(57)【要約】  異種・同種移植技術（生体内培養）を使用することなく、インビトロ（生体外培養）において、少なくとも歯冠を有する歯に、少なくとも歯根を形成することができる方法、及び該方法により形成された再生歯の提供。  少なくとも歯冠を有する歯に、少なくとも歯根を形成する方法であって、前記歯を、歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞を含む細胞含有基材で包んだ培養用コアを形成する培養用コア形成工程と、前記培養用コアを、培養液中で培養し、前記培養用コア中の歯に少なくとも歯根を形成する工程とを含み、前記培養液が、所定の成分を有する。
2010027008.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも歯冠を有する歯に、少なくとも歯根を形成する方法であって、
前記歯を、歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞を含む細胞含有基材で包んだ培養用コアを形成する培養用コア形成工程と、
前記培養用コアを、培養液中で培養し、前記培養用コア中の歯に少なくとも歯根を形成する工程とを含み、
前記培養液が、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分、並びに、
ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＧＨ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、Ｍ−ＣＳＦ、デキサメタゾン、インスリン、サイロキシン、サイロカルシトニン、アスコルビン酸、及びβ−グリセロリン酸の少なくともいずれかを有する培養液添加物
の少なくともいずれかを有することを特徴とする方法。
【請求項２】
培養用コアを、培養液中で培養し、前記培養用コア中の歯に少なくとも歯根を形成する工程において、更に、歯周組織を形成する請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
細胞含有基材が、細胞シート、及び細胞含有多孔性基材の少なくともいずれかである請求の範囲第１項から第２項のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
培養用コアが、更に、細胞を含有しない多孔性基材で包まれた請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
培養用コア形成工程において、歯が、細胞シート上で前培養される請求の範囲第３項から第４項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の方法によって形成されたことを特徴とする少なくとも歯根を有する再生歯。
【請求項７】
再生歯が、更に、歯周組織を有する請求の範囲第６項に記載の再生歯。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物の器官を形成する器官形成方法等に関し、特に、哺乳動物の歯根や、歯周組織、又はその複合体（ユニット）を形成する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、組織欠損、機能障害又は機能不全に陥った器官の形態と機能を回復させることを目的とした、再生医療技術が注目されている。この技術分野では、機能障害等を有する器官と代替可能な、再生器官の提供が望まれている。この種の再生器官には、正常な形態と機能を備えることと共に、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）（生体内培養）を介さない技術によって形成されることが求められる。何故ならば、異種・同種移植を介して形成された器官には、免疫拒絶やウイルス等の感染の危険性があるからである。
そのため、そのような感染等の問題のない、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）（生体外培養）において、器官再生することが求められている。【０００３】
例えば、歯の再生が望まれている歯科領域においては、現代の歯科臨床技術で補綴物により再建可能な歯冠よりも、歯を顎骨に固定し、歯冠を支える機能等を備えた歯根の提供、ならびに、この歯根を支える歯周組織（歯根膜・歯槽骨・セメント質・歯肉）の提供が望まれている。特に、歯根膜や歯槽骨を備えた歯根の提供が望まれている。歯根膜は、歯根のセメント質と歯槽骨との間に介在している軟組織（結合組織）であり、この歯根膜により咀嚼時の衝撃の緩和や知覚応答が為されている。【０００４】
非特許文献１は、生後６ヶ月齢のブタの未萌出の第３大臼歯から得られた、歯胚由来の多種類の細胞を含む細胞懸濁液を、歯の形に整形した生分解吸収ポリマーに播種して、人工歯胚を作製する。この人工歯胚を、血流が豊富で、栄養及び酸素の供給が十分得られるラットの大網（腹腔内にある脂肪の膜）に異種移植することによって、生体内培養に基づく技術を開示する。移植から２５〜３０週間後に、エナメル質、象牙質、歯髄等の小さな歯牙様組織が移植体中で確認されている。【０００５】
非特許文献２は、上皮−間葉相互作用に着目して、歯の発生のプロセスを再現する手法を開示する。この非特許文献２では、胎齢１０日目のマウス胎仔から採取した歯胚上皮と、歯胚由来ではない３種類の幹細胞を、歯胚間葉の代わりとして組み合わせて人工歯胚を作製している。その作製に続いて、人工歯胚を成体マウスの腎臓の被膜下に同種移植し、生体内培養により１２日間成長させて、歯を形成している。【０００６】
上記非特許文献１及び２に示されるように、これまでは、異種・同種移植（生体内培養）を必要とする歯の再生技術のみが知られていた。それは、非特許文献３に示されるように、生体外培養では、十分な歯は形成されず、歯槽骨などの骨の形成が認められないため、歯周組織を得ることができなかった。そのため、歯を形成するためには、異種・同種移植（生体内培養）に頼らざるを得ないのが現状であった。そして、ヒト歯の再生を試みた報告はまったく存在せず、臨床的には歯科用インプラント（人工歯根）によって、金属（チタン）で歯根の機能を代替するのみであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｙｏｕｎｇ  ＣＳ，Ｔｅｒａｄａ  Ｓ，  Ｖａｃａｎｔｉ  ＪＰ，  Ｈｏｎｄａ  Ｍ，  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ＪＤ，  Ｙｅｌｉｃｋ  ＰＣ，  Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｏｏｔｈ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｎ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ；Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ，８１，６９５−７００，２００２
【非特許文献２】Ｍｏｄｉｎｏ  ＳＡ，Ｓｈａｒｐｅ  ＰＴ；  Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｅｅｔｈ  ｕｓｉｎｇ  ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；  Ａｒｃｈ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ，５０，２５５−２５８，２００５
【非特許文献３】日本歯科医師会雑誌、Ｖｏｌ．  ６０、Ｎｏ．  ７、２００７−１０、６５７−６７４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記従来の諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、異種・同種移植技術（生体内培養）を使用することなく、インビトロ（生体外培養）において、少なくとも歯冠を有する歯に、少なくとも歯根を形成することができる方法、及び該方法により形成された再生歯を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するため、本発明者らは、鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、本発明者らは、少なくとも歯冠を有する歯を、歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞を含む細胞含有基材などで包み、かつ、その細胞含有基材などで包まれてなる培養用コアを、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）に含まれる成分、並びに、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＧＨ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、Ｍ−ＣＳＦ、デキサメタゾン、インスリン、サイロキシン、サイロカルシトニン、アスコルビン酸、及びβ−グリセロリン酸の少なくともいずれかを有する培養液添加物の少なくともいずれかを有する培養液中で培養することにより、歯冠に歯根や歯周組織（歯根膜・歯槽骨・セメント質・歯肉）、又はその複合体を形成できることを知見し、本発明の完成に至った。
本発明の「歯根・歯周組織ユニット」とは、本発明の方法により歯根と歯周組織の形成が同時に為され、ひとつの複合体（ユニット）として形成できるために、その特徴を明確に示す呼称として、歯根・歯周組織ユニットと命名した。【００１０】
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  少なくとも歯冠を有する歯に、少なくとも歯根を形成する方法であって、
前記歯を、歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞を含む細胞含有基材で包んだ培養用コアを形成する培養用コア形成工程と、
前記培養用コアを、培養液中で培養し、前記培養用コア中の歯に少なくとも歯根を形成する工程とを含み、
前記培養液が、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液に含まれる成分、並びに、
ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＧＨ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、Ｍ−ＣＳＦ、デキサメタゾン、インスリン、サイロキシン、サイロカルシトニン、アスコルビン酸、及びβ−グリセロリン酸の少なくともいずれかを有する培養液添加物
の少なくともいずれかを有することを特徴とする方法である。
＜２＞  培養用コアを、培養液中で培養し、前記培養用コア中の歯に少なくとも歯根を形成する工程において、更に、歯周組織を形成する前記＜１＞に記載の方法である。
＜３＞  細胞含有基材が、細胞シート、及び細胞含有多孔性基材の少なくともいずれかである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の方法である。
＜４＞  培養用コアが、更に、細胞を含有しない多孔性基材で包まれた前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の方法である。
＜５＞  培養用コア形成工程において、歯が、細胞シート上で前培養される前記＜３＞から＜４＞のいずれかに記載の方法である。
