(57)【要約】本願発明では、細胞内に容易に吸収されつつも、生体内で代謝され化学構造が変化することなく、かつ免疫誘導を起こさない、抗がん剤であって、他の抗がん剤との併用が可能な抗がん剤を提供する。本願発明者らは鋭意研究の結果、長期保存が可能なオゾン水に抗がん作用があることを新たに見出した。さらに既存の抗がん剤と併用した場合、その効果が大幅の上昇することもわかった。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒径が１μｍ未満のオゾンのナノバブルを含むオゾン水を活性成分として含む、がん治療又は予防用の医薬組成物。
【請求項２】
オゾン水中のオゾン濃度が１ｐｐｍ以上である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
オゾン水が、Ｎａイオン、Ｍｇイオン、Ｋイオン及び／又はＣａイオンを含む請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
オゾン水が、さらに硫黄、ホウ素、リチウム、ケイ素、亜鉛、鉄及びストロンチウムからなる群から選択される少なくとも一つのイオンを含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
オゾン水がにがり含有水を含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
がんが、肺癌、乳癌、膵癌、大腸癌、胃癌、肝癌、前立腺癌及び卵巣癌からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
他の抗がん剤と共に又は連続して投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
他の抗がん剤がプラチナ製剤である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
他の抗がん剤が分子標的薬である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
経口投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
静脈投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
腫瘍内投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
毎日1回投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
週３回投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オゾンを含有する水溶液を活性成分として含む抗がん剤、該抗がん剤の製造方法、該抗がん剤を用いた治療方法並びに該抗がん剤と既存の抗がん剤の併用に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な抗がん剤が、開発され上市されているが、がん細胞を死滅させる又は増殖を抑えることを目的としているため、正常細胞への副作用が避けられず、かつ臨床試験においては既存の抗がん剤との併用でその薬理効果が試験されるため、新規の抗がん剤の開発が難しい。そのため、特定の遺伝子産物を標的とする分子標的薬（主に抗体医薬）の開発が進んでいる。【０００３】
例えば、抗ＣＤ２０抗体（一般名リキシマブ）は、ＣＤ２０陽性の非ホジキンリンパ腫の治療に用いられ、細胞表面にＣＤ２０が発現していない細胞には副作用が少ない。
抗ＶＥＧＦ抗体（一般名ベバシズマブ）は、ＶＥＧＦの働きを阻害することにより、血管新生を抑えたり腫瘍の増殖や転移を抑えたりする作用がある。
抗ＨＥＲ２抗体（一般名トラスツズマブ）は、ＨＥＲ２蛋白を細胞表面に抗発現している乳などに抗腫瘍効果を有する。【０００４】
一方、体内の免疫反応を利用してがん細胞を死滅させるがん免疫療法にも分子標的薬が用いられている。抗ＣＴＬＡ４抗体（一般名イピリムマブ）や抗ＰＤ−１抗体（一般名ニボルマブ）は、ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）のがん細胞への攻撃抑制機能を解除することにより、間接的に抗がん剤として機能しうる。【０００５】
これらの分子標的薬（抗体）は主として天然に存在するアミノ酸から構成されるため、代謝物の影響を考慮する必要がないもの、過剰投与は抗イディオタイプ抗体（薬剤として投与された抗体を異物として認識結合する抗体）が体内で誘導される可能性もあり、かつ高分子であるため、細胞内に入ることが出来ないという問題もあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２４６２９３号
【特許文献２】特許５２６１５６９号公報
【特許文献３】国際公開２０１６／０２１５２３号
【０００７】
【非特許文献１】ｉｎ  ｖｉｖｏ  ３１：  ５７９−５８３  （２０１７）
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ  １２７(１１)，  １８３７−１８４２，  ２００７−１１−０１
