(57)【要約】  多種系統に分化できるストレス耐性のある（Ｍｕｓｅ）細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団に存在する段階特異的な胚抗原３（ＳＳＥＡ−３）陽性細胞である。Ｍｕｓｅ細胞は、胚性幹細胞としての全ての胚葉に分化する多能性を有する。本研究では、骨軟骨損傷を修復するためのＭｕｓｅ細胞移植の有効性を調査することを目的とした。Ｍｕｓｅ細胞は、ヒト骨髄ＭＳＣから単離した。骨軟骨損傷は、免疫不全ラットの膝蓋溝に生じさせた。該ラットに細胞を注射し、３群に分けた：対照群には、ＰＢＳを注射した；非Ｍｕｓｅ細胞群には、５×１０4個のＳＳＥＡ−３陰性の非Ｍｕｓｅ細胞を注射した；Ｍｕｓｅ細胞群には、５×１０4個のＳＳＥＡ−３陽性のＭｕｓｅ細胞を注射した。修復された組織は、Ｍｕｓｅ群において処置後の１２週でほぼ平滑な均質表面を有し、対照及び非Ｍｕｓｅ群では修復組織は検出されなかった。組織学的評価によれば、処置後の４週及び１２週で他の群と比較して、Ｍｕｓｅ群では骨軟骨損傷部位でより良好な修復を示した。Ｍｕｓｅ細胞は、骨軟骨損傷の治療のための新たな有望な細胞源であり得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞を含む、骨軟骨損傷を治療又は修復するための細胞製剤。
【請求項２】
外部ストレス刺激によりＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞が濃縮された細胞画分を含む、請求項１に記載に細胞製剤。
【請求項３】
前記多能性幹細胞が、ＣＤ１０５陽性である、請求項１又は２に記載の細胞製剤。
【請求項４】
前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性及びＣＤ１４６陰性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【請求項５】
前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＮＧ２陰性、ＣＤ３４陰性、ｖＷＦ陰性、及びＣＤ２７１陰性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【請求項６】
前記多能性幹細胞が、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＣＤ２７１陰性、ＮＧ２陰性、ｖＷＦ陰性、Ｓｏｘ１０陰性、Ｓｎａｉ１陰性、Ｓｌｕｇ陰性、Ｔｙｒｐ１陰性、及びＤｃｔ陰性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【請求項７】
前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞製剤：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
【請求項８】
前記多能性幹細胞が、骨軟骨損傷部位に蓄積する能力を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【請求項９】
前記多能性幹細胞が、軟骨細胞に分化する能力を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療に用いられる細胞製剤及び／又は医薬組成物に関する。より具体的には、本発明は、骨軟骨損傷の治療又は修復に有効な多能性幹細胞を含む細胞製剤又は医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨病変は、自己修復能力が限られていることや関節機能の低下に起因する関節障害の原因となり、これは、特に高齢患者の重大な障害に該当する（非特許文献１）[1]。【０００３】
骨髄刺激技術や骨軟骨移植などの方法を用いたいくつかの臨床試験が軟骨修復を改善する試みとして行われてきたが、成功は限定的なものあった。１９９４年に、Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇらは、自家軟骨移植（ＡＣＩ）と呼ばれる第１世代の細胞治療を実施した（非特許文献２）[2]。Ｏｃｈｉらは、アテロコラーゲンゲルを軟骨細胞と組み合わせて使用することにより、ＡＣＩを改変し、良好な臨床転帰をもたらした（非特許文献３）[3]。しかしながら、インタクトな軟骨の罹患率、脱分化、及び２段階の外科的処置のために、成功は依然として限定的であった。【０００４】
近年、再生医療分野において、幹細胞を用いた細胞療法が様々な疾患に対して研究が行われ、臨床応用への可能性が期待されている幹細胞として、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、神経幹／前駆細胞（ＮＳＰＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、臍帯血幹細胞（ＵＣＢＣ）が知られている。【０００５】
また、骨髄間葉系細胞画分（ＭＳＣ）は、成体から単離され、例えば、骨、軟骨、脂肪細胞、神経細胞、骨格筋等に分化する能力を有することが知られている（非特許文献４及び５）。しかしながら、ＭＳＣは様々な細胞を含む細胞群であり、その分化能の実体が分かっておらず、治療効果にバラつきが大きい。また、成体由来の多能性幹細胞としてｉＰＳ細胞（特許文献１）が報告されているが、ｉＰＳ細胞の樹立には、間葉系細胞である皮膚線維芽細胞画分に特定の遺伝子や特定の化合物を体細胞に導入するという極めて複雑な操作を必要とすることに加え、ｉＰＳ細胞が高い腫瘍形成能力を有することから、臨床応用への極めて高いハードルが存在している。【０００６】
過去１０年間に、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を容易に単離することができるようになり、様々な組織から非常にアクセスしやすく、しかも非常に速やかに増殖することから、臨床応用のための細胞ベースの治療法として広く使用されている。さらに、三胚葉系に幅広く分化することができる（非特許文献６）[4]。【０００７】
