(57)【要約】本発明は、新規なプロテオグリカン含有物を製造し、さらに当該プロテオグリカン含有物の新規用途及び／又は優れた効果を見出すことを課題としてなされた。本発明は、魚類の軟骨から得られるプロテオグリカン含有物であって、分子量が２０００ｋＤａ以上の酸性糖成分を含む、プロテオグリカン含有物を提供する。当該プロテオグリカン含有物は、優れた皮膚繊維芽細胞増殖効果、皮膚バリア機能増強及び改善効果、皮膚コラーゲン産生能増強及び改善効果、真皮肥厚抑制効果等、皮膚の保湿及び抗老化のために有利な効果を奏する。
2011007885.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類の軟骨から得られる、酸性糖成分としてプロテオグリカン及び酸性糖を含むプロテオグリカン含有物であって、
分子量が２０００ｋＤａ以上の酸性糖成分を含む、プロテオグリカン含有物。
【請求項２】
分子量が５０００ｋＤａ以上のプロテオグリカンを含む、請求項１に記載のプロテオグリカン含有物。
【請求項３】
酸性糖成分の５０質量％以上が２０００ｋＤａ以上の分子量を有する、請求項１又は２に記載のプロテオグリカン含有物。
【請求項４】
プロテオグリカンの２０質量％以上が１００００ｋＤａ以上の分子量を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のプロテオグリカン含有物。
【請求項５】
酸性糖成分の２０質量％以上がプロテオグリカンである、請求項１〜４のいずれかに記載のプロテオグリカン含有物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のプロテオグリカン含有物を含む飲食品組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のプロテオグリカン含有物を含む口腔用組成物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のプロテオグリカン含有物を含む化粧品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテオグリカン含有物に関する。より詳細には魚類の軟骨から得られるプロテオグリカン含有物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオグリカンは、コラーゲンなどとともに結合組織の細胞外マトリックス中の基質を形成している主要な生体高分子である。プロテオグリカンは、従来哺乳動物（特に牛）軟骨に含まれるものを抽出分離して得ていたが、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）発症が報告されてから、これに代わるプロテオグリカン供給源及び製造方法が求められるようになっている。【０００３】
水産動物組織は有力なプロテオグリカン供給源代替候補である。水産動物である鯨やサメの軟骨に含まれるプロテオグリカンの抽出が試みられている。しかし、これらの水産動物の捕獲量には限りがあり、大量のプロテオグリカンを製造することは困難であった。また、抽出分離操作も煩雑であり、抽出に用いられる溶媒等には毒性が低くないものが存在するなどした。このため、製品の用途が制限され、特に食品や化粧品の製造に用いることは難しい状況であった。【０００４】
このような状況において、様々なプロテオグリカン製造方法が研究されている。例えば、特許文献１には、サケの鼻軟骨を粉砕及び脱脂処理して得た脱脂乾燥粉末を溶媒で抽出し、得られた抽出液から粗プロテオグリカンを分離精製した後透析を行うことを特徴とする、プロテオグリカンの精製方法が記載されている。しかしながら、当該方法ではクロロホルム、メタノール等の毒性の低くはない有機溶媒が抽出溶媒として使用されており、また、得られるプロテオグリカンに生臭さが残存するなど、問題があった。【０００５】
また、特許文献２には抽出溶媒として酢酸を用いてサケ鼻軟骨からプロテオグリカンを精製する方法が記載されている。特許文献３では、特許文献２記載の精製方法にて精製されたプロテオグリカンに繊維芽細胞増殖促進作用及びヒアルロン酸合成促進作用があることが示唆されている。【０００６】
このように、プロテオグリカンの製造方法や、その用途及び効果については、現在も研究が行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−１７２２９６号公報
【特許文献２】特開２００２−０６９０９７号公報
【特許文献３】特開２００８−２４７８０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、毒性の低い溶媒を用いて、魚類軟骨から新規なプロテオグリカンを含む組成物（プロテオグリカン含有物）を製造し、さらに当該プロテオグリカン含有物の新規用途及び優れた効果を見出すことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、驚くべき事に、魚類の軟骨から特定の手順により抽出して得られる、酸性糖成分を含む抽出物が、従来知られていたプロテオグリカンよりも大きい分子量を有するプロテオグリカンを含んでいることを見出した。さらに、当該抽出物が種々の優れた効果を奏することを見出し、改良を重ねて本発明を完成させるに至った。【００１０】
なお、本明細書では、酸性糖、及び酸性糖を構成成分として有する化合物を酸性糖成分と呼ぶこととする。プロテオグリカンは、酸性糖とタンパク質が結合した構造を有する物質であるため、当該化合物に相当する。よって、プロテオグリカンは、酸性糖成分の１種である。本発明のプロテオグリカン含有物は、酸性糖成分として、プロテオグリカン及び酸性糖を含む。よって、本発明のプロテオグリカン含有物は、酸性糖成分含有物と換言してもよい。
本発明は、例えば以下の項に記載のプロテオグリカン含有物、当該含有物を含む組成物等を包含する。
項１．
魚類の軟骨から得られる、酸性糖成分としてプロテオグリカン及び酸性糖を含むプロテオグリカン含有物であって、
分子量が２０００ｋＤａ以上の酸性糖成分を含む、プロテオグリカン含有物。
項２．
分子量が５０００ｋＤａ以上のプロテオグリカンを含む、項１に記載のプロテオグリカン含有物。
項３．
酸性糖成分の５０質量％以上が２０００ｋＤａ以上の分子量を有する、項１又は２に記載のプロテオグリカン含有物。
項４．
プロテオグリカンの２０質量％以上が１００００ｋＤａ以上の分子量を有する、項１〜３のいずれかに記載のプロテオグリカン含有物。
項５．
酸性糖成分の２０質量％以上がプロテオグリカンである、項１〜４のいずれかに記載のプロテオグリカン含有物。
項６．
項１〜５のいずれかに記載のプロテオグリカン含有物を含む飲食品組成物。
項７．
項１〜５のいずれかに記載のプロテオグリカン含有物を含む口腔用組成物。
項８．
項１〜５のいずれかに記載のプロテオグリカン含有物を含む化粧品組成物。
項９．
魚類の軟骨から抽出されたプロテオグリカンであって、分子量が５０００ｋＤａ以上のプロテオグリカン。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のプロテオグリカン含有物は、優れた皮膚繊維芽細胞増殖効果、皮膚バリア機能増強及び改善効果、皮膚コラーゲン産生能増強及び改善効果、真皮肥厚抑制効果等、皮膚の保湿及び抗老化のために有利な効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明において、プロテオグリカンを示すピーク面積を考える際の手順の模式図を示す。
【図２】サケ鼻軟骨由来粉末（左図）及びサケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物（右図）をサンプルとしてゲル濾過クロマトグラフィー（Sepharose CL-2B充填カラムを使用）で処理し、溶出フラクションを１ｍＬずつ採取して、当該各フラクションに含まれる酸性糖量及びタンパク質量をそれぞれカルバゾール硫酸法及びＵＶ吸収法で定量した結果を示す。
【図３】市販されているプロテオグリカン（ＰＧ−Ｋ）及び市販されているグリコサミノグリカン（ＰＧ−Ｍ；コンドロイチンとして市販）について、ゲル濾過クロマトグラフィー処理を行い、各溶出フラクションに含まれる酸性糖量を定量した結果を示す。ＰＧ−Ｍの結果を左図に、ＰＧ−Ｋの結果を右図に示す。
【図４】デキストラン分子量マーカーについてゲル濾過クロマトグラフィーを行い、フェノール・硫酸法により各溶出フラクションに含まれる糖量（すなわちデキストラン量）を定量した結果を示す。
【図５】図４から得られた、各分子量マーカーが溶出される液量をもとに作成した検量線を示す。
【図６】図１及び図２に示される酸性糖量測定結果をまとめたグラフを示す。
【図７】サケ鼻軟骨由来粉末をサンプルとしてゲル濾過クロマトグラフィー（Sephacryl S-1000 SF充填カラムを使用）で処理し、溶出フラクションを１ｍＬずつ採取して、当該各フラクションに含まれる酸性糖量をカルバゾール硫酸法で定量した結果を示す。
【図８】サケ鼻軟骨由来粉末、及びサケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物の、ヒト皮膚繊維芽細胞増殖能を検討した結果を示す。
【図９】サケ鼻軟骨由来粉末、及びサケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物が、経口摂取により皮膚バリア機能（ＴＥＷＬ値）へ与える影響を検討した結果を示す。
【図１０】サケ鼻軟骨由来粉末、及びサケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物が、経口摂取により皮膚弾力性に与える影響を検討した結果を示す。
【図１１】サケ鼻軟骨由来粉末、及びサケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物が、経口摂取により皮膚におけるコラーゲン産生能に与える影響を検討した結果を示す。
【図１２】サケ鼻軟骨由来粉末、及びサケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物が、真皮皮厚へ与える影響について検討するため、これらを経口投与したマウスの背部の真皮皮厚を測定した結果を示す。
