(57)【要約】  未利用原料を新たに用いることによって、高い安全性とともに、資源再利用の観点からも酵素活性阻害効果の観点からも優れた低コストな新しいタイプの酵素活性阻害剤を提供する。  酵素活性阻害剤は、以下の一般式（I）で表される有効成分を含有し、【化１】2019082909.tif 000030（但し、Ｘ１〜Ｘ５は、各々互いに独立して、以下の一般式（II）で表される置換基Ａまたは水素原子であり、当該置換基Ａが上記式中に少なくとも２つ含まれ、Ｘ１〜Ｘ５のうちの隣接する置換基Ａ同士が直接又は架橋構造を介して相互連結されていてもよい）【化２】2019082909.tif 000031（但し、ｍは、１〜３の整数であり、水酸基を構成する水素原子の少なくとも一部が置換基Ａで置換されていてもよい）  コラゲナーゼまたはエラスターゼの酵素活性を阻害する。
2019082909.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（I）で表される有効成分を含有し、【化１】
2019082909.tif 000028
（但し、Ｘ１〜Ｘ５は、各々互いに独立して、以下の一般式（II）で表される置換基Ａまたは水素原子であり、当該置換基Ａが上記式中に少なくとも２つ含まれ、Ｘ１〜Ｘ５のうちの隣接する置換基Ａ同士が直接又は架橋構造を介して相互連結されていてもよい）
【化２】
2019082909.tif 000029
（但し、ｍは、１〜３の整数であり、水酸基を構成する水素原子の少なくとも一部が置換基Ａで置換されていてもよい）  コラゲナーゼまたはエラスターゼの酵素活性を阻害することを特徴とする  酵素活性阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載の酵素活性阻害剤において、  前記有効成分が、ジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパイン、もしくはこれらの類縁体から成る群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする  酵素活性阻害剤。
【請求項３】
請求項１に記載の酵素活性阻害剤において、  前記有効成分が、ジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、およびＤＢＴＧ、もしくはこれらの類縁体から成る群から選択される少なくとも１つであり、  ヒアルロニダーゼまたはチロシナーゼの酵素活性を阻害することを特徴とする  酵素活性阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の酵素活性阻害剤において、  前記有効成分が、菱科植物の果皮を抽出および／または粉砕して得られたものであることを特徴とする  酵素活性阻害剤。
【請求項５】
請求項４に記載の酵素活性阻害剤において、  少なくとも１つの前記有効成分を含有し、さらに／または、前記有効成分に相当する成分を含有し、さらに／または、前記有効成分と同等の物質を含有することを特徴とする  酵素活性阻害剤。
【請求項６】
菱科植物の果皮の抽出物および／または粉砕物を有効成分として含有する酵素活性阻害剤であって、当該酵素が、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、またはチロシナーゼであることを特徴とする  酵素活性阻害剤。
【請求項７】
請求項６に記載の酵素活性阻害剤において、  前記酵素が、コラゲナーゼまたはエラスターゼであることを特徴とする  酵素活性阻害剤。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれかに記載の酵素活性阻害剤において、  菱科植物が、ワビシ（Ｔｒａｐａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、オニビシ（Ｔｒａｐａ  ｎａｔａｎｓ）、トウビシ（Ｔｒａｐａ  ｂｉｃｏｒｎｉｓ）、およびヒメビシ（Ｔｒａｐａ  ｉｎｃｉｓａ）から成る群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする  酵素活性阻害剤。
【請求項９】
請求項１〜請求項８のいずれかに記載の酵素活性阻害剤において、  経口剤、肌用塗布剤、皮下注射剤、点鼻剤、および点眼剤からなる群から選択される薬剤として、または、機能性食品、化粧品、およびヘルスケア商品からなる群から選択される形態として用いられることを特徴とする  酵素活性阻害剤。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、生化学の技術分野に属し、特に、植物から抽出された新規な酵素活性阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】  現代社会では、美容と健康の維持や増進に高い関心が寄せられている。特に、肌（皮膚）は外部に露出される箇所であり、美容上、最も重要視されている領域である。さらに、肌の外観はその健康状態を如実に顕すことから、健康で張りのある肌を得たいという需要は非常に高い。【０００３】  健康で張りのある肌では、肌（皮膚）の表皮の内層にある真皮が健康な状態に維持されている。真皮では、コラーゲンとエラスチンにより形成されるネットワークによって、真皮に張りや弾力性が与えられ、その弾力性によって、肌を押しても弾かれて元の状態に戻る強固な復元力が得られる。【０００４】  しかし、ストレスや加齢によって、真皮に含まれるコラーゲン、エラスチン、さらにはヒアルロン酸が分解されて変性したり減少したりすると、肌の張りや弾力性が失われて、たるみなどの年齢肌の原因となる。さらに、真皮にたるみが生じることによって、皮膚が沈み、皮膚に深い皺ができる原因ともなる。【０００５】  このようなことから、健康で張りのある肌を得るには、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸の変性や減少を抑制することが重要となっている。コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸を分解する物質としては、各々、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼといった酵素が特定されている。さらに、肌の美観の点でシミの原因となるメラニンの合成に関わる酵素としてチロシナーゼが特定されている。すなわち、このような酵素の作用（活性）を阻害することができれば、健康で張りのある肌が得られると考えられる。【０００６】  従来から、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、チロシナーゼなどの酵素活性を阻害する酵素活性阻害剤が提案されている。【０００７】  例えば、従来の酵素活性阻害剤としては、カッコウアザミ属（Ageratum）の抽出物を配合するエラスターゼ活性阻害剤が知られている（特許文献１参照）。また、例えば、アムラ（Phyllanthus emblica）の抽出物を配合するエラスターゼ活性阻害剤も知られている（特許文献２参照）。また、グアバの葉、西河柳および菱実よりなる群より選んだ少なくとも一種の溶媒抽出物を含むコラゲナーゼ活性阻害剤も知られている（特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−０６２９８８号公報
【特許文献２】特開２００６−０６２９８９号公報
【特許文献３】特開平７−２９１８７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  しかし、従来の酵素活性阻害剤では、原料として、カッコウアザミ属や西河柳のように園芸用として市場に流通しているものや、アムラや菱実のように食用として流通しているものを用いるものである。すなわち、既に他の用途がある材料を酵素活性阻害剤の原料として用いることから、コストが嵩むという課題がある。【００１０】  このようなことから、廃材のような現時点では用途の無い材料を原料として、安全性の高い酵素活性阻害剤を得ることができれば、コスト抑制の観点のみならず、資源再利用の観点からも、特に有益と考えられる。しかし、現状ではそのようなものは見当たらない。【００１１】  さらに、本発明者らが確認したところに拠れば、従来の酵素活性阻害剤として、例えば、上述した特許文献３の菱実の溶媒抽出物を含むコラゲナーゼ活性阻害剤を例にとると、実用上、十分に酵素活性を阻害するものではなく（後述の実施例参照）、すなわち、従来の酵素活性阻害剤では、その酵素活性阻害効果も、実際のところ、総じて十分なものであるとは言い切れないのが実情である。【００１２】  本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、他の用途が無い原料（未利用原料）を新たに用いることによって、高い安全性とともに、資源再利用の観点からも酵素活性阻害効果の観点からも優れた低コストな新しいタイプの酵素活性阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】  本発明者らは、鋭意研究の結果、廃材の菱科植物の果皮を利用することによって、上記の目的を達成できることを見出し、本発明を導き出した。さらに、その有効成分を特定し、上記の目的を達成できることを見出した。【００１４】  かくして、本発明に従えば、以下の一般式（I）で表される有効成分を含有し、【化１】
2019082909.tif 000003
（但し、Ｘ１〜Ｘ５は、各々互いに独立して、以下の一般式（II）で表される置換基Ａまたは水素原子であり、当該置換基Ａが上記式中に少なくとも２つ含まれ、Ｘ１〜Ｘ５のうちの隣接する置換基Ａ同士が直接又は架橋構造を介して相互連結されていてもよい）