本発明者らの一人である出澤の研究により、間葉系細胞画分に存在し、誘導操作なしに得られる、ＳＳＥＡ−３（Ｓｔａｇｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ−３）を表面抗原として発現している多能性幹細胞（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｅｎｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ；Ｍｕｓｅ細胞）が間葉系細胞画分の有する多能性を担っており、組織再生を目指した疾患治療に応用できる可能性があることが分かってきた。また、Ｍｕｓｅ細胞は、間葉系細胞画分を種々のストレスで刺激することにより濃縮できることもわかってきた（特許文献２；非特許文献７）。【０００８】
しかしながら、胎児発育不全に伴う脳障害の改善及び／又は治療にＭｕｓｅ細胞を使用し、期待される治療効果が得られることを明らかにした例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第４１８３７４２号公報
【特許文献２】国際公開第２０１１／００７９００号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】A. Mobasheri, et al., Histol. Histopathol., vol. 24, p.347-366 (2009)
【非特許文献２】M. Brittberg, et al., N. Engl. J. Med., vol. 331, p.889-895 (1994)
【非特許文献３】M. Ochi, et al., J. Bone. Joint Surg. Br., vol. 84, p.571-578 (2002)
【非特許文献４】M. Dezawa, et al., J. Clin. Investi., vol. 113, p.1701-1710 (2004)
【非特許文献５】M. Dezawa, et al., Science, vol. 309, p.314-317 (2005)
【非特許文献６】K. Tamai, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 108, p.6609-6614 (2011)
【非特許文献７】S. Wakao, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 108, p.9875-9880 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、再生医療において、多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を用いた新たな医療用途を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、Ｍｕｓｅ細胞を含有する、骨軟骨損傷を修復するための細胞製剤及び／又は医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、免疫不全ラットモデルに、Ｍｕｓｅ細胞を注入又は投与することにより、Ｍｕｓｅ細胞が、骨軟骨損傷部位に局所的に蓄積し、損傷部位において軟骨細胞に分化し、骨軟骨損傷を修復し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１３】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［項目１］生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞を含む、骨軟骨損傷を治療又は修復するための細胞製剤。
［項目２］外部ストレス刺激によりＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞が濃縮された細胞画分を含む、上記［１］記載に細胞製剤。
［項目３］前記多能性幹細胞が、ＣＤ１０５陽性である、上記［項目１］又は［項目２］に記載の細胞製剤。
［項目４］前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性及びＣＤ１４６陰性である、上記［項目１］〜［項目３］のいずれかに記載の細胞製剤。
［項目５］前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＮＧ２陰性、ＣＤ３４陰性、ｖＷＦ陰性、及びＣＤ２７１陰性である、上記［項目１］〜［項目４］のいずれかに記載の細胞製剤。
［項目６］前記多能性幹細胞が、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＣＤ２７１陰性、ＮＧ２陰性、ｖＷＦ陰性、Ｓｏｘ１０陰性、Ｓｎａｉ１陰性、Ｓｌｕｇ陰性、Ｔｙｒｐ１陰性、及びＤｃｔ陰性である、上記［項目１］〜［項目５］のいずれかに記載の細胞製剤。
［項目７］前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、上記［項目１］〜［項目６］のいずれかに記載の細胞製剤：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
［項目８］前記多能性幹細胞が、骨軟骨損傷部位に蓄積する能力を有する、上記［項目１］〜［項目７］のいずれかに記載の細胞製剤。
［項目９］前記多能性幹細胞が、軟骨細胞に分化する能力を有する、上記［項目１］〜［項目８］のいずれかに記載の細胞製剤。【００１４】
本発明は、骨軟骨損傷を患っている対象に対し、Ｍｕｓｅ細胞を損傷部位に直接、又は静脈等から投与することにより、Ｍｕｓｅ細胞が損傷部位において軟骨細胞に分化するという骨軟骨組織再生メカニズムによって、骨軟骨損傷、特に繊維組織によって覆われた軟骨下骨を修復することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、処置後の４週及び１２週における、対照群、非Ｍｕｓｅ群、及びＭｕｓｅ群での修復された組織の肉眼的所見を示す。１２週では、Ｍｕｓｅ群は、正常組織と同レベルで白色の組織により損傷部位が完全に補充された。
【図２】図２は、肉眼による評点システムを示し、処置後の４週では、Ｍｕｓｅ群で改善傾向が見られた。また、１２週では、Ｍｕｓｅ群は、他の群より有意に良好な結果を示した。*Ｐ＜０．０５。
【図３】図３Ａは、４週及び１２週における、サフラニンＯ／ファーストグリーン染色を用いた修復組織の組織学的評価を示す。図３Ｂ及びＣは、１２週におけるＨ＆Ｅ染色像を示す。スケールバー：Ａ及びＢ：５００μｍ、Ｃ：１００μｍ。
