(57)【要約】  破壊強度が高く、破壊伸びが高い高分子量体の４−ヒドロキシブチレート単位含有ポリヒドロキシアルカノエートを提供すること。  ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量が１２５万以上であり、重合単位として３−ヒドロキシブチレート単位及び４−ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含み、全モノマー単位に対する４−ヒドロキシブチレート単位の割合が１４モル％〜４０モル％である、ポリエステル。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量が１２５万以上であり、重合単位として３−ヒドロキシブチレート単位及び４−ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含み、全モノマー単位に対する４−ヒドロキシブチレート単位の割合が１４モル％〜４０モル％である、ポリエステル。
【請求項２】
ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量が１３８万以上である、請求項１に記載のポリエステル。
【請求項３】
ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量が１８０万以上である、請求項１または２に記載のポリエステル。
【請求項４】
ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による数平均分子量が３０万以上である、請求項１から３の何れか一項に記載のポリエステル。
【請求項５】
重合単位が、３−ヒドロキシブチレート単位と４−ヒドロキシブチレート単位のみからなる、請求項１から４の何れか一項に記載のポリエステル。
【請求項６】
ランダムポリマーである、請求項１から５の何れか一項に記載のポリエステル。
【請求項７】
請求項１から６の何れか一項に記載のポリエステルを含むフィルム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−ヒドロキシブチレート単位及び４−ヒドロキシブチレート単位を含み、かつ高分子量を有するポリエステルに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの微生物はその生体内にエネルギー源・炭素源貯蔵物質としてポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を蓄積する。炭素源が十分にあり、窒素、リン、硫黄、酸素、マグネシウム等の栄養素が制限されるとＰＨＡの蓄積が起きることがよく知られている。ＰＨＡは熱可塑性のポリエステルであり、生分解性・生体適合性のプラスチックとして注目され、多くの研究がなされてきた（非特許文献１）。ＰＨＡを構成するモノマーユニットは１００種類以上知られており、もっとも代表的なものは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート（以下、３ＨＢと略す）からなるポリ−３−ヒドロキシブチレート（以下、Ｐ（３ＨＢ）と略す）である（非特許文献１）。【０００３】
Ｐ（３ＨＢ）はポリプロピレン（以下、ＰＰと略す）と同程度の高い融点を持ち、破壊強度もＰＰと同程度であるが破壊伸びが５％以下であり、結晶性が高く、固くて脆い材料である。工業的にＰＨＡを利用しようとする場合、その物性を向上させる方法として、第二成分モノマーユニットを導入し共重合体化する方法や、分子量を増大させる方法がある。
第二成分モノマーユニットを導入し共重合体化する方法としては、４−ヒドロキシブチレート（以下、４ＨＢ）を導入した共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）と略す）（非特許文献２）が一例としてあげられる。【０００４】
また、分子量を増大させる方法としては、ＰＨＡ合成系・分解系を持たない大腸菌  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−ＢｌｕｅへＰ（３ＨＢ）合成細菌Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒから取り出したＰ（３ＨＢ）生合成遺伝子（ｐｈａＣＡＢ）を導入し、その遺伝子組換え菌をｐＨ６で培養し超高分子量Ｐ（３ＨＢ）を製造する方法がある（非特許文献３）。【０００５】
Ｐ（３ＨＢ）を生産する野生株のＰ（３ＨＢ）の重量平均分子量Ｍｗは一般的には５０万〜１５０万程度とも２０万〜２００万程度、さらには１万〜３００万程度ともいわれ、野生型の微生物では菌体内に多数の分解酵素を有するためＭｗ３００万以上になる超高分子量体Ｐ（３ＨＢ）の合成が難しいとされる。また、Ｐ（３ＨＢ）は微生物がエネルギー源・炭素源貯蔵物質として蓄積しているため、炭素源が枯渇した場合に分解して使用されることは多くの微生物で調べられている。しかし、ＰＨＡの合成と分解が同時に起きていることを示す例も示されている。ＰＨＡの合成と分解が同時に起きていることの生理学的意義はまだ解明されていない。またＰＨＡ生産野生株ではＰＨＡの合成と分解がこのように同時に起こってしまうため、超高分子量体ＰＨＡ合成が難しい要因の一つである。【０００６】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）の製造研究も多数行われており、Ｐ（３ＨＢ）生産野生株であるＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒに４−ヒドロキシ酪酸（４ＨＢ）、γ−ブチロラクトン、１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，８−オクタンジオール、１，１０−デカンジオール、１，１２−ドデカンジオールなどの炭素源を与えて培養することでＰ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）が生産される。【０００７】
Ｐ（３ＨＢ）生産野生株ではなく、Ｐ（３ＨＢ）非生産菌である大腸菌を遺伝子組換えしてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）やＰ（４ＨＢ）を生産する方法も報告されている。当初はアセチルＣｏＡからＰ（３ＨＢ）を生産するのに必要なＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ由来のβ−ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）、ＰＨＡ重合酵素（ＰｈａＣ）の各遺伝子ｐｈａＡ，ｐｈａＢ，ｐｈａＣに加えて、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来のコハク酸分解経路の遺伝子（ｓｕｃＤ、４ｈｂＤ、ｏｒｆＺ）を導入することで、コハク酸から４ＨＢ−ＣｏＡを供給し、大腸菌にてグルコースを炭素源として分子量Ｍｗが約１８０万のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）が生産されたが、ＰＨＡ中の４ＨＢ比率は１．３〜１．５％と低いものであった（非特許文献４）。【０００８】