【化２】
2019082909.tif 000004
（但し、ｍは、１〜３の整数であり、水酸基を構成する水素原子の少なくとも一部が置換基Ａで置換されていてもよい）  コラゲナーゼまたはエラスターゼの酵素活性を阻害する酵素活性阻害剤が提供される。本発明の酵素活性阻害剤に拠れば、コラゲナーゼ、エラスターゼの各酵素に対して、効果的に活性阻害することができ、例えば、肌の健康状態を良好に維持することやシミの生成を抑制して肌の美観を保つことが可能となる。また、上記一般式で表される前記有効成分が、ジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、およびＤＢＴＧ、もしくはこれらの類縁体から成る群から選択される少なくとも１つである場合には、ヒアルロニダーゼまたはチロシナーゼの各酵素に対しても、効果的に活性阻害することができ、例えば、肌の健康状態を良好に維持することが可能となる。さらに付随する効果として、メラニン合成も抑制され、肌のシミを抑制して肌の美観を向上させることができる。さらに付随する効果として、抗酸化作用も発揮され、高い保存性も得ることができる。
【００１５】  本発明に係る酵素活性阻害剤は、菱科植物の果皮という大量に廃棄されている材料を原料に用いることから、低コストで製造できるとともに、廃棄資源の有効利用という観点からも優れたものである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明に係る酵素活性阻害剤の原料となるヒシ果皮の部位を説明する断面図（ａ）およびヒシを部位ごとに取り出した写真（ｂ）を示す。
【図２】本実施例に係る酵素活性阻害剤の原料となるヒシ果皮に対する高速液体クロマトグラフィー結果を示す。
【図３】本実施例に係る酵素活性阻害剤の原料となるヒシ果皮由来の有効成分を含有する粗ポリフェノールに対する高速液体クロマトグラフィー結果を示す。
【図４】本実施例に係る酵素活性阻害剤の原料となるヒシ果皮における内層皮と表皮に対する高速液体クロマトグラフィー結果を示す。
【図５ａ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のコラゲナーゼ阻害活性結果を示す。
【図５ｂ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のコラゲナーゼ阻害活性結果を示す。
【図５ｃ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のコラゲナーゼ阻害活性結果を示す。
【図５ｄ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のコラゲナーゼ阻害活性結果を示す。
【図５ｅ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のコラゲナーゼ阻害活性結果を示す。
【図５ｆ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のコラゲナーゼ阻害活性結果を示す。
【図５ｇ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のコラゲナーゼ阻害活性結果を示す。
【図６ａ】比較例に係る酵素活性阻害剤のコラゲナーゼ阻害活性結果を示す。
【図６ｂ】比較例に係る酵素活性阻害剤のコラゲナーゼ阻害活性結果を示す。
【図７ａ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のエラスターゼ阻害活性結果を示す。
【図７ｂ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のエラスターゼ阻害活性結果を示す。
【図７ｃ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のエラスターゼ阻害活性結果を示す。
【図７ｄ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のエラスターゼ阻害活性結果を示す。
【図７ｅ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のエラスターゼ阻害活性結果を示す。
【図７ｆ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のエラスターゼ阻害活性結果を示す。
【図８】比較例に係る酵素活性阻害剤のエラスターゼ阻害活性結果を示す。
【図９】比較例に係るヒシ実に関する高速液体クロマトグラフィー結果を示す。
【図１０ａ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のヒアルロニダーゼ阻害活性結果を示す。
【図１０ｂ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のヒアルロニダーゼ阻害活性結果を示す。
【図１０ｃ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のヒアルロニダーゼ阻害活性結果を示す。
【図１０ｄ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のヒアルロニダーゼ阻害活性結果を示す。
【図１０ｅ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のヒアルロニダーゼ阻害活性結果を示す。
【図１０ｆ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のヒアルロニダーゼ阻害活性結果を示す。
【図１１】比較例に係る酵素活性阻害剤のヒアルロニダーゼ阻害活性結果を示す。
【図１２ａ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のチロシナーゼ阻害活性結果を示す。
【図１２ｂ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のチロシナーゼ阻害活性結果を示す。
【図１２ｃ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のチロシナーゼ阻害活性結果を示す。
【図１２ｄ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のチロシナーゼ阻害活性結果を示す。
【図１２ｅ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のチロシナーゼ阻害活性結果を示す。
【図１２ｆ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のチロシナーゼ阻害活性結果を示す。
【図１３】比較例に係る酵素活性阻害剤のチロシナーゼ阻害活性結果を示す。
【図１４ａ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のメラニン産生抑制結果を示す。
【図１４ｂ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のメラニン産生抑制結果を示す。
【図１４ｃ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のメラニン産生抑制結果を示す。
【図１４ｄ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のメラニン産生抑制結果を示す。
【図１４ｅ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のメラニン産生抑制結果を示す。
【図１４ｆ】本実施例に係る酵素活性阻害剤のメラニン産生抑制結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】  本発明に係る酵素活性阻害剤は、以下の一般式（I）で表される有効成分を含有し、【化３】
2019082909.tif 000005
（但し、Ｘ１〜Ｘ５は、各々互いに独立して、以下の一般式（II）で表される置換基Ａまたは水素原子であり、当該置換基Ａが上記式中に少なくとも２つ含まれ、Ｘ１〜Ｘ５のうちの隣接する置換基Ａ同士が直接又は架橋構造を介して相互連結されていてもよい）
【化４】
2019082909.tif 000006
（但し、ｍは、１〜３の整数であり、水酸基を構成する水素原子の少なくとも一部が置換基Ａで置換されていてもよい）  コラゲナーゼまたはエラスターゼの酵素活性を阻害することを特徴としている。
【００１８】  その分子量は、特に限定されないが、好ましくは、４００〜１０００であり、より好ましくは、５００〜１０００である。
【００１９】  置換基Ａの水酸基数ｍは１〜３であり、例えば、ｍが１の場合の置換基Ａとしては、サリチル酸誘導体や、3-ヒドロキシ安息香酸誘導体が挙げられるが、水酸基の作用によって酵素阻害活性をより高めるという点からは、ｍはより好ましくは２であり、例えば、ｍが２の場合の置換基Ａとして、置換基Ａは、2,3-ジヒドロキシ安息香酸（2-ピロカテク酸）誘導体、2,4-ジヒドロキシ安息香酸（β-レゾルシン酸）誘導体、2,5-ジヒドロキシ安息香酸（ゲンチジン酸）誘導体、2,6-ジヒドロキシ安息香酸（γ-レゾルシン酸）誘導体、3,4-ジヒドロキシ安息香酸（プロトカテク酸）誘導体、3,5-ジヒドロキシ安息香酸（α-レゾルシン酸）誘導体が挙げられ、ｍはさらに好ましくは３であり、ｍが３の場合の置換基Ａとしては、没食子酸誘導体（3,4,5-トリヒドロキシ安息香酸）が挙げられる。
【００２０】  Ｘ１〜Ｘ５は、各々互いに独立して、上記一般式（II）で表される置換基Ａまたは水素原子であり、当該置換基Ａが上記一般式（II）中に少なくとも２つ含まれる。
