(57)【要約】［課題］本発明は、ＳＰＲのシグナルを向上させるのみならずＳＰＦＳによる蛍光シグナルを向上させることができる高感度かつ高精度なアッセイ法、該アッセイ用装置および該アッセイ用キットを提供することを目的とする。［解決手段］下記工程（ａ）〜（ｅ）を含むことを特徴とするアッセイ法；工程（ａ）：特定のプラズモン励起センサに検体を接触させる工程，工程（ｂ）：工程（ａ）のセンサに、第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程，工程（ｃ）：工程（ｂ）のセンサに、外部刺激を加える工程，工程（ｄ）：工程（ｃ）のセンサが有する透明平面基板の、上記金属薄膜が形成されている表面の反対側の表面からプリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された上記蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程，および工程（ｅ）：工程（ｄ）で得られた測定結果から、上記検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程。
2010123073.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも下記工程（ａ）〜（ｅ）を含むことを特徴とするアッセイ法；
工程（ａ）：透明平面基板と；該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と；該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された刺激応答性ポリマーを含む層と；該層に固定化された第１のリガンドとを含むプラズモン励起センサに検体を接触させる工程，
工程（ｂ）：上記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程，
工程（ｃ）：上記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、該刺激応答性ポリマーが応答し得る外部刺激を加える工程，
工程（ｄ）：上記工程（ｃ）を経て得られたプラズモン励起センサが有する透明平面基板の、上記金属薄膜が形成されている表面の反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された上記蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程，および
工程（ｅ）：上記工程（ｄ）で得られた測定結果から、上記検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程。
【請求項２】
上記刺激応答性ポリマーが、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド，ポリメタクリレート，ポリビニルメチルエーテル，ポリアクリル酸，ポリメタクリル酸，ポリ（２−エチルアクリル酸），ポリ（２−プロピルアクリル酸），ポリ（２−ジメチルアミノ）メチルメタクリレート，ポリ（２−ジエチルアミノ）メチルメタクリレートおよびポリ（２−メトキシアニリン−５−スルホネート）からなる群から選択される少なくとも１種のポリマーである請求項１に記載のアッセイ法。
【請求項３】
上記外部刺激が、温度変化および／またはｐＨ変化である請求項１または２に記載のアッセイ法。
【請求項４】
上記金属薄膜が、金，銀，アルミニウム，銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成されている請求項１〜３のいずれかに記載のアッセイ法。
【請求項５】
上記金属が、金である請求項４に記載のアッセイ法。
【請求項６】
上記金属薄膜の、上記透明平面基板とは接していないもう一方の表面にＳＡＭ〔自己組織化単分子膜〕が形成され、上記の刺激応答性ポリマーが該ＳＡＭに固定化されている請求項１〜５に記載のアッセイ法。
【請求項７】
上記検体が、血液，血清，血漿，尿，鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも１種の体液を含む請求項１〜６のいずれかに記載のアッセイ法。
【請求項８】
少なくとも上記プラズモン励起センサを含み、請求項１〜７のいずれかに記載のアッセイ法に用いられることを特徴とする装置。
【請求項９】
透明平面基板と；該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と；該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された刺激応答性ポリマーを含む層とを含むプラズモン励起センサ用基板を少なくとも含み、請求項１〜７のいずれかに記載のアッセイ法に用いられることを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、刺激応答性ポリマーを有するプラズモン励起センサを用いたアッセイ法に関する。より詳細には、本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法〔ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ〕および表面プラズモン共鳴〔ＳＰＲ；Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ〕の原理に基づいた該センサを用いるアッセイ法，該アッセイ用装置ならびに該アッセイ用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＰＲ〔表面プラズモン共鳴〕とは、照射したレーザ光が金属薄膜表面で全反射減衰〔ＡＴＲ〕する条件において、誘電体に接触した金属薄膜表面に発生させた粗密波（表面プラズモン）と、誘電率（または屈折率）の差異による影響を受け易いエバネッセント波との波数が一致したとき両者が共鳴して反射光が減衰する現象であって、センサ表面においてリガンドとアナライトとが相互作用することによって誘電体の誘電率（または屈折率）に差異が生じ、その結果、表面プラズモン共鳴が変化することによって、リガンドとアナライトとの相互作用を定量することができる。【０００３】
ＳＰＲを利用したバイオセンサとして、図２に示すように、金属膜が形成された基板１１と、該基板に結合されているポリＮ−イソプロピルアクリルアミドなどの刺激応答性高分子１３と、該高分子に結合されている生体物質認識分子（リガンド）１４とを有するバイオセンサ用測定チップが、特許文献１に開示されており、アナライトが該高分子に結合することによる屈折率変化に加え、該高分子の相転移変化による屈折率変化によってシグナルを増強させる旨記載されている。【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載のバイオセンサ用測定チップは、外部刺激の加え方が非効率的であり、相転移の現象を有効に利用していないことから改良の余地が認められる。【０００５】
さらに、特許文献２には、加熱や電場の印加等による刺激応答性を示す誘電体試料を、金属薄膜の一方の面に接触させるとともに表面プラズモン共鳴を誘起させ、該誘電体試料の状態（結晶−液晶相転移、相分離や配向変化など）を測定することができる測定装置が提案されている。【０００６】
しかしながら、特許文献２に、該誘電体試料の相転移を有効に利用するという技術的思想はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−６４４６５号公報
【特許文献２】特開平６−１６７４４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＳＰＦＳによる蛍光シグナルを向上させるのみならず、ＳＰＲのシグナルを向上させることができる高感度かつ高精度なアッセイ法，該アッセイ用装置および該アッセイ用キットを提供することを目的とする。【０００９】
