(57)【要約】次式Ｉ：【化１１】2019004482.tif 000015（式中、Ｒ１は水素原子又は窒素原子を表し、Ｒ２は、単結合、又は−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−若しくは−ＮＨＣＯＯ−で示される基を表し、Ｒ３は、水素原子、置換基を有していてもよい炭化水素基、又は置換基を有していてもよい複素環式官能基を表す。）で示される、複素環式ボロン酸誘導体。
2019004482.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式Ｉ：
【化９】
2019004482.tif 000013
（式中、Ｒ１は水素原子又は窒素原子を表し、Ｒ２は、単結合、又は−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−若しくは−ＮＨＣＯＯ−で示される基を表し、Ｒ３は、水素原子、置換基を有していてもよい鎖状又は分岐状の炭化水素基、又は置換基を有していてもよい複素環式官能基を表す。）
で示される、複素環式ボロン酸誘導体。
【請求項２】
Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２が−Ｃ（Ｏ）Ｏ−又は−ＣＯＮＨ−で示される基である、請求項１に記載の複素環式ボロン酸誘導体。
【請求項３】
Ｒ３が炭素数１〜６のアルキル基である請求項１又は２に記載の複素環式ボロン酸誘導体。
【請求項４】
次式（１１）又は（１２）で示される複素環式ボロン酸誘導体。
【化１０】
2019004482.tif 000014
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の複素環式ボロン酸誘導体に、機能性分子が結合された複合体。
【請求項６】
機能性分子が、薬物、ＣＴ造影剤、ＭＲＩ造影剤、ＰＥＴプローブ、蛍光色素プローブ、アミノ酸、核酸、コレステロール誘導体、脂質及びポリマーからなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
機能性分子がポリマーである請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
ポリマーに、さらに核酸が静電結合により結合された、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
複素環式ボロン酸誘導体が、機能性分子に一価で連結された、請求項５〜８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１０】
複素環式ボロン酸誘導体が、機能性分子に多価で連結された、請求項５〜８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１１】
ポリマーが直鎖状又は分岐状のポリエチレングリコールである請求項６〜１０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の複素環式ボロン酸誘導体を含む、細胞又は組織への機能性分子送達用担体。
【請求項１３】
請求項６〜１１のいずれか１項に記載の複合体を含む、細胞又は組織への機能性分子送達システム。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の複素環式ボロン酸誘導体に目的物質を結合又は担持させ、これを酸性条件下でシアル酸を発現する細胞に接触させることを特徴とする、前記目的物質を当該細胞に輸送、送達又は結合させる方法。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の複素環式ボロン酸誘導体に標識物質を結合又は担持させ、これを被験細胞と接触させた後に標識物質を検出することを特徴とする、シアル酸発現細胞の検出方法。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の複素環式ボロン酸誘導体に標識物質を結合又は担持させ、これを被検細胞と接触させた後に標識物質を検出し、当該被検細胞周囲のｐＨを検出することを特徴とする、被検細胞周囲のｐＨの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複素環式ボロン酸誘導体及び当該誘導体を用いた応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞は、糖タンパク質及び糖脂質を介して細胞表面に付着したグリカンとして知られる糖鎖の密な層によって取り囲まれている（図１）。糖鎖は全ての哺乳動物組織において存在しているにもかかわらず、その正確な役割は、構造が非常に多様であるため完全に解明されておらず、現在、各特定の糖鎖構造の役割を予測するための包括的な「コード」はない１。【０００３】
糖鎖構造のかなりの割合を構成することが知られている糖の１つのファミリーは、シアル酸（ＳＡ又はＮ−アセチルノイラミン酸）である（図１）。ＳＡは、最も外側（鎖末端）の配置及び独自のアニオン性極性を考慮すると、多種多様な生理学的及び病理学的細胞プロセスを媒介し得るものであり、従って、細胞事象の文脈において糖鎖の状態を伝えるためのアクセス可能な「コード」を提供し得る。例えば、シアリル化は、典型的には癌において変化し、シアリル化グリカンの発現が増加することは、いくつかの例外を除いて、癌の進行、不良な予後、及びより高い転移の可能性の一般的な徴候となる２。従って、糖鎖シアル酸の測定は、これらの癌性状態の診断に関与し得る３。【０００４】
さらに、ＳＡ特異的に分子を認識することは、治療剤を高度にシアリル化されたエピトープ又は腫瘍細胞を標的化する能力をもたらす４。低酸素腫瘍微小環境の局在化ｐＨは一般的に周囲組織より低く、典型的には約６．５であり、一方、健康な組織についてのｐＨは７．４である５。従って、このような弱酸性条件下におけるＳＡの存在は、腫瘍及び他の癌性変化に対する高度に選択的なマーカーとなり得る。同様に、ＳＡ特異的分子認識は、このような酸性化に依存する様式で達成される場合、高度に腫瘍特異的な化学療法及び診断の戦略をもたらす３，４。【０００５】
他方、フェニルボロン酸をリガンドとして搭載したポリマーミセルを作製し、これを固形腫瘍におけるシアル酸エピトープを標的に使用する研究も進められている４ｅ。この研究では、フェニルボロン酸が効率的なシアル酸への結合剤として示されており、この構造が最も一般的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａ．Ｖａｒｋｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｂ．Ｌｏｗｅ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃａｎｓ，ｉｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（ＮＹ），２００９；
【非特許文献２】Ａ．Ｖａｒｋｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２００８，１４（８），３５１；
【非特許文献３】Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｚｏｏｌ．，２００４，１０７（１），４９；
【非特許文献４】Ｍ．Ｆｕｋｕｄａ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９６，５６，２２３７；
【非特許文献５】Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ  ａｎｄ  Ｌ．Ｌ．Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９１，２３５７；
【非特許文献６】Ｒ．Ｒａｍａｎ，Ｓ．Ｒａｇｕｒａｍ，Ｇ．Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｊ．Ｃ．Ｐａｕｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００５，２，８１７；
【非特許文献７】Ｊ．Ｅ．Ｓｃｏｔｔ，Ｃｏｎｎ’ｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｓ．Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｙｅｓ，Ｓｔａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊ．Ａｎａｔ．，２００３，２０３（４），４３３．
【非特許文献８】Ｓ．Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９６，５６，５３０９；
【非特許文献９】Ｄ．Ｈ．Ｄｕｂｅ  ａｎｄ  Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２００６，４，４７７；
【非特許文献１０】Ｙ．Ｘｕ，Ａ．Ｓｅｔｔｅ，Ｊ．Ｓｉｄｎｅｙ，Ｓ．Ｊ．Ｇｅｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ａ．Ｆｒａｎｃｏ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００５，８３，４４０；
【非特許文献１１】Ｌ．Ｄａｎｉｅｌ，Ｊ．Ｔｒｏｕｉｌｌａｓ，Ｗ．Ｒｅｎａｕｄ，Ｐ．Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ，Ｊ．Ｇｏｕｖｅｒｎｅｔ，Ｇ．Ｒｏｕｇｏｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｆｉｇａｒｅｌｌａ−Ｂｒａｎｇｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０００，６０，８０；
【非特許文献１２】Ｌ．Ｄａｎｉｅｌ，Ｐ．Ｄｕｒｂｅｃ，Ｅ．Ｇａｕｔｈｅｒｏｔ，Ｅ．Ｒｏｕｖｉｅｒ，Ｇ．Ｒｏｕｇｏｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｆｉｇａｒｅｌｌａ−Ｂｒａｎｇｅｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１，２０，９９７；
【非特許文献１３】Ｓ．Ｍ．Ｅｌｋａｓｈｅｆ，Ｓ．Ｊ．Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｍ．Ｓａｄｉｑ，Ｈ．Ａ．Ｂａｓｈｅｅｒ，Ｇ．Ｒ．Ｍｏｒａｉｓ，Ｐ．Ｍ．Ｌｏａｄｍａｎ，Ｋ．Ｐｏｒｓ  ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｆａｌｃｏｎｅｒ，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３３０２６．
【非特許文献１４】Ａ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｎ．Ｓａｔｏ，Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｍｉｙａｈａｒａ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００９，１３１，１２０２２；
【非特許文献１５】Ａ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｈ．Ｃａｂｒａｌ，Ｎ．Ｓａｔｏ，Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｍｉｙａｈａｒａ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１０，４９，５４９４．
【非特許文献１６】Ｇ．Ｌｅｍｉｅｕｘ，Ｋ．Ｊ．Ｙａｒｅｍａ，Ｃ．Ｌ．Ｊａｃｏｂｓ  ａｎｄ  Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９９，１２１，４２７８；
【非特許文献１７】Ｌ．Ｋ．Ｍｈａｌ，Ｎ．Ｗ．Ｃｈａｒｔｅｒ，Ｋ．Ａｎｇａｔａ，Ｍ．Ｆｕｋｕｄａ，Ｄ．Ｅ．Ｋｏｓｈｌａｎｄ  Ｊｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９４，３８０；
【非特許文献１８】Ｊ．Ｆｒｕｌｌａｎｏ，Ｊ．Ｓ．Ｒｏｈｏｖｅｃ，Ｔ．Ａｉｍｅ，Ｔ．Ｍａｓｃｈｍｅｙｅｒ，Ｍ．Ｉ．Ｐｒａｔａ，Ｊ．Ｊ．Ｐ．Ｄ．Ｌｉｍａ，Ｃ．Ｆ．Ｇ．Ｃ．Ｇｅｒａｌｄｅｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｃｈｅｍ．−Ｅｕｒ．Ｊ．，２００４，１０，５２０５；
【非特許文献１９】Ｋ．Ｄｊａｎａｓｈｖｉｌｉ，Ｇ．Ａ．Ｋｏｎｉｎｇ，Ａ．Ｊ．Ｇ．Ｍ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ，Ｈ．Ｔ．Ｗｏｌｔｅｒｂｅｅｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ｍｅｄｉａ  Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ，２００７，２，３５；
【非特許文献２０】Ｓ．Ｄｅｓｈａｙｅｓ，Ｈ．Ｃａｂｒａｌ，Ｔ．Ｉｓｈｉｉ，Ｙ．Ｍｉｕｒａ，Ｓ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ａ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｙ．Ｍｉｙａｈａｒａ，Ｎ．Ｎｉｓｈｉｙａｍａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１３，１３５，１５５０１；
【非特許文献２１】Ａ．Ｌｉｕ，Ｓ．Ｐｅｎｇ，Ｊ．Ｃ．Ｓｏｏ，Ｍ．Ｋｕａｎｇ，Ｐ．Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｈ．Ｄｕａｎ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，８３，１１２４；