また、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）の生産にε−カプロラクトンまたはそのけん化物である６−ヒドロキシヘキサノエート（またはその塩）を利用した報告もある。ε−カプロラクトンを炭素源としてＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒを培養した場合、ＰＨＡ含量２６から３８％、４ＨＢ比率３０％から３６％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）を蓄積したという報告があるが（非特許文献５）、分子量や力学的試験の記載はない。
さらに、高分子量かつ高弾性のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）の製造が報告されているが（非特許文献６）、破壊強度は十分なものではなかった。【０００９】
また特許文献１には、  ポリヒドロキシアルカノエート（Ａ）、酢酸ビニルを含む共重合体（Ｂ）およびペンタエリスリトール（Ｃ）を含有する脂肪族ポリエステル樹脂組成物であり、ポリヒドロキシアルカノエート（Ａ）と酢酸ビニルを含む共重合体（Ｂ）が非相溶である脂肪族ポリエステル樹脂組成物が記載されている。特許文献１に記載の脂肪族ポリエステル樹脂組成物は、ポリヒドロキシアルカノエートの欠点である結晶化の遅さを改善して、射出成形などの成形加工における加工性を改善し、加工速度を向上するとともに、得られる成形体からのブルームを抑制することを目的とするものである。特許文献１においては、酢酸ビニルを含む共重合体（Ｂ）およびペンタエリスリトール（Ｃ）を配合し、さらにポリヒドロキシアルカノエート（Ａ）と酢酸ビニルを含む共重合体（Ｂ）を非相溶とすることにより上記の目的を達成している。特許文献１では、破壊強度が高く、かつ破壊伸びが高いフィルムを製造できる４ＨＢ含有ＰＨＡを提供するための条件については検討されていない。【００１０】
特許文献２においては、繊維集合体および３−ヒドロキシブチレート単位と４−ヒドロキシブチレート単位とを有するポリエステル共重合体からなる軟組織用医療用材料が記載されている。特許文献２では、３ＨＢ・４ＨＢポリエステル共重合体の４ＨＢ単位含有量は、通常３０〜９９モル％、好ましくは４０〜９８モル％、特に好ましくは６０〜９５モル％であることが記載されている。また、特許文献３には、３−ヒドロキシブチレート単位９７〜８０モル％および４−ヒドロキシブチレート単位３〜２０モル％からなるポリエステル共重合体を、アルカリゲネス属菌の存在下に製造する方法が記載されている。特許文献２および３においても、破壊強度が高く、かつ破壊伸びが高いフィルムを製造できる４ＨＢ含有ＰＨＡを提供するための条件については検討されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１５／０９８００１号
【特許文献２】特開平７−２７５３４４号公報
【特許文献３】特開平６−１８１７８４号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ａｌｉｓｔａｉｒ  Ｊ. Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．５４，Ｎｏ．４，４５０−４７２，１９９０
【非特許文献２】Ｍａｓａｏ  Ｋｕｎｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｖｏｌ．２２，６９４−６９７，１９８９
【非特許文献３】Ｓ．Ｋｕｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４７，１４０−１４３，１９９７
【非特許文献４】Ｈｅｎｒｙ  Ｅ．  Ｖａｌｅｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．５８，３３−３８，１９９７
【非特許文献５】Ｓｕｎｇ  Ｃｈｕｌ  Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｏｒｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．２，７１−７９，２０００
【非特許文献６】Ｋａｉ−Ｈｅｅ  Ｈｕｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１２４，Ｎｏ．１，７６−８３，２０１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ＰＨＡの共重合体化と高分子量化はＰＨＡの物性を改善することが期待される。Ｐ（３ＨＢ）は硬くてもろい物性であるが、３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）ユニットを共重合体化しても共結晶化してしまうために、あまり物性の改善は見込めない。しかし、４ＨＢユニットや３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）ユニットなど、３ＨＢユニットとは共結晶化しない第二成分ユニットからなる共重合ＰＨＡはその第二ユニット成分の比率を変化させることで大幅な物性の改善が見込める。特に、側鎖を持つ３ＨＢユニットや他の３−ヒドロキシアルカノエートからなるＰＨＡがリパーゼ分解性を示さないのに対して、３ＨＢと比較して側鎖を持たない４ＨＢユニットを共重合体化させたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）は、ＰＨＡ分解酵素だけでなくリパーゼによる酵素分解も受けることが知られており、生体内での分解性の向上が見込まれ、医療材料として期待されている。しかし、従来からよく用いられてきた４ＨＢユニット前駆体である１，４−ブタンジオールやγ−ブチロラクトンや４ＨＢを使用したＰＨＡ生産野生株を使用した製造法では、４ＨＢ比率が１４モル％〜４０モル％であり、かつ重量平均分子量Ｍｗが１２５万以上のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）共重合体を得る方法は知られていない。遺伝子組換え菌（Ｄｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）を使用した場合には、重量平均分子量Ｍｗ２４７万、数平均分子量Ｍｎ４８万のＰ（４ＨＢ）の生産の報告はある。遺伝子組換え大腸菌にて分子量１８０万のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）の生産の報告もあるが、４ＨＢ比率は僅か１．３〜１．５％である。【００１４】
上記の通り、大幅に物性の改善が見込める例えば４ＨＢ比率が１４モル％〜４０モル％であり、かつ重量平均分子量Ｍｗが１２５万以上のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）共重合体の製造方法は知られていない。【００１５】
ＰＨＡ生産野生株は必要に応じて蓄積したＰＨＡを分解利用し細胞内にＰＨＡ分解酵素を持っているため、超高分子量ＰＨＡを合成することは難しいとされ、また培養期間を通してＰＨＡの分子量が次第に減少していくことは一般的な現象だと理解されている。【００１６】