なお、ＳＰＦＳ〔表面プラズモン励起増強蛍光分光法〕とは、照射したレーザ光が金属薄膜表面で全反射減衰〔ＡＴＲ〕する条件において、誘電体に接触した金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、照射したレーザ光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金薄膜近傍の蛍光色素を効率良く励起させることによって、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意研究した結果、刺激応答性高分子に対して効率的に外部刺激を加えることによって、測定したい蛍光色素と金属薄膜との距離を短縮させ、ＳＰＦＳおよびＳＰＲの蛍光シグナルが向上することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明のアッセイ法は、少なくとも下記工程（ａ）〜（ｅ）を含むことを特徴とする。
工程（ａ）：透明平面基板と；該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と；該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された刺激応答性ポリマーを含む層と；該層に固定化された第１のリガンドとを含むプラズモン励起センサに検体を接触させる工程，
工程（ｂ）：上記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程，
工程（ｃ）：上記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、該刺激応答性ポリマーが応答し得る外部刺激を加える工程，
工程（ｄ）：上記工程（ｃ）を経て得られたプラズモン励起センサが有する透明平面基板の、上記金属薄膜が形成されている表面の反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された上記蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程，および
工程（ｅ）：上記工程（ｄ）で得られた測定結果から、上記検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程。【００１２】
上記刺激応答性ポリマーは、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド，ポリメタクリレート，ポリビニルメチルエーテル，ポリアクリル酸，ポリメタクリル酸，ポリ（２−エチルアクリル酸），ポリ（２−プロピルアクリル酸），ポリ（２−ジメチルアミノ）メチルメタクリレート，ポリ（２−ジエチルアミノ）メチルメタクリレートおよびポリ（２−メトキシアニリン−５−スルホネート）からなる群から選択される少なくとも１種のポリマーであることが好ましい。【００１３】
上記外部刺激は、温度変化および／またはｐＨ変化であることが好ましい。
上記金属薄膜は、金，銀，アルミニウム，銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属から形成されていることが好ましく、特に金から形成されていることが好ましい。【００１４】
上記金属薄膜の、上記透明平面基板とは接していないもう一方の表面にＳＡＭ〔自己組織化単分子膜〕が形成され、上記刺激応答性ポリマーが該ＳＡＭに固定化されていることが好ましい。【００１５】
上記検体は、血液，血清，血漿，尿，鼻孔液および唾液からなる群から選択される少なくとも１種の体液であることが好ましい。
本発明の装置は、少なくとも上記プラズモン励起センサを含み、上記アッセイ法に用いられることを特徴とする。【００１６】
また、本発明のキットは、透明平面基板と；該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と；該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された刺激応答性ポリマーを含む層とを含むプラズモン励起センサ用基板を少なくとも含み、上記アッセイ法に用いられることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、測定したい蛍光色素と金属薄膜との距離を、刺激応答性高分子に外部刺激を加え短縮させることによって、ＳＰＦＳにおける蛍光シグナルを向上させるだけでなく、ＳＰＲのシグナル向上にも寄与できるアッセイ法、該アッセイ用装置および該アッセイ用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１（Ａ）は、本発明のアッセイ法の工程（ｂ）で得られたプラズモン励起センサの断面図を模式的に示したものであり、（Ｂ）は、本発明のアッセイ法の工程（ｃ）で得られたプラズモン励起センサの断面図を模式的に示したものである。
【図２】図２は、特許文献１に記載のバイオセンサ用測定チップの断面図を模式的に示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明のアッセイ法について具体的に説明する。
＜アッセイ法＞
本発明のアッセイ法は、少なくとも下記工程（ａ）〜（ｅ）を含むことを特徴とするものであり、さらに洗浄工程を含むことが好ましい。
【００２０】
工程（ａ）：透明平面基板と；該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と；該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された刺激応答性ポリマーを含む層と；該層に固定化された第１のリガンドとを含むプラズモン励起センサに検体を接触させる工程。
【００２１】
工程（ｂ）：上記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程。
工程（ｃ）：上記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、該刺激応答性ポリマーが応答し得る外部刺激を加える工程。
【００２２】
工程（ｄ）：上記工程（ｃ）を経て得られたプラズモン励起センサが有する透明平面基板の、上記金属薄膜が形成されている表面の反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された上記蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程。
【００２３】
工程（ｅ）：上記工程（ｄ）で得られた測定結果から、上記検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程。
洗浄工程：上記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサの表面、および上記工程（ｂ）を経て得られるプラズモン励起センサの表面のうち少なくともいずれか一方を洗浄する工程。
【００２４】
［工程（ａ）］
工程（ａ）とは、透明平面基板と；該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と；該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された刺激応答性ポリマーを含む層と；該層に固定化された第１のリガンドとを含むプラズモン励起センサに検体を接触させる工程である。
【００２５】
（プラズモン励起センサ）
本発明で用いるプラズモン励起センサは、透明平面基板と；該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と；該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された刺激応答性ポリマーを含む層と；該層に固定化された第１のリガンドとを含み、さらに金属薄膜の、透明平面基板とは接していないもう一方の表面に形成されたＳＡＭ〔Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜〕を含むことが好ましく、刺激応答性ポリマーを該ＳＡＭに固定化することができる。
【００２６】
また、金属薄膜による蛍光色素の金属消光を防止することを目的として、誘電体からなるスペーサ層を適宜形成してもよい。このスペーサ層は、金属薄膜の、透明平面基板と接していないもう一方の表面に形成されることが望ましい。
【００２７】
（透明平面基板）
本発明において、プラズモン励起センサの構造を支持する平面基板として透明平面基板が用いられる。本発明において、平面基板として透明平面基板を用いるのは、後述する金属薄膜への光照射をこの平面基板を通じて行うからである。
【００２８】
