(57)【要約】要約  抗インスリン自己抗体の影響を受けることなく、生体から分離された試料中のより正確なインスリン量を測定することができる、インスリンの測定方法及び測定試薬が開示されている。生体から分離された試料中のインスリンを測定する方法は、生体から分離された試料と、界面活性剤及び酸性化剤のいずれか又は両方を含む前処理液とを混和する前処理工程を含む。インスリン測定用試薬は、界面活性剤及び酸性化剤のいずれか又は両方を含む前処理液を備える。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から分離された試料と、界面活性剤及び酸性化剤のいずれか又は両方を含む前処理液とを混和する前処理工程を含む、生体から分離された試料中のインスリンを測定する方法。
【請求項２】
前記試料中のインスリンをイムノアッセイにより測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記前処理液が酸性化剤を含み、前処理工程が０．０１Ｎ以上の酸濃度の条件下で行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記前処理液が界面活性剤を含み、前記界面活性剤が陰イオン性界面活性剤である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記前処理液が界面活性剤と酸性化剤を含み、その界面活性剤が非イオン性界面活性剤、または両イオン性界面活性剤、または陽イオン性界面活性剤である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記前処理工程が、加熱条件下で行われる、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
界面活性剤及び酸性化剤のいずれか又は両方を含む前処理液を備える、インスリン測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリンの測定方法及び測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリンとは、膵臓のランゲルハンス島（膵島）β細胞から分泌されるペプチドホルモンの一種である。血中インスリンの測定は、膵β細胞機能検査として重要であり、糖尿病、低血糖などの糖代謝異常を示す疾患の診断、鑑別、病態の解明などに広く用いられている。血中のインスリン濃度は、インスリン分泌消失速度が種々の生理的条件により鋭敏に影響されるため一定条件での測定が困難であるため、通常は糖質負荷によるインスリン分泌刺激試験時に測定される。血中インスリンの測定は、免疫測定で行われる。【０００３】
しかし、糖代謝異常を示す患者、特にＩ型糖尿病患者には、血中に抗インスリン抗体（以下、「抗インスリン自己抗体」とも称する）を有する者が一部存在する。抗インスリン自己抗体が陽性の患者においては、インスリン測定時に測定試薬中のマウス等の抗ヒトインスリン抗体（以下、「インスリン抗体」とも称する）とインスリンとの反応に、抗インスリン自己抗体が干渉することにより、インスリンの正確な測定が困難な場合があることが示唆された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】葛谷 健ら  「糖尿病の分類と診断基準に関する委員会報告」、 糖尿病、 1999年 42(5): 385-404
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、抗インスリン自己抗体の影響を受けることなく、より正確なインスリン量を測定可能な、インスリンの測定方法及び測定試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、生体試料中のインスリンの測定に際し、免疫反応に供する前に、前記生体試料を界面活性剤及び酸性化剤のいずれか又は両方を含む前処理液と混和する前処理工程を介することで、抗インスリン自己抗体の影響を受けず、より正確なインスリン測定値が得られることを見出し、本発明を完成した。【０００７】
本発明の構成は以下の通りである。
（１）生体から分離された試料と、界面活性剤及び酸性化剤のいずれか又は両方を含む前処理液とを混和する前処理工程を含む、生体から分離された試料中のインスリンを測定する方法。
（２）前記試料中のインスリンをイムノアッセイにより測定する、（１）に記載の方法。
