体組織のエタノール抽出液濃縮物と特定の含水エタノールとの混合液を、特定の条件で静置する工程を含む方法が挙げられる。より具体的には、生体組織のエタノール抽出液濃縮物と４０〜６０質量％エタノール水溶液との質量比１：０．８〜１．２の混合液を、４０〜６０℃で静置する工程を含む方法を挙げることができる。なお、特に制限はされないが、当該方法に供される生体組織としては、鶏の生体組織が好ましく、中でも鶏ムネ肉が好ましい。
【００３８】
当該方法において、生体組織のエタノール抽出の方法としては、特に限定されず、公知の方法又は公知の方法から容易に想到できる方法を用いることができる。例えば、生体組織に対して質量比１〜５倍程度のエタノールを加え、撹拌又は静置することで行うことができる。撹拌又は静置は、加温して行ってもよい。加温は、例えば３０〜５０℃、又は３５〜４５℃程度で行うことができる。また、撹拌又は静置の時間は特に制限されないが、例えば０．５〜２４時間、又は１〜１２時間程度を挙げることができる。得られた抽出液は、必要に応じて濾過などにより固液分離してもよい。また、抽出残渣に対して、同様の操作を行い、再度抽出液を得て、先に得られた抽出液に合算してもよい。
【００３９】
なお、気温が低い（特に冬期）場合、当該抽出工程中に析出が生じるおそれがある。このような温度は析出が生じる温度であれば制限はされないが、具体的には例えば１０℃以下、９℃以下、８℃以下、７℃以下、６℃以下、５℃以下、４℃以下、３℃以下、２℃以下、１℃以下、又は０℃以下が挙げられる。当該析出にはリン脂質が含まれるため、析出したままでエタノール抽出操作を続けると、析出に含まれるリン脂質がエタノール抽出液に含まれず、このため最終的に得られるリン脂質濃縮物に含まれるリン脂質量がばらつくおそれがある。よって、析出が生じた場合には、まず加温して析出を溶解させるか、あるいは析出が生じない温度下で当該工程を行うことが好ましい。加温して析出を溶解させる場合、加温の温度は析出が溶解し、且つ品質に影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、例えば２０〜３０℃程度が例示される。また、析出が生じない温度下でエタノール抽出工程を行う場合、例えば２０〜３０℃程度の温度下で当該工程を行うことができる。
【００４０】
得られたエタノール抽出液を濃縮する方法としては、特に限定されず、公知の方法又は公知の方法から容易に相当できる方法を用いることができる。例えば、減圧濃縮、又は加熱濃縮等が挙げられる。
【００４１】
濃縮は、得られるエタノール抽出液濃縮物の水分含有量が１質量％以下になるまで行うことが好ましく、０．９質量％以下、０．８質量％以下、０．７質量％以下、０．６質量％以下、又は０．５質量％以下になるまで行うことがより好ましく、０．４質量％以下、０．３質量％以下、又は０．２質量％以下になるまで行うことがさらに好ましい。なお、当該水分含有量は、カールフィッシャー法により求めた値である。
【００４２】
また、得られるエタノール抽出液濃縮物のエタノール含有量は、１５質量％以下であることが好ましく、１４質量％以下、１３質量％以下、１２質量％以下、１１質量％以下、１０質量％以下、９質量％以下、又は８質量％以下であることがより好ましい。なお、当該エタノール含有量は、乾熱乾燥法（１０５℃、３時間）で求めた乾燥減量から上記水分含有量を減じた値である。例えば、当該乾熱乾燥減量が９０質量％であり、上記水分含有量が１質量％であった場合、エタノール含有量は１００−９０−１＝９（質量％）となる。
【００４３】
生体組織のエタノール抽出液濃縮物と４０〜６０質量％エタノール水溶液とを、質量比１：０．８〜１．２で混合する。当該質量比の下限は、例えば１：０．８５、０．９、０．９５、又は１であってもよい。また、当該質量比の上限は、例えば１：１．１５、１．１、１．０５、又は１であってもよい。また、用いるエタノール水溶液の濃度の下限は、例えば４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０質量％であってもよい。また、用いるエタノール水溶液の濃度の上限は、例えば５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、又は５０質量％であってもよい。
【００４４】
このようにして得られた混合液を、４０〜６０℃で静置する。これにより、混合液は３層（上層、中層、下層）に分離され、下層にはプラズマローゲンが濃縮される。
【００４５】
静置時の温度の下限は、例えば４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０℃であってもよい。また、静置時の温度の上限は、例えば５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、又は５０℃であってもよい。また、静置時の温度は、当該温度範囲であれば変化してもよいが、できるだけ一定であることが好ましく、変化する場合であっても変化幅は少ない（例えば変化幅１〜５℃、又は１〜３℃程度）方が好ましく、また変化する早さもできるだけゆっくりであることが好ましい。
