(57)【要約】  本発明の目的は、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化（S化）されたオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)を使用して、癌細胞に対する接着活性、増殖、及び生着を効果的に阻害できる医薬を提供することである。  S化ODNをβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との複合体にすることによって、癌細胞に対する接着活性、増殖阻害能、及び生着阻害能が飛躍的に向上する。
2018174140.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子と多糖との複合体を含み、
前記核酸分子が、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含み、
前記多糖がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖である、
癌細胞の接着活性阻害剤。
【請求項２】
核酸分子と多糖との複合体を含み、
前記核酸分子が、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含み、
前記多糖がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖である、
癌細胞の増殖阻害剤。
【請求項３】
核酸分子と多糖との複合体を含み、
前記核酸分子が、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含み、
前記多糖がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖である、
癌細胞の生着阻害剤。
【請求項４】
核酸分子と多糖との複合体を含み、
前記核酸分子が、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含み、
前記多糖がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖である、
癌転移の阻害剤。
【請求項５】
核酸分子と多糖との複合体を含み、
前記核酸分子が、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチド（但し、CpGオリゴデオキシヌクレオチドを除く）を含み、
前記多糖がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖である、
癌の治療剤。
【請求項６】
前記多糖がシゾフィランである、請求項１〜５のいずれかに記載の剤。
【請求項７】
前記オリゴデオキシヌクレオチドにポリデオキシアデニンが付加されている、請求項１〜６のいずれかに記載の剤。
【請求項８】
前記ポリデオキシアデニンを構成するデオキシアデニンの数が１０〜１００個である、請求項７に記載の剤。
【請求項９】
オリゴデオキシヌクレオチドの塩基数が５〜４０である、請求項１〜８のいずれかに記載の剤。
【請求項１０】
癌細胞の接着活性を阻害する方法であって、
癌細胞の接着活性の阻害が求められる者に、核酸分子と多糖との複合体を投与する工程を含み、
前記核酸分子がホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含み、且つ前記多糖がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖である、
癌細胞の接着活性阻害方法。
【請求項１１】
癌細胞の増殖を阻害する方法であって、
癌細胞の増殖阻害が求められる者に、核酸分子と多糖との複合体を投与する工程を含み、
前記核酸分子がホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含み、且つ前記多糖がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖である、
癌細胞の増殖阻害方法。
【請求項１２】
癌細胞の生着を阻害する方法であって、
癌細胞の生着阻害が求められる者に、核酸分子と多糖との複合体を投与する工程を含み、
前記核酸分子がホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含み、且つ前記多糖がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖である、
癌細胞の生着阻害方法。
【請求項１３】
癌転移を阻害する方法であって、
癌転移の阻害が求められる者に、核酸分子と多糖との複合体を投与する工程を含み、
前記核酸分子がホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含み、且つ前記多糖がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖である、
癌転移の阻害方法。
【請求項１４】
癌の治療方法であって、
癌患者に、核酸分子と多糖との複合体を投与する工程を含み、
前記核酸分子がホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドド（但し、CpGオリゴデオキシヌクレオチドを除く）を含み、且つ前記多糖がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖である、
癌の治療方法。
【請求項１５】
ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含む核酸分子とβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との複合体の、
癌細胞の接着活性阻害剤の製造のための使用。
【請求項１６】
ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含む核酸分子とβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との複合体の、
癌細胞の増殖阻害剤の製造のための使用。
【請求項１７】
ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含む核酸分子とβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との複合体の、
癌細胞の生着阻害剤の製造のための使用。
【請求項１８】
ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含む核酸分子とβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との複合体の、
癌転移の阻害剤の製造のための使用。
【請求項１９】
ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチド（但し、CpGオリゴデオキシヌクレオチドを除く）を含む核酸分子とβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との複合体の、
癌の治療剤の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸多糖複合体を用いた癌細胞の接着活性阻害剤に関する。更に、本発明は、核酸多糖複合体を用いた、癌細胞の増殖阻害剤、癌細胞の生着阻害剤、癌転移の阻害剤、及び癌の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸多糖複合体は、「ポリデオキシアデニン（polydA）の末端に結合した機能性核酸分子」と「β-1,3-グルカン」が水素結合と疎水性相互作用で複合化を形成した「高分子複合体」であり、Dectin-1受容体に特異的に標的され細胞内に導入され、当該複合体に包摂される機能性核酸に求められた薬理効果を発揮することが知られている（特許文献１及び２等)。【０００３】
一方、CpGオリゴデオキシヌクレオチド（CpG ODN）は、TLR9(Toll-like receptor 9)を刺激し自然免疫を活性化することが知られていることから、外来ウィルス抗原に対する感染症ワクチン用のアジュバントとして開発されている。また、2009年ごろまで、この自然免疫活性を利用した癌治療薬が開発されてきた。【０００４】