本発明で用いられる透明平面基板について、本発明の目的が達せられる限り、材質に特に制限はない。例えば、この透明平面基板が、ガラス製であってもよく、また、ポリカーボネート〔ＰＣ〕，シクロオレフィンポリマー〔ＣＯＰ〕などのプラスチック製であってもよい。
【００２９】
また、ｄ線（５８９．３ｎｍ）における屈折率〔ｎd〕が好ましくは１．４０〜２．２０であり、厚さが好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
【００３０】
なお、ガラス製の透明平面基板は、市販品として、ショット日本（株）製の「ＢＫ７」（屈折率〔ｎd〕１．５２）および「ＬａＳＦＮ９」（屈折率〔ｎd〕 １．８５），（株）住田光学ガラス製の「Ｋ−ＰＳＦｎ３」（屈折率〔ｎd〕１．８４），「Ｋ−ＬａＳＦｎ１７」（屈折率〔ｎd〕１．８８）および「Ｋ−ＬａＳＦｎ２２」（屈折率〔ｎd〕１．９０），ならびに（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ１０」（屈折率〔ｎd〕１．７２）などが、光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。
【００３１】
透明平面基板は、その表面に金属薄膜を形成する前に、その表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。
酸による洗浄処理としては、０．００１〜１Ｎの塩酸中に、１〜３時間浸漬することが好ましい。
【００３２】
プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製の「ＰＤＣ２００」）中に、０．１〜３０分間浸漬させる方法が挙げられる。
（金属薄膜）
本発明に係るプラズモン励起センサでは、上記透明平面基板の一方の表面に金属薄膜を形成する。この金属薄膜は、光源からの照射光により表面プラズモン励起を生じ、電場を発生させ、蛍光色素の発光をもたらす役割を有する。
【００３３】
上記透明平面基板の一方の表面に形成された金属薄膜としては、金，銀，アルミニウム，銅，および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、金からなることがより好ましい。これらの金属は、その合金の形態であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。
【００３４】
なお、透明平面基板としてガラス製平面基板を用いる場合には、ガラスと上記金属薄膜とをより強固に接着するため、あらかじめクロム，ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。
【００３５】
透明平面基板上に金属薄膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法，蒸着法（抵抗加熱蒸着法，電子線蒸着法等），電解メッキ，無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および／または金属薄膜を形成することが好ましい。
【００３６】
金属薄膜の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ，銀：５〜５００ｎｍ，アルミニウム：５〜５００ｎｍ，銅：５〜５００ｎｍ，白金：５〜５００ｎｍ，およびそれらの合金：５〜５００ｎｍが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜２０ｎｍが好ましい。
【００３７】
電場増強効果の観点から、金：２０〜７０ｎｍ，銀：２０〜７０ｎｍ，アルミニウム：１０〜５０ｎｍ，銅：２０〜７０ｎｍ，白金：２０〜７０ｎｍ，およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜３ｎｍがより好ましい。
【００３８】
金属薄膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
【００３９】
（誘電体からなるスペーサ層）
誘電体からなるスペーサ層の形成に用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然または合成ポリマーを用いることもできる。その中で、化学的安定性，製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素〔ＳｉＯ2〕または二酸化チタン〔ＴｉＯ2〕を含むことが好ましい。
【００４０】
誘電体からなるスペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ〜１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１０〜２０ｎｍである。一方、電場増強の観点から、好ましくは２００ｎｍ〜１ｍｍであり、さらに電場増強の効果の安定性から、４００ｎｍ〜１，６００ｎｍがより好ましい。
【００４１】
誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法，電子線蒸着法，熱蒸着法，ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。
【００４２】
（ＳＡＭ）
ＳＡＭ〔Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜〕は、金属薄膜の透明平面基板とは反対側の面に形成されることが好ましい。本発明のプラズモン励起センサでは、検体および蛍光色素を、リガンドを介して金属薄膜に捕捉した状態で蛍光測定を行うが、このとき、刺激応答性ポリマーを、ＳＡＭを介して金属薄膜に固定することが望ましい。すなわち、ＳＡＭは、刺激応答性ポリマーを金属薄膜に固定する際の土台としての役割を有する。
【００４３】
本発明において、このＳＡＭが含む単分子としては、通常、炭素原子数４〜２０程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同仁化学研究所，シグマ  アルドリッチ  ジャパン（株）などから入手可能）、特に好ましくは１０−カルボキシ−１−デカンチオールが用いられる。炭素原子数４〜２０のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。
【００４４】
ＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。
具体例として、金属薄膜がその表面に形成されたガラス製透明平面基板を、１０−カルボキシ−１−デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。このように、１０−カルボキシ−１−デカンチオールが有するチオール基が、金属と結合し固定化され、金薄膜の表面上で自己組織化し、ＳＡＭを形成する。
【００４５】
（刺激応答性ポリマーを含む層）
本発明に係る刺激応答性ポリマーとしては、一般的な刺激応答性ポリマー、すなわち、熱や光、ｐＨ等の外部刺激に対して高次構造を変化させるポリマーが用いられる。なかでも、熱またはｐＨの変化により、高次構造を可逆的に変化させることが可能な温度応答性ポリマーまたはｐＨ応答性ポリマーを用いることが好ましい。
【００４６】
また、刺激応答性ポリマーを含む層は、該刺激応答性ポリマーとリガンドを固定化するためのカルボキシデキストランなどの高分子とを含むことが好ましく、このような高分子としては、例えば、カルボキシメチルデキストラン等のデキストラン，グリコーゲン，デンプン（アミロース，アミロペクチン），セルロース，グルカン（β１，３−グルカン）など、グルコースを重合してなる多糖類等が挙げられるが、本発明においては、水溶性であり、リガンドを固定化するための反応性官能基を有するものであれば、特に限定されない。
【００４７】
図１に示すように、この刺激応答性ポリマーを含む層３は、下限臨界溶液温度〔ＬＣＳＴ〕またはある特定のｐＨを境に、（Ａ）から（Ｂ）へ相転移による体積変化を生じさせるものであるため、捕捉された蛍光色素と第２のリガンドとのコンジュゲート４が有する蛍光色素が、金属薄膜により近接することにより、効率良く励起される。なお、本発明におけるポリマーの「体積変化」とは、収縮を意味する。
【００４８】