【図１３】サケ鼻軟骨由来粉末、及びサケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物が、経皮投与により皮膚バリア機能（ＴＥＷＬ値）へ与える影響を検討した結果を示す。
【図１４】イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーを用いた、サケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物の分画の概要を示す。
【図１５】サケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物の分画画分について細胞増殖効果を検討した結果を示す。具体的には、各サンプル添加（５０μｇ／ｍｌ）から７日後の細胞数を示す。なお、「ＰＧＮＰ水抽出物」とは、サケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物を示す。
【図１６】サケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物の分画画分について細胞増殖効果を検討した結果を示す。具体的には、各サンプル添加（１０μｇ／ｍｌ）から７日後の細胞数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。なお、以下に記載する酸性糖及びプロテオグリカンの分子量値及び平均分子量値は、ゲル濾過クロマトグラフィー解析において、デキストランを分子量マーカーとして用いたときに算出される値である。
【００１４】
本発明のプロテオグリカン含有物は、魚類の軟骨から製造される。魚類としては特に制限されないが、具体的にはマス（カラフトマス、サクラマス、サツキマス等）、サケ（シロザケ、ベニザケ、ギンザケ、マスノスケ、スチールヘッド等）、サメ、タラ等が挙げられる。サケ科サケ属の魚が好ましく、特にサケ又はマスが好ましい。また、軟骨としては、特に制限されないが、頭部軟骨、中でも鼻軟骨が好ましい。また、魚類が食品製品等へ加工される際に頭部は通常廃棄されることから、頭部軟骨の入手コストは安く、大量に安定供給され得るという利点もある。
【００１５】
本発明において、酸性糖成分とは、酸性糖及び酸性糖を構成成分として有する化合物をいう。本発明のプロテオグリカン含有物は、酸性糖成分（すなわち、酸性糖及び酸性糖を構成成分として有する化合物）を含有する。
【００１６】
ここで酸性糖とは、ウロン酸を含有する多糖類である。本発明のプロテオグリカン含有物に含まれる酸性糖は、例えばヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等の、グリコサミノグリカンが挙げられる。なお、ヒアルロン酸以外のグリコサミノグリカンは通常タンパク質に共有結合した形で（すなわちプロテオグリカンとして）存在している。
【００１７】
酸性糖を構成成分として有する化合物としては、具体的にはプロテオグリカンが挙げられる。プロテオグリカンは、グリコサミノグリカン及びタンパク質が共有結合した構造を有する。プロテオグリカンを構成するグリコサミノグリカンは、硫酸基が付加した2糖の繰り返し構造を有する酸性糖であり、具体的にはコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸等が例示できる。つまり、プロテオグリカンはタンパク質と酸性糖が結合した構造を有する化合物である。
【００１８】
これら酸性糖成分が有する２糖の繰り返し構造において、当該２糖のうち通常１つはアミノ糖、もう１つはウロン酸である。従って、酸性糖成分の検出には、ウロン酸検出法の常法の１つであるカルバゾール硫酸法を用いることができる。
【００１９】
カルバゾール硫酸法とは、ウロン酸であるグルクロン酸（Ｇｌｃ  Ａ）及びイズロン酸の発色色素であるカルバゾール溶液を測定検体に添加し、分光光度計を用いて吸光度を測定する方法である。濃度を規定したグルクロン酸標準溶液を用いて検量線を作成し、検体中のグルクロン酸含量を求める。より具体的には、例えば次のようにして行い得る。
【００２０】
ホウ酸ナトリウム・１０水和物０．９５ｇを濃硫酸１００ｍｌに溶解した試薬２．５ｍｌを試験管にとり、氷冷する。これに被検体０．５ｍｌ（4〜40μｇのウロン酸を含むようにする）を静かに重層する。室温以上にならないように水冷しながらよく攪拌する。ガラス球で蓋をした後に、沸騰湯浴中で１０分間加熱し、室温まで水冷する。これに、カルバゾール１２５ｍｇを無水メチルアルコール１００ｍｌに溶解した試薬を０．１ｍｌ加えて混合し、更に１５分間沸騰湯浴中で加熱する。その後、室温まで水冷し530ｎｍにおける吸光度を測定する。ブランクは蒸留水０．５ｍｌを用いる。同時に、グルクロン酸を用いて検量線を作成する。
【００２１】
本発明のプロテオグリカン含有物に含まれる酸性糖成分の平均分子量は、通常約２０００ｋＤａ〜４００００ｋＤａ、好ましくは２５００ｋＤａ〜３００００ｋＤａ、より好ましくは３０００ｋＤａ〜２００００ｋＤａ、さらにより好ましくは３０００ｋＤａ〜１００００ｋＤａ、特に好ましくは４０００ｋＤａ〜８０００ｋＤａである。
【００２２】
本発明のプロテオグリカン含有物には、分子量が２０００ｋＤａ以上の酸性糖成分が含まれる。好ましくは２５００ｋＤａ以上、より好ましくは３０００ｋＤａ以上、さらに好ましくは４０００ｋＤａ以上、よりさらに好ましくは５０００ｋＤａ以上の酸性糖成分が含まれる。
【００２３】
また、本発明のプロテオグリカン含有物に含まれる酸性糖成分は、好ましくはその５０質量％以上が、より好ましくはその５５質量％以上が、さらに好ましくはその６０質量％以上が、よりさらに好ましくはその６５質量％以上が、２０００ｋＤａ以上の分子量を有する。
【００２４】
本発明のプロテオグリカン含有物に含まれるプロテオグリカンは、従来製造されていたプロテオグリカンに比べ、分子量（ＭＷ）が著しく大きい。具体的には、本発明のプロテオグリカン含有物に含まれるプロテオグリカンの分子量は、小さいものでも約５０００ｋＤａ〜６０００ｋＤａ以上ある。すなわち、本発明のプロテオグリカン含有物には、約５０００ｋＤａ以上の分子量を有するプロテオグリカンが含まれる。本発明のプロテオグリカン含有物には、例えば約５０００ｋＤａ〜１０００００ｋＤａ、好ましくは５０００ｋＤａ〜９００００ｋＤａ、より好ましくは５０００ｋＤａ〜８００００ｋＤａ、さらにより好ましくは５０００ｋＤａ〜７００００ｋＤａのプロテオグリカンが含まれ得る。またさらに、本発明のプロテオグリカン含有物に含まれるプロテオグリカンの平均分子量は、特に制限されないが、通常約６０００ｋＤａ〜６００００ｋＤａ、好ましくは約７０００ｋＤａ〜５００００ｋＤａ、より好ましくは約９０００ｋＤａ〜４００００ｋＤａである。
【００２５】
また、本発明のプロテオグリカン含有物に含まれるプロテオグリカンは、好ましくはその２０質量％以上が、より好ましくはその３０質量％以上が、６０００ｋＤａ以上（さらに好ましくは１００００ｋＤａ以上）の分子量を有する。
【００２６】
なお、本発明のプロテオグリカン含有物は、乾燥質量換算で、好ましくは１５〜７０質量％、より好ましくは３０〜７０質量％の酸性糖成分を含む。また、本発明のプロテオグリカン含有物は、乾燥質量換算で、好ましくは４〜４０質量％、より好ましくは１０〜４０質量％、さらに好ましくは１５〜４０質量％のプロテオグリカンを含む。
【００２７】
本発明のプロテオグリカン含有物に含まれる酸性糖成分又はプロテオグリカンの分子量は、クロマトグラフィー等を用いて測定することができる。特にゲル濾過クロマトグラフィーを用いて測定するのが好適である。具体的には、例えばカラムの担体としてアガロース系（アガロース、架橋アガロース等）のゲルマトリックスを、バッファーとしてリン酸緩衝液（好ましくは塩化ナトリウムを含有するもの）を用いればよい。プロテオグリカン含有物をゲル濾過して、酸性糖成分又はプロテオグリカンが溶出されるまでの液量（溶出液量）に応じて当該組成物に含まれる酸性糖成分又はプロテオグリカンの分子量を決定することができる。
【００２８】
なお、プロテオグリカンはグリコサミノグリカン（ムコ多糖）とタンパク質とが共有結合した構造を有するため、クロマトグラフィーを行う際、酸性糖及びタンパク質についてモニタリングすることで、プロテオグリカンが溶出されるのを検出することができる。つまり、酸性糖についてモニタリングして得られるクロマトグラムと、タンパク質についてモニタリングして得られるクロマトグラムとを重ね、両クロマトグラムにおいてほぼ同じ溶出液量範囲にピークがあれば、そのピークがプロテオグリカンを検出したピークであるとわかる。例えば酸性糖のモニタリングにはカルバゾール硫酸法を用いることができる。クロマトグラフィーの溶出フラクションを一定量ずつ分取し、各分取フラクションに含まれる酸性糖量をカルバゾール硫酸法にて定量して決定することができる。また、例えば、タンパク質のモニタリングにはＵＶ吸収法（280 nm付近に吸収のあるトリプトファン・チロシン・フェニルアラニンの吸光度を測定しタンパク質を定量する方法）、ニンヒドリン反応、ＢＣＡ法、ブラッドフォード法、ローリー法、ビューレット法等を用いることができる。中でも、ＵＶ吸収法により定量するのが簡便である。
【００２９】
なお、溶出液量から分子量を決定するには、分子量マーカーを同様にゲル濾過クロマトグラフィー処理し、当該分子量マーカーが溶出される液量を測定して検量線（溶出液量ｖｓ分子量）を作成しておけばよい。分子量マーカーは、上述したプロテオグリカン含有物の分子量値や使用するゲルマトリックスの種類等を考慮して、適当なものを選択・購入して使用することができる。例えば、デキストランからなる分子量マーカーを使用することができる。このような分子量マーカーはＳＩＧＭＡ等から購入することができる。
【００３０】
本発明のプロテオグリカン含有物には、酸性糖成分以外の魚類軟骨由来の成分も含まれる。このような成分としては、例えば、コラーゲンなどのタンパク質や、塩類等が挙げられる。
【００３１】
本発明において、物質の平均分子量とは、当該物質をゲル濾過クロマトグラフィーにより解析して得られるクロマトグラム中の当該物質のピークの面積を２等分する、横軸（溶出液量）に垂直な線（２等分線）を引き、当該２等分線位置に相当する溶出液量から検量線を用いて求められる分子量をいう。具体的には、実施例の「プロテオグリカン含有物の分子量の検討」において記載する方法で求められる分子量をいう。
