(57)【要約】  (i)肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な塩基の配列を含むRNAおよび(ii)該RNAを内部に封入したリポソームを含有する、肺高血圧症治療剤等を提供する。RNAを封入したリポソームは、例えば、カチオン性物質を含むリード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームであり、該脂質二重膜は、例えば中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である。
2010110314.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な塩基の配列を含むRNAおよび(ii)該RNAを内部に封入したリポソームを含有する、組成物。
【請求項２】
リポソームが、静脈内投与可能な大きさのリポソームである、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
RNAが、RNA干渉(RNAi)を利用した前記遺伝子の発現抑制作用を有するRNAである、請求項1または2記載の組成物。
【請求項４】
肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子が、細胞増殖関連因子、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（MAPキナーゼ;MAPK）シグナル伝達関連因子およびアポトーシス関連因子のいずれかについての遺伝子である、請求項1〜3のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAがMAPキナーゼシグナル伝達関連因子についてのmRNAである、請求項1〜3のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAがMAPK/ERKキナーゼ(MEK)についてのmRNAである、請求項1〜3のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
mRNAがヒトのmRNAである、請求項1〜6のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
RNAを封入したリポソームが、リード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームであり、
該脂質二重膜の構成成分が特定の極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能である、請求項1〜7のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
極性有機溶媒がアルコールである、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
極性有機溶媒がエタノールである、請求項8記載の組成物。
【請求項１１】
リード粒子が、カチオン性物質を含むリード粒子であり、脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、請求項8〜10のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
RNAを封入したリポソームが、カチオン性物質を含むリード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームであり、
該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、請求項1〜7のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
カチオン性物質がN-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N-ジメチルアミン、N-［1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジテトラデシルオキシプロピル)］-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウム、1,2-ジリノレイルオキシ- N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウムおよび3β-［N-(N’,N’-ジメチルアミノエチル)カルバモイル］コレステロールから選ばれる一つ以上である、請求項11または12記載の組成物。
【請求項１４】
水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミンである、請求項11〜13のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、請求項11〜14のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
(i)肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な塩基の配列を含むRNAおよび(ii)該RNAを内部に封入したリポソームを含有する、肺高血圧症治療剤。
【請求項１７】
リポソームが、静脈内投与可能な大きさのリポソームである、請求項16記載の肺高血圧症治療剤。
【請求項１８】
RNAが、RNA干渉(RNAi)を利用した前記遺伝子の発現抑制作用を有するRNAである、請求項16または17記載の肺高血圧症治療剤。
【請求項１９】
肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子が、細胞増殖関連因子、MAPキナーゼシグナル伝達関連因子およびアポトーシス関連因子のいずれかについての遺伝子である、請求項16〜18のいずれかに記載の肺高血圧症治療剤。
【請求項２０】
肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAがMAPキナーゼシグナル伝達関連因子のについてのmRNAである、請求項16〜18のいずれかに記載の肺高血圧症治療剤。
【請求項２１】
肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAがMEKのmRNAである、請求項16〜18のいずれかに記載の肺高血圧症治療剤。
【請求項２２】
mRNAがヒトのmRNAである、請求項16〜21のいずれかに記載の肺高血圧症治療剤。
【請求項２３】
RNAを封入したリポソームが、リード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームであり、
該脂質二重膜の構成成分が特定の極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能である、請求項16〜22のいずれかに記載の肺高血圧症治療剤。
【請求項２４】
極性有機溶媒がアルコールである、請求項23記載の肺高血圧症治療剤。
【請求項２５】
極性有機溶媒がエタノールである、請求項23記載の肺高血圧症治療剤。
【請求項２６】
リード粒子が、カチオン性物質を含むリード粒子であり、脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、請求項23〜25のいずれかに記載の肺高血圧症治療剤。
【請求項２７】
RNAを封入したリポソームが、カチオン性物質を含むリード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームであり、
該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、請求項16〜22のいずれかに記載の肺高血圧症治療剤。
【請求項２８】
カチオン性物質がN-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N-ジメチルアミン、N-［1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジテトラデシルオキシプロピル)］-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウム、1,2-ジリノレイルオキシ- N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウムおよび3β-［N-(N’,N’-ジメチルアミノエチル)カルバモイル］コレステロールから選ばれる一つ以上である、請求項26または27記載の肺高血圧症治療剤。
【請求項２９】
水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミンである、請求項26〜28のいずれかに記載の肺高血圧症治療剤。
【請求項３０】
中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、請求項26〜29のいずれかに記載の肺高血圧症治療剤。
【請求項３１】
(i)肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な塩基の配列を含むRNAおよび(ii)該RNAを内部に封入したリポソームを含有する、組成物を哺乳動物に投与する肺高血圧症の治療方法。
【請求項３２】
(i)肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な塩基の配列を含むRNAおよび(ii)該RNAを内部に封入したリポソームを含有する、組成物の肺高血圧症治療剤の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺高血圧症治療剤および肺高血圧症治療用組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
収縮期圧で 30mmHg以上、平均圧で 20mmHg 以上の肺動脈圧が存在する場合に、これを肺高血圧と定義することが一般的であり、肺高血圧症とは、肺血管系の血管抵抗が増大し、肺動脈圧の持続的な亢進をきたす病態をいう。
肺高血圧症には、原発性肺高血圧症と、心房中隔欠損、肺塞栓症、動脈管開存症、僧帽弁狭窄症、肺線維症、肺気腫、膠原病または肝硬変等を元疾患とする二次性肺高血圧症とがある。肺高血圧症では、何らかの原因で肺小動脈の血液の流れが細くなり、その結果、肺動脈内の圧力が高くなっている。肺動脈に血液が流れにくくなると、そこに血液を送り込んでいる右心室は、心筋を肥大させて血液を送り出すように変化する。しかし、このような負荷のかかった状態が続くと、心筋の収縮力は低下し、右心房を含む右心系の機能が障害された状態(右心不全という)になり、全身の血液の循環に障害がでてくると言われている。
肺高血圧症においては、肺小動脈の肺血管壁組織の肥大が観察され、これが本疾患の発生または増悪の原因であると考えられている。【０００３】
肥大した肺血管壁組織においては、細胞を増殖または成長させる因子が過剰に存在していることが知られている(非特許文献1、2参照)。それら細胞を増殖または成長させる因子をコードする遺伝子の発現を抑制することで、肺血管壁組織の肥大または硬化を抑制して、肺高血圧症を治療することが期待されている。
しかしながら、細胞を増殖または成長させる因子をコードする遺伝子の発現を抑制するためには、肥大した肺血管壁組織に薬物を送達させる必要があり、例えば薬物として核酸を用いた場合には、生体内での安定性が極めて低いことから、肥大した肺血管壁組織に高い選択性をもって送達させなければならないが、これまでそのような送達手段の報告はなかった。【０００４】
一方、核酸の細胞内への送達手段として、核酸封入リポソーム(リポソーム内に核酸を封入したリポソーム)が報告されている(特許文献1〜3および非特許文献3参照)。特許文献1では、核酸等を封入するリポソームの製造方法として、例えば、カチオン性脂質をクロロホルムに予め溶解し、次いでオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)の水溶液とメタノールを加えて混合後、遠心分離することでクロロホルム層にカチオン性脂質/ODNの複合体を移行させ、さらにクロロホルム層を取り出し、これにポリエチレングリコール化リン脂質と中性の脂質と水を加えて油中水型(W/O)エマルジョンを形成し、逆相蒸発法で処理してODN内包リポソームを製造する方法が報告され、特許文献2および非特許文献3では、ODNをpH3.8のクエン酸水溶液に溶解し、脂質(エタノール中)を加え、エタノール濃度を20v/v%まで下げてODN内包リポソームを調製し、サイジングろ過し、透析によって、過剰のエタノールを除去した後、試料をさらにpH7.5にて透析してリポソーム表面に付着したODNを除去してODN内包リポソームを製造する方法が報告され、それぞれ核酸等の有効成分を封入したリポソームが製造されている。【０００５】
これらに対して特許文献3では、液体中で微粒子を脂質二重膜で被覆する方法で核酸等の有効成分を封入したリポソームを製造することが報告されている。該方法においては、微粒子が分散し、かつ脂質が溶解した極性有機溶媒含有水溶液中の極性有機溶媒の濃度を減少させることによって、微粒子が脂質二重膜で被覆されており、液体中において被覆が行われ、例えば静脈注射用微粒子等に好適な大きさの脂質二重膜で被覆された微粒子(被覆微粒子)が、すぐれた効率で製造されている。また、特許文献3では微粒子の例として例えば水溶性薬物とカチオン性脂質からなる静電的相互作用により形成される複合体が例示されている。複合粒子を被覆した被覆微粒子の粒子径は、被覆される複合粒子に応じて異なるが、ODN-脂質複合体を被覆して得られた被覆微粒子は、粒子径が小さく、注射剤として使用可能であること、該被覆微粒子は、静脈内に投与した場合、高い血中滞留性を示し、腫瘍組織に多く集積したことが報告されている。
しかしながら、特許文献1〜3および非特許文献3のいずれにも、肥大した肺血管壁組織に対して、選択的に核酸を送達することに関しての報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表2002-508765号公報
【特許文献２】特表2002-501511号公報
【特許文献３】国際公開第02/28367号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション(The Journal of clinical investigation), 2005年, 第115巻, p.2811-2821
【非特許文献２】サーキュレーション・リサーチ(Circulation Research), 2001年, 第88巻, p.555-562
【非特許文献３】バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ(Biochemica et Biophysica Acta), 2001年, 第1510巻, p.152-166
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、核酸を含有する肺高血圧症治療剤等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下の(1)〜(60)に関する。
(1)  (i)肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な塩基の配列を含むRNAおよび(ii)該RNAを内部に封入したリポソームを含有する、組成物。
(2)  リポソームが、静脈内投与可能な大きさのリポソームである、(1)記載の組成物。