【００２１】  例えば、置換基Ａが上記一般式（II）中に２つ含まれる場合として、置換基Ａを含むＸ１〜Ｘ５の組み合わせとしては、Ｘ１およびＸ２の場合、Ｘ１およびＸ３の場合、Ｘ２およびＸ３の場合、Ｘ４およびＸ５の場合、などその組み合わせは特に限定されないが、例えば、Ｘ１およびＸ５の各々に置換基Ａを含む場合として、以下のジ-ＧＧ（1,6-ジ-O-ガロイル-β-D-グルコピラノース：1,6-di-O-galloyl-β-D-glucopyranose）が挙げられる。【化５】
2019082909.tif 000007
【００２２】  また、例えば、置換基Ａが上記一般式（II）中に３つ含まれる場合として、置換基Ａを含むＸ１〜Ｘ５の組み合わせとしては、Ｘ１〜Ｘ５のうち置換基Ａを含む組み合わせとしては、例えば、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３の場合、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５の場合などその組み合わせは特に限定されないが、例えば、Ｘ１、Ｘ２およびＸ５の各々に置換基Ａを含む場合として、以下のトリ-ＧＧ（1,2,6-トリ-O-ガロイル-β-D-グルコピラノース：1,2,6-tri-O-galloyl-β-D-glucopyranose）が挙げられる。【化６】
2019082909.tif 000008
【００２３】  また、例えば、置換基Ａが上記一般式（II）中に４つ含まれる場合として、置換基Ａを含むＸ１〜Ｘ５の組み合わせとしては、例えば、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の場合、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５の場合などその組み合わせは特に限定されないが、例えば、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ５の各々に置換基Ａを含む場合として、以下のテトラ-ＧＧ（1,2,3,6-テトラ-O-ガロイル-β-D-グルコピラノース：1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucopyranose）が挙げられる。【化７】
2019082909.tif 000009
【００２４】  テトラ-ＧＧ(ＴＧＧまたはｔｅｔｒａ−ＧＧとも呼ばれる）は、1,2,3,6-テトラ-O-ガロイル-β-D-グルコピラノース（1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucopyranose）とも呼ばれ、グルコースの一形態であるグルコピラノースの一種である（分子量７８８）。
【００２５】  また、上述したように、Ｘ１〜Ｘ５のうちの隣接する置換基Ａ同士が、直接、相互連結されていてもよく、このような相互連結はどのような化学構造によって構成されていてもよく、例えば、ビフェニル構造によって直接、隣接する２つの置換基Ａが相互連結されることができ、例えば、以下の構造が挙げられる。【化８】
2019082909.tif 000010
【００２６】  例えば、置換基Ａが上記一般式（II）中に４つ含まれる場合として、上記同様にＸ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ５の各々に置換基Ａが含まれる場合に、このように隣接する２つの置換基ＡがＸ２およびＸ３に存在する場合に、ビフェニル構造によって相互連結された場合の一例として、以下のＣＨ−ｄｉ−ＧＧ（β-D-グルコピラノース, サイクリック2,3-[(1S)-4,4’,5,5’,6,6’-ヘキサヒドロキシ[1,1’- ビフェニル]-2,2’-ジカルボキシレート] 1,6-ビス(3,4,5-トリヒドロキシベンゾエート)：β-D-glucopyranose, cyclic2,3-[(1S)-4,4’,5,5’,6,6’-hexahydroxy[1,1’- biphenyl]-2,2’-dicarboxylate] 1,6-bis(3,4,5-trihydroxybenzoate)）が挙げられる。【化９】
2019082909.tif 000011
【００２７】  このような隣接する置換基Ａがビフェニル構造によって相互連結された場合の一例としては、Ｘ４およびＸ５の各々に存在する置換基Ａがビフェニル構造によって相互連結された一例として、以下のオイゲニン（β-D-glucopyranose, cyclic 4,6-((1S)-4,4',5,5',6,6'-hexahydroxy(1,1'-biphenyl)-2,2'-dicarboxylate) 1,2,3-tris(3,4,5-trihydroxybenzoate)）が挙げられる。【化１０】
2019082909.tif 000012
【００２８】  オイゲニイン（オイゲニンとも呼ばれる）は、ヘキサヒドロキジフェノール基を持つ加水分解型のタンニンで、エラジタンニンとも呼ばれるものである（分子量９３８．７）。
【００２９】  また、上述したように、置換基Ａは、水酸基を構成する水素原子の少なくとも一部が置換基Ａで置換されていてもよく、このような置換された置換基Ａの一例としては、以下の構造が挙げられる。【化１１】
2019082909.tif 000013
【化１２】
2019082909.tif 000014
【００３０】  このような置換された置換基Ａを含む一例としては、例えば、置換基Ａが４つ含まれる場合として、上記同様にＸ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ５の各々に置換基Ａが含まれる一例として、以下のＤＢＴＧ（β-D-Glucopyranose, 6-[3,5-dihydroxy-4-[(3,4,5-trihydroxybenzoyl)oxy]benzoate] 1,2,3-tris(3,4,5-trihydroxybenzoate)およびβ-D-Glucopyranose, 6-[3,4-dihydroxy-5-[(3,4,5-trihydroxybenzoyl)oxy]benzoate] 1,2,3-tris(3,4,5-trihydroxybenzoate)）が挙げられる。【化１３】
2019082909.tif 000015
【化１４】
2019082909.tif 000016
【００３１】  また、上述したように、Ｘ１〜Ｘ５のうちの隣接する置換基Ａ同士が、架橋構造を介して相互連結されていてもよく、架橋構造の種類は、特に限定されないが、例えば、酸素原子による-O-構造とすることができ、このような相互連結された２つの置換基Ａの一例としては、以下の構造が挙げられる。【化１５】
2019082909.tif 000017
【００３２】  例えば、置換基Ａが４つ含まれる場合として、上記同様にＸ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ５に置換基Ａが含まれる場合に、このような隣接する２つの置換基Ａが架橋構造を介して相互連結された場合の一例として、以下のトラパイン（6-O,4-O-[2,9,10,11,11-Pentahydroxy-3-oxo-3,6-dihydro-2,6-methano-2H-1-benzoxocin-5,7-diylbis(carbonyl)]-1-O,2-O,3-O-trigalloyl-β-D-glucopyranose）が挙げられる。
【００３３】  トラパインは、タンニンの一種であり、以下の化学式で表される（分子量９５４．７）。【化１６】
2019082909.tif 000018
【００３４】  上記の主要な有効成分の例示をまとめて以下の表に示す。勿論、以下は主要な有効成分の例示であって、当該有効成分が各種置換基で置換されたような類縁体であっても、同等な有効成分を奏するものとして、本有効成分として含まれる。【表１】
2019082909.tif 000019
【００３５】  本発明者らが解明したところに拠れば、上記有効成分のうち、特に、ジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパイン、もしくはこれらの類縁体から成る群から選択される少なくとも１つが、コラゲナーゼまたはエラスターゼに対して優れた酵素活性阻害作用を発揮するものであり、また、上記有効成分のうち、特に、ジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、およびＤＢＴＧ、もしくはこれらの類縁体から成る群から選択される少なくとも１つが、ヒアルロニダーゼまたはチロシナーゼの酵素活性を阻害するものであることが確認されている。さらに、上記の有効成分ジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインが、菱科植物の果皮から得られることが確認されている（後述の実施例参照）。
【００３６】  すなわち、本発明の酵素活性阻害剤の一形態としては、菱科植物の果皮の抽出物および／または粉砕物を有効成分として含有するものでもある。
【００３７】  菱科植物とは、菱科（Ｔｒａｐａｃｅａｅ）に属する植物（通称ヒシ）であれば特に制限されない。好適には、ワビシ（Ｔｒａｐａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、オニビシ（Ｔｒａｐａ ｎａｔａｎｓ）、トウビシ（Ｔｒａｐａ ｂｉｃｏｒｎｉｓ）、ヒメビシ（Ｔｒａｐａ ｉｎｃｉｓａ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】  ヒシは、池、沼、およびクリークに自生する一年生水草であり、とげのある実が水底に固着して越冬し、春になると芽を出し、秋に果実をつける。