（３）前記前処理液が酸性化剤を含み、前処理工程が０．０１Ｎ以上の酸濃度の条件下で行われる、（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記前処理液が界面活性剤を含み、前記界面活性剤が陰イオン性界面活性剤である、（１）または（２）に記載の方法。
（５）前記前処理液が界面活性剤と酸性化剤とを含み、前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、または陽イオン性界面活性剤である、（１）または（２）に記載の方法。
（６）前記前処理工程が、加熱条件下で行われる、（４）または（５）に記載の方法。
（７）界面活性剤及び酸性化剤のいずれか又は両方を含む前処理液を備える、インスリン測定用試薬。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、抗インスリン自己抗体を含有する生体試料中であっても、インスリンを抗インスリン自己抗体から遊離させ、相互作用の影響を低減させることにより、試料に含まれるインスリン量をより正確に測定し得る、インスリンの測定方法及び測定試薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】酸性化前処理サンプルと未処理サンプルとでインスリン測定結果に乖離が見られた血清検体について、酸性化前処理サンプルと未処理サンプルとをゲル濾過カラムに供したクロマトグラフィーである。
【図２】酸性化前処理液の酸濃度と、検体の測定値との相関を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書中で記載される「％」の濃度は、特に記載のない限り、重量／体積（ｗ／ｖ）の濃度表示である。
【００１１】
＜インスリンの測定方法＞
本発明で測定されるインスリンは、任意の動物由来のインスリンであるが、好ましくは、哺乳動物（例、ヒト、サル、チンパンジー等の霊長類；マウス、ラット、ウサギ等の齧歯類；イヌ、ネコ等の愛玩動物；ブタ、ウシ等の家畜；ウマ、ヒツジ等の使役動物）由来のインスリンであり、より好ましくは霊長類由来のインスリンであり、特に好ましくは、ヒト由来のインスリンである。
【００１２】
１．前処理工程
本発明の方法は、生体試料と抗体とを反応させる免疫反応により生体試料中に存在するインスリンを測定する方法であるが、免疫反応（反応工程）の前に、生体試料と前処理液とを混和することによる前処理工程を含むことを特徴とする。前処理工程により、インスリンを抗インスリン自己抗体等から遊離させた状態とすることができる。前処理液は、界面活性剤及び酸性化剤のいずれか一方のみを含んでいてもよく、両方を含んでいてもよい。
【００１３】
前記前処理工程において混和する生体試料と前処理液の体積比は、１：１０〜１０：１、特に１：５〜５：１、さらに１：３〜３：１とすることが好ましい。本発明で用いられる生体試料は、インスリンを含有し得る試料であれば特に限定されず、例えば、血清、血漿、全血、尿、便、口腔粘膜、咽頭粘膜、腸管粘膜および生検試料（例、膵臓試料、腸管試料、肝臓試料）が挙げられる。好ましくは、生体試料は、血清または血漿である。
【００１４】
前記前処理液に含まれる界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤のいずれも使用可能であるが、特に陰イオン性界面活性剤が好ましい。陰イオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ−ラウロイルサルコシン、ドデシル硫酸リチウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、デオキシコール酸などを好適に使用でき、特にＳＤＳを好適に使用できる。界面活性剤の濃度は、インスリンを抗インスリン自己抗体等から遊離させるために十分な濃度であることを要する。界面活性剤を使用する場合、生体試料と混和した混和液の前処理時の濃度として、０．１〜１２．５％、特に０．２５〜１０％、さらに０．５〜７．５％とすることが好ましい。界面活性剤がＳＤＳの場合、ＳＤＳの濃度を０．１〜１０％とすることで、インスリンを十分に遊離させるとともに、ＳＤＳの析出等を生じにくい、という効果を奏する。
【００１５】
前処理液に含まれる主要な界面活性剤を陰イオン性界面活性剤とする場合、前処理後に、反応系に持ち込まれる陰イオン界面活性剤の影響を軽減するために、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤を単独または複数含む中和液を添加してもよい。