＜６＞  前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の方法によって形成されたことを特徴とする少なくとも歯根を有する再生歯である。
＜７＞  再生歯が、更に、歯周組織を有する前記＜６＞に記載の再生歯である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、前記従来の諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、異種・同種移植技術（生体内培養）を使用することなく、インビトロ（生体外培養）において、少なくとも歯冠を有する歯に、少なくとも歯根を形成することができる方法、及び該方法により形成された再生歯を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例１で用いたマウス歯冠の説明図（実体顕微鏡写真）である。
【図２】図２は、実施例１の歯根膜由来細胞の継代培養の説明図である。
【図３】図３は、実施例１の前培養（プレカルチャー）の説明図である。
【図４】図４は、実施例１の培養用コアの断面の説明図である。
【図５】図５は、実施例１の培養１週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
【図６】図６は、実施例１の培養２週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
【図７】図７は、実施例１の培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
【図８】図８は、実施例１の培養４週間後の歯の軟エックス線写真である。
【図９】図９は、実施例１の培養４週間後の歯の薄片をＨＥ染色した結果を示す説明図である。
【図１０】図１０は、図９における囲みａ部分を拡大して示した説明図である。
【図１１】図１１は、図９における囲みｂ部分を拡大して示した説明図である。
【図１２】図１２は、図９における囲みｃ部分を拡大して示した説明図である。
【図１３】図１３は、実施例１の培養４週間後の歯の歯根膜周辺の組織を拡大して示した説明図（ＨＥ染色像）である。
【図１４】図１４は、実施例１のＰｅｒｉｏｓｔｉｎを用いた、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法の結果を示す説明図である。
【図１５】図１５は、実施例１のＢＳＰを用いた、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法の結果を示す説明図である。
【図１６】図１６は、実施例１の移植４週間後の移植歯の歯科用エックス線像を示す説明図である。
【図１７】図１７は、実施例１の移植４週間後の移植歯のマイクロＣＴ像を示す説明図である。
【図１８Ａ】図１８Ａは、実施例１のマウス頭蓋骨中の移植歯の蛍光観察像を示す説明図である。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、実施例１のマウス頭蓋骨中の移植歯の蛍光観察像を示す説明図である。
【図１９】図１９は、実施例２で用いたヒト歯冠の説明図（実体顕微鏡写真）である。
【図２０】図２０は、実施例２の前培養の説明図（実体顕微鏡写真）である。
【図２１】図２１は、実施例２の培養用コアの培養の説明図（実体顕微鏡写真）である。
【図２２】図２２は、実施例２の培養２４週間後に培養用コアから取り出した直後の歯の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
【図２３】図２３は、実施例２の培養２４週間後の歯の実体顕微鏡像を示す説明図である。
【図２４】図２４は、実施例２の培養２４週間後の歯を根尖斜め方向から撮影した実体顕微鏡像を示す図である。
【図２５】図２５は、実施例２の培養２４週間後の歯を根尖方向から撮影した実体顕微鏡像を示す図である。
【図２６】図２６は、実施例２の培養２４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。
【図２７Ａ】図２７Ａは、実施例２の培養２４週間後の歯の側面のマイクロＣＴ像を示す説明図である。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、実施例２の培養２４週間後の歯の側面のマイクロＣＴ像を示す説明図である。
【図２７Ｃ】図２７Ｃは、実施例２の培養２４週間後の歯の側面断面のマイクロＣＴ像を示す説明図である。
【図２８Ａ】図２８Ａは、実施例２の培養２４週間後の歯の根尖方向からの歯根断面のマイクロＣＴ像を示す説明図である。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、実施例２の培養２４週間後の歯の根尖方向からの歯根断面のマイクロＣＴ像を示す説明図である。
【図２８Ｃ】図２８Ｃは、実施例２の培養２４週間後の歯の根尖方向からの歯根断面のマイクロＣＴ像を示す説明図である。
【図２９】図２９は、実施例２の歯から剥がした軟組織の実体顕微鏡像を示す説明図である。
【図３０】図３０は、実施例２の歯から剥がした軟組織の軟エックス線像を示す説明図である。
【図３１Ａ】図３１Ａは、図３０の囲み部のマイクロＣＴ像を示す説明図である。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、図３０の囲み部のマイクロＣＴ像を示す説明図である。
【図３２】図３２は、実施例３の培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
【図３３】図３３は、実施例３の培養４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。
【図３４】図３４は、実施例４の培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
【図３５】図３５は、実施例４の培養４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。
【図３６】図３６は、実施例５の培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
【図３７】図３７は、実施例５の培養４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。
【図３８】図３８は、実施例６の培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
【図３９】図３９は、実施例６の培養４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。
【図４０】図４０は、実施例７の培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
【図４１】図４１は、実施例７の培養４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。
【図４２】図４２は、実施例８の培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
【図４３】図４３は、実施例８の培養４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。
【図４４】図４４は、実施例９の培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
【図４５】図４５は、実施例９の培養４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。
【図４６】図４６は、実施例１０の培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
【図４７】図４７は、実施例１０の培養４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。
【図４８】図４８は、実施例１１の培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
【図４９】図４９は、実施例１１の培養４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
〔少なくとも歯冠を有する歯に、少なくとも歯根を形成する方法〕
本発明の、少なくとも歯冠を有する歯に少なくとも歯根を形成する方法は、培養用コア形成工程と、前記培養用コア中の歯に少なくとも歯根を形成する工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。前記培養用コアを、培養液中で培養し、前記培養用コア中の歯に少なくとも歯根を形成する工程において、更に、歯周組織を形成することが好ましい。
前記方法は、ヒトやマウスなどの哺乳類の少なくとも歯冠を有する歯に、少なくとも歯根を形成する方法に関し、特に、ヒトの少なくとも歯冠を有する歯に、少なくとも歯根を形成する方法として有用である。
【００１４】
（培養用コア形成工程）
前記培養用コア形成工程は、少なくとも歯冠を有する歯を、歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞を含む細胞含有基材で包んで培養用コアを形成する工程である。
【００１５】
＜培養用コア＞
前記培養用コアは、少なくとも歯冠を有する歯と、細胞含有基材とを少なくとも有し、必要に応じて、さらに細胞を含有しない多孔性基材などを有する。
【００１６】
−少なくとも歯冠を有する歯−
前記少なくとも歯冠を有する歯としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、歯冠のみの歯（歯根が未形成の歯）、根未完成歯（歯根が形成途上の歯）などが挙げられる。
前記少なくとも歯冠を有する歯としては、例えば、ヒト、マウスなどの哺乳動物から摘出された歯冠などが用いられる。例えば、ヒトの場合、歯根未完成の第３大臼歯（智歯）等の天然歯の歯冠を用いることができる。
また、前記少なくとも歯冠を有する歯としては、前記天然歯以外に、人工的に製造されたエナメル質、象牙質、各種生体材料等からなる人工歯冠を用いてもよい。
【００１７】
−細胞含有基材−
前記細胞含有基材は、歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞を含む。
前記細胞含有基材としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞シート、細胞含有多孔性基材などが挙げられる。前記細胞含有基材は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。中でも、前記少なくとも歯冠を有する歯を、細胞シートで包み、更に、細胞含有多孔性基材で包む態様が好ましい。
前記少なくとも歯冠を有する歯を、細胞シートで包み、更に、細胞含有多孔性基材で包む態様では、歯根の形成期間が短く、歯槽骨の形成が良好である点で有利である。
【００１８】
−−歯根膜由来細胞−−
前記歯根膜由来細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、歯根膜線維芽細胞、歯根膜上皮細胞（マラッセの上皮残遺由来細胞）、歯周組織幹細胞などが挙げられる。
前記歯根膜由来細胞の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ヒト、マウスなどの哺乳動物由来のものを用いることができる。なお、前記歯根膜由来細胞は、前記少なくとも歯冠を有する歯と同種由来のものであってもよく、異種由来のものであってもよい。