温度応答性ポリマーとしては、ポリ（Ｎ−置換アクリルアミド），ポリ（Ｎ−置換メタクリルアミド），ポリ（Ｎ，Ｎ−二置換アクリルアミド），ポリビニルエーテル類などを用いることができる。具体的には、ポリ（Ｎ−エチルアクリルアミド），ポリ（Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド），ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド），ポリ（Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド），ポリ（Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド），ポリ（Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド），ポリ（Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド），Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアクリルアミド，Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド，Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド，ポリビニルメチルエーテルなどが挙げられる。これらのうち、相転移温度が３０℃前後と比較的体温に近いことから、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミドが好ましい。
【００４９】
ｐＨ応答性ポリマーとしては、例えば、ポリアクリル酸，ポリメタクリル酸，ポリ（２−エチルアクリル酸），ポリ（２−プロピルアクリル酸），ポリ（２−ジメチルアミノ）メチルメタクリレート，ポリ（２−ジエチルアミノ）メチルメタクリレート，ポリ（２−メトキシアニリン−５−スルホネート）などが挙げられる。これらのうち、相転移ｐＨがｐＨ７．４前後と比較的生体のｐＨに近いことから、ポリアクリル酸が好ましい。
【００５０】
また、これらの単独ポリマーのみならず、これらポリマーを構成するモノマー単位の２種以上を組み合わせた共重合体や、他の重合性モノマーとの共重合体も含まれる。
これら刺激応答性ポリマーは、１種単独でも２種以上併用してもよい。
【００５１】
刺激応答性ポリマーの重量平均分子量は、１，０００〜１，０００，０００であることが好ましい。重量平均分子量が上記範囲内であると、刺激応答性ポリマーが外部刺激を加えられた際、該ポリマーに捕捉された蛍光色素と金属薄膜との距離が約２００ｎｍ以内となるので好適である。
【００５２】
本発明における刺激応答性ポリマーは、該刺激応答性ポリマーを構成するモノマーを溶媒に溶解させ、公知の重合方法により得られる。具体的には、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを、開始剤を用いて共重合させる。開始剤としては、ラジカル重合では、アゾビスイソブチロニトリル〔ＡＩＢＮ〕、２，２−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロライド〔ＡＢＡＨ〕，２−［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）カルバモイル］プロピル−２−ジチオベンゾエートを用いることが好ましい。
【００５３】
なお、得られたポリＮ−イソプロピルアクリルアミドを用いてゲルを製造する際には架橋剤を用いることが好ましい。架橋剤としては、具体的にはＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド，エチレングリコールジメタクリレート等が挙げられる。
【００５４】
このような刺激応答性ポリマーは、金属薄膜（好ましくはＳＡＭ）に、好ましくは１〜１００ｎｇ／ｍｍ2という密度で、より好ましくは１〜１０ｎｇ／ｍｍ2という密度で結合する。刺激応答性ポリマーの密度が上記範囲内であると、粗密のバランスが良好である、すなわち、流路中のアナライトと刺激応答性ポリマーに固定化されているリガンドとが充分に接触できるほど密であり、かつ流路中のアナライト以外の物質を滞留させないほど粗であることから好適である。
【００５５】
刺激応答性ポリマーを含む層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法，電子線蒸着法，熱蒸着法，ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。
【００５６】
（リガンド）
本発明では、上記刺激応答性ポリマーを含む層に第１のリガンドを固定化させる。このリガンドは、プラズモン励起センサに、検体中のアナライトを固定（捕捉）させる目的で用いられるものである。なお、本発明において、工程（ａ）で用いられるリガンドを「第１のリガンド」と称するのは、後述する工程（ｂ）で用いられるリガンド（「第２のリガンド」）と区別するためである。
【００５７】
本発明において、「リガンド」とは、検体中に含有されるアナライトを特異的に認識し（または、認識され）結合し得る分子または分子断片をいう。このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド，オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
「タンパク質」としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能），抗ガン胎児性抗原〔ＣＥＡ〕モノクローナル抗体，抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体，抗ＰＳＡモノクローナル抗体などが挙げられる。
【００５９】
なお、本発明において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、遺伝子組換えにより得られる抗体、および抗体断片を包含する。
このリガンドの固定化方法としては、例えば、刺激応答性ポリマーを含む層に含まれることが好ましいカルボキシメチルデキストランなどの反応性官能基を有する高分子が有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシル基と、上記リガンドが有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；上記ＳＡＭを形成するシランカップリング剤などが有するカルボキシル基を、上述のようにして上記リガンドが有するアミノ基と脱水反応させ固定化させる方法などが挙げられる。
【００６０】
なお、後述する検体等がプラズモン励起センサに非特異的に吸着することを防止するため、上記リガンドを固定化させた後に、プラズモン励起センサの表面を牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕等のブロッキング剤により処理することが好ましい。
【００６１】
（第１のリガンド）
本発明において、工程（ａ）で用いられるリガンドを「第１のリガンド」と称するのは、下記工程（ｂ）で用いられるリガンド（「第２のリガンド」）と区別するためである。
【００６２】
第１のリガンドは、上述した「リガンド」と同様である。
（検体）
本発明において、「検体」とは、本発明のアッセイ法による測定対象となる種々の試料をいう。
【００６３】
「検体」としては、例えば、血液（血清・血漿），尿，鼻孔液，唾液，便，体腔液（髄液，腹水，胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液，血清，血漿，尿，鼻孔液および唾液が好ましい。これらは１種単独で用いてもよく、また、２種以上を併用してもよい。
【００６４】
（接触）
本発明において、「接触」とは、プラズモン励起センサのリガンド等が固定化されている面が送液中に浸漬されている状態で、この送液中に含まれる対象物をこのプラズモン励起センサと接触させることをいう。工程（ａ）では、上記検体とプラズモン励起センサとの「接触」は、流路中に循環する送液に検体が含まれ、プラズモン励起センサのリガンドが固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、プラズモン励起センサと検体とを接触させる態様が好ましい。
【００６５】
