(57)【要約】  本発明の課題は、蛍光画像から合焦位置を特定し、組織標本全体の生体物質発現量の定量解析を可能にする画像処理装置、合焦位置特定方法及び合焦位置特定プログラムを提供することである。生体物質が蛍光ナノ粒子により染色された組織標本の細胞の形態を表す形態画像、及び前記形態画像と同一範囲かつ組織標本の高さ方向に焦点面を所定の間隔で異ならせた生体物質の発現を表す蛍光画像を入力する入力手段と、形態画像又は蛍光画像から細胞領域を抽出する第１抽出手段と、細胞領域ごとに、最も合焦している焦点面を合焦面として特定する合焦面特定手段と、細胞領域の合焦面における座標を特定する座標特定手段と、合焦面及び座標を記憶する記憶手段と、合焦面に対応する焦点面における蛍光画像から蛍光輝点領域を抽出する第２抽出手段と、蛍光輝点領域における輝度値又は蛍光ナノ粒子数を算出する算出手段と、を備える。
2019082788.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一又は複数種類の生体物質が蛍光ナノ粒子により染色された組織標本における、細胞の形態を表す形態画像、及び前記形態画像と同一範囲かつ組織標本の高さ方向に焦点面を所定の間隔で異ならせた前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す複数の蛍光画像を入力する入力手段と、
前記形態画像又は前記蛍光画像から細胞領域を抽出する第１抽出手段と、
前記第１抽出手段によって抽出された細胞領域ごとに、最も合焦している焦点面を合焦面として特定する合焦面特定手段と、
前記第１抽出手段によって抽出された細胞領域ごとに、当該細胞領域の前記合焦面における座標を特定する座標特定手段と、
前記第１抽出手段によって抽出された細胞領域ごとの、前記合焦面及び前記座標を記憶する記憶手段と、
前記第１抽出手段によって抽出された細胞領域ごとに、前記合焦面に対応する焦点面における前記蛍光画像から蛍光輝点領域を抽出する第２抽出手段と、
前記蛍光輝点領域における輝度値又は蛍光ナノ粒子数を算出する算出手段と、を備える
画像処理装置。
【請求項２】
前記形態画像は、組織標本の高さ方向に焦点面を所定の間隔で異ならせた細胞の形態を表す複数の形態画像であり、
前記蛍光画像は、複数の前記形態画像の各々と同一範囲及び各々の焦点面に対応した焦点面における前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す複数の蛍光画像である
請求項１に記載の画像処理装置。
【請求項３】
前記第１抽出手段は、細胞核を認識することで、前記形態画像から細胞領域を抽出する請求項１又は２に記載の画像処理装置。
【請求項４】
前記算出手段は、前記第１抽出手段によって抽出された細胞領域ごとに、輝度値又は蛍光色素集積粒子数を算出する請求項１から３のいずれか一項に記載の画像処理装置。
【請求項５】
前記第１抽出手段によって抽出された細胞領域ごとに、前記合焦面に対応する焦点面における前記蛍光画像から当該細胞領域に対応する部分の部分画像を前記座標に基づいて抽出し、抽出された各々の細胞領域の全ての部分画像を合成して一の合成画像を生成する画像合成手段を備える請求項１から４のいずれか一項に記載の画像処理装置。
【請求項６】
単一又は複数種類の生体物質が蛍光ナノ粒子により染色された組織標本における、細胞の形態を表す形態画像、及び前記形態画像と同一範囲かつ組織標本の高さ方向に焦点面を所定の間隔で異ならせた前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す複数の蛍光画像を入力する入力工程と、
前記形態画像又は前記蛍光画像から細胞領域を抽出する第１抽出工程と、
前記第１抽出工程によって抽出された細胞領域ごとに、最も合焦している焦点面を合焦面として特定する合焦面特定工程と、
前記第１抽出工程によって抽出された細胞領域ごとに、当該細胞領域の前記合焦面における座標を特定する座標特定工程と、
前記第１抽出工程によって抽出された細胞領域ごとの、前記合焦面及び前記座標を記憶する記憶工程と、
前記第１抽出工程によって抽出された細胞領域ごとに、前記合焦面に対応する焦点面における前記蛍光画像から蛍光輝点領域を抽出する第２抽出工程と、
前記蛍光輝点領域における輝度値又は蛍光ナノ粒子数を算出する算出工程と、を備える
合焦位置特定方法。
【請求項７】
コンピューターに、
単一又は複数種類の生体物質が蛍光ナノ粒子により染色された組織標本における、細胞の形態を表す形態画像、及び前記形態画像と同一範囲かつ組織標本の高さ方向に焦点面を所定の間隔で異ならせた前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す複数の蛍光画像を入力する入力手段、
前記形態画像又は前記蛍光画像から細胞領域を抽出する第１抽出手段、
前記第１抽出手段によって抽出された細胞領域ごとに、最も合焦している焦点面を合焦面として特定する合焦面特定手段、
前記第１抽出手段によって抽出された細胞領域ごとに、当該細胞領域の前記合焦面における座標を特定する座標特定手段、
前記第１抽出手段によって抽出された細胞領域ごとの、前記合焦面及び前記座標を記憶する記憶手段、
前記第１抽出手段によって抽出された細胞領域ごとに、前記合焦面に対応する焦点面における前記蛍光画像から蛍光輝点領域を抽出する第２抽出手段、
前記蛍光輝点領域における輝度値又は蛍光ナノ粒子数を算出する算出手段、
として機能させるための蛍光画像の合焦位置特定プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、画像処理装置、合焦位置特定方法及び合焦位置特定プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、がん診断方法として組織標本中の抗原を検出する免疫染色法が知られている。免疫染色法のなかでも、近年では酵素抗体法に代えて蛍光抗体法が使用されることが多くなってきている。「蛍光抗体法」とは、抗体に蛍光体を標識しておき、組織標本の染色（抗原抗体反応）後にその組織標本に励起光を照射し蛍光発光させ、これを蛍光顕微鏡で観察する手法である。
特許文献１には蛍光抗体法を用いた例が開示されている。特に特許文献１では、生体物質に結合した蛍光体を蛍光顕微鏡により観察し蛍光輝点数および蛍光強度を計測することで、生体物質の発現レベルを評価する手法が提案されている。【０００３】
上記蛍光輝点数及び蛍光強度を計測するには、高い倍率と開口数（ＮＡ）を有する光学系が必要となる。光学系の倍率や開口数が高くなると焦点深度が狭くなってしまうため、合焦位置の調整が重要になる。「合焦」とはいわゆるピント合わせのことであるが、合焦ずれが発生すると、蛍光輝点を含む顕微鏡画像（蛍光画像）において、蛍光輝点を見失う可能性がある。【０００４】
この点、蛍光画像の合焦位置の特定方法が特許文献２に開示されている。