前記歯根膜由来細胞の採取方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ヒト成人の抜去歯や、混合歯列期（交換期）の乳歯から歯根膜由来細胞を採取することができる。
【００１９】
−−骨髄由来細胞−−
前記骨髄由来細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、骨髄間質細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。
前記骨髄由来細胞の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ヒト、マウスなどの哺乳動物由来のものを用いることができる。なお、前記骨髄由来細胞は、前記少なくとも歯冠を有する歯と同種由来のものであってもよく、異種由来のものであってもよい。
前記骨髄由来細胞の採取方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、骨髄穿刺によって骨髄由来細胞を採取することができる。
【００２０】
−−歯小嚢由来細胞−−
前記歯小嚢由来細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、歯小嚢線維芽細胞、歯小嚢幹細胞などが挙げられる。
前記歯小嚢由来細胞の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ヒト、マウスなどの哺乳動物由来のものを用いることができる。なお、前記歯小嚢由来細胞は、前記少なくとも歯冠を有する歯と同種由来のものであってもよく、異種由来のものであってもよい。
前記歯小嚢由来細胞の採取方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ヒトの未完成の抜去歯の周囲組織から歯小嚢由来細胞を採取することができる。
【００２１】
−−歯髄由来細胞−−
前記歯髄由来細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、歯髄線維芽細胞、歯髄幹細胞などが挙げられる。
前記歯髄由来細胞の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ヒト、マウスなどの哺乳動物由来のものを用いることができる。なお、前記歯髄由来細胞は、前記少なくとも歯冠を有する歯と同種由来のものであってもよく、異種由来のものであってもよい。
前記歯髄由来細胞の採取方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ヒトの抜去歯や、混合歯列期（交換期）の乳歯から歯髄由来細胞を採取することができる。
【００２２】
−−歯乳頭由来細胞−−
前記歯乳頭由来細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、歯乳頭線維芽細胞、歯乳頭幹細胞などが挙げられる。
前記歯乳頭由来細胞の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ヒト、マウスなどの哺乳動物由来のものを用いることができる。なお、前記歯乳頭由来細胞は、前記少なくとも歯冠を有する歯と同種由来のものであってもよく、異種由来のものであってもよい。
前記歯乳頭由来細胞の採取方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ヒトの歯根未完成の抜去歯から歯乳頭由来細胞を採取することができる。
【００２３】
−−細胞シート−−
前記細胞シートは、歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞を所定の培養液で培養し、コンフルエントに達した後で、少なくとも１週間が経過したものである。前記コンフルエントに達した後で、少なくとも１週間が経過した歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞は、培養器から剥離した後にもシート状の様相を呈するため、本明細書の中では、便宜上「細胞シート」と表記する。
前記細胞シートに用いる細胞の継代数としては、正常２倍体の細胞であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、継代３代目までが好ましく、継代２代目がより好ましい。前記継代が４代目以上であると、異数体の細胞（異常な染色体を有する細胞）が生ずることがある。一方、前記継代が２代目であると、ほぼ全ての細胞が正常２倍体であるため、安全性の点で有利である。
前記細胞シートとしては、歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞を培養し、コンフルエントに達した後、１週間以上が経過したものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、コンフルエントに達した後、１週間〜４週間が好ましい。
【００２４】
前記所定の培養液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＨＡＭ  Ｆ１２、α−ＭＥＭなどを用いることができる。
前記培養液に含まれる成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、非必須アミノ酸溶液、ペニシリン、ストレプトマイシン、ファンギゾンなどが挙げられる。
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２５】
−−細胞含有多孔性基材−−
前記細胞含有多孔性基材は、歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞を含む。
前記多孔性基材としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、テルダーミス、テルプラグ（登録商標、オリンパス  テルモ  バイオマテリアル社製）、コラーゲンスポンジ（コーケン社製）、コラーゲンスポンジ（新田ゼラチン社製）、セルマトリックス（登録商標、組織培養用コラーゲンゲル、新田ゼラチン社製）、ＢＤマトリゲル（登録商標、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）シート（Ａｌｂａｎｙ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、ポリＤＬ−ラクチド−コ−グリコシド（ＰＬＧＡ、シグマ社製）などが挙げられる。
前記多孔性基材は、局所に多数の細胞を３次元的に配置できて、個々の細胞の機能や細胞同士の相互作用を効果的に引き出すことができ、歯根や、セメント質、歯根膜、歯槽骨、歯肉といった多様な組織から成る歯周組織を３次元的に形成することができる点で好ましい。
前記多孔性基材に歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞を含ませる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、多孔性基材に前記細胞の懸濁液を播種して培養する方法、培養した前記細胞上に多孔性基材を置いて、培養した前記細胞の移動を図る方法などが挙げられる。
前記多孔性基材に前記細胞の懸濁液を播種して培養する方法における細胞の懸濁液の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌなどが挙げられる。
また、前記多孔性基材に前記細胞の懸濁液を播種して培養する方法における培養期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７２時間以上が好ましく、７２時間〜１週間ほどがより好ましい。
【００２６】
−細胞を含有しない多孔性基材−
前記細胞を含有しない多孔性基材に用いる多孔性基材としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、細胞含有多孔性基材で記載した多孔性基材と同様のものを用いることができる。
【００２７】
−包み方−
前記少なくとも歯冠を有する歯を前記細胞含有基材で包む方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、前記細胞含有基材として、前記細胞シートを用いる場合、細胞シートを滅菌メス刃で切り出して、前記少なくとも歯冠を有する歯を包む方法が挙げられる。
また、前記細胞シートで包まれた前記少なくとも歯冠を有する歯を前記細胞含有多孔性基材、もしくは、前記細胞を含有しない多孔性基材で包む方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２８】
＜前培養工程＞
前記培養用コア形成工程は、前培養（プレカルチャー）工程を含んでもよい。
前記前培養工程は、前記少なくとも歯冠を有する歯が、前記細胞シート上で培養される工程である。
前記前培養の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、０．５日〜７日が好ましく、１日〜２日がより好ましい。
前記前培養を行うことで、前記少なくとも歯冠を有する歯が細胞シート上に固定されて動かなくなるため、前記少なくとも歯冠を有する歯を細胞シートで包む操作が容易となり、また、前記細胞シートが産生する液性因子によって、前記少なくとも歯冠を有する歯に存在しうる各種細胞（歯乳頭細胞（歯髄細胞）、エナメル上皮細胞、ヘルトヴィッヒ上皮鞘細胞、歯小嚢細胞）に、歯根や歯周組織形成細胞への分化誘導を図ることができる点で有利である。
なお、前記前培養工程に代えて、前記少なくとも歯冠を有する歯を前記歯根膜由来細胞、骨髄由来細胞、歯小嚢由来細胞、歯髄由来細胞、及び歯乳頭由来細胞の少なくともいずれかの細胞の順化培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）に数時間浸漬することもできる。
【００２９】
（培養用コア中の歯に少なくとも歯根を形成する工程）
前記培養用コア中の歯に少なくとも歯根を形成する工程は、培養用コアを、培養液中で培養し、前記培養用コア中の歯に少なくとも歯根を形成する工程である。前記工程において、更に、歯周組織を形成することが好ましい。
【００３０】
＜培養液＞
前記培養用コアの培養液は、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株の無血清増殖株の順化培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）の成分（以下、「天然ＥＴＦｓ」（Ｅｍｂｒｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ）と称することがある。）、並びに、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＧＨ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、Ｍ−ＣＳＦ、デキサメタゾン、インスリン、サイロキシン、サイロカルシトニン、アスコルビン酸、及びβ−グリセロリン酸の少なくともいずれかを有する培養液添加物（「合成ＥＴＦｓ」に相当し、以下、合成ヒト器官再生因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｏｒｇａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒｓ：ｒｈＯＥＦｓ）と称することがある。）の少なくともいずれかを有し、必要に応じてさらにその他の成分を有してなる。