【００３２】
例えば、プロテオグリカン含有物に含まれる酸性糖成分の平均分子量については、プロテオグリカン含有物をゲル濾過クロマトグラフィーで分離し、これに含まれる酸性糖成分をモニタリングして得られるクロマトグラムにおいて、当該クロマトグラムの面積を２等分する線を引き、当該２等分線位置に相当する溶出液量から検量線を用いて（すなわち、当該溶出液量を検量線の方程式に代入して）分子量値を求め、当該値を平均分子量とする。酸性糖成分のモニタリングについて、より具体的に説明すれば、プロテオグリカン含有物をゲル濾過クロマトグラフィー解析に供し、一定速度で溶出を行い、溶出液を一定量ずつ回収し、回収した各溶出液（フラクション）中にどの程度の酸性糖が含まれるかを定量し、結果をクロマトグラムとすればよい。
【００３３】
また、プロテオグリカン含有物に含まれるプロテオグリカンの平均分子量については、ゲル濾過クロマトグラフィーでプロテオグリカン含有物を解析して得られるクロマトグラムにおいて、プロテオグリカンを示すピークの面積を２等分する線を引き、当該２等分線位置に相当する溶出液量から検量線を用いて分子量値を求め、当該値を平均分子量とする。
【００３４】
前述の通り、酸性糖についてモニタリングして得られるクロマトグラムと、タンパク質についてモニタリングして得られるクロマトグラムとを重ね、両クロマトグラムにおいてほぼ一致する位置に存在するピークが、プロテオグリカンを示すピークである。
【００３５】
プロテオグリカンを示すピークの立ち上がりや立ち下がりが、他の酸性糖成分のピークと重なって確認出来ない場合は、ピークの形状から立ち上がり及び立ち下がりを推定する。そして、推定された立ち上がりや立ち下がりから分子量や平均分子量を求める。例として、図１に立ち下がりが確認できない場合のピークの輪郭の推定方法の概要を示す。図１では、ピークの右肩下がりの延長線を引いてピークの輪郭を決定している。
【００３６】
酸性糖成分及びプロテオグリカンのいずれの分子量又は平均分子量を求める場合でも、酸性糖についてモニタリングして得られるクロマトグラムを解析するのが好ましい。
【００３７】
また、ゲル濾過クロマトグラフィーを行う際、プロテオグリカンを示すピークに相当するフラクションのみを回収することにより、本発明のプロテオグリカン含有物に含まれるプロテオグリカンを精製することも可能である。また、プロテオグリカンを示すピークも含めて途中までのフラクションを回収することで、平均分子量がより大きいプロテオグリカン含有物を得ることもできる。
【００３８】
本発明のプロテオグリカン含有物に含まれる酸性糖成分は、通常その２０質量％以上が、好ましくは２０〜６０質量％が、より好ましくは２５〜５５質量％が、さらにより好ましくは、３０〜５０質量％が、プロテオグリカンである。この酸性糖成分に占めるプロテオグリカンの割合は、上述した酸性糖成分又はプロテオグリカンの分子量を求めるために用いたクロマトグラムから求めることができる。すなわち、プロテオグリカン含有物の酸性糖成分についてモニタリングして得られたクロマトグラム面積において、プロテオグリカンを示すピークの面積が占める割合を求めることにより、酸性糖成分に占めるプロテオグリカンの割合を求めることができる。
【００３９】
本発明のプロテオグリカン含有物は、上述の通り、魚類軟骨から製造される。詳細には、エタノール処理により魚類軟骨を脱脂することにより製造され得る。また、脱脂された魚類軟骨から水抽出することにより製造され得る。
例えば以下の工程により製造することができる。
【００４０】
工程（１）：水処理工程
魚類の軟骨含有組織（例えば魚類頭部）を数分〜数日程度、常温又は低温（約０〜４０℃）の水に浸漬する。静置浸漬しても撹拌しながら浸漬してもよいし、ラインミキサー等を用いて水と混合撹拌してもよい。水の量は特に制限されないが、当該軟骨含有組織全体が浸かる量が好ましい。これにより、当該組織の生臭さが抜けるとともに、当該組織に水が浸透して膨潤するので、軟骨以外の部分を除去しやすくなる。なお水に浸漬させる前に、当該軟骨含有組織を予めスライス又は粗砕する、あるいは軟骨以外の組織で除去できる組織は予め除去する等、しておいてもよい。
【００４１】
水に浸漬して、組織が脱臭され、適度に膨潤した段階で、魚類の軟骨含有組織から脂質等が抽出される（すなわち、軟骨含有組織が脱脂される）。当該脂質等は、水層に溶解又は懸濁するか、あるいは水層の上に脂質層となって浮遊する。当該水層及び脂質層を除去することにより、軟骨含有組織に含まれていた脂質が除去される。遠心分離によりこれら不要物を分離し除去してもよい。
【００４２】
工程（２）：エタノール処理工程
脂質層及び水層を除去した後得られた残渣（軟骨組織）を回収し、当該残渣にエタノールを加え、さらに脂質を抽出して除去する。脂質を除去することにより、より高度に脱臭もなされる。なお、含水エタノールを用いてもよい。また、有機溶媒を加える前に残渣（軟骨組織）を粉砕することが、好ましい。粉砕方法は特に制限されないが、例えば、軟質物質を微粉砕できるボールミル、スイングミル、低温破砕機、凍結破砕機、ローターミル、グラインドミックス、ミキサーミル等を用いて行うことができる。また、粉砕粒度も特に制限されないが、１０〜５００μｍ程度が好ましく、５０〜２５０μｍ程度がより好ましい。なお、当該粒度はレーザー回折散乱法により測定することができる。
【００４３】
具体的には、例えば、上述のようにして得られる軟骨組織（好ましくは粉砕軟骨組織）に、当該組織が十分浸漬する容量のエタノールを加えて静置又は撹拌し、その後当該溶媒を除去すればよい。また、この操作は複数回（例えば２〜５回）繰り返して行うことが好ましい。あるいは、エタノールを循環させて脂質除去処理を行ってもよい。この場合は例えばソックスレー抽出器等を好ましく用いることができる。このような処理の後、固形分を回収する。回収した固形分を風乾する等して、有機溶媒を完全に除去してもよい。
【００４４】
このようにして得られる固形分をプロテオグリカン含有物として用いることができる。
【００４５】
上記工程（２）について、さらに具体的な一例を挙げると、例えば次の〔１〕〜〔９〕に記載の工程を含む方法により当該工程（２）を行うことができる。
〔１〕皮や硬骨などの付着物を除去したサケ鼻軟骨をミートチョッパーで粗粉砕する。
〔２〕粉砕したサケ鼻軟骨に、ｐＨ６〜７.５の水道水または精製水を、サケ鼻軟骨の同量〜２倍量（容積）加えて、４０℃以下の温度で十分に攪拌する。
〔３〕攪拌後、遠心分離機処理を行ない、固形分を採取する。
〔４〕〔２〕および〔３〕の処理を１又は２回繰り返す。
〔５〕得られた固形分を、公知の湿式粉砕機を用いて更に微粉砕する。
〔６〕95°以上の純度のエタノールを微粉砕サケ微軟骨の約１０倍量（容積）程度加えて、４０℃以下の温度で十分に攪拌する。
〔７〕攪拌後、遠心分離機処理を行ない、固形分を採取する。
〔８〕〔６〕および〔７〕の処理を１〜３回繰り返す。
〔９〕必要に応じて乾燥する。
なお、上記〔５〕では、得られた固形物を一旦凍結乾燥してから微粉砕を行ってもよい。
【００４６】
工程（３）：水抽出処理工程
工程（２）で得られた固形分を、さらに水による抽出工程に供し、水で抽出されたものをプロテオグリカン含有物として用いることがより好ましい。例えば、工程（２）で得られた固形分が十分浸漬する量の水を加え、撹拌した後、不溶物を除去して得られる溶液やその乾燥物をプロテオグリカン含有物として用いることができる。用いる水は、通常ｐHが５．５〜８．０、好ましくはｐH６．０〜７．５、より好ましくはｐH６．５〜７．５である。具体的には、例えば、３０分〜６時間程度水に浸漬しながら撹拌する、あるいはラインミキサー等により水と混合撹拌する等した後、不溶物を除去すればよい。不要物を除去後、公知の方法を用いて乾燥させてもよい。また、不要物を除去後、容量で２〜１０倍量のエタノールを加え、生じた固形分を回収してもよい。この場合、エタノールを加える前に塩化ナトリウムを添加してもよい。
【００４７】
上記工程（３）について、さらに具体的な一例を挙げると、例えば上記〔１〕〜〔９〕を行った後、次の〔１０〕〜〔１２〕に記載のようにして当該工程（３）を行うことができる。
〔１０〕ｐＨ６〜７.５の精製水を、〔９〕で得られた乾燥物の同量〜２倍量（容積）程度加えて、４０℃以下の温度で３０分〜４８時間程度十分に攪拌する。
〔１１〕遠心分離処理を行ない、固形分を除去する。
〔１２〕必要に応じて乾燥する。
【００４８】
なお、上記〔１１〕の後、さらにエタノールを添加して撹拌し、生じた固形分を回収してもよい。
【００４９】
以上のように、本願発明のプロテオグリカン含有物は、
（Ａ）魚類軟骨を精製する工程
（Ｂ）有機溶媒を用いて魚類軟骨から脂質を除去する工程
（Ｃ）脂質除去済み魚類軟骨を用いて、さらに水抽出を行い、抽出物を回収する工程
の（Ａ）〜（Ｂ）又は（Ａ）〜（Ｃ）を経て製造されるとも言える。（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）工程は、上記の（１）、（２）、（３）工程にそれぞれ相当する。
【００５０】
本発明のプロテオグリカン含有物は、皮膚の抗老化のために好ましく用いることができる。皮膚は、様々な要因により、日々ダメージを受けている。例えば、表皮層においては、外的要因（例えば紫外線等の光照射等）や内的要因（例えば老齢化等）により表皮バリア機能が低下し、経表皮透過蒸散水分量（transepidermal water loss：ＴＥＷＬ）が上昇する。このため、肌が乾燥したり、肌あれが起こる等する。また、同様の理由により、真皮においても、コラーゲン産生能の低下、皮膚弾力性の低下、真皮層の肥厚等が起こり、皮膚の硬直化が進行する。このため、皮膚にシワが生じる等する。
【００５１】
本発明のプロテオグリカン含有物は、このような皮膚の症状を抑制及び改善する多種の効果（皮膚繊維芽細胞増殖効果、皮膚バリア機能増強及び改善効果、皮膚コラーゲン産生能増強及び改善効果、真皮肥厚抑制効果等、皮膚の保湿及び抗老化のために有利な効果）を有しており、特に光（中でも紫外線）照射により起こる上述の皮膚症状の予防及び改善に好ましく用いることができる。
