(57)【要約】要約  シスタチンＣの容器への吸着を簡便な方法で抑制し、シスタチンＣの測定精度を向上させることができる方法が開示されている。非イオン型界面活性剤を含有するシスタチンＣ吸着抑制剤、該吸着抑制剤を含むシスタチンＣ測定試薬及びシスタチンＣ測定キットを提供した。また、非イオン型界面活性剤の存在下でシスタチンＣを含有する試料を測定器具と接触させることを含む、シスタチンＣの吸着抑制方法を提供した。前記非イオン型界面活性剤は、好ましくはポリオキシエチレン型界面活性剤である。あるいは、前記非イオン型界面活性剤は、好ましくはフェノキシ構造、より好ましくはベンジルフェノキシ構造を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非イオン型界面活性剤を含有するシスタチンＣ吸着抑制剤。
【請求項２】
前記非イオン型界面活性剤がポリオキシエチレン型界面活性剤である請求項１記載のシスタチンＣ吸着抑制剤。
【請求項３】
前記非イオン型界面活性剤がフェノキシ構造を有する請求項１又は２記載のシスタチンＣ吸着抑制剤。
【請求項４】
前記非イオン型界面活性剤がベンジルフェノキシ構造を有する請求項３記載のシスタチンＣ吸着抑制剤。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のシスタチンＣ吸着抑制剤を含有するシスタチンＣ測定試薬。
【請求項６】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のシスタチンＣ吸着抑制剤を含むシスタチンＣ測定キット。
【請求項７】
非イオン型界面活性剤の存在下でシスタチンＣを含有する試料を測定器具と接触させることを含む、シスタチンＣの吸着抑制方法。
【請求項８】
前記非イオン型界面活性剤がポリオキシエチレン型界面活性剤である請求項７記載の吸着抑制方法。
【請求項９】
前記非イオン型界面活性剤がフェノキシ構造を有する請求項７又は８記載の吸着抑制方法。
【請求項１０】
前記非イオン型界面活性剤がベンジルフェノキシ構造を有する請求項９記載の吸着抑制方法。
【請求項１１】
前記非イオン型界面活性剤の存在量が0.001〜10w/v%である請求項７ないし１０のいずれか１項に記載の吸着抑制方法。
【請求項１２】
前記非イオン型界面活性剤の存在量が0.01〜5w/v%である請求項１１記載の吸着抑制方法。
【請求項１３】
前記測定器具がプラスチック製容器である請求項７ないし１２のいずれか１項に記載の吸着抑制方法。
【請求項１４】
請求項７ないし１３のいずれか１項に記載の吸着抑制方法により、前記測定器具へのシスタチンＣの吸着を抑制する工程を含む、試料中のシスタチンＣの測定方法。
【請求項１５】
免疫測定法により行なわれる請求項１４記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シスタチンＣ吸着抑制剤及びシスタチンＣの吸着抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シスタチンＣは全身の有核細胞からcystein proteaseとして産生されている。シスタチンＣはシスタチンスーパーファミリーに属し、分子量 13kD の塩基性低分子タンパク質である。臨床検査では、クレアチニンに替わる腎機能のマーカーとして注目されている(非特許文献１参照)。臨床検査では、一度に多数の検体を扱うため、自動化による正確なシスタチンＣの定量手段が必要である。【０００３】
シスタチンＣの定量方法として、抗ヒトシスタチンＣ抗体を結合させたラテックスを用い、ラテックス凝集比濁法で可視光の吸収又は散乱を測定する方法（特許文献１参照）や、酵素標識法で測定する方法（特許文献２参照）等が知られている。【０００４】
また、尿中に排泄されたシスタチンＣ濃度及び内因性クリアランス物質であるクレアチニン濃度を測定することにより、シスタチンＣ濃度とクレアチニン濃度との比を算出し、これらを用いることを特徴とする腎疾患の検査方法が知られている（特許文献３参照）。【０００５】
特許文献４には、硫酸エステル塩系及びスルホン酸塩系の陰イオン性界面活性剤を１種又は２種以上用いることを特徴とする、免疫反応測定用プロゾーン現象抑制剤を用いたシスタチンＣの定量方法が記載されている。【０００６】
シスタチンＣはその物性からプラスチックやガラスなど容器に吸着しやすいことが指摘されている。自動分析装置では市販のプラスチック容器を使用することが多く、臨床的なシスタチンＣ測定では、シスタチンＣがプラスチック容器に吸着することによる測定精度低下を防ぐことが重要とされている。シスタチンＣの容器への吸着を抑制する方法として、容器自体を表面処理する手段が考えられるが、表面処理した専用容器が必要となり、コスト高になるという問題がある。【０００７】