【００３１】
前記培養用コアの培養液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｈａｍ  Ｆ１２、α−ＭＥＭなどが挙げられる。
前記培養液は、前記天然ＥＴＦｓ、及び前記ｒｈＯＥＦｓの少なくともいずれかを有していればよいが、未知の感染物質が存在しない点で、前記ｒｈＯＥＦｓを単独で用いることが好ましい。
【００３２】
−天然ＥＴＦｓ−
前記天然ＥＴＦｓとは、ヒト子宮頸部の扁平上皮癌細胞株（ＳＫＧ−ＩＩ）の無血清増殖株（ＳＫＧ−ＩＩ−ＳＦ）の順化培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）に含まれる成分である。
前記天然ＥＴＦｓの調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＳＫＧ−ＩＩ−ＳＦを培養し、その培養液を脱塩後、凍結乾燥する方法が挙げられる。
前記ＳＫＧ−ＩＩ−ＳＦの培養期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、コンフルエントの状態で４日間培養する、などが挙げられる。
【００３３】
前記天然ＥＴＦｓは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＥＧＦ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−α、ＩＧＦ−Ｉ、ＧＨ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＩＧＦ−ＢＰ−３、ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、及びＨＧＦを少なくとも有し、さらにその他の成分（前記順化培養液由来の成分）を有する。
前記各成分の天然ＥＴＦｓ中における各成分の一般的な含有量としては、例えば、以下が挙げられる。
ＩＬ−１α（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１α）・・・≦３．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）・・・１００ｐｇ／ｍＬ〜２００ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２）・・・≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３）・・・≦３１ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４）・・・≦２．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−５（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−５）・・・≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）・・・５０ｐｇ／ｍＬ〜１５０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−９（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−９）・・・４００ｐｇ／ｍＬ〜５００ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−１０（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０）・・・≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−１２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２）・・・≦７．８ｐｇ／ｍＬ
ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）・・・０．５ｎｇ／ｍＬ〜２．０ｎｇ／ｍＬ
ＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α）・・・≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＴＧＦ−α（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−α）・・・≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＧＦ−Ｉ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｉ）・・・≦６．３ｎｇ／ｍＬ
ＧＨ（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ）・・・０．１ｎｇ／ｍＬ〜０．５ｎｇ／ｍＬ
ＰＤＧＦ−ＡＢ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ＡＢ）・・・４５０ｐｇ／ｍＬ〜５５０ｐｇ／ｍＬ
ＩＧＦ−ＢＰ−３（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−３）・・・≦０．２μｇ／ｍＬ
ＦＧＦ−２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）・・・３５ｐｇ／ｍＬ〜４５ｐｇ／ｍＬ
ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）・・・１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ
ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）・・・２５ｐｇ／ｍＬ〜３５ｐｇ／ｍＬ
ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）・・・０．５ｎｇ／ｍＬ〜１．５ｎｇ／ｍＬ
【００３４】
前記培養用コアを培養する培養液中における前記天然ＥＴＦｓの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１体積％〜１２体積％が好ましく、５体積％〜１０体積％がより好ましい。前記培養液中における前記天然ＥＴＦｓの含有量が、１体積％未満、又は、１２体積％より大きいと歯根や歯周組織、又はその複合体の形成が困難となることがある。一方、前記天然ＥＴＦｓの含有量が、前記より好ましい範囲内であると、歯根や歯周組織、又はその複合体の形成効率が良い点で有利である。
【００３５】
−ｒｈＯＥＦｓ−
前記ｒｈＯＥＦｓは、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＧＨ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、Ｍ−ＣＳＦ、デキサメタゾン、インスリン、サイロキシン、サイロカルシトニン、アスコルビン酸、及びβ−グリセロリン酸の少なくともいずれかを少なくとも有し、必要に応じてさらにその他の成分を有する。
前記ｒｈＯＥＦｓの各成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、未知の感染物質を含まない点で、市販品を用いることが好ましい。
【００３６】
前記培養用コアを培養する培養液中における前記ｒｈＯＥＦｓの各成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、以下の含有量以上であることが好ましい。
ＩＬ−１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）・・・１５０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）・・・１００ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８）・・・１．０ｎｇ／ｍＬ
ＩＬ−９（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−９）・・・４５０ｐｇ／ｍＬ
ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）・・・１．５ｎｇ／ｍＬ
ＩＧＦ−Ｉ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｉ）・・・２０ｎｇ／ｍＬ
ＧＨ（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ）・・・２．５ｎｇ／ｍＬ
ＰＤＧＦ−ＡＢ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ＡＢ）・・・０．６ｎｇ／ｍＬ
ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）・・・３．２ｎｇ／ｍＬ
ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）・・・３５ｐｇ／ｍＬ
ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）・・・１．０ｎｇ／ｍＬ
ＦＧＦ−２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−２）・・・２０ｎｇ／ｍＬ
ＦＧＦ−１（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１）・・・５．０ｎｇ／ｍＬ
ＢＭＰ−２（Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２）・・・１０ｎｇ／ｍＬ
ＢＭＰ−４（Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−４）・・・１５ｎｇ／ｍＬ
Ｍ−ＣＳＦ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）・・・１０μｇ／ｍＬ
デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）・・・５μＭ
インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）・・・７．５ｎｇ／ｍＬ
サイロキシン（Ｔｈｙｒｏｘｉｎｅ）・・・５．５ｎｇ／ｍＬ
サイロカルシトニン（Ｔｈｙｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）・・・１０ｎｇ／ｍＬ
アスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）・・・５０μｇ／ｍＬ
β−グリセロリン酸（β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）・・・１０ｍＭ
培養液中における前記ｒｈＯＥＦｓの各成分の含有量が、上記含有量未満であると歯根や歯周組織、又はその複合体の形成が困難となることがある。
【００３７】
前記ｒｈＯＥＦｓを培養液に添加する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記各成分の全てを培養液に添加する方法や、上記各成分を種々の組み合わせで培養液に添加する方法などが挙げられる。
【００３８】
−その他の成分−