近年では、B/K型CpG ODNとシゾフィラン（SPG）との複合体が強い免疫賦活作用があり、抗癌活性が示されている（特許文献３）。更に、ホスホロチオエート化（S化）したCpG ODNが、非特異的に細胞接着を阻害しアポトーシスを誘導する可能性を示唆する知見も報告されている（非特許文献１）。しかしながら、従来報告されているCpG ODNの効果は、いずれも免疫活性作用に依存しており、免疫活性作用によることなく、CpG ODNを利用して接着阻害活性等を飛躍的に向上させる技術についてはいまだ報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Eitan Okun et al., Journal of Neuroscience Research 87:1947-1952 (2009)
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第2001/34207号
【特許文献２】国際公開第2004/100965号
【特許文献３】国際公開第2016/103531号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、S化オリゴデオキシヌクレオチド（S化ODN）を使用して、癌細胞に対する接着活性、増殖、及び生着を効果的に阻害できる医薬を提供することである。また、本発明の他の目的は、S化オリゴデオキシヌクレオチド（S化ODN）を使用して、癌の治療や癌転移の阻害に有効な医薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討したところ、S化ODNをβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との複合体（S化ODN/BG複合体）にすることによって、癌細胞に対する接着活性、増殖阻害能、及び生着阻害能を飛躍的に向上させ得ることを見出した。また、S化ODN/BG複合体の前記効果は、ODNとしてCpG ODNを使用した場合だけでなく、ODNの配列非特異的にその活性を示すことを見出した。また、S化ODN/BG複合体は、ODNとしてCpG ODNを使用した場合に、癌細胞の生着阻害が認められたが、予測された自然免疫の活性化は確認されなかった。即ち、S化CpG ODNを使用したS化ODN/BG複合体で認められる癌細胞の生着阻害等の活性は、従来報告されているCpG ODNの免疫活性作用によるものではなく、従来報告されていない作用機序に基づいていることも見出した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。【０００９】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の剤を提供する。
項1-1.  核酸分子と多糖との複合体を含み、
前記核酸分子が、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含み、
前記多糖がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖である、
癌細胞の接着活性阻害剤。
項1-2.  核酸分子と多糖との複合体を含み、
前記核酸分子が、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含み、
前記多糖がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖である、
癌細胞の増殖阻害剤。
項1-3.  核酸分子と多糖との複合体を含み、
前記核酸分子が、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含み、
前記多糖がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖である、
癌細胞の生着阻害剤。
項1-4.  核酸分子と多糖との複合体を含み、
前記核酸分子が、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含み、
前記多糖がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖である、
癌転移の阻害剤。
項1-5.  核酸分子と多糖との複合体を含み、
前記核酸分子が、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチド（但し、CpGオリゴデオキシヌクレオチドを除く）を含み、
前記多糖がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖である、
癌の治療剤。
項1-6.  前記多糖がシゾフィランである、項1-1〜1-5のいずれかに記載の剤。
項1-7.  前記オリゴデオキシヌクレオチドにポリデオキシアデニンが付加されている、項1-1〜1-6のいずれかに記載の剤。
項1-8.  前記ポリデオキシアデニンを構成するデオキシアデニンの数が１０〜１００個である、項1-7に記載の剤。
項1-9.  オリゴデオキシヌクレオチドの塩基数が５〜４０である、項1-1〜1-8のいずれかに記載の剤。【００１０】
また、本発明は、下記に掲げる態様の方法を提供する。
項2-1.  癌細胞の接着活性を阻害する方法であって、
癌細胞の接着活性の阻害が求められる者に、核酸分子と多糖との複合体を投与する工程を含み、
前記核酸分子がホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含み、且つ前記多糖がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖である、
癌細胞の接着活性阻害方法。
項2-2.  癌細胞の増殖を阻害する方法であって、
癌細胞の増殖阻害が求められる者に、核酸分子と多糖との複合体を投与する工程を含み、
前記核酸分子がホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含み、且つ前記多糖がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖である、
癌細胞の増殖阻害方法。
項2-3.  癌細胞の生着を阻害する方法であって、
癌細胞の生着阻害が求められる者に、核酸分子と多糖との複合体を投与する工程を含み、
前記核酸分子がホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含み、且つ前記多糖がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖である、
癌細胞の生着阻害方法。
項2-4.  癌転移を阻害する方法であって、
癌転移の阻害が求められる者に、核酸分子と多糖との複合体を投与する工程を含み、
前記核酸分子がホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含み、且つ前記多糖がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖である、
癌転移の阻害方法。
項2-5.  癌の治療方法であって、
癌患者に、核酸分子と多糖との複合体を投与する工程を含み、
前記核酸分子がホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドド（但し、CpGオリゴデオキシヌクレオチドを除く）を含み、且つ前記多糖がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖である、
癌の治療方法。
項2-6.  前記多糖がシゾフィランである、項2-1〜2-5のいずれかに記載の方法。
項2-7.  前記オリゴデオキシヌクレオチドにポリデオキシアデニンが付加されている、項2-1〜2-6のいずれかに記載の方法。
項2-8.  前記ポリデオキシアデニンを構成するデオキシアデニンの数が１０〜１００個である、項2-7に記載の方法。
項2-9.  オリゴデオキシヌクレオチドの塩基数が５〜４０である、項2-1〜2-8のいずれかに記載の方法。【００１１】
また、本発明は、下記に掲げる態様の使用を提供する。
項3-1.  ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含む核酸分子とβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との複合体の、
癌細胞の接着活性阻害剤の製造のための使用。
項3-2.  ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含む核酸分子とβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との複合体の、