【非特許文献３】ＰＮＡＳ  ｖｏｌ．１１４，  ｎｏ．５，  Ｅ７６１−，  ２０１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本願発明では、細胞内に容易に吸収されつつも、生体内で代謝され化学構造が変化することなく、かつ免疫誘導を起こさない、抗がん剤であって、他の抗がん剤との併用が可能な抗がん剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは鋭意研究の結果、長期保存が可能なオゾン水に抗がん作用があることを新たに見出した。さらに既存の抗がん剤と併用した場合、その効果が大幅の上昇することもわかった。
【発明の効果】
【００１０】
従って、本願発明に係る医薬組成物は、細胞内に容易に吸収されつつも、生体内で代謝され化学構造が変化することなく、かつ免疫誘導を起こさず、抗がん作用を有することが出来、他の抗がん剤との併用も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１  ＮＡｎＯ３によるがん細胞株１０種に対する細胞増殖抑制試験（２Ｄ培養）
【図２】実施例１  ＮＡｎＯ３によるがん細胞株１０種に対する細胞増殖抑制試験（３Ｄ培養）
【図３】実施例２  ＭＩＡＰａＣａ−２（膵臓がん細胞）に対するＮＡｎＯ３と既存の抗がん剤との併用による抗腫瘍効果検討試験（共投与実験）
【図４】実施例２  ＭＩＡＰａＣａ−２（膵臓がん細胞）に対するＮＡｎＯ３と既存の抗がん剤との併用による抗腫瘍効果検討試験（連続投与実験）
【図５】実施例３  被験体群の体重変化
【図６】実施例３  被験体群のマウスの写真
【図７】実施例３  被験体群の腫瘍体積の変化
【発明を実施するための形態】
【００１２】
従って、本発明は本発明の構成は以下の［１］から［１４Ａ］の通りである：
［１］粒径が１μｍ未満のオゾンのナノバブルを含むオゾン水を活性成分として含む、がん治療又は予防用の医薬組成物。
［２］オゾン水中のオゾン濃度が１ｐｐｍ以上、好ましくは１０ｐｐｍ以上、より好ましくは１００ｐｐｍ以上である、［１］に記載の医薬組成物。
［３］オゾン水が、Ｎａイオン、Ｍｇイオン、Ｋイオン及び／又はＣａイオンを含む［１］又は［２］に記載の医薬組成物。
［４］オゾン水が、さらに硫黄、ホウ素、リチウム、ケイ素、亜鉛、鉄及びストロンチウムからなる群から選択される少なくとも一つのイオンを含む、［３］に記載の医薬組成物。
［５］オゾン水がにがり含有水を含む、［４］に記載の医薬組成物。
【００１３】
［６］がんが、肺癌、乳癌、膵癌、大腸癌、胃癌、肝癌、前立腺癌及び卵巣癌からなる群から選択される、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【００１４】
［７］他の抗がん剤と共に又は連続して投与される、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［８］他の抗がん剤がプラチナ製剤である、［７］に記載の医薬組成物。
［９］他の抗がん剤が分子標的薬である、［７］に記載の医薬組成物。
【００１５】
［１０］経口投与される、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［１１］静脈投与される、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［１２］腫瘍内投与される、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【００１６】
［１３］毎日1回投与される、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［１４］週３回投与される、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【００１７】
［１Ａ］がん治療又は予防用の医薬の製造における、粒径が１μｍ未満のオゾンのナノバブルを含むオゾン水の使用。
［２Ａ］オゾン水中のオゾン濃度が１ｐｐｍ以上、好ましくは１０ｐｐｍ以上、より好ましくは１００ｐｐｍ以上である、［１Ａ］に記載の使用。
［３Ａ］オゾン水が、Ｎａイオン、Ｍｇイオン、Ｋイオン及び／又はＣａイオンを含む［１Ａ］又は［２Ａ］に記載の使用。
［４Ａ］オゾン水が、さらに硫黄、ホウ素、リチウム、ケイ素、亜鉛、鉄及びストロンチウムからなる群から選択される少なくとも一つのイオンを含む、［３Ａ］に記載の使用。
［５Ａ］オゾン水がにがり含有水を含む、［４Ａ］に記載の使用。
【００１８】
［６Ａ］がんが、肺癌、乳癌、膵癌、大腸癌、胃癌、肝癌、前立腺癌及び卵巣癌からなる群から選択される、［１Ａ］〜［５Ａ］のいずれか一項に記載の使用。
【００１９】
［７Ａ］医薬が、他の抗がん剤と共に又は連続して投与される、［１Ａ］〜［６Ａ］のいずれか一項に記載の使用。
［８Ａ］他の抗がん剤がプラチナ製剤である、［７Ａ］に記載の使用。
［９Ａ］他の抗がん剤が分子標的薬である、［７Ａ］に記載の使用。
【００２０】
［１０Ａ］医薬が経口投与される、［１Ａ］〜［６Ａ］のいずれか一項に記載の使用。
［１１Ａ］医薬が静脈投与される、［１Ａ］〜［６Ａ］のいずれか一項に記載の使用。