【００３９】  図１（ａ）に示すように、ヒシは、内部から外部に向かって順に、実１、実皮２、内層皮３、表皮４と区別される。このうち、本発明で用いるヒシの果皮は、内層皮３および表皮４を用いるものであり、より高い酵素活性阻害を呈するという点から、より好ましくは、内層皮３のみを用いるものである。ヒシの果皮は、ヒシの果実（通称ヒシ実）とは異なり、利用価値が無いという扱いで大量に廃棄されており、未利用植物となっている。
【００４０】  ヒシ実は、主としてヒシの実（実１）を指し、薄皮である実皮（実皮２）も含める場合もある。ヒシ実は、デンプン質が多く、茹でて食用とすることや、民間薬や煎茶として飲用され、さらには焼酎の原料としても利用されている。
【００４１】  ヒシ実を利用した酵素活性阻害剤は一部で提案されてはいるものの（例えば、上記の特許文献３参照）、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、またはチロシナーゼに対する十分な酵素活性阻害は得られていない（後述の比較例参照）。また、ヒシ実は、既にデンプン源や焼酎の原料などの食用としても使われていることからも、購入コストが嵩むものとなる。
【００４２】  本発明に係る酵素阻害剤では、ヒシ実を原料に使わないという点で従来には無いものであり、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、またはチロシナーゼといった各種の酵素に対して、従来では得られなかった高い酵素活性阻害性を奏するという優れた効果が確認されている（後述の実施例参照）。さらに、廃材であるヒシの果皮を用いることから、コストの観点のみならず、未利用植物を活用して資源循環を行えるという資源再利用の観点からも有益である。
【００４３】  本発明に係る酵素阻害剤の製造方法は、特に限定されないが、例えば、水や有機溶媒（例えばアセトン）を溶媒として、ヒシの果皮の粗粉砕に対して例えば重量比１：９〜２：８で溶媒を混合し、抽出物を得ることができる。得られた抽出液の残渣物を取り除き、濾過液を得る。濾過液（濃縮液）をポリフェノール吸着剤に通液させ、その後溶媒にて脱着させ、純化した粗ポリフェノール（ヒシ果皮ポリフェノール）抽出物を得ることができる。
【００４４】  この他にも、菱科植物の果皮を熱水中で攪拌することによって熱水抽出して製造することも可能である。熱水とは、特に限定されないが、好適には６０℃〜１００℃に加熱された水であり、例えば９０℃とすることができる。また、攪拌する際には、超音波振動を適用することもでき、これによって、抽出が効率的に行なわれる。
【００４５】  この他にも、菱科植物の果皮を粉砕したものも、本発明に係る酵素阻害剤として用いることができる。
【００４６】  本発明に係る酵素活性阻害剤は、上記のジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインの全てを有効成分として同時に含むことが好ましく、その場合には、菱科植物の果皮からの抽出物（粗ポリフェノール溶液）として簡易に得られると共に、これらの有効成分による酵素活性阻害効果が同時に発揮されるものとなる。
【００４７】  さらに、本発明者らが解明したところに拠れば、菱科植物の果皮から抽出される有効成分として、ジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインの各々の単離にも成功している（後述の実施例参照）。そのため、本発明に係る酵素活性阻害剤の一形態としては、菱科植物の果皮から単離されたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインから成る群から選択される少なくとも１つの有効成分を用いて構成することも可能である。
【００４８】  また、菱科植物の果皮から抽出される有効成分であるジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインの各々の一部を置換基で置換したこれらの類縁体も、ジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインの構造に近いことから、菱科植物の果皮から抽出される有効成分に相当し、すなわち、当該有効成分と同等の物質である。
【００４９】  当該有効成分と同等の物質を構成する上記の置換基としては、メチル基、エチル基などのアルキル基、カルボキシ基、リン酸基、シアノ基、アルコキシカルボニル基、アシル基、ニトロ基、ヒドロキシ基などが挙げられる。
【００５０】  このようなことから、本発明に係る酵素活性阻害剤の一形態としては、菱科植物の果皮から抽出されたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインから成る群から選択される少なくとも１つの有効成分と同等の物質を含有するものである。
【００５１】  また、当該有効成分としては、菱科植物の果皮から抽出されたもの以外であってもよい。すなわち、本発明に係る酵素活性阻害剤は、当該有効成分に相当する成分として、菱科植物の果皮から抽出されたものと同じジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインから成る群から選択される少なくとも１つを含むものであれば、菱科植物の果皮から抽出されたもの以外（例えば化学合成プロセスで精製されたもの）であってもよく、また、菱科植物の果皮から抽出されたもの（もしくはさらに単離されたもの）であってもよく、また、これらを混合したものでもよい。
【００５２】  このようなことから、本発明に係る酵素活性阻害剤の一形態としては、菱科植物の果皮から抽出されたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインから成る群から選択される少なくとも１つの有効成分を含有し、さらに／または、当該有効成分に相当する成分を含有するものである。
【００５３】  さらに、本発明に係る酵素活性阻害剤の一形態としては、上記の有効成分と同等の物質を含有することも可能である。
【００５４】  以上のことから、本発明に係る酵素活性阻害剤の一形態としては、菱科植物の果皮から抽出されたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインから成る群から選択される少なくとも１つの有効成分を含有し、さらに／または、当該有効成分に相当する成分を含有し、さらに／または、当該有効成分と同等の物質を含有するものである。
【００５５】  このようにして得られた本発明に係る酵素阻害剤は、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、またはチロシナーゼの活性を阻害することが確認されており、その用途としては、特に限定されないが、好適には皮膚外用剤、化粧品原料（化粧品組成物）、または健康食品として用いることであり、肌の真皮に作用することによって、真皮に含まれるコラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸の分解が効果的に抑制され、健康で張りのある肌が得られるものとなる。さらに付随的にメラニン合成も抑制できることが確認されており、肌のシミを抑制して肌の美観をさらに向上させることができる。さらに付随的に抗酸化作用を呈することも確認されており、高い保存性も発揮できるという付加価値の高いものとなる。
【００５６】  本発明に係る酵素阻害剤の利用形態は、特に限定されず、化粧品組成物、医薬品組成物、食品添加物等が挙げられ、エキスまたはパウダーとして提供することができる。特に限定されないが、本発明に係る酵素阻害剤は、経口剤、肌用塗布剤、皮下注射剤、点鼻剤、および点眼剤からなる群から選択される薬剤として、または、機能性食品、化粧品、およびヘルスケア商品からなる群から選択される形態として用いることが可能である。
【００５７】  さらに、本発明に係る酵素阻害剤は、製薬上許容され得る担体、希釈剤、活性剤、賦形剤、充填剤、浸透促進剤、増粘剤、香料、乳化剤、分散助剤または結合剤等と組み合わされた医薬組成物として使用することもできる。さらに、本発明に係る酵素阻害剤は、薬剤という用途に限定されず、例えば、機能性食品の原料または添加物として利用することもでき、この場合には、機能性食品を摂取することによって手軽に健康改善効果を得ることができる。
【００５８】  以下に、本発明の特徴をさらに具体的に示すために実施例を記すが、本発明は以下の実施例によって制限されるものではない。
【００５９】（実施例１）（１）ヒシ抽出物の調製  原料となるヒシとして、千葉県の印旛沼に自生するオニビシ、佐賀県のクリークに自生するワビシ、および市販の台湾ヒシを入手した。これらの原料を代表して千葉県の印旛沼に自生するオニビシについて、冷凍保存した分析用サンプルを作成し、一般財団法人日本食品分析センターにて、環境由来の有害物質、重金属類、放射性物質の含有量の分析に使用した（採取日2015.9.18、保管温度-21℃、試験期間2015.12.3〜2016.1.7）。結果として、すべての対象項目において基準値を超えるものは無かった。このことから、原料として高い安全性を有することが確認された。
【００６０】  それぞれのヒシは水道水にて洗浄後、天日で２〜３日間乾燥させ、ヒシ実とヒシ果皮（果皮）とに分けた。図１（ｂ）に示すように、実１、実皮２、内層皮３、表皮４に分別した。このうち、ヒシ果皮（内層皮３および表皮４）を原料に用いた。マイクロ波常温乾燥機にてヒシ果皮を乾燥させ、粉砕機にて微粉末とした。溶媒であるアセトンを用いて１：９〜２：８の混合抽出液に一昼夜漬込み、これを上清をろ紙（Ｎｏ．６、アドバンテック）を用いて濾過後、ロータリーエバポレーター（N-1200B：東京理化器械株式会社）にて濃縮させた。吸着剤（三菱ケミカル株式会社「ダイアイオンHP20」）に濃縮液を通液させ、溶媒（80%エタノール）で粗ポリフェノールを脱着させ、純化した粗ポリフェノール抽出物エキスを得たあと、上記ロータリーエバポレーターで乾固した。