上記「流路」とは、微量な薬液の送達を効率的に行うことができ、反応促進を行うために送液速度を変化させたり、循環させたりすることができる角筒状または円筒（管）状のものである。また、この流路の形状として、プラズモン励起センサを設置する個所近傍は角筒状構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は円筒（管）状を有することが好ましい。
【００６６】
その材料としては、プラズモン励起センサ部ではメチルメタクリレート，スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどの光透過性の材質からなり、薬液送達部ではシリコーンゴム，テフロン(登録商標)，ポリエチレン，ポリプロピレン等のポリマーを用いる。
【００６７】
ただし、プラズモン励起センサ部については、蛍光測定時に流路が一定の形状に保たれ、かつプラズモン励起により発生した蛍光の検出が妨げられない限り、必ずしもその流路造のすべてを光透過性の材質のみから構成する必要はない。すなわち、プラズモン励起センサ部の流路のうち、プラズモン励起により発生した蛍光を透過させて検出部に導くために必要な部分、具体的には蛍光の集光に必要な透光窓を含む部分については、光透過性の材質で構成する必要があるが、その他の部分については、その一部または全部を光透過性の材質以外の化学的に安定な材質で構成してもよい。プラズモン励起センサ部の流路が直方体構造を有する場合、金属薄膜（または、好ましくはＳＡＭ）が表面に存在するプラズモン励起センサの面を底面としたときに、例えば、この底面と対向する位置にある天井面を光透過性の材質で構成し、側面を光透過性の材質以外の化学的に安定な材質で構成してもよい。
【００６８】
ここで、上記その他の部分、例えば側面は、蛍光測定時に一定の形状が保たれる限り、必ずしも剛体である必要はなく、シール性を確保するために適度な弾性を有していてもよい。例えば、プラズモン励起センサ部の流路について、天井面をポリメチルメタクリレート〔ＰＭＭＡ〕で構成し、側面をシリコーンゴムで構成してもよい。
【００６９】
プラズモン励起センサ部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、プラズモン励起センサ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に１００ｎｍ〜１ｍｍ程度が好ましい。
【００７０】
流路において、薬物送達部からプラズモン励起センサ部に送液を導入する送液導入口、およびその送液をプラズモン励起センサ部から排出する送液排出口の位置は、いずれも、蛍光測定の妨げとならない限り特に限定されない。例えば、プラズモン励起センサ部の流路が直方体構造を有する場合、前記送液導入口及び送液排出口とも天井面に設けるのが流路の作製上簡便であるが、この送液導入口と送液排出口とのうちいずれか一方、あるいはその両方を側面に設けてもよい。
【００７１】
流路にプラズモン励起センサを固定する方法は、流路が一定の形状に保たれ、かつ蛍光測定が妨げられない限り特に限定されない。
このような固定方法の例としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている表面上に、一定の厚さを有するシリコーンゴム製シートまたはＯリングを載せることによって流路の側面構造を形成し、次いで、その上に送液導入口及び送液排出口を設けてある光透過性の天板（例えば、ＰＭＭＡ基板など）を配置することによって流路の天井面を形成し、その後、これらを圧着して適当な留め具により固定する方法などが挙げられる。このとき、側面構造を構成する材料として、その中央部に任意の形状および大きさを有する穴を開けてある、適当な厚さを有するシリコーンゴム製シートを用いると、この穴の内周がプラズモン励起センサ部の流路の側面構造となることから、所要の形状および大きさを有する流路を容易に形成することができるので好ましい。例えば、まず、該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有する穴あきポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートを該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている部位を囲むようにして配置し、次いで、このポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートの上に、予め送液導入口および送液排出口を設けてあるＰＭＭＡ基板を配置し、その後、該ＰＭＭＡ基板と該ポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートと該プラズモン励起センサとを圧着し、ビス等の留め具により固定する方法が好ましい。また、プラズモン励起センサに、シリコーンゴム製シートまたはＯリングと光透過性の天板とを圧着し、固定するにあたっては、必要に応じて、シリコーンゴムまたはステンレスなどの材質でできた適当なスペーサを併用してもよい。
【００７２】
また、工業的に製造される大ロット（工場レベル）では、流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品に直接金基板を形成するかあるいは別途作製した金基板を固定し、金表面に（好ましくはＳＡＭ）金コロイドを基点とする高分子からなる層の形成およびリガンドの固定化を行った後、流路の天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。
【００７３】
このような「送液」としては、検体を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕，トリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００７４】
送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０〜４０℃×１〜６０分間、好ましくは３７℃×５〜１５分間である。
【００７５】
送液中の検体中に含有されるアナライトの初期濃度は、１００μｇ／ｍＬ〜０．０００１ｐｇ／ｍＬであってもよい。
送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常０．０００１〜２０ｍＬ、好ましくは０．０１〜１ｍＬである。
【００７６】
送液の流速は、通常１〜２,０００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５〜５００μＬ／ｍｉｎである。
［洗浄工程］
洗浄工程とは、工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサの表面、および後述する工程（ｂ）を経て得られるプラズモン励起センサの表面のうち少なくともいずれか一方を洗浄する工程である。この洗浄工程は、工程（ｂ）の前後のうち少なくともいずれか一方に含まれることが好ましい。
【００７７】
洗浄工程に使用される洗浄液としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０，ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を、工程（ａ）および（ｂ）の反応で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に溶解させ、好ましくは０．００００１〜１重量％含有するものが望ましい。
【００７８】
洗浄液を循環させる温度および流速は、上記工程（ａ）の「送液を循環させる温度および流速」と同じであることが好ましい。
洗浄液を循環させる時間は、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。
【００７９】
［工程（ｂ）］
工程（ｂ）とは、上記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程である。
【００８０】
（蛍光色素）
「蛍光色素」とは、本発明において、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
【００８１】