［１２Ａ］医薬が腫瘍内投与される、［１Ａ］〜［６Ａ］のいずれか一項に記載の使用。
【００２１】
［１３Ａ］医薬が毎日1回投与される、［１Ａ］〜［６Ａ］のいずれか一項に記載の使用。
［１４Ａ］医薬が週３回投与される、［１Ａ］〜［６Ａ］のいずれか一項に記載の使用。
【００２２】
［１Ｂ］粒径が１μｍ未満のオゾンのナノバブルを含むオゾン水を対象に投与することを含む、がんの治療又は予防方法；ここで対象はヒト又は非ヒトである。
［２Ｂ］オゾン水中のオゾン濃度が１ｐｐｍ以上、好ましくは１０ｐｐｍ以上、より好ましくは１００ｐｐｍ以上である、［１Ｂ］に記載の方法。
［３Ｂ］オゾン水が、Ｎａイオン、Ｍｇイオン、Ｋイオン及び／又はＣａイオンを含む［１Ｂ］又は［２Ｂ］に記載の方法。
［４Ｂ］オゾン水が、さらに硫黄、ホウ素、リチウム、ケイ素、亜鉛、鉄及びストロンチウムからなる群から選択される少なくとも一つのイオンを含む、［３Ｂ］に記載の方法。
［５Ｂ］オゾン水がにがり含有水を含む、［４Ｂ］に記載の方法。
【００２３】
［６Ｂ］がんが、肺癌、乳癌、膵癌、大腸癌、胃癌、肝癌、前立腺癌及び卵巣癌からなる群から選択される、［１Ｂ］〜［５Ｂ］のいずれか一項に記載の方法。
【００２４】
［７Ｂ］前記オゾン水が、他の抗がん剤と共に又は連続して投与される、［１Ｂ］〜［６Ｂ］のいずれか一項に記載の方法。
［８Ｂ］他の抗がん剤がプラチナ製剤である、［７Ｂ］に記載の方法。
［９Ｂ］他の抗がん剤が分子標的薬である、［７Ｂ］に記載の方法。
【００２５】
［１０Ｂ］前記オゾン水が、経口投与される、［１Ｂ］〜［６Ｂ］のいずれか一項に記載の方法。
［１１Ｂ］前記オゾン水が、静脈投与される、［１Ｂ］〜［６Ｂ］のいずれか一項に記載の方法。
［１２Ｂ］前記オゾン水が、腫瘍内投与される、［１Ｂ］〜［６Ｂ］のいずれか一項に記載の方法。
【００２６】
［１３Ｂ］前記オゾン水が、毎日1回投与される、［１Ｂ］〜［６Ｂ］のいずれか一項に記載の方法。
［１４Ｂ］前記オゾン水が、週３回投与される、［１Ｂ］〜［６Ｂ］のいずれか一項に記載の方法。
【００２７】
［１Ｃ］がん治療又は予防における使用のための、粒径が１μｍ未満のオゾンのナノバブルを含むオゾン水。
［２Ｃ］オゾン水中のオゾン濃度が１ｐｐｍ以上、好ましくは１０ｐｐｍ以上、より好ましくは１００ｐｐｍ以上である、［１Ｃ］に記載のオゾン水。
［３Ｃ］オゾン水が、Ｎａイオン、Ｍｇイオン、Ｋイオン及び／又はＣａイオンを含む［１Ｃ］又は［２Ｃ］に記載のオゾン水。。
［４Ｃ］オゾン水が、さらに硫黄、ホウ素、リチウム、ケイ素、亜鉛、鉄及びストロンチウムからなる群から選択される少なくとも一つのイオンを含む、［３Ｃ］に記載のオゾン水。
［５Ｃ］オゾン水がにがり含有水を含む、［４Ｃ］に記載のオゾン水。
【００２８】
［６Ｃ］がんが、肺癌、乳癌、膵癌、大腸癌、胃癌、肝癌、前立腺癌及び卵巣癌からなる群から選択される、［１Ｃ］〜［５Ｃ］のいずれか一項に記載のオゾン水。
【００２９】
［７Ｃ］他の抗がん剤と共に又は連続して投与される、［１Ｃ］〜［６Ｃ］のいずれか一項に記載のオゾン水。
［８Ｃ］他の抗がん剤がプラチナ製剤である、［７Ｃ］に記載のオゾン水。
［９Ｃ］他の抗がん剤が分子標的薬である、［７Ｃ］に記載のオゾン水。
【００３０】
［１０Ｃ］医薬が経口投与される、［１Ｃ］〜［６Ｃ］のいずれか一項に記載のオゾン水。
［１１Ｃ］医薬が静脈投与される、［１Ｃ］〜［６Ｃ］のいずれか一項に記載のオゾン水。
［１２Ｃ］医薬が腫瘍内投与される、［１Ｃ］〜［６Ｃ］のいずれか一項に記載のオゾン水。
【００３１】
［１３Ｃ］医薬が毎日1回投与される、［１Ｃ］〜［６Ｃ］のいずれか一項に記載のオゾン水。
［１４Ｃ］医薬が週３回投与される、［１Ｃ］〜［６Ｃ］のいずれか一項に記載のオゾン水。
【００３２】
「オゾン水」とは、オゾン（Ｏ３）を溶け込ませた水を指す。本願発明に係るオゾン水はオゾンのナノバブルを含んだ状態で維持されている高濃度ミネラル含有オゾンナノバブル水である。
【００３３】
「ファインバブル」とは粒径が１００μｍ以下の浮遊性微細気泡を指し、「ウルトラファインバブル」とは粒径が１μｍ未満の浮遊性微細気泡を指す。従って、本願発明に係る「ナノバブル」は、「ウルトラファインバブル」であってよい。「ナノバブル」は粒径が１ｎｍ以上〜１μｍ未満、好ましくは１０ｎｍ以上〜１μｍ未満の浮遊性微細気泡を含んでよく、より好ましくは数十から数百ｎｍの気泡を含んでよい。
浮遊性微細気泡は、エジェクター方式、キャビテーション方式、旋回流方式、加圧溶解法などで作製することが出来る。
【００３４】
「にがり」とは、海水からとれる塩化マグネシウムを主成分とするミネラル混合物（粉末又は液体）を指す。
【００３５】
「がん」とは、「癌」や「肉腫」（ｓａｒｃｏｍａ）、白血病などの血液悪性腫瘍も含めた広義的な意味で「悪性腫瘍」を表す。
悪性腫瘍は、遺伝子変異によって自律的で制御されない増殖を行うようになった細胞集団（腫瘍、良性腫瘍と悪性腫瘍）のなかで周囲の組織に浸潤し、または転移を起こす腫瘍であり、悪性腫瘍（Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｕｍｏｒ）の用語は病理学において
１）癌腫（Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）：上皮組織由来の悪性腫瘍