【００５２】
本発明のプロテオグリカン含有物は、その使用態様は特に制限されないが、特に口腔ケア分野、化粧品分野及び飲食品分野で好ましく用いることができる。よって、本発明には、本発明のプロテオグリカン含有物を含む口腔用組成物、本発明のプロテオグリカン含有物を含む化粧品組成物、及び、本発明のプロテオグリカン含有物を含む飲食品組成物が含まれる。
【００５３】
口腔ケア分野にて用いられる、プロテオグリカン含有物を含む口腔用組成物（以下「本発明に係る口腔用組成物」と記載することがある）は、本発明のプロテオグリカン含有物と口腔用組成物に用いられる他の成分（例えば研磨剤、発泡剤、洗浄剤、界面活性剤、湿潤剤、ｐＨ調節剤、増粘剤、香味剤等）を適宜配合して製造され得る。例えば、常法によりペースト剤、軟膏剤、ジェル剤、塗布剤、スプレー剤、補填剤、液剤、洗口剤、パスタ、チューイングガム、トローチ、タブレット等の形態に製造することができる。
【００５４】
このような本発明に係る口腔用組成物は、特に口腔内に塗布する、スプレーする、あるいは洗口すること等により、特に口腔内の繊維芽細胞を増殖させ、皮膚バリア機能を増強・改善させ、皮膚コラーゲン産生能を増強・改善させることから、口腔組織の再生・老化防止に好適に用いられる。
【００５５】
特に制限されるものではないが、本発明に係る口腔用組成物のプロテオグリカン含有物に含まれる酸性糖成分量は、特に制限されないが、組成物全体に対し、通常０．００２〜１３質量％、好ましくは０．０１〜５質量％、より好ましくは０．０２〜３質量％である。またさらに、当該口腔用組成物のプロテオグリカン含有物に含まれるプロテオグリカンの量は、特に制限されないが、組成物全体に対し、通常０．００１〜５質量％、好ましくは０．００５〜２質量％、より好ましくは０．０１〜１質量％である。
【００５６】
化粧品分野にて用いられる、本発明のプロテオグリカン含有物を含む化粧品組成物（以下「本発明に係る化粧品組成物」と記載することがある）は、本発明のプロテオグリカン含有物と化粧品用として許容される媒体、基剤、担体、添加剤や、その他化粧品用として許容される成分、材料を適宜配合して、常法に従って製造され得る。具体的には、本発明のプロテオグリカン含有物を含んで製造される乳液、化粧水、クリーム、美容液、ファンデーション、パック、日焼け止め等を挙げることができる。このような本発明に係る化粧品組成物は、日焼け予防用、日焼け手入れ用、保湿用及び抗皮膚老化用（例えば乾燥肌、肌荒れ、肌のシワ・たるみ等の予防又は改善用）として好ましく用いることができる。
【００５７】
特に制限されるものではないが、本発明に係る化粧品組成物のプロテオグリカン含有物に含まれる酸性糖成分量は、組成物全体に対し、通常０．００２〜５質量％、好ましくは０．０２〜２質量％、より好ましくは０．１〜２質量％である。またさらに、当該化粧品組成物のプロテオグリカン含有物に含まれるプロテオグリカンの量は、組成物全体に対し、通常０．００１〜２質量％、好ましくは０．０１〜１質量％、より好ましくは０．０５〜１質量％である。
【００５８】
飲食品（飲料及び食品）分野にて用いられる、本発明のプロテオグリカン含有物を含む飲食品組成物（以下「本発明に係る飲食品組成物」と記載することがある）は、本発明のプロテオグリカン含有物と、食品衛生学上許容される基剤、担体、添加剤や、その他食品として利用され得る成分・材料等が適宜配合されたものである。例えば、本発明のプロテオグリカン含有物を含む、保湿用及び抗皮膚老化用（例えば乾燥肌、肌荒れ、肌のシワ・たるみ等の予防又は改善用）の加工食品、飲料、健康食品（栄養機能食品、特定保健用食品等）、サプリメント、美容食品、病者用食品等が例示できる。さらに、このような本発明に係る飲食品組成物からなる保湿剤、抗皮膚老化剤も本発明に包含される。当該保湿剤、抗皮膚老化剤は、美容用や抗皮膚老化用（例えば乾燥肌、肌荒れ、肌のシワ・たるみ等の予防又は改善用）のドリンク剤、錠剤、タブレット剤、カプセル剤、顆粒剤、ゼリー剤、トローチ剤などの形態で供給され得る。
【００５９】
特に制限されるものではないが、本発明に係る飲食品組成物のプロテオグリカン含有物に含まれる酸性糖成分量は、食品組成物又は食品組成物からなる剤の場合、組成物又は剤全体に対し、通常０．０１〜５０質量％、好ましくは０．０２〜２５質量％、より好ましくは０．１〜８質量％である。また、特に制限されるものではないが、飲料組成物又は飲料組成物からなる剤の場合、組成物又は剤全体に対し、通常０．００２〜１３質量％、好ましくは０．０１〜８質量％、より好ましくは０．１〜２質量％である。またさらに、当該飲食品組成物のプロテオグリカン含有物に含まれるプロテオグリカンの量は、食品組成物又は食品組成物からなる剤の場合、組成物又は剤全体に対し、通常０．００５〜２０質量％、好ましくは０．０１〜１０質量％、より好ましくは０．０５〜３質量％である。飲料組成物又は飲料組成物からなる剤の場合、組成物又は剤全体に対し、通常０．００１〜５質量％、好ましくは０．００５〜３質量％、より好ましくは０．０１〜１質量％である。
【００６０】
またさらに、本発明のプロテオグリカン含有物は、ヒアルロン酸やコラーゲンと併せて適用すると、本発明のプロテオグリカン含有物の効果が高まるため、好ましい。よって、上述の本発明に係る口腔用組成物、化粧品組成物、飲食品組成物においても、ヒアルロン酸及び／又はコラーゲン（好ましくはコラーゲン加水分解物）をさらに配合することが好ましい。特に、本発明のプロテオグリカン含有物とヒアルロン酸を併せて経口摂取することにより、皮膚の保湿効果及び抗老化効果がより一層高まり、好ましい。特に制限されるものではないが、ヒアルロン酸は、本発明に係るプロテオグリカン含有物を１質量部としたとき、０．０１〜１質量部、好ましくは０．０２〜０．５質量部、より好ましくは０．０５〜０．２質量部を併せて用いることができる。
【００６１】
なお、当該本発明に係る口腔用組成物、化粧品組成物、及び飲食品組成物に含まれる酸性糖成分の量は、例えばカルバゾール硫酸法により求めることができる。また、これらの組成物をゲル濾過クロマトグラフィーで分析して得られる、酸性糖検出クロマトグラムから求めることができる。また、これらの組成物に含まれるプロテオグリカンの量は、例えばこれらの組成物をゲル濾過クロマトグラフィーで分析し、酸性糖検出クロマトグラム及びタンパク質検出クロマトグラムを重ねて、重複するピークをプロテオグリカンとして検出、定量することで決定することができる。
【００６２】
また本発明は、本発明のプロテオグリカン含有物を皮膚又は口腔内へ塗布することにより、繊維芽細胞を増殖させ、又は皮膚バリア機能を増強・改善させる等、本明細書に記載の効果を得る方法をも包含する。当該方法には、本発明のプロテオグリカン含有物をそのまま用いてもよい。また、上述の本発明に係る口腔用組成物や化粧品組成物を好ましく用いることができる。当該方法を適用する対象は特に制限されないが、特に老化や日焼けにより皮膚バリア機能が低下した人が好ましい。また、美容目的で適用してもよい。適用量も特に制限されず、必要量を適宜設定できる。
【００６３】
又さらに本発明は、本発明のプロテオグリカン含有物を経口摂取することにより、繊維芽細胞を増殖させ、皮膚バリア機能を増強・改善させ、皮膚弾力性を改善させ、真皮皮厚を抑制させ、又は皮膚コラーゲン産生能を増強・改善させる等、本明細書に記載の効果を得る方法をも包含する。当該方法には、本発明のプロテオグリカン含有物をそのまま用いてもよい。また、上述の本発明に係る飲食品組成物を好ましく用いることができる。当該方法を適用する対象は特に制限されないが、特に老化や日焼けにより皮膚バリア機能が低下した人、皮膚弾力性が低下した人、等が好ましい。また、美容目的で適用してもよい。適用量も特に制限されず、必要量を適宜設定できる。
【実施例】
【００６４】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。【００６５】
プロテオグリカン含有物の製造
サケ頭部を水に浸漬して１日静置し、膨潤させた。次に、サケ頭部から鼻軟骨以外の組織を除去してサケ鼻軟骨を得た。このサケ鼻軟骨を粗砕し、サケ鼻軟骨粉末とした。当該粉末１００ｇに水１００ｍＬを加え、穏やかに撹拌した後、１０分間室温にて静置し、脱脂を行った。その後、遠心分離（8000rpm, 30分, 室温）を行い、得られた残渣（サケ鼻軟骨脱脂粉末）を回収し、凍結乾燥した。凍結乾燥したサケ鼻軟骨脱脂粉末9.02 gを超遠心粉砕機にて粒径約１００〜２００μｍ（レーザー回折散乱法により測定）の微粉末にした。そして、当該微粉末を20ｍＬのエタノールを用いて3回洗浄した後に風乾し、酸性糖成分含有微粉末7.69 gを得た。当該微粉末を、以下「サケ鼻軟骨由来粉末」ということがある。なお、ここでのエタノールを用いた“洗浄”とは、微粉末をエタノールに分散させた後遠心して沈殿を回収する操作（エタノール沈殿）のことである。【００６６】
さらに、サケ鼻軟骨由来粉末２０ｇに１０００ｍＬの常温の精製水（ｐH６．５）を加え、３０分間撹拌した後、１０分間室温にて静置した。その後、遠心分離（8000rpm, 30分, 室温）を行い、上清を回収して濃縮乾固して酸性糖成分含有粉末約７ｇを得た。このようにして得た水抽出物を、以下「サケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物」ということがある。【００６７】
当該サケ鼻軟骨由来粉末には、酸性糖成分が約２０質量％、プロテオグリカンが約９質量％含まれていた（つまり、グリコサミノグリカン等の酸性糖は約１１質量％含まれていた）。また、当該サケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物には、酸性糖成分が約３５質量％、プロテオグリカンが約１５質量％含まれていた（つまり、グリコサミノグリカン等の酸性糖は約２０質量％含まれていた）。なお、当該数字は、カルバゾール硫酸法によりウロン酸（グルクロン酸）を定量し、さらに当該定量法においてよく知られている下記式を用いてコンドロイチン硫酸量（質量）を求め、これを酸性糖成分量とした際の数字である。【００６８】
[式１]
コンドロイチン硫酸量＝グルクロン酸量×2.593【００６９】