【００１６】
前記前処理液に含まれる酸性化剤としては、塩酸、硫酸、酢酸等を好適に使用できる。酸性化剤を使用する場合、前処理液の酸の規定度は、前処理時の濃度として、０．０１Ｎ以上、特に０．０２Ｎ以上０．５Ｎ以下、さらに０．０５Ｎ以上０．４Ｎ以下とすることが好ましい。酸の規定度を０．０１Ｎ以上とすることで、前処理の効果が十分に得ることが可能である。
【００１７】
前処理に酸性化剤を用いる場合、生体試料との混和時に沈澱が生じないよう、非イオン性界面活性剤、または両イオン性界面活性剤、または陽イオン性界面活性剤を添加することが好ましく、陽イオン性界面活性剤を添加することが特に好ましい。陽イオン性界面活性剤としては、特に炭素数１０個以上の一本鎖アルキル基と、第３級アミンまたは第４級アンモニウム塩を同分子中に有している陽イオン性界面活性剤が好ましい。このような界面活性剤の例としては、デシルトリメチルアンモニウムクロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド（Ｃ１６ＴＡＣ）、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）、ラウリルピリジニウムクロライド、テトラデシルピリジニウムクロライド、セチルピリジニウムクロライド等が挙げられる。陽イオン性界面活性剤の添加量は、検体との混和時の濃度で０．１％以上１５%以下が好ましく、さらに、０．５％〜１０％が好ましい。
【００１８】
酸性化剤を含む前処理液には、上記陽イオン性界面活性剤に加えて、さらに非イオン性界面活性剤等の他の界面活性剤が含まれていてもよい。他の界面活性剤の添加により、さらに高感度にインスリンを検出することが可能となる。
【００１９】
前処理液には、さらに還元剤が使用されてもよい。還元剤としては、２−（ジエチルアミノ）エタンチオール塩酸塩（ＤＥＡＥＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール等の既存の還元剤をいずれも使用可能であるが、溶液中の安定性に優れることから、ＤＥＡＥＴ、ＴＣＥＰを特に好適に使用できる。還元剤の濃度としては、生体試料との混和液の終濃度として０．５〜１００ｍＭ、特に１．０〜５０ｍＭ、さらに２．０〜２０ｍＭとすることが好ましい。
【００２０】
前処理液には、必要に応じて、尿素、チオ尿素等、他のタンパク変性剤が含まれていてもよい。変性剤の濃度は、処理時濃度で０．１Ｍ以上が好ましく、さらに０．５Ｍ以上４Ｍ未満が好ましい。また、前処理液には、処理効果を増強させるために、単糖類、二糖類、クエン酸、及びクエン酸塩類のいずれか、またはこれらを組合せて添加してもよい。さらに、前処理液には、ＥＤＴＡ等のキレート剤が含まれていてもよい。
【００２１】
前処理工程は、生体試料と前処理液を混和した後、さらに加熱することが好ましい。特に、前処理液に界面活性剤を使用する場合には、その効果を高めるために加熱をすることが好ましい。加熱温度は３５〜９５℃、特に５０〜９０℃、さらに７０〜８５℃とすることが好ましい。また、加熱時間は、１分以上、特に３分以上、さらに５分以上とすることが好ましい。加熱時間の上限は特に存在しないが、通常６０分以下、特に３０分以下の加熱時間でよい。なお、前処理液が酸性化剤を含み、界面活性剤を含まない場合には、加熱温度は３５〜４０℃程度でもよい。
【００２２】
２．反応工程
本発明の方法の前処理工程で処理された生体試料混和液は、次いで反応工程に供される。反応工程においては、生体試料混和液を緩衝液と混合させ、混合液中の抗原をインスリンに対する抗体と反応させる。
【００２３】
前記緩衝液としては、例えば、ＭＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、炭酸緩衝液をベースとしたものが挙げられ、特にリン酸緩衝液をベースとしたものを好適に使用できる。前処理液として界面活性剤を含有するものを使用した場合には、例えば、ＢＳＡ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、デキストラン硫酸ナトリウム等の水溶性高分子を、前処理後の混和液と混合した際の終濃度で０．０１〜１０．０％、特に０．０５〜５．０％程度含む緩衝液を使用することが好ましい。また、前処理液として酸性化剤を含有するものを使用した場合には、アルカリ剤を含むか、前処理液の酸の影響を緩和し得る緩衝能を有する緩衝液を使用することが好ましい。前処理工程の混和液と緩衝液との混合は、体積比で、１：１０〜１０：１、特に１：５〜５：１、さらに１：３〜３：１とすることが好ましい。