２）肉腫（Ｓａｒｃｏｍａ）：非上皮組織由来の悪性腫瘍（骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管など）
３）その他：白血病など
に分類される。
従って本願において「がん」とは、特に限定しないが、頭頸部癌（上顎癌、（上、中、下）咽頭癌、喉頭癌、舌癌、甲状腺癌）、胸部癌（乳癌、肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌））、消化器癌（食道癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌）、肝癌（肝細胞癌、胆管細胞癌）、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、肛門癌、泌尿器の癌（腎癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣（睾丸）癌）、生殖器癌（子宮癌（子宮頸癌、子宮体癌）、卵巣癌、外陰癌、膣癌）、皮膚癌（基底細胞癌、有棘細胞癌）などの癌腫を含んでもよい。
さらに本願において「がん」とは、特に限定しないが、線維肉腫、脂肪肉腫、筋肉腫(平滑筋肉腫など)、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、骨肉腫
骨外性骨肉腫、悪性末梢神経性腫瘍が含まれてもよい。
さらに本願において「がん」とは、特に限定しないが、血液悪性腫瘍（例えば白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫）が含まれていてもよい。
【００３６】
「抗がん剤」とはがんを治療又は予防するための医薬を指す。これに限定しないが、分子標的薬、アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイド、抗がん性抗生物質、プラチナ製剤、ホルモン剤、生物学的応答調節剤などに分類される。
【００３７】
「分子標的薬」とは、がん細胞の持つ特異性を遺伝子産物分子レベルで捉え、その遺伝子産物を標的として効率よく作用するように作られた薬である。特に限定しないが、イブリツモマブチウキセタン、イマチニブ、エベロリムス、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、スニチニブ、セツキシマブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、タミバロテン、トラスツズマブ、トレチノイン、パニツムマブ、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、ラパチニブ、リツキシマブなどが挙げられる。さらに、ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）のがん細胞への攻撃抑制機能を解除して、がん免疫療法でがんを間接的に治療するイピリムマブやニボルマブもこれにあたる。
【００３８】
「アルキル化剤」はアルキル基と呼ばれる原子のかたまりをがん細胞のＤＮＡに付着させ、らせん状にねじれた二本のＤＮＡを異常な形で結合させて、ＤＮＡのコピーができないようにする。特に限定しないが、イホスファミド、シクロホスファミド、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、プロカルバジン、メルファラン、ラニムスチンなどが挙げられる。
【００３９】
「代謝拮抗薬」とはがん細胞が分裂・増殖する際に、核酸の材料となる物質と化学的構造が似ている物質でＤＮＡの合成を妨げ、がん細胞の代謝を阻害して、増殖を抑制する抗がん剤である。特に限定しないが、エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリビン、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、ドキシフルリジン、ネララビン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メルカプトプリン、メトトレキサートなどが挙げられる。
【００４０】
「植物アルカロイド」は強い毒性のある植物成分を応用した抗がん剤である。これに限定しないが、微小管阻害剤やトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン、エトポシド、エリブリン、ソブゾキサン、ドセタキセル、ノギテカン、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン）が含まれる。
【００４１】
「抗がん性抗生物質」とは、土壌に含まれるカビなどから作られた抗腫瘍性抗生物質である。特に限定しないが、アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ジノスタチンスチマラマー、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、リポソーマルドキソルビシンなどが挙げられる。
【００４２】