前記培養用コアを培養する培養液に含まれるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＦＢＳなどが挙げられる。
【００３９】
−β−グリセロリン酸濃度−
前記培養用コアを培養する培養液に添加するβ−グリセロリン酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０ｍＭが特に好ましい。
前記培養液中のβ−グリセロリン酸濃度が、１０ｍＭ未満であると、歯根や歯周組織、又はその複合体の形成が不十分となることがあり、３倍量を超えると、歯根や歯周組織、又はその複合体が形成されないことがある。一方、前記特に好ましい範囲内であると、硬組織（象牙質、セメント質、歯槽骨）を効率よく形成させることができる点で好ましい。
【００４０】
＜培養＞
前記培養用コアを培養する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、静置培養や灌流培養などが好適に挙げられる。
前記培養の期間としては、歯根や歯周組織、又はその複合体の形成に応じて適宜選択することができる。例えば、静置培養を用いた場合、マウスの場合は３週間〜４週間が好ましく、ヒトの場合は２４週間が好ましい。灌流培養を用いた場合は、さらに培養期間の短縮が可能である。
前記培養（静置培養）における培養液の交換時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、４日〜５日毎が好ましく、３日〜４日毎がより好ましく、２日〜３日毎が特に好ましい。
【００４１】
〔再生歯〕
本発明の再生歯は、上述した本発明の方法によって得ることができる。本発明の再生歯の第１の態様は、歯冠と、歯根とを少なくとも有する。また、本発明の再生歯の第２の態様は、歯冠と、歯根と、歯周組織とを少なくとも有する。
前記歯周組織には、歯根膜、歯槽骨、セメント質、歯肉が含まれる。
本発明の再生歯は、そのまま移植に用いてもよいし、整形などの加工をしたうえで移植してもよい。また、前記歯周組織を取り外して、個別に移植床への移植に用いることもできる。
【実施例】
【００４２】
以下に本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。【００４３】
〔実施例１〕
（マウス歯冠、及び歯根膜由来細胞シートを用いた歯根や歯周組織の形成）
＜培養用コアの形成＞
−歯冠の準備−
生後６日目の新生仔マウスの下顎第１臼歯を摘出した。図１に示されるように、この臼歯（以下、「マウス歯冠」と称することがある。）は、歯冠形成が完了しているが、未だ歯根は形成されていなかった。【００４４】
−歯根膜由来細胞シートの調製−
ヒト成人の抜去歯から歯根膜組織を片刃カミソリで採取した。採取した歯根膜組織の細片を更に両刃カミソリで細切し、その細切された歯根膜組織を、０．１％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）液中で、３７℃、３０分間、加温し、強くピペッティングして、歯根膜由来細胞を解離させた。次いで、該歯根膜由来細胞を含む溶液を、３００×ｇで５分間遠沈し、上澄みを吸引除去した後、沈渣に、基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社製）＋１５％ＦＢＳ（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製、ロット番号  ２４３００１１３）＋１％ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ液（インビトロジェン社製）＋５０Ｕ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（インビトロジェン社製）＋５０μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（インビトロジェン社製）＋０．２５μｇ  Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（インビトロジェン社製））を加えて、培養シャーレで初代培養（図２の２１）した。初代培養がコンフルエントに達した後、３つのシャーレに分けて歯根膜由来細胞を継代培養（１代目、図２の２２）した。１代目がコンフルエントに達した後、１代目の継代培養後のシャーレから、更に３つのシャーレに分けて歯根膜由来細胞を継代培養（２代目、図２の２３）した。２代目がコンフルエントに達して、シート状となった歯根膜由来細胞を、歯根膜由来細胞シートとした。図２は、歯根膜由来細胞の継代培養の説明図である。【００４５】
−前培養−
前記のようにして培養したヒト歯根膜由来細胞シート（図３の３２）の上に、前記マウス歯冠（図３の３１）を置き（１シャーレあたり、歯冠４個）、その状態で２日間培養（前培養）した。図３は、前培養（プレカルチャー）の説明図である。
この前培養により、マウス歯冠が、ヒト歯根膜由来細胞シート上に固定された。【００４６】
−培養用コア−
前培養後、マウス歯冠を乗せたヒト歯根膜由来細胞シートを、滅菌したカミソリを用いて所定の大きさに切り出し、ラバーポリスマン（ＴＰＰ社製）を用いてシャーレから剥離して、マウス歯冠をヒト歯根膜由来細胞シートで包み込んだ。その後、ヒト歯根膜由来細胞シートで包み込んだマウス歯冠を、更に、テルダーミス（登録商標）（オリンパス  テルモ  バイオマテリアル社製）で包み込んだ。以上のように、マウス歯冠（図４の３１）を、ヒト歯根膜由来細胞シート（図４の３２）及びテルダーミス（図４の４１）内に埋入させ、培養用コアを得た。図４は、前記培養用コアの断面の説明図である。【００４７】
＜歯根や歯周組織の形成＞
前記培養用コアを、１５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に天然ＥＴＦｓを０．１ｍＬ／ｍＬ添加した培養液中で、培養した。培養液は、数日おきに交換した。なお、前記天然ＥＴＦｓは、以下のようにして調製した。【００４８】
−天然ＥＴＦｓの調製−
ヒト子宮頸部の扁平上皮癌細胞株（ＳＫＧ−ＩＩ）の無血清増殖株（ＳＫＧ−ＩＩ−ＳＦ、理化学研究所バイオリソースセンター細胞銀行、登録番号ＲＣＢ０６８５）を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、あるいはＨａｍ  Ｆ１２を培養液に用いて、４日間培養し、その順化培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）を回収して、脱塩後、凍結乾燥することによって天然ＥＴＦｓを調製した。【００４９】
前記天然ＥＴＦｓを、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）、及びラジオイムノアッセイ法による免疫学的解析により、次の成分が含まれていることがわかった。
ＩＬ−１α        ・・・  ≦３．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−１β        ・・・  １６３ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−２          ・・・  ≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−３          ・・・  ≦３１ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−４          ・・・  ≦２．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−５          ・・・  ≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−６          ・・・  １０４ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−９          ・・・  ４５３ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−１０        ・・・  ≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−１２        ・・・  ≦７．８ｐｇ／ｍＬ
ＥＧＦ            ・・・  １．３ｎｇ／ｍＬ
ＴＮＦ−α        ・・・  ≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＴＧＦ−α        ・・・  ≦５．０ｐｇ／ｍＬ
ＩＧＦ−Ｉ        ・・・  ≦６．３ｎｇ／ｍＬ
ＧＨ              ・・・  ０．１７ｎｇ／ｍＬ
ＰＤＧＦ−ＡＢ    ・・・  ５１０ｐｇ／ｍＬ
ＩＧＦ−ＢＰ−３  ・・・  ≦０．２μｇ／ｍＬ
ＦＧＦ−２        ・・・  ３７ｐｇ／ｍＬ
ＶＥＧＦ          ・・・  ≧１，０００ｐｇ／ｍＬ
ＬＩＦ            ・・・  ３１ｐｇ／ｍＬ
ＨＧＦ            ・・・  １．１ｎｇ／ｍＬ【００５０】
−培養１週間後−
培養開始から１週間後、歯を取り出して、歯根の確認を行った。図５は、培養１週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。図５に示されるように、根分岐部が閉じ、２つの歯根が分岐したことが確認された。【００５１】
−培養２週間後−
培養開始から２週間後、歯を取り出して、歯根の確認を行った。図６は、培養２週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
図６に示されるように、２つの歯根が更に伸長したことが確認された。【００５２】
−培養４週間後−
培養開始から４週間後、歯を取り出して、歯根の確認を行った。図７は、培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
図７に示されるように、歯根相当部に、歯槽骨が形成されていることが確認された。【００５３】
−−軟エックス線像−−
図８は、前記４週間後の歯の軟エックス線写真である。図８に示されるように、歯根とともに歯槽骨が形成され、歯根と歯槽骨の間には、歯根膜腔（軟組織である歯根膜の形成を示す空隙）が確認された。【００５４】
−−ＨＥ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ）染色−−
図９は、培養４週間後の歯の薄片をＨＥ染色した結果を示す説明図である。図９中、「９１」は歯冠を、「９２」は「歯根」を示す。
図１０は、図９における囲みａ部分を拡大して示した説明図である。囲みａ部分は、歯冠の周りの組織の一部を表す。図１０に示されるように、歯冠の周囲に、歯肉１０１、及び筋組織１０２が形成されていることが確かめられた。【００５５】
図１１は、図９における囲みｂ部分を拡大して示した説明図である。囲みｂ部分は、２つの歯根の間の骨組織の一部を表す。図１１に示されるように、新生歯槽骨の骨髄内において、多数の赤芽球が観察され、造血を示唆する所見が確認された。図１１において、符号＊で示される箇所が、骨髄腔である。【００５６】
図１２は、図９における囲みｃ部分を拡大して示した説明図である。囲みｃ部分は、歯根部歯髄の一部を表す。図１２に示されるように、歯根部の歯髄内において赤血球を伴う血管新生が確認された（矢印部）。図１２において、符号＊で示される箇所は、血管腔である。【００５７】