癌細胞の増殖阻害剤の製造のための使用。
項3-3.  ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含む核酸分子とβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との複合体の、
癌細胞の生着阻害剤の製造のための使用。
項3-4.  ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチドを含む核酸分子とβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との複合体の、
癌転移の阻害剤の製造のための使用。
項3-5.  ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されたオリゴデオキシヌクレオチド（但し、CpGオリゴデオキシヌクレオチドを除く）を含む核酸分子とβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との複合体の、
癌の治療剤の製造のための使用。
項3-6.  前記多糖がシゾフィランである、項3-1〜3-5のいずれかに記載の使用。
項3-7.  前記オリゴデオキシヌクレオチドにポリデオキシアデニンが付加されている、項3-1〜3-6のいずれかに記載の使用。
項3-8.  前記ポリデオキシアデニンを構成するデオキシアデニンの数が１０〜１００個である、項3-7に記載の使用。
項3-9.  オリゴデオキシヌクレオチドの塩基数が５〜４０である、項3-1〜3-8のいずれかに記載の使用。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、S化ODN/BG複合体を使用することによって、ODNが本来有する、癌細胞に対する接着活性阻害能、増殖阻害能、及び生着阻害能を飛躍的に向上させることができる。S化ODN/BG複合体によるこれらの阻害能は、T細胞の活性化等による免疫機能を不活化に起因するものではなく、従来報告されていないS化ODN/BG複合体の機能に基づいている。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】試験例３において、S化ODN(ODN#1、ODN#2、ODN#3)、又はS化ODN/BG複合体（ODN#1/SPG複合体、ODN#2/SPG複合体、ODN#3/SPG複合体）の共存下で、マウス大腸癌株細胞（ルシフェラーゼが形質導入されているcolon26）を培養し、ウェルへの当該細胞の接着状態について顕微鏡観察した結果を示す図である。
【図２】試験例３において、S化ODN(ODN#1、ODN#2、ODN#3)、又はS化ODN/BG複合体（ODN#1/SPG複合体、ODN#2/SPG複合体、ODN#3/SPG複合体）の共存下で、マウス大腸癌株細胞（ルシフェラーゼが形質導入されているcolon26）を培養して、ルシフェラーゼアッセイを行い、ウェルに接着した細胞数を評価した結果を示す図である。
【図３】試験例４において、細胞外マトリックスがコートされているアッセイプレートｗｐ用いて、S化ODN(ODN#4)、又はS化ODN/BG複合体（ODN#4/SPG複合体）の共存下で、マウス大腸癌株細胞（ルシフェラーゼが形質導入されているcolon26）を培養し、種細胞外マトリックスタンパク質への接着活性を評価した結果を示す図である。
【図４】試験例５において、S化ODN(ODN#3)、又はS化ODN/BG複合体（ODN#2/SPG複合体、ODN#3/SPG複合体）の共存下で、マウス大腸癌株細胞（ルシフェラーゼが形質導入されているcolon26）を培養し、MHC class Iの発現量を測定した結果を示す図である。
【図５】試験例６において、S化ODN(ODN#3)、又はS化ODN/BG複合体（ODN#3/SPG複合体）の共存下で、マウス大腸癌株細胞（ルシフェラーゼが形質導入されているcolon26）を培養し、生細胞と死細胞の比率を分析した結果を示す図である。
【図６】試験例９において、S化ODN(OODN#3-dA(s)40)又はS化ODN/BG複合体（ODN#3/SPG複合体）の共存下で培養したマウス大腸癌細胞（ルシフェラーゼが形質導入されているcolon26）をマウスに投与して、投与5日後及び10日後に当該癌細胞のマウスの肺への生着を評価した示す図である。
【図７】試験例１０において、マウス大腸癌細胞（ルシフェラーゼが形質導入されているcolon26）と、S化されたS化ODN(OODN#3-dA(s)40)又はS化ODN/BG複合体（ODN#3/SPG複合体）とを、マウスに投与して、投与10日後に当該癌細胞のマウスの肺への生着を評価した示す図である。
【図８】試験例１１において、マウス大腸癌細胞（ルシフェラーゼが形質導入されているcolon26）と、S化ODN(OODN#3-dA(s)40)又はS化ODN/BG複合体（ODN#3/SPG複合体）とを、マウスに投与して、投与10日後に当該癌細胞のマウスの肺への生着を評価した示す図である。
【図９】試験例１２において、マウス大腸癌細胞（ルシフェラーゼが形質導入されているcolon26）と、S化ODN(OODN#3-dA(s)40)又はS化ODN/BG複合体（ODN#3/SPG複合体）とを、マウスに投与して、投与6日後に当該癌細胞のマウスの肺への生着を評価した示す図である。
【図１０】試験例１３において、マウス大腸癌細胞（ルシフェラーゼが形質導入されているcolon26）と、S化ODN(OODN#3-dA(s)40)又はS化ODN/BG複合体（ODN#3/SPG複合体）とを、マウスに投与して、投与5日後に当該癌細胞のマウスの肺への生着を評価した示す図である。
【図１１】試験例１４において、マウス大腸癌細胞（ルシフェラーゼが形質導入されているcolon26）と、S化ODN(OODN#3-dA(s)40)又はS化ODN/BG複合体（ODN#3/SPG複合体）とを、マウスに投与して、投与5日後に当該癌細胞のマウスの肺への生着を評価した示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の癌細胞の接着活性阻害剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌細胞の生着阻害剤、癌転移の阻害剤、及び癌の治療剤について説明する。また、本発明の方法及び使用の具体的態様についても、以下に示す接着活性阻害剤等の説明の通りである。
【００１５】
S化ODN
本発明では、核酸分子として、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート化されているODN（S化ODN）を使用する。本発明では、S化ODNがSPGと複合化されることにより、ODNが本来有している、癌細胞に対する接着活性阻害、増殖阻害、生着阻害等の機能を飛躍的に向上させることが可能になっている。
【００１６】
後述する試験例に示す通り、本発明によってもたらされる効果は、ODNの塩基配列に非特異的に認められるため、本発明で使用されるODNの塩基配列については、特に制限されず、任意の塩基配列のものを使用することができる。即ち、本発明で使用されるODNは、CpG ODN等のように機能性が公知のODNであってもよく、またランダムに塩基を配列された機能性が未知のODNであってもよい。但し、癌の治療剤の場合であれば、本発明で使用されるODNは、CpG ODN以外のものを使用する。
【００１７】
ここで、CpG ODNとは、メチル化されていないシトシン−グアニン配列を含むCpGモチーフを有するODNである。CpG ODNにおいて、含まれているCpGモチーフの数は、特に制限されないが、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個が挙げられる。また、CpG ODNは、塩基配列に応じて、Ｋ型、Ｄ型、Ｃ型、及びＰ型の４つのタイプが知られているが（Vollmer, J. & Krieg, A.M. Advanced drug delivery reviews 61, 195-204, 2009）、本発明においてCpG ODNを使用する場合、これらのいずれのタイプであってもよい。
【００１８】
発明で使用されるODNの塩基数については、特に制限されないが、例えば、５〜４０個、好ましくは１０〜３０個、更に好ましくは１５〜２５個が挙げられる。
【００１９】
本発明では、ホスホジエステル結合がS化（ホスホロチオエート化）されたODN（S化ODN）を使用する。このようにS化ODNを使用することが、癌細胞に対する接着活性阻害、増殖阻害、生着阻害等の機能を飛躍的に向上させる上で重要になる。