本発明で用いられる蛍光色素は、金属薄膜による吸光に起因する消光を受けない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計〔ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ〕よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。
【００８２】
このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製），ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製），ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製），クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製），ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス（株）製），シアニン・ファミリーの蛍光色素，インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素，オキサジン・ファミリーの蛍光色素，チアジン・ファミリーの蛍光色素，スクアライン・ファミリーの蛍光色素，キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製），ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素，ピレン・ファミリーの蛍光色素，トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６,４０６,２９７号、同第６,２２１,６０４号、同第５,９９４,０６３号、同第５,８０８,０４４号、同第５,８８０,２８７号、同第５,５５６,９５９号および同第５,１３５,７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。
【００８３】
これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。
【００８４】
【表１】
2010123073.tif 000003
【００８５】
また、蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えば、例えばＥｕ，Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素も、本願発明に用いられる蛍光色素となりうる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０〜３４０ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ3+が挙げられる。
【００８６】
本発明においては、後述する蛍光測定を行う際に、金属薄膜に含まれる金属による吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属薄膜として金を用いる場合には、金薄膜による吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が６００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。したがって、この場合には、Ｃｙ５，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７等近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが特に望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、金属薄膜として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が４００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。
【００８７】
これら蛍光色素は１種単独でも、２種以上併用してもよい。
（第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート）
「第２のリガンドと蛍光色素からなるコンジュゲート」は、リガンドとして２次抗体を用いる場合、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）を認識し結合し得る抗体であることが好ましい。
【００８８】
本発明のアッセイ法において、第２のリガンドは、アナライトに蛍光色素による標識化を行う目的で用いられるリガンドであり、上記第１のリガンドと同じでもよいし、異なっていてもよい。ただし、第１のリガンドとして用いる１次抗体がポリクローナル抗体である場合、第２のリガンドとして用いる２次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、該１次抗体がモノクローナル抗体である場合、２次抗体は、該１次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。
【００８９】
さらに、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）と競合する第２のアナライト（競合抗原；ただし、標的抗原とは異なるものである。）と２次抗体とがあらかじめ結合した複合体を用いる態様も好ましい。このような態様は、蛍光信号（蛍光シグナル）量と標的抗原量とを比例させることができるため好適である。
【００９０】
「第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート」の作製方法としては、第２のリガンドとして２次抗体を用いる場合、例えば、まず蛍光色素にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と２次抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ビオチン化された蛍光色素とストレプトアビジン化された２次抗体（あるいは、ストレプトアビジン化された蛍光色素とビオチン化された２次抗体）とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。
【００９１】
このように作製された「第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート」の送液中の濃度は、０.００１〜１０,０００μｇ／ｍＬが好ましく、１〜１,０００μｇ／ｍＬがより好ましい。
【００９２】
送液を循環させる温度、時間および流速は、それぞれ上記工程（ａ）の場合と同様である。
［工程（ｃ）］
工程（ｃ）とは、上記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサに、上記刺激応答性ポリマーが応答し得る外部刺激を加える工程である。
【００９３】
（外部刺激）
本発明において、外部刺激は、用いる刺激応答性ポリマーの種類によって適宜選択される。例えば、温度応答性ポリマーであるポリＮ−イソプロピルアクリルアミド〔ＮＩＰＡＭ〕を室温（２５℃程度）で用いている場合、ＮＩＰＡＭの相転移温度が３０℃前後であるので、外部刺激としては３７℃程度以上まで温度を上げることに相当する。その際、プラズモン励起センサおよび流路に付属している温度制御装置を用い、送液の温度を制御する。また、ｐＨ応答性ポリマーであるポリアクリル酸をｐＨ７．４程度で用いている場合、ポリアクリル酸の相転移ｐＨがｐＨ４前後であるので、外部刺激としてはｐＨ３．０程度以下までｐＨを下げることに相当する。
【００９４】
［工程（ｄ）］
工程（ｄ）とは、上記工程（ｃ）を経て得られたプラズモン励起センサが有する透明平面基板の、上記金属薄膜が形成されている表面の反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された上記蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程である。
【００９５】
（光学系）
本発明のアッセイ法で用いる光源は、金属薄膜にプラズモン励起を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
【００９６】
