(57)【要約】  本発明は、望ましくない遺伝子の発現に関連する疾患または障害を処置するための核酸医薬を提供することに関する。より具体的には、本発明者らは、遺伝子発現調節の対象となる標的ＲＮＡ配列について、その配列情報を元に構造解析を行ない、得られた構造解析結果とそれぞれのエネルギー量から、それぞれの存在確率を算出し、内在性のステムループ部分構造の存在確率を統一的に算出することでより好ましい内在性ステムループ部分構造を特定し、核酸医薬を設計する方法を確立することで、比較的短いオリゴヌクレオチドを用いて、効率よく細胞内における遺伝子発現を調節する手法を開発した。本手法は、原理的にあらゆる遺伝子発現の調節に応用可能であることから、多様な疾患および障害の治療または予防に有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞内の標的ＲＮＡを切断するための方法であって、
１）標的ＲＮＡに相補的な６ｍｅｒから１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ｓｇＡＳＯ）がハイブリダイズすることによって、少なくとも１つのステムループ構造が形成される配列を標的ＲＮＡ配列中に同定する工程、
２）該ｓｇＡＳＯを調製して、真核細胞内において標的ＲＮＡと接触させる工程、
を含み、
該ｓｇＡＳＯがハイブリダイズして形成されるステムループ構造を真核細胞内のｔＲＮａｓｅＺＬが認識して標的ＲＮＡを切断することを特徴とする、方法。
【請求項２】
該ｓｇＡＳＯがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のステム部分の塩基対数が１１から１４である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｓｇＡＳＯが７ｍｅｒである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
該ｓｇＡＳＯがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のうち、ループ部分が標的ＲＮＡによって形成されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
該ｓｇＡＳＯがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のループ部分の塩基数が３から１０である、請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項６】
該ｓｇＡＳＯがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のステム部分がミスマッチまたはバルジを含まない、請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
該ｓｇＡＳＯがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のステム部分がミスマッチまたはバルジを含む、請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
ステム部分の塩基対数の計数において、ステム中のミスマッチまたはバルジの塩基数が２以下の場合は、ミスマッチまたはバルジが塩基対を形成するとみなしてカウントし、ステム中のミスマッチまたはバルジの塩基数が３以上の場合は、ミスマッチまたはバルジの塩基数の２分の１の数を塩基対数としてカウントする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
標的ＲＮＡがｍＲＮＡまたはｎｃＲＮＡである、請求項１〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
ｓｇＡＳＯが修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項１〜９のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
標的ＲＮＡによって形成されるステム部分の５’側配列と３’側配列の塩基数の差が１以下である、請求項１〜１０のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
該ｓｇＡＳＯの末端水酸基の一方または両方が修飾されている、請求項１〜１１のいずれか記載の方法。
【請求項１３】
該ｓｇＡＳＯの末端水酸基の一方または両方にリン酸基が付加されている、請求項１〜１２のいずれか記載の方法。
【請求項１４】
標的ＲＮＡ上のｓｇＡＳＯが結合する領域の５’側から構成する塩基をＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７とし、さらにｓｇＡＳＯが結合する領域の３’側に隣接する最初の塩基をＮ８とした場合に、以下の条件１〜３の少なくとも一つが満たされることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか記載の方法：
−条件１：Ｎ８がＡもしくはＧである；
−条件２：Ｎ７がＣである；
−条件３：Ｎ６がＡ、ＣもしくはＧである。
【請求項１５】
ｓｇＡＳＯが配列番号１から配列番号１６３８４のいずれか１つの配列から成るオリゴヌクレオチドである、請求項１〜１４のいずれか記載の方法。
【請求項１６】
約７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを含む、患者における疾患または障害の治療または予防に用いるための医薬組成物であって、
該約７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが、疾患または障害に関連する標的ＲＮＡに相補的であり、
該標的ＲＮＡが少なくとも１つのステムループ構造を形成することができ、
該約７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが該ステムループ構造の３’側の領域にハイブリダイズして、該標的ＲＮＡが形成するステムループと合わせて少なくとも１つのより大きなステムループ構造を形成することができ、
形成された構造が患者体内のｔＲＮａｓｅＺＬによって認識されて、標的ｍＲＮＡが切断されることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１７】
癌の治療もしくは予防のための医薬組成物であって、以下から選択されるいずれかの配列を含むｓｇＡＳＯを含む、医薬組成物：
５’−ＧＡＡＡＣＵＵ−３’；
５’−ＣＵＧＵＣＡＡ−３’；
５’−ＵＣＵＵＣＡＡ−３’；
５’−ＵＵＡＵＣＧＵ−３’；
５’−ＣＵＵＡＵＡＡ−３’；
５’−ＧＣＧＧＧＧＧ−３’；
５’−ＡＣＵＣＡＡＡ−３’。
【請求項１８】
真核細胞内の標的ＲＮＡを切断するためのオリゴヌクレオチド（ｓｇＡＳＯ）の設計方法であって、
１）標的ＲＮＡ配列中に少なくとも１つのステムループ構造が形成される配列を同定する工程、
２）該ステムループ構造に隣接する３’側の６〜１０塩基の配列をｓｇＡＳＯの結合配列として同定する工程、および
３）該結合配列に相補的な配列をｓｇＡＳＯの配列として同定する工程
を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８記載のオリゴヌクレオチド（ｓｇＡＳＯ）の設計方法であって、
ｉ）標的ＲＮＡによって形成されるステムループ構造のステム部分の塩基対数が４〜８であり、
ｉｉ）該ステムループ構造のループ部分の塩基数が３から１０であり、
ｉｉｉ）該ステムループ構造のステム部分がミスマッチまたはバルジを含む場合、ステム部分の塩基対数の計数において、ステム中のミスマッチまたはバルジの塩基数が２以下の場合は、ミスマッチまたはバルジが塩基対を形成するとみなしてカウントし、ステム中のミスマッチまたはバルジの塩基数が３以上の場合は、ミスマッチまたはバルジの塩基数の２分の１の数を塩基対数としてカウントし、そして
ｉｖ）該ステム部分の５’側配列と３’側配列の塩基数の差が１以下である、
方法。
【請求項２０】
スモールガイドアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｓｇＡＳＯ）の設計方法であって、
１）標的ＲＮＡ上に、存在確率の高いステムループを同定する工程、
２）該ステムループを評価する工程、および
３）該ステムループを形成する塩基対の３’側直後から７塩基を標的配列（センス鎖）とし、そのアンチセンス鎖をｓｇＡＳＯ配列として同定する工程
を含み、
ここで、１）標的ＲＮＡ上に、存在確率の高いステムループを同定する工程は、
ｉ）５’末端からＲ塩基刻みでＷ塩基の幅の枠ｎを設定し、該枠ｎは標的ＲＮＡからｎｍａｘ個得られ、それぞれの枠ｎにおいて、構成するＷ塩基の塩基配列についてパターンマッチングによって取り得る塩基対パターンを算出し、その結果に公知の熱力学的安定性計算を適用し、それぞれの塩基対パターンに対してΔＧとして与えることを含む、構造予測ステップと、
ｉｉ）枠ｎにおいてｍｍａｘ（ｎ）個得られている予測構造結果とそれぞれのエネルギー量から該ＲＮＡがおかれている細胞内での状態が平衡状態であることを仮定し、予測構造結果それぞれの存在確率をマクスウェル＝ボルツマン統計に従って算出し、ここで、ｎ枠目での構造予測結果のうち最安定構造からｍ番目の予測結果について、その存在確率をおのおのｊ（ｎ，ｍ）とすることを含む、構造解析ステップと、
ｉｉｉ）枠内ではなく配列上の絶対位置ｘから始まり、構成するループとステムの特徴プロファイル（ステムを構成する塩基対の塩基の位置で定義されるステムループの個性）をｐとした時に、当該ステムループをｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ）と呼び、ｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ）の枠ｎ内での存在確率を、部分的な存在確率Ｐ＿ｌｏｃａｌ（ｘ，ｐ，ｎ）とし、その値は、枠ｎにおいて得られた構造予測結果すべてについての中で当該ステムループが存在する構造予測結果についてのｊ値の総和Σｊ（ｎ，ｍ）であるとすることを含む、局所存在確率計算ステップ、ここで、枠ｎにおける、ｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ）の局所的な存在確率Ｐ＿ｌｏｃａｌ（ｘ，ｐ，ｎ）は以下で表され：
【数１】
2019044974.tif 000061
ｉｖ）Ｐ＿ｌｏｃａｌ（ｘ，ｐ，ｎ）について枠１からｎｍａｘまで総和をとった結果をΣＰ＿ｌｏｃａｌ（ｘ，ｐ，ｎ）、ステムループを構成する配列全長が枠内におさまることのできる枠の数をｎ＿ａｌｌ（ｘ，ｐ）個としたとき、全体の中でのｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ）の存在確率Ｐ＿ｇｌｏｂａｌ（ｘ，ｐ）をΣＰ＿ｌｏｃａｌ（ｘ，ｐ，ｎ）／ｎ＿ａｌｌ（ｘ，ｐ）として表すことを含む、存在確率計算ステップ、ここで、ｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ）についての全体の中での存在確率Ｐ＿ｇｌｏｂａｌ（ｘ，ｐ）は以下で表され：
【数２】
2019044974.tif 000062
ｖ）得られたｍｏｔｉｆ（ｘ、ｐ）についての存在確率Ｐ＿ｇｌｏｂａｌ（ｘ，ｐ）に対して、存在確率および特徴ｐから、ステムループを選択する解析ステップ
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、特願２０１７−１６６６４１号（出願日：２０１７年８月３１日）の優先権を主張する出願であり、これは引用することによりその全体が本明細書に取り込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子発現の調節に関する。より詳細には、遺伝子発現を調節するための比較的短いオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物とそれを用いた疾患の処置に関する。また、本発明は遺伝子発現を調節するための比較的短いオリゴヌクレオチドの設計方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
医薬品開発における創薬技術では、従来より創薬標的を蛋白質とする取組みが多く推進されて、低分子医薬や抗体とはじめとする蛋白医薬およびペプチド医薬による創薬が中心であった。近年、ゲノム科学や個別化医療など疾患の原因が遺伝子レベルで解明されてきたため、創薬標的を核酸とする取組みが開発され、低分子医薬品や抗体医薬品では狙いにくい治療標的にも対応できると考えられるため、核酸医薬が新しいモダリティ（創薬手法）として、期待されつつある。【０００４】
基礎研究としては、アンチセンス核酸やＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）などの研究（非特許文献１）が行われ、その技術に基づく医薬品開発が行われ、上市される製品も出始めている。さらに、蛋白質の遺伝情報を持たない核酸の機能が明らかとされつつあり、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）として遺伝子発現調節技術としての創薬技術への応用が進められている（非特許文献２）。【０００５】
アンチセンス核酸の技術において、梨本らは、ＴＲＵＥジーンサイレンシング（tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing）と名付けた遺伝子発現抑制技術を開発している（特許文献１〜３、非特許文献３〜１０）。このＴＲＵＥジーンサイレンシングは、標的ＲＮＡと合成スモールガイドアンチセンス核酸とによって形成されるｐｒｅ−ｔＲＮＡ様またはマイクロｐｒｅ−ｔＲＮＡ様複合体を認識することによって、いかなるＲＮＡの任意箇所をも切断することができるという哺乳動物ｔＲＮａｓｅ  ＺＬのユニークな酵素的特性に基づいている。特に、合成スモールガイドアンチセンス核酸が７塩基である場合については、ｈｕｍａｎＢＣＬ−２、ＷＴ−１、ＣＣＮＤ−１について、ＴＲＵＥジーンサイレンシングの報告がある（非特許文献５〜８）。ＴＲＵＥジーンサイレンシングの効果は、ＲＮＡ干渉（RNA interference：ＲＮＡｉ）と同等であり（非特許文献９）、幾つかの場合ではＲＮＡｉの効果を凌ぐことも確認されている（非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３６６０７１８号
【特許文献２】特許第５９５９５２２号
【特許文献３】特許第５９９５８４９号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Chery,J. (2016) RNA therapeutics: RNAi and antisense mechanisms and clinical applications. Postdoc J. 4(7): 35-50
【非特許文献２】Rupaimoole,R. & Slack,F.J. (2017) MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Review Drug Discovery, 16, 203-221
【非特許文献３】Tamura,M., Nashimoto,C., Miyake,N., Daikuhara,Y., Ochi,K. and Nashimoto,M.(2003) Intracellular mRNA cleavage by 3’ tRNase under the direction of 2’-O-methylRNA heptamers. Nucleic Acids Res., 31, 4354-4360.
