(57)【要約】【課題】  微生物の脂肪酸合成経路の判別方法の提供。【解決手段】  脂肪酸合成関連酵素遺伝子に対する縮重プライマーを作製し、それを用いて、微生物より抽出したゲノム遺伝子において、脂肪酸合成関連遺伝子存在の有無を判別することを特徴とする、微生物の脂肪酸合成経路の判別方法。脂肪酸合成関連酵素遺伝子であるC20-エロンゲース遺伝子に対する縮重プライマーの配列がATHGARTWYTKBRTITTYGTICA（配列番号１）及びTARTRISWRTACATIADIAMRTG（配列番号２）であり、Δ4-デサチュラーゼ遺伝子に対する縮重プライマーの配列がGGNCAYCAYCMITAYACNAA（配列番号３）及びTCDATYTGRTGIBWIARNCC（配列番号４）である。微生物がラビリンチュラ類である。上記判別方法に用いるＰＣＲプライマーセット。脂肪酸を合成する微生物のスクリーニング方法として有用である。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸合成関連酵素遺伝子に対する縮重プライマーを作製し、それを用いて、微生物より抽出したゲノム遺伝子において、脂肪酸合成関連遺伝子存在の有無を判別することを特徴とする、微生物の脂肪酸合成経路の判別方法。
【請求項２】
脂肪酸合成関連酵素がC20-エロンゲース及び／又はΔ4-デサチュラーゼである、請求項１記載の判別方法。
【請求項３】
C20-エロンゲース遺伝子に対する縮重プライマーの配列が配列表の配列番号１及び２で示される塩基配列からなる、請求項１又は２記載の判別方法。
【請求項４】
Δ4-デサチュラーゼ遺伝子に対する縮重プライマーの配列が配列表の配列番号３及び４で示される塩基配列からなる、請求項１又は２記載の判別方法。
【請求項５】
微生物がラビリンチュラ綱（Labyrinthulea）に属する、請求項１乃至４のいずれかに記載の判別方法。
【請求項６】
配列表の配列番号１で示される塩基配列からなるプライマーと配列表の配列番号２で示される塩基配列からなるプライマー、及び／又は、配列表の配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーと配列表の配列番号４で示される塩基配列からなるプライマー、とを含むことを特徴とする、微生物の脂肪酸合成経路検出用プライマーセット。
【請求項７】
請求項６に記載のプライマーセットを構成する各プライマーをプローブとして含む微生物の脂肪酸合成経路検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の脂肪酸合成経路の判別方法及び検出用プライマーセットに関する。詳しくは、脂肪酸合成関連酵素遺伝子に対する縮重プライマーを作製し、それを用いて微生物における脂肪酸合成関連遺伝子存在の有無を判別することを特徴とする、微生物の脂肪酸合成経路の判別方法及びそれに用いるＰＣＲプライマー及びプローブセットに関する。本発明は、脂肪酸を合成する微生物のスクリーニング方法として有用である。
【背景技術】
【０００２】
多不飽和ω3-脂肪酸及びω6-脂肪酸は動物及びヒトの栄養において重要な成分である。エイコサペンタエン酸（ EPA）またはドコサヘキサエン酸（ DHA,）のような多不飽和長鎖ω3-脂肪酸は、小児の脳の発達、眼の機能、ホルモン及び他のシグナル物質の合成ならびに心血管障害、癌及び糖尿病の予防を含め健康の態様において種々の役割を果たすため（非特許文献１参照）、それらはヒトの栄養において重要な成分である。そのような理由で、多不飽和長鎖脂肪酸の製造が必要とされている。【０００３】
一方、ラビリンチュラ綱に分類される微生物は、長鎖不飽和脂肪酸を製造することが既に知られている。ヤブレツボカビ科に属する微生物においては、スキゾキトリウム属の微生物を用いた長鎖高度不飽和脂肪酸含有リン脂質の製造方法（特許文献１参照）、ドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム属の微生物（特許文献２参照）等が既に報告されている。これらの不飽和脂肪酸は、食物及び／または飼料の強化を可能にするために、これらの不飽和脂肪酸の、特に真核生物系における、簡便で経済的な製造方法が大いに必要とされている。微生物を利用して不飽和脂肪酸を効率よく生産するには、先ず、脂肪酸を産生する微生物を効率よく判別する手段を見出すことが重要である。【０００４】