図１３は、培養４週間後の歯の歯根膜周辺の組織を拡大して示した説明図（ＨＥ染色像）である。図１３に示されるように、歯槽骨（Ｂ）と、セメント質（Ｃ）及び象牙質（Ｄ）との間に、歯根膜（ＰＤＬ；図８の軟エックス写真における歯根膜腔に相当）が形成されていることが確かめられた。【００５８】
−−Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−−
Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法を用いて、再生組織の遺伝子発現の確認を行った。歯根膜マーカーとして、Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ、及び骨・セメント質マーカーとして、Ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＳＰ）を用いた。
図１４は、Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎを用いた、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法の結果を示す説明図である。図１５は、ＢＳＰを用いた、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法の結果を示す説明図である。図１４及び図１５に示されるように、これらの歯根膜・骨・セメント質に特異的なマーカーによって、再生組織が間違いなく歯周組織であることが、遺伝子発現レベルで確かめられた。これにより、培養により形成された歯根の周囲に、歯周組織も形成されていることが確かめられた。【００５９】
＜移植試験１＞
−生着確認試験−
培養４週間後の歯を、マウス上顎切歯の抜歯窩に移植した。
移植から４週間後、上顎切歯部の歯科用エックス線像、及びマイクロＣＴ像を撮影した。図１６は、移植４週間後の移植歯の歯科用エックス線像を示す説明図である。図１７は、移植４週間後の移植歯のマイクロＣＴ像を示す説明図である。図１６中、１６１は移植歯を、１６２は正常切歯（反対側切歯）を示し、図１７中、移植歯の１７１は歯冠を、１７２は歯根（２根）を、１７３は歯根膜腔を示す。
図１６及び図１７に示されるように、移植歯は、顎骨内で維持され、生着していることが確かめられた。【００６０】
＜移植試験２＞
−血管侵入の確認−
培養１０週間後の歯を、マウスの頭蓋骨に移植した。移植から９週間後、前記マウスに蛍光標識した液状ゼラチンを心臓から灌流して、組織切片を作製した後、共焦点レーザー顕微鏡を用いて移植歯内の血管の有無を確認した。
図１８Ａ、及び図１８Ｂは、マウス頭蓋骨中の移植歯の蛍光観察像を示す説明図である。図１８Ｂ中、１８１は頭蓋骨壁を、１８２は移植歯を示す。
図１８Ａ、及び図１８Ｂに示されるように、移植歯の歯髄内にホスト由来の毛細血管（矢印部）が侵入しており、移植歯が生着していることが確かめられた。【００６１】
〔実施例２〕
（ヒト歯冠、及び歯根膜由来細胞シートを用いた歯根や歯周組織の形成）
＜培養用コアの形成＞
−歯冠の準備−
ヒト歯冠として、１３歳女性患者の歯根未形成の第３大臼歯（智歯）を用いた。図１９は、前記ヒト歯冠の説明図（実体顕微鏡写真）である。図１９中、２３１は歯冠を示し、１９１は歯乳頭を示す。図１９に示すように、歯冠の形成は完了しているが、歯根は未形成であった。【００６２】
−歯根膜由来細胞シートの調製−
実施例１と同様にして、歯根膜由来細胞シートを調製した。【００６３】
−前培養−
前記歯根膜由来細胞シートの上に、前記ヒト歯冠を置き、その状態で、２日間培養（前培養）した。図２０は、前培養の説明図（実体顕微鏡写真）である。【００６４】
−包み−
前培養後、実施例１と同様にして、ヒト歯冠を、ヒト歯根膜由来細胞シート、及びテルダーミス（登録商標）で包み込み、培養用コアを得た。【００６５】
＜歯根や歯周組織の形成＞
前記培養用コアを、１５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に、天然ＥＴＦｓを０．１ｍＬ／ｍＬ添加した培養液中で、培養した。培養液は、数日おきに交換した。図２１は、前記培養用コアの培養の説明図（実体顕微鏡写真）である。なお、天然ＥＴＦｓは、実施例１と同様にして調製した。【００６６】
−培養２４週間後−
培養開始から２４週間後、歯を取り出して、歯根の確認を行った。図２２は、培養用コアから歯を取り出した直後の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。図２２では、主に歯根周囲を軟組織（＊部分）が覆っていることが確認された。【００６７】
−−実体顕微鏡像−−
前記取り出した歯を実体顕微鏡で撮影した。なお、撮影の際に、ピンセットで触れると前記軟組織は、容易に剥がれ、伸長した歯根が露出した。図２３は、前記培養２４週間後の歯の実体顕微鏡像を示す説明図であり、歯冠２３１から歯根２３２が形成されたことが確認された。図２４は、前記培養２４週間後の歯を根尖斜め方向から撮影した実体顕微鏡像を示す図である。図２５は、前記培養２４週間後の歯を根尖方向から撮影した実体顕微鏡像を示す図である。図２４、及び図２５中の矢印部分は、根尖部歯髄を示す。図２３から図２５に示されるように、歯根の形成が確認された。【００６８】
−−軟エックス線像−−
図２６は、前記培養２４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。図２６に示されるように、歯髄腔（＊部分）が形成されていることが確認された。【００６９】
−−マイクロＣＴ像−−
図２７Ａから図２７Ｂは、前記培養２４週間後の歯の側面のマイクロＣＴ像を示す説明図である。図２７Ｃは、前記培養２４週間後の歯の側面断面のマイクロＣＴ像を示す説明図である。図２８Ａから図２８Ｃは、前記培養２４週間後の歯の根尖方向からの歯根断面のマイクロＣＴ像を示す説明図である。図２７Ａから図２８Ｃに示されるように歯根が伸長されていることが確認された。図中、「矢印」は、根尖部歯髄を示し、「＊」は、歯髄腔を示す。【００７０】
−−軟組織の分析−−
前記培養２４週間後の歯の周囲を覆っていた軟組織（図２２の＊部分）を分析した。
図２９は、歯から剥がした軟組織の実体顕微鏡像を示す説明図である。図中の「＊」は、図２２の「＊」に対応する部分を示す。
図３０は、歯から剥がした軟組織の軟エックス線像を示す説明図である。図の囲み部は、図２９の囲み部に対応する部分を示した巨大な歯槽骨であり、矢印は、歯槽骨の小塊を示す。
図３１Ａ、及び図３１Ｂは、図３０の囲み部の巨大な歯槽骨のマイクロＣＴ像を示す説明図である。
上記分析の結果、結合組織と歯槽骨の形成が確認された。【００７１】
〔実施例３〕
（マウス歯冠、及び骨髄由来細胞シートを用いた歯根や歯周組織の形成）
実施例１の歯根膜由来細胞シートに代えて、骨髄由来細胞シートを用いた以外は、実施例１と同様にして、歯根や歯周組織、又はその複合体の形成を行った。【００７２】
−骨髄由来細胞シートの調製−
骨髄輸血の際の余剰骨髄を採取して、基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社製）＋１５％ＦＢＳ（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製、ロット番号  ２４３００１１３）＋１％ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ液（インビトロジェン社製）＋５０Ｕ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（インビトロジェン社製）＋５０μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（インビトロジェン社製）＋０．２５μｇ  Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（インビトロジェン社製））にて、初代培養した。培養開始数日後に培養液の交換を行うと、シャーレには接着性の細胞が出現し、浮遊性の細胞は除去された。この接着性細胞の培養を続け、コンフルエントに達した後、３つのシャーレに分けて骨髄由来細胞を継代培養（１代目）した。１代目がコンフルエントに達した後、１代目の継代培養後のシャーレから、更に３つのシャーレに分けて骨髄由来細胞を継代培養（２代目）した。２代目がコンフルエントに達し、シート状となった骨髄由来細胞を、骨髄由来細胞シートとした。【００７３】
−培養４週間後−
培養開始から４週間後、歯を取り出して、歯根や歯周組織の確認を行った。図３２は、培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
図３２に示されるように、歯根相当部に、歯槽骨が形成されていることが確認された。【００７４】
−−軟エックス線像−−
図３３は、前記４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。図３３に示されるように、歯根とともに歯槽骨が形成され、歯根と歯槽骨の間には、歯根膜腔が確認された。【００７５】
〔実施例４〕
（マウス歯冠、及び歯小嚢由来細胞シートを用いた歯根や歯周組織の形成）
実施例１の歯根膜由来細胞シートに代えて、歯小嚢由来細胞シートを用いた以外は、実施例１と同様にして、歯根や歯周組織、又はその複合体の形成を行った。【００７６】
−歯小嚢由来細胞シートの調製−
未完成のヒト抜去歯の周囲に付着した軟組織（これを歯小嚢と呼ぶ。未完成歯の周囲に存在する線維性結合組織である。）を採取してカミソリメスで細切し、その細切された歯小嚢組織を、０．１％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）液中で、３７℃、３０分間、加温し、強くピペッティングして、歯小嚢由来細胞を解離させた。次いで、該歯小嚢由来細胞を含む溶液を、３００×ｇで５分間遠沈し、上澄みを吸引除去した後、沈渣に、基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社製）＋１５％ＦＢＳ（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製、ロット番号  ２４３００１１３）＋１％ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ液（インビトロジェン社製）＋５０Ｕ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（インビトロジェン社製）＋５０μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（インビトロジェン社製）＋０．２５μｇ  Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（インビトロジェン社製））を加えて、培養シャーレで初代培養した。あるいは、カミソリメスで細切した組織を培養シャーレ上で前記基本培地を用いて初代培養した。両者の方法によって初代培養がコンフルエントに達した後、３つのシャーレに分けて歯小嚢由来細胞を継代培養（１代目）した。１代目がコンフルエントに達した後、１代目の継代培養後のシャーレから、更に３つのシャーレに分けて歯小嚢由来細胞を継代培養（２代目）した。２代目がコンフルエントに達し、シート状となった歯小嚢由来細胞を、歯小嚢由来細胞シートとした。【００７７】
−培養４週間後−
培養開始から４週間後、歯を取り出して、歯根や歯周組織の確認を行った。図３４は、培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