(3)  RNAが、RNA干渉(RNAi)を利用した前記遺伝子の発現抑制作用を有するRNAである、(1)または(2)記載の組成物。
(4)  肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子が、細胞増殖関連因子、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（MAPキナーゼ;MAPK）シグナル伝達関連因子およびアポトーシス関連因子のいずれかについての遺伝子である、(1)〜(3)のいずれかに記載の組成物。
(5)  肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAがMAPキナーゼシグナル伝達関連因子についてのmRNAである、(1)〜(3)のいずれかに記載の組成物。
(6)  肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAがMAPK/ERKキナーゼ(MEK)についてのmRNAである、(1)〜(3)のいずれかに記載の組成物。
(7)  mRNAがヒトのmRNAである、(1)〜(6)のいずれかに記載の組成物。
(8)  RNAを封入したリポソームが、リード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームであり、
該脂質二重膜の構成成分が特定の極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能である、(1)〜(7)のいずれかに記載の組成物。
(9)  極性有機溶媒がアルコールである、(8)記載の組成物。
(10)  極性有機溶媒がエタノールである、(8)記載の組成物。
(11)  リード粒子が、カチオン性物質を含むリード粒子であり、脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、(8)〜(10)のいずれかに記載の組成物。
(12)  RNAを封入したリポソームが、カチオン性物質を含むリード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームであり、
該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、(1)〜(7)のいずれかに記載の組成物。
(13)  カチオン性物質がN-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N-ジメチルアミン、N-［1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジテトラデシルオキシプロピル)］-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウム、1,2-ジリノレイルオキシ- N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウムおよび3β-［N-(N’,N’-ジメチルアミノエチル)カルバモイル］コレステロールから選ばれる一つ以上である、(11)または(12)記載の組成物。
(14)  水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミンである、(11)〜(13)のいずれかに記載の組成物。
(15)  中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、(11)〜(14)のいずれかに記載の組成物。
(16)  (i)肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な塩基の配列を含むRNAおよび(ii)該RNAを内部に封入したリポソームを含有する、肺高血圧症治療剤。
(17)  リポソームが、静脈内投与可能な大きさのリポソームである、(16)記載の肺高血圧症治療剤。
(18)  RNAが、RNA干渉(RNAi)を利用した前記遺伝子の発現抑制作用を有するRNAである、(16)または(17)記載の肺高血圧症治療剤。
(19)  肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子が、細胞増殖関連因子、MAPキナーゼシグナル伝達関連因子およびアポトーシス関連因子のいずれかについての遺伝子である、(16)〜(18)のいずれかに記載の肺高血圧症治療剤。
(20)  肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAがMAPキナーゼシグナル伝達関連因子についてのmRNAである、(16)〜(18)のいずれかに記載の肺高血圧症治療剤。
(21)  肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAがMEKのmRNAである、(16)〜(18)のいずれかに記載の肺高血圧症治療剤。
(22)  mRNAがヒトのmRNAである、(16)〜(21)のいずれかに記載の肺高血圧症治療剤。
(23)  RNAを封入したリポソームが、リード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームであり、
該脂質二重膜の構成成分が特定の極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能である、(16)〜(22)のいずれかに記載の肺高血圧症治療剤。
(24)  極性有機溶媒がアルコールである、(23)記載の肺高血圧症治療剤。
(25)  極性有機溶媒がエタノールである、(23)記載の肺高血圧症治療剤。
(26)  リード粒子が、カチオン性物質を含むリード粒子であり、脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、(23)〜(25)のいずれかに記載の肺高血圧症治療剤。
(27)  RNAを封入したリポソームが、カチオン性物質を含むリード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームであり、
該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、(16)〜(22)のいずれかに記載の肺高血圧症治療剤。
(28)  カチオン性物質がN-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N-ジメチルアミン、N-［1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジテトラデシルオキシプロピル)］-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウム、1,2-ジリノレイルオキシ- N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウムおよび3β-［N-(N’,N’-ジメチルアミノエチル)カルバモイル］コレステロールから選ばれる一つ以上である、(26)または(27)記載の肺高血圧症治療剤。
(29)  水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミンである、(26)〜(28)のいずれかに記載の肺高血圧症治療剤。
(30)  中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、(26)〜(29)のいずれかに記載の肺高血圧症治療剤。
(31)  (i)肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な塩基の配列を含むRNAおよび(ii)該RNAを内部に封入したリポソームを含有する、組成物を哺乳動物に投与する肺高血圧症の治療方法。
(32)  リポソームが、静脈内投与可能な大きさのリポソームである、(31)記載の肺高血圧症の治療方法。
(33)  RNAが、RNA干渉(RNAi)を利用した前記遺伝子の発現抑制作用を有するRNAである、(31)または(32)記載の肺高血圧症の治療方法。
(34)  肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子が、細胞増殖関連因子、MAPキナーゼシグナル伝達関連因子およびアポトーシス関連因子のいずれかについての遺伝子である、(31)〜(33)のいずれかに記載の肺高血圧症の治療方法。
(35)  肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAがMAPキナーゼシグナル伝達関連因子についてのmRNAである、(31)〜(33)のいずれかに記載の肺高血圧症の治療方法。
(36)  肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAがMEKのmRNAである、(31)〜(33)のいずれかに記載の肺高血圧症の治療方法。
(37)  mRNAがヒトのmRNAである、(31)〜(36)のいずれかに記載の肺高血圧症の治療方法。
(38)  RNAを封入したリポソームが、リード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームであり、
該脂質二重膜の構成成分が特定の極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能である、(31)〜(37)のいずれかに記載の肺高血圧症の治療方法。
(39)  極性有機溶媒がアルコールである、(38)記載の肺高血圧症の治療方法。
(40)  極性有機溶媒がエタノールである、(38)記載の肺高血圧症の治療方法。
(41)  リード粒子が、カチオン性物質を含むリード粒子であり、脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、(38)〜(40)のいずれかに記載の肺高血圧症の治療方法。
(42)  RNAを封入したリポソームが、カチオン性物質を含むリード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームであり、
該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、(31)〜(37)のいずれかに記載の肺高血圧症の治療方法。
(43)  カチオン性物質がN-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N-ジメチルアミン、N-［1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジテトラデシルオキシプロピル)］-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウム、1,2-ジリノレイルオキシ- N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウムおよび3β-［N-(N’,N’-ジメチルアミノエチル)カルバモイル］コレステロールから選ばれる一つ以上である、(41)または(42)記載の肺高血圧症の治療方法。
(44)  水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミンである、(41)〜(43)のいずれかに記載の肺高血圧症の治療方法。
(45)  中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、(41)〜(44)のいずれかに記載の肺高血圧症の治療方法。
(46)  (i)肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な塩基の配列を含むRNAおよび(ii)該RNAを内部に封入したリポソームを含有する、組成物の肺高血圧症治療剤の製造のための使用。
(47)  リポソームが、静脈内投与可能な大きさのリポソームである、(46)記載の使用。
(48)  RNAが、RNA干渉(RNAi)を利用した前記遺伝子の発現抑制作用を有するRNAである、(46)または(47)記載の使用。
(49)  肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子が、細胞増殖関連因子、MAPキナーゼシグナル伝達関連因子およびアポトーシス関連因子のいずれかについての遺伝子である、(46)〜(48)のいずれかに記載の使用。
(50)  肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAがMAPキナーゼシグナル伝達関連因子についてのmRNAである、(46)〜(48)のいずれかに記載の使用。
(51)  肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAがMEKのmRNAである、(46)〜(48)のいずれかに記載の使用。
(52)  mRNAがヒトのmRNAである、(46)〜(51)のいずれかに記載の使用。
(53)  RNAを封入したリポソームが、リード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームであり、
該脂質二重膜の構成成分が特定の極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能である、(46)〜(52)のいずれかに記載の使用。
(54)  極性有機溶媒がアルコールである、(53)記載の使用。
(55)  極性有機溶媒がエタノールである、(53)記載の使用。
(56)  リード粒子が、カチオン性物質を含むリード粒子であり、脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、(53)〜(55)のいずれかに記載の使用。
(57)  RNAを封入したリポソームが、カチオン性物質を含むリード粒子と該RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるリポソームであり、
該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とする脂質二重膜である、(46)〜(52)のいずれかに記載の使用。
(58)  カチオン性物質がN-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N-ジメチルアミン、N-［1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム、N-［1-(2,3-ジテトラデシルオキシプロピル)］-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウム、1,2-ジリノレイルオキシ- N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウムおよび3β-［N-(N’,N’-ジメチルアミノエチル)カルバモイル］コレステロールから選ばれる一つ以上である、(56)または(57)記載の使用。
(59)  水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体が、ポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミンである、(56)〜(58)のいずれかに記載の使用。
