(57)【要約】  本発明は、Ｓｉｎ３モジュレーター、特に下記化合物又はその医薬上許容され得る塩を有効成分として含む精神疾患の予防及び／又は治療薬を提供する。本発明の精神疾患の予防及び／又は治療薬は、特にＡＳＤ、うつ病及びてんかん等の精神疾患に有用である。2019044844.tif 000014
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｉｎ３モジュレーターを有効成分として含む精神疾患の予防及び／又は治療薬。
【請求項２】
精神疾患が自閉スペクトラム症／自閉症スペクトラム障害である、請求項１記載の予防及び／又は治療薬。
【請求項３】
精神疾患がうつ病である、請求項１記載の予防及び／又は治療薬。
【請求項４】
精神疾患がてんかんである、請求項１記載の予防及び／又は治療薬。
【請求項５】
Ｓｉｎ３モジュレーターが下記化合物又はその医薬上許容され得る塩である、請求項１記載の予防及び／又は治療薬。
【化１】
2019044844.tif 000009
【請求項６】
下記化合物又はその医薬上許容され得る塩を有効成分として含む精神疾患の予防及び／又は治療薬。
【化２】
2019044844.tif 000010
【請求項７】
精神疾患が自閉スペクトラム症／自閉症スペクトラム障害である、請求項６記載の予防及び／又は治療薬。
【請求項８】
精神疾患がうつ病である、請求項６記載の予防及び／又は治療薬。
【請求項９】
精神疾患がてんかんである、請求項６記載の予防及び／又は治療薬。
【請求項１０】
下記化合物又はその医薬上許容され得る塩。
【化３】
2019044844.tif 000011
【請求項１１】
下記化合物又はその医薬上許容され得る塩の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、精神疾患の予防及び／又は治療薬。
【化４】
2019044844.tif 000012
【請求項１２】
精神疾患が自閉スペクトラム症／自閉症スペクトラム障害、うつ病及びてんかんからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１１記載の予防及び／又は治療方法。
【請求項１３】
精神疾患の予防及び／又は治療に使用する為の、下記化合物又はその医薬上許容され得る塩。
【化５】
2019044844.tif 000013
【請求項１４】
精神疾患が自閉スペクトラム症／自閉症スペクトラム障害、うつ病及びてんかんからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１３記載の化合物又はその医薬上許容され得る塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は精神疾患の予防及び／又は治療に有用な薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
精神疾患は、多くの遺伝要因と環境要因が複雑に相互作用して発症すると考えられているが、その分子レベルのメカニズムは未だほとんど不明であり、薬による治療の効果が、必ずしも十分ではない疾患もある。
例えば、発達障害の１種である自閉スペクトラム症／自閉症スペクトラム障害（以下ＡＳＤと略す）では、その中核症状の予防、治療に有効な医薬品はなく、有効な予防、治療薬が強く望まれている。
うつ病は、気分障害と言われる精神疾患の1種であり、現有の抗うつ薬は、作用発現までの時間が長く、また抗うつ薬に無効な患者が３割程存在し、作用発現の早い抗うつ薬や従来の抗うつ薬が無効な患者（治療抵抗性うつ病）に有効な新規メカニズムの抗うつ薬が強く望まれている。
また、てんかんは、突然意識を失って反応がなくなるなどの「てんかん発作」をくりかえし起こす病気であり、抗てんかん薬として、現在多種の薬剤が存在するが、それらにより改善しない難治性てんかん患者が２〜３割存在する。難知性てんかん患者にも有効な新規メカニズムの抗てんかん薬が強く望まれている。【０００３】
種々の創薬標的に対する治療薬の開発がなされているが、「複雑遺伝疾患」と考えられる精神疾患の発症にエピジェネティックな機序の関与が考えられることもあり、革新的（従来の作用機序とは異なる）且つ有効な薬剤の開発には至っていないのが現状である。【０００４】
具体的作用標的として、多くの神経特異的遺伝子の転写調節を担う核内タンパク質ＮＲＳＦ(Neuron-Restrictive Silencer Factor、別名ＲＥＳＴ(RE1-Silencing Transcription Factor))が挙げられ、ＮＲＳＦに特異的に結合する転写コリプレッサーとしてＳｉｎ３タンパク質が知られている（非特許文献１、２）。
Ｓｉｎ３の制御因子（モジュレーター）が線維筋痛症や鎮痛に有効であるとの報告（特許文献１）はあるが、精神疾患、特にＡＳＤ、うつ病及びてんかん等に効果的であるとの報告は為されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO2014/088106A1
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Molecular and Cellular Biology, 2000, 20, 2147.