【図４】図４は、４週及び１２週でＳｅｌｌｅｒｓスケールを用いた組織学的スコアリングを行った結果を示し、非Ｍｕｓｅ群及び対照群のいずれかとも異なり、Ｍｕｓｅ群において、組織学的に有意な差が認められた。*Ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、ＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む、骨軟骨損傷を治療または修復するための細製剤又は医薬組成物に関する。
【００１７】
１．適用疾患
本発明は、ＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む細胞製剤又は医薬組成物を用いて変形性関節症、外傷性軟骨損傷、関節リウマチ、及び癌などの骨軟骨損傷に関連する疾患又は症候状態の治療、修復または緩和に使用することができる。本発明において、「骨軟骨損傷」とは、限定されないが、上記疾患等に起因した骨及び／又は軟骨の損傷、並びに事故及び外科的操作の結果により生じた損傷を指す。ここで、「損傷」とは、正常な構造又は機能の変化を意味し、一般的に使用される用語と同じ意味を有し、障害、変性、外傷、又は欠損と同義に使用され得る。
【００１８】
本発明において使用するとき、「骨」とは、主に、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン（主にＩ型コラーゲン）の形態で沈着したカルシウムおよびリン酸の成分、および骨細胞（例えば、骨芽細胞、骨細胞、および破骨細胞）、ならびに真の軟骨内骨の内部で形成する骨髄を含む石灰化（鉱化）された結合性の組織をいう。骨組織は、他の組織（軟骨組織を含む）とは有意に異なる。具体的には、骨組織は、細胞、および二相性の媒体（鉱化、無機成分（主にヒドロキシアパタイト結晶）および有機成分（主にＩ型コラーゲン）を含む）から構成される脈管化した組織である。グリコサミノグリカンは、２％未満のこの有機成分および１％未満の二相性媒体自身、または骨組織自体を構成する。さらに、軟骨組織と比較して、骨組織に存在するコラーゲンは、非常に組織化された平行の配置で存在する。
【００１９】
本発明において使用するとき、「軟骨」とは、軟骨細胞または軟骨細胞様細胞、細胞間質（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＸ型、およびＸＩ型コラーゲン）、プロテオグリカン（例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、およびデルマタン硫酸プロテオグリカン）、および他のタンパク質を含む結合組織をいう。軟骨には、関節軟骨および非関節軟骨が含まれる。
【００２０】
「関節軟骨」は、関節内の骨の連接表面を覆い、２つの対向する骨表面の間の摩擦低減接合部分としての機能を果たす無血管の非無機化結合組織をいう。関節軟骨により、骨同士が直接接触することなく運動することが可能である。関節軟骨は、隣接する滑膜の血管および被覆される骨の血管から部分的に栄養素を得ている。関節軟骨は、ＩＩ型およびＩＸ型のコラーゲンならびに種々のプロテオグリカンを含み、軟骨内性骨形成に関連するＸ型コラーゲンを含まない。関節軟骨は骨の上を覆っており、軟骨の下の骨のことを軟骨下骨と呼ぶ。損傷が軟骨と軟骨下骨まで広がったものを骨軟骨損傷（軟骨全層欠損）といい、軟骨層までで留まるものを軟骨損傷（軟骨部分損傷）という。本発明において、「軟骨損傷」とは、上記「骨軟骨損傷」及び「軟骨損傷」を包含するものである。
【００２１】
「非関節軟骨」は、関節表面を被覆しない軟骨をいい、線維軟骨（関節円板、線維軟骨円板、結合線維軟骨、および関節周縁線維軟骨）および弾性軟骨が含まれる。線維軟骨では、ミクロポリサッカリド網が突出したコラーゲン束と組み合わされ、軟骨細胞が硝子軟骨または関節軟骨よりも広範に散在している。関節円板は衝撃に曝され、且つ頻繁に運動する関節（例えば、膝の半月板）で見出される。このような関節の例には、側頭下顎骨、胸鎖関節、手関節、および膝関節が含まれるが、これらに限定されない。二次軟骨結合は、線維軟骨の半月板によって形成される。対向する両表面に密接して接着するこのような線維軟骨円板は、軟骨の薄層が介在した線維組織の同心円状の輪から構成される。このような線維軟骨円板の例は、脊髄の椎間板である。結合線維軟骨は、これらの関節の骨表面の間に介在し、椎体の間および恥骨の間をわずかに移動することが可能である。関節周縁線維軟骨は、いくつかの関節腔（臀部の寛骨臼および肩の関節窩など）の縁部を取り囲む。
【００２２】
２．細胞製剤
（１）多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）
本発明の細胞製剤に使用される多能性幹細胞は、本発明者らの一人である出澤が、ヒト生体内にその存在を見出し、「Ｍｕｓｅ（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｅｎｄｕｒｉｎｇ）細胞」と命名した細胞である。Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄液、脂肪組織（Ｏｇｕｒａ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．，Ｎｏｖ  ２０，２０１３（Ｅｐｕｂ）（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎ  Ｊａｎ  １７，２０１４））や真皮結合組織等の皮膚組織から得ることができ、各臓器の結合組織にも散在する。また、この細胞は、多能性幹細胞と間葉系幹細胞の両方の性質を有する細胞であり、例えば、それぞれの細胞表面マーカーである「ＳＳＥＡ−３（Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ−３）」と「ＣＤ１０５」のダブル陽性として同定される。したがって、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、これらの抗原マーカーを指標として生体組織から分離することができる。Ｍｕｓｅ細胞の分離法、同定法、及び特徴などの詳細は、国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に開示されている。また、Ｗａｋａｏら（２０１１、上述）によって報告されているように、骨髄、皮膚などから間葉系細胞を培養し、それをＭｕｓｅ細胞の母集団として用いる場合、ＳＳＥＡ−３陽性細胞の全てがＣＤ１０５陽性細胞であることが分かっている。したがって、本発明における細胞製剤においては、生体の間葉系組織又は培養間葉系幹細胞からＭｕｓｅ細胞を分離する場合は、単にＳＳＥＡ−３を抗原マーカーとしてＭｕｓｅ細胞を精製し、使用することができる。なお、本明細書においては、骨軟骨損傷（後遺症を含む）を治療するための細胞製剤において使用され得る、ＳＳＥＡ−３を抗原マーカーとして、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織から分離された多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を単に「ＳＳＥＡ−３陽性細胞」と記載することがある。また、本明細書においては、「非Ｍｕｓｅ細胞」とは、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織に含まれる細胞であって、「ＳＳＥＡ−３陽性細胞」以外の細胞を指す。