【非特許文献４】Habu,Y., Miyano-Kurosaki,N., Kitano,M., Endo,Y., Yukita,M., Ohira,S., Takaku,H., Nashimoto,M. and Takaku,H. (2005) Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL. Nucleic Acids Res., 33, 235-243.
【非特許文献５】Takako Sano, Masayuki Takahashi, Tadasuke Nozaki, Yoshiaki Takahashi, Masato Tamura, and Masayuki Nashimoto. (2011) Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing. Biochem. and Biophys. Res. Commun. 416, 427-432.
【非特許文献６】Masayuki Takahashi, Reyad A. Elbarbary, Aiko Nakashima, Mayumi Abe, Norihiro Watanabe, Miwako Narita, Masuhiro Takahashi, Masato Tamura, Tetsuo Yoshida, and Masayuki Nashimoto. (2013) A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells. Cancer Letters 328, 362-368.
【非特許文献７】Norihiro Watanabe, Miwako Narita, Akie Yamahira, Tomoyo Taniguchi, Tatsuo Furukawa, Tetsuo Yoshida, Tatsuya Miyazawa, Masayuki Nashimoto, and Masuhiro Takahashi. (2013) Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA. Leukemia Research 37, 580-585.
【非特許文献８】Satoshi Iizuka, Nobuhiko Oridate, Masayuki Nashimoto, Satoshi Fukuda, and Masato Tamura. (2014) Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing. PLoS One 9, e114121.
【非特許文献９】Nakashima,A., Takaku,H., Shibata,H.S., Negishi,Y., Takagi,M., Tamura,M. and Nashimoto,M. (2007) Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA. Gene Therapy, 14, 78-85.
【非特許文献１０】Elbarbary,R.A., Takaku,H., Tamura,M. and Nashimoto,M. (2009) Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing.Biochem.and Biophys. Res. Commun., 379, 924-927.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、遺伝子発現を調節するための比較的短いオリゴヌクレオチド（スモールガイドアンチセンスオリゴヌクレオチド；以下、ｓｇＡＳＯとも言う）を含有する医薬組成物とそれを用いた疾患の処置方法を提供することを目的の一つとする。また、本発明の目的には、本発明は遺伝子発現を調節するための比較的短いオリゴヌクレオチドの設計方法を提供することが含まれる。【０００９】
ＴＲＵＥジーンサイレンシングにおいて、活性薬剤として用いられるスモールガイドアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｓｇＡＳＯ）が標的ＲＮＡに結合して、ｔＲＮａｓｅＺＬの基質となる構造を形成するためには、標的ＲＮＡの配列において少なくとも１つの内在性ステムループ構造が形成されることが必要であり、そのような配列を標的ＲＮＡ配列中に同定する工程が必要である。しかし、これまでは標的とするＲＮＡの一次配列より網羅的にステムループ構造などの高次構造やその安定性をこのような創薬技術として活用するレベルの精度で解析する手法は開発されてこなかった。本発明においては、ｓｇＡＳＯが標的ＲＮＡに結合して、ｔＲＮａｓｅＺＬの基質となるために少なくとも１つのステムループ構造が形成されるような配列を標的ＲＮＡ配列中に同定する方法を提供することを課題の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、遺伝子発現調節の対象となる標的ＲＮＡ配列について、その配列情報を元に構造解析を行なった。そして、得られた構造解析結果とそれぞれのエネルギー量から、それぞれの存在確率を算出した。内在性のステムループ部分構造の存在確率を統一的に算出することでより好ましい内在性ステムループ部分構造を特定し、ｓｇＡＳＯを設計するという方法を確立することで、本発明者らは、比較的短いオリゴヌクレオチドを用いて、効率よく細胞内における遺伝子発現を調節する手法を開発した。本発明は、本発明者らが開発したこのような手法に基づくものであり、以下の態様を包含する：【００１１】
［態様１］真核細胞内の標的ＲＮＡを切断するための方法であって、
１）標的ＲＮＡに相補的な６ｍｅｒから１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ｓｇＡＳＯ）がハイブリダイズすることによって、少なくとも１つのステムループ構造が形成される配列を標的ＲＮＡ配列中に同定する工程、
２）該ｓｇＡＳＯを調製して、真核細胞内において標的ＲＮＡと接触させる工程、
を含み、
該ｓｇＡＳＯがハイブリダイズして形成されるステムループ構造を真核細胞内のｔＲＮａｓｅＺＬが認識して標的ＲＮＡを切断することを特徴とする、方法。
［態様２］該ｓｇＡＳＯがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のステム部分の塩基対数が１１から１４である、態様１記載の方法。
［態様３］該ｓｇＡＳＯがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のステム部分の塩基対数が１２である、態様１または２記載の方法。
［態様４］ｓｇＡＳＯが７ｍｅｒである、態様１〜３のいずれか記載の方法。
［態様５］該ｓｇＡＳＯがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のうち、標的ＲＮＡによって形成されるステム部分の塩基対数が５である、態様１〜４のいずれか記載の方法。
［態様６］該ｓｇＡＳＯがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のうち、ループ部分が標的ＲＮＡによって形成されることを特徴とする、態様１〜５のいずれか記載の方法。
［態様７］該ｓｇＡＳＯがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のループ部分の塩基数が３から１０である、態様１〜６のいずれか記載の方法。
［態様８］該ｓｇＡＳＯがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のループ部分の塩基数が４から８である、態様１〜７のいずれか記載の方法。
［態様９］該ｓｇＡＳＯがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のループ部分の塩基数が７である、態様１〜８のいずれか記載の方法。
［態様１０］該ｓｇＡＳＯが標的ＲＮＡに完全に相補的であることを特徴とする、態様１〜９のいずれか記載の方法。
［態様１１］該ｓｇＡＳＯがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のステム部分がミスマッチまたはバルジを含まない、態様１〜１０のいずれか記載の方法。
［態様１２］該ｓｇＡＳＯがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のステム部分がミスマッチまたはバルジを含む、態様１〜１０のいずれか記載の方法。
［態様１３］ステム部分の塩基対数の計数において、ステム中のミスマッチまたはバルジの塩基数が２以下の場合は、ミスマッチまたはバルジが塩基対を形成するとみなしてカウントし、ステム中のミスマッチまたはバルジの塩基数が３以上の場合は、ミスマッチまたはバルジの塩基数の２分の１の数を塩基対数としてカウントする、態様１２記載の方法。
［態様１４］標的ＲＮＡがｍＲＮＡまたはｎｃＲＮＡである、態様１〜１３のいずれか記載の方法。
［態様１５］標的ＲＮＡが核ゲノム由来のＲＮＡである、態様１〜１４のいずれか記載の方法。
［態様１６］標的ＲＮＡがミトコンドリアゲノム由来のＲＮＡである、態様１〜１４のいずれか記載の方法。
［態様１７］標的ＲＮＡがウイルスゲノムまたは細菌ゲノム由来のＲＮＡである、態様１〜１４のいずれか記載の方法。
［態様１８］ｓｇＡＳＯが修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含む、態様１〜１７のいずれか記載の方法。
［態様１９］標的ＲＮＡによって形成されるステム部分の５’側配列と３’側配列の塩基数の差が１以下である、態様１〜１８のいずれか記載の方法。
［態様２０］該ｓｇＡＳＯの末端水酸基の一方または両方が修飾されている、態様１〜１９のいずれか記載の方法。
［態様２１］該ｓｇＡＳＯの末端水酸基の一方または両方にリン酸基が付加されている、態様１〜２０のいずれか記載の方法。
［態様２２］標的ＲＮＡ上のｓｇＡＳＯが結合する領域の５’側から構成する塩基をＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７とし、さらにｓｇＡＳＯが結合する領域の３’側に隣接する最初の塩基をＮ８とした場合に、以下の条件１〜３の少なくとも一つが満たされることを特徴とする、態様１〜２１のいずれか記載の方法：
−条件１：Ｎ８がＡもしくはＧである；
−条件２：Ｎ７がＣである；
−条件３：Ｎ６がＡ、ＣもしくはＧである。
［態様２３］ｓｇＡＳＯが配列番号１から配列番号１６３８４のいずれか１つの配列から成るオリゴヌクレオチドである、態様１〜２２のいずれか記載の方法。
［態様２４］約７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを含む、患者における疾患または障害の治療または予防に用いるための医薬組成物であって、
該約７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが、疾患または障害に関連する標的ＲＮＡに相補的であり、
該標的ＲＮＡが少なくとも１つのステムループ構造を形成することができ、