【非特許文献２】The Journal of Biological Chemistry, 2000, 275, 9461.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、精神疾患、特にＡＳＤ、うつ病及びてんかん等の精神疾患に有用な、且つ既存薬とは異なる新たな作用機序を有する精神疾患の予防及び／又は治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑み、まず、ＮＲＳＦとＳｉｎ３との結合に着目し、当該結合を阻害する（制御する）化合物を探索し、さらに動物モデルを用いて該化合物の各種精神疾患への効果を確認し本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
［１］Ｓｉｎ３モジュレーターを有効成分として含む精神疾患の予防及び／又は治療薬。
［２］精神疾患が自閉スペクトラム症／自閉症スペクトラム障害である、上記［１］記載の予防及び／又は治療薬。
［３］精神疾患がうつ病である、上記［１］記載の予防及び／又は治療薬。
［４］精神疾患がてんかんである、上記［１］記載の予防及び／又は治療薬。
［５］Ｓｉｎ３モジュレーターが下記化合物又はその医薬上許容され得る塩である、上記［１］記載の予防及び／又は治療薬。【０００９】
【化１】
2019044844.tif 000003
【００１０】
［６］下記化合物又はその医薬上許容され得る塩を有効成分として含む精神疾患の予防及び／又は治療薬。【００１１】
【化２】
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【００１２】
［７］精神疾患が自閉スペクトラム症／自閉症スペクトラム障害である、上記［６］記載の予防及び／又は治療薬。
［８］精神疾患がうつ病である、上記［６］記載の予防及び／又は治療薬。
［９］精神疾患がてんかんである、上記［６］記載の予防及び／又は治療薬。
［１０］下記化合物又はその医薬上許容され得る塩。【００１３】
【化３】
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【００１４】
［１１］下記化合物又はその医薬上許容され得る塩の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、精神疾患の予防及び／又は治療薬。
【化４】
2019044844.tif 000006
【００１５】
［１２］精神疾患が自閉スペクトラム症／自閉症スペクトラム障害である、上記［１１］記載の予防及び／又は治療方法。
［１３］精神疾患がうつ病である、上記［１１］記載の予防及び／又は治療方法。
［１４］精神疾患がてんかんである、上記［１１］記載の予防及び／又は治療方法。
［１５］精神疾患の予防及び／又は治療に使用する為の、下記化合物又はその医薬上許容され得る塩。【００１６】
【化５】
2019044844.tif 000007
【００１７】
［１６］精神疾患が自閉スペクトラム症／自閉症スペクトラム障害である、上記［１５］記載の化合物又はその医薬上許容され得る塩。
［１７］精神疾患がうつ病である、上記［１５］記載の化合物又はその医薬上許容され得る塩。
［１８］精神疾患がてんかんである、上記［１５］記載の化合物又はその医薬上許容され得る塩。
【発明の効果】
【００１８】
本発明化合物及び該化合物を含む薬剤は既存の治療薬とは異なる作用機序により各種精神疾患（ＡＳＤ、うつ病、てんかん等）に有効であることから、既存の治療薬で得られない効果が期待でき、また、既存の治療薬で問題となっていた副作用の懸念を解消することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は試験例１の結果を示したグラフである。胎仔期バルプロ酸投与マウスの社会性行動障害（Ａ）及び認知機能障害（Ｂ）に対する実施例１化合物の作用を表わす。
【図２】図２は試験例１の結果を示したグラフである。胎仔期バルプロ酸投与マウスの痛覚過敏、異痛（アロディニア）に対する実施例１化合物の作用を表わす。（Ａ）はホットプレート試験の結果を、（Ｂ）はホンフライ試験の結果を、（Ｃ）は酢酸ライジング試験の結果をそれぞれ示す。
【図３】図３は試験例２の結果を示したグラフである。コルチコステロン慢性投与マウスうつモデルを用いた強制水泳試験での実施例１化合物の作用を表わす。
【図４】図４は試験例２の結果を示したグラフである。コルチコステロン慢性投与により誘発されるアンヘドニアに対する実施例１化合物の作用を表わす。
【図５】図５は試験例３（ＮＭＲ実験）の結果を示したチャート図である。ｍＳｉｎ３Ｂ  ＰＡＨ１及びＧＳＴ融合ｍＳｉｎ３Ｂ  ＰＡＨ１の存在下で実施例１化合物のＮＭＲのピーク形状が変化することを示している。上段はＳＴＤ−ＮＭＲの、中段はＷａｔｅｒｌｏｇｓｙ測定の、下段は３９１９  Ｗａｔｅｒｇａｔｅ測定の結果をそれぞれ示す。
【図６】図６は試験例３（１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ滴定実験）の結果を示したグラフである。ｍＳｉｎ３Ｂ  ＰＡＨ１の１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルにおいて実施例１化合物の存在によりケミカルシフトが変化することを示している。
【図７】図７Ａは実施例１化合物とｍＳｉｎ３Ｂ  ＰＡＨ１との結合構造を示した図である。図７ＢはＮＲＳＦとｍＳｉｎ３Ｂ  ＰＡＨ１との結合構造を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、Ｓｉｎ３モジュレーターを有効成分として含む精神疾患の予防及び／又は治療薬を提供するものである。以下、詳細に説明する。
【００２１】
（Ｓｉｎ３モジュレーター）
Ｓｉｎ３は、転写制御機構に関わる足場タンパク質の一つであり、組織特異性がなく、広く発現し、酵母からヒトまで高度に保存されている。転写因子やコリプレッサー、メチル化ＣｐＧ結合タンパク質といった、結合相手の異なる４つのＰＡＨ(paired amphipathic helix)ドメインとＨＤＡＣ(Histone deacetylase)相互作用ドメインを有している。ＰＡＨ１ドメインは、４つのＰＡＨドメインのうち最もＮ末端側にあるドメインで、転写抑制因子ＮＲＳＦと相互作用する。本発明において「Ｓｉｎ３モジュレーター」とは、このＳｉｎ３−ＮＲＳＦ相互作用を阻害（制御）できる物質であれば特にその由来は限定されず、低分子化合物であっても高分子化合物であってもかまわない。ここで低分子化合物とは分子量１０００未満程度の化合物であって、例えば医薬品として通常使用し得る有機化合物およびその誘導体が挙げられ、有機合成法等を駆使して製造される化合物やその誘導体、天然由来の化合物やその誘導体等であり、望ましくは医薬品として使用し得る有機化合物およびその誘導体をいう。また、高分子化合物としては分子量１０００以上程度の化合物であって、タンパク質、ポリ核酸類、多糖類、およびこれらを組み合わせたものなどが挙げられる。
【００２２】
Ｓｉｎ３モジュレーターはその医薬上許容され得る塩であってもよい。当該塩としては、例えば、トリフルオロ酢酸、酢酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ケイ皮酸、フマル酸、ホスホン酸、塩酸、硝酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、スルファミン酸、硫酸等の酸との酸付加塩；例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等の金属塩；例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、Ｎ−メチルピロリジン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン等の有機塩基との塩等が挙げられる。
【００２３】
Ｓｉｎ３モジュレーターが、光学異性体、立体異性体、位置異性体、回転異性体等の異性体を有する場合には、いずれか一方の異性体も、異性体の混合物も本発明においてＳｉｎ３モジュレーターとして使用できる。例えば、Ｓｉｎ３モジュレーターに光学異性体が存在する場合には、ラセミ体から分割された光学異性体もＳｉｎ３モジュレーターとして使用できる。これらの異性体は、自体公知の合成手法、分離手法（濃縮、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、再結晶等）によりそれぞれを単品として得ることができる。
【００２４】
Ｓｉｎ３モジュレーターは、結晶であっても無晶形であってもよい。Ｓｉｎ３モジュレーターが結晶である場合、結晶形が単一であっても結晶形混合物であっても本発明においてＳｉｎ３モジュレーターとして使用できる。結晶は、自体公知の結晶化法を適用して、結晶化することによって製造することができる。