なお、以下特に断りが無い場合は、カルバゾール硫酸法により求めた酸性糖成分量は、上記と同様にして求めたコンドロイチン硫酸量を示す。【００７０】
また、プロテオグリカンの含有量は、下記のように酸性糖成分量をウロン酸定量によりモニタリングしながらゲル濾過クロマトグラフィー解析をしてクロマトグラムを得、当該クロマトグラム中のプロテオグリカンを示すピークがクロマトグラム全体に占める面積比から算出できる。つまり、当該面積比を酸性糖成分量に乗ずることで算出できる。【００７１】
プロテオグリカン含有物の分子量の検討
得られたプロテオグリカン含有物の分子量について、ゲル濾過クロマトグラフィーにより検討した。具体的には、まず、サケ鼻軟骨由来粉末及びサケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物をサンプルとして下記条件のゲル濾過クロマトグラフィーで処理し、溶出フラクションを１ｍＬずつ採取して、当該各フラクションに含まれる酸性糖量及びタンパク質量をそれぞれカルバゾール硫酸法及びＵＶ吸収法で定量した。【００７２】
当該ゲル濾過クロマトグラフィー解析の結果得られたクロマトグラムを図２に示す。但し、酸性糖量を解析したクロマトグラムは、カルバゾール硫酸法にて定量したグルクロン酸量を示している（2.593倍してコンドロイチン硫酸量とはしていない）。なお、サケ鼻軟骨由来粉末については、純度を高めるために４Ｍグアニジン塩酸塩（4M GuCl）で抽出処理を行い、得られた抽出物をサンプルとして用いた。当該抽出処理は、具体的には次のようにして行った。サケ鼻軟骨由来粉末１ｇに４ＭＧｕＣｌを加え、４℃にて１日間撹拌後遠心分離し、上清に３倍量の食塩飽和エタノールを加えて１晩放置後、遠心分離して沈殿を回収した。当該沈殿をゲル濾過クロマトグラフィー用サンプルとした。サケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物はそのままサンプルとして用いた。【００７３】
〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕
カラム： Sepharose CL-2B 充填カラム（Sepharose CL-2Bを担体としてφ1cm×48cmのカラムに充填したもの。Sepharose CL-2Bのデキストランの分画範囲は100〜20,000kDaであり、GE Healthcare社等から入手できる。Sepharose CL-2Bは、２％架橋アガロース、粒子径６０〜２００μｍ（レーザー回折散乱法による）、CAS登録番号65099-79-8である。）
バッファー： 0.1Mリン酸緩衝液（pＨ 7.1, 0.2M NaCl含有）
アプライサンプル量： 4mg（１ｍｌバッファーに溶解させて使用）
流速： 0.15ｍＬ/min
フラクション量： 1ｍＬ/tube【００７４】
また、市販されているプロテオグリカン（以下「ＰＧ−Ｋ」とも称する）及び市販されているグリコサミノグリカン（コンドロイチン）（以下「ＰＧ−Ｍ」とも称する）についても、同様の条件でゲル濾過クロマトグラフィー処理を行い、各溶出フラクションに含まれる酸性糖量を定量した。結果を図３に示す。【００７５】
図２に示されるように、溶出液量が約１５〜２３ｍＬの範囲において、糖及びタンパク質両方のピークが得られた。よって、このピークがプロテオグリカンを示していることがわかった。【００７６】
次に、下記の各種デキストラン分子量マーカーについても、それぞれを上記と同様の条件（但しサンプル量は１ｍｇ）でゲル濾過クロマトグラフィーを行い、フェノール・硫酸法により各溶出フラクションに含まれる糖量（すなわちデキストラン量）を定量した。具体的には、Hodge, J. E. and Hofreiter, B. T., Method in Carbohydrate Chemistry, 1, 338 (1962)に記載の方法に従い、次のようにして定量した。
〔１〕105×15mmの試験管に試料水溶液あるいは標準単糖（マンノース）水溶液を500μｌ加えた。
〔２〕フェノール試薬（5 v/v%フェノール水溶液）を500μｌ加え、撹拌した。
〔３〕濃硫酸を２．５ｍｌ加え、すぐに１０秒間激しく撹拌した。
〔４〕室温に２０分以上放置した。
〔５〕分光光度計で４９０ｎｍの吸収を測定した。【００７７】
＜デキストラン分子量マーカー＞
Dextran from Leuconostoc mesenteroides（mol wt 5,000,000−40,000,000）（SIGMA）
・・・void volume測定用、10000kDa
Dextran Standard 1,400,000（SIGMA）  ・・・1400kDa
Dextran Standard 670,000（SIGMA）  ・・・ 670kDa
Dextran Standard 410,000（SIGMA）  ・・・ 410kDa
Dextran Standard 270,000（SIGMA）  ・・・ 270kDa【００７８】
なお、マーカーDextran from Leuconostoc mesenteroidesについては、SepharoseCL-2B充填カラム（分画上限20,000kDa）のボイドボリュームを測定するために用いた。ボイドボリュームをより正確に測定するため、当該マーカーに含まれる低分子のデキストランを除去する前処理を行った。前処理は、上述の〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕によりDextran from Leuconostoc mesenteroidesを溶出させ、分子量20,000kDa以上の分子を回収し、凍結乾燥することで行った。具体的には、最初に出現したピークに相当する、溶出液量１５〜１９ｍＬの分画物を回収し、これを凍結乾燥した（これにより、分子量20,000kDa以上の分子を回収、凍結乾燥できたと考えられる）。そして、この凍結乾燥物をカラムにアプライして測定を行った。【００７９】
結果として得られたクロマトグラムを図４ａ〜ｅに示す。なお、図４ａは、上述の前処理を経た凍結乾燥物を測定したものである。図４ａのLeuconostoc mesenteroides由来デキストラン前処理物については、分子量が使用したSepharose CL-2B充填カラムの分画範囲（１００ｋＤａ〜２００００ｋＤａ）を超えているため、ピーク頂点位置に対応する溶出液量を、当該カラムの排除限界である２００００ｋＤａの分子が溶出される溶出液量とした。なお、当該溶出液量はカラムのボイドボリューム（Void Volume）を示すと解釈される。図４ｂ〜ｅについてはクロマトグラムのピーク面積の２等分線の位置に相当する溶出液量を、それぞれのマーカー分子量の分子が溶出される時点の溶出液量とした。図４ｂ〜ｅはそれぞれDextran Standard 1,400,000、670,000、410,000、270,000を測定した結果である。これらの溶出液量及び分子量の関係をグラフ化し、検量線としたところ、直線となった（y = −4.1355Ln(x)＋59.47 ； Ｒ２＝０．９８６９）（図５）ことから、当該デキストラン分子量マーカーにより得られた分子量と溶出液量との関係は高い相関性を有することが確認できた。【００８０】
またさらに、分析結果から、ボイドボリュームに達する前の溶出液にプロテオグリカンが含まれる（すなわち、分画限界の２００００ｋDaを超えるプロテオグリカンが存在する）可能性が高いことがわかった。当該ゲル濾過クロマトグラフィーに用いたカラムは、分画範囲が１００ｋＤａ〜２００００ｋＤａであるため、２００００ｋＤａ以上の分子を正確に分画できていない可能性が高い。よって、上記と同様にして、サケ鼻軟骨由来粉末をサンプルとして下記条件のゲル濾過クロマトグラフィーによる解析及び各フラクションの酸性糖量の定量も行った。【００８１】
〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕
カラム： Sephacryl S-1000 SF 充填カラム（Sephacryl S-1000 SFを担体としてφ1cm×48cmのカラムに充填したもの。Sephacryl S-1000 SFのデキストランの分画範囲は5×105〜1×108Daであり、GE Healthcare社等から入手できる。）
バッファー：0.1Mリン酸緩衝液（pＨ7.1, 0.2M NaCl含有）
アプライサンプル量： 4mg
流速： 0.3ｍＬ/min
フラクション量： 1ｍＬ/tube【００８２】
さらに、以下の分子量マーカーを同様の条件でゲル濾過クロマトグラフィーを行い、フェノール・硫酸法により各溶出フラクションに含まれる糖量（すなわちデキストラン量）を定量して検量線を作成した。【００８３】
＜デキストラン分子量マーカー＞
Dextran from Leuconostoc mesenteroides（mol wt 5,000,000−40,000,000）（SIGMA）
・・・10000kDa
Dextran Standard 1,400,000（SIGMA）  ・・・1400kDa
Dextran Standard 670,000（SIGMA）  ・・・ 670kDa【００８４】
得られた検量線は
ｙ＝−3.8743 Ln(x)＋59.887 （Ｒ２＝0.9961）
であった。【００８５】
図２及び図３に示される酸性糖量測定結果グラフを１つのグラフにまとめ、さらに上述のようにして得られた分子量と溶出液量との関係を記載した図を図６に示す。上述の通り、サケ鼻軟骨由来粉末及びサケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物については、ゲル濾過クロマトグラフィー解析における溶出量約１５〜２３ｍＬの範囲にピークが表れるのに対し、プロテオグリカンの市販品であるＰＧ−Ｍは約２８〜４９ｍＬ、同じく市販品のＰＧ−Ｋは約１８〜４７ｍＬの範囲にピークが表れる。このことは、サケ鼻軟骨由来粉末及びサケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物（すなわち、本発明のプロテオグリカン含有物）が、従来知られていたプロテオグリカンとは異なる非常に高分子のプロテオグリカンを含有することを示している。【００８６】