【００４６】
静置する時間としては、混合液が層分離される範囲であれば特に制限されないが、例えば１時間以上が好ましい。２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上、又は６時間以上であってもよい。静置時間の上限は特に制限されないが、例えば２４時間以下、１８時間以下、１２時間以下、又は１０時間以下が例示される。
【００４７】
上述の通り、３層に分離された混合液の下層にプラズマローゲンが濃縮されている。よって、当該プラズマローゲン抽出方法は、静置後に３層に分離した混合液から、下層を回収する工程をさらに含むことができる。
【００４８】
下層の回収は、例えば、（ｉ）３層に分離した混合液から上層を除去し、下層がゲル状になるまで１０℃以下の温度で静置した後に中層を除去する、あるいは、（ｉｉ）３層に分離した混合液を下層がゲル状になるまで１０℃以下の温度で静置した後に上層及び中層を除去することで行うことができる。
【００４９】
（ｉ）及び（ｉｉ）のいずれにおいても、これらの工程における静置温度は１０℃以下であり、例えば９℃以下、８℃以下、７℃以下、６℃以下、５℃以下、４℃以下であってもよい。また、当該静置時間としては、下層がゲル状になる範囲であれば特に制限されないが、例えば１２時間以上が例示される。
【００５０】
また、生体組織のエタノール抽出液濃縮物と４０〜６０質量％エタノール水溶液との質量比１：０．８〜１．２の混合液は、上記のエタノール抽出液濃縮物のエタノール含有量の好ましい範囲も考慮すると、例えば、生体組織のエタノール抽出物、エタノール、及び水を含む混合液であって、エタノール含有量が２０〜４３．５質量％の混合液、ということができる。当該混合液のエタノール含有量の下限は、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０質量％であってもよい。また、当該混合液のエタノール含有量の上限は、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、又は３３質量％であってもよい。また、当該混合液の水含有量は、上記のエタノール抽出液濃縮物の水分含有量の好ましい範囲も考慮すると、例えば１６〜３６．５質量％ということができる。当該混合液の水含有量の下限は、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４質量％であってもよい。また、当該混合液の水含有量の上限は、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、又は２６質量％であってもよい。
【００５１】
例えば上記のような方法で抽出（さらに必要に応じて精製）したプラズマローゲン含有抽出物を、好ましくＰｌｓ−γＣＤ−ｐＨ剤含有組成物に用いることができる。
【００５２】
シクロデキストリンは数分子のＤ−グルコースが、α−１，４グリコシド結合によって結合し環状構造をとった環状オリゴ糖であり、６分子結合したものがα−シクロデキストリン、７分子結合したものがβ−シクロデキストリン、８分子結合したものがγ−シクロデキストリンである。これらは公知の化合物である。また、γ−シクロデキストリンは市販品を購入してＰｌｓ−γＣＤ−ｐＨ剤含有組成物に用いることもできる。
【００５３】
ｐＨアルカリ調整剤は、酸性ｐＨ値を大きくする作用を有する化合物をいう。必ずしもアルカリ性にまで調整する必要はなく、例えば強酸性を弱酸性若しくは中性に調整することができる化合物もｐＨアルカリ調整剤に包含される。ｐＨアルカリ調整剤としては、公知のものを用いることができ、中でも薬理学的または食品衛生学的に許容されるｐＨアルカリ調整剤が好ましい。具体的には、例えば、クエン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、及びリン酸水素ナトリウム等が好ましく例示できる。なお、クエン酸ナトリウムはクエン酸一ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、及びクエン酸三ナトリウムのいずれも用いることができ、クエン酸三ナトリウムが中でも好ましい。また、リン酸水素ナトリウムはリン酸水素二ナトリウム及びリン酸二水素ナトリウムのいずれも用いることができ、リン酸水素二ナトリウムが中でも好ましい。ｐＨアルカリ調整剤は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００５４】
Ｐｌｓ−γＣＤ−ｐＨ剤含有組成物は、例えば液状組成物及び固形状組成物であってよく、固形組成物であることが好ましい。固形組成物の中でも、乾燥組成物が好ましく、特に粉末状組成物であることが好ましい。