【００２５】
Ｓｉｎ３モジュレーターは、溶媒和物（例えば、水和物等）であっても、無溶媒和物であってもよく、いずれも本発明のＳｉｎ３モジュレーターとして使用できる。
【００２６】
Ｓｉｎ３モジュレーターは、同位元素（例、３Ｈ，１４Ｃ，３５Ｓ，１２５Ｉ等）等で標識されていてもよい。
【００２７】
本発明において使用するＳｉｎ３モジュレーターとして、好ましくは下記式
【００２８】
【化６】
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【００２９】
で表される化合物である（以下、本発明化合物とも称する）。
本発明化合物は新規な化合物であり、例えば実施例１に記載の方法によって製造することができる。
【００３０】
Ｓｉｎ３モジュレーターは、Ｓｉｎ３−ＮＲＳＦ相互作用を阻害することにより、哺乳動物（例、ヒト、サル、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ウサギ等）に対し、精神疾患改善作用に寄与する種々の薬理効果を示し、従って、各種精神疾患の予防及び／又は治療薬（以下、本発明の薬剤とも称する）として有用である。
【００３１】
（精神疾患）
本発明において、精神疾患とは『疾病及び関連保健問題の国際統計分類』第１０版（ＩＣＤ−１０）の第５章「精神および行動の障害」で定義される各種疾患／症状並びにアメリカ精神医学会より出版されている『精神障害の診断と統計マニュアル』第５版（ＤＳＭ−５）で定義される各種疾患／症状を意味し、さらに、ＩＣＤ−１０の第６章「神経系の疾患」Ｇ４０及びＧ４１で定義されるてんかんを含む。本発明は、精神疾患の中でもＳｉｎ３−ＮＲＳＦ相互作用により惹起される疾患や病態に有効であり、特に、ＡＳＤ、うつ病及びてんかんに対して優れた改善効果を発揮することができる。
「自閉スペクトラム症／自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）」は、米国精神医学会の診断基準であるＤＳＭ−５では、「神経発達症群／神経発達障害群」に分類され、ＩＣＤ−１０では、Ｆ８４広汎性発達障害(pervasive developmental disorders, PDD)に関連づけられている疾患であり、アスペルガー症候群、特定不能の広範性発達障害、小児期崩壊性障害（ＣＤＤ）、脆弱Ｘ症候群、レット症候群等を含む概念である。その基本的特徴は、３歳位までに表れ、以下の中核症状を主な特徴とする行動的症候群である。
１．社会的コミュニケーションや社会的相互作用（social interaction）における持続的な欠陥
２．限定された、反復的行動、興味、または活動の様式
「うつ病」は、ＩＣＤ−１０では、Ｆ３０−Ｆ３９「気分[感情]障害」に分類される障害を意味し、米国精神医学会の診断基準であるＤＳＭ−５によれば、「抑うつ障害群」のカテゴリーに含まれる。より狭義には大うつ病性障害を意味し、病歴において大うつ病エピソードが確認できれば大うつ病性障害の診断がつけられ、躁病エピソード、軽躁エピソード、混合性エピソードがあれば双極性障害と診断される。しかし、一般的には、うつ病という用語が大うつ病性障害と気分変調性障害を意味する場合や気分障害全般を意味する場合もあり、必ずしも定まった使われ方をしていない。従って、本発明における「うつ病」は、医師がうつ状態またはうつ病と診断した場合の全てを含む。本明細書において、「うつ病」なる用語は、うつ状態を含む概念である。
「てんかん」は、種々の原因によってもたらされる慢性の脳疾患であり大脳ニューロンの過剰な発射に由来する反復性の発作（てんかん発作）を特徴とし、それにさまざまな臨床症状及び検査所見がともなう。発作は全般発作（強直間代発作、単純欠神発作、複雑欠神発作、点頭発作、脱力発作）及び部分発作（単純部分発作、複雑部分発作、二次性全般化発作）に大別されるが、いずれの発作も本発明の対象となり得る。
【００３２】
Ｓｉｎ３モジュレーターは、薬学的に許容される担体と配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等の固形製剤；シロップ剤、注射剤等の液状製剤；貼付剤、軟膏剤、硬膏剤等の経皮吸収剤；吸入剤；坐剤として、適宜製剤化することができる。有効成分であるＳｉｎ３モジュレーターの該製剤中における含有量は製剤全体に対して通常、約０．０１〜約９９．９重量％、好ましくは約０．１〜約５０重量％である。
【００３３】
薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用されている各種有機あるいは無機担体物質を用いることができる。具体的には、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等を配合することができる。又、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることもできる。
【００３４】
賦形剤の例としては、乳糖、白糖、ブドウ糖、でんぷん、蔗糖、微結晶セルロース、カンゾウ末、マンニトール、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム等が挙げられる。
【００３５】
滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、精製タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。
【００３６】
結合剤の例としては、結晶セルロース、白糖、マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００３７】
崩壊剤の例としては、でんぷん、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等が挙げられる。
【００３８】
溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油等が挙げられる。
【００３９】
溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００４０】
懸濁化剤の例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤；ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
【００４１】
等張化剤の好適な例として、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。
【００４２】
緩衝剤の好適な例として、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びクエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。
無痛化剤の好適な例として、例えばベンジルアルコール等が挙げられる。
【００４３】
防腐剤の好適な例として、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。
抗酸化剤の好適な例として、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸等が挙げられる。
着色剤の好適な例として、例えばタール色素、カラメル、三二酸化鉄、酸化チタン、リボフラビン類等が挙げられる。
甘味剤の好適な例として、ブドウ糖、果糖、転化糖、ソルビトール、キシリトール、グリセリン、単シロップ等が挙げられる。
【００４４】
該製剤の投与量は、年令、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、使用するＳｉｎ３モジュレーターの種類、薬物の組み合わせ、患者のその時に治療を行なっている病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。
例えば、Ｓｉｎ３モジュレーターが本発明化合物である場合、該製剤は、有効成分であるＳｉｎ３モジュレーターの量として１日量約１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは約２〜６０ｍｇ／ｋｇ（体重）、より好ましくは５〜４０ｍｇ／ｋｇ、更に好ましくは約１０〜３０ｍｇ／ｋｇ（体重）程度を１回又は２ないし３回に分けて投与するのが好ましい。
【実施例】
【００４５】
以下に本発明を実施例、参考例および試験例により、更に具体的に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
LC-MSの測定条件は以下に示す。
分析装置：Waters 2795
カラム：Develosil C30-UG-5 (50 x 4.6 mm, Nomura Kagaku Co., Ltd.) 