【００２０】
本発明において、ホスホジエステル結合がS化されているとは、ホスホジエステル結合部分のリン酸残基の酸素原子の一つが硫黄原子に置換されている結合構造を示す。本発明で使用するODNは、含まれる全てのホスホジエステル結合がS化されていることが好ましいが、本発明の効果を妨げない限り、一部のホスホジエステル結合がS化されていなくてもよい。ODNのS化は、従来公知の方法に従って行うことができる。
【００２１】
発明で使用されるODNは、それ自体がβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖（BG）との複合体を形成できない場合には、例えば、5'末端及び3'末端のいずれか少なくとも一方に、BGと複合化可能なポリデオキシヌクレオチドを付加していることが望ましい。このような、BGと複合化可能なポリデオキシヌクレオチドの好適な一例として、ポリデオキシアデニン（polydA）が挙げられる。polydAはBGと共に三重螺旋構造を採ることにより、BGとの複合体を容易に形成できる。
【００２２】
ODNに対するpolydAの結合態様については、特に制限されず、ODNの5'末端にのみpolydAが結合している態様、ODNの3'末端にのみpolydAが結合している態様、ODNの5'末端及び3'末端の双方にpolydAが結合している態様のいずれであってもよいが、好適な例としては、ODNの3'末端にのみpolydAが結合している態様が挙げられる。
【００２３】
また、polydAは、ODNの末端デオキシリボヌクレオチドにリン酸エステル結合によって直接結合していてもよいが、リンカー（スペーサー）を介して結合していてもよい。
【００２４】
polydAを構成するデオキシアデニンの数としては、後述するシゾフィランとの複合体形成が可能であることを限度として、特に限定されるものではないが、例えば、10〜100個、好ましくは20〜100個、より好ましくは20〜80個、更に好ましくは30〜50個が挙げられる。
【００２５】
polydA等のBGと複合化可能なポリデオキシヌクレオチドについても、ホスホジエステル結合がS化されていることが好ましい。当該ポリデオキシヌクレオチドのS化は、含まれる全てのホスホジエステル結合に対して施されていることが好ましいが、本発明の効果を妨げない限り、一部のホスホジエステル結合がS化されていなくてもよい。当該ポリデオキシヌクレオチドのS化は、従来公知の方法に従って行うことができる。
【００２６】
BG
β-1,3-グルカン骨格を有する多糖(BG)は、グルコースがβ1→3グルコシド結合により連結している主鎖を有する多糖であり、主鎖のグルコース残基数に対する側鎖のグルコース残基数の割合（以下、側鎖率と略記する）の異なる各種のものが知られている。１本鎖のポリデオキシヌクレオチドに対してBG２本が結合して３重螺旋構造を形成できることが知られている。本発明に使用されるBGについては、S化ODNと容易に複合体を形成させるという観点から、側鎖率の比較的高いβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖が好適である。
【００２７】
本発明において使用されるBGとして、具体的には、シゾフィラン、レンチナン、カードラン、パーキマン、グリフォラン、スクレログルカン等が例示される。これらの中でも、好ましくはシゾフィラン及びレンチナン、更に好ましくはシゾフィランが挙げられる。
【００２８】
SPG(シゾフィラン）は、例えば、文献（A.C.S.38(1),253(1997);Carbohydrate Research, 89, 121-135(1981)）記載の定法に従って製造することができる。このようにして得られたシゾフィランは、超音波処理により所望の分子量のシゾフィランを得ることができる。
【００２９】
本発明で使用されるBGには、本発明の効果を妨げない範囲で、機能性分子が結合していてもよい。BGに機能性分子を結合させる場合、機能性分子の結合割合としては、例えば、BGの側鎖100個当たり、機能性分子が1〜200個、好ましくは1〜100個、特に好ましくは1〜50個が挙げられる。このような機能性分子の結合割合は、前記製造法において、分枝グルコース残基に対する過ヨウ素酸ナトリウム等の酸化剤の添加量を制御することにより調整できる。
【００３０】
また、BGへの機能性分子の結合部位や当該機能性分子を連結させるリンカーを結合する部位については、特に限定されるものではないが、BGのβ-1,3-グルカンの主鎖から分枝された1,6-グルコピラノシド結合を持つグルコースの1,2-ジオール部位と置換されて結合していることが好ましい。
【００３１】
本発明で使用されるBGの分子量については、特に制限されず、前記S化ODNにおいてBGとの複合化を担っている領域の鎖長等に応じて適宜設定すればよい。具体的には、SPGの分子量として、通常25,000〜500,000、好ましくは25,000〜250,000が挙げられる。
【００３２】
S化ODN/BG複合体
本発明では、S化ODNの少なくとも一部と２本のBGによって三重螺旋構造を形成されたS化ODN/BG複合体を使用する。このような複合体を使用することによって、ODNが本来有している、癌細胞に対する接着活性阻害、増殖阻害、生着阻害等の機能を飛躍的に向上させることが可能になる。
【００３３】
S化ODN/BG複合体の形成は、ポリデオキシヌクレオチドとBGとを複合化させる公知の方法に従って行うことができる。
【００３４】
例えば、polydAが付加されたS化ODN（S化polydA-ODN）とSPGを複合化させる方法としては、以下の(1)〜(3)の工程で製造する方法が例示される：(1)S化polydA-ODNを公知の方法に従って調製する、(2)また、別途、SPGを用意する、或いは機能性分子が直接又はリンカーを介して結合しているSPG（修飾型SPG）を調製する、(3)次いで、S化polydA-ODNに含まれる１本鎖polydA部分と前記SPG又は前記修飾型SPGとを用いて複合体を形成させる。
【００３５】
前記方法の(3)の工程において、前記S化polydA-ODNと、前記SPG又は前記修飾型SPGとの混合比は、polydAの鎖長や前記SPG又は前記修飾型SPGの鎖長に応じて適宜選択することができる。polydAのアデニン１分子に対してSPGの主鎖のグルコース１分子が対応して、polydA１本とSPG２本が３重らせん構造を取る。すなわち、S化polydA-ODNとSPGとの複合体では、２本のSPGで形成された２重らせん構造の１カ所又は2カ所以上にpolydAが取り込まれて３重らせん構造が形成されている。例えば、40merのpolydAを含むS化polydA-ODNと分子量150000のSPGであれば、分子量150000のSPG2分子に当該S化polydA-ODNを17分子含んで3重らせん構造を取ることができる。S化polydA-ODNとSPGの好ましいモル比としては、20:1〜1:5、好ましくは10:1〜1:1で混合し、S化polydA-ODNの1本鎖polydA部分と前記SPG又は前記修飾型SPGを複合化させることが好ましい。このようなモル比で、前記S化ODNと、前記SPG又は前記修飾型SPGとを複合体形成条件下に晒すことにより、両者を効率的に相互作用させることが可能になり、S化polydA-ODNとSPGとの複合体の製造効率を向上させることができる。
【００３６】
また、S化polydA-ODNとSPGとの複合体における3重鎖螺旋構造の形成は、具体的には以下の方法に従って実施できる。SPGは、天然若しくは水中では、3重螺旋構造をとっている。このSPGを、DMSO（ジメチルスルホオキシド）等の極性溶媒や水酸化ナトリウム水溶液等のアルカリ水溶液に溶解して1本鎖に変性させた後、S化polydA-ODNを加え、溶媒を水に戻すことまたはアルカリ水溶液を中和すること（再生過程）によって、S化polydA-ODNに含まれるpolydA 1本鎖部分と2本のSPGからなる、3重螺旋型に複合化された構造（会合構造）が形成される。このようなpolydAとSPGの複合化は、主に、水素結合と疎水性相互作用を介して形成されると考えられる。
【００３７】
用途
前記S化ODN/BG複合体は、ODNが本来有する癌細胞に対する接着活性阻害、増殖阻害、生着阻害等の機能が飛躍的に向上しているので、癌細胞の接着活性阻害剤、癌細胞の増殖阻害剤、及び／又は癌細胞の生着阻害剤として使用される。
【００３８】