【００２４】
本発明の方法で使用されるインスリンに対する抗体は、インスリンのアミノ酸配列の少なくとも一部をエピトープとして認識する抗体である。インスリンに対する抗体は、特に限定されず、既知のエピトープを認識する抗体をいずれも使用することができるが、好ましくは、インスリンに対する抗体は、インスリン特異的エピトープ（特に、ヒトインスリン特異的エピトープ）を認識する抗体である。
【００２５】
インスリンに対する抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。インスリンに対する抗体は、免疫グロブリン（例、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ）のいずれのアイソタイプであってもよい。インスリンに対する抗体はまた、全長抗体であってもよい。全長抗体とは、可変領域および定常領域を各々含む重鎖および軽鎖を含む抗体（例、２つのＦａｂ部分およびＦｃ部分を含む抗体）をいう。インスリンに対する抗体はまた、このような全長抗体に由来する抗体断片であってもよい。抗体断片は、全長抗体の一部であり、例えば、定常領域欠失抗体（例、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）が挙げられる。インスリンに対する抗体はまた、単鎖抗体等の改変抗体であってもよい。
【００２６】
インスリンに対する抗体は、公知の方法を用いて作製することができる。例えば、インスリンに対する抗体は、上記のエピトープを抗原として用いて作製することができる。また、上述したようなエピトープを認識するインスリンに対する多数の抗体が市販されているので、このような市販品を使用することもできる。
【００２７】
インスリンに対する抗体は、固相に固相化されていてもよい。本明細書において、固相に固相化された抗体を、単に固相化抗体ということがある。固相としては、例えば、液相を収容または搭載可能な固相（例、プレート、メンブレン、試験管等の支持体、及びウェルプレート、マイクロ流路、ガラスキャピラリー、ナノピラー、モノリスカラム等の容器）、ならびに液相中に懸濁または分散可能な固相（例、粒子等の固相担体）が挙げられる。固相の材料としては、例えば、ガラス、プラスチック、金属、及びカーボンが挙げられる。固相の材料としてはまた、非磁性材料、又は磁性材料を用いることができるが、操作の簡便性等の観点から、磁性材料が好ましい。固相は、好ましくは固相担体であり、より好ましくは磁性固相担体であり、さらにより好ましくは磁性粒子である。抗体の固相化方法としては、従前公知の方法を利用することができる。このような方法としては、例えば、物理的吸着法、共有結合法、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン）を利用する方法、及びイオン結合法が挙げられる。特定の実施形態では、インスリンに対する抗体は、固相に固相化された抗体であり、好ましくは、磁性の固相に固相化された抗体であり、より好ましくは、磁性粒子に固相化された抗体である。
【００２８】
反応工程は、前処理工程の混和液と緩衝液とを混合した後、固相化した抗体に接触させてもよく、また、緩衝液中に例えば粒子上に固相化した抗体を予め入れて粒子液とし、前記混和液と粒子液とを混合させてもよい。反応工程は、例えば免疫凝集法や競合法のように一次反応工程のみで実施してもよいが、サンドイッチ法のように二次反応工程を設けてもよい。なお、二次反応工程を設ける場合、一次反応工程と二次反応工程の間に、未反応成分を除去するための洗浄工程を設けてもよい。
【００２９】
インスリンに対する抗体は、標識物質で標識化されていてもよい。本明細書において、標識物質で標識化された抗体を、単に標識化抗体ということがある。標識物質としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン）、蛍光物質またはタンパク質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光又は吸光物質（例、ルシフェリン、エクオリン、アクリジニウム）、放射性物質（例、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ）が挙げられる。また、本発明の方法では二次反応を設ける場合、二次反応に用いる抗体としては、このような標識物質で標識化されていてもよい。
【００３０】