「プラチナ（白金）製剤」とはプラチナを含む抗がん剤を指す。特に限定しないが、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチンなどが挙げられる。
【００４３】
「ホルモン剤」とは体内のホルモンの分泌又は機能の抑制をする抗がん剤である。特に限定しないが、アナストロゾール、エキセメスタン、エストラムスチン、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、ゴセレリン、タモキシフェン、デキサメタゾン、トレミフェン、ビカルタミド、フルタミド、プレドニゾロン、ホスフェストロール、ミトタン、メチルテストステロン、メドロキシプロゲステロン、メピチオスタン、リュープロレリン、レトロゾールなどが挙げられる。
【００４４】
「生物学的応答調節剤」とは、体内の生物学的反応を引き出して治療を行う抗がん剤である。インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、インターロイキンなどがこれに該当する。
【００４５】
以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【００４６】
＜オゾン水の製造方法＞
国際公開２０１６／０２１５２３号明細書に記載の方法に従って製造した。具体的には実施例１の記載に従い、「深層水にがり  業務用」（赤穂化成株式会社製）のにがり含有水を、水（水道水）で３倍希釈したものを用いた。「深層水にがり  業務用」は、ＭｇイオンをＭｇＣｌ２換算で１２〜３０重量％含み、その他に、Ｃａイオンを１０〜１００ｍｇ/リットル、Ｎａイオンを１００〜１０００ｍｇ/リットル含む。
上記希釈無機水溶液中に、粒径が１．０μｍ〜５０μｍのオゾンのマイクロバブルを発生させる。水中に上記マイクロバブルが発生すると、最初は乳白色になる。そして、時間の経過と共にマイクロバブルの圧壊によって透明化し、オゾン濃度が安定的に１００ｐｐｍ以上含まれるオゾン水を得た（非特許文献１）。
かかるオゾン水はＮＡｎＯ３としてオプトクリエーション社より購入可能である。【００４７】
＜実施例１．ＮＡｎＯ３によるがん細胞株１０種に対する細胞増殖抑制試験＞
安定化したオゾン水ＮＡｎＯ３のがん細胞株１０種に対する影響を２Ｄ培養および３Ｄ培養で検討した。
以下の細胞株をＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）又はＪＣＲＢ細胞バンクより入手し、表1に記載の培地で培養した。
【表１】
2019107341.tif 000003
【００４８】
１．１  ２Ｄ培養評価
Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ，  ９６−Ｗｅｌｌ，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｒｅａｔｅｄ（ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ  Ｃａｔ＃  ３５３２１９）に４０μＬの各培養培地を加え、その後各細胞懸濁液を５０μＬ（０．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）ずつ播種し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。
培養１日後、以下の被験物質溶液を各１０μＬ加えて培養を継続した。
【表２】
2019107341.tif 000004
【００４９】
培養４日後ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（ＣＴＧ）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｔ＃Ｇ７５７２）を用いて、ＡＴＰ標準曲線に基づきＡＴＰ濃度を検出した。陰性対照群（被験物質溶液１）のＡＴＰの濃度を生存率１００％とした時の各試験群の生存率を算出した（図１）。【００５０】
１．２  ３Ｄ培養評価
ＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ（ＭＨ  パターン，  低接着：ＯＲＧＡＮＯＧＥＮＩＸ）に４０μＬの各培養培地を加え、その後各細胞懸濁液を５０μＬ（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）ずつ播種し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。
培養３日後、表２に記載の被験物質溶液を各１０μＬ加えて培養を継続した。【００５１】
培養７日後ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（ＣＴＧ）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｔ＃Ｇ７５７２）を用いて、ＡＴＰ標準曲線に基づきＡＴＰ濃度を検出した。陰性対照群（被験物質溶液１）のＡＴＰの濃度を生存率１００％とした時の各試験群の生存率を算出した（図２）。【００５２】