【非特許文献２２】Ｓ．Ｇ．Ｃｒｉｃｈ，Ｄ．Ａｌｂｅｒｔｉ，Ｉ．Ｓｚａｂｏ，Ｓ．Ａｉｍｅ  ａｎｄ  Ｋ．Ｄｊａｎａｓｈｖｉｌｉ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１３，５２，１１６１；
【非特許文献２３】Ａ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｍｉｙａｈａｒａ，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，２０１４，４６，４８３．
【非特許文献２４】Ｖ．Ｅｓｔｒｅｌｌａ，Ｔ．Ａ．Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｌｌｏｙｄ，Ｊ．Ｗｏｊｔｋｏｗｉａｋ，Ｈ．Ｈ．Ｃｏｒｎｎｅｌｌ，Ａ．Ｉｂｒａｈｉｍ−Ｈａｓｈｉｍ，Ｋ．Ｂａｉｌｅｙ，Ｙ．Ｂａｌａｇｕｒｕｎａｔｈａｎ，Ｊ．Ｍ．Ｒｏｔｈｂｅｒｇ，Ｂ．Ｆ．Ｓｌｏａｎｅ，Ｊ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ａ．Ｇａｔｅｎｂｙ  ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０１３，７３（５），１５２４；
【非特許文献２５】Ｙ．Ｋａｔｏ，Ｓ．Ｏｚａｗａ，Ｃ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｍａｅｈａｔａ，Ａ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．Ｍａｅｄａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｂａｂａ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔ．，２０１３，１３，８９；
【非特許文献２６】Ｒ．Ａ．Ｇａｔｅｎｂｙ  ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，２００４，４（１１），８９１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記フェニルボロン酸よりもさらに結合性及び特異性の高い化合物を提供することを目的とする。【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、複素環式ボロン酸が、他のボロン酸ベースの化合物に代替できる物質であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）次式Ｉ：
【化１】
2019004482.tif 000003
（式中、Ｒ１は水素原子又は窒素原子を表し、Ｒ２は、単結合、又は−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−若しくは−ＮＨＣＯＯ−で示される基を表し、Ｒ３は、水素原子、置換基を有していてもよい鎖状又は分岐状の炭化水素基、又は置換基を有していてもよい複素環式官能基を表す。）
で示される、複素環式ボロン酸誘導体。
（２）Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２が−Ｃ（Ｏ）Ｏ−又は−ＣＯＮＨ−で示される基である、（１）に記載の複素環式ボロン酸誘導体。
（３）Ｒ３が炭素数１〜６のアルキル基である（１）又は（２）に記載の複素環式ボロン酸誘導体。
（４）次式（１１）又は（１２）で示される複素環式ボロン酸誘導体。
【化２】
2019004482.tif 000004
（５）（１）〜（４）のいずれか１項に記載の複素環式ボロン酸誘導体に、機能性分子が結合された複合体。
（６）機能性分子が、薬物、ＣＴ造影剤、ＭＲＩ造影剤、ＰＥＴプローブ、蛍光色素プローブ、アミノ酸、核酸、コレステロール誘導体、脂質及びポリマーからなる群から選ばれる少なくとも１つである、（５）に記載の複合体。
（７）機能性分子がポリマーである（６）に記載の複合体。
（８）ポリマーに、さらに核酸が静電結合により結合された、（７）に記載の複合体。
（９）複素環式ボロン酸誘導体が、機能性分子に一価で連結された、（５）〜（８）のいずれか１項に記載の複合体。
（１０）複素環式ボロン酸誘導体が、機能性分子に多価で連結された、（５）〜（８）のいずれか１項に記載の複合体。
（１１）ポリマーが直鎖状又は分岐状のポリエチレングリコールである（６）〜（１０）のいずれか１項に記載の複合体。
（１２）（１）〜（４）のいずれか１項に記載の複素環式ボロン酸誘導体を含む、細胞又は組織への機能性分子送達用担体。
（１３）（６）〜（１１）のいずれか１項に記載の複合体を含む、細胞又は組織への機能性分子送達システム。
（１４）（１）〜（４）のいずれか１項に記載の複素環式ボロン酸誘導体に目的物質を結合又は担持させ、これを酸性条件下でシアル酸を発現する細胞に接触させることを特徴とする、前記目的物質を当該細胞に輸送、送達又は結合させる方法。
（１５）（１）〜（４）のいずれか１項に記載の複素環式ボロン酸誘導体に標識物質を結合又は担持させ、これを被験細胞と接触させた後に標識物質を検出することを特徴とする、シアル酸発現細胞の検出方法。
（１６）（１）〜（４）のいずれか１項に記載の複素環式ボロン酸誘導体に標識物質を結合又は担持させ、これを被検細胞と接触させた後に標識物質を検出し、当該被検細胞周囲のｐＨを検出することを特徴とする、被検細胞周囲のｐＨの検出方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、複素環式ボロン酸誘導体が提供される。本発明の誘導体は、シアル酸に対して特異的かつ強力な結合力を有する。シアル酸は細胞表面に発現していることから、本発明の誘導体を用いることで、各種機能性物質のデリバリーが可能となる。また、本発明の誘導体は、がん環境に特徴的な低酸素及び弱酸性条件下でシアル酸を特異的に認識する。従って、本発明の誘導体は例えば癌治療のためのドラッグデリバリーシステムとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
［図１］細胞における糖タンパク質と糖鎖を示す模式図である。
［図２］本発明の誘導体と機能性分子との結合を示す模式図である。
［図３］本発明の誘導体とブロックコポリマーにより形成されるポリマーミセルのコア領域に薬物が導入されている態様を示す図である。
［図４］本発明の誘導体に脂質が結合した複合体により形成されるリポソームを示す図である。
［図５］本発明の誘導体と機能性分子との結合を示す図である。
［図６］本発明の誘導体と機能性分子との結合を示す図である。
［図７］種々のボロン酸へのＳＡ結合の結合定数（Ｋ，Ｍ−１）をＢ１１核磁気共鳴法（ＮＭＲ）により測定した結果を示す図である。
（Ａ）３−ピリジルボロン酸、（Ｂ）５−ピリミジンボロン酸、（Ｃ）５−ボロノピコリン酸、（Ｄ）（６−プロピルカルバモイル）ピリジン−３−ボロン酸、（Ｅ）３−ボロノ−１−（カルボキシメチル）ピリジン、（Ｆ）３−プロピオンアミドフェニルボロン酸、（Ｇ）４−（メチルスルホニル）ベンゼンボロン酸。（Ｂ）及び（Ｃ）の値は、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）を表す。
［図８］４つの代表的なボロン酸誘導体について決定した結合定数（Ｋ、Ｍ−１）を示す図である。
（Ａ）３−ピリジルボロン酸、（Ｂ）５−ピリミジンボロン酸、（Ｃ）５−ボロノピコリン酸、及び（Ｄ）（６−プロピルカルバモイル）ピリジン−３−ボロン酸は、ｐＨの関数として様々な糖と結合する。
［図９］共焦点レーザー走査顕微鏡を用いたボロン酸のＳＡ結合能のＩｎ  ｖｉｔｒｏ評価を示す図である。
（Ａ）ＰＡＮＣ１細胞をＰＢＳ、０．２ｍｇ／ｍＬ（３−プロピオンアミド）フェニルボロン酸酸及び０．２ｍｇ／ｍＬ  ５−ボロノピコリン酸と共にｐＨ７．４又はｐＨ６．５で１５分間インキュベートした後のＳａｍｂｕｃｕｓ  Ｎｉｇｒａレクチン（ＳＮＡ、赤色）の結合。細胞核をヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）（青色）で染色した。（Ｂ、Ｃ）（Ｂ）ｐＨ７．４及び（Ｃ）ｐＨ６．５でのＰＡＮＣ１細胞におけるＳＮＡ蛍光強度の定量（ｎ＝１００細胞）。
＊＊＊ｐ＜０００１、＊＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定で判定。
［図１０］共焦点レーザー走査顕微鏡を用いたローダミン標識５−ボロノピコリン酸のＳＡ結合能のＩｎ  ｖｉｔｒｏ評価を示す図である。
（Ａ）シアリダーゼ処理が有り及び無しのときの、ｐＨ７．４又はｐＨ６．５でＰＡＮＣ１細胞をＰＢＳと５分間インキュベートした後のローダミン標識５−ボロノピコリン酸（赤）の結合。細胞核をヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）（青色）で染色した。
（Ｂ）シアリダーゼ処理が有り及び無しのときの、ｐＨ７．４及びｐＨ６．５のＰＡＮＣ１細胞におけるローダミン標識５−ボロノピコリン酸の発光度の定量（ｎ＝１００細胞）。
＊＊＊スチューデントのｔ検定でｐ＜０００１。
［図１１］（６−プロピルカルバモイル）ピリジン−３−ボロン酸のＮＭＲスペクトルを示す図である。
［図１２］（６−プロピルカルバモイル）ピリジン−３−ボロン酸の質量スペクトルを示す図である。
［図１３］３−ボロノ−１−（カルボキシメチル）ピリジンのＮＭＲスペクトル及び質量スペクトルを示す図である。
［図１４］ローダミン６ＧのＮＭＲスペクトルを示す図である。
［図１５］５−ボロノピコリン酸とローダミンとのコンジュゲートのＮＭＲスペクトルを示す図である。
［図１６］５−ボロノピコリン酸とローダミンとのコンジュゲートの質量スペクトルを示す図である。
［図１７］各ｐＨにおける種々の糖を含む３−プロピオンアミドフェニルボロン酸水溶液（２０ｍＭ／２０ｍＭ）の１１Ｂ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
［図１８］３−プロピオンアミドフェニルボロン酸と種々の糖との間の結合定数（Ｋ）を示す図である。図はｐＨの関数として表示。
［図１９］各種糖を含む３−ピリジルボロン酸水溶液（２０ｍＭ／２０ｍＭ）の一連のｐＨにおける１１Ｂ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
［図２０］各種糖を含む３−ボロノ−１−（カルボキシメチル）ピリジン水溶液（２０ｍＭ／２０ｍＭ）の一連のｐＨにおける１１Ｂ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
［図２１］３−ボロノ−１−（カルボキシメチル）ピリジンと種々の糖との間の結合定数（Ｋ）を示す図である。図はｐＨの関数として表示。
［図２２］各種糖を含む５−ピリミジンボロン酸水溶液（２０ｍＭ／２０ｍＭ）の一連のｐＨにおける１１Ｂ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
［図２３］各種糖を含む５−ボロノピコリン酸水溶液（２０ｍＭ／２０ｍＭ）の一連のｐＨにおける１１Ｂ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
［図２４］５−ボロノピコリン酸のＮＭＲスペクトル、及び５−ボロノピコリン酸のＳＡとの結合定数を示す図である。
（ａ）（ｂ）２０ｍＭ  ＳＡを含む５−ボロノピコリン酸の２０ｍＭ水溶液の１１Ｂ  ＮＭＲスペクトルを、異なる塩化ナトリウム濃度（それぞれ３００ｍＭ及び６００ｍＭ）及びｐＨについて調べた。
（ｃ）５−ボロノピコリン酸とＳＡとの間の結合定数を、異なる塩濃度についてｐＨの関数として表示。
［図２５］ＳＡを含有する（６−プロピルカルバモイル）ピリジン−３−ボロン酸のＮＭＲ及び結合定数を示す図である。
（ａ），（ｂ），（ｃ）異なる塩化ナトリウム濃度（それぞれ０ｍＭ、３００ｍＭ、及び６００ｍＭ）及びｐＨに対する、２０ｍＭ  ＳＡを含有する（６−プロピルカルバモイル）ピリジン−３−ボロン酸の２０ｍＭ水溶液の１１Ｂ  ＮＭＲスペクトル。
（ｄ）（６−プロピルカルバモイル）ピリジン−３−ボロン酸とＳＡの結合定数を、異なる塩濃度についてｐＨの関数として表示。
［図２６］各種糖を含む（６−プロピルカルバモイル）ピリジン−３−ボロン酸水溶液（２０ｍＭ／２０ｍＭ）の一連のｐＨにおける１１Ｂ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
［図２７］一連のｐＨに対する４−（メチルスルホニル）ベンゼンボロン酸含有ＳＡ水溶液（２０ｍＭ／２０ｍＭ）の１１Ｂ  ＮＭＲスペクトル（左）、及び４−（メチルスルホニル）ベンゼンボロン酸とＳＡの結合定数（右）を示す図である。右図は、ｐＨの関数として表示。
［図２８］一連のｐＨに対するＮ−アセチルノイラミン酸メチルエステルを含む５−ボロノピコリン酸水溶液（２０ｍＭ／２０ｍＭ）の１１Ｂ  ＮＭＲスペクトル（Ａ）、及び５−ボロノピコリン酸とＮ−アセチルノイラミン酸メチルエステルの結合定数（Ｂ）を示す図である。（Ｂ）はｐＨの関数として表示。
［図２９］一連のｐＨに対する５−ボロノピコリン酸水溶液とＮ−グリコリルノイラミン酸水溶液（２０ｍＭ／２０ｍＭ）の１１Ｂ核磁気共鳴スペクトル（Ａ）、及び５−ボロノピコリン酸とＮ−グリコリルノイラミン酸の結合定数（Ｂ）を示す図である。（Ｂ）はｐＨの関数として表示。
［図３０］一連のｐＨに対するＮ−アセチルノイラミン酸三量体（α、２→８）を含む５−ボロノピコリン酸水溶液（２０ｍＭ／５．７ｍＭ）の１１Ｂ  ＮＭＲスペクトル（Ａ）、及び５−ボロノピコリン酸とＮ−アセチルノイラミン酸三量体（α、２→８）の結合定数（Ｂ）を示す図である。（Ｂ）はｐＨの関数として表示。