ＰＨＡを医療材料として用いる場合にはエンドトキシン除去を始めとする高度な精製技術が用いられるが、一般的に精製を高度に行うほどＰＨＡは分解し分子量は低下していく傾向がある。また加熱溶融など熱処理を加えることでも分子量低下は進行するため、精製後や製品化後ＰＨＡの分子量が高分子量体の必要が有る場合には、精製前の培養段階において十分に高分子量体であることが求められる。医療材料でなく一般工業品向けであっても、ある程度の精製工程は必ず必要であり、精製後ＰＨＡの物性向上にはより高分子量体であることが求められている。よって培養段階で従来よりも高分子量体ＰＨＡが得られる方法が求められてきた。【００１７】
本発明は、破壊強度が高く、破壊伸びが高い高分子量体の４ＨＢ含有ＰＨＡを提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、遺伝子組換えを用いないＰＨＡ生産野生株であっても様々な分子量のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）が得られ、特に重量平均分子量１２５万以上であり、全モノマー単位に対する４−ヒドロキシブチレート単位の割合が１４モル％〜４０モル％であるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）が優れた物性を示すことを見出した。本発明は、上記の知見に基づいて完成したものである。【００１９】
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）  ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量が１２５万以上であり、重合単位として３−ヒドロキシブチレート単位及び４−ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含み、全モノマー単位に対する４−ヒドロキシブチレート単位の割合が１４モル％〜４０モル％である、ポリエステル。
（２）  ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量が１３８万以上である、（１）に記載のポリエステル。
（３）  ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量が１８０万以上である、（１）または（２）に記載のポリエステル。
（４）  ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による数平均分子量が３０万以上である、（１）から（３）の何れか一に記載のポリエステル。
（５）  重合単位が、３−ヒドロキシブチレート単位と４−ヒドロキシブチレート単位のみからなる、（１）から（４）の何れか一に記載のポリエステル。
（６）  ランダムポリマーである、（１）から（５）の何れか一に記載のポリエステル。
（７）  （１）から（６）の何れか一に記載のポリエステルを含むフィルム。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により提供される重量平均分子量１２５万以上であり、全モノマー単位に対する４−ヒドロキシブチレート単位の割合が１４モル％〜４０モル％であるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）は、優れた物性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、実施例８のＰＨＡの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】図２は、実施例８のＰＨＡの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図３】図３は、実施例９のＰＨＡの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図４】図４は、実施例９のＰＨＡの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】図５は、実施例８のＰＨＡ含有菌体のＰＨＡ組成分析（ＧＣ−ＦＩＤクロマトグラム）を示す。
【図６】図６は、図５のクロマトグラムで示した各ピークの同定結果（ＧＣ−ＭＳスペクトル）を示す。
【図７】図７は、図５のクロマトグラムで示した各ピークの同定結果（ＧＣ−ＭＳスペクトル）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
［ポリエステル］
本発明のポリエステルは、ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量が１２５万以上であり、重合単位として３−ヒドロキシブチレート単位及び４−ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含み、全モノマー単位に対する４−ヒドロキシブチレート単位の割合が１４モル％〜４０モル％である。
【００２３】
上記の通り、本発明のポリエステルの特徴の一つは、ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量（Ｍｗ）が１２５万以上であるという高分子量であることである。ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量は好ましくは１３８万以上であり、より好ましくは１８０万以上であり、さらに好ましくは１９０万以上である。ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量は、２００万以上、２１０万以上、２２０万以上、２３０万以上、２４０万以上、２５０万以上、２６０万以上、２７０万以上、２８０万以上、２９０万以上、３００万以上、３１０万以上、３２０万以上、３３０万以上、３４０万以上、３５０万以上、３６０万以上、３７０万以上、３８０万以上、３９０万以上、または４００万以上でもよい。ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量の上限は特に限定されないが、一般的には、２０００万以下であり、１０００万以下、８００万以下、７００万以下、６００万以下、または５００万以下でもよい。ポリエステルの重量平均分子量を１２５万以上とすることにより、高い破壊強度を有するフィルムを製造することが可能になる。
【００２４】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）は伸展性がありしなやかであることが知られるが、重量平均分子量が１２５万以上の場合、望ましくは重量平均分子量が３００万を超える超高分子量体の場合には、伸展性があると同時に破壊強度が向上することが本発明において見出された。
【００２５】
本発明のポリエステルは、好ましくは、ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による数平均分子量（Ｍｎ）が３０万以上である。ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による数平均分子量は、３５万以上、４０万以上、４５万以上、５０万以上、５５万以上、６０万以上、６５万以上、７０万以上、７５万以上、８０万以上、８５万以上、９０万以上、９５万以上、または１００万以上でもよい。ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による数平均分子量の上限は特に限定されないが、一般的には、１０００万以下であり、５００万以下、４００以下、３００万以下、または２００万以下でもよい。