(60)  中性脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、(56)〜(59)のいずれかに記載の使用。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基の配列および該配列と相補的な塩基の配列を含むRNAを封入したリポソームを含有する組成物を、ほ乳類等に投与することにより、気管支または肺の肥大した肺血管壁組織において、肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子の発現を抑制することができる。また、気管支または肺において、肺血管壁組織の肥大に関連した前記遺伝子の発現を抑制することで、肺高血圧症を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例1で得られた組成物を投与した場合に、肺高血圧症を生じるモデルであるMCTラット特異的に、RNAが高濃度で集積することを示している。横軸は投与開始後の日数、縦軸は肺のCy5標識MEKsiRNAの濃度(nM)を表わしている。○は対照群、●はモノクロタリン誘発性肺高血圧症ラット（MCTラット）群の平均値と標準偏差を示す。また、＊は統計解析(student t テスト)の結果、ベースラインに対して有意差p値＜0.05の認められた点を示す。†は、統計解析(student t テスト)の結果、群間で有意差p値＜0.05 の認められた点を示す。
【図２】実施例1で得られた組成物を投与した場合に、肺高血圧症の疾患部位である肺に、RNAが選択的に集積することを示した。横軸は臓器または組織の名称、縦軸は各臓器または組織のCy5標識MEKsiRNAの濃度(nM)を表わしている。白抜きカラムは対照群、黒ぬりカラムはMCTラット群の平均値と標準偏差を示す。また、＊は統計解析(student t テスト)の結果、群間で有意差p値＜0.05の認められた点を示す。
【図３】対照群(左図)、MCTラット群(右図)の肺動脈およびその近傍を免疫染色した切片を示した。図中の白色部分が緑色に染色された血管内皮細胞を示し、矢印が赤色の蛍光が強く認められたCy5標識MEKsiRNAの集積を示す。
【図４】実施例2で得られた組成物を投与した場合に、肺高血圧症を生じた肺において、投与量依存的に遺伝子の発現を抑制することを示した。縦軸は肺におけるMEK1(左図)およびMEK2(右図)のmRNAの発現強度の、GAPDHのmRNA発現強度に対する比を示した。0.2および2は、実施例2で得られた組成物を0.2mg/kgおよび2mg/kgの各投与量で静脈内投与した群を表し、Controlは、比較例1で得られた組成物を投与した群を表す。
【図５】実施例2で得られた組成物を投与した場合において、肺高血圧症を生じた肺での遺伝子の発現抑制効果の経時的変化を示した。縦軸は肺におけるMEK1(左図)およびMEK2(右図)のmRNAの発現強度の、GAPDHのmRNA発現強度に対する比を示した。24、48および96は、それぞれ実施例2で得られた組成物の投与後24、48および96時間後を表し、Controlは、比較例1で得られた組成物を投与した群を表す。
【図６】実施例2で得られた組成物を投与した場合に、肺高血圧を抑制することを示した。縦軸は収縮期右心室圧(mmHg)を示した。MCT、比較例1および実施例2は、それぞれ生理食塩水、比較例1で得られた組成物および実施例2で得られた組成物を投与したMCTラットの群、Shamは、MCTの代わりに生理食塩水を皮下投与し、生理食塩水を静脈内投与したラットの群を表す。＊は、統計解析(student t テスト)の結果、実施例2で得られた組成物を投与した群と比較例1で得られた組成物を投与した群との間で有意差p値＜0.05 の認められたことを示す。
【図７】実施例2で得られた組成物を投与した場合に、右心室の肥大化を抑制することを示した。縦軸は左心室と心室中隔の総重量に対する右心室の重量の相対比を示した。MCT、比較例1および実施例2は、それぞれ生理食塩水、比較例1で得られた組成物および実施例2で得られた組成物を投与したMCTラットの群、Shamは、MCTの代わりに生理食塩水を皮下投与し、生理食塩水を静脈内投与したラットの群を表す。＊は、統計解析(student t テスト)の結果、実施例2で得られた組成物を投与した群と比較例1で得られた組成物を投与した群との間で有意差p値＜0.05 の認められたことを示す。
【図８】各ラットにおける肺動脈の肥大化をEV染色によって可視化した顕微鏡画像を示した。MCT、比較例1および実施例2は、それぞれ生理食塩水、比較例1で得られた組成物および実施例2で得られた組成物を投与したMCTラットの群、Shamは、MCTの代わりに生理食塩水を皮下投与し、生理食塩水を静脈内投与したラットの群を表す。
【図９】実施例2で得られた組成物を投与した場合に、肺動脈壁の肥大化を抑制することを示した。縦軸は肺動脈壁の肥大化の度合いを示した。MCT、比較例1および実施例2は、それぞれ生理食塩水、比較例1で得られた組成物および実施例2で得られた組成物を投与したMCTラットの群、Shamは、MCTの代わりに生理食塩水を皮下投与し、生理食塩水を静脈内投与したラットの群を表す。＊は、統計解析(student t テスト)の結果、実施例2で得られた組成物を投与した群と比較例1で得られた組成物を投与した群との間で有意差p値＜0.05 の認められたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明で用いられる肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子としては、ほ乳類の気管支または肺においてmRNAを産生して発現する肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子であれば特に限定されないが、例えば肺血管の増殖または成長に関連する遺伝子があげられ、好ましくは細胞増殖関連因子、MAPキナーゼシグナル伝達関連因子、アポトーシス関連因子等についての遺伝子があげられる。細胞増殖関連因子としては、例えば、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、上皮成長因子、上皮成長因子受容体、血管内皮増殖因子(VGEF)、血管内皮増殖因子受容体、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子受容体、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、クルッペル様因子、Ets転写因子、低酸素誘導因子、核因子等があげられ、MAPキナーゼシグナル伝達関連因子としては、例えば、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)、MAPKキナーゼ(MAPKK)、MAPKKキナーゼ(MAPKKK)、c-Jun N末端キナーゼ(JNK)、p38MAPK等があげられ、アポトーシス関連因子としては、例えば、サバイビン、FLICE抑制タンパク質(FLIP)、アポトーシス抑制系関連タンパク質Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1および微小管結合タンパク質等があげられ、好ましくは線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子受容体、MAPキナーゼシグナル伝達関連因子、クルッペル様因子、Bcl-2およびBcl-xLがあげられ、さらに好ましくはMAPキナーゼシグナル伝達関連因子、Bcl-2があげられる。
【００１３】
分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ(Mitogen-activated Protein Kinase、MAPK)とはセリン/スレオニンキナーゼの一つであり、何らかの刺激(酸化ストレス、サイトカインなど)を受けて活性化される。全身の細胞に広く発現しており、様々な細胞の機能発現において重要な働きをしている。単にMAP(マップ)キナーゼと略して呼ばれることが多い。
細胞外からの刺激が入ると低分子量Gタンパク質であるRasが活性化され、さらにその下流に続くシグナルカスケードの活性化が引き起こされる。また、MAPKホスファターゼ(MAPK Phosphatase:MKP)による脱リン酸化がMAPKを不活性化し、この機構に対して抑制的に働いている。狭義にはMAPKは細胞外シグナル調節キナーゼ(Extracellular Signal-regulated Kinase、ERK)1/2のみを指すが、広義にはこれに加えてc-Jun N末端キナーゼ(c-jun N-terminal kinase、JNK)、p38 MAPK、ERK5及びERK7等の分子をも含み、MAPKファミリーとも呼ばれる。
【００１４】
ERK1/2はMAPKファミリーの中でも最初に同定されたものであり、古典的MAPKとも称される。ERK1/2は分子量が44kDaのERK1と42kDaのERK2から成り、これらのタンパク質のアミノ酸配列は互いに85%の相同性がある。
ERK1/2の活性化は以下のような機序で生じる。上皮増殖因子受容体(Epidermal Growth Factor Receptor、EGFR)等のチロシンキナーゼ関連型受容体にリガンドが結合すると受容体細胞内ドメインのリン酸化が生じる。Grb2等のSH2ドメインを含むアダプタータンパク質が受容体のリン酸化チロシンに結合すると、Grb2はSH3ドメインを介してSosと結合し、Sosを活性化させる。活性化したSosはRasのGDP-GTP交換反応によりRasを活性化させる。以下、RasはMAPキナーゼカスケードへとシグナルを伝えていくが、RasはMAPキナーゼキナーゼキナーゼ(MAPKKK)であるRafを、RafはMAPキナーゼキナーゼであるMAPK/ERK kinase(MEK)を活性化し、このMEKによりERKの活性化が引き起こされる。なお、ERK1に対するMEKがMEK1、ERK2に対するMEKがMEK2である。ERKの活性化にはThr183及びTyr185が重要な働きをしている。通常ERK1/2は細胞質に優位に存在するが、活性化されることにより核内へ移行して転写因子と相互作用することにより転写の制御を行っている。
【００１５】
JNKはc-JunのSer63とSer73をリン酸化する活性を持つキナーゼとして同定された。JNKは放射線やリポ多糖、IL-1、浸透圧及び熱ショックなどのストレスにより活性化し、ストレス応答性MAPK(Stress-activated Protein Kinase、SAPK)とも呼ばれる。
JNK遺伝子にはJNK1〜JNK3が存在する。JNK1はアポトーシスや神経変性、細胞の分化・増殖、炎症性サイトカインの産生などの過程に関与している。JNKは様々な細胞内タンパク質のリン酸化を行い、それらの機能修飾をしている。
【００１６】
本発明で用いられるRNAとしては、前記遺伝子のmRNAの連続する15〜30塩基、好ましくは17〜25塩基、より好ましくは19〜23塩基の配列および該配列と相補的な塩基の配列を含んでいるRNAがあげられる。
本発明で用いられるRNAは、リボースの一部または全部が、デオキシリボースに置換されているもの、すなわちDNAも包含する。さらに、本発明で用いられるRNA中のリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドに修飾を施していてもよく、例えば、糖部修飾ヌクレオチド類似体やリン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体等になっていてもよい。また、本発明で用いられるRNAとしては、該RNA中のリン酸部、エステル部等に含まれる酸素原子等が、例えば硫黄原子等の他の原子に置換された誘導体も包含される。
本発明において、本発明で用いられるRNA中のリボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドとすること、本発明で用いられるRNA中のリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドに修飾を施すこと、本発明で用いられるRNA中のリン酸部、エステル部等に含まれる酸素原子等を、例えば硫黄原子等の他の原子に置換することは、RNAまたはDNAに比べ、ヌクレアーゼ耐性を向上させるため、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、細胞透過性を上げるため、あるいは可視化させるため等のいかなる目的で成されたものであってもよい。
【００１７】
糖部修飾ヌクレオチド類似体とは、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学構造物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、2’-O-メチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’-O-プロピルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’-メトキシエトキシリボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’-O-メトキシエチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’-O-［2-(グアニジウム)エチル］リボースで置換されたヌクレオチド類似体、2’-O-フルオロリボースで置換されたヌクレオチド類似体、糖部に架橋構造を導入することにより2つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)、より具体的には、2’位の酸素原子と4’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)、エチレン架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)［Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)］等があげられ、さらにペプチド核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)]、オキシペプチド核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)]、ペプチドリボ核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)]等をあげることができる。
【００１８】
リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体とは、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、ホスフォロチオエート結合に置換されたヌクレオチド類似体、N3'-P5'ホスフォアミデート結合に置換されたヌクレオチド類似体等をあげることができる［細胞工学, 16, 1463-1473 (1997)］［RNAi法とアンチセンス法、講談社(2005)］。
【００１９】
また、本発明で用いられるRNAとしては、好ましくはRNA干渉(RNAi)を利用した前記遺伝子の発現抑制作用を有するRNAがあげられる。ここではMEK遺伝子の発現を抑制するRNAを例にとって、RNA干渉(RNAi)を利用した遺伝子の発現を抑制するRNAについて説明する。他の遺伝子の場合も同様の構造を有し、また同様の操作で得ることができる。
【００２０】