【００６１】  さらに、これらの成分について高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で調べた。HPLC条件は、カラム：CAPCELL PAK C18 UG120（250 mm × 4.6 mm、5 μm：株式会社資生堂）、溶離液：0.1% ギ酸：アセトニトリル＝95：5% (v/v) から30分後に70：30% (v/v)（リニアグラジエント）、カラム温度：40℃、流速：1 mL/分、検出：UV-Vis検出器（280 nm）であった。その結果、図２に示すように、リテンションタイムによって、大きいピークの後に、３つのピークを検出した。最初の大きいピークは、ヒシ果皮からの６０％のアセトン抽出物からクロマトグラム直後に観察されたが、これはタンパク質、アミノ酸などの不純物に起因するものであった。
【００６２】  なお、HPLCチャートの縦軸単位は、ピーク強度（もしくは出力強度（mV））を示すものであるが、図２では、グラフを統合して表示する目的で、表記上の見易さを優先して縦軸単位を省略しているが、確かに、ヒシに含まれる成分のリテンションタイムが、各既知成分と一致することが確認された。
【００６３】  これら３つの成分の分取を以下のように行った。オニビシ粗ポリフェノール1gを秤り取り、エタノールを10ml入れることで、100 mg/mlの濃度とした。超音波洗浄器（MCD-2、アズワン株式会社）にて充分溶かした後、メンブレンフィルター（13HP045AN、アドバンテック）にてろ過を行った。3つの成分の分取は、HPLCにて行った。HPLC条件は、カラム：CAPCELL PAK C18 UG120（250 mm × 10 mm、5 μm：株式会社資生堂）、ガードカラム： C18 UG120（20 mm × 10 mm、5 μm：株式会社資生堂）、溶離液：0.1% ギ酸：アセトニトリル＝95：5% (v/v) から30分後に70：30% (v/v)（リニアグラジエント）、カラム温度：40℃、流速：5 mL/分、検出：UV-Vis検出器（280 nm）であった。さらに、ロータリーエバポレーター（N-1200B：東京理化器械株式会社）にて溶媒を除去し、単離成分を得た。
【００６４】  液体クロマトグラフ質量分析計(ＬＣ／ＭＳ)（ＬＣＭＳ−２０２０：島津製作所製）を用いて測定した。ＬＣ／ＭＳ測定条件は、カラム：CAPCELL PAK C18 UG120（150 mm × 2 mm、3 μm：株式会社資生堂）、溶離液：0.1% ギ酸：アセトニトリル＝95：5% (v/v) から30分後に70：30% (v/v)（リニアグラジエント）、カラム温度：40℃、流速：0.2 mL/分、イオンモード：ネガティブであった。その結果、各々の単離成分のｍ／ｚ値は、各々９３７、７８７、および４７６であった。
【００６５】  高速液体クロマトグラフィーのリテンションタイム値と、上記ＬＣ／ＭＳ測定から、単離成分のサンプルのうち、１番目のリテンションタイム値でピークを有するものは、オイゲニイン（分子量９３８）と同定された。同じく、３番目のリテンションタイム値でピークを有するものは、トラパイン（分子量９５４）と同定された。また、２番目のリテンションタイム値でピークを有するものについては、さらに、核磁気共鳴装置(NMR)（JNM-AL400（1H-NMR：400 MHz 、13C-NMR：100 MHz）：日本電子株式会社製）を用いて、1H NMRスペクトルを測定したところ、次の結果が得られた。δ4.13 (m, 2 H, H-4 and H-5), 4.59 (m, 2 H, H-6), 5.46 (t, 1 H,J = 8 Hz, H-2), 5.66 (t, 1 H, J = 9 Hz, H-3), 6.16 (d, 1 H, J = 8 Hz, H-1), 6.99, 7.07, 7.08, 7.17 (s, each 2 H, galloyl H). この結果から、テトラガロイルグルコース類であることが確認され、上述のｍ／ｚ値７８７と、１３Ｃ ＮＭＲ測定結果[glucose moiety: 93.4, 76.0, 75.9, 71.8, 69.3, 63.6; ester carbons:166.6, 166.2, 165.8, 165.0]から、グルコピラノース骨格におけるガロイル基の位置がＣ−１、２、３および６であることが特定され、この単離成分がテトラ-ＧＧ(1,2,3,6-テトラ-O-ガロイル-β-D-グルコピラノース:1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucopyranose)であることが同定された。
【００６６】  上記と同様に、オニビシおよびワビシの果皮を原料とする抽出物に対する高速液体クロマトグラフィーの結果を、各々、図３に示す。得られた結果から、この抽出物は、有効成分としてジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインをすべて含有する粗ポリフェノール溶液であることが確認された。
【００６７】  また、オニビシの内層皮と表皮を原料とする抽出物に対する高速液体クロマトグラフィーの結果を、各々、図４（ａ）および（ｂ）に示す。得られた結果から、この抽出物は、上記有効成分をすべて含有する粗ポリフェノール溶液であることが確認された。
【００６８】  得られたトラパイン、オイゲニイン、およびテトラ-ＧＧの各ポリフェノール含量を３回測定し、以下表の結果を得た。なお、ヒシは天然物であるため、そのポリフェノール含量は、採取時期や保存状態に依存して多少変動する。そのため、以下表の各サンプルでは、同時期に採取されたヒシを用いて、同じ保存状態（凍結乾燥）のもとで測定を行った。得られた比較結果から、ヒシのうち、特にオニビシが、高いポリフェノール含量を有することが確認された。【表２】
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【００６９】（２）コラゲナーゼ阻害活性の測定  上記得られたトラパイン、オイゲニイン、テトラ-ＧＧ、およびこれらを含む粗ポリフェノール抽出物の各サンプルについて、コラゲナーゼ阻害活性を測定した。比較例として、既にコラゲナーゼ阻害活性があるとして知られているエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、および同じポリフェノール化合物である茶カテキンであるＥＧＣＧ（（−）−エピガロカテキンガレート）を用いた。
【００７０】  基質としてＰｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ、トリフルオロ酢酸塩（和光純薬株式会社）、酵素としてコラゲナーゼ（ヒストリチクス菌由来、Type IV、シグマアルドリッチ）を各々用いた。基質溶液は、20 mMCaCl2を含む0.1 M Tris-HCl緩衝溶液（pH7.1）にて0.39 mg/ml（0.5mM）となるよう溶かしたものを用いた。コラゲナーゼ酵素溶液は、コラゲナーゼをCaCl2（20mM）を含んだ0.1M Tris-HCl緩衝溶液（pH7.1）に溶解し、0.1mg/mlとしたものを用いた。
【００７１】  先ず、マイクロチューブ（２ｍＬ）にサンプル溶液１５μＬを入れた。次に、コラゲナーゼ酵素溶液１５μＬを入れた。さらに、基質溶液１２０μＬを入れた。３７℃で３０分間インキュベートした。２５ｍＭクエン酸（反応停止液）３００μＬを入れた。酢酸エチルを１．５ｍＬ入れ、激しく振とうし、抽出させた。遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）を行った。上清の酢酸エチル層を石英セルに入れ、分光光度計（V−560、日本分光株式会社）にて３２０ｎｍにおける吸光度を測定した。以下の式にそれぞれの吸光度を入れ、サンプルのコラゲナーゼ阻害活性を求めた。[数１］コラゲナーゼ阻害活性（％）＝｛1−（A−B）／（C−D）｝×100
【００７２】  上記の式において、A：サンプルの吸光度、B：サンプルブランク（酵素なし）の吸光度、C：対照（緩衝液）の吸光度、D：対照ブランク（酵素なし）の吸光度を示す。
【００７３】  それぞれのサンプルについて、コラゲナーゼ阻害活性の結果を図５ａ〜５ｇに示す。また、比較例であるＥＤＴＡおよびＥＧＣＧの結果を図６ａおよび図６ｂに示す。また、それぞれのサンプルについて標的酵素の半数（５０％）の働きを阻害できる濃度を示す５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出した結ｓ果をまとめて以下の表３に示す。なお、以下表中、オニビシ粗ポリフェノール抽出物については、混合物であることから分子量が特定できないため、μＭ単位でのＩＣ５０値は省略されている。【表３】
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【００７４】  得られた結果から、比較例に対して、ジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインのほうが、極めて低い濃度でコラゲナーゼを阻害することが確認された。オニビジ粗ポリフェノールも極めて低い濃度でコラゲナーゼを阻害することが確認された。特に、トラパインにおけるコラゲナーゼ阻害活性は極めて高いことが確認された。