レーザ光の照射により、全反射減衰条件〔ＡＴＲ〕において、金属薄膜の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十〜数百倍に増えたフォトンにより蛍光色素を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、透明平面基板の屈折率、金属薄膜の金属種および膜厚に依存するが、通常、金では約１０〜２０倍の増加量となる。
【００９７】
蛍光色素は、光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。
【００９８】
「レーザ光」としては、例えば、波長２００〜９００ｎｍ、０.００１〜１,０００ｍＷのＬＤ、波長２３０〜８００ｎｍ（金属薄膜に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。）、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザなどが挙げられる。
【００９９】
「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン励起センサに効率よく入射することを目的としており、屈折率が透明平面基板と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明平面基板」の市販品と同様のものが挙げられる。
【０１００】
「光学フィルタ」としては、例えば、減光〔ＮＤ〕フィルタ，ダイアフラムレンズなどが挙げられる。「減光（ＮＤ）フィルタ」（または、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
【０１０１】
「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光），励起光（励起光の透過成分），迷光（各所での励起光の散乱成分），プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光），酵素蛍光基質の自家蛍光，などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
【０１０２】
「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【０１０３】
「ＳＰＦＳ検出部」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。
【０１０４】
［工程（ｅ）］
工程（ｅ）とは、上記工程（ｄ）で得られた測定結果から、上記検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程である。
【０１０５】
（アナライト）
アナライトとしては、上記高分子に固定化された第１のリガンドを特異的に認識され（または、認識し）結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド，オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ〔αフェトプロテイン〕などのがん胎児性抗原や腫瘍マーカー，シグナル伝達物質，ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
【０１０６】
（アッセイＳ／Ｎ比）
さらに、工程（ｄ）は、上記工程（ｃ）の前に測定した"ブランク蛍光シグナル"、上記工程（ｃ）で得られた"アッセイ蛍光シグナル"、および何も修飾していない金基板を流路に固定し、超純水を流しながらＳＰＦＳを測定して得られたシグナルを"初期ノイズ"としたとき、下記式（１ａ）で表されるアッセイＳ／Ｎ比を算出することができる：
アッセイＳ／Ｎ比＝｜Ｉａ／Ｉｏ｜／Ｉｎ  …（１ａ）
（上記式（１ａ）において、Ｉａはアッセイ蛍光シグナル、Ｉｏはブランク蛍光シグナル、Ｉｎは初期ノイズである）。
【０１０７】
ただし、アッセイＳ／Ｎ比を算出するにあたっては、実用上、上記式（１ａ）に代えて、検体中に含まれるアナライトの濃度が０の場合における"アッセイノイズシグナル"を基準として、下記式（１ｂ）にしたがって算出してもよい：
アッセイＳ／Ｎ比＝｜Ｉａ｜／｜Ｉａｎ｜  …（１ｂ）
（上記式（１ｂ）において、Ｉａｎはアッセイノイズシグナル、Ｉａは上記式（１ａ）の場合と同様にアッセイ蛍光シグナルである）。
【０１０８】
＜装置＞
本発明の装置は、少なくとも、上記プラズモン励起センサを含み、上記アッセイ法に用いられることを特徴とするものであり、本発明のアッセイ法を実施するためのものである。
【０１０９】
「装置」としては、該プラズモン励起センサ以外に、例えば、光源，各種光学フィルタ，プリズム，カットフィルタ，集光レンズ，表面プラズモン励起増強蛍光検出部，温度変更部（ヒーター）などを含むものとする。なお、検体液，洗浄液，標識抗体液などを取り扱う際に、プラズモン励起センサと組み合った送液系を有することが好ましい。送液系としては、本発明の目的が達せられる限り、その種類を問わない。例えば、液ポンプと連結したマイクロ流路デバイスなどでもよい。
【０１１０】
また、表面プラズモン共鳴〔ＳＰＲ〕検出部、すなわちＳＰＲ専用の受光センサとしてのフォトダイオード，ＳＰＲおよびＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰〔ＡＴＲ〕条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、４５〜８５°の角度変更を可能とする。分解能は０．０１°以上が好ましい。）、表面プラズモン励起増強蛍光検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。
【０１１１】
光源、光学フィルタ，カットフィルタ，集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部の好ましい態様は上述したものと同様である。
「送液ポンプ」としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ、送り精度が高く脈動が少なく好ましいが循環することができないシリンジポンプ、簡易で取り扱い性に優れるが微量送液が困難な場合があるチューブポンプなどが挙げられる。
【０１１２】
＜キット＞
本発明のキットは、少なくとも、透明平面基板と；該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と；薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された刺激応答性ポリマーを含む層とを含むプラズモン励起センサ用基板を含み、上記アッセイ法に用いられることを特徴とする。
【０１１３】
本発明のキットは、本発明のアッセイ法を実施するにあたり、該プラズモン励起センサ用基板以外に、第１のリガンドと第２のリガンドと検体とを除き必要とされるすべてのもの、例えば、１次抗体、抗原などのリガンド（すなわち、検体中に含まれるアナライトは、抗原とは限らず、抗体であってもよい。）と検体と２次抗体とを除き必要とされるすべてのものを含むことが好ましい。
【０１１４】
例えば、本発明のキットと、検体として血液または血清と、特定の腫瘍マーカーに対する抗体とを用いることによって、特定の腫瘍マーカーの含有量を、高感度かつ高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。
【０１１５】
このような「キット」としては、具体的に、該プラズモン励起センサ用基板；ＳＡＭを形成するための炭素原子数４〜２０程度のカルボキシアルカンチオール；蛍光色素；検体を溶解または希釈するための溶解液または希釈液；プラズモン励起センサと検体とを反応させるための各種反応試薬および洗浄試薬が挙げられ、本発明のアッセイ法を実施するために必要とされる各種器材または資材や上記「装置」を含めることもできる。
【０１１６】
さらに、キット要素として、検量線作成用の標準物質，説明書，多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレートなどの必要な器材一式などを含んでもよい。
【実施例】
【０１１７】
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
［作製例１］（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識２次抗体の作製）