従来、既知の遺伝子が他の生物にも存在するか否かなどを調べるとき、遺伝子の塩基配列よりもタンパク質のアミノ酸配列の方が保存(共通)されている場合があるので、既知のアミノ酸配列から縮重プライマーを作製してPCRにより判別を行う方法が知られている。例えば、合成ピレスロイド抵抗性ワタアブラムシの判別は、既知の縮重プライマーと、新たに設計した特異的プライマーを組み合わせて PCR を行い、制限酵素で消化することにより合成ピレスロイド抵抗性クローンを判別するとの報告がある。また、スルホニルウレア系除草剤及びイミダゾリノン系除草剤に対して抵抗性を示す植物体におけるPC系除草剤の有効性を判別するにあたり、縮重プライマーを利用すること（特許文献３参照）や、オオムギ渦遺伝子の存在の有無を判定する方法において重縮合プライマーを利用すること（特許文献４参照）などが開示されている。
ラビリンチュラ綱に分類される微生物に対しても、このような縮重プライマーを作製してPCRにより判別を行う方法が報告されており、例えばPUFA-PKS遺伝子の存在の有無を判定する方法（特許文献５参照）が開示されている。ラビリンチュラ綱に分類される微生物が有する長鎖高度不飽和脂肪酸の生合成経路として、２種類の経路が知られている。一つはパルミチン酸等の脂肪酸から出発し、デサチュラーゼによる不飽和化、エロンガーゼによる鎖長伸長を繰り返してEPAやDHAを生成する経路であり、もう一つはポリケチドシンターゼによって長鎖高度不飽和脂肪酸を生成する経路である。後者の生合成経路の遺伝子はPUFA-PKS遺伝子として知られており、特許文献５に開示された方法によりこの遺伝子の存在の有無を判定することが可能である。しかしながら、この方法では前者の生合成経路の遺伝子の存在の有無を判定することは出来ない。
この他のPUFA-PKS系を含む微生物の判定法として、微生物を培養し、その脂肪酸組成からPUFA-PKSを含むかどうかを判定する方法（特許文献６参照）が開示されている。この方法は微生物を好気性条件および無酸素/低酸素条件で培養し、その脂肪酸組成を比較して５つの質問に対し「はい」または「いいえ」で答えることにより判定する方法である。この方法では「はい」の数が多いほど、その微生物がPUFA-PKS遺伝子を含んでいる徴候が強くなるとしているが、PCRにより遺伝子を直接検出する方法と比較して、非常に手間がかかるわりに直接的な証拠が得られず、徴候が強いか弱いか程度の結論しかえられない。
また特許文献５および６の方法のいずれを用いても、PUFA-PKS経路に関する情報しか得ることができず、もう一つの重要な経路であるエロンガーゼおよびデサチュラーゼによってEPAやDHAを生成する経路の有無を判別することは出来ない。そのため、この経路を簡便かつ確実に検出し判別する方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−１４３４７９号公報
【特許文献２】特開２００５−１０２６８０号公報
【特許文献３】特開２００２−２８１９８３号公報
【特許文献４】特開２００４−２１５６０５号公報
【特許文献５】特表２００７−５３２１０５号公報
【特許文献６】特表２００５−５１０２０３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Poulos, A Lipids 30:1-14, 1995; Horrocks, LA及びYeo YK Pharmacol Res 40:211-225, 1999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、微生物の脂肪酸合成経路の存在の有無を判別する方法及びそれに用いるＰＣＲプライマー及びプローブセットを提供することを課題とする。より詳しくは、脂肪酸を合成する微生物を効率よくスクリーニングするのに用いることが出来る微生物の脂肪酸合成経路の存在有無の判別方法及びそれに用いるＰＣＲプライマー及びプローブセットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上述の状況に鑑みより効率的な、脂肪酸合成経路を有する微生物をスクリーニングする方法を鋭意研究した結果、簡便且つ迅速に判別できる方法及びそれに用いるＰＣＲプライマーセットを見出し、本発明を完成させるに至った。【０００９】
本発明は、以下の（１）〜（５）記載の技術的事項を要旨とするものである。
（１）  脂肪酸合成関連酵素遺伝子に対する縮重プライマーを作製し、それを用いて、微生物より抽出したゲノム遺伝子において、脂肪酸合成関連遺伝子存在の有無を判別することを特徴とする、微生物の脂肪酸合成経路の判別方法。
（２）  脂肪酸合成関連酵素がC20-エロンゲース及び／又はΔ4-デサチュラーゼである、前記（１）記載の判別方法。
（３）  C20-エロンゲース遺伝子に対する縮重プライマーの配列が配列１（ATHGARTWYTKBRTITTYGTICA）及び配列２（TARTRISWRTACATIADIAMRTG）である、前記（１）又は（２）記載の判別方法。