【００２３】
簡単には、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、細胞表面マーカーであるＳＳＥＡ−３に対する抗体を単独で用いて、又はＳＳＥＡ−３及びＣＤ１０５に対するそれぞれの抗体を両方用いて、生体組織（例えば、間葉系組織）から分離することができる。ここで、「生体」とは、哺乳動物の生体をいう。本発明において、生体には、受精卵や胞胚期より発生段階が前の胚は含まれないが、胎児や胞胚を含む胞胚期以降の発生段階の胚は含まれる。哺乳動物には、限定されないが、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が挙げられる。本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、生体の組織から直接マーカーを持って分離される点で、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）やｉＰＳ細胞と明確に区別される。また、「間葉系組織」とは、骨、滑膜、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、歯髄、臍帯、臍帯血などの組織及び各種臓器に存在する組織をいう。例えば、Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄や皮膚、脂肪組織から得ることができる。例えば、生体の間葉系組織を採取し、この組織からＭｕｓｅ細胞を分離し、利用することが好ましい。また、上記分離手段を用いて、線維芽細胞や骨髄間葉系幹細胞などの培養間葉系細胞からＭｕｓｅ細胞を分離してもよい。なお、本発明の細胞製剤においては、使用されるＭｕｓｅ細胞は、細胞移植を受けるレシピエントに対して自家であってもよく、又は他家であってもよい。
【００２４】
上記のように、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、ＳＳＥＡ−３陽性、及びＳＳＥＡ−３とＣＤ１０５の二重陽性を指標にして生体組織から分離することができるが、ヒト成人皮膚には、種々のタイプの幹細胞及び前駆細胞を含むことが知られている。しかしながら、Ｍｕｓｅ細胞は、これらの細胞と同じではない。このような幹細胞及び前駆細胞には、皮膚由来前駆細胞（ＳＫＰ）、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）、メラノブラスト（ＭＢ）、血管周囲細胞（ＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）が挙げられる。これらの細胞に固有のマーカーの「非発現」を指標として、Ｍｕｓｅ細胞を分離することができる。より具体的には、Ｍｕｓｅ細胞は、ＣＤ３４（ＥＰ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）（ＭＢのマーカー）、ＣＤ１４６（ＰＣ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ）（ＮＣＳＣのマーカー）、ＮＧ２（ＰＣのマーカー）、ｖＷＦ因子（フォンビルブランド因子）（ＥＰのマーカー）、Ｓｏｘ１０（ＮＣＳＣのマーカー）、Ｓｎａｉ１（ＳＫＰのマーカー）、Ｓｌｕｇ（ＳＫＰのマーカー）、Ｔｙｒｐ１（ＭＢのマーカー）、及びＤｃｔ（ＭＢのマーカー）からなる群から選択される１１個のマーカーのうち少なくとも１個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。例えば、限定されないが、ＣＤ１１７及びＣＤ１４６の非発現を指標に分離することができ、さらに、ＣＤ１１７、ＣＤ１４６、ＮＧ２、ＣＤ３４、ｖＷＦ及びＣＤ２７１の非発現を指標に分離することができ、さらに、上記の１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。
【００２５】
また、本発明の細胞製剤に使用される上記特徴を有するＭｕｓｅ細胞は、以下：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ
からなる群から選択される少なくとも１つの性質を有してもよい。本発明の一局面では、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、上記性質を全て有する。ここで、上記（ｉ）について、「テロメラーゼ活性が低いか又は無い」とは、例えば、ＴＲＡＰＥＺＥ  ＸＬ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に、低いか又は検出できないことをいう。テロメラーゼ活性が「低い」とは、例えば、体細胞であるヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、又はＨｅｌａ細胞に比べて１／５以下、好ましくは１／１０以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。上記（ｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、三胚葉（内胚葉系、中胚葉系、及び外胚葉系）に分化する能力を有し、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導培養することにより、肝細胞、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨細胞、脂肪細胞等に分化し得る。また、ｉｎ  ｖｉｖｏで精巣に移植した場合にも三胚葉に分化する能力を示す場合がある。さらに、静注により生体に移植することで損傷を受けた臓器（心臓、皮膚、脊髄、肝、筋肉等）に遊走及び生着し、組織に応じた細胞に分化する能力を有する。