特定の実施形態では、本発明の方法は、二次反応に用いる抗体として、インスリンに対する抗体と異なるエピトープを認識するインスリンに対する別の抗体を含む。このような別の抗体が認識するエピトープの詳細は、上述したインスリンに対する抗体について詳述したエピトープと同様である（但し、併用される場合、エピトープの種類は異なる）。インスリンに対する抗体により認識されるエピトープと、インスリンに対する別の抗体により認識されるエピトープとの組合せは、特に限定されない。このような別の抗体の使用は、例えば、サンドイッチ法が利用される場合に好ましい。
【００３１】
３．検出工程
一次抗体又は二次抗体に標識を用いた場合、使用する標識に適した方法、例えば酵素標識を用いた場合は酵素の基質を添加することによって、検出する。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を標識抗体として用いた場合は、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）を酵素基質として用いた化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）の系とすることができる。
【００３２】
本発明の方法は、インスリンに対する抗体を使用するイムノアッセイである。このようなイムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、及びサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、及びサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、及びイムノクロマトグラフィー法が挙げられる。
【００３３】
本発明の方法を用いることにより、特にヒトの生体試料中のインスリン測定において、抗インスリン自己抗体の影響を低減させることが可能である。これに加えて、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）等の異好性抗体が陽性のヒト生体試料における、偽陽性の発生を低減できることが示唆される。このように、本発明の方法は、生体試料由来の測定干渉物質の影響を低減し、より正確なインスリンの測定を可能とする。
【００３４】
＜インスリンの測定試薬＞
本発明のインスリンの測定試薬は、上述のインスリンの測定方法を実現し得る測定試薬である。本発明の測定試薬は、通常のイムノアッセイに使用される構成に加え、界面活性剤及び酸性化剤のいずれか又は両方を含む前処理液を構成成分として含むことを特徴とする。
【００３５】
本発明の試薬は、互いに隔離された形態または組成物の形態において各構成成分を含む。具体的には、各構成成分はそれぞれ異なる容器（例、チューブ、プレート）に収容された形態で提供されてもよいが、一部の構成成分が組成物の形態（例、同一溶液中）で提供されてもよい。あるいは、本発明の試薬は、デバイスの形態で提供されてもよい。具体的には、構成成分の全部がデバイス中に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、構成成分の一部がデバイス中に収容された形態で提供され、残りのものがデバイス中に収容されない形態（例、異なる容器に収容された形態）で提供されてもよい。この場合、デバイス中に収容されない構成成分は、標的物質の測定の際に、デバイス中に注入されることにより使用されてもよい。
【００３６】
好ましい実施形態では、本発明の試薬は、採用されるべきイムノアッセイの種類に応じた構成を有していてもよい。例えば、サンドイッチ法が採用される場合、本発明の試薬は、必須の構成成分として、ｉ）前処理液、ｉｉ）インスリンに対する抗体、ｉｉｉ）緩衝液、並びに任意の構成成分として、ｉｖ）インスリンに対する別の抗体、ｖ）標識物質、ｖｉ）希釈液、及び、必要に応じて、ｖｉｉ）標識物質と反応する基質を含んでいてもよい。ｉｉ）及びｉｉｉ）の構成成分は、同一溶液に含まれていてもよい。ｉｖ）の構成成分は、ｖ）標識物質で標識化されていてもよい。好ましくは、インスリンに対する抗体は、磁性粒子に固相化されていてもよい。
【実施例】
【００３７】
＜実施例１  酸性化前処理の効果確認試験＞
（１）検体前処理