また、図５に示す検量線から、溶出量２３ｍLは分子量約６７００ｋDaに相当することが算出できる。このことから、サケ鼻軟骨由来粉末及びサケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物は、分子量が約６０００ｋDa以上のプロテオグリカンを含有することがわかった。【００８７】
さらに、Sephacryl S-1000 SF充填カラムを用いてサケ鼻軟骨由来粉末を解析した結果を図７に示す。図７では、クロマトグラムの最初に表れるプロテオグリカンを示すピークの立ち上がりが、溶出液量１５〜１６ｍLの範囲から始まっている。上述の検量線（ｙ＝−3.8743 Ln(x)＋59.887）を用いて当該溶出液量範囲に相当する分子量を算出すると、およそ９００００ｋDaであった。よって、サケ鼻軟骨由来粉末は９００００ｋDa程度のプロテオグリカンを含むことがわかった。【００８８】
以上のことから、サケ鼻軟骨由来粉末は６０００ｋDa〜９００００ｋDa程度のプロテオグリカンを含むことが確認できた。【００８９】
さらに、図５に示す検量線を用いて、図６の各グラフのピーク位置の溶出液量から各試料中のプロテオグリカンの平均分子量を算出した。通常、平均分子量は、ピーク面積の２等分線位置の溶出液量から算出するが、図６に示す各クロマトグラムのプロテオグリカンピークがほぼ左右対称であったため、ピーク位置を２等分線位置として算出を行った。具体的には、実験誤差及びロット差も考慮し、ピーク位置の溶出液量±１ｍＬの範囲の溶出液量値を検量線のｙ値とし、得られるｘ値の範囲を各試料中のプロテオグリカンの平均分子量とした。ただし、当該解析により得られたプロテオグリカンの平均分子量の上限値については、用いたカラム（Sepharose CL-2B充填カラム）の分画量上限が２００００ｋＤａのために正確に算出されていない可能性があるため、Sephacryl S-1000 SF充填カラムを用いた場合の結果からも、同様にしてプロテオグリカンの平均分子量を求めた。結果を表１に示す。【００９０】
【表１】
2011007885.tif 000003
【００９１】
以上の結果から、本発明のプロテオグリカン含有物に含まれるプロテオグリカンの平均分子量は９７００ｋＤａ〜３８０００ｋＤａ程度であることがわかった。【００９２】
また、サケ鼻軟骨由来粉末、及びサケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物については、Sepharose CL-2B充填カラムによる解析で得られたクロマトグラム面積を２等分する位置に相当する溶出液量を求め（図６点線矢印）、当該液量±１ｍＬの範囲の値から平均分子量を求めた。その結果、サケ鼻軟骨由来粉末に含まれる酸性糖含有成分の混合物の平均分子量は約４８００kDa〜７７００kDa、サケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物に含まれる酸性糖含有成分の混合物の平均分子量は約１８００kDa〜４２００kDaであった。【００９３】
さらに、サケ鼻軟骨由来粉末についてはSephacryl S-1000 SF充填カラムによる解析についてもクロマトグラム面積を２等分する位置に相当する溶出液量を求め（図７点線矢印）、当該液量±１ｍＬの範囲の値から平均分子量を求めた。その結果、サケ鼻軟骨由来粉末に含まれる酸性糖成分の平均分子量は約３９００kDa〜６６００kDaであった。【００９４】
プロテオグリカン含有物の皮膚抗老化効果の検討
細胞増殖促進能評価
サケ鼻軟骨由来粉末、サケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物、及びＰＧ−Ｋをサンプルとして用い、これらの細胞増殖効果を検討した。具体的には、次のように実験を行った。培養用シャーレ内で、１０％fetal bovine serum（ＦＢＳ）を含むminimum essential medium（最小必須培地：ＭＥＭ培地）中に、ヒト皮膚繊維芽細胞（HDF50：CELL APPLICATIONS, INC）を1.0×104 cells播種し、各サンプルをＭＥＭ培地中、１μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬの濃度になるように添加した。また、何も添加しないものをコントロールとした。添加後、５日間培養した。培養後、ＭＥＭ培地を除去し、Trypsin-EDTA（invitrogen）で細胞を剥がし懸濁させた後、トリパンブルー染色液（シグマ）を添加し、Burker-Turk計測盤で細胞数を計測した。【００９５】
結果を図８に示す。当該結果から、サケ鼻軟骨由来粉末、及びサケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物は有意なヒト皮膚繊維芽細胞増殖能を示すのに対して、市販プロテオグリカンであるＰＧ−Ｋは当該増殖能を示さないことがわかった。【００９６】
また、図６に示されるように、サケ鼻軟骨由来粉末及びサケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物と、ＰＧ−Ｋとでは、含まれる成分の分子量に大きな差がある。特にＰＧ−Ｋのクロマトグラムには、サケ鼻軟骨由来粉末及びサケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物のクロマトグラムに存在する分子量の大きなプロテオグリカンのピークが見られないことから、上述のヒト皮膚繊維芽細胞増殖能は当該プロテオグリカンに起因すると考えられた。【００９７】
経口摂取による保湿及び抗皮膚老化能評価
＜使用実験動物＞
ヘアレスマウス（Hr-/Kud ♂）（九動社）を実験に用いた。エストロゲン変動による皮膚状態への影響がないオス（4週齢）を予備飼育後、実験に供した。【００９８】
＜試験方法＞
マウスを５つの飼育ケージに表２のとおり割り付けた（１群６匹）。また、被検体は固体識別できるよう尾部に印を付けた。7週齢になるまで予備飼育を続けた。【００９９】
【表２】
2011007885.tif 000004
【０１００】
＜評価素材の経口投与サンプル調製＞
サケ鼻軟骨由来粉末の２%分散液を調製し、遠心分離を行い、その上清をプロテオグリカン含有物の投与サンプルとした。当該上清は、サケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物が水に溶解したものに相当する。当該上清を乾固して固形分を得たところ、当該上清には、サケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物が約０．７質量％含まれていた。また、当該上清に含まれる酸性糖成分量をカルバゾール硫酸法により定量したところ、上清に対して約０．１７質量％であった。また、当該上清に含まれるプロテオグリカン量をゲル濾過クロマトグラフィーで解析しクロマトグラムの面積比から求めたところ、上清に対して約０．０７質量％であった。【０１０１】
ヒアルロン酸の0.5質量％水溶液を調製し、これをヒアルロン酸の投与サンプルとした。また、プロテオグリカン投与サンプルとヒアルロン酸投与サンプルの１：１混合液（質量比）をプロテオグリカン及びヒアルロン酸同時投与のための投与サンプルとした。コントロールには、蒸留水を投与した。なお、ヒアルロン酸は（株）中原から購入したものを用いた。【０１０２】
＜経口投与方法＞
ヘアレスマウスが7週齢に達した段階で、投与サンプル0.5mLを１日１回、ゾンデによる強制経口投与により投与した。この投与を5回/週（月〜金曜日）の頻度で、試験が終了するまで続けた。【０１０３】
各投与サンプルが含有する各評価素材量は次の通りである。【０１０４】
ヒアルロン酸：2.5mg/day
プロテオグリカン含有物：約3.5mg/day（酸性糖成分：約0.83mg/day、プロテオグリカン：約0.33mg/day）
プロテオグリカン含有物＋ヒアルロン酸：プロテオグリカン含有物 約1.75mg/day（酸性糖成分：約0.42mg/day、プロテオグリカン：約0.17mg/day）、ヒアルロン酸1.25mg/day【０１０５】
＜UVB照射方法＞
UVB照射は、経口投与開始4週間後より開始した。UVB照射用ケージにマウスを入れ、UVB照射装置内に入れて、１．０ｍＷ／ｃｍ２の強度でＵＶＢを５回/週（月〜金曜日）照射した。照射１週目のみ６０ｍＪ／ｃｍ２の照射量とし、２週目以降１２０ｍＪ／ｃｍ２の照射量とした。10週間のUVB照射量の総量は5.7J/cm2であった。なお、ＵＶＢは波長280-315 nmの紫外線である。【０１０６】
＜皮膚バリア機能評価＞
マルチプローブ式皮膚計測器（MPA580：Courage-Khazaka社）のTewameterにより、経表皮透過蒸散水分量（TEWL）を週１回の頻度で測定し、皮膚バリア機能を評価した。各マウス背部3ヶ所を測定し、平均値を算出した。なお、ＴＥＷＬ値が大きいほど皮膚バリア機能（皮膚の外から体内への異物の侵入を防ぐ機能及び体内の水分が外へ逃げるのを防ぐ機能）が低下していることを示す。【０１０７】
ＵＶＢ照射開始から８週後のＴＥＷＬ測定結果を図９に示す。また、未照射コントロール（群１：Co-UVB）のＴＥＷＬ値を１００、ＵＶＢ照射コントロール（群２：Co+UVB）のＴＥＷＬ値を０とした場合の、群３〜５のマウスのＵＶＢ照射４週、６週、８週後のＴＥＷＬ値の相対値を表３に示す。当該相対値は皮膚バリア改善率（％）を示すといえる。【０１０８】
【表３】
2011007885.tif 000005
【０１０９】
これらの結果から、サケ鼻軟骨由来のプロテオグリカン含有物は、経口投与によりＴＥＷＬ値を下げ、皮膚バリア機能を改善することがわかった（図９、表３）。さらに、サケ鼻軟骨由来のプロテオグリカン含有物とヒアルロン酸とを併せて経口摂取することにより、当該皮膚バリア機能改善効果が、早期に得られることがわかった（表３）。【０１１０】
＜皮膚弾力性評価＞
マルチプローブ式皮膚計測器（MPA580：Courage-Khazaka社）のCutometerにより、皮膚弾力性測定を行った。具体的には、各マウス背部4ヶ所を測定し、得られたUf値及びUa値を用いて下記の式により弾力性（R2値）を算出した。なお、Ua値は吸引開放時の皮膚の戻りを、Uf値は吸引時の皮膚の伸びを、それぞれ表す。【０１１１】
弾力性（R2）＝Ua/Uf