【００２６】
Ｍｎに対するＭｗの比率（Ｍｗ／Ｍｎ）は特に限定されないが、好ましくは１．０〜１０．０であり、より好ましくは１．０〜８．０であり、さらに好ましくは１．０〜７．０であり、１．０〜６．０、１．０〜５．０さらには１．０〜４．０が好ましい。
【００２７】
ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量の測定は、後記する実施例に記載した方法と同様に行うことができる。
【００２８】
本発明のポリエステルは、重合単位として３−ヒドロキシブチレート単位及び４−ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含む。即ち、本発明のポリエステルは、重合単位として３−ヒドロキシブチレート単位及び４−ヒドロキシブチレート単位のみを含むポリエステルでもよいし（即ち、重合単位は、３−ヒドロキシブチレート単位と４−ヒドロキシブチレート単位のみからなる）、あるいは、重合単位として３−ヒドロキシブチレート単位及び４−ヒドロキシブチレート単位を含み、さらに上記以外の別の重合単位を含んでいてもよい。上記した別の重合単位としては、ラクテート（ＬＡ）、グリコレート（ＧＡ）、３−ヒドロキシプロピオネート（３ＨＰ）、３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）、５−ヒドロキシバレレート（５ＨＶ）、５−ヒドロキシヘキサノエート（５ＨＨ）、６−ヒドロキシヘキサノエート（６ＨＨ）、又は３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）、あるいは炭素数７以上のヒドロキシアルカノエート等を挙げることができる。
【００２９】
本発明において、３−ヒドロキシブチレート単位と４−ヒドロキシブチレート単位はそれぞれ次式で表される。
３−ヒドロキシブチレート単位：−ＯＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）−
４−ヒドロキシブチレート単位：−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）−
【００３０】
本発明のポリエステルの特徴の一つは、全モノマー単位に対する４−ヒドロキシブチレート単位の割合が１４モル％〜４０モル％であることである。
全モノマー単位に対する４−ヒドロキシブチレート単位の割合は、１５モル％以上、１６モル％以上、１７モル％以上、１８モル％以上、１９モル％以上、または２０モル％以上でもよく、２０．２モル％以上、２０．６モル％上、２１モル％以上、２２モル％以上、２３モル％以上、２４モル％以上、２５モル％以上、２６モル％以上、２７モル％以上、又は２８モル％以上でもよい。
全モノマー単位に対する４−ヒドロキシブチレート単位の割合は、３５モル％以下、３４モル％以下、３３モル％以下、３２モル％以下、３１モル％以下、３０モル％以下、２９．９モル％以下、２９．８モル％以下、２９モル％以下、２８モル％以下、２７モル％以下、２６モル％以下、または２５モル％以下でもよい。
【００３１】
全モノマー単位に対する４−ヒドロキシブチレート単位の割合は、好ましくは２０．２モル％以上、２０．６モル％上、２１モル％以上、２２モル％以上、２３モル％以上、２４モル％以上、又は２５モル％以上であり、かつ２９．９モル％以下、２９．８モル％以下、２９モル％以下、２８モル％以下、又は２７モル％以下である。全モノマー単位に対する４−ヒドロキシブチレート単位の割合の一例としては、２１モル％以上２９モル％以下である。
【００３２】
ポリエステルの重量平均分子量を１２５万以上である場合、全モノマー単位に対する４−ヒドロキシブチレート単位の割合が１４モル％〜４０モル％という範囲においては、全モノマー単位に対する４−ヒドロキシブチレート単位の割合が増加するに伴って、製造されるフィルムの破壊伸びも増大する傾向が認められる。本発明においては、ポリエステルの重量平均分子量を１２５万以上である特徴と、全モノマー単位に対する４−ヒドロキシブチレート単位の割合が１４モル％〜４０モル％であるという特徴とを組み合わせることにより、高い破壊強度と、高い破壊伸びとの両立を図ることができる。
【００３３】
全モノマー単位に対する４−ヒドロキシブチレート単位の割合は、後記する実施例に記載した方法に準じて測定することができる。
【００３４】
本発明のポリエステルは、ランダムポリマー、ブロックポリマー、交互ポリマー、またはグラフトポリマーの何れでもよいが、好ましくはランダムポリマーである。
【００３５】
［ポリエステルの製造方法］
本発明のポリエステルは、Ｐ（３ＨＢ）生産能を有する微生物を、炭素源としてε−カプロラクトン（別名６−ヘキサノラクトン）、またはそのけん化物である６−ヒドロキシヘキサノエートまたはその塩の存在下に培養を行うことにより、製造することができる。
【００３６】
Ｐ（３ＨＢ）生産能を有する微生物としては、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ属、  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、またはＰａｒａｃｏｃｃｏｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ属、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｔｈｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ属に属する微生物を使用することができる。上記の中でも、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属は好ましく、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒがより好ましい。一例としては、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株（ＡＴＣＣ１７６９９）を使用することができる。
【００３７】
なお、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株野生株では３ＨＢ、３ＨＶ、４ＨＢ、５ＨＶなどは十分ＰＨＡに取り込み可能であるが、基質特異性の異なるＰＨＡ重合酵素遺伝子を導入した遺伝子組換え菌を用いれば他のヒドロキシ酸もＰＨＡに重合可能である。従って、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株だけではなく、その遺伝子組換株や、上記した通り、他のＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ属、  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐａｒａｃｏｃｃｏｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ属、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｔｈｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ属などＰＨＡを重合する能力を有する、あるいは付与した微生物を使用することも可能である。