図３４に示されるように、歯根相当部に、歯槽骨が形成されていることが確認された。【００７８】
−−軟エックス線像−−
図３５は、前記４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。図３５に示されるように、歯根とともに歯槽骨が形成され、歯根と歯槽骨の間には、歯根膜腔が確認された。【００７９】
〔実施例５〕
（マウス歯冠、及び歯髄由来細胞シートを用いた歯根や歯周組織の形成）
実施例１の歯根膜由来細胞シートに代えて、歯髄由来細胞シートを用いた以外は、実施例１と同様にして、歯根や歯周組織、又はその複合体の形成を行った。【００８０】
−歯髄由来細胞シートの調製−
歯科用のスチールバーを用いて、ヒトの抜去歯の歯頸部（エナメル質とセメント質の境界部）でＨａｎｋｓ液（ニッスイ社製）で冷却しながら歯を切断した。続いて、歯冠部と歯根部の歯髄組織を採取して、カミソリメスで組織を細切し、その細切した歯髄組織を、０．１％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）液中で、３７℃、３０分間、加温し、強くピペッティングして、歯髄由来細胞を解離させた。次いで、該歯髄由来細胞を含む溶液を、３００×ｇで５分間遠沈し、上澄みを吸引除去した後、沈渣に、基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社製）＋１５％ＦＢＳ（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製、ロット番号  ２４３００１１３）＋１％ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ液（インビトロジェン社製）＋５０Ｕ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（インビトロジェン社製）＋５０μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（インビトロジェン社製）＋０．２５μｇ  Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（インビトロジェン社製））を加えて、培養シャーレで初代培養した。あるいは、カミソリメスで細切した組織を培養シャーレ上で前記基本培地を用いて初代培養した。両者の方法によって初代培養がコンフルエントに達した後、３つのシャーレに分けて歯髄由来細胞を継代培養（１代目）した。１代目がコンフルエントに達した後、１代目の継代培養後のシャーレから、更に３つのシャーレに分けて歯髄由来細胞を継代培養（２代目）した。２代目がコンフルエントに達し、シート状となった歯髄由来細胞を、歯髄由来細胞シートとした。【００８１】
−培養４週間後−
培養開始から４週間後、歯を取り出して、歯根や歯周組織の確認を行った。図３６は、培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
図３６に示されるように、歯根相当部に、歯槽骨が形成されていることが確認された。【００８２】
−−軟エックス線像−−
図３７は、前記４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。図３７に示されるように、歯根とともに歯槽骨が形成され、歯根と歯槽骨の間には、歯根膜腔が確認された。【００８３】
〔実施例６〕
（マウス歯冠、及び歯乳頭由来細胞シートを用いた歯根や歯周組織の形成）
実施例１の歯根膜由来細胞シートに代えて、歯乳頭由来細胞シートを用いた以外は、実施例１と同様にして、歯根や歯周組織、又はその複合体の形成を行った。【００８４】
−歯乳頭由来細胞シートの調製−
歯根未完成のヒト抜去歯の歯根先端部の歯髄組織（これを歯乳頭と呼ぶ。）を採取してカミソリメスで細切し、その細切された歯乳頭組織を、０．１％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）液中で、３７℃、３０分間、加温し、強くピペッティングして、歯乳頭由来細胞を解離させた。次いで、該歯乳頭由来細胞を含む溶液を、３００×ｇで５分間遠沈し、上澄みを吸引除去した後、沈渣に、基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社製）＋１５％ＦＢＳ（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製、ロット番号  ２４３００１１３）＋１％ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ液（インビトロジェン社製）＋５０Ｕ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（インビトロジェン社製）＋５０μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（インビトロジェン社製）＋０．２５μｇ  Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（インビトロジェン社製））を加えて、培養シャーレで初代培養した。あるいは、カミソリメスで細切した組織を培養シャーレ上で前記基本培地を用いて初代培養した。両者の方法によって初代培養がコンフルエントに達した後、３つのシャーレに分けて歯乳頭由来細胞を継代培養（１代目）した。１代目がコンフルエントに達した後、１代目の継代培養後のシャーレから、更に３つのシャーレに分けて歯乳頭由来細胞を継代培養（２代目）した。２代目がコンフルエントに達し、シート状となった歯乳頭由来細胞を、歯乳頭由来細胞シートとした。【００８５】
−培養４週間後−
培養開始から４週間後、歯を取り出して、歯根や歯周組織の確認を行った。図３８は、培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
図３８に示されるように、歯根相当部に、歯槽骨が形成されていることが確認された。【００８６】
−−軟エックス線像−−
図３９は、前記４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。図３９に示されるように、歯根とともに歯槽骨が形成され、歯根と歯槽骨の間には、歯根膜腔が確認された。【００８７】
〔実施例７〕
（マウス歯冠、及び歯根膜由来細胞含有多孔性基材を用いた歯根や歯周組織の形成）
＜培養用コアの形成＞
−歯冠の準備−
実施例１と同様にして、マウス歯冠を用意した。【００８８】
−歯根膜由来細胞の調製−
ヒト成人の抜去歯から歯根膜組織を片刃カミソリで採取した。採取した歯根膜組織の細片を更にカミソリメスで細切し、その細切された歯根膜組織を、０．１％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）液中で、３７℃、３０分間、加温し、強くピペッティングして、歯根膜由来細胞を解離させた。次いで、該歯根膜由来細胞を含む溶液を、３００×ｇで５分間遠沈し、上澄みを吸引除去した後、沈渣に、基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社製）＋１５％ＦＢＳ（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製、ロット番号  ２４３００１１３）＋１％ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ液（インビトロジェン社製）＋５０Ｕ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（インビトロジェン社製）＋５０μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（インビトロジェン社製）＋０．２５μｇ  Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（インビトロジェン社製））を加えて、培養シャーレで培養し、歯根膜由来細胞を調製した。【００８９】
−歯根膜由来細胞含有多孔性基材の調製−
多孔性基材として、テルダーミス（登録商標）（オリンパス  テルモ  バイオマテリアル社製）を使用した。前記基本培地に含浸させた前記多孔性基材（４ｃｍ×４ｃｍ大のシート状基材）に、前記歯根膜由来細胞（２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を播種した後、３７℃の条件で、７２時間培養して、歯根膜由来細胞含有多孔性基材を調製した。【００９０】
−培養用コア−
前記マウス歯冠を、前記歯根膜由来細胞を含有させた多孔性基材で包み込み、マウス歯冠を、ヒト歯根膜由来細胞を含有する多孔性基材内に埋入させ、培養用コアを得た。【００９１】
＜歯根や歯周組織の形成＞
前記培養用コアを、１５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に、天然ＥＴＦｓを０．１ｍＬ／ｍＬ添加した培養液中で、培養した。培養液は、数日おきに交換した。なお、天然ＥＴＦｓは、実施例１と同様にして調製した。【００９２】
−培養４週間後−
培養開始から４週間後、歯を取り出して、歯根や歯周組織の確認を行った。図４０は、培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
図４０に示されるように、歯根相当部に、歯槽骨が形成されていることが確認された。【００９３】
−−軟エックス線像−−
図４１は、前記４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。図４１に示されるように、歯根とともに歯槽骨が形成され、歯根と歯槽骨の間には、歯根膜腔が確認された。【００９４】
〔実施例８〕
（マウス歯冠、歯根膜由来細胞シート、及び歯根膜由来細胞含有多孔性基材を用いた歯根や歯周組織の形成）
＜培養用コアの形成＞
−歯冠の準備−
実施例１と同様にして、マウス歯冠を用意した。【００９５】
−歯根膜由来細胞シートの調製−
実施例１と同様にして、歯根膜由来細胞シートを調製した。【００９６】
−前培養−
実施例１と同様にして、前培養を行い、マウス歯冠をヒト歯根膜由来細胞シート上に固定した。【００９７】
−歯根膜由来細胞含有多孔性基材の調製−
実施例４と同様にして、歯根膜由来細胞含有多孔性基材を調製した。【００９８】
−培養用コア−
実施例１において、細胞を含有しないテルダーミスを、前記歯根膜由来細胞含有多孔性基材に代えた以外は、実施例１と同様にして、マウス歯冠を、ヒト歯根膜由来細胞シート、及び歯根膜由来細胞含有多孔性基材内に埋入させ、培養用コアを得た。【００９９】
＜歯根や歯周組織の形成＞
前記培養用コアを、１５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液に、天然ＥＴＦｓを０．１ｍＬ／ｍＬ添加した培養液中で、培養した。培養液は、数日おきに交換した。なお、天然ＥＴＦｓは、実施例１と同様にして調製した。【０１００】
−培養４週間後−
培養開始から４週間後、歯を取り出して、歯根や歯周組織の確認を行った。図４２は、培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
図４２に示されるように、歯根相当部に、歯槽骨が形成されていることが確認された。【０１０１】
−−軟エックス線像−−
図４３は、前記４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。図４３に示されるように、歯根とともに歯槽骨が形成され、歯根と歯槽骨の間には、歯根膜腔が確認された。【０１０２】
〔実施例９〕
