(57)【要約】【課題】  本発明は、自家軟骨組織、軟骨代替物あるいは未分化細胞の移植による治療法とは異なる、新たな軟骨組織の再生治療法を可能にする医療材料を提供する。【解決手段】  本発明は、酸性基を有する酸及び／又は酸性基に金属が付加された塩をモノマー単位として有するハイドロゲルであって、２以上のポリマーからなる相互侵入網目構造及びセミ相互侵入網目構造のいずれも含まないハイドロゲルからなる、骨充填型軟骨組織再生誘導剤を提供する。本発明の骨充填型軟骨組織再生誘導剤は、軟骨欠損部の直下にある軟骨下骨に設けた孔ないし溝に充填されることで、軟骨組織の自然再生を生体内で誘導することができる。
2010024300.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性基を有する酸及び／又は酸性基に金属が付加された塩をモノマー単位として有するハイドロゲルであって、２以上のポリマーからなる相互侵入網目構造及びセミ相互侵入網目構造のいずれも含まないハイドロゲルからなる、骨充填型軟骨組織再生誘導剤。
【請求項２】
酸性基がカルボキシル基、リン酸基又はスルホン酸基である、請求項１に記載の骨充填型軟骨組織再生誘導剤。
【請求項３】
酸性基がスルホン酸基である、請求項２に記載の骨充填型軟骨組織再生誘導剤。
【請求項４】
前記ハイドロゲルが、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）が重合したハイドロゲル及び／又は２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）のスルホン酸基に金属が付加された塩が重合したハイドロゲルである、請求項１に記載の骨充填型軟骨組織再生誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節組織における軟骨組織の再生治療に有用な、骨充填型軟骨組織再生誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
膝関節や肩関節等に代表される関節組織において、関節によって連結されている骨の頂部は、骨同士が直接擦れ合うことのない様に軟骨組織で覆われている。加齢により又は過大な荷重負荷もしくは荷重の反復負荷などによってこの軟骨組織が損傷を受けると、関節内で炎症が起こり、いわゆる関節痛として自覚されることになる。関節の軟骨組織の損傷と関節痛は、若年者から高齢者に至るまで広くかつ高頻度に認められており、患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ）向上の見地から、あるいは医療経済学的見地からも、有効かつ合理的な治療法の開発が求められている。【０００３】
損傷を受けた軟骨組織の治療において最も重要な問題は、軟骨組織は生体内では自然再生せず、従って薬物投与等によって損傷した軟骨組織を再生させることが極めて困難であることである。例えば、軟骨下骨に多数の小穿孔を加えるマイクロフラクチャー法では線維軟骨が形成されるが、正常の関節軟骨である硝子軟骨は再生しない。そのため、損傷を受けた軟骨組織の治療は、専ら生体から採取される軟骨組織の移植によって行われているのが実情である。【０００４】
生体から採取される軟骨組織の移植による治療法は、自家軟骨移植法（モザイクプラスティー）と培養自家軟骨移植法の２種類に大きく分けることが出来る。自家軟骨移植法（モザイクプラスティー）は、損傷を受けた関節の健常部分又は反対側の関節組織から自己の軟骨組織を、骨プラグを付けて採取し、これを欠損部に自家移植する方法である。しかしこの治療法は、軟骨を採取する部位における正常な軟骨を傷つけてしまうという不可避の問題を有し、また軟骨組織の損傷部位が大きい場合には、移植に足る量の軟骨組織を生体から採取することができないという問題を有する。一方、培養自家軟骨移植法は、患者の自家軟骨（硝子軟骨）組織の一部を採取し、これを適当な培地及び／又は培養基材と共に培養することによって試験管内で軟骨組織を再生させ、これを患部に自家移植する方法である。培養自家軟骨移植法は、軟骨組織の無菌的培養のためのきわめて高額な設備の用意、軟骨組織の採取作業と移植という２度の処置、患者の長期間の入院などによる治療コストの増加、培養時の汚染による人獣共通疾患感染リスク、治療効果の不確実性という問題を有している。【０００５】