上記（ｉｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、浮遊培養では増殖速度約１．３日で増殖するが、浮遊培養では１細胞から増殖し、胚様体様細胞塊を作り１４日間程度で増殖が止まる、という性質を有するが、これらの胚様体様細胞塊を接着培養に持っていくと、再び細胞増殖が開始され、細胞塊から増殖した細胞が広がっていく。さらに精巣に移植した場合、少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。また、上記（ｉｖ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、セルフリニューアル（自己複製）能を有する。ここで、「セルフリニューアル」とは、１個のＭｕｓｅ細胞から浮遊培養で培養することにより得られる胚様体様細胞塊に含まれる細胞から３胚葉性の細胞への分化が確認できると同時に、胚様体様細胞塊の細胞を再び１細胞で浮遊培養に持っていくことにより、次の世代の胚様体様細胞塊を形成させ、そこから再び３胚葉性の分化と浮遊培養での胚様体様細胞塊が確認できることをいう。セルフリニューアルは１回又は複数回のサイクルを繰り返せばよい。
【００２６】
また、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞を含む細胞画分は、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に外的ストレス刺激を与え、該外的ストレスに耐性の細胞以外の細胞を死滅させ、生き残った細胞を回収することを含む方法によって得られる、以下の性質の少なくとも１つ、好ましくは全てを有する、ＳＳＥＡ−３陽性及びＣＤ１０５陽性の多能性幹細胞が濃縮された細胞画分であってもよい。
（ｉ）ＳＳＥＡ−３陽性；
（ｉｉ）ＣＤ１０５陽性；
（ｉｉｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｖ）三胚葉に分化する能力を持つ；
（ｖ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｖｉ）セルフリニューアル能を持つ。
【００２７】
上記外的ストレスは、プロテアーゼ処理、低酸素濃度での培養、低リン酸条件下での培養、低血清濃度での培養、低栄養条件での培養、熱ショックへの曝露下での培養、低温での培養、凍結処理、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養、振とう処理下での培養、圧力処理下での培養又は物理的衝撃のいずれか又は複数の組み合わせであってもよい。例えば、上記プロテアーゼによる処理時間は、細胞に外的ストレスを与えるために合計０．５〜３６時間行うことが好ましい。また、プロテアーゼ濃度は、培養容器に接着した細胞を剥がすとき、細胞塊を単一細胞にばらばらにするとき、又は組織から単一細胞を回収するときに用いられる濃度であればよい。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ又はＮ末端スレオニンプロテアーゼであることが好ましい。さらに、前記プロテアーゼがトリプシン、コラゲナーゼ又はジスパーゼであることが好ましい。
【００２８】
（２）細胞製剤の調製及び使用
本発明の細胞製剤は、限定されないが、上記（１）で得られたＭｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を生理食塩水や適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁させることによって得られる。この場合、自家又は他家の組織から分離したＭｕｓｅ細胞数が少ない場合には、細胞移植前に細胞を培養して、所定の細胞濃度が得られるまで増殖させてもよい。なお、すでに報告されているように（国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号パンフレット）、Ｍｕｓｅ細胞は、腫瘍化しないため、生体組織から回収した細胞が未分化のまま含まれていても癌化の可能性が低く安全である。また、回収したＭｕｓｅ細胞の培養は、特に限定されないが、通常の増殖培地（例えば、１０％仔牛血清を含むα−最少必須培地（α−ＭＥＭ））において行うことができる。より詳しくは、上記国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号パンフレットを参照して、Ｍｕｓｅ細胞の培養及び増殖において、適宜、培地、添加物（例えば、抗生物質、血清）等を選択し、所定濃度のＭｕｓｅ細胞を含む溶液を調製することができる。ヒト対象に本発明の細胞製剤を投与する場合には、ヒトの腸骨から数ｍｌ程度の骨髄液を採取し、例えば、骨髄液からの接着細胞として骨髄間葉系幹細胞を培養して有効な治療量のＭｕｓｅ細胞を分離できる細胞量に達するまで増やした後、Ｍｕｓｅ細胞をＳＳＥＡ−３の抗原マーカーを指標として分離し、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。あるいは、例えば、Ｍｕｓｅ細胞をＳＳＥＡ−３の抗原マーカーを指標として分離後、有効な治療量に達するまで細胞を培養して増やした後、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。
【００２９】
また、Ｍｕｓｅ細胞の細胞製剤への使用においては、該細胞を保護するためにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等を、細菌の混入及び増殖を防ぐために抗生物質等を細胞製剤に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）や間葉系幹細胞に含まれるＭｕｓｅ細胞以外の細胞又は成分を細胞製剤に含有させてもよい。当業者は、これら因子及び薬剤を適切な濃度で細胞製剤に添加することができる。このように、Ｍｕｓｅ細胞は、各種添加物を含む医薬組成物として使用することも可能である。
【００３０】