溶媒：Solution A = 蒸留水 [ 0.1% (v/v) ぎ酸  含有]
Solution B = アセトニトリル [ 0.1% (v/v) ぎ酸  含有] 
グラジエント条件：0〜5 min. 5 〜 100% (v/v) Solution B、5〜6 min. 100% (v/v) Solution B
流速：1 mL/min【００４６】
実施例１
（１）イソプロピル（Ｒ）−１−（（Ｓ）−１−（（２，２−ジエトキシエチル）（イソペンチル）アミノ）−４−（メチルチオ）−１−オキソブタン−２−イルアミノ）−１−オキソブタン−２−イルオキシカーバメイト
（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（２，２−ジエトキシエチル）−Ｎ−イソペンチル−４−（メチルチオ）ブタナミド（参考例３の化合物：２．９ｇ，８．６６ｍｍｏｌ）と（Ｒ）−２−（イソプロピルオキシカルボニルアミノオキシ）酪酸（参考例１０の化合物：１．７８ｇ，８．６７ｍｍｏｌ）をメタノール（５０ｍＬ）に溶解し、Ｎ−メチルモルホリン（０．８７ｇ，８．６ｍｍｏｌ）と塩化４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム（ＤＭＴ−ＭＭ，３．６ｇ，１３．０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で一晩放置した。反応混合物を減圧下に濃縮し、酢酸エチル（８０ｍｌ）を加えた。有機相を食塩水、１０％クエン酸水、重曹水で洗浄し、芒硝で乾燥し、ろ液を減圧下に濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル混合溶媒、酢酸エチル濃度２０％〜５０％グラジエント）で精製し、表題化合物（無色油状物質、３．３３ｇ，収率７４％）を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、展開溶媒  ヘキサン：酢酸エチル＝１：１），Ｒｆ＝０．５２（リンモブデン酸加熱呈色）
（２）（３Ｒ，６Ｓ，９ａＳ）−イソプロピル３−エチル−８−イソペンチル−６−（２−（メチルチオ）エチル）−４，７−ジオキソヘキサヒドロピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］オキサジアジン−１（６Ｈ）−カルボキシレート（実施例１化合物）
イソプロピル（Ｒ）−１−（（Ｓ）−１−（（２，２−ジエトキシエチル）（イソペンチル）アミノ）−４−（メチルチオ）−１−オキソブタン−２−イルアミノ）−１−オキソブタン−２−イルオキシカーバメイト（３．３３ｇ，６．３８ｍｍｏｌ）にぎ酸（３５ｍｌ）を加え、室温で一晩放置した。ぎ酸を減圧下に留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル混合溶媒、酢酸エチル濃度２０％〜５０％グラジエント）で精製し、表題化合物（無色油状物質、２．０３ｇ、収率７４％）を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、展開溶媒  ヘキサン：酢酸エチル＝１：１），Ｒｆ＝０．６３（リンモリブデン酸加熱呈色）
LC-MS: RT= 4.75 min. Obs MS m/z= 430 (M+1)+【００４７】
参考例１
Ｎ−（２，２−ジエトキシエチル）−３−メチルブタン−１−アミン
２−ブロモ−１，１−ジエトキシエタン（３９．４ｇ，０．２ｍｏｌ）と３−メチルブタン−１−アミン（５２．２ｇ，０．６ｍｏｌ）のアセトニトリル（３００ｍＬ）溶液に炭酸カリウム（５５．３ｇ，０．４ｍｏｌ）を加え、オイルバスで８０℃、３０時間加熱した。反応混合物をろ過し、ろ液を減圧下に濃縮した。残渣を真空蒸留に付し、沸点１００−１０２℃（１２００Ｐａ）の留分として表題化合物（無色油状物質、３４．４ｇ、収率８４％）を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、展開溶媒  クロロホルム：メタノール＝１０：１）Ｒｆ＝０．６８（ヨウ素呈色）【００４８】
参考例２
（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル  １−（（２，２−ジエトキシエチル）（イソペンチル）アミノ）−４−（メチルチオ）−１−オキソブタン−２−イルカルバメート
Ｎ−（２，２−ジエトキシエチル）−３−メチルブタン−１−アミン（参考例１の化合物：４．２８ｇ，２１．０ｍｍｏｌ）と（Ｓ）−２−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−４−（メチルチオ）酪酸（７．４３ｇ，２０．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、氷冷下にジイソプロピルエチルアミン（５．６８ｇ，４４ｍｍｏｌ）と（１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム−３−オキシド  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ，９．１ｇ，２４ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌した。反応混合物を減圧下に濃縮し、残渣に酢酸エチルを加えた。有機相を食塩水、１０％クエン酸水、重曹水で洗浄し、芒硝で乾燥し、減圧下に濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル混合溶媒、酢酸エチル濃度１０％〜３５％グラジエント）で精製し、表題化合物（無色油状物質、１０．９ｇ、収率９８％）を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、展開溶媒  ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）Ｒｆ＝０．５１（紫外線ライト発色）【００４９】
参考例３
（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（２，２−ジエトキシエチル）−Ｎ−イソペンチル−４−（メチルチオ）ブタナミド
（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル  １−（（２，２−ジエトキシエチル）（イソペンチル）アミノ）−４−（メチルチオ）−１−オキソブタン−２−イルカルバメート（参考例２の化合物：１０．９ｇ，１９．６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（８．５１ｇ，１００ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩放置した。反応混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（最初にヘキサン−酢酸エチル混合溶媒、酢酸エチル濃度２０％〜３０％グラジエント、次にクロロホルム−メタノール混合溶媒、メタノール濃度０％〜２０％グラジエント）で精製し、表題化合物（無色油状物質、３．６０ｇ，収率５５％）を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、展開溶媒  クロロホルム：メタノール＝１０：１）Ｒｆ＝０．４６（ニンヒドリン加熱呈色）【００５０】