（マウス歯冠、及び歯根膜由来細胞シートを用いた歯根や歯周組織の形成）
前記実施例１において、天然ＥＴＦｓを以下のｒｈＯＥＦｓとした以外は、実施例１と同様にして、歯根や歯周組織の形成を行った。【０１０３】
前記培養用コアを培養する培養液中における前記ｒｈＯＥＦｓの各成分の含有量は、以下の通りである。
ＩＬ−１β（商品名：ＩＬ−１β、Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社製）・・・１５０ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−６（商品名：ＩＬ−６、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）・・・１００ｐｇ／ｍＬ
ＩＬ−８（商品名：ＩＬ−８、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）・・・１．０ｎｇ／ｍＬ
ＩＬ−９（商品名：ＩＬ−９、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）・・・４５０ｐｇ／ｍＬ
ＥＧＦ（商品名：ＥＧＦ、Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社製）・・・１．５ｎｇ／ｍＬ
ＩＧＦ−Ｉ（商品名：ＩＧＦ−１、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）・・・２０ｎｇ／ｍＬ
ＧＨ（商品名：ｈＧＨ、ノボ・ノルディスク社製）・・・２．５ｎｇ／ｍＬ
ＰＤＧＦ−ＡＢ（商品名：ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）・・・０．６ｎｇ／ｍＬ
ＶＥＧＦ（商品名：ＶＥＧＦ、Ｂａｃｈｅｍ  Ｆｅｉｎｃｈｅ−ｍｉｋａｌｉｅｎ  ＡＧ社製）・・・３．２ｎｇ／ｍＬ
ＬＩＦ（商品名：ＬＩＦ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）・・・３５ｐｇ／ｍＬ
ＨＧＦ（商品名：ＨＧＦ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）・・・１．０ｎｇ／ｍＬ
ＦＧＦ−２（商品名：ＦＧＦ−２、ＰｒｏＳｐｅｃ−Ｔａｎｙ  Ｔｅｃｈｎｏｇｅｎｅ社製）・・・２０ｎｇ／ｍＬ
ＦＧＦ−１（商品名：ＦＧＦ−１、ＰｒｏＳｐｅｃ−Ｔａｎｙ  Ｔｅｃｈｎｏｇｅｎｅ社製）・・・５．０ｎｇ／ｍＬ
ＢＭＰ−２（商品名：ＢＭＰ−２、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）・・・１０ｎｇ／ｍＬ
ＢＭＰ−４（商品名：ＢＭＰ−４、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）・・・１５ｎｇ／ｍＬ
Ｍ−ＣＳＦ（商品名：Ｍ−ＣＳＦ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）・・・１０μｇ／ｍＬ
デキサメタゾン（商品名：デキサメタゾン、ＢＩＯＭＯＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  ＬＰ社製）・・・５μＭ
インスリン（商品名：インスリン、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）・・・７．５ｎｇ／ｍＬ
サイロキシン（商品名：サイロキシン、ＳＩＧＭＡ社製）・・・５．５ｎｇ／ｍＬ
サイロカルシトニン（商品名：カルシトニン（ｈｕｍａｎ）、Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社製）・・・１０ｎｇ／ｍＬ
アスコルビン酸（商品名：アスコルビン酸、ＳＩＧＭＡ社製）・・・５０μｇ／ｍＬ
β−グリセロリン酸（商品名：β−グリセロリン酸、ＳＩＧＭＡ社製）・・・１０ｍＭ【０１０４】
−培養４週間後−
培養開始から４週間後、歯を取り出して、歯根や歯周組織の確認を行った。図４４は、培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
図４４に示されるように、歯根相当部に、歯槽骨が形成されていることが確認された。【０１０５】
−−軟エックス線像−−
図４５は、前記４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。図４５に示されるように、歯根とともに歯槽骨が形成され、歯根と歯槽骨の間には、歯根膜腔が確認された。【０１０６】
〔実施例１０〕
（マウス歯冠、及び歯根膜由来細胞シートを用いた歯根や歯周組織の形成）
前記実施例７において、天然ＥＴＦｓを前記実施例９のｒｈＯＥＦｓとした以外は、実施例７と同様にして、歯根や歯周組織の形成を行った。【０１０７】
−培養４週間後−
培養開始から４週間後、歯を取り出して、歯根や歯周組織の確認を行った。図４６は、培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
図４６に示されるように、歯根相当部に、歯槽骨が形成されていることが確認された。【０１０８】
−−軟エックス線像−−
図４７は、前記４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。図４７に示されるように、歯根とともに歯槽骨が形成され、歯根と歯槽骨の間には、歯根膜腔が確認された。【０１０９】
〔実施例１１〕
（マウス歯冠、及び歯根膜由来細胞シートを用いた歯根や歯周組織の形成）
前記実施例８において、天然ＥＴＦｓを前記実施例９のｒｈＯＥＦｓとした以外は、実施例８と同様にして、歯根や歯周組織の形成を行った。【０１１０】
−培養４週間後−
培養開始から４週間後、歯を取り出して、歯根や歯周組織の確認を行った。図４８は、培養４週間後のマウス歯冠の状態を示す説明図（実体顕微鏡写真）である。
図４８に示されるように、歯根相当部に、歯槽骨が形成されていることが確認された。【０１１１】
−−軟エックス線像−−
図４９は、前記４週間後の歯の軟エックス線像を示す説明図である。図４９に示されるように、歯根とともに歯槽骨が形成され、歯根と歯槽骨の間には、歯根膜腔が確認された。【０１１２】
上記に示したように、異種・同種移植技術（生体内培養）を使用することなく、インビトロ（生体外培養）において、マウス歯冠、及びヒト歯冠から、歯根を有する再生歯が得られること、及び、歯周組織を有する歯根を形成することができ、歯根と、歯周組織とを有する再生歯が得られることが確認された。なお、本発明の技術は、歯に限らず、他の組織・臓器のインビトロでの形成にも応用可能であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明の方法は、異種・同種移植技術（生体内培養）を使用することなく、インビトロ（生体外培養）において、歯周組織を有する歯根を形成することができるので、免疫拒絶やウイルス等の感染のおそれのない再生歯の形成が可能となる。
また、本発明の再生歯は、本発明の方法により得ることができるので、歯の喪失部への移植、さらに歯槽骨が失われている症例においても、好適に用いることができる。
そして、本発明は、歯に限らず、他の組織・臓器の再生に好適に利用可能である。
【符号の説明】
【０１１４】
２１    初代培養
２２    継代１代目
２３    継代２代目
３１    マウス歯冠
３２    歯根膜由来細胞シート
４１    多孔性基材
９１    歯冠
９２    歯根
１０１    歯肉
１０２    筋組織
１６１    移植歯
１６２    正常切歯
１７１    歯冠
１７２    歯根
１７３    歯根膜腔
１８１    頭蓋骨壁
１８２    移植歯
１９１    歯乳頭
２３１    歯冠
２３２    歯根
Ｂ    歯槽骨
Ｃ    セメント質
Ｄ    象牙質
ＰＤＬ    歯根膜
【図１】
2010027008.tif 000003
【図２】
2010027008.tif 000004
【図３】
2010027008.tif 000005
【図４】
2010027008.tif 000006
【図５】
2010027008.tif 000007
【図６】
2010027008.tif 000008
【図７】
2010027008.tif 000009
【図８】
2010027008.tif 000010
【図９】
2010027008.tif 000011
【図１０】
2010027008.tif 000012
【図１１】
2010027008.tif 000013
【図１２】
2010027008.tif 000014
【図１３】
2010027008.tif 000015
【図１４】
2010027008.tif 000016
【図１５】
2010027008.tif 000017
【図１６】
2010027008.tif 000018
【図１７】
2010027008.tif 000019
【図１８Ａ】
2010027008.tif 000020
【図１８Ｂ】
2010027008.tif 000021
【図１９】
2010027008.tif 000022
【図２０】
2010027008.tif 000023
【図２１】
2010027008.tif 000024
【図２２】
2010027008.tif 000025
【図２３】
2010027008.tif 000026
【図２４】
2010027008.tif 000027
【図２５】
2010027008.tif 000028
【図２６】
2010027008.tif 000029
【図２７Ａ】
2010027008.tif 000030
【図２７Ｂ】
2010027008.tif 000031
【図２７Ｃ】
2010027008.tif 000032
【図２８Ａ】
2010027008.tif 000033
【図２８Ｂ】
2010027008.tif 000034
【図２８Ｃ】
2010027008.tif 000035
【図２９】
2010027008.tif 000036
【図３０】
2010027008.tif 000037
【図３１Ａ】
2010027008.tif 000038
【図３１Ｂ】
2010027008.tif 000039
【図３２】
2010027008.tif 000040
【図３３】
2010027008.tif 000041
【図３４】
2010027008.tif 000042
【図３５】
2010027008.tif 000043
【図３６】
2010027008.tif 000044
【図３７】
2010027008.tif 000045
【図３８】
2010027008.tif 000046
【図３９】
2010027008.tif 000047
【図４０】
2010027008.tif 000048
【図４１】
2010027008.tif 000049
【図４２】
2010027008.tif 000050
【図４３】
2010027008.tif 000051
【図４４】
2010027008.tif 000052
【図４５】
2010027008.tif 000053
【図４６】
2010027008.tif 000054
【図４７】
2010027008.tif 000055
【図４８】
2010027008.tif 000056
【図４９】
2010027008.tif 000057
【国際調査報告】
2010027008.tif 000058
2010027008.tif 000059
2010027008.tif 000060
2010027008.tif 000061
2010027008.tif 000062
2010027008.tif 000063