この様な問題を回避するためにも、患者の体内での軟骨組織の自然再生を促す治療法の開発は、重要な課題である。現在、損傷を受けた軟骨組織を含む関節にｂ−ＦＧＦやＯＰ−１などのサイトカインを担体と共に局所投与する方法や、自家間葉系幹細胞やＥＳ細胞を、損傷を受けた軟骨組織を含む関節に投与する方法も実験的に研究されている。しかしこれらの方法に関する効果や副作用等の問題点の確認は、今後の大きな課題であり、この種の治療法は全く実用化されていない。【０００６】
本発明者らは、自家軟骨組織、軟骨代替物あるいは未分化細胞の移植による治療法とは異なる、全く新規な概念に基づいた新たな軟骨組織の再生治療法を確立させ、架橋網目構造を有する２以上のポリマーからなる、相互侵入網目構造又はセミ相互侵入網目構造を有するハイドロゲル（以下、ＤＮゲル（ｄｏｕｂｌｅ ｎｅｔｗｏｒｋ ｇｅｌ）と表す）が当該軟骨組織の再生治療法において骨充填型軟骨組織再生誘導剤として利用可能であることを見いだし、国際特許出願（ＰＣＴ／ＪＰ２００７／００１３２０）を行い、またウェブサイト（非特許文献１）において公表している。【０００７】
上記ＤＮゲルは、相互侵入網目構造又はセミ相互侵入網目構造を有する強度の優れたゲル材料であるが、２以上のポリマーからなる相互侵入網目構造又はセミ相互侵入網目構造を形成させる必要があり、ゲルの調製が煩雑であるという問題が指摘される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】北海道大学  未来創薬・医療イノベーション拠点形成、医学研究科  機能再生医学講座  運動機能再建医学分野、http://www.lfsci.hokudai.ac.jp/innovahome/team/index5.html
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記ＤＮゲルからなる軟骨組織再生治療用骨充填剤に換わる、新たな軟骨組織再生誘導剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記ＤＮゲルではなく、当該ＤＮゲルを構成するポリマーの一種として利用可能なスルホン酸又はスルホン酸塩をモノマー単位として有するハイドロゲルが、意外なことにそれ単独で骨に充填されたときに軟骨組織の再生を誘導することができることを見いだし、下記の各発明を完成した。【００１１】
（１）酸性基を有する酸及び／又は酸性基に金属が付加された塩をモノマー単位として有するハイドロゲルであって、２以上のポリマーからなる相互侵入網目構造及びセミ相互侵入網目構造のいずれも含まないハイドロゲルからなる、骨充填型軟骨組織再生誘導剤。【００１２】
（２）酸性基がカルボキシル基、リン酸基又はスルホン酸基である、（１）に記載の骨充填型軟骨組織再生誘導剤。【００１３】
（３）酸性基がスルホン酸基である、（２）に記載の骨充填型軟骨組織再生誘導剤。【００１４】
（４）前記ハイドロゲルが、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）が重合したハイドロゲル及び／又は２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）のスルホン酸基に金属が付加された塩が重合したハイドロゲルである、（１）に記載の骨充填型軟骨組織再生誘導剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の骨充填型軟骨組織再生誘導剤は、前記ＤＮゲルと同様に損傷を受けた軟骨組織の直下にある下骨に設けた孔ないし溝に充填することで軟骨組織の再生を促すことができ、これまでの自家移植法や培養自家軟骨移植法について指摘されてきた前記の諸問題を全く伴わない、極めて有効な治療法を提供することが可能である。