参考例４
（Ｓ）−２−アセトキシ酪酸
（Ｓ）−２−ヒドロキシ酪酸（３５ｇ，３４０ｍｍｏｌ）に氷冷下に塩化アセチルを加え、次に６０℃で４時間加熱還流した。過剰の塩化アセチルを減圧下に留去し、ジエチルエーテルを加えた。有機相を芒硝乾燥し、減圧下に濃縮して、表題化合物（無色油状物質、４２ｇ，収率８５％）を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、展開溶媒  石油エーテル：酢酸エチル：酢酸＝１０：１：０．１）Ｒｆ＝０．８（リンモリブデン酸加熱呈色）【００５１】
参考例５
（Ｓ）−２−アセトキシ酪酸  ｔｅｒｔ−ブチル
（Ｓ）−２−アセトキシ酪酸（参考例４の化合物：４２ｇ，２８８ｍｍｏｌ）とｔｅｒｔ−ブチル  アルコールのジクロロメタン（４００ｍＬ）溶液に４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ，１７ｇ，１４０ｍｍｏｌ）を加えた。次にジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ，８５ｇ，４３８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２５０ｍＬ）溶液を氷冷下に加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌した。生成した尿素化合物を濾別し、有機相を水で洗浄し、乾燥し、減圧下に濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル−酢酸エチル混合溶媒、酢酸エチル濃度４％）で精製し、表題化合物（黄色油状物質、４６ｇ、収率８０％）を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、展開溶媒  石油エーテル：酢酸エチル＝１０：１），Ｒｆ＝０．８（リンモリブデン酸加熱呈色）【００５２】
参考例６
（Ｓ）−２−ヒドロキシ酪酸  ｔｅｒｔ−ブチル
炭酸カリウム（２０．１ｇ，１４６ｍｍｏｌ）をメタノール（５６ｍＬ）と水（８０ｍＬ）に溶解し、（Ｓ）−２−アセトキシ酪酸  ｔｅｒｔ−ブチル（参考例５の化合物：１０ｇ，４９ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で一晩激しく攪拌した。メタノールを減圧下に留去し、ジクロロメタンで２回抽出し、表題化合物（白色固体、５ｇ、収率６４％）を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、展開溶媒  石油エーテル：酢酸エチル＝１０：１），Ｒｆ＝０．６（リンモリブデン酸加熱呈色）【００５３】
参考例７
（Ｒ）−２−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イルオキシ）酪酸  ｔｅｒｔ−ブチル
（Ｓ）−２−ヒドロキシ酪酸  ｔｅｒｔ−ブチル（参考例６の化合物：１．８６ｇ，１１．６ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（１．８９ｇ，１１．６ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（３．０４ｇ，１１．６ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（３０  ｍＬ）に溶解し、氷冷下にアゾジカルボン酸ジエチル（２ｍＬ，１２．７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で一晩攪拌し、溶媒を減圧下に濃縮した。反応混合物にジクロロメタンと水を加え攪拌し、有機相を芒硝で乾燥し、減圧下に濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル混合溶媒、酢酸エチル濃度３％）で精製し、表題化合物（白色固体、２．５ｇ、収率７２％）を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、展開溶媒  石油エーテル：酢酸エチル＝１０：１），Ｒｆ＝０．４（リンモリブデン酸加熱呈色）【００５４】
参考例８
（Ｒ）−２−（アミノオキシ）酪酸  ｔｅｒｔ−ブチル
（Ｒ）−２−（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）酪酸  ｔｅｒｔ−ブチル（参考例７の化合物：２．５ｇ，８．２ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解し、抱水ヒドラジン（１．７ｍＬ，２５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。反応混合物を減圧下に濃縮し、３％の重曹水（１０ｍＬ）とエーテルを加え、攪拌した。有機相を芒硝で乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン−ジクロロメタン混合溶媒、ジクロロメタン濃度３０％）で精製し、表題化合物（無色油状物質、１ｇ、収率  ７０％）を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、展開溶媒  石油エーテル：ジクロロメタン＝１：２），Ｒｆ＝０．３（リンモリブデン酸加熱呈色）【００５５】
参考例９
（Ｒ）−２−（イソプロピルオキシカルボニルアミノオキシ）酪酸  ｔｅｒｔ−ブチル
（Ｒ）−２−（アミノオキシ）酪酸  ｔｅｒｔ−ブチル（参考例８の化合物：７．０ｇ，４０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２０ｍＬ）溶液にピリジン（６．３ｇ，８０ｍｍｏｌ）を加え、さらに氷冷下にクロロぎ酸イソプロピル（５．８８ｇ，４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。反応混合物を減圧下に濃縮し、酢酸エチル（８０ｍｌ）を加えた。有機相を１０％クエン酸水、重曹水で洗浄し、芒硝で乾燥し、減圧下に濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル混合溶媒、酢酸エチル濃度０％〜３０％グラジエント）で精製し、表題化合物（無色油状物質、１０．４ｇ、収率  定量的）を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、展開溶媒  ヘキサン：酢酸エチル＝４：１），Ｒｆ＝０．５８（リンモリブデン酸加熱呈色）【００５６】
参考例１０
（Ｒ）−２−（イソプロポキシカルボニルアミノオキシ）酪酸
（Ｒ）−２−（イソプロポキシカルボニルアミノオキシ）酪酸  ｔｅｒｔ−ブチル（参考例９の化合物：１０．４５ｇ，４０ｍｍｏｌ）にぎ酸（５０ｍｌ）を加え、一晩放置した。ぎ酸を減圧下に留去し、表題化合物（白色固体、８．４５ｇ、収率定量的）を得た。【００５７】
試験例１  胎仔期バルプロ酸投与ＡＳＤモデルマウスを用いた薬理作用評価