【００５５】
また、Ｐｌｓ−γＣＤ−ｐＨ剤含有組成物は、ｐＨが６〜８であることが好ましい。
【００５６】
例えば、Ｐｌｓ−γＣＤ−ｐＨ剤含有組成物が固形組成物である場合は、水に分散させて、１質量％の水懸濁液としたとき、ｐＨが６〜８となる。当該分散操作は、５５℃のウォーターバス中で１時間振とうすることにより行う。当該ｐＨは、２５℃でｐＨメーターにより測定する。水に分散させて、１質量％の水懸濁液としたとき、ｐＨが６〜８となるＰｌｓ−γＣＤ−ｐＨ剤含有組成物は、含有するプラズマローゲンの安定性が高く、好ましい。当該ｐＨ範囲は、下限は６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、又は６．８であってもよく、また上限は７．９、７．８、７．７、７．６、７．５、７．４、７．３、又は７．２であってもよい。当該固形組成物は、下述するように、例えばプラズマローゲン、γ−シクロデキストリン、及びｐＨアルカリ調整剤を含有する液状組成物を乾燥処理することで調製できるところ、当該原料である液状組成物調製時にｐＨアルカリ調整剤を適切に配合して当該ｐＨ範囲になるようにすることが好ましい。なお、本明細書において質量％は特に断らない限りｗ／ｗ％を示す。
【００５７】
また例えば、Ｐｌｓ−γＣＤ−ｐＨ剤含有組成物が液状組成物である場合には、当該組成物のｐＨが６〜８であることが好ましい。また当該液状組成物の溶媒は、プラズマローゲンを分散させることができ、ｐＨが６〜８となるものであれば制限はされないが、例えば水が好ましい。当該液状組成物としては、特に水懸濁液が好ましい。上記と同様に、当該ｐＨは、２５℃でｐＨメーターにより測定する。ｐＨが６〜８となるＰｌｓ−γＣＤ−ｐＨ剤含有液状組成物は、含有するプラズマローゲンの安定性が高く、好ましい。当該ｐＨ範囲は、下限は６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、又は６．８であってもよく、また上限は７．９、７．８、７．７、７．６、７．５、７．４、７．３、又は７．２であってもよい。なお、当該液状組成物はｐＨが６〜８であるため、当該液状組成物を乾燥処理して上記固形組成物を好ましく調製することができる。言い換えれば、当該液状組成物は上記固形組成物の原料としても好ましく用いることができる。
【００５８】
Ｐｌｓ−γＣＤ−ｐＨ剤含有組成物は、例えば、プラズマローゲン（生体組織から抽出したプラズマローゲン含有抽出物等であってもよい）、γ−シクロデキストリン、及びｐＨアルカリ調整剤を、必要に応じて溶媒（特に好ましくは水）とともに混合することにより調製することができる。当該方法により得られる組成物は液状組成物であるが、組成物を固形組成物としたい場合には、例えば、得られた混合物を乾燥処理することにより固形組成物とすることができる。乾燥処理としては、公知の方法を用いることができ、例えば凍結乾燥及び噴霧乾燥等を挙げることができる。また、乾燥処理前に濃縮処理を行ってもよく、濃縮処理方法としては例えば減圧濃縮等を挙げることができる。乾燥処理後に、得られた固形組成物を必要に応じて粉砕する等して、粉末状とすることもできる。また、噴霧乾燥により乾燥処理を行った場合には、粉末状組成物が直接得られうる。
【００５９】
Ｐｌｓ−γＣＤ−ｐＨ剤含有組成物における各含有物の含有量は、含有されるプラズマローゲンの安定性が向上するという効果が得られる範囲であれば、特に制限はされない。例えば、固形組成物（特に乾燥組成物）の場合には、プラズマローゲンは０．１〜１０質量％含有されることが好ましい。当該範囲の下限は、例えば０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、又は１質量％であってもよい。また、当該範囲の上限は、例えば９．５、９、８．５、８、７．５、７、６．５、６、５．５、５、４．５、４、３．５、又は３質量％であってもよい。
【００６０】
また、Ｐｌｓ−γＣＤ−ｐＨ剤含有組成物において、γ−シクロデキストリンは、プラズマローゲン１質量部に対して１０〜１００質量部程度含まれることが好ましく、１５〜１００質量部程度含まれることがより好ましい。また、特に固形組成物（特に乾燥組成物）においては、４０〜９５質量％程度含まれることが好ましい。当該下限は例えば４５、５０、５５、６０、又は６５質量％であってもよい。また、当該上限は例えば９０、８５、８０、又は７５質量％であってもよい。
【００６１】
また、Ｐｌｓ−γＣＤ−ｐＨ剤含有組成物において、ｐＨアルカリ調整剤は、組成物のｐＨが６〜８となるよう配合されていればよく、用いるｐＨアルカリ調整剤の種類に応じて適宜設定することができる。特に、Ｐｌｓ−γＣＤ−ｐＨ剤含有組成物が固形組成物（特に乾燥組成物）であり、用いるｐＨアルカリ調整剤がクエン酸ナトリウム（特にクエン酸三ナトリウム）である場合には、例えば０．５〜２０質量％程度含まれることが好ましい。当該範囲の下限は、例えば１又は１．５質量％であってもよい。また、当該範囲の上限は、例えば１９、１８、１７、１６、１５、１４、又は１３質量％であってもよい。