MEK遺伝子の発現を抑制するRNAは、MEK mRNAの連続する15〜30塩基、好ましくは17〜25塩基、より好ましくは19〜23塩基の配列(以下配列Xとする)および該配列と相補的な塩基の配列(以下相補配列X’とする)を含んでいる。RNAとしては、(A)配列Xの鎖(センス鎖)および相補配列X’の鎖(アンチセンス鎖)からなる二本鎖RNA、(B)配列Xの鎖(センス鎖)および相補配列X’の鎖(アンチセンス鎖)からなる二本鎖RNAの配列Xの鎖もしくは相補配列X’の鎖またはそれぞれの鎖の3’端に1〜6個、好ましくは2〜4個のヌクレオチドが同一または異なって付加された二本鎖RNAであってMEK遺伝子の発現を抑制するRNA(以下、(A)および(B)のような構造のRNAをMEKsiRNAとよぶ)、(C)配列XからなるRNAおよび相補配列X’からなるRNAが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、ヘアピン構造を有するRNAであってMEK遺伝子の発現を抑制するRNA、(D)配列XからなるRNAおよび相補配列X’からなるRNAが、スペーサーオリゴヌクレオチドでつながれ、3’端に1〜6個、好ましくは2〜4個のヌクレオチドが付加された、ヘアピン構造を有するRNAであってMEK遺伝子の発現を抑制するRNA(以下、(C)および(D)のようなRNAをMEKshRNAとよぶ)等があげられる。これらのRNAに付加されるヌクレオチドの塩基は、グアニン、アデニン、シトシン、チミンおよびウラシルのいずれか1種または複数種でもよく、またRNAでもDNAでもよいが、ウリジル酸(U)およびデオキシチミジル酸(dT)のいずれか1種または2種が好ましい。またスペーサーオリゴヌクレオチドとしては6〜12塩基のRNAが好ましく、その5’端の配列は2個のUであるのが好ましい。スペーサーオリゴヌクレオチドの例として、UUCAAGAGAの配列からなるRNAがあげられる。スペーサーオリゴヌクレオチドによってつながれる2つのRNAの順番はどちらが5’側になってもよい。また、いずれの場合も、相補配列X’の3’端側に隣接して付加されるヌクレオチドの塩基の配列を、mRNA内で配列Xと隣接する塩基の配列と相補的な塩基の配列としてもよく、この構造がより好ましい。配列Xは、MEK mRNAの連続する15〜30塩基の配列、好ましくは17〜25塩基、より好ましくは19〜23塩基の配列であれば、いずれの配列でもよいが、遺伝子の発現を抑制したい動物のMEK cDNAの塩基配列から、AAではじまる21塩基の部分配列を取り出す。取り出した配列のGC含量を計算し、GC含量が20〜80%、好ましくは30%〜70%、より好ましくは40〜60%の配列を複数個選択して設計した配列がより好ましい。
【００２１】
MEK遺伝子の発現を抑制するRNAは、配列XによってMEK遺伝子の発現の抑制の強さが異なり、抑制が弱い場合もあるので、配列Xとして複数の配列を設計して、それぞれの配列XをもとにしたRNAを調製し、RNAをMEK遺伝子が発現している細胞に導入してMEK遺伝子の発現を測定し、MEK遺伝子の発現をより強く抑制するRNAを選択することより、本発明のRNAを取得できる。
MEK1遺伝子の発現を抑制するRNAとして、例えば表１に示すNo.1〜No.40のRNAがあげられる。また、MEK2遺伝子の発現を抑制するRNAとして、例えば表２に示すNo.41〜No.74のRNAがあげられる。
【００２２】
【表１】
2010110314.tif 000003
【表２】
2010110314.tif 000004
【表３】
2010110314.tif 000005
【表４】
2010110314.tif 000006
【００２３】
本発明で用いられるRNAを合成する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等にて合成することができる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスフォロチオエート法、ホスホトリエステル法等をあげることができ、例えば、ABI3900ハイスループット核酸合成機(アプライドバイオシステムズ社製)により合成することができる。酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミドまたはDNAを鋳型として典型的なファージRNAポリメラーゼ、例えば、T7ポリメラーゼ、T3ポリメラーゼ、SP6RNAポリメラーゼ等を用いて転写し、合成することができる。
【００２４】
なお、表1のMEKsiRNA  No.1は、例えば株式会社日本バイオサービス等に依頼して化学合成し、アニーリングさせることにより調製できる。表1および表２のMEKsiRNA  No.2〜74はサイレンサーsiRNA作製キット(Silencer(登録商標)siRNA Construction Kit、アンビオン社製)を利用したインビトロ転写により調製できる。インビトロ転写の鋳型作製に用いるDNAは、例えば北海道システムサイエンス株式会社等に化学合成を依頼して得ることができる。
【００２５】
本発明の組成物におけるリポソーム(以下リポソームA)としては、本発明で用いられるRNAを内部に封入したリポソームであれば特に限定されないが、例えばカチオン性脂質/RNAの複合体を疎水性の有機溶媒層に分散させ、ポリエチレングリコール化脂質と中性の脂質と水を加えて油中水型(W/O)エマルジョンを形成し、逆相蒸発法で処理して製造されたリポソーム(特許文献1参照)、RNAを、酸性の電解質水溶液に溶解し、脂質(エタノール中)を加え、エタノール濃度を下げてRNA内包リポソームを調製した後、試料のpHを上げて透析してリポソーム表面に付着した前記RNAを除去して製造されたリポソーム(特許文献2および非特許文献3参照)、リード粒子と前記RNAから構成される複合粒子および該複合粒子を封入した脂質二重膜から構成されたリポソーム(特許文献3および国際公開第2006/080118号パンフレット参照)等があげられ、リード粒子と前記RNAから構成される複合粒子および該複合粒子を封入した脂質二重膜から構成されたリポソームが好ましく、該脂質二重膜の構成成分が特定の極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能であることがより好ましい。また、リポソームAとしては、好ましくはカチオン性物質を含むリード粒子と前記RNAを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成され、該脂質二重膜が、中性脂質および水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体を構成成分とするリポソームもあげられ、該脂質二重膜の構成成分が特定の極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能であることがより好ましい。
なお、本発明において、分散とは、溶解せずに分散することを意味する。
【００２６】
本発明におけるリード粒子としては、例えば、脂質集合体、リポソーム(以下リポソームB)、エマルジョン粒子、高分子ミセル、金属コロイド等を構成成分とする微粒子があげられ、好ましくはリポソームBを構成成分とする微粒子があげられる。本発明におけるリード粒子は、脂質集合体、リポソームB、エマルジョン粒子、高分子ミセル、金属コロイド等を2つ以上組み合わせた複合体を構成成分としていてもよく、脂質集合体、リポソームB、エマルジョン粒子、高分子ミセル、金属コロイド等と他の化合物(例えば糖、脂質、無機化合物等)とを組み合わせた複合体を構成成分としていてもよい。
【００２７】
リード粒子の構成成分としての脂質集合体またはリポソームBは、例えば親水性と疎水性の両方の性質を兼ね備えた両親媒性を持つ、水中において脂質二重層構造をとる極性脂質等によって構成されるのが好ましい。該脂質としては、単純脂質、複合脂質または誘導脂質のいかなるものであってもよく、例えばリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、スフィンゴイド、ステロール、カチオン性脂質等があげられるがこれらに限定されない。好ましくはリン脂質またはカチオン性脂質があげられる。
【００２８】
上記リード粒子を構成する脂質におけるリン脂質としては、例えばホスファチジルコリン(具体的には大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン(EPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン等)、ホスファチジルエタノールアミン(具体的にはジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DORE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(POPE)、1 -ステアロイル- 2 -オレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(SOPE)等)、グリセロリン脂質(具体的にはホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、パルミトイルオレヨールホスファチジルグリセロール(POPG)、リゾホスファチジルコリン等)、スフィンゴリン脂質(具体的にはスフィンゴミエリン、セラミドホスホエタノールアミン、セラミドホスホグリセロール、セラミドホスホグリセロリン酸等)、グリセロホスホノ脂質、スフィンゴホスホノ脂質、天然レシチン(具体的には卵黄レシチン、大豆レシチン等)または水素添加リン脂質(具体的には水素添加大豆ホスファチジルコリン等)等の天然または合成のリン脂質があげられる。
【００２９】
上記リード粒子を構成する脂質におけるグリセロ糖脂質としては、例えばスルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリドまたはグリコシルジグリセリド等があげられる。
【００３０】
上記リード粒子を構成する脂質におけるスフィンゴ糖脂質としては、例えばガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシドまたはガングリオシド等があげられる。
【００３１】
上記リード粒子を構成する脂質におけるスフィンゴイドとしては、例えばスフィンガン、イコサスフィンガン、スフィンゴシン等、またはそれらの誘導体等があげられる。誘導体としては、例えばスフィンガン、イコサスフィンガンまたはスフィンゴシン等の-NH2を-NHCO(CH2)xCH3(式中、xは0〜18の整数を表し、中でも6、12または18が好ましい)に変換したもの等があげられる。
【００３２】
上記リード粒子を構成する脂質におけるステロールとしては、例えばコレステロール、ジヒドロコレステロール、ラノステロール、β-シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴカステロール、フコステロール等があげられる。
【００３３】
上記リード粒子を構成する脂質におけるカチオン性脂質としては、親水性と疎水性の両方の性質を兼ね備えた両親媒性を持つ、水中において脂質二重層構造をとる極性脂質のうち、親水性部に第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、第四級アンモニウム、窒素原子を含む複素環等を有する構造を持つものであり、例えば、N-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム(DOTAP)、N-［1-(2,3-ジオレオイルプロピル)］-N,N-ジメチルアミン(DODAP)、N-［1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)］-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム(DOTMA)、2,3-ジオレイルオキシ-N-［2-(スペルミンカルボキシアミド)エチル］-N,N-ジメチル-1-プロパナミニウムトリフルオロ酢酸(DOSPA)、N-［1-(2,3-ジテトラデシルオキシプロピル)］-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウム(DMRIE)、N-［1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)］-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウム(DORIE)、1,2-ジリノレイルオキシ- N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウムまたは3β-［N-(N',N'-ジメチルアミノエチル)カルバモイル]コレステロール(DC-Chol)等があげられる。
【００３４】
リポソームBにおいては、これら脂質は、1種単独でまたは2種以上を組み合わせて用いられ、好ましくは2種以上組み合わせて用いられる。2種以上組み合わせて用いる場合の組み合わせとしては、例えば水素添加大豆ホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール化脂質(後記のポリエチレングリコール化脂質と同義)およびコレステロールから選ばれる2成分以上の組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール化脂質およびコレステロールから選ばれる2成分以上の組み合わせ、EPCおよびDOTAPの組み合わせ、DOTAPおよびポリエチレングリコール化脂質の組み合わせ、EPC、DOTAPおよびポリエチレングリコール化脂質の組み合わせ、EPC、DOTAP、コレステロールおよびポリエチレングリコール化脂質の組み合わせ等があげられる。
【００３５】
また、リポソームBは、必要に応じて、例えばコレステロール等のステロール等の膜安定化剤、例えばトコフェロール等の抗酸化剤等の安定化剤を含有していてもよい。これら安定化剤は1種単独でまたは2種以上組み合わせて使用し得る。
【００３６】
脂質集合体としては、例えば球状ミセル、球状逆ミセル、ソーセージ状ミセル、ソーセージ状逆ミセル、板状ミセル、板状逆ミセル、ヘキサゴナルI、ヘキサゴナルIIまたは脂質2分子以上からなる会合体等があげられる。
【００３７】
エマルジョン粒子としては、例えば脂肪乳剤、非イオン性界面活性剤と大豆油等の油からなるエマルジョン、リピッドエマルジョン、リピッドナノスフェアー等の水中油型(O/W)エマルジョンや水中油中水型(W/O/W)エマルジョン粒子等があげられる。
【００３８】
上記リード粒子を構成するエマルジョン粒子における非イオン性界面活性剤としては、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン(具体的にはポリソルベート80等)、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール(具体的にはプルロニックF68等)、ソルビタン脂肪酸エステル(具体的にはソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート等)、ポリオキシエチレン誘導体(具体的にはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、ポリオキシエチレンラウリルアルコール等)またはグリセリン脂肪酸エステル等があげられる。
【００３９】
高分子ミセルとしては、例えばアルブミン、デキストラン、ポリフェクト(polyfect)、キトサン、デキストラン硫酸またはDNA等の天然高分子、例えばポリ-L-リジン、ポリエチレンイミン、ポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド-アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸またはポリエチレングリコール化ポリ乳酸等の高分子あるいはそれらの塩の１以上からなるミセルがあげられる。