血清検体３７例について、各３０μＬを酸性化前処理液（２．５Ｍ  尿素、０．４１Ｍ  塩酸、０．０８Ｍ  クエン酸二水和物、２．５％  マルトース、１０．０％    ＣＴＡＢ、４．９％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）３０μＬと混和し、３７℃で６分間加温した。次いで、中和液（５００ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅ、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ３Ｎａ、１０．０％  ＢＳＡ、ＮａＯＨ（〜ｐＨ９．５））を６０μＬ加え、酸性化前処理サンプルとした。【００３８】
同検体について、別途各３０μＬを、酸性化前処理液３０μＬと中和液６０μＬとを混合した緩衝液に添加し、未処理サンプルとした。【００３９】
ルミパルスインシュリン−Ｎキャリブレータ（富士レビオ社製、濃度：０、１０、１００、４００μＩＵ／ｍＬ）についても、上記と同様の方法で酸性化前処理サンプルと未処理サンプルを調製した。【００４０】
（２）検体中のインスリン測定
各酸性化前処理サンプルと各未処理サンプルについて、自動分析装置ルミパルスプレスト及び専用試薬ルミパルスプレストインシュリン（いずれも富士レビオ社製）を用いてインスリン濃度の測定を行った。ルミパルスプレストインシュリンの通常の測定方法はワンステップの免疫測定であるが、前処理液中の尿素等が標識酵素等に与える影響を回避するため、以下の通り、ツーステップの免疫測定方法に変更して測定した。なお、抗体結合粒子液、洗浄液、酵素標識抗体液、基質液は、いずれもルミパルスプレストインシュリンの構成試薬を使用した。【００４１】
抗体結合粒子液５０μＬとサンプル（検体またはキャリブレータの酸性化前処理サンプルまたは未処理サンプル）３０μＬとをキュベットに分注した。撹拌後、３７℃で８分間インキュベートした。キュベット内の粒子を磁石で集磁し、キュベット内を洗浄液にて洗浄した。洗浄後のキュベットに酵素標識抗体液５０μＬを加え、３７℃で８分間インキュベートした。キュベット内の粒子を磁石で集磁し、キュベット内を洗浄液にて洗浄した後、基質液２００μＬを添加し、３７℃で４分間反応させた。波長４６３ｎｍに極大吸収波長を持つ光の発光量（カウント）を測定した。キャリブレータの酸性化前処理サンプル、未処理サンプルのカウントを用いてそれぞれの検量線を作成し、検体中のインスリン濃度を算出した。【００４２】
（３）結果
各検体の酸性化前処理サンプル、未処理サンプルの、発光量（カウント）、インスリン測定値を表１に示す。併せて、既存の方法（ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法）で測定された、各検体のインスリン抗体（抗インスリン自己抗体）測定値を表１に示す。キャリブレータについては、酸性化前処理の有無による影響はほとんど見られなかった。検体については、特に抗インスリン自己抗体の濃度の高い検体（Ｎｏ．１６、３４）で、未処理サンプルと比して、酸性化前処理サンプルにおけるインスリン測定値が高くなった。【００４３】
【表１】
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【００４４】
＜実施例２  酸性化前処理検体のゲル濾過試験＞
実施例１で前処理により測定値が増加したＮｏ．１６の検体について、未処理サンプル、酸性化前処理サンプルを調製し、ゲル濾過クロマログラフィーを行った。
未処理サンプルは、酸性化前処理液５０μＬと中和液１００μＬとを混合した緩衝液に検体５０μＬとを混合し、ＰＢＳ４００μＬで希釈して調製した。酸性化前処理サンプルは、検体５０μＬと酸性化前処理液５０μＬとを混和して３７℃で６分間加温した後、中和液１００μＬを添加し、ＰＢＳ４００μＬで希釈して調製した。これらのサンプルを０．２２μｍ孔のフィルターでろ過した後、５００μＬをゲル濾過カラムに通した。
（分離条件）
カラム：Superdex 200 10/30
分離緩衝液：PBS, 0.05% CHAPS, 0.08% Tween20, 0.1% NaN3 (pH 7.4)
流速：0.5mL/分
回収範囲：6mL〜26mL（0.5mL／画分）
回収した各画分について、再度の前処理は行わず、ルミパルスプレストインシュリン（富士レビオ社製）を用いて、通常の方法でインスリン測定を行った。【００４５】
Ｎｏ．１６の検体の各画分のインスリン測定結果を図１に示す。Ｎｏ．１６の検体の未処理サンプルについては、インスリンと同じ分子量の領域と、インスリンより高分子の領域でそれぞれ微量のインスリン測定値のピークが現れた。一方、酸性化前処理サンプルでは、高分子の領域のピークは見られず、インスリンと同じ分子量の領域でインスリン測定値のピークが現れた。これらの結果より、前処理により測定値が増加したＮｏ．１６の検体の未処理サンプルでは、インスリンが何らかの物質（抗インスリン自己抗体と推測される）と複合体を形成して高分子化し、インスリン測定系での反応性が低下していたのに対し、酸性化前処理によりインスリンが複合体から遊離し、インスリン測定系での反応性も向上したことが示唆された。【００４６】