上記で調製される細胞製剤中に含有するＭｕｓｅ細胞数は、骨軟骨損傷における所望の効果（例えば、骨・軟骨の再生、骨軟骨損傷に関連した各種疾患の消失など）が得られるように、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態等を考慮して、適宜、調整することができる。後述する実施例においては、大腿骨の一部を欠損させたラット骨軟骨欠損モデルに対して、Ｍｕｓｅ細胞移植による各種の効果を検討した。約２００〜３００ｇのラットに対しては、ＳＳＥＡ３陽性細胞を５×１０4細胞／頭で関節内投与することにより、非常に優れた効果が得られた。この結果から哺乳動物一個体あたり１．６〜２．５×１０5細胞／ｋｇを体重換算した細胞量を投与することで優れた効果が得られることが期待される。なお、対象とする個体はラット、ヒトを含むがこれに限定されない。また、本発明の細胞製剤は、所望の治療効果が得られるまで、複数回（例えば、２〜１０回）、適宜、間隔（例えば、１日に２回、１日に１回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、６カ月に１回）をおいて投与されてもよい。したがって、対象の状態にもよるが、治療上有効量としては、例えば、一個体あたり１×１０3細胞〜２×１０7細胞で１〜１０回の投与量が好ましい。一個体における投与総量としては、限定されないが、１×１０3細胞〜２×１０8細胞、１×１０4細胞〜１×１０8細胞、２×１０4細胞〜５×１０7細胞、５×１０4細胞〜２×１０7細胞、１×１０5細胞〜１×１０7細胞などが挙げられる。また、本発明の細胞製剤は、特に限定されないが、骨軟骨損傷部位（例えば、関節、大腿骨など）に直接に投与されてもよく、また、静脈内に投与されてもよい。
【００３１】
３．ラット骨軟骨欠損モデルの作製
本明細書においては、本発明の細胞製剤による骨軟骨損傷の治療効果を検討するためにラット骨軟骨欠損モデルを構築し、使用することができる。該モデルとして使用されるラットには、限定されないが、一般的に、免疫不全ラット（例えば、Ｆ３４４／ＮＪｃｌ−ｒｎｕ／ｒｎｕ）、Ｗｉｓｔａｒ系ラット、スプラーグドーリー（ＳＤ）系ラットが挙げられる。後述する実施例においては、ラットの大腿骨に直径１ｍｍの球形の先端を有する金属ドリルにより骨軟骨を欠損させたラットモデルを使用した。本発明の細胞製剤はヒト由来のＭｕｓｅ細胞であるため、該製剤を投与されるラットとは異種の関係にある。通常、モデル動物において異種の細胞等が投与される実験では、異種細胞の生体内で拒絶反応を抑制するために、異種細胞の投与前又は同時に免疫抑制剤（シクロスポリンなど）が投与される。
【００３２】
４．Ｍｕｓｅ細胞による治療効果
本発明の実施形態では、本発明の細胞製剤は、骨軟骨損傷の患者の骨及び軟骨の機能を正常に回復させることができる。本明細書において使用するとき、骨軟骨機能の「回復」とは、骨軟骨損傷（欠損を含む）に伴う各種の機能障害の治療、修復及び緩和を意味し、一例として、日常生活に差し支えない程度にまで骨軟骨損傷を緩和することを意味する。また、骨軟骨の機能を「回復する」とは、骨軟骨損傷に起因した機能障害が改善、緩和、又は除去されて、骨軟骨損傷前の状態に戻ることを意味する。また、骨軟骨機能の回復の評価には、限定されないが、組織学的評価として、一般的には、骨軟骨組織の染色にサフラニンＯ／ファーストグリーンを使用するＳｅｌｌｅｒｓによる組織学的スコアリングを用いて行うことができる[8]。
【００３３】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
本研究の動物実験に関する手法は、広島大学動物実験のガイドラインに従って実施された。すべてのプロトコールは、広島大学大学院生物医学研究科実験動物科学研究施設委員会により承認され、使用された。【００３５】
実施例１：細胞調製
ヒト骨髄ＭＳＣ（ｈＢＭＳＣ；Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を購入し、これを１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１ｍｇ／ｍｌカナマイシン、及び１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を含むイーグル最小必須培地（α−ＭＥＭ）中で、３７℃にて５％ＣＯ2で培養した。ｈＢＭＳＣが９０〜１００％コンフルエントに達した後、０．２５％トリプシン−エチレンジアミン四酢酸を用いて１：２の比で継代培養した。Ｋｕｒｏｄａらによるプロトコールに従った[5]。簡潔に述べると、ｈＢＭＳＣを、ＳＳＥＡ−３の発現の有無に応じて、Ｍｕｓｅ細胞（ＳＳＥＡ−３+）及び非Ｍｕｓｅ細胞（ＳＳＥＡ−３-）に分離した。ｈＢＭＳＣをＳＳＥＡ−３抗体（１：１００；Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）とともにインキュベートし、抗体希釈液中でＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎをコンジュゲートした抗ラットＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）によって検出し、Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｏｒｄｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰｒｏｄｕｃｔであるＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）によって選別した。【００３６】
実施例２：骨軟骨欠損部位への細胞注入
本実施例は、１６匹の１０週齢の免疫不全ラット（３２個の膝）（Ｆ３４４／ＮＪｃｌ−ｒｎｕ／ｒｎｕ）で行った。直径１ｍｍの球形の先端を有する市販の金属ドリルを用いて、大腿骨の膝蓋骨溝内に骨軟骨欠損（直径２ｍｍ、深さ２ｍｍ）を左右に作製した。膝関節を閉じた直後に、ラットの膝を３群に不均一に分布させた（表１）：対照群−ＰＢＳ注射；非Ｍｕｓｅ群−非Ｍｕｓｅ細胞の関節内注射（５×１０4）；Ｍｕｓｅ群−Ｍｕｓｅ細胞の関節内注射（５×１０4）。細胞を５０μｌのＰＢＳに懸濁させた。【００３７】
【表１】
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【００３８】
実施例３：肉眼的及び組織学的な評価法
（１）肉眼的な評価法
処置後の４週及び１２週で、致死量のペントバルビタールナトリウムを腹腔内に注射して、ラットを屠殺した。Ｗａｙｎｅら[6][7]による肉眼的スコアリングシステムを用いて、大腿顆を肉眼的に評価した。「１４」が最も良く、「０」が最も悪かった（表２）。【００３９】
表２．肉眼的スコアリングシステム【００４０】
【表２−１】
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【００４１】
【表２−１】