【００４０】
ここで、高分子における塩は、例えば金属塩、アンモニウム塩、酸付加塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等を包含する。金属塩としては、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩または亜鉛塩等があげられる。アンモニウム塩としては、例えばアンモニウムまたはテトラメチルアンモニウム等の塩があげられる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩またはリン酸塩等の無機酸塩、および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩またはクエン酸塩等の有機酸塩があげられる。有機アミン付加塩としては、例えばモルホリンまたはピペリジン等の付加塩があげられる。アミノ酸付加塩としては、例えばグリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはリジン等の付加塩があげられる。
【００４１】
金属コロイドとしては、例えば金、銀、白金、銅、ロジウム、シリカ、カルシウム、アルミニウム、鉄、インジウム、カドミウム、バリウムまたは鉛等を含む金属コロイドがあげられる。
【００４２】
また、本発明におけるリード粒子は、糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤等を含有することが好ましく、糖脂質、または水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体を含有することがより好ましく、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体を含有することがさらに好ましい。糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤は、分子の一部がリード粒子の他の構成成分と例えば疎水性親和力、静電的相互作用等で結合する性質を有し、他の部分がリード粒子の製造時の溶媒と、例えば親水性親和力、静電的相互作用等で結合する性質を有する、2面性をもつ物質であるのが好ましい。糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤は、リード粒子の構成成分として含有されてもよく、リード粒子の構成成分に加えて用いてもよい。
【００４３】
糖、ペプチドおよび核酸から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばショ糖、ソルビトール、乳糖等の糖、例えばカゼイン由来ペプチド、卵白由来ペプチド、大豆由来ペプチド、グルタチオン等のペプチド、例えばDNA、RNA、プラスミド、siRNA、ODN等の核酸と、例えば前記リード粒子の定義の中であげた脂質、または例えばステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸等の脂肪酸とが結合してなるもの等があげられる。
【００４４】
また、糖の脂質誘導体または脂肪酸誘導体には、例えば前記リード粒子の定義の中であげたグリセロ糖脂質またはスフィンゴ糖脂質等も含まれる。
【００４５】
水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリエチレングリコール、ポリグリセリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、オリゴ糖、デキストリン、水溶性セルロース、デキストラン、コンドロイチン硫酸、ポリグリセリン、キトサン、ポリビニルピロリドン、ポリアスパラギン酸アミド、ポリ-L-リジン、マンナン、プルラン、オリゴグリセロール等またはそれらの誘導体と、例えば前記リード粒子の定義の中であげた脂質、または例えばステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸もしくはラウリン酸等の脂肪酸とが結合してなるもの等があげられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体、ポリグリセリン誘導体等の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられ、さらに好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられる。
【００４６】
ポリエチレングリコール誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリエチレングリコール化脂質(具体的にはポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミン(より具体的には1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-［メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000］(PEG-DSPE)等)、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、クレモフォアイーエル(CREMOPHOR  EL)等)、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル類(具体的にはモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等)またはポリエチレングリコール脂肪酸エステル類等があげられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール化脂質があげられる。
【００４７】
ポリグリセリン誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリグリセリン化脂質(具体的にはポリグリセリン-ホスファチジルエタノールアミン等)またはポリグリセリン脂肪酸エステル類等があげられ、より好ましくは、ポリグリセリン化脂質があげられる。
【００４８】
界面活性剤としては、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン(具体的にはポリソルベート80等)、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール(具体的にはプルロニックF68等)、ソルビタン脂肪酸エステル(具体的にはソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート等)、ポリオキシエチレン誘導体(具体的にはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、ポリオキシエチレンラウリルアルコール等)、グリセリン脂肪酸エステルまたはポリエチレングリコールアルキルエーテル等があげられ、好ましくは、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステルまたはポリエチレングリコールアルキルエーテル等があげられる。
【００４９】
上記したリード粒子は、正電荷をもつものが好ましい。ここで述べる、正電荷とは、本発明で用いられるRNA内の電荷、分子内分極等に対して静電的引力を生じる電荷、表面分極等を包含する。リード粒子が正電荷をもつには、リード粒子は、カチオン性物質を含有するのが好ましく、リード粒子は、カチオン性脂質を含有するのがより好ましい。
【００５０】
リード粒子に含有されるカチオン性物質は、カチオン性を呈する物質であるが、カチオン性の基とアニオン性の基の両方をもつ両性の物質であっても、pHや、他の物質との結合等により相対的な陰性度が変化するので、その時々に応じてカチオン性物質に分類され得るものも含まれる。これらカチオン性物質は、リード粒子の構成成分として含有されてもよく、リード粒子の構成成分に加えて用いてもよい。
【００５１】
カチオン性物質としては、例えば前記のリード粒子の定義で例示したもののうちのカチオン性物質［具体的には、カチオン性脂質(前記と同義)、カチオン性高分子等］、等電点以下の値のpHで複合体の形成を行える蛋白質またはペプチド等があげられ、好ましくはカチオン性脂質があげられる。
【００５２】
カチオン性高分子としては、例えばポリ-L-リジン、ポリエチレンイミン、ポリフェクト(polyfect)またはキトサン等があげられる。
【００５３】
等電点以下の値のpHで複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドとしては、その物質の等電点以下の値のpHで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドであれば特に限定されない。該蛋白質またはペプチドとしては、例えば、アルブミン、オロソムコイド、グロブリン、フィブリノーゲン、ペプシンまたはリボヌクレアーゼT1等があげられる。
【００５４】
本発明におけるリード粒子は、公知の製造方法またはそれに準じる方法で製造することができ、いかなる製造方法で製造されたものであってよい。例えば、リード粒子の1つであるリポソームBを構成成分とするリード粒子の製造には、公知のリポソームの調製方法が適用できる。公知のリポソームの調製方法としては、例えばバンガム(Bangham)らのリポソーム調製法［“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.)”,1965年,第13巻,p.238-252参照］、エタノール注入法［“ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(J.Cell Biol.)”,1975年,第66巻,p.621-634参照］、フレンチプレス法［“エフイービーエス・レターズ(FEBS Lett.)”,1979年,第99巻,p.210-214参照］、凍結融解法［“アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス(Arch. Biochem. Biophys.)”,1981年,第212巻,p.186-194参照］、逆相蒸発法［“プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)”,1978年,第75巻, p.4194-4198参照］またはpH勾配法(例えば特許第2572554号公報、特許第2659136号公報等参照)等があげられる。リポソームBの製造の際にリポソームBを分散させる溶液としては、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理的食塩液またはアミノ酸輸液等を用いることができる。また、リポソームBの製造の際には、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインまたはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)等の抗酸化剤、例えばグリセリン、ブドウ糖または塩化ナトリウム等の等張化剤等の添加も可能である。また、脂質等を例えばエタノール等の有機溶媒に溶解し、溶媒を留去した後、生理食塩水等を添加、振とう撹拌し、リポソームを形成させることによってもリポソームBを製造することができる。
【００５５】
また、例えばカチオン性物質、高分子、ポリオキシエチレン誘導体等によるリポソームB等のリード粒子の表面改質も任意に行うことができる［ラジック(D.D.Lasic)、マーティン(F.Martin)編,“ステルス・リポソームズ(Stealth Liposomes)”(米国),シーアールシー・プレス・インク(CRC Press Inc),1995年,p.93-102参照］。表面改質に使用し得る高分子としては、例えばデキストラン、プルラン、マンナン、アミロペクチンまたはヒドロキシエチルデンプン等があげられる。ポリオキシエチレン誘導体としては、例えばポリソルベート80、プルロニックF68、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、ポリオキシエチレンラウリルアルコールまたはPEG-DSPE等があげられる。リポソームB等のリード粒子の表面改質は、リード粒子に糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有させる方法の1つである。
【００５６】
リポソームBの平均粒子径は、所望により自由に選択できるが、下記の粒子径とするのが好ましい。リポソームBの平均粒子径を調節する方法としては、例えばエクストルージョン法、大きな多重膜リポソーム(MLV)を機械的に粉砕(具体的にはマントンゴウリン、マイクロフルイダイザー等を使用)する方法［ミュラー(R.H.Muller)、ベニタ(S.Benita)、ボーム(B.Bohm)編著,“エマルジョン・アンド・ナノサスペンジョンズ・フォー・ザ・フォーミュレーション・オブ・ポアリー・ソラブル・ドラッグズ(Emulsion and Nanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs)”,ドイツ,サイエンティフィック・パブリッシャーズ・スチュットガルト(Scientific Publishers Stuttgart),1998年,p.267-294参照］等があげられる。
【００５７】
また、リード粒子を構成する例えば脂質集合体、リポソームB、エマルジョン粒子、高分子ミセル、金属コロイド等から選ばれる2つ以上を組み合わせた複合体の製造方法は、例えば水中で例えば脂質、高分子等を混合するだけでもよく、所望によりさらに整粒工程や無菌化工程等を加えることもできる。また、前記複合体の製造は例えばアセトンまたはエーテル等種々の溶媒中で行うことも可能である。
【００５８】
本発明におけるリード粒子の大きさは、平均粒子径が約10nm〜1000nmであるのが好ましく、約30nm〜300nmであるのがより好ましく、約50nm〜200nmであるのがさらに好ましい。
【００５９】
本発明におけるリード粒子とRNAを含む複合粒子を被覆する脂質二重膜の構成成分としては、例えば前記リード粒子の定義の中であげた脂質または界面活性剤等があげられ、好ましくは、脂質のうちの中性脂質があげられる。ここで、中性脂質とは、脂質のうちの、前記リード粒子が正電荷をもつ場合におけるカチオン性物質の中であげたカチオン性脂質および後記の付着競合剤の中であげたアニオン性脂質を除いたもののことであり、中性脂質としてより好ましくは、リン脂質、グリセロ糖脂質またはスフィンゴ糖脂質等があげられる。より好ましくはリン脂質があげられ、さらに好ましくはEPCがあげられる。これら脂質は1種単独でまたは2種以上を組み合わせて用いることができる。
【００６０】
複合粒子を被覆する脂質二重膜の構成成分は、特定の極性有機溶媒に可溶であることが好ましく、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液中には、分散可能であることが好ましい。特定の濃度で該極性溶媒を含む液中の該極性溶媒の濃度は、該脂質二重膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度が好ましい。該極性有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、n-プロパノール、2-プロパノール、n-ブタノール、2-ブタノール、tert-ブタノール等のアルコール、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコールまたはポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール等があげられ、中でも、アルコールが好ましく、エタノールがより好ましい。