このように、簡単な操作で、正確に自動測定できるシスタチンＣの定量方法が必要とされており、シスタチンＣの容器への吸着を簡便な方法で抑制する手段が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2000−193662号公報
【特許文献２】特許第03342819号公報
【特許文献３】特許第03398372号公報
【特許文献４】特開2003−149244号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】斎藤憲祐、”第１３回生物試料分析科学学会大会  シスタチンＣの測定と臨床学的意義”、[online]、平成１５年３月１４日、[平成20年2月8日検索]、インターネット<URL:http://www.higo.ne.jp/anal-bio-sci13/NewFiles/saitou.html>
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、シスタチンＣの容器への吸着を簡便な方法で抑制する手段を提供し、シスタチンＣの測定精度を向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、非イオン型の界面活性剤にシスタチンＣのプラスチック容器への吸着を抑制する効果があることを見出し、本願発明を完成した。【００１２】
すなわち、本発明は、非イオン型界面活性剤を含有するシスタチンＣ吸着抑制剤を提供する。また、本発明は、上記本発明のシスタチンＣ吸着抑制剤を含有するシスタチンＣ測定試薬を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のシスタチンＣ吸着抑制剤を含むシスタチンＣ測定キットを提供する。さらに、本発明は、非イオン型界面活性剤の存在下でシスタチンＣを含有する試料を測定器具と接触させることを含む、シスタチンＣの吸着抑制方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の吸着抑制方法により、前記測定器具へのシスタチンＣの吸着を抑制する工程を含む、試料中のシスタチンＣの測定方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、測定系内に非イオン型界面活性剤を共存させるという簡便な方法により、プラスチック製容器等の測定器具へのシスタチンＣの吸着を効果的に抑制することができる。多数の検体を同時に扱う臨床検査では、通常、プラスチック製の測定容器を用いた自動測定システムにより被測定物の測定が行なわれるが、本発明によれば、このような自動測定システムによりシスタチンＣを測定する場合にも、容易な操作で正確な値を測定できるようになるので、臨床応用上非常に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
「シスタチンＣ吸着抑制剤」とは、溶液中のシスタチンＣが測定器具に吸着するのを抑制する剤をいう。該吸着抑制剤は、特に、プラスチック製の器具への吸着を抑制するのに好適に用いることが出来る。なお、本発明において、「測定器具」とは、シスタチンＣの測定のための一連の操作において用いられる種々の器具類を指し、例えば自動分析装置に含まれる検体試料と接触する部材も包含される。具体的には、例えばプレート、セル等の容器、ピペット、チップ等が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明において、「プラスチック製の器具」と言った場合、器具全体がプラスチックから成るもののみならず、シスタチンＣ含有試料と接触する表面のみがプラスチックから成るものも包含される。例えば、「プラスチック製容器」には、少なくとも容器内壁がプラスチックから成るものが広く包含される。「プラスチック」は特に限定されず、実験器具類に従来用いられているポリプロピレンやポリスチレン等の合成樹脂をいう。
【００１５】
本発明で用いられる非イオン型界面活性剤としては、例えば第2級アルコールエトキシレート、ポリオキシエチレンクミルフェニルエーテル、ｐ−イソオクチルポリオキシエチレンフェノールホルムアルデヒドポリマー、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルプロピレンジアミン、ノニルフェノールエトキシレート、オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエキレンオキシプロピレンブロックポリマー、ラウリルアルコールアルコキシレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンオクタデシルアミン、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンベンジルフェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル等のポリオキシエチレン型や、脂肪族リン酸エステル等のリン酸エステル型、アルキルアルキローラアミド等のアミド型の非イオン型界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。非イオン型界面活性剤は、１種類のみであってもよく、また２種類以上の混合物であってもよい。下記実施例に具体的に示される通り、非イオン型界面活性剤をシスタチンＣ含有試料に添加すると、シスタチンＣがプラスチック器具に吸着する量を低下させることができる。イオン型界面活性剤ではこのような効果は得られない（比較例参照）。