胎生期１２．５日齢にバルプロ酸に暴露されたマウスは、妥当性の高いＡＳＤ(Autistic Spectrum Disorder)モデルとして広く認知されている。本マウスでは、社会性行動障害、新奇物体認識障害、痛覚感受性異常等が認められる。そこで、本マウスを用いて、本発明化合物の投与による社会性行動障害、新奇物体認識障害、痛覚感受性異常（ホットプレート試験、ホンフライ試験、酢酸ライジング試験）に対する改善作用を評価した。【００５８】
（１）胎仔期バルプロ酸投与ＡＳＤモデルマウスの作製
ＩＣＲ系８週齢の雄ならびに雌マウスを、室温２２±１℃、照明時間１日１２時間（８：００−２０：００）の条件下、それぞれポリカーボネート樹脂製ケージ（２４ｃｍ×１７ｃｍ×１２ｃｍ）内で餌・水は自由に摂取できる環境のもと、１ケージあたり５−６匹で群飼育をした。飼育環境に馴化後、９−１２週齢の雌マウスから毎日膣垢を採取し、ギムザ染色により性周期を確認した。発情前期もしくは発情期の雌マウスを、９−２０週齢の雄マウスと一晩のみ同居させ、交配させた。翌日を妊娠０日目と定義し、そのマウス由来の雄の出生仔を実験に用いた。妊娠１２．５日目のマウスに、５００ｍｇ／ｋｇのバルプロ酸ナトリウムを腹腔内投与した（Kataoka et al., 2013; Takuma et al., 2014; Hara et al., 2016）（図１、２中、ＶＰＡ）。対照群（図１、２中、Ｓａｌｉｎｅ）には、溶媒として用いた生理食塩水を腹腔内投与した。生後３週齢時に母子分離を行い、８週齢以降に実験に供した。被験化合物は、ＤＭＳＯ最終濃度が８％、Ｓｏｌｔｏｌ  ＨＳ１５最終濃度が２％、被験化合物濃度が３ｍｇ／ｍＬとなるように生理食塩水に溶かした薬液を８週齢時から１日１回腹腔内に投与（３０ｍｇ／ｋｇ）し、１０週齢目に社会性行動試験、新奇物体認識試験を行い、１１週齢に痛覚感受性試験を行った。比較対照としては、被験化合物を含まない薬液を同量投与した（図１、２中、Ｖｅｈｉｃｌｅ）。【００５９】
（２）社会性行動試験
Haraらの方法(2016)に準じ、明期（８：００−２０：００）に行った。３５０ルクスの照度に設定した防音実験室内において、木製の滅菌済みソフトチップ（三協ラボサービス株式会社）を入れたポリサルホン製の試験ケージ（３８ｃｍ×２２ｃｍ×２０ｃｍ）内に被験マウスを入れ、６０分間馴化させた。その後、被験マウスと遭遇したことのない同系統かつ体重が同程度の雄の侵入マウスを入れ、２０分間の様子をビデオ録画した。被験マウスが侵入マウスに対して示した嗅覚行動（face sniffおよびano-genital sniff）を社会性行動の指標とし、その総時間を計測した。【００６０】
（３）新奇物体認識試験
新奇物体認識試験はHaraらの方法(2016)に準じ、明期（８：００−２０：００）に行った。まず３０ルクスの照度に設定した防音実験室内において、木製の滅菌済みソフトチップ（三協ラボサービス株式会社）のみを敷いたアクリル変性ポリ塩化ビニル製の試験ケージ（３０ｃｍ×３０ｃｍ×３５ｃｍ）に１日１０分間、連続３日間、被験マウスを馴化させた。４日目に壁から８ｃｍ離れた位置に異なる２つの物体（ｏｂｊｅｃｔ  ａ、ｂはゴルフボール、レゴブロック、プラスチックの円柱およびコンセントより２つをランダムに選択）を置き、１０分間自由に探索させた（訓練試行）。その２４時間後に、物体ｂを新奇物体である物体ｃと置換した試験ケージ内で５分間自由に探索させた（試験試行）。訓練試行および試験試行における動物の行動をビデオ録画し、２つの物体に対するそれぞれの探索時間を計測した。試験試行における総探索時間に対する物体ｃと物体ａの探索時間差の割合（％）を識別指数として算出した。【００６１】
（４）社会性行動試験、新奇物体認識試験評価結果
胎仔期のバルプロ酸投与による成熟後の社会性行動障害や新奇物体認知機能障害が、被験化合物（実施例１の化合物）の慢性投与により改善された（図１）。以上の結果から、実施例１の化合物が、胎仔期バルプロ酸投与マウスの示すＡＳＤ様の行動異常に対して有効であることが明らかとなった。なお各群ｎ＝１２で、データは平均値±標準誤差として表記した。**P < 0.01（two-way ANOVA後、Tukey-Kramer testを行った。）【００６２】
（５）ホットプレート試験
ホットプレート試験は、Horiguchiらの方法(2013a)に準じ、明期（８：００−２０：００）に行った。装置（HOT/COLD PLATE; Model 35100; Ugo Basile, Italy）の熱板温度を４９±０．５℃に設定し、被験マウスを静かに導入した。マウスが後肢を舐める、または跳躍する行動を痛みの反応とし、いずれかの反応を最初に起こすまでの時間（逃避反応時間）を計測した。なお熱刺激による組織障害を防ぐために、逃避反応時間のカットオフ値を３０秒とした。 【００６３】
（６）ホンフライ試験
ホンフライ試験は、Horiguchiらの方法(2013b)に準じ、明期（８：００−２０：００）に行った。マウスをステンレスメッシュの上に置き、アクリル樹脂製ボックス（３．５ｃｍ×８．５ｃｍ×８．０ｃｍ）をかぶせ、自発運動が軽減したのを確認後、足蹠の肉趾中央部に垂直にホンフライフィラメント（Touch-Test（登録商標） Sensory Evaluators; North Coast Medical, CA, USA）が曲がるまで押し付けた。フィラメント径の太いものから細いものへと順次刺激を加えていき、逃避行動を引き起こすフィラメントの最小機械的刺激値を逃避反応閾値とした。【００６４】
（７）酢酸ライジング試験
酢酸ライジング試験は、Horiguchiらの方法（2013a）に従って行った。アクリル樹脂製シリンダー（直径１７ｃｍ、高さ２４ｃｍ）内に被験マウスを入れ、３０分間馴化させた後、０．９％酢酸（Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka）を１０ｍＬ／ｋｇの容量で腹腔内投与した。投与後１５分間におけるライジング行動（腹部を収縮させる行動、あるいは体をひねって後肢を伸展させる行動）の発現回数を計測した。【００６５】
（８）ホットプレート試験、ホンフライ試験、酢酸ライジング試験評価結果
胎仔期のバルプロ酸投与による成熟後の痛覚過敏及び異痛（ホットプレート試験、ホンフライ試験、酢酸ライジング試験）が、被験化合物（実施例１の化合物）の慢性投与により改善された（図２）。以上の結果から、実施例１の化合物が、胎仔期バルプロ酸投与マウスの示すＡＳＤ様の痛覚感受性異常に対して有効であることが明らかとなった。なお各群ｎ＝１２で、データは平均値±標準誤差として表記した。*P < 0.05, **P < 0.01（two-way ANOVA後、Tukey-Kramer testを行った。）【００６６】
試験例２  コルチコステロン慢性投与うつ病モデルマウスを用いた薬理作用評価
コルチコステロンの慢性投与マウスは、ストレス負荷によるコルチコステロン分泌増加を模倣し、ＨＰＡ軸（hypothalamic-pituitary-adrenal axis）の機能破綻を示すうつ病モデル動物であり、既存の抗うつ薬（三環系及びSSRI (Selective Serotonin Reuptake Inhibitors)）によって改善しないことから、治療抵抗性のうつ病モデル動物であると考えられている。