【００７５】（３）エラスターゼ阻害活性の測定  上記得られたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパイン、およびこれらを含む粗ポリフェノール抽出物について、エラスターゼ阻害活性を測定した。比較例として、同じポリフェノール化合物である緑茶のポリフェノール（カテキン）の一種である（−）-エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を用いた。
【００７６】  基質としてＮ−Ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ（S4760、シグマアルドリッチ）、酵素としてエラスターゼ（豚の膵臓由来、Type III、シグマアルドリッチ）を各々用いた。基質溶液は、0.2 M Tris-HCl緩衝溶液（pH7.5）にて0.451 mg/ml（1mM）となるよう溶かしたものを用いた。酵素溶液は、エラスターゼを0.2 MのTris-HCl緩衝溶液（pH7.5）に溶解して10 mg/mlとしたものを用いた。
【００７７】  先ず、マイクロプレートにサンプル溶液５０μＬを入れた。次に、エラスターゼ酵素溶液５０μＬを入れた。基質溶液１００μＬを入れた。２５℃で５０分間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（Synergy HT、バイオテック・ジャパン）で４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。以下の式にそれぞれの吸光度を入れ、サンプルのエラスターゼ阻害活性を求めた。[数２]  エラスターゼ阻害活性（％）＝｛1−（A−B）／（C−D）｝×100
【００７８】  なお、上記の式において、A：サンプルの吸光度、B：サンプルブランク（酵素なし）の吸光度、C：対照（緩衝液）の吸光度、D：対照ブランク（酵素なし）の吸光度を示す。
【００７９】  それぞれのサンプルについて、エラスターゼ阻害活性の結果を図７ａ〜７ｆに示す。また、比較例であるＥＧＣＧの結果を図８に示す。また、それぞれのサンプルについて標的酵素の半数（５０％）の働きを阻害できる濃度を示す５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出した結果をまとめて以下の表４に示す。【表４】
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【００８０】  得られた結果から、比較例に対して、トラパイン、オイゲニイン、テトラ-ＧＧ、ＤＢＴＧのほうが、極めて低い濃度でエラスターゼを阻害することが確認された。特に、オイゲニインにおけるエラスターゼ阻害活性は極めて高いことが確認された。
【００８１】（４）ヒアルロニダーゼ阻害活性の測定上記得られたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、トラパインおよびこれらを含む粗ポリフェノール抽出物の各サンプルについて、ヒアルロニダーゼ阻害活性を測定した。比較例として、既にコラゲナーゼ阻害活性があるとして知られているクロモグリク酸ナトリウムを用いた。
【００８２】  基質として鶏冠由来のヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬株式会社）、酵素としてヒアルロニダーゼ（Type IV-S from Brovine Testes、シグマアルドリッチ）を各々用いた。基質溶液は、0.1 M 酢酸−酢酸ナトリウム緩衝溶液（pH4.0）にて0.8 mg/mlとなるよう溶かしたものを用いた。ヒアルロニダーゼ酵素溶液は、ヒアルロニダーゼを0.1 M 酢酸−酢酸ナトリウム緩衝溶液（pH4.0）に溶解し、4 mg/mlとしたものを用いた。酵素活性化液として、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４８／８０を用い、塩化カルシウム・二水和物（3.75 ｍｇ/ｍｌ）を含んだ0.1 M 酢酸−酢酸ナトリウム緩衝溶液（pH4.0）にて0.5 mg/mlとなるよう溶かした。ホウ酸カリウム溶液は、0.8M ホウ酸100mlに水酸化カリウム2.24gを加えて溶解した。p-ジメチルアミノベンズアルデヒド（p-DABA）溶液は、p-ジメチルアミノベンズアルデヒド（和光純薬株式会社）5gを氷酢酸44ml、10M塩酸6mlに溶解した。使用時に、氷酢酸で10倍希釈した。
【００８３】  先ず、マイクロチューブ（２ｍＬ）にサンプル溶液５０μＬを入れた。次に、ヒアルロニダーゼ酵素溶液２５μＬを入れ、３７℃で２０分間インキュベートした。さらに、酵素活性化液５０μＬを入れ、３７℃で２０分間インキュベートした。基質であるヒアルロン酸溶液１２５μＬを加え、３７℃で４０分間インキュベートした。０．４Ｍの水酸化ナトリウム溶液５０μＬを加え、反応を停止させた。さらに、ホウ酸カリウム溶液５０μＬを加え、沸騰水で３分間加熱し、すぐに冷水にて冷却を行った。ｐ−ＤＡＢＡ溶液１．５ｍｌを加え、３７℃で２０分間インキュベートした。９６穴のマイクロプレートにそれぞれのサンプルを２００μＬずつ入れ、マイクロプレートリーダー（Synergy HT、バイオテック・ジャパン）にて４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。以下の式にそれぞれの吸光度を入れ、サンプルのヒアルロニダーゼ阻害活性を求めた。    [数３]ヒアルロニダーゼ阻害活性（％）＝｛1−（A−B）／（C−D）｝×100
【００８４】  上記の式において、A：サンプルの吸光度、B：サンプルブランク（酵素なし）の吸光度、C：対照（緩衝液）の吸光度、D：対照ブランク（酵素なし）の吸光度を示す。
【００８５】  それぞれのサンプルについて、ヒアルロニダーゼ阻害活性の結果を図１０ａ〜１０ｆに示す。また、比較例であるクロモグリク酸ナトリウムの結果を図１１に示す。また、それぞれのサンプルについて標的酵素の半数（５０％）の働きを阻害できる濃度を示す５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出した結果をまとめて以下の表５に示す。なお、以下表中、オニビシ粗ポリフェノール抽出物については、混合物であることから分子量が特定できないため、μＭ単位でのＩＣ５０値は省略されている。【表５】
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【００８６】  得られた結果から、オニビジ粗ポリフェノールは、比較例に対して、極めて低い濃度でヒアルロニダーゼを阻害することが確認された。
【００８７】（５）チロシナーゼ阻害活性の測定上記得られたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、トラパインおよびこれらを含む粗ポリフェノール抽出物の各サンプルについて、チロシナーゼ阻害活性を測定した。比較例として、既にチロシナーゼ阻害活性があるとして知られているアルブチンを用いた。
【００８８】  基質としてL-チロシン（和光純薬株式会社）、酵素としてチロシナーゼ（マッシュルーム由来、シグマアルドリッチ）を各々用いた。基質溶液は、水にて２ ｍＭとなるよう溶かし、メンブランフィルターにてろ過したものを用いた。チロシナーゼ酵素溶液は、チロシナーゼをリン酸緩衝溶液（0.1M Na2HPO4と0.1M NaH2PO4を用いてｐＨ６．８に調整したもの）にて０．１２５ ｍｇ／ｍｌとしたものを用いた。
【００８９】  先ず、96穴のマイクロプレートに基質溶液５０μＬ、リン酸緩衝溶液９０μＬ、サンプル溶液１０μＬを入れ、３７℃で５分間プレインキュベーションを行った。次に、チロシナーゼ酵素溶液５０μＬを入れ、３７℃で１５分間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（Synergy HT、バイオテック・ジャパン）にて４７５ｎｍにおける吸光度を測定した。以下の式にそれぞれの吸光度を入れ、サンプルのチロシナーゼ阻害活性を求めた。    [数３]チロシナーゼ阻害活性（％）＝｛1−（A−B）／（C−D）｝×100
【００９０】  上記の式において、A：サンプルの吸光度、B：サンプルブランク（酵素なし）の吸光度、C：対照（緩衝液）の吸光度、D：対照ブランク（酵素なし）の吸光度を示す。
【００９１】  それぞれのサンプルについて、チロシナーゼ阻害活性の結果を図１２ａ〜１２ｆに示す。また、比較例であるアルブチンの結果を図１３に示す。それぞれのサンプルについて標的酵素の半数（５０％）の働きを阻害できる濃度を示す５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出した結果をまとめて以下の表６に示す。なお、以下表中、オニビシ粗ポリフェノール抽出物については、混合物であることから分子量が特定できないため、μＭ単位でのＩＣ５０値は省略されている。【表６】
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【００９２】  得られた結果から、オニビジ粗ポリフェノールは、比較例に対して、極めて低い濃度でチロシナーゼを阻害することが確認された。
【００９３】（６）メラニン産生抑制作用の測定上記得られたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、トラパインおよびこれらを含む粗ポリフェノール抽出物の各サンプルについて、メラニン産生抑制作用について調べた。比較例として、既にメラニン産生抑制作用があるとして知られているアルブチンを用いた。