（４）  Δ4-デサチュラーゼ遺伝子に対する縮重プライマーの配列が配列３（GGNCAYCAYCMITAYACNAA）及び配列４（TCDATYTGRTGIBWIARNCC）である、前記（１）又は（２）記載の判別方法。
（５）  微生物がラビリンチュラ綱（Labyrinthulea）に属する、前記（１）乃至（４）記載の判別方法。
（６）配列表の配列番号１で示される塩基配列からなるプライマーと配列表の配列番号２で示される塩基配列からなるプライマー、及び／又は、配列表の配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーと配列表の配列番号４で示される塩基配列からなるプライマー、とを含むことを特徴とする、微生物の脂肪酸合成経路検出用プライマーセット。
（７）（６）に記載のプライマーセットを構成する各プライマーをプローブとして含む微生物の脂肪酸合成経路検出用キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、脂肪酸を合成する微生物をスクリーニングするに有用な方法が提供される。また、それに用いるＰＣＲプライマー及びプローブセットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１における、各種微生物のC20-エロンゲースのアミノ酸配列のアライメント解析の結果を示す。下線部はプライマー設計部位を表す。図１に示される各種微生物のC20-エロンゲースのアミノ酸配列を上から下に向かって順番に（表1の下から上に向かって順番に）配列番号５、６、７、８、９でそれぞれ表示した。
【図２】実施例１における、各種微生物のΔ4-デサチュラーゼのアミノ酸配列のアライメント解析の結果を示す。下線部はプライマー設計部位を表す。図２に示される各種微生物のΔ4-デサチュラーゼのアミノ酸配列を上から下に向かって順番に（表２の上から２番目、３番目、１番目、５番目、４番目の順番に）配列番号１０、１１、１２、１３、１４でそれぞれ表示した。
【図３】実施例２における、C20-エロンゲースの電気泳動の結果を示す。
【図４】実施例２における、Δ4-デサチュラーゼの電気泳動の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［脂肪酸合成関連酵素］
本発明は、縮重プライマーにより微生物の脂肪酸関連酵素遺伝子の存在の有無を判別するものであり、脂肪酸関連酵素は、微生物の種類、脂肪酸合成関連酵素の種類には特に限定されないが、例えば、C20-エロンゲースまたはΔ4-デサチュラーゼを代表的な酵素類としてあげることができる。これらの酵素はラビリンチュラ綱（Labyrinthulea）に属する微生物に存在することは知られている。デサチュラーゼは脂肪酸のカルボニル基から決まった位置に二重結合を作る酵素であり、エロンゲースは脂肪酸の伸長反応を司る酵素である。
【００１３】
［脂肪酸合成関連酵素遺伝子］
本発明は、脂肪酸合成関連酵素遺伝子に対する縮重プライマーを作製し、それを用いて脂肪酸合成関連遺伝子の有無を判別することを特徴とする、微生物の脂肪酸合成経路の判別方法に関する。脂肪酸合成関連酵素遺伝子は、当該合成に関連する酵素をコードする遺伝子であれば特に限定されないが、特に好ましくはC20-エロンゲース遺伝子及び／又はΔ4-デサチュラーゼ遺伝子を対象とする。
【００１４】
［縮重プライマー］
一般に、遺伝子の塩基配列よりもタンパク質のアミノ酸配列の方が保存(共通)されている場合があるので、既知のアミノ酸配列から縮重プライマーを作製してPCRにより該アミノ酸配列が存在するか否か判別を行う方法が知られている。すなわち、脂肪酸合成関連酵素のアミノ酸配列からこれらの酵素の遺伝子に対する縮重プライマーを作製し、縮重プライマーを判別するべき微生物から抽出したゲノムDNAとPCRにより反応させることにより、当該酵素遺伝子が抽出したゲノム遺伝子での存在有無を確認し、この結果をもって微生物の脂肪酸合成経路の有無を判別することができる。
【００１５】
［縮重プライマーの作製］
本発明で、脂肪酸合成関連酵素遺伝子に対する縮重プライマーを作製するには、例えば、Genbankに公開されている各種微生物のC20-エロンゲース（表1、図1）及びΔ4-デサチュラーゼ（表2、図2）の生物種間の各アミノ酸配列のアライメント解析を行い相同性を比較し、種間で保存されているアミノ酸配列情報に基づいて、20〜23の塩基配列からなる縮重プライマーを設計した。各酵素に対する縮重プライマーの配列を、表３に示す。表3中、上から配列番号１，２，３，４とする。縮重プライマーは、各種生物の当該酵素遺伝子の配列からデザインすれば良い。縮重プライマーは、脂肪酸合成関連酵素のアミノ酸配列において保存された領域に対応するものである。