特許文献２では、撮影範囲を組織標本の高さ方向（Ｚ方向）に複数に分割し、分割撮影範囲ごとに、ステージをＺ方向に下から上に等速移動させるとともに蛍光像を撮像する。その後、複数の蛍光像に対して周波数解析を実行し、最大周波数成分が最も高い蛍光像を選択する。選択した蛍光像について蛍光マーカーの軌跡の像を解析し、その解析結果に基づき複数の蛍光マーカーの分布情報を算出する。さらに、蛍光マーカーの分布情報からヒストグラム形式のデータを生成し、そのヒストグラムから合焦位置を特定している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１３−５７６３１号公報
【特許文献２】特開２０１３−１１４０４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、従来の蛍光色素を用いた染色では細胞表面のみならず細胞内部まで蛍光色素が浸透するため、焦点位置を変動させることで比較的容易に合焦位置を特定できる。しかしながら、蛍光色素による蛍光標識は輝度安定性に乏しく、また蛍光色素自体が退色しやすいため、定量的な解析には適していない。
これに対して、蛍光色素を内包した蛍光物質内包ナノ粒子や量子ドット等、高輝度の蛍光標識は、蛍光輝点数および蛍光強度を蛍光顕微鏡で計測することが可能であり、定量解析に適している。しかし、これらの蛍光標識は細胞表面に特異的に吸着するため、組織標本表面の凹凸に沿って吸着する一方で、細胞は高さ方向にも分布して存在する。したがって、ある焦点面で蛍光画像を撮像しても、合焦している細胞と合焦していない細胞とが混在することとなる。特許文献２に記載の合焦位置特定方法では、組織標本の高さ方向に焦点面を変えながら撮影を行っているものの、一枚の蛍光画像からは同一の焦点面内の蛍光情報しか得られないため、組織標本表面に吸着した蛍光輝点の総数を高精度かつ高再現性で定量することは難しい。また、生体物質の発現量が少ない場合や発現していない場合には、蛍光情報から焦点面を決定することが困難であるため、やはり定量的な解析は困難である。【０００７】
本発明は上記課題に鑑みてなされたものであって、蛍光画像から合焦位置を特定し、組織標本全体の生体物質発現量の定量解析を可能にする画像処理装置、合焦位置特定方法及び合焦位置特定プログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、請求項１に記載の画像処理装置は、
単一又は複数種類の生体物質が蛍光ナノ粒子により染色された組織標本における、細胞の形態を表す形態画像、及び前記形態画像と同一範囲かつ組織標本の高さ方向に焦点面を所定の間隔で異ならせた前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す複数の蛍光画像を入力する入力手段と、
前記形態画像又は前記蛍光画像から細胞領域を抽出する第１抽出手段と、
前記第１抽出手段によって抽出された細胞領域ごとに、最も合焦している焦点面を合焦面として特定する合焦面特定手段と、
前記第１抽出手段によって抽出された細胞領域ごとに、当該細胞領域の前記合焦面における座標を特定する座標特定手段と、
前記第１抽出手段によって抽出された細胞領域ごとの、前記合焦面及び前記座標を記憶する記憶手段と、
前記第１抽出手段によって抽出された細胞領域ごとに、前記合焦面に対応する焦点面における前記蛍光画像から蛍光輝点領域を抽出する第２抽出手段と、
前記蛍光輝点領域における輝度値又は蛍光ナノ粒子数を算出する算出手段と、を備える
ことを特徴とする。【０００９】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の画像処理装置において、
前記形態画像は、組織標本の高さ方向に焦点面を所定の間隔で異ならせた細胞の形態を表す複数の形態画像であり、
前記蛍光画像は、複数の前記形態画像の各々と同一範囲及び各々の焦点面に対応した焦点面における前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す複数の蛍光画像である
ことを特徴とする。【００１０】
請求項３に記載の発明は、請求項１又は２に記載の画像処理装置において、
前記第１抽出手段は、細胞核を認識することで、前記形態画像から細胞領域を抽出することを特徴とする。【００１１】
請求項４に記載の発明は、請求項１から３のいずれか一項に記載の画像処理装置において、
前記算出手段は、前記第１抽出手段によって抽出された細胞領域ごとに、輝度値又は蛍光色素集積粒子数を算出することを特徴とする。【００１２】
請求項５に記載の発明は、請求項１から４のいずれか一項に記載の画像処理装置において、
前記第１抽出手段によって抽出された細胞領域ごとに、前記合焦面に対応する焦点面における前記蛍光画像から当該細胞領域に対応する部分の部分画像を前記座標に基づいて抽出し、抽出された各々の細胞領域の全ての部分画像を合成して一の合成画像を生成する画像合成手段を備えることを特徴とする。【００１３】
請求項６に記載の合焦位置特定方法は、
単一又は複数種類の生体物質が蛍光ナノ粒子により染色された組織標本における、細胞の形態を表す形態画像、及び前記形態画像と同一範囲かつ組織標本の高さ方向に焦点面を所定の間隔で異ならせた前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す複数の蛍光画像を入力する入力工程と、
前記形態画像又は前記蛍光画像から細胞領域を抽出する第１抽出工程と、
前記第１抽出工程によって抽出された細胞領域ごとに、最も合焦している焦点面を合焦面として特定する合焦面特定工程と、
前記第１抽出工程によって抽出された細胞領域ごとに、当該細胞領域の前記合焦面における座標を特定する座標特定工程と、
前記第１抽出工程によって抽出された細胞領域ごとの、前記合焦面及び前記座標を記憶する記憶工程と、
前記第１抽出工程によって抽出された細胞領域ごとに、前記合焦面に対応する焦点面における前記蛍光画像から蛍光輝点領域を抽出する第２抽出工程と、
前記蛍光輝点領域における輝度値又は蛍光ナノ粒子数を算出する算出工程と、を備える
ことを特徴とする。【００１４】
請求項７に記載の合焦位置特定プログラムは、
コンピューターに、
単一又は複数種類の生体物質が蛍光ナノ粒子により染色された組織標本における、細胞の形態を表す形態画像、及び前記形態画像と同一範囲かつ組織標本の高さ方向に焦点面を所定の間隔で異ならせた前記生体物質の発現を蛍光輝点で表す複数の蛍光画像を入力する入力手段、
前記形態画像又は前記蛍光画像から細胞領域を抽出する第１抽出手段、
前記第１抽出手段によって抽出された細胞領域ごとに、最も合焦している焦点面を合焦面として特定する合焦面特定手段、
前記第１抽出手段によって抽出された細胞領域ごとに、当該細胞領域の前記合焦面における座標を特定する座標特定手段、
前記第１抽出手段によって抽出された細胞領域ごとの、前記合焦面及び前記座標を記憶する記憶手段、
前記第１抽出手段によって抽出された細胞領域ごとに、前記合焦面に対応する焦点面における前記蛍光画像から蛍光輝点領域を抽出する第２抽出手段、
前記蛍光輝点領域における輝度値又は蛍光ナノ粒子数を算出する算出手段、