本発明における極性有機溶媒を含む液中の、極性有機溶媒以外の溶媒としては、例えば、水、液体二酸化炭素、液体炭化水素、ハロゲン化炭素またはハロゲン化炭化水素等があげられ、好ましくは水があげられる。また、イオンまたは緩衝成分等を含んでいてもよい。溶媒は1種または2種以上を用いることができるが、2種以上用いる場合は、相溶する組み合わせが好ましい。
【００６１】
複合粒子を被覆する脂質二重膜は、水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体もしくは脂肪族炭化水素誘導体、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステルまたはポリエチレングリコールアルキルエーテルを含有することが好ましく、水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体もしくは脂肪族炭化水素誘導体を含有することがより好ましい。水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体としては、例えば前記の糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体、または糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂肪族炭化水素誘導体があげられ、好ましくは前記水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられ、より好ましくは前記ポリエチレングリコール化脂質があげられ、さらに好ましくはポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミンがあげられる。なお、本発明における水溶性物質の脂肪族炭化水素誘導体としては、水溶性物質と、例えば長鎖脂肪族アルコール、ポリオキシプロピレンアルキルまたはグリセリン脂肪酸エステルのアルコール性残基等とが結合してなるものもあげられる。
【００６２】
糖、ペプチドまたは核酸の脂肪族炭化水素誘導体としては、例えばショ糖、ソルビトールまたは乳糖等の糖、例えばカゼイン由来ペプチド、卵白由来ペプチド、大豆由来ペプチドまたはグルタチオン等のペプチド、あるいは例えばDNA、RNA、プラスミド、siRNAまたはODN等の核酸の脂肪族炭化水素誘導体があげられる。
【００６３】
水溶性高分子の脂肪族炭化水素誘導体としては、例えばポリエチレングリコール、ポリグリセリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、オリゴ糖、デキストリン、水溶性セルロース、デキストラン、コンドロイチン硫酸、キトサン、ポリビニルピロリドン、ポリアスパラギン酸アミド、ポリ-L-リジン、マンナン、プルラン、オリゴグリセロール等またはそれらの誘導体の脂肪族炭化水素誘導体があげられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体またはポリグリセリン誘導体等の脂肪族炭化水素誘導体があげられ、さらに好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体の脂肪族炭化水素誘導体があげられる。
【００６４】
リード粒子がリポソームBを構成成分とする微粒子である場合、リポソームBと本発明で用いられるRNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成されるものがリポソームAとなり、その構成から狭義のリポソームと分類され、リード粒子がリポソームBを構成成分とする微粒子以外である場合でも、脂質二重膜で被覆されているので、広義のリポソームと分類される。本発明において、リード粒子がリポソームBを構成成分とする微粒子であることがより好ましい。
【００６５】
本発明におけるリード粒子と本発明で用いられるRNAを構成成分とする複合粒子は、該リード粒子を製造後または該リード粒子の製造と同時に、本発明で用いられるRNAをリード粒子に付着または封入して複合粒子を製造でき、さらに該複合粒子の製造後または複合粒子の製造と同時に、脂質二重膜で該複合粒子を被覆することによりリポソームAを製造することができる。リポソームAは、例えば、特許文献1、2、3、非特許文献3等に記載の公知の製造方法またはそれに準じる方法で製造するか、例えばリード粒子に本発明で用いられるRNAを付着または封入して複合粒子を製造後、該複合粒子および被覆層成分を、該被覆層成分が可溶な極性有機溶媒を含み、該複合粒子が溶解せず、該被覆層成分が分散状態で存在することが可能な濃度の液中に分散させる工程および該複合粒子を該被覆層成分で被覆する工程を含む製造方法で製造することができる。
【００６６】
本発明の組成物におけるリポソームAの好ましい製造方法としては、以下のリード粒子と本発明で用いられるRNAを構成成分とする複合粒子を製造する工程(工程1)および該複合粒子を脂質二重膜で被覆する工程(工程2または工程3)を含む製造方法があげられる。
【００６７】
工程1)  リード粒子と本発明で用いられるRNAを構成成分とする複合粒子を製造する工程
リード粒子を、例えば水等の溶媒中に分散させ、リード粒子が分散した液中に、本発明で用いられるRNAを分散または溶解して含有させて混合し、リード粒子に本発明で用いられるRNAを付着させることが好ましい。工程1において、リード粒子の凝集を抑制するために、リード粒子は凝集抑制物質を含有するリード粒子であることが好ましい。凝集抑制物質としては、前記糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤が好ましくあげられる。また、リード粒子が、正電荷をもつものである場合、リード粒子が分散した液中で、本発明で用いられるRNAと付着競合剤を共存させ、付着競合剤を該RNAとともにリード粒子に付着させてもよく、さらにリード粒子が凝集抑制物質を含有するリード粒子である場合にも、リード粒子の凝集をより抑制させるために付着競合剤を用いてもよい。リード粒子と本発明で用いられるRNAのいずれかの組み合わせとしては、複合粒子が極性有機溶媒を含有する液に分散可能となる組み合わせを選択することが好ましく、極性有機溶媒に対しての複合粒子の溶解度が、工程2または3で用いる脂質二重膜の構成成分のそれよりも低いことがより好ましく、また、該極性有機溶媒を含む液中に、該脂質二重膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能な濃度で該極性有機溶媒を含む液が存在する組み合わせを選択することがより好ましい。
【００６８】
付着競合剤としては、例えばアニオン性物質等があげられる。該アニオン性物質は、分子内の電荷、分子内分極等による静電的引力により、リード粒子の構成成分に静電的に付着する物質を包含する。付着競合剤としてのアニオン性物質は、アニオン性を呈する物質であるが、アニオン性の基とカチオン性の基の両方をもつ両性の物質であっても、pHや他の物質との結合等により相対的な陰性度が変化するので、その時々に応じてアニオン性物質に分類され得る。
【００６９】
アニオン性物質としてはアニオン性脂質、アニオン性界面活性剤、アニオン性高分子等または等電点以上の値のpHで複合体の形成を行える蛋白質、ペプチドもしくは核酸等があげられ、好ましくはデキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸またはデキストランフルオレセインアニオニック等があげられる。これらアニオン性物質は1種単独でまたは2種以上を組み合わせて用いることができる。
【００７０】
アニオン性脂質としては、例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトールまたはホスファチジン酸等があげられる。
アニオン性界面活性剤としては、例えばアシルサルコシン、アルキル硫酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸塩、炭素数7〜22の脂肪酸ナトリウム等があげられる。具体的にはドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムまたはタウロデオキシコール酸ナトリウム等があげられる。
【００７１】
アニオン性高分子としては、例えばポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド-アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール化ポリ乳酸、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸またはデキストランフルオレセインアニオニック等があげられる。
等電点以上の値のpHで複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドとしては、その物質の等電点以上の値のpHで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドであれば特に限定されない。例えば、アルブミン、オロソムコイド、グロブリン、フィブリノーゲン、ヒストン、プロタミン、リボヌクレアーゼまたはリゾチーム等があげられる。
【００７２】
アニオン性物質としての核酸としては、例えばDNA、RNA、プラスミド、siRNAまたはODN等があげられ、生理活性を示さないものであれば、どのような長さ、配列のものであってもよい。
【００７３】
付着競合剤は、リード粒子の構成成分に静電的に付着することが好ましく、リード粒子の構成成分に付着してもリード粒子の構成成分を凝集させるような架橋を形成しない大きさの物質であるか、分子内に付着する部分と、付着に反発してリード粒子の凝集を抑制する部分をもつ物質であることが好ましい。
【００７４】
工程1は、より具体的には、例えば凝集抑制物質を含有するリード粒子が分散した液を製造する操作および該リード粒子が分散した液中に、本発明で用いられるRNAを分散または溶解して含有させる操作(例えば該リード粒子が分散した液中に、本発明で用いられるRNAを加えて分散または溶解させる操作、該リード粒子が分散した液中に、本発明で用いられるRNAが分散または溶解した液を加える操作等)を含む製造方法において実施することができる。ここで、リード粒子が分散した液中に、本発明で用いられるRNAを分散または溶解して含有させる工程により得られる複合粒子としては、具体的には、例えばカチオン性脂質を含有するリポソームBを構成成分とする微粒子に本発明で用いられるRNAが付着して形成される複合粒子、カチオン性脂質を含有する脂質集合体を構成成分とする微粒子に本発明で用いられるRNAが付着して形成される複合粒子、ポリ-L-リジン等のカチオン性高分子を含有する高分子ミセルを構成成分とする微粒子に本発明で用いられるRNAが付着して形成される複合粒子、カチオン性高分子を含有するリポソームBを構成成分とする微粒子に本発明で用いられるRNAが付着して形成される複合粒子、カチオン性脂質を含有する高分子ミセルを構成成分とする微粒子に本発明で用いられるRNAが付着して形成される複合粒子等があげられる。また、リード粒子が分散した液中に、本発明で用いられるRNAを分散または溶解して含有させる操作が、本発明で用いられるRNAが分散または溶解した液に、さらに付着競合剤を含有させて、これを該リード粒子が分散した液中に加える操作であることが好ましく、この場合、該リード粒子に、本発明で用いられるRNAと該付着競合剤が共に付着して複合粒子が製造され、該複合粒子の製造中におけるリード粒子の凝集も、製造後における複合粒子の凝集もより抑制されて製造できる。
【００７５】
リード粒子のリード粒子が分散する液に対する割合は、リード粒子に本発明で用いられるRNAが付着できれば特に限定されるものではないが、約1μg/mL〜1g/mLであるのが好ましく、約0.1〜500mg/mLであるのがより好ましい。
【００７６】
工程2)  複合粒子を脂質二重膜で被覆する工程(その1)
工程1で得られた複合粒子が分散し、かつ脂質二重膜の構成成分の全部または一部が溶解した極性有機溶媒を含む液(液A)を調製する操作、次いで、液A中の極性有機溶媒の濃度を減少させることによって、複合粒子を脂質二重膜で被覆する操作を含む製造方法によってリポソームAが製造できる。この場合、リポソームAは分散液(液B)の形態で得られる。液Aにおける溶媒は、該脂質二重膜の構成成分が可溶で、該複合粒子が分散可能な極性有機溶媒の濃度の該極性有機溶媒を含む溶媒であり、液A中の極性有機溶媒の濃度を減少させた液Bでは、該脂質二重膜の構成成分が分散可能で、該複合粒子も分散可能であることが好ましい。液A中の溶媒が、極性有機溶媒と極性有機溶媒以外の溶媒との混合液である場合、例えば該極性有機溶媒と混合可能な極性有機溶媒以外の溶媒を含む溶媒(液C)を加えること、および/または、蒸発留去、半透膜分離、分留等によって、選択的に極性有機溶媒を取り除くことで、極性有機溶媒の濃度を減少させることができる。ここで、液Cは、極性有機溶媒以外の溶媒を含む液が好ましいが、極性有機溶媒も液Aにおける極性有機溶媒の濃度より低ければ含んでいてよい。
【００７７】
工程2における極性有機溶媒以外の溶媒としては、例えば、水、液体二酸化炭素、液体炭化水素、ハロゲン化炭素またはハロゲン化炭化水素等があげられ、好ましくは水があげられる。また、液Aおよび液Cは、イオンまたは緩衝成分等を含んでいてもよい。これら溶媒は1種単独でまたは2種以上を組み合わせて用いることができる。
【００７８】
極性有機溶媒と極性有機溶媒以外の溶媒の組み合わせは、相互に混合可能である組み合わせであるのが好ましく、液Aおよび液B中の溶媒ならびに液Cに対する複合粒子および脂質二重膜の構成成分の溶解度等を考慮して選択できる。一方、複合粒子については、液Aおよび液B中の溶媒ならびに液Cのいずれに対しての溶解度も低いことが好ましく、また極性有機溶媒および極性有機溶媒以外の溶媒のいずれに対しての溶解度も低いことが好ましく、脂質二重膜の構成成分は、液B中の溶媒および液Cに対しての溶解度が低いことが好ましく、液A中の溶媒に対しての溶解度が高いことが好ましく、また極性有機溶媒に対しての溶解度が高いことが好ましく、極性有機溶媒以外の溶媒に対する溶解度が低いことが好ましい。ここで、「複合粒子の溶解度が低い」とは、複合粒子に含有されるリード粒子、本発明で用いられるRNAおよび付着競合剤等の各成分の、溶媒中における溶出性が小さいことであり、各成分の個々の溶解度が高くても各成分間の結合等によって各成分の溶出性が小さくなっていればよい。例えば、リード粒子に含まれる成分のいずれかの液A中の溶媒に対する溶解度が高い場合でも、リード粒子が正電荷をもつ場合、本発明で用いられるRNA内の電荷、分子内分極等と静電的に結合することで、複合粒子中の成分の溶出が抑制され、複合粒子の液A中の溶媒に対する溶解度を低くすることが可能である。すなわち、リード粒子が正電荷をもつことは、リポソームAの製造において、複合粒子の成分の溶出を抑制し、製造性と歩留まりを向上させる効果も備えている。
【００７９】