【００３８】
培養液のｐＨは、一般的には約４〜約１０であり、好ましくは約５〜約８であり、より好ましくは約５．８〜約７．５である。
培養温度は、一般的には１５℃〜４５℃であり、好ましくは２０℃〜４０℃であり、より好ましくは２５℃〜３８℃である。
培養方式は、回分培養、流加培養または連続培養のいずれでもよい。
【００３９】
培地成分は、使用する微生物を資化し得る物質であれば特に制限はない。
炭素源としては、例えば、メタノール、エタノール、ブタノール、酢酸または酪酸などの有機炭素源、二酸化炭素などの無機炭素源、酵母エキス、糖蜜、ペプトンおよび肉エキスなどの天然物、アラビノース、グルコース、マンノース、フラクトースおよびガラクトースなどの糖類、またはソルビトール、マンニトールおよびイソシトールなどを使用することができる。
【００４０】
窒素源としては、例えば、アンモニア、アンモニウム塩（塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム）、硝酸塩などの無機窒素化合物および／または、たとえば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物を使用することができる。
【００４１】
無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩、ニッケル塩、クロム塩、ホウ素化合物およびヨウ素化合物等からそれぞれ選択され、より具体的には、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
【００４２】
そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
【００４３】
４ＨＢ含有ＰＨＡを製造する方法としては、ＰＨＡ生産野生株に４ＨＢ−ＣｏＡになりうる前駆体を入れて培養する方法と、遺伝子組換えによって４ＨＢ−ＣｏＡの供給経路を導入する方法とがある。本発明において、ＰＨＡ生産野生株に４ＨＢ−ＣｏＡになりうる前駆体を入れて培養する方法を採用する場合には、従来からよく知られた４ＨＢ、γ−ブチロラクトン、炭素数４以上の偶数ジオールではなくε−カプロラクトンまたは６−ヒドロキシヘキサノエートまたはその塩（例えば、６−ヒドロキシヘキサノエートＮａ、６−ヒドロキシヘキサノエートＫ）を使用することが好ましい。
【００４４】
３ＨＢ−ＣｏＡは２つのアセチルＣｏＡからβケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）によってアセトアセチルＣｏＡに変換され、さらにアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）によって３ＨＢ−ＣｏＡに変換され、３ＨＢ−ＣｏＡはＰＨＡ重合酵素（ＰｈａＣ）によってＰ（３ＨＢ）へ重合される。短鎖長ユニット（炭素数３〜５）からなるＰＨＡを合成する細菌の多くはこの３種類の酵素に対する遺伝子ｐｈａＡ，ｐｈａＢ，ｐｈａＣを持っており、糖や油脂類、アルコールなどの炭素源の代謝により生じるアセチルＣｏＡからＰ（３ＨＢ）を合成する能力を持っている。このような菌ではプロピオン酸が存在すると、アセチルＣｏＡとプロピオニルＣｏＡから縮合還元されて３ＨＶ−ＣｏＡが供給され、３ＨＢ−ＣｏＡと３ＨＶ−ＣｏＡがともに存在することになり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）が蓄積されることになる。バレレート（吉草酸）やペンタノールからも３ＨＶ−ＣｏＡが供給され、３ＨＶユニットとしてＰＨＡに取り込まれる。
【００４５】
また４ＨＢ−ＣｏＡの前駆体になる４ＨＢそのものやγ−ブチロラクトン、１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，８−オクタンジオール、１，１０−デカンジオール等が存在すると、４ＨＢ−ＣｏＡが供給され、３ＨＢ−ＣｏＡと４ＨＢ−ＣｏＡがともに存在することになり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）が蓄積されることになる。
炭素数６以上の偶数ジオールではβ酸化系によってアセチルＣｏＡが生成すると同時に４ＨＢ−ＣｏＡも生成する。
【００４６】
４ＨＢ、γ−ブチロラクトン、１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，８−オクタンジオール、１，１０−デカンジオールなどを使用した従来のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）の合成（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９８９），  ３０，５６９−５７３、やＰｏｌｙｍｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３９，Ｉｓｓｕｅ  ３，ｐａｇｅｓ１６９−１７４，Ｍａｒｃｈ  １９９６）では、あまり高分子量体が得られておらず、よい物性を確保したまま工業化するのには問題があった。
【００４７】
ε−カプロラクトンを培養に添加すると、ε−カプロラクトンは開環され、６−ヒドロキシヘキサノエート（６ＨＨ）になり、ＣｏＡが付加されて６ＨＨ−ＣｏＡとなり、β酸化系でアセチルＣｏＡが抜けて４ＨＢ−ＣｏＡが残り、ＰＨＡに取り込まれると４ＨＢユニットになる。ＰＨＡ重合酵素の基質特異性から６ＨＨ−ＣｏＡはＰＨＡには取り込まれにくく、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）が蓄積される。
４ＨＢ−ＣｏＡもβ酸化を受ければ、アセチルＣｏＡも生成する。
【００４８】
伸長中のＰＨＡ重合酵素の酵素−Ｓ−ＰＨＡ複合体にヒドロキシ基を有する化合物が入り込み、酵素とＰＨＡポリマー鎖間のチオエステルを切断し、ＰＨＡポリマー鎖は酵素から連鎖移動剤に移動しＰＨＡ重合が停止する反応は、ラジカル重合に倣い連鎖移動反応と言われている。４ＨＢやジオール類はヒドロキシ基を持つ化合物であり、γ−ブチロラクトンも開環して４ＨＢになるため、これらヒドロキシ基を持つ化合物はＰＨＡ重合時の連鎖移動剤として働き、ＰＨＡの重合を停止させてしまう可能性がある。特にジオール類は末端の２つのヒドロキシ基のどちらでも連鎖移動に関与することが可能なため、特にＰＨＡ重合の停止を引き起こしやすく、高分子量体ＰＨＡが得られにくいと考えられる。
【００４９】
ε−カプロラクトンが開環すると６ＨＨが生成し、やはりヒドロキシ基をもつ化合物になる。ＰＨＡ重合酵素の基質に４ＨＢ−ＣｏＡはなりえるが６ＨＨ−ＣｏＡは基質になりにくいのと同様に、６ＨＨの方が４ＨＢよりもおそらく連鎖移動剤としても働きにくいために、ε−カプロラクトンを使用した場合により高分子量体ＰＨＡが得られるものと考えられる。
【００５０】
微生物による物質生産には、増殖連動的生産と増殖非連動的生産とがある。