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【００４２】
【表２−３】
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【００４３】
【表２−４】
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【００４４】
（２）組織学的な評価法
修復組織を、パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝溶液（４％）中で１日間固定し、１０％ＥＤＴＡ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）で４週間、脱灰した後、パラフィンブロックに包埋した。試料を５μｍ切片に矢状に切断した。組織学的評価のために、切片をサフラニンＯ／ファーストグリーン（Ｍｕｔｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）で染色し、Ｓｅｌｌｅｒｓスケールの組織学的スコアリングを行った（表３）[8]。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を用いて、修復組織の細胞密度を評価した。【００４５】
表３．修復組織の組織学的評価のためのＳｅｌｌｅｒｓスケール【００４６】
【表３−１】
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【００４７】
【表３−２】
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【００４８】
【表３−３】
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【００４９】
【表３−４】
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【００５０】
【表３−５】
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【００５１】
【表３−６】
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【００５２】
【表３−７】
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【００５３】
【表３−８】
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【００５４】
実施例４：免疫染色
処理後の４週及び１２週で、切片を抗原回収試薬（Ｉｍｍｕｎｏａｃｔｉｖｅ、Ｍａｔｓｕｎａｍｉ  Ｇｌａｓｓ  Ｉｎｄ．、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）で前処理し、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするために、０．３％Ｈ2Ｏ2に浸漬する。切片をブロッキング溶液（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ；Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）でブロッキングし、Ｉ型コラーゲン（１：２５０、Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｔｏｙａｍａ、Ｊａｐａｎ）及びＩＩ型コラーゲン（１：２５０、Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）に対するマウスモノクローナル抗体とともにインキュベートする。視覚化のための反応は、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ系（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を用いて行い、３，３’−ジアミノベンジジン（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅキット、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて切片を着色する。【００５５】
実施例５：各種実験の結果
（１）肉眼的所見
４週で対照及び非Ｍｕｓｅ群の膝蓋溝において損傷部辺縁が容易に同定され、修復組織は検出されなかった。また、４週及び１２週で、Ｍｕｓｅ群及び非Ｍｕｓｅ群と比較して、対照群において、隣接する軟骨の変性を伴う変形性関節症変化が増加した。１２週で、非Ｍｕｓｅ群では、損傷部の深さは、褐色組織で満たされ、減少した。一方、Ｍｕｓｅ群では、白色組織で完全に損傷部が被覆され、これは、周囲組織に応じて、平滑であり、均質な表面を有し、損傷部辺縁を明確に特定することが困難である（図１）。肉眼的スコアリングでは、処置後の４週では３群間に有意差はなかったが、対照、非Ｍｕｓｅ群、Ｍｕｓｅ群の順で改善傾向が見られた（対照群：０．８±０．４；非Ｍｕｓｅ群：１．３±０．５、Ｍｕｓｅ群：１．８±０．８）。しかしながら、Ｍｕｓｅ群の肉眼的な結果は、欠陥部の補充によって測定すると、処置後、１２週で他の群の結果よりも有意に良好であった（対照群：０．５±０．６、非Ｍｕｓｅ群：１．５±０．５、Ｍｕｓｅ群：１０．０±１．５）（図２）。個々のパラメーターの肉眼的スコアを表４に示した。【００５６】
【表４−１】
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【００５７】
【表４−２】
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【００５８】
【表４−３】
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【００５９】
【表４−４】
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【００６０】
（２）組織学的所見及びスコアリング