として機能させる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、蛍光画像から合焦位置を特定し、組織標本全体の生体物質発現量の定量解析を可能にする画像処理装置、合焦位置特定方法及び合焦位置特定プログラムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明に係る合焦位置特定システムの概略構成を示す図である。
【図２】図１の画像処理装置の機能的構成を示すブロック図である。
【図３】明視野画像の一例を示す図である。
【図４】蛍光画像の一例を示す図である。
【図５】図２の制御部により実行される画像解析処理を示すフローチャートである。
【図６】図５のステップＳ２の処理の詳細を示すフローチャートである。
【図７Ａ】明視野画像を示す図である。
【図７Ｂ】細胞核が抽出された画像を示す図である。
【図８】図５のステップＳ４の処理の詳細を示すフローチャートである。
【図９】図５のステップＳ５の処理の詳細を示すフローチャートである。
【図１０】図５のステップＳ７の処理の詳細を示すフローチャートである。
【図１１Ａ】合成前の部分画像を示す図である。
【図１１Ｂ】合成した部分画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００１８】
＜合焦位置特定システム１００の構成＞
図１に、合焦位置特定システム１００の全体構成例を示す。
図１に示すように、合焦位置特定システム１００は、顕微鏡画像取得装置１Ａと、画像処理装置２Ａと、がケーブル３Ａなどのインターフェースを介してデータ送受信可能に接続されて構成されている。
顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２Ａとの接続方式は特に限定されない。たとえば、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２ＡはＬＡＮ（Local Area Network）により接続されることとしてもよいし、無線により接続される構成としてもよい。
【００１９】
顕微鏡画像取得装置１Ａは、公知のカメラ付き顕微鏡であり、スライド固定ステージ上に載置されたスライド上の組織切片の顕微鏡画像を取得し、画像処理装置２Ａに送信するものである。
顕微鏡画像取得装置１Ａは、照射手段、結像手段、撮像手段、通信Ｉ／Ｆなどを備えて構成されている。照射手段は、光源、フィルターなどにより構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の組織切片に光を照射する。結像手段は、接眼レンズ、対物レンズなどにより構成され、照射した光によりスライド上の組織切片から発せられる透過光、反射光、又は蛍光を結像する。撮像手段は、ＣＣＤ(Charge Coupled Device)センサーなどを備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して顕微鏡画像のデジタル画像データを生成する顕微鏡設置カメラである。通信Ｉ／Ｆは、生成された顕微鏡画像の画像データを画像処理装置２Ａに送信する。
顕微鏡画像取得装置１Ａでは、明視野観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた明視野ユニット、蛍光観察に適した照射手段及び結像手段を組み合わせた蛍光ユニットが備えられており、ユニットを切り替えることにより明視野／蛍光を切り替えることが可能である。
なお、公知の任意の顕微鏡（たとえば、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、電子顕微鏡等）にカメラを設置したものを顕微鏡画像取得装置１Ａとして用いることができる。
【００２０】
なお、顕微鏡画像取得装置１Ａとしては、カメラ付き顕微鏡に限定されず、たとえば、顕微鏡のスライド固定ステージ上のスライドをスキャンして組織切片全体の顕微鏡画像を取得するバーチャル顕微鏡スライド作成装置（たとえば、特表２００２−５１４３１９号公報参照）などを用いてもよい。バーチャル顕微鏡スライド作成装置によれば、スライド上の組織切片全体像を表示部で一度に閲覧可能な画像データを取得することができる。
【００２１】
画像処理装置２Ａは、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織切片における細胞ごとの合焦位置を特定する。
図２に、画像処理装置２Ａの機能構成例を示す。
図２に示すように、画像処理装置２Ａは、制御部２１、操作部２２、表示部２３、通信Ｉ／Ｆ２４、記憶部２５などを備えて構成され、各部はバス２６を介して接続されている。
【００２２】
制御部２１は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＲＡＭ（Random Access Memory）などを備えて構成され、記憶部２５に記憶されている各種プログラムとの協働により各種処理を実行し、画像処理装置２Ａの動作を統括的に制御する。
たとえば、制御部２１は、記憶部２５に記憶されている画像処理プログラムとの協働により画像解析処理を実行し、第１抽出手段、合焦面特定手段、座標特定手段、第２抽出手段、算出手段、画像合成手段としての機能を実現する。
【００２３】
操作部２２は、文字入力キー、数字入力キー、各種機能キーなどを備えたキーボードと、マウスなどのポインティングデバイスを備えて構成され、キーボードで押下操作されたキーの押下信号とマウスによる操作信号とを、入力信号として制御部２１に出力する。
【００２４】
表示部２３は、たとえばＣＲＴ（Cathode Ray Tube）やＬＣＤ（Liquid Crystal Display）などのモニタを備えて構成されており、制御部２１から入力される表示信号の指示に従って、各種画面を表示する。
【００２５】
通信Ｉ／Ｆ２４は、顕微鏡画像取得装置１Ａをはじめとする外部機器との間でデータ送受信を行なうためのインターフェースである。通信Ｉ／Ｆ２４は、蛍光画像及び形態画像の入力手段としての機能を実現する。
【００２６】
記憶部２５は、たとえばＨＤＤ（Hard Disk Drive）や半導体の不揮発性メモリーなどで構成されている。記憶部２５には、前述のように各種プログラムや各種データ、及び後述する細胞領域の細胞の座標や細胞ごとの合焦位置等が記憶され、記憶手段としての機能を実現する。
その他、画像処理装置２Ａは、ＬＡＮアダプターやルーターなどを備え、ＬＡＮなどの通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。
【００２７】
＜画像について＞
本実施形態では、画像処理装置２Ａは、たとえば、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された、細胞における特定の生体物質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像、及び細胞全体の形態や、細胞核、細胞膜等、細胞の所定の構造の形態を表す形態画像（たとえば、明視野画像）を用いて解析を行うことが好ましい。
【００２８】