【００６２】
Ｐｌｓ−γＣＤ−ｐＨ剤含有組成物には、プラズマローゲン、γ−シクロデキストリン、及びｐＨ調整剤以外にも、本発明の効果を損なわない範囲で、その他の成分を配合することもできる。このような成分としては、医薬品分野又は食品分野において公知の各種成分を用いることができる。例えば薬理学的若しくは食品衛生学的に許容される担体等を用いることができる。また、より具体的には、例えば公知の賦形剤、甘味剤、結合剤、崩壊剤等が挙げられるが、特にこれらに制限はされない。これら他の成分を配合する場合には、例えば組成物調製時に、プラズマローゲン、γ−シクロデキストリン、及びｐＨ調整剤に加えてその他成分（並びに必要に応じて溶媒）も混合することができる。
【００６３】
また、Ｐｌｓ−γＣＤ−ｐＨ剤含有組成物は、例えば医薬品または食品の製造に好ましく用いることができる。
【００６４】
本発明は、また、（Ａ）少なくともプラズマローゲン、γ−シクロデキストリン、ｐＨ調整剤、及び溶媒（好ましくは水）を混合してｐＨ６〜８の懸濁液を調製する工程を含む、プラズマローゲン含有組成物の製造方法をも包含する。当該工程（Ａ）で得られた懸濁液をそのままプラズマローゲン含有組成物として用いてもよいし、さらに乾燥処理して固形組成物としてもよい。工程（Ａ）の後に、（Ｂ）工程（Ａ）で得た懸濁液を乾燥させて乾燥組成物を得る工程をさらに含む方法も好ましい。
【００６５】
本発明は、また、（Ａ）少なくともプラズマローゲン、γ−シクロデキストリン、ｐＨ調整剤、及び溶媒（好ましくは水）を混合してｐＨ６〜８の懸濁液を調製する工程を含む、プラズマローゲンの安定性を高める方法をも包含する。工程（Ａ）の後に、（Ｂ）工程（Ａ）で得た懸濁液を乾燥させて乾燥組成物を得る工程をさらに含む方法も好ましい。
【００６６】
これらの方法については、上記Ｐｌｓ−γＣＤ−ｐＨ剤含有組成物についての説明がそのまま好ましく当てはまり得る。
【００６７】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本発明は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。
【００６８】
また、上述した本発明の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本発明に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本発明には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。
【実施例】
【００６９】
以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、プラズマローゲンを抽出する原料として、凍結乾燥された鶏ムネ肉（ＦＤ鶏ムネ肉）を使用した。また、特に断らない限り、％は質量（ｗ／ｗ）％を示す。【００７０】
エタノール抽出
ＦＤ鶏ムネ肉４２ｋｇを抽出釜に投入した。ＦＤ鶏ムネ肉の４倍量（ｗ／ｖ）の９９％エタノール（１６８Ｌ）を抽出釜に投入して窒素置換後、攪拌しながら加温し４０℃達温後、９０分間保持した。３０メッシュで濾過後、抽出液をドラム缶に回収した。１回目の抽出残渣を抽出釜に投入後、ＦＤ鶏ムネ肉の２．５倍量（ｗ／ｖ）の９９％エタノール（１０５Ｌ）を釜に投入して窒素置換後、攪拌しながら加温し４０℃達温後、９０分間保持した。３０メッシュで濾過後、抽出液をドラム缶に回収した。当該抽出液を１０Ｓろ紙で吸引ろ過した。得られた液をエタノール抽出液として用いた。【００７１】
エタノール抽出液の減圧濃縮
エタノール抽出液を、内温４０℃以下で減圧し、５０Ｌバットに全量入る程度の量（約８ｋｇ）になるまで減圧濃縮した。当該一次濃縮液を５０Ｌバットに入れて外温５０〜６０℃で減圧した。得られた濃縮液を３０メッシュでろ過後、重量を測定したところ、５．１２ｋｇであった。当該濃縮液をエタノール抽出液濃縮物とし、使用するまで４℃で保管した。【００７２】
なお、エタノール抽出液濃縮物の乾燥減量を乾熱乾燥法（１０５℃、３時間）で、水分量をカールフィッシャー法で、それぞれ測定した。また、差引法でエタノール濃度を算出した。結果は次のとおりであった。乾燥減量：８．０５％、水分：０．１５％、エタノール：７．９％。【００７３】
エタノール抽出液濃縮物とエタノール水溶液との混合検討
＜分離検討１＞
エタノール抽出液濃縮物１５ｇに対し、５０、６０、７０、又は８０％エタノール水溶液を等量添加（ｗ／ｗ）し、室温で撹拌した。室温で３時間静置後、分離状況を確認した。
＜分離検討２＞