液Aにおける極性有機溶媒の濃度は、脂質二重膜の構成成分が可溶で、複合粒子が分散可能であれば特に限定されるものではなく、用いる溶媒や複合粒子、脂質二重膜の構成成分の種類等により異なるが、好ましくは約30v/v%以上、より好ましくは約60〜90v/v%である。また、液Bにおける極性有機溶媒の濃度は、液Aよりも低い濃度で該極性有機溶媒を含み、脂質二重膜の構成成分が分散可能で、複合粒子も分散可能であれば特に限定されるものではないが、好ましくは約50v/v%以下である。
【００８０】
液Aを調製する工程としては、極性有機溶媒、複合粒子および脂質二重膜の構成成分、必要により極性有機溶媒以外の溶媒を混合して液Aを調製する工程があげられる。極性有機溶媒、複合粒子および脂質二重膜の構成成分、必要により極性有機溶媒以外の溶媒は、複合粒子が溶解しなければ、それらを加える順序に特に制限はないが、好ましくは、例えば該複合粒子が分散した極性有機溶媒を含む液(液D)を調製し、液D中の極性有機溶媒と同一または異なった極性有機溶媒を含む溶媒に該脂質二重膜の構成成分を溶解させた液(液E)を調製し、液Dと液Eを混合して調製する工程があげられる。液Dと液Eを混合して液Aを調製する際には、徐々に混合することが好ましい。
【００８１】
工程3)  複合粒子を脂質二重膜で被覆する工程(その2)
工程1で得られた複合粒子および脂質二重膜の構成成分を、該脂質二重膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む、該複合粒子が溶解せず、該脂質二重膜の構成成分が分散状態で存在することが可能な濃度の液中に分散させる操作(得られる液を液Fとする)を含む製造方法でリポソームAが製造でき、この場合、リポソームAは分散液の状態で得られる。液Fにおける溶媒は、該脂質二重膜の構成成分が可溶な極性有機溶媒を含む溶媒であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子がともに分散可能な特定の濃度で液Fに含まれている。
【００８２】
液Fの調製方法はいかなる形態をも取ることができる。例えば複合粒子の分散液と、脂質二重膜の構成成分の溶解液または分散液を調製した後、両液を混合して液Fを調製してもよく、複合粒子または脂質二重膜の構成成分のどちらか一方の分散液を調製し、その分散液に、固体状態の複合粒子または脂質二重膜の構成成分の残る一方を加えて分散させて液Fを調製してもよい。複合粒子の分散液と、脂質二重膜の構成成分の溶解液または分散液を混合する場合には、複合粒子の分散媒は、あらかじめ極性有機溶媒を含んでいてもよく、脂質二重膜の構成成分の溶媒または分散媒は極性有機溶媒を含む液または極性有機溶媒のみで構成される液であってもよい。一方、複合粒子または脂質二重膜の構成成分のどちらか一方の分散液を調製し、該分散液に、固体状態の複合粒子または脂質二重膜の構成成分の残る一方を加える場合には、該分散液は、極性有機溶媒を含む液であることが好ましい。なお、液Fを調製した後に複合粒子が溶解せず、脂質二重膜の構成成分が分散している場合には、複合粒子が溶解せず、脂質二重膜の構成成分が分散する極性有機溶媒濃度の範囲であれば極性有機溶媒を加えてもよく、極性有機溶媒を除去してもよく、または濃度を減少させてもよい。一方、液Fを調製した後に複合粒子は溶解していないが、脂質二重膜の構成成分が溶解している場合には、複合粒子が溶解せず、脂質二重膜の構成成分が分散する極性有機溶媒濃度の範囲で極性有機溶媒を除去するかまたは濃度を減少させればよい。また、複合粒子と脂質二重膜の構成成分をあらかじめ極性有機溶媒以外の溶媒中で混合し、そこに複合粒子が溶解せず、脂質二重膜の構成成分が分散する極性有機溶媒濃度の範囲で極性有機溶媒を加えてもよい。その場合には、複合粒子および脂質二重膜の構成成分のそれぞれを極性有機溶媒以外の溶媒中に分散させ、両分散液を混合した後で、極性有機溶媒を加えてもよく、複合粒子または脂質二重膜の構成成分のどちらか一方を極性有機溶媒以外の溶媒中に分散させ、その分散液に、固体状態の複合粒子または脂質二重膜の構成成分の残る一方を加えて分散させた後で、極性有機溶媒を加えてもよい。また、複合粒子および脂質二重膜の構成成分が分散し、極性有機溶媒を含有する液を、複合粒子が脂質二重膜で被覆されるに充分な時間、静置または混合する操作を含むことが好ましい。複合粒子と脂質二重膜の構成成分を、極性有機溶媒を含有する液中に分散させた後、静置または混合する時間は、複合粒子および脂質二重膜の構成成分を、極性有機溶媒を含有する液中に分散させた後に瞬時に終了させるのでなければ制限はないが、脂質二重膜の構成成分や、極性有機溶媒を含有する液の種類に応じて任意に設定することができ、得られたリポソームAの収率が定常量となる時間を設定することが好ましく、例えば約3秒〜30分である。なお、複合粒子および脂質二重膜の構成成分を、極性有機溶媒を含有する液中に分散させると、複合粒子への脂質二重膜の被覆が開始され、速やかに複合粒子への脂質二重膜の被覆が完了することもあり、例えば、脂質二重膜の構成成分の溶解液を調製した後、複合粒子の分散液と、脂質二重膜の構成成分の溶解液とを混合して液Fを調製する場合において、脂質二重膜の構��成分の液Fへの溶解性が低いと、脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒を含有する液中に分散するのとほぼ同時に、複合粒子への脂質二重膜の被覆が完了することもある。
【００８３】
液Fにおける極性有機溶媒以外の溶媒としては、例えば工程2における極性有機溶媒以外の溶媒で例示した物があげられ、好ましくは水があげられる。
【００８４】
液Fにおける極性有機溶媒の濃度は、複合粒子と、脂質二重膜の構成成分がともに分散されている条件さえ満たしていれば特に限定されるものではなく、用いる溶媒や複合粒子、脂質二重膜の構成成分の種類等により異なるが、好ましくは約1〜80v/v%、より好ましくは約10〜60v/v%、さらに好ましくは約20〜50v/v%、最も好ましくは約30〜40v/v%である。
【００８５】
本発明において、「脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に対して可溶」とは、脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に溶解する性質をもつ場合、可溶化剤等を用いることにより脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に溶解する性質をもつ場合、脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒中で凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化し得る性質をもつ場合等を包含する。
また、「脂質二重膜の構成成分が分散する」とは、脂質二重膜の構成成分の全部が凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化している状態、脂質二重膜の構成成分の一部が凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化し、残る部分が溶解している状態、脂質二重膜の構成成分の一部が凝集体またはミセル等を形成して乳濁もしくはエマルジョン化し、残る部分が沈殿している状態等を包含し、脂質二重膜の構成成分の全部が溶解している状態を包含しない。
【００８６】
本発明において、「複合粒子が分散する」とは、複合粒子が懸濁または乳濁もしくはエマルジョン化している状態のことであり、複合粒子の一部が懸濁または乳濁もしくはエマルジョン化し、残る部分が溶解している状態、複合粒子の一部が乳濁もしくはエマルジョン化し、残る部分が沈殿している状態等を包含し、複合粒子の全部が溶解している状態を包含しない。「複合粒子が溶解しない」とは、前記の「複合粒子が分散する」と同義である。
【００８７】
本発明におけるリポソームAの製造方法において用いられる、極性有機溶媒含有水溶液中の複合粒子の濃度は、複合粒子を脂質二重膜で被覆できれば特に限定されるものではないが、約1μg/mL〜1g/mLであるのが好ましく、約0.1〜500mg/mLであるのがより好ましい。また、用いられる脂質二重膜の構成成分の濃度は、複合粒子を被覆できれば特に限定されるものではないが、約1μg/mL〜1g/mLであるのが好ましく、約0.1〜400mg/mLであるのがより好ましい。
【００８８】
本発明のリポソームAに対する脂質二重膜の割合は、重量比で約1:0.1〜1:1000が好ましく、約1:1〜1:10がより好ましい。
【００８９】
また、本発明におけるリポソームAの大きさは、例えば注射可能な大きさであることが好ましい。具体的には、平均粒子径が約10nm〜1000nmであるのが好ましく、約50nm〜300nmであるのがより好ましく、約70nm〜200nmであるのがさらに好ましい。
【００９０】
さらに、上記で得られるリポソームAに抗体等の蛋白質、糖類、糖脂質、アミノ酸、核酸、種々の低分子化合物または高分子化合物等の物質による修飾を行うこともでき、これらで得られる被覆複合粒子もリポソームAに包含される。例えば、ターゲッティングに応用するため、上記で得られるリポソームAに対して、さらに抗体等の蛋白質、ペプチドまたは脂肪酸類等による脂質二重膜の表面修飾を行うこともできる［ラジック(D. D. Lasic)、マーティン(F. Martin)編,“ステルス・リポソームズ(Stealth Liposomes)”(米国),シーアールシー・プレス・インク(CRC Press Inc),1995年,p.93-102参照］。また、リポソームAに例えば水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体による表面改質も任意に行うことができ、これら表面改質に用いられる水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体は、前記脂質二重膜の構成成分としての水溶性物質の脂質誘導体、脂肪酸誘導体または脂肪族炭化水素誘導体と同義である。
【００９１】
本発明の組成物を、肺高血圧症または気管支もしくは肺における肥大した肺血管壁組織を有する哺乳動物(人を含む)に投与することで、本発明で用いられるRNAを肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子の発現部位である気管支または肺における肥大した肺血管壁組織へ送達することができ、該遺伝子の発現が抑制される。肺血管壁組織の肥大に関連した遺伝子の発現が抑制されることで、肺血管壁組織の肥大が抑制され、肺高血圧症を治療または予防する。また、気管支または肺における肺血管壁組織の肥大が抑制されることで、肺動脈内の圧力を下げ、肺動脈の血液が流れやすなり、心筋の肥大や右心房を含む右心系の機能障害が改善され、肺高血圧症に起因する右心不全または全身の血液の循環障害が治療または予防される。
即ち、本発明は、上記説明した本発明の組成物を哺乳動物に投与する肺高血圧症の治療方法も提供する。投与対象は、肺高血圧症に罹患している人または気管支もしくは肺における肥大した肺血管壁組織を有する人であることが好ましく、肺高血圧症に罹患している人がより好ましい。
また、本発明の組成物におけるRNAを、補酵素や抗体等のペプチドおよび蛋白質、オリゴヌクレオチドやプラスミド等の核酸等に換えた組成物も、同様に気管支または肺における肥大した肺血管壁組織へ送達することができ、気管支または肺における疾患の治療剤または予防剤として使用することができる。
【００９２】
また、本発明の組成物、および本発明の組成物におけるRNAを補酵素や抗体等のペプチドおよび蛋白質、オリゴヌクレオチドやプラスミド等の核酸等に換えた組成物は、送達の量を直接または間接的に測定して、肺高血圧症に罹患しているかどうかまたは気管支もしくは肺における肥大した肺血管壁組織を有するかどうかを診断するための診断薬として使用することもできる。
また、本発明の組成物、および本発明の組成物におけるRNAを補酵素や抗体等のペプチドおよび蛋白質、オリゴヌクレオチドやプラスミド等の核酸等に換えた組成物は、例えば血液成分等の生体成分(例えば血液、消化管等)中での該RNA、ペプチド、蛋白質または核酸の安定化、副作用の低減または気管支または肺への薬剤集積性の増大等を目的とする製剤としても使用できる。
【００９３】
本発明の組成物、および本発明の組成物におけるRNAを補酵素や抗体等のペプチドおよび蛋白質、オリゴヌクレオチドやプラスミド等の核酸等に換えた組成物を、気管支または肺における肺高血圧症等の疾患の治療剤または予防剤として使用する場合、投与経路としては、治療に際し最も効果的な投与経路を使用するのが望ましく、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内または静脈内等の非経口投与または経口投与をあげることができ、好ましくは静脈内投与または筋肉内投与をあげることができ、より好ましくは静脈内投与があげられる。
投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路などによって異なるが、例えばRNAに換算した1日投与量が約0.1μg〜1000mgとなるように投与すればよい。
【００９４】
静脈内投与または筋肉内投与に適当な剤形としては、例えば注射剤があげられ、上述の方法により調製したリポソームAの分散液をそのまま例えば注射剤等の形態として用いることも可能であるが、該分散液から例えば濾過、遠心分離等によって溶媒を除去して使用することも、該分散液を凍結乾燥して使用すること、または例えばマンニトール、ラクトース、トレハロース、マルトースまたはグリシン等の賦形剤を加えた分散液を凍結乾燥して使用することもできる。
注射剤の場合、前記のリポソームAの分散液または前記の溶媒を除去または凍結乾燥したリポソームAに、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理的食塩液またはアミノ酸輸液等を混合して調製された本発明の組成物を使用することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインもしくはEDTA等の抗酸化剤またはグリセリン、ブドウ糖もしくは塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。
【００９５】
本発明の肺高血圧症治療剤としては、肺高血圧症の治療または予防に用いることを意図した本発明の組成物があげられるが、例えば、本発明の組成物のうち、リポソームAが、リード粒子と前記RNAを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成され、該脂質二重膜の構成成分が特定の極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能であるリポソーム、またはカチオン性物質を含むリード粒子と前記RNAを構成成分とする複合粒子、および該複合粒子を被覆する脂質二重膜から構成され、該脂質二重膜の構成成分が極性有機溶媒に可溶であり、該脂質二重膜の構成成分および該複合粒子が、特定の濃度で該極性有機溶媒を含む液に分散可能であるリポソームを含有することが好ましい。
また、本発明は、上記説明した本発明の組成物の、肺高血圧症の治療剤の製造のための使用も提供する。
【００９６】