増殖連動的なＰＨＡ生産では、ＰＨＡ以外の菌体成分が増殖していると同時にＰＨＡも蓄積する。増殖連動的ＰＨＡ生産では、アセチルＣｏＡはＰＨＡ合成と菌体増殖の両方で取り合いになり、アセチルＣｏＡは余剰になりにくい。増殖連動的ＰＨＡ生産の間は、ＰＨＡの分解による遊離のヒドロキシ酸の発生も抑えられ、連鎖移動反応も起きにくいと推測され、分子量が相対的に高くなるものと推測される。
【００５１】
増殖非連動的なＰＨＡ生産では、菌体成分の増殖が停止した後に、ＰＨＡの蓄積が起き、ＰＨＡ含量が増加していく。菌体増殖が停止しているため、過剰のアセチルＣｏＡはＰＨＡ生産に使用される。増殖非連動的なＰＨＡ生産の間では、一旦ＰＨＡの形に取り込まれた成分を再度分化して遊離ヒドロキシ酸を菌体内外に排出しているようである。培養の後半において窒素源が枯渇した場合、増殖連動的生産から増殖非連動的生産に移行し、連鎖移動反応も頻繁に起き、合成と分解が同時に起こりやすい状態（分子量が低下しやすい状態）になるものと推測される。
【００５２】
本発明においては、増殖連動的にＰＨＡを蓄積させた場合に、栄養制限状態で増殖非連動的にＰＨＡを蓄積させる場合よりも優位に高分子量のＰＨＡを蓄積することが発見された。即ち、本発明のポリエステルの製造においては、菌体の増殖とＰＨＡの蓄積を分けた栄養制限による増殖非連動的なＰＨＡ生産ではなく、菌体の増殖とＰＨＡの蓄積が同時に起きる増殖連動的なＰＨＡ生産であることが望ましい。
【００５３】
本発明の方法に従って培養することにより得られた培養液から、ろ過及び遠心分離などの通常の固液分離手段によって菌体を分離回収し、この菌体を洗浄、乾燥して乾燥菌体を得ることができる。この乾燥菌体から、常法により、たとえば、クロロホルムのような有機溶剤で、生成されたポリエステルを抽出し、この抽出液に、例えば、ヘキサンのような貧溶媒を加えることによって本発明のポリエステルを沈澱させ、回収することができる。
【００５４】
［フィルム］
本発明によればさらに、上記した本発明のポリエステルを含むフィルムが提供される。
本発明のフィルムの製造方法は特に限定されず、ソルベントキャスト法、溶融押出成型法などの常法により製膜してフィルムを製造することができる。
【００５５】
本発明のフィルムの破壊強度は、好ましくは１８Ｎ／ｍｍ2以上であり、１９Ｎ／ｍｍ2以上、２０Ｎ／ｍｍ2以上、２１Ｎ／ｍｍ2以上、２２Ｎ／ｍｍ2以上、２３Ｎ／ｍｍ2以上、２４Ｎ／ｍｍ2以上、２５Ｎ／ｍｍ2以上、２６Ｎ／ｍｍ2以上、２７Ｎ／ｍｍ2以上、２８Ｎ／ｍｍ2以上、２９Ｎ／ｍｍ2以上、又は３０Ｎ／ｍｍ2以上でもよい。破壊強度の上限は特に限定されないが、一般的には、１００Ｎ／ｍｍ2以下であり、５０Ｎ／ｍｍ2以下でもよい。
破壊強度は、ＩＳＯ  ５２７−１、ＪＩＳ  Ｋ７１６１に準拠して測定されたものである。
【００５６】
本発明のフィルムの破壊伸びは、好ましくは３００％以上であり、４００％以上、４６０％以上、４７０％以上であり、４８０％以上、４９０％以上、又は５００％以上でもよい。破壊伸びの上限は特に限定されないが、一般的には１０００％以下であり、９００％以下、８００％以下、又は７００％以下でもよい。
破壊伸びは、ＩＳＯ  ５２７−１、ＪＩＳ  Ｋ７１６１に準拠して測定されたものである。
【００５７】
本発明のフィルムの弾性率は、好ましくは２４０Ｎ／ｍｍ2以上であり、２５０Ｎ／ｍｍ2以上、２７０Ｎ／ｍｍ2以上、３００Ｎ／ｍｍ2以上、３５０Ｎ／ｍｍ2以上、４００Ｎ／ｍｍ2以上、４５０Ｎ／ｍｍ2以上、又は５００Ｎ／ｍｍ2以上でもよい。弾性率の上限は特に限定されないが、一般的には、１０００Ｎ／ｍｍ2以下であり、９００Ｎ／ｍｍ2以下、又は８００Ｎ／ｍｍ2以下でもよい。
弾性率は、ＩＳＯ  ５２７−１、ＪＩＳ  Ｋ７１６１に準拠して測定されたものである。
【００５８】
ポリエステルの重量平均分子量を１２５万以上である場合、弾性率は、全モノマー単位に対する４−ヒドロキシブチレート単位の割合の影響を受け易い傾向がある。即ち、全モノマー単位に対する４−ヒドロキシブチレート単位の割合が１４モル％〜４０モル％という範囲においては、全モノマー単位に対する４−ヒドロキシブチレート単位の割合が増加するに伴って、製造されるフィルムの弾性率は低下する傾向が認められる。
【００５９】
上記した物性を有するフィルムは、本発明により提供される「ポリスチレン換算ゲル浸透クロマトグラフィー測定による重量平均分子量が１２５万以上であり、重合単位として３−ヒドロキシブチレート単位及び４−ヒドロキシブチレート単位を少なくとも含み、全モノマー単位に対する４−ヒドロキシブチレート単位の割合が１４モル％〜４０モル％である、ポリエステル」を製膜することにより得られる。
【００６０】
本発明のフィルムを製造する際には、本発明により提供されるポリエステルを製膜すればよく、酢酸ビニルを含む共重合体及び／またはペンタエリスリトールを配合する必要はない。即ち、本発明のフィルムの一実施形態としては、本発明により提供されるポリエステルを含み、酢酸ビニルを含む共重合体を含まず、かつペンタエリスリトールを含まないフィルムを挙げることができる。
【００６１】
本発明のフィルムは、上記した優れた物性を有し、且つ生分解性及び生体適合性に優れたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）からなるものであり、医療用器具、食品その他の包装材料、農業用ビニールシート、苗用の鉢、建設土木用シート等に有用である。
【００６２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００６３】
［ポリマーの製造（ジャー培養）］
＜実施例１＞
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株（ＡＴＣＣ１７６９９）を使用してＰＨＡを製造した。
ＫＨ2ＰＯ4  ２．７２ｇ／Ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4  ４．２６ｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ3  ０．３ｇ／Ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4  ２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．２ｇ／Ｌ、酵母エキス  ０．２ｇ／Ｌ、下記ミネラル溶液３．５ｍＬからなる滅菌された培地１に、フルクトースを１４．２４ｇ／Ｌにて加えた培地にて試験管振とう培養を３０℃２４時間行い、前前培養液を得た。【００６４】
ミネラル溶液：ＦｅＣ6Ｈ5Ｏ7・ｘＨ2Ｏ  ６ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ２ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  ０．１ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ  １ｇ／Ｌ、ＫＩ  ０．１ｇ／Ｌ、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ  ０．１ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ  ０．１ｇ／Ｌ、Ｈ3ＢＯ3  ０．２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ  ４ｇ／Ｌを水に溶解させたもの。【００６５】