エタノール抽出液濃縮物１０ｇに対し、２５、５０、又は７５％エタノール水溶液を等量添加して（ｗ／ｗ）し、５０℃になるまで加温撹拌した。５０℃で３時間静置後、分離状況を確認した。
＜ＴＬＣ分析＞
各検討で分離された層に含まれる成分を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で確認した。より詳細には、薄層板（シリカゲル）で作られた薄層を使い、検討１及び検討２で分離させた各層を移動相（クロロホルム／メタノール／水＝６５／２５／４）で展開させて中性脂質とリン脂質を分離した。検出溶液には１０％硫酸を用いた。【００７４】
検討１においては、５０％エタノール水溶液を等量混合した場合、乳化状態になり分離は確認できなかった。６０、７０、又は８０％エタノール水溶液を等量混合した場合には２層の分離はみられたが、それぞれの層の脂質分布をＴＬＣで確認したところ、いずれの層にも中性脂質とリン脂質が存在し分離が不十分であった。このことから、室温条件下では分離が不十分であることが明らかとなった。【００７５】
検討２においては、２５％エタノール水溶液を等量混合した場合、乳化状態になり分離は確認できなかったが、５０又は７５％エタノール水溶液を等量混合した場合には３層に分離した（図１）。ＴＬＣ分析によれば、７５％エタノールを等量混合した場合には、リン脂質が最も多かった下層画分で中性脂質やコレステロールも多く存在していた。一方、５０％エタノール水溶液を等量混合した場合、上層には主として中性脂質、下層に主としてリン脂質が存在していることがわかった（図２）。なお、図２では、（Ａ）は上層、（Ｂ）は中層、（Ｃ）は下層を示す。【００７６】
このことから、５０％エタノール水溶液を当量混合して５０℃で静置することにより、鳥ムネ肉のエタノール抽出液濃縮物について、遠心分離を用いずとも、効率よくリン脂質濃縮物を得られることが分かった。【００７７】
そこで、上記のように、エタノール抽出液濃縮物に対し、５０％エタノール水溶液を等量添加（ｗ／ｗ）し、５０℃になるまで加温撹拌し、５０℃で３時間静置後、３層に分離したうちの下層を回収したものを、プラズマローゲン含有鶏ムネ肉エキスとして以下の検討に使用した。なお、以下、「鶏ムネ肉エキス」との表記は当該プラズマローゲン含有鶏ムネ肉エキスを意味する。【００７８】
鶏ムネ肉エキスの検討
鶏ムネ肉エキス０．２ｇにクロロホルム／メタノール（２：１  ｖ／ｖ）３０ｍＬを加えて脂質を抽出し、そこに０．９％塩化カリウム溶液７．５ｍＬを加えて振とう後、遠心分離して液を二層に分けた。その後、下層を回収し、溶媒を留去することで脂質のみ（約０．１３ｇ）を回収した。鶏ムネ肉エキス調製を複数回繰り返し、含まれる脂質量を調べたところ、鶏ムネ肉エキスの約６０〜７０質量％が脂質であることがわかった。
また、その後、シリカゲルカラムで分画し、リン脂質を含む画分のみを分取し、それを既知の方法（上記非特許文献１：日本畜産学会報８５（２），１５３−１６１，２０１４を参照）に準じてＨＰＬＣで分離することでＰｌｓの定量を行った。具体的には、次のようにして行った。抽出した脂質２０ｍｇを少量のクロロホルムに溶解させ、クロロホルム３０ｍLをシリカゲルカラムに通液させ、中性脂質画分を溶出させた。その後、クロロホルム／メタノール（２：１  ｖ／ｖ）およびメタノール３０ｍLを当該シリカゲルカラムに通液させて極性脂質画分（リン脂質含有画分）を分取した。さらに、当該リン脂質含有画分を下記条件でのＨＰＬＣ分析に供し、プラズマローゲン量を測定した。【００７９】
［ＨＰＬＣ分析］
機器：ＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所，京都），移動相：Ａ液；ヘキサン／２−プロパノール：酢酸（８２：１７：１，ｖ／ｖ／ｖ），Ｂ液；２−プロパノール／水／酢酸（８５：１４：１，ｖ／ｖ／ｖ）＋０．２％トリエチルアミン，グラジエント条件（Ｂ液％）：０−１分（０−５％），１−２５分（５−４０％），２５−２８分（４０−０％），カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００−Ｄｉｏｌ（２５０ｍｍ×４ｍｍ，  粒径５μｍ；Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ），流速：１ｍＬ／分，サンプル量：１０μｇ，  カラム温度：５０℃，検出器：ＥＬＳＤ−ＬＴII（５０℃，３５０ｋＰａ；島津製作所）【００８０】
なお、プラズマローゲンの定量は、ＨＰＬＣのクロマトグラムにおいて検出されるプラズマローゲンのピーク面積に基づいて行った。より具体的には、プラズマローゲンのピーク位置は標準物質を予め分析することで確認しておき、また、ピーク面積からの定量は、濃度既知の標準物質を分析し、得られた面積値と標準物質濃度から標準曲線を作成することにより、行った。なお、プラズマローゲンの標準物質として、Ｃ１８（Ｐｌａｓｍ）−１８：１ＰＥ、Ｃ１８（Ｐｌａｓｍ）−１８：１ＰＣ［Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社］を用いた。【００８１】