該約７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが該ステムループ構造の３’側の領域にハイブリダイズして、該標的ＲＮＡが形成するステムループと合わせて少なくとも１つのより大きなステムループ構造を形成することができ、
形成された構造が患者体内のｔＲＮａｓｅＺＬによって認識されて、標的ｍＲＮＡが切断されることを特徴とする、医薬組成物。
［態様２５］癌の治療もしくは予防のための医薬組成物であって、以下から選択されるいずれかの配列を含むｓｇＡＳＯを含む、医薬組成物：
５’−ＧＡＡＡＣＵＵ−３’；
５’−ＣＵＧＵＣＡＡ−３’；
５’−ＵＣＵＵＣＡＡ−３’；
５’−ＵＵＡＵＣＧＵ−３’；
５’−ＣＵＵＡＵＡＡ−３’；
５’−ＧＣＧＧＧＧＧ−３’；
５’−ＡＣＵＣＡＡＡ−３’。
［態様２６］真核細胞内の標的ＲＮＡを切断するためのオリゴヌクレオチド（ｓｇＡＳＯ）の設計方法であって、
１）標的ＲＮＡ配列中に少なくとも１つのステムループ構造が形成される配列を同定する工程、
２）該ステムループ構造に隣接する３’側の６〜１０塩基の配列をｓｇＡＳＯの結合配列として同定する工程、および
３）該結合配列に相補的な配列をｓｇＡＳＯの配列として同定する工程
を含む、方法。
［態様２７］態様２５記載のオリゴヌクレオチド（ｓｇＡＳＯ）の設計方法であって、
ｉ）標的ＲＮＡによって形成されるステムループ構造のステム部分の塩基対数が４〜８であり、
ｉｉ）該ステムループ構造のループ部分の塩基数が３から１０であり、
ｉｉｉ）該ステムループ構造のステム部分がミスマッチまたはバルジを含む場合、ステム部分の塩基対数の計数において、ステム中のミスマッチまたはバルジの塩基数が２以下の場合は、ミスマッチまたはバルジが塩基対を形成するとみなしてカウントし、ステム中のミスマッチまたはバルジの塩基数が３以上の場合は、ミスマッチまたはバルジの塩基数の２分の１の数を塩基対数としてカウントし、そして
ｉｖ）該ステム部分の５’側配列と３’側配列の塩基数の差が１以下である、
方法。
［態様２８］標的ＲＮＡ上のｓｇＡＳＯが結合する領域の５’側から構成する塩基をＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７とし、さらにｓｇＡＳＯが結合する領域の３’側に隣接する最初の塩基をＮ８とした場合に、以下の条件１〜３の少なくとも一つが満たされることを特徴とする、態様２７記載の方法：
−Ｎ８がＡもしくはＧである；
−Ｎ７がＣである；
−Ｎ６がＡ、ＣもしくはＧである。
［態様２９］スモールガイドアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｓｇＡＳＯ）の設計方法であって、
１）標的ＲＮＡ上に、存在確率の高いステムループを同定する工程、
２）該ステムループを評価する工程、および
３）該ステムループを形成する塩基対の３’側直後から７塩基を標的配列（センス鎖）とし、そのアンチセンス鎖をｓｇＡＳＯ配列として同定する工程
を含み、
ここで、１）標的ＲＮＡ上に、存在確率の高いステムループを同定する工程は、
ｉ）５’末端からＲ塩基刻みでＷ塩基の幅の枠ｎを設定し、該枠ｎは標的ＲＮＡからｎｍａｘ個得られ、それぞれの枠ｎにおいて、構成するＷ塩基の塩基配列についてパターンマッチングによって取り得る塩基対パターンを算出し、その結果に公知の熱力学的安定性計算を適用し、それぞれの塩基対パターンに対してΔＧとして与えることを含む、構造予測ステップと、
ｉｉ）枠ｎにおいてｍｍａｘ（ｎ）個得られている予測構造結果とそれぞれのエネルギー量から該ＲＮＡがおかれている細胞内での状態が平衡状態であることを仮定し、予測構造結果それぞれの存在確率をマクスウェル＝ボルツマン統計に従って算出し、ここで、ｎ枠目での構造予測結果のうち最安定構造からｍ番目の予測結果について、その存在確率をおのおのｊ（ｎ，ｍ）とすることを含む、構造解析ステップと、
ｉｉｉ）枠内ではなく配列上の絶対位置ｘから始まり、構成するループとステムの特徴プロファイル（ステムを構成する塩基対の塩基の位置で定義されるステムループの個性）をｐとした時に、当該ステムループをｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ）と呼び、ｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ）の枠ｎ内での存在確率を、部分的な存在確率Ｐ＿ｌｏｃａｌ（ｘ，ｐ，ｎ）とし、その値は、枠ｎにおいて得られた構造予測結果すべてについての中で当該ステムループが存在する構造予測結果についてのｊ値の総和Σｊ（ｎ，ｍ）であるとすることを含む、局所存在確率計算ステップ、ここで、枠ｎにおける、ｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ）の局所的な存在確率Ｐ＿ｌｏｃａｌ（ｘ，ｐ，ｎ）は以下で表され：
【数１】
2019044974.tif 000003
ｉｖ）Ｐ＿ｌｏｃａｌ（ｘ，ｐ，ｎ）について枠１からｎｍａｘまで総和をとった結果をΣＰ＿ｌｏｃａｌ（ｘ，ｐ，ｎ）、ステムループｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ）を構成する配列全長が枠内におさまることのできる枠の数をｎ＿ａｌｌ（ｘ，ｐ）個としたとき、全体の中でのｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ）の存在確率Ｐ＿ｇｌｏｂａｌ（ｘ，ｐ）をΣＰ＿ｌｏｃａｌ（ｘ，ｐ，ｎ）／ｎ＿ａｌｌ（ｘ，ｐ）として表すことを含む、存在確率計算ステップ、ここで、ｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ）についての全体の中での存在確率Ｐ＿ｇｌｏｂａｌ（ｘ，ｐ）は以下で表され：
【数２】
2019044974.tif 000004
ｖ）得られたｍｏｔｉｆ（ｘ、ｐ）についての存在確率Ｐ＿ｇｌｏｂａｌ（ｘ，ｐ）に対して、存在確率および特徴ｐから、ステムループを選択する解析ステップ
を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明に従って設計したｓｇＡＳＯ（ＶＩＳ−１〜ＶＩＳ−７）によるＢｃｌ−２  ｍＲＮＡの発現抑制について、ヒト白血病細胞株ＨＬ６０を用いて試験した結果を示すグラフである。結果として、既に報告されているｓｇＡＳＯであるＨｅｐ１と比して、倍程度の活性を示すｓｇＡＳＯとしてＶＩＳ−１、ＶＩＳ−５を得ることができた。縦軸はｍｏｃｋ（溶媒とした水のみの試料）を１とした場合の相対的Ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者らは、比較的短いオリゴヌクレオチドを用いて、効率よく細胞内における遺伝子発現を調節する手法を開発した。以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
ＴＲＵＥジーンサイレンシング
本発明の発明者らは、ＴＲＵＥジーンサイレンシング（tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing）と名付けた新しい遺伝子発現抑制技術を開発している。ｔＲＮａｓｅ  ＺＬは、ｔＲＮＡの３’末端部をプロセシングするエンドリボヌクレアーゼ（ｔＲＮａｓｅ  Ｚまたは３’ｔＲＮａｓｅ）の分子量の大きい種類の酵素であり、前駆体ｔＲＮＡの３’末端部を切除する。このＴＲＵＥジーンサイレンシングは、標的ＲＮＡと合成スモールガイドアンチセンス核酸とによって形成されるｐｒｅ−ｔＲＮＡ様またはマイクロｐｒｅ−ｔＲＮＡ様複合体を認識することによって、いかなるＲＮＡの任意箇所をも切断することができるという哺乳動物ｔＲＮａｓｅ  ＺＬのユニークな酵素的特性に基づいている。スモールガイドアンチセンスオリゴヌクレオチド（特にスモールガイドＲＮＡ）は、５’−ｈａｌｆ  ｔＲＮＡ（Nashimoto,M. (1996) Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5’ half tRNA by mammalian tRNA 3’ processing endoribonuclease. RNA, 2, 2523-2524.）、１２〜１６−ｎｔ直鎖ＲＮＡ（Shibata,H.S., Takaku,H., Takagi,M. and Nashimoto,M. (2005) The T ループ structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem., 280, 22326-22334.）、ヘプタマー型ＲＮＡ（Nashimoto,M., Geary,S., Tamura,M. and Kasper,R. (1998) RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3’ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res., 26, 2565-2571.）およびフック型ＲＮＡ（Takaku,H., Minagawa,A., Takagi,M. and Nashimoto,M. (2004) A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3’ terminal nucleotides from RNA molecules. Nucleic Acids Res., 32, e91.）の４種に分けられる。
【００１５】
これまでに、様々なｍＲＮＡを標的とするスモールガイドアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｓｇＡＳＯ）を、その発現プラスミドまたは２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡを導入することによって、様々な哺乳動物細胞におけるＴＲＵＥジーンサイレンシングの有効性が実証されている。例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＨＩＶ−１発現は、５’−ｈａｌｆ  ｔＲＮＡ型ｓｇＲＮＡによって１８日間以上抑制され（上掲のHabu et al. (2005)）、マウス肝臓におけるルシフェラーゼ発現はヘプタマー型ｓｇＡＳＯによって抑制された（上掲のNakashima et al. (2007)）。さらに、ＴＲＵＥジーンサイレンシングの効果は、ＲＮＡ干渉（RNA interference：ＲＮＡｉ）と同等であり、幾つかの場合ではＲＮＡｉの効果を凌ぐことも確認されている。
【００１６】