ここで、「癌細胞の接着活性阻害剤」とは、癌細胞が正常細胞又は組織に接着する機能を阻害する薬剤である。「癌細胞の増殖阻害剤」とは、癌細胞の増殖活性を阻害し、癌細胞数の増加を抑制、又は癌細胞数を減少させる薬剤である。「癌細胞の生着阻害剤」とは、正常細胞又は組織に接着した癌細胞が癌組織として機能することを阻害する薬剤である。
【００３９】
本発明において、癌細胞の接着活性阻害、増殖阻害、及び／又は生着阻害の対象となる癌種については、特に制限されないが、例えば、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頚癌、腎臓癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、胃癌、直腸癌、脳腫瘍、頭頚部癌、胆管癌、胆嚢癌、口腔癌、皮膚癌、子宮体癌、甲状腺癌等の固形癌；白血病、悪性リンパ腫等の血液癌が挙げられる。
【００４０】
前記S化ODN/BG複合体を癌細胞の接着活性阻害剤、癌細胞の増殖阻害剤、及び／又は癌細胞の生着阻害剤として使用する場合、その投与経路については、特に制限されず、例えば、経口、非経口（静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸内、膣内投与を含む）、吸入、全身投与、局所投与（皮膚や頬面窩洞への外用；眼、耳、鼻等の実質的に血流に侵入しない部位への点滴注入を含む）等、患者の症状、病態、疾患の種類等に基づいて従来利用されている方法から適宜選択することができる。
【００４１】
また、前記S化ODN/BG複合体を癌細胞の接着活性阻害剤、癌細胞の増殖阻害剤、及び／又は癌細胞の生着阻害剤として使用する場合、その投与量については、当業者であれば日常的な実験により、所望の薬効を発現させるために前記S化ODN/BG複合体の有効かつ非毒性の投与量を決定することが可能であり、特に制限されない。例えば、前記S化ODN/BG複合体の投与量は、通常、1日当たり体重1kg当たり約0.001〜10mgの範囲から選択することができる。
【００４２】
前記S化ODN/BG複合体は、治療有効量と共に、薬学的に許容される担体を適宜組み合わせて製剤化して使用される。このような担体としては、精製水、糖含有水溶液、緩衝液、生理食塩水、ヌクレアーゼフリーの水等の水性担体；賦形剤等が挙げられる。
【００４３】
また、癌細胞に対する接着活性阻害、増殖阻害、及び生着阻害は、癌の治療にも有効になるので、前記S化ODN/BG複合体は、癌治療剤として使用することもできる。なお、前述するように、S化ODN/BG複合体を癌治療剤として使用する場合には、S化ODN/BG複合体を構成するODNについては、CpG ODN以外のものが使用される。前記S化ODN/BG複合体複合体を癌治療剤として使用する場合、対象となる癌種、投与方法、投与量等については前記の通りである。
【００４４】
また、癌細胞の接着、増殖、及び生着は、癌の転移機序と密接に関連しているので、前記S化ODN/BG複合体は、癌転移の阻害剤として好適に使用することができる。前記S化ODN/BG複合体を癌転移の阻害剤として使用する場合、対象となる癌種、投与方法、投与量等については前記の通りである。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【００４６】
試験材料
（S化polydA-ODN、及びS化ODN）
表１に示す配列のS化polydA-ODN及びS化ODNを準備した。表１に示すODN#1-dA(S)40、ODN#2-dA(S)40、ODN#3-dA(s)40、ODN#4-dA(s)40、ODN#1、ODN#2、及びODN#3では、含まれるホスホジエステル結合部分の全てがS化されている。【００４７】
ODN#1-dA(S)40は、CpGモチーフを有していないODNであるODN#1の3'末端側に40merのpolydAが付加されている。ODN#2-dA(S)40は、CpGモチーフを有しておらず、グアニンが２個以上つながっている箇所を３つ有するODNであるODN#2の3'末端側に40merのpolydAが付加されている。ODN#3-dA(S)40は、CpGモチーフを３つ有するCpG ODNであるODN#3の3'末端側に40merのpolydAが付加されている。ODN#4-dA(s)40は、CpGモチーフを有しておらず、グアニンが２個以上つながっている箇所を３つ有するODNであるODN#4の3'末端側に40merのpolydAが付加されている。【００４８】
【表１】
2018174140.tif 000003
【００４９】
（SPG）
分子量約15万のSPGを準備した。【００５０】
（S化ODN/BG複合体の調製）
以下の試験例で用いたS化ODN/BG複合体は次のようにして調製した。SPGを0.25N水酸化ナトリウム水溶液に最終濃度15mg/mlになるように調製した後、1時間振動攪拌して4℃で１日静置し変性させた。330mMの第１リン酸ナトリウムに溶解させた表１に示す各S化polydA-ODNの溶液を、この変性SPG溶液に加えて中和し4℃で24時間以上静置した。この時、S化polydA-ODN 1モルに対してSPGが0.27モルとなるようにした。【００５１】
以下、S化ODN/BG複合体について、ODN#1-dA(S)40とSPGを使用して得られたものを「ODN#1/SPG複合体」、ODN#2-dA(S)40とSPGを使用して得られたものを「ODN#2/SPG複合体」、ODN#3-dA(S)40とSPGを使用して得られたものを「ODN#3/SPG複合体」、及びODN#4-dA(S)40とSPGを使用して得られたものを「ODN#4/SPG複合体」と表記する。【００５２】
試験例１：大腸癌細胞の接着活性阻害能の評価（１）
本試験では、ODN#3/SPG複合体について、マウス大腸癌株細胞の接着活性に対する阻害能を評価した。【００５３】
先ず、1×PBS(ThermoFisher)を用いて10μMの濃度になるようにODN#3溶液、及びODN#3/SPG複合体溶液を準備した。また、1×PBS(ThermoFisher)を用いて、0.3μg/μlの濃度になるようにSPG溶液を準備した。10%FBS含有RPMI1640(ThermoFisher)培地に懸濁したcolon26-Luc細胞（JCRB1496）（2×105 cells/ml）3mlにODN#3溶液、ODN#3/SPG複合体溶液、SPG溶液をそれぞれ120μｌ加え、ピペッティングにて混和後、24ウェルプレートの各ウェルに1mlずつ入れ、培養を行った。培養1日後に顕微鏡観察及び写真撮影を行った。なお、colon26-Luc細胞（JCRB1496）は、マウス大腸癌株細胞にルシフェラーゼが形質導入された株であり、生存状態の場合にはルシフェラーゼを発現する特性を有している。【００５４】
ウェルに接着している細胞について顕微鏡観察した結果、ODN#3処理、SPG処理、及び未処理（コントロール）のウェルでは、底に接着した細胞が多く観察され、これらの群間で接着した細胞の数には殆ど差が認められなかった。これに対して、ODN#3/SPG複合体でコートしたウェルでは、底に接着した細胞数が低減されていた。即ち、本結果から、ODN#3/SPG複合体には、腸癌細胞の接着を抑制する作用があることが明らかとなった。【００５５】
試験例２：悪性黒色腫株細胞の接着活性阻害能の評価
本試験では、ODN#3/SPG複合体について、悪性黒色腫株細胞の接着活性に対する阻害能を評価した。先ず、24ウェルプレートの各ウェルに、ODN#3（最終濃度1000nM）、ODN#3/SPG複合体（最終濃度500nM又は1000nM）、又はSPG（最終濃度29.3μg/ml）を添加し、更にB16 F0-Luc（マウス悪性黒色腫株細胞、JCRB1474）を2×105cells/ml含む細胞懸濁液（DMEM(FBS10%)）を各ウェルに1ml添加して、培養した。なお、B16 F0-Lucは、マウス悪性黒色腫株細胞にルシフェラーゼが形質導入された株であり、生存状態の場合にはルシフェラーゼを発現する特性を有している。培養２日後に、顕微鏡観察を行った。また、コントロールとして、ODN#3、ODN#3/SPG複合体、及びSPGをウェルに添加しなかったこと以外は、前記と同様に試験を行った。【００５６】
ウェルに接着している細胞について顕微鏡観察した結果、ODN#3/SPG複合体には、悪性黒色腫細胞の接着を抑制する作用が認められ、癌種に拘わらず、癌細胞の接着活性を阻害する作用があることが確認された。【００５７】
試験例３：大腸癌細胞の接着活性阻害能の評価（２）