ＵＶＢ照射開始から８週後に行った検討結果を図１０に示す（図１０では、ＵＶＢをＵＶと表記している）。当該結果から、サケ鼻軟骨由来のプロテオグリカン含有物は、経口投与により皮膚弾力性を改善する効果を有することが示唆された。またさらに、サケ鼻軟骨由来のプロテオグリカン含有物とヒアルロン酸とを併せて経口摂取することにより、有意に皮膚弾力性を回復させることがわかった。【０１１２】
＜コラーゲン産生能評価＞
UVB照射開始から10週後に、各マウスの背部の皮膚組織採取を行った。背部皮膚を採取し、一部はホルマリン固定を行い（皮膚組織切片作成用）、残りをコラーゲン定量用とした。【０１１３】
このようにして得た皮膚組織（コラーゲン定量用）を凍結させ、細胞破砕装置（オートミル TK-AM5）（トッケン）により粉砕し、真空乾燥機により乾燥させた。０．５Ｍ酢酸にプロテアーゼインヒビター（P.I.）カクテル錠（コンプリートミニEASY Pack（ロシュ社））を入れ溶解させ、上述の皮膚組織粉末に当該酢酸（P.I.入り）を加え、低温にて撹拌した後遠心分離を行い、上清部（酸可溶性コラーゲン抽出液）を採取した。【０１１４】
そして、酸可溶性コラーゲン定量キット（Sircol Soluble Collagen Assay（biocolor社））を用いて、マニュアルに基づき、上記酸可溶性コラーゲン抽出液のコラーゲン量を測定した。【０１１５】
結果を図１１に示す。当該結果から、サケ鼻軟骨由来のプロテオグリカン含有物は、経口投与により、皮膚におけるコラーゲン産生能の低下を有意に改善することがわかった。【０１１６】
＜真皮肥厚抑制効果検討＞
上述のホルマリン固定された組織切片を自動パラフィン固定装置 （tissue processor（ティシュー・テック社））を用いてパラフィン包埋ブロックを作成した。ミクロトームで切片を作成し、Hematoxylin-Eosin (ＨＥ)染色を行いサンプルとした。【０１１７】
サンプルは光学顕微鏡にて観察し、デジタルカメラにて画像を保存した。得られた画像各々において、真皮層の厚さを10ヶ所において測定し、その平均値を真皮層の厚さとして算出した。結果を図１２に示す（図１２では、ＵＶＢをＵＶと表記している）。当該結果から、サケ鼻軟骨由来のプロテオグリカン含有物は、経口投与により、真皮の肥厚を有意に抑制することがわかった。またさらに、サケ鼻軟骨由来のプロテオグリカン含有物とヒアルロン酸とを併せて経口摂取することにより、真皮の肥厚を有意に抑制でき、その抑制能はサケ鼻軟骨由来のプロテオグリカン含有物のみを摂取したときより優れていることがわかった。【０１１８】
皮膚への塗布による保湿及び抗皮膚老化能評価
＜使用実験動物＞
ヘアレスマウス（Hr-/Kud ♂  ）（九動社）を実験に用いた。エストロゲン変動による皮膚状態への影響がないオス（4週齢）を予備飼育後、実験に供した。【０１１９】
＜試験方法＞
マウスを４つの飼育ケージに表４のとおり割り付けた（１群５匹）。また、被検体は固体識別できるよう尾部に印を付けた。7週齢になるまで予備飼育を続けた。【０１２０】
【表４】
2011007885.tif 000006
【０１２１】
＜皮膚バリア機能評価＞
ヘアレスマウスが7週齢に達した段階で、塗布サンプル０．１mLを背部１日１回塗布するとともに、上述の「経口摂取による保湿及び抗皮膚老化能評価」に記載したのと同様にして、ヘアレスマウスにUVB照射を行った。そして、ＵＶＢ照射開始から５週後に、上述の「経口摂取による保湿及び抗皮膚老化能評価」に記載したのと同様にして、経表皮透過蒸散水分量（TEWL）を測定した。結果を図１３に示す（図１３では、ＵＶＢをＵＶと表記している）。当該結果から、サケ鼻軟骨由来のプロテオグリカン含有物は、皮膚への塗布により有意にＴＥＷＬ値を下げ、皮膚バリア機能を改善することがわかった。【０１２２】
なお、上述のように、ヒト皮膚繊維芽細胞増殖能は、ＰＧ−Ｋには含まれない分子量の大きいプロテオグリカンに起因することが推察されたことも考慮すると、それ以外の各種効果についても、当該プロテオグリカンに起因することが考えられた。【０１２３】
サケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物の分画及び効果検証
サケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物を、イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分画し、どの画分が細胞増殖効果を有するのかを検討した。当該分画の概要を図１４に示す。分画条件は以下の通りである。【０１２４】
＜イオン交換クロマトグラフィー＞
カラム：φ５．０ｃｍ×２０ｃｍのカラムに担体（DEAE Sephacel（GE Healthcare社））を高さ１５ｃｍになるように充填した。なお、DEAEはジエチルアミノエチルの略である。【０１２５】
溶媒：７M尿素−５０ｍMトリス−塩酸緩衝液（ｐH ７．４）を溶媒として用いた。同溶媒に０〜０．７５Ｍ塩化ナトリウムを加えた溶離液を用い、グラジェント溶出（直線勾配）により溶出を行った。
サケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物約１００ｍｇを、上記溶媒約２０ｍｌに溶解した。その後、日本生化学会編 基礎生化学実験法 第５巻（脂質・糖質・複合糖質）ｐ１８９  （東京化学同人）に準じて操作を行い、タンパク質画分、ヒアルロン酸画分、硫酸基を有する酸性糖画分へと分画した。カラムの溶出は流速 2.0ml/minで行い、各フラクション量は16mlとした。この場合において、タンパク質画分はフラクションNo.１６〜３５、ヒアルロン酸画分はフランクションNo.３７〜４２、硫酸基を有する酸性糖画分はフラクションNo.５２〜６７の各フラクションを、それぞれ合わせた画分とした。
なお、ヒアルロン酸も酸性糖の１種であるが、硫酸基を有さない。プロテオグリカンに含まれる酸性糖（例えばコンドロイチン硫酸）は、硫酸基を有する。また、タンパク質（特にコラーゲン）、ヒアルロン酸、硫酸基を有する酸性糖の順に分子極性が大きくなるため、これら３種をイオン交換クロマトグラフィーにより分画することが可能である。【０１２６】
タンパク質の定量は、280nm吸光度測定により行なった。ヒアルロン酸の定量は、生化学工業（株）のヒアルロン酸定量キットを用いて行った。硫酸基を有する酸性糖の定量は、カルバゾール硫酸法により行なった。【０１２７】
サケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物１００ｍｇを分離した場合に相当するタンパク質量は０．９ｍｇ、ヒアルロン酸量は１．２ｍｇ、硫酸基を有する酸性糖は４３．０ｍｇであった。【０１２８】
このようにして得られたタンパク画分、ヒアルロン酸画分、硫酸基を有する酸性糖画分、及びサケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物の４サンプルを用い、上記「細胞増殖促進能評価」と同様にして、各サンプルのヒト皮膚繊維芽細胞増殖能を検討した。結果を図１５に示す。サケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物以外でコントロールに対して有意にヒト皮膚繊維芽細胞増殖能が高かったのは、硫酸基を有する酸性糖画分のみであった。また、硫酸基を有する酸性糖画分は、サケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物に比べてもヒト皮膚繊維芽細胞増殖能が高かった。よって、サケ鼻軟骨由来粉末の水抽出物が有するヒト皮膚繊維芽細胞増殖効果は、硫酸基を有する酸性糖に起因すると考えられた。また、硫酸基を有する酸性糖画分には、プロテオグリカンが多く含まれることから、当該効果はプロテオグリカンによるものであると推察された。【０１２９】
なお、図１４〜１６において、硫酸基を有する酸性糖画分は、単に「酸性糖画分」と表記している。【０１３０】
＜ゲル濾過クロマトグラフィー＞
上述のようにして得た、硫酸基を有する酸性糖画分４３．０ｍｇをさらにゲル濾過クロマトグラフィーで分画した。具体的には、上述の「プロテオグリカン含有物の分子量の検討」に記載のSepharose CL-2B 充填カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィー条件で、硫酸基を有する酸性糖画分５ｍｇあたり１ｍｌのバッファーを加えて溶解したものを、硫酸基を有する酸性糖画分を分子量５０００ｋＤａ以上の画分と５０００ｋＤａ未満の画分とに分画した。それぞれの画分に含まれる酸性糖量をカルバゾール硫酸法により定量すると、分子量５０００ｋＤａ以上の画分には９．７ｍｇ、分子量５０００ｋＤａ未満の画分には１６．８ｍｇの酸性糖が含まれていた。【０１３１】
上記と同様にして、これらの画分のヒト皮膚繊維芽細胞増殖効果を検討した結果を図１６に示す。分子量５０００ｋＤａ以上の画分の方が、分子量５０００ｋＤａ未満の画分に比べて、ヒト皮膚繊維芽細胞増殖効果が高いことがわかった。この結果からも、当該効果はプロテオグリカンに起因するところが大きく、特に分子量の大きい（分子量５０００ｋＤａ以上の）プロテオグリカンの寄与が大きいと考えられた。【０１３２】
なお、図１５及び１６の「＋」、「＊＊」、「＊＊＊」の意味については、図８と同様である。【０１３３】
以下に、本発明に係る口腔用組成物、化粧品組成物及び飲食品組成物の処方例を示す。％は質量％を示す。処方例１〜７は化粧品組成物、処方例８〜１６は飲食品組成物、処方例１７〜２２は口腔用組成物である。
なお、以下の各処方例に用いたプロテオグリカン含有物の製造方法についても、以下に合わせて記載する。【０１３４】
＜プロテオグリカン含有物Ａ＞
〔１〕  皮や硬骨などの付着物を除去したサケ鼻軟骨をミートチョッパーで粗粉砕する。
〔２〕  粉砕したサケ鼻軟骨に、ｐH６.０〜７.５の水道水を、サケ鼻軟骨の２〜３倍量程度（容積）加えて、４０℃以下の温度（室温）で十分に攪拌する。
〔３〕  攪拌後、固形物を分離採取する。
〔４〕  〔２〕および〔３〕の処理を２回繰り返す。
〔５〕  得られた固形物を、凍結乾燥する。
〔６〕  乾燥固形物を、アトマイザーミル粉砕機を用いて微粉砕する。