次に、実施例および試験例により、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例および試験例に限定されるものではない。なお、実施例1において用いたRNAは、ラットMEK1/2遺伝子に相同性を有する19塩基の配列および該配列と相補的な塩基の配列を含むRNAであり、それぞれの3’端にdTdTを付加したRNA［5’-GCAUCUGCAUGGAGCACAUdTdT-3’(配列a、配列番号149)、5’-AUGUGCUCCAUGCAGAUGCdTdT-3’(配列b、配列番号150)］であり、配列aの1本鎖RNAの5’端をCyanine5(Cy5)で修飾したRNA［5’-Cy5-GCAUCUGCAUGGAGCACAUdTdT-3’(配列c、配列番号151)］を、Eurogenetec社から入手し、配列cと配列bをアニーリングさせることにより調製した(以下、「Cy5標識MEKsiRNA」という)。また、実施例2において用いたRNAは、配列aおよび配列bのRNAを用いて同様に調製した(以下、「MEKsiRNA」という)。比較例1において用いたRNAは、ラットのMEK1/2遺伝子に相同性のない19塩基の配列および該配列と相補的な塩基の配列を含むRNA［5’-UACACGAGGUACGUCUACGdTdT-3’(配列番号152)、5’-CGUAGACGUACCUCGUGUAdTdT-3’(配列番号153)］であり、同様に調製した(以下、「Control-siRNA」という)。
【実施例１】
【００９７】
DOTAP(アバンチポーラルリピッズ社製)/PEG-DSPE(日本油脂製、以下同様)/蒸留水を40mg/16mg/1mLになるように混合し、ボルテックスミキサーで振とう攪拌した。得られた分散液を室温で0.4μmのポリカーボネートメンブランフィルター(ワットマン製)に4回、0.1μmのポリカーボネートメンブランフィルターに10回、さらに0.05μmのポリカーボネートメンブランフィルターに24回通してリード粒子を調製した。得られたリード粒子の分散液0.375mLに、Cy5標識MEKsiRNAの24mg/mL水溶液0.125mLを添加し、複合粒子を調製した。得られた複合粒子の分散液0.5mLを、脂質二重膜の構成成分のEPC(日本油脂製)/PEG-DSPE/エタノール/蒸留水を15mg/3.125mg/0.625mL/0.375mLになるように混合して得られた溶液2mL（エタノール濃度はおよそ62.5v/v%）に添加した。次に蒸留水0.625mLを徐々に加え、エタノールの濃度をおよそ40v/v %とした。次に、EPC/PEG-DSPE/エタノール/蒸留水を62.5mg/62.5mg/0.4mL/0.6mLになるように混合して得られた溶液を0.2mL添加し、蒸留水23.275mLを添加してリポソームを調製した。得られたリポソームの分散液を超遠心分離(1時間、110,000×g、25℃)し、上清を除去し、沈殿に生理食塩水を添加して再分散させ、生理食塩水をさらに添加して濃度を調整し、組成物を得た。【００９８】
試験例1
肺高血圧症を生じる疾患モデル(Sugita T, Hyers TM, Dauber IM, Wagner WW, McMurtry IF, Reeves JT. Lung vessel leak precedes right ventricular hypertrophy in monocrotaline-treated rats. J Appl Physiol. Feb 1983;54(2):371-374. 参照)を用い、次の方法により、実施例1で得られた組成物を投与した場合には、肺高血圧症を生じた肺に、RNAが特異的に到達することを確認した。
Wistar(5週齢)雄性ラット(100〜120g)の皮下にモノクロタリン(MCT)を投与(60mg/kg)し、モノクロタリン誘発性肺高血圧症ラット(MCTラット)とした。また、MCTの代わりに生理食塩水を同様に投与し、対照群とした。
MCTまたは生理食塩水投与10日後、ラット尾静脈より実施例1で得られた組成物(Cy5標識MEKsiRNAとして0.2 mg/kg)を投与し、組成物投与1日、2日、4日、7日後の肺を採取した。得られた肺を生理食塩水で洗浄灌流して血液を除いた後、肺1.0mgあたり1μLの1%TritonX-100含有PBSを添加し、肺をホモジナイズした。これを遠心分離(10000×g、4℃)し、得られた上清中におけるCy5の蛍光強度を測定した。各肺におけるCy5標識MEKsiRNAの濃度は、実施例1で得られた組成物の代わりに生理食塩水を同様に静脈内投与したMCTラットおよび対照群それぞれの肺における自家蛍光強度を減じて補正することで算出した。
図1に、実施例1で得られた組成物の投与1、2、4、および7日後の、肺におけるCy5標識MEKsiRNAの集積の時間変化を示した。
図1から、MCTラットの肺において、実施例1で得られた組成物の投与2日後にCy5標識MEKsiRNAの濃度が最大となり、一方、対照群の肺におけるCy5標識MEKsiRNAの濃度は、組成物投与から1日後に緩やかなピークを示したことがわかる。MCTラットにおける肺でのCy5標識MEKsiRNAの濃度は、組成物投与2日後において、対照群に対して有意に高い濃度であった。【００９９】
試験例2
実施例1で得られた組成物を投与した場合に、肺高血圧症の疾患部位である肺に、RNAが選択的に到達することを確認した。
試験例1と同様にMCTラットおよび対照群を用意した。MCTまたは生理食塩水の投与10日後、ラット尾静脈より実施例1で得られた組成物(Cy5標識MEKsiRNAとして0.2 mg/kg)を投与し、組成物投与48時間後の肺、肝臓、腎臓、心臓、脳を採取した。得られた各臓器中におけるCy5標識MEKsiRNAの濃度を、試験例1と同様に測定し算出した。
図2に、実施例1で得られた組成物の投与48時間後のMCTラットおよび対照群の、各臓器中におけるCy5標識MEKsiRNA濃度を示した。
図2から、48時間後のMCTラットの肺は対照群の肺と比較して、有意に高いCy5標識MEKsiRNA濃度を示すことが分かる。一方、肺以外の臓器ではそれぞれのラットにおいてCy5標識MEKsiRNAの濃度に有意な差がないことが分かる。【０１００】
試験例3
実施例1で得られた組成物を投与した場合において、肥大した肺血管壁組織およびその近傍に、RNAが選択的に到達することを確認した。
試験例1と同様にMCTラットおよび対照群を用意して実施例1で得られた組成物を投与した。組成物投与48時間後の肺を摘出し、右肺下部の凍結切片を作成した。血管内皮細胞を免疫染色し(緑色)、DAPI染色によって核を染色し(青色)、Cy5標識MEKsiRNA(赤色)の集積部位を蛍光顕微鏡で観察した。
図3に各ラットにおける肺動脈およびその近傍を免疫染色した切片を示した（左：対照群、右：MCTラット）。図中の白色部分が緑色に染色された血管内皮細胞を示し、矢印が赤色の蛍光が強く認められたCy5標識MEKsiRNAの集積を示す。
図3より、肥大した肺血管壁組織を有するMCTラット（図3右）において、Cy5標識MEKsiRNAの集積が、肥大した肺血管壁組織を有さない対照群（図3左）と比較して血管内皮細胞の近傍に高い割合で局在しており、実施例1で得られた組成物を投与した場合に、肥大した肺血管壁組織およびその近傍にRNAが集積することが分かる。
【実施例２】
【０１０１】
実施例1におけるCy5標識MEKsiRNAを、MEKsiRNAに換え、同様に組成物を得た。【０１０２】
比較例1
実施例1におけるCy5標識MEKsiRNAを、Control-siRNAに換え、同様に組成物を得た。【０１０３】
試験例4
実施例2で得られた組成物を投与した場合において、肺高血圧症を生じた肺で、投与量依存的に遺伝子の発現を抑制することを確認した。
試験例1と同じ病態モデルラットを用いて、MCT投与10日後に実施例2で得られた組成物をMEKsiRNAとして0.2mg/kgおよび2mg/kgの各投与量で静脈内投与した。また、比較例1で得られた組成物を対照として同様に投与した。摘出した各肺からTRIzol Reagent(インビトロジェン製)および、RNeasy Mini Kit(キアゲン製)を用いて全RNAを抽出した。全RNAはQuantiTect  Reverse Transcription  Kit(キアゲン製)と以下に示す鋳型DNAプライマー(cDNA)を用いてMEK1およびMEK2のmRNAを逆転写させた［MEK1 sense(5’-CAGGTGCTGCATGAGTGCAA-3’(配列番号154))、MEK1 antisense(5’-CTTGATCCAAGGACCCACCATC-3’(配列番号155))、MEK2 sense(5’-TGCAACTCACCGTACATCGT-3’(配列番号156))、MEK2 antisense(5’-CCTTCAGTACCTGGTCCAGT-3’(配列番号157))］。また、内部標準としてGAPDHのmRNAも以下に示すcDNAを用いて同様に逆転写させた。［GAPDH sense(5’-GAACATCATCCCTGCATCCA-3’(配列番号158))、GAPDH antisense(5’-CCAGTGAGCTTCCCGTTCA-3’(配列番号159))］。PCR増幅では1μLのcDNAと25μLのPower SYBR Green PCR Master Mix(バイオシステム製)を添加して、全量を50μLとしたRNA溶液を用いた。95℃、15秒間で熱変性し、60℃、1分間でアニーリングおよび伸張反応を繰り返して、これを40サイクル行った。肺におけるMEK1およびMEK2のmRNAの発現強度は、各摘出肺でのGAPDHのmRNA発現強度で補正して算出した。
図4に、組成物投与48時間後の肺における、投与量依存的なMEK1（左）およびMEK2（右）のmRNAの発現抑制効果を示した。
図4から、実施例2で得られた組成物を投与した群が、比較例1で得られた組成物を投与した群と比較して、肺において投与量依存的にMEK1およびMEK2のmRNAの発現をどちらも抑制されていることが分かる。【０１０４】
試験例5
実施例2で得られた組成物を投与した場合において、肺高血圧症を生じた肺での遺伝子の発現抑制効果の経時的変化を確認した。
試験例1と同じ病態モデルラットを用いて、MCT投与10日後に実施例2で得られた組成物を静脈内投与し(0.2 mg/kg)、組成物投与24、48、96時間後に肺を摘出した。また、比較例1で得られた組成物を対照として同様に投与し、組成物投与48時間後に肺を摘出した。摘出した肺から試験例4と同様に、肺におけるMEK1およびMEK2のmRNAの発現強度を測定した。
図5に、組成物投与24、48、96時間後の肺におけるMEK1（左）およびMEK2（右）のmRNAの発現抑制効果の経時的変化を示した。
図5から、実施例2で得られた組成物を投与した場合に、比較例1で得られた組成物(Control)を投与した場合と比較して、肺においてMEK1およびMEK2のmRNAの発現を抑制し、その抑制効果は組成物の投与24時間後には確認され、96時間以上持続することが分かる。【０１０５】
試験例6
試験例1と同じ病態モデルラットを用いて、実施例2で得られた組成物を投与した場合に、肺高血圧を抑制することを確認した。
MCT投与3、10、17日後のラットに実施例2で得られた組成物を静脈内投与(0.2 mg/kg)し、MCT投与21日後に血行動態を測定した。イソフルラン(1〜1.5%)で麻酔したラットにポリエチレンカテーテル(PE-50)(BDバイオサイエンス製)を用いて右頚静脈を介して右心室に挿入し、収縮期右心室圧を測定した。収縮期右心室圧は連続20回の心拍動中における各測定値から算出した。
対照群として、比較例1で得られた組成物(0.2 mg/kg)を静脈内投与したMCTラット（比較例1）、生理食塩水を同様に静脈内投与したMCTラット(MCT)、およびMCTの代わりに生理食塩水を皮下投与し、生理食塩水を静脈内投与したラット(Sham)においても同様に試験した。
図6に、各ラットにおける収縮期右心室圧を棒グラフで示した。
図6から、肺高血圧症モデルのMCTラットではShamに対して有意に高い血圧を示しており、比較例1で得られた組成物を投与した群は、その高血圧を抑制していないことが分かる。一方、実施例2で得られた組成物を投与した群は、MCT誘発性の血圧上昇を、比較例1で得られた組成物を投与した群に対して有意に抑えることが分かる。【０１０６】
試験例7
試験例1と同じ病態モデルラットを用いて、実施例2で得られた組成物を投与した場合に、右心室の肥大化を抑制することを確認した。
試験例6と同様に実施例2で得られた組成物を投与した。MCT投与から21日後にラットを安楽死させた後、心室を摘出し右心室、左心室および心室中隔の重量をそれぞれ測定し、左心室と心室中隔の総重量に対する右心室の重量の相対比を算出した(Kimura H, Kasahara Y, Kurosu K, Sugito K, Takiguchi Y, Terai M, Mikata A, Natsume M, Mukaida N, Matsushima K, Kuriyama T. Alleviation of monocrotaline-induced pulmonary hypertension by antibodies to monocyte chemotactic and activating factor/monocyte chemoattractant protein-1. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. May 1998;78(5):571-581.)。対照群も試験例6と同様に用意し試験した。
図7に左心室と心室中隔の総重量に対する右心室の重量の相対比を棒グラフで示した。
図7から、肺高血圧症モデルのMCTラットでは、Shamに対して右心室重量が増加しており(MCT)、比較例1で得られた組成物は、その右心室の重量増加を抑制していないことが分かる。一方、実施例2で得られた組成物は、MCT誘発性の相対的な右心室重量の増加を、比較例1で得られた組成物を投与した群に対して有意に抑えることが分かる。【０１０７】
試験例8
試験例1と同じ病態モデルラットを用いて、実施例2で得られた組成物を投与した場合に、肺動脈壁の肥大化を抑制することを確認した。
試験例6と同様に実施例2で得られた組成物を投与し、ラットを安楽死させた後に肺を摘出した。摘出した肺のうち右肺下部から4μm厚のパラフィン切片を作製した。これをエラスチカ・ワンギーソン染色(EV染色)し、肺血管壁の肥大化を結合組織の弾性線維を染めることで鑑別した。肺の切片あたり、20箇所の動脈壁の外殻の直径(外径)および内殻の直径(内径)を測定し、肥大化の度合いを以下の計算式から算出した〔% Wall thickness＝(内径×2)/(外径)×100〕( Ono S, Voelkel NF. PAF antagonists inhibit monocrotaline-induced lung injury and pulmonary hypertension. J Appl Physiol. Dec 1991; 71(6):2483-2492.参照)。対照群も試験例6と同様に用意し、試験した。
図8に各ラットにおける肺動脈の肥大化をEV染色によって可視化した顕微鏡画像を示した。
図9にこれら切片から肺動脈の肥大化の度合いを算出し［% Wall thickness］を棒グラフで示した。
図8から、肺高血圧症モデルのMCTラット(MCT)の切片から、MCTラットではShamラットに対して肺動脈周囲において肺血管壁の肥大化が進行し、中央の血管部位の狭窄が生じていることが分かる。比較例1で得られた組成物は、その肥大化を抑制していないが、一方、実施例2で得られた組成物が、MCT誘発性の肺動脈の肥大化を抑制し、狭窄が減少していることが分かる。
図9では、実施例2で得られた組成物が、比較例1で得られた組成物と比較して、肺高血圧症モデルのMCTラットにおける血管の肥大化を有意に抑制することを実測値から定量的に示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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