うつ病様行動として、絶望を模した行動モデルとして汎用されている強制水泳試験を行い、また無快感（アンヘドニア）を模した行動モデルとして雌選択性試験を行い、本発明化合物の投与によるうつ様症状の改善を評価した。【００６７】
（１）コルチコステロン慢性投与うつ病モデルマウスの作製
C57BL6/J系５週齢の雄マウスを、室温２２±１℃、照明時間１日１２時間（８：００−２０：００）の条件下、ポリカーボネート樹脂製ケージ（２４ｃｍ×１７ｃｍ×１２ｃｍ）内で餌・水は自由に摂取できる環境のもと、１ケージあたり５−６匹で群飼育をした。６週齢の時点から、２０ｍｇ／ｋｇのコルチコステロン（図３、４中、ＣＯＲＴ）を１日１回３週間連続で皮下投与した。対照群には、溶媒として用いた０．５％（Ｗ／Ｖ）カルボキシメチルセルロース溶液（図３、４中、Ｖｅｈｉｃｌｅ）を皮下投与した。
被験化合物は、ＤＭＳＯ最終濃度が８％、Ｓｏｌｔｏｌ  ＨＳ１５最終濃度が２％、被験化合物濃度が３ｍｇ／ｍＬとなるように生理食塩水に溶かした薬液をコルチコステロン慢性投与の１週間後から、コルチコステロンの投与30分前に２週間腹腔内に投与（１０、３０ｍｇ／ｋｇ）し、最終投与の２４時間後に行動試験を行った。【００６８】
（２）強制水泳試験
強制水泳試験はAgoらの方法（2013）に準じ、明期（８：００−２０：００）に行った。アクリル樹脂製シリンダー（直径１９ｃｍ、高さ２５ｃｍ）内に水（２５±１℃）を１３ｃｍの深さまで入れ、被験マウスを１匹ずつ６分間水泳させ、その様子をビデオ録画した。試験終了後、マウスを速やかに水中より引き上げ、ペーパータオルで清拭した。「手足などを動かすことなく水面に浮いているだけの状態」を無動とみなし、６分間の試験中における無動時間を計測した。【００６９】
（３）強制水泳試験評価結果
コルチコステロン慢性投与により誘発され強制水泳試験により評価されたうつ病様症状が、被験化合物（実施例１の化合物）の慢性投与により改善された（図３）。以上の結果から、実施例１の化合物が、コルチコステロン慢性投与マウスが示すうつ病様の症状に対して有効であることが明らかとなった。なお各群ｎ＝１２で、データは平均値±標準誤差として表記した。*P < 0.05, **P < 0.01（two-way ANOVA後、Tukey-Kramer testを行った。）【００７０】
（４）雌選択性試験
雌選択性試験はAgoらの方法(2015)に準じ、明期（８：００−２０：００）に行った。４００ルクスの照度に設定した防音実験室内において、２枚の透明な仕切りで三つの区画に分けたアクリル変性ポリ塩化ビニル製の試験ケージ（４２ｃｍ×５０ｃｍ×３０ｃｍ）に木製の滅菌済みソフトチップ（実験動物用床敷き；三協ラボサービス株式会社）を入れ、装置の中央区画に被験雄マウスを導入した。９０分間の馴化後、被験マウスと遭遇したことのない同週齢、同系統の雌および雄マウスを侵入マウスとして、それぞれ左右の区画に設置した金網ボックス（１０ｃｍ×６．５ｃｍ×２０ｃｍ）に導入した。その後、被験マウスに１０分間、試験ケージ内を自由に探索させた。その様子をビデオ撮影し、被験マウスが各区画に滞在した時間をANY-maze（登録商標） video tracking software（Stoelting Co., IL, USA）を用いて解析した。雌および雄マウスの区画での総滞在時間に対する雌マウスの区画での滞在時間の割合を雌選択率（％）として算出した。【００７１】
（５）雌選択性試験評価結果
コルチコステロン慢性投与により誘発され雌選択性試験により評価されたうつ病様症状が、被験化合物（実施例１の化合物）の慢性投与により改善された（図４）。以上の結果から、実施例１の化合物が、コルチコステロン慢性投与マウスの示すうつ病様の症状に対して有効であることが明らかとなった。なお各群ｎ＝１２で、データは平均値±標準誤差として表記した。*P < 0.05, **P < 0.01（two-way ANOVA後、Tukey-Kramer testを行った。）【００７２】
試験例３  ＮＭＲによるＳｉｎ３との相互作用解析
本発明化合物とＳｉｎ３との相互作用を、ＳＴＤ(Saturation Transfer Difference)−ＮＭＲ及びＷａｔｅｒｌｏｇｓｙ法を用いて解析した。【００７３】
（１）ｍＳｉｎ３Ｂ  ＰＡＨ１タンパク質の調製
マウスＳｉｎ３ＢのＰＡＨ１ドメイン(mSin3B PAH1)は、以前報告された方法で調製した（Naruse et al., 1999; Nomura et al., 2005）。【００７４】
（２）ＧＳＴ融合ｍＳｉｎ３Ｂ  ＰＡＨ１タンパク質の調製
ＧＳＴ融合ｍＳｉｎ３Ｂ  ＰＡＨ１タンパク質は、ｍＳｉｎ３Ｂ  ＰＡＨ１コード領域を組換えたｐＧＸ−６Ｐ−１ベクター(GE Healthcare)でサブクローニングし、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた。【００７５】
（３）ＮＭＲ実験
ＮＭＲ実験は、クライオプローブを装備したBruker AVANCE700で298Kにて行った。スペクトルはTOPSPIN 3.2ソフトウェアで処理した。
１Ｈ  ＳＴＤ−ＮＭＲ(Mayer et al., 2001; Meyer et al., 2003)及びＷａｔｅｒｌｏｇｓｙ(Dalvit et al., 2000; Dalvit et al., 2001; Antanasijevic et al., 2014)測定は、ｍＳｉｎ３Ｂ  ＰＡＨ１（１０μＭ）及び被験化合物（実施例１の化合物、１００μＭ）で実施した。測定サンプルは、５％ジメチルスルホキシドを含むリン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．２）５００μｌを調製した。
被験化合物のＮＭＲは、ｍＳｉｎ３Ｂ  ＰＡＨ１及びＧＳＴ融合ｍＳｉｎ３Ｂ  ＰＡＨ１の存在によりピーク形状が変化し（図５、上段：ＳＴＤ  ＮＭＲ、中段：Ｗａｔｅｒｌｏｇｓｙ、下段：３９１９  Ｗａｔｅｒｇａｔｅ(Sklenar et al., 1993)）、本発明化合物とＳｉｎ３との強い相互作用が示された。【００７６】
（４）１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ滴定
１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ滴定実験（Davis et al., 1992）は、５％ジメチルスルホキシドを含むリン酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ７．２）を用いてｍＳｉｎ３Ｂ（１００μＭ）と被験化合物（実施例１の化合物、１ｍＭ）を１：１又は１：１０の混合割合で実施した。
ｍＳｉｎ３Ｂ  ＰＡＨ１の１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルにおいて被験化合物の存在によりケミカルシフト変化が観測され、本発明化合物とＳｉｎ３との強い相互作用が示された（図６、１：０と１：１の重ね書き）。【００７７】
試験例４  結合解析計算