特に本発明において使用されるゲルは、ＤＮゲルの様な相互侵入網目構造及びセミ相互侵入網目構造を形成させる必要が無く、ゲルの調製や骨に充填する際の成型能においてＤＮゲルより優れる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の「相互侵入網目構造」を模式的に示した図である。図中、Ａは一つの架橋網目ポリマー、Ｂは他方の架橋網目ポリマー、１及び２は各架橋網目ポリマーの架橋点を示す。尚、この図は網目構造中に溶媒（水）を含有しているゲルの概念図である。
【図２】本発明の「セミ相互侵入網目構造」を模式的に示した図である。図中、Ｃは架橋網目ポリマー、Ｄは直鎖ポリマー、３は架橋網目ポリマーの架橋点を示す。
【図３】ＰＡＭＰＳゲルを充填していない無処置対照群の骨欠損部を、サフラニンＯ染色した結果を示す写真である。図中、中央のくぼみ部分から下部が骨欠損部であり、薄緑色に染色されている部分が細胞質を、白色が骨組織をそれぞれ表している。
【図４】ＰＡＭＰＳゲルを充填した処置群の骨欠損部を、サフラニンＯ染色及び２型コラーゲン免疫染色した結果を示す写真である。図中、左図がサフラニンＯ染色の結果であり、赤色に染色されている部分がＰＡＭＰＳゲルを、ピンク色ないし薄赤色に染色されている部分が再生された軟骨組織を、薄緑色に染色されている部分が細胞質を、白色が骨組織をそれぞれ表している。また右図が左図と同じ切片を２型コラーゲン免疫染色したときの左図の枠で囲まれた部分の拡大図であり、褐色に染色されている部分が再生された軟骨組織を表している。
【図５】図４の左図と同じ写真と、その枠で囲まれた部分の拡大図を示す。拡大図において濃く染色されている部分は軟骨細胞の細胞核を、ピンク色〜薄赤色に染色されている部分は再生された軟骨組織をそれぞれ示す。
【図６】ＰＡＭＰＳゲルを充填した処置群の骨欠損部を、サフラニンＯ染色した結果を示す、図４及び図５とは異なる写真である。図中、赤色に染色されている部分がＰＡＭＰＳゲルを、ピンク色ないし薄赤色に染色されている部分が再生された軟骨組織を、薄緑色に染色されている部分が細胞質を、白色に染色されている部分が骨組織をそれぞれ表している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、酸性基を有する酸及び／又は酸性基に金属が付加された塩をモノマー単位として含むハイドロゲルであって、２以上のポリマーからなる相互侵入網目構造及びセミ相互侵入網目構造のいずれも含まないハイドロゲルからなる骨充填型軟骨組織再生誘導剤に関する。
【００１８】
本発明における酸性基とは、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基、スルフィン酸基その他の負電荷を有する基を意味し、酸性基を有する酸とは、プロトンがその酸性基の対イオンであることを意味する。また金属が付加された酸性基とは、金属が付加されて塩の形態となった前記負電荷を有する基を意味し、酸性基に金属が付加された塩とは、正の金属イオンがその酸性基の対イオンであることを意味する。以下特に断らない限り、酸性基と金属若しくは塩基が付加された酸性基とをまとめて「酸性基等」と、酸性基を有する酸と酸性基に金属が付加された塩とをまとめて「酸性基等を有する電解質」と表すこととする。特に好ましい酸性基はスルホン酸基である。
【００１９】
前記のような「酸性基等を有する電解質」をモノマー単位として含むハイドロゲルは、「酸性基等」及び不飽和結合のような重合可能な化学結合を有する適当なモノマー同士を重合させてなるポリマーとして作製することができる。かかるモノマーとしては、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）、アクリル酸（ＡＡ）、メタクリル酸、スチレンスルホン酸、又はそれらの塩、例えば２−アクリルアミド−２ーメチルプロパンスルホン酸ナトリウム、アクリル酸ナトリウム、スチレンスルホン酸ナトリウムを挙げることができる。