本試験では、ODN#1/SPG複合体、ODN#2/SPG複合体、及びODN#3/SPG複合体について、大腸癌細胞の接着活性に対する阻害能を評価した。先ず、96ウェルプレートの各ウェルに、Colon26-Luc（ルシフェラーゼを発現するマウスColon26株、JCRB1496）を2×105cells/ml含む細胞懸濁液（DMEM(FBS10%)）を100μl添加し、更に、ODN#1、ODN#2、ODN#3、ODN#1/SPG複合体、ODN#2/SPG複合体、又はODN#3/SPG複合体を最終濃度が1μMとなるように添加して、培養した。なお、Colon26-Lucは、マウス大腸癌細胞株Colon26にルシフェラーゼが形質導入された株であり、生存状態の場合にはルシフェラーゼを発現する特性を有している。培養１日後に、顕微鏡観察、及びルシフェラーゼアッセイによってウェルに接着した細胞数の測定を行った。また、コントロールとして、ODN#3、ODN#3/SPG複合体、及びSPGをウェルに添加しなかったこと以外は、前記と同様に試験を行った。【００５８】
なお、ウェルに接着した細胞数の測定は、次の手順で実施した。先ず、ウェルから培養上清を除去した。その後、各ウェルにRPMI(serum free）を100μl添加して上清を除去する操作を2回行った。次いで、ONE-GloTM Luciferase Assay Systemを用いて、各ウェルに含まれるルシフェラーゼ(Luc)量を測定した。【００５９】
ウェルに接着している細胞について顕微鏡観察した結果を図１に示し、ルシフェラーゼアッセイの結果を図２に示す。この結果、CpGモチーフを有していないODNを使用したODN#1/SPG複合体及びODN#2/SPG複合体でも、CpG ODNを使用したODN#3/SPG複合体と同様に、大腸癌細胞の接着活性を阻害できることが確認された。【００６０】
試験例４：大腸癌細胞の細胞外マトリックスへの接着活性阻害の評価
本試験では、ODN#4/SPG複合体について、大腸癌細胞の細胞外マトリックスへの接着活性に対する阻害能を評価した。【００６１】
colon26-Luc細胞（ルシフェラーゼを発現するマウスColon26株、JCRB1496）を10%FBS含有RPMI1640で培養し、80% confluencyになった時点でaccutase(AT104, Innovative Cell Technologies, Inc.)を用いて細胞を培養ディッシュから剥離し、回収した。0.5%BSA、2mM CaCl2及び2mM MgCl2を添加したRPMI1640(ThermoFisher)培地で細胞を洗浄した後、同様のRPMI1640培地に再懸濁し、1.0×106cells/mlの細胞懸濁液を調製した。【００６２】
次いで、1.5mlチューブに前記細胞懸濁液を分注し、更にODN#4/SPG複合体及びODN#4を1.0μMとなるように添加して、ピペッティングにより混和した後、室温で10分温めたCytoSelect 48well Cell Adhesion Assay Kit(CBA-071,CELL BIOLABS,INC.)のアッセイプレートのウェルに150μl/wellとなるように分注し、37℃、5%CO2下で90分間培養した。なお、CytoSelect 48well Cell Adhesion Assay Kitのアッセイプレートには、細胞外マトリックスタンパク質（フィブロネクチン、コラーゲンI/IV、ラミニンI、フィブリノーゲン）及びポジティブコントロールタンパク質（BSA）が均一にコートされており、種細胞外マトリックスタンパク質への接着活性を評価できるようになっている。【００６３】
培養終了後、上清を除去した。次いで、各ウェルに2mM CaCl2及び2mM MgCl2を含むPBS 150μlを分注した後、そのPBSを除去した。この洗浄操作を4回行った。別途、CytoSelect Assay Kit 付属のCyQuant GR dyeをLysis bufferを用いて1:300に希釈し、CyQuant GR dye希釈液を準備した。洗浄後に各ウェルからPBSを除去し、CyQuant GR dye希釈液を各wellに200μlずつ分注し、室温で20分間振盪した。各ウェル中の溶液を150μlずつ 96well black plateへ移して、蛍光プレートリーダー（励起480nm/蛍光520nm）により蛍光強度を測定した。当該蛍光強度の値が高い程、ウェルに接着している細胞が多いことを示す。また、コントロールとして、ODN#4/SPG複合体及びODN#4の代わりにPBSを添加したこと以外は、前記と同様に試験を行った。【００６４】
得られた結果を図３に示す。この結果、ODN#4で処理した大腸癌細胞と無処理の大腸癌細胞の蛍光強度が変わらなかった。それとは対照的に、ODN#4/SPG複合体で処理した大腸癌細胞は、フィブロネクチンを除くすべての細胞外マトリックスに対して蛍光強度が減少していた。これらのことから、ODN#4/SPG複合体が選択的に細胞外マトリックスに対する腫瘍細胞の接着を阻害することが確認された。なお、ポジティブコントロールであるBSA対しては接着阻害活性を示していないことから、本実験が正常に行われていることが確認できた。【００６５】
試験例５：癌細胞におけるMHC class Iの発現に及ぼす影響の解析
本試験では、ODN#2/SPG複合体及びODN#3/SPG複合体が大腸癌細胞のMHC class Iの発現に及ぼす影響について評価した。先ず、Colon26-Luc（ルシフェラーゼを発現するマウスColon26株、JCRB1496）をRPMI(FBS10%)にて10cm dishで培養し、90% confluencyになったところで、accutase(Innovative Cell Technologies)を用いてcolon26-Luc細胞をdishより剥離、分散させて回収した。回収したcolon26-Lucを洗浄後、RPMI(FBS10%)に懸濁した。T25-flaskに3.0×106cells/flaskで播種した。培地量は4mL/flaskとした。また、colon26-Lucの播種と同時に500 nMになるように、ODN#3、ODN#2/SPG複合体、又はODN#3/SPG複合体を最終濃度が1μMとなるように各flaskに添加し、37oC、5%CO2下で20時間培養した。培養後、accutase(Innovative Cell Technologies)を用いてcolon26-LucをT25-flaskより剥離、分散して回収した。回収した細胞を洗浄後、FCM bufferに懸濁してCellometer(Nexcerom社)を用いて、細胞数を計数した。細胞数の計数後、定法に従って細胞をFCM用の抗mouse MHC Class I抗体(H-2Kd)で染色し、更に染色細胞に核染色液（7-AAD；7-Amino-Actinomycin D）を添加して、フローサイトメトリー(Gallios, Beckman Coulter)を用いて解析を行った。また、コントロールとして、ODN#3、ODN#2/SPG複合体、及びODN#3/SPG複合体を添加しなかったこと以外は、前記と同様に試験を行った。【００６６】
結果を図４に示す。この結果から、ODN#3、ODN#2/SPG複合体、及びODN#3/SPG複合体を添加すると、MHC class I 高発現の細胞群が増える傾向か認められた。また、ODN（ODN#3）と、SPG複合体（ODN#2/SPG複合体及びODN#3/SPG複合体）とを比較すると、複合体の方が、MHC class I 高発現細胞群がより多くなることが確認された。【００６７】
試験例６：癌細胞の増殖阻害能の評価
本試験では、ODN#3/SPG複合体が大腸癌細胞の増殖に及ぼす影響について評価した。先ず、６ウェルプレートの各ウェルに、Colon26-Luc（ルシフェラーゼを発現するマウスColon26株、JCRB1496）を1×106cells/ml含む細胞懸濁液（RPMI(FBS10%)）を2ml、更に、ODN#3、又はODN#3/SPG複合体を最終濃度が400μMとなるように添加して、培養した。なお、Colon26-Lucは、マウス大腸癌細胞株Colon26にルシフェラーゼが形質導入された株であり、生存状態の場合にはルシフェラーゼを発現する特性を有している。培養2.5時間後及び48時間後に、培養上清を15mlチューブに回収した。また、培養上清を回収した各ウェルに、PBS 1mlを加え、軽くゆすって同じチューブに回収した。次に、各ウェルにTrypsin EDTA 0.5ml加え、37℃で3分間処理して細胞を剥がし、PBSを加えて同じチューブに回収した。チューブを遠心（400g×5min）し、上清を除去した後に、細胞をPBS 500mlに懸濁した。得られた細胞懸濁液1.5mlを新たなチューブに移し、PBSでチューブを洗いながらトータル約1.5mlとする。次いで、チューブを遠心（400g×5min）し、上清を除去して回収された細胞を、250μlのAnnexin V Binding Buffer(BioLegend)に懸濁した。得られた細胞懸濁液100μlを1.5mlのチューブに入れ、更に5μlのAnnexine V-FITC(BioLegend)及び5μlの核染色液（7-AAD又はPI（Propidium Iodide））を添加して穏やかな条件でVortexした後に、暗所で室温で15分間静置した。次いで、400μlのAnnexine V binding Bufferを加え、フィルターを通しながらフローサイトメトリー用のチューブに移し、フローサイトメトリー(Gallios, Beckman Coulter)を用いて解析を行った。また、コントロールとして、ODN#3、ODN#2/SPG複合体、及びODN#3/SPG複合体を添加しなかったこと以外は、前記と同様に試験を行った。また、コントロールとして、ODN#3及びODN#3/SPG複合体を添加しなかったこと以外は、前記と同様に試験を行った。【００６８】