［図３１］一連のｐＨに対するＮ−アセチルノイラミン酸五量体（α、２→８）を含む５−ボロノピコリン酸水溶液（２０ｍＭ／５．３ｍＭ）の１１Ｂ  ＮＭＲスペクトル（Ａ）、及び５−ボロノピコリン酸とＮ−アセチルノイラミン酸の五量体（α、２→８）の結合定数（Ｂ）を示す図である。（Ｂ）はｐＨの関数として表示。
［図３２］種々のｐＨについて異なる量の５−ボロノピコリン酸（５−Ｂｏｐｉ）を含有する９ｕＭアリザリンレッドＳ（ＡＲＳ）水溶液の蛍光強度（ｅｘ：４６８ｎｍ、ｅｍ：５７２ｎｍ）変化を示す図である。データは平均±標準偏差（ＳＤ）、（ｎ＝３）として示す。
［図３３］５−ＢｏｐｉとＡＲＳ（ＫＡＲＳ）の結合定数を示す図である。ＫＡＲＳは、１／Ｃ５−Ｂｏｐｉ対１／ΔＦ（Δ蛍光強度）のプロットにおける切片及び傾きの比である。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。
［図３４］種々の濃度のＳＡ（ＣＳＡ）及びｐＨについてのＡＲＳ−５−Ｂｏｐｉ複合体溶液の蛍光スペクトル（ｅｘ：４６８ｎｍ）を示す図である。
［図３５］シアル酸（ＳＡ）のＡＲＳ−５−Ｂｏｐｉ複合体溶液への滴定結果を示す図である。
ＳＡの存在によるＡＲＳ−５−Ｂｏｐｉ複合体の蛍光強度（ｅｘ：４６８ｎｍ、ｅｍ：５７２ｎｍ）の低下が示される。Ｆ０は溶液の初回蛍光強度、Ｆは溶液の蛍光強度、及びＣＳＡはＳＡの濃度。データは平均±標準偏差（ｎ＝３）として提示した。
［図３６］種々のｐＨについての５−ＢｏｐｉとＳＡ（ＫＳＡ）の結合定数を示す図である。
ＫＳＡは［Ｓ０］／ＰをＱの関数としてプロットすることにより決定され、ＫＳＡはＫＡＲＳをプロット式の傾きで割ることにより計算することができる。
Ｐ及びＱ値は、以前の文献（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５８：５２９１−５３００（２００２））からの方程式によって決定した。Ｓ０はＳＡの総濃度。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示される。
［図３７］ｐＨの関数としての５−ＢｏｐｉとＳＡ（ＫＳＡ）の結合定数を示す図である。結合定数は、１１Ｂ  ＮＭＲ分析（黒枠の丸：図７Ｃ参照）から得られたものと比較して、ＡＲＳアッセイ（青枠の丸）によって測定した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。
［図３８］ＢＳ−Ｘ１７３３Ｚアレイ（タイプＩ：２８グリカン）（住友ベークライト（株）上にインストールしたグリカンのタイプと構造を示す図である。
Ｎｏ．３、６、２１、２２（赤色長方形で囲ったもの）は、ＳＮＡレクチンが特異性を有する、末端がＮｅｕ５Ａｃ（α，６）ＧａｌＮＡｃ構造を有するものである。
［図３９］ＳＮＡ及びＷＧＡレクチンのグリカン特異性アッセイを、グリカンアレイ（ＢＳ−Ｘ  １７３３Ｚ：住友ベークライト（株））によって評価した結果を示す図である。上パネル：ＳＮＡ、下パネル：ＷＧＡ
［図４０］グリカンアレイ（ＢＳ−Ｘ  １７３３Ｚ：住友ベークライト（株））上の異なるｐＨに対するＳＮＡレクチンと５−ボロノピコリン酸の競合的ＳＡ結合アッセイを示す図である。
［図４１］５−ＢＰＡ−ＰＥＧ−ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ｂ−ｐＧｌｕ−Ａｃの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
［図４２］５−ＢＰＡ−ＰＥＧ−Ａｃ（Ｍｗ  ５５００）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。１Ｈ−ＮＭＲ測定は、Ｄ２Ｏを用い２５℃で行った。
［図４３］異なる濃度の５−ＢＰＡにおけるＡＲＳ−５ＢＰＡ複合体の蛍光スペクトル（上パネル）及びＡＲＳ−５−ＢＰＡ複合体の溶液へのＳＡの滴定結果を示す図である（下パネル）。下パネルは、ｐＨ６．５におけるＳＡ濃度依存的なＡＲＳ−５ＢＰＡ複合体の蛍光強度を示す。
［図４４］高分子−金属錯体化による高分子ミセルの水中での自己組織化を示す図である。
［図４５］共焦点顕微鏡にて評価したｐＨ依存的Ａｌｅｘａ  ６４７標識ミセル（ＭｅＯ，ＰＢＡ，５−ＢＰＡ）の取り込み挙動を示す図である。（Ａ）ｐＨ７．４（Ｂ）ｐＨ６．５
［図４６］各種ミセルの細胞取り込み挙動の評価を示す図である。
［図４７］各種ミセルの細胞取り込み挙動の評価を示す図である。
［図４８］共焦点レーザー顕微鏡により評価したＢ１６Ｆ１０に対するミセル取込み挙動の評価を示す図である。
［図４９］ボロンコンジュゲート８−ａｒｍ−ＰＥＧのＮＭＲスペクトルを示す図である。
［図５０］共焦点レーザー走査顕微鏡によるＣ２６におけるＣｙ５標識５−ＢＰＡ及びＰＢＡ修飾８−ａｒｍ−ＰＥＧ（緑色）の細胞取り込み評価を示す図である。
［図５１］Ｃｙ５標識５−ＢＰＡ及びＰＢＡ修飾８−ａｒｍ−ＰＥＧの細胞取り込み評価を示す図である。
［図５２］５−ＢＰＡ、及びＰＢＡ修飾８−ａｒｍ−ＰＥＧの液滞留性評価（Ａ）、並びに組織特異性（Ｂ）を示す図である。
［図５３］５−ＢＰＡ−８−ａｒｍ  ＰＥＧ（Ａ）及びＰＢＡ−８−ａｒｍ−ＰＥＧ（Ｂ）のＩＶＩＳ画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる米国仮出願６２／５２４，７４０号明細書の内容を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００１３】
１．概要
ボロン酸は、糖及び糖タンパク質中に見出されるジオール基と可逆的に相互作用し、その機能は周知である。しかし、この相互作用は、一般に無差別的である。本発明は、腫瘍の増殖及び癌の進行と密接に関係する糖残基であるシアル酸（ＳＡ又はＮ−アセチルノイラミン酸）に対して非常に高い親和性及び選択性を示す複素環式ボロン酸の誘導体を見出したことに基づくものである。
注目すべきことに、これらの相互作用は、低酸素腫瘍微小環境に関連する弱酸性ｐＨ条件下で強化される。
【００１４】
本発明においては、インビトロ競合結合アッセイにおいて、強力なＳＡ結合物質として、ボロン酸誘導体の１つである５−ボロノピコリン酸を同定した。５−ボロノピコリン酸は、３−プロピオンアミドフェニルボロン酸（効率的なＳＡ結合物質として多数の報告で証明されているゴールドスタンダード構造である）と比較して、細胞表面のＳＡとの相互作用が有意に高いことを明らかにした。この構造はまた、十分に保存されたＳＡ結合能力を有するさらなる化学結合に適していることが判明した。
これらの知見は、腫瘍特異的化学療法及び診断を達成することを目的とした、他の研究中のボロン酸ベースの化学技術に対して魅力的な代替法となり得るものである。
【００１５】
２．複素環式ボロン酸誘導体
本発明、は次式Ｉ：
【化３】
2019004482.tif 000005
で示される、複素環式ボロン酸誘導体を提供する。
【００１６】
式Ｉにおいて、Ｒ１は水素原子又は窒素原子を表し、Ｒ２は、単結合、又は−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−若しくは−ＮＨＣＯＯ−で示される基を表し、Ｒ３は、水素原子、置換基を有していてもよい鎖状又は分岐状の炭化水素基、又は置換基を有していてもよい複素環式官能基を表す。
炭化水素基は、飽和又は不飽和の非環式又は環式であるが、飽和の非環式であることが好ましい。また炭素数は限定されるものではないが、例えば炭素数１〜２０である。炭化水素基が非環式の場合には、直鎖状でも分岐状でもよい。炭化水素基には、炭素数１〜２０（「Ｃ１−２０」と表記する。他の炭素数の場合も同様。）アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基、Ｃ２−２０アルキニル基、Ｃ４−２０アルキルジエニル基、Ｃ６−１８アリール基、Ｃ７−２０アルキルアリール基、Ｃ７−２０アリールアルキル基、Ｃ３−２０シクロアルキル基、Ｃ３−２０シクロアルケニル基、Ｃ１−２０アルコキシ基、Ｃ６−２０アリールオキシ基、Ｃ７−２０アルキルアリールオキシ基、Ｃ２−２０アルコキシカルボニル基などが含まれる。
【００１７】
Ｃ１−２０アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ‐ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基等が挙げられる。
Ｃ２−２０アルケニル基としては、例えばビニル基、アリル基、プロペニル基、イソプロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、２−メチルアリル基、２−ブテニル基等が挙げられる。
【００１８】
Ｃ２−２０アルキニル基としては、例えばエチニル基、プロピニル基、ブチニル基等が挙げられる。
Ｃ４−２０アルキルジエニル基としては、例えば１，３−ブタジエニル基等が挙げられる。
Ｃ６−１８アリール基としては、例えばフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、インデニル基、ビフェニル基、アントリル基、フェナントリル基等が挙げられる。
【００１９】
Ｃ７−２０アルキルアリール基としては、例えばｏ−トリル基、ｍ−トリル基、ｐ−トリル基、２，３−キシリル基、２，５−キシリル基、ｏ−クメニル基、ｍ−クメニル基、ｐ−クメニル基、メシチル基等が挙げられる。
Ｃ７−２０アリールアルキル基としては、例えばベンジル基、フェネチル基、１−ナフチルメチル基、２−ナフチルメチル基、１−フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、フェニルペンチル基、フェニルヘキシル基、メチルベンジル基、ジメチルベンジル基、トリメチルベンジル基、エチルベンジル基、メチルフェネチル基、ジメチルフェネチル基、ジエチルベンジル基等が挙げられる。
【００２０】
Ｃ３−２０シクロアルキル基としては、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等が挙げられる。
Ｃ３−２０シクロアルケニル基としては、例えばシクロプロペニル基、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロペンタジエニル基、シクロヘキセニル基等が挙げられる。
Ｃ１−２０アルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基等が挙げられる。
【００２１】
Ｃ６−２０アリールオキシ基としては、例えばフェニルオキシ基、ナフチルオキシ基、ビフェニルオキシ基等が挙げられる。
Ｃ７−２０アルキルアリールオキシ基としては、例えばメチルフェニルオキシ基、エチルフェニルオキシ基、プロピルフェニルオキシ基、ブチルフェニルオキシ基、ジメチルフェニルオキシ基、ジエチルフェニルオキシ基、ジプロピルフェニルオキシ基、ジブチルフェニルオキシ基、メチルエチルフェニルオキシ基、メチルプロピルフェニルオキシ基、エチルプロピルフェニルオキシ基等が挙げられる。
【００２２】
Ｃ２−２０アルコキシカルボニル基としては、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、２−メトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基等が挙げられる。
【００２３】
Ｒ３における置換基の具体例としては、例えば、ハロゲン原子（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、水酸基、チオール基、ニトロ基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、シリル基、トリメチルシリル基、トリメトキシシリル基、メタンスルホニル基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ６−１０アリール基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−７アシル基又はＣ２−７アルコキシカルボニル基などを挙げることができる。
複素環式官能基としては、例えばピロリドン基、スクシンイミジル基、フラン環、ピリジン環、モルホリン環、エポキシ環、プリン環、ピリミジン環などが挙げられる。
【００２４】
本発明においては、例えばＲ１が水素原子であり、Ｒ２が−Ｃ（Ｏ）Ｏ−又は−ＣＯＮＨ−で示される基である。
また、本発明の一態様では、Ｒ３が炭素数１〜６のアルキル基である。
本発明において好ましい誘導体としては、例えば次式（１１）又は（１２）で示される複素環式ボロン酸誘導体が挙げられる。
【化４】
2019004482.tif 000006
【００２５】
本発明の複素環式ボロン酸誘導体は、公知方法により合成することができる。具体的には実施例に記載の方法が挙げられる。
【００２６】
３．複合体
本発明は、前記複素環式ボロン酸誘導体（「本発明の誘導体」ともいう）に、機能性分子が連結された複合体（コンジュゲート）を提供する。
図２は、本発明の誘導体と機能性分子との結合を示す模式図である。図２において、「Ｒ」は機能性分子を表し、丸で囲ったアルファベット「Ｂ」は本発明の複素環式ボロン酸誘導体を表す。上パネルは、薬物を担持したポリマーと本発明の誘導体とが１価で結合した態様であり、シアル酸に対する１価ボロンリガンドとして機能する。下パネルは、薬物を担持したポリマーと本発明の誘導体とが多価で結合した態様（ポリマー−薬物コンジュゲート）であり、シアル酸に対する多価ボロンリガンドとして機能する。
【００２７】
機能性分子としては、薬物、ＣＴ造影剤、ＭＲＩ造影剤、ＰＥＴプローブ、蛍光色素プローブ、アミノ酸、核酸、コレステロール誘導体、脂質及びポリマーなどが挙げられ、これらを単独で、又は適宜組み合わせて選択することができる。
これらの機能性分子の種類は特に限定されるものではない。例えば以下のものを例示することができる。
【００２８】
薬物：アモキシシリン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシン、バンコマイシン、シプロフロキサシン  などの抗癌剤、シスプラチン、ドキソルビシン、エピルビシン、カンプトテシン、エトポシド、ゲムシタビン、シタラビン、ブレオマイシン、イリノテカン、ＳＮ−３８．