【００１６】
［検出用プライマーセット、プローブセット］
上記のようにしてデザインされたプライマーを、対象微生物から抽出したゲノムDNAとPCR反応させることにより当該酵素遺伝子が増幅されるかどうかの結果をもって微生物の脂肪酸合成経路の有無を判別することができる。PCR反応は常法により行えば良いが、例えば熱変性を94℃、60秒行った後、熱変性94℃、30秒、アニーリング55℃、30秒、伸長反応72℃、30〜60秒を30サイクル行い、その後伸長反応を72℃、7分行えば良い。この結果、当該酵素遺伝子が増幅されるかどうかを電気泳動等にて確認することにより、微生物の脂肪酸合成経路の有無を判別することができる。
【００１７】
本発明の微生物の脂肪酸合成経路検出用プライマーセットの好ましい態様においては、配列表の配列番号１で示される塩基配列からなるプライマーと配列表の配列番号２で示される塩基配列からなるプライマー、及び／又は、配列表の配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーと配列表の配列番号４で示される塩基配列からなるプライマー、とを含むことを特徴とする。よって、ブローブセットの好ましい態様においては、上記のプライマーセットを構成する各プライマーをプローブとして含むことを特徴とする。そして、該ブローブを含む微生物の脂肪酸合成経路検出用キットを構成する。
【００１８】
なお、微生物としては脂肪酸合成を行うであろうと思われるものであれば特に限定されないが、特に好ましくはラビリンチュラ類を対象とする。ラビリンチュラ類としては、ラビリンチュラ属(Labyrinthula)、アルトルニア属(Althornia)、アプラノキトリウム属（Aplanochytrium）、イァポノキトリウム属(Japonochytrium)、ラビリンチュロイデス属（Labyrinthuloides）、シゾキトリウム属(Schizochytrium)、ヤブレツボカビ属(Thraustochytrium)、またはウルケニア属(Ulkenia)、アウランティオキトリウム属(Aurantiochytrium)が挙げられる。
【００１９】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
プライマーの設計
Genbankに公開されている各種微生物のC20-エロンゲース（表1、図1）及びΔ4-デサチュラーゼ（表2、図2）の生物種間の各アミノ酸配列のアライメント解析を行い相同性を比較し、種間で保存されているアミノ酸配列情報に基づいて、20〜23の塩基配列からなる縮重プライマーを設計した。各酵素に対する縮重プライマーの配列を、表３に示す。【００２１】
【表１】
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【００２２】
【表２】
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【００２３】
【表３】
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【実施例２】
【００２４】
ラビリンチュラ類の脂肪酸合成経路の判別
実施例１で得られた縮重プライマーを用い、公知のラビリンチュラ類６種の脂肪酸合成経路の判別を行った。対象としたラビリンチュラ類を表４に示す。尚、これらは全てATCCより入手した。これらのラビリンチュラ類よりISOPLANT（ニッポンジーン社製）を用いて、キットのプロトコールに従ってゲノムDNAを抽出した。【００２５】
【表４】
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【００２６】
各ラビリンチュラより抽出されたゲノムDNAに対し、実施例１で得られた脂肪酸合成関連酵素遺伝子に対する縮重プライマーを用いてPCR反応を行った。PCRの条件を表５に示す。【００２７】
【表５】
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【００２８】
前記PCRにより得られたPCR産物を電気泳動した結果、C20-エロンゲースでは約230 bpの位置に（図3）、Δ4-デサチュラーゼでは約700 bpの位置に（図4）バンドが確認された。これらのバンドはThraustochytrium aureum ATCC 34304、Thraustochytrium roseum ATCC28210、Thraustochytrium striatum ATCC24473、Schizochytrium aggregatum ATCC28209で検出された。一方、Aurantiochytrium limacinum SR21 ATCC MYA-1381、Schizochytrium (Aurantiochytrium) sp. ATCC 20888では、いずれのバンドも検出されなかった。【００２９】