ＮＭＲデータに基づくｍＳｉｎ３Ｂと本発明化合物（実施例１の化合物）との結合解析計算はＨＡＤＤＯＣＫ／ＣＮＳプロトコール（Dominguez et al., 2003; de Vries et al., 2010; Wassenaar et al., 2012）を用いて実施した。ｍＳｉｎ３Ｂの初期構造としてＮＭＲ解析構造（２ＣＲ７）を用い、本発明化合物の初期構造としてＵＦＦ  力場（Rappe et al., 1992）を用いたエネルギー最小化構造を用いた。ＨＳＱＣスペクトルにおいてＰｈｅ５８，Ｇｌｕ８５，Ｉｌｅ９０，Ｖａｌ９１及びＬｅｕ９７のアミノ酸残基のシグナルが消失しており、これらのアミノ酸残基が実施例１化合物と接触していると考えられ、これらを活性残基とし結合解析計算を実施した。１０００個の構造を生成し、その中の最適な２００構造について分子動力学計算により構造最適化を実施した。本発明化合物とｍＳｉｎ３Ｂ  ＰＡＨ１との結合構造を図７に示す。本発明化合物は、ＮＲＳＦの結合部位を占有していることが示された。【００７８】
参考文献
・Ago Y, Hasebe S, Nishiyama S, Oka S, Onaka Y, Hashimoto H, Takuma K, Matsuda T (2015). Int J Neuropsychopharmacol 18(11): pyv062.
・Ago Y, Yano K, Araki R, Hiramatsu N, Kita Y, Kawasaki T, Onoe H, ChakiS, Nakazato A, Hashimoto H, Baba A, Takuma K, Matsuda T (2013). Neuropharmacology 65:29-38.
・Hara Y, Ago Y, Taruta A, Katashiba K, Hasebe S, Takano E, OnakaY, Hashimoto H, Matsuda T, Takuma K (2016). Autism Res 9(9):926-939.
・Horiguchi N, Ago Y, Asada K, Kita Y, Hiramatsu N, Takuma K, Matsuda T (2013a). Psychopharmacology (Berl) 227(2):251-261.
・Horiguchi N, Ago Y, HasebeS, Higashino K, Asada K, Kita Y, Takuma K, Matsuda T (2013b). Pharmacol Biochem Behav 113:46-52.
・Kataoka S, Takuma K, Hara Y, Maeda Y, Ago Y, Matsuda T (2013). Int J Neuropsychopharmacol 16(1):91-103.
・Takuma K, Hara Y, Kataoka S, Kawanai T, Maeda Y, Watanabe R, Takano E, Hayata-Takano A, Hashimoto H, Ago Y, Matsuda T (2014). Pharmacol Biochem Behav 126:43-49.
・Naruse Y, Aoki T, Kojima T, Mori N (1999). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96:13691-6.
・Nomura M, Uda-Tochio H, Murai K, Mori N, Nishimura Y (2005). J. Mol. Biol. 354:903-15.
・Mayer M, Meyer B 2001). J. Am. Chem. Soc. 123:6108-17.
・Meyer B, Peters T (2003). Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42:864-90.
・Dalvit C, Pevarello P, Tato M, Veronesi M, Vulpetti A, Sundstrom M (2000). J. Biomol. NMR 18:65-8.
・Dalvit C, Fogliatto G, Stewart A, Veronesi M, Stockman B (2001). J. Biomol. NMR 21:349-59.
・Antanasijevic A, Ramirez B, Caffrey M (2014). J. Biomol. NMR 60:37-44.
・Sklenar V, Piotto M, Leppik R, Saudek V (1993). J. Magn. Reson. Ser. A 102:241-45.
・Davis A. L, Keeler J, Laue E. D, Moskau D. J (1992). Magn. Reson. 98:207-16.
・Dominguez C, Boelens R, Bonvin A. M. J. J. J. (2003). Am. Chem. Soc. 125:1731-7.
・de Vries S. J, van Dijk M, Bonvin A. M. J. J. (2010). Nat. Protoc. 5:883-97.
・Wassenaar T. A, van Dijk M, Loureiro-Ferreira N, van der Schot G, de Vries S. J, ; Schmitz C, van der Zwan J, Boelens R, Giachetti A, Ferella L, Rosato A, Bertini I, Herrmann T, Jonker H. R. A, Bagaria A, Jaravine V, Guntert P, Schwalbe H, Vranken W. F, Doreleijers J. F,; Vriend G, Vuister G. W, Franke D, Kikhney A, Svergun D. I, Fogh R. H, Ionides J, Laue E. D, Spronk C, Jurksa S, Verlato M, Badoer S, Dal PraS, Mazzucato M, Frizziero E, Bonvin A. M. J. J. J. (2012), 10, 743-67.
・Rappe A K, Casewit C J, Colwell K S, Goddard W A, Skiff W. M. J. (1992), Am. Chem. Soc. 114, 10024-10035.
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明化合物及び該化合物を含む薬剤は既存の治療薬とは異なる作用機序により各種精神疾患（ＡＳＤ、うつ病、てんかん等）に有効であることから、既存の治療薬で得られない効果が期待でき、また、既存の治療薬で問題となっていた副作用の懸念を解消することが可能となる。【００８０】
本出願は、日本で出願された特願２０１７−１６３７４１（出願日２０１７年８月２８日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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