【００１６】
非イオン型界面活性剤の中でも、ポリオキシエチレン型の界面活性剤の場合、試料中のシスタチンＣが容器器壁に吸着する量が特に少ないので、より好ましい。また、フェノキシ構造を親油基として有する非イオン型界面活性剤も好ましい。中でも、本発明で用いる非イオン型界面活性剤としては、ポリオキシエチレンベンジルフェニルエーテルやポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル等のベンジルフェノキシ構造を親油基として有する非イオン型界面活性剤が最も好ましい。ここで、ベンジルフェノキシ構造とはＰｈ−ＣＨ２−Ｐｈ−Ｏ−構造であって、Phはフェニル基であり、フェニル基又はＣＨ２基の水素Ｈの一部はハロゲン又はアルキル基等の置換基で置換していても良い。
【００１７】
非イオン型界面活性剤のHLB値（Hydrophile-Lipophile Balance値）は、１１〜１６が好ましく、特に１２．５〜１５がより好ましい。ＨＬＢ値がこの範囲だと、測定器具へのシスタチンＣの吸着を抑制する効果が高い。
【００１８】
界面活性剤にベンジルフェノキシ構造を採用すると、シスタチンＣの吸着を特に効果的に抑制できる理由は定かではないが、直鎖状の親油基中にあるベンジルフェノキシ構造部分が、シスタチンＣもしくは測定器具の親油性部位と絡まって、シスタチンＣが測定器具に吸着するのを抑制すると考えられる。
【００１９】
本発明のシスタチンＣ吸着抑制剤は、非イオン型界面活性剤のみから成るものであってもよいし、また、非イオン型界面活性剤を緩衝液に溶解した形態であってもよい。緩衝液は特に限定されず、シスタチンＣの測定系に悪影響を及ぼさないいずれの緩衝液を用いてもよい。そのような緩衝液としては、例えば、グッド緩衝液、トリス緩衝液、リン酸系緩衝液、炭酸系緩衝液、酢酸系緩衝液、グリシン緩衝液等が使用可能である。グッド緩衝液としては、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミンクロリド、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、グリシンアミド、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ等が好適に用いられる。また、シスタチンＣ吸着抑制剤は、安定化剤、キレート剤等の公知の添加剤を含んでいてもよい。添加剤の具体例としては、牛血清アルブミンやカゼイン等の安定化剤、EDTA等のキレート剤等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
本発明のシスタチンＣ吸着抑制剤は、シスタチンＣを含む溶液に添加して用いることができる。シスタチンＣを含む溶液としては、生体から分離した検体試料や、シスタチンＣの定量に必要な検量線を作成するためのシスタチンＣ標準液等が挙げられる。生体から分離した試料としては、例えば血液、血清、血漿、尿、便、唾液、組織液、髄液、ぬぐい液やこれらの希釈物が挙げられる。シスタチンＣ吸着抑制剤の使用量は、溶液中のシスタチンＣ含有量に応じて適宜選択することができるが、生体由来試料中の含有量は通常０．０１〜１００mg/L程度の範囲内であり、検量線の作成も通常この濃度範囲のシスタチンＣ標準液を用いて行なわれる。従って、シスタチンＣ吸着抑制剤の使用量としては、０．０１〜１００mg/LのシスタチンＣ濃度に適した量が好ましく、具体的には、非イオン型界面活性剤の最終濃度（複数の界面活性剤が用いられる場合はその合計濃度）で０．００１〜１０w/v%が好ましく、０．０１〜５w/v%がより好ましい。
【００２１】
シスタチンＣ吸着抑制剤を添加した試料は、公知のシスタチンＣ測定方法のいずれにも好適に用いることができる。本発明のシスタチンＣ吸着抑制剤を試料に添加すると、試料中のシスタチンＣがプラスチック製容器等の器具に吸着するのを効果的に抑制することができるので、試料中のシスタチンＣを正確に測定可能になる。
【００２２】