「明視野画像」とは、たとえば、ヘマトキシリン染色試薬（Ｈ染色試薬）、ヘマトキシリン−エオジン染色試薬（ＨＥ染色試薬）を用いて染色された組織切片を、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて明視野で拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像であって、当該組織切片における細胞の形態を表す細胞形態画像である。図３に明視野画像の一例を示す。ヘマトキシリン（Ｈ）は青紫色の色素であり、細胞核、骨組織、軟骨組織の一部、漿液成分など（好塩基性の組織など）を染色する。エオジン（Ｅ）は赤〜ピンク色の色素であり、細胞質、軟部組織の結合組織、赤血球、線維素、内分泌顆粒など（好酸性の組織など）を染色する。
細胞の形態画像としては、明視野画像の他に、細胞の診断対象とする構造を特異的に染色可能な蛍光染色試薬を用いて組織切片を染色し、用いた蛍光染色試薬が発する蛍光を撮影した蛍光画像を用いても良い。形態画像の取得に用いることができる蛍光染色試薬としては、たとえば、細胞核を染色可能なＤＡＰＩ染色、細胞質を染色可能なパパロニコロウ染色等が挙げられる。また、位相差画像、微分干渉画像、電子顕微鏡画像等を形態画像として用いても良い。
【００２９】
細胞における特定の生体物質の発現を蛍光輝点で表す「蛍光画像」は、蛍光染色試薬を用いて染色された組織切片に対し、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて所定波長の励起光を照射して蛍光物質を発光させ、この蛍光を拡大結像及び撮影することにより得られる顕微鏡画像である。図４に蛍光画像の一例を示す。
蛍光染色試薬としては、本発明においては、特定の生体物質と特異的に結合及び／又は反応する蛍光ナノ粒子を指す。なお、「蛍光ナノ粒子」とは、詳しくは後述するが、励起光の照射を受けて蛍光発光するナノサイズの粒子であって、特定の生体物質を１分子ずつ輝点として表すのに十分な強度の蛍光を発光しうる粒子である。
蛍光ナノ粒子として、好ましくは量子ドット（半導体ナノ粒子）、蛍光物質内包ナノ粒子が使用される。好ましくは発光波長が顕微鏡画像取得装置１Ａの撮像手段の感度域内に存在するナノ粒子であって、詳しくは発光波長が４００〜７００ｎｍのナノ粒子が使用される。
【００３０】
＜蛍光染色試薬や染色方法など＞
以下、細胞に特異的に発現する特定の生体物質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像を取得するための蛍光染色試薬や当該蛍光染色試薬を用いた組織切片の染色方法について説明する。
【００３１】
（１）蛍光物質
蛍光染色試薬に用いられる蛍光物質としては、蛍光有機色素及び量子ドット（半導体粒子）を挙げることができる。２００〜７００ｎｍの範囲内の波長の紫外〜近赤外光により励起されたときに、４００〜１１００ｎｍの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示すことが好ましい。
【００３２】
蛍光有機色素としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ系色素分子、シアニン系色素分子などを挙げることができる。
具体的には、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン  ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７などを挙げることができる。これら蛍光有機色素は単独で使用されてもよいし、複数種を混合して使用されてもよい。
【００３３】
量子ドットとしては、II−VI族化合物、III−V族化合物、又はIV族元素を成分として含有する量子ドット（それぞれ、「II−VI族量子ドット」、「III−V族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。）のいずれかを用いることができる。これら量子ドットも単独で使用されてもよいし、複数種を混合して使用されてもよい。
具体的には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
上記量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。下記では、シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがＣｄＳｅ、シェルがＺｎＳの場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳと表記する。
たとえば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ、Ｓｉ／ＳｉＯ2、Ｓｉ／ＺｎＳ、Ｇｅ／ＧｅＯ2、Ｇｅ／ＺｎＳなどを用いることができるが、これらに限定されない。
【００３５】
量子ドットは必要に応じて、有機ポリマーなどにより表面処理が施されているものを用いてもよい。たとえば、表面カルボキシ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）、表面アミノ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）などが挙げられる。
【００３６】
（２）蛍光物質内包ナノ粒子
「蛍光物質内包ナノ粒子」とは、上記のような蛍光物質を内包したナノ粒子であって、詳しくは蛍光物質をナノ粒子の内部に分散させたものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していてもよいし、結合していなくてもよい。
ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、シリカ、ポリスチレン、ポリ乳酸、メラミンなどを挙げることができる。
【００３７】
蛍光物質内包ナノ粒子は、公知の方法により作製することが可能である。
たとえば、蛍光有機色素を内包したシリカナノ粒子は、ラングミュア  ８巻  ２９２１ページ（１９９２）に記載されているＦＩＴＣ内包シリカ粒子の合成を参考に合成することができる。ＦＩＴＣの代わりに所望の蛍光有機色素を用いることで種々の蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を合成することができる。
量子ドットを内包したシリカナノ粒子は、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー  ３３巻  ５６１ページ（２００９）に記載されているＣｄＴｅ内包シリカナノ粒子の合成を参考に合成することができる。
蛍光有機色素を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許４３２６００８（１９８２）に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許５３２６６９２（１９９２）に記載されているポリスチレンナノ粒子への蛍光有機色素の含浸法を用いて作製することができる。
量子ドットを内包したポリマーナノ粒子は、ネイチャー・バイオテクノロジー１９巻６３１ページ（２００１）に記載されているポリスチレンナノ粒子への量子ドットの含浸法を用いて作製することができる。