【００２０】
前記ハイドロゲルの好ましい例としては、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）をモノマーとして重合させたポリアクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＰＡＭＰＳ）、また２−アクリルアミド−２ーメチルプロパンスルホン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ２−ａｃｒｙｌａｍｉｄｏ−２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆａｔｅ、ＮａＡＭＰＳ）をモノマーとして重合させたポリアクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム（ＰＮａＡＭＰＳ）を挙げることができる。
【００２１】
また、酸性基に金属が付加された塩をモノマー単位としてを有するハイドロゲルは、酸性基及び重合可能な化学結合を有する適当なモノマー同士を重合させてポリマーを得た後、当該ポリマー中の酸性基に金属を付加させて作製してもよい。例えば、生理食塩水中では、一部またはその全部の対イオン（プロトン）がナトリウムイオンに置換され、塩の状態になっていると考えられる。
【００２２】
なお、「酸性基等を有する電解質」をモノマー単位として有するハイドロゲルは、酸性基を有する酸又は酸性基に金属が付加された塩の何れかのみをモノマー単位として有するハイドロゲルであってもよく、酸性基を有する酸と酸性基に金属が付加された塩とをモノマー単位として有するハイドロゲルであってもよい。したがって、「酸性基等を有する電解質」をモノマー単位として有するハイドロゲルは、酸性基又は金属が付加された酸性基の何れかを有する単一のモノマーを重合させたホモポリマーでもよく、また「酸性基等」を有する２種以上のモノマーを重合させたコポリマーであってもよい。さらに、「酸性基等」と中性基を持つモノマーを共重合させたコポリマーであってもよい。後者の場合、「酸性基等」のモノマー単位の分率は１０％以上であることが望ましい。
【００２３】
また前記ハイドロゲルは、相互侵入網目構造及びセミ相互侵入網目構造はいずれも含まないハイドロゲルである。相互侵入網目構造とは、例えば国際特許出願公開ＷＯ２００６／０１３６１２［図１］（本明細書に図１として引用する）に示すように、２以上の架橋網目ポリマーが互いの網目構造に進入するように絡みついており、結果として内部に複数の網目構造が形成されている構造ないし状態をいう。ここで架橋網目ポリマーとは、複数の架橋点を有することによって網目構造を形成しているポリマーをいう。また「セミ相互侵入網目構造」とは、相互侵入網目構造とは、例えば国際特許出願公開ＷＯ２００６／０１３６１２［図２］（本明細書に図２として引用する）に示すように、架橋網目ポリマーに直鎖ポリマーが架橋網目ポリマーの網目に進入するように絡みついており、結果として内部に複数の網目構造が形成されている構造ないし状態をいう。
【００２４】
前記ハイドロゲルは、上記の相互侵入網目構造及びセミ相互侵入網目構造はいずれも含まないという点で、前記非特許文献１に記載されたハイドロゲルと区別される。しかしながら、これは本発明におけるハイドロゲルがかかる２以上のポリマーが複雑に絡み合うことで形成される網目構造を含まないことを意味し、本発明におけるハイドロゲルが一つのポリマーのみからなるハイドロゲルに限定されることを意味するものではない。すなわち、本発明におけるハイドロゲルは一つのポリマーのみからなるハイドロゲルだけではなく、２以上のポリマーを含むハイドロゲルの混合物であってもよく、相互侵入網目構造及びセミ相互侵入網目構造が形成されない限り、ポリマー間が架橋されていてもよい。
【００２５】
次に、前記ハイドロゲルの骨充填型軟骨組織再生誘導剤としての使用方法について説明する。
【００２６】