ＣＴ造影剤：アミドトリゾ酸、メトリゾ酸、イオタラム酸、イオキサグリック酸
ＭＲＩ造影剤：ガドリニウムキレート、マンガンキレート、１９Ｆ誘導体、酸化鉄ナノ粒子
ＰＥＴプローブ：放射性同位元素キレート
【００２９】
蛍光色素プローブ：アクリジン色素、フルオレセイン、シアニン色素、エオシン、カルセイン、ナイルレッド、ナイルブルー、ヨウ化プロピジウム、ローダミン、スルホローダミンＢ、テキサスレッド
アミノ酸及びペプチド：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、各種ペプチド（ポリペプチドを含む）
核酸：ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡ
コレステロール誘導体：コルチゾール、アルドステロン、ビタミンＤ
【００３０】
脂質：アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、アナンダミド、リン脂質、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、リポ多糖類
ポリマー：ポリエチレングリコール、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（リシン）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（オルニチン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ  酸）、ポリ（サルコシン）、ポリ（グリセロール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（スルホベタイン）
【００３１】
本発明の誘導体と機能性分子との結合は、例えば式Ｉに示すＲ３の置換基をＣＯＮＨやＣＯＯＨで置換し、アミド結合、エステル結合等により行うことができる。
【００３２】
図３は、本発明の誘導体とブロックコポリマーとにより形成されるポリマーミセルであって、ミセルのコア領域に薬物が導入されている態様の模式図である。
上パネルは、疎水性ブロックポリマーと親水性ブロックポリマーとの共重合体に本発明の複合体を結合させた複合体を作製し、これに薬物を導入して自己組織化させるとポリマーミセルが形成することを示している。下パネルは、ブロックコポリマーの疎水性セグメントに予め薬物を導入した上で自己組織化させてミセルを形成させる態様である。
【００３３】
図４は、本発明の誘導体に脂質が結合した複合体により形成されるリポソームの模式図であり、下パネルには薬物が導入されている態様を示す。
本発明の誘導体は、前記の通り、弱酸性ｐＨ条件下でＳＡと高度に特異的な相互作用を示す。腫瘍細胞の環境におけるｐＨは弱酸性であり、また腫瘍細胞の表面にはシアル酸が発現していることから、図２〜４に示す複合体に担持させる薬剤を例えば抗癌剤とすることにより、これらの複合体は腫瘍細胞上のシアル酸を標的として特的かつ強力に結合し、抗癌剤を腫瘍細胞特異的にデリバリーすることが可能となる。
【００３４】
図５及び６は、１個の本発明の誘導体と１個の機能性分子とが結合した態様（１価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）リガンド）、及び２個以上の本発明の誘導体と１個の機能性分子とが結合した態様（多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）リガンド）を示す。多価リガンドの場合、本発明の誘導体はデンドリマーの末端に結合するもの、あるいはポリマーの側鎖に結合するものがある（図５）。本発明においては、本発明の誘導体の数に限定されるものではなく、２個、３個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、・・・、９９個、１００個のようにすることができる。後述の実施例では、多価リガンドとして、８アームのポリエチレングリコールに本発明の誘導体を結合させた例を示した（実施例３）。
【００３５】
また、側鎖に本発明の誘導体を結合したポリマー末端にカチオン性ポリマーを連結すると、アニオン性の核酸などを非共有結合的に静電結合させることができる（いわゆるポリイオンペアリング）。図６に示すように本発明の誘導体自体、又は本発明の誘導体に薬物を結合させた複合体は、中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）用組成物として使用することができる。
【００３６】
本発明において、多価リガンドを作製する場合は、機能性分子としてポリマーを使用することができ、ポリエチレングリコールであることが好ましい。
ここで、多価リガンドは、一般的にデンドリマーを作製する方法に準じて作製することができる。デンドリマーの合成法としては、例えばダイバージェント法（発散的合成）、コンバージェント法（収束的合成）のほか、クリックケミストリーを利用することができる。市販のポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）を使用することもできる。
このようにして設計された複素環式ボロン酸誘導体は、機能性分子を目的細胞に送達するための担体又はリガンドとして使用される。また、本発明の複合体は、細胞又は組織への機能性分子送達システムとして使用される。
【００３７】
本発明の誘導体をリガンドとして用いる場合、酸性条件下で目的物質をシアル酸発現細胞に輸送（結合）させることができる。すなわち、本発明は、所望の目的物質を結合又は担持した本発明の誘導体を、酸性条件下でシアル酸を発現する細胞と接触させることを特徴とする、前記目的物質を当該細胞に輸送、送達又は結合させる方法を提供する。ここで酸性条件とは、ｐＨが７未満であることを意味し、弱酸性も含まれる。例えばｐＨが６．９以下、６．５以下又は６．０以下であるが、例えばｐＨは３．０〜６．９、３．０〜６．５、３．０〜６．０の範囲である。また目的物質としては、前記機能性物質が挙げられる。また、「接触」とは、本発明の誘導体が被験細胞と接触できる条件下におくことを意味し、例えば、被験細胞を有する容器（培養容器、チューブ等）に本発明の誘導体を添加する方法、被験細胞を本発明の誘導体の存在下で培養する方法などが挙げられる。
本発明によれば、本発明の誘導体は抗がん剤などの薬剤を酸性環境に存在するがん細胞などに輸送する方法に用いることができる。
【００３８】
また、本発明の誘導体に標識物質を結合させることにより、ｐＨ感応性シアル酸発現細胞を検出することができる。すなわち、本発明は、標識物質を結合又は担持した本発明の誘導体を、被験細胞と接触させ、標識物質を検出することを特徴とする、シアル酸発現細胞の検出方法を提供する。「接触」の定義は前記と同様である。
検出手段としては、本明細書に記載の標識物質（例えば前記蛍光色素プローブ）を用いることができる。
【００３９】
さらに、本発明の誘導体は、ｐＨ依存的に細胞指向性を有するため、使用する誘導体により、シアル酸発現細胞が存在する周囲のｐＨを検知することもできる。すなわち、本発明は、標識物質を結合又は担持した本発明の誘導体を、被験細胞と接触させ、標識物質を検出することを特徴とする、細胞周囲のｐＨの検出方法を提供する。例えば、本発明の誘導体としてボロノピコリン酸を使用して細胞に結合させると、その細胞周囲のｐＨは、がん細胞などの弱酸性環境であると判断することができる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］【００４１】
複素環式ボロン酸の合成及びシアル酸への選択的結合試験
材料及び方法
３−ピリジルボロン酸（和光純薬工業）、５−ピリミジンボロン酸（和光純薬工業）、６−メトキシピリジン−３−ボロン酸（和光純薬工業）、２−フルオロ−３−ピリミジンボロン酸（和光純薬工業）、ピラゾール−４−ボロン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ピラゾール−５−ボロン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５−ボロノピコリン酸（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム塩化物  ｎ−水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）（和光純薬工業）及びＮ−（６−アミノヘキシル）ローダミン６Ｇ−アミドビス（トリフルオロアセテート）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）はすべて、さらに精製せずに使用した。【００４２】
３−ボロノ−１−（カルボキシメチル）ピリジンは以前に報告された方法で合成した８ｃ。糖（Ｎ−アセチルノイラミン酸、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース及びキシロース）は全て和光純薬工業から購入し、さらに精製することなく使用した。【００４３】
１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは全てＢｒｕｋｅｒ５００ＭＨｚ分光計で取得し、全ての質量スペクトル（高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析：ＨＲＥＳＩＭＳ）を収集し、ＢｒｕｋｅｒマイクロＴＯＦ分光計で分析した。【００４４】
（６−プロピルカルバモイル）ピリジン−３−ボロン酸の合成（図１１、１２）
ＤＭＦ（３０ｍＬ）中の５−ボロノピコリン酸（５００ｍｇ、３ｍｍｏｌ）及びプロピルアミン（２００ｍｇ、３．１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴ−ＭＭ（１．２ｇ、約４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を除去し、粗黄色油状物を０．１Ｍ  ＨＣｌ水溶液（１０ｍＬ／ｍｍｏｌ）に溶解し、次いでロータリーエバポレーターで蒸発させた。次いで、得られた淡黄色着色固体をアセトン中で攪拌して、白色結晶性沈殿物（６６０ｍｇ、９４％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）：δ  ８．８６（ｓ，１Ｈ），８．６８（ｄ，１Ｈ），８．２１（ｄ，１Ｈ），３．３２（ｔ，２Ｈ），１．５５（ｓｅｘｔ，２Ｈ），０．８４（ｔ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，９６ＭＨｚ）：δ  １７１．２４，１７０．１５，１５４．４５，１４９．３８，１４３．９７，１２４．２５，４４．２０，２４．８８，１３．５３；ＨＲＥＳＩＭＳ  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ９Ｈ１４ＢＮ２Ｏ３＋（Ｍ＋Ｈ＋）２０９．１１，ｆｏｕｎｄ  ２０９．０８．【００４５】
３−ボロノ−１−（カルボキシメチル）ピリジンの同定（図１３）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）：δ  ８．８３（ｄ，１Ｈ），８．７９−８．７５（ｍ，２Ｈ），８．０３（ｔ，１Ｈ），５．４２（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）：δ  １７４．７３，１５１．２１，１４９．１１，１４４．４７，１２９．０９，１１２．０２，５１．７４；ＨＲＥＳＩＭＳ  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ８Ｈ１２ＢＮＯ４−（Ｍ＋ＯＨ−）１９６．０９，ｆｏｕｎｄ  １９６．０９．
５−ボロノピコリン酸のローダミンコンジュゲート化（図１４−１６）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の５−ボロノピコリン酸（１５ｍｇ、９０μｍｏｌ）及びＮ−（６−アミノヘキシル）ローダミンの６Ｇ−アミドビス（トリフルオロアセテート）（５０ｍｇ、７０μｍｏｌ）にＤＭＴ−ＭＭ（３０ｍｇ、約１００μｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１０ｍｇ、１００μｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で３時間撹拌した。溶媒を除去し、粗生成物をクロロホルムに分散させ、ブラインで数回洗浄した。有機層を蒸発させ、真空中で乾燥させて赤色固体（５５ｍｇ、８９％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＭｅＯＤ  ４００ＭＨｚ）：δ  ８．７４（ｓ，１Ｈ），δ  ８．０３（ｄ，１Ｈ），δ  ７．９２（ｄ，１Ｈ），δ  ７．８９（ｔ，１Ｈ），δ  ７．５５（ｔ，２Ｈ），δ  ７．０７（ｔ，１Ｈ），δ  ６．２３（ｓ，２Ｈ），δ  ６．０３（ｓ，２Ｈ），δ  ３．１１（ｔ，４Ｈ），δ  １．９５（ｓ，６Ｈ），δ  １．２６（ｔ，８Ｈ），δ  １．１０（ｓ，６Ｈ）；ＨＲＥＳＩＭＳ  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ４０Ｈ５１ＢＮ７Ｏ５＋（Ｍ＋ＮＨ４＋ＣＨ３ＣＮ）＋７２０．４０，ｆｏｕｎｄ  ７２０．４３．
修飾体の収率は、ピーク面積積分比に基づいて８４％と計算された：２３−２４チャート上の対比１−４。【００４６】
ホウ素核磁気共鳴（１１Ｂ  ＮＭＲ）
ＮＭＲ用の試料溶液は、糖及びボロン酸化合物の両方を脱イオン蒸留水に室温で撹拌しながら溶解させることにより調製した。各化合物の濃度は、特に明記しない限り２０ｍＭであった。溶液のｐＨは、塩酸及びナトリウムのヒドロキシドで調整した。溶液を調製した直後にＮＭＲスペクトルを記録した。Ｂ１１  ＮＭＲスペクトルは、９６ＭＨｚでＪＥＯＬ  ＥＸ３００分光計で収集し、その化学シフトは三フッ化ホウ素−ジエチルエーテレート（０ｐｐｍ）の化学シフトを基準とした。測定は、ガラス中に混入されたホウ素不純物によるノイズの出現を避けるために、ポリテトラフルオロエチレン製のチューブ中で行った。データは、Ｄｅｌｔａ  ＮＭＲ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、バージョン５．０．４．４を用いて処理した。【００４７】