【００３８】
蛍光物質内包ナノ粒子の平均粒径は特に限定されないが、３０〜８００ｎｍ程度のものを用いることができる。また、粒径のばらつきを示す変動係数（＝（標準偏差／平均値）×１００％）は特に限定されないが、２０％以下のものを用いることが好ましい。
平均粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径として求めた値である。本実施形態では、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とする。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とする。
【００３９】
（３）生体物質認識部位と蛍光ナノ粒子との結合
本実施形態では、特定の生体物質と特異的に結合及び／又は反応する蛍光染色試薬として、蛍光ナノ粒子と生体物質認識部位を予め直接結合したものを用いる場合を例にとって説明する。「生体物質認識部位」とは、特定の生体物質と特異的に結合及び／又は反応する部位である。
特定の生体物質としては、それと特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されるものではないが、代表的にはタンパク質（ペプチド）及び核酸（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）などが挙げられる。
したがって、生体物質認識部位としては、前記タンパク質を抗原として認識する抗体やそれに特異的に結合する他のタンパク質など、及び前記核酸にハイブリタイズする塩基配列を有する核酸などが挙げられる。
具体的な生体物質認識部位としては、細胞表面に存在するタンパク質であるＨＥＲ２に特異的に結合する抗ＨＥＲ２抗体、細胞核に存在するエストロゲン受容体（ＥＲ）に特異的に結合する抗ＥＲ抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体などが挙げられる。
中でも、抗ＨＥＲ２抗体及び抗ＥＲ抗体を蛍光ナノ粒子に結合させたもの（蛍光染色試薬）は、乳癌の投薬選定に用いることができ、好ましい。
【００４０】
生体物質認識部位と蛍光ナノ粒子の結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着などが挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。
【００４１】
生体物質認識部位と蛍光ナノ粒子との間にはこれらを連結する有機分子があってもよい。たとえば、生体物質との非特異的吸着を抑制するため、ポリエチレングリコール鎖を用いることができ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＳＭ（ＰＥＧ）１２を用いることができる。
【００４２】
蛍光物質内包シリカナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。
たとえば、無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基などの官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。
具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤（たとえば、Ｇｅｌｅｓｔ社製ＰＥＧ−ｓｉｌａｎｅ  ｎｏ．ＳＩＭ６４９２．７）などが挙げられる。
シランカップリング剤を用いる場合、２種以上を併用してもよい。
【００４３】
蛍光有機色素内包シリカナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。
たとえば、得られた蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で１２時間反応させる。反応終了後、遠心分離又はろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を得ることができる。続いてアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を蛍光有機色素内包シリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じて、ＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）社製）のような縮合剤を用いることもできる。
【００４４】
必要により、有機分子で修飾された蛍光有機色素内包シリカナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。具体例として、アミノ基と選択的に反応する部位とメルカプト基と選択的に反応する部位の両方をもつｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した蛍光有機色素内包シリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基を結合させることで、抗体結合した蛍光有機色素内包シリカナノ粒子ができる。
【００４５】
蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。すなわち、アミノ基などの官能基をもつポリスチレンナノ粒子へ蛍光有機色素、量子ドットを含浸することにより、官能基もつ蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子を得ることができ、以降ＥＤＣ又はｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを用いることで、抗体結合した蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子ができる。
【００４６】
生体物質認識部位の一例として、M.アクチン、M.S.アクチン、S.M.