未処理サンプルをゲル濾過した各画分について、実施例２と同様に酸性化処理を行い、インスリン測定を行ったところ、高分子の画分でインスリン測定値が上昇した（データ示さず）。また、上記各画分について、抗ヒトＩｇＧ抗体結合粒子とアルカリフォスファターゼ標識抗インスリン抗体を用いた２ステップサンドイッチイムノアッセイ系でＩｇＧ−インスリン複合体の検出を行ったところ、上記のインスリン測定値が上昇した高分子の画分でＩｇＧ−インスリン複合体が検出された（データ示さず）。これらの結果からも、未処理サンプルにおいて、インスリンがＩｇＧ−インスリンの複合体として存在すること、酸性化前処理によりインスリンが複合体から遊離し、効率よく測定可能となることが示唆された。【００４７】
＜実施例３  酸性化剤の至適濃度＞
酸性化前処理に用いる酸性化剤の至適濃度を検討した。酸性化前処理液を純水で希釈して、表２に示す塩酸濃度となるよう複数の酸性化前処理剤を調製した。表２に示す複数のｐＨの粒子希釈液（組成：５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ３Ｎａ、０．１０％  ＰｒｏＣｌｉｎｅ３００、１０．０％  ＢＳＡ、ＮａＯＨ）を調製し、それぞれに磁性粒子を終濃度０．０２％となるように懸濁し粒子液とした。酸性化前処理液と粒子希釈液は、表２に示す通りに組み合せて使用した。【００４８】
【表２】
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【００４９】
Ｎｏ．１６の検体及びキャリブレータについて、各酸性化前処理液、各粒子液を用いた以外は、実施例の同様の方法により、インスリン濃度の測定を行った。併せて、Ｎｏ．１６の検体及びキャリブレータについて、ルミパルスプレストインシュリンの通常の方法を用いてインスリンを測定した。【００５０】
各酸性化処理剤条件における検体のインシュリン測定値を図２に示す。同一の検体をルミパルスプレストインシュリンの通常の方法で測定したインスリン測定値は、２．２μＩＵ／ｍＬであった。図２の結果より、酸性化処理剤の酸濃度が約０．０１Ｎ以上であれば、インスリン測定値の偽低値に明らかな改善が見られることが分かった。一方、酸濃度が高くなるとインスリン測定値が少し低くなる傾向が見られた。【００５１】
＜実施例４  ＳＤＳ前処理の効果確認試験＞
血清検体３７例について、各５０μＬをＳＤＳ前処理液（３４７ｍＭ  ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ２Ｎａ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）１００μＬと混和し、１０００ｒｐｍの振とう条件下で８０℃で５分間加熱した。次いで、中和液（１．２％  Ｃ１６ＴＡＣ、４％  ＣＨＡＰＳ、２．９％  Ｔｗｅｅｎ２０）で４倍希釈し、室温で３０分間インキュベーションした後、１５℃、１２０００ｒｐｍの条件下で１５分間遠心分離し、得られた上清をＳＤＳ前処理サンプルとした。同時に、同じ検体について、ＳＤＳ前処理液に代えてＰＢＳ１００μＬを使用したことと、加熱を行わないこと以外は、上記ＳＤＳ前処理と同様の処理を行い、得られたサンプルを未処理サンプルとした。ルミパルスインシュリン−Ｎキャリブレータについても、上記と同様の方法でＳＤＳ前処理サンプルと未処理サンプルを調製した。
各検体及びキャリブレータのＳＤＳ前処理サンプル及び未処理サンプルを、ルミパルスプレストインシュリン（富士レビオ社製）を用いて、通常の方法でインスリンの測定を行った。【００５２】
各検体及びキャリブレータのＳＤＳ前処理サンプルと未処理サンプルの測定結果を表３に示す。キャリブレータも含め、全体的にＳＤＳ前処理サンプルの発光量が未処理サンプルの発光量より１．４〜１．５倍程度高い傾向が見られたが、酸性化処理時と同様に、抗インスリン自己抗体濃度の高いＮｏ．１６、３４の検体で、ＳＤＳ前処理サンプルで顕著に発光量が高くなった。【００５３】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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