１１Ｂ  ＮＭＲは一般に、観察された化学シフトがホウ素核のハイブリダイゼーション状態、すなわち三角形（ｔｒｉｇｏｎａｌ）又は四面体（ｔｅｔｒａｈｅｄｒａｌ）に感受性であるボロン酸−ジオール相互作用を解明するために使用される。（Ｄｕｉｎ，Ｍ．Ｖ．；Ｐｅｔｅｒｓ，Ｊ．Ａ．；Ｋｉｅｂｏｏｍ，Ａ．Ｐ．Ｇ．；Ｂｅｋｋｕｍ，Ｈ．Ｖ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９８４，４０，２９０１／Ｂｅｒｇ，Ｒ．Ｖ．Ｄ．；Ｐｅｔｅｒｓ，Ｊ．Ａ．；Ｂｅｋｋｕｍ，Ｈ．Ｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９４，２５３，１）【００４８】
典型的には四面体状態又はボロネートが約０ｐｐｍで化学シフトを示し、一方、三方状態（ボロン酸）は有意なダウンフィールド共鳴（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｄｏｗｎｆｉｅｌｄ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を生じる。結合標的の非存在下では２つのハイブリダイゼーション状態間の急速な相互変換のために、所定のｐＨにおける２つの状態の比に対応する場に１つのシグナルのみが現れ、その結果、化学シフトは目的のボロン酸のｐＫａ値の範囲にわたるｐＨの減少を伴うダウンフィールドシフトを受ける。ジオールと錯体を形成させると、自由状態と錯体状態との間の交換速度は１１Ｂ  ＮＭＲ時間スケールに対して遅いので、スペクトルは２つのピークからなる。遊離ボロン酸／ボロン酸塩のピークは化学シフトが上記と同様のｐＨ低下を伴うダウンフィールドシフトを示し、より高い電界（０ｐｐｍ付近）で錯体に起因するピークを示す。
一連のｐＨのスペクトル上の各ピークに、元素の割り当てを行った。必要に応じて、重複したピークを、上記のソフトウェアを用いた分析の前にデコンボリューションを行った。【００４９】
安定性定数は錯体及び遊離状態に割り当てられたピーク面積を積分し、それらを以下の式に当てはめることによって計算した（ここで、糖及びホウ素酸の初期濃度は同一（すなわち、２０ｍＭ）であるため、全ての値が既知である。）。
【数１】
2019004482.tif 000007
【００５０】
文献レベルでｐＫａ値を入手できなかった、図７に提示されたいくつかの誘導体（５−ピリミジンボロン酸、ピラゾール−５−ボロン酸及び５−ボロノピコリン酸）について、Ｂ１１  ＮＭＲ滴定を行った。
すなわち、種々のｐＨについてケミカルシフトの各重心値をプロットして滴定曲線を求め、その変曲点をｐＫａとした（表１）。【００５１】
表１は、種々のｐＫａを有する一連のボロン酸誘導体に対するＳＡ結合の安定性定数（ｐＨ６）の比較であり、１１Ｂ  ＮＭＲにより測定した結果を示す。
【表１】
2019004482.tif 000008
【００５２】
ＡＲＳアッセイ。
アリザリンレッドＳ（ＡＲＳ）（和光純薬工業）を購入し、そのまま使用した。結合実験に使用した水を二重蒸留し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ濾過システムでさらに精製した。蛍光光度計（Ｔｅｃａｎ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ：Ｔｅｃａｎ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００）を全ての蛍光及び吸光度試験に使用し、９６ウェルプレート形式で行った（図３２）。方法及びデータ分析は特に明記しない限り、Ｓｐｒｉｎｇｓｔｅｅｎ及びＷａｎｇ９ａによって概説されたとおりに行った。【００５３】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ。
ヒト膵類上皮癌細胞（ＰＡＮＣ１）をアッセイに用いた。２．５×１０５細胞／ｍｌをＩｗａｋｉ３５ｍｍガラスベースプレート上に播き、３７℃で４８時間インキュベートした。実験は、ｐＨ７．４、生理的ｐＨ、及び腫瘍内部で見出される最も低いｐＨであるｐＨ６．５で行った。細胞は、最初に１０ｍｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ）で染色し、次いで、室温でプレート当たり２００μｇ／ｍｌの各々のボロン酸と共に２０分間インキュベートし、最後に、プレート当たり１００μｇ／ｍｌのＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ標識Ｓａｍｂｕｃｕｓ  Ｎｉｇｒａ（ＳＮＡ，ＥＢＬ）レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて２５分間、４℃で染色した。対照のプレートは、Ｈｏｅｃｈｓｔ及びＳＮＡ−レクチンのみで染色した。【００５４】
最後に、共焦点レーザー走査顕微鏡及びｉｍａｇｅＪソフトウェアを用いて蛍光強度を測定し、計算した。５−ボロノピコリン酸のローダミンコンジュゲートを用いた特異性試験は以下のように行った。【００５５】
２．０×１０４細胞／２００μｌを、Ｃｈａｍｂｅｒｅｄ  ＃１．０  Ｂｒｏｓｉｌｉｃａｔｅ  Ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に播いた。細胞を４８時間インキュベートし、次いでＨｏｅｃｈｓｔで染色した。洗浄後、培地をＰＢＳ（ｐＨ６．５及びｐＨ７．４；１９０μｌ）に置き換えた。次いで、細胞を、ＤＭＳＯ（２００μｇ／ｍｌ）に溶解した１０μｌのローダミンコンジュゲートと共に、４℃で１５分間インキュベートした。細胞を再びＰＢＳ（ｐＨ６．５及びｐＨ７．４）で洗浄した後、画像化した。【００５６】
陰性対照試験は、細胞を１μｌのシアリダーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のノイラミニダーゼ（１Ｕ／５０μｌ  ２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．５）；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）と共に３７℃で４０分間インキュベートすることによって実施した。次いで、細胞を洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔで染色し、最後にローダミンコンジュゲートと共にインキュベートし、上記と同様に分析した。【００５７】
グリカンアレイ。
グリカンアレイ実験は、住友ベークライト（株）の製品ＢＳ−Ｘ１７３３Ｚ（タイプＩ：２８グリカン）を用いて、商業的分析サービスを利用した。各ウェルに固定化された２８の異なるグリカンの構造の詳細を、図３８に示す。ビオチン化Ｓａｍｂｕｃｕｓ  Ｎｉｇｒａ（ＳＮＡ，ＥＢＬ）レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）及びビオチン化Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＷＧＡ）レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を、市販の標識キット（ＨｉＬｙｔｅ  ＦｌｕｏｒＴＭ５５５Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．））を用いて、Ｃｙ３標識ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とコンジュゲートさせた。【００５８】
特異性試験については、１μｇ／ｍＬのＣｙ３標識ＳＮＡレクチン及び１００μｇ／ｍＬのＣｙ３標識ＷＧＡレクチンをアレイに適用し、比較した（図３９）。競合アッセイについては、最初に、ウェルを、４ｍＭ  ５−ボロノピコリン酸を含む及び含まない７０μＬ  ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４又は６．５のいずれかに調整）を用い、室温で２０分間、平衡化した。その後、各ウェルの半分（３５μＬ）容量を、１００ｎｇ／ｍＬのＣｙ３標識ＳＮＡを含む同容量溶液で交換した。反応物を室温で９０分間放置し、エバネッセント光スキャナー装置（ＢＩＯ−ＲＥＸ  ＳＣＡＮ２００（Ｒｅｘｘａｍ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いて光学分析を行った（図４０）。【００５９】
２．結果と考察
ボロン酸は、シアル酸（ＳＡ３，４，７を含む糖６と可逆的に共有結合の相互作用を示す化合物である。本発明者は、複素環式ボロン酸誘導体が、弱酸性ｐＨ条件下でＳＡと高度に特異的な相互作用を示し、腫瘍部位に関与することを見出した。
た。この相互作用はｐＨ依存性であり、ｐＨが低下すると、ＳＡと誘導体との間の相互作用が有意に増加し、従来知られている結合定数よりも数桁高い結合定数を生じた。【００６０】
最近、ピリジン構造に基づくボロン酸の複素環式クラスについて、いくつかの報告がある８。これらの化合物の多くを、Ｂ１１  ＮＭＲによってそれらの糖結合活性についてスクリーニングする一方で、興味深く、そして本発明者の知る限りではこれまで記載されていなかったが、ｐＨ依存性のＳＡとの相互作用が認められた。ｐＨが低下するにつれて、ＳＡと本発明の誘導体との間の相互作用は有意に増加し、以前に報告されたものより数桁高い結合定数を生じた（図７）。【００６１】
ＳＡとメタアミド置換フェニルボロン酸（図７Ｆ）との間の結合定数は上述の治療及び診断応用３，４ｄ−ｇのための効率的なＳＡバインダーであることが証明されたゴールドスタンダード構造であり、最大で４０Ｍ−１であったのに対し７ｃ、図７に示された誘導体のいくつかは、これまでに報告された最高レベルの１０００Ｍ−１をはるかに超える値を示している。また、４−（メチルスルホニル）ベンゼンボロン酸（図７Ｇ）は、文献にて報告されている全ての構造の中で、従来、最も強いＳＡ相互作用を有する構造として知られていたものである（図２７も参照）。しかし、４−（メチルスルホニル）ベンゼンボロン酸による相互作用の程度は、本発明の複素環誘導体について観察されたもの（図７Ａ−Ｄ）よりもはるかに低く、さらには、本発明の複素環式誘導体のように酸性化依存性のＳＡ相互作用の増大（図７Ａ−Ｄ）は認められなかった。【００６２】
ＳＡとの相互作用の前例のないレベルを示すこの特別なクラスの誘導体の同定に続いて、本発明者らはさらに、これらの化合物が、生物学的サンプルにおいて一般的に見出される他のグリカンに存在する糖と、一連のｐＨ条件下でどのように相互作用するかを調べた（図８）。
これらの糖との相互作用は、他の十分に立証されたタイプの（フェニル）ボロン酸について観察されたものに典型的であることが明らかになった。すなわち、本発明の誘導体は、従来十分に検証されているフェニルボロン酸に観察された相互作用と同じであり、シアル酸以外の糖との結合においては、そのｐＨ依存性が「右上がり」となることが分かった。また、ボロン酸−糖の相互作用は平衡反応であるが、ＰＨ条件によりその平衡がどちらか（フリー又はコンプレックス）に偏っていた７ｆ。【００６３】
結果として、本発明の複素環式ボロン酸は、酸性条件下でＳＡに対して高度に選択的であり、生物学的サンプル中に存在する他の一般的な糖からの干渉はほとんど受けないと考えられる。しかし、通常の生理学的条件下では、ＳＡの結合は大幅に減少した。これらの相互作用のいくつかを、アリザリンレッドＳ（ＡＲＳ）９を用いる色素置換検定によっても評価した。その結果、ボロンＮＭＲによる評価及びＡＲＳアッセイの２つの独立した方法の間のｐＨ依存性の量及び傾向の両方において良好な一致を確認した（図３２−３７）。【００６４】
この独特の挙動を考慮して、本発明の誘導体をコンジュゲート（複合体化）する方法を検討した結果、本発明の誘導体は医学的適用（例えば、ポリマーコンジュゲーションを介して）に対するそれらの適合性について評価できるものであり、そしてまた、観察された相互作用のメカニズムを解明し得るものである。【００６５】
調べたすべての化合物の中で、最も成功した構造は５−ボロノピコリン酸（図７Ｃ）とそのプロピルアミン共役（（６−プロピルカルバモイル）ピリジン−３−ボロン酸（図７Ｄ）であることがわかった。コンジュゲートは親化合物の高結合定数を維持し、ｐＨ６．５でほとんど変化しないままであることが見出され（図７Ｃ及びＤ）、これは、上記のような腫瘍微小環境に関連する。したがって、本発明の誘導体の構造は、薬物及びポリマーとコンジュゲートさせるための合理的な候補となるものであり、さらなる化学的改良を行う余地を提供する。さらに、本発明の誘導体に関する一連の研究により、相互作用が起こるメカニズムを明らかにすることができた。【００６６】
従って、Ｂ１１  ＮＭＲによって確認されるように、観察される相互作用は常にボロン酸（又はボロン酸）−エステル形成を含み、各ボロン酸ｐＫａとＳＡ結合強度との間には緩い相関関係がある（表１）。しかしながら、以前に得られた結果は、化合物中の窒素種が複合体の安定化において重要な役割を果たさなければならないことを示唆している７ｃ，ｆ，１０。実際、Ｎ−置換３−ピリジルボロン酸は、この置換がボロン酸塩自身に無視できるほどの電子的影響、すなわちｐＫａの変化を引き起こさないにもかかわらず８ａ、その親構造（図７Ａ）と比較してＳＡ結合強度の劇的な低下（図７Ｅ）を示した。【００６７】
本発明者らは、これらのボロン酸塩−ＳＡ相互作用は、塩濃度が６００ｍＭに達するほど過剰に増加しても妨害されないことを見出した（図２４及び２５）。したがって、結合の安定性の増大は芳香族窒素とＳＡカルボキシル基との間の水素結合（静電相互作用ではない）によるものであると仮定し、２つの基の間の立体的に妨害された接近性は、上記の知見を説明することができる（図７Ｅ）。また、５−ボロノピコリン酸と、転移性腫瘍細胞に関与する誘導体であるＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）のメチルのエステル的誘導体との相互作用を調べた（図２８及び２９）２ｄ−ｆ。【００６８】