その結果、がん細胞株においては  ２Ｄ培養および３Ｄ培養共にヒト肺腺がん細胞株Ａ５４９、ヒト乳がん細胞株ＢＴ４７４、ヒト膵がん細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２、ヒト胃がん細胞株ＭＫＮ−４５、ヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ２、ヒト前立腺がん細胞株ＤＵ−１４５およびヒト大腸がん細胞株ＨＴ２９において、ＮＡｎＯ３の最終濃度１０％群（被験物質溶液５）およびｖｅｈｉｃｌｅ群（海水ミネラル溶液の最終濃度１０％：被験物質溶液２）は、陰性対照群（被験物質溶液１）と比較して６０％以下まで生存率が減少した。また、これらがん細胞に対しては用量依存的に生存率が低下した。一方、ｖｅｈｉｃｌｅ群（海水ミネラル溶液の最終濃度１０％：被験物質溶液２）の各種がん細胞に対する生存率低下作用はＮＡｎＯ３の１０％（被験物質溶液５）と同等なものと考えられた。【００５３】
以上より、本試験条件下では、がん細胞株においてＮＡｎＯ３の増殖抑制効果は用量依存的に観察されたが、濃度１０％（被験物質溶液５）と海水ミネラル溶液の１０％（被験物質溶液２）では大きな差異は確認されなかった。【００５４】
＜実施例２．ＭＩＡＰａＣａ−２に対するＮＡｎＯ３と既存の抗がん剤（ドキソルビシン、ゲムシタビン、シスプラチン）との併用による抗腫瘍効果検討試験＞
ＮＡｎＯ３と既存の抗がん剤（ドキソルビシン、ゲムシタビン、シスプラチン）との併用によるＭＩＡＰａＣａ−２細胞（表１参照）に対する抗腫瘍効果について検討した。
抗がん剤は以下のものを用いた。
（１）ドキソルビシン：注射用ドキソルビシン塩酸塩（アドリアシン注射用１０ｍｇ（日本化薬株式会社））
腫瘍細胞のＤＮＡの塩基対間に挿入し、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼＩＩ反応を阻害し、ＤＮＡ、ＲＮＡ双方の生合成を抑制することによって抗腫瘍効果を示す。悪性リンパ腫、肺がん、胃がん、胆嚢・胆管がん、膵臓がん、肝臓がん、大腸がん、乳がん、膀胱がん、子宮体がん、骨肉腫、多発性骨髄腫、各種の小児がん等に適用される。
（２）ゲムシタビン：注射用ゲムシタビン塩酸塩（ジェムザール注射用２００ｍｇ（日本イーライリリー株式会社））
ＤＮＡ鎖に取り込まれ、別のヌクレオシドが１つ付くことにより、ＤＮＡ鎖を伸長停止させる。このことにより、アポトーシスが誘導され、腫瘍細胞を自殺に追い込む。非小細胞肺がん、膵臓がん、胆道がん、尿路上皮がん、手術不能または再発乳がんに適用される。
（３）シスプラチン：シスプラチン製剤（ランダ注１０ｍｇ／２０ｍＬ（日本化薬株式会社））
ＤＮＡの構成塩基であるグアニン、アデニンのＮ−７位に結合し、ＤＮＡ鎖内に架橋が形成されることにより、ＤＮＡの複製を妨げ、がん細胞を死滅させる。肺がん、膀胱がん、前立腺がん、卵巣がん、食道がん、胃がん、子宮頸がん、悪性リンパ腫など、さまざまながんに、多くの場合は併用で使われる。【００５５】
２．１  共投与実験
ＭＩＡＰａＣａ−２生細胞数が５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞懸濁液を調製し、１２ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに１ｍＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２に設定したＣＯ２インキュベーター内に静置して１８時間以上培養を行い、細胞をプレートの底面に接着させた。培養終了後にプレート内の培地を除去し、以下の被験物質溶液を１ｍＬずつ添加した。同様の操作を４８時間および７２時間後にも行った。
【表３】
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【００５６】
ＤＭＥＭ培地には、１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ（ハナ・ネスコバイオ）及び１ｘＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯＣａｔ＃１０３７８０１６）を含む。１０ｖ／ｖ％生理食塩液／ＤＭＥＭ培地は、ＤＭＥＭ培地９ｍＬに生理食塩液を１ｍＬ加え、調製した。１０ｖ／ｖ％ＮＡｎＯ３／ＤＭＥＭ培地は、ＤＭＥＭ培地９ｍＬにＮＡｎＯ３を１ｍＬ加え、調製した。抗がん剤／ＤＭＥＭ培地は、抗がん剤を１０倍濃度になるように生理食塩水で希釈後、溶液１ｍＬにＤＭＥＭ培地９ｍＬを加えて調製した。抗がん剤＋１０ｖ／ｖ％ＮＡｎＯ３／ＤＭＥＭ培地は、抗がん剤を１０倍濃度になるようにＮＡｎＯ３で希釈後、溶液１ｍＬにＤＭＥＭ培地９ｍＬを加えて調製した。【００５７】
培養終了後に培地を除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄した後、プレートの各穴に０．００５％ニュートラルレッド（ＮＲ）（関東化学株式会社、Ｌｏｔ  Ｎｏ．８０６Ｗ２２９４）Ｄ−ＭＥＭ溶液を１ｍＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター内に３時間静置した。３時間後、ＮＲ溶液を除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄後、固定・抽出液（エタノール５０％（ｖ／ｖ）氷酢酸１％（ｖ／ｖ）水溶液）を各プレートに１ｍＬずつ加え、１０分間振とうした。その後、マイクロプレートリーダー（ＥＬｘ８００、ＢＩＯ−ＴＥＣ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ，  ＩＮＣ．、波長：５４０ｎｍ）を用いて吸光度を測定した。