ｔＲＮａｓｅ  ＺＬが核内だけでなくサイトゾルにも存在すること、そしてｓｇＡＳＯとして使用していたのと同一の５’−ｈａｌｆ  ｔＲＮＡが細胞質に存在することが見出されている。また、ヒトサイトゾルｔＲＮａｓｅ  ＺＬが、５’−ｈａｌｆ  ｔＲＮＡの指揮のもとでｍＲＮＡを切断することによって遺伝子発現を調節すること、そしてＰＰＭ１Ｆ  ｍＲＮＡがｔＲＮａｓｅ  ＺＬの真の標的の一つであることが見出されている（Elbarbary,R.A., Takaku,H., Uchiumi,N., Tamiya,H., Abe,M., Takahashi,M., Nishida,H. and Nashimoto,M. (2009) Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA. PLoS ONE, 4, e5908.）。さらにまた、ｍｉＲ−１０３を含むマイクロＲＮＡの一部がフック型ｓｇＡＳＯとして働き、サイトゾルｔＲＮａｓｅ  ＺＬによるｍＲＮＡ切断を介して遺伝子発現を下方調節し得ることが証明されている（Elbarbary,R.A., Takaku,H., Uchiumi,N., Tamiya,H., Abe,M., Nishida,H. and Nashimoto,M. (2009) Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA. FEBS Lett., 583, 3241-3246.）。以上のことから、ＴＲＵＥジーンサイレンシングは、細胞内の小さな非コードＲＮＡによって作動されるサイトゾルｔＲＮａｓｅ  ＺＬの新たに解明された生理学的役割を基礎として機能していることは明らかである。
【００１７】
ＴＲＵＥジーンサイレンシングの最終的な目的の一つは、特定遺伝子の発現を原因とする疾患治療剤または予防剤としてのｓｇＡＳＯの使用である。例えば、発明者らは以前に、癌治療の分子標的として有望視されているＢｃｌ−２およびＶＥＧＦをコードする細胞内ｍＲＮＡレベルが、５’−ｈａｌｆ  ｔＲＮＡ型ｓｇＡＳＯ、１４−ｎｔ直鎖型ｓｇＡＳＯまたはヘプタマー型ｓｇＡＳＯによって発現抑制されることを見出している（上掲のTamura et al.(2003)およびElbarbary et al. (2009)）。本発明の態様の一つは、真核細胞内の標的ＲＮＡを切断するための方法であって、（１）標的ＲＮＡに相補的な６ｍｅｒから１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ｓｇＡＳＯ）がハイブリダイズすることによって、少なくとも１つのステムループ構造が形成される配列を標的ＲＮＡ配列中に同定する工程、および（２）該ｓｇＡＳＯを調製して、真核細胞内において標的ＲＮＡと接触させる工程を含み、該ｓｇＡＳＯがハイブリダイズして形成されるステムループ構造を真核細胞内のｔＲＮａｓｅＺＬが認識して標的ＲＮＡを切断することを特徴とする方法に関する。本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでも、ｉｎ  ｖｉｖｏでも適用されうる。ヒトもしくは非ヒト動物に対してｉｎ  ｖｉｖｏで適用される場合、このような、真核細胞内の標的ＲＮＡを切断するための方法は、望ましくない遺伝子の発現に関係する疾患または障害の治療のために用いられうる。したがって、別の観点からは、本発明の態様の一つは、ヒトもしくは非ヒト動物における望ましくない遺伝子の発現に関係する疾患または障害の治療のための方法であって、（１）疾患に関係する遺伝子から転写された標的ＲＮＡに相補的な６ｍｅｒから１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ｓｇＡＳＯ）がハイブリダイズすることによって、少なくとも１つのステムループ構造が形成される配列を標的ＲＮＡ配列中に同定する工程、および（２）該ｓｇＡＳＯを調製して、ヒトもしくは非ヒト動物に投与し、その細胞内において標的ＲＮＡと接触させる工程を含み、該ｓｇＡＳＯがハイブリダイズして形成されるステムループ構造を該細胞内のｔＲＮａｓｅＺＬが認識して標的ＲＮＡを切断することを特徴とする方法に関する。対象とする疾患は、例えば、癌でありうる。
【００１８】
スモールガイドアンチセンス核酸（ｓｇＡＳＯ）
一つの態様において、スモールガイドアンチセンス核酸は、比較的短いオリゴヌクレオチドであり、例えば６ｍｅｒから１０ｍｅｒ、つまり、６ｍｅｒ、７ｍｅｒ、８ｍｅｒ、９ｍｅｒ、または１０ｍｅｒ、好ましくは７ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ヘプタマー型ｓｇＡＳＯ）である。ｓｇＡＳＯを薬剤成分とする場合、薬理学的およびＣＭＣ（Chemistry，Manufacturing and Control）の視点からは、より短いｓｇＡＳＯが好ましい。何故ならば、より短いｓｇＡＳＯは長鎖のｓｇＡＳＯよりも簡便かつ安価に合成することができる。また、より短いｓｇＡＳＯは、細胞導入剤（トランスフェクション試薬等）およびＤＤＳ基剤を用いることなく容易に細胞内に取込ませることができる（Loke,S.L., Stein,C.A., Zhang X.H., Mori,K., Nakanishi,M., Subasinghe,C., Cohen,J.S. and Neckers,L.M. (1989) Characterization of oligonucleotide transport into living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3474-3478.）。実際の応用において、合成上の利点や、配列認識の特異性の観点からは、７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが好ましいとされ得る。
【００１９】
本発明に係るｓｇＡＳＯは、公知の化学合成を用いる方法、あるいは酵素的転写法等にて製造することができる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法等をあげることができ、例えば、ＡＢＩ３９００ハイスループット核酸合成機（アプライドバイオシステムズ社製）やＮＴＳ  Ｈ−６核酸合成機（日本テクノサービス社製）、Ｏｌｉｇｏｉｌｏｔ１０核酸合成機（ＧＥヘルスケア社製）により合成することができる。酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有するプラスミドまたはＤＮＡを鋳型として、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼを用いた転写をあげることができる。合成法または転写法により製造したヘプタマー型ｓｇＡＳＯは、次いでＨＰＬＣ等にて精製する。例えばＨＰＬＣ精製時には、triethylammonium acetate（ＴＥＡＡ）またはhexylammonium acetate（ＨＡＡ）とアセトニトリルの混合溶液を用いて、ｓｇＡＳＯをカラムから溶出する。その後、溶出体積の１０００倍量の蒸留水で溶出溶液を１０時間透析し、透析溶液を凍結乾燥した後、使用時まで冷凍保存する。使用時には、例えば、蒸留水で最終濃度が１００μＭ程度になるように溶解する。
【００２０】
本発明に係るｓｇＡＳＯに用いられる核酸としては、ヌクレオシドまたはそのヌクレオシドと同等の機能を有する分子がヌクレオシド間結合を介して重合した分子であればいかなるものでもよい。ヌクレオシドは、塩基（核酸塩基）と糖が結合した化合物の一種である。塩基としては、アデニン、グアニンなどのプリン塩基、チミン、シトシン、ウラシルなどのピリミジン塩基、ニコチンアミド、ジメチルイソアロキサジンなどを含む。アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジンなどが代表的なヌクレオシドである。ヌクレオチドとは、ヌクレオシドにリン酸基が結合した物質である。オリゴヌクレオチド（ポリヌクレオチドとも言う）としては、例えばリボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡが混合した重合体、修飾ヌクレオシドを含むヌクレオチド重合体が、それぞれあげられる。天然のＤＮＡ、ＲＮＡはヌクレオシド間結合として、ホスホジエステル結合を有している。本発明に係るｓｇＡＳＯに用いられる核酸は、修飾を含むものであってもよい。核酸修飾の位置には、糖部分、骨格（連結）部分、核酸塩基（塩基）部分、３’または５’末端部分が含まれる。また、本発明において用いられるｓｇＡＳＯには、モルホリノ核酸、ペプチド核酸が含まれていてもよい。
【００２１】
修飾ヌクレオシド
修飾ヌクレオシドとしては、例えばＲＮＡまたはＤＮＡと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上または安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、あるいは可視化させるために、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、ＲＮＡまたはＤＮＡに修飾を施した分子を挙げるこことができる。例えば、糖部修飾ヌクレオシドがあげられる。本発明のｓｇＡＳＯは、例えば、Khvorova & Watts（Nature Biotechnology 35, 238-248 (2017) doi:10.1038/nbt.3765）に開示の修飾核酸分子を含んでいてもよい。
【００２２】
修飾糖とは、天然糖部分（すなわち、ＤＮＡ（２’−Ｈ）またはＲＮＡ（２’−ＯＨ）中に認められる糖部分）からの置換および／または任意の変化を有する糖を指し、糖部修飾ヌクレオシドとは、修飾糖を含む修飾ヌクレオシドを指す。糖部修飾ヌクレオシドとは、ヌクレオシドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学構造物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、２’−Ｏ−メチルリボースで置換された修飾ヌクレオシド、２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された修飾ヌクレオシド、２’−メトキシエトキシリボースで置換された修飾ヌクレオシド、２’−Ｏ−メトキシエチルリボースで置換された修飾ヌクレオシド、２’−Ｏ−［２−（グアニジウム）エチル］リボースで置換された修飾ヌクレオシド、２’−Ｏ−フルオロリボースで置換された修飾ヌクレオシド、糖部に架橋構造を導入することにより２つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸（Bridged Nucleic Acid）（ＢＮＡ）、より具体的には、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸（Locked Nucleic Acid：ＬＮＡ）、エチレン架橋構造型人工核酸（Ethylene bridged nucleic acid：ＥＮＡ）［Nucleic Acid Research, 32, e175 (2004)］等があげられ、さらにペプチド核酸（ＰＮＡ）［Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)］、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）［J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)］、およびペプチドリボ核酸（ＰＲＮＡ）［J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)］等をあげることができる。
【００２３】