４週および１２週で、対照群及び非Ｍｕｓｅ群の屠殺時には、線維組織は少量であったが、損傷部位に修復組織は見られなかった。４週でのＭｕｓｅ群においては、軟骨の置換はなく、軟骨下骨の修復を伴う損傷の部分的修復が見られた。また、１２週でのＭｕｓｅ群においては、軟骨損傷の修復が確認され、軟骨下骨の完全修復が伴っていたが、繊維組織で覆われ、統合に加えて、骨軟骨接合が観察された（図３Ａ）。４週及び１２週で、それぞれ、Ｓｅｌｌｅｒｓスケールに基づいて、以下の結果が記録された：対照群（４週：２６．２±１．６；１２週：２７．８±１．５）、非Ｍｕｓｅ群（４週：２７．２±１．２；１２週：２５±０．６）、及びＭｕｓｅ群（４週：１７．４±０．６；１２週：１１．８±２．０）。非Ｍｕｓｅ群は、処置後の１２週で、対照群よりも有意に良好な結果を示した。さらに、Ｍｕｓｅ群のスコアは、処置後の４週と１２週の両方で他の群よりも有意に良好であった（図４）。個々のパラメーターのＳｅｌｌｅｒｓスコアを表５に示した。また、１２週でのＨ＆Ｅ染色は、他の群と比較して、Ｍｕｓｅ群の修復組織の細胞密度が高いことを示した（図３Ｂ、Ｃ）。【００６１】
表５．Ｓｅｌｌｅｒｓスコア【００６２】
【表５−１】
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【００６３】
【表５−２】
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【００６４】
【表５−３】
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【００６５】
【表５−４】
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【００６６】
【表５−５】
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【００６７】
【表５−６】
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【００６８】
【表５−７】
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【００６９】
【表５−８】
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【００７０】
Ｍｕｓｅ細胞の関節内注射は、骨軟骨損傷、特に繊維組織によって覆われた軟骨下骨を修復する有望な方法である。【００７１】
参考文献
[1] A. Mobasheri, C. Csaki, A.L. Clutterbuck, M. Rahmanzadeh, and M. Shakibaei, Mesenchymal stem cells in connective tissue engineering and regenerative medicine: applications in cartilage repair and osteoarthritis therapy. Histol Histopathol, vol. 24, no. 3, pp. 347-366, 2009.
[2] M. Brittberg, A. Lindahl, A. Nilsson, C. Ohlsson, O. Isaksson, and L. Peterson, Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med, vol. 331, no. 14, pp. 889-895, 1994.
[3] M. Ochi, Y. Uchio, K. Kawasaki, S. Wakitani, and J. Iwasa, Transplantation of cartilage-like tissue made by tissue engineering in the treatment of cartilage defects of the knee. J Bone Joint Surg Br, vol. 84, no. 4, pp. 571-578, 2002.
[4] K. Tamai, T. Yamazaki, T. Chino, et al., PDGFRalpha-positive cells in bone marrow are mobilized by high mobility group box 1 (HMGB1) to regenerate injured epithelia. Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 108, no. 16, pp. 6609-6614, 2011.
[5] Y. Kuroda, S. Wakao, M. Kitada, T. Murakami, M. Nojima, and M. Dezawa, Isolation, culture and evaluation of multilineage-differentiating stress-enduring (Muse) cells. Nat Protoc, vol. 8, no. 7, pp. 1391-1415, 2013.
[6] J.S. Wayne, C.L. McDowell, K.J. Shields, and R.S. Tuan, In vivo response of polylactic acid-alginate scaffolds and bone marrow-derived cells for cartilage tissue engineering. Tissue Eng, vol. 11, no. 5-6, pp. 953-963, 2005.
[7] W. Cui, Q. Wang, G. Chen, et al., Repair of articular cartilage defects with tissue-engineered osteochondral composites in pigs. J Biosci Bioeng, vol. 111, no. 4, pp. 493-500, 2011.
[8] R.S. Sellers, D. Peluso, and E.A. Morris, The effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) on the healing of full-thickness defects of articular cartilage. J Bone Joint Surg Am, vol. 79, no. 10, pp. 1452-1463, 1997.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2019078262.tif 000033
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