アクチン、ACTH、Alk-1、α1-アンチキモトリプシン、α1-アンチトリプシン、AFP、bcl-2、bcl-6、β-カテニン、BCA  225、CA19-9、CA125、カルシトニン、カルレチニン、CD1a、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD15、CD20、CD21、CD23、CD30、CD31、CD34、CD43、CD45、CD45R、CD56、CD57、CD61、CD68、CD79a、"CD99,  MIC2"、CD138、クロモグラニン、c-KIT、c-MET、コラーゲン  タイプIV、Cox-2、サイクリンD1、ケラチン、サイトケラチン（高分子量）、パンケラチン、パンケラチン、サイトケラチン  5/6、サイトケラチン  7、サイトケラチン  8、サイトケラチン  8/18、サイトケラチン  14、サイトケラチン  19、サイトケラチン  20、CMV、E-カドヘリン、EGFR、ER、EMA、EBV、第VIII因子関連抗原、ファッシン、FSH、ガレクチン-3、ガストリン、GFAP、グルカゴン、グリコフォリン  A、グランザイムB、hCG、hGH、ヘリコバクターピロリ、HBc抗原、HBs抗原、ヘパトサイト特異抗原、HER2、HSV-I、HSV-II、HHV-8、IgA、IgG、IgM、IGF-1R、インヒビン、インスリン、カッパL鎖、Ki67、ラムダL鎖、LH、リゾチーム、マクロファージ、メランA、MLH-1、MSH-2、ミエロパーオキシダーゼ、ミオゲニン、ミオグロビン、ミオシン、ニューロフィラメント、NSE、p27(Kip1)、p53、P63、PAX  5、PLAP、ニューモシスティス  カリニ、ポドプラニン（D2-40）、PGR、プロラクチン、PSA、前立腺酸性フォスファターゼ、Renal  Cell  Carcinoma、S100、ソマトスタチン、スペクトリン、シナプトフィジン、TAG-72、TdT、サイログロブリン、TSH、TTF-1、TRAcP、トリプターゼ、ビリン、ビメンチン、WT1、Zap-70などの特定抗原を認識する抗体が挙げられる。
【００４７】
なお、蛍光ナノ粒子は、上記のように生体物質認識部位と予め直接結合して用いる他、免疫染色における公知の間接法のように、染色工程において間接的に生体物質認識部位に結合されても良い。具体的には、たとえば、組織標本に対して特定の生体物質を抗原とするビオチン化一次抗体を反応させた後、ストレプトアビジンにより修飾された蛍光ナノ粒子を結合させた染色試薬をさらに反応させて、ストレプトアビジンとビオチンが特異的に結合して複合体を形成することを利用して染色しても良い。また、たとえば、組織標本に対して、特定タンパクを抗原とする一次抗体を反応させ、さらに当該一次抗体を抗原とするビオチン化二次抗体を反応させた後、ストレプトアビジンにより修飾された蛍光ナノ粒子を反応させて染色しても良い。
【００４８】
（４）染色方法
組織切片の作製方法は特に限定されず、公知の方法により作製されたものを用いることができる。下記染色方法は病理組織切片に限定せず、培養細胞にも適用可能である。
【００４９】
（４．１）脱パラフィン工程
キシレンを入れた容器に組織切片を浸漬させ、パラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
次いで、エタノールを入れた容器に組織切片を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
次いで、水を入れた容器に組織切片を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
【００５０】
（４．２）賦活化処理
公知の方法にならい、組織切片の生体物質の賦活化処理を行う。
賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。加熱機器は、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０〜１３０℃、時間は５〜３０分で行うことができる。
次いで、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline：リン酸緩衝生理食塩水）を入れた容器に、賦活化処理後の組織切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
【００５１】
（４．３）蛍光染色試薬を用いた染色
蛍光染色試薬のＰＢＳ分散液を組織切片に載せ、組織切片の生体物質と反応させる。
蛍光染色試薬の生体物質認識部位を変えることにより、さまざまな生体物質に対応し染色が可能となる。蛍光染色試薬として、数種類の生体物質認識部位が結合された蛍光ナノ粒子を用いる場合には、それぞれの蛍光ナノ粒子ＰＢＳ分散液を予め混合しておいてもよいし、別々に順次組織切片に載せてもよい。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
蛍光染色試薬による染色を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳなど、公知のブロッキング剤を滴下することが好ましい。
次いで、ＰＢＳを入れた容器に、染色後の組織切片を浸漬させ、未反応の蛍光ナノ粒子の除去を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。カバーガラスを組織切片に載せ、封入する。必要に応じて市販の封入剤を使用してもよい。
【００５２】
なお、形態画像を得るためにＨＥ染色等を実施する場合は、カバーガラスによる封入前の任意の段階に行う。
【００５３】
（５）蛍光画像の取得
染色した組織切片に対し顕微鏡画像取得装置１Ａを用いて、顕微鏡画像（蛍光画像）を取得する。励起光源と蛍光検出用光学フィルターは、蛍光染色試薬に用いた蛍光物質の吸収極大波長及び蛍光波長に対応したものを適宜選択する。
【００５４】
＜合焦位置特定システム１００の動作＞
以下、合焦位置特定システム１００において、上記説明した蛍光画像及び明視野画像を取得して解析を行う動作について説明する。
ここでは、特定のタンパク質（たとえば、乳癌組織においてはＫｉ６７タンパク等。以下、特定タンパクと呼ぶ。）を認識する生体物質認識部位が結合した蛍光物質内包ナノ粒子を含む染色試薬を用いて染色された組織標本を観察対象とする場合を例にとり説明する。ただし、これに限定されず、本発明においては異なる発光特性の蛍光ナノ粒子を用いて複数種類の生体物質を染色し、同一画面上で観察することもできる。
【００５５】
まず、操作者は、ＨＥ染色試薬と、特定タンパクを認識する生体物質認識部位が結合した蛍光物質内包ナノ粒子を蛍光標識材料とした染色試薬との、２種の染色試薬を用いて組織標本を染色する。
その後、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて、（ａ１）〜（ａ５）の手順により明視野画像及び蛍光画像が取得される。
（ａ１）操作者は、ヘマトキシリン染色試薬と蛍光物質内包ナノ粒子を含む染色試薬とにより染色された組織標本をスライドに載置し、そのスライドを顕微鏡画像取得装置１Ａのスライド固定ステージに設置する。
（ａ２）明視野ユニットに設定し、撮影倍率、ピントの調整を行い、組織上の観察対象の領域を視野に納める。
（ａ３）撮像手段によって、組織標本の上面から下面まで、組織標本の高さ方向（Ｚ方向）に所定の間隔（例えば、０．５ｕｍ）を空けて焦点面をずらしながら撮影を行って複数枚の明視野画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。
（ａ４）ユニットを蛍光ユニットに変更する。
（ａ５）視野及び撮影倍率を変えずに撮像手段によって、組織標本の高さ方向に焦点面をずらしながら、明視野画像撮影時の焦点面に対応する焦点面の蛍光像の撮影を行って複数枚の蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。
【００５６】