ＲＮＡの２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾（２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ）は、天然にも存在する修飾であり、修飾オリゴヌクレオチドの結合親和性とヌクレアーゼ耐性を向上させると共に、免疫刺激性を低下させる。２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）は、ヌクレアーゼ耐性が２’−ＯＭｅ修飾よりもさらに増加しており、修飾ヌクレオチドの結合親和性（ΔＴｍ）も大幅に上昇している。２’−ＯＭｅを含有するｓｇＡＳＯは、ｔＲＮａｓｅＺＬによる認識と切断にも適合する。ＲＮＡの２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾（２’−Ｆ−ＲＮＡ）を用いてオリゴヌクレオチドの親和性を増加させることもできる。他の２’修飾核酸としては、２’−Ｆ−ＡＮＡや、関根らの２’―修飾誘導体（特許第５１９４２５６号、特開２０１５−０２０９９４）を挙げることができる。
【００２４】
リボースの２’酸素と４’炭素を連結したＬＮＡ（Locked nucleic acid）は、結合親和性に大幅な増加をもたらす。ＬＮＡでは、ＲＮＡのリボース糖の２’酸素と４’炭素が環構造において固定されている。この修飾は、特異性、親和性、および半減期を増加させ、目的の組織への効果的な送達を、より低い毒性で可能とする。ＬＮＡで完全に修飾された約８ヌクレオチドよりも長いオリゴマーは凝集する傾向があることが知られており、一般的には、ＤＮＡや他の糖部修飾核酸との混合で用いられる。ＬＮＡを含有するｓｇＡＳＯは、ｔＲＮａｓｅＺＬによる認識と切断にも適合する。
【００２５】
ＬＮＡのメチル化類似体であるｃＥｔもＬＮＡと同様に有用である。トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）は、３環骨格に基づく拘束型ヌクレオチドである。
【００２６】
修飾ヌクレオシドとしては、その他に、核酸の塩基部分の原子（例えば、水素原子、酸素原子）もしくは官能基（例えば、水酸基、アミノ基）が他の原子（例えば、水素原子、硫黄原子）、官能基（例えば、アミノ基）、もしくは炭素数１〜６のアルキル基で置換されたものまたは保護基（例えばメチル基またはアシル基）で保護されたもの、ヌクレオシドに、例えば脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素など、別の化学物質を付加した分子等を用いてもよい。
【００２７】
修飾核酸塩基（または修飾塩基）には、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、またはウラシル以外のあらゆる核酸塩基が含まれるが、例えば、５−メチルシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−ヨードシトシン、Ｎ４−メチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、２−チオチミン、Ｎ６−メチルアデニン、８−ブロモアデニン、Ｎ２−メチルグアニン、８−ブロモグアニン、およびイノシンなどが挙げられる。
【００２８】
ヌクレオシド間結合
天然のＤＮＡ、ＲＮＡはヌクレオシド間結合として、ホスホジエステル結合を有している。本発明の一つの態様においては、ヌクレオシド間結合は、修飾を含んでいてもよい。修飾ヌクレオシド間結合とは、天然に存在するヌクレオシド間結合（すなわち、ホスホジエステル結合）からの置換または任意の変化を有するヌクレオシド間結合を指し、修飾ヌクレオシド間結合には、リン原子を含むヌクレオシド間結合、およびリン原子を含まないヌクレオシド間結合が含まれる。修飾ヌクレオシド間結合としては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学物質を付加あるいは置換したものでもよく、例えば、ホスホロチオエート結合に置換された修飾ヌクレオシド間結合、Ｎ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に置換された修飾ヌクレオシド間結合等をあげることができる。他の修飾ヌクレオシド間結合としては（ＳＣ５’Ｒｐ）−α，β−ＣＮＡ、ＰＭＯなどが挙げられる。
【００２９】
代表的なリン含有ヌクレオシド間結合としては、例えば、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、およびメチルホスホネート結合、メチルチオホスホネート結合、ボラノホスフェート結合、ホスホロアミデート結合を挙げることができる。
【００３０】
主要な修飾ヌクレオシド間結合の一つであるホスホロチオエート（ＰＳ）結合は、ヌクレアーゼによる分解からオリゴヌクレオチドを保護するのに役立つ。ホスホロジチオエート（ＰＳ）修飾は、もともとはヌクレアーゼ耐性を付与するためにオリゴヌクレオチドに組み込まれたものであるが、この修飾は、オリゴヌクレオチドの輸送と取り込みにも大きな影響を与える。ＰＳは、ＡＳＯの電荷を変えることによって、受容体部位および血漿タンパク質への結合を増加させ、標的組織に到達するＡＳＯの量を増加させる。ヘパリン結合タンパク質は、ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドの最も親和性の高い標的の一つである。血漿タンパク質による適切な結合は、腎臓系による血液からの迅速な排除を抑制し、最適な送達を促進する。ホスホチオエート結合を有するｓｇＡＳＯは、ｔＲＮａｓｅＺＬによる認識と切断にも適合する。
【００３１】
ホスホロチオエート結合は、リン原子部分に立体中心を有しており、完全修飾オリゴヌクレオチドは通常、２ｎ−１種のジアステレオマーの混合物となる（例えば、７ｍｅｒのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、２６種のジアステレオマーの混合物となる）。ＳｐおよびＲｐジアステレオマー結合は、異なる特性を示すことが知られている。Ｒｐジアステレオマーは、Ｓｐジアステレオマーよりもヌクレアーゼ耐性が低いが、より高い親和性で相補鎖と結合する。本発明のｓｇＡＳＯにおいては、特定のホスホロチオエート結合が特定のジアステレオマーとなるように合成を制御してもよい。
【００３２】
リガンド等を連結したオリゴヌクレオチド／末端修飾オリゴヌクレオチド
核酸に別の化学物質を付加した分子としては、例えば、５’−ポリアミン付加誘導体、コレステロール付加誘導体、ステロイド付加誘導体、胆汁酸付加誘導体、ビタミン付加誘導体、Ｃｙ５付加誘導体、Ｃｙ３付加誘導体、６−ＦＡＭ付加誘導体、ビオチン付加誘導体等および北出らの誘導体（ＰＣＴ／ＪＰ２００７／００００８７、ＰＣＴ／ＪＰ２０１６／５９３９８）をあげることができる。リガンド等を付加する部位は、オリゴヌクレオチドの末端（５’末端または３’末端）および／またはオリゴヌクレオチドの内部でありうる。
【００３３】
末端修飾の例として、ＧａｌＮＡｃ連結オリゴヌクレオチドやＰＵＦＡ連結オリゴヌクレオチドが知られている。ＧａｌＮＡｃを末端に連結することにより、オリゴヌクレオチドの肝臓への送達効率を高めることができる。本発明において用いられるｓｇＡＳＯには、ＧａｌＮＡｃなどのリガンドが連結されていてもよい。
【００３４】
短いオリゴヌクレオチドは、腎臓に多く送達され、長いオリゴマーは肝臓に多く送達される傾向がある。短いオリゴヌクレオチドは、血漿タンパク質に結合しにくく、結果として血漿中の半減期が短くなる傾向があるが、切断可能なリンカーなどを用いて多量体を構築することが可能である。本発明において用いられるｓｇＡＳＯは、切断可能なリンカーなどを用いて、他のｓｇＡＳＯに連結されていてもよい。
【００３５】
本発明に係るｓｇＡＳＯは、５’末端および／または３’末端にリン酸基が付加されていてもよい。他の末端修飾としては、Ｅ−ＶＰ、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、Ｃ−メチルアナログなどがあり、オリゴヌクレオチドの安定性を高めることが知られている。本発明において用いられるｓｇＡＳＯは、これらの末端修飾を含んでいてもよい。
【００３６】
ｓｇＡＳＯの配列設計
本発明に係るｓｇＡＳＯは、塩基対合を介して標的ＲＮＡとｔＲＮＡアクセプターステム様二重鎖を形成することによって、ｔＲＮａｓｅ  ＺＬによる標的ＲＮＡの特異的切断を可能とするため、ｓｇＡＳＯの標的部位は、ｔＲＮＡ  Ｔアームに類似する安定したヘアピン構造領域の直下となる。ｓｇＡＳＯはその７塩基だけでなく、安定したヘアピン構造を形成する配列領域の特異性によって効果的にＲＮＡを切断する。したがって、ｓｇＡＳＯの塩基配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列情報に基づき設計することができる。
【００３７】
本発明の態様の一つは、上述のとおり、真核細胞内の標的ＲＮＡを切断するための方法であって、（１）標的ＲＮＡに相補的な６ｍｅｒから１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ｓｇＡＳＯ）がハイブリダイズすることによって、少なくとも１つのステムループ構造が形成される配列を標的ＲＮＡ配列中に同定する工程、および（２）該ｓｇＡＳＯを調製して、真核細胞内において標的ＲＮＡと接触させる工程を含み、該ｓｇＡＳＯがハイブリダイズして形成されるステムループ構造を真核細胞内のｔＲＮａｓｅＺＬが認識して標的ＲＮＡを切断することを特徴とする方法に関する。
【００３８】
ｔＲＮＡのアクセプターステムとＴアームは、立体構造上は直列して一本のステムループ構造をとっており、ｔＲＮａｓｅ  ＺＬはこのステムループ構造を認識して、ＲＮＡの切断を行うと考えられる。よって、ｓｇＡＳＯと標的ＲＮＡとがハイブリダイズすることにより、このようなアクセプターステムとＴアームが形成する構造と類似の一本のステムループ構造を再現できれば、標的ＲＮＡの切断も可能となる。
【００３９】
例えば、ヒトのグルタミン酸ｔＲＮＡの場合、アクセプターステムは７塩基長であり、Ｔアームのステム部分は５塩基長であり、Ｔアームのループ部分は７塩基長である。よって、アクセプターステムに対応するｓｇＡＳＯは、例えば、７塩基長であり得るが、必ずしもこれに限定はされない。本発明に係るｓｇＡＳＯの長さは、例えば、６〜１０ｍｅｒであり得る。また、標的ＲＮＡが形成するＴアーム様のステムループ構造は、ステム部分が５塩基長であり、ループ部分が７塩基であり得るが、必ずしもこれに限定はされない。標的ＲＮＡが形成するＴアーム様ステムループ構造のステム部分の長さは、例えば、４〜８塩基長であり得る。ループ部分の塩基数は、例えば、３〜１０塩基であることができ、好ましくは４〜８塩基である。さらに、ｓｇＡＳＯの長さと、標的ＲＮＡが形成するＴアーム様のステムループ構造のステム部分の長さの和は、１２塩基長であり得るが、これも必ずしもそれに限定はされない。この長さの和は、例えば、１１〜１４塩基であり得る。ただし、実際の応用において、合成上の利点や、配列認識の特異性の観点からは、ｓｇＡＳＯは７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであることが好ましいとされ得る。また、標的ＲＮＡが形成するＴアーム様のステムループ構造については、安定性や存在確率の観点から、ステム部分の長さが５塩基長であることが好ましいとされ得る。また、同様な観点から、標的ＲＮＡが形成するＴアーム様のステムループ構造については、ステム部分の２本の鎖の長さが均等（ループを挟んでステムの５’側配列と３’側配列の塩基数の差が１つ以内）であって、ループ部分の長さが１０を超えないものが好ましいとされ得る。