鶏ムネ肉エキス０．２ｇ中、プラズマローゲンは約０．０２５ｇ含まれていた。複数回プラズマローゲン定量検討を繰り返したところ、鶏ムネ肉エキスの約１０〜１５質量％がプラズマローゲンであることがわかった。【００８２】
プラズマローゲン安定性向上方法の検討１
プラズマローゲンの安定性を向上させる物質を見いだすため、まずシクロデキストリンについて検討した。シクロデキストリンはいくつかのグルコースがα−１，４結合により環状に連結した構造を有しており、その特徴的な構造により、環の外側は親水性、内側の空洞は親油性を示すことから、水中において脂溶性の物資をその空洞内に取り込むことができる。この現象は一般的に包接と呼ばれ、シクロデキストリンは包接した脂溶性物質の安定性を向上させることが期待される。このため、シクロデキストリンは、例えばコエンザイムＱ１０やαリポ酸などの抗酸化能を有する機能性食品素材の安定化に利用されている。【００８３】
なお、シクロデキストリンを「ＣＤ」と表記することがある。また、α−シクロデキストリン及びγ−シクロデキストリンを、それぞれ「αＣＤ」及び「γＣＤ」と表記することがある。また、プラズマローゲンを「Ｐｌｓ」と表記することがある。【００８４】
＜安定化検討１＞
鶏ムネ肉エキス１７５ｇに対して、αＣＤ若しくはγＣＤ（シクロケム）５００ｇ、及び脱イオン水１５００ｇを加えて、ホモジナイザーを用いて撹拌（６０００ｒｐｍ、２０分間、室温）した。撹拌後の試料を凍結させ、凍結乾燥後に粉砕することで粉末を調製した。【００８５】
なお、鶏ムネ肉エキス及びＣＤについては、それぞれ、１０５℃で１時間加熱した際の乾燥減量を求めた。そして、もとの量から当該乾燥減量を差し引いた値を固形分量とした。鶏ムネ肉エキスは、その大部分が水、エタノール、及び脂質であるため、固形分量は含有脂質量とほぼ同じ値を示す。また、ＣＤは若干の水分を含んでいるところ、固形分量は水分が除去された状態のＣＤ量を示す。本検討のように、プラズマローゲン含有組成物を乾燥組成物として調製した場合には、当該固形分量が、当該乾燥組成物中に含まれる脂質量及びＣＤ量を反映する。【００８６】
表１に、鶏ムネ肉エキス、並びにＣＤα及びＣＤγの配合量並びに固形分量及び固形分量比（質量％）を示す。また、あわせて、含有されるＰｌｓの配合量並びに固形分量及び固形分量比（質量％）を示す。【００８７】
【表１】
2020009173.tif 000004
【００８８】
得られた粉末は４０℃での加速試験に供し、３０日目にＰｌｓ量の測定を行った。具体的には、次のようにして測定した。得られた粉末０．１ｇに対して０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２４ｍＬを加えて、５５℃で３０分間振とうした。その後、メタノール３２ｍＬを加えてさらに１５分振とうした後、クロロホルム６４ｍＬを加えて脂質を抽出した。得られた脂質を上記と同様にしてシリカゲルカラム及びＨＰＬＣで分離解析し、Ｐｌｓの定量を行った。結果を表２に示す。また、当該結果において、Ｐｌｓの安定性は粉末調製直後の粉末中のＰｌｓ定量値（初期値）に対する各保存期間終了後のＰｌｓ定量値の割合（Ｐｌｓ残存率％）で評価した。結果を表３に示す。また表３をグラフ化して図３に示す。【００８９】
【表２】
2020009173.tif 000005
【００９０】
【表３】
2020009173.tif 000006
【００９１】
４０℃３０日目の残存率は、αＣＤを用いた場合は５４質量％、γＣＤを用いた場合は７７質量％だった。今回用いた両ＣＤともに４０℃３０日目でＰｌｓ残存率の低下が認められ、その低下はαＣＤにおいて顕著に認められた。このことから、それほど効果は大きくはないものの、γＣＤはＰｌｓの安定化に適した成分であると考えられた。【００９２】
プラズマローゲン安定性向上方法の検討２
上記の通り、γＣＤはＰｌｓの安定化に資するものの、その効果は十分ではなかった。そこで、さらにＰｌｓの安定性を向上させる方法を検討した。具体的には、γＣＤのみならず、さらに他の成分を配合することによりＰｌｓの安定性をさらに向上させることができないか、各種成分をさらに配合して検討した。その結果、クエン酸ナトリウムをさらに配合することにより、Ｐｌｓの安定性をさらに向上させることができる可能性を見いだした。【００９３】