前記ハイドロゲルは、軟骨組織の再生治療を目的とした外科的処置において使用される。この外科的処置は、損傷を受けた軟骨組織の直下にある軟骨下骨を軟骨組織と共に削って適当な深さを有する孔ないし溝（以下、これを骨欠損部とする）を設け、ここに前記ハイドロゲルを充填するというものである。なお、本願発明で使用されるハイドロゲルの多くは脆いために、骨欠損部に充填する際にハイドロゲルは細かく破砕されて使用される場合もあり、その様な使用も本発明に含まれる。
【００２７】
従来から存在した治療概念である人工軟骨は軟骨の再生を期待するものではなく、代替材料としての人工材料を損傷した軟骨部分にあわせて充填するものであるが、前記ハイドロゲルの使用法はこれとまったく異なる。この前記ハイドロゲルを利用した外科的処置による軟骨組織の再生治療においては、生体から採取される軟骨組織の移植も、軟骨の再生を促す特別な液性因子の投与も必須ではなく、軟骨組織の自然再生のための生物学的及び力学的環境を骨欠損部に前記ハイドロゲルを充填することで提供して、硝子軟骨からなる正常な軟骨組織の自然再生を促す。
【００２８】
また、前記ハイドロゲルは、骨に充填されるという使用形態において生体にとって無毒であり、軟骨組織が再生した後に骨欠損部から除去することは必ずしも必要ではない。そのため、前記ハイドロゲルを用いた外科的処置を受ける患者は、骨欠損部を設けて前記ハイドロゲルを充填するという処置を一回受けるだけで済むので、複数回の処置が必要であった従来の治療法に比べて、患者の負担軽減をもたらすことができる。
【００２９】
以上のように、前記ハイドロゲルは損傷を受けた軟骨組織に設けた骨欠損部に充填されて軟骨組織の再生を誘導するために使用されるものであり、骨に充填させることで軟骨組織の再生を誘導する剤として把握することができる。したがって、本発明における「骨充填型」とは、骨欠損部に充填されて用いられるという、前記ハイドロゲルの外科的処置における使われ方を表す用語として理解され、また「軟骨組織誘導」とは、かかる使われ方をされた前記ハイドロゲルに期待されあるいは発揮される、骨欠損部周辺に残存する軟骨組織の再生を誘導するあるいは促進するという使用目的ないし効果を現す用語として理解される。
【００３０】
この様に、前記ハイドロゲルからなる骨充填型軟骨組織再生誘導剤という本発明は、「骨充填型」及び「軟骨組織再生誘導剤」である点において、前記ハイドロゲルを構成ポリマーの一種とする人工軟骨としての使用とは相違する。また骨欠損部に充填された前記ハイドロゲルは、骨欠損部の周辺に残存する軟骨組織ないし軟骨細胞と直に接触しないにも拘わらず軟骨細胞ないし軟骨組織の再生を促すという効果を示しており、このことは前記ハイドロゲルが軟骨細胞の増殖における直接の「足場」として作用しているものではないことを示唆するものである。
【００３１】
以下、本発明の骨充填型軟骨組織再生誘導剤の製造例と使用例を示して、本発明をさらに詳細に説明するが、これらの例は本発明を限定的に解釈させるものではない。
【実施例】
【００３２】
＜実施例１＞
（１）ハイドロゲルの調製
縦８０ｍｍ×横８０ｍｍ×厚さ５ｍｍ、幅５ｍｍのシリコン板枠を用意し、板枠の１片に枠の外から内に向けた３ｍｍの溝を空けた。このシリコン板枠を２枚の縦１００ｍｍ×横１００ｍｍ×厚さ３ｍｍのガラス板で挟み、重合容器を組み立てた。【００３３】
２ｍｏｌ／Ｌの２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）水溶液２５ｍＬ、架橋剤である２ｍｏｌ／ＬのＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡ）水溶液１ｍＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌの２−オキソグルタル酸水溶液０．５ｍＬ、及び水を混合して水溶液５０ｍＬを調製した。窒素ガスを用いて脱酸素した水溶液を前記重合容器の溝から流し込み、溝部分をシールした後、波長３６５ｎｍのＵＶランプ（２２Ｗ、０．３４Ａ）を用いて紫外線を常温で６時間照射して重合させることにより、架橋度が４ｍｏｌ％のＰＡＭＰＳゲルシート（厚さ１０ｍｍ）を作製した。【００３４】