ＤＭＥＭ培地（被験物質溶液１）の吸光度値を１００％として、各試験群の細胞生存率（％）を求めた（図３）。【００５８】
２．２  連続投与実験
ＭＩＡＰａＣａ−２生細胞数が５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞懸濁液を調製し、１２ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに１ｍＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２に設定したＣＯ２インキュベーター内に静置して１８時間以上培養を行い、細胞をプレートの底面に接着させた。培養終了後にプレート内の培地を除去し、以下の被験物質溶液を加えた。
【表４】
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【００５９】
被験物質溶液１〜６は、２．１と同様に調製し使用した。被験物質溶液７〜９は、各抗がん剤／ＤＭＥＭ培地を０．９ｍＬ添加後、数分以内に０．１ｍＬのＮＡｎＯ３を添加した。同様の操作を４８時間および７２時間後にも行った。【００６０】
培養終了後に培地を除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄した後、プレートの各穴に０．００５％ニュートラルレッド（ＮＲ）（関東化学株式会社、Ｌｏｔ  Ｎｏ．８０６Ｗ２２９４）Ｄ−ＭＥＭ溶液を１ｍＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター内に３時間静置した。３時間後、ＮＲ溶液を除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄後、固定・抽出液（エタノール５０％（ｖ／ｖ）、氷酢酸１％（ｖ／ｖ）水溶液）を各プレートに１ｍＬずつ加え、１０分間振とうした。その後、マイクロプレートリーダー（ＥＬｘ８００、ＢＩＯ−ＴＥＣ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ，  ＩＮＣ．、波長：５４０ｎｍ）を用いて吸光度を測定した。
ＤＭＥＭ培地（被験物質溶液１）の吸光度値を１００％として、各試験群の細胞生存率（％）を求めた（図４）。【００６１】
その結果、共投与実験では、生理食塩液で調製した各抗がん剤の細胞生存率とＮＡｎＯ３で調製した抗がん剤の細胞生存率に差が認めらなかった。そのため、連続投与実験として、生理食塩液で調製した各抗がん剤の暴露後にＮＡｎＯ３を１０％追加暴露する方法で検討した結果、ドキソルビシン、ゲムシタビンおよびシスプラチンの単独群での細胞生存率は５１．１％、４４．８％および４７．５％に対してＮＡｎＯ３追加投与群では、３０．３％、３０．３％および２１．３％と明らかな抑制が認められた。さらにシスプラチンはＮＡｎＯ３単独群の細胞生存率２８．５％よりも高い抑制を示した。
以上の結果より、ＮＡｎＯ３で調製した各抗がん剤の同時暴露ではガン細胞の増殖抑制は認められなかったのに対し、抗がん剤暴露後にＮＡｎＯ３を暴露した方法では、各抗がん剤共に単独暴露よりも明らかな増殖抑制が認められ、中でもシスプラチンとの併用では相乗的な効果が推察された。【００６２】
＜実施例３．ＮＡｎＯ３のＭＩＡＰａＣａ−２（膵がん細胞）移植マウスにおける腫瘍増殖抑制試験＞
インビボでのＮＡｎＯ３の抗腫瘍効果を検討するため、ＭＩＡＰａＣａ−２（膵がん細胞）移植マウスにＮＡｎＯ３を投与して、その薬理効果を調べた。【００６３】
３．１  実験レジメン
動物（ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ．Ｃｇ−ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＣｒｌｊ）、雌、５週齢）を日本チャールズリバーから４２匹入荷し、１週間の馴化期間絡了後（移値０日）、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞を全ての動物の背部皮下に１匹あたり５．０×１０６ｃｅｌｌｓを定法に従い、マトリスゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇマトリゲル基底膜マトリックス）を用いて移植した。移植後６日目に、腫瘍体積が１５０ｍｍ３以上の個体を選抜し、腫瘍体積がが平均化するように６群（５匹／群）に群わけを実施した。ＮＡｎＯ３（１０００ｍｇ≒１ｍｌ）を１４日間１日１回の強制経口投与、または静脈内及び腫瘍内間欠投与（週３回）を行った。飼育期間中、定法に従い飼育し、定期的に体重及び腫瘍径を測定した。表５に実験レジメンを示す。
【表５】
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【００６４】
３．２  体重測定