【００４０】
ｓｇＡＳＯの配列設計においては、本発明者らが行ったｔＲＮＡ遺伝子の配列解析の結果に基づき、標的ＲＮＡ上のｓｇＡＳＯが結合する領域の５’側から構成する塩基をＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７とし、さらにｓｇＡＳＯが結合する領域の３’側に隣接する最初の塩基をＮ８とした場合に、以下の条件１〜３の少なくとも１つを満たすように配列を設計してもよく、条件１〜３の少なくとも２つ、あるいは条件１〜３の全てを満たすように配列を設計してもよい：
−条件１：Ｎ８がＡもしくはＧである；
−条件２：Ｎ７がＣである；
−条件３：Ｎ６がＡ、ＣもしくはＧである。
【００４１】
標的ＲＮＡが形成するＴアーム様のステムループ構造および／または標的ＲＮＡとｓｇＡＳＯとが形成するアクセプターステム様構造には、ワトソン−クリック型塩基対以外の非ワトソン−クリック型塩基対（例えばＧ−Ｕ結合）が含まれていてもよい。また、ステムにはミスマッチやバルジが含まれていてもよい。
【００４２】
ｓｇＡＳＯが７ｍｅｒである場合は、ｓｇＡＳＯは、配列番号１から配列番号１６３８４のいずれか１つの配列から成るオリゴヌクレオチドでありうる。なお、本明細書において「配列番号ｎ」は「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：ｎ」と表記する場合もある。配列番号１から配列番号１６３８４の配列を以下の表に示す：
【００４３】
【表１】
2019044974.tif 000005
【００４４】
【表２】
2019044974.tif 000006
【００４５】
【表３】
2019044974.tif 000007
【００４６】
【表４】
2019044974.tif 000008
【００４７】
【表５】
2019044974.tif 000009
【００４８】
【表６】
2019044974.tif 000010
【００４９】
【表７】
2019044974.tif 000011
【００５０】
【表８】
2019044974.tif 000012
【００５１】
【表９】
2019044974.tif 000013
【００５２】
【表１０】
2019044974.tif 000014
【００５３】
【表１１】
2019044974.tif 000015
【００５４】
【表１２】
2019044974.tif 000016
【００５５】
【表１３】
2019044974.tif 000017
【００５６】
【表１４】
2019044974.tif 000018
【００５７】
【表１５】
2019044974.tif 000019
【００５８】
【表１６】
2019044974.tif 000020
【００５９】
【表１７】
2019044974.tif 000021
【００６０】
【表１８】
2019044974.tif 000022
【００６１】
【表１９】
2019044974.tif 000023
【００６２】
【表２０】
2019044974.tif 000024
【００６３】
【表２１】
2019044974.tif 000025
【００６４】
【表２２】
2019044974.tif 000026
【００６５】
【表２３】
2019044974.tif 000027
【００６６】
【表２４】
2019044974.tif 000028
【００６７】
【表２５】
2019044974.tif 000029
【００６８】
【表２６】
2019044974.tif 000030
【００６９】
【表２７】
2019044974.tif 000031
【００７０】
【表２８】
2019044974.tif 000032
【００７１】
【表２９】
2019044974.tif 000033
【００７２】
【表３０】
2019044974.tif 000034
【００７３】
【表３１】
2019044974.tif 000035
【００７４】
【表３２】
2019044974.tif 000036
【００７５】
【表３３】
2019044974.tif 000037
【００７６】
【表３４】
2019044974.tif 000038
【００７７】
【表３５】
2019044974.tif 000039
【００７８】
【表３６】
2019044974.tif 000040
【００７９】
【表３７】
2019044974.tif 000041
【００８０】
【表３８】
2019044974.tif 000042
【００８１】
【表３９】
2019044974.tif 000043
【００８２】
【表４０】
2019044974.tif 000044
【００８３】
【表４１】
2019044974.tif 000045
【００８４】
【表４２】
2019044974.tif 000046
【００８５】
【表４３】
2019044974.tif 000047
【００８６】
【表４４】
2019044974.tif 000048
【００８７】
【表４５】
2019044974.tif 000049
【００８８】
【表４６】
2019044974.tif 000050
【００８９】
【表４７】
2019044974.tif 000051
【００９０】
【表４８】
2019044974.tif 000052
【００９１】
【表４９】
2019044974.tif 000053
【００９２】
【表５０】
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【００９３】
【表５１】
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【００９４】
【表５２】
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【００９５】
【表５３】
2019044974.tif 000057
【００９６】
【表５４】
2019044974.tif 000058
【００９７】
標的ＲＮＡが形成するＴアーム様のステムループ構造を標的ＲＮＡ中に同定するために、パターンマッチングおよび熱力学的安定性に基づく評価を行うという構造解析を行うことができる。構造解析のための計算においては、１）ｍＲＮＡは一本鎖でタンパク質の関与なく自身のみで高次構造をとる、２）ｍＲＮＡはリボソームによりタンパク質合成の最中にあっては全長ではなくリボソームとリボソームに挟まれたと仮定されるある部分としての一定長の部分配列で高次構造をとる、３）単一の一次構造のｍＲＮＡ（あるいはその部分としての一定長の部分配列）は複数の高次構造をとることが想定されそれらは平衡状態にある（すなわちエネルギー量に応じて存在確率が分布している）、という作業仮説を置くことができる。内在性の部分構造の算出や評価については、この仮説を元に算出することができる。さらに、ｓｇＡＳＯの設計は、ｓｇＡＳＯと内在性の構造が形作る高次構造をｔＲＮａｓｅ  ＺＬが認識しうるかという点について、内在性の構造として１）ループが１０塩基以下、２）ステムが５塩基対、であるという仮説を置くことができる。パターンマッチングおよび熱力学的安定性に基づく構造解析においては網羅的に考えうるすべての構造を取り扱うこともできれば、一般的な構造予測ソフトウェアを用いて重要と思われる構造のみを算出することで解析を簡素化することもできる。構造予測には、例えば、vswindow、UNAFold、mfoldなどのソフトウェアを利用することができる。
【００９８】
構造予測に関しては、以下の参考文献を参照してもよい：
- Markham, N. R. & Zuker, M. (2005) DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res., 33, W577-W581; 
- Markham, N. R. & Zuker, M. (2008) UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. In Keith, J. M., editor, Bioinformatics, Volume II. Structure, Function and Applications, number 453 in Methods in Molecular Biology, chapter 1, pages 3-31. Humana Press, Totowa, NJ. ISBN 978-1-60327-428-9.）。
【００９９】
例えば、ｍＲＮＡの５’末端からＲ塩基刻みでＷ塩基の幅の枠ｎを設定し（枠は、対象とするトランスクリプトからｎｍａｘ個得られる）、それぞれの枠ｎにおいて、予測構造結果とそれぞれのエネルギー量から、当該ｍＲＮＡがおかれている細胞内での状態が平衡状態であることを仮定して、予測構造結果それぞれの存在確率をマクスウェル＝ボルツマン統計より算出する。ここで、ｎ枠目での構造予測結果のうち最安定構造からｍ番目の予測結果（枠ｎにおいて、予測構造結果はｍｍａｘ（ｎ）個得られている）については、その予測された構造の存在確率をｊ（ｎ，ｍ）とすることができる。
【０１００】
ここで、各構造予測結果中それぞれに発見される部分構造として、ループ部位を１つだけ持ち、互いに相手とだけ相補的である１つのステムよりなるものをステムループ構造と定義する（ステムループ中のステムの「互いに相手とだけ相補的である」とは、他の予測構造枠であっても他のステムループを構成しないという意味ではなく、ある１つの予測構造結果において、単一のステムループ中に他のステムループの一部を決して含まないという意味である）。ここで、ステムにはミスマッチ（ステム中にある、塩基対に参加しない塩基が対向しているもの）やバルジ（ステム中にある、塩基対に参加しない塩基が対向していないもの）を含んでもよいが、両端は塩基対であるものとする。さらに、ステムループが内包するステムループも別個のステムループとみなす（例えば、ステムの最もループから遠い塩基対がほどけたものは、解けていないものと別のステムループとみなす）。
【０１０１】
こうしたステムループを、枠内ではなく配列上の絶対位置ｘから始まり、構成するループとステムの特徴プロファイル（ステムを構成する塩基対の塩基の位置で定義されるステムループの個性）をｐとした時に、ｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ）と呼ぶ。そして、ｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ）の枠ｎ内での存在確率を、部分的な存在確率Ｐ＿ｌｏｃａｌ（ｘ，ｐ，ｎ）とし、その値は、ｎ枠において得られた構造予測結果の中で当該ステムループが存在する構造についてのｊ値の総和すなわちΣｊ（ｎ，ｍ）であるとする。さらに、このＰ＿ｌｏｃａｌ（ｘ，ｐ，ｎ）について枠１からｎｍａｘまで総和をとった結果をΣＰ＿ｌｏｃａｌ（ｘ，ｐ，ｎ）、当該ステムループを構成する配列全長が枠内におさまることのできる枠の数をｎ＿ａｌｌ（ｘ，ｐ）個としたとき、全体の中でのｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ）の存在確率Ｐ＿ｇｌｏｂａｌ（ｘ，ｐ）は、ΣＰ＿ｌｏｃａｌ（ｘ，ｐ，ｎ）／ｎ＿ａｌｌ（ｘ，ｐ）として表される。