結果を図５に示す。この結果、ODN#3/SPG複合体を添加した場合、短時間の培養後で死細胞が増え、生きた癌細胞が増殖を示す48時間後でもでも、死細胞比率は変わらなかった。即ち、本結果から、ODN#3/SPG複合体には、優れた癌細胞の増殖抑制作用があることが明らかとなった。【００６９】
試験例７：正常肺細胞に対する接着活性阻害能の評価
本試験では、ODN#3/SPG複合体が正常細胞の接着活性に対する阻害能を評価した。先ず、Balb/c雌マウス２匹の肺から全細胞（Lung whole cells）を回収し、肺細胞を2×105cells/ml含む細胞懸濁液（DMEM(FBS10%)）を調製した。96ウェルプレートの各ウェルに、細胞懸濁液100μlを入れ、更に、SPG（最終濃度5.8μg/ml）、ODN#3-dA(s)40（最終濃度0.5μM又は1.0μM）、又はODN#3/SPG複合体（最終濃度0.5μM又は10μM）を添加して、培養した。培養20時間後に、顕微鏡観察を行った。また、コントロールとして、SPG、ODN#3-dA(s)40、及びODN#3/SPG複合体の代わりにPBSを添加したこと以外は、前記と同様に試験を行った。【００７０】
ウェルに接着している細胞について顕微鏡観察した結果、ODN#3/SPG複合体は、正常肺細胞に対しては、接着を阻害しないことが確認された。【００７１】
試験例８：正常肺線維芽細胞に対する接着活性阻害能の評価
本試験では、ODN#3/SPG複合体が正常細胞の接着活性に対する阻害能を評価した。先ず、Balb/c雌マウス１匹の肺からコラーゲナーゼを使用して、肺線維芽細胞を回収し、肺細胞を3×105cells/ml含む細胞懸濁液（DMEM(FBS10%)）を調製した。96ウェルプレートの各ウェルに、細胞懸濁液100μlを入れ、更に、SPG（最終濃度6.3μg/ml）、ODN#3-dA(s)40（最終濃度0.5μM又は1.0μM）、又はODN#3/SPG複合体（最終濃度0.5μM又は10μM）を添加して、培養した。培養3時間後及び24時間後に、顕微鏡観察を行った。また、コントロールとして、SPG、ODN#3-dA(s)40、及びODN#3/SPG複合体の代わりにPBSを添加したこと以外は、前記と同様に試験を行った。【００７２】
ウェルに接着している細胞について顕微鏡観察した結果ODN#3/SPG複合体は、正常肺線維芽細胞に対しても、接着を阻害しないことが確認された。試験例７及び８の結果から、ODN#3/SPG複合体は、癌細胞に対して特異的に接着活性を阻害し、正常細胞に対しては接着活性を阻害しないことが明らかとなった。【００７３】
試験例９：Exo vivoによる癌細胞の生着阻害能の評価
本試験では、ODN#3/SPG複合体を用いて、Exo vivoによる癌細胞の生着阻害能を評価した。先ず、ディッシュにColon26-Luc（ルシフェラーゼを発現するマウスColon26株、JCRB1496）を含む細胞懸濁液（RPMI(FBS10%)）を5×106cells/dishとなるように添加した。次いで、ODN#3-dA(s)40又はODN#3/SPG複合体を最終濃度が1μMとなるようにディッシュに添加し、37℃で4時間培養した。培養後に細胞を回収して、PBSに2×106cells/mlとなるように懸濁させた。得られた細胞懸濁液500μlを、BALB/cマウス(メス、10週齢)に尾静脈注射（i.v.）により投与し、飼育した。細胞懸濁液の投与から5日後及び10日後に、マウスから肺を摘出し、肺細胞のルシフェラーゼアッセイを行った。また、コントロールとして、ODN#3-dA(s)40及びODN#3/SPG複合体の代わりにPBSを添加してColon26-Lucの培養を行ったこと以外は、前記と同様に試験を行った。更に、コントロールとして、細胞懸濁液の投与しなかった場合についても、前記と同様に試験を行った。【００７４】
肺細胞のルシフェラーゼアッセイは、次の手順で行った。マウスの肺を直剪刀で4mm角に切断し、tumor dissociation kit(MiltenyiBiotek)、gentle MACS cell dissociator(MiltenyiBiotek)を用いて肺単細胞懸濁液を調製した。調製した肺単細胞にRPMI1640を加えて全量を350μlにした。この細胞液を氷冷しながら10秒間3回、sonicatorで細胞を破砕した。得られた細胞破砕液に、350μlのOneGlo液(Promega)を加え、10回転倒混和した後に、遠心分離（12000×g、3分間）を行い、上清を回収した。上清200μlを96ウェルホワイトプレートに移し(3 well/sample)、luminometer (GloMax, Promeg)で直ちに発光を測定した。【００７５】
結果を図６に示す。ODN#3-dA(s)40との共存下で培養した癌細胞を移植すると、癌細胞の肺での生着が認められたが、ODN#3/SPG複合体との共存下で培養した癌細胞の場合には、肺での生着を著しく抑制できることが確認された。即ち、本結果から、ODN#3/SPG複合体には、優れた癌細胞の生着強い作用があることが分かった。【００７６】
試験例１０：In vivoによる癌細胞の生着阻害能の評価
本試験では、ODN#3/SPG複合体を用いて、in vivoによる癌細胞の生着阻害能を評価した。先ず、BALB/cマウス(メス、10週齢)に、Colon26-Luc（ルシフェラーゼを発現するマウスColon26株、JCRB1496）を2×106cells/ml含む細胞懸濁液（PBS）500μlを尾静脈経由で注射投与した(1×106cells/head)。細胞懸濁液の投与日をday 0とし、day 1, 3, 5, 7,及び9に10μg/300μ1/headとなるようにODN#3-dA(s)40又はODN#3/SPG複合体を投与した。day 10にマウスから肺を摘出し、前記試験例９と同様の方法で肺細胞のルシフェラーゼアッセイを行った。また、コントロールとして、ODN#3-dA(s)40及びODN#3/SPG複合体の代わりにPBSを投与したこと以外は、前記と同様に試験を行った。更に、コントロールとして、細胞懸濁液、ODN#3-dA(s)40及びODN#3/SPG複合体を投与しなかった場合についても、前記と同様に試験を行った。【００７７】
結果を図７に示す。この結果から、ODN#3/SPG複合体を投与することによって、移植した癌細胞の肺への生着を効果的に抑制できることが確認された。【００７８】
試験例１１：In vivoによる癌細胞の生着阻害能、及び脾臓における免疫作用の評価
本試験では、ODN#3/SPG複合体を用いて、in vivoによる癌細胞の生着阻害能と共に、脾臓における免疫作用を評価した。先ず、BALB/cマウス(メス、10週齢)に、Colon26-Luc（ルシフェラーゼを発現するマウスColon26株、JCRB1496）を2×106cells/ml含む細胞懸濁液（PBS）500μlを尾静脈経由で注射投与した(1×106cells/head)。細胞懸濁液の投与日をday 0とし、day 5, 7,及び9に10μg/300μ1/headとなるようにODN#3-dA(s)40又はODN#3/SPG複合体を投与した。day 10にマウスから肺及び脾臓を摘出した。摘出した肺については、前記試験例９と同様の方法で肺細胞のルシフェラーゼアッセイを行った。摘出した脾臓を用いて、脾臓由来の細胞懸濁液を調製し、F4/80:FITC、CCR7:PE, 7AAD, H-2Kd:APC、及びCD11c:PBによる染色、並びにCD8:FITC, IgM:PE, 7AAD, H-2Kd:APC、及びCD80:PBによる染色を施し、フローサイトメトリー(Gallios, Beckman Coulter)を用いて解析を行った。【００７９】