なお、複数種類の生体物質を染色する場合には、上記（ａ５）の工程を繰り返す。各蛍光画像の取得に用いる励起光及びフィルターは、発光特性に適した組み合わせを適宜選択する。
【００５７】
画像処理装置２Ａにおいては、明視野画像及び蛍光画像に基づき画像解析処理が実行される。
図５に、画像処理装置２Ａにおける画像解析処理のフローチャートを示す。図５に示す画像解析処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
【００５８】
まず、通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１ＡからＺ方向に所定の間隔を空けて複数枚撮影された明視野画像の全てが入力されると（ステップＳ１）、各明視野画像から細胞核領域の抽出が行われる（ステップＳ２）。
図６に、ステップＳ２における処理の詳細フローを示す。ステップＳ２の処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
【００５９】
ステップＳ２においては、まず、各々の明視野画像についてモノクロ画像への変換が行われる（ステップＳ２０１）。図７Ａに、明視野画像の一例を示す。
次いで、モノクロ画像に対し予め定められた閾値を用いて閾値処理が施され、各画素の値が二値化される（ステップＳ２０２）。
【００６０】
次いで、ノイズ処理が行われる（ステップＳ２０３）。ノイズ処理は、具体的には、二値画像にクロージング処理が施されることにより行うことができる。クロージング処理は、膨張処理を行ってから同じ回数分だけ収縮処理を行う処理である。膨張処理は、注目画素からｎ×ｎ画素（ｎは２以上の整数）の範囲内にある画素に１つでも白が含まれている場合に注目画素を白に置き換える処理である。収縮処理は、注目画素からｎ×ｎ画素の範囲内にある画素に１つでも黒が含まれている場合に注目画素を黒に置き換える処理である。クロージング処理により、ノイズ等の小さい領域を除去することができる。図７Ｂに、ノイズ処理後の画像の一例を示す。図７Ｂに示すように、ノイズ処理後には、細胞核が抽出された画像（細胞核画像）が生成される。
【００６１】
次いで、ノイズ処理後の画像にラベリング処理が施され、抽出された細胞核のそれぞれにラベルが付与される（ステップＳ２０４）。ラベリング処理とは、連結している画素に同じラベル（番号）を付与していくことで画像内のオブジェクトを識別する処理である。ラベリング処理により、ノイズ処理後の画像から各細胞核を識別してラベルを付与することができる。なお、ステップＳ２の処理は、入力された複数の明視野画像の全てについて実行される。
【００６２】
ステップＳ３においては、各明視野画像から細胞領域の抽出が行われる。細胞領域の抽出は、細胞核を認識し、細胞膜を境界として切り出すことで行われる。細胞核の認識には、例えば細胞核の色味、大きさ、真円度等の値が用いられる。なお、ステップＳ３の処理は、入力された複数の明視野画像の全てについて実行される。
【００６３】
ステップＳ４においては、細胞ごとに平面内の細胞位置の特定が行われる。
図８に、ステップＳ４における処理の詳細フローを示す。ステップＳ４の処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
【００６４】
まず、ステップＳ３において抽出された個々の細胞領域について、中心点を決定する（ステップＳ４０１）。細胞領域の中心点とは、例えば細胞の外縁に接するように細胞を囲んだ四角形の中心となる点とする。
【００６５】
次いで、ステップＳ４０１で決定した中心点の、画像平面上の座標（以降、ＸＹ座標と表記）を取得し（ステップＳ４０２）、当該ＸＹ座標を記憶部２５によって記憶させる（ステップＳ４０３）。なおステップＳ４の処理は、入力された複数の明視野画像の全てについて実行する必要はなく、各々の細胞について、その中心点及びそのＸＹ座標を特定可能な明視野画像について実行すれば足りる。
ステップＳ４の処理によって各細胞の平面内の位置が記憶されるため、後述する細胞ごとの合焦高さの特定時に、Ｚ方向に高さの異なる焦点面の画像を扱う場合でも、細胞を見失うことなく解析を続行することが可能となる。
【００６６】
ステップＳ５においては、細胞ごとに合焦位置の特定が行われる。
図９に、ステップＳ５における処理の詳細フローを示す。ステップＳ５の処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
【００６７】
まず、ステップＳ３において抽出された各々の細胞領域について、細胞領域ごとに複数枚の明視野画像のうち最も合焦した画像を特定する（ステップＳ５０１）。細胞が最も合焦している画像の特定には、例えば細胞核の大きさ（直径、面積、周長等）や、コントラスト等を用いることができる。この時、ステップＳ４において各々の細胞のＸＹ座標が記憶部２５によって記憶されているため、Ｚ方向に高さが異なる画像間で細胞の形状や大きさが変化しても、細胞を見失うことなく処理を実行することが可能である。
次いで、最も合焦している画像のＺ方向の座標（以降、Ｚ座標と表記）を記憶部２５によって記憶させる（ステップＳ５０２）。
【００６８】
一方、通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの蛍光画像が入力されると（ステップＳ６）、蛍光画像から輝点領域が抽出される（ステップＳ７）。なお、ステップＳ７の処理は、ステップＳ５において特定された、個々の細胞が最も合焦する画像について実行する。
図１０に、ステップＳ７における処理の詳細フローを示す。ステップＳ７の処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されているプログラムとの協働により実行される。
【００６９】
ステップＳ７においては、まず、蛍光画像から蛍光輝点の波長に応じた色成分の抽出が行われる（ステップＳ７０１）。ステップＳ７０１では、たとえば、蛍光粒子の発光波長が５５０ｎｍである場合には、その波長成分を有する蛍光輝点のみが画像として抽出される。
【００７０】
次いで、抽出された画像に閾値処理が施され、二値化画像が生成され、蛍光輝点を中心とした輝点領域が抽出される（ステップＳ７０２）。
なお、閾値処理の前に細胞自家蛍光や他の不要信号成分等のノイズ除去処理が施されてもよく、ガウシアンフィルタ等のローパスフィルタや二次微分等のハイパスフィルタが好ましく用いられる。
【００７１】
次いで、輝点領域にラベリング処理が施され、抽出された輝点領域のそれぞれにラベルが付与される（ステップＳ７０３）。
【００７２】
ステップＳ５とステップＳ７の処理の終了後、図５の処理に戻り、細胞ごとに細胞画像と輝点領域画像の加算処理が行われる（ステップＳ８）。ステップＳ８における加算処理は、ステップＳ７で輝点領域が抽出された蛍光画像と、これとＺ座標が同一の明視野画像とが加算される。即ち、ステップＳ８の処理によって、個々の細胞について最も合焦している明視野画像に、その表面に結合した蛍光ナノ粒子の輝点が表示された蛍光画像が重ね合わされた第２の蛍光画像が得られる。
【００７３】