【０１０２】
すなわち、枠ｎにおける、ｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ）の局所的な存在確率Ｐ＿ｌｏｃａｌ（ｘ，ｐ，ｎ）は：
【数３】
2019044974.tif 000059
ｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ）についての、全体の中での存在確率Ｐ＿ｇｌｏｂａｌ（ｘ，ｐ）は：
【数４】
2019044974.tif 000060
で表される。
【０１０３】
標的ＲＮＡ中に、Ｐ＿ｇｌｏｂａｌ（ｘ，ｐ）が５０％以上であってｐ１＝“ステムが５塩基対”であるｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ１）を同定することができる。このうち、ｐ２＝“左右均等（ループを挟んでステムの５’側配列と３’側配列の塩基数の差が１つ以内）であって、ループの長さが１０を超えないもの”であるｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ２）をさらに同定することができる。
【０１０４】
ついで、ｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ２）のそれぞれのステムループ直後の７塩基に対してｓｇＡＳＯの結合サイトとすることができるが、以下の補正処理を行なってもよい：（１）ループ部分が３塩基と予測されているものはその次の塩基対をほどいて５塩基のループとなっていると想定する、（２）ステム中のミスマッチやバルジの塩基数が２以下の場合はそれを無視して塩基対数をカウントする、かつ／または（３）ステム中のミスマッチやバルジの塩基数が３以上の場合はミスマッチやバルジの塩基数の２分の１の数を塩基対数とカウントする。こうした処理によってステムループ構造の５塩基対目を特定し、その直後（３’側）をｓｇＡＳＯ結合サイトとすることができる。
【０１０５】
本発明の一つの態様は、真核細胞内の標的ＲＮＡを切断するためのオリゴヌクレオチド（ｓｇＡＳＯ）の設計方法であって、（１）標的ＲＮＡ配列中に少なくとも１つのステムループ構造が形成される配列を同定する工程、（２）該ステムループ構造に隣接する３’側の６〜１０塩基の配列をｓｇＡＳＯの結合配列として同定する工程、および（３）該結合配列に相補的な配列をｓｇＡＳＯの配列として同定する工程を含む、方法に関する。
【０１０６】
標的転写産物
標的ＲＮＡは、その発現を抑制または消失させる対象となる遺伝子（標的遺伝子）の転写産物ＲＮＡ、特にｍＲＮＡであるが、ｎｃＲＮＡであってもよい。また、標的ＲＮＡとしては、核ゲノム由来のＲＮＡ、ミトコンドリアゲノム由来のＲＮＡ、ウイルスゲノムまたは細菌ゲノム由来のＲＮＡなどが含まれる。本発明において用いられるｓｇＡＳＯは、必ずしも標的ＲＮＡに完全に相補的である必要はないが、典型的には、標的ＲＮＡに完全に相補的である。標的遺伝子の発現抑制とは、その遺伝子から転写合成されるタンパク質量が、２５％以下、好ましくは５０％以下、さらに好ましくは７５％以下、特に好ましくは９５％以下に低減することである。標的遺伝子は、その発現抑制または発現消失が産業上の利用価値を有する遺伝子であり、とくにその遺伝子の発現亢進が特定の疾患の原因となるような遺伝子（以下、病原遺伝子と記載することがある）。そのような病原遺伝子の例としては、例えば、ｒａｓ、ｅｒｂｂ２、ｍｙｃ、ａｐｃ、ｂｒｃａ１、ｒｂ、Ｂｃｌ−２、ＢＧＥＦ癌遺伝子、レニンなどの高血圧に関与する遺伝子、インスリンなどの糖尿病関連遺伝子、ＬＤＬレセプターなどの高脂血症関連遺伝子、レプチンなどの肥満関連遺伝子、アンギオテンシンなどの動脈硬化疾患関連遺伝子、痴呆の原因として知られているアポリポタンパク質およびプレセリニン、老化に関連する遺伝子などが例示される。これらの遺伝子およびそのｍＲＮＡ配列は公知のデータベース（ＮＣＢＩヌクレオチドデータベース等）において公知である。
【０１０７】
医薬組成物
スモールガイドアンチセンス核酸はそれ単独で製剤化することもできるが、通常は薬理学的に許容される１つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として投与するのが望ましい。医薬組成物には、異なる配列を有する複数のｓｇＡＳＯの混合物が含まれていてもよい。
【０１０８】
投与対象には、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物が含まれる。投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、静脈内および経皮などの非経口投与をあげることができ、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
【０１０９】
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
【０１１０】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。
【０１１１】
担体として具体的には乳糖、グリセリン、リポソーム、ナノミセルなどが例示される。本発明で用いる核酸、さらには用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０１１２】
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。
【０１１３】
本発明の一つの態様は、約７ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ｓｇＡＳＯ）を含む、患者における疾患または障害の治療または予防に用いるための医薬組成物であって、該約７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが、疾患または障害に関連する標的ＲＮＡに相補的であり、該標的ＲＮＡが少なくとも１つのステムループ構造を形成することができ、該約７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが該ステムループ構造の３’側の領域にハイブリダイズして、該標的ＲＮＡが形成するステムループと合わせて少なくとも１つのより大きなステムループ構造を形成することができ、形成された構造が患者体内のｔＲＮａｓｅＺＬによって認識されて、標的ＲＮＡが切断されることを特徴とする、医薬組成物に関する。患者は、ヒトもしくは非ヒト動物でありうる。なお、本明細書において、約７ｍｅｒと言った場合は、６ｍｅｒ、７ｍｅｒ、および８ｍｅｒを含むものと解される。
【０１１４】
ｓｇＡＳＯは一般的には、標的ＲＮＡが形成するステムループ構造の根本（つまり、ループとは反対側の末端塩基対）を形成する塩基の３’側に直に隣接する塩基と、ｓｇＡＳＯの３’末端塩基とが塩基対を形成するように設計されるが、これに限定はされない。例えば、標的ＲＮＡが形成するステムループ構造の根本から数えて２〜３番目の塩基とｓｇＡＳＯの３’末端塩基とが塩基対を形成するように設計されてもよい。
【０１１５】
本発明の一つの態様において、医薬組成物は、本願の実施例に開示されるＶＩＳ−０１〜ＶＩＳ−０７の少なくとも１つのｓｇＡＳＯを含むことができる。本発明の一つの態様において、医薬組成物は、癌の治療もしくは予防のための組成物、または癌の治療もしくは予防に用いるための組成物でありうる。
【０１１６】
本発明の一つの態様は、癌の治療もしくは予防のための医薬組成物、または癌の治療もしくは予防に用いるための医薬組成物であって、以下から選択されるいずれかの配列を含むか、いずれかの配列から成るｓｇＡＳＯを含む、医薬組成物に関する：５’−ＧＡＡＡＣＵＵ−３’；５’−ＣＵＧＵＣＡＡ−３’；５’−ＵＣＵＵＣＡＡ−３’；５’−ＵＵＡＵＣＧＵ−３’；５’−ＣＵＵＡＵＡＡ−３’；５’−ＧＣＧＧＧＧＧ−３’；５’−ＡＣＵＣＡＡＡ−３’。ｓｇＡＳＯは、その一方または両方の末端にリン酸基を有していてもよい。本医薬組成物が用いられうる癌は、Ｂｃｌ−２遺伝子が関与する癌であり、例えば、リンパ腫を含む。
【０１１７】
医薬の製造における使用および治療方法
本発明の一つの態様は、患者における疾患または障害の治療または予防に用いるための医薬の製造における、約７ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ｓｇＡＳＯ）の使用であって、該約７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが、疾患または障害に関連する標的ＲＮＡに相補的であり、該標的ＲＮＡが少なくとも１つのステムループ構造を形成することができ、該約７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが該ステムループ構造の３’側の領域にハイブリダイズして、該標的ＲＮＡが形成するステムループと合わせて少なくとも１つのより大きなステムループ構造を形成することができ、形成された構造が患者体内のｔＲＮａｓｅＺＬによって認識されて、標的ＲＮＡが切断されることを特徴とする、使用に関する。
【０１１８】
また、本発明の一つの態様は、患者における疾患または障害の治療または予防のための方法であって、該患者に約７ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ｓｇＡＳＯ）を投与する工程を含み、ここで、該約７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドは、疾患または障害に関連する標的ＲＮＡに相補的であり、該標的ＲＮＡが少なくとも１つのステムループ構造を形成することができ、該約７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが該ステムループ構造の３’側の領域にハイブリダイズして、該標的ＲＮＡが形成するステムループと合わせて少なくとも１つのより大きなステムループ構造を形成することができ、形成された構造が患者体内のｔＲＮａｓｅＺＬによって認識されて、標的ＲＮＡが切断されることを特徴とする、方法に関する。
【０１１９】
本発明の一つの態様は、癌の治療もしくは予防のための医薬の製造における、以下から選択されるいずれかの配列を含むか、いずれかの配列から成るｓｇＡＳＯの使用に関する：５’−ＧＡＡＡＣＵＵ−３’；５’−ＣＵＧＵＣＡＡ−３’；５’−ＵＣＵＵＣＡＡ−３’；５’−ＵＵＡＵＣＧＵ−３’；５’−ＣＵＵＡＵＡＡ−３’；５’−ＧＣＧＧＧＧＧ−３’；５’−ＡＣＵＣＡＡＡ−３’。
【０１２０】
また、本発明の一つの態様は、患者における癌の治療もしくは予防のための方法であって、以下から選択されるいずれかの配列を含むか、いずれかの配列から成るｓｇＡＳＯを患者に投与する工程を含む方法に関する：５’−ＧＡＡＡＣＵＵ−３’；５’−ＣＵＧＵＣＡＡ−３’；５’−ＵＣＵＵＣＡＡ−３’；５’−ＵＵＡＵＣＧＵ−３’；５’−ＣＵＵＡＵＡＡ−３’；５’−ＧＣＧＧＧＧＧ−３’；５’−ＡＣＵＣＡＡＡ−３’。