また、コントロールとして、ODN#3-dA(s)40及びODN#3/SPG複合体の代わりにPBSを投与したこと以外は、前記と同様に試験を行った。更に、コントロールとして、細胞懸濁液、ODN#3-dA(s)40及びODN#3/SPG複合体を投与しなかった場合についても、前記と同様に試験を行った。【００８０】
摘出した肺についてルシフェラーゼアッセイを行った結果を図８に示す。この結果からも、ODN#3/SPG複合体を投与することによって、移植した癌細胞の肺への生着を効果的に抑制できることが確認された。【００８１】
また、摘出した脾臓についてフローサイトメトリー解析を行った結果、ODN#3-dA(s)40及びODN#3/SPG複合体を投与すると、脾臓において MHC class I高発現細胞群が増加したが、両者では、その傾向が顕著に異なっていた。ODN#3/SPG複合体を投与した場合では、CD8陽性細胞を抑制する傾向を示し、炎症性マクロファージは活性化されていなかった。更に、ODN#3/SPG複合体を投与した場合には、コントロールやODN#3-dA(s)40を投与した場合に比べて、癌細胞やnaive T細胞の遊走マーカーであるCCR7発現細胞が減少していた。即ち、ODN#3/SPG複合体による癌細胞の生着阻害作用は、脾臓でのCD8陽性細胞の活性化に依存していないことが確認された。【００８２】
試験例１２：In vivoによる癌細胞の生着阻害能、及び脾臓における免疫作用の評価
本試験では、ODN#3/SPG複合体を用いて、in vivoによる癌細胞の生着阻害能と共に、脾臓における免疫作用を評価した。先ず、BALB/cマウス(メス、12週齢)に、Colon26-Luc（ルシフェラーゼを発現するマウスColon26株、JCRB1496）を2×106cells/ml含む細胞懸濁液（PBS）500μlを尾静脈経由で注射投与した(1×106cells/head)。細胞懸濁液の投与日をday 0とし、day 1, 3,及び5に10μg/300μ1/headとなるようにODN#3-dA(s)40又はODN#3/SPG複合体を投与した。day 6にマウスから肺及び脾臓を摘出した。摘出した肺については、前記試験例９と同様の方法で肺細胞のルシフェラーゼアッセイを行った。また、摘出した脾臓を用いて、脾臓由来の細胞懸濁液を調製し、Gr-1/FITC, DX5/PE, 7AAD, H-2Kd/APC及びCD80/PBによる染色による染色、並びにCD40/FITC, CCR7/PE, 7AAD, H-2Kd/APC及びCD80/PBによる染色を施し、フローサイトメトリー(Gallios, Beckman Coulter)を用いて解析を行った。【００８３】
摘出した肺についてルシフェラーゼアッセイを行った結果を図９に示す。この結果からも、ODN#3/SPG複合体を投与することによって、移植した癌細胞の肺への生着を効果的に抑制できることが確認された。【００８４】
また、摘出した脾臓についてフローサイトメトリー解析を行った結果、ODN#3-dA(s)40及びODN#3/SPG複合体を投与すると、NK細胞群の比率は、コントロール（PBS投与）との比較において、ODN#3-dA(s)40及びODN#3/SPG複合体を投与した場合では共に減少していたが、ODN#3/SPG複合体が最も低い比率を示した。成熟顆粒球群の比率は、コントロール、ODN#3-dA(s)40、及びODN#3/SPG複合体の間に殆ど差はなかった。癌転移や naiveT細胞の遊走性の指標となるCCR7発現細胞比率は、コントロール（PBS投与）との比較では、ODN#3-dA(s)40及びODN#3/SPG複合体の双方で減少を示したが、ODN#3/SPG複合体では顕著に減少していた。ほぼ同一の細胞群に発現していると考えられるCD40とCD80の発現については、ODN#3-dA(s)40を投与した場合ではCD80発現細胞比率が増加し、ODN#3/SPGを投与した場合ではCD40発現細胞比率が増加していた。これらの結果から、ODN#3-dA(s)40及びODN#3/SPG複合体の投与では、脾臓における明確な免疫の活性化は認められなかった。このことから、ODN#3/SPG複合体による癌細胞の生着抑制は、脾臓での免疫的な作用によるものではないことが確認された。【００８５】
試験例１３：In vivoによる癌細胞の生着阻害能、及び脾臓における免疫作用の評価
本試験では、ODN#3/SPG複合体を用いて、in vivoによる癌細胞の生着阻害能と共に、脾臓における免疫作用を評価した。先ず、BALB/cマウス(メス、8週齢)に、Colon26-Luc（ルシフェラーゼを発現するマウスColon26株、JCRB1496）を2×106cells/ml含む細胞懸濁液（PBS）500μlを尾静脈経由で注射投与した(1×106cells/head)。細胞懸濁液の投与日をday 0とし、day 1に10μg/300μ1/headとなるようにODN#3-dA(s)40又はODN#3/SPG複合体を投与した。day 5にマウスから肺及び脾臓を摘出した。摘出した肺については、前記試験例９と同様の方法で肺細胞のルシフェラーゼアッセイを行った。また、摘出した脾臓を用いて、脾臓由来の細胞懸濁液を調製し、EpCAM/FITC, CD44/PE, 7AAD及びCD11b/APCによる染色を施し、フローサイトメトリー(Gallios, Beckman Coulter)を用いて解析を行った。【００８６】
摘出した肺についてルシフェラーゼアッセイを行った結果を図１０に示す。この結果からも、ODN#3/SPG複合体を投与することによって、移植した癌細胞の肺への生着を効果的に抑制できることが確認された。【００８７】
また、摘出した脾臓についてフローサイトメトリー解析を行った結果、コントロール、ODN#3-dA(s)40、及びODN#3/SPG複合体の間に、生細胞及び死細胞の各比率に差異は認めなかった。また、細胞接着、細胞増殖、及び腫瘍の進行を表す指標であるEpCAM(CD326)は、ODN#3/SPG複合体を投与した場合に減少していた。【００８８】
試験例１４：In vivoによる癌細胞の生着阻害能、及び脾臓における免疫作用の評価
本試験では、ODN#3/SPG複合体を用いて、in vivoによる癌細胞の生着阻害能と共に、脾臓における免疫作用を評価した。先ず、BALB/cマウス(メス、10週齢)に、Colon26-Luc（ルシフェラーゼを発現するマウスColon26株、JCRB1496）を2×106cells/ml含む細胞懸濁液（PBS）500μlを尾静脈経由で注射投与した(1×106cells/head)。細胞懸濁液の投与日をday 0とし、day 0に10μg/300μ1/headとなるようにODN#3-dA(s)40又はODN#3/SPG複合体を投与した。day 5にマウスから肺及び脾臓を摘出した。摘出した肺については、前記試験例９と同様の方法で肺細胞のルシフェラーゼアッセイを行った。また、摘出した脾臓を用いて、脾臓由来の細胞懸濁液を調製し、DX5/FITC, CXCR4/PE, 7AAD, NKG2D/APC及びCD11c/PBによる染色による染色、並びにEpCAM/FITC, CD3/PE, 7AAD、CD8/APC及びCD11c/PBによる染色を施し、フローサイトメトリー(Gallios, Beckman Coulter)を用いて解析を行った。【００８９】
摘出した肺についてルシフェラーゼアッセイを行った結果を図１１に示す。この結果からも、ODN#3/SPG複合体を投与することによって、移植した癌細胞の肺への生着を効果的に抑制できることが確認された。【００９０】
また、摘出した脾臓についてフローサイトメトリー解析を行った結果、コントロールに比べて、ODN#3-dA(s)40、及びODN#3/SPG複合体では共にNK細胞の活性化誘導が観察された。ODN#3/SPG複合体では、コントロール及びODN#3-dA(s)40に比べて、癌細胞の転移マーカー・遊走マーカーであるCXCR4発現細胞や、癌細胞の接着性・増殖性を示すマーカーであるEpiCAM発現細胞が減少し、活性化NK細胞が増強されていた。また、ODN#3/SPG複合体では、T細胞は活性化されていなかったが、ODN#3-dA(s)40ではT細胞の活性化（CD8+細胞率の増加）が認められた。以上の結果から、ODN#3/SPG複合体投与による癌細胞の生着抑制は、癌細胞の接着性や増殖性が抑制された結果であって、T細胞の活性化に依存しないことが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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