次いで、ステップＳ８において合成された第２の蛍光画像を用いて、細胞ごとの蛍光ナノ粒子数を算出する（ステップＳ９）。ここで、細胞ごとの蛍光ナノ粒子数は、例えば「細胞膜の内側に存在する輝点」をカウントすることで算出することが可能である。あるいは、例えば「細胞膜外の１０ピクセルの内側に存在する輝点」といった基準を設け、細胞膜外の一定の領域を含めるものとしてもよい。以上の処理により、画像解析システムを終了する。
【００７４】
以上説明したように、本実施形態に係る合焦位置特定システム１００は、組織標本の高さ方向に焦点面を変えながら、形態画像及び蛍光画像を撮像する顕微鏡画像取得装置１Ａと、撮像された形態画像及び蛍光画像に画像処理を施す画像処理装置２Ａと、を備え、画像処理装置は、複数の明視野画像及び複数の蛍光画像を入力する入力手段としての通信Ｉ／Ｆと、明視野画像から細胞領域を抽出する第１抽出手段、細胞領域ごとに最も合焦している焦点面を特定する合焦面特定手段、細胞領域ごとに当該細胞領域の焦点面における座標を特定する座標特定手段、細胞領域ごとに最も合焦している焦点面における蛍光画像から蛍光輝点領域を抽出する第２抽出手段、蛍光輝点領域における輝度値又は蛍光色素集積粒子数を算出する算出手段、として機能する制御部２１と、焦点面及び座標を記憶する記憶手段としての記憶部２５と、を備える。したがって、本発明に係る合焦位置特定システム１００によれば、細胞領域ごとに合焦位置を特定することが可能となる。即ち、組織標本におけるすべての細胞について合焦位置を特定することができるため、組織標本全体における生体物質発現量を精度よく定量解析することが可能となる。
【００７５】
また、本発明に係る合焦位置特定システム１００は、明視野画像から細胞核を認識し、細胞核の色味、大きさ、真円度等の値を用いて細胞領域を抽出する。細胞核は細胞内の他の領域に比べて認識が容易であるため、細胞抽出に適している。
【００７６】
また、本発明に係る合焦位置特定システム１００は、抽出された細胞領域ごとの蛍光ナノ粒子数を算出する。したがって、細胞領域ごとの値を合算することで、組織標本全体の蛍光ナノ粒子数を算出することができる。
【００７７】
なお、本発明に係る合焦位置特定システム１００によれば、細胞ごとに最も合焦した明視野画像から細胞領域を切り出した部分画像を作成し、全ての細胞領域の部分画像を蛍光合成することで、１枚の蛍光画像を再構築することが可能である。
具体的には、図５のステップＳ８において、細胞ごとに細胞画像と輝点領域画像を加算した画像が得られる。例えば、図１１Ａに示すように、明視野画像Ｐ１において細胞Ｃ１及びＣ２が、明視野画像Ｐ２において細胞Ｃ３が、明視野画像Ｐ３において細胞Ｃ４及びＣ５が合焦しているとする（なお、図中のｎは細胞核を、ｆは蛍光輝点を示す）。これらの明視野画像から細胞領域を抽出し、輝点領域画像が加算されて部分画像が作成される。そして図１１Ｂに示すように、各々の細胞についての部分画像を、画像合成手段としての制御部２１により、ＸＹ座標に基づいて同一平面上に再構築する。これにより、全ての細胞領域が合焦し、かつ各々の細胞領域に蛍光輝点が描かれた一枚の蛍光画像Ｐ０を得ることができる。
あるいは、蛍光ナノ粒子によって組織切片を免疫染色するとともに、細胞核をＤＡＰＩ等の蛍光色素で染色し、上述のように焦点面を変えながら複数枚の蛍光画像を撮像する。撮像した蛍光画像から細胞領域を抽出し、細胞領域ごとに最も合焦しているＺ座標を導出することでも同様の効果を得られる。この場合、蛍光画像は形態画像としての機能も果たす。
これにより、目的のタンパク質の定量等の種々の解析を一枚の画像をもとに実行することができるため、効率的である。
【００７８】
［他の実施形態］
以上、本発明に係る実施形態に基づいて具体的に説明したが、上記の実施形態は本発明の好適な一例であり、これに限定されない。
【００７９】
上記実施形態においては、生体物質の定量解析として、図５のステップＳ９にいて蛍光ナノ粒子数を算出するものとしたが、これに限定されず、蛍光輝点領域における輝度値を算出することによっても、生体物質の発現量を定量することが可能である。
【００８０】
また、上記実施形態においては、細胞の抽出を、細胞核を認識することによって実行するものとしたが、これに限定されず、例えば細胞膜等の他の器官を認識することによっても実行可能である。
【００８１】
また、上記実施形態においては、明視野画像を組織標本の高さ方向に焦点面を異ならせた複数枚の画像としたが、明視野画像は必ずしも複数枚である必要はなく、視野内の細胞を抽出可能であれば一枚の画像であってもよい。
【００８２】
また、上記実施形態において、明視野画像と蛍光画像とで合焦位置のズレが予めわかっている場合には、明視野画像の合焦位置に、オフセット値を考慮した高さの蛍光画像から輝点を抽出して、蛍光ナノ粒子数あるいは輝度値を算出するものとしてもよい。
【００８３】
また、上記実施形態においては、特定タンパクの例として１種類の生体物質の発現量を定量する場合について説明したが、これに限定されず、発光特性の異なる蛍光ナノ粒子を用いることによって、複数種類の生体物質の定量を行うことも可能である。たとえば、乳癌組織においては、ホルモン受容体（エストロゲン受容体（ＥＲ）及びプロゲステロン受容体（ＰｇＲ））、ＨＥＲ２、及びＫｉ６７の発現解析によって、乳癌のサブタイプの分類を行うことができる。
【００８４】
また、上記実施形態においては、細胞特徴量として細胞の形状を利用するものとしたが、これに限定されるものではなく、細胞核の形状を細胞特徴量として抽出してもよい。これにより、たとえば癌細胞における細胞核の肥大化などの異型性を検出することで、陽性細胞又は陰性細胞の分類を行うことができる。
【００８５】
また、上記の説明では、本発明に係るプログラムのコンピューター読み取り可能な媒体としてＨＤＤや半導体の不揮発性メモリー等を使用した例を開示したが、この例に限定されない。その他のコンピューター読み取り可能な媒体として、ＣＤ-ＲＯＭ等の可搬型記録媒体を適用することが可能である。また、本発明に係るプログラムのデータを、通信回線を介して提供する媒体として、キャリアウエーブ(搬送波)も適用される。
【００８６】
その他、合焦位置特定システム１００を構成する各装置の細部構成及び細部動作に関しても、発明の趣旨を逸脱することのない範囲で適宜変更可能である。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明は、画像処理装置、合焦位置特定方法及び合焦位置特定プログラムに利用できる。
【符号の説明】
【００８８】
１Ａ  顕微鏡画像取得装置
２Ａ  画像処理装置
３Ａ  ケーブル
２１  制御部（入力手段、第１抽出手段、合焦面特定手段、座標特定手段、第２抽出手段、算出手段、画像合成手段）
２２  操作部
２３  表示部
２４  通信Ｉ／Ｆ（入力手段）
２５  記憶部（記憶手段）
２６  バス
１００  合焦位置特定システム
【図１】
2019082788.tif 000003
【図２】
2019082788.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【国際調査報告】
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