シスタチンＣの測定方法としては、シスタチンＣに対する抗体を用いた免疫測定が知られている（例えば特許文献１〜４及び非特許文献１参照）。シスタチンＣは公知のタンパク質であり、シスタチンＣに対する抗体も既に知られている。また、免疫測定方法自体は周知の常法であり、そのための試薬類やキットも市販されている。本発明のシスタチンＣ吸着抑制剤は、そのような市販の測定試薬やキットと組み合わせて提供することができる。すなわち、本発明は、シスタチンＣ吸着抑制剤を含む測定試薬やキットも提供する。なお、ここでいう「測定試薬」には、検体希釈液、抗体希釈液、洗浄液、酵素液、基質液等の他、上記したシスタチンＣ標準液も包含される。シスタチンＣ標準液中に本発明のシスタチンＣ吸着抑制剤を添加すると、標準液中のシスタチンＣを正確に測定できるため、正確な検量線を作成することができる。
【００２３】
上記の通り、非イオン型界面活性剤を含有するシスタチンＣ吸着抑制剤を用いることで、生体試料等の試料中のシスタチンＣが測定器具に吸着するのを抑制することができる。すなわち、本発明は、非イオン型界面活性剤の存在下でシスタチンＣを含有する試料を測定器具と接触させることを含む、シスタチンＣの吸着抑制方法も提供する。ここでいう「吸着抑制方法」とは、プラスチック製容器等の測定器具に試料中のシスタチンＣが吸着するのを抑制することを意味する。該吸着抑制方法において用いられる非イオン型界面活性剤、その存在濃度、シスタチンＣ含有試料の条件は、吸着抑制剤について上記した条件と同様である。
【００２４】
また、本発明は、上記シスタチンＣの吸着抑制方法により、測定器具へのシスタチンＣの吸着を抑制する工程を含む、試料中のシスタチンＣの測定方法をも提供する。該測定方法は、好ましくは免疫測定法により行なわれる。上記吸着抑制方法を用いることで、シスタチンＣの測定精度を高め、試料中のシスタチンＣを正確に測定することが可能になる。吸着抑制方法を実施する工程は、試料を測定プレート等の測定容器に接触させる前に行われるのが好ましく、例えば、測定に供する試料を調製する工程で試料と非イオン型界面活性剤とを混合するのが好ましい。なお、本発明において、「測定」という語には、「検出」、「定量」、「半定量」が包含される。
【００２５】
試料中のシスタチンＣの測定自体は、公知のいかなる方法を用いてもよい。例えば、シスタチンＣに対する抗体を用いた免疫測定が公知であり（例えば特許文献１〜４及び非特許文献１参照）、このような公知の方法を採用することができる。ただし、免疫測定方法自体は上記の通り周知であるから、これらの公知の方法に限定されず、いずれの免疫測定方法をも適用することができる。すなわち、反応形式に基づき分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法、イムノクロマト法等があり、標識に基づき分類すると、酵素免疫分析、放射免疫分析、蛍光免疫分析、化学発光免疫分析等があるが、これらのいずれもが本発明で言う「免疫測定」に包含され、上記免疫測定法として採用することができる。また、上記した通り、シスタチンＣは公知のタンパク質であり、抗シスタチンＣ抗体も公知であり、市販品も存在するため、入手は容易である。また、公知のタンパク質を遺伝子工学的手法により調製する方法も、公知のタンパク質に対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体等の抗体及び抗原結合性断片（Fab断片やF(ab')2断片のような、対応抗原に対する結合性を維持している抗体断片）の調製方法も、この分野で周知の常法であるから、当業者であれば、シスタチンＣに対する抗体又はその抗原結合性断片を容易に調製することができる。
【００２６】
本発明のシスタチンＣ測定方法に用いられる試料としては、生体から分離された試料が好ましく、例えば血液、血清、血漿、尿、便、唾液、組織液、髄液、ぬぐい液やこれらの希釈物が挙げられる。本発明の測定方法には、特に血液、血清及び血漿等の血液由来の体液、並びに血液由来の体液の希釈物が好適に用いられる。
【００２７】
下記実施例では免疫凝集法が採用されている。以下、免疫凝集法について説明するが、これは本発明の範囲を免疫凝集法に限定することを意図しているものではない。
【００２８】
免疫凝集法は、抗原抗体反応により生じる反応液の濁度や吸光度のような光学的性質の変化に基づいて、被検試料中の抗原又は抗体を検出又は定量する方法である。免疫凝集法には、免疫比濁法及び免疫比ろう法（ネフェロメトリー）が包含される。免疫凝集法では、金コロイドやラテックス粒子のような感作粒子が用いられる。免疫凝集法では、検体中の抗原と感作粒子の抗体が抗原抗体反応するか、又は検体中の抗体と感作粒子の抗原が抗原抗体反応して、溶液の濁度や吸光度等の光学的性質が変化することを利用して被検物質（本発明ではシスタチンＣ）の測定を行う。ラテックス粒子を用いる免疫凝集法は、ラテックス凝集法とも呼ばれる。免疫凝集法には、感作粒子の代わりに抗血清を用いる場合もある。
【００２９】
本発明のシスタチンＣ測定方法として免疫凝集法を採用する場合、反応液中の感作粒子の濃度は、通常０．０１〜０．５％程度であり、反応温度は、通常１〜５５℃、好ましくは３５〜４０℃で１分間〜１０分間程度である。反応媒体は特に限定されず、グリシン緩衝液やグットの緩衝液等の各種緩衝液を用いることができる。