上記培地１にフルクトースを１４．２４ｇ／Ｌにて加えた培地、あるいはフルクトース８．８６ｇ／Ｌとε−カプロラクトン５．３８ｇ／Ｌにて加えた培地１００ｍＬが入った５００ｍＬ容積の三角フラスコに上記前前培養液１ｍＬを植菌し、３０℃、１５０ｒｐｍにて４８時間から９６時間培養し、培養主母（前培養液）とした。【００６６】
上記培地１の（ＮＨ4）2ＳＯ4を１２．５ｇ／Ｌに変更した培地を３Ｌ容ジャーファーメンターに２Ｌ用意、滅菌し、培養主母１００ｍＬを植菌し、４２質量％フルクトースとε−カプロラクトンを滅菌フィルター（ＰＴＦＥ０．２μｍポア）を介して無菌的に流加開始した。炭素源の流加速度や流加比率は任意に設定することができるが、炭素源を菌体が消費しきれず培養槽内に過剰に残存し菌体増殖が停止するのを避けるために、４２質量％フルクトースの流加速度は１〜２ｇ／ｈ程度（０．５〜１ｇ／ｈ・Ｌ）、ε−カプロラクトンの流加速度は０．２〜０．５ｇ／ｈ（０．１〜０．２５ｇ／ｈ・Ｌ）程度と低流速で培養開始し、菌体の増殖に合わせて段階的あるいは連続的に流加速度を増加させた。通気量は０．２〜０．３Ｌ／ｍｉｎ、攪拌速度は５００〜７００ｒｐｍ、培養温度は３６℃、培養ｐＨ下限は６．０にて制御し、１２．５％アンモニア水をｐＨ調整用アルカリに使用した。ε−カプロラクトン：フルクトースの比率は約０．５とした。培養開始後１００時間で培養終了した。【００６７】
培養後、菌体を遠心分離により回収し、−２０℃にて凍結後、凍結乾燥に供した。
菌体からＰＨＡを抽出精製する方法は以下のように行った。スクリューキャップ付きガラス製三角フラスコにて、凍結乾燥菌体４〜１０ｇ程度を４００ｍＬのクロロホルムに懸濁し、３０℃にて２４〜４８時間抽出した。得られた粘調の溶液をろ紙にてろ過し、菌体残渣をとり除いた。得られた清澄液をエバポレーターにて１００〜２００ｍＬ程度に濃縮し、５倍量の貧溶媒であるヘキサンにてＰＨＡを析出させた。得られた白色沈殿物をエタノールにて洗浄後、真空乾燥させ、精製ＰＨＡを得た。【００６８】
＜実施例２＞
ジャー培養での培養温度を３４℃とし、培養時間を１１２．５時間とした以外は実施例１と同様に行った。【００６９】
＜実施例３＞
ジャー培養での培養温度を３０℃、（ＮＨ4）2ＳＯ4を１５ｇ／Ｌに変更した培地を使用し、培養時間を１４９時間とした以外は実施例１と同様に行った。【００７０】
＜実施例４＞
ジャー培養での（ＮＨ4）2ＳＯ4を１０ｇ／Ｌに変更した培地を使用した以外は実施例１と同様に行った。【００７１】
＜実施例５＞
ジャー培養での（ＮＨ4）2ＳＯ4を１５ｇ／Ｌに変更した培地を使用し、培養時間を１８４．８時間とした以外は実施例１と同様に行った。【００７２】
＜実施例６＞
ジャー培養でのε−カプロラクトン：フルクトースの比率は０．７とし、培養時間を１１３．５時間とした以外は実施例１と同様に行った。【００７３】
＜実施例７＞
ジャー培養での培養時間を１１２時間とした以外は実施例１と同様に行った。【００７４】
＜実施例８＞
ジャー培養での（ＮＨ4）2ＳＯ4を７．５ｇ／Ｌに変更した培地を使用し、ｐＨ調整用アルカリとして４Ｎ  ＮａＯＨ溶液を使用し、培養時間を１２２．５時間とした以外は実施例１と同様に行った。【００７５】
＜実施例９＞
ジャー培養での培養温度を３７℃、（ＮＨ4）2ＳＯ4を７．５ｇ／Ｌに変更した培地を使用し、ｐＨ調整用アルカリとして４Ｎ  ＮａＯＨ溶液を使用し、培養時間を１０２．５時間とした以外は実施例１と同様に行った。【００７６】
＜実施例１０＞
ジャー培養でのε−カプロラクトン：フルクトースの比率は０．４とし、培養時間を９４．５時間とした以外は実施例１と同様に行った。【００７７】
＜実施例１１＞
ジャー培養での培養温度を３７℃とした以外は実施例１と同様に行った。【００７８】
＜実施例１２＞
ジャー培養での培養温度を３８℃とした以外は実施例１と同様に行った。【００７９】
＜実施例１３＞
ジャー培養での培養温度を３８℃、（ＮＨ4）2ＳＯ4を７．５ｇ／Ｌに変更した培地を使用し、培養時間を１１４．３時間とした以外は実施例１と同様に行った。【００８０】
＜実施例１４＞
ジャー培養での培養温度を３８℃、（ＮＨ4）2ＳＯ4を７．５ｇ／Ｌに変更した培地を使用し、ｐＨ調整用アルカリとして４Ｎ  ＮａＯＨ溶液を使用し、培養時間を１１４．３時間とした以外は実施例１と同様に行った。【００８１】
＜実施例１５＞
ジャー培養での（ＮＨ4）2ＳＯ4を７．５ｇ／Ｌに変更した培地を使用し、４２質量％フルクトース溶液に対して２５ｇ／Ｌの酢酸ナトリウムを添加し、培養時間を１２２．５時間とした以外は実施例１と同様に行った。【００８２】
＜実施例１６＞
ジャー培養での（ＮＨ4）2ＳＯ4を１７．５ｇ／Ｌに変更した培地を使用し、ε−カプロラクトンのかわりにγ−ブチロラクトンを使用し、培養時間を１８５．８時間とした以外は実施例１と同様に行った。【００８３】
＜実施例１７＞
培地１の（ＮＨ4）2ＳＯ4を２．５ｇ／Ｌに変更し、ＮａＣｌを3ｇ／Ｌで添加した培地にフルクトース８．８６ｇ／Ｌとε−カプロラクトン５．３８ｇ／Ｌにて加えた培地１２５ｍＬが入った５００ｍＬ容積の三角フラスコに試験管培養前培養液１ｍＬを植菌し、３０℃、１５０ｒｐｍにて９６時間培養した。菌体の回収、ＰＨＡの抽出精製は実施例１と同様に行った。【００８４】
＜比較例１＞
ジャー培養での培養温度を３０℃とし、（ＮＨ4）2ＳＯ4を７．５ｇ／Ｌに変更した培地を使用し、培養時間を１３６．５時間とした以外は実施例１と同様に行った。【００８５】
＜比較例２＞
ジャー培養での培養温度を３６℃とし、（ＮＨ4）2ＳＯ4を７．５ｇ／Ｌに変更した培地を使用し、ε−カプロラクトンのかわりにγ−ブチロラクトンを使用し、ｐＨ調整用アルカリとして２Ｎ  ＮａＯＨ溶液を使用し、培養時間を１０８時間とした以外は実施例１と同様に行い、抽出したＰＨＡを脱湿脱酸素状態（三菱ガス化学製ＲＰパック）で２５℃、６ヶ月保存した。【００８６】
＜比較例３＞
比較例２で培養抽出し作成したＰＨＡサンプルを湿度１００％、４０℃、１ヶ月保存した。【００８７】
＜比較例４＞
比較例２で培養抽出し作成したＰＨＡサンプルを湿度１００％、２５℃、６ヶ月保存した。【００８８】
＜比較例５＞
比較例２で培養抽出し作成したＰＨＡサンプルを脱湿脱酸素状態（三菱ガス化学製ＲＰパック）で６０℃、３ヶ月保存した。【００８９】
＜比較例６＞
比較例２で培養抽出し作成したＰＨＡサンプルを脱湿脱酸素状態（三菱ガス化学製ＲＰパック）で６０℃、６ヶ月保存した。【００９０】
＜比較例７＞
比較例２で培養抽出し作成したＰＨＡサンプルを湿度１００％、４０℃、６ヶ月保存した。【００９１】
＜比較例８＞
比較例２で培養抽出し作成したＰＨＡサンプルを湿度１００％、６０℃、１ヶ月保存した。【００９２】
［ポリマーの分析］
＜１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ＞
各実施例及び比較例で製造した精製ＰＨＡの組成分析と連鎖分析は核磁気共鳴分光装置（日本分光ＥＣＡ５００）を使用し決定した。精製したＰＨＡを１．５質量％濃度でＣＤＣｌ3に溶解し、測定サンプルとした。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは５００ＭＨｚ、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルは１２５ＭＨｚにて室温で計測した。【００９３】