【００９４】  細胞は、マウス由来のＢ１６の４Ａ５メラノーマ細胞（理化学研究所バイオリソースセンター）を用いた。培地は、Ｄ−ＭＥＭ（和光純薬株式会社）に１０％の不動化処理を行ったＦＢＳ（ウシ胎児血清、フナコシ）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（×１００、和光純薬株式会社）、１％のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン溶液（２００ｍＭ、和光純薬株式会社）を加えたものを用いた。洗浄液として１０％ＦＢＳを含んだＨＢＳＳ（和光純薬株式会社）を用いた。メラノーマ細胞の成長ホルモン剤として、α−ＭＳＨ（ペプチド研究所）を培地にて２０μＭとなるように溶かしたものを用いた。細胞増殖停止液として、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を用いた。各々のサンプルは、まずエタノールにて溶解し、培地にて適宜希釈を行った。なお、エタノールの最終濃度は、細胞の増殖に影響を与えないよう１％以下とした。
【００９５】メラニン標準溶液は、市販のメラニン（シグマアルドリッチ）を１Ｍの水酸化ナトリウムに溶解して０．２ｍｇ／ｍＬの溶液を作成し、それから、１Ｍ水酸化ナトリウムにて０、０．００６２５、０．０１２５、０．０２５、０．０５、０．１ｍｇ／ｍＬの検量線用溶液を調製した。
【００９６】タンパク質の測定には、ＤＣＴＭプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いた。すなわち、Ａ試薬（アルカリ性酒石酸銅）、Ｂ試薬（フォーリン試薬）、Ｓ試薬を用い、Ａ’試薬は、１．５ｍＬのＡ試薬に対し、３０μＬのＳ試薬を加えたものとした。血清アルブミン溶液は、血清アルブミン（プロテインスタンダードｓｔａｎｄａｒｄII）２０ｍＬの水に溶解し（１．４１  ｍｇ／ｍＬ）、検量線用溶液を作成した。
【００９７】  先ず、２４穴のウェルプレートに細胞（１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を５００μＬ播種し、３７℃、ＣＯ2濃度５％で２４時間培養を行った。２０μＭのα-ＭＳＨ２５０μＬ、サンプル溶液、比較例としてアルブチン溶液（最終濃度１ｍＭ）、培地（コントロール）をそれぞれ２５０μＬ入れ、さらに３日間培養を行った。その後、培地を捨て、ＨＢＳＳにて２回洗浄した後、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液２００μＬを加えた。アルミ製プレートシールにてウェルプレートをシールし、８０℃で１時間加熱を行った。冷却後、１８０μＬずつを９６穴のマイクロプレートに入れ、マイクロプレートリーダー（Synergy HT、バイオテック・ジャパン）にて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。また、メラニンの検量線用溶液を９６穴のマイクロプレートに２００μＬずつ入れ、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。メラニン標準溶液の検量線から、サンプル中のメラニン濃度を算出した。
【００９８】また、次のようにサンプル中のタンパク質濃度を調べた。血清アルブミン標準溶液またはサンプル溶液（必要に応じて水にて希釈）３０μＬを９６穴のマイクロプレートに入れ、Ａ’試薬１５μＬを入れてよく混ぜた。Ｂ試薬１２０μＬを加えて、直ちによく混ぜ、１５分放置した。マイクロプレートリーダー（Synergy HT、バイオテック・ジャパン）にて７５０ｎｍにおける吸光度を測定した。血清アルブミン標準溶液の検量線から、サンプル中のタンパク質濃度を算出した。さらに、以下の式にそれぞれのメラニン濃度、タンパク質濃度を入れ、サンプルに含まれるタンパク質１ｍｇあたりのメラニン含量比を求めた。    [数３]メラニン含量比（％）＝｛（Ａ／Ｂ）／（Ｃ／Ｄ）｝×１００
【００９９】  上記の式において、ＡおよびＢはサンプルのメラニン濃度（ｍｇ／ｍＬ）およびタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）、ＣおよびＤはコントロールのメラニン濃度（ｍｇ／ｍＬ）およびタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）を示す。
【０１００】  それぞれのサンプルについて、メラニン産生抑制作用の結果を図１４ａ〜１４ｆに示す。それぞれのサンプルについて標的酵素の半数（５０％）の働きを阻害できる濃度を示す５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出した結果をまとめて以下の表７に示す。なお、以下表中、オニビシ粗ポリフェノール抽出物については、混合物であることから分子量が特定できないため、μＭ単位でのＩＣ５０値は省略されている。【表７】
2019082909.tif 000025
【０１０１】  得られた結果から、オニビジ粗ポリフェノールは、比較例に対して、極めて低い濃度でメラニンを阻害することが確認された。
【０１０２】（７）抗酸化活性の測定上記得られたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、トラパインおよびこれらを含む粗ポリフェノール抽出物の各サンプルについて、2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）を用いた抗酸化活性を評価した。比較例として、既に抗酸化活性があるとして知られているアスコルビン酸を用いた。
【０１０３】  ＤＰＰＨ溶液は、ＤＰＰＨ（シグマアルドリッチ）をエタノールにて４００μＭとしたものを用いた。ＤＰＰＨ混液は、ＤＰＰＨ溶液：０．１ＭのＭＥＳ-ＮａＯＨ緩衝溶液（ｐＨ６）：エタノール＝１０：５：１０の割合で混ぜたものを用いた。トロロックス標準溶液は、80％エタノールにてトロロックス（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を溶解し、２００μＭとしたものを用いた。このトロロックス標準溶液を用いて、８０％エタノールにて０、５０、１００、１５０、２００μＭに調製したものを検量線用のトロロックス標準溶液とした。
【０１０４】  先ず、サンプル溶液またはトロロックス標準溶液５０μＬを各々９６穴のマイクロプレートに入れ、ＤＰＰＨ混液１５０μＬを加え、静かに振とうした。室温（２５℃）、暗所にて２０分間放置後、マイクロプレートリーダー（Synergy HT、バイオテック・ジャパン）にて５２０ｎｍにおける吸光度を測定した。以下の式にそれぞれの値を入れ、１μmolのトロロックス（ＴＥ）に相当するＤＰＰＨラジカル捕捉能を「ＤＰＰＨ単位（μmolＴＥ／g）」として表した。また、サンプル１μmolあたりのＤＰＰＨ単位（μmol ＴＥ／μmol）も求めた。
【０１０５】ＤＰＰＨ単位（μmol ＴＥ／g）＝ｘ×Ａ／１０００×１／ｗ×１０００×希釈倍率
【０１０６】  上記の式においてx：検量線からのモル濃度（μM）、w：サンプルの採取量（mg）、A：サンプルを抽出した時の容量(ml)を示す。
【０１０７】  それぞれのサンプルおよび比較例であるアスコルビン酸について、抗酸化活性の結果を表８に示す。なお、以下の表中、オニビシ粗ポリフェノール抽出物については、混合物であることから分子量が特定できないため、μmol TE/μmol単位での値は省略されている。【表８】
2019082909.tif 000026
【０１０８】  得られた結果から、オニビジ粗ポリフェノールは、比較例に対して、極めて低い濃度で高い抗酸化活性を発揮することが確認された。
【０１０９】（８）ヒシ実とヒシ果皮との比較  上述したように、ヒシ果皮を抽出して得られたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインを有効成分とする粗ポリフェノール抽出物は、優れたコラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、またはチロシナーゼに対する阻害活性、さらに付随してメラニン産生抑制作用および抗酸化作用が確認された。これは、ヒシ果皮に、ジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインが豊富に含まれていることが要因と考えられる。これらのうちヒシ果皮中のトラパイン、オイゲニイン、テトラ-ＧＧの含有量を測定した。
【０１１０】  さらに、比較例として、従来から一部の酵素活性阻害剤として知られているヒシ実に対して、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、またはチロシナーゼに対する阻害活性を確認した。確認手法としては、ヒシ実における上記有効成分トラパイン、オイゲニイン、およびテトラ-ＧＧの含有量を測定し、これらの有効成分がどの程度含有されているかによって、コラゲナーゼ阻害活性およびエラスターゼ阻害活性を確認した。得られた結果を、以下の表に示すと共に、比較例であるオニビシの実を原料とする抽出物に対する高速液体クロマトグラフィーの結果を図９に示す。
【０１１１】  なお、ヒシは天然物であるため、そのポリフェノール含量は、採取時期や保存状態に依存して多少変動する。そのため、以下表の各サンプルでは、同時期に採取されたワビシを用いて、同じ保存状態のもとで測定を行った。【表９】
2019082909.tif 000027
【０１１２】  得られた結果から、図９では、図３や図４で現れたジ-ＧＧ、トリ-ＧＧ、テトラ-ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインのピークが、現れていないことからも、比較例のヒシ実に係る抽出物は、上記３つの有効成分を含有しない溶液であることが確認された。また、ヒシ実を覆う薄皮である実皮をヒシ実に含めて使ったとしても、非常に薄皮であることから、量的にはヒシ実に対して無視できる程度の微量であり、実用上は、ヒシ実における実皮の寄与分は無視されるものとなる。従って、比較例に係る抽出物では、コラゲナーゼ阻害活性およびエラスターゼ阻害活性は得られないことが確認された。