ＳＡカルボキシル基をもはや利用できない５−ボロノピコリン酸の場合、結合安定性は劇的に減少したが、構造中に依然として利用可能なカルボキシル基を有するＮｅｕ５Ｇｃの場合では、依然としてＮｅｕ５Ａｃで観察されたものに匹敵するボロネート結合安定性が明らかになった。さらに、本発明者らはＳＡのオリゴマー（三量体及び五量体）にわたって相互作用が優勢であることを確認し、興味深いことに、結合強度はＳＡ繰り返し単位の数とは無関係であり（図３０及び３１）、立体的に制限されないカルボキシル基を有する末端ＳＡが主に健全な相互作用に関与することを示唆した。【００６９】
図７及び８で得られた異常なｐＨ依存性ＳＡ結合プロフィールについては疑問が残る。各ボロン酸ｐＫａより明らかに低い酸性ｐＨ値におけるＳＡ結合安定性の増加はボロン酸のいくらかの画分（ボロン酸塩とは対照的に）も複合体に関与し、これは観察されたＢ１１  ＮＭＲ化学シフト（図１７−２７）及び以前の報告と一致すると思われる。【００７０】
これらのプロフィールは電荷平衡機構（「電荷規則」）、すなわち、錯体と遊離状態種との間の電荷の合計（「平衡」）を、系中の所与のｐＨについての各々の存在量の決定因子として考慮する理論に関して解釈され得る１１。実際、ボロン酸（ボロン酸とは対照的に）が錯体に関与する場合、この理論は図７及び８の場合のように、ボロン酸ｐＫａより低いｐＨでの錯体の最大集団の発生を予測する。【００７１】
ボロン酸（又はボロン酸塩）とＳＡとの間の立体因子も、それらの多部位結合性のために、この関係を完全に説明するように考慮されなければならない。しかし、包括的なメカニズムは依然として解明されていない。我々の知見を医学的応用のための有意性に転換するために、次に、我々は、単糖レベル認識を超えて、５−ボロノピコリン酸がシアリル化複合糖質と結合する能力を評価した。この目的のために、ヒト膵臓類上皮癌細胞（ＰＡＮＣ１）をＳＡに富む腫瘍標的のモデルとして利用した（図９）。【００７２】
５−ボロノピコリン酸のＳＡ結合能を、ＳＡ特異的サンブカス・ニグラ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  Ｎｉｇｒａ）（ＳＮＡ）レクチンと競合して、多くの報告において有効なＳＡ結合剤として以前に検証された３−プロピオンアミドフェニルボロン酸３，４ｄ−ｈの結合能と比較した（図９、３８−４０）。【００７３】
ボロン酸の非存在下では、細胞表面はレクチンで十分に染色される（図９Ａ、ＰＢＳ、赤色）。しかし、細胞がこれらの誘導体と共に予備インキュベートされる場合、恐らくそれらのＳＡブロッキング作用のために、ｐＨ７．４での２つの誘導体間でより小さくかつ類似した程度まで（図９Ｂ）、及びｐＨ６．５、すなわち腫瘍内ｐＨで５−ボロノピコリン酸で処理される場合、より大きな程度まで、着色は劇的に弱められる（図９Ｃ）。弱酸性条件下での５−ボロノピコリン酸による増強されたＳＡ遮断効果は、図７及び８に示される結果と一致する。【００７４】
この競合的ブロッキングアッセイは種々の分子的に規定されたグリカン構造（図４０）をインストールしたグリカンアレイフォーマットでさえも再現可能であり、さらに、ボロン酸塩化合物が生物学的に関連するシアリル化グリココンジュゲートと結合できることを、単糖類濃度の識別を超えて証明した。より直接的なエビデンスのために、５−ボロノピコリン酸のローダミン修飾版も調製し、レクチンを使用せずに細胞染色に対するその能力を試験した。【００７５】
図１０から明らかなように、シアリダーゼで処置した場合、著しくｐＨ依存性で劇的なサイレンシング挙動が達成され、ＳＡ特異性についての直接的な証拠が提供される。総合すると、これらの知見は、全ての関連する腫瘍標的化及び診断適用における改善された結果を得るために有用である。【００７６】
注目すべきことに、本発明者らは以前に、腫瘍特異的化学療法を得るための経路として、抗癌剤を封入する高分子ミセルをインストールした３−プロピオンアミドフェニルボロン酸（ＳＡに対するリガンドとして）を報告した４ｅ。メラノーマの同所性及び肺転移モデルの両方の成長速度を（非リガンド対照と比較して）効果的に低下させることを達成する一方で、本発明者らはまた、静脈内注射されたミセルが対照（リガンドなし）系と顕著な類似性を伴って、長期の血液循環を保持し、これは、ミセルと、血管系における赤血球及び内皮細胞との相互作用の低下を示すことも観察した。【００７７】
相互作用の減少は血漿中のグルコースによる干渉（〜ｐＨ７．４）に起因し、正常なグルコースレベルは〜５ｍＭであり、一方、赤血球中のＳＡの濃度は〜０．２μＭ（２０ｎｍｏｌ／１０９細胞）であった。腫瘍に入ると、グルコース濃度は、拡散及び癌細胞における乳酸への持続的な代謝のために減少する。さらに、この嫌気的解糖の代謝産物は腫瘍内腔の酸性化（約ｐＨ６．５）を引き起こし５、グルコースの結合定数を減少させ、逆にＳＡの結合定数を増加させる。【００７８】
したがって、ボロネートと糖との間のこのような可逆的かつｐＨ依存的な結合の性質のために、血液循環中の他の競合糖（主にグルコース）は、ある種の適用については関心事ではないかもしれない。このことを念頭に置いて、複素環式のボロン酸のクラスで本明細書に明らかにされた糖結合のパターンは、興味深い意味合いを提供するはずである。【００７９】
結論
レクチンと比較して比較的「弱い」が可逆的な濃度依存性分子認識ボロン酸ケミストリーは、バイオアプリケーションツールの特殊な部類である。このような動的な相互作用モードは、連続的なモニタリング、及び生体分子の時間的、可逆的、及び振動的挙動が関心事である、環境に敏感で生体相互作用の応用などの他の困難な課題に対処することができる。本発明では、複素環式ボロン酸誘導体が以前に報告されたものよりも数桁高い結合定数で、ＳＡ特異的な相互作用を呈することを見出した。特筆すべきことに、これらの誘導体の結合強度及びＳＡ特異性の両者は、弱酸性ｐＨ条件下で、腫瘍性微小環境に密接に関連する範囲で強化される。この特性はまた、健康な部位における他のグリカンエピトープとの非特異的相互作用を予防するのに役立つはずである。本発明の誘導体、なかでも５−ボロノピコリン酸の使用は、十分に保存されたＳＡ結合能を有するさらなる化学結合に適していることが判明した。【００８０】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは単糖レベルの認識を超えて、生物学的に適切なシアリル化複合糖質と結合するその能力を実証し、ＳＡ特異性の確かな証拠を提供した。また、優れた水溶性がこれらの誘導体で一般に見出され、それは、さもなければ（例えば、フェニルボロン酸）しばしば、医療用途の範囲を制限する問題であることにも言及する価値がある７ａ，ｂ。【００８１】
まとめると、本発明において得られた知見は、腫瘍特異的化学療法及び診断を達成することを目的とした、現在進行中の多くのボロン酸化学法の魅力的な代替法を提供することが可能である。
［実施例２］【００８２】
１）Ａｚｉｄｅ−ＰＥＧ−ｂ−ｐＢＬＧの合成
Ａｚｉｄｅ−ＰＥＧ−ｂ−ｐＢＬＧは既報［７］に従い合成した。γ−ｂｅｎｚｙｌ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ−Ｎ−ｃａｒｂｏｘｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ重合（ＢＬＧ−ＮＣＡ重合）はＡｚｉｄｅ−ＰＥＧ−ＮＨ２を開始剤とし、乾燥  ＤＭＦ中で行った（スキーム１）。
スキーム１：
【化５】
2019004482.tif 000009
【００８３】
２）５−ＢＰＡ−ＰＥＧ−ｂ−ｐｏｌｙ（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）−Ａｃ（５−ＢＰＡ−ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｇｌｕ）−Ａｃ）の合成
Ｎ３−ＰＥＧ−ｂ−ｐＢＬＧ−Ａｃに対して１０当量の５−Ｂｏｒｏｎｏｐｉｃｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（５−ＢＰＡ）を１０当量のＤＭＴ−ＭＭによってＤＭＦ中で活性化し、５当量のＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２を加えてＴＥＡとともに終夜撹拌することで５−ＢＰＡ−ＰＥＧ−ＤＢＣＯを作製した（スキーム２）。反応溶液に１当量のＮ３−ＰＥＧ−ｂ−ｐＢＬＧ−Ａｃを添加して２４時間撹拌した。反応溶液をイオン交換水中で透析することによって精製し、凍結乾燥することで５−ＢＰＡ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＢＬＧ−Ａｃを得た。５−ＢＰＡ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＢＬＧ−Ａｃを０．５規定水酸化ナトリウム水溶液で撹拌することによってＢｚ基を脱保護し、透析後に凍結することで５−ＢＰＡ−ＰＥＧ−ｂ−ｐｏｌｙ（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）−Ａｃ（５−ＢＰＡ−ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｇｌｕ）−Ａｃ）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ測定によって反応の有意な進行を確認した（スキーム２、図４１）。【００８４】
スキーム２：
【化６】
2019004482.tif 000010
【００８５】
３）Ａｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−５−ＢＰＡの合成
Ａｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−Ａｍｉｎｅに対してそれぞれ２当量の５−Ｂｏｒｏｎｏｐｉｃｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（５−ＢＰＡ）とＤＭＴ−ＭＭをＤＭＦ中でＴＥＡとともに終夜撹拌した（スキーム３）。反応溶液をイオン交換水中にて透析し、凍結乾燥することでＡｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−５−ＢＰＡを得た。（ＮＭＲ：図４２）【００８６】
スキーム３：
【化７】
2019004482.tif 000011
【００８７】
４）Ａｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−５−ＢＰＡの結合定数の測定
５−ＢＰＡとシアル酸間の相互作用強度をアリザリンレッド法にて算出した［５，６］。
実験１）アリザリンレッド（ＡＲＳ）水溶液９（μＭ）を、５−ＢＰＡ水溶液（２ｍＭ）をそれぞれ調製した（図４３）。【００８８】
５）５−ＢＰＡ−ｉｎｓｔａｌｌｅｄ  Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ（ＣＤＤＰ）−ｌｏａｄｅｄ  ｍｉｃｅｌｌｅｓの作製
ＣＤＤＰ封入ミセルを既報［７］に従って作製した（図４４）。ＣＤＤＰ（５．５５６ｍＭ）を超純水に溶解して５０ｏＣで撹拌し、０．２２ｕｍ経のフィルターでろ過精製を行った。ここに５−ＢＰＡ−ＰＥＧ−Ａｚｉｄｅ−ＰＥＧ−ｂ−ｐＧｌｕ（ｆｉｎａｌ  Ｇｌｕ  ｃｏｎｃ．＝５ｍＭ）を添加し、３７ｏＣで１２０時間撹拌した。反応溶液を分子量分画１０００００の透析膜を用いて透析することで、ＣＤＤＰ封入ミセル（５−ＢＰＡ−ＣＤＤＰ／ｍ）溶液を調整した（図４４）。【００８９】
６）Ｍｉｃｅｌｌｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
作製した５−ＢＰＡ−ＣＤＤＰ／ｍの粒径分布をＤＬＳ測定装置にて測定した（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）ｅｑｕｉｐｐｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｈｅ−Ｎｅ  ｉｏｎｌａｓｅｒ（ａｔ  ｗａｖｅ  ｌｅｎｇｔｈ  ５３２ｎｍ）ｗｉｔｈ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｇｌｅ  ｅｑｕａｌ  ｔｏ  ９０°ａｔ  ３７℃）。ＣＤＤＰ封入率についてはｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  ｃｏｕｐｌｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＩＣＰ−ＭＳ：［Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）；ＲＦ  ｐｏｗｅｒ：１２００  Ｗ；ｐｅｒｉｐｕｍｐ：０．１６  ｒｐｓ；ｍｏｎｔｏｒｉｎｇ  ｍａｓｓ：ｍ／ｚ  １９５（Ｐｔ）；ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｖａｌ；０．１ｓｅｃ；ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｐｅｒｉｏｄ：０．３ｓｅｃ］）にて評価した。【００９０】
７）Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ
Ｂ１６Ｆ１０を８Ｃｈａｍｂｅｒｅｄ  ＃１．０  Ｂｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅ  Ｃｏｖｅｒ  ｇｌａｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌａｂ  Ｔｅｋ）上に２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種した（培地：ＤＭＥＭ  ｍｅｄｉａ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １０％  ＦＢＳ  ａｎｄ  １％  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）。高分子ミセルの細胞への取り込み挙動について、Ａｌｅｘａ６４７修飾ＭｅＯミセル、ＰＢＡミセル、５−ＢＰＡミセルを調製し、１時間後と６時間後の細胞中における蛍光強度を定量することによって評価した。また、比較対象群として、細胞表面のシアル酸を除去するために１μＬのシアリターゼ添加群でも同様に試験を行った。評価の際、Ｈｏｅｃｈｓｔを用いて核染色を行い、その後共焦点顕微鏡にて評価を行った（図４５−４８）。【００９１】
８）シアル酸過剰発現Ｂ１６Ｆ１０細胞株に対する蛍光標識ミセルの取り込み挙動は共焦点顕微鏡を用いて評価した。蛍光標識ミセルの作製手法はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒをＭｅＯ−ＰＥＧ−ｂ−ｐＧｌｕ．のω−アミノ酸に対して付加した。この蛍光標識ポリマーを種々のミセル調製の際に任意の割合で混ぜることにより、蛍光ミセルを作製した。【００９２】
９）結果
本発明のボロン酸誘導体をシアル酸リガンドとして搭載した高分子ミセルを調製し、そのシアル酸特異的な細胞取り込み能の向上を実ｉｎ  ｖｉｔｒｏで証明した。
［実施例３］【００９３】
１）ボロンコンジュゲート８−ａｒｍ−ＰＥＧの合成
８−ａｒｍ−ＰＥＧは以下のスキームに従って合成した。
【化８】
2019004482.tif 000012
【００９４】
合成されたボロンコンジュゲート８−ａｒｍ−ＰＥＧのＮＭＲスペクトルを図４９に示す。【００９５】
２）ボロンコンジュゲート８−ａｒｍ−ＰＥＧ
マウス結腸がん細胞株Ｃ２６に対するＣｙ５標識を行った５−ＢＰＡ、及びＰＢＡ修飾８−ａｒｍ−ＰＥＧの取り込み挙動を評価した。８−ａｒｍ−ＰＥＧのアミンに対して１０当量のＮＨＳ−ＯＨとＥＤＣ、ＴＥＡをＤＭＦ中で室温、３５時間反応させた。未反応の蛍光試薬を透析にて除去した後、凍結乾燥することで個体を得た。得られた高分子と１０当量のＤＭＴ−ＭＭ、５−Ｂｏｒｏｎｏｐｉｃｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ、３−ｃａｒｂｏｘｙ  ｐｈｅｎｙｌｂｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄをＤＭＦ中で一晩反応させ、透析、凍結乾燥によってＢｏｒｏｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ８−ａｒｍ−ＰＥＧを得た。【００９６】
３）ボロンコンジュゲート８−ａｒｍ−ＰＥＧのＩｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞内取込み
Ｃ２６を８Ｃｈａｍｂｅｒｅｄ  ＃１．０  Ｂｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅ  Ｃｏｖｅｒ  ｇｌａｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌａｂ  Ｔｅｋ）上に２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種した（培地：ＤＭＥＭ  ｍｅｄｉａ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １０％  ＦＢＳ  ａｎｄ  １％  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）。培地を低グルコース培地に変え、種々のｐＨ（ｐＨ＝６．５及び７．４）に調節した条件でｂｏｒｏｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ８−ａｒｍ−ＰＥＧを添加し、１時間後に共焦点顕微鏡にて像観察を行った。【００９７】
４）ボロンコンジュゲート８−ａｒｍ−ＰＥＧの腫瘍内蓄積及びバイオ分布
皮下Ｃ−２６腫瘍モデルを有するＢａｌｂ／ｃマウスを調製した。次に、マウスを２つの群（群ｎ＝４）に分け、Ｃｙ５修飾５−ＢＰＡ及びＰＢＡ修飾８−ａｒｍ−ＰＥＧをマウスに投与した。２４時間後、インビボイメージングシステム（励起光：６４０ｎｍ；放射光：７２０ｎｍ；曝露時間：３秒）によって生体内での腫瘍を画像化した。次に、マウスの尾部より血液を回収することで各種ミセルの血液滞留時間を評価した。【００９８】
５）結果を図５０−５３に示す。
本発明のボロン酸誘導体をシアル酸リガンドとして搭載した８−ａｒｍ−ＰＥＧシステムにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのシアル酸特異的な細胞取り込み能の向上、ならびに、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるがん集積性の向上を証明した。【００９９】
参考文献
１  （ａ）Ａ．Ｖａｒｋｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｂ．Ｌｏｗｅ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃａｎｓ，ｉｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（ＮＹ），２００９；
（ｂ）Ａ．Ｖａｒｋｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２００８，１４（８），３５１；
（ｃ）Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｚｏｏｌ．，２００４，１０７（１），４９；
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（ｇ）Ｊ．Ｅ．Ｓｃｏｔｔ，Ｃｏｎｎ’ｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｓ．Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｙｅｓ，Ｓｔａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊ．Ａｎａｔ．，２００３，２０３（４），４３３．
２  （ａ）Ｓ．Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９６，５６，５３０９；
（ｂ）Ｄ．Ｈ．Ｄｕｂｅ  ａｎｄ  Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２００６，４，４７７；
（ｃ）Ｙ．Ｘｕ，Ａ．Ｓｅｔｔｅ，Ｊ．Ｓｉｄｎｅｙ，Ｓ．Ｊ．Ｇｅｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ａ．Ｆｒａｎｃｏ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００５，８３，４４０；
（ｄ）Ｌ．Ｄａｎｉｅｌ，Ｊ．Ｔｒｏｕｉｌｌａｓ，Ｗ．Ｒｅｎａｕｄ，Ｐ．Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ，Ｊ．Ｇｏｕｖｅｒｎｅｔ，Ｇ．Ｒｏｕｇｏｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｆｉｇａｒｅｌｌａ−Ｂｒａｎｇｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０００，６０，８０；
（ｅ）Ｌ．Ｄａｎｉｅｌ，Ｐ．Ｄｕｒｂｅｃ，Ｅ．Ｇａｕｔｈｅｒｏｔ．Ｅ．Ｒｏｕｖｉｅｒ，Ｇ．Ｒｏｕｇｏｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｆｉｇａｒｅｌｌａ−Ｂｒａｎｇｅｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１，２０，９９７；
（ｆ）Ｓ．Ｍ．Ｅｌｋａｓｈｅｆ，Ｓ．Ｊ．Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｍ．Ｓａｄｉｑ，Ｈ．Ａ．Ｂａｓｈｅｅｒ，Ｇ．Ｒ．Ｍｏｒａｉｓ，Ｐ．Ｍ．Ｌｏａｄｍａｎ，Ｋ．Ｐｏｒｓ  ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｆａｌｃｏｎｅｒ，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３３０２６．
３  （ａ）Ａ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｎ．Ｓａｔｏ，Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｍｉｙａｈａｒａ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００９，１３１，１２０２２；
（ｂ）Ａ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｈ．Ｃａｂｒａｌ，Ｎ．Ｓａｔｏ，Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｍｉｙａｈａｒａ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１０，４９，５４９４．
４  （ａ）Ｇ．Ｌｅｍｉｅｕｘ，Ｋ．Ｊ．Ｙａｒｅｍａ，Ｃ．Ｌ．Ｊａｃｏｂｓ  ａｎｄ  Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９９，１２１，４２７８；
（ｂ）Ｌ．Ｋ．Ｍｈａｌ，Ｎ．Ｗ．Ｃｈａｒｔｅｒ，Ｋ．Ａｎｇａｔａ，Ｍ．Ｆｕｋｕｄａ，Ｄ．Ｅ．Ｋｏｓｈｌａｎｄ  Ｊｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９４，３８０；
（ｃ）Ｊ．Ｆｒｕｌｌａｎｏ，Ｊ．Ｓ．Ｒｏｈｏｖｅｃ，Ｔ．Ａｉｍｅ，Ｔ．Ｍａｓｃｈｍｅｙｅｒ，Ｍ．Ｉ．Ｐｒａｔａ，Ｊ．Ｊ．Ｐ．Ｄ．Ｌｉｍａ，Ｃ．Ｆ．Ｇ．Ｃ．Ｇｅｒａｌｄｅｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｃｈｅｍ．−Ｅｕｒ．Ｊ．，２００４，１０，５２０５；
（ｄ）Ｋ．Ｄｊａｎａｓｈｖｉｌｉ，Ｇ．Ａ．Ｋｏｎｉｎｇ，Ａ．Ｊ．Ｇ．Ｍ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ，Ｈ．Ｔ．Ｗｏｌｔｅｒｂｅｅｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ｍｅｄｉａ  Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ，２００７，２，３５；
（ｅ）Ｓ．Ｄｅｓｈａｙｅｓ，Ｈ．Ｃａｂｒａｌ，Ｔ．Ｉｓｈｉｉ，Ｙ．Ｍｉｕｒａ，Ｓ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ａ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，
Ｙ．Ｍｉｙａｈａｒａ，Ｎ．Ｎｉｓｈｉｙａｍａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１３，１３５，１５５０１；
（ｆ）Ａ．Ｌｉｕ，Ｓ．Ｐｅｎｇ，Ｊ．Ｃ．Ｓｏｏ，Ｍ．Ｋｕａｎｇ，Ｐ．Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｈ．Ｄｕａｎ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，８３，１１２４；
（ｇ）Ｓ．Ｇ．Ｃｒｉｃｈ，Ｄ．Ａｌｂｅｒｔｉ，Ｉ．Ｓｚａｂｏ，Ｓ．Ａｉｍｅ  ａｎｄ  Ｋ．Ｄｊａｎａｓｈｖｉｌｉ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１３，５２，１１６１；
（ｈ）Ａ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｍｉｙａｈａｒａ，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，２０１４，４６，４８３．
５  （ａ）Ｖ．Ｅｓｔｒｅｌｌａ，Ｔ．Ａ．Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｌｌｏｙｄ，Ｊ．Ｗｏｊｔｋｏｗｉａｋ，Ｈ．Ｈ．Ｃｏｒｎｎｅｌｌ，Ａ．Ｉｂｒａｈｉｍ−Ｈａｓｈｉｍ，Ｋ．Ｂａｉｌｅｙ，Ｙ．Ｂａｌａｇｕｒｕｎａｔｈａｎ，Ｊ．Ｍ．Ｒｏｔｈｂｅｒｇ，Ｂ．Ｆ．Ｓｌｏａｎｅ，Ｊ．Ｊｏｈｓｏｎ，Ｒ．Ａ．Ｇａｔｅｎｂｙ  ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０１３，７３（５），１５２４；
（ｂ）Ｙ．Ｋａｔｏ，Ｓ．Ｏｚａｗａ，Ｃ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｍａｅｈａｔａ，Ａ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．Ｍａｅｄａ  ａｎｄ  Ｙ．Ｂａｂａ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔ．，２０１３，１３，８９；
（ｃ）Ｒ．Ａ．Ｇａｔｅｎｂｙ  ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，２００４，４（１１），８９１．
６  （ａ）Ｊ．Ｐ．Ｌｏｒａｎｄ  ａｎｄ  Ｊ．Ｏ．Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９５９，２４，７６９；