具体的には、次のようにして検討した。クエン酸ナトリウムとしては、クエン酸三ナトリウムを用いた。クエン酸ナトリウム無しのサンプル（対照群）では鶏ムネ肉エキス２．４３ｇに対してγＣＤ（シクロケム）３０．８ｇ、脱イオン水適量を加えて、攪拌機を用いて撹拌して懸濁液を調製した。得られた懸濁液のｐＨを２５℃でｐＨメーターで測定したところ、５．０であった。その後、試料を凍結させ、凍結乾燥後に粉砕することで粉末を調製した。クエン酸ナトリウム有りのサンプルでは、対照群と同様の原料にクエン酸ナトリウム０．５５ｇを追加し、同様に撹拌して懸濁液を調製した。得られた懸濁液のｐＨを２５℃でｐＨメーターで測定したところ、７．０であった。その後、当該懸濁液を用いて対照群と同様の方法で粉末を調製した。得られた各粉末は６０℃での加速試験に供し、保存開始から１週後、２週後、及び４週後に上記と同様にしてＰｌｓ量の測定を行った。クエン酸ナトリウムを使用した粉末の組成を、表４に示す。（表４からわかるように、用いた鶏ムネ肉エキス２．４ｇにはＰｌｓ０．３０ｇが含まれていた。）【００９４】
【表４】
2020009173.tif 000007
【００９５】
なお、鶏ムネ肉エキスにγＣＤ及びクエン酸ナトリウムを加えて調製した粉末について、水に再分散させてｐＨを測定した。具体的には、当該粉末０．１ｇにイオン交換水１０ｍＬを加えて５５℃のウォータバス中で１時間振とうして分散させた後、得られた懸濁液のｐＨを２５℃でｐＨメーターで測定した結果、７．０８であった。【００９６】
各保存期間終了後のＰｌｓ残存率を表５に示す。また、表５をグラフ化して図４に示す。【００９７】
【表５】
2020009173.tif 000008
【００９８】
対照群（クエン酸ナトリウム無し）では保存開始１週後の時点からＰｌｓ残存率が低下し、４週後では７１％まで低下した。一方、クエン酸ナトリウムを添加した粉末では対照群と比較して、Ｐｌｓ残存率の低下がほとんど認められず、４週後の時点で９４％と高かった。この結果から、γＣＤのみならずクエン酸ナトリウムをも添加した粉末ではＰｌｓの安定性がさらに向上することが明らかとなった。【００９９】
プラズマローゲン安定性向上方法の検討３
上記の検討では、凍結乾燥後に粉砕することで粉末を調製したが、より簡便に大量調製が可能となる噴霧乾燥により粉末調製しても得られる効果が変化しないかを検討した。【０１００】
具体的には次のようにして行った。鶏ムネ肉エキス３２３．６ｇに対してγＣＤ（シクロケム）８７３．８ｇ、クエン酸ナトリウム１４５ｇ、脱イオン水１８００ｇを加えて、ホモジナイザーを用いて撹拌（３５００ｒｐｍ、２０分間、室温）し懸濁液を得た。得られた懸濁液のｐＨを２５℃でｐＨメーターで測定したところ、６．８であった。当該懸濁液を噴霧乾燥機を用いて乾燥させ、粉末を得た（表６）。得られた粉末は６０℃での加速試験に供し、保存開始から１週後及び２週後に上記と同様にしてＰｌｓ量の測定を行った。クエン酸ナトリウムを使用した粉末の配合値を、表６に示す。（表６からわかるように、用いた鶏ムネ肉エキス３２３．６ｇにはＰｌｓ４０．５ｇが含まれていた。）【０１０１】
【表６】
2020009173.tif 000009
【０１０２】
なお、当該粉末について、水に再分散させてｐＨを測定した。具体的には、当該粉末０．１ｇにイオン交換水１０ｍＬを加えて５５℃のウォータバス中で１時間振とうして分散させた後、得られた懸濁液のｐＨを２５℃でｐＨメーターで測定した結果、７．１６であった。【０１０３】
各保存期間終了後のＰｌｓ残存率を図５に示す。２週後までＰｌｓ残存率の低下は認められず、噴霧乾燥により調製した粉末も、凍結乾燥で調製した粉末と同等若しくはそれ以上の、優れた安定性を示した。【０１０４】
プラズマローゲン安定性向上方法の検討４
上記の検討結果から、得られた粉末組成物を水に分散させたときのｐＨが中性付近であることが、当該組成物中でプラズマローゲンが安定に存在するために重要ではないかと考えられた。そこで、クエン酸ナトリウム以外のｐＨアルカリ調整剤を用いた場合にも、同様にプラズマローゲンの安定性が向上するかを検討した。【０１０５】
鶏ムネ肉エキスγＣＤ、水、及び各種ｐＨアルカリ調整剤を上記と同様に撹拌して懸濁液を調製し、当該懸濁液を凍結乾燥して粉末を調製した。このとき、凍結乾燥前の懸濁液のｐＨ（２５℃、ｐＨメーター測定）が中性（７付近：６．５〜７．５程度）になるよう組成を調整した。それぞれの組成について、下記表７に示す。得られた各粉末を上記同様にして６０℃での加速試験に供し、保存開始から１週後、２週後、及び４週後に上記と同様にしてＰｌｓ量の測定を行った。各種ｐＨアルカリ調整剤を使用した粉末の組成を、表７に示す。（表７からわかるように、用いた鶏ムネ肉エキス２．４ｇにはＰｌｓ０．３０ｇが含まれていた。）【０１０６】
【表７】
2020009173.tif 000010
【０１０７】
各保存期間終了後のＰｌｓ残存率を表８に示す。また、表８に基づき描いたグラフを図６に示す。【０１０８】
【表８】
2020009173.tif 000011
【０１０９】
また、各粉末について、水に再分散させてｐＨを測定した。具体的には、当該粉末０．１ｇにイオン交換水１０ｍＬを加えて５５℃のウォータバス中で１時間振とうして分散させた後、得られた懸濁液のｐＨを２５℃でｐＨメーターで測定した。結果を表９に示す。【０１１０】
【表９】