実験開始から３、７、１０、１５日目に各群の個体の体重を測定した（表６及び図５）。その結果全期間において、 いずれの被験体群においても対象群１と比してもほぼ同様の体重変化を示した。またいずれの被験体群も、一般状態観察で異常は観察されなかった。１５日目の各被験群に属するマウスの写真を図６に示す。
【表６】
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【００６５】
３．３  腫瘍体積の測定
移植部位を目視及ぴ触診により観察し、腫瘍の長径、短径を電子ノギスで測定し、 
[長径]（ｍｍ）×［短径］（ｍｍ）×［短径］（ｍｍ）×０．５＝腫瘍体積（ｍｍ３）
により、腫瘍体積を算出した（表７、図７）。
【表７】
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【００６６】
対照群１の平均腫瘍体積は群分け時２１７．７６±２４．２２ｍｍ３、投与期間終了時には７１５．６６±１３６．５５ｍｍ３まで増殖し、移植したＭＩＡＰａＣａ−２膵がん細胞は順調に増殖したものと判断した。経ロ投与群では、１０００ｍｇ／ｋｇ投与群２では群分け時２１９．０４±２２．１６ｍｍ３、投与期間終了時には７０８．６４±２５１．６３ｍｍ３、２０００ｍｇ／ｋｇ投与群３では、群分け時２２２．７０±２５．１９ｍｍ３、投与期間終了時には６１０．５８±１８７．１８ｍｍ３、さらに４０００ｍｇ／ｋｇ投与群４では群分け時２２３．８０±２５．３０ｍｍ３、投与期間終了時には５６７．９９±１３０．３８ｍｍ３であり、有意差は認められないものの用量依存的に腫瘍増殖の抑制傾向が認められた。静脈内投与群５では、群分け時２２５．２１±２７．８６ｍｍ３、投与期間終了時には５７４．９２±１５７．３５ｍｍ３であり、有意に増殖抑制傾向を示した。腫瘍内投与群６では、群分け時２２５．２４±２７．５０ｍｍ３、投与期間終了時には５８３．２４±３０５．４５ｍｍ３を示し、対照群１と比較して増殖抑制傾向を示し、特に１例では、Ｄａｙ１５の測定時において、腫瘍体積の顕著な縮小を認めた。【００６７】
以上の結果より、ＮＡｎＯ３は経口投与、静脈内投与、腫瘍内投与のいずれにおいても、がん細胞増殖抑制効果が見られ、かつ体重減少などの顕著な副作用は認められなかった。【００６８】
＜実施例４．ＮＡｎＯ３のＭＩＡＰａＣａ−２（膵がん細胞）移植マウスにおける腫瘍内DNA損傷試験＞
実施例３の結果をふまえ、ＭＩＡＰａＣａ−２ヒト膵がん細胞を移植した雌５週齢ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ）６匹にＮＡｎＯ３を腫瘍内投与（４００μＬ／ｂｏｄｙ）週３回実施し、１４日後、腫瘍組織を摘出し病理組織学的検査を行い、ｇａｍｍａ−Ｈ２ＡＸの陽性細胞率を算出した。
腫瘍組織について定法に従い１０％中性ホルマリンで固定並びにパラフィン包埋後、抗ｇａｍｍａ−Ｈ２ＡＸ抗体（Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ２ＡＸ  リン酸化抗体（Ｓｅｒ  １３９）、ＯｘｉＳｅｌｅｃｔ(登録商標)ＤＮＡ二本鎖切断染色キット、セルバイオラボ社）を用いた免疫組織化学染色標本を作製し、各検体につき、対物レンズ４０倍で無作為に３か所の組織画像撮影後、ＤＮＡ二重鎖切断陽性細胞数を計測した（表８）。
【表８】
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【００６９】
ｇａｍｍａ−Ｈ２ＡＸ（リン酸化ヒストン蛋白質）は、ＤＮＡ２本鎖切断のマーカーであり、以上の結果から、腫瘍内ＤＮＡ二重鎖切断能について極めて低いながら認められた。従来、オゾンのような活性酸素種はＤＮＡを強く損傷することがわかっている。また、シスプラチンやドキソルビシンなど多くの抗がん剤はＤＮＡ損傷が作用機序と言われている。しかし、これからは正常細胞にもダメージを与えることが問題となっている。一方、ＮＡｎＯ３はほとんどＤＮＡ損傷を起こさず抗がん効果を示すことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本願発明に係る医薬組成物は、細胞内に容易に吸収されつつも、生体内で代謝され化学構造が変化することなく、かつ免疫誘導を起こさず、抗がん作用を有することが出来、他の抗がん剤との併用も可能である。ＤＮＡ損傷能を含めた有効性を高めたい場合には、ミネラルやオゾンの濃度を変化させて使用し、或いは光や超音波などを併用すること可能である（非特許文献２）。現在、活性酸素（ＲＯＳ：ＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｙｇｅｎＳｐｅｃｉｅｓ）のＩｎｄｕｃｅｒがニボルマブをはじめとした薬剤の活性化に重要なことがわかってきた（非特許文献３）。
マイルドな活性酸素として作用できるＮＡｎＯ３はこれらの薬剤との併用にも適している。さらにその効果を高めるためには光や超音波などを併用することが可能である。あるいは放射線治療やがん免疫療法などと併用することも可能である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【国際調査報告】
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