〔７〕  ９５度エタノールを前記微粉砕サケ微軟骨の約１０倍量（容積）程度加えて、４０℃以下の温度で十分に攪拌する。
〔８〕  攪拌後、固形物を分離採取する。
〔９〕  〔７〕および〔８〕の処理を２回繰り返す。
〔１０〕  乾燥し、固形物を得る。【０１３５】
＜プロテオグリカン含有物Ｂ＞
〔１〕  ｐH６.０〜７.０の精製水を、プロテオグリカン含有物Ａの１０倍量（容積）程度加えて、４０℃以下の温度（室温）で３０分〜６時間程度十分に攪拌する。
〔２〕  固形分を分離除去した後に、乾燥して固形分を得る。【０１３６】
＜プロテオグリカン含有物Ｃ＞
〔１〕  ｐH６.０〜７.０の精製水を、プロテオグリカン含有物Ａの１０倍量（容積）程度加えて、４０℃以下の温度（室温）で３０分〜６時間程度十分に攪拌後、固形分を分離除去する。
〔２〕  得られた水溶液の５倍量程度のエタノールを添加して、４０℃以下の温度（室温）で十分に攪拌する。
〔３〕  生じた固形物を分離採取し、乾燥する。【０１３７】
＜プロテオグリカン含有物Ｄ＞
〔１〕  皮や硬骨などの付着物を除去したサケ鼻軟骨をミートチョッパーで粗粉砕する。
〔２〕  粉砕したサケ鼻軟骨に、ｐH６.５〜７.５の精製水を、サケ鼻軟骨の同量〜２倍量程度（容積）加えて、４０℃以下の温度（室温）で十分に攪拌する。
〔３〕  攪拌後、固形物を分離採取する。
〔４〕  〔２〕および〔３〕の処理を３回繰り返す。
〔５〕  得られた固形物を、湿式粉砕機を用いて微粉砕する。
〔６〕  95度エタノールを前記微粉砕サケ微軟骨の１０倍量（容積）程度加えて、４０℃以下の温度（室温）で十分に攪拌する。
〔７〕  攪拌後、固形物を分離採取する。
〔８〕  〔６〕および〔７〕の処理を１回繰り返す。
〔９〕  乾燥し、固形物を得る。
〔１０〕  ｐH６.５〜７.５の精製水を、〔９〕で得られた乾燥物の１０倍量（容積）程度加えて、低温で１２〜４８時間程度攪拌しながら浸漬する。
〔１１〕  浸漬後、固形物を分離除去する。
〔１２〕  水溶液の５倍量程度のエチルアルコールを添加して、４０℃以下の温度（室温）で十分に攪拌する。
〔１３〕  生じた固形物を分離採取し、乾燥する。【０１３８】
＜プロテオグリカン含有物Ｅ＞
〔１〕  皮や硬骨などの付着物を除去したサケ鼻軟骨をミートチョッパーで粉砕する。
〔２〕  粉砕したサケ鼻軟骨に、ｐH６.０〜７.５の水道水を、サケ鼻軟骨の５倍量程度（容積）加えて、４０度以下の温度（室温）で十分に攪拌する。
〔３〕  攪拌後、固形分を分離採取する。
〔４〕  〔２〕および〔３〕の処理を２回繰り返す。
〔５〕  得られた固形分を、湿式粉砕機を用いて微粉砕する。
〔６〕  95度エタノールを微粉砕サケ微軟骨の５倍量（容積）程度加えて、４０℃以下の温度（室温）で十分に攪拌する。
〔７〕  攪拌後、固形分を分離採取する。
〔８〕  〔６〕および〔７〕の処理を２回繰り返す。
〔９〕  ｐH６.０〜７.０の精製水を、得られた固形分の同量〜２倍量（容積）程度加えて、４０℃以下の温度で３０分〜６時間程度十分に攪拌した後に、固形分を分離除去する。【０１３９】
＜プロテオグリカン含有物Ｆ＞
〔１〕  皮や硬骨などの付着物を除去したサケ鼻軟骨を湿式粉砕機で粗粉砕する。
〔２〕  粉砕したサケ鼻軟骨に、ｐH６.０〜７.５の水道水を、サケ鼻軟骨の５倍量程度（容積）加えて、４０度以下の温度（室温）で十分に攪拌する。
〔３〕  攪拌後、固形分を分離採取する。
〔４〕  〔２〕および〔３〕の処理を２回繰り返す。
〔５〕  得られた固形分を、湿式粉砕機を用いて微粉砕する。
〔６〕  エタノール（食品添加物基準品）を微粉砕サケ微軟骨の５倍量（容積）程度加えて、４０℃以下の温度（室温）で十分に攪拌する。
〔７〕  攪拌後、固形分を分離採取する。
〔８〕  〔６〕および〔７〕の処理を２回繰り返す。
〔９〕  ｐH６.０〜７.０の精製水を、得られた固形分の５倍量（容積）程度加えて、４０℃以下の温度で３０分〜６時間程度十分に攪拌した後に、固形分を分離除去する。
〔１０〕  得られた水溶液の１０倍量程度の９５度エタノールを添加して、４０℃以下の温度（室温）で十分に攪拌し、生じた固形物を分離採取後、乾燥して固形物を得る。【０１４０】
＜プロテオグリカン含有物Ｇ＞
〔１〕  皮や硬骨などの付着物を除去したサケ鼻軟骨を湿式粉砕機で粗粉砕する。
〔２〕  粉砕したサケ鼻軟骨に、ｐH６.０〜７.５の水道水を、サケ鼻軟骨の１０倍量程度（容積）加えて、４０度以下の温度（室温）で十分に攪拌する。
〔３〕  攪拌後、固形分を分離採取する。
〔４〕  〔２〕および〔３〕の処理を２回繰り返す。
〔５〕  得られた固形分を、湿式粉砕機を用いて微粉砕する。
〔６〕  ９５度エタノールを微粉砕サケ微軟骨の３倍量（容積）程度加えて、４０℃以下の温度（室温）で十分に攪拌する。
〔７〕  攪拌後、固形分を分離採取する。
〔８〕  〔６〕および〔７〕の処理を３回繰り返す。
〔９〕  ｐH６.０〜７.０の精製水を、得られた固形分の２〜３倍量（容積）程度加えて、４０℃以下の温度で３０分〜６時間程度十分に攪拌した後に、固形分を分離除去する。
〔１０〕  分離後の水溶液に塩化ナトリウムを添加して、塩化ナトリウムを飽和状態にする。
〔１１〕  水溶液の５倍量程度の９５度エタノールを添加して、４０℃以下の温度（室温）で十分に攪拌し、生じた固形物を分離採取後、乾燥して固形物を得る。【０１４１】
なお、プロテオグリカン含有物Ａ〜Ｄについては、カルバゾール硫酸法により酸性糖量を、クロマトグラムの面積比からプロテオグリカン量を、それぞれ求めたところ、乾燥質量換算で、プロテオグリカン含有物に対する質量比は以下の通りであった。
Ａ：酸性糖  約３５％、  プロテオグリカン  約１５％
Ｂ：酸性糖  約４５％、  プロテオグリカン  約１８％
Ｃ：酸性糖  約５５％、  プロテオグリカン  約２３％
Ｄ：酸性糖  約６０％、  プロテオグリカン  約２４％【０１４２】
[処方例]
処方例１：化粧水
2011007885.tif 000007
【０１４３】
処方例２：美容液
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【０１４４】
処方例３：乳液
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【０１４５】
処方例４：クリーム
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【０１４６】
処方例５：育毛剤
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【０１４７】
処方例６：ヘアトニック
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【０１４８】
処方例７：毛穴ひきしめローション
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【０１４９】
処方例８：粉末玄米飲料
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【０１５０】
処方例９：タブレット
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【０１５１】
処方例１０：粉末食品
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【０１５２】
処方例１１：錠剤
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【０１５３】
処方例１２：飴
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【０１５４】
処方例１３：チュアブル錠
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【０１５５】
処方例１４：粉末茶
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【０１５６】
実施例１５：カプセル剤
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【０１５７】
実施例１６：チューイングガム
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【０１５８】
処方例１７：口腔用ジェル剤
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【０１５９】
処方例１８：口腔用塗布剤
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【０１６０】
処方例１９：洗口剤
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【０１６１】
処方例２０：液体歯磨剤
2011007885.tif 000026
【０１６２】
処方例２１：歯磨剤
2011007885.tif 000027
【０１６３】
処方例２２：マウススプレイ剤
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2011007885.tif 000033
【図６】
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【図７】
2011007885.tif 000035
【図８】
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【図９】
2011007885.tif 000037
【図１０】
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【図１１】
2011007885.tif 000039
【図１２】
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【図１３】
2011007885.tif 000041
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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