２次抗体として、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（６Ｄ２；２．５ｍｇ／ｍＬ，（株）日本医学臨床検査研究所製）を、市販のビオチン化キット（（株）同仁化学研究所製）を用いてビオチン化した。その手順は、該キットに添付のプロトコールに従った。【０１１８】
次に、得られたビオチン化抗ＡＦＰモノクローナル抗体の溶液とストレプトアビジン標識Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）溶液とを混合し、４℃で６０分間、攪拌混合することで反応させた。【０１１９】
最後に、未反応抗体および未反応酵素を、分子量カットフィルタ（日本ミリポア（株）製）を用いて精製することで、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液を得た。【０１２０】
［作製例２］（刺激応答性ポリマーが温度応答性ポリマーであるプラズモン励起センサの作製）
まず、金からなる金属薄膜の厚さが５０ｎｍになるように、透明平面基板として光学ガラスである「ＢＫ７」（ショット日本（株）製）の一方の表面に金を蒸着することによって金薄膜を形成した。【０１２１】
得られた金基板を、金薄膜を形成した表面が露出するようにスピンコータにセットし、基板の中央付近にポリＮ−イソプロピルアクリルアミドのエタノール溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を１００μＬ滴下して、１，０００ｒｐｍにて１分間回転させる。【０１２２】
さらに、その上からカルボキシメチルデキストラン（名糖産業(株)製；分子量１００万）のアセトン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を１ｍＬ滴下し、１，０００ｒｐｍにて１分間回転させる。常温で充分に乾燥させることによって、金薄膜の、透明平面基板とは接していないもう一方の表面に刺激応答性ポリマー（温度応答性ポリマー）を含む層を形成する。【０１２３】
次に、得られる金基板を流路に固定し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ；(株)同人化学研究所製）４００ｍＭと、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）１００ｍＭとの混合液を、１０μＬ／ｍｉｎにて１０分間フローして、カルボキシメチルデキストランの活性エステル化を行う。【０１２４】
続いて、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（１Ｄ５；２．５ｍｇ／ｍＬ，（株）日本医学臨床検査研究所製）を、１０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）にて２０μｇ／ｍＬに希釈して得られる溶液を、１０μＬ／ｍｉｎにて１０分間フローして、該抗体をカルボキシメチルデキストランに固定化する。【０１２５】
最後に、１Ｍエタノールアミン塩酸塩（ＳＩＧＭＡ社製；ｐＨ８．５）水溶液を１０μＬ／ｍｉｎにて１０分間フローすることによってブロッキング処理を行い、刺激応答性ポリマーとして温度応答性ポリマーを用いたプラズモン励起センサを作製する。【０１２６】
［作製例３］（刺激応答性ポリマーがｐＨ応答性ポリマーであるプラズモン励起センサの作製）
作製例２において、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミドのエタノール溶液（１ｍｇ／ｍＬ）の代わりにポリアクリル酸メチルのエチルメチルケトン溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた以外は作製例２と同様にしてプラズモン励起センサを作製する。【０１２７】
なお、作製例３で得られるプラズモン励起センサは、刺激応答性ポリマーとしてｐＨ応答性ポリマーを用いたものである。
［実施例１］
工程（ａ）として、作製例２で得られるプラズモン励起センサに、検体として、αフェトプロテイン（ＡＦＰ；２．０ｍｇ／ｍＬ，Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＧｍｂＨ製）をＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）にて１０ｎｇ／ｍＬに希釈調製した溶液を、１０μＬ／ｍｉｎにて、２０分間フローすることによって接触させる。【０１２８】
工程（ｂ）として、作製例１で得られた標識２次抗体を、１％ＢＳＡ  ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）にて２．５μｇ／ｍＬに調製した希釈溶液を、１０μＬ／ｍｉｎにて、さらに２０分間フローすることによって反応させる。【０１２９】
洗浄工程として、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだＴＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を１０μＬ／ｍｉｎにて、１０分間フローする。
工程（ｃ）として、プラズモン励起センサおよび流路に付属している温度制御装置により温度設定を２５℃から３７℃に変更することによって外部刺激を加える。【０１３０】
工程（ｄ）および（ｅ）として、プリズムを経由してレーザ光を照射し、装置に付属しているＣＣＤカメラより蛍光シグナルを測定する。なお、蛍光シグナルは、外部刺激を加えて１分後のＣＣＤから観察したときのＳＰＦＳシグナル値を計測したものである。【０１３１】
予測される結果を表２に示す。
［実施例２］
実施例１において、工程（ａ）で用いるプラズモン励起センサを作製例２で得られるものの代わりに作製例３で得られるものを用い、さらに工程（ｃ）の外部刺激として温度変更の代わりに１０ｍＭグリシン塩酸水溶液（ｐＨ３．０）を１０μＬ／ｍｉｎにて１０分間フローするというｐＨ変更を加える以外は、実施例１と同様にしてアッセイ法を実施し、蛍光シグナルを測定する。【０１３２】
予測される結果を表２に示す。
［比較例１］
実施例１において工程（ｃ）を実施しない、すなわち、実施例１の全工程を２５℃で実施する以外は実施例１と同様にしてアッセイ法を実施し、蛍光シグナルを測定する。【０１３３】
予測される結果を表２に示す。
［比較例２］
実施例１において、工程（ｃ）を実施せず、かつ全工程を３７℃で実施する以外は実施例１と同様にしてアッセイ法を実施し、蛍光シグナルを測定する。【０１３４】
予測される結果を表２に示す。
［比較例３］
実施例２において工程（ｃ）を実施しない、すなわち、実施例２の全工程をｐＨ７．４で実施する以外は実施例２と同様にしてアッセイ法を実施し、蛍光シグナルを測定する。【０１３５】
予測される結果を表２に示す。
［比較例４］
実施例２において、工程（ｃ）を実施せず、かつ全工程をｐＨ３．０で実施する以外は実施例２と同様にしてアッセイ法を実施し、蛍光シグナルを測定する。【０１３６】
予測される結果を表２に示す。【０１３７】
【表２】
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【０１３８】
表２から、外部刺激をアッセイ法の工程に加えることによって、相転移を効率的に利用することができ、プラズモン励起センサの高感度化が優れることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１３９】
本発明のアッセイ法は、高感度かつ高精度に検出することができる方法であるから、例えば、血液中に含まれる極微量の腫瘍マーカーであっても検出することができ、この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。
【符号の説明】
【０１４０】
１・・・・・・透明平面基板
２・・・・・・金属薄膜
３・・・・・・刺激応答ポリマーを含む層
４・・・・・・蛍光色素と第２のリガンドとのコンジュゲート
１１・・・・・・金属膜が形成された基板
１３・・・・・・刺激応答性高分子
１４・・・・・・生体物質認識分子
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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