（２）ハイドロゲルを用いた外科的処置 
成熟した日本白色家兎（３．０〜４．２ｋｇ）を２０羽用意し、それぞれの右膝蓋大腿関節の大腿骨側（滑車部分）に直径４．３ｍｍ深さ約８〜１０ｍｍの骨欠損部を作製した。（１）で調製したＰＡＭＰＳゲルシートから直径４．５ｍｍのロッドに相当する量のＰＡＭＰＳゲルを採り、前記骨欠損部を埋めるように充填し、処置群とした。このとき、前記骨欠損部の関節面からＰＡＭＰＳゲル表面までの間隔を２ｍｍとなるように調節して、ＰＡＭＰＳゲルを前記骨欠損部に充填した。【００３５】
また、同じ日本白色家兎の左膝大腿骨／膝蓋骨の大腿骨側に、垂直に骨欠損部（径４．３ｍｍ、深さ約８〜１０ｍｍ）を作製した。これらの骨欠損部には何も充填せず、無処置対照群とした。【００３６】
術後４週間、ケージ内での飼育を行ってから屠殺し、膝関節を肉眼観察した後に、左右それぞれの膝関節から、損傷部位の中心を通る矢状面で切片を作成し、下記１）、２）の組織学的観察を行った。【００３７】
１）サフラニンＯ染色
廣谷ら（臨床整形外科、１９７６年、第１１巻、第１２号、４０頁−４４頁）に記載の方法に従って、サフラニンＯ染色を行った。また対比染色として鉄ヘマトキシリン及びファストグリーンを使用した。この染色により、ＰＡＭＰＳゲルは赤色に、軟骨組織はピンク色に、細胞核は濃紫色に、細胞質は薄緑色に、骨組織が白色に表される。【００３８】
２）２型コラーゲンに対する免疫染色
Ｋｕｍａｇａｉら（Ｋｕｍａｇａｉら、Ｊ．Ａｎａｔ．、１９９４年、第１８５巻、第２７９−２８４頁）の方法に従って、２型コラーゲンに対する免疫染色を行った。具体的には、切片を脱パラフィン、脱水、水洗後、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを用いて室温で６分間処理した後、ＰＢＳで洗浄し、１％過酸化水素メタノールに３０分間浸漬し、ＰＢＳで洗浄後、５０倍稀釈した一次抗体（マウス抗ヒトコラーゲンＩＩ型抗体、富士薬品工業）を用いて室温で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで再洗浄し、二次抗体（抗マウスＩｇＧ抗体、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ）を用いて室温で３０分間インキュベートして、２型コラーゲンを免疫染色した。この染色により、ＰＡＭＰＳゲルは紫色に染まり、軟骨組織は褐色に染色される。【００３９】
上記１）及び２）の結果、無処置対照群における骨欠損部は新生骨で充填されていたが（図３）、軟骨組織はまったく認められなかった。一方、ＰＡＭＰＳゲルを充填した骨欠損部を有する兎の右膝では、骨欠損部に充填されたＰＡＭＰＳゲルの隙間を埋めるように存在している組織が、サフラニンＯ染色及び２型コラーゲン免疫染色によっていずれも染まることが確認された（図４、図５及び図６）。この２種類の染色結果は、前記組織が再生された軟骨組織であることを示すものである。【００４０】
また、再生された軟骨組織は、骨欠損部に充填されたＰＡＭＰＳゲルの隙間を埋めるように再生するばかりでなく、骨欠損部の開放孔の表面に向かって盛り上がるように、かつ広範に再生することも、サフラニンＯ染色により確認された（図６）。【００４１】
なお、以上の結果に基づき、Ｗａｙｎｅら（Ｗａｙｎｅら、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．２００５年、第１１巻、第９５３−９６３頁）の方法に従ってスコアを求めたところ、処置群と無処置対照群の総平均スコアはそれぞれ、２１．６点および１５．３点であり、ｔ検定よるｐ値が０．０１３５と有意差が認められた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
2010024300.tif 000009
2010024300.tif 000010