【０１１３】  以上の結果から、本実施例に係るヒシの果皮抽出物は、従来の比較例に比べて高いコラゲナーゼ阻害活性およびエラスターゼ阻害活性を示した。このような結果から、本実施例に係るヒシの果皮抽出物は、コラーゲンおよびエラスチンの分解や変性を抑制できることから、例えば、機能性食品（例えば、健康補助食品、栄養機能食品など）、化粧品、ヘルスケア商品（健康の維持や増進を促進するための商品を指し、例えば、栄養ドリンク剤や肌に潤いを与えるパックなどが挙げられる）などに含有させることによって、さらには、薬剤の形態として、経口剤、肌用塗布剤、皮下注射剤、点鼻剤、または点眼剤として用いられることによって、健康で張りのある肌を得ることや維持することが可能となる。
【符号の説明】
【０１１４】１  実２  実皮３  内層皮４  表皮
【図１】
2019082909.tif 000032
【図２】
2019082909.tif 000033
【図３】
2019082909.tif 000034
【図４】
2019082909.tif 000035
【図５ａ】
2019082909.tif 000036
【図５ｂ】
2019082909.tif 000037
【図５ｃ】
2019082909.tif 000038
【図５ｄ】
2019082909.tif 000039
【図５ｅ】
2019082909.tif 000040
【図５ｆ】
2019082909.tif 000041
【図５ｇ】
2019082909.tif 000042
【図６ａ】
2019082909.tif 000043
【図６ｂ】
2019082909.tif 000044
【図７ａ】
2019082909.tif 000045
【図７ｂ】
2019082909.tif 000046
【図７ｃ】
2019082909.tif 000047
【図７ｄ】
2019082909.tif 000048
【図７ｅ】
2019082909.tif 000049
【図７ｆ】
2019082909.tif 000050
【図８】
2019082909.tif 000051
【図９】
2019082909.tif 000052
【図１０ａ】
2019082909.tif 000053
【図１０ｂ】
2019082909.tif 000054
【図１０ｃ】
2019082909.tif 000055
【図１０ｄ】
2019082909.tif 000056
【図１０ｅ】
2019082909.tif 000057
【図１０ｆ】
2019082909.tif 000058
【図１１】
2019082909.tif 000059
【図１２ａ】
2019082909.tif 000060
【図１２ｂ】
2019082909.tif 000061
【図１２ｃ】
2019082909.tif 000062
【図１２ｄ】
2019082909.tif 000063
【図１２ｅ】
2019082909.tif 000064
【図１２ｆ】
2019082909.tif 000065
【図１３】
2019082909.tif 000066
【図１４ａ】
2019082909.tif 000067
【図１４ｂ】
2019082909.tif 000068
【図１４ｃ】
2019082909.tif 000069
【図１４ｄ】
2019082909.tif 000070
【図１４ｅ】
2019082909.tif 000071
【図１４ｆ】
2019082909.tif 000072
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月27日(2019.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
菱科植物の果皮を抽出および／または粉砕して得られる粗ポリフェノール溶液から構成される酵素活性阻害剤であって、
ジ−ＧＧ、トリ−ＧＧ、テトラ−ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパインを含む有効成分を少なくともすべて含有し、
コラゲナーゼの酵素活性を阻害することを特徴とする
酵素活性阻害剤。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
請求項１に記載の酵素活性阻害剤において、
少なくとも１つの前記有効成分を含有し、さらに／または、前記有効成分に相当する成分を含有し、さらに／または、前記有効成分と同等の物質を含有することを特徴とする
酵素活性阻害剤。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
請求項１または請求項５のいずれかに記載の酵素活性阻害剤において、菱科植物が、ワビシ（Ｔｒａｐａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、オニビシ（Ｔｒａｐａ  ｎａｔａｎｓ）、トウビシ（Ｔｒａｐａ  ｂｉｃｏｒｎｉｓ）、およびヒメビシ（Ｔｒａｐａ  ｉｎｃｉｓａ）から成る群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする
酵素活性阻害剤。
【請求項９】
請求項１、請求項５、または請求項８のいずれかに記載の酵素活性阻害剤において、
経口剤、肌用塗布剤、皮下注射剤、点鼻剤、および点眼剤からなる群から選択される薬剤として、または、機能性食品、化粧品、およびヘルスケア商品からなる群から選択される形態として用いられることを特徴とする
酵素活性阻害剤。
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月30日(2020.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）で表される有効成分を含有し、
【化１】
2019082909.tif 000073
（但し、Ｘ１〜Ｘ５は、各々互いに独立して、以下の一般式（ＩＩ）で表される置換基Ａまたは水素原子であり、当該置換基Ａが上記式中に少なくとも２つ含まれ、Ｘ１〜Ｘ５のうちの隣接する置換基Ａ同士が直接又は架橋構造を介して相互連結されていてもよい）
【化２】
2019082909.tif 000074
（但し、ｍは、１〜３の整数であり、水酸基を構成する水素原子の少なくとも一部が置換基Ａで置換されていてもよい）
コラゲナーゼまたはエラスターゼの酵素活性を阻害することを特徴とする
酵素活性阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載の酵素活性阻害剤において、
前記有効成分が、ジ−ＧＧ、トリ−ＧＧ、テトラ−ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、ＤＢＴＧ、オイゲニイン、およびトラパイン、もしくはこれらの類縁体から成る群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする
酵素活性阻害剤。
【請求項３】
請求項１に記載の酵素活性阻害剤において、
前記有効成分が、ジ−ＧＧ、トリ−ＧＧ、ＣＨ−ｄｉ−ＧＧ、およびＤＢＴＧ、もしくはこれらの類縁体から成る群から選択される少なくとも１つであり、
ヒアルロニダーゼまたはチロシナーゼの酵素活性を阻害することを
特徴とする
酵素活性阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の酵素活性阻害剤において、
前記有効成分が、菱科植物の果皮を抽出および／または粉砕して得られたものであることを特徴とする
酵素活性阻害剤。
【請求項５】
請求項４に記載の酵素活性阻害剤において、
少なくとも１つの前記有効成分を含有し、さらに／または、前記有効成分に相当する成分を含有し、さらに／または、前記有効成分と同等の物質を含有することを特徴とする
酵素活性阻害剤。
【請求項６】
菱科植物の果皮の抽出物および／または粉砕物を有効成分として含有する酵素活性阻害剤であって、当該酵素が、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、またはチロシナーゼであることを特徴とする
酵素活性阻害剤。
【請求項７】
請求項６に記載の酵素活性阻害剤において、
前記酵素が、コラゲナーゼまたはエラスターゼであることを特徴とする
酵素活性阻害剤。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれかに記載の酵素活性阻害剤において、
菱科植物が、ワビシ（Ｔｒａｐａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、オニビシ（Ｔｒａｐａ  ｎａｔａｎｓ）、トウビシ（Ｔｒａｐａ  ｂｉｃｏｒｎｉｓ）、およびヒメビシ（Ｔｒａｐａ  ｉｎｃｉｓａ）から成る群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする
酵素活性阻害剤。
【請求項９】
請求項１〜請求項８のいずれかに記載の酵素活性阻害剤において、
経口剤、肌用塗布剤、皮下注射剤、点鼻剤、および点眼剤からなる群から選択される薬剤として、または、機能性食品、化粧品、およびヘルスケア商品からなる群から選択される形態として用いられることを特徴とする
酵素活性阻害剤。
【国際調査報告】
2019082909.tif 000075
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