次に、目的の遺伝子が増幅されていることを確認した。前記電気泳動のゲルより目的のバンドを切り出した後、Wizard SV gel and PCR clean-up system (プロメガ社製)を用い、製品マニュアルに従って精製した。PCR精製産物を濃度調整後、TAクローニングベクターに挿入した。クローニングはpGEM(R)-T Easy Vector System（プロメガ社製）を用い、製品マニュアルに従って行った。プラスミドDNAの抽出はQIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社製）を用いて行った。抽出したプラスミドをシークエンス解析に供した。シークエンス解析はダイターミネーター法により行った。得られたC20-エロンゲース断片及びΔ4-デサチュラーザ断片のシークエンス配列を、BLASTによる相同性検索（http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）に供した。【００３０】
C20-エロンゲース断片の相同性検索の結果を、表６に示す。
Thraustochytrium aureum ATCC 34304、Thraustochytrium roseum ATCC28210、Thraustochytrium striatum ATCC24473、Schizochytrium aggregatum ATCC28209から得られたC20-elongase断片（配列名をそれぞれTAC20、TRC20、TSC20、SAC20とする）は、データベース上に公開されている既知のC20-エロンゲース遺伝子とアミノ酸配列で40-48％の相同性を示した。【００３１】
また、Δ4-デサチュラーゼ断片の相同性検索の結果を表７に示す。Thraustochytrium aureum ATCC 34304、Thraustochytrium roseum ATCC28210、Thraustochytrium striatum ATCC24473、Schizochytrium aggregatum ATCC28209から得られたΔ4-デサチュラーゼ断片（配列名をそれぞれTAD4、TRD4、TSD4、SAD4とする）は、データベース上に公開されている既知のΔ4-desaturase遺伝子とアミノ酸配列で78-97％の相同性を示した。【００３２】
これらの結果より、本発明にて設計したC20-エロンゲースとΔ4-デサチュラーゼを検出するための縮重プライマーにより、Thraustochytrimu属及びSchizochytrium属ではC20-エロンゲース及びΔ4-デサチュラーゼ遺伝子が検出された。一方、Aurantiochytrium属においては、C20-elongaseとΔ4-desaturase遺伝子は検出されなかった。即ち、ラビリンチュラ類の従来知られている性質と同等の結果を示しており、従って本発明はラビリンチュラ類の脂肪酸合成経路を判別する方法として有用であることが確認された。【００３３】
【表６】
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【００３４】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明は、脂肪酸合成関連酵素遺伝子に対する縮重プライマーを作製しそれを用いて、微生物より抽出したゲノム遺伝子において、脂肪酸合成関連遺伝子存在の有無を判別することを特徴とする微生物の脂肪酸合成経路の判別方法に係るものであり、微生物の脂肪酸合成関連酵素遺伝子の存在有無を簡便に判別することを可能としたものであり、食物及び／または飼料に添加して健康増進作用を強化するために有用な不飽和脂肪酸を産生する微生物を簡便に識別するものである。本発明は、特に、真核生物系により経済的に不飽和脂肪酸を製造する技術を開発し確立するために有用である。不飽和脂肪酸の製造技術が進展することにより、ヒトが健康的な生活を送るために役立つ有用な物質を提供することができる。  
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2010101218.tif 000015
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