【０１２１】
以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。
【実施例】
【０１２２】
概要
対象疾患として、癌を選び、その治療法としてＢｃｌ−２をダウンレギュレーションすることを想起した。そのために、Ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡを標的とした核酸医薬品を創出することを試みた。構造予測および構造解析セクションでは、１）ｍＲＮＡは一本鎖でタンパク質の関与なく自身のみで高次構造をとる、２）単一の一次構造のｍＲＮＡは複数の高次構造をとることが想定されそれらは平衡状態にある（すなわちエネルギー量に応じて存在確率が分布している）、という作業仮説を置いている。内在性の部分構造の算出や評価については、この仮説を元に算出する。さらに、ｓｇＡＳＯの設計は、ｓｇＡＳＯと内在性の構造が形作る高次構造をｔＲＮａｓｅ  ＺＬが認識しうるかという点について、内在性の構造として１）ループが１０塩基以下、２）ステムが５塩基対、であるという仮説を基本的に置いている。【０１２３】
＜例１：構造予測および構造解析＞
Ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡの配列情報（アクセッション番号：ＮＭ＿０００６３３．２）をＮＣＢＩのデータベースより取得した。その配列情報を元に、５’末端から３塩基刻みで３００塩基の幅の枠を設定した（第一枠は、５’末端の塩基（１塩基目）から３００塩基目まで。第２枠は、４塩基目から３０３塩基目まで。以下同様。枠はｎｍａｘ個得られているとする）。それぞれの枠において、構成する３００塩基の塩基配列についてパターンマッチングおよび熱力学的安定性に基づく構造予測を行なった（例えば、以下の参考文献を参照：Markham, N. R. & Zuker, M. (2005) DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res., 33, W577-W581; Markham, N. R. & Zuker, M. (2008) UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. In Keith, J. M., editor, Bioinformatics, Volume II. Structure, Function and Applications, number 453 in Methods in Molecular Biology, chapter 1, pages 3-31. Humana Press, Totowa, NJ. ISBN 978-1-60327-428-9.）。得られた予測構造結果とそれぞれのエネルギー量から、当該ｍＲＮＡがおかれている細胞内での状態が平衡状態であることを仮定して、予測構造結果それぞれの存在確率を算出した。ここで、ｎ枠目での構造予測結果のうち最安定構造からｍ番目の予測結果（枠ｎにおいて、予測構造結果はｍｍａｘ（ｎ）個得られている）については、その存在確率をｊ（ｎ，ｍ）とした。【０１２４】
ここで、各構造予測結果中それぞれに発見される部分構造として、ループ部位を１つだけ持ち、互いに相手とだけ相補的である１つのステムよりなるものをステムループ構造と定義する（ステムループ中のステムの「互いに相手とだけ相補的である」とは、他の予測構造枠であっても他のステムループを構成しないという意味ではなく、ある１つの予測構造結果において、単一のステムループ中に他のステムループの一部を決して含まないという意味である）。ここで、ステムにはミスマッチ（ステム中にある、塩基対に参加しない塩基が対向しているもの）やバルジ（ステム中にある、塩基対に参加しない塩基が対向していないもの）を含んでもよいが、両端は塩基対であるものとする。さらに、ステムループが内包するステムループも別個のステムループとみなす（例えば、ステムの最もループから遠い塩基対がほどけたものは、解けていないものと別のステムループとみなす）。【０１２５】
こうしたステムループを、枠内ではなく配列上の絶対位置ｘから始まり、構成するループとステムの情報プロファイル（ステムを構成する塩基対の塩基の位置で定義されるステムループのアイデンティティ）をｐとした時に、ｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ）と呼ぶ。そして、ｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ）の枠ｎ内での存在確率を、部分的な存在確率Ｐ＿ｌｏｃａｌ（ｘ，ｐ，ｎ）とし、その値は、ｎ枠において得られた構造予測結果の中で当該ステムループが存在する構造についてのｊ値の総和すなわちΣｊ（ｎ，ｍ）であるとする。さらに、このＰ＿ｌｏｃａｌ（ｘ，ｐ，ｎ）について枠１からｎｍａｘまで総和をとった結果をΣＰ＿ｌｏｃａｌ（ｘ，ｐ，ｎ）、当該ステムループを構成する配列全長が枠内におさまることのできる枠の数をｎ＿ａｌｌ（ｘ，ｐ）個としたとき、全体の中でのｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ）の存在確率Ｐ＿ｇｌｏｂａｌ（ｘ，ｐ）は、ΣＰ＿ｌｏｃａｌ（ｘ，ｐ，ｎ）／ｎ＿ａｌｌ（ｘ，ｐ）として表される。【０１２６】
＜例２：ｓｇＡＳＯ配列設計＞
Ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡの５’ＵＴＲおよびＣＤＳおよび３’ＵＴＲ中に、Ｐ＿ｇｌｏｂａｌ（ｘ，ｐ）が５０％以上であってｐ１＝“ステムが５塩基対”であるｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ１）を探したところ、１２個が見つかった。このうち、ｐ２＝“左右均等（ループを挟んでステムの５’側配列と３’側配列の塩基数の差が１つ以内）であって、ループの長さが１０を超えないもの”であるｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ２）は７個であった。【０１２７】
ついで、ｍｏｔｉｆ（ｘ，ｐ２）のそれぞれのステムループ直後の７塩基に対してｓｇＡＳＯの結合サイトとするが、以下の補正処理を行なった。１）ループ部分が３塩基と予測されているものはその次の塩基対をほどいて５塩基のループとなっていると想定する、２）ステム中のミスマッチやバルジの塩基数が２以下の場合はそれを無視して塩基対数をカウント、３）ステム中のミスマッチやバルジの塩基数が３以上の場合はミスマッチやバルジの塩基数の２分の１の数を塩基対数とカウント、こうした処理によって５塩基対目を特定し、その直後をｓｇＡＳＯ結合サイトとした。【０１２８】
結果として、ｓｇＡＳＯが効果を発揮すると期待される結合箇所の配列は、ＡＡＧＵＵＵＣ、ＵＵＧＡＣＡＧ、ＵＵＧＡＡＧＡ、ＡＣＧＡＵＡＡ、ＵＵＡＵＡＡＧ、ＣＣＣＣＣＧＣ、ＵＵＵＧＡＧＵであり、それぞれに対して以下の７ｍｅｒのアンチセンスオリゴ（ＶＩＳ−０１〜ＶＩＳ−０７）を合成した（株式会社日本バイオサービスにて合成）。【０１２９】
標的配列  名称     sgASO配列            配列番号
AAGUUUC   VIS-01   5’- pGAAACUUp -3’  8224
UUGACAG   VIS-02   5’- pCUGUCAAp -3’  7889
UUGAAGA   VIS-03   5’- pUCUUCAAp -3’  14289
ACGAUAA   VIS-04   5’- pUUAUCGUp -3’  15580
UUAUAAG   VIS-05   5’- pCUUAUAAp -3’  7985
CCCCCGC   VIS-06   5’- pGCGGGGGp -3’  9899
UUUGAGU   VIS-07   5’- pACUCAAAp -3’  1857【０１３０】
＜例３：細胞実験＞
上記ｓｇＡＳＯ（ＶＩＳ−１〜ＶＩＳ−７）によるＢｃｌ−２  ｍＲＮＡ発現抑制実験をヒト白血病細胞株ＨＬ６０を用いて行った。核酸鎖は全て、両末端をリン酸化し、２’ＯＨ部分をＯＭｅ化したものを用いた。すでに報告されているｓｇＡＳＯの一つであるＨｅｐ１（配列：ＧＧＧＣＣＡＧ；日本国特許第５９９５８４９号およびCancer Letters 328 (2013) 362-368を参照）についても参考として用いた。２４−ｗｅｌｌプレートを用いてＨＬ６０細胞を１０，０００ｃｅｌｌｓ／５００μＬの密度で、ＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有）中、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて培養した。培地に最終濃度１μＭになるように各ｓｇＡＳＯを添加し、更に４８時間培養した。４８時間後、ＨＬ６０細胞からＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓを用いて全ＲＮＡを抽出し、定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。インターナルコントロールとしてＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ量を用い、Ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡ量をノーマライズした。結果として、既に報告されているｓｇＡＳＯであるＨｅｐ１と比して倍程度の活性を示すｓｇＡＳＯとしてＶＩＳ−１、ＶＩＳ−５を得ることができた（図１）。この結果より、本発明によるｓｇＡＳＯの設計および同定方法が、先行技術より優れていることが明らかとなった。【０１３１】
本明細書には、本発明の好ましい実施態様を示してあるが、そのような実施態様が単に例示の目的で提供されていることは、当業者には明らかであり、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、様々な変形、変更、置換を加えることが可能であろう。本明細書に記載されている発明の様々な代替的実施形態が、本発明を実施する際に使用されうることが理解されるべきである。また、本明細書中において参照している特許および特許出願書類を含む、全ての刊行物に記載の内容は、その引用によって、本明細書中に明記された内容と同様に取り込まれていると解釈すべきである。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明者らは、遺伝子発現調節の対象となる標的ＲＮＡ配列について、その配列情報を元に構造予測を行ない、得られた予測構造結果とそれぞれのエネルギー量から、それぞれの存在確率を算出し、存在確率とステムループ構造より、ｓｇＡＳＯを設計する方法を確立することで、比較的短いオリゴヌクレオチドを用いて、効率よく細胞内における遺伝子発現を調節する手法を開発した。本手法は、原理的にあらゆる遺伝子発現の調節に応用可能であることから、多様な疾患および障害の治療または予防に有用である。
【図１】
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【国際調査報告】
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