各実施例及び比較例のＰＨＡについてＮＭＲにより測定した４ＨＢ比率を下記表３に示す。【００９４】
実施例８のＰＨＡの1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲを図１及び図２に示す。
実施例９のＰＨＡの1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲを図３及び図４に示す。【００９５】
1Ｈ−ＮＭＲ分析結果によるＰＨＡの組成分析の結果を下記表１に示す。
13Ｃ−ＮＭＲ分析結果による連鎖分析結果を下記表２に示す。
実施例で製造したポリマーは、ランダムポリマーであった。【００９６】
【表１】
2019044836.tif 000002
【００９７】
【表２】
2019044836.tif 000003
【００９８】
＜ＰＨＡ組成分析（ＧＣ法）＞
菌体に含まれるＰＨＡのＧＣ法による組成分析は以下のように行った。得られた乾燥菌体約１０ｍｇをスクリューキャップ付き試験管に量りとり、クロロホルム２ｍＬと内部標準入りメタノール硫酸混液（内部標準：安息香酸０．５ｇ／Ｌ、硫酸３．７質量％）２ｍＬを混合し、１２１℃、９０分加熱処理をして室温まで冷却し、ＰＨＡをメチルエステル化した。反応終了後純水を１ｍｌ加え、激しく撹拌した後、遠心分離を行い有機溶媒層を得た。この有機溶媒層を硫酸ナトリウムにて脱水後ガスクロマトグラフィーで分析することにより、ＰＨＡ成分含量を算出した。ＧＣ条件は以下の通りである。【００９９】
ガスクロマトグラフィー分析条件
装置：島津ＧＣ−２０２５
キャピラリーカラム：ＤＢ−１  （０．２５ｍｍ（ｉｄ）×６０ｍ、Ｆｉｌｍ厚１μｍ）
キャリアガス：Ｈｅ（３．２３ｍｌ／ｍｉｎ）
カラム温度：  １２５℃  ６．５ｍｉｎ  −  ｒａｔｅ２５℃／ｍｉｎ−２６０℃
メイクアップ流量：３０ｍＬ／ｍｉｎ
Ｈ２流量：４０ｍｌ／ｍｉｎ
Ａｉｒ流量：４００ｍｌ／ｍｉｎ
インジェクション：２５０℃
検出器：ＦＩＤ（２６０℃）
スプリット：１：２０
注入量：１μＬ
分析時間：２１．５分【０１００】
ＧＣ−ＦＩＤにおける典型的なクロマトグラム（実施例８で製造したＰＨＡ）を図５に示す。
４ＨＢを含むＰＨＡあるいはそのＰＨＡを含む乾燥菌体をメチルエステル化し、高分解能のキャピラリーカラムを使用したＧＣ−ＦＩＤ分析の場合、３ＨＢと４ＨＢに由来するピークは複数発生する。よってＧＣ−ＭＳ（島津製作所製ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０  Ｐｌｕｓ）を使用して各ピークの同定を行った。ＧＣ条件は先のＧＣ−ＦＩＤと同様である。各ピークの同定結果を図６、図７に示す。【０１０１】
＜ＰＨＡ分子量測定（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）法）＞
ＰＨＡ分子量の測定は以下のようにゲルパーミエーションクロマトグラフィー法により行った。各実施例及び比較例のＰＨＡについて分子量の測定結果を下記表３に示す。
精製したＰＨＡを約０．５ｍｇ／ｍｌとなるようにクロロホルムを加え、６０℃で４時間溶解させた後、室温に戻し、孔径０．２μｍのＰＴＦＥフィルターでろ過して不溶物を除き、測定サンプルとした。ＧＰＣ条件は以下の通りである。
装置：島津製作所製  ＨＰＬＣ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅシステム
カラム：昭和電工製  Ｓｈｏｄｅｘ  Ｋ−８０６Ｌ（２本直列）
カラム温度：  ４０℃
移動相：  クロロホルム（１ｍｌ／ｍｉｎ）
検出器：  ＲＩ（４０℃）
スタンダード：Ｓｈｏｄｅｘポリスチレン分子量スタンダード（６８７万〜１２７０）
注入量：６０μｌ
分析時間：３０分【０１０２】
［ＰＨＡフィルムの作製（ソルベントキャスト法）］
２００ｍｌのクロロホルムに５ｇのＰＨＡ（各実施例及び各比較例のＰＨＡ）を溶解させ、１８ｃｍ角ガラス底の平坦な容器に流し込み、クロロホルムをゆっくりと蒸発させ、ソルベントキャストフィルムを作製した。厚み約０．１〜０．２ｍｍのフィルムが作製できた。クロロホルムの蒸発後、フィルムを容器から剥がし、２週間以上真空乾燥後に引張試験に用いた。【０１０３】
［引張試験方法］
ソルベントキャストフィルムはＪＩＳＫ７１２７タイプ５の形状に試験用ダンベルを打ち抜き、オートグラフＡＧＳ−Ｘ（（株）島津製作所製）を使用して、温度２３℃、試験速度１００ｍｍ／分の条件でフィルムの破壊強度、破断伸び、及び弾性率を測定した。測定結果を下記表３に示す。【０１０４】
【表３】
2019044836.tif 000004
【０１０５】
［ポリマーの製造（フラスコ培養）］
＜実施例１８〜３１＞
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株（ＡＴＣＣ１７６９９）を使用してＰＨＡを製造した。
ＫＨ2ＰＯ4  ２．７２ｇ／Ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4  ４．２６ｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ3  ０．３ｇ／Ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4  ２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．２ｇ／Ｌ、酵母エキス０．２ｇ／Ｌ、実施例１と同様のミネラル溶液３．５ｍＬからなる滅菌された培地１に、フルクトースを１４．２４ｇ／Ｌにて加えた培地にて試験管培養を３０℃２４時間行い、前培養液を得た。【０１０６】
上記培地１にフルクトース８．８６ｇ／Ｌとε−カプロラクトン５．３８ｇ／Ｌにて加えた培地（実施例２１〜３３、ただし硫酸アンモニウム濃度は表に記載の量）、又はフルクトース８．８６ｇ／Ｌとε−カプロラクトン６．４６ｇ／Ｌにて加えた培地（実施例３４、ただし硫酸アンモニウム濃度は表に記載の量）、それぞれ１００ｍＬが入った５００ｍＬ容積の三角フラスコに上記前培養培地１ｍＬを植菌し、３０℃、１５０ｒｐｍにて表に記載の時間で培養した。培養開始前のｐＨは６．８〜７．５程度である。培養終了後、遠心分離にて菌体を回収し、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。また、メチルエステル化後のＧＣ分析によるＰＨＡ含量や組成、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ法）による分子量測定の結果も合わせて下記表４に示す。ＧＣ法によるＰＨＡ組成分析は実施例１〜１７及び比較例１〜８の場合と同様にして行なった。【０１０７】
＜ＰＨＡ分子量測定（ＧＰＣ法）＞
精製したＰＨＡを使用する代わりに凍結乾燥菌体を使用すること以外は、実施例１〜１７及び比較例１〜８の場合と同様にして、ＰＨＡ分子量の測定をゲルパーミエーションクロマトグラフィー法により行った。【０１０８】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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