2020009173.tif 000012
【０１１１】
これらの結果から、γＣＤに加え、ｐＨアルカリ調整剤を用いてｐＨを中性付近になるように調整することによって、プラズマローゲンの安定性がより向上することがわかった。また、ｐＨアルカリ調整剤の中でも、クエン酸ナトリウムが、プラズマローゲン安定性向上効果が特に優れていることがわかった。
【図１】
2020009173.tif 000013
【図２】
2020009173.tif 000014
【図３】
2020009173.tif 000015
【図４】
2020009173.tif 000016
【図５】
2020009173.tif 000017
【図６】
2020009173.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月27日(2019.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラズマローゲン、
γ−シクロデキストリン、及び
ｐＨアルカリ調整剤
を含有し、
１質量％水懸濁液としたときのｐＨが６〜８である、
プラズマローゲン含有乾燥固形組成物。
【請求項２】
プラズマローゲン、
γ−シクロデキストリン、並びに
クエン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、及びリン酸水素ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１種
を含有し、
１質量％水懸濁液としたときのｐＨが６〜８である、
プラズマローゲン含有乾燥固形組成物。
【請求項３】
粉末状である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
プラズマローゲンを０．１〜１０質量％含有する請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
（Ａ）少なくともプラズマローゲン、γ−シクロデキストリン、ｐＨ調整剤、及び水を混合してｐＨ６〜８の懸濁液を調製する工程、及び
（Ｂ）工程（Ａ）で得た懸濁液を乾燥させて乾燥組成物を得る工程
を含む、プラズマローゲン含有乾燥組成物の製造方法。
【請求項６】
（Ａ）少なくともプラズマローゲン、γ−シクロデキストリン、ｐＨ調整剤、及び水を混合してｐＨ６〜８の懸濁液を調製する工程、及び
（Ｂ）工程（Ａ）で得た懸濁液を乾燥させて乾燥組成物を得る工程
を含む、乾燥組成物中のプラズマローゲンの安定性を高める方法。
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月23日(2020.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラズマローゲン、
γ−シクロデキストリン、並びに
クエン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、及びリン酸水素ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１種
を含有し、
１質量％水懸濁液としたときのｐＨが６〜８である、
プラズマローゲン含有乾燥固形組成物。
【請求項２】
粉末状である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
プラズマローゲンを０．１〜１０質量％含有する請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
（Ａ）少なくとも
プラズマローゲン、
γ−シクロデキストリン、
クエン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、及びリン酸水素ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１種、並びに
水
を混合してｐＨ６〜８の懸濁液を調製する工程、及び
（Ｂ）工程（Ａ）で得た懸濁液を乾燥させて乾燥組成物を得る工程
を含む、プラズマローゲン含有乾燥組成物の製造方法。
【請求項５】
（Ａ）少なくとも
プラズマローゲン、
γ−シクロデキストリン、
クエン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、及びリン酸水素ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１種、並びに
水
を混合してｐＨ６〜８の懸濁液を調製する工程、及び
（Ｂ）工程（Ａ）で得た懸濁液を乾燥させて乾燥組成物を得る工程
を含む、乾燥組成物中のプラズマローゲンの安定性を高める方法。
【国際調査報告】
2020009173.tif 000019
2020009173.tif 000020
2020009173.tif 000021
2020009173.tif 000022