【００３０】
試料中のシスタチンＣ濃度は、反応溶液の濁度又は吸光度を測定し、変化の大きさ（エンドポイント法）又は変化の速度（レート法）に基づいて算出される。エンドポイント法は反応の開始前と開始後一定時間測定した濁度若しくは吸光度の変化の大きさに基づき、レート法は反応の開始前及び開始後経時的に測定した濁度若しくは吸光度の変化の大きさに基づく方法である。免疫凝集法は、手動により行なってもよく、公知の自動分析装置を用いてもよい。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。ただし、本発明は下記実施例に限定されるものではない【００３２】
（サンプル液の調製）
50mM Hepesバッファー(pH7.5)に下記の各界面活性剤を0.1（w/v）％となるように添加したものをベース液とし、各々のベース液にシスタチンＣ抗原を約1mg/Lの濃度になるように添加して調製サンプル液とした。【００３３】
調製サンプル液を二つの新品の日立自動分析用サンプルカップに移し、一つを「移し替え0回サンプル」とした。もう一つのサンプル液は新しいサンプルカップに移し替え、ボルテックスで十分に撹拌することにより、カップに十分に接触させた。この操作をもう１度繰り返し、計2回の移し替えを行った。このサンプル液を「移し替え2回サンプル」とした。また、比較例としてベース液に界面活性剤を含まないサンプル液を調製し、実施例と同様に吸光度変化量の測定を行った。【００３４】
（使用材料）
非イオン型界面活性剤A：エマルゲン707（花王社製、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを主体）、HLB値１２．１
非イオン型界面活性剤B：エマルゲンA−90（花王社製、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルを主体）、HLB値１４．５
非イオン型界面活性剤C： エマルゲンB−66（花王社製、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテルを主体）、HLB値１３．２
非イオン型界面活性剤D： Tween80（シグマ社製、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを主体）、HLB値１５．０
陰イオン型界面活性剤A：PS−1（東ソー社製、ポリスチレンスルホン酸ナトリウムを主体）
陰イオン型界面活性剤B：ペレックスNBL（花王、アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウムを主体）
シスタチンＣ抗原：リコンビナントヒトシスタチンＣ（DAKO社製）【００３５】
（測定用試薬）
第1試薬：100 mMトリス緩衝液、pH8.5、500 mM塩化ナトリウムを含有。
第２試薬：抗ヒトシスタチンＣ抗体感作ラテックス浮遊液。
測定方法：日立7180型自動分析装置（日立製作所製、http://www.hitachi-hitec.com/science/medical/7180.html参照）により、エンドポイント法で自動測定を行った。【００３６】
（自動分析装置による測定）
前述のシスタチンＣ測定用試薬を用いて各サンプルのシスタチンＣ濃度の測定を行った。前述の調製サンプル液3μＬに第1試薬230μＬを添加し、この混合液を37℃で攪拌混合した後、5分放置後、第2試薬を50μＬ添加し、更に37±0.1℃で攪拌混合した。約5分間の凝集反応を546nmの吸光度変化量として測定し、シスタチンＣ濃度の比較を行った。あらかじめ既知濃度の試料を同一条件で測定し、シスタチンＣ濃度と吸光度変化量の関係を用いて検量線を作成した。吸光度変化量の測定、検量線作成、及び定量値の計算は、自動分析装置の付属ソフトウエアで行った。【００３７】
以下の計算式で吸着率を算出し、判定基準に従って各検討材料におけるシスタチンＣの吸着抑制能を評価した。
吸着率 [％]＝（移し変え２回サンプル液のシスタチンＣ濃度／移し変え０回サンプル液のシスタチンＣ濃度−１）×１００
判定基準
◎（優良）：吸着率の絶対値が１％以下
○（良）  ：吸着率の絶対値が１０％以下
×（不可）：吸着率の絶対値が１０％超【００３８】
【表１】
2010021399.tif 000002
注１：吸着率の数値は、絶対値が小さいほうが吸着量が少ない。【００３９】
（考察）
非イオン型界面活性剤を用いることで、シスタチンＣのサンプルカップへの吸着を簡便に抑制することができた。これにより、自動分析装置を用いて、簡単な操作で、正確にシスタチンＣの定量ができることが示された。
【国際調査報告】
2010021399.tif 000003
2010021399.tif 000004
2010021399.tif 000005
2010021399.tif 000006