（ｂ）Ａ．Ｂ．Ｆｏｓｔｅｒ，Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．，１９５７，１２，８１；
（ｃ）Ｊ．Ｂｏｅｓｅｋｅｎ，Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．，１９４９，４，１８９；
（ｄ）Ｓ．Ａｒｏｎｏｆｆ，Ｔ．Ｃ．Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｃｈｅｖｅｌｄａｙｏｆｆ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１９７５，４０，２９９；
（ｅ）Ｔ．Ｄ．Ｊａｍｅｓ，Ｋ．Ｒ．Ａ．Ｓ．Ｓａｎｄａｎａｙａｋｅ  ａｎｄ  Ｓ．Ｓｈｉｎｋａｉ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．，１９９６，３５（１７），１９１０；
（ｆ）Ｒ．Ｎｉｓｈｉｙａｂｕ，Ｙ．Ｋｕｂｏ，Ｔ．Ｄ．Ｊａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓ．Ｆｏｓｓｅｙ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１１，４７（４），１１０６；
（ｇ）Ｃ．Ｌｕ，Ｈ．Ｌｉ，Ｈ．Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｚ．Ｌｉｕ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１３，８５（４），２３６１．
７  （ａ）Ｍ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｍ．Ｙａｍａｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓ．Ｓｈｉｎｋａｉ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９７，１７３１；
（ｂ）Ｍ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｓｈｉｎｋａｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３１２５；
（ｃ）Ｈ．Ｏｔｓｕｋａ，Ｅ．Ｕｃｈｉｍｕｒａ，Ｈ．Ｋｏｓｈｉｎｏ，Ｔ．Ｏｋａｎｏ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００３，１２５，３４９３；
（ｄ）Ｋ．Ｄｊａｎａｓｈｖｉｌｉ，Ｌ．Ｆｒｕｌｌａｎｏ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｃｈｅｍ．−Ｅｕｒ．Ｊ．，２００５，１１，４０１０；
（ｅ）Ｄ．Ｇ．Ｈａｌｌ，Ｂｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄｓ：  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２ｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｒｅｖ  ｅｄｎ，２０１１；
（ｆ）Ｊ．Ａ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｃｏｏｒｄ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，２０１４，２６８，１；
（ｇ）Ｅ．Ｕｃｈｉｍｕｒａ，Ｈ．Ｏｔｓｕｋａ，Ｔ．Ｏｋａｎｏ，Ｙ．Ｓａｋｕｒａｉ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００１，７２，３０７．
８  （ａ）Ｓ．Ｉｗａｔｓｕｋｉ，Ｙ．Ｋａｎａｍｉｔｓｕ，Ｈ．Ｏｈａｒａ，Ｅ．Ｗａｔａｎａｂｅ  ａｎｄ  Ｋ．Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１２，２５（９），７６０；
（ｂ）Ｙ．Ｊ．Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｂ．Ｊｉａｎｇ，Ｊ．Ｓ．Ｆｏｓｓｅｙ，Ｔ．Ｄ．Ｊａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｆ．Ｍａｒｋｅｎ，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，２０（３８），８３０５；
（ｃ）Ｍ．Ｓａｎｊｏｈ，Ｄ．Ｉｉｚｕｋａ，Ａ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｙ．Ｍｉｙａｈａｒａ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，２０１５，１７（３），５８８．
９  （ａ）Ｇ．Ｓｐｒｉｎｇｓｔｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂ．Ｈ．Ｗａｎｇ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００１，１６０８；
（ｂ）Ｇ．Ｓｐｒｉｎｇｓｔｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂ．Ｈ．Ｗａｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００２，５８（２６），５２９１．
１０  Ｍ．Ｒｅｇｕｅｉｒｏ−Ｆｉｇｕｅｒｏａ，Ｋ．Ｄｊａｎａｓｈｖｉｌｉ，Ｄ．Ｅｓｔｅｂａｎ−Ｇｏｍｅｚ，Ｔ．Ｃｈａｕｖｉｎ，Ｅ．Ｔｏｔｈ，Ａ．ｄｅ  Ｂｌａｓ，Ｔ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｂｌａｓ  ａｎｄ  Ｃ．Ｐｌａｔａｓ−Ｉｇｌｅｓｌａｓ，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，４９（９），４２１２．
１１  （ａ）Ｍ．ｖａｎ  Ｄｕｉｎ，Ｊ．Ａ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ａ．Ｐ．Ｇ．Ｋｉｅｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｈ．ｖａｎ  Ｂｅｋｋｕｍ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９８４，４０，２９０１；
（ｂ）Ｊ．Ｙａｎ，Ｇ．Ｓｐｒｉｎｇｓｔｅｅｎ，Ｓ．Ｄｅｅｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｗａｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００４，６０，１１２０５；
（ｃ）Ｍ．Ａ．Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ａｇｕｉｒｒｅ，Ｒ．Ｖｉｌｌａｍｉｌ−Ｒａｍｏｓ，Ｊ．Ａ．Ｇｕｅｒｒｅｒｏ−Ａｌｖａｒｅｚ  ａｎｄ  Ａ．Ｋ．Ｙａｔｓｉｍｉｒｓｋｙ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１３，７８，４６７４．
【図１】
2019004482.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2019004482.tif 000025
【図１１】
2019004482.tif 000026
【図１２−１】
2019004482.tif 000027
【図１２−２】
2019004482.tif 000028
【図１３−１】
2019004482.tif 000029
【図１３−２】
2019004482.tif 000030
【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2019004482.tif 000037
【図２０】
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【図２１】
2019004482.tif 000039
【図２２】
2019004482.tif 000040
【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
2019004482.tif 000046
【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９−１】
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【図４９−２】
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【図５０】
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【図５１】
2019004482.tif 000071
【図５２】
2019004482.tif 000072
【図５３−１】
2019004482.tif 000073
【図５３−２】
2019004482.tif 000074
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月4日(2019.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式Ｉ：
【化９】
2019004482.tif 000075
（式中、Ｒ１は炭素原子又は窒素原子を表し、Ｒ２は、単結合、又は−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−若しくは−ＮＨＣＯＯ−で示される基を表し、Ｒ３は、水素原子、置換基を有していてもよい鎖状又は分岐状の炭化水素基、又は置換基を有していてもよい複素環式官能基を表す。）
で示される、複素環式ボロン酸誘導体。
【請求項２】
Ｒ１が炭素原子であり、Ｒ２が−Ｃ（Ｏ）Ｏ−又は−ＣＯＮＨ−で示される基である、請求項１に記載の複素環式ボロン酸誘導体。
【請求項３】
Ｒ３が炭素数１〜６のアルキル基である請求項１又は２に記載の複素環式ボロン酸誘導体。
【請求項４】
次式（１１）又は（１２）で示される複素環式ボロン酸誘導体。
【化１０】
2019004482.tif 000076
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の複素環式ボロン酸誘導体に、機能性分子が結合された複合体。
【請求項６】
機能性分子が、薬物、ＣＴ造影剤、ＭＲＩ造影剤、ＰＥＴプローブ、蛍光色素プローブ、アミノ酸、核酸、コレステロール誘導体、脂質及びポリマーからなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
機能性分子がポリマーである請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
ポリマーに、さらに核酸が静電結合により結合された、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
複素環式ボロン酸誘導体が、機能性分子に一価で連結された、請求項５〜８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１０】
複素環式ボロン酸誘導体が、機能性分子に多価で連結された、請求項５〜８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１１】
ポリマーが直鎖状又は分岐状のポリエチレングリコールである請求項６〜１０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の複素環式ボロン酸誘導体を含む、細胞又は組織への機能性分子送達用担体。
【請求項１３】
請求項６〜１１のいずれか１項に記載の複合体を含む、細胞又は組織への機能性分子送達システム。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の複素環式ボロン酸誘導体に目的物質を結合又は担持させ、これを酸性条件下でシアル酸を発現する細胞に接触させることを特徴とする、前記目的物質を当該細胞に輸送、送達又は結合させる方法。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の複素環式ボロン酸誘導体に標識物質を結合又は担持させ、これを被験細胞と接触させた後に標識物質を検出することを特徴とする、シアル酸発現細胞の検出方法。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の複素環式ボロン酸誘導体に標識物質を結合又は担持させ、これを被検細胞と接触させた後に標識物質を検出し、当該被検細胞周囲のｐＨを検出することを特徴とする、被検細胞周囲のｐＨの検出方法。
【請求項１７】
次式（１２）で示される複素環式ボロン酸誘導体。
【化１１】
2019004482.tif 000077
【請求項１８】
次式（１１）又は１２で示される複素環式ボロン酸誘導体を含む、細胞又は組織への機能性分子送達用担体。
【化１２】
2019004482.tif 000078
【請求項１９】
次式（１１）又は（１２）で示される複素環式ボロン酸誘導体に機能性分子が結合された複合体を含む、細胞又は組織への機能性分子送達システム。
【化１３】
2019004482.tif 000079
【請求項２０】
複合体が次式（１３）で示されるものである、請求項１９に記載のシステム。
【化１４】
2019004482.tif 000080
【請求項２１】
次式（１３）で示される、複素環式ボロン酸誘導体とポリエチレングリコールとの複合体。
【化１５】
2019004482.tif 000081
【